a) dieren: landzoogdieren van alle soorten die behoren tot de taxa Proboscidea en Artiodactyla, alsmede kruisingen daarvan;

b) bedrijf: een landbouwbedrijf of een andere onder officieel toezicht staande agrarische, industriële of commerciële onderneming, met inbegrip van dierentuinen, pretparken, wildparken en jachtgebieden waar normaliter dieren worden gehouden of gefokt;

c) opgemaakte slachtafvallen: afvallen waaruit de beenderen, het kraakbeen, de trachea en de belangrijkste bronchiën, de lymfeklieren en het daaraan vastzittende bindweefsel, het vet en de mucus volledig zijn verwijderd; wanneer het gaat om vlees van als huisdier gehouden runderen, worden ook de hele kauwspieren, ingesneden overeenkomstig hoofdstuk VIII, punt 41, onder a), van bijlage I bij Richtlijn 64/433/EEG van de Raad als opgemaakte slachtafvallen beschouwd.

i) dieren die bestemd zijn om onmiddellijk te worden geslacht, onverwijld worden overgebracht naar het slachthuis van bestemming, waar zij binnen vijf werkdagen moeten worden geslacht;

ii) dieren die bestemd zijn voor fok-, gebruiks- of mestdoeleinden, en dieren die bestemd zijn voor dierentuinen, pretparken en wildparken of jachtgebieden, onverwijld worden overgebracht naar het bedrijf van bestemming waar zij ten minste 30 dagen moeten blijven voordat zij dat bedrijf weer mogen verlaten, behoudens om rechtstreeks naar een slachthuis te worden gevoerd.

a) niet-onthuide karkassen van vrij evenhoevig wild, bestemd voor menselijke consumptie na verdere verwerking;

b) opgemaakte slachtafvallen van als huisdier gehouden runderen, bestemd voor menselijke consumptie als vleesproduct na verdere hittebehandeling in de vorm van koken tot een kerntemperatuur van ten minste 80 °C of sterilisatie in hermetisch gesloten recipiënten tot een Fo-waarde van ten minste 3.

a) de naam en het adres van de inrichtingen als bedoeld in lid 2, en van de plaatselijke bevoegde autoriteit die verantwoordelijk is voor het toezicht op deze inrichtingen alsmede

b) de categorieën producten waarvoor deze inrichtingen zijn erkend en geregistreerd.

a) de zending is in de grensinspectiepost van binnenkomst in de Gemeenschap door de veterinaire dienst van de bevoegde autoriteit verzegeld met een zegel dat van een volgnummer is voorzien;

b) de documenten die de zending vergezellen, zoals bedoeld in artikel 7 van Richtlijn 97/78/EG, worden op elke bladzijde door de officiële dierenarts van de bevoegde autoriteit waaronder de grensinspectiepost valt, voorzien van het stempel „ALLEEN VOOR DOORVOER DOOR DE EG NAAR RUSLAND”;

c) aan de procedurevoorschriften van artikel 11 van Richtlijn 97/78/EG is voldaan;

d) de officiële dierenarts van de grensinspectiepost van binnenkomst heeft op het Gemeenschappelijk veterinair document van binnenkomst verklaard dat de zending kan worden doorgevoerd.

a) Het land van uitvoer stelt een veterinair certificaat op overeenkomstig het in deel 2 van bijlage I vastgestelde model, naar gelang van de betrokken diersoort. Op elk certificaat worden, in de in het model aangegeven volgorde, de verklaringen opgenomen die voor elk derde land zijn vereist en, naar gelang van het geval, ook de aanvullende garanties die zijn vereist voor het derde land van uitvoer of een deel daarvan.

Indien de EU-lidstaat van bestemming dat vereist, worden de aanvullende certificeringsvoorschriften voor de betrokken dieren opgenomen in het origineel van het veterinair certificaat.

b) Een apart en uniek certificaat moet worden opgesteld voor dieren die afkomstig zijn uit één enkel gebied als vermeld in de kolommen 2 en 3 van deel 1 van bijlage I, die verzonden worden naar dezelfde bestemming en vervoerd worden in dezelfde spoorwegwagon, dezelfde vrachtwagen, hetzelfde vliegtuig of hetzelfde schip.

c) Het originele exemplaar van elk certificaat bestaat uit één enkel blad waarvan de beide zijden worden gebruikt, of het moet een zodanige vorm hebben dat alle bladzijden één enkel ondeelbaar geheel vormen.

d) Het wordt opgesteld in ten minste één van de officiële talen van de EU-lidstaat waar de controle in de grensinspectiepost zal worden uitgevoerd en van de EU-lidstaat van bestemming. Deze lidstaten kunnen evenwel toestaan dat in plaats van de eigen taal een andere communautaire taal wordt gebruikt, indien nodig vergezeld van een officiële vertaling.

e) Indien voor de identificatie van de bestanddelen van de zending (zie punt 8.2 van het modelcertificaat) extra bladen aan het certificaat worden gehecht, worden deze bladen beschouwd als deel uitmakend van het originele certificaat en moeten op elke bladzijde de handtekening en het stempel van de certificerende officiële dierenarts worden aangebracht.

f) Wanneer het certificaat, inclusief de onder e) bedoelde aanvullingen, uit meer dan één bladzijde beslaat, wordt elke bladzijde onderaan genummerd — (bladzijdenummer) van (totaal aantal bladzijden) — en wordt elke bladzijde bovenaan ook voorzien van het codenummer van het certificaat dat door de bevoegde autoriteit is toegekend.

g) Het originele exemplaar van het certificaat moet door een officiële dierenarts worden ingevuld en ondertekend in de laatste 24 uur vóór het laden van de zending voor uitvoer naar de Gemeenschap. De bevoegde autoriteiten van het land van uitvoer moeten er daarbij op toezien dat beginselen van certificering worden toegepast die ten minste gelijkwaardig zijn aan die van Richtlijn 96/93/EG van de Raad.

De kleur van de handtekening moet verschillen van die van de gedrukte tekst. Dat geldt ook voor andere stempels dan reliëfstempels of watermerken.

h) Het originele exemplaar van het certificaat vergezelt de zending tot in de EU-grensinspectiepost.

i) Het certificaat is 10 dagen geldig vanaf de datum van afgifte.

Bij vervoer per schip wordt de geldigheidsduur verlengd met de duur van de zeereis. Daartoe wordt een verklaring van de kapitein van het schip, opgesteld overeenkomstig het addendum in deel 3 van bijlage I bij deze beschikking, aan het originele formulier van het veterinair certificaat vastgehecht.

j) Dieren mogen niet samen worden vervoerd met andere dieren die niet bestemd zijn voor de Europese Gemeenschap of die een lagere gezondheidsstatus hebben.

k) Tijdens het vervoer naar de Europese Gemeenschap mogen de dieren niet worden afgeladen op het grondgebied van een land of een deel van een land dat niet erkend is voor invoer in de Gemeenschap van de betrokken dieren.

I. zij moeten onder toezicht staan van een officiële dierenarts;

II. zij moeten gelegen zijn in het centrum van een gebied met een diameter van 20 km waar zich, volgens de officiële bevindingen, in de laatste 30 dagen vóór het gebruik als erkend centrum, geen enkel geval van mond- en klauwzeer heeft voorgedaan;

III. zij moeten vóór het gebruik als erkend centrum worden gereinigd en ontsmet met een ontsmettingsmiddel dat in het land van uitvoer is erkend als doeltreffend bij de bestrijding van de in punt II genoemde ziekten;

IV. zij moeten, rekening houdend met de capaciteit, beschikken over: a) voorzieningen die uitsluitend als verzamelcentrum worden gebruikt; b) adequate voorzieningen, die gemakkelijk te reinigen en te ontsmetten zijn, om de dieren in en uit te laden, naar behoren te huisvesten, te drenken en te voederen en de eventueel noodzakelijke behandelingen te verstrekken; c) adequate voorzieningen voor inspectie en afzondering; d) adequate apparatuur voor het reinigen en ontsmetten van lokalen en vrachtwagens; e) adequate ruimte voor de opslag van voeder, van strooisel en van mest; f) een adequaat systeem voor het verzamelen en afvoeren van afvalwater; g) een kantoor voor de officiële dierenarts;

V. wanneer de centra in gebruik zijn, moeten er voldoende dierenartsen zijn om alle taken te vervullen;

VI. zij mogen uitsluitend dieren toelaten die individueel zijn geïdentificeerd om de traceerbaarheid te garanderen. Daartoe moet, wanneer dieren worden toegelaten, de eigenaar van het centrum of de voor het centrum verantwoordelijke persoon erop toezien dat alle dieren naar behoren zijn geïdentificeerd en vergezeld gaan van de voor de betrokken soort en categorie vereiste gezondheidsdocumenten of certificaten. Bovendien moet deze persoon de naam van de eigenaar, de oorsprong, de datum van aankomst en van vertrek, het aantal en de identificatie van de dieren of het registratienummer van het beslag van herkomst en de bestemming van de dieren, alsmede het registratienummer van de vervoerder en het kentekennummer van de vrachtwagen waarmee de dieren bij het centrum worden afgeleverd of opgehaald, in een register of een gegevensbank registreren en gedurende ten minste drie jaar bewaren;

VII. alle dieren die via het centrum passeren, moeten voldoen aan de gezondheidsvoorschriften die zijn vastgesteld voor de invoer van de betrokken categorie dieren in de Europese Gemeenschap;

VIII. naar de Europese Gemeenschap uit te voeren dieren die via een centrum passeren, moeten binnen zes dagen na aankomst worden ingeladen en rechtstreeks naar de grens van het land van uitvoer worden verzonden: a) zonder in contact te komen met evenhoevige dieren die niet aan de gezondheidsvoorschriften voor de invoer van de betrokken categorie dieren in de Europese Gemeenschap voldoen; b) na te zijn verdeeld over zodanige zendingen dat geen enkele zending bestaat uit zowel fok- of gebruiksdieren als dieren die onmiddellijk moeten worden geslacht; c) in transportvoertuigen of containers die vooraf zijn gereinigd en ontsmet met een ontsmettingsmiddel dat in het land van uitvoer officieel is goedgekeurd als doeltreffend bij de bestrijding van de onder punt II genoemde ziekte, en die zo zijn gebouwd dat uitwerpselen, urine, strooisel of voeder tijdens het vervoer niet uit het voertuig kunnen stromen of vallen;

IX. wanneer op grond van de voorwaarden voor de uitvoer van dieren naar de Gemeenschap een test moet worden verricht binnen een bepaalde periode vóór het laden, omvat die periode de periode van ten hoogste zes dagen die volgt op de aankomst van de dieren in het verzamelcentrum;

X. het land van uitvoer duidt aan welke centra erkend zijn voor fok- en gebruiksdieren en welke voor dieren die onmiddellijk moeten worden geslacht, en stelt de Commissie en de bevoegde centrale autoriteiten van de lidstaten in kennis van de naam en het adres van de betrokken inrichtingen en van elke wijziging in de gegevens;

XI. het land van uitvoer stelt de procedure vast voor het officiële toezicht op de erkende centra en ziet erop toe dat dat toezicht ook wordt uitgeoefend;

XII. de centra worden regelmatig geïnspecteerd om na te gaan of nog steeds aan de eisen voor erkenning wordt voldaan. Wanneer niet meer aan de eisen wordt voldaan en de erkenning derhalve wordt geschorst, kan zij pas opnieuw worden verleend wanneer de bevoegde autoriteit heeft geconstateerd dat het centrum waar aan alle voorwaarden voldoet.

A. De „blocking” of „competitie-Elisa” wordt uitgevoerd overeenkomstig de onderstaande voorschriften.

Materiaal en reagentia

Proefopstelling

Cc: conjugaat controle (geen serum/geen monoklonaal antilichaam); C++: sterk positief controleserum; C+: zwak positief controleserum; C-: negatief controleserum; Cm: controle monoklonaal antilichaam (geen serum).

Protocol

Conjugaatcontrole (Cc) : De putjes 1A en 1B zijn een blancocontrole, bestaande uit BTV-antigeen en conjugaat. Deze kan worden gebruikt om de nulwaarde in te stellen op het Elisa-afleesapparaat.

MAL-controle (Cm) : De kolommen 1 en 2, rijen G en H, zijn de monoclonale antilichaamcontrole en bestaan uit BTV-antigeen, monoklonale antilichamen en conjugaat. Deze putjes zijn maximaal gekleurd. Het gemiddelde van de gemeten optische dichtheid van deze controlerij is de 0 %-inhibitiewaarde.

Positieve controle (C++, C+) : De kolommen 1 en 2, rijen C-D-E-F. Deze putjes bevatten BTV-antigeen, sterk positief antiserum tegen BTV, zwak positief antiserum tegen BTV, monoclonaal antilichaam en conjugaat.

Negatieve controle (C-) : De putjes 2A en 2B zijn de negatieve controles en bevatten BTV-antigeen, negatief antiserum tegen BTV, monoklonaal antilichaam en conjugaat.

Testsera : Voor grootschalig serologisch onderzoek en snelle screening kunnen sera worden getest in een enkele verdunning 1:5 (aanhangsel 1). Anderzijds kunnen 10 sera worden getest in een verdunningsreeks van 1:5 tot en met 1:640 (aanhangsel 2). Dit geeft een indicatie van de antilichaamtiter in de testsera.

Procedure

Analyse van de resultaten

Print de OD-waarden en het inhibitiepercentage (IP) voor de test en de controlesera, gebaseerd op de gemiddelde waarde voor de antigeencontroleputjes, uit met gebruikmaking van een speciaal softwarepakket. De verkregen OD- en IP-waarden worden gebruikt om te bepalen of de testresultaten binnen aanvaardbare grenzen liggen. De bovenste controlegrens en de laagste controlegrens voor de MAL-controle (antigeen plus MAL zonder testsera) liggen tussen OD-waarden 0,4 en 1,4. Elk plaatje dat niet aan bovenstaande criteria voldoet, moet worden afgewezen.

Indien geen softwarepakket beschikbaar is, dienen de OD-waarden te worden uitgeprint met de ELISA-printer. Bereken de gemiddelde OD-waarde voor de antigeencontroleputjes, die gelijk is aan de 100 %-waarde. Bepaal de 50 % OD-waarde en bereken manueel de positieve en de negatieve waarde van elk monster.

Inhibitiepercentage (IP)-waarde = 100 — (OD van elke testcontrole/gemiddelde OD van Cm) × 100.

De in duplo aangelegde putjes met negatief controleserum en de in duplo aangelegde blanco's moeten IP-waarden te zien geven tussen + 25 % en − 25 %, respectievelijk tussen + 95 % en + 105 %. Wanneer deze waarden niet in acht worden genomen, betekent dat niet dat het plaatje onbruikbaar is, maar ontstaat de suggestie dat zich achtergrondkleuring ontwikkelt. De sterk positieve en de zwak positieve controlesera moeten IP-waarden te zien geven tussen + 81 % en + 100 %, respectievelijk tussen + 51 % en + 80 %.

De diagnostische drempel voor testsera bedraagt 50 % (IP 50 % of OD 50 %). Monsters die een IP-waarde te zien geven van meer dan 50 % worden als negatief beschouwd. Monsters met IP-waarden boven en beneden de drempel voor de in duplo aangelegde putjes, worden als twijfelachtig beschouwd; deze monsters mogen opnieuw worden getest met de spottest en/of door titrering. Positieve monsters mogen ook worden getitreerd om een indicatie te geven van de graad van positiviteit.

Visuele aflezing: positieve en negatieve monsters kunnen gemakkelijk met het blote oog worden geïnterpreteerd; zwak positieve of sterk negatieve monsters zijn eventueel moeilijker af te lezen met het blote oog.

Bereiding van het BTV-Elisa-antigeen

Titrering van BTV-Elisa-antigeen

Bluetongue Elisa-antigeen wordt getitreerd met de indirecte Elisa. Duplo verdunningen van het antigeen worden getitreerd tegen een constante verdunning (1/100) van monoklonaal antilichaam 3-17-A3. Voor de test gelden de onderstaande voorschriften.

Bij de competitietest dient een teveel aan monoklonaal aanwezig te zijn; daarom wordt een verdunning van het antigeen gekozen die ligt op de titratiecurve (niet op het horizontale gedeelte), wat ongeveer 0,8 OD geeft na tien minuten.

B. De agargel-immunodiffusietest wordt uitgevoerd overeenkomstig de onderstaande voorschriften.

Antigeen:

Precipiterend antigeen wordt bereid in een celcultuur die geschikt is voor de snelle vermeerdering van een referentiestam van het bluetonguevirus. Bij voorkeur wordt hiervoor gebruik gemaakt van BHK- of Vero-cellen. Het antigeen bevindt zich in het aan het einde van de virusgroei verkregen supernatant, maar moet 50 tot 100 keer worden geconcentreerd om effectief te zijn. Daartoe kan om het even welke gestandaardiseerde methode voor eiwitconcentratie worden gebruikt; het virus in het antigeen kan worden geïnactiveerd door toevoeging van 0,3 % (v/v) beta-propiolacton.

Positief controleserum:

Met gebruikmaking van het internationale referentie-antiserum en -antigeen wordt een nationaal standaardserum geproduceerd, dat voor een optimale verhouding wordt gestandaardiseerd ten opzichte van het internationale referentieserum; vervolgens wordt het gevriesdroogd en bij iedere test als positief controleserum gebruikt.

Testserum

Procedure : 1 % agar, in boraat- of natriumbarbituraatbuffer, pH 8,5 à 9,0, wordt in een petrischaaltje gegoten, en wel zo dat het laagje agar een dikte heeft van ten minste 3 mm. In de agar worden zeven vochtvrije putjes gemaakt, met een diameter van elk 5 mm. Eén putje ligt centraal en de zes anderen liggen er omheen in een cirkel met een straal van 3 cm. Het centrale putje wordt gevuld met het standaard antigeen. De perifere putjes 2, 4 en 6 worden gevuld met het positieve controleserum en de putjes 1, 3 en 5 met het testserum. Het geheel wordt gedurende 72 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in een gesloten vochtige kamer.

Interpretatie : Een testserum is positief indien het een specifieke precipitatielijn vormt met het antigeen en een volledig identieke lijn met het controleserum. Een testserum is negatief indien het geen specifieke lijn vormt met het antigeen en indien het de lijn van het controleserum niet buigt. De petrischaaltjes moeten worden bekeken bij donkerveldbelichting met indirect licht.

A. De serumneutralisatietest wordt uitgevoerd overeenkomstig de onderstaande voorschriften.

Serum : Vóór gebruik worden de sera geïnactiveerd door blootstelling aan een temperatuur van 56 °C gedurende 30 minuten.

Procedure : De neutralisatietest met constant virus tegenover wisselende serumverdunningen wordt uitgevoerd door microtitrering, waarbij gebruik wordt gemaakt van MDBK of andere gevoelige cellen. De Colorado-, de Oxford- of een andere referentiestam van het virus wordt gebruikt in een concentratie van 100 TCID50 per 0,025 ml; geïnactiveerde onverdunde serummonsters worden vermengd met een gelijke hoeveelheid (0,025 ml) virussuspensie. De virus/serummengsels worden gedurende één uur bij 37 °C geïncubeerd in microtiterplaatjes voordat de MDBK-cellen worden toegevoegd. De cellen worden gebruikt in een zodanige concentratie dat na 24 uur een volledige monolayer wordt gevormd.

Controles : (i) bepaling van het infectievermogen van het virus, (ii) controles op de toxiciteit van het serum, (iii) controles van niet-geïnoculeerde celcultures, (iv) referentie-antisera.

Interpretatie : De resultaten van de neutralisatietest en de titer van het bij de test gebruikte virus worden afgelezen na een incubatieperiode van drie tot zes dagen bij 37 °C. De serumtiters worden als negatief beschouwd indien er geen neutralisatie is bij een verdunning van 1/2 (onverdund serum).

B. Elke andere test die is erkend in het kader van Beschikking 93/42/EG van de Commissie betreffende aanvullende garanties ten aanzien van IBR voor runderen die bestemd zijn voor lidstaten of gebieden daarvan die vrij zijn van deze ziekte.

A. Het verzamelen van monsters uit oesophagus en pharynx en het onderzoeken daarvan vinden plaats overeenkomstig de onderstaande voorschriften.

Reagentia : Voordat met de bemonstering wordt begonnen, wordt het transportmedium bereid. 2 ml daarvan wordt overgebracht in evenveel containers als er dieren zijn die moeten worden bemonsterd. De gebruikte containers moeten bestand zijn tegen invriezing over CO2 in vaste vorm of over vloeibare stikstof. Voor de bemonstering moet gebruik worden gemaakt van een speciaal ontworpen sputumvanger of „probang”. Om het monster te nemen wordt het probanglepeltje via de mond over het dorsale gedeelte van de tong tot in het bovenste deel van de slokdarm gebracht. Via lateraal en dorsaal gerichte bewegingen wordt getracht het oppervlakte-epitheel van het bovenste gedeelte van de slokdarm af te schrapen. Vervolgens wordt de probang teruggetrokken, bij voorkeur nadat het dier heeft geslikt. Het lepeltje moet gevuld zijn en een mengsel bevatten van slijm, speeksel, slokdarmvocht en celresten. Er dient evenwel voor te worden gezorgd dat elk monster zichtbaar celmateriaal bevat. Elke ruwe beweging die bloedingen kan veroorzaken, moet worden vermeden. De monsters van sommige dieren kunnen zwaar verontreinigd zijn met resten van het herkauwde voeder. Dergelijke monsters moeten worden weggegooid en de bek van het betrokken dier moet worden gespoeld met water, of beter nog met een fysiologische zoutoplossing, voordat een nieuw monster wordt genomen.

Behandeling van de monsters : Elk in het probanglepeltje genomen monster wordt op zijn kwaliteit onderzocht en 2 ml ervan wordt toegevoegd aan dezelfde hoeveelheid transportmedium in een vriesbestendige container. De containers worden stevig gesloten, verzegeld, ontsmet en van een etiket voorzien. De monsters worden koel bewaard (+ 4 °C) en binnen drie à vier uur onderzocht ofwel op droog ijs (-69 °C) of vloeibare stikstof geplaatst en bevroren gehouden totdat zij worden onderzocht. Na elke monstername moet de probang worden ontsmet en driemaal gespoeld, telkens in schoon water.

Onderzoek op MKZ-virus : De monsters worden geïnoculeerd op cultures van primaire boviene schildkliercelkweken, waarbij per monster ten minste drie buisjes worden gebruikt. Andere gevoelige cellen, bijvoorbeeld primaire runder- of varkensniercellen, kunnen eveneens worden gebruikt, maar daarbij mag niet worden vergeten dat zij voor bepaalde stammen van het MKZ-virus minder gevoelig zijn. De buisjes worden geïncubeerd bij 37 °C op een rollerbank en gedurende 48 uur dagelijks onderzocht op de aanwezigheid van cytopathogeen effect (CPE). Indien de uitkomst negatief is, worden de cultures blind gepasseerd op nieuwe cultures en opnieuw onderzocht gedurende 48 uur. De specificiteit van elk CPE moet worden bevestigd.

Aanbevolen transportmedia:

B. De virusneutralisatietest wordt uitgevoerd overeenkomstig de volgende voorschriften.

Reagentia : Het stamantigeen van het mond- en klauwzeervirus wordt aangemaakt in celcultures of op rundertongen en wordt vervolgens opgeslagen bij ten hoogste −70 °C of bij -20 °C indien 50 % glycerol is toegevoegd. Dit is het stam- of bewaarantigeen. Het MKZ-virus is onder deze omstandigheden stabiel en de titers variëren slechts in geringe mate in de loop van een aantal maanden.

Procedure : De test wordt uitgevoerd op gegradueerde, voor weefselkweek bestemde microtiterplaatjes met vlakke bodem, met gebruikmaking van gevoelige cellen, bij voorbeeld IB-RS-2, BHK-21 of kalfsniercellen. De testsera worden verdund in een verhouding 1/4 in een serumvrij celkweekmedium, waaraan vervolgens 100 IE per ml neomycine of een ander daartoe geschikt antibioticum wordt toegevoegd. De sera worden geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 minuten en 0,05 ml ervan wordt gebruikt voor de aanleg, in duplo, van een verdunningsreeks op microtiterplaatjes met behulp van verdunningscapillairen met een inhoud van 0,05 ml. Vooraf getitreerd virus, dat eveneens in serumvrij cultuurmedium is verdund en in een concentratie van 100 TCID50 per 0,05 ml, wordt vervolgens aan elk putje toegevoegd. Na incubatie bij 37 °C gedurende één uur, om het neutralisatieproces te doen plaatsvinden, wordt 0,05 ml celsuspensie, met 0,5 — 1,0 × 106 cellen per 1 ml in celkweekmedium dat een serum bevat dat vrij is van antilichamen tegen MKZ, toegevoegd aan elk putje en worden de platen verzegeld. De plaatsjes worden geïncubeerd bij 37 °C. De daarbij gevormde monolayers zijn normaal binnen 24 uur confluent. Na 48 uur is er gewoonlijk voldoende CPE om de test microscopisch af te lezen. Op dat ogenblik kan een definitieve microscopische aflezing plaatsvinden of kunnen de plaatjes worden gefixeerd en gemerkt met het oog op macroscopische aflezing, bijvoorbeeld met behulp van 10 %-ige formol-zoutoplossing en 0,05 %-ig methylethyleenblauw.

Controles : De controles bij elke test omvatten een homoloog antiserum met bekende titer, een celcontrole, een controle op de toxiciteit van het serum, een controle van het medium en een virustitratie aan de hand waarvan de juiste hoeveelheid virus in de test wordt berekend.

Interpretatie : Putjes die CPE vertonen, worden als besmet beschouwd en de neutralisatietiters worden uitgedrukt als de reciproke van de uiteindelijke verdunning van het in het serum/virusmengsel aanwezige serum bij het 50 % eindpunt, berekend aan de hand van de methode van Spearman-Karber (Karber, G., 1931, Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmokologie, 162, 480.). Een test wordt als geldig beschouwd wanneer de werkelijke hoeveelheid virus per putje in de test tussen 101,5 en 102,5 TCID50 ligt en wanneer de titer van het referentieserum minder bedraagt dan het dubbele van de verwachte titer, berekend op basis van voorafgaande titreringen. Wanneer bij de controles waarden worden gevonden buiten deze limieten, worden de tests overgedaan. Een eindpunttiter van 1/11 of minder wordt als negatief beschouwd.

C. De opsporing en kwantificering van antilichamen met behulp van de Elisa worden uitgevoerd overeenkomstig de onderstaande voorschriften.

Reagentia : Konijnantiserum tegen 146S-antigeen van zeven typen van mond- en klauwzeervirus (MKZ-virus), gebruikt bij een vooraf vastgestelde optimale concentratie in carbonaat/bicarbonaat-bufferoplossing, pH 9,6. Antigeen wordt bereid uit geselecteerde virusstammen, gekweekt op monolayers van BHK-21-cellen. Niet-gezuiverd supernatant wordt vooraf getitreerd overeenkomstig de voorschriften, maar zonder serum, en dan gebruikt voor het aanleggen van een verdunning die na toevoeging van een gelijk volume PBST (met fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,05 % Tween-20 en fenolrood bevat) bij aflezing een optische densiteit oplevert tussen 1,2 en 1,5. De virussen mogen vóór gebruik worden geïnactiveerd. PBST wordt gebruikt als diluent. Cavia-antiserum wordt bereid door cavia's te enten met 146S-antigeen van elk serotype. Een vooraf bepaalde optimale concentratie in PBST dat 10 % normaal runderserum en 5 % normaal konijnenserum bevat. Konijn-anticavia-immunoglobuline, geconjugeerd met mierikswortelperoxidase, wordt gebruikt in een vooraf bepaalde optimale concentratie in PBST dat 10 % normaal runderserum en 5 % normaal konijnenserum bevat. De testsera worden verdund in PBST.

Procedure:

De plaatjes worden spectrofotometrisch afgelezen bij 492 nm op een Elisa-afleesapparaat dat met een microcomputer is verbonden.

Controles : Voor elk gebruikt antigeen zijn er 40 putjes die geen serum bevatten maar antigeen verdund in PBST. Een in duplo aangelegde tweevoudige verdunningsreeks van homoloog bovien referentie-antiserum. Een in duplo aangelegde tweevoudige verdunningsreeks van negatief runderserum.

Interpretatie : Antilichaamtiters worden uitgedrukt als de uiteindelijke verdunning van het testserum dat 50 % oplevert van de gemiddelde OD-waarde die is geregistreerd in de viruscontroleputjes zonder testserum. Titers boven 1/40 worden als positief beschouwd.

Referenties : Hamblin C, Barnett ITR and Hedger RS (1986) — A new enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of Elisa. Journal of Immunological Methods, 93, 115 to 121.11.

A. De serumneutralisatietest wordt uitgevoerd overeenkomstig de onderstaande voorschriften.

Serum : Vóór gebruik worden de sera geïnactiveerd door blootstelling aan een temperatuur van 56 °C gedurende 30 minuten.

Procedure : De neutralisatietest met constant virus tegenover wisselende serumverdunningen wordt uitgevoerd op microtiterplaatjes, waarbij gebruik wordt gemaakt van Vero-cellen of andere gevoelige cellen. Het virus van de ziekte van Aujeszky wordt gebruikt in een concentratie van 100 TCID50 per 0,025 ml; geïnactiveerde onverdunde serummonsters worden vermengd met een gelijke hoeveelheid (0,025 ml) virussuspensie. De virus/serummengsels worden gedurende twee uur bij 37 °C geïncubeerd in de microtiterplaatjes voordat de nodige cellen worden toegevoegd. De cellen worden gebruikt in een zodanige concentratie dat na 24 uur een volledige monolayer wordt gevormd.

Controles : (i) bepaling van het infectievermogen van het virus, (ii) controles op de toxiciteit van het serum, (iii) controles van niet-geïnoculeerde celcultures, (iv) referentie-antisera.

Interpretatie : De resultaten van de neutralisatietest en de titer van het bij de test gebruikte virus worden afgelezen na een incubatieperiode van drie tot zeven dagen bij 37 °C. Een serumtiter van minder dan 1/2 (onverdund serum) wordt als negatief beschouwd.

B. Elke andere test die is erkend in het kader van Beschikking 93/42/EG van de Commissie betreffende aanvullende garanties ten aanzien van IBR voor runderen die bestemd zijn voor lidstaten of gebieden daarvan die vrij zijn van deze ziekte.

a) Het land van uitvoer stelt een veterinair certificaat op overeenkomstig het in deel 2 van bijlage II vastgestelde model, naar gelang van de betrokken soort vlees. Op elk certificaat worden, in de in het model aangegeven volgorde, de verklaringen opgenomen die voor elk derde land zijn vereist en, naar gelang van het geval, ook de aanvullende garanties die zijn vereist voor het derde land van uitvoer of een deel daarvan.

b) Een apart en uniek certificaat moet worden opgesteld voor vlees dat afkomstig is uit één enkel gebied als vermeld in de kolommen 2 en 3 van deel 1 van bijlage II, die verzonden worden naar dezelfde bestemming en vervoerd worden in dezelfde spoorwegwagon, dezelfde vrachtwagen, hetzelfde vliegtuig of hetzelfde schip.

c) Het originele exemplaar van elk certificaat bestaat uit één enkel blad waarvan de beide zijden worden gebruikt, of het moet een zodanige vorm hebben dat alle bladzijden één enkel ondeelbaar geheel vormen.

d) Het wordt opgesteld in ten minste één van de officiële talen van de EU-lidstaat waar de controle in de grensinspectiepost zal worden uitgevoerd en van de EU-lidstaat van bestemming. Deze lidstaten kunnen evenwel toestaan dat in plaats van de eigen taal een andere communautaire taal wordt gebruikt, indien nodig vergezeld van een officiële vertaling.

e) Indien voor de identificatie van de bestanddelen van de zending (zie punt 8.3 van het modelcertificaat) extra bladen aan het certificaat worden gehecht, worden deze bladen beschouwd als deel uitmakend van het originele certificaat en moeten op elke bladzijde de handtekening en het stempel van de certificerende officiële dierenarts worden aangebracht.

f) Wanneer het certificaat, inclusief de onder e) bedoelde aanvullingen, uit meer dan één bladzijde beslaat, wordt elke bladzijde onderaan genummerd — (bladzijdenummer) van (totaal aantal bladzijden) — en wordt elke bladzijde bovenaan voorzien van het codenummer van het certificaat dat door de bevoegde autoriteit is toegekend.

g) Het originele exemplaar van het certificaat moet door een officiële dierenarts worden ingevuld en ondertekend. De bevoegde autoriteiten van het land van uitvoer moeten er daarbij op toezien dat beginselen van certificering worden toegepast die ten minste gelijkwaardig zijn aan die van Richtlijn 96/93/EG van de Raad.

De kleur van de handtekening moet verschillen van die van de gedrukte tekst. Dat geldt ook voor andere stempels dan reliëfstempels of watermerken.

h) Het originele exemplaar van het certificaat vergezelt de zending tot in de EU-grensinspectiepost.