Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32016R0266

Verordening (EU) 2016/266 van de Commissie van 7 december 2015 tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van Verordening (EG) nr. 440/2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (Voor de EER relevante tekst)

C/2015/8529

OJ L 54, 1.3.2016, p. 1–446 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2016/266/oj

1.3.2016   

NL

Publicatieblad van de Europese Unie

L 54/1


VERORDENING (EU) 2016/266 VAN DE COMMISSIE

van 7 december 2015

tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van Verordening (EG) nr. 440/2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)

(Voor de EER relevante tekst)

DE EUROPESE COMMISSIE,

Gezien het Verdrag betreffende de werking van de Europese Unie,

Gezien Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (1), en met name artikel 13, lid 2,

Overwegende hetgeen volgt:

(1)

Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie (2) bevat de testmethoden voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van chemische stoffen die worden toegepast voor de uitvoering van Verordening (EG) nr. 1907/2006.

(2)

Verordening (EG) nr. 440/2008 moet worden bijgewerkt om daarin nieuwe en bijgewerkte, recentelijk door de OESO goedgekeurde testmethoden op te nemen teneinde rekening te houden met de technische vooruitgang en overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad (3) tot een verlaging van het aantal proefdieren te komen. De belanghebbenden zijn over dit voorstel geraadpleegd.

(3)

De aanpassing betreft twintig testmethoden: één nieuwe methode voor de bepaling van een fysisch-chemische eigenschap, elf nieuwe en drie aangepaste testmethoden voor de beoordeling van de ecotoxiciteit, en vijf nieuwe testmethoden voor de beoordeling van het uiteindelijk lot en het gedrag in het milieu.

(4)

Verordening (EG) nr. 440/2008 moet derhalve dienovereenkomstig worden gewijzigd.

(5)

De in deze verordening vervatte bepalingen zijn in overeenstemming met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt gewijzigd overeenkomstig de bijlage bij deze verordening.

Artikel 2

Deze verordening treedt in werking op de derde dag na die van de bekendmaking ervan in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.

Gedaan te Brussel, 7 december 2015.

Voor de Commissie

De voorzitter

Jean-Claude JUNCKER


(1)  PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1.

(2)  Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie van 30 mei 2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (PB L 142 van 31.5.2008, blz. 1).

(3)  Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).


BIJLAGE

De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt als volgt gewijzigd:

1)

Aan het begin van de bijlage, vóór deel A, wordt een noot ingevoegd:

„Noot:

Voordat een van de volgende testmethoden voor het testen van een stof met meerdere bestanddelen, een stof van onbekende of wisselende samenstelling, een complex reactieproduct of biologisch materiaal (UVCB-stoffen) of een mengsel wordt gebruikt en daar waar de toepasbaarheid ervan voor het testen van stoffen met meerdere bestanddelen, UVCB-stoffen of mengsels niet in de desbetreffende testmethode is aangegeven, moet worden nagegaan of de methode geschikt is voor het beoogde regelgevingsdoel.

Indien de testmethode voor het testen van een stof met meerdere bestanddelen, een UVCB-stof of een mengsel wordt gebruikt, moet voor zover mogelijk voldoende informatie over de samenstelling van het mengsel beschikbaar worden gesteld, bijvoorbeeld aan de hand van de chemische identiteit van de bestanddelen, hun kwantitatieve aandeel in het mengsel en relevante eigenschappen van de bestanddelen.”

2)

Hoofdstuk A.24 wordt toegevoegd:

A.24.   VERDELINGSCOËFFICIËNT (N-OCTANOL/WATER), HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE-METHODE (HPLC)

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 117 (2004) van de OESO.

1.

De verdelingscoëfficiënt (P) is gedefinieerd als de verhouding van de evenwichtsconcentraties van een opgeloste stof in een tweefasensysteem bestaande uit twee in hoge mate niet mengbare oplosmiddelen. Voor n-octanol en water:

Formula

De verdelingscoëfficiënt is het quotiënt van twee concentraties en is daarom dimensieloos; deze waarde wordt meestal opgegeven als een logaritme met grondtal tien.

2.

Pow is een belangrijke parameter in onderzoeken naar het lot van chemische stoffen in het milieu. Er is een zeer duidelijk verband aangetoond tussen de Pow van de niet-geïoniseerde vorm van stoffen en hun bioaccumulatie in vissen. De Pow is ook een bruikbare parameter gebleken bij het voorspellen van adsorptie aan grond en sedimenten en het vaststellen van kwantitatieve structuur-activiteitrelaties voor een groot aantal verschillende biologische effecten.

3.

Het eerste voorstel voor deze testmethode was gebaseerd op een artikel van C.V. Eadsforth en P. Moser (1). De ontwikkeling van de testmethode en een interlaboratorium-vergelijkingstest van de OESO werden in 1986 gecoördineerd door het Umweltbundesamt van de Bondsrepubliek Duitsland (2).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

4.

Log Pow-waarden in het bereik van – 2 tot 4 (soms tot 5 en hoger) (1) kunnen experimenteel worden bepaald met de schudflesmethode (hoofdstuk A.8 van deze bijlage, testrichtlijn 107 van de OESO). De HPLC-methode is geschikt voor het bepalen van verdelingscoëfficiënten in het log Pow-bereik van 0 tot 6 (1) (2) (3) (4) (5). Voor deze methode kan een schatting van de Pow nodig zijn om geschikte referentiestoffen aan te wijzen en conclusies getrokken uit de meetgegevens van de test te ondersteunen. Een beknopte beschrijving van berekeningsmethoden is te vinden in het aanhangsel bij deze testmethode. De HPLC wordt isocratisch uitgevoerd.

5.

De Pow-waarden zijn afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, zoals temperatuur, pH, ionsterkte enz., en deze moeten in het experiment gedefinieerd worden om de Pow-gegevens goed te kunnen interpreteren. Voor ioniseerbare stoffen komt mogelijk een andere methode beschikbaar (bv. ontwerprichtlijn van de OESO betreffende een pH-metrische methode voor geïoniseerde stoffen (6)) die als alternatief kan worden gebruikt. Hoewel de methode volgens deze OESO-ontwerprichtlijn geschikt kan zijn voor de bepaling van de Pow voor ioniseerbare stoffen, is het in sommige gevallen beter om de HPLC-methode te gebruiken bij een voor het milieu relevante pH.

PRINCIPE VAN DE METHODE

6.

Reversed phase HPLC wordt uitgevoerd met analytische kolommen, gepakt met een in de handel verkrijgbare vaste fase bestaande uit chemisch aan silica gebonden lange koolwaterstofketens (bv. C8, C18).

7.

Een in zo'n kolom geïnjecteerde chemische stof wordt door de mobiele fase meegevoerd door de kolom en verdeelt zich daarbij tussen de mobiele oplosmiddelfase en de stationaire koolwaterstoffase. De mate waarin stoffen worden vastgehouden is evenredig met hun koolwaterstof/water-verdelingscoëfficiënt, waarbij hydrofiele stoffen het eerst elueren en lipofiele stoffen het laatst. De retentietijd wordt beschreven door de capaciteitsfactor k, met de volgende formule:

Formula

waarbij tR de retentietijd van de teststof is, en t0 de dode tijd, d.w.z. de gemiddelde tijd die een oplosmiddelmolecuul nodig heeft om door de kolom te lopen. Kwantitatieve analysemethoden zijn niet vereist, alleen de retentietijd moet worden bepaald.

8.

De octanol/water-verdelingscoëfficiënt van een teststof kan berekend worden door de capaciteitsfactor k van de stof experimenteel te bepalen en deze waarde vervolgens in te vullen in de volgende vergelijking:

Formula

waarbij:

a, b

=

lineaire regressiecoëfficiënten.

Bovenstaande vergelijking kan worden verkregen door lineaire regressie van de logaritme van de octanol/water-verdelingscoëfficiënten van referentiestoffen tegen de logaritme van de capacteitsfactoren van de referentiestoffen.

9.

Met de reversed phase HPLC-methode kunnen verdelingscoëfficiënten in het log Pow-bereik van 0 tot 6 worden geschat, en in uitzonderlijke gevallen kan dit worden uitgebreid met het log Pow-bereik van 6 tot 10. Hiervoor kan het nodig zijn de mobiele fase aan te passen (3). De methode kan niet worden gebruikt voor sterke zuren en basen, metaalcomplexen, stoffen die met het eluens reageren en oppervlakteactieve stoffen. Er kunnen metingen worden uitgevoerd met ioniseerbare stoffen in hun niet-geïoniseerde vorm (vrij zuur of vrije base) door een geschikte buffer te gebruiken met een pH onder de pKa voor een vrij zuur of boven de pKa voor een vrije base. De pH-metrische methode voor het testen van ioniseerbare stoffen (6) komt mogelijk beschikbaar en zou als alternatieve methode kunnen worden gebruikt (6). Als de log Pow wordt bepaald voor gebruik bij de indeling van milieugevaren of beoordeling van het milieurisico, moet de test worden uitgevoerd in het pH-bereik dat relevant is voor de natuurlijke omgeving, d.w.z. in het pH-bereik 5,0 - 9.

10.

In sommige gevallen kunnen verontreinigingen de interpretatie van de resultaten bemoeilijken vanwege onzekerheid bij het benoemen van de pieken. Voor mengsels die een band van niet volledig gescheiden pieken geven, moeten de boven- en ondergrens van de log Pow, en het oppervlaktepercentage van elke log Pow-piek worden gerapporteerd. Voor mengsels die uit een groep homologen bestaan moet ook de log Pow als gewogen gemiddelde worden opgegeven (7), berekend op basis van de individuele Pow-waarden en de desbetreffende oppervlaktepercentages (8). Alle pieken die meer dan 5 % van de totale piekoppervlakte uitmaken, moeten in de berekening worden meegenomen (9).

Formula

Het gewogen gemiddelde van log Pow is alleen geldig voor stoffen of mengsels (bv. tallolie) die uit homologen bestaan (bv. een reeks alkanen). Metingen aan mengsels kunnen betekenisvolle resultaten opleveren mits de voor analyse gebruikte detector dezelfde gevoeligheid heeft voor alle stoffen in het mengsel en het scheidend vermogen voldoende groot is.

INFORMATIE OVER DE TESTSTOF

11.

De dissociatieconstante, de structuurformule en de oplosbaarheid in de mobiele fase moeten bekend zijn voordat de methode wordt gebruikt. Daarnaast is informatie over hydrolyse nuttig.

KWALITEITSCRITERIA

12.

Om de betrouwbaarheid van de meting te vergroten moeten de bepalingen in duplo worden uitgevoerd.

Herhaalbaarheid: De log Pow-waarden die worden afgeleid uit herhaalde metingen onder identieke omstandigheden en met dezelfde set referentiestoffen mogen niet meer dan 0,1 log-eenheden van elkaar verschillen.

Reproduceerbaarheid: De resultaten van herhaalde metingen met een verschillende set referentiestoffen mogen verschillend zijn. De correlatiecoëfficiënt R voor het verband tussen log k en log Pow voor een set teststoffen ligt doorgaans rond 0,9, wat neerkomt op een octanol/water-verdelingscoëfficiënt van log Pow ± 0,5 log-eenheden.

13.

De interlaboratorium-vergelijkingstest heeft uitgewezen dat met de HPLC-methode log Pow-waarden kunnen worden verkregen die minder dan ± 0,5 eenheden verschillen van de schudfleswaarden (2). Andere vergelijkingen zijn terug te vinden in de literatuur (4) (5) (10) (11) (12). Correlatiegrafieken op basis van structureel verwante referentiestoffen geven de meest nauwkeurige resultaten (13).

REFERENTIESTOFFEN

14.

Om de gemeten capaciteitsfactor k van een stof te kunnen correleren met zijn Pow, moet een ijklijn worden gemaakt met ten minste 6 punten (zie punt 24). Het is aan de gebruiker de geschikte referentiestoffen te kiezen. De log Pow-waarden van de referentiestoffen moeten normaal gesproken zodanig zijn dat ze de log Pow van de teststof omvatten, dat wil zeggen dat ten minste één referentiestof een Pow moet hebben boven die van de teststof, en een andere een Pow onder die van de teststof. Extrapolatie dient alleen in uitzonderlijke gevallen te worden gebruikt. De referentiestoffen zijn bij voorkeur structureel verwant met de teststof. De log Pow-waarden van de voor de ijking gebruikte referentiestoffen moeten op betrouwbare experimentele gegevens zijn gebaseerd. Voor stoffen met een hoge log Pow (in de regel hoger dan 4) mogen berekende waarden worden gebruikt, tenzij er betrouwbare experimentele gegevens beschikbaar zijn. Als geëxtrapoleerde waarden worden gebruikt, moet een grenswaarde worden opgegeven.

15.

Er zijn uitgebreide lijsten beschikbaar met log Pow-waarden voor een groot aantal groepen van chemische stoffen (14) (15). Als er geen gegevens over de verdelingscoëfficiënt van structureel verwante stoffen beschikbaar zijn, mag een meer algemene ijking worden toegepast met andere referentiestoffen. Aanbevolen referentiestoffen en hun Pow-waarden zijn vermeld in tabel 1. Voor ioniseerbare stoffen hebben de vermelde waarden betrekking op de niet-geïoniseerde vorm. De aannemelijkheid en kwaliteit van de waarden werden gecontroleerd tijdens de interlaboratorium-vergelijkingstest.

Tabel 1

Aanbevolen referentiestoffen

 

CAS-nummer

Referentiestof

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-Butanon

(Methylethylketon)

0,3

 

2

1122-54-9

4-Acetylpyridine

0,5

 

3

62-53-3

Aniline

0,9

 

4

103-84-4

Aceetanilide

1,0

 

5

100-51-6

Benzylalcohol

1,1

 

6

150-76-5

4-Methoxyfenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

fenoxyazijnzuur

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-Dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benzonitril

1,6

 

11

140-29-4

Fenylacetonitril

1,6

 

12

589-18-4

4-Methylbenzylalcohol

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-Nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-Nitrobenzoëzuur

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-Chlooraniline

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenzeen

1,9

 

18

104-54-1

Cinnamylalcohol

(kaneelalcohol)

1,9

 

19

65-85-0

Benzoëzuur

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-Kresol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Kaneelzuur

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisool

2,1

 

23

93-58-3

Methylbenzoaat

2,1

 

24

71-43-2

Benzeen

2,1

 

25

99-04-7

3-Methylbenzoëzuur

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-Chloorfenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trichloorethyleen

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazine

2,6

 

29

93-89-0

Ethylbenzoaat

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-Dichloorbenzonitril

2,6

 

31

535-80-8

3-Chloorbenzoëzuur

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Tolueen

2,7

 

33

90-15-3

1-Naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-Dichlooraniline

2,8

 

35

108-90-7

Chloorbenzeen

2,8

 

36

1746-13-0

Allylfenylether

2,9

 

37

108-86-1

Broombenzeen

3,0

 

38

100-41-4

Ethylbenzeen

3,2

 

39

119-61-9

Benzofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-Fenylfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Thymol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-Dichloorbenzeen

3,4

 

43

122-39-4

Difenylamine

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftaleen

3,6

 

45

93-99-2

Fenylbenzoaat

3,6

 

46

98-82-8

Isopropylbenzeen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-Trichloorfenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenyl

4,0

 

49

120-51-4

Benzylbenzoaat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-Dinitro-6-sec-butylfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-Trichloorbenzeen

4,2

 

52

143-07-7

Dodecaanzuur

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenylether

4,2

 

54

85-01-8

Fenantreen

4,5

 

55

104-51-8

n-Butylbenzeen

4,6

 

56

103-29-7

Dibenzyl

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-Difenylpyridine

4,9

 

58

206-44-0

Fluorantheen

5,1

 

59

603-34-9

Trifenylamine

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Oriënterende schatting van de verdelingscoëfficiënt

16.

Indien nodig kan de verdelingscoëfficiënt van de teststof worden geschat, bij voorkeur met een berekeningsmethode (zie aanhangsel) of, waar van toepassing, op basis van de verhouding van de oplosbaarheidswaarden van de teststof in de zuivere oplosmiddelen.

Apparatuur

17.

Benodigd is een vloeibare-fase-chromatograaf uitgerust met een licht pulserende pomp en een geschikt detectiesysteem. Een UV-detector, ingesteld op een golflengte van 210 nm, of een brekingsindexdetector is toepasbaar voor de grote verscheidenheid van chemische groepen. De aanwezigheid van polaire groepen in de stationaire fase kan de prestaties van de HPLC-kolom in ernstige mate nadelig beïnvloeden. Om deze reden dienen stationaire fasen een zo klein mogelijk percentage polaire groepen te bevatten (16). Men kan gebruik maken van in de handel verkrijgbare, uit microdeeltjes bestaande reversed phase-pakkingen of van voorgepakte kolommen. Tussen het injectiesysteem en de analytische kolom kan een voorkolom worden geïnstalleerd.

Mobiele fase

18.

Voor de bereiding van het elutiemiddel worden methanol van HPLC-kwaliteit en gedestilleerd of gedeïoniseerd water gebruikt, en het elutiemiddel wordt voor gebruik ontgast. De elutie dient isocratisch te worden uitgevoerd. Er moeten methanol/water-verhoudingen met een wateraandeel van minimaal 25 % worden gebruikt. Een 3:1 (v/v) methanol/water-mengsel voldoet meestal goed om stoffen met een log P van 6 binnen een uur te elueren bij een debiet van 1 ml/minuut. Voor stoffen met een log P groter dan 6 kan het nodig zijn de elutietijd te verkorten (en ook die voor de referentiestoffen) door de polariteit van de mobiele fase te verlagen of de kolomlengte te reduceren.

19.

De teststof en de referentiestoffen moeten zodanig goed oplosbaar zijn in de mobiele fase dat hun concentraties detecteerbaar zijn. Aan het methanol/water-mengsel mogen alleen in uitzonderlijke gevallen hulpstoffen worden toegevoegd, aangezien ze de eigenschappen van de kolom veranderen. In die gevallen moet bevestigd worden dat de retentietijd van de test- en referentiestoffen niet wordt beïnvloed. Als methanol/water niet voldoet, kunnen andere mengsels van een organisch oplosmiddel en water worden gebruikt, bij voorbeeld ethanol/water, acetonitril/water of isopropylacohol (2-propanol)/water.

20.

Voor ioniseerbare stoffen is de pH van het eluens kritisch. Deze moet in het functionele pH-bereik van de kolom liggen, gewoonlijk tussen 2 en 8. Bufferen wordt aangeraden. Zoutprecipitatie en achteruitgang van de kolom, verschijnselen die zich bij sommige mengsels van een organische fase en een buffer kunnen voordoen, moeten worden vermeden. HPLC-metingen met stationaire fasen op basis van silica bij een pH hoger dan 8 worden doorgaans afgeraden, omdat door het gebruik van een alkalische mobiele fase de kolomprestaties snel kunnen afnemen.

Oplossingen

21.

De test- en referentiestoffen moeten voldoende zuiver zijn om de pieken in de chromatogrammen te kunnen toewijzen aan de respectieve stoffen. Stoffen die voor test- of ijkdoeleinden worden gebruikt, worden zo mogelijk in de mobiele fase opgelost. Als voor het oplossen van de test- en referentiestoffen een ander oplosmiddel dan de mobiele fase wordt gebruikt, moet de mobiele fase worden gebruikt voor de laatste verdunningsstap voorafgaand aan injectie.

Testomstandigheden

22.

De temperatuur tijdens de meting mag niet meer variëren dan ± 1 °C.

Bepaling van de dode tijd to

23.

De dode tijd t0 kan worden gemeten met behulp van organische stoffen die niet worden vastgehouden (bv. thioureum of formamide). Een nauwkeurigere waarde voor de dode tijd kan worden afgeleid uit de gemeten retentietijden van een set van ongeveer zeven stoffen uit een homologe reeks (bv. alkylmethylketonen) (17). De retentietijden tR (nC + 1) worden uitgezet tegen tR (nC), waarbij nC het aantal koolstofatomen is. Er wordt een rechte lijn, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, verkregen waarbij A, zijnde k(nC + 1)/k(nC), constant is. De dode tijd t0 wordt verkregen uit het snijpunt met de y-as (1 – A)t0 en de helling A.

Regressievergelijking

24.

De volgende stap bestaat uit het maken van een correlatiegrafiek van log k versus log P voor geschikte referentiestoffen met log P-waarden in de buurt van de waarde die voor de teststof wordt verwacht. In de praktijk worden 6 tot 10 referentiestoffen gelijktijdig geïnjecteerd. De retentietijden worden bepaald, bij voorkeur met een recorder/integrator die is aangesloten op het detectiesysteem. De corresponderende logaritmen van de capaciteitsfactoren, log k, worden uitgezet als functie van log P. De regressievergelijking wordt met regelmatige tussenpozen, ten minste eenmaal per dag, uitgevoerd zodat eventuele veranderingen in de prestaties van de kolom in aanmerking kunnen worden genomen.

BEPALING VAN DE POW VAN DE TESTSTOF

25.

De teststof wordt in de kleinste detecteerbare hoeveelheden geïnjecteerd. De retentietijd wordt in duplo bepaald. De verdelingscoëfficiënt van de teststof wordt verkregen door interpolatie van de berekende capaciteitsfactor in de ijkgrafiek. Voor zeer lage en zeer hoge verdelingscoëfficiënten is extrapolatie noodzakelijk. Vooral in deze gevallen moet aandacht worden besteed aan de betrouwbaarheidsgrenzen van de regressielijn. Als de retentietijd van een teststof buiten het voor de referentiestoffen verkregen bereik valt, moet een grenswaarde worden opgegeven.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Testverslag

26.

In het verslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

de eventuele oriënterende schatting van de verdelingscoëfficiënt, de geschatte waarden en de gebruikte methode, en indien een berekeningsmethode werd gebruikt, een volledige beschrijving daarvan inclusief opgave van de database en uitgebreide informatie over de keuze van de fragmenten;

test- en referentiestoffen: zuiverheid, structuurformule en CAS-nummer;

beschrijving van de apparatuur en chromatografische omstandigheden: analytische kolom, voorkolom;

mobiele fase, manier van detectie, temperatuurbereik, pH;

elutieprofielen (chromatogrammen);

dode tijd en hoe deze werd gemeten;

gemeten retentiewaarden en log Pow-waarden uit de literatuur voor de bij de ijking gebruikte referentiestoffen;

details van de gefitte regressielijn (log k versus log Pow), de correlatiecoëfficiënt van de lijn met de betrouwbaarheidsintervallen;

gemiddelde van de gemeten retentiewaarden en de geïnterpoleerde log Pow waarde voor de teststof;

in het geval van een mengsel: chromatogram met het elutieprofiel, met aangegeven grenswaarden;

log Pow-waarden in relatie tot het oppervlaktepercentage van de log Pow-piek;

berekening met behulp van een regressielijn;

log Pow-waarden als berekend gewogen gemiddelde, indien van toepassing.

LITERATUUR

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals — Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). „Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Aanhangsel

Methoden voor de berekening van POW

INLEIDING

1.

In dit aanhangsel wordt een korte inleiding gegeven tot de berekening van Pow. Voor meer informatie wordt de lezer naar handboeken verwezen (1) (2).

2.

Berekende waarden van Pow worden gebruikt om:

te beslissen welke experimentele methode moet worden gebruikt: de schudflesmethode bij een log Pow tussen – 2 en 4 en de HPLC-methode bij een log Pow tussen 0 en 6;

de juiste HLPC-omstandigheden te kiezen (referentiestoffen, methanol/water-verhouding);

de aannemelijkheid van experimenteel verkregen waarden te controleren;

een schatting te geven in het geval er geen experimentele methoden kunnen worden toegepast.

Principe van de berekeningsmethoden

3.

Alle voorgestelde berekeningsmethoden zijn gebaseerd op de theoretische fragmentatie van het molecuul in geschikte substructuren waarvoor betrouwbare Pow-fragmentwaarden bekend zijn. De log Pow van het volledige molecuul wordt dan berekend als de som van de fragmentwaarden en de correctietermen voor intramoleculaire interacties. Lijsten van fragmentconstanten en correctietermen zijn te vinden in de literatuur (1) (2) (3) (4) (5) (6). Sommige hiervan worden regelmatig bijgewerkt (3).

Betrouwbaarheid van berekende waarden

4.

Over het algemeen neemt de betrouwbaarheid van berekeningsmethoden af naarmate de complexiteit van de onderzochte stof toeneemt. Voor eenvoudige moleculen met een laag molecuulgewicht en slechts één of twee functionele groepen kan een afwijking van 0,1 tot 0,3 log Pow-eenheden worden verwacht tussen de resultaten van de verschillende fragmentatiemethoden en de gemeten waarden. De foutmarge is afhankelijk van de betrouwbaarheid van de gebruikte fragmentconstanten, het vermogen om intramoleculaire interacties (bv. waterstofbruggen) te herkennen en het juiste gebruik van correctietermen. In het geval van ioniserende stoffen moeten de lading en mate van ionisatie in aanmerking worden genomen (10).

Fujita-Hansch π -methode

5.

De hydrofobe-substituent-constante, π, die door Fujita et al. werd geïntroduceerd (7), wordt gedefinieerd als:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

waarbij PhX een aromatisch derivaat is en PhH de moederstof.

bv.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

De π-methode is hoofdzakelijk van belang voor aromatische stoffen. π voor een groot aantal substituenten zijn de π -waarden beschikbaar (4) (5).

Rekker-Methode

6.

Volgens de Rekker-methode (8) wordt de log Pow-waarde als volgt berekend:

Formula

waarbij ai het aantal keren is dat een bepaald fragment in het molecuul voorkomt en fi de log Pow-toename van het fragment is. De interactietermen kunnen worden uitgedrukt als een gehele veelvoud van één enkele constante Cm (de zogenaamde „magische constante”). De fragmentconstanten fi en Cm zijn bepaald op grond van een lijst van 1 054 experimentele Pow-waarden (825 stoffen) met behulp van meervoudige regressieanalyse (6) (8). De bepaling van de interactietermen wordt uitgevoerd volgens vaste regels (6) (8) (9).

Hansch-Leo-methode

7.

Volgens de methode volgens Hansch en Leo (4) wordt de log Pow-waarde berekend als:

Formula

waarbij fi een fragmentconstante is, Fj een correctieterm (factor), ai en bj de corresponderende frequentie van voorkomen. Uit experimentele Pow-waarden zijn door „trial and error” lijsten van fragmentwaarden voor atomen en groepen en van correctietermen Fj afgeleid. De correctietermen zijn ingedeeld in verschillende klassen (1) (4). Er zijn softwarepakketten ontwikkeld voor berekeningen waarbij alle regels en correctietermen in aanmerking worden genomen (3).

GECOMBINEERDE METHODE

8.

De berekening van de log Pow van complexe moleculen kan aanzienlijk worden verbeterd als het molecuul wordt opgesplitst in grotere substructuren waarvoor betrouwbare log Pow-waarden beschikbaar zijn, hetzij uit tabellen (3) (4) of uit bestaande metingen. Zulke fragmenten (bv. heterocyclische structuren, antrachinon, azobenzeen) kunnen dan gecombineerd worden met de π-waarden volgens Hansch of met de fragmentconstanten volgens Rekker of Leo.

Opmerkingen

i)

Voor gedeeltelijk of volledig geïoniseerde stoffen kunnen de berekeningsmethoden alleen worden toegepast wanneer rekening wordt gehouden met de nodige correctiefactoren.

ii)

Als de aanwezigheid van intramoleculaire waterstofbruggen kan worden aangenomen, moeten de desbetreffende correctietermen (ongeveer + 0,6 tot + 1,0 log Pow-eenheden) bij het resultaat worden opgeteld (1). Aanwijzingen voor de aanwezigheid van waterstofbruggen kunnen uit stereomodellen of spectroscopische gegevens worden verkregen.

iii)

Als meerdere tautomere vormen mogelijk zijn, moet de berekening gebaseerd worden op de meest waarschijnlijke vorm.

iv)

Het is belangrijk de herzieningen van lijsten van fragmentconstanten in de gaten te houden.

LITERATUUR OVER BEREKENINGSMETHODEN

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

3)

Hoofdstuk C.3 wordt vervangen door:

C.3.   ZOETWATERALGEN EN CYANOBACTERIËN: GROEIREMMINGSTEST

INLEIDING

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 201 (2006, bijlage gecorrigeerd in 2011) van de OESO. De testmethode moest worden herzien om er meer soorten in op te nemen en aan te sluiten bij de eisen inzake risico-evaluatie en de indeling van chemische stoffen. Deze herziening is uitgevoerd op basis van uitgebreide praktische ervaring, vorderingen van de wetenschap op het gebied van toxiciteitsonderzoek met algen en uitgebreid gebruik in het kader van regelgeving sinds de oorspronkelijke vaststelling.

2.

De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

PRINCIPE VAN DE TEST

3.

Deze test is bedoeld om de effecten van een chemische stof op de groei van zoetwatermicroalgen en/of cyanobacteriën te bepalen. Exponentieel groeiende testorganismen worden gedurende normaal gesproken 72 uur in batchculturen aan de teststof blootgesteld. Ondanks de betrekkelijk korte duur van de test kunnen de effecten over verschillende generaties worden bepaald.

4.

De respons van het systeem is de afname van de groei in een reeks algenculturen (testeenheden) die aan verschillende concentraties van een teststof worden blootgesteld. De respons wordt bepaald als functie van de blootstellingsconcentratie in vergelijking met de gemiddelde groei van een duploreeks van niet-blootgestelde controleculturen. Om de respons van het systeem op toxische effecten volledig tot uitdrukking te laten komen (optimale gevoeligheid) laat men de culturen onbeperkt exponentieel groeien met voldoende nutriënten en continu licht gedurende een periode die lang genoeg is om een afname van de specifieke groeisnelheid te kunnen meten.

5.

De groei en de remming van de groei worden kwantitatief bepaald door de biomassa van de algen als functie van de tijd te meten. De biomassa van de algen wordt gedefinieerd als het drooggewicht per volume-eenheid, bv. mg algen/liter testoplossing. Omdat het drooggewicht echter moeilijk te bepalen is, worden vaak vervangende parameters gebruikt. Het aantal cellen is de meest gangbare van deze parameters. Andere mogelijkheden zijn celvolume, fluorescentie, optische dichtheid enz. Er moeten omrekeningsfactoren bekend zijn tussen de gemeten vervangende parameter en de biomassa.

6.

Het eindpunt van de test is groeiremming, uitgedrukt als de logaritmische toename van de biomassa (gemiddelde specifieke groeisnelheid) gedurende de blootstellingsperiode. Op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheden die in een reeks testoplossingen worden geregistreerd, wordt de concentratie bepaald die een specifiek percentage remming van de groeisnelheid ('growth rate') (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de ErCx (bv. ErC50).

7.

Bij deze testmethode wordt ook de opbrengst ('yield') als responsvariabele gebruikt; deze kan in bepaalde landen nodig zijn om aan specifieke voorschriften in de regelgeving te voldoen. De opbrengst wordt gedefinieerd als de biomassa aan het eind van de blootstellingsperiode verminderd met de biomassa aan het begin van de blootstellingsperiode. Op basis van de opbrengst die in een reeks testoplossingen wordt geregistreerd, wordt de concentratie berekend die een specifiek percentage verlaging van de opbrengst (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de EyCx (bv. EyC50).

8.

Daarnaast kunnen langs statistische weg de laagste concentratie met waargenomen effect (LOEC) en de concentratie zonder waargenomen effect (NOEC) worden bepaald.

INFORMATIE OVER DE TESTSTOF

9.

De informatie over de teststof, die nuttig kan zijn om de testomstandigheden te bepalen, omvat bijvoorbeeld de structuurformule, zuiverheid, stabiliteit in licht, stabiliteit onder de testomstandigheden, lichtabsorberende eigenschappen, pKa en resultaten van onderzoek naar de omzetting van de stof, waaronder de biologische afbreekbaarheid in water.

10.

De oplosbaarheid in water, de verdelingscoëfficiënt octanol/water (Pow) en de dampspanning van de teststof moeten bekend zijn en er moet een gevalideerde methode beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de stof in de testoplossingen met een gerapporteerde recovery en detectiegrens.

GELDIGHEID VAN DE TEST

11.

Voor een geldige test moet aan de volgende criteria worden voldaan:

De biomassa in de controleculturen moet binnen de testperiode van 72 uur exponentieel met ten minste een factor 16 zijn toegenomen. Dit komt overeen met een specifieke groeisnelheid van 0,92 dag– 1. Voor de meest gebruikte soorten is de groeisnelheid meestal aanzienlijk hoger (zie aanhangsel 2). Wanneer soorten worden gebruikt die trager groeien dan de in aanhangsel 2 vermelde soorten, wordt wellicht niet aan dit criterium voldaan. In dat geval moet de testperiode worden verlengd, zodat in de controleculturen ten minste een groei met een factor 16 wordt verkregen, terwijl de groei gedurende de hele testperiode exponentieel moet zijn. De testperiode kan worden ingekort, maar moet ten minste 48 uur zijn, om gedurende de test een onbeperkte, exponentiële groei te houden, zolang de vermenigvuldigingsfactor minimaal 16 is.

De gemiddelde variatiecoëfficiënt voor partiële specifieke groeisnelheden (dagen 0-1, 1-2 en 2-3 voor tests van 72 uur) in de controleculturen (zie aanhangsel 1 onder „variatiecoëfficiënt”) mag niet hoger zijn dan 35 %. Zie punt 49 voor de berekening van de partiële specifieke groeisnelheid. Dit criterium geldt voor de gemiddelde waarde van variatiecoëfficiënten die voor replicaatcontroleculturen worden berekend.

De variatiecoëfficiënt van gemiddelde specifieke groeisnelheden gedurende de hele testperiode in replicaatcontroleculturen mag bij tests met Pseudokirchneriella subcapitata en Desmodesmus subspicatus niet hoger zijn dan 7 %. Voor andere minder vaak gebruikte soorten mag deze waarde niet hoger zijn dan 10 %.

REFERENTIESTOF

12.

Er kunnen een of meer referentiestoffen worden getest, zoals 3,5-dichloorfenol dat in het internationale ringonderzoek is gebruikt (1), om de testprocedure te controleren. Kaliumdichromaat kan ook als referentiestof voor groene algen worden gebruikt. Het is wenselijk een referentiestof ten minste twee keer per jaar te testen.

TOEPASBAARHEID VAN DE TEST

13.

Deze testmethode kan het gemakkelijkst worden toegepast op stoffen die oplosbaar zijn in water en waarvan kan worden verwacht dat ze onder de testomstandigheden in oplossing blijven. Voor het testen van chemische stoffen die vluchtig zijn, sterk adsorberen, gekleurd zijn, slecht oplosbaar zijn in water of nadelige gevolgen kunnen hebben voor de beschikbaarheid van nutriënten of mineralen in het testmedium, kan het nodig zijn de beschreven procedure op bepaalde punten aan te passen (bv. een gesloten systeem of conditionering van de testvaten). In de literatuur (2), (3) en (4) wordt een leidraad gegeven voor enkele geschikte aanpassingen.

BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

Apparatuur

14.

Testvaten en andere apparaten die in aanraking komen met de testoplossingen, mogen alleen uit glas of een ander chemisch inert materiaal bestaan. Alle voorwerpen moeten grondig worden gewassen om ervoor te zorgen dat er geen organische of anorganische verontreinigingen zijn die invloed kunnen hebben op de groei van de algen of de samenstelling van de testoplossingen.

15.

Als testvat zullen normaal gesproken glazen kolven worden gebruikt die zo groot zijn dat het volume van de cultuur groot genoeg is voor metingen tijdens de test en een afdoende massaoverdracht van CO2 uit de lucht mogelijk is (zie punt 30). Let op dat het volume van de vloeistof groot genoeg moet zijn voor de analyses (zie punt 37).

16.

Daarnaast kan (een deel van) de volgende apparatuur nodig zijn:

Kweekapparatuur: aanbevolen wordt een kast of kamer waarin de gekozen incubatietemperatuur tot op ± 2 °C nauwkeurig kan worden gehandhaafd.

Instrumenten voor lichtmeting: er moet rekening mee worden gehouden dat de meetmethode voor de lichtintensiteit en met name de aard van de receptor (collector) de gemeten waarde kan beïnvloeden. De metingen moeten bij voorkeur worden uitgevoerd met een sferische (4 π) receptor (die reageert op direct en gereflecteerd licht uit alle hoeken boven en onder het meetvlak) of een 2 π (die reageert op licht uit alle hoeken boven het meetvlak).

Apparatuur om de biomassa van de algen te bepalen. De meest gebruikte vervangende parameter voor de biomassa van de algen is het aantal cellen, dat kan worden bepaald met een elektronische deeltjesteller, een microscoop met een telkamer of een flowcytometer. Andere vervangende parameters voor de biomassa kunnen worden gemeten met een flowcytometer, een fluorimeter, een spectrofotometer of een colorimeter. Er moet een omrekeningsfactor worden berekend voor het verband tussen aantal cellen en drooggewicht. Om bij gebruik van een spectrofotometer bij lage biomassaconcentraties bruikbare metingen uit te kunnen voeren kan het nodig zijn cuvetten te gebruiken met een optische weglengte van ten minste 4 cm.

Testorganismen

17.

Er kunnen verschillende soorten los groeiende microalgen en cyanobacteriën worden gebruikt. Van de in aanhangsel 2 vermelde stammen is aangetoond dat ze geschikt zijn voor de in deze testmethode beschreven testprocedure.

18.

Als andere soorten worden gebruikt, moeten de stam en/of de herkomst worden vermeld. Bevestig dat de gekozen algen onder de gebruikte omstandigheden gedurende de hele testperiode exponentieel kunnen blijven groeien.

Groeimedium

19.

Er worden twee groeimedia aanbevolen: het OESO-medium en het AAP-medium. De samenstelling van deze media wordt in aanhangsel 3 vermeld. Let op dat de aanvankelijke pH-waarde en de buffercapaciteit (die de pH-stijging reguleert) voor deze media verschillen. Dit betekent dat de resultaten van de tests afhankelijk van het gebruikte medium kunnen verschillen, vooral wanneer ionogene chemische stoffen worden getest.

20.

In bepaalde gevallen kan het nodig zijn de groeimedia te wijzigen, bijvoorbeeld wanneer metalen en chelaatvormers worden getest of wanneer bij andere pH-waarden wordt getest. Wanneer een gewijzigd medium wordt gebruikt, moet dit gedetailleerd worden beschreven en moet een motivering worden gegeven (3) (4).

Aanvankelijke biomassaconcentratie

21.

De aanvankelijke biomassaconcentratie moet in alle testculturen even groot zijn en moet klein genoeg zijn om zonder risico op een tekort aan nutriënten exponentiële groei gedurende de hele incubatieperiode mogelijk te maken. De aanvankelijke biomassaconcentratie mag niet groter zijn dan 0,5 mg/l als drooggewicht. De volgende beginconcentraties cellen worden aanbevolen:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 cellen/ml

Desmodesmus subspicatus

2-5 × 103 cellen/ml

Navicula pelliculosa

104 cellen/ml

Anabaena flos-aquae

104 cellen/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 cellen/ml

Concentraties van de teststof

22.

Op basis van de resultaten van bereikbepalingstests kan het concentratiebereik worden bepaald waar effecten te verwachten zijn. Voor de definitieve test moeten ten minste vijf concentraties worden gekozen die een meetkundige reeks vormen met een reden van ten hoogste 3,2. Voor teststoffen met een vlakke concentratie-responscurve moet wellicht een hogere reden worden gekozen. De concentratiereeks moet bij voorkeur het interval bestrijken waar 5-75 % remming van de groeisnelheid optreedt.

Replicaten en controles

23.

Elke testconcentratie moet in triplo worden getest. Als bepaling van de NOEC niet nodig is, mag het aantal concentraties worden vergroot en het aantal replicaten per concentratie worden verkleind. De controlebepaling moet ten minste in triplo worden uitgevoerd en het aantal controles moet liefst twee keer zo groot zijn als het aantal replicaten dat voor elke testconcentratie wordt gebruikt.

24.

Voor de analyse van de teststofconcentraties kan een aparte reeks testoplossingen worden bereid (zie punten 36 en 38).

25.

Wanneer een oplosmiddel wordt gebruikt om de teststof in oplossing te brengen, moeten extra controles worden opgenomen met dezelfde concentratie oplosmiddel als in de testculturen.

Bereiding van de entcultuur

26.

Om de algen aan de testomstandigheden te laten adapteren en ervoor te zorgen dat ze in de exponentiële groeifase zijn wanneer ze voor het beënten van de testoplossingen worden gebruikt, wordt 2-4 dagen vóór het begin van de test een entcultuur in het testmedium gemaakt. De hoeveelheid biomassa van de algen moet zo groot zijn dat exponentiële groei in de entcultuur tot het begin van de test mogelijk is. Incubeer de entcultuur onder dezelfde omstandigheden als de testculturen. Meet de toename van de biomassa in de entcultuur om na te gaan of de groei onder de kweekomstandigheden binnen het normale bereik voor de teststam ligt. In aanhangsel 4 wordt een voorbeeld gegeven van de procedure voor het kweken van algen gegeven. Om synchrone celdelingen tijdens de test te voorkomen kan een tweede vermeerderingsstap van de entcultuur nodig zijn.

Bereiding van de testoplossingen

27.

Alle testoplossingen moeten dezelfde concentratie groeimedium en dezelfde hoeveelheid biomassa aan algen bevatten. De testoplossingen met de gekozen concentraties worden meestal bereid door een stamoplossing van de teststof met groeimedium en entcultuur te mengen. Stamoplossingen worden normaal gesproken bereid door de chemische stof in testmedium op te lossen.

28.

Om slecht in water oplosbare chemische stoffen in het testmedium op te nemen kunnen oplosmiddelen zoals aceton, tert-butanol en dimethylformamide als drager worden gebruikt (2) (3). De oplosmiddelconcentratie mag niet hoger zijn dan 100 μl/l en aan alle culturen (met inbegrip van de controles) in de testreeks moet dezelfde concentratie oplosmiddel worden toegevoegd.

Incubatie

29.

De testvaten worden afgesloten met een luchtdoorlatende stop. Ze worden geschud en in het kweekapparaat gezet. Tijdens de test moeten de algen in suspensie worden gehouden en moet de overdracht van CO2 worden bevorderd. Daartoe moet voortdurend worden geschud of geroerd. De culturen moeten op een temperatuur tussen 21 °C en 24 °C worden gehouden, gereguleerd tot op ± 2 °C nauwkeurig. Voor andere soorten dan in aanhangsel 2 worden vermeld, bv. tropische soorten, zijn hogere temperaturen wellicht geschikt, mits aan de geldigheidscriteria kan worden voldaan. Er wordt aanbevolen de kolven een willekeurige plaats te geven en hun plaats in de incubator elke dag te veranderen.

30.

De pH van het controlemedium mag gedurende de test niet meer dan 1,5 eenheden stijgen. Voor metalen en chemische stoffen die bij een pH in de buurt van de pH van de test gedeeltelijk ioniseren, kan het nodig zijn de pH-verschuiving te beperken om reproduceerbare en goed gedefinieerde resultaten te verkrijgen. Een verschuiving van minder dan 0,5 pH-eenheid is technisch haalbaar en kan worden bereikt door te zorgen voor een afdoende massaoverdracht van CO2 vanuit de omgevingslucht naar de testoplossing, bijvoorbeeld door de schudsnelheid op te voeren. Het is ook mogelijk de behoefte aan CO2 te verminderen door de aanvankelijke hoeveelheid biomassa of de duur van de test te verlagen.

31.

Het oppervlak waar de culturen worden geïncubeerd, moet continu worden verlicht met uniform fluorescerend licht, bv. van het type „cool white” (koel wit) of „daylight” (daglicht). De lichtvereisten zijn niet voor alle stammen algen en cyanobacteriën gelijk. De lichtintensiteit moet zodanig worden gekozen dat deze geschikt is voor het gebruikte testorganisme. Voor de aanbevolen soorten groene algen moet de lichtintensiteit ter hoogte van de testoplossingen binnen het bereik 60-120 μE · m– 2 · s– 1 liggen, gemeten met een geschikte receptor binnen het voor fotosynthese effectieve golflengtebereik van 400-700 nm. Sommige soorten, met name Anabaena flos-aquae, groeien goed bij een lage lichtintensiteit en kunnen bij een hoge intensiteit worden beschadigd. Voor deze soorten moet een gemiddelde lichtintensiteit binnen het bereik 40-60 μE·m– 2 · s– 1 worden gekozen. (Voor lichtmeetinstrumenten die in lux gekalibreerd zijn, komt een bereik van 4 440-8 880 lux voor „cool white” licht ongeveer overeen met de aanbevolen lichtintensiteit 60-120 μE·m– 2 · s– 1). De lichtintensiteit mag niet meer dan ± 15 % afwijken van de over het incubatieoppervlak gemiddelde lichtintensiteit.

Testduur

32.

De test duurt normaal gesproken 72 uur. De duur van de test mag echter ook korter of langer zijn, mits aan alle geldigheidscriteria van punt 11 kan worden voldaan.

Metingen en analyses

33.

Gedurende de testperiode wordt ten minste één keer per dag de biomassa van de algen in elke kolf bepaald. Als de metingen worden uitgevoerd met kleine volumes die met een pipet uit de testoplossing worden gehaald, mogen deze niet worden vervangen.

34.

Meting van de biomassa gebeurt door handmatige celtelling met een microscoop of met een elektronische deeltjesteller (door telling van cellen en/of bepaling van biovolume). Ook andere technieken kunnen worden gebruikt, zoals flowcytometrie, in vitro of in vivo chlorofylfluorescentie (5) (6) of optische dichtheid, mits voor de hoeveelheden die bij de test worden gevonden, een bevredigende correlatie met de biomassa kan worden aangetoond.

35.

Aan het begin en aan het eind van de test wordt de pH van de oplossingen gemeten.

36.

Mits een analyseprocedure voor het bepalen van de teststof in het gebruikte concentratiebereik beschikbaar is, moeten de testoplossingen worden geanalyseerd om de beginconcentraties en het behoud van de blootstellingsconcentraties tijdens de test te controleren.

37.

Wanneer het waarschijnlijk is dat de blootstellingsconcentraties gedurende de test minder dan 20 % van de nominale waarden zullen afwijken, kan een analyse van de concentratie van de teststof aan het begin en het eind van de test bij een lage en een hoge testconcentratie en een concentratie rond de verwachte EC50 voldoende zijn. Wanneer het onwaarschijnlijk is dat de concentraties binnen 80-120 % van de nominale waarde blijven, wordt een analyse van alle testconcentraties aan het begin en het eind van de test aanbevolen. Bij vluchtige, instabiele of sterk adsorberende teststoffen wordt daarnaast aanbevolen om gedurende de blootstellingsperiode om de 24 uur een monster te analyseren om beter te kunnen bepalen hoeveel teststof verloren gaat. Voor deze chemische stoffen kunnen extra replicaten nodig zijn. In alle gevallen hoeft de bepaling van de teststofconcentratie slechts op één van de replicaatvaten voor elke testconcentratie te worden uitgevoerd (of op de gecombineerde inhoud van de replicaatvaten).

38.

De testmedia die specifiek worden bereid voor de analyse van de blootstellingsconcentraties gedurende de test, moeten net zo worden behandeld als die welke voor de test worden gebruikt, d.w.z. ze moeten met algen worden beënt en onder identieke omstandigheden worden geïncubeerd. Als de concentratie van de opgeloste teststof moet worden bepaald, kan het nodig zijn de algen van het medium te scheiden. De scheiding moet bij voorkeur gebeuren door centrifugeren met een laag toerental dat voldoende is om de algen te laten bezinken.

39.

Als kan worden aangetoond dat de concentratie van de geteste stof gedurende de gehele test op afdoende wijze binnen ± 20 % van de nominale of gemeten beginconcentratie is gebleven, kan de analyse van de resultaten op basis van de nominale of gemeten beginwaarden worden uitgevoerd. Als de afwijking van de nominale of gemeten beginconcentratie niet binnen de marge van ± 20 % ligt, moet de analyse van de resultaten worden uitgevoerd op basis van het meetkundige gemiddelde van de concentratie gedurende de blootstelling of op basis van modellen waarmee de afname van de concentratie van de teststof wordt beschreven (3) (7).

40.

De groeiremmingstest met algen is een dynamischer testsysteem dan de meeste andere tests op aquatische toxiciteit op korte termijn. Dit betekent dat de feitelijke blootstellingsconcentraties moeilijk te bepalen kunnen zijn, vooral voor adsorberende chemische stoffen die bij lage concentraties worden getest. In die gevallen betekent het verdwijnen van de teststof uit de oplossing door adsorptie aan de toenemende biomassa van de algen niet dat deze uit het testsysteem verloren gaat. Wanneer het resultaat van de test wordt geanalyseerd, moet worden gecontroleerd of een daling van de concentratie van de teststof in de loop van de test gevolgd wordt door een daling van de groeiremming. Als dit het geval is, kan worden overwogen een geschikt model te gebruiken om de daling van de concentratie van de teststof te beschrijven (7). Als dit niet het geval is, zal het wellicht correct zijn om de analyse van de resultaten op basis van de (nominale of gemeten) beginconcentraties uit te voeren.

Andere opmerkingen

41.

Er moet een microscopische observatie worden uitgevoerd om na te gaan of de entcultuur een normaal en gezond uiterlijk heeft en om een eventueel abnormaal uiterlijk van de algen (wellicht veroorzaakt door de blootstelling aan de teststof) aan het eind van de test te detecteren.

Limiettest

42.

Onder bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld wanneer een oriënterende test erop wijst dat de teststof in concentraties tot 100 mg/l of tot de oplosbaarheidsgrens in het testmedium (als deze lager ligt) geen toxische effecten heeft, kan een limiettest worden uitgevoerd, waarbij de respons in een controlegroep en één dosisgroep (100 mg/ml of een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheidsgrens) wordt vergeleken. Er wordt sterk aanbevolen dit te ondersteunen met een analyse van de blootstellingsconcentratie. Alle in het voorgaande beschreven testomstandigheden en geldigheidscriteria zijn ook van toepassing bij een limiettest, alleen moet het aantal replicaten in de dosisgroep ten minste zes zijn. De responsvariabelen in de controlegroep en de dosisgroep kunnen worden geanalyseerd met behulp van een statistische toets om gemiddelden te vergelijken, bijvoorbeeld een t-toets van Student. Als de variantie in de twee groepen niet gelijk is, moet een aangepaste t-toets voor ongelijke varianties worden uitgevoerd.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Uitzetting van de groeicurven

43.

De biomassa in de testvaten kan worden uitgedrukt in eenheden van de voor de meting gebruikte vervangende parameter (bv. aantal cellen of fluorescentie).

44.

Maak een tabel met de geschatte biomassaconcentratie in de testculturen en de controles en daarnaast de concentraties teststof en de meettijdstippen met een resolutie van ten minste hele uren om zo de groeicurven uit te kunnen zetten. Bij deze eerste stap kan zowel een logaritmische schaal als een lineaire schaal nuttig zijn, maar een logaritmische schaal is verplicht en levert meestal een betere presentatie op van de variaties in het groeipatroon gedurende de testperiode. Wanneer de exponentiële groei op een logaritmische schaal wordt uitgezet, levert dit een rechte lijn op met als helling de specifieke groeisnelheid.

45.

Ga met behulp van de curven na of de controleculturen gedurende de hele test met de verwachte snelheid exponentieel groeien. Kijk met een kritisch oog naar alle datapunten en de vorm van de grafieken en controleer de ruwe gegevens en procedures op mogelijke fouten. Controleer vooral punten waarvan de afwijking het gevolg van een systematische fout lijkt. Als duidelijk is dat er sprake is van fouten in de procedures en/of deze zeer waarschijnlijk zijn, moet het desbetreffende punt als uitbijter worden beschouwd en niet in de verdere statistische analyses worden opgenomen. (Een algenconcentratie van nul in een van de twee of drie replicaatvaten kan erop wijzen dat het testvat niet correct beënt is of niet goed schoongemaakt was.) In het verslag moet duidelijk worden vermeld om welke redenen een bepaald punt als uitbijter is beschouwd. Alleen (zeldzame) fouten in de procedures worden als reden geaccepteerd en dit geldt niet voor alleen een slechte precisie. Statistische procedures om te bepalen wat een uitbijter is, zijn voor een probleem van dit type maar beperkt bruikbaar en kunnen niet als vervanging voor een deskundig oordeel worden gebruikt. Uitbijters (als zodanig gemarkeerd) moeten bij voorkeur niet worden verwijderd uit later weergegeven grafieken of tabellen met gegevens.

Responsvariabelen

46.

De test is bedoeld om de effecten van de teststof op de groei van algen te bepalen. In deze testmethode worden twee responsvariabelen beschreven, aangezien verschillende rechtsgebieden verschillende voorkeuren en behoeften qua regelgeving hebben. De testresultaten zijn alleen in alle rechtsgebieden aanvaardbaar als de effecten met beide onderstaande responsvariabelen a) en b) worden bepaald:

(a)    Gemiddelde specifieke groeisnelheid : deze responsvariabele wordt berekend op basis van de logaritmische toename van de biomassa gedurende de testperiode, uitgedrukt per dag;

(b)    Opbrengst : dit is de biomassa aan het eind van de test verminderd met de biomassa aan het begin.

47.

Er moet worden opgemerkt dat de met behulp van deze twee responsvariabelen berekende waarden voor de toxiciteit niet vergelijkbaar zijn, en bij gebruik van de resultaten van de test moet met dit verschil rekening worden gehouden. Vanwege de mathematische grondslagen van de respectieve benaderingen zullen de ECx -waarden op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheid (ErCx) in het algemeen hoger zijn dan de resultaten op basis van de opbrengst (EyCx) als de testomstandigheden van deze testmethode worden aangehouden. Dit moet niet worden opgevat als een verschil in gevoeligheid tussen de twee responsvariabelen, maar zuiver als een mathematisch verschil tussen de waarden. Het begrip gemiddelde specifieke groeisnelheid is gebaseerd op het algemene exponentiële groeipatroon van algen in niet-beperkte culturen, waarbij de toxiciteit wordt geschat op basis van de effecten op de groeisnelheid, zonder dat deze afhankelijk is van het absolute niveau van de specifieke groeisnelheid van de controle, van de helling van de concentratie-responscurve of van de duur van de test. De resultaten op basis van de responsvariabele opbrengst zijn daarentegen afhankelijk van al deze andere variabelen. De EyCx is afhankelijk van de specifieke groeisnelheid van de bij elke test gebruikte algensoort en van de maximale specifieke groeisnelheid die van soort tot soort en zelfs van stam tot stam kan verschillen. Deze responsvariabele moet niet worden gebruikt om de gevoeligheid voor toxische stoffen te vergelijken tussen algensoorten en zelfs niet tussen verschillende stammen. De wetenschap geeft weliswaar de voorkeur aan het gebruik van de gemiddelde specifieke groeisnelheid om de toxiciteit te schatten, maar in deze testmethode wordt ook de bepaling van de toxiciteit op basis van de opbrengst opgenomen om te voldoen aan de vereisten in de huidige regelgeving in bepaalde landen.

Gemiddelde groeisnelheid

48.

De gemiddelde specifieke groeisnelheid voor een bepaalde periode wordt voor elk testvat (controle of behandeld) met de volgende vergelijking berekend als de logaritmische toename van de biomassa [1]:

Formula

[1],

waarbij

μi-j

de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip i tot tijdstip j;

Xi

de biomassa op tijdstip i;

Xj

de biomassa op tijdstip j.

Voor elke dosisgroep en controlegroep wordt een gemiddelde waarde voor de groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie.

49.

Bereken de gemiddelde specifieke groeisnelheid over de hele duur van de test (normaal gesproken dagen 0-3) met de nominaal geënte biomassa als startwaarde en niet een gemeten startwaarde, omdat op deze manier meestal een grotere precisie wordt bereikt. Als de voor de meting van de biomassa gebruikte apparatuur een voldoende precieze bepaling van de geringe biomassa in het inoculum mogelijk maakt (bv. een flowcytometer), kan de gemeten aanvankelijke biomassaconcentratie worden gebruikt. Bepaal tevens de partiële groeisnelheid, berekend als de specifieke groeisnelheden voor elke dag gedurende de test (dagen 0-1, 1-2 en 2-3) en ga na of de controlegroeisnelheid constant blijft (zie de geldigheidscriteria in punt 11). Wanneer de specifieke groeisnelheid op dag 1 significant lager is dan de totale gemiddelde specifieke groeisnelheid, wijst dit op een lag-fase. Een lag-fase kan in controleculturen worden beperkt en vrijwel geëlimineerd door een juiste vermeerdering van de voorcultuur, maar een lag-fase bij behandelde culturen kan wijzen op herstel na aanvankelijke toxische stress of een verminderde blootstelling door verlies van de teststof (bijvoorbeeld door sorptie aan de algenbiomassa) na de aanvankelijke blootstelling. Dit betekent dat de partiële groeisnelheid kan worden bepaald om de effecten van de teststof gedurende de blootstellingsperiode te evalueren. Aanzienlijke verschillen tussen de partiële groeisnelheid en de gemiddelde groeisnelheid wijzen erop dat de groei niet voortdurend exponentieel is en dat de groeicurven grondig moeten worden bestudeerd.

50.

De procentuele remming van de groeisnelheid wordt voor elk dosisreplicaat berekend met de volgende vergelijking [2]:

Formula

[2],

waarbij

%Ir

procentuele remming van de gemiddelde specifieke groeisnelheid;

μC

gemiddelde waarde van de gemiddelde specifieke groeisnelheid (μ) in de controlegroep;

μT

gemiddelde specifieke groeisnelheid in de dosisgroep.

51.

Wanneer oplosmiddelen worden gebruikt om de teststof in oplossing te brengen, moeten bij de berekening van de procentuele remming niet de controles zonder oplosmiddel maar de oplosmiddelcontroles worden gebruikt.

Opbrengst

52.

De opbrengst wordt voor elk testvat van de dosis- en controlegroepen berekend als de biomassa aan het eind van de test verminderd met de biomassa aan het begin. Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de opbrengst berekend en een waarde voor de variantie. De procentuele remming van de opbrengst ( %Iy) kan voor elk dosisreplicaat als volgt worden berekend:

Formula

[3]

waarbij

% Iy

procentuele remming van de opbrengst;

YC

gemiddelde waarde van de opbrengst in de controlegroep;

YT

waarde voor de opbrengst in de dosisgroep.

Uitzetting van de concentratie-responscurve

53.

De procentuele remming wordt uitgezet tegen de logaritme van de concentratie van de teststof en de curve wordt zorgvuldig bestudeerd, waarbij elk punt dat in de eerste fase als uitbijter is beschouwd, niet wordt gebruikt. Trek op het oog of met behulp van computerinterpolatie een vloeiende lijn door de punten om een eerste indruk te krijgen van de concentratie-responsrelatie en gebruik daarna een gedetailleerdere methode, bij voorkeur een gecomputeriseerde statistische methode. Afhankelijk van het beoogde gebruik van de gegevens, de kwaliteit (precisie) van de gegevens en de hoeveelheid gegevens alsmede de beschikbaarheid van instrumenten voor gegevensanalyse kan worden besloten (soms volledig terecht) de gegevensanalyse in deze fase te beëindigen en de kerncijfers EC50 en EC10 (en/of EC20) simpelweg uit de op het oog getrokken curve af te lezen (zie ook de onderstaande tekst over stimulerende effecten). Geldige redenen om niet gebruik te maken van een statistische methode kunnen bijvoorbeeld zijn:

De gegevens zijn niet geschikt voor gecomputeriseerde methoden om betrouwbaarder resultaten te verkrijgen dan op grond van een deskundig oordeel mogelijk is — in dergelijke situaties is het mogelijk dat sommige computerprogramma's zelfs geen betrouwbare oplossing opleveren (iteraties die wellicht niet convergeren enz.).

Een respons waarbij de groei wordt gestimuleerd, kan met de beschikbare computerprogramma's niet afdoende worden verwerkt (zie hieronder).

Statistische procedures

54.

Het is de bedoeling om met behulp van regressieanalyse een kwantitatieve concentratie-responsrelatie te verkrijgen. Het is mogelijk een gewogen lineaire regressie te gebruiken nadat op de responsgegevens een lineariserende transformatie is uitgevoerd, bijvoorbeeld naar probit-, logit- of Weibull-eenheden (8), maar de voorkeur wordt gegeven aan niet-lineaire regressieprocedures, die beter omgaan met onvermijdelijke onregelmatigheden in gegevens en afwijkingen van uniforme verdelingen. In de buurt van het nulpunt of totale remming kunnen dergelijke onregelmatigheden door de transformatie worden uitvergroot en kunnen ze de analyse storen (8). Er moet worden opgemerkt dat standaardmethoden voor analyses met behulp van probit-, logit- of Weibull-transformaties bedoeld zijn voor gebruik bij een binaire respons (bv. sterfte of overleven) en moeten worden aangepast om voor groei- of biomassadata te kunnen worden gebruikt. Specifieke procedures voor de bepaling van ECx-waarden uit continue data zijn te vinden in (9), (10) en (11). Het gebruik van niet-lineaire regressieanalyse wordt in aanhangsel 5 nader beschreven.

55.

Voor elke te analyseren responsvariabele wordt de concentratie-responsrelatie gebruikt voor de berekening van puntschattingen van ECx-waarden. Waar mogelijk moeten voor elke schatting de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden bepaald. De kwaliteit van de fitting van de responsgegevens op het regressiemodel moet grafisch of statistisch worden bepaald. De regressieanalyse moet met responsen van individuele replicaten worden uitgevoerd en niet met gemiddelden van dosisgroepen. Als niet-lineaire fitting van de curve echter moeilijk is of niet lukt vanwege een te grote spreiding in de gegevens, kan het probleem worden omzeild door de regressie uit te voeren op groepsgemiddelden om zo op praktische wijze de invloed van vermoedelijke uitbijters te beperken. Wanneer deze mogelijkheid wordt gebruikt, moet dit in het testverslag worden vermeld als een afwijking van de normale procedure, omdat fitting van de curve met individuele replicaten geen goede resultaten opleverde.

56.

Als de beschikbare regressiemodellen/methoden niet geschikt zijn voor de gegevens, kunnen de EC50 en de betrouwbaarheidsgrenzen ook worden bepaald met behulp van lineaire interpolatie met bootstrapping (13).

57.

Voor de bepaling van de LOEC en daaruit de NOEC, voor de effecten van de teststof op de groeisnelheid, moeten de gemiddelden van de dosisgroepen worden vergeleken met behulp van variantieanalyse-technieken (ANOVA). Het gemiddelde voor elke concentratie moet dan worden vergeleken met het gemiddelde van de controlegroep met behulp van een geschikte methode voor meervoudige vergelijking of trendtoets. Hiervoor kan de Dunnett- of Williams-toets geschikt zijn (12) (14) (15) (16) (17). Er moet worden bepaald of de ANOVA-aanname van homogeniteit van variantie opgaat. Deze bepaling kan grafisch worden uitgevoerd of met een formele toets (17). Hiervoor kan de Levene- of Bartlett-toets worden gebruikt. Wanneer de aanname van homogeniteit van variantie niet opgaat, kan dit soms worden gecorrigeerd door logaritmische transformatie van de gegevens. Als de heterogeniteit van variantie extreem is en niet door transformatie kan worden gecorrigeerd, moet een analyse met methoden als de stap-omlaag-trendtoets van Jonckheere worden overwogen. Aanvullende richtsnoeren voor het bepalen van de NOEC zijn te vinden in (11).

58.

Recente wetenschappelijke ontwikkelingen hebben geleid tot een aanbeveling om het begrip NOEC niet langer te gebruiken en te vervangen door op regressie gebaseerde puntschattingen van ECx. Voor deze algentest is geen geschikte waarde voor x vastgesteld. Een interval van 10 tot 20 % lijkt geschikt (afhankelijk van de gekozen responsvariabele) en bij voorkeur moeten zowel de EC10 als de EC20 worden gerapporteerd.

Groeistimulering

59.

Soms wordt bij lage concentraties groeistimulering (negatieve remming) waargenomen. Dit kan een gevolg zijn van hormese („toxische stimulering”) of van de toevoeging van stimulerende groeifactoren met het testmateriaal aan het gebruikte minimale medium. De toevoeging van anorganische nutriënten zou geen directe effecten mogen hebben omdat het testmedium gedurende de hele test een overschot aan nutriënten zou moeten bevatten. Stimulering bij lage dosis kan bij EC50-berekeningen meestal worden genegeerd, tenzij deze stimulering extreem is. Als de stimulering extreem is of als een ECx-waarde voor een lage x moet worden berekend, kunnen echter speciale procedures nodig zijn. Schrapping van een respons met stimulering uit de gegevensanalyse moet indien mogelijk worden vermeden en als de beschikbare software voor fitting van de curve een lichte stimulering niet accepteert, kan lineaire interpolatie met bootstrapping worden gebruikt. Als de stimulering extreem is, kan gebruik van een hormese-model worden overwogen (18).

Niet-toxische groeiremming

60.

Wanneer het testmateriaal licht absorbeert, kan dit tot een verlaging van de groeisnelheid leiden omdat schaduwwerking de beschikbare hoeveelheid licht vermindert. Dergelijke fysische effecten moeten door aanpassing van de testomstandigheden van toxische effecten worden gescheiden en apart worden gerapporteerd. Een leidraad hiervoor is te vinden in (2) en (3).

TESTVERSLAG

61.

In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:

 

Teststof:

fysische aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de oplosbaarheidsgrens in water;

chemische identificatiegegevens (bv. CAS-nummer), waaronder de zuiverheid (verontreinigingen).

 

Geteste soort:

stam, leverancier of herkomst en de gebruikte kweekomstandigheden.

 

Testomstandigheden:

begindatum en duur van de test;

beschrijving van de testopzet: testvaten, cultuurvolumes, dichtheid van de biomassa aan het begin van de test;

samenstelling van het medium;

testconcentraties en replicaten (bv. aantal replicaten, aantal testconcentraties en reden van de gebruikte meetkundige reeks);

beschrijving van de bereiding van testoplossingen met vermelding van het gebruik van oplosmiddelen enz.;

kweekapparatuur;

intensiteit en eigenschappen van het licht (bron, homogeniteit);

temperatuur;

geteste concentraties: de nominale testconcentraties en eventuele resultaten van analyses om de concentratie van de teststof in de testvaten te bepalen. De recovery van de methode en de kwantificeringsgrens in de testmatrix moeten worden gerapporteerd;

alle afwijkingen van deze testmethode;

de methode voor de bepaling van de biomassa en bewijsmateriaal voor de correlatie tussen de gemeten parameter en het drooggewicht.

 

Resultaten:

de pH aan het begin en het eind van de test voor alle dosisgroepen;

de biomassa voor elke kolf bij elk meetpunt en de methode voor het meten van de biomassa;

de groeicurven (biomassa uitgezet tegen de tijd);

de berekende responsvariabelen voor elk dosisreplicaat, met het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt voor de replicaten;

een grafische weergave van de concentratie-effectrelatie;

toxiciteitsschattingen voor responsvariabelen, zoals EC50, EC10, EC20 en de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen. De LOEC en de NOEC, indien deze zijn berekend, en de voor de bepaling daarvan gebruikte statistische methoden;

als ANOVA is gebruikt, de grootte van het effect dat kan worden gedetecteerd (bv. het minst significante verschil);

een eventuele stimulering van de groei, als deze bij een behandeling is geconstateerd;

andere waargenomen effecten, zoals morfologische veranderingen van de algen;

bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.

LITERATUUR

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442 Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Aanhangsel 1

Definities

De volgende definities en afkortingen zijn voor deze testmethode relevant:

Biomassa : het drooggewicht van het levende materiaal in een populatie per volume-eenheid, bv. mg algen/liter testoplossing. Meestal wordt „biomassa” als massa gedefinieerd, maar in de context van deze test wordt de eenheid massa per volume gebruikt. Bovendien wordt de biomassa bij deze test meestal gemeten in vervangende eenheden, zoals aantal cellen of fluorescentie, en ook deze eenheden kunnen onder de term „biomassa” worden verstaan.

Chemische stof : een stof of een mengsel.

Variatiecoëfficiënt : een dimensieloze maat voor de variabiliteit van een parameter, gedefinieerd als het quotiënt van standaardafwijking en gemiddelde. Dit quotiënt kan ook als percentage worden uitgedrukt. De gemiddelde variatiecoëfficiënt van de gemiddelde specifieke groeisnelheid in replicaten van controleculturen moet als volgt worden berekend:

1.

bereken de procentuele variatiecoëfficiënt van de gemiddelde specifieke groeisnelheid uit de dagelijkse/partiële groeisnelheid in de verschillende replicaten;

2.

bereken de gemiddelde waarde van alle onder punt 1 berekende waarden; dit geeft de gemiddelde variatiecoëfficiënt van de dagelijkse/partiële specifieke groeisnelheid in replicaten van controleculturen.

ECx : de concentratie van de in het testmedium opgeloste teststof die binnen een bepaalde blootstellingsperiode (die expliciet moet worden vermeld als deze afwijkt van de volledige of normale duur van de test) leidt tot een afname van de groei van het testorganisme met x % (bv. 50 %). Om ondubbelzinnig aan te geven of een EC-waarde gebaseerd is op de groeisnelheid ('growth rate') of de opbrengst ('yield'), worden respectievelijk de symbolen „ErC” en „EyC” gebruikt.

Groeimedium : het volledige kunstmatige kweekmedium waarin de algen gedurende de blootstelling aan de teststof groeien. De teststof wordt normaal gesproken in het medium opgelost.

Groeisnelheid : (gemiddelde specifieke groeisnelheid): de logaritmische toename van de biomassa gedurende de blootstellingsperiode.

LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste geteste concentratie waarbij wordt waargenomen dat de stof binnen een bepaalde blootstellingstijd in vergelijking met de controle tot een statistisch significante afname van de groei (p < 0,05) leidt. Alle testconcentraties boven de LOEC moeten een schadelijk effect hebben dat ten minste gelijk is aan het bij de LOEC waargenomen effect. Wanneer niet aan deze twee voorwaarden kan worden voldaan, moet een volledige toelichting worden gegeven op de wijze waarop de LOEC (en dus de NOEC) is bepaald.

NOEC (No Observed Effect Concentration) : de testconcentratie die direct onder de LOEC ligt.

Responsvariabele : een variabele voor de bepaling van de toxiciteit, met uiteenlopende berekeningsmethoden afgeleid van de gemeten parameters voor de biomassa. Voor deze testmethode worden de responsvariabelen groeisnelheid en opbrengst afgeleid van de direct gemeten biomassa of een van de vermelde vervangende eenheden.

Specifieke groeisnelheid : een responsvariabele die wordt gedefinieerd als het quotiënt van het verschil tussen de natuurlijke logaritmen van een observatieparameter (in deze testmethode de biomassa) en de betrokken tijdsduur.

Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.

Opbrengst : de waarde van een meetvariabele aan het eind van de blootstellingstijd, verminderd met de waarde van de meetvariabele aan het begin van de blootstellingstijd, waarmee de toename van de biomassa gedurende de test wordt uitgedrukt.

Aanhangsel 2

Stammen waarvan is aangetoond dat ze geschikt zijn voor de test

Groene algen

 

Pseudokirchneriella subcapitata (voorheen bekend als Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (voorheen bekend als Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Diatomeeën

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cyanobacteriën

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Bronnen van stammen

De aanbevolen stammen zijn in culturen met één algensoort verkrijgbaar bij de volgende collecties (in alfabetische volgorde):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

USA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

Verenigd Koninkrijk

 

SAG: Sammlung von Algenkulturen

Inst. Plant Physiology

Universität Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

DUITSLAND

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

V.S.

Uiterlijk en kenmerken van de aanbevolen soorten

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Uiterlijk

Gekromde, gedraaide losse cellen

Ovale, meestal losse cellen

Staafjes

ketens van ovale cellen

Staafjes

Grootte (L × W) in μm

8-14 × 2-3

7-15 × 3-12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Celvolume (μm3/cel)

40-60 (2)

60-80 (2)

40-50 (2)

30-40 (2)

2.5 (3)

Drooggewicht cel (mg/cel)

2-3 × 10– 8

3-4 × 10– 8

3-4 × 10– 8

1-2 × 10– 8

2-3 × 10– 9

Groeisnelheid (4) (dag– 1)

1,5-1,7

1,2-1,5

1,4

1,1-1,4

2,0 - 2,4

Specifieke aanbevelingen voor het kweken en behandelen van de voor de test aanbevolen soorten

Pseudokirchneriella subcapitata en Desmodesmus subspicatus

Deze groene algen zijn in het algemeen gemakkelijk in verschillende kweekmedia te kweken. Bij de cultuurcollecties is informatie verkrijgbaar over geschikte media. De cellen zijn normaal gesproken solitair en de celdichtheid kan gemakkelijk worden gemeten met behulp van een elektronische deeltjesteller of een microscoop.

Anabaena flos-aquae

Voor het bewaren van een stamcultuur kunnen verschillende groeimedia worden gebruikt. Het is vooral belangrijk te voorkomen dat de groei in de log-fase voorbij is voordat de batchcultuur wordt overgezet, omdat herstel op dit punt moeilijk is.

Anabaena flos-aquae ontwikkelt klonten met geneste ketens van cellen. De omvang van deze klonten is afhankelijk van de kweekomstandigheden. Het kan nodig zijn deze klonten in stukken te breken wanneer voor de bepaling van biomassa telling met een microscoop of een elektronische deeltjesteller wordt gebruikt.

Ultrasoonbehandeling van submonsters kan worden gebruikt om ketens in stukken te breken teneinde de variabiliteit bij het tellen te verminderen. Als deze behandeling langer duurt dan nodig is om de ketens in stukken te breken, kunnen de cellen uiteenvallen. De intensiteit en de duur van de behandeling moeten voor elke dosisgroep identiek zijn.

Tel genoeg velden op de hemocytometer (ten minste 400 cellen) om de variabiliteit te compenseren. Dit zal de betrouwbaarheid van bepaling van de dichtheid met een microscoop verhogen.

Voor de bepaling van het totale celvolume van Anabaena kan, nadat de celketens door voorzichtig ultrasoon behandelen in stukken zijn gebroken, een elektronische deeltjesteller worden gebruikt. De ultrasoon-energie moet worden aangepast om uiteenvallen van de cellen te voorkomen.

Gebruik een vortex-mixer of soortgelijke geschikte methoden om ervoor te zorgen dat de voor het beënten van de testvaten gebruikte algensuspensie goed gemengd en homogeen is.

De testvaten worden op een schudtafel (draaiend of heen-en-weer-gaand) met ongeveer 150 bewegingen per minuut geplaatst. Ook periodiek schudden kan worden gebruikt om de neiging van Anabaena om samen te klonteren tegen te gaan. Als er klonten ontstaan, moet erop worden gelet dat de monsters voor de meting van de biomassa representatief zijn. Krachtig schudden vóór de bemonstering kan nodig zijn om klonten met algen uiteen te laten vallen.

Synechococcus leopoliensis

Voor het bewaren van een stamcultuur kunnen verschillende groeimedia worden gebruikt. Bij de cultuurcollecties is informatie verkrijgbaar over geschikte media.

Synechococcus leopoliensis groeit als solitaire staafvormige cellen. De cellen zijn heel klein en dit compliceert het gebruik van een microscoop voor celtellingen om de biomassa te meten. Elektronische deeltjestellers die geschikt zijn voor het tellen van deeltjes vanaf een grootte van ongeveer 1 μm, zijn nuttig. Ook in vitro fluorimetrische bepaling is bruikbaar.

Navicula pelliculosa

Voor het bewaren van een stamcultuur kunnen verschillende groeimedia worden gebruikt. Bij de cultuurcollecties is informatie verkrijgbaar over geschikte media. Let op dat het medium silicaat moet bevatten.

Navicula pelliculosa kan onder bepaalde groeiomstandigheden klonten vormen. Door de vorming van lipiden hebben de algencellen soms de neiging zich in de oppervlaktelaag op te hopen. Onder deze omstandigheden moeten er bij het nemen van submonsters voor de bepaling van de biomassa speciale maatregelen worden genomen om representatieve monsters te krijgen. Krachtig schudden, bijvoorbeeld met een vortex-mixer, kan nodig zijn.

Aanhangsel 3

Groeimedia

Een van de volgende twee groeimedia kan worden gebruikt:

OESO-medium: oorspronkelijk medium van OESO TG 201, tevens overeenkomstig ISO 8692

U.S. EPA-medium AAP, tevens overeenkomstig ASTM.

Bij de bereiding van deze media moeten reagentia van p.a.-kwaliteit en gedeïoniseerd water worden gebruikt.

Samenstelling van het AAP-medium (US. EPA) en het medium van OESO TG 201

Component

AAP

OESO

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA·2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4·2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

De molaire verhouding EDTA/ijzer is iets hoger dan 1. Dit voorkomt dat ijzer neerslaat en beperkt tevens chelaatvorming van ionen van zware metalen tot een minimum.

In de test met het diatomee Navicula pelliculosa moeten beide media worden aangevuld met Na2SiO3 · 9H20 tot een concentratie van 1,4 mg Si/l.

De pH van het medium wordt verkregen bij evenwicht tussen het carbonaatsysteem van het medium en de partiële druk van CO2 in de lucht. Een bruikbare relatie tussen de pH bij 25 °C en de molaire bicarbonaat-concentratie is:

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

Bij 15 mg NaHCO3/l is pHeq = 7,5 (U.S. EPA-medium) en bij 50 mg NaHCO3/l is pHeq = 8,1 (OESO-medium).

Samenstelling in elementen van de testmedia

Element

AAP

OESO

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Bereiding van het OESO-medium

Nutriënt

Concentratie in de stamoplossing

Stamoplossing 1:

macronutriënten

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Stamoplossing 2:

ijzer

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA·2H2O

100 mg/l

Stamoplossing 3:

spoorelementen

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Stamoplossing 4:

bicarbonaat

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Steriliseer de stamoplossingen door membraanfiltratie (gemiddelde poriediameter 0,2 μm) of in de autoclaaf (120 °C, 15 min). Bewaar de oplossingen in het donker bij 4 °C.

Stamoplossingen 2 en 4 mogen niet in de autoclaaf worden gesteriliseerd; steriliseer ze door middel van membraanfiltratie.

Bereid een groeimedium door toevoeging van de benodigde volumes van stamoplossingen 1-4 aan water:

 

Voeg aan 500 ml gesteriliseerd water toe:

 

10 ml stamoplossing 1

 

1 ml stamoplossing 2

 

1 ml stamoplossing 3

 

1 ml stamoplossing 4

 

Vul met gesteriliseerd water aan tot 1 000 ml.

Laat het medium lang genoeg staan om het evenwicht met CO2 in de lucht zich te laten instellen, indien nodig door enkele uren steriele gefilterde lucht door te leiden.

Bereiding van U.S. EPA-medium

1.

Voeg 1 ml van elke stamoplossing in 2.1–2.7 toe aan ongeveer 900 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water en vul aan tot 1 liter.

2.

De macronutriënten-stamoplossingen worden bereid door de volgende reagentia op te lossen in 500 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water. De reagentia 2.1, 2.2, 2.3, en 2.4 kunnen in één stamoplossing worden gecombineerd.

2.1

NaNO3

12,750 g.

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3

MgCl2 · 6H2O

2,205 g.

2.4

Micronutriënten-stamoplossing (zie 3).

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6

K2HPO4

0,522 g.

2.7

NaHCO3

7,500 g.

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

Zie opmerking 1.

Opmerking 1: Alleen voor diatomeeën-testsoorten gebruiken. Kan rechtstreeks worden toegevoegd (202,4 mg) of als stamoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg Si/l in het medium.

3.

De micronutriënten-stamoplossing wordt bereid door de volgende reagentia op te lossen in 500 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water:

3.1

H3BO3

92,760 mg.

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3.3

NaNO2

1,635 mg.

3.4

MgCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg.

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg.

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg.

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [dinatrium(ethyleendinitrilo)tetraacetaat].

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg Zie opmerking 2.

Opmerking 2: Alleen in medium voor stamculturen van diatomeeënsoorten gebruiken

4.

Breng de pH op 7,5 ± 0,1 met 0,1 N of 1,0 N NaOH of HCl.

5.

Filtreer de media in een steriele fles over een 0,22 μm membraanfilter (als een deeltjesteller wordt gebruikt) of een 0,45 μm filter als er geen deeltjesteller wordt gebruikt.

6.

Bewaar het medium in het donker bij ongeveer 4 °C tot het wordt gebruikt.

Aanhangsel 4

Voorbeeld van een procedure voor het kweken van algen

Algemene opmerkingen

Het doel van het kweken op basis van de volgende procedure is het verkrijgen van algenculturen voor toxiciteitstesten.

Gebruik geschikte methoden om ervoor te zorgen dat de algenculturen niet met bacteriën worden besmet. Axenische culturen kunnen wenselijk zijn, maar er moeten culturen met één algensoort worden gemaakt en gebruikt.

Alle handelingen dienen onder steriele omstandigheden te worden uitgevoerd om besmetting met bacteriën of andere algen te voorkomen.

Apparatuur en materiaal

Zie in de testmethode onder Apparatuur.

Procedure voor het verkrijgen van algenculturen

Bereiding van de nutriëntenoplossingen (media):

Alle nutriëntzouten van het medium worden bereid als geconcentreerde stamoplossing en koel en in het donker bewaard. Deze oplossingen worden door filtratie of in een autoclaaf gesteriliseerd.

Het medium wordt bereid door de juiste hoeveelheid stamoplossing aan steriel gedestilleerd water toe te voegen, waarbij moet worden opgelet dat besmetting wordt voorkomen. Voor vast medium wordt 0,8 % agar toegevoegd.

Stamculturen:

Stamculturen zijn kleine algenculturen die regelmatig op vers medium worden overgezet om zo als nieuw uitgangsmateriaal voor tests te dienen. Indien de culturen niet regelmatig worden gebruikt, worden zij uitgestreken in schuine agarbuizen. Deze worden ten minste éénmaal per twee maanden overgebracht op vers medium.

De stamculturen worden gekweekt in erlenmeyers met het geschikte medium (volume ongeveer 100 ml). Wanneer de algen bij 20 °C met continue verlichting worden geïncubeerd, is wekelijks overzetten vereist.

Bij het overzetten wordt een hoeveelheid „oude” cultuur met steriele pipetten zodanig overgebracht naar een kolf met vers medium dat de beginconcentratie van de snel groeiende soort ongeveer 100 maal kleiner is dan in de oude cultuur.

De groeisnelheid van een soort kan uit de groeicurve worden bepaald. Indien bekend, is het mogelijk de dichtheid te schatten waarbij de cultuur moet worden overgezet naar het nieuwe medium. Dit dient te geschieden voordat de cultuur de afstervingsfase bereikt.

Voorcultuur:

De voorcultuur is bedoeld om een aantal algen te krijgen dat geschikt is voor het beënten van de testculturen. De voorcultuur wordt geïncubeerd onder de testomstandigheden en wordt gebruikt terwijl deze nog exponentieel groeit, normaal gesproken na een incubatieperiode van 2 tot 4 dagen. Wanneer de algenculturen misvormde of abnormale cellen bevatten, moeten ze worden afgekeurd.

Aanhangsel 5

Gegevensanalyse door niet-lineaire regressie

Algemene overwegingen

De respons bij tests met algen en andere groeitests met micro-organismen (groei van biomassa) is van nature een continue of metrische variabele — een processnelheid als de groeisnelheid wordt gebruikt en de integraal over tijd als voor de hoeveelheid biomassa wordt gekozen. Beide worden vergeleken met de corresponderende gemiddelde respons van niet-blootgestelde controles waar de respons voor de gebruikte omstandigheden maximaal is, waarbij licht en temperatuur in de algentest de primaire bepalende factoren zijn. Het systeem is gedistribueerd of homogeen en de biomassa kan als een continuüm worden beschouwd zonder naar individuele cellen te kijken. De variantieverdeling van het type respons voor een dergelijk systeem houdt uitsluitend verband met experimentele factoren (meestal beschreven als lognormale of normale foutverdeling). Bij een karakteristieke binaire bioassay-respons wordt de tolerantie (meestal binomiaal verdeeld) van individuele organismen daarentegen vaak als de belangrijkste variantie-component beschouwd. In dit geval is de controlerespons nul of het achtergrondniveau.

In de ongecompliceerde situatie neemt de genormaliseerde of relatieve respons r monotoon af van 1 (geen remming) tot 0 (100 % remming). Hierbij dient te worden opgemerkt dat elke respons een bijbehorende fout heeft en dat een schijnbare negatieve remming uitsluitend ten gevolge van een toevalsfout kan worden berekend.

Regressieanalyse

Modellen:

Een regressieanalyse is gericht op een kwantitatieve beschrijving van de concentratie/responscurve in de vorm van een mathematische regressiefunctie Y = f (C) of in de meeste gevallen F (Z) waarbij Z = log C. Met de inverse C = f– 1 (Y) kunnen ECx-waarden, zoals de EC50, de EC10 en de EC20, en hun 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden berekend. Van verschillende eenvoudige mathematische functionele vormen is gebleken dat ze met succes kunnen worden gebruikt voor de beschrijving van het verband tussen concentratie en respons bij groeiremmingstests met algen. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de logistische vergelijking, de asymmetrische Weibull-vergelijking en de lognormale verdelingsfunctie; dit zijn allemaal sigmoïde curves die asymptotisch tot 1 naderen voor C → 0 en tot 0 voor C → ∞.

Het gebruik van continue drempelfunctiemodellen (bv. het model van Kooijman voor remming van de populatiegroei, Kooijman et al., 1996) is recent voorgesteld als alternatief voor asymptotische modellen. Dit model gaat uit van het ontbreken van effecten bij concentraties beneden een bepaald drempelwaarde, EC0+, die wordt bepaald door extrapolatie van de concentratie/responscurve tot de concentratie-as met behulp van een eenvoudige continue functie die in het beginpunt niet differentieerbaar is.

Er moet worden opgemerkt dat de analyse een eenvoudige minimumbepaling van residuele kwadratensommen kan zijn (uitgaande van constante variantie) of van gewogen kwadratensommen als heterogeniteit van de variantie wordt gecompenseerd.

Procedure

De procedure kan als volgt worden geschetst: Kies een geschikte functionele vergelijking Y = f (C) en fit deze met behulp van niet-lineaire regressie op de gegevens. Gebruik bij voorkeur de metingen van elke kolf afzonderlijk en niet de gemiddelden van de replicaten om zo veel mogelijk informatie uit de gegevens te kunnen halen. Anderzijds heeft de praktijk geleerd dat als de variantie hoog is, de gemiddelde waarden van de replicaten wellicht een robuustere mathematische bepaling opleveren, die minder wordt beïnvloed door toevallige fouten in de gegevens, dan wanneer elk datapunt afzonderlijk wordt gebruikt.

Teken de gefitte curve en de gemeten gegevens en kijk of de fitting van de curve geschikt is. Analyse van de residuen kan hiervoor een zeer geschikt instrument zijn. Als het gekozen functionele verband om de concentratie/responscurve te fitten niet de hele curve beschrijft of een bepaald essentieel deel niet goed beschrijft, zoals de respons bij lage concentraties, moet in plaats van een symmetrische een andere optie voor fitting van de curve worden gekozen, bijvoorbeeld een asymmetrische curve zoals de Weibull-functie. Negatieve remming kan problemen opleveren bij bijvoorbeeld de lognormale verdelingsfunctie en ook in dat geval is een andere regressiefunctie nodig. Er wordt niet aanbevolen aan dergelijke negatieve waarden de waarde 0 of een kleine positieve waarde toe te kennen, omdat dit de foutverdeling verstoort. Het kan nuttig zijn een aparte fitting van de curve voor bepaalde delen van de curve te maken, bijvoorbeeld het deel met een geringe remming voor de bepaling van EClage x-waarden. Bereken uit de gefitte vergelijking — door „inverse bepaling”, C = f– 1 (Y) — karakteristieke puntramingen ECx en rapporteer minimaal de EC50 en een of twee EClage x-waarden. De praktijk heeft geleerd dat de precisie van de algentest normaal gesproken een redelijk nauwkeurige bepaling bij 10 % remming mogelijk maakt als de datapunten volstaan, tenzij stimulering bij lage concentraties als storende factor optreedt. De precisie van een EC20-waarde is vaak aanzienlijk beter dan die van een EC10, omdat de EC20 meestal op het ongeveer lineaire deel van de centrale concentratie/responscurve ligt. Soms kan de EC10 vanwege groeistimulering moeilijk te interpreteren zijn. Dit betekent dat de EC10 weliswaar normaal gesproken met een afdoende nauwkeurigheid te bepalen is, maar dat toch wordt aanbevolen altijd ook de EC20 te rapporteren.

Wegingsfactoren

De toevallige variantie is in het algemeen niet constant en heeft meestal een evenredige component, zodat het de voorkeur verdient standaard een gewogen regressie uit te voeren. Meestal wordt aangenomen dat de wegingsfactoren voor een dergelijke analyse omgekeerd evenredig zijn met de variantie:

Wi = 1/Var(ri)

Veel regressieprogramma's bieden de mogelijkheid om een gewogen regressieanalyse uit te voeren, waarbij de wegingsfactoren in een tabel worden opgenomen. Wegingsfactoren moeten liefst worden genormaliseerd door ze met n/Σ wi te vermenigvuldigen (n is het aantal datapunten), zodat de som gelijk aan 1 is.

Normalisering van de respons

Normalisering met de gemiddelde controlerespons levert bepaalde principeproblemen op en leidt tot een nogal gecompliceerde variantiestructuur. Door de respons te delen door de gemiddelde controlerespons om de procentuele remming te berekenen wordt een extra fout geïntroduceerd, die wordt veroorzaakt door de fout in het controlegemiddelde. Tenzij deze fout te verwaarlozen is, moeten de wegingsfactoren in de regressie en betrouwbaarheidsgrenzen worden gecorrigeerd voor de covariantie met de controle (Draper en Smith, 1981). Er moet worden opgemerkt dat een hoge precisie bij de bepaalde gemiddelde controlerespons belangrijk is om de algehele variantie voor de relatieve respons tot een minimum te beperken. Deze variantie is

(subscript i verwijst naar concentratie i en subscript 0 naar de controles):

Yi = Relatieve respons = ri/r0 = 1 – I = f (Ci)

met variantie: Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi/ ∂ri)2 · Var(ri) + ((∂Yi/ ∂r0)2 · Var(r0)

Aangezien (∂Yi/ ∂ri) = 1/r0 and (∂ Yi/∂r0) = ri/r0 2

wordt met een normale datadistributie en mi en m0-replicaten: Var(ri ) = σ2/mi

de totale variantie van de relatieve respons Yi:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 ·m0

De fout in het controlegemiddelde is omgekeerd evenredig met de vierkantswortel van het gemiddelde aantal controleduplicaten en soms kan het gerechtvaardigd zijn om historische gegevens mee te nemen en zo de fout sterk te verlagen. Het is ook mogelijk de gegevens niet te normaliseren en de absolute respons, inclusief de controlerespons, te fitten maar de controlerespons als extra parameter te introduceren voor de fitting met niet-lineaire regressie. Bij een gebruikelijke regressievergelijking met twee parameters moeten met deze methode drie parameters worden gefit, zodat er meer datapunten nodig zijn dan bij niet-lineaire regressie met gegevens die met een vooraf bepaalde controlerespons worden genormaliseerd.

Inverse betrouwbaarheidsintervallen

De berekening van betrouwbaarheidsintervallen voor niet-lineaire regressie met behulp van inverse bepaling is vrij gecompliceerd en meestal niet als standaardoptie beschikbaar in normale statistische computerprogrammapakketten. Benaderde betrouwbaarheidsgrenzen kunnen worden verkregen met behulp van standaardprogramma's voor niet-lineaire regressie met herparametrisering (Bruce en Versteeg, 1992), hetgeen inhoudt dat de mathematische vergelijking moet worden herschreven met de gewenste puntbepalingen, bijvoorbeeld de EC10 en de EC50 als de te bepalen parameters. (Neem als functie I = f (α, β, concentratie) en gebruik de definitierelaties f (α, β, EC10) = 0,1 en f (α, β, EC50) = 0,5 om f (α, β, concentratie) te substitueren door een gelijkwaardige functie g (EC10, EC50, concentratie).

Een directere berekening (Andersen et al, 1998) wordt uitgevoerd door de oorspronkelijke vergelijking te houden en een Taylor-expansie rond het gemiddelde van ri en r0 te gebruiken.

De laatste tijd zijn „bootstrap-methoden” populair geworden. Deze methoden gebruiken de gemeten gegevens en een door een aselecte getallengenerator bepaalde frequent herhaalde steekproeftrekking voor de bepaling van een empirische variantieverdeling.

LITERATUUR

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R..D. and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

4)

Hoofdstuk C.11 wordt vervangen door:

C.11.   ACTIEF SLIB: ADEMHALINGSREMMINGSTEST (KOOLSTOF- EN AMMONIUMOXIDATIE)

INLEIDING

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 209 (2010) van de OESO. Met deze testmethode wordt de invloed van een chemische stof op micro-organismen uit actief slib (voornamelijk bacteriën) bepaald door meting van hun ademhalingssnelheid (koolstof- en/of ammoniumoxidatie) onder gedefinieerde omstandigheden in aanwezigheid van verschillende concentraties van de teststof. De testmethode is gebaseerd op de test van de ETAD (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry) (1) (2), de eerdere OESO TG 209 (3) en de herziene ISO-norm 8192 (4). Deze test voorziet in een snelle screeningsmethode om de effecten van chemische stoffen op de micro-organismen van actief slib uit het biologische (aerobe) stadium van afvalwaterbehandelingsinstallaties te bepalen. Ook kan de test dienen om een indicatie te krijgen van geschikte niet-remmende concentraties van teststoffen waarvan de biologische afbreekbaarheid moet worden onderzocht (bv. hoofdstukken C.4 A-F, C.9, C.10, C.12 en C.29 van deze bijlage, OESO TG 302C). In dat geval kan de test als screeningstest worden uitgevoerd, vergelijkbaar met een bereikbepalingstest of limiettest (zie punt 39), waarbij alleen naar de totale ademhaling wordt gekeken. Voorzichtigheid is echter geboden als de gegevens worden gebruikt voor tests op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (hoofdstuk C.4 A-F en C.29 van deze bijlage) waarbij de concentratie entmateriaal beduidend lager is dan bij deze testmethode. Afwezigheid van remming in deze ademhalingstest betekent niet automatisch dat dit ook het geval is in de test op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid van hoofdstuk C.4 A-F of C.29 van deze bijlage.

2.

Hoewel de ademhalingsremmingstest sinds de eerste publicatie over het algemeen met succes is toegepast, werden in enkele gevallen foutieve resultaten gerapporteerd, bv. in (2) (4) (5). Concentratiegerelateerde ademhalingscurven waren soms bifasisch, dosis-responscurven afwijkend van vorm en EC50-waarden onverwacht laag (5). Uit onderzoeken is gebleken dat dergelijke resultaten worden verkregen wanneer in het gebruikte actief slib aanzienlijke nitrificatie plaatsvindt en de teststof een groter effect heeft op de ammoniumoxidatie dan op de algemene heterotrofe oxidatie. Deze foutieve resultaten zijn te corrigeren door de uitvoering van extra tests met een specifieke nitrificatieremmer. Uit metingen van de zuurstofopnamesnelheid in aanwezigheid en afwezigheid van een dergelijke remmer, bv. N-allylthioureum (ATU), kunnen de totale, de heterotrofe en de nitrificatie-zuurstofopname worden berekend (4) (7) (8). Aldus kunnen de remmende effecten van een teststof op deze twee processen worden bepaald en kunnen de EC50-waarden voor de oxidatie van organische koolstof (heterotroof) en ammonium (nitrificatie) op de gebruikelijke manier worden berekend. Hierbij moet worden opgemerkt dat het remmende effect van N-allylthioureum in uitzonderlijke gevallen geheel of gedeeltelijk teniet wordt gedaan door complexvorming met teststoffen of mediumsupplementen, bv. Cu++ -ionen (6). Voor Nitrosomonas zijn Cu++ -ionen essentieel, maar in hoge concentraties toxisch.

3.

Met name in Europese landen is de behoefte aan nitrificatie bij de aerobe behandeling van afvalwater, als noodzakelijke stap in het proces waarbij stikstofverbindingen uit afvalwater worden verwijderd door denitrificatie tot gasvormige producten, urgent geworden; de EU heeft nu lagere grenswaarden vastgesteld voor de stikstofconcentratie in behandelde effluenten die in ontvangende wateren worden geloosd (5).

4.

Voor de meeste doeleinden volstaat het om alleen het effect op de oxidatie van organische koolstof te bepalen. Soms is het echter nodig om het effect op alleen nitrificatie of op zowel nitrificatie als oxidatie van organische koolstof afzonderlijk te onderzoeken om de resultaten te kunnen interpreteren en de effecten te kunnen begrijpen.

PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

5.

De ademhalingssnelheid van actief slib waaraan kunstmatig afvalwater wordt toegevoegd, wordt na een contacttijd van 3 uur gemeten in een gesloten cel die een zuurstofelektrode bevat. Afhankelijk van het reële blootstellingsscenario kunnen langere contacttijden wenselijk zijn. Als de teststof snel wordt afgebroken, bv. abiotisch door hydrolyse, of vluchtig is en de concentratie niet goed op peil blijft, kan een bijkomende kortere blootstellingsperiode, bv. 30 minuten, worden gebruikt. De gevoeligheid van elke partij actief slib moet op de dag van de blootstelling gecontroleerd worden met een geschikte referentiestof. De test wordt meestal gebruikt om de ECx (bv. EC50) van de teststof en/of de concentratie zonder waargenomen effect (NOEC) te bepalen.

6.

De remming van de zuurstofopname door organische-koolstof-oxiderende organismen en die door ammonium-oxiderende micro-organismen kunnen apart worden uitgedrukt door de zuurstofopnamesnelheid te meten in afwezigheid en aanwezigheid van N-allylthioureum, een specifieke remmer van de oxidatie van ammonium tot nitriet door de nitrificerende bacteriën van deze eerste stap. De procentuele remming van de zuurstofopnamesnelheid wordt dan berekend door de zuurstofopnamesnelheid in aanwezigheid van de teststof te vergelijken met die van corresponderende controles zonder teststof, zowel in aanwezigheid als afwezigheid van de specifieke remmer N-allylthioureum.

7.

Eventuele zuurstofopname ten gevolge van abiotische processen kan gedetecteerd worden door bepaling van de snelheid in mengsels van teststof, kunstmatig afvalwater en water, maar zonder actief slib.

INFORMATIE OVER DE TESTSTOF

8.

De identificatie (bij voorkeur CAS-nummer), naam (IUPAC), zuiverheid, wateroplosbaarheid, dampspanning, vluchtigheid en adsorptie-eigenschappen van de teststof moeten bekend zijn om de resultaten goed te kunnen interpreteren. Normaal gesproken kunnen vluchtige chemische stoffen niet naar behoren worden getest, tenzij er speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen (zie punt 21).

TOEPASBAARHEID VAN DE TESTMETHODE

9.

De testmethode is geschikt voor in water oplosbare, slecht oplosbare en vluchtige chemische stoffen. Voor chemische stoffen met een beperkte oplosbaarheid is het niet altijd mogelijk EC50 -waarden te verkrijgen en met vluchtige stoffen kunnen alleen geldige resultaten worden verkregen indien het grootste deel (grofweg > 80 %) van de teststof aan het eind van de blootstellingsperiode(n) nog in het reactiemengsel aanwezig is. Bij onzekerheid over de stabiliteit of vluchtigheid van de teststof moeten aanvullende ondersteunende analysegegevens worden ingediend om de schatting van de ECx-concentratie te verfijnen.

REFERENTIESTOFFEN

10.

De test moet periodiek met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van de testmethode en testomstandigheden te waarborgen, en tevens op de dag van blootstelling om van elke partij actief slib die als microbieel entmateriaal wordt gebruikt de gevoeligheid te controleren. De chemische stof 3,5-dichloorfenol (3,5-DCP) wordt aanbevolen als remmende referentiestof, omdat het een bekende remmer van de ademhaling is en in veel soorten remmings-/toxiciteitstests wordt gebruikt (4). Ook koper(II)sulfaatpentahydraat is een geschikte referentiestof voor remming van de totale ademhaling (9). N-methylaniline kan als specifieke referentieremmer van nitrificatie worden gebruikt (4).

GELDIGHEIDSCRITERIA EN REPRODUCEERBAARHEID

11.

De zuurstofopnamesnelheid van de blanco controles (zonder teststof of referentiestof) moet minimaal 20 mg zuurstof per gram actief slib (drooggewicht van gesuspendeerde vaste stoffen) per uur zijn. Als de snelheid lager is moet de test worden herhaald met gewassen actief slib of met slib uit een andere bron. De variatiecoëfficiënt van de zuurstofopnamesnelheid in controlereplicaten aan het eind van de definitieve test mag niet hoger dan 30 % zijn.

12.

In een door ISO (4) georganiseerd internationaal ringonderzoek in 2004 met actief slib uit huishoudelijk afvalwater lag de EC50 van 3,5-DCP tussen 2 mg/l en 25 mg/l voor totale ademhaling, tussen 5 mg/l en 40 mg/l voor heterotrofe ademhaling en tussen 0,1 mg/l en 10 mg/l voor nitrificatie-ademhaling. Wanneer de EC50 van 3,5-DCP niet in het verwachte bereik ligt, moet de test worden herhaald met actief slib uit een andere bron. De EC50 van koper(II)sulfaatpentahydraat voor de totale ademhaling moet tussen 53 mg/l en 155 mg/l liggen (9).

BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

Testvaten en apparatuur

13.

Naast de gebruikelijke laboratoriumuitrusting is het volgende nodig:

(a)

Testvaten — bijvoorbeeld bekerglazen van 1 000 ml, voor 500 ml reactiemengsel (zie 5 in figuur 1);

(b)

Cel en toebehoren voor het meten van de concentratie opgeloste zuurstof; een geschikte zuurstofelektrode; een gesloten cel die het monster kan bevatten zonder gasruimte bovenin en een recorder (bv. 7, 8, 9 in figuur 1 van aanhangsel 2); er kan ook een BOD-fles worden gebruikt met een geschikte hulsadapter om de zuurstofelektrode vast te klemmen in de hals van de fles (zie figuur 2 van aanhangsel 3). Om bij het inbrengen van de elektrode overlopen en daarmee verlies van vloeistof te voorkomen is het raadzaam eerst een trechter of glazen buisje door de huls te steken, of om vaten met uitlopende randen te gebruiken. In beide gevallen moet een magneetroerder of een andere roermethode, bv. een zelfroerende elektrode, worden gebruikt.

(c)

Magneetroerders en roerbonen, bekleed met inert materiaal, voor gebruik in de meetcel en/of de testvaten;

(d)

Beluchtingstoestel: perslucht moet, indien nodig, door een geschikt filter worden geleid om stof en olie te verwijderen en door wasflessen met water om de lucht te bevochtigen. De inhoud van de vaten wordt belucht met pasteurpipetten of andere beluchtingshulpmiddelen die geen chemische stoffen adsorberen. Een draaiende schudder ingesteld op een snelheid tussen 150 en 250 rpm met flessen met een inhoud van bijvoorbeeld 2 000 ml is geschikt om aan de zuurstofbehoefte van het slib te voldoen en moeilijkheden te ondervangen met stoffen die overmatig schuim produceren, vluchtig zijn en daardoor verloren gaan, of moeilijk dispergeerbaar zijn bij beluchting door luchtdoorleiding. Het testsysteem bestaat doorgaans uit een aantal continu beluchte bekerglazen die één voor één worden gevuld (bv. met tussenpozen van 10-15 minuten) en vervolgens één voor één worden geanalyseerd. Gevalideerde apparatuur voor gelijktijdige beluchting en meting van de zuurstofverbruikssnelheid in de mengsels kan ook worden gebruikt.

(e)

pH-meter;

(f)

Centrifuge: standaard tafelmodel voor slib die een versnelling van 10 000 m/s2 kan produceren.

Reagentia

14.

Alle reagentia dienen van p.a.-kwaliteit te zijn.

Water

15.

Er moet gedestilleerd of gedeïoniseerd water met een DOC-gehalte van minder dan 1 mg/l worden gebruikt, behalve wanneer chloorvrij kraanwater wordt voorgeschreven.

Kunstmatig afvalwater

16.

Het medium dat wordt bereid bevat de volgende bestanddelen in de aangegeven hoeveelheden:

pepton

16 g

vleesextract (of een vergelijkbaar plantenextract)

11 g

ureum

3 g

natriumchloride (NaCl)

0,7 g

calciumchloridedihydraat (CaC12, 2H2O)

0,4 g

magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

watervrij kaliummonowaterstoffosfaat (K2HPO4)

2,8 g

met gedestilleerd of gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter

 

17.

De pH van deze oplossing moet 7,5 ± 0,5 zijn. Indien het bereide medium niet onmiddellijk wordt gebruikt, moet het in het donker bij 0 °C tot 4 °C worden bewaard gedurende maximaal 1 week of onder omstandigheden waarbij de samenstelling niet verandert. Let op: dit kunstmatige afvalwater is 100 maal zo geconcentreerd als dat wat beschreven wordt in het technisch rapport van de OESO „Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents” van 11 juni 1976, en bovendien is er dikaliumwaterstoffosfaat toegevoegd.

18.

Het is ook mogelijk om componenten van het medium vóór opslag apart te steriliseren, of om de pepton en het vleesextract kort voor de test toe te voegen. Vóór gebruik moet het medium goed worden gemengd en de pH zo nodig worden bijgesteld tot pH 7,5 ± 0,5.

Teststof

19.

Voor stoffen die goed in water oplosbaar zijn wordt een stamoplossing bereid die onder de oplosbaarheidsgrens moet blijven (er mogen geen precipitaten ontstaan). Slecht in water oplosbare stoffen, mengsels met componenten met een verschillende oplosbaarheid in water, en adsorberende stoffen moeten rechtstreeks in de testvaten worden afgewogen. Het gebruik van stamoplossingen kan in zulke gevallen een alternatief zijn, mits de concentraties van de opgeloste teststof analytisch worden bepaald in de testvaten (voordat actief slib wordt toegevoegd). Ook als er WAF's (Water Accommodated Fractions) worden bereid is een analytische bepaling van de concentratie van de opgeloste teststof in de testvaten essentieel. Het gebruik van organische oplosmiddelen, dispergeermiddelen/emulgatoren om te oplosbaarheid te verhogen, moet worden vermeden. Ultrasoonbehandeling van stamoplossingen en het vooraf roeren van suspensies, bv. overnacht, is een optie als er adequate informatie over de stabiliteit van de teststof onder dergelijke omstandigheden beschikbaar is.

20.

De teststof kan de pH in het testsysteem in negatieve zin beïnvloeden. Voordat de test wordt opgezet moet de pH van met teststof behandelde mengsels in een oriënterende test worden gemeten, om na te gaan of de pH zal moeten worden bijgesteld vóór de hoofdtest, en nogmaals op de dag van de hoofdtest. Oplossingen/suspensies van teststof in water moeten, indien nodig, geneutraliseerd worden voordat het entmateriaal wordt toegevoegd. Omdat de chemische eigenschappen van de chemische stof hierdoor kunnen veranderen kan het, afhankelijk van het doel van het onderzoek, wenselijk zijn het effect van de teststof op het slib tevens uit te voeren in een test zonder pH-bijstelling.

21.

In tests met vluchtige stoffen, met name als het systeem met lucht wordt doorborreld, kunnen de waargenomen toxische effecten variabel zijn als gevolg van verliezen van de stof gedurende de blootstelling. Bij zulke stoffen moet men zorgvuldig te werk gaan door stofspecifieke analyse uit te voeren op controlemengsels die de stof bevatten en door de manier van beluchten te wijzigen.

Referentiestof

22.

Als 3,5-dichloorfenol als referentiestof wordt gebruikt, moet een oplossing van 1,00 g 3,5-dichloorfenol in 1 000 ml water worden bereid (15). Gebruik warm water en/of ultrasoonbehandeling om het oplossen te versnellen en vul de oplossing aan tot het eindvolume nadat deze is afgekoeld tot kamertemperatuur. Men moet zich er echter van verzekeren dat de structuur van de referentiestof onveranderd blijft. De pH van de oplossing moet gecontroleerd worden en zo nodig met NaOH of H2SO4 op pH 7 — 8 worden gesteld.

23.

Als koper(II)sulfaatpentahydraat de referentiestof is, worden concentraties van 58 mg/l, 100 mg/l en 180 mg/l (een reden van 1.8) gebruikt. De stof wordt rechtstreeks in de testvaten afgewogen (29 — 50 — 90 mg voor een totaal volume van 500 ml). Vervolgens wordt de stof opgelost in 234 ml geautoclaveerd kraanwater. Koper(II)sulfaat lost gemakkelijk op. De test wordt gestart door toevoeging van 16 ml kunstmatig afvalwater en 250 ml actief slib.

Specifieke remmer van nitrificatie

24.

Er wordt een 2,32 g/l stamoplossing van N-allylthioureum (ATU) bereid. Toevoeging van 2,5 ml van deze stamoplossing aan een incubatiemengsel met een eindvolume van 500 ml geeft een eindconcentratie van 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l), die hoog genoeg is (4) om 100 % remming van de nitrificatie te veroorzaken in nitrificerend actief slib dat 1,5 g/l gesuspendeerde vaste stoffen bevat.

Abiotische controle

25.

Onder sommige uitzonderlijke omstandigheden kan een teststof met sterk reducerende eigenschappen meetbaar abiotisch zuurstofverbruik veroorzaken. In die gevallen zijn abiotische controles nodig om onderscheid te kunnen maken tussen abiotische zuurstofopname door de teststof en microbiële ademhaling. Abiotische controles kunnen bereid worden door het entmateriaal weg te laten uit de testmengsels. Evenzo kunnen abiotische controles zonder entmateriaal worden opgenomen wanneer ondersteunende analytische metingen worden uitgevoerd om de bereikte concentratie gedurende de blootstellingsfase van de test te bepalen, bijvoorbeeld bij het gebruik van stamoplossingen van slecht in water oplosbare stoffen met componenten met een verschillende oplosbaarheid in water. In specifieke gevallen is een abiotische controle nodig met entmateriaal dat is gesteriliseerd (bv. door autoclavering of toevoeging van steriliserende toxische stoffen). Sommige chemische stoffen kunnen zuurstof produceren of verbruiken als er voldoende oppervlak voor reactie is, zelfs als ze hiervoor normaal gesproken een veel hogere temperatuur of druk nodig hebben. In dit verband moet speciale aandacht worden geschonken aan peroxyverbindingen. Gesteriliseerd entmateriaal biedt een groot oppervlak.

Entmateriaal

26.

Voor algemeen gebruik wordt actief slib verzameld uit de uitlaat, of dicht bij de uitlaat, van de beluchtingstank van een goed functionerende afvalwaterbehandelingsinstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater behandelt. Afhankelijk van het doel van de test kunnen ook andere geschikte bronnen van actief slib worden gebruikt, bv. in het laboratorium gekweekt slib, met een concentratie gesuspendeerde vaste stoffen tussen 2 g/l en 4 g/l. Het is echter waarschijnlijk dat slib uit verschillende behandelingsinstallaties zal verschillen in eigenschappen en gevoeligheid.

27.

Het verzamelde slib kan zo gebruikt worden. Wel moeten grove deeltjes worden verwijderd door kortstondige bezinking, bv. 5 tot 15 minuten, en decanteren van de bovenlaag met fijnere deeltjes, of door zeven (bv. mazen van 1 mm2 ). Het slib kan ook ca 15 seconden of langer gehomogeniseerd worden in een blender, maar dit moet voorzichtig gebeuren met het oog op de afschuifkrachten en temperatuurverandering die bij langdurig homogeniseren in een blender kunnen optreden.

28.

Vaak is het nodig het slib te wassen, bijvoorbeeld wanneer de endogene ademhalingssnelheid laag is. Hiertoe wordt het slib eerst gecentrifugeerd, bv. 10 minuten bij ca.10 000 m/s2, waardoor een helder supernatant en een pellet van vaste stoffen wordt verkregen. Vervolgens wordt het supernatant weggegooid en het slib onder schudden geresuspendeerd in chloorvrij kraanwater, waarna het waswater wordt verwijderd door opnieuw centrifugeren en weggooien. Indien nodig wordt het proces van wassen en centrifugeren herhaald. De droge massa van een bekend volume geresuspendeerd slib moet worden bepaald, waarna het slib hetzij wordt geconcentreerd door vloeistofverwijdering of verder wordt verdund met chloorvrij kraanwater, zodat slib met de gewenste concentratie vaste stoffen van 3 g/l wordt verkregen. Het actief slib moet continu worden belucht (bv. 2 l/minuut) bij de testtemperatuur en zo mogelijk op de dag van verzameling worden gebruikt. Als dat niet mogelijk is dient dagelijks kunstmatig afvalwater aan het slib te worden toegevoegd (50 ml kunstmatig afvalwater per liter actief slib), gedurende de twee volgende dagen. Dan wordt het slib voor de test gebruikt; de resultaten worden als geldig beschouwd als uit de snelheid van de endogene, heterotrofe ademhaling en de nitrificatie-ademhaling blijkt dat de activiteit van het slib niet significant is veranderd.

29.

Er kunnen moeilijkheden ontstaan als tijdens de incubatie zoveel schuimvorming optreedt dat er schuim met daarin vaste slibdeeltjes uit de beluchtingsvaten wordt gedreven. Schuimvorming, hoewel soms simpelweg veroorzaakt door het kunstmatige afvalwater, is te verwachten als de teststof een oppervlakteactieve stof is of bevat. Verlies van vaste slibdeeltjes uit de testmengsels leidt tot kunstmatig verlaagde ademhalingssnelheden die ten onrechte geïnterpreteerd zouden kunnen worden als een resultaat van remming. Daarnaast heeft het beluchten van een oplossing met een oppervlakteactieve stof tot gevolg dat deze stof in de schuimlaag wordt geconcentreerd, waardoor bij verlies van schuim de blootstellingsconcentraties zullen afnemen. Schuimvorming kan onder controle worden gehouden met eenvoudige mechanische methoden (bv. af en toe handmatig roeren met een glasstaafje) of door toevoeging van een siliconenantischuimmiddel zonder oppervlakteactieve stoffen en/of door het gebruik van de schudfles-beluchtingsmethode. Indien het probleem samenhangt met de aanwezigheid van kunstmatig afvalwater, moet een antischuimmiddel aan het afvalwater worden toegevoegd met een snelheid van bv. 50 μl/l. Als de teststof schuimvorming veroorzaakt, moet bij de hoogste testconcentratie worden bepaald welke hoeveelheid nodig is om dit tegen te gaan, en moeten vervolgens alle beluchtingsvaten op identieke wijze worden behandeld (ook de vaten zonder schuim, zoals de blanco controles en referentievaten). Er mag geen interactie optreden tussen het antischuimmiddel en het entmateriaal en/of de teststof.

TESTPROCEDURE

30.

De remming van drie verschillende zuurstofopnameprocessen kan worden bepaald: totale opname, alleen heterotrofe opname, en opname ten gevolge van nitrificatie. Normaal gesproken volstaat het om remming van de totale zuurstofopname te meten. Het is nodig de effecten op heterotrofe zuurstofopname ten gevolge van organische-koolstof-oxidatie en zuurstofopname ten gevolge van ammoniumoxidatie te bepalen wanneer deze twee afzonderlijke eindpunten specifiek vereist zijn voor een bepaalde chemische stof, of (als dat wenselijk is) om een verklaring te vinden voor een atypische dosis-responscurve voor remming van de totale zuurstofopname.

Testomstandigheden

31.

De test moet worden uitgevoerd bij een temperatuur van 20 ± 2 °C.

Testmengsels

32.

Testmengsels (FT volgens tabel 1) bestaande uit water, kunstmatig afvalwater en teststof worden zodanig bereid zodat verschillende nominale concentraties van de teststof worden verkregen (zie tabel 1 voor een voorbeeld van volumes van bestanddelen). De pH moet indien nodig worden bijgesteld tot 7,5 ± 0.5. De mengsels worden verdund met water en het entmateriaal wordt toegevoegd, zodanig dat in de vaten gelijke eindvolumes worden verkregen; vervolgens wordt de beluchting gestart.

Referentiemengsels

33.

Mengsels (FR) met in plaats van de teststof de referentiestof, bv. 3,5-dichloorfenol, worden op dezelfde manier als de testmengsels bereid.

Blanco controles

34.

In tests waarbij de testbekerglazen één voor één met tussenpozen worden opgezet moeten blanco controles (FB) aan het begin en aan het eind van de blootstellingsperiode worden bereid. In tests met apparatuur die gelijktijdige metingen van het zuurstofverbruik toestaat, moeten in elke ronde van gelijktijdige analyses ten minste twee blanco controles worden opgenomen. Blanco controles bevatten een even groot volume actief slib en kunstmatig medium, maar geen test- of referentiestof. Ze moeten met water worden verdund tot hetzelfde volume als de test- en referentiemengsels.

Abiotische controle

35.

Indien nodig, bijvoorbeeld als van een teststof bekend is of vermoed wordt dat deze sterk reducerende eigenschappen heeft, moet een FA-mengsel worden bereid om het abiotische zuurstofverbruik te meten. Dit mengsel bevat dezelfde hoeveelheden teststof en kunstmatig afvalwater en heeft hetzelfde volume als de testmengsels, maar bevat geen actief slib.

Algemene procedure en metingen

36.

Testmengsels, referentiemengsels en de blanco en abiotische controles worden bij de testtemperatuur geïncubeerd onder geforceerde beluchting (0,5 tot 1 l/min) om de concentratie opgeloste zuurstof boven 60-70 % van de verzadigingswaarde te houden en de slibvlokken in suspensie te houden. Roeren van de culturen is ook nodig om de slibvlokken in suspensie te houden. De incubatie begint wanneer het entmateriaal van actief slib in contact komt met de andere bestanddelen van het uiteindelijke mengsel. Aan het eind van de incubatie, na de gespecificeerde blootstellingstijd van doorgaans 3 uur, worden monsters onttrokken om daarin de snelheid te meten waarmee de concentratie opgeloste zuurstof afneemt, in de speciaal daarvoor ontworpen cel (figuur 2 van aanhangsel 3) of in een volledig gevulde BOD-fles. De manier waarop de incubaties worden gestart hangt ook af van de capaciteit van de apparatuur die voor meting van het zuurstofverbruik wordt gebruikt. Als deze één enkele zuurstofelektrode omvat, worden individuele metingen verricht. In dat geval bereid men de verschillende mengsels die voor de test in afvalwater nodig zijn, maar nog zonder entmateriaal. De vereiste hoeveelheden slib worden dan apart toegevoegd aan elk vat van de serie. De incubaties worden één voor één gestart met geschikte tijdsintervallen van bijvoorbeeld 10 tot 15 minuten. Het meetsysteem kan ook meerdere elektroden omvatten waardoor gelijktijdige metingen mogelijk zijn; in dat geval wordt aan de juiste groepen vaten op hetzelfde moment entmateriaal toegevoegd.

37.

De nominale concentratie actief slib bedraagt in alle test-, controle- en blanco monsters (maar niet in de abiotische controlemonsters) 1,5 g gesuspendeerde vaste stoffen per liter. Het zuurstofverbruik moet na 3 uur blootstelling worden gemeten. In bepaalde gevallen is een extra meting na een blootstelling van 30 minuten wenselijk, zoals beschreven in punt 5.

Nitrificerend vermogen van slib

38.

Om vast te stellen of en, zo ja, met welke snelheid het slib nitrificeert, moeten controlemengsels (FB) worden bereid zoals bij de blanco controles, maar waarbij aan een deel van de mengsels N-allylthioureum (11,6 mg/l) wordt toegevoegd (FN). De mengsels moeten worden belucht en 3 uur bij 20° ± 2 °C worden geïncubeerd. Dan worden de zuurstofopnamesnelheden gemeten en kan de snelheid van zuurstofopname ten gevolge van nitrificatie worden berekend.

Opzet van de tests

Bereikbepalingstest

39.

Indien nodig kan met een oriënterende test het concentratiebereik van een teststof worden geschat dat gebruikt moet worden in een definitieve test voor bepaling van de remming van het zuurstofverbruik. Als in een oriënterende test geen remming van het zuurstofverbruik door de teststof wordt gevonden, kan dat betekenen dat een definitieve test overbodig is. Wel moeten bepalingen in triplo bij de hoogste geteste concentratie van de oriënterende test (meestal 1 000 mg/l, maar afhankelijk van de vereiste meetgegevens) worden opgenomen.

Tabel 1

Voorbeelden van mengsels voor een oriënterende test

Reagens

Oorspronkelijke concentratie

Stamoplossing van teststof

10 g/l

Stamoplossing van kunstmatig medium

Zie punt 16

Stamsuspensie van actief slib

3 g/l gesuspendeerde vaste stoffen

Componenten van mengsels

Toevoeging aan testvaten (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Stamoplossing van teststof (ml)

(punten 19 tot en met 21)

0,5

5

50

0

50

Stamoplossing van kunstmatig afvalwater

(punt 16)

16

16

16

16

16

Suspensie van actief slib

(punten 26 tot en met 29)

250

250

250

250

0

Water

(punt 15)

233,5

229

184

234

434

Totale volume van mengsels (ml)

500

500

500

500

500

Concentraties in het mengsel

 

 

 

 

 

Testsuspensie (mg/l)

Actief slib

10

100

1 000

0

1 000

(gesuspendeerde vaste stoffen) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

De test moet worden uitgevoerd met minimaal drie concentraties teststof, bv. 10 mg/l, 100 mg/l en 1 000 mg/l, een blanco controle en, indien nodig, minimaal drie abiotische controles met de hoogste concentraties teststof (zie voor een voorbeeld tabel 1). In het ideale geval heeft de laagste concentratie geen effect op het zuurstofverbruik. Eerst worden de snelheden van zuurstofopname en, indien van toepassing, de snelheid van nitrificatie berekend, en vervolgens de procentuele remming. Afhankelijk van het doel van de test is het ook mogelijk om alleen de toxiciteit van een limietconcentratie, bv. 1 000 mg/l, te bepalen. Als er bij deze concentratie geen statistisch significant toxisch effect optreedt, zijn geen verdere tests bij hogere of lagere concentraties nodig. Slecht in water oplosbare stoffen, mengsels met componenten met een verschillende oplosbaarheid in water en adsorberende stoffen moeten rechtstreeks in de testvaten worden afgewogen. In dat geval wordt in plaats van stamoplossing van de teststof een even groot volume verdunningswater toegevoegd.

Definitieve test

Remming van de totale zuurstofopname

41.

De test moet worden uitgevoerd met een reeks concentraties die uit de oriënterende test zijn afgeleid. Om zowel een NOEC als een ECx (bv. EC50) te verkrijgen, worden in de meeste gevallen zes controles en vijf behandelingsconcentraties in een meetkundige reeks met bepalingen in vijfvoud aanbevolen. De abiotische controle hoeft niet te worden herhaald als er in de oriënterende test geen zuurstofopname was; als er wel significante opname optrad, moeten voor elke concentratie teststof abiotische controles worden opgenomen. De gevoeligheid van het slib moet gecontroleerd worden met de referentiestof 3,5-dichloorfenol. Omdat bekend is dat de gevoeligheid van slib fluctueert, moet deze vóór elke testreeks worden gecontroleerd. In alle gevallen worden na 3 uur monsters uit de testvaten onttrokken, en als dat nodig is ook na 30 min, voor meting van de zuurstofopnamesnelheid in de zuurstofelektrodecel. Uit de verzamelde gegevens wordt de specifieke ademhalingssnelheid van de controlemengsels en testmengsels berekend, waarna de procentuele remming wordt berekend met vergelijking 7 hieronder.

Onderscheid maken tussen remming van heterotrofe ademhaling en nitrificatie

42.

Door de specifieke nitrificatieremmer ATU toe te voegen kunnen de remmende effecten van teststoffen op de heterotrofe oxidatie rechtstreeks worden bepaald, en door deze zuurstofopnamesnelheid in aanwezigheid van ATU af te trekken van de totale opnamesnelheid (in afwezigheid van ATU) kunnen de effecten op de nitrificatiesnelheid worden berekend. Er moeten twee series mengsels worden bereid volgens de in punt 41 beschreven testopzet voor de ECx of NOEC, maar in dit geval wordt aan elk mengsel van één serie ATU toegevoegd in een eindconcentratie van 11,6 mg/l; het is aangetoond dat deze concentratie de nitrificatie volledig remt in slib met concentraties gesuspendeerde vaste stoffen tot 3 000 mg/l (4). De zuurstofopnamesnelheden worden na de blootstellingsperiode gemeten; deze rechtstreeks gemeten waarden zijn representatief voor alleen de heterotrofe ademhaling en de verschillen tussen deze waarden en de corresponderende waarden voor totale ademhaling zijn representatief voor nitrificatie. De verschillende maten van remming worden vervolgens berekend.

Metingen

43.

Na de blootstellingsperiode(n) moet een monster vanuit het eerste beluchtingsvat worden overgebracht naar de zuurstofelektrodecel (figuur 1 van aanhangsel 2), waarna de concentratie opgeloste zuurstof direct moet worden gemeten. Indien een systeem met meerdere elektroden beschikbaar is, kunnen de metingen gelijktijdig worden uitgevoerd. Het is belangrijk dat met dezelfde snelheid wordt geroerd (met behulp van een beklede magneet) als tijdens de kalibratie van de elektrode, om te zorgen dat de elektrode zo direct mogelijk op veranderingen van de zuurstofconcentratie reageert en de metingen in de meetcel regelmatig en reproduceerbaar zijn. Het zelfroerende mechanisme dat sommige zuurstofelektroden hebben, voldoet meestal goed. Tussen de metingen in moet de cel met water worden gespoeld. Het monster kan ook worden overgebracht in een BOD-fles (figuur 2 van aanhangsel 3) uitgerust met een magneetroerder. Er moet dan een zuurstofelektrode met een hulsadapter in de hals van de fles worden gestoken, en de magneetroerder moet worden aangezet. In beide gevallen wordt de concentratie opgeloste zuurstof continu gemeten en geregistreerd gedurende een bepaalde tijd, meestal 5 tot 10 minuten, of totdat de zuurstofconcentratie lager is geworden dan 2 mg/l. Als er metingen na langere blootstellingsperioden volgen, wordt de elektrode verwijderd en het mengsel teruggevoerd naar het beluchtingsvat, waar het beluchten en roeren moet worden voortgezet.

Verificatie van de concentratie teststof

44.

Voor sommige doeleinden kan meting van de concentratie van de teststof in de testvaten nodig zijn. Let op het volgende: bij het gebruik van stamoplossingen van:

slecht in water oplosbare stoffen,

mengsels met componenten met een verschillende oplosbaarheid in water, of

stoffen met een goede oplosbaarheid in water, maar waarbij de concentratie van de stamoplossing dicht bij de oplosbaarheidsgrens ligt,

is onbekend welke fractie is opgelost, en is dus niet bekend wat de werkelijke teststofconcentratie is die in de testvaten wordt gebracht. Om de blootstelling te definiëren is een analytische bepaling van de concentraties van de teststof in de testvaten nodig. Deze bepaling kan het gemakkelijkst worden uitgevoerd vóór de toevoeging van entmateriaal. Aangezien alleen opgeloste fracties in de vaten worden overgebracht, kunnen de gemeten concentraties zeer laag zijn.

45.

Om tijdrovende en kostbare analyses te voorkomen wordt aanbevolen de teststof rechtstreeks in de testvaten af te wegen en voor latere berekeningen de afgewogen nominale beginconcentratie te gebruiken. Het is niet nodig om onderscheid te maken tussen opgeloste, niet-opgeloste en geadsorbeerde fracties van de teststof, omdat al deze fracties onder praktijkomstandigheden in een afvalwaterbehandelingsinstallatie op dezelfde wijze voorkomen en bovendien kunnen variëren naargelang van de samenstelling van het afvalwater. De test heeft tot doel een realistische niet-remmende concentratie te schatten en is niet geschikt om in detail te onderzoeken welke fracties bijdragen tot de remming van de organismen in actief slib. Ook adsorptieve stoffen moeten rechtstreeks in de testvaten worden afgewogen, en de vaten moeten gesilaniseerd worden om verliezen door adsorptie zo veel mogelijk te beperken.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Berekening van zuurstofopnamesnelheden

46.

De zuurstofopnamesnelheden worden berekend uit de gemiddelden van de gemeten waarden, bijvoorbeeld in het lineaire deel van de grafieken van de zuurstofconcentratie als functie van de tijd, waarbij alleen zuurstofconcentraties tussen 2,0 mg/l en 7,0 mg/l worden gebruikt omdat hogere en lagere concentraties zelf van invloed kunnen zijn op de verbruikssnelheid. Soms is het onvermijdelijk en nodig om buiten dit concentratiegebied te komen, bijvoorbeeld wanneer de ademhaling sterk wordt onderdrukt en daardoor erg traag is, of als een bepaald actief slib een zeer snelle ademhaling vertoont. Dit is aanvaardbaar mits de betreffende delen van de opnamegrafiek recht zijn en de helling niet verandert bij het passeren vans de betreffende O2-grenswaarde van 2,0 mg/l of 7,0 mg/l. Gebogen delen van de grafiek geven aan dat het meetsysteem aan het stabiliseren is of dat de opnamesnelheid aan het veranderen is en mogen niet voor de berekening van ademhalingssnelheden worden gebruikt. De zuurstofopnamesnelheid moet worden uitgedrukt in milligram per liter per uur (mg/l.uur) of in milligram per gram droog slib per uur (mg/g.uur). De zuurstofverbruikssnelheid R, in mg/l.uur, kan worden berekend of geïnterpoleerd uit het lineaire deel van de geregistreerde grafiek van de zuurstofafname volgens vergelijking 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

waarbij

Q1

de zuurstofconcentratie aan het begin van het gekozen deel van de lineaire fase (mg/l);

Q2

de zuurstofconcentratie aan het eind van het gekozen deel van de lineaire fase (mg/l);

Δt

het tijdsinterval tussen deze twee metingen (minuten).

47.

De specifieke ademhalingssnelheid (Rs) wordt uitgedrukt als de hoeveelheid zuurstof verbruikt per g drooggewicht slib per uur (mg/g.uur), volgens vergelijking 2:

Rs = R/SS

(2)

waarbij SS de concentratie gesuspendeerde vaste stoffen in het testmengsel is (g/l).

48.

De verschillende indexen van R, die gecombineerd kunnen worden, zijn:

S

specifieke snelheid

T

totale ademhalingssnelheid

N

snelheid ten gevolge van nitrificatie-ademhaling

N

snelheid ten gevolge van heterotrofe ademhaling

A

snelheid ten gevolge van abiotische processen

B

snelheid op basis van blanco bepalingen (gemiddelde)

Berekening van de zuurstofopname door nitrificatie

49.

Het verband tussen totale ademhaling (RT), nitrificatie-ademhaling (RN) en heterotrofe ademhaling (RH) wordt beschreven door vergelijking 3:

RN = RT – RH

(3)

waarbij

RN

de snelheid van zuurstofopname door nitrificatie (mg/l.uur);

RT

de gemeten snelheid van zuurstofopname van de blanco controle (zonder ATU; FB) (mg/l.uur);

RT

de gemeten snelheid van zuurstofopname van de blanco controle met toegevoegd ATU; FN) (mg/l.uur).

50.

Dit verband geldt voor blanco waarden (RNB, RTB, RHB), abiotische controles (RNA, RTA, RHA) en bepalingen met teststoffen (RNS, RTS, RHS) (mg/g.uur). Specifieke ademhalingssnelheden worden berekend uit:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Indien RN niet-significant is (bv. < 5 % van RT in blanco controles) in een oriënterende test, kan worden aangenomen dat de heterotrofe zuurstofopname gelijk is aan de totale opname en dat er geen nitrificatie plaatsvindt. Er zou actief slib uit een andere bron nodig zijn als de tests bedoeld zijn om de effecten op heterotrofe en nitrificerende micro-organismen te onderzoeken. Een definitieve test wordt uitgevoerd indien bij verschillende concentraties teststof onderdrukte zuurstofopnamesnelheden worden gevonden.

Berekening van de procentuele remming

52.

De procentuele remming, IT, van het totale zuurstofverbruik bij elke concentratie teststof, wordt beschreven door vergelijking 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

De procentuele remming van de heterotrofe zuurstofopname, IH, bij elke concentratie teststof, wordt beschreven door vergelijking 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

De remming van de zuurstofopname door nitrificatie, IN, bij elke concentratie, wordt beschreven door vergelijking 9:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(9)

55.

De procentuele remming van de zuurstofopname moet worden uitgezet tegen de logaritme van de concentratie teststof (remmingscurve, zie figuur 3 van aanhangsel 4). Voor elke beluchtingsperiode van 3 uur, en eventueel ook na 30 min, worden remmingscurven maakt. De concentratie teststof die de zuurstofopname met 50 % remt (EC50) moet uit de grafiek worden berekend of geïnterpoleerd. Als de meetgegevens dat toelaten kunnen de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen voor de EC50, de helling van de curve en geschikte markerende waarden voor het begin (bv. EC10 of EC20) en het eind (bv. EC80 of EC90) van het remmende bereik, worden berekend of geïnterpoleerd.

56.

Met het oog op de vaak waargenomen variabiliteit in de resultaten kan het in veel gevallen voldoende zijn om de resultaten tevens uit te drukken in orde van grootte, bijvoorbeeld:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l tot 10 mg/l

EC50

10 mg/l tot 100 mg/l

EC50

< 100 mg/l

Interpretatie van de resultaten

ECx

57.

ECx-waarden en de bijbehorende 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden berekend met een geschikte statistische methode (bv. probitanalyse, logistische functie of Weibull-functie, getrimde Spearman-Karber-methode of eenvoudige interpolatie (11)). Een ECx wordt verkregen door de waarde die correspondeert met x % van het controlegemiddelde in de gevonden vergelijking in te vullen. Voor berekening van de EC50 of een andere ECx wordt regressieanalyse uitgevoerd met de gemiddelden voor elke dosisgroep (x).

Bepaling van de NOEC

58.

Voor het bepalen van de NOEC door middel van statistische analyse moeten de metingen per vat (individuele vaten worden als replicaten beschouwd) worden gebruikt. Er dienen passende statistische methoden te worden gebruikt als beschreven in het OESO-document „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application” (11). Negatieve effecten van de teststof, in vergelijking met de controle, worden in het algemeen onderzocht met behulp van eenzijdige hypothesetoetsing met p ≤ 0,05.

Testverslag

59.

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

 

Teststof

triviale naam, chemische naam, CAS-nummer, zuiverheid;

fysisch-chemische eigenschappen van de teststof (bv. log Kow, oplosbaarheid in water, dampspanning, Henry-constante (H) en beschikbare informatie over het lot van de chemische stof, bv. adsorptie aan actief slib).

 

Testsysteem

herkomst, bedrijfsomstandigheden van de afvalwaterbehandelingsinstallatie en het influent, concentratie, voorbehandeling en instandhouding van het actief slib.

 

Testomstandigheden

testemperatuur, pH tijdens de test en duur van de blootstellingsfase(n).

 

Resultaten

het specifieke zuurstofverbruik van de controles (mg O2/(g slib × uur);

alle meetresultaten, remmingscurve(n) en methode voor het berekenen van EC50,

EC50, indien mogelijk met 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen, eventueel EC20, EC80; eventueel NOEC en de gebruikte statistische methoden, als de EC50 niet kan worden bepaald;

resultaten voor remming van totale, en indien van toepassing, heterotrofe en nitrificatie-ademhaling;

abiotische zuurstofopname in de fysisch-chemische controle (indien uitgevoerd);

naam van de referentiestof en de resultaten met deze chemische stof;

alle waarnemingen en alle afwijkingen van de standaardprocedure die van invloed kunnen zijn op de resultaten.

LITERATUUR

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Aanhangsel 1

Definities

De volgende definities zijn voor deze testmethode relevant:

Chemische stof : een stof of een mengsel.

ECx (concentratie voor x % effect) : de concentratie die binnen een bepaalde blootstellingsperiode x % effect op testorganismen veroorzaakt (bv. 50 %) in vergelijking met een controle.. De EC50 is bijvoorbeeld de geschatte concentratie die gedurende een bepaalde blootstellingsperiode bij 50 % van een blootgestelde populatie een effect op een testeindpunt zal hebben.

NOEC (concentratie zonder waargenomen effect) : de concentratie teststof waarbij geen effect wordt waargenomen. In deze test heeft de concentratie die overeenkomt met de NOEC geen statistisch significant effect (p < 0,05) binnen een bepaalde blootstellingsperiode in vergelijking met de controle.

Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.

Aanhangsel 2

Figuur 1:   Voorbeeld van een meetsysteem

Image

Legenda

1

actief slib

2

kunstmatig medium

3

teststof

4

lucht

5

mengvat

6

magneetroerder

7

zuurstofmeetcel

8

zuurstofelektrode

9

zuurstofmeetinstrument

10

recorder

Aanhangsel 3

Figuur 2:   Voorbeeld van een meetsysteem met een BOD-fles

Image

Legenda

1

testvat

2

zuurstofelektrode

3

zuurstofmeetinstrument

Aanhangsel 4

Figuur 3:   Voorbeeld van remmingscurven

Image

Legenda

X

concentratie 3,5-dichloorfenol (mg/l)

Y

remming ( %)

Image

remming van heterotrofe ademhaling bij gebruik van nitrificerend slib

Image

remming van nitrificatie bij gebruik van nitrificerend slib

5)

Hoofdstuk C.26 wordt vervangen door:

C.26   LEMNA-SOORTEN: GROEIREMMINGSTEST

INLEIDING

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 221 (2006) van de OESO. Ze is bedoeld om de toxiciteit van stoffen te bepalen voor zoetwaterplanten van het geslacht Lemna (eendenkroos). Deze testmethode is gebaseerd op bestaande methoden (1) (2) (3) (4) (5) (6), maar met een aantal wijzigingen naar aanleiding van recent onderzoek en adviezen over een aantal belangrijke aspecten. Deze testmethode is gevalideerd door middel van een internationaal ringonderzoek (7).

2.

In deze testmethode worden toxiciteitstests beschreven met Lemna gibba en Lemna minor, die beide uitgebreid zijn bestudeerd en waarvoor bovengenoemde normen zijn verschenen. De taxonomie van Lemna spp. is lastig en wordt gecompliceerd doordat er een breed scala van fenotypen bestaat. Hoewel er bij Lemna sprake kan zijn van genetische variabiliteit bij de respons op toxische stoffen, zijn er momenteel onvoldoende gegevens over deze bron van variabiliteit om het gebruik van een specifieke kloon voor deze testmethode aan te kunnen bevelen. De test wordt niet axenisch wordt uitgevoerd, maar in bepaalde fasen van de testprocedure worden maatregelen genomen om besmetting door andere organismen tot een minimum te beperken.

3.

Tests met verversing (semistatisch en doorstroom) en zonder verversing (statisch) van de testoplossing worden in detail beschreven. Afhankelijk van de doelstellingen van de test en de voorschriften in de regelgeving wordt aanbevolen het gebruik van semistatische en doorstroommethoden te overwegen, bijvoorbeeld voor stoffen die ten gevolge van verdamping, afbraak onder invloed van licht, neerslaan of biologische afbraak snel uit de oplossing verdwijnen. Zie (8) voor een nadere leidraad.

4.

De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

PRINCIPE VAN DE TEST

5.

Men laat exponentieel groeiende plantenculturen van het geslacht Lemna gedurende zeven dagen als monocultuur groeien in aanwezigheid van verschillende concentraties van de teststof. Het doel van de test is om op basis van bepalingen van gekozen meetvariabelen de effecten van de chemische stof op de vegetatieve groei gedurende deze periode kwantitatief te bepalen. De primaire meetvariabele is het aantal schijfjes. Daarnaast wordt ten minste één andere meetvariabele gemeten (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht), omdat sommige chemische stoffen mogelijk een veel grotere invloed hebben op andere meetvariabelen dan het aantal schijfjes. Om de effecten van de stof te kwantificeren, wordt de groei in de testoplossingen vergeleken met de groei van de controles en wordt de concentratie bepaald die een specifiek percentage remming van de groeisnelheid (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de ECx (bv. EC50).

6.

Het eindpunt van de test is groeiremming, uitgedrukt als de logaritmische toename van de meetvariabele (gemiddelde specifieke groeisnelheid) gedurende de blootstellingsperiode. Op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheden die in een reeks testoplossingen worden geregistreerd, wordt de concentratie bepaald die een specifiek percentage remming van de groeisnelheid ('growth rate') (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de ErCx (bv. ErC50).

7.

Bij deze testmethode wordt ook de opbrengst ('yield') als responsvariabele gebruikt; deze kan in bepaalde landen nodig zijn om aan specifieke voorschriften in de regelgeving te voldoen. De opbrengst wordt gedefinieerd als de biomassa aan het eind van de blootstellingsperiode verminderd met de biomassa aan het begin van de blootstellingsperiode. Op basis van de opbrengst die in een reeks testoplossingen wordt geregistreerd, wordt de concentratie berekend die een specifiek percentage verlaging van de opbrengst ('yield') (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de EyCx (bv. EyC50).

8.

Daarnaast kunnen langs statistische weg de laagste concentratie met waargenomen effect (LOEC) en de concentratie zonder waargenomen effect (NOEC) worden bepaald.

INFORMATIE OVER DE TESTSTOF

9.

Er moet een analysemethode beschikbaar zijn met een afdoende gevoeligheid voor kwantitatieve bepaling van de stof in het testmedium.

10.

Gegevens over de teststof die nuttig kunnen zijn om de testomstandigheden vast te stellen, zijn bijvoorbeeld de structuurformule, zuiverheid, oplosbaarheid in water, stabiliteit in water en licht, pKa, Kow, dampspanning en biologische afbreekbaarheid. De oplosbaarheid in water en de dampspanning kunnen gebruikt worden om de constante van de Wet van Henry te berekenen die aangeeft of tijdens de testperiode significante verliezen van de teststof te verwachten zijn. Mede op grond hiervan kan worden bepaald of er specifieke maatregelen moeten worden genomen om dergelijke verliezen te beperken. Wanneer de informatie over de oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof onzeker is, wordt aanbevolen deze eigenschappen te bepalen onder de omstandigheden van de test, d.w.z. in het groeimedium, bij de temperatuur en met het lichtregime zoals die in de test worden gebruikt.

11.

Wanneer regulering van de pH van het testmedium van bijzonder belang is, bijvoorbeeld bij het testen van metalen of stoffen die instabiel voor hydrolyse zijn, wordt aanbevolen een buffer aan het groeimedium toe te voegen (zie punt 21). Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat ze moeilijk te testen zijn, worden gegeven in (8).

GELDIGHEID VAN DE TEST

12.

Voor een geldige test moet de verdubbelingstijd van het aantal schijfjes in de controlegroep minder dan 2,5 dagen (60 uur) zijn, hetgeen overeenkomt met een ongeveer zevenvoudige toename in zeven dagen en een gemiddelde specifieke groeisnelheid van 0,275 d– 1. Bij gebruik van de in deze testmethode beschreven media en testomstandigheden kan met een statische testopzet aan dit criterium worden voldaan (5). Ook bij een semistatische en een doorstroomtest zal naar verwachting aan dit criterium kunnen worden voldaan. In punt 49 wordt de berekening van de verdubbelingstijd beschreven.

REFERENTIESTOF

13.

Om de testprocedure te controleren kunnen een of meer referentiestoffen worden getest, zoals 3,5-dichloorfenol dat in het internationale ringonderzoek is gebruikt (7). Het is raadzaam om een referentiestof ten minste twee keer per jaar of, wanneer de test minder frequent wordt uitgevoerd, tegelijk met de bepaling van de toxiciteit van een teststof te testen.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Apparatuur

14.

Alle apparatuur die in aanraking komt met de testmedia moet van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn. Glaswerk dat voor het kweken en de test wordt gebruikt, moet worden ontdaan van chemische verontreinigingen die in het medium terecht kunnen komen, en moet steriel zijn. De testvaten moeten zo breed zijn dat de schijfjes van de verschillende kolonies in de controlevaten kunnen groeien zonder dat ze elkaar aan het eind van de test overlappen. De wortels mogen de bodem van de testvaten raken, maar een minimale diepte van 20 mm en een minimaal volume van 100 ml in elk testvat wordt aanbevolen. De keuze van de testvaten is geen kritische factor zolang aan deze eisen wordt voldaan. Van zowel bekerglazen (van glas) als kristalliseerschalen of glazen petrischalen met geschikte afmetingen is gebleken dat ze geschikt zijn. De testvaten moeten worden afgedekt om verdamping en onopzettelijke verontreiniging tot een minimum te beperken, waarbij echter wel de nodige uitwisseling van lucht mogelijk moet zijn. Bij het kiezen van geschikte testvaten en met name deksels moet erop worden gelet dat ze geen schaduwwerking of veranderingen in de spectrale kenmerken van licht veroorzaken.

15.

De culturen en de testvaten mogen niet samen worden bewaard. Hiervoor kan het best worden gezorgd door aparte klimaatkasten, incubators of klimaatkamers te gebruiken. De verlichting en de temperatuur moeten regelbaar zijn en constant worden gehouden (zie punten 35-36).

Testorganismen

16.

Het organisme dat voor deze test wordt gebruikt is Lemna gibba of Lemna minor. Aanhangsel 2 bevat korte beschrijvingen van eendenkroossoorten die voor toxiciteitstests zijn gebruikt. Het plantenmateriaal kan van een cultuurcollectie of een ander laboratorium worden betrokken of uit het veld worden gehaald. Als de planten uit het veld worden gehaald, moeten ze ten minste gedurende acht weken vóór gebruik in hetzelfde medium in cultuur worden gehouden als voor de test wordt gebruikt. Op de plaatsen die voor het verzamelen van de beginculturen worden gebruikt, mogen er geen zichtbare bronnen van verontreiniging zijn. Als ze van een ander laboratorium of van een cultuurcollectie worden betrokken, moeten ze op dezelfde manier gedurende minimaal drie weken in cultuur worden gehouden. De herkomst van het plantenmateriaal en de voor de test gebruikte soort en kloon (indien bekend) moeten altijd worden gerapporteerd.

17.

Er dienen monoculturen te worden gebruikt die zichtbaar vrij zijn van verontreiniging door andere organismen zoals algen en protozoën. Gezonde planten van L. minor bestaan uit kolonies van twee tot vijf schijfjes, terwijl gezonde kolonies van L. gibba maximaal zeven schijfjes kunnen bevatten.

18.

De kwaliteit en uniformiteit van de voor de test gebruikte planten hebben een substantiële invloed op de resultaten van de test, en daarom moeten de planten met zorg worden gekozen. Er moeten jonge, snel groeiende planten worden gebruikt zonder zichtbare beschadigingen en zonder verkleuring (chlorose). Wanneer een cultuur veel kolonies van ten minste twee schijfjes bevat, wijst dit op een goede kwaliteit. Een groot aantal losse schijfjes wijst op milieustress, bv. een nutriënt als beperkende factor, en plantenmateriaal van dergelijke culturen mag niet voor de test worden gebruikt.

Kweek

19.

Om de onderhoudfrequentie van culturen te beperken (bv. wanneer er gedurende enige tijd geen Lemna-tests gepland zijn), kunnen de culturen onder beperkte verlichting en bij verlaagde temperatuur (4-10 °C) worden bewaard. Nadere informatie over het kweken is te vinden in aanhangsel 3. Wanneer er duidelijke tekenen van verontreiniging door algen of andere organismen zijn, moet er bij een submonster van Lemna-schijfjes oppervlaktesterilisatie worden uitgevoerd, waarna het naar vers medium wordt overgezet (zie aanhangsel 3). In dat geval moet de resterende verontreinigde cultuur worden afgekeurd.

20.

Ten minste zeven dagen vóór de test worden voldoende kolonies aseptisch overgezet naar vers steriel medium en gedurende 7-10 dagen onder de testomstandigheden gekweekt.

Testmedium

21.

Voor Lemna minor en Lemna gibba worden verschillende groeimedia aanbevolen, die hieronder worden beschreven. Er moet zorgvuldig worden overwogen of er een pH-buffer in het testmedium moet worden opgenomen (MOPS (4-morfolinepropaansulfonzuur, CAS-nr. 1132-61-2) in L. minor-medium en NaHCO3 in L. gibba-medium) wanneer het vermoeden bestaat dat deze met de teststof kan reageren en de toxische effecten kan beïnvloeden. Steinberg-medium (9) is ook aanvaardbaar zo lang aan de geldigheidscriteria wordt voldaan.

22.

Voor het kweken van en testen met L. minor wordt een gewijzigde versie van het Lemna-groeimedium van het Zweedse instituut voor normalisatie (SIS) aanbevolen. De samenstelling van deze media wordt in aanhangsel 4 beschreven.

23.

Het in aanhangsel 4 beschreven groeimedium 20X-AAP wordt aanbevolen voor het kweken van en testen met L. gibba.

24.

Het eveneens in aanhangsel 4 beschreven Steinberg-medium is juist geschikt voor L. minor, maar kan ook voor L. gibba worden gebruikt zo lang aan de geldigheidscriteria wordt voldaan.

Testoplossingen

25.

De testoplossingen worden meestal bereid door verdunning van een stamoplossing. Stamoplossingen van de teststof worden doorgaans bereid door de stof op te lossen in groeimedium.

26.

De hoogste geteste concentratie van de teststof mag normaal gesproken niet hoger zijn dan de wateroplosbaarheid van de stof onder de testomstandigheden. Er moet echter worden opgemerkt dat Lemna spp. op het oppervlak drijft en kan worden blootgesteld aan stoffen die zich aan het grensvlak tussen water en lucht ophopen (bijvoorbeeld stoffen die slecht oplosbaar zijn in water, hydrofobe stoffen of oppervlakteactieve stoffen). Onder dergelijke omstandigheden is er sprake van blootstelling aan materiaal dat niet in oplossing is en mogen de testconcentraties, afhankelijk van de eigenschappen van de teststof, de wateroplosbaarheid overschrijden. Voor slecht in water oplosbare teststoffen kan het nodig zijn om met een organisch oplosmiddel of dispergeermiddel een geconcentreerde stamoplossing of dispersie van de stof te maken, om nauwkeurige hoeveelheden teststof aan het testmedium te kunnen toevoegen en het dispergeren en oplossen ervan te bevorderen. Al het mogelijke moet worden gedaan om gebruik van dergelijke materialen te vermijden. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen als hulpstof mag niet tot fytotoxiciteit leiden. Vaak gebruikte oplosmiddelen die bij concentraties tot 100 μl/l geen fytotoxiciteit veroorzaken zijn bijvoorbeeld aceton en dimethylformamide. Wanneer een oplosmiddel of dispergeermiddel wordt gebruikt, moet de eindconcentratie worden gerapporteerd en tot een minimum worden beperkt (≤ 100 μl/l) en moeten alle test- en controleoplossingen dezelfde concentratie oplosmiddel of dispergeermiddel bevatten. Zie (8) voor nadere richtsnoeren over het gebruik van dispergeermiddelen.

Test- en controlegroepen

27.

Wanneer er vooraf iets bekend is over de toxiciteit van de teststof voor Lemna, bijvoorbeeld uit een oriënterende test, kan dit nuttig zijn bij het kiezen van geschikte testconcentraties. Bij de definitieve toxiciteitstest moeten normaal gesproken ten minste vijf testconcentraties worden gebruikt die een meetkundige reeks vormen. De rede van de reeks mag bij voorkeur niet hoger zijn dan 3,2 maar bij een vlakke concentratie/responscurve mag een hogere waarde worden gebruikt. Als er minder dan vijf concentraties worden gebruikt, moet een motivering worden gegeven. Voor elke testconcentratie moeten ten minste drie replicaten worden gebruikt.

28.

Bij het kiezen van de testconcentraties (voor een bereikbepalingstest en/of de definitieve toxiciteitstest) moeten de volgende punten in aanmerking worden genomen:

Als een ECx wordt bepaald, moet de ECx-waarde binnen het bereik van de testconcentraties vallen om een adequaat betrouwbaarheidsniveau te waarborgen. Als bijvoorbeeld de EC50 wordt bepaald, moet de hoogste testconcentratie hoger dan de EC50 zijn. Als de EC50 buiten het bereik van de testconcentraties ligt, zullen de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen groot zijn en zal een correcte bepaling van de statistische fit van het model wellicht niet mogelijk zijn.

Als het de bedoeling is de LOEC/NOEC te schatten, moet de laagste testconcentratie zodanig laag zijn dat de groei niet significant lager is dan in de controle. Bovendien moet de hoogste testconcentratie dan zodanig hoog zijn dat de groei significant lager is dan in de controle. Als dit niet het geval is, moet de test met een ander concentratiebereik worden herhaald (tenzij de hoogste concentratie samenvalt met de oplosbaarheidsgrens of de hoogste grensconcentratie die vereist is, bv. 100 mg·/l).

29.

In elke test moeten controles worden opgenomen waarbij het voedingsmedium, het aantal schijfjes en kolonies, de milieuomstandigheden en de procedures identiek zijn aan die van de testvaten, maar zonder de teststof. Als er een oplosmiddel of dispergeermiddel als hulpstof wordt gebruikt, moet een extra controle worden opgenomen die dezelfde concentratie oplosmiddel/dispergeermiddel bevat als de vaten met de teststof. Het aantal replicaatcontrolevaten (en -oplosmiddelvaten, indien van toepassing) moet ten minste gelijk zijn aan en liefst twee keer zo groot zijn als het aantal vaten dat voor elke testconcentratie wordt gebruikt.

30.

Als bepaling van de NOEC niet nodig is, mag het aantal concentraties worden vergroot en het aantal replicaten per concentratie worden verminderd. Er moeten echter minimaal drie controlereplicaten worden gebruikt.

Blootstelling

31.

Kolonies bestaande uit 2 tot 4 zichtbare schijfjes worden vanuit de entcultuur onder aseptische omstandigheden op aselecte wijze overgezet naar de testvaten. Elk testvat moet in totaal 9 tot 12 schijfjes bevatten. Het aantal schijfjes en kolonies moet in elk testvat hetzelfde zijn. Uit de met deze methode opgedane ervaring en de gegevens van het ringonderzoek is gebleken dat drie replicaten per dosisgroep, waarbij elk replicaat aanvankelijk 9 tot 12 schijfjes bevat, voldoende is om verschillen in groei tussen de dosisgroepen te detecteren van ongeveer 4 % tot 7 % remming (berekend op basis van groeisnelheid) of 10 % tot 15 % remming (berekend op basis van opbrengst) (7).

32.

Wat de locatie van de testvaten in de incubator betreft, moet een aselecte opzet worden gehanteerd om de invloed van plaatselijke verschillen in lichtintensiteit of temperatuur zo veel mogelijk te beperken. Een blokopzet of aselecte verplaatsing van de vaten bij het doen van observaties (of frequenter verplaatsen) is ook vereist.

33.

Als uit een oriënterende stabiliteitstest is gebleken dat de concentratie van de teststof in de loop van de test (7 dagen) niet op peil blijft (d.w.z. dat de gemeten concentratie lager wordt dan 80 % van de gemeten beginconcentratie), wordt een semistatische testopzet aanbevolen. In dit geval moeten de kolonies ten minste twee keer in de loop van de test (bijvoorbeeld op dag 3 en op dag 5) aan vers bereide test- en controleoplossingen worden blootgesteld. De frequentie van blootstelling aan vers medium is afhankelijk van de stabiliteit van de teststof; bij zeer instabiele of vluchtige stoffen kan een hogere frequentie nodig zijn om de concentratie nagenoeg constant te houden. In sommige gevallen kan een doorstroomprocedure nodig zijn (8) (10).

34.

Blootstelling door aanbrengen op het blad (spuiten) komt in deze testmethode niet aan de orde; zie hiervoor (11).

Incubatieomstandigheden

35.

Er moet continue warm witte of koud witte fluorescerende belichting worden gebruikt om te zorgen voor een lichtintensiteit binnen het bereik 85-135 μE · m– 2s– 1, gemeten binnen het voor fotosynthese effectieve golflengtebereik (400-700 nm) op punten op dezelfde afstand van de lichtbron als de Lemna-schijfjes (dit komt overeen met 6 500-10 000 lux). De lichtintensiteit in het testgebied mag niet meer dan ± 15 % afwijken van de gekozen lichtintensiteit. De methode waarmee het licht wordt gedetecteerd en gemeten, met name het type sensor, zal de meetwaarde beïnvloeden. De voorkeur wordt gegeven aan sferische sensoren (die reageren op licht uit alle hoeken boven en onder het meetvlak) en „cosinus”-sensoren (die reageren op licht uit alle hoeken boven het meetvlak) in plaats van unidirectionele sensoren, aangezien deze een hogere uitslag geven voor een meerpuntslichtbron van het hier beschreven type.

36.

De temperatuur in de testvaten moet 24 ± 2 °C zijn. De pH van het controlemedium mag gedurende de test niet meer dan 1,5 eenheden stijgen. Een afwijking van meer dan 1,5 eenheden maakt de test echter niet ongeldig wanneer kan worden aangetoond dat aan de geldigheidscriteria wordt voldaan. In speciale gevallen, bijvoorbeeld wanneer instabiele stoffen of metalen worden getest, moet extra aandacht aan pH-verschuiving worden besteed. Zie (8) voor nadere richtsnoeren.

Duur

37.

De test wordt beëindigd 7 dagen na het overzetten van de planten naar de testvaten.

Metingen en analyses

38.

Aan het begin van de test wordt het aantal schijfjes in de testvaten geteld en geregistreerd, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat overlappende maar apart zichtbare schijfjes worden meegeteld. Het aantal schijfjes (normaal of abnormaal) moet aan het begin van de test, ten minste één keer per drie dagen gedurende de blootstellingsperiode (d.w.z. ten minste twee keer gedurende de periode van 7 dagen) en aan het eind van de test worden bepaald. Veranderingen in de ontwikkeling van de plant (bv. qua grootte van de schijfjes, uiterlijk, verschijnselen van necrose, chlorose of gebocheldheid, uit elkaar vallen of verlies van drijfvermogen van kolonies, lengte en uiterlijk van de wortels) moeten geregistreerd worden. Ook significante kenmerken van het testmedium (bijvoorbeeld aanwezigheid van onopgelost materiaal of algengroei in het testvat) moeten worden geregistreerd.

39.

Naast bepalingen van het aantal schijfjes gedurende de test, moeten ook de effecten van de teststof op een (of meer) van de volgende meetvariabelen worden bepaald:

(i)

totaaloppervlak van de schijfjes,

(ii)

drooggewicht,

(iii)

versgewicht.

40.

Het voordeel van het totaaloppervlak van de schijfjes is dat het voor elk testvat en controlevat aan het begin, gedurende en aan het eind van de test kan worden bepaald. Het droog- of versgewicht moet aan het begin van de test worden bepaald bij een monster van de entcultuur dat representatief is voor wat er wordt gebruikt om de test te starten, en aan het eind van de test bij het plantenmateriaal van elk testvat en controlevat. Als het oppervlak van de schijfjes niet wordt gemeten, krijgt het drooggewicht de voorkeur boven het versgewicht.

41.

Het totaaloppervlak van de schijfjes, het drooggewicht en het versgewicht kunnen als volgt worden bepaald:

(i)

Totaaloppervlak van de schijfjes: het totaaloppervlak van de schijfjes van alle kolonies kan door beeldanalyse worden bepaald. Met een videocamera kan een silhouet van het testvat en de planten worden opgenomen (bijvoorbeeld door het vat op een lichtbak te zetten) en dit beeld kan gedigitaliseerd worden. Door kalibratie met vlakke vormen met een bekend oppervlak kan vervolgens het totaaloppervlak van de schijfjes in een testvat worden bepaald. Er moet op worden gelet dat storing door de rand van het testvat wordt voorkomen. Een andere methode, die echter bewerkelijker is, is een foto van de testvaten en planten te maken, het resulterende silhouet van de kolonies uit te knippen en het oppervlak te bepalen met een bladoppervlakanalysator of millimeterpapier. Ook andere technieken (bv. de papiergewicht-verhouding tussen het silhouet van het kolonieoppervlak en een oppervlakte-eenheid) kunnen bruikbaar zijn.

(ii)

Drooggewicht: Uit elk testvat worden alle kolonies verzameld en afgespoeld met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Ze worden afgevloeid om het aanhangend water te verwijderen en vervolgens bij 60 °C gedroogd tot constant gewicht. Wortelfragmenten moeten in de bepaling worden meegenomen. Het drooggewicht moet worden uitgedrukt met een precisie van ten minste 0,1 mg.

(iii)

Versgewicht: Alle kolonies worden overgebracht naar vooraf gewogen buizen van polystyreen (of een ander inert materiaal) met kleine (1 mm) gaten in de afgeronde bodem. De buizen worden vervolgens tien minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 3 000 rpm. De buizen, die nu de kolonies zonder vocht bevatten, worden opnieuw gewogen en het versgewicht wordt berekend door aftrekking van het gewicht van de lege buis.

Frequentie van de metingen en analyses

42.

Als een statische testopzet wordt gebruikt, moet de pH van elke dosisgroep aan het begin en het eind van de test worden gemeten. Als een semistatische testopzet wordt gebruikt, moet de pH vóór elke verversing worden gemeten in elke batch „verse” testoplossing en ook in de corresponderende „gebruikte” oplossingen.

43.

De lichtintensiteit moet in de klimaatkast, incubator of klimaatkamer worden gemeten op punten op dezelfde afstand van de lichtbron als de Lemna-schijfjes. De metingen dienen ten minste eenmaal gedurende de test te worden uitgevoerd. De temperatuur van het medium moet ten minste eenmaal per dag worden gemeten in een speciaal vat dat onder dezelfde omstandigheden in de klimaatkast, incubator of klimaatkamer wordt bewaard.

44.

Gedurende de test worden de concentraties van de teststof op geschikte tijdstippen bepaald. Bij statische tests moeten de concentraties in elk geval aan het begin en aan het eind van de test worden bepaald.

45.

In semistatische tests waarbij de concentratie van de teststof naar verwachting niet binnen ± 20 % van de nominale concentratie zal blijven, is het nodig om alle vers bereide testoplossingen en dezelfde oplossingen bij elke verversing te analyseren (zie punt 33). Wanneer de gemeten beginconcentratie van de teststof niet binnen ± 20 % van de nominale concentratie ligt, maar afdoende kan worden aangetoond dat de beginconcentraties herhaalbaar en stabiel zijn (d.w.z. binnen het bereik van 80-120 % van de beginconcentratie liggen), hoeven de chemische bepalingen alleen bij de hoogste en laagste testconcentratie te worden uitgevoerd. In alle gevallen volstaat het de bepaling van de teststofconcentraties vóór verversing op één van de replicaatvaten voor elke testconcentratie uit te voeren (of op de gecombineerde inhoud van de replicaatvaten).

46.

Als een doorstroomtest wordt gebruikt, kan een vergelijkbaar bemonsteringsschema worden gebruikt als voor semistatische tests is beschreven, met een analyse aan het begin, halverwege en aan het eind van de test, maar in dit geval is een meting van de „gebruikte” oplossingen niet relevant. Bij een dergelijke test moet de stroomsnelheid van het verdunningsmiddel en de teststof of de stamoplossing van de teststof dagelijks worden gecontroleerd.

47.

Als kan worden aangetoond dat de concentratie van de geteste stof gedurende de gehele test op afdoende wijze binnen ± 20 % van de nominale of gemeten beginconcentratie is gebleven, kan de analyse van de resultaten op basis van de nominale of gemeten beginwaarden worden uitgevoerd. Als de afwijking ten opzichte van de nominale of gemeten beginconcentratie groter is dan ± 20 %, moet de analyse van de resultaten worden uitgevoerd op basis van het meetkundige gemiddelde van de concentratie gedurende de blootstelling of op basis van modellen waarmee de afname van de concentratie van de teststof wordt beschreven (8).

Limiettest

48.

Onder bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld wanneer een oriënterende test erop wijst dat de teststof in concentraties tot 100 mg/l of tot de oplosbaarheidsgrens in het testmedium (als deze lager ligt) geen toxische effecten heeft, kan een limiettest worden uitgevoerd, waarbij de respons in een controlegroep en één dosisgroep (100 mg/ml of een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheidsgrens) wordt vergeleken. Er wordt sterk aanbevolen dit te ondersteunen met een analyse van de blootstellingsconcentratie. Alle in het voorgaande beschreven testomstandigheden en geldigheidscriteria zijn ook van toepassing bij een limiettest, alleen moet het aantal replicaten per dosis worden verdubbeld. De groei in de controlegroep en de dosisgroep kan geanalyseerd worden met behulp van een statistische toets om gemiddelden te vergelijken, bijvoorbeeld een t-toets van Student.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Verdubbelingstijd

49.

Om de verdubbelingstijd (Td ) van het aantal schijfjes te bepalen en na te gaan of in deze test aan dit geldigheidscriterium wordt voldaan (zie punt 12), wordt op de gegevens van de controlevaten de volgende formule toegepast:

Td = ln 2/μ

Hierbij is μ de gemiddelde specifieke groeisnelheid, bepaald zoals beschreven in de punten 54 en 55.

Responsvariabelen

50.

De test is bedoeld om de effecten van de teststof op de vegetatieve groei van Lemna te bepalen. In deze testmethode worden twee responsvariabelen beschreven, aangezien verschillende rechtsgebieden verschillende voorkeuren en behoeften qua regelgeving hebben. De testresultaten zijn alleen in alle rechtsgebieden aanvaardbaar als de effecten met beide onderstaande responsvariabelen a) en b) worden bepaald:

(a)

Gemiddelde specifieke groeisnelheid: deze responsvariabele wordt berekend op basis van de logaritmische verandering in het aantal schijfjes en daarnaast op basis van de logaritmische verandering in een andere meetparameter (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in de loop van de tijd (uitgedrukt per dag) in de controles en elke dosisgroep. Dit wordt ook wel de relatieve groeisnelheid genoemd (12).

(b)

Opbrengst: deze responsvariabele wordt berekend op basis van de verandering in het aantal schijfjes en daarnaast op basis van de verandering in een andere meetparameter (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in de controles en elke dosisgroep tot het eind van de test.

51.

Er moet worden opgemerkt dat de met behulp van deze twee responsvariabelen berekende waarden voor de toxiciteit niet vergelijkbaar zijn en bij gebruik van de resultaten van de test moet met dit verschil rekening worden gehouden. Vanwege de mathematische grondslagen van de respectieve benaderingen zullen ECx -waarden op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheid (ErCx) in het algemeen hoger zijn dan resultaten op basis van de opbrengst (EyCx) als de testomstandigheden van deze testmethode worden aangehouden. Dit moet niet worden geïnterpreteerd als een verschil in gevoeligheid tussen de twee responsvariabelen, maar zuiver als een mathematisch verschil tussen de waarden. Het begrip gemiddelde specifieke groeisnelheid is gebaseerd op het algemene exponentiële groeipatroon van eendenkroos in niet-beperkte culturen, waarbij de toxiciteit wordt geschat op basis van de effecten op de groeisnelheid, zonder dat deze afhankelijk is van het absolute niveau van de specifieke groeisnelheid van de controle, van de helling van de concentratie-responscurve of van de duur van de test. De resultaten op basis van de responsvariabele opbrengst zijn daarentegen afhankelijk van al deze andere variabelen. De EyCx is afhankelijk van de specifieke groeisnelheid van de bij elke test gebruikte eendenkroossoort en van de maximale specifieke groeisnelheid die van soort tot soort en zelfs van kloon tot kloon kan verschillen. Deze responsvariabele moet niet worden gebruikt voor een vergelijking tussen eendenkroossoorten of zelfs verschillende klonen qua gevoeligheid voor toxische stoffen. De wetenschap geeft weliswaar de voorkeur aan het gebruik van de gemiddelde specifieke groeisnelheid om de toxiciteit te schatten, maar in deze testmethode wordt ook de schatting van de toxiciteit op basis van de opbrengst opgenomen om te voldoen aan de vereisten in de huidige regelgeving in bepaalde landen.

52.

De toxiciteit moet worden geschat op basis van het aantal schijfjes en daarnaast één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht), omdat sommige stoffen mogelijk een veel grotere invloed hebben op andere meetvariabelen dan het aantal schijfjes. Dit effect zou niet worden gedetecteerd als alleen naar het aantal schijfjes wordt gekeken.

53.

Er wordt een tabel gemaakt met het aantal schijfjes en een andere geregistreerde meetvariabele, d.w.z. het totaaloppervlak van de schijfjes, het drooggewicht of het versgewicht, alsmede de concentraties van de teststof op elk meettijdstip. Bij de latere gegevensanalyse, bijvoorbeeld om de LOEC, de NOEC of de ECx te bepalen, moet worden uitgegaan van de waarden voor de afzonderlijke replicaten en niet van de berekende gemiddelden voor elke dosisgroep.

Gemiddelde specifieke groeisnelheid

54.

De gemiddelde specifieke groeisnelheid voor een bepaalde periode wordt voor elk controlereplicaat en elk dosisreplicaat met de volgende vergelijking berekend als de logaritmische toename van de groeivariabelen — het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht):

Formula

waarbij

:

μi-j

:

de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip i tot tijdstip j;

:

Ni

:

de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip i tot tijdstip j;

:

Nj

:

de meetvariabele in het test- of controlevat op tijdstip j;

:

t

:

de periode van tijdstip i tot tijdstip j.

Voor elke dosisgroep en controlegroep wordt een gemiddelde waarde voor de groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie.

55.

De gemiddelde specifieke groeisnelheid moet voor de volledige testperiode worden berekend (tijdstip „i” in bovenstaande formule is het begin van de test en tijdstip „j” is het einde van de test). Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de gemiddelde specifieke groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie. Daarnaast moet de partiële groeisnelheid worden bepaald om effecten van de teststof gedurende de blootstellingsperiode te evalueren (bijvoorbeeld door inspectie van de log-getransformeerde groeicurven). Aanzienlijke verschillen tussen de partiële groeisnelheid en de gemiddelde groeisnelheid wijzen erop dat de groei niet voortdurend exponentieel is en dat de groeicurven grondig moeten worden bestudeerd. In dit geval zou het een behoedzame aanpak zijn om de specifieke groeisnelheden van behandelde culturen gedurende de periode van maximale remming te vergelijken met die van controles gedurende dezelfde periode.

56.

De procentuele remming van de groeisnelheid (Ir) kan dan voor elke testconcentratie (dosisgroep) worden berekend met de volgende formule:

Formula

waarbij

:

%Ir

:

procentuele remming van de gemiddelde specifieke groeisnelheid;

:

μC

:

gemiddelde waarde van μ in de controlegroep

:

μT

:

gemiddelde waarde van μ in de dosisgroep

Opbrengst

57.

De effecten op de opbrengst worden bepaald op basis van twee meetvariabelen, het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in elk testvat aan het begin en aan het eind van de test. Voor het drooggewicht of het versgewicht wordt de biomassa aan het begin bepaald op basis van een schijfjesmonster genomen uit de batch die voor het beënten van de testvaten wordt gebruikt (zie punt 20). Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de opbrengst berekend en een waarde voor de variantie. De gemiddelde procentuele remming van de opbrengst (%Iy) kan voor elke dosisgroep als volgt worden berekend:

Formula

waarbij

:

% Iy

:

procentuele remming van de opbrengst;

:

bC

:

biomassa aan het eind minus biomassa aan het begin in de controlegroep;

:

bT

:

biomassa aan het eind minus biomassa aan het begin in de dosisgroep.

Uitzetting van de groeicurven

58.

Uitzetting van de gemiddelde procentuele remming van de responsvariabele (Ir, of Iy, berekend volgens punt 56 of 57) tegen de logaritme van de concentratie van de teststof levert concentratie-responscurven op.

Schatting van de ECx

59.

De ECx (bv. EC50) moet worden geschat op basis van zowel de gemiddelde specifieke groeisnelheid (ErCx) als de opbrengst (EyCx), in beide gevallen op basis van het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht). De reden hiervoor is dat sommige teststoffen het aantal schijfjes anders beïnvloeden dan andere meetvariabelen. De gewenste toxiciteitsparameters zijn derhalve vier ECx-waarden voor elk berekend remmingsniveau x: ErCx (aantal schijfjes); ErCx (totaaloppervlak schijfjes, drooggewicht of versgewicht); EyCx (aantal schijfjes); en EyCx (totaaloppervlak schijfjes, drooggewicht of versgewicht).

Statistische procedures

60.

Het is de bedoeling om met behulp van regressieanalyse een kwantitatieve concentratie-responsrelatie te verkrijgen. Het is mogelijk een gewogen lineaire regressie te gebruiken nadat op de responsgegevens een lineariserende transformatie is uitgevoerd, bijvoorbeeld naar probit-, logit- of Weibull-eenheden (13), maar de voorkeur wordt gegeven aan niet-lineaire regressieprocedures, die beter omgaan met onvermijdelijke onregelmatigheden in gegevens en afwijkingen van uniforme verdelingen. In de buurt van het nulpunt of totale remming kunnen dergelijke onregelmatigheden door de transformatie worden uitvergroot en kunnen ze de analyse storen (13). Er moet worden opgemerkt dat standaardanalysemethoden met probit-, logit- of Weibull-transformaties bedoeld zijn voor gebruik bij een binaire respons (bv. sterfte of overleven) en moeten worden aangepast om voor groeisnelheid- of opbrengstdata te kunnen worden gebruikt. Specifieke procedures voor de bepaling van ECx-waarden uit continue data zijn te vinden in (14), (15) en (16).

61.

Voor elke te analyseren responsvariabele wordt de concentratie-responsrelatie gebruikt voor de berekening van puntschattingen van ECx-waarden. Waar mogelijk moeten voor elke schatting de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden bepaald. De kwaliteit van de fitting van de responsgegevens op het regressiemodel moet grafisch of statistisch worden bepaald. De regressieanalyse moet met responsen van individuele replicaten worden uitgevoerd en niet met gemiddelden van dosisgroepen.

62.

Als de beschikbare regressiemodellen/methoden niet geschikt zijn voor de gegevens, kunnen de EC50 en de betrouwbaarheidsgrenzen ook worden bepaald met behulp van lineaire interpolatie met bootstrapping (17).

63.

Voor de bepaling van de LOEC en daaruit de NOEC moeten de gemiddelden van de dosisgroepen worden vergeleken met behulp van variantieanalyse-technieken (ANOVA). Het gemiddelde voor elke concentratie moet dan worden vergeleken met het gemiddelde van de controlegroep met behulp van een geschikte methode voor meervoudige vergelijking of trendtoets. Hiervoor kan de Dunnett- of Williams-toets geschikt zijn (18) (19) (20) (21). Er moet worden bepaald of de ANOVA-aanname van homogeniteit van variantie opgaat. Deze bepaling kan grafisch worden uitgevoerd of met een formele toets (22). Hiervoor kan de Levene- of Bartlett-toets worden gebruikt. Wanneer de aanname van homogeniteit van variantie niet opgaat, kan dit soms worden gecorrigeerd door logaritmische transformatie van de gegevens. Als de heterogeniteit van variantie extreem is en niet door transformatie kan worden gecorrigeerd, moet een analyse met methoden als de stap-omlaag-trendtoets van Jonckheere worden overwogen. Aanvullende richtsnoeren voor het bepalen van de NOEC zijn te vinden in (16).

64.

Recente wetenschappelijke ontwikkelingen hebben geleid tot een aanbeveling om het begrip NOEC niet langer te gebruiken en te vervangen door op regressie gebaseerde puntschattingen van ECx. Voor deze Lemna-test is geen geschikte waarde voor x vastgesteld. Een interval van 10 tot 20 % lijkt geschikt (afhankelijk van de gekozen responsvariabele) en bij voorkeur moeten zowel de EC10 als de EC20 worden gerapporteerd.

Rapportage

65.

In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:

 

Teststof:

fysische aard en fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de oplosbaarheidsgrens in water;

chemische identificatiegegevens (bv. CAS-nummer), waaronder de zuiverheid (verontreinigingen).

 

Geteste soort:

wetenschappelijke naam, kloon (indien bekend) en herkomst.

 

Testomstandigheden:

gebruikte testprocedure (statisch, semistatisch of doorstroom);

begindatum en duur van de test;

testmedium;

beschrijving van de testopzet: testvaten en deksels, volume van de oplossingen, aantal kolonies en schijfjes per testvat aan het begin van de test;

testconcentraties (nominaal en gemeten, indien van toepassing) en aantal replicaten per concentratie;

wijze van bereiding van de stam- en testoplossingen met vermelding van het gebruik van eventuele oplosmiddelen of dispergeermiddelen;

temperatuur tijdens de test;

lichtbron, lichtintensiteit en homogeniteit van het licht;

pH-waarden van de test- en controlemedia;

concentraties van de teststof en de analysemethode met relevante kwaliteitsborgingsgegevens (valideringsstudies, standaarddeviaties of betrouwbaarheidsgrenzen van analyses);

methoden voor de bepaling van het aantal schijfjes en andere meetvariabelen (bv. drooggewicht, versgewicht of oppervlak schijfjes);

alle afwijkingen van deze testmethode.

 

Resultaten:

de ruwe data: het aantal schijfjes en andere meetvariabelen in elk test- en controlevat bij elke observatie en op elk analysetijdstip;

de gemiddelden en standaarddeviaties voor elke meetvariabele;

de groeicurven voor elke concentratie (aanbevolen met log-getransformeerde meetvariabele; zie punt 55);

de verdubbelingstijd/groeisnelheid in de controle op basis van het aantal schijfjes;

de berekende responsvariabelen voor elk dosisreplicaat, met het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt voor de replicaten;

een grafische weergave van de concentratie-effectrelatie;

schattingen van de toxiciteit voor responsvariabelen, zoals EC50, EC10, EC20 en de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen. De LOEC en/of de NOEC, indien deze zijn berekend, en de voor de bepaling daarvan gebruikte statistische methoden;

als ANOVA is gebruikt, de grootte van het effect dat kan worden gedetecteerd (bv. het minst significante verschil);

een eventuele stimulering van de groei, als deze bij een behandeling is geconstateerd;

eventuele zichtbare tekenen van fytotoxiciteit en observaties aan de testoplossingen;

bespreking van de resultaten, met inbegrip van eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.

LITERATUUR

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA — United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp. 8pp.

(3)

AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

(4)

SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. 15pp. (in het Zweeds).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 — 120 pp.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(9)

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3- September 1977.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 — 359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

(13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

(16)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Aanhangsel 1

Definities

In de context van deze testmethode worden de volgende definities en afkortingen gebruikt:

Biomassa : het drooggewicht van het levende materiaal in een populatie. Bij deze test worden meestal vervangende eenheden voor biomassa gemeten, zoals aantal schijfjes of schijfoppervlak, en ook deze eenheden kunnen bij gebruik van de term „biomassa” worden bedoeld.

Chemische stof : een stof of een mengsel.

Chlorose : gele verkleuring van schijfweefsel.

Kloon : een organisme of cel, door ongeslachtelijke voortplanting ontstaan uit één individu. Individuen uit één kloon zijn derhalve genetisch identiek.

Kolonie : een combinatie van aan elkaar vastzittende moeder- en dochterschijfjes (meestal 2 tot 4). Soms ook plant genoemd.

ECx : de concentratie van de in het testmedium opgeloste teststof die binnen een bepaalde blootstellingsperiode (die expliciet moet worden vermeld als deze afwijkt van de volledige of normale duur van de test) leidt tot een afname van de groei van Lemna met x % (bv. 50 %). Om ondubbelzinnig aan te geven of een EC-waarde gebaseerd is op de groeisnelheid of de opbrengst, worden de symbolen „ErC” voor de groeisnelheid en „EyC” voor de opbrengst gebruikt, gevolgd door de gebruikte meetvariabele, bv. ErC (aantal schijfjes).

Doorstroomtest : een test waarbij de testoplossing continu wordt ververst.

Schijfje : een individuele „bladachtige” structuur van een eendenkroosplant. Het is de kleinste eenheid (d.w.z. individu) die zich kan voortplanten.

Gebocheldheid : schijfjes die er gebocheld of gezwollen uitzien.

Groei : een toename van de meetvariabele, bv. aantal schijfjes, drooggewicht, natgewicht of schijfoppervlak, gedurende de testperiode.

Groeisnelheid : (gemiddelde specifieke groeisnelheid): de logaritmische toename van de biomassa gedurende de blootstellingsperiode.

LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste geteste concentratie waarbij wordt waargenomen dat de stof binnen een bepaalde blootstellingstijd in vergelijking met de controle tot een statistisch significante afname van de groei (p < 0,05) leidt. Alle testconcentraties boven de LOEC moeten een schadelijk effect hebben dat ten minste gelijk is aan het bij de LOEC waargenomen effect. Wanneer niet aan deze twee voorwaarden kan worden voldaan, moet een volledige toelichting worden gegeven op de wijze waarop de LOEC (en dus de NOEC) is bepaald.

Meetvariabelen : alle soorten variabelen die gemeten worden om aan de hand van een of meer verschillende responsvariabelen het eindpunt van de test te beschrijven. Bij deze methode zijn aantal schijfjes, schijfoppervlak, versgewicht en drooggewicht meetvariabelen.

Monocultuur : een cultuur met één plantensoort.

Necrose : sterfte van schijfjesweefsel (dat daardoor wit of met water doordrenkt wordt).

NOEC (No Observed Effect Concentration) : de testconcentratie die direct onder de LOEC ligt.

Fenotype : de waarneembare kenmerken van een organisme die door de interactie van de genen met het milieu worden bepaald.

Responsvariabelen : variabelen voor de geschatte toxiciteit die met uiteenlopende berekeningsmethoden wordt afgeleid uit gemeten variabelen die de biomassa beschrijven. Voor deze testmethode worden de responsvariabelen groeisnelheid en opbrengst afgeleid uit meetvariabelen zoals aantal schijfjes, schijfoppervlak, versgewicht of drooggewicht.

Semi-statische test (met verversing) : een test waarbij de testoplossing op specifieke tijdstippen gedurende de test periodiek wordt ververst.

Statische test : een testmethode waarbij de testoplossing gedurende de test niet wordt ververst.

Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.

Testeindpunt : de algemene factor die volgens het doel van de test door de teststof zal worden veranderd in vergelijking met de controle. Het eindpunt van deze testmethode is groeiremming, die kan worden uitgedrukt door verschillende responsvariabelen die op een of meer meetvariabelen gebaseerd zijn.

Groeimedium : het volledige kunstmatige groeimedium waarin de testplanten gedurende de blootstelling aan de teststof groeien. De teststof wordt normaal gesproken in het medium opgelost.

Opbrengst : de waarde van een meetvariabele om de biomassa uit te drukken aan het eind van de blootstellingstijd, verminderd met de waarde van de meetvariabele aan het begin van de blootstellingstijd.

Aanhangsel 2

Beschrijving van Lemna spp.

De meestal als „eendenkroos” aangeduide waterplant, Lemna spp., behoort tot de familie Lemnaceae, die een aantal wereldwijd voorkomende soorten in vier geslachten omvat. Hun uiterlijk en taxonomie is uitgebreid beschreven (1) (2). Lemna gibba en L. minor zijn soorten die representatief zijn voor gematigde zones en worden vaak voor toxiciteitstests gebruikt. Beide soorten hebben een drijvende of in het water ondergedompelde bladachtige stengel (schijfje) en uit het midden van de onderkant van elk schijfje steekt een heel dunne wortel. Lemna spp. heeft zelden bloemen en de voortplanting verloopt ongeslachtelijk door het maken van nieuwe schijfjes (3). De jongere planten zijn meestal bleker dan de oudere, hebben kortere wortels en bestaan uit twee of drie schijfjes die niet even groot zijn. Doordat Lemna klein is, een eenvoudige structuur heeft, zich ongeslachtelijk voortplant en een korte generatietijd heeft, zijn planten van dit geslacht heel geschikt voor laboratoriumproeven (4) (5).

Omdat de gevoeligheid waarschijnlijk van soort tot soort verschilt, mag de gevoeligheid alleen binnen één soort worden vergeleken.

Voorbeelden van Lemna-soorten die voor tests zijn gebruikt: soortenreferentie

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in het Zweeds).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Bronnen van Lemna-soorten

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Tel:. +1-416-978-3641

Fax:+1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Verenigde Staten

Telefoon 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

ZWEDEN

Tel:. +46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlijn

Duitsland

e-mail: lemna@uba.de

LITERATUUR

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Aanhangsel 3

Bewaring van stamculturen

Stamculturen kunnen bij lage temperatuur (4-10 °C) geruime tijd gebruiksklaar worden bewaard. Voor Lemna kan hetzelfde groeimedium worden gebruikt als voor de test, maar voor stamculturen kan een ander nutriëntrijk medium worden gebruikt.

Periodiek wordt een aantal jonge, lichtgroene planten met een aseptische techniek overgezet naar nieuwe kweekvaten met vers medium. Onder de hier voorgestelde koele omstandigheden kan tot drie maanden worden gewacht voordat een nieuwe subcultuur wordt gemaakt.

Er moeten chemisch zuivere (met zuur gewassen) en steriele glazen kweekvaten worden gebruikt en aseptische behandelingstechnieken worden toegepast. Bij verontreiniging van de stamcultuur, bv. met algen of schimmels, moeten maatregelen worden genomen om de verontreinigende organismen te verwijderen. Bij algen en de meeste andere verontreinigende organismen kan dit gebeuren door oppervlaktesterilisatie. Er wordt een monster van het verontreinigde plantenmateriaal genomen en de wortels worden afgeknipt. Het materiaal wordt krachtig geschud in schoon water en daarna gedurende 30 seconden tot 5 minuten ondergedompeld in 0,5 % (v/v) natriumhypochlorietoplossing. Vervolgens wordt het plantenmateriaal afgespoeld met steriel water en in een aantal porties overgebracht in kweekvaten met vers groeimedium. Veel schijfjes zullen door deze behandeling afsterven, vooral als er een lange blootstellingstijd wordt gebruikt, maar meestal zullen sommige van de overlevende schijfjes vrij van verontreiniging zijn. Deze kunnen dan worden gebruikt om nieuwe culturen te beënten.

Aanhangsel 4

Media

Voor L. minor and L. gibba worden verschillende groeimedia aanbevolen. Voor L. minor wordt een gewijzigde versie van een medium van het SIS (Zweeds instituut voor normalisatie) aanbevolen, terwijl voor L. gibba het medium 20X-AAP wordt aanbevolen. Voor beide media is de samenstelling hieronder vermeld. Bij de bereiding van deze media moeten reagentia van p.a.-kwaliteit en gedeïoniseerd water worden gebruikt.

Groeimedium voor Lemna van het SIS

De stamoplossingen I-V worden in de autoclaaf (15 minuten bij 120 °C) of door membraanfiltratie (poriediameter ongeveer 0,2 μm) gesteriliseerd.

Stamoplossing VI (en facultatief VII) worden alleen door membraanfiltratie gesteriliseerd; deze mogen niet in de autoclaaf worden behandeld.

De steriele stamoplossingen moeten koel en in het donker worden bewaard. De stamoplossingen I-V moeten binnen zes maanden worden gebruikt, terwijl stamoplossing VI (en facultatief VII) ten hoogste één maand kunnen worden bewaard.

Stamoplossing nr.

Stof

Concentratie in stamoplossing

(g/l)

Concentratie in bereid medium

(mg/·l)

Bereid medium

 

 

 

 

Element

Concentratie

(mg/·l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (buffer)

490

490

Voor de bereiding van één liter SIS-medium wordt aan 900 ml gedeïoniseerd water toegevoegd:

10 ml stamoplossing I

5 ml stamoplossing II

5 ml stamoplossing III

5 ml stamoplossing IV

1 ml stamoplossing V

5 ml stamoplossing VI

1 ml stamoplossing VII (facultatief)

Noot: Stamoplossing VII (MOPS-buffer) kan voor bepaalde teststoffen nodig zijn (zie punt 11).

De pH wordt met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH op 6,5 ± 0,2 gebracht en het volume wordt met gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter.

Groeimedium 20X-AAP

De stamoplossingen worden bereid in steriel gedestilleerd of gedeïoniseerd water.

De steriele stamoplossingen moeten koel en in het donker worden bewaard. Onder deze omstandigheden kunnen de stamoplossingen ten minste 6-8 weken worden bewaard.

Voor het medium 20X-AAP worden vijf nutriënt-stamoplossingen gemaakt (A1, A2, A3, B en C), waarbij p.a. reagentia worden gebruikt. Voor de bereiding van het groeimedium wordt 20 ml van elke nutriënt-stamoplossing toegevoegd aan ongeveer 850 ml gedeïoniseerd water. De pH wordt met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH op 7,5 ± 0,1 gebracht en het volume wordt met gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter. Vervolgens wordt het medium over een (ongeveer) 0,2 μm membraanfilter in een steriele fles gefiltreerd.

Het groeimedium voor de test moet 1-2 dagen vóór gebruik worden bereid, zodat de pH kan stabiliseren. De pH van het groeimedium moet vóór gebruik worden gecontroleerd en indien nodig met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH worden bijgesteld, zoals hierboven is beschreven.

Stamoplossing nr.

Stof

Concentratie in stamoplossing

(g/ · l) (7)

Concentratie in bereid medium

(mg/ · l) (7)

Bereid medium

 

 

 

 

Element

Concentratie

(mg/ · l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na;N

190;84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2 · O

1,4

30

K;P

9,4;3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

STEINBERG-medium (volgens ISO 20079)

Concentraties en stamoplossingen

Het gewijzigde Steinberg-medium wordt in ISO 20079 alleen voor Lemna minor gebruikt (aangezien daar alleen Lemna minor wordt toegestaan), maar uit tests is gebleken dat ook met Lemna gibba goede resultaten te verkrijgen zijn.

Bij de bereiding van het medium moeten chemische stoffen van reagens- of p.a.-kwaliteit en gedeïoniseerd water worden gebruikt.

Het nutriëntmedium wordt bereid uit stamoplossingen of het 10-voudig geconcentreerde medium, dat een maximale concentratie van het medium mogelijk maakt zonder dat er een neerslag ontstaat.

Tabel 1

pH-gestabiliseerd STEINBERG-medium (gewijzigd volgens Altenburger)

Component

Voedingsmedium

Macro-elementen

mol. gewicht

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Micro-elementen

mol. gewicht

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

Dinatrium-EDTA, dihydraat

372,24

1 500,00

4,03


Tabel 2

Stamoplossingen (macro-elementen)

1.

Macro-elementen (50-voudig geconcentreerd)

g/l

Stamoplossing 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Stamoplossing 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Stamoplossing 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tabel 3

Stamoplossingen (micro-elementen)

2.

Macro-elementen (1 000-voudig geconcentreerd)

mg/l

Stamoplossing 4:

H3BO3

120,0

Stamoplossing 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Stamoplossing 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Stamoplossing 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Stamoplossing 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

Dinatrium-EDTA, dihydraat

1 500,00

De stamoplossingen 2 en 3 en (apart) 4 tot en met 7 kunnen worden gecombineerd (rekening houdend met de vereiste concentraties).

Om de stamoplossingen langer te kunnen bewaren kunnen ze 20 minuten bij 121 °C in een autoclaaf worden behandeld of steriel worden gefiltreerd (0,2 μm). Voor stamoplossing 8 wordt steriele filtratie (0,2 μm) sterk aanbevolen.

Bereiding van het (gewijzigde) STEINBERG-medium in de uiteindelijke concentratie

Voeg 20 ml van de stamoplossingen 1, 2 en 3 (zie tabel 2) toe aan ongeveer 900 ml gedeïoniseerd water om neerslaan te voorkomen.

Voeg 1,0 ml van de stamoplossingen 4, 5, 6, 7 en 8 toe (zie tabel 3).

De pH moet nu 5,5 ± 0,2 zijn (eventueel aanpassen met een minimaal volume verdund NaOH of HCl).

Vul met water aan tot 1 000 ml.

Als de stamoplossingen gesteriliseerd zijn en er geschikt water wordt gebruikt, is verdere sterilisatie niet nodig. Als de sterilisatie met het uiteindelijke medium wordt uitgevoerd, moet stamoplossing 8 na de behandeling in de autoclaaf (20 minuten bij 121 °C) worden toegevoegd.

Bereiding van het 10-voudig geconcentreerde (gewijzigde) STEINBERG-medium om tijdelijk te bewaren

Voeg 20 ml van de stamoplossingen 1, 2 en 3 (zie tabel 2) toe aan ongeveer 30 ml gedeïoniseerd water om neerslaan te voorkomen.

Voeg 1,0 ml van de stamoplossingen 4, 5, 6, 7 en 8 toe (zie tabel 3). Vul met water aan tot 100 ml.

Als de stamoplossingen gesteriliseerd zijn en er geschikt water wordt gebruikt, is verdere sterilisatie niet nodig. Als de sterilisatie met het uiteindelijke medium wordt uitgevoerd, moet stamoplossing 8 na de behandeling in de autoclaaf (20 minuten bij 121 °C) worden toegevoegd.

De pH van het medium (uiteindelijke concentratie) moet 5,5 ± 0,2 zijn.

(6)

de volgende hoofdstukken C.31 tot C.46 worden toegevoegd:

C.31.   TEST MET TERRESTRISCHE PLANTEN: OPKOMST EN GROEI VAN ZAAILINGEN

INLEIDING