ISSN 1725-5104 |
||
Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea |
L 54 |
|
![]() |
||
Edizzjoni bil-Malti |
Leġiżlazzjoni |
Volum 52 |
Werrej |
|
I Atti adottati skont it-Trattati tal-KE/Euratom li l-pubblikazzjoni tagħhom hija obbligatorja |
Paġna |
|
|
REGOLAMENTI |
|
|
* |
Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 152/2009 tas-27 ta' Jannar 2009 li jistabbilixxi l-metodi ta' teħid ta' kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf ( 1 ) |
|
|
||
|
* |
|
|
|
(1) Test b’relevanza għaż-ŻEE |
MT |
L-Atti li t-titoli tagħhom huma stampati b'tipa ċara huma dawk li għandhom x'jaqsmu mal-maniġment ta' kuljum ta' materji agrikoli, u li ġeneralment huma validi għal perijodu limitat. It-titoli ta'l-atti l-oħra kollha huma stampati b'tipa skura u mmarkati b'asterisk quddiemhom. |
I Atti adottati skont it-Trattati tal-KE/Euratom li l-pubblikazzjoni tagħhom hija obbligatorja
REGOLAMENTI
26.2.2009 |
MT |
Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea |
L 54/1 |
REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 152/2009
tas-27 ta' Jannar 2009
li jistabbilixxi l-metodi ta' teħid ta' kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf
(Test b’relevanza għaż-ŻEE)
IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,
Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea,
Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 882/2004 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tad-29 ta' April 2004 dwar il-kontrolli uffiċjali mwettqa biex tiġi żgurata l-verifikazzjoni tal-konformità mal-liġi tal-għalf u l-ikel, mas-saħħa tal-annimali u mar-regoli dwar il-welfare tal-annimali (1), u b’mod partikolari l-Artikolu 11(4)(a), (b) u (c) tiegħu,
Billi:
(1) |
L-atti segwenti ġew adottati għall-implimentazzjoni tad-Direttiva 70/373/KEE u jibqgħu fis-seħħ skont l-Artikolu 61(2) tar-Regolament (KE) Nru 882/2004:
|
(2) |
Billi d-Direttiva 70/373/KEE ġiet sostitwita bir-Regolament (KE) Nru 882/2004, huwa xieraq li l-atti implimentattivi għal dik id-Direttiva jiġu sostitwiti b’Regolament wieħed. Fl-istess waqt, il-metodi għandhom jiġu adattati fid-dawl tal-iżviluppi fl-għarfien xjentifiku u teknoloġiku. Metodi li m’għadhomx validi għall-iskop intenzjonat tagħhom, għandhom jiġu eliminati. Hemm il-ħsieb li meta jkun il-waqt jiġu aġġornati d-dispożizzjonijiet għat-teħid ta' kampjuni sabiex jiġu kkunsidrati l-iżviluppi reċenti fil-mod ta' kif inhu prodott, maħżun, trasportat u kkummerċjalizzat l-għalf. Madankollu, huwa xieraq li sadanittant jinżammu d-dispożizzjonijiet eżistenti fuq it-teħid ta' kampjuni. |
(3) |
Għalhekk, id-Direttivi 71/250/KEE, 71/393/KEE, 72/199/KEE, 73/46/KEE, 76/371/KEE, 76/372/KEE, 78/633/KEE, 81/715/KEE, 84/425/KEE, 86/174/KEE, 93/70/KEE, 93/117/KE, 98/64/KE, 1999/27/KE, 1999/76/KE, 2000/45/KE, 2002/70/KE u 2003/126/KE għandhom jiġu revokati. |
(4) |
Il-miżuri kif imsemmija f’dan ir-Regolament huma konformi mal-opinjoni tal- Kumitat Permanenti tal-Katina tal-Ikel u s-Saħħa tal-Annimali, |
ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:
Artikolu 1
It-teħid ta' kampjuni għall-kontroll uffiċjali tal-għalf, fir-rigward tad-determinazzjoni ta' kostitwenti, addittivi u sustanzi mhux mixtieqa, bl-eċċezzjoni ta' residwi ta' pestiċidi u mikro-organiżmi, għandu jsir skont il-metodi stabbiliti fl-Anness I.
Artikolu 2
Il-preparazzjoni tal-kampjuni għall-analiżi u l-espressjoni tar-riżultati għandha ssir skont il-metodi stabbiliti fl-Anness II.
Artikolu 3
L-analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf għandha ssir bl-użu tal-metodi stabbiliti fl-Anness III (Metodi ta' analiżi biex tiġi kkontrollata l-kompożizzjoni tal-materjal tal-għalf u l-għalf kompost), fl-Anness IV (Metodi ta' analiżi biex jiġi kkontrollat il-livell ta' addittivi awtorizzati fl-għalf) u fl-Anness VI (Metodi ta' analiżi għad-determinazzjoni ta' kostitwenti li ġejjin mill-annimali għall-kontroll uffiċjali tal-għalf).
Artikolu 4
Il-valur ta' enerġija tal-għalf kompost għat-tjur għandu jiġi kkalkulat skont l-Anness VII.
Artikolu 5
Il-metodi ta' analiżi għall-kontroll tal-preżenza illegali ta' addittivi li m’għadhomx awtorizzati fl-għalf stabbiliti fl-Anness VIII għandhom jintużaw għal skopijiet ta' konferma.
Artikolu 6
Id-Direttivi 71/250/KEE, 71/393/KEE, 72/199/KEE, 73/46/KEE, 76/371/KEE, 76/372/KEE, 78/633/KEE, 81/715/KEE, 84/425/KEE, 86/174/KEE, 93/70/KEE, 93/117/KE, 98/64/KE, 1999/27/KE, 1999/76/KE, 2000/45/KE, 2002/70/KE u 2003/126/KE huma revokati.
Ir-referenzi għad-Direttivi revokati għandhom jiġu interpretati bħala referenzi għal dan ir-Regolament u għandhom jinqraw skont it-tabelli ta' korrelazzjoni fl-Anness IX.
Artikolu 7
Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum ta' wara l-pubblikazzjoni tiegħu f’Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.
Dan għandu japplika mis-26 ta' Awwissu 2009.
Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u għandu japplika direttament fl-Istati Membri kollha.
Magħmul fi Brussell, is-27 ta' Jannar 2009.
Għall-Kummissjoni
Androulla VASSILIOU
Membru tal-Kummissjoni
(1) ĠU L 165, 30.4.2004, p. 1, ikkoreġut bil-ĠU L 191, 28.5.2004, p. 1.
(2) ĠU L 155, 12.7.1971, p. 13.
(3) ĠU L 279, 20.12.1971, p. 7.
(4) ĠU L 123, 29.5.1972, p. 6.
(5) ĠU L 83, 30.3.1973, p. 21.
(6) ĠU L 102, 15.4.1976, p. 1.
(7) ĠU L 102, 15.4.1976, p. 8.
(8) ĠU L 206, 29.7.1978, p. 43.
(9) ĠU L 257, 10.9.1981, p. 38.
(10) ĠU L 238, 6.9.1984, p. 34.
(11) ĠU L 130, 16.5.1986, p. 53.
(12) ĠU L 234, 17.9.1993, p. 17.
(13) ĠU L 329, 30.12.1993, p. 54.
(14) ĠU L 257, 19.9.1998, p. 14.
(15) ĠU L 118, 6.5.1999, p. 36.
(16) ĠU L 207, 6.8.1999, p. 13.
(17) ĠU L 174, 13.7.2000, p. 32.
(18) ĠU L 209, 6.8.2002, p. 15.
(19) ĠU L 339, 24.12.2003, p. 78.
ANNESS I
METODI TA' TEĦID TA' KAMPJUNI
1. GĦAN U SKOP
Kampjuni maħsubin għall-kontroll uffiċjali ta' l-għalf, għandhom jittieħdu skont il-metodi deskritti hawn taħt. Kampjuni miksubin b'dan il-mod għandhom jiġu kkunsidrati bħala rappreżentattivi tal-porzjonijiet li ttieħdu kampjuni minnhom.
2. UFFIĊJALI LI JIEĦDU L-KAMPJUNI
Il-kampjuni għandhom jittieħdu minn uffiċjali awtorizzati għal dak l-iskop mill-Istati Membri.
3. DEFINIZZJONIJIET
Porzjon kampjun: Kwantità ta' prodott li jikkostitwixxi unità, u li għandu karatteristiċi preżunti li huma uniformi.
Kampjun inkrimentali: Kwantità meħuda minn punt wieħed fil-porzjon li ttieħed kampjun minnu.
Kampjun aggregat: Aggregat ta' kampjuni inkrimentali meħudin mill-istess porzjon li ttieħed kampjun minnu.
Kampjun imnaqqas: Parti rappreżentattiva tal-kampjun aggregat miksuba minn tal-aħħar bi proċess ta' tnaqqis.
Kampjun finali: Parti tal-kampjun imnaqqas jew tal-kampjun aggregat omoġenizzat
4. APPARAT
4.1. |
L-apparat għat-teħid ta' kampjuni jrid ikun magħmul minn materjal li ma jikkontaminax il-prodotti li jridu jittieħdu kampjuni minnhom. Dan l-apparat jista' jkun approvat uffiċjalment mill-Istati Membri. |
4.2. Apparat rakkomandat għat-teħid ta' kampjuni minn għalf solidu
4.2.1. It-teħid ta' kampjuni b'mod manwali
4.2.1.1. |
Pala b'qiegħ ċatt bi ġnub vertikali. |
4.2.1.2. |
Lanzetta għat-teħid ta' kampjuni b'qasma twila jew kompartimenti. Il-qisien tal-lanzetta għat-teħid ta' kampjuni jridu jkunu adattati għall-karatteristiċi tal-porzjon bħala kampjun (fond tal-kontenitur, id-dimensjonijiet tal-ixkora eċċ) u għad-daqs tal-partikoli tal-għalf. |
4.2.2. Teħid ta' kampjuni b'mod mekkaniku
Apparat mekkaniku approvat jista' jintuża għat-teħid ta' kampjuni tal-għalf mobbli.
4.2.3. Diviżur
Apparat imfassal sabiex jaqsam il-kampjun f'partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs jista' jintuża sabiex jittieħdu kampjuni inkrimentali u għall-preparazzjoni ta' kampjuni mnaqqsa u finali.
5. ĦTIĠIET KWANTITATTIVI
5.A. |
Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti ddistribwiti b'mod uniformi fl-għalf |
|
5.A.1. |
Porzjon li ttieħed kampjun minnu Id-daqs tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu jrid ikun tali li kull waħda mill-partijiet kostitwenti tiegħu tista' ttittieħed bħala kampjun. |
|
5.A.2. |
Kampjuni inkrimentali |
|
5.A.2.1. |
Għalf maħlul: |
Numru minimu ta' kampjuni inkrimentali: |
5.A.2.1.1. |
Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li ma jaqbżux it-2,5 tunnellati metriċi |
Sebgħa |
5.A.2.1.2. |
Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jaqbżu t-2,5 tunnellati metriċi |
√ 20 darba n-numru ta' tunnellati metriċi li jiffurmaw il-porzjon li ttieħed kampjun minnu (*), sa massimu ta' 40 kampjun inkrimentali |
5.A.2.2. |
Għalf ippakkettjat: |
Numru minimu ta' pakketti li għandhom jittieħdu kampjuni minnhom (**): |
5.A.2.2.1. |
Pakketti ta' aktar minn kg waħda: |
|
5.A.2.2.1.1. |
Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' pakkett sa erba' pakketti |
il-pakketti kollha |
5.A.2.2.1.2. |
Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' ħames pakketti sa 16-il pakkett |
erbgħa |
5.A.2.2.1.3. |
Porzjonijiet li ttieħed kampjun minnhom ta' aktar minn 16-il pakkett |
√ numru ta' pakketti li jiffurmaw il-porzjon bħala kampjun (*), sa massimu ta' 20 pakkett |
5.A.2.2.2. |
Pakketti li ma jaqbżux 1 kg |
erbgħa |
5.A.2.3. |
Għalf likwidu jew semi-likwidu: |
Numru minimu ta' kontenituri li għandhom jittieħdu kampjuni minnhom (**): |
5.A.2.3.1. |
Kontenituri ta' aktar minn litru: |
|
5.A.2.3.1.1. |
porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' kontenitur wieħed sa erba' kontenituri |
il-kontenituri kollha |
5.A.2.3.1.2. |
porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' ħames kontenituri sa 16-il kontenitur |
erbgħa |
5.A.2.3.1.3. |
porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' aktar minn 16-il kontenitur |
√ in-numru ta' kontenituri li jiffurmaw il-porzjon li ttieħed kampjun minnu (*), sa massimu ta' 20 kontenitur |
5.A.2.3.2. |
Kontenituri li ma jaqbżux litru wieħed |
erbgħa |
5.A.2.4. |
Blokok tal-għalf u licks minerali |
Numru minimu ta' blokok jew licks li jridu jittieħdu kampjuni minnhom (**): Blokka jew lick waħda għal kull porzjon bħala kampjun ta' 25 unità, sa massimu ta' erba' blokok jew licks |
5.A.3. |
Kampjun aggregat Għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu hemm bżonn ta' kampjun aggregat wieħed. L-ammont totali ta' kampjuni inkrimentali li jiffurmaw il-kampjun aggregat m'għandux ikun inqas mis-segwenti: |
|
5.A.3.1. |
Għalf maħlul |
4 kg |
5.A.3.2. |
Għalf ippakkettjat: |
|
5.A.3.2.1. |
pakketti ta' aktar minn 1 kg |
4 kg |
5.A.3.2.2. |
pakketti li ma jaqbżux 1 kg |
piż tal-kontenut ta' erba' pakketti oriġinali |
5.A.3.3. |
Għalf likwidu jew semi-likwidu: |
|
5.A.3.3.1. |
kontenituri ta' aktar minn litru |
erba' litri |
5.A.3.3.2. |
kontenituri li ma jaqbżux il-litru |
Volum tal-kontenuti ta' erba' kontenituri oriġinali |
5.A.3.4. |
Blokok tal-għalf jew licks minerali: |
|
5.A.3.4.1. |
kull waħda b'piż ta' aktar minn 1 kg |
4 kg |
5.A.3.4.2. |
kull waħda b'piż ta' mhux aktar minn 1 kg |
piż ta' erba' blokok jew licks oriġinali |
5.A.4. |
Kampjuni finali Il-kampjun aggregat jagħti l-kampjuni finali mat-tnaqqis meta neċessarju. L-analiżi ta' mill-inqas kampjun finali wieħed hija meħtieġa. L-ammont fil-kampjun finali għall-analiżi m'għandux ikun inqas mis-segwenti: |
|
|
Għalf solidu |
500 g |
|
Għalf likwidu jew semi-likwidu |
500 ml |
5.B. |
Fir-rigward tal–kontroll ta' sustanzi jew prodotti mhux mixtieqa li x'aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, bħal aflatossiċi, rye ergot, il-pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'għalf dirett (***) |
|
5.B.1. |
Porzjon kampjun: ara 5.A.1. |
|
5.B.2. |
Kampjuni inkrimentali |
|
5.B.2.1. |
Għalf maħlul: ara 5.A.2.1. |
|
5.B.2.2. |
Għalf ippakkettjat: |
Numru minimu ta' pakketti għandhom jittieħdu kampjuni minnhom: |
5.B.2.2.1. |
porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jikkonsistu f'pakkett sa erba' pakketti |
il-pakketti kollha |
5.B.2.2.2. |
porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jikkonsistu f'ħames sa 16-il pakkett |
erbgħa |
5.B.2.2.3. |
porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jikkonsistu f'aktar minn 16-il pakkett |
√ in-numru ta' pakketti li jiffurmaw il-porzjon li ttieħed kampjun minnu (*), sa massimu ta' 40 pakkett |
5.B.3. |
Kampjuni Aggregati In-numru ta' kampjuni aggregati jvarja mad-daqs tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu. In-numru minimu ta' kampjuni aggregati għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu huwa mogħti hawn taħt. Il-piż totali tal-kampjuni inkrimentali li jiffurmaw kull kampjun aggregat m'għandux ikun inqas minn 4 kg |
|
5.B.3.1. |
Għalf maħlul |
|
|
Piż tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu f'tunnellati metriċi: |
Numru minimu ta' kampjuni aggregati għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu: |
|
sa 1 |
1 |
|
aktar minn 1 u sa 10 |
2 |
|
aktar minn 10 u sa 40 |
3 |
|
Aktar minn 40 |
4 |
5.B.3.2. |
Għalf ippakkjat |
|
|
Daqs tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu f'numru ta' pakketti: |
Numru minimu ta' kampjuni aggregati għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu: |
|
1 sa 16 |
1 |
|
17 sa 200 |
2 |
|
201 sa 800 |
3 |
|
Aktar minn 800 |
4 |
5.B.4. |
Kampjuni finali Kull kampjun aggregat jagħti l-kampjuni finali mat-tnaqqis. L-analiżi ta' mill-inqas kampjun finali wieħed għal kull kampjun aggregat hija meħtieġa. Il-piż tal-kampjun finali għall-analiżi ma jistax ikun inqas minn 500 g. |
6. ISTRUZZJONIJIET GĦAT-TEĦID, IL-PREPARAZZJONI U L-IPPAKKJAR TAL-KAMPJUNI
6.1. Ġenerali
Il-kampjun għandu jittieħed u jiġi ppreparat malajr kemm jista' jkun waqt li wieħed iżomm f'moħħu l-prekawzjonijiet neċessarji sabiex jiġi assigurat li l-prodott la jinbidel u lanqas jiġi ikkontaminat. Strumenti kif ukoll is-superfiċi u l-kontenituri maħsubin biex jirċievu kampjuni għandhom ikunu nodfa u xotti.
6.2. Kampjuni inkrimentali
6.2.A. Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti ddistribwiti b'mod uniformi fl-għalf
Kampjuni inkrimentali jridu jittieħdu b'mod każwali matul il-porzjon ikkampjunat kollu u bejn wieħed u ieħor jridu jkunu tal-istess daqs.
6.2.A.1.
Trid issir diviżjoni immaġinarja tal-porzjon kampjun f'numru ta' partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs. Numru ta' partijiet li jikkorrispondu għan-numru ta' partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs meħtieġa skont 5.A.2 għandhom jintagħżlu b'mod każwali u tal-inqas irid jittieħed kampjun wieħed minn dawn il-partijiet.
Fejn ikun hemm bżonn, it-teħid ta' kampjuni jista' jsir meta l-porzjon kampjun ikun qiegħed jiġi spustjat (jitgħabba jew jinħatt).
6.2.A.2.
Wara li jkunu ntagħżlu n-numru ta' pakketti meħtieġa għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f 5.A.2, parti mill-kontenut ta' kull pakkett għandha titneħħa permezz ta' lanzetta jew pala. Fejn meħtieġ, il-kampjuni għandhom jittieħdu wara li l-pakketti jitbattlu separatament. Kull biċċa sħiħa għandha titkisser, jekk ikun hemm bżonn, billi tinfired u mbagħad titpoġġa lura fil-kampjuni, separatament f'kull kampjun aggregat.
6.2.A.3.
Wara li jkun intagħżel in-numru ta' kontenituri meħtieġa għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f 5.A.2, jekk ikun hemm bżonn, il-kontenuti għandhom jiġu omoġjenizzati u jittieħed ammont minn kull kontenitur.
Il-kampjuni inkrimentali jistgħu jittieħdu meta l-kontenut ikun qiegħed jitbattal.
6.2.A.4.
Wara li jkun intagħżel in-numru meħtieġ ta' kontenituri għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f 5.A.2., il-kampjuni għandhom jittieħdu minn livelli differenti.
Jistgħu wkoll jittieħdu kampjuni meta l-kontenut ikun qiegħed jitbattal imma l-ewwel frazzjonijiet għandhom jintremew.
Fi kwalunkwe każ il-volum totali meħud m'għandux ikun inqas minn 10 litri.
6.2.A.5.
Wara li jkun intgħażel in-numru ta' blokok jew licks meħtieġa għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f5.A.2, tittieħed parti minn kull blokka jew lick.
6.2.B. Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti mhux mixtieqa li x'aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, bħal aflatossiċi, rye ergot, il-pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'materjal tal-għalf.
Trid issir diviżjoni immaġinarja tal-porzjon kampjun f'numru ta' partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs, li tikkorrispondi għan-numru ta' kampjuni aggregati msemmija f 5.B.3. Jekk dan in-numru huwa aktar minn wieħed, in-numru totali ta' kampjuni inkrimentali msemmija f 5.B.2 għandu jkun distribwit bejn wieħed u ieħor ugwalment fuq il-partijiet differenti. Wara ħu kampjuni ta' bejn wieħed u ieħor l-istess daqs (1)btali mod li l-ammont totali fil-kampjuni ma jkunx inqas mill-kwantità minima ta' 4 kg meħtieġa għal kull kampjun aggregat. Kampjuni inkrimentali meħuda minn partijiet differenti ma għandhomx jiġu aggregati.
6.3. Preparazzjoni ta' kampjuni aggregati
6.3.A. Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti distribwiti uniformement fl-għalf
Il-kampjuni inkrimentali għandhom jitħalltu biex jagħmlu kampjun aggregat wieħed.
6.3.B. Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti mhux mixtieqa li x'aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, bħal aflatoxins, rye ergot, pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'materjali tal-għalf
Il-kampjuni inkrimentali minn kull parti tal-porzjon kampjun għandhom jitħalltu u għandhom jittieħdu n-numru ta' kampjuni aggregati imsemmija f'5.B.3, waqt li tingħata attenzjoni għall-oriġini ta' kull kampjun aggregat.
6.4. Preparazzjoni tal-kampjuni finali
Il-materjal f'kull kampjun aggregat għandu jitħallat b'reqqa sabiex jinkiseb kampjun omoġenizzat (2). Jekk ikun hemm bżonn, il-kampjun aggregat għandu l-ewwel jiġi mnaqqas għal tal-anqas 2 kg jew żewġ litri (kampjun imnaqqas) jew bl-użu ta' diviżur mekkaniku jew bl-użu ta' diviżur awtomatiku jew bil-metodu tal-qsim f'erba' partijiet.
Wara, għandhom jiġu preparati tal-inqas tliet kampjuni finali, ta' bejn wieħed u ieħor l-istess ammont u li jkunu konformi mal-ħtiġiet kwantitattivi ta' 5.A.4 jew 5.B.4. Kull kampjun għandu jitpoġġa f'kontenitur xieraq. għandhom jittieħdu l-prekawzjonijiet kollha meħtieġa sabiex jiġi evitat bdil fil-kompożizzjoni tal-kampjun, il-kontaminazzjoni jew adulterazzjoni li tista' sseħħ waqt il-ġarr jew il-ħżin.
6.5. Ippakkjar tal-kampjuni finali
Il-kontenituri jew il-pakketti għandhom jiġu ssiġillati u ttikkettjati (it-tikketta kollha trid tkun inkorporata fis-siġill) b'tali mod li ma jkunux jistgħu jinfetħu mingħajr ma ssir ħsara lis-siġill.
7. REĠISTRU TAT-TEĦID TA' KAMPJUNI
Irid jinżamm reġistru ta' kull teħid ta' kampjun, li jippermetti li kull porzjon kampjun tkun identifikata b'mod ċar.
8. DESTINAZZJONI TAL-KAMPJUNI
Għal kull kampjun aggregat, irid jintbagħat tal-inqas kampjun finali wieħed lill-laboratorju analitiku awtorizzat malajr kemm jista' jkun, flimkien mal-informazzjoni neċessarja għall-analista.
(*) Fejn in-numru miksub huwa frazzjoni, dan għandu jiġi mqarreb għan-numru sħiħ li jmiss.
(**) Għall-pakketti jew kontenituri li l-kontenut tagħhom ma jaqbiżx 1 kg jew litru wieħed u għal blokok jew licks li ma jiżnux aktar minn 1 kg kull wieħed, kampjun inkrimentali għandu jkun il-kontenuti ta' pakkett jew kontenitur oriġinali wieħed, blokka waħda jew lick waħda.
(***) Il-metodi previsti f'5A huma għal użu fil-kontroll ta' aflatossiċi, rye ergot, pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'għalf komplet u komplementari.
(1) Għal għalf ippakkettjat, parti mill-kontenut tal-pakketti li għandu jittieħed kampjun minnhom għandha titneħħa, bl-użu ta' lanzetta jew pala, wara li l-pakketti jkunu tbattlu separatament, jekk neċessarju.
(2) B'mod separat, il-biċċiet sħaħ f'kull kampjun aggregat għandhom jitkissru (jekk ikun hemm bżonn, billi jinfirdu u jitpoġġew lura fil-kampjun).
ANNESS II
DISPOŻIZZJONIJIET ĠENERALI DWAR IL-METODI GĦALL-ANALIŻI TAL-GĦALF
A. PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUNI GĦALL-ANALIŻI
1. Skop
Il-proċeduri deskritti hawn taħt jikkonċernaw il-preparazzjoni għall-analiżi tal-kampjuni finali, mibgħuta fil-laboratorji tal-kontroll wara t-teħid ta' kampjuni skont id-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.
Dawn il-kampjuni jridu jiġu ppreparati b'tali mod li l-ammonti li jintiżnu, kif imsemmija fil-metodi tal-analiżi, jkunu omoġenji u rappreżentattivi tal-kampjuni finali.
2. Prekawzjonijiet li jridu jittieħdu
Il-proċedura ta' preparazzjoni tal-kampjun li trid tiġi segwita tiddependi fuq il-metodi ta' analiżi użati. għalhekk huwa importanti ferm li l-proċedura segwita għall-preparazzjoni tal-kampjun tkun waħda xierqa għall-metodu ta' analiżi użat.
L-operazzjonijiet neċessarji kollha jridu jsiru b'tali mod li sa fejn ikun possibbli tiġi evitata kemm il-kontaminazzjoni tal-kampjun kif ukoll kull bidla fil-kompożizzjoni tiegħu.
It-tħin, it-taħlit u l-mogħdija minn passatur għandhom isiru kemm jista' jkun malajr b'espożizzjoni minima tal-kampjun għall-arja u d-dawl. M'għandhomx jintużaw imtieħen u grinders li jistgħu jsaħħnu l-kampjun b'mod apprezzabbli.
It-tħin manwali huwa rakkomandat għall-għalf li huwa partikolarment sensittiv għas-sħana. Trid tingħata attenzjoni wkoll sabiex jiġi assigurat li l-apparat innifsu ma jkunx sors ta' kontaminazzjoni tal-elementi ta' traċċa.
Jekk il-preparazzjoni ma tistax issir mingħajr bidliet sostanzjali fl-umdità tal-kampjun, iddetermina l-kontenut likwidu qabel u wara l-preparazzjoni skont il-metodu stabbilit f'Parti A tal-Anness III.
3. Proċedura
Aqsam il-kampjun f'subkampjuni adegwati billi tuża tekniki adegwati għall-qsim bħal impalar alternattiv, it-tqallib stazzjonarju jew ċirkolari. Il-coning u l-qsim f'erba biċċiet mhuwiex rakkomandat għax dawn jistgħu jipprovdu subkampjuni bi probabbiltà għolja ta' żball fil-qsim. Żomm il-kampjun għar-referenza f'kontenitur xieraq, nadif, xott, li għandu għatu li ma tgħaddix arja minnu, u pprepara s-subkampjuni għall-analiżi ta' almenu 100 g kif indikat hawn taħt.
3.1. Għalf li jista' jintaħan kif inhu
Sakemm ma jkunx speċifikat b'mod ieħor fil-metodi tal-analiżi, jekk ikun hemm bżonn, wara t-tħin, għaddi l-kampjun kollu minn passatur b'xibka kwadra b'toqob ta' 1 mm (skont ir-rakkomandazzjoni ISO R565). Evita li titħan iż-żejjed.
Ħallat il-kampjun mgħoddi minn passatur u iġbru f'kontenitur xieraq, nadif, xott, li għandu għatu li ma tgħaddix arja minnu. Erġa' ħallat immedjatament qabel ma tiżen l-ammont għall-analiżi.
3.2. Għalf li jista' jintaħan wara li jinxef
Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor fil-metodi tal-analiżi, nixxef il-kampjun sabiex tniżżel l-umdità tiegħu għal-livell ta' 8 sa 12 %, skont il-proċedura preliminari ta' tnixxif deskritta fil-punt 4.3 tal-metodu ta' determinazzjoni tal-umdità imsemmi f'Parti A tal-Anness III. Wara kompli kif indikat fit-taqsima 3.1.
3.3. Għalf likwidu jew semi-likwidu
Iġbor il-kampjun f'kontenitur xieraq, nadif, xott, li għandu għatu li ma tgħaddix arja minnu. Ħallat sewwa eżatt qabel ma tiżen l-ammont għall-analiżi.
3.4. Għalf ieħor
Kampjuni li ma jistgħux jiġu ppreparati skont waħda mill-proċeduri msemmija hawn fuq, għandhom jiġu ttrattati bi kwalunkwe proċedura oħra li tassigura li l-ammonti li ntiżnu għall-analiżi jkunu omoġenji u rappreżentattivi tal-kampjuni finali.
4. Ħżin tal-kampjuni
Il-kampjuni jridu jinħażnu f'temperatura li ma tibdilx il-kompożizzjoni tagħhom. Il-kampjuni intenzjonati għall-analiżi ta' vitamini jew sustanzi li huma partikolarment sensittivi għad-dawl għandhom jinħażnu f'kontenituri tal-ħġieġ kannella.
B. DISPOŻIZZJONIJIET RELATATI MAR-REAĠENTI U L-APPARAT UŻAT FIL-METODI TAL-ANALIŻI
1. |
Sakemm mhux speċifikat b'mod ieħor fil-metodi tal-analiżi, ir-reaġenti analitiċi kollha jridu jkunu analitikament puri (a.p.). Meta ssir analiżi għal traċċi, il-purità tar-reaġenti trid tiġi iċċekkjata b'test blank. Skont ir-riżultati miksuba, jista' jkun hemm bżonn ta' aktar purifikazzjoni tar-reaġenti. |
2. |
Kull operazzjoni li tinvolvi l-preparazzjoni ta' soluzzjonijiet, sustanza dilwita, tlaħliħ jew ħasil imsemmija fil-metodi ta' analiżi mingħajr indikazzjoni għan-natura tas-solvent jew id-dilwent użat, timplika li jrid jintuża l-ilma. Bħala regola ġenerali, l-ilma jrid jiġi demineralizzat jew distillat. F'każijiet partikolari indikati fil-metodi tal-analiżi, irid jiġi sottomess għal proċeduri speċjali ta' purifikazzjoni. |
3. |
Minħabba l-apparat li normalment jinstab f'laboratorji ta' kontroll, dawk l-istrumenti u apparat li huma speċjali jew li jeħtieġu użu speċifiku biss huma imsemmija fil-metodi ta' analiżi. Dawn iridu jkunu nodfa, speċjalment meta jkun meħtieġ li jiġu determinati ammonti żgħar ta' sustanzi. |
C. APPLIKAZZJONI TAL-METODI TA' ANALIŻI U ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI
1. Proċedura ta' estrazzjoni
Diversi metodi jiddeterminaw proċedura ta' estrazzjoni speċifika. Bħala regola ġenerali, jistgħu jiġu applikati proċeduri oħrajn ta' estrazzjoni apparti l-proċedura msemmija, bil-kundizzjoni li tkun ingħatat prova li l-proċedura ta' estrazzjoni użata għandha l-effikaċja tal-estrazzjoni ekwivalenti għall-massa analizzata bħalma għandha l-proċedura msemmija fil-metodu.
2. Proċedura ta' tindif
Diversi metodi jiddeterminaw proċedura speċifika ta' tindif. Bħala regola ġenerali, jistgħu jiġu applikati proċeduri oħra ta' tindif apparti l-proċedura msemmija, bil-kundizzjoni li tkun ingħatat prova li l-proċedura ta' tindif użata tirriżulta f'riżultati analitiċi ekwivalenti għall-matriċi analizzata bħall-proċedura msemmija fil-metodu.
3. Rappurtaġġ tal-metodu ta' analiżi użat
Ġeneralment, metodu wieħed ta' analiżi huwa stabbilit għad-determinazzjoni ta' kull sustanza fl-għalf. Fejn jingħataw ħafna metodi, il-metodu partikolari użat mill-laboratorju ta' kontroll irid ikun indikat fuq ir-rapport tal-analiżi.
4. Numru ta' determinazzjonijiet
Ir-riżultat mogħti fir-rapport tal-analiżi għandu jkun il-valur medju miksub minn tal-inqas żewġ determinazzjonijiet, li jkunu saru fuq porzjonijiet separati tal-kampjun u ta' ripetibilità sodisfaċenti.
Madankollu, f'każ ta' analiżi ta' sustanzi mhux mixtieqa, jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni ikun sostanzjalment (> 50 %) inqas mill-ispeċifikazzjoni li trid tiġi kkontrollata, m'hemmx bżonn ta' determinazzjonijiet addizzjonali, bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta' kwalità xierqa.
Fil-każ tal-kontroll tal-kontenut iddikjarat ta' sustanza jew ingredjent, jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni jikkonferma l-kontenut iddikjarat, jiġifieri r-riżultat analitiku jaqa' fi ħdan il-marġni ta' varjazzjoni aċċettabbli tal-kontenut iddikkjarat, m'hemm bżonn tal-ebda determinazzjoni addizzjonali, bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta' kwalità xierqa.
F'ċerti każijiet dan il-marġni ta' varjazzjoni aċċettabbli huwa definit f'leġiżlazzjoni bħalma hemm fid-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE (1)
5. Rappurtaġġ tar-riżultat analitiku
Ir-riżultat analitiku għandu jiġi mfisser bil-mod stabbilit fil-metodu ta' analiżi għal numru xieraq ta' ċifri sinifikanti u jekk ikun hemm bżonn, għandu jiġi kkoreġut għall-kontenut likwidu tal-kampjun finali qabel il-preparazzjoni.
6. Inċertezza tal-kejl u r-rata ta' rkuprar fil-każ ta' analiżi ta' sustanzi mhux mixtieqa.
Rigward is-sustanzi mhux mixtieqa fi ħdan it-tifsira tad-Direttiva 2002/32/KE, inkluż dijossini u PCBs simili għad-dijossini, prodott intenzjonat għall-għalf tal-annimali għandu jitqies bħala mhux konformi mal-kontenut massimu stabbilit, jekk ir-riżultat analitiku jitqies li jaqbeż il-kontenut massimu filwaqt li tiġi kkunsidrata kemm l-inċertezza tal-kejl imwessa' kif ukoll il-korrezzjoni għall-irkupru. Sabiex tiġi analizzata l-konformità, tintuża l-konċentrazzjoni analizzata wara li tiġi kkoreġuta għall-irkupru u wara t-tnaqqis tal-inċertezza tal-kejl imwessa'. Din il-proċedura hija applikabbli biss f'każijiet fejn il-metodu tal-analiżi jippermetti l-istima tal-inċertezza tal-kejl u l-korrezzjoni għall-irkupru (eż. Mhux possibbli fil-każ ta' analiżi mikroskopika).
Ir-riżultat analitiku għandu jiġi rappurtat kif ġej (sakemm il-metodu ta' analiżi użat jippermetti li tiġi stmata l-inċertezza tal-kejl u r-rata tal-irkupru):
(a) |
ikkoreġut għall-irkupru, bil-livell ta' rkuprar ikun indikat. Il-korrezzjoni għall-irkupru mhix neċessarja fil-każ li r-rata tal-irkupru tkun bejn 90 – 110 %. |
(b) |
bħala “x +/- U”, fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl imwessa', billi jintuża fattur ta' kopertura ta' 2 li jagħti livell ta' fiduċja ta' madwar 95 %. |
Madankollu, jekk ir-riżultat tal-analiżi huwa sostanzjalment (> 50 %) inqas mill-ispeċifikazzjoni li trid tiġi kkontrollata, u bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri xierqa ta' kwalità, u l-analiżi sservi biss l-iskop li tiġi ċċekkjata l-konformità mad-dispożizzjonijiet legali, ir-riżultat analitiku jista' jiġi rrappurtat mingħar korrezzjoni għall-irkupru u f'dawn il-każijiet, ir-rappurtaġġ tar-rata tal-irkupru u l-inċertezza tal-kejl jistgħu jitħallew barra.
ANNESS III
METODI TA' ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-KOMPOŻIZZJONI TAL-MATERJALI TAL-GĦALF U L-GĦALF KOMPOST
A. DETERMINAZZJONI TAL-UMDITÀ
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-umdità fl-għalf. Fil-każ ta' għalf li jkun fih sustanzi volatili, bħall-aċidi organiċi, għandu jiġi osservati li ammont sinifikanti ta' sustanzi volatili wkoll jiġi determinat flimkien mal-umdità.
Dan ma jkoprix l-analiżi ta' prodotti tal-ħalib bħala materjal għall-għalf, l-analiżi ta' sustanzi minerali u taħlitiet fil-maġġoranza komposti minn sustanzi minerali, l-analiżi ta' xaħmijiet u żjut mill-annimali u mill-ħxejjex jew l-analiżi taż-żerriegħa taż-żejt u frott żejtni.
2. Prinċipju
Il-kampjun jitnixxef taħt kundizzjonijiet speċifikati li jvarjaw skont in-natura tal-għalf. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin. Huwa neċessarju li tagħmel tnixxif preliminari meta tkun qed titratta ma' għalf solidu li li għandu kontenut ta' umdità għoli.
3. Apparat
3.1. |
Kraxer magħmul minn materjal li ma jassorbix l-umdità u li jkun faċli biex jitnaddaf, jippermetti tifrik rapidu u ndaqs mingħajr ma jipproduċi sħana apprezzabbli, sa fejn possibbli jipprevjeni l-kuntatt mal-arja ta' barra u jissodisfa l-ħtiġiet stabbiliti f'4.1.1. u 4.1.2. (e.ż. taħħana-mikro tal-martell jew imkessħa bl-ilma, taħħana f'forma ta' koni li jistgħu jiġu żarmati, taħħana li jaħdmu bil-mod jew dawk b'roti bis-snien). |
3.2. |
Miżien analitiku, preċiż sa 1 mg. |
3.3. |
Kontenituri xotti magħmulin minn metall li ma jissaddadx jew tal-ħġieġ bl-għotien li jassiguraw għeluq li ma tgħaddix arja minnu, superfiċje ta' fejn isir ix-xogħol li jippermetti li l-kampjun għat-test jinfirex f'madwar 0,3 g/cm2. |
3.4. |
Forn isotermiku li jissaħħan bl-elettriku (± 2 oC) ventilat kif suppost u li jassigura regolazzjoni rapida tat-temperatura (1). |
3.5. |
Forn tal-vakum li jisħon bl-elettriku li jista' jkun aġġustat armat b'pompa għaż-żejt u/jew b'mekkaniżmu li jintroduċi arja xotta sħuna jew aġent li jnixxef (eż. ossidu tal-kalċju). |
3.6. |
Dessikatur b'metall oħxon perforat jew pjanċa tal-porċellana, li fiha aġent li jnixxef b'mod effiċjenti. |
4. Proċedura
N.B. |
L-operazzjonijiet deskritti f'din it-taqsima jridu jsiru immedjatament wara li jinfetħu l-pakketti tal-kampjuni. Tal-inqas, l-analiżi trid issir darbtejn. |
4.1. Preparazzjoni
4.1.1.
Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Jekk ikun hemm bżonn, farrak jew aqsam b'tali mod li tevita kwalunkwe varjazzjoni fl-umdità (ara 6).
4.1.2.
Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Itħan f'partikoli li minnhom tal-inqas 50 % jgħaddu minn passatur b'malji ta' 0,5 mm u ma jibqax iktar minn 10 % skart f'passatur tond b'malji ta' 1 mm
4.1.3.
Ħu madwar 25 g mill-kampjun, iżen sal-eqreb 10 mg, żid kwantità xierqa ta' ramel anidridu miżun sal-eqreb 10 mg u ħallat sakemm jinkiseb prodott omoġenju.
4.2. Tnixxif
4.2.1.
Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 1 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 103 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Ħallih ħa jinxef għal madwar erba' sigħat ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 103 oC. Erġa' poġġi l-għatu fuq il-kontenitur, u neħħih mill-forn u ħallih jibred għal madwar 30 sa 45 minuta fid-dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.
Għal għalf kompost fil-maġġoranza minn żjut u xaħmijiet, nixxef fil-forn għal 30 minuta oħra b'temperatura ta' 130 oC. Id-differenza bejn użin u ieħor m'għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-umdità.
4.2.2.
Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun mitħun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 130 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Ħallih ha jinxef għal sagħtejn ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 130 oC. Erġa' poġġi l-għatu fuq il-kontenitur, u neħħih mill-forn u ħallih jibred għal madwar 30 sa 45 minuta fid-dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.
4.2.3. |
Għalf kompost li fih aktar minn 4 % sukrożju jew lattożju: materjal tal-għalf bħal ħarrub, prodotti taċ-ċereali idrolizzati, żerriegħa tax-xgħir, laqx tal-pitravi imnixxef, sustanzi li jdubu tal-ħut u taz-zokkor; għalf kompost li fih aktar minn 25 % melħ minerali inkluż l-ilma tal-kristallazzjoni. Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn tal-arja (3.5) li huwa diġà msaħħan sa bejn 80 oC u 85 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Tella' l-pressjoni sa 100 Torr u ħallih ħa jinxef f'din il-pressjoni għal madwar erba' sigħat, jew f'kurrent ta' arja taħraq u niexfa jew bl-użu ta' aġent li jnixxef (madwar 300 g għal 20 kampjun). F'każ li tuża dan tal-aħħar, skonnettja l-pompa tal-arja meta tintlaħaq il-pressjoni preskritta. Ikkalkula l-ħin tat-tnixxif mill-mument meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 80 oC sa 85 oC. B'attenzjoni erġa' ġib il-forn lura għall-pressjoni atmosferika. Iftaħ il-forn, poġġi l-għatu fuq il-kontenitur minnufih, neħħi l-kontenitur mill-forn, ħallih ħa jibred għal 30 sa 45 minuta f'dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg. Nixxef għal 30 minuta oħra fil-forn vakwu b'temperatura ta' 80 oC sa 85 oC u erġa' iżen. Id-differenza bejn iż-żewġ piżijiet m'għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-umdità. |
4.3. Tnixxif preliminari
4.3.1.
Għalf solidu b'umdità għolja li jagħmel it-tħin diffiċli għandu jkun soġġett għal tnixxif preliminari kif ġej:
Iżen 50 g tal-kampjun mhux imfarrak sal-eqreb 10 mg (jekk ikun hemm bżonn, għalf kompressat jew agglomerat jista' jinqasam b'mod każwali) f'kontenitur adattat (eż. platt tal-aluminju 20 × 12 cm b'xifer ta 0,5 cm). Ħallih ħa jinxef f'forn b'60 oC sa 70 oC sakemm l-umdità tkun tnaqqset għal bejn 8 % u 12 %. Neħħih mill-forn u ħallih ħa jibred mikxuf fil-laboratorju għal siegħa u iżen sal-eqreb 10 mg. Farrak immedjatament kif indikat f'4.1.1 u nixxef kif indikat f'4.2.1 jew 4.2.3 skont in-natura tal-għalf.
4.3.2.
Qamħ b'umdità ta' aktar minn 17 % irid ikun soġġett għal tnixxif preliminari kif ġej:
Iżen 50 g qamħ mhux mitħun sal-eqreb 10 mg f'kontenitur adattat (eż. platt tal-aluminju 20 × 12 cm b'xifer ta 0,5 cm). Ħallih ħa jinxef f'forn ta' 130 oC għal 5 sa 7 minuti. Neħħih mill-forn u ħallih ħa jibred mikxuf fil-laboratorju għal sagħtejn u iżen sal-eqreb 10 mg. Farrak immedjatament kif indikat f'4.1.2 u nixxef kif indikat f'4.2.2.
5. Kalkolu tar-riżultati.
L-umdità (X), bħala perċentwal tal-kampjun, hija kkalkulata billi jintużaw il-formoli li ġejjin:
5.1. Tnixxif mingħajr tnixxif preliminari
fejn:
m |
= |
piż inizjali fi grammi, tal-kampjun għat-test, |
m0 |
= |
piż fi grammi, tal-kampjun għat-test imnixxef. |
5.2. Tnixxif bi tnixxif preliminari
fejn:
m |
= |
piż inizjali fi grammi, tal-kampjun għat-test, |
m1 |
= |
piż fi grammi, tal-kampjun għat-test wara t-tnixxif preliminari, |
m2 |
= |
piż fi grammi, tal-kampjun għat-test war t-tifrik jew it-tħin, |
m0 |
= |
piż fi grammi, tal-kampjun għat-test imnixxef. |
5.3. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li saru fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn 0,2 % tal-valur assolut tal-umdità.
6. Osservazzjoni
Jekk jidher li hemm bżonn tat-tifrik u jekk dan jidher li jibdel l-umdità tal-prodott, ir-riżultati tal-analiżi tal-komponenti tal-għalf iridu jiġu korretti skont l-umdità tal-kampjun fl-istat inizjali tiegħu.
B. DETERMINAZZJONI TAL-UMDITÀ FIX-XAĦMIJIET U Ż-ŻJUT TAL-ANNIMALI U L-ĦXEJJEX
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-ilma u sustanzi volatili fiż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali.
2. Prinċipju
Il-kampjun jitnixxef għal piż kostanti (it-telf fil-piż bejn żewġ piżijiet suċċessivi jrid ikun inqas jew ugwali għal 1 mg) f'103 oC. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin.
3. Apparat
3.1. |
Dixx b'qiegħ ċatt, magħmul minn materjal li jiflaħ għall-korrużjoni, b'dijametru ta' 8 sa 9 cm u għoli bejn wieħed u ieħor 3 cm. |
3.2. |
Termometru b'bozza rinfurzata u b'tubu ta' espansjoni fit-tarf ta' fuq, immarkat minn madwar 80 oC sa mill-anqas 110 oC, u twil madwar 10 cm. |
3.3. |
Banju tar-ramel jew hot-plate tal-elettriku. |
3.4. |
Dessikatur, li fih aġent li jnixxef effiċjenti. |
3.5. |
Miżien analitiku. |
4. Proċedura
Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun omoġenizzat, fid-dixx xott li jkun intiżen minn qabel (3.1) bit-termometru fih (3.2). Saħħan fuq il-banju tar-ramel jew fuq il-hot-plate (3.3), filwaqt li tħawwad kontinwament sabiex it-temperatura tilħaq 90 oC f'madwar 7 minuti.
Naqqas is-sħana, filwaqt li tinnota l-frekwenza li biha l-bżieżaq jitilgħu mill-qiegħ tad-dixx. It-temperatura m'għandhiex taqbeż il-105 oC. Kompli ħawwad, aqla' mill-qiegħ tad-dixx sakemm ma jibqgħux jiffurmaw aktar bżieżaq.
Sabiex tassigura l-eliminazzjoni kompluta tal-umdità, erġa' saħħan għal diversi drabi għal 103 oC ± 2 oC, berred sa 93 oC bejn it-tisħin suċċessiv. Imbagħad ħallih jiksaħ sat-temperatura tal-ambjent fid-dessikatur (3.4) u iżen. Irrepeti din l-operazzjoni sakemm it-telf fil-piż bejn żewġ piżijiet suċċessivi ma tkunx aktar minn 2 mg.
N.B. |
Żieda fil-piż tal-kampjun wara tisħin ripetut tindika ossidazzjoni tax-xaħam, u f'dan il-każ ikkalkula r-riżultat mill-użin li jkun sar immedjatament qabel ma beda jiżdied il-piż. |
5. Kalkolu tar-riżultati
Il-kontenut tal-umdità (X), bħala perċentwali tal-kampjun, jiġi kkalkulat permezz tal-formula segwenti:
fejn:
m |
= |
piż, fi grammi, tal-kampjun għat-test; |
m1 |
= |
piż, fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu qabel jissaħħan; |
m2 |
= |
piż fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu wara li jissaħħan. |
Riżultati inqas minn 0,05 % jridu jiġu rrekordjati bħala “inqas minn 0,05 %”.
Ripetibbiltà
Id-differenza fl-umdità bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li jkunu saru fuq l-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu 0,05 %, f'valur assolut.
C. DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAL-PROTEINA MHUX RAFFINATA
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-kontenut tal-proteina mhux raffinata fl-għalf fuq il-bażi tal-kontenut tan-nitroġenu, iddeterminat skont il-metodu Kjeldahl.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa diġerit bl-aċidu sulfuriku fil-preżenza ta' katalista. Is-soluzzjoni aċidika hija magħmula alkalina b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju. L-ammonja hija distillata u miġbura fi kwantità mkejla ta' aċidu sulfuriku li l-eċċess tagħha huwa titrat b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju.
Inkella, l-ammonja libera hija distillata f'eċċess ta' soluzzjoni ta' aċidu boriku, segwita minn titrazzjoni b'soluzzjoni ta' aċidu idrokloriku jew aċidu sulfuriku.
3. Reaġenti
3.1. |
Sulfat tal-potassju. |
3.2. |
Katalist: copper (II) oxide CuO jew copper (II) sulphate pentahydrate, CuSO4 5H2O. |
3.3. |
Frak taż-żingu. |
3.4. |
Aċidu sulfuriku, ρ20 = 1,84 g/ml. |
3.5. |
Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. |
3.6. |
Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. |
3.7. |
Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. |
3.8. |
Indikatur tal-metil aħmar; dewweb 300 mg metil aħmar f'100 ml etanol, , σ = 95–96 % (v/v). |
3.9. |
Soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (Jista' jintuża l-grad tekniku) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). |
3.10. |
Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni volumetrika standard c (NaOH) = 0,25 mol/l. |
3.11. |
Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni volumetrika standard c (NaOH) = 0,10 mol/l. |
3.12. |
Ħaffiefa mfarrka, maħsula fl-aċidu idrokloriku u mogħTija n-nar. |
3.13. |
Acetanilide (m.p. = 114 oC, N-kontenut = 10,36 %). |
3.14. |
Sukrożju (ħieles min-nitroġenu). |
3.15. |
Aċidu boriku (H3BO3). |
3.16. |
Soluzzjoni tal-indikatur tal-metil aħmar: dewweb 100 mg metil aħmar f'100 ml etanol jew metanol. |
3.17. |
Soluzzjoni ta' bromocresol aħdar: dewweb 100 mg bromocresol aħdar f'100 ml etanol jew metanol. |
3.18. |
Soluzzjoni tal-aċidu boriku (10 g/l sa 40 g/l skont l-apparat użat) Meta tiġi applikata l-aħħar ditezzjoni kolorimetrika, l-indikaturi metil aħmar u l-bromocresol iridu jiżdiedu mas-soluzzjonijiet tal-aċidu boriku. Jekk jiġi ppreparat 1 l aċidu boriku, qabel jiġi aġġustat il-volum, għandhom jiżdiedu 7 ml soluzzjoni tal-indikatur metil aħmar (3.16) u 10 ml soluzzjoni ta' bromocresol aħdar (3.17). Il-pH tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku tista' tvarja minn lott għal lott skont l-ilma użat. Ħafna drabi jkun hemm bżonn ta' aġġustament b'volum żgħir ta' alkali sabiex tinkiseb risposta pożittiva.
|
3.19 |
Soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku c(HCl) = 0,10 mol/l.
|
4. Apparat
Apparat adattat sabiex issir id-diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni skont il-proċedura Kjeldahl.
5. Proċedura
5.1. Digestjoni
Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb 0,001 g u qiegħed il-kampjun fil-kunjett tal-apparat tad-diġestjoni. Żid 15 g sulfat tal-potassju (3.1.), kwantità adatta tal-katalist (3.2) (0,3 sa 0,4 g copper (II) oxide jew 0,9 sa 1,2 g copper (II) sulphate pentahydrate), 25 ml aċidu sulfuriku (3.4) u jekk meħtieġ, ftit frak tal-ħaffiefa (3.12) u ħallat.
Saħħan il-kunjett moderatament għall-ewwel, jekk ikun hemm bżonn ħawdu minn żmien għal żmien sakemm il-massa tkun ikkarbonizzata u r-ragħwa tkun sparixxiet; imbagħad saħħan b'mod aktar intensiv sakemm il-likwidu jkun qiegħed jagħli sew. It-tisħin huwa adegwat jekk l-aċidu li jkun qiegħed jagħli jikkondensa fuq il-ħajt tal-kunjett. Tħallix li l-ġnub jisħnu żżejjed u li partikoli organiċi jeħlu magħhom.
Meta s-soluzzjoni ssir ċara u ħadra ċara, kompli għalli għal sagħtejn oħra, u wara ħalliha ħa tibred.
5.2. Distillazzjoni
Bil-mod, żid biżżejjed ilma sabiex tassigura li s-sulfati jdubu kompletament. Ħalli ħa jibred u wara, jekk ikun hemm bżonn, żid ftit trab taż-żingu (3.3). Kompli skont 5.2.1. jew 5.2.2.
5.2.1.
Fil-kunjett tal-ġbir tal-apparat għad-distillazzjoni poġġi kwantità mkejla eżatta ta' 25 ml aċidu sulfuriku (3.5) jew (3.7) skont il-kontenut preżunt tan-nitroġenu. Żid ftit qtar ta' indikatur tal-metil aħmar (3.8).
Qabbad il-kunjett tad-diġestjoni mal-kondensatur tal-apparat għad-distillazzjoni u għaddas it-tarf tal-kondensatur fil-likwidu li jinsab fil-kunjett tal-ġbir għal fond ta' madwar 1 cm (ara l-osserv azzjoni 8.3). Bil-mod, ferra' 100 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.9) fil-kunjett għad-diġestjoni mingħajr telf ta' ammonja (ara osservazzjoni 8.1). Saħħan il-kunjett sakemm l-ammonja tkun iddistillat.
5.2.2.
Fejn it-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat issir manwalment, tapplika l-proċedura msemmija hawn taħt. Fejn l-unità tad-distillazzjoni hija kompletament awtomatika biex tinkludi t-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat, segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-operazzjoni tal-unità tad-distillazzjoni.
Poġġi l-kunjett tal-ġbir li fih 25 ml sa 30 ml tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (3.18) taħt il-ħruġ tal-kondensatur b'tali mod li t-tubu tal-ġarr ikun taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni ta' aċidu boriku żejda. Irranġa l-unità tad-distillazzjoni biex tagħti 50 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.9). Irranġa l-unità tad-distillazzjoni skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur u ddistilla ‘l barra l-ammonja li nħelset biż-żieda tas-soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju. Iġbor id-distillat fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku riċevitriċi. L-ammont ta' distillat (ħin tad-distillazzjoni bil-fwar) jiddependi mill-ammont ta' nitroġenu fil-kampjun. Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
Nota: |
F'unità għad-distillazzjoni semi-awtomatika, iż-żieda tal-eċċess ta' idrossidu tas-sodju u d-distillazzjoni bil-fwar isiru awtomatikament. |
5.3. Titrazzjoni
Ipproċedi skont 5.3.1. jew 5.3.2.
5.3.1.
Fil-kunjett tal-ġbir ittitra l-eċċess tal-aċidu sulfuriku b'soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju (3.10 jew 3.11) skont il-konċentrazzjoni ta' aċidu sulfuriku użat, sakemm jintlaħaq il-punt finali.
5.3.2.
Ittitra l-kontenut tal-kunjett tal-ġbir bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku (3.19) jew bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu sulfuriku (3.6) billi tuża buretta u aqra l-ammont ta' titrant użat.
Meta tiġi applikata l-aħħar ditezzjoni kolorimetrika, il-punt finali jintlaħaq mal-ewwel traċċa tal-kulur roża fil-kontenut. Ivvaluta l-qari tal-buretta sal-eqreb 0,05 ml. Stirrer plate manjetika jew ditettur fotometriku jistgħu jgħinu sabiex tara l-punt finali.
Dan jista' jsir awtomatikament billi jintuża distillatur tal-fwar b'titrazzjoni awtomatika.
Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur biex tħaddem id-distillatur speċifiku jew distillatur/titratur.
Nota: |
Meta tintuża sistema ta' titrazzjoni awtomatika, it-titrazzjoni tibda immedjatament wara li tibda d-distillazzjoni u tintuża 1 % tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (3.18). Fejn titħaddem unità tad-distillazzjoni kompletament awtomatika, it-titrazzjoni awtomatika tal-ammonja tista' ssir bid-ditezzjoni tal-punt finali billi tintuża sistema ta' potentiometric pH. F'dan il-każ jintuża titratur awtomatiku b'pH-miter. Il-pH-miter għandu jkun ikkalibrat sewwa fil-medda ta' pH 4 sa pH 7 bi proċeduri ta' kalibrar ta' pH normali fil-laboratorju. Il-punt finali ta' pH tat-titrazzjoni jintlaħaq f'pH 4,6, billi huwa l-ogħla punt fil-kurva tat-titrazzjoni (punt ta' inflezzjoni). |
5.4. Test blank
Biex tikkonferma li r-reaġenti m'għandhomx nitroġenu, agħmel test blank (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) billi tuża 1 g sukrożju (3.14) minflok il-kampjun.
6. Kalkolu tar-riżultati
Il-kalkoli jsiru skont 6.1 jew 6.2.
6.1. Kalkolu tat-titrazzjoni skont 5.3.1
Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:
fejn:
Vo |
= |
hija l-volum (ml) ta' NaOH (3.10 jew 3.11) użat fit-test blank. |
V1 |
= |
hija l-volum (ml) ta' NaOH (3.10 or 3.11) użat fil-kampjun tat-titrazzjoni. |
c |
= |
hija l-konċentrazzjoni (mol/l) ta' idrossidu tas-sodju (3.10 jew 3.11). |
m |
= |
hija l-piż (g) tal-kampjun. |
6.2 Kalkolu tat-titrazzjoni skont 5.3.2
6.2.1.
Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:
fejn:
m |
= |
hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test; |
c |
= |
hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta' aċidu idrokloriku (3.19); |
V0 |
= |
hija l-volum (f'ml) ta' aċidu idrokloriku użat għat-test blank; |
V1 |
= |
hija l-volum (f'ml) ta' aċidu idrokloriku użat għall-porzjon għat-test. |
6.2.2.
Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:
fejn:
m |
= |
hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test; |
c |
= |
hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta' aċidu sulfuriku (3.6); |
V0 |
= |
hija l-volum (f'ml) ta' aċidu sulfuriku (3.6) użat għat-test blank; |
V1 |
= |
hija l-volum (f'ml) ta'aċidu sulfuriku (3.6) użat għall-porzjon għat-test. |
7. Verifika tal-metodu
7.1. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu:
— |
0,2, f'valur assolut għall-kontenut mhux raffinat ta' proteini ta' inqas minn 20 %; |
— |
1,0 %, relattiv għall-ogħla valur, għall-kontenut mhux raffinat ta' proteini ta' mhux inqas minn 20 % u mhux aktar minn 40 %; |
— |
0,4, f'valur assolut, għall-kontenut mhux raffinat ta' proteini ta' aktar minn 40 %. |
7.2. Preċiżjoni
Agħmel l-analiżi (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) fuq 1,5 sa 2,0 g acetanilide (3.13) fil-preżenza ta' 1 g sukrożju (3.14); 1 g acetanilide tikkonsma 14,80 ml aċidu sulfuriku (3.5). L-irkupru jrid ikun tal-inqas 99 %.
8. Osservazzjonijiet
8.1. |
L-apparat jista' jkun tat-tip manwali, semi-awtomatiku jew awtomatiku. Jekk l-apparat jeħtieġ it-trasferiment bejn diġestjoni u distillazzjoni, dan it-trasferiment għandu jitwettaq mingħajr telf. Jekk il-kunjett tal-apparat tad-distillazzjoni ma jkunx iffittjat b'lenbut għat-tifrigħ żid l-idrossidu tas-sodju immedjatament qabel ma tqabbad il-kunjett mal-kondensatur, waqt li tferra' l-likwidu bil-mod mal-ġnub tal-kondensatur. |
8.2. |
Jekk id-diġestjoni tissolidifika, erġa' ibda d-determinazzjoni billi tuża ammont akbar ta' aċidu sulfuriku (3.4) minn dak speċifikat hawn fuq. |
8.3. |
Għall-prodotti b'kontenut baxx ta' nitroġenu, il-volum tal-aċidu sulfuriku (3.7) li għandu jitqiegħed fil-kunjett tal-ġbir jista' jitnaqqas, fejn meħtieġ, sa 10 jew 15 ml u jiżdied sa 25 ml bl-ilma. |
8.4. |
Għal analiżi ta' rutina, jistgħu jiġu applikati metodi ta' analiżi alternattivi għad-determinazzjoni ta' proteina mhux raffinata iżda l-metodu Kjeldahl deskritt f'din il-Parti C huwa l-metodu ta' referenza. L-ekwivalenti tar-riżultati miksubin bil-metodu alternattiv, (eż. DUMAS) imqabbla mal-metodu ta' referenza, jridu jintwerew individwalment għal kull massa. Billi r-riżultati miksubin b'metodu alternattiv, jistgħu jvarjaw xi ftit mir-riżultati miksubin bil-metodu ta' referenza anke wara li tkun ġiet ivverifikata l-ekwivalenza, fir-rapport analitiku jrid jissemma' l-metodu ta' analiżi għad-determinazzjoni tal-proteina mhux raffinata. |
D. DETERMINAZZJONI TA' UREA
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' urea fl-għalf.
2. Prinċipju
Il-kampjun jiġi sospiż fl-ilma b'aġent li jiċċara. Is-sospensjoni tiġi filtrata. Il-kontenut tal-urea tal-filtrat jiġi stabbilit wara ż-żieda ta' 4-dimethylaminobenzaldehyde (4-DMAB) billi titkejjel id-densità ottika f'wavelength ta' 420 nm.
3. Reaġenti
3.1. |
Soluzzjoni ta' 4-dimethylaminobenzaldehyde: dewweb 1,6 g ta' 4-DMAB f'100 ml ta' 96 % etanol u żid 10 ml aċidu idrokloriku ((ρ201,19 g/ml). Dan ir-reaġent iżomm għal perjodu massimu ta' ġimagħtejn. |
3.2. |
Soluzzjoni Carrez I: fl-ilma dewweb 21,9 g zinc acetate, Zn(CH3COO)2 2H2O u 3 g aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.3. |
Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g potassium ferrocyanide, K4 Fe (CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.4. |
Karbonju attiv li ma jassorbix l-urea (irid jiġi vverifikat). |
3.5. |
0,1 % soluzzjoni (w/v) ta' urea. |
4. Apparat
4.1. |
Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm. |
4.2. |
Test tubes: 160 × 16 mm b'tappijiet tal-ħġieġ mitħun. |
4.3. |
Spettrofotometru. |
5. Proċedura
5.1. Analiżi tal-kampjun
Iżen 2 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 500 ml 1g karbonju attiv(3.4). Żid 400 ml ilma u 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal madwar 30 sekonda u żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3). Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza. Żid sal-volum bl-ilma, ħawwad u ffiltra.
Neħħi 5 ml tal-filtrati trasparenti bla kulur, qiegħed f'test tubes b'tappijiet tal-ħġieġ mitħun, żid 5 ml ta' soluzzjoni 4-DMAB (3.1) u ħawwad. Qiegħed it-tubi f'banju bl-ilma sħun f'temperatura ta' 20 oC (+/- 4 oC). Wara ħmistax-il minuta kejjel id-densità ottika tas-soluzzjoni tal-kampjun bl-ispettrofotometru f'420 nm. Qabbel is-soluzzjoni tat-test blank tar-reaġenti.
5.2. Kurva ta' kalibrar
Neħħi volumi ta' 1, 2, 4, 5 u 10 ml tas-soluzzjoni tal-urea (3.5), qiegħed f'kunjetti volumettriċi ta' 100 ml u żid sal-volum bl-ilma. Neħħi 5 ml minn kull soluzzjoni, żid 5 ml ta' soluzzjoni ta' 4-DMAB (3.1) f'kull wieħed minnhom, omoġenizza u kejjel id-densità ottika kif murija fuq meta mqabbla mas-soluzzjoni ta' kontroll li jkun fiha 5 ml ta' 4-DMAB u 5 ml ilma ħieles mill-urea. Ipplottja l-kurva ta' kalibrar.
6. Kalkolu tar-riżultati
Stabbilixxi l-ammont ta' urea fil-kampjun permezz tal-kurva ta' kalibrar.
Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
Fil-każ ta' kontenuti ta' urea li jaqbżu t-3 %, naqqas il-kampjun sa 1 g jew żid is-soluzzjoni oriġinali bl-ilma sabiex ma jkunx hemm aktar minn 50 mg urea f'500 ml. |
7.2. |
Fil-każ ta' kontenuti baxxi ta' urea, żid il-kampjun sakemm il-filtrat jibqa' trasparenti u bla kulur. |
7.3. |
Jekk il-kampjun ikun fih komponenti nitroġeni sempliċi bħal ma huma amino acids, id-densità ottika għandha titkejjel f'435 nm. |
E. DETERMINAZZJONI TA' BAŻIJIET VOLATILI TAN-NITROĠENU
I. BIL-MIKRODIFFUŻJONI
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-kontenut ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu, imfissra bħala ammonja, fl-għalf.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa estratt bl-ilma u s-soluzzjoni kjarifikata u ffiltrata. Il-bażijiet volatili tan-nitroġenu huma spustjati bil-mikrodiffużjoni bl-użu ta' soluzzjoni ta' karbonat tal-potassju, miġburin f'soluzzjoni ta' aċidu boriku u titrat b'aċidu sulfuriku.
3. Reaġenti
3.1. |
20 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid. |
3.2. |
L-indikatur: dewweb 33 mg bromokresol aħdar u 65 mg metil aħmar f'100 ml 95 %-96 % (v/v) etanol. |
3.3. |
Is-soluzzjoni tal-aċidu boriku: f'kunjett iggradat ta' 1 l dewweb 10g aċidu boriku f'200 ml ta' 95 %-96 % (v/v) etanol u 700 ml ilma. Żid 10 ml tal-indikatur (3.2.). Ħallat u, jekk neċessarju, aġġusta l-kulur tas-soluzzjoni għal aħmar ċar billi tiżdied soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju. 1 ml ta' din is-soluzzjoni tiffissa massimu ta' 300 μg ta' NH3. |
3.4. |
Soluzzjoni saturata tal-karbonat tal-potassju: dewweb 100 g karbonat tal-potassju f'100 ml ilma jagħli. Ħallih jiksaħ, iffiltra. |
3.5. |
Aċidu sulfuriku 0,01 mol/litru. |
4. Apparat
4.1. |
Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 r.p.m. |
4.2. |
Ċelloli tal-ħġieġ jew tal-plastik Conway (ara t-tpinġija). |
4.3. |
Mikroburetti ggradati f'1/100 ml. |
5. Proċedura
Iżen 10 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u qiegħed ma' 100 ml ilma f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħallat fit-tazza għal 30 minuta. Żid 50 ml ta' soluzzjoni ta' trichloroacetic acid (3.1), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad bis-saħħa u ffiltra minn filtru mmewweġ.
Bl-użu ta' pipetta, introduċi 1 ml soluzzjoni ta' aċidu boriku (3.3) fil-parti ċentrali taċ-ċellola Conway u 1 ml tal-kampjun iffiltrat fil-parti ta' fuq taċ-ċellola. għatti parzjalment bl-għatu bix-xaħam. Ferra' 1 ml tas-soluzzjoni tal-karbonat tal-potassju saturat (3.4) malajr fil-parti ta' fuq u agħlaq l-għatu sabiex iċ-ċellola tkun issiġillata kontra d-dħul tal-arja. Dawwar iċ-ċellola b'attenzjoni fi pjan orizzontali sabiex jitħalltu ż-żewġ reaġenti. Ħalliha inkubata għal mill-inqas erba' sigħat f'temperatura ambjentali jew għal siegħa f'40 oC.
Bl-użu ta' mikroburetta (4.3), ittitra l-bażijiet volatili fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku bl-aċidu sulfuriku (3.5).
Wettaq test blank bl-użu tal-istess proċedura imma mingħajr kampjun li għandu jiġi analizzat.
6. Kalkolu tar-riżultati
1 ml ta' H2SO40,01 mol/litru jikkorrispondi għal 0,34 mg ammonja.
Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:
— |
10 %, f'valur relattiv, għal kontenut tal-ammonja ta' inqas minn 1,0 %; |
— |
0,1 %, f'valur assolut, għal kontenuti tal-ammonja ta' 1,0 % jew iktar. |
7. Osservazzjoni
Jekk il-kontenut tal-ammonja tal-kampjun ikun aktar minn 0,6 %, iddilwixxi l-filtrat inizjali.
CONWAY CELL
Scale 1/1
II. BID-DISTILLAZZJONI
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu, imfisser bħala ammonja, f'ħut mitħun li ma jkun fih prattikament ebda urea. Huwa applikabbli biss għal kontenuti tal-ammonja ta' inqas minn 0,25 %.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa estratt bl-ilma u s-soluzzjoni kjarifikata u ffiltrata. Il-bażijiet volatili tan-nitroġenu huma spustjati fil-punt ta' togħlija billi jiżdied l-ossidu tal-manjeżju u miġbura fi kwantità speċifika ta' aċidu sulfuriku, li l-eċċess tiegħu huwa titrat lura b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju.
3. Reaġenti
3.1. |
20 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid. |
3.2. |
Ossidu tal-manjeżju. |
3.3. |
Emulsjoni kontra r-ragħwa (eż. silicone). |
3.4. |
Aċidu sulfuriku 0,05 mol/litru. |
3.5. |
Soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru. |
3.6. |
0,3 % (w/v) soluzzjoni tal-metil aħmar f'95 %-96 % (v/v) etanol. |
4. Apparat
4.1. |
Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 r.p.m. |
4.2. |
Apparat ta' distillazzjoni tat-tip Kjeldahl. |
5. Proċedura
Iżen 10 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u qiegħed ma' 100 ml ilma f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħallat fit-tazza għal 30 minuta. Żid 50 ml ta' soluzzjoni ta' trichloroacetic acid (3.1), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad bis-saħħa u ffiltra minn filtru mmewweġ.
Ħu kwantità ta' filtrat ċar xieraq għall-kontenut preżunt ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu (100ml huwa normalment xieraq). Iddilwixxi sa 200 ml u żid 2 ossidu tal-manjeżju (3.2) u ftit qtar ta' emulsjoni li ma tagħmilx ragħwa (3.3). Is-soluzzjoni għandha tkun alkalina għal karta litmus; inkella żid ftit ossidu tal-manjeżju (3.2). Kompli skont 5.2 u 5.3 tal-metodu tal-analiżi għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-proteina mhux raffinata (Parti C ta' dan l-Anness).
Wettaq test blank bl-użu tal-istess proċedura imma mingħajr kampjun li għandu jiġi analizzat.
6. Kalkolu tar-riżultati
1 ml ta' H2SO40,05 mol/litru jikkorrispondi għal 1,7 mg ammonja.
Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn, f'valur relattiv, 10 % ammonja.
F. DETERMIMAZZJONI TA' AMINO ACIDS (BARRA TRYPTOPHAN)
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu determinati l-amino acids ħielsa (sintetiċi u naturali) u totali (marbutin b'peptides u ħielsa) fl-għalf, bl-użu ta' analizzatur tal-amino acid. Dan japplika għall-amino acids li ġejjin: cycs(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidne, isoleucine, leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine u valine.
Il-metodu ma jiddistingwix bejn l-imluħa tal-amino acids u ma jistax jagħmel distinzjoni bejn il-forom D u L tal-amino acids. M'huwiex validu għad-determinazzjoni ta' analogi ta' tryptophan jew hydroxy ta' amino acids.
2. Prinċipju
2.1. Amino acids ħielsa
L-amino acids ħielsa jinħarġu b'aċidu idrokloriku dilwit. Makromolekuli nitroġeniċi koestratti jiġu ppreċipitati bis-sulfosalicylic acid u jitneħħew billi jiġu ffiltrati. Is-soluzzjoni ffiltrata tiġi aġġustata għal pH 2,20. L-amino acids jiġu sseparati bi kromatografija ta' skambju tal-jonji u jiġu ddeterminati permezz ta' reazzjoni man-ninhydrin b'ditezzjoni fotometrika f'570 nm.
2.2. Amino acids totali
Il-proċedura magħżula tiddependi fuq l-amino acids li jkunu qegħdin jiġu investigati. Is-Cyst(e)ine u l-methionine għandhom jiġu ossidizzati għal cysteic acid u methionine sulphone rispettivament qabel ma ssir l-idroliżi. It-tyrosine għandu jiġi ddeterminat f'hydrolysates ta' kampjuni mhux ossidizzati. L-amino acids l-oħra kollha li huma mniżżlin fil-paragrafu 1 jistgħu jiġu ddeterminati kemm fil-kampjun ossidizzat kif ukoll f'dak li mhuwiex ossidizzat.
L-ossidizzazzjoni ssir f'0 oC b'taħlita ta' performic acid/phenol. Ir-reaġent li jkun fadal jiġi dekompost b'sodium disulphate. Il-kampjun ossidizzat jew mhux ossidizzat jiġi idrolizzat bl-aċidu idrokloriku (3.20) għal 23 siegħa. Il-hydrolysate jiġi aġġustat għal pH 2,20. L-amino acids jiġu sseparati bi kromatografija ta' skambju tal-jonji u jiġu ddeterminati permezz ta' reazzjoni man-ninhydrin b'ditezzjoni fotometrika f'570 nm (440 nm għall-proline).
3. Reaġenti
Għandu jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta' kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS).
3.1. |
Hydrogen peroxide, w (w/w) = 30 %. |
3.2. |
Formic acid, w (w/w) = 98 – 100 %. |
3.3. |
Phenol. |
3.4. |
Sodium disulphite. |
3.5. |
Idrossidu tas-sodju. |
3.6. |
5-Sulfosalicylic acid dihydrate. |
3.7. |
Aċidu idrokloriku, densità bejn wieħed u ieħor 1,18 g/ml. |
3.8. |
tri-Sodium citrate dihydrate. |
3.9. |
2,2'-Thiodiethanol (thiodiglycol). |
3.10. |
Sodium chloride. |
3.11. |
Ninhydrin. |
3.12. |
Petroleum ħafif, jiftaħ jagħli bejn 40 – 60 oC. |
3.13. |
Norleucine, jew komponent ieħor xieraq għall-użu bħala standard intern. |
3.14. |
Gass tan-nitroġenu (< 10 ppm ossiġnu). |
3.15. |
1-Octanol. |
3.16. |
Amino acids. |
3.16.1. |
Sustanzi standard imniżżlin fil-paragrafu 1. Komponenti puri li ma jkunx fihom ilma tal-kristallizzazzjoni. Nixxef taħt vakwu fuq P2O5 jew H2SO4 għal ġimgħa (1) qabel l-użu. |
3.16.2. |
Cysteic acid. |
3.16.3. |
Methionine sulphone. |
3.17. |
Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 7,5 mol/l: Dewweb 300 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l. |
3.18. |
Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 1 mol/l: Dewweb 40 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l. |
3.19. |
Soluzzjoni ta' Formic acid-phenol: Ħallat 889 g formic acid (3.2) ma' 111 g ilma u żid 4,73 g phenol (3.3). |
3.20. |
Taħlita ta' hydrolysis, c = 6 mol HCl/l li jkun fih 1 g phenol/l: Żid 1 g phenol (3.3) sa 492 ml HCl (3.7) u żid bl-ilma sakemm ikollok 1 l. |
3.21. |
Taħlita għall-estrazzjoni, c = 0,1 mol HCl/l li jkun fiha 2 % thiodiglycol: Ħu 8,2 ml HCl (3.7), żid bejn wieħed u ieħor 900 ml ilma, żid 20 ml thiodiglycol (3.9) u żid bl-ilma sakemm ikollok 1 l, (tħallatx 3.7 u 3.9 direttament). |
3.22. |
5-Sulfosalicylic acid, ß = 6 %: Dewweb 60 g 5-sulfosalicylic acid (3.6) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l. |
3.23. |
Taħlita għall-ossidizzazzjoni (Performic acid-phenol): Ħallat 0,5 ml hydrogen peroxide (3.1) ma' 4,5 ml soluzzjoni ta' formic acid-phenol (3.19) f'tazza żgħira. Poġġi f'inkubatur f'temperatura ta' bejn 20-30 oC għal madwar siegħa (1hr) sabiex tifforma l-performic acid, imbagħad kessaħ f'banju tal-ilma bis-silġ (15-il minuta) qabel ma żżid mal-kampjun. Attenzjoni: Evita l-kuntatt mal-ġilda u ilbes ilbies protettiv. |
3.24. |
Citrate buffer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Dewweb 19,61 g sodium citrate (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g phenol (3.3) u 16,50 ml HCl (3.7) f'bejn wieħed u ieħor 800 ml ilma. Aġġusta l-pH għal 2,20. Żid sa 1 l bl-ilma. |
3.25. |
Elution buffers, ippreparati skont il-kundizzjonijiet tal-analizzatur użat (4.9). |
3.26. |
Reaġent tan-ninhydrin, ippreparat skont il-kundizzjonijiet tal-analizzatur użat (4.9). |
3.27. |
Soluzzjonijiet standard tal-amino acids. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitpoġġew taħt temperatura ta' 5 oC. |
3.27.1. |
Soluzzjoni standard ta' amino acids (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml minn kull wieħed fl-aċidu idrokloriku. Jista' jinkiseb kummerċjalment |
3.27.2. |
Soluzzjoni stokk standard ta' cysteic acid u methionine sulphone, c = 1,25 μmol/ml. Dewweb 0,2115 g cysteic acid (3.16.2) u 0,2265 g methionine sulphone (3.16.3) f'citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat tal-1 l u imla sal-marka bis-citrate buffer. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 12-il xahar. Din is-soluzzjoni ma tinużax jekk is-soluzjoni standard (3.27.1) ikun fiha cysteic acid u methionine sulphone. |
3.27.3. |
Soluzzjoni standard tal-istandard intern eż. norleucine, C = 20 μmol/ml. Dewweb 0,6560 g norleucine (3.13) f'citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat u imla sa 250 ml bis-citrate buffer. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 6 xhur. |
3.27.4. |
Soluzzjoni ta' kalibrar ta' amino acids standard biex jintużaw ma' hydrolysates, c = 5nmol/50μl cysteic acid u methionine sulphone u c = 10 nmml/50 μl tal-amino acids l-oħra. Dewweb 2,2 g sodium chloride (3.10) f'tazza ta' 100 ml ma' 30 ml citrate buffer (3.24). Żid 4,00 ml soluzzjoni standard tal-amino acids (3.27.1), 4,00 ml soluzzjoni standard cysteic acid u methionine sulphone (3.27.2) u 0,50 ml soluzzjoni stokk standard tal-istandard intern (3.27.3) jekk intuża. Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-idrossidu tas-sodju (3.18). Ittrasferixxi kwantittivament f'kunjett iggradat ta' 50ml u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24) u ħawwad. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 3 xhur. Ara wkoll l-osservazzjonijiet 9.1 |
3.27.5. |
Soluzzjoni ta' kalibrar tal-amino acids standard għall-użu mal-hydrolysates ippreparati skont il-paragrafu 5.3.3.1. u għall-użu mal-estratti (5.2). Is-soluzzjoni ta' kalibrar tiġi ppreparata skont 3.27.4 mingħajr sodium chloride. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 3 xhur. |
4. Apparat
4.1. |
Kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 jew 250 ml li għandu reflux condenser imwaħħal miegħu. |
4.2. |
Kunjett tal-ħġieġ borosilicate 100 ml bit-tapp bil-kamin b'kisja ta' gomma/teflon (eż. Duran, Schott) sabiex jintuża fil-forn. |
4.3. |
Forn b'ventilazzjoni sfurzata u regolatur tat-temperatura bi preċiżjoni aqwa minn + 2 oC. |
4.4. |
miter tal-pH (tliet postijiet deċimali). |
4.5. |
Filtru tal-membrana (0,22 μm). |
4.6. |
Magna ċentrifuga. |
4.7. |
Evaporatur tat-tip rotary vacuum. |
4.8. |
Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika. |
4.9. |
Analizzatur tal-amino acids jew apparat HPLC b'kolonna għall-iskambju tal-jonji, tagħmir għan-ninhydrin, post column derivatization u ditettur fotometriku. Il-kolonna timtela b'sulfonated polystyrene resins li huma kapaċi li jisseparaw l-amino acidsi minn xulxin u minn materjali li huma ninhydrin-positive. Iċ-ċirkolazzjoni fit-tubi tal-buffer u tan-ninhydrin hija pprovduta minn pompi li għandhom stabilità ta' ċirkolazzoni ta' ±0,5 % fil-perjodu li jkopri kemm it-test tal-kalibrar standard kif ukoll l-analiżi tal-kampjun. B'xi ftit analizzatturi tal-aċidu amminiku, jistgħu jintużaw proċeduri li fihom, il-hydrolysate għandu konċentrazzjoni ta' sodju ta' c = 0,8 mol/l u li jkun fih il-formic acid li jifdal mill-istadju tal-ossidazzjoni. Oħrajn ma jagħtux separazzjoni sodisfaċenti ta' ċerti amino acidsi jekk il-hydrolysate ikun fih wisq formic acid u/jew konċentrazzjonijiet għoljin ta' sodium ion. F'dan il-każ il-volum ta' aċidu jitnaqqas permezz ta' evaporazzjoni għal bejn wieħed u ieħor 5 ml wara l-idroliżi u qabel l-aġġustament tal-pH. L-evaporazzjoni għandha ssir f'vakwu f'temperatura massima ta' 40 oC. |
5. Proċedura
5.1. Preparazzjoni tal-kampjun
Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b'malji ta' 0,5 mm. Kampjuni bi kwantità għolja ta' umdità jridu jew jitnixxfu bl-arja f'temperatura li ma tkunx aktar minn 50 oC jew jitnixxfu bil-friża qabel ma jintaħnu. Kampjuni b'kontenut għoli ta' xaħam għandhom jiġu estratti b'żejt ħafif mhux raffinat (3.12) qabel ma jintaħnu.
5.2. Determinazzjoni ta' Amino Acids Ħielsa fl-għalf u Taħlit li jkun sar minn qabel
Iżen sal-eqreb 0,2 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun ippreparat (5.1), f'kunjett koniku u żid 100,0 ml mit-taħlita tal-estrazzjoni (3.21). Ħawwad it-taħlita għal 60 minuta bl-użu ta' shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku (4.8). Ħalli s-sediment joqgħod u itfa' bil-pipetta 10,0 mis-supernatant solution f'tazza ta' 100 ml.
Żid 5,0 ml soluzzjoni ta' sulfosalicylic acid (3.22), mat-taħwid u kompli ħawwad bl-għajnuna ta' stirrer manjetika għal 5 minuti. Iffiltra jew iċċentrifuga s-supernatant sabiex jitneħħa kull preċipitat. Qiegħed 10,0 ml mis-soluzzjoni li tirriżulta f'tazza ta' 100 ml u aġġusta l-pH għal 2,20 bl-użu ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18), ittrasferixxi għal kunjett volumetriku ta' volum xieraq bl-użu ta' citrate buffer (3.24), u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24).
Jekk qiegħed jintuża standard intern, żid 1,00 ml mill-istandard intern (3.27.3) għal kull 100 ml soluzzjoni finali u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24).
Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.
Jekk l-estratti m'humiex qegħdin jiġu eżaminati, għandhom jinħażnu taħt il-5 oC.
5.3. Determinazzjoni tal-Amino Acids Totali
5.3.1.
Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g mill-kampjun ippreparat (5.1) fi:
— |
kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 ml (4.1) għall-idroliżi miftuħa (5.3.2.3) jew, |
— |
kunjett ta' 250 ml bil-qiegħ tond (4.1) jekk hi meħtieġa konċentrazzjoni baxxa ta' sodju (5.3.3.1) jew, |
— |
kunjett ta' 100 ml b'tapp bil-kamin (4.2), (għall-idroliżi magħluqa 5.3.2.4). |
Il-porzjon tal-kampjun miżun għandu jkollu kontenut ta' nitroġenu ta' bejn wieħed u ieħor 10 mg u umdità ta' mhux aktar minn 100 mg.
Qiegħed il-kunjett/flixkun f'banju ilma bis-silġ u kessaħ sa 0 oC, żid 5 ml mit-taħlita ta' ossidazzjoni (3.23) u ħawwad bi spatula tal-ħġieġ bil-ponta mgħawġa. Issiġilla l-kunjett/flixkun li fih l-ispatula b'rita li ma jgħaddix arja minnha, qiegħed il-banju bl-ilma bis-silġ li fih ir-reċipjent issiġillat fi friġġ f'temperatura ta' 0 oC u ħalli għal 16-il siegħa. Wara 16-il siegħa neħħi mill-friġġ u ddekomponi r-reaġent eċċessiv tal-ossidazzjoni biż-żieda ta' 0,84 g sodium disulphite (3.4).
Ipproċedi għal 5.3.2.1.
5.3.2.
5.3.2.1.
Mal-kampun ossidizzat ippreparat skont 5.3.1 żid 25 ml taħlita ta' idroliżi (3.20) u oqgħod attent li tlaħlaħ ir-residwu tal-kampjun li jeħel mal-ġnub tar-reċipjent u tal-ispatula.
Skont il-proċedura ta' idroliżi li qiegħda tintuża, kompli skont 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.
5.3.2.2.
Iżen f'kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 ml jew 250 ml (4.1) jew kunjett ta' 100 ml bit-tapp bil-kamin (4.2), sal-eqreb 0,2 mg, minn0,1 sa 1 g tal-kampjun ippreparat (5.1). Il-porzjon miżun tal-kampjun għandu jkollu kontenut ta' nitroġenu ta' bejn wieħed u ieħor 10 mg. B'attenzjoni żid 25 ml tat-taħlita tal-idroliżi (3.20) u ħallat mal-kampjun.. Kompli skont 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.
5.3.2.3.
Żid 3 żibeġ tal-ħġieġ mat-taħlita fil-kunjett (ippreparat skont 5.3.2.1 jew 5.3.2.2) u għalli kontinwament taħt reflux għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, aħsel il-kondensatur b'5 ml citrate buffer (3.24). Skonnettja l-kunjett u kessħu f'banju ta' silġ.
Kompli skont 5.3.3.
5.3.2.4.
Poġġi l-kunjett li jkun fih it-taħlita ppreparata f'konformità ma' 5.3.2.1 jew 5.3.2.2 f'forn (4.3) f'temperatura ta' 110 oĊ. Waqt l-ewwel siegħa sabiex tipprevjeni milli tiżdied il-pressjoni (minħabba l-evoluzzjoni ta' sustanzi li fihom il-gass) u sabiex tipprevjeni xi splużjoni, poġġi t-tapp bil-kamin fuq ir-reċipjent. Tagħlaqx ir-reċipjent bit-tapp. Wara siegħa, agħlaq ir-reċipjent bit-tapp u ħallih fil-forn (4.3) għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, neħħi l-kunjett mill-forn, iftaħ it-tapp tal-kunjett b'attenzjoni u poġġi l-kunjett f'banju ta' ilma bis-silġ. Ħallih jiksaħ.
Skont il-proċedura għall-aġġustament tal-pH (5.3.3), ittrasferixxi kwantitattivament il-kontenuti tal-kunjett f'tazza ta' 250 ml jew kunjett ta' 250 ml bil-qiegħ tond bl-użu ta' citrate buffer (3.24).
Kompli skont 5.3.3.
5.3.3.
Skont it-tolleranza tas-sodju tal-analizzatur tal-amino acids (4.9), kompli skont 5.3.3.1 jew 5.3.3.2 għall-aġġustament tal-pH.
5.3.3.1.
Huwa rrakkomandat li tintuża soluzzjoni stokk standard interna (3.27.3) meta jintużaw l-analizzaturi tal-amino acids li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju (meta l-volum tal-aċidu jkollu jitnaqqas).
F'dan il-każ, żid 2,00 ml mis-soluzzjoni stokk standard interna (3.2-7.3) mal-hydrolysate qabel l-evaporazzjoni.
Żid 2 qatriet 1-octanol (3.15) mal-hydrolysate miksub f'konformità mal-paragrafu 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.
Bl-użu ta' evaporatur rotanti (4.7) naqqas il-volum sa 5-10 ml f'vakwu f'temperatura ta' 40 oC. Jekk il-volum aċċidentalment jitnaqqas għal inqas minn 5 ml il-hydrolysate għandu jintrema u l-analiżi terġa' tibda.
Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18) u kompli għall-paragrafu 5.3.4.
5.3.3.2.
Ħu l-hydrolysates miksuba f'konformità ma' 5.3.2.3 jew 5.3.2.4 u nnewtralizzahom parzjalment billi żżid filwaqt li tħawwad b'attenzjoni, 17-il ml soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (3.17) filwaqt li tiżgura li t-temperatura tinżamm taħt l-40 oC.
Aġġusta l-pH għal 2,20 f'temperatura ambjentali bl-użu tas-soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (3.17) u finalment soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18). Kompli għal 5.3.4.
5.3.4.
Ittrasferixxi kwantittivament il-hydrolysate bil-pH aġġustat (5.3.3.1 jew 5.3.3.2) bis-citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat ta' 200 ml, u imla sal-marka bil-buffer (3.24).
Jekk ma ntużax diġà standard intern, żid 2,00 ml standard intern (3.27.3) u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24). Ħawwad sew.
Kompli għall-istadju tal-kromatografija (5.4).
Jekk il-kampjuni tas-soluzzjonijiet ma jkunux sejrin jiġu eżaminati dakinhar stess għandhom jinħażnu taħt il-5 oC.
5.4. Kromatografija
Qabel il-kromatografija ġib l-estratt (5.2) jew tal-hydrolysate (5.3.4) għal temperatura ambjentali. Ħawwad it-taħlita u ffiltra ammont xieraq minn filtru tal-membrana ta' 0,22 μm (4.5). Is-soluzzjoni ċara li tirriżulta tiġi soġġetta għal kromatografija ta' skambju tal-jonji bl-użu ta' analizzatur tal-amino acid (4.9).
L-injezzjoni tista' ssir b'mod manwali jew awtomatiku. Huwa importanti li tiżdied l-istess kwantità tas-soluzzjoni ±0,5 % mal-kolonna għall-analiżi tal-istandards u kampjuni ħlief meta jintuża standard intern, u li l-proporzjonijiet ta' sodju: amino acid fis-soluzzjonijiet standard u kampjuni huma simili kemm jista' jkun.
B'mod ġenerali, il-frekwenza tal-provi tal-kalibrar tiddependi fuq l-istabilità tar-reaġent tan-ninhydrin u s-sistema analitika. L-istandard jew il-kampjun jiġi dilwit bis-citrate buffer (3.24) sabiex jagħti erja tal-ogħla livell tal-istandard ta' 30-200 % tal-erja tal-ogħla livell tal-kampjun tal-amino acid.
Il-kromatografija tal-amino acids tvarja ftit skont it-tip tal-analizzatur u r-raża użati. Is-sistema magħżula għandha tkun kapaċi tissepara l-amino acids minn xulxin u mill-materjali li huma pożittivi fin-ninhydrin. Fil-medda tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika għandha tagħti rispons lineari għat-tibdil fl-ammonti ta' amino acids miżjudin mal-kolonna.
Waqt l-istadju tal-kromatografija japplikaw il-proporzjonijiet tal-inqas: l-ogħla livell imsemmija hawn taħt, meta tiġi analizzata soluzzjoni ekwimolari (tal-amino acids li qegħdin jiġu stabbiliti). Is-soluzzjoni ekwimolari għandu jkollha mill-inqas 30 % tat-tagħbija massima ta' kull amino acid li jista' jitkejjel amino acid (4.9).
Għas-separazzjoni tat-threonine-serine, il-proporzjon tal-inqas:l-ogħla livell minn żewġ amino acids li huma overlapping fuq il-kromatogramma ma għandux ikun aktar minn 2:10 (jekk jiġu ddeterminati biss is-cyst(e)ine, methionine, threonine u lysine, separazzjoni insuffiċjenti mill-ogħla livelli (qċaċet) qrib xulxin tinfluwenza d-determinazzjoni b'mod ħażin). għall-amino acids l-oħrajn kollha, is-separazzjoni għandha tkun aħjar minn 1:10.
Is-sistema għandha tiżgura li l-lysine huwa sseparat mill-“lysine artifacts” u ornithine.
6. Kalkolu tar-riżultati
L-erja tal-kampjun u l-ogħla livelli standard jitkejlu għal kull amino acid individwali u jiġi kkalkulat l-ammont (X), fi g amino acid għal kull kg tal-kampjun.
Jekk jintuża standard intern immultiplika bi:
A |
= |
erja tal-ogħla livell, hydrolysate jew estratt |
B |
= |
erja tal-ogħla livell, soluzzjoni standard ta' kalibrar |
C |
= |
erja tal-ogħla livell, standard intern f'hydrolysate jew estratt |
D |
= |
erja tal-ogħla livell, standard intern, soluzzjoni ta' kalibrar standard |
M |
= |
piż molekulari tal-amino acid li qiegħed jiġi ddeterminat |
c |
= |
konċentrazzjoni ta' standard f'μmol/ml |
m |
= |
piż tal-kampjun (g) (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk huwa mnixxef jew bix-xaħam imneħħi) |
V |
= |
ml hydrolysate totali (5.3.4) jew kalkolu f'ml tal-volum tal-estratt totali dilwit (6.1) |
Kemm is-cystine kif ukoll is-cysteine t-tnejn huma ddeterminati bħala cicteic acid fil-hydrolysates ta' kampjun ossidizzat, iżda huma kkalkulati bħala cystine (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) billi jintuża M 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).
Il-methionine huwa ddeterminat bħala methionine sulphone f'hydrolysates ta' kampjun ossidizzat iżda kkalkulat bħala methionine billi jintuża M tal-methionine: 149,21 g/mol.
Methionine ħieles miżjud huwa ddeterminat wara l-estrazzjoni bħala methionine, għall-kalkolu jintuża l-istess M.
6.1. |
Il-volum totali dilwit ta' estratti (F) għad-determinazzjoni ta' amino acids ħielsa (5.2) huwa kkalkulat kif ġej: ![]()
|
7. Evalwazzjoni tal-metodu
Il-metodu ġie ttestjat f'interparagun f'livell internazzjoni fl-1990 billi intużaw erba' tipi differenti ta' għalf (għalf tal-majjali mħallat, kompost tal-brojlers, konċentrazzjoni ta' proteini, taħlit minn qabel). Ir-riżultati, wara eliminazzjoni ta' dawk li jvarjaw ħafna, ta' devjazzjoni medja u standard huma mogħtija fit-tabelli f'dan il-punt:
Medji f'g/kg
Materjal għar-referenza |
Amino Acid |
||||||
Threonine |
Cyst(e)ine |
Methionine |
Lysine |
||||
Għalf tal-majjali mħallat |
6,94 n = 15 |
3,01 n = 17 |
3,27 n = 17 |
9,55 n = 13 |
|||
Kompost għall-brojlers |
9,31 n = 16 |
3,92 n = 18 |
5,08 n = 18 |
13,93 n = 16 |
|||
Konċentrat ta' proteini |
22,32 n = 16 |
5,06 n = 17 |
12,01 n = 17 |
47,74 n = 15 |
|||
Taħlit minn qabel |
58,42 n = 16 |
— |
90,21 n = 16 |
98,03 n = 16 |
|||
|
7.1. Ripetibbiltà
Ir-ripetibilità mfissra bħala “Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju” tal-interparagun imsemmi hawn fuq hija mogħtija fit-tabella ta' hawn taħt:
Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju (Sr) fi g/kg
Materjal għar-referenza |
Amino Acid |
||||||
Threonine |
Cyst(e)ine |
Methionine |
Lysine |
||||
Għalf tal-majjali mħallat |
0,13 n = 15 |
0,10 n = 17 |
0,11 n = 17 |
0,26 n = 13 |
|||
Kompost għall-brojlers |
0,20 n = 16 |
0,11 n = 18 |
0,16 n = 18 |
0,28 n = 16 |
|||
Konċentrat ta' proteini |
0,48 n = 16 |
0,13 n = 17 |
0,27 n = 17 |
0,99 n = 15 |
|||
Taħlit minn qabel |
1,30 n = 16 |
— |
2,19 n = 16 |
2,06 n = 16 |
|||
|
Koeffiċjent ta' Varjazzjoni ( %) għal Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju (Sr)
Materjal għar-referenza |
Amino Acid |
||||||
Threonine |
Cyst(e)ine |
Methionine |
Lysine |
||||
Għalf tal-majjali mħallat |
1,9 n = 15 |
3,3 n = 17 |
3,4 n = 17 |
2,8 n = 13 |
|||
Kompost għall-brojlers |
2,1 n = 16 |
2,8 n = 18 |
3,1 n = 18 |
2,1 n = 16 |
|||
Konċentrat ta' proteini |
2,7 n = 16 |
2,6 n = 17 |
2,2 n = 17 |
2,4 n = 15 |
|||
Taħlit minn qabel |
2,2 n = 16 |
— |
2,4 n = 16 |
2,1 n = 16 |
|||
|
7.2 Riproduċibilità
Ir-riżultati għal bejn id-devjazzjoni standard tal-laboratorju mill-interparagun imsemmi hawn fuq huma mogħtija fit-tabella ta' hawn taħt:
Devjazzjoni Standard Bejn il-Laboratorji (SR) f'g/kg
Materjal għar-referenza |
Amino Acid |
||||||
Threonine |
Cyst(e)ine |
Methionine |
Lysine |
||||
Għalf tal-majjali mħallat |
0,28 n = 15 |
0,30 n = 17 |
0,23 n = 17 |
0,30 n = 13 |
|||
Kompost għall-brojlers |
0,48 n = 16 |
0,34 n = 18 |
0,55 n = 18 |
0,75 n = 16 |
|||
Konċentrat ta' proteini |
0,85 n = 16 |
0,62 n = 17 |
1,57 n = 17 |
1,24 n = 15 |
|||
Taħlit minn qabel |
2,49 n = 16 |
— |
6,20 n = 16 |
6,62 n = 16 |
|||
|
Koeffiċjent ta' varjazzjoni ( %) għad-Devjazzjoni Standard Bejn il-Laboratorji (SR)
Materjal għar-referenza |
Amino Acid |
||||||
Threonine |
Cyst(e)ine |
Methionine |
Lysine |
||||
Għalf tal-majjali mħallat |
4,1 n = 15 |
9,9 n = 17 |
7,0 n = 17 |
3,2 n = 13 |
|||
Kompost għall-brojlers |
5,2 n = 16 |
8,8 n = 18 |
10,9 n = 18 |
5,4 n = 16 |
|||
Konċentrat ta' proteini |
3,8 n = 16 |
12,3 n = 17 |
13,0 n = 17 |
3,0 n = 15 |
|||
Taħlit minn qabel |
4,3 n = 16 |
— |
6,9 n = 16 |
6,7 n = 16 |
|||
|
8. Użu ta' materjali għar-referenza
L-applikazzjoni korretta tal-metodu għandha tiġi vverifikata billi jsir kejl ripetut ta' materjali għar-referenza ċċertifikati meta huma disponibbli. Huwa rrakommandat kalibrar b'soluzzjoni ta' kalibrar ċċertifikata ta' amino acids.
9. Osservazzjonijiet
9.1. |
Minħabba differenzi bejn l-analizzaturi tal-amino acids il-konċentrazzjonijiet finali tas-soluzzjonijiet ta' kalibrar tal-amino acids standard (ara 3.27.4 u 3.27.5) u tal-hydrolysate (ara 5.3.4) għandhom jittieħdu bħala gwida. Ir-rispons lineari varju tal-apparat għandu jiġi ċċekkjat għall-amino acids kollha. Is-soluzzjoni standard tiġi dilwita bis-citrate buffer sabiex tagħti l-ogħla livelli f'nofs il-medda. |
9.2. |
Fejn jintuża apparat ta' kromatografija b'likwidi ta' prestazzjoni għolja sabiex jiġu analizzati l-hydrolysates, il-kundizzjonijiet sperimentali għandhom jiġu ottimizzati f'konformità mar-rakkommandazzjonijiet tal-manifattur. |
9.3. |
Billi jiġi applikat il-metodu għall-għalf li jkun fih aktar minn 1 % ta' chloride (konċentrat, għalf minerali, għalf supplimentari) l-istima tal-methionine tista' tirriżulta f'waħda baxxa u jkun jeħtieġ li jsir trattament speċjali. |
G. DETERMINAZZJONI TA' TRYPTOPHAN
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmel possibbli d-determinazzjoni tat-tripotofan totali u ħieles fl-għalf. Ma jagħmilx distinzjoni bejn il-forom D- u L-.
2. Prinċipju
Għad-determinazzjoni ta' tryptophan totali, il-kampjun jiġi idrolizzat f'kundizzjonijiet alkalini ma' soluzzjoni ta' barium hydroxide saturata u msaħħna sa 110 oC għal 20 siegħa. Wara jiżdied l-istandard ta' idroliżi interna.
Għad-determinazzjoni ta' tryptophan ħieles, il-kampjun huwa estratt taħt kundizzjonijiet aċidi ħfief fil-preżenza ta' standard intern.
It-tryptophan u l-istandard intern fil-hydrolysate jew fl-estratt huma determinati bl-HPLC b'ditezzjoni fluworexxenti.
3. Reaġenti
3.1. |
Irid jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta' kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS/cm). |
3.2. |
Is-sustanza standard: tryptophan (purità/kontenut ≥ 99 %) imnixxef taħt vakwu fuq phosphorous pentoxide. |
3.3. |
Sustanza standard interna: α-methyl-tryptophan (purità/kontenut ≥ 99 %), imnixxef taħt vakum fuq phosphorous pentoxide. |
3.4. |
Barium hydroxide octa-hydrate (għandha tingħata attenzjoni sabiex il-Ba(OH)2 .8 H2O ma jiġix espost b'mod eċċessiv għall-arja sabiex tiġi evitata l-formazzjoni ta' BaCO3, li jista jiddisturba d-determinazzjoni) (ara l-osservazzjoni 9.3). |
3.5. |
Idrossidu tas-sodju. |
3.6. |
Ortho-phosphoric acid, w (w/w) = 85 %. |
3.7. |
Aċidu idrokloriku, ρ201,19 g/ml. |
3.8. |
Metanol, ekwivalenti għall-grad HPLC. |
3.9. |
Petroleum ħafif, medda ta' togħlija 40 – 60 oĊ. |
3.10. |
Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 1 mol/l: Dewweb 40,0 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sa 1 l bl-ilma (3.1). |
3.11. |
Aċidu idrokloriku, c= 6 mol/l: Ħu 492 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma. |
3.12. |
Aċidu idrokloriku, c= 1 mol/l: Ħu 82 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma. |
3.13. |
Aċidu idrokloriku, c= 0,1 mol/l: Ħu 8,2 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma. |
3.14. |
Ortho-phosphoric acid, c = 0,5 mol/l: Ħu 34 ml ortho-phosphoric acid (3.6) u imla sa 1 l bl-ilma (3.1). |
3.15. |
Soluzzjoni konċentrata ta' tryptophan (3.2), c = 2,50 μmol/ml: F'kunjett volumetriku ta' 500 ml dewweb 0,2553 g tryptophan (3.2) fl-aċidu idrokloriku (3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idrokloriku (3.13). Aħżen f'-18 oC għal massimu ta' 4 ġimgħat. |
3.16. |
Soluzzjoni standard konċentrata interna, c = 2,50 μmol/ml: F'kunjett volumetriku ta' 500 ml dewweb 0,2728 g α-methyl-tryptophan (3.3) fl-aċidu idrokloriku (3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idrokloriku (3.13). Aħżen f'-18 oC għal massimu ta' 4 ġimgħat. |
3.17. |
Soluzzjoni standard ta' kalibrar ta' tryptophan u standard intern: Ħu 2.00 ml ta' soluzzjoni konċentrata ta' tryptophan (3.15), u 2,00 ml ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (α-metil-tryptophan) (3.16). Ħallat bl-ilma (3.1) u l-metanol (3.8) għal bejn wieħed u ieħor l-istess volum u għal bejn wieħed u ieħor l-istess konċentrazzjoni ta' metanol (10-30 %) bħall-hydrolysate lest. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu. Ipproteġi mid-dawl tax-xemx dirett waqt l-operazzjoni. |
3.18. |
Acetic acid |
3.19. |
1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol. |
3.20. |
Ethanolamine w (w/w) > 98 %. |
3.21. |
Soluzjoni ta' 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) f'100 ml metanol (3.8) |
3.22. |
Fażi mobbli għal HPLC: 3,00 g aċidu aċetiku (3.18) + 900 ml ilma (3.1) +50,0 ml soluzzjoni (3.21) ta' 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol (3.19) fil-metanol (3.8) (1g/100ml). Aġġusta pH għal 5,00 bl-użu ta' etanolamina (3.20). Imla sa 1 000 ml bl-ilma (3.1). |
4. Apparat
4.1. |
Apparat HPLC bid-ditettur spektrofluworimetriku. |
4.2. |
Kolonna għal kromatografija b'likwidi, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm ippakkjar, jew ekwivalenti. |
4.3. |
Miter tal-pH. |
4.4. |
Kunjett tal-polypropylene, kapaċità 125 ml, bl-għonq wiesa' u b'tapp bil-kamin. |
4.5. |
Filtru membrana, 0,45 μm. |
4.6. |
Autoclave, 110 (± 2) oC, 1,4 (0,1) bar. |
4.7. |
Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika. |
4.8. |
Vortex mixer. |
5. Proċedura
5.1. Preparazzjoni ta' kampjuni
Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b'malji ta' 0,5 mm. Kampjuni bi kwantità għolja ta' umdità jridu jew jitnixxfu bl-arja f'temperatura li ma tkunx aktar minn 50 oC jew jitnixxfu bil-friża qabel ma jintaħnu. Kampjuni b'kontenut għoli ta' xaħam iridu jiġu estratti b'petroleum ħafif (3.9) qabel ma jintaħnu.
5.2. Determinazzjoni ta' tryptophan ħieles (estratt)
Iżen sal-eqreb 1 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun separat (5.1), f'kunjett konikali. Żid 100,0 ml aċidu idrokloriku (3.13) u 5,00 ml soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16). Ħawwad għal 60 min. bl-użu tax-shaker mekkaniku jew stirrer manjetika (4.7). Ħalli s-sediment joqgħod u bil-pipetta tella' 10,0 ml tas-soluzzjoni supernatant f'beaker. Żid 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14). Aġġusta l-pH sa 3 bl-użu ta' idrossidu tas-sodju (3.10). Żid metanol suffiċjenti (3.8) biex tinkiseb konċentrazzjoni ta' bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f'kunjett volumetriku ta' volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum neċessarju għall-kromatografija (bejn wieħed u ieħor l-istess volum bħall-kalibrar ta' soluzzjoni standard (3.17)).
Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.
Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-estratti kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-estratti fl-istess ġurnata, l-estratti jistgħu jinħażnu f'5 oC għal massimu ta' 3 ijiem.
5.3. Determinazzjoni ta' tryptophan totali (hydrolysate)
Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun separat (5.1) f'kunjett tal-polypropylene (4.4). Il-porzjon tal-kampjun li jkun intiżen irid ikollu kontenut ta' nitroġenu ta' madwar 10 mg. Żid 8,4 g barium hydroxide octa-hydrate (3.4) u 10 ml ilma. Ħallat fuq mixer vortex (4.8) jew stirrer manjetika (4.7). Ħalli il-kalamita miksija bit-teflon fit-taħlita. Aħsel il-ġnub tar-reċipjent b'4 ml ilma. Poġġi t-tapp u agħlaq kemxejn il-kunjett. Ittrasferixxi f'autoclave (4.6) bl-ilma jagħli u ħallih għall-fwar għal 30-60 minuta. Agħlaq l-autoclave u awtoklava f'110 (± 2) oC għal 20 siegħa.
Qabel tiftaħ l-autoclave baxxi t-temperatura għal ftit taħt il-100 oC. Sabiex tiġi evitata kristallizzazzjoni ta' Ba(OH)2 .8 H2O, żid it-taħlita sħuna bi 30 ml ilma li jkun għadu f'temperatura ambjentali. Ħawwad bil-mod. Żid 2,00 ml soluzzjoni standard interna (α-methyl-tryptophan) konċentrata (3.16). Berred ir-reċipjenti fuq banju ilma/silġ għal 15-il minuta.
Wara żid 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14). Żomm ir-reċipjent fil-banju li jberred u nnewtralizza b'HCl (3.11) waqt li tħawwad u aġġusta l-pH għal 3,0 bl-użu ta' HCl (3.12). Żid metanol suffiċjenti biex tagħti konċentrazzjoni ta' bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f'kunjett volumetriku ta' volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum definit neċessarju għal kromatografija (pereżempju 100 ml). Iż-żieda ta' metanol ma tridx tikkawza preċipitazzjoni.
Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.
Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-hydrolysates kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-hydrolysates fl-istess ġurnata, jistgħu jinħażnu f'5 oC għal massimu ta' 3 ijiem.
5.4. Determinazzjoni tal-HPLC
Il-kundizzjonijiet li jmiss għal eluzzjoni iżokratika huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn, diment li jagħtu riżultati ekwivalenti (ara wkoll l-osservazzjonijiet 9.1 u 9.2):
Kolonna kromatografika likwida (4.2): |
125 mm × 4 mm, C18, 3 μm ippakkjar, jew ekwivalenti |
Temperatura tal-kolonna: |
Temperatura ambjentali |
Fażi mobbli (3.22): |
3,00 g aċidu aċetiku (3.18) + 900 ml ilma (3.1) + soluzzjoni 50,0 ml (3.21) ta' 1.1.1-trichloro-2-methyl-2-propanol (3.19) f'metanol (3.8) (1 g/100 ml). Aġġusta pH għal 5,00 permezz ta' etanolamina (3.20). Imla sa 1 000 ml bl-ilma (3.1) |
Rata ta' tnixxija: |
1 ml/min |
Ħin totali tal-proċedura: |
bejn wieħed u ieħor 34 min |
Wavelength tad-ditezzjoni: |
eċċitazzjoni: 280 nm, emissjoni: 356 nm. |
Volum tal-injezzjoni |
20 μl |
6. Kalkolu tar-riżultati
L-ammont ta' tryptophan (X), fi g għal kull kampjun ta' 100g huwa kkalkulat.
A |
= |
l-ikbar erja ta' standard intern, soluzzjoni standard ta' kalibrar (3.17) |
B |
= |
l-ikbar erja ta' tryptophan, estratt (5.2) jew hydrolysate (5.3) |
V1 |
= |
volum f'ml (2 ml) ta' soluzzjoni ta' tryptophan konċentrat (3.15) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17) |
c |
= |
konċentrazzjoni f'μmol/ml (= 2,50) ta' soluzzjoni ta' tryptophan konċentrat (3.15) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17) |
V2 |
= |
volum f'ml ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fl-estrazzjoni (5.2) (= 5,00 ml) jew għall-hydrolysate (5.3) (= 2,00 ml) |
C |
= |
żona ta' livelli l-għolja ta' standard intern, estratt (5.2) jew hydrolysate (5.3) |
D |
= |
l-ikbar erja ta' tryptophan, soluzzjoni standard ta' kalibrar (3.17) |
V3 |
= |
volum f'ml (= 2,00 ml) ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17) |
m |
= |
piż ta' kampjun fi g (irranġat għall-piż oriġinali jekk imnixxef u/jew bix-xaħam imneħħi) |
M |
= |
piż molari ta' tryptophan (= 204,23 g/mol) |
7. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 10 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.
8. Riżultati ta' studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE (ir-4 interparagun), fejn ġew analizzati tliet kampjuni min 12-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għal idroliżi. Saru għadd ta' analiżi (5) replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:
|
Kampjun 1 Għalf għall-ħnieżer |
Kampjun 2 Għalf għall-ħnieżer imsaħħaħ b'L-tryptophan |
Kampjun 3 Għalf konċentrat għall-ħnieżer |
L |
12 |
12 |
12 |
n |
50 |
55 |
50 |
Medja [g/kg] |
2,42 |
3,40 |
4,22 |
sr [g/kg] |
0,05 |
0,05 |
0,08 |
r [g/kg] |
0,14 |
0,14 |
0,22 |
CVr [ %] |
1,9 |
1,6 |
1,9 |
SR [g/kg] |
0,15 |
0,20 |
0,09 |
R [g/kg] |
0,42 |
0,56 |
0,25 |
CVR [ %] |
6,3 |
6,0 |
2,2 |
L |
= |
numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati |
n |
= |
numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon) |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
r |
= |
ripetibilità |
R |
= |
riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % |
CVR |
= |
koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, % |
Ġie organizzat studju kollaborattiv Komunitarju ieħor (it-3 interparagun) fejn żewġ kampjuni ġew analizzati minn 13-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għall-estrazzjoni ta' tryptophan ħieles. Saru għadd ta' analiżi (5) replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:
|
Kampjun 4 Taħlita ta' qamħ u soja |
Kampjun 5 Taħlita ta' qamħ u soja (= kampjun 4) b'żieda ta' tryptophan (0,457 g/kg1) |
L |
12 |
12 |
n |
55 |
60 |
Medja [g/kg] |
0,391 |
0,931 |
sr [g/kg] |
0,005 |
0,012 |
r [g/kg] |
0,014 |
0,034 |
CVr [ %] |
1,34 |
1,34 |
SR [g/kg] |
0,018 |
0,048 |
R [g/kg] |
0,050 |
0,134 |
CVR [ %] |
4,71 |
5,11 |
L |
= |
numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati |
n |
= |
numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon) |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
r |
= |
ripetibilità |
R |
= |
riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % |
CVR |
= |
koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, % |
Ġie organizzat studju ta' interparagun Komunitarju ieħor li fih ġew analizzati erba' kampjuni minn 7 laboratorji għall-għanijiet ta' ċertifikazzjoni ta' tryptophan għall-idroliżi. Ir-riżultati huma mogħtija hawn taħt. Saru 5 analiżijiet replikati fuq kull kampjun.
|
Kampjun 1 Għalf tal-ħnieżer imħallat (CRM 117) |
Kampjun 2 Ħut mitħun b'xaħam baxx (CRM 118) |
Kampjun 3 Soybean mitħun (CRM 119) |
Kampjun 4 Trab ta' ħalib xkumat (CRM 120) |
L |
7 |
7 |
7 |
7 |
n |
25 |
30 |
30 |
30 |
Medja [g/kg] |
2,064 |
8,801 |
6,882 |
5,236 |
sr [g/kg] |
0,021 |
0,101 |
0,089 |
0,040 |
r [g/kg] |
0,059 |
0,283 |
0,249 |
0,112 |
CVr [ %] |
1,04 |
1,15 |
1,30 |
0,76 |
SR [g/kg] |
0,031 |
0,413 |
0,283 |
0,221 |
R [g/kg] |
0,087 |
1,156 |
0,792 |
0,619 |
CVR [ %] |
1,48 |
4,69 |
4,11 |
4,22 |
L |
= |
numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati |
n |
= |
numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon) |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
r |
= |
ripetibilità |
R |
= |
riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % |
CVR |
= |
koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, % |
9. Osservazzjonijiet
9.1. |
Jekk issegwi kundizzjonijiet kromatografiċi speċjali tista' tikseb separazzjonijiet aħjar bejn tryptophan u α-metil-tryptophan. Eluzzjoni isokratika segwita bi gradient column cleaning:
|
9.2. |
Il-kromatografija tvarja skont it-tip ta' HPLC u tal-materjal tal-ippakkjar tal-kolonna użat. Is-sistema magħżula trid tkun kapaċi tagħti separazzjoni ta' linja bażi bejn it-tryptophan u l-istandard intern. Madankollu huwa importanti li prodotti ta' degradazzjoni jiġu separati mit-tryptophan u l-istandard intern. Hydrolysates mingħajr standard intern iridu jitħaddmu sabiex tiġi ċċekjata l-linja bażi taħt l-istandard intern għal impuritajiet. Huwa importanti li l-ħin ta' tħaddim ikun twil biżżejjed għall-eluzzjoni ta' kull prodott ta' degradazzjoni, inkella l-livelli għoljin ta' eluzzjoni jistgħu jinterferixxu ma' tħaddim kromatografiku sussegwenti. Fil-medda tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika trid tagħti risposta lineari. Ir-risposta lineari trid titkejjel b'konċentrazzjoni kostanti (in-normal) tal-istandard intern u l-konċentrazzjonijiet li jvarjaw ta' tryptophan. Huwa importanti li l-kejl tal-ogħla livelli kemm tal-istandard intern kif ukoll tat-tryptophan ikunu fl-iskala lineari tas-sistema HPLC/sistema ta' fluworexxenza. Jekk il-livell/i tat-tryptophan u/jew l-ogħla livelli standard interni ma jkunux żgħar ħafna jew kbar ħafna l-analiżijiet jridu jiġu ripetuti b'qies ta' kampjun ieħor u/jew bil-volum finali mibdul. |
9.3. |
Barium hydroxide
Biż-żmien, il-barium hydroxide jsir aktar diffiċli biex jiġi dilwit. Dan jirriżulta f'soluzzjoni mhux ċara għad-determinazzjoni tal-HPLC, li tista' tipproduċi riżultati baxxi għal tryptophan. |
H. ID-DETERMINAZZJONI TA' ŻJUT U XAĦMIJIET MHUX RAFFINATI
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta' żjut u xaħmijiet mhux raffinati fl-għalf. Dan il-metodu ma jkoprix l-analiżi taż-żrieragħ taż-żejt u frott oleaġinuż.
L-użu taż-żewġ proċeduri deskritti hawn taħt jiddependi min-natura u l-kompożizzjoni tal-għalf u r-raġuni li għaliha qiegħda ssir l-analiżi.
1.1. Proċedura A – Żjut u xaħmijiet mhux raffinati estratti direttament
Dan il-metodu huwa applikabbli għall-għalf li ġej mill-pjanti barra dawk inklużi fi ħdan l-iskop tal-Proċedura B.
1.2. Proċedura B – Żjut u xaħmijiet mhux raffinati totali
Dan il-metodu japplika għal materjal tal-għalf li ġej mill-annimali u għall-għalf kompost kollu. Dan irid jintuża għall-materjal kollu li minnhom iż-żjut u x-xaħmijiet ma jistgħux jiġu estratti kompletament mingħajr idroliżi qabel (eż. glutina, ħmira, proteini tal-patata u prodotti soġġetti għal proċessi bħall-estrużjoni, flaking u tisħin).
1.3. Interpretazzjoni tar-riżultati
Fil-każijiet kollha fejn jinkiseb riżultat ogħla permezz tal-Proċedura B u mhux Proċedura A, ir-riżultat miksub mill-Proċedura B għandu jkun aċċettat bħala l-valur veru.
2. Prinċipju
2.1. Proċedura A
Il-kampjun huwa estratt bil-petroleum ħafif. Is-solvent jiġi ddistillat u r-residwu mnixxef u miżun.
2.2. Proċedura B
Il-kampjun huwa trattat b'tisħin b'aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni hija mkessħa u ffiltrata. Ir-residwu jinħasel u jitnixxef u huwa sottomess għad-determinazzjoni skont il-Proċedura A.
3. Reaġenti
3.1. |
Petroleum ħafif, jiftaħ jagħli: 40 – 60 oC. Il-valur tal-bromine jrid ikun inqas minn 1 u r-residwu wara l-evaporazzjoni jrid ikun inqas minn 2 mg/100 ml. |
3.2. |
Sodium sulfate, anidru. |
3.3. |
Aċidu idrokloriku, c = 3 mol/l. |
3.4. |
Assistenza għall-filtrazzjoni, eż. Kieselgur, Hyflo-supercel. |
4. Apparat
4.1. |
Apparat għall-estrazzjoni. Jekk għandu siphon (apparat Soxhlet), ir-rata ta' rifluss trid tkun tali li tipproduċu madwar 10 ċikli kull siegħa; jekk fuq it-tip non-siphoning, ir-rata ta' rifluss trid tkun madwar 10 ml fil-minuta. |
4.2. |
Thimble ta' estrazzjoni, meħlusin minn materjal li jinħall f'petroleum ħafif u li jkollu porosità konsistenti mal-ħtiġiet ta' punt 4.1. |
4.3. |
Forn li jnixxef, jew forn vakwu issettjat f'75 ± 3 oC jew forn tal-arja issettjat f'100 ± 3 oC. |
5. Proċedura
5.1. Proċedura A (ara punt 8.1)
Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u ttrasferih f'thimble ta' estrazzjoni (4.2) u għatti b'biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam.
Qiegħed it-thimble f'estrattur (4.1) u għamel l-estrazzjoni għal sitt sigħat b'petroleum ħafif (3.1). Iġbor l-estratt tal-petroleum ħafif f'kunjett xott miżun li fih biċċiet ta' ġebla ħaffiefa (2).
Iddistilla s-solvent. Nixxef ir-residwu u żomm il-kunjett għal siegħa u nofs fil-forn li jnixxef (4.3). Kessaħ f'dessikatur u iżen. Erġa' nixxef għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż taż-żjut u tax-xaħmijiet jibqa' kostanti (telf fil-piż bejn iż-żewġ kejlijiet tal-piż suċċessivi għandu jkun inqas minn jew ugwali għal 1 mg).
5.2. Proċedura B
Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg (ara 8.2) u qiegħed f'beaker ta' 400 ml jew kunjett koniku ta' 300 ml. Żid 100 ml hydrochlorc acid (3.3) u biċċiet ta' ġebla ħaffiefa. għatti l-beaker b'watch glass jew waħħal reflux condenser mal-kunjett. Wassal it-taħlita sakemm tagħli bil-mod fuq fjamma baxxa jew hot plate u żommha hekk għal siegħa. Tħallix il-prodott jeħel mal-ġnub tal-kontenitur.
Kessaħ u żid kwantità ta' għajnuna għall-filtrazzjoni (3.4) biżżejjed biex tipprevjeni xi telf ta' żejt u xaħam tul il-filtrazzjoni. Iffiltra minn karta filtru doppja, niedja, ħielsa mix-xaħam. Aħsel ir-residwu f'ilma kiesaħ sakemm jinkiseb filtrat newtrali. Ikkontrolla li l-filtrat ma jkunx fih xi żejt jew xaħam. Il-preżenza tagħhom fil-filtrat tindika li l-kampjun għandu jiġi estratt b'petroleum ħafif, permezz tal-Proċedura A, qabel l-idroliżi.
Qiegħed il-karta filtru doppja li jkun fiha r-residwu fuq watch glass u nixxef għal siegħa u nofs fil-forn tal-arja (4.3) f'100 ± 3 oC.
Qiegħed il-karta tal-filtru doppja li fiha r-residwu niexef f'thimble ta' estrazzjoni (4.2), u għatti b'biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam. Poġġi t-thimble f'estrattur (4.1) u ipproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu tal-punt 5.1.
6. Espressjoni tar-riżultat
Esprimi l-piż tar-residwu bħala perċentwal tal-kampjun.
7. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m'għandhomx jaqbżu:
— |
0,2 %, f'valur assolut, għall-kontenut ta' żjut u xaħmijiet mhux raffinati inqas minn 5 %, |
— |
4,0 % fir-rigward tal-ogħla riżultat għall-kontenut ta' 5 sa 10 %, |
— |
0,4 % f'valur assolut, għall-kontenut ogħla minn 10 %. |
8. Osservazzjonijiet
8.1. |
Għal prodotti b'kontenut għoli ta' żjut u xaħmijiet u li huma diffiċli biex tagħsar jew mhux xierqa biex jittieħed minnhom kampjun tat-test imnaqqas u omoġenju, ipproċedi kif ġej. Iżen 20 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u ħallat ma' 10 g jew iktar sodium sulfate anidridu (3.2). għamel l-estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.1) kif indikat f'5.1. Żid l-estratt miksub għal 500 ml b'petroleum ħafif (3.1) u ħawwad. Ħu 50 ml tas-soluzzjoni u qiegħed f'kunjett żgħir, niexef, miżun li fih biċċiet ta' ġebla ħaffiefa. Iddistilla s-solvent, nixxef u pproċedi kif indikat fl-aħħar paragrafu ta' 5.1. Elimina s-solvent mir-residwu tal-estrazzjoni li jkun baqa' fit-thimble u għasar ir-residwu għal irquqija ta' 1 mm, reġġa' lura l-prodott għat-thimble ta' estrazzjoni (iżżidx is-sodium sulfate), u ipproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu ta' 5.1. Ikkalkula l-kontenut ta' żjut u xaħmijiet bħala perċentwali tal-kampjun, billi tuża l-formula li ġejja: (10m1 + m2) × 5 fejn:
|
8.2. |
Fil-każ ta' prodotti li għandhom kontenut baxx ta' żejt u xaħam, il-kampjun għat-test jista' jiżdied sa 5 g. |
8.3. |
Ikel tal-annimali domestiċi li fih kontenut għoli ta' ilma jista' jkollu bżonn jitħallat ma' sodium sulfate anidridu qabel l-idroliżi u l-estrazzjoni skont il-Proċedura B. |
8.4. |
F'paragrafu 5.2. jista' jkun aktar effettiv li tuża ilma sħun minflok ilma kiesaħ sabiex taħsel ir-residwu wara l-filtrazzjoni. |
8.5. |
Għal xi għalf, il-ħin ta' tnixxif ta' 1.5 siegħa, jista' jkun estiż. It-tnixxif eċċessiv għandu jiġi evitat billi dan jista' jwassal għal riżultati baxxi. Jista' jintuża wkoll forn microwave. |
8.6. |
L-estrazzjoni minn qabel skont il-Proċedura A qabel l-idroliżi u l-estrazzjoni mill-ġdid skont il-Proċedura B hija rakkomandata jekk il-kontenut taż-żejt/xaħam mhux raffinati huwa aktar minn 15 %. Sa ċertu punt, dan jiddependi fuq in-natura taż-żejt/xaħam fl-għalf. |
I. DETERMINAZZJONI TA' FIBRA MHUX RAFFINATA
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli sabiex jiġu stabbiliti s-sustanzi organiċi neqsin mix-xaħam fl-għalf li ma jinħallux fil-mezzi aċidużi u alkalini u li huma konvenzjonalment deskritti bħala fibra mhux raffinata.
2. Prinċipju
Il-kampjun, bix-xaħam imneħħi fejn meħtieġ, huwa trattat suċċessivament b'soluzzjonijiet li jkunu qiegħdin jagħlu ta' aċidu sulfuriku u potassium hydroxide. Il-fdalijiet huma sseparati permezz ta' filtrazzjoni bl-użu ta' filtru ta' ħġieġ sintered maħsul, ixxuttat, miżun u magħmul irmied fi ħdan il-medda ta' 475 u 500 oC. It-telf fil-piż li jirriżulta mill-proċess tal-irmied jikkorrispondi mal-fibra mhux raffinata preżenti fit-test tal-kampjun.
3. Reaġenti
3.1. |
Aċidu sulfuriku, c = 0,13 mol/l. |
3.2. |
Aġent għal kontra r-ragħwa (eż. n-octanol). |
3.3. |
Għajnuna għall-filtrazzjoni (Celite 545 jew ekwivalenti), imsaħħna fuq 500 oC għal erba' sigħat (8.6). |
3.4. |
Aċetun. |
3.5. |
Petroleum ħafif li jagħli bejn 40 sa 60 oC. |
3.6. |
Aċidu idrokloriku, c = 0,5 mol/l. |
3.7. |
Soluzzjoni tal-potassium hydroxide, c = 0,23 mol/l. |
4. Apparat
4.1. |
L-unità tat-tisħin għal diġestjoni ma' aċidu sulfuriku jew soluzzjoni ta' potassium hydroxide, mgħammra b'appoġġ għall-griġjol tal-filtru (4.2) u pprovduta b'tubu ta' żbokk li jkollu tapp għall-iżbokk tal-likwidu u l-vakwu, possibbilment b'arja kkumpressata. Qabel ma tintuża, l-unità għandha tissaħħan kuljum minn qabel b'ilma jagħli għal ħames minuti. |
4.2. |
Griġjol tal-filtru tal-ħġieġ b'daqs tal-pora tal-platt b'filtru tal-ħġieġ sintered fjusjat ta' bejn 40-90μm. Qabel l-ewwel użu, saħħan sa 500 oC għal ftit minuti u berred (8.6). |
4.3. |
Ċilindru ta' mill-inqas 270ml b'kondensatur reflux, adatt għall-għali. |
4.4. |
Forn imnixxef b'termostat. |
4.5. |
Muffle furnace bit-termostat. |
4.6. |
Unità ta' estrazzjoni li tikkonsisti minn platt ta' appoġġ għall-griġjol tal-filtru (4.2) u b'pajp tal-iżvujtar b'tapp għall-vakwu u għall-iżbokk tal-likwidu. |
4.7. |
L-anelli tal-għaqid għall-armar tal-unità tat-tisħin (4.1), il-griġjol (4.2) u ċ-ċilindru (4.3) u għall-armar tal-unità kiesħa tal-estrazzjoni (4.6) u l-griġjol. |
5. Proċedura
Iżen 1g tal-kampjun preparat sal-eqreb 1 mg u poġġih fil-griġjol (4.2), (ara l-osservazzjonijiet 8.1, 8.2 u 8.3) u żid 1 g ta' għajnuna għall-filtrazzjoni (3.3).
Għaqqad l-unità tat-tisħin (4.1) u l-filtru (4.2), u wara waħħal iċ-ċilindru (4.3) mal-griġjol. Ferra' 150 ml aċidu sulfuriku jagħli (3.1) ġewwa ċ-ċilindru magħqud u l-griġjol u jekk meħtieġ żid ftit qtar tal-aġent għal kontra r-ragħwa (3.2).
Ġib il-likwidu jagħli għal bejn 5 ± 2 minuti u għalli bil-qawwa għal 30 minuta eżatt.
Iftaħ it-tapp għall-pajp tal-ftuħ (4.1) u, taħt vakwu, iffiltra l-aċidu sulfuritiku mill- filtru tal-griġjol u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 30ml ilma jagħli, filwaqt li tiżgura li r-residwu jiġi ffiltrat xott wara kull ħasla.
Agħlaq it-tapp ta' ftuħ u ferra' 150ml tas-soluzzjoni tagħli ta' potassium hydroxide (3.7) fiċ-ċilindru magħqud u fil-griġjol u żid ftit qatriet ta' aġent kontra r-ragħwa (3.2). Ġib il-likwidu sal-punt li jagħli fi żmien 5 ± 2 minuti u għalli bis-saħħa għal 30 minuta preċiż. Iffiltra u rrepeti l-proċedura tal-ħasil użata għall-pass tal-aċidu sulfuriku.
Wara l-ħasla u t-tnixxif finali, skonnettja l-griġjol u l-kontenut tiegħu u erġa' qabbdu mal-unità ta' estrazzjoni kiesħa (4.6). Applika l-vakwu u aħsel ir-residwu fil-griġjol bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 25ml ta' aċetun (3.4) filwaqt li tiżgura li r-residwi jiġu ffiltrati xotti wara kull ħasla.
Nixxef il-griġjol għal piż kostanti fil-forn f'temperatura ta' 130 oC. Wara kull nixfa berred fid-dessikatur u iżen mill-ewwel. Poġġi l-griġjol ġewwa forn muffle u agħmel f'irmied għal użin kostanti (it-telf fil-piż bejn użin u ieħor għandu jkun 2 mg jew inqas) f'475 u 500 oC għal mill-inqas 30 minuta.
Wara kull tisħin, qabel tiżen, l-ewwel kessaħ fil-forn u wara fid-dessikatur.
Agħmel test blank mingħajr il-kampjun. It-telf fl-użin li jirriżulta mill-irmied ma għandux ikun aktar minn 4 mg.
6. Kalkolu tar-riżultati
Il-kontenut tal-fibra mhux raffinata bħala perċentwal tal-kampjun huwa mogħti mill-espressjoni:
fejn:
m |
= |
piż tal-kampjun fi g; |
m0 |
= |
it-telf ta' piż wara li ssir irmied matul id-determinazzjoni, fi grammi; |
m1 |
= |
it-telf ta' piż wara li ssir irmied matul it-test blank, fi grammi. |
7. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn iż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:
— |
0,6 % fil-valur assolut għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata inqas minn 10 %, |
— |
6 % fir-rigward tal-ogħla riżultat, għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata daqs jew aktar minn 10 %. |
8. Osservazzjonijiet
8.1. |
L-għalf li jkun fih aktar minn 10 % xaħam mhux raffinat għandu jkollu x-xaħam imneħħi qabel l-analiżi bil-petroleum ħafif (3.5). għaqqad il-griġjol tal-filtru (4.2) u l-kontenuti tiegħu mal-estrazzjoni kiesħa tal-unità (4.6) u applika l-vakwu u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 30 ml ta' petroleum ħafif, filwaqt li tiżgura li r-residwu jibqa' xott. għaqqad il-griġjol u l-kontenuti tiegħu mal-unità tat-tisħin (4.1) u kompli kif deskritt skont 5. |
8.2. |
L-għalf li jkollu fih xaħmijiet li ma jistgħux jiġu estratti direttament mill-petroleum ħafif (3.5) għandu jkollu x-xaħam imneħħi kif muri fi 8.1 u għandu jerġa' jkollu x-xaħam imneħħi wara l-għali mal-aċidu. Wara l-għali mal-aċidu u l-ħasil sussegwenti għaqqad il-griġjol u l-kontenuti tiegħu mal-unità kiesħa tal-estrazzjoni (4.6) u aħsel għal tliet darbiet bi 30ml aċetun segwit minn tliet ħasliet oħra bi 30 ml petroleum ħafif. Iffiltra taħt vakwu sakemm ikun niexef u kompli l-analiżi kif deskritt skont 5, billi tibda mit-trattament bil-potassium hydroxide. |
8.3. |
Jekk l-għalf ikun fih aktar minn 5 % karbonati, espressi bħala calcium carbonate, għandek tgħaqqad il-griġjol (4.2) mal-kampjun tal-użin mal-unità tat-tisħin (4.1). Aħsel il-kampjun għal tliet darbiet bi 30 ml aċidu idrokloriku (3.6). Wara kull żieda ħalli l-kampjun joqgħod għal xi minuta qabel ma tiffiltra. Aħsel darba bi 30 ml ilma u mbagħad kompli kif deskritt skont 5. |
8.4. |
Jekk jintuża apparat bil-forma wieqfa (bosta griġjoli mehmużin mal-istess unità tat-tisħin) ma jkunu jistgħu jsiru l-ebda żewġ determinazzjonijiet individwali fuq l-istess kampjun għall-analiżi fl-istess serje. |
8.5. |
Jekk wara t-togħlija jkun diffiċli li tiffiltra s-soluzzjonijiet aċidużi u bażiċi, uża l-arja kkompressata permezz tal-pajp tat-tbattil tal-unità tat-tisħin u mbagħad kompli ffiltra. |
8.6. |
It-temperatura għall-irmied ma għandhiex tkun aktar minn 500 oC sabiex tkun tista' testendi l-ħajja tal-griġjoli ffiltrati tal-ħġieġ. għandha tingħata l-attenzjoni meħtieġa sabiex ikun evitat ix-xokk eċċessiv tas-sħana matul iċ-ċikli tat-tisħin u tat-tkessiħ. |
J. DETERMINAZZJONI TAZ-ZOKKOR
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-ammont ta' zokkor ta' riduzzjoni u zokkor totali wara inverżjoni, imfisser bħala glukożju jew fejn xieraq bħala sukrożju, b'konverżjoni bil-fattur 0,95. Huwa applikabbli għal għalf kompost. Metodi speċjali huma pprovduti għal għalf ieħor. Fejn meħtieġ, il-lattożju għandu jitkejjel separatament u jitqies meta jiġu kkalkolati r-riżultati.
2. Prinċipju
Iz-zokkor huwa estratt f'etanol dilwit; is-soluzzjoni tiġi ċċarata bis-soluzzjonijiet Carrez I u II. Wara li jiġi eliminat l-etanol, il-kwantitajiet qabel u wara l-inverżjoni huma stabbiliti mill-metodu Luff-Schoorl.
3. Reaġenti
3.1. |
40 % (v/v) soluzzjoni ta' etanol densità: 0,948 g/ml f'temperatura ta' 20 oC, newtralizzata għall-phenolphthalein. |
3.2. |
Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g zinc acetate Zn (CH3COO)2 2H2O u 3 g aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.3. |
Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta' potassium ferrocyanide K4Fe (CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.4. |
Soluzzjoni ta' 0,1 % (w/v) metil oranġo. |
3.5. |
Aċidu idrokloriku 4 mol/litru. |
3.6. |
Aċidu idrokloriku 0,1 mol/litru. |
3.7. |
Soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru. |
3.8. |
Reaġent Luff-Schoorl: Waqt li tħawwad b'attenzjoni, ferra' s-soluzzjoni tal-aċidu ċitriku (3.8.2) fis-soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (3.8.3). Żid is-soluzzjoni tas-sulfat tar-ram (3.8.1) u żid sa 1 l bl-ilma. Ħalliħa toqgħod matul il-lejl u ffiltra. Ivverifika l-konċentrazzjoni tar-reaġent hekk miksub (Cu 0,05 mol/litre; Na2 CO3 1 mol/litru), ara l-aħħar paragrafu ta' (5.4). Il-pH tas-soluzzjoni għandu jkun bejn wieħed u ieħor 9,4. |
3.8.1. |
Soluzzjoni tas-sulfat tar-ram: dewweb 25 g sulfat tar-ram Cu SO4 5H2O, ħieles mill-ħadid, f'100 ml ilma. |
3.8.2. |
Soluzzjoni ta' aċidu ċitriku: dewweb 50 g citric acid, C6H8O7·H2O f'50 ml ilma |
3.8.3. |
Soluzzjoni ta' karbonat tas-sodju: dewweb 143,8 g karbonat tas-sodju anidridu f'bejn wieħed u ieħor 300 ml ilma sħun. Ħallih jiksaħ. |
3.9. |
Soluzzjoni ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru. |
3.10. |
Soluzzjoni tal-lamtu: żid taħlita ta' 5 g lamtu li jinħall fi 30 ml ilma ma' 1 l ilma jagħli. għalli għal tliet minuti, ħallieħ jiksaħ u jekk ikun meħtieġ żid 10 mg mercuric iodide bħala preżervattiv. |
3.11. |
Aċidu sulfuriku 3 mol/litru. |
3.12. |
Soluzzjoni ta' jodur tal-potassju, 30 % (w/v). |
3.13. |
Frak ta' ħaffiefa mgħolli fl-aċidu idrokloriku, maħsul fl-ilma u mnixxef. |
3.14. |
3-methylbutan-l-ol. |
4. Apparat
Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.
5. Proċedura
5.1. Estrazzjoni tal-kampjun
Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 250 ml. Żid 200 ml etanol (3.1) u ħawwad fit-tazza għal siegħa. Żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 30 sekonda. Żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3) u erġa' ħawwad għal minuta. Żid sal-volum bl-etanol (3.1), omoġenizza u ffiltra. Neħħi 200 ml tal-filtrat u evapora sa bejn wieħed u ieħor nofs il-volum sabiex telimina l-parti l-kbira tal-etanol. Ittrasferixxi r-residwu tal-evaporazzjoni kwantitattivament f'kunjett volumetriku ta' 200 ml billi tuża l-ilma sħun, kessaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra jekk ikun meħtieġ. Din is-soluzzjoni tintuża biex jiġi stabbilit l-ammont ta' zokkor ta' riduzzjoni u, wara l-inverżjoni, l-ammonti totali taz-zokkor.
5.2. Determinazzjoni ta' zokkor ta' riduzzjoni
Permezz ta' pipetta, neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li jkun fiha inqas minn 60 mg ta' zokkor ta' riduzzjoni espress bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b'ilma distillat u stabbilixxi l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat huwa mfisser bħala perċentwal tal-kontenut ta' glukożju fil-kampjun.
5.3. Determinazzjoni ta' zokkor totali wara l-inverżjoni
Permezz ta' pipetta ħu 50 ml tas-soluzzjoni u ttrasferiha f'kunjett volumetriku ta' 100 ml. Żid ftit qatriet ta' soluzzjoni ta' metil oranġo (3.4) u mbagħad, b'attenzjoni u waqt li tħawwad il-ħin kollu, żid l-aċidu idrokloriku (3.5) sakemm il-likwidu jsir aħmar sew. Żid 15 ml aċidu idrokloriku (3.6), daħħal il-kunjett f'banju bil-misħun jagħli sew u żommu hemm għal tletin minuta. Kessaħ malajr sa bejn wieħed u ieħor 20 oCu żid 15 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.7). Żid sa 100 ml bl-ilma u omoġenizza. Neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li fiha inqas minn 60 mg zokkor ta' riduzzjoni mfisser bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b'ilma distillat u stabbilixxi l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat huwa mfisser bħala perċentwal ta' glukożju jew, fejn xieraq, sukrożju, billi timmultiplika bil-fattur 0,95.
5.4. Titrazzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl
Permezz ta' pipetta, ħu 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.8) u ittrasferih f'kunjett Erlenmeyer tat-300ml; żid eżattament 25 ml tas-soluzzjoni ċċarata taz-zokkor. Żid 2 granuli ta' ħaffiefa (3.13), saħħan, waqt li tħawwad bl-idejn, fuq fjamma mikxufa ta' għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f'bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Qiegħed l-Erlenmeyer minnufih fuq xibka tal-wajer miksija bl-asbestos b'toqba b'dijametru ta' bejn wieħed u ieħor 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tiġi regolata b'tali mod li l-qiegħ tal-Erlenmeyer biss jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f'ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:
Żid 10 ml ta' soluzzjoni ta' potassium iodide (3.12) u minnufih wara (b'attenzjoni, minħabba r-riskju ta' produzzjoni ta' ħafna ragħwa) żid 25 ml ta' aċidu sulfuriku (3.11). Ittitra b'soluzzjoni tat-tiosulfat tas-sodju (3.9) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (3.10) u lesti t-titrazzjoni.
Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b'mod eżatt ta' 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.8) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (3.12) u 25 ml aċidu sulfuriku (3.11) mingħajr ma tgħalli.
6. Kalkolu tar-riżultati
Permezz tat-tabella, stabbilixxi l-ammont ta' glukożju f'mg li jikkorrespondi għad-differenza bejn il-valuri taż-żewġ titrazzjonijiet, espressi bħala mg ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru. Agħti r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
7. Proċeduri speċjali
7.1. |
Fil-każ ta' għalf b'kontenut għoli ta' għasel iswed u għalf ieħor li mhuwiex partikolarment omoġenju, iżen 20 g u qegħedhom ma' 500 ml ilma f'kunjett volumetriku tal-1 l. Ħawwad għal siegħa fit-tumbler. Iċċara permezz tar-reaġenti Carrez 1 (3.2) u II (3.3) kif deskritti taħt 5.1, din id-darba iżda b'erba' darbiet il-kwantitajiet ta' kull reaġent. Żid sal-volum bi 80 % etanol (v/v). Omoġenizza u ffiltra. Elimina l-etanol kif deskritt taħt 5.1. Jekk ma hemm l-ebda lamtu dextrinised, żid sal-volum b'ilma distillat. |
7.2. |
Fil-każ ta' għasel iswed u għalf li għandu ammont kbir ta' zokkor u li huma kważi ħielsa mil-lamtu (ħarrub, cossettes tal-pitravi mnixxfa eċċ.), iżen 5 g, poġġi f'kunjett volumettriku ta' 250 ml, żid 200 ml ilma distillat u ħawwad fit-tumbler għal siegħa, jew aktar jekk ikun meħtieġ. Iċċara bir-reaġenti Carrez I (3.2) u II (3.3) kif deskritti f'5.1. Żid sal-volum bl-ilma kiesaħ, omoġenizza u ffiltra. Sabiex jiġi stabillit l-ammont totali ta' zokkor, kompli kif deskritt taħt 5.3. |
8. Osservazzjonijiet
8.1. |
Sabiex ma jkunx hemm produzzjoni ta' ragħwa huwa rakkomandabbli li żżid (minkejja l-volum) bejn wieħed u ieħor 1 ml ta' 3-methylbutan-l-ol (3.14) qabel ma tgħalli bir-reaġent Luff-Schoorl. |
8.2. |
Id-differenza bejn il-kontenut totali ta' zokkor wara l-inverżjoni, espress bħala glukożju, u l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni, espress bħala glukożju, immultiplikat b'0,95, tagħti l-perċentwali tal-kontenut ta' sukrożju. |
8.3. |
Sabiex jiġi stabbilit il-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni, minbarra lattożju, jistgħu jiġu adottati żewġ metodi: |
8.3.1. |
Għal kalkolazzjoni approssimattiva, immultiplika b'0,675 il-kontenut tal-lattożju stabbilit permezz ta' metodu differenti ta' analiżi u naqqas ir-riżultat miksub mill-kontenut taz-zokkor ta' riduzzjoni. |
8.3.2. |
Għal kalkolu eżatt ta' zokkor ta' riduzzjoni, minbarra lattożju, l-istess kampjun irid jintuża għaż-żewġ determinazzjonijiet finali. Waħda mill-analiżi ssir fuq parti mis-soluzzjoni miksuba taħt 5.1, l-oħra fuq parti mis-soluzzjoni miksuba matul l-istabbiliment ta' lattożju permezz tal-metodu stabbilit għal dak il-għan (wara fermentazzjoni u kjarifikazzjoni taż-żewġ tipi l-oħra taz-zokkor). Fiż-żewġ każijiet l-ammont ta' zokkor preżenti huwa stabbilit permezz tal-metodu Luff-Schoorl u kkalkolat f'mg ta' glukożju. Wieħed mill-valuri huwa mnaqqas mill-ieħor u d-differenza hija espressa bħala perċentwal tal-kampjun. Eżempju: Iż-żewġ volumi meħudin jikkorrespondu, għal kull determinazzjoni, għal kampjun ta' 250 mg. Fl-ewwel każ, huma kkunsmati 17 ml ta' soluzzjoni ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru li jikkorrispondu għal 44,2 mg glukożju; fit-tieni, 11 ml, li jikkorrespondu għal 27,6 mg glukożju. Id-differenza hija ta' 16,6 mg glukożju. Il-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni (minbarra lattożju), ikkalkolat bħala glukożju, huwa għalhekk:
|
Tabella ta' valuri għal 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl
ml ta' Na2 S2 O30,1 mol/litru, tisħin għal żewġ minuti, togħlija għal għaxar minuti
Na2 S2 O3 0,1 mol/litru |
Glukożju, fruttożju zokkor invertit C6 H12 O6 |
Lattożju C12 H22 O11 |
Maltożju C12 H22 O11 |
Na2 S2 O3 0,1 mol/litru |
|||
ml |
mg |
differenza |
mg |
differenza |
mg |
differenza |
ml |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 |
2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 |
3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 |
3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 |
3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6 |
3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
K. DETERMINAZZJONI TAL-LATTOŻJU
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' lattożju fl-għalf li jkun fih aktar minn 0,5 % ta' lattożju.
2. Prinċipju
Iz-zokkor huwa maħlul fl-ilma. Is-soluzzjoni tiġi suġġetta għall-fermentazzjoni permezz tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae li tħalli l-lattożju intatt. Wara l-kjarifika u l-filtrazzjoni, il-kontenut tal-lattożju jiġi stabbilit permezz tal-metodu Luff-Schoorl.
3. Reaġenti
3.1. |
Sospensjoni ta' Saccharomyces cerevisiae: poġġi 25 g ħmira friska f'100 ml ta' ilma. Is-sospensjoni żżomm għal perjodu massimu ta' ġimgħa fi friġġ. |
3.2. |
Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta' aċetat taż-żingu, Zn (CH3 COO)2 2H2O u 3 g ta' aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.3. |
Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta' potassium ferrocyanide K4Fe (CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.4. |
Reaġent Luff-Schoorl: Waqt li tħawwad b'attenzjoni, itfa' s-soluzzjoni ta' aċidu ċitriku (3.4.2) fis-soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (3.4.3). Żid is-soluzzjoni tas-sulfat tar-ram (3.4.1) u żid sa 1 l bl-ilma. Ħalliħa toqgħod matul il-lejl u ffiltra. Ivverifika l-konċentrazzjoni tar-reaġent hekk miksub (Cu 0,05 mol/litre; Na2 CO3 1 mol/litru). Il-pH tas-soluzzjoni għandu jkun bejn wieħed u ieħor 9,4. |
3.4.1. |
Soluzzjoni tas-sulfat tar-ram: dewweb 25 g sulfat tar-ram Cu SO4 5H2O ħieles mill-ħadid, f'100 ml ilma. |
3.4.2. |
Soluzzjoni ta' aċidu ċitriku: dewweb 50 g aċidu ċitriku C6H8O7 · H2O f'50 ml ilma. |
3.4.3. |
Soluzzjoni ta' karbonat tas-sodju: dewweb 143,8 g karbonat tas-sodju anidridu f'bejn wieħed u ieħor 300 ml ilma sħun. Ħallih jiksaħ. |
3.5. |
Frak ta' ħaffiefa mgħolli fl-aċidu idrokloriku, maħsul fl-ilma u mnixxef. |
3.6. |
Soluzzjoni ta' jodur tal-potassju, 30 % (w/v). |
3.7. |
Aċidu sulfuriku 3 mol/litru. |
3.8. |
Soluzzjoni ta' tiosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru. |
3.9. |
Soluzzjoni tal-lamtu: żid taħlita ta' 5 g lamtu li jinħall fi 30 ml ilma ma' 1 l ilma jagħli. għalli għal tliet minuti, ħalliha tiksaħ, u jekk ikun meħtieġ żid 10 mg jodur merkuriku bħala preservattiv. |
4. Apparat
Banju bl-ilma b'termostat issettjat f'temperatura ta' 38 – 40 oC.
5. Proċedura
Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed dan il-porzjon tal-kampjun f'kunjett volumetriku ta' 100 ml. Żid 25 sa 30 ml ilma. Qiegħed il-kunjett f'banju b'misħun jagħli għal tletin minuta u mbagħad kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 35 oC. Żid 5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1) u omoġenizza. Ħalli l-kunjett joqgħod għal sagħtejn f'banju marija, f'temperatura ta' 38 – 40 oC. Kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 20 oC.
Żid 2,5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal tletin sekonda, imbagħad żid 2,5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3) u erġa' ħawwad għal tletin sekonda. Żid sa 100 ml bl-ilma, ħawwad u ffiltra. Permezz ta' pipetta, neħħi ammont ta' filtrat li ma jaqbiżx il-25 ml u li preferibbilment ikun fih minn 40 sa 80 mg ta' lattożju u ttrasferixxi f'kunjett Erlenmeyer ta' 300 ml. Jekk ikun meħtieġ, żid il-volum sa 25 ml bl-ilma.
Wettaq test blank bl-istess mod b'5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1). Stabbilixxi l-kontenut tal-lattożju skont Luff-Schoorl, kif ġej: żid eżattament 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl (3.4) u żewġ granuli ħaffiefa (3.5). Ħawwad bl-idejn waqt li ssaħħan fuq fjamma mikxufa ta' għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f'bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Qiegħed l-Erlenmeyer minnufih fuq xibka tal-wajer miksija bl-asbestos b'toqba b'dijametru ta' bejn wieħed u ieħor 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tiġi regolata b'tali mod li l-qiegħ tal-Erlenmeyer biss jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f'ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:
Żid 10 ml ta' soluzzjoni tal-jodur tal-potassju (3.6) u minnufih wara (b'attenzjoni, minħabba fir-riskju ta' produzzjoni ta' ħafna ragħwa) żid 25 ml aċidu sulfuriku (3.7). Ittitra b'soluzzjoni tat-tiosulfat tas-sodju (3.8) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (3.9) u lesti t-titrazzjoni.
Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b'mod eżatt ta' 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.4) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (3.6) u 25 ml aċidu sulfuriku (3.7) mingħajr ma tgħalli.
6. Kalkolu tar-riżultati
Permezz tat-tabella hawn mehmuża, stabbilixxi l-ammont ta' lattożju f'mg li jikkorrispondi għad-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ titrazzjonijiet, imfissra bħala ml ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru.
Agħti r-riżultat miksub bħala lattożju anidru bħala perċentwali tal-kampjun.
7. Osservazzjoni
Għall-prodotti li jkun fihom aktar minn 40 % ta' zokkor fermentabbli, uża aktar minn 5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1).
Tabella tal-valuri għal 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl
ml ta' Na2 S2 O30,1 mol/litru, tisħin għal żewġ minuti, togħlija għal għaxar minuti
Na2 S2 O3 0,1 mol/litru |
Glukożju, fruttożju zokkor invertit C6 H12 O6 |
Lattożju C12 H22 O11 |
Maltożju C12 H22 O11 |
Na2 S2 O3 0,1 mol/litru |
|||
ml |
mg |
differenza |
mg |
differenza |
mg |
differenza |
ml |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 |
2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 |
3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 |
3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 |
3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6 |
3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
L. DETERMINAZZJONI TAL-LAMTU
– METODU POLARIMETRIKU –
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-livelli ta' lamtu u ta' prodotti ta' degradazzjoni tal-lamtu b'piż molekulari għoli fl-għalf, bil-għan li tiġi ċċekkjata l-konformità mal-valur tal-enerġija ddikjarat (dispożizzjonijiet fl-Anness VII) u d-Direttiva tal-Kunsill 96/25/KE (3).
2. Prinċipju
Il-metodu jinkludi żewġ determinazzjonijiet. Fl-ewwel waħda, il-kampjun jiġi trattat u mħallat bl-aċidu idrokloriku dilwit. Wara li jiċċara u li ssir il-filtrazzjoni, ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni titkejjel permezz tal-polarimetrija.
Fit-tieni wieħed, il-kampjun jiġi estratt b'40 % etanol. Wara l-aċidifikazzjoni tal-filtrat b'aċidu idrokloriku, l-iċċarar u l-filtrazzjoni, titkejjel ir-rotazzjoni ottika bħal fil-każ tal-ewwel determinazzjoni.
Id-differenza bejn iż-żewġ kejlijiet, immultiplikata b'fattur magħruf, tagħti l-kontenut tal-lamtu tal-kampjun.
3. Reaġenti
3.1. |
Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku, 25 % (w/w) densità: 1,126 g/ml. |
3.2. |
Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku 1,13 % (w/v) Il-konċentrazzjoni għandha tiġi vverifikata permezz ta' titrazzjoni bl-użu ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru fil-preżenza ta' 0,1 % (w/v) metil aħmar f'94 % (v/v) etanol. għan-newtralizzazzjoni hemm bżonn ta' 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/litru. |
3.3. |
Soluzzjoni Carrez I: Dewweb 21,9 g zinc acetate Zn(CH3COO)2 2H2O u 3g aċidu aċetiku inġazzat fl-ilma. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.4. |
Soluzzjoni Carrez II: Dewweb 10,6 g potassium ferrocyanide K4 Fe(CN)6 3H2O fl-ilma. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.5. |
Soluzzjoni ta' etanol, 40 % (v/v), densità: 0,948 g/ml f''20 oC. |
4. Apparat
4.1. |
250 ml kunjett erlenmeyer b'ġonta tal-ħġieġ matt standard u b'kondensatur reflux. |
4.2. |
Polarimetru jew sakkarimetru. |
5. Proċedura
5.1. Preparazzjoni tal-kampjun
Għaffeġ il-kampjun sakemm ikun fin biżżejjed biex jgħaddi kollu kemm hu minn passatur b'toqob tondi ta' 0,5 mm.
5.2. Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika totali (P jew S) (ara osservazzjoni 7.1)
Iżen 2,5 g tal-kampjun mgħaffeġ sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett iggradat ta' 100 ml. Żid 25 ml aċidu idrokloriku (3.2), ħawwad biex tikseb distribuzzjoni uniformi tal-kampjun tat-test u żid 25 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.2). Daħħal il-kunjett f'banju bl-ilma jagħli waqt li tħawwad sew u sod għall-ewwel tliet minuti biex tevita l-formazzjoni ta' agglomerati. Il-kwantità ta' ilma fil-banju tal-ilma għandha tkun suffiċjenti biex il-banju jibqa' jagħli meta l-kunjett jiddaħħal fih. Il-kunjett m'għandux jinħareġ mill-banju meta jkun qed jitħawwad. Eżattament wara 15-il minuta, neħħi mill-banju, żid 30 ml ilma kiesaħ u kessaħ minnufih sa 20 oC.
Żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez I (3.3) u ħawwad għal madwar 30 sekonda. Imbagħad żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez II (3.4) u erġa' ħawwad għal 30 sekonda. Żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u iffiltra. Jekk il-filtrat ma jkunx ċar għal kollox (ħaġa rari), irrepeti d-determinazzjoni bl-użu ta' kwantità akbar tas-soluzzjonijiet Carrez I u II, pereżempju 10 ml.
Kejjel ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni f'tubu ta' 200 mm bil-polarimetru jew bis-sakkimetru.
5.3. Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika (P' jew S') ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol
Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg, qiegħed fil-kunjett iggradat ta' 100 ml u żid bejn wieħed u ieħor 80 ml etanol (3.5) (ara osservazzjoni 7.2). Ħalli l-kunjett jiksaħ għal siegħa 1 f'temperatura ambjentali; matul dan il-ħin ħawwad sew f'sitt okkażjonijiet biex il-kampjun tat-test jitħallat sew mal-etanol. Żid sal-volum bl-etanol (3.5), ħallat u iffiltra.
Iġbed b'pipetta 50 ml tal-filtrat (li jikkorrispondi għal 2,5 g tal-kampjun) f'kunjett Erlenmeyer ta' 250 ml, żid 2,1 ml aċidu idrokloriku (3.1) u ħawwad sew. Iffittja l-kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer u daħħal dan tal-aħħar fil-banju bl-ilma jagħli. Eżattament wara 15-il minuta, neħħi l-kunjett Erlenmeyer mill-banju, ittrasferixxi l-kontenut għall-kunjett iggradat ta' 100 ml, u laħlaħ bi ftit ilma kiesaħ u kessaħ sa 20 oC.
Iċċara billi tuża s-soluzzjonijiet Carrez I (3.3) u II (3.4), żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza, iffiltra u kejjel ir-rotazzjoni ottika kif indikat fit-2 u fit-3 paragrafi tal-5.2.
6. Kalkolu tar-riżultati
Il-kontenut tal-lamtu bħala perċentwali ( %) tal-kampjun huwa kalkolat kif ġej:
6.1. Kejl skont il-polarimetrija
P |
= |
Rotazzjoni ottika totali fi gradi |
||||||||||||||
P' |
= |
Rotazzjoni ottika fi gradi ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol (V/V) |
||||||||||||||
|
= |
Rotazzjoni ottika speċifika ta' lamtu pur. Il-valuri numeriċi. Il-valuri D numeriċi aċċettati b'mod konvenzjonali għal dan il-fattur huma kif ġejjin:
|
6.2. Kejl permezz ta' sakkarimetru
S |
= |
Rotazzjoni ottika totali fi gradi sakkarimetriċi |
S' |
= |
Rotazzjoni ottika fi gradi sakkarimetriċi ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol (v/v) |
N |
= |
Piż fi g ta' sukrożju f'100 ml ta' ilma li jagħti rotazzjoni ottika ta' 100 grad sakkarimetriku f'tubu ta' 200 mm. 16,29 g għal sakkarimetri Franċiżi, 26,00 g għal sakkarimetri Ġermaniżi, 20,00 g għal sakkarimetri varji.
|
6.3. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun iktar minn 0,4, f'valur assolut, għall-kontenut ta' lamtu ta' inqas minn 40 % u 1 % f'valur relattiv, għall-kontenut ta' lamtu ta' 40 % jew aktar.
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
Jekk il-kampjun ikun fih aktar minn 6 % ta' karbonati, ikkalkolati f'termini ta' calcium carbonate, dawn għandhom jinqerdu bi trattament bi kwantità xierqa ta' aċidu sulfuriku imħallat qabel ma tiġi stabbilita r-rotazzjoni ottika totali. |
7.2. |
Fil-każ ta' prodotti b'kontenut għoli ta' lattożju, bħas-serum tal-ħalib tat-trab jew ħalib tat-trab xkumat, ipproċedi kif ġej wara li żżid 80 ml ta' etanol (3.5). Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett u daħħal dan tal-aħħar fil-banju tal-ilma f'50 oC għal 30 minuta. Ħallih jiksaħ u kompli l-analiżi kif indikat f'5.3. |
7.3. |
Il-materjal tal-għalf li ġej, meta jkun preżenti f'ammonti sinifikanti fl-għalf, huwa magħruf li joħloq interferenzi waqt id-determinazzjoni tal-kontenut tal-lamtu permezz tal-metodu polarimetriku u għalhekk jista' jwassal għal riżultati mhux korretti:
|
M. DETERMINAZZJONI TA' RMIED MHUX RAFFINAT
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-kontenut ta' rmied mhux raffinat fl-għalf.
2. Prinċipju
Il-kampjun jiġi magħmul f'irmied f'temperatura ta' 550 oC; ir-residwu jintiżen.
3. Reaġenti
20 % (w/v) soluzzjoni ta' nitrat tal-ammonja.
4. Apparat
4.1. |
Hot-plate. |
4.2. |
Muffle-furnace tal-elettriku bit-termostat. |
4.3. |
Griġjoli biex isir l-irmied magħmula mis-silica, porċellana jew mill-platinu f'għamla rettangolari (60 × 40 × 25 mm) jew tondi (dijametru: 60 sa 75 mm, għoli: 20 sa 40 mm). |
5. Proċedura
Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun (2,5 fil-każ ta' prodotti li għandhom tendenza li jintefħu) u qiegħdu fi griġjol għall-irmied wara li l-ewwel ikun issaħħan f'550 oC, imkessaħ u tnaqqaslu l-piż fi proporzjon mal-piż tal-kontenitur. Qiegħed il-griġjol fuq il-hotplate u saħħan gradwalment sakemm is-sustanza tikkarbonizza. Agħmel irmied skont 5.1 u 5.2.
5.1. |
Daħħal il-griġjol fil-muffle-furnace kalibrat f'temperatura ta' 550 oC. Żomm din it-temperatura sakemm jinkiseb irmied abjad, griż ċar jew ħamrani li jidher li huwa ħieles minn partikoli li jkun fihom il-karbonju. Qiegħed il-griġjol f'dessikatur, ħallih jiksaħ u iżen minnufih. |
5.2. |
Daħħal il-griġjol fil-muffle-furnace kalibrat f'temperatura ta' 550 oC. Agħmel irmied għal 3 sigħat. Qiegħed il-griġjol f'dessikatur, ħallih jiksaħ u iżen minnufih. Erġa' agħmel irmied għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż tal-irmied jibqa' kostanti (telf fil-piż bejn żewġ wiżniet suċċessivi jrid ikun inqas minn jew ugwali għal 1 mg). |
6. Kalkolu tar-riżultati
Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare.
Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
L-irmied ta' sustanzi li huma diffiċli biex isiru rmied għandu jiġi soġġett għall-proċess ta' produzzjoni ta' rmied inizjali ta' mill-inqas tliet sigħat, imkessaħ u mbagħad jiżdied miegħu ftit taqtir ta' 20 % soluzzjoni ta' nitrat tal-ammonja (b'attenzjoni, sabiex jiġi evitat it-tixrid tal-irmied jew il-formazzjoni ta' għoqiedi). Kompli kkalċina wara li tnixxef fil-forn. Irrepeti l-proċess kif meħtieġ sakemm il-produzzjoni tal-irmied titlesta. |
7.2. |
Fil-każ ta' sustanzi li huma reżistenti għat-trattament deskritt taħt 7.1, ipproċedi kif ġej: wara l-produzzjoni tal-irmied ta' tliet sigħat, qiegħed l-irmied f'ilma sħun u ffiltra minn filtru żgħir, ħieles mill-irmied. Agħmel l-irmied mill-filtru u l-kontenuti tiegħu fil-griġjol oriġinali. Qiegħed il-filtrat fi griġjol imkessaħ, evapora sakemm jinxef, għamel irmied minnu u iżen. |
7.3. |
Fil-każ ta' żjut u xaħmijiet, iżen b'mod preċiż kampjun ta' 25 g fi griġjol ta' daqs xieraq. Ikkarbonizza billi tqabbad is-sustanza bi strixxa ta' karta tal-filtru ħielsa mill-irmied. Wara li jkun qabad, xarrab bl-inqas ilma possibbli. Nixxef u għamlu rmied kif deskritt taħt 5. |
N. DETERMINAZZJONI TA' RMIED LI MA JINĦALLX FL-AĊIDU IDROKLORIKU
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' sustanzi minerali fl-għalf li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku. Jistgħu jintużaw żewġ metodi, skont in-natura tal-kampjun.
1.1. |
Metodu A: jgħodd għal għalf mhux imħallat u organiku u għall-maġġoranza tal-għalf kompost; |
1.2. |
Metodu B: jgħodd għal komposti u taħlitiet minerali u għal għalf kompost li l-kontenut tagħhom f'sustanzi li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku, kif stabbilit minn Metodu A, huwa aktar minn 1 %. |
2. Prinċipju
2.1. |
Metodu A: il-kampjun jiġi magħmul irmied, l-irmied jitgħalla fl-aċidu idrokloriku u r-residwu li ma jinħallx jiġi iffiltrat u jintiżen. |
2.2. |
Metodu B: il-kampjun jiġi ittrattat bl-aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni tiġi ffiltrata, ir-residwu jkun magħmul irmied u l-irmied miksub ittrattat skont il-Metodu A. |
3. Reaġenti
3.1. |
Aċidu idrokloriku 3 mol/litru. |
3.2. |
20 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid. |
3.3. |
1 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid. |
4. Apparat
4.1. |
Hot plate. |
4.2. |
Muffle-furnace tal-elettriku bit-termostat. |
4.3. |
Griġjoli biex isir l-irmied magħmulin mis-silica, porċellana jew mill-platinu f'għamla rettangolari (60 × 40 × 25 mm) jew tondi (dijametru: 60 sa 75 mm, għoli: 20 sa 40 mm). |
5. Proċedura
5.1. Metodu A
Ipproduċi rmied mill-kampjun permezz tal-metodu deskritt għad-determinazzjoni ta' rmied mhux raffinat. Irmied miksub minn dik l-analiżi jista' jintuża wkoll.
Qiegħed l-irmied f'beaker ta' 250 sa 400 ml billi tuża 75 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1). Ħallih jiftaħ jagħli bil-mod u għalli bil-mod għal ħmistax-il minuta. Iffiltra s-soluzzjoni sħuna minn karta tal-filtru ħielsa mill-irmied u aħsel ir-residwu b'ilma sħun sakemm ir-reazzjoni tal-aċidu ma tidhirx aktar. Nixxef il-filtru li fih ir-residwu u għamlu rmied fi griġjol li jkun tnaqqaslu l-piż fi proporzjon mat-toqol (tared) tal-kontenitur f'temperatura ta' mhux inqas minn 550 oC u mhux aktar minn 700 oC. Kessaħ f'dessikatur u iżen.
5.2. Metodu B
Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u poġġih f'tazza ta' 250 sa 400 ml. Żid 25 ml ta' ilma u 25 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1) suċċessivament, ħawwad u stenna sakemm tieqaf l-effervexxenza. Żid 50 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.1). Stenna sakemm jieqaf xi rilaxx ta' gass imbagħad qiegħed it-tazza f'banju bl-ilma jagħli u żommha hemm għal tletin minuta jew aktar, jekk ikun meħtieġ, sabiex xi lamtu li jista' jkun preżenti jiġi idrolizzat sew. Iffiltra waqt li jkun sħun minn filtru ħieles mill-irmied u aħsel il-filtru f'50 ml ta' ilma sħun (ara osservazzjoni 7). Qiegħed il-filtru li jkun fih ir-residwu u għamlu rmied fi griġjol biex isir rmied f'temperatura ta' mhux inqas minn 550 oC u mhux aktar minn 700 oC. Qiegħed l-irmied f'tazza ta' 250 sa 400 ml bl-użu ta' 75 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1); kompli kif deskritt fit-tieni subparagrafu tal-5.1.
6. Kalkolu tar-riżultati
Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare. Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
7. Osservazzjoni
Jekk il-filtrazzjoni tkun diffiċli erġa' ibda l-analiżi, billi tibdel il-50 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1) ma' 50 ml ta' 20 % trichloroacetic acid (3.2) u aħsel il-filtru f'soluzzjoni sħuna ta' 1 % trichloroacetic acid (3.3).
O. DETERMINAZZJONI TAL-KARBONATI
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-ammont ta' karbonati, konvenzjonalment espress bħala calcium carbonate fil-biċċa l-kbira tal-għalf.
Iżda f'ċerti każijiet (pereżempju, iron carbonate) għandu jintuża metodu speċjali.
2. Prinċipju
Il-karbonati huma dekomposti f'aċidu idrokloriku; il-carbon dioxide rilaxxat huwa miġbur f'tubu ggradat, u l-volum tiegħu mqabbel ma' dak rilaxxat taħt l-istess kundizzjonijiet permezz ta' kwantità magħrufa ta' calcium carbonate.
3. Reaġenti
3.1. |
Aċidu idrokloriku, densità 1,10 g/ml. |
3.2. |
Calcium carbonate. |
3.3. |
Aċidu sulfuriku, bejn wieħed u ieħor 0,05 mol/litru, kulurit b'metil aħmar. |
4. Apparat
Apparat Scheibler-Dietrich (ara d-dijagramma) jew apparat ekwivalenti.
5. Proċedura
Skont il-kontenut tal-karbonat tal-kampjun, iżen porzjon tal-kampjun kif muri hawn taħt:
— |
0,5 g għall-prodotti li jkun fihom minn 50 sa 100 % ta' karbonati, imfissra bħala calcium carbonate; |
— |
1 g għall-prodotti li jkun fihom minn 40 sa 50 % ta' karbonati, imfissra bħala calcium carbonate; |
— |
2 sa 3 g għal prodotti oħra. |
Qiegħed il-porzjon tal-kampjun fil-kunjett speċjali (4) tal-apparat, mgħammar b'tubu żgħir ta' materjal li ma jinkisirx li jkun fih 10 ml aċidu idrokloriku (3.1), u qabbad il-kunjett mal-apparat. Dawwar il-vit ta' bi tlieta (5) sabiex it-tubu (1) jaqbad ma' barra. Bl-użu tat-tubu mobbli (2), li huwa mimli b'aċidu sulfuriku ikkulurit (3.3) u mqabbad mat-tubu ggradat (1), ġib il-livell tal-likwidu sal-marka żero. Dawwar il-vit (5) sabiex tqabbad it-tubi (1) u (3) u vverifika li l-livell huwa fuq iż-żero.
Ħalli l-aċidu idrokloriku joħroġ (3.1) bil-mod fuq il-porzjon tal-kampjun, waqt li tmejjel il-kunjett (4). Agħmel il-pressjoni indaqs billi tbaxxi t-tubu (2). Ħawwad il-kunjett (4) sakemm ir-rilaxx tal-carbon dioxide ikun waqaf għal kollox.
Reġġa' lura l-pressjoni billi tirritorna l-likwidu lura sal-istess livell fit-tubi (1) u (2). Wara ftit minuti, meta l-volum tal-gass isir kostanti, ħu l-qari.
Wettaq test ta' kontroll fl-istess kundizzjonijiet fuq 0,5 g ta' calcium carbonate (3.2).
6. Kalkolu tar-riżultati
Il-kontenut ta' karbonati, imfisser bħala calcium carbonate, huwa kkalkolat permezz tal-formula:
fejn:
X |
= |
% (w/w) ta' karbonati fil-kampjun, espress bħal karbonat tal-kalċju, |
V |
= |
ml ta' CO2 rilaxxat mill-porzjon tal-kampjun m, |
V1 |
= |
ml ta' CO2 rilaxxat minn 0,5 g ta'CaCO, |
m |
= |
piż, fi grammi, tal-porzjon tal-kampjun. |
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
Meta l-porzjon tal-kampjun jiżen aktar minn 2 g, l-ewwel qiegħed 15 ml ta' ilma distillat fil-kunjett (4) u ħawwad qabel ma tibda t-test. Uża l-istess volum ta' ilma għat-test ta' kontroll. |
7.2. |
Jekk l-apparat użat ikollu volum differenti minn dak tal-apparat Scheibler-Dietrich, il-porzjonijiet meħuda mill-kampjun u mis-sustanza ta' kontroll u l-kalkolu tar-riżultati għandhom jiġu addattati kif jixraq.
|
P. DETERMINAZZJONI TAL-FOSFRU TOTALI
METODU FOTOMETRIKU
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-fosfru totali fl-għalf. Huwa partikolarment adattat għal-analiżi ta' prodotti bi kwantitajiet żgħar ta' fosfru fihom. F'ċerti każijiet (prodotti b'ħafna fosfru), jista' jintuża metodu gravimetriku.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa mineralizzat, jew b'kombustjoni niexfa (fil-każ ta' għalf organiku) jew b'diġestjoni ta' aċidu (fil-każ ta' komposti minerali u l-għalf likwidu), u mqiegħda f'soluzzjoni ta' aċidu. Is-soluzzjoni hija trattata b'reaġent molybdovanadate. Id-densità ottika tas-soluzzjoni s-safra hekk iffurmata hija mkejjla fin spektrofotometru f' 430 mm.
3. Reaġenti
3.1. |
Calcium carbonate. |
3.2. |
Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,10 g/ml (bejn wieħed u ieħor 6 mol/litru). |
3.3. |
Aċidu nitriku, ρ20 = 1,045 g/ml. |
3.4. |
Aċidu nitriku, ρ20 = 1,38 sa 1,42 g/ml. |
3.5. |
Aċidu sulfuriku, ρ20 = 1,84 g/ml. |
3.6. |
Aġent Molybdovanadate: ħallat 200 ml soluzzjoni ta' ammonium heptamolybdate (3.6.1), 200 ml soluzzjoni ta' ammonium monovanadate (3.6.2) u 134 ml ta' aċidu nitriku (3.4) f'kunjett tal-1 l ggradat. Żid sal-volum bl-ilma. |
3.6.1. |
Soluzzjoni ta' ammonium: dewweb f'ilma jaħraq 100 g ta' ammonium heptamolybdate (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Żid 10 ml ammonja (Densità 0,91 g/mlu żid sa 1 l bl-ilma. |
3.6.2. |
Soluzzjoni tal-ammonium monovanadate: dewweb 2,35 g ammonium monovanadate NH4VO3 f'400 ml ilma jaħraq. Waqt li tħawwad kontinwament, żid bil-mod 20ml ta' aċidu nitriku dilwit (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O u żid sa 1 l bl-ilma. |
3.7. |
Soluzzjoni standard ta' 1 mg fosfru għal kull ml: dewweb 4,387 g potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 fl-ilma. Żid sa 1 l bl-ilma. |
4. Apparat
4.1. |
Griġjoli tas-silika jew tal-porċellana għall-irmied. |
4.2. |
Muffle-furnace elettriku bit-termostat stabbilit f'550 oC. |
4.3. |
kunjett Kjeldahl ta' 250 ml. |
4.4. |
Kunjetti ggradati u pipetti ta' preċiżjoni. |
4.5. |
Spettrofotometru. |
4.6. |
Test tubes b'dijametru ta' madwar 16mm, b'tappijiet gradati għal dijametru ta' 14,5 mm; jesgħu: 25 sa 30 ml. |
5. Proċedura
5.1. Preparazzjoni tas-soluzzjoni
Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif indikat f'5.1.1 jew 5.1.2.
5.1.1.
Iżen 1 g jew iktar tal-kampjun sal-eqreb 1 mg. Qiegħed il-kampjun tat-test fi Kjeldahl kunjett, żid 20ml aċidu sulfuriku (3.5), ħallat sabiex is-sustanza tiġi kompletament imprenjata bl-aċidu u sabiex tippreveniha milli teħel mal-ġnub tal-kunjett, saħħan u żommha fil-punt tat-togħlija għal 10 minuti. Ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid 2 ml ta' aċidu nitriku (3.4), saħħan bil-mod, ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid ftit iktar aċidu nitriku (3.4) u erġa' għalli. Irrepeti din il-proċedura sakemm tikseb soluzzjoni mingħajr kulur. Kessaħ, żid ftit ilma, ferra' l-likwidu f'kunjett iggradat b'500ml, u laħlaħ fil-kunjett Kjeldahl b'ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.
5.1.2.
Iżen madwar 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg fi griġjol tal-irmied. Ħallat il-kampjun tat-test sakemm jagħqad kompletament ma' 1g calcium carbonate (3.1). Ħallih sakemm isir irmied fil-forn f'550 oC sakemm jinkiseb irmied abjad jew griż (ftit faħam ma jimpurtax). Ittrasferixxi l-irmied għal beaker ta' 250 ml. Żid 20 ml ilma u aċidu idrokloriku (3.2) sakemm jieqaf il-gass. Żid 10 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.2). Qiegħed il-beaker f'banju tar-ramel u evapora sakemm niexef biex is-silika issir insolubbli. Erġa' dewweb ir-residwu f'10ml ta' aċidu nitriku (3.3) u għalli fil-banju tar-ramel għal 5 minuti mingħajr ma jevapora sakemm jinxef. Ferra' l-likwidu f'kunjett iggradat ta' 500 ml, u laħlaħ il-beaker diversi drabi b'ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.
5.2. L-iżvilupp tal-kolorazzjoni u l-kejl tad-densità ottika
Iddilwixxi parti ta' alikwot tal-filtrat miksuba b'5.1.1 jew 5.1.2 sabiex tikseb konċentrazzjoni tal-fosfru ta' mhux iktar minn 40 μg/ml. Poġġi 10 ml ta' din is-soluzzjoni f'test-tube (4.6) u żid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f'20 oC. Kejjel id-densità ottika fi spettrofotometru f'430 nm kontra soluzzjoni miksuba billi żżid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (3.6) sa 10 ml ilma.
5.3. Kurva ta' kalibrar
Mis-soluzzjoni standard (3.7) ipprepara soluzzjonijiet li jkun fihom rispettivament 5, 10, 20, 30 u 40 μg fosfru għal kull ml. Ħu 10 ml minn kull waħda minn dawn is-soluzzjonijiet u żid magħhom 10 ml tal-aġent tal-molybdovanadate (3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f'20 oC. Kejjel id-densità ottika kif indikat f'5.2. Segwi l-kurva ta' kalibrar billi tipplottja d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet korrispondenti ta' fosfru. għal konċentrazzjonijiet bejn 0 u 40 μg/ml, il-kurva tkun lineari.
6. Kalkolu tar-riżultati
Iddetermina l-ammont tal-fosfru fil-kampjun tat-test billi tuża l-kurva ta' kalibrar.
Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.
Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:
— |
3 %, f'valur relattiv, għall-kontenuti tal-fosfru ta' inqas minn 5 %; |
— |
0,15 %, f'valur assolut, għall-kontenuti tal-fosfru ta' 5 % jew iktar. |
Q. DETERMINAZZJONI TA' KLORIN MINN KLORUR
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat l-ammont ta' klorin fi klorur li jinħall fl-ilma, imfisser b'mod konvenzjonali bħala sodium chloride. Huwa applikabbli għall-għalf kollu.
2. Prinċipju
Il-kloruri jinħallu fl-ilma. Jekk il-prodott ikun fih materjal organiku dan jiġi ċċarat. Is-soluzzjoni tiġi kemm kemm aċidifikata bl-aċidu nitriku u l-kloruri jiġu preċipitati fil-forma ta' silver chloride permezz ta' soluzzjoni ta' silver nitrate. In-nitrat tal-fidda żejjed huwa titrat b'soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate, bil-metodu ta' Volhard.
3. Reaġenti
3.1. |
Soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate 0,1 mol/litru. |
3.2. |
Soluzzjoni ta' silver nitrate 0,1 mol/litre. |
3.3. |
Soluzzjoni saturata ta' ammonium ferric sulphate (NH4)Fe(SO4)2. |
3.4. |
Aċidu nitriku, densità: 1,38 g/ml. |
3.5. |
Diethyl ether. |
3.6. |
Aċetun. |
3.7. |
Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta' zinc acetate, Zn (CH3COO)2·2H2O u 3 g ta' aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.8. |
Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta' potassium ferrocyanide K4Fe(CN)6·3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma. |
3.9. |
Karbonju attiv, ħieles mill-kloruri u li ma jassorbihomx. |
4. Apparat
Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.
5. Proċedura
5.1. Preparazzjoni tas-soluzzjoni
Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif muri f'5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3.
Fl-istess ħin wettaq test blank mingħajr il-kampjun li jrid jiġi analizzat.
5.1.1.
Iżen sal-eqreb mg kampjun ta' mhux aktar minn 10 g u li jkun fih mhux aktar minn 3 g ta' klorin fil-forma ta' klorur. Qiegħed ma' 400 ml ilma f'kunjett volumetriku ta' 500 ml f'temperatura ta' bejn wieħed u ieħor 20 oC. Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.
5.1.2.
Iżen bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 500 ml ma' 1 g karbonju attiv. Żid 400 ml ilma f' temperatura ta' bejn wieħed u ieħor 20 oC u 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.7), ħawwad għal 30 sekonda u mbagħad żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.8). Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.
5.1.3.
Ipprepara s-soluzzjoni kif deskritt taħt 5.1.2 imma tiffiltrax. Ferra minn kunjett għall-ieħor (jekk meħtieġ iċċentrifuga), neħħi 100 ml tal-likwidu li jitla' fil-wiċċ u ttrasferixxi f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħawwad ma' aċeton (3.6) u żid sal-volum b'dan is-solvent, omoġenizza u ffiltra.
5.2. Titrazzjoni
Permezz ta' pipetta, ittrasferixxi f'kunjett Erlenmayer minn 25 ml sa 100 ml tal-filtrat (skont il-kontenut ta' klorin preżunt) miksub kif deskritt taħt 5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3. Il-porzjon li jiġi diviż bl-eżatt ma jridx ikun fih aktar minn 150 mg ta' klorin (Cl). Żid bl-ilma kif meħtieġ sa mhux inqas minn 50 ml, żid 5 ml ta' aċidu nitriku (3.4.), 20 ml ta' soluzzjoni saturata ta' ammonium ferric sulphate (3.3) u żewġ taqtiriet ta' soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate (3.1) ittrasferiti permezz ta' buretta mimlija sal-marka taż-żero. Permezz ta' buretta, ittrasferixxi s-soluzzjoni tas-silver nitrate (3.2) b'tali mod li jinkisbu 5 ml żejda. Żid 5 ml ta' etere diethyl (3.5) u ħawwad bis-saħħa sabiex il-preċipitat jaqgħad. Ittitra s-silver nitrate żejjed mas-soluzzjoni tal-ammonium thiocyanate (3.1) sakemm il-kulur kannella fl-aħmar idum għal minuta.
6. Kalkolu tar-riżultati
L-ammont ta' klorin (X), imfisser bħala % ta' sodium chloride huwa kkalkolat permezz tal-formola segwenti:
fejn:
V1 |
= |
ml ta' soluzzjoni ta' silver nitrate 0,1 mol/l miżjuda |
V2 |
= |
ml ta' soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate 0,1 mol/l użata għat-titrazzjoni |
m |
= |
piż tal-kampjun. |
Jekk it-test blank jindika li s-soluzzjoni tas-silver nitrate 0,1 mol/l ġiet ikkunsmata naqqas dan il-valur mill-volum (V1 - V2).
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
It-titrazzjoni tista' titwettaq wkoll permezz ta' potentiometry; |
7.2. |
Fil-każ ta' prodotti li għandhom ammont kbir ta' żjut u xaħmijiet fihom, l-ewwel neħħi x-xaħam b'diethyl ether jew b'petroleum ħafif; |
7.3. |
Fil-każ ta' ikel mill-ħut, it-titrazzjoni tista' ssir bil-metodu Mohr. |
(1) Għat-tnixxif ta' ċereali, dqiq, xgħir u barli mitħun oħxon u qamħ mitħun mhux raffinat, il-forn irid ikollu kapaċità termali tali li, meta jkun issettjat minn qabel għal 131 oC dan jerġa' lura għal dik it-temperatura f'inqas minn 45 minuta wara li n-numru massimu ta' kampjuni għat-test ikunu tpoġġew ġewwa sabiex jitnixxfu flimkien. Il-ventilazzjoni trid tkun b'tali mod li meta jitpoġġew b'kemm jiflaħ kampjuni ta' qamħ komuni, ir-riżultati jvarjaw b'inqas minn 0,15 % minn dawk miksuba wara erba' sigħat ta' tnixxif.
(2) Meta ż-żejt jew ix-xaħam ikollu jgħaddi minn testijiet sussegwenti, issostitwixxi l-biċċiet tal-ġebla ħaffiefa b'żibeġ tal-ħġieġ.
ANNESS IV
METODI TA’ ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-LIVELL TA’ ADDITTIVI AWTORIZZATI FL-GĦALF
(A) DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA A
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ vitamina A (retinol) fl-għalf u f’taħlitiet minn qabel. Il-vitamina A tinkludi l-alkoħol all-trans-retinyl u cis-isomers tagħha li huma ddeterminati b’dan il-metodu. The content of vitamin A is expressed in International Units (IU) per kg. IU wieħed jikkorrispondi mal-attività ta’ 0,300 μg all-trans-vitamin A alkoħol jew 0,344 μg ta’ all-trans-vitamin A acetate jew 0,550 μg all-trans-vitamin A palmitate.
Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2 000 IU vitamina A/kg.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina A hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina A huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (RP-HPLC) bl-użu ta’ UV jew ditettur tal-fluworexxenza. Il-parametri kromatografiċi huma magħżula sabiex ma jkunx hemm separazzjoni bejn l-all-trans- vitamin A alkoħol u cis isomers tiegħu.
3. Reaġenti
3.1. |
Etanol, σ = 96 % |
3.2. |
Petroleum ħafif, medda ta’ togħlija 40 oC – 60 oC |
3.3. |
Metanol |
3.4. |
Soluzzjoni ta’ potassium hydroxide, c = 50 g/100 ml |
3.5. |
Soluzzjoni ta’ sodium ascorbate, c = 10 g/100 ml (ara l-osservazzjoni 7.7) |
3.6. |
Sodium sulphide, Na2S x H2O (x = 7 – 9) |
3.6.1. |
Soluzzjoni tas-sodium sulphide, c = 0,5 mol/l fi glycerol, ß = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-osservazzjonijiet 7.8) |
3.7. |
Soluzzjoni ta’ phenolphthalein, c = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1) |
3.8. |
2-Propanol |
3.9. |
Fażi mobbli għal HPLC: taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata. |
3.10. |
Nitroġenu, bla ossiġenu |
3.11. |
All-trans-vitamin A acetate, extra pur, ta’ attività ċertifikata, pereżempju 2,80 × 106 IU/g |
3.11.1. |
Soluzzjoni tal-istokk tal-all-trans-vitamin A acetate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ aċetat ta’ vitamina A (3.11) f’kunjett ta’ 100 ml iggradat. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.1. |
3.12. |
All-trans-vitamin A palmitate, extra pur, ta’ attività ċertifikata, pereżempju 1,80 × 106 IU/g. |
3.12.1. |
Soluzzjoni tal-istokk tal-all-trans-vitamin A palmitate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 80 mg ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.2. |
3.13. |
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara l-osservazzjonijiet 7.5) |
4. Apparat
4.1. |
Evaporatur rotanti b’vakwu |
4.2. |
Oġġetti tal-ħġieġ ambra |
4.2.1. |
Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass |
4.2.2. |
Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml |
4.2.3. |
Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass |
4.2.4. |
Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass |
4.3. |
Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għall-pajp tat-tmigħ tal-gass |
4.4. |
Karta filtru mitwija għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2) |
4.5. |
Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni |
4.5.1. |
Kolonna għal kromatografija b’likwidi, 250 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta’ 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti (kriterju ta’ prestazzjoni: ogħla livell wieħed biss għar-retinol isomers kollha fil-kundizzjonijiet-HPLC) |
4.5.2. |
Ditettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli |
4.6. |
Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz |
4.7. |
Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku |
4.8. |
Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn: |
4.8.1. |
Ċilindru tal-ħġieġ li jesa’ 1 l iffitjat bl-għonq u b’tapp tal-ground glass |
4.8.2. |
Insert tal-ground glass mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni. |
5. Proċedura
Nota: |
Il-Vitamina A hija sensitiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor). |
5.1. Preparazzjoni tal-kampjun
Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina A.
5.2. Saponifikazzjoni
Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina A, iżen sal-eqreb 1 mg, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.
5.3. Estrazzjoni
Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.
5.3.1.
Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).
Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.
5.3.2.
Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.
Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.
5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC
Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.10) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ vitamina A trid tkun fil-medda ta’ 5 IU/ml sa 30 IU/ml).
5.5. Determinazzjoni permezz HPLC
Il-vitamina A tissepara fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni titkejjel permezz ta’ ditettur bl-UV (325 nm) jew ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm, emissjoni: 475 nm) (4.5.2).
Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.9). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.
Kolonna għal kromografija b’likwidi (4.5.1): |
250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ippakkjar jew ekwivalenti |
Fażi mobbli (3.9): |
Taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v). |
Rata ta’ tnixxija: |
1 – 2 ml/min |
Ditettur (4.5.2): |
Ditettur tal-UV (325 nm) jew Ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm/emissjoni: 475 nm) |
5.6. Kalibrar
5.6.1.
Ippipetta 20 ml ta’ soluzzjoni ta’ aċetat tal-vitamina A maħżuna (3.11.1) jew 20 ml tas-soluzzjoni ta’ palmitat tal-vitamina A maħżuna (3.12.1) f’kunjett konikali jew tal-qiegħ ċatt li jesa’ 500 ml (4.2.1) u idrolizzah kif spjegat fil-5.2, imma mingħajr żieda ta’ BHT. Sussegwentament agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif (3.2). Evapora 100 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u erġa’ dewweb ir-residwi f’10,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 560 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont il-5.6.3.3. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.
Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’kunjett iggradat ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita hija 56 IU vitamina A għal kull ml.
5.6.2.
Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 5,0 u 10,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,8, 5,6, 14,0 u 28,0 IU vitamina A għal kull ml.
Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Billi tuża l-medji tal-għoli tal-ogħla livelli (erjas) ipplottja grafika ta’ kalibrar li tikkunsidra r-riżultati tal-kontroll tal-UV (5.6.3.3).
5.6.3.
5.6.3.1.
Ippipetta 2,0 ml tas-soluzzjoni stokk tal-aċetat ta’ vitamina A (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ aċetat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.
Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:
IU vitamina A/ml = E326 × 19,0
( għall-aċetat tal-vitamina A=1 530 f’326 nm fi 2-propanol)
5.6.3.2.
Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita ta’ palmitat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.
Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:
IU vitamina A/ml = E326 × 19,0
( għal palmitat tal-vitamina A=957 fi 326 nm f’2-propanoli)
5.6.3.3.
Ippipetta 3,0 ml tas-soluzzjoni ta’ vitamina A mhux dilwita, preparata skont 5.6.1 f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Ippipetta 5,0 ml ta’ din is-soluzzjoni f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.
Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:
IU vitamina A/ml = E325 × 18,3
( għal alkoħol tal-vitamina A=1 821 fi 325 nm f’2-propanol)
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-għoli maħsub (żona) tal-livelli l-għolja tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’IU/ml b’referenza għall-grafika ta’ kalibrar (5.6.2).
Il-kontenut tal-vitamina A w f’IU/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:
[UI/kg]
fejn:
c |
= |
konċentrazzjoni tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’IU/ml |
V1 |
= |
volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’ml |
V2 |
= |
volum tal-alikwot meħud f’5.4 f’ml |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina A huwa utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ karigi ta’ saponifikazzjonijiet (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC. |
7.2. |
Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam. |
7.3. |
Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni. |
7.4. |
Biż-żejt tal-fwied tal-bakkaljaw u xaħmijiet puri oħra il-ħin ta’ saponifikazzjoni jrid jiġi estiż għal 45 – 60 minuta. |
7.5. |
Hydroquinone jista’ jintuża minflok BHT. |
7.6. |
Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ retinol isomers hija possibbli. Iżda f’dak il-każ l-għoli (erjas) tal-ogħla livelli kollha tas-cis u trans iżomeri jridu jingħaddu għall-kalkoli. |
7.7. |
Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg ascorbic acid minflok soluzzjoni ta’ sodium ascorbate. |
7.8. |
Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sodium sulphide. |
7.9. |
F’każijiet ta’ analiżi ta’ vitamina A fi prodotti li jissostitwixxu l-ħalib, trid tingħata attenzjoni speċjali:
Biex tiċekkja jekk il-metodu ta’ analiżi applikat jiġġenerax riżultati affidabbli fuq din il-matriċi speċifika (sostitut tal-ħalib), irid jiġi applikat test tal-irkupru fuq porzjon għat-test addizzjonali. Jekk ir-rata ta’ rkupru hija inqas minn 80 %, ir-riżultat analitiku jrid jiġi emendat għall-irkupru. |
8. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % meta mqabbla mal-ogħla riżultat.
9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv (1)
|
Taħlit minn qabel |
Taħlit minn qabel kompost |
Konċentrat ta’ mineral |
Għalf tal-proteina |
Qażquż |
L |
13 |
12 |
13 |
12 |
13 |
n |
48 |
45 |
47 |
46 |
49 |
Medja [IU/kg] |
17,02 x 106 |
1,21 x 106 |
537 100 |
151 800 |
18 070 |
sr [IU/kg] |
0,51 x 106 |
0,039 x 106 |
22 080 |
12 280 |
682 |
r [IU/kg] |
1,43 x 106 |
0,109 x 106 |
61 824 |
34 384 |
1 910 |
CVr [ %] |
3,0 |
3,5 |
4,1 |
8,1 |
3,8 |
sR [IU/kg] |
1,36 x 106 |
0,069 x 106 |
46 300 |
23 060 |
3 614 |
R [IU/kg] |
3,81 x 106 |
0,193 x 106 |
129 640 |
64 568 |
10 119 |
CVR [ %] |
8,0 |
6,2 |
8,6 |
15 |
20 |
L |
= |
numru ta’ laboratorji |
n |
= |
numru ta’ valuri singoli |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
sR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
r |
= |
ripetibilità |
R |
= |
riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità |
(B) DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA E
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell tal-vitamina E fl-għalf u l-t-taħlitiet lesti minn qabel. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa mfisser bħala mg DL-α-tocopherol acetate għal kull kg. 1 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate jikkorrispondi għal 0,91 mg mg DL-α-tocopherol (vitamina E).
Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 2 mg vitamina E/kg. Dan il-limitu ta’ kwantifikazzjoni jinkiseb biss b’ditettur tal-fluworexxenza. B’ditettur bl-UV, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa biss 10 mg/kg.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina E hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa determinat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (EK-FGLK) bl-użu ta’ ditettur bl-UV jew fluworexxenti.
3. Reaġenti
3.1. |
Etanol, σ = 96 % |
3.2. |
Petroleum ħafif, medda ta’ togħlija 40 oC – 60 oC |
3.3. |
Metanol |
3.4. |
Soluzzjoni ta’ potassium hydroxide, c = 50 g/100 ml |
3.5. |
Soluzzjoni ta’ sodium ascorbate, c = 10 g/100 ml (ara l-osservazzjoni 7.7) |
3.6. |
Sodium sulphide, Na2S x H2O (x = 7 – 9) |
3.6.1. |
Soluzzjoni ta’ sodium sulphide, c = 0,5 mol/l fi gliċerol, β = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-osservazzjonijiet 7.8) |
3.7. |
Soluzzjoni ta’ phenolphthalein, c = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1) |
3.8. |
Fażi mobbli għal HPLC: taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata. |
3.9. |
Nitroġenu, bla ossiġenu |
3.10. |
DL-α-tocopherol acetate, extra pur, ta’ attività ċertifikata |
3.10.1. |
Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tocopherol acetate. (Kontroll UV ara 5.6.1.3; stabbilizzazzjoni ara l-osservazzjonijijiet 7.4). |
3.11. |
DL-α-tocopherol, extra pur, ta’ attività attestata |
3.11.1. |
Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tocopherol: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tocopherol (3.11) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tocopherol. (Kontroll UV ara 5.6.2.3; stabbilizzazzjoni ara l-osservazzjonijijiet 7.4). |
3.12. |
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara l-osservazzjonijiet 7.5) |
4. Apparat
4.1. |
Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti |
4.2. |
Oġġetti tal-ħġieġ ambra |
4.2.1. |
Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass |
4.2.2. |
Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml |
4.2.3. |
Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass |
4.2.4. |
Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass |
4.3. |
Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għall-pajp tat-tmigħ tal-gass |
4.4. |
Karta filtru mitwija għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2) |
4.5. |
Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni |
4.5.1. |
Kolonna għal kromatografija b’likwidi, 250 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta’ 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti |
4.5.2. |
Ditettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli |
4.6. |
Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz |
4.7. |
Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku |
4.8. |
Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn: |
4.8.1. |
Ċilindru tal-ħġieġ li jesa’ 1 l iffitjat bl-għonq u b’tapp tal-ground glass |
4.8.2. |
Insert tal-ground glass mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni. |
5. Proċedura
Nota: |
Il-Vitamina E hija sensittiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor). |
5.1. Preparazzjoni tal-kampjun
Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina E.
5.2. Saponifikazzjoni
Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina E, iżen sal-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.12), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.
5.3. Estrazzjoni
Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.
5.3.1.
Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).
Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.
5.3.2.
Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.
Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.
5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC
Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.9) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ DL-α-tocopherol trid tkun fil-medda ta’ 5 μg/ml sa 30 μg/ml).
5.5. Determinazzjoni permezz HPLC
Vitamina E hija separata fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni hija mkejla permezz ta’ ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 295 nm, emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm) (4.5.2).
Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.8). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.
Kolonna għal kromografija b’likwidi (4.5.1): |
250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm, ippakkjar jew ekwivalenti |
Fażi mobbli (3.8): |
Taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v). |
Rata ta’ tnixxija: |
1 – 2 ml/min |
Ditettur (4.5.2) |
Ditettur fluworexxenti (eċitazzjoni: 295 nm/emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm) |
5.6. Kalibrar (DL-α-tocopherol acetate jew DL-α-tocopherol)
5.6.1.
5.6.1.1.
Ittrasferixxi bil-pipetta 25 ml tas-soluzzjonita’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) f’kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt ta’ 500 ml (4.2.1) u idrolizza kif spjegat f’5.2. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif. Evapora 25 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u erġa’ dewweb ir-residwi f’25,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 45,5 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 50 μg DL-α-tocopherol acetate għal kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.
5.6.1.2.
Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,5, 5,0, 10,0 u 25,0 μg DL-α-tocopherol acetate, eż. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml u 2,28 μg/ml DL-α-tocopherol.
Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.
5.6.1.3.
Iddilwixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm.
L-assorbiment massimu għandu jkun f’284nm:
= 43,6 at 284 nm f’etanol
F’din it-taħlita irid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,84 sa 0,88.
5.6.2.
5.6.2.1.
Ittrasferixxi bil-pipetta 2 ml tas-soluzzjoni stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, dewweb fil-metanol (3.3) u imla sal-marka bil-metanol. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 40 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 44,0 μg DL-α-tocopherol acetate kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.
5.6.2.2.
Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. L-inqas konċentrazzjonijiet ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,0, 4,0, 8,0 u 20,0 μg/ml DL-α-tocopherol, i. e. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml u 22,0 μg/ml DL-α-tocopherol acetate.
Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.
5.6.2.3.
Iddilwixxi 2,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm. L-assorbiment massimu għandu jkun f’292nm:
= 75,8 at 292 nm f’etanol
F’din it-taħlita jrid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,6.
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun stabbilixxi l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml (ikkalkolata bħala α-tocopherol acetate) b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.6.1.2 jew 5.6.2.2).
Il-kontenut tal-vitamina E w f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
c |
= |
il-konċentrazzjoni tal-vitamina E (bħala α-tocopherol acetate) tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) μg/ml |
V1 |
= |
volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4), f’ml |
V2 |
= |
volum tal-alikwot meħud f’(5.4), f’ml |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
7. Osservazzjonijiet
7.1. |
Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina E jista’ jkun utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ saponifikazzjonijiet-kargati (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC. |
7.2. |
Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam. |
7.3. |
Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni. |
7.4. |
Wara l-kejl spettrofotometriku tad-DL-α-tocopherol acetate jew tas-soluzzjoni tad-DL-α-tocopherol skont 5.6.1.3 jew 5.6.2.3 rispettivament żid bejn wieħed u ieħor 10 mg BHT (3.12) għas-soluzzjoni (3.10.1 jew 3.10.2) u żomm is-soluzzjoni fi friġġ (tul ta’ ħażna massima ta’ 4 gimgħat). |
7.5. |
Hydroquinone jista’ jintuża minflok BHT. |
7.6. |
Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ α-, β-, γ- and δ-tocopherol hija possibbli. |
7.7. |
Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg ascorbic acid minflok soluzzjoni ta’ sodium ascorbate. |
7.8. |
Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sodium sulphide. |
7.9. |
L-aċetat tal-vitamina E jidrolizza malajr taħt kundizzjonijiet alkaliniċi u għalhekk huwa sensittiv ħafna għall-ossidazzjoni, b’mod speċjali fil-preżenza ta’ elementi ta’ traċċa bħall-ħadid jew ram. Fil-każ tad-determinazzjoni ta’ vitamina E f’taħlitiet lesti minn qabel f’livelli ogħla minn 5 000 mg/kg, id-degradazzjoni tal-vitamina E tista’ tkun il-konsegwenza. għalhekk metodu HPLC inkluż diġestjoni enzimatika tal-formulazzjoni tal-vitamina E mingħajr il-fażi ta’ saponifikazzjoni bl-alkalina għandu jkun rakkomandat għall-konferma. |
8. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.
9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv (2)
|
Taħlit minn qabel |
Taħlit minn qabel tal-proteina |
Konċentrat ta’ mineral |
Għalf tal-proteina |
Qażquż |
L |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
n |
48 |
48 |
48 |
48 |
48 |
medja [mg/kg] |
17 380 |
1 187 |
926 |
315 |
61,3 |
sr [mg/kg] |
384 |
45,3 |
25,2 |
13,0 |
2,3 |
r [mg/kg] |
1 075 |
126,8 |
70,6 |
36,4 |
6,4 |
CVr [ %] |
2,2 |
3,8 |
2,7 |
4,1 |
3,8 |
sR mg/kg] |
830 |
65,0 |
55,5 |
18,9 |
7,8 |
R [mg/kg] |
2 324 |
182,0 |
155,4 |
52,9 |
21,8 |
CVR [ %] |
4,8 |
5,5 |
6,0 |
6,0 |
12,7 |
L |
= |
numru ta’ laboratorji |
n |
= |
numru ta’ valuri singoli |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
sR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
r |
= |
ripetibilità |
R |
= |
riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità |
(C) DETERMINAZZJONI TA’ OLIGOELEMENTI – ĦADID, RAM, MANGANIŻ U ŻINGU
1. Għan u skop
Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-elementi traċċa ta’ ħadid, ram, manganiż u żingu fl-għalf. Il-limiti ta’ kwantifikazzjoni huma:
— |
ħadid (Fe): 20 mg/kg |
— |
ram (Cu): 10 mg/kg |
— |
manganiż (Mn): 20 mg/kg |
— |
żingu (Zn): 20 mg/kg |
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa mdaħħal fis-soluzzjoni fl-aċidu idrokloriku wara l-qerda tal-materja organika, jekk ikun hemm. L-elementi ħadid, ram, manganiż u żingu jiġu stabbiliti, wara dilwizzjoni xierqa, bl-atomic absorption spectrometry.
3. Reaġenti
Kummenti ta’ introduzzjoni
Għall-preparazzjoni tar-reaġenti u soluzzjonijiet analitiċi uża ilma ħieles mill-cations li għandhom jiġu stabbiliti, akkwistati jew b’distillar doppju tal-ilma jew f’tazza tal- borosilicate jew lampik tal-kwartz jew bi trattament doppju fuq raża ta’ skambju ta’ jonji.
Ir-reaġenti għandhom ikunu mill-anqas ta’ grad analitiku. Il-ħelsien mill-element li għandu jiġi stabbilit għandu jkun ivverifikat f’esperiment blank. Jekk meħtieġ, ir-reaġenti għandhom jiġu ppurifikati aktar.
Minflok is-soluzzjonijiet standard deskritti hawn taħt, jistgħu jintużaw soluzzjonijiet standard kummerċjali diment li dawn ikunu garantiti u jkunu ġew ivverifikati qabel l-użu.
3.1. |
Aċidu idrokloriku. (d:1,19 g/ml). |
3.2. |
Aċidu idrokloriku. (6 mol/litru). |
3.3. |
Aċidu idrokloriku. (0,5 mol/litru). |
3.4. |
Aċidu idrofluworiku 38 sa 40 % (v/v) li jkollu element ta’ kontenut ta’ ħadid (Fe) ta’ inqas minn 1 mg/litru u residwu wara l-evaporazzjoni ta’ inqas minn 10 mg (bħala sulfat)/litru |
3.5. |
Aċidu sulfuriku. (d: 1,84 g/ml). |
3.6. |
Perossidu tal-idroġenu. (bejn wieħed u ieħor 100 volum ta’ ossiġenu (30 % bil-piż)). |
3.7. |
Soluzzjoni standard tal-ħadid (1 000 μg Fe/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: dewweb 1g ta’ fil tal-ħadid f’200 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), żid 16 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (3.6) u żid sa litru bl-ilma. |
3.7.1. |
Soluzzjoni ta’ ħidma standard tal-ħadid (100 μg Fe/ml) ippreparata billi parti waħda tas-soluzzjoni standard (3.7) tiġi dilwita ma’ 9 partijiet ilma. |
3.8. |
Soluzzjoni standard tar-ram (1 000 μg Cu/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment:
|
3.8.1. |
Soluzzjoni ta’ ħidma standard tar-ram (10 μg Cu/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.8) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma. |
3.9. |
Soluzzjoni standard tal-manganiż (1 000 μg Mn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment:
|
3.9.1. |
Soluzzjoni ta’ ħidma standard tal-manganiż (10 μg Mn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.9) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma. |
3.10. |
Soluzzjoni standard taż-żingu (1 000 μg Zn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment:
|
3.10.1. |
Soluzzjoni standard taż-żingu (10 μg Zn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.10) ma’ 9 partijiet ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni riżultanti ma’ 9 partijiet ta’ ilma. |
3.11. |
Soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu: dewweb 12 g ta’ ossidu tal-lantanu f’150 ml ilma, żid 100 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma. |
4. Apparat
4.1. |
Muffle furnace b’regolatur tat-temperatura u preferibbilment b’reġistru. |
4.2. |
L-apparat tal-ħġieġ għandu jkun tat-tip ta’ borosilikat reżistenti u huwa rrakomandat li jintuża apparat li jkun riżervat esklussivament għad-determinazjoni ta’ elementi ta’ traċċa. |
4.3. |
Atomic absorption spectrophotometer li jissodisfa l-ħtiġiet tal-metodu fir-rigward tas-sensittività u preċiżjoni fil-medda meħtieġa. |
5. Proċedura (3)
5.1. Kampjuni li fihom materjal organiku
5.1.1. (4)
5.1.1.1. |
Poġġi 5 sa 10 g ta’ kampjun miżun sal-eqreb 0,2 mg fi griġjol tal-kwartz jew tal-platinum (ara n-Nota (b)), nixxef f’forn f’105 oC u daħħal il-griġjol fil-muffle furnace kiesaħ (4.1). Agħlaq il-forn (ara n-Nota (c)) u gradwalment tella’ t-temperatura għal 450 sa 475 oC f’ħin ta’ 90 minuta. Żomm din it-temperatura għal 4 sa 16-il siegħa (eż. matul il-lejl) biex tneħħi l-materjal faħmi u imbagħad iftaħ il-forn u ħallih jibred (ara Nota (d)). Xarrab l-irmied bl-ilma u poġġihom f’beaker ta’ 250 ml. Aħsel il-griġjol b’total ta’ madwar 5 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1) u żid dan tal-aħħar bil-mod u b’attenzjoni fil-beaker (jista’ jkun hemm reazzjoni vigoruża minħabba l-formazzjoni tad-CO2). Żid l-aċidu idrokloriku (3.1) bit-taqtir b’aġitazzjoni sakemm l-effervexxenza tieqaf għal kollox. Evapora sakemm jixxotta, waqt li kultant tħawwad b’virga tal-ħġieġ. Wara żid 15 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2) mar-residwu segwit b’madwar 120 ml ilma. Ħawwad bil-virga tal-ħġieġ, li għandha titħalla fil-beaker, u għatti t-tazza b’watch-glass. Wassal bil-mod sat-togħlija u żomm il-punt tat-togħlija sakemm ebda rmied ma jkun jidher jinħall iktar. Iffiltra fuq karta tal-filtru ħielsa minn kull irmied u iġbor il-filtrat f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml. Aħsel il-beaker u iffiltra b’5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku jaħraq (3.2) u darbtejn b’ilma jagħli. Imla l-kunjett volumetriku sal-marka bl-ilma (konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru). |
5.1.1.2. |
Jekk ir-residwu fil-filtru jidher iswed (karbonju), erġa’ poġġih fil-forn u agħmlu mill-ġdid f’irmied f’450 sa 475 oC. Dan il-proċess ta’ rmied, li jeħtieġ biss ftit sigħat (madwar tlieta sa ħames sigħat), ikun intemm meta l-irmied jidher abjad jew kważi abjad. Dewweb ir-residwu f’madwar 2 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1), evapora sakemm jixxotta u żid 5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2). Saħħan, iffiltra s-soluzzjoni fil-kunjett volumetriku u imla sal-marka b’ilma (Konċentrazzjoni tal-HCl madwar 0,5 mol/litru). Noti:
|
5.1.2.
5.1.2.1.
Għal kull wieħed mill-elementi li jeħtieġ jiġi determinat, ipprepara mis-soluzzjonijiet standard tax-xogħol kif mogħtija fil-punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 u 3.10.1 medda ta’ soluzzjonijiet ikkalibrati, kull soluzzjoni kalibrata jkollha konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru u (fil-każijiet ta’ ħadid, manganiż u żingu) konċentrazzjoni ta’ lanthanum chloride ekwivalenti għal 0,1 % La (w/v).
Il-konċentrazzjonijiet ta’ elementi ta’ traċċa magħżula jridu jkunu fil-medda ta’ sensittività tal-ispettrofotometru użat. It-tabelli ta’ hawn taħt juru, permezz ta’ eżempju, il-kompożizzjoni ta’ meded tipiċi ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar; iżda jiddependi fuq it-tip u s-sensittività tal-ispettrofotometru wżat jista’ jkun meħtieġ li jintgħażlu konċentrazzjonijiet oħrajn.
Ħadid
μg Fe/ml |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
ml HCl (3.2) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma |
Ram
μg Cu/ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.8.1) (1 ml = 10 μg Fe) |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
ml HCl (3.2) |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
Manganiż
μg Mn/ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
ml HCl (3.2) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma |
Żingu
μg Zn/ml |
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
ml HCl (3.2) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma |
5.1.2.2.
Għad-determinazzjoni ta’ ram, is-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 tista’ normalment tintuża direttament. Jekk meħtieġ, sabiex twassal il-konċentrazzjoni tagħha fi ħdan il-medda tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar, porzjon alikwot jista’ jkun imseffed f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml u miżjud sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3).
Għad-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu, seffed porzjon alikwot tas-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml, żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u wassal sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3) ara wkoll punt 8 “Osservazjoni”).
5.1.2.3.
L-esperiment blank għandu jinkludi l-passi kollha stabbiliti fil-proċedura ħlief li l-materjal tal-kampjun jitħalla barra. Is-soluzjoni tal-kalibrar “0” m’għandhiex tintuża bħala l-blank.
5.1.2.4.
Kejjel l-assorbiment atomiku tal-soluzzjonijiet tal-kalibrar u tas-soluzzjoni li għandha tkun analizzata billi tuża fjamma tal-aċitelena ta’ ossiġinazzjoni tal-arja f’dawn il-“wavelengths” segwenti:
|
Fe: 248,3 nm |
|
Cu: 324,8 nm |
|
Mn: 279,5 nm |
|
Zn: 213,8 nm |
Wettaq kull kejl erba’ darbiet.
5.2. Għalf minerali
Jekk il-kampjun ma jkun fih ebda materjal organiku, m’hemmx għalfejn issir l-operazzjoni ta’ rmied qabel. Ipproċedi kif deskritt fil-punt 5.1.1.1. billi tibda mit-tieni paragrafu. L-evaporazzjoni bil-hydrofluoric acid tista’ titħalla barra.
6. Kalkolu tar-riżultati
Permezz ta’ kurva ta’ kalibrar, ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ elementi ta’ traċċa fis-soluzzjoni li għandha tiġi analizzata u uri r-riżultat f’milligrammi ta’ elementi ta’ traċċa għal kull kilogramma tal-kampjun (ppm).
7. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jaqbżu:
— |
5 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-element ta’ traċċa kkonċernat sa massimu ta’ 50 mg/kg; |
— |
10 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati minn 50 u sa massimu 100 mg/kg; |
— |
10 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati minn 100 u sa massimu ta’ 200 mg/kg; |
— |
5 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati aktar minn 200 mg/kg. |
8. Osservazzjoni
Il-preżenza ta’ kwantitajiet kbar ta’ fosfati tista’ tfixkel id-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu. Interferenza bħal din għandha tiġi kkoreġuta biż-żieda ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11). Jekk, madankollu, fil-kampjun, il-proporzjon tal-piż Ca + mg/P huwa > 2, iż-żieda tas-soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) mas-soluzzjoni għall-analiżi u għas-soluzzjoni ta’ kalibrar tista’ titħalla barra.
(D) DETERMINAZZJONI TA’ HALOFUGINONE
DL-trans-7-bromo-6-chloro-3- [3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromide
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ halofuginone fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.
2. Prinċipju
Wara t-trattament b’ilma jaħraq, halofuginone jiġi estratt bħala l-bażi libera fl-ethyl acetate u sussegwentament imqassam bħala l-hydrochloride f’soluzzjoni ta’ aċidu milwiem. Dan l-estratt jiġi ppurifikat bi kromotografia tal-iskambju tal-jonji. Il-kontenut tal-halofuginone huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC/MGKL) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.2. |
Amberlite XAD-2 resin |
3.3. |
Ammonium acetate |
3.4. |
Ethyl acetate |
3.5. |
Aċidu aċetiku, inġazzat |
3.6. |
Sustanza standard tal-halofuginone (DL-trans-7-brome-6-chloro-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl] quinazoline-4-(3H)-one hydrobromide, E 764) |
3.6.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ halofuginone (3.6) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, dewweb f’soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate (3.18), żid sal-marka bis-soluzzjoni buffer u ħawwad. Din it-taħlita tibqa’ stabbli għal tliet ġimgħat f’5 oC jekk merfugħa fid-dlam. |
3.6.2. |
F’serje ta’ kunjetti ikkalibrati ta’ 100 ml, ittrasferixxi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.6.1). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.21) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom konċentrazzjonijiet ta’ 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 mg/ml ta’ halofuginone rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu. |
3.7. |
Aċidu idrokloriku (ρ20 bejn wieħed u ieħor 1,16 g/ml). |
3.8. |
Metanol |
3.9. |
Silver nitrate |
3.10. |
Sodium ascorbate |
3.11. |
Sodium carbonate |
3.12. |
Sodium chloride |
3.13. |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt) |
3.14. |
Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.15. |
Soluzzjoni ta’ sodium carbonate, c = 10 g/100 ml |
3.16. |
Soluzzjoni ta’ sodium chloride-sodium carbonate saturata, c = 5 g/100 ml Dewweb 50 g ta’ sodium carbonate (3.11) fl-ilma, iddilwa sa 1 l u żid bil-klorur tas-sodju (3.12) sakemm is-soluzzjoni tkun saturata. |
3.17. |
Aċidu idrokloriku, bejn wieħed u ieħor 0,1 mol/l Iddilwixxi 10 ml ta’ HCl (3.7) bl-ilma sa 1 l. |
3.18. |
Soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate, bejn wieħed u ieħor 0,25 mol/l Dewweb 19,3 g ammonium acetate (3.3) u 30 ml aċidu aċetiku (3.5) fl-ilma (3.14) u ddilwixxi sa 1 l. |
3.19. |
Preparazzjoni ta’ amberlite XAD-2 raża Aħsel kwantità xierqa ta’ Amberlite (3.2) bl-ilma sakemm il-joni tal-klorur kollha jitneħħew, kif indikat b’test tas-silver nitrate (3.20) magħmul fuq il-fażi milwiema mwarrba. Imbagħad aħsel ir-raża b’50 ml metanol (3.8), armi l-metanol u żomm ir-raża taħt il-metanol frisk. |
3.20. |
Soluzzjoni tas-silver nitrate, bejn wieħed u ieħor 0,1 mol/l Dewweb 0,17 g ta’ silver nitrate (3.9) f’10 ml ilma. |
3.21. |
Fażi mobbli HPLC Ħallat 500 ml aċetronil (3.1) ma’ 300 ml ta’ soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate (3.18) u 1 200 ml tal-ilma (3.14). Aġġusta l-pH għal 4,3 billi tuża l-aċidu aċetiku (3.5). Iffiltra minn filtru ta’ 0,22 m (4.8) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b’ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). Din is-soluzzjoni tibqa’ stabbli għal xahar, jekk tinħażen fid-dlam f’reċipjent magħluq. |
4. Apparat
4.1. |
Banju ultrasoniku |
4.2. |
Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti |
4.3. |
Ċentrifuga |
4.4. |
Tagħmir tal-HPLC b’ditettur tal-ultravjola b’wavelength varjabbli jew ditettur diode-array. |
4.4.1. |
Kolonna għal kromatografija b’likwidi, ippakkjar ta’ 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm, jew kolonna ekwivalenti |
4.5. |
Kolonna tal-ħġieġ (300 mm × 10 mm) mgħammra b’filtru tal-ħġieġ sileċju bi stopcock |
4.6. |
Filtri tal-fibra tal-ħġieiġ, b’dijametru ta’ 150 mm |
4.7. |
Filtri tal-membrana, 0,45 μm |
4.8. |
Filtri tal-membrana, 0,22 μm |
5. Proċedura
Nota |
Halofuginone bħala l-bażi libera huwa instabbli fis-soluzzjonijiet alkalini u tal-ethyl acetate. M’għandux jibqa’ fl-ethyl acetate għal iżjed minn 30 minuta. |
5.1. Ġenerali
5.1.1. |
Għalf blank għandu jiġi analizzat għall-verifika li la halofuginone u lanqas is-sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. |
5.1.2. |
Għandu jitwettaq test tal-irkupru billi jiġi analizzat l-għalf blank li jkun ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ halofuginone, simili għal dak preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ sa livell ta’ 3 mg/kg, żid 300 μl tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.6.1) sa 10 g tal-għalf blank, ħallat u stenna għal 10 minuti qabel ma tipproċiedi bil-pass tal-estrazzjoni (5.2).
|
5.2. Estrazzjoni
Iżen sal-eqreb 0,1 g, 10 g mill-kampjun ippreparat, ġewwa tubu ċentrifugu tal-200 ml, żid 0,5 g ta’ sodium ascorbate (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) u 20 ml ilma u ħawwad. Qiegħed it-tubu għal 5 minuti f’banju bl-ilma (80 oC). Wara li jibred għat-temperatura ambjentali, żid 20 ml ta’ taħlita tas-sodium carbonate (3.15) u ħawwad. Żid minnufih 100 ml tal-ethyl acetate (3.4) u ħawwad bis-saħħa bl-idejn għal 15 il-sekonda. Imbagħad qiegħed it-tubu għal tliet minuti fil-banju ultrasoniku (4.1) u ħoll ftit it-tapp. Iċċentrifuga għal żewġ minuti u ferra’ l-fażi tal-ethyl acetate minn filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.6), għal f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml. Irrepeti l-estrazzjoni tal-kampjun bit-tieni porzjon ta’ 100 ml tal-ethyl acetate. Aħsel l-estratti miġmugħin għal minuta b’50 ml ta’ soluzzjoni ta’ sodium chloride saturated sodium carbonate (3.16) u armi s-saff milwiem.
Islet is-saff organiku għal minuta (1) b’50 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.17). għaddi s-saff aċiduż il-baxx f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 250 ml. Erġa’ islet is-saff organiku għal 1,5 minuti b’50 ml ieħor ta’ aċidu idrokloriku u għaqqad mal-ewwel estratt. Aħsel l-estratti magħqudin billi ddawwar għal bejn wieħed u ieħor 10 sekondi ma’ 10 ml tal-ethyl acetate (3.4).
Ittrasferixxi b’mod kwantitattiv is-saff milwiem għal kunjett b’qiegħ tond ta’ 250 ml u armi l-fażi organika. Evapora l-ethyl acetate kollu li jkun baqa’ mit-taħlita aċiduża bl-użu tal-evaporatur bil-pelikola rotanti (4.2). It-temperatura tal-banju bl-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Taħt vakwu ta’ bejn wieħed u ieħor of 25 mbar l-ethyl acetate kollu li jifdal għandu jitneħħa fi żmien 5 minuti fi 38 oC.
5.3. Tindifa
5.3.1.
Kolonna XAD-2 tiġi ppreparata għal kull estratt tal-kampjun. Ittrasferixxi 10 g tal-Amberlit ippreparat (3.19) f’kolonna tal-ħġieġ (4.5) bil-metanol (3.8). Żid plagg żgħir tas-suf tal-ħġieġ mal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Battal il-metanol mill-kolonna u aħsel ir-raża b’100 ml ilma, filwaqt li twaqqaf in-nixxija hekk kif il-likwidu jilħaq il-parti tal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Ħalli l-kolonna tekwilibra ruħha għal 10 minuti qabel l-użu. Qatt tħalli l-kolonna tixxotta.
5.3.2.
Ittrasferixxi l-estratt (5.2) b’mod kwantitattiv lejn il-wiċċ tal-kolonna tal-Amberlit ippreparat (5.3.1) u saffi, filwaqt li twarrab it-tisfija. Ir-rata tat-tisfija m’għadhiex tkun aktar minn 20 ml/min. Laħlaħ il-kunjett bil-qiegħ tond b’20 ml hydrochlorid acid (3.17) u uża dan biex tlaħlaħ il-kolonna tar-raża. Onfoħ il-barra b’nixxija ta’ arja xi taħlita aċiduża li tkun baqgħet. Armi l-likwidu użat fil-ħasil. Żid 100 ml metanol (3.8) mal-kolonna u ħalli 5 sa 10 ml tal-ħasil, filwaqt li tiġbor is-soluzzjoni tal-ħasil f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Ħalli l-metanol li jkun baqa’ jekwilibra mar-raża għal 10 minuti u kompli t-tlaħliħ b’rata li ma taqbiżx 20 ml/min, u iġbor it-tlaħliħ fl-istess kunjett bil-qiegħ tond. Evapora l-metanol fuq l-evaporatur tal-pellikola rotanti (4.2), it-temperatura tal-banju tal-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Ittrasferixxi l-fdal b’mod kwantitattiv f’kunjett ikkalibrat ta’ 10 ml billi tuża l-fażi mobbli (3.21). Wassal sal-marka bil-fażi mobbli u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.7). Aħżen din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).
5.4. Determinazzjoni tal-HPLC
5.4.1.
Il-kundizzjonijiet segwenti huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn basta dawn jagħtu riżultati ekwivalenti:
Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),
Fażi mobbli HPLC (3.21),
Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/min.
Wavelength tad-ditezzjoni: 243 nm
Volum tal-injezzjoni: 40 sa 100 μl.
Ivverifika l-istabbilità tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 3,0 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli (jew erjas) u ż-żmien ta’ żamma kostanti.
5.4.2.
Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) bosta drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar bl-użu tal-aqwa għoljiet jew żoni tal-medja tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala l-axxiżi.
5.4.3.
Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum bħal dak meħud għas-soluzzjoni tal-kalibrar u iddetermina l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli (iż-żona) tal-halofuginone.
6. Kalkolu tar-riżultati
Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, mill-medja tal-għoli (erja) tal-ogħla livelli ta’ halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun bis-soluzzjoni kampjun b’referenza għall-graff tal-kalibrar (5.4.2).
Il-kontenut tal-halofuginone w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:
fejn:
c |
: |
konċentrazzjoni tal-halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, |
m |
: |
piż tal-porzjoni tat-test fi grammi. |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tista’ tiġi ikkonfermata b’ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ dittetur tad-diode-array li bih huma mqabbla l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 6,0 μg/ml.
7.1.1.
Estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2). L-ammont ta’ halofuginone miżjud għandu jkun simili għal-ammont ikkalkolat ta’ halofuginone misjub fl-estratt tal-kampjun.
L-għoli tal-halofuginone miżjud biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jitiqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll it-taħlit tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli masimu, għandha tkun madwar ± 10 % tal-wisa’ oriġinali.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni tad-diode-array, din hija tipikament fi ħdan ± 2 nm; |
(b) |
bejn 225 u 300 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru ‘fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard; |
(c) |
bejn 225 u 300 nm, l-ispettri tal-parti ’il fuq, tal-apiċi u tal-parti ’l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhiex tkun aktar minn 0,5 mg/kg għall-kontenut ta’ halofuginone sa 3 mg/kg.
7.3. Irkupru
Għal kampjun blank imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.
8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv (5) li fih ġew analizzati tliet kampjuni minn tmien laboratorji.
Riżultati
|
Kampjun A (blank) Mal-wasla |
Kampjun B (Mitħun) |
Kampjun C(Pritkuni) |
||
|
|
Mal-wasla |
Wara xahrejn |
Mal-wasla |
Wara xahrejn |
Medja [mg/kg] |
ND |
2,80 |
2,42 |
2,89 |
2,45 |
SR [mg/kg] |
— |
0,45 |
0,43 |
0,40 |
0,42 |
CVR [ %] |
— |
16 |
18 |
14 |
17 |
Rec. [ %] |
|
86 |
74 |
88 |
75 |
ND |
= |
mhux rilevat |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVR |
= |
ko-effiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità ( %) |
Rec. |
= |
irkupru ( %) |
E. DETERMINAZZJONI TA’ ROBENIDINE
1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-livelli ta’ robenidine fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa estratt b’metanol aċidifikat. L-estratt jitnixxef u porzjon alikwot ikun soġġett għal tindifa sewwa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. Robenidine jitneħħa bil-ħasil mill-kolonna bil-metanol, konċentrat, u miżjud sa volum xieraq b’fażi mobbli. Il-kontenut ta’ robenidine jiġi stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja (HPLC – High performance liquid chromatography) b’fażi riversjata bl-użu ta’ ditettur bl-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Metanol |
3.2. |
Metanol aċidifikat Ittrasferixxi 4,0 ml aċidu idrokloriku (ρ20 = 1,18 g/ml) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.1) u ħawwad. Din is-soluzzjoni għandha titħejja friska qabel l-użu. |
3.3. |
Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.4. |
Passatur molekulari Tat-tip 3A, minn 8 sa 12-il malja (malji ta’ 1,6 – 2,5 mm, alumino-silicate kristallin, dijametru tal-pori 0,3 mm). |
3.5. |
Attività aċiduża tal-ossidu tal-aluminju grad I tal-kromatografija b’kolonna Ittrasferixxi 100 g ossidu tal-aluminju f’kontenitur adatt u żid 2,0 ml ilma. Poġġi t-tapp u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 20 minuta. Aħżen f’kontenitur li għandu t-tapp magħluq sew. |
3.6. |
Soluzzjoni tal-potassium dihydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Dewweb 3,40 g ta’ potassium dihydrogen phosphate fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka u ħawwad. |
3.7. |
Soluzzjoni tad-di-sodium hydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Dewweb 3,55 g ta’ di-sodium hydrogen phosphate anidru (jew 4,45 g ta’ dihydrate jew 8,95 g ta’ dodecahydrate) fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 l, żid sal-marka u ħawwad. |
3.8. |
Fażi mobbli tal-HPLC Ħawwad flimkien ir-reaġenti li ġejjin:
Għaddi minn filtru ta’ 0,22 μm (4.6) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni, (eżempju permezz ta’ ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). |
3.9. |
Sustanza standard Robenidine pur: 1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride. |
3.9.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 30 mg ta’ sustanza standard ta’ robenidine (3.9). Dewweb f’metanal aċidifikat (3.2) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam. |
3.9.2. |
Ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 250 ml, żid sal-marka b’fażi mobbli (3.8) u ħawwad. geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam. |
3.9.3. |
F’serje ta’ kunjetti kkalibrati ta’ 50 ml, ittrasferixxi 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 u 25,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedja (3.9.2). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.8) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 u 6,0 μg/ml ta’ robenidine rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu. |
3.10. |
Ilma ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
4. Apparat
4.1. |
Kolonna tal-ħġieġ Mibnija mill-ħġieġ tal-ambra mgħamra bi stopcock u b’reċipjent li jesa’ bejn wieħed u ieħor 150 ml, dijametru intern ta’ 10 sa 15 mm, tul ta’ 250 mm. |
4.2. |
Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika |
4.3. |
Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti |
4.4. |
Tagħmir HPLC b’ditettur tal-ultravjola b’wavelength varjabbli jew ditettur tad-diode array li jaħdem fil-medda ta’ bejn 250 u 400 mm |
4.4.1. |
Kolonna għal kromatografija b’likwidi: ippakkjar 300 mm × 4 mm, C18 10 μm jew ekwivalenti |
4.5. |
Karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman gF/A jew ekwivalenti) |
4.6. |
Filtri tal-membrana, 0,22 μm |
4.7. |
Filtri tal-membrana, 0,45 μm |
5. Proċedura
Nota: |
Robenidine huwa sensittiv għad-dawl. għandhom jintużaw oġġetti tal-ħġieġ tal-ambra fl-operazzjonijiet kollha. |
5.1. Ġenerali
5.1.1. |
Għalf blank għandu jkun analizzat biex ikun iċċekkjat li la robenidine u lanqas is-sustanzi li jikkaġunaw interferenza ma jkunu preżenti. |
5.1.2. |
Għandu jsir eżami ta’ rkuprar billi ssir analiżi tal-għalf blank (5.1.1) li jkun ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ robenidine, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 60 mg/kg, ittrasferixxi 3,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.9.1) f’kunjett konikali tal-250 ml. Evapora s-soluzzjoni sa c. 0,5 ml fi fluss tan-nitroġenu. Żid 15 g tal-għalf blank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2).
|
5.2. Estrazzjoni
Iżen sal-eqreb 0,01g, bejn wieħed u ieħor 15 g tal-kampjun ippreparat. Ittrasferixxi għal kunjett konikali ta’ 250 ml u żid 100,0 ml ta’ metanal aċidifikat (3.2), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal siegħa fuq ix-shaker (4.2). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.5) u iġbor il-filtrat kollu f’kunjett konikali ta’ 150 ml. Żid passatur molekulari ta’ 7,5 g (3.4), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal ħames minuti. Iffiltra minnufih minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ. Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta’ purifikazzjoni (5.3).
5.3. Purifikazzjoni
5.3.1.
Daħħal plagg żgħir ta’ suf tal-ħġieġ fil-parti t’isfel tal-kolonna tal-ħġieġ (4.1) u għafsu l-isfel bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ. Iżen 11,0 g tal-aluminium oxide ippreparat (3.5) u ttrasferixxi fil-kolonna. għandha tingħata attenzjoni biex titnaqqas kemm jista’ jkun l-espożizzjoni għall-arja matul din il-fażi. Taptap bil-mod il-kolonna mgħobbija fil-parti t’isfel tagħha biex l-aluminium-oxide joqgħod.
5.3.2.
Ittrasferixxi fil-kolonna bil-pipetta 5,0 ml tal-estratt tal-kampjun ippreparat f’(5.2). Serraħ il-ponta tal-pipetta qrib il-ħajt tal-kolonna u ħalli s-soluzzjoni tkun assorbita fuq l-aluminium oxide. Neħħi bil-ħasil robenidine mill-kolonna billi tuża 100 ml methanol (3.1), b’rata ta’ fluss ta’ 2 sa 3 ml/minuta u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Evapora s-soluzzjoni tal-metanol sakemm jinxef taħt pressjoni mnaqqsa f’40 oC permezz ta’ evaporatur b’pellikola rotanti (4.3). Erġa’ dewweb ir-residwu f’3 sa 4 ml ta’ fażi mobbli (3.8) u ttrasferixxi b’mod kwantitattiv f’kunjett iggradat ta’ 10 ml. Laħlaħ il-kunjett b’diversi porzjonijiet ta’ 1 sa 2 ml tal-fażi mobbli u ttrasferixxi dawn it-tlaħliħiet fil-kunjett iggradat. Żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn 0,45 mm (4.7). Erfa’ din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).
5.4. Determinazzjoni tal-HPLC
5.4.1.
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:
Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),
Fażi mobbli tal-HPLC (3.8),
Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/minuta,
Wavelength tad-ditettur: 317 nm,
Volum tal-injezzjoni: 20 sa 50 μl.
Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, billi tinjetta s-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) li fiha 3,6 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli u l-ħinijiet ta’ żamma kostanti.
5.4.2.
Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) diversi drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-kurva tal-kalibrar bl-użu tal-medja tal-ogħla livelli jew erjas tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’mg għal kull ml bħala axxiżi.
5.4.3.
Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tar-robenidine.
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli ta’ robenidine tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.4.2).
Il-kontenut ta’ robenidine w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:
fejn:
c |
= |
il-konċentrazzjoni ta’ robenidine tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml, |
m |
= |
piż tal-porzjoni tat-test fi grammi. |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tistà tigi kkonfermata b'ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.9.3) li fiha 6 μg/ml.
7.1.1.
Estratt kampjun jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3). L-ammont ta’ robenidine miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat ta’ robenidine misjub fl-estratt tal-kampjun.
L-għoli tal-ogħla livell ta’ robenidine biss għandu jiżdied wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f’bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa’ oriġinali.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni diode-array, din tipikament hija bejn wieħed u ieħor fi ħdan 2 nm; |
(b) |
bejn 250 u 400 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru ‘fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard; |
(c) |
bejn 250 u 400 nm, l-ispettri tal-parti ’il fuq, tal-apiċi u tal-parti ’l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhiex taqbeż l-10 % tal-ogħla riżultat għal kontenut ta’ robenidine ogħla minn 15 mg/kg.
7.3. Irkupru
Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 85 %.
8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE li fih, erba’ kampjuni tal-għalf tat-tjur u tal-fniek, f’forma mitħun jew ta’ pritkuni kienu analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella hawn taħt:
|
Tjur |
Fniek |
||
|
Mitħun |
Pritkuni |
Mitħun |
Pritkuni |
Medja [mg/kg] |
27,00 |
27,99 |
43,6 |
40,1 |
sr [mg/kg] |
1,46 |
1,26 |
1,44 |
1,66 |
CVr [ %] |
5,4 |
4,5 |
3,3 |
4,1 |
SR [mg/kg] |
4,36 |
3,36 |
4,61 |
3,91 |
CVR [ %] |
16,1 |
12,0 |
10,6 |
9,7 |
Recovery [ %] |
90,0 |
93,3 |
87,2 |
80,2 |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, % |
(F) DETERMINAZZJONI TA’ DICLAZURIL
(+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phenyl] acetonitrile.
1. Għan u skop
Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ diclazuril fl-għalf u f’taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 0,1 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 0,5 mg/kg.
2. Prinċipju
Wara ż-żieda ta’ standard intern, il-kampjun jiġi estratt b’metanol aċidifikat. għall-għalf, l-alikwot tal-estratt huwa ppurifikat fuq cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 . Id-diclazuril jinħareġ mill-cartridge b’taħlita ta’ metanol aċidifikat u ilma. Wara l-evaporazzjoni, ir-residwu jinħall f’DMF/ilma. għal taħlitiet lesti minn qabel, l-estratt huwa evaporat u r-residwu jinħall f’DMF/ilma. Il-kontenut tad-diclazuril huwa stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata b’ternary gradient (HPLC) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Ilma, ekwivalenti għall-grad ta’ HPLC |
3.2. |
Ammonium acetate |
3.3. |
Tetrabutylammonium hydrogen sulphate (TBHS) |
3.4. |
Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.5. |
Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.6. |
N, N-dimethylformamide (DMF) |
3.7. |
Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,19 g/ml |
3.8. |
Is-sustanza standard: diclazuril II-24 : (+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl) phenyl] acetonitrile b’purità garantita, E771. |
3.8.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard ta’ diclazuril (3.8) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.8.2. |
Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.9. |
Sustanza standard interna: 2,6 dichloro-α-(4-chlorophenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2 (3H) – yl) α-methylbenzene-acetonitrile |
3.9.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg 25 mg tas-sustanza standard interna (3.9) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.9.2. |
Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard interna maħżuna (3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.9.3. |
(p = kontenut nominali ta’ diclazuril f’taħlita lesta minn qabel f’mg/kg). Iżen sal-eqreb 0,1 mg p/10 mg tas-sustanza standard interna f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’DMF (3.6) f’banju ultrasoniku (4.6), żid sal-marka b’DMF u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.10. |
Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 2 g/ml. Ippipetta 2,00 ml soluzzjoni standard ta’ diclazuril (3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 16 ml DMF (3.6), żid sal-marka bl-ilma u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu. |
3.11. |
Cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 , e.g. Bond Elut, daqs: 1 cc, piż sorbenti: 100 mg. |
3.12. |
Solvent tal-estrazzjoni: acidified methanol. Ippipetta 5,0 ml aċidu idrokloriku (3.7) f’1 000 ml metanol (3.5), u ħallat. |
3.13. |
Fażi mobbli għall-HPLC |
3.13.1. |
Elwent A: soluzzjoni ta’ ammonium acetate – tetrabutylammonium hydrogen sulphate. Dewweb 5 g ammonium acetate (3.2) u 3,4 g TBHS (3.3) f’1 000 ml ilma (3.1) u ħallat. |
3.13.2. |
Elwent B: acetonitrile (3.4). |
3.13.3. |
Elwent C: metanol (3.5). |
4. Apparat
4.1. |
Shaker mekkaniku |
4.2. |
Tagħmir għal HPLC ta’ ternary gradient |
4.2.1. |
Kolonna għal kromatografija b’likwidi, Hypersil ODS, ippakkjar ta’ 3 m, 100 mm x 4,6 mm, jew ekwivalenti. |
4.2.2. |
Ditettur bil-UV b’aġġustament varjabbli ta’ wavelength jew ditettur diode array |
4.3. |
Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti |
4.4. |
Filtru tal-membrana, 0,45 μm. |
4.5. |
Manifold b’vakwu. |
4.6. |
Banju ultrasoniku |
5. Proċedura
5.1. Ġenerali
5.1.1.
Għalf blank għandu jiġi analizzat sabiex jiġi kkontrollat li la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. L-għalf blank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti m’għandhom jiġu rilevati.
5.1.2.
Għandu jtiwettaq test tal-irkupru billi jkun analizzat l-għalf blank li jkun ġie imsaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ diclazuril simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 1 mg/kg, żid 0,1 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) għal 50 g ta’ għalf blank, ħallat sewwa u ħalli għal 10 min, u erġa’ ħallat għal diversi drabi qabel ma tipproċedi (5.2.).
Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ diclazuril, simili għal dik diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.
5.2. Estrazzjoni
5.2.1.
Iżen sal-eqreb 0,01 g bejn wieħed u ieħor 50 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku ta’ 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita fuq ix-shaker (4.1) tul il-lejl. Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 20 ml tas-supernatant fil-kontenitur adattat tal-ħġieġ u ddilwa b’20 ml ilma. Itrasferixxi din is-soluzzjoni fuq cartridge tal-estrazzjoni (3.11), u għaddi minn vakwu (4.5.). Aħsel il-cartridge b’25ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 65 + 35 (V + V). Armi l-frazzjonijiet miġbura u elwixxi l-komposti b’25 ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 80 + 20 (V + V). Evapora din il-frazzjoni sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Dewweb ir-residwu f’1,0 ml DMF (3.6), żid 1,5 ml ilma (3.1) u ħallat. Iffiltra minn filtru tal-membrana (4.4). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.2.2.
Iżen sal-eqreb 0,001 g bejn wieħed u ieħor 1 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.3), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita tul il-lejl fuq ix-shaker (4.1). Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 10 000/p ml (p = kontenut nominali ta’ diclazuril fit-taħlita lesta minn qabel f’mg/kg) tas-supernatant f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ daqs adattat. Evapora sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Erġa’ dewweb ir-residwu f’10,0 ml DMF (3.6), żid 15,0 ml ilma (3.1) u ħallat. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.3. Determinazzjoni tal-HPLC
5.3.1.
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.
Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.2.1.): |
100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, ippakkjar ta’ 3 μm, jew simili |
|
||||||
Fażi mobbli : |
Elwent A (3.13.1): |
Soluzzjoni fl-ilma ta’ ammonium acetate u tetrabutyl-ammonium Sulfat tal-idroġenu |
||||||
|
Elwent B (3.13.2): |
acetonitrile |
||||||
|
Elwent C (3.13.3): |
metanol |
||||||
Mod ta’ eluzzjoni : |
Aħsel b’B għal 10 min. |
|||||||
Rata ta’ tnixxija: |
1,5 – 2 ml/min |
|
||||||
Volum tal-injezzjoni: |
20 μl |
|
||||||
Wavelength tad-ditettur: |
280 nm |
|
Ikkontrolla l-istabbilità tas-sistema kromatografika billi tinjetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10), li jkun fiha 2 g/ml, sakemm jintlaħqu ogħla livelli u ħinijiet ta’ żamma kostanti.
5.3.2.
Injetta 20 μl tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) għal diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.
5.3.3.
Injetta 20 μl tas-soluzzjoni kampjun (5.2.1. jew 5.2.2.) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.
6. Kalkolu tar-riżultati
6.1. L-Għalf
Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
hd, s |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1) |
hi, s |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1) |
hd, c |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) |
hi, c |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) |
cd, c |
= |
il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni ta’ kalibrar f’g/ml (3.10) |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g. |
V |
= |
il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 (jiġifieri 2,5 ml) |
6.2. Taħlitiet lesti minn qabel
Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
hd, c |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) |
hi, c |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) |
hd, s |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2) |
hi, s |
= |
l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2) |
cd, c |
= |
il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar f’μg/ml (3.10) |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g. |
V |
= |
il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 (jiġifieri 25 ml) |
p |
= |
il-kontenut nominali ta’ diclazuril fi mg/kg fit-taħlita lesta minn qabel |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża ditettur ta’ diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10).
7.1.1.
Kampjun estratt (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrar (3.10). L-ammont ta’ diclazuril miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ diclazuril li jinstab fl-estratt tal-kampjun
L-għoli tal-ogħla livell ta’ diclazuril u l-ogħla livell tal-istandard intern biss għandhom jitjiebu wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-ogħla livell tad-diclazuril jew tal-ogħla livell tal-istandard intern tal-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
Il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġini determinata bis-saħħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni b’diode array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm. |
(b) |
Bejn 230 u 320 nm, il-kampjun u l-ispettri standard irreġistrati fl-apiċi tal-ogħla livell tal-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta’ 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju għandu jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u fl-ebda punt osservat il-punt ta’ devjazzjoni bejn iż-żewġ spettra ma għandu jaqbeż 15 % tal-assorbiment tal-analit standard. |
(c) |
Bejn 230 u 320 nm, l-ispettri tal-parti tiela’ ’l fuq, tal-apiċi u tal-parti nieżla ’l isfel tal-ogħla livell prodotti mill-kampjun tal-estratt m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta’ 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-ogħla apiċi. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:
— |
30 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diclazuril minn 0,5 mg/kg sa 2,5 mg/kg |
— |
0,75 mg/kg għall-kontenuti ta’ diclazuril bejn 2,5 mg/kg u 5 mg/kg |
— |
15 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diclazuril ta’ aktar minn 5 mg/kg |
7.3. Irkupru
Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.
8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati 5 kampjuni minn 11-il laboratorju. Dawn il-kampjuni kienu jikkonsistu minn żewġ taħlitiet lesti minn qabel; waħda kienet imħallta b’matriċi organika (O 100) u l-oħra b’matriċi inorganika (A 100). Il-kontenut teoretiku huwa 100 mg diclazuril għal kull kg. It-tliet taħlitiet tal-għalf għat-tjur saru minn 3 produtturi differenti (NL) (L1/Z1/K1). Il-kontenut teoretiku huwa 1 mg diclazuril għal kull kg. Il-laboratorji ngħataw struzzjonijiet biex janalizzaw kull wieħed mill-kampjuni għal darba jew darbtejn. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista’ tinstab fil-Journal of AOAC International, Volum 77, Nru 6, 1994, p. 1359-1361). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:
|
Kampjun 1 A 100 |
Kampjun 2 O 100 |
Kampjun 3 L1 |
Kampjun 4 Z1 |
Kampjun 5 K1 |
L |
11 |
11 |
11 |
11 |
6 |
n |
19 |
18 |
19 |
19 |
12 |
Medja |
100,8 |
103,5 |
0,89 |
1,15 |
0,89 |
Sr (mg/kg) |
5,88 |
7,64 |
0,15 |
0,02 |
0,03 |
CVr ( %) |
5,83 |
7,38 |
17,32 |
1,92 |
3,34 |
SR (mg/kg) |
7,59 |
7,64 |
0,17 |
0,11 |
0,12 |
CVR ( %) |
7,53 |
7,38 |
18,61 |
9,67 |
13,65 |
Kontenut nominali mg/kg) |
100 |
100 |
1 |
1 |
1 |
L |
= |
numru ta’ laboratorji |
n |
= |
numru ta’ valuri singoli |
Sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibbiltà |
CVr |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità |
9. Osservazzjonijiet
Ir-reazzjoni ta’ diclazuril jeħtieġ li tkun intweriet preċedentament bħala lineari tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet imkejla.
(G) DETERMINAZZJONI TA’ LASALOCID SODIUM
Melħ tas-sodju ta ’ polyether monocarboxylic acid prodott bi Streptomyces lasaliensis
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ lasalocid sodium fl-għalf u taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 5 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 10 mg/kg.
2. Prinċipju
Lasalocid sodium huwa estratt minn kampjun ta’ metanol aċidifikat u stabbilit mill-kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta’ ditettur spettrofluworimetriku.
3. Reaġenti
3.1. |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) |
3.2. |
Orthophosphoric acid, w (w/w) = 85 % |
3.3. |
Soluzzjoni ta’ orthophosphoric, c = 20 % Iddilwixxi 23,5 ml ta’ orthophosphoric acid (3.2) għal 100 ml ilma. |
3.4. |
6-Methyl-2-heptylamine (1,5-dimethylhexylamine), w (w/w) = 99 % |
3.5. |
Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.6. |
Aċidu idrokloriku, densità = 1,19 g/ml |
3.7. |
Soluzzjoni ta’ phosphate buffer, c = 0,01 mol/l Dewweb 1,36 g ta’ KH2PO4 (3.1) f’500 ml ta’ ilma (3.11), żid 3,5 ml ta’ orthophosphoric acid (3.2) u 10,0 ml ta’ 6-methyl-2-heptylamine (3.4). Aġġusta l-pH għal 4,0 b’soluzzjoni ta’ orthophosphoric acid (3.3) u ddilwa sa 1 000 ml bl-ilma (3.11). |
3.8. |
Metanol aċidifikat Ittrasferixxi 5,0 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.6) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka bil-metanol (3.5) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu. |
3.9. |
Fażi HPLC mobbli, soluzzjoni phosphate buffer-methanol 5 + 95 (V + V) Ħallat 5ml tas-soluzzjoni tal-phosphate buffer (3.7) ma’ 95 ml ta’ metanol (3.5). |
3.10. |
Sustanza standard tal-lasalocid sodium b’purità ggarantita, C34H53O8Na (melħ tas-sodju tal-aċidu polyether monocarboxylic prodott bi Streptomyces lasaliensis), E763 |
3.10.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg lasalocid sodium (3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’metanol aċidifikat (3.8), żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu. |
3.10.2. |
Iġbed b’pipetta 10,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.10.1) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu. |
3.10.3. |
F’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 50 ml ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedjarja (3.10.2). Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrespondu għal 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 μg lasalocid sodium għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski qabel l-użu. |
3.11. |
Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
4. Apparat
4.1. |
Banju ultrasoniku (jew banju tal-ilma li jiċċaqlaq) bil-kontroll tat-temperatura |
4.2. |
Filtri membrana, 0,45 μm. |
4.3. |
Tagħmir tal-HPLC b’sistema ta’ injezzjoni, adattat għall-injettar ta’ volumi ta’ 20 l. |
4.3.1. |
Kolonna għal kromatografija b’likwidi 125 mm x 4mm, b’fażi riversjata C18, ippakkjar ta’ 5 μm jew ekwivalenti |
4.3.2. |
Spettrofluworimetru b’aġġustament tal-wavelength varjabbli ta’ wavelengths ta’ eċċitazzjoni u ta’ emissjoni |
5. Proċedura
5.1. Ġenerali
5.1.1.
Biex isir l-eżami tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analizzat kampjun blank biex jiġi ivverifikat li la lasalocid sodium u lanqas sustanzi ta’ tfixkil ma jkunu preżenti. Il-kampjun blank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u m’għandux ikun hemm lasalocid sodium jew sustanzi tat-tfixkil.
5.1.2.
L-eżami tal-irkupru għandu jsir bl-analiżi tal-kampjun blank li kien ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ lasalocid sodium, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tal-istandard tal-istokk (3.10.1) f’kunjett koniku ta’ 250ml u evapora s-soluzzjoni għal madwar 0,5 ml. Żid 50 g tal-kampjun blank, ħawwad sew u ħalli għal 10 minuti filwaqt li tħallat għal bosta drabi qabel ma tkompli bil-pass tal-estrazzjoni (5.2).
Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ il-kampjun li għandu jkun analizzat jiġi msaħħaħ bi kwantità ta’ lasalocid sodium simili għal dik li diġà hemm preżenti fil-kampjun. Dan l-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.
5.2. Estrazzjoni
5.2.1.
Iżen sal-eqreb 0,01 g, minn 5 g sa 10 g tal-kampjun f’kunjett koniku ta’ 250 ml b’tapp. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) b’pipetta. Poġġi t-tapp b’mod laxk u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Ħallih joqgħod għal madwar siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2) f’reċipjent xieraq. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.2.2.
Iżen sal-eqreb 0,001 g madwar 2 g ta’ taħlit lest minn qabel mhux mitħun f’kunjett iggradat ta’ 250 ml. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett u l-kontenut f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat kollox sew. Ħallih joqgħod għal siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2). Żid volum xieraq tal-filtrat ċar b’metanol aċidifikat (3.8) biex tkun prodotta soluzzjoni finali tal-eżami li jkun fiha madwar 4 μg/ml ta’ lasalocid sodium. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.3. Determinazzjoni tal-HPLC
5.3.1.
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħra, sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:
Kolonna għal kromatografija b'likwidi (4.3.1.): |
125 mm × 4 mm, fażi riversjata C18, 5 μm ippakkjar, jew ekwivalenti |
Fażi mobbli (3.9): |
Taħlita ta’ soluzzjoni ta’ phosphate buffer (3.7) u metanol (3.5), 5 + 95 (V + V) |
Rata ta’ tnixxija: |
1,2 ml/min |
Wavelengths ta’ ditezzjoni: |
|
Eċċitazzjoni: |
310 nm |
Emissjoni: |
419 nm |
Volum tal-injezzjoni: |
20 μl |
Ivverifika l-istabbilta tas-sistema kromatografika, injetta s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10.3) li fiha 4,0 μgg/ml bosta drabi, sakemm jinkisbu l-ogħla livelli (jew erjas) u ħinijiet ta’ żamma kostanti.
5.3.2.
Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3) bosta drabi u stabbilixxi l-medja tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar billi tuża l-medji tal-ogħla livelli (meded) bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet li jikkorrispondu fi μg/ml bħala l-axxiżi.
5.3.3.
Injetta l-estratti tal-kampjun miksubin fi 5.2.1 jew 5.2.2 bosta drabi, uża l-istess volum kif meħud fis-soluzzjoni ta’ kalibrar u stabbilixxi l-medja tal-ogħla livelli (meded) tal-ogħla livelli tas-sodju lasaloċidu.
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-medja tal-ogħla livelli (meded) prodotti mill-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.3.3) stabbilixxi l-konċentrazzjoni ta’ lasalocid sodium (μg/ml) b’riferenza għall-graff ta’ kalibrar.
6.1. Għalf
Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
c |
= |
il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.1) fi μg/ml |
V1 |
= |
volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 f’ml (jiġifieri 100) |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
6.2. Taħlitiet lesti minn qabel
Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
c |
= |
il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.2) fi μg/ml |
V2 |
= |
il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 f’ml (jiġifieri 250) |
f |
= |
il-fattur ta’ dilwizzjoni skont 5.2.2 |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
Il-metodi bbażati fuq l-ispettrofluworometrija huma inqas soġġetti għal interferenza minn dawk li fihom tintuża d-ditezzjoni bl-UV. L-identità tal-analizzat tista’ tiġi ikkonfermata bil-ko-kromatografija.
7.1.1.
L-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3). L-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ lasalocid sodium li jinstab fl-estratt tal-kampjun. L-għoli tal-ogħla livell tal-lasalocid sodium biss għandu jittejjeb wara li jitqies l-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud u d-dilwizzjoni tal-estratt. L-akbar wisa’, f’nofs l-għoli, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-akbar wisa’ oriġinali prodott mill-estratt mhux imsaħħaħ tal-kampjun.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:
— |
15 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ lasalocid sodium minn 30 mg/kg sa 100 mg/kg; |
— |
15 mg/kg għall-kontenuti ta’ lasalocid sodium minn 100 mg/kg sa 200 mg/kg |
— |
7,5 % fir-rigward tal-ogħla valur għall-kontenuti ta’ lasalocid sodium ta’ aktar minn 200 mg/kg. |
7.3. Irkupru
Għall-kampjun (blank) imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-anqas 80 %. għall-kampjuni msaħħa ta’ taħlit lest minn qabel, l-irkupru għandu jkun ta’ mill-inqas 90 %.
8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv (*) li fih, 2 taħlitiet lesti minn qabel (kampjuni 1 u 2) u 5 kampjuni ta’ għalf (kampjuni 3 – 7) ġew analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:
|
Kampjun 1 Taħlita lesta minn qabel għat-tiġieġ |
Kampjun 2 Taħlita lesta minn qabel għad-dundjani |
Kampjun 3 Prietken għad-dundjani |
Kampjun 4 Frak għat-tiġieġ |
Kampjun 5 Għalf għad-dundjani |
Kampjun 6 Għalf għat-tjur A |
Kampjun 7 Għalf għat-tjur B |
L |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
n |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
Medja [mg/kg] |
5 050 |
16 200 |
76,5 |
78,4 |
92,9 |
48,3 |
32,6 |
sr [mg/kg] |
107 |
408 |
1,71 |
2,23 |
2,27 |
1,93 |
1,75 |
CVr [ %] |
2,12 |
2,52 |
2,24 |
2,84 |
2,44 |
4,00 |
5,37 |
sR [mg/kg] |
286 |
883 |
3,85 |
7,32 |
5,29 |
3,47 |
3,49 |
CVR [ %] |
5,66 |
5,45 |
5,03 |
9,34 |
5,69 |
7,18 |
10,70 |
Kontenut nominali [mg/kg] |
5 000 (**) |
16 000 (**) |
80 (**) |
105 (**) |
120 (**) |
50 (***) |
35 (***) |
L |
= |
numru ta’ laboratorji |
n |
= |
numru ta’ riżultati singoli |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
sR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % |
CVR |
= |
koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, % |
(1) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).
(2) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA)
(3) Jistgħu jintużaw metodi ta’ diġestjoni oħrajn diment li dawn ikunu wrew li jwasslu għal riżultati simili (bħad-diġestjoni permezz tal-pressa bil-micowave).
(4) Għalf aħdar (frisk jew imnixxef) jista’ jkun fih ammonti kbar ta’ silika tal-ħaxix, li tista’ żżomm fiha elementi ta’ traċċa u għandha titneħħa. Għal kampjuni ta’ dan l-għalf, għalhekk, għandha tiġi segwita l-proċedura modifikata segwenti. Wettaq operazjoni 5.1.1.1 sal-fażi tal-filtrazjoni. Aħsel il-karta tal-filtru, li jkun fiha r-residwu mhux maħlul, darbtejn b’ilma jagħli u poġġiha fi griġjol tal-kwarz jew tal-platinum. Ixgħel il-muffle furnace (4.1) b’temperatura taħt il-550 oC sakemm il-materjal faħmi kollu jkun sparixxa għal kollox. Ħallih jibred, żid ftit qtar ta’ ilma segwit b’10 sa 15 ml ta’ hydrofluoric acid (3.4) u evapora sakemm jinxef f’madwar 150 oC. Jekk tibqa’ xi silika fir-residwu, dewweb mill-ġdid fi ftit millilitri ta’ hydrofluoric acid (3.4) u evapora sakemm jixxotta. Żid ħames taqtiriet ta’ sulphuric acid (3.5) u saħħan sakemm ma jibqa’ l-ebda fwar abjad. Wara ż-żieda ta’ 5 ml ta’ 6 mol/litru hydrochloric acid (3.2) u madwar 30 ml ta’ ilma, saħħan, iffiltra s-soluzzjoni f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml u wassal sal-marka b’ilma (konċentrazzjoni ta’ HCI ta’ madwar 0,5 mol/l). Imbagħad ipproċedi bid-determinazzjoni minn punt 5.1.2.
(5) The Analyst 108, 1983, pp. 1252 sa 1256
(*) Analyst, 1995, 120, pp.2175-2180
(**) kontenut iddikjarat mill-manifattur.
(***) għalf ippreparat fil-laboratorju.
ANNESS V
METODI TA ANALIŻI BIEX JIĠU KKONTROLLATI S-SUSTANZI MHUX MIXTIEQA FL-GĦALF
(A) DETERMINAZZJONI TA' GOSSYPOL LIBERU U TOTALI
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-livelli ta' gossypol liberu, gossypol totali u sustanzi kimikament relatati fiż-żerriegħa tal-qoton, smida taż-żerriegħa tal-qoton u kejk ta' żerriegħa tal-qoton u f’għalf kompost li fih dawn il-materjali tal-għalf fejn huma preżenti aktar minn 20 mg/kg ta' gossypol liberu, gossypol totali u sustanzi kimikament relatati.
2. Prinċipju
Il-gossypol jiġi estratt fil-preżenza ta' 3-aminopropan-1-ol, jew b’taħlita ta' propan-2-ol u hexane, għall-istabbiliment ta' gossypol liberu, jew b’dimethylformamide, għall-istabbiliment tal-gossypol totali. Il-gossypol huwa kkonvertit bl-anilina f’gossypol-dianiline, li d-densità ottika tiegħu hija mkejla f’440 nm.
3. Reaġenti
3.1. |
Taħlita ta' propan-2-ol-hexane: ħallat 60 parti skont il-volum ta' propan-2-ol A. R. ma' 40 parti skont il-volum ta' n-hexane. |
3.2. |
Solvent A: F’kunjett iggradat ta' 1 l, qiegħed bejn wieħed u ieħor 500 ml ta' taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), 2 ml ta' 3-aminopropan-1-ol, 8 ml aċidu aċetiku inġazzat u 50 ml ilma. Żid sal-volum bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Dan ir-reaġent huwa stabbli għal ġimgħa. |
3.3. |
Solvent B: Iġbed b’pipetta 2 ml ta' 3-aminopropan-1-ol u 10 ml aċidu aċetiku inġazzat f’kunjett iggradat ta' 100 ml. Kessaħ għat-temperatura ambjentali u żid sal-volum b’N, N-dimethylformamide. Dan ir-reaġent huwa stabbli għal ġimgħa. |
3.4. |
Anilina: Jekk id-densità ottika fit-test blank tkun aktar minn 0,022, iddistilla l-anilina fuq trab taż-żingu, waqt li twarrab l-ewwel u l-aħħar 10 % tal-frazzjonijiet tad-distillat. Impoġġi fi friġġ u maħżun f’kunjett kannella, b’tapp tal-ħġieġ, dan ir-reaġent iżomm għal bosta xhur. |
3.5. |
Soluzzjoni A tal-gossypol standard: Poġġi 27,9 mg gossypol acetate f’kunjett iggradat ta' 250 ml. Dewweb u żid sal-volum bis-solvent A (3.2). Ippipetta 50 ml ta' din is-soluzzjoni f’kunjett iggradat ta' 250 ml u imla sal-marka bis-solvent A. Il-konċentrazzjoni ta' gossypol ta' din is-soluzzjoni hija 0,02 mg kull ml. Ħalliha toqgħod għal siegħa f’temperatura ambjentali qabel l-użu. |
3.6. |
Soluzzjoni B tal-gossypol standard: Poġġi 27,9 mg gossypol acetate f’kunjett iggradat ta' 50 ml. Dewweb u żid sal-volum bis-solvent B (3.3). Il-konċentrazzjoni ta' gossypol ta' din is-soluzzjoni hija 0,5 mg kull ml. Is-soluzzjonijiet ta' gossypol standard A u B jibqgħu stabbli għal 24 siegħa jekk ikunu protetti mid-dawl |
4. Apparat
4.1. |
Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 rpm. |
4.2. |
Spettrofotometru. |
5. Proċedura
5.1. Kampjun tat-test
L-ammont tal-kampjun tat-test jiddependi fuq il-kontenut preżunt ta' gossypol tal-kampjun. Huwa preferibbli li taħdem b’kampjun żgħir tat-test u ammont relattivament kbir ta' partijiet ta' alikwoti tal-filtrat, sabiex tikseb biżżejjed gossypol biex ikun jista’ jsir kejl fotometriku preċiż. għad-determinazzjoni ta' gossypol liberu fiż-żerriegħa tal-qoton, smida miż-żerriegħa tal-qoton u kejk ta' żerriegħa tal-qoton, il-kampjun tat-test m’għandux jaqbeż 1 g; għall-għalf kompost jista’ jkun sa 5g. Parti alikwota ta' 10 ml tal-filtrat hija adatta għall-parti ’l kbira tal-każijiet; għandu jkun fiha bejn 50 u 100 μg gossypol. għad-determinazzjoni tal-gossypol totali, il-kampjun tat-test għandu jkun ta' bejn 0,5 u 5 g, sabiex parti alikwota ta' 2 ml tal-filtrat ikun fiha bejn 40 u 200 μg gossypol.
L-analiżi għandha ssir f’temperatura ambjentali ta' madwar 20 oC.
5.2. Determinazzjoni ta' gossypol liberu
Poġġi l-kampjun tat-test f’kunjett ta' 250 ml bl-għonq bil-ħġieġ matt, bil-qiegħ tal-kunjett miksi bi ħġieġ imfarrak. Permezz ta' pipetta, żid 50 ml tas-solvent A (3.2), agħlaq il-kunjett u ħawwad għal siegħa fl-apparat tat-taħlit. Iffiltra minn filtru niexef u iġbor il-filtrat f’kunjett żgħir bl-għonq tal-ħġieġ matt. Matul il-filtrazzjoni għatti l-lembut b’watch glass.
Iġbed b’pipetta partijiet alikwotti identiċi li jkun fihom bejn 50 u 100 μg ta' gossypol f’kull wieħed minn żewġ kunjetti ggradati ta' 25 ml (A u B). Fejn meħtieġ żid sal-volum b’10 ml ta' solvent A (3.2). Imbagħad żid il-kontenuti tal-kunjett (A) sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1). Din is-soluzzjoni għandha tintuża bħala soluzzjoni ta' referenza li kontriha titkejjel is-soluzzjoni tal-kampjun.
Iġbed b’pipetta 10 ml tas-solvent A (3.2) f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti ggradati l-oħra ta' 25 ml (C u D). Żid il-kontenuti tal-kunjett (c) sal-volum bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Din is-soluzzjoni għandha tintuża bħala soluzzjoni ta' referenza li kontriha titkejjel is-soluzzjoni tat-test blank.
Żid 2 ml tal-anilina (3.4) f’kull wieħed mill-kunjetti (D) u (N). Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli biex tiżviluppa l-kulur. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita tal-propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa.
Stabbilixxi d-densità ottika tat-test blank tas-soluzzjoni (D) billi tqabbel mas-soluzzjoni ta' referenza (c), u d-densità ottika tal-kampjun tas-soluzzjoni (B) billi tqabbel is-soluzzjoni (A) ta' referenza, fl-ispettrometru f’440 nm bl-użu ta' ċelluli tal-ħġieġ ta' 1 cm.
Naqqas id-densità tas-soluzzjoni tal-kampjun blank minn dik tas-soluzzjoni tal-kampjun (= densità ottika korretta). Minn dan il-valur ikkalkula l-kontenut liberu ta' gossypol kif indikat f’6.
5.3. Determinazzjoni tal-gossypol totali
Qiegħed kampjun tat-test li jkun fih minn 1 sa 5 mg gossypol f’kunjett iggradat ta' 50 ml u żid 10 ml tas-solvent B (3.3). Fl-istess waqt, ipprepara test blank, billi tqiegħed 10 ml tas-solvent B (3.3) f’kunjett ieħor iggradat ta' 50 ml. Saħħan iż-żewġ kunjetti għal 30 minuta fuq banju bl-ilma jagħli. Kessaħ sat-temperatura ambjentali u żid il-kontenuti ta' kull kunjett sal-volum bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal bejn 10 u 15-il minuta, imbagħad iffiltra u iġbor il-filtrati fil-kunjetti bl-għonq matt.
Iġbed b’pipetta 2 ml tal-kampjun tal-filtrat f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti ggradati ta' 25 ml, u 2 ml tal-filtrat tat-test blank f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti l-oħra ta' 25 ml. Żid il-kontenuti tal-kunjett wieħed minn kull serje sa 25 ml bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jintużaw bħala s-soluzzjonijiet ta' referenza.
Żid 2 ml ta' anilina (3.4) f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti l-oħra. Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli biex tiżviluppa l-kulur. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid għal 25 ml bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa.
Iddetermina d-densità ottika kif indikat fil-5.2 għal gossypol liberu. Minn dan il-valur ikkalkula l-kontenut totali ta' gossypol kif indikat f'6.
6. Kalkolu tar-riżultati
Ir-riżultati jistgħu jiġu ikkalkulati jew mid-densità ottika speċifika (6.1) jew b’referenza għall-kurva ta' kalibrar (6.2).
6.1. Mid-densità ottika speċifika
Id-densitajiet ottiċi speċifiċi, taħt il-kundizzjonijiet deskritti, għandhom ikunu dawn li ġejjin:
Gossypol liberu: |
|
Gossypol totali: |
|
Il-kontenut liberu jew totali tal-gossypol tal-kampjun huwa kalkulat bl-użu tal-formula segwenti:
fejn:
E |
= |
id-densità ottika korretta, kif indikat fil-5.2; |
p |
= |
il-kampjun tat-test fi g; |
a |
= |
il-parti alikwota tal-filtrat f’ml. |
6.2. Mill-kurva ta' kalibrar
6.2.1.
Ipprepara 2 serje ta' ħames kunjetti ggradati ta' 25 ml. Iġbed b’pipetta alikwotti ta' 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 u 10,0 ml ta' soluzzjoni A ta' gossypol standard (3.5) f’kull waħda mis-serje ta' kunjetti. Żid sal-volumi b’10 ml tas-solvent A (3.2). Qabbel kull serje ma' kunjett iggradat ta' 25 ml li jkun fih biss 10 ml tas-solvent A (3.2) (test blank).
Żid il-volum tal-kunjetti tal-ewwel serje (inkluż il-kunjett tat-test blank) sa 25 ml bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1) (serje ta' referenza).
Żid 2 ml anilina (3.4) f’kull kunjett tat-tieni serje (inkluż il-kunjett għat-test blank). Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli biex tiżviluppa l-kulur. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa (serje standard).
Kif indikat f’5.2, iddetermina d-densità ottika tas-soluzzjonjiet fis-serje standard billi tqabbel mas-soluzzjonijiet li jikkorrispondu fis-serje ta' referenza. Niżżel il-kurva ottika billi tevalwa d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet ta' gossypol (f/μg).
6.2.2.
Ipprepara sitt kunjetti ggradati ta' 50 ml. Fl-ewwel kunjett qiegħed 10 ml tas-solvent B (3.3), u fl-oħrajn 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 u 10,0 ml ta' soluzzjoni B standard ta' gossypol (3.6) rispettivament. Żid il-kontenut ta' kull kunjett sa 10 ml bis-solvent B (3.3). Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1) u omoġenizza.
Qiegħed 2,0. ml ta' dawn is-soluzzjonijiet f’kull wieħed miż-żewġ serje ta' kunjetti ggradati ta' 25 ml. Żid il-kontenuti tal-fliexken fl-ewwel serje sa 25 ml bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1) (serje ta' referenza).
Żid 2 ml anilina (3.4) f’kull kunjett tat-tieni serje. Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa (serje standard).
Kif indikat f’5.2, iddetermina d-densità ottika tas-soluzzjonjiet fis-serje standard billi tqabbel mas-soluzzjonijiet li jikkorrispondu fis-serje ta' referenza. Niżżel il-kurva ottika billi tevalwa d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet ta' gossypol (f/μg).
6.3. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:
— |
15 %, f’valur relattiv għall-ogħla valur, għall-kontenuti ta' gossypol inqas minn 500 ppm; |
— |
75 ppm, f’valur assolut, għall-kontenuti ta' mhux inqas minn 500 ppm u mhux aktar minn 750 ppm; |
— |
10 %, f’valur relattiv għall-ogħla valur, għal kontenuti ta' aktar minn 750 ppm. |
(B) DETERMINAZZJONI TAL-LIVELLI TA' DIOXINS (PCDD/PCDF) U TA' PCBs SIMILI GĦAD-DIOXIN
I. METODI TA' TEĦID TA' KAMPJUNI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI ANALITIĊI
1. Għan u skop
Il-kampjuni intenzjonati għall-kontroll uffiċjali tal-livelli ta' kontenut ta' dioxins (polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD/) u polychlorinated dibenzofurans (PCDF)) u dioxin -like polychlorinated biphenyls (PCBs) (1) fl-għalf, għandhom jittieħdu skont id-dispożizzjonijiet tal-Anness I. Ir-rekwiżiti kwantitattivi fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti distribwiti b’mod uniformi matul l-għalf kif hemm ipprovdut għalihom fil-punt 5.A. tal-Anness I jeħtieġu jiġu applikati. Kampjuni aggregati li jkunu nkisbu għandhom jiġu kkunsidrati bħala rappreżentattivi tal-materjal li minnu jkunu ttieħdu. għandha tiġi stabbilita konformità mal-livelli massimi stabbiliti fid-Direttiva 2002/32/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (2) fuq bażi tal-livelli ddeterminati fil-kampjuni tal-laboratorju.
2. Konformità tal-lott jew is-sublott mal-ispeċifikazzjoni
Il-lott huwa aċċettat jekk ir-riżultat analitiku ta' analiżi waħdanija ma jaqbiżx il-livell massimu rispettiv kif stabbilit fid-Direttiva 2002/32/KE filwaqt li tiġi kkunsidrata l-inċertezza tal-kejl.
Il-lott mhux konformi mal-livell massimu kif stabbilit fid-Direttiva 2002/32/KE, jekk ir-riżultat analitiku upperbound (3) ikkonfermat minn analiżi duplikata (4), jaqbeż il-livell massimu mingħajr l-ebda dubju, filwaqt li tiġi kkunsidrata l-inċertezza tal-kejl.
L-inċertezza tal-kejl tista’ tiġi kkunsidrata skont wieħed minn dawn l-approċċi:
— |
billi tiġi kkalkulata l-inċertezza estiża, jintuża fattur ta' kopertura ta' 2 li jagħti livell ta' fiduċja ta' bejn wieħed u ieħor 95 %. Lott ma jkunx konformi jekk il-valur imkejjel nieqes U huwa ogħla mill-livell massimu. F’każ li ssir determinazzjoni separata ta' dioxins u PCBs simili għad-dioxins, is-somma tal-inċertezza estiża stmata tar-riżultati analitiċi separati tad-dioxins u tal-PCBs simili għad-dioxins trid tintuża għas-somma ta' dioxins u PCBs simili għad-dioxins. |
— |
billi jiġi stabbilit il-limitu ta' deċiżjoni (CCα) skont id-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 2002/657/KE (5) (punt 3.1.2.5. tal-Anness – il-każ ta' sustanzi b’livell permess stabbilit). Lott ma jkunx konformi jekk il-valur imkejjel huwa ugwali jew aktar minn CCα |
Ir-regoli ta' interpretazzjoni preżenti japplikaw għar-riżultat analitiku miksub fuq il-kampjun għall-kontroll uffiċjali. Dawn ma jaffettwawx id-dritt tal-Istati Membri li japplikaw regoli nazzjonali għal analiżi għal finijiet ta' difiża jew referenza.
II. PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUNI U REKWIŻITI gĦALL-METODI TA' ANALIŻI UŻATI FIL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-LIVELLI TA' DIOXINS (PCDD/PCDF) U TA' PCBs SIMILI GĦAD-DIOXINS
1. Skop u qasam tal-applikazzjoni
Dawn ir-rekwiżiti għandhom jiġu applikati fejn materjal li minnu jsir l-għalf u għalf huma analizzati għad-determinazzjoni tad-dioxins (polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD) u polychlorinated dibenzofurans (PCDF)) u polychlorinated biphenyls (PCBs) simili għad-dioxins.
Il-monitoraġġ għall-preżenza ta' dioxins fl-għalf jista’ jsir permezz ta' strateġija li tinvolvi metodu ta' skrinjar sabiex jintgħażlu kampjuni b’livelli ta' dioxin u PCBs simili għad-dioxins li huma inqas minn 25 % taħt jew li jaqbżu l-livell ta' interess. Il-konċentrazzjoni ta' dioxins f’dawk il-kampjuni b’livelli sinifikanti teħtieġ tkun stabbilita/ikkonfermata b’metodu konfermatorju.
Metodi ta' skrinjar huma metodi użati sabiex isibu l-preżenza ta' dioxins u PCBs simili għad-dioxins fil-livell ta' interess. Dawn il-metodi jesgħu kampjun kbir għal waqt il-metodu kollu u jintużaw biex jagħrblu numru kbir ta' kampjuni għal pożittivi potenzjali. Huma magħmulin speċifikament biex jevitaw negattivi foloz.
Metodi konfermatorji huma metodi li jipprovdu informazzjoni sħiħa jew kumplimentarja li tippermetti lid-dioxins u lill-PCBs simili għad-dioxins jiġu identifikati u kkwantifikati mingħajr żball fil-livell ta' interess.
2. Sfond
Minħabba li kampjuni ambjentali u bioloġiċi (li jinkludu kampjuni ta' materjal li minnu jsir l-għalf u għalf) in ġenerali fihom taħlitiet kumplessi ta' dioxin congeners differenti, il-kunċett ta' Fatturi ta' Ekwivalenza Tossika (TEFs) ġie żviluppat sabiex tiġi ffaċilitata l-valutazzjoni tar-riskji. Dawn it-TEFs ġew stabbiliti sabiex jesprimu konċentrazzjonijiet ta' taħlitiet ta' PCDDs u PCDFs tat-tip 2,3,7,8 u xi PCBs sostitwiti bil-chlorine non-ortho u mono-ortho li fihom attività simili għad-dioxin f’ekwivalenti tossiċi (TEQs) tat-TCDD 2,3,7,8. Il-konċentrazzjonijiet ta' sustanzi individwali f’kampjun huma mmultiplikati bit-TEF rispettiv tagħhom u sussegwentament miġbura biex jagħtu konċentrazzjoni totali ta' komponenti simili għad-dioxin imfissra f’TEQs.
Għall-fini ta' dan ir-Regolament biss, il-limitu speċifiku ta' kwantifikazzjoni aċċettat ta' congener individwali huwa l-konċentrazzjoni ta' analit fl-estratt ta' kampjun li jipproduċi rispons strumentali f’żewġ jonji differenti li għandhom jiġu mmonitorjati b’porzjon S/N (sinjal/ħoss) ta' 3:1 għas-sinjal inqas sensittiv u s-sodisfazzjon tar-rekwiżiti bażiċi bħal pereżempju ħin ta' żamma u proporzjon ta' isotope skont il-proċedura ta' determinazzjoni kif deskritta fil-metodu EPA 1613, reviżjoni B.
3. Rekwiżiti ta' assigurazzjoni tal-kwalità li jridu jiġu osservati għall-preparazzjoni tal-kampjuni
Id-dispożizzjonijiet ġenerali fuq il-preparazzjoni tal-kampjuni għall-analiżi hekk kif stabbilit fl-Anness II huma applikabbli.
Barra minn hekk għandhom jiġu applikati r-rekwiżiti li ġejjin:
— |
Il-kampjuni għandhom jinħażnu u jiġu ttrasportati f’kontenituri tal-ħġieġ, aluminju, polypropylene jew polyethylene. Traċċi ta' trab tal-karti jridu jitneħħew mill-kontenitur tal-kampjuni. Kontenituri tal-ħġieġ għandhom jinħaslu b’likwidi li qabel ikunu ġew ikkontrollati għall-preżenza ta' dioxins. |
— |
Wettaq analiżi blank billi ssir il-proċedura analitika kollha filwaqt li jitħalla barra l-kampjun biss. |
— |
Il-piż tal-kampjun użat għall-estrazzjoni għandu jkun biżżejjed sabiex jissodisfa r-rekwiżiti f’dak li għandu x’jaqsam mas-sensittività. |
4. Rekwiżiti għal-laboratorji
— |
Il-laboratorji għandhom juru l-prestazzjoni ta' metodu fil-medda tal-livell ta' interess, pereżempju, 0,5x, 1x u 2x il-livell ta' interess b’koeffiċjent aċċettabbli ta' varjazzjoni għal analiżi ripetuta. għad-dettaliji tal-kriterji ta' aċċetazzjoni, ara punt 5. |
— |
Il-limitu ta' kwantifikazzjoni għall-metodu konfermatorju għandu jkun fil-grad ta' madwar wieħed minn ħamsa tal-livell ta' interess, sabiex jiġi żgurat li koeffiċjenti aċċettabbli tal-varjazzjonijiet jiġu ssodisfati fil-grad tal-livell ta' interess. |
— |
Bħala miżuri interni ta' kontroll ta' kwalità, għandhom jitwettqu kontrolli blank regolari u esperimenti jew analiżi spiking ta' kontroll tal-kampjuni (preferibbilment, jekk ikun hemm, materjal iċċertifikat ta' referenza). |
— |
Parteċipazzjoni b’suċċess fi studji interlaboratorji li jivvalutaw il-progress ta' suċċess tal-laboratorji hija l-aħjar mod ta' kif tista’ tingħata prova tal-kompetenza f’analiżi speċifika. Madankollu parteċipazzjoni ta' suċċess fi studji interlaboratorji għal, pereżempju, kampjuni ta' ħamrija jew drenaġġ mhux bilfors tagħti prova wkoll tal-kompetenza fil-qasam tal-kampjuni tal-għalf, li jippreżentaw livelli ta' kontaminazzjoni iktar baxxi. għaldaqstant, il-parteċipazzjoni kontinwa fi studji interlaboratorji għad-determinazzjoni tad-dioxins u PCBs simili għad-dioxins fil-matriċijiet tal-ikel relevanti hija mandatorja. |
— |
Il-laboratorji għandhom jiġu akkreditati minn entità rikonoxxuta skont il-Gwida 58 ISO sabiex jiġi żgurat li dawn ikunu qed japplikaw assigurazzjoni analitika ta' kwalità. Il-laboratorji għandhom jiġu akkreditati skont l-istandard ISO/IEC/17025. |
5. Rekwiżiti għall-proċeduri analitiċi għad-dioxins u PCBs simili għad- dioxins.
Rekwiżiti bażiċi għall-aċċettazzjoni tal-proċeduri analitiċi:
— |
Sensittività għolja u limiti baxxi ta' ditezzjoni. għall-PCDDs u PCDFs, kwantitajiet li jistgħu jiġu rilevati għandhom ikunu fil-medda tal-piktogramma TEQ (10 -12 g) minħabba t-tossiċità estrema ta' uħud minn dawn il-komponenti. Il-PCBs huma magħrufin li jsiru f’livelli ogħla mill-PCDDs u l-PCDFs. għal ħafna mill-congeners PCB, is-sensittività fil-grad nanogramm (10 -9 g) hija diġà biżżejjed. Madankollu, għall-kejl tal-iktar congeners tossiċi PCB simili għad-dioxin (b’mod partikolari congeners sostitwiti non-ortho), trid tintlaħaq l-istess sensittività bħalma tintlaħaq għall-PCDDs u l-PCDFs. |
— |
Għażla għolja (speċifiċità). Hija meħtieġa distinzjoni għall-PCDDs, PCDFs, u PCBs simili għad-dioxins minn ħafna komponenti preżenti, koestratti u komposti oħrajn li possibbilment jinterferixxu preżenti f’konċentrazzjonijiet għoljin sa bosta ordnijiet ta' magnitudni ogħla minn dawk tal-analiti ta' interess. għall-metodi ta' spettrometrija ta' kromatografija/massa tal-gass (GC/MS) jeħtieġ li ssir differenzazzjoni fost congeners varji, bħal pereżempju bejn tossiċi (eż. is-sbatax-il PCDDs u PCDFs 2,3,7,8-sostitwiti u PCBs simili għad-dioxins) u congeners oħra. Bioassays għandhom ikunu kapaċi jiddeterminaw valuri TEQ b’mod selettiv bħala s-somma ta' PCDDs, PCDFs, u PCBs simili għad-dioxins. |
— |
Preċiżjoni għolja (verità u preċiżjoni). Id-determinazzjoni għandha tipprovdi stima valida u affidabbli ta' konċentrazzjoni awtentika f’kampjun. Preċiżjoni għolja (preċiżjoni tal-kejl: il-qrubija tal-ftehim bejn ir-riżultat ta' kejl mal-valur awtentiku jew assenjat tal-qies) hija neċessarja biex jiġi evitat rifjut tar-riżultat ta' analiżi ta' kampjun fuq bażi ta' affidabbiltà batuta tal-istima tat-TEQ. Il-preċiżjoni hija espressa bħala l-verità (differenza bejn il-valur medju mkejjel għal analit f’materjal ċertifikat u l-valur ċertifikat tiegħu, imfisser bħala perċentwal ta' dan il-valur) u preċiżjoni (devjazzjoni standard fir-rigward ta' RSDR, ikkalkulata minn riżultati ġġenerati taħt kundizzjonijiet ta' riproduċibilità). |
Metodi ta' skrinjar jistgħu jikkompromettu bioassaġġi u metodi gC/MS; metodi konfermatorji huma metodi ta' kromatografija bil-gass b’riżoluzzjoni għolja/spettrometrija tal-massa b’riżoluzzjoni għolja (HRGC/HRMS).
Il-kriterji li ġejjin għandhom jiġu ssodisfati fuq il-valur TEQ totali:
|
Metodi ta' skrinjar |
Metodi konfermatorji |
Rata negattiva falza |
< 1 % |
|
Verità |
|
- 20 % sa + 20 % |
Preċiżjoni RSDR |
< 30 % |
< 15 % |
6. Rekwiżiti speċifiċi għal metodi gc/ms li għandhom jiġu ssodisfati għal raġunijiet konfermatorji u ta' skrinjar.
— |
Żieda ta' standards PCDD/F interni sostituti b’2,3,7,8-chlorine ittikkettjati 13C u ta' standards interni PCB li jixbħu d-dioxins ittikkettjati 13C għandha ssir fil-bidu nett tal-metodu analitiku, pereżempju, qabel l-estrazzjoni sabiex il-proċedura analitika tkun ivvalidata. għandu jiżdied mill-inqas congener wieħed għal kull wieħed mill-grupp tetra sal-grupp octa-chlorinated omologi għal PCDD/F u mill-inqas congener wieħed għal kull grupp omologu għal PCBs li jixbħu d-dioxins (inkella, mill-inqas congener wieħed għal kull mass spectrometric selected ion recording function użata għall-kontroll ta' PCDD/F u PCBs li jixbħu d-dioxins). għandu jkun hemm preferenza ċara, ċertament fil-każ ta' metodi konfermatorji, fl-użu tas-17-il standard intern għal PCDD/F 13C-labelled 2,3,7,8-substituted kollha u ta' 12-il standards interni għal PCBs 13CC-labelled interni li jixbħu d-dioxins kollha. |
— |
Fatturi relattivi ta' rispons għandhom jiġu ddeterminati wkoll għal dawk il-congeners li għalihom l-ebda analogu 13C-labelled m’huwa miżjud permezz ta' soluzzjonijiet ta' kalibrar xierqa. |
— |
Għall-għalf li joriġina mill-pjanti u għalf li joriġina mill-annimali li fih inqas minn 10 % xaħam, iż-żieda ta' standards interni hija mandatorja qabel l-estrazzjoni. għall-għalf li joriġina mill-annimali u li fih iktar minn 10 % xaħam, l-istandards interni jistgħu jiżdiedu jew qabel l-estrazzjoni jew wara l-estrazzjoni tax-xaħam. Validazzjoni xierqa tal-effikaċja tal-estrazzjoni għandha titwettaq, skont l-istadju li fih standards interni jiġu introdotti u fuq jekk ir-riżultati humiex rrappurtati fuq bażi ta' prodott jew ta' xaħam. |
— |
Qabel l-analiżi gC/MS, għandu jiżdied standard 1 jew 2 (mhux diretti) ta' rkupru. |
— |
Kontroll tal-irkupru huwa neċessarju. għal metodi konfermatorji, l-irkupru tal-istandards interni individwali għandhom ikunu fil-grad ta' 60 % sa 120 %. Irkupri ogħla jew iktar baxxi għal congeners individwali, b’mod partikolari għal xi hepta- u octa- chlorinated dibenzodioxins u dibenzofurans, huma aċċettabbli bil-kundizzjoni li l-kontribuzzjoni tagħhom għall-valur TEQ ma taqbiżx l-10 % tal-valur totali TEQ (abbażi tat-total ta' PCDD/F u PCBs li jixbħu d-dioxins biss). għal metodi ta' skrinjar, l-irkupri għandhom ikunu fil-medda ta' 30 % sa 140 %. |
— |
Separazzjoni ta' dioxins minn komponenti klorinati li jinterferixxu bħal PCBs li mhumiex simili għal dioxins u chlorinated diphenyl ethers għandha ssir b’tekniki kromatografiċi adattati (preferebbilment bi florisil, alumina u/jew kolonna tal-karbonju). |
— |
Separazzjoni gaskromatografika ta' isomeri għandha tkun biżżejjed (< 25 % ogħla livell ma' ogħla livell bejn 1,2,3,4,7,8-HxCDF u 1,2,3,6,7,8-HxCDF). |
— |
Għandha titwettaq determinazzjoni skont il-Metodu tal-EPA 1613 reviżjoni B: Tetra- permezz ta' dioxins octa-chlorinated u furans b’HRGC/HRMS b’dilwizzjoni ta' isotipi jew kriterji ta' prestazzjoni ekwivalenti. |
— |
Id-differenza bejn il-livell ta' fuq u l-livell t’isfel m’għandhiex taqbeż l-20 % għal għalf b’kontaminazzjoni ta' dioxins fil-medda jew ogħla mil-livell massimu. għal għalf b’livelli ta' kontaminazzjoni taħt sewwa il-livell massimu, id-differenza tista’ tkun fil-medda ta' 25 % sa 40 %. |
7. Metodi ta' analiżi ta' skrinjar
7.1. Introduzzjoni
Approċċi analitiċi differenti jistgħu jsiru permezz ta' metodu ta' skrinjar: approċċ pur ta' skrinjar u approċċ kwantitattiv.
Ir-rispons tal-kampjuni huwa mqabbel ma' dak ta' kampjun ta' referenza fil-livell ta' interess. Kampjuni b’rispons inqas mir-referenza huma ddikjarati negattivi, dawk li għandhom rispons ogħla huma meqjusin bħala pożittivi. Rekwiżiti:
— |
Kampjun(i) blank u ieħor(oħrajn) ta' referenza għandhom jiġu inklużi f’kull serje ta' test, li jiġi estratt u ttestjat fl-istess ħin taħt kundizzjonijiet identiċi. Il-kampjun ta' referenza għandu juri rispons elevat b’mod ċar meta mqabbel ma' wieħed blank. |
— |
Kampjuni ta' referenza addizzjonali f’livell ta' interess ta' 0,5x u 2x għandhom jiġu inklużi sabiex juru li t-test ikun sar kif suppost fil-medda ta' interess għall-kontroll tal-livell ta' interess. |
— |
Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati matriċi oħrajn, għandha tintwera l-adegwatezza tal-kampjun(i) ta' referenza, preferebbilment billi jiġu inklużi kampjuni murija b’HRGC/HRMS li fihom livell ta' TEQ li jkun bejn wieħed u ieħor daqs dak tal-kampjun ta' referenza jew inkella daqs kampjun blank f’dan il-livell. |
— |
Ladarba l-ebda standard intern ma jista’ jintuża f’bioassaġġi, testijiet fuq ir-ripetibbiltà huma importanti ħafna sabiex tinkiseb informazzjoni dwar id-devjazzjoni standard fi ħdan serje waħda ta' testijiet. Il-koeffiċjent ta' varjazzjoni għandu jkun taħt it-30 %. |
— |
Għal bioassaġġi, il-komponenti fil-mira, l-interferenzi possibbli, u l-livelli massimi tollerabbli tal-blank għandhom ikunu definiti. |
L-approċċ kwantitattiv jirrikjedi serje standard ta' dilwizzjoni, tindif doppju jew tripplu u kejl kif ukoll kontrolli tal-blank u tal-irkupru. Ir-riżultat jista’ jiġi mfisser bħala TEQ, u b’hekk jiġi assunt li l-komposti responsabbli għas-sinjal jikkorrispondu għall-prinċipju TEQ. Dan jista’ jsir billi jintuża TCDD (jew taħlita standard ta' dioxin/furan/PCB simili għal dioxin) biex tipproduċi kurva ta' kalibrar sabiex tikkalkula l-livell ta' TEQ fl-estratt u b’hekk fil-kampjun. Dan huwa sussegwentament ikkoreġut għal-livell ta' TEQ ikkalkulat għal kampjun blank (biex isir tajjeb għall-impuritajiet minn likwidi u kimiċi użati), u rkupru (ikkalkulat mil-livell TEQ f’kampjun ta' kontroll ta' kwalità fil-limitu ta' interess). Huwa essenzjali li wieħed jinnota li parti mit-telf apparenti tal-irkupru jista’ jkun dovut għal effetti matriċi u/jew differenzi bejn il-valuri TEF fil-bioassaġġi u l-valuri TEF uffiċjali stabbiliti mill-WHO.
7.2. Rekwiżiti għall-metodi ta' analiżi użati għall-iskrinjar.
— |
Metodi ta' analiżi gC/MS u bioassaġġi jistgħu jintużaw għall-iskrinjar. għall-metodi gC/MS, għandhom jintużaw ir-rekwiżiti stabbiliti f’punt 6. għall-bioassaġi ibbażati fuq ċelloli, rekwiżiti speċifiċi huma stabbiliti f’punt 7.3 u għall-bioassaġġi ibbażati fuq kit f’punt 7.4 |
— |
Informazzjoni fuq in-numru ta' riżultati foloz-pożittivi u foloz-negattivi ta' sett kbir ta' kampjuni taħt u fuq il-livell massimu jew livell ta' azzjoni hija neċessarja, meta mqabbla mal-kontenut TEQ kif stabbilit b’metodu ta' analiżi konfermatorja. Rati negattivi foloz attwali għandhom ikunu taħt 1 %. Ir-rata ta' kampjuni pożittivi foloz għandha tkun baxxa biżżejjed biex tagħmel l-użu ta' għodda ta' skrinjar ħaġa vantaġġjuża. |
— |
Riżultati pożittivi għandhom jiġu kkonfermati dejjem b’metodu ta' analiżi konfermatorju (HRGC/HRMS). Barra minn hekk, kampjuni minn medda wiesgħa ta' TEQ għandhom jiġu konfermati minn HRGC/HRMS (bejn wieħed u ieħor 2 % sa 10 % tal-kampjuni negattivi). Informazzjoni fuq il-korrispondenza bejn ir-riżultati ta' bioassaġġi u ta' HRGC/HRMS għandha tkun disponibbli. |
7.3. Rekwiżiti speċifiċi għal bioassaġġi ibbażati fuq ċelluli
— |
Meta jkun qiegħed isir bioassaġġ, kull test ta' prova jeħtieġ serje ta' konċentrazzjoni referenza ta' TCDD jew ta' taħlita ta' dioxin/furan (kurva ta' doża sħiħ-rispons b’R2 > 0,95). Madankollu, għal raġunijiet ta' skrinjar, tista’ tintuża kurva estiża ta' livell baxx għall-analiżi ta' kampjuni ta' livell baxx. |
— |
Għandha tintuża konċentrazzjoni ta' referenza ta' TCDD (xi 3 darbiet il-limitu ta' kwantifikazzjoni) fuq karta ta' kontroll ta' kwalità għar-riżultat tal-bioassaġġ fuq perjodu ta' żmien kostanti. Alternattiva tista’ tkun ir-rispons relattiv ta' kampjun referenza meta mqabbel ma' linja ta' kalibrar ta' TCDD minħabba li r-rispons taċ-ċelluli jista’ jiddependi fuq ħafna fatturi. |
— |
Ċarts tal-kontroll tal-kwalità (QC) għal kull tip ta' materjal ta' referenza għandhom jiġu rrekordjati u ċċekkjati sabiex jiġi żgurat li r-riżultat ikun jaqbel mal-linji gwida ddikjarati. |
— |
B’mod partikolari għal kalkoli kwantitattivi, l-induzzjoni tad-dilwizzjoni tal-kampjun użata għandha tkun fi ħdan il-porzjon lineari tal-kurva ta' rispons. Kampjuni ’l fuq mill-porzjon lineari tal-kurva ta' rispons għandhom jiġu dilwiti u ttestjati mill-ġdid. għaldaqstant, hu rrakkomandat li jiġu ttestjati mill-inqas 3 dilwizzjonijiet jew iktar f’ħin wieħed. |
— |
Il-perċentwali tad-devjazzjoni standard m’għandux jaqbeż il-15 % f’determinazzjoni triplikata għal kull dilwizzjoni tal-kampjuni u mhux aktar minn 30 % bejn tliet esperimenti indipendenti. |
— |
Il-limitu ta' ditezzjoni jista’ jiġi ssettjat bħala 3 darbiet id-devjazzjoni standard tal-likwidu blank jew tar-rispons tal-isfond. Approċċ ieħor huwa li jiġi applikat rispons li jkun ogħla mill-isfond (fattur ta' induzzjoni 5 darbiet iktar mil-likwidu blank) ikkalkulat mill-kurva tal-kalibrar tal-ġurnata. Il-limitu ta' kwantifikazzjoni jista’ jiġi ssettjat bħala 5 sa 6 darbiet id-devjazzjoni standard tas-solvent blank jew tar-rispons tal-isfond jew biex jiġi applikat rispons li jkun b’mod ċar ogħla mill-isfond (fattur ta' induzzjoni 10 darbiet iktar mis-solvent blank) ikkalkulat mill-kurva tal-kalibrar tal-ġurnata. |
7.4. Rekwiżiti speċifiċi għal bioassaġġi ibbażati fuq kit
— |
Għandu jiġi assigurat li l-bioassaġġi ibbażati fuq kitt għandhom sensittivita u affidabilità biżżejjed sabiex ikunu applikati għall-għalf. |
— |
Struzzjonijiet tal-manifattur għall-preparazzjoni u għall-analiżi tal-kampjuni għandhom jiġu segwiti. |
— |
Kits ta' testijiet m’għandhomx jintużaw wara d-data ta' skadenza. |
— |
Materjali jew komponenti mfasslin għall-użu ma' kits oħrajn m’għandhomx jintużaw. |
— |
Kits ta' testijiet għandhom jinżammu fi ħdan il-medda speċifikata tat-temperatura ta' ħżin u għandhom jintużaw fit-temperatura speċifikata ta' tħaddim. |
— |
Il-limitu ta' kxif għal immunoassaġġi huwa stabbilit bħala t-total tal-medja u 3 darbiet daqs id-devjazzjoni standard, abbażi ta' 10 analiżi replika tal-blank; li għandhom jitqassmu skont il-valur tal-pendil tal-ekwazzjoni ta' rigressjoni lineari. |
— |
Standards ta' referenza għandhom jintużaw għal testijiet fil-laboratorju sabiex jiġi żgurat li r-rispons għall-istandard huwa fi ħdan medda aċċettabbli. |
8. Rapport tar-Riżultati
Sakemm il-proċedura analitika tagħmilha possibbli, ir-riżultati analitiċi għandu jkollhom il-livelli tal-PCDD/F u PCB congeners individwali u r-riżultati analitiċi għandhom jiġu rrappurtati bħala lowerbound, upperbound u mediumbound sabiex jinkludu massimu ta' informazzjoni fir-rapport tar-riżultati u b’hekk tħalli lill-interpretazzjoni tar-riżultati skont ir-rekwiżiti speċifiċi.
Ir-rapport għandu jinkludi wkoll il-kontenut lipidu tal-kampjun kif ukoll il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-lipidu.
L-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu disponibbli f’każ li r-recoveries qegħdin ‘il barra mill-grad imsemmi f’punt 6, f’każ li l-livell massimu jiġi maqbuż u f’każijiet oħra jkun kif mitlub.
Billi l-inċertezza tal-istrument trid tiġi kkunsidrata meta tittieħed deċiżjoni dwar il-konformita ta' kampjun, dan il-parametru għandu jkun disponibbli wkoll. għalhekk, ir-riżultati analitiċi għandhom ikunu rrappurtati bħala x +/- U fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl estiża bl-użu ta' fattur ta' kopertura ta' 2 li jagħti livell ta' kunfidenza ta' bejn wieħed u ieħor 95 %. F’każ li ssir determinazzjoni separata ta' dioxins u PCBs simili għad-dioxins, is-somma tal-inċertezza estiża stmata tar-riżultati analitiċi separati tad-dioxins u tal-PCBs simili għad-dioxins trid tintuża għas-somma ta' dioxins u PCBs simili għad-dioxins.
Jekk l-inċertezza tal-kejl tiġi kkunsidrata bl-applikazzjoni ta' CCα (kif deskritta f’I. 2 ta' din il-Parti B) dan il-parametru jrid jiġi rrappurtat.
(1) Tabella ta’ TEF (= fatturi tossiċi ekwivalenti) għal dioxins, furans u PCBs tat-tip dioxin.
Congener |
Valur TEF |
Congener |
Valur TEF |
Dibenzo-p-dioxins (“PCDDs”) |
|
PCBs simili għal Dioxins: |
|
2,3,7,8-TCDD |
1 |
|
|
1,2,3,7,8-PeCDD |
1 |
PCBs non-ortho |
|
1,2,3,4,7,8-HxCDD |
0,1 |
PCB 77 |
0,0001 |
1,2,3,6,7,8-HxCDD |
0,1 |
PCB 81 |
0,0001 |
1,2,3,7,8,9-HxCDD |
0,1 |
PCB 126 |
0,1 |
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD |
0,01 |
PCB 169 |
0,01 |
OCDD |
0,0001 |
PCBs mono-ortho |
|
|
|
PCB 105 |
0,0001 |
Dibenzofurans (“PCDFs”) |
|
PCB 114 |
0,0005 |
2,3,7,8-TCDF |
0,1 |
PCB 118 |
0,0001 |
1,2,3,7,8-PeCDF |
0,05 |
PCB 123 |
0,0001 |
2,3,4,7,8-PeCDF |
0,5 |
PCB 156 |
0,0005 |
1,2,3,4,7,8-HxCDF |
0,1 |
PCB 157 |
0,0005 |
1,2,3,6,7,8-HxCDF |
0,1 |
PCB 167 |
0,00001 |
1,2,3,7,8,9-HxCDF |
0,1 |
PCB 189 |
0,0001 |
2,3,4,6,7,8-HxCDF |
0,1 |
|
|
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF |
0,01 |
|
|
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF |
0,01 |
|
|
OCDF |
0,0001 |
|
|
Taqsiriet użati: “T” = tetra; “Pe” = penta; “Hx” = hexa; “Hp” = hepta; “O” = octa; “CDD” = chlorodibenzo-p-dioxin; “CDF” = chlorodibenzofuran; “CB” = chlorobiphenyl. |
(2) ĠU L 140, 30.5.2002, p. 10.
(3) Il-kunċett ta’ “upperbound” jirrikjedi li jintuża l-limitu ta’ kwantifikazzjoni għall-kontribuzzjoni ta’ kull congener mhux kwantifikat għall-Ekwivalent Tossiku (TEQ).
Il-kunċett ta’ “lowerbound” jirrikjedi l-użu taż-żero għall-kontribuzzjoni ta’ kull congener mhux kwantifikat għall-TEQ.
Il-kunċett ta’ “mediumbound” jirrikjedi l-użu ta’ nofs il-limitu ta’ kwantifikazzjoni billi tiġi kkalkulata l-kontribuzzjoni ta’ kull congener mhux kwantifikat għat-TEQ.
(4) L-analiżi duplikata hija neċessarja sabiex tiġi eskluża l-possibilità tal-kontroeżami intern jew ta’ taħwida aċċidentali tal-kampjuni. L-ewwel analiżi li tikkunsidra l-kejl tal-inċertezza tintuża għall-verifika tal-konformità.
F’każ li l-analiżi issir fil-qasam tal-inċidenza ta’ kontaminazzjoni bid-dioxin, il-konferma b’analiżi duplikata tista’ ma ssirx f’każ li l-kampjuni magħżula għall-analiżi huma marbuta permezz ta’ traċċi, mal-inċident tal-kontaminazzjoni bid-dioxin.
ANNESS VI
METODI TA' ANALIŻI GĦAD-DETERMINAZZJONI TA' KOSTITWENTI TA' ORIĠINI MILL-ANNIMALI GĦALL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-GĦALF
Kundizzjonijiet għall-kxif mikroskopiku, l-identifikazzjoni jew l-estimi tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali fl-għalf
1. Skop u qasam tal-applikazzjoni
Dawn il-kundizzjonijiet għandhom jintużaw meta l-kxif tal-kostitwenti ta' oriġini mill-annimali (definiti bħala prodotti mill-ipproċessar tal-karkassi u l-partijiet mill-karkassi ta' mammali, tjur u ħut) fl-għalf tal-bhejjem, isir permezz ta' eżaminazzjoni mikroskopika fil-qafas ta' programm ta' spezzjoni koordinat fil-qasam tan-nutriment tal-annimali b'konformità mar-Regolament (KE) 882/2004 (1). Sakemm il-metodi f'dan l-Anness jintużaw fit-testijiet uffiċjali kollha, it-tieni test jista' jsir ukoll bl-użu ta' metodi varjanti jew alternattivi, sabiex jitjieb il-kxif ta' ċerti tipi ta' kostitwenti mill-annimali jew sabiex ikun speċifikat aktar l-oriġini tal-kostitwenti mill-annimali. Barra minn hekk, protokoll varjant jista' jintuża wkoll meta jkunu qegħdin jiġu eżaminati ċerti kostitwenti speċifiċi mill-annimali bħalma huma l-plażma jew l-għadam fid-dam (ara wkoll il-punt 9), diment li din l-analiżi ssir b'żieda mal-analiżijiet previsti fil-programm tal-ispezzjoni koordinat.
2. Sensittività
Skont in-natura tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali, jistgħu jinkixfu ammonti żgħar ħafna (< 0,1 %) fl-għalf.
3. Prinċipju
Kampjun rappreżentattiv, miġbur b'konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I li jkun għadda minn preparazzjoni xierqa, jintuża għall-identifikazzjoni. Il-protokoll li ġej huwa adatt għall-ittrattar ta' għalf b'kontenut baxx ta' umidità. għalf b'ammont ta' umdità ogħla minn 14 % għandu jkun imnixxef (ikkondensat) qabel ma jkun studjat. għalf jew materjali tal-għalf speċjali (eż. xaħmijiet, żjut) jeħtieġu trattament dedikat (ara l-punt 9). Il-kostitwenti ta' oriġini mill-annimali jiġu identifikati fuq il-bażi tal-karatteristiċi tipiċi, identifikabbli mikroskopikament (i.e. il-fibri tal-muskoli u partikoli oħrajn tal-laħam, il-qarquċa, il-għadam, il-qrun, ix-xagħar, il-lanżit, id-demm, ir-rix, il-qxur tal-bajd, ix-xewk tal-ħut, il-qxur tal-ħut). L-identifikazzjoni għandha ssir kemm fuq il-frazzjonijiet tal-passatur (6.1) kif ukoll fuq is-sediment ikkonċentrat (6.2) tal-kampjun.
4. Reaġenti
4.1. Aġent għall-integrazzjoni
4.1.1. |
Chloral hydrate (akweju, 60 % w/v) |
4.1.2. |
Lissija (NaOH 2,5 % w/v jew KOH 2,5 % w/v) għall-frazzjonijiet tal-passatur |
4.1.3. |
Żejt tal-parafin jew gliċerol (viskożità: 68-81) għal osservazzjonijiet mikroskopiċi fis-sediment |
4.2. Aġenti tat-tlaħliħ
4.2.1. |
Alkoħol, 96 % |
4.2.2. |
Aċetun |
4.3. Aġent ta' konċentrazzjoni
4.3.1. |
Tetrachloroethylene (densità 1,62) |
4.4. Reaġenti tal-kulur
4.4.1. |
Soluzzjoni ta' jodju/potassium iodide (Dewweb 2 g ta' potassium iodide f'100 ml ilma u żid 1 g jodju waqt li tħawwad ta' spiss) |
4.4.2. |
Aħmar aliżarin (dewweb 2,5 ml 1M aċidu idrokloriku f'100 ml ilma u żid 200 mg aħmar alżarin ma' din is-soluzzjoni) |
4.4.3. |
Reaġent ċistin (2 g lead acetate, 10 g NaOH/100 ml H2O) |
4.4.4. |
Soluzzjoni tal-jodju/potassium iodide (dewweb f'70 % etanol) |
4.5. Reaġent tal-bliċjar
4.5.1 |
Soluzzjoni kummerċjali ta' sodium hypochlorite (9,6 % klorin attiv) |
5. Apparat u aċċessorji
5.1. |
Miżien analitiku (preċiżjoni ta' 0,01 g għajr għas-sediment ikkonċentrat: 0,001 g) |
5.2. |
Materjal għat-tħin (mitħna żgħira tat-tħin jew mehrież, speċjalment għal għalf li jkun fih > 15 % xaħam fl-analiżi). |
5.3. |
Passatur mgħammar b'xibka b'toqob kwadri wisgħin massimu ta' 0,50 mm |
5.4. |
Lembut tas-separazzjoni jew beaker bil-qiegħ koniku għas-sediment |
5.5. |
Stereomikroskopju (tkabbir minimu ta' 40') |
5.6. |
Mikroskopju kompost (tkabbir minimu ta' 400'), dawl trażmess jew dawl polarizzat |
5.7. |
L-apparat tal-ħġieġ standard tal-laboratorju L-apparat kollu għandu jitnaddaf bl-akbar reqqa. L-għeniebet tas-separazzjoni u l-oġġetti tal-ħġieġ jeħtieġ li jitnaddfu f'magna tal-ħasil. Il-passaturi jeħtieġu tindif bl-użu ta' xkupilji b'lanżit iebes. |
6. Proċedura
Għalf f'għamla ta' boċċi jista' jkun magħrbul minn qabel jekk iż-żewġ frazzjonijiet jiġu analizzati bħala kampjun separat.
Għallinqas 50 g tal-kampjun għandhom jiġu ittrattati (mitħun b'attenzjoni bl-użu ta' tagħmir xieraq għat-tħin (5.2) jekk meħtieġ sabiex tkun akkwistata l-istruttura xierqa). Mill-materjal mitħun għandhom jittieħdu żewġ porzjonijiet, wieħed għall-frazzjoni tal-għarbiel (għallinqas 5 g) (6.1) u wieħed għal sediment ikkonċentrat (għallinqas 5 g) (6.2). Il-kulur b'reaġenti tal-kuluri (6.3) jista', addizzjonalment, ikun applikat għall-identifikazzjoni.
Sabiex tkun indikata n-natura tal-proteini mill-annimali u l-oriġini tal-partikoli, tista' tintuża sistema ta' appoġġ għal deċiżjoni bħalma hija ARIES u jistgħu jiġu ddokumentati kampjuni ta' referenza.
6.1. L-identifikazzjoni tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali fil-frazzjonijiet tal-passatur.
Mill-inqas 5 g tal-kampjun jingħadda mill-passatur (5.3) f'żewġ frazzjonijiet.
Il-frazzjoni(jiet) tal-passatur b'partikoli kbar (jew parti rapreżentattiva tal-frazzjoni) hija applikata bħala saff irqiq ma' appoġġ xieraq u din tiġi eżaminata sistematikament taħt stereomikroskopju (5.5) bl-użu ta' tkabbir (bil-lenti) differenti għall-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali.
Il-lastri magħmula bil-frazzjoni(jiet) tal-passatur b'partikoli fini jiġu eżaminati sistematikament taħt mikroskopju kompost (5.6) bl-użu ta' tkabbir (bil-lenti) differenti għall-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali.
6.2. L-identifikazzjoni tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali f'sediment ikkonċentrat
Mill-anqas 5 g (preċiżjoni ta' 0,01 g) tal-kampjun għandu jiġi ittrasferit lejn lembut tas-separazzjoni jew mill-beaker bil-qiegħ koniku għas-sediment u ttrattat b'mill-anqas 50 ml ta' tetrachloroethylene (4.3.1). It-taħlita għandha tiġi mħawwda 'l fuq u 'l isfel jew imħawwda orizzontali ripetutament.
— |
Jekk jintuża lembut magħluq tas-seperazzjoni, is-sediment għandu jitħalla joqgħod għal ħin suffiċjenti (mill-anqas 3 minuti) qabel mas-sediment jiġi isseparat. It-tħawwid għandu jkun irrepetut u s-sediment għandu jitħalla joqgħod mill-ġdid għal mill-anqas 3 minuti. Is-sediment għandu jerġa' jiġi isseparat mill-ġdid. |
— |
Jekk jintuża beaker miftuħ, is-sediment għandu jitħalla joqgħod għal mill-anqas 5 minuti qabel ma s-sediment jiġi isseparat. |
Is-sediment totali għandu jitnixxef u sussegwentament miżun (bi preċiżjoni sa 0,001 g). L-użin ikun meħtieġ biss fil-każ li tkun meħtieġa stima. Jekk is-sediment ikun jikkonsisti minn ħafna partikoli kbar dan jista' jingħadda minn passatur (5.3) f'żewġ frazzjonijiet. Is-sediment imnixxef għandu jiġi eżaminat għall-kostitwenti tal-għadam taħt stereomikroskopju (5.5) u taħt mikroskopju kompost (5.6).
6.3. L-użu ta' aġenti integrati u r-reaġenti tat-tbajja'
L-identifikazzjoni mikroskopika tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali tista' tkun sostnuta bl-użu ta' aġenti speċjali integrati u aġenti tat-tbajja'.
Chloral hydrate (4.1.1): Billi ssaħħan bil-galbu, l-istrutturi taċ-ċelloli jistgħu ikunu jidhru aktar ċari minħabba li l-gelatinise tal-frak tal-lamtu u kontenuti ta' ċelloli mhux mixtieqa jitneħħew.
Lissa (4.1.2.): jew sodiumhydroxide jew potassiumhydroxide inaddaf il-materjal tal-għalf, jgħin fil-kxif tal-fibri tal-muskoli, ix-xagħar u strutturi oħrajn tal-keratina.
Żjut u gliċerina tal-pitrolju (4.1.3.): Il-kostitwenti tal-għadam jistgħu jiġu identifikati sewwa f'dan l-aġent integrat minħabba ħafna mill-lakuni jibqgħu mimlija bl-arja u jidhru bħala toqob suwed ta' madwar 5-15 μm.
Soluzzjoni tal-jodju/potassium Iodide (4.4.1): Użata għas-sejbien tal-lamtu (lewn vjola fl-ikħal) u proteina (lewn isfar fl-oranġo). It-taħlitiet jistgħu jiġu dilwiti jekk ikun hemm bżonn.
Soluzzjoni tal-Alizarin red (4.4.2): L-għoti ta' kulur aħmar fir-roża tal-għadam, xewk u l-qxur tal-ħut. Qabel it-tnixxif tas-sediment (ara s-sezzjoni 6.2), is-sediment totali għandu jiġi ittrasferit f'test-tube tal-ħġieġ u mlaħlaħ darbtejn b'madwar 5 ml alkoħol (4.2.1) (kull darba għandha tintuża vortex, is-solvent għandu jitħalla joqgħod għal madwar minuta u mferra' 'l barra). Qabel l-użu ta' dan l-aġent tal-kulur, is-sediment għandu jiġi ibbliċjat biż-żieda ta' mill-anqas 1 ml tas-soluzzjoni ipo-klorit (4.5.1). Ir-reazzjoni għandha titħalla tkompli għal 10 minuti. It-test-tube għandu jiġi mimli bl-ilma, is-sediment għandu jitħalla joqgħod għal 2 jew 3 minuti, u l-ilma u l-partikoli sospiżi għandhom jitferrgħu 'l barra. Is-sediment għandu jitlaħlaħ darbtejn oħra b'madwar 10 ml ta' ilma (għandu jintuża vortex, ħallieħ joqgħodu armi l-ilma kull darba). għandhom jiżdiedu żewġ sa 10 taqtiriet (skont l-ammont ta' residwi) ta' aliżarina ta' soluzzjoni ħamra. It-taħlita għandha titħawwad u r-reazzjoni għandha titħalla sseħħ għal ftit sekondi. Is-sediment ikkulurit għandu jitlaħlaħ darbtejn b'madwar 5 ml alkoħol (4.2.1) segwit bi tlaħliħa waħda bl-aċetun (4.2.2), (kull darba għandha tintuża vortex, is-solvent għandu jitħalla joqgħod għal madwar minuta u mferra' 'l barra). Imbagħad, is-sediment ikun lest sabiex jitnixxef.
Reaġent ċistin (4.4.3): Billi jissaħħnu bil-galbu, kostitwenti li jkun fihom iċ-ċistin (xagħar, rix, eċċ.) isiru suwed fil-kannella.
6.4. Eżaminazzjoni fl-għalf possibbilment ikkontaminat b'ħut mitħun.
Mill-anqas lastra waħda għandha tkun eżaminata mill-frazzjoni tal-passatur fin u mill-frazzjoni fina tas-sediment taħt mikroskopju kompost (ara s-sezzjonijiet 6.1 u 6.2).
Meta t-tikketta tindika li l-ingredjenti jinkludu ħut mitħun, jew jekk ikun hemm suspett tal-preżenza ta' ħut mitħun jew jekk dan jinkixef fl-eżami inizjali, għandhom jiġu eżaminati mill-anqas żewġ lastri addizzjonali tal-frazzjoni tal-passatur fin mill-kampjun oriġinali, kif ukoll il-frazzjoni tas-sediment totali.
7. Kalkolu u Evalwazzjoni
L-Istati Membri għandhom jassiguraw li l-proċeduri deskritti f'dan il-punt jintużaw meta l-analiżi uffiċjali ssir bil-għan li jkun ikkalkolat l-ammont (u mhux sempliċiment il-preżenza) tal-kostitwenti mill-annimali.
Il-kalkolu jista' jsir biss jekk il-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali jkun fihom frak tal-għadam.
Tista' ssir distinzjoni bejn frak tal-għadam ta' speċje terrestri ta' demm sħun (i.e. mammali u għasafar) mit-tipi differenti ta' xewk tal-ħut fuq lastra mikroskopika permezz ta' lacunae tipiċi. Il-proporzjon tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali fil-materjal tal-kampjun huwa stmat filwaqt li jitqies:
— |
il-proporzjon ikkalkolat (piż %) tal-frak tal-għadam fis-sediment ikkonċentrat, u |
— |
il-proporzjon (piż %) tal-għadam fil-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali. |
L-istima għandha tkun ibbażat fuq mill-inqas tliet (jekk possibbli) lastri u mill-anqas ħames oqsma kull lastra. Bħala regola, f'għalf kompost, is-sediment ikkonċentrat għandu jkun fih mhux biss il-frak tal-għadam ta' annimali terrestri u l-frak tax-xewk tal-ħut, imma wkoll partikoli oħrajn ta' piż speċifiku għoli, eż. minerali, ramel, frammenti minn pjanti linjifikati u x-xorta.
7.1. Il-valur stmat tal-perċentwal tal-frak tal-għadam
% tal-frak tal-għadam terrestri = (S × c)/W
% tal-frak tax-xewk u l-qxur tal-ħut = (S × d)/W
(S = |
il-piż tas-sediment (mg). C = fattur tal-korrezzjoni ( %) għall-porzjon ikkalkolat tal-għadam tal-annimali terrestri fis-sediment, d = fattur tal-korrezzjoni ( %) għall-porzjon ikkalkolat ta' frak ta' xewk u qxur tal-ħut fis-sediment, W = il-piż tal-materjal tal-kampjun għas-sediminazzjoni (mg)). |
7.2. Il-valur stmat tal-kostitwenti ta' oriġini mill-annimali
Il-proporzjon tal-għadam fi prodotti tal-annimali jista' jvarja ħafna. (Il-perċentwal tal-għadam fil-każ ta' għadam mitħun huwa ta' bejn 50 sa 60 % u fil-każ ta' laħam mitħun huwa ta' bejn 20 sa 30 %; fil-każ ta' ħut mitħun, il-kontenut tal-għadam u tax-xewk ivarja sostanzjalment skont il-kategorija u l-oriġini tal-ħut mitħun, normalment dan huwa bejn 10 u 20 %).
Jekk it-tip ta' annimali mitħuna preżenti fil-kampjun ikun magħruf, ikun possibbli li jiġi stmat il-kontenut:
Kontenut stmat tal-kostitwenti ta' prodotti mill-ħut ( %) = (S × c)/(W × f) × 100
Kontenut stmat tal-kostitwenti ta' prodotti mill-ħut ( %) = (S × d)/(W × f) × 100
(S = |
il-piż tas-sediment (mg). c = fattur tal-korrezzjoni ( %) għall-porzjon stmat tal-għadam tal-annimali terrestri fis-sediment, d = fattur tal-korrezzjoni ( %) għall-porzjon stmat ta' frak ta' xewk u qxur tal-ħut fis-sediment, f = il-fattur tal-korrezzjoni fil-proporzjon tal-għadam fil-kostitwenti ta' oriġini mill-annimali fil-kampjun eżaminat, W = il-piż tal-materjal tal-kampjun għas-sediminazzjoni (mg)). |
8. Espressjoni tar-riżultat tal-eżaminazzjoni
Ir-rapport għandu mill-anqas ikun fih informazzjoni rigward il-preżenza ta' kostitwenti miksubin minn annimali terrestri u minn ħut mitħun. Il-każijiet differenti għandhom jiġu rrapportati b'dan il-mod:
8.1. |
Fir-rigward tal-preżenza ta' kostitwenti miksubin minn annimali terrestri:
|
8.2. |
U fir-rigward tal-preżenza ta' ħut mitħun:
Fil-każ li jkunu nstabu kostitwenti miksubin minn ħut jew minn annimali terrestri, ir-rapport tar-riżultat tal-eżaminazzjoni, jekk meħtieġ, jista' jindika aktar stimi tal-ammont tal-kostitwenti misjuba (x %, < 0,1 %, 0,1 – 0,5 %, 0,5 – 5 % jew > 5 %), aktar speċifikazzjoni tat-tip tal-annimal terristri jekk possibbli u tal-kostitwenti mill-annimali kif identifikati (fibri tal-muskoli, qarquċa, għadam, qrun, xagħar, lanżit, rix, demm, qxur tal-bajd, xewk u qxur tal-ħut). Fil-każ meta jiġi stmat l-ammont tal-ingredjenti mill-annimali, il-fattur 'f' tal-korrezzjoni użat għandu jissemma'. Fil-każijiet ta' meta jkunu identifikati kostitwenti tal-għadam minn annimali terrestri, ir-rapport għandu jinkludi l-klawsola addizzjonali: “Ma tistax tkun eskluża l-possibiltà li l-kostitwenti ta' hawn fuq huma miksubin minn mammali.” Din il-klawsola addizzjonali ma tkunx meħtieġa fil-każijiet meta l-frak tal-għadam minn annimali terrestri jkunu ġew speċifikati bħala frak tal-għadam minn tjur jew minn mammali. |
9. Protokoll volontarju għall-analażi ta' xaħam jew żejt
Il-protokoll segwenti jista' jintuża għall-analiżi tax-xaħam jew taż-żejt:
— |
Jekk ix-xaħam huwa solidu, dan jissaħħan pereżempju f'forn microwave sakemm isir likwidu. |
— |
Bl-użu ta' pipetta, 40 ml ta' xaħam huwa trasferit mill-qiegħ tal-kampjun lejn tubu taċ-ċentrifugazzjoni. |
— |
Iċċentrifuga għal 10 minuti fi 4 000 rpm. |
— |
Jekk ix-xaħam huwa solidu wara ċ-ċentrifugazzjoni, dan jissaħħan għal darba oħra f'forn microwave sakemm isir likwidu. Irrepeti ċ-ċentrifugazzjoni għal 5 minuti f'4 000 rpm. |
— |
Bl-użu ta' mgħarfa żgħira jew spatula, nofs l-impuritajiet imferrgħin jiġu ttrasferiti lejn dixx Petri żgħir jew lastra mikroskopika għall-identifikazzjoni mikroskopika tal-possibbiltà tal-kontenut ta' kostitwenti mill-annimali (fibri tal-laħam, rix, frak tal-għadam,...). Bħala aġent integrat għall-mikroskopija, huwa rrakkomandat żejt jew gliċerol tal-pitrolju. |
— |
L-impuritajiet li jkun baqa' jintużaw għas-sedimentazzjoni kif deskritta fil-punt 6.2. |
(1) ĠU L 165, 30.4.2004, p. 1; ikkoreġut bil-ĠU L 191, 28.5.2004, p. 1.
ANNESS VII
IL-METODU SABIEX IKUN IKKALKOLAT IL-VALUR TAL-ENERĠIJA TAL-GĦALF TAT-TJUR
1. Il-metodu tal-kalkolu u l-espressjoni tal-valur tal-enerġija
Il-valur tal-enerġija tal-għalf kompost tat-tjur għandu jiġi kkalkolat bi qbil mal-formula mniżżla hawn taħt fuq il-bażi tal-perċentwali ta' ċerti komponenti analitiċi tal-għalf. Dan il-valur għandu jitfisser f'megajoules (MJ) tal-enerġija metabolizzabbli (ME), f'nitroġenu kkorreġut, għal kull kilogram ta' għalf kompost:
MJ/kg ta' ME = 0,1551 x % ta' proteina mhux raffinata +0,3431 × % xaħam +0,1669 × % ta' lamtu +0,1301 × % tat-totali taz-zokkor (imfissra bħala sukrożju)
2. Tolleranzi applikabbli għall-valuri dikjarati
Jekk l-ispezzjoni uffiċjali turi diskrepanza (il-valur tal-għalf tal-annimali miżjud jew imnaqqas) bejn ir-riżultat tal-ispezzjoni u l-valur iddikjarat tal-enerġija, għandha tiġi permessa tolleranza minima ta' 0,4 MJ/kg ta' ME.
3. Espressjoni tar-riżultat
Wara l-applikazzjoni tal-formula ta' hawn fuq, ir-riżultat miksub għandu jingħata sa post deċimali wieħed.
4. It-teħid ta' kampjuni u l-metodi ta' analiżi
L-għażla tal-kampjuni tal-għalf kompost u d-determinazzjoni tal-kontenut tal-komponenti analitiċi indikati fil-metodu tal-kalkoli għandhom isiru skont metodi tal-għażla tal-kampjuni tal-Komunità u skont metodi analitiċi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf rispettivament.
Is-segwenti għandhom jiġu applikati:
— |
sabiex ikun determinat il-kontenut tax-xaħam mhux proċessat: proċedura B tal-metodu, għad-determinazzjoni ta' żjut u ta' xaħmijiet mhux proċessati, kif stabbiliti f'Parti H tal-Anness III, |
— |
sabiex ikun determinat il-kontenut tal-lamtu: il-metodu polarimetriku stabbilit f'Parti L tal-Anness III. |
ANNESS VIII
METODI TA' ANALIŻI BIEX JIĠU KKONTROLLATI L-PREŻENZI ILLEGALI TA' ADDITTIVI LI M'GĦADHOMX AWTORIZZATI FL-GĦALF
Noti importanti:
Jistgħu jintużaw metodi ta' analiżi aktar sensittivi barra l-metodi ta' analiżi msemmija f'dan l-Anness għas-sejbien ta' preżenza illegali ta' addittivi li m'għadhomx awtorizzati fl-għalf.
Il-metodi ta' analiżi msemmija f'dan l-Anness għandhom jintużaw għal għanijiet konfermatorji.
(A) DETERMINAZZJONI TA' METHYL BENZOQUATE
7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta' methyl benzoquate fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.
2. Prinċipju
Il-methyl benzoquate huwa estratt mill-kampjun b'soluzzjoni ta' methanolic methanesulfonic acid. L-estratt jiġi purifikat bil-dichloromethane, bil-kromatografija ta' skambju tal-joni u mbagħad darb'oħra b'dichloromethane. Il-kontenut tal-methyl benzoquate huwa determinat minn kromatografija b'likwidi ta' prestazzjoni għolja b'fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta' ditettur bl-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Dichloromethane |
3.2. |
Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.3. |
Fażi mobbli tal-HPLC taħlita ta' metanol (3.2) u ilma (ekwivalenti gaħll-grad HPLC) 75 + 25 (v + v). Iffiltra minn filtru ta' 0,22 m (4.5) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b'ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). |
3.4. |
Soluzzjoni tal-methanesulfonic acid, c = 2 % Iddilwixxi 20,0 ml tal-methanesulfonic acid sa 1 000 ml bil-metanol (3.2). |
3.5. |
Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku, c = 10 % Iddilwixxi 100 ml aċidu idrokloriku (ρ201,18 g/ml) sa 1 000 ml bl-ilma. |
3.6. |
Ir-raża ta' skambju ta' cation Amberlite CG-120 (Na), bil-malja 100 sa 200. Ir-raża hija pre-trattata qabel l-użu. Ħallat 100 g tar-raża li ma ddubx ma' 500 ml tas-soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku (3.5) u saħħan fuq hot plate sakemm tagħli, u ħawwad b'mod kontinwu. Ħalliha tibred u ferra' l-aċidu minn kunjett għal ieħor. Iffiltra minn karta filtru taħt vakwu. Aħsel ir-raża darbtejn b'porzjonijiet ta' 500 ml ta' ilma u imbagħad b'250 ml tal-metanol (3.2). Laħlaħ ir-raża b'porzjoni oħra ta' 250 ml tal-metanol u nixxef billi tgħaddi l-arja mill-filter cake. Aħżen ir-raża mnixxfa f'kunjett b'tapp. |
3.7. |
Is-sustanza standard: methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) pur. |
3.7.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg tas-sustanza standard (3.7), dewweb fis-soluzzjoni tal-aċidu methanesulfonic (3.4) f'kunjett iggradat tal-100 ml, żid sal-marka u ħallat. |
3.7.2. |
Ittrasferixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni standard tal-istokk tal-methyl benzoquate (3.7.1) f'kunjett iggradat tal-50 ml, żid sal-marka bil-metanol (3.2) u ħallat. |
3.7.3. |
Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 5,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedja tal-methyl benzoquate (3.7.2) f'serje ta' kunjetti ggradati tal-25 ml. Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.3) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom konċentrazzjonijiet ta' 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 u 10,0 μg/ml tal-methyl benzoquate rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b'mod frisk qabel l-użu. |
4. Apparat
4.1. |
Shaker tal-laboratorju |
4.2. |
Evaporatur b'pellikola li taħdem b'sistema rotanti |
4.3. |
Kolonna tal-ħġieġ (250 mm × 15 mm) mwaħħla bi stopcock u b'depożitu li jesa' madwar 200 ml. |
4.4. |
Tagħmir tal-HPLC b'ditettur tal-ultravjola b'wavelength varjabbli jew ditettur diode-array. |
4.4.1. |
Kolonna għal kromatografija b'likwidi: 300 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta' 10 μm jew ekwivalenti |
4.5. |
Filtri tal-membrana, 0,22 μm |
4.6. |
Filtri tal-membrana, 0,45 μm |
5. Proċedura
5.1. Ġenerali
5.1.1. |
Għalf blank għandu jiġi analizzat biex ikun kontrollat li la l-methyl benzoquate u lanqas sostanzi li jikkaġunaw interferenza ma jkunu preżenti. |
5.1.2. |
Għandu jsir eżami tal-irkupru billi jkun analizzat l-għalf blank li jkun issaħħaħ biż-żieda ta' kwantità tal-methyl benzoquate, li jixbaħ lil dak preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f'livell ta' 15 mg/kg, żid 600 ml tas-soluzzjoni standard ta' stokk (3.7.1) ma' 20 g ta' għalf blank, ħallat u stenna sa 10 minuti qabel ma tipproċedi bl-istadju tal-estrazzjoni (5.2). Nota: għall-fini ta' dan il-metodu, l-għalf blank għandu jkun ta' tip simili għal dak tal-kampjun u mill-analiżi m'għandux jinstab l-methyl benzoquate. |
5.2. Estrazzjoni
Iżen sal-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun ippreparat u ttrasferixxi għal kunjett koniku tal-250 ml. Żid 100,0 ml tas-soluzzjoni ta' methanesulfonic acid (3.4) u ħawwad b'mod mekkaniku (4.1) għal 30 minuta. għaddi s-soluzzjoni minn karta filtru u żomm il-filtrat għall-istadju tal-qsim likwidu-likwidu (5.3).
5.3. Qsim likwidu-likwidu
Ittrasferixxi f'lenbut ta' separazzjoni ta' 500 ml li fih 100 ml tas-soluzzjoni ta' aċidu idrokloriku (3.5), 25,0 ml tal-filtrat miksub f'(5.2). Żid 100 ml tal-dichloromethane (3.1) fil-lenbut u ħawwad għal minuta. Ħalli s-safef jinfirdu u skula s-saff l-aktar baxx (dichloromethane) f'kunjett b'qiegħ tond ta' 500 ml. Irripeti l-estrazzjoni tal-fażi milwiema b'żewġ porzjonijiet oħra ta' 40 ml ta' dichloromethane u ħallat dawn mal-ewwel estratt fil-kunjett b'qiegħ tond. Evapora l-estratt tad-dichloromethane sakemm jinxef fuq l-evaporatur b'sistema rotanti (4.2) li jaħdem taħt pressjoni mnaqqsa f'40 oC. Dewweb ir-residwu fil-kunjett f'minn 20 sa 25 ml tal-metanol (3.2), agħlaq il-kunjett u żomm l-estratt kollu għall-kromotografija tal-iskambju tal-joni (5.4).
5.4. Il-kromatografija tal-iskambju tal-joni
5.4.1.
Daħħal tapp tal-ħġieġ f'forma ta' fibri fini fil-qiegħ l-aktar baxx tal-kolonna tal-ħġieġ (4.3). Ipprepara taħlita ta' 5,0 g tar-raża tal-iskambju ta' cation trattata (3.6) b'50 ml tal-aċidu idrokloriku (3.5), ferra' fil-kolonna tal-ħġieġ u ħalliha toqgħod. Skula l-aċidu żejjed eżattament għal fuq il-wiċċ tar-raża u aħsel il-kolonna bl-ilma sakemm l-effluwent huwa newtrali għall-karta tat-tornasol. Ittrasferixxi 50 ml tal-metanol (3.2) għal fuq il-kolonna u ħallih joskula 'l isfel sal-wiċċ tar-raża.
5.4.2.
Permezz ta' pipetta, ittrasferixxi b'attenzjoni l-estratt miksub f'(5.3) għal fuq il-kolonna. Laħlaħ il-beaker b'qiegħ tond b'5 sa 10 ml tal-metanol (3.2) u ttrasferixxi dawn il-ħasliet għall-kolonna. Skula l-estratt sal-wiċċ tar-raża u aħsel il-kolonna b'50 ml tal-metanol, waqt li tiżgura li r-rata tal-fluss ma taqbiżx il-5ml kull minuta. Armi l-effluwent. Neħħi bil-ħasil il-methyl benzoquate mill-kolonna bl-użu ta' 150 ml tas-soluzzjoni methanesulfonic acid (3.4) u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa bl-elużjoni mill-kolonna f'kunjett konikali ta' 250 ml.
5.5. Qsim likwidu-likwidu
Ittrasferixxi s-soluzzjoni li titneħħa bl-elużjoni miksuba f'(5.4.2) f'lenbut ta' separazzjoni ta' 1 l. Laħlaħ il-kunjett koniku b'5 sa 10 ml tal-methanol (3.2) u ħallat il-ħasliet mal-kontenuti tal-lenbut ta' separazzjoni. Żid 300 ml aċidu idrokloriku (3.5) u 130 ml dichloromethane (3.1). Ħawwad għal 1 minuta u stenna sakemm jisseparaw il-fażijiet. Skula s-saff l-aktar baxx (dichloromethane) fil-kunjett b'qiegħ tond ta' 500 ml. Irripeti l-estrazzjoni tal-fażi milwiema b'żewġ porzjonijiet oħra ta' 70-ml tad-dichloromethane u ħallat dawn l-estratti mal-ewwel estratt fil-kunjett b'qiegħ tond.
Evapora l-estratt tad-dichloromethane sakemm jinxef fuq l-evaporatur b'sistema rotanti (4.2) li jaħdem taħt pressjoni mnaqqsa f'40o C. Dewweb ir-residwu fil-kunjett b'bejn wieħed u ieħor 5 ml tal-metanol (3.2) u ttrasferixxi din is-soluzzjoni b'mod kwantitattiv għal kunjett iggradat ta' 10 ml. Laħlaħ il-beaker b'qiegħ tond b'1 sa 2 ml tal-metanol u ttrasferixxi dawn il-ħasliet għall-kunjett iggradat. Wassal sal-marka bil-metanol u ħawwad. Tiġi ffiltrata porzjoni aliquot mill-filtru membrana (4.6). Żomm din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.6).
5.6. Determinazzjoni tal-HPLC
5.6.1.
Il-kundizzjonijiet segwenti qegħdin jiġu offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħra sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:
— |
Kolonna għal kromatografija b'likwidi (4.4.1), |
— |
fażi mobili tal-HPLC: taħlita metanol-ilma (3.3), |
— |
rata ta' fluss: 1 sa 1,5 ml/minuta, |
— |
wavelength tad-ditezzjoni: 265 nm, |
— |
Volum tal-injezzjoni: 20 sa 50 μl. |
Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, b'injezzjoni tas-soluzzjoni ta' kalibrar (3.7.3) li fiha 4 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-aqwa għoli jew żoni kostanti u l-ħinijiet ta' żamma.
5.6.2.
Injetta kull soluzzjoni ta' kalibrar (3.7.3) għal diversi drabi u kejjel l-aqwa għoli (l-erji) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta' kalibrar bl-użu tal-aqwa għoljiet jew żoni tal-medja tas-soluzzjonijiet ta' kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f'μg għal kull ml bħala l-axxiżi.
5.6.3.
Injetta l-estratt tal-kampjun (5.5) għal diversi drabi, bl-użu tal-istess volum bħal dak li ttieħed għas-soluzzjonijiet ta' kalibrar u ddetermina l-aqwa għoli (l-erja) medja tal-aqwa tal-methyl benzoquate.
6. Kalkolu tar-riżultati
Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f'μg/ml mill-għoli (l-erja) medja tal-aqwa tal-methyl benzoquate tas-soluzzjoni tal-kampjun b'referenza għall-graff ta' kalibrar (5.6.2).
Il-kontenut tal-methyl benzoquate w (mg/kg) tal-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:
fejn:
c |
= |
konċentrazzjoni tal-methyl benzoquate tas-soluzzjoni tal-kampjun f'μg/ml, |
m |
= |
piż tal-porzjoni tat-test fi grammi. |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tista' tiġi kkonfermata bil-ko-kromatografija, jew bl-użu ta' ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni ta' kalibrar (3.7.3) li fiha 10 μg/ml.
7.1.1.
L-estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq tas-soluzzjoni standard intermedja (3.7.2). L-ammont ta' methyl benzoquate miżjud għandu jixbah lill-ammont stmat tal-methyl benzoquate fl-estratt tal-kampjun.
L-għoli tal-ogħla livell ta' methyl-benzoquate biss għandu jissaħħaħ wara li jitqies kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f'bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa' oriġinali.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-aqwa quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f'marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta' ditezzjoni. għad-ditezzjoni diode-array, din tipikament hija bejn wieħed u ieħor fi ħdan 2 nm; |
(b) |
bejn 220 u 350 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m'għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta' bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard; |
(ċ) |
bejn 220 u 350 nm, l-ispettri tal-parti 'il fuq, tal-apiċi u tal-parti 'l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m'għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta' bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfatt meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil-punti kollha ta' osservazzjoni d-devjazzjoni bejn l-ispettri ma taqbiżx il-15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-ogħla livell. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu: l-10 % fir-rigward għar-riżultat ogħla għall-kontenuti tal-methyl benzoquate bejn 4 u 20 mg/kg.
7.3. Irkupru
Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 90 %.
8. Riżultati ta' studju kollaborattiv
Ħames kampjuni kienu analizzati minn 10 laboratorji. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun.
|
Blank |
Biċċa 1 |
Pellit 1 |
Biċċa 2 |
Pellit 2 |
Medja [mg/kg] |
ND |
4,50 |
4,50 |
8,90 |
8,70 |
sr [mg/kg] |
— |
0,30 |
0,20 |
0,60 |
0,50 |
CVr [ %] |
— |
6,70 |
4,40 |
6,70 |
5,70 |
sR [mg/kg] |
— |
0,40 |
0,50 |
0,90 |
1,00 |
CVR [ %] |
— |
8,90 |
11,10 |
10,10 |
11,50 |
Irkupru [ %] |
— |
92,00 |
93,00 |
92,00 |
89,00 |
ND |
= |
mhux rilevat |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent ta' varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % |
sR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent ta' varjazzjoni tar-riproduċibilità, % |
(B) DETERMINAZZJONI TA' OLAQUINDOX
2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxide
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' olaquindox fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.
2. Prinċipju
Il-kampjun jiġi estratt b'taħlita ta' ilma u metanol. Il-kontenut ta' olaquindox jiġi ddeterminat bi kromatografija b'likwidi ta' prestazzjoni għolja b'fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta' ditettur bl-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Metanol |
3.2. |
Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.3. |
Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.4. |
Fażi mobbli għall-HPLC Taħlita ta' ilma (3.3)-methanol (3.2), 900 + 100 (V + V). |
3.5. |
Is-sustanza standard: olaquindox 2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxide, E 851 pur |
3.5.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg 50 mg olaquindox (3.5) f'kunjett iggradat ta' 200 ml u żid madwar 190 ml ilma. Imbagħad qiegħed it-tubu għal 20 minuta f'banju ultrasoniku (4.1). Wara t-trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni għat-temperatura ambjentali, żid sal-marka bl-ilma u ħallat. geżwer il-kunjett b'fojl tal-aluminju u poġġih fi friġġ. Din is-soluzzjoni għandha titħejja friska kull xahar. |
3.5.2. |
Ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard maħżuna (3.5.1) f'kunjett iggradat ta' 100 ml, imla sal-marka bil-fażi mobbli (3.4) u ħawwad. geżwer il-kunjett b'fojl tal-aluminju u poġġih fi friġġ. Din is-soluzzjoni għandha titħejja friska kuljum. |
3.5.3. |
Ittrasferixxi f'serje ta' kunjetti ggradati ta' 50 ml 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 u 20,0 ml mis-soluzzjoni standard intermedja (3.5.2). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.4) u ħallat. geżwer il-kunjetti bil-fojl tal-aluminju. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrespondu ma' 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 u 10,0 μg ta' aquindox kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski kuljum. |
4. Apparat
4.1. |
Banju ultrasoniku |
4.2. |
Shaker mekkaniku |
4.3. |
Tagħmir ta' HPLC b'ditekter ultra-vjola ta' wavelength varjabbli jew ditettur diode array |
4.3.1. |
Kolonna għal kromatografija b'likwidi, 250mm x 4 mm, ippakkjar ta' C18, 10 μm, jew ekwivalenti. |
4.4. |
Filtri tal-membrana, 0,45 μm |
5. Proċedura
Nota: |
Olaquindox huwa sensittiv għad-dawl. Wettaq il-proċeduri taħt dawl baxx jew uża oġġetti tal-ħġieġ kulur ambra. |
5.1. Ġenerali
5.1.1. |
Għandu jiġi analizzat għalf blank sabiex ikun iċċekkjat li la l-olquindox u lanqas sustanzi li jinterferixxu ma jkunu preżenti. |
5.1.2. |
Għandu jsir test ta' rkupru billi jiġi analizzat l-għalf blank li ssaħħaħ permezz ta' żieda ta' kwantità ta' olaquindox, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f'livell ta' 50 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard ta' stokk (3.5.1) għal kunjett koniku ta' 250 ml u evapora s-soluzzjoni għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml. Żid 50 g tal-għalf blank, ħawwad sewwa u ħalli għal 10 minuti u erġa' ħawwad ħafna drabi qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2).
|
5.2. Estrazzjoni
Iżen sal-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 50 g mill-kampjun. Ittrasferixxi f'kunjett koniku ta' 1 000 ml, żid 100 ml metanol (3.1) u poġġi l-kunjett għal 5 minuti f'banju ultrasoniku (4.1). Żid 410 ml ilma u ħalli fil-banju ultrasoniku għal 15-il minuta oħra. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku, ħawwdu għal 30 minuta fix-shaker (4.2) u ffiltra minn filtru mitwi. Ittrasferixxi 10,0 ml mill-filtrat f'kunjett iggradat ta' 20 ml, imla sal-marka bl-ilma u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.4). (Ara 9. Osservazzjoni) Kompli għad-Determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.3. Determinazzjoni tal-HPLC
5.3.1.
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.
Kolonna analitika (4.3.1) |
|
Fażi mobbli (3.4): |
Taħlita ilma (3.3) – metanol (3.2.), 900 + 100 (V + V) |
Rata ta' tnixxija: |
1,5 – 2 ml/min |
Wavelength tad-ditezzjoni: |
380 nm |
Volum tal-injezzjoni: |
20 μl – 100 μl |
Iċċekkja l-istabbilità tas-sistema kromatografika, billi tinjetta ħafna drabi s-soluzzjoni ta' kalibrar (3.5.3) li fiha 2,5 μg/ml, sakemm jinkisbu ogħla livelli u ħinijiet ta' żamma kostanti.
5.3.2.
Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.5.3) ħafna drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħal livelli (żoni) għal kull kalibrar. Ipplottja graff tal-kalibrar billi tuża l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f'g/ml bħala l-axxiżi.
5.3.3.
Injetta l-kampjun tal-estratt (5.2) ħafna drabi billi tuża' l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta' kalibrar u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta' olaquindox.
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-għolji medju (erja) tal-ogħla livelli ta' olaquindox tas-soluzzjoni kampjun stabbilixxi l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f'μg/ml b'referenza għall-graff ta' kalibrar (5.3.2).
Il-kontenut ta' olaquindox w f'mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja:
fejn:
c |
= |
konċentrazzjoni ta' olaquindox tal-estratt tal-kampjun (5.2) f'g/ml |
m |
= |
piż tal-kampjun tat-test fi g (5.2) |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tista' tiġi kkonfermata permezz ta' ko-kromatografija, jew billi jintuża' ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettra tal-kampjun estratt (5.2) u s-soluzzjoni ta' kalibrar (3.5.3) li fiha 5,0 g/ml.
7.1.1.
Kampjun estratt (5.2) jissaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq mis-soluzzjoni ta' kalibrar (3.5.3). L-ammont ta' olaquindox miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta' olaquindox li jinsab fil-kampjun estratt.
L-għoli tal-ogħla livelli tal-olaquindox biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwit tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħla livell, f'nofs l-għoli tiegħu, għandu jkun fi ħdan 10 % tal-wisa' oriġinali tal-quċċata ta' olaquindox tal-kampjun estratt mhux imsaħħaħ.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
Il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f'marġini determinata bis-saħħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema ta' ditezzjoni. għad-ditezzjoni b'diode array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm. |
(b) |
Bejn 220 u 400 nm, il-kampjun u l-ispettri standard irreġistrati fl-apiċi tal-ogħla livell tal-kromatogramma, m'għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta' 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju għandu jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u fl-ebda punt osservat il-punt ta' devjazzjoni bejn iż-żewġ spettra ma għandu jaqbeż 15 % tal-assorbiment tal-analit standard. |
(ċ) |
Bejn 220 u 400 nm, l-ispettri tal-parti 'l fuq, tal-apiċi u tal-parti 'l isfel tal-quċċata prodotti mill-kampjun tal-estratt m'għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta' 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-ogħla apiċi. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralelli li jkunu saru fuq l-istess kampjun m'għandhiex taqbeż il-15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat għall-kontenuti ta' olaquindox bejn 10 u 200 mg/kg.
7.3. Irkupru
Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 90 %.
8. Riżultati ta' studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE li fih erba' kampjuni ta' għalf tal-qżieqeż li jinkludu għalf blank ġew analizzati minn 13-il laboratorju. Ir-riżultati huma mogħtija hawn taħt:
|
Kampjun 1 |
Kampjun 2 |
Kampjun 3 |
Kampjun 4 |
L |
13 |
10 |
11 |
11 |
n |
40 |
40 |
44 |
44 |
medja [mg/kg] |
— |
14,6 |
48,0 |
95,4 |
Sr [mg/kg] |
— |
0,82 |
2,05 |
6,36 |
SR [mg/kg] |
— |
1,62 |
4,28 |
8,42 |
CVr [ %] |
— |
5,6 |
4,3 |
6,7 |
CVR [ %] |
— |
11,1 |
8,9 |
8,8 |
Kontenut nominali |
|
|
|
|
[mg/kg] |
— |
15 |
50 |
100 |
Irkupru. % |
— |
97,3 |
96,0 |
95,4 |
L |
= |
numru ta' laboratorji |
n |
= |
numru ta' valuri singoli |
Sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità |
9. Osservazzjoni
Għalkemm il-metodu ma ġiex ivvalidat għal għalf li fih aktar minn 100 mg/kg ta' olaquindox, jista' jkun possibbli li jinkisbu riżultati sodisfaċenti billi jittieħed piż iżgħar tal-kampjun u/jew billi l-estratt jiġi dilwit (5.2) sabiex tintlaħaq konċentrazzjoni fi ħdan il-medda tal-graff ta' kalibrar (5.3.2).
(C) DETERMINAZZJONI TAL-AMPROLJU
1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methyl-pyridinium chloride hydrochloride
1. Għan u Skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell tal-amprolju fl-għalf u f'taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta' ditezzjoni huwa 1 mg/kg, il-limitu ta' kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa estratt b'taħlita ta' ilma u metanol. Wara dilwizzjoni bil-fażi mobbli u l-filtrazzjoni bil-membrana, il-kontenut tal-amprolju huwa determinat permezz ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja bi skambju katoniku (HPLC), bl-użu ta' ditettur bl-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Metanol |
3.2. |
Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.3. |
Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.4. |
Soluzzjoni ta' sodium dihydrogen phosphate, c = 0,1 mol/l Dewweb 13,80 g sodium dihydrogen phosphate monohydrate fl-ilma (3.3) f'kunjett iggradat ta' 1 000 ml, żid sal-marka bl-ilma (3.3) u ħallat. |
3.5. |
Soluzzjoni ta' sodium perchlorate, c = 1,6 mol/l Dewweb 224,74 g sodium perchlorate monohydrate fl-ilma (3.3) f'kunjett iggradat ta'1 000 ml, żid sal marka bl-ilma (3.3) u ħallat. |
3.6. |
Fażi mobbli għall-HPLC (ara l-osservazzjoni 9.1). Taħlita ta' acetonitrile (3.2), soluzzjoni ta' sodium dihydrogen phosphate (3.4) u ta' soluzzjoni ta' sodium perchlorate (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Qabel l-użu iffiltra minn filtru tal-membrana ta' 0,22 μm (4.3) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. fil-banju ultrasoniku (4.4) għal mill-inqas 15-il minuta). |
3.7. |
Is-sustanza standard: l-amprolju pur, 1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methyl-pyridinium chloride hydrochloride, E 750 (ara 9.2). |
3.7.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg amprolju (3.7) f'kunjett ta' 100 ml immarkat, dewweb fi 80 ml metanol (3.1) u qiegħed il-kunjett għal 10 minuti f'banju ultrasoniku (4.4). Wara t-trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni għat-temperatura ambjentali, żid sal-marka bl-ilma u ħallat. F'temperatura ta' ≤ 4 oC, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.7.2. |
Ippipetta 5,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.7.1) f'kunjett iggradat ta' 50 ml, żid sal-marka bis-solvent tal-estrazzjoni (3.8) u ħallat. F'temperatura ta' ≤ 4 oC, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.7.3. |
Ittrasferixxi 0,5, 1,0 u 2,0 ml tas-soluzzjoni intermedja standard (3.7.2) f'serje ta' kunjetti ggradati ta' 50 ml. Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.6) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 0,5, 1,0 u 2,0 μg tal-amprolju għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski qabel l-użu. |
3.8. |
Is-solvent tal-estrazzjoni Taħlita tal-metanol (3.1)-ilma 2 + 1 (v + v). |
4. Apparat
4.1. |
Tagħmir tal-HPLC b'sistema ta' injezzjoni, adattat għal volumi ta' injezzjoni ta' 100 μl |
4.1.1. |
Kolonna għal kromatografija b'likwidi 125 mm x 4 mm, skambju katjoniku Nukleosil 10 SA, ippakkjar ta' 5 jew 10 μm jew ekwivalenti |
4.1.2. |
Ditettur bil-UV b'aġġustament varjabbli ta' wavelength jew ditettur diode array |
4.2. |
Filtru tal-membrana, materjal PTFE, 0,45 μm |
4.3. |
Filtru tal-membrana, 0,22 μm |
4.4. |
Banju ultrasoniku |
4.5. |
Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika |
5. Proċedura
5.1. Ġenerali
5.1.1.
Biex isir it-test tal-irkupru (5.1.2) għandu jkun analizzat għalf blank biex jiġi vverifikat li la l-amprolju u lanqas is-sustanzi li jinterferixxu ma jkunu preżenti. L-għalf blank m'għandux ikun ta' tip simili għal dak tal-kampjun u l-amprolju jew inkella s-sustanzi intereferenti m'għandhomx ikunu rilevati.
5.1.2
Għandu jsir test tal-irkupru bl-analiżi tal-għalf blank li jkun ġie msaħħan b'żieda ta' kwantità ta' amprolju, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Sabiex jiġi msaħħaħ il-livell ta' 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni ta' stokk standard, (3.7.1) għal kunjett koniku ta' 250 ml u ħalliha tevapora għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml. Żid 50 g tal-għalf blank, ħawwad sewwa u ħalli għal 10 minuti u erġa' ħawwad ħafna drabi qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2).
Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista' jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta' żieda standard. F'dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa msaħħaħ bi kwantità ta' amprolju simili għal dak diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista' jiġi kkalkolat permezz tat-tnaqqis.
5.2. Estrazzjoni
5.2.1.
Iżen sal-eqreb 0,01 g, 5 sa 40 g tal-kampjun, jiddependi fuq il-kontenut tal-amprolju, f'kunjett koniku ta' 500 ml u żid 200 ml tas-solvent tal-estrazzjoni (3.8). Qiegħed il-kunjett f'banju ultrasoniku (4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa (1) fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.5). Iddilwixxi l-alikwot tal-estratt bil-fażi mobbli (3.6) għall-kontenut tal-amprolju ta' 0,5sa 2 μ/ml u ħawwad (ara l-osservazzjoni 9.3). Iffiltra 5 sa 10ml ta' din is-soluzzjoni dilwita minn filtru tal-membrana (4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.2.2.
Iżen sal-eqreb 0,001 g, 1 sa 4 g tat-taħlita lesta minn qabel, jiddependi fuq il-kontenut tal-amprolju, f'kunjett koniku ta' 500ml u żid 200ml tas-solvent tal-estrazzjoni (3.8). Qiegħed il-kunjett f'banju ultrasoniku (4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa (1) fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.5). Iddilwixxi l-alikwot tal-estratt bil-fażi mobbli (3.6) b'kontenut tal-amprolju ta' 0,5 sa 2 g/ml u ħawwad. Iffiltra 5 sa 10ml ta' din is-soluzzjoni dilwita minn filtru tal-membrana (4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).
5.3. Determinazzjoni tal-HPLC
5.3.1.
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.
Kolonna għal kromatografija |
|
b'likwidi (4.1.1.): |
125 mm x 4 mm, skambju katoniku Nukleosil 10 SA, ippakkjar ta' 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti |
Fażi mobbli (3.6): |
Taħlita ta' acetonitrile (3.2), soluzzjoni ta' sodium dihydrogen phosphate (3.4) u soluzzjoni ta' sodium perchlorate (3.5), 450+450+100 (v+v+v). |
Rata ta' tnixxija: |
0,7 – 1 ml/min |
Wavelength tad-ditezzjoni: |
264 nm |
Volum tal-injezzjoni: |
100 μl |
Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, u injetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3) li fiha 1,0 μg/ml, sakemm jintlaħqu għoljiet u ħinijiet ta' żamma kostanti.
5.3.2.
Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3) diversi drabi u ddetermina l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff tal-kalibrar billi tuża l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f'g/ml bħala l-axxiżi.
5.3.3.
Injetta l-kampjun tal-estratt (5.2) ħafna drabi billi tuża' l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta' kalibrar u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta' amprolium.
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tal-amprolju tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f'g/ml b'referenza għall-graff tal-kalibrar (5.3.2).
Il-kontenut ta' amprolium w f'mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja:
[mg/kg]
fejn:
V |
= |
il-volum tal-estratt tas-solvent(3.8) f'ml skont 5.2 (jiġifieri 200 ml) |
c |
= |
konċentrazzjoni ta' amprolium tal-estratt tal-kampjun (5.2) f'μg/ml |
f |
= |
il-fattur ta' dilwizzjoni skont 5.2 |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tista' tiġi kkonfermata bil-ko-kromatografija, jew billi jintuża ditettur ta' diode array li bih jitqabblu l-ispettra tal-estratt tal-kampjun (5.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3) li jkun fiha 2,0 g/ml.
7.1.1.
Estratt kampjun (5.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq ta' soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3). L-ammont tal-amprolju miżjud għandu jkun simili għall-ammont tal-amprolju li jinstab fl-estratt tal-kampjun.
L-għoli tal-ogħla livelli tal-amprolju biss għandu jiġi mtejjeb wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-diluwizzjoni tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħla livell, f'nofs l-għoli tagħha, għandu jkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa' oriġinali tal-ogħla livell tal-amprolju tal-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
Il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f'marġini determinata bis-saħħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema ta' ditezzjoni. għad-ditezzjoni b'diode array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm. |
(b) |
Bejn 210 u 320 nm, il-kampjun u l-ispettri standard irreġistrati fl-apiċi tal-ogħla livell tal-kromatogramma, m'għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta' 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju għandu jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u fl-ebda punt osservat il-punt ta' devjazzjoni bejn iż-żewġ spettra ma għandu jaqbeż 15 % tal-assorbiment tal-analit standard. |
(ċ) |
Bejn 210 u 320 nm, l-ispettri tal-parti 'l fuq, tal-apiċi u tal-parti 'l isfel tal-quċċata prodotti mill-kampjun tal-estratt m'għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta' 10 – 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-ogħla apiċi. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fl-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:
— |
15 % fir-rigward tal-valur ogħla għall-kontenuti tal-amprolju minn 25 mg/kg sa 500 mg/kg |
— |
75 mg/kg għall-kontenuti tal-amprolju bejn 500 mg/kg u 1 000 mg/kg |
— |
7,5 % fir-rigward tal-valur għoli għall-kontenuti tal-amprolju ta' aktar minn 1 000 mg/kg |
7.3. Irkupru
Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 90 %.
8. Riżultati ta' studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati tliet tipi ta' għalf tat-tjur (il-kampjun 1-3), għalf minerali wieħed (il-kampjun 4) u taħlita waħda minn qabel (il-kampjun 5). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja
|
Kampjun 1 (Għalf blank) |
Kampjun 2 |
Kampjun 3 |
Kampjun 4 |
Kampjun 5 |
L |
14 |
14 |
14 |
14 |
15 |
n |
56 |
56 |
56 |
56 |
60 |
medja [mg/kg] |
— |
45,5 |
188 |
5 129 |
25 140 |
sr [mg/kg] |
— |
2,26 |
3,57 |
178 |
550 |
CVr [ %] |
— |
4,95 |
1,90 |
3,46 |
2,20 |
sR [mg/kg] |
— |
2,95 |
11,8 |
266 |
760 |
CVR [ %] |
— |
6,47 |
6,27 |
5,19 |
3,00 |
Kontenut nominali [mg/kg] |
— |
50 |
200 |
5 000 |
25 000 |
L |
= |
numru ta' laboratorji |
n |
= |
numru ta' valuri singoli |
sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità |
sR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità |
9. Osservazzjonijiet
9.1. |
Jekk il-kampjun ikun fih it-thiamine, l-ogħla livell tat-thiamine fil-kromatogramma jidher ftit qabel l-ogħla livell tal-amprolju. Wara dan il-metodu l-amprolju u t-thiamine għandhom jiġu sseparati. Jekk l-amprolju u t-thiamine ma jiġux isseparati bil-kolonna (4.1.1) użata f'dan il-metodu, issostitwixxi sa 50 % tal-porzjon tal-acetonitrile tal-fażi mobbli (3.6) bil-metanol. |
9.2. |
Skont il-British Pharmacopoeia, l-ispettru tas-soluzzjoni tal-amprolju (c = 0,02 mol/l) f'aċidu idrokloriku (c = 0,1 mol/l) juri maxima fi 246 nm u 262 nm. L-assorbiment għandu jammonta għal 0,84 b'246 nm u 0,80 b'262 nm. |
9.3. |
L-estratt għandu dejjem jiġi dilwit bil-fażi mobbli, għax inkella l-ħin ta' żamma tal-ogħla livell tal-amprolju jista' jiċċaqlaq b'mod sinifikanti, minħabba bidliet fis-saħħa jonika. |
(D) DETERMINAZZJONI TA' KARBADOKS
Methyl 3-(2-quinoxalinylmethylene)carbazate N1,N4-dioxide
1. Għan u skop
Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta' karbadoks fl-għalf, taħlitiet lesti minn qabel u preparazzjonijiet. Il-limitu ta' ditezzjoni huwa 1 mg/kg. Il-limitu ta' kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.
2. Prinċipju
Il-kampjun huwa ekwilibrat bl-ilma u estratt bil-metanol-acetonitrile. għall-għalf, porzjon alikwot tal-estratt iffiltrat jiġi soġġett għal tindifa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. għal taħlitiet lesti minn qabel u preparazzjonijiet, porzjon alikwot tal-estratt iffiltrat jiġi dilwit għal konċentrazzjoni xierqa bl-ilma, bil-metanol u bl-acetonitrile. Il-kontenut tal-karbadoks jiġi ddeterminat bi kromatografija b'likwidi bi prestazzjoni għolja b'fażi riversjata (HPLC – reversed-phase high-performance liquid chromatography) bl-użu ta' ditettur bil-UV.
3. Reaġenti
3.1. |
Metanol |
3.2. |
Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.3. |
Aċidu aċetiku, w = 100 % |
3.4. |
Ossidu tal-aluminju: newtrali, grad ta' attività I |
3.5. |
Metanol-acetonitrile 1 + 1 (v + v) Ħallat 500 ml ta' metanol (3.1) ma' 500 ml ta' acetonitrile (3.2). |
3.6. |
Aċidu aċetiku, σ = 10 % Iddilwixxi 10 ml aċidu aċetiku (3.3) sa 100 ml bl-ilma. |
3.7. |
Aċetat tas-sodju |
3.8. |
Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC |
3.9. |
Soluzzjoni bafer tal-aċetat, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0 Dewweb 0,82 g ta' aċetat tas-sodju (3.7) f'700 ml ilma (3.8) u aġġusta l-pH għal 6,0 bl-aċidu aċetiku (3.6). Ittrasferixxi għal kunjett iggradat ta' 1 000 ml, żid sal-marka bl-ilma (3.8) u ħallat. |
3.10. |
Fażi mobbli għall-HPLC Ħallat 825 ml tas-soluzzjoni ta' acetate buffer (3.9) ma' 175 ml ta' acetonitrile (3.2). Iffiltra minn filtru ta' 0,22 m (4.5) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b'ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). |
3.11. |
Sustanza standard Karbadoks pur: Methyl 3-(2-quinoxalinylmethylene)carbazate N1,N4-dioxide, E 850 |
3.11.1. |
Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard tal-karbadoks (3.11) f'kunjett iggradat ta' 250 ml. Dewweb f'metanol-acetonitrile (3.5) b'ultrasonifikazzjoni (4.7). Wara trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni għat-temperatura ambjentali, żid sal-marka b'metanol-acetonitrile (3.5) u ħallat. geżwer il-kunjett b'fojl tal-aluminju jew uża apparat tal-ħġieġ ambra u aħżen fi friġġ. F'temperatura ta' ≤ 4 oC, is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1. |
3.11.2. |
Ittrasferixxi 2,0, 5,0, 10,0, u 20,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.11.1) f'serje ta' kunjetti ikkalibrati ta' 100 ml. Żid 30 ml ilma, żid sal-marka bil-metanol-acetonitrile (3.5) u ħallat. geżwer il-kunjetti bil-fojl tal-aluminju. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 2,0, 5,0, 10,0 u 20,0 g/ml ta' karbadoks rispettivament. Is-soluzzjonijiet ta' kalibrar għandhom jitħejjew friski qabel l-użu.
|
3.12. |
Taħlita ta' ilma-[metanol-acetonitrile] (3.5), 300 + 700 (v + v) Ħallat 300 ml ilma ma' 700 ml tat-taħlita ta' metanol-acetonitrile (3.5). |
4. Apparat
4.1. |
Shaker tal-laboratorju jew stirrer manjetika |
4.2. |
Karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman gF/A jew ekwivalenti). |
4.3. |
Kolonna tal-ħġieġ (tul 300 sa 400 mm, dijametru intern ta' bejn wieħed u ieħor 10 mm) b'sintered glass frit u valv li jista' jinqala'.
|
4.4. |
Tagħmir tal-HPLC b'sistema ta' injezzjoni, adattat għal volumi ta' injezzjoni ta' 20 μl |
4.4.1. |
Kolonna għal kromatografija b'likwidi: 300 mm x 4 mm, C18, ippakkjar ta' 10 m jew ekwivalenti. |
4.4.2. |
Ditettur bil-UV b'aġġustament varjabbli tal-wavelength jew ditettur ta' diode array li jaħdmu fil-medda ta' 225 sa 400 nm. |
4.5. |
Filtru tal-membrana, 0,22 μm |
4.6. |
Filtru tal-membrana, 0,45 μm |
4.7. |
Banju ultrasoniku |
5. Proċedura
Nota |
Il-karbadoks huwa sensittiv għad-dawl. Wettaq il-proċeduri kollha f'dawl baxx jew uża apparat tal-ħġieġ ambra jew apparat tal-ħġieġ imgeżwer fil-fojl jew fl-aluminju. |
5.1. Ġenerali
5.1.1.
Biex isir it-test tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analizzat għalf blank biex jiġi kkontrollat li la l-karbadoks u lanqas is-sustanzi li jinterferixxu ma jkunu preżenti. L-għalf blank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, il-karbadoks jew is-sustanzi interferenti m'għandhomx jiġu rilevati.
5.1.2.
Test tal-irkupru għandu jitwettaq bl-analiżi tal-għalf blank (5.1.1) li jkun ġie imsaħħaħ biż-żieda ta' kwantità ta' karbadoks, simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f'livell ta' 50 mg/kg, ittrasferixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni standard ta' stokk (3.11.1) f'kunjett koniku ta' 200 ml. Evapora s-soluzzjoni għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml f'banju tan-nitroġenu. Żid 10 g tal-għalf blank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2).
Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista' jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta' żieda standard. F'dan il-każ, il-kampjun huwa msaħħaħ bi kwantità ta' karbadoks, simili għal dak diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista' jiġi kkalkolat permezz ta' tnaqqis.
5.2. Estrazzjoni
5.2.1.
Iżen sal-eqreb 0,01 g, 10 g tal-kampjun u ittrasferixxi għal kunjett koniku ta' 200 ml. Żid 15,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 35,0 ml metanol-acetonitrile (3.5), agħlaq b'tapp u ħawwad għal 30 minuta fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2). Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta' purifikazzjoni (5.3).
5.2.2.
Iżen sal-eqreb 0,01 g, 1 g tal-kampjun mhux mitħun u ttrasferixxi għal kunjett koniku ta' 200 ml. Żid 15,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 35,0 ml metanol-acetonitrile (3.5), agħlaq b'tapp u ħawwad għal 30 minuta fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2).
Ippipetta alikwot tal-filtrat f'kunjett kalibrat ta' 50 ml. Żid 15,0 ml ilma, żid sal-marka bil-metanol-acetonitrile (3.5) u ħallat. Il-konċentrazzjoni karbadoks tas-soluzzjoni finali għandha tkun bejn wieħed u ieħor 10 μg/ml. L-alikwot huwa ffiltrat minn filtru ta' 0,45 μm (4.6).
Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).
5.2.3.
Iżen sal-eqreb 0,01 g, 0,2 g tal-kampjun mhux mitħun u ttrasferixxi għal kunjett koniku ta' 250 ml. Żid 45,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 105,0 ml metanol-acetonitrile (3.5), agħlaq b'tapp u omoġenizza. Issonika (4.7) l-kampjun għal 15-il minuta u wara ħawwdu jew dawwru bi stirrer għal 15-il minuta (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2).
Iddilwixxi l-alikwot tal-filtrat b'taħlita ta' ilma-metanol-acetonitrile (3.12) għal konċentrazzjoni finali tal-karbadoks ta' 10-15 g/ml (għal preparat ta' 10 %, il-fattur tad-dilwizzjoni huwa 10). L-alikwot huwa ffiltrat minn filtru ta' 0,45 μm (4.6).
Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).
5.3. Purifikazzjoni
5.3.1.
Iżen 4 g aluminium oxide (3.4) u ttrasferih għall-kolonna tal-ħġieġ (4.3).
5.3.2.
Applika 15 ml tal-estratt iffiltrat (5.2.1) għall-kolonna tal-aluminium oxide u warrab l-ewwel 2 ml tal-elwat. Iġbor il-5 ml li jmiss u ffiltra l-alikwot minn filtru ta' 0,45 m (4.6).
Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).
5.4. Determinazzjoni tal-HPLC
5.4.1.
Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:
Kolonna għal kromatografija |
|
b'likwidi (4.4.1): |
300 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta' 10 μm jew ekwivalenti |
Fażi mobbli (3.10): |
Taħlita ta' soluzzjoni ta' acetate buffer (3.9) u acetonitrile (3.2), 825 + 175 (v + v) |
Rata ta' tnixxija: |
1,5 – 2 ml/min |
Wavelength tad-ditezzjoni: |
365 nm |
Volum tal-injezzjoni: |
20 μl |
Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, u injetta għal diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.11.2) li jkun fiha 5,0 g/ml, sakemm jintlaħqu ogħla livell (erjas) u ħinijiet ta' żamma kostanti.
5.4.2.
Injetta kull waħda mis-soluzzjoni ta' kalibrar (3.11.2) għal diversi drabi u ddetermina l-għoli tal-ogħla livelli (żoni) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-graff tal-kalibrar billi tuża l-għoli medju tal-ogħla livelli jew l-erjas tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f'g/ml bħala l-axxiżi.
5.4.3.
Injetta l-estratt kampjun [(5.3.2) għall-għalf, (5.2.2) għal taħlitiet lesti minn qabel u (5.2.3) għal preparati] diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) tal-ogħla livelli tal-karbadoks.
6. Kalkolu tar-riżultati
Mill-għoli medju (żona) tal-ogħla livelli tal-karbadoks tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tal-carbadox tas-soluzzjoni kampjun f'g/ml b'referenza għall-graff ta' kalibrar (5.4.2).
6.1. Għalf
Il-kontenut tal-karbadoks “w” (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
c |
= |
il-konċentrazzjoni tal-karbadoks tal-estratt tal-kampjun (5.3.2) fi g/ml, |
V1 |
= |
il-volum tal-estrazzjoni f'ml (jiġifieri 50) |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
6.2. Taħlitiet lesti minn qabel u preparati
Il-kontenut tal-karbadoks “w” (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:
[mg/kg]
fejn:
c |
= |
il-konċentrazzjoni tal-karbadoks tal-estratt tal-kampjun (5.2.2 jew 5.2.3) fi g/ml, |
V2 |
= |
il-volum tal-estrazzjoni f'ml (jiġifieri 50 għal taħlitiet lesti minn qabel; 150 għal preparati). |
f |
= |
fattur ta' dilwent skont 5.2.2 (taħlitiet lesti minn qabel) jew 5.2.3 (preparati) |
m |
= |
il-piż tal-porzjon tat-test fi g |
7. Validazzjoni tar-riżultati
7.1. Identità
L-identità tal-analit tista' tkun ikkonfermata bil-ko-kromatografija, jew billi jintuża ditettur ta' diode array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.11.2) li fiha 10,0 g/ml.
7.1.1.
Estratt kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq ta' soluzzjoni ta' kalibrar (3.11.2). L-ammont tal-karbadoks miżjud għandu jkun simili għall-ammont stmat ta' karbadoks li jinstab fl-estratt tal-kampjun.
L-għoli tal-ogħla livell tal-karbadoks biss għandu jiġi mtejjeb wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f'bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa' oriġinali.
7.1.2.
Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:
(a) |
Il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f'marġini determinata bis-saħħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema ta' ditezzjoni. għal ditezzjoni ta' diode array, dan huwa tipikament fi ħdan + 2 nm; |
(b) |
Bejn 225 u 400 nm, il-kampjun u l-ispettri standard irreġistrati fl-apiċi tal-ogħla livell tal-kromatogramma, m'għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta' 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard; |
(ċ) |
Bejn 225 u 400 nm, l-ispettra tal-parti 'l fuq, tal-apiċi u tal-parti 'l isfel tal-quċċata prodotti mill-kampjun tal-estratt m'għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta' 10 – 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi. |
Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.
7.2. Ripetibbiltà
Għal kontenuti ta' 10 mg/kg u ogħla, id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn 15 % fir-rigward tar-riżultat l-aktar għoli.
7.3. Irkupru
Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 90 %.
8. Riżultati ta' studju kollaborattiv
Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih, 6 tipi ta' għalf, 4 taħlitiet lesti minn qabel u 3 preparati ġew analizzati minn 8 laboratorji. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista' tinsab fil-Journal of the AOAC, Volume 71, 1988, p. 484-490). Ir-riżultati (esklużi dawk barra l-limitu) jidhru hawn taħt:
Tabella 1.
Riżultati tal-istudju kollaborattiv għall-għalf
|
Kampjun 1 |
Kampjun 2 |
Kampjun 3 |
Kampjun 4 |
Kampjun 5 |
Kampjun 6 |
L |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
n |
15 |
14 |
15 |
15 |
15 |
15 |
Medja (mg/kg) |
50,0 |
47,6 |
48,2 |
49,7 |
46,9 |
49,7 |
Sr (mg/kg) |
2,90 |
2,69 |
1,38 |
1,55 |
1,52 |
2,12 |
CVr ( %) |
5,8 |
5,6 |
2,9 |
3,1 |
3,2 |
4,3 |
SR (mg/kg) |
3,92 |
4,13 |
2,23 |
2,58 |
2,26 |
2,44 |
CVR ( %) |
7,8 |
8,7 |
4,6 |
5,2 |
4,8 |
4,9 |
Kontenut nominali (mg/kg) |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
Tabella 2.
Riżultati tal-istudju kollaborattiv għal taħlitiet lesti minn qabel u preparati
|
Taħlitiet lesti minn qabel |
Preparati |
|||||
A |
B |
C |
D |
A |
B |
C |
|
L |
7 |
7 |
7 |
7 |
8 |
8 |
8 |
n |
14 |
14 |
14 |
14 |
16 |
16 |
16 |
Medja (g/kg) |
8,89 |
9,29 |
9,21 |
8,76 |
94,6 |
98,1 |
104 |
Sr (g/kg) |
0,37 |
0,28 |
0,28 |
0,44 |
4,1 |
5,1 |
7,7 |
CVr ( %) |
4,2 |
3,0 |
3,0 |
5,0 |
4,3 |
5,2 |
7,4 |
SR (g/kg) |
0,37 |
0,28 |
0,40 |
0,55 |
5,4 |
6,4 |
7,7 |
CVR ( %) |
4,2 |
3,0 |
4,3 |
6,3 |
5,7 |
6,5 |
7,4 |
Kontenut nominali (g/kg) |
10,0 |
10,0 |
10,0 |
10,0 |
100 |
100 |
100 |
L |
= |
numru ta' laboratorji |
n |
= |
numru ta' valuri singoli |
Sr |
= |
devjazzjoni standard tar-ripetibilità |
CVr |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità |
SR |
= |
devjazzjoni standard tar-riproduċibilità |
CVR |
= |
koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità |
ANNESS IX
KORRELAZZJONIJIET IMSEMMIJA F'ARTIKOLU 6
1. Direttiva 71/250/KEE
Direttiva 71/250/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 l-ewwel sub-paragrafu |
Artikolu 3 |
Artikolu 1 it-tieni sub-paragrafu |
Artikolu 2 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness, parti 1 |
Anness II |
Anness, parti 2 |
–– |
Anness, parti 3 |
–– |
Anness, parti 4 |
Anness III, parti O |
Anness, parti 5 |
Anness III, parti M |
Anness, parti 6 |
Anness III, parti N |
Anness, parti 7 |
Anness III, parti Q |
Anness, parti 9 |
Anness III, parti K |
Anness, parti 10 |
–– |
Anness, parti 11 |
–– |
Anness, parti 12 |
Anness III, parti J |
Anness, parti 14 |
Anness III, parti D |
Anness, parti 16 |
–– |
2. Direttiva 71/393/KEE
Direttiva 71/393/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness, parti I |
Anness III, parti A |
Anness, parti II |
Anness III, parti E |
Anness, parti III |
Anness III, parti P |
Anness, parti IV |
Anness III, parti H |
3. Direttiva 72/199/KEE
Direttiva 72/199/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Anness I, parti 1 |
Anness III, parti L |
Anness I, parti 2 |
Anness III, parti C |
Anness I, parti 3 |
–– |
Anness I, parti 4 |
–– |
Anness I, parti 5 |
Anness V, parti A |
Anness II |
–– |
4. Direttiva 73/46/KEE
Direttiva 73/46/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Anness I, parti 1 |
Anness III, parti B |
Anness I, parti 2 |
–– |
Anness I, parti 3 |
Anness III, parti I |
5. Direttiva 76/371/KEE
Direttiva 76/371/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 1 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness |
Anness I |
6. Direttiva 76/372/KEE
Direttiva 76/372/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
–– |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness |
–– |
7. Direttiva 78/633/KEE
Direttiva 78/633/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness, parti 1 |
–– |
Anness, parti 2 |
–– |
Anness, parti 3 |
Anness IV, parti C |
8. Direttiva 81/715/KEE
Direttiva 81/715/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
–– |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness |
–– |
9. Direttiva 84/425/KEE
Direttiva 84/425/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
–– |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness |
–– |
10. Direttiva 86/174/KEE
Direttiva 86/174/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 4 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness |
Anness VII |
11. Direttiva 93/70/KEE
Direttiva 93/70/KEE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness |
Anness IV, parti D |
12. Direttiva 93/117/KE
Direttiva 93/117/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikoli 3 u 5 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Anness, parti 1 |
Anness IV, parti E |
Anness, parti 2 |
Anness VIII, parti A |
13. Direttiva 98/64/KE
Direttiva 98/64/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikoli 3 u 5 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Anness, parti A |
Anness III, parti F |
Anness, parti C |
Anness VIII, parti B |
14. Direttiva 1999/27/KE
Direttiva 1999/27/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikoli 3 u 5 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Artikolu 5 |
–– |
Artikolu 6 |
–– |
Artikolu 7 |
–– |
Anness, parti A |
Anness VIII, parti C |
Anness, parti B |
Anness IV, parti F |
Anness, parti C |
Anness VIII, parti D |
15. Direttiva 1999/76/KE
Direttiva 1999/76/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Anness |
Anness IV, parti G |
16. Direttiva 2000/45/KE
Direttiva 2000/45/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Anness, parti A |
Anness IV, parti A |
Anness, parti B |
Anness IV, parti B |
Anness, parti C |
Anness III, parti G |
17. Direttiva 2002/70/KE
Direttiva 2002/70/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 1 |
Artikolu 2 |
Artikoli 2 u 3 |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Artikolu 5 |
–– |
Anness I |
Anness I u Anness V parti B (I) |
Anness II |
Anness II u Anness V parti B (II) |
18. Direttiva 2003/126/KE
Direttiva 2003/126/KE |
Dan ir-Regolament |
Artikolu 1 |
Artikolu 3 |
Artikolu 2 |
–– |
Artikolu 3 |
–– |
Artikolu 4 |
–– |
Artikolu 5 |
–– |
Artikolu 6 |
–– |
Anness |
Anness VI |
26.2.2009 |
MT |
Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea |
L 54/s3 |
NOTA LILL-QARREJ
L-istituzzjonijiet iddeċidew li ma jikkwotawx aktar fit-testi tagħhom l-aħħar emenda ta' l-atti kkwotati.
Sakemm mhux indikat mod ieħor, l-atti mmsemija fit-testi ppubblikati hawn jirreferu għall-atti li bħalissa huma fis-seħħ.