*****

VERORDENING (EEG) Nr. 1864/90 VAN DE COMMISSIE

van 29 juni 1990

tot wijziging van Verordening (EEG) nr. 1470/68 betreffende het nemen en het omzetten van monsters, alsmede betreffende de analysemethoden voor oliehoudende zaden

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE

GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,

Gelet op Verordening nr. 136/66/EEG van de Raad van 22 september 1966 houdende de totstandbrenging van een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector oliën en vetten (1), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 2902/89 (2), en met name op artikel 24 bis,

Overwegende dat de benaming »dubbel nul" voor kool- en raapzaad afhangt van het gehalte aan glucosinolaten ervan; dat de meest geëigende methode moet worden vastgesteld om dit gehalte te bepalen;

Overwegende dat in Verordening (EEG) nr. 1470/68 van de Commissie (3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 2435/86 (4), de gemeenschappelijke methode voor de Gemeenschap voor de bepaling van het gehalte aan glucosinolaten is vastgesteld; dat sedertdien een betere analysemethode is ontwikkeld en uitgetest; dat derhalve de gemeenschappelijke methode voor de Gemeenschap voor de bepaling van het gehalte aan glucosinolaten moet worden gewijzigd;

Overwegende dat de in deze verordening vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Comité van beheer voor oliën en vetten,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING

VASTGESTELD:

Artikel 1

Bijlage VIII bij Verordening (EEG) nr. 1470/68 wordt vervangen door de bijlage bij deze verordening.

Artikel 2

Deze verordening treedt in werking op de dag van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Zij is van toepassing met ingang van 1 juli 1990.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.

Gedaan te Brussel, 29 juni 1990.

Voor de Commissie

Ray MAC SHARRY

Lid van de Commissie

(1) PB nr. 172 van 30. 9. 1966, blz. 3025/66.

(2) PB nr. L 280 van 29. 9. 1989, blz. 2.

(3) PB nr. L 239 van 28. 9. 1968, blz. 2.

(4) PB nr. L 210 van 1. 8. 1986, blz. 55.

BIJLAGE

»BIJLAGE VIII

OLIEHOUDENDE ZADEN - BEPALING VAN GLUCOSINOLATEN

Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)

1.2 // // // 1. // TOEPASSINGSGEBIED // // Deze bijlage beschrijft een methode voor de bepaling van verschillende glucosinolaten in oliehoudende zaden van de soort »Brassica, in het bijzonder koolzaad, waarbij gebruik gemaakt wordt van hogedrukvloeistofchromatografie. Deze methode meet geen glucosinolaten met substituties in het glucosemolecuul, deze verbindingen zijn echter van weinig belang voor handelsraapzaad. // 2. // REFERENTIES // // Analysemonsters moeten bereid worden volgens de relevante bijlagen bij deze verordening. De volgende bijlagen zijn hierbij in het bijzonder van belang: // // bijlage II - Verkleinen van laboratoriummonsters tot analysemonsters // // bijlage III - Bepaling van het gehalte aan vocht en vluchtige bestanddelen. // 3. // PRINCIPE // // Glucosinolaten worden met een methanoloplossing geëxtraheerd en vervolgens gezuiverd en enzymatisch gedesulfateerd op een ionenwisselaar. Bij de bepaling wordt reversed phase hogedrukvloeistofchromatografie met gradiëntelutie en UV-detectie gebruikt. // 4. // REAGENTIA EN MATERIALEN // // Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn: gebruik gedestilleerd water of water van ten minste gelijke zuiverheid. // 4.1. // Methanoloplossing, 70 % (v/v) in water. // 4.2. // Natriumacetaatoplossing, 0,02 mol/l, pH 4,0. // 4.3. // Natriumacetaatoplossing, 0,2 mol/l. // 4.4. // Imidazoolformiaatoplossing, 6 mol/l. Los 204 g imidazool met 113 ml mierezuur op in een maatkolf van 500 ml. Verdun met water tot 500 ml. // 4.5. // Interne standaard // // Gebruik sinigrine (kaliumallylglucosinolaat monohydraat, M = 415,49) waarvan de zuiverheid gecontroleerd wordt zoals aangegeven is in 4.5.3. // 4.5.1. // Sinigrine-oplossing, 5 mmol/l // // Los 207,7 mg kaliumallylglucosinolaat monohydraat met water op in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de maatstreep. // 4.5.2. // Sinigrine-oplossing, 20 mmol/l // // Los 831,0 mg kaliumallylglucosinolaat monohydraat met water op in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de maatstreep. // // Deze oplossingen zijn beperkt houdbaar (ca. een week) in een koelkast bij 4 °C. Bij -18 °C kunnen ze langer bewaard worden. // 4.5.3. // Controle van de zuiverheid van sinigrine // // Gebruik ten minste een van de volgende drie tests: // // - analyse met HPLC waarbij de hier beschreven methode gebruikt wordt, mag slechts één grote piek geven; // // - analyse van het intacte sinigrine met HPLC (ion-paar techniek) mag slechts één grote piek geven; // // - analyse van het gedesulfateerde en gesylileerde sinigrine met gaschromatografie mag slechts één grote piek geven. // // // Bij deze tests moet het oppervlak van de grote piek ten minste 98 % van de totale piekoppervlakte zijn. // // Bevestig de zuiverheid door de hoeveelheid vrijgekomen glucose na hydrolyse met myrosinase (thioglucoside glucohydrolase EC 3.2.3.1) te bepalen. Bepaal de glucose enzymatisch m.b.v. een in de handel verkrijgbare testkit. Hierbij moet rekening gehouden worden met eventueel aanwezige vrije glucose; bepaal deze vrije glucose door de toevoeging van myrosinase achterwege te laten. De molaire concentratie van de gemeten glucose moet ten minste 98 % zijn van de molaire concentratie van de sinigrine-oplossing die gecontroleerd wordt. // 4.5.4. // Alternatieve interne standaard: glucotropaeoline // // In bepaalde zaden van Brassicasoorten of in zaden van vergelijkbare soorten (geteeld of wild), kan sinigrine als natuurlijk bestanddeel voorkomen. Als sinigrine in natuurlijke staat voorkomt, moet een andere standaard glucotropaeoline (benzylglucosinolaat, kaliumzout, M = 447,52) gebruikt worden, maar deze is soms moeilijk te scheiden van andere natuurlijk voorkomende minder belangrijke glucosinolaten. // // Gebruik glucotropaeoline op dezelfde manier (oplossingen van 5 en 20 mmol/l) als sinigrine, nadat de zuiverheid gecontroleerd is met de procedure beschreven in 4.5.3. Verifieer of de responsfactor in vergelijking met sinigrine overeenkomt met de waarde aangegeven in 7.2. // 4.6. // Mobiele fasen // 4.6.1. // Eluens A: water (HPLC-kwaliteit). // 4.6.2. // Eluens B: acetonitriloplossing (acetonitril van HPLC-kwaliteit), 20 % (v/v) in water (HPLC-kwaliteit). Afhankelijk van de gebruikte kolom, kan het nodig zijn de concentratie aan te passen. // 4.7. // Ionenwisselaar hars // 4.7.1. // Suspensie van DEAE Sepharose C1-6B, gebruiksklaar // 4.7.2. // Suspensie van Sephadex A25 als volgt bereid: // // Meng 10 g hars met een overmaat azijnzuur (2 mol/l). Laat bezinken. Breng met azijnzuur (2 mol/l) het volume op tweemaal het volume van het bezonken materiaal. // 4.8. // Sulfatase, Helix pomatia type H1 (EC 3.1.6.1), vooraf gezuiverd en gecontroleerd zoals hierna aangegeven, en vervolgens verdund. // 4.8.1. // Bereiding van de ionenwisselaarkolommetjes // // Snijd vijf Pasteurpipetten (5.9) 7 cm boven het dunne eind af en breng een plukje glaswol (5.8) aan in het dunne eind. Plaats de pipetten verticaal in een houder en breng in ieder kolommetje zoveel van de suspensie van DEAE Sepharose C1-6B (4.7.1) dat het bezonken volume van het hars 500 ml is. // // Breng 1 ml imidazoolformaatoplossing (4.4) op ieder kolommetje en was tweemaal met 1 ml water. // 4.8.2. // Zuivering van sulfatase // // Weeg af, op 0,1 mg nauwkeurig, 25 mg Helix pomatia type H1 (EC 3.1.6.1), los op in 2,5 ml water en breng 500 ml van deze oplossing op elk van de geregenereerde kolommetjes (4.8.1). Was elk kolommetje met 1,5 ml water en verwijder het eluaat. Voeg vervolgens 1,5 ml natriumacetaatoplossing (4.3) toe, vang de eluaten van de vijf kolommetjes op en verzamel ze in een reageerbuis. // // Concentreer de eluaten tot ongeveer 100 ml door te filtreren over een Millipore PTGC 11K25 filter (sulfatase met een mol massa > 5000 wordt niet verwijderd). Voeg 2,5 ml water toe en concentreer nogmaals door filtreren totdat een residu van ongeveer 100 ml is verkregen. Verdun tot 2,5 ml met water en bewaar de gezuiverde sulfatase in een diepvriezer bij -18 °C (in kleine porties, zodat alleen de hoeveelheid nodig voor direct gebruik ontdooid hoeft te worden). // 4.8.3. // Controle van de activiteit van sulfatase // 4.8.3.1. // Bereiding van een gebufferde sinigrine-oplossing van 0,15 mmol/l en pH 5,8 // // Bereid achtereenvolgens de volgende oplossingen: // // (a) breng 1 ml azijnzuur in een maatkolf van 500 ml en vul aan tot de maatstreep met water; // // (b) breng 1 ml ethyleendiamine in een maatkolf van 500 ml en vul aan tot de maatstreep met water; // // // (c) meng 73 ml van oplossing (a) met 40 ml van oplossing (b); // // (d) breng de pH op 5,8 met oplossing (a) of (b). // // Breng 3 ml sinigrine-oplissing, 5 mmol/l (4.5.1), in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de maatstreep met oplossing (c). // 4.8.3.2. // Controle van de activiteit // // Een eenheid activiteit komt overeen met de vorming van 1 mmol gedesulfateerd sinigrine per minuut bij 30 °C en pH 5,8. // // Breng 2 ml van de gebufferde sinigrine-oplossing (4.8.3.1) in de referentie- en meetcel van de spectrometer (5.3), waarvan de golflengte is ingesteld op 228 nm en de temperatuur van de cellen 30 °C bedraagt. Voeg op tijdstip t = 0, 50 ml gezuiverde sulfatase-oplossing (4.8.2) toe aan de meetcel en start de recorder. Stop de recorder als de absorbantie (Ae) niet meer verandert, trek de raaklijn in het punt t = 0 en bepaal de tangens D A D t . // // De activiteit van de sulfatase, uitgedrukt in eenheden activiteit per ml sulfatase-oplossing, is gelijk aan: 1.2.3.4.5.6.7 // // D A D t // × // V D E // × // 1 000 50 // × 106 1.2 // // waarin: 1.2.3 // // D A D t // is de tangens van de raaklijn in punt t = 0, in absorbantie-eenheden per minuut // // V // is het volume van het reactiemengsel (i.e. 2,0510 × 10-3 l) in liter. // // D E // is het verschil tussen de molaire absorptiviteiten van sinigrine en desulfosinigrine bij 228 nm: 1.2.3.4 // // // D E = // D Ae e × c 1.2.3 // // // waarin: 1.2.3.4 // // // D Ae // is het verschil tussen de absorbantie van het gedesulfateerde sinigrine in de evenwichtstoestand en de absorbantie op tijdstip t = 0 // // // e // is de lengte van de cel (i.e. 1 cm), in cm // // // c // is de concentratie van het gedesulfateerde sinigrine in de evenwichtstoestand, in mol/l: 1.2.3.4.5.6 // // // // c = // 0,15 × 10-3 × 0,95 × 2 2,05 // = 1,39 × 10-4 mol/l 1.2 // // De opbrengst van de desulfatering van sinigrine in de evenwichtstoestand is 0,95. // // Berekend DE, die ongeveer 1 500 l; mol-1; cm-1 moet bedragen. // // De activiteit van sulfatase kan ook met behulp van de volgende vereenvoudigde formule worden berekend: 1.2.3 // // Apstioiteit = // D A × 5,7 D t × D Ae 1.2 // // De gezuiverde sulfatase-oplossing (4.8.2) moet een activiteit hebben die groter is dan 0,5 mmol/min;ml. // 4.8.4. // Verdunning // // Pipetteer 1 ml van de gezuiverde sulfatase-oplossing (4.8.2) in een maatkolf van 10 ml en vul aan tot de maatstreep met water en meng. // // Verdeel deze oplossing in kleine porties en bewaar deze bij -18 °C. // 5. // APPARATUUR // // Normale laboratoriumapparatuur en in het bijzonder: // 5.1. // Hogedrukvloeistofchromatograaf met mogelijkheid voor gradiëntelutie, voorzien van een kolomoven instelbaar op 30 °C en een UV-detector waarmee bij 229 nm gemeten kan worden. // 5.2. // HPLC-kolommen, type C18 of C8 met deeltjesgrootte 5 mm, bij voorbeeld: 1.2.3 // // Lichrosorb RP18 kolom 5 mm // (150 mm × 4,6 mm) // // Spherisorb ODS2 kolom 5 mm // (250 mm × 4-5 mm) // // Novapak C18 kolom 4 mm // (150 mm × 4 mm) // // Lichrospher RP8 kolom 5 mm // (125 mm × 4 mm) // // Nucleosil C18 kolom 5 mm // (200 mm × 4 mm) 1.2 // 1.2 // // De prestatie van de gekozen kolom moet regelmatig gecontroleerd worden, bij voorkeur met behulp van een referentiemonster raapzaad (geadviseerd wordt om desulfoglucosinolaten afkomstig van monsters van het referentiebureau van de Gemeenschap te gebruiken). In het bijzonder mag 4-hydroxybrassicine, een belangrijk maar relatief onstabiel glucosinolaat, op de kolom niet afgebroken worden. Bij nieuwe kolommen moeten een of meerdere proefinjecties worden uitgevoerd, zodat reproduceerbare resultaten worden verkregen. // 5.3. // Dubbelstraal-spectrometer, geschikt voor het ultravioletgebied, met kwartscuvetten en bij voorkeur een registratiesysteem en de mogelijkheid te meten bij een gecontroleerde temperatuur van 30 °C. // 5.4. // Laboratoriummolen, bij voorbeeld een koffiemolen. // 5.5. // Centrifuge voor buizen van 6 ml, waarmee een centrifugale versnelling van 5 000 g bereikt kan worden. // 5.6. // Waterbad of verwarmingseenheid, instelbaar op 75 °C. // 5.7. // Polypropyleenbuizen met een inhoud van 6 ml. // 5.8. // Glaswol. // 5.9. // Pasteurpipetten met een lengte van 150 mm. // 6. // PROCEDURE // 6.1. // Bereiding van het analysemonster // // Verklein het laboratoriummonster volgens bijlage II en maal in de laboratoriummolen (5.4) gedurende 20 seconden. Meng het meel en maal nogmaals gedurende 5 seconden. // // Droog de zaden vooraf in een luchtstroom bij ongeveer 45 °C, indien de zaden een vochtgehalte van meer dan 10 % (m/m) hebben. // // Opmerking: Als behandelde zaden geanalyseerd worden, moeten ze vóór het malen gewassen worden met dichloormethaan. // 6.2. // Bepaling van het gehalte aan vocht en vluchtige bestanddelen // // Bepaal het gehalte aan vocht en vluchtige bestanddelen in het analysemonster volgens bijlage III. // 6.3. // Analyseportie // // Breng 200 mg van het analysemonster, op 0,1 mg nauwkeurig afgewogen, in elk van de twee buizen (5.7). // 6.4. // Extractie van glucosinolaten // // Plaats de buizen gedurende 1 minuut in het waterbad of de verwarmingseenheid (5.6) ingesteld op 75 °C. Voeg 2 ml kokende 70 % methanoloplossing (4.1) toe en voeg onmiddellijk daarna toe: // // - aan de eerste buis A, 200 m l sinigrine-oplossing 5 mmol/l (4.5.1), // // - aan de tweede buis B, 200 ml sinigrine-oplossing 20 mmol/l (4.5.2). // // Blijf gedurende 10 minuten verwarmen in het bad bij 75 °C, en schud regelmatig. Meng de inhoud van elke buis en centrifugeer gedurende 3 minuten bij een centrifugale versnelling van 5 000 g. Breng elk supernatans over in een andere buis (5.7). // // Voeg 2 ml kokende 70 % methanoloplossing (4.1) toe aan elk sediment, verhit opnieuw in het bad bij 75 °C gedurende 10 minuten, en schud regelmatig. Centrifugeer gedurende 3 minuten en voeg het supernatans toe aan het origineel. Breng het volume met water op ongeveer 5 ml en meng. // // Dit extract kan 2 weken bewaard worden in het donker in de diepvries bij -18 °C. // 6.5. // Bereiding van de ionenwisselaarkolommetjes // // Snijd het vereiste aantal Pasteurpipetten (5.9), d. w. z. een pipet per monster, af zodat een volume van 1,2 ml boven het dunne eind overblijft en breng een plukje glaswol (5.8) aan in het dunne eind. Plaats de pipetten verticaal in een houder. // // Breng in ieder kolommetje 0,5 ml van de goed gemengde suspensie van DEAE Sephadex A25 (4.7.2) en laat bezinken. // // Was de kolommetjes met 2 ml imidazoolformaat 6 mol/l (4.4) en vervolgens tweemaal met 1 ml water.

1.2.3 // 6.6. // Zuivering en desulfatering // // // Breng 1 ml extract (6.4) op het bereide kolommetje (6.5) zonder het oppervlak van de hars te verstoren, en laat het kolommetje uitlekken. Voeg tweemaal 1 ml natriumacetaatbuffer 0,02 mol/l, pH 4,8 (4.2), toe en laat het kolommetje telkens uitlekken. // // // Breng 75 ml van de verdunde gezuiverde sulfatase-oplossing (4.8.4) op het kolommetje. Laat een nacht bij kamertemperatuur reageren. Elueer de verkregen desulfoglucosinolaten tweemaal met 1 ml water (HPLC-kwaliteit) en laat het kolommetje na iedere toevoeging uitlekken. Verzamel het eluaat in een buis. Meng het eluaat goed en bewaar het in het donker in de diepvries bij -18 °C als niet onmiddellijk verder wordt gegaan met de chromatografie. // // 6.7. // Referentiebepaling // // // Voer, indien nodig (zie 7.3), een referentiebepaling uit onder dezelfde omstandigheden op een identiek analysemonster, waarbij echter de interne standaardoplossing van sinigrine weggelaten wordt om mogelijk aanwezig sinigrine in het analysemonster aan te tonen en te kwantificeren. // // 6.8. // Chromatografie // // 6.8.1. // Instelling van de apparatuur // // // Stroomsnelheid van de mobiele fase: hangt af van het type kolom (zie 6.8.2) // // // Temperatuur van de kolom: 30 °C // // // Golflengte detectie: 229 nm // // 6.8.2. // Bepaling en elutiegradiënt // // // Volg de gebruiksaanwijzing van de apparatuur en injecteer niet meer dan 50 ml van de desulfoglucosinolatenoplossing verkregen bij 6.6. // // // Afhankelijk van de gebruikte kolom kunnen een aantal gradiënten geschikt zijn. // // // - Spherisorb RP18 5 mm kolom (150 mm × 4,6 mm) // // // - 100 % eluens A (4.6.1) + 0 % eluens B (4.6.2) gedurende 1 minuut // // // - een lineaire gradiënt in 20 minuten naar 0 % eluens A en 100 % eluens B // // // - een lineaire gradiënt in 5 minuten naar 100 % eluens A en 0 % eluens B // // // - 100 % eluens A en 0 % eluens B gedurende 5 minuten om te equilibreren // // // - Lichrospher RP8 5 mm kolom (125 mm × 4,0 mm) // // // - 100 % eluens A gedurende 2 minuten 30 seconden // // // - een lineaire gradiënt in 18 minuten naar 0 % eluens A en 100 % eluens B // // // - 100 % eluens B gedurende 5 minuten // // // - een lineaire gradiënt in 2 minuten naar 100 % eluens A en 0 % eluens B // // // - equilibreer gedurende 5 minuten // // // Opmerking: Voor een optimale scheiding kan een gradiëntprofiel worden aangepast aan de gebruikte kolom. // // 6.8.3. // Evaluatie van het chromatogram // // // Houd alleen rekening met glucosinolatenpieken waarvan de oppervlakte groter is dan 1 % van de totale som van de piekoppervlakten. // // // De elutievolgorde van de pieken op een C18 type kolom en een gradiënt als aangegeven in 6.8.2, is over het algemeen als volgt: // // // 1. Desulfoglucoiberine // // // 2. Desulfoprogoitrine // // // 3. Desulfo-epi-progoitrine // // // 4. Desulfosinigrine // // // 5. Desulfoglucoraphanine // // // 6. Desulfogluconapoleiferine // // // 7. Desulfoglucoalyssine // // // 8. Desulfogluconapine // // // 9. Desulfo-4-hydroxyglucobrassicine // // // 10. Desulfoglucobrassicanapine // // // 11. Desulfoglucotropaeoline // // // 12. Desulfoglucobrassicine // // // 13. Desulfogluconasturtiine // // // 14. Desulfo-4-methoxyglucobrassicine // // // 15. Desulfoneoglucobrassicine // // 7. // WEERGAVE VAN DE RESULTATEN // // 7.1. // Berekening van het gehalte aan afzonderlijke glucosinolaten // // // Het gehalte aan afzonderlijke glucosinolaten, uitgedrukt in micromol per gram gehele gedroogde zaden, is gelijk aan: // 1.2.3.4 // // oppervlakte desulfoglucosinolaatpiek oppervlakte desulfosinigrine // × // hoeveelheid interne standaard toegevoegd aan de buis in 6.4 (in mmol) gewicht van het geëxtraheerde zaadmonster 1.2.3.4 // // × responsfactor van desulfoglucosinolaat (7.2) // × // 100 100 - H 1.2 // // waarin: // // H is het gehalte aan vocht en vluchtige bestanddelen van het analysemonster, uitgedrukt in massaprocent (6.2). // // In sommige gevallen moeten de resultaten worden uitgedrukt op basis van een welbepaald vochtgehalte (thans 9 %). Vermenigvuldig in dat geval het resultaat verkregen voor drogestofbasis met // // 100 - vochtgehalte 100 // 7.2. // Responsfactoren // // De waarden voor de responsfactoren zijn experimenteel bepaald; ze zijn vastgelegd op basis van overeenstemming tussen de verschillende laboratoria die hieraan deelnamen en moeten te zijner tijd wellicht worden herzien. // // Desulfoglucoiberine 1,07 // // Desulfoglucobrassicanapine 1,15 // // Desulfoglucoraphanine 1,07 // // Desulfo-4-hydroxyglucobrassicine 0,28 // // Desulfoglucoalyssine 1,07 // // Desulfoglucobrassicine 0,29 // // Desulfoprogoitrine 1,09 // // Desulfoneoglucobrassicine 0,20 // // Desulfo-epi-progoitrine 1,09 // // Desulfoglucotropaeoline 0,95 // // Desulfosinigrine 1,00 // // Desulfogluconasturtiine 0,95 // // Desulfogluconapine 1,11 // // Desulfogluconapoleiferine 1,00 // // Desulfo-4-methoxyglucobrassicine 0,25 // // Overige desulfoglucosinolaten 1,00 // 7.3. // Totale gehalte aan glucosinolaten // // Het totale gehalte aan glucosinolaten, uitgedrukt in mmol per gram droge stof van het monster, is gelijk aan de som van de afzonderlijke glucosinolaten waarvan de piekoppervlakte groter is dan 1 % van de totale som van de piekoppervlakten. // // Het gebruik van interne standaarden met twee verschillende concentraties (4.5.1 en 4.5.2) maakt het mogelijk rekening te houden met sinigrine aanwezig in het monster of met een onbekende verbinding die gelijk met sinigrine elueert. // // - Als voor het totale glucosinolaatgehalte het verschil tussen de resultaten van de duplobepalingen overeenkomt met de herhaalbaarheidseisen (8.2), is er geen contaminatie van de interne referentie. Het resultaat is het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen. // // - Als het verschil tussen de resultaten niet met de herhaalbaarheidseisen overeenkomt (8.2), herhaal dan de bepaling in twee andere analysemonsters en voer de referentiebepaling (6.7) uit, waarbij de interne standaard wordt weggelaten. De oppervlakte van de contaminant wordt afgetrokken van de oppervlakte van de interne standaard en geeft aldus de ware oppervlakte van de interne referentie voor de formule in 7.1. Het resultaat is het rekenkundig gemiddelde van de twee nieuwe bepalingen. // 8. // NAUWKEURIGHEID EN JUISTHEID // 8.1. // Nauwkeurigheid (herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid) // // Een ringtest, georganiseerd in 1988 op internationale basis waaraan 12 laboratoria deelnamen, die elk twee bepalingen in 4 monsters koolzaad uitvoerden, leverde de waarden voor herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid weergegeven in tabel 1. De resultaten werden geëvalueerd volgens ISO 5725 (Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests). // // Tabel 1: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald in een ringtest (1988) 1.2.3.4.5 // // // // // // Monsters // Raapzaad A // Raapzaad B // Raapzaad C // Raapzaad D // // // // // // Aantal laboratoria na elimineren van uitschieters // 11 // 11 // 11 // 11 // // // // // // Gemiddeld // 20,6 // 14,1 // 4,9 // 25,6 // // // // // // Standaardafwijking herhaalbaarheid // 1,7 // 0,6 // 0,3 // 0,8 // Herhaalbaarheidscoëfficiënt // 8,5 % // 4,4 % // 6,7 % // 3,3 % // Herhaalbaarheid // 4,9 // 1,7 // 0,9 // 2,4 // // // // // // Standaardafwijking reproduceerbaarheid // 3,4 // 2,5 // 1,5 // 2,4 // Reproduceerbaarheidsvariatiecoëfficiënt // 17 % // 18 % // 31 % // 9,4 % // Reproduceerbaarheid // 9,6 // 7,1 // 1,4 // 6,8 // // // // // 1.2 // 8.1.1. // Herhaalbaarheid // // Op grond van bovenstaande resultaten mag het verschil tussen de uitkomsten van twee bepalingen, kort na elkaar uitgevoerd (of gelijktijdig door dezelfde analist, met dezelfde apparatuur, in hetzelfde onderzoekmonster niet groter zijn dan 2 mmol/g voor gehalten kleiner dan 20 mmol/g en 4 mmol/g voor gehalten tussen 20 en 35 mmol/g. // 8.1.2. // Reproduceerbaarheid // // Op grond van bovenstaande resultaten mag het verschil tussen de uitkomsten van twee laboratoria verkregen met de onderhavige methode in hetzelfde laboratoriummonster, niet groter zijn dan 4 mmol/g voor gehalten kleiner dan 20 mmol/g en 8 mmol/g voor gehalten tussen 20 en 35 mmol/g. // 8.2. // Juistheid // // Het juiste gebruik van de methode zal nagegaan worden aan de hand van herhaalde metingen van referentiemonsters met een gewaarborgd gehalte aan glucosinolaten en in overeenstemming met de betrokken concentratieschaal. // // Het geëinde referentiemateriaal met gewaarborgd gehalte kan men krijgen bij het referentiebureau (BCR) van de Commissie van de Europese Gemeenschappen. // // Het protocol om de laboratoriumresultaten te vergelijken met het referentiemateriaal met gewaarborgd gehalte wordt beschreven onder de paragraaf »Instruction for use" van het rapport dat bij het referentiemateriaal gevoegd is. // 9. // VERSLAG // // Vermeld in het verslag het resultaat en de gebruikte methode. Vermeld tevens details bij de uitvoering die niet in het voorschrift aangegeven zijn of als optioneel worden beschouwd en bijzonderheden die waarschijnlijk van invloed zijn geweest op het resultaat. // // Geef in het verslag alle gegevens die noodzakelijk zijn voor de volledige identificatie van het monster."

3 . Desulfo-epi-progoitrine // //

4 . Desulfosinigrine // //

5 . Desulfoglucoraphanine // //

6 . Desulfogluconapoleiferine // //

7 . Desulfoglucoalyssine // //

8 . Desulfogluconapine // //

9 . Desulfo-4-hydroxyglucobrassicine // //

10 . Desulfoglucobrassicanapine // //

11 . Desulfoglucotropaeoline // //

12 . Desulfoglucobrassicine // //

13 . Desulfogluconasturtiine // //

14 . Desulfo-4-methoxyglucobrassicine // //

15 . Desulfoneoglucobrassicine //

7 .

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN //

7.1 .

Berekening van het gehalte aan afzonderlijke glucosinolaten // //

Het gehalte aan afzonderlijke glucosinolaten, uitgedrukt in micromol per gram gehele gedroogde zaden, is gelijk aan : //

1.2.3.4 //

oppervlakte desulfoglucosinolaatpiek oppervlakte desulfosinigrine

x

hoeveelheid interne standaard toegevoegd aan de buis in 6.4 ( in *mol ) gewicht van het geëxtraheerde zaadmonster

1.2.3.4x responsfactor van desulfoglucosinolaat ( 7.2 )

x

100 100 _ H

1.2 //

waarin : //

H is het gehalte aan vocht en vluchtige bestanddelen van het analysemonster, uitgedrukt in massaprocent ( 6.2 ). //

In sommige gevallen moeten de resultaten worden uitgedrukt op basis van een welbepaald vochtgehalte ( thans 9 %). Vermenigvuldig in dat geval het resultaat verkregen voor drogestofbasis met //

100 _ vochtgehalte 100

7.2 .

Responsfactoren //

De waarden voor de responsfactoren zijn experimenteel bepaald; ze zijn vastgelegd op basis van overeenstemming tussen de verschillende laboratoria die hieraan deelnamen en moeten te zijner tijd wellicht worden herzien . //

Desulfoglucoiberine 1,07 //

Desulfoglucobrassicanapine 1,15 //

Desulfoglucoraphanine 1,07 //

Desulfo-4-hydroxyglucobrassicine 0,28 //

Desulfoglucoalyssine 1,07 //

Desulfoglucobrassicine 0,29 //

Desulfoprogoitrine 1,09 //

Desulfoneoglucobrassicine 0,20 //

Desulfo-epi-progoitrine 1,09 //

Desulfoglucotropaeoline 0,95 //

Desulfosinigrine 1,00 //

Desulfogluconasturtiine 0,95 //

Desulfogluconapine 1,11 //

Desulfogluconapoleiferine 1,00 //

Desulfo-4-methoxyglucobrassicine 0,25 //

Overige desulfoglucosinolaten 1,00

7.3 .

Totale gehalte aan glucosinolaten //

Het totale gehalte aan glucosinolaten, uitgedrukt in *mol per gram droge stof van het monster, is gelijk aan de som van de afzonderlijke glucosinolaten waarvan de piekoppervlakte groter is dan 1 % van de totale som van de piekoppervlakten . //

Het gebruik van interne standaarden met twee verschillende concentraties ( 4.5.1 en 4.5.2 ) maakt het mogelijk rekening te houden met sinigrine aanwezig in het monster of met een onbekende verbinding die gelijk met sinigrine elueert . //

_ Als voor het totale glucosinolaatgehalte het verschil tussen de resultaten van de duplobepalingen overeenkomt met de herhaalbaarheidseisen ( 8.2 ), is er geen contaminatie van de interne referentie . Het resultaat is het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen . //

_ Als het verschil tussen de resultaten niet met de herhaalbaarheidseisen overeenkomt ( 8.2 ), herhaal dan de bepaling in twee andere analysemonsters en voer de referentiebepaling ( 6.7 ) uit, waarbij de interne standaard wordt weggelaten . De oppervlakte van de contaminant wordt afgetrokken van de oppervlakte van de interne standaard en geeft aldus de ware oppervlakte van de interne referentie voor de formule in 7.1 . Het resultaat is het rekenkundig gemiddelde van de twee nieuwe bepalingen .

8 .

NAUWKEURIGHEID EN JUISTHEID

8.1 .

Nauwkeurigheid ( herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid ) //

Een ringtest, georganiseerd in 1988 op internationale basis waaraan 12 laboratoria deelnamen, die elk twee bepalingen in 4 monsters koolzaad uitvoerden, leverde de waarden voor herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid weergegeven in tabel 1 . De resultaten werden geëvalueerd volgens ISO 5725 ( Precision of test methods _ Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests ).

Tabel 1 : Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald in een ringtest ( 1988 )

1.2.3.4.5 // // // // //

Monsters

Raapzaad A

Raapzaad B

Raapzaad C

Raapzaad D // // // // //

Aantal laboratoria na elimineren van uitschieters

11

11

11

11 // // // // //

Gemiddeld

20,6

14,1

4,9

25,6 // // // // //

Standaardafwijking herhaalbaarheid

1,7

0,6

0,3

0,8

Herhaalbaarheidscoëfficiënt

8,5 %

4,4 %

6,7 %

3,3 %

Herhaalbaarheid

4,9

1,7

0,9

2,4 // // // // //

Standaardafwijking reproduceerbaarheid

3,4

2,5

1,5

2,4

Reproduceerbaarheidsvariatiecoëfficiënt

17 %

18 %

31 %

9,4 %

Reproduceerbaarheid

9,6

7,1

1,4

6,8 // // // // //

1.28.1.1 .

Herhaalbaarheid //

Op grond van bovenstaande resultaten mag het verschil tussen de uitkomsten van twee bepalingen, kort na elkaar uitgevoerd ( of gelijktijdig door dezelfde analist, met dezelfde apparatuur, in hetzelfde onderzoekmonster niet groter zijn dan 2 *mol/g voor gehalten kleiner dan 20 *mol/g en 4 *mol/g voor gehalten tussen 20 en 35 *mol/g .

8.1.2 .

Reproduceerbaarheid //

Op grond van bovenstaande resultaten mag het verschil tussen de uitkomsten van twee laboratoria verkregen met de onderhavige methode in hetzelfde laboratoriummonster, niet groter zijn dan 4 *mol/g voor gehalten kleiner dan 20 *mol/g en 8 *mol/g voor gehalten tussen 20 en 35 *mol/g .

8.2 .

Juistheid //

Het juiste gebruik van de methode zal nagegaan worden aan de hand van herhaalde metingen van referentiemonsters met een gewaarborgd gehalte aan glucosinolaten en in overeenstemming met de betrokken concentratieschaal . //

Het geëinde referentiemateriaal met gewaarborgd gehalte kan men krijgen bij het referentiebureau ( BCR ) van de Commissie van de Europese Gemeenschappen . //

Het protocol om de laboratoriumresultaten te vergelijken met het referentiemateriaal met gewaarborgd gehalte wordt beschreven onder de paragraaf "Instruction for use" van het rapport dat bij het referentiemateriaal gevoegd is .

9 .

VERSLAG //

Vermeld in het verslag het resultaat en de gebruikte methode . Vermeld tevens details bij de uitvoering die niet in het voorschrift aangegeven zijn of als optioneel worden beschouwd en bijzonderheden die waarschijnlijk van invloed zijn geweest op het resultaat . //

Geef in het verslag alle gegevens die noodzakelijk zijn voor de volledige identificatie van het monster ."