1991R2568 — NL — 04.08.2016 — 029.001
Onderstaande tekst dient louter ter informatie en is juridisch niet bindend. De EU-instellingen zijn niet aansprakelijk voor de inhoud. Alleen de besluiten die zijn gepubliceerd in het Publicatieblad van de Europese Unie (te raadplegen in EUR-Lex) zijn authentiek. Deze officiële versies zijn rechtstreeks toegankelijk via de links in dit document
|
VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE van 11 juli 1991 (PB L 248 van 5.9.1991, blz. 1) |
Gewijzigd bij:
Gerectificeerd bij:
VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE
van 11 juli 1991
inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven en de desbetreffende analysemethoden
Artikel 1
1. Als „olijfoliën van eerste persing” in de zin van punt 1, onder a) en b), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG worden aangemerkt de oliën waarvan de respectieve kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punten 1 en 2, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
2. Als „olijfolie voor verlichting” in de zin van punt 1, onder c), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 3, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
3. Als „geraffineerde olijfolie” in de zin van punt 2 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 4, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
4. Als „olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing” in de zin van punt 3 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 5, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
5. Als „ruwe olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 4 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 6, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
6. Als „geraffineerde olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 5 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 7, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
7. Als „olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 6 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 8, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.
Artikel 2
1. De in bijlage I vastgestelde kenmerken van de oliën worden aan de hand van de volgende analysemethoden bepaald:
a) voor de bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, uitgedrukt in een percentage oliezuur, de in bijlage II beschreven methode;
b) voor de bepaling van het peroxidegetal, de in bijlage III beschreven methode;
c) voor de bepaling van het gehalte aan was, de in bijlage IV beschreven methode;
d) voor de bepaling van de samenstelling van en het gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie, de in bijlage V beschreven methode;
e) voor de bepaling van het percentage 2-glycerylmonopalmitaat, de in bijlage VII beschreven methode;
f) voor de spectrofotometrische analyse, de in bijlage IX beschreven methode;
g) voor de bepaling van de vetzuursamenstelling, de in bijlage X beschreven methode;
h) voor de bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen, de in bijlage XI beschreven methode;
i) voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie, de in bijlage XII beschreven methode;
j) voor de bepaling van stigmastadiënen, de in bijlage XVII beschreven methode;
k) voor de bepaling van het gehalte aan triglyceriden met ECN42, de in bijlage XVIII beschreven methode;
l) voor de bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen, de in bijlage XIX beschreven methode;
m) voor de bepaling van het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren, de in bijlage XX beschreven methode.
▼M28 —————
2. De verificatie van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers wordt uitgevoerd door een door de lidstaten erkend proeverspanel.
De organoleptische kenmerken van in de eerste alinea genoemde olie zijn die van de voor de olijfolie opgegeven categorie wanneer een door de betrokken lidstaat erkend panel de indeling in die categorie bevestigt.
Wanneer het panel de indeling van de olie ten aanzien van de organoleptische kenmerken van de opgegeven categorie niet bevestigt, laten de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers op verzoek van de belanghebbende onverwijld twee tegenanalyses door andere proeverspanels uitvoeren, waarvan minstens één door een panel dat is erkend door de lidstaat van de betrokken producent. Er wordt aangenomen dat de betrokken kenmerken overeenstemmen met de opgegeven kenmerken als de twee tegenanalyses de indeling bevestigen. Zo niet, komen de kosten van de tegenanalyses voor rekening van de belanghebbende.
3. Wanneer de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers de kenmerken van de olie overeenkomstig lid 1 verifiëren, worden monsters voor de controle van de kenmerken van de in lid 1 bedoelde olie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers worden genomen volgens de internationale normen EN ISO 661 met betrekking tot de voorbehandeling van het monster en EN ISO 5555 met betrekking tot de monsterneming. In afwijking van punt 6.8 van norm EN ISO 5555 worden echter voor partijen van dergelijke oliën in onmiddellijke verpakkingen monsters genomen volgens bijlage I bis bij deze verordening. In het geval van bulkoliën waarvoor de bemonstering niet kan worden uitgevoerd in overeenstemming met EN ISO 5555 wordt de bemonstering uitgevoerd in overeenstemming met de door de bevoegde autoriteit van de lidstaat verstrekte instructies.
Onverminderd het bepaalde in norm EN ISO 555 en hoofdstuk 6 van norm EN ISO 661 worden de genomen monsters zo snel mogelijk tegen licht en hitte beschermd en niet later dan de vijfde werkdag na het nemen verzonden naar het laboratorium voor analyse; anders worden de monsters op zodanige wijze bewaard dat zij niet aan kwaliteit verliezen of beschadigd raken tijdens het vervoer of de opslag voordat zij naar het laboratorium worden gezonden.
4. Voor de in lid 3 bedoelde verificatie worden in het geval van verpakte producten de in de bijlagen II, III, IX, XII en XX bepaalde analyses en in voorkomend geval de door de nationale wetgevingen voorgeschreven tegenexpertises uitgevoerd vóór de datum van minimale houdbaarheid. Voor bulkoliën worden deze analyses niet later uitgevoerd dan de zesde maand na de maand waarin het monster is genomen.
Voor de andere in deze verordening bepaalde analyses is geen termijn van toepassing.
Als de resultaten van de analyses niet beantwoorden aan de kenmerken van de aangegeven categorie olijfolie of olie uit perskoeken van olijven, wordt de betrokkene hiervan uiterlijk één maand vóór het verstrijken van de in de eerste alinea bedoelde termijn in kennis gesteld, tenzij het monster minder dan twee maanden vóór de datum van minimale houdbaarheid is genomen.
5. Voor de bepaling van de kenmerken van olijfolie volgens de in de lid 1, eerste alinea, aangegeven methoden, worden de analyseresultaten rechtstreeks vergeleken met de in deze verordening vastgestelde grenswaarden.
Artikel 2 bis
1. In het kader van dit artikel wordt onder „in de handel gebrachte olijfolie” verstaan: de totale hoeveelheid olijfolie en olie uit afvallen van olijven van een bepaalde lidstaat die in die lidstaat wordt verbruikt of die wordt uitgevoerd uit die lidstaat.
2. De lidstaten zien erop toe dat op een risicoanalyse gebaseerde normcontroles zorgvuldig en voldoende frequent worden verricht om te garanderen dat de in de handel gebrachte olijfolie overeenstemt met de opgegeven categorie.
3. Als criteria voor de beoordeling van het risico kunnen de volgende gegevens in aanmerking worden genomen:
a) de categorie olie, de productieperiode, de prijs van de olie in verhouding tot andere plantaardige oliën, de meng- en verpakkingshandelingen, de opslagvoorzieningen en -omstandigheden, het land van oorsprong, het land van bestemming, de vervoermiddelen of het volume van de partij;
b) de positie van de marktdeelnemers in de afzetketen, het volume en/of de waarde van de door hen afgezette producten, de verschillende categorieën olie die zij in de handel brengen, de aard van hun werkzaamheden, zoals malen, opslag, raffinage, mengen, verpakken of kleinhandel;
c) uitkomsten van eerdere controles, waaronder het aantal en de aard van de geconstateerde afwijkingen, de gebruikelijke kwaliteit van de in de handel gebrachte olie, het prestatieniveau van de gebruikte technische uitrusting;
d) de betrouwbaarheid van de door de marktdeelnemer gebruikte kwaliteitsborgingssystemen of internecontrolesystemen met betrekking tot de naleving van de handelsnormen;
e) de plaats waar de controle wordt uitgevoerd, in het bijzonder als het gaat over de plaats waar de olie de Unie binnenkomt, waar deze de Unie verlaat of waar deze wordt geproduceerd, verpakt, geladen of verkocht aan de eindverbruiker;
f) andere gegevens die kunnen wijzen op een risico van niet-naleving.
4. De lidstaten stellen vooraf het volgende vast:
a) de criteria voor de beoordeling van het risico dat partijen niet aan de handelsnormen voldoen;
b) op basis van een risicoanalyse voor elke risicocategorie, het minimumaantal marktdeelnemers of partijen en/of hoeveelheden die aan een normcontrole zullen worden onderworpen.
Jaarlijks wordt ten minste één normcontrole verricht per duizend ton olijfolie die in de lidstaat in de handel wordt gebracht.
5. De lidstaten gaan de naleving na door:
a) de in bijlage I voorgeschreven analyses uit te voeren in om het even welke volgorde; of
b) de in bijlage I ter betreffende het beslissingsschema bepaalde volgorde te volgen totdat dit proces uitmondt in een van de in dat schema vermelde beslissingen.
▼M19 —————
Artikel 3
Wanneer wordt geconstateerd dat een bepaalde olie verschilt van de beschrijving van de categorie waartoe deze behoort, past de betrokken lidstaat, onverminderd eventuele andere sancties, doeltreffende, evenredige en afschrikkende boeten toe, waarvan de hoogte wordt bepaald op basis van de ernst van de geconstateerde onregelmatigheid.
Wanneer bij controles significante onregelmatigheden aan het licht komen, verrichten de lidstaten frequentere controles van het handelsstadium, de categorie olie, de oorsprong of andere parameters.
Artikel 4
1. Voor de beoordeling en controle van de organoleptische kenmerken door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordiger kunnen de lidstaten panels van proevers erkennen.
De erkenningsvoorwaarden worden door de lidstaten vastgesteld en wel zodanig dat:
— aan de voorwaarden van punt 4 van bijlage XII wordt voldaan;
— de voorzitter van het panel wordt opgeleid door een daartoe door de lidstaat erkende instelling en onder door de lidstaat goedgekeurde voorwaarden;
— de geldigheid van de erkenning afhankelijk wordt gemaakt van de resultaten van een jaarlijkse controle door de lidstaat.
Elke lidstaat stelt de Commissie in kennis van de lijst van erkende panels en van de overeenkomstig dit lid genomen maatregelen.
2. Ingeval een Lid-Staat op zijn grondgebied moeilijk een panel van proevers kan instellen, mag hij een beroep doen op een door een andere Lid-Staat erkend panel.
3. Elke Lid-Staat stelt de lijst op van de door beroepsorganisaties of sectorale organisaties overeenkomstig de in lid 1 vermelde voorwaarden ingestelde panels van proevers en ziet toe op de naleving van deze voorwaarden.
▼M19 —————
Artikel 6
1. Het oliegehalte van afvallen van olijven en van de andere bij de winning van olijfolie verkregen afvallen (GN-codes 2306 90 11 en 2306 90 19 ) wordt bepaald overeenkomstig de in bijlage XV opgenomen methode.
2. Het in lid 1 bedoelde oliegehalte wordt uitgedrukt in gewichtspercenten berekend over de droge stof.
Artikel 7
De communautaire bepalingen betreffende de aanwezigheid van verontreinigende stoffen zijn van toepassing.
Wat het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen betreft, gelden voor alle categorieën olijfolie de volgende grenswaarden:
— maximumgehalte voor elk gedetecteerd gehalogeneerd oplosmiddel: 0,1 mg/kg,
— maximumgehalte voor de som van de gedetecteerde gehalogeneerde oplosmiddelen: 0,2 mg/kg.
Artikel 7 bis
De natuurlijke of rechtspersonen en de groepen personen die, in welke hoedanigheid dan ook, beroepshalve of voor handelsdoeleinden olijfolie en olie uit afvallen van olijven, vanaf de winning in de molen tot en met de botteling, in hun bezit hebben, zijn verplicht registers bij te houden waarin met name elke in- of uitslag van elke categorie van deze oliën wordt vermeld.
De lidstaten zien erop toe dat de in de eerste alinea bedoelde verplichting naar behoren wordt nageleefd.
Artikel 8
1. De lidstaten stellen de Commissie in kennis van de ter uitvoering van deze verordening genomen maatregelen. Zij stellen de Commissie in kennis van latere wijzigingen.
2. Uiterlijk op 31 mei van elk jaar dienen de lidstaten bij de Commissie een verslag in over de tenuitvoerlegging van deze verordening in het voorgaande kalenderjaar. Dit verslag bevat op zijn minst de resultaten van de volgens de modellen in bijlage XXI op olijfolie verrichte normcontroles.
3. De in deze verordening bedoelde kennisgevingen worden gedaan overeenkomstig Verordening (EG) nr. 792/2009 van de Commissie ( 1 ).
Artikel 9
Verordening (EEG) nr. 1058/77 wordt hierbij ingetrokken.
Artikel 10
1. Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.
De in bijlage XII beschreven methode wordt, behalve voor verrichtingen in het kader van de interventieregeling, met ingang van ►M1 1 november 1992 ◄ toegepast.
Deze methode geldt niet voor olijfolie van de eerste persing die vóór 1 november 1992 is verpakt.
2. Deze verordening is niet van toepassing op olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn verpakt en tot en met 31 oktober 1992 worden verkocht.
Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.
BIJLAGEN
Inhoudsopgave
|
Bijlage I: |
Kenmerken van olijfolie |
|
Bijlage I bis: |
Bemonstering van olijfolie of olie uit perskoeken van olijven die worden geleverd in onmiddellijke verpakkingen |
|
Bijlage I ter: |
Beslissingsschema om na te gaan of een monster olijfolie overeenstemt met de aangegeven categorie |
|
Bijlage II: |
Bepaling van vrije vetzuren, koude methode |
|
Bijlage III: |
Bepaling van het peroxidegetal |
|
Bijlage IV: |
Bepaling van het wasgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie |
|
Bijlage V: |
Bepaling van de samenstelling van en het gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie |
|
Bijlage VII: |
►M21 Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat ◄ |
|
▼M20 ————— |
|
|
Bijlage IX: |
Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied |
|
Bijlage X: |
Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren |
|
Bijlage XI: |
Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen |
|
Bijlage XII: |
Methode van de internationale olijfolieraad voor de organoleptische beoordeling van olijfolie van de eerste persing |
|
▼M20 ————— |
|
|
▼M19 ————— |
|
|
Bijlage XV: |
Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven |
|
Bijlage XVI: |
Bepaling van het joodgetal |
|
Bijlage XVII: |
Methode voor de bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën |
|
Bijlage XVIII: |
Bepaling van het verschil tussen het werkelijke en het theoretische gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42 |
|
Bijlage XIX: |
►M28 Bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen middels capillaire gaschromatografie ◄ |
|
Bijlage XX: |
Methode voor de bepaling van het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren met behulp van capillaire gaschromatografie |
|
▼M28 ————— |
|
|
Bijlage ХХI: |
Resultaten van de conformiteitscontroles van olijfoliën als bedoeld in artikel 8, lid 2 |
BIJLAGE I
KENMERKEN VAN OLIJFOLIE
|
Categorie |
Ethylesters van vetzuren (FAEE's) (*) |
Zuurgraad (%) (*) |
Peroxidegetal mEq O2/kg (*) |
Was mg/kg (**) |
Glycerol-2-monopalmitaat (%) |
Stigmastadiënen mg/kg (1) |
Verschil: ECN42 (HPLC) en ECN42 (theoretische berekening) |
K232 (*) |
K268 of K270 (*) |
Delta-K (*) |
Organoleptische beoordeling Mediaan voor de gebreken (Md) (*) |
Organoleptische beoordeling Mediaan „fruitig” (Mf) (*) |
|
1. Extra olijfolie van eerste persing |
FAEE's ≤ 40 mg/kg (oogstjaar 2013-2014) (2) FAEE's ≤ 35 mg/kg (oogstjaar 2014-2016) FAEE's ≤ 30 mg/kg (na oogstjaar 2016) |
≤ 0,8 |
≤ 20 |
C42 + C44 + C46 ≤ 150 |
≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % |
≤ 0,05 |
≤ |0,2| |
≤ 2,50 |
≤ 0,22 |
≤ 0,01 |
Md = 0 |
Mf > 0 |
|
≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % |
||||||||||||
|
2. Olijfolie van eerste persing |
— |
≤ 2,0 |
≤ 20 |
C42 + C44 + C46 ≤ 150 |
≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % |
≤ 0,05 |
≤ |0,2| |
≤ 2,60 |
≤ 0,25 |
≤ 0,01 |
Md ≤ 3,5 |
Mf > 0 |
|
≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % |
||||||||||||
|
3. Olijfolie voor verlichting |
— |
> 2,0 |
— |
C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) |
≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % |
≤ 0,50 |
≤ |0,3| |
— |
— |
— |
Md > 3,5 (4) |
— |
|
≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14 % |
||||||||||||
|
4. Geraffineerde olijfolie |
— |
≤ 0,3 |
≤ 5 |
C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 |
≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % |
— |
≤ |0,3| |
— |
≤ 1,10 |
≤ 0,16 |
— |
— |
|
≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14 % |
||||||||||||
|
5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing |
— |
≤ 1,0 |
≤ 15 |
C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 |
≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % |
— |
≤ |0,3| |
— |
≤ 0,90 |
≤ 0,15 |
— |
— |
|
≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % |
||||||||||||
|
6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven |
— |
— |
— |
C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) |
≤ 1,4 |
— |
≤ |0,6| |
— |
— |
— |
— |
— |
|
7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven |
— |
≤ 0,3 |
≤ 5 |
C40 + C42 + C44 + C46 > 350 |
≤ 1,4 |
— |
≤ |0,5| |
— |
≤ 2,00 |
≤ 0,20 |
— |
— |
|
8. Olie uit perskoeken van olijven |
— |
≤ 1,0 |
≤ 15 |
C40 + C42 + C44 + C46 > 350 |
≤ 1,2 |
— |
≤ |0,5| |
— |
≤ 1,70 |
≤ 0,18 |
— |
— |
|
(1) Totaal van de isomeren dat (al dan niet) kan worden gescheiden over een capillaire kolom. (2) Deze grenswaarde is van toepassing op olijfoliën die vanaf 1 maart 2014 worden geproduceerd. (3) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als olijfolie voor verlichting aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen niet hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol niet meer bedraagt dan 3,5 %. (4) Of de mediaan voor de gebreken is lager dan of gelijk aan 3,5 en de mediaan „fruitig” is gelijk aan 0. (5) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als ruwe olie uit perskoeken van olijven aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen hoger is dan 350 mg/kg en wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol meer bedraagt dan 3,5 %. |
||||||||||||
|
Categorie |
Vetzuursamenstelling (1) |
Totaal transoliezuurisomeren (%) |
Totaal translinolzuur en translinoleenzuurisomeren (%) |
Sterolsamenstelling |
Totaal sterolen (mg/kg) |
Erytrodiol en uvaol (%) (**) |
||||||||||
|
Myristinezuur (%) |
Linoleenzuur (%) |
Arachidezuur (%) |
Eicosaanzuur (%) |
Beheenzuur (%) |
Lignocerinezuur (%) |
Cholesterol (%) |
Brassicasterol (%) |
Campesterol (2) (%) |
Stigmasterol (%) |
App β-sitosterol (3) (%) (**) |
Delta-7-stigmastenol (2) (%) |
|||||
|
1. Extra olijfolie van eerste persing |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
2. Olijfolie van eerste persing |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
3. Olijfolie voor verlichting |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,10 |
≤ 0,10 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
— |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 (4) |
|
4. Geraffineerde olijfolie |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,30 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,30 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,30 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,10 |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
— |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 2 500 |
> 4,5 (5) |
|
7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,30 |
≤ 0,20 |
≤ 0,40 |
≤ 0,35 |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 800 |
> 4,5 |
|
8. Olie uit perskoeken van olijven |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,40 |
≤ 0,30 |
≤ 0,20 |
≤ 0,40 |
≤ 0,35 |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 600 |
> 4,5 |
|
(1) Gehalte aan andere vetzuren (%): palmitinezuur: 7,50-20,00; palmitoleïnezuur: 0,30-3,50; heptadecaanzuur: ≤ 0,30; heptadeceenzuur: ≤ 0,30; stearinezuur: 0,50-5,00; oliezuur: 55,00-83,00; linolzuur: 2,50-21,00. (2) Zie het aanhangsel bij deze bijlage. (3) App β-sitosterol: delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol. (4) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als olijfolie voor verlichting aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen niet hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol niet meer bedraagt dan 3,5 %. (5) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als ruwe olie uit perskoeken van olijven aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol meer bedraagt dan 3,5 %. |
||||||||||||||||
Opmerkingen:
a) De resultaten van de analyses moeten worden opgegeven met hetzelfde aantal decimale cijfers als in de normen voor elk kenmerk. De laatste significante decimaal wordt naar boven afgerond als de volgende decimaal hoger is dan 4.
b) Om olie in een andere categorie in te delen of qua zuiverheid onvoldoende te verklaren, volstaat het dat een van de kenmerken niet aan de vastgestelde normen beantwoordt.
c) Bij de kenmerken met een asterisk (*) die betrekking hebben op de kwaliteit van de olie, geldt: — voor olijfolie voor verlichting kunnen beide relevante grenswaarden tegelijkertijd verschillen van de vermelde waarden; — voor olijfolie van eerste persing wordt, wanneer minstens een van deze grenswaarden afwijkt van de vermelde waarden, de categorie van de olijfolie gewijzigd, maar wordt de olie wel ingedeeld in een van de categorieën olijfolie van eerste persing.
d) Bij de kenmerken met dubbele asterisk (**) geldt voor alle oliën uit perskoeken van olijven dat beide relevante grenswaarden tegelijkertijd kunnen afwijken van de vermelde waarden.
Aanhangsel
BESLISSINGSSCHEMA
Beslissingssschema betreffende campesterol voor olijfolie van eerste persing en extra olijfolie van eerste persing:
De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.
Beslissingsschema betreffende delta-7-stigmastenol voor:
— Olijfolie van eerste persing en extra olijfolie van eerste persing
—
De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.
— Olie uit perskoeken van olijven (ruw en geraffineerd)
—
BIJLAGE I bis
BEMONSTERING VAN OLIJFOLIE OF OLIE UIT PERSKOEKEN VAN OLIJVEN DIE WORDEN GELEVERD IN ONMIDDELLIJKE VERPAKKINGEN
Onderstaande bemonsteringsmethode is van toepassing op partijen olijfolie of olie uit perskoeken van olijven in onmiddellijke verpakkingen. Er zijn verschillende bemonsteringsmethoden van toepassing, afhankelijk van of de onmiddellijke verpakking groter is dan 5 liter of niet.
Onder "partij" wordt verstaan een verzameling voor verkoop bestemde eenheden die onder zodanige omstandigheden zijn geproduceerd, vervaardigd en verpakt dat de olie in al deze eenheden als homogeen wordt beschouwd wat alle analytische kenmerken betreft. De afzonderlijke identificatie van een partij moet worden uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2011/91/EU van het Europees Parlement en de Raad ( 2 ).
Onder "increment" wordt verstaan: de hoeveelheid olie in een onmiddellijke verpakking die afkomstig is van een willekeurig punt in de partij.
1. SAMENSTELLING VAN EEN PRIMAIR MONSTER
1.1. Onmiddellijke verpakking van maximaal 5 liter
Onder "primair monster" voor onmiddellijke verpakkingen van maximaal 5 liter wordt verstaan: het aantal incrementen genomen uit een partij en in overeenstemming met tabel 1.
Tabel 1
Het primaire monster omvat ten minste
|
In het geval van onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van |
moet het primaire monster olie bevatten van |
|
a) 1 liter of meer, |
a) 1 onmiddellijke verpakking, |
|
b) minder dan 1 liter, |
b) het minimumaantal verpakkingen met een totale capaciteit van minstens 1,0 liter. |
Het in tabel 1 vermelde aantal verpakkingen dat een primair monster vormt, kan door elke lidstaat naar eigen behoefte worden verhoogd (bijvoorbeeld organoleptische beoordeling door een ander laboratorium dan het laboratorium dat de chemische analyses heeft uitgevoerd, contra-analyse enz.).
1.2. Onmiddellijke verpakking van meer dan 5 liter
Onder "primair monster" voor onmiddellijke verpakkingen van meer dan 5 liter wordt verstaan: een representatief deel van het totale aantal incrementen, verkregen door het monster exemplaren in overeenstemming met tabel 2 te verkleinen. Het primaire monster moet bestaan uit verschillende voorbeelden.
Onder "exemplaar" van een primair monster wordt verstaan: elk van de verpakkingen waaruit het primaire monster bestaat.
Tabel 2
Minimumaantal te selecteren incrementen
|
Aantal verpakkingen in de partij |
Minimumaantal te selecteren incrementen |
|
Tot en met 10 |
1 |
|
Van … 11 tot en met 150 |
2 |
|
Van … 151 tot en met 500 |
3 |
|
Van … 501 tot en met 1 500 |
4 |
|
Van … 1 501 tot en met 2 500 |
5 |
|
> 2 500 per 1 000 verpakkingen |
1 extra increment |
Om het volume van de bemonsterde onmiddellijke verpakkingen te verkleinen, wordt de inhoud van de bemonsterde incrementen gehomogeniseerd voor de bereiding van het primaire monster. De porties van de verschillende incrementen worden in één recipiënt gegoten om door middel van roeren te worden gehomogeniseerd, zodat het zo goed mogelijk wordt beschermd tegen lucht.
De inhoud van het primaire monster moet in een reeks verpakkingen met elk een minimale capaciteit van 1,0 liter worden gegoten; elk van de verpakkingen vormt een exemplaar van het primaire monster.
Het aantal primaire monsters kan door elke lidstaat naar eigen behoefte worden verhoogd (bijvoorbeeld organoleptische beoordeling door een ander laboratorium dan het laboratorium dat de chemische analyses heeft uitgevoerd, contra-analyse enz.).
Elke verpakking moet op zodanige wijze worden gevuld dat de luchtlaag aan de bovenzijde minimaal is en daarna zodanig worden gesloten en verzegeld dat niet met het product kan worden gefraudeerd.
Deze exemplaren moeten worden voorzien van een etiket om de juiste identificatie te verzekeren.
2. ANALYSES EN RESULTATEN
2.1. Elk primair monster moet worden onderverdeeld in laboratoriummonsters, in overeenstemming met punt 2.5 van norm EN ISO 5555 en worden geanalyseerd in de volgorde die is weergegeven in het beslissingsschema dat is opgenomen in bijlage 1 bis of in een andere willekeurige volgorde.
2.2. Indien alle resultaten van de analyses overeenstemmen met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de partij in haar geheel als in overeenstemming met de voorschriften beschouwd.
Indien één van de resultaten van de analyses niet overeenstemt met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de voorschriften beschouwd.
3. VERIFICATIE VAN DE CATEGORIE VAN DE PARTIJ
3.1. Om de categorie van de partij te verifiëren, kan de bevoegde autoriteit het aantal primaire monsters dat op verschillende punten in de partij wordt genomen, verhogen overeenkomstig de volgende tabel:
Tabel 3
Aantal primaire monsters vastgesteld aan de hand van de omvang van de partij
|
Omvang van de partij (liter) |
Aantal primaire monsters |
|
Minder dan 7 500 |
2 |
|
Van 7 500 tot minder dan 25 000 |
3 |
|
Van 25 000 tot minder dan 75 000 |
4 |
|
Van 75 000 tot minder dan 125 000 |
5 |
|
Gelijk aan of meer dan 125 000 |
6 + 1 voor elke extra 50 000 liter |
Elk increment waaruit een primair monster bestaat, moet worden genomen van een continue plaats in de partij; de locatie van elk primair monster moet worden genoteerd en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd.
Elk primair monster moet worden gevormd overeenkomstig de in de punten 1.1 en 1.2 bedoelde procedures.
Elk primair monster wordt dan onderworpen aan de in artikel 2, lid 1, bedoelde analyses.
3.2. Indien een van de resultaten van de in artikel 2, lid 1, bedoelde analyses van minstens één primair monster niet overeenstemt met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de bemonsterde partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de voorschriften beschouwd.
BIJLAGE 1 ter
BESLISSINGSSCHEMA OM NA TE GAAN OF EEN MONSTER OLIJFOLIE OVEREENSTEMT MET DE AANGEGEVEN CATEGORIE
Tabel 1
Tabel 2
Tabel 3
Aanhangsel 1
Equivalentietabel tussen de bijlagen bij deze verordening en de in het beslissingsschema vermelde analyses
|
— Zuurgraad |
Bijlage II |
Bepaling van vrije vetzuren, koude methode |
|
— Peroxidegetal |
Bijlage III |
Bepaling van het peroxidegetal |
|
— UV-spectrometrie |
Bijlage IX |
Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied |
|
— Organoleptische beoordeling |
Bijlage XII |
Organoleptische beoordeling van olijfolie van de eerste persing |
|
— Ethylesters |
Bijlage XX |
Methode voor de bepaling van het gehalte aan was, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren met behulp van capillaire gaschromatografie |
|
— 3,5-Stigmastadieen |
Bijlage XVII |
Methode voor de bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën |
|
— Transisomeren van vetzuren |
Bijlage X |
Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren |
|
— Gehalte aan vetzuren |
Bijlage X |
Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren |
|
— ΔECN42 |
Bijlage XVIII |
Bepaling van triglyceriden met ECN42 (verschil tussen HPLC-gegevens en theoretisch gehalte) |
|
— Sterolsamenstelling en totaal gehalte aan sterolen — Erytrodiol en uvaol |
Bijlage V |
Bepaling van de samenstelling van en het gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie |
|
— Wassen |
Bijlage IV |
Bepaling van het wasgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie |
|
— Alifatische en triterpeenalcoholen |
Bijlage XIX |
Bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen middels capillaire gaschromatografie |
|
— Verzadigde vetzuren op de 2-positie |
Bijlage VII |
Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat |
BIJLAGE II
BEPALING VAN VRIJE VETZUREN, KOUDE METHODE
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Deze methode beschrijft hoe het gehalte aan vrije vetzuren in olijfolie en olie uit perskoeken van olijven moet worden bepaald. Het gehalte aan vrije vetzuren wordt uitgedrukt in de zuurgraad die is berekend als percentage oliezuur.
2. PRINCIPE
Oplossing van het monster in een mengsel van oplosmiddelen, daarna titrering van de aanwezige vrije vetzuren met behulp van een oplossing van kaliumhydroxide of natriumhydroxide.
3. REAGENTIA
Alle reagentia moeten p.a. zijn en het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.
|
3.1. |
Diëthylether — 95 % ethanol (v/v), mengsel 1:1 (v/v) in volume. Neutraliseer, precies op het ogenblik van gebruik, met de kaliumhydroxide-oplossing (3.2), in aanwezigheid van 0,3 ml fenolftaleïne-oplossing (3.3) voor 100 ml mengsel. Opmerking 1: Diëthylether is zeer ontvlambaar en kan explosieve peroxiden vormen. Bij gebruik ervan dienen bijzondere voorzorgen te worden genomen. Opmerking 2: Indien gebruik van diëthylether onmogelijk is, kan een mengsel van uit ethanol en tolueen bestaande oplosmiddelen worden gebruikt. Zo nodig kan ethanol worden vervangen door propanol-2. |
|
3.2. |
Kaliumhydroxide of natriumhydroxide, in ethanol of water getitreerde oplossing, c(KOH) [of c(NaOH)], ongeveer 0,1 mol/l of, indien nodig, c(KOH) [of c(NaOH)], ongeveer 0,5 mol/l. Oplossingen zijn in de handel verkrijgbaar. De precieze concentratie van de kaliumhydroxideoplossing (of de natriumhydroxideoplossing) dient bekend te zijn en vóór gebruik te worden geverifieerd. Gebruik een oplossing die minstens vijf dagen voor gebruik is bereid en is gedecanteerd in een donkerbruine, met een rubberen stop gesloten fles. De oplossing dient kleurloos of strogeel te zijn. Indien fasescheiding optreedt bij gebruik van een oplossing in water van kaliumhydroxide (of natriumhydroxide), een oplossing in ethanol in plaats van in water gebruiken. Opmerking 3: Een stabiele, kleurloze oplossing van kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) kan op de volgende wijze worden bereid. 1 000 ml ethanol of water op temperatuur en gedurende één uur koken, met reflux, met 8 g kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) en 0,5 g aluminiumsnippers. Onmiddellijk distilleren. In het distillaat de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) oplossen. Verschillende dagen laten rusten en het heldere supernatant van het neerslag van kaliumcarbonaat (of natriumcarbonaat) decanteren. De oplossing kan ook zonder distillatie op de volgende wijze worden bereid: aan 1 000 ml ethanol (of water) 4 ml aluminiumbutylaat toevoegen en het mengsel enkele dagen laten staan. Het supernatant decanteren en de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) erin oplossen. De oplossing is klaar voor gebruik. |
|
3.3. |
Fenolftaleïne, oplossing van 10 g/l in 95-96 % ethanol (v/v) of alkaliblauw 6B of thymolftaleïne, oplossing van 20 g/l in 95-96 % ethanol (v/v). Bij sterk gekleurde oliën dient alkaliblauw of thymolftaleïne te worden gebruikt. |
4. APPARATUUR
Gebruikelijk laboratoriummateriaal, en met name:
4.1. analytische balans;
4.2. kolf van 250 ml;
4.3. buret van 10 ml, klasse A, met een schaalverdeling van 0,05 ml, of gelijkwaardige automatische buret.
5. WERKWIJZE
5.1. Bereiding van het analysemonster
Een troebel monster moet worden gefiltreerd.
5.2. Monsterweging
Houd bij het nemen van het monster rekening met de verwachte zuurgraad volgens de gegevens van de volgende tabel.
|
Verwachte zuurgraad (zuurgraad van de olie in g/100 g) |
Hoeveelheid af te wegen monster (g) |
Nauwkeurigheid van de weging van het monster (g) |
|
0 t/m 2 |
10 |
0,02 |
|
> 2 t/m 7,5 |
2,5 |
0,01 |
|
> 7,5 |
0,5 |
0,001 |
Weeg het monster in de kolf (4.2).
5.3. Bepaling
Los het monster (5.2) op in 50 tot 100 ml van het mengsel diëthylether/ethanol (3.1) dat tevoren is geneutraliseerd.
Titreer, al schuddend, met de oplossing 0,1 mol/l kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) (3.2) (zie opmerking 4) tot omslag van de indicator (de kleuring van de gekleurde indicator houdt ten minste 10 seconden aan).
Opmerking 4: Als de nodige hoeveelheid 0,1 mol/l kaliumhydroxideoplossing (of natriumhydroxideoplossing) 10 ml overschrijdt, gebruik dan een oplossing van 0,5 mol/l of wijzig de hoeveelheid af te wegen monster op basis van de verwachte zuurgraad en de voorgestelde tabel.
Opmerking 5: Als de oplossing troebel wordt tijdens de titrering, voeg dan een hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen (3.1) toe tot de oplossing helder wordt.
Alleen een tweede bepaling uitvoeren indien het eerste resultaat boven de voor de desbetreffende categorie olijfolie vastgestelde grens ligt.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
De zuurgraad, uitgedrukt in gewichtspercentage oliezuur, is gelijk aan:
waarbij:
|
V |
= |
het volume in ml van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing (of natriumhydroxideoplossing); |
|
c |
= |
de precieze concentratie, in mol/l van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing (of natriumhydroxideoplossing); |
|
M |
= |
282 g/mol, de molaire massa, in grammen per mol, van het oliezuur; |
|
m |
= |
de massa van het monster in g. |
De zuurgraad van de olie wordt als volgt gerapporteerd:
a) afgerond tot op twee decimalen voor waarden van 0 tot en met 1;
b) afgerond tot op één decimaal voor waarden van 1 tot en met 100.
BIJLAGE III
BEPALING VAN HET PEROXIDEGETAL
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het peroxidegetal van oliën en vetten.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor dierlijke en plantaardige oliën en vetten.
3. DEFINITIE
Het peroxidegetal is de hoeveelheid stoffen in het monster, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, die kaliumjodide oxideren bij de beschreven werkomstandigheden.
4. PRINCIPE VAN DE METHODE
Het in een mengsel van azijnzuur en chloroform opgeloste vet wordt behandeld met kaliumjodide en het vrijgemaakte jodide wordt getitreerd met natriumthiosulfaatoplossing.
5. APPARATUUR
Alle gebruikte apparatuur dient vrij te zijn van reducerende of oxiderende stoffen.
Opmerking:
Geslepen oppervlakten niet invetten.
|
5.1. |
3 ml glazen weegschuitje. |
|
5.2. |
Kolven met geslepen halzen en stoppen, van ongeveer 250 ml, vooraf gedroogd en gevuld met een zuiver, droog inert gas (stikstof of, bij voorkeur, koolstofdioxide). |
|
5.3. |
Buret van 25 of 50 ml, met een schaalindeling van 0,1 ml. |
6. REAGENTIA
|
6.1. |
Chloroform, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog inert gas. |
|
6.2. |
IJsazijn, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog gas. |
|
6.3. |
Kaliumjodide, verzadigde oplossing in water, vlak vóór gebruik bereid, vrij van jodium of jodaat. |
|
6.4. |
Natriumthiosulfaat, 0,01 of 0,002 N nauwkeurig gestelde oplossing in water, onmiddellijk vóór gebruik gesteld. |
|
6.5. |
Zetmeeloplossing, 10 g/l oplossing in water, vers bereid uit natuurlijk oplosbaar zetmeel. |
7. MONSTER
Zorg ervoor dat het monster niet in de nabijheid van licht wordt genomen, dat het in het donker wordt bewaard en vervolgens koud wordt opgeslagen in volledig gevulde glazen recipiënten, hermetisch afgesloten met stoppen van geslepen glas of kurk.
8. WERKWIJZE
De proef dient in diffuus daglicht of bij kunstlicht te worden uitgevoerd. Weeg in een glazen weegschuitje (5.1), of bij gebrek daaraan in een kolf (5.2), tot op 0,001 g nauwkeurig, een hoeveelheid van het monster volgens de volgende tabel, afhankelijk van het verwachte peroxidegetal.
|
Verwacht peroxidegetal (meq O2/kg) |
Hoeveelheid van het monster (g) |
|
0 tot 12 |
5,0 tot 2,0 |
|
12 tot 20 |
2,0 tot 1,2 |
|
20 tot 30 |
1,2 tot 0,8 |
|
30 tot 50 |
0,8 tot 0,5 |
|
50 tot 90 |
0,5 tot 0,3 |
Ontstop een kolf (5.2) en breng er het glazen weegschuitje in dat het monster bevat. Voeg 10 ml chloroform toe (6.1). Los het monster snel op door roeren. Voeg 15 ml azijnzuur (6.2) toe, daarna 1 ml kaliumjodideoplossing (6.3). Sluit snel af met de stop, schud gedurende één minuut en laat precies vijf minuten in het donker staan bij een temperatuur van 15 tot 25 °C.
Voeg ongeveer 75 ml gedistilleerd water toe. Titreer, krachtig schuddend, het vrijgekomen jodium met de natriumthiosulfaatoplossing (6.4) (0,002 N oplossing voor verwachte waarden van minder dan 12 en 0,01 N oplossing voor verwachte waarden boven 12), met gebruik van de zetmeeloplossing (6.5) als indicator.
Voer twee bepalingen uit op hetzelfde proefmonster.
Voer terzelfder tijd een blanco bepaling uit. Indien het resultaat van de blanco bepaling meer bedraagt dan 0,05 ml van de 0,01 N natriumthiosulfaatoplossing (6.4), vervang dan de onzuivere reagentia.
9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het peroxidegetal, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, wordt weergegeven met de formule:
waarin:
V = de gebruikte hoeveelheid gestelde natriumthiosulfaatoplossing (6.4) in millimeter, gecorrigeerd om rekening te houden met de blanco bepaling;
T = de precieze normaliteit van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing (6.4);
m = het gewicht van het monster, in gram.
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee uitgevoerde bepalingen.
BIJLAGE IV
BEPALING VAN HET WASGEHALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het wasgehalte van olijfolie. De was wordt aan de hand van het aantal koolstofatomen gescheiden. De methode kan vooral worden gebruikt om geperste olijfolie te onderscheiden van geëxtraheerde olijfolie (uit persafvallen van olijven).
2. PRINCIPE
De olie of het vet, waaraan een geschikte interne standaard is toegevoegd, wordt gefractioneerd door kolomchromatografie over een gehydrateerde silicagel-kolom. De onder de werkomstandigheden eerst geëlueerde fractie (met een lagere polariteit dan de triglyceridenfractie) wordt opgevangen en vervolgens direct geanalyseerd met behulp van capillaire gaschromatografie.
3. APPARATUUR
|
3.1. |
Erlenmeyer, 25 ml. |
|
3.2. |
Glazen kolom voor gaschromatografie met een inwendige diameter van 15,0 mm en een lengte van 30-40 cm, voorzien van een kraan. |
|
3.3. |
Geschikte gaschromatograaf voor een capillaire kolom, voorzien van een „on-column” injectiesysteem, bestaande uit:
|
|
3.4. |
Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, voor directe injectie op de kolom. |
|
3.5. |
Elektrisch schudapparaat. |
|
3.6. |
Rotatieverdamper. |
|
3.7. |
Droogstoof. |
|
3.8. |
Analytische balans met een nauwkeurigheid van + 0,1 mg. |
|
3.9. |
Standaard-laboratoriumglaswerk. |
4. REAGENTIA
|
4.1. |
Silicagel met een korrelgrootte tussen 60 en 200 μm. Droog de silicagel in een droogstoof gedurende ten minste 4 uur bij 500 °C. Voeg na afkoelen een volume water toe dat overeenkomt met 2 % van het gewicht van de gebruikte silicagel. Schud voldoende om de massa uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik in het donker rusten. |
|
4.2. |
n-Hexaan (voor chromatografie). |
|
4.3. |
Ethylether (voor chromatografie). |
|
4.4. |
n-Heptaan (voor chromatografie). |
|
4.5. |
Standaardoplossing van laurylarachidaat, 0,1 % (m/v) in hexaan (interne standaard). (Ook palmitylpalmitaat en myristylstearaat kunnen worden gebruikt.)
|
|
4.6. |
Draaggas: zuivere waterstof of helium (voor gaschromatografie). |
|
4.7. |
Hulpgassen: — zuivere waterstof (voor gaschromatografie); — zuivere lucht (voor gaschromatografie). |
5. PROCEDURE
5.1. Voorbehandeling van de chromatografiekolom
Suspendeer 15 g silicagel (4.1) in n-hexaan (4.2) en breng dit in de kolom (3.2). Laat eerst spontaan uitzakken en vervolgens met een elektrisch schudapparaat (3.5) om de chromatografielaag homogener te maken. Laat 30 ml n-hexaan doorlopen om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Weeg met de balans (3.8) nauwkeurig 500 mg monster af in de erlenmeyer van 25 ml (3.1) en voeg afhankelijk van het verwachte wasgehalte de juiste hoeveelheid interne standaard (4.5) toe. Voeg bij olijfolie bijvoorbeeld 0,1 mg laurylarachidaat toe en bij olie uit afvallen van olijven 0,25-0,5 mg. Breng het zo voorbehandelde monster met behulp van twee porties van elk 2 ml n-hexaan (4.2) op de chromatografiekolom.
Laat het oplosmiddel door de kolom lopen tot 1 mm boven de bovenkant van het adsorbens en laat vervolgens nog eens 70 ml n-hexaan doorlopen om van nature aanwezige n-alkanen te verwijderen. Begin vervolgens de chromatografische elutie met 180 ml van het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) met een elutiesnelheid van ongeveer 15 druppels per 10 seconden. De elutie van het monster moet bij kamertemperatuur (22 ± 4 °C) worden uitgevoerd.
NB:
— Het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) moet elke dag vers worden bereid.
— Voor een visuele controle op een juiste elutie van de was kan aan het opgeloste monster 100 μl soedanrood 1 (1 % in de elutievloeistof) worden toegevoegd. Aangezien deze kleurstof een retentietijd tussen die van de was en de triglyceriden heeft, kan de elutie worden gestopt wanneer de kleur de onderkant van de chromatografiekolom bereikt, omdat de was dan volledig is geëlueerd.
Damp de aldus verkregen fractie in de rotatieverdamper (3.6) in tot bijna droog. Verwijder de laatste 2 ml oplosmiddel met een zachte stikstofstroom en neem het residu op in 2-4 ml n-heptaan.
5.2. Gaschromatografische analyse
5.2.1. Voorbereidende werkzaamheden
Bevestig de kolom in de gaschromatograaf (3.3), waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten op het „on-column”-systeem en het uiteinde op de detector. Voer de gebruikelijke controle van de gaschromatografieapparatuur uit (toestand van de gasleidingen, efficiëntie van de detector en de recorder enz.).
Als de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, wordt conditionering aanbevolen. Laat een zachte gasstroom door de kolom lopen en schakel de gaschromatografieapparatuur in. Verwarm geleidelijk totdat na ongeveer 4 uur een temperatuur van 350 °C wordt bereikt. Houd deze temperatuur gedurende ten minste 2 uur aan en stel vervolgens de apparatuur in op de gebruiksomstandigheden (gassnelheid instellen, vlam ontsteken, elektronische recorder (3.3.4) aansluiten, temperatuur van de kolomoven instellen, temperatuur van de detector instellen enz.) en registreer het signaal bij een gevoeligheid die ten minste twee keer zo groot is als bij de uitvoering van de analyse wordt verwacht. De basislijn moet lineair zijn, mag geen enkele piek vertonen en mag niet verlopen.
Een rechtlijnig negatief verloop wijst op lekkage bij de aansluiting van de kolom; een positief verloop wijst op een onvoldoende conditionering van de kolom.
5.2.2. Keuze van de werkomstandigheden
In het algemeen dienen de volgende werkomstandigheden te worden aangehouden:
— kolomtemperatuur:
—
|
|
20 °C/minuut |
|
5 °C/minuut |
|
20 °C/minuut |
|
|
vanaf 80 °C (1′) |
→ |
240 °C |
→ |
325 °C (6′) |
→ |
340 °C (10′) |
— detectortemperatuur: 350 °C;
— geïnjecteerde hoeveelheid: 1 μl van de oplossing (2-4 ml) in n-heptaan;
— draaggas: helium of waterstof met de optimale lineaire snelheid voor het gekozen gas (zie aanhangsel);
— gevoeligheid van de recorder: deze moet voldoen aan de volgende voorwaarden:
Deze voorwaarden kunnen afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig worden gewijzigd dat alle wassen volledig worden gescheiden met een afdoende resolutie van de pieken (zie figuur), terwijl de retentietijd van de interne standaard (C32) 18 ± 3 minuten moet bedragen. De meest representatieve piek van de wassen moet een hoogte van ten minste 60 % van de volle schaaluitslag hebben.
De piekintegratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakken wordt verkregen.
NB:Gezien de hoge eindtemperatuur wordt een positief verloop toegestaan, dat niet groter mag zijn dan 10 % van de volle schaaluitslag.
5.3. Uitvoering van de analyse
Zuig met de 10 μl micro-injectiespuit 1 μl oplossing op. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Steek de naald door het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden; trek de naald ongeveer 5 seconden later langzaam terug.
Neem het chromatogram op tot de was volledig is geëlueerd.
De basislijn moet steeds aan de vereiste voorwaarden voldoen.
5.4. Identificatie van de pieken
De verschillende pieken worden geïdentificeerd aan de hand van de retentietijd en door vergelijking met wasmengsels met een bekende retentietijd die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.
De figuur bevat een chromatogram van de wassen in een olijfolie van eerste persing.
5.5. Kwantitatieve evaluatie
Bereken met de integrator het piekoppervlak van de interne standaard en de alifatische esters (C40-C46).
Bereken met de volgende formule het wasgehalte van elke ester in mg/kg vet:
Hierbij is:
|
Ax |
= |
het piekoppervlak van elke ester in mm2; |
|
As |
= |
het piekoppervlak van de interne standaard in mm2; |
|
ms |
= |
de toegevoegde massa interne standaard in mg; |
|
m |
= |
de massa van het monster voor de bepaling in g. |
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Vermeld de som van de gehaltes aan de verschillende wassen (C40-C46) in mg/kg vet (ppm).
NB:De te kwantificeren verbindingen verwijzen naar de pieken met een even aantal koolstofatomen tussen de esters C40 en C46, zoals weergegeven in onderstaand chromatogram voor was uit olijfolie. Als de ester C46 een dubbele piek oplevert, wordt aanbevolen voor de identificatie daarvan de wasfractie van een olijfolie uit afvallen van olijven te analyseren, aangezien de C46-fractie daarin duidelijk de overhand heeft en de piek dus gemakkelijk te identificeren is.
De resultaten worden met één cijfer achter de komma vermeld.
Figuur
Gaschromatogram van de wasfractie van een olijfolie ( 3 )
Verklaring:
|
I.S. |
= |
Laurylarachidaat |
|
1 |
= |
Diterpeenesters |
|
2 + 2′ |
= |
C40-esters |
|
3 + 3′ |
= |
C42-esters |
|
4 + 4′ |
= |
C44-esters |
|
5 |
= |
C46-esters |
|
6 |
= |
Sterolesters en triterpeenalcoholen. |
AANHANGSEL
Bepaling van de lineaire gassnelheid
Injecteer 1-3 μl methaan (of propaan) in de gaschromatograaf nadat deze op de normale werkomstandigheden is ingesteld. Registreer hoeveel tijd verstrijkt tussen het moment waarop het gas op de kolom wordt geïnjecteerd en het moment waarop de piek verschijnt (tM).
De lineaire snelheid (in cm/s) wordt berekend met de formule L/tM, waarbij L de lengte van de kolom in cm is en tM de geregistreerde tijd in seconden.
BIJLAGE V
BEPALING VAN DE SAMENSTELLING VAN EN HET GEHALTE AAN STEROLEN EN TRITERPEENDIALCOHOLEN MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het individuele en totale gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen van olijfoliën en olie uit perskoeken van olijven.
2. PRINCIPE
De olie, waaraan α-cholestanol als interne standaard is toegevoegd, wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met ethylether.
De sterol- en triterpeendialcoholfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden met behulp van basische kiezelgel dunnelaagchromatografie. De van de dunnelaagplaat verzamelde fracties worden omgezet in trimethylsilylethers en via capillaire gaschromatografie geanalyseerd.
3. APPARATUUR
De gebruikelijke laboratoriumuitrusting en in het bijzonder het volgende:
3.1. Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.
3.2. Scheitrechters van 500 ml.
3.3. Kolven van 250 ml.
3.4. Volledige uitrusting voor dunnelaagchromatografie met 20 × 20 cm glasplaten.
3.5. Ultravioletlamp met een golflengte van 254 of 366 nm.
3.6. Injectiespuiten van 100 μl en 500 μl.
3.7. Filterkroes G 3 (porositeit 15-40 μm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21 (uitwendig).
3.8. Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21 (inwendig), waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten (punt 3.7).
3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.
3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem bestaande uit:
3.10.1. een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ± 1 °C;
3.10.2. een temperatuurgeregelde injectie-eenheid met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement en splitsysteem;
3.10.3. een vlamionisatiedetector (FID);
3.10.4. gegevensverzamelsysteem dat geschikt is voor gebruik met de FID (punt 3.10.3), geschikt voor handmatige integratie.
3.11. Fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m, inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met 5 % difenyl - 95 % simethylpolysiloxaan (SE-52 of SE-54 stationaire fase of equivalent) in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 μm.
3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 μl met een geharde naald voor splitinjectie.
3.13. Met calciumchloride gevulde exsiccator.
4. REAGENTIA
4.1. Kaliumhydroxideoplossing met een minimumgehalte van 85 %.
4.2. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol.
Los 130 g kaliumhydroxide (punt 4.1) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (punt 4.10). Bewaar de oplossing maximaal twee dagen in goed afgesloten flessen van donker glas.
4.3. Ethylether, p.a.
4.4. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 0,2 M in ethanol.
Los 13 g kaliumhydroxide (punt 4.1) op in 20 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (punt 4.10).
4.5. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.
4.6. Glasplaten (20x20 cm) gecoat met kiezelgel zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).
4.7. Tolueen, voor chromatografische doeleinden.
4.8. Aceton, voor chromatografische doeleinden.
4.9. n-hexaan, voor chromatografische doeleinden.
4.10. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.
4.11. Ethanol, p.a.
4.12. Ethylacetaat, p.a.
4.13. Dunne-laagchromatografische referentieoplossing: cholesterol of fytosyerolen en een 5 %-oplossing van erytrodiol in ethylacetaat (punt 4.11).
4.14. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing (punt 4.2).
4.15. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden (zie opmerking 5).
4.16. Hexamethyldisilazaan, p.a.
4.17. Trimethylchloorsilaan, p.a.
4.18. Standaardoplossingen van steroltrimethylsilylethers.
Direct vóór gebruik te bereiden uit sterolen en erytrodiol verkregen uit oliën die deze bevatten.
4.19. α-cholestanol, zuiverheid meer dan 99 % (zuiverheid moet worden gecontroleerd door gaschromatografische analyse).
4.20. α-cholestanol, 0,2 (m/V) oplossing in ethylacetaat (punt 4.11) (interne standaard)
4.21. Fenolftaleïne-oplossing, 10 g/l in ethanol (punt 4.10).
4.22. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.
4.23. Hulpgassen: waterstof, helium, stikstof en lucht, gaschromatografisch zuiver.
4.24. Mengsel van n-hexaan (punt 4.9)/ethylether (punt 4.10) met een 65:35-verhouding (v/v).
4.25. Silyleringsreagens, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan 9:3:1 (v/v/v).
5. WERKWIJZE
|
5.1. |
Bereiding van het onverzeepbare residu.
|
|
5.2. |
Scheiding van de sterol- en triterpeendialcholfractie (erytrodiol + uvaol)
|
|
5.3. |
Bereiding van de trimethylsilylethers
|
|
5.4. |
Gaschromatografische analyse
|
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
6.1. Geef de gehaltes van de individuele sterolen op in mg/kg vethoudend materiaal en hun som als "totaal sterolen".
De samenstelling van alle individuele sterolen en van erytrodiol en uvaol moet worden uitgedrukt met één cijfer achter de komma.
De samenstelling van het totaal sterolen moet worden uitgedrukt zonder cijfers achter de komma.
6.2. Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som van de piekoppervlakken van de sterolen:
waarbij:
|
Ax |
= |
piekoppervlak van x; |
|
ΣA |
= |
som van de piekoppervlakken van alle sterolen. |
6.3. Kennelijke β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.
6.4. Berekenen van het percentage erytrodiol en uvaol:
waarbij:
|
ΣA |
= |
totale oppervlak voor sterolen in de computersysteemtellingen; |
|
Er |
= |
oppervlak van erytrodiol in computersysteemtellingen; |
|
Uv |
= |
oppervlak van uvaol in computersysteemtellingen. |
Aanhangsel
Bepaling van de lineaire snelheid van het draaggas
Injecteer 1-3 μl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek (tM).
De lineaire snelheid in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij L de lengte van de kolom in centimeters is en tM de gemeten tijd in seconden.
Tabel 1
Relatieve retentietijden voor de sterolen
|
Piek |
Identificatie |
Relatieve retentie-tijd |
||
|
SE 54-kolom |
SE 52-kolom |
|||
|
1 |
Cholesterol |
Δ-5-cholesteen-3ß-ol |
0,67 |
0,63 |
|
2 |
Cholestanol |
5α-cholestaan-3ß-ol |
0,68 |
0,64 |
|
3 |
Brassicasterol |
[24S]-24-methyl-Δ-5,22-cholestadieen-3ß-ol |
0,73 |
0,71 |
|
* |
Ergosterol |
[24S] 24 methy Δ5-7-22 cholestatrieen 3ß-ol |
0,78 |
0,76 |
|
4 |
24-methyleencholesterol |
24-methyleen-Δ-5,24-cholestadien-3ß-o1 |
0,82 |
0,80 |
|
5 |
Campesterol |
(24R)-24-methyl-Δ-5-cholesteen-3ß-ol |
0,83 |
0,81 |
|
6 |
Campestanol |
(24R)-24-methyl-cholestaan-3ß-ol |
0,85 |
0,82 |
|
7 |
Stigmasterol |
(24S)-24-ethyl-Δ-5,22-cholestadieen-3ß-ol |
0,88 |
0,87 |
|
8 |
Δ7-campesterol |
(24R)-24-methyl-Δ-7-cholesteen-3ß-ol |
0,93 |
0,92 |
|
9 |
Δ5,23-stigmastadienol |
(24R,S)-24-ethyl-Δ-5,23-cholestadieen-3ß-ol |
0,95 |
0,95 |
|
10 |
Chlerosterol |
(24S)-24-ethyl-Δ-5,25-cholestadieen-3ß-ol |
0,96 |
0,96 |
|
11 |
ß-sitosterol |
(24R)-24-ethyl-Δ-5-cholesteen-3ß-ol |
1,00 |
1,00 |
|
12 |
Sitostanol |
24-ethyl-cholestaan-3ß-ol |
1,02 |
1,02 |
|
13 |
Δ5-avenasterol |
(24Z)-24-ethylideen-Δ-cholesteen-3ß-ol |
1,03 |
1,03 |
|
14 |
Δ5-24-stigmastadienol |
(24R,S)-24-ethyl-Δ5,24-cholestadieen-3ß-ol |
1,08 |
1,08 |
|
15 |
Δ7-stigmastenol |
(24R,S)-24-ethyl-Δ7-cholesteen-3ß-ol |
1,12 |
1,12 |
|
16 |
Δ7-avenasterol |
(24Z)-24-ethylideen-Δ7-cholesteen-3ß-ol |
1,16 |
1,16 |
|
17 |
Erytrodiol |
5α oleaan-12en-3ß28 diol |
1,41 |
1,41 |
|
18 |
Uvaol |
Δ12-urseen-3ß28 diol |
1,52 |
1,52 |
Afbeelding 1
Gaschromatogram van de sterol- en triterpeendialcoholfractie van een olijfolie voor verlichting (met interne standaard)
Afbeelding 2
Gaschromatogram van de sterol- en triterpeendialcoholfractie van een geraffineerde olijfolie (met interne standaard)
Afbeelding 3
Plaat voor dunnelaaggaschromatografie met olie uit perskoeken van olijven met de zone die moet worden weggeschraapt voor de bepaling van sterolen en triterpeendialcoholen
1 – Squaleen
2 – Triterpeen en alifatische alcoholen
3 – Sterolen en triterpeendialcoholen
4 – Begin en vetzuren
▼M26 —————
BIJLAGE VII
BEPALING VAN HET PERCENTAGE GLYCEROL-2-MONOPALMITAAT
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Hier wordt de analysemethode beschreven voor de bepaling van het percentage palmitinezuur op de 2-positie van triglyceriden via de bepaling van glycerol-2-monopalmitaat
Deze methode kan worden gebruikt voor plantaardige oliën die bij kamertemperatuur (20 °C) vloeibaar zijn.
2. PRINCIPE
Na een voorbehandeling wordt het oliemonster behandeld met pancreaslipase: door een partiële en specifieke hydrolyse op de 1- en 3-positie van het triglyceride ontstaan 2-monoglyceriden. Het percentage glycerol-2-monopalmitaat in de monoglyceridefractie wordt na silylering bepaald met behulp van capillaire gaschromatografie.
3. APPARATUUR EN STANDAARDMATERIAAL
|
3.1. |
Erlenmeyer, 25 ml. |
|
3.2. |
Bekerglazen, 100, 250 en 300 ml. |
|
3.3. |
Glazen chromatografiekolom met een inwendige diameter van 21-23 mm en een lengte van 400 mm, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan. |
|
3.4. |
Maatcilinders, 10, 50, 100 en 200 ml. |
|
3.5. |
Kolven, 100 en 250 ml |
|
3.6. |
Rotatieverdamper. |
|
3.7. |
Centrifugebuizen met een ronde bodem, 10 ml, met geslepen stop. |
|
3.8. |
Centrifuge voor buizen van 10 en 100 ml. |
|
3.9. |
Waterbad waarin de temperatuur op 40 °C + 0,5 °C kan worden gehouden. |
|
3.10. |
Meetpipetten, 1 en 2 ml. |
|
3.11. |
Injectiespuit, 1 ml. |
|
3.12. |
Micro-injectiespuit, 100 μl. |
|
3.13. |
Scheitrechter, 1 000 ml. |
|
3.14. |
Gaschromatograaf voor een capillaire kolom met een „cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen en een oven waarin de ingestelde temperatuur op ± 1 °C nauwkeurig kan worden gehouden. |
|
3.15. |
„Cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen. |
|
3.16. |
Vlamionisatiedetector en elektrometer. |
|
3.17. |
Recorder/integrator, geschikt voor de elektrometer, met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid. |
|
3.18. |
Capillaire kolom, glas of kwartsglas, met een lengte van 8-12 m en een inwendige diameter van 0,25-0,32 mm en bekleed met een laagje 5 % methylpolysiloxaan of fenylmethylpolysiloxaan met een dikte van 0,10-0,30 μm, die bij 370 °C kan worden gebruikt. |
|
3.19. |
Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, met een lengte van ten minste 7,5 cm, voor directe injectie op de kolom. |
4. REAGENTIA
|
4.1. |
Silicagel met een korrelgrootte tussen 0,063 en 0,200 mm (70/280 mesh), als volgt voorbehandeld: droog de silicagel in een porseleinen kroes in een droogstoof gedurende 4 uur bij 160 °C en laat vervolgens in een exsiccator afkoelen. Voeg als volgt een volume water toe dat overeenkomt met 5 % van het gewicht van de silicagel: weeg in een erlenmeyer van 500 ml 152 g silicagel af en voeg 8 g gedestilleerd water toe; sluit de erlenmeyer af en schud voorzichtig om het water uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik rusten. |
|
4.2. |
n-Hexaan (voor chromatografie). |
|
4.3. |
Isopropanol. |
|
4.4. |
Isopropanol, 1/1 (v/v) oplossing in water. |
|
4.5. |
Pancreaslipase. De gebruikte lipase moet een activiteit tussen 2,0 en 10 lipase-eenheden per mg hebben (In de handel is pancreaslipase met een activiteit tussen 2 en 10 enzymeenheden per mg verkrijgbaar.) |
|
4.6. |
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan-bufferoplossing: 1 M oplossing in water, met geconcentreerd HCl (1/1 v/v) op pH 8 gebracht (controle met potentiometer). |
|
4.7. |
Natriumcholaat, enzymkwaliteit, 0,1 %-oplossing in water (deze oplossing moet binnen 15 dagen na de bereiding worden gebruikt). |
|
4.8. |
Calciumchloride, 22 %-oplossing in water. |
|
4.9. |
Diethylether (voor chromatografie). |
|
4.10. |
Elutievloeistof: mengsel van n-hexaan en diethylether (87/13 v/v). |
|
4.11. |
Natriumhydroxide, 12 %-oplossing (g/g). |
|
4.12. |
Fenolftaleïne, 1 %-oplossing in ethanol. |
|
4.13. |
Draaggas: waterstof of helium (voor gaschromatografie). |
|
4.14. |
Hulpgassen: waterstof (minimaal 99 %, watervrij en zonder organische stoffen) en lucht (voor gaschromatografie en met dezelfde zuiverheid). |
|
4.15. |
Silaniseringsreagens: mengsel pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan (9/3/1 v/v/v) (In de handel zijn gebruiksklare oplossingen verkrijgbaar.) Er kunnen ook andere silyleringsreagentia worden gebruikt, bijvoorbeeld bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, verdund met een gelijk volume watervrije pyridine. |
|
4.16. |
Referentiemonsters: zuivere monoglyceriden of mengsels van monoglyceriden met een bekende samenstelling die vergelijkbaar is met die van het monster. |
5. PROCEDURE
5.1. Voorbehandeling van het monster
|
5.1.1. |
Olie met een gehalte aan vrij zuur van minder dan 3 % behoeft niet vóór de silicagel-kolomchromatografie te worden geneutraliseerd. Olie met een gehalte aan vrij zuur van meer dan 3 % moet overeenkomstig punt 5.1.1.1 worden geneutraliseerd.
|
|
5.1.2. |
Breng 1,0 g olie, voorbehandeld zoals hierboven beschreven, in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) en los dit op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Laat de oplossing vóór de silicagel-kolomchromatografie gedurende ten minste 15 minuten rusten. Centrifugeer de oplossing, als deze troebel is, om optimale omstandigheden voor de chromatografie te waarborgen. (Er kunnen gebruiksklare SPE-silicagelpatronen van 500 mg worden gebruikt). |
|
5.1.3. |
Voorbehandeling van de chromatografiekolom Giet ongeveer 30 ml elutievloeistof (4.10) in de kolom (3.3) en breng met een glasstaaf onder in de kolom een propje watten; duw het aan om de lucht te verwijderen. Bereid in een bekerglas een suspensie van 25 g silicagel (4.1) in ongeveer 80 ml elutievloeistof en giet dit met behulp van een trechter in de kolom. Controleer of alle silicagel in de kolom is gegoten; spoel met elutievloeistof (4.10), open de kraan en laat het vloeistofniveau zakken tot ongeveer 2 mm boven de bovenkant van de silicagel-laag. |
|
5.1.4. |
Kolomchromatografie Weeg in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) precies 1,0 g monster af, voorbehandeld volgens punt 5.1. Los het monster op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Schenk de oplossing op de chromatografiekolom, voorbehandeld volgens punt 5.1.3. Zorg dat het oppervlak van de kolom niet verstoord wordt. Open de kraan en laat de monsteroplossing inzakken tot de bovenkant van de silicagel-laag. Elueer met 150 ml elutievloeistof. Stel de snelheid in op 2 ml/minuut (zodat de 150 ml in ongeveer 60-70 minuten door de kolom loopt). Vang het eluaat op in een vooraf getarreerde kolf van 250 ml. Verdamp het oplosmiddel onder vacuüm en verwijder de laatste sporen ervan onder een stikstofstroom. Weeg de kolf en bereken de opgevangen hoeveelheid extract. (Bij gebruik van gebruiksklare SPE-silicagelpatronen is de werkwijze: Breng 1 ml oplossing (5.1.2) in de vooraf voorbereide patronen met 3 ml n-hexaan. Elueer na het doorlopen van de oplossing met 4 ml n-hexaan/diethylether (9/1 v/v). Vang het eluaat op in een buis van 10 ml en damp droog onder een stikstofstroom. Laat pancreaslipase (5.2) op het residu inwerken. Het is van cruciaal belang dat de vetzuursamenstelling vóór en na de passage door de SPE-patroon wordt bepaald). |
5.2. Hydrolyse met pancreaslipase
|
5.2.1. |
Weeg in de centrifugebuis overeenkomstig punt 5.1 0,1 g van de voorbehandelde olie af. Voeg 2 ml bufferoplossing (4.6), 0,5 ml natriumcholaatoplossing (4.7) en 0,2 ml calciumchlorideoplossing toe en schud na elke toevoeging goed. Sluit de buis met de geslepen stop en zet hem in het waterbad bij 40 ± 0,5 °C. |
|
5.2.2. |
Voeg 20 mg lipase toe, schud voorzichtig (zorg dat de stop niet nat wordt) en zet de buis gedurende precies 2 minuten in het waterbad, haal de buis eruit, schud krachtig gedurende precies één minuut en laat de buis afkoelen. |
|
5.2.3. |
Voeg 1 ml diethylether toe, zet de stop op de buis en schud krachtig, centrifugeer en breng de etheroplossing met een micro-injectiespuit over in een schone droge buis. |
5.3. Bereiding van de gesilaniseerde verbindingen en voorbereiding van de gaschromatografie
|
5.3.1. |
Breng met een micro-injectiespuit 100 μl oplossing (5.2.3) in een rondbodemkolf van 10 ml. |
|
5.3.2. |
Verwijder het oplosmiddel onder een zachte stikstofstroom, voeg 200 μl silaniseringsreagens (4.15) toe, zet de stop op de kolf en laat gedurende 20 minuten staan. |
|
5.3.3. |
Voeg na 20 minuten 1-5 ml (afhankelijk van de chromatografie-omstandigheden) n-hexaan toe: de resulterende oplossing is gereed voor gaschromatografie. |
5.4. Gaschromatografie
De werkomstandigheden zijn als volgt:
— temperatuur van de injector („on column” injector) onder het kookpunt van het oplosmiddel (68 °C);
— temperatuur van de detector: 350 °C;
— temperatuur van de kolom: de oventemperatuur wordt als volgt geprogrammeerd: eerst gedurende 1 minuut op 60 °C, daarna met 15 °C per minuut oplopend tot 180 °C, vervolgens met 5 °C per minuut oplopend tot 340 °C en ten slotte gedurende 13 minuten op 340 °C;
— Draaggas: waterstof of helium met een lineaire snelheid die voldoende is om de in figuur 1 aangegeven resolutie te verkrijgen. De retentietijd van triglyceride C54 moet 40 + 5 minuten zijn (zie figuur 2). (Bovenstaande werkomstandigheden worden ter indicatie aangegeven. Ze moeten in elke situatie worden geoptimaliseerd om de gewenste resolutie te verkrijgen. De piekhoogte van glycerol-2-monopalmitaat moet minimaal 10 % van de volle schaaluitslag van de recorder zijn.)
— Geïnjecteerde hoeveelheid: 0,5-1 μl van de oplossing (5 ml) in n-hexaan (5.3.3).
5.4.1. Identificatie van de pieken
De verschillende monoglyceriden worden geïdentificeerd aan de hand van de verkregen retentietijd en door vergelijking met de pieken voor standaardmengsels monoglyceriden die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.
5.4.2. Kwantitatieve bepaling
Met een elektronische integrator wordt het oppervlak van elke piek berekend.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het percentage glycerol-2-monopalmitaat wordt aan de hand van de verhouding tussen het piekoppervlak voor deze stof en het piekoppervlak voor alle monoglyceriden samen (zie figuur 2) berekend met de formule:
Gycerolmonopalmitaat (%) =
Hierbij is:
|
Ax |
= |
het piekoppervlak voor glycerol-2-monopalmitaat en |
|
ΣA |
= |
de som van de piekoppervlakken van alle monoglyceriden samen. |
Het resultaat moet met één cijfer achter de komma worden vermeld.
7. ANALYSEVERSLAG
Het analyseverslag moet bevatten:
— een verwijzing naar deze methode;
— alle informatie die nodig is om het monster volledig te kunnen identificeren;
— het resultaat van de analyse;
— elke afwijking van deze methode, ongeacht of dit op grond van een besluit van de betrokken partijen of om een andere reden is gebeurd;
— de identificatiegegevens van het laboratorium, de datum van de analyse en de handtekeningen van de voor de analyse verantwoordelijke personen.
Figuur 1
Chromatogram van de producten van de silaniseringsreactie, verkregen door de inwerking van lipase op een geraffineerde olijfolie waaraan 20 % veresterde olie is toegevoegd (100 %).
NdT: Acides gras libres = Vrije vetzuren; Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = Geraffineerde olijfolie + 20 % veresterde olie; 1-2 monopalmitoléine = 1-2-monopalmitoleïne; 1-2 monopalmitine = 1-2 monopalmitine; 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono C18 onverz.; Squalene = Squaleen
Figuur 2
Chromatogram van:
|
A) |
onveresterde olijfolie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. 
Verklaring:
|
Chromatogram van:
|
B) |
veresterde olie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. 
Verklaring:
|
8. OPMERKINGEN
BEREIDING VAN LIPASE
Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel verkrijgbaar. Het kan ook als volgt in het laboratorium worden bereid:
Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 °C. Verwijder het omringende vet en bindweefsel en maal het restant in een messenmolen fijn tot een vloeibare pasta is overgebleven. Roer deze pasta gedurende 4-6 uur met 2,5 l watervrije aceton en centrifugeer daarna. Extraheer het residu nog driemaal met hetzelfde volume watervrije aceton en vervolgens tweemaal met een 1/1 (v/v) mengsel van aceton en diethylether en tweemaal met diethylether.
Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuüm; hierdoor wordt een stabiel poeder verkregen dat lange tijd vochtvrij in een koelkast kan worden bewaard.
CONTROLE VAN DE LIPASEACTIVITEIT
Bereid als volgt een olijfolie-emulsie:
Schud in een mengapparaat gedurende 10 minuten een mengsel van 165 ml van een oplossing van arabische gom (100 g/l), 15 g ijsgruis en 20 ml vooraf geneutraliseerde olijfolie.
Breng in een bekerglas van 50 ml achtereenvolgens 10 ml van deze emulsie, 0,3 ml natriumcholaatoplossing (0,2 g/ml) en 20 ml gedestilleerd water.
Zet het bekerglas in een waterbad dat op 37 °C is ingesteld; hang de elektroden van de pH-meter in de vloeistof en voeg een roermagneetje toe.
Voeg met een buret druppelsgewijs een 0,1 N natriumhydroxideoplossing toe tot een pH van 8,3 is bereikt.
Voeg een hoeveelheid suspensie van lipasepoeder in water toe (0,1 g lipase/ml). Start de stopwatch zodra de pH-meter een pH van 8,3 aangeeft en voeg druppelsgewijs de natriumhydroxideoplossing met een zodanige snelheid toe dat de pH 8,3 blijft. Noteer elke minuut het verbruikte volume.
Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij op de x-as de tijd wordt aangegeven en op de y-as het volume (ml) 0,1 N alkalioplossing dat is verbruikt om de pH constant te houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn.
De lipaseactiviteit, uitgedrukt in lipase-eenheden per mg, wordt met de volgende formule berekend:
Hierbij is:
|
A |
= |
de activiteit in lipase-eenheden/mg; |
|
V |
= |
het volume (ml) 0,1 N natriumhydroxideoplossing per minuut (berekend uit de grafiek); |
|
N |
= |
de normaliteit van de natriumhydroxideoplossing; |
|
m |
= |
de massa van het onderzochte lipase (in mg). |
Eén lipase-eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 micro-equivalent zuur vrijmaakt.
▼M20 —————
BIJLAGE IX
SPECTROFOTOMETRISCH ONDERZOEK IN HET ULTRAVIOLETTE GEBIED
OPMERKING VOORAF
Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied kan informatie verschaffen over de kwaliteit van een vet, de toestand van bewaring en veranderingen veroorzaakt door technologische processen. De absorptie bij de in deze methode aangegeven golflengten wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van dubbele en drievoudig onverzadigde systemen als gevolg van oxidatieprocessen en/of raffinagepraktijken. Deze absorpties worden uitgedrukt als de specifieke extincties
(de extinctie van een oplossing van 1 % (m/v) van het vet in het aangegeven oplosmiddel, in een 10 mm-cuvet), en worden volgens afspraak als K, ook extinctiecoëfficiënt genoemd, opgegeven.
1. DOEL
Deze bijlage bevat een beschrijving van de werkwijze voor de uitvoering van een spectrofotometrisch onderzoek van vetten in het ultraviolette gebied.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
Het monster wordt in het vereiste oplosmiddel opgelost en de absorptie wordt gemeten bij de opgegeven golflengten ten opzichte van het zuivere oplosmiddel.
De specifieke extincties bij 232 nm en 268 nm in iso-octaan of bij 232 nm en 270 nm in cyclohexaan worden berekend voor een concentratie van 1 % (m/v) in een 10 mm-cuvet.
3. APPARATUUR
|
3.1. |
Een spectrofotometer, geschikt voor metingen bij ultraviolette golflengten (tussen 220 en 360 nm), instelbaar tot op de nm nauwkeurig. Een regelmatige controle van de absorptie- en de golflengteschaal op nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid en van het strooilicht wordt aanbevolen.
|
|
3.2. |
Kwartscuvetten, met deksel, geschikt voor metingen bij de ultraviolette golflengten (tussen 220 en 360 nm) met een optische weglengte van 10 mm. Gevuld met water of een ander geschikt oplosmiddel mogen de cuvetten onderling geen verschillen vertonen groter dan 0,01 extinctie-eenheden. |
|
3.3. |
Maatkolven van 25 ml, klasse A. |
|
3.4. |
Analytische balans, afleesbaar tot op 0,0001 g nauwkeurig. |
4. REAGENTIA
Gebruik bij de analyse, tenzij anders bepaald, uitsluitend reagentia die p.a. zijn, en gedestilleerd of gedemineraliseerd water of water van een gelijkwaardige zuiverheid.
Oplosmiddel: iso-octaan (2,2,4-trimethylpentaan) voor metingen bij 232 nm en 268 nm of cyclohexaan voor metingen bij 232 nm en 270 nm, met een absorptie van minder dan 0,12 bij 232 nm en minder dan 0,05 bij 270 nm ten opzichte van gedistilleerd water, als gemeten in een 10 mm-cuvet.
5. WERKWIJZE
|
5.1. |
Het monster dient volledig homogeen te zijn en vrij van gesuspendeerde onzuiverheden. Is dat niet het geval, dan moet het over papier worden gefiltreerd bij een temperatuur van ongeveer 30 °C. |
|
5.2. |
Weeg 0,25 g van het voorbehandelde monster (tot op 1 mg nauwkeurig) af in een maatkolf van 25 ml, vul aan tot de streep met het aangegeven oplosmiddel en homogeniseer. De verkregen oplossing moet volmaakt helder zijn. Indien opalescentie of troebeling optreedt, dient direct over papier te worden gefiltreerd. LET OP: Doorgaans is een massa van 0,25-0,30 g voldoende voor absorptiemetingen van olijfolie van de eerste persing en extra olijfolie van de eerste persing bij 268 nm en 270 nm. Voor metingen bij 232 nm is gewoonlijk 0,05 g monster vereist; dan worden dus twee afzonderlijke oplossingen bereid. Voor absorptiemetingen van oliën uit perskoeken van olijven, geraffineerde olijfoliën en aangelengde olijfoliën is vanwege de hogere absorptie ervan gewoonlijk een kleiner monster van bijvoorbeeld 0,1 g nodig. |
|
5.3. |
Corrigeer zo nodig de basislijn (220-290 nm) met oplosmiddel in beide kwartscuvetten (monster en referentie), vul vervolgens de kwartscuvet van het monster met de testoplossing en meet de extincties ten opzichte van het als referentie gebruikte oplosmiddel bij 232, 268 of 270 nm. De gemeten extinctiewaarden moeten tussen 0,1 en 0,8 liggen of binnen het lineariteitsbereik van de spectrofotometer, hetgeen moet worden geverifieerd. Zo niet, dan moeten de metingen worden herhaald bij een aangepaste inweeg van het monster. |
|
5.4. |
Meet na de meting van de absorptie bij 268 of 270 nm de absorptie bij λmax, λmax + 4 en λmax – 4. Deze absorptiewaarden worden gebruikt ter bepaling van de variatie in de specifieke extinctie (ΔΚ). LET OP: λmax wordt geacht 268 nm te zijn voor iso-octaan als oplosmiddel en 270 nm voor cyclohexaan. |
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
|
6.1. |
Geef de specifieke extincties op, die bij de verschillende golflengten als volgt worden berekend:
waarbij:
weergegeven met twee cijfers achter de komma. |
|
6.2. |
Variatie van de specifieke extinctie (ΔΚ) De variatie van de absolute waarde van de extinctie (ΔΚ) wordt bepaald aan de hand van de volgende formule:
waarbij Km de specifieke extinctie is bij de golflengte van het absorptiemaximum bij 270 nm en 268 nm, welke afhangt van het gebruikte oplosmiddel; De resultaten moeten worden weergegeven met twee cijfers achter de komma. |
BIJLAGE X
GASCHROMATOGRAFISCHE BEPALING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN
1. DOEL
Deze bijlage bevat richtsnoeren voor de gaschromatografische bepaling van vrije en gebonden vetzuren in plantaardige oliën en vetten na de omzetting ervan in methylesters van vetzuren.
De gebonden vetzuren van de triacylglycerolen (TAG's) en, afhankelijk van de veresteringsmethode, de vrije vetzuren (FFA's) worden omgezet in methylesters van vetzuren (FAME's), die worden bepaald middels capillaire gaschromatografie.
Met de in deze bijlage beschreven methode kunnen FAME's van C12 tot en met C24, inclusief verzadigde, cis- en trans-mono-onverzadigde en cis- en trans-poly-onverzadigde methylesters van vetzuren, worden bepaald.
2. PRINCIPE
Gaschromatografie (GC) wordt gebruikt voor de kwantitatieve analyse van FAME's. De FAME's worden bereid overeenkomstig deel A. Vervolgens worden ze geïnjecteerd en gevaporiseerd in de injector. De scheiding van FAME's vindt plaats op analytische kolommen met een specifieke polariteit en lengte. Een vlamionisatiedetector (FID) wordt gebruikt voor de detectie van de FAME's. De analyseomstandigheden worden gegeven in deel B.
Waterstof of helium kan worden gebruikt als draaggas (mobiele fase) in de gaschromatografie van FAME's met FID's. Waterstof versnelt de scheiding en geeft scherpere pieken. De stationaire fase is een microscopisch dunne vloeistoffilm op een inert vast oppervlak van fused silica.
Wanneer ze door de capillaire kolom stromen, gaan de te analyseren vervluchtigde stoffen een interactie aan met de stationaire fase waarmee de binnenzijde van de kolom is gecoat. Door de uiteenlopende interactie van de verschillende stoffen hebben ze elk een bepaalde tijd nodig om te elueren, hetgeen de retentietijd van de stof voor een bepaalde reeks analyseparameters wordt genoemd. Aan de hand van een vergelijking van de retentietijden worden de verschillende stoffen geïdentificeerd.
DEEL A
BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN VAN OLIJFOLIE EN OLIE UIT PERSKOEKEN VAN OLIJVEN
1. DOEL
In dit deel wordt ingegaan op de bereiding van de methylesters van vetzuren. Het bevat een beschrijving van methoden voor de bereiding van methylesters van vetzuren van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven.
2. TOEPASSINGSGEBIED
De methylesters van vetzuren van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven worden bereid middels omestering met een methanoloplossing van kaliumhydroxide bij omgevingstemperatuur. Het hangt van het gehalte aan vrije vetzuren van het monster en van de te bepalen analyseparameter af of het monster vóór de omestering moet worden gezuiverd. In dit verband kan de volgende tabel worden gebruikt:
|
Soort olie |
Methode |
|
Olijfolie van de eerste persing met een gehalte aan vetzuren ≤ 2,0 % |
1. Vetzuren 2. Transvetzuren 3. ΔECN42 (na zuivering met silicagel SPE) |
|
Geraffineerde olijfolie |
|
|
Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing |
|
|
Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven |
|
|
Olie uit perskoeken van olijven |
|
|
Olijfolie van de eerste persing met een gehalte aan vetzuren > 2,0 %. Ruwe olie uit perskoeken van olijven |
1. Vetzuren (na zuivering met silica-gel SPE) 2. Transvetzuren (na zuivering met silica-gel SPE) 3. ΔECN42 (na zuivering met silica-gel SPE) |
3. METHODIEK
3.1. Omestering met een methanoloplossing van kaliumhydroxide bij omgevingstemperatuur
3.1.1. Principe
De methylesters worden gevormd door omestering in een methanoloplossing van kaliumhydroxide, als tussenfase vóór de verzeping.
3.1.2. Reagentia
|
3.1.2.1. |
Methanol met hoogstens 0,5 % (m/m) water |
|
3.1.2.2. |
Hexaan voor chromatografie |
|
3.1.2.3. |
Heptaan voor chromatografie |
|
3.1.2.4. |
Diethylether, gestabiliseerd voor analysedoeleinden |
|
3.1.2.5. |
Aceton voor chromatografie |
|
3.1.2.6. |
Elutievloeistof voor het zuiveren van de olie door kolom-/SPE-chromatografie: mengsel van hexaan/diethylether 87/13 (v/v) |
|
3.1.2.7. |
Kaliumhydroxide, methanoloplossing van ca. 2 M: los 11,2 g kaliumhydroxide op in 100 ml methanol. |
|
3.1.2.8. |
Silicagelpatronen, 1 g (6 ml) voor vastefase-extractie |
3.1.3. Apparatuur
|
3.1.3.1. |
Reageerbuisjes met schroefsluiting (capaciteit 5 ml), met een dop die voorzien is van een PTFE-dichting |
|
3.1.3.2. |
Pipetten, met schaalverdeling of automatische, van 2 ml en 0,2 ml |
3.1.4. Zuivering van oliemonsters
Indien nodig worden de monsters gezuiverd door deze door een silicagelpatroon voor vastefase-extractie te voeren. Plaats een silicagelpatroon (3.1.2.8) in een apparaat voor elutie onder vacuüm en was met 6 ml hexaan (3.1.2.2); het wassen geschiedt niet onder vacuüm. Breng vervolgens op de kolom een oplossing van de olie (ongeveer 0,12 g) in 0,5 ml hexaan (3.1.2.2). De oplossing wordt naar beneden getrokken. Elueer met 10 ml hexaan/diethylether (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogeniseer het totaal van de eluaten en verdeel deze in twee gelijke volumes. Laat een van de volumes tot uitdroging verdampen in een draaibaar verdamptoestel onder verminderde druk en bij omgevingstemperatuur. Los het residu op in 1 ml heptaan. De verkregen oplossing is klaar voor de GC-analyse van vetzuren. Laat het tweede volume verdampen en los het residu op in 1 ml aceton voor de HPLC-analyse van de triglyceriden, indien nodig.
3.1.5. Werkwijze
Weeg ca. 0,1 g van het oliemonster af in een reageerbuisje van 5 ml met schroefsluiting (3.1.3.1). Voeg 2 ml heptaan toe (3.1.2.2) en schud. Voeg 0,2 ml van de methanoloplossing van kaliumhydroxide toe (3.1.2.7), sluit met behulp van de dop die van een PTFE-dichting is voorzien, sluit goed af en schud krachtig gedurende 30 seconden. Laat rusten totdat het bovenste deel van de oplossing helder wordt. Schenk de bovenste laag af; dat is de laag waarin zich de methylesters bevinden. De heptaanoplossing is gereed om in de chromatograaf geïnjecteerd te worden. Het verdient aanbeveling om de oplossing in de koelkast te laten tot het ogenblik van de chromatografische analyse. Het is af te raden de oplossing langer dan twaalf uur te bewaren.
DEEL B
GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN
1. DOEL
Dit deel bevat richtsnoeren voor de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatografische bepaling met capillaire kolom van een mengsel van methylesters van vetzuren, verkregen overeenkomstig deel A.
Dit deel is niet van toepassing op gepolymeriseerde vetzuren.
2. REAGENTIA
2.1. Draaggas
Inert gas (helium of waterstof), zeer goed gedroogd en met een zuurstofgehalte kleiner dan 10 mg/kg.
Opmerking 1: Waterstof kan de snelheid van de analyse verdubbelen, maar is gevaarlijk. Veiligheidsvoorzieningen zijn verkrijgbaar.
2.2. Hulpgassen
|
2.2.1. |
Waterstof (zuiverheid ≥ 99,9 %), vrij van organische onzuiverheden |
|
2.2.2. |
Lucht of zuurstof, vrij van organische onzuiverheden |
|
2.2.3. |
Stikstof (zuiverheid > 99 %) |
2.3. Referentiestandaard
Een mengsel van methylesters van zuivere vetzuren of de methylesters van een vetstof met bekende samenstelling, bij voorkeur met dezelfde vetzuursamenstelling als het te analyseren monster. Cis- en transisomeren van octadeceen-, octadecadieen- en octadecatrieenmethylesters zijn nuttig voor de identificatie van transisomeren van onverzadigde zuren.
Oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren moet worden voorkomen.
3. APPARATUUR
De instructies hebben betrekking op apparatuur die gewoonlijk wordt gebruikt bij gaschromatografie met een capillaire kolom en een vlamionisatiedetector.
3.1. Gaschromatograaf
De gaschromatograaf dient te bestaan uit de volgende onderdelen:
3.1.1. Injectiestuk
Gebruik een injectiestuk met capillaire kolommen, in welk geval het injectiestuk speciaal dient te zijn ontworpen voor gebruik met dergelijke kolommen. Dit injectiestuk mag van het splittype zijn of van het splitloze kolominjectortype.
3.1.2. Oven
De oven moet de kolom tot ten minste 260 °C kunnen verwarmen en de gekozen temperatuur op 0,1 °C nauwkeurig kunnen aanhouden. De laatstgenoemde voorwaarde is van bijzonder belang wanneer een fused-silicabuis wordt gebruikt.
Het verdient aanbeveling steeds temperatuur-geprogrammeerde gaschromatografie toe te passen, in het bijzonder voor vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen.
3.1.3. Capillaire kolom
|
3.1.3.1. |
Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren verbindingen (gewoonlijk glas of fused silica). Inwendige diameter 0,20-0,32 mm. De binnenzijde dient een adequate behandeling te ondergaan (bij voorbeeld voorbehandeling van de oppervlakte, inactivering) voordat ze met de stationaire fase wordt gecoat. Een lengte van 60 meter is voldoende voor vetzuur en cis- en transisomeren van vetzuren. |
|
3.1.3.2. |
Stationaire fase, polair polysiloxaan (cyanopropylsilicon). Kruiselings verbonden kolommen zijn geschikt. Opmerking 2: Polaire polysiloxanen kunnen problemen opleveren bij de identificatie en scheiding van linoleenzuur en C20-zuren. De coating moet dun zijn, dat wil zeggen 0,1-0,2 μm. |
|
3.1.3.3. |
Montage en conditionering van de kolom Neem de gebruikelijke voorzorgen voor het monteren van capillaire kolommen, dat wil zeggen bevestiging van de kolom in de oven (ondersteuning), keuze en montage van verbindingsstukken (lekken), plaatsing van de uiteinden van de kolom in de injector en de detector (beperking van dode ruimten). Leid een stroom van draaggas onder druk door de kolom (bijvoorbeeld 0,3 bar (30 kPa) voor een kolom van 25 m lengte en een inwendige diameter van 0,3 mm). Conditioneer de kolom door de temperatuur in de oven geprogrammeerd met 3 °C/min. te verhogen van de omgevingstemperatuur tot 10 °C onder de ontledingstemperatuur van de stationaire fase. Houd de oven gedurende één uur op deze temperatuur, tot stabilisatie van de basislijn. Verlaag de temperatuur tot 180 °C en werk onder isotherme omstandigheden. Opmerking 3: In de handel zijn geschikte, reeds geconditioneerde kolommen verkrijgbaar. |
3.1.4. Vlamionisatiedetector en omzetter/versterker.
3.2. Injectiespuit
Injectiespuit van maximaal 10 μl, met schaalverdeling in 0,1 μl.
3.3. Gegevensverzamelsysteem
Gegevensverzamelsysteem online verbonden met de detectoren. Gebruikt wordt een softwareprogramma dat geschikt is voor piekintegratie en normalisatie.
4. WERKWIJZE
De in 4.1, 4.2 en 4.3 beschreven handelingen gelden voor het gebruik van een vlamionisatiedetector.
4.1. Testomstandigheden
4.1.1. Bepaling van de optimale werkomstandigheden voor capillaire kolommen
De efficiëntie en permeabiliteit van capillaire kolommen brengen mee dat de scheiding van de componenten en de duur van de analyse sterk afhankelijk zijn van het debiet van het draaggas in de kolom. Daarom moeten de werkomstandigheden worden geoptimaliseerd door aanpassing van deze parameter (of eenvoudiger door beïnvloeding van het drukverval van de kolom), naargelang een betere scheiding of een snellere analyse wordt beoogd.
De volgende omstandigheden zijn geschikt gebleken voor de scheiding van FAME's (C4 tot en met C26). Voorbeelden van chromatogrammen zijn te vinden in aanhangsel B:
|
Injectortemperatuur: |
250 °C |
|
Detectortemperatuur: |
250 °C |
|
Oventemperatuur: |
165 °C (8 min) tot 210 °C bij 2 °C/min |
|
Draaggas waterstof: |
kolomdruk (top): 179 kPa |
|
Totaal debiet: |
154,0 ml/min |
|
Splitverhouding: |
1:100 |
|
Injectievolume: |
1 μl |
4.1.2. Bepaling van de resolutie (zie aanhangsel A)
Bereken de resolutie, R, van twee naast elkaar liggende pieken I en II aan de hand van de volgende formule:
R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) or R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),
Of
R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia))
waarbij:
d r(I) de retentieafstand van piek I is;
d r(II) de retentieafstand van piek II is;
t r(I) de retentietijd van piek I is;
t r(II) de retentietijd van piek II is;
ω(I) de breedte van de basis van piek I is;
ω(II) de breedte van de basis van piek II is;
ω0,5 de piekbreedte van de gespecificeerde stof, op halve hoogte van de piek is;
Indien ω(I) ≈ ω(II), bereken R dan aan de hand van de volgende formules:
R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ
waarbij:
σ de standaardafwijking is (zie aanhangsel A, afbeelding 1).
Indien de afstand dr tussen de twee pieken d r(II) – d r(I) gelijk is aan 4σ, dan is resolutiefactor R gelijk aan 1.
Indien de pieken niet volledig zijn gescheiden, dan komen de raaklijnen van de buigpunten van de twee pieken samen op punt C. Om de twee pieken volledig te scheiden, moet de afstand tussen de twee pieken gelijk zijn aan:
d r(II) – d r(I) = 6 σ dus R = 1,5 (zie aanhangsel A, afbeelding 3).
5. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
5.1. Kwalitatieve analyse
Identificeer de methylesterpieken van het monster met behulp van het chromatogram in aanhangsel B, afbeelding 1, zo nodig middels interpolatie of middels vergelijking met die van de referentiemengsels van methylesters (als bedoeld in 2.3).
5.2. Kwantitatieve analyse
5.2.1. Bepaling van de samenstelling
Bereken de massafractie w i van de individuele methylesters van vetzuren, uitgedrukt als massapercentage van methylesters, als volgt:
5.2.2. Berekening
5.2.2.1. Algemeen te volgen methode
Bereken het gehalte van een bepaalde component i, uitgedrukt als een massapercentage van de methylesters, door het percentage van het oppervlak van de betrokken piek te bepalen ten opzichte van het totale piekoppervlak, met de formule:
wi = (Ai/ΣA) × 100
waarbij:
Ai het piekoppervlak van de individuele vetzuurmethylester i is;
ΣA de som van de oppervlakken van alle pieken van alle individuele methylesters van vetzuren is.
De resultaten worden uitgedrukt tot op twee cijfers achter de komma.
Opmerking 4: Bij vetten en oliën is de massafractie van de methylesters van vetzuren gelijk aan de massafractie van de triacylglycerolen in gram per 100 g. Zie punt 5.2.2.2 voor de gevallen waarin dit niet mag worden aangenomen.
5.2.2.2. Gebruik van correctiefactoren
In bepaalde gevallen, bijvoorbeeld bij aanwezigheid van vetzuren met minder dan acht koolstofatomen of van zuren met secundaire groepen, moeten de oppervlakken worden gecorrigeerd met bepaalde correctiefactoren (Fci's). Deze factoren worden voor elk afzonderlijk instrument bepaald. Daartoe moeten geschikte referentiematerialen met een gecertificeerde vetzuursamenstelling in het corresponderende bereik worden gebruikt.
Opmerking 5: Deze correctiefactoren zijn niet identiek aan de theoretische FID-correctiefactoren die in aanhangsel A worden gegeven, omdat deze ook rekening houden met de prestatie van het injectiestuk etc. Bij grotere verschillen moet evenwel het gehele systeem op de prestatie ervan worden gecontroleerd.
Voor het referentiemengsel wordt het massapercentage van FAME i berekend aan de hand van de formule:
wi = (mi /Σm) × 100
waarbij:
m i de massa van FAME i in het referentiemengsel is;
Σm de som van de massa's van de verschillende componenten als FAME's van het referentiemengsel is.
Bereken met het chromatogram van het referentiemengsel het percentage (per oppervlak) van FAME i op de volgende wijze:
wi = (Ai/ΣA) × 100
waarbij:
Ai het oppervlak van FAME i in het referentiemengsel is;
ΣA de som van alle oppervlakken van alle FAME's van het referentiemengsel is.
De correctiefactor Fc is dan:
Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)
Voor het monster is het massapercentage van elke FAME i:
wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)
De resultaten worden uitgedrukt tot op twee cijfers achter de komma.
Opmerking 6: De berekende waarde komt overeen met het massapercentage van het individuele vetzuur, berekend als triacylglycerolen per 100 g vet.
5.2.2.3. Gebruik van een interne standaard
In bepaalde gevallen (bijvoorbeeld wanneer niet alle zuren worden bepaald, zoals wanneer zuren met 4 en 6 koolstofatomen voorkomen naast zuren met 16 en 18 koolstofatomen, of bij bepaling van de absolute hoeveelheid van een vetzuur in een monster) moet een interne standaard worden gebruikt. Daarvoor wordt vaak gebruik gemaakt van vetzuren met 5, 15 of 17 koolstofatomen. Dan moet de correctiefactor voor de interne standaard worden bepaald.
Het massapercentage van component i uitgedrukt in methylesters wordt dan berekend met de formule:
wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS),
waarbij:
A i het oppervlak van FAME i is;
A IS het oppervlak van de interne standaard is;
F i de correctiefactor is van vetzuur i, uitgedrukt als FAME;
F IS de correctiefactor van de interne standaard is;
m de massa is van de proefeenheid, in mg;
m IS de massa van de interne standaard is, in mg;
De resultaten worden uitgedrukt tot op twee cijfers achter de komma.
6. VERSLAG
Vermeld in het verslag de methoden die zijn gebruikt voor de bereiding van de methylesters en voor de gaschromatografische analyse. Vermeld tevens alle uitvoeringsdetails die niet in deze standaardmethode zijn aangegeven of die als optioneel worden beschouwd, en voorts bijzonderheden die wellicht van invloed zijn geweest op de resultaten.
Geef in het verslag alle informatie die nodig is voor een volledige identificatie van het monster.
7. PRECISIE
7.1. Resultaten van het ringonderzoek
Details over de methode voor de precisieberekening bij een ringonderzoek zijn te vinden in bijlage C bij standaard IOC/T.20/Doc. nr. 33. De uit dit ringonderzoek afgeleide waarden kunnen wellicht niet op andere dan de vermelde concentratiebereiken en matrices worden toegepast.
7.2. Herhaalbaarheid
Het absolute verschil tussen twee onafhankelijke afzonderlijke testresultaten, met dezelfde methode en identiek testmateriaal in hetzelfde laboratorium door dezelfde laboratoriummedewerker met dezelfde apparatuur met een korte tussenpoos verkregen, zal in niet meer dan 5 % van de gevallen groter zijn dan „r” in de tabellen 1 tot en met 14 in bijlage C bij standaard IOC/T.20/Doc. nr. 33.
7.3. Reproduceerbaarheid
Het absolute verschil tussen twee afzonderlijke testresultaten, met dezelfde methode en identiek testmateriaal in verschillende laboratoria met verschillende laboratoriummedewerkers met verschillende apparatuur verkregen, zal in niet meer dan 5 % van de gevallen groter zijn dan „R” in de tabellen 1 tot en met 14 in bijlage C bij standaard IOC/T.20/Doc. nr. 33.
Aanhangsel A
Afbeelding 1
met ω0,5 = breedte op halve hoogte van de driehoek ABC en b = breedte op halve hoogte van driehoek NPM.
|
Afbeelding 2 |
Afbeelding 3 |
|
|
|
Aanhangsel B
Afbeelding 1
Met behulp van de methode van koude methylering verkregen chromatografisch profiel van een olie uit perskoeken van olijven
De chromatografische pieken komen, tenzij anders aangegeven, overeen met de methyl- en ethylesters.
BIJLAGE XI
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN GEHALOGENEERDE OPLOSMIDDELEN
1. BEGINSEL
Gaschromatografische bepaling met behulp van de head-space techniek.
2. APPARATUUR
|
2.1. |
Gaschromatograaf, voorzien van een electron capture detector (ECD). |
|
2.2. |
Instrumentatie voor head-space gaschromatografie. |
|
2.3. |
Glazen gaschromatografiekolom met een lengte van 2 m en een diameter van 2 mm, stationaire fase. OV101 10 % gelijkwaardig, op gecalcineerde, met zuur gewassen en gesilaniseerde diatomeeënaarde met korrelgrootte 80—100 Mesh. |
|
2.4. |
Draaggas en hulpgas: stikstof voor gaschromatografie, geschikt voor electron capture detection. |
|
2.5. |
Glazen flesjes van 10 tot 15 ml, bekleed met teflon en voorzien van een stop van aluminium met een opening voor het inbrengen van een injectiespuitje. |
|
2.6. |
Klemmen voor hermetische sluiting. |
|
2.7. |
Gasinjectiespuitje van 0,5 tot 2 ml. |
3. REAGENTIA
Standaard: gehalogeneerde oplosmiddelen met een voor gaschromatografie adequate zuiverheidsgraad.
4. WERKWIJZE
|
4.1. |
Weeg een nauwkeurig bepaalde hoeveelheid van ongeveer 3 g olie af in een glazen flesje (dat achteraf niet meer mag worden gebruikt) en sluit het flesje met de stop hermetisch af. Het flesje bij 70 °C gedurende een uur in eén thermostaat plaatsen. Neem uit de gasruimte met de injectiespuit 0,2 tot 0,5 ml op. Injecteer in de kolom van de als volgt ingestelde gaschromatograaf: — temperatuur injector: 150 °C; — temperatuur kolom: 70—80 °C; — temperatuur detector: 200—250 °C. Eventueel mag op andere temperaturen worden ingesteld, op voorwaarde dat de resultaten gelijkwaardig zijn. |
|
4.2. |
Referentieoplossingen. Maak standaardoplossingen aan met geraffineerde olijfolie zonder sporen van oplosmiddelen en met verschillende concentraties van gehalogeneerde oplosmiddelen tussen 0,05 en 1 ppm, overeenkomstig het veronderstelde gehalte van het monster. Gebruik pentaan voor eventuele verdunning. |
|
4.3. |
Kwantitatieve evaluatie. Bepaal de verhouding tussen de oppervlakten of de hoogten van de pieken van het monster en de standaardoplossing waarvan de concentratie verondersteld wordt het dichtst bij die van het monster te liggen. Als de relatieve afwijking groter is dan 10 % moet de analyse worden overgedaan door verrijking met een nieuwe standaardoplossing, en dit totdat de concentratie niet meer dan 10 % afwijkt. Het gehalte wordt bepaald op basis van een gemiddelde van elementaire injecties. |
|
4.4. |
Weergave van de resultaten. De resultaten worden uitgedrukt in mg/kg (ppm). De detectiegrens van de methode is 0,01 mg/kg. |
BIJLAGE XII
METHODE VAN DE INTERNATIONALE OLIJFOLIERAAD VOOR DE ORGANOLEPTISCHE BEOORDELING VAN OLIJFOLIE VAN DE EERSTE PERSING
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Het doel van de in deze bijlage beschreven internationale methode is het vaststellen van de procedure voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van olijfolie van de eerste persing in de zin van deel VIII, punt 1, van bijlage VII bij Verordening (EU) nr. 1308/2013 van het Europees Parlement en de Raad ( 4 ) en het vaststellen van de methode voor de indeling daarvan op basis van deze kenmerken. De methode bevat tevens aanwijzingen voor een facultatieve etikettering.
De beschreven methode geldt slechts voor olijfoliën van de eerste persing en voor de indeling of de etikettering daarvan op basis van de intensiteit van de waargenomen gebreken en de fruitigheid, zoals bepaald door een geselecteerde, getrainde en gemonitorde groep proevers die samen een panel vormen.
De in deze bijlage genoemde normen van de Internationale Olijfolieraad worden gebruikt in de laatst beschikbare versie ervan.
2. BASISTERMINOLOGIE SENSORISCHE ONDERZOEKEN
Zie de norm IOC/T.20/Doc. nr. 4 "Sensorisch onderzoek: basisterminologie"
3. SPECIFIEKE TERMINOLOGIE
3.1. Negatieve kenmerken
Olijvengisting/droesem: flavour die kenmerkend is voor olie uit olijven die onder zodanige omstandigheden zijn opgehoopt of opgeslagen dat de anaerobe vergisting ver gevorderd is, of voor olie die in contact is gebleven met het bezinksel in de tanks en bakken, dat ook een anaeroob vergistingsproces heeft ondergaan.
Schimmel-vochtig-grond: flavour die kenmerkend is voor olie uit olijven waarop schimmels en gisten zijn gegroeid doordat de vruchten enkele dagen onder vochtige omstandigheden zijn opgeslagen of van olie die afkomstig is van olijven waar bij het rapen grond of modder aan zat en die niet zijn gewassen.
Wijnachtig-azijnachtig/zuur-wrang: flavour die kenmerkend is voor sommige oliën die aan wijn of azijn doen denken. Deze wordt vooral veroorzaakt door een aeroob vergistingsproces van de olijven of de resten olijvenvruchtvlees in persmanden die niet op de juiste wijze zijn gewassen, waardoor azijnzuur, ethylacetaat en ethanol ontstaan.
Ranzig: flavour van olie die een intens oxidatieproces heeft ondergaan.
Bevroren olijven (vochtig hout): flavour die kenmerkend is voor olie die afkomstig is van olijven die aan de boom door vorst zijn beschadigd.
3.1.1. Andere negatieve kenmerken
|
Gekookt of verbrand |
Kenmerkende flavour voor olie die wordt veroorzaakt door te sterke en/of te lange verhitting tijdens de productie en met name door een onjuiste temperatuurregeling bij het mengen van het olijvenvruchtvlees. |
|
Hooi-hout |
Flavour die kenmerkend is voor sommige oliën die afkomstig zijn van droge olijven. |
|
Robuust |
Dik en kleverig mondgevoel dat wordt veroorzaakt door sommige oude oliën. |
|
Smeermiddelen |
Flavour van olie die doet denken aan stookolie, vet of minerale olie. |
|
Plantaardig water |
Flavour die ontstaat doordat de olie langdurig in contact is geweest met vruchtwater dat een vergistingsproces heeft ondergaan. |
|
Pekel |
Flavour van olie die afkomstig is van olijven die in pekel zijn bewaard. |
|
Metalig |
Flavour die aan metaal doet denken. Deze is kenmerkend voor olie die tijdens het malen, het mengen, het persen of de opslag lang in contact is geweest met metalen oppervlakken. |
|
Esparto |
Flavour die kenmerkend is voor olie die afkomstig is van olijven die in nieuwe persmanden van esparto zijn geperst. De flavour kan verschillen naargelang de persmanden van ongedroogd of gedroogd esparto zijn gemaakt. |
|
Wormstekig |
Flavour van olie die afkomstig is van olijven die ernstig door larven van de olijfvlieg (Bactrocera oleae) zijn aangetast. |
|
Komkommer |
Flavour van olie die kenmerkend is voor te lange hermetische bewaring, met name in blikken, en die wordt toegeschreven aan de vorming van 2,6-nonadienal. |
3.2. Positieve kenmerken
|
Fruitig |
Reeks reukgewaarwordingen die kenmerkend zijn voor de olie, afhankelijk van de olijvensoort, afkomstig van gezonde en verse, groene of rijpe vruchten. De gewaarwording vindt rechtstreeks en/of retronasaal plaats. |
|
Bitter |
Elementaire smaak die kenmerkend is voor olie die uit groene of rijpende olijven is verkregen. De smaak wordt waargenomen met de papillae vallatae (omwalde papillen), die in V-vorm op de tong liggen. |
|
Scherp |
Prikkelend gevoel in de mond dat kenmerkend is voor olie die aan het begin van het seizoen voornamelijk uit nog onrijpe olijven is verkregen. Dit gevoel kan in de hele mondholte, voornamelijk in de keel, worden waargenomen. |
3.3. Facultatieve terminologie voor de etikettering
Op verzoek kan de voorzitter van het panel uitsluitend voor de volgende termen certificeren dat de beoordeelde olie, afhankelijk van de intensiteit en de waarneming van de kenmerken, aan de definities voldoet en binnen het desbetreffende bereik valt:
Positieve kenmerken (fruitig, bitter en scherp): afhankelijk van de intensiteit van de gewaarwording:
— krachtig: wanneer de mediaan van het betrokken kenmerk hoger dan 6 ligt;
— gemiddeld: wanneer de mediaan van het betrokken kenmerk tussen 3 en 6 ligt;
— delicaat: wanneer de mediaan van het betrokken kenmerk lager dan 3 ligt.
|
Fruitigheid |
Reeks reukgewaarwordingen die kenmerkend zijn voor de olie, afhankelijk van de olijvensoort, afkomstig van gezonde en verse olijven, waarin groene noch rijpe fruitigheid de boventoon voert. De gewaarwording vindt rechtstreeks en/of retronasaal plaats. |
|
Groene fruitigheid |
Reeks reukgewaarwordingen die kenmerkend is voor de olie en die doet denken aan groene vruchten, afhankelijk van de olijvensoort en afkomstig van groene, gezonde en verse olijven. De gewaarwording vindt rechtstreeks en/of retronasaal plaats. |
|
Rijpe fruitigheid |
Reeks reukgewaarwordingen die kenmerkend is voor de olie en die doet denken aan rijpe vruchten, afhankelijk van de olijvensoort en afkomstig van gezonde en verse olijven. De gewaarwording vindt rechtstreeks en/of retronasaal plaats. |
|
Evenwichtig |
Een olie die niet onevenwichtig is, hetgeen betekent dat de reuk/smaakgewaarwordingen en het mondgevoel van de olie zodanig zijn dat de mediaan van het kenmerk bitter en de mediaan van het kenmerk scherp niet meer dan twee punten hoger liggen dan de mediaan van het kenmerk fruitigheid. |
|
Zachte olie |
Een olie waarvan de mediaan van het kenmerk bitter en de mediaan van het kenmerk scherp gelijk zijn aan 2 of lager dan 2 liggen. |
Lijst van termen volgens de intensiteit van de gewaarwording:
|
Termen waarvoor een organoleptisch analysecertificaat nodig is |
Mediaan van het betrokken kenmerk |
|
Fruitigheid |
— |
|
Rijpe fruitigheid |
— |
|
Groene fruitigheid |
— |
|
Delicate fruitigheid |
Minder dan 3 |
|
Gemiddelde fruitigheid |
Tussen 3 en 6 |
|
Krachtige fruitigheid |
Meer dan 6 |
|
Delicate rijpe fruitigheid |
Minder dan 3 |
|
Gemiddelde rijpe fruitigheid |
Tussen 3 en 6 |
|
Krachtige rijpe fruitigheid |
Meer dan 6 |
|
Delicate groene fruitigheid |
Minder dan 3 |
|
Gemiddelde groene fruitigheid |
Tussen 3 en 6 |
|
Krachtige groene fruitigheid |
Meer dan 6 |
|
Delicate bitterheid |
Minder dan 3 |
|
Gemiddelde bitterheid |
Tussen 3 en 6 |
|
Krachtige bitterheid |
Meer dan 6 |
|
Delicate scherpte |
Minder dan 3 |
|
Gemiddelde scherpte |
Tussen 3 en 6 |
|
Krachtige scherpte |
Meer dan 6 |
|
Evenwichtige olie |
De mediaan van het kenmerk bitter en de mediaan van het kenmerk scherp liggen niet meer dan twee punten hoger dan de mediaan van het kenmerk fruitigheid. |
|
Zachte olie |
De mediaan van het kenmerk bitter en de mediaan van het kenmerk scherp zijn gelijk aan 2 of liggen lager dan 2. |
4. PROEFGLAS VOOR OLIJFOLIE
Zie de norm IOC/T.20/Doc. nr. 5, "Glass for Oil Tasting".
5. TESTRUIMTE
Zie de norm IOC/T.20/Doc. nr. 6, "Guide for the Installation of a Test Room".
6. BENODIGDHEDEN
De volgende toebehoren, die proevers nodig hebben om hun taken op correcte wijze uit te voeren, moeten aanwezig zijn in elke testcabine en binnen handbereik liggen:
— glazen (gestandaardiseerd) met de monsters, genummerd met een code, afgedekt met een horlogeglaasje en bewaard bij 28 °C ± 2 °C;
— beoordelingsformulier (zie afbeelding 1) op papier, of digitaal mits aan de voorwaarden van het beoordelingsformulier wordt voldaan, samen met de gebruiksinstructies, indien nodig;
— pen of onuitwisbare inkt;
— schalen met schijfjes appel en/of water, water met koolzuur en/of beschuit;
— glas water op kamertemperatuur;
— blad met de in de afdelingen 8.4 en 9.1.1 vermelde algemene voorschriften;
— spuwbakken.
7. VOORZITTER VAN HET PANEL EN PROEVERS
7.1. Voorzitter van het panel
De voorzitter van het panel moet degelijk zijn opgeleid, en een ervaren deskundige zijn op het gebied van de verschillende soorten olie die hij of zij tijdens de werkzaamheden kan tegenkomen. Hij is de spil van het panel en verantwoordelijk voor de organisatie en het functioneren ervan.
Het werk van de voorzitter vergt een basisopleiding in de hulpmiddelen voor sensorisch onderzoek, sensorische bekwaamheid, nauwgezetheid bij de voorbereiding, organisatie en de uitvoering van de tests, alsmede de bekwaamheden en het geduld om de tests op wetenschappelijke wijze te plannen en uit te voeren.
De voorzitter is als enige verantwoordelijk voor de selectie en opleiding van en het toezicht op de proevers om hun bekwaamheidsniveau vast te stellen. De voorzitter is dus verantwoordelijk voor de beoordeling van de proevers, die altijd objectief moet zijn en waarvoor specifieke procedures moeten worden ontwikkeld op basis van tests en solide acceptatie- en afwijzingscriteria. Zie de norm IOC/T.20/Doc. nr. 14 "Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters".
De voorzitter van een panel is verantwoordelijk voor de prestaties van het panel en dus voor de beoordeling ervan, waarvoor hij betrouwbaar en objectief bewijs moet overleggen. De voorzitter moet te allen tijde kunnen aantonen dat de methode en de proevers onder controle staan. Periodieke kalibratie van het panel wordt aanbevolen (IOC/T.20/Doc. nr. 14, § 5).
De voorzitter heeft de uiteindelijke verantwoordelijkheid voor het bijhouden van de verslagen van het panel. Deze verslagen moeten altijd traceerbaar zijn. Ze moeten voldoen aan de borgings- en kwaliteitseisen zoals vastgesteld in internationale sensorische normen en te allen tijde de anonimiteit van de monsters verzekeren.
De voorzitter is ervoor verantwoordelijk dat de benodigde apparatuur en uitrusting om aan de specificaties van deze methode te voldoen aanwezig is en op de juiste wijze is gereinigd en wordt onderhouden, en bewaart hier schriftelijk bewijs van, evenals van de conformiteit met de testomstandigheden.
De voorzitter is belast met de ontvangst en opslag van de monsters bij hun aankomst in het laboratorium en met de opslag na het uitvoeren van de test. Bij het uitvoeren van deze werkzaamheden zorgt de voorzitter er te allen tijde voor dat de monsters anoniem blijven en op de juiste wijze worden opgeslagen; ten behoeve hiervan worden schriftelijke procedures opgesteld om te verzekeren dat het gehele proces traceerbaar is en garanties biedt.
Daarnaast is de voorzitter verantwoordelijk voor het voorbereiden, coderen en presenteren van de monsters aan de proevers in overeenstemming met een geschikt testontwerp dat is gebaseerd op vooraf opgestelde protocollen, evenals voor het verzamelen en statistisch verwerken van de door de proevers verkregen gegevens.
De voorzitter is belast met de ontwikkeling en opstelling van andere procedures die nodig kunnen zijn in aanvulling op deze norm en om te verzekeren dat het panel op de juiste wijze functioneert.
De voorzitter moet manieren zoeken om de resultaten van het panel te vergelijken met de resultaten die zijn verkregen door andere panels die olijfolie van de eerste persing analyseren om vast te stellen of het panel op de juiste wijze functioneert.
Het is de taak van de voorzitter van het panel om de panelleden te motiveren door hun interesse en nieuwsgierigheid te wekken en een concurrerende houding te creëren. Hiervoor wordt de voorzitters ten zeerste aangeraden om een soepele uitwisseling van informatie in twee richtingen te verzekeren met de panelleden, door hen te blijven informeren over de taken die zij hebben uitgevoerd en de verkregen resultaten. Daarnaast verzekert de voorzitter dat zijn mening niet bekend wordt en voorkomt hij dat dominantere personen hun criteria opdringen aan andere proevers.
De voorzitter roept de proevers ruim van tevoren op en beantwoordt eventuele vragen over de uitvoering van de tests, maar suggereert geen mening met betrekking tot het monster.
7.1.1. Vicevoorzitter van het panel
De voorzitter van het panel kan om gegronde redenen worden vervangen door een vicevoorzitter van het panel, die de taken kan overnemen die betrekking hebben op de uitvoering van de tests. Deze vervanger moet over alle vaardigheden beschikken die vereist zijn voor een voorzitter van een panel.
7.2. Proevers
Personen die optreden als proevers bij organoleptische tests van olijfoliën moeten dit vrijwillig doen. Het is kandidaten daarom aan te raden schriftelijk een sollicitatie in te dienen. Kandidaten worden geselecteerd, opgeleid en gemonitord door de voorzitter van het panel, in overeenstemming met hun bekwaamheid in het onderscheiden tussen soortgelijke monsters; daarbij mag niet vergeten worden dat de nauwkeurigheid door opleiding zal verbeteren.
Proevers moeten zich gedragen als echte sensorische waarnemers, waarbij persoonlijke smaak opzij wordt gezet en uitsluitend hun gewaarwordingen worden gerapporteerd. Om dit te doen, moeten zij altijd in stilte werken, op een relaxte en ongehaaste manier, waarbij zij hun sensorische aandacht zo volledig mogelijk richten op het monster dat zij proeven.
Voor elke test zijn tussen de acht en twaalf proevers nodig, maar het is verstandig om enkele proevers in reserve te houden in verband met eventuele absenties.
8. TESTOMSTANDIGHEDEN
8.1. Presentatie van het monster
Het te analyseren oliemonster wordt gepresenteerd in een gestandaardiseerd proefglas dat voldoet aan de norm IOC/T.20/Doc. nr. 5 "Glass for Oil Tasting".
Het glas bevat 14-16 ml olie, of tussen 12,8 g en 14,6 g wanneer de monsters moeten worden gewogen, en wordt afgedekt met een horlogeglaasje.
Elk glas wordt voorzien van een code bestaande uit willekeurig gekozen cijfers of een willekeurig gekozen combinatie van letters en cijfers. De code wordt aangebracht door middel van een geurvrij systeem.
8.2. Test- en monstertemperatuur
De voor het proeven bestemde oliemonsters worden gedurende de test bewaard in glazen bij 28 °C ± 2 °C. Deze temperatuur is gekozen omdat deze het eenvoudiger maakt om organoleptische verschillen waar te nemen dan bij omgevingstemperatuur en omdat bij lagere temperaturen de aromatische stoffen die kenmerkend zijn voor deze oliën slecht vervliegen en hogere temperaturen leiden tot de vorming van vluchtige stoffen die kenmerkend zijn voor verhitte oliën. Zie de norm IOC/T.20/Doc. nr. 5 "Glass for Oil Tasting" voor de methode die moet worden gebruikt voor het verhitten van de monsters wanneer deze in het glas zitten.
De testruimte moet een temperatuur hebben van tussen de 20 °C en 25 °C (zie IOC/T.20/Doc. nr. 6).
8.3. Testtijden
De ochtend is de beste tijd voor het proeven van oliën. Het is aangetoond dat er optimale waarnemingsperioden zijn met betrekking tot smaak en geur gedurende de dag. Maaltijden worden voorafgegaan door een periode waarin de reuk/smaakgevoeligheid toeneemt, terwijl na afloop deze gewaarwordingen verminderen.
Dit criterium moet echter niet tot het extreme worden doorgevoerd, waarbij proevers kunnen worden afgeleid door hongergevoelens waardoor hun onderscheidende capaciteit wordt aangetast; daarom wordt aangeraden om de proefsessies tussen tien uur 's ochtends en twaalf uur 's middags te houden.
8.4. Proevers: algemene gedragsregels
De volgende aanbevelingen zijn van toepassing op het gedrag van proevers gedurende hun werkzaamheden.
Wanneer een proever door de organisator wordt opgeroepen om deel te nemen aan een organoleptische test, moet hij ervoor zorgen dat hij op de aangegeven tijdstippen kan meewerken en dient hij de volgende regels in acht te nemen:
— De proever mag uiterlijk vanaf 30 minuten vóór het tijdstip dat voor de test is vastgesteld niet roken of koffie drinken.
— De proever mag geen parfum, cosmetica of zeep gebruiken waarvan de geur bij de test nog waarneembaar zou kunnen zijn. De handen moeten worden gewassen met ongeparfumeerde of nauwelijks geparfumeerde zeep, vervolgens zo vaak als nodig is worden afgespoeld en gedroogd om iedere geur van de zeep te doen verdwijnen.
— De proever mag ten minste het laatste uur voor de test niets eten.
— Als de proever zich fysiek niet goed voelt, in het bijzonder als de geur- of smaakwaarneming is aangetast, of bij psychologische omstandigheden die concentratie onmogelijk maken, onthoudt de proever zich van het proeven en dient hij de organisator in te lichten.
— Als de proever aan bovengenoemde regels voldoet, dient hij zich ordelijk en stil in de hem toegewezen cabine te installeren.
— De proever dient de aanwijzingen op het beoordelingsformulier aandachtig te lezen en pas met de test van het monster te beginnen wanneer hij volledig is voorbereid op de taak die hij moet uitvoeren (relaxt en ongehaast). Bij twijfel overlegt de proever onder vier ogen met de voorzitter.
— De proever voert zijn taken in stilte uit.
— Mobiele telefoons moeten te allen tijde uitgeschakeld zijn om verstoring van de concentratie en werkzaamheden van collega's te voorkomen.
9. PROCEDURE VOOR DE ORGANOLEPTISCHE BEOORDELING EN INDELING VAN OLIJFOLIE VAN DE EERSTE PERSING
9.1. Proeftechniek
9.1.1. De proever neemt het glas, met daarop nog het horlogeglaasje, vervolgens houdt hij het iets schuin en maakt een draaiende beweging met het glas zodat een zo groot mogelijk gedeelte van de binnenkant wordt bevochtigd. Vervolgens neemt hij het horlogeglaasje van het glas en inhaleert hij de geur van het monster met langzame diepe teugen om zich een oordeel te vormen over de olie. Dit ruiken dient niet langer te duren dan 30 seconden. Als de proever in die periode niet tot een conclusie is gekomen, moet hij even onderbreken alvorens opnieuw te beginnen.
Zodra de geurtest is beëindigd, wordt de flavour (het totaal van retronasale olfactorische, smaak- en tactiele gewaarwordingen) beoordeeld. Daartoe wordt een slokje, ongeveer 3 ml, olijfolie genomen. Het is van zeer groot belang dat de olijfolie door de hele mondholte wordt verspreid, dat wil zeggen vanaf de voorkant van de mond en de tong, via de zijkanten en het achterste gedeelte van de tong tot het gehemelte en de keel, aangezien smaak en mondgevoel in de verschillende zones van de tong, het gehemelte en de keel met een verschillende intensiteit worden waargenomen.
Er moet met nadruk op worden gewezen dat het noodzakelijk is dat voldoende olijfolie zeer langzaam over het achterste gedeelte van de tong tot het gehemelte en de keel wordt verspreid, waarbij de aandacht moet worden geconcentreerd op de volgorde waarin bitterheid en scherpte worden waargenomen. Als deze methode niet wordt gevolgd, kunnen bij bepaalde soorten olijfolie deze twee stimuli onopgemerkt blijven of kan de bitterheid worden gemaskeerd door de scherpte.
Door korte opeenvolgende inademingen via de mond kan er niet alleen voor worden gezorgd dat het monster zich in de hele mondholte verspreidt, maar ook dat retronasaal de vluchtige aromatische componenten worden waargenomen.
NB: Wanneer de proevers in een monster geen fruitigheid waarnemen en de intensiteit van het tot indeling leidende negatieve kenmerk niet hoger dan 3,5 ligt, kan de voorzitter van het panel besluiten dat de proevers het monster opnieuw dienen te analyseren bij omgevingstemperatuur (COI/T.20/Doc. nr. 6/Rev. 1, september 2007, afdeling 3 — „General specifications for installation [of a test room]”); hij omschrijft in dat geval de context en het begrip omgevingstemperatuur. Wanneer het monster op omgevingstemperatuur is, dienen de proevers een nieuwe beoordeling uit te voeren waarbij zij slechts nagaan of zij al dan niet fruitigheid waarnemen. Als dat het geval is, moeten zij de intensiteit vermelden op de schaal.
Er moet rekening worden gehouden met het mondgevoel van de scherpte. Hiervoor is het raadzaam de olijfolie in te slikken.
9.1.2. Bij de organoleptische beoordeling van olijfolie van de eerste persing wordt aanbevolen om maximaal VIER MONSTERS te beoordelen bij elke sessie, met maximaal drie sessies per dag, om een contrast-effect te voorkomen dat kan ontstaan bij het direct na elkaar proeven van andere monsters.
Aangezien bij opeenvolgende tests vermoeidheid of verlies van waarnemingsscherpte optreedt, moet een product worden gebruikt waarmee de resten van olijfolie van de juist verrichte test uit de mond kunnen worden verwijderd.
Aanbevolen wordt om een stukje appel te gebruiken dat na kauwen in de spuwbak kan worden gegooid. Vervolgens dient de mond te worden gespoeld met een beetje water op omgevingstemperatuur. Er dient minstens 15 minuten te zitten tussen het einde van de ene sessie en het begin van de volgende.
9.2. Gebruik van het beoordelingsformulier door proevers
Het beoordelingsformulier dat is bestemd voor de proevers is opgenomen in afbeelding 1 van deze bijlage.
Elke proever die deel uitmaakt van het panel, moet aan de aangeboden olie ruiken en die daarna proeven ( 5 ). Vervolgens moet hij op de schaal van 10 cm van het beoordelingsformulier de intensiteit vermelden waarmee hij elk van de negatieve en positieve kenmerken waarneemt.
Wanneer negatieve kenmerken worden waargenomen die niet in afdeling 4 worden vermeld, moeten die in de rubriek "overige" worden aangegeven, waarbij de termen worden gebruikt die deze kenmerken het best beschrijven.
9.3. Gebruik van de gegevens door de voorzitter van het panel
De voorzitter van het panel verzamelt de door de proevers ingevulde beoordelingsformulieren en bekijkt de aan de verschillende kenmerken toegekende intensiteit. Wanneer hij een anomalie constateert, vraagt hij de proever zijn of haar beoordelingsformulier te herzien en eventueel de test te herhalen.
De voorzitter van het panel verwerkt de door elke proever vermelde gegevens in een computerprogramma, bijvoorbeeld die welke zijn vermeld in norm IOC/T.20/Doc. nr. 15 teneinde de resultaten van de analyse statistisch te berekenen op basis van de berekening van de mediaan. Zie in dit verband punt 9.4 en het aanhangsel bij deze bijlage. De gegevens voor een monster worden ingevoerd als een matrix met negen kolommen (die overeenkomen met de negen kenmerken) en n regels (de n proevers van het panel).
Wanneer een gebrek door ten minste 50 % van de panelleden in de rubriek „overige” wordt vermeld, wordt de mediaan van dit gebrek berekend en wordt de olie dienovereenkomstig ingedeeld.
De waarde van de robuuste variatiecoëfficiënt die de indeling bepaalt (het gebrek met de sterkste intensiteit en het kenmerk fruitig) mag niet groter zijn dan 20 %.
Indien het tegendeel het geval is, moet de voorzitter van het panel de beoordeling van dat specifieke monster herhalen bij een andere proefsessie.
Indien deze situatie zich vaak voordoet, wordt het de voorzitter van het panel aangeraden om de proevers specifieke aanvullende opleiding te geven (IOC/T.20/Doc. nr. 14, § 5) en de herhaalbaarheidsindex en afwijkingsindex te gebruiken om de prestaties van de proever te controleren (IOC/T.20/Doc. nr. 14, § 6).
9.4. Indeling van de olie
De olie wordt aan de hand van de mediaan van de gebreken en de mediaan van het kenmerk fruitigheid in één van onderstaande categorieën ingedeeld. De mediaan van de gebreken wordt gedefinieerd als de mediaan van het gebrek dat met de grootste intensiteit is waargenomen. De mediaan van de gebreken en de mediaan van de fruitigheid worden met één decimaal weergegeven.
De indeling van de olie gebeurt door de waarde van de mediaan van de gebreken en de mediaan van de fruitigheid met onderstaande referentie-intervallen te vergelijken. Aangezien bij de vaststelling van de grenzen van deze intervallen rekening is gehouden met de fout van de methode, worden zij als absoluut beschouwd. Met de computerprogramma's kan de indeling als een tabel met statistische gegevens of als een grafiek zichtbaar worden gemaakt.
a) Extra olijfolie van de eerste persing: de mediaan van de gebreken is gelijk aan 0 en de mediaan van de fruitigheid is hoger dan 0.
b) Olijfolie van de eerste persing: de mediaan van de gebreken is hoger dan 0, maar niet hoger dan 3,5 en de mediaan van de fruitigheid is hoger dan 0.
c) Olijfolie voor verlichting verkregen bij de eerste persing: de mediaan voor de gebreken is hoger dan 3,5 of de mediaan voor de gebreken is lager dan of gelijk aan 3,5 en de mediaan van de fruitigheid is gelijk aan 0.
Opmerking 1: Wanneer de mediaan van het kenmerk „bitter” en/of „scherp” hoger dan 5,0 ligt, vermeldt de voorzitter van het panel dit op het analysecertificaat.
Wanneer een analyse wordt uitgevoerd om na te gaan of aan de normen wordt voldaan, wordt één bepaling gedaan. Bij tegenanalyses moet de analyse in duplo in verschillende proefsessies worden uitgevoerd. De resultaten van de duplicaatanalyse moeten statistisch homogeen zijn (zie punt 9.5). Als dat niet het geval is, moet het monster opnieuw twee keer worden geanalyseerd. De definitieve waarde van de mediaan van de indelingskenmerken wordt berekend als het gemiddelde van de beide medianen.
9.5. Criteria voor de aanvaarding en de afwijzing van duplicaatanalyses
De hieronder omschreven genormaliseerde fout wordt gebruikt om vast te stellen of de twee resultaten van een duplicaatanalyse homogeen of statistisch aanvaardbaar zijn:
waarin Me1 en Me2 staan voor de medianen van de twee duplicaten (van respectievelijk de eerste en de tweede analyse) en U1 en U2 voor de uitgebreide meetonzekerheid voor de twee waarden, die overeenkomstig het aanhangsel als volgt wordt berekend:
U
1 = c × s* and
Voor de uitgebreide meetonzekerheid is c = 1,96; derhalve:
U1 = 0,0196 × CVr × Me1
waarin CVr staat voor de robuuste variatiecoëfficiënt.
Om te kunnen concluderen dat de twee verkregen waarden niet statistisch van elkaar afwijken, mag En niet groter zijn dan 1,0.
Aanhangsel
Methode voor de berekening van de mediaan en de betrouwbaarheidsintervallen
Mediaan
De mediaan wordt gedefinieerd als het reële getal Xm, dat wordt gekenmerkt door het feit dat de waarschijnlijkheid (p) dat de waarden van de verdeling (X) lager dan dat getal (Xm) liggen, kleiner dan of gelijk aan 0,5 is en dat tegelijkertijd de waarschijnlijkheid (p) dat de waarden van de verdeling (X) gelijk aan Xm zijn of lager dan Xm liggen, gelijk aan of groter dan 0,5 is. Een meer praktische definitie is dat de mediaan het 50e percentiel is van een naar opklimmende grootte gerangschikte reeks getallen. Eenvoudiger gezegd: de mediaan is de middelste waarde van een gerangschikte reeks met een oneven aantal getallen of het gemiddelde van de twee middelste waarden van een gerangschikte reeks met een even aantal getallen.
Robuuste standaardafwijking
Om de variabiliteit rond de mediaan op betrouwbare wijze te kunnen schatten, moet de robuuste standaardafwijking volgens Stuart en Kendall worden geschat (4). Met onderstaande formule wordt de asymptotische robuuste standaardafwijking berekend, d.w.z. de robuuste schatting van de variabiliteit van de betrokken gegevens, waarbij N het aantal waarnemingen is en IQR de interkwartielafstand, die precies 50 % omvat van de gevallen van ongeacht welke waarschijnlijkheidsverdeling:
De interkwartielafstand wordt berekend op basis van de afstand tussen het 75e en 25e percentiel.
Het percentiel is de waarde Xpc, die wordt gekenmerkt door het feit dat de waarschijnlijkheid (p) dat de waarden van de verdeling lager dan Xpc liggen, kleiner dan of gelijk aan een bepaald honderdste is en dat tegelijkertijd de waarschijnlijkheid (p) dat de waarden van de verdeling gelijk aan Xpc zijn of lager dan Xpc liggen, gelijk aan of groter dan het genoemde honderdste is. Het honderdste bepaalt de geselecteerde fractie van de verdeling. In het geval van de mediaan is deze gelijk aan 50/100.
In de praktijk is het percentiel de verdelingswaarde die overeenkomt met een bepaald oppervlak dat wordt begrensd door de verdelings- of dichtheidskromme. Zo is het 25e percentiel de verdelingswaarde die overeenkomt met een oppervlak van 0,25 of 25/100.
In deze methode worden percentielen berekend op basis van de werkelijke waarden die voorkomen in de gegevensmatrix (berekeningsprocedure voor percentielen).
Robuuste variatiecoëfficiënt (%)
De robuuste variatiecoëfficiënt rVC% is een dimensieloos getal, dat de procentuele variabiliteit van de geanalyseerde reeks getallen aangeeft. Daarom is deze coëfficiënt zeer nuttig bij het beoordelen van de betrouwbaarheid van de panelleden.
95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de mediaan
Het 95 %-betrouwbaarheidsinterval (waarde van de fout van de eerste soort gelijk aan 0,05 of 5 %) is het interval waarop de mediaan zou kunnen variëren wanneer de test een oneindig aantal keren zou kunnen worden herhaald. In de praktijk geeft dit interval de variabiliteit van de test onder de gekozen praktijkomstandigheden aan als men uitgaat van de veronderstelling dat het experiment vaak zou kunnen worden herhaald. Het interval helpt net als de rVC% bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van de test.
waarbij C voor het 95 %-betrouwbaarheidsinterval gelijk is aan 1,96.
Een voorbeeld van het berekeningsformulier is opgenomen in bijlage I bij de norm IOC/T.20/Doc. nr. 15.
Referenties
(1) Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.
(2) Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.
(3) Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.
(4) Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.
(5) McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12-16.
(6) IOC/T.28/Doc. nr. 1, september 2007, Guidelines for the accreditation of sensory testing laboratories with particular reference to virgin olive oil according to standard ISO/IEC 17025:2005.
(7) IOC/T.20/Doc. nr.14.
(8) IOC/T.20/Doc. nr. 15.
(9) ISO/IEC 17025:05.
▼M20 —————
▼M19 —————
BIJLAGE XV
1. BEPALINGEN VAN HET OLIEGEHALTE VAN DE AFVALLEN VAN OLIJVEN
1.1. Toestellen
Geschikt extractietoestel; inhoud van de kolf 200 à 250 ml.
Bad met elektrische verwarming (zandbad, waterbad, enz.) op verwarmingsplaat.
Analystische balans.
Droogoven, ingesteld op maximaal 80 °C.
Elektrische droogstoof, voorzien van een temperatuurregelaar en de mogelijkheid om lucht in te blazen of een gereduceerde druk te bewerkstelligen, ingesteld op 103 °C ± 2 °C.
Machinale molen, die gemakkelijk kan worden gereinigd en waarmede men in staat is te malen zonder dat het materiaal warm wordt en zonder dat het vocht- en oliegehalte van het gemalen produkt verminderen.
Mortier en stamper van porselein, ijzer of brons of bij voorkeur geschikt machinaal fijnmaaltoestel.
Extractiehuls en watten of filtreerpapier, vrij van in n-hexaan oplosbare stoffen.
Exsiccator.
Zeef met gaten 1 mm doorsnede.
Puimsteen in kleine korrels, vooraf gedroogd.
1.2. Reagentia
n-Hexaan technisch, waarvan het residu bij volledige verdamping minder bedraagt dan 0,002 g/100 ml.
2. WERKWIJZE
2.1. Bereiding van het analysemonster
Maal het analysemonster indien nodig in het vooraf goed gereinigd maaltoestel. Verwijder daartoe het eerste maalsel (ongeveer 1/20 deel van het analysemonster) en maal de rest zodanig dat deeltjes worden verkregen die volledig door de zeef gaan. Meng zorgvuldig en analyseer onmiddellijk.
2.2. Monsterweging
Weeg onmiddellijk na het malen tot op 0,01 g nauwkeurig ongeveer 10 g van het analysemonster af.
2.3. Gereedmaken van de extractiehuls
Breng de proefeenheid in de huls en sluit deze met een watje af.
Pak, indien filtreerpapier wordt gebruikt, de proefeenheid in dit papier.
2.4. Voordrogen
Plaats wanneer het monster zeer vochtig is (gehalte aan water en vluchtige bestanddelen, vochtgehalte meer dan 10 %) de gevulde huls of het in filtreerpapier verpakte monster enige tijd in de tot maximaal 80 °C verwarmde stoof om het vochtgehalte tot minder dan 10 % terug te brengen.
2.5. Gereedmaken van de kolf
Weeg tot op 0,001 g nauwkeurig een kolf die 1 à 2 korrels puimsteen bevat en die tevoren is gedroogd bij een temperatuur van 103 ± 2 °C en gedurende ten minste een uur in een exsiccator is afgekoeld.
2.6. Eerste extractie
Plaats de huls of het in filtreerpapier verpakte monster in het extractietoestel, giet in de kolf de benodigde hoeveelheid hexaan. Bevestig de kolf aan het extractietoestel en plaats het geheel op het elektrische verwarmingsbad.
Verwarm zodanig dat de terugvloei ten minste 3 druppels/seconde bedraagt (matig, niet heftig koken).
Extraheer gedurende 4 uur.
Laat het geheel afkoelen.
Neem de huls uit het extractietoestel en plaats haar in een luchtstroom ter verwijdering van het grootste deel van het oplosmiddel waarmee de huls is doordrenkt.
2.7. Tweede extractie
Ledig de huls in de mortier en maak het geheel zo fijn mogelijk. Breng het mengsel weer kwantitatief in de huls en plaats de huls in het extractietoestel en zet de extractie nog twee uur voort, met gebruikmaking van dezelfde kolf die het eerste extract bevat. De in de extractiekolf verkregen oplossing dient helder te zijn.
Filtreer indien dit niet het geval is de oplossing over een filtreerpapier. Was de kolf en het filtreerpapier meerdere malen met hexaan uit.
Verzamel het filtraat en het voor het wassen gebruikt oplosmiddel in een tweede kolf, die vooraf werd gedroogd en gewogen op 0,001 g nauwkeurig.
2.8. Verwijdering van het oplosmiddel en weging van het extract
Verwijder het grootste deel van het oplosmiddel uit de kolf door afdistilleren op een elektrisch verwarmingsbad.
Verwijder de laatste sporen oplosmiddel door verhitting van de kolf gedurende 20 minuten bij een temperatuur van 103 ± 2 °C.
Vergemakkelijk deze verwijdering, hetzij door van tijd tot tijd lucht of bij voorkeur een inert gas in te blazen, hetzij door onder verminderde druk te werken. Laat de kolf gedurende ten minste 1 uur in een exsiccator afkoelen en weeg tot op 0,001 g nauwkeurig.
Verwarm opnieuw gedurende 10 minuten onder dezelfde omstandigheden, laat afkoelen in een exsiccator en weeg.
Het verschil tussen deze beide wegingen mag niet groter zijn dan 0,010 g; anders dient opnieuw steeds gedurende 10 minuten te worden verwarmd gevolgd door afkoelen en wegen totdat het gewichtsverschil ten hoogste 0,010 g bedraagt.
Noteer het resultaat van de laatste weging van de kolf.
Verricht twee bepalingen op hetzelfde analysemonster.
3. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
3.1. Berekeningswijze en formule
a) Bereken het oliegehalte in gewichtspercenten van het onbehandelde produkt met de formule:
waarin:
S = gehalte aan olie in massaprocenten van het onbehandelde produkt;
m0 = massa, in grammen van de proefeenheid;
m1 = massa, in grammen van de olie die bij de laatste weging in de kolf is gevonden.
Indien aan de eisen inzake de reproduceerbaarheid is voldaan, neemt men als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen.
Druk de resultaten uit met één decimaal.
b) Op verzoek kan het oliegehalte worden uitgedrukt ten opzichte van de droge stof en berekend met de formule:
waarin:
S = gehalte aan olie in massaprocenten van het onbehandelde produkt (zie a);
U = vochtgehalte in %.
3.2. Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door dezelfde analist gelijktijdig en snel na elkaar worden verricht mag niet meer bedragen dan 0,2 g voor het met behulp van hexaan verkregen extract uit 100 g monster.
Indien dit niet het geval is, moet de bepaling worden herhaald met twee andere analysemonsters.
Neem, indien ditmaal het verschil nog groter is dan 0,2 g, als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de vier verrichte bepalingen.
BIJLAGE XVI
BEPALING VAN HET JOODGETAL
1. DOEL
Deze internationale norm beschrijft een methode voor de bepaling van het joodgetal van dierlijke en plantaardige oliën en vetten, hierna te noemen vetstoffen.
2 DEFINITIE
In het kader van deze internationale norm geldt de volgende definitie:
|
2.1. |
Joodgetal: de hoeveelheld jodium die door het analysemonster wordt opgenomen onder de omstandigheden die in deze internationale norm zijn gespecificeerd. Het joodgetal wordt uitgedrukt in grammen jodium per 100 g analysemonster. |
3. PRINCIPE
Een analyseportie wordt opgelost in een oplosmiddel, waarna Wijs-reagens wordt toegevoegd. Na een bepaalde tijd worden een kaliumjodideoplossing en water toegevoegd en vervolgens wordt het vrijgemaakte jodide getitreerd met natriumthiosulfaatoplossing.
4. REAGENTIA
Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn.
|
4.1. |
Water, dat voldoet aan de eisen van ISO 3896, kwaliteit 3. |
|
4.2. |
Kaliumjodideoplossing, 100 g/l, zonder vrij jodium of jodaat. |
|
4.3. |
Zetmeeloplossing Meng 5 g oplosbaar zetmeel met 30 ml water, en voeg dit mengsel toe aan 1 000 ml kokend water; laat 3 minuten koken en laat afkoelen. |
|
4.4. |
Volumetrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l die niet ouder is dan 7 dagen. |
|
4.5. |
Oplosmiddel, bereid door menging van gelijke volumes cyclohexaan en azijnzuur. |
|
4.6. |
Wijs-reagens met joodmonochloride in azijnzuur. Er dient in de handel verkrijgbaar Wijs-reagens te worden gebruikt. Opmerking: De reagens bevat 9 g ICl3 + 9 g I in azijnzuur. |
5. APPARATUUR
Normale laboratoriumapparatuur en in het bijzonder:
|
5.1. |
Glazen weegschaaltjes die geschikt zijn voor de analyseportie en die in de Erlenmeyers (5.2) kunnen worden gebracht. |
|
5.2. |
Erlenmeyers van 500 ml, met ingeslepen glazen stop en volledig droog. |
6. BEREIDING VAN HET ANALYSEMONSTER
Droog het gehomogeniseerde monster op natriumsulfaat en filtreer.
7. WERKWIJZE
|
7.1. |
Analyseportie De analyseportie heeft, naar gelang van het verwachte joodgetal, de in tabel 1 vermelde grootte.
Tabel 1
Weeg de analyseportie in een glazen weegschaaltje (6.1) af op 0,1 mg nauwkeurig. |
|
7.2. |
Bepaling Breng de analyseportie in een Erlenmeyer (5.2) van 500 ml. Voeg 20 ml van het oplosmiddel (4.5) toe om de vetstof op te lossen. Voeg exact 25 ml van het Wijs-reagens (4.6) toe, sluit de kolf af, schud met een draaiende beweging en plaats de Erlenmeyer in het donker. Gebruik geen mondpipet voor het Wijs-reagens. Bereid op dezelfde wijze een blanco met het oplosmiddel en de reagens, maar zonder de analyseportie. Laat de Erlenmeyers voor monsters met een joodgetal van minder dan 150 gedurende 1 uur in het donker staan; laat de Erlenmeyers voor monsters met een joodgetal boven 150 en voor gepolymeriseerde produkten of produkten die in aanzienlijke mate zijn geoxideerd, gedurende 2 uur in het donker staan. Voeg na afloop van die periode 20 ml van de kaliumjodideoplossing (4.2) en 150 ml water (4.1) toe in elk van de Erlenmeyers. Titreer met de volumtrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing (4.4) totdat de gele kleur als gevolg van het jodium vrijwel is verdwenen. Voeg enkele druppels van de zetmeeloplossing (4.3) toe en ga verder met het titreren totdat de blauwe kleur verdwijnt na heftig schudden. Opmerking: Potentiometrische bepaling van het eindpunt is toegestaan. |
|
7.3. |
Aantal bepalingen Voer twee bepalingen uit op hetzelfde analysemonster. |
8. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het joodgetal is
waarin:
c = de concentratie in mol per liter van de gebruikte volumetrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing (4.4);
V1 = het volume, in ml, van de volumetrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing (4.4) dat is gebruikt voor de blanco;
V2 = het volume, in ml, van de volumetrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing (4.4) dat is gebruikt voor de bepaling;
m = de hoeveeldheid, in grammen, van de analyseportie (7.1).
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen, voor zover aan de eis inzake herhaalbaarheid is voldaan.
BIJLAGE XVII
METHODE VOOR DE BEPALING VAN STIGMASTADIËNEN IN PLANTAARDIGE OLIËN
1. DOEL
Bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën met lage concentraties van deze koolwaterstoffen, met name in olijfolie verkregen bij de eerste persing en olie uit afvallen van olijven.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm kan worden gebruikt voor alle plantaardige oliën, hoewel de metingen alleen betrouwbaar zijn wanneer het gehalte aan deze koolwaterstoffen tussen 0,01 en 4,0 mg/kg ligt. De methode is vooral geschikt om te bepalen of olijfolie verkregen bij de eerste persing, geraffineerde plantaardige oliën (olijfolie, olie uit afvallen van olijven, zonnebloemolie, palmolie, enz.) bevat, aangezien geraffineerde olie stigmastadiënen bevat en olie verkregen bij de eerste persing niet.
3. PRINCIPE
Bereiding van het onverzeepbare residu. De steroïd-koolwaterstoffractie wordt geïsoleerd met behulp van kolomchromatografie over silicagel en geanalyseerd met behulp van capillaire gaschromatografie.
4. APPARATUUR
|
4.1. |
Kolven, 250 ml, met refluxkoeler. |
|
4.2. |
Scheitrechters, 500 ml. |
|
4.3. |
Rondbodemkolven, 100 ml. |
|
4.4. |
Rotatieverdamper. |
|
4.5. |
Glazen chromatografiekolom (inwendige diameter 1,5-2,0 cm en lengte 50 cm) met een teflon kraan en een pluk glaswol of een schijf gesinterd glas op de bodem. Schenk voor de bereiding van de chromatografiekolom een laag van ongeveer 5 cm hexaan in de kolom en voeg vervolgens in porties een slurrie van silicagel in hexaan toe (15 g in 40 ml). Laat de kolom eerst spontaan en vervolgens door licht te vibreren uitzakken. Voeg watervrij natriumsulfaat toe totdat het vloeistofpeil ongeveer 0,5 cm is gestegen en elueer ten slotte de overmaat van hexaan. |
|
4.6. |
Gaschromatograaf met vlamionisatiedetector, splitinjector of koude kolominjector en een met een nauwkeurigheid van ± 1 °C programmeerbare oven. |
|
4.7. |
Fused-silica capillaire kolom voor gaschromatografie (inwendige diameter 0,25 of 0,32 mm, lengte 25 m), inwendig gecoat met een 5 % fenylmethylsilicon-fase met een laagdikte van 0,25 μm. NB 1 Ook andere kolommen met een soortgelijke of lagere polariteit kunnen worden gebruikt. |
|
4.8. |
Integrerende recorder met een instelling voor dal/dal-integratie. |
|
4.9. |
Micro-injectiespuit voor gaschromatografie, 5-10 μl, met geharde naald. |
|
4.10. |
Elektrische verwarmingsmantel of -plaat. |
5. REAGENTIA
Alle reagentia moeten p.a. zijn, tenzij een andere specificatie wordt gegeven. Het gebruikte water moet gedestilleerd zijn of minimaal dezelfde zuiverheidsgraad hebben.
|
5.1. |
Hexaan of een mengsel van alkanen met een kooktraject van 65-70 °C, gedestilleerd met een fractioneerkolom. NB 2 Het oplosmiddel moet worden gedestilleerd om verontreinigingen te verwijderen. |
|
5.2. |
Ethanol, 96 % (v/v). |
|
5.3. |
Natriumsulfaat, watervrij. |
|
5.4. |
Alcoholische kaliumhydroxideoplossing, 10 %: voeg 10 ml water toe aan 50 g kaliumhydroxide, roer en los vervolgens het mengsel op in ethanol (aanvullen tot 500 ml). NB 3 Deze oplossing wordt na verloop van tijd bruin en moet dan ook elke dag vers worden bereid en in een goed afgesloten fles van donker glas worden bewaard. |
|
5.5. |
Silicagel 60 voor kolomchromatografie, 70-230 mesh (Merck ref. nr. 7734 of soortgelijk). NB 4 Meestal kan silicagel zonder behandeling rechtstreeks uit de verpakking worden gebruikt. Sommige partijen kunnen echter een lage activiteit hebben, hetgeen leidt tot slechte chromatografische scheidingen. In dat geval moet de silicagel als volgt worden behandeld: activeer de silicagel door deze gedurende minimaal vier uur op 550 °C te verhitten. Laat daarna de silicagel in een exsiccator afkoelen en breng deze vervolgens over in een gesloten fles. Voeg 2 % water toe en schud tot er geen klonten meer zichtbaar zijn en het poeder vrij stroomt. Als een partij silicagel chromatogrammen met overlappende pieken oplevert, moet de silicagel op dezelfde manier worden behandeld. Het is ook mogelijk extra zuivere silicagel 60 te gebruiken (Merck, ref. nr. 7754). |
|
5.6. |
Voorraadoplossing (200 ppm) cholesta-3,5-dieen (Sigma, 99 % zuiver) in hexaan (10 mg in 50 ml). |
|
5.7. |
Standaardoplossing: 20 ppm cholesta-3,5-dieen in hexaan, verkregen door verdunning van bovengenoemde oplossing. NB 5 Indien de oplossingen in de punten 5.6 en 5.7 bij minder dan 4 °C worden bewaard, blijven zij minimaal vier maanden goed. |
|
5.8. |
Oplossing de n-nonacosaan in hexaan (ongeveer 100 ppm). |
|
5.9. |
Draaggas voor chromatografie: helium of waterstof, zuiverheid 99,9990 %. |
|
5.10. |
Hulpgassen voor de vlamionisatiedetector: waterstof, zuiverheid 99,9990, en gezuiverde lucht. |
6. WERKWIJZE
6.1. Bereiding van het onverzeepbare residu.
|
6.1.1. |
Weeg 20 ± 0,1 g olie af in een kolf van 250 ml (punt 4.1), voeg 1 ml standaardoplossing cholesta-3,5-dieen (20μg) en 75 ml alcoholische kaliumhydroxideoplossing, 10 %, toe, bevestig de refluxkoeler en laat de oplossing gedurende 30 minuten zachtjes koken. Stop met verwarmen en laat de oplossing enigszins afkoelen (laat niet helemaal afkoelen, aangezien het monster dan gaat stollen). Voeg 100 ml water toe en breng de oplossing met behulp van 100 ml hexaan over in een scheitrechter (punt 4.2). Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden en laat het vervolgens uitzakken. NB 6 Voeg, indien een emulsie ontstaat die niet snel verdwijnt, kleine hoeveelheiden ethanol toe. |
|
6.1.2. |
Breng de waterige onderlaag over in een tweede scheitrechter en extraheer opnieuw met 100 ml hexaan. Tap opnieuw de onderlaag af en was de hexaanextracten (samengevoegd in een andere scheitrechter) drie keer met telkens 100 ml van een ethanol/watermengsel (1 : 1) tot een neutrale pH wordt bereikt. |
|
6.1.3. |
Droog de hexaanoplossing over watervrij natriumsulfaat (50 g), was met 20 ml hexaan en damp de oplossing droog in een rotatieverdamper bij 30 °C en lage druk. |
6.2. Isolatie van de steroïd-koolwaterstoffractie.
|
6.2.1. |
Breng het residu op de fractioneerkolom met behulp van twee porties hexaan van 1 ml. Laat het monster in de kolom zakken door het niveau van de oplossing te laten dalen tot de bovenkant van de natriumsulfaat-laag. Begin de elutie met hexaan met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml/min. Gooi de eerste 25-30 ml eluaat weg en vang de volgende 40 ml op. Breng deze fractie vervolgens over in een rondbodemkolf van 100 ml (punt 4.3). NB 7 De eerste fractie bevat verzadigde koolwaterstoffen (zie figuur 1a) en de tweede fractie de steroïd-koolwaterstoffen. Bij verdere elutie verschijnen squaleen- en soortgelijke verbindingen. Om een goede scheiding tussen de verzadigde en de steroïd-koolwaterstoffen te krijgen moeten de fractievolumes worden geoptimaliseerd. Hiertoe moet het volume van de eerste fractie zodanig worden aangepast dat bij analyse van de tweede fractie de pieken van de verzadigde koolwaterstoffen (zie figuur 1c) laag zijn. Als deze pieken niet verschijnen, maar de piek van de standaard laag is, moet het volume worden verlaagd. Een volledige scheiding tussen de componenten van de eerste en de tweede fractie is overigens niet nodig, aangezien de pieken elkaar bij gaschromatografie niet overlappen als de bij punt 6.3.1 vermelde werkomstandigheden worden gehanteerd. Meestal hoeft het volume van de tweede fractie niet te worden geoptimaliseerd, aangezien er een goede scheiding is met de verbindingen die later elueren. Een grote piek bij een retentietijd van ongeveer 1,5 min. lager dan de standaard, wordt echter veroorzaakt door squaleen en wijst op een slechte scheiding. |
|
6.2.2. |
Damp de tweede fractie bij 30 °C en verlaagde druk in de rotatieverdamper droog. Neem het residu onmiddellijk op in 0,2 ml hexaan en bewaar de oplossing in de koelkast tot deze geanalyseerd wordt. NB 8 De residu's van de punten 6.1.3 en 6.2.2 mogen niet droog bij kamertemperatuur worden bewaard. Zodra ze worden verkregen, moet het oplosmiddel worden toegevoegd en daarna moeten ze in de koelkast worden bewaard. |
6.3. Gaschromatografie.
|
6.3.1. |
Werkomstandigheden voor splitinjector: — Injectortemperatuur: 300 °C. — Detectortemperatuur: 320 °C. — Integrator/recorder: De piek-integratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen. Aanbevolen wordt de integrator in te stellen op dal/dal-integratie. — Gevoeligheid: ongeveer 16 keer de minimumverzwakking. — Geïnjecteerde hoeveelheid oplossing: 1μl. — Programmering oventemperatuur: eerst 235 °C gedurende zes minuten en daarna oplopend met 2 °C/min. tot 285 °C. — Splitverhouding injector: 1 : 15. — Draaggas: helium of waterstof bij een druk van ongeveer 120 kPa. Deze omstandigheden kunnen afhankelijk van de kenmerken van de chromatograaf en de kolom zodanig worden aangepast dat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen: de piek van de interne standaard moet binnen ongeveer vijf minuten van de bij punt 6.3.2 vermelde retentietijd liggen; de hoogte van de piek van de interne standaard moet minimaal 80 % van de volledige schaaluitslag zijn. De gaschromatografieopstelling moet worden gecontroleerd door een mengsel van de voorraadoplossing van cholesta-3,5-dieen (punt 5.6) en de oplossing van n-nonacosaan (punt 5.8) te injecteren. De piek van cholesta-3,5-dieen moet vóór die van n-nonacosaan verschijnen (figuur 1c); wanneer dit niet gebeurt, kan de temperatuur van de oven worden verlaagd en/of kan de kolom worden vervangen door een kolom met een lagere polariteit. |
|
6.3.2. |
Identificatie van de pieken De piek van de interne standaard verschijnt bij een retentietijd van ongeveer 19 minuten en stigmasta-3,5-dieen bij een relatieve retentietijd van ongeveer 1,29 (figuur 1b). Naast stigmasta-3,5-dieen worden kleine hoeveelheden van een isomeer geëlueerd, die meestal geen aparte chromatografische piek opleveren. Als de kolom te polair is of een te hoge resolutie heeft, kan de isomeer echter als een kleine piek vlak voor die van stigmasta-3,5-dieen verschijnen (figuur 2). Om ervoor te zorgen dat de stigmastadiënen als één piek worden geëlueerd, verdient het aanbeveling de kolom te vervangen door een kolom met een lagere polariteit of een grotere inwendige diameter. NB 9 Een referentie voor stigmastadiënen kan worden verkregen door de analyse van een geraffineerde plantaardige olie met een kleinere monsterhoeveelheid (1-2 g). Hierbij leveren stigmastadiënen een duidelijke en gemakkelijk te identificeren piek op. |
|
6.3.3. |
Kwantitatieve analyse Het gehalte aan stigmastadiënen wordt berekend met de volgende formule: stigmastadiënen (mg/kg) =
Detectielimiet: ongeveer 0,01 mg/kg. |
Figuur 1
Gaschromatogrammen van olijfoliemonsters over een fused-silica capillaire kolom (inwendige diameter 0,25 mm en lengte 25 m), gecoat met 5 % fenylmethylsilicon met een laagdikte van 0,25 μm.
a) Eerste fractie (30 ml) van een olijfolie van eerste persing met interne standaard.
b) Tweede fractie (40 ml) van een olijfolie met 0,10 mg/kg stigmastadiënen.
c) Tweede fractie (40 ml) met een kleine hoeveelheid van de eerste fractie.
Figuur 2
Gaschromatogram van een monster van geraffineerde olijfolie over een DB-5-kolom met het isomeer van stigmasta-3,5-dieen.
BIJLAGE XVIII
BEPALING VAN HET VERSCHIL TUSSEN HET WERKELIJKE EN HET THEORETISCHE GEHALTE AAN TRIACYLGLYCEROLEN MET ECN 42
1. DOEL
Bepaling van het absolute verschil tussen de experimentele waarde van het gehalte aan triacylglycerolen (TAG’s) met equivalent koolstofgetal 42 (ECN 42HPLC), verkregen door hogedrukvloeistofchromatografie van de olie, en de theoretische waarde van het gehalte aan TAG’s met equivalent koolstofgetal 42 (ECN 42theoretisch) berekend op basis van de vetzuursamenstelling.
2. TOEPASSINGSGEBIED
De norm geldt voor olijfolie. De methode geldt voor het detecteren van de aanwezigheid van kleine hoeveelheden zaadolie (rijk aan linolzuur) in elke klasse olijfolie.
3. PRINCIPE
Het gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42 bepaald door middel van HPLC-analyse en het theoretische gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42 (berekend op basis van de GLC-bepaling van de vetzuursamenstelling) stemmen voor echte olijfoliën binnen bepaalde grenzen overeen. Een verschil groter dan de voor elk soort olie vastgestelde waarde wijst erop dat de olie zaadolie bevat.
4. METHODE
De methode voor de berekening van het theoretische gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42 en van het verschil tussen dit gehalte en het resultaat van de HPLC-analyse bestaat in wezen uit het vergelijken van de met andere methoden verkregen analysegegevens. Er kunnen drie fasen worden onderscheiden: bepaling van de vetzuursamenstelling door capillaire gaschromatografie, berekening van de theoretische samenstelling van triacylglycerolen met ECN 42, en bepaling van het gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42 door HPLC-analyse.
4.1. Apparatuur
|
4.1.1. |
Rondbodemkolven 250 en 500 ml. |
|
4.1.2. |
Bekerglazen 100 ml. |
|
4.1.3. |
Glazen chromatografiekolom, inwendige diameter 21 mm, lengte 450 mm, kraan, met taps slijpstuk (vrouwelijk) bovenaan. |
|
4.1.4. |
Scheitrechters van 250 ml, met taps slijpstuk (mannelijk) onderaan, geschikt om boven aan de kolom te worden bevestigd. |
|
4.1.5. |
Glazen staaf, lengte 600 mm. |
|
4.1.6. |
Glazen trechter, diameter 80 mm. |
|
4.1.7. |
Maatkolven van 50 ml. |
|
4.1.8. |
Maatkolven van 20 ml. |
|
4.1.9. |
Rotatieverdamper. |
|
4.1.10. |
Hogedrukvloeistofchromatografie, met gethermostatiseerde kolomtemperatuur. |
|
4.1.11. |
Injectietoestellen voor inspuiten van hoeveelheden van 10 μl. |
|
4.1.12. |
Detector: differentiële refractometer. De gevoeligheid van de volle uitslag dient ten minste 10–4 eenheden van de brekingsindex te bedragen. |
|
4.1.13. |
Kolom: roestvrijstalen buis, 250 mm (lengte) × 4,5 mm (inwendige diameter), gepakt met silicadeeltjes met een diameter van 5 μm en met 22 tot 23 % koolstof in de vorm van octadecylsilaan. |
|
4.1.14. |
Gegevensverwerkingssoftware. |
|
4.1.15. |
Flesjes met een inhoud van ongeveer 2 ml, met teflon beklede septa en schroefdoppen. |
4.2. Reagentia
De reagentia dienen van „pro analysi”-kwaliteit te zijn. Elutievloeistoffen dienen te worden ontgast en kunnen verschillende keren worden hergebruikt zonder gevolgen voor de scheidingen.
|
4.2.1. |
Petroleumether 40-60 °C voor chromatografie of hexaan. |
|
4.2.2. |
Ethylether, vrij van peroxiden, zojuist gedistilleerd. |
|
4.2.3. |
Elutievloeistof voor het zuiveren van de olie door kolomchromatografie: mengsel van petroleumether/ethylether 87/13 (v/v). |
|
4.2.4. |
Silicagel, korrelgrootte 70-230 mesh, type Merck 7734, op een standaardwatergehalte van 5 % gebracht (m/m). |
|
4.2.5. |
Glaswol. |
|
4.2.6. |
Aceton voor HPLC. |
|
4.2.7. |
Acetonitril of propionitril voor HPLC. |
|
4.2.8. |
HPLC-elutievloeistof: acetonitril + aceton (verhouding aan te passen om de gewenste scheiding te krijgen; begin met een 50:50 mengsel) of propionitril. |
|
4.2.9. |
Oplosmiddel: aceton. |
|
4.2.10. |
Referentietriglyceriden: ofwel kunnen triglyceriden van handelskwaliteit (tripalmitaat, trioleïne enz.) worden gebruikt, waarvan de retentietijden worden uitgezet volgens het equivalent koolstofgetal, ofwel kunnen referentiechromatogrammen worden verkregen uitgaande van sojaolie, een 30:70 mengsel sojaolie/olijfolie en pure olijfolie (zie opmerkingen 1 en 2 en figuren 1 tot en met 4). |
|
4.2.11. |
Vastefase-extractiekolom (SPE-kolom) met silicafase 1 g, 6 ml. |
4.3. Voorbereiding van het monster
Aangezien een aantal interfererende stoffen vals positieve resultaten kunnen veroorzaken, moet het monster altijd worden gezuiverd volgens IUPAC-methode 2.507 betreffende de bepaling van polaire stoffen in bakvetten.
4.3.1. Bereiding van de chromatografiekolom
Vul de kolom (4.1.3) met circa 30 ml elutievloeistof (4.2.3); breng een prop glaswol (4.2.5) in en druk deze met de glazen staaf (4.1.5) tot onder in de kolom.
Bereid in een bekerglas van 100 ml een suspensie van 25 g silicagel (4.2.4) in 80 ml van het elutiemengsel (4.2.3) en breng deze over in de kolom met behulp van een glazen trechter (4.1.6).
Om er zeker van te zijn dat het silicagel volledig in de kolom wordt overgebracht, het bekerglas met het elutiemengsel uitspoelen en de wasporties ook in de kolom overbrengen.
De kraan aan de kolom openen en het oplosmiddel eruit laten stromen tot de vloeistofspiegel van de elutievloeistof 1 cm boven het silicagel staat.
4.3.2. Kolomchromatografie
Weeg op 0,001 g nauwkeurig 2,5 ± 0,1 g gefiltreerde, gehomogeniseerde en, indien nodig, gedroogde olie af in een maatkolf van 50 ml (4.1.7).
Los op in ongeveer 20 ml elutievloeistof (4.2.3). Indien nodig, licht verwarmen om het oplossen te vergemakkelijken. Laat het mengsel afkoelen tot omgevingstemperatuur en vul tot de maatstreep aan met elutievloeistof.
Breng met een maatpipet 20 ml van de oplossing aan op de volgens punt 4.3.1 bereide kolom; open de kraan en laat het oplosmiddel uitstromen tot het niveau van het silicagel.
De oplossing moet vervolgens worden geëlueerd met 150 ml elutievloeistof (4.2.3), waarbij de stroomsnelheid wordt afgeregeld tot ongeveer 2 ml/min (zodat 150 ml in 60-70 minuten door de kolom stroomt).
Vang het eluaat op in een kolf van 250 ml (4.1.1) die vooraf in de oven is gekalibreerd en exact is gewogen. Verwijder het oplosmiddel bij lage druk in een rotatieverdamper (4.1.9) en weeg het residu; hiermee wordt de oplossing bereid voor HPLC-analyse en voor de bereiding van de methylesters.
Voor de categorieën extra olijfolie van eerste persing, olijfolie van eerste persing, geraffineerde olijfolie en olijfolie moet, nadat het monster door de kolom gestroomd is, daarvan minimaal 90 % worden teruggewonnen; voor olijfolie voor verlichting en olijfolie uit afvallen van olijven geldt een terugwinningspercentage van minimaal 80.
4.3.3. Opzuivering door vastefase-extractie (SPE)
De silica-SPE-kolom wordt geactiveerd door er onder vacuüm 6 ml hexaan (4.2.3) doorheen te laten lopen zonder dat uitdroging optreedt.
Weeg op 0,001 g nauwkeurig 0,12 g af in een 2 ml-flesje (4.1.15) en los op in 0,5 ml hexaan (4.2.3).
Breng de oplossing op de SPE-kolom en elueer vervolgens met 10 ml hexaan/diethylether (87:13 v/v) (4.2.3) onder vacuüm.
Laat de ingezamelde fractie tot uitdroging verdampen in een rotatieverdamper (4.1.9) onder verminderde druk en bij omgevingstemperatuur. Het residu wordt in 2 ml aceton (4.2.6) opgelost met het oog op de triacylglycerol-analyse (TAG-analyse).
4.4. HPLC-analyse
4.4.1. Monsterbereiding voor chromatografische analyse
Een 5 %-oplossing van het te analyseren monster wordt bereid door 0,5 ± 0,001 g van het monster in een maatkolf van 10 ml af te wegen en aan te lengen tot 10 ml met het oplosmiddel (4.2.9).
4.4.2. Werkwijze
Stel het chromatografiesysteem op. Pomp de elutievloeistof (4.2.8) op met een snelheid van 1,5 ml/min teneinde het volledige systeem te zuiveren. Wacht tot er een stabiele basislijn wordt verkregen.
Injecteer 10 μl van het volgens punt 4.3 bereide monster.
4.4.3. Berekening en uitdrukking van de resultaten
Gebruik de methode met interne standaard, dat wil zeggen ga ervan uit dat de som van de piekoppervlakken voor de TAG’s met ECN 42 tot en met ECN 52 gelijk is aan 100 %.
Bereken het relatieve percentage van elk triglyceride aan de hand van de formule:
.
Het resultaat wordt opgegeven met minstens twee cijfers achter de komma.
Zie de opmerkingen 1 tot en met 4.
4.5. Berekening van de samenstelling van de triacylglycerolen (in mol %) uit de gegevens over de vetzuursamenstelling (oppervlak %)
4.5.1. Bepaling van de vetzuursamenstelling
De vetzuursamenstelling wordt bepaald overeenkomstig ISO 5508 met behulp van een capillaire kolom. De bereiding van de methylesters wordt uitgevoerd volgens COI/T.20/Doc. nr. 24.
4.5.2. Vetzuren gebruikt bij de berekening
Glyceriden zijn gegroepeerd volgens hun equivalent koolstofgetal (ECN), rekening houdend met de volgende equivalenties tussen ECN en vetzuren. Er werden alleen vetzuren met 16 en 18 koolstofatomen in aanmerking genomen, aangezien alleen deze van belang zijn voor olijfolie. De totale hoeveelheid in aanmerking genomen vetzuren wordt gelijkgesteld aan 100 %.
|
Vetzuur (VZ) |
Afkorting |
Molecuulgewicht (MG) |
ECN |
|
Palmitinezuur |
P |
256,4 |
16 |
|
Palmitoleïnezuur |
Po |
254,4 |
14 |
|
Stearinezuur |
S |
284,5 |
18 |
|
Oleïnezuur |
O |
282,5 |
16 |
|
Linolzuur |
L |
280,4 |
14 |
|
Linoleenzuur |
Ln |
278,4 |
12 |
4.5.3. Omrekening van oppervlak % in aantal mol voor alle vetzuren (1)
|
|
|
|
|
|
|
|
4.5.4. Normalisering van vetzuren (in mol) tot 100 % (2)
Het resultaat geeft het vetzuurpercentage in mol % in de globale (1,2,3-)positie van de TAG’s.
Vervolgens wordt de som van de verzadigde vetzuren (VVZ) P en S en de onverzadigde vetzuren (OVZ) Po, O, L en Ln berekend (3):
4.5.5. Berekening van de vetzuursamenstelling in 2- en 1,3-posities van TAG’s
De vetzuren zijn als volgt over de drie groepen verdeeld: één voor de 2-positie en twee identieke voor de 1- en 3-posities, met verschillende coëfficiënten voor de verzadigde (P en S) en de onverzadigde zuren (Po, O, L en Ln).
4.5.5.1. Verzadigde vetzuren in de 2-positie [P(2) en S(2)] (4):
4.5.5.2. Onverzadigde vetzuren in de 2-positie [Po(2), O(2), L(2) en Ln(2)] (5):
4.5.5.3. Vetzuren in 1,3-posities [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) en Ln(1,3)] (6):
4.5.6. Berekening van triacylglycerolen
4.5.6.1. TAG’s met één vetzuur (AAA, hier LLL, PoPoPo) (7)
4.5.6.2. TAG’s met twee vetzuren (AAB, hier PoPoL, PoLL) (8)
4.5.6.3. TAG’s met drie verschillende vetzuren (ABC, hier OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)
4.5.6.4. Triacylglycerolen met ECN 42
De triacylglycerolen met ECN 42 worden berekend volgens de vergelijkingen 7, 8 en 9 en vermeld in volgorde van verwachte elutie bij HPLC (normaal slechts drie pieken).
LLL
PoLL en de positie-isomeer LPoL
OLLn en de positie-isomeren OLnL en LnOL
PoPoL en de positie-isomeer PoLPo
PoOLn en de positie-isomeren OPoLn en OLnPo
PLLn en de positie-isomeren LLnP en LnPL
PoPoPo
SLnLn en de positie-isomeer LnSLn
PPoLn en de positie-isomeren PLnPo en PoPLn
De som van de negen triacylglycerolen, inclusief de positie-isomeren, geeft de triacylglycerolen met ECN 42. Het resultaat wordt opgegeven met minstens twee cijfers achter de komma.
5. BEOORDELING VAN HET RESULTAAT
Het berekende theoretische gehalte en het gehalte bepaald met HPLC-analyse worden vergeleken. Als de absolute waarde van het verschil tussen de HPLC-gegevens en de theoretische gegevens groter is dan de waarde die voor de betrokken categorie olie in de norm is vermeld, dan bevat het monster zaadolie.
De resultaten worden opgegeven met twee cijfers achter de komma.
6. VOORBEELD (DE NUMMERS VERWIJZEN NAAR DE SECTIES IN DE TEKST VAN DE METHODE)
— 4.5.1. Berekening van mol % vetzuren uit GLC-gegevens (genormaliseerd oppervlak %)
De volgende gegevens voor de vetzuursamenstelling worden verkregen door middel van GLC:
|
VZ |
P |
S |
Po |
O |
L |
Ln |
|
MG |
256,4 |
284,5 |
254,4 |
282,5 |
280,4 |
278,4 |
|
Opp. % |
10,0 |
3,0 |
1,0 |
75,0 |
10,0 |
1,0 |
— 4.5.3. Omrekening van oppervlak % in aantal mol voor alle vetzuren (zie formule (1))
|
aantal mol P |
= |
|
|
aantal mol S |
= |
|
|
aantal mol Po |
= |
|
|
aantal mol O |
= |
|
|
aantal mol L |
= |
|
|
aantal mol Ln |
= |
|
|
Totaal |
= |
0,35821 mol TAG’s |
— 4.5.4. Normalisering van vetzuren (in mol) tot 100 % (zie formule (2))
|
mol % P(1,2,3) |
= |
|
|
mol % S(1,2,3) |
= |
|
|
mol % Po(1,2,3) |
= |
|
|
mol % O(1,2,3) |
= |
|
|
mol % L(1,2,3) |
= |
|
|
mol % Ln(1,2,3) |
= |
|
|
Totaal mol % |
= |
100 % |
Som van de verzadigde en onverzadigde vetzuren in 1,2,3-posities van TAG’s (zie formule (3)):
— 4.5.5. Berekening van de vetzuursamenstelling in 2- en 1,3-posities van de TAG’s
— 4.5.5.1. Verzadigde vetzuren in de 2-positie [P(2) en S(2)] (zie formule (4))
— 4.5.5.2. Onverzadigde vetzuren in de 2-positie [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) en Ln(1,3)] (zie formule (5))
— 4.5.5.3. Vetzuren in 1,3-posities [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) en Ln(1,3)] (zie formule (6))
— 4.5.6. Berekening van triacylglycerolen
Uit de berekende vetzuursamenstelling in sn-2- en sn-1,3-posities:
|
VZ in |
1,3-pos. |
2-pos. |
|
P |
16,004 % |
0,653 % |
|
S |
4,325 % |
0,177 % |
|
Po |
1,015 % |
1,262 % |
|
O |
68,526 % |
85,296 % |
|
L |
9,204 % |
11,457 % |
|
Ln |
0,927 % |
1,153 % |
|
Som |
100,0 % |
100,0 % |
worden de volgende triacylglycerolen berekend:
LLL
PoPoPo
PoLL met 1 positie-isomeer
SLnLn met 1 positie-isomeer
PoPoL met 1 positie-isomeer
PPoLn met 2 positie-isomeren
OLLn met 2 positie-isomeren
PLLn met 2 positie-isomeren
PoOLn met 2 positie-isomeren
— 4.5.6.1. TAG’s met één vetzuur (LLL, PoPoPo) (zie formule (7))
, = 0,09706 mol LLL
— 4.5.6.2. TAG’s met twee vetzuren (PoLL, SLnLn, PoPoL) (zie formule (8))
0,03210 mol PoLL
0,00094 mol SLnLn
0,00354 mol PoPoL
— 4.5.6.3. TAG’s met drie verschillende vetzuren (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) (zie formule (9))
0,00761 mol PPoLn
0,43655 mol OLLn
0,06907 mol PLLn
0,04812 mol PoOLn
ECN 42 = 0,69512 mol TAG’s
Opmerking 1: De elutievolgorde kan worden bepaald door het berekenen van de equivalente koolstofgetallen, dikwijls gedefinieerd met de vergelijking 
, waarin CN het koolstofgetal is en n het aantal dubbele bindingen; zij kan preciezer worden berekend door rekening te houden met de oorsprong van de dubbele binding. Als no, nl en nln de aantallen dubbele bindingen zijn die respectievelijk worden toegeschreven aan oleïnezuur, linolzuur en linoleenzuur, kan het equivalent koolstofgetal worden berekend aan de hand van de formule:
waarin de coëfficiënten do, dl en dln kunnen worden berekend door middel van de referentietriglyceriden. Onder de in deze methode gespecificeerde voorwaarden zal de verkregen vergelijking dicht liggen bij:
Opmerking 2: Met verschillende referentietriglyceriden kan ook de resolutie ten opzichte van trioleïne berekend worden:
trioleïnedoor gebruik van de gereduceerde retentietijd
.
De grafiek van log α tegen f (aantal dubbele bindingen) maakt het mogelijk de retentiewaarden te bepalen voor alle triglyceriden van vetzuren in de referentietriglyceriden (zie figuur 1).
Opmerking 3: De efficiëntie van de kolom dient zodanig te zijn dat de trilinoleïnepiek duidelijk gescheiden is van de pieken van triglyceriden met een aangrenzende RT. De elutie wordt uitgevoerd tot de piek van ECN 52.
Opmerking 4: Om een chromatogram te krijgen dat een juiste meting van de oppervlakken van alle belangrijke pieken mogelijk maakt, moet de tweede piek die overeenkomt met ECN 50 een intensiteit (hoogte) hebben van 50 % van de volle uitslag.
Figuur 1
Grafiek van log α tegen f (aantal dubbele bindingen)
Aantal dubbele bindingen
La: laurinezuur; My: myristinezuur; P: palmitinezuur; S: stearinezuur; O: oleïnezuur; L: linolzuur; Ln: linoleenzuur
Figuur 2
Linolzuurarme olijfolie
a)
Oplosmiddel: aceton/acetonitril.
Profiel a: Belangrijkste componenten van de chromatografische pieken: ECN 42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN 44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN 46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN 48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN 50: (17) SOO; (18) POS + SLS.
b)
Oplosmiddel: propionitril.
Profiel b: Belangrijkste componenten van de chromatografische pieken: ECN 42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN 44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN 46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN 48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN 50: (17) SOO; (18) POS + SLS
Figuur 3
Linolzuurrijke olijfolie
a)
Oplosmiddel: aceton/acetonitril (50:50).
Profiel a: belangrijkste componenten van de chromatografische pieken: ECN 42: (1’) LLL + PoLL; (2’) OLLn + PoOLn; (3’) PLLn; ECN 44: (4’) OLL + PoOL; (5’) OOLn + PLL; (6’) POLn + PPoPo; ECN 46: (7’) OOL + PoOO; (8’) PLO + SLL + PoOP; (9’) PLP + PoPP; ECN 48: (10’) OOO; (11’) POO + SLL + PPoO; (12’) POP + PLS; ECN 50: (13’) SOO; (14’) POS + SLS
b)
Oplosmiddel: propionitril.
Profiel b: belangrijkste componenten van de chromatografische pieken: ECN 42: (1) LLL; (2 + 2’) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN 44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN 46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN 48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN 50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN 52: (19) AOO.
BIJLAGE XIX
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ALIFATISCHE EN TRITERPEENALCOHOLEN MIDDELS CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. ONDERWERP
Deze bijlage bevat een beschrijving van een methode voor de bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen in oliën en vetten.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De vetten, waaraan 1-eicosanol als interne standaard is toegevoegd, worden verzeept met behulp van een oplossing van kaliumhydroxide in ethanol. Vervolgens worden de onverzeepbare bestanddelen geëxtraheerd met ethylether. De alcoholfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden door middel van dunnelaagchromatografie met een basische silicagel als stationaire fase. De alcoholen in de silicagel worden omgezet in trimethylsilylethers en geanalyseerd door middel van gaschromatografie in een capillaire kolom.
3. APPARATUUR
3.1. Erlenmeyer van 250 ml met een refluxkoeler met geslepen uiteinde.
3.2. Scheitrechter van 500 ml.
3.3. Erlenmeyers van 250 ml.
3.4. Volledige uitrusting voor dunnelaagchromatografie, met glasplaten van 20 × 20 cm.
3.5. Ultraviolette lamp, met een golflengte van 366 of 254 nm.
3.6. Micropipetten van 100 en 500 μl.
3.7. Filterkroes G 3 (porositeit 15 tot 40 μm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van 5 cm, geschikt om onder vacuüm te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.
3.8. Afzuigkolf van 50 ml voorzien van een slijpstuk 12/21 waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten (3.7).
3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.
3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem, bestaande uit:
3.10.1. Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ± 1 °C.
3.10.2. Een temperatuurregelbare injector met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement.
3.10.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid.
3.10.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid.
3.11. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m, inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52- of SE-54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 μm.
3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 μl met een geharde naald.
3.13. Precisiebalans met een gevoeligheid van 1 mg (af te lezen tot op 0,1 mg).
4. REAGENTIA
4.1. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 N in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 l met ethanol. Bewaar de oplossing in goed afgesloten flessen van donker glas.
4.2. Diëthylether, p.a.
4.3. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.
4.4. Glazen dunnelaagplaten gecoat met kiezelgel, zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).
4.5. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 0,2 N in ethanol. Los 13 g kaliumhydroxide op in 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol aan tot 1 l.
4.6. Benzeen, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.7. Aceton, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.8. Hexaan, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.9. Ethylether, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.10. Chloroform, p.a.
4.11. Dunnelaagchromatografische (TLC) referentieoplossing: 0,5 % C20-C28-alcoholen in chloroform, of een fractie van alcoholen verkregen op de in 5.2 aangegeven wijze uit het onverzeepbare residu van een olie uit perskoeken van olijven.
4.12. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 N alcoholische kaliumhydroxideoplossing.
4.13. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.
4.14. Hexamethyldisilazaan.
4.15. Trimethylchloorsilaan.
4.16. Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de C20-C28 alifatische alcoholen. Direct vóór gebruik te bereiden uit een mengsel van de zuivere alcoholen.
4.17. 1-eicosanol, 0,1 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).
4.18. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.
4.19. Hulpgassen: stikstof, gaschromatografisch zuiver.
5. WERKWIJZE
5.1. Bereiding van het onverzeepbare residu
|
5.1.1. |
Breng in de kolf van 250 ml met behulp van de injectiespuit van 500 μl een hoeveelheid 0,1 % l-eicosanoloplossing in chloroform (4.17) die overeenkomt met ongeveer 10 % van het gehalte aan alifatische alcoholen in het in bewerking te nemen monster. Bijvoorbeeld: voeg voor 5 g monster 250 μl 0,1 % 1-eicosanoloplossing toe indien het gaat om olijfolie en 1 500 μl indien het gaat om olie uit afvallen van olijven. Damp het chloroform in een stikstofstroom in tot droog en weeg in dezelfde kolf nauwkeurig ongeveer 5 g af van het gedroogde gefiltreerde monster. |
|
5.1.2. |
Voeg 50 ml 2 N ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken op een waterbad onder voortdurend krachtig schudden totdat de verzeping heeft plaatsgevonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 °C. |
|
5.1.3. |
Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml scheitrechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml diëthylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en laat uitzakken (zie opmerking 1). Tap de waterige onderlaag af in een tweede scheitrechter. Herhaal de extractie van de waterlaag twee keer op dezelfde manier en gebruik hierbij telkens 60-70 ml ethylether. Opmerking 1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylalcohol toe te voegen. |
|
5.1.4. |
Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens 50 ml gedistilleerd water totdat het waswater neutraal reageert. Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf, was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden diëthylether. Er mag ook gebruik worden gemaakt van 1-eneicosanol. |
|
5.1.5. |
Distilleer de ether tot op enkele ml af, droog door toepassing van een kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in een oven bij 100 °C gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in een exsiccator en weeg. |
5.2. Scheiding van de alcoholfractie
|
5.2.1. |
Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedurende 10 seconden volledig in de 0,2 N ethanolische kaliumhydroxideoplossing (4.5), laat de platen gedurende twee uur in een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende één uur in een stoof bij 100 °C. Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de op deze manier bereide platen moeten binnen twee weken worden gebruikt). Opmerking 2: Bij gebruik van basischekiezelgelplaten voor de scheiding van de alcoholfractie is de behandeling van het onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig. Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren en andere) vastgehouden op de startlijn en is de band van de alifatische- en terpeenalcoholen duidelijk van de sterolband gescheiden. |
|
5.2.2. |
Breng in de ontwikkeltank een mengsel van hexaan/ethylether, 65:35 (v/v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm ( 6 ). Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende ongeveer een half uur staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten. Opmerking 3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden ververst om volkomen reproduceerbare elutiecondities te verwezenlijken. |
|
5.2.3. |
Bereid een ongeveer 5 %-oplossing van het onverzeepbare residu (5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulp van de 100 μl injectiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens 2-3 μl aan van de alcoholreferentieoplossing (4.11) zodat de alcoholband na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd. |
|
5.2.4. |
Plaats de plaat in de volgens punt 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 °C en 20 °C. Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren totdat het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof in een heteluchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te drogen, verdampen. |
|
5.2.5. |
Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. De alifatische alcoholenband kan door bekijken onder ultraviolet licht worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte ligt als de vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen van deze band en van de band direct hierboven, die correspondeert met de triterpeenalcoholen, aan de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood (opmerking 4). Opmerking 4: Het voorschrift om zowel de alifatische alcoholenband als de triterpeenalcoholband samen verder te verwerken, houdt verband met het feit dat aanzienlijke hoeveelheden alifatische alcoholen bij deze methode in de triterpeenalcoholband terechtkomen. Een voorbeeld van de TLC-scheiding wordt gegeven in afbeelding 1 van het aanhangsel. |
|
5.2.6. |
Schraap met een metalen spatel de silicagel in het gemarkeerde gebied af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filterkroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de metalen spatel en filtreer onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes. Was de silicagel in de filterkroes driemaal met ethylether (telkens ongeveer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf. Damp het filtraat in tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), damp droog door voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende ongeveer tien minuten in een oven bij 105 °C, laat afkoelen in een exsiccator en weeg. Het in de centrifugebuis aanwezige residu is de alcoholfractie. |
5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers
|
5.3.1. |
Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige alcoholfractie een hoeveelheid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan 9:3:1 (v/v/v) (zie opmerking 5), waarbij voor elke mg alcohol 50 μl wordt toegevoegd. Vermijd hierbij bevochtiging (zie opmerking 6). Opmerking 5: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar, zoals bijvoorbeeld bistrimethylsilyltrifluoraceetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden verdund met een gelijk volume watervrije pyridine. Opmerking 6: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De vorming van witte vlokken of de verschijning van een roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van vocht of van veroudering van het reagens. In deze gevallen moet opnieuw worden begonnen. |
|
5.3.2. |
Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te draaien) totdat de alcoholfractie volledig is opgelost. Laat ten minste 15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten. De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse. |
5.4. Gaschromatografische analyse
5.4.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom
|
5.4.1.1. |
Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten aan het splitsysteem met injector en het uiteinde aan de detector. Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.). |
|
5.4.1.2. |
Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij geconditioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een temperatuur van ten minste 20 °C boven de bij de analyse gebruikelijke temperatuur (zie opmerking 7). Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste twee uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, onsteking van de vlam, aansluiting van de elektronische recorder, temperatuurregeling van de kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen. Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende uitgevoerde conditionering van de kolom. Opmerking 7: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten minste 20 °C lager zijn dan de maximumtemperatuur die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven. |
5.4.2. Keuze van de werkomstandigheden
5.4.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden dienen:
— kolomtemperatuur: acht minuten isotherm op 180 °C, opwarmen met 5 °C per minuut tot 260 °C, gedurende vijf minuten handhaven, afkoelen tot 160 °C en deze temperatuur vijf minuten handhaven;
— injectietemperatuur: 280 °C;
— detectortemperatuur: 290 °C;
— lineaire snelheid van het draaggas: helium 20-35 cm/s, waterstof 30-50 cm/s;
— splitverhouding: van 1:50 tot 1:100;
— gevoeligheid: vier tot 16 keer de minimumverzwakking;
— gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag;
— papiersnelheid: 30-60 cm/uur;
— injectiehoeveelheid: 0,5-1 μl TMSE-oplossing.
Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de retentietijd van de C26-alcohol moet ongeveer 18 ± vijf minuten zijn;
— de piek van de C22-alcohol moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie 80 ± 20 % volle schaaluitslag en voor zaadoliën 40 ± 0 % volle schaaluitslag.
5.4.2.2. Voer, om de hierboven genoemde vereisten te controleren, een aantal injecties uit van oplossingen van TMSE-alcoholen en pas de omstandigheden zodanig aan dat de beste resultaten worden verkregen.
5.4.2.3. De piek-integratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen.
5.4.3. Bepaling
5.4.3.1. Zuig in de 10 μl-injectiespuit 1 μl hexaan, 0,5 μl lucht en ten slotte 0,5-1,0 μl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na één tot twee seconden, verwijder daarna voorzichtig na ongeveer vijf seconden de naald.
5.4.3.2. Neem het chromatogram op totdat alle aanwezige TMSE-alcoholen volledig zijn geëlueerd. De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste specificaties (5.4.1.2).
5.4.4. Identificatie van de pieken
Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door vergelijking met mengsels van TMSE-alcoholen die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.
In de afbeeldingen 2 en 3 van het aanhangsel worden chromatogramvoorbeelden van de alcoholfractie van een geraffineerde olijfolie getoond.
5.4.5. Berekening
5.4.5.1. Bereken met de integrator de piekoppervlakten van 1-eicosanol en de C22-C28 alifatische alcoholen.
5.4.5.2. Bereken het gehalte aan elke individuele alifatische alcohol in mg/
1 000
g vethoudend materiaal als volgt:
waarbij:
Ax = piekoppervlak van alcohol x;
As = piekoppervlak van 1-eicosanol;
ms = gewicht van het toegevoegde 1-eicosanol, in mg;
m = gewicht van het monster voor de bepaling, in g.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Geef de gehaltes van de individuele alifatische alcoholen op in mg/1 000 g vethoudend materiaal en hun som als „totaal alifatische alcoholen”.
Aanhangsel
Voorbeeld TLC-scheiding en chromatogramvoorbeelden
Afbeelding 1
TLC-plaat van de onverzeepbare fractie van olijfolie geëlueerd met hexaan/ethylether (65/35)
|
1 |
C26-alcohol |
A |
Sterolen |
|
2 |
C30-alcohol |
B |
Alifatische alcoholen |
|
3 |
C20-alcohol |
C |
Triterpeenalcoholen |
|
4 |
Mengsel C20-22-26-30-alcoholen |
D |
Squaleen |
|
5 |
Onverzeepbare extra olijfolie van de eerste persing |
|
|
Afbeelding 2
Chromatogram van de alcoholfractie van een geraffineerde olijfolie
|
1 = Fytol |
5 = C24-alcohol |
9 = 24-methyleen-cycloartenol |
|
2 = Geranylgeraniol |
6 = C26-alcohol |
10 = Citrostadienol |
|
3 = C20-alcohol (IS) |
7 = C28-alcohol |
11 = Cyclobranol |
|
4 = C22-alcohol |
8 = Cycloartenol |
|
Afbeelding 3
Alifatische en triterpeenalcoholen van een geraffineerde olijfolie en een bij de tweede centrifugering verkregen olijfolie
|
1 = Fytol |
5 = C24-alcohol |
9 = 24-methyleen-cycloartenol (24MeCA) |
|
2 = Geranylgeraniol (CX) |
6 = C26-alcohol |
10 = Citrostadienol |
|
3 = C20-alcohol |
7 = C28-alcohol |
11 = Cyclobranol |
|
4 = C22-alcohol |
8 = Cycloartenol (CA) |
|
BIJLAGE XX
Methode voor de bepaling van het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren met behulp van capillaire gaschromatografie
1. DOEL
Met deze methode wordt het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren in olijfolie bepaald. De individuele wassen en alkylesters worden gescheiden aan de hand van het aantal koolstofatomen. De methode maakt het mogelijk te constateren of extra olijfolie van eerste persing frauduleus is gemengd met olie van mindere kwaliteit (olie van eerste persing, olie voor verlichting of sommige ontgeurde oliën) en wordt derhalve aanbevolen om een onderscheid te maken tussen olijfolie en olie uit afvallen van olijven en als parameter voor het bepalen van de kwaliteit van extra olijfolie van eerste persing.
2. PRINCIPE
De olie, waaraan een geschikte interne standaard is toegevoegd, wordt gefractioneerd door chromatografie over een gehydrateerde silicagel-kolom. De onder de werkomstandigheden eerst geëlueerde fractie (met een lagere polariteit dan de triacylglycerolenfractie) wordt opgevangen en vervolgens direct geanalyseerd met behulp van capillaire gaschromatografie.
3. APPARATUUR
|
3.1. |
Erlenmeyer, 25 ml. |
|
3.2. |
Glazen kolom voor vloeistofchromatografie met een inwendige diameter van 15 mm en een lengte van 30-40 cm, voorzien van een geschikte kraan. |
|
3.3. |
Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een systeem voor directe injectie op de kolom, bestaande uit:
|
|
3.4. |
Micro-injectiespuit van 10 μl, met een geharde naald, om het monster direct op de kolom te brengen |
|
3.5. |
Elektrisch schudapparaat. |
|
3.6. |
Rotatieverdamper. |
|
3.7. |
Droogstoof. |
|
3.8. |
Analytische balans met een nauwkeurigheid van ± 0,1 mg. |
|
3.9. |
Gebruikelijk laboratoriumglaswerk. |
4. REAGENTIA
|
4.1. |
Silicagel met een korrelgrootte tussen 60 en 200 μm. Droog de silicagel bij 500 °C in een droogstoof gedurende ten minste 4 uur. Voeg na afkoelen een volume water toe dat overeenkomt met 2 % van het gewicht van de gebruikte silicagel. Schud krachtig om de massa te homogeniseren en bewaar de massa ten minste 12 uur in een exsiccator vóór gebruik. |
|
4.2. |
n-hexaan, voor chromatografie of residuanalyse (de zuiverheid moet worden gecontroleerd). WAARSCHUWING – De dampen kunnen ontvlammen. Uit de buurt van hittebronnen, vonken of open vlammen houden. Zorg ervoor dat de flessen altijd goed zijn gesloten. Zorg voor adequate ventilatie tijdens het gebruik. Voorkom de accumulatie van dampen en verwijder eventuele bronnen van brand, zoals verwarmingstoestellen of elektrische apparaten die niet met onontvlambaar materiaal zijn vervaardigd. Schadelijk bij inademing vanwege mogelijke schade aan zenuwcellen. Adem de dampen niet in. Gebruik zo nodig een geschikt ademapparaat. Vermijd contact met ogen en huid. |
|
4.3. |
Ethylether, voor chromatografie.
WAARSCHUWING – Zeer ontvlambaar en matig toxisch. Veroorzaakt huidirritatie. Schadelijk bij inademing. Kan schade aan de ogen veroorzaken De effecten kunnen met vertraging optreden. Kan explosieve peroxiden vormen. De dampen kunnen ontvlammen. Uit de buurt van hittebronnen, vonken of open vlammen houden. Zorg ervoor dat de flessen altijd goed zijn gesloten. Zorg voor adequate ventilatie tijdens het gebruik. Voorkom de accumulatie van dampen en verwijder eventuele bronnen van brand, zoals verwarmingstoestellen of elektrische apparaten die niet met onontvlambaar materiaal zijn vervaardigd. Verdamp de stof niet tot ze droog of bijna droog is. Toevoeging van water of een geschikt reducerend agens kan de vorming van peroxiden verminderen. Niet drinkbaar. Adem de dampen niet in. Vermijd lang of herhaald contact met de huid. |
|
4.4. |
n-heptaan, voor chromatografie, of iso-octaan. WAARSCHUWING – Ontvlambaar. Schadelijk bij inademing. Uit de buurt van hittebronnen, vonken of open vlammen houden. Zorg ervoor dat de flessen altijd goed zijn gesloten. Zorg voor adequate ventilatie tijdens het gebruik. Adem de dampen niet in. Vermijd lang of herhaald contact met de huid. |
|
4.5. |
Standaardoplossing van laurylarachidaat (noot 3), 0,05 %-oplossing (m/v) in heptaan (interne standaard voor wassen). Noot 3: Ook palmitylpalmitaat, myristylstearaat en arachidyllaureaat kunnen worden gebruikt |
|
4.6. |
Standaardoplossing van methylheptadecanoaat, 0,02 %-oplossing (m/v) in heptaan (interne standaard voor methyl- en ethylesters). |
|
4.7. |
Soedanrood 1 (1-fenylazo-2-naftol). |
|
4.8. |
Draaggas: zuivere waterstof of helium, voor gaschromatografie. WAARSCHUWING Waterstof. Zeer ontvlambaar onder druk. Uit de buurt houden van hittebronnen, vonken, open vlammen en elektrische apparaten die niet met onontvlambaar materiaal zijn vervaardigd. Houd het flesventiel steeds gesloten wanneer het gas niet wordt gebruikt. Gebruik steeds samen met een drukregelaar. Verminder de druk van de drukveer alvorens het flesventiel te openen. Sta bij het openen van het ventiel niet vóór de flesopening. Zorg voor adequate ventilatie tijdens het gebruik. Breng de waterstof niet van de ene naar de andere fles over. Meng het gas niet in de fles. Zorg ervoor dat de flessen niet kunnen omvallen. Houd de flessen uit de buurt van zonlicht en hittebronnen. Bewaar ze in een corrosievrije omgeving. Gebruik geen beschadigde of niet-geëtiketteerde flessen. Helium. Bij hoge druk gecomprimeerd gas. Vermindert de hoeveelheid zuurstof die beschikbaar is om te ademen. Houd de fles dicht. Zorg voor adequate ventilatie tijdens het gebruik. Ga de opslagplaats slechts binnen als ze adequaat geventileerd is. Gebruik steeds samen met een drukregelaar. Verminder de druk van de drukveer alvorens het flesventiel te openen. Breng het gas niet van de ene naar de andere fles over. Zorg ervoor dat de flessen niet kunnen omvallen. Sta bij het openen van het ventiel niet vóór de flesopening. Houd de flessen uit de buurt van zonlicht en hittebronnen. Bewaar ze in een corrosievrije omgeving. Gebruik geen beschadigde of niet-geëtiketteerde flessen. Adem het gas niet in. Gebruik uitsluitend voor technische doeleinden. |
|
4.9. |
Hulpgassen: — zuivere waterstof, voor gaschromatografie. — zuivere lucht, voor gaschromatografie. WAARSCHUWING Lucht. Bij hoge druk gecomprimeerd gas. Voorzichtig te gebruiken in aanwezigheid van brandbare stoffen: de zelfontbrandingstemperatuur van de meeste organische verbindingen die in lucht aanwezig zij, ligt aanzienlijk lager bij hoge druk. Houd het flesventiel steeds gesloten wanneer het gas niet wordt gebruikt. Gebruik steeds samen met een drukregelaar. Verminder de druk van de drukveer alvorens het flesventiel te openen. Sta bij het openen van het ventiel niet vóór de flesopening. Breng het gas niet van de ene naar de andere fles over. Meng het gas niet in de fles. Zorg ervoor dat de flessen niet kunnen omvallen. Houd de flessen uit de buurt van zonlicht en hittebronnen. Bewaar ze in een corrosievrije omgeving. Gebruik geen beschadigde of niet-geëtiketteerde flessen. Voor technische doeleinden bestemde lucht mag niet worden gebruikt voor inhaleer- of ademapparatuur. |
5. WERKWIJZE
5.1. Voorbereiding van de chromatografiekolom
Suspendeer 15 g silicagel (4.1) in n-hexaan (4.2) en breng dit in de kolom (3.2). Laat spontaan uitzakken. Vibreer de kolom met een elektrisch schudapparaat om het chromatografiebed homogener te maken. Laat 30 ml n-hexaan doorlopen om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Weeg met de analytische balans (3.8) ongeveer 500 mg van het monster nauwkeurig af in de erlenmeyer van 25 ml (3.1), voeg een hoeveelheid interne standaard (4.5) toe die overeenkomt met het verwachte gehalte aan was. Bijvoorbeeld: voeg 0,1 mg laurylarachidaat toe indien het gaat om olijfolie, 0,25-0,50 mg indien het gaat om olie uit afvallen van olijven, en 0,05 mg methylheptadecanoaat indien het gaat om olijfoliën (4.6).
Breng het aldus voorbereide monster over in de chromatografiekolom, voeg dan 2 porties van elk 2 ml n-hexaan toe (4.2).
Laat dit door de kolom lopen tot boven het absorbens een laag vloeistof van 1 mm resteert. Laat vervolgens een mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) doorlopen en vang 220 ml op tegen een debiet van 15 druppels per 10 seconden. (Deze fractie bevat de methyl- en ethylesters en de wassen). (noot 4) (noot 5).
Noot 4: Het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) moet elke dag vers worden bereid.
Noot 5: Aan de monsteroplossing mag 100 μl soedanrood worden toegevoegd om visueel na te gaan of de wassen goed zijn geëlueerd.
De retentietijd van de kleurstof ligt tussen die van de wassen en die van triacylglycerolen in. De elutie moet worden gestopt wanneer de kleurstof de onderkant van de chromatografiekolom bereikt, omdat de wassen dan volledig zijn geëlueerd.
Laat de resulterende fracties verdampen in een rotatieverdamper totdat het oplosmiddel bijna volledig is verwijderd. Verwijder de laatste 2 ml met een zachte stikstofstroom. Verzamel de fractie met de methyl- en ethylesters die is verdund met 2-4 ml n-heptaan of iso-octaan.
5.2. Gaschromatografische analyse
5.2.1. Voorbereiding
Bevestig de kolom in de gaschromatograaf (3.3), waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten op het „on-column”-systeem en het uiteinde op de detector. Voer de gebruikelijke controle van het gaschromatografisch apparaat uit (werking van de gasleidingen, efficiëntie van de detector en de recorder, enz.).
Als de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, wordt conditionering aanbevolen. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan en zet de gaschromatografische eenheid aan. Verwarm geleidelijk totdat na ca. 4 uur een temperatuur van 350 °C wordt bereikt.
Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in op de normale werkomstandigheden (regeling van de gassnelheid, ontsteking van de vlam, aansluiting aan de elektronische recorder (3.3.4), regeling van de temperatuur van de oven, regeling van de detector, enz.). Registreer het signaal met een gevoeligheid die tenminste twee keer groter is dan vereist voor de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen.
Een rechtlijnig negatief verloop wijst op verkeerde kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoend uitgevoerde conditionering van de kolom.
5.2.2. Bepaling van de werkomstandigheden voor wassen, methylesters en ethylesters (noot 6).
In het algemeen dienen de volgende werkomstandigheden te worden aangehouden:
|
— |
kolomtemperatuur : 20 °C/min 5 °C/min start op 80 °C (1′) |
|
— |
temperatuur van de detector : 350 °C. |
|
— |
injectiehoeveelheid : 1 μl van de oplossing in n-heptaan (2-4 ml). |
|
— |
draaggas : helium of waterstof met de optimale lineaire snelheid voor het gekozen gas (zie aanhangsel A). |
|
— |
gevoeligheid van het instrument : geschikt om aan de hierboven uiteengezette voorwaarden te voldoen. |
Noot 6: Gezien de hoge eindtemperatuur wordt een positief verloop toegestaan dat niet groter mag zijn dan 10 % van de volle schaaluitslag.
Deze voorwaarden kunnen afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en van de gaschromatograaf worden gewijzigd om alle wassen en methyl- en ethylesters te scheiden en om een toereikende piekscheiding (figuren 2, 3 en 4) en een retentietijd van 18 ± 3 minuten voor de interne standaard laurylarachidaat te krijgen. De meest representatieve piek van de wassen moet meer dan 60 % van de volle schaaluitslag bereiken en de interne standaard methylheptadecanoaat voor de methyl- en ethylesters moet de volle schaaluitslag bereiken.
De piekintegratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen.
5.3. Uitvoering van de analyse
Zuig met de 10 μl micro-injectiespuit 10 μl oplossing op en trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden. Verwijder de naald voorzichtig na ongeveer 5 seconden.
Neem het chromatogram op tot de wassen of de stigmastadiënen volledig zijn geëlueerd, afhankelijk van de fractie die wordt geëlueerd.
De basislijn moet steeds aan de vereiste voorwaarden voldoen.
5.4. Identificatie van de pieken
Identificeer de verschillende pieken op basis van de retentietijden en door vergelijking met wasmengsels met een bekende retentietijd die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd. De alkylesters worden geïdentificeerd aan de hand van mengsels van methyl- en ethylesters van de voornaamste vetzuren die in olijfolie aanwezig zijn (palmitine- en oliezuur).
Figuur 1 bevat een chromatogram van de wassen in een olijfolie van eerste persing. De figuren 2 en 3 bevatten de chromatogrammen van twee extra olijfoliën van eerste persing uit de kleinhandel, één met en één zonder methyl- en ethylesters. Figuur 4 bevat de chromatogrammen van een extra olijfolie van eerste persing van topkwaliteit en van dezelfde olie, dit keer gemengd met 20 % ontgeurde olie.
5.5. Kwantitatieve analyse van de wassen
Bereken met de integrator de piekoppervlakken van de interne standaard laurylarachidaat en de C40-C46 alifatische esters.
Bepaal het totale gehalte aan wassen door de individuele wassen, uitgedrukt in mg/kg, als volgt bij elkaar op te tellen:
waarbij:
|
Ax |
= |
piekoppervlak van de ester, in computer counts |
|
As |
= |
piekoppervlak van de interne standaard laurylarachidaat, in computer counts |
|
ms |
= |
toegevoegde massa interne standaard laurylarachidaat, in mg; |
|
m |
= |
massa van het genomen monster, in gram. |
5.5.1. Kwantitatieve analyse van de methyl- en ethylesters
Bereken met de integrator de piekoppervlakken van de interne standaard methylheptadecanoaat, de methylesters van de C16- en C18-vetzuren en de ethylesters van de C16- en C18-vetzuren.
Bepaal het gehalte van elke alkylester, uitgedrukt in mg/kg, als volgt:
waarbij:
|
Ax |
= |
piekoppervlak van de individuele C16- en C18-ester, in computer counts |
|
As |
= |
piekoppervlak van de interne standaard methylheptadecanoaat, in computer counts |
|
ms |
= |
toegevoegde massa interne standaard methylheptadecanoaat, in mg; |
|
m |
= |
massa van het genomen monster, in gram. |
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Geef het gehalte van de verschillende wassen (C40 tot C46) (noot 7) in mg/kg vethoudend materiaal, en tevens de som van die gehaltes.
Geef het gehalte van de methyl- en ethylesters (C16 tot C18) en tevens de som van die twee gehaltes.
De resultaten worden afgerond op de dichtstbijzijnde mg/kg.
Noot 7: De te kwantificeren bestanddelen verwijzen naar de pieken met een even aantal koolstofatomen tussen de esters C40 en C46, zoals weergegeven in het onderstaande chromatogram voor wassen in olijfolie. Indien de C46-ester gesplitst is, wordt met het oog op identificatie aanbevolen de wasfractie van een olie uit afvallen van olijven te analyseren omdat de C46-piek daar duidelijk overheerst en dus gemakkelijk kan worden opgemerkt.
Geef de verhouding ethylesters en methylesters op.
Figuur 1
Voorbeeld van een gaschromatogram van de wasfractie van een olijfolie ( 7 )
Pieken met een retentietijd van de methyl- en ethylesters van vetzuren van 5 tot 8 min
Legenda:
|
I.S. |
= |
Laurylarachidaat |
|
1 |
= |
Diterpeenesters |
|
2+2′ |
= |
C40-esters |
|
3+3′ |
= |
C42-esters |
|
4+4′ |
= |
C44-esters |
|
5 |
= |
C46-esters |
|
6 |
= |
Sterolesters en triterpeenalcoholen |
Figuur 2
Methylesters, ethylesters en wassen in een olijfolie van eerste persing
Legenda:
|
1 |
– |
Methyl C16 |
|
2 |
– |
Ethyl C16 |
|
3 |
– |
Methylheptadecanoaat I.S. |
|
4 |
– |
Methyl C18 |
|
5 |
– |
Ethyl C18 |
|
6 |
– |
Squaleen |
|
7 |
– |
Laurylarachidaat I.S. |
|
A |
– |
Diterpeenesters |
|
B |
– |
Wassen |
|
C |
– |
Sterolesters en triterpeenesters |
Figuur 3
Methylesters, ethylesters en wassen in een extra olijfolie van eerste persing
Legenda:
|
1 |
– |
Methylheptadecanoaat I.S. |
|
2 |
– |
Methyl C18 |
|
3 |
– |
Ethyl C18 |
|
4 |
– |
Squaleen |
|
5 |
– |
Laurylarachidaat I.S. |
|
A |
– |
Diterpeenesters |
|
B |
– |
Wassen |
|
C |
– |
Sterolesters en triterpeenesters |
Figuur 4
Deel van een chromatogram van een extra olijfolie van eerste persing en dezelfde olie vermengd met ontgeurde olie
Legenda:
|
1 |
– |
Methylmyristaat I.S. |
|
2 |
– |
Methylpalmitaat |
|
3 |
– |
Ethylpalmitaat |
|
4 |
– |
Methylheptadecanoaat I.S. |
|
5 |
– |
Methyllinoleaat |
|
6 |
– |
Methyloleaat |
|
7 |
– |
Methylstearaat |
|
8 |
– |
Ethyllinoleaat |
|
9 |
– |
Ethyloleaat |
|
10 |
– |
Ethylstearaat |
Aanhangsel A
Bepaling van de lineaire snelheid van het draaggas
Injecteer 1:3 μl methaan (of propaan) in de gaschromatograaf nadat deze op de normale werkomstandigheden is ingesteld. Meet de tijd die het gas nodig heeft om door de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek (tM).
De lineaire snelheid in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij L de lengte is van de kolom in centimeter en tM de gemeten tijd in seconden.
▼M28 —————
BIJLAGE XXI
Resultaten van de conformiteitscontroles van olijfoliën als bedoeld in artikel 8, lid 2
|
|
Etikettering |
Chemische parameters |
Organoleptische kenmerken (4) |
Slotconclusie |
|||||||||||||
|
Monster |
Categorie |
Land van oorsprong |
Plaats van controle (1) |
Wettelijke benaming |
Oorsprongsbenaming |
Bewaaromstandigheden |
Foutieve informatie |
Leesbaarheid |
C/NC (3) |
Overschrijding drempelwaarde(n)? J/N |
Zo ja, geef aan voor welke parameter(s) (2) |
C/NC (3) |
Mediaan voor de gebreken |
Mediaan „fruitig” |
C/NC (3) |
Vereiste maatregelen |
Sanctie |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(1) Interne markt (olijfoliefabriek, bottelarij, kleinhandel), uitvoer, invoer (2) Met elk in bijlage I genoemd kenmerk van olijfolie stemt een code overeen (3) Conform/niet conform (4) Niet vereist in het geval van olijfolie en olie uit afvallen van olijven |
|||||||||||||||||
( 1 ) PB L 228 van 1.9.2009, blz. 3.
( 2 ) Richtlijn 2011/91/EU van het Europees Parlement en de Raad van 13 december 2011 betreffende de vermeldingen of merktekens die het mogelijk maken de partij waartoe een levensmiddel behoort te identificeren (PB L 334, 16.12.2011, blz. 1).
( 3 ) Na de elutie van de sterolesters mag het chromatogram geen significante pieken (triglyceriden) meer bevatten.
( 4 ) Verordening (EU) nr. 1308/2013 van het Europees Parlement en de Raad van 17 december 2013 tot vaststelling van een gemeenschappelijke ordening van de markten voor landbouwproducten en tot intrekking van de Verordeningen (EEG) nr. 922/72, (EEG) nr. 234/79, (EG) nr. 1037/2001 en (EG) nr. 1234/2007 van de Raad (PB L 347 van 20.12.2013, blz. 671).
( 5 ) De proever behoeft een olie niet te proeven wanneer hij alleen door te ruiken een uiterst intens negatief kenmerk waarneemt. Hij dient deze uitzonderlijke situatie op het beoordelingsformulier te vermelden.
( 6 ) In het bijzonder in deze gevallen dient een eluentmengsel benzeen/aceton 95:5 (v/v) te worden gebruikt om een goede scheiding in banden te verkrijgen.
( 7 ) Na de elutie van de sterolesters mag het chromatogram geen significante pieken (triacylglycerolen) meer bevatten.
140 °C 
335 °C (20)