ANNESS I

“ANNESS I

METODI TA’ TEĦID TA’ KAMPJUNI

1. SKOP U KAMP TA’ APPLIKAZZJONI

Il-kampjuni maħsubin għall-kontroll uffiċjali tal-għalf, għandhom jittieħdu skont il-metodi deskritti hawn taħt. Il-kampjuni akkwistati b’dan il-mod għandhom ikunu meqjusa bħala rappreżentattivi tal-porzjonijiet kampjunati.

L-għan tat-teħid tal-kampjuni rappreżentattiv hu li tinkiseb frazzjoni żgħira minn lott b’mod li meta tiġi ddeterminata xi karatteristika partikolari ta’ din il-frazzjoni, din tkun tirrappreżenta l-valur medju tal-karatteristika tal-lott. It-teħid ta’ kampjuni mil-lott isir billi ripetutament jittieħdu kampjuni inkrimentali minn għadd ta’ punti partikolari mil-lott. Dawn il-kampjuni inkrimentali jiġu kkumbinati billi jitħalltu b’tali mod li jiffurmaw kampjun aggregat biex minnu jiġu ppreparati kampjuni rappreżentattivi finali permezz ta’ qsim rappreżentattiv.

Jekk minn spezzjoni viżiva jew abbażi ta’ informazzjoni rilevanti oħra, il-porzjonijiet tal-għalf li jkunu se jiġu kampjunati jkunu jidhru ta’ kwalità differenti mill-bqija tal-għalf mill-istess lott, dawn il-porzjonijiet jiġu separati mill-bqija tal-għalf u jiġu ttrattati bħala sublott separat. Jekk ma jkunx possibbli li l-għalf jiġi diviż f’sublottijiet separati, l-għalf jiġi kampjunat bħallikieku hu lott wieħed. F’każijiet bħal dawn, dan irid jissemma fir-rapport dwar it-teħid tal-kampjuni.

Meta l-għalf kampjunat f’konformità mad-dispożizzjonijiet ta’ dan ir-Regolament jiġi ddeterminat li ma jissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, u jkun parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni, jiġi preżunt li dan japplika għall-għalf kollu f’dak il-lott, kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

It-teħid ta’ kampjuni jista’ jinkludi wkoll għalf offrut għall-bejgħ minn operaturi tan-negozju tal-għalf permezz ta’ komunikazzjoni mill-bogħod f’konformità mal-Artikolu 11(3) tar-Regolament (KE) Nru 767/2009 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill. (1) It-teħid ta’ kampjuni tal-għalf offrut għall-bejgħ permezz ta’ komunikazzjoni mill-bogħod għandu fil-prinċipju jkun soġġett għall-punti stabbiliti f’dan l-Anness. Aspetti speċifiċi tat-teħid tal-kampjuni mill-bogħod huma deskritti fil-Punt 11.

2. DEFINIZZJONIJIET

—

Lott: kwantità identifikata ta’ għalf iddeterminat li għandha karatteristiċi komuni, bħalma huma l-oriġini, il-varjetà, it-tip ta’ imballaġġ, il-persuna li ppakkjata, l-ispeditur jew it-tikkettar, u fil-każ ta’ proċess tal-produzzjoni, unità ta’ produzzjoni minn impjant wieħed bl-użu ta’ parametri tal-produzzjoni uniformi jew numru ta’ tali unitajiet, meta jkunu prodotti f’ordni kontinwa u maħżuna flimkien.

—	Porzjon kampjunat: Lott jew parti identifikata mil-lott jew mis-sublott.

—	Kampjun issiġillat: kampjun issiġillat b’tali mod li ma jkun possibbli l-ebda aċċess għall-kampjun mingħajr ma jitkisser jew jitneħħa s-siġill.

—	Kampjun inkrimentali: Kwantità meħuda minn punt wieħed fil-porzjon kampjunat.

—	Kampjun aggregat: Aggregat ta’ kampjuni inkrimentali meħudin mill-istess porzjon kampjunat.

—	Kampjun imnaqqas: Parti mill-kampjun aggregat, miksuba minnu bi proċess ta’ tnaqqis rappreżentattiv.

—	Kampjun finali: Parti mill-kampjun aggregat (imħallat), mill-kampjun imnaqqas jew mill-kampjun aggregat omoġenizzat, skont it-tip ta’ kontroll (ara l-punt 9.4).

—	Kampjun tal-laboratorju: kampjun intenzjonat għal-laboratorju (kif jasal fil-laboratorju) u jista’ jkun il-kampjun finali, imnaqqas jew dak aggregat.

—	Kampjun ta’ bejgħ mill-bogħod: Kampjun ta’ lott ta’ għalf offrut għall-bejgħ permezz ta’ komunikazzjoni mill-bogħod.

3. DISPOŻIZZJONIJIET ĠENERALI

—	Il-kampjuni għandhom jittieħdu minn persuni awtorizzati għal dak l-iskop mill-awtorità kompetenti.

—	Għal kampjun tal-bejgħ mill-bogħod, l-awtorità kompetenti għandha titlob kwantità tal-għalf mill-operatur tan-negozju tal-għalf permezz ta’ komunikazzjoni mill-bogħod.

—	Il-kampjun għandu jkun issiġillat b’tali mod li ma jkun possibbli l-ebda aċċess għall-kampjun mingħajr ma jitkisser jew jitneħħa s-siġill.

Il-marka tas-siġill jenħtieġ li tkun identifikabbli u viżibbli b’mod ċar.

—	L-identifikazzjonijiet tal-kampjun: il-kampjun irid jiġi mmarkat b’mod permanenti u jrid jiġi identifikat b’mod li jkun hemm rabta mhux ambigwa mar-rapport dwar il-kampjuni.

—

Minn kull kampjun aggregat jew kampjun imnaqqas, jittieħdu l-kampjuni finali li ġejjin: irid jittieħed wieħed għall-kontroll (infurzar) u wieħed għall-operatur tan-negozju tal-għalf (kampjun tad-difiża). Eventwalment, jista’ jittieħed kampjun finali ieħor ta’ referenza. Fil-każ li l-kampjun aggregat sħiħ ikun omoġenizzat, il-kampjuni finali jittieħdu mill-kampjun aggregat omoġenizzat, u dan kemm-il darba din il-proċedura ma tiġix f’kunflitt mar-regoli tal-Istati Membri fejn jidħlu d-drittijiet tal-operatur ta’ negozju tal-għalf.

—

F’konformità mal-Artikolu 15, il-paragrafi 1 u 2, tar-Regolament (UE) 2017/625, meta jkun meħtieġ għat-twettiq tat-teħid ta’ kampjuni uffiċjali, l-operaturi tan-negozju tal-għalf għandhom, fejn meħtieġ mill-awtoritajiet kompetenti:

—	Jagħtu lill-persunal tal-awtoritajiet kompetenti aċċess għat-tagħmir taħt il-kontroll tagħhom, inkluż, fejn meħtieġ, jagħmlu disponibbli t-tagħmir xieraq għat-teħid tal-kampjuni u t-tagħmir protettiv personali;

—	Jassistu u jikkooperaw mal-persunal tal-awtoritajiet kompetenti sabiex jippermettu t-teħid ta’ kampjuni, inkluż li l-għalf isir aċċessibbli għall-persunal tal-awtoritajiet kompetenti.

4. APPARAT

4.1. L-apparat għat-teħid ta’ kampjuni jrid ikun magħmul minn materjal li ma jikkontaminax il-prodotti li jridu jittieħdu kampjuni minnhom. Apparat li huwa intiż biex jintuża iktar minn darba jrid ikun wieħed li faċli jitnaddaf biex tkun evitata l-kontaminazzjoni kroċjata.

4.2. Apparat rakkomandat għat-teħid ta’ kampjuni minn għalf solidu.

4.2.1. Il-manwal tat-teħid ta’ kampjuni

4.2.1.1.

Pala bil-qiegħ ċatt u bil-ġnub vertikali għat-teħid tal-kampjuni.

4.2.1.2.

Sonda b’qasma twila jew bil-kompartimenti għat-teħid tal-kampjuni. Il-qisien tas-sonda għat-teħid tal-kampjuni jridu jkunu adattati għall-karatteristiċi tal-porzjon kampjunat (il-fond tal-kontenitur, id-dimensjonijiet tal-ixkora eċċ) u għad-daqs tal-partikoli tal-għalf.

Fil-każ lis-sonda għat-teħid tal-kampjuni jkollha bosta fetħiet, sabiex jiġi żgurat li l-kampjun jittieħed minn postijiet differenti ma’ tul is-sonda, il-fetħiet jenħtieġ li jkunu separati permezz ta’ kompartimenti jew ta’ fetħiet, waħda viċin l-oħra.

4.2.2. Teħid ta’ kampjuni b’mod mekkaniku

Għat-teħid tal-kampjuni ta’ għalf fi fluss jista’ jintuża apparat mekkaniku adattat. L-apparat mekkaniku għandu jitqies xieraq meta mill-inqas jittieħed kampjun tas-sezzjoni kollha tal-fluss.

It-teħid tal-kampjuni tal-għalf fi fluss (b’rata mgħaġġla) jista’ jitwettaq permezz ta’ mekkaniżmi awtomatiċi għat-teħid tal-kampjuni.

4.2.3. Diviżur

Jekk possibbli u jekk ikun f’loku, biex jiġu ppreparati kampjuni mnaqqsa b’mod rappreżentattiv, jenħtieġ li jintuża apparat imfassal biex jiddividi l-kampjun f’partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs.

5. REKWIŻITI KWANTITATTIVI FIR-RIGWARD TAL-GĦADD TA’ KAMPJUNI INKRIMENTALI

—

Ir-rekwiżiti kwantitattivi fil-punti 5.1 u 5.2 dwar l-għadd ta’ kampjuni inkrimentali huma applikabbli għal daqsijiet ta’ porzjonijiet kampjunati sa massimu ta’ 500 tunnellata u li jista’ jittieħed minnhom kampjun b’mod rappreżentattiv. Il-proċedura tat-teħid tal-kampjuni deskritta tkun valida bl-istess mod fil-każ ta’ kwantitajiet akbar mid-daqs massimu preskritt tal-porzjon kampjunat kemm-il darba n-numru massimu ta’ kampjuni inkrimentali mogħti fit-tabelli li ġejjin fil-punti 5.1.1, 5.1.3, u 5.1.5 jiġi injorat, u n-numru ta’ kampjuni inkrimentali jiġi ddeterminat permezz tal-formula tal-għerq kwadrat mogħtija fil-parti xierqa tal-proċedura (ara l-punt 5.3) u jekk id-daqs minimu tal-kampjun aggregat ikun żdied proporzjonalment. Dan ma jfissirx li lott kbir ma jkunx jista’ jiġi diviż f’sublottijiet iżgħar u jiġi kampjunat kull sublott, f’konformità mal-proċedura deskritta fil-punti 5.1 u 5.2.

—	Id-daqs tal-porzjon kampjunat għandu jkun tali hekk li l-partijiet kostitwenti tiegħu jistgħu ikunu miġbura bħala kampjun.

—

Għal-lottijiet jew sublottijiet kbar ħafna (> 500 tunnellata), u fil-każ ta’ lottijiet li jiġu trasportati jew li jinħażnu b’tali mod li it-teħid tal-kampjuni ma jkunx jista’ jsir f’konformità mal-proċedura ta’ teħid ta’ kampjuni stipulata fil-punti 5.1 u 5.2 ta’ dan il-punt, għandha tiġi applikata l-proċedura tat-teħid tal-kampjuni prevista fil-punt 5.3.

—	Għall-kampjuni tal-bejgħ mill-bogħod, id-daqs tal-lott li minnu tintalab il-kwantità normalment ma jkunx magħruf mill-awtorità kompetenti. Għalhekk, il-proċedura msemmija fil-punti 5.1 u 5.2 ma tistax tintuża. F’dan il-każ, għandha tiġi applikata l-proċedura deskritta fil-punt 11.

—

F’każ li l-operatur tan-negozju tal-għalf ikun obbligat bil-liġi li jikkonforma ma’ dan ir-Regolament fil-qafas ta’ sistema ta’ monitoraġġ mandatorja, l-operatur tan-negozju tal-għalf ikun jista’ jiddevja mir-rekwiżiti kwantitattivi kif ipprovdut f’dan il-punt biex jitqiesu l-karatteristiċi operattivi bil-kundizzjoni li l-operatur tan-negozju tal-għalf jkun wera, b’mod li jissodisfa l-awtorità kompetenti, l-ekwivalenza tal-proċedura tat-teħid tal-kampjuni f’dik li hi rappreżentattività, u dan jagħmlu wara li jkun awtorizzat mill-awtorità kompetenti.

—

F’każijiet eċċezzjonali, jekk ma jkunx possibbli li wieħed ikompli jaħdem bil-metodu ta’ teħid tal-kampjuni stabbilit fir-rigward tar-rekwiżiti kwantitattivi minħabba l-ħsara kummerċjali inaċċettabbli li tkun saret lil-lott (dovuta għat-tip ta’ imballaġġar, għall-mezz ta’ trasport, għall-mod kif inħażen, eċċ.), ikun jista’ jiġi applikat metodu alternattiv ta’ teħid tal-kampjuni, sakemm dan ikun kemm jista’ jkun rappreżentattiv u jiġi deskritt u dokumentat bis-sħiħ.

5.1. Rekwiżiti kwantitattivi rigward kampjuni inkrimentali b’rabta mal-kontroll ta’ sustanzi jew ta’ prodotti ddistribwiti b’mod uniformi fl-għalf.

5.1.1. Għalf solidu mhux imballaġġat

Id-daqs tal-porzjon kampjunat	L-għadd minimu ta’ kampjuni inkrimentali
≤ 2,5 tunnellati	7
> 2,5 tunnellati	√(20 darba n-numru ta’ tunnellati li fih il-porzjon kampjunat) (*1) , sa 40 kampjun inkrimentali

5.1.2. Għalf likwidu mhux imballaġġat

Id-daqs tal-porzjon kampjunat	L-għadd minimu ta’ kampjuni inkrimentali
≤ 2,5 tunnellata jew ≤ 2 500 litru	4 (*2)
> 2,5 tunnellata jew > 2 500 litru	7 (*2)

5.1.3. Għalf fl-imballaġġ

L-għalf (solidu u likwidu) jista’ jkun imballaġġat f’boroż, xkejjer, laned, bramel, eċċ. li fit-tabella li ġejja jissemmew bħala unitajiet. L-unitajiet kbar (≥ 500 kg jew litru) iridu jiġu kampjunati f’konformità mad-dispożizzjonijiet previsti għall-għalf mhux imballaġġat (ara 5.1.1 u 5.1.2)

Id-daqs tal-porzjon kampjunat	L-għadd minimu ta’ unitajiet li minnhom irid jittieħed (mill-inqas) kampjun inkrimentali wieħed (*3)
1 sa 20 unità	1 unità (*4)
21 sa 150 unità	3 unitajiet (*4)
151 sa 400 unità	5 unitajiet (*4)
> 400 unità	¼ ta’ √(numru ta’ unitajiet li jiffurmaw il-porzjon kampjunat) (*5), sa 40 unità

5.1.4. Blokok tal-għalf u licks minerali

Mill-inqas jittieħed kampjun minn blokka jew lick waħda għal kull porzjon kampjunat ta’ 25 unità, sa massimu ta’ erba’ blokok jew licks.

Għal blokok jew licks li ma jiżnux aktar minn 1 kg kull wieħed, jittieħed bħala kampjun inkrimentali il-kontenut ta’ blokka waħda jew lick waħda.

5.1.5. Għalf oħxon/foraġġ

Id-daqs tal-porzjon kampjunat	L-għadd minimu ta’ kampjuni inkrimentali (*6)
≤ 5 tunnellati	5
> 5 tunnellati	√(5 darbiet in-numru ta’ tunnellati li jiffurmaw il-porzjon kampjunat) (*7), sa 40 kampjun inkrimentali

5.2. Rekwiżiti kwantitattivi rigward kampjuni inkrementali b’rabta mal-kontroll ta’ kostitwenti jew sustanzi li x’aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf

Dawn ir-rekwiżiti kwantitattivi b’rabta ma’ kampjuni inkrimentali jridu jintużaw fis-sitwazzjonijiet li ġejjin:

—	il-kontroll tal-aflatossini, l-ergotina tas-segala, il-mikotossini u impuritajiet botaniċi perikolużi oħra f’materjal tal-għalf;

—	il-kontroll ta’ kontaminazzjoni kroċjata minn xi kostitwent, inkluż materjal ġenetikament modifikat, jew sustanza li fil-każ tagħha tkun mistennija distribuzzjoni mingħajr uniformità fl-għalf.

Fil-każ li l-awtorità ta’ kontroll jiġiha suspett qawwi li t-tali distribuzzjoni mingħajr uniformità sseħħ ukoll fil-każ ta’ kontaminazzjoni kroċjata minn kostitwent jew sustanza f’għalf kompost, ikunu jistgħu jiġu applikati r-rekwiżiti kwantitattivi kif stipulati fit-tabella li ġejja.

Id-daqs tal-porzjon kampjunat	L-għadd minimu ta’ kampjuni inkrimentali
< 80 tunnellata	Ara r-rekwiżiti kwantitattivi f’5.1. L-għadd ta’ kampjuni inkrimentali li jridu jittieħdu jrid jiġi multiplikat bi 2,5.
≥ 80 tunnellati	100

5.3. Rekwiżiti kwantitattivi fir-rigward ta’ kampjuni inkrimentali fil-każ ta’ lottijiet kbar ħafna

Fil-każ ta’ porzjonijiet kampjunati kbar ħafna (porzjonijiet kampjunati > 500 tunnellata), l-għadd ta’ kampjuni inkrimentali li għandu jittieħed = 40 kampjun inkrimentali + √tunnellati fejn jidħol il-kontroll ta’ sustanzi jew prodotti ddistribwiti b’mod uniformi fl-għalf, jew 100 kampjun inkrimentali + √tunnellati fejn jidħol il-kontroll ta’ kostitwenti jew sustanzi li x’aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf.

6. REKWIŻITI KWANTITATTIVI FIR-RIGWARD TA’ KAMPJUN AGGREGAT

Kampjun aggregat wieħed għal kull porzjon kampjunat huwa meħtieġ.

	In-natura tal-għalf	Daqs minimu tal-kampjun aggregat (8) (9)
6.1.	Għalf mhux f’imballaġġ	4 kg
6.2.	Għalf imballaġġat:	4 kg (*10)
6.3.	Għalf likwidu jew semilikwidu:	4 litri
6.4.	Blokok tal-għalf jew licks minerali:
6.4.1.	kull waħda tiżen aktar minn 1 kg	4 kg
6.4.2.	kull waħda ma tiżinx aktar minn 1 kg	piż ta’ erba’ blokok jew licks oriġinali
6.5.	Għalf oħxon/foraġġ	4 kg (*11)

7. REKWIŻITI KWANTITATTIVI FIR-RIGWARD TA’ KAMPJUNI FINALI

Kampjuni finali

L-analiżi ta’ mill-anqas kampjun finali wieħed tkun meħtieġa. L-ammont fil-kampjun finali li jkun se jiġi analizzat ma għandux ikun inqas minn kif ġej:

Għalf solidu	500 g (12) (13) (14) (15)
Għalf likwidu jew semilikwidu	500 ml (*12)

8. METODU TA’ TEĦID TA’ KAMPJUNI GĦAL LOTTIJIET KBAR ĦAFNA JEW LOTTIJIET MAĦŻUNA JEW TRASPORTAT B’MOD LI MA JKUNX FATTIBBLI LI JSIR TEĦID TA’ KAMPJUNI TAL-LOTT KOLLU

8.1. Prinċipji ġenerali

Jekk il-mod ta’ trasport jew ta’ ħażna ta’ lott ma jippermettix li jittieħdu kampjuni inkrimentali mil-lott kollu, it-teħid tal-kampjuni ta’ tali lottijiet preferibbilment jenħtieġ li jsir meta l-lott ikun fi fluss.

Fil-każ ta’ mħażen kbar intiżi biex jaħżnu l-għalf, l-operaturi jenħtieġ li jiġu inkoraġġuti jinstallaw tagħmir fil-maħżen li jippermetti t-teħid tal-kampjuni (awtomatiku) mil-lott kollu maħżun.

Fil-każ li jiġu applikati l-proċeduri ta’ teħid tal-kampjuni previsti f’dan il-punt, l-operatur tan-negozju tal-għalf jew ir-rappreżentant tiegħu jiġi infurmat dwar il-proċedura tat-teħid tal-kampjuni. Jekk din il-proċedura ta’ teħid tal-kampjuni tiġi kkontestata mill-operatur tan-negozju tal-għalf jew mir-rappreżentant tiegħu, l-operatur tan-negozju tal-għalf jew ir-rappreżentant tiegħu għandhom jippermettu lill-awtorità kompetenti tieħu kampjuni mil-lott kollu bi spejjeż tal-operatur.

8.2. Lottijiet kbar ittrasportati bil-baħar

8.2.1. Teħid dinamiku ta’ kampjuni ta’ lottijiet kbar ittrasportati bil-baħar

It-teħid ta’ kampjuni ta’ lottijiet kbar fuq il-bastimenti preferibbilment isir waqt li l-prodott ikun fi fluss (teħid dinamiku ta’ kampjuni).

It-teħid ta’ kampjuni għandu jsir għal kull stiva (entità li tkun tista’ tiġi separata fiżikament). L-istivi madankollu jiġu mbattla parzjalment, waħda wara l-oħra, biex is-separazzjoni fiżika inizjali ma tibqax hemm wara t-trasferiment tal-lottijiet f’faċilitajiet tal-ħżin. It-teħid tal-kampjuni għalhekk jista’ jsir skont is-separazzjoni fiżika inizjali jew skont is-separazzjoni wara t-trasferiment fil-faċilitajiet tal-ħżin.

Il-ħatt ta’ vapur jista’ jdum diversi jiem. Normalment, it-teħid ta’ kampjuni jsir f’intervalli regolari tul il-perjodu kollu li fih ikun għaddej il-ħatt. Madankollu mhux dejjem ikun fattibbli jew f’loku li jkun hemm spettur uffiċjali preżenti waqt it-teħid ta’ kampjuni tul l-operazzjoni kollha tal-ħatt. Għalhekk jista’ jittieħed kampjun ta’ parti (porzjon kampjunat) tal-lott kollu. L-għadd ta’ kampjuni inkrementali jiġi ddeterminat billi jitqies id-daqs tal-porzjon kampjunat.

Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

Anke jekk il-kampjun uffiċjali jittieħed b’mod awtomatiku, il-preżenza ta’ spettur hija neċessarja. Madankollu, meta it-teħid tal-kampjuni awtomatiku jsir skont parametri ddeterminati minn qabel u li ma jkunux jistgħu jinbidlu waqt it-teħid tal-kampjuni, u l-kampjuni inkrimentali jinġabru f’reċipjent issiġillat b’mod li jelimina kull possibbiltà ta’ frodi, il-preżenza ta’ spettur allura tkun meħtieġa biss fil-bidu tat-teħid tal-kampjuni, kull darba li r-reċipjent tal-kampjuni jkun irid jinbidel u fi tmiem it-teħid tal-kampjuni.

8.2.2. It-teħid ta’ kampjuni tal-lottijiet ittrasportati bil-baħar permezz ta’ teħid ta’ kampjuni statiku

Jekk it-teħid tal-kampjuni jsir b’mod statiku, tkun trid tiġi applikata l-istess proċedura kif prevista fil-faċilitajiet ta’ ħżin (sajlos) aċċessibbli minn fuq (ara l-punt 8.4.1).

It-teħid ta’ kampjuni jsir fuq il-parti aċċessibbli (minn fuq) tal-lott/stiva. L-għadd ta’ kampjuni inkrementali jiġi ddeterminat billi jitqies id-daqs tal-porzjon kampjunat. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.3. It-teħid ta’ kampjuni ta’ lottijiet kbar maħżuna fi mħażen

It-teħid ta’ kampjuni jrid isir fuq il-parti aċċessibbli tal-lott. L-għadd ta’ kampjuni inkrementali jiġi ddeterminat billi jitqies id-daqs tal-porzjon kampjunat. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.4. It-teħid tal-kampjuni ta’ faċilitajiet ta’ ħażna (sajlos)

8.4.1. It-teħid ta’ kampjuni minn sajlos (faċilment) aċċessibbli minn fuq

8.4.2. It-teħid ta’ kampjuni minn sajlos mhux aċċessibbli minn fuq (sajlos magħluqa)

8.4.2.1. Sajlos mhux aċċessibbli minn fuq (sajlos magħluqa) ta’ > 100 tunnellata

Għalf maħżun f’sajlos bħal dawn ma jistax jitteħidlu kampjun b’mod statiku. Għalhekk, jekk l-għalf maħżun fis-sajlo jrid jittieħed kampjun minnu u ma hemm l-ebda possibbiltà li l-kunsinna tiċċaqlaq, irid isir ftehim mal-operatur li hu jrid jinforma l-ispettur dwar meta jkun se jinħatt is-sajlo hekk li it-teħid tal-kampjuni jsir meta l-għalf ikun fi fluss.

8.4.2.2. Sajlos mhux aċċessibbli minn fuq (sajlos magħluqa) ta’ < 100 tunnellata

Il-proċedura tat-teħid tal-kampjuni tinvolvi li f’kontejner tiġi rilaxxata kwantità ta’ bejn 50 u 100 kg biex imbagħad jittieħed il-kampjun minnha. Id-daqs tal-kampjun aggregat jikkorrispondi mal-lott kollu u l-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jikkorrispondu mal-kwantità rilaxxata mis-sajlo għal ġo reċipjent biex jittieħed kampjun minnha. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.5. Teħid ta’ kampjuni ta’ għalf mhux imballaġġat f’kontenituri kbar u magħluqa

Spiss, dawn il-lottijiet ikun jista’ jittieħed kampjun minnhom biss wara li jinħattu. F’ċerti każijiet ma jkunx possibbli li jinħattu fil-post li jaslu fih mal-importazzjoni jew fejn jiġu kkontrollati, u għalhekk it-teħid tal-kampjuni jenħtieġ li jsir meta jinħattu dawn il-kontenituri.

9. STRUZZJONIJIET GĦAT-TEĦID, IL-PREPARAZZJONI U L-IPPAKKJAR TAL-KAMPJUNI

9.1. Ġenerali

Il-kampjuni jridu jittieħdu u jiġu ppreparati kemm jista’ jkun malajr filwaqt li wieħed iżomm f’moħħu l-prekawzjonijiet neċessarji biex ikun żgurat li l-prodott la jinbidel u lanqas jiġi kkontaminat. L-istrumenti, is-superfiċji u l-kontenituri maħsuba biex jiġu f’kuntatt mal-kampjuni għandhom ikunu nodfa u xotti.

9.2. Il-kampjuni inkrementali

Mill-porzjon kampjunat kollu jridu jittieħdu kampjuni inkrimentali b’mod aleatorju u ddistribwiti b’mod uniformi, u bejn wieħed u ieħor iridu jkunu tal-istess daqs.

Id-daqs tal-kampjun inkrimentali jkun mill-inqas 100 g, inkella 25 g fil-każ ta’ għalf oħxon jew foraġġ b’densità speċifika baxxa.

Meta jkunu jridu jittieħdu inqas minn 40 kampjun inkrimentali, f’konformità mar-regoli dwar il-proċedura tat-teħid tal-kampjuni stabbiliti fil-punt 8, id-daqs tal-kampjuni inkrimentali jiġi ddeterminat skont id-daqs mitlub għall-kampjun aggregat li jkun irid jittieħed (ara l-punt 6).

Fil-każ tat-teħid tal-kampjuni ta’ lottijiet żgħar ta’ għalf imballaġġat fejn, skont ir-rekwiżiti kwantitattivi, ikun irid jittieħed numru limitat ta’ kampjuni inkrimentali, kampjun inkrimentali jkun kostitwit mill-kontenut ta’ unità waħda oriġinali li l-kontenut tagħha ma jkunx jaqbeż il-1 kg jew litru.

Fil-każ ta’ teħid ta’ kampjuni ta’ għalf imballaġġat magħmul minn unitajiet żgħar (eż. < 250 g), id-daqs tal-kampjun inkrimentali jiddependi mid-daqs tal-unità.

Fil-każ ta’ kampjuni għall-bejgħ mill-bogħod, id-daqs tal-kampjun inkrementali jiddependi mid-daqs tal-unità u jista’ jkun fih ukoll inqas minn 100 g jew 100 ml f’każijiet individwali.

9.2.1. Għalf mhux f’imballaġġ

Fejn ikun hemm bżonn, it-teħid ta’ kampjuni jista’ jsir meta l-porzjon kampjunat ikun qiegħed jiġi spustjat (jitgħabba jew jinħatt).

9.2.2. Għalf fl-imballaġġ

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ unitajiet għat-teħid tal-kampjuni, kif indikat fil-punt 5, parti mill-kontenut ta’ kull pakkett titneħħa permezz ta’ sonda jew pala. Fejn ikun meħtieġ, il-kampjuni jittieħdu wara li l-unitajiet jitbattlu separatament.

9.2.3. Għalf likwidu jew semilikwidu, omoġenju jew omoġenizzabbli

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ unitajiet għat-teħid tal-kampjuni, kif indikat fil-punt 5, jekk ikun meħtieġ il-kontenut jiġi omoġenizzat u jittieħed ammont minn kull unità.

Il-kampjuni inkrimentali jistgħu jittieħdu meta l-kontenut ikun qiegħed jinħatt.

9.2.4. Għalf likwidu jew semilikwidu mhux omoġenizzabbli

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ unitajiet għat-teħid tal-kampjuni, kif indikat fil-punt 5, jittieħdu kampjuni minn livelli differenti.

Jistgħu wkoll jittieħdu kampjuni meta l-kontenut ikun qiegħed jitbattal imma l-ewwel frazzjonijiet għandhom jintremew.

Fi kwalunkwe każ il-volum totali meħud ma għandux ikun inqas minn 10 litri.

9.2.5. Blokok tal-għalf u licks minerali

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ blokok jew licks għat-teħid tal-kampjuni kif indikat fil-punt 5, tista’ tittieħed parti minn kull blokka jew lick. F’każ ta’ suspett ta’ blokka jew lick mhux omoġenja, bħala kampjun tista’ tittieħed il-blokka jew il-lick sħiħa.

Għal blokok jew licks li ma jiżnux aktar minn 1 kg kull wieħed, jittieħed bħala kampjun inkrimentali il-kontenut ta’ blokka waħda jew lick waħda.

9.3. Preparazzjoni tal-kampjuni aggregati

Il-kampjuni aggregati għandhom ikunu mħallta sabiex jiffurmaw kampjun aggregat wieħed.

9.4. Preparazzjoni tal-kampjuni finali

Il-materjal fil-kampjun aggregat għandu jitħallat tajjeb (2).

Kull kampjun jitpoġġa f’kontenitur/reċipjent xieraq. Għandhom jittieħdu l-prekawzjonijiet kollha meħtieġa sabiex tiġi evitata xi bidla fil-kompożizzjoni tal-kampjun, xi kontaminazzjoni jew adulterazzjoni li jistgħu jfiġġu waqt il-ġarr jew il-ħżin.

9.4.1. Sustanzi distribwiti b’mod uniformi

Meta jkunu qed jiġu kkontrollati kostitwenti jew sustanzi ddistribwiti b’mod uniformi fl-għalf kollu, il-kampjun aggregat jista’ jitnaqqas b’mod rappreżentattiv għal mill-inqas 2,0 kg jew 2,0 litri (kampjun imnaqqas) (3), preferibbilment billi jintuża diviżur mekkaniku inkella wieħed awtomatiku. Meta tkun qed tiġi kkontrollata l-preżenza ta’ residwi tal-pestiċidi fil-legumi, fiċ-ċereali u fil-ġewż tas-siġar, id-daqs minimu tal-kampjun imnaqqas ikun 3 kg. Jekk in-natura tal-għalf ma tkunx tippermetti l-użu ta’ diviżur, jew jekk ma jkunx hemm diviżur, allura l-kampjun ikun jista’ jitnaqqas bil-metodu tal-qsim f’erba’ partijiet.

Mill-kampjun aggregat jew il-kampjuni mnaqqsa mbagħad jittieħdu l-kampjuni finali (għall-kontroll, id-difiża u possibbilment għar-referenza) ta’ bejn wieħed u ieħor l-istess ammont u b’mod li jikkonformaw mar-rekwiżiti kwantitattivi tal-punt 7.

9.4.2. Sustanzi distribwiti b’mod mhux uniformi

Meta jkun qed isir kontroll għall-kostitwenti — inkluż xi materjal ġenetikament modifikat — jew għal sustanzi li x’aktarx ikunu se jiġu ddistribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, il-kampjun aggregat ikun:

(i)	kompletament omoġenizzat. Wara, mill-kampjun aggregat omoġenizzat, għandhom jittieħdu l-kampjuni finali (għall-kontroll, id-difiża u possibbilment għar-referenza) ta’ bejn wieħed u ieħor l-istess ammont u b’mod li jikkonformaw mar-rekwiżiti kwantitattivi tal-punt 7; jew

(ii)

imnaqqas għal tal-anqas 2 kg jew 2 litri (4) billi jintuża diviżur mekkaniku jew wieħed awtomatiku. Fil-każ biss fejn in-natura tal-għalf ma tippermettix l-użu ta’ diviżur, il-kampjun jista’, jekk ikun hemm bżonn, jitnaqqas permezz tal-metodu tal-qsim f’erba’ partijiet. Biex tiġi vverifikata l-preżenza ta’ materjal ġenetikament modifikat fil-qafas tar-Regolament (UE) Nru 619/2011, il-kampjun imnaqqas għandu jkun fih mill-inqas 35 000 żerriegħa/qamħa biex ikunu jistgħu jittieħdu l-kampjuni finali għall-infurzar, id-difiża u possibbilment ir-referenza ta’ mill-inqas 10 000 żerriegħa/qamħa (ara n-nota f’qiegħ il-paġna(**) fil-punt 6 u n-nota f’qiegħ il-paġna(*) fil-punt 7).

Mill-kampjun imnaqqas mbagħad jittieħdu l-kampjuni finali ta’ bejn wieħed u ieħor l-istess ammont u b’mod li jikkonformaw mar-rekwiżiti kwantitattivi tal-punt 7.

9.5. Imballaġġ tal-kampjuni

Il-kontenituri jew il-pakketti għandhom jiġu ssiġillati u ttikkettjati b’tali mod li ma jkunux jistgħu jinfetħu mingħajr ma ssir ħsara lis-siġill. It-tikketta trid tkun inkorporata għalkollox fis-siġill. Alternattivament, il-kampjun jista’ jitqiegħed f’riċevitur li jista’ jingħalaq b’tali mod li ma jkunx jista’ jinfetaħ mingħajr ma ssir ħsara permanenti lill-kontenitur jew lir-reċipjent, hekk li l-kontenitur jew ir-reċipjent ma jkunx jista’ jerġa’ jintuża.

9.6. L-ispedizzjoni ta’ kampjuni fil-laboratorju

Il-kampjun għandu jintbagħat mingħajr telf ta’ żmien lil-laboratorju analitiku magħżul, flimkien mal-informazzjoni essenzjali għall-analista.

10. REKORD TAL-KAMPJUNI

Kull kampjun irid jinżamm rekord tiegħu, b’tali mod li kull porzjon kampjunat u d-daqs tiegħu jiġu identifikati b’mod mhux ambigwu.

Ir-rekord għandu jinkludi kull devjazzjoni mill-proċedura tat-teħid tal-kampjuni kif previst f’dan ir-Regolament.

Barra milli jkun disponibbli għal-laboratorju uffiċjali ta’ kontroll, ir-rekord irid ikun disponibbli wkoll għall-operatur tan-negozju tal-għalf u/jew il-laboratorju magħżul mill-operatur tan-negozju tal-għalf.

11. KAMPJUN TA’ BEJGĦ MILL-BOGĦOD

—

Għal kampjun ta’ bejgħ mill-bogħod, l-għalf għandu jintalab mill-operatur tan-negozju tal-għalf permezz ta’ tekniki ta’ komunikazzjoni mill-bogħod. F’dan il-każ, meta titlob l-għalf, l-awtorità kompetenti ma għandhiex għalfejn tidentifika lilha nnifisha b’identità uffiċjali lill-operatur tan-negozju tal-għalf u tista’ tuża identità ta’ kopertura.

—

Il-kampjun aggregat u l-kampjuni finali tal-kampjun għall-bejgħ mill-bogħod għandhom jittieħdu immedjatament malli tasal il-kunsinna minn persuni awtorizzati għal dan l-għan. Għall-ġenerazzjoni tal-kampjun aggregat, għandu jittieħed għadd xieraq ta’ kampjuni inkrementali b’mod aleatorju u distribwiti b’mod uniformi mill-kwantità totali miksuba u mħalltin/omoġenizzati b’attenzjoni, sa fejn ikun possibbli, f’konformità mal-prinċipji stabbiliti fil-punt 5 u l-punti 9.2 u 9.3. Jekk l-għalf jiġi ppakkjat f’unitajiet individwali, jenħtieġ li jinkisbu mill-inqas 4 unitajiet li minnhom irid jittieħed mill-inqas kampjun inkrementali wieħed. Jekk jintwera fuq bażi ta’ każ b’każ li l-unitajiet miksuba jiġu minn lottijiet differenti, l-għadd ta’ unitajiet li jridu jittieħdu kampjuni minnhom irid jitnaqqas u jiġi limitat għal dawk l-unitajiet li joriġinaw mill-istess lott. Fil-każ tal-analiżi tal-kampjun għall-bejgħ mill-bogħod għal kostitwenti jew sustanzi li huma distribwiti b’mod mhux uniformi fl-għalf, l-għadd ta’ kampjuni inkrementali jrid ikun mill-inqas 2,5 darbiet ogħla minn dak tal-kampjuni analizzati għal sustanzi distribwiti b’mod uniformi fl-għalf kollu.

Mill-kampjun aggregat, il-kampjuni finali korrispondenti (għall-kontroll, għad-difiża u possibbilment referenza) jittieħdu f’konformità, sa fejn ikun fattibbli, mal-prinċipji stabbiliti fil-punt 9.4 u r-rekord tat-teħid tal-kampjuni jindika li l-kampjun huwa kampjun tal-bejgħ mill-bogħod. L-awtorità kompetenti mbagħad tinforma minnufih lill-operatur tan-negozju tal-għalf dwar it-teħid tal-kampjuni. L-operatur tan-negozju tal-għalf jiġi nnotifikat ukoll li kampjun wieħed (għad-difiża) jinżamm, meta possibbli, għad-dispożizzjoni tiegħu mill-awtorità kompetenti, f’post speċifikat, għal skopijiet ta’ difiża jew jintbagħat lill-operatur tan-negozju tal-għalf jew jintbagħat lil-laboratorju magħżul mill-operatur tan-negozju tal-għalf f’konformità mar-regoli nazzjonali fis-seħħ.

Jekk il-kampjun jintbagħat direttament lil-laboratorju uffiċjali, il-kampjun finali għandu jiġi ppreparat u ssiġillat fil-laboratorju minn persuni awtorizzati għal dan l-għan jew fil-preżenza ta’ persuni awtorizzati għal dan l-għan. Ir-rekord tat-teħid tal-kampjuni tal-kampjun tal-bejgħ mill-bogħod irid jintbagħat immedjatament wara li jkunu ġew iffurmati l-kampjuni finali lill-awtorità kompetenti, li tinforma lill-operatur tan-negozju tal-għalf dwar it-teħid tal-kampjuni.

Huwa kkunsidrat li l-kwantità fornuta mill-operatur tan-negozju tal-għalf lill-awtorità kompetenti tirrappreżenta parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni. F’konformità mal-Artikolu 15 tar-Regolament (KE) Nru 178/2002 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (5), jekk ikun instab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt, anki fil-każ ta’ kampjun ta’ bejgħ mill-bogħod, li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata (fejn xieraq spezzjoni fuq il-post) ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

”

(1) Ir-Regolament (KE) Nru 767/2009 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-13 ta’ Lulju 2009 dwar it-tqegħid fis-suq u l-użu ta’ għalf, li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1831/2003 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill u li jħassar id-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE, id-Direttiva tal-Kummissjoni 80/511/KEE, id-Direttivi tal-Kunsill 82/471/KEE, 83/228/KEE, 93/74/KEE, 93/113/KE u 96/25/KE u d-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 2004/217/KE (ĠU L 229, 1.9.2009, p. 1).

(*1) Fejn in-numru miksub ikun frazzjoni, dan għandu jiġi arrotondat għan-numru sħiħ li jmiss.

(*2) Fil-każ li ma jkunx possibbli li l-likwidu jiġi omoġenizzat, l-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jkun irid jiżdied.

(*3) Fil-każ fejn il-ftuħ ta’ unità jista’ jaffettwa l-analiżi (eż. għalf imxarrab li jista’ jitħassar) kampjun inkrimentali minnhom ikun l-unità mhux miftuħa.

(*4) Għal unitajiet li l-kontenut tagħhom ma jaqbiżx il-1 kg jew litru, kampjun inkrimentali jkun il-kontenut ta’ unità waħda oriġinali.

(*5) Fejn in-numru miksub ikun frazzjoni, dan għandu jiġi arrotondat għan-numru sħiħ li jmiss.

(*6) Huwa fatt magħruf li f’ċerti sitwazzjonijiet (eż. għall-ħaxix tal-għalf f’sajlo) ma jkunx possibbli li jittieħdu l-kampjuni inkrimentali meħtieġa mingħajr ma ssir ħsara inaċċettabbli lil-lott. F’sitwazzjonijiet bħal dawn jista’ jiġi applikat metodu alternattiv ta’ teħid tal-kampjuni u hemm gwida għat-teħid ta’ kampjuni minn lottijiet bħal dawn li ġiet elaborata u hija disponibbli fuq https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/animal-feed-guidance_documents_691_2013_en.pdf

(*7) Fejn in-numru miksub ikun frazzjoni, dan għandu jiġi arrotondat għan-numru sħiħ li jmiss.

(*8) Fil-każ li l-għalf fil-kampjun ikun ta’ valur għoli, tkun tista’ tittieħed kwantità iżgħar tal-kampjun aggregat bil-kundizzjoni li dan jiġi deskritt u ddokumentat fir-rapport tat-teħid tal-kampjuni.

(*9) F’konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 619/2011 tal-24 ta’ Ġunju 2011 li jistabbilixxi l-metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf fir-rigward tal-preżenza ta’ materjal ġenetikament modifikat li għalih hija pendenti proċedura ta’ awtorizzazzjoni jew li l-awtorizzazzjoni tiegħu skadiet (ĠU L 166, 25.6.2011, p. 9), il-kampjun aggregat biex tiġi vverifikata l-preżenza ta’ materjal ġenetikament modifikat għandu jkun fih mill-inqas 35000 żerriegħa/qamħa. Dan ifisser li, fil-każ tal-qamħirrum, id-daqs tal-kampjun aggregat irid ikun mill-inqas 10,5 kg u għas-sojja 7 kg. Għal żrieragħ u ċereali oħra bħax-xgħir, il-millieġ, il-ħafur, ir-ross, is-segala, il-qamħ u ż-żerriegħa tal-lift, id-daqs tal-kampjun aggregat ta’ 4 kg jikkorrispondi għal aktar minn 35000 żerriegħa/ċereali.

(*10) Fil-każ tal-għalf imballaġġat, jista’ wkoll ma jkunx possibbli li jintlaħaq id-daqs ta’ 4 kg għall-kampjun aggregat, minħabba li dan jiddependi mid-daqs tal-unitajiet individwali.

(*11) Jekk dan ikun il-każ għall-għalf oħxon u l-foraġġ b’densità speċifika baxxa (eż. ħuxlief, tiben), id-daqs tal-kampjun aggregat jenħtieġ li jkun minn tal-inqas 1 kg.

(*12) F’konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (UE) Nru 619/2011, il-kampjun finali biex tiġi vverifikata l-preżenza ta’ materjal ġenetikament modifikat irid ikollu mill-inqas 10 000 żerriegħa/qamħa. Dan ifisser li, fil-każ tal-qamħirrum, id-daqs tal-kampjun finali jrid ikun mill-inqas 3000 g u għall-fażola tas-sojja 2000 g. Għal żrieragħ u ċereali oħra bħax-xgħir, il-millieġ, il-ħafur, ir-ross, is-segala, il-qamħ u ż-żerriegħa tal-lift, id-daqs tal-kampjun finali ta’ 500 g jikkorrispondi għal aktar minn 10 000 żerriegħa/ċereali.

(*13) Meta d-daqs tal-kampjun aggregat ikun konsiderevolment inqas minn 4 kg jew litru (ara n-noti f’qiegħ il-paġna, il-punt 6), tkun tista’ tittieħed ukoll kwantità iżgħar mill-kampjun finali, bil-kundizzjoni li dan jiġi deskritt u dokumentat fir-rapport tat-teħid tal-kampjuni.

(*14) Fil-każ tat-teħid tal-kampjuni tal-legumi, il-qmuħ taċ-ċereali u l-ġewż tas-siġar biex jiġi determinat fihomx residwi mill-pestiċidi, id-daqs minimu tal-kampjun finali għandu jkun 1 kg f’konformità mad-dispożizzjonijiet tad-Direttiva tal-Kummissjoni 2002/63/KE tal-11 ta’ Lulju 2002 li tistabbilixxi metodi tal-Komunità ta’ teħid ta’ kampjuni għall-kontroll uffiċjali ta’ residwi ta’ pestiċidi ġo u fuq prodotti li joriġinaw mill-pjanti jew mill-annimali u li tħassar id-Direttiva 79/700/KEE (ĠU L 187, 16.7.2002, p. 30).

(*15) (****) F’każ ta’ eżami permezz ta’ spezzjoni viżwali jew permezz tal-mikroskopija, l-ammont tal-kampjun finali għall-eżami għandu jkun ta’ 1 kg.

(2) Jekk ikun hemm xi ċapep, dawn iridu jiġu mfarrka (jekk ikun hemm bżonn billi jisseparawhom u mbagħad jitpoġġew lura fil-kampjun).

(3) Ħlief fil-każ ta’ għalf oħxon jew foraġġ b’densità speċifika baxxa.

(4) Ħlief fil-każ ta’ għalf oħxon jew foraġġ b’densità speċifika baxxa.

(5) Ir-Regolament (KE) Nru 178/2002 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-28 ta’ Jannar 2002 li jistabbilixxi l-prinċipji ġenerali u l-ħtiġijiet tal-liġi dwar l-ikel, li jistabbilixxi l-Awtorità Ewropea dwar is-Sigurtà fl-Ikel u jistabbilixxi l-proċeduri fi kwistjonijiet ta’ sigurtà tal-ikel (ĠU L 31, 1.2.2002, p. 1).

ANNESS III

“ANNESS III

METODI TA’ ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-KOMPOŻIZZJONI TAL-MATERJALI TAL-GĦALF U L-GĦALF KOMPOST

A. DETERMINAZZJONI TAL-INDEWWA

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li tiġi ddeterminata l-indewwa fl-għalf. Fil-każ ta’ għalf li jkun fih sustanzi volatili, bħall-aċidi organiċi, għandu jiġi osservati li għadd sinifikanti ta’ sustanzi volatili wkoll jiġi determinat flimkien mal-indewwa.

Dan ma jkoprix l-analiżi ta’ prodotti tal-ħalib bħala materjal tal-għalf u komposti tal-għalf fil-maġġoranza komposti minn prodotti tal-ħalib, l-analiżi ta’ xaħmijiet u żjut mill-annimali u mill-ħxejjex jew l-analiżi taż-żerriegħa taż-żejt u frott żejtni.

Id-determinazzjoni tal-kontenut ta’ ndewwa fiż-żrieragħ taż-żejt għandha tiġi ddeterminata bil-metodu kif previst mill-EN ISO 665 Determinazzjoni tal-kontenut ta’ indewwa u ta’ materja volatili, bl-intendiment li l-fażola tas-sojja għandha tintaħan qabel ma jiġi ddeterminat il-kontenut ta’ ndewwa.

2. Prinċipju

Il-kampjun jitnixxef f’kundizzjonijiet speċifikati li jvarjaw skont in-natura tal-għalf. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin. Huwa neċessarju li tagħmel tnixxif preliminari meta tkun qed tittratta ma’ għalf solidu li għandu kontenut ta’ indewwa għoli.

3. Apparat

3.1.

Kraxer magħmul minn materjal li ma jassorbix l-indewwa u li jkun faċli biex jitnaddaf, jippermetti tifrik rapidu u ndaqs mingħajr ma jipproduċi sħana apprezzabbli, sa fejn possibbli jipprevjeni l-kuntatt mal-arja ta’ barra u jissodisfa l-ħtiġiet stabbiliti f’4.1.1 u 4.1.2 (eż. mikrokraxers tal-martell jew imkessħa bl-ilma, mtieħen f’forma ta’ koni li jistgħu jiġu żarmati, kraxers li jaħdmu bil-mod jew dawk bir-roti bis-snien).

3.2.

Miżien analitiku, preċiż sa 1 mg.

3.3.

Kontenituri xotti ta’ metall li ma jikkorrodix jew tal-ħġieġ bl-għotjien li jagħlqu ermetikament; bank tax-xogħol li fuqu jista’ jinfirex il-kampjun tat-test b’madwar 0,3 g/cm2.

3.4.

Forn isotermiku li jissaħħan bl-elettriku (± 2 °C) ventilat kif suppost u li jassigura regolazzjoni rapida tat-temperatura (1).

3.5.

Forn tal-vakwu li jisħon bl-elettriku li jista’ jkun aġġustat armat b’pompa għaż-żejt u/jew b’mekkaniżmu li jintroduċi arja xotta sħuna jew aġent li jnixxef (eż. ossidu tal-kalċju).

3.6.

Dessikatur b’metall oħxon perforat jew pjanċa tal-porċellana, li fiha aġent li jnixxef b’mod effiċjenti.

4. Proċedura

NB:	L-operazzjonijiet deskritti f’din it-taqsima jridu jsiru immedjatament wara li jinfetħu l-pakketti tal-kampjuni. Tal-inqas, l-analiżi trid issir darbtejn.

4.1. Preparazzjoni

4.1.1. Għalf għajr dak imniżżel taħt 4.1.2 u 4.1.3

Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Jekk ikun hemm bżonn, farrak jew aqsam b’tali mod li tevita kwalunkwe varjazzjoni fl-indewwa (ara l-punt 6).

4.1.2. Ċereali u ħbub imfesdqa misħuqa

Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Itħan f’partikoli li minnhom tal-inqas 50 % jgħaddu minn passatur b’malji ta’ 0,5 mm u ma jibqax iktar minn 10 % skart f’passatur tond b’malji ta’ 1 mm.

4.1.3. Għalf f’forma likwida jew pejst, għalf kompost fil-maġġoranza minn żjut u xaħmijiet

Ħu madwar 25 g mill-kampjun, iżen sal-eqreb 10 mg, żid kwantità xierqa ta’ ramel anidridu miżun sal-eqreb 10 mg u ħallat sakemm jinkiseb prodott omoġenju.

4.2. It-tnixxif

Nixxef kontenitur (il-punt 3.3) bl-għatu tiegħu fil-forn issettjat f’temperatura ta’ 103 °C għal 30 min ± 1 min. Neħħi mill-forn u ħallih jiksaħ għat-temperatura ambjentali fid-dessikatur (3.6).

4.2.1. Għalf għajr dak imniżżel taħt il-punti 4.2.2 u 4.2.3

Iżen il-kontenitur bl-għatu sal-eqreb 1 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b’mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 103 °C. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista’ jkun. Ħallih ħa jinxef għal madwar erba’ sigħat ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa’ lura għal 103 °C. Iftaħ il-forn, issostitwixxi l-għatu fuq il-kontenitur minnufih, neħħi l-kontenitur mill-forn, ħallih ħa jibred għal 30 sa 45 minuta f’dessikatur (il-punt 3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.

Għal għalf kompost fil-maġġoranza (> 50 %) minn żjut u xaħmijiet, nixxef fil-forn għal 30 minuta oħra b’temperatura ta’ 103 °C. Id-differenza bejn iż-żewġ piżijiet ma għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-indewwa.

4.2.2. Ċereali, dqiq, ħbub imfesdqa misħuqa u grixa

Iżen il-kontenitur bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun mitħun u xerred b’mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 130 °C. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista’ jkun. Ħallih jinxef għal sagħtejn ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa’ lura għal 130 °C. Iftaħ il-forn, issostitwixxi l-għatu fuq il-kontenitur minnufih, neħħi l-kontenitur mill-forn, ħallih ħa jibred għal 30 sa 45 minuta f’dessikatur (il-punt 3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.

4.2.3. Għalf kompost li fih aktar minn 4 % sukrożju jew lattożju: materjal tal-għalf bħal ħarrub, prodotti taċ-ċereali idrolizzati, żerriegħa tax-xgħir, laqx tal-pitravi imnixxef, sustanzi li jdubu tal-ħut u taz-zokkor;

Iżen il-kontenitur bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b’mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn tal-arja (il-punt 3.5) li huwa diġà msaħħan sa bejn 80 °C u 85 °C. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista’ jkun.

Tella’ l-pressjoni sa 100 Torr u ħallih ħa jinxef f’din il-pressjoni għal madwar erba’ sigħat, jew f’kurrent ta’ arja taħraq u niexfa jew bl-użu ta’ aġent li jnixxef (madwar 300 g għal 20 kampjun). F’każ li tuża dan tal-aħħar, skonnettja l-pompa tal-arja meta tintlaħaq il-pressjoni preskritta. Ikkalkula l-ħin tat-tnixxif mill-mument meta t-temperatura tal-forn terġa’ lura għal 80 °C sa 85 °C. Bl-attenzjoni ġib lura l-forn għall-pressjoni atmosferika. Iftaħ il-forn, issostitwixxi l-għatu fuq il-kontenitur minnufih, neħħi l-kontenitur mill-forn, ħallih ħa jibred għal 30 sa 45 minuta f’dessikatur (il-punt 3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg. Nixxef għal 30 minuta oħra fil-forn vakwu b’temperatura ta’ 80 °C sa 85 °C u erġa’ iżen. Id-differenza bejn iż-żewġ piżijiet ma għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-indewwa.

4.3. Tnixxif preliminari (parzjali)

Huwa meħtieġ li l-għalf “imxarrab” jitnixxef parzjalment bi frazzjoni tal-massa ta’ inqas minn 85 % ta’ materja niexfa (eż. foraġġ, razzjonijiet imħallta totali, għal (mhux) likwidu) qabel it-tħin fin sabiex jiġu analizzati s-sustanzi stabbli tagħhom; għal sustanzi instabbli, it-tnixxif parzjali mhuwiex possibbli.

It-tnixxif parzjali jista’ jsir bl-użu ta’ forn tal-arja sfurzata jew forn microwave jew bit-tnixxif bil-lijofilizzazzjoni. Bl-eċċezzjoni ta’ tnixxif parzjali permezz ta’ tnixxif bil-lijofilizzazzjoni, l-għan huwa li l-għalf jitnixxef filwaqt li t-temperatura tal-kampjun tinżamm taħt is-60 °C sabiex il-kompożizzjoni kimika tiġi affettwata mill-inqas. It-tnixxif f’temperaturi ogħla minn 60 °C jikkawża bidliet kimiċi fl-għalf (eż. degradazzjoni tal-proteini). L-għalf imnixxef għandu jiġi ekwilibrat f’temperatura ambjentali għal madwar 15-il minuta qabel ma titkejjel il-materja parzjalment niexfa sabiex tiġi minimizzata l-bidla potenzjali fl-indewwa li tista’ sseħħ waqt it-tħin u l-ħżin. It-tnixxif f’temperaturi ta’ inqas minn 60 °C ma jneħħix l-ilma kollu mill-għalf; għalhekk, it-tnixxif parzjali (inizjali) ma jirrappreżentax il-materja niexfa totali tal-għalf. Wara t-tnixxif, is-subkampjun jintaħan u jiġi analizzat għall-materja niexfa (finali) tal-kampjun parzjalment niexef (it-3 % sal-15 % tal-indewwa li jifdal) meta jiġu ddeterminati kostitwenti kimiċi oħra.

Għalhekk, hija rakkomandata proċedura f’żewġ stadji għad-determinazzjoni tal-materja niexfa. L-ewwel iddetermina l-kontenut parzjalment xott (jekk inqas minn 85 % ta’ materja xotta), imbagħad iddetermina l-kontenut xott li jifdal fuq kampjun tat-test mitħun u mmultiplika l-materja parzjalment xotta bil-materja niexfa li jifdal biex tiddetermina l-kontenut totali ta’ materja xotta.

5. Il-kalkolu tar-riżultati

L-indewwa (X), bħala perċentwal tal-kampjun, hija kkalkulata billi jintużaw il-formoli li ġejjin:

5.1. Tnixxif mingħajr tnixxif preliminari

fejn:

m	=	piż inizjali fi grammi, tal-kampjun tat-test,
m0	=	piż fi grammi, tal-kampjun tat-test imnixxef.

5.2. Tnixxif bi tnixxif preliminari (2)

fejn:

m	=	piż inizjali fi grammi, tal-kampjun tat-test,
m1	=	piż fi grammi, tal-kampjun tat-test wara t-tnixxif preliminari,
m2	=	piż fi grammi, tal-kampjun tat-test wara t-tifrik jew it-tħin,
m0	=	piż fi grammi, tal-kampjun tat-test imnixxef.

5.3. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex taqbeż iż–0,2 % tal-valur assolut tal-indewwa, ħlief għall-ikel imxarrab għall-annimali domestiċi u oġġetti tal-magħad għall-klieb, fejn id-differenza ma għandhiex taqbeż iż–0,5 % tal-valur assolut tal-indewwa.

6. Osservazzjoni

Jekk jidher li hemm bżonn tat-tifrik u jekk dan jidher li jibdel l-indewwa tal-prodott, ir-riżultati tal-analiżi tal-komponenti tal-għalf iridu jiġu korretti skont l-indewwa tal-kampjun fl-istat inizjali tiegħu.

B. DETERMINAZZJONI TAL-INDEWWA FIX-XAĦMIJIET U Ż-ŻJUT TAL-ANNIMALI U L-ĦXEJJEX

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-ilma u sustanzi volatili fiż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali.

2. Prinċipju

Il-kampjun jitnixxef għal piż kostanti (it-telf fil-piż bejn żewġ użinijiet suċċessivi jrid ikun inqas minn jew ugwali għal 1 mg) f’103 °C. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin.

3. Apparat

3.1.

Dixx b’qiegħ ċatt, magħmul minn materjal li jiflaħ għall-korrużjoni, b’dijametru ta’ 8 sa 9 cm u għoli bejn wieħed u ieħor 3 cm.

3.2.

Termometru b’bozza rinfurzata u b’tubu ta’ espansjoni fit-tarf ta’ fuq, immarkat minn madwar 80 °C sa mill-anqas 110 °C, u twil madwar 10 cm.

3.3.

Banju tar-ramel jew hot-plate tal-elettriku.

3.4.

Dessikatur, li fih aġent li jnixxef effiċjenti.

3.5.

Miżien analitiku.

4. Proċedura

Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun omoġenizzat, fid-dixx xott li jkun intiżen minn qabel (il-punt 3.1) bit-termometru fih (il-punt 3.2). Saħħan fuq il-banju tar-ramel jew fuq il-hot-plate (il-punt 3.3), filwaqt li tħawwad kontinwament sabiex it-temperatura tilħaq 90 °C f’madwar 7 minuti.

Naqqas is-sħana, filwaqt li tinnota l-frekwenza li biha l-bżieżaq jitilgħu mill-qiegħ tad-dixx. It-temperatura ma tridx tkun ta’ aktar minn 105 °C. Kompli ħawwad, aqla’ mill-qiegħ tad-dixx sakemm ma jibqgħux jiffurmaw aktar bżieżaq.

Sabiex tassigura l-eliminazzjoni kompluta tal-indewwa, erġa’ saħħan għal diversi drabi għal 103 °C ± 2 °C, berred sa 93 °C bejn it-tisħin suċċessiv. Imbagħad ħallih jiksaħ sat-temperatura tal-ambjent fid-dessikatur (il-punt 3.4) u iżen. Irrepeti din l-operazzjoni sakemm it-telf fil-piż bejn żewġ użinijiet suċċessivi ma tkunx aktar minn 2 mg.

NB:	Żieda fil-piż tal-kampjun wara tisħin ripetut tindika ossidazzjoni tax-xaħam, u f’dan il-każ ikkalkula r-riżultat mill-użin li jkun sar immedjatament qabel ma beda jiżdied il-piż.

5. Il-kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-indewwa (X), bħala perċentwali tal-kampjun, jiġi kkalkulat permezz tal-formula segwenti:

fejn:

m	=	piż, fi grammi, tal-kampjun tat-test;
m1	=	piż, fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu qabel jissaħħan;
m2	=	piż fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu wara li jissaħħan.

Riżultati inqas minn 0,05 % jridu jiġu rrekordjati bħala ‘inqas minn 0,05 %’.

Ripetibbiltà

Id-differenza fl-indewwa bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li jkunu saru fuq l-istess kampjun ma għandhiex taqbeż iż–0,1 %, f’valur assolut.

C. DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAN-NITROĠENU U KALKOLU TAL-KONTENUT TA’ PROTEINA MHUX RAFFINATA

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-kontenut tal-proteina mhux raffinata fl-għalf fuq il-bażi tal-kontenut tan-nitroġenu, iddeterminat skont il-metodu Kjeldahl (3).

2. Prinċipju

Il-kampjun jiġi diġerit bl-aċidu sulfuriku fil-preżenza ta’ katalizzatur. Is-soluzzjoni aċidika ssir alkalina b’soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju. L-ammonja tiġi distillata u miġbura fi kwantità mkejla ta’ aċidu sulfuriku li l-eċċess tiegħu jiġi titrat b’soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju.

Inkella, l-ammonja liberata tiġi distillata f’eċċess ta’ soluzzjoni ta’ aċidu boriku, segwit minn titrazzjoni b’soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku jew l-aċidu sulfuriku.

3. Reaġenti

3.1.

Sulfat tal-potassju.

3.2.

Katalizzatur: ossidu tar-ram CuO jew sulfat tar-ram pentaidratat, CuSO4 5H2O.

3.3.

Frak taż-żingu.

3.4.

Aċidu sulfuriku, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indikatur tal-aħmar tal-metil; dewweb 300 mg aħmar tal-metil f’100 ml etanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju (Jista’ jintuża l-grad tekniku) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni volumetrika standard c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni volumetrika standard c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Ġebla ħaffiefa mfarrka, maħsula fl-aċidu idrokloriku u mogħtija n-nar.

3.13.

Aċetanilid (m.p. = 114 °C, kontenut ta’ N = 10,36 %).

3.14.

Sukrożju (ħieles min-nitroġenu).

3.15.

Aċidu boriku (H3BO3).

3.16.

Soluzzjoni tal-indikatur tal-aħmar tal-metil: dewweb 100 mg aħmar tal-metil f’100 ml etanol jew metanol.

3.17.

Soluzzjoni ta’ aħdar tal-bromokresol: dewweb 100 mg aħdar tal-bromokresol f’100 ml etanol jew metanol.

3.18.

Soluzzjoni tal-aċidu boriku (10 g/l sa 40 g/l skont l-apparat użat)

Meta tiġi applikata d-detezzjoni kolorimetrika tal-punt finali, l-indikaturi aħmar tal-metil u l-bromokresol iridu jiżdiedu mas-soluzzjonijiet tal-aċidu boriku. Jekk jiġi ppreparat 1 l aċidu boriku, qabel jiġi aġġustat il-volum, għandhom jiżdiedu 7 ml soluzzjoni tal-indikatur aħmar tal-metil (il-punt 3.16) u 10 ml soluzzjoni ta’ aħdar tal-bromokresol (il-punt 3.17).

Il-pH tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku tista’ tvarja minn lott għal lott skont l-ilma użat. Il-pH tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku għandu jkun bejn il-punti 4.3 u 4.7. Ħafna drabi jkun hemm bżonn ta’ aġġustament b’volum żgħir ta’ alkali sabiex jinkiseb imbjank pożittiv

Nota:

Iż-żieda ta’ 3 ml sa 4 ml NaOH (il-punt 3.11) f’1 l ta’ 10 g/l aċidu boriku ġeneralment tagħti aġġustamenti tajbin. Aħżen is-soluzzjoni f’temperatura ambjentali u waqt il-ħażna, ipproteġi s-soluzzjoni mid-dawl u sorsi ta’ dħaħen tal-ammonja.

3.19.

Soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku c(HCl) = 0,10 mol/l.

Nota:

Jistgħu jintużaw konċentrazzjonijiet oħra ta’ soluzzjonijiet volumetriċi (il-punti 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, u 3.19), jekk isir tajjeb għalihom fil-kalkoli. Il-konċentrazzjonijiet għandhom dejjem ikunu espressi sa erba’ postijiet deċimali.

4. Apparat

Apparat adattat sabiex issir id-diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni skont il-proċedura Kjeldahl.

5. Proċedura

5.1. Diġestjoni

Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb 0,001 g u qiegħed il-kampjun fil-kunjett tal-apparat tad-diġestjoni. Żid 15 g sulfat tal-potassju (il-punt 3.1.), kwantità adatta tal-katalizzatur (il-punt 3.2) (0,3 sa 0,4 g ossidu tar-ram jew 0,9 sa 1,2 g sulfat tar-ram pentaidratat), 25 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.4) u jekk meħtieġ, ftit frak tal-ġebla ħaffiefa (il-punt 3.12) u ħallat.

Saħħan il-kunjett moderatament għall-ewwel, jekk ikun hemm bżonn ħawdu minn żmien għal żmien sakemm il-massa tkun ikkarbonizzata u r-ragħwa tkun sparixxiet; imbagħad saħħan b’mod aktar intensiv sakemm il-likwidu jkun qiegħed jagħli sew. It-tisħin huwa adegwat jekk l-aċidu li jkun qiegħed jagħli jikkondensa mal-ġnub tal-kunjett. Tħallix li l-ġnub jisħnu żżejjed u li partikoli organiċi jeħlu magħhom.

Meta s-soluzzjoni ssir ċara u ħadra ċara, kompli għalli għal sagħtejn oħra, u wara ħalliha ħa tibred.

5.2. Distillazzjoni

Bilmod, żid biżżejjed ilma sabiex tassigura li s-sulfati jdubu kompletament. Ħalli ħa jibred u wara, jekk ikun hemm bżonn, żid ftit granuli taż-żingu (il-punt 3.3). Kompli skont il-punt 5.2.1. jew 5.2.2.

5.2.1. Distillazzjoni fl-aċidu sulfuriku

Fil-kunjett tal-ġbir tal-apparat għad-distillazzjoni poġġi kwantità mkejla eżatta ta’ 25 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.5) jew (il-punt 3.7) skont il-kontenut preżunt tan-nitroġenu. Żid ftit qtar ta’ indikatur tal-aħmar tal-metil (il-punt 3.8).

Qabbad il-kunjett tad-diġestjoni mal-kondensatur tal-apparat għad-distillazzjoni u għaddas it-tarf tal-kondensatur fil-likwidu li jinsab fil-kunjett tal-ġbir għal fond ta’ madwar 1 cm (ara l-punt ta’ osservazzjoni 8.3). Bil-mod, ferra’ 100 ml ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.9) fil-kunjett għad-diġestjoni mingħajr telf ta’ ammonja (ara l-punt ta’ osservazzjoni 8.1). Saħħan il-kunjett sakemm l-ammonja tkun iddistillat.

5.2.2. Distillazzjoni fl-aċidu boriku

Fejn it-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat issir manwalment, tapplika l-proċedura msemmija hawn taħt. Fejn l-unità tad-distillazzjoni hija kompletament awtomatika biex tinkludi t-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat, segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-operazzjoni tal-unità tad-distillazzjoni.

Poġġi l-kunjett tal-ġbir li fih 25 ml sa 30 ml tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (il-punt 3.18) taħt il-ħruġ tal-kondensatur b’tali mod li t-tubu tal-ġarr ikun taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku żejda. Irranġa l-unità tad-distillazzjoni biex tagħti 50 ml ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.9). Ħaddem l-unità tad-distillazzjoni f’konformità mal-istruzzjonijiet tal-manifattur u ddistilla ’l barra l-ammonja li nħelset biż-żieda tas-soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju. Iġbor id-distillat fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku riċevitriċi. L-ammont ta’ distillat (ħin tad-distillazzjoni bil-fwar) jiddependi mill-ammont ta’ nitroġenu fil-kampjun. Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Nota:

F’unità għad-distillazzjoni semiawtomatika, iż-żieda tal-eċċess tal-idrossidu tas-sodju u d-distillazzjoni bil-fwar isiru awtomatikament.

5.3. Titrazzjoni

Kompli skont il-punt 5.3.1. jew 5.3.2.

5.3.1. Aċidu sulfuriku

Fil-kunjett tal-ġbir ittitra l-eċċess tal-aċidu sulfuriku b’soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju (il-punt 3.10 jew 3.11) skont il-konċentrazzjoni tal-aċidu sulfuriku użat, sakemm jintlaħaq il-punt finali.

5.3.2. Aċidu boriku

Ittitra l-kontenut tal-kunjett tal-ġbir bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku (il-punt 3.19) jew bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu sulfuriku (il-punt 3.6) billi tuża buretta u aqra l-ammont ta’ titrant użat.

Meta tiġi applikata d-detezzjoni kolorimetrika tal-punt finali, il-punt finali jintlaħaq mal-ewwel traċċa tal-kulur roża fil-kontenut. Ivvaluta l-qari tal-buretta sal-eqreb 0,05 ml. Stirrer plate manjetika jew detettur fotometriku jistgħu jgħinu sabiex tara l-punt finali.

Dan jista’ jsir awtomatikament billi jintuża distillatur tal-fwar b’titrazzjoni awtomatika.

Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur biex tħaddem id-distillatur speċifiku jew distillatur/titratur.

Nota:

Meta tintuża sistema ta’ titrazzjoni awtomatika, it-titrazzjoni tibda immedjatament wara li tibda d-distillazzjoni u tintuża 1 % tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (il-punt 3.18).

Fejn titħaddem unità tad-distillazzjoni kompletament awtomatika, it-titrazzjoni awtomatika tal-ammonja tista’ ssir bid-detezzjoni tal-punt finali billi tintuża sistema ta’ pH potenzjometrika.

F’dan il-każ jintuża titratur awtomatiku b’pH-miter. Il-pH-miter għandu jkun ikkalibrat sewwa fil-firxa ta’ pH 4 sa pH 7 bi proċeduri ta’ kalibrar ta’ pH normali fil-laboratorju.

Il-punt finali ta’ pH tat-titrazzjoni jintlaħaq f’pH 4,6, billi huwa l-ogħla punt fil-kurva tat-titrazzjoni (punt ta’ inflezzjoni).

5.4. Test fl-inbjank

Biex tikkonferma li r-reaġenti ma għandhomx nitroġenu, agħmel test fl-inbjank (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) billi tuża 1 g sukrożju (il-punt 3.14) minflok il-kampjun.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Il-kalkoli jsiru skont il-punt 6.1 jew 6.2.

6.1. Kalkolu tat-titrazzjoni skont il-punt 5.3.1

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, espress bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

Fejn:

V0	=	hija l-volum (ml) ta’ NaOH (il-punt 3.10 jew 3.11) użat fit-test fl-inbjank.
V1	=	hija l-volum (ml) ta’ NaOH (il-punt 3.10 jew 3.11) użat fil-kampjun tat-titrazzjoni.
c	=	hija l-konċentrazzjoni (mol/l) ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.10 jew 3.11).
m	=	hija l-piż (g) tal-kampjun.

6.2. Kalkolu tat-titrazzjoni skont il-punt 5.3.2

6.2.1. Titrazzjoni bl-aċidu idrokloriku

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, espress bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

m	=	hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test;
c	=	hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku (il-punt 3.19);
V0	=	hija l-volum (f’ml) ta’ aċidu idrokloriku użat għat-test fl-imbjank;
V1	=	hija l-volum (f’ml) ta’ aċidu idrokloriku użat għall-porzjon għat-test.

6.2.2. Titrazzjoni bl-aċidu sulfuriku

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, espress bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

m	=	hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test;
c	=	hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta’ aċidu sulfuriku (il-punt 3.6);
V0	=	hija l-volum (f’ml) ta’ aċidu sulfuriku (il-punt 3.6) użat għat-test fl-imbjank;
V1	=	hija l-volum (f’ml) ta’ aċidu sulfuriku (il-punt 3.6) użat għall-porzjon tat-test.

7. Verifika tal-metodu

7.1. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fl-istess kampjun ma għandhiex tkun aktar minn:

—	0,4 % f’valur assolut, għal kontenuti ta’ proteina mhux raffinata ta’ inqas minn 20 %;

—	2,0 % relattiv għall-valur ogħla, għal kontenuti ta’ proteina mhux raffinata minn 20 % sa 40 %;

—	0,8 % f’valur assolut, għall-kontenut ta’ proteina mhux raffinata ta’ aktar minn 40 %.

7.2. Riproduċibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun fl-laboratorji differenti ma għandhiex taqbeż:

—	1,8 % f’valur assolut, għal kontenuti ta’ proteina mhux raffinata ta’ inqas minn 20 %;

—	9,0 % relattiv għall-valur ogħla, għal kontenuti ta’ proteina mhux raffinata minn 20 % sa 40 %;

—	3,6 % f’valur assolut, għall-kontenut ta’ proteina mhux raffinata ta’ aktar minn 40 %.

7.3. Preċiżjoni

Agħmel l-analiżi (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) fuq kwantità xierqa ta’ aċetanilide (il-punt 3.13) (eż. 0,2 sa 0,3 g) fil-preżenza ta’ 1 g sukrożju (il-punt 3.14); 1 g aċetanilide tikkonsma 14,80 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.5). L-irkupru jrid ikun tal-inqas 99 %.

8. Osservazzjonijiet

8.1.

L-apparat jista’ jkun tat-tip manwali, semi-awtomatiku jew awtomatiku. Jekk l-apparat jeħtieġ it-trasferiment bejn diġestjoni u distillazzjoni, dan it-trasferiment għandu jitwettaq mingħajr telf. Jekk il-kunjett tal-apparat tad-distillazzjoni ma jkunx iffittjat b’lenbut għat-tifrigħ żid l-idrossidu tas-sodju immedjatament qabel ma tqabbad il-kunjett mal-kondensatur, billi tferra’ l-likwidu bilmod mal-ġnub tal-kondensatur.

8.2.

Jekk id-diġestjoni tissolidifika, erġa’ ibda d-determinazzjoni billi tuża ammont akbar ta’ aċidu sulfuriku (il-punt 3.4) minn dak speċifikat fil-punt 5.1.

8.3.

Għall-prodotti b’kontenut baxx ta’ nitroġenu, il-volum tal-aċidu sulfuriku (3.7) li għandu jitqiegħed fil-kunjett tal-ġbir jista’ jitnaqqas, fejn meħtieġ, sa 10 jew 15 ml u jiżdied sa 25 ml bl-ilma.

8.4.

Għal analiżi ta’ rutina, jistgħu jiġu applikati metodi ta’ analiżi alternattivi għad-determinazzjoni ta’ proteina mhux raffinata iżda l-metodu Kjeldahl deskritt f’din il-Parti C huwa l-metodu ta’ referenza. L-ekwivalenza tar-riżultati miksubin bil-metodu alternattiv, (eż. DUMAS) imqabbla mal-metodu ta’ referenza, trid tintwera individwalment għal kull matriċi. Billi r-riżultati miksubin b’metodu alternattiv, jistgħu jvarjaw xi ftit mir-riżultati miksubin bil-metodu ta’ referenza anke wara li tkun ġiet ivverifikata l-ekwivalenza, fir-rapport analitiku jrid jissemmal-metodu ta’ analiżi użat għad-determinazzjoni tal-proteina mhux raffinata.

D. DETERMINAZZJONI TAL-UREA

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ urea fl-għalf.

2. Prinċipju

Il-kampjun jiġi sospiż fl-ilma b’aġent li jiċċara. Is-sospensjoni tiġi ffiltrata. Il-kontenut tal-urea tal-filtrat jiġi ddeterminat wara ż-żieda ta’ 4-dimetilamminobenżaldeid (4-DMAB) billi titkejjel id-densità ottika f’tul ta’ mewġa ta’ 420 nm.

3. Reaġenti

3.1.

Soluzzjoni ta’ 4-dimetilamminobenżaldeid: dewweb 1,6 g ta’ 4-DMAB f’100 ml ta’ 96 % etanol u żid 10 ml aċidu idrokloriku (ρ20 1,19 g/ml). Dan ir-reaġent jista’ jinżamm għal perjodu massimu ta’ ġimagħtejn.

3.2.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta’ aċetat taż-żingu, Zn(CH3COO)2 2H2O u 3 g ta’ aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.3.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta’ ferroċjanur tal-potassju, K4Fe(CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Karbonju attiv li ma jassorbix l-urea (irid jiġi vverifikat).

3.5.

Urea, soluzzjoni 0,1 % (w/v).

4. Apparat

4.1.

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

4.2.

Tubi tat-testijiet: 160 × 16 mm b’tappijiet tal-ħġieġ mitħun.

4.3.

Spettrofotometru.

5. Proċedura

5.1. Analiżi tal-kampjun

Iżen 2 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f’kunjett volumetriku ta’ 500 ml ma’ 1 g karbonju attiv (il-punt 3.4). Żid 400 ml ilma u 5 ml ta’ soluzzjoni Carrez I (il-punt 3.2) u ħawwad għal madwar 30 sekonda u żid 5 ml ta’ soluzzjoni Carrez II (il-punt 3.3). Ħawwad għal tletin minuta ġot-tazza. Żid sal-volum bl-ilma, ħawwad u ffiltra.

Neħħi 5 ml tal-filtrati trasparenti bla kulur, qiegħed f’tubi tat-testijiet b’tappijiet tal-ħġieġ mitħun, żid 5 ml ta’ soluzzjoni 4-DMAB (il-punt 3.1) u ħawwad. Qiegħed it-tubi f’banjumarija sħun f’temperatura ta’ 20 °C (+/- 4 °C). Wara ħmistax-il minuta kejjel id-densità ottika tas-soluzzjoni tal-kampjun bl-ispettrofotometru f’ 420 nm. Qabbel is-soluzzjoni tat-test fl-inbjank tar-reaġenti.

5.2. Kurva ta’ kalibrar

Neħħi volumi ta’ 1, 2, 4, 5 u 10 ml tas-soluzzjoni tal-urea (il-punt 3.5), qiegħed f’kunjetti volumetriċi ta’ 100 ml u żid sal-volum bl-ilma. Neħħi 5 ml minn kull soluzzjoni, żid 5 ml ta’ soluzzjoni ta’ 4-DMAB (il-punt 3.1) f’kull wieħed minnhom, omoġenizza u kejjel id-densità ottika kif murija fuq meta mqabbla mas-soluzzjoni ta’ kontroll li jkun fiha 5 ml ta’ 4-DMAB u 5 ml ilma ħieles mill-urea. Ipplottja l-kurva ta’ kalibrar.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Stabbilixxi l-ammont ta’ urea fil-kampjun permezz tal-kurva ta’ kalibrar.

Esprimi r-riżultat f’mg ta’ urea għal kull kg ta’ kampjun.

7. Evalwazzjoni tal-metodu

7.1. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun fl-istess laboratorju u mill-istess operatur, ma għandhiex taqbeż:

—

F’420 nm

—	50 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea minn 3 000 mg/kg sa inqas minn 5 000 mg/kg;

—	25 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea minn 5 000 mg/kg sa inqas minn 7 000 mg/kg;

—	20 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea ta’ 7 000 mg/kg jew aktar.

—

F’435 nm

—	40 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea minn 3 000 mg/kg sa inqas minn 5 000 mg/kg;

—	25 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea minn 5 000 mg/kg sa inqas minn 9 000 mg/kg;

—	5 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea ta’ 9 000 mg/kg jew aktar.

7.2. Riproduċibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun fl-laboratorji differenti u/jew minn operaturi differenti ma għandhiex taqbeż:

—

F’420 nm

—	3 000 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-urea minn 3 000 mg/kg sa inqas minn 12 000 mg/kg;

—	4 500 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-urea ta’ 12 000 mg/kg jew iktar.

—

F’435 nm

—	50 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea minn 3 000 mg/kg sa inqas minn 8 000 mg/kg;

—	25 % relattiv għall-valur l-aktar għoli, għall-kontenuti tal-urea ta’ 8 000 mg/kg jew aktar.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat eżerċizzju ta’ tqabbil bejn il-laboratorji tal-UE li fih ħadu sehem 18-il laboratorju. Ħames kampjuni pożittivi tal-għalf kompost tar-ruminanti (fit-tabelli 1 u 2 imsejħa MAT) ġew analizzati (analiżi waħda) f’duplikati fl-għama filwaqt li għalf kompost inbjank tar-ruminanti ġie analizzat darba.

Il-kalkoli għal-limiti ta’ ripetibbiltà (r) u riproduċibbiltà (R) kif definiti mil-linji gwida internazzjonali twettqu wara t-tneħħija ta’ outliers bl-użu tal-Analiżi tal-Varjanza tal-valuri validi.

Iċ-ċifri kkalkolati tal-prestazzjoni tal-metodu (ripetibbiltà, riproduċibbiltà) huma ppreżentati fit-tabelli li ġejjin. Fuq il-kampjuni ttestjati kollha inkluż il-materjal inbjank, ma nstabu l-ebda pożittivi foloz jew negattivi foloz.

Tabella 1

Karatteristiċi tal-prestazzjoni tal-metodu għall-urea mkejla f’λ = 420 nm fil-materjali kollha

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Nagħaġ	Bovini	Nagħaġ	Nagħaġ	Bovini
Frazzjoni tal-massa fil-mira (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Frazzjoni tal-massa medja. (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Devjazzjoni standard tar-riproduċibilità sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Devjazzjoni standard tar-ripetibilità sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Devjazzjoni standard relattiva tar-riproduċibilità RSDR (%)	27	19	13	10	14
Devjazzjoni standard relattiva tar-ripetibilità RSDr (%)	17	9	7	7	6
Limitu tar-riproduċibilità, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Limitu tar-ripetibbiltà, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabella 2

Karatteristiċi tal-prestazzjoni tal-metodu għall-urea mkejla f’λ = 435 nm fil-materjali kollha

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Nagħaġ	Bovini	Nagħaġ	Nagħaġ	Bovini
Frazzjoni tal-massa fil-mira (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Frazzjoni tal-massa medja. (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Devjazzjoni standard tar-riproduċibilità sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Devjazzjoni standard tar-ripetibilità sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Devjazzjoni standard relattiva tar-riproduċibilità RSDR (%)	17	18	9	7	12
Devjazzjoni standard relattiva tar-ripetibilità RSDr (%)	14	10	8	2	1
Limitu tar-riproduċibilità, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Limitu tar-ripetibbiltà, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9. Osservazzjonijiet

9.1.

Fil-każ ta’ kontenuti ta’ urea li jaqbżu t-3 %, naqqas il-kampjun sa 1 g jew iddilwixxi s-soluzzjoni oriġinali sabiex ma jkunx hemm aktar minn 50 mg urea f’500 ml.

9.2.

Fil-każ ta’ kontenuti baxxi ta’ urea, żid il-kampjun sakemm il-filtrat jibqa’ trasparenti u bla kulur.

9.3.

Ir-riżultati ta’ hawn fuq minn provi kollaborattivi ma jindikawx differenza sinifikanti fil-preċiżjoni bejn l-urea mkejla f’420 nm jew f’435 nm.

E. DETERMIMAZZJONI TA’ AMMINOAĊIDI (MINBARRA T-TRIPTOFAN)

Il-metodi tal-analiżi li għandhom jintużaw għad-determinazzjoni tal-amminoaċidi (ħlief it-triptofan) huma:

—	EN ISO 13903 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-kontenut tal-amminoaċidi

—	EN ISO 17180 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-liżina, tal-metijonina u tat-treonina fi prodotti u taħlitiet lesti minn qabel tal-amminoaċidi kummerċjali (4)

—	il-metodu ta’ analiżi kif deskritt fil-punti 1 sa 10 hawn taħt,

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu determinati l-amminoaċidi ħielsa (sintetiċi u naturali) u totali (marbutin mal-peptidi u ħielsa) fil-materjali tal-għalf, l-għalf kompost u t-taħlitiet lesti minn qabel li fihom inqas minn 10 % (5) minn kull amminoaċidu, bl-użu ta’ analizzatur tal-amminoaċidi. Dan japplika għall-amminoaċidi li ġejjin: ċis(e)ina, metijonina, liżina, treonina, alanina, arġinina, aċidu aspartiku, aċidu glutamiku, gliċina, istidina, isolewċina, lewċina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina u valina.

Il-metodu ma jiddistingwix bejn l-imlieħ varji tal-amminoaċidi u ma jistax jagħmel distinzjoni bejn il-forom D u L tal-amminoaċidi. Mhuwiex validu għad-determinazzjoni tat-triptofan jew għal analogi tal-idrossi tal-amminoaċidi.

2. Prinċipju

2.1. Amminoaċidi ħielsa

L-amminoaċidi ħielsa jiġu estratti bl-aċidu idrokloriku dilwit. Makromolekuli nitroġeniċi koestratti jiġu ppreċipitati bl-aċidu sulfosaliċiliku u jitneħħew billi jiġu ffiltrati. Is-soluzzjoni ffiltrata tiġi aġġustata għal pH 2,20. L-amminoaċidi jiġu sseparati bi kromatografija ta’ skambju tal-joni u jiġu ddeterminati permezz ta’ reazzjoni man-ninidrina b’detezzjoni fotometrika f’570 nm.

2.2. Amminoaċidi totali

Il-proċedura magħżula tiddependi mill-amminoaċidi li jkunu qegħdin jiġu investigati. Iċ-ċist(e)ina u l-metijonina għandhom jiġu ossidizzati fl-aċidu ċisteiku u l-metijonina sulfon rispettivament qabel ma ssir l-idroliżi. It-tirożina għandha tiġi ddeterminata fl-idroliżati ta’ kampjuni mhux ossidizzati. L-amminoaċidi l-oħra kollha li huma mniżżlin fil-punt 1 (Fini u kamp ta’ applikazzjoni) jistgħu jiġu ddeterminati kemm fil-kampjun ossidizzat kif ukoll f’dak li mhuwiex ossidizzat.

L-ossidizzazzjoni ssir f’0 °C b’taħlita ta’ aċidu performiku/fenol. Ir-reaġent li jkun fadal jiġi dekompost bid-disulfat tas-sodju. Il-kampjun ossidizzat jew mhux ossidizzat jiġi idrolizzat bl-aċidu idrokloriku (il-punt 3.20) għal 23 siegħa. Il-idroliżat jiġi aġġustat għal pH 2,20. L-amminoaċidi jiġu sseparati bi kromatografija ta’ skambju tal-joni u jiġu ddeterminati permezz ta’ reazzjoni man-ninidrina b’detezzjoni fotometrika f’570 nm (440 nm għall-prolina).

3. Reaġenti

Għandu jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta’ kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS).

3.1.

Perossidu tal-idroġenu, w (w/w) = 30 %.

3.2.

Aċidu formiku, w (w/w) = 98-100 %.

3.3.

Fenol.

3.4.

Disulfit tas-sodju.

3.5.

Idrossidu tas-sodju.

3.6.

Diidrat tal-aċidu 5-sulfosaliċiliku.

3.7.

Aċidu idrokloriku, densità bejn wieħed u ieħor 1,18 g/ml.

3.8.

ċitrat trisodiku diidrat.

3.9.

2,2’-Tijodietanol (tijodiglikol).

3.10.

klorur tas-sodju.

3.11.

Ninidrina.

3.12.

Petroleum ħafif, firxa tat-togħlija 40-60 °C.

3.13.

Norlewċina, jew kompost ieħor xieraq għall-użu bħala standard intern.

3.14.

Gass tan-nitroġenu (< 10 ppm ossiġnu).

3.15.

1-Ottanol.

3.16.

Amminoaċidi.

3.16.1.

Sustanzi standard tal-amminoaċidi elenkati taħt il-punt 1 (Skop u kamp ta’ applikazzjoni). Komposti puri li ma jkunx fihom ilma tal-kristallizzazzjoni. Nixxef f’vakwu fuq P2O5 jew H2SO4 għal ġimgħa waħda qabel l-użu.

3.16.2.

Aċidu ċisteiku.

3.16.3.

Metijonina sulfon.

3.17.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 7,5 mol/l:

Dewweb 300 g NaOH (il-punt 3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l.

3.18.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 1 mol/l:

Dewweb 40 g NaOH (il-punt 3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l.

3.19.

Soluzzjoni ta’ aċidu formiku-fenol:

Ħallat 889 g aċidu formiku (il-punt 3.2) ma’ 111 g ilma u żid 4,73 g fenol (il-punt 3.3).

3.20.

Taħlita tal-idroliżi, c = 6 mol HCl/l li jkun fih 1 g fenol/l:

Żid 1 g fenol (il-punt 3.3) sa 492 ml HCl (il-punt 3.7) u żid bl-ilma sakemm ikollok 1 l.

3.21.

Taħlita għall-estrazzjoni, c = 0,1 mol HCl/l li jkun fiha 2 % tijodiglikol: Ħu 8,2 ml HCl (il-punt 3.7), iddilwixxi bejn wieħed u ieħor b’900 ml ilma, żid 20 ml tijodiglikol (il-punt 3.9) u żid bl-ilma sakemm ikollok 1 l, (tħallatx il-punt il-punt 3.7 u 3.9 direttament).

3.22.

Aċidu 5-sulfosaliċiliku, ß = 6 %:

Dewweb 60 g aċidu 5-sulfosaliċiliku (il-punt 3.6) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l.

3.23.

Taħlita għall-ossidizzazzjoni (aċidu performiku -fenol):

Ħallat 0,5 ml perossidu tal-idroġenu (il-punt 3.1) ma’ 4,5 ml soluzzjoni ta’ aċidu formiku-fenol (il-punt 3.19) f’beaker żgħir. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ bejn 20-30 °C għal madwar siegħa (1hr) sabiex tifforma l-aċidu performiku, imbagħad kessaħ f’banjumarija bis-silġ (15 min) qabel ma żżid mal-kampjun.

Attenzjoni: Evita l-kuntatt mal-ġilda u ilbes ilbies protettiv.

3.24.

Buffer ta’ ċitrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20:

Dewweb 19,61 g ċitrat tas-sodju (il-punt 3.8), 5 ml tijodiglikol (il-punt 3.9), 1 g fenol (il-punt 3.3) u 16,50 ml HCl (il-punt 3.7) f’bejn wieħed u ieħor 800 ml ilma. Aġġusta l-pH għal 2,20. Żid sa 1 l bl-ilma.

3.25.

Buffers tal-elwizzjoni, ippreparati skont il-kundizzjonijiet tal-analizzatur użat (il-punt 4.9).

3.26.

Reaġent tan-ninidrina, ippreparat skont il-kundizzjonijiet tal-analizzatur użat (il-punt 4.9).

3.27.

Soluzzjonijiet standard tal-amminoaċidi. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jinħażnu f’temperatura taħt il-5 oC.

3.27.1.

Soluzzjoni standard stokk ta’ amminoaċidi (il-punt 3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml minn kull wieħed fl-aċidu idrokloriku.

Tista’ tinkiseb kummerċjalment.

3.27.2.

Soluzzjoni standard stokk ta’ aċidu ċisteiku u metijonina sulfon, c = 1,25 μmol/ml.

Dewweb 0,2115 g aċidu ċisteiku (il-punt 3.16.2) u 0,2265 g metijonina sulfon (il-punt 3.16.3) f’buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24) f’kunjett iggradat tal-1 l u imla sal-marka bil-buffer ta’ ċitrat. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °C għal mhux aktar minn 12-il xahar. Din is-soluzzjoni ma tintużax jekk is-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.27.1) ikun fiha l-aċidu ċisteiku u l-metijonina sulfon.

3.27.3.

Soluzzjoni standard stokk tal-istandard intern eż. norlewċina, C = 20 μmol/ml.

Dewweb 0,6560 g norlewċina (il-punt 3.13) f’buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24) f’kunjett iggradat u imla sa 250 ml bil-buffer ta’ ċitrat. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °C għal mhux aktar minn 6 xhur.

3.27.4.

Soluzzjoni ta’ kalibrar ta’ amminoaċidi standard biex jintużaw mal-idroliżati, c = 5 nmol/50 μl aċidu ċisteiku u metijonina sulfon u c = 10 nmol/50 μl tal-amminoaċidi l-oħra. Dewweb 2,2 g klorur tas-sodju (il-punt 3.10) f’beaker ta’ 100 ml ma’ 30 ml buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24). Żid 4,00 ml soluzzjoni standard stokk tal-amminoaċidi (il-punt 3.27.1), 4,00 ml soluzzjoni standard stokk tal-aċidu ċisteiku u metijonina sulfon (il-punt 3.27.2) u 0,50 ml soluzzjoni standard stokk tal-istandard intern (il-punt 3.27.3) jekk intuża. Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-idrossidu tas-sodju (il-punt 3.18).

Ittrasferixxi kwantittivament f’kunjett iggradat ta’ 50 ml u imla sal-marka bil-buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24) u ħawwad.

Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °C għal mhux aktar minn 3 xhur.

Ara wkoll il-punt ta’ osservazzjonijiet 9.1.

3.27.5.

Soluzzjoni ta’ kalibrar tal-amminoaċidi standard għall-użu mal-idroliżati ppreparati skont il- il-punt 5.3.3.1. u għall-użu mal-estratti (5.2). Is-soluzzjoni ta’ kalibrar tiġi ppreparata skont il-punt 3.27.4 mingħajr klorur tas-sodju.

Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °C għal mhux aktar minn 3 xhur.

4. Apparat

4.1.

Kunjett bil-qiegħ tond ta’ 100 jew 250 ml li għandu reflux condenser imwaħħal miegħu.

4.2.

Kunjett tal-ħġieġ borosilikat ta’ 100 ml bit-tapp bil-kamin b’kisja ta’ gomma/teflon (eż. Duran, Schott) sabiex jintuża fil-forn.

4.3.

Forn b’ventilazzjoni sfurzata u regolatur tat-temperatura bi preċiżjoni aqwa minn ± 2 oC.

4.4.

miter tal-pH (tliet postijiet deċimali).

4.5.

Filtri tal-membrana (0,22 μm).

4.6.

Magna ċentrifuga.

4.7.

Evaporatur rotatorju b’vakwu.

4.8.

Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika.

4.9.

Analizzatur tal-amminoaċidi jew apparat HPLC b’kolonna għall-iskambju tal-joni, tagħmir għan-ninidrina, derivatizzazzjoni postkolonna u detettur fotometriku.

Il-kolonna timtela b’reżini tal-polistiren sulfonati li huma kapaċi li jisseparaw l-amminoaċidi minn xulxin u minn materjali oħrajn li huma pożittivi għan-ninidrina. Iċ-ċirkolazzjoni fit-tubi tal-buffer u tan-ninidrina hija pprovduta minn pompi li għandhom stabilità ta’ ċirkolazzoni ta’ ±0,5 % fil-perjodu li jkopri kemm it-test tal-kalibrar standard kif ukoll l-analiżi tal-kampjun.

B’xi analizzaturi tal-amminoaċidi, jistgħu jintużaw proċeduri tal-idroliżi fejn l-idroliżat ikollu konċentrazzjoni tas-sodju ta’ c = 0,8 mol/l u jkun fih l-aċidu formiku residwali mill-pass tal-ossidazzjoni. Oħrajn ma jagħtux separazzjoni sodisfaċenti ta’ ċerti amminoaċidi jekk l-idroliżat ikun fih eċċess ta’ aċidu formiku u/jew konċentrazzjonijiet għoljin ta’ joni tas-sodju. F’dan il-każ il-volum ta’ aċidu jitnaqqas permezz tal-evaporazzjoni għal bejn wieħed u ieħor 5 ml wara l-idroliżi u qabel l-aġġustament tal-pH. L-evaporazzjoni għandha ssir f’vakwu f’temperatura massima ta’ 40 °C.

5. Proċedura

5.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b’malji ta’ 0,5 mm. Kampjuni b’ħafna umdità iridu jiġu mnixxfa bl-arja f’temperatura li ma teċċedix il-50 °C jew lijofilizzati qabel ma jiġu mitħuna. Kampjuni b’kontenut għoli ta’ xaħam għandhom jiġu estratti bil-petroleum ħafif (il-punt 3.12) qabel ma jintaħnu.

5.2. Determinazzjoni tal-amminoaċidi Ħielsa

Iżen sal-eqreb 0,2 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun ippreparat (il-punt 5.1), f’kunjett koniku u żid 100,0 ml mit-taħlita tal-estrazzjoni (il-punt 3.21). Ħawwad it-taħlita għal 60 min bl-użu ta’ shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku (il-punt 4.8). Ħalli s-sediment joqgħod u itfa’ bil-pipetta 10,0 ml mis-soluzzjoni supernatanti f’beaker ta’ 100 ml.

Żid 5,0 ml soluzzjoni ta’ aċidu sulfosaliċiliku (il-punt 3.22), mat-taħwid u kompli ħawwad bl-għajnuna ta’ stirrer manjetika għal 5 min. Iffiltra jew iċċentrifuga s-supernatant sabiex jitneħħa kull preċipitat. Qiegħed 10,0 ml mis-soluzzjoni li tirriżulta f’beaker ta’ 100 ml u aġġusta l-pH għal 2.20 bl-użu ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.18), ittrasferixxi għal kunjett volumetriku ta’ volum xieraq bl-użu ta’ buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24), u imla sal-marka bil-buffer solution (il-punt 3.24).

Jekk qiegħed jintuża standard intern, żid 1,00 ml mill-istandard intern (il-punt 3.27.3) għal kull 100 ml soluzzjoni finali u imla sal-marka bil-buffer solution (il-punt 3.24).

Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-punt 5.4.

Jekk l-estratti mhumiex qegħdin jiġu eżaminati fl-istess ġurnata, għandhom jinħażnu taħt il-5 °C.

5.3. Determinazzjoni tal-amminoaċidi Totali

5.3.1. Ossidazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g mill-kampjun ippreparat (il-punt 5.1) fi:

—	kunjett bil-qiegħ tond ta’ 100 ml (il-punt 4.1) għall-idroliżi miftuħa (il-punt 5.3.2.3) jew,

—	kunjett ta’ 250 ml bil-qiegħ tond (il-punt 4.1) jekk hi meħtieġa konċentrazzjoni baxxa ta’ sodju (il-punt 5.3.3.1) jew,

—	kunjett ta’ 100 ml b’tapp bil-kamin (il-punt 4.2), (għall-idroliżi magħluqa l-punt 5.3.2.4).

Il-porzjon tal-kampjun miżun għandu jkollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg u indewwa ta’ mhux aktar minn 100 mg.

Qiegħed il-kunjett/flixkun f’banjumarija bis-silġ u kessaħ sa 0 °C, żid 5 ml mit-taħlita ta’ ossidazzjoni (il-punt 3.23) u ħawwad bi spatula tal-ħġieġ bil-ponta mgħawġa. Issiġilla l-kunjett/flixkun li fih l-ispatula b’rita li ma jgħaddix arja minnha, qiegħed il-banjumarija bis-silġ li fih ir-reċipjent issiġillat fi friġġ f’temperatura ta’ 0 °C u ħalli għal 16-il siegħa. Wara 16-il siegħa neħħi mill-friġġ u ddekomponi r-reaġent eċċessiv tal-ossidazzjoni biż-żieda ta’ 0,84 g disulfit tas-sodju (il-punt 3.4).

Ipproċedi għall-punt 5.3.2.1.

5.3.2. Idroliżi

5.3.2.1.

Idroliżi ta’ kampjuni ossidizzati

Mal-kampun ossidizzat ippreparat skont il-punt 5.3.1 żid 25 ml taħlita ta’ idroliżi (il-punt 3.20) u oqgħod attent li tlaħlaħ ir-residwu tal-kampjun li jeħel mal-ġnub tar-reċipjent u tal-ispatula.

Skont il-proċedura ta’ idroliżi li qiegħda tintuża, kompli skont il-punt 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Idroliżi ta’ kampjuni li mhumiex ossidizzati

Iżen f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 100 ml jew 250 ml (il-punt 4.1) jew kunjett ta’ 100 ml bit-tapp bil-kamin (il-punt 4.2), sal-eqreb 0,2 mg, minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun ippreparat (5.1). Il-porzjon miżun tal-kampjun għandu jkollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg. B’attenzjoni żid 25 ml tat-taħlita tal-idroliżi (il-punt 3.20) u ħallat mal-kampjun. Kompli skont il-punt 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Idroliżi miftuħa

Żid 3 żibeġ tal-ħġieġ mat-taħlita fil-kunjett (ippreparat f’konformità ma’ il-punt 5.3.2.1 jew il-punt 5.3.2.2) u għalli kontinwament taħt reflux għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, aħsel il-kondensatur b’5 ml buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24). Skonnettja l-kunjett u kessħu f’banju ta’ silġ.

Kompli skont il-punt 5.3.3.

5.3.2.4.

Idroliżi magħluqa

Poġġi l-kunjett li jkun fih it-taħlita ppreparata f’konformità mal-punt 5.3.2.1 jew 5.3.2.2 f’forn (il-punt 4.3) f’temperatura ta’ 110 °C. Waqt l-ewwel siegħa sabiex tipprevjeni milli tiżdied il-pressjoni (minħabba l-evoluzzjoni ta’ sustanzi li fihom il-gass) u sabiex tipprevjeni xi splużjoni, poġġi t-tapp bil-kamin fuq ir-reċipjent. Tagħlaqx ir-reċipjent bit-tapp. Wara siegħa, agħlaq ir-reċipjent bit-tapp u ħallih fil-forn (il-punt 4.3) għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, neħħi l-kunjett mill-forn, iftaħ it-tapp tal-kunjett b’attenzjoni u poġġi l-kunjett f’banjumarija bis-silġ. Ħallih jiksaħ.

Skont il-proċedura għall-aġġustament tal-pH (il-punt 5.3.3), ittrasferixxi kwantitattivament il-kontenuti tal-kunjett f’beaker ta’ 250 ml jew kunjett ta’ 250 ml bil-qiegħ tond bl-użu ta’ buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24).

Kompli skont il-punt 5.3.3.

5.3.3. Aġġustament tal-pH

Skont it-tolleranza tas-sodju tal-analizzatur tal-amminoaċidi (il-punt 4.9), kompli skont il-punt 5.3.3.1 jew 5.3.3.2 għall-aġġustament tal-pH.

5.3.3.1.

Għal Sistemi Kromatografiċi (4.9) li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju.

Huwa rrakkomandat li tintuża soluzzjoni standard stokk interna (il-punt 3.27.3) meta jintużaw l-analizzaturi tal-amminoaċidi li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju (meta l-volum tal-aċidu jkollu jitnaqqas).

F’dan il-każ, żid 2,00 ml mis-soluzzjoni standard stokk interna (il-punt 3.27.3) mal-idroliżat qabel l-evaporazzjoni.

Żid 2 qatriet 1-ottanol (il-punt 3.15) mal-idroliżat miksub f’konformità mal-punt 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

Bl-użu ta’ evaporatur rotatorju (4.7) naqqas il-volum sa 5-10 ml f’vakwu f’temperatura ta’ 40 °C. Jekk il-volum aċċidentalment jitnaqqas għal inqas minn 5 ml l-idroliżat għandu jintrema u l-analiżi terġa’ tibda.

Aġġusta l-pH għal 2,0 bis-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.18) u kompli għall-punt 5.3.4.

5.3.3.2.

Għall-analizzaturi tal-amminoaċidi l-oħrajn kollha (il-punt 4.9)

Ħu l-idroliżati miksuba f’konformità mal-punt 5.3.2.3 jew 5.3.2.4 u nnewtralizzahom parzjalment billi żżid filwaqt li tħawwad b’attenzjoni, 17 ml soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (il-punt 3.17) filwaqt li tiżgura li t-temperatura tinżamm taħt l-40 °C.

Aġġusta l-pH għal 2,20 f’temperatura ambjentali bl-użu tas-soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (il-punt 3.17) u finalment soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.18). Kompli għall-punt 5.3.4.

5.3.4. Kampjun ta’ soluzzjoni għall-kromatografija

Ittrasferixxi kwantittivament l-idroliżat bil-pH aġġustat (il-punt 5.3.3.1 jew 5.3.3.2) bil-buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24) f’kunjett iggradat ta’ 200 ml, u imla sal-marka bil-buffer (il-punt 3.24).

Jekk ma ntużax diġà standard intern, żid 2,00 ml standard intern (il-punt 3.27.3) u imla sal-marka bil-buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24). Ħawwad tajjeb.

Kompli għall-pass tal-kromatografija (il-punt 5.4).

Jekk il-kampjuni tas-soluzzjonijiet ma jkunux sejrin jiġu eżaminati dakinhar stess għandhom jinħażnu taħt il-5 °C.

5.4. Kromatografija

Qabel il-kromatografija ġib l-estratt (il-punt 5.2) jew l-idroliżat (il-punt 5.3.4) għal temperatura ambjentali. Ħawwad it-taħlita u ffiltra ammont xieraq minn filtru tal-membrana ta’ 0,22 μm (il-punt 4.5). Is-soluzzjoni ċara li tirriżulta tiġi soġġetta għal kromatografija ta’ skambju tal-joni bl-użu ta’ analizzatur tal-amminoaċidi (il-punt 4.9).

L-injezzjoni tista’ ssir b’mod manwali jew awtomatiku. Huwa importanti li tiżdied l-istess kwantità tas-soluzzjoni ± 0,5 % mal-kolonna għall-analiżi tal-istandards u kampjuni ħlief meta jintuża standard intern, u li l-proporzjonijiet ta’ sodju:amminoaċidi fis-soluzzjonijiet standard u kampjuni huma simili kemm jista’ jkun.

B’mod ġenerali, il-frekwenza tal-provi tal-kalibrar tiddependi fuq l-istabilità tar-reaġent tan-ninidrina u s-sistema analitika. L-istandard jew il-kampjun jiġi dilwit bil-buffer ta’ ċitrat (il-punt 3.24) sabiex jagħti erja tal-quċċata tal-istandard ta’ 30-200 % tal-erja tal-quċċata tal-amminoaċidi tal-kampjun.

Il-kromatografija tal-amminoaċidi tvarja ftit skont it-tip tal-analizzatur u r-raża użati. Is-sistema magħżula għandha tkun kapaċi tissepara l-amminoaċidi minn xulxin u mill-materjali li huma pożittivi għan-ninidrina. Fil-firxa tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika għandha tagħti rispons lineari għat-tibdil fl-ammonti ta’ amminoaċidi miżjudin mal-kolonna.

Waqt l-istadju tal-kromatografija japplikaw il-proporzjonijiet tal-għoli tal-quċċata msemmija hawn taħt, meta tiġi analizzata soluzzjoni ekwimolari (tal-amminoaċidi li qegħdin jiġu determinati). Is-soluzzjoni ekwimolari għandu jkollha mill-inqas 30 % tat-tagħbija massima ta’ kull amminoaċidu li jista’ jitkejjel bis-sistema tal-analizzatur tal-amminoaċidi (il-punt 4.9).

Għas-separazzjoni tat-treonina-serina, il-proporzjon tal-għoli tal-qċaċet minn żewġ amminoaċidi li huma mrikkba fuq il-kromatogramma ma għandux ikun aktar minn 2:10 (jekk jiġu ddeterminati biss is-ċist(e)ina, il-metijonina, it-treonina u l-liżina, separazzjoni insuffiċjenti mill-qċaċet ħdejn xulxin tinfluwenza d-determinazzjoni b’mod ħażin). Għall-amminoaċidi l-oħrajn kollha, is-separazzjoni għandha tkun aħjar minn 1:10.

Is-sistema għandha tiżgura li l-liżina tkun isseparata mill-“artifatti tal-liżina” u l-ornitina.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

L-erja tal-qċaċet tal-kampjun u tal-standard jitkejlu għal kull amminoaċidu individwali u jiġi kkalkulat l-ammont (X), fi g ta’ amminoaċidu għal kull kg tal-kampjun.

Jekk jintuża standard intern immultiplika bi:

A	=	erja tal-quċċata, idroliżat jew estratt
B	=	erja tal-quċċata, soluzzjoni standard ta’ kalibrar
C	=	erja tal-quċċata, standard intern fl-idroliżat jew estratt
D	=	erja tal-quċċata, standard intern, soluzzjoni standard ta’ kalibrar
M	=	piż molari tal-amminoaċidi li qiegħed jiġi ddeterminat
c	=	konċentrazzjoni tal-istandard f’μmol/ml
m	=	piż tal-kampjun (g) (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk huwa mnixxef jew bix-xaħam imneħħi)
V	=	ml idroliżat totali (il-punt 5.3.4) jew kalkolu f’ml tal-volum totali dilwit tal-estratt (il-punt 6.1)

Kemm iċ-ċistina kif ukoll iċ-ċisteina huma ddeterminati bħala aċidu ċisteiku fl-idroliżati ta’ kampjun ossidizzat, iżda jiġu kkalkulati bħala ċistina (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) bl-użu ta’ M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Il-metijonina tiġi ddeterminata bħala metijonina sulfon f’idroliżati ta’ kampjun ossidizzat iżda kkalkulata bħala metijonina bl-użu ta’ M tal-metijonina: 149,21 g/mol.

Il-metijonina ħielsa miżjuda tiġi ddeterminata wara l-estrazzjoni bħala metijonina, u għall-kalkolu jintuża l-istess M.

6.1.

Il-volum totali dilwit ta’ estratti (F) għad-determinazzjoni ta’ amminoaċidi ħielsa (il-punt 5.2) ikkalkulat kif ġej:

volum ta’ estratt finali

7. Evalwazzjoni tal-metodu

Il-metodu ġie ttestjat f’interparagun f’livell internazzjoni fl-1990 billi intużaw erba’ tipi differenti ta’ għalf (għalf tal-majjali mħallat, kompost tal-brojlers, konċentrazzjoni ta’ proteini, taħlita minn qabel).

Nota:

Il-metodu ġie ttestjat matul it-tieni studju interkomparattiv internazzjonali fl-2003 bl-użu ta’ pari duplikati fl-għama ta’ għalf għall-finitura tat-tiġieġ tas-simna, għalf tal-bidu tat-tiġieġ tas-simna, qamħirrum, ħut mitħun u kampjuni tad-dqiq tal-pollam. Għad-dettalji ara EN ISO 13903.

Ir-riżultati tal-interparagun tal-1990, wara l-eliminazzjoni tal-outliers, tad-devjazzjoni medja u standard huma mogħtija fit-tabelli f’dan il-punt:

Medji f’g/kg

Materjal ta’ Referenza

Amminoaċidu

Treonina

Ċist(e)ina

Metijonina

Liżina

Għalf tal-majjali mħallat

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Għalf kompost tat-tiġieġ għas-simna

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Konċentrat tal-Proteini

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Taħlita minn qabel

58,42

n = 16

—

90,21

n = 16

98,03

n = 16

n = Numru ta’ laboratorji parteċipanti

7.1. Ripetibbiltà

Ir-ripetibilità espressa bħala “Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju” tal-interparagun tat-tabella preċedenti hija mogħtija fit-tabelli li ġejjin:

Koeffiċjent tal-Varjazzjoni (%) għar-ripetibbiltà (CVr)

Materjal ta’ Referenza

Amminoaċidu

Treonina

Ċist(e)ina

Metijonina

Liżina

Għalf tal-majjali mħallat

1,9

n = 15

3,3

n = 17

3,4

n = 17

2,8

n = 13

Għalf kompost tat-tiġieġ għas-simna

2,1

n = 16

2,8

n = 18

3,1

n = 18

2,1

n = 16

Konċentrat tal-Proteini

2,7

n = 16

2,6

n = 17

2,2

n = 17

2,4

n = 15

Taħlita minn qabel

2,2

n = 16

—

2,4

n = 16

2,1

n = 16

n = Numru ta’ laboratorji parteċipanti

7.2. Riproduċibbiltà

Ir-riżultati għal bejn id-devjazzjoni standard tal-laboratorju mal-paragonar imsemmi hawn fuq huma mogħtija fil-werrej ta’ hawn taħt:

Koeffiċjent tal-Varjazzjoni (%) għar-riproduċibbiltà (CVR)

Materjal ta’ Referenza

Amminoaċidu

Treonina

Ċist(e)ina

Metijonina

Liżina

Għalf tal-majjali mħallat

4,1

n = 15

9,9

n = 17

7,0

n = 17

3,2

n = 13

Għalf kompost Għalf kompost

5,2

n = 16

8,8

n = 18

10,9

n = 18

5,4

n = 16

Konċentrat tal-Proteini

3,8

n = 16

12,3

n = 17

13,0

n = 17

3,0

n = 15

Taħlita minn qabel

4,3

n = 16

—

6,9

n = 16

6,7

n = 16

n = Numru ta’ laboratorji parteċipanti

8. Użu ta’ materjali għar-referenza

L-applikazzjoni korretta tal-metodu għandha tiġi vverifikata billi jsir kejl ripetut ta’ materjali għar-referenza ċċertifikati meta huma disponibbli. Huwa rrakkomandat kalibrar b’soluzzjoni ta’ kalibrar ċċertifikata ta’ amminoaċidi.

9. Osservazzjonijiet

9.1.

Minħabba differenzi bejn l-analizzaturi tal-amminoaċidi, il-konċentrazzjonijiet finali tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar tal-amminoaċidi standard (ara l-punti 3.27.4 u 3.27.5) u tal-idroliżat (ara l-punt 5.3.4) għandhom jittieħdu bħala gwida.

Ir-rispons lineari varju tal-apparat għandu jiġi ċċekkjat għall-amminoaċidi kollha.

Is-soluzzjoni standard tiġi dilwita bil-buffer ta’ ċitrat sabiex tagħti l-ikbar qċaċet f’nofs il-firxa.

9.2.

Fejn jintuża apparat ta’ kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja sabiex jiġu analizzati l-idroliżati, il-kundizzjonijiet sperimentali għandhom jiġu ottimizzati f’konformità mar-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur.

9.3.

Billi jiġi applikat il-metodu għall-għalf kompost jew it-taħlitiet lesti minn qabel li jkun fihom aktar minn 1 % ta’ klorur (konċentrat, għalf minerali, għalf supplimentari) l-istima tal-metijonina tista’ tirriżulta f’waħda baxxa u jkun jeħtieġ li jsir trattament speċjali.

10. Kriterji ta’ prestazzjoni

Il-kompilazzjoni tar-riżultati (ħlief għat-tirożina) li ġejjin miż-2 studji kollaborattivi (mill-1990 rrapportat fil-punt 7 hawn fuq u mill-2005 rrapportat fl-EN/ISO 13903) tagħti l-kriterji li ġejjin għar-ripetibbiltà u r-riproduċibbiltà. Il-valuri mnissla minn dawn iż-2 testijiet interlaboratorji aktarx ma jkunux applikabbli għall-firxiet ta’ konċentrazzjoni u għall-matriċijiet għajr dawk mogħtija.

10.1. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun fl-istess laboratorju u mill-istess operatur, ma għandhiex taqbeż:

—	6 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tal-gliċina, l-alanina, il-liżina, il-prolina, l-aċidu glutamiku, l-isolewċina u l-istidina;

—	8 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tat-treonina, il-fenilalanina, il-metijonina, l-aċidu aspartiku u l-lewċina;

—	10 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tal-arġinina u l-valina;

—	12 % relattiv għall-ogħla valur, għat-total tal-amminoaċidu serina;

—	15 % relattiv għall-ogħla valur, għat-total tal-amminoaċidu ċist(e)ina.

10.2. Riproduċibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun fl-laboratorji differenti u/jew minn operaturi differenti ma għandhiex taqbeż:

—	15 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tal-gliċina, l-alanina u t-treonina;

—	20 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tal-liżina, il-prolina, il-fenilalanina, il-metijonina u l-aċidu aspartiku;

—	22 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tal-aċidu glutamiku u l-lewċina;

—	27 % relattiv għall-ogħla valur, għat-total tal-amminoaċidu arġinina;

—	32 % relattiv għall-ogħla valur, għat-total tal-amminoaċidu isolewċina;

—	35 % relattiv għall-ogħla valur, għall-amminoaċidi totali fil-każ tal-valina u s-serina;

—	40 % relattiv għall-ogħla valur, għat-total tal-amminoaċidu istidina;

—	50 % relattiv għall-ogħla valur, għat-total tal-amminoaċidu ċist(e)ina.

F. DETERMINAZZJONI TAT-TRIPTOFAN

Il-metodi tal-analiżi li għandhom jintużaw għad-determinazzjoni tat-triptofan huma

—	EN ISO 13904 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-kontenut tat-triptofan

—	il-metodu ta’ analiżi kif deskritt fil-punti 1 sa 9 hawn taħt,

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmel possibbli d-determinazzjoni tat-triptofan totali u ħieles fl-għalf. Ma jagħmilx distinzjoni bejn il-forom D- u L-.

2. Prinċipju

Għad-determinazzjoni tat-triptofan totali, il-kampjun jiġi idrolizzat f’kundizzjonijiet alkalini ma’ soluzzjoni saturata ta’ idrossidu tal-barju u msaħħna sa 110 °C għal 20 siegħa. Wara jiżdied l-istandard ta’ idroliżi interna.

Għad-determinazzjoni ta’ triptofan ħieles, il-kampjun huwa estratt taħt kundizzjonijiet aċidi ħfief fil-preżenza ta’ standard intern.

It-triptofan u l-istandard intern fl-idroliżat jew fl-estratt huma determinati bl-HPLC b’detezzjoni tal-fluworexxenza.

3. Reaġenti

3.1.

Għandu jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta’ kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS/cm).

3.2.

Sustanza standard: triptofan (purità/kontenut ≥ 99 %) imnixxef taħt vakwu fuq il-pentossidu tal-fosforu.

3.3.

Sustanza standard interna: α-metil-triptofan (purità/kontenut ≥ 99 %) imnixxef taħt vakwu fuq il-pentossidu tal-fosforu.

3.4.

Idrossidu tal-barju otta-idratat (għandha tingħata attenzjoni sabiex il-Ba(OH)2.8 H2O ma jiġix espost b’mod eċċessiv għall-arja sabiex tiġi evitata l-formazzjoni ta’ BaCO3, li jista jiddisturba d-determinazzjoni) (ara l-punt ta’ osservazzjoni 9.3).

3.5.

Idrossidu tas-sodju.

3.6.

Orto-aċidu fosforiku, w (w/w) = 85 %.

3.7.

Aċidu idrokloriku, ρ20 1,19 g/ml.

3.8.

Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.9.

Petroleum ħafif, firxa ta’ togħlija 40-60 °C.

3.10.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 1 mol/l

Dewweb 40,0 g NaOH (il-punt 3.5) fl-ilma u imla sa 1 l bl-ilma (il-punt 3.1).

3.11.

Aċidu idrokloriku, c = 6 mol/l:

Ħu 492 ml HCl (il-punt 3.7) u imla sa 1 l bl-ilma.

3.12.

Aċidu idrokloriku, c = 1 mol/l:

Ħu 82 ml HCl (il-punt 3.7) u imla sa 1 l bl-ilma.

3.13.

Aċidu idrokloriku, c = 0,1 mol/l:

Ħu 8,2 ml HCl (il-punt 3.7) u imla sa 1 l bl-ilma.

3.14.

Orto-aċidu fosforiku, c = 0,5 mol/l:

Ħu 34 ml aċidu orto-fosforiku (il-punt 3.6) u imla sa 1 l bl-ilma (il-punt 3.1).

3.15.

Soluzzjoni konċentrata ta’ triptofan (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

F’kunjett volumetriku ta’ 500 ml dewweb 0,2553 g triptofan (il-punt 3.2) fl-aċidu idrokloriku (il-punt 3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idrokloriku (il-punt 3.13). Aħżen f’-18 °C għal massimu ta’ 4 ġimgħat.

3.16.

Soluzzjoni standard interna kkonċentrata, c = 2,50 μmol/ml:

F’kunjett volumetriku ta’ 500 ml dewweb 0,2728 g α-metil-triptofan (il-punt 3.3) fl-aċidu idrokloriku (il-punt 3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idrokloriku (il-punt 3.13). Aħżen f’-18 °C għal massimu ta’ 4 ġimgħat.

3.17.

Soluzzjoni standard ta’ kalibrar ta’ triptofan u standard intern:

Ħu 2,00 ml ta’ soluzzjoni kkonċentrata ta’ triptofan (il-punt 3.15), u 2,00 ml ta’ soluzzjoni standard interna kkonċentrata (α-metil-triptofan) (il-punt 3.16). Iddilwixxi bl-ilma (il-punt 3.1) u metanol (il-punt 3.8) għal bejn wieħed u ieħor l-istess volum u għal bejn wieħed u ieħor l-istess konċentrazzjoni ta’ metanol (10-30 %) bħall-idroliżat lest.

Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

Ipproteġi mid-dawl tax-xemx dirett waqt l-operazzjoni.

3.18.

Aċidu aċetiku

3.19.

1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol.

3.20.

Etanolammina w (w/w) > 98 %.

3.21.

Soluzzjoni ta’ 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (il-punt 3.19) f’100 ml metanol (3.8).

3.22.

Fażi mobbli għal HPLC: 3,00 g aċidu aċetiku (il-punt 3.18) + 900 ml ilma (il-punt 3.1) + 50,0 ml soluzzjoni (il-punt 3.21) ta’ 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (il-punt 3.19) fil-metanol (il-punt 3.8) (1 g/100 ml). Aġġusta l-pH għal 5,00 bl-użu tal-etanolammina (il-punt 3.20). Imla sa 1 000 ml bl-ilma (il-punt 3.1).

4. Apparat

4.1.

Apparat HPLC bid-detettur spettrofluworimetriku.

4.2.

Kolonna għal kromatografija likwida, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm ippakkjar, jew ekwivalenti.

4.3.

Miter tal-pH.

4.4.

Kunjett tal-polipropilen, kapaċità 125 ml, bl-għonq wiesa’ u b’tapp bil-kamin.

4.5.

Filtri tal-membrana, 0,45 μm.

4.6.

Awtoklava, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika.

4.8.

Mixer vortex.

5. Proċedura

5.1. Preparazzjoni tal-kampjuni

Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b’malji ta’ 0,5 mm. Kampjuni b’ħafna umdità iridu jiġu mnixxfa bl-arja f’temperatura li ma teċċedix il-50 °C jew lijofilizzati qabel ma jiġu mitħuna. Kampjuni b’kontenut għoli ta’ xaħam iridu jiġu estratti b’petroleum ħafif (il-punt 3.9) qabel ma jintaħnu.

5.2. Determinazzjoni ta’ triptofan ħieles (estratt)

Iżen sal-eqreb 1 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun separat (il-punt 5.1), f’kunjett konikali. Żid 100,0 ml aċidu idrokloriku (il-punt 3.13) u 5,00 ml soluzzjoni standard interna kkonċentrata (il-punt 3.16). Ħawwad għal 60 min. bl-użu tax-shaker mekkaniku jew stirrer manjetika (il-punt 4.7). Ħalli s-sediment joqgħod u bil-pipetta tella’ 10,0 ml tas-soluzzjoni supernatanti f’beaker. Żid 5 ml aċidu orto-fosforiku (il-punt 3.14). Aġġusta l-pH sa 3 bl-użu ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.10). Żid metanol suffiċjenti (il-punt 3.8) biex tagħti konċentrazzjoni ta’ bejn 10 u 30 % ta’ metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f’kunjett volumetriku ta’ volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum neċessarju għall-kromatografija (bejn wieħed u ieħor l-istess volum bħall-kalibrar ta’ soluzzjoni standard (il-punt 3.17)).

Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (il-punt 4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-punt 5.4.

Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-estratti kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-estratti fl-istess ġurnata, l-estratti jistgħu jinħażnu f’5 °C għal massimu ta’ 3 ijiem.

5.3. Determinazzjoni ta’ triptofan totali (idroliżat)

Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun separat (il-punt 5.1) f’kunjett tal-polipropilen (il-punt 4.4). Il-porzjon tal-kampjun li jkun intiżen irid ikollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ madwar 10 mg. Żid 8,4 g idrossid tal-barju otta-idratat (il-punt 3.4) u 10 ml ilma. Ħallat fuq mixer b’vortiċi (il-punt 4.8) jew ħawwad manjetiku (il-punt 4.7). Ħalli l-kalamita miksija bit-teflon fit-taħlita. Aħsel il-ġnub tar-reċipjent b’4 ml ilma. Poġġi t-tapp u agħlaq kemxejn il-kunjett. Ittrasferixxi f’awtoklava (il-punt 4.6) bl-ilma jagħli u ħallih l-fwar joħroġ għal 30-60 minuta. Agħlaq l-awtoklava u awtoklava f’110 (± 2) °C għal 20 siegħa.

Qabel tiftaħ l-awtoklava baxxi t-temperatura għal ftit taħt il-100 °C. Sabiex tiġi evitata kristallizzazzjoni ta’ Ba(OH)2.8 H2O, żid it-taħlita sħuna bi 30 ml ilma li jkun f’temperatura ambjentali. Ħawwad bil-mod. Żid 2,00 ml soluzzjoni standard interna kkonċentrata ta’ (α-metil-triptofan) (il-punt 3.16). Berred ir-reċipjenti fuq banju ilma/silġ għal 15-il minuta.

Wara żid 5 ml orto-aċidu fosforiku (il-punt 3.14). Żomm ir-reċipjent fil-banju li qed jiksaħ u nnewtralizza bl-HCl (il-punt 3.11) waqt li tħawwad u aġġusta l-pH għal 3,0 bl-użu tal-HCl (il-punt 3.12). Żid metanol suffiċjenti biex tagħti konċentrazzjoni ta’ bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f’kunjett volumetriku ta’ volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum definit neċessarju għal kromatografija (pereżempju 100 ml). Iż-żieda ta’ metanol ma tridx tikkawża preċipitazzjoni.

Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (il-punt 4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-punt 5.4.

Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-idroliżati mid-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-idroliżati fl-istess ġurnata, jistgħu jinħażnu f’5 °C għal massimu ta’ 3 ijiem.

5.4. Determinazzjoni tal-HPLC

Il-kundizzjonijiet li jmiss għal elwizzjoni iżokratika huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn, diment li jagħtu riżultati ekwivalenti (ara wkoll il-punti ta’ osservazzjonijiet 9.1 u 9.2):

Kromatografija likwida kolonna (il-punt 4.2):	125 mm × 4 mm, C18, 3 μm ippakkjar jew ekwivalenti
Temperatura tal-kolonna:	Temperatura tal-kamra
Fażi mobbli (il-punt 3.22):	3,00 g aċidu aċetiku (il-punt 3.18) + 900 ml ilma (il-punt 3.1) + 50,0 ml soluzzjoni (il-punt 3.21) ta’ 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (il-punt 3.19) fil-metanol (il-punt 3.8) (1 g/100 ml). Aġġusta l-pH għal 5,00 bl-użu tal-etanolammina (il-punt 3.20). Imla sa 1 000 mlbl-ilma (il-punt 3.1)
Rata tal-fluss:	1 ml/min
Ħin totali tal-proċedura:	madwar 34 min
Tul tal-mewġa tad-detezzjoni:	eċċitazzjoni: 280 nm, emissjoni: 356 nm.
Volum tal-injezzjoni	20 μl

6. Il-kalkolu tar-riżultati

L-ammont ta’ triptofan (X), fi g għal kull kampjun ta’ 100 g huwa kkalkulat.

A	=	erja tal-quċċata ta’ standard intern, soluzzjoni standard ta’ kalibrar (il-punt 3.17)
B	=	erja tal-quċċata ta’ triptofan, estratt (il-punt 5.2) jew idroliżat (il-punt 5.3)
V1	=	volum f’ml (2 ml) ta’ soluzzjoni ta’ triptofan konċentrat (3.15) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.17)
c	=	konċentrazzjoni f’μmol/ml (= 2,50) ta’ soluzzjoni kkonċentrata ta’ triptofan (il-punt 3.15) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.17)
V2	=	volum f’ml ta’ soluzzjoni standard interna kkonċentrata (il-punt 3.16) miżjuda fl-estrazzjoni (il-punt 5.2) (= 5,00 ml) jew mal-idroliżat (il-punt 5.3) (= 2,00 ml)
C	=	erja tal-quċċata tal-istandard intern, estratt (il-punt 5.2) jew idroliżat (il-punt 5.3)
D	=	erja tal-quċċata tat-triptofan, soluzzjoni standard ta’ kalibrar (il-punt 3.17)
V3	=	volum f’ml (= 2,00 ml) ta’ soluzzjoni standard interna konċentrata (il-punt 3.16) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.17)
m	=	piż tal-kampjun fi g (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk imnixxef u/jew bix-xaħam imneħħi)
M	=	piż molari tat-triptofan (= 204,23 g/mol)

7. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 10 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-UE (ir-4 interparagun), fejn ġew analizzati tliet kampjuni minn 12-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għall-idroliżi. Saru 5 analiżijiet replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

Kampjun 1

Għalf għall-ħnieżer

Kampjun 2

Għalf għall-ħnieżer imsaħħaħ b’L-triptofan

Kampjun 3

Għalf ikkonċentrat għall-ħnieżer

Medja [g/kg]

2,42

3,40

4,22

sr [g/kg]

0,05

0,08

r [g/kg]

0,14

0,22

CVr [%]

1,9

1,6

1,9

SR [g/kg]

0,15

0,20

0,09

R [g/kg]

0,42

0,56

0,25

CVR [%]

6,3

6,0

2,2

L =	numru ta’ laboratorji li ssottomettew riżultati

n =	in-numru ta’ riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati l-outliers (identifikati mill-outlier test ta’ Cochran, Dixon)

sr =	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r =	ripetibilità

R =	riproduċibilità

CVr =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-UE ieħor (it-3 interparagun) fejn żewġ kampjuni ġew analizzati minn 13-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għall-estrazzjoni tat-triptofan ħieles. Saru 5 analiżijiet replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

Kampjun 4

Taħlita ta’ qamħ u sojja

Kampjun 5

Taħlita ta’ qamħ u sojja (= kampjun 4) b’żieda tat-triptofan (0,457 g/kg)

Medja [g/kg]

0,391

0,931

sr [g/kg]

0,005

0,012

r [g/kg]

0,014

0,034

CVr [%]

1,34

SR [g/kg]

0,018

0,048

R [g/kg]

0,050

0,134

CVR [%]

4,71

5,11

L =	numru ta’ laboratorji li ssottomettew riżultati

n =	in-numru ta’ riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati l-outliers (identifikati mill-outlier test ta’ Cochran, Dixon)

sr =	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r =	ripetibilità

R =	riproduċibilità

CVr =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

Ġie organizzat studju ta’ interparagun tal-UE ieħor li fih ġew analizzati erba’ kampjuni minn 7 laboratorji għall-għanijiet ta’ ċertifikazzjoni tat-triptofan għall-idroliżi. Ir-riżultati jingħataw taħt — saru 5 analiżijiet replikati fuq kull kampjun.

Kampjun 1

Għalf tal-ħnieżer imħallat (CRM 117)

Kampjun 2

Ħut mitħun b’xaħam baxx

(CRM 118)

Kampjun 3

Fażola tas-sojja mitħuna

(CRM 119)

Kampjun 4

Trab tal-ħalib xkumat

(CRM 120)

Medja [g/kg]

2,064

8,801

6,882

5,236

sr [g/kg]

0,021

0,101

0,089

0,040

r [g/kg]

0,059

0,283

0,249

0,112

CVr [%]

1,04

1,15

1,30

0,76

SR [g/kg]

0,031

0,413

0,283

0,221

R [g/kg]

0,087

1,156

0,792

0,619

CVR [%]

1,48

4,69

4,11

4,22

L =	numru ta’ laboratorji li ssottomettew riżultati

n =	in-numru ta’ riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati l-outliers (identifikati mill-outlier test ta’ Cochran, Dixon)

sr =	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r =	ripetibilità

R =	riproduċibilità

CVr =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

9. Osservazzjonijiet

9.1.

Jekk issegwi kundizzjonijiet kromatografiċi speċjali tista’ tikseb separazzjonijiet aħjar bejn triptofan u α-metil-triptofan.

Elwizzjoni isokratika segwita bil-ħasil tal-kolonna bil-gradjent:

Kolonna għal kromatografija likwida:	125 mm × 4 mm, C18, 5 μm ppakkjar jew ekwivalenti
Temperatura tal-kolonna:	32 °C
Fażi mobbli:	A: 0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95 + 5 (V+V).
	B: Metanol
Programm tal-gradjent:	0 min 100 % A	0 % B
	15 min 100 % A	0 % B
	17 min 60 % A	40 % B
	19 min 60 % A	40 % B
	21 min 100 % A	0 % B
	33 min 100 % A	0 % B
Rata tal-fluss:	1,2 ml/min
Ħin totali tal-proċedura:	madwar 33 min

9.2.

Il-kromatografija tvarja skont it-tip ta’ HPLC u tal-materjal tal-ippakkjar tal-kolonna użat. Is-sistema magħżula trid tkun kapaċi tagħti separazzjoni ta’ linja bażi bejn it-triptofan u l-istandard intern. Madankollu huwa importanti li prodotti ta’ degradazzjoni jiġu separati mit-triptofan u l-istandard intern. L-idroliżati mingħajr standard intern iridu jitħaddmu sabiex tiġi ċċekkjata l-linja bażi taħt l-istandard intern għall-impuritajiet. Huwa importanti li l-ħin ta’ tħaddim ikun twil biżżejjed għall-elwizzjoni ta’ kull prodott ta’ degradazzjoni, inkella l-qċaċet tal-elwizzjoni jistgħu jinterferixxu ma’ tħaddim kromatografiku sussegwenti.

Fil-firxa tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika trid tagħti risposta lineari. Ir-risposta lineari trid titkejjel b’konċentrazzjoni kostanti (in-normal) tal-istandard intern u l-konċentrazzjonijiet li jvarjaw tat-triptofan. Huwa importanti li l-kejl tal-qċaċet kemm tal-istandard intern kif ukoll tat-triptofan ikunu fl-iskala lineari tas-sistema HPLC/sistema ta’ fluworexxenza. Jekk il-quċċata/qċaċet tat-triptofan u/jew tal-istandard interni jkunu żgħar ħafna jew kbar ħafna l-analiżijiet jridu jiġu ripetuti b’qies ta’ kampjun ieħor u/jew bil-volum finali mibdul.

9.3. Idrossidu tal-barju

Biż-żmien, l-idrossidu tal-barju jsir aktar diffiċli biex jiġi dilwit. Dan jirriżulta f’soluzzjoni mhux ċara għad-determinazzjoni tal-HPLC, li tista’ tipproduċi riżultati baxxi għal triptofan.

G. ID-DETERMINAZZJONI TA’ ŻJUT U XAĦMIJIET MHUX RAFFINATI

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta’ żjut u xaħmijiet mhux raffinati fl-għalf.

L-użu taż-żewġ proċeduri deskritti hawn taħt jiddependi min-natura u l-kompożizzjoni tal-għalf u r-raġuni li għaliha qiegħda ssir l-analiżi.

Għad-determinazzjoni ta’ żjut u xaħmijiet mhux raffinati fiż-żrieragħ taż-żejt u fil-frott żejtni kif ukoll fl-għalf li fih il-kontenut ta’ żejt mhux raffinat/xaħam huwa ogħla minn 15 %, l-estrazzjoni jenħtieġ li ssir bil-Proċedura A u l-estrazzjoni mill-ġdid bil-Proċedura B (il-punt 5.3).

1.1. Proċedura A — Żjut u xaħmijiet mhux raffinati li jistgħu jiġi estratti direttament

Dan il-metodu huwa applikabbli għall-għalf li ġej mill-pjanti barra dawk inklużi fi ħdan l-iskop tal-Proċedura B.

1.2. Proċedura B — Żjut u xaħmijiet mhux raffinati kollha

Dan il-metodu japplika għal materjal tal-għalf li ġej mill-annimali u għall-għalf kompost kollu. Dan irid jintuża għall-materjal kollu li minnhom iż-żjut u x-xaħmijiet ma jistgħux jiġu estratti kompletament mingħajr idroliżi qabel (eż. glutina, ħmira, proteini tal-patata u prodotti soġġetti għal proċessi bħall-estrużjoni, flaking u tisħin).

1.3. Interpretazzjoni tar-riżultati

Fil-każijiet kollha fejn jinkiseb riżultat ogħla permezz tal-Proċedura B u mhux Proċedura A, ir-riżultat miksub mill-Proċedura B għandu jkun aċċettat bħala l-valur veru.

2. Prinċipju

2.1. Proċedura A

Il-kampjun huwa estratt bil-petroleum ħafif. Is-solvent jiġi ddistillat u r-residwu mnixxef u miżun.

2.2. Proċedura B

Il-kampjun huwa trattat b’tisħin b’aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni hija mkessħa u ffiltrata. Ir-residwu jinħasel u jitnixxef u huwa sottomess għad-determinazzjoni skont il-Proċedura A.

3. Reaġenti

3.1.

Petroleum ħafif, jiftaħ jagħli: 40 sa 60 °C. Il-valur tal-bromu jrid ikun inqas minn 1 u r-residwu wara l-evaporazzjoni jrid ikun inqas minn 2 mg/100 ml.

3.2.

Sulfat tas-sodju, anidru.

3.3.

Aċidu idrokloriku, c = 3 mol/l

3.4.

Assistenza għall-filtrazzjoni, eż. Kieselgur, Hyflo-supercel.

4. Apparat

4.1.

Apparat għall-estrazzjoni. Jekk għandu siphon (apparat Soxhlet), ir-rata ta’ rifluss trid tkun tali li tipproduċi madwar 10 ċikli kull siegħa; jekk fuq it-tip non-siphoning, ir-rata ta’ rifluss trid tkun madwar 10 ml fil-minuta.

4.2.

ħolqa ta’ estrazzjoni, meħlusin minn materjal li jinħall f’petroleum ħafif u li jkollu porożità konsistenti mal-ħtiġiet tal-punt 4.1.

4.3.

Forn ta’ tnixxif, jew forn vakwu stabbilit f’75 ± 3 °C jew forn tal-arja stabbilit f’100 ± 3 °C.

5. Proċedura

5.1. Proċedura A (ara l-punt 8.1)

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u ttrasferih f’ħolqa ta’ estrazzjoni (il-punt 4.2) u għatti b’biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam.

Qiegħed il-ħolqa f’estrattur (il-punt 4.1) u għamel l-estrazzjoni għal sitt sigħat b’petroleum ħafif (il-punt 3.1). Iġbor l-estratt tal-petroleum ħafif f’kunjett xott miżun li fih biċċiet ta’ ġebla ħaffiefa (6).

Iddistilla s-solvent. Nixxef ir-residwu u żomm il-kunjett għal siegħa u nofs fil-forn li jnixxef (il-punt 4.3). Kessaħ f’dessikatur u iżen. Erġa’ nixxef għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż taż-żjut u tax-xaħmijiet jibqa’ kostanti (telf fil-piż bejn iż-żewġ użinijiet suċċessivi għandu jkun inqas minn jew ugwali għal 1 mg).

5.2. Proċedura B

Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg (ara l-punt 8.2) u qiegħed f’beaker ta’ 400 ml jew kunjett koniku ta’ 300 ml u żid 100 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.3) u frammenti ta’ ġebla ħaffiefa. Għatti l-beaker b’watch glass jew waħħal reflux condenser mal-kunjett konikali. Wassal it-taħlita sakemm tagħli bil-mod fuq fjamma baxxa jew hot plate u żommha hekk għal siegħa. Tħallix il-prodott jeħel mal-ġnub tal-kontenitur.

Kessaħ u żid kwantità ta’ għajnuna għall-filtrazzjoni (il-punt 3.4) biżżejjed biex tipprevjeni xi telf ta’ żejt u xaħam tul il-filtrazzjoni. Iffiltra minn karta filtru doppja, niedja, ħielsa mix-xaħam. Aħsel ir-residwu f’ilma kiesaħ sakemm jinkiseb filtrat newtrali. Ikkontrolla li l-filtrat ma jkunx fih xi żejt jew xaħam. Il-preżenza tagħhom fil-filtrat tindika li l-kampjun għandu jiġi estratt b’petroleum ħafif, permezz tal-Proċedura A, qabel l-idroliżi.

Qiegħed il-karta filtru doppja li jkun fiha r-residwu fuq watch glass u nixxef għal siegħa u nofs fil-forn tal-arja (il-punt 4.3) f’100 ± 3 °C.

Qiegħed il-karta tal-filtru doppja li fiha r-residwu niexef f’ħolqa ta’ estrazzjoni (il-punt 4.2), u għatti b’biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam. Poġġi l-ħolqa f’estrattur (il-punt 4.1) u pproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu tal-punt 5.1.

5.3. Proċedura A u estrazzjoni mill-ġdid bil-Proċedura B.

Dan ifisser li wara l-estrazzjoni bil-petroleum ħafif (il-proċedura A), ir-residwu jew porzjon tar-residwu jiġi estratt mill-ġdid bl-aċidu idrokloriku (il-proċedura B). Il-kontenut ta’ żejt u tax-xaħam mhux raffinati huwa s-somma tar-riżultat tal-proċeduri A u B.

6. Espressjoni tar-riżultat

Esprimi l-piż tar-residwu bħala perċentwal tal-kampjun.

7. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista ma għandhomx jaqbżu:

—	0,2 %, f’valur assolut, għall-kontenut ta’ żjut u xaħmijiet mhux raffinati inqas minn 5 %,

—	4,0 % relattiv għall-ogħla riżultat għall-kontenuti ta’ 5 sa 10 %,

—	0,4 % f’valur assolut, għal kontenuti l-fuq minn 10 %.

8. Osservazzjonijiet

8.1.

Għal prodotti b’kontenut għoli ta’ żjut u xaħmijiet u li huma diffiċli biex tagħsar jew mhux xierqa biex jittieħed minnhom kampjun tat-test imnaqqas u omoġenju, ipproċedi kif ġej.

Iżen 20 g mill-kampjun sal-eqreb 1 mg u ħallat ma’ 10 g jew aktar mis-sulfat tas-sodju anidru (il-punt 3.2). Oħroġ b’żejt ħafif mhux raffinat (il-punt 3.1) kif indikat fil-punt 5.1. Żid l-estratt miksub għal 500 ml b’petroleum ħafif (il-punt 3.1) u ħawwad. Ħu 50 ml tas-soluzzjoni u qiegħed f’kunjett żgħir, niexef, miżun li fih biċċiet ta’ ġebla ħaffiefa. Iddistilla s-solvent, nixxef u pproċedi kif indikat fl-aħħar paragrafu tal-punt 5.1.

Elimina s-solvent mir-residwu tal-estrazzjoni li jkun baqa’ fil-ħolqa u għasar ir-residwu għal irquqija ta’ 1 mm, reġġa’ lura l-prodott għal-ħolqa ta’ estrazzjoni (iżżidx is-sulfat tas-sodju), u ipproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu tal-punt 5.1.

Ikkalkula l-kontenut ta’ żjut u xaħmijiet bħala perċentwali tal-kampjun, billi tuża l-formula li ġejja:

fejn:

m1	=	piż fi grammi tar-residwu wara l-ewwel estrazzjoni (il-parti alikwota tal-estratt),
m2	=	piż fi grammi tar-residwu wara t-tieni estrazzjoni.

8.2.

Għal xi (eż. b’kontenut baxx ta’ żejt u xaħam) il-kampjun tat-test jista’ jiżdied.

8.3.

Ikel tal-annimali domestiċi li fih kontenut għoli ta’ ilma jista’ jkollu bżonn jitħallat ma’ sulfat tas-sodju anidridu qabel l-idroliżi u l-estrazzjoni skont il-Proċedura B.

8.4.

Fil-punt 5.2. jista’ jkun aktar effettiv li tuża ilma sħun minflok ilma kiesaħ sabiex taħsel ir-residwu wara l-filtrazzjoni.

8.5.

Għal xi għalf, il-ħin ta’ tnixxif ta’ 1,5 siegħa, jista’ jkun estiż. It-tnixxif eċċessiv għandu jiġi evitat billi dan jista’ jwassal għal riżultati baxxi. Jista’ jintuża wkoll forn microwave.

H. TIĠI STABBILITA L-FIBRA MHUX RAFFINATA

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli sabiex jiġu ddeterminati s-sustanzi organiċi neqsin mix-xaħam fl-għalf li ma jinħallux fil-mezzi aċidużi u alkalini u li huma konvenzjonalment deskritti bħala fibra mhux raffinata.

Il-metodu mhuwiex applikabbli fil-każ tal-linjoċelluloża u tal-karbonju veġetali (partiċelli fini wisq).

2. Prinċipju

Il-kampjun, bix-xaħam imneħħi fejn meħtieġ, huwa trattat suċċessivament b’soluzzjonijiet li jkunu qiegħdin jagħlu ta’ aċidu sulfuriku u idrossidu tal-potassju. Il-fdalijiet huma sseparati permezz ta’ filtrazzjoni bl-użu ta’ filtru ta’ ħġieġ sinterizzat, maħsul, ixxuttat, miżun u inċinerat fi ħdan il-firxa ta’ 475 sa 500 °C. It-telf fil-piż li jirriżulta mill-proċess tal-inċinerazzjoni jikkorrispondi mal-fibra mhux raffinata preżenti fil-kampjun tat-test.

3. Reaġenti

3.1.

Aċidu sulfuriku, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Aġent għal kontra r-ragħwa (eż. n-ottanol).

3.3.

Għajnuna għall-filtrazzjoni (Celite 545 jew ekwivalenti), imsaħħna fuq 500 °C għal erba’ sigħat (il-punt 8.6).

3.4.

Aċeton.

3.5.

Petroleum ħafif li jagħli bejn 40 sa 60 °C.

3.6.

Aċidu idrokloriku, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju, c = 0,23 mol/l.

4. Apparat

4.1.

L-unità tat-tisħin għal diġestjoni ma’ aċidu sulfuriku jew soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju, mgħammra b’appoġġ għall-griġjol tal-filtru (il-punt 4.2) u pprovduta b’tubu ta’ żbokk li jkollu tapp għall-iżbokk tal-likwidu u l-vakwu, possibbilment b’arja kompressata. Qabel ma tintuża, l-unità għandha tissaħħan kuljum minn qabel b’ilma jagħli għal ħames minuti.

4.2.

Griġjol tal-filtru tal-ħġieġ b’daqs tal-pora tal-platt b’filtru tal-ħġieġ sinterizzat fjusjat ta’ bejn 40-90μm. Qabel l-ewwel użu, saħħan sa 500 °C għal ftit minuti u berred (il-punt 8.6).

4.3.

Ċilindru ta’ mill-inqas 270 ml b’kondensatur reflux, adatt għat-tgħollija.

4.4.

Forn imnixxef b’termostat.

4.5.

Muffle furnace bit-termostat.

4.6.

Unità ta’ estrazzjoni li tikkonsisti minn platt ta’ appoġġ għall-griġjol tal-filtru (il-punt 4.2) u b’pajp tal-iżvujtar b’tapp għall-vakwu u għall-iżbokk tal-likwidu.

4.7.

L-anelli tal-għaqid għall-armar tal-unità tat-tisħin (il-punt 4.1), il-griġjol (il-punt 4.2) u ċ-ċilindru (il-punt 4.3) u għall-armar tal-unità kiesħa tal-estrazzjoni (il-punt 4.6) u l-griġjol.

5. Proċedura

Iżen 1 g tal-kampjun preparat sal-eqreb 1 mg u poġġih fil-griġjol (il-punt 4.2), (ara l- punti ta’ osservazzjonijiet 9.1, 9.2 u 9.3) u żid 1 g ta’ għajnuna għall-filtrazzjoni (il-punt 3.3).

Għaqqad l-unità tat-tisħin (il-punt 4.1) u l-filtru (il-punt 4.2), u wara waħħal iċ-ċilindru (il-punt 4.3) mal-griġjol. Ferra’ 150 ml aċidu sulfuriku jagħli (il-punt 3.1) ġewwa ċ-ċilindru magħqud u l-griġjol u jekk meħtieġ żid ftit qtar tal-aġent għal kontra r-ragħwa (il-punt 3.2).

Ġib il-likwidu jagħli għal bejn 5 ± 2 minuti u għalli bil-qawwa għal 30 minuta eżatt.

Iftaħ it-tapp għall-pajp tal-ftuħ (il-punt 4.1) u, taħt vakwu, iffiltra l-aċidu sulfuritiku mill- filtru tal-griġjol u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta’ 30 ml ilma jagħli, filwaqt li tiżgura li r-residwu jiġi ffiltrat xott wara kull ħasla.

Agħlaq it-tapp ta’ ftuħ u ferra’ 150 ml tas-soluzzjoni tagħli ta’ idrossidu tal-potassju (il-punt 3.7) fiċ-ċilindru magħqud u fil-griġjol u żid ftit qatriet ta’ aġent kontra r-ragħwa (il-punt 3.2). Ġib il-likwidu sal-punt li jagħli fi żmien 5 ± 2 minuti u għalli bis-saħħa għal 30 minuta preċiż. Iffiltra u rrepeti l-proċedura tal-ħasil użata għall-pass tal-aċidu sulfuriku.

Wara l-ħasla u t-tnixxif finali, skonnettja l-griġjol u l-kontenut tiegħu u erġa’ qabbdu mal-unità ta’ estrazzjoni kiesħa (il-punt 4.6). Applika l-vakwu u aħsel ir-residwu fil-griġjol bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta’ 25 ml ta’ aċetun (il-punt 3.4) filwaqt li tiżgura li r-residwi jiġu ffiltrati xotti wara kull ħasla.

Nixxef il-griġjol għal piż kostanti fil-forn f’temperatura ta’ 130 °C. Wara kull nixfa berred fid-dessikatur u iżen mill-ewwel. Poġġi l-griġjol ġewwa forn muffle u inċinera għal użin kostanti (it-telf fil-piż bejn użin u ieħor għandu jkun 2 mg jew inqas) f’475 °C u 500 °C għal mill-inqas 30 minuta.

Wara kull tisħin, qabel tiżen, l-ewwel kessaħ fil-forn u wara fid-dessikatur.

Agħmel test fl-inbjank mingħajr il-kampjun. It-telf fl-użin li jirriżulta mill-inċinerazzjoni ma għandux ikun aktar minn 4 mg.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-fibra mhux raffinata bħala perċentwal tal-kampjun huwa mogħti mill-espressjoni:

fejn:

m	=	piż tal-kampjun fi g;
m0	=	it-telf ta’ piż wara li ssir inċinerazzjoni matul id-determinazzjoni, fi grammi;
m1	=	it-telf ta’ piż wara li l-inċinerazzjoni matul it-test fl-inbjank, fi grammi.

7. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn iż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun aktar minn:

—	0,6 % fil-valur assolut għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata inqas minn 10 %,

—	6 % fir-rigward tal-ogħla riżultat, għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata daqs jew aktar minn 10 %.

8. Riproduċibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun fl-laboratorji differenti ma għandhiex taqbeż:

—	1,0 % fil-valur assolut għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata inqas minn 10 %,

—	10 % fir-rigward tal-ogħla riżultat, għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata daqs jew aktar minn 10 %.

9. Osservazzjonijiet

9.1.

L-għalf li jkun fih aktar minn 10 % xaħam mhux raffinat għandu jkollu x-xaħam imneħħi qabel l-analiżi bil-petroleum ħafif (il-punt 3.5). Għaqqad il-griġjol tal-filtru (il-punt 4.2) u l-kontenuti tiegħu mal-unità tal-estrazzjoni kiesħa (il-punt 4.6) u applika l-vakwu u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta’ 30 ml ta’ petroleum ħafif, filwaqt li tiżgura li r-residwu jibqa’ xott. Qabbad il-griġjol u l-kontenut tiegħu mal-unità tat-tisħin (il-punt 4.1) u kompli kif deskritt fil-punt 5.

9.2.

L-għalf li jkollu fih xaħmijiet li ma jistgħux jiġu estratti direttament mill-petroleum ħafif (il-punt 3.5) għandu jkollu x-xaħam imneħħi kif muri fi 8.1 u għandu jerġa’ jkollu x-xaħam imneħħi wara l-għali mal-aċidu. Wara l-għali mal-aċidu u l-ħasil sussegwenti għaqqad il-griġjol u l-kontenuti tiegħu mal-unità kiesħa tal-estrazzjoni (il-punt 4.6) u aħsel għal tliet darbiet bi 30 ml aċetun segwit minn tliet ħasliet oħra bi 30 ml petroleum ħafif. Iffiltra taħt vakwu sakemm ikun niexef u kompli l-analiżi kif deskritt skont il-punt 5, billi tibda mit-trattament bil-idrossidu tal-potassju.

9.3.

Jekk l-għalf ikun fih aktar minn 5 % karbonati, espressi bħala karbonat tal-kalċju, għaqqad il-griġjol (il-punt 4.2) mal-kampjun miżun mal-unità tat-tisħin (il-punt 4.1). Aħsel il-kampjun għal tliet darbiet bi 30 ml aċidu idrokloriku (il-punt 3.6). Wara kull żieda ħalli l-kampjun joqgħod għal xi minuta qabel ma tiffiltra. Aħsel darba bi 30 ml ilma u mbagħad kompli kif deskritt skont il-punt 5.

9.4.

Jekk jintuża apparat bil-forma wieqfa (bosta griġjoli mehmużin mal-istess unità tat-tisħin) ma jistgħux isiru żewġ determinazzjonijiet individwali fuq l-istess kampjun għall-analiżi fl-istess serje.

9.5.

Jekk wara t-togħlija jkun diffiċli li tiffiltra s-soluzzjonijiet aċidużi u bażiċi, uża l-arja kkompressata permezz tal-pajp tat-tbattil tal-unità tat-tisħin u mbagħad kompli ffiltra.

9.6.

It-temperatura għall-inċinerazzjoni ma għandhiex tkun aktar minn 500 °C sabiex tkun tista’ testendi l-ħajja tal-griġjoli għall-iffiltrar tal-ħġieġ. Għandha tingħata l-attenzjoni meħtieġa sabiex ikun evitat ix-xokk termali eċċessiv matul iċ-ċikli tat-tisħin u tat-tkessiħ.

I. DETERMINAZZJONI TAZ-ZOKKOR

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat l-ammont ta’ zokkor riduċenti u zokkor totali wara l-inverżjoni, espress bħala glukożju jew fejn xieraq bħala sukrożju, b’konverżjoni bil-fattur 0,95. Huwa applikabbli għall-għalf kompost kollu. Metodi speċjali huma pprovduti għal għalf ieħor. Fejn meħtieġ, il-lattożju għandu jitkejjel separatament u jitqies meta jiġu kkalkolati r-riżultati.

Dan il-metodu għandu jintuża għad-determinazzjoni tal-kontenut taz-zokkor għall-użu fil-kalkolu tal-valur enerġetiku tal-għalf.

F’każ li l-kontenut taz-zokkor għandu jiġi ddeterminat għal skopijiet oħra, jistgħu jintużaw metodi oħra ta’ analiżi.

2. Prinċipju

Iz-zokkor huwa estratt f’etanol dilwit; is-soluzzjoni tiġi ċċarata bis-soluzzjonijiet Carrez I u II. Wara li jiġi eliminat l-etanol, il-kwantitajiet qabel u wara l-inverżjoni huma stabbiliti mill-metodu Luff-Schoorl.

3. Reaġenti

3.1.

40 % (v/v) soluzzjoni ta’ etanol densità: 0,948 g/ml f’20 °C, innewtralizzat għall-fenolftaleina.

3.2.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta’ aċetat taż-żingu, Zn (CH3COO)2 2H2O u 3 g ta’ aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.3.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta’ ferroċjanur tal-potassju, K4Fe(CN)6·3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Oranġjo tal-metil, soluzzjoni 0,1 % (w/v).

3.5.

Aċidu idrokloriku 4 mol/litru.

3.6.

Aċidu idrokloriku 0,1 mol/litru.

3.7.

Soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru.

3.8.

Reaġent Luff-Schoorl:

Waqt li tħawwad b’attenzjoni, ferra’ s-soluzzjoni tal-aċidu ċitriku (il-punt 3.8.2) fis-soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (il-punt 3.8.3). Żid is-soluzzjoni tas-sulfat tar-ram (il-punt 3.8.1) u żid sa 1 l bl-ilma. Ħalliha toqgħod matul il-lejl u ffiltra.

Ivverifika l-konċentrazzjoni tar-reaġent hekk miksub (Cu 0,05 mol/litru; Na2 CO3 1 mol/litru), ara l-punt 5.4, l-aħħar paragrafu. Il-pH tas-soluzzjoni għandu jkun bejn wieħed u ieħor 9,4.

3.8.1.

Soluzzjoni tas-sulfat tar-ram: dewweb 25 g sulfat tar-ram, Cu SO4 5H2O, ħieles mill-ħadid, f’100 ml ilma.

3.8.2.

Soluzzjoni ta’ aċidu ċitriku: dewweb 50 g ta’ aċidu ċitriku, C6H8O7•H2O f’50 ml ilma.

3.8.3.

Soluzzjoni ta’ karbonat tas-sodju: dewweb 143,8 g karbonat tas-sodju anidridu f’bejn wieħed u ieħor 300 ml ilma sħun. Ħallih jiksaħ.

3.9.

Soluzzjoni ta’ tijosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru.

3.10.

Soluzzjoni tal-lamtu: żid taħlita ta’ 5 g ta’ lamtu li jinħall ġo 30 ml ta’ ilma ma’ 1 l ta’ ilma jagħli. Għalli għal tliet minuti ħallieh jiksaħ u jekk ikun meħtieġ żid 10 mg ta’ jodju merkuriku bħala preservattiv.

3.11.

Aċidu sulfuriku 3 mol/litru.

3.12.

Soluzzjoni ta’ jodur tal-potassju, 30 % (w/v).

3.13.

Frak ta’ ħaffiefa mgħolli fl-aċidu idrokloriku, maħsul fl-ilma u mnixxef.

3.14.

3-metilbutan-1-ol.

4. Apparat

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

5. Proċedura

5.1. Estrazzjoni tal-kampjun

Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml. Żid 200 ml etanol (il-punt 3.1) u ħawwad fit-tazza għal siegħa. Żid 5 ml ta’ soluzzjoni Carrez I (il-punt 3.2) u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 30 sekonda. Żid 5 ml ta’ soluzzjoni Carrez II (il-punt 3.3) u erġa’ ħawwad għal minuta. Żid sal-volum bl-etanol (il-punt 3.1), omoġenizza u ffiltra. Neħħi 200 ml tal-filtrat u evapora sa bejn wieħed u ieħor nofs il-volum sabiex telimina l-parti l-kbira tal-etanol. Ittrasferixxi r-residwu tal-evaporazzjoni kwantitattivament f’kunjett volumetriku ta’ 200 ml billi tuża l-ilma sħun, kessaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra jekk ikun meħtieġ. Din is-soluzzjoni tintuża biex jiġi ddeterminat l-ammont ta’ zokkor riduċenti u, wara l-inverżjoni, l-ammonti totali taz-zokkor.

5.2. Determinazzjoni ta’ zokkor riduċenti

Permezz ta’ pipetta, neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li jkun fiha inqas minn 60 mg ta’ zokkor riduċenti espress bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b’ilma distillat u ddetermina l-kontenut ta’ zokkor riduċenti permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat jiġi espress bħala perċentwal tal-kontenut ta’ glukożju fil-kampjun.

5.3. Determinazzjoni ta’ zokkor totali wara l-inverżjoni

Permezz ta’ pipetta ħu 50 ml tas-soluzzjoni u ttrasferiha f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml. Żid ftit qatriet ta’ soluzzjoni ta’ oranġjo tal-metil (il-punt 3.4) u mbagħad, b’attenzjoni u waqt li tħawwad il-ħin kollu, żid l-aċidu idrokloriku (il-punt 3.5) sakemm il-likwidu jsir aħmar sew. Żid 15 ml aċidu idrokloriku (il-punt 3.6), daħħal il-kunjett f’banjumarija bil-misħun jagħli sew u żommu hemm għal tletin minuta. Kessaħ malajr sa bejn wieħed u ieħor 20 °Cu żid 15 ml ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (il-punt 3.7). Żid sa 100 ml bl-ilma u omoġenizza. Neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li fiha inqas minn 60 mg zokkor riduċenti espress bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b’ilma distillat u ddetermina l-kontenut ta’ zokkor riduċenti permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat jiġi espress bħala perċentwal ta’ glukożju jew, fejn xieraq, sukrożju, billi timmultiplika bil-fattur 0,95.

5.4. Titrazzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl

Permezz ta’ pipetta, ħu 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (il-punt 3.8) u ittrasferih f’kunjett Erlenmeyer tat-300 ml; żid eżattament 25 ml tas-soluzzjoni ċċarata taz-zokkor. Żid 2 granuli ta’ ġebla ħaffiefa (il-punt 3.13), saħħan, waqt li tħawwad bl-idejn, fuq fjamma mikxufa ta’ għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f’bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Poġġi l-Erlenmeyer immedjatament fuq garża tal-wajers miksija bl-asbestos b’toqba ta’ madwar 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tkun irregolata b’tali mod li l-qiegħ biss tal-Erlenmeyer jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. Għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f’ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:

Żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ jodur tal-potassju (il-punt 3.12) u minnufih wara (b’attenzjoni, minħabba r-riskju ta’ produzzjoni ta’ ħafna ragħwa) żid 25 ml ta’ aċidu sulfuriku (il-punt 3.11). Ittitra b’soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju (il-punt 3.9) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (il-punt 3.10) u lesti t-titrazzjoni.

Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b’mod eżatt ta’ 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (il-punt 3.8) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ jodur tal-potassju (il-punt 3.12) u 25 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.11) mingħajr ma tgħalli.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Permezz tat-tabella, stabbilixxi l-ammont ta’ glukożju f’mg li jikkorrispondi għad-differenza bejn il-valuri taż-żewġ titrazzjonijiet, espressi f’ml ta’ tijosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru. Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7. Proċeduri speċjali

7.1.

Fil-każ ta’ għalf b’kontenut rikk fil-melassa u għalf ieħor li mhuwiex partikolarment omoġenju, iżen 20 g u poġġihom ma’ 500 ml ta’ ilma ġo kunjett volumetriku ta’ 1 l. Ħawwad għal siegħa ġot-tazza. Iċċara permezz tar-reaġenti Carrez I (il-punt 3.2) u II (il-punt 3.3) kif deskritt taħt il-punt 5.1, din id-darba iżda b’erba’ darbiet il-kwantitajiet ta’ kull reaġent. Żid sal-volum bi 80 % etanol (v/v).

Omoġenizza u ffiltra. Elimina l-etanol kif deskritt taħt il-punt 5.1. Jekk ma hemm l-ebda lamtu dextrinised, żid sal-volum b’ilma distillat.

7.2.

Fil-każ ta’ melassa u materjali tal-għalf li għandhom ammont kbir ta’ zokkor u li huma kważi ħielsa mil-lamtu (ħarrub, cossettes tal-pitravi mnixxfa eċċ.), iżen 5 g, poġġi f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml, żid 200 ml ilma distillat u ħawwad fit-tazza għal siegħa, jew aktar jekk ikun meħtieġ. Iċċara bis-soluzzjonijiet tar-reaġenti Carrez I (il-punt 3.2) u II (il-punt 3.3) kif deskritti fil-punt 5.1. Żid sal-volum bl-ilma kiesaħ, omoġenizza u ffiltra. Sabiex jiġi stabbilit l-ammont totali ta’ zokkor, kompli kif deskritt taħt il-punt 5.3.

8. Osservazzjonijiet

8.1.

Sabiex ma jkunx hemm produzzjoni ta’ ragħwa huwa rakkomandabbli li żżid (minkejja l-volum) bejn wieħed u ieħor 1 ml ta’ 3-metilbutan-1-ol (il-punt 3.14) qabel ma tgħalli bir-reaġent Luff-Schoorl.

8.2.

Id-differenza bejn il-kontenut totali ta’ zokkor wara l-inverżjoni, espress bħala glukożju, u l-kontenut ta’ zokkor riduċenti, espress bħala glukożju, immultiplikat b’0,95, tagħti l-perċentwali tal-kontenut ta’ sukrożju.

8.3.

Sabiex jiġi ddeterminat il-kontenut ta’ zokkor riduċenti, minbarra lattożju, jistgħu jiġu adottati żewġ metodi:

8.3.1.

Għal kalkolu approssimattiv, immultiplika b’0,675 il-kontenut tal-lattożju stabbilit permezz ta’ metodu differenti ta’ analiżi u naqqas ir-riżultat miksub mill-kontenut taz-zokkor riduċenti.

8.3.2.

Għal kalkolu eżatt ta’ zokkor riduċenti, minbarra l-lattożju, l-istess kampjun irid jintuża għaż-żewġ determinazzjonijiet finali. Waħda mill-analiżijiet ssir fuq parti mis-soluzzjoni miksuba taħt il-punt 5.1, l-oħra fuq parti mis-soluzzjoni miksuba matul l-istabbiliment ta’ lattożju permezz tal-metodu stabbilit għal dak il-għan (wara fermentazzjoni taż-żewġ tipi l-oħra taz-zokkor u ċċarar).

Fiż-żewġ każijiet l-ammont ta’ zokkor preżenti huwa stabbilit permezz tal-metodu Luff-Schoorl u kkalkolat f’mg ta’ glukożju. Wieħed mill-valuri huwa mnaqqas mill-ieħor u d-differenza hija espressa bħala perċentwal tal-kampjun.

Eżempju

Iż-żewġ volumi meħudin jikkorrispondu, għal kull determinazzjoni, għal kampjun ta’ 250 mg.

Fl-ewwel każ, huma kkunsmati 17 ml ta’ soluzzjoni ta’ tijosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru li jikkorrispondu għal 44,2 mg glukożju; fit-tieni, 11 ml, li jikkorrispondu għal 27,6 mg glukożju.

Id-differenza hija ta’ 16,6 mg glukożju.

Il-kontenut ta’ zokkor riduċenti (minbarra lattożju), ikkalkolat bħala glukożju, huwa għalhekk:

Tabella tal-valuri għal 25 ml ta’ reaġent Luff-Schoorl

ml ta’ Na2 S2 O3 0,1 mol/litru, tisħin għal żewġ minuti, togħlija għal għaxar minuti

Na2 S2 O3

0,1 mol/litru

Glukożju, fruttożju zokkor invertit

C6 H12 O6

Lattożju

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/litru

differenza

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

J. DETERMINAZZJONI TAL-LATTOŻJU

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ lattożju fl-għalf li jkun fih aktar minn 0,5 % ta’ lattożju.

2. Prinċipju

Iz-zokkor huwa maħlul fl-ilma. Is-soluzzjoni tiġi suġġetta għall-fermentazzjoni permezz tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae li tħalli l-lattożju intatt. Wara l-iċċarar u l-filtrazzjoni, il-kontenut tal-lattożju jiġi ddeterminat permezz tal-metodu Luff-Schoorl.

3. Reaġenti

3.1.

Sospensjoni ta’ Saccharomyces cerevisiae: poġġi 25 g ħmira friska f’100 ml ta’ ilma. Is-sospensjoni żżomm għal perjodu massimu ta’ ġimgħa fil-friġġ.

3.2.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta’ aċetat taż-żingu, Zn (CH3 COO)2 2H2O u 3 g ta’ aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.3.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta’ ferroċjanur tal-potassju, K4Fe(CN)6·3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Reaġent Luff-Schoorl:

Waqt li tħawwad b’attenzjoni, ferra’ s-soluzzjoni tal-aċidu ċitriku (il-punt 3.4.2) fis-soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (il-punt 3.4.3). Żid is-soluzzjoni tas-sulfat tar-ram (il-punt 3.4.1) u żid sa 1 l bl-ilma. Ħalliha toqgħod matul il-lejl u ffiltra. Ivverifika l-konċentrazzjoni tar-reaġent hekk miksub (Cu 0,05 mol/litru; Na2 CO3 1 mol/litru). Il-pH tas-soluzzjoni għandu jkun bejn wieħed u ieħor 9,4.

3.4.1.

Soluzzjoni tas-sulfat tar-ram: dewweb 25 g sulfat tar-ram Cu SO4 5H2O, ħieles mill-ħadid, f’100 ml ilma.

3.4.2.

Soluzzjoni ta’ aċidu ċitriku: dewweb 50 g ta’ aċidu ċitriku C6H8O7 • H2O f’50 ml ilma.

3.4.3.

Soluzzjoni ta’ karbonat tas-sodju: dewweb 143,8 g karbonat tas-sodju anidridu f’bejn wieħed u ieħor 300 ml ilma sħun. Ħallih jiksaħ.

3.5.

Frak ta’ ħaffiefa mgħolli fl-aċidu idrokloriku, maħsul fl-ilma u mnixxef.

3.6.

Soluzzjoni ta’ jodur tal-potassju, 30 % (w/v).

3.7.

Aċidu sulfuriku 3 mol/litru.

3.8.

Soluzzjoni ta’ tijosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru.

3.9.

Soluzzjoni tal-lamtu: żid taħlita ta’ 5 g ta’ lamtu li jinħall ġo 30 ml ta’ ilma ma’ 1 l ta’ ilma jagħli. Għalli għal tliet minuti, ħallieh jiksaħ, u jekk ikun meħtieġ żid 10 mg ta’ jodju merkuriku bħala preservattiv.

4. Apparat

Banjumarija b’termostat issettjat f’temperatura ta’ 38–40 °C.

5. Proċedura

Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed dan il-porzjon tal-kampjun f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml. Żid 25 sa 30 ml ilma. Qiegħed il-kunjett ġo banjumarija b’misħun jagħli għal tletin minuta u mbagħad kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 35 °C. Żid 5 ml ta’ sospensjoni tal-ħmira (il-punt 3.1) u omoġenizza. Ħalli l-kunjett joqgħod għal sagħtejn f’banjumarija, f’temperatura ta’ 38–40 °C. Kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 20 °C.

Żid 2,5 ml ta’ soluzzjoni Carrez I (il-punt 3.2) u ħawwad għal tletin sekonda, imbagħad żid 2,5 ml ta’ soluzzjoni Carrez II (il-punt 3.3) u erġa’ ħawwad għal tletin sekonda. Żid sa 100 ml bl-ilma, ħawwad u ffiltra. Permezz ta’ pipetta, neħħi ammont ta’ filtrat li ma jaqbiżx il-25 ml u li preferibbilment ikun fih minn 40 sa 80 mg ta’ lattożju u ttrasferixxi f’kunjett Erlenmeyer ta’ 300 ml. Jekk ikun meħtieġ, żid il-volum sa 25 ml bl-ilma.

Wettaq test fl-inbjank bl-istess mod b’5 ml ta’ sospensjoni tal-ħmira (il-punt 3.1). Stabbilixxi l-kontenut tal-lattożju skont Luff-Schoorl, kif ġej: żid eżattament 25 ml ta’ reaġent Luff-Schoorl (il-punt 3.4) u żewġ granuli ta’ ħaffiefa (il-punt 3.5). Ħawwad bl-idejn waqt li ssaħħan fuq fjamma mikxufa ta’ għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f’bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Poġġi l-Erlenmeyer immedjatament fuq garża tal-wajers miksija bl-asbestos b’toqba ta’ madwar 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tkun irregolata b’tali mod li l-qiegħ biss tal-Erlenmeyer jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. Għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f’ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:

Żid 10 ml ta’ soluzzjoni tal-jodur tal-potassju (il-punt 3.6) u minnufih wara (b’attenzjoni, minħabba fir-riskju ta’ produzzjoni ta’ ħafna ragħwa) żid 25 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.7). Ittitra b’soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju (il-punt 3.8) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (il-punt 3.9) u lesti t-titrazzjoni.

Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b’mod eżatt ta’ 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (il-punt 3.4) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ jodur tal-potassju (il-punt 3.6) u 25 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.7) mingħajr ma tgħalli.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Permezz tat-tabella mehmuża, stabbilixxi l-ammont ta’ lattożju f’mg li jikkorrispondi għad-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ titrazzjonijiet, espressa f’ml ta’ tijosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru.

Agħti r-riżultat miksub bħala lattożju anidru bħala perċentwali tal-kampjun.

7. Osservazzjoni

Għall-prodotti li jkun fihom aktar minn 40 % ta’ zokkor fermentabbli, uża aktar minn 5 ml ta’ sospensjoni tal-ħmira (il-punt 3.1).

Fl-għalf ta’ “lattożju mnaqqas” (eż. ħalib għall-qtates), il-lattożju jiġi kkonvertit f’fruttożju, li ma jiġix iffermentat kompletament fi żmien sagħtejn (2 h) li jirriżulta f’riżultati pożittivi ogħla jew foloz (minħabba li r-residwi tal-fruttożju jibqgħu fl-estratt).

Tabella tal-valuri għal 25 ml ta’ reaġent Luff-Schoorl

ml ta’ Na2 S2 O3 0,1 mol/litru, tisħin għal żewġ minuti, togħlija għal għaxar minuti

Na2 S2 O3

0,1 mol/litru

Glukożju, fruttożju zokkor invertit

C6 H12 O6

Lattożju

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/litru

differenza

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

K. DETERMINAZZJONI TAL-LAMTU

METODU POLARIMETRIKU

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-livelli ta’ lamtu u ta’ prodotti ta’ degradazzjoni tal-lamtu b’piż molekulari għoli fl-għalf, bil-għan li tiġi ċċekkjata l-konformità mal-valur tal-enerġija ddikjarat (dispożizzjonijiet fl-Anness VII) u r-Regolament (KE) Nru 767/2009.

Dan il-metodu għandu jintuża għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-lamtu għall-użu fil-kalkolu tal-valur enerġetiku tal-għalf.

F’każ li l-kontenut tal-lamtu għandu jiġi determinat għal għanijiet oħra, jistgħu jintużaw metodi oħra ta’ analiżi.

2. Prinċipju

Il-metodu jinkludi żewġ determinazzjonijiet. Fl-ewwel wieħed, il-kampjun jiġi trattat u mħallat bl-aċidu idrokloriku dilwit. Wara li jiċċara u li ssir il-filtrazzjoni, ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni titkejjel permezz tal-polarimetrija.

Fit-tieni wieħed, il-kampjun jiġi estratt b’40 % etanol. Wara l-aċidifikazzjoni tal-filtrat bl-aċidu idrokloriku, l-iċċarar u l-filtrazzjoni, titkejjel ir-rotazzjoni ottika bħal fil-każ tal-ewwel determinazzjoni.

Id-differenza bejn iż-żewġ kejlijiet, immultiplikata b’fattur magħruf, tagħti l-kontenut tal-lamtu tal-kampjun.

3. Reaġenti

3.1.

Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku, 25 % (w/w) densità: 1,126 g/ml.

3.2.

Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku 1,13 % (w/v)

Il-konċentrazzjoni għandha tiġi kkontrollata bit-titrazzjoni bl-użu ta’ soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru fil-preżenza ta’ 0,1 % (w/v) aħmar tal-metil f’94 % (v’/v) etanol. Għan-newtralizzazzjoni hemm bżonn ta’ 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/litru.

3.3.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb 21,9 g aċetat taż-żingu Zn(CH3COO)2 2H2O u 3 g aċidu aċetiku inġazzat fl-ilma. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta’ ferroċjanur tal-potassju, K4 Fe(CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.5.

Soluzzjoni ta’ etanol, 40 % (v/v), densità: 0,948 g/ml f’20 °C.

4. Apparat

4.1.

250 ml kunjett Erlenmeyer b’ġonta standard tal-ħġieġ mitħun b’kondensatur reflux.

4.2.

Polarimetru jew sakkarimetru.

5. Proċedura

5.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Għaffeġ il-kampjun sakemm ikun fin biżżejjed biex jgħaddi kollu kemm hu minn passatur b’toqob tondi ta’ 0,5 mm.

5.2. Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika totali (P jew S) (ara l-punt ta’ osservazzjoni 7.1)

Iżen 2,5 g tal-kampjun mgħaffeġ sal-eqreb mg u qiegħed f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Żid 25 ml aċidu idrokloriku (il-punt 3.2), ħawwad biex tikseb distribuzzjoni uniformi tal-kampjun tat-test u żid 25 ml oħra ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.2). Daħħal il-kunjett f’banjumarija jagħli waqt li tħawwad sew u sod għall-ewwel tliet minuti biex tevita l-formazzjoni ta’ agglomerati. Il-kwantità ta’ ilma fil-banjumarija għandha tkun suffiċjenti biex il-banju jibqa’ jagħli meta l-kunjett jiddaħħal fih. Il-kunjett ma għandux jinħareġ mill-banju meta jkun qed jitħawwad. Wara eżattament 15-il minuta, neħħi mill-banju, żid 30 ml ilma kiesaħ u kessaħ immedjatament għal 20 °C.

Żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez I (il-punt 3.3) u ħawwad għal madwar 30 sekonda. Imbagħad żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez II (il-punt 3.4) u erġa’ ħawwad għal 30 sekonda. Żid sal-volum bl-ilma, ħawwad u ffiltra. Jekk il-filtrat ma jkunx ċar għal kollox (ħaġa rari), irrepeti d-determinazzjoni bl-użu ta’ kwantità akbar tas-soluzzjonijiet Carrez I u II, pereżempju 10 ml.

Kejjel ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni f’tubu ta’ 200 mm bil-polarimetru jew bis-sakkarimetru.

5.3. Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika (P’ jew S’) ta’ sustanzi li jdubu f’40 % etanol

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg, qiegħed fil-kunjett iggradat ta’ 100 ml u żid bejn wieħed u ieħor 80 ml etanol (il-punt 3.5) (ara l-punt ta’ osservazzjoni 7.2). Ħalli l-kunjett jiksaħ għal siegħa 1 f’temperatura ambjentali; matul dan il-ħin ħawwad sew f’sitt okkażjonijiet biex il-kampjun tat-test jitħallat sew mal-etanol. Żid sal-volum bl-etanol (il-punt 3.5), ħallat u ffiltra.

Iġbed b’pipetta 50 ml tal-filtrat (li jikkorrispondi għal 2,5 g tal-kampjun) f’kunjett Erlenmeyer ta’ 250 ml, żid 2,1 ml aċidu idrokloriku (il-punt 3.1) u ħawwad sew. Waħħal kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer u għaddsu f’banjumarija bl-ilma jagħli. Wara eżattament 15-il minuta, neħħi l-kunjett Erlenmeyer mill-banju, ittrasferixxi l-kontenut għal kunjett iggradat ta’ 100 ml, billi tlaħlaħ bi ftit ilma kiesaħ, u kessaħ għal 20 °C.

Ikkjarifika bl-użu ta’ soluzzjonijiet Carrez I (il-punt 3.3) u II (il-punt 3.4), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad, iffiltra u kejjel ir-rotazzjoni ottika kif indikat fil-punt 5.2, it-tieni u t-tielet paragrafi.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-lamtu bħala perċentwali (%) tal-kampjun huwa kalkolat kif ġej:

6.1. Kejl skont il-polarimetrija

Rotazzjoni ottika totali fi gradi tal-angoli

P’

Rotazzjoni ottika fi gradi ta’ angoli tas-sustanzi li jdubu f’40 % (V/V) etanol

Rotazzjoni ottika speċifika ta’ lamtu pur. Il-valuri numeriċi aċċettati b’mod konvenzjonali għal dan il-fattur huma kif ġejjin:

+ 185,9°	:	lamtu tar-ross
+ 185,7°	:	lamtu tal-patata
+ 184,6°	:	lamtu tal-qamħirrum
+ 182,7°	:	lamtu tal-qamħ
+ 181,5°	:	lamtu tax-xgħir
+ 181,3°	:	lamtu tal-ħafur
+ 184,0°	:	tipi oħra ta’ lamtu u taħlitiet ta’ lamtu f’għalf kompost

6.2. Kejl permezz ta’ sakkarimetru

Rotazzjoni ottika totali fi gradi sakkarimetriċi

S’

Rotazzjoni ottika fi gradi sakkarimetriċi tas-sustanzi li jdubu f’40 % (v/v) etanol

Piż fi g ta’ sukrożju f’100 ml ta’ ilma li jagħti rotazzjoni ottika ta’ 100 grad sakkarimetriku f’tubu ta’ 200 mm

16,29 g għal sakkarimetri Franċiżi

26,00 g għal sakkarimetri Ġermaniżi

20,00 g għal sakkarimetri mħallta.

Rotazzjoni ottika speċifika ta’ lamtu pur (ara l-punt 6.1)

6.3. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun iktar minn 0,4, f’valur assolut, għall-kontenut ta’ lamtu ta’ inqas minn 40 % u 1 % f’valur relattiv, għall-kontenut ta’ lamtu ta’ 40 % jew aktar.

7. Osservazzjonijiet

7.1.

Jekk il-kampjun ikun fih aktar minn 6 % ta’ karbonati, ikkalkolati f’termini ta’ karbonat tal-kalċju, dawn għandhom jinqerdu bi trattament bi kwantità xierqa ta’ aċidu sulfuriku dilwit qabel ma tiġi ddeterminata r-rotazzjoni ottika totali.

7.2.

Fil-każ ta’ prodotti b’kontenut għoli ta’ lattożju, bħat-trab tas-serum tal-ħalib jew trab tal-ħalib xkumat, ipproċedi kif ġej wara li żżid 80 ml ta’ etanol (il-punt 3.5). Waħħal kondensatur reflux mal-kunjett u għaddas lil tal-aħħar f’banjumarija f’50 °C għal 30 minuta. Ħallih jiksaħ u kompli l-analiżi kif indikat fil-punt 5.3.

7.3.

Il-materjal tal-għalf li ġej, meta jkun preżenti f’ammonti sinifikanti fl-għalf, huwa magħruf li joħloq interferenzi waqt id-determinazzjoni tal-kontenut tal-lamtu permezz tal-metodu polarimetriku u għalhekk jista’ jwassal għal riżultati mhux korretti:

—	prodotti tal-pitravi (taz-zokkor) bħal polpa tal-pitravi (taz-zokkor), melassa tal-pitravi (taz-zokkor), polpa tal-pitravi (taz-zokkor) magħmula melassa, vinasse tal-pitravi (taz-zokkor), zokkor (tal-pitravi);

—	polpa taċ-ċitru;

—	żerriegħa tal-kittien; espellent taż-żerriegħa tal-kittien; żerriegħa tal-kittien estratta;

—	żerriegħa tal-lift; espellent taż-żerriegħa tal-lift; żerriegħa tal-lift estratta; qxur taż-żerriegħa tal-lift;

—	żerriegħa tal-ġirasol; żerriegħa tal-ġirasol estratta; żerriegħa tal-ġirasol estratta parzjalment, imqaxxra, estratta;

—	espellent tal-kopra; kopra, estratta;

—	polpa tal-patata;

—	ħmira deidrata;

—	prodotti rikki fl-inulina (eż. biċċiet u dqiq tal-artiċokks ta’ Ġerusalemm);

—	fdalijiet tax-xaħam ta’ dam;

—	prodotti tal-fażola tas-sojja. F’dawn il-każijiet il-metodu ta’ analiżi kif previst mir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 121/2008 jista’ (7) jiġi applikat. Dan il-metodu jista’ jintuża wkoll għal għalf li fih inqas minn 1 % lamtu.

L. DETERMINAZZJONI TA’ RMIED MHUX RAFFINAT

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-kontenut ta’ rmied mhux raffinat fl-għalf.

2. Prinċipju

Il-kampjun issirlu l-inċinerazzjoni f’temperatura ta’ 550 °C; ir-residwu jintiżen.

3. Reaġenti

Nitrat tal-ammonja, soluzzjoni 20 % (w/v).

4. Apparat

4.1.

Hot-plate.

4.2.

Muffle-furnace tal-elettriku bit-termostat.

4.3.

Griġjoli biex issir l-inċinerazzjoni magħmulin mis-siliċe, porċellana jew mill-platinu f’għamla rettangolari (madwar 60 × 40 × 25 mm) jew tondi (dijametru: 60 sa 75 mm, għoli: minn 20 sa 40 mm).

5. Proċedura

Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun (2,5 fil-każ ta’ prodotti li għandhom tendenza li jintefħu) u qiegħdu fi griġjol għall-inċinerazzjoni wara li l-ewwel ikun issaħħan f’550 °C, imkessaħ u tnaqqaslu l-piż tal-kontenitur. Qiegħed il-griġjol fuq il-hotplate u saħħan gradwalment sakemm is-sustanza tikkarbonizza. Inċinera skont il-punt 5.1 jew 5.2.

5.1.

Daħħal il-griġjol fil-muffle-furnace ikkalibrat f’temperatura ta’ 550 °C. Żomm din it-temperatura sakemm jinkiseb irmied abjad, griż ċar jew ħamrani li jidher li huwa ħieles minn partikoli karbonjużi. Qiegħed il-griġjol f’dessikatur, ħallih jiksaħ u iżen minnufih.

5.2.

Daħħal il-griġjol fil-muffle-furnace kalibrat f’temperatura ta’ 550 °C. Inċinera għal 3 sigħat. Qiegħed il-griġjol f’dessikatur, ħallih jiksaħ u iżen minnufih. Erġa’ inċinera għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż tal-irmied jibqa’ kostanti (telf fil-piż bejn żewġ wiżniet suċċessivi jrid ikun inqas minn jew ugwali għal 1 mg).

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Ikkalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7. Osservazzjonijiet

7.1.

L-irmied ta’ sustanzi li huma diffiċli biex isiru rmied għandu jiġi soġġett għall-proċess ta’ inċinerazzjoni inizjali ta’ mill-inqas tliet sigħat, imkessaħ u mbagħad jiżdied miegħu ftit taqtir ta’ 20 % soluzzjoni ta’ nitrat tal-ammonja (b’attenzjoni, sabiex jiġi evitat it-tixrid tal-irmied jew il-formazzjoni ta’ ċapep). Kompli kkalċina wara li tnixxef fil-forn. Irrepeti l-proċess kif meħtieġ sakemm l-inċinerazzjoni titlesta.

7.2.

Fil-każ ta’ sustanzi li huma reżistenti għat-trattament deskritt taħt il-punt 7.1, ipproċedi kif ġej: wara l-inċinerazzjoni ta’ tliet sigħat, qiegħed l-irmied f’ilma sħun u ffiltra minn filtru żgħir, ħieles mill-irmied. Inċinera l-filtru u l-kontenuti tiegħu fil-griġjol oriġinali. Qiegħed il-filtrat fi griġjol imkessaħ, evapora sakemm jinxef, inċinera u iżen.

7.3.

Fil-każ ta’ żjut u xaħmijiet, iżen b’mod preċiż kampjun ta’ 25 g fi griġjol ta’ daqs xieraq. Ikkarbonizza billi tqabbad is-sustanza bi strixxa ta’ karta tal-filtru ħielsa mill-irmied. Wara li jkun qabad, xarrab bl-inqas ilma possibbli. Nixxef u inċinera kif deskritt taħt il-punt 5.

M. DETERMINAZZJONI TA’ RMIED LI MA JINĦALLX FL-AĊIDU IDROKLORIKU

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ sustanzi minerali fl-għalf li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku. Jistgħu jintużaw żewġ metodi, skont in-natura tal-kampjun.

1.1.

Metodu A: jgħodd għal materjali tal-għalf organiċi u għall-maġġoranza tal-għalf kompost;

1.2.

Metodu B: jgħodd għal komposti u taħlitiet minerali u għal għalf kompost li l-kontenut tagħhom f’sustanzi li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku, kif stabbilit minn Metodu A, huwa aktar minn 1 %.

2. Prinċipju

2.1.

Metodu A: il-kampjun jiġi inċinerat, l-irmied jitgħalla fl-aċidu idrokloriku u r-residwu li ma jinħallx jiġi iffiltrat u jintiżen.

2.2.

Metodu B: il-kampjun jiġi ittrattat bl-aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni tiġi ffiltrata, ir-residwu jkun inċinerat u l-irmied miksub ittrattat f’konformità mal-Metodu A.

3. Reaġenti

3.1.

Aċidu idrokloriku 3 mol/litru.

3.2.

Aċidu trikloroaċetiku, soluzzjoni 20 % (w/v).

3.3.

Aċidu trikloroaċetiku, soluzzjoni 1 % (w/v).

4. Apparat

4.1.

Hot plate.

4.2.

Muffle-furnace tal-elettriku bit-termostat.

4.3.

4.4.

Filtri mingħajr irmied

5. Proċedura

5.1. Metodu A:

Inċinera l-kampjun permezz tal-metodu deskritt għad-determinazzjoni ta’ rmied mhux raffinat. Irmied miksub minn dik l-analiżi jista’ jintuża wkoll.

Qiegħed l-irmied f’beaker ta’ 250 sa 400 ml billi tuża 75 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1). Ħallieh jiftaħ jagħli bilmod u għalli bilmod għal ħmistax-il minuta. Iffiltra s-soluzzjoni sħuna minn karta tal-filtru ħielsa mill-irmied u aħsel ir-residwu b’ilma sħun sakemm ir-reazzjoni tal-aċidu ma tidhirx aktar. Nixxef il-filtru li fih ir-residwu u inċinera fi griġjol li jkun tnaqqaslu l-piż (tared) tal-kontenitur f’temperatura ta’ mhux inqas minn 550 °C u mhux aktar minn 700 °C. Kessaħ f’dessikatur u iżen.

5.2. Metodu B

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u poġġih f’beaker ta’ 250 sa 400 ml. Żid 25 ml ta’ ilma u 25 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1) suċċessivament, ħawwad u stenna sakemm tieqaf l-effervexxenza. Żid 50 ml oħra ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1). Stenna sakemm jieqaf xi rilaxx ta’ gass imbagħad qiegħed il-beaker f’banjumarija jagħli u żommha hemm għal tletin minuta jew aktar, jekk ikun meħtieġ, sabiex xi lamtu li jista’ jkun preżenti jiġi idrolizzat sew. Iffiltra waqt li jkun sħun minn filtru ħieles mill-irmied u aħsel il-filtru f’50 ml ta’ ilma sħun (ara l-punt ta’ osservazzjoni 7). Qiegħed il-filtru li jkun fih ir-residwu u fi griġjol għall-inċinerazzjoni, nixxef u inċinera f’temperatura ta’ mhux inqas minn 550 °C u mhux aktar minn 700 °C. Qiegħed l-irmied f’beaker ta’ 250 sa 400 ml billi tuża 75 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1); kompli kif deskritt fit-tieni subparagrafu tal-punt 5.1.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare. Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7. Osservazzjoni

Jekk il-filtrazzjoni tkun diffiċli erġa’ ibda l-analiżi, billi tibdel il-50 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1) ma’ 50 ml aċidu trikloroaċetiku, soluzzjoni 20 % (w/v) (il-punt 3.2) u aħsel il-filtru f’soluzzjoni sħuna ta’ 1 % aċidu trikloroaċetiku (il-punt 3.3).

N. DETERMINAZZJONI TAL-FOSFRU TOTALI

Il-fosforu totali għandu jiġi ddeterminat permezz ta’

—	il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 15510 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kalċju, tas-sodju, tal-fosfru, tal-manjeżju, tal-potassju, tal-ħadid, taż-żingu, tar-ram, tal-manganiż, tal-kobalt, tal-molibdenu u taċ-ċomb bl-ICP-AES, jew

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 15621 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kalċju, tas-sodju, tal-fosfru, tal-manjeżju, tal-potassju, tal-kubrit, tal-ħadid, taż-żingu, tar-ram, tal-manganiż u tal-kobalt wara d-diġestjoni bil-pressjoni mill-ICP-AES, jew

—	il-metodu fotometriku, kif deskritt hawn taħt.

METODU FOTOMETRIKU

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-fosfru totali fl-għalf. Huwa partikolarment adattat għal-analiżi ta’ prodotti bi kwantitajiet żgħar ta’ fosfru fihom. F’ċerti każijiet (prodotti b’ħafna fosfru), jista’ jintuża metodu gravimetriku.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa mineralizzat, jew b’kombustjoni niexfa (fil-każ ta’ għalf organiku) jew b’diġestjoni ta’ aċidu (fil-każ ta’ komposti minerali u l-għalf likwidu), u mqiegħda f’soluzzjoni ta’ aċidu. Is-soluzzjoni hija trattata b’reaġent molibdovanadat. Id-densità ottika tas-soluzzjoni s-safra hekk iffurmata hija mkejjla fin spettrofotometru f’ 430 nm.

3. Reaġenti

3.1.

Karbonat tal-kalċju.

3.2.

Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,10 g/ml (bejn wieħed u ieħor 6 mol/litru).

3.3.

Aċidu nitriku, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Aċidu nitriku, ρ20 = 1,38 sa 1,42 g/ml.

3.5.

Aċidu sulfuriku, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Aġent Moibdovanadat: ħallat 200 ml soluzzjoni ta’ ettamolibdat tal-ammonju (il-punt 3.6.1), 200 ml soluzzjoni ta’ monovanadat tal-ammonju (il-punt 3.6.2) u 134 ml ta’ aċidu nitriku (il-punt 3.4) f’kunjett tal-1 l ggradat. Żid sal-volum bl-ilma.

3.6.1.

Soluzzjoni ta’ ettamolibdat tal-ammonju: dewweb f’ilma jaħraq 100 g ta’ ettamolibdat tal-ammonju (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Żid 10 ml ammonja (Densità 0,91 g/ml) żid sa 1 l bl-ilma.

3.6.2.

Soluzzjoni tal-monovanadat tal-ammonju: dewweb 2,35 g monovanadat tal-ammonju NH4VO3 f’400 ml ilma jaħraq. Waqt li tħawwad kontinwament, żid bilmod 20 ml ta’ aċidu nitriku dilwit (7 ml HNO3 (il-punt 3.4) + 13 ml of H2O u żid sa 1 l bl-ilma.

3.7.

Soluzzjoni standard ta’ 1 mg fosfru għal kull ml: dewweb 4,387 g fosfat diidroġenat tal-potassju KH2PO4 fl-ilma. Żid sa 1 l bl-ilma.

4. Apparat

4.1.

Griġjoli tas-siliċe, tal-porċellana jew tal-platinu għall-inċinerazzjoni.

4.2.

Muffle-furnace elettriku bit-termostat stabbilit f’550 °C.

4.3.

kunjett Kjeldahl ta’ 250 ml.

4.4.

Kunjetti ggradati u pipetti ta’ preċiżjoni.

4.5.

Spettrofotometru.

4.6.

Test tubes b’dijametru ta’ madwar 16 mm, b’tappijiet gradati għal dijametru ta’ 14,5 mm; kapaċità: 25 sa 30 ml.

5. Proċedura

5.1. Preparazzjoni tas-soluzzjoni

Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif indikat fil-punt 5.1.1 jew 5.1.2.

5.1.1. Proċedura abitwali

Iżen 1 g jew iktar tal-kampjun sal-eqreb 1 mg. Qiegħed il-kampjun tat-test fi Kjeldahl kunjett, żid 20 ml aċidu sulfuriku (il-punt 3.5), ħallat sabiex is-sustanza tiġi kompletament imprenjata bl-aċidu u sabiex tippreveniha milli teħel mal-ġnub tal-kunjett, saħħan u żommha fil-punt tat-togħlija għal 10 minuti. Ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid 2 ml ta’ aċidu nitriku (il-punt 3.4), saħħan bil-mod, ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid ftit iktar aċidu nitriku (il-punt 3.4) u erġa’ għalli. Irrepeti din il-proċedura sakemm tikseb soluzzjoni mingħajr kulur. Kessaħ, żid ftit ilma, ferra’ l-likwidu f’kunjett iggradat b’500 ml, u laħlaħ fil-kunjett Kjeldahl b’ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.

5.1.2. Kampjuni li fihom sustanzi organiċi u ħielsa minn diidroġenufosfati tal-kalċju u tal-manjeżju

Iżen madwar 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg fi griġjol tal-inċinerazzjoni. Ħallat il-kampjun tat-test sakemm jagħqad kompletament ma’ 1 g karbonat tal-kalċju (il-punt 3.1). Inċinera fil-forn f’550 °C sakemm jinkiseb irmied abjad jew griż (ftit faħam ma jimpurtax). Ittrasferixxi l-irmied għal beaker ta’ 250 ml. Żid 20 ml ilma u aċidu idrokloriku (il-punt 3.2) sakemm jieqaf il-gass. Żid 10 ml oħra ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.2). Qiegħed il-beaker f’banju tar-ramel u evapora sakemm niexef biex is-silika issir insolubbli. Erġa’ dewweb ir-residwu f’10 ml ta’ aċidu nitriku (il-punt 3.3) u għalli fil-banju tar-ramel għal 5 minuti mingħajr ma jevapora sakemm jinxef. Ferra’ l-likwidu f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, u laħlaħ il-beaker diversi drabi b’ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.

5.2. L-iżvilupp tal-kolorazzjoni u l-kejl tad-densità ottika

Iddilwixxi parti ta’ alikwota tal-filtrat miksuba bil-punt 5.1.1 jew 5.1.2 sabiex tikseb konċentrazzjoni tal-fosfru ta’ mhux iktar minn 40 μg/ml. Poġġi 10 ml ta’ din is-soluzzjoni f’test-tube (il-punt 4.6) u żid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (il-punt 3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f’20 °C. Kejjel id-densità ottika fi spettrofotometru f’430 nm kontra soluzzjoni miksuba billi żżid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (il-punt 3.6) sa 10 ml ilma.

5.3. Kurva ta’ kalibrar

Mis-soluzzjoni standard (il-punt 3.7) ipprepara soluzzjonijiet li jkun fihom rispettivament 5, 10, 20, 30 u 40 μg fosfru għal kull ml. Ħu 10 ml minn kull waħda minn dawn is-soluzzjonijiet u żid magħhom 10 ml tal-aġent tal-molibdovanadat (il-punt 3.6). Omoġenizza u ħallih joqgħod għal mill-inqas 10 minuti f’ 20 °C. Kejjel id-densità ottika kif indikat fil-punt 5.2. Segwi l-kurva ta’ kalibrar billi tpinġi d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet korrispondenti ta’ fosfru. Segwi l-kurva ta’ kalibrar billi tipplottja d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet korrispondenti ta’ fosfru. għal konċentrazzjonijiet bejn 0 u 40 μg/ml, il-kurva tkun lineari.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-ammont tal-fosfru fil-kampjun tat-test billi tuża l-kurva ta’ kalibrar.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun aktar minn:

—	3 %, f’valur relattiv, għall-kontenuti tal-fosfru ta’ inqas minn 5 %;

—	0,15 %, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-fosfru ta’ 5 % jew iktar.

O. DETERMINAZZJONI TA’ KLORIN MINN KLORUR

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat l-ammont ta’ klorin fi klorur li jinħall fl-ilma, espress b’mod konvenzjonali bħala klorur tas-sodju. Huwa applikabbli għall-għalf kollu.

2. Prinċipju

Il-kloruri jinħallu fl-ilma. Jekk il-prodott ikun fih materjal organiku dan jiġi ċċarat. Is-soluzzjoni tiġi kemm kemm aċidifikata bl-aċidu nitriku u l-kloruri jiġu preċipitati fil-forma ta’ klorur tal-fidda permezz ta’ soluzzjoni ta’ nitrat tal-fidda. In-nitrat tal-fidda żejjed huwa titrat b’soluzzjoni ta’ tijoċjanat tal-ammonju, bil-metodu ta’ Volhard.

3. Reaġenti

3.1.

Soluzzjoni ta’ tijoċjanat tal-ammonju 0,1 mol/litru.

3.2.

Soluzzjoni ta’ nitrat tal-fidda 0,1 mol/litre.

3.3.

Soluzzjoni saturata ta’ sulfat ferriku tal-ammonju (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.

Aċidu nitriku, densità: 1,38 g/ml.

3.5.

Etere tad-dietil.

3.6.

Aċeton.

3.7.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta’ aċetat taż-żingu, Zn (CH3COO)2·2H2O u 3 g ta’ aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.8.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta’ ferroċjanur tal-potassju, K4Fe(CN)6·3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.9.

Karbonju attiv, ħieles mill-kloruri u li ma jassorbihomx.

4. Apparat

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

5. Proċedura

5.1. Preparazzjoni tas-soluzzjoni

Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif muri fil-punt 5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3.

Fl-istess ħin wettaq test fl-inbjank mingħajr il-kampjun li jrid jiġi analizzat.

5.1.1. Kampjuni ħielsa minn materjal organiku

Iżen sal-eqreb mg kampjun ta’ mhux aktar minn 10 g u li jkun fih mhux aktar minn 3 g ta’ kloru fil-forma ta’ kloruri. Qiegħed ma’ 400 ml ilma f’kunjett volumetriku ta’ 500 ml f’temperatura ta’ bejn wieħed u ieħor 20 °C. Ħawwad għal tletin minuta ġot-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.

5.1.2. Kampjuni li jkun fihom materjal organiku, minbarra l-prodotti elenkati taħt il-punt 5.1.3.

Iżen bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f’kunjett volumetriku ta’ 500 ml ma’ 1 g karbonju attiv. Żid 400 ml ilma f’ temperatura ta’ bejn wieħed u ieħor 20 °C u 5 ml ta’ soluzzjoni Carrez I (il-punt 3.7), ħawwad għal 30 sekonda u mbagħad żid 5 ml ta’ soluzzjoni Carrez II (il-punt 3.8). Ħawwad għal tletin minuta ġot-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.

5.1.3. Għalf imsajjar, kejkijiet tal-kittien u dqiq, prodotti bi dqiq tal-kittien għoli u prodotti oħra rikki fil-muċilaġni jew fis-sustanzi kollojdali (pereżempju, lamtu iddestrinat)

Ipprepara s-soluzzjoni kif deskritt taħt il-punt 5.1.2 imma tiffiltrax. Ferra minn kunjett għall-ieħor (jekk meħtieġ iċċentrifuga), neħħi 100 ml tal-likwidu li jitla’ fil-wiċċ u ttrasferixxi f’kunjett iggradat ta’ 200 ml. Ħawwad mal-aċeton (il-punt 3.6) u żid sal-volum b’dan is-solvent, omoġenizza u ffiltra.

5.2. Titrazzjoni

Permezz ta’ pipetta, ittrasferixxi f’kunjett Erlenmayer minn 25 ml sa 100 ml tal-filtrat (skont il-kontenut ta’ klorin preżunt) miksub kif deskritt taħt il-punt 5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3. Il-porzjon li jiġi diviż bl-eżatt ma jridx ikun fih aktar minn 150 mg ta’ kloru (Cl). Żid bl-ilma kif meħtieġ sa mhux inqas minn 50 ml bl-ilma, żid 5 ml ta’ aċidu nitriku (il-punt 3.4), 2 ml ta’ soluzzjoni saturata ta’ sulfat tal-ammonju ferriku (il-punt 3.3) u żewġ taqtiriet ta’ soluzzjoni ta’ tijoċijanat ta’l-ammonju (il-punt 3.1) ittrasferiti permezz ta’ buretta mimlija sal-marka taż-żero. Permezz ta’ buretta, ittrasferixxi s-soluzzjoni tan-nitrat tal-fidda (il-punt 3.2) b’tali mod li jinkiseb eċċess ta’ 5 ml. Żid 5 ml ta’ etere tad-dietil (il-punt 3.5) u ħawwad bis-saħħa sabiex il-preċipitat jikkoagula. Ittitra n-nitrat tal-fidda żejjed mas-soluzzjoni tat-tijoċjanat tal-ammonju (il-punt 3.1) sakemm il-kulur kannella fl-aħmar idum għal minuta.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

L-ammont ta’ klorin (X), espress bħala % ta’ klorur tas-sodju huwa kkalkolat permezz tal-formola segwenti:

fejn:

V1	=	ml ta’ soluzzjoni ta’ nitrat tal-fidda 0,1 mol/l miżjuda
V2	=	ml ta’ soluzzjoni ta’ tijoċjanat tal-ammonju 0,1 mol/l użata għat-titrazzjoni
m	=	g tal-piż tal-kampjun fl-alikwota.

Jekk it-test fl-inbjank jindika li s-soluzzjoni tan-nitrat tal-fidda 0,1 mol/l ġiet ikkunsmata naqqas dan il-valur mill-volum (V1 – V2).

7. Osservazzjonijiet

7.1.

It-titrazzjoni tista’ titwettaq wkoll permezz tal-potenzjometrija jew tal-amperometrija.

7.2.

Fil-każ ta’ prodotti li għandhom żjut u xaħmijiet għolja, l-ewwel neħħi x-xaħam b’etere tad-dietil jew pitrolju ħafif.

7.3.

Fil-każ ta’ ħut miħun, it-titrazzjoni tista’ ssir bil-metodu Mohr.

”

(1) Għat-tnixxif ta’ ċereali, dqiq, ħbub imfesdqa misħuqa u grixa, il-forn irid ikollu kapaċità termali tali li, meta jkun issettjat minn qabel għal 131 °C dan jerġa’ lura għal dik it-temperatura f’inqas minn 45 minuta wara li n-numru massimu ta’ kampjuni tat-test ikunu tpoġġew ġewwa sabiex jitnixxfu flimkien. Il-ventilazzjoni trid tkun b’tali mod li meta jitpoġġew b’kemm jiflaħ kampjuni ta’ qamħ komuni u jitnixxfu għal sagħtejn, ir-riżultati jvarjaw b’inqas minn 0,15 % minn dawk miksuba wara erba’ sigħat ta’ tnixxif.

(2) Għal aktar dettalji dwar il-kalkolu, irreferi għall-EN ISO 6498 — Għalf tal-Annimali — Linji gwida għall-preparazzjoni tal-kampjuni.

(3) Il-kontenut tan-nitroġenu jista’ jiġi ddeterminat fl-għalf kollu iżda l-fattur ta’ konverżjoni ta’ 6,25 għall-kalkolu tal-kontenut ta’ proteina mhux raffinata jista’ ma jkunx applikabbli għall-materjali tal-għalf mill-insetti (fattur ta’ konverżjoni aktar baxx) u għal ċertu ikel għall-annimali domestiċi u proteini tal-plażma tad-demm (fattur ta’ konverżjoni ogħla).

(4) Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17180 jissejjaħ metodu alternattiv li għandu jintuża għall-finijiet ta’ kontroll uffiċjali għad-determinazzjoni tal-amminoaċidi fl-għalf li fih aktar minn 10 % ta’ amminoaċidi.

(5) Dan il-metodu ma ġiex ivvalidat permezz ta’ prova kollaborattiva għal taħlitiet lesti minn qabel li fihom aktar minn 10 % ta’ addittivi tal-għalf. Madankollu, huwa applikabbli wkoll għal dawn il-matriċijiet b’modifiki żgħar xierqa dejjem jekk il-metodu mbagħad jiġi vvalidat internament. Għal aktar informazzjoni, ikkonsulta https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.

(6) Meta ż-żejt jew ix-xaħam ikollu jgħaddi minn testijiet sussegwenti, issostitwixxi l-biċċiet tal-ġebla ħaffiefa b’żibeġ tal-ħġieġ.

(7) Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 121/2008 tal-11 ta’ Frar 2008 li jistabbilixxi l-metodu ta’ analiżi għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-lamtu fil-preparazzjonijiet ta’ tip użat fl-għalf tal-annimali (kodiċi NM 2309 ) (ĠU L 37, 12.2.2008, p. 3).

ANNESS IV

“ANNESS IV

METODI TA’ ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-LIVELL TA’ ADDITTIVI AWTORIZZATI FL-GĦALF

A. DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA A

Il-vitamina A għandha tiġi ddeterminata bi:

—	il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17547 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kontenut ta’ vitamini A, E u D (1) — Metodu li juża tindif tal-estrazzjoni f’fażi solida (SPE) u kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja (HPLC), jew

—	permezz ta’ kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV jew tal-fluworexxenza, kif deskritt fil-punti 1 sa 9 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell tal-vitamina A (retinol) fl-għalf. Il-vitamina A tinkludi l-alkoħol all-trans-retinl u s-cis-isomeri tagħha li huma ddeterminati b’dan il-metodu. Il-kontenut ta’ vitamina A jiġi espress f’Unitajiet Internazzjonali (IU) kull kg. IU wieħed jikkorrispondi mal-attività ta’ 0,300 μg alkoħol all-trans-vitamina A jew 0,344 μg ta’ aċetat tal-all-trans-vitamin A jew 0,550 μg palmitat tal-all-trans-vitamin A.

Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2 000 IU vitamina A/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju etanoliku u l-vitamina A hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jiġi dilwit sal-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina A huwa ddeterminat bi kromatografija likwidai ta’ prestazzjoni għolja b’fażi inversa (RP-HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV jew tal-fluworexxenza. Il-parametri kromatografiċi huma magħżula sabiex ma jkunx hemm separazzjoni bejn l-alkoħol all-trans-vitamina A u l-isomeri cis tiegħu.

3. Reaġenti

3.1.

Etanol, σ = 96 %.

3.2.

Petroleum ħafif, firxa tat-tgħollija 40 °C-60 °C.

3.3.

Metanol.

3.4.

Soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju, c = 50 g/100 ml.

3.5.

Soluzzjoni tal-askorbat tas-sodju, c = 10 g/100 ml (ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.7).

3.6.

Sulfur tas-sodju, Na2S · x H2O (x = 7 – 9).

3.6.1.

Soluzzjoni tas-sulfur tas-sodju, c = 0,5 mol/l fil-gliċerol, ß = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.8).

3.7.

Soluzzjoni ta’ fenolftaleina, c = 2 g/100 ml fl-etanol (il-punt 3.1).

3.8.

2-Propanol.

3.9.

Fażi mobbli għall-HPLC: taħlita ta’ metanol (il-punt 3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata.

3.10.

Nitroġenu, bla ossiġenu.

3.11.

Aċetat tal-All-trans-vitamina A, extra pur, ta’ attività ċċertifikata, pereżempju 2,80 × 106 IU/g.

3.11.1.

Soluzzjoni stokk tal-aċetat tal-all-trans-vitamina A: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ aċetat ta’ vitamina A (il-punt 3.11) f’kunjett ta’ 100 ml iggradat. Dewweb f’2-propanol (il-punt 3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont il-punt 5.6.3.1.

3.12.

Palmitat tal-all-trans-vitamina A, extra pur, ta’ attività ċċertifikata, pereżempju 1,80 × 106 IU/g

3.12.1.

Soluzzjoni stokk tal-palmitat tal-all-trans-vitamina A: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 80 mg ta’ palmitat ta’ vitamina A (il-punt 3.12) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb f’2-propanol (il-punt 3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.2.

3.13.

2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.5).

4. Apparat

4.1.

Evaporatur rotatorju b’vakwu.

4.2.

Oġġetti tal-ħġieġ ambra.

4.2.1.

Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass.

4.2.2.

Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ħġieġ mitħun, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml.

4.2.3.

Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass.

4.2.4.

Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass.

4.3.

Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ħġieġ mitħun, bl-adapter għall-pajp minn fejn jidħol il-gass.

4.4.

Karta filtru mitwija għal separazzjoni f’fażijiet, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.

Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni.

4.5.1.

Kolonna għal kromatografija likwida,250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ppakkjar, jew ekwivalenti (kriterju tal-prestazjoni: quċċata waħda biss għall-isomeri tar-retinol kollha fil-kundizzjonijiet HPLC).

4.5.2.

detettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tat-tul tal-mewġa varjabbli.

4.6.

Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz.

4.7.

Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku.

4.8.

Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn:

4.8.1.

Ċilindru tal-ħġieġ ta’ 1 l kapaċitá ffittjat bl-għonq u tapp tal-ħġieġ mitħun.

4.8.2.

Insert tal-ħġieġ mitħun mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni.

5. Proċedura

Nota:

Il-vitamina A hija sensitiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjonijiet kollha jridu jsiru fid-dlam (bl-użu ta’ oġġetti tal-ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folja tal-aluminju) u ossiġenu (aħsel bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni, l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin għandu jsir immedjatament qabel l-użin u s-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf tal-vitamina A. Titħinx il-kampjun (i) jekk id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikoli tkun adegwata (eż. taħlitiet lesti minn qabel u addittivi tal-għalf).

5.2. Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina A, iżen sal-eqreb 1 mg, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (il-punt 4.2.1). Fil-każ ta’ konċentrazzjonijiet baxxi, il-piż tal-kampjun jista’ jiżdied sabiex ikun hemm biżżejjed partikoli fil-porzjon tat-test. Żid suċċessivament, waqt li ddawwar il-kunjett 130 ml etanol (il-punt 3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (il-punt 3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ askorbat tas-sodju (il-punt 3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sulfur tas-sodju (il-punt 3.6). Iffittja l-kondensur (il-punt 4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (il-punt 4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni idrossida tal-potassju (il-punt 3.4) minn ġol-kondensur (il-punt 4.3) u ħalli biex issir reflux 25 minuta oħra, waqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’bejn wieħed u ieħor 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3. Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’dekantazzjoni s-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (il-punt 4.2.3) jew fl-apparat ta’ estrazzjoni (il-punt 4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (il-punt 3.1) u 100 ml petroleum ħafif (il-punt 3.2) u ttrasferixxi t-tlaħliħ f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1. Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (il-punt 4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara l-punt ta’ osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (il-punt 4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita l-formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ fenolftaleina (il-punt 3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (il-punt 4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (il-punt 4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (il-punt 3.2) u ħawwad sew.

5.3.2. Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (il-punt 4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara l-punt ta’ osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (il-punt 4.8.1) bl-insert tal-ħġieġ mitħun (il-punt 4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interfaċċja. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (il-punt 4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2), imbagħad darbtejn b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt fil-punt 5.3.1 u pproċedi kif deskritt hawn.

5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (mill-punt 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (il-punt 4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotatorju (il-punt 4.1) bi pressa imnaqqsa f’banju ta’ temperatura li ma teċċedix 40 °C. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (il-punt 3.10) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotatorju. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (il-punt 3.10) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (il-punt 3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ vitamina A trid tkun fil-firxa ta’ 5 IU/ml sa 30 IU/ml).

5.5. Determinazzjoni bl-HPLC

Il-vitamina A tissepara fuq kolonna ta’ fażi inversa C18 (il-punt 4.5.1) u l-konċentrazzjoni titkejjel permezz ta’ detettur tal-UV (325 nm) jew detettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm, emissjoni: 475 nm) (il-punt 4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba fil-punt 5.4 u elwixxi bil-fażi mobbli (il-punt 3.9). Ikkalkola l-għoli medju tal-quċċata (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-quċċata (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (il-punt 5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromografija likwida (il-punt 4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ippakkjar, jew ekwivalenti
Fażi mobbli (il-punt 3.9):	Taħlita ta’ metanol (il-punt 3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v).
Rata tal-fluss:	1–2 ml/min
detettur (il-punt 4.5.2):	detettur tal-UV (325 nm) jew detettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm/emissjoni: 475 nm)

5.6. kalibrar

5.6.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet standard tax-xogħol

Ippipetta 20 ml ta’ soluzzjoni stokk ta’ aċetat tal-vitamina A (il-punt 3.11.1) jew 20 ml tas-soluzzjoni stokk ta’ palmitat tal-vitamina A (il-punt 3.12.1) f’kunjett konikali jew tal-qiegħ ċatt li jesa’ 500 ml (il-punt 4.2.1) u idrolizza kif spjegat fil-punt 5.2, imma mingħajr żieda ta’ BHT. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (il-punt 3.2) skont il-punt 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif (il-punt 3.2). Evapora 100 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotatorju (ara l-punt 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (il-punt 3.10) u erġa’ dewweb ir-residwi f’10,0 ml metanol (il-punt 3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 560 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont il-punt 5.6.3.3. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard tax-xogħol f’kunjett iggradat ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (il-punt 3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni standard tax-xogħol dilwita hija 56 IU vitamina A għal kull ml.

5.6.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 5,0 u 10,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard tax-xogħol dilwita f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (il-punt 3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,8, 5,6, 14,0 u 28,0 IU vitamina A għal kull ml.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erja). Billi tuża l-medji tal-għoli tal-quċċata (erjas) ipplottja graff ta’ kalibrar li tikkunsidra r-riżultati tal-kontroll tal-UV (il-punt 5.6.3.3).

5.6.3. Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjonijiet standard

5.6.3.1. Soluzzjoni stokk tal-aċetat tal-vitamina A

Ippipetta 2,0 ml tas-soluzzjoni stokk tal-aċetat tal-vitamina A (il-punt 3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (il-punt 4.2.2) u imla sal-marka bit-2-propanol (il-punt 3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita tal-aċetat tal-vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka bit-2-propanol (il-punt 3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanol (il-punt 3.8) fl-ispettrofotometru (il-punt 4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinzjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

5.6.3.2. Soluzzjoni stokk tal-palmitat ta’ vitamina A

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni stokk ta’ palmitat tal-vitamina A (il-punt 3.12.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (il-punt 4.2.2) u imla sal-marka bit-2-propanol (il-punt 3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita ta’ palmitat tal-vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka bit-2-propanol (il-punt 3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanol (il-punt 3.8) fl-ispettrofotometru (il-punt 4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinzjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

5.6.3.3. Soluzzjoni standard tax-xogħol ta’ vitamina A

Ippipetta 3,0 ml tas-soluzzjoni standard tax-xogħol mhux dilwita tal-vitamina A, ippreparata skont il-punt 5.6.1 f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (il-punt 4.2.2) u imla sal-marka bit-2-propanol (il-punt 3.8). Ippipetta 5,0 ml ta’ din is-soluzzjoni f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka bit-2-propanol (il-punt 3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanol (il-punt 3.8) fl-ispettrofotometru (il-punt 4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinzjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-qċaċet tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’IU/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (il-punt 5.6.2).

Il-kontenut tal-vitamina A w f’IU/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

fejn:

c	=	konċentrazzjoni tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.4) f’IU/ml
V1	=	volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.4), f’ml
V2	=	volum tal-alikwota meħud fil-punt 5.4, f’ml
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Osservazzjonijiet

7.1.

Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina A huwa utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ karigi ta’ saponifikazzjonijiet (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC.

7.2.

Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam.

7.3.

Jekk separazzjoni tal-fażijiet ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (il-punt 3.1) biex tkisser l-emulsjoni.

7.4.

Biż-żejt tal-fwied tal-bakkaljaw u xaħmijiet puri oħra l-ħin ta’ saponifikazzjoni jrid jiġi estiż għal 45–60 minuta.

7.5.

Idrokinon jista’ jintuża minflok BHT.

7.6.

Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ retinol isomers hija possibbli. Iżda f’dak il-każ l-għoli (erjas) tal-qċaċet kollha tal-isomeri cis u trans jridu jingħaddu għall-kalkoli.

7.7.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg aċidu askorbiku minflok soluzzjoni ta’ askorbat tas-sodju.

7.8.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sufur tas-sodju.

7.9.

F’każijiet ta’ analiżi tal-vitamina A fi prodotti li jissostitwixxu l-ħalib, trid tingħata attenzjoni speċjali

—	fis-saponifikazzjoni (il-punt 5.2): minħabba l-ammont ta’ xaħam preżenti fil-kampjun, jista’ jkun hemm bżonn li jiżdied l-ammont tas-soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (il-punt 3.4);

—	fl-estrazzjoni (il-punt 5.3): minħabba l-preżenza ta’ emulsjonijiet, jista’ jkun hemm bżonn ta’ addattament tal-proporzjon 2:1 tal-ilma/etanol.

Biex tiċekkja jekk il-metodu ta’ analiżi applikat jiġġenerax riżultati affidabbli fuq din il-matriċi speċifika (sostitut tal-ħalib), irid jiġi applikat test tal-irkupru fuq porzjon għat-test addizzjonali. Jekk ir-rata ta’ rkupru hija inqas minn 80 %, ir-riżultat analitiku jrid jiġi kkoreġut għall-irkupru.

8. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv (2)

Taħlit minn qabel

Għalf taħlitiet lesti minn qabel

Konċentrat ta’ minerali

Għalf tal-proteini

Qażquż

Medja [IU/kg]

17,02 × 106

1,21 × 106

537 100

151 800

18 070

sr [IU/kg]

0,51 × 106

0,039 × 106

22 080

12 280

682

r [IU/kg]

1,43 × 106

0,109 × 106

61 824

34 384

1 910

CVr [%]

3,0

3,5

4,1

8,1

3,8

sR [IU/kg]

1,36 × 106

0,069 × 106

46 300

23 060

3 614

R [IU/kg]

3,81 × 106

0,193 × 106

129 640

64 568

10 119

CVR [%]

8,0

6,2

8,6

L:	numru ta’ laboratorji

n:	numru ta’ valuri singoli

sr:	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r:	ripetibilità

R;	riproduċibilità

CVr:	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

CVR:	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

Figura 1

Apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

B. DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA E

Il-vitamina E għandha tiġi ddeterminata bi:

—	il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17547 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kontenut ta’ vitamini A, E u D (3) — Metodu li juża tindif tal-estrazzjoni f’fażi solida (SPE) u kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja (HPLC), jew

—	permezz ta’ kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV, kif deskritt fil-punti 1 sa 9 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-livell tal-vitamina E fl-għalf. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa espress bħala mg ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol għal kull kg. 1 mg ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol jikkorrispondi għal 0,91 mg mg DL-α-tokoferol (vitamina E).

Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 2 mg vitamina E/kg. Dan il-limitu ta’ kwantifikazzjoni jinkiseb biss b’detettur tal-fluworexxenza. B’detettur bl-UV, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 10 mg/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju etanolika u l-vitamina E hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jiġi dilwit sal-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa determinat bi kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja b’fażi inversa (RP-HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV jew tal-fluworexxenza.

3. Reaġenti

3.1.

Etanol, σ = 96 %.

3.2.

Petroleum ħafif, firxa tat-tgħollija 40 °C–60 °C.

3.3.

Metanol.

3.4.

Soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju, c = 50 g/100 ml.

3.5.

Soluzzjoni tal-askorbat tas-sodju, c = 10 g/100 ml (ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.7).

3.6.

Sulfur tas-sodju, Na2S · x H2O (x = 7 – 9).

3.6.1.

Soluzzjoni tas-sulfur tas-sodju, c = 0,5 mol/l fil-gliċerol, β = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.8).

3.7.

Soluzzjoni ta’ fenolftaleina, c = 2 g/100 ml fl-etanol (il-punt 3.1).

3.8.

Fażi mobbli għall-HPLC: taħlita ta’ metanol (il-punt 3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata.

3.9.

Nitroġenu, bla ossiġenu.

3.10.

aċetat tad-DL-α-tokoferol, extra pur, ta’ attività ċċertifikata

3.10.1.

Soluzzjoni stokk ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol (il-punt 3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (il-punt 3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg aċetat tad-DL-α-tokoferol. (Kontroll tal-UV ara il-punt 5.6.1.3; stabbilizzazzjoni ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.4).

3.11.

DL-α-tokoferol, extra pur, ta’ attività attestata

3.11.1.

Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tokoferol: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tokoferol (il-punt 3.11) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (il-punt 3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tokoferol. (Kontroll tal-UV ara 5.6.2.3; stabbilizzazzjoni ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.4).

3.12.

2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (ara l-punt ta’ osservazzjonijiet 7.5).

4. Apparat

4.1.

Evaporatur rotatorju bil-pellikola.

4.2.

Oġġetti tal-ħġieġ ambra.

4.2.1.

Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass.

4.2.2.

Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ħġieġ mitħun, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml.

4.2.3.

Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass.

4.2.4.

Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass.

4.3.

Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ħġieġ mitħun, bl-adapter għall-pajp minn fejn jidħol il-gass.

4.4.

Karta filtru mitwija għal separazzjoni f’fażijiet, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.

Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni.

4.5.1.

Kolonna għal kromatografija likwida, 250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ippakkjar, jew ekwivalenti.

4.5.2.

Detettur UV jew florexxenti, b’aġġustament tat-tul tal-mewġa varjabbli.

4.6.

Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz.

4.7.

Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku.

4.8.

Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn:

4.8.1.

Ċilindru tal-ħġieġ ta’ 1 l kapaċitá ffittjat bl-għonq u tapp tal-ħġieġ mitħun.

4.8.2.

5. Proċedura

Nota:

Il-Vitamina E hija sensittiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjonijiet kollha jridu jsiru fid-dlam (bl-użu ta’ oġġetti tal-ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folja tal-aluminju) u ossiġenu (aħsel bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni, l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina E.

5.2. Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina E, iżen sal-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (il-punt 4.2.1). Żid suċċessivament, waqt li ddawwar il-kunjett 130 ml etanol (il-punt 3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (il-punt 3.12), 2 ml soluzzjoni ta’ askorbat tas-sodju (il-punt 3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sulfur tas-sodju (il-punt 3.6). Iffittja l-kondensur (il-punt 4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (il-punt 4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni idrossida tal-potassju (il-punt 3.4) minn ġol-kondensur (il-punt 4.3) u ħalli biex issir reflux 25 minuta oħra waqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’bejn wieħed u ieħor 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3. Estrazzjoni

5.3.1. Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (il-punt 4.2.3)

5.3.2. Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (il-punt 4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara l-osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (il-punt 4.8.1) bl-insert tal-ħġieġ mitħun (il-punt 4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interfaċċja. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (il-punt 4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2), imbagħad darbtejn b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (il-punt 3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt fil-punt 5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hemmhekk.

5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (mill-punt 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (il-punt 4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotatorju (il-punt 4.1) bi pressa imnaqqsa f’banju ta’ temperatura li ma teċċedix 40 °C. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (il-punt 3.9) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotatorju. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (il-punt 3.9) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10–100 ml) ta’ metanol (il-punt 3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ DL-α-tokoferol trid tkun fil-firxa ta’ 5 μg/ml sa 30 μg/ml).

5.5. Determinazzjoni bl-HPLC

Il-vitamina E tiġi sseparata fuq kolonna b’fażi inversa C18 (il-punt 4.5.1) u l-konċentrazzjoni tiġi mkejla permezz ta’ detettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 295 nm, emissjoni: 330 nm) jew detettur tal-UV (292 nm) (il-punt 4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba fil-punt 5.4 u elwixxi bil-fażi mobbli (il-punt 3.8). Ikkalkola l-għoli medju tal-quċċata (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-quċċata (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (il-punt 5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromografija likwida (il-punt 4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ippakkjar, jew ekwivalenti
Fażi mobbli (il-punt 3.8):	Taħlita ta’ metanol (il-punt 3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v).
Rata tal-fluss:	1–2 ml/min
Detettur (il-punt 4.5.2)	Detettur tal-fluworexxenza (eċċitazzjoni: 295 nm/emissjoni: 330 nm) jew detettur tal-UV (292 nm)

5.6. kalibrar (aċetat tad-DL-α-tokoferol jew DL-α-tokoferol)

5.6.1. Standard tal-aċetat tad-DL-α-tokoferol

5.6.1.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni standard tax-xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 25 ml tas-soluzzjoni stokk ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol (il-punt 3.10.1) f’kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt ta’ 500 ml (il-punt 4.2.1) u idrolizza kif spjegat fil-punt 5.2. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (il-punt 3.2) skont il-punt 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif. Evapora 25 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotatorju (ara l-punt 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (il-punt 3.9) u erġa’ dewweb ir-residwi f’25,0 ml metanol (il-punt 3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 45,5 μg ta’ DL-α-tokoferol kull ml, ekwivalenti għal 50 μg ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.1.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard tax-xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (il-punt 3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,5, 5,0, 10,0 u 25,0 μg aċetat tad-DL-α-tokoferol, eż. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml u 22,8 μg/ml DL-α-tokoferol.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erja). Permezz tal-għoli medju tal-quċċata (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.1.3. Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni stokk tal-aċetat tad-DL-α-tokoferol (il-punt 3.10.1)

Iddilwixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni stokk ta’aċetat tad-DL-α-tokoferol (3.10.1) għal 25,0 ml bl-etanol u kejjel l-ispettru UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (il-punt 3.1) fl-ispettrofotometru (il-punt 4.6) bejn 250 nm u 320 nm.

L-assorbiment massimu għandu jkun f’284 nm:

F’din it-taħlita irid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,84 sa 0,88.

5.6.2. Standard tal-aċetat tad-DL-α-tokoferol

5.6.2.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni standard tax-xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 2 ml tas-soluzzjoni stokk DL-α-tokoferol (il-punt 3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, dewweb fil-metanol (il-punt 3.3) u imla sal-marka bil-metanol. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 40 μg ta’ DL-α-tokoferol kull ml, ekwivalenti għal 44,0 μg ta’ aċetat tad-DL-α-tokoferol kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.2.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard tax-xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (il-punt 3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,0, 4,0, 8,0 u 20,0 μg/ml tad-DL-α-tokoferol, eż. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml u 22,0 μg/ml tal-aċetat tad-DL-α-tokoferol.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erja). Permezz tal-għoli medju tal-quċċata (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.2.3. Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tokoferol (il-punt 3.11.1)

Iddilwixxi 2,0 ml tas-soluzzjoni stokk tad-DL-α-tocopherol (il-punt 3.11.1) għal 25,0 ml bl-etanol u kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (il-punt 3.1) fl-ispettrofotometru (il-punt 4.6) bejn 250 nm u 320 nm. L-assorbiment massimu għandu jkun f’292 nm:

F’din it-taħlita jrid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,6.

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-qċaċet tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml (ikkalkolata bħala aċetat tad-DL-α-tokoferol) b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (il-punt 5.6.1.2 jew 5.6.2.2).

Il-kontenut tal-vitamina E w f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

fejn:

c	=	konċentrazzjoni tal-vitamina E (bħala aċetat tad-DL-α-tokoferol) tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.4) f’μg/ml
V1	=	volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.4), f’ml
V2	=	volum tal-alikwota meħud (il-punt 5.4), f’ml
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Osservazzjonijiet

7.1.

Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina E huwa utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ karigi ta’ saponifikazzjoni (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC.

7.2.

Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam.

7.3.

Jekk separazzjoni tal-fażijiet ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (il-punt 3.1) biex tkisser l-emulsjoni.

7.4.

Wara l-kejl spettrofotometriku tal-aċetat tad-DL-α-tocopherol jew tas-soluzzjoni tad-DL-α-tocopherol skont il-punt 5.6.1.3 jew 5.6.2.3 rispettivament żid bejn wieħed u ieħor 10 mg BHT (il-punt 3.12) mas-soluzzjoni (il-punt 3.10.1 jew 3.10.2) u żomm is-soluzzjoni fi friġġ (tul ta’ ħżin: massimu ta’ 4 gimgħat).

7.5.

Idrokinon jista’ jintuża minflok BHT.

7.6.

Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ α-, β-, γ- u δ-tokoferol hija possibbli.

7.7.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg aċidu askorbiku minflok soluzzjoni ta’ askorbat tas-sodju.

7.8.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sufur tas-sodju.

7.9.

L-aċetat tal-vitamina E jidrolizza malajr ħafna f’kundizzjonijiet alkalini u għalhekk huwa sensittiv ħafna għall-ossidazzjoni, b’mod speċjali fil-preżenza ta’ mikroelementi bħall-ħadid jew ir-ram. Fil-każ tad-determinazzjoni tal-vitamina E f’taħlitiet lesti minn qabel f’livelli ogħla minn 5 000 mg/kg, id-degradazzjoni tal-vitamina E tista’ tkun il-konsegwenza. Għalhekk, metodu HPLC li jinkludi diġestjoni enżimatika tal-formulazzjoni tal-vitamina E mingħajr stadju ta’ saponifikazzjoni alkalina għandu jiġi rrakkomandat għall-konferma

8. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv (4)

Taħlit minn qabel

Għalf taħlitiet lesti minn qabel

Konċentrat ta’ minerali

Għalf tal-proteini

Qażquż

medja [mg/kg]

17 380

1 187

926

315

61,3

sr [mg/kg]

384

45,3

25,2

13,0

2,3

r [mg/kg]

1 075

126,8

70,6

36,4

6,4

CVr [%]

2,2

3,8

2,7

4,1

3,8

sR mg/kg]

830

65,0

55,5

18,9

7,8

R [mg/kg]

2 324

182,0

155,4

52,9

21,8

CVR [%]

4,8

5,5

6,0

12,7

L:	numru ta’ laboratorji

n:	numru ta’ valuri singoli

sr:	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR:	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r:	ripetibilità

R:	riproduċibilità

CVr:	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

CVR:	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

Figura 2

Apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

C. DETERMINAZZJONI TA’ MIKROELEMENTI — ĦADID, RAM, MANGANIŻ U ŻINGU

Il-kontenut tal-ħadid, tar-ram, tal-manganiż u taż-żingu għandu jiġi ddeterminat bi:

—	Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 15510 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kalċju, tas-sodju, tal-fosfru, tal-manjeżju, tal-potassju, tal-ħadid, taż-żingu, tar-ram, tal-manganiż, tal-kobalt, tal-molibdenu u taċ-ċomb bl-ICP-AES, jew

—

Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 15621 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kalċju, tas-sodju, tal-fosfru, tal-manjeżju, tal-potassju, tal-kubrit, tal-ħadid, taż-żingu, tar-ram, tal-manganiż u tal-kobalt wara d-diġestjoni bil-pressjoni mill-ICP-AES, jew

—	Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17053 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni ta’ mikroelementi, metalli tqal u elementi oħra fl-għalf mill-ICP-MS (multimetodu), jew

—	Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN ISO 6869 Għalf tal-annimali. Determinazzjoni tal-kontenuti ta’ kalċju, ram, ħadid, manjeżju, manganiż, potassju, sodju u żingu. Metodu li juża spettrometrija ta’ assorbiment atomiku, jew

—	Il-metodu tal-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku tal-fjamma (FAAS), kif deskritt fil-punti 1 sa 8 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-mikroelementi ta’ ħadid, ram, manganiż u żingu fl-għalf (5). Il-limiti ta’ kwantifikazzjoni huma:

—	ħadid (Fe): 20 mg/kg

—	ram (Cu): 10 mg/kg

—	manganiż (Mn): 20 mg/kg

—	żingu (Zn): 20 mg/kg

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa mdaħħal fis-soluzzjoni fl-aċidu idrokloriku wara l-qerda tal-materja organika, jekk ikun hemm. L-elementi ħadid, ram, manganiż u żingu jiġu ddeterminati, wara dilwizzjoni xierqa, bl-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku.

3. Reaġenti

Kummenti ta’ introduzzjoni

Għall-preparazzjoni tar-reaġenti u soluzzjonijiet analitiċi uża ilma ħieles mill-katjoni li għandhom jiġu ddeterminati, akkwistati b’distillar doppju tal-ilma jew f’tazza tal-borosilikat jew lampik tal-kwartz jew bi trattament doppju fuq raża ta’ skambju tal-joni.

Ir-reaġenti għandhom ikunu mill-anqas ta’ grad analitiku. Il-ħelsien mill-element li għandu jiġi ddeterminat għandu jkun ivverifikat f’esperiment fl-inbjank. Jekk meħtieġ, ir-reaġenti għandhom jiġu ppurifikati aktar.

Minflok is-soluzzjonijiet standard deskritti hawn taħt, jistgħu jintużaw soluzzjonijiet standard kummerċjali dment li dawn ikunu garantiti u jkunu ġew ivverifikati qabel l-użu.

3.1.

Aċidu idrokloriku. (d: 1,19 g/ml).

3.2.

Aċidu idrokloriku. (6 mol/litre).

3.3.

Aċidu idrokloriku. (0,5 mol/litre).

3.4.

Aċidu idrofluworiku 38 sa 40 % (v/v) li jkollu kontenut ta’ ħadid (Fe) ta’ inqas minn 1 mg/litru u residwu wara l-evaporazzjoni ta’ inqas minn 10 mg (bħala sulfat)/litru.

3.5.

Aċidu sulfuriku. (d: 1,84 g/ml).

3.6.

Perossidu tal-idroġenu. (bejn wieħed u ieħor 100 volum ta’ ossiġenu (30 % bil-piż)).

3.7.

Soluzzjoni standard taż-ħadid (1 000 μg Fe/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: dewweb 1 g ta’ fil tal-ħadid f’200 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2), żid 16 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (il-punt 3.6) u żid sa litru bl-ilma.

3.7.1.

Soluzzjoni standard tax-xogħol tal-ħadid (100 μg Fe/ml) ippreparata billi parti waħda tas-soluzzjoni standard (il-punt 3.7) tiġi dilwita ma’ 9 partijiet ilma.

3.8.

Soluzzjoni standard tar-ram (1 000 μg Cu/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment:

—	dewweb 1 g ta’ ram f’forma ta’ trab f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2), żid 5 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (il-punt 3.6) u żid sa litru bl-ilma.

3.8.1.

Soluzzjoni standard tax-xogħol tar-ram (10 μg Cu/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (il-punt 3.8) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma.

3.9.

Soluzzjoni standard tal-manganiż (1 000 μg Mn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment:

—	dewweb 1 g ta’ manganiż f’għamla ta’ trab f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2), u żid sa litru bl-ilma.

3.9.1.

Soluzzjoni standard tax-xogħol tal-manganiż (10 μg Mn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (il-punt 3.9) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma.

3.10.

Soluzzjoni standard taż-żingu (1 000 μg Zn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment:

—	dewweb 1 g ta’ żingu f’għamla ta’ strixxa jew folja f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2), u żid sa litru bl-ilma.

3.10.1.

Soluzzjoni standard tax-xogħol taż-żingu (10 μg Zn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (il-punt 3.10) ma’ 9 partijiet ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni riżultanti ma’ 9 partijiet ta’ ilma.

3.11.

Soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu: dewweb 12 g ta’ ossidu tal-lantanu f’150 ml ilma, żid 100 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2), u żid sa litru bl-ilma.

4. Apparat

4.1.

Muffle furnace b’regolatur tat-temperatura u preferibbilment b’rekorder.

4.2.

L-apparat tal-ħġieġ għandu jkun tat-tip ta’ borosilikat reżistenti u huwa rrakomandat li jintuża apparat li jkun riżervat esklussivament għad-determinazjoni tal-mikroelementi.

4.3.

Spettrofotometru tal-assorbiment atomiku li jissodisfa l-ħtiġiet tal-metodu fir-rigward tas-sensittività u preċiżjoni fil-firxa meħtieġa.

5. Proċedura (6)

5.1. Kampjuni li fihom materjal organiku

5.1.1. L-inċinerazzjoni u l-preparazzjoni tas-soluzzjoni għal analiżi (7)

5.1.1.1.

Poġġi 5 sa 10 g ta’ kampjun miżun sal-eqreb 0,2 mg fi griġjol tal-kwartz jew tal-platinu (ara n-Nota (b)), nixxef f’forn f’105 °C u daħħal il-griġjol fil-muffle furnace kiesaħ (il-punt 4.1). Għalaq il-forn (ara Nota (c)) u gradwalment tella’ t-temperatura għal 450 sa 475 °C f’ħin ta’ 90 minuta. Żomm din it-temperatura għal 4 sa 16-il siegħa (eż. matul il-lejl) biex tneħħi l-materjal karbonjuż u imbagħad iftaħ il-forn u ħallih jibred (ara Nota (d)).

Xarrab l-irmied bl-ilma u poġġihom f’beaker ta’ 250 ml. Aħsel il-griġjol b’total ta’ madwar 5 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1) u żid dan tal-aħħar bilmod u b’attenzjoni fil-beaker (jista’ jkun hemm reazzjoni vigoruża minħabba l-formazzjoni tad-CO2). Żid l-aċidu idrokloriku (il-punt 3.1) bit-taqtir b’aġitazzjoni sakemm l-effervexxenza tieqaf għal kollox. Evapora sakemm jixxotta, waqt li kultant tħawwad b’virga tal-ħġieġ.

Wara żid 15 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2) mar-residwu segwit b’madwar 120 ml ilma. Ħawwad bil-virga tal-ħġieġ, li għandha titħalla fil-beaker, u għatti l-beaker b’watch-glass. Wassal bil-mod sat-togħlija u żomm il-punt tat-togħlija sakemm ebda rmied ma jkun jidher jinħall iktar. Iffiltra fuq karta tal-filtru ħielsa minn kull irmied u iġbor il-filtrat f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml. Aħsel il-beaker u iffiltra b’5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku jaħraq (il-punt 3.2) u darbtejn b’ilma jagħli. Imla l-kunjett volumetriku sal-marka bl-ilma (konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru).

5.1.1.2.

Jekk ir-residwu fil-filtru jidher iswed (karbonju), erġa’ poġġih fil-forn u inċinerixxi mill-ġdid f’450 sa 475 °C. Dan il-proċess ta’ inċinerazzjoni, li jeħtieġ biss ftit sigħat (madwar tlieta sa ħames sigħat), ikun intemm meta l-irmied jidher abjad jew kważi abjad. Dewweb ir-residwu f’madwar 2 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.1), evapora sakemm jixxotta u żid 5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2). Saħħan, iffiltra s-soluzzjoni fil-kunjett volumetriku u imla sal-marka b’ilma (konċentrazzjoni tal-HCl madwar 0,5 mol/litru).

Noti:

(a)

Fid-determinazzjoni tal-mikroelementi huwa importanti li wieħed joqgħod attent għar-riskji ta’ kontaminazzjoni, b’mod partikolari biż-żingu, ir-ram u l-ħadid. Għal din ir-raġuni, it-tagħmir użat fil-preparazzjoni tal-kampjuni għandu jkun ħieles minn dawn il-metalli.

Biex jitnaqqas ir-riskju ġenerali ta’ kontaminazzjoni, aħdem f’atmosfera ħielsa mit-trab b’tagħmir skrupolużament nadif u apparat tal-ħġieġ maħsul b’galbu. Id-determinazzjoni ta’ żingu hija partikolarment sensittiva għal ħafna tipi ta’ kontaminazzjoni, eż. minn apparat tal-ħġieġ, reaġenti, trab, eċċ.

(b)

Il-piż tal-kampjun li jkun jeħtieġ li jiġi inċinerat huwa kkalkolat mill-kontenut approssimattiv ta’ mikroelementi tal-għalf fir-rigward tas-sensittività tal-ispettrofotometru użat. Għal ċertu għalf li jkollu ftit mikroelementi, jista’ jkun meħtieġ li tibda b’kampjun ta’ 10 sa 20 g u żżid għal soluzzjoni finali ta’ 100 ml biss.

(c)	L-inċinerazzjoni għandha titwettaq f’forn magħluq mingħajr dħul ta’ arja jew ossiġenu.

(d)	It-temperatura indikata mil-pirometru ma għandhiex tkun aktar minn 475 °C.

5.1.2. Determinazzjoni spettrofotometrika

5.1.2.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar

Għal kull wieħed mill-elementi li jeħtieġ jiġi determinat, ipprepara mis-soluzzjonijiet standard tax-xogħol kif mogħtija fil-punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 u 3.10.1 firxa ta’ soluzzjonijiet ikkalibrati, kull soluzzjoni kkalibrata jkollha konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru u (fil-każijiet ta’ ħadid, manganiż u żingu) konċentrazzjoni ta’ klorur tal-lantanu ekwivalenti għal 0,1 % La (w/v).

Il-konċentrazzjonijiet ta’ mikroelementi magħżula jridu jkunu fil-firxa ta’ sensittività tal-ispettrofotometru użat. It-tabelli ta’ hawn taħt juru, permezz ta’ eżempju, il-kompożizzjoni ta’ firxiet tipiċi ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar; iżda jiddependi fuq it-tip u s-sensittività tal-ispettrofotometru wżat jista’ jkun meħtieġ li jintgħażlu konċentrazzjonijiet oħrajn.

Ħadid

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (il-punt 3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (il-punt 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu (il-punt 3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

Ram

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (il-punt 3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (il-punt 3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Manganiż

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (il-punt 3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (il-punt 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu (il-punt 3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

Żingu

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (il-punt 3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (il-punt 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu (il-punt 3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

5.1.2.2. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni għal analiżi

Għad-determinazzjoni ta’ ram, is-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 tista’ normalment tintuża direttament. Jekk meħtieġ, sabiex twassal il-konċentrazzjoni tagħha fi ħdan il-firxa tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar, porzjon alikwota jista’ jkun ippipettat f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml u miżjud sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.3).

Għad-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu, ippipettja porzjon alikwota tas-soluzzjoni mħejjija mill-punt 5.1.1 f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml, żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu (il-punt 3.11) u żid sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.3) (ara wkoll il-punt 8 “Osservazjoni”).

5.1.2.3. Esperiment fl-inbjank

L-esperiment fl-inbjank għandu jinkludi l-passi kollha preskritti tal-proċedura ħlief li l-materjal tal-kampjun jitħalla barra. Is-soluzjoni tal-kalibrar ‘0’ ma għandhiex tintuża bħala l-inbjank.

5.1.2.4. Kejl tal-assorbiment atomiku

Kejjel l-assorbiment atomiku tal-soluzzjonijiet tal-kalibrar u tas-soluzzjoni li għandha tkun analizzata billi tuża fjamma ossidizzanti tal-aċetilen u tal-arja f’dawn it-tulijiet tal-mewġa segwenti:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Wettaq kull kejl erba’ darbiet.

5.2. Għalf minerali

Jekk il-kampjun ma jkun fih ebda materjal organiku, m’hemmx għalfejn issir l-inċinerazzjoni qabel. Ipproċedi kif deskritt fil-punt 5.1.1.1. billi tibda mit-tieni paragrafu. L-evaporazzjoni bl-aċidu idrofluworiku tista’ titħalla barra.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Permezz ta’ kurva ta’ kalibrar, ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ mikroelementi fis-soluzzjoni li għandha tiġi analizzata u uri r-riżultat f’milligrammi ta’ mikroelementi għal kull kilogramma tal-kampjun (ppm).

7. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista ma għandhomx jaqbżu:

—	5 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-mikroelement ikkonċernat sa massimu ta’ 50 mg/kg;

—	10 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-mikroelement ikkonċernat minn 50 u sa massimu 100 mg/kg;

—	10 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-mikroelement ikkonċernat minn 100 u sa massimu ta’ 200 mg/kg;

—	5 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-mikroelement ikkonċernat aktar minn 200 mg/kg.

8. Osservazzjoni

Il-preżenza ta’ kwantitajiet kbar ta’ fosfati tista’ tfixkel id-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu. Interferenza bħal din għandha tiġi kkoreġuta biż-żieda ta’ soluzzjoni tal-klorur tal-lantanu (il-punt 3.11). Jekk, madankollu, fil-kampjun, il-proporzjon tal-piż Ca + Mg/P ikun > 2,, iż-żieda tas-soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu (il-punt 3.11) mas-soluzzjoni għall-analiżi u għas-soluzzjoni ta’ kalibrar tista’ titħalla barra.

D. DETERMINAZZJONI TA’ ALOFUĠINON

idrobromur tad-DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-idrossi-2-piperidil)aċetonil]-kinażolin-4-(3H)-on

Il-kontenut ta’ alofuġinon għandu jiġi ddeterminat bi:

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u 1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	permezz ta’ kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV, kif deskritt fil-punti 1 sa 8 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ alofuġinon fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.

2. Prinċipju

Wara t-trattament b’ilma jaħraq, l-alofuġinon jiġi estratt bħala l-bażi libera fl-aċetat tal-etil u sussegwentement imqassam bħala l-idroklorur f’soluzzjoni milwiema tal-aċidu. Dan l-estratt jiġi ppurifikat bi kromotografija tal-iskambju tal-joni. Il-kontenut tal-alofuġinon huwa ddeterminat bi kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC/MGKL) bl-użu ta’ detettur bl-UV.

3. Reaġenti

3.1.

Aċetonitril, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.2.

Amberlit XAD-2 reżina.

3.3.

Aċetat tal-ammonju.

3.4.

Aċetat tal-etil.

3.5.

Aċidu aċetiku, inġazzat.

3.6.

Sustanza standard tal-alofuġinon idrobromur tad-(DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-idrossi-2-piperidil)aċetonil] kinażolin-4-(3H)-on, E 764).

3.6.1.

Soluzzjoni standard stokk tal-alofuġinon, 100 μg/ml.

Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ alofuġinon (il-punt 3.6) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, dewweb f’soluzzjoni buffer tal-aċetat tal-ammonju (il-punt 3.18), żid sal-marka bis-soluzzjoni buffer u ħawwad. Din is-soluzzjoni tibqa’ stabbli għal tliet ġimgħat f’5 °C jekk merfugħa fid-dlam.

3.6.2.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar

F’serje ta’ kunjetti kkalibrati ta’ 100 ml, ittrasferixxi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 ml tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.6.1). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (il-punt 3.21) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom konċentrazzjonijiet ta’ 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 μg/ml tal-alofuġinon rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu.

3.7.

Aċidu idrokloriku (ρ20 bejn wieħed u ieħor 1,16 g/ml).

3.8.

Metanol.

3.9.

Nitrat tal-fidda.

3.10.

Askorbat tas-sodju.

3.11.

Karbonat tas-sodju.

3.12.

Klorur tas-sodju.

3.13.

EDTA (aċidu etilendiammintetraaċetiku, melħ disodiku).

3.14.

Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.15.

Soluzzjoni ta’ karbonat tas-sodju, c = 10 g/100 ml.

3.16.

soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju saturata bil-klorur tas-sodju, c = 5 g/100 ml.

Dewweb 50 g ta’ karbonat tas-sodju (il-punt 3.11) fl-ilma, iddilwixxi sa 1 l u żid bil-klorur tas-sodju (il-punt 3.12) sakemm is-soluzzjoni tkun saturata.

3.17.

Aċidu idrokloriku, bejn wieħed w-ieħor 0,1 mol/l.

Iddilwixxi 10 ml ta’ HCl (il-punt 3.7) bl-ilma sa 1 l.

3.18.

Soluzzjoni buffer tal-aċetat tal-ammonju, bejn wieħed u ieħor 0,25 mol/l.

Dewweb 19,3 g aċetat tal-ammonju (il-punt 3.3) u 30 ml aċidu aċetiku (il-punt 3.5) fl-ilma (3.14) u ddilwixxi sa 1 1.

3.19.

Preparazzjoni ta’ amberlite XAD-2 reżina

Aħsel kwantità xierqa ta’ Amberlite (il-punt 3.2) bl-ilma sakemm il-joni tal-klorur kollha jitneħħew, kif indikat b’test tan-nitrat tal-fidda (il-punt 3.20) magħmul fuq il-fażi milwiema mwarrba. Imbagħad aħsel ir-raża b’50 ml metanol (il-punt 3.8), armi l-metanol u żomm ir-raża taħt il-metanol frisk.

3.20.

Soluzzjoni tan-nitrat tal-fidda, bejn wieħed w-ieħor 0,1 mol/l

Dewweb 0,17 g ta’ nitrat tal-fidda (il-punt 3.9) f’10 ml ilma.

3.21.

HPLC Fażi mobbli

Ħallat 500 ml aċetronil (il-punt 3.1) ma’ 300 ml ta’ soluzzjoni buffer tal-aċetat tal-ammonju (il-punt 3.18) u 1 200 ml tal-ilma (il-punt 3.14). Aġġusta l-pH għal 4,3 billi tuża l-aċidu aċetiku (il-punt 3.5). Iffiltra minn filtru ta’ 0,22 μm (il-punt 4.8) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b’ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). Din is-soluzzjoni tibqa’ stabbli għal xahar, jekk tinħażen fid-dlam f’reċipjent magħluq.

4. Apparat

4.1.

Banju ultrasoniku.

4.2.

Evaporatur rotatorju bil-pellikola.

4.3.

Magna ċentrifuga.

4.4.

Tagħmir tal-HPLC b’detettur tal-ultravjola b’tul tal-mewġa varjabbli jew detettur b’serje ta’ dijodi.

4.4.1.

Kolonna għal kromatografija likwida, 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm, ippakkjar jew kolonna ekwivalenti.

4.5.

Kolonna tal-ħġieġ (300 mm × 10 mm) mgħammra b’filtru tal-ħġieġ sinterizzat b’rubinett tal-għeluq.

4.6.

Filtri tal-fibra tal-ħġieiġ, b’dijametru ta’ 150 mm.

4.7.

Filtri tal-membrana, 0,45 μm.

4.8.

Filtri tal-membrana, 0,22 μm.

5. Proċedura

Nota:

Alofuġinon bħala l-bażi libera huwa instabbli fis-soluzzjonijiet alkalini u tal-aċetat tal-etil. Ma għandux jibqa’ fl-aċetat tal-etil għal iżjed minn 30 minuta.

5.1. Ġenerali

5.1.1.

Għalf fl-inbjank għandu jiġi analizzat għall-verifika li la alofuġinon u lanqas is-sustanzi interferenti ma jkunu preżenti.

5.1.2.

Għandu jitwettaq test tal-irkupru billi jiġi analizzat l-għalf fl-inbjank li jkun ġie ffortifikat biż-żieda ta’ kwantità ta’ alofuġinon, simili għal dak preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ sa livell ta’ 3 mg/kg, żid 300 μl tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.6.1) sa 10 g tal-għalf fl-inbjank, ħallat u stenna għal 10 minuti qabel ma tipproċiedi bil-pass tal-estrazzjoni (il-punt 5.2).

Nota:

għall-għanijiet ta’ dan il-metodu, l-għalf fl-inbjank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u fl-analiżi ma għandux jinstab alofuġinon.

5.2. Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,1 g, 10 g mill-kampjun ippreparat, ġewwa tubu ċentrifugu tal-200 ml, żid 0,5 g ta’ askorbat tas-sodju (il-punt 3.10), 0,5 g EDTA (il-punt 3.13) u 20 ml ilma u ħawwad. Qiegħed it-tubu għal 5 minuti f’banjumarija (80 °C). Wara li jibred għat-temperatura ambjentali, żid 20 ml ta’ soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (il-punt 3.15) u ħawwad. Żid minnufih 100 ml tal-aċetat tal-etil (il-punt 3.4) u ħawwad bis-saħħa bl-idejn għal 15 il-sekonda. Imbagħad qiegħed it-tubu għal tliet minuti fil-banju ultrasoniku (il-punt 4.1) u ħoll ftit it-tapp. Iċċentrifuga għal żewġ minuti u ferra’ l-fażi tal-aċetat tal-etil minn filtru tal-fibri tal-ħġieġ (il-punt 4.6), għal f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml. Irrepeti l-estrazzjoni tal-kampjun bit-tieni porzjon ta’ 100 ml tal-aċetat tal-etil. Aħsel l-estratti miġmugħin għal minuta b’50 ml ta’ soluzzjoni ta’ karbonat tas-sodju saturata bil-klorur tas-sodju (il-punt 3.16) u armi s-saff milwiem.

Neħħi s-saff organiku għal 1 min bi 50 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.17). Għaddi s-saff aċiduż il-baxx għal ġo lembut li jissepara ta’ 250 ml. Erġa’ islet is-saff organiku għal 1,5 minuti b’50 ml ieħor ta’ aċidu idrokloriku u għaqqad mal-ewwel estratt. Aħsel l-estratti magħqudin billi ddawwar għal bejn wieħed u ieħor 10 sekondi ma’ 10 ml tal-aċetat tal-etil (il-punt 3.4).

Ittrasferixxi b’mod kwantitattiv is-saff milwiem għal kunjett b’qiegħ tond ta’ 250 ml u armi l-fażi organika. Evapora l-aċetat tal-etil kollu li jkun baqa’ mis-soluzzjoni aċiduża bl-użu tal-evaporatur rotatorju bil-pellikola (il-punt 4.2). It-temperatura tal-banjumarija ma għandiex teċċedi l-40 °C. Taħt vakwu ta’ bejn wieħed u ieħor of 25 mbar l-aċetat tal-etil kollu li jifdal għandu jkun imneħħi fi żmien ħames minuti fi 38 °C.

5.3. Tindifa

5.3.1. Preparazzjoni tal-kolonna tal-Amberlit

Kolonna XAD-2 tiġi ppreparata għal kull estratt tal-kampjun. Ittrasferixxi 10 g tal-Amberlite ippreparat (il-punt 3.19) f’kolonna tal-ħġieġ (il-punt 4.5) bil-metanol (il-punt 3.8). Żid plagg żgħir tas-suf tal-ħġieġ mal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Battal il-metanol mill-kolonna u aħsel ir-raża b’100 ml ilma, filwaqt li twaqqaf in-nixxija hekk kif il-likwidu jilħaq il-parti tal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Ħalli l-kolonna tekwilibra ruħha għal 10 minuti qabel l-użu. Qatt tħalli l-kolonna tixxotta.

5.3.2. Tindif tal-kampjun

Ittrasferixxi l-estratt (il-punt 5.2) b’mod kwantitattiv lejn il-wiċċ tal-kolonna tal-Amberlite ippreparat (il-punt 5.3.1) u elwixxi, filwaqt li twarrab it-tisfija. Ir-rata tat-tisfija ma għadhiex tkun aktar minn 20 ml/min. Laħlaħ il-kunjett bil-qiegħ tond b’20 ml aċidu kloridriku (il-punt 3.17) u uża dan biex tlaħlaħ il-kolonna tar-raża. Onfoħ il-barra b’nixxija ta’ arja s-soluzzjoni tal-aċidu li tkun baqgħet. Armi l-likwidu użat fil-ħasil. Żid 100 ml metanol (il-punt 3.8) mal-kolonna u ħalli 5 sa 10 ml tal-ħasil, filwaqt li tiġbor l-elwat f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Ħalli l-metanol li jkun baqgħa jekwillibra mar-reiżina għal 10 minuti u kompli t-tlaħlieħ b’rata li ma teċċedix l-20 ml/min, u iġbor it-tlaħlieħ fl-istess garfina tal-qiegħ tond. Evapora l-metanol fuq l-evaporatur rotatorju bil-pellikola (il-punt 4.2), it-temperatura tal-banjumarija ma għandiex tkun aktar minn 40 °C. Ittrasferixxi l-fdal b’mod kwantitattiv f’kunjett ikkalibrat ta’ 10 ml billi tuża l-fażi mobbli (il-punt 3.21). Wassal sal-marka bil-fażi mobbli u ħawwad. Alikwota tiġi ffiltrata minn filtru tal-membrana (il-punt 4.7). Aħżen din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.4).

5.4. Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet segwenti huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn basta dawn jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromatografija likwida (il-punt 4.4.1)

Fażi mobbli HPLC (il-punt 3.21)

Rata tal-fluss: 1,5 sa 2 ml/min.

tul tal-mewġa tad-detezzjoni: 243 nm

Volum tal-injezzjoni: 40 sa 100 μl.

Ivverifika l-istabbilità tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.6.2) li jkun fiha għal diversi drabi 3,0 μg/ml, sakemm qċaċet ta’ għoli (jew erjas) u ħin ta’ retenzjoni kostanti jkunu milħuqa.

5.4.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.6.2) bosta drabi u kejjel l-għoli tal-qċaċet (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar bl-użu tal-medja tal-għoli jew l-erja tal-qċaċet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala l-axxissi.

5.4.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (il-punt 5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum bħal dak meħud għas-soluzzjoni tal-kalibrar u ddetermina l-medja tal-għoli tal-quċċata (erja) tal-alofuġinon.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, mill-għoli medju (erja) tal-qċaċet ta’ alofuġinon tas-soluzzjoni tal-kampjun b’referenza għall-graff tal-kalibrar (il-punt 5.4.2).

Il-kontenut tal-alofuġinon w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c	:	halofuginone concentration of the sample solution in μg/ml,
m	:	il-piż tal-porzjon tat-test fi grammi.

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

L-identità tal-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew bl-użu tad-detettur b’serje ta’ dijodi li bih l-ispettra tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.6.2) li jkun fiha 6,0 μg/ml huma mqabbla.

7.1.1. Kokromatografija

Estratt tal-kampjun huwa ffortifikat biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.6.2). L-ammont ta’ alofuġinon miżjud għandu jkun simili għal-ammont ikkalkolat ta’ alofuġinon misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-quċċata tal-alofuġinon biss għandu jkun imtejjeb wara li jitiqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli masimu tagħha, għandha tkun madwar ± 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2. detezzjoni b’serje ta’ dijodi

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)

it-tul tal-mewġa tal-assorbiment massimu tal-ispettra tal-kampjun u ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġini determinata mis-setgħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema tad-detezzjoni. Għad-detezzjoni b’serje ta’ dijodi, din hija tipikament fi ħdan ± 2 nm;

(b)

bejn 225 u 300 nm, l-ispettra tal-kampjun u tal-istandard irreġistrati fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, ma għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa 10-100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jkun issodisfat meta l-istess massimi jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-analit standard;

(c)

bejn 225 u 300 nm, l-ispettra tal-inklinazzjoni ’l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ’l isfel tal-quċċata prodotta mill-estratt tal-kampjun ma għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa ta’ 10-100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess massimi u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-ispettru tal-apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun aktar minn 0,5 mg/kg għall-kontenut ta’ alofuġinon sa 3 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għal kampjun fl-inbjank iffortifikat, l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv (8) li fih ġew analizzati tliet kampjuni minn tmien laboratorji.

Riżultati

Kampjun A (inbjank)

Mal-wasla

Kampjun B (Grixa)

Kampjun C (Pritkuni)

Mal-wasla

Wara xahrejn

Mal-wasla

Wara xahrejn

Medja [mg/kg]

2,80

2,42

2,89

2,45

SR [mg/kg]

—

0,45

0,43

0,40

0,42

CVR [%]

—

Rec. [%]

ND =	mhux rilevat

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità (%)

Rec. =

irkupru (%)

E. DETERMINAZZJONI TAR-ROBENIDINA

1,3-bis [(4-klorobenżiliden)ammino]gwanidina — idroklorur

il-kontenut ta’ robenidina għandu jiġi ddeterminat permezz ta’

—

Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	permezz ta’ kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV, kif deskritt fil-punti 1 sa 8 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-livelli ta’ robenidina fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt b’metanol aċidifikat. L-estratt jitnixxef u porzjon alikwota ikun soġġett għal tindifa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. Ir-robenidina ssirilha elwizzjoni mill-kolonna bil-metanol, ikkonċentrat, u miżjud sa volum xieraq b’fażi mobbli. Il-kontenut ta’ robenidina jiġi ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja (HPLC)b’fażi inversa bl-użu ta’ detettur tal-UV.

3. Reaġenti

3.1.

Metanol

3.2.

Metanol aċidifikat

Ittrasferixxi 4,0 ml aċidu idrokloriku (ρ20 = 1,18 g/ml) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, imla sal-marka bil-metanol (il-punt 3.1) u ħawwad. Din is-soluzzjoni għandha titħejja friska qabel l-użu.

3.3.

Aċetonitril, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.4.

Passatur molekulari.

Żibeġ tat-tip 3 A, minn 8 sa 12 mesh (żibeġ ta’ 1,6–2,5 mm, alumino-silikat kristallini, dijametru tal-pori 0,3 mm).

3.5.

Attività aċiduża tal-ossidu tal-aluminju grad I tal-kromatografija b’kolonna.

Ittrasferixxi 100 g ossidu tal-aluminju f’kontenitur adatt u żid 2,0 ml ilma. Poġġi t-tapp u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 20 minuta. Aħżen f’kontenitur li għandu t-tapp magħluq sew.

3.6.

Soluzzjoni tal-, c = 0,025 mol/l.

Dewweb 3,40 g ta’ fosfat diidroġenat tal-potassju fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka u ħawwad.

3.7.

Soluzzjoni tal-idroġenufosfat tad-disodju, c = 0,025 mol/l

Dewweb 3,55 g ta’ fosfat diidroġenat tal-potassju anidru (jew 4,45 g ta’ diidratat jew 8,95 g ta’ dodekaidratat) fl-ilma (ekwivalenti għal grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 l, żid sal-marka u ħawwad.

3.8.

Fażi mobbli HPLC

Ħawwad flimkien ir-reaġenti li ġejjin:

650 ml aċetonitril (il-punt 3.3),

250 ml ilma (ekwivalenti għall-grad tal-HPLC),

50 ml soluzzjoni tal-fosfat diidroġenat tal-potassju (il-punt 3.6),

50 ml soluzzjoni tal-fosfat idroġenat tad-disodju (il-punt 3.7).

Għaddi minn filtru ta’ 0,22 μm (il-punt 4.6) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni, (eżempju permezz ta’ ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti).

3.9.

Sostanza standard

robenidina pura: 1,3-bis [(4-klorobenżiliden)ammino]gwanidina-idroklorur.

3.9.1.

Soluzzjoni standard stokk ta’ robenidina: 300 μg/ml

Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 30 mg ta’ sustanza standard ta’ robenidina (il-punt 3.9). Ħoll f’metanol aċidifikat (il-punt 3.2) ġo kunjett iggradat ta’ 100 ml, tella’ sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam.

3.9.2.

Soluzzjoni standard intermedja ta’ robenidina: 12 μg/ml

Ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 250 ml, imla sal-marka bil-fażi mobbli (il-punt 3.8) u ħawwad. Geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam.

3.9.3.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar

F’serje ta’ kunjetti kkalibrati ta’ 50 ml, ittrasferixxi 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 u 25,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedja (il-punt 3.9.2). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (il-punt 3.8) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 u 6,0 μg/ml ta’ robenidina rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu.

3.10.

Ilma ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

4. Apparat

4.1.

Kolonna tal-ħġieġ

Mibnija mill-ħġieġ tal-ambra mgħamra b’robinett tal-għeluq u b’reċipjent li jesa’ bejn wieħed u ieħor 150 ml, dijametru intern ta’ 10 sa 15 mm, tul ta’ 250 mm.

4.2.

Apparat li jħawwad mekkanikament jew ħawwad manjetiku.

4.3.

Evaporatur rotatorju bil-pellikola.

4.4.

Tagħmir HPLC b’detettur tal-ultravjola b’tul tal-mewġa varjabbli jew detettur b’serje ta’ dijodi li jaħdem fil-firxa ta’ bejn 250 u 400 nm.

4.4.1.

Kolonna għal kromatografija likwida: 300 mm × 4 mm, C18 10 μm ppakkjar jew ekwivalenti.

4.5.

Karta filtranti tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman GF/A jew l-ekwivalenti).

4.6.

Filtri tal-membrana, 0,22 μm.

4.7.

Filtri tal-membrana, 0,45 μm.

5. Proċedura

Nota:

Ir-robenidina hija sensittiva għad-dawl. Oġġetti tal-ħġieġ tal-ambra għandhom jintużaw fl-operazzjonijiet kollha.

5.1. Ġenerali

5.1.1.

Għalf fl-inbjank għandu jkun analizzat biex ikun iċċekkjat li la robenidina u lanqas is-sustanzi interferenti ma jkunu preżenti.

5.1.2.

Għandu jsir eżami ta’ rkuprar billi ssir analiżi tal-għalf fl-inbjank (il-punt 5.1.1) li jkun ġie ffortifikat biż-żieda ta’ kwantità ta’ robenidina, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 60 mg/kg, ittrasferixxi 3,0 ml tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.9.1) f’kunjett konikali tal-250 ml. Evapora s-soluzzjoni sa madwar 0,5 ml fi fluss tan-nitroġenu. Żid 15 g tal-għalf fl-inbjank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (il-punt 5.2).

Nota:

Għall-għanijiet ta’ dan il-metodu, l-għalf fl-inbjank għandu jkun tat-tip simili għal dak tal-kampjun u mill-analiżi robenidina ma għandhiex tinstab.

5.2. Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 15 g tal-kampjun ippreparat. Ittrasferixxi għal kunjett konikali ta’ 250 ml u żid 100,0 ml ta’ metanal aċidifikat (il-punt 3.2), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal siegħa fuq ix-shaker (il-punt 4.2). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (il-punt 4.5) u iġbor il-filtrat kollu f’kunjett konikali ta’ 150 ml. Żid passatur molekulari ta’ 7,5 g (il-punt 3.4), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal ħames minuti. Iffiltra minnufih minn karta filtru tal-fibri tal-ħġieġ. Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta’ purifikazzjoni (il-punt 5.3).

5.3. Purifikazzjoni

5.3.1. Preparazzjoni tal-kolonna ta’ ossidu tal-aluminju

Daħħal plagg żgħir tas-suf tal-ħġieġ fil-parti t’isfel tal-kolonna tal-ħġieġ (il-punt 4.1) u għafsu ’l isfel bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ. Iżen 11,0 g tal-ossidu tal-aluminju ppreparat (il-punt 3.5) u ttrasferixxi għall-kolonna. Għandha tingħata attenzjoni biex jitnaqqas l-esponiment għall-arja matul dan l-istadju. Taptap bil-mod il-kolonna mgħobbija fil-parti t’isfel tagħha biex l-ossidu tal-aluminju joqgħod.

5.3.2. Purifikazzjoni tal-kampjun

Ittrasferixxi fil-kolonna bil-pipetta 5,0 ml tal-estratt tal-kampjun ippreparat (fil-punt 5.2). Serraħ il-ponta tal-pipetta qrib il-ħajt tal-kolonna u ħalli s-soluzzjoni tkun assorbita fuq l-ossidu tal-aluminju. Elwixxi r-robenidina mill-kolonna billi tuża 100 ml metanol (il-punt 3.1), b’rata ta’ fluss ta’ 2 sa 3 ml/minuta u iġbor l-elwat f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Evapora s-soluzzjoni tal-metanol sakemm jinxef taħt pressjoni mnaqqsa f’40 °C permezz ta’ evaporatur rotatorju bil-pellikola (il-punt 4.3). Erġa’ dewweb ir-residwu f’3 sa 4 ml ta’ fażi mobbli (il-punt 3.8) u ttrasferixxi b’mod kwantitattiv f’kunjett iggradat ta’ 10 ml. Laħlaħ il-kunjett b’diversi porzjonijiet ta’ 1 sa 2 ml tal-fażi mobbli u ttrasferixxi dawn it-tlaħliħiet fil-kunjett iggradat. Żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Alikwota tiġi ffiltrata minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (il-punt 4.7). Erfa’ din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.4).

5.4. Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistgħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromografija likwida (il-punt 4.4.1),

Fażi mobbli tal-HPLC (il-punt 3.8),

Rata tal-fluss: 1,5 sa 2 ml/minuta,

Tul tal-mewġa tad-detettur: 317 nm,

Volum tal-injezzjoni: 20 sa 50 μl.

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (il-punt 3.9.3) li fiha jinsab 3,6 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu għoli tal-quċċata u ħinijiet ta’ retenzjoni kostanti.

5.4.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.9.3) bosta drabi u kejjel l-għoli tal-quċċata (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-kurva tal-kalibrar bl-użu tal-medja tal-quċċata jew erjas tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala axxissi.

5.4.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (il-punt 5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-għoli medju (erja) tal-quċċata tar-robenidina.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-qċaċet ta’ robenidina tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (il-punt 5.4.2).

Il-kontenut ta’ robenidina w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni ta’ robenidina tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml,
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi grammi.

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

7.1.1. Kokromatografija

Estratt tal-kampjun jiġi ffortifikat biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (il-punt 3.9.3). L-ammont ta’ robenidina miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat ta’ robenidina misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-quċċata ta’ robenidina biss għandu jiżdied wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli massimu tagħha, għandha tkun f’bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2. detezzjoni b’serje ta’ dijodi

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)

(b)

bejn 250 u 400 nm, l-ispettra tal-kampjun u tal-standard irrekordjati fl-apiċi tal-quċċata tal-kromatogramma, ma għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa 10 sa 100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jkun issodisfat meta l-istess massimi jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-analit standard;

(c)

bejn 250 u 400 nm, l-ispettra tal-inklinazzjoni ’l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ’l isfel tal-quċċata prodotti mill-estratt tal-kampjun ma għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa ta’ 10-100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess massimi u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-ispettru tal-apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun ma għandhiex taqbeż l-10 % tal-ogħla riżultat għal kontenut ta’ robenidina ogħla minn 15 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għal kampjun fl-inbjank iffortifikat l-irkupru għandu jkun tal-anqas 85 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-UE li fih, erba’ kampjuni tal-għalf tat-tjur u tal-fniek, f’forma ta’ grixa jew ta’ pritkuni kienu analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżijiet duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

Pollam

Fniek

Grixa

Pritkuni

Grixa

Pritkuni

Medja [mg/kg]

27,00

27,99

43,6

40,1

sr [mg/kg]

1,46

1,26

1,44

1,66

CVr [%]

5,4

4,5

3,3

4,1

SR [mg/kg]

4,36

3,36

4,61

3,91

CVR [%]

16,1

12,0

10,6

9,7

Irkupru [%]

90,0

93,3

87,2

80,2

sr =	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

F. DETERMINAZZJONI TA’ DIKLAŻURIL

(+)-4-klorfenil [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetraidro-3,5-diosso-1,2,4-triażin-2-il)fenil] aċetonitril.

Il-kontenut tad-diklażuril għandu jiġi ddeterminat permezz ta’:

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	permezz ta’ kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja b’fażi inversa bi gradjent ternarju (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV, kif deskritt fil-punti 1 sa 9 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ diklażuril fl-għalf kompost u f’taħlitiet lesti minn qabel (9). Il-limitu ta’ detezzjoni huwa ta’ 0,1 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 0,5 mg/kg. Jistgħu jinkisbu limiti aktar baxxi ta’ kwantifikazzjoni iżda dan għandu jiġi vvalidat mill-utent.

2. Prinċipju

Wara ż-żieda ta’ standard internazzjonali, il-kampjyn huwa estratt b’metanol aċidifikat. Għall-għalf, l-alikwota tal-estratt huwa ppurifikat fuq skartoċċ tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18. Id-diklażuril jiġi elwit mill-iskartoċċ b’taħlita ta’ metanol aċidifikat u ilma. Wara l-evaporazzjoni, ir-residwu jinħall fi DMF/ilma. Għal taħlitiet minn qabel, l-estratt huwa evaporat u r-residwu jinħall fi DMF/ilma. Il-kontenut ta’ diklażuril jiġi ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja (HPLC) b’fażi inversa bi gradjent ternarju bl-użu ta’ detettur tal-UV.

3. Reaġenti

3.1.

Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.2.

Aċetat tal-ammonju.

3.3.

Idroġenusulfat tat-tetrabutilammonju (TBHS).

3.4.

Aċetonitril, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.5.

Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.6.

N, N-dimetilformammid (DMF).

3.7.

Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.

Sustanza standard: diklażuril: (+)-4-klorfenil [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetraidro–3,5-diosso-1,2,4-triażin-2-il) fenil] aċetonitril b’purità ggarantita.

3.8.1.

Soluzzjoni standard stokk tad-diklażuril, 500 μg/ml

Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard interna tad-diklażuril (il-punt 3.8) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb fi DMF (il-punt 3.6), żid sal marka b’ DMF (il-punt 3.6) u ħallat. Kebbeb il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ 4 °C jew inqas, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1 (10).

3.8.2.

Soluzzjoni standard tad-diklażuril, 50 μg/ml

Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.8.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal marka bid-DMF (il-punt 3.6) u ħallat. Kebbeb il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ 4 °C jew inqas, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.

Sustanza standard interna: 2,6 dikloro-α-(4-klorofenil)-4-(4,5 diidro–3,5-diosso-1,2,4-triażina-2 (3H) —il) α-metilbenżen-aċetonitril (metil diklażuril)

3.9.1.

Soluzzjoni standard stokk interna, 500 μg/ml

Iżen sal-eqreb 0,1 mg 25 mg tas-sustanza standard interna (il-punt 3.9) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb fi DMF (il-punt 3.6), żid sal marka b’ DMF (il-punt 3.6) u ħallat. Kebbeb il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ 4 °C jew inqas, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.2.

Soluzzjoni standard interna, 50 μg/ml

Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard stokk interna (il-punt 3.9.1) f’kunjett iggradat b’50 ml, żid sal marka b’ DMF (il-punt 3.6) u ħallat. Kebbeb il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ 4 °C jew inqas, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.3.

Soluzzjoni standard interna għal taħlitiet lesti minn qabel, p/1 000 mg/ml (p = kontenut nominali ta’ diklażuril fit-taħlita lesta minn qabel f’ mg/kg)

Iżen sal-eqreb 0,1 mg p/10 mg tas-sustanza standard interna f’kunjett ta’ 100 ml iggradat, dewweb fi DMF (il-punt 3.6) f’banju ultrasoniku (il-punt 4.7), żid sal marka b’ DMF u ħallat. Kebbeb il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen f’refriġeratur. F’temperatura ta’ 4 °C jew inqas, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.10.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar

3.10.1.

Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 1 μg/ml (diklażuril)

Ippipetta 1,00 ml soluzzjoni standard ta’ diklażuril (il-punt 3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 17 ml DMF (il-punt 3.6), żid sal-marka bl-ilma (3.1) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.2.

Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 2 μg/ml (diklażuril)

Ippipetta 2,00 ml soluzzjoni standard ta’ diklażuril (il-punt 3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 16 ml DMF (il-punt 3.6), żid sal-marka bl-ilma (il-punt 3.1) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.3.

Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 3 μg/ml (diklażuril)

Ippipetta 3,00 ml soluzzjoni standard ta’ diklażuril (il-punt 3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 15 ml DMF (il-punt 3.6), żid sal-marka bl-ilma (il-punt 3.1) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.4.

Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 4 μg/ml (diklażuril)

Ippipetta 4,00 ml soluzzjoni standard ta’ diklażuril (il-punt 3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 14 ml DMF (il-punt 3.6), żid sal-marka bl-ilma (il-punt 3.1) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.5.

Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 5 μg/ml (diklażuril)

Ippipetta 5,00 ml soluzzjoni standard ta’ diklażuril (il-punt 3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 13 ml DMF (il-punt 3.6), żid sal-marka bl-ilma (3.1) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

Nota:

is-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (il-punti 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 u 3.10.5) ikopru l-konċentrazzjoni tad-diklażuril fl-għalf li tvarja minn 0,5 sa 2,5 mg/kg meta jintuża l-protokoll attwali.

3.11.

C18 skartoċċ tal-estrazzjoni f’fażi solida, eż. Mega Bond Elut, daqs: 20 cc, piż sorbenti: 5 000 mg (prekundizzjonament skont il-linji gwida tal-fornitur).

3.12.

Solvent tal-estrazzjoni: metanol aċidifikat.

Ippipetta 5,0 ml aċidu idrokloriku (il-punt 3.7) f’1 000 ml metanol (il-punt 3.5), u ħallat.

3.13.

Fażi mobbli għall-HPLC

3.13.1.

Elwent A: soluzzjoni ta’ aċetat tal-ammonju — idroġenusulfat tat-tetrabutilammonju.

Dewweb 5 g aċetat tal-ammonju (il-punt 3.2) u 3,4 g TBHS (il-punt 3.3) f’1 000 ml ilma (il-punt 3.1) u ħallat.

3.13.2.

Elwent B: aċetonitril (il-punt 3.4).

3.13.3.

Elwent C: metanol (il-punt 3.5).

4. Apparat

4.1.

Xejker mekkaniku.

4.2.

Tagħmir għal HPLC ta’ gradjent ternarju:

4.2.1.

Kolonna għal kromatografija likwida, Hypersil ODS, 3 μm ippakkjar, 100 mm x 4,6 mm, jew ekwivalenti.

4.2.2.

detettur tal-UV b’aġġustament varjabbli tat-tul tal-mewġa jew detettur b’serje ta’ dijodi.

4.3.

Evaporatur rotatorju bil-pellikola.

4.4.

Filtru tal-membrana (eż. Nylon reżistenti kimikament), 0,45 μm.

4.5.

Siringa li tintrema, 5 ml.

4.6.

Manifold b’vakwu.

4.7.

Banju ultrasoniku.

5. Proċedura

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf fl-inbjank

Għalf fl-inbjank għandu jiġi analizzat sabiex jiġi kkontrollat li la dikclażuril u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. L-għalf fl-inbjank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, la diklażuril u lanqas sustanzi interferenti ma għandhom jiġu rilevati.

5.1.2. Test tal-irkupru

Għandu jtiwettaq test tal-irkupru billi jkun analizzat l-għalf fl-inbjank li jkun ġie iffortifikat biż-żieda ta’ kwantità ta’ diklażuril simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 1 mg/kg, żid 0,1 ml tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.8.1.) għal 50 g ta’ għalf fl-inbjank, ħallat sewwa u ħalli għal 10 min, u erġa’ ħallat għal diversi drabi qabel ma tipproċedi (il-punt 5.2).

Inkella, jekk għalf fl-inbjank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara l-punt 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa ffortifikat bi kwantità ta’ diklażuril, simili għal dik diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux iffortifikat u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2. Estrazzjoni

5.2.1. Għalf kompost

Iżen sal-eqreb 0,01 g bejn wieħed u ieħor 50 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku ta’ 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.2), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita fuq ix-shaker (il-punt 4.1) tul il-lejl. Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwota ta’ 20 ml tas-supernatant fil-kontenitur adattat tal-ħġieġ u ddilwixxi b’20 ml ilma (il-punt 3.1). Itrasferixxi din is-soluzzjoni fuq skartoċċ tal-estrazzjoni (il-punt 3.11), u għaddi minn vakwu (il-punt 4.6). Aħsel l-iskartoċċ b’25 ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.12) u bl-ilma (il-punt 3.1), 65 + 35 (V + V). Armi l-frazzjonijiet miġbura u elwixxi l-komposti b’25 ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.12) u bl-ilma, 80 + 20 (V + V). Evapora din il-frazzjoni sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur rotatorju (il-punt 4.3) f’60 °C. Dewweb ir-residwu f’1,0 ml DMF (il-punt 3.6), żid 1,5 ml ilma (il-punt 3.1) u ħallat. Iffiltra minn filtru tal-membrana (il-punt 4.4) immuntat fuq siringa li tintrema (il-punt 4.5). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.3).

5.2.2. It-taħlitiet minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g bejn wieħed u ieħor 1 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku ta’ 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (il-punt 3.9.3), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita tul il-lejl fuq ix-shaker (il-punt 4.1). Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwota ta’ 10 000/p ml (p = kontenut nominali ta’ diklażuril fit-taħlita lesta minn qabel f’mg/kg) tas-supernatant f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ daqs adattat. Evapora sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur rotatorju (il-punt 4.3) f’60 °C. Erġa’ dewweb mill-ġdid ir-residwu fi 10,0 ml DMF (il-punt 3.6), żid 15,0 ml ilma (il-punt 3.1) u ħallat. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.3).

5.3. Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti jew aħjar.

—	Kolonna għal kromografija likwida (il-punt 4.2.1): 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm ippakkjar, jew ekwivalenti.

—

Fażi mobbli

—	Elwent A (il-punt 3.13.1): Soluzzjoni milwiema ta’ aċetat tal-ammonju u idroġensulfat tat-tetrabutil-ammonju.

—	Elwent B (il-punt 3.13.2): aċetonitril.

—	Elwent C (il-punt 3.13.3): metanol.

—

Modalità ta’ elwizzjoni — gradjent lineari

—	kundizzjoni inizjali: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V);

—	wara 10 minuti ggrada l-elwizzjoni għal 30 minuta għal: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V);

—	Aħsel b’B għal 10 min.

—	Rata tal-fluss: 1,5–2 ml/min

—	Volum tal-injezzjoni: 20 μl

—	Tul tal-mewġa tad-detettur: 280 nm.

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, u injetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.10.2) li fiha 2 μg/ml ta’ diklażuril u tal-istandard intern, sakemm jintlaħqu għoli tal-quċċata u ħin ta’ retenzjoni kostanti.

5.3.2. Analiżi kromatografika tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar

Injetta 20 μl tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (il-punti 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 u 3.10.5) darbtejn kull waħda, identifika u integra l-qċaċet tad-diklażuril u tal-istandard intern, u pinġi l-kurva ta’ kalibrar bbażata fuq il-proporzjon tal-medja tal-għoli jew tal-erja tal-quċċata tad-diklażuril mal-medja tal-għoli jew tal-erja tal-quċċata tal-konċentrazzjoni tal-istandard intern versus diklażuril fis-soluzzjonijiet tal-kalibrar (μg/ml).

5.3.3. Analiżi kromatografika tas-soluzzjonijiet tal-kampjun

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.1 jew 5.2.2) darbtejn u ddetermina l-għoli medju tal-quċċata jew l-erja tal-qċaċet tad-diklażuril u tal-istandard intern.

6. Kalkolu tar-riżultati

6.1. Għalf kompost

Il-kontenut ta’ diklażuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

jew

fejn:

—	Għoli (d,s) hija l-għoli tal-quċċata ta’ diklażuril fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.1)

—	Erja (d,s) hija l-erja tal-quċċata ta’ diklażuril fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.1)

—	Għoli (i,s) hija l-għoli tal-quċċata tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.1)

—	Erja (i,s) hija l-erja tal-quċċata tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.1)

—	b hija l-interċezzjoni tal-kurva tal-kalibrar ipplottjata mis-soluzzjonijiet tal-kalibrar (il-punti 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 u 3.10.5) skont il-punt 5.3.2

—	a hija l-inklinazzjoni tal-kurva tal-kalibrar ipplottjata mis-soluzzjonijiet tal-kalibrar (il-punti 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 u 3.10.5) skont il-punt 5.3.2

—	m hija l-massa tal-porzjon tat-test, fi grammi

—	V hija l-volum finali f’millilitri tal-estratt tal-kampjun wara li jerġa jiġi mdewweb skont il-punt 5.2.1 (jiġifieri 2,5 ml)

6.2. It-taħlitiet minn qabel

Il-kontenut ta’ diklażuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

jew

fejn:

—	Għoli (d,s) hija l-għoli tal-quċċata ta’ diklażuril fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.2)

—	Erja (d,s) hija l-erja tal-quċċata ta’ diklażuril fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.2)

—	Għoli (i,s) hija l-għoli tal-quċċata tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.2)

—	Erja (i,s) hija l-erja tal-quċċata tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.2)

—	b hija l-interċettazzjoni tal-kurva ta’ kalibrar pplottjata mis-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (il-punti 3.10.1, 3.10. 2, 3.10.3, 3.10.4 u 3.10.5) skont il-punt 5.3.2

—	a hija l-inklinazzjoni tal-kurva tal-kalibrar ipplottjata mis-soluzzjonijiet tal-kalibrar (il-punti 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 u 3.10.5) skont il-punt 5.3.2

—	m hija l-massa tal-porzjon tat-test, fi grammi

—	V hija l-volum finali f’millilitri tal-estratt tal-kampjun wara li jerġa jiġi mdewweb skont il-punt 5.2.2 (jiġifieri 25 ml)

—	p hija l-kontenut nominali ta’ diklażuril f’mg/kg fit-taħlita lesta minn qabel

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

L-identità tal-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża detettur b’serje ta’ dijodi li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun (il-punt 5.2.1 jew 5.2.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.10.2).

7.1.1. Kokromatografija

Estratt tal-kampjun (il-punt 5.2.1 jew 5.2.2) huwa ffortifikat biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.10.2). L-ammont ta’ diklażuril miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ diklażuril li jinstab fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-quċċata ta’ diklażuril u l-quċċata tal-istandard intern biss għandhom jitjiebu wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-quċċata tad-diklażuril jew tal-quċċata tal-istandard intern tal-estratt tal-kampjun mhux iffortifikat.

7.1.2. detezzjoni b’serje ta’ dijodi

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)

It-tul tal-mewġa tal-assorbiment massimu tal-ispettra tal-kampjun u ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġini determinata mis-setgħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema tad-detezzjoni. Għad-detezzjoni b’serje ta’ dijodi dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm.

(b)

Bejn 230 u 320 nm, l-ispettra tal-kampjun u tal-istandard irrekordjati fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, ma għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa 10 %–100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jkun issodisfat meta l-istess massimi jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-analit standard.

(c)

Bejn 230 u 320 nm, l-ispettra tal-inklinazzjoni ’l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ’l isfel tal-quċċata prodotta mill-estratt tal-kampjun ma għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa ta’ 10 %–100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-ispettru tal-apiċi tal-quċċata.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ kejlijiet indipendenti mwettqa fuq żewġ subkampjuni ma għandhiex tkun aktar minn:

—	30 % relattiv għalal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diklażuril minn 0,5 mg/kg sa 2,5 mg/kg,

—	0,75 mg/kg għall-kontenuti ta’ diklażuril bejn 2,5 mg/kg u 5 mg/kg,

—	15 % relattiv għall-ogħla valur għal kontenuti ta’ diklażuril ta’ aktar minn 5 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għal kampjun iffortifikat (fl-inbjank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġew organizzati żewġ studji kollaborattivi. Fl-ewwel wieħed, imwettaq minn grupp ieħor ta’ laboratorji fl-1994, il-kampjuni analizzati kienu żewġ taħlitiet lesti minn qabel (O 100, A 100) u tliet kampjuni ta’ għalf komplementari għat-tjur (L1, Z1, K1). Kampjun wieħed ta’ taħlita lesta minn qabel kienet tħallat b’matriċi organika (O 100) u l-ieħor b’matriċi inorganika (A 100). Il-kontenut teoretiku huwa 100 mg diklażuril għal kull kg. Il-laboratorji ngħataw struzzjonijiet biex janalizzaw kull wieħed mill-kampjuni għal darba jew darbtejn. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar l-ewwel studju kollaborattiv tista’ tinstab fil-Journal of AOAC International, Volum 77, Nru 6, 1994, p. 1359–1361).

Fit-tieni studju kollaborattiv, ġew analizzati tliet tipi ta’ għalf kompost għall-pollam, li fih id-diklażuril f’konċentrazzjonijiet ta’ 0,9 mg/kg (MAT 1), 1,5 mg/kg (MAT 2) u għalf inbjank (MAT 3). Informazzjoni dettaljata dwar dan it-tieni studju tista’ tinstab fil-JRC Technical report (2016) u fil-Journal of AOAC International, Volum 102, Nru 2, 2019, p. 646–652. Ir-riżultati taż-żewġ studji kollaborattivi huma mogħtija fit-tabella li ġejja.

1 A 100

Kampjun 2O 100

Kampjun 3 L1

Kampjun 4 Z1

Kampjun 5 K1

Kampjun 6

MAT 1

Kampjun 7

MAT 2

Kampjun 8

MAT 3

Medja (mg/kg)

100,8

103,5

0,89

1,15

0,89

1,0

1,5

< LOQ

Sr (mg/kg)

5,88

7,64

0,15

0,02

0,03

0,11

0,07

—

CVr (%)

5,83

7,38

17,32

1,92

3,34

11,2

4,5

—

SR (mg/kg)

7,59

7,64

0,17

0,11

0,12

0,18

0,21

—

CVR (%)

7,53

7,38

18,61

9,67

13,65

18,1

14,3

—

Kontenut nominali (mg/kg)

100

1,0

0,9

1,5

—

Referenza (*1)

L-ewwel studju mill-1 994

It-tieni studju mill-2 015

L	= numru ta’ laboratorji

n	= numru ta’ valuri singoli

Sr =	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

SR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

LOQ=	Limitu ta’ Kwantifikazzjoni

9. Kummenti ġenerali

Ir-reazzjoni ta’ diklażuril jeħtieġ li tkun intweriet preċedentament bħala lineari tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet imkejla.

Għall-inqas għall-analiżi tad-diklażuril fl-għalf kompost b’kontenut għoli ta’ xaħam (għal dan l-iskop jaqbeż it-12 % ta’ xaħam) il-metodu analitiku jista’ jiġi sostitwit b’metodi oħra bbażati fuq l-HPLC, eż. metodu bbażat fuq il-kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja abbinata ma’ spettrometrija tal-massa (HPLC-MS), dejjem jekk il-metodu alternattiv ikollu karatteristiċi ta’ prestazzjoni ekwivalenti (rata ta’ rkupru, preċiżjoni f’kundizzjonijiet ta’ ripetibbiltà u riproduċibbiltà).

(G) DETERMINAZZJONI TA’ LAŻALOĊID-SODJU

Melħ tas-sodju ta’ polietere tal-aċidu monokarbossiliku prodott bi Streptomyces lasaliensis.

Il-kontenut ta’ lażoloċid-sodju għandu jiġi ddeterminat permezz ta’

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	permezz ta’ kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC) bl-użu ta’ detettur spettrofluworometriku (fluworexxenza), kif deskritt fil-punti 1 sa 8 hawn taħt.

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ lażaloċid-sodju fl-għalf. Il-limitu ta’ detezzjoni huwa ta’ 5 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 10 mg/kg.

2. Prinċipju

Lażaloċid-sodju huwa estratt minn kampjun ta’ metanol aċidifikat u stabbilit mill-kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi inversa (HPLC) bl-użu ta’ detettur spettrofluworimetriku (fluworexxenza).

3. Reaġenti

3.1.

Fosfat diidroġenat tal-potassju (KH2PO4).

3.2.

Aċidu ortofosforiku, w (w/w) = 85 %.

3.3.

Soluzzjoni ta’ aċidu ortofosforiku, c = 20 %.

Iddilwixxi 23,5 ml ta’ aċidu ortofosforiku (il-punt 3.2) għal 100 ml ilma.

3.4.

6-Metil-2-ettilammina (1,5-dimetileżilammina), w (w/w) = 99 %.

3.5.

Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC.

3.6.

Aċidu idrokloriku, densità = 1,19 g/ml.

3.7.

Soluzzjoni mewwieta ta’ fosfat, c = 0,01 mol/l.

Dewweb 1,36 g ta’KH2PO4 (il-punt 3.1) f’500 ml ta’ ilma (il-punt 3.11), żid 3,5 ml ta’ aċidu ortofosforiku (il-punt 3.2) u 10,0 ml ta’ 6-metil-2-ettilammina (il-punt 3.4). Aġġusta l-pH għal 4,0 b’soluzzjoni ta’ aċidu ortofosforiku (il-punt 3.3) u ddilwixxi sa 1 000 ml bl-ilma (il-punt 3.11).

3.8.

Metanol aċidifikat

Ittrasferixxi 5,0 ml ta’ aċidu idrokloriku (il-punt 3.6) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka bil-metanol (il-punt 3.5) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.9.

Fażi HPLC mobbli, soluzzjoni mewwieta metanol ta’ fosfat-5 + 95 (V + V)

Ħallat 5 ml tas-soluzzjoni tal-phosphate buffer (il-punt 3.7) ma’ 95 ml ta’ metanol (il-punt 3.5).

3.10.

Sustanza standard tal-lażaloċid-sodju b’purità ggarantita, C34H53O8Na (melħ tas-sodju tal-polieteri tal-aċidu monokarbossiliku prodoti minn Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1.

Soluzzjoni standard stokk tal-lażaloċid-sodju, 500 μg/ml

Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg lażaloċid-sodju (il-punt 3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’metanol aċidifikat (il-punt 3.8), żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.2.

Soluzzjoni standard intermedja ta’ lażaloċid-sodju, 50 μg/ml

Iġbed b’pipetta 10,0 ml tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.10.1) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (il-punt 3.8) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.3.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar

F’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 50 ml ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni normali intermedja (il-punt 3.10.2). Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (il-punt 3.8) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 μg ta’ lażaloċid-sodju għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski qabel l-użu.

3.11.

Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

4. Apparat

4.1.

Banju ultrasoniku (jew banju tal-ilma li jiċċaqlaq) bil-kontroll tat-temperatura.

4.2.

Filtri tal-membrana, 0,45 μm.

4.3.

Tagħmir tal-HPLC b’sistema ta’ injezzjoni, adattat għall-injettar ta’ volumi ta’ 20 μl.

4.3.1.

Kolonna għal kromatografija likwida 125 mm x 4 mm, b’fażi inversa C18, 5 μm ippakkjar jew ekwivalenti.

4.3.2.

Spettrofluworimetru b’aġġustament varjabbli tat-tul tal-mewġa ta’ tulijiet tal-mewġa ta’ eċċitazzjoni u ta’ emissjoni.

5. Proċedura

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf fl-inbjank

Biex isir l-eżami tal-irkupru (il-punt 5.1.2) għandu jiġi analizzat kampjun fl-inbjank biex jiġi ivverifikat li la lażaloċid-sodju u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. Il-kampjun fl-inbjank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u ma għandux ikun hemm lażaloċid-sodju jew sustanzi interferenti.

5.1.2. Test tal-irkupru

L-eżami tal-irkupru għandu jsir bl-analiżi tal-kampjun fl-inbjank li kien ġie ffortifikat biż-żieda ta’ kwantità ta’ lażaloċid-sodju, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tal-istandard stokk (il-punt 3.10.1) f’kunjett koniku ta’ 250 ml u evapora s-soluzzjoni għal madwar 0,5 ml. Żid 50 g tal-kampjun fl-inbjank, ħawwad sew u ħalli għal 10 minuti filwaqt li tħallat għal bosta drabi qabel ma tkompli bil-pass tal-estrazzjoni (il-punt 5.2).

Inkella, jekk għalf fl-inbjank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara l-punt 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ il-kampjun li għandu jkun analizzat jiġi ffortifikat bi kwantità ta’ lażaloċid-sodju simili għal dik li diġà hemm preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun jiġi analizzat flimkien mal-kampjun mhux iffortifikat u l-irkupru kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2. Estrazzjoni

5.2.1. Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, minn 5 g sa 10 g tal-kampjun f’kunjett koniku ta’ 250 ml b’tapp. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (il-punt 3.8) b’pipetta. Poġġi t-tapp b’mod laxk u dawwar biex tħawwad. Poġġi l-kunjett f’banju ultrasoniku (il-punt 4.1) f’madwar 40 °C għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Ħallih joqgħod għal madwar siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwota minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (il-punt 4.2) f’reċipjent xieraq. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.3).

5.2.2. It-taħlitiet minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g madwar 2 g ta’ taħlita lesta minn qabel mhux mitħuna f’kunjett iggradat ta’ 250 ml. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (il-punt 3.8) u dawwar biex tħallat. Poġġi l-kunjett u l-kontenut f’banju ultrasoniku (il-punt 4.1) f’madwar 40 °C għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (il-punt 3.8) u ħallat kollox sew. Ħallih joqgħod għal siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwota minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (il-punt 4.2). Żid volum xieraq tal-filtrat ċar b’metanol aċidifikat (il-punt 3.8) biex tkun prodotta soluzzjoni finali tal-eżami li jkun fiha madwar 4 μg/ml ta’ lażaloċid-sodju. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.3).

5.3. Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet segwenti huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn, dment li dawn jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kromatografija likwida kolonna (il-punt 4.3.1):	125 mm × 4 mm, fażi invertita C18, 5 μm ippakkjar jew ekwivalenti
Fażi mobbli (il-punt 3.9):	Taħlita ta’ soluzzjoni buffer tal-fosfat (il-punt 3.7) u metanol (il-punt 3.5), 5 + 95 (V + V)
Rata tal-fluss:	1,2 ml/min
Tul tal-mewġa tad-detezzjoni:	Eċċitazzjoni: 310 nm
	Emissjoni: 419 nm
Volum tal-injezzjoni:	20 μl

Ivverifika l-istabbilità tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni għal diversi drabi tas-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.10.3) li jkun fiha 4,0 μg/ml, sakemm jinkisbu qċaċet ta’ għoli (jew erjas) u ħin ta’ retenzjoni kostanti.

5.3.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (il-punt 3.10.3) bosta drabi u stabbilixxi l-medja tal-għoli tal-quċċata (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar billi tuża l-medji tal-għoli tal-quċċata (erjas) bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet li jikkorrispondu fi μg/ml bħala l-axxissi.

5.3.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratti tal-kampjun miksubin fil-punt 5.2.1 jew 5.2.2 bosta drabi, uża l-istess volum kif meħud fis-soluzzjoni ta’ kalibrar u stabbilixxi l-medja tal-quċċata (erjas) tal-quċċata tal-lażaloċid-sodju.

6. Il-kalkolu tar-riżultati

Mill-medja tal-għoli tal-quċċata (erja) prodotta mill-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.3.3) stabbilixxi l-konċentrazzjoni ta’ lażaloċid-sodju (μg/ml) b’riferenza għall-graff ta’ kalibrar.

6.1. Għalf

Il-kontenut tal-lażaloċid-sodju, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni tal-lażaloċid-sodju tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.1) fi μg/ml
V1	=	volum tal-estratt tal-kampjun skont il-punt 5.2.1 f’ml (jiġifieri 100)
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

6.2. It-taħlitiet minn qabel

Il-kontenut tal-lażaloċid-sodju, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni tal-lażaloċid-sodju tas-soluzzjoni tal-kampjun (il-punt 5.2.2) fi μg/ml
V2	=	volum tal-estratt tal-kampjun skont il-punt 5.2.2 f’ml (jiġifieri 250)
f	=	il-fattur ta’ dilwizzjoni skont il-punt 5.2.2
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

Il-metodi bbażati fuq l-ispettrofluworometrija huma inqas soġġetti għal interferenza minn dawk li fihom tintuża d-detezzjoni bl-UV. L-identità tal-analizzat tista’ tiġi ikkonfermata bil-kokromatografija.

7.1.1. Kokromatografija

L-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) huwa ffortifikat biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3). L-ammont ta’ lażaloċid-sodju miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ lażaloċid-sodju li jinstab fl-estratt tal-kampjun. L-għoli tal-quċċata tal-lażaloċid-sodju biss għandu jittejjeb wara li jitqies l-ammont ta’ lażaloċid-sodju miżjud u d-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ tal-quċċata oriġinali prodotta mill-estratt mhux iffortifikat tal-kampjun.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fl-istess kampjun ma għandhiex tkun aktar minn:

—	15 % relattiva għall-għola valur għall-kontenuti ta’ lażaloċid-sodju minn 30 mg/kg sa 100 mg/kg;

—	15 mg/kg għall-kontenuti ta’ lażaloċid-sodju minn 100 mg/kg sa 200 mg/kg;

—	7,5 % fir-rigward tal-ogħla valur għall-kontenuti ta’ lażaloċid-sodju ta’ aktar minn 200 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għall-kampjun (bjank) iffortifikat, l-irkupru għandu jkun mill-anqas 80 %. Għall-kampjuni ffortifikati ta’ taħlit minn qabel, l-irkupru għandu jkun mill-anqas 90 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv (*2) li fih, 2 taħlitiet lesti minn qabel (kampjuni 1 u 2) u 5 kampjuni ta’ għalf (kampjuni 3–7) ġew analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżijiet duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

Kampjun 1

Taħlita lesta minn qabel għat-tiġieġ

Kampjun 2

Taħlita lesta minn qabel għad-dundjani

Kampjun 3

Prietken għad-dundjani

Kampjun 4

Frak għat-tiġieġ

Kampjun 5

Għalf għad-dundjani

Kampjun 6

Għalf għall-pollam A

Kampjun 7

Għalf għall-pollam B

Medja [mg/kg]

5 050

16 200

76,5

78,4

92,9

48,3

32,6

sr [mg/kg]

107

408

1,71

2,23

2,27

1,93

1,75

CVr [%]

2,12

2,52

2,24

2,84

2,44

4,00

5,37

sR [mg/kg]

286

883

3,85

7,32

5,29

3,47

3,49

CVR [%]

5,66

5,45

5,03

9,34

5,69

7,18

10,70

Kontenut nominali [mg/kg]

5 000 (*3)

16 000 (*3)

80 (*3)

105 (*3)

120 (*3)

50 ((+))

35 ((+))

L =	numru ta’ laboratorji

n =	numru ta’ riżultati singoli

sr =	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

sR =	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVr =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR =

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

H. DETERMINAZZJONI TAL-IDROKLORUR TAL-AMPROLJU

klorur monoidroklorur tal-1-[(4-ammino-2-propil-5-pirimidinil)metil]-2-metilpiridinju

1. Skop u Kamp ta’ applikazzjoni

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ amprolju fl-għalf. Il-limitu ta’ detezzjoni huwa 1 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt b’taħlita ta’ ilma u metanol. Wara dilwizzjoni bil-fażi mobbli u l-filtrazzjoni bil-membrana, il-kontenut tal-amprolju huwa determinat permezz ta’ kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja bi skambju katoniku (HPLC), bl-użu ta’ detettur bl-UV.

3. Reaġenti

3.1.

Metanol

3.2.

Aċetonitril, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.3.

Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.4.

Soluzzjoni ta’ fosfat tad-diidroġenu, c = 0,1 mol/l

Dewweb 13,80 g diidroġenufosfat tas-sodju monoidratat fl-ilma (il-punt 3.3) f’kunjett iggradat b’ 1 000 ml, żid sal marka bl-ilma (il-punt 3.3) u ħallat.

3.5.

Soluzzjoni ta’ perklorat tas-sodju, c = 1,6 mol/l

Dewweb 224,74 g perklorat tas-sodju monoidratat fl-ilma (il-punt 3.3) f’kunjett iggradat ta’1 000 ml, żid sal marka bl-ilma (il-punt 3.3) u ħallat.

3.6.

Fażi mobbli għall-HPLC (ara l-punt ta’ osservazzjoni 9.1).

Taħlita ta’ aċetonitril (il-punt 3.2), soluzzjoni ta’ diidroġenufosfat tas-sodju (il-punt 3.4) u ta’ soluzzjoni ta’ perklorat tas-sodju (il-punt 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Qabel l-użu iffiltra minn filtru tal-membrana a 0,22 μm (il-punt 4.3) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (e.g. Fil-banju ultrasoniku (il-punt 4.4) għal mill-inqas 15-il minuta).

3.7.

Sustanza standard: amprolju pur, klorur tal-1-[(4-ammino-2-propil-5-pirimidinil)metil]-2-metilpiridinju, E 750 (ara l-punt 9.2)

3.7.1.

Soluzzjoni standard stokk tal-amprolju, 500 mg/ml

Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg tal-amprolju (il-punt 3.7) f’kunjett ta’ 100 ml iggradat, dewweb fi 80 ml metanol (il-punt 3.1) u qiegħed il-kunjett għal 10 min f’banju ultrasoniku (il-punt 4.4). Wara t-trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni għat-temperatura ambjentali, żid sal-marka bl-ilma u ħallat. F’temperatura ta’ ≤ 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar (1).

3.7.2.

Is-soluzzjoni standard intermedja tal-amprolju, 50 μg/ml

Ippipetta 5,0 ml tas-soluzzjoni standard stokk (il-punt 3.7.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka bis-solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.8) u ħallat. F’temperatura ta’ ≤ 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar (1).

3.7.3.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 0,5, 1,0 u 2,0 ml tas-soluzzjoni intermedja standard (il-punt 3.7.2) f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 50 ml. Żid sal-marka bil-fażi mobbli (il-punt 3.6) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 0,5, 1,0 u 2,0 μg tal-amprolju għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski qabel l-użu.

3.8.

Solvent ta’ estrazzjoni

Taħlita tal-metanol (il-punt 3.1)-ilma 2 + 1 (v + v)

4. Apparat

4.1.

Tagħmir tal-HPLC b’sistema ta’ injezzjoni, adattat għall-injettar ta’ volumi ta’ 100 μl.

4.1.1.

Kolonna għal kromatografija likwida, 125 mm × 4 mm, skambju tal-katjoni Nucleosil 10 SA, 5 jew 10 μm ippakkjar, jew ekwivalenti.

4.1.2.

detettur bil-UV b’aġġustament varjabbli ta’ tul tal-mewġa jew detettur b’serje ta’ dijodi.

4.2.

Filtru tal-membrana, materjal PTFE, 0,45 μm.

4.3.

Filtri tal-membrana, 0,22 μm.

4.4.

Banju ultrasoniku.

4.5.

Apparat li jħawwad mekkanikament jew ħawwad manjetiku.

5. Proċedura

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf fl-inbjank

Biex isir it-test tal-irkupru (il-punt 5.1.2) għandu jkun analizzat għalf fl-inbjank biex jiġi vverifikat li la l-amprolju u lanqas is-sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. L-għalf fl-inbjank ma għandux ikun ta’ tip simili għal dak tal-kampjun u l-amprolju jew inkella s-sustanzi intereferenti ma għandhomx ikunu rilevati.

5.1.2. Test tal-irkupru

Għandu jsir test tal-irkupru bl-analiżi tal-għalf fl-inbjank li jkun ġie ffortifikat b’żieda ta’ kwantità ta’ amprolju, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Sabiex jiġi ffortifikat il-livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni standard stokk, (il-punt 3.7.1) għal kunjett koniku ta’ 250 ml u ħalliha tevapora għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml. Żid 50 g mill-għalf mingħajr kampjun, ħawwad sew u ħallih għal 10 minuti u erġa’ ħawwad għal ħafna drabi qabel tkompli bil-pass tal-estrazzjoni (il-punt 5.2).

Inkella, jekk għalf fl-inbjank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara l-punt 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa ffortifikat bi kwantità ta’ amprolju simili għal dak diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux iffortifikat u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat permezz tat-tnaqqis.

5.2. Estrazzjoni

5.2.1. Taħlitiet lesti minn qabel (kontenut < 1 % amprolju) u għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, 5 sa 40 g tal-kampjun, jiddependi fuq il-kontenut tal-amprolju, f’kunjett koniku ta’ 500 ml u żid 200 ml tas-solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.8). Qiegħed il-kunjett f’banju ultrasoniku (il-punt 4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa (1) fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (il-punt 4.5). Iddilwixxi alikwota tal-estratt bil-fażi mobbli (il-punt 3.6) b’kontenut tal-amprolju ta’ 0,5–2 μg/ml u ħawwad (ara l-osservazzjoni 9.3). Iffiltra 5 sa 10 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita b’filtru tal-membrana (il-punt 4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.3).

5.2.2. Taħlitiet lesti minn qabel (kontenut ≥ 1 % amprolju)

Iżen sal-eqreb 0,001 g, 1 sa 4 g tat-taħlita lesta minn qabel, jiddependi fuq il-kontenut tal-amprolju, f’kunjett koniku ta’ 500 ml u żid 200 ml tas-solvent tal-estrazzjoni (il-punt 3.8). Qiegħed il-kunjett f’banju ultrasoniku (il-punt 4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa (1h) fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (il-punt 4.5). Iddilwixxi l-alikwota tal-estratt bil-fażi mobbli (il-punt 3.6) b’kontenut tal-amprolju ta’ 0,5–2 μg/ml u ħawwad. Iffiltra 5 sa 10 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita b’filtru tal-membrana (il-punt 4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (il-punt 5.3).

5.3. Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromatografija likwida (il-punt 4.1.1):	125 mm × 4 mm, skambju tal-katjoni Nucleosil 10 SA, 5 jew 10 μm ippakkjar, jew ekwivalenti
Fażi mobbli (il-punt 3.6):	Taħlita ta’ aċetonitril (il-punt 3.2), soluzzjoni ta’ diidroġenufosfat tas-sodju (il-punt 3.4) u ta’ soluzzjoni ta’ perklorat tas-sodju (il-punt 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v).
Rata tal-fluss:	0,7 –1 ml/min
Tul tal-mewġa tad-detezzjoni:	264 nm
Volum tal-injezzjoni:	100 μl

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (il-punt 3.7.3) li fiha 1,0 μg/ml, għal diversi drabi, sakemm jinkisbu għoli tal-qċaċet u ħinijiet ta’ retenzjoni kostanti.

5.3.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (il-punt 3.7.3) bosta drabi u stabbilixxi l-medja tal-għoli tal-quċċata (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff tal-kalibrar billi tuża l-medja tal-għoli tal-quċċata (erjas) tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f’μg/ml bħala l-axxissi.

5.3.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (il-punt 5.2) diversi drabi billi tuża’ l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erjas) ta’ amprolju.

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-qċaċet tal-amprolju tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff tal-kalibrar (il-punt 5.3.2).

Il-kontenut ta’ amprolju w f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja:

fejn:

V	=	il-volum tal-estratt tas-solvent (il-punt 3.8) f’ml skont il-punt 5.2 (jiġifieri 200 ml)
c	=	konċentrazzjoni ta’ amprolju tal-estratt tal-kampjun (il-punt 5.2) f’μg/ml
f	=	il-fattur ta’ dilwizzjoni skont il-punt 5.2
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

L-identità tal-analit tista’ tiġi kkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża detettur b’serje ta’ dijodi li bih jitqabblu l-ispettra tal-estratt tal-kampjun (il-punt 5.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.7.3) li jkun fiha 2,0 μg/ml.

7.1.1. Kokromatografija

Estratt tal-kampjun (il-punt 5.2) huwa ffortifikat biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrar (il-punt 3.7.3). L-ammont tal-amprolju miżjud għandu jkun simili għall-ammont tal-amprolju li jinstab fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-quċċata tal-amprolju biss għandu jiġi mtejjeb wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-diluwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli tagħha, għandu jkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-quċċata tal-amprolju tal-estratt tal-kampjun mhux iffortifikat.

7.1.2. detezzjoni b’serje ta’ dijodi

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)

It-tul tal-mewġa tal-assorbiment massimu tal-ispettra tal-kampjun u ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġini determinata mis-setgħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema tad-detezzjoni. Ghad-detezzjoni b’serje ta’ dijodi, dan huwa tipikament sa ± 2 nm.

(b)

Bejn 210 u 320 nm, l-ispettra tal-kampjun u tal-istandard irreġistrati fl-apiċi tal-quċċata tal-kromatogramma, ma għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa 10-100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jkun issodisfat meta l-istess massimi jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-analit standard.

(c)

Bejn 210 u 320 nm, l-ispettra tal-inklinazzjoni ’l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ’l isfel tal-quċċata prodotta mill-estratt tal-kampjun ma għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-firxa ta’ 10-100 % tal-assorbanza relattiva. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbanza tal-ispettru tal-apiċi tal-quċċata.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fl-istess kampjun ma għandhiex tkun aktar minn:

—	15 % relattiv għall-valur ogħla għal kontenuti ta’l-amprolju minn 25 mg/kg sa 500 mg/kg.

—	75 mg/kg għal kontenuti tal-amprolju bejn 500 mg/kg u 1 000 mg/kg.

—	7,5 % relattiv għall-valur l-aktar għoli għall-kontenuti tal-amprolju ta’ aktar minn 1 000 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għal kampjun iffortifikat (fl-inbjank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 90 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati tliet tipi ta’ għalf tat-tjur (il-kampjun 1-3), għalf minerali wieħed (il-kampjun 4) u taħlita waħda minn qabel (il-kampjun 5). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

kampjun 1 (għalf inbjank)

kampjun 2

kampjun 3

kampjun 4

kampjun 5

medja [mg/kg]

—

45,5

188

5 129

25 140

sr [mg/kg]

—

2,26

3,57

178

550

CVr [%]

—

4,95

1,90

3,46

2,20

sR [mg/kg]

—

2,95

11,8

266

760

CVR [%]

—

6,47

6,27

5,19

3,00

kontenut nominali [mg/kg]

—

200

5 000

25 000

L:	numru ta’ laboratorji

n:	numru ta’ valuri singoli

sr:	devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr:	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

sR:	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR:	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

9. Osservazzjonijiet

9.1.

Jekk il-kampjun ikun fih it-tijamina, l-ogħla livell tat-tijamina fil-kromatogramma jidher ftit qabel il-quċċata tal-amprolju. Wara dan il-metodu l-amprolju u t-tijamina għandhom jiġu sseparati. Jekk l-amprolju u t-tijamina ma jiġux isseparati bil-kolonna (il-punt 4.1.1) użata f’dan il-metodu, issostitwixxi sa 50 % tal-porzjon tal-aċetonitril tal-fażi mobbli (il-punt 3.6) bil-metanol.

9.2.

Skont il-British Pharmacopoeia, l-ispettru tas-soluzzjoni tal-amprolju (c = 0,02 mol/l) f’aċidu idrokloriku (c = 0,1 mol/l) juri massimi fi 246 nm u 262 nm. L-assorbanza għandu jammonta għal 0,84 b’246 nm u 0,80 b’262 nm.

9.3.

L-estratt għandu dejjem jiġi dilwit bil-fażi mobbli, għax inkella l-ħin ta’ retenzjoni tal-quċċata tal-amprolju jista’ jiċċaqlaq b’mod sinifikanti, minħabba bidliet fis-saħħa jonika.

I. DETERMINAZZJONI TAN-NARASINA

Il-kontenut tan-narasina għandu jiġi ddeterminat permezz ta’

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	il-metodu pprovdut mill-EN ISO 14183 Għalf għall-annimali — Determinazzjoni ta’ kontenut ta’ monensina, narasina u salinomiċina — Metodu kromatografiku likwidu bl-użu ta’ derivatizzazzjoni postkolonna

J. DETERMINAZZJONI TAN-NIKARBAŻINA

Il-kontenut tan-nikarbazina għandu jiġi ddeterminat permezz ta’:

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	il-metodu pprovdut mill-EN 15782 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tan-nikarbażina — Metodu kromatografiku likwidu bi prestazzjoni għolja.

K. DETERMINAZZJONI TAD-DEKOKINAT

Il-kontenut ta’ dekokinat għandu jiġi ddeterminat permezz ta’:

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	il-metodu pprovdut mill-EN 16162 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tad-dekokinat bl-HPLC bid-detezzjoni fluworexxenti.

L. DETERMINAZZJONI TAL-MONENSINA

Il-kontenut tal-monensina għandu jiġi ddeterminat permezz ta’

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	il-metodu pprovdut mill-EN ISO 14183 Għalf għall-annimali — Determinazzjoni ta’ kontenut ta’ monensina, narasina u salinomiċina — Metodu kromatografiku likwidu bl-użu ta’ derivatizzazzjoni postkolonna.

M. DETERMINAZZJONI TAS-SALINOMIĊINA

Il-kontenut ta’ salinomiċina għandu jiġi ddeterminat permezz ta’

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	il-metodu pprovdut mill-EN ISO 14183 Għalf għall-annimali — Determinazzjoni ta’ kontenut ta’ monensina, narasina u salinomiċina — Metodu kromatografiku likwidu bl-użu ta’ derivatizzazzjoni postkolonna.

N. DETERMINAZZJONI TAS-SEMDURAMIĊINA

Il-kontenut ta’ semduramiċina għandu jiġi ddeterminat bi:

—

il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17299 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Skrinjar u determinazzjoni ta’ koċċidjostati awtorizzati fil-livell ta’ addittiv u f’1 % u 3 % ta’ kontaminazzjoni kroċjata, u ta’ koċċidjostati mhux irreġistrati u ta’ antibijotiku wieħed f’livelli ta’ subaddittivi, fl-għalf kompost b’Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja — detezzjoni tal-Ispettrometrija tal-Massa f’Tandem (LC-MS/MS), jew

—	il-metodu pprovdut mill-EN 16158 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-kontenut ta’ semduramiċina — Metodu kromatografiku likwidu bl-użu ta’ approċċ analitiku “siġra”.

O. STANDARDS EN

Għall-applikazzjoni tal-Artikolu 34(2)(a) tar-Regolament (UE) 2017/625, huma rilevanti l-istandards EN li ġejjin:

EN ISO 30024 Oġġetti tal-għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-attività tal-fitażi

EN 17050 Għalf tal-annimali — metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-jodju fl-għalf tal-annimali mill-ICP-MS

EN 17550 Għalf tal-annimali: Determinazzjoni tal-karotenojdi fl-għalf kompost tal-annimali u taħlitiet lesti minn qabel permezz ta’ kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja — detezzjoni bil-UV (HPLC-UV)

EN 15784 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Detezzjoni u enumerazzjoni ta’ Bacillus spp

EN 15785 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi Isolazzjoni u enumerazzjoni ta’ Bifidobacterium spp.

EN 15786 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi Detezzjoni u enumerazzjoni ta’ Pediococcus spp

EN 15787 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Detezzjoni u enumerazzjoni ta’ Lactobacillus spp. użat bħala addittiv fl-għalf

EN 15788 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Detezzjoni u enumerazzjoni tal-Enterococcus (E. faecium) spp. użat bħala addittiv tal-għalf

EN 15789 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Detezzjoni u enumerazzjoni ta’ Saccharomyces cerevisiae użat bħala addittiv fl-għalf

EN 15510 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kalċju, tas-sodju, tal-fosforu, tal-manjeżju, tal-potassju, tal-ħadid, taż-żingu, tar-ram, tal-manganiż, tal-kobalt, tal-molibdenu, u taċ-ċomb mill-ICP-AES (għall-analiżi tal-addittivi tal-għalf: il-kobalt u l-molibdenu)

EN 15621 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid tal-kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kalċju, tas-sodju, tal-fosforu, tal-manjeżju, tal-potassju, tal-kubrit, tal-ħadid, taż-żingu, tar-ram, tal-manganiż u tal-kobalt wara diġestjoni bil-pressjoni mill-ICP-AES (għall-analiżi tal-addittivi tal-għalf: il-kobalt)

EN 16159 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tas-selenju permezz tal-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku bil-ġenerazzjoni tal-idruri (HGAAS) wara d-diġestjoni bil-microwave (diġestjoni b’65 % aċidu nitriku u 30 % perossidu tal-idroġenu) (għall-analiżi tal-addittiv tal-għalf: is-selenju)

EN 17053: Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni ta’ mikroelementi, metalli tqal u elementi oħra fl-għalf mill-ICP-MS (multimetodu) (għall-analiżi tal-addittivi tal-għalf:il-kobalt, il-molibdenu, u s-selenju)

”

(1) Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17547 huwa msemmi bħala metodu alternattiv li għandu jintuża għall-finijiet ta’ kontroll uffiċjali għad-determinazzjoni tal-vitamini A u E minflok il-metodu deskritt għad-determinazzjoni tal-vitamina A fil-parti A ta’ dan l-Anness u għall-vitamina E fil-parti B ta’ dan l-Anness.

(2) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3) Il-metodu ta’ analiżi previst mill-EN 17547 huwa msemmi bħala metodu alternattiv li għandu jintuża għall-finijiet ta’ kontroll uffiċjali għad-determinazzjoni tal-vitamini A u E minflok il-metodu deskritt għad-determinazzjoni tal-vitamina A fil-parti A ta’ dan l-Anness u għall-vitamina E fil-parti B ta’ dan l-Anness.

(4) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(5) Dan il-metodu ġie vvalidat permezz ta’ prova kollaborattiva għal diversi matriċijiet tal-għalf. Għal aktar informazzjoni, ikkonsulta https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.

(6) Jistgħu jintużaw metodi ta’ diġestjoni oħrajn dment li dawn ikunu wrew li jwasslu għal riżultati simili (bħad-diġestjoni permezz tal-pressa bil-micowave).

(7) Għalf aħdar (frisk jew imnixxef) aktarx ikun fih ammonti kbar ta’ siliċe veġetali, li tista’ żżomm fiha l-mikroelementi u għandha titneħħa. Għal kampjuni ta’ dan l-għalf, għalhekk, għandha tiġi segwita l-proċedura modifikata segwenti. Wettaq operazjoni 5.1.1.1 sal-fażi tal-filtrazjoni. Aħsel il-karta tal-filtru, li jkun fiha r-residwu mhux maħlul, darbtejn b’ilma jagħli u poġġiha fi griġjol tal-kwarz jew tal-platinu.

Ixgħel il-muffle furnace (il-punt 4.1) b’temperatura taħt il-550 °C sakemm il-materjal karbonjuż kollu jkun sparixxa għal kollox. Ħallih jibred, żid ftit qtar ta’ ilma segwit b’10 sa 15 ml ta’ aċidu idrofluworiku (il-punt 3.4) u evapora sakemm jinxef f’madwar 150 °C. Jekk tibqa’ xi silika fir-residwu, dewweb mill-ġdid fi ftit millilitri ta’ aċidu idrofluworiku (il-punt 3.4) u evapora sakemm jixxotta. Żid ħames qatriet ta’ aċidu sulfuriku (il-punt 3.5) u saħħan sakemm ma jibqgħux jiġu rilaxxati dħaħen bojod. Wara ż-żieda ta’ 5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (il-punt 3.2) u madwar 30 ml ta’ ilma, saħħan, iffiltra s-soluzzjoni f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml u wassal sal-marka b’ilma (konċentrazzjoni ta’ HCI ta’ madwar 0,5 mol/l). Imbagħad ipproċedi bid-determinazzjoni mill-punt 5.1.2.

(8) The Analyst 108, 1983, pp. 1252 sa 1256.

(9) Il-metodu jista’ jkun applikabbli wkoll għad-determinazzjoni tad-diklażuril fil-materjali tal-għalf.

(10) Stabbiltà itwal (sa sena (1)) tista’ tkun possibbli iżda trid tiġi kkonfermata mil-laboratorju individwali.

(*1) L-ewwel studju mill-1994: Journal of AOAC International, Volume 77, No 6, 1994, p. 1359-1361; It-tieni studju mill-2015: Rapport Tekniku tal-JRC “ Re-validation of a method for the determination of diclazuril by collaborative study ” (2016).

(*2) Analyst, 1995, 120, p. 2175-2180.

(*3) Kontenut iddikjarat mill-manifattur.

((+)) Għalf ippreparat fil-laboratorju.

ANNESS V

“ANNESS V

METODI TA ANALIŻI BIEX JIĠU KKONTROLLATI S-SUSTANZI MHUX MIXTIEQA FL-GĦALF

A. DETERMINAZZJONI TAL-LIVELLI TA’ DIOSSINI (PCDD/PCDF) U TA’ PCBs

KAPITOLU I

METODI TA’ TEĦID TA’ KAMPJUNI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI ANALITIĊI

1. Kamp ta’ applikazzjoni u definizzjonijiet

Il-kampjuni intiżi għall-kontroll uffiċjali tal-livelli ta’ dibenżo-p-diossini poliklorinati (PCDDs), dibenżofurani poliklorinati (PCDFs), poliklorobifenili simili għad-diossini (PCBs) (1) u PCBs mhux simili għad-diossini fl-għalf għandhom jittieħdu f’konformità mad-dispożizzjonijiet tal-Anness I. Ir-rekwiżiti kwantitattivi f’rabta mal-kontroll tas-sustanzi jew il-prodotti ddistribwiti b’mod uniformi fl-għalf kif previst fil-punt 5.1 tal-Anness I għandhom jiġu applikati. Aggregazzjoni ta’ kampjuni li tkun inkisbet għandha tiġi kkunsidrata bħala rappreżentattiva tal-lottijiet jew tas-sublottijiet li minnhom tkun ittieħdet. Għandha tiġi ddeterminata konformità mal-livelli massimi stipulati mid-Direttiva 2002/32/KE fuq bażi tal-livelli ddeterminati fil-kampjuni tal-laboratorju.

Għall-finijiet ta’ din il-Parti, għandhom japplikaw id-definizzjonijiet tal-Anness I tad-Deċiżjoni ta’ Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2021/808 (2).

Minbarra dawk id-definizzjonijiet, id-definizzjonijiet li ġejjin għandhom japplikaw għall-finijiet ta’ din il-Parti:

“Metodi tal-iskrinjar” tfisser il-metodi użati għall-għażla ta’ dawk il-kampjuni b’livelli ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini li jaqbżu l-livelli massimi, jew il-livelli ta’ azzjoni. Dawn għandhom jippermettu ammont qawwi ta’ teħid ta’ kampjuni kosteffiċjenti, biex b’hekk iżidu l-possibbiltà li jiġu skoperti każijiet ġodda ta’ esponiment għoli tal-konsumaturi u ta’ riskji għal saħħithom. Il-metodi ta’ skrinjar għandhom ikunu bbażati fuq metodi bijoanalitiċi jew metodi GC-MS. Ir-riżultati minn kampjuni li jaqbżu l-valur ta’ limitu użat biex tiġi vverifikata l-konformità mal-livell massimu għandhom jiġu verifikati bl-użu ta’ rianaliżi sħiħa mill-kampjun oriġinali b’metodu ta’ konferma.

“Metodi ta’ konferma” tfisser metodi li jipprovdu informazzjoni sħiħa jew kumplimentarja li tippermetti li jiġu identifikati l-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini u li dawn jiġu kkwantifikati mingħajr żball fil-livell massimu jew fil-każ ta’ ħtieġa fil-livell ta’ azzjoni. Dawn il-metodi jużaw kromatografija b’fażi gassuża/spettrometrija tal-massa b’riżoluzzjoni għolja (GC-HRMS) jew kromatografija b’fażi gassuża/spettrometrija tal-massa tandem (GC-MS/MS).

2. Konformità tal-lott jew tas-sublott mal-livell massimu

2.1. Fir-rigward ta’ PCBs mhux simili għad-diossini

Il-lott jew is-sublott jikkonforma mal-livell massimu jekk ir-riżultat analitiku tas-somma ta’ PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 u PCB 180 (minn hawn ’il quddiem imsejħa PCBs mhux simili għad-diossini) ma jaqbiżx il-livell massimu stabbilit mid-Direttiva 2002/32/KE, b’qies tal-inċertezza tal-kejl estiża (3). Il-lott jew is-sublott ma jikkonformax mal-livell massimu kif stabbilit mid-Direttiva 2002/32/KE, jekk il-medja taż-żewġ riżultati analitiċi ta’ livell superjuri (4) miksuba minn analiżijiet duplikati (5),b’qies tal-inċertezza tal-kejl estiża, raqbeż il-livell massimu bla dubju raġjonevoli, jiġifieri l-konċentrazzjoni analizzata wara li titnaqqas l-inċertezza tal-kejl estiża tintuża biex tiġi evalwata l-konformità.

L-inċertezza tal-kejl estiża hija kkalkulata bl-użu ta’ fattur ta’ kopertura ta’ 2 li jagħti livell ta’ kunfidenza ta’ madwar 95 %. Lott jew sublott ma jkunx konformi jekk il-medja tal-valuri mkejla nieqes l-inċertezza estiża tal-medja tkun ogħla mil-livell massimu.

Ir-regoli, imsemmija fil-paragrafi hawn fuq taħt dan il-punt, għandhom japplikaw għar-riżultat analitiku miksub fuq il-kampjun għall-kontroll uffiċjali. Fil-każ ta’ analiżi għal skopijiet ta’ opinjoni esperta oħra jew ta’ referenza, għandhom japplikaw ir-regoli nazzjonali.

2.2. Rigward il-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini

Il-lott jew sublott ikun jaqbel mal-livell massimu jekk ir-riżultat ta’ analiżi waħda

—	imwettqa minn metodu ta’ skrinjar b’rata ta’ konformità falza taħt il-5 %, jindika li l-livell ma jaqbiżx il-livell massimu rispettiv ta’ PCDD/Fs u s-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini stipulati mid-Direttiva 2002/32/KE,

—	imwettqa minn metodu ta’ konferma, ma jaqbiżx il-livell massimu rispettiv ta’ PCDD/Fs u s-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini stipulati mid-Direttiva 2002/32/KE, meta wieħed jikkunsidra l-inċertezza tal-kejl estiża.

Għal assaġġi tal-iskrinjar għandu jkun stabbilit valur ta’ limitu għal deċiżjonijiet dwar il-konformità tal-kampjuni mal-livelli massimi rispettivi stipulati jew għal PCDD/Fs, jew inkella għas-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini.

Il-lott jew is-sublott ma jikkonformax mal-livell massimu kif stabbilit mid-Direttiva 2002/32/KE, jekk il-medja taż-żewġ riżultati analitiċi ta’ livell superjuri (6) miksuba minn analiżi (7), duplikata, bl-użu ta’ metodu ta’ konferma, b’qies tal-inċertezza tal-kejl estiża, taqbeż il-livell massimu bla dubju raġjonevoli, jiġifieri l-konċentrazzjoni analizzata wara li titnaqqas l-inċertezza tal-kejl estiża tintuża biex tiġi evalwata l-konformità.

Is-somma tal-istima tal-inċertezzi estiżi tar-riżultati analitiċi separati tal-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini għandha tintuża għas-somma tal-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini.

Ir-regoli, imsemmija fil-paragrafi hawn fuq taħt dan il-punt, għandhom japplikaw għar-riżultat analitiku miksub fuq il-kampjun għall-kontroll uffiċjali. Fil-każ ta’ analiżi għal skopijiet ta’ difiża jew ta’ referenza, għandhom japplikaw ir-regoli nazzjonali.

3. Riżultati li jaqbżu l-livelli ta’ azzjoni kif stipulat fl-Anness II tad-Direttiva 2002/32/KE

Il-livelli ta’ azzjoni jservu ta’ għodda biex jintgħażlu l-kampjuni f’dawk il-każijiet fejn hu meħtieġ li jiġi identifikat is-sors ta’ kontaminazzjoni u li jittieħdu miżuri biex din titnaqqas jew titneħħa. Il-metodi ta’ skrinjar għandhom jistabbilixxu l-valuri ta’ limitu xierqa għall-għażla ta’ dawk il-kampjuni. F’każ li jkunu meħtieġa sforzi sinifikanti biex ikun identifikat is-sors u biex il-kontaminazzjoni titnaqqas jew tiġi eliminata, ikun xieraq li tiġi konfermata l-qabża fil-livelli ta’ azzjoni bl-analiżi duplikata permezz ta’ metodu ta’ konferma u b’kunsiderazzjoni tal-inċertezza tal-kejl estiża (8).

KAPITOLU II

PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUN U REKWIŻITI GĦALL-METODI TAL-ANALIŻI UŻATI FIL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-LIVELLI TA’ DIOSSINI (PCDD/Fs) U TA’ PCBs SIMILI GĦAD-DIOSSINI FL-GĦALF

1. Qasam tal-applikazzjoni

Ir-rekwiżiti stipulati f’dan il-Kapitolu għandhom jiġu applikati meta l-għalf ikun analizzat għall-kontroll uffiċjali tal-livelli ta’ PCDD/Fs sostituti fi 2,3,7,8 u diossini simili għall-PCBs u fir-rigward ta’ tħejjija ta’ kampjuni u rekwiżiti analitiċi għal għanijiet regolatorji oħrajn, li jinkludu l-kontrolli mwettqa mill-operatur tan-negozju tal-għalf biex jiżgura l-konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (KE) Nru 183/2005 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (9).

Il-monitoraġġ tal-preżenza ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini fl-għalf jista’ jsir għal żewġ tipi differenti ta’ metodi analitiċi:

(a) Metodi ta’ skrinjar

L-għan tal-metodi tal-iskrinjar huwa li jintgħażlu dawk il-kampjuni b’livelli ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini li jaqbżu l-livelli massimi, jew il-livelli ta’ azzjoni. Il-metodi tal-iskrinjar għandhom jiżguraw ammont qawwi ta’ teħid ta’ kampjuni kosteffiċjenti, biex b’hekk iżidu l-possibbiltà li jiġu skoperti każijiet ġodda ta’ esponiment għoli tal-konsumaturi u ta’ riskji għal saħħithom. L-applikazzjoni tagħhom għandha l-għan li jiġu evitati riżultati ta’ konformità falza. Dawn jistgħu jinkludu metodi bijoanalitiċi u ta’ GC-MS.

Il-metodi tal-iskrinjar iqabblu r-riżultat analitiku mal-valur ta’ limitu, filwaqt li jipprovdu deċiżjoni iva/le dwar il-possibbiltà li jkun inqabeż il-livell massimu jew ta’ livell ta’ azzjoni. Huwa meħtieġ li l-konċentrazzjoni ta’ PCDD/Fs u s-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini fil-kampjuni suspettati li mhumiex konformi mal-livell massimu għandha tiġi ddeterminata/kkonfermata permezz ta’ metodu ta’ konferma.

Barra minn hekk, il-metodi ta’ skrinjar jistgħu jagħtu indikazzjoni tal-livelli ta’ PCDD/Fs u ta’ PCBs simili għad-diossini preżenti fil-kampjun. Fil-każ tal-applikazzjoni ta’ metodi ta’ skrinjar bijoanalitiċi r-riżultat jiġi espress bħala Ekwivalenti Bijoanalitiċi (BEQ), filwaqt li f’każ ta’ applikazzjoni ta’ metodi fiżiko-kimiċi GC-MS jiġi espress bħala Ekwivalenti Tossiku (TEQ). Ir-riżultati tal-metodi ta’ skrinjar indikati numerikament huma adattati biex tintwera l-konformità jew is-suspett ta’ nonkonformità jew il-qbiż tal-limiti ta’ azzjoni u jagħtu indikazzjoni tal-firxa ta’ livelli f’każ ta’ segwitu permezz ta’ metodi konfermatorji. Dawn mhumiex adattati għal għanijiet bħalma huma l-evalwazzjoni tal-livelli ta’ sfond, l-istima tal-konsum, is-segwiment tax-xejriet matul iż-żmien f’livelli jew ir-rivalutazzjoni tal-livelli massimi u l-livelli ta’ azzjoni.

(b) Metodi ta’ konferma

Il-metodi ta’ konferma jippermettu l-identifikazzjoni inekwivokabbli u l-kwantifikazzjoni ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini preżenti f’kampjun u jipprovdu informazzjoni sħiħa fil-livell ta’ konġeneri individwali. Għalhekk, dawn il-metodi jippermettu l-kontroll tal-livelli massimi u ta’ livelli ta’ azzjoni, inkluża l-konferma tar-riżultati miksuba permezz tal-metodi ta’ skrinjar. Barra minn hekk, ir-riżultati jistgħu jintużaw għal skopijiet oħra bħalma hija d-determinazzjoni tal-livelli ta’ sfond inferjuri fil-monitoraġġ tal-għalf, is-segwiment tax-xejriet matul iż-żmien, l-istima tal-esponiment u t-tiswir ta’ bażi ta’ data għar-rivalutazzjoni tal-livelli massimi u ta’ livelli ta’ azzjoni. Dawn huma importanti wkoll biex jiġu stabbiliti profili ta’ konġeneri sabiex jiġi identifikat is-sors ta’ kontaminazzjoni potenzjali. Dawn il-metodi jużaw il-GC-HRMS. Jistgħu jintużaw ukoll il-GC-MS/MS għall-konferma tal-konformità jew tan-nonkonformità mal-livell massimu.

2. Kuntest

Għall-kalkolu tal-konċentrazzjonijiet tat-TEQ, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi individwali f’kampjun partikolari għandhom jiġu mmultiplikati mal-Fattur ta’ Ekwivalenza Tossika (TEF) rispettiv tagħhom (ara n-nota f’qiegħ il-paġna 27 tal-Kapitolu I) u sussegwentement magħduda biex jinkiseb it-total tal-konċentrazzjoni tal-komposti simili għad-diossini espress bħala TEQs.

Għall-finijiet ta’ din il-Parti A, il-limitu speċifiku aċċettat ta’ kwantifikazzjoni ta’ konġeneri individwali jfisser il-kontenut l-aktar baxx tal-analita li jista’ jitkejjel b’ċertezza statistika raġonevoli, li jissodisfa l-kriterji ta’ identifikazzjoni kif deskritti fl-istandards rikonoxxuti internazzjonalment, pereżempju, fl-istandard EN 16215:2012 (Għalf għall-annimali — Determinazzjoni tad-diossini u PCBs simili għad-diossini permezz tal-GC-HRMS u ta’ PCBs indikaturi permezz tal-GC-HRMS) u/jew il-metodi EPA 1613 u 1668 kif riveduti.

Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni ta’ konġeneru individwali jista’ jiġi identifikat bħala:

(a)	il-konċentrazzjoni ta’ analit fl-estratt ta’ kampjun li jipproduċi rispons strumentali f’żewġ joni differenti li għandhom jiġu mmonitorjati bi proporzjon S/N (signal/noise) ta’ 3:1 għas-sinjal inqas intensiv ta’ data mhux ipproċessata; jew

(b)

jekk għal raġunijiet tekniċi l-kalkolu signal-to-noise ma jipprovdix riżultati affidabbli, il-punt ta’ konċentrazzjoni l-aktar baxx fuq kurva ta’ kalibrar li jagħti devjazzjoni aċċettabbli (≤ 30 %) u konsistenti (imkejla mill-inqas fil-bidu u fit-tmiem ta’ serje ta’ kampjuni analitiċi) mill-medja tal-fattur ta’ reazzjoni relattiva kkalkulata għal kull punt fuq il-kurva ta’ kalibrar f’kull serje ta’ kampjuni. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni (LOQ) huwa kkalkulat mill-punt ta’ konċentrazzjoni l-aktar baxx b’kunsiderazzjoni tal-irkupru tal-istandards interni u l-intake tal-kampjun.

Metodi ta’ skrinjar bijoanalitiċi mhumiex se jagħtu riżultati f’livell ta’ konġeneru imma biss indikazzjoni (10) tal-livell TEQ, espress f’BEQ sabiex ikun magħruf il-fatt li f’estratt tal-kampjun mhux il-komposti kollha preżenti li jipproduċu rispons f’test jistgħu jissodisfaw ir-rekwiżiti kollha tal-prinċipju TEQ.

Il-metodi ta’ skrinjar u konfermatorji jistgħu jiġu applikati biss għall-kontroll ta’ ċerti matriċi jekk il-metodi huma sensittivi biżżejjed biex jinstabu livelli b’mod li wieħed jista’ joqgħod fuqhom fil-limitu ta’ azzjoni jew il-livell massimu.

3. Rekwiżiti għall-assigurazzjoni tal-kwalità

3.1.

Għandhom jittieħdu miżuri sabiex tkun evitata l-kontaminazzjoni nkroċjata f’kull stadju tal-proċedura tat-teħid ta’ kampjuni u tal-analiżi.

3.2.

Il-kampjuni għandhom jinħażnu u jiġu ttrasportati f’kontenituri tal-ħġieġ, tal-aluminju, tal-polipropilen jew tal-polietilen adattati għall-ħżin mingħajr ebda influwenza fuq il-livelli ta’ PCDD/Fs u ta’ PCBs simili għad-diossini fil-kampjuni. Traċċi ta’ trab tal-karti għandhom jitneħħew mill-kontenitur tal-kampjun.

3.3.

Il-ħażna u t-trasport tal-kampjuni għandhom jitwettqu b’mod li tinżamm l-integrità tal-kampjun tal-għalf.

3.4.

Sa fejn huwa rilevanti, kull kampjun tal-laboratorju għandu jkun mitħun fin u mħallat sew permezz ta’ proċess li jkun intwera li jista’ jikseb omoġenizzazzjoni kompluta (pereżempju tħin li jgħaddi minn arbiel ta’ 1 mm). Il-kampjuni għandhom jitnixxfu qabel ma jiġu mitħuna jekk il-kontenut ta’ ndewwa jkun għoli wisq.

3.5.

Għandu jsir kontroll tar-reaġenti, tal-oġġetti tal-ħġieġ u tat-tagħmir għall-possibbiltà ta’ influwenza tar-riżultati bbażati fuq it-TEQ jew il-BEQ.

3.6.

Għandha ssir analiżi inbjank billi ssir il-proċedura analitika sħiħa filwaqt li jitħalla barra l-kampjun biss.

3.7.

Għall-metodi bijoanalitiċi, l-oġġetti kollha tal-ħġieġ u s-solventi użati fl-analiżi għandhom ikunu ttestjati biex ikunu ħielsa minn komposti li jistgħu jfixklu d-detezzjoni tal-komposti fil-mira fil-firxa ta’ ħidma. L-oġġetti tal-ħġieġ għandhom jitlaħalħu b’solventi jew jissaħnu f’temperaturi adattati biex ineħħu kull traċċa ta’ PCDD/Fs, komposti simili għad-diossini u komposti interferenti, mill-wiċċ tagħhom.

3.8.

Il-kwantità ta’ kampjuni użata għall-estrazzjoni għandha tkun biżżejjed biex tissodisfa r-rekwiżiti b’kunsiderazzjoni ta’ firxa ta’ ħidma baxxa biżżejjed inkluż il-konċentrazzjonijiet tal-livelli massimi jew il-livell ta’ azzjoni.

3.9.

Il-proċeduri speċifiċi ta’ preparazzjoni tal-kampjun użati għall-prodotti meqjusa għandhom isegwu l-linji gwida aċċettati internazzjonalment, i.e. EN ISO 6498.

4. Rekwiżiti għal-laboratorji

4.1.

F’konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (UE) 2017/625, il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati minn korp rikonoxxut li jopera skont il-Gwida ISO/IEC 58 biex jiżgura li dawn qegħdin japplikaw assigurazzjoni ta’ kwalità analitika. Il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati skont l-istandard EN ISO/IEC 17025. Il-prinċipji mfissra fil-Linji Gwida Tekniċi għall-istima tal-inċertezza tal-kejl u l-limiti ta’ kwantifikazzjoni għall-analiżi tal-PCDD/F u l-PCB għandhom jiġu segwiti (11).

4.2.

Il-profiċjenza tal-laboratorju għandha tiġi ppruvata permezz tal-parteċipazzjoni kontinwa b’suċċess fi studji interlaboratorji għad-determinazzjoni ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini fil-matriċijiet tal-għalf rilevanti u fil-firxiet ta’ konċentrazzjoni.

4.3.

Il-laboratorji li japplikaw metodi ta’ skrinjar għall-kontroll ta’ rutina għandhom jistabbilixxu kooperazzjoni mill-qrib ma’ laboratorji li japplikaw il-metodi ta’ konferma, kemm għall-kontroll ta’ kwalità kif ukoll għall-konferma tar-riżultat analitiku ta’ kampjuni suspettużi.

5. Rekwiżiti bażiċi li għandhom jiġu ssodisfati bil-proċedura analitika għad-diossini (PCDD/Fs) u PCBs simili għad-diossini

5.1. Firxa ta’ ħidma baxxa u limiti ta’ kwantifikazzjoni

Għal PCDD/Fs, il-kwantitajiet li jistgħu jinstabu għandhom ikunu fil-firxa femtogramma superjuri (10-15 g) minħabba t-tossiċità estrema ta’ xi wħud minn dawn il-komposti. Għall-biċċa l-kbira tal-konġeneri tal-PCB, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni fil-firxa tan-nanogrammi (10-9 g) diġà huwa biżżejjed. Għall-kejl tal-konġeneri ta’ PCB simili għad-diossini li huma aktar tossiċi (b’mod partikolari konġeneri sostituti mhux orto) il-livell inferjuri tal-firxa ta’ ħidma għandu jilħaq il-livelli pikogrammi (10-12 g). Għall-kumplament tal-konġeneri ta’ PCB il-limitu ta’ kwantifikazzjoni fil-firxa tan-nanogrammi (10-9 g) huwa suffiċjenti.

5.2. Selettività għolja (speċifiċità)

5.2.1.

Jeħtieġ li ssir distinzjoni bejn PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini u għadd kbir ta’ komposti oħra koestratti u possibbilment interferenti li jkunu preżenti f’konċentrazzjonijiet ta’ daqs ferm akbar minn dawk tal-analiti ta’ interess. Għall-metodi ta’ GC-MS, hija meħtieġa differenza fost il-konġeneri varji, bħal pereżempju bejn it-tossiċità (pereżempju, is-sbatax-il sostitut 2,3,7,8 PCDD/Fs u tnax-il PCBs simili għad-diossini) u konġeneri oħrajn.

5.2.2.

Il-metodi bijoanalitiċi għandhom ikunu kapaċi jindividwaw il-komposti fil-mira fl-għamla tas-somma tal-PCDD/Fs, u/jew tal-PCBs simili għad-diossini. It-tindif tal-kampjun għandu jimmira li jneħħi l-komposti li jikkawżaw riżultati ta’ nuqqas ta’ konformità falza jew il-komposti li jistgħu jnaqqsu r-rispons u jikkawżaw riżultati ta’ konformità falza.

5.3. Preċiżjoni kbira (eżattezza u preċiżjoni, irkupru apparenti tal-bijoassaġġ)

5.3.1.

Għall-metodi GC/MS, id-determinazzjoni għandha tipprovdi stima valida tal-konċentrazzjoni reali f’kampjun. Eżattezza għolja hija meħtieġa biex tkun evitata ċ-ċaħda ta’ riżultat ta’ analiżi ta’ kampjun abbażi ta’ affidabbiltà baxxa tal-livell TEQ determinat. L-eżattezza hija espressa bħala l-eżattezza (id-differenza bejn il-valur medju mkejjel għall-analita f’materjal iċċertifikat u l-valur iċċertifikat tiegħu, li huwa espress bħala perċentwal ta’ dan il-valur) u l-preċiżjoni (RSDR id-devjazzjoni standard relattiva kkalkolata mir-riżultati ġġenerati f’kundizzjonijiet ta’ riproduċibilità).

5.3.2.

Għall-metodi bijoanalitiċi, għandu jiġi ddeterminat l-irkupru apparenti tal-bijoassaġġ. L-irkupru apparenti tal-bijoassaġġ ifisser il-livell BEQ ikkalkulat mill-kurva tal-kalibrar tat-TCDD jew il-PCB 126 korretta għall-inbjank u mbagħad diviża bil-livell TEQ determinat mill-metodu ta’ konferma. Dan għandu l-għan li jikkoreġi fatturi bħat-telf ta’ PCDD/Fs u komposti simili għad-diossini waqt l-estrazzjoni u l-istadji tat-tindif, komposti koestratti li jżidu jew inaqqsu r-rispons (effetti agonistiċi u antagonistiċi), il-kwalità tal-aġġustament tal-kurva, jew id-differenzi bejn il-valuri TEF u l-valuri tal-Potenza Relattiva (REP). L-irkupru apparenti tal-bijoassaġġ huwa kkalkulat minn kampjuni ta’ referenza adattati bi profili ta’ konġeneri rappreżentattivi madwar il-livell ta’ interess.

5.4. Il-validazzjoni fil-firxa tal-livell massimu u l-miżuri ġenerali tal-kontroll tal-kwalità

5.4.1.

Il-laboratorji għandhom juru t-twettiq ta’ metodu fil-firxa tal-livell massimu, pereżempju 0,5x, 1x u 2x il-livell massimu b’koeffiċjent aċċettabbli ta’ varjazzjoni għall-analiżi ripetuta, waqt il-proċedura ta’ validazzjoni u waqt l-analiżi ta’ rutina.

5.4.2.

Bħala miżuri interni ta’ kontroll tal-kwalità, għandhom jitwettqu kontrolli inbjank regolari u esperimenti miżjuda jew analiżi tal-kampjuni ta’ kontroll (preferibbilment, jekk ikun hemm, materjal iċċertifikat ta’ referenza). Għandhom jiġu rrekordjati u ċċekkjati iċ-ċarts tal-kontroll tal-kwalità tal-kontrolli inbjank, tal-esperimenti ta’ taħlit jew tal-analiżi tal-kontroll tal-kampjuni biex ikun żgurat li r-rendiment analitiku huwa f’konformità mar-rekwiżiti.

5.5. Limitu ta’ kwantifikazzjoni

5.5.1.

Għal metodu ta’ skrinjar bijoanalitiku, l-istabbiliment tal-limitu ta’ kwantifikazzjoni (LOQ) mhuwiex rekwiżit indispensabbli imma l-metodu għandu jipprova li jista’ jagħmel differenza bejn il-valur inbjank u l-valur ta’ limitu. Meta jingħata l-livell BEQ, għandu jiġi stabbilit livell ta’ rappurtar biex ikollu x’jaqsam ma’ kampjuni li juru rispons taħt dan il-livell. Il-livell ta’ rappurtar għandu jintwera li hu differenti mill-kampjuni inbjank tal-proċedura mill-inqas b’fattur ta’ tlieta, b’rispons taħt il-firxa ta’ ħidma. Għalhekk għandu jiġi kkalkulat mill-kampjuni li fihom il-komposti fil-mira madwar il-livell minimu meħtieġ, u mhux minn proporzjon S/N jew minn assaġġ inbjank.

5.5.2.

Il-LOQ għall-metodu ta’ konferma għandu jkun ta’ madwar wieħed minn ħamsa tal-livell massimu.

5.6. Kriterji analitici

Għal riżultati ta’ min joqgħod fuqhom mill-metodi ta’ konferma jew tal-iskrinjar, għandhom jintlaħqu l-kriterji li ġejjin fil-firxa tal-livell massimu għall-valur tat-TEQ jew il-BEQ, rispettivament, kemm jekk determinati bħala total tat-TEQ jew total ta’ BEQ (bħala s-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini) kemm jekk separatament għall-PCDD/Fs u għall-PCBs simili għad-diossini:

	Skrinjar permezz ta’ metodi bijoanalitiċi jew fiżikokimiċi	Metodi ta’ konferma
Rata ta’ konformità falza (*1)	< 5 %
Eżattezza		–20 % sa +20 %
Ripetibbiltà (RSDr)	< 20 %
Preċiżjoni intermedja (RSDR)	< 25 %	< 15 %

5.7. Rekwiżiti speċifiċi għal metodi ta’ skrinjar

5.7.1.

Għall-iskrinjar jistgħu jintużaw kemm il-metodi GC-MS kif ukoll dawk bijoanalitiċi. Għall-metodi GC-MS għandhom jintlaħqu r-rekwiżiti stipulati fil-punt 6. Għall-metodi bijoanalitiċi bbażati fuq iċ-ċelloli hemm stipulati rekwiżiti speċifiċi fil-punt 7.

5.7.2.

Il-laboratorji li japplikaw metodi ta’ skrinjar għall-kontroll ta’ rutina ta’ kampjuni għandhom jistabbilixxu kooperazzjoni mill-qrib ma’ laboratorji li japplikaw il-metodu ta’ konferma.

5.7.3.

Ir-rendiment tal-metodu ta’ skrinjar irid jiġi vverifikat matul l-analiżi ta’ rutina, mill-kontroll tal-kwalità tal-analiżi u mill-validazzjoni kontinwa tal-metodu. Għandu jkun hemm programm kontinwu għall-kontroll ta’ riżultati konformi.

5.7.4.

Iċċekkjar għall-possibilità ta’ suppressjoni tar-rispons taċ-ċellola u taċ-ċitossiċità:

20 % tal-estratti tal-kampjun għandhom jitkejlu fi skrinjar ta’ rutina biż-żieda ta’ 2,3,7,8-TCDD jew mingħajrha, b’konformità mal-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni, biex jiġi ċċekkjat jekk ir-rispons huwiex imħassar minn sustanzi interferenti, li jinsabu fl-estratt tal-kampjun. Il-konċentrazzjoni mkejla tal-kampjun miżjud għandha titqabbel mas-somma tal-konċentrazzjoni tal-estratt mhux miżjud u tingħadd mal-konċentrazzjoni taż-żieda. Jekk din il-konċentrazzjoni mkejla tkun aktar minn 25 % anqas mill-konċentrazzjoni kkalkulata (is-somma), dan ikun indikazzjoni ta’ potenzjalità ta’ suppressjoni tas-sinjal u l-kamjun rispettiv għandu jintbgħat għand il-GC-HRMS għal analiżi konfermatorja. Ir-riżultati għandhom jiġu mmonitorjati f’tabelli ta’ kontroll tal-kwalità.

5.7.5.

Kontroll ta’ kwalità fuq kampjuni konformi:

Madwar 2 sa 10 % tal-kampjuni konformi, skont il-matriċi tal-kampjun u l-esperjenza tal-laboratorju, għandhom jiġu kkonfermati permezz tal-GC/HRMS.

5.7.6.

Id-determinazzjoni ta’ rati ta’ konformità falza mid-data tal-kontroll ta’ kwalità:

Għandha tiġi determinata r-rata ta’ riżultati ta’ konformità falza mill-iskrinjar tal-kampjuni anqas jew aktar mil-limitu massimu jew il-livell ta’ azzjoni. Ir-rati attwali ta’ konformità falza għandhom ikunu inqas minn 5 %. Meta jkun hemm disponibbli minimu ta’ 20 riżultat konfermat għal kull matriċi jew grupp ta’ matriċi mill-kontroll tal-kwalità ta’ kampjuni konformi, għandhom isiru konklużjonijiet minn din il-bażi ta’ data dwar ir-rata ta’ konformità falza. Ir-riżultati mill-kampjuni analizzati fil-provi interlaboratorji jew waqt każijiet ta’ kontaminazzjoni, li jkopru firxa ta’ konċentrazzjoni sa pereżempju ta’ 2x il-livell massimu (ML), jistgħu jiġu inklużi wkoll fil-minimu ta’ 20 riżultat għall-evalwazzjoni tar-rata ta’ konformità falza. Il-kampjuni għandhom ikopru l-profili ta’ konġeneri l-aktar frekwenti, li jirrappreżentaw diversi sorsi.

Għalkemm l-iskrinjar tal-assaġġ għandu preferenzjalment ikollu l-iskop li jsib il-kampjuni li jaqbżu l-limitu ta’ azzjoni, il-kriterju biex jiddetermina r-rati ta’ konformità falza huwa l-livell massimu, b’kunsiderazzjoni tal-inċertezza estiża tal-kejl tal-metodu ta’ konferma.

5.7.7.

Kampjuni mill-iskrinjar potenzjalment mhux konformi għandhom dejjem jiġu vverifikati permezz ta’ rianaliżi sħiħa tal-kampjun oriġinali b’metodu ta’ analiżi konfermatorju. Dawn il-kampjuni jistgħu jintużaw ukoll biex tiġi evalwata r-rata ta’ riżultati ta’ nuqqas ta’ konformità falza. Għal metodi ta’ skrinjar, ir-rata ta’ riżultati ta’ nuqqas ta’ konformità falza għandha tkun il-frazzjoni ta’ riżultati kkonfermati li huma konformi skont l-analiżi konfermatorja, waqt li fi skrinjar li sar qabel il-kampjun ikun ġie ddikjarat bħala potenzjalment mhux konformi. L-evalwazzjoni tal-vantaġġi tal-metodu ta’ skrinjar għandha tkun ibbażata fuq it-tqabbil tal-kampjuni b’nuqqas ta’ konformità falza man-numru totali ta’ kampjuni ċċekkjati. Din ir-rata għandha tkun baxxa biżżejjed biex jibqa’ vantaġġuż l-użu ta’ għodda ta’ skrinjar.

5.7.8.

Il-metodi bijoanalitiċi għandhom jipprovdu, f’kundizzjonijiet ta’ validazzjoni, indikazzjoni valida tal-livell TEQ, ikkalkolat u espress bħala BEQ.

Għall-metodi bijoanalitiċi mwettqa f’kundizzjonijiet ripetuti wkoll, l-RSDr bejn laboratorju u ieħor tkun tipikament iżgħar milli f’kundizzjonijiet ta’ riproduċibbiltà (RSDR)

6. Rekwiżiti speċifiċi għal metodi gc-ms li għandhom jiġu ssodisfati għal raġunijiet ta’ konferma u ta’ skrinjar

6.1. Differenzi aċċettabbli bejn ir-riżultati superjuri u inferjuri tad-WHO-TEQ

Id-differenza bejn il-livell superjuri u l-livell inferjuri ma għandhiex teċċedi l-20 % għal konferma ta’ qbiż tal-livell massimu jew f’każ ta’ bżonn, tal-limiti ta’ azzjoni.

6.2. Kontroll tal-irkupri

6.2.1.

Għandha titwettaq żieda ta’ standards interni għal PCDD/PCDF 2,3,7,8-sostituti bil-kloru ttikkettjati 13C u ta’ standards interni għall-PCBs simili għad-diossini ttikkettjati 13C, fil-bidu nett tal-metodu analitiku eż. qabel l-estrazzjoni sabiex tkun ivvalidata l-proċedura analitika. Tal-inqas konġeneru wieħed għal kull wieħed mill-gruppi omologi tetra jew ottaklorinati għall-PCDD/F u tal-inqas konġeneru wieħed għal kull wieħed mill-gruppi omologi għall-PCBs simili għad-diossini għandhom jiġu miżjuda (alternattivament, tal-inqas konġeneru wieħed għal kull funzjoni ta’ reġistrazzjoni ta’ jon magħżula għal kull spettrometrija ta’ massa użata għall-monitoraġġ ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini). Fil-każ ta’ metodi ta’ konferma, għandhom jintużaw is-17-il standard intern għal PCDD/PCDF 2,3,7,8-sostituti ttikkettjati 13C kollha u t-12-il standard intern għall-PCBs simili għad-diossini ttikkettjati 13C kollha.

6.2.2.

Għandhom jiġu determinati wkoll fatturi ta’ rispons relattivi għal dawk il-konġeneri li għalihom mhu miżjud l-ebda analogu ttikkettjat b’13C, bl-użu ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar xierqa.

6.2.3.

Għal għalf ta’ oriġini mill-pjanti u għal għalf ta’ oriġini mill-annimali li jkun fih anqas minn 10 % ta’ xaħam, iż-żieda ta’ standards interni hija obbligatorja qabel l-estrazzjoni. Għal għalf ta’ oriġini mill-annimali li jkun fih aktar minn 10 % ta’ xaħam, l-istandards interni jistgħu jiġu magħduda qabel jew wara l-estrazzjoni tax-xaħam. Għandha titwettaq validazzjoni xierqa tal-effiċjenza tal-estrazzjoni, skont l-istadju li fih huma introdotti l-istandards interni.

6.2.4.

Qabel l-analiżi GC-MS, għandhom ikunu miżjuda standard wieħed (1) jew tnejn (2) tal-irkupru (surrogat).

6.2.5.

Il-kontroll tal-irkupru huwa neċessarju. Għal metodi ta’ konferma, l-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu fil-firxa ta’ minn 60 sa 120 %. L-irkupri ogħla jew aktar baxxi mill-kongeneri individwali, b’mod partikolari għal xi dibenżo-p-diossini ettaklorinati u ottaklorinati u xi dibenżofurani, għandhom ikunu aċċettabbli b’kundizzjoni li l-kontribuzzjoni tagħhom lill-valur TEQ ma taqbiżx l-10 % tal-valur totali tat-TEQ (ibbażat fuq is-somma tal-PCDD/F u tal-PCBs simili għad-diossini). Għal metodi ta’ skrinjar GC-MS, l-irkupri għandhom ikunu fil-firxa ta’ minn 30 sa 140 %.

6.3. Tneħħija ta’ sustanzi interferenti

—	Is-separazzjoni ta’ PCDD/Fs minn komposti klorinati interferenti bħal PCB mhux simili għad-diossini u eteri tad-difenil klorinati għandha ssir permezz ta’ tekniki kromatografiċi adattati (preferibbilment b’kolonna tal-florisil, tal-alumina u/jew tal-karbonju).

—	Is-separazzjoni kromatografika b’fażi gassuża tal-isomeri għandha tkun < 25 % minn quċċata sa quċċata bejn 1,2,3,4,7,8-HxCDF u 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

6.4. Kalibrar b’kurva standard

Il-firxa tal-kurva ta’ kalibrar għandha tkopri l-firxa rilevanti tal-livell massimu jew il-livelli ta’ azzjoni.

6.5. Kriterji speċifiċi għal metodi ta’ konferma

—

Fil-każ tal-GC-HRMS:

F’każ ta’ HRMS, ir-riżoluzzjoni tipikament tkun akbar minn jew ugwali għal 10 000 għall-iskala sħiħa tal-piż f’deklinazzjoni ta’ 10 %.

L-issodisfar ta’ aktar kriterji ta’ identifikazzjoni u konferma kif deskritti fl-istandards rikonoxxuti internazzjonalment, pereżempju, fl-istandard EN 16215:2012 (Għalf għall-annimali — Determinazzjoni ta’ diossini u PCBs simili għad-diossini permezz tal-GC-HRMS u ta’ PCBs indikaturi permezz ta’ GC-HRMS) u/jew il-metodi EPA 1613 u 1668 kif riveduti.

—

Fil-każ tal-GC-MS/MS:

Monitoraġġ ta’ mill-inqas 2 joni prekursuri speċifiċi, kull wieħed b’jone ta’ prodott ta’ tranżizzjoni korrespondenti speċifika waħda għal kull analita ttikkettjata u mhix ittikkettjata fl-ambitu tal-analiżi.

It-tolleranza massima permessa tal-intensitajiet tal-joni relattivi ta’ ± 15 % għall-joni ta’ prodott ta’ tranżizzjoni magħżula meta mqabbla ma’ valuri kkalkulati jew imkejla (medja minn standards ta’ kalibrar), li japplikaw kundizzjonijiet MS/MS identiċi, b’mod partikolari tal-enerġija tal-ħbit u l-pressjoni tal-ħbit tal-gass, għal kull tranżizzjoni ta’ analita.

Ir-riżoluzzjoni għal kull kwadrupolu tiġi stabbilita indaqs jew aħjar mir-riżoluzzjoni tal-massa unitarja (riżoluzzjoni tal-massa unitarja: riżoluzzjoni biżżejjed sabiex tissepara żewġ qċaċet b’unità waħda tal-massa bejniethom) sabiex titnaqqas il-possibbiltà ta’ interferenzi fuq l-analiti ta’ interess.

L-issodisfar ta’ aktar kriterji kif deskritt fl-istandards rikonoxxuti internazzjonalment, pereżempju, fl-istandard EN 16215:2012 (Għalf għall-annimali — Determinazzjoni ta’ diossini u PCBs simili għad-diossini permezz tal-GC-HRMS u ta’ PCBs indikaturi permezz ta’ GC-HRMS) u/jew il-metodi EPA 1613 u 1668 kif riveduti, għajr l-obbligu li jintuża l-GC-HRMS.

7. Rekwiżiti speċifiċi għall-metodi bijoanalitiċi

Il-metodi bijoanalitiċi huma metodi msejsa fuq l-użu ta’ prinċipji bijoloġiċi bħal assaġġi bbażati fuq iċ-ċelloli, assaġġi bbażati fuq ir-riċevituri jew immunoassaġġi. Dan il-punt jistabbilixxi r-rekwiżiti għall-metodi bijoanalitiċi b’mod ġenerali.

Il-metodu ta’ skrinjar bħala prinċipju jikklassifika kampjun bħala konformi jew suspettat li ma jikkonformax. Għal dan il-għan, il-livell tal-BEQ ikkalkulat jitqabbel mal-valur ta’ limitu (ara l-punt 7.3). Kampjuni taħt il-valur ta’ limitu huma ddikjarati konformi, kampjuni daqs jew ’il fuq mill-valur ta’ limitu huma suspettati li mhumiex konformi, u għalhekk jeħtieġu analiżi permezz tal-metodu ta’ konferma. Fil-prattika, il-livell BEQ li jikkorrispondi għal żewġ terzi tal-livell massimu jista’ jservi bħala valur ta’ limitu sakemm jiżgura rata ta’ konformità falza taħt il-5 % u rata aċċettabbli għal riżultati ta’ nuqqas ta’ konformità falza. B’livelli massimi separati għall-PCDD/Fs u għas-somma ta’ PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini, il-kontroll tal-konformità ta’ kampjuni mingħajr frazzjonament jirrikjedi valuri ta’ limitu għall-bijoassaġġi adattati għall-PCDD/Fs. Għall-iċċekkjar ta’ kampjuni li jaqbżu l-livelli ta’ azzjoni, bħala valur ta’ limitu għandu jkun adattat perċentwal xieraq tal-limitu ta’ azzjoni rispettiv.

Jekk livell indikattiv jiġi espress f’BEQs, ir-riżultati tal-kampjun għandhom ikunu fil-firxa ta’ ħidma u jaqbżu l-limitu tar-rapportar (ara l-punti 7.1.1 u 7.1.6).

7.1. Evalwazzjoni tar-rispons għat-test

7.1.1. Rekwiżiti ġenerali

—

Meta jiġu kkalkolati l-konċentrazzjonijiet minn kurva ta’ kalibrar tat-TCDD, il-valuri fil-limitu superjuri tal-kurva juru varjazzjoni għolja (koeffiċjent għoli ta’ varjazzjoni (CV)). Il-firxa tal-ħidma hija l-erja fejn dan is-CV ikun iżgħar minn 15 %. Il-limitu inferjuri tal-firxa ta’ ħidma (il-limitu ta’ rappurtar) għandu jkun iffissat tal-anqas b’fattur ta’ tlieta ’l fuq mill-proċedura inbjank. Il-limitu superjuri tal-firxa ta’ ħidma normalment huwa rrappreżentat bil-valur EC70 (70 % tal-konċentrazzjoni effettiva massima), iżda huwa inferjuri jekk is-CV jkun ogħla minn 15 % f’din il-firxa. Il-firxa ta’ ħidma għandha tiġi stabbilita waqt il-validazzjoni. Il-valuri ta’ limitu (ara l-punt 7.3) għandhom ikunu sew fil-firxa ta’ ħidma.

—

Is-soluzzjonijiet standard u l-estratti tal-kampjuni għandhom jiġu ttestjati għall-inqas b’mod duplikat. Meta jintużaw id-duplikati, soluzzjoni standard jew estratt ta’ kontroll ittestjat f’minn erba’ sa sitt kontenituri mqassma fuq il-platt għandu jipproduċi rispons jew konċentrazzjoni (possibbli biss fil-firxa ta’ ħidma) msejsa fuq CV< 15 %.

7.1.2. Kalibrar

7.1.2.1. Kalibrar b’kurva standard

—	Il-livelli fil-kampjuni għandhom jiġu kkalkulati permezz tat-tqabbil tar-rispons għat-test mal-kurva ta’ kalibrar ta’ TCDD (jew PCB 126 jew taħlita standard ta’ PCDD/PCDF/PCBs simili għad-diossini) biex jiġi kkalkulat il-livell BEQ fl-estratt u sussegwentement fil-kampjun.

—

Il-kurvi ta’ kalibrar għandhom jinkludu minn 8 sa 12-il konċentrazzjoni (għall-inqas f’duplikati), b’konċentrazzjonijiet biżżejjed fil-parti t’isfel tal-kurva (il-firxa ta’ ħidma). Għandha tingħata attenzjoni speċjali għall-kwalità tal-aġġustament tal-kurva fil-firxa ta’ ħidma. Bħala tali, il-valur R2 għandu ftit jew l-ebda valur fl-istima tal-adegwatezza tal-aġġustament fir-rigressjoni nonlineari. Jista’ jinkiseb aġġustament aħjar billi d-differenza bejn il-livelli kkalkulati u osservati fil-firxa ta’ ħidma tal-kurva tiġi minimizzata, pereżempju billi s-somma ta’ residwi kwadrata tiġi minimizzata.

—

Il-livell stmat fl-estratt tal-kampjun għandu sussegwentement jiġi kkoreġut għal-livell BEQ ikkalkulat għal kampjun inbjank ta’ matriċi/solvent (biex jagħti rendikont tal-impuritajiet minn solventi u kimiċi użati), u l-irkupru apparenti (ikkalkulat mil-livell BEQ ta’ kampjuni ta’ referenza adattati bi profili konġeneri rappreżentattivi madwar il-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni). Biex issir korrezzjoni ta’ rkupru, l-irkupru apparenti għandu jkun fil-firxa meħtieġa (ara l-punt 7.1.4). Kampjuni ta’ referenza użati għall-korrezzjoni ta’ rkupru għandhom ikunu konformi mar-rekwiżiti stipulati fil-punt 7.2.

7.1.2.2. Kalibrar bil-kampjuni ta’ referenza

Alternattivament, kurva ta’ kalibrar ppreparata minn tal-anqas erba’ kampjuni ta’ referenza (ara l-punt 7.2.4): matriċi waħda vojta, flimkien ma’ tliet kampjuni ta’ referenza f’0,5x, 1x u 2x il-livell massimu jew il-limitu ta’ azzjoni jistgħu jintużaw, bl-eliminazzjoni tal-ħtieġa li ssir korrezzjoni għall-vojt u l-irkupru jekk il-karatteristiċi tal-matriċi fil-kampjuni ta’ referenza jaqblu ma’ dawk tal-kampjuni mhux magħrufa. F’dan il-każ, ir-reazzjoni tat-test li tikkorrispondi ma’ żewġ terzi tal-livell massimu (ara l-punt 7.3) tista’ tiġi kkalkulata direttament minn dawn il-kampjuni u użata bħala valur ta’ limitu. Għall-iċċekkjar ta’ kampjuni li jaqbżu l-livelli ta’ azzjoni, bħala valur ta’ limitu għanu jkun adattat perċentwal xieraq ta’ dawn il-limiti ta’ azzjoni.

7.1.3. Id-determinazzjoni separata ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini

L-estratti jistgħu jinqasmu fi frazzjonijiet li jkun fihom PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini, u jippermettu indikazzjoni separata tal-livelli TEQ tal-PCDD/Fs u tal-PCBs simili għad-diossini (f’BEQ). Għandha tintuża preferibbilment kurva ta’ kalibrar standard tal-PCB 126 biex jiġu evalwati r-riżultati għall-frazzjoni li fiha l-PCBs simili għad-diossini.

7.1.4. Irkupri apparenti tal-bijoassaġġi

L-“irkupru apparenti tal-bijoassaġġi” għandu jiġi kkalkulat minn kampjuni ta’ referenza adattati bi profili ta’ konġeneri rappreżentattivi madwar il-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni u espressi bħala perċentwal tal-livell BEQ imqabbel mal-livell TEQ. Id-differenzi bejn il-fatturi tat-TEF u tar-REP għal PCBs simili għad-diossini jistgħu joħolqu rkupri apparenti baxxi għal PCBs simili għad-diossini meta mqabbla ma’ PCDD/Fs, skont it-tip ta’ assaġġ u TEFs (12) użati. Għaldaqstant, jekk titwettaq determinazzjoni separata tal-PCDD/Fs u tal-PCBs simili għad-diossini, l-irkupri apparenti tal-bijoassaġġ għandhom ikunu: fil-każ ta’ PCBs simili għad-diossini 20 % sa 60 %, għal PCDD/Fs 50 % sa 130 % (il-firxiet japplikaw għall-kurva ta’ kalibrar ta’ TCDD). Peress li l-kontribuzzjoni ta’ PCBs simili għad-diossini għas-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini tista’ tvarja bejn il-matriċijiet u l-kampjuni differenti, l-irkupri apparenti tal-bijoassaġġ għas-somma tal-PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini jirriflettu dawn il-firxiet u għandhom ikunu bejn 30 % u 130 %. Kull implikazzjoni ta’ reviżjoni sostanzjali ta’ valuri TEF għal-leġiżlazzjoni tal-Unjoni għall-PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini teħtieġ ir-reviżjoni ta’ dawn il-firxiet.

7.1.5. Kontroll tal-irkupri għat-tindif

It-telf ta’ komposti waqt it-tindif għandu jiġi kkontrollat waqt il-validazzjoni. Il-kampjun inbjank miżjud b’taħlita ta’ konġeneri differenti għandu jiġi ppreżentat għat-tindif (mill-inqas n = 3) u l-irkupru u l-varjabbiltà għandhom jiġu ċċekkjati permezz ta’ metodu ta’ konferma. L-irkupru għandu jkun bejn 60 % u 120 % speċjalment għal konġeneri li jikkontribwixxu aktar minn 10 % għal-livell TEQ f’diversi taħlitiet.

7.1.6. Limitu ta’ rappurtar

Meta jiġu rrappurtati l-livelli BEQ, għandu jiġi ddeterminat il-limitu ta’ rappurtar minn kampjuni ta’ matriċi rilevanti li jinvolvu profili ta’ konġeneri tipiċi iżda mhux mill-kurva ta’ kalibrar tal-istandards minħabba l-preċiżjoni baxxa fil-firxa inferjuri tal-kurva. L-effetti tal-estrazzjoni u tat-tindif għandhom jiġu kkunsidrati. Il-limitu ta’ rappurtar għandu jkun iffissat tal-anqas b’fattur ta’ tlieta ’l fuq mill-proċedura inbjank.

7.2. Użu ta’ kampjuni ta’ referenza

7.2.1.

Il-kampjuni ta’ referenza għandhom jirrappreżentaw matriċi ta’ kampjun, profili ta’ konġeneri u firxiet ta’ konċentrazzjoni għal PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini madwar il-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni.

7.2.2.

Kull serje ta’ testijiet għandha tinkludi matriċi inbjank, u fejn dan mhux possibbli, proċedura inbjank, u kampjun ta’ referenza fil-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni. Dawn il-kampjuni għandhom jiġu estratti u ttestjati fl-istess ħin taħt kundizzjonijiet identiċi. Il-kampjun ta’ referenza għandu juri rispons elevat ċar imqabbel mal-kampjun inbjank, biex b’hekk ikun żgurat li t-test ikun adattat. Dawn il-kampjuni jistgħu jintużaw għall-korrezzjonijiet tal-bjank u tal-irkupru.

7.2.3.

Il-kampjuni ta’ referenza magħżulin biex issir korrezzjoni ta’ rkupru għandhom ikunu rappreżentattivi għall-kampjuni tat-test, li jfisser li l-profili tal-konġeneri ma jistgħux iwasslu għal sottovalutazzjoni tal-livelli.

7.2.4.

Il-kampjuni żejda ta’ referenza, eż. b’0,5x u 2x il-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni għandhom jiġu inklużi sabiex juru r-rendiment korrett tat-test fil-firxa ta’ interess għall-kontroll tal-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni. Meta mpoġġija flimkien, dawn il-kampjuni jistgħu jintużaw biex ikunu kkalkulati l-livelli BEQ fil-kampjuni tat-test (ara l-punt 7.1.2.2).

7.3. Determinazzjoni tal-valuri ta’ limitu

Ir-relazzjoni bejn ir-riżultati bijoanalitiċi f’BEQ u r-riżultati mill-metodu ta’ konferma fit-TEQ għandha tiġi stabbilita, pereżempju permezz ta’ esperimenti ta’ kalibrar adattata għall-matriċi, li jinvolvu kampjuni ta’ referenza miżjuda b’0, 0,5x, 1x u 2x l-LM, b’6 ripetizzjonijiet fuq kull livell (n = 24). Jistgħu jiġu stmati fatturi ta’ korrezzjoni (inbjank u rkupru) minn din ir-relazzjoni imma dawn għandhom jiġu ċċekkjati f’konformità mal-punt 7.2.2.

Għandhom jiġu stabbiliti valuri ta’ limitu għal deċiżjonijiet dwar konformità ta’ kampjuni ma’ livelli massimi jew għall-kontroll ta’ limiti ta’ azzjoni, jekk rilevanti, mal-livelli massimi jew il-livell ta’ azzjoni rispettiv iffissat jew għall-PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini waħidhom jew inkella għas-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini. Dawn huma rrappreżentati mill-punt finali inferjuri tad-distribuzzjoni tar-riżultati bijoanalitiċi (ikkoreġuti għall-inbjank u għall-irkupru) u jikkorrispondu mal-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu ta’ konferma msejjes fuq livell ta’ kunfidenza ta’ 95 %, li jimplika rata ta’ konformità falza ta’ < 5 %, u fuq RSDR < 25 %. Il-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu konfermatorju huwa l-livell massimu, filwaqt li titqies l-inċertezza tal-kejl estiża.

Il-valur ta’ limitu (f’BEQ) jista’ jiġi kkalkulat f’konformità ma’ wieħed mill-approċċi stipulati fil-punti 7.3.1, 7.3.2 u 7.3.3 (ara l-figura 1).

7.3.1.

L-użu tal-faxxa inferjuri tal-intervall ta’ previżjoni ta’ 95 % fil-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu konfermatorju

fejn:

BEQDL	BEQ jikkorrespondi mal-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu ta’ konferma, billi huwa l-livell massimu, meta titqies l-inċertezza estiża tal-kejl
sy,x	devjazzjoni standard residwa
t α,f = m-2	fattur student (α = 5 %, f = gradi ta’ libertà, b’naħa waħda)
m	numru totali ta’ punti ta’ kalibrar (indiċi j)
n	għadd ta’ ripetizzjonijiet f’kull livell
xi	konċentrazzjoni fil-kampjun (f’TEQ) tal-punt ta’ kalibrar i stabbilit minn metodu ta’ konferma
	medja tal-konċentrazzjonijiet (fit-TEQ) tal-kampjuni kollha ta’ kalibrar
	parametru globali kwadrat, i = indiċi għall-punt ta’ kalibrar i

7.3.2.

Il-kalkolu mir-riżultati bijoanalitiċi (kkoreġuti għall-irkupru u inbjank) ta’ analiżijiet multipla tal-kampjuni (n≥ 6) ikkontaminati fil-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu ta’ konferma, bħala l-punt finali inferjuri tad-distribuzzjoni tad-data fil-valur BEQ medju korrispondenti:

fejn:

SDR	devjazzjoni standard tar-riżultati tal-bijoassaġġ f’BEQDL, imkejla f’kundizzjonijiet ta’ riproduċibilità fil-laboratorju

7.3.3.

Il-kalkolu bħala valur medju tar-riżultati bijoanalitiċi (f’BEQ, ikkoreġuti għall-inbjank u l-irkupru) minn analiżi multipla tal-kampjuni (n ≥ 6) ikkontaminati f’żewġ terzi tal-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni, imsejjes fuq l-osservazzjoni li dan il-livell se jkun madwar il-valur ta’ limitu ddeterminat skont il-punt 7.3.1 jew il-punt 7.3.2:

Il-kalkolu tal-valuri ta’ limitu msejjes fuq livell ta’ kunfidenza ta’ 95 % li jimplika rata ta’ konformità falza < 5 %, u RSDR < 25 %:

(1)	mill-faxxa inferjuri tal-intervall ta’ previżjoni ta’ 95 % fil-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu ta’ konferma.

(2)	mill-analiżi multipli tal-kampjuni (n ≥ 6) kontaminati fil-limitu ta’ deċiżjoni tal-metodu ta’ konferma bħala l-punt finali inferjuri tad-distribuzzjoni tad-data (rappreżentat fil-Figura 1 bħala kurva forma ta’ qanpiena) fil-valur medju BEQ korrispondenti.

Figura 1

7.3.4.

Restrizzjonijiet għall-valuri ta’ limitu:

Il-valuri ta’ limitu msejsa fuq il-BEQ ikkalkolati minn RSDR miksuba waqt il-validazzjoni bl-użu ta’ numru limitat ta’ kampjuni bi profili ta’ konġeneri/matriċi differenti jistgħu jkunu ogħla mil-livelli massimi jew mil-livelli ta’ azzjoni msejsa fuq it-TEQ minħabba preċiżjoni aħjar minn dik miksuba f’analiżi ta’ rutina fejn irid jiġi kkontrollat spettru mhux magħruf ta’ profili ta’ konġeneri potenzjali. F’dawn il-każijiet, il-valuri ta’ limitu għandhom jiġu kkalkolati b’RSDR = 25 % jew preferibbilment, b’żewġ terzi tal-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni.

7.4. Karatteristiċi tal-prestazzjoni

7.4.1.

Billi ma jista’ jintuża l-ebda standard intern fil-metodi bijoanalitiċi, għandhom isiru testijiet fuq ir-ripetibilità tal-metodi bijoanalitiċi sabiex tinkiseb informazzjoni dwar id-devjazzjoni standard f’serje ta’ testijiet u bejniethom. Ir-ripetibilità għandha tkun inqas minn 20 % u r-riproduċibbiltà intralaboratorju għandha tkun inqas minn 25 %. Dan għandu jkun imsejjes fuq il-livelli kkalkulati f’BEQ wara l-korrezzjoni tal-inbjank u l-irkupru.

7.4.2.

Bħala parti mill-proċess ta’ validazzjoni, it-test għandu juri distinzjoni bejn kampjun inbjank u livell fil-valur ta’ limitu, kif ukoll jippermetti l-identifikazzjoni ta’ kampjuni ogħla mill-valur ta’ limitu korrispondenti (ara l-punt 7.1.2).

7.4.3.

Għandhom jiġu definiti l-komposti fil-mira, l-interferenzi potenzjali u l-livelli massimi tollerabbli inbjank.

7.4.4.

Il-perċentwal tad-devjazzjoni standard fir-rispons jew fil-konċentrazzjoni kkalkolata mir-rispons (possibbli biss fil-firxa ta’ ħidma) ta’ determinazzjoni tripla ta’ estratt tal-kampjun, ma għandux ikun ogħla minn 15 %.

7.4.5.

Ir-riżultati mhux ikkoreġuti tal-kampjun(i) ta’ referenza espressi f’BEQ (l-inbjank u l-livell massimu jew il-livell ta’ azzjoni) għandhom jintużaw għall-evalwazzjoni tar-rendiment tal-metodu bijoanalitiku tul perjodu ta’ żmien kostanti.

7.4.6.

Tabelli għall-kontroll ta’ kwalità għal proċeduri inbjank u kull tip ta’ kampjun ta’ referenza għandhom jiġu rrekordjati u ċċekkjati biex ikun żgurat li r-rendiment analitiku huwa f’konformità mar-rekwiżiti, b’mod partikolari għall-proċeduri inbjank fir-rigward tad-differenza minima mitluba meta mqabbla mal-limitu inferjuri tal-firxa ta’ ħidma u għall-kampjuni ta’ referenza fir-rigward tar-riproduċibilità fil-laboratorju. Il-proċeduri inbjank għandhom jiġu kkontrollati b’mod li meta jitnaqqsu jiġu evitati r-riżultati b’konformità falza.

7.4.7.

Ir-riżultati mill-analiżi tal-metodi ta’ konferma ta’ kampjuni suspettati u bejn 2 u 10 % tal-kampjuni konformi (minimu ta’ 20 kampjun għal kull matriċi) għandhom jinġabru u jintużaw biex issir evalwazzjoni tal-metodu ta’ skrinjar u r-relazzjoni bejn il-BEQ u t-TEQ. Din il-bażi ta’ data tista’ tintuża għall-evalwazzjoni mill-ġdid tal-valuri ta’ limitu applikabbli f’kampjuni ta’ rutina għall-matriċijiet vvalidati.

7.4.8.

Ir-rendiment b’suċċess tal-metodu jista’ jintwera wkoll permezz ta’ parteċipazzjoni fil-provi interlaboratorji. Ir-riżultati mill-kampjuni analizzati fil-provi interlaboratorji, li jkopru sa firxa ta’ konċentrazzjoni ta’ eż. 2x il-livell massimu, jistgħu jiġu inklużi wkoll fl-evalwazzjoni tar-rata ta’ konformità falza, jekk laboratorju jkun jista’ juri r-rendiment b’suċċess tiegħu. Il-kampjuni għandhom ikopru l-profili ta’ konġeneri l-aktar frekwenti, li jirrappreżentaw diversi sorsi.

7.4.9.

F’xi każijiet, il-valuri ta’ limitu jistgħu jiġu evalwati mill-ġdid, b’riflessjoni tal-matriċi speċifika u l-profili tal-konġeneri ta’ dan l-inċident partikolari.

8. Rappurtar tar-riżultati

8.1. Metodi ta’ konferma

8.1.1.

Ir-riżultati analitiċi għandhom jinkludu l-livelli tal-konġeneri individwali tal-PCDD/F u tal-PCB simili għad-diossini u l-valuri tat-TEQ għandhom jiġu rrappurtati bħala livell inferjuri, livell superjuri u livell medju sabiex jiġi inkluż il-massimu tal-informazzjoni fir-rappurtar tar-riżultati u tkun tista’ ssir l-interpretazzjoni tar-riżultati skont rekwiżiti speċifiċi.

8.1.2.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini.

8.1.3.

L-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu disponibbli f’każ li l-irkupri jkunu barra l-firxa msemmija fil-punt 6.2.5, f’każ li jinqabeż il-livell massimu (f’dan il-każ, l-irkupri għal waħda miż-żewġ analiżijiet duplikati) u fuq talba f’każijiet oħra.

8.1.4.

Peress li l-inċertezza estiża tal-kejl titqies fil-mument tad-deċiżjoni dwar il-konformità tal-kampjun, dan il-parametru għandu jkun disponibbli. Għalhekk, ir-riżultati analitiċi għandhom jiġu rrappurtati bħala x +/- U fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl estiża bl-użu ta’ fattur ta’ kopertura ta’ 2 li jagħti livell ta’ kunfidenza ta’ madwar 95 %. Fil-każ ta’ determinazzjoni separata ta’ PCDD/Fs u ta’ PCBs simili għad-diossini, għas-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini għandha tintuża s-somma tal-istima tal-inċertezza estiża tar-riżultati analitiċi separati tal-PCDD/Fs u tal-PCBs simili għad-diossini.

8.1.5.

Ir-riżultati għandhom jiġu espressi fl-istess unitajiet u tal-anqas bl-istess numru ta’ figuri sinifikattivi bħala l-livelli massimi stabbiliti mid-Direttiva 2002/32/KE.

8.2. Metodi ta’ skrinjar bijoanalitiċi

8.2.1.

Ir-riżultat tal-iskrinjar għandu jkun espress bħala “konformi” jew “suspettat li mhuwiex konformi” (“suspettat”).

8.2.2.

Barra minn hekk, jista’ jingħata riżultat indikattiv ta’ PCDD/Fs u/jew PCBs simili għad-diossini espress f’BEQ, u mhux f’TEQ.

8.2.3.

Kampjuni b’rispons taħt il-limitu ta’ rappurtar għandhom ikunu espressi bħala “taħt il-limitu ta’ rappurtar”. Kampjuni b’rispons ogħla mill-firxa ta’ ħidma għandhom jiġu rrappurtati bħala li “jaqbżu l-firxa ta’ ħidma” u l-livell li jikkorrespondi mal-limitu superjuri tal-firxa ta’ ħidma għandu jingħata f’BEQ.

8.2.4.

Għal kull tip ta’ matriċi ta’ kampjun, ir-rapport għandu jsemmi l-livell massimu jew il-limitu ta’ azzjoni li fuqu tkun imsejsa l-evalwazzjoni.

8.2.5.

Ir-rapport għandu jsemmi t-tip ta’ test applikat, il-prinċipju bażiku tat-test u t-tip ta’ kalibrar.

8.2.6.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini.

8.2.7.

F’każ ta’ kampjuni li dwarhom ikun hemm suspett li ma humiex konformi, ir-rapport għandu jinkludi nota dwar l-azzjoni li għandha tittieħed. Il-konċentrazzjoni ta’ PCDD/Fs u s-somma ta’ PCDD/Fs u PCBs simili għad-diossini fil-kampjuni b’livelli għoljin jeħtieġ li jiġu ddeterminati/kkonfermati b’metodu konfermatorju.

8.2.8.

Ir-riżultati nonkonformi għandhom jiġu rrappurtati biss minn analiżi konfermatorja.

8.3. Metodi ta’ skrinjar fiżikokimiċi

8.3.1.

Ir-riżultat tal-iskrinjar għandu jkun espress bħala “konformi” jew “suspettat li mhuwiex konformi” (“suspettat”).

8.3.2.

Għal kull tip ta’ matriċi ta’ kampjun, ir-rapport għandu jsemmi l-livell massimu jew il-limitu ta’ azzjoni li fuqu tkun imsejsa l-evalwazzjoni.

8.3.3.

Barra minn hekk, jistgħu jingħataw il-livelli għal konġeneri individwali tal-PCDD/Fs u/jew tal-PCBs simili għad-diossini u l-valuri tat-TEQ irrappurtati bħala livell inferjuri, livell superjuri u livell medju. Ir-riżultati għandhom jiġu espressi fl-istess unitajiet u tal-anqas bl-istess numru ta’ figuri sinifikattivi bħala l-livelli massimi stabbiliti mid-Direttiva 2002/32/KE.

8.3.4.

8.3.5.

Ir-rapport għandu jsemmi t-tip ta’ metodu GC-MS applikat.

8.3.6.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCDD/Fs u l-PCBs simili għad-diossini.

8.3.7.

8.3.8.

In-nonkonformità tista’ tiġi deċiża biss wara analiżi konfermatorja.

KAPITOLU III

PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUN U R-REKWIŻITI GĦALL-metodi ta’ analiżi UŻATI FIL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-LIVELLI TA’ PCBs MHUX SIMILI GĦAD-DIOSSINI FL-GĦALF

1. Qasam tal-applikazzjoni

Ir-rekwiżiti stipulati f’dan il-Kapitolu għandhom jiġu applikati meta l-għalf ikun analizzat għall-kontroll uffiċjali tal-livelli ta’ PCBs mhux simili għad-diossini u fir-rigward ta’ tħejjija ta’ kampjuni u rekwiżiti analitiċi għal għanijiet regolatorji oħrajn, li jinkludu l-kontrolli mwettqa mill-operatur tan-negozju tal-għalf biex jiżgura l-konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (KE) Nru 183/2005.

2. Metodi ta’ detezzjoni applikabbli

Kromatografija b’fażi gassuża/Detezzjoni tal-Qbid tal-Elettroni (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS jew metodi ekwivalenti.

3. Identifikazzjoni u konferma tal-analiti ta’ interess

3.1.

Ħin ta’ retenzjoni relattiv b’rabta mal-istandards interni jew standards ta’ referenza (devjazzjoni aċċettabbli ta’ +/- 0,25 %).

3.2.

Is-separazzjoni permezz ta’ kromatografija b’fażi gassuża tal-PCBs mhux simili għad-diossini minn sustanzi interferenti, speċjalment PCBs ta’ koelwizzjoni, b’mod partikolari jekk il-livelli tal-kampjuni jkunu fil-firxa tal-limiti legali u n-nonkonformità trid tiġi kkonfermata (13).

3.3.

Rekwiżiti għal tekniki ta’ GC-MS

Monitoraġġ ta’ mill-inqas l-għadd li ġej ta’ joni molekulari jew joni karatteristiċi mir-raggruppament molekulari:

(a)	żewġ joni speċifiċi fil-każ tal-HRMS;

(b)	tliet joni speċifiċi fil-każ tal-LRMS;

(c)	żewġ joni prekursuri speċifiċi, li kull waħda minnhom ikollha jon prodott ta’ tranżizzjoni korrespondenti speċifiku għal MS-MS.

Il-massimu tat-tolleranzi permessi għall-proporzjonijiet ta’ abbundanza għall-mases tal-frammenti magħżula:

Id-devjazzjoni relattiva tal-proporzjon ta’ abbundanza tal-frammenti ta’ massa magħżula minn abbundanza teoretika jew standard ta’ kalibrar għall-jon fil-mira (il-jon immonitorjat l-aktar abbundanti) tal-jon jew joni kwalifikaturi: ± 15 %.

3.4.

Rekwiżiti għal tekniki tal-GC-ECD

Riżultati li jaqbżu l-livell massimu għandhom jiġu kkonfermati ma’ żewġ kolonni tal-GC f’fażijiet stazzjonarji ta’ polarità differenti.

4. Dimostrazzjoni tar-rendiment tal-metodu

Ir-rendiment tal-metodu għandu jiġi vvalidat fil-firxa tal-livell massimu (0,5 sa darbtejn (2) il-livell massimu) b’koeffiċjent ta’ varjazzjoni aċċettabbli għal analiżi ripetuta (ara r-rekwiżiti għall-preċiżjoni intermedja fil-punt 9).

5. Limitu ta’ kwantifikazzjoni

Is-somma tal-LOQs (14) tal-PCBs mhux simili għad-diossini ma għandux ikun ogħla minn terz tal-livell massimu (15).

6. Kontroll tal-kwalità

Kontrolli regolari inbjank, analiżi ta’ kampjuni miżjuda, kampjuni ta’ kontroll ta’ kwalita, parteċipazzjoni fi studji interlaboratorji dwar matriċijiet rilevanti.

7. Kontroll tal-irkupri

7.1.

Għandhom jintużaw standards interni adattati bi proprjetajiet fiżikokimiċi li jikkomparaw ma’ analiti ta’ interess.

7.2.

Iż-żieda ta’ standards interni:

Żieda mal-prodotti (qabel il-proċess ta’ estrazzjoni u tindif).

7.3.

Ir-rekwiżiti għall-metodi bl-użu tal-konġeneri tas-sitt PCBs mhux simili għad-diossini kollha ttikkettjati b’isotopu:

(a)	ir-riżultati għandhom jiġu kkoreġuti għall-irkupri tal-istandards interni;

(b)	l-irkupri ta’ standards interni b’tikketta tal-isotopi għandhom ikunu bejn 60 u 120 %;

(c)	irkupri anqas jew aktar għal konġeneri individwali b’kontribuzzjoni għas-somma ta’ sitt PCBs mhux simili għad-diossini taħt l-10 % huma aċċettabbli.

7.4.

Rekwiżiti għall-metodi li ma jużawx is-sitt standards interni kollha ttikkettati b’isotopu jew standards interni oħra:

(a)	l-irkupru ta’ standard(s) intern(i) għandu jiġi kkontrollat għal kull kampjun;

(b)	l-irkupri ta’ standard(s) intern(i) għandhom ikunu bejn 60 u 120 %;

(c)	ir-riżultati għandhom jiġu kkoreġuti għall-irkupri tal-istandards interni.

7.5.

L-irkupri tal-konġeneri mhux ittikkettati għandhom jiġu vverifikati permezz ta’ kampjuni miżjuda jew kampjuni ta’ kontroll tal-kwalità b’konċentrazzjonijiet fil-firxa tal-livell massimu. L-irkupri ta’ dawn il-konġeneri għandhom ikunu kkunsidrati aċċettabbli, jekk huma bejn is-60 u l-120 %.

8. Rekwiżiti għal-laboratorji

F’konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (UE) 2017/625, il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati minn korp rikonoxxut li jopera skont il-Gwida ISO/IEC 58 biex jiżgura li dawn qegħdin japplikaw assigurazzjoni ta’ kwalità analitika. Il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati skont l-istandard EN ISO/IEC 17025. Barra minn hekk, il-prinċipji mfissra fil-Linji Gwida Tekniċi għall-istima tal-inċertezza tal-kejl u l-limiti ta’ kwantifikazzjoni għall-analiżi tal-PCBs għandhom jiġu segwiti (16).

9. Karatteristiċi tar-rendiment: kriterji għas-somma tal-PCBs mhux simili għad-diossini fil-livell massimu

	Dilwizzjoni ta’ isotopi bi spettrometrija ta’ massa (*2)	Tekniki oħrajn
Eżattezza	–20 sa +20 %	–30 sa +30 %
Preċiżjoni intermedja (RSD%)	≤ 15 %	≤ 20 %
Differenza bejn il-kalkolu tal-livell superjuri u dak inferjuri	≤ 20 %	≤ 20 %

10. Rappurtar tar-riżultati

10.1.

Ir-riżultati analitiċi għandhom jinkludu l-livelli tal-konġeneri individwali tal-PCBs mhux simili għad-diossini u s-somma tal-konġeneri ta’ dawk il-PCBs irrapportati bħala livell inferjuri, livell superjuri u livell medju sabiex ikun inkluż il-massimu tal-informazzjoni fir-rappurtar tar-riżultati u tkun tista’ ssir l-interpretazzjoni tar-riżultati skont rekwiżiti speċifiċi.

10.2.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCBs.

10.3.

L-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu disponibbli f’każ li l-irkupri jkunu barra mill-firxa msemmija fil-punt 7, f’każ li jinqabeż il-livell massimu u fuq talba f’każijiet oħra.

10.4.

Peress li fid-deċiżjoni dwar il-konformità ta’ kampjun għandha titqies l-inċertezza tal-kejl estiża, dak il-parametru għandu jkun disponibbli wkoll. Għalhekk, ir-riżultati analitiċi għandhom jiġu rrappurtati bħala x +/- U fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl estiża bl-użu ta’ fattur ta’ kopertura ta’ 2 li jagħti livell ta’ kunfidenza ta’ madwar 95 %.

10.5.

Ir-riżultati għandhom jiġu espressi fl-istess unitajiet u tal-anqas bl-istess numru ta’ figuri sinifikattivi bħala l-livelli massimi stabbiliti mid-Direttiva 2002/32/KE.

B. STANDARDS EN

Għall-applikazzjoni tal-Artikolu 34(2)(a) tar-Regolament (UE) 2017/625, huma rilevanti l-istandards EN li ġejjin:

EN 17194: Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tat-tossini Deossinivalenol, Aflatossina B1, Fumonisina B1 & B2, it-tossini T-2 & HT-2, Żearalenon u Okratossina A fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost permezz tal-LC-MS/MS

EN 17270: Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tat-teobromu fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost, inklużi ingredjenti derivati mill-kawkaw, permezz tal-kromatografija likwida

EN 17504 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ kampjonar u analiżi. Determinazzjoni tal-gossipol fiż-żerriegħa tal-qoton u fl-għalf minn LC-MS/MS

EN 17362 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-pentaklorofenol (PCP) fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost permezz tal-LCMS/MS

EN 16279: Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-kontenut tal-fluworur wara t-trattament tal-aċidu idrokloriku b’metodu ta’ elettrodu sensittiv għall-joni (ISE)

EN 17053: Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni ta’ mikroelementi, metalli tqal u elementi oħra fl-għalf mill-ICP-MS (multimetodu)

EN 15550 Għalf tal-annimali — Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-kadmju u taċ-ċomb permezz tal-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku tal-forn tal-grafit (GF-AAS) wara d-diġestjoni bil-pressjoni

EN 16206 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-arseniku permezz tal-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku bil-ġenerazzjoni tal-idruri (HGAAS) wara d-diġestjoni bil-pressjoni bil-microwave (diġestjoni b’ 65 % aċidu nitriku u 30 % perossidu tal-idroġenu)

EN 16277 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-merkurju bl-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku bil-fwar kiesaħ (CVAAS) wara d-diġestjoni bil-pressjoni bil-microwave (estrazzjoni b’65 % aċidu nitriku u 30 % perossidu tal-idroġenu)

EN 16278 Għalf tal-annimali — Determinazzjoni tal-arseniku inorganiku permezz tal-ispettrometrija tal-assorbiment atomiku bil-ġenerazzjoni tal-idruri (HG-AAS) wara l-estrazzjoni bil-microwave u s-separazzjoni permezz ta’ estrazzjoni f’fażi solida (SPE)

EN 17374 Għalf tal-annimali: Metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi — Determinazzjoni tal-arseniku inorganiku fl-għalf tal-annimali permezz ta’ skambju tal-anjoni HPLC-ICP-MS

”

(1) Tabella tat-TEF (= fatturi ta’ ekwivalenza tossika) għal PCDDs, PCDFs u PCBs simili għad-diossini: It-TEFs tad-WHO għall-valutazzjoni tar-riskju għall-bnedmin imsejsa fuq il-konklużjonijiet tal-laqgħa ta’ esperti tal-Programm Internazzjonali dwar is-Sigurtà tas-Sustanzi Kimiċi (IPCS) tal-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa (WHO), li saret f’Ġinevra f’Ġunju 2005 (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Konġeneru	Valur TEF	Konġeneru	Valur TEF
Dibenżo-p-diossini (“PCDDs”) u Dibenżo-p-furani ’(“PCDFs”)		PCBs “simili għad-diossini” PCBs non-orto + PCBs mono-orto
2,3,7,8-TCDD	1
1,2,3,7,8-PeCDD	1	PCBS mhux orto
1,2,3,4,7,8-HxCDD	0,1	PCB 77	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDD	0,1	PCB 81	0,0003
1,2,3,7,8,9-HxCDD	0,1	PCB 126	0,1
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	0,01	PCB 169	0,03
OCDD	0,0003	PCBS mono-orto
2,3,7,8-TCDF	0,1	PCB 105	0,00003
1,2,3,7,8-PeCDF	0,03	PCB 114	0,00003
2,3,4,7,8-PeCDF	0,3	PCB 118	0,00003
1,2,3,4,7,8-HxCDF	0,1	PCB 123	0,00003
1,2,3,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 156	0,00003
1,2,3,7,8,9-HxCDF	0,1	PCB 157	0,00003
2,3,4,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 167	0,00003
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	0,01	PCB 189	0,00003
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	0,01
OCDF	0,0003

Taqsiriet użati: “T” = tetra; “Pe” = penta; “Hx” = eża; “Hp” = etta; “O” = otta; “CDD” = klorodibenżodiossina; “CDF” = klorodibenżofuran; “CB” = klorobifenil.

(2) Ir-Regolament ta’ Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2021/808 tat-22 ta’ Marzu 2021 dwar il-prestazzjoni ta’ metodi analitiċi għal residwi ta’ sustanzi farmakoloġikament attivi użati f’annimali li jipproduċu l-ikel u dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati kif ukoll dwar il-metodi li jridu jintużaw għat-teħid tal-kampjuni u li jħassar id-Deċiżjonijiet 2002/657/KE u 98/179/KE (ĠU L 180, 21.5.2021, p. 84).

(3) Il-prinċipji mfissra fil-“Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf) għandhom jiġu segwiti fejn japplika.

(4) Il-kunċett tal-“livell superjuri” (upper-bound) jeħtieġ l-użu tal-limitu ta’ kwantifikazzjoni għall-kontribuzzjoni ta’ kull konġeneru mhux kwantifikat. Il-kunċett tal-“livell inferjuri” (lower-bound) jeħtieġ l-użu ta’ żero għall-kontribuzzjoni ta’ kull konġeneru mhux kwantifikat. Il-kunċett tal-“livell medju” (medium-bound) jeħtieġ l-użu ta’ nofs il-limitu ta’ kwantifikazzjoni meta tiġi kkalkulata l-kontribuzzjoni ta’ kull konġeneru mhux kwantifikat.

(5) Analiżi duplikata: Analiżi separata tal-analiti ta’ interess bl-użu tat-tieni alikwota tal-istess kampjun omoġenizzat. B’mod ġenerali, japplikaw ir-rekwiżiti għal analiżi duplikata kif previst fl-Anness II, il-Kapitolu C, il-punt 3. Madankollu, fil-każ tal-metodi bl-użu ta’ standard intern bit-tikketta 13C għall-analiti rilevanti, tkun meħtieġa analiżi duplikata jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni ma jkunx konformi. L-analiżi duplikata hija neċessarja biex tiġi eskluża l-possibbiltà ta’ kontaminazzjoni nkroċjata jew xi taħwid aċċidentali tal-kampjuni. Fil-każ li l-analiżi ssir fil-qafas ta’ inċident ta’ kontaminazzjoni, il-konferma b’analiżi duplikata tista’ tiġi eliminata f’każ li l-kampjuni magħżulin għall-analiżi jkunu konnessi, permezz tat-traċċabbiltà, mal-inċident ta’ kontaminazzjoni u l-livell misjub ikun konsiderevolment ogħla mil-livell massimu.

(6) Il-kunċett tal-“livell superjuri” jirrikjedi l-użu tal-limitu ta’ kwantifikazzjoni għall-kontribuzzjoni ta’ kull konġenru mhux kwantifikat għall-Ekwivalenti Tossiku (TEQ). Il-kunċett tal-“livell inferjuri” jeħtieġ l-użu taż-żero għall-kontribuzzjoni ta’ kull konġeneru mhux kwantifikat għat-TEQ. Il-kunċett ta’ “limitu medju” jeħtieġ l-użu ta’ nofs il-limitu ta’ kwantifikazzjoni billi tiġi kkalkulata l-kontribuzzjoni ta’ kull konġenru mhux kwantifikat għat-TEQ.

(7) B’mod ġenerali, japplikaw ir-rekwiżiti għal analiżi duplikata kif previst fl-Anness II, il-Kapitolu C, il-punt 3. Madankollu, fil-każ tal-metodi ta’ konferma bl-użu ta’ standard intern bit-tikketta 13C għall-analiti rilevanti, tkun meħtieġa analiżi duplikata jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni ma jkunx konformi. L-analiżi duplikata hija neċessarja biex tiġi eskluża l-possibbiltà ta’ kontaminazzjoni nkroċjata jew xi taħwid aċċidentali tal-kampjuni. Fil-każ li l-analiżi ssir fil-qafas ta’ inċident ta’ kontaminazzjoni, il-konferma b’analiżi duplikata tista’ tiġi eliminata f’każ li l-kampjuni magħżulin għall-analiżi jkunu konnessi, permezz tat-traċċabbiltà, mal-inċident ta’ kontaminazzjoni u l-livell misjub ikun konsiderevolment ogħla mil-livell massimu.

(8) Spjegazzjoni identika u r-rekwiżiti għall-analiżi duplikata għall-kontroll tal-livelli ta’ azzjoni kif imsemmi fin-nota f’qiegħ il-paġna 5 għal-livelli massimi.

(9) Ir-Regolament (KE) Nru 183/2005 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-12 ta’ Jannar 2005 li jistabbilixxi l-ħtiġijiet għall-iġjene tal-għalf (ĠU L 35, 8.2.2005, p. 1).

(10) Il-metodi bijoanalitiċi mhumiex speċifiċi għal dawk il-konġeneri inklużi fl-iskema TEF. Fl-estratt tal-kampjun jista’ jkun hemm komposti oħra strutturalment relatati attivi fl-AhR li jikkontribwixxu għar-reazzjoni ġenerali. Għaldaqstant, ir-riżultati bijoanalitiċi ma jistgħux ikunu stima, iżda pjuttost indikazzjoni, tal-livell tat-TEQ fil-kampjun.

(11) “Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf), “Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/cs_contaminants_sampling_analysis-report_2004_en.pdf).

(*1) Fir-rigward tal-livelli massimi.

(12) Ir-rekwiżiti attwali huma msejsa fuq it-TEFs ippubblikati fi: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

(13) Il-konġeneri li spiss jinstabu li jikkoelutaw huma pereżempju PCB 28/31, PCB 52/69 u PCB 138/163/164. Fil-każ ta’ GC-MS għandhom jiġu kkunsidrati wkoll interferenzi potenzjali ta’ frammenti ta’ konġeneri aktar klorinati.

(14) Il-prinċipji mfissra fil-“Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” [https://data.europa.eu/doi/10.2787/8931] għandhom jiġu segwiti fejn japplika.

(15) Hu rakkomandat ferm li jkun hemm kontribuzzjoni aktar baxxa tal-livell inbjank tar-reaġent għal-livell ta’ kontaminant f’kampjun. Il-laboratorju huwa responsabbli għall-kontroll tal-varjazzjoni tal-livelli inbjank, b’mod partikolari, jekk il-livelli inbjank huma mnaqqsa.

(16) Ara nota f’qiegħ il-paġna 9.

(*2) Huwa meħtieġ l-użu tas-sitt analogi kollha ttikkettati 13C bħala standards interni.

Mc	:	kontenut ta’ ndewwa tal-kampjun (f’%). 100 — Mc għalhekk jirrappreżenta l-kontenut xott tal-kampjun (f’%).
Rana	:	riżultat analitiku kif imkejjel fuq il-kampjun
R12 %	:	riżultat għal għalf b’kontenut ta’ ndewwa ta’ 12 %; għandu jiġi vvalutat skont il-livell regolatorju.