ISSN 1977-074X

Il-Ġurnal Uffiċjali

tal-Unjoni Ewropea

L 54

European flag  

Edizzjoni bil-Malti

Leġiżlazzjoni

Volum 59
1 ta' Marzu 2016


Werrej

 

II   Atti mhux leġiżlattivi

Paġna

 

 

REGOLAMENTI

 

*

Regolament tal-Kummissjoni (UE) 2016/266 tas-7 ta' Diċembru 2015 li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, ir-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' Sustanzi Kimiċi (REACH) ( 1 )

1

 


 

(1)   Test b'rilevanza għaż-ŻEE

MT

L-Atti li t-titoli tagħhom huma stampati b'tipa ċara huma dawk li għandhom x'jaqsmu mal-maniġment ta' kuljum ta' materji agrikoli, u li ġeneralment huma validi għal perijodu limitat.

It-titoli ta'l-atti l-oħra kollha huma stampati b'tipa skura u mmarkati b'asterisk quddiemhom.


II Atti mhux leġiżlattivi

REGOLAMENTI

1.3.2016   

MT

Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea

L 54/1


REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) 2016/266

tas-7 ta' Diċembru 2015

li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, ir-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' Sustanzi Kimiċi (REACH)

(Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI EWROPEA,

Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,

Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' Sustanzi Kimiċi (REACH), li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni (1), u b'mod partikolari l-Artikolu 13(2) tiegħu,

Billi:

(1)

Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 (2) fih il-metodi ta' ttestjar għall-finijiet tad-determinazzjoni tal-karatteristiċi fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta' sustanzi kimiċi li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006.

(2)

Hemm il-ħtieġa li r-Regolament (KE) Nru 440/2008 jiġi aġġornat biex jinkludi metodi ġodda u aġġornati ta' ttestjar adottati dan l-aħħar mill-OECD sabiex jitqies il-progress tekniku, u biex jiġi żgurat it-tnaqqis fl-għadd ta' annimali li jintużaw għal skopijiet sperimentali, b'konformità mad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (3). Il-partijiet interessati ġew ikkonsultati dwar dan l-abbozz.

(3)

L-adattament fih għoxrin metodu ta' ttestjar, metodu wieħed ġdid għad-determinazzjoni ta' karatteristika fiżikokimika, ħdax-il metodu ġdid ta' ttestjar u tliet metodi aġġornati ta' ttestjar għall-valutazzjoni tal-ekotossiċità, u ħames metodi ġodda ta' ttestjar għall-valutazzjoni tad-destin u l-imġiba ambjentali.

(4)

Għalhekk, ir-Regolament (KE) Nru 440/2008 għandu jiġi emendat skont dan.

(5)

Il-miżuri previsti f'dan ir-Regolament huma konformi mal-opinjoni tal-Kumitat imwaqqaf skont l-Artikolu 133 tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006,

ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:

Artikolu 1

L-Anness għar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat skont l-Anness għal dan ir-Regolament.

Artikolu 2

Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu f'Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.

Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha.

Magħmul fi Brussell, is-7 ta' Diċembru 2015.

Għall-Kummissjoni

Il-President

Jean-Claude JUNCKER


(1)  ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.

(2)  Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 tat-30 ta' Mejju 2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (ĠU L 142, 31.5.2008, p. 1).

(3)  Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat- 22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).


ANNESS

L-Anness għar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat kif ġej:

(1)

Hija mdaħħla nota fil-bidu tal-Anness, qabel il-Parti A:

“Nota:

Qabel ma jintuża xi wieħed mill-metodi ta' ttestjar li ġejjin biex tiġi ttestjata sustanza multikostitwenti (MCS), sustanza ta' kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, proditt ta' reazzjoni kumplessa jew materjal bijoloġiku (UVCB), jew taħlita u fejn l-applikabbiltà tiegħu għall-ittestjar ta' MCS, UVCB jew taħlitiet ma tkunx indikata fil-medtodu tal-ittestjar rispettiv, għandu jiġi kkunsidrat jekk il-metodu huwiex xieraq għall-finijiet regolatorji maħsuba.

Jekk il-metodu ta' ttestjar jintuża għall-ittestjar ta' MCS, UVCB jew taħlita, għandha titqiegħed kemm jista' jkun disponibbli biżżejjed informazzjoni dwar il-kompożizzjoni tagħha, eż. mill-identità kimika tal-kostitwenti tagħha, l-okkorrenza kwantitattiva tagħhom, u l-proprjetajiet rilevanti tal-kostitwenti tagħha.”

(2)

Huwa miżjud il-Kapitolu A.24:

A.24.   KOEFFIĊJENT TA' PARTIZZJONI (N-OTTANOL/ILMA), METODU TA' KROMATOGRAFIJA LIKWIDA BI PRESTAZZJONI GĦOLJA (HPLC)

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida ta' ttestjar tal-OECD (TG) 117 (2004)

1.

Il-koeffiċjent ta' partizzjoni (P) huwa ddefinit bħala l-proporzjon tal-konċentrazzjonijiet tal-ekwlibriju ta' sustanza maħlula f'sistema b'żewġ fażijiet li tikkonsisti f'żewġ solventi li fil-parti l-kbira ma jistgħux jitħalltu. Fil-każ ta' n-ottanol u ilma,

Formula

Il-koeffiċjent ta' partizzjoni li huwa l-kwozjent ta' żewġ konċentrazzjonijiet, huwa mingħajr dimensjoni u normalment jingħata fil-forma tal-logaritma tiegħu għal bażi ta' għaxra.

2.

Pow huwa paremetru ewlieni fl-istudji tad-destin ambjentali tas-sustanzi kimiċi. Intweriet relazzjoni sinifikanti ħafna bejn il-Pow ta' forma mhux jonizzata ta' sustanzi u l-bijoakkumulazzjoni tagħhom fil-ħut. Intwera wkoll li Pow huwa parametru utli fit-tbassir tal-adsorbiment fil-ħamrija u n-naqal u għall-istabbiliment ta' relazzjonijiet bejn l-istruttura u l-attività kwantitattivi għal firxa wiesgħa ta' effetti bijoloġiċi.

3.

Il-proposta oriġinali għal dan il-metodu ta' ttestjar kienet ibbażata fuq artiklu minn C.V. Eadsforth u P. Moser (1). L-iżvilupp tal-metodu ta' ttestjar u test ta' tqabbil bejn il-laboratorji tal-OECD kienu kkoordinati mill-Umweltbundesamt tar-Repubblika Federali tal-Ġermanja matul l-1986 (2).

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

4.

Valuri log Pow fil-medda – 2 sa 4 (xi drabi sa 5 u iktar) (1) jistgħu jiġu determinati b'mod sperimentali bil-metodu Flask tat-Theżżiż (Kapitolu A.8 ta' dan l-Anness, Linja Gwida tat-Test 107 tal-OECD). Il-metodu HPLC ikopri log Pow fil-medda ta' 0 sa 6 (1)(2)(3)(4)(5). Dan il-metodu jaf ikun jeħtieġ stima tal-Pow biex jassenja s-sustanzi ta' referenza xierqa u jappoġġja kwalunkwe konklużjoni maħruġa mid-dejta ġġenerata mit-test. Il-metodi ta' kalkolu huma diskussi fil-qosor fl-Appendiċi ta' dan il-metodu ta' ttestjar. Il-modalità ta' operazzjoni HPLC hija isokratika.

5.

Il-valuri tal-Pow jiddependu mill-kundizzjonijiet ambjentali bħat-temperatura, il-pH, is-saħħa jonika eċċ, u dawn għandhom jiġu ddefiniti fl-esperiment għall-interpretazzjoni korretta tad-dejta dwar il-Pow. Għal sustanzi jonizzabbli, metodu ieħor (eż. abbozz tal-linja gwida tal-OECD dwar il-metodu metriku tal-pH għal sustanzi jonizzati (6)) jista' jsir disponibbli u jista' jintuża bħala metodu alternattiv. Għalkemm dan l-abbozz tal-lingwa gwida tal-OECD jaf ikun xieraq biex jiġi ddeterminat il-Pow għal dawn is-sustanzi jonizzabbli, f'xi każijiet huwa iktar xieraq li jintuża l-metodu HPLC f'pH ambjentalment rilevanti (ara l-paragrafu 9).

PRINĊIPJU TAL-METODU

6.

Titwettaq HPLC f'fażi inversa fuq kolonni analitiċi ppakkjati b'fażi solida kummerċjalment disponibbli li fihom ktajjen tal-idrokarburi twal (eż. C8, C18) magħqud kimikament mas-siliċju.

7.

Sustanza kimika injettata f'tali partizzjonijiet tal-kolonna bejn il-fażi tas-solvent mobbli u l-fażi stazzjonarja tal-idrokarbouri hekk kif tiġi ttrasportata tul il-kolonna mill-fażi mobbli. Is-sustanzi jinżammu fi proporzjon tal-koeffiċjent ta' partizzjoni idrokarbur/ilma tagħhom, b'sustanzi idrofiliċi elwiti l-ewwel u sustanzi lipofiliċi l-aħħar. Il-ħin ta' żamma huwa deskritt mill-fattur ta' kapaċità k ikkalkolat bl-espressjoni:

Formula

fejn tR huwa l-ħin ta' żamma tas-sustanza tat-test, u t0 huwa l-ħin mejjet, jiġifieri l-ħin medju li molekula tas-solvent teħtieġ biex tgħaddi mill-kolonna. Mhumiex meħtieġa metodi analitiċi kwantitattivi u hija meħtieġa biss id-determinazzjoni tal-ħinijiet ta' żamma.

8.

Il-koeffiċjent tal-partizzjoni tal-ottanol/ilma ta' sustanza tat-test jista' jiġi kkalkolat billi jiġi ddeterminat b'mod sperimentali l-fattur tal-kapaċità k tiegħu fejn imbagħad jiddaħħal k fl-ekwazzjoni li ġejja:

Formula

fejn

a, b

=

koeffiċjenti ta' rigressjoni lineari.

L-ekwazzjoni ta' hawn fuq tista' tinkiseb bir-rigressjoni lineari tal-log tal-koeffiċjenti ta' partizzjoni ottanol/ilma tas-sustanzi ta' referenza kontra l-log tal-fatturi ta' kapaċità tas-sustanzi ta' referenza.

9.

Il-metodu HPLC f'fażi inversa jippermetti li jiġu stmati l-koeffiċjenti ta' partizzjoni fil-medda tal-log Pow bejn 0 u 6, iżda jista' jiġi estiż biex ikopri l-medda tal-log Pow bejn 6 u 10 f'każijiet eċċezzjonali. Dan jaf ikun jeħtieġ li tiġi mmodifikata l-fażi mobbli (3). Il-metodu mhuwiex applikabbli għal aċidi u bażijiet b'saħħithom, kumplessi tal-metalli, sustanzi li jkollhom reazzjoni mal-elwent, jew aġenti tensjoattivi. Il-miżuri jistgħu jitwettqu fuq sustanzi jonizzabbli fil-forma mhux jonizzata tagħhom (aċidu ħieles jew bażi ħielsa) biss permezz ta' bafer xieraq b'pH taħt il-pKa għal aċidu ħieles jew iktar mill-pKa għal bażi ħielsa. Inkella, il-metodu metriku tal-pH għall-ittestjar ta' sustanzi jonizzabbli (6) jista' jitqiegħed għad-dispożizzjoni u jista' jintuża bħala metodu alternattiv (6). Jekk il-valur tal-log Pow jiġi ddeterminat għall-użu fi klassifikazzjoni tal-perikli tal-ambjent jew f'valutazzjoni tar-riskju ambjentali, it-test għandu jitwettaq fil-medda ta' pH rilevanti għall-ambjent naturali, jiġifieri fil-medda tal-pH ta' 5,0 - 9.

10.

F'xi każijiet, l-impuritajiet jistgħu jagħmlu l-interpretazzjoni tar-riżultati diffiċli minħabba l-inċertezza fl-assenjazzjonijiet tal-ogħla livelli. Għal taħlitiet li jirriżultaw f'faxxa mhux riżolta, għandhom jiġu rrapportati l-limiti superjuri u inferjuri tal-log Pow, u l- % taż-żona tal-ogħla livelli tal-log Pow kollha. Għal taħlitiet li huma gruppi ta' omologi, għandu jiġi ddikjarat ukoll il-log Pow medju ppeżat (7), ikkalkolat abbażi ta' valuri Pow uniċi u l-valuri korrispondenti tal- % taż-żona (8). L-ogħla livelli kollha li jikkontribwixxu għal żona ta' 5 % jew iktar għaż-żona totali tal-ogħla livell għandhom jitqiesu fil-kalkolu (9):

Formula

Il-log Pow medju mwieżen huwa validu biss għal sustanzi jew taħlitiet (eż. żjut twal) li jikkonsistu f'omologi (eż. serje ta' alkani). It-taħlitiet jistgħu jitkejlu b'riżultati sinifikanti, sakemm ir-rilevatur analitiku użat ikollu l-istess sensittività għas-sustanzi kollha fit-taħlita u jistgħu jiġu riżolti b'mod adegwat.

INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST

11.

Il-kostant ta' dissoċjazzjoni, il-formula strutturali, u s-solubbiltà fil-fażi mobbli għandhom ikunu magħrufin qabel jintuża l-metodu. Barra minn hekk, informazzjoni dwar l-idrolożi tkun utli.

KRITERJI TAL-KWALITÀ

12.

Sabiex tiżdied il-kunfidenza fil-kejl, għandhom isiru determinazzjonijiet doppji.

Ripetibbiltà: Il-valur tal-log Pow minn kejliet ripetuti li jittieħdu f'kundizzjonijiet identiċi u permezz tal-istess sett ta' sustanzi ta' referenza għandu jaqa' fi ħdan medda ta' ± 0,1 tal-unitajiet tal-log.

Riproduċibbiltà: Jekk il-kejliet jiġu ripetuti b'sett ta' sustanzi ta' referenza differenti, ir-riżultati jaf ivarjaw. Ġeneralment, il-koeffiċjent ta' korrelazzjoni R għar-relazzjoni bejn il-log k u l-log Pow għal sett ta' sustanzi tat-test huwa ta' madwar 0,9, li jikkorrispondi għal koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma tal-log Pow ± 0,5 unitajiet tal-log.

13.

It-test tal-tqabbil bejn il-laboratorji wera li bil-metodu HPLC, il-valuri tal-log Pow jistgħu jinkisbu sa fi ħdan ± 0,5 unitajiet tal-valuri tal-Flask tat-Theżżiż (2). Paraguni oħra jistgħu jinstabu fid-dokumentazzjoni (4)(5)(10)(11)(12). Graffs ta' korrelazzjoni bbażati fuq sustanzi ta' referenza strutturalment relatati jagħtu l-iktar riżultati preċiżi (13).

SUSTANZI TA' REFERENZA

14.

Sabiex il-fattur tal-kapaċità k imkejjel jiġi kkorrelat mal-Pow tiegħu, irid jiġi stabbilit graff ta' kalibrazzjoni permezz ta' mill-anqas 6 punti (ara l-paragrafu 24). Huwa f'idejn l-utent li jagħżel is-sustanzi ta' referenza xierqa. Normalment is-sustanzi ta' referenza għandu jkollhom valuri tal-log Pow li jinkludu l-log Pow tas-sustanza tat-test, jiġifieri tal-inqas sustanza ta' referenza waħda għandu jkollha Pow ogħla minn dak tas-sustanza tat-test, u oħra Pow inqas minn dak tas-sustanza tat-test. L-estrapolazzjoni għandha tintuża biss f'każijiet eċċezzjonali. Idealment dawn is-sustanzi ta' referenza jkunu strutturalment relatati mas-sustanza tat-test. Il-valuri tal-log Pow tas-sustanzi ta' referenza użati għall-kalibrazzjoni għandhom ikunu bbażati fuq dejta sperimentali affidabbli. Madankollu, għal sustanzi b'log Pow għoli (ġeneralment iktar minn 4), jistgħu jintużaw il-valuri kkalkolati sakemm ma tkunx disponibbli dejta sperimentali affidabbli. Jekk jintużaw valuri estrapolati, għandu jiġi kkwotat valur ta' limitu.

15.

Huma disponibbli listi estensivi ta' valuri tal-log Pow għal ħafna gruppi ta' sustanzi kimiċi (14)(15). Jekk dejta dwar il-koeffiċjent ta' partizzjoni tas-sustanzi strutturalment relatati ma tkunx disponibbli, tista' tintuża kalibrazzjoni iktar ġenerali, stabbilita b'sustanzi ta' referenza oħra. Sustanzi ta' referenza rakkomandati u l-valuri Pow tagħhom huma elenkati fit-Tabella 1. Għal sustanzi jonizzabbli, il-valuri mogħtija japplikaw għall-forma mhux jonizzata. Il-valuri kienu ċċekkjati għall-plawżibbiltà u l-kwalità matul it-test ta' tqabbil bejn il-laboratorji.

Tabella 1

Sustanzi ta' referenza rakkomandati

 

Numru CAS

Sustanza ta' referenza

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-Butanon

(Metiletilketon)

0,3

 

2

1122-54-9

4-Aċetilpiridina

0,5

 

3

62-53-3

Anilinea

0,9

 

4

103-84-4

Aċetanilid

1,0

 

5

100-51-6

Alkoħol benżiliku

1,1

 

6

150-76-5

4-Metossifenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Aċidu fenossiaċetiku

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-Dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benżonitril

1,6

 

11

140-29-4

Fenilaċetonitril

1,6

 

12

589-18-4

Alkoħol 4-metilbenzil

1,6

 

13

98-86-2

Aċetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-Nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

Aċidu 3-nitrobenżojku

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-Kloroanilina

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenżen

1,9

 

18

104-54-1

Alkoħol taċ-ċinnamil

(Alkoħol ċinnamiku)

1,9

 

19

65-85-0

Aċidu benżojku

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-Kreżol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Aċidu ċinnamiku

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Aniżol

2,1

 

23

93-58-3

Metilbenżoat

2,1

 

24

71-43-2

Benżen

2,1

 

25

99-04-7

Aċidu 3-metilbenżojku

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-Klorofenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trikloroetilen

2,4

 

28

1912-24-9

Atrażina

2,6

 

29

93-89-0

Benżoat tal-etil

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-Diklorobenżonitril

2,6

 

31

535-80-8

Aċidu 3-klorobenżojku

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluwen

2,7

 

33

90-15-3

1-Naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-Dikloroanilina

2,8

 

35

108-90-7

Klorobenżen

2,8

 

36

1746-13-0

Eter tal-fenil tal-allil

2,9

 

37

108-86-1

Bromobenżen

3,0

 

38

100-41-4

Etilbenżen

3,2

 

39

119-61-9

Benżofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-Fenilfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-Diklorobenżen

3,4

 

43

122-39-4

Difenilamina

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalen

3,6

 

45

93-99-2

Fenilbenżoat

3,6

 

46

98-82-8

Isopropilbenżen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-Triklorofenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenil

4,0

 

49

120-51-4

Benżilbenżoat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-Dinitro-6-sek-butilfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-Triklorobenżen

4,2

 

52

143-07-7

Aċidu dodekanojku

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Etere tad-difenil

4,2

 

54

85-01-8

Fenantren

4,5

 

55

104-51-8

n-Butilbenżen

4,6

 

56

103-29-7

Dibenżil

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-Difenilpiridina

4,9

 

58

206-44-0

Fluworanten

5,1

 

59

603-34-9

Trifenilamina

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Stima preliminari tal-koeffiċjenti ta' partizzjoni

16.

Jekk ikun hemm bżonn, il-koeffiċjent ta' partizzjoni tas-sustanza tat-test jista' jiġi stmat idealment permezz ta' metodu ta' kalkolu (ara l-Appendiċi, jew fejn ikun xieraq, permezz tal-proporzjon tas-solubbiltà tas-sustanza tat-test fis-solventi puri.

Apparat

17.

Huwa meħtieġ kromatografu b'fażi likwida mgħammar b'pompa b'ritmu baxx u sistema ta' detezzjoni xierqa. Huwa applikabbli rilevatur tal-UV, li juża tul ta' mewġa ta' 210 nm, jew rilevatur tal-RI għal varjetà wiesgħa ta' gruppi ta' sustanzi kimiċi. Il-preżenza ta' gruppi polari fil-fażi stazzjonarja tista' serjament ixxekkel il-prestazzjoni tal-kolonna HPLC. Għalhekk, il-fażijiet stazzjonarji għandu jkollhom perċentwal minimu ta' gruppi polari (16). Jista' jintuża ppakkjar f'fażi inversa tal-mikropartikulati kummerċjali jew kolonni ppakkjati bil-lest. Tista' titqiegħed kolonna ta' lqugħ bejn is-sistema ta' injezzjoni u l-kolonna analitika.

Fażi mobbli

18.

Jintużaw metanol tal-grad HPLC u ilma dejonizzat jew distillat biex jitħejja s-solvent ta' elużjoni, li jitneħħielu l-gass qabel jintuża. Għandha tintuża elużjoni isokratika. Għandhom jintużaw proporzjonijiet ta' metanol/ilma b'kontenut minimu ta' ilma ta' 25 %. Ġeneralment taħlita ta' 3:1 (v/v) metanol/ilma hija sodisfaċenti għall-elużjoni ta' sustanzi b'log P ta' 6 fi żmien siegħa, b'rata ta' fluss ta' 1 ml/min. Għal sustanzi b'log P ikbar minn 6, jaf ikun hemm bżonn li jitqassar il-ħin ta' elużjoni (u dawk tas-sustanzi ta' referenza) billi titnaqqas il-polarità tal-fażi mobbli jew it-tul tal-kolonna.

19.

Is-sustanza tat-test u s-sustanzi ta' referenza għandhom ikunu solubbli fil-fażi mobbli f'konċentrazzjoni suffiċjenti li tippermetti d-detezzjoni tagħhom. Jistgħu jintużaw addittivi mat-taħlita ta' metanol/ilma f'każijiet eċċezzjonali biss, peress li dawn jibdlu l-proprjetajiet tal-kolonna. F'dawn il-każijiet, għandu jiġi kkonfermat li l-ħin ta' żamma tas-sustanzi tat-test u ta' referenza mhumiex influwenzati. Jekk it-taħlita ta' metanol/ilma ma tkunx xierqa, jistgħu jintużaw taħlitiet ta' solvent/ilma organiċi oħrajn, eż. etanol/ilma, aċetonitril/ilma jew isopropil alkoħol (2-propanol)/ilma.

20.

Il-pH tal-elwent huwa essenzjali għal sustanzi jonizzabbli. Għandu jkun fi ħdan il-medda pH operattiva tal-kolonna, ġeneralment bejn 2 u 8. Huwa rakkomandat ibbaferjar. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġu evitati preċipitazzjoni tal-melħ u tgħarriq tal-kolonna li jseħħu b'xi taħlitiet tal-fażi/bafer organiċi. Il-kejliet tal-HPLC b'fażijiet stazzjonari bbażati fuq is-siliċju b'pH ogħla minn 8 normalment mhumiex rakkomandati peress li l-użu ta' fażi mobbli alkalina tista' tikkawża tgħarriq fil-prestazzjoni tal-kolonna.

Soluti

21.

Is-sustanzi tat-test u ta' referenza għandhom ikunu kemm jista' jkun puri biżżejjed sabiex jiġu assenjati l-ogħla livelli fil-kromatogrammi għas-sustanzi rispettivi. Is-sustanzi li għandhom jintużaw għall-finijiet tal-ittestjar jew il-kalibrazzjoni jinħallu fil-fażi mobbli jekk ikun possibbli. Jekk solvent minbarra l-fażi mobbli jintuża biex iħoll is-sustanzi tat-test u ta' referenza, il-fażi mobbli għandha tintuza għad-dilwizzjoni finali qabel l-injezzjoni.

Kundizzjonijiet tat-test

22.

It-temperatura matul il-kejl ma għandhiex tvarja b'aktar minn ± 1 °C.

Determinazzjoni tal-ħin mejjet to

23.

Il-ħin mejjet t0 jista' jitkejjel permezz ta' sustanzi organiċi mhux miżmuma (eż. tjourea jew formamid). Jista' jiġi derivat ħin mejjet iktar preċiż mill-ħinijiet ta' żamma mkejla jew sett ta' madwar seba' membri ta' serje omologa (eż. n-alkil metil ketoni) (17). Il-ħinijiet ta' żamma tR (nC + 1) jiġu pplottjati mat-tR (nC), fejn nC huwa n-numru ta' atomi tal-karbonju. Tinkiseb linja dritta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, meta A, li tirrappreżenta k(nC + 1)/k(nC), tkun kostanti. Il-ħin mejjet t0 jinkiseb mill-interċett (1 – A)t0 u l-gradjent A.

Ekwazzjoni ta' Rigressjoni

24.

Il-pass li jmiss huwa li tiġi pplottjata korrelazzjoni ta' log k ma' log P għal sustanzi ta' referenza xierqa b'valuri log P qrib il-valur mistenni għas-sustanza tat-test. Fil-prattika, jiġu injettati minn 6 sa 10 sustanzi ta' referenza fl-istess ħin. Il-perjodi ta' żamma huma ddeterminati, preferibbilment fuq integratur ta' reġistrazzjoni marbut mas-sistema ta' detezzjoni. Il-logaritmi korrispondenti tal-fatturi ta' kapaċità, log k, huma pplottjati bħala funzjoni ta' log P. L-ekwazzjoni ta' rigressjoni titwettaq f'intervalli regolari, tal-inqas darba kuljum, sabiex jittieħed kont tal-bidliet possibbli fil-prestazzjoni tal-kolonna.

DETERMINAZZJONI TAL-POW TAS-SUSTANZA TAT-TEST

25.

Is-sustanza tat-test tiġi injettata fl-iżgħar kwantitajiet traċċabbli. Il-ħin ta' żamma huwa ddeterminat darbtejn. Il-koeffiċjent tal-partizzjoni tas-sustanza tat-test, jinkiseb bl-interpolazzjoni tal-fattur tal-kapaċità kkalkolat fuq il-graff tal-kalibrazzjoni. Għal koeffiċjenti ta' partizzjoni baxxi ħafna u għolja ħafna, hija meħtieġa estrapolazzjoni. Speċjalment f'dawn il-każijiet, għandha tingħata attenzjoni lil-limiti ta' kunfidenza tal-linja ta' rigressjoni. Jekk il-ħin ta' żamma tal-kampjun ma jaqax taħt il-medda tal-ħinijiet ta' żamma miksuba għall-istandards, għandu jiġi kkwotat valur ta' limitu.

DEJTA U RAPPORTAR

Rapport tat-test

26.

Dan li ġej għandu jiġi inkluż fir-rapport:

jekk tkun iddeterminata, l-istima preliminari tal-koeffiċjent tal-partizzjoni, il-valuri stmati u l-metodu użat; u jekk intuża metodu ta' kalkolu, id-deskrizzjoni sħiħa tiegħu inkluż l-identfikazzjoni tal-bażi ta' dejta u informazzjoni ddettaljata dwar l-għażla tal-frammenti;

is-sustanzi tat-test ta' referenza: il-purità, il-formula strutturali u n-numru CAS,

deskrizzjoni tat-tagħmir u l-kundizzjonijiet operattivi: il-kolonna analitika, il-kolonna ta' lqugħ,

il-fażi mobbli, il-mezzi ta' detezzjoni, il-medda tat-temperatura, il-pH;

il-profili ta' elużjoni (kromatogrammi);

il-ħin mejjet u kif tkejjel;

id-dejta u d-dokumentazzjoni dwar iż-żamma tal-valuri tal-log Pow għal sustanzi ta' referenza użati fil-kalibrazzjoni;

dettalji dwar linja ta' rigressjoni mdaħħla (log k meta mqabbel ma' log Pow) u l-koeffiċjent ta' korrelazzjoni tal-linja inklużi l-intervalli ta' kunfidenza;

dejta ta' żamma medja u valur tal-log Pow interpolat għas-sustanza tat-test;

fil-każ ta' taħlita: il-kromatogramma tal-profil ta' elużjoni bil-valuri ta' limitu indikati;

il-valuri tal-log Pow relattivi għall- % taż-żona tal-ogħla livell ta' Pow;

kalkolu permezz ta' linja ta' rigressjoni;

valuri tal-log Pow medji ppeżati kkalkolati, fejn ikun xieraq.

LETTERATURA

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals — Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). ‘Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Appendiċi

Metodi ta' kalkolu tal-POW

INTRODUZZJONI

1.

Dan l-appendiċi jipprovdi introduzzjoni qasira għall-kalkolu tal-Pow. Għal iktar informazzjoni, il-qarrej għandu jirreferi għall-kotba (1)(2).

2.

Il-valuri kkalkolati tal-Pow jintużaw għal:

deċiżjoni dwar liema metodu sperimentali għandu jintuża: Metodu tal-Flask Mheżżeż għal log Pow bejn – 2 u 4 u metodu HPLC għal log Pow bejn 0 u 6;

l-għażla tal-kundizzjonijiet li għandhom jintużaw fl-HPLC (sustanzi ta' referenza, proporzjon ta' metanol/ilma);

il-verifika tal-plawżibbiltà tal-valuri miksuba permezz ta' metodi sperimentali;

l-għoti ta' stima meta ma jkunux jistgħu applikati metodi sperimentali.

Prinċipju tal-metodi ta' kalkolu

3.

Il-metodi ta' kalkolu ssuġġeriti hawnhekk huma bbażati fuq il-frammentazzjoni teoretika tal-molekula f'sottostrutturi xierqa għal liema huma magħrufin żidiet fil-log Pow affidabbli. Il-log Pow jinkiseb billi l-valuri tal-frammenti jiżdiedu mat-termini ta' korrezzjoni għall-interazzjonijiet intramolekulari. Huma disponibbli listi ta' kostanti frammentati u termini ta' korrezzjoni (1)(2)(3)(4)(5)(6). Xi wħud huma aġġornati regolarment (3).

Affidabbiltà tal-valuri kkalkolati

4.

B'mod ġenerali, l-affidabbiltà tal-metodi ta' kalkolu tonqos hekk kif tiżdied il-kumplessità tas-sustanza studjata. Fil-każ ta' molekuli sempliċi b'piż molekulari baxx u b'grupp funzjonali wieħed jew tnejn, wieħed jista' jistenna devjazzjoni ta' 0,1 sa 0,3 unitajiet ta' log Pow bejn ir-riżultati tal-metodi ta' frammentazzjoni differenti u l-valuri mkejla. Il-marġni ta' żball sejjer jiddependi fuq l-affidabbiltà tal-kostanti tal-frammenti użati, il-ħila li jingħarfu l-interazzjonijiet intramolekulari (eż. ir-rabtiet tal-idroġenu) u l-użu xieraq tat-termini ta' korrezzjoni. Fil-każ ta' sustanzi jonizzanti, iċ-ċarġ u l-grad ta' jonizzazzjoni għandhom jittieħdu inkunsiderazzjoni (10).

Metodu Fujita-Hansch π

5.

Il-kostant tas-sostitwent idrofobiku, π, introdott oriġinarjament minn Fujita et al. (7) huwa ddefinit bħala:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

fejn PhX huwa derivattiv aromatiku u PhH huwa s-sustanza ewlenija.

eż.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

≥ 0,71

Il-π-metodu huwa primarjament ta' interess għal sustanzi aromatiċi. Huma disponibbli valuri-π għal numru kbir ta' sostitwenti (4)(5).

Metodu Rekker

6.

Permezz tal-metodu Rekker (8) il-valur tal-Pow huwa kkalkolat bħala:

Formula

fejn ai huwa n-numru ta' drabi li jseħħ framment partikolari fil-molekula u fi huwa ż-żieda fil-Pow tal-framment. It-termini ta' interazzjoni jistgħu jiġu espressi bħala multiplu integrali ta' kostanti wieħed Cm (l-hekk imsejjaħ ‘kostanti maġiku’). Il-kostanti tal-framment fi u Cm ġew iddeterminati minn lista ta' 1 054 valur Pow sperimentali ta' 825 sustanza permezz ta' analiżi tar-rigressjoni tal-multipli (6)(8). Id-determinazzjoni tat-termini ta' interazzjoni ssir skont regoli stabbiliti (6)(8)(9).

Metodu Hansch-Leo

7.

Permezz tal-metodu Hansh u Leo (4), il-valur tal-log Pow huwa kkalkolat bħala:

Formula

fejn fi huwa kostant tal-framment, Fj terminu ta' korrezzjoni (fattur), ai u bj il-frekwenza korrispondenti tal-okkorrenza. Lista ta' valuri frammentali atomiċi u tal-grupp tat-termini ta' korrezzjoni Fj kienet idderivata b'approssimazzjoni minn valuri Pow sperimentali. It-termini tal-korrezzjoni tqassmu f'diversi klassijiet differenti (1)(4). Il-pakketti tas-softwer ġew żviluppati biex iqisu r-regoli u t-termini ta' korrezzjoni kollha (3).

METODU KKOMBINAT

8.

Il-kalkolu tal-log Pow ta' molekuli kumplessi jista' jittejjeb b'mod konsiderevoli, jekk il-molekula tinqasam f'sottostrutturi ikbar għal liema jkunu disponibbli valuri log Pow affidabbli mit-tabelli (3)(4) jew minn miżuri eżistenti. Imbagħad, it-tali frammenti (eż. eteroċikli, antrakinon, ażobenżen) jistgħu jiġu kkombinati mal-valuri Hansch π jew mal-kostanti tal-frammenti ta' Rekker jew Leo.

Rimarki

i)

Il-metodi ta' kalkolu huma applikabbli biss ma' sustanzi parzjalment jew kompletament jonizzati meta jitqiesu l-fatturi ta' korrezzjoni meħtieġa.

ii)

Jekk wieħed jista' jassumi l-eżistenza ta' rabtiet tal-idroġenu intramolekulari, għandhom jiżdiedu t-termini ta' korrezzjoni korrispondenti (madwar + 0,6 sa + 1,0 unitajiet ta' log Pow) (1). Indikazzjonijiet dwar il-preżenza ta' tali rabtiet tista' tinkiseb minn mudelli tridimensjonali jew dejta spektroskopika.

iii)

Jekk ikunu possibbli diversi forom tawtomeriċi, l-iktar forma probabbli għandha tintuża bħala l-bażi tal-kalkolu.

iv)

Ir-reviżjonijiet tal-listi ta' kostanti frammentati għandhom jiġu segwiti b'attenzjoni.

LETTERATURA DWAR IL-METODI TA' KALKOLU

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

(3)

Il-Kapitolu C.3 huwa sostitwit ma' dan li ġej:

C.3.   ALGA TAL-ILMA ĦELU U ĊJANOBATTERJI, TEST TAL-INIBIZZJONI TAT-TKABBIR

INTRODUZZJONI

1.

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tal-ittestjar (TG) 201 tal-OECD (2006, anness korrett fl-2011). Ġiet identifikata l-ħtieġa li jiġi estiż il-metodu ta' ttestjar biex jinkludi speċijiet addizzjonali u jiġi aġġornat biex jissodisfa r-rekwiżiti għal valutazzjoni tal-periklu u l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi. Din ir-reviżjoni tlestiet abbażi ta' esperjenza prattika estensiva, progress xjentifiku fil-qasam tal-istudji tat-tossiċità algali, u użu regolatorju estensiv, li seħħ mill-adozzjoni oriġinali.

2.

Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati.

PRINĊIPJU TAT-TEST

3.

Il-fini ta' dan it-test huwa li jiddetermina l-effetti ta' sustanza kimika fuq it-tkabbir tal-mikroalgi tal-ilma ħelu u/jew iċ-ċjanobatterji. Organiżmi tal-ittestjiar li qegħdin jikbru esponenzjalment huma esposti għas-sustanza kimika tat-test f'kulturi tal-lott fuq perjodu li normalment ikun ta' 72 siegħa. Minkejja d-durata relattivament qasira tat-test, l-effetti fuq diversi ġenerazzjonijiet jistgħu jiġu vvalutati.

4.

Ir-rispons tas-sistema huwa t-tnaqqis fit-tkabbir f'serje ta' kulturi algali (unitajiet tal-ittestjar) esposti għal diversi konċentrazzjonijiet ta' sustanza kimika tat-test. Ir-rispons huwa evalwat bħala funzjoni tal-konċentrazzjoni tal-espożizzjoni meta mqabbel mat-tkabbir medju tar-replikat, kulturi tal-kontroll mhux esposti. Għal espressjoni sħiħa tar-rispons tas-sistema għall-effetti tossiċi (sensittività ottimali), il-kulturi huma permessi tkabbir esponenzjali illimitat f'kundizzjonijiet ta' nutrijenti suffiċjenti u dawl kontinwu għal perjodu twil biżżejjed ta' żmien biex jitkejjel it-tnaqqis tar-rata ta' tkabbir speċifiku.

5.

It-tkabbir u l-inibizzjoni tat-tkabbir huma kkwantifikati minn kejliet tal-bijomassa algali bħala funzjoni taż-żmien. Il-bijomassa algali hija ddefinita bħala l-piż xott skont il-volum, eż. algi/litri mg ta' soluzzjoni tat-test. Madankollu, il-piż xott huwa diffiċli biex jitkejjel u għalhekk jintużaw parametri sostituti. Minn dawn is-surrogati, ħafna drabi jintuża l-għadd taċ-ċelloli. Parametri ta' surrogati oħra jinkludu l-volum taċ-ċelloli, il-fluworexxenza, id-densità ottika, eċċ. Għandu jkun magħruf fattur ta' konverżjoni bejn il-parametru sostitut imkejjel u l-bijomassa.

6.

Dan il-punt ta' tmiem l-ittestjar huwa l-inibizzjoni tat-tkabbir, espress bħala ż-żieda logaritmika fil-bijomassa (rata ta' tkabbir speċifika medja) matul il-perjodu ta' espożizzjoni. Mir-rati medji ta' tkabbir speċifiku rreġistrati f'serje ta' soluzzjonijiet tat-test, il-konċentrazzjoni li twassal għal rata ta' x % ta' inibizzjoni speċifika ta' tkabbir (eż. 50 %) hija ddeterminata u espressa bħala l-ErCx (eż. ErC50).

7.

Rispons varjabbli addizzjonali użat f'dan il-metodu ta' ttestjar huwa r-rendiment, li jista' jkun meħtieġ sabiex jiġu ssodisfati rekwiżiti regolatorji speċifiċi f'xi pajjiżi. Huwa ddefinit bħala l-bijomassa fi tmiem il-perjodu ta' espożizzjoni neqes il-bijomassa fil-bidu tal-perjodu ta' espożizzjoni. Mill-prodott reġistrat f'serje ta' soluzzjonijiet tat-test, il-konċentrazzjoni ġġib magħha x % speċifikat ta' rata ta' inibizzjoni ta' prodott (eż. 50 %) determinata u espressa bħala l-EyCx (eż. EyC50).

8.

Barra minn hekk, jistgħu jiġu stabbiliti statistikament il-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) u l-konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC).

INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST

9.

Informazzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test li jaf tkun siewja biex jiġu stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test inklużi l-formula strutturali, il-purità, l-istabbiltà fid-dawl, l-istabbiltà fil-kundizzjonijiet tat-test, il-proprjetajiet ta' assorbiment tad-dawl, il-pKa, u r-riżultati tal-istudji tat-trasformazzjoni li jinkludu l-bijodegradabilità fl-ilma.

10.

Is-solubbiltà fl-ilma, il-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma (Pow) u l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza kimika tat-test għandha tkun magħrufa u għandu jkun disponibbli metodu vvalidat għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza kimika fis-soluzzjonijiet tat-test b'effiċjenza tal-irkupru rrapportata u limitu ta' detezzjoni.

VALIDITÀ TAT-TEST

11.

Biex it-test ikun validu, għandhom jiġu ssodisfati l-kriterji ta' prestazzjoni li ġejjin:

Il-bijomassa fil-kulturi tal-kontroll għandhom ikunu żdiedu b'mod esponenzjali b'fattur ta' mill-anqas 16 fi żmien il-perjodu ta' ttestjar ta' 72 siegħa. Din tikkorrispondi għal rata ta' tkabbir speċifika ta' 0,92 ġurnata– 1. Għall-ispeċijiet użati l-iktar frekwentement, ir-rata ta' tkabbir ġeneralment tkun sostanzjalment ogħla (ara l-Appendiċi 2). Dan il-kriterju jaf ma jiġix sodisfatt meta jintużaw speċijiet li jikbru iktar bil-mod minn dawk elenkati fl-Appendiċi 2. F'dan il-każ, il-perjodu tal-ittestjar għandu jiġi estiż biex jinkiseb tal-inqas tkabbir 16-il darba ikbar fil-kulturi tal-kontroll, filwaqt li t-tkabbir għandu jkun esponenzjali matul il-perjodu tal-ittestjar. Il-perjodu tal-ittestjar jista' jitqassar għal tal-inqas 48 siegħa biex jinżamm tkabbir illimitat u esponenzjali matul it-test sakemm jintlaħaq il-fattur ta' multiplikazzjoni minimu ta' 16.

Il-koeffiċjent medju tal-varjazzjoni għal rati ta' tkabbir speċifiċi skont is-sezzjoni (jiem 0-1, 1-2 u 2-3, għal testijiet ta' 72 siegħa) fil-kulturi ta' kontroll (Ara l-Appendiċi 1 taħt ‘koeffiċjent ta' varjazzjoni’) ma għandux jaqbeż il-35 %. Ara l-paragrafu 49 għall-kalkolu tar-rata ta' tkabbir speċifika skont is-sezzjoni. Dan il-kriterju japplika għall-valur medju tal-koeffiċjenti ta' varjazzjoni kkalkolati għall-kulturi tal-kontroll irreplikati.

Il-koeffiċjent ta' varjazzjoni tar-rati ta' tkabbir speċifiċi medji matul il-perjodu tal-ittestjar kollu fil-kulturi ta' kontroll tar-repliki ma għandux jaqbeż 7 % fit-testijiet b'Pseudokirchneriella subcapitata u Desmodesmus subspicatus. Għal speċijiet oħrajn ittestjati inqas spiss, il-valur ma għandux jaqbeż l-10 %.

SUSTANZA KIMIKA TA' REFERENZA

12.

Is-sustanza (jew sustanzi) ta' referenza bħal 3,5-diklorofenol użata fir-ringtest internazzjonali (1), tista' tiġi ttestjata bħala mezz ta' vverifikar tal-proċedura tal-ittestjar. Id-dikromat tal-potassju jista' jintuża bħala sustanza kimika ta' referenza għal alga ħadra wkoll. Idealment tiġi ttestjata sustanza kimika ta' referenza mill-anqas darbtejn fis-sena.

APPLIKABBILTÀ TAT-TEST

13.

Dan il-metodu ta' ttestjar iktar faċli jiġi applikat għal sustanzi kimiċi li jinħallu fl-ilma li, fil-kundizzjonijiet tat-test, aktarx li jibqgħu fl-ilma. Għall-ittestjar tas-sustanzi kimiċi li huma volatili, adsorbenti ħafna, ikkuluriti, b'solubbiltà baxxa fl-ilma jew sustanzi kimiċi li jistgħu jaffettwaw id-disponibbiltà ta' nutrijenti jew minerali fil-midjum tat-test, jistgħu jkunu meħtieġa ċerti modifiki tal-proċedura deskritta (eż. sistema magħluqa, kundizzjonar tar-reċipjent tat-test). Hija pprovduta gwida dwar xi modifiki xierqa f'(2) (3) u (4).

DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR

Apparat

14.

Ir-reċipjenti tat-test u apparat ieħor li sejrin jiġu f'kuntatt mas-soluzzjonijiet tat-test għandhom ikunu magħmula kompletament mill-ħġieġ jew materjal kimikament inerti ieħor. L-oġġetti għandhom jinħaslu sew biex jiġi żgurat li ebda kontaminant organiku jew inorganiku ma jinterferixxi mat-tkabbir tal-alga jew il-kompożizzjoni tas-soluzzjonijiet tat-test.

15.

Ir-reċipjenti tat-test normalment ikunu fliexken tal-ħġieġ b'qisien li jippermettu volum suffiċjenti ta' kultura għall-kejliet matul it-test u trasferiment suffiċjenti ta' massa ta' CO2 mill-atmosfera (ara l-paragrafu 30). Ta' min jinnota li l-volum tal-likwidu għandu jkun biżżejjed għal determinazzjonijiet analitiċi (ara l-paragrafu 37).

16.

Barra minn hekk, jaf ikun meħtieġ it-tagħmir li ġej jew kollu kemm hu:

Apparat tal-kultura: huwa rakkomandat armadju jew kompartiment, fejn tista' tinżamm it-temperatura ta' inkubazzjoni magħżula fi ± 2 °C.

Strumenti ta' kejl ħfief: ta' min jgħid li l-metodu ta' kejl tal-intensità tad-dawl, u b'mod partikolari t-tip ta' riċettur (kollettur), jista' jaffettwa l-valur imkejjel. Idealment, il-kejliet għandhom isiru permezz ta' riċettur (4 π) sferiku (li jirrispondi għal dawl dirett u rifless mill-angoli kollha 'l fuq u taħt il-pjan tal-kejl), jew riċettur π 2 (li jirrispondi għad-dawl mill-angoli kollha 'l fuq mill-pjan tal-kejl).

Apparat biex tiġi ddeterminata l-bijomassa algali. L-għadd taċ-ċelloli, li huwa l-iktar parametru sostitut użat spiss għall-bijomassa algali, jista' jsir permezz ta' kontantur elettroniku tal-partiċelli, mikroskopju b'kompartiment tal-għadd, jew ċitometru tal-fluss. Surrogati tal-bijomassa oħrajn jistgħu jitkejlu permezz ta' ċitometru tal-fluss, fluworimetru, spettrofotometru jew kulurimetru. Fattur ta' konverżjoni li jirrelata l-għadd ta' ċelloli mal-piż xott huwa siewi għall-kalkolu. Sabiex jiġu pprovduti miżuri siewja f'konċentrazzjonijiet baxxi tal-bijomassa meta jintuża spettrofotometru, jaf ikun meħtieġ li jintużaw kuvetti b'passaġġ tad-dawl ta' mill-anqas 4 cm.

Organiżmi tat-test

17.

Jistgħu jintużaw diversi speċijiet ta' mikroalgi li ma jaggregawx u ċjanobatterji. Intwera li r-razez elenkati fl-Appendiċi 2 huma xierqa bil-proċedura tal-ittestjar speċifikata f'dan il-metodu ta' ttestjar.

18.

Jekk jintużaw speċijiet oħrajn, għandha tiġi rrapportata r-razza u/jew l-oriġini. Ikkonferma li t-tkabbir esponenzjali tal-alga tat-test magħżula tista' tinżamm matul il-perjodu ta' ttestjar fil-kundizzjonijiet eżistenti.

Midjum ta' tkabbir

19.

Huma rakkomandati żewġ midjums ta' tkabbir alternattivi, il-midjum tal-AAP u l-OECD u. Il-kompożizzjonijiet ta' dawn il-midjums huma indikati fl-Appendiċi 3. Kun af li l-valur tal-pH inizjali u l-kapaċità ta' bbaferjar (li tirregola ż-żieda fil-pH) taż-żewġ midjums huma differenti. Għalhekk, ir-riżultati tat-testijiet jaf ikunu differenti skont il-midjum użat, b'mod partikolari meta jiġu ttestjati sustanzi kimiċi jonizzanti.

20.

Jaf tkun meħtieġa modifika tal-midjums ta' tkabbir għal ċerti finijiet, eż. meta jiġu ttestjati metalli u aġenti kelanti jew meta jsir ittestjar f'valuri tal-pH differenti. L-użu ta' midjum immodifikat għandu jiġi deskritt fid-dettall u ġġustifikat (3) (4).

Konċentrazzjoni tal-bijomassa inizjali

21.

Il-bijomassa inizjali fil-kulturi tat-test għandha tkun l-istess fil-kulturi tat-test kollha u baxxa biżżejjed biex tippermetti tkabbir esponenzjali matul il-perjodu ta' inkubazzjoni kollu mingħajr ir-riskju ta' tnaqqis fin-nutrijenti. Il-bijomassa inizjali ma għandhiex taqbeż iż-0,5 mg/l bħala piż xott. Huma rakkomandati l-konċentrazzjonijiet ta' ċelloli inizjali li ġejjin:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 ċelloli/ml

Desmodesmus subspicatus

2-5 × 103 ċelloli/ml

Navicula pelliculosa

104 ċelloli/ml

Anabaena flos-aquae

104 ċelloli/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 ċelloli/ml

Konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test

22.

Il-medda tal-konċentrazzjoni li fiha l-effetti x'aktarx li jseħħu hija determinata fuq il-bażi tar-riżultati mit-testijiet tas-sejbien tal-medda. Għat-test finali definittiv, għandhom jintgħażlu tal-inqas ħames konċentrazzjonijiet, irranġati f'serje ġeometrika b'fattur li ma jaqbiżx it-3.2. Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru kurva konċentrazzjoni rispons stabbli, jista' jkun iġġustifikat fattur ogħla. Idealment, is-serje ta' konċentrazzjoni għandha tkopri l-medda li tikkawża inibizzjoni ta' 5-75 % tar-rata ta' tkabbir tal-alga.

Repliki u kontrolli

23.

Id-disinn tat-test għandu jinkludu tliet repliki f'kull konċentrazzjoni tat-test. Jekk ma jkunx meħtieġ li tiġi ddeterminata l-NOEC, id-disinn tat-test jista' jinbidel biex jiżdied in-numru ta' konċentrazzjonijiet u jitnaqqas in-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni. In-numru ta' repliki tal-kontroll għandu jkun tal-inqas tlieta, u idealment għandu jkun id-doppju tan-numru ta' repliki użati għal kull konċentrazzjoni tat-test.

24.

Jista' jitħejja sett separat ta' soluzzjonijiet tat-test għal determinazzjonijiet analitiċi tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test (ara l-paragrafi 36 u 38).

25.

Meta jintuża solvent biex tinħall is-sustanza kimika tat-test, kontrolli addizzjonali li fihom is-solvent fl-istess konċentrazzjoni kif użat fil-kulturi tat-test għandhom jiġu inklużi fid-disinn tat-test.

Tħejjija tal-kultura tal-inokulu

26.

Sabiex l-alga tal-ittestjar tiġi adattata għall-kundizzjonijiet tat-test u jiġi żgurat li l-algi huma f'fażi ta' tkabbir esponenzjali meta jintużaw biex jinokulaw is-soluzzjonijiet tat-test, titħejja kultura tal-inokulu fil-midjum tat-test bejn jumejn u 4 ijiem qabel jibda t-test. Il-bijomassa algali għandha tiġi aġġustata sabiex tippermetti li jkun hemm tkabbir esponenzjali fil-kultura tal-inokulu sakemm jibda t-test. Inkuba l-kultura tal-inokulu fl-istess kundizzjonijiet bħall-kulturi tat-test. Kejjel iż-żieda fil-bijomassa fil-kultura tal-inokulu biex tiżgura li t-tkabbir huwa fi ħdan il-medda normali għar-razza tal-ittestjar f'kundizzjonijiet ta' kulturi. Eżempju tal-proċedura għall-kulturi algali huwa deskritt fl-Appendiċi 4. Biex jiġu evitati diviżjonijiet ta' ċelloli sinkroniċi matul it-test jaf ikun meħtieġ pass ieħor ta' propagazzjoni tal-kultura tal-inokulu.

Tħejjija tas-soluzzjonijiet tat-test

27.

Is-soluzzjonijiet tat-test kollha għandu jkun fihom l-istess konċentrazzjonijiet tal-midjum ta' tkabbir u l-bijomassa inizjali tal-alga tat-test. Is-soltu, is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżulin jitħejjew billi titħallat soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test b'midjum ta' tkabbir u kultura tal-inokulu. Is-soluzzjonijiet ewlenin normalment jitħejjew billi s-sustanza kimika titħalla tinħall fil-midjum tat-test.

28.

Jistgħu jintużaw solventi, bħal aċeton, alkoħol t-butil u dimetil formamid bħala portaturi sabiex jiżdiedu sustanzi kimiċi b'solubbiltà baxxa mal-midjum tat-test (2)(3). Il-konċentrazzjoni ta' solvent ma għandhiex taqbeż il-100 μl/l, u l-istess konċentrazzjoni ta' solvent għandha tiżdied mal-kulturi kollha (inkluż il-kontrolli) fis-serje tat-test.

Inkubazzjoni

29.

Agħtti r-reċipjenti tat-test b'tappijiet li tgħaddi l-arja minnhom. Ir-reċipjenti jitheżżu u jitqiegħdu fl-apparat tal-kulturi. Matul it-test huwa meħtieġ li l-algi jinżammu f'sospensjoni u sabiex tiffaċilita trasferiment ta' CO2. Għal dan il-għan, għandek theżżeż jew tħawwad b'mod konsistenti. Il-kulturi għandhom jinżammu f'temperatura fil-medda ta' 21 sa 24 °C, ikkontrollati f'± 2 °C. Għal speċijiet għajr dawk elenkati fl-Appendiċi 2, eż. speċijiet tropikali, jaf ikunu xierqa temperaturi ogħla, sakemm jistgħu jiġu ssodisfati l-kriterji ta' validità. Huwa rakkomandat li l-flasks jitqiegħdu b'mod każwali u li jerġgħu jiġu pożizzjonati mill-ġdid kuljum fl-inkubatur.

30.

Il-pH tal-midjum ta' kontroll ma għandux jiżdied b'aktar minn 1,5 unitajiet matul it-test. Għal metalli u sustanzi kimiċi li parzjalment jonizzaw b'pH madwar il-pH tat-test, jista' jkun meħtieġ li jiġi limitat it-tifrix tal-pH biex jinkisbu riżultati riproduċibbli u ddefiniti sew. Differenza ta' < 0,5 pH unità hija teknikament fattibbli u tista' tiġi miksuba billi tiġi żgurata rata ta' trasferiment ta' massa ta' CO2 adegwata mill-arja tal-madwar tas-soluzzjoni tat-test, eż. billi tiżdied ir-rata taċ-ċaqlieq. Possibilità oħra hija li titnaqqas id-domanda għal CO2 billi titnaqqas il-bijomassa tal-bidu jew it-tul tat-test.

31.

Il-wiċċ fejn il-kulturi huma inkubati għandu jingħata illuminazzjoni fluworexxenti, uniformi, kontinwa, eż. tat-tip ‘cool-white’ jew ‘daylight’. Razez ta' algi u ċjanobatterji jvarjaw fir-rekwiżti tad-dawl tagħhom. L-intensità tad-dawl għandha tintgħażel biex taddatta għall-organiżmu tat-test użat. Għal speċijiet rakkomandati ta' algi ħodor, agħżel l-intensità tad-dawl fil-livell tas-soluzzjonijiet tat-test mill-medda ta' 60-120 μE · m– 2 s– 1 meta titkejjel fil-medda ta' tul ta' mewġa fotosintetikament effikaċi ta' 400 – 700 nm permezz ta' riċettur xieraq. Xi speċijiet, b'mod partikolari Anabaena flos-aquae, jikbru sew f'intensitajiet tad-dawl iktar baxxi u jaf issirilhom ħsara f'intensitajiet għolja. Għal dawn l-ispeċi għandha tintgħażel intensità ta' dawl medja fl-isfera ta' 40-60 μE · m– 2 · s– 1. (Għal strumenti ta' kejl tad-dawl ikkalibrati fil-lux, medda ekwivalenti ta' 4 440 – 8 880 lux għal dawl cool white tikkorrispondi bejn wieħed u ieħor għall-intensità tad-dawl rakkomandata 60-120 μE · m– 2 · s– 1). Żomm l-intensità tad-dawl fi ħdan ± 15 % mill-intensità tad-dawl medja fuq iż-żona tal-inkubazzjoni.

Durata tat-test

32.

Normalment it-test jieħu 72 siegħa. Madankollu, jistgħu jintużaw durati tat-test iqsar jew itwal diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' validita kollha fil-paragrafu 11.

Kejl u determinazzjonijiet analitiċi

33.

Il-bijomassa algali f'kull flask hija ddeterminata tal-inqas kuljum matul il-perjodu tal-ittestjar. Jekk isiru miżuri fuq volumi żgħar imneħħija mis-soluzzjoni tat-test bil-pipetta, dawn ma għandhomx jiġu ssostitwiti.

34.

Il-kejl tal-bijomassa jsir bl-għadd manwali taċ-ċelloli minn mikroskopju jew apparat elettroniku li jgħodd il-partiċelli (minn għadd taċ-ċelloli/jew bijovolum). Jistgħu jintużaw tekniki alternattivi, eż. ċitometrija tal-fluss, fluworexxenza klorofilljana in vitro jew in vivo (5) (6), jew densità ottika jekk tista' tintwera korrelazzjoni sodisfaċenti tul il-medda ta' bijomassa li sseħħ fit-test.

35.

Kejjel il-pH tas-soluzzjonijiet fil-bidu u fl-aħħar tat-test.

36.

Sakemm tkun disponibbli proċedura analitika għad-determinazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fil-medda tal-konċentrazzjoni użata, is-soluzzjonijiet tat-test għandhom jiġu analizzati biex jiġu vverifikati l-konċentrazzjonijiet u ż-żamma inizjali tal-konċentrazzjonijiet tal-espożizzjoni matul it-test.

37.

Analiżi tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-bidu u fl-aħħar tat-test tat-test ta' konċentrazzjoni għolja u baxxa, u konċentrazzjoni madwar il-mistennija EC50 tista' tkun suffiċjenti fejn x'aktarx il-konċentrazzjonijiet esposti jvarjaw inqas minn 20 % mill-valuri nominali matul it-test. Hija rakkomandata analiżi tal-konċentrazzjonijiet tat-test kollha fil-bidu u fi tmiem tat-test, meta ma jkunx probabbli li l-konċentrazzjonijiet jibqgħu fi ħdan it-80-120 % tal-konċentrazzjoni nominali. Għal sustanzi kimiċi tat-test volatili, mhux stabbli, adsorbenti ħafna huma rakkomandati kampjuni addizzjonali għall-analiżi f'intervalli ta' 24 siegħa matul il-perjodu ta' espożizzjoni sabiex jiġi ddefinit aħjar it-telf tas-sustanza kimika tat-test. Għal dawn is-sustanzi kimiċi, jaf ikunu meħtieġa repliki żejda. Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test tista' titwettaq biss fuq reċipjent tar-repliki wieħed f'kull konċentrazzjoni tat-test (jew il-kontenut tar-reċipjenti miġbura mir-replikat).

38.

Il-midjums tal-ittestjar imħejjija speċifikament għall-analiżi tal-konċentrazzjonijiet ta' espożizzjoni matul it-test għandhom jiġu ttrattati bl-istess mod bħal dawk użati għall-ittestjar, jiġifieri għandhom jiġu inokulati b'algi u inkubatur fl-istess kundizzjonijiet. Jekk tkun meħtieġa analiżi tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test maħlula, jaf tkun meħtieġa separazzjoni tal-alga mill-midjum. Idealment, is-seperazzjoni għandha issir b'ċentrifugazzjoni b'forza-g baxxa, suffiċjenti biex tissettja l-alga.

39.

Jekk ikun hemm evidenza li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika li qiegħda tiġi ttestjata nżammet b'mod sodisfaċenti fi ħdan 20 % tal-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla matul it-test, l-analiżi tar-riżultati tista' tkun ibbażata fuq valuri inizjali nominali jew imkejla. Jekk id-devjazzjoni mill-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla ma tkunx fi ħdan il-medda ta' ± 20 %, l-analiżi tar-riżultati għandha tkun ibbażata fuq il-konċentrazzjoni medja ġeometrika matul l-espożizzjoni jew fuq il-mudelli li jiddeskrivu t-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (3) (7).

40.

It-test ta' inibizzjoni tat-tkabbir tal-alga huwa sistema ta' ttestjar iktar dinamiku mill-biċċa l-kbira tat-testijiet tat-tossiċità akkwatika għal terminu qasir l-oħrajn. Bħala konsegwenza, jaf ikun diffiċli tiddefinixxi l-konċentrazzjonijiet ta' espożizzjoni attwali, speċjalment għall-adsorbiment ta' sustanzi kimiċi ttestjati f'konċentrazzjonijiet baxxi. F'tali każijiet, l-għajbien tas-sustanza kimika tat-test mis-soluzzjoni b'adsorbiment mal-bijomassa algali li dejjem tiżdied ma jfissirx li din tintilef mis-sistema tat-test. Meta jiġi analizzat ir-riżultat tat-test, għandu jiġi ċċekkjat jekk tnaqqis fil-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test matul it-test huwiex akkumpanjat minn tnaqqis fl-inibizzjoni tat-tkabbir. Jekk dan ikun il-każ, tista' tiġi kkunsidrata l-applikazzjoni ta' mudell xieraq li jiddeskrivi t-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (7). Jekk le, jaf ikun xieraq li tibbaża l-analiżi tar-riżultati fuq il-konċentrazzjonijiet (nominali jew imkejla) inizjali.

Osservazzjonijiet oħra

41.

Għandha titwettaq osservazzjoni mikroskopika biex tiġi vverifikata dehra normali u sana ta' kultura tal-inokulu u biex tiġi osservata kwalunkwe dehra anormali tal-alga (peress li jaf tkun ikkawżata mill-espożizzjoni għas-sustanza kimika tat-test) fi tmiem it-test.

Test tal-limitu

42.

F'ċerti ċirkostanzi, eż. meta test preliminari jindika li s-sustanza kimika tat-test ma għandha ebda effetti tossiċi f'konċentrazzjonijiet sa 100 mg/l jew sal-limitu ta' solubbiltà tagħha fil-midjum tat-test (irrispettivament minn liema huwa l-inqas), jista' jsir test tal-limitu li jinvolvi tqabbil tar-risponsi fi grupp ta' kontroll u grupp ta' trattament partikolari (100 mg/l jew konċentrazzjoni daqs il-limitu ta' solubbiltà). Huwa rakkomandat ħafna li dan jiġi appoġġjat minn analiżi tal-konċentrazzjoni tal-espożizzjoni. Japplikaw kull kundizzjoni tat-test u kriterju ta' validità deskritti preċedentement għal test tal-limitu, bl-eċċezzjoni li n-numru ta' repliki tat-trattament għandhom ikunu tal-inqas sitta. Il-varjabbli tar-rispons fil-grupp ta' kontroll u trattament jistgħu jiġu analizzati permezz ta' test tal-istatistika biex jitqabblu l-medji, eż. Test-t ta' Student. Jekk il-varjanzi taż-żewġ gruppi ma jkunux l-istess, għandu jsir test-t aġġustat għal varjanzi mhux indaqs.

DEJTA U RAPPORTAR

Ipplottjar tal-kurvi tat-tkabbir

43.

Il-bijomassa fir-reċipjenti tat-test, tista' tiġi espressa f'unitajiet tal-parametru sostitut użat għall-kejl (eż. in-numru ta' ċelloli, fluworexxenza).

44.

Indika l-konċentrazzjoni ta' bijomassa stmata fil-kulturi tat-test u l-kontrolli flimkien mal-konċentrazzjonijiet tal-materjal tat-test u l-ħinijiet tal-kejl, irreġistrata b'riżoluzzjoni ta' mill-anqas sigħat sħaħ, biex jiġu prodotti plottijiet ta' kurvi ta' tkabbir. Kemm l-iskali logaritmiċi kif ukoll l-iskali lineari jistgħu jkunu utli f'dan l-istadju, iżda l-iskali logaritmiċi huma obbligatorji u ġeneralment jagħtu preżentazzjoni aħjar tal-varjazzjonijiet fil-mudell ta' tkabbir matul il-perjodu tal-ittestjar. Ta' min jinnota li tkabbir esponenzjali jipproduċi linja dritta meta jiġi pplottjat fuq skala logaritmika, u inklinazzjoni tal-linja (gradjent) tindika r-rata ta' tkabbir speċifika.

45.

Permezz tal-plottijiet, eżamina jekk il-kulturi ta' kontroll jikbrux b'mod esponenzjali bir-rata mistennija matul it-test kollu. Eżamina l-punti ta' dejta kollha u d-dehra tal-graffs b'mod kritiku u ċċekkja d-dejta mhux ipproċessata u l-proċeduri għall-iżbalji possibbli. Iċċekkja b'mod partikolari kwalunkwe punt ta' dejta li jidher li jiddevja bi żball sistematiku. Jekk ikun ovvju li l-iżbalji proċedurali jistgħu jiġu identifikati u/jew jitqiesu probabbli ħafna, il-punt ta' dejta speċifiku huwa mmarkat minn outlier u mhuwiex inkluż f'analiżi statistika sussegwenti. (Konċentrazzjoni algali żero f'wieħed miż-żewġ jew tliet reċipjenti tar-repliki tista' tindika li r-reċipjent ma kienx inokulat b'mod korrett, jew tnaddaf b'mod mhux xieraq). Iddikjara r-raġunijiet għar-rifjut ta' punt ta' dejta bħala outlier fir-rapport tat-test. Ir-raġunijiet aċċettati huma biss żbalji proċedurali (rari) u mhux sempliċi preċiżjoni ħażina. Il-proċeduri tal-istatistika għall-identifikazzjoni tal-outlier huma ta' użu limitat għal din it-tip ta' problema u ma jistgħux jieħdu post il-ġudizzju tal-esperti. Idealment l-outliers (immarkati bħala tali) għandhom jinżammu fost il-punti ta' dejta murija fi kwalunkwe preżentazzjoni ta' dejta grafika jew tabulari sussegwenti.

Varjabbli ta' rispons

46.

L-iskop tat-test huwa li jiddetermina l-effetti tas-sustanza kimika tat-test fuq it-tkabbir tal-alga. Dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi żewġ varjabbli ta' rispons, peress li ġurisidizzjonijiet differenti għandhom preferenzi u ħtiġijiet regolatorji differenti. Sabiex ir-riżultati tat-test ikunu aċċettabbli fil-ġurisdizzjonijiet kollha, l-effetti għandhom jiġu evalwati permezz taż-żewġ varjabbli tar-rispons (a) u (b) deskritti hawn taħt.

(a)    Rata ta' tkabbir speċifika medja : dan il-varjabbli ta' rispons huwa kkalkolat abbażi taż-żieda logaritmika fil-bijomassa matul il-perjodu tal-ittestjar, espressa għal kull jum

(b)    Rendiment : dan il-varjabbli tar-rispons huwa l-bijomassa fi tmiem it-test li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu.

47.

Ta' min jinnota li l-valuri tat-tossiċità kkalkolati permezz ta' dawn iż-żewġ varjabbli ta' rispons ma jistgħux jitqabblu u din id-differenza għandha tiġi rikonoxxuta meta jintużaw ir-riżultati tat-test. Valuri ECx ibbażati fuq rata medja ta' tkabbir speċifiku (ErCx) ikunu ġeneralment ogħla minn riżultati bbażati fuq ir-rendiment (EyCx) jekk il-kundizzjonijiet tat-test ta' dan il-Metodu ta' ttestjar jiġu rrispettati, minħabba l-bażi matematika tal-approċċi rispettivi. Dan ma għandux jiġi interpretat bħala d-differenza fis-sensittività bejn iż-żewġ varjabbli ta' rispons, iżda sempliċement li li l-valuri huma matematikament differenti. Il-kunċett ta' rata ta' tkabbir speċifika medja huwa bbażat fuq il-mudell ta' tkabbir esponenzjali tal-alga f'kulturi mhux limitati, fejn it-tossiċità hija stmata abbażi tal-effetti fuq ir-rata ta' tkabbir, mingħajr ma tiddependi fuq il-livell assolut tar-rata ta' tkabbir speċifika tal-kontroll, il-gradjent tal-kurva konċentrazzjoni rispons jew fuq id-durata tat-test. B'kuntrast, ir-riżultati bbażati fuq il-varjabbli tar-rispons tar-rendimentjiddependu fuq dawn il-varjabbli l-oħra kollha. EyCx huwa dipendenti fuq ir-rata speċifika ta' tkabbir tal-ispeċi ta' alka użata fit-test u fuq ir-rata massima ta' tkabbir speċifiku li tista' tvarja bejn speċijiet u kif ukoll bejn razez differenti ta' alka. Dan ir-rispons varjabblima għandux jintuża għat-tqabbil tas-sensittività għat-tossikanti fost l-ispeċijiet ta' algi jew anki razez differenti. Filwaqt li l-użu tar-rata ta' tkabbir speċifika medja għall-istima tat-tossiċità huwa ppreferut xjentifikament, l-istimi tat-tossiċità ibbażati fuq ir-rendimenthuma inklużi wkoll f'dan il-metodu ta' ttestjar biex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti regolatorji attwali f'xi pajjiżi.

Rata ta' tkabbir medja

48.

Ir-rata ta' tkabbir speċifika medja għal perjodu speċifiku hija kkalkolata bħala ż-żieda logaritmika fil-bijomassa mill-ekwazzjoni għal kull reċipjenti uniku tal-kontrolli u t-trattamenti [1]:

Formula

[1],

fejn:

μi-j

hija r-rata medja speċifika ta' tkabbir minn ħin i sa j;

Xi

hija l-bijomassa fil-ħin i;

Xj

hija l-bijomassa fil-ħin j;

Għal kull grupp ta' trattament u kull grupp ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rata ta' tkabbir flimkien mal-istimi tal-varjanza.

49.

Ikkalkola r-rata ta' tkabbir speċifika medja matul id-durata kollha tat-test (normalment 0-3 ijiem), permezz tal-bijomassa inokulata nominalment bħala l-valur tal-bidu iktar minn valur tal-bidu mkejjel, peress li b'dan il-mod, normalment tinkiseb iktar preċiżjoni. Jekk it-tagħmir użat għall-kejl tal-bijomassa jippermetti determinazzjoni preċiża biżżejjed tal-bijomassa tal-inokulu (eż. citometru tal-fluss) allura tista' tintuża l-konċentrazzjoni tal-bijomassa inizjali mkejla. Ivvaluta wkoll ir-rata ta' tkabbir skont is-sezzjoni, ikkalkolata bħala r-rati ta' tkabbir speċifiċi għal kull jum matul il-kors tat-test (0-1, 1-2 u 2-3 jiem) u eżamina jekk ir-rata ta' tkabbir tal-kontroll tibqax kostanti (ara l-kriterji tal-validità, paragrafu 11). Rata ta' tkabbir speċifika sinifikament inqas fl-ewwel jum mir-rata ta' tkabbir speċifika medja totali tista' tindika fażi latenti. Filwaqt li fażi latenti tista' titnaqqas u prattikament tiġi eliminata f'kulturi tal-kontroll bi propagazzjoni xierqa tal-prekultura, fażi latenti f'kulturi esposti tista' tindika rkupru wara stress tossiku inizjali jew tnaqqis fl-espożizzjoni minħabba telf ta' sustanza kimika tat-test (inkluż sorbiment fil-bijomassa algali) wara l-espożizzjoni inizjali. Għalhekk ir-rata ta' tkabbir skont is-sezzjoni tista' tiġi vvalutata sabiex jiġu evalwati l-effetti tas-sustanza kimika tat-test li jseħħu fil-perjodu ta' espożizzjoni. Differenzi sostanzjali bejn ir-rata ta' tkabbir skont is-sezzjoni u r-rata ta' tkabbir medja jindikaw devjazzjoni minn tkabbir esponenzjali kostanti u li hija ggarantita eżaminazzjoni mill-qrib tal-kurvi ta' tkabbir.

50.

Ikkalkola l-inibizzjoni perċentwali tar-rata ta' tkabbir għal kull replikat ta' trattament mill-ekwazzjoni [2]:

Formula

[2],

fejn:

%Ir

=

inibizzjoni perċentwali fir-rata ta' tkabbir speċifika medja;

μC

=

valur medju għal rata medja ta' tkabbir speċifiku (μ) fil-grupp ta' kontroll;

μT

=

rata medja ta' tkabbir speċifiku għar-replika ta' trattament;

51.

Meta biex jitħejjew is-soluzzjonijiet tat-test jintużaw solventi, għandhom jintużaw il-kontrolli bis-solventi u mhux ili l-kontrolli bla solventi fil-kalkolu ta' inibizzjoni perċentwali.

Rendiment

52.

Ir-rendiment huwa kkalkolat bħala l-bijomassa fi tmiem it-test li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu għal kull reċipjent uniku ta' kontrolli u trattamenti. Għal kull konċentrazzjoni tat-test u ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rendiment flimkien mal-istimi tal-varjanza. Il-persentaġġ ta' inibizzjoni fil-prodott (%Iy) jista' jiġi kkalkulat għal kull replika ta' trattament kif ġej:

Formula

[3]

fejn:

% Iy

=

inibizzjoni perċentwali tar-rendiment;

YC

=

valur medju għall-prodott fil-grupp ta' kontroll;

YT

=

valur għall-prodott għar-replika ta' trattament.

Ipplottjar tal-kurva konċentrazzjoni rispons

53.

Ipplottja l-perċentwali tal-inibizzjoni mal-logaritma tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u eżamina l-plott bir-reqqa, filwaqt li tinjora kwalunkwe tali punt ta' dejta li ġie individwat bħala outlier fl-ewwel fażi. Għaddi linja ċara mill-punti ta' dejta b'għajnejk jew b'interpolazzjoni bil-kompjuter biex tieħu idea tar-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons, u mbagħad kompli b'metodu iktar iddettaljat, idealment metodu statistiku kompjuterizzat. Skont l-użu intiż tad-dejta, il-kwalità (preċiżjoni) u l-ammont ta' dejta, kif ukoll id-disponibblità ta' għodda ta' analiżi tad-dejta, jista' jiġi deċiż (u xi drabi ġġustifikat sew) li titwaqqaf l-analiżi tad-dejta f'dan l-istadju u sempliċement jinqraw il-figuri prinċipali EC50 u EC10 (u/jew EC20) mill-kurva mdaħħla fuq l-għajn (ara wkoll it-taqsima ta' hawn taħt fuq effetti stimulatorji). Raġunijiet validi biex ma jintużax metodu statistiku jistgħu jinkludu:

Id-dejta mhijiex xierqa għal metodi kompjuterizzati biex jipproduċu xi riżultat affidabbli ieħor apparti dawk li jistgħu jinkisbu b'ġudizzju espert — f'tali sitwazzjonijiet xi programmi tal-kompjuter jistgħu anki jonqsu milli jipproduċu soluzzjoni affidabbli (ir-rikorrenzi jaf ma jaqblux, eċċ.)

Ir-risponsi għal tkabbir stimulatorju ma jistgħux jiġu indirizzati b'mod adegwat permezz tal-programmi tal-kompjuter disponibbli (ara hawn taħt).

Proċeduri statistiċi

54.

L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons b'analiżi tar-rigressjoni. Huwa possibbli li tintuża rigressjoni lineari ppeżata wara li tkun twettqet trasformazzjoni linearizzanti tad-dejta dwar ir-rispons — pereżempju f'unitajiet probit jew logit jew Weibull (8), iżda proċeduri ta' rigressjoni mhux lineari huma tekniki ppreferuti li jimmaniġġjaw aħjar irregolaritajiet inevitabbli ta' dejta u devjazzjonijiet minn distribuzzjonijiet bla intoppi. Meta jkunu viċin inibizzjoni żero jew totali, tali irregolaritajiet jistgħu jitkabbru bit-trasformazzjoni, u dan jinterferixxi mal-analiżi (8). Ta' min jinnota li metodi standard ta' analiżi bl-użu ta' trasformati ta' probit, logit jew Weibull huma maħsuba għall-użu f'dejta kwantali (eż. mortalità jew sopravivenza), u jridu jiġu mmodifikati biex jakkomodaw id-dejta dwar it-tkabbir jew il-bijomassa. Proċeduri speċifiċi għad-determinazzjoni ta' valuri ECx minn dejta kontinwa jistgħu jinstabu f'(9), (10), u (11). L-użu ta' analiżi tar-rigressjoni mhux lineari huwa ddettaljat iktar fl-Appendiċi 5.

55.

Għal kull varjabbli ta' rispons li jiġi analizzat, għandha tintuża r-relazzjoni konċentrazzjoni-rispons biex jiġu kkalkulati l-estimi ta' punti ta' valuri ECx. Fejn ikun possibbli, għandhom jiġu stmati l-limiti ta' kunfidenza ta' 95 % għal kull stima. Kemm toqgħod tajjeb id-dejta dwar ir-rispons għall-mudell ta' rigressjoni għandu jiġi vvalutat grafikament jew statistikament. L-analiżi tar-rigressjoni għandha ssir permezz ta' risponsi tar-repliki individwali, mhux il-medji tal-grupp ta' trattament. Jekk, madankollu, ma jkunx faċli li tintuża kurva mhux lineari huwa diffiċli jew ma jirnexxiex minħabba dispersjoni kbira wisq fid-dejta, il-problema tista' tiġi evitata billi ssir ir-rigressjoni fuq il-medji tal-grupp bħala mod prattiku ta' tnaqqis fl-influwenza ta' outliers suspettati. L-użu ta' din l-għażla għandu jiġi identifikat fir-rapport tat-test bħala devjazzjoni mill-proċedura normali peress li l-interpolazzjoni ta' kurva b'repliki individwali ma pproduċietx riżultat tajjeb.

56.

Stimi EC50 u limiti ta' kunfidenza jistgħu wkoll jiġi miksuba bl-użu ta' interpolazzjoni lineari b'sekwenza ta' istruzzjonijiet inizjali (13), jekk il-mudelli/metodi ta' regressjoni aċċessibli m'humiex xierqa għad-data.

57.

Għal stima tal-LOEC u, għalhekk, l-NOEC, għal effetti tas-sustanza kimika tat-test fuq ir-rata ta' tkabbir, huwa meħtieġ li jitqabblu l-medji tat-trattament permezz ta' analiżi tat-tekniki ta' varjanza (ANOVA). Imbagħad il-medja għal kull konċentrazzjoni għandha titqabbel mal-medja tal-kontroll permezz ta' tqabbil multiplu xieraq jew test tat-tendenza. It-test ta' Dunnett jew Williams jista' jkun siewi (12)(14)(15)(16)(17). Huwa meħtieġ li jiġi vvalutat jekk treġġix is-suppożizzjoni tal-omoġeneità ta' varjanza ta' ANOVA. Din il-valutazzjoni tista' titwettaq grafikament jew b'test formali (17). Testijiet xierqa huma Levene jew Bartlett. Jekk is-suppożizzjoni ta' omoġeneità tal-varjanzi ma tkunx issodisfata, din kultant tista' tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni logaritmika tad-dejta. Jekk l-eteroġeneità tal-varjanza hija estrema u ma tistax tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni, għandha tiġi kkunsidrata analiżi b'metodi bħat-test ta' tendenza rigressiva ta' Jonckheere. Fi (11) tista' tinstab gwida addizzjonali dwar id-determinazzjoni tal-NOEC.

58.

Żviluppi xjentifiċi riċenti wasslu għal rakkomandazzjoni biex jiġi abbandunat il-kunċett tal-NOEC u minflok jinbidel bi stimi ECx ta' punti bbażati fuq regressjoni. Valur xieraq għal x ma ġiex stabbilit għal dan it-test algali. Sfera ta' 10 sa 20 % tidher li hija xierqa (tiddependi fuq il-varjabbli ta' rispons magħżul), u preferibbilment kemm l-EC10 u EC20 għandhom jiġu rrappurtati.

Stimulazzjoni tat-tkabbir

59.

Xi drabi hija osservata stimulazzjoni tat-tkabbir (inibizzjoni negattiva) f'konċentrazzjonijiet baxxi. Dan jista' jirriżulta minn ormeżi (‘stimulazzjoni tossika’) jew miż-żieda ta' fatturi ta' tkabbir ta' stimulazzjoni bil-materjal tat-test sal-midjum minimu użat. Ta' min jinnota li ż-żieda ta' nutrijenti inorganiċi ma għandu jkollha ebda effett dirett peress li l-midjum tat-test għandu jżomm eċċess ta' nutrijenti matul it-test. Stimulazzjoni f'doża baxxa tista' ġeneralment tiġi injorata f'kalkulazzjonijiet EC50 sakemm ma tkunx estrema. Madankollu, jekk hija estrema, jew valur ECx għal x baxxa għandu jiġi kkalkulat, proċeduri speċjali jistgħu ikunu meħtieġa. Jekk ikun possibbli għandu jiġi evitat tħassir ta' risponsi stimulatorji mill-analiżi tad-dejta, u jekk is-softwer li jadatta l-kurva ma jistax jaċċetta stimulazzjoni minuri, tista' tintuża interpolazzjoni lineari b'bootstrapping. Jekk l-istimulazzjoni tkun estrema, jista' jiġi kkunsidrat l-użu tal-mudell tal-ormesi (18).

Inibizzjoni tat-tkabbir mhux tossiku

60.

Materjali tal-ittestjar li jassorbu d-dawl jistgħu jagħtu lok għal tnaqqis fir-rata ta' tkabbir peress li d-dellijiet inaqqsu l-ammont ta' dawl disponibbli. Tali tipi fiżiċi ta' effetti għandhom jiġu sseparati minn effetti tossiċi billi jiġu mmodifikati l-kundizzjonijiet tat-test u dawn tal-aħħar għandhom jiġu rrapportati b'mod separat. Fi (2) u (3) tista' tinstab gwida.

RAPPORT TAL-ITTESTJAR

61.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi dan li ġej:

 

Sustanza kimika tat-test:

natura fiżika u proprjetajiet fiżiċi u kimiċi rilevanti, inkluż il-limitu tas-solubbiltà fl-ilma;

dejta ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (eż. Numru CAS), inkluża l-purità (impuritajiet).

 

Speċijiet tat-test:

ir-razza, il-fornitur jew is-sors u l-kundizzjonijiet tal-kulturi użati.

 

Kundizzjonijiet tat-test:

id-data tal-bidu tal-ittestjar u d-durata tiegħu;

deskrizzjoni tad-disinn tal-ittestjar, reċipjenti tat-test, volumi tal-kultura, densità tal-bijomassa fil-bidu tat-test;

il-komposizzjoni tal-midjum;

il-konċentrazzjoni tat-test u r-repliki (eż. numru ta' repliki, numru ta' konċentrazzjonijiet tat-test u l-progress ġeometriku użat);

deskrizzjoni tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tat-test, inkluż l-użu ta' solventi eċċ.

apparat tal-kulturi;

l-intensità u l-kwalità tad-dawl (sors, omoġenità);

it-temperatura;

konċentrazzjonijiet ittestjati: il-konċentrazzjonijiet tat-test nominali u kwalunkwe riżultat tal-analiżijiet biex tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fir-reċipjenti tat-test. Għandha tiġi rrapportata l-effiċjenza fl-irkupru tal-metodu u l-limitu tal-kwantifikazzjoni fil-matriċi tal-ittestjar;

id-devjazzjonijiet kollha minn dan il-metodu ta' ttestjar;

il-metodu għad-determinazzjoni tal-bijomassa u l-evidenza tal-korrelazzjoni bejn il-parametru mkejjel u l-piż xott;

 

Riżultati:

valuri tal-pH fil-bidu u fi tmiem it-test fit-trattamenti kollha;

il-bijomassa għal kull flask f'kull punt ta' kejl u l-metodu għall-kejl tal-bijomassa;

kurvi ta' tkabbir (plott tal-bijomassa mal-ħin);

il-varjabbli ta' rispons ikkalkolati għal kull replikat tat-trattament, bil-valuri medji u l-koeffiċjenti ta' varjazzjoni għar-repliki;

preżentazzjoni grafika tar-relazzjoni bejn il-l-konċentrazzjoni u l-effett;

stimi ta' tossiċità varjabbli ta' rispons eż. EC50, EC10, EC20 u intervalli ta' kunfidenza assoċjati. Jekk ikkalkolati, LOEC u NOEC u l-metodi statistiċi użati għad-determinazzjoni tagħhom;

jekk tintuża ANOVA, id-daqs tal-effett li jista' jiġi skopert (eż. id-differenza l-inqas sinifikanti);

kwalunkwe stimulazzjoni ta' tkabbir misjuba fi kwalunkwe trattament;

kwalunkwe effett ieħor osservat, eż. bidliet morfoloġiċi tal-alga;

diskussjoni tar-riżultati, inkluż kwalunkwe influwenza fuq l-eżitu tat-test li tirriżulta mid-devjazzjonijiet minn dan il-metodu ta' ttestjar.

LETTERATURA

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Appendiċi 1

Definizzjonijiet

Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet li ġejjin jintużaw għall-finijiet ta' dan il-metodu ta' ttestjar:

 

Il-bijomassa hija l-piż xott tal-materja ħajja preżenti f'popolazzjoni espressa f'termini ta' volum partikolari; eż. mg soluzzjoni ta' algi/litri. Ġeneralment il-‘bijomassa’ hija ddefinita bħala l-massa, iżda f'dan it-test, din il-kelma tintuża biex tirreferi għall-massa skont il-volum. Barra minn hekk f'dan it-test, is-surrogati għall-bijomassa, bħall-għadd taċ-ċelloli, il-fluworexxenza, eċċ. ġeneralment jitkejlu u l-użu tat-terminu ‘bijomassa’ għalhekk jirreferi wkoll għal dawn il-miżuri surrogati.

 

Sustanza kimika tfisser sustanza jew taħlita

 

Koeffiċjent ta' varjazzjoni hija miżura mingħajr dimensjoni tal-varjabbiltà ta' parametru, iddefinit bħala l-proporzjon tad-devjazzjoni standard mill-medja. Dan jista' jiġi wkoll espress bħala valur perċentwali. Il-koeffiċjent medju ta' varjazzjoni ta' rata ta' tkabbir speċifika medja fil-kulturi ta' kontroll tar-replikat għandu jiġi kkontrollat kif ġej:

1.

Ikkalkola % CV tar-rata ta' tkabbir speċifika medja mir-rati ta' tkabbir kuljum/skont is-sezzjoni għar-replikat rispettiv;

2.

Ikkalkola l-valur medju mill-valuri kollha kkalkolati skont il-punt 1 biex tikseb il-koeffiċjenti medju tal-varjazzjoni tar-rata tkabbir ta' kuljum/skont is-sezzjoni fil-kulturi ta' kontroll tar-repliki.

 

ECx hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test maħlula fil-midjum tat-test li tirriżulta fi tnaqqis ta' x % (eż. 50 %) fit-tkabbir tal-organiżmu tal-ittestjar f'perjodu ta' espożizzjoni ddikjarat (li għandu jissemma b'mod espliċitu jekk ikun hemm devjazzjoni mid-durata tat-test kollu jew normali). Sabiex issir denotazzjoni li ma hijiex ambigwa ta' valur ta' EC li jidderiva mir-rata ta' tkabbir jew prodott, is-simbolu ‘ErC’ huwa użat għar-rata ta' tkabbir u ‘EyC’ huwa użat għall-prodott.

 

Midjum ta' tkabbir huwa l-midjum tal-kultura sintetiku komplut li fih tikber l-alga tat-test meta tiġi esposta għas-sustanza kimika tat-test. Normalment is-sustanza kimika tat-test tinħall fil-midjum tat-test.

 

Rata ta' tkabbir (rata ta' tkabbir speċifika medja) hija ż-żieda logaritmika fil-bijomassa matul il-perjodu ta' espożizzjoni.

 

Il-Konċentrazzjoni bl-Inqas Effett Osservat (LOEC) hija l-inqas konċentrazzjoni ttestjata li fiha s-sustanza kimika hija osservata li jkollha effett ta' tnaqqis statistikament sinifikanti fuq it-tkabbir (b'p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll, f'ħin ta' espożizzjoni partikolari. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tat-test kollha ogħla mil-LOEC għandu jkollhom effett dannuż ugwali jew ikbar minn dawk osservati fl-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jkunux jistgħu jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni sħiħa dwar kif intgħażlet l-LOEC (u għalhekk l-NOEC).

 

Il-Konċentrazzjoni Bla Effett Osservat (NOEC) hija l-konċentrazzjoni tat-test eżatt taħt l-LOEC.

 

Il-varjabbli ta' rispons huwa varjabbli għall-istima tat-tossiċità derivata minn parametri mkejla li jiddeskrivu l-bijomassa minn metodi differenti ta' kalkolu. Għal dan il-metodu ta' ttestjar, ir-rati ta' tkabbir u r-rendiment huma varjabbli ta' rispons derivati mill-bijomassa ta' kejl direttament jew kwalunkwe wieħed mis-surrogati msemmija.

 

Rata ta' tkabbir speċifika hija varjabbli ta' rispons iddefinit bħala l-kwozjent tad-differenza tal-logaritmi naturali ta' parametru ta' osservazzjoni (f'dan il-metodu ta' ttestjar, il-bijomassa) u l-perjodu ta' żmien rispettiv.

 

Sustanza kimika tat-test tfisser kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

 

Rendiment huwa l-valur ta' varjabbli tal-kejl fi tmiem il-perjodu ta' espożizzjoni neqes il-valur tal-varjabbli tal-kejl fil-bidu tal-perjodu ta' espożizzjoni biex tiġi espressa ż-żieda fil-bijomassa matul it-test.

Appendiċi 2

Razez murija li huma xierqa għat-test

Alga ħadra

 

Pseudokirchneriella subcapitata (li qabel kienet magħrufa bħala Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (li qabel kienet magħrufa bħala Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Dijatomi

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Ċjanobatterji

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Sorsi ta' Razez

Ir-razez rakkomandati huma disponibbli f'kulturi unialgali mill-kollezzjonijiet li ġejjin (f'ordni alfabetiku):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

USA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

UK

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nickolausberger Weg 18

37073 Göttingen

GERMANY

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA.

Dehra u karatteristiċi tal-ispeċijiet rakkomandati

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Dehra

Ċelloli uniċi mgħawġin u milwijin

Ċelloli ovali fil-biċċa l-kbira uniċi

Vireg

Ktajjen ta' ċelloli ovali

Vireg

Qies (T × W) μm

8-14 × 2-3

7-15 × 3-12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Volum ta' ċelloli (μm (4)/ċellola)

40-60 (2)

60-80 (2)

40-50 (2)

30-40 (2)

2,5 (3)

Piż xott taċ-ċelloli (mg/ċellola)

2-3 × 10– 8

3-4 × 10– 8

3-4 × 10– 8

1-2 × 10–8

2-3 × 10– 9

Rata ta' tkabbir (4) (jum– 1)

1,5 -1,7

1,2-1,5

1,4

1,1-1,4

2,0-2,4

Rakkomandazzjonijiet Speċifiċi dwar il-Kulturi u l-Immaniġġar tal-Ispeċijiet tal-Ittestjar Rakkomandati

Pseudokirchneriella subcapitata u Desmodesmus subspicatus

Ġeneralment faċli żżomm dawn l-algi ħodor f'diversi midjums ta' kulturi. Informazzjoni dwar midjums xierqa hija disponibbli mill-kollezzjonijiet ta' kulturi. Iċ-ċelloli ġeneralment huma solitarji, u l-kejliet tad-densità taċ-ċelloli jistgħu jsiru faċilment permezz ta' kontatur tal-frak elettroniku jew mikroskopju.

Anabaena flos-aquae

Jistgħu jintużaw diversi midjums ta' tkabbir biex tinżamm kultura ewlenija. Huwa partikolarment importanti li jiġi evitat milli l-kultura tal-lott tgħaddi l-fażi ta' tkabbir taz-zokk meta tiġġedded, l-irkupru huwa diffiċli f'dan il-punt.

Anabaena flos-aquae tiżvilupppa aggregati ta' ktajjen ta' ċelloli mbejta. Id-daqs ta' dawn l-aggregati jista' jvarja skont il-kundizzjonijiet tal-kulturi. Jaf ikun meħtieġ li dawn l-aggregati jitqassmu meta l-għadd tal-mikroskopju jew kontatur tal-frak elettroniku jintuża għad-determinazzjoni tal-bijomassa.

Is-sonikazzjoni tas-sottokampjuni tista' tintuża biex jinkisru l-ktajjen biex titnaqqas il-varjabbiltà tal-għadd. Sonikazzjoni itwal milli meħtieġ sabiex jinkisru l-ktajjen f'tulijiet iqsar tista' teqred iċ-ċelloli. L-intensità u d-durata tas-sonikazzjoni għandhom ikunu l-istess għal kull trattament.

Għodd biżżejjed oqsma fuq l-emoċitometru (tal-inqas 400 ċellola) biex tgħin tikkumpensa għall-varjabbiltà. Dan sejjer itejjeb l-affidabbiltà tad-determinazzjonijiet tad-densità mikroskopika.

Jista' jintuża kontatur elettroniku tal-partiċelli għad-determinazzjoni tal-volum ta' ċelloli totali ta' Anabaena wara t-tkissir tal-ktajjen taċ-ċelloli b'sonifikazzjoni b'attenzjoni. L-enerġija ta' sonifikazzjoni għandha tiġi aġġustata biex jiġi evitat it-txifkil taċ-ċelloli.

Uża mikser b'vortiċi jew metodu xieraq simili biex tiżgura li s-sospensjoni tal-alga użata biex tinokula r-reċipjenti tat-test titħallat sew u tkun omoġenja.

Ir-reċipjenti tat-test għandhom jitqiegħdu fuq mejda b'mikser orbitali jew reċiprokat b'madwar 150 rivoluzzjoni fil-minuta. Inkella, jistgħu jiġu aġitati b'mod intermittenti biex titnaqqas it-tendenza ta' Anabaena li tifforma ċapep. Jekk ikun hemm ċapep, għandha tingħata attenzjoni biex jintlaħqu kampjuni rappreżentattivi għall-kejliet tal-bijomassa. Jaf tkun hemm bżonn ta' aġitazzjoni qawwija qabel il-kampjunar biex jiġu diżintegrati ċ-ċapep ta' alga.

Synechococcus leopoliensis

Jistgħu jintużaw diversi midjums ta' tkabbir biex tinżamm kultura ewlenija. Informazzjoni dwar midjums xierqa hija disponibbli mill-kollezzjonijiet ta' kulturi.

Synechococcus leopoliensis tikber bħala ċelloli f'forma ta' vireg solitarji. Iċ-ċelloli huma żgħar ħafna, u dan jikkomplika l-użu ta' għadd mikroskopiku għall-kejliet tal-bijomassa. Kontaturi elettroniċi tal-partiċelli mgħammra għall-għadd ta' partiċelli sa daqs ta' madwar 1 μm huma siewja. Kejliet fluworometriċi in vitro huma applikabbli wkoll.

Navicula pelliculosa

Jistgħu jintużaw diversi midjums ta' tkabbir biex tinżamm kultura ewlenija. Informazzjoni dwar midjums xierqa hija disponibbli mill-kollezzjonijiet ta' kulturi. Kun af li f'dan il-midjum huwa meħtieġ is-silikat.

Navicula pelliculosa tista' tifforma aggregati f'ċerti kundizzjonijiet ta' tkabbir. Minħabba l-produzzjoni ta' lipidi, iċ-ċelloli algali għandhom it-tendenza li kultant jakkumulaw fir-rita tal-wiċċ. F'ċerti ċirkostanzi jridu jittieħdu miżuri speċjali meta jittieħdu sottokampjuni għad-determinazzjoni tal-bijomassa sabiex jinkisbu kampjuni rappreżentattivi. Jaf ikun meħtieġ tħawwid bis-saħħa, eż. permezz ta' mikser b'vortiċi.

Appendiċi 3

Idjums tat-tkabbir

Jista' jintuża wieħed miż-żewġ midjums tat-tkabbir li ġejjin:

Midjum tal-OECD: Midjum oriġinali tat-TG 201 tal-OECD, skont l-ISO 8692 ukoll

US. AAP tal-midjum tal-EPA, skont l-ASTM ukoll.

Meta jiġu ppreparati dawn il-midjums, għandhom jintużaw sustanzi kimiċi ta' reaġent jew grad analitiku u ilma dejonizzat.

Kompożizzjonijiet tal-midjum AAP (US. EPA) u l-midjum OECD TG 201.

Komponent

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Il-proporzjon ta' molari ta' EDTA mal-ħadid taqbeż bi ftit l-unità. Dan jevita l-preċipitazzjoni tal-ħadid u fl-istess ħin, il-kelazzjoni ta' jonji tal-metall tqil tiġi minimizzata.

Fit-test bid-dijatomu Navicula pelliculosa, iż-żewġ midja jridu jkunu supplimentati b'Na2SiO3 · 9H20 sabiex tinkiseb konċentrazzjoni ta' 1,4 mg Si/l.

Il-pH tal-midjum jinkiseb f'ekwilibriju bejn is-sistema ta' karbonat tas-sistema tal-midjum u l-pressjoni parzjali tas-CO2 fl-arja atmosferika. Relazzjoni approssimattiva bejn il-pH f'25 °C u l-konċentrazzjoni ta' bikarbonanat molari hija:

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

B'15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (midjum tal-EPA tal-Istati Uniti) u b'50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (midjum ta' OECD).

Kompożizzjoni tal-elementi tal-midjums tat-test

Element

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Preparazzjoni tal-midjum OECD

Nutrijent

Konċentrazzjoni fis-soluzzjoni ewlenija

Soluzzjoni ewlenija 1:

makro nutrijenti

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Soluzzjoni ewlenija 2:

ħadid

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Soluzzjoni ewlenija 3:

elementi tat-traċċi

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Soluzzjoni ewlenija 4:

bikarbonat

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Sterilizza s-soluzzjoni ewlenija b'filtrazzjoni tal-membrana (dijametru medju tal-pori ta' 0,2 μm) jew b'awtoklavazzjoni (120 °C, 15 min). Aħżen is-soluzzjonijiet fid-dlam f'4 °C.

Tagħmilx awtoklavazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin 2 u 4, iżda sterilizzahom b'filtrazzjoni tal-membrana.

Ipprepara midjum tat-tkabbir billi żżid volum xieraq tas-soluzzjonijiet elwenin 1-4 mal-ilma:

 

Żid 500 ml ilma sterelizzat:

 

10 ml soluzzjoni ewlenija 1

 

1 ml soluzzjoni ewlenija 2

 

1 ml soluzzjoni ewlenija 3

 

1 ml soluzzjoni ewlenija 4

 

Żid sakemm isiru 1 000 ml bl-ilma sterilizzat.

Ħalli biżżejjed ħin biex tekwilibrija l-midjum mas-CO2 atmosferiku, jekk ikun meħtieġ billi ddaħħal bżieżaq tal-arja sterili u ffiltrati għal xi sigħat.

Preparazzjoni tal-midjum EPA tal-Istat Uniti

1.

Żid 1 ml ta' kull soluzzjoni ewlenija f'2.1-2.7 għal madwar 900 ml ta' ilma dejonizzat jew distillat u mbagħad ħallat sa litru (1).

2.

Is-soluzzjonijiet ewlenin tal-makronutrijenti jiġu prodotti billi jinħallu dawn li ġejjin f'500 ml ta' ilma dejonizzat jew distillat. Ir-reaġenti 2.1, 2.2, 2.3, u 2.4 jistgħu jiġu kkombinati f'soluzzjoni ewlenija waħda.

2.1

NaNO3

12,750 g.

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2.4

Soluzzjoni Ewlenija tal-Mikronutrijenti (ara 3).

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6

K2HPO4

0,522 g.

2.7

NaHCO3

7,500 g.

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

Ara n-Nota 1

Nota 1: Uża għal speċijiet tat-test tad-dijatoma biss. Tista' tiżdied direttament (202,4 mg) jew permezz ta' soluzzjoni ewlenija biex tingħata konċentrazzjoni ta' 20 mg/l Si fil-midjum.

3.

Is-soluzzjoni ewlenija tal-mikronutrijenti tiġi prodotta billi jinħallu dawn li ġejjin f'500 ml ta' ilma dejonizzat jew distillat:

3.1

H3BO3

92,760 mg.

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3.3

ZnCl2

1,635 mg.

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3.5

CoCl2·6H2O

0,714 mg.

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg.

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg.

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [Disodium (Ethylenedinitrilo) tetraacetate].

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg Ara n-Nota 2.

Nota 2: Uża biss f'midjum għall-kulturi ewlenin tal-ispeċijiet ta' dijatomi.

4.

Aġġusta l-pH għal 7,5 ± 0,1 b'0,1 N jew 1,0 N NaOH jew HCl.

5.

Iffiltra l-midjums f'kontenitur sterili jew permezz ta' filtru tal-membrana ta' 0,22 μm jekk ser jintuża kontatur tal-partiċelli jew filtru ta' 0,45 μm jekk mhux ser jintuża kontatur tal-partiċelli.

6.

Aħżen il-midjum fid-dlam f'madwar 4 °C sakemm jintuża.

Appendiċi 4

Eżempju ta' proċedura għall-kulturi tal-algi

Osservazzjonijiet ġenerali

Il-fini tal-kulturi abbażi tal-proċedura li ġejja huwa li jinkisbu kulturi algali għat-testijiet tat-tossiċità.

Uża metodi xierqa biex tiżgura li l-kulturi algali mhumiex infettati b'batterji. Il-kulturi akseniċi jistgħu jkunu rakkomandabbli iżda għandhom jiġu stabbiliti u użati kulturi unialgali.

L-operazzjonijiet kollha għandhom jitwettqu f'kundizzjonijiet sterili sabiex tiġi evitata kontaminazzjoni b'batterji u algi oħra.

Tagħmir u materjali

Ara taħt il-metodu ta' ttestjar: Apparat.

Proċeduri għall-kisba ta' kulturi algali

Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tan-nutrijenti (midjums):

Il-melħ kollu tan-nutrijenti tal-midjum huwa ppreparat bħala soluzzjonijiet ewlenin ikkonċentrati u maħżuna fid-dlam u l-kesħa. Dawn is-soluzzjonijiet huma sterilizzati b'filtrazzjoni jew b'awtoklavazzjoni.

Il-midjum jitħejja billi jiżdied l-ammont xieraq tas-soluzzjoni ewlenija biex jiġi sterilizzat l-ilma distillat, filwaqt li tingħata attenzjoni li ma sseħħ ebda infezzjoni. Għal midjum solidu, jiżdied 0,8 fil-mija ta' agar.

Kultura ewlenija:

Il-kulturi ewlenin huma kulturi algali li huma ttrasferiti b'mod regolari lejn midjum ġdid biex jaġixxu bħala materjal tat-test inizjali. Jekk il-kulturi ma jintużawx b'mod regolari, dawn jitferrxu f'tubi agari mżerżqa. Dawn huma ttrasferiti lejn midjum ġdid tal-inqas darba kull xahrejn.

Il-kulturi ewlenin jitkabbru fi flasks konikali li fihom l-midjum xieraq (volum ta' madwar 100 ml). Meta l-algi jkunu inkubati f'20 °C b'illuminazzjoni kontinwa, huwa meħtieġ trasferiment kull ġimgħa.

Matul it-trasferiment, ammont ta' kultura ‘qadima’ huwa ttrasferit b'pipetti sterili fi flixkun ta' midjum ġdid, biex b'hekk bl-ispeċijiet li jikbru malajr, il-konċentrazzjoni inizjali hija madwar 100 darba iżgħar mill-kultura l-qadima.

Ir-rata ta' tkabbir ta' speċi tista' tiġi ddeterminata mill-kurva tat-tkabbir. Jekk dan ikun magħruf, huwa possibbli li tiġi stmata d-densità li biha għandha tiġi ttrasferita fil-midjum il-ġdid. Dan għandu jsir qabel ma l-kultura tilħaq il-fażi tal-mewt.

Prekultura:

Il-prekultura hija maħsuba biex tagħti ammont ta' algi xierqa għall-inokulazzjoni tal-kulturi tat-test. Il-prekultura hija inkubatur fil-kundizzjonijiet tat-test u użata meta tkun qiegħda tikber b'mod esponenzjali, normalment wara perjodu ta' inkubazzjoni ta' 2 sa 4 ijiem. Meta l-kulturi algali jkun fihom ċelloli deformati jew anormali, dawn għandhom jiġu skartati.

Appendiċi 5

Analiżi tad-dejta skont ir-rigressjoni nonlineari

Kunsiderazzjonijiet ġenerali

Ir-rispons f'testijiet algali u testijiet tat-tkabbir mikrobjali oħra — tkabbir tal-bijomassa — huwa min-natura tiegħu varjabbli kontinwu jew metriku — rata ta' proċess jekk tintuża rata ta' tkabbir u huwa integrali maż-żmien jekk tintgħażel il-bijomassa. It-tnejn huma referenzjati għar-rispons medju korrispondenti tal-kontrolli mhux esposti tar-repliki li juru rispons massimu għall-kundizzjonijiet imposti — b'dawl u temperatura bħala fatturi determinanti prinċipali tat-test algali. Is-sistema hija distribwita jew omoġenja u l-bijomassa tista' tidher bħala kontinwazzjoni mingħajr konsiderazzjoni taċ-ċelloli individwali. Id-distribuzzjoni tal-varjanza tat-tip ta' rispons għal tali sistema hija relatata unikament mal-fatturi sperimentali (ġeneralment deskritti mil-log-normali jew distribuzzjonijiet normali tal-iżball). Dan b'kuntrast għar-risponsi tal-bijomassa tipiċi b'dejta kwantali għal liema t-tolleranza (ġeneralment iddistribwita b'mod binomjali) tal-organiżmi individwali li ħafna drabi huma supponuti li huma komponent tal-varjanza dominanti. Hawnhekk ir-risponsi tal-kontroll huma żero jew fil-livell ta' sfond.

Fis-sitwazzjoni mhux ikkumplikata, ir-rispons normalizzat jew relattiv, r, jonqos monotonikament minn 1 (l-ebda inibizzjoni) sa 0 (inibizzjoni ta' 100 fil-mija). Wieħed għandu jinnota li r-risponsi kollha għandhom żball assoċjat magħhom u li l-inibizzjonijiet negattivi evidenti jistgħu jiġu kkalkolati bħala riżultat ta' żball każwali biss.

Analiżi ta' rigressjoni

Mudelli

Analiżi ta' regressjoni timmira li tiddeskrivi kwantitattivament il-kurva konċentrazzjoni-rispons fil-forma ta' funzjoni matematika regressjoni Y = f (C) jew aktar ta' spiss F(Z) fejn Z = log C. Użata inversament C = f– 1 (Y) tħalli l-kalkolu tal-figuri ECx li jinkludi l-EC50, EC10 u EC20, u l-95 % tagħhom ta' limiti ta' kunfidenza. Diversi forom matematiċi funzjonali sempliċi taw prova li jiddeskrivu b'suċċess ir-relazzjonijiet bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons miksuba fit-testijiet tal' inibizzjoni tat-tkabbir tal-alga. Il-funzjonijiet jinkludu eż. l-ekwazzjoni loġistika, l-ekwazzjoni asimettrika ta' Weibull u l-funzjoni tad-distribuzzjoni normali tal-log, li huma kollha kurvi ta' sigmoid li asimptotikalment joqorbu lejn iż-żero għal C → 0 u waħda għall-infinit ta' C →.

L-użu tal-mudelli tal-funzjoni tal-livell limitu kontinwu (eż. il-mudell ta' Kooijman ‘għall-inibizzjoni tat-tkabbir tal-popolazzjoni’ Kooijman et al. 1996) ġie propost dan l-aħħar jew alternattiv għall-mudelli asintotiċi. Dan il-mudell jassumi xejn effetti f'konċentrazzjonijiet taħt ċertu livell, EC0+, li huwa stmat permezz ta' estrapolazzjoni tar-relazzjoni rispons-konċentrazzjoni biex tinterċetta l-bażi ta' konċentrazzjoni permezz tal-użu ta' funzjoni kontinwa li ma hijiex differenzjabbli fil-punt tat-tluq.

Kun af li l-analiżi tista' tkun sempliċi minimizzazzjoni tas-somom tal-kwadri residwi (jekk tiġi supponuta varjanza kostanti) jew kwadri ppeżati jekk l-eteroġenità tal-varjanza tiġi kkumpensata.

Proċedura

Il-proċedura tista' tiġi deskritta kif ġej: Agħżel ekwazjoni funzjonali xierqa, Y = f(C), u adattaha għad-dejta permezz ta' rigressjoni nonlineari. Idealment għandek tuża l-kejliet minn kull flask individwali iktar milli l-medji tar-repliki, sabiex testratta kemm jista' jkun informazzjoni mid-dejta. Jekk il-varjanza tkun għolja, min-naħa l-oħra, l-esperjenza prattika tissuġġerixxi li l-medji tar-repliki jistgħu jipprovdu stima matematika iktar robusta li hija inqas influwenzata minn żbalji sistematiċi fid-dejta, milli b'kull punt ta' dejta individwali miżmum.

Ipplottja l-kurva mdaħħla u d-dejta mkejla u eżamina jekk il-kurva mdaħħla hijiex xierqa. Analiżi tar-residwi tista' tkun għodda partikolarment utli għal dan il-għan. Jekk ir-relazzjoni funzjonali magħżula biex jiddaħħal ir-rispons tal-konċentrazzjoni ma tiddeskrivix sew il-kurva kollha jew xi parti essenzjali tagħha, bħar-rispons f'konċentrazzjonijiet baxxi, agħżel opzjoni ta' dħul tal-kurva oħra — eż. kurva mhux asimettrika bħall-funzjoni ta' Weibul minflok waħda simettrika. L-inibizzjonijiet negattivi jistgħu jkunu problema, pereżempju bil-funzjoni tad-distribuzzjoni normali tal-log li bl-istess mod titlob funzjoni tar-rigressjoni alternattiva. Mhuwiex rakkomandat li tassenja valur żero jew pożittiv żgħir għal tali valuri negattivi peress li dan ifixkel id-distribuzzjoni tal-iżball. Jista' jkun adegwat li jsir dħul ta' kurvi separati fuq partijiet tal-kurva bħall-parti ta' inibizzjoni baxxa sabiex jiġu stmati figuri EClowx. Ikkalkula mill-ekwazjoni mdaħħla (permezz ta' ‘estimazzjoni inversa’, C = f– 1(Y)), stimi karatteristiċi ta' punt ECx's,u rraporta bħala minimu l-EC50 u wieħed jew żewġ stimi EClow x. L-esperjenza mill-ittestjar prattiku wriet li l-preċiżjoni tat-test algali normalment tippermetti stima raġonevolment preċiża fil-livell tal-inibizzjoni ta' 10 % jekk il-punti ta' dejta jkunu suffiċjenti — sakemm ikun hemm stimulazzjoni f'konċentrazzjonijiet baxxa bħala fattur ta' konfużjoni. Il-preċiżjoni ta' stima EC20 hija ta' spiss konsiderevolment aħjar minn dik ta' EC10, għaliex l-EC20 huwa ġeneralment ippożizzjonat fuq il-parti bejn wieħed u ieħor lineari tal-kurva ċentrali konċentrazzjoni rispons. Xi drabi huwa diffiċli li ssir interpretazzjoni ta' EC10 minħabba stimulazzjoni ta' tkabbir. Għalhekk, filwaqt li l-EC10 hija normalment miksuba b'akkurezza suffiċjenti, huwa wkoll rakkomandat li tirraporta dejjem l-EC20.

Fatturi ta' ppeżar

Il-varjanza sperimentali, ġeneralment mhijiex konsistenti u ġeneralment tinkludi komponenti proporzjonali, u għalhekk normalment titwettaq rigressjoni ppeżata b'mod vantaġġjuż. Il-fatturi ta' ppeżar għal tali analiżi, normalment huma preżunti bħala proporzjonalment inversi għall-varjanza:

Wi = 1/Var(ri)

Ħafna programmi ta' rigressjoni jippermettu l-opzjoni ta' analiżi ta' rigressjoni ppeżata b'fatturi ta' ponderazzjoni elenkati f'tabella. B'mod konvenjenti l-fatturi ta' ppeżar għandhom jiġu normalizzati billi dawn jiġu mmoltiplikati b'n/Σ wi (n huwa n-numru ta' punti ta' dejta) biex b'hekk it-total tagħhom ikun wieħed.

Risponsi normalizzanti

In-normalizzazzjoni permezz tar-rispons ta' kontroll medju twassal għal xi problemi ewlenin u tagħti lok għal struttura ta' varjanza pjuttost ikkumplikata. Meta wieħed jaqsam ir-risponsi bir-rispons ta' kontroll medju għall-kisba tal-perċentwal ta' inibizzjoni, jintroduċi żball addizzjonali kkawżat mill-iżball fil-medja tal-kontroll. Sakemm dan l-iżball ma jkunx negliġibbilment żgħir, il-fatturi ta' ppeżar fil-limiti ta' rigressjoni u kunfidenza għandhom jiġu korretti għall-kovarjanza mal-kontroll (Draper u Smith, 1981). Kun af li l-preċiżjoni għolja fuq ir-rispons ta' kontroll medju stmat huwa importanti sabiex titnaqqas il-varjanza globali għar-rispons relattiv. Din il-varjanza hija kif ġej:

(Is-sottoskritt i jirreferi għal-livell ta' konċentrazzjoni u s-sottoskritt 0 għall-kontrolli)

Yi = Rispons relattiv = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

bil-varjanza Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ri)2 · Var(ri) + ((∂Yi/ ∂r0)2 · Var(r0)

u għax (∂Yi/ ∂ri) = 1/r0 u (∂Y i/ ∂r0) = ri/r0 2

b'dejta normalment distribwita u mi u m0 repliki: Var(ri ) = σ2/mi

il-varjanza totali tar-rispons relattiva, Yi għalhekk issir:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 ·mi) + ri 2 · σ2/r0 4 ·m0

L-iżball fil-medja tal-kontroll huwa proporzjonat b'mod invers għall-għerq kwadrat tan-numru tar-repliki tal-kontroll bħala medja, u xi drabi jista' jkun iġġustifikat biex jinkludi dejta storika u b'dan il-mod inaqqas bil-qawwi l-iżball. Proċedura alternattiva mhijiex dik li tiġi nnormalizzata d-dejta u jitqiegħdu risponsi assoluti inkluża d-dejta tar-rispons ta' kontroll iżda li jiġi introdott valur tar-rispons ta' kontroll bħala parametru addizzjonali li għandu jiddaħħal b'rigressjoni nonlineari. B'ekwazzjoni tar-rigressjoni b'2 parametri tas-soltu, dan il-metodu jeħtieġ li jiddaħħlu 3 parametri u, għalhekk, jirrekjedi iktar punti ta' dejta minn rigressjoni nonlineari fuq id-dejta li hi normalizzata permezz ta' rispons predeterminat ta' kontroll.

Intervalli ta' kunfidenza inversi

Il-kalkolu tal-intervalli ta' kunfidenza tar-rigressjoni mhux lineari minn stima inversa huwa pjuttost kumpless u mhux opzjoni standard disponibbi f'pakketti ta' programmi statistiċi tal-kompjuter ordinarji. Limiti ta' kunfidenza approssimattivi jistgħu jiġu miksuba ma' programmi standard ta' regressjoni non-lineari ma' riparametrizzazzjoni (Bruce u Versteeg, 1992), li jinvolvu l-kitba mill-ġdid tal-ekwazjoni matematika bil-punti ta' stima mixtieqa, eż. l-EC10 u l-EC50 bħala parametri li għandhom jiġu stmati. (Ħalli l-funzjoni tkun I = f (α, β, Konċentrazzjoni) u uża r-relazzjonijiet tad-definizzjoni f (α, β, EC10) = 0,1 u f (α, β, EC50 ) = 0,5 għas-sostitut f (α, β, konċentrazzjoni ) b'funzjoni ekwivalenti g( EC10, EC50, konċentrazzjoni).

Kalkulazzjoni aktar diretta (Andersen et al, 1998) hija magħmula permezz taż-żamma tal-ekwazjoni oriġinali u l-użu ta' espansjoni ta' Taylor madwar il-medji ta' ri u r0.

Dan l-aħħar il-‘metodi boot strap’ saru popolari. Tali metodi jużaw id-dejta mkejla u kampjunar mill-ġdid frekwenti mmexxi minn ġeneratur tan-numri każwali biex tiġi stmata d-distribuzzjoni tal-varjanza empirika.

REFERENZI

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R..D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

(4)

Il-Kapitolu C.11 huwa sostitwit ma' dan li ġej:

C.11.   ĦAMA ATTIVATA, TEST TAL-INIBIZZJONI RESPIRATORJA (KARBONJU U OSSIDAZZJONI TAL-AMMONIJAKA)

INTRODUZZJONI

1.

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 209 tal-OECD (2010) Dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi metodu biex jiddetermina l-effetti ta' sustanza kimika fuq il-mikro-organiżmi minn ħama attivata (fil-biċċa l-kbira batterji) billi titkejjel ir-rata ta' respirazzjoni tagħhom (karbonju u/jew ossidazzjoni tal-ammonju) f'kundizzjonijiet iddefiniti fil-preżenza ta' konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza kimika tat-test. Il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq it-test ETAD (1) (2) (Assoċjazzjoni Ekoloġika u Tossikoloġika tal-industrija tal-Manifattura tas-Sustanżi taż-Żebgħa), fuq l-OECD TG 209 preċedenti (3) u fuq l-Istandard ISO rivedut 8192 (4). L-iskop tat-test huwa li jipprovdi metodu ta' skrinjar rapidu biex jivvaluta l-effetti tas-sustanzi kimiċi fuq il-mikro-organiżmi tal-ħama attivata tal-istadju (aerobiku) bijoloġiku tal-impjanti tat-trattament tal-ilma mormi. Ir-riżultati tat-test jistgħu jservu wkoll bħala indikatur ta' konċentrazzjonijiet mhux inibitorji xierqa tas-sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jintużaw fit-testijiet tal-bijodegradabilità (perżempju Kapitoli C.4 A-F, C.9, C.10, C12 u C.29 ta' dan l-Anness, OECD TG302C). F'dan il-każ, it-test jista' jitwettaq bħala test tal-iskrinjar, b'mod simili għas-sejba tal-medda jew it-test tal-limitu (ara l-paragrafu 39), li jikkunsidra r-respirazzjoni globali biss. Madankollu, din l-informazzjoni għandha titqies b'attenzjoni għal testijiet tal-bijodegradabbiltà lesti (Kapitolu C.4 A-F u C.29 ta' dan l-Anness) għal liema l-konċentrazzjoni tal-inokulu hija sinifikament inqas minn dik użata f'dan il-metodu ta' ttestjar. Fil-fatt, nuqqas ta' inibizzjoni f'dan it-test tar-respirazzjoni mhux bilfors jirriżulta f'kudizzjonijiet mhux inibitorji fit-test tal-bijodegradabilità faċli tal-Kapitoli C.4 A-F jew C.29 ta' dan l-Anness.

2.

B'mod ġenerali, l-inibizzjoni tar-respirazzjoni tidher li ġiet applikata b'suċċess minn mindu ġiet applikata l-ewwel, iżda f'xi okkażjonijiet ġew irrapportati riżultati foloz, eż. (2) (4) (5). Kurvi ta' respirazzjoni relatati mal-konċentrazzjoni xi drabi jkunu maqsumin f'żewġ fażijiet, il-plotts ta' doża-rispons tgħawġu u l-valuri EC50 kienu baxxi b'mod mhux mistenni (5). L-investigazzjonijiet urew li tali riżultati jinkisbu meta l-ħama attivata użata fit-test tinnitrifika b'mod sinifikanti u s-sustanza kimika tat-test għandha effett ikbar fuq l-ossidazzjoni tal-ammonju milli fuq l-ossidazzjoni eterotrofika ġenerali. Għalhekk, dawn ir-riżultati foloz jistgħu jingħelbu billi jsir ittestjar addizzjonali permezz ta' inibitur speċifiku tan-nitrifikazzjoni. Bil-kejl tar-rati ta' teħid tal-ossiġenu fil-preżenza u n-nuqqas ta' tali inibitur, eż. N-alliltjourea (ATU), jistgħu jiġu kkalkolati r-rati ta' teħid tal-ossiġenu eterotrofiku u ta' nitrifikazzjoni separat totali (4) (7) (8). Għalhekk, l-effetti inibitorji ta' sustanza kimika tat-test fuq iż-żewġ proċessi jistgħu jiġu ddeterminati u l-valuri EC50 kemm għall-ossidazzjoni tal-karbonju organiku (eterotrofika) kif ukoll l-ossidazzjoni tal-ammonijaka (nitrifikazzjoni) jistgħu jiġu kkalkolati bħas-soltu. Ta' min jinnota li f'xi każijiet rari, l-effett inibitorju ta' N-alliltjourea jista' jitħassar parzjalment jew kompletament bħala riżultat tal-kumplessazzjoni mas-sustanzi kimiċi tat-test jew is-supplimenti tal-midjum, eż. joni Cu++ (6). Il-joni Cu++ huma essenzjali għal Nitrosomonas, iżda huma tossiċi f'konċentrazzjoni ogħla.

3.

Il-ħtieġa għal nitrifikazzjoni fit-trattament ajrobiku tal-ilmijiet mormija, bħala pass meħtieġ fil-proċess ta' tneħħija tal-komposti tan-nitroġenu mill-ilmijiet mormija b'denitrifikazzjoni għall-prodotti gassużi, saret urġenti b'mod partikolari fil-pajjiżi Ewropej; l-UE issa stabbilixxiet limiti iktar baxxi għall-konċentrazzjoni ta' nitroġenu fl-effluwenti trattati skarikati fl-ilmijiet riċeventi. (5).

4.

Għall-biċċa l-kbira tal-każijiet, il-metodu biex jiġi vvalutat l-effett fuq il-proċessi ta' ossidazzjoni tal-karbonju organiku waħdu huwa biżżejjed. Madankollu, f'xi każijiet tkun meħtieġa eżaminazzjoni tal-effett fuq in-nitrifikazzjoni waħedha, jew kemm fuq in-nitrifikazzjoni kif ukoll fuq l-ossidazzjoni tal-karbonju organiku b'mod separat, għall-interpretazzjoni tar-riżultati u l-fehim tal-effetti.

PRINCIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR

5.

Ir-rati ta' respirazzjoni tal-kampjuni ta' ħama attivata mogħtija drenaġġ sintetiku jitkejlu f'ċellola magħluqa li fiha elettrodu tal-ossiġenu wara ħin ta' kuntatt ta' 3 sigħat. B'kunsiderazzjoni tax-xenarju ta' espożizzjoni realistiku, jaf ikunu xierqa żminijiet ta' kuntatt itwal. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi degradata malajr, eż. b'mod abjotiku permezz ta' idrolisi, jew hija volatili u l-konċentrazzjoni ma tistax tinżamm b'mod adegwat, jista' jintuża perjodu ta' espożizzjoni addizzjonali iqsar ta' eż. 30 minuta. Is-sensittività ta' kull lott ta' ħama attivata għandha tiġi vverifikata b'sustanza kimika ta' referenza xierqa fil-jum tal-espożizzjoni. It-test ġeneralment jintuża biex jiddetermina l-ECx (eż. EC50) tas-sustanza kimika tat-test u/jew il-konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC).

6.

L-inibizzjoni tat-teħid tal-ossiġenu minn mikro-organiżmi li jossidaw il-karbonju organiku tista' tkun espressa b'mod separat minn dik minn mikro-organiżmi li jossidaw l-ammonju permezz tal-kejl tar-rati ta' teħid ta' ossiġenu fin-nuqqas u l-preżenza ta' N-alliltjourea, inibitur speċifiku tal-ossidazzjoni tal-ammonju għan-nitrit mill-batterji nitrifikanti tal-ewwel stadju. F'dan il-każ, il-perċentwal ta' inibizzjoni tar-rata ta' teħid ta' ossiġenu huwa kkalkolat bi tqabbil tar-rata ta' teħid ta' ossiġenu fil-preżenza ta' sustanza kimika tat-test bir-rata ta' teħid tal-ossiġenu medja tal-kontrolli korrispondenti li ma fihom ebda sustanza kimika tat-test, kemm fil-preżenza kif ukoll fin-nuqqas tal-inibitur speċifiku, N-alliltjourea.

7.

Kwalunkwe teħid ta' ossiġenu li jirriżulta minn proċessi abijotiċi jista' jiġi skopert billi tiġi ddeterminata r-rata fit-taħlitiet tas-sustanza kimika tat-test, il-midjum tad-drenaġġ sintetiku u l-ilma, filwaqt li titħalla barra l-ħama attivata.

INFORMAZZJONI TAS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST

8.

L-identifikazzjoni (idealment in-numru CAS), l-isem (IUPAC), il-purita, is-solubbiltà fl-ilma, il-pressjoni tal-fwar, il-volatilità u l-karatteristiċi tal-adsorbiment tas-sustanza kimika tat-test għandhom ikunu magħrufa biex issir l-interpretazzjoni korretta tar-riżultati. Normalment, is-sustanzi kimiki volatili ma jistgħux jiġu ttestjati b'mod adegwat sakemm ma jittiħdux prekawzzjonijiet speċjali (ara l-paragrafu 21).

APPLIKABBILTÀ TAL-METODU TA' TTESTJAR

9.

Il-metodu ta' ttestjar jista' jiġi applikat għal sustanzi kimiċi li jinħallu fl-ilma, li ma tantx jinħallu u sustanzi kimiċi volatili. Madankollu, mhux dejjem jaf ikun possibbli li jinkisbu valuri EC50 b'sustanzi kimiċi ta' solubbiltà limitata u riżultati validi b'sustanzi kimiċi volatili jistgħu jinkisbu biss sakemm il-biċċa l-kbira (xi > 80 %) tas-sustanza kimika tat-test tibqa' fit-taħlita tar-reazzjoni fi tmiem il-perjodu/perjodi ta' espożizzjoni. Għandha tiġi sottomessa dejta ta' appoġġ analitika addizzjonali biex tiġi rfinata l-konċentrazzjoni ECx meta jkun hemm xi inċertezza dwar l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test jew il-volatilità tagħha.

SUSTANZI KIMIĊI TA' REFERENZA

10.

Is-sustanzi kimiċi ta' referenza għandhom jiġu ttestjati perjodikament sabiex jiġi żgurat li l-metodu ta' ttestjar u l-kundizzjonijiet tat-test huma affidabbli, u biex tiġi ċċekkjata s-sensittività ta' kull lott ta' ħama attivata użata bħala inokulu mikrobjali dakinhar tal-espożizzjoni. Is-sustanza kimika 3,5-diklorofenol (3,5-DCP) hija rakkomandata bħala s-sustanza kimika inibitorja ta' referenza, peress li hija inibitur magħruf tar-respirazzjoni u tintuża f'diversi tipi ta' test għal inibizzjoni/tossiċità (4). Jista' jintuża wkoll sulfat tar-ram (II) pentaidrat bħala sustanza kimika ta' referenza għall-inibizzjoni tar-respirazzjoni totali (9). N-metilanilina tista' tintuża bħala inibitur ta' nitrifikazzjoni ta' referenza speċifiku (4).

KRITERJI TA' VALIDITÀ U RIPRODUĊIBBILTÀ

11.

Ir-rata ta' teħid tal-ossiġenu b'kontrolli inbjank (mingħajr is-sustanza kimika tat-test jew is-sustanza kimika ta' referenza) ma għandhiex tkun inqas minn 20 mg ossiġenu għal kull gramma ħama attivata (piż xott ta' solidi sospiżi) f'siegħa. Jekk ir-rata hija inqas, it-test għandu jiġi ripetut b'ħama attivata maħsula jew mill-ħama minn sors ieħor. Il-koeffiċjent ta' varjazzjoni tar-rata ta' teħid tal-ossiġenu fir-repliki ta' kontroll ma għandux ikun iktar ta' 30 % fi tmiem it-test finali.

12.

F'ring test internazzjonali tal-2004 organizzat mill-ISO (4) permezz ta' ħama attivata derivata minn drenaġġ domestiku, instab li l-EC50 ta' 3,5-DCP hija fil-medda ta' 2 mg/l sa 25 mg/l għar-respirazzjoni totali, 5 mg/l sa 40 mg/l għal respirazzjoni eterotropika u 0,1 mg/l sa 10 mg/l għal respirazzjoni ta' nitrifikazzjoni. Jekk l-EC50 ta' 3,5-DCP ma taqax fil-medda mistennija, it-test għandu jiġi ripetut b'ħama attivata minn sors ieħor. L-EC50 ta' sulfat tar-ram (II) pentaidrat għandha taqa' fil-medda ta' 53-155 mg/l għar-respirazzjoni totali (9).

DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR

Reċipjenti u apparat tal-ittestjar

13.

Għandu jintuża t-tagħmir tal-laboratorju tas-soltu u dawn li ġejjin:

(a)

Reċipjenti tat-test — pereżempju, bekkijiet ta' 1 000 ml biex ikun fihom 500 ml taħlita ta' reazzjoni (ara 5 f'Fig.1);

(b)

Ċelloli u aċċessorji għall-kejl ta' konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt; elettrodu tal-ossiġenu xieraq; ċellola magħluqa biex tinkludi l-kampjun mingħajr ebda spazju vojt fuqani u reġistratur (eż. 7, 8, 9 f'Fig.1 tal-Appendiċi 2); inkella, jista' jintuża flixkun BOD bi sleeve adaptor xieraq għall-issiġillar tal-elettrodu tal-ossiġenu mal-għonq tal-flixkun (ara Fig. 2 tal-Appendiċi 3). Biex jiġi evitat it-telf ta' likwidu spostat mal-inserzjoni tal-elettrodu tal-ossiġenu, huwa rakkomandat li l-ewwel jiddaħħal lembut jew tubu tal-ħġieġ mis-sleeve, jew li jintużaw reċipjenti b'rimmijiet flared-out. Fiż-żewġ każijiet għandu jintuża ħawwad manjetiku jew metodu ta' tħawwid alternattiv, eż. sonda awtomatika ta' taħwid;

(c)

Ħawwada manjetiċi u segwituri, mgħottijin b'materjali inerti, għall-użu f'kompartiment tal-kejl u/jew fir-reċipjenti tat-test;

(d)

Apparat ta' arjazzjoni: jekk ikun meħtieġ, għandha tingħadda arja kumpressa permezz ta' filtru xieraq biex jitneħħa t-trab u ż-żejt u permezz ta' fliexken tal-ħasil li fihom l-ilma biex tiġi umidifikata l-arja. Il-kontenuti tar-reċipjenti għandhom jiġu arjati b'pipetti tal-Pasteur, jew apparat ta' arjazzjoni ieħor, li ma jassorbix sustanzi kimiċi. Ħawwad orbitali mħaddem f'veloċitajiet orbitanti bejn 150 u 250 rpm bi flasks pereżempju, b'kapaċità ta' 2 000 ml, jistgħu jintużaw biex jissodisfaw id-domanda ta' ossiġenu għall-ħama u jingħelbu d-diffikultajiet bis-sustanzi kimiċi li jipproduċu ragħwa eċċessiva, huma volatili u għalhekk jintilfu, jew huma diffiċli biex tferrixhom meta jiġu arjati bi sparging tal-arja. Is-sistema tat-test hija ġeneralment ta' bekkijiet arjati kontinwament u sekwenzjalment stabbiliti (eż. f'intervalli ta' madwar 10 — 15-il minuta), imbagħad analizzati b'mod sekwenzali. Tista' tintuża wkoll strumentazzjoni vvalidata li tippermetti l-arjazzjoni simultanja u l-kejl tar-rata ta' konsum tal-ossiġenu fit-taħlitiet;

(e)

miter tal-pH;

(f)

Iċċentrifuga, ċentrifuga ġenerali ta' fuq il-bank għal ħama b'kapaċità ta' 10 000 m/s2.

Reaġenti

14.

Għandhom jintużaw biss reaġenti bi grad analitiku l-ħin kollu.

Ilma

15.

Għandu jintuża ilma distillat jew dejonizzat, li fih inqas minn 1 mg/l DOC, ħlief meta jkun speċifikat ilma tal-vit mingħajr klorin.

Għalf minn drenaġġ sintetiku

16.

Il-midjum għandu jitħejja biex ikun fih il-kostitwenti li ġejjin fl-ammonti ddikjarati:

pepton

16 g

estratt tal-laħam (jew estratt tal-ħxejjex paragunabbli)

11 g

urea

3 g

klorur tas-sodju (NaCl)

0,7 g

diidrat tal-klorur tal-kalċju (CaC12, 2H2O)

0,4 g

eptaidrat tas-sulfat tal-magneżju, (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

anhydrous potassium monohydrogen phosphate (K2HPO4)

2,8g

ilma distillat jew dejonizzat sa litru

 

17.

Il-pH ta' din is-soluzzjoni għandu jkun ta' 7,5 ± 0,5. Jekk il-midjum imħejji ma jintużax mill-ewwel, dan għandu jinħażen fid-dlam f'0 °C sa 4 °C, għal mhux iktar minn ġimgħa jew f'kundizzjonijiet, li ma jibdlux il-kompożizzjoni tiegħu. Ta' min jinnota li dan id-drenaġġ sintetiku huwa konċentrat ta' 100 darba ta' dak deskritt fir-Rapport Tekniku tal-OECD ‘Metodu propost għad-determinazzjoni tal-bijodegradabbiltà tas-surfetanti użati fid-deterġenti sintentiċi’11 ta' Ġunju 1976, b'żieda ta' fosfat tal-idroġenu tad-dipotassju wkoll.

18.

Inkella, il-komponenti tal-midjum jistgħu jiġi sterilizzati individwalment qabel il-ħżin, jew il-pepton u l-estratt tal-laħam jistgħu jiżdiedu ftit qabel ma jsir it-test. Qabel l-użu, il-midjum għandu jitħallat sew u l-pH aġġustat jekk ikun meħtieġ għal pH 7,5 ± 0,5.

Sustanza kimika tat-test

19.

Għandha tiġi ppreparata soluzzjoni ewlenija għal sustanzi tat-test li jinħallu fl-ilma mill-ewwel sas-solubbiltà massima tal-ilma biss (preċipitazzjonijiet mhumiex aċċettabbli). Sustanzi li ma tantx jinħallu fl-ilma, it-taħlitiet b'komponenti ta' solubbiltà fl-ilma differenti u s-sustanzi adsorbivi għandhom jiġu pponderati direttament fir-reċipjenti tat-test. F'dawn il-każijiet, l-użu ta' soluzzjonijiet ewlenin jaf ikun alternattiva jekk il-konċentrazzjonijiet maħlula tas-sustanzi kimiċi tat-test huma analitikament determinati fir-reċipjenti tat-test (qabel tiżdied ħama attivata). Jekk jiġu ppreparati frazzjonijiet akkomodati bl-ilma (WAFs), hija essenzjali wkoll determinazzjoni analitika tal-konċentrazzjonijiet maħlula tas-sustanzi kimiċi tat-test fir-reċipjenti tat-test. Għandu jiġi evitat l-użu ta' solventi organiċi, aġenti dispersivi/emulsifikanti biex tittejjeb is-solubbiltà. Ultrasonikazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u sospensjonijiet ta' qabel it-taħlit, eż. ta' matul il-lejl, huwa possibbli meta jkun hemm informazzjoni adegwata disponibbli dwar l-istabbilità tas-sustanza kimika tat-test f'tali kundizzjonijiet.

20.

Is-sustanza kimika tat-test tista' taffettwa ħażin il-pH fi ħdan is-sistema tal-ittestjar. Il-pH tat-taħlitiet ittrattati bis-sustanza kimika tat-test għandu jiġi ddeterminat qabel il-konfigurazzjoni tat-test, fi prova preliminari, biex jiġi aċċertat jekk ikunx meħtieġ aġġustament tal-pH qabel it-test ewlieni u anki dakinhar tat-test ewlieni. Soluzzjonijiet/sospensjonijiet tas-sustanza kimika tat-test fl-ilma għandhom jiġu newtralizzati qabel iż-żieda tal-inokulu, jekk ikun meħtieġ. Madankollu, peress li n-newtralizzazzjoni tista' tibdel il-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza kimika, jista' jsir iktar ittestjar, skont il-finijiet tal-istudju, biex jiġi vvalutat l-effett tas-sustanza kimika tat-test fuq il-ħama mingħajr l-aġġustament tal-pH.

21.

L-effetti tossiċi tas-sustanzi kimiċi volatili, speċjalment fit-testijiet li fihom l-arja tgħaddi effervexxentement mis-sistema, jistgħu jirriżultaw f'livelli ta' effett varjabbli minħabba t-telf tas-sustanza matul il-perjodu ta' espożizzjoni. Għandha tiġi eżerċitata kawtela b'tali sustanzi billi ssir analiżi speċifika għas-sustanza tat-taħlitiet ta' kontroll li fihom is-sustanza u jiġi mmodifikat ir-reġim ta' arjazzjoni.

Sustanza kimika ta' referenza

22.

Jekk 3,5-diklorofenol jintuża bħala sustanza kimika ta' referenza, għandha tiġi ppreparata soluzzjoni ta' 1,00 g ta' 3,5-diklorofenol f'1 000 ml ilma (15). Għandu jintuża ilma sħun u/jew ultrasonifikazzjoni biex jiġi aċċellerat ix-xoljiment u biex is-soluzzjoni tilħaq il-volum meta titkessaħ għat-temperatura tal-kamra. Madankollu, għandu jiġi żgurat li s-sustanza kimika ta' referenza ma tinbidilx strutturalment. Il-pH tas-soluzzjoni għandu jiġi ċċekkjat u aġġustat, jekk ikun meħtieġ, b'NaOH jew H2SO4 sa pH 7 — 8.

23.

Jekk jintuża sulfat tar-ram(II)pentaidrat bħala sustanza kimika ta' referenza, jintużaw konċentrazzjonijiet ta' 58 mg/l, 100 mg/l u 180 mg/l (fattur ta' 1,8). Is-sustanza tiġi ponderata dirrettament fir-reċipjenti tat-test (29 — 50 — 90 mg għal volum totali ta' 500 ml). Imbagħad tinħall b'234 ml ta' ilma tal-vit awtoklavat. Is-sulfat tar-ram(II)pentaidrat jinħall faċilment. Meta jinbeda t-test, jiżdiedu 16-il ml drenaġġ sintetiku u 250 ml ħama miżjuda.

Inibitur speċifiku tan-nitrifikazzjoni

24.

Għandha tiġi ppreparata soluzzjoni ewlenija ta' 2,32 g/l N-alliltjourea (ATU). Iż-żieda ta' 2,5 ml ta' din is-soluzzjoni ewlenija ma' taħlita ta' inkubazzjoni ta' volum finali ta' riżultati ta' 500 ml f'konċentrazzjoni finali ta' 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l) li hija magħrufa bħala suffiċjenti (4) biex tikkawża inibizzjoni ta' 100 % f'ħama attivata nitrifikanti li fiha 1,5 g/l solidi sospiżi.

Kontroll abjotiku

25.

F'ċerti kundizzjonijiet rari, sustanza kimika tat-test bi proprjetajiet riduċenti qawwija jistgħu jikkawżaw konsum ta' ossiġenu abjotiku li jista' jitkejjel. F'tali każijiet, huma meħtieġa kontrolli abjotiċi biex issir diskriminazzjoni bejn it-teħid ta' ossiġenu abjotiku mis-sustanza kimika tat-test u r-respirazzjoni mikrobjali. Jistgħu jiġu ppreparati kontrolli abjotiċi billi l-inokulu jitħalla barra mit-taħlitiet tat-test. B'mod simili, kontrolli abjotiċi mingħajr inokulu jistgħu jiġu inklużi meta jitwettqu miżuri analitiċi biex tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni milħuqa matul il-fażi ta' espożizzjoni tal-ittestjar, eż. meta jintużaw soluzzjonijiet ewlenin ta' sustanzi kimiċi li ma tantx jinħallu fl-ilma b'komponenti b'solubbiltà fl-ilma differenti. F'każijiet speċifiċi, jaf ikun meħtieġ li jitħejja kontroll abjotiku b'inokulu sterilizzat (eż. bl-awtoklavazzjoni jew iż-żieda ta' tossikanti sterilizzati). Xi sustanzi kimiċi jafu jipproduċu jew jikkunsmaw ossiġenu biss jekk l-erja tal-wiċċ hija kbira biżżejjed għal reazzjoni, anki jekk normalment iridu temperatura jew pressjoni ferm ogħla biex jagħmlu hekk. F'dan ir-rigward, għandha tingħata attenzjoni speċjali lis-sustanzi perossidiċi. Inokulu sterilizzat jipprovdi erja tal-wiċċ kbira.

Inokulu

26.

Għal użu ġenerali, għandha tinġabar ħama attivata mill-ħruġ tat-tank ta' arjazzjoni, jew qrib il-ħruġ mit-tank, ta' impjant ta' trattament tal-ilma mormi operat sew li jirċievi fil-biċċa l-kbira drenaġġ domestiku. Skont il-fini tat-test, tipi jew sorsi oħra adegwata ta' ħama attivata, eż. ħama mkabbra fil-laboratorju, tista' tintuża f'konċentrazzjonijiet ta' solidi sospiżi xierqa ta' 2 g/l sa 4 g/l. Madankollu, il-ħama minn impjanti ta' trattament differenti x'aktarx li tesebixxi karatteristiċi u sensittivitajiet differenti.

27.

Il-ħama tista' tintuża kif miġbura iżda l-frak oħxon għandu jitneħħa billi jitħalla joqgħod għal perjodu qasir, eż. 5 sa 15-il minuta, u bid-dekantazzjoni tas-saff ta' fuq ta' solidi rqaq jew billi jingħadda minn passatur (eż. malja ta' 1 mm2). Inkella, il-ħama tista' tiġi omoġenizzata f'mikser għal madwar 15-il sekonda jew iktar, iżda hija meħtieġa kawtela fir-rigward tal-forzi laterali u l-bidla fit-temperatura li tista' sseħħ għal perjodi twal ta' taħlit.

28.

Ħafna drabi huwa meħtieġ il-ħasil tal-ħamrija, eż. jekk ir-rata ta' respirazzjoni endoġena tkun baxxa. Il-ħama għandha l-ewwel tiġi ċentrifugata għal perjodu biex jiġi prodott supernatant u gerbub ta' solidi tad-drenaġġ, eż. 10 minuti f'madwar 10 000 m/s2. Il-likwidu supernatanti għandu jintrema' u l-ħama għandha tiġi sospiża mill-ġdid f'ilma tal-vit mingħajr kloru, billi titħawwad, u l-ilma tal-ħasil imbagħad għandu jitneħħa b'ċentrifugazzjoni mill-ġdid u billi jerġa' jitneħħa. Il-proċess tal-ħasil u ċ-ċentrifugazzjoni għandu jiġi ripetut, jekk ikun meħtieġ. Il-massa xotta ta' volum magħruf ta' ħama sospiża mill-ġdid għandha tiġi ddeterminata u l-ħama tiġi kkonċentrata billi jitneħħa l-likur jew tiġi dilwita iktar f'ilma tal-vit mingħajr kloru biex jinkisbu l-konċentrazzjonijiet ta' solidi tal-ħama meħtieġa ta' 3 g/l. Il-ħama attivata għandha tiġi arjata kontinwament (eż. 2 l/minuta) fit-temperatura tal-ittestjar u, fejn ikun possibbli tintuża fil-jum tal-ġbir. Jekk dan ma jkunx possibbli, il-ħama kuljum għandha tingħata drenaġġ sintetiku (50 ml ħama attivata mdaħħla/l ta' drenaġġ sintetiku) għal jumejn oħra. Imbagħad il-ħama tintuża għat-test u r-riżultati jiġu aċċettati bħala validi, sakemm ma tkun seħħet ebda bidla sinifikanti fl-attività tagħha, ivvalutata mir-rata ta' respirazzjoni eterotropika u ta' nitrifikazzjoni endoġena.

29.

Jistgħu jinqalgħu diffikultajiet jekk ikun hemm ragħwa matul l-inkubazzjoni sal-punt li r-ragħwa u s-solidi tal-ħama li jinġarru magħha, jinħarġu mir-reċipjenti tal-arjazzjoni. Xi drabi, ir-ragħwa tista' sempliċement tirriżulta mill-preżenta tad-drenaġġ sintetiku, iżda wieħed għandu jantiċipa l-formazzjoni rar-ragħwa jekk is-sustanza kimika tat-test hija, jew fiha, aġent tensjoattiv. Telf ta' solidi tal-ħama mit-taħlitiet tal-ittestjar sejjer jirriżulta f'rati ta' respirazzjoni artifiċjalment inqas li bi żball jistgħu jiġu interpretati bħala riżultat tal-inibizzjoni. Barra minn hekk, l-arjazzjoni ta' soluzzjoni ta' aġent tensjoattiv tikkonċentra l-aġent tensjoattiv fis-saff tar-ragħwa; telf tar-ragħwa mis-sistema tal-ittestjar sejjer ibaxxi l-konċentrazzjonijiet tal-espożizzjoni. Ir-ragħwa tista' sempliċement tiġi kkontrollata b'metodi mekkaniċi sempliċi (eż. billi xi drabi titħawwad manwalment permezz ta' virga tal-ħġieġ) jew biż-żieda ta' aġent kontra r-ragħwa b'emulsjoni tas-siliċju mingħajr aġenti tensjoattivi u/jew bl-użu tal-metodu ta' arjazzjoni tat-tħawwid tal-flask. Jekk il-problema hija assoċjata mal-preżenza tad-drenaġġ sintetiku, il-kompożizzjoni tad-drenaġġ għandha tiġi mmodifikata billi jiġi inkluż reaġent kontra r-ragħwa b'rata ta' eż. 50 μl/l. Jekk ir-ragħwa hija kkawżata mis-sustanza kimika tat-test, il-kwantità meħtieġa għat-tnaqqis għandha tiġi ddeterminata fil-konċentrazzjoni tat-test massima, u mbagħad ir-reċipjenti ta' arjazzjoni individwali kollha għandhom jiġu ttrattati bl-istess mod (inkluż dawk, eż. kontrolli inbjanki u r-reċipjenti ta' referenza fejn ma jkunx hemm ragħwa). Jekk jintużaw aġenti kontra r-ragħwa, ma għandu jkun hemm ebda interazzjoni mal-inokulu u/jew is-sustanza kimika tat-test.

PROĊEDURA TAT-TEST

30.

L-inibizzjoni ta' tliet drabi differenti ta' teħid ta' ossiġenu tista' tkun determinata, totali, eterotropatika biss u dan minħabba n-nitrifikazzjoni. Normalment, il-kejl tal-inibizzjoni tat-teħid tal-ossiġenu totali għandu jkun adegwat. L-effetti fuq it-teħid tal-ossiġenu eterotropatiku mill-ossidazzjoni tal-karbonju organiku, u minħabba l-ossidazzjoni tal-ammonijaka huma meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit speċifiku għal tali żewġ punti ta' tmiem separati għal sustanza kimika partikolari jew (b'mod fakultattiv) biex jiġu spjegati kurvi ta' doża-rispons atipiċi mill-inibizzjoni tat-teħid totali tal-ossiġenu.

Kundizzjonijiet tat-test

31.

It-test għandu jitwettaq f'temperatura fi ħdan il-medda ta' 20 ± 2 °C.

Taħlitiet tat-test

32.

Għandhom jiġu ppreparati t-taħtliet tal-ittestjar (FT bħal fit-Tabella 1) li fihom l-ilma, għalf tad-drenaġġ sintetiku u s-sustanza kimika tat-test biex jinkisbu konċentrazzjonijiet nominali differenti tas-sustanza kimika tat-test (Ara t-Tabella 1 għal eżempji tal-volumi tal-kostitwenti). Il-pH għandu jiġi aġġustat għal 7,5 ± 0,5, jekk ikun meħtieġ, it-taħlitiet għandhom jitħalltu bl-ilma u l-inokulu miżjud biex jinkisbu volumi finali ugwali fir-reċipjenti u biex tinbeda l-arjazzjoni.

Taħlitiet ta' referenza

33.

It-taħlitiet (FR) għandhom jiġu ppreparati bis-sustanza kimika ta' referenza, eż. 3,5-diklorofenol, minflok is-sustanza kimika tat-test bl-istess mod bħat-taħlitiet tal-ittestjar.

Kontrolli inbjank

34.

Fil-bidu (FB) u fi tmiem il-perjodu ta' espożizzjoni fit-testijiet li fihom il-bekkijiet jiġu kkonfigurati sekwenzjalment f'intervalli għandhom jiġu ppreparati kontrolli inbjanki (FB). Fit-testijiet imwettqa permezz ta' tagħmir li jippermetti li jsiru kejliet simultanji tal-konsum tal-ossiġenu, għandhom tal-inqas jiġu inklużi żewġ kontrolli inbjanki f'kull lott ta' analiżi simultanja. Il-kontrolli inbjank li fihom volum ugwali ta' ħama attivata u midjum sintetiku iżda mhux sustanza kimika tat-test jew ta' referenza. Dawn għandhom jitħalltu mal-ilma sal-istess volum bħat-taħlitiet tat-test u ta' referenza.

Kontroll abjotiku

35.

Jekk ikun meħtieġ, pereżempju jekk sustanza kimika tat-test hija magħrufa jew suspettata li għandha proprjetajiet riduċenti qawwija, għandha tiġi pprepata taħlita FA biex jitkejjel il-konsum tal-ossiġenu abjotiku. It-taħlita għandu jkollha l-istess ammonti ta' sustanza kimika tat-test, għalf tad-drenaġġ sintetiku u l-istess volum bħat-taħlitiet tat-test, iżda ebda ħama attivata.

Proċedura u kejliet ġenerali

36.

It-taħlitiet tat-test, it-taħlitiet ta' referenza u l-kontrolli inbjank u abijotiċi huma inkubati fit-temperatura tal-ittestjar f'kundizzjonijiet ta' arjazzjoni sfurzata (0,5 sa 1 l/min) biex il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu maħlul tinżamm 'il fuq minn 60 % — 70 % saturazzjoni u biex il-frak tal-ħama jinżamm f'sospensjoni. Huwa meħtieġ ukoll li l-kulturi jitħawdu biex il-frak tal-ħama jinżamm f'sospensjoni. L-inkubazzjoni hija kkunsidrata mibdija mal-kuntatt inizjali tal-inokulu tal-ħama attivata ma' kosistwenti oħra tat-taħlita finali. Fi tmiem l-inkubazzjoni, wara l-ħinijiet ta' espożizzjoni speċifikati li s-soltu jkunu ta' 3 sigħat, il-kampjuni jiġu rtirati biex titkejjel ir-rata ta' tnaqqis tal-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt fiċ-ċellola ddisinjata għal dan il-għan (Fig.2 tal-Appendiċi 3) jew fi flixkun BOD mimli kollu. Il-mod li bih jinbdew l-inkubazzjonijiet jiddependi fuq il-kapaċità tat-tagħmir użat biex ikejjel ir-rati ta' konsum tal-ossiġenu. Pereżempju, jekk jinkludi sonda tal-ossiġenu waħda, il-kejliet isiru b'mod individwali. F'dan il-każ, id-diversi taħlitiet meħtieġa għat-test fid-drenaġġ sintetiku għandhom jiġu ppreparati iżda l-inokulu għandu jinżamm, u l-porzjonijiet meħtieġa ta' ħama għandhom jiżdiedu ma' kull reċipjent tas-serje. Kull inkubazzjoni għandha tinbeda sussegwentement, f'intervalli konvenjentement puntwali ta' eż. 10 sa 15-il minuta. Inkella, is-sistema ta' kejl tista' tinkludi diversi sondi li jiffaċilitaw kejliet multiplu simultanji; f'dan il-każ, l-inokulu jista' jiżdied fl-istess ħin ma' gruppi ta' reċipjenti xierqa.

37.

Il-konċentrazzjoni tal-ħama attivata fit-taħlitiet tal-ittestjar, ta' referenza u inbjank kollha (iżda mhux ta' kontroll abijotiku) hija nominalment 1,5 g/l ta' solidi suspiżi. Il-konsum ta' ossiġenu għandu jitkejjel wara 3 sigħat ta' espożizzjoni. Għandhom isiru kejliet addizzjonali tal-espożizzjoni ta' 30 minuta kif xieraq u kif deskritt preċedentement fil-paragrafu 5.

Potenzjal ta' nitrifikazzjoni tal-ħama

38.

Sabiex jiġi deċiż jekk il-ħama tinitrifikax u, jekk iva, b'liema rata, għandhom jiġu ppreparati taħlitiet (FB) bħal fit-taħlitiet ta' kontroll inbjank u ta' ‘kontroll’ addizzjonali (FN) li iżda fihom ukoll N-alliltjourea f'11,6 mg/l. It-taħlitiet għandhom jiġu arjati u inkubati f'20° ± 2 °C għal 3 sigħat. Imbagħad għandhom jitkejlu r-rata ta' teħid tal-ossiġenu u għandha tiġi kkalkolata r-rata ta' teħid tal-ossiġenu minħabba n-nitrifikazzjoni.

Disinji tat-test

Test tas-sejba tal-medda

39.

Meta jkun meħtieġ jintuża test preliminari, biex tiġi stmata l-medda ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test meħtieġa f'test finali għad-determinazzjoni tal-inibizzjoni tal-konsum tal-ossiġenu. Inkella, in-nuqqas ta' inibizzjoni tal-konsum tal-ossiġenu mis-sustanza kimika tat-test f'test preliminarji jista' juri li test finali mhuwiex meħtieġ, iżda għandhom jiġu inklużi triplikati fl-ogħla konċentrazzjoni ttestjata tat-test preliminari (ġeneralment 1 000 mg/l, iżda li jiddependu fuq ir-rekwiżit tad-dejta).

Tabella 1

Eżempji ta' taħlitiet għat-test preliminari

Reaġent

Konċentrazzjoni Oriġinali

Soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test

10 g/l

Soluzzjoni ewlenija tal-midjum sintetiku

Ara l-paragrafu 16

Sospensjoni ewlenija tal-ħama attivata

3 g/l solidi suspiżi

Komponenti tat-taħlita

Dożaġġ f'reċipjenti tat-test (1)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test (ml)

(paragrafi 19 sa 21)

0,5

5

50

0

50

Soluzzjoni ewlenija tal-għalf ta' drenaġġ sintetiku (ml)

(paragrafu 16)

16

16

16

16

16

Sospensjoni ta' ħama attivata (ml)

(paragrafi 26 sa 29)

250

250

250

250

250

Ilma

(paragrafu 15)

233,5

229

184

234

434

Volum totali tat-taħlitiet (ml)

500

500

500

500

500

Konċentrazzjonijiet fit-taħlita

 

 

 

 

 

Sospensjoni tal-ittestjar (mg/l)

Ħama attivata

10

100

1 000

0

1 000

(solidi sospiżi) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

It-test għandu jitwettaq tal-inqas permezz ta' tliet konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test, pereżempju, 10 mg/l, 100 mg/l u 1 000 mg/l b'kontroll inbjank u, jekk ikun hemm bżonn, tal-inqas tliet kontrolli abjotiċi bl-ogħla konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test (ara bħala eżempju t-Tabella 1). Idealment l-inqas konċentrazzjoni ma għandu jkollha l-ebda effett fuq il-konsum tal-ossiġenu. Għandhom jiġu kkalkolati r-rati ta' teħid ta' ossiġenu u r-rata ta' nitrifikazzjoni, jekk ikunu rilevanti; imbagħad għandu jiġi kkalkolat il-perċentwal ta' inibizzjoni. Skont l-iskop tat-test, huwa possibbli wkoll li sempliċement tiġi ddeterminata t-tossiċità ta' konċentrazzjoni limitu, pereżemju 1 000 mg/l. Jekk ma jseħħ ebda effett tossiku statistikament sinifikanti f'din il-konċentrazzjoni, mhuwiex meħtieġ ittestjar ulterjuri f'konċentrazzjonijiet ogħla jew inqas. Għandu jiġi nnotat li sustanzi li ma tantx jinħallu fl-ilma, taħlitiet b'komponenti ta' solubbiltà fl-ilma differenti u s-sustanzi adsorbivi għandhom jiġu ponderati direttament fir-reċipjenti tat-test. F'dan il-każ, il-volum riservat għas-soluzzjoni ewlenija tas-sustanza tat-test għandu jiġi sostitwit b'ilma tat-taħlit.

Test finali

Inibizzjoni tat-teħid totali tal-ossiġenu

41.

It-test għandu jitwettaq permezz ta' medda ta' konċentrazzjoni mnaqqsa mit-test preliminari. Sabiex jinkisbu kemm l-NOEC kif ukoll l-ECx (eż. l-EC50), fil-biċċa l-kbira tad-drabi huma rakkomandati sitt kontrolli u ħames konċentrazzjonijiet ta' trattament f'serje ġeometrika b'ħames repliki. Il-kontroll abjotiku ma għandux bżonn jiġi ripetut jekk ma kien hemm ebda teħid tal-ossiġenu fit-test preliminari, iżda jekk iseħħ teħid sinifikanti, għandhom jiġu inklużi kontrolli abijotiċi għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test. Is-sensittività tal-ħama għandha tiġi vverifikata permezz tas-sustanza kimika ta' referenza 3,5-diklorofenol. Is-sensittività tal-ħama għandha tiġi vverifikata għal kull serje ta' testijiet, peress li s-sensittività hija magħrufa li tvarja. Fil-każijiet kollha, il-kampjuni huma rtirati mir-reċipjenti tat-test wara 3 sigħat, u 30 minuta addizzjonali jekk ikun meħtieġ, għall-kejl tar-rata ta' teħid tal-ossiġenu fiċ-ċellola tal-elettrodi tal-ossiġenu. Mid-dejta miġbura, jiġu kkalkolati r-rati ta' respirazzjoni speċifiċi tat-taħlitiet ta' kontroll u tal-ittestjar; imbagħad il-perċentwal tal-inibizzjoni jiġi kkalkolat mill-ekwazzjoni 7, hawn taħt.

Distinzjoni bejn inibizzjoni ta' respirazzjoni eterotropika u nitrifikazzjoni

42.

L-użu ta' inibitur ta' nitrifikazzjoni speċifku, ATU, jippermetti l-valutazzjoni diretta tal-effetti inibitorji tas-sustanzi kimiċi tat-test fuq l-ossidazzjoni eterotropika, u billi titnaqqas ir-rata ta' teħid tal-ossiġenu fil-preżenza tal-ATU mir-rata ta' teħid totali (l-ebda ATU preżenti), jistgħu jiġu kkalkolati l-effetti fuq ir-rata ta' nitrifikazzjoni. Għandhom jiġu ppreparati żewġ settijiet ta' taħlitiet ta' reazzjoni skont id-disinji tal-ittestjar għall-ECx jew l-NOEC deskritti fil-paragrafu 41, iżda barra minn hekk, l-ATU għandu jiżdied ma' kull taħlita ta' sett wieħed fil-konċentrazzjoni finali ta' 11,6 mg/l, li ntweriet li tinibixxi kompletament in-nitrifikazzjoni fil-ħama b'konċentrazzjonijiet ta' solidi sospiżi sa 3 000 mg/l (4). Ir-rati ta' teħid ta' ossiġenu għandhom jitkejlu wara l-perjodu ta' espożizzjoni; dawn il-valuri diretti jirrappreżentaw ir-respirazzjoni eterotropika biss, u d-differenzi bejn dawn ir-rati ta' respirazzjoni u dawk totali korrispondenti jirrappreżentaw in-nitrifikazzjoni. Imbagħad jiġu kkalkolati d-diversi gradi ta' inibizzjoni.

Kejl

43.

Wara l-perjodu/perjodi ta' espożizzjoni, għandu jiġi ttrasferit kampjun mill-ewwel reċipjent ta' arjazzjoni lejn iċ-ċellola tal-elettrodi tal-ossiġenu (Fig. 1 tal-Appendiċi 2) u l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu maħlula għandha titkejjel minnufih. Jekk tkun disponibbli sistema tal-elettrodi multipla, allura l-kejliet jistgħu jsiru b'mod simultanju. It-taħwid (permezz ta' kalamita mgħottija) huwa essenzjali fl-istess rata bħal meta l-elettrodu jiġi kkalibrat biex jiżgura li s-sonda tirrispondi b'dewmien minimu għall-konċentrazzjonijiet tal-ossiġenu li jinbidlu, u biex ikun jista' jitkejjel l-ossiġenu regolari u riproduċibbli fir-reċipjent tal-kejl. Ġeneralment, is-sistema tas-sonda li titħawwad awtomatikament ta' xi elettrodi tal-ossiġenu hija adegwata. Iċ-ċellola għandha titlaħlaħ bl-ilma bejn kull kejl. Inkella, il-kampjun jista' jintuża biex jimla flixkun BOD (Fig. 2 tal-Appendiċi 3) mgħammar b'ħawwad manjetiku. Imbagħad għandha tiddaħħal sonda tal-ossiġenu bi sleeve adaptor fl-għonq tal-flixkun u l-ħawwad manjetiku għandu jiġi attivat. Fiż-żewġ każijiet, il-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt għandha titkejjel b'mod kontinwu u rreġistrata għal perjodu, ġeneralment 5 sa 10 minuti jew sakemm il-konċentrazzjoni taqa' taħt iż-2 mg/l. L-elettrodu għandu jitneħħa, it-taħlita terġa' titpoġġa fir-reċipjent tal-arjazzjoni u għandhom jitkomplew l-arjazzjoni u t-taħwid, jekk ikun meħtieġ kejl wara perjodi ta' espożizzjoni twal.

Verifika tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

44.

Għal xi finijiet, jaf ikun meħtieġ li titkejjel il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fir-reċipjenti tat-test. Wieħed għandu jinnota li jekk jintużaw soluzzjonijiet ewlenin ta':

sustanzi li ma tantx jinħallu fl-ilma,

taħlitiet b'komponenti b'solubbiltà fl-ilma differenti, jew

sustanzi b'solubbiltà fl-ilma tajba, iżda fejn il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ewlenija tqarreb is-solubbiltà fl-ilma massima,

jintuża, il-parti maħlula hija magħrufa, u l-konċentrazzjoni reali tas-sustanza kimika tat-test li hija ttrasferita fir-reċipjenti tat-test mhijiex magħrufa. Sabiex tiġi kkaratterizzata l-espożizzjoni, hija meħtieġa stima analitika tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test fir-reċipjenti tat-test. Biex jiġu simplifikati l-kwistjonijiet, għandha ssir stima analitika qabel iż-żieda tal-inokulu. Minħabba l-fatt li l-frazzjonijiet maħlula biss sejrin jiġu ttrasferiti fir-reċipjenti tat-test, il-konċentrazzjonijiet imkejla jistgħu jkunu baxxi ħafna.

45.

Sabiex tiġi evitata analitika li tieħu l-ħin u li tiswa ħafna flus, huwa rakkomandat li s-sustanza kimika tat-test tiġi sempliċement ppeżata fir-reċipjenti tat-test u li ssir referenza għall-konċentrazzjoni nominali ponderata inizjali għal kalkoli sussegwenti. Mhijiex meħtieġa distinzjoni bejn frazzjonijiet maħlula, mhux maħlula jew adsorbiti tas-sustanza kimika tat-test peress li dawn il-frazzjonijiet kollha jidhru f'kundizzjonijiet reali f'impjant ta' trattament tal-ilma mormi bl-istess mod, u dawn il-frazzjonijiet jista' jvarjaw skont il-kompożizzjoni tad-drenaġġ. L-għan tal-metodu ta' ttestjar huwa li jagħti stima realistika tal-konċentrazzjoni inibitorja u mhuwiex xieraq biex jinvestiga fid-dettall liema frazzjonijiet jagħmlu kontribuzzjoni għall-inibizzjoni tal-organiżmi tal-ħama attivata. Fl-aħħar nett, is-sustanzi adsorbivi għandhom jintiżnu direttament ukoll fir-reċipjenti tat-test; u r-reċipjenti għandhom jiġu silanizzati biex jitnaqqas it-telf permezz ta' adsorbiment.

DEJTA U RAPPORTAR

Kalkolu tar-rati ta' teħid tal-ossiġenu

46.

Ir-rati ta' teħid tal-ossiġenu għandhom jiġu kkalkolati mill-medja tal-valuri mkejla, perżempju minn parti lineari tal-graffs tal-konċentrazzjoni tal-ossiġenu meta mqabbel mal-ħin, billi jiġu limitati l-kalkoli tal-konċentrazzjonijiet tal-ossiġenu bejn 2,0 mg/l u 7,0 mg/l, peress li konċentrazzjonijiet ogħla u inqas jistgħu huma stess jinfluwenzaw ir-rati ta' konsum. Devjazzjoni minn dawn il-faxex ta' konċentrazzjoni taħt jew 'il fuq minn dawn il-valuri hija xi drabi inevitabbli u meħtieġa, pereżempju, meta r-respirazzjoni tkun imrażżna ħafna u konsegwentement bil-mod ħafna, jew jekk xi ħama attivata partikolari jkollha respirazzjoni mgħaġġla ħafna. Dan huwa aċċettabbli sakemm is-sezzjonijiet estiżi tal-graff tat-teħid huma dritti u l-gradjenti tagħhom ma jinbidlux peress li jgħaddu mil-limiti ta' 2,0 mg/l jew 7,0 mg/l O2. Kwalunkwe sezzjoni mgħawġa tal-graff tindika li s-sistema ta' kejl qiegħda tistabbilizza jew ir-rata ta' teħid qiegħda tinbidel u ma għandhiex tintuża għall-kalkolu tar-rati ta' respirazzjoni. Ir-rata ta' teħid tal-ossiġenu għandha tiġi espressa f'milligrammi għal kull litru fis-siegħa (mg/lh) jew milligrammi għall kull gramma ħama xotta fis-siegħa (mg/gh). Ir-rata ta' konsum tal-ossiġenu, R, f'mg/lh, tista' tiġi kkalkolata jew interpolata mill-parti lineari tal-graff ta' tnaqqis tal-ossiġenu rreġistrata skont l-Ekwazzjoni 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

fejn:

Q1

hija l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu fil-bidu tas-sezzjoni magħżula tal-fażi lineari (mg/l);

Q2

hija l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu fi tmiem is-sezzjoni magħżula tal-fażi lineari (mg/l);

Δt

huwa l-intervall ta' ħin bejn dawn iż-żewġ kejliet (min.).

47.

Ir-rata ta' respirazzjoni speċifika (Rs) hija espressa bħala l-ammont ta' ossiġenu kkunsmat għal kull gramma ta' piż xott ta' ħama fis-siegħa (mg/gh) skont l-Ekwazzjoni 2:

Rs = R/SS

(2)

fejn SS hija l-konċentrazzjoni tas-solidi suspiżi fit-taħlita tal-ittestjar (g/l).

48.

L-indiċijiet differenti ta' R li jistgħu jingħaqdu flimkien huma:

S

rata speċifika

T

rata ta' respirazzjoni totali

N

rata minħabba respirazzjoni tan-nitrifikazzjoni

H

rata minħabba respirazzjoni eterotropika

A

rata minħabba l-proċessi abijotiċi

B

rata bbażata fuq l-assaġġi inbjank (medja)

Kalkolu tar-rata ta' teħid tal-ossiġenu minħabba n-nitrifikazzjoni

49.

Ir-relazzjoni bejn ir-respirazzjoni totali (RT), ir-respirazzjoni tan-nitrifikazzjoni (RN) u r-respirazzjoni eterotropika (RH) tiġi kkalkolata bl-Ekwazzjoni 3:

RN = RT – RH

(3)

fejn:

RN

hija r-rata ta' teħid tal-ossiġenu minħabba n-nitrifikazzjoni (mg/lh);

RT

hija r-rata mkejla tar-rata tal-ossiġenu mill-kontroll inbjank (l-ebda ATU; FB) (mg/lh).

RH

hija r-rata mkejla tar-rata tal-ossiġenu tal-kontroll inbjank b'ATU miżjud (FN) (mg/lh).

50.

Din ir-relazzjoni hija valida għal valuri vojta (RNB, RTB, RHB), kontrolli abjotiċi (RNA, RTA, RHA) u assaġġi b'kimiċi ta' prova (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Rati ta' respirazzjoni speċifiċi huma kkalkolati minn:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Jekk RN hija insinifikanti (eż. < 5 % ta' RT f'kontrolli inbjanki) f'test preliminari, wieħed jista' jassumi li t-teħid tal-ossiġenu eterotrofiku huwa ugwali għat-teħid totali u li mhi qiegħda sseħħ ebda nitrifikazzjoni. Ikun meħtieġ sors alternattiv ta' ħama attivata, jekk it-testijiet kellhom jikkunsidraw l-effetti fuq il-mikro-organiżmi eterotrofiċi u nitrifikanti. Test finali jitwettaq jekk ikun hemm evidenza ta' rati ta' teħid tal-ossiġenu suppressi b'konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test differenti.

Kalkolu tal-perċentwal tal-inibizzjoni

52.

Il-perċentwal tal-inibizzjoni, IT, tal-konsum tal-ossiġenu totali f'kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, jiġi kkalkolat bl-Ekwazzjoni 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Bl-istess mod, il-perċentwal ta' inibizzjoni tat-teħid tal-ossiġenu eterotrofiku, IH, f'kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, jiġi kkalkolat bl-Ekwazzjoni 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Fl-aħħar nett, l-inibizzjoni tat-teħid tal-ossiġenu minħabba n-nitrifikazzjoni, IN, f'kull konċentrazzjoni, tiġi kkalkolata bl-Ekwazzjoni 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Il-perċentwal tal-inibizzjoni tat-teħid tal-ossiġenu għandu jiġi pplottjat mal-logaritmu tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (kurva ta' inibizzjoni, ara Fig.3 tal-Appendiċi 4). Il-kurvi ta' inibizzjoni jiġu pplottjati għal kull perjodu ta' arjazzjoni ta' 3 sigħat jew addizzjonalment wara 30 minuta. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tinibixxi t-teħid tal-ossiġenu sa 50 % (EC50) għandha tiġi kkalkolata jew interpolata mill-graff. Jekk tkun disponibbli dejta xierqa, il-limiti ta' kunfidenza ta' 95 % ta' EC50, il-gradjent tal-kurva, jistgħu jiġu kkalkolati jew interpolati l-valuri xierqa biex jiġi mmarkat il-bidu tal-inibizzjoni (pereżempju, EC10 jew EC20) u t-tmiem tal-medda ta' inibizzjoni (eż., EC80 jew EC90).

56.

Għandu jiġi nnotat li fid-dawl tal-varjabbiltà li ħafna drabi tiġi osservata fir-riżultati, f'ħafna każijiet jaf ikun suffiċjenti li r-riżultati jiġu espressi skont id-daqs, pereżempju:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l sa 10 mg/l

EC50

10 mg/l sa 100 mg/l

EC50

> 100mg/l

Interpretazzjoni tar-riżultati

ECx

57.

Il-valuri ECx inkluż il-limiti ta' kunfidenza baxxi u superjuri assoċjati tagħhom ta' 95 % għall-parametru huma kkalkolati permezz ta' metodi statistiċi xierqa (eż. analiżi probit, funzjoni loġistika jew Weibull, metodu Spearman-Karber trimmjat jew interpolazzjoni sempliċi (11)). ECx tinkiseb billi jiddaħħal valur korrispondenti għal x % tal-medja ta' kontroll fl-ekwazzjoni misjuba. Biex tiġi kkalkolata l-EC50 jew kwalunkwe ECx, il-medji għal kull trattament (x) għandhom ikunu soġġetti għal analiżi tar-rigressjoni.

Stima NOEC

58.

Jekk analiżi statistika hija maħsuba biex tiddetermina l-NOEC, hija meħtieġa statistika għal kull reċipjent (reċipjenti individwali jitqiesu repliki). Għandhom jintużaw metodi statistiċi xierqa skont id-Dokument tal-OECD dwar l-Approċċi Attwali fl-Analiżi Statistika tad-Dejta Ekotossika: Gwida għall-Applikazzjoni (11). B'mod ġenerali, l-effetti avversi tas-sustanza kimika tat-test meta mqabbel mal-kontroll huma investigati permezz ta' ttestjar tal-ipoteżijiet (iżgħar) bi tmiem wieħed f'p ≤ 0,05.

Rapport tal-ittestjar

59.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

 

Sustanza kimika tat-test

isem komuni, isem is-sustanza kimika, numru CAS, purità;

il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanza kimika tat-test (eż. il-log Kow, is-solubbiltà fl-ilma, il-pressjoni tal-fwar, il-kostant ta' Henry (H) u informazzjoni possibbli dwar id-destin tas-sustanza kimika tat-test, eż. adsorbiment mal-ħama attivata);

 

Sistema tat-test

sors, kundizzjonijiet ta' operazzjoni tal-impjant ta' trattament tal-ilma mormi u l-influwent li jirċievi, il-konċentrazzjoni, it-trattament minn qabel u ż-żamma tal-ħama attivata;

 

Kundizzjonijiet tat-test

it-temperatura tal-ittestjar, il-pH matul l-ittestjar u d-durata tal-fażi(jiet) ta' espożizzjoni;

 

Riżultati

konsum speċifiku tal-ossiġenu tal-kontrolli (mg O2/(g × h ta' ħama);

id-dejta mkejla, il-kurva(i) ta' inibizzjoni u l-metodu għall-kalkolu ta' EC50;

EC50 u, jekk ikun possibbli, 95 fil-mija tal-limiti ta' kunfidenza, possibbilment EC20, EC80; possibbilment NOEC u l-metodi statistiċi użati, jekk EC50 ma jistax jiġi ddeterminat;

ir-riżultati għall-inibizzjoni totali, u jekk tkun meħtieġa eterotrofika u nitrifikanti;

teħid ta' ossiġenu abijotiku fil-kontroll fiżikokimiku (jekk jintuża);

l-isem tas-sustanza kimika ta' referenza u r-riżultati b'din is-sustanza kimika;

l-osservazzjonijiet u d-devjazzjonijiet kollha mill-proċedura standard, li setgħu jinfluwenzaw ir-riżultat.

LETTERATURA

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Appendiċi 1

Definizzjonijiet

Id-definizzjonijiet li ġejjin huma applikabbli għal dan il-metodu ta' ttestjar.

 

Sustanza kimika tfisser sustanza jew taħlita.

 

ECx (Konċentrazzjoni tal-effett għall-effett ta' x %) hija l-konċentrazzjoni li tikkawża x % tal-effett fuq l-organiżmi tal-ittestjar f'perjodu ta' espożizzjoni meta mqabbel ma' kontroll. Pereżempju, EC50 hija konċentrazzjoni stmata li tikkawża effett fuq il-punt ta' tmiem l-ittestjar f'50 % ta' popolazzjoni esposta fuq perjodu ta' espożizzjoni ddefinit.

 

NOEC (konċentrazzjoni bla effett osservat) hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fejn mhuwa osservat ebda effett. F'dan it-test, il-konċentrazzjoni li tikkorrispondi għall-NOEC, ma għandha ebda effett statistikament sinifikanti (p < 0,05) f'perjodu ta' espożizzjoni partikolari meta mqabbel mal-kontroll.

 

Sustanza kimika tal-ittestjar tfisser kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Appendiċi 2

Fig. 1:   Eżempji għall-kejl tal-unità

Image

Spjega

1

ħama attivata

2

midjum sintetiku

3

sustanza kimika tat-test

4

arja

5

reċipjent tat-taħlit

6

ħawwad manjetiku

7

ċellola li tkejjel l-ossiġenu

8

elettrodu tal-ossiġenu

9

strument li jkejjel l-ossiġenu

10

reġistratur

Appendiċi 3

Fig. 2:   Eżempju tal-unità tal-kejl, permezz ta' flixkun BOD

Image

Spjega

1

Reċipjent tal-ittestjar

2

elettrodu tal-ossiġenu

3

strument li jkejjel l-ossiġenu

Appendiċi 4

Fig. 3:   Eżempji ta' kurvi tal-inibizzjoni

Image

Spjega

X

konċentrazzjoni ta' 3,5-dichlorophenol (mg/l)

Y

Inibizzjoni (%)

Image

respirazzjoni eterotrofika tal-inibizzjoni permezz ta' ħama nitrifikanti

Image

nitrifikazzjoni tal-inibizzjoni permezz ta' ħama nitrifikanti

(5)

Il-Kapitolu C.26 huwa sostitwit ma' dan li ġej:

C.26   TEST TAL-INIBIZZJONI TAT-TKABBIR TAL-ISPEĊI LEMNA

INTRODUZZJONI

1.

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida tat-Test (TG) 221 tal-OECD (2006). Huwa maħsub biex jivvaluta t-tossiċità tas-sustanzi kimiċi lill-pjanti akkwatiċi tal-ilma ħelu tal-ġeneru Lemna (duckweed). Huwa bbażat fuq il-metodi eżistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6) iżda jinkludi modifikazzjonijiet ta' dawn il-metodi biex tiġi riflessa r-riċerka riċenti u l-konsultazzjoni fuq għadd ta' kwistjonijiet ewlenin. Dan il-Metodu ta' Ttestjar ġie vvalidat minn ring test internazzjonali (7).

2.

Dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi l-ittestjar tat-tossiċità permezz ta' Lemna gibba u Lemna minor, li t-tnejn intużaw b'mod estensiv u huma s-suġġett tal-istandards imsemmija hawn fuq. It-tassonomija ta' Lemna spp. hija diffiċli, peress li hija kkumplikata bl-eżistenza ta' firxa wiesgħa ta' fenotipi. Għalkemm tista' sseħħ varjabbiltà ġenetika fir-rispons għat-tossikanti b'Lemna, bħalissa hemm dejta insuffiċjenti dwar dan is-sors ta' varjabbiltà biex jiġi rakkomandat klonu speċifiku għall-użu ma' dan il-metodu ta' ttestjar. Ta' min jinnota li t-test ma jitwettaqx b'mod akseniku, iżda jittieħdu passi fi stadji matul il-proċedura tal-ittestjar biex il-kontaminazzjoni minn organiżmi oħra tinżamm kemm jista' jkun baxxa.

3.

Huma deskritti d-dettalji tal-ittestjar b'tiġdid (semistatiku u bi fluss kontinwu) u mingħajr tiġdid (statiku) tas-soluzzjoni tat-test. Skont l-objettivi tal-ittestjar u r-rekwiżiti regolatorji, huwa rakkomandat li tiġi kkunsidrata l-applikazzjoni ta' metodi semistatiċi u bi fluss kontinwu, eż. għal sustanzi kimiċi li jintilfu rapidament minn soluzzjoni bħala riżultat ta' volatilizzazzjoni, fotodegradazzjoni, preċipitazzjoni jew bijodegradazzjoni. F'(8) tingħata gwida ulterjuri.

4.

Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati.

PRINĊIPJU TAL-ITTESTJAR

5.

Kulturi ta' pjanti li jikbru b'mod esponenzjali tal-ġeneru Lemna jistgħu jikbru bħala monokulturi f'konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza kimika tat-test f'perjodu ta' sebat ijiem. L-objettiv tal-ittestjar huwa li jikkwantifika l-effetti relatati mas-sustanzi kimiċi fuq it-tkabbir veġettativ matul dan il-perjodu abbażi ta' valutazzjonijiet tal-varjabbli ta' kejl magħżula. L-għadd ta' frondi huwa l-varjabbli ta' kejl primarju. Tal-inqas jitkejjel ukoll varjabbli ta' kejl ieħor (erja totali tal-frondi, piż xott jew piż frisk), peress li xi sustanzi kimiċi jistgħu jaffettwaw varjabbli ta' kejl oħra ħafna iktar mill-għadd ta' frondi. Biex jiġu kkwantifikati l-effetti relatati mas-sustanza, it-tkabbir fis-soluzzjonijiet tat-test huwa mqabbel ma' dak tal-kontrolli u l-konċentrazzjoni li twassal għal rata ta' x % ta' inibizzjoni speċifika ta' tkabbir (eż. 50 %) hija ddeterminata u espressa bħala l-ECx (eż. EC50)

6.

Dan il-punt ta' tmiem tat-test huwa l-inibizzjoni tat-tkabbir, espress bħala ż-żieda logaritmika fil-varjabbli ta' kejl (rata ta' tkabbir speċifika medja) matul il-perjodu ta' espożizzjoni. Mir-rati medji ta' tkabbir speċifiku rreġistrati f'serje ta' soluzzjonijiet tat-test, il-konċentrazzjoni li twassal għal rata ta' x % ta' inibizzjoni speċifika ta' tkabbir (eż. 50 %) hija ddeterminata u espressa bħala l-ErCx (eż. ErC50).

7.

Rispons varjabbli addizzjonali li jintuża f'dan il-Metodu ta' Ttestjar huwa r-rendiment, li jista' jkun meħtieġ sabiex jiġu ssodisfati rekwiżiti regolatorji speċifiċi f'xi pajjiżi. Huwa ddefinit bħala l-varjabbli ta' kejl fi tmiem il-perjodu ta' espożizzjoni li minnu jitneħħa l-varjabbli ta' kejl fil-bidu tal-perjodu ta' espożizzjoni. Mill-prodott reġistrat f'serje ta' soluzzjonijiet tat-test, il-konċentrazzjoni ġġib magħha x % speċifikat ta' rata ta' inibizzjoni ta' prodott (eż. 50 %) determinata u espressa bħala l-EyCx (eż. EyC50).

8.

Barra minn hekk, jistgħu jiġu stabbiliti statistikament il-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) u l-konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC).

INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST

9.

Għandu jkun disponibbli metodu analitiku, b'sensittività adegwata għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza kimika fil-midjum tat-test.

10.

Informazzjoni fuq is-sustanza kimika tat-test li tista' tkun utli biex jiġu stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula strutturali, purità, solubilità tal-ilma, stabbiltà fl-ilma u dawl, pKa, Kow, pressjoni tal-fwar u bijodegradabilità. Is-solubbiltà fl-ilma u l-pressjoni tal-fwar jistgħu jintużaw biex jiġi kkalkolat il-kostanti ta' Henry's Law, li sejrin jindikaw jekk huwiex probabbli telf sinifikanti fis-sustanza kimika tat-test matul il-perjodu tal-ittestjar. Dan sejjer jgħin biex jindika jekk għandhomx jittieħdu passi partikolari biex jiġi kkontrollat tali telf. Fejn l-informazzjoni dwar is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test mhijiex ċerta, huwa rakkomandat li dawn jiġu vvalutati fil-kundizzjonijiet tat-test, jiġifieri l-midjum tat-tkabbir, it-temperatura, ir-reġim tad-dawl li għandhom jintużaw fit-test.

11.

Meta l-kontroll tal-pH tal-midjum tat-test ikun partikolarment importanti, eż. meta l-metalli jew is-sustanzi kimiċi tat-test li huma idrolitikament instabbli, hija rakkomandata żieda ta' bafer mal-midjum tat-tkabbir (ara paragrafu 21). Hija pprovduta gwida ulterjuri għas-sustanzi kimiċi tat-test bi proprjetajiet fiżikokimiċi li jagħmluhom diffiċli biex jiġu ttestjati fi (8).

VALIDITÀ TAT-TEST

12.

Biex it-test ikun validu, iż-żmien tal-irdoppjar tal-għadd ta' frondi fil-kontroll għandu jkun inqas minn 2,5 jiem (60 siegħa), li jikkorrispondu għal żieda ta' bejn wieħed u ieħor seba' darbiet f'sebat ijiem u rata ta' tkabbir speċifika medja ta' 0,275 d– 1. Permezz tal-midjums u l-kundizzjonijiet tat-test deskritti f'dan il-Metodu ta' Ttestjar, dan il-kriterju jista' jinkiseb permezz ta' reġim tal-ittestjar statiku (5). Huwa antiċipat ukoll li dan il-kriterju sejjer jintlaħaq f'kundizzjonijiet tat-test semistatiċi u bi fluss kontinwu. Il-kalkolu tal-ħin għall-irdoppjar huwa indikat fil-paragrafu 49.

SUSTANZA KIMIKA TA' REFERENZA

13.

Is-sustanza (sustanzi) ta' referenza bħal 3,5-diklorofenol użata fir-ring test internazzjonali (7), tista' tiġi ttestjata bħala mezz ta' vverifikar tal-proċedura tat-test. Huwa rakkomandat li tiġi ttestjata sustanza kimika ta' referenza tal-inqas darbtejn f'sena jew, fejn jitwettaq ittestjar bi frekwenza inqas, b'mod parallel mad-determinazzjoni tat-tossiċità ta' sustanza kimika tat-test.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Apparat

14.

It-tagħmir kollu f'kuntatt mal-midjums tat-test għandu jkun magħmul mill-ħġieġ jew materjal kimikament inerti ieħor. L-oġġetti tal-ħġieġ li jintużaw għal finijiet ta' kulturi u ttestjar għandhom jitnaddfu minn kontaminanti kimiċi li jistgħu jinfiltraw fil-midjum tat-test u għandhom ikunu sterili. Ir-reċipjenti tat-test għandhom ikunu wisgħin biżżejjed għall-frondi ta' kolonji differenti fir-reċipjenti ta' kontroll biex jikbru mingħajr ma jikkoinċidu fi tmiem it-test. Ma tagħmilx differenza jekk l-għeruq imissx mal-qigħan tar-reċipjenti tat-test, iżda huwa rakkomandat fond minimu ta' 20 mm u volum minimu ta' 100 mL f'kull reċipjent tat-test. L-għażla tar-reċipjenti tat-test mhijiex kritika sakemm jiġu sodisfatti dawn ir-rekwiżiti. Il-bekkijiet tal-ħġieġ, id-dixxijiet kristalizzanti jew id-dixxijiet tal-ħġieġ petri b'dimensjonijiet xierqa kollha rriżultaw adegwati. Ir-reċipjenti tat-test għandhom jitgħattew biex titnaqqas l-evaporazzjoni u l-kontaminazzjoni aċċidentali, filwaqt li jippermettu l-bdil tal-arja meħtieġ. Reċipjenti tal-ittestjar xierqa, u b'mod partikolari l-għotjien, għandhom jevitaw id-dell jew bidliet fil-karatteristiċi spettrali tad-dawl.

15.

Il-kulturi u r-reċipjenti tat-test ma għandhomx jinżammu flimkien. Dan jintlaħaq bl-aħjar mod permezz ta' kompartimenti, inkubaturi, jew kmamar ta' tkabbir ambjentali separati. L-illuminazzjoni u t-temperatura għandhom ikunu kontrollabbli u miżmuma f'livell kostanti (ara l-paragrafi 35-36).

Organiżmu tat-test

16.

L-organiżmu użat għal dan it-test huwa Lemna gibba jew Lemna minor. Fl-Appendiċi 2 jingħataw deskrizzjonijiet fil-qosor tal-ispeċijiet ta' duckweed li ntużaw għall-ittestjar tat-tossiċità. Il-materjal tal-pjanti jista' jinkiseb minn ġabra tal-kultura, laboratorju ieħor jew minn fuq il-post. Jekk jinġabru minn fuq il-post, l-impjanti għandhom jinżammu f'kultura fl-istess midjum kif użat għall-ittestjar għal minimu ta' tmien ġimgħat qabel l-użu. Is-siti tal-oqsma użati għall-ġbir tal-kulturi tal-bidu għandhom ikunu mingħajr sorsi ovvji ta' kontaminazzjoni. Jekk jinkisbu minn laboratorju jew ġbir ta' kultura ieħor, għandhom jinżammu bl-istess mod għal minimu ta' tliet ġimgħat. Is-sors tal-materjal tal-pjanti l-ispeċi u l-klonu (jekk ikunu magħrufa) użati għall-ittestjar għandhom dejjem jiġu rrapportati.

17.

Għandhom jintużaw monokulturi, li huma viżibbilment mingħajr kontaminazzjoni minn organiżmi oħra bħal algi u protozoa. Pjanti b'saħħithom ta' L. minor sejrin jikkonsistu minn kolonji li jinkludu bejn żewġ frondi u ħamsa filwaqt li kolonji b'saħħithom ta' L. gibba jista' jkun fihom sa seba' frondi.

18.

Il-kwalità u l-unformità tal-pjanti użati għall-ittestjar sejjer ikollhom influwenza sinifikanti fuq l-eżitu tal-ittestjar u għandhom għalhekk jintgħażlu b'attenzjoni. Għandhom jintużaw pjanti żgħar li jikbru rapidament mingħajr leżjonijiet jew diskolorazzjoni (klorożi) evidenti. Kulturi ta' kwalità tajba huma indikati minn inċidenza għolja ta' kolonji li jinkludu tal-inqas żewġ frondi. Numru kbir ta' frondi uniċi huwa indikattiv ta' stress ambjentali, eż. limitazzjoni ta' nutrijenti, u ma għandux jintuża materjal ta' pjanti minn tali kulturi għall-ittestjar.

Kultivazzjoni

19.

Biex titnaqqas il-frekwenza taż-żamma tal-kultura (eż. meta jkunu ppjanati testjiet ta' Lemna għal perjodu), il-kulturi jistgħu jinżammu f'illuminazzjoni u temperatura mnaqqsin (4 — 10 °C). Dettalji tal-kulturi jingħataw fl-Appendiċi 3. Sinjali ovvji ta' kontaminazzjoni minn algi jew organiżmi oħra jaf ikunu jeħtieġu sterilizzazzjoni tal-wiċċ ta' sottokampjun ta' frondi ta' Lemna, segwita minn trasferiment għal midjum ġdid (ara l-Appendiċi 3). F'din l-eventwalità, il-kultura kontaminata li jifdal għandha tintrema.

20.

Tal-inqas sebat ijiem qabel l-ittestjar, biżżejjed kolonji jiġu ttrasferiti b'mod asettiku f'midjum sterili ġdid u kkulturati għal 7 — 10 ijiem f'kundizzjonijiet tat-test.

Midjum tat-test

21.

Huma rakkomandati midjums differenti għal Lemna minor u Lemna gibba, kif deskritt hawn taħt. Għandha tingħata kunsiderazzjoni b'attenzjoni ta' bafer ta' pH fil-midjum tat-test (MOPS (aċidu sulfoniku ta' 4-morfolinapropan, Nru CAS: 1132-61-2) fil-midjum L. minor u NaHCO3 fil-midjum L. gibba) meta jkun suspettat li dan jista' jkollu reazzjoni mas-sustanza kimika tat-test u jinfluwenza l-espressjoni tat-tossiċità tagħha. Il-Midjum ta' Steinberg (9) huwa aċċettabbli wkoll sakemm jiġu sodisfatti l-kriterji ta' validità.

22.

Hija rakkomandata modifikazzjoni tal-midjum ta' tkabbir Lemna tal-istandard Svediż (SIS) għall-kulturi u l-ittestjar b'L. minor. Fl-Appendiċi 4 tingħata l-kompożizzjoni ta' dan il-midjum.

23.

Huwa rakkomandat il-midjum tat-tkabbir, 20X — AAP, kif deskritt fl-Appendiċi 4, għall-kulturi u l-ittestjar b'L. gibba.

24.

Il-midjum Steinberg, kif deskritt fl-Appendiċi 4, huwa xieraq ukoll għal L. minor, iżda jista' jintuża wkoll għal L. gibba sakemm jiġu sodisfatti l-kriterji ta' validità.

Soluzzjonijiet tal-ittestjar

25.

Is-soluzzjonjiet tal-ittestjar, ġeneralment jiġu ppreparati bid-dilwizzjoni ta' soluzzjoni ewlenija. Is-soluzzjonijiet ewlenin tas-sustanza kimika tat-test normalment jiġu ppreparati billi tinħall is-sustanza kimika fil-midjum tat-tkabbir.

26.

Il-konċentrazzjoni l-iktar ogħla ttestjata tas-sustanza kimika tat-test ma għandhiex normalment taqbeż is-solubbiltà fl-ilma tas-sustanza kimika f'kundizzjonijiet tat-test. Madankollu għandu jiġi nnotat li Lemna spp. jżommu f'wiċċ l-ilma u jaf ikunu esposti għal sustanzi kimiċi li jinġabru bejn l-ilma u l-arja (eż. sustanzi kimiċi li ma tantx jinħallu fl-ilma jew idrofobiċi jew sustanzi kimiċi tensjoattivi). F'tali ċirkostanzi, sejjer ikun hemm espożizzjoni mill-materjal minbarra fis-soluzzjoni u l-konċentrazzjonijiet tat-test jistgħu, skont il-karatteristiċi tas-sustanza kimika tat-test, jaqbżu, is-solubbiltà fl-ilma. Għas-sustanzi kimiċi tat-test ta' solubbiltà fl-ilma baxxa, jaf ikun meħtieġ li tiġi ppreparata soluzzjoni ewlenija kkonċentrata jew dispersjoni tas-sustanza kimika permezz ta' solvent organiku jew aġent dispersiv sabiex tiġi ffaċilitata ż-żieda ta' kwantitajiet preċiżi tas-sustanza kimika tat-test mal-midjum tat-test u tiġi megħjuna fid-dispersjoni u x-xoljiment tagħha. Għandu jsir kull sforz possibbli biex jiġi evitat l-użu ta' tali materjali. Ma għandu jkun hemm ebda fitotossiċità li tirriżulta mill-użu ta' solventi jew aġenti dispersivi awżiljarji. Pereżempju, solventi li jintużaw b'mod komuni li ma jikkawżawx fitotossiċità fil-konċentrazzjonijiet sa 100 μl//l jinkludu aċetun u dimetilformamid. Jekk jintuża solvent jew aġent dispersiv, għandha tiġi rrapportata l-konċentrazzjoni finali tiegħu li għandha tinżamm kemm jista' jkun baxxa (≤ 100 μl/l), u t-trattamenti u l-kontrolli kollha għandu jkun fihom l-istess konċentrazzjoni ta' solvent jew aġent dispersiv. F'(8) ingħatat gwida ulterjuri dwar l-użu ta' aġenti dispersivi.

Gruppi tat-test u ta' kontroll

27.

Għarfien minn qabel tat-tossiċità tas-sustanza kimika tat-test għal Lemna, eż. minn test tas-sejba tal-medda, sejjer jgħin fl-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test xierqa. Fit-test finali tat-tossiċità, normalment għandu jkun hemm tal-inqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test irranġati f'serje ġeometrika. Preferibbilment il-fattur ta' separazzjoni bejn il-konċentrazzjonijiet tat-test ma għandhomx ikunu ikbar minn 3,2, iżda jista' jintuża valur ikbar fejn il-kurva tal-konċentrazzjoni/rispons hija dritta. Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. Għandhon jintużaw tal-inqas tliet repliki f'kull konċentrazzjoni tat-test.

28.

Fl-istabbiliment tal-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test (għas-sejba tal-medda u/jew għat-test finali tat-tossiċità), għandu jiġi kkunsidrat li ġej:

Biex tiddetermina ECx, il-konċentrazzjonijiet tat-test iridu jsostnu l-valur ECx sabiex tiżgura livell ta' kunfidenza adegwat. Pereżempju, jekk tkun qed tikkalkula l-EC50, l-iktar konċentrazzjoni għolja għandha tkun ikbar mill-valur tal-EC50. Jekk il-valur EC50 jinstab barra l-firxa ta' konċentrazzjonijiet tat-test, intervalli ta' kunfidenza assoċjati jkunu kbar u valutazzjoni xierqa tal-fit statistiku tal-mudell tista' ma tkunx possibbli,

Jekk l-għan huwa li jiġu stmati l-LOEC/NOEC, l-inqas konċentrazzjoni tat-test għandha tkun baxxa biżżejjed biex b'hekk it-tkabbir ma jkunx sinifikatament iktar baxx minn dak tal-kontroll. Barra minn hekk, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun għolja biżżejjed biex b'hekk it-tkabbir ikun ferm inqas milli fil-kontroll. Jekk dan ma jkunx il-każ, it-test għandu jiġi ripetut permezz ta' medda ta' konċentrazzjoni differenti (sakemm l-ogħla konċentrazzjoni tkun fil-limitu tas-solubbiltà jew il-konċentrazzjoni limitu meħtieġa massima, eż. 100 mg/l).

29.

Kull test għandu jinkludi kontrolli li jikkonsistu mill-istess midjum ta' nutrijenti, in-numru ta' frondi u kolonji, il-kundizzjonijiet ambjentali u l-proċeduri bħar-reċipjenti tat-test iżda mingħajr is-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent jew aġent dispersiv awżiljari, għandu jiġi inkluż trattament ta' kontroll addizzjonali bis-solvent/aġent dispersiv preżenti fl-istess konċentrazzjoni bħar-reċipjenti bis-sustanza kimika tat-test. In-numru ta' repliki tar-reċipjenti ta' kontroll (u r-reċipjenti tas-solventi, jekk ikun applikabbli) għandu tal-inqas ikun l-istess, u idealment darbtejn, in-numru ta' reċipjenti użati għal kull konċentrazzjoni tat-test.

30.

Jekk ma tkunx meħtieġa determinazzjoni tal-NOEC, id-disinn tal-ittestjar jista' jiġi mmodifikat biex jiżdied in-numru ta' konċentrazzjonijiet u jitnaqqas in-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni. Madankollu, in-numru ta' repliki ta' kontroll għandu jkun tal-inqas tlieta.

Espożizzjoni

31.

Kolonji li jikkonsistu minn 2 sa 4 frondi viżibbli huma ttrasferiti mill-kultura tal-inokulu u jiġu assenjati b'mod każwali għar-reċipjenti tat-test f'kundizzjonijiet asettiċi. Kull reċipjent tat-test għandu jkun fih total ta' 9 sa 12-il frond. In-numru ta' frondi u kolonji għandu jkun l-istess f'kull reċipjent tat-test. L-esperjenza miksuba b'dan il-metodu u d-dejta tar-ring test indikaw li l-użu ta' tliet repliki għal kull trattament, b'kull replikat li fil-bidu jkun fih 9 sa 12-il frond, huwa biżżejjed biex jiġu skoperti differenzi fit-tkabbir ta' madwar 4 sa 7 % tal-inibizzjoni kkalkolata mir-rata ta' tkabbir (10 sa 15 % ikkalkolata mir-rendiment) bejn it-trattamenti (7).

32.

Huwa meħtieġ disinn aleatorju għal-lokazzjoni tar-reċipjenti tat-test fl-inkubatur biex titnaqqas l-influwenza tad-differenzi spazjali fl-intensità tad-dawl jew it-temperatura. Huma meħtieġ ukoll disinn ibblokkjat jew ripożizzjonament każwali tar-reċipjenti meta jsiru l-osservazzjonijiet (jew ripożizzjonament iktar frekwenti).

33.

Jekk test tal-istabbiltà preliminari juri li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tistax tinżamm (jiġifieri l-konċentrazzjoni mkejla taqa' taħt it-80 % tal-konċentrazzjoni inizjali mkejla) matul id-durata tat-test (7 ijiem), huwa rakkomandat reġim tal-ittestjar semistatiku. F'dan il-każ, il-kolonji għandhom ikunu esposti għal testijiet li għadhom kif jiġu ppreparati u s-soluzzjonijiet ta' kontroll f'tal-anqas żewġ okkażjonijiet matul it-test (eż. il-jiem 3 u 5). Il-frekwenza ta' espożizzjoni għal midjum ġdid sejra tiddependi fuq l-istabbilità tas-sustanza kimika tat-test; frekwenza ogħla jaf tkun meħtieġa biex jinżammu konċentrazzjonijiet viċin għall-kostanti ta' sustanzi kimiċi volatili u mhux stabbli ħafna. F'xi ċirkostanzi, jaf tkun meħtieġa proċedura bi fluss kontinwu (8)(10).

34.

Ix-xenarju ta' espożizzjoni permezz ta' applikatur tal-weraq (sprej) mhuwiex kopert f'dan il-metodu ta' ttestjar; minflok, ara (11).

Kundizzjonijiet tal-inkubazzjoni

35.

Dawl kontinwu fluworexxenti sħun jew frisk għandu jintuża biex jipprovdi intensità tad-dawl magħżula minn għażla ta' 85-135 μE · m– 2s– 1 meta mkejjel f'radjazzjoni attiva fotosintetika (400-700 nm) f'punti fl-istess distanza mis-sors ta' dawl bħall-frondi Lemna (ekwivalenti għal 6 500-10 000 lux). Kwalunkwe differenza mill-intensità tad-dawl magħżula fl-erja tal-ittestjar ma għandhiex taqbeż il-medda ta' ± 15 %. Il-metodu ta' detezzjoni u kejl, b'mod partikolari t-tip ta' senser, sejjer jaffettwa l-valur imkejjel. Is-sensers sferiċi (li jirrispondu għad-dawl minn angoli 'l fuq u taħt il-pjan ta' kejl) u s-sensers ‘cosine’ (li jirrispondu għad-dawl mill-angoli kollha 'l fuq mill-pjan ta' kejl) huma ppreferuti minn sensers unidirezzjonali, u ser jagħtu riżultati tal-qari ogħla, għal sors ta' dawl b'ħafna punti tat-tip deskritt hawnhekk.

36.

It-temperatura fir-reċipjenti tat-test għandha tkun ta' 24 ± 2 °C. Il-pH tal-midjum ta' kontroll ma għandux jiżdied b'aktar minn 1 5 unitajiet matul it-test. Madankollu, devjazzjoni ta' iktar minn 1,5 unità ma tinvalidax it-test meta jkun jista' jintwera li ġew sodisfatti l-kriterji ta' validità. Hija meħtieġa iktar attenzjoni f'każijiet speċjali bħal meta jiġu ttestjati sustanzi kimiċi mhux stabbli jew metalli. Ara (8) għal gwida ulterjuri.

Perjodu

37.

It-test jintemm 7 ijiem wara li l-pjanti jiġu ttrasferiti fir-reċipjenti tat-test.

Kejliet u determinazzjonijiet analitiċi

38.

Fil-bidu tat-test, jingħadd u jiġi rreġistrat in-numru ta' frondi fir-reċipjenti tat-test, filwaqt li jiġi żgurat li jittieħed kont tal-frondi viżibbli b'mod evidenti li jisporġu 'l barra. In-numru ta' frondi li jidher normali jew anormali, jeħtieġ li jiġi ddeterminat fil-bidu tat-test, tal-inqas darba kull 3 ijiem matul il-perjodu ta' espożizzjoni (jiġifieri tal-inqas 2 okkażjonijiet matul il-perjodu ta' 7 ijiem) u fi tmiem ti-test. Għandhom jiġu nnotati l-bidliet fl-iżvilupp tal-impjant, eż. d-daqs tal-frond, id-dehra, l-indikazzjoni ta' nekrożi, klorożi jew gibbożità, it-tifrik ta' kolonja jew it-telf taż-żamma fil-wiċċ, u fit-tul u d-dehra tal-għeruq. Għandhom jiġu nnotati wkoll karatteristiċi sinifikanti tal-midjum tat-test (eż. preżenza ta' materjal mhux maħlul, tkabbir ta' algi fir-reċipjenti tat-test).

39.

Minbarra d-determinazzjoni tan-numru ta' frondi matul it-test, huma vvalutati l-effetti tas-sustanza kimika tat-test fuq wieħed (jew iktar) mill-varjabbli ta' kejl li ġejjin:

(i)

erja totali tal-frond,

(ii)

piż xott,

(iii)

piż frisk.

40.

L-erja totali tal-frondi għandha vantaġġ, li tista' tiġi ddeterminata għal kull reċipjent tat-test u ta' kontroll fil-bidu, matul u fi tmiem it-test. Fil-bidu tal-ittestjar għandu jiġi ddeterminat il-piż xott jew frisk minn kampjun tal-kultura tal-inokulu li jirrappreżenta x'jintuża fil-bidu tat-test, u fi tmiem l-ittestjar bil-materjal tal-impjant minn reċipjent tat-test u ta' kontroll. Jekk ma titkejjilx l-erja tal-frond, il-piż xott huwa ppreferut mill-piż frisk.

41.

L-erja totali tal-frond, il-piż xott u l-piż frisk jistgħu jiġu ddeterminati kif ġej:

(i)

Erja totali tal-frond: L-erja totali tal-frond tal-kolonji kollha tista' tiġi ddeterminata b'analiżi tal-immaġnijiet. Tista' tittieħed il-forma tar-reċipjent tat-test u l-pjanti permezz ta' kamera bil-vidjo (jiġifieri billi r-reċipjent jitqiegħed fuq kaxxa tad-dawl) u l-immaġni li tirriżulta tiġi diġitizzata. Bil-kalibrazzjoni b'forom ċatti ta' erja magħrufa, tista' tiġi ddeterminata l-erja totali tal-frond f'reċipjent tat-test. Wieħed għandu joqgħod attent biex jeskludi interferenza kkawżata mir-rimm tar-reċipjent tat-test. Approċċ alternattiv iżda iktar impenjattiv huwa li jiġu fotokopjati r-reċipjenti tat-test u l-pjanti, tinqata' l-forma li tirriżulta tal-kolonji u tiġi ddeterminata l-erja tagħhom permezz ta' analizzatur tal-erja tal-weraq jew karta tal-graffs. Jaf ikunu xierqa wkoll tekniki oħra (eż. il-proporzjon tal-piż tal-karta bejn l-erja tas-siluwett tal-kolonji u l-unità tal-erja).

(ii)

Piż xott: Il-kolonji kollha jinġabru minn kull wieħed mir-reċipjenti tat-test u jitlaħalħu b'ilma distillat jew dejonizzat. Dawn jiġu xxugati biex jitneħħa l-ilma żejjed u mbagħad jitnixxfu f'60 °C sa piż kostanti. Għandu jiġi inkluż kwalunkwe framment tal-għeruq. Il-piż xott għandu jiġi espress għal preċiżjoni ta' mill-anqas 0,1 mg.

(iii)

Piż frisk: Il-kolonji kollha huma ttrasferiti għal tubi ta' polistiren (jew materjal inerti ieħor) li ntiżnu minn qabel b'toqob żgħar (1 mm) fil-qigħan tondi. Imbagħad it-tubi jiġu ċentrifugati f'3 000 rpm għal 10 minuti f'temperatura tal-ambjent. Tubi, li fihom kolonji li issa nixfu, jerġgħu jintiżnu u l-piż frisk jiġi kkalkolat billi jitnaqqas il-piż tat-tubu vojt.

Frekwenza tal-kejliet u d-determinazzjonijiet analitiċi

42.

Jekk jintuża disinn ta' test statiku, għandha titkejjel il-pH ta' kull trattament fil-bidu u fi tmiem it-test. Jekk jintuża disinn tat-test semistatiku, il-pH għandha titkejjel f'kull lott ta' soluzzjoni tat-test ‘ġdid’ qabel kull tiġdid u anki fis-soluzzjonijiet korrispondenti ‘użati’.

43.

L-intensità tad-dawl għandha titkejjel fil-kompartiment, l-inkubatur jew il-kamra tat-tkabbir f'punti li jinsabu fl-istess distanza mis-sors tad-dawl bħall-frondi Lemna. Il-kejliet għandhom isiru tal-inqas darba matul it-test. It-temperatura tal-midjum f'reċipjent surrogat miżmum fl-istess kundizzjonijiet fil-kompartiment tat-tkabbir, l-inkubatur jew il-kamra għandha tiġi rreġistrata tal-inqas kuljum.

44.

Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test huma ddeterminati f'intervalli xierqa. F'testijiet statiċi, ir-rekwiżit minimu huwa li jiġu ddeterminati l-konċentrazzjonijiet fil-bidu u fi tmiem it-test.

45.

F'testijiet semistatiċi li fihom il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx mistennija li tibqa' fi ħdan l-± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali, huwa meħtieġ li jiġu analizzati s-soluzzjonijiet tat-test li għadhom kif jiġu ppreparati u l-istess soluzzjonijiet f'kull tiġdid (ara l-paragrafu 33). Madankollu, għal dawk it-testijiet fejn il-konċentrazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza kimika tat-test hija fi ħdan l-± 20 % tan-nominali iżda fejn tista' tingħata biżżejjed evidenza biex jintwera li l-konċentrazzjonijiet inizjali huma repetibbli u stabbli (jiġifieri fi ħdan il-medda 80 — 120 % tal-konċentrazzjoni inizjali), id-determinazzjonijiet kimiċi jistgħu jitwettqu biss fuq l-ogħla jew l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test. Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test qabel it-tiġdid għandha ssir biss fuq reċipjent tar-replikat wieħed f'kull konċentrazzjoni tat-test (jew il-kontenut tar-reċipjenti miġbura mir-replikat).

46.

Jekk jintuża test bi fluss kontinwu, reġim ta' kampjunar simili għal dak deskritt għat-testijiet semistatiċi, inkluż analiżi fil-bidu, fin-nofs u fit-tmiem it-test, huwa xieraq, iżda l-kejl ta' soluzzjonijiet użati mhuwiex xieraq f'dan il-każ. F'dan it-tip ta' test, ir-rata ta' fluss tad-dilwent u s-sustanza kimika tat-test jew is-soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test għandhom jiġu ċċekkjati kuljum.

47.

Jekk ikun hemm evidenza li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika li qiegħda tiġi ttestjata nżammet b'mod sodisfaċenti fi ħdan il-konċentrazzjoni ta' ± 20 % tal-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla matul it-test, l-analiżi tar-riżultati tista' tkun ibbażata fuq valuri inizjali nominali jew imkejla. Jekk id-devjazzjoni mill-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla ma tkunx fi ħdan il-medda ta' ± 20 %, l-analiżi tar-riżultati għandha tkun ibbażata fuq il-konċentrazzjoni medja ġeometrika matul l-espożizzjoni jew il-mudelli li jiddeskrivu t-tnaqqis tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (8).

Test tal-limitu

48.

F'ċerti ċirkostanzi, eż. meta test preliminari jindika li s-sustanza kimika tat-test ma għandha ebda effetti tossiċi f'konċentrazzjonijiet sa 100 mg/l jew sal-limitu ta' solubbiltà tagħha fil-midjum tat-test (irrispettivament minn liema huwa l-inqas), jista' jsir test tal-limitu li jinvolvi tqabbil tar-risponsi fi grupp ta' kontroll u grupp ta' trattament partikolari (100 mg/l jew konċentrazzjoni daqs il-limitu ta' solubbiltà). Huwa rakkomandat ħafna li dan jiġi appoġġjat minn analiżi tal-konċentrazzjoni tal-espożizzjoni. Japplikaw il-kundizzjonijiet tat-test u l-kriterji ta' validità deskritti preċedentement kollha għal test tal-limitu, bl-eċċezzjoni li n-numru ta' repliki tat-trattament għandhom jiġu dduplikati. It-tkabbir fil-grupp ta' kontroll u trattament jista' jiġi analizzat permezz ta' test tal-istatistika biex jitqabblu l-midjums, eż. Test-t ta' Student.

DEJTA U RAPPORTAR

Ħin għall-irdoppjar

49.

Biex jiġi ddeterminat il-ħin għall-irdoppjar (Td) tan-numru ta' frondi u l-konformità ma' dan il-kriterju ta' validità mill-istudju (paragrafu 12), tintuża l-formola li ġejja b'dejta miksuba mir-reċipjenti ta' kontroll:

Td = ln 2/μ

fejn μ hija r-rata ta' tkabbir speċifika medja ddeterminata kif deskritt fil-paragrafi 54-55.

Varjabbli ta' rispons

50.

Il-fini tat-test huwa li jiddetermina l-effetti tas-sustanza kimika tat-test fuq it-tkabbir veġetattiv ta' Lemna. Dan il-Metodu ta' Ttestjar jiddeskrivi żewġ fatturi ta' rispons, peress li ġurisidizzjonijiet differenti għandhom preferenzi u ħtiġijiet regolatorji differenti. Sabiex ir-riżultati tat-test ikunu aċċettabbli fil-ġurisdizzjonijiet kollha, l-effetti għandhom jiġu evalwati permezz taż-żewġ varjabbli tar-rispons (a) u (b) deskritti hawn taħt.

(a)

Rata ta' tkabbir speċifika medja: dan il-varjabbli ta' rispons huwa kkalkolat fuq il-bażi tal-bidliet fil-logaritmi tan-numru ta' frondi, u barra minn hekk, fuq il-bażi tal-bidliet fil-logaritmi ta' parametru ta' kejl ieħor (erja totali tal-frondi, piż xott jew piż frisk) maż-żmien (espress għal kull jum) fil-kontrolli u kull grupp ta' trattament. Xi drabi jissejjaħ bħala r-rata ta' tkabbir relattiva (12).

(a)

Rendiment: dan il-varjabbli ta' rispons huwa kkalkolat fuq il-bażi tal-bidliet fin-numru ta' frondi, u barra minn hekk, fuq il-bażi tal-bidliet fil-parametru ta' kejl ieħor (erja totali tal-frondi, piż xott jew piż frisk) fil-kontrolli u f'kull grupp ta' trattament sa tmiem it-test.

51.

Għandu jiġi nnotat li l-valuri tat-tossiċità kkalkolati permezz ta' dawn iż-żewġ varjabbli ta' rispons ma jistgħux jitqabblu u din id-differenza għandha tiġi rikonoxxuta meta jintużaw ir-riżultati tat-test. Valuri ECx ibbażati fuq rata medja ta' tkabbir speċifiku (ErCx) ikunu ġeneralment ogħla minn riżultati bbażati fuq ir-rendiment (EyCx) jekk il-kundizzjonijiet tat-test ta' dan il-Metodu ta' ttestjar jiġu rrispettati, minħabba l-bażi matematika tal-approċċi rispettivi. Dan ma għandux jiġi interpretat bħala d-differenza fis-sensittività bejn iż-żewġ varjabbli ta' rispons, iżda sempliċement li li l-valuri huma matematikament differenti. Il-kunċett ta' rata ta' tkabbir speċifika medja huwa bbażat fuq il-mudell ta' tkabbir esponenzjali tad-duckweed f'kulturi mhux limitati, fejn it- tossiċità hija stmata abbażi tal-effetti fuq ir-rata ta' tkabbir, mingħajr ma tiddependi fuq il-livell assolut tar-rata ta' tkabbir speċifika tal-kontroll, il-pendil tal-kurva tal-konċentrazzjoni/rispons jew fuq id-durata tat-test. B'kuntrast, ir-riżultati bbażati fuq il-varjabbli tar-rispons tar-rendimentjiddependu fuq dawn il-varjabbli l-oħra kollha. EyCx hija dipendenti fuq ir-rata speċifika ta' tkabbir tal-ispeċje tad-duckweed użata fit-test u fuq ir-rata massima speċifika ta' tkabbir li tista' tvarja bejn speċi jew anki kloni differenti. Dan ir-rispons varjabblima għandux jintuża għat-tqabbil tas-sensittività għat-tossikanti fost l-ispeċijiet ta' duckweedjew anki kloni differenti. Filwaqt li l-użu tar-rata ta' tkabbir speċifika għall-istima tat-tossiċità hija xjentifikament ppreferuta, l-istimi tat-tossiċità ibbażati fuq ir-rendiment huma inklużi wkoll f'dan il-Metodu ta' Ttestjar biex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti regolatorji attwali f'xi ġurisdizzjonijiet.

52.

L-istimi tat-tossiċità għandhom ikunu bbażati fuq in-numru ta' frondi u fuq varjabbli ta' kejl addizzjonali wieħed (erja totali tal-frond, piż xott jew piż frisk) peress li xi sustanzi kimiċi jistgħu jaffettwaw varjabbli ta' kejl oħra ħafna iktar min-numru ta' frondi. L-effett ma jiġix identifikat bil-kalkolu tan-numru ta' frondi biss.

53.

In-numru ta' frondi, kif ukoll kwalunkwe varjabbli ta' kejl irreġistrat ieħor, jiġifieri l-erja totali tal-frondi, il-piż xott jew il-piż frisk, huma tabulati flimkien mal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għal kull okkażjoni ta' kejl. Analiżi tad-dejta sussegwenti eż. biex tikkalkula LOEC, NOEC jew ECx għandhom ikunu bbażati fuq il-valuri għar-repliki individwali u mhux fuq medji kkalkulati għal kull grupp ta' trattament.

Rata ta' tkabbir speċifika medja

54.

Ir-rata ta' tkabbir speċifika medja għal perjodu speċifiku hija kkalkolata bħala ż-żieda logaritmika fil-varjabbli tat-tkabbir — in-numru tal-frondi u varjabbli ta' kejl ieħor (erja totali tal-frondi, piż xott jew piż frisk) — permezz tal-formola ta' hawn taħt għal kull replikat ta' kontroll u t-trattamenti:

Formula

fejn:

:

μi-j

:

rata ta' tkabbir speċifika medja mill-ħin i sa j

:

Ni

:

varjabbli ta' kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f'ħin i

:

Nj

:

varjabbli ta' kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f'ħin j

:

t

:

perjodu ta' ħin minn i sa j

Għal kull grupp ta' trattament u kull grupp ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rata ta' tkabbir flimkien mal-istimi tal-varjanza.

55.

Ir-rata ta' tkabbir speċifika medja għandha tiġi kkalkolata għall-perjodu ta' ttestjar kollu (il-ħin ‘i’ fil-formola ta' hawn fuq huwa l-bidu tat-test u l-ħin ‘j’ huwa t-tmiem tat-test). Għal kull konċentrazzjoni tat-test u ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rata ta' tkabbir speċifika medja flimkien mal-istimi tal-varjanza. Barra minn hekk, għandha tiġi vvalutata r-rata ta' tkabbir skont is-sezzjoni sabiex jiġu evalwati l-effetti tas-sustanza kimika tat-test li jseħħu matul il-perjodu ta' espożizzjoni (eż. billi jiġu spezzjonati l-kurvi ta' tkabbir ittrasformati mil-log). Differenzi sostanzjali bejn ir-rata ta' tkabbir skont is-sezzjoni u r-rata ta' tkabbir medja jindikaw devjazzjoni minn tkabbir esponenzjali kostanti u li hija ggarantita eżaminazzjoni mill-qrib tal-kurvi ta' tkabbir. F'dan il-każ, approċċ konservattiv ikun li jitqabblu rati ta' tkabbir speċifiċi minn kulturi ttrattati matul il-perjodu tal-ħin tal-inibizzjoni massima għal dawk għall-kontrolli matul l-istess perjodu ta' żmien.

56.

Persentaġġ ta' inibizzjoni tar-rata ta' tkabbir (Ir) jista' jiġi kkalkulat fuq kull konċentrazzjoni tat-test (grupp ta' trattament) bil-formula li ġejja:

Formula

fejn:

:

% Ir

:

inibizzjoni perċentwali fir-rata ta' tkabbir speċifika medja;

:

μC

:

valur medju għal μ fil-kontroll

:

μT

:

valur medju għal μ fil-grupp ta' trattament

Rendiment

57.

L-effetti fuq ir-rendiment huma ddeterminati abbażi ta' żewġ varjabbli ta' kejl, in-numru ta' frondi u varjabbli ta' kejl ieħor (erja totali tal-frond, piż xott jew piż frisk) preżenti f'kull reċipjent tat-test fil-bidu u fi tmiem it-test. Għal piż xott jew piż frisk, il-bijomassa tal-bidu hija ddeterminata abbażi ta' kampjun tal-frondi meħud mill-istess lott użat biex jiġu inokulati r-reċipjenti tat-test (ara l-paragrafu 20). Għal kull konċentrazzjoni tat-test u ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rendiment flimkien mal-istimi tal-varjanza. L-inibizzjoni perċentwali medja fir-rendiment (%Iy) tista' tiġi kkalkolata għal kull grupp ta' trattament kif ġej:

Formula

fejn:

:

% Iy

:

tnaqqis perċentwali fir-rendiment

:

bC

:

bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu għall-grupp ta' kontroll

:

bT

:

bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu fil-grupp ta' trattament

Ipplottjar tal-kurvi konċentrazzjoni rispons

58.

Għandhom jiġu pplottjat kurvi konċentrazzjoni rispons relatati mal-inibizzjoni perċentwali tal-varjabbli ta' rispons (Ir, jew Iy ikkalkolati kif indikati fil-paragrafu 56 jew 57) u l-konċentrazzjoni tal-log tas-sustanza kimika tat-test.

Estimi ta' ECx

59.

Estimi ta' ECx (eż. EC50) għandhom dejjem ikunu bbażati kemm fuq ir-rata medja ta' tkabbir speċifiku (ErCx) kif ukoll fuq ir-rendiment (EyCx), u t-tnejn li huma għandhom ikunu bbażati fuq l-għadd tal-frondi u varjabbli ieħor ta' kejl (erja totali ta' frond, piż niexef, jew piż frisk). Dan huwa minħabba li hemm sustanzi kimiċi tat-test li jaffettwaw in-numru ta' frondi u varjabbli ta' kejl b'mod differenti. Il-parametri ta' tossiċità mixtieqa huma għalhekk erba' valuri ECx għal kull livell ta' inibizzjoni kkalkulat: ErCx (numru ta' frond); ErCx (area totali ta' frond, piż niexef, jew piż frisk); EyCx (numru ta' frond); u EyCx (area totali ta' frond, piż niexef, jew piż frisk).

Proċeduri ta' statistika

60.

L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons b'analiżi tar-rigressjoni. Huwa possibbli li tintuża rigressjoni lineari ppeżata wara li tkun twettqet trasformazzjoni linearizzanti tad-dejta dwar ir-rispons — eż. f'unitajiet probit jew logit jew Weibull (13), iżda proċeduri ta' rigressjoni mhux lineari huma tekniki ppreferuti li jimmaniġġjaw aħjar irregolaritajiet inevitabbli fid-dejta u devjazzjonijiet minn distribuzzjonijiet uniformi. Meta jkunu viċin iż-żero jew inibizzjoni totali, tali irregolaritajiet jistgħu jitkabbru bit-trasformazzjoni, u dan jinterferixxi mal-analiżi (13). Għandu jiġi nnotat li metodi standard ta' analiżi permezz ta' trasformati ta' probit, logiit jew Weibull huma maħsuba għall-użu f'dejta kwantali (eż. mortalità jew sopravivenza), u għandhom jiġu mmodifikati biex jakkomodaw id-dejta dwar ir-rata ta' tkabbir jew ir-rendiment. Proċeduri speċifiċi għad-determinazzjoni ta' valuri ECx minn data kontinwa jistgħu jinstabu f'(14), (15), u (16).

61.

Għal kull varjabbli ta' rispons li jiġi analizzat, għandha tintuża r-relazzjoni konċentrazzjoni-rispons biex jiġu kkalkulati l-estimi ta' punti ta' valuri ECx. Fejn ikun possibbli, għandhom jiġu stmati l-limiti ta' kunfidenza ta' 95 % għal kull stima. Kemm toqgħod tajjeb id-dejta dwar ir-rispons għall-mudell ta' rigressjoni għandu jiġi vvalutat grafikament jew statistikament. L-analiżi tar-rigressjoni għandha ssir permezz ta' risponsi tar-repliki individwali, mhux il-medji tal-grupp ta' trattament.

62.

Stimi EC50 u limiti ta' kunfidenza jistgħu wkoll jiġi miksuba bl-użu ta' interpolazzjoni lineari b'sekwenza ta' istruzzjonijiet inizjali (17), jekk il-mudelli/metodi ta' regressjoni aċċessibli m'humiex xierqa għad-data.

63.

Għal stima tal-LOEC u għalhekk tal-NOEC, huwa meħtieġ li jitqabblu l-medji ta' trattament permezz ta' analiżi tat-tekniki ta' varjanza (ANOVA). Il-medja għal kull konċentrazzjoni għandha mbagħad titqabbel mal-medja ta' kontroll permezz ta' tqabbil multiplu xieraq jew test ta' tendenza. It-test ta' Dunnett jew ta' Williams jista' jkun utili (18)(19)(20)(21). Huwa meħtieġ li jiġi vvalutat jekk treġġix is-suppożizzjoni tal-omoġeneità ta' varjanza ta' ANOVA. Din il-valutazzjoni tista' titwettaq grafikament jew b'test formali (22). Testijiet xierqa huma Levene jew Bartlett. Jekk is-suppożizzjoni ta' omoġeneità tal-varjanzi ma tkunx issodisfata, din kultant tista' tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni logaritmika tad-dejta. Jekk l-eteroġeneità tal-varjanza hija estrema u ma tistax tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni, għandha tiġi kkunsidrata analiżi b'metodi bħat-test ta' tendenza rigressiva ta' Jonckheere. F'(16) tista' tinstab gwida addizzjonali li tiddetermina l-NOEC.

64.

Żviluppi xjentifiċi riċenti wasslu għal rakkomandazzjoni biex jiġi abbandunat il-kunċett tal-NOEC u minflok jinbidel bi stimi ECx ta' punti bbażati fuq regressjoni. Valur xieraq għal x ma ġiex stabbilit għal dan it-test ta' Lemna. Madankollu, sensiela ta' minn 10 sa 20 % tidher xierqa (tiddependi fuq il-varjabbli ta' rispons magħżul), u preferibbilment l-EC10 u l-EC20 għandhom jiġu rrapurtati t-tnejn li huma.

Rapportar

65.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi dan li ġej:

 

Sustanza kimika tal-ittestjar:

natura fiżika u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti, inkluż il-limitu tas-solubbiltà fl-ilma;

dejta ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (eż. Numru CAS), inkluż il-purità (impuritajiet).

 

Speċijiet tat-test:

isem xjentifiku, klonu (jekk ikun magħruf) u sors.

 

Kundizzjonijiet tal-ittestjar:

proċedura tal-ittestjar użata (statika, semistatika jew bi fluss kontinwu);

id-data tal-bidu tal-ittestjar u d-durata tiegħu;

midjum tat-test;

deskrizzjoni tad-disinn sperimentali: reċipjenti u għotjien tat-test, volumi ta' soluzzjonijiet, numru ta' kolonji u frondi għal kull reċipjent tat-test fil-bidu tat-test;

il-konċentrazzjonijiet tat-test (nominali u mkejla kif xierqa) u n-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni;

metodi ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u tat-test inkluż l-użu ta' kwalunkwe solvent jew aġent dispersiv;

temperatura matul it-test;

sors ta' dawl, intensità tad-dawl u omoġenità;

valuri tal-pH tal-midjums tat-test u ta' kontroll;

konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test u l-metodu tal-analiżi b'dejta ta' valutazzjoni tal-kwalità xierqa (studji ta' validazzjoni, devjazzjonijiet standard jew limiti ta' kunfidenza tal-analiżijiet);

metodi għad-determinazzjonijiet tan-numru ta' frondu u varjabbli ta' kejl oħrajn, eż. piż xott, piż frisk jew erja tal-frond;

id-devjazzjonijiet kollha minn dan il-Metodu ta' Ttestjar.

 

Riżultati:

dejta mhux ipproċessata: numru ta' frondi u varjabbli ta' kejl oħra f'kull reċipjent tat-test u ta' kontroll f'kull osservazzjoni u okkażjoni ta' analiżi;

medji u devjazzjonijiet standard għal kull varjabbli ta' kejl;

kurvi ta' tkabbir għal kull konċentrazzjoni tat-test (rakkomandati b'varjabbli ta' kejl ittrasformati bil-log, ara l-paragrafu 55);

ħin għall-irdoppjar/rata ta' tkabbir fil-kontroll abbażi tan-numru ta' frondi;

il-varjabbli ta' rispons ikkalkolati għal kull replikat tat-trattament, bil-valuri medji u l-koeffiċjenti ta' varjazzjoni għar-repliki;

rappreżentazzjoni grafika tar-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u l-effett;

stimi ta' punti ta' tmiem tossiċi għal varjabbli ta' rispons eż. EC50, EC10, EC20, u l-intervalli ta' kunfidenza assoċjati. Jekk ikunu kkalkolati, l-LOEC u/jew l-NOEC u l-metodi statistiċi użati għad-determinazzjoni tagħhom;

jekk tintuża ANOVA, id-daqs tal-effett li jista' jiġi skopert (eż. id-differenza l-inqas sinifikanti);

kwalunkwe stimulazzjoni ta' tkabbir misjuba fi kwalunkwe trattament;

kwalunkwe sinjal viżwali tal-fitotossiċità kif ukoll l-osservazzjonijiet tas-soluzzjonijiet tat-test;

diskussjoni tar-riżultati, inkluż kwalunkwe influwenza fuq l-eżitu tat-test li tirriżulta mid-devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta' Ttestjar.

LETTERATURA

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA — United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‘Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8pp.

(3)

AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

(4)

SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 — 120 pp.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.)

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(9)

Organizzazzjoni Internazzjonali għall-Istandardizzazzjoni (International Organization for Standardization.). ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 18. September 1977.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 — 359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

(13)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

(16)

OECD. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(22)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Appendiċi 1

Definizzjonijiet

Għall-finijiet ta' dan il-Metodu ta' Ttestjar jintużaw id-definizzjonijiet u l-abbrevazzjonijiet li ġejjin:

 

Il-bijomassa hija l-piż xott tal-materja ħajja preżenti f'popolazzjoni. F'dan it-test, is-surrogati għall-bijomassa, bħall-għadd ta' frondi jew l-erja tal-frondi, ġeneralment jitkejlu u għalhekk l-użu tat-terminu ‘bijomassa’ jirreferi għal dawn il-kejliet ta' surrogati wkoll.

 

Sustanza kimika tfisser sustanza jew taħlita.

 

Klorożi hija s-sfurija tat-tessut ta' frond.

 

Klonu huwa organiżmu jew ċellola li nħolqot minn individwu singolu b'riproduzzjoni asseswali. Għalhekk, l-individwi mill-istess klonu huma ġenetikament identiċi.

 

Kolonja tfisser aggregat ta' frondi ommijiet u bniet (ġeneralment 2 sa 4) imwaħħla ma' xulxin. Xi drabi jissejħu pjanta.

 

ECx hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test maħlula fil-midjum tat-test li tirriżulta f'tnaqqis ta' x % (eż. 50 %) fit-tkabbir ta' Lemna f'perjodu ta' espożizzjoni ddikjarat (li għandu jissemma b'mod espliċitu jekk ikun hemm devjazzjoni mid-durata tat-test kollu jew normali). Sabiex issir denotazzjoni li ma hijiex ambigwa ta' valur ta' EC li jidderiva mir-rata ta' tkabbir jew rendiment, is-simbolu ‘ErC’ huwa użat għar-rata ta' tkabbir u ‘EyC’ huwa użat għar-rendiment, segwit mill-varjabbli ta' kejl użat, eż. ErC (għadd ta' frond).

 

Bi fluss kontinwu huwa test fejn is-soluzzjonijiet tat-test jiġu ssostitwiti b'mod kontinwu.

 

Frond huwa struttura individwali/unika ‘qisha werqa’ ta' pjanta duckweed. Hija l-iżgħar unità, jiġifieri individwu, li jista' jirriproduċi.

 

Gibbożità tfisser frondi li huma mħattbin jew minfuħin.

 

Tkabbir hija żieda fil-varjabbli ta' kejl, eż. numru ta' frondi, piż xott, piż imxarrab, jew erja tal-frondi, matul il-perjodu tal-ittestjar.

 

Rata ta' tkabbir (rata ta' tkabbir speċifika medja) hija ż-żieda logaritmika fil-bijomassa matul il-perjodu ta' espożizzjoni.

 

Il-Konċentrazzjoni bl-Inqas Effett Osservat (LOEC) hija l-inqas konċentrazzjoni ttestjata li fiha s-sustanza kimika hija osservata li jkollha effett ta' tnaqqis statistikament sinifikanti fuq it-tkabbir (b'p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll, f'ħin ta' espożizzjoni partikolari. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tat-test kollha 'l fuq mil-LOEC għandu jkollhom effett dannuż ugwali jew ikbar minn dawk osservati fl-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jkunux jistgħu jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni sħiħa dwar kif intgħażlet l-LOEC (u għalhekk l-NOEC).

 

Varjabbli ta' kejl huma kwalunkwe tip ta' varjabbli li jitkejlu biex jiġi espress il-punt ta' tmiem tal-ittestjar permezz ta' varjabbli ta' rispons differenti wieħed jew iktar. F'dan il-metodu, in-numru ta' frondi, l-erja tal-frondi, il-piż frisk u l-piż xott huma varjabbli ta' kejl.

 

Monokultura hija kultura bi speċi ta' pjanta waħda.

 

Nekrożi huwa tessut ta' frond mejjet (jiġifieri abjad jew imxarrab fl-ilma).

 

Il-Konċentrazzjoni Bla Effett Osservat (NOEC) hija l-konċentrazzjoni tat-test eżattament taħt l-LOEC.

 

Fenotip huma l-karatteristiċi osservabbli ta' organiżmu ddeterminati mill-interazzjoni tal-ġeni tiegħu mal-ambjent tiegħu.

 

Il-varjabbli ta' rispons huma varjabbli għall-istima tat-tossiċità derivati minn kwalunkwe parametru mkejjel li jiddeskrivi l-bijomassa minn metodi differenti ta' kalkolu. Għal dan il-Metodu ta' Ttestjar, ir-rati ta' tkabbir u r-rendiment huma varjabbli ta' rispons derivati mill-varjabbli ta' kejl bħan-numru ta' frondi, l-erja tal-frondi, il-piż frisk jew il-piż xott.

 

Test semistatiku (tiġdid) huwa test fejn is-soluzzjoni tat-test tiġi sostitwita perjodikament f'intervalli speċifiċi matul it-test.

 

Test statiku huwa metodu ta' ttestjar mingħajr tiġdid tas-soluzzjoni tat-test matul it-test.

 

Sustanza kimika tat-test hija sustanza jew taħlita ttestjata matul dan il-metodu ta' ttestjar.

 

Punt ta' tmiem tat-test jiddeskrivi l-fattur ġenerali li sejjer jinbidel b'mod relattiv għall-kontroll mis-sustanza kimika tat-test bħala mira tat-test. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-punt ta' tmiem tal-ittestjar hija l-inibizzjoni li tista' tiġi espressa b'varjabbli ta' rispons differenti li huma bbażati fuq varjabbli ta' kejl wieħed jew iktar.

 

Midjum tat-test huwa midjum ta' tkabbir sintetiku komplut li fuqu jikbru l-pjanti tal-ittestjar meta esposti għas-sustanza kimika tat-test. Is-sustanza kimika tat-test sejra tinħall fil-midjum tat-test.

 

Rendiment huwa l-valur ta' varjabbli ta' kejl biex tiġi espressa l-bijomassa fi tmiem il-perjodu ta' espożizzjoni li minnu jitnaqqas il-varjabbli ta' kejl fil-bidu tal-perjodu ta' espożizzjoni.

Appendiċi 2

Deskrizzjoni ta' Lemna spp.

Il-pjanta akkwatika, li komunement tissejjaħ duckweed, Lemna spp., tagħmel parti mill-familja Lemnaceae li għandha numru ta' speċijiet mad-dinja kollha f'erba' ġeneri. Id-dehra u t-tassonomija differenti tagħhom ġew deskritt b'mod eżawrjenti (1)(2). Lemna gibba u L. minor huma speċijiet rappreżentattivi ta' erjas b'temperatura moderata u huma komunement użati għal testijiet ta' tossiċità. Iż-żewġ speċijiet għandhom fergħa (frond) diskojdi li żżomm ril-wiċċ jew mgħaddsa u għerq irqiq ħafna ħiereġ miċ-ċentru tal-wiċċ ta' isfel ta' kull frond. Lemna spp. rarament jipproduċu fjuri u l-pjanti jirriproduċu billi veġetattivament jipproduċu frondi ġodda (3). Meta mqabbla ma' pjanti li għandhom iktar żmien, iż-żgħar għandhom tendenza li jkunu iktar ċari, ikollhom għeruq iqsar u jikkonsistu minn tnejn sa tliet frondi b'qisien differenti. Id-daqs żgħir tal-Lemna, l-istruttura sempliċi, ir-riproduzzjoni asseswali u l-ħin ta' ġenerazzjoni qasir tagħha jagħmlu l-pjanti ta' dan il-ġeneru adattati ħafna għall-ittestjar fil-laboratorju (4)(5).

Minħabba l-varjazzjoni probabbli bejn l-ispeċijiet fis-sensittività, huma validi biss paraguni ta' sensittività fi ħdan speċi.

Eżempji ta' speċijiet ta' Lemna li ntużaw għall-ittestjar: Referenza għall-Ispeċijiet

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‘Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

 

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‘Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Sources of Lemna species

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Tel: +1-416-978-3641

Fax:+1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

United States

phone 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

SWEDEN

Tel: +46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

Germany

e-mail: lemna@uba.de

LETTERATURA

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Appendiċi 3

Żamma tal-kultura ewlenija

Koltivazzjonijiet ikkonċentrati jistgħu jiġu miżmuma f'temperaturi iktar baxxi (4-10 °C) għal żmien itwal mingħajr il-bżonn li jerġgħu jsiru mill-ġdid. Il-midjum ta' tkabbir ta' Lemna jista' jkun l-istess bħal dak għall-ittestjar iżda jistgħu jintużaw midjums rikki fin-nutrijenti oħra għall-kulturi ewlenin.

Perjodikament, numru ta' pjanti ħodor ċari, żgħar jitpoġġew f'kontenituri tal-kultura li fihom midjum ġdid permezz ta' teknika aseptika. Fil-kundizzjonijiet iktar kesħin issuġġeriti hawnhekk, jistgħu jitwettqu sottokulturi f'intervalli sa tliet xhur.

Għandhom jintużaw reċipjenti tal-kulturi tal-ħġieġ kimikament nodfa (maħsula bl-aċidu) u sterilizzati kif ukoll tekniki ta' mmanniġġar asettiċi. Fil-każ ta' kontaminazzjoni tal-kultura ewlenija, eż. b'algi jew fungi, huma meħtieġa passi biex jiġu eliminati l-organiżmi kontaminanti. Fil-każ ta' algi u l-biċċa l-kbira ta' organiżmi kontaminanti oħra, dan jista' jintlaħaq bl-isterilizzazzjoni tal-wiċċ. Jittieħed kampjun tal-materjal tal-pjanta kkontaminat u l-għeruq jinqatgħu. Il-materjal imbagħad jitħawwad bis-saħħa f'ilma nadif, segwit minn immersjoni f'soluzzjoni ta' 0,5 % (v/v) ipoklorit tas-sodju għal bejn 30 sekonda u 5 minuti. Imbagħad il-materjal tal-pjanta jitlaħlaħ b'ilma sterili u jiġi ttrasferit, bħala numru ta' lottijiet, f'reċipjenti ta' kulturi li fihom midjum tat-tkabbir frisk. Ħafna mill-frondi sejrin imutu bħala riżultat ta' dan it-trattament, speċjalment jekk jintużaw perjodi ta' espożizzjoni itwal, iżda xi wħud minn dawk li jibqgħu ħajjin ġeneralment sejrin ikunu ħielsa mill-kontaminazzjoni. Imbagħad dawn jistgħu jintużaw biex jerġgħu jinokulaw kulturi ġodda.

Appendiċi 4

Midjums

Huma rakkomandati midjums ta' tkabbir differenti għal L. minor u L. gibba. Għal L. minor, huwa rakkomandat midjum ta' Standard Svediż (SIS) immodifikat filwaqt li għal L. gibba, huwa rakkomandat midjum 20X AAP. Il-kompożizzjonijiet taż-żewġ midjums jingħataw hawn taħt. Meta jiġu ppreparati dawn il-midjums, għandhom jintużaw sustanzi kimiċi ta' reaġent jew grad analitiku u ilma dejonizzat.

Midjum ta' tkabbir Lemna ta' Standard Svediż (SIS)

Soluzzjonijiet ikkonċentrati I — V huma sterilizzati b'awtoklavazzjoni (120 °C, 15-il minuta) jew b'tisfija minn membrana (b'daqs tal-pori ta' ċirka 0,2 μm).

L-Istokk VI (u b'mod fakultattiv VII) jiġu sterlizzati bil-filtrazzjoni tal-membrana biss; dawn ma għandhiex issirilhom awtoklavazzjoni.

Soluzzjonijiet ewlenin sterilizzati għandhom jinħażnu f'kundizzjonijiet friski u fid-dlam. L-Istokkijiet I — V għandhom jintremew wara sitt xhur filwaqt li l-istokkijiet VI (u b'mod fakultattiv VII) għandhom żmien tal-ħżin ta' xahar.

Soluzzjoni ewlenija Nru

Sustanza

Konċentrazzjoni fis-soluzzjoni ewlenija

(g/l)

Konċentrazzjoni f'midjums imħejjija

(mg/ߦl)

Midjum imħejji

 

 

 

 

Element

Konċentrazzjoni

(mg/ߦl)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4. 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (bafer)

490

490

Biex tħejji litru ta' midjum SIS, dan li ġej jiżdied ma' 900 ml ta' ilma dejonizzat:

10 ml ta' soluzzjoni ewlenija I

5 ml ta' soluzzjoni ewlenija II

5 ml ta' soluzzjoni ewlenija III

5 ml ta' soluzzjoni ewlenija IV

1 ml ta' soluzzjoni ewlenija V

5 ml ta' soluzzjoni ewlenija VI

1 ml ta' soluzzjoni ewlenija VII (fakultattiva)

Nota: Soluzzjoni ewlenija oħra VII (buffer MOPS) jaf tkun meħtieġa għal ċerti sustanzi kimiċi tat-test (ara l-paragrafu 11).

Il-pH huwa aġġustat għal 6,5 ± 0,2 b'0,1 jew 1 mol HCl jew NaOH, u l-volum aġġustat għal litru b'ilma dejonizzat.

Midjum ta' tkabbir 20X AAP

Soluzzjonijiet ewlenin jiġu ppreparati f'ilma distillat jew dejonizzat sterilizzat.

Soluzzjonijiet ewlenin sterilizzati għandhom jinħażnu f'kundizzjonijiet friski u fid-dlam. F'dawn il-kundizzjonijiet, is-soluzzjonijiet ewlenin sejrin ikollhom żmien tal-ħżin ta' mill-anqas 6 — 8 ġimgħat.

Jiġu ppreparati ħames soluzzjonijiet ewlenin tan-nutrijenti (A1, A2, A3, B u C) għal midjum 20X — AAP, permezz ta' sustanzi kimiċi tal-grad tar-reaġenti. L-20 ml ta' kull soluzzjoni ewlenija tan-nutrijenti jiżdied ma' madwar 850 ml ta' ilma dejonizzat biex jiġi prodott il-midjum tat-tkabbir. Il-pH huwa aġġustat għal 7,5 ± 0,1 b'0,1 jew 1 mol HCl jew NaOH, u l-volum aġġustati għal litru b'ilma dejonizzat. Il-midjum imbagħad jiġi ffiltrat permezz ta' (madwar) 0,2 μm tal-filtru tal-membrani f'kontenitur sterilizzat.

Il-midjum tat-tkabbir maħsub għall-ittestjar għandu jiġi ppreparat 1-2 jum qabel l-użu biex iħalli lill-pH jistabbilizza. Il-pH tal-midjum tat-tkabbir għandu jiġi ċċekkjat qabel l-użu u jerġa' jiġi aġġustat biż-żieda ta' 0,1 jew 1 mol NaOH jew HCl kif deskritt hawn fuq.

Soluzzjoni ewlenija Nru

Sustanza

Konċentrazzjoni fis-soluzzjoni ewlenija

(g/ߦl) (*)

Konċentrazzjoni f'midjum ippreparat

(mg/ߦl)

Midjum imħejji

 

 

 

 

Element

Konċentrazzjoni

(mg/ߦl) (*)

A1

NaNO3

26

510

Na;N

190;84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2·O

1,4

30

K;P

9,4;3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

Midjum STEINBERG (Wara l-ISO 20079)

Konċentrazzjoni u soluzzjonijiet ewlenin

Il-midjum Steinberg immodifikat jintuża f'ISO 20079 għal Lemna minuri waħdu (peress li hemm Lemna minor biss huwa permess) iżda t-testijiet urew li jistgħu jintlaħqu riżultati tajba b'Lemna gibba wkoll.

Meta tipprepara l-midjum, għandhom jintużaw reaġent jew sustanzi kimiċi tal-grad analitiku u ilma dejonizzat.

Ipprepara l-midjum tal-nutrijenti mis-soluzzjonijiet ewlenin k jew il-midjum ikkonċentrat ta' 10 darbiet il-konċentrazzjoni massima tal-midjum mingħajr preċipitazzjoni.

Tabella 1

Midjum STEINBERG stabbilizzat bil-pH (immodifikat skont Altenburger)

Komponent

Midjum tan-nutrijent

Makroelementi

piż mol

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelementi

piż mol

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA Disodju-diidrat

372,24

1 500,00

4,03


Tabella 2

Soluzzjonijiet ewlenin (Makroelementi)

1.

Makroelementi (ikkonċentrati għal 50 darba)

g/l

Soluzzjoni ewlenija 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Soluzzjoni ewlenija 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Soluzzjoni ewlenija 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tabella 3

Soluzzjonijiet ewlenin (Mikroelementi)

2.

Mikrolementi (ikkonċentrati għal 1 000  darba)

mg/l

Soluzzjoni ewlenija 4:

H3BO3

120,0

Soluzzjoni ewlenija 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Soluzzjoni ewlenija 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Soluzzjoni ewlenija 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Soluzzjoni ewlenija 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA Disodju-diidrat

1 500,00

Is-soluzzjonijiet ewlenin 2 u 3 u b'mod separat 4 sa 7 jiistgħu jiġu raggruppati (filwaqt li jitqiesu l-konċentrazzjonijiet meħtieġa).

Għal żmien tal-ħżin itwal ittratta s-soluzzjonijiet ewlenin f'awtoklava f'121 °C għal 20 minuta jew inkella wettaq filtrazzjoni sterilizzata (0,2 μm). Għas-soluzzjoni ewlenija 8 hija rakkomandata ħafna filtrazzjoni sterili (0,2 μm).

Preparazzjoni tal-konċentrazzjoni finali tal-midjum STEINBERG (immodifikat)

Żid 20 ml ta' soluzzjonijiet ewlenin 1, 2 u 3 (ara t-tabella 2) ma' madwar 900 ml ta' ilma dejonizzat biex tevita preċipitazzjoni.

Żid 1,0 ml ta' soluzzjonijiet ewlenin 4, 5, 6, 7 u 8 (ara t-tabella 3).

Il-pH għandu jkun 5,5 +/– 0,2 (aġġusta b'żieda ta' volum minimizzat ta' soluzzjoni NaOH jew HCl).

Aġġusta bl-ilma għal 1 000 ml.

Jekk is-soluzzjonijiet ewlenin huma sterlizzati u jintuża ilma xieraq, ma tkun meħtieġa ebda sterilizzazzjoni ulterjuri. Jekk l-isterilizzazzjoni ssir bil-midjum finali, wara l-awtoklavazzjoni għandha tiżdied is-soluzzjoni ewlenija 8 (f'121 °C għal 20 min).

Il-preparazzjoni ta' midjum STEINBERG b'konċentrazzjoni ta' 10 darbiet (immodifikat) għal ħżin intermedju