|
(8)
|
Fil-Parti B, jiżdiedu l-Kapitoli li ġejjin:
“B.63 TEST TA’ SKRINJAR TAT-TOSSIĊITÀ RIPRODUTTIVA/TAL-IŻVILUPP
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 421 tal-OECD (2016). Il-linji gwida tal-OECD għall-ittestjar tas-sustanzi kimiċi jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku. Il-linja gwida tat-test ta’ skrinjar oriġinali 421 ġiet adottata fl-1995, fuq il-bażi ta’ protokoll għal “Test ta’ Skrinjar għat-Tossiċità Riproduttiva Preliminari” diskuss f’żewġ laqgħat ta’ esperti, f’Londra fl-1990 (1) u f’Tokyo fl-1992 (2).
|
|
2.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar ġie aġġornat b’punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali, bħala segwitu għall-attività ta’ prijorità għolja mnedija fl-OECD fl-1998 biex jiġu riveduti l-linji gwida tat-test eżistenti u jiġu żviluppati linji gwida tat-test ġodda għall-iskrinjar u għall-ittestjar ta’ interferenti endokrinali potenzjali (3). Pereżempju, it-TG 407 tal-OECD (Studju dwar it-Tossiċità Orali fuq 28 Jum b’Doża Ripetuta fir-Rodituri, Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness) ġiet miżjuda fl-2008 b’parametri xierqa biex tiġi individwata l-attività endokrinali tas-sustanzi kimiċi tat-test. L-objettiv fl-aġġornar tat-TG 421 kien li jiġu inklużi xi punti ta’ tmiem rilevanti ta’ interferenti endokrinali fit-TGs tal-iskrinjar meta l-perjodi ta’ esponiment ikopru wħud mill-perjodi sensittivi matul l-iżvilupp (perjodi ta’ qabel it-twelid jew ta’ kmieni wara t-twelid).
|
|
3.
|
Il-punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali addizzjonali magħżula, li wkoll huma parti mit-TG 443 (Studju Estiż dwar it-Tossiċità Riproduttiva f’Ġenerazzjoni Waħda, Kapitolu B.56 ta’ dan l-Anness), kienu inklużi fit-TG 421 fuq il-bażi ta’ studju tal-fattibbiltà li jindirizza mistoqsijiet xjentifiċi u tekniċi relatati mal-inklużjoni tagħhom, kif ukoll adattamenti possibbli fid-disinn tat-test meħtieġa għall-inklużjoni tagħhom (4).
|
|
4.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jiġġenera informazzjoni limitata rigward l-effetti ta’ sustanza kimika tat-test fuq il-prestazzjoni riproduttiva fl-irġiel u fin-nisa bħall-funzjoni gonadali, l-imġiba tat-tgħammir, il-konċepiment, l-iżvilupp tal-konċepit u l-ħlas. Mhuwiex alternattiva għall-metodi ta’ ttestjar eżistenti B.31, B.34, B.35 jew B.56 u lanqas ma jiħdilhom posthom.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
|
5.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar ta’ skrinjar jista’ jintuża biex jipprovdi informazzjoni inizjali dwar l-effetti possibbli fuq ir-riproduzzjoni u/jew l-iżvilupp, jew fi stadju bikri ta’ valutazzjoni tal-proprjetajiet tossikoloġiċi tas-sustanzi kimiċi, jew fuq is-sustanzi kimiċi ta’ tħassib. Jista’ jintuża wkoll bħala parti minn sett ta’ testijiet ta’ skrinjar inizjali għal sustanzi kimiċi tat-test eistenti li għalihom ftit li xejn ikun hemm informazzjoni tossikoloġika disponibbli jew l-ebda affattu, bħal studju ta’ individwazzjoni tad-doża għal studji aktar estensivi dwar ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp, jew meta jitqies rilevanti b’xi mod ieħor. Fit-twettiq tal-istudju, għandhom jiġu segwiti l-prinċipji ta’ gwida u l-kunsiderazzjonijiet spjegati fid-dokument ta’ gwida nru 19 tal-OECD dwar ir-rikonoxximent, il-valutazzjoni, u l-użu ta’ sinjali kliniċi bħala punti ta’ tmiem umanitarji għal annimali sperimentali użati fl-evalwazzjonijiet tas-sikurezza (5).
|
|
6.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni kompluta fuq l-aspetti kollha tar-riproduzzjoni u tal-iżvilupp. B’mod partikolari, dan joffri biss mezz limitat kif jiġu individwati l-manifestazzjonijiet ta’ wara t-twelid ta’ esponiment ta’ qabel it-twelid, jew l-effetti li jistgħu jiġu indotti matul l-esponiment ta’ wara t-twelid. Minħabba (fost raġunijiet oħra) in-numri relattivament żgħar ta’ annimali fil-gruppi tad-doża, is-selettività tal-punti ta’ tmiem, u d-durata qasira tal-istudju, dan il-metodu mhux se jipprovdi evidenza għal dikjarazzjonijiet definiti ta’ ebda effett. Barra minn hekk, fin-nuqqas ta’ data minn testijiet oħra dwar it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, ir-riżultati pożittivi huma siewja għall-valutazzjoni inizjali tal-periklu u jikkontribwixxu għal deċiżjonijiet b’rabta man-neċessità u mat-tempestività tat-testijiet addizzjonali.
|
|
7.
|
Ir-riżultati miksubin mill-parametri relatati mas-sistema endokrinali għandhom jitqiesu fil-kuntest tal-“OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (6). F’dan il-Qafas Kunċettwali, it-TG 421 imtejba tal-OECD tinsab fil-livell 4 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi data dwar l-effetti avversi fuq il-punti ta’ tmiem endokrinali rilevanti. Madankollu, sinjal endokrinali waħdu jaf ma jitqiesx evidenza suffiċjenti li s-sustanza kimika tat-test hi interferent endokrinali.
|
|
8.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jassumi amministrazzjoni orali tas-sustanza kimika tat-test. Jaf ikun hemm bżonn ta’ modifiki jekk jintużaw rotot oħra ta’ esponiment.
|
|
9.
|
Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
|
|
10.
|
Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
11.
|
Is-sustanza kimika tat-test tingħata f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ rġiel u nisa. L-irġiel għandhom jingħataw doża għal minimu ta’ erba’ ġimgħat u sal-jum ta’ qabel il-qatla skedata (dan jinkludi minimu ta’ ġimagħtejn qabel it-tgħammir, matul il-perjodu ta’ tgħammir u, bejn wieħed u ieħor, ġimagħtejn wara t-tgħammir). Fid-dawl tal-perjodu ta’ dożaġġ limitat ta’ qabel it-tgħammir, il-fertilità jaf ma tkunx indikatur partikolarment sensittiv ta’ tossiċità testikolari. Għaldaqstant, eżami istoloġiku dettaljat tat-testikoli hu essenzjali. Il-kombinazzjoni tal-perjodu ta’ dożaġġ ta’ qabel it-tgħammir ta’ ġimagħtejn u l-osservazzjonijiet sussegwenti dwar it-tgħammir/il-fertilità b’perjodu ta’ dożaġġ ġenerali ta’ tal-anqas erba’ ġimgħat, segwiti minn istopatoloġija dettaljata tal-gonadi tal-irġiel, hija meqjusa suffiċjenti biex tkun tista’ tiġi individwata l-maġġoranza tal-effetti fuq il-fertilità u l-ispermatoġenesi tal-irġiel.
|
|
12.
|
In-nisa għandhom jingħataw doża matul l-istudju kollu. Dan jinkludi ġimagħtejn qabel it-tgħammir (bl-objettiv li jkunu koperti tal-anqas żewġ ċikli estrużi sħaħ), il-ħin varjabbli sal-konċepiment, id-durata tat-tqala u tal-anqas 13-il jum wara l-ħlas, sa u inkluż il-jum ta’ qabel il-qatla skedata.
|
|
13.
|
Id-durata tal-istudju, wara l-akklimatizzazzjoni u l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż ta’ qabel id-dożaġġ, tiddependi mill-prestazzjoni tan-nisa u hi madwar 63 jum, [tal-anqas 14-il jum qabel it-tgħammir, (sa) 14-il jum tat-tgħammir, 22 jum tal-ġestazzjoni, 13-il jum tat-treddigħ].
|
|
14.
|
Matul il-perjodu ta’ amministrazzjoni l-annimali jkunu osservati mill-qrib, kull jum għal sinjali ta’ tossiċità. L-annimali li jmutu jew li jinqatlu matul il-perjodu tat-test issirilhom awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali li jkunu baqgħu ħajjin jinqatlu u ssirilhom awtopsja.
|
DESKRIZZJONI TAL-METODU
Għażla tal-ispeċi tal-annimali
|
15.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jintuża b’firien. Għandha tingħata ġustifikazzjoni dettaljata jekk il-parametri speċifikati f’dan il-metodu ta’ ttestjar ikunu investigati fi speċijiet oħra ta’ rodituri. Fil-programm internazzjonali ta’ validazzjoni għad-detezzjoni tal-interferenti endokrinali fit-TG 407 tal-OECD (li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness), il-far kien l-unika speċi użata. Ma għandhomx jintużaw razez b’fekundità baxxa jew li huma magħrufa li għandhom inċidenza għolja ta’ difetti fl-iżvilupp. Għandhom ikunu użati annimali verġni f’saħħithom li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali preċedenti. L-annimali ittestjati għandhom ikunu karatterizzati skont l-ispeċi, ir-razza, is-sess, il-piż u/jew l-età. Malli jinbeda l-istudju l-varjazzjoni fil-piż tal-annimali użati għandha tkun minima u ma għandhiex taqbeż l-20 % tal-piż medju taż-żewġ sessi. Meta l-istudju jsir bħala studju preliminari għal studju fit-tul jew ta’ ġenerazzjoni sħiħa, idealment fiż-żewġ studji jintużaw annimali li jkunu mill-istess razza u sors.
|
Abitazzjoni u għalf
|
16.
|
Il-proċeduri kollha għandhom ikunu konformi ma’ standards lokali tal-kura tal-annmali tal-laboratorju. It-temperatura fil-kamra tal-esperimenti tal-annimali għandha tkun ta’ 22 °C (± 3 °). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun tal-anqas ta’ 30 % u preferibbilment ma taqbiżx is-70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta’ 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, billi l-fotoperjodu jkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata b’dan il-metodu.
|
|
17.
|
L-annimali għandhom jitqiegħdu f’abitazzjoni fi gruppi żgħar tal-istess sess; l-annimali jistgħu jitqiegħdu f’abitazzjoni waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat. Għal gruppi f’gaġeġ, ma għandux ikun hemm aktar minn ħames annimali jabitaw f’gaġġa waħda. Il-proċeduri ta’ tgħammir għandhom jitwettqu f’gaġeġ adattati għall-iskop. In-nisa tqal għandhom jitqiegħdu fil-gaġeġ waħedhom u jiġu pprovduti b’materjali tat-tibjit. In-nisa li jkunu qed ireddgħu jitqiegħdu f’gaġeġ waħedhom mal-wild tagħhom.
|
|
18.
|
L-għalf għandu jkun analizzat regolarment għall-kontaminanti. Għandu jinżamm kampjun tad-dieta sakemm ikun iffinalizzat ir-rapport.
|
Preparazzjoni tal-annimali
|
19.
|
L-annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ikunu assenjati b’mod każwali lill-gruppi ta’ kontroll u ta’ trattament. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati unikament u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom tal-anqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju biex jippermetti żmien biex jidraw il-kundizzjonijiet fil-laboratorju.
|
Preparazzjoni tad-dożi
|
20.
|
Hu rakkomandat li s-sustanza kimika tat-test tingħata b’mod orali sakemm rotot oħra ta’ amministazzjoni ma jitqisux aktar xierqa. Meta tingħażel ir-rotta orali, is-sustanza kimika tat-test normalment tingħata b’gavage; madankollu, f’każijiet oħra, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw mad-dieta jew mal-ilma tax-xorb.
|
|
21.
|
Meta jkun hemm bżonn, is-sustanza kimika tat-test tinħall jew tiġi sospiża f’veikolu xieraq. Hu rrakkomandat li, kull meta jkun possibbli, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta’ soluzzjoni fl-ilma/sospensjoni, segwit minn kunsiderazzjoni ta’ soluzzjoni/emulsjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħa) u mbagħad possibbilment b’soluzzjoni f’veikoli oħra. Għal veikoli li mhumiex ilma, għandhom ikunu magħrufin il-karatteristiċi tossiċi tal-veikolu. Għandhom jiġu ddeterminati l-istabbiltà u l-omoġenità tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu.
|
PROĊEDURA
Numru u Sess tal-annimali
|
22.
|
Hu rakkomandat li kull grupp jinbeda b’tal-anqas 10 irġiel u 12-13-il mara. In-nisa jiġu evalwati qabel l-esponiment għaċ-ċikliċità estruża u l-annimali li ma jurux ċikli tipiċi ta’ bejn erba’ u ħamest ijiem ma jiddaħħlux fl-istudju; għaldaqstant, huma rakkomandati nisa żejda biex jinkisbu 10 nisa għal kull grupp. Ħlief fil-każ ta’ effetti tossiċi ċari, hu mistenni li dan jipprovdi tal-anqas tmien nisa tqal għal kull grupp li normalment ikun in-numru minimu aċċettabbli ta’ nisa tqal għal kull grupp. L-objettiv hu li jiġu prodotti biżżejjed nisa tqal u wlied biex tkun żgurata evalwazzjoni sinifikattiva tal-potenzjal tas-sustanza kimika tat-test biex taffettwa l-fertilità, it-tqala, l-imġiba materna u tat-treddigħ, u t-tkabbir u l-iżvilupp tal-ulied F1, mill-konċepiment sa 13-il jum wara l-ħlas.
|
Dożaġġ
|
23.
|
Ġeneralment tal-anqas għandhom jintużaw tliet gruppi għat-test u grupp ta’ kontroll. Il-livelli tad-doża jistgħu jkunu bbażati fuq informazzjoni minn testijiet tat-tossiċità akuta jew fuq riżultati minn studji dwar doża ripetuta. Ħlief għat-trattament bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jitqandlu bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintuża veikolu għall-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi l-veikolu fl-ogħla volum użat.
|
|
24.
|
Il-livelli tad-doża għandhom jintgħażlu b’kunsiderazzjoni ta’ kwalunkwe data eżistenti disponibbli dwar it-tossiċità u l-kinetika (jew it-tossikokinetika). Ta’ min iqis ukoll li jista’ jkun hemm differenzi fis-sensittività bejn annimali tqal u annimali mhux tqal. L-ogħla livell ta’ doża għandu jintgħażel bl-għan li jġib effetti tossiċi iżda mhux il-mewt jew tbatija severa. Wara, għandha tingħażel sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża bl-għan li jintwerew kwalunkwe reazzjoni relatata mad-dożaġġ u l-livell bla effett ħażin osservat (NOAEL) fl-anqas livell tad-doża. Intervalli ta’ darbtejn jew ta’ erba’ darbiet ta’ spiss ikunu l-aħjar biex ikunu stabbiliti l-livelli neżlin tad-dożi, u ż-żieda tar-raba’ grupp tat-test sikwit spiss tkun preferibbli milli jintużaw intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ 10) bejn id-dożaġġi.
|
|
25.
|
Meta jkun hemm tossiċità ġenerali osservata (eż. piż tal-ġisem imnaqqas, effetti tal-fwied, qalb, pulmun jew kliewi, eċċ.) jew tibdiliet oħra li jistgħu ma jkunux risponsi tossiċi (eż. konsum anqas ta’ ikel, tkabbir tal-fwied), l-effetti osservati fuq punti ta’ tmiem sensittivi endokrinali għandhom ikunu interpretati b’kawtela.
|
Test tal-limitu
|
26.
|
Jekk studju orali b’livell ta’ doża waħda ta’ mill-anqas 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum jew, għall-amministrazzjoni tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, ta’ perċentwali ekwivalenti fid-dieta jew ta’ ilma tax-xorb, billi jintużaw il-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi osservabbli u jekk ma tkunx mistennija tossiċità bbażata fuq data minn sustanzi relatati strutturalment, f’dak il-każ studju sħiħ bl-użu ta’ diversi livelli ta’ doża jista’ ma jitqiesx li jkun meħtieġ. It-test tal-limitu hu applikabbli apparti minn meta l-eposizzjoni umana tindika il-ħtieġa għal doża orali għola fil-livell użat. Għal tipi oħrajn ta’ amministrazzjoni, bħal ma hi l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanzi kimiċi tat-test, bħal kemm tinħall, ta’ spiss jistgħu jiddettaw il-konċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb.
|
Amministrazzjoni tad-dożi
|
27.
|
L-annimali jingħataw doża tas-sustanza kimika tat-test darba kuljum għal sebat ijiem fil-ġimgħa. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata b’gavage, dan għandu jsir b’doża singola lill-annimali billi jintuża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni adattat. Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment juru effetti ta’ irritazzjoni b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tkun imminimizzata billi l-konċentrazzjoni tkun aġġustata biex ikun żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.
|
|
28.
|
Għas-sustanzi kimiċi tat-test mogħtija permezz tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza kimika tat-test involuti ma jxekklux in-nutrizzjoni jew il-bilanċ tal-ilma normali. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata fid-dieta, jistgħu jintużaw konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm) jew livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal; l-alternattiva użata għandha tkun speċifikata. Għal sustanza amministrata b’gavage, id-doża għandha tingħata f’ħinijiet simili ta’ kull jum, u tiġi aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa biex jinżamm livell kostanti ta’ doża f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal.
|
Skeda sperimentali
|
29.
|
Id-dożaġġ taż-żewġ sessi għandu jibda tal-anqas ġimagħtejn (2) qabel it-tgħammir, wara li jkunu tħallew iderru għal tal-anqas ħamest ijiem u n-nisa jkunu ġew skrinjati għaċ-ċikli estrużi normali (f’perjodu ta’ pretrattament ta’ ġimagħtejn). L-istudju għandu jkun skedat b’tali mod li l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż tibda ftit wara li l-annimali jkunu kisbu maturità sesswali sħiħa. Dan jista’ jvarja ftit għal razez differenti ta’ firien f’laboratorji differenti, eż. firien Sprague Dawley ta’ 10 ġimgħat, firien Wistar li jkollhom madwar 12-il ġimgħa. L-ommijiet b’wild għandhom jinqatlu fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara. Il-jum tat-twellid (meta jitlesta l-ħlas) hu definit bħala l-jum 0 wara l-ħlas. In-nisa li ma juru ebda evidenza ta’ tgħammir jinqatlu 24-26 jum wara l-aħħar jum tal-perjodu ta’ tgħammir. Id-dożaġġ jissokta għaż-żewġ sessi matul il-perjodu ta’ tgħammir. L-irġiel għandhom jibqgħu jingħataw id-doża wara l-perjodu ta’ tgħammir tal-anqas sakemm jitlesta l-perjodu minimu totali ta’ dożaġġ ta’ 28 jum. Imbagħad dawn jinqatlu jew inkella jinżammu u jibqgħu jingħataw id-doża għat-twettiq possibbli tat-tieni fażi ta’ tgħammir jekk jitqies li din tkun xierqa.
|
|
30.
|
Id-dożaġġ ta’ kuljum tan-nisa ommijiet għandu jkompli matul it-tqala u tal-anqas sal-jum 13 wara l-ħlas, b’dan il-jum inkluż, jew sal-jum ta’ qabel is-sagrifiċċju. Għall-istudji li fihom is-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs jew bir-rotta dermali, id-dożaġġ għandu jkompli tal-anqas sal-jum 19 tal-ġestazzjoni, b’dan il-jum inkluż, u d-dożaġġ għandu jerġa’ jinbeda mill-aktar fis possibbli u mhux aktar tard mill-PND 4.
|
|
31.
|
Dijagramma tal-iskeda sperimentali hi mogħtija fl-Appendiċi 2.
|
Priċedura tat-tgħammir
|
32.
|
Normalment, f’dan l-istudju għandu jsir tgħammir 1:1 (raġel wieħed ma’ mara waħda). Jista’ jkun hemm eċċezzjonijiet f’każ ta’ mwiet okkażjonali tal-irġiel. Il-mara għandha titqiegħed mal-istess raġel sakemm tiġi osservata evidenza ta’ tgħammir jew ikunu għaddew ġimagħtejn. Kull filgħodu in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta’ sperma jew ta’ tapp vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala hu definit bħala l-jum li fih tiġi kkonfermata evidenza ta’ tgħammir (jinstabu tapp vaġinali jew sperma). Fil-każ li l-par ma jirnexxix, jista’ jiġi kkunsidrat it-tgħammir mill-ġdid ta’ nisa ma’ rġiel diġa ipprovati tal-istess grupp.
|
Daqs tal-boton
|
33.
|
Fil-jum 4 wara t-twelid, id-daqs ta’ kull boton jista’ jiġi aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda b’għażla aleatorja biex jitrendew, l-aktar viċin possibbli, erba’ jew ħamest ifrieħ għal kull sess għal kull boton skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użata. Il-kampjuni tad-demm għandhom jinġabru minn tnejn mill-frieħ eċċessi, jiġu raggruppati, u jintużaw għad-determinazzjoni tal-livelli tas-serum T4. Ma għandhiex issir eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż. fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem, jew tad-distanza anoġenitali (AGD). Mull meta n-numru ta’ frieħ irġiel jew nisa jipprevjeni milli jkun hemm erbgħa jew ħamsa minn kull sess għal kull boton, hu aċċettabbli li jsir aġġustament parzjali (pereżempju, sitt irġiel u erba’ nisa). Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas mill-mira tal-qtil (8 jew 10 ferħ/boton). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mill-mira tal-qtil, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4.
|
|
34.
|
Jekk id-daqs tal-boton ma jkunx aġġustat, żewġt ifrieħ għal kull boton jiġu sagrifikati fil-jum 4 wara t-twelid u jittieħdu l-kampjuni tad-demm għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-ormon tat-tirojde tas-serum. Jekk possibbli, iż-żewġt ifrieħ għal kull boton għandhom ikunu frieħ nisa biex il-frieħ irġiel jinżammu għall-evalwazzjonijiet taż-żamma tal-beżżula ħlief fil-każ li jekk jitneħħew dawn il-frieħ ma jifdal ebda nisa għall-valutazzjoni fit-terminazzjoni. Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas minn 8 jew 10 ifrieħ/boton (skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użati). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mid-daqs normali tal-boton, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4.
|
Osservazzjonijiet fil-ħajja
Osservazzjonijiet kliniċi
|
35.
|
Matul il-perjodu tat-test, għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali tal-anqas darba kuljum, u aktar spiss meta jiġu osservati sinjali ta’ tossiċità. Idealment dawn għandhom isiru fl-istess ħin kuljum, b’kunsiderazzjoni tal-perjodu bl-ogħla livell ta’ effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Tibdil relevanti fl-imġiba, sinjali ta’ diffikultà jew titwil tal-proċess tal-ħlas u kull sinjal ta’ tossiċità, inkluża l-mortalità, għandhom ikunu irreġistrati. Dawn ir-rekords għandhom jinkludu l-ħin tal-bidu, il-grad u d-durata tas-sinjali ta’ tossiċità.
|
Piż tal-ġisem u konsum ta’ ikel/ilma
|
36.
|
L-irġiel u n-nisa għandhom jintiżnu fl-ewwel jum tad-dożaġġ, tal-anqas darba fil-ġimgħa wara dan, u fit-terminazzjoni. Matul it-tqala, in-nisa għandhom jintiżnu fil-jiem 0, 7, 14 u 20 u fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom ikunu rapportati individwalment għal kull annimal adult.
|
|
37.
|
Matul il-fażi ta’ qabel it-tgħammir, it-tqala u t-treddigħ, il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel tal-anqas darba fil-ġimgħa. Il-kejl tal-konsum tal-ikel matul it-tgħammir hu fakultattiv. Il-konsum tal-ikel matul dawn il-perjodi għandu jitkejjel ukoll meta s-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb.
|
Ċikli estrużi
|
38.
|
Iċ-ċikli estrużi għandhom jiġu ssorveljati qabel ma jibda t-trattament biex għall-istudju jintgħażlu nisa b’ċikliċità regolari (ara l-paragrafu 22). It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu ssorveljati ta’ kuljum ukoll mill-bidu tal-perjodu ta’ trattament sal-evidenza ta’ tgħammir. Jekk ikun hemm tħassib dwar effetti akuti ta’ stress li jistgħu jbiddlu ċ-ċikli estrużi bit-tnedija tad-dożaġġ, il-laboratorji jistgħu jesponu l-annimali tat-test għal ġimagħtejn (2), imbagħad jiġbru tiċpisiet vaġinali ta’ kuljum biex jissorveljaw iċ-ċiklu estruż għal minimu ta’ ġimagħtejn matul il-perjodu ta’ qabel it-tgħammir b’monitoraġġ issoktat fil-perjodu ta’ tgħammir sakemm ikun hemm evidenza ta’ tgħammir. Meta jinkisbu ċelloli vaġinali/ċervikali, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat tfixkil tal-mukoża, li jista’ jinduċi psewdotqala (7) (8).
|
Parametri tal-ulied
|
39.
|
Id-durata tal-ġestazzjoni għandha tiġi reġistrata u hi kkalkolata mill-jum 0 tat-tqala. Kull boton għandu jiġi eżaminat mill-aktar fis possibbli wara l-ħlas biex jiġu stabbiliti n-numru u s-sess tal-frieħ, it-twelid mejjet, it-twelid ħaj, it-twelid mhux żviluppat (frieħ li jkunu ferm iżgħar mill-frieħ tal-kontroll korrispondenti) u l-preżenza ta’ anormalitajiet serji.
|
|
40.
|
Frieħ ħajjin għandhom jingħaddu u jitqassmu skont is-sess u kull boton għandu jintiżen fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Minbarra l-osservazzjonijiet deskritti fil-paragrafu 35, kwalunkwe mġiba anormali tal-wild għandha tiġi reġistrata.
|
|
41.
|
L-AGD ta’ kull ferħ għandha titkejjel fl-istess jum postnatali bejn il-PND 0 sal-PND 4. Il-piż tal-ġisem tal-frieħ għandu jinġabar dakinhar li titkejjel l-AGD u l-AGD għandha tiġi normalizzata għal kejl tad-daqs tal-ferħ, idealment l-għerq kwadrat tal-piż tal-ġisem (9). In-numru ta’ bżieżel/areoli fil-frieħ irġiel għandu jingħadd fil-PND 12 jew 13 kif rakkomandat fil-GD 151 tal-OECD (10).
|
Bijokimika klinika
|
42.
|
Il-kampjuni tad-demm minn sit definit jittieħdu fuq il-bażi tal-iskeda li ġejja:
|
—
|
minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fil-jum 4 wara t-twelid, jekk in-numru ta’ frieħ jippermetti (ara l-paragrafi 33-34)
|
|
—
|
mill-ommijiet kollha u minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fit-terminazzjoni fil-jum 13, u
|
|
—
|
mill-irġiel adulti kollha, fit-terminazzjoni,
|
|
Il-kampjuni kollha tad-demm jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa. Kampjuni tad-demm mill-frieħ tal-jum 13 u mill-irġiel adulti jiġu vvalutati għal-livelli tas-serum għall-ormoni tat-tirojde (T4). Issir valutazzjoni ulterjuri tat-T4 fil-kampjuni tad-demm għall-ommijiet u għall-frieħ tal-jum 4 jekk tkun rilevanti. Hemm l-għażla li jistgħu jitkejlu ormoni oħra jekk ikunu rilevanti. Id-demm tal-frieħ jista’ jiġi raggruppat skont il-boton għall-analiżijiet tal-ormon tat-tirojde. L-ormoni tat-tirojde (T4 u TSH) idealment għandhom jitkejlu bħala “total”.
|
43.
|
Il-fatturi li ġejjin jistgħu jinfluwenzaw il-varjabbiltà u l-konċentrazzjonijiet assoluti tad-determinazzjonijiet tal-ormoni:
|
—
|
il-ħin tal-qatla minħabba varjazzjonijiet tul il-jum tal-konċentrazzjonijiet tal-ormoni
|
|
—
|
il-metodu tal-qatla biex tkun evitata tensjoni bla bżonn għall-annimali li tista’ taffettwa l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni
|
|
—
|
is-settijiet tat-testijiet għad-determinazzjonijiet tal-ormoni li jistgħu jkunu differenti mill-kurvi standard tagħhom.
|
|
|
44.
|
Kampjuni ta’ plażma maħsubin speċifikatament għal determinazzjoni tal-ormoni għandhom jinkisbu f’ħin komparabbli tal-jum. Il-valuri numeriċi miksubin meta jkunu analizzati l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni jkunu differenti fost diversi settijiet ta’ analiżi kummerċjali.
|
Patoloġija
Nekroskopija grossa
|
45.
|
Fil-waqt tas-sagrifiċċju jew tal-mewt matul l-istudju, l-annimali adulti għandhom jiġu eżaminati makroskopikament għal kwalunkwe anormalità jew tibdil patoloġiku. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għall-organi tas-sistema riproduttiva. In-numru ta’ siti ta’ impjantazzjoni għandu jiġi reġistrat. It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu eżaminati filgħodu dakinhar tan-nekroskopija biex jiġi determinat l-istadju taċ-ċiklu estruż u tkun tista’ ssir korrelazzjoni mal-istopatoloġija tal-ovarji.
|
|
46.
|
It-testikoli u l-epididimidi kif ukoll il-bżieżaq tal-prostata u seminali bil-glandoli koagolanti fis-sħuħija tagħhom, tal-annimali adulti rġiel kollha għandhom jiġu mirquma minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u l-piż niedi tagħhom għandu jittieħed mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni biex jiġi evitat milli jinxfu. Barra minn hekk, il-piżijiet tal-organi fakultattivi jistgħu jinkludu l-kumpless tal-levator ani u tal-muskolu bulbokavernuż, il-glandoli ta’ Cowper u r-ras tal-pene fl-irġiel u l-ovarji f’pari (piż imxarrab) u l-utru (inkluż iċ-ċerviċi) fin-nisa; jekk inklużi, dawn il-piżijiet għandhom jinġabru mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni.
|
|
47.
|
Frieħ mejtin u frieħ maqtula fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara, tal-anqas għandhom jiġu eżaminati bir-reqqa esternament għal anormalitajiet serji. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għall-ġenitali riproduttivi esterni li għandhom jiġu eżaminati għal sinjali ta’ żvilupp mibdul. Fil-jum 13, għandha tiġi preservata t-tirojde minn ferħ raġel wieħed u minn ferħ mara waħda għal kull boton.
|
|
48.
|
L-ovarji, it-testikoli, l-organi sesswali aċċessorji (utru u ċerviċi, epididimidu, prostata, bużżieqa seminali u l-glandoli koagolanti), it-tirojde u l-organi kollha li juru leżjonijiet makroskopiċi tal-annimali adulti kollha għandhom jiġu preservati. Il-fissazzjoni formalina mhix rakkomandata għall-eżaminazzjoni ta’ rutina tat-testikoli u tal-epididimidu. Metodu aċċettabbli hu l-użu tal-fissattiv ta’ Bouin jew ta’ Davidsons modifikat għal dawn it-tessuti (11). It-tunika albuġinea tista’ tittaqqab bil-mod u mhux fil-fond fiż-żewġ poli tal-organu b’labra biex jitħalla jkun hemm penetrazzjoni malajr tal-fissattiv.
|
Istopatoloġija
|
49.
|
Għandu jsir eżami istoloġiku dettaljat fuq l-ovarji, it-testikoli u l-epididimide (b’enfasi speċjali fuq l-istadji tal-ispermatoġenesi u l-istopatoloġija tal-istruttura ċellolari testikolari interstizjali) tal-annimali tal-grupp tal-ogħla doża u tal-grupp tal-kontroll. L-organi preservati l-oħra inkluża t-tirojde mill-frieħ u mill-annimali adulti jistgħu jiġu eżaminati meta jkun hemm bżonn. Il-piż tat-tirojde jista’ jiġi ddeterminat wara l-fissazzjoni. It-tirqim għandu jsir ukol b’reqqa kbira u biss wara l-fissazzjoni biex tkun evitata l-ħsara lit-tessut. Il-ħsara fit-tessut tista’ tippreġudika analiżi istopatoloġika. L-eżaminazzjonijiet għandhom ikunu estiżi għall-annimali tal-gruppi l-oħra ta’ dożaġġ meta jkunu osservati tibdiliet fil-grupp tal-ogħla doża. Il-Gwida dwar l-istopatoloġija (11) tagħti aktar informazzjoni dwar id-dissezzjoni, fissazzjoni, tqassim f’taqsimiet u l-istopatoloġija ta’ tessuti endokrinali.
|
DATA U RAPPORTAR
Data
|
50.
|
Għandha tkun ipprovduta d-data dwar l-annimali individwali. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tinġabar f’forma tabulari, u għal kull grupp tat-test għandha turi n-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta’ xi mewt jew qtil uman, in-numru ta’ annimali fertili, in-numru ta’ nisa tqal, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inklużi l-ħin tal-ewwel darba, id-durata, u s-severità ta’ kwalunkwe effett tossiku, it-tip ta’ tibdiliet istopatoloġiċi u d-data rilevanti kollha dwar il-boton. Format tabulari tar-rapport ta’ sommarju li wera li hu tassew siewi għall-evalwazzjoni tal-effett riproduttiv/tal-iżvilupp hu mogħti fl-Appendiċi 3.
|
|
51.
|
Minħabba d-dimensjonijiet limitati tal-istudju, l-analiżijiet statistiċi fil-forma ta’ testijiet għal “sinifikat” huma ta’ valur limitat għal ħafna punti ta’ tmiem, speċjalment il-punti ta’ tmiem riproduttivi. Jekk jintużaw analiżijiet statistiċi, il-metodu magħżul għandu jkun xieraq għad-distribuzzjoni tal-varjabbli eżaminat, u jintgħażel qabel il-bidu tal-istudju. Analiżi statistika tal-AGD u taż-żamma tal-beżżula għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tal-effetti fuq il-boton. Fejn xieraq, il-boton hu l-unità ta’ analiżi. Analiżi statistika tal-piż tal-ġisem tal-frieħ għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tad-daqs tal-boton. Minħabba d-daqs żgħir tal-grupp, l-użu ta’ data storika tal-kontroll (eż. għad-daqs tal-boton), fejn disponibbli, jista’ jkun siewi wkoll bħala għajnuna għall-interpretazzjoni tal-istudju.
|
Evalwazzjoni tar-riżultati
|
52.
|
Is-sejbiet ta’ dan l-istudju tat-tossiċità għandhom jiġu evalwati f’termini tal-effetti osservati, tan-nekroskopija u tas-sejbiet mikroskopiċi. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni bejn id-doża u s-sustanza kimika tat-test u l-preżenza jew l-assenza, l-inċidenza jew is-severità tal-annormalitajiet, inklużi l-feriti kbar, l-organi tal-mira identifikati, l-infertilità, l-anormalitajiet kliniċi, l-imġiba tar-riproduzzjoni u l-boton affettwati, it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem, l-effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossiċi oħra.
|
|
53.
|
Minħabba l-perjodu qasir ta’ trattament tal-irġiel, l-istopatoloġija tat-testikoli u tal-epididimu għandha tiġi kkunsidrata flimkien mad-data dwar il-fertilità meta jiġu vvalutati l-effetti riproduttivi fuq l-irġiel. L-użu ta’ data storika tal-kontroll fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp (eż. għad-daqs tal-boton, l-AGD, iż-żamma tal-beżżula, il-livelli tas-serum T4), fejn disponibbli, jista’ jkun siewi wkoll bħala għajnuna għall-interpretazzjoni tal-istudju.
|
|
54.
|
Għall-kontroll tal-kwalità hu propost li tinġabar data storika ta’ kontroll u li għad-data numerika jkunu kkalkolati l-koeffiċjenti ta’ varjazzjoni, speċjalment għall-parametri li jkollhom rabta mad-detezzjoni tal-interferenti endokrinali. Din id-data tista’ tintuża għal finijiet ta’ paragun meta jkunu evalwati studji attwali.
|
Rapport tat-test
|
55.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
|
Sustanza kimika tat-test:
|
—
|
is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli
|
|
—
|
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.
|
|
|
|
Sustanza monokostitwenti:
|
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
|
—
|
l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
|
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
|
—
|
ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
|
|
|
|
Veikolu (jekk xieraq):
|
—
|
ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu jekk mhuwiex ilma.
|
|
|
|
L-annimali tat-test:
|
—
|
l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;
|
|
—
|
is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;
|
|
—
|
il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.
|
|
—
|
ġustifikazzjoni għal speċi jekk ma jkunx far
|
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test:
|
—
|
ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
|
|
—
|
dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjonijiet, l-istabbiltà u l-omoġenità miksubin tal-preparazzjoni;
|
|
—
|
dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;
|
|
—
|
konverżjoni minn dieta/konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ta’ ilma tax-xorb (ppm) għad-doża attwali (mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;
|
|
—
|
dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;
|
|
—
|
deskrizzjoni dettaljata tal-proċedura ta’ każwalizzazzjoni biex jintgħażlu l-frieħ għall-qtil, jekk jinqatlu.
|
|
|
|
Ir-riżultati:
|
—
|
il-piż tal-ġisem/it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;
|
|
—
|
il-konsum ta’ ikel, u konsum ta’ ilma, jekk disponibbli;
|
|
—
|
id-data dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u d-doża, inklużi l-fertilità, il-ġestazzjoni u kwalunkwe sinjal ieħor ta’ tossiċità;
|
|
—
|
it-tul tal-ġestazzjoni;
|
|
—
|
l-effetti tossiċi jew oħra fuq ir-riproduzzjoni, l-ulied, it-tkabbir ta’ wara t-twelid, eċċ.;
|
|
—
|
in-natura, is-severità u d-durata tal-osservazzjonijiet kliniċi (jekk reversibbli jew le);
|
|
—
|
in-numru ta’ nisa adulti b’ċiklu estruż normali jew anormali u d-durata taċ-ċiklu;
|
|
—
|
in-numru ta’ twelid ħaj u ta’ telf ta’ wara l-impjantazzjoni;
|
|
—
|
id-data dwar il-piż tal-ġisem tal-frieħ
|
|
—
|
l-AGD tal-frieħ kollha (u l-piż tal-ġisem fl-jum tal-kejl tal-AGD)
|
|
—
|
iż-żamma tal-beżżula fil-frieħ irġiel,
|
|
—
|
il-livelli tal-ormon tat-tirojde, il-frieħ tal-jum 13 u l-irġiel adulti (u l-ommijiet u l-frieħ tal-jum 4 jekk jitkejlu)
|
|
—
|
in-numru ta’ frieħ b’anormalitajiet viżibbli ċari, evalwazzjoni grossa tal-ġenitali esterni, in-numru ta’ frieħ imwielda żgħar;
|
|
—
|
il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;
|
|
—
|
in-numru ta’ impjantazzjonijiet, id-daqs tal-boton u l-piżijiet tal-boton fil-ħin tar-reġistrazzjoni;
|
|
—
|
il-piż tal-ġisem fis-sagrifiċċju u d-data dwar il-piż tal-organi għall-annimali ġenituri;
|
|
—
|
sejbiet tan-nekroskopija;
|
|
—
|
deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatoloġiċi;
|
|
—
|
id-dettalji tal-assorbiment (jekk disponibbli);
|
|
—
|
trattament statistiku tar-riżultati, fejn xieraq.
|
|
Diskussjoni tar-riżultati.
Kunklużjonijiet.
|
Interpretazzjoni tar-riżultati
|
56.
|
L-istudju jipprovdi evalwazzjonijiet tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp assoċjata mal-amministrazzjoni ta’ dożi ripetuti (ara l-paragrafi 5 u 6). Jista’ jipprovdi indikazzjoni tal-ħtieġa li jsiru investigazzjonijiet ulterjuri u jipprovdi gwida fit-tfassil tal-istudji sussegwenti. Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 43 għandu jiġi kkonsultat għal għajnuna fl-interpetazzjoni tar-riżultati dwar ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp (12). Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 106 dwar l-Evalwazzjoni Istoloġika tat-Testijiet Endokrinali u Riproduttivi fir-Rodituri (11) jipprovdi informazzjoni dwar it-tħejjija u l-evalwazzjoni tal-organi (endokrinali) u tat-tiċpisiet vaġinali li jistgħu jkunu ta’ għajnuna għal din it-TG.
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
OECD (1990). Dokument tas-seduta Nru 1 għall-14-il Laqgħa Konġunta tal-Chemicals Group and Management Committee. Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(2)
|
OECD (1992). Ir-Rapport tal-President tal-Laqgħa ta’ Esperti ad hoc dwar il-Metodi ta’ Skrinjar tat-Tossiċità Riproduttiva, Tokyo, 27-29 ta’ Ottubru, 1992. Disponibbli Fuq Talba Mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(3)
|
OECD (1998). Rapport tal-Ewwel Laqgħa tat-Task Force tal-OECD dwar l-Ittestjar u l-Valutazzjoni tal-Interferenti Endokrinali (EDTA), 10-11 ta’ Marzu 1998. Disponibbli Fuq Talba Mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(4)
|
OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(5)
|
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(6)
|
OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(7)
|
Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. u Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Parti B, 80 (2), 84-97.
|
|
(8)
|
Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, f’Auston C.R. u Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.
|
|
(9)
|
Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. u Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
|
|
(10)
|
OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(11)
|
OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(12)
|
OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET (ARA WKOLL IL-GD 150 TAL-OECD (6))
Androġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu.
Antiandroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu.
Antiestroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu.
Attività tal-antitirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu.
Sustanza kimika hi sustanza jew taħlita.
Tossiċità tal-iżvilupp: il-manifestazzjoni tat-tossiċità riproduttiva, li tirrappreżenta disturbi strutturali jew funzjonali prenatali, perinatali u postnatali fil-wild.
Dożaġġ hi terminu ġenerali li jinvolvi d-doża, il-frekwenza tagħha u d-durata tad-dożaġġ.
Doża hi l-ammont ta’ sustanza kimika tat-test mogħtija. Id-doża hi espressa bħala piż tas-sustanza kimika tat-test għal kull unità ta’ piż tal-ġisem ta’ annimal tat-test għal kull jum (eż. mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jew bħala konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta.
Tossiċità evidenti hi terminu ġenerali li jiddeskrivi sinjali ċari ta’ tossiċità wara li tkun ġiet amministrata kimika għall-ittestjar. Dawn għandhom ikunu suffiċjenti għal valutazzjoni tal-periklu u għandhom ikunu tali li żieda fid-doża amministrata tista’ tkun mistennija li tirriżulta fl-iżvilupp ta’ sinjali ta’ tossiċità estrema u probabbilment mortalità.
Indeboliment tal-fertilità tirrappreżenta disturbi tal-funzjonijiet jew tal-kapaċità riproduttivi tal-irġiel jew tan-nisa.
Tossiċità materna: effetti avversi fuq nisa tqal, li jseħħu b’mod speċfiku (effett dirett) jew mhux speċifiku (effett indirett).
NOAEL hi l-abbrevjazzjoni għal-livell bla effett ħażin osservat. Dan hu l-ogħla livell ta’ doża fejn l-ebda sejbiet ħżiena relatati ma’ trattament ma jkunu osservati minħabba trattament.
Estroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu.
Tossiċità riproduttiva tirrappreżenta l-effetti dannużi fuq il-wild u/jew indeboliment tal-funzjonijiet jew tal-kapaċità riproduttivi tal-irġiel u tan-nisa.
Sustanza kimika tat-test hi kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
Attività tat-tirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu.
Validazzjoni hi proċess xjentifiku mfassal biex jiġu karatterizzati r-rekwiżiti u l-limitazzjonijiet operazzjonali ta’ metodu ta’ ttestjar u biex tintwera l-affidabbiltà u r-relevanza tiegħu għal skop partikolari.
Appendiċi 2
DIJAGRAMMA TAL-ISKEDA SPERIMENTALI LI TINDIKA D-DURATA MASSIMA TAL-ISTUDJU, FUQ IL-BAŻI TA’ PERJODU SĦIĦ TA’ TGĦAMMIR FUQ 14-IL JUM
Appendiċi 3
RAPPORT SOMMARJU TABULARI TAL-EFFETTI FUQ IR-RIPRODUZZJONI/L-IŻVILUPP
|
OSSERVAZZJONIJIET
|
Valuri
|
|
|
|
Dożaġġ (unitajiet)
|
0 (kontroll)
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
Pari mibdija (N)
|
|
|
|
|
|
|
Ċiklu estruż (tal-anqas it-tul medju u l-frekwenza taċ-ċikli irregolari)
|
|
|
|
|
|
|
Nisa li juru evidenza ta’ tgħammir (N)
|
|
|
|
|
|
|
Nisa li jilħqu t-tqala (N)
|
|
|
|
|
|
|
Jiem tal-konċepiment 1 - 5 (N)
|
|
|
|
|
|
|
Jiem tal-konċepiment 6 -...(
(21)
) (N)
|
|
|
|
|
|
|
Tqala ≤ 21 jum (N)
|
|
|
|
|
|
|
Tqala = 22 jum (N)
|
|
|
|
|
|
|
Tqala ≥ 23 jum (N)
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’żgħar ħajjin imwielda (N)
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’żgħar ħajjin imwielda fil-jum 4 pp (N)
|
|
|
|
|
|
|
Impjanti/omm (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Frieħ ħajjin/omm fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Frieħ ħajjin/omm fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Proporzjon tas-sessi (r/n) fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Proporzjon tas-sessi (r/n) fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-boton fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-boton fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-ħin tal-kejl tal-AGD (medja tal-irġiel, medja tan-nisa)
|
|
|
|
|
|
|
AGD tal-frieħ fl-istess jum wara t-twelid, fil-ħlas – fil-jum 4 (medja tal-irġiel, medja tan-nisa, nota tal-PND)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Żamma tal-beżżula tal-frieħ irġiel fil-jum 13 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-jum 13 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
FRIEĦ ANORMALI
|
|
Ommijiet b’0
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’1
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet bi ≥ 2
|
|
|
|
|
|
|
|
|
TELF TAL-ULIED
|
|
|
|
Impjantazzjonijiet qabel/wara t-twelid (impjantazzjonijiet nieqes it-twelid ħaj)
|
|
Nisa b’0
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’1
|
|
|
|
|
|
|
Nisa bi 2
|
|
|
|
|
|
|
Nisa bi ≥ 3
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Wara t-twelid (twelid ħaj nieqes il-ħajjin fil-jum 13 wara t-twelid)
|
|
Nisa b’0
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’1
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’2
|
|
|
|
|
|
|
Nisa bi ≥ 3
|
|
|
|
|
|
B.64 STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ B’DOŻA RIPETUTA KOMBINAT MAT- TEST TA SKRINJAR TAT-TOSSIĊITÀ RIPRODUTTIVA/TAL-IŻVILUPP
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 422 tal-OECD (2016). Il-linji gwida tal-OECD għall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku. Il-linja gwida tat-test ta’ skrinjar oriġinali 422 ġiet adottata fl-1996, fuq il-bażi ta’ protokoll għal “Doża Ripetuta Kombinata u Test ta’ Skrinjar Riproduttiv/tal-Iżvilupp” diskuss f’żewġ laqgħat ta’ esperti, f’Londra fl-1990 (1) u f’Tokyo fl-1992 (2).
|
|
2.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jgħaqqad parti tal-iskrinjar tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp li hi bbażata fuq l-esperjenza miksuba fil-Pajjiżi membri mill-użu tal-metodu oriġinali fuq sustanzi kimiċi eżistenti b’volum ta’ produzzjoni għoli u f’testijiet esploratorji b’sustanzi tal-kontroll pożittiv (3) (4), u parti tat-tossiċità b’doża ripetuta, b’mod konkordat mal-linja gwida tat-test 407 tal-OECD (Studju dwar it-Tossiċità Orali fuq 28 Jum b’Doża Ripetuta, li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness).
|
|
3.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar ġie aġġornat b’punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali, bħala segwitu għall-attività ta’ prijorità għolja mnedija fl-OECD fl-1998 biex jiġu riveduti l-linji gwida tat-test eżistenti u jiġu żviluppati linji gwida tat-test ġodda għall-iskrinjar u għall-ittestjar ta’ interferenti endokrinali potenzjali (5). F’dan il-kuntest, it-TG 407 (li jikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness) issaħħet fl-2008 b’paramettri xierqa għall-individwar tal-attività endokrinali tas-sustanzi kimiċi tat-test. L-objettiv fl-aġġornar tat-TG 422 kien li jiġu inklużi xi punti ta’ tmiem rilevanti ta’ interferenti endokrinali fit-TGs tal-iskrinjar meta l-perjodi ta’ esponiment ikopru wħud mill-perjodi sensittivi matul l-iżvilupp (perjodi ta’ qabel it-twelid jew ta’ kmieni wara t-twelid).
|
|
4.
|
Il-punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali addizzjonali magħżula, li wkoll huma parti mit-TG 443 (Studju Estiż dwar it-Tossiċità Riproduttiva f’Ġenerazzjoni Waħda, li jikkorrispondi għall-Kapitolu B.56 ta’ dan l-Anness), kienu inklużi fit-TG 422 fuq il-bażi ta’ studju tal-fattibbiltà li jindirizza mistoqsijiet xjentifiċi u tekniċi relatati mal-inklużjoni tagħhom, kif ukoll adattamenti possibbli fid-disinn tat-test meħtieġa għall-inklużjoni tagħhom (6).
|
|
5.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jiġġenera informazzjoni limitata rigward l-effetti ta’ sustanza kimika tat-test fuq il-prestazzjoni riproduttiva fl-irġiel u fin-nisa bħall-funzjoni gonadali, l-imġiba tat-tgħammir, il-konċepiment, l-iżvilupp tal-konċepit u l-ħlas. Mhuwiex alternattiva għall-metodi ta’ ttestjar eżistenti B.31, B.34, B.35 jew B.56 u lanqas ma jiħdilhom posthom.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
|
6.
|
Fil-valutazzjoni u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi ta’ sustanza kimika tat-test, id-determinazzjoni ta’ tossiċità orali bl-użu ta’ dożi ripetuti tista’ ssir wara li tkun inkisbet l-informazzjoni inizjali dwar it-tossiċità bl-ittestjar akut. Dan l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar il-perikli possibbli għas-saħħa li aktarx li jirriżultaw minn esponiment ripetut fuq perjodu relattivament limitat ta’ żmien. Il-metodu jinkludi l-istudju dwar id-doża bażika ripetuta ta’ tossiċità li jista’ jintuża għal kimiċi li dwarhom ma jkunx jista’ jsir studju ta’ 90 jum (eż. meta l-volum tal-produzzjoni ma jkunx jeċċedi ċerti limiti) jew bħala studju preliminari għal studju fit-tul. Fit-twettiq tal-istudju, għandhom jiġu segwiti l-prinċipji ta’ gwida u l-kunsiderazzjonijiet spjegati fid-dokument ta’ gwida nru 19 tal-OECD dwar ir-rikonoxximent, il-valutazzjoni, u l-użu ta’ sinjali kliniċi bħala punti ta’ tmiem umanitarji għal annimali sperimentali użati fl-evalwazzjonijiet tas-sikurezza (7).
|
|
7.
|
Jinkludi wkoll test ta’ skrinjar tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp u, għalhekk, jista’ jintuża wkoll biex jipprovdi informazzjoni inizjali dwar l-effetti possibbli fuq il-prestazzjoni riproduttiva tal-irġiel u tan-nisa bħall-funzjoni gonadali, l-imġiba tat-tgħammir, il-konċepiment, l-iżvilupp tal-konċepit u tal-ħlas, fi stadju bikri tal-valutazzjoni tal-proprjetajiet tossikoloġiċi tas-sustanzi kimiċi tat-test, jew inkella fuq is-sustanzi kimiċi tat-test ta’ tħassib. Dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni kompluta fuq l-aspetti kollha tar-riproduzzjoni u tal-iżvilupp. B’mod partikolari, dan joffri biss mezz limitat kif jiġu individwati l-manifestazzjonijiet ta’ wara t-twelid ta’ esponiment ta’ qabel it-twelid, jew l-effetti li jistgħu jiġu indotti matul l-esponiment ta’ wara t-twelid. Minħabba (fost raġunijiet oħra) is-selettività tal-punti ta’ tmiem, u d-durata qasira tal-istudju, dan il-metodu mhux se jipprovdi evidenza għal dikjarazzjonijiet definiti ta’ ebda effett fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp. Barra minn hekk, fin-nuqqas ta’ data minn testijiet oħra dwar it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, ir-riżultati pożittivi huma siewja għall-valutazzjoni inizjali tal-periklu u jikkontribwixxu għal deċiżjonijiet b’rabta man-neċessità u mat-tempestività tat-testijiet addizzjonali.
|
|
8.
|
Ir-riżultati miksubin mill-parametri relatati mas-sistema endokrinali għandhom jitqiesu fil-kuntest tal-“Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni ta’ Sustanzi Kimiċi Interferenti Endokrinali” (8). F’dan il-Qafas Kunċettwali, it-TG 422 imtejba tal-OECD tinsab fil-livell 4 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi data dwar l-effetti avversi fuq il-punti ta’ tmiem endokrinali rilevanti. Madankollu, sinjal endokrinali waħdu jaf ma jitqiesx evidenza suffiċjenti li s-sustanza kimika tat-test hi interferent endokrinali.
|
|
9.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jenfasizza wkoll fuq l-effetti newroloġiċi bħala punt ta’ tmiem, u fuq il-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet kliniċi bil-galbu tal-annimali, biex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni. Il-metodu għandu jidentifika is-sustanzi kimiċi li għandhom potenzjal newrotossiku, u li jistgħu jiġġustifikaw investigazzjoni approfondita ulterjuri ta’ dan l-aspett. Barra minn hekk, il-metodu jista’ jagħti wkoll indikazzjoni bażika tal-effetti immunoloġiċi.
|
|
10.
|
Fin-nuqqas ta’ data minn studji oħra dwar it-tossiċità sistemika, it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, in-newrotossiċità u/jew l-immunotossiċità, ir-riżultati pożittivi huma siewja għall-valutazzjoni inizjali tal-periklu u jikkontribwixxu għal deċiżjonijiet b’rabta man-neċessità u mat-tempestività tat-testijiet addizzjonali. It-test jista’ jkun partikolarment siewi bħala parti mill-Ġabra ta’ Data għall-Analiżi (SIDS) tal-OECD għall-valutazzjoni tas-sustanzi kimiċi eżistenti li għalihom ftit li xejn ikun hemm informazzjoni tossikoloġika disponibbli jew ebda informazzjoni affattu u jista’ jservi bħala alternattiva għat-twettiq ta’ żewġ testijiet separati għal tossiċità b’doża ripetuta (TG 407 tal-OECD, li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness) u t-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp (TG 421 tal-OECD, li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.63 ta’ dan l-Anness), rispettivament. Jista’ jintuża wkoll bħala studju ta’ individwazzjoni tad-doża għal studji aktar estensivi dwar ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp, jew meta jitqies rilevanti għal xi raġuni oħra.
|
|
11.
|
Ġeneralment jiġi preżunt li jkun hemm differenzi fis-sensittività bejn annimali tqal u mhux tqal. Konsegwentement, jista’ jkun aktar kumplikat li jiġu determinati livelli tad-doża f’dan it-test kombinat li jkunu adegwati biex jiġu evalwati kemm it-tossiċità sistemika ġenerali kif ukoll it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp speċifika, minflok meta t-testijiet indiviwali jitwettqu b’mod separat. Barra minn hekk, l-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test fir-rigward tat-tossiċità sistemika ġenerali tista’ tkun aktar diffiċli milli meta jitwettaq studju separat b’doża ripetuta, speċjalment meta l-parametri tas-serum u tal-istopatoloġija ma jkunux evalwati fl-istess ħin fl-istudju. Minħabba dawn il-kumplesstajiet tekniċi, hi meħtieġa esperjenza konsiderevoli fl-ittestjar tat-tossiċità għat-twettiq ta’ dan it-test ta’ skrinjar kombinat. Min-naħa l-oħra, apparti n-numru iżgħar ta’ annimali involuti, it-test kombinat jista’ joffri mezz aħjar kif jiġu disrkiminati l-effetti diretti fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp minn dawk li huma sekondarji għal effetti (sistemiċi) oħra.
|
|
12.
|
F’dan it-test, il-perjodu ta’ dożaġġ hu itwal milli fi studju konvenzjonali b’doża ripetuta fuq 28 jum. Madankollu, juża anqas annimali ta’ kull sess għal kull grupp meta mqabbel mas-sitwazzjoni li fiha jitwettaq studju konvenzjonali b’doża ripetuta fuq 28 jum minbarra Test ta’ Skrinjar tat-Tossiċità Riproduttiva/tal-Iżvilupp.
|
|
13.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jassumi amministrazzjoni orali tas-sustanza kimika tat-test. Jaf ikun hemm bżonn ta’ modifiki jekk jintużaw rotot oħra ta’ esponiment.
|
|
14.
|
Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
|
|
15.
|
Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
16.
|
Is-sustanza kimika tat-test tingħata f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ rġiel u nisa. L-irġiel għandhom jingħataw doża għal minimu ta’ erba’ ġimgħat, sal-jum ta’ qabel il-qatla skedata (dan jinkludi minimu ta’ ġimagħtejn qabel it-tgħammir, matul il-perjodu ta’ tgħammir u, bejn wieħed u ieħor, ġimagħtejn wara t-tgħammir). Fid-dawl tal-perjodu ta’ dożaġġ limitat ta’ qabel it-tgħammir, il-fertilità jaf ma tkunx indikatur partikolarment sensittiv ta’ tossiċità testikolari. Għaldaqstant, eżami istoloġiku dettaljat tat-testikoli hu essenzjali. Il-kombinazzjoni tal-perjodu ta’ dożaġġ ta’ qabel it-tgħammir ta’ ġimagħtejn u l-osservazzjonijiet sussegwenti dwar it-tgħammir/il-fertilità b’perjodu ta’ dożaġġ ġenerali ta’ tal-anqas erba’ ġimgħat, segwiti minn istopatoloġija dettaljata tal-gonadi tal-irġiel, hija meqjusa suffiċjenti biex tkun tista’ tiġi individwata l-maġġoranza tal-effetti fuq il-fertilità u l-ispermatoġenesi tal-irġiel.
|
|
17.
|
In-nisa għandhom jingħataw doża matul l-istudju kollu. Dan jinkludi ġimagħtejn qabel it-tgħammir (bl-objettiv li jkunu koperti tal-anqas żewġ ċikli estrużi sħaħ), il-ħin varjabbli sal-konċepiment, id-durata tat-tqala u tal-anqas 13-il jum wara l-ħlas, sa u inkluż il-jum ta’ qabel il-qatla skedata.
|
|
18.
|
Id-durata tal-istudju, wara l-akklimatizzazzjoni u l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż ta’ qabel id-dożaġġ, tiddependi mill-prestazzjoni tan-nisa u hi madwar 63 jum, [tal-anqas 14-il jum qabel it-tgħammir, (sa) 14-il jum tat-tgħammir, 22 jum tal-ġestazzjoni, 13-il jum tat-treddigħ].
|
|
19.
|
Matul il-perjodu ta’ amministrazzjoni l-annimali jkunu osservati mill-qrib, kull jum għal sinjali ta’ tossiċità. L-annimali li jmutu jew li jinqatlu matul it-test issirilhom awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali li jkunu baqgħu ħajjin jinqatlu u ssirilhom awtopsja.
|
DESKRIZZJONI TAL-METODU
Għażla tal-ispeċi tal-annimali
|
20.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jintuża b’firien. Għandha tingħata ġustifikazzjoni dettaljata jekk il-parametri speċifikati f’dan it-TG 422 ikunu investigati fi speċijiet oħra ta’ rodituri. Fil-programm internazzjonali ta’ validazzjoni għad-detezzjoni tal-interferenti endokrinali fit-TG 407, il-far kien l-unika speċi użata. Ma għandhomx jintużaw razez b’fekundità baxxa jew li huma magħrufa li għandhom inċidenza għolja ta’ difetti fl-iżvilupp. Għandhom ikunu użati annimali verġni f’saħħithom li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali preċedenti. L-annimali ittestjati għandhom ikunu karatterizzati skont l-ispeċi, ir-razza, is-sess, il-piż u/jew l-età. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali użati ma għandux jaqbeż ± 20 % tal-valur medju ta’ kull sess. Meta l-istudju jsir bħala studju preliminari għal studju fit-tul jew ta’ ġenerazzjoni sħiħa, idealment fiż-żewġ studji jintużaw annimali li jkunu mill-istess razza u sors.
|
Abitazzjoni u għalf
|
21.
|
Il-proċeduri kollha għandhom ikunu konformi ma’ standards lokali tal-kura tal-annmali tal-laboratorju. It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperiment għandha tkun ta’ 22 °C (± 3 °). L-umdità relattiva għandha tkun tal-anqas ta’ 30 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, billi l-fotoperjodu jkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata b’dan il-metodu.
|
|
22.
|
L-annimali għandhom jitqiegħdu f’abitazzjoni fi gruppi żgħar tal-istess sess; l-annimali jistgħu jitqiegħdu f’abitazzjoni waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat. Għal gruppi f’gaġeġ, ma għandux ikun hemm aktar minn ħames annimali jabitaw f’gaġġa waħda. Il-proċeduri ta’ tgħammir għandhom jitwettqu f’gaġeġ adattati għall-iskop. In-nisa tqal għandhom jitqiegħdu fil-gaġeġ waħedhom u jiġu pprovduti b’materjali tat-tibjit. In-nisa li jkunu qed ireddgħu jitqiegħdu f’gaġeġ waħedhom mal-wild tagħhom.
|
|
23.
|
L-għalf għandu jkun analizzat regolarment għall-kontaminanti. Għandu jinżamm kampjun tad-dieta sakemm ikun iffinalizzat ir-rapport.
|
Preparazzjoni tal-annimali
|
24.
|
Annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma miġbura kif jinzerta u assenjati għall-gruppi tat-trattament u għall-gaġeġ. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati unikament u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom tal-anqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju biex jippermetti żmien biex jidraw il-kundizzjonijiet fil-laboratorju.
|
Preparazzjoni tad-dożi
|
25.
|
Hu rakkomandat li s-sustanza kimika tat-test tingħata b’mod orali sakemm rotot oħra ta’ amministazzjoni ma jitqisux aktar xierqa. Meta tingħażel ir-rotta orali, is-sustanza kimika tat-test normalment tingħata b’gavage; madankollu, f’każijiet oħra, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw ukoll mad-dieta jew mal-ilma tax-xorb.
|
|
26.
|
Meta jkun hemm bżonn, is-sustanza kimika tat-test tinħall jew tiġi sospiża f’veikolu xieraq. Hu rrakkomandat li, kull meta jkun possibbli, l-ewwel għandu jitqies l-użu ta’ soluzzjoni/sospensjoni fl-ilma, segwit minn konsiderazzjoni ta’ soluzzjoni/sospensjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħa) u mbagħad possibbilment b’soluzzjoni f’veikoli oħra. Għal veikoli mhux milwiema, għandhom ikunu magħrufin il-karatteristiċi tossiċi tal-veikolu. Għandhom jiġu ddeterminati l-istabbiltà u l-omoġenità tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu.
|
PROĊEDURA
Numru u Sess tal-annimali
|
27.
|
Hu rakkomandat li kull grupp jinbeda b’tal-anqas 10 irġiel u 12-13-il mara. In-nisa jiġu evalwati qabel l-esponiment għaċ-ċikliċità estruża u l-annimali li ma jurux ċikli tipiċi ta’ bejn erba’ u ħamest ijiem ma jiddaħħlux fl-istudju; għaldaqstant, huma rakkomandati nisa żejda biex jinkisbu 10 nisa għal kull grupp. Ħlief fil-każ ta’ effetti tossiċi ċari, hu mistenni li dan jipprovdi tal-anqas tmien nisa tqal għal kull grupp li normalment ikun in-numru minimu aċċettabbli ta’ nisa tqal għal kull grupp. L-objettiv hu li jiġu prodotti biżżejjed nisa tqal u wlied biex tkun żgurata evalwazzjoni sinifikattiva tal-potenzjal tas-sustanza kimika tat-test biex taffettwa l-fertilità, it-tqala, l-imġiba materna u tat-treddigħ, u t-tkabbir u l-iżvilupp tal-ulied F1, mill-konċepiment sa 13-il jum wara l-ħlas. Jekk il-qtil interim ikun pjanat, in-numru għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali ppjanati li jinqatlu qabel tmiem l-istudju. Għandha tingħata konsiderazzjoni għal grupp satellitarju addizzjonali ta’ ħames annimali għal kull sess fil-grupp ta’ kontroll u f’dak tad-doża l-aktar għolja għall-osservazzjoni ta’ riversibbiltà, persistenza jew okkorrenza mdewma ta’ effetti tossiċi sistemiċi, għal mill-anqas 14-il jum wara it-trattament. L-annimali tal-gruppi satellitarji ma jitgħammrux u, konsegwentement, ma jintużawx għall-valutazzjoni tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp.
|
Dożaġġ
|
28.
|
Ġeneralment, tal-anqas għandhom jintużaw tliet gruppi għat-test u grupp ta’ kontroll. Jekk ma jkun hemm l-ebda data adattata disponibbli dwar it-tossiċità ġenerali, jista’ jsir studju dwar tiftix ta’ firxa (annimali tal-istess razza u sors) bħala għajnuna għad-determinazzjoni tad-dożi li jkollhom jintużaw. Ħlief għat-trattament bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jitqandlu bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintuża veikolu biex tkun amministrata s-sustanza kimika tat-test, il-grupp ta’ kontroll għandu jirċievi l-veikolu fl-ogħla volum użat.
|
|
29.
|
Il-livelli tad-doża għandhom jintgħażlu b’kunsiderazzjoni ta’ kwalunkwe data eżistenti disponibbli dwar it-tossiċità u l-kinetika (jew it-tossikokinetika). Ta’ min iqis ukoll li jista’ jkun hemm differenzi fis-sensittività bejn annimali tqal u annimali mhux tqal. L-ogħla livell ta’ doża għandu jintgħażel bl-għan li jġib effetti tossiċi iżda mhux il-mewt jew tbatija evidenti. Wara, għandha tingħażel sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża bl-għan li jintwerew kwalunkwe reazzjoni relatata mad-dożaġġ u ebda effett avvers fl-anqas livell tad-doża. Intervalli ta’ darbtejn jew ta’ erba’ darbiet ta’ spiss ikunu ottimali u ż-żieda tar-raba’ grupp tat-test sikwit spiss tkun preferibbli milli jintużaw intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ 10) bejn id-dożaġġi.
|
|
30.
|
Meta jkun hemm tossiċità ġenerali osservata (eż. piż tal-ġisem imnaqqas, effetti tal-fwied, qalb, pulmun jew kliewi, eċċ.) jew tibdiliet oħra li jistgħu ma jkunux risponsi tossiċi (eż. konsum anqas ta’ ikel, tkabbir tal-fwied), l-effetti osservati fuq punti ta’ tmiem sensittivi endokrinali għandhom ikunu interpretati b’kawtela.
|
Test tal-limitu
|
31.
|
Jekk studju orali b’livell ta’ doża waħda ta’ mill-anqas 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum jew, għall-amministrazzjoni tad-dieta, ta’ perċentwali ekwivalenti fid-dieta, jew ta’ ilma tax-xorb (fuq il-bażi tad-determinazzjonijiet tal-piż tal-ġisem), billi jintużaw il-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi osservabbli u jekk ma tkunx mistennija tossiċità bbażata fuq data minn sustanzi relatati strutturalment, f’dak il-każ studju sħiħ bl-użu ta’ diversi livelli ta’ doża jista’ ma jitqiesx li jkun meħtieġ. It-test ta’ limitu japplika ħlief meta espożizzjoni umana tindika l-ħtieġa li jkollu jintuża livell ogħla ta’ doża. Għal tipi oħrajn ta’ amministrazzjoni, bħal ma hi l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanzi kimiċi tat-test, bħal kemm tinħall, ta’ spiss jistgħu jiddettaw l-esponiment massimu li jista’ jinkiseb.
|
Amministrazzjoni tad-dożi
|
32.
|
L-annimali jingħataw doża tas-sustanza kimika tat-test darba kuljum għal sebat ijiem f’ġimgħa. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata b’gavage, dan għandu jsir b’doża singola lill-annimali billi jintuża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni adattat. Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment juru effetti ta’ irritazzjoni b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tkun imminimizzata billi l-konċentrazzjoni tkun aġġustata biex ikun żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.
|
|
33.
|
Għal sustanzi kimiċi tat-test mogħtija permezz tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza kimika tat-test involuti ma jxekklux in-nutrizzjoni jew il-bilanċ tal-ilma normali. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata fid-dieta, konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm) jew livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal, jista’ jkun użat; l-alternattiva użata għandha tkun speċifikata. Għal sustanza amministrata b’gavage, id-doża għandha tingħata f’ħinijiet simili ta’ kull jum, u tiġi aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa biex jinżamm livell kostanti ta’ doża f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal. Meta l-istudju kombinat jintuża bħala preliminari għal studju tat-tossiċità riproduttiva fit-tul jew sħiħ, għandha tintuża dieta simili fiż-żewġ studji.
|
Skeda sperimentali
|
34.
|
Id-dożaġġ taż-żewġ sessi għandu jibda ġimagħtejn (2) qabel it-tgħammir, wara li jkunu tħallew iderru għal tal-anqas ħamest ijiem u n-nisa jkunu ġew skrinjati għaċ-ċikli estrużi normali (f’perjodu ta’ pretrattament ta’ ġimagħtejn). L-istudju għandu jkun skedat b’tali mod li l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż tibda ftit wara li l-annimali jkunu kisbu maturità sesswali sħiħa. Dan jista’ jvarja ftit għal razez differenti ta’ firien f’laboratorji differenti, eż. firien Sprague Dawley ta’ 10 ġimgħat, firien Wistar li jkollhom madwar 12-il ġimgħa. L-ommijiet b’wild għandhom jinqatlu fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara. Biex l-ommijiet jitħallew isumu qabel il-ġbir tad-demm (jekk din l-għażla tkun preferuta), l-ommijiet u uliedhom mhux bilfors ikollhom jinqatlu fl-istess jum. Il-jum tat-twellid (meta jitlesta l-ħlas) hu definit bħala l-jum 0 wara l-ħlas. In-nisa li ma juru ebda evidenza ta’ tgħammir jinqatlu 24-26 jum wara l-aħħar jum tal-perjodu ta’ tgħammir. Id-dożaġġ jissokta għaż-żewġ sessi matul il-perjodu ta’ tgħammir. L-irġiel għandhom jibqgħu jingħataw id-doża wara l-perjodu ta’ tgħammir tal-anqas sakemm jitlesta l-perjodu minimu totali ta’ dożaġġ ta’ 28 jum. Imbagħad dawn jinqatlu jew inkella jinżammu u jibqgħu jingħataw id-doża għat-twettiq possibbli tat-tieni fażi ta’ tgħammir jekk jitqies li din tkun xierqa.
|
|
35.
|
Id-dożaġġ ta’ kuljum tan-nisa ommijiet għandu jkompli matul it-tqala u tal-anqas sal-jum 13 wara l-ħlas, b’dan il-jum inkluż, jew sal-jum ta’ qabel is-sagrifiċċju. Għall-istudji li fihom is-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs jew bir-rotta dermali, id-dożaġġ għandu jkompli tal-anqas sal-jum 19 tal-ġestazzjoni, b’dan il-jum inkluż, u d-dożaġġ għandu jerġa’ jinbeda mill-aktar fis possibbli u mhux aktar tard mill-jum 4 ta’ wara t-twelid (PND).
|
|
36.
|
L-annimali fi grupp satellitarju skedati għall-osservazzjonijiet ta’ segwitu, jekk jiġu inklużi, ma jitħallewx jitgħammru. Dawn għandhom jinżammu tal-anqas għal 14-il jum ulterjuri wara l-ewwel qtil skedat tal-ommijiet, mingħajr trattament biex jiġu individwati okkorrenza ttardjata, jew persistenza ta’ effetti tossiċi jew irkupru minn dawn.
|
|
37.
|
Dijagramma tal-iskeda sperimentali hi mogħtija fl-Appendiċi 2.
|
Ċikli estrużi
|
38.
|
Iċ-ċikli estrużi għandhom jiġu ssorveljati qabel ma jibda t-trattament biex għall-istudju jintgħażlu nisa b’ċikliċità regolari (ara l-paragrafu 27). It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu ssorveljati ta’ kuljum ukoll mill-bidu tal-perjodu ta’ trattament sal-evidenza ta’ tgħammir. Jekk ikun hemm tħassib dwar effetti akuti ta’ stress li jistgħu jbiddlu ċ-ċikli estrużi bit-tnedija tad-dożaġġ, il-laboratorji jistgħu jesponu l-annimali tat-test għal ġimagħtejn (2), imbagħad jiġbru tiċpisiet vaġinali ta’ kuljum biex jissorveljaw iċ-ċiklu estruż għal minimu ta’ ġimagħtejn matul il-perjodu ta’ qabel it-tgħammir b’monitoraġġ issoktat fil-perjodu ta’ tgħammir sakemm ikun hemm evidenza ta’ tgħammir. Meta jinkisbu ċelloli vaġinali/ċervikali, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat tfixkil tal-mukoża, li jista’ jinduċi psewdotqala (8) (9).
|
Priċedura tat-tgħammir
|
39.
|
Normalment, f’dan l-istudju għandu jsir tgħammir 1:1 (raġel wieħed ma’ mara waħda). Jista’ jkun hemm eċċezzjonijiet f’każ ta’ mwiet okkażjonali tal-irġiel. Il-mara għandha titqiegħed mal-istess raġel sakemm tiġi osservata evidenza ta’ tgħammir jew ikunu għaddew ġimagħtejn. Kull filgħodu in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta’ sperma jew ta’ tapp vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala hu definit bħala l-jum li fih tiġi kkonfermata evidenza ta’ tgħammir (jinstabu tapp vaġinali jew sperma). Fil-każ li l-par ma jkunx irnexxa, jista’ jiġi kkunsidrat it-tgħammir mill-ġdid ta’ nisa ma’ rġiel diġa ipprovati tal-istess grupp.
|
Daqs tal-boton
|
40.
|
Fil-jum 4 wara t-twelid, id-daqs ta’ kull boton jista’ jiġi aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda b’għażla aleatorja biex jitrendew, l-aktar viċin possibbli, erba’ jew ħamest ifrieħ għal kull sess għal kull boton skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użata. Il-kampjuni tad-demm għandhom jinġabru minn tnejn mill-frieħ eċċessivi, jiġu raggruppati, u jintużaw għad-determinazzjoni tal-livelli tas-serum T4. Ma għandhiex issir eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż. fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem jew tad-distanza anoġenitali (AGD). Mull meta n-numru ta’ frieħ irġiel jew nisa jipprevjeni milli jkun hemm erbgħa jew ħamsa minn kull sess għal kull boton, hu aċċettabbli li jsir aġġustament parzjali (pereżempju, sitt irġiel u erba’ nisa). Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas mill-mira tal-qtil (8 jew 10 ferħ/boton). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mill-mira tal-qtil, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4.
|
|
41.
|
Jekk id-daqs tal-boton ma jkunx aġġustat, żewġt ifrieħ għal kull boton jiġu sagrifikati fil-jum 4 wara t-twelid u jittieħdu l-kampjuni tad-demm għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-ormon tat-tirojde tas-serum. Jekk possibbli, iż-żewġt ifrieħ għal kull boton għandhom ikunu frieħ nisa biex il-frieħ irġiel jinżammu għall-evalwazzjonijiet taż-żamma tal-beżżula, ħlief fil-każ li jekk jitneħħew dawn il-frieħ ma jifdal ebda nisa għall-valutazzjoni fit-terminazzjoni. Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas minn 8 jew 10 ifrieħ/boton (skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użati). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mid-daqs normali tal-boton, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4.
|
Osservazzjonijiet
|
42.
|
Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali tal-anqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u b’kunsiderazzjoni tal-perjodu bl-ogħla livell ta’ effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjoni tas-saħħa tal-annimali għandha tiġi rreġistrata. Tal-inqas darbtejn kuljum l-annimali kollha jiġu osservati għal morbidità u għal mortalità.
|
|
43.
|
Darba qabel l-ewwel esponiment (biex ikunu jistgħu jsiru paraguni fi ħdan l-istess suġġetti), u tal-anqas darba fil-ġimgħa wara dan, għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi dettaljati fl-annimali ġenituri kollha. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom isiru barra l-gaġġa f’arena standard u preferebbilment fl-istess jum kull darba. Dawn għandhom jiġu reġistrati bir-reqqa; idealment bl-użu ta’ sistemi ta’ punteġġ, definiti b’mod espliċitu mil-laboratorju tal-ittestjar. Għandu jsir sforz biex ikun żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test ikunu minimi u li l-osservazzjonijiet preferibbilment jitmexxew minn osservaturi li ma jkunux jafu bit-trattament. Is-sinjali osservati għandhom jinkludu, iżda mhumiex limitati għal, tibdliet fil-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta’ tnixxijiet u eskrezzjonijiet u attività awtonomika (eż., dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, xejra respiratorja mhux tas-soltu). Tibdliet fil-mixja, fil-qagħda u fir-rispons għal immaniġġar, kif ukoll il-preżenza ta’ movimenti kloniċi jew toniċi, stereotipi (eż. tindif eċċessiv, dawran ripetittiv), ħlas bit-tbatija jew fit-tul jew imġiba biżarra (eż. awtomutilazzjoni, mixi b’lura) għandhom ukoll ikunu rreġistrati (10).
|
|
44.
|
Darba matul l-istudju, ir-reattività sensorjali għal stimoli ta’ modalitajiet differenti (eż. stimoli awditorji, viżwali u proprjoċettivi) (8) (9) (11), valutazzjoni tas-saħħa tal-qabda (12) u valutazzjoni tal-attività motorja (13) għandhom isiru f’ħamest irġiel u f’ħames nisa, magħżula b’mod aleatorju minn kull grupp. Aktar dettalji tal-proċeduri li jistgħu jkunu segwiti jingħataw fir-referenzi rispettivi. Iżda jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi minbarra dawk fir-referenzi. Fl-irġiel, dawn l-osservazzjonijiet funzjonali għandhom isiru lejn tmiem il-perjodu tad-dożaġġ, ftit qabel il-qtil skedat iżda qabel il-kampjunar tad-demm għall-ematoloġija jew għall-kimika klinika (ara l-paragrafi 53-56, inkluża n-nota 1 f’qiegħ il-paġna). In-nisa għandhom ikunu fi stat fiżjoloġikament simili matul dawn it-testijiet funzjonali u idealment għandhom jiġu ttestjati darba matul l-aħħar ġimgħa tat-treddigħ (eż. LD 6-13), ftit qabel il-qtil skedat. Sa fejn possibbli, naqqas il-ħinijiet ta’ separazzjoni tal-ommijiet u tal-frieħ.
|
|
45.
|
Osservazzjonijiet funzjonali li jsiru darba lejn tmiem l-istudju jistgħu jitħallew barra meta l-istudju jsir bħala studju preliminari għal studju subkroniku sussegwenti (90 jum) jew fit-tul. F’dak il-każ, l-osservazzjonijiet funzjonali għandhom ikunu inklużi f’dan studju ta’ segwitu. Min-naħa l-oħra, id-disponibbiltà ta’ data dwar osservazzjonijiet funzjonali minn dan l-istudju b’doża ripetuta tista’ ssaħħaħ il-kapaċità biex jintgħażlu dożi għal studju subkroniku sussegwenti jew fit-tul.
|
|
46.
|
Bħala eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistgħu wkoll jitħallew barra għal gruppi li xort’oħra juru sinjali ta’ tossiċità tant li tfixkel b’mod sinifikanti l-prestazzjoni funzjonali tat-test.
|
|
47.
|
Id-durata tal-ġestazzjoni għandha tiġi reġistrata u hi kkalkolata mill-jum 0 tat-tqala. Kull boton għandu jiġi eżaminat mill-aktar fis possibbli wara l-ħlas biex jiġu stabbiliti n-numru u s-sess tal-frieħ, it-twelid mejjet, it-twelid ħaj, it-twelid mhux żviluppat (frieħ li jkunu ferm iżgħar mill-frieħ tal-kontroll korrispondenti), u l-preżenza ta’ anormalitajiet serji.
|
|
48.
|
Frieħ ħajjin għandhom jingħaddu u jitqassmu skont is-sess u kull boton għandu jintiżen fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Minbarra l-osservazzjonijiet fuq l-annimali ġenituri (ara l-paragrafi 43 u 44), kwalunkwe mġiba anormali tal-wild għandha tiġi reġistrata.
|
|
49.
|
L-AGD ta’ kull ferħ għandha titkejjel fl-istess jum postnatali bejn il-PND 0 sal-PND 4. Il-piż tal-ġisem tal-frieħ għandu jinġabar dakinhar li titkejjel l-AGD u l-AGD għandha tiġi normalizzata għal kejl tad-daqs tal-ferħ, idealment l-għerq kwadrat tal-piż tal-ġisem (14). In-numru ta’ bżieżel/areoli fil-frieħ irġiel għandu jingħadd fil-PND 12 jew 13 kif rakkomandat fil-GD 151 tal-OECD (15).
|
Piż tal-ġisem u konsum ta’ ikel/ilma
|
50.
|
L-irġiel u n-nisa għandhom jintiżnu fl-ewwel jum tad-dożaġġ, tal-anqas darba fil-ġimgħa wara dan, u fit-terminazzjoni. Matul it-tqala, in-nisa għandhom jintiżnu fil-jiem 0, 7, 14 u 20 u fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom ikunu rapportati individwalment għal kull annimal adult.
|
|
51.
|
Matul il-fażi ta’ qabel it-tgħammir, it-tqala u t-treddigħ, il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel tal-anqas darba fil-ġimgħa. Il-kejl tal-konsum tal-ikel matul it-tgħammir hu fakultattiv. Il-konsum tal-ikel matul dawn il-perjodi għandu jitkejjel ukoll meta s-sustanza kimika tat-test tingħata b’dak il-medium.
|
Ematoloġija
|
52.
|
Darba matul l-istudju, għandhom isiru l-eżaminazzjonijiet ematoloġiċi li ġejjin f’ħamest irġiel u ħames nisa magħżula b’mod aleatorju minn kull grupp: ematokrit, konċentrazzjoni ta’ emoglobina, l-għadd ta’ eritroċiti, retikuloċiti, l-għadd totali u differenzjali tal-lewkoċiti, l-għadd tal-pjastrini u kejl tal-ħin/potenzjali ta’ koagulazzjoni. Determinazzjonijiet oħra li għandhom isiru, jekk is-sustanza kimika tat-test jew il-metaboliti putattivi tagħha jkollhom jew ikunu ssuspettati li jkollhom proprjetajiet ossidanti, jinkludu konċentrazzjoni ta’ metemoglobina u l-korpi ta’ Heinz.
|
|
53.
|
Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn sit imsemmi. In-nisa għandhom ikunu fi stat fiżjoloġikament simili matul il-kampjunar. Biex jiġu evitati diffikultajiet prattiċi relatati mal-varjabbiltà fil-bidu tal-ġestazzjoni, il-ġbir tad-demm fin-nisa jista’ jsir fi tmiem il-perjodu ta’ tgħammir bħala alternattiva għall-kampjunar eżatt qabel il-proċedura għall-ewtanażja tal-annimali jew bħala parti minn din. Il-kampjuni tad-demm tal-irġiel idealment għandhom jittieħdu eżatt qabel l-ewtanażja tal-annimali jew bħala parti minn din. Inkella, il-ġbir tad-demm fl-irġiel jista’ jsir ukoll fi tmiem il-perjodu ta’ tgħammir meta dan il-punt ta’ żmien ikun ingħata preferenza għan-nisa.
|
|
54.
|
Il-kampjuni tad-demm għandhom jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa.
|
Bijokimika klinika
|
55.
|
Id-determinazzjonijiet tal-bijokimika klinika biex jiġu investigati effetti tossiċi kbar f’tessuti u, b’mod speċifiku, l-effetti fuq il-kliewi u l-fwied, għandhom isiru fuq kampjuni tad-demm miksuba mill-ħamest irġiel u mill-ħames nisa magħżula ta’ kull grupp. Hu rakkomandat is-sawm mal-lejl tal-annimali qabel it-teħid tal-kampjuni tad-demm (22). L-investigazzjonijiet tal-plażma jew serum għandhom jinkludu is-sodju, il-potassju, il-glokożju, il-kolesterol totali, l-urea, il-kreatinina, il-proteini u l-albumina totali, tal-anqas żewġ enzimi indikattivi ta’ effetti epatoċellulari (bħalma huma l-alanina aminotransferażi, aspartataminotransferażi u sorbitol deidroġenażi) u aċidi biljari. Il-kejl ta’ enzimi addizzjonali (ta’ oriġini epatika jew oriġinijiet oħra) u ta’ bilirubina jistgħu jipprovdu informazzjoni utli f’ċerti ċirkostanzi.
|
|
56.
|
Il-kampjuni tad-demm minn sit definit jittieħdu fuq il-bażi tal-iskeda li ġejja:
|
—
|
minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fil-jum 4 wara t-twelid, jekk in-numru ta’ frieħ jippermetti (ara l-paragrafi 40-41)
|
|
—
|
mill-ommijiet kollha u minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fit-terminazzjoni fil-jum 13, u
|
|
—
|
mill-irġiel adulti kollha, fit-terminazzjoni
|
Il-kampjuni kollha tad-demm jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa. Kampjuni tad-demm mill-frieħ tal-jum 13 u mill-irġiel adulti jiġu vvalutati għal-livelli tas-serum għall-ormoni tat-tirojde (T4). Issir valutazzjoni ulterjuri tat-T4 fil-kampjuni tad-demm għall-ommijiet u għall-frieħ tal-jum 4 jekk tkun rilevanti. Hemm l-għażla li jistgħu jitkejlu ormoni oħra jekk ikunu rilevanti. Id-demm tal-frieħ jista’ jiġi raggruppat skont il-boton għall-analiżijiet tal-ormon tat-tirojde. L-ormoni tat-tirojde (T4 u TSH) idealment għandhom jitkejlu bħala “total”.
|
|
57.
|
Hemm l-għażla li jsiru d-determinazzjonijiet tal-urinaliżi li ġejjin f’ħamest irġiel magħżula b’mod aleatorju ta’ kull grupp matul l-aħħar ġimgħa tal-istudju bl-użu ta’ ġbir ta’ volum ta’ urina bil-ħin miżmum; l-apparenza, il-volum, l-ożmolalità jew gravità speċifika, il-pH, il-proteini, il-glukożju u d-demm/iċ-ċelloli tad-demm.
|
|
58.
|
Barra minn hekk, l-istudji biex jinvestigaw l-immarkar tas-serum ta’ ħsara ġenerali għat-tessuti għandhom jiġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet oħra li għandhom jitwettqu jekk il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza kimika tat-test jistgħu, jew huma suspettati li jaffettwaw il-profili metaboliċi relatati jinkludu il-kalċju, it-trigliċeridi waqt sawm u l-glukożju waqt sawm, l-ormoni speċifiċi, il-metaemoglobina u l-kolinesterasi. Dawn jeħtieġ li jiġu eżaminati fuq bażi ta’ każ b’każ.
|
|
59.
|
Il-fatturi li ġejjin jistgħu jinfluwenzaw il-varjabbiltà u l-konċentrazzjonijiet assoluti tad-determinazzjonijiet tal-ormoni:
|
—
|
il-ħin tal-qatla minħabba varjazzjonijiet tul il-jum tal-konċentrazzjonijiet tal-ormoni
|
|
—
|
il-metodu tal-qatla biex tkun evitata tensjoni bla bżonn għall-annimali li tista’ taffettwa l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni
|
|
—
|
is-settijiet tat-testijiet għad-determinazzjonijiet tal-ormoni li jistgħu jkunu differenti mill-kurvi standard tagħhom.
|
|
|
60.
|
Kampjuni ta’ plażma maħsubin speċifikatament għal determinazzjoni tal-ormoni għandhom jinkisbu f’ħin komparabbli tal-jum. Il-valuri numeriċi miksubin meta jkunu analizzati l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni jkunu differenti fost diversi settijiet ta’ analiżi kummerċjali.
|
|
61.
|
Jekk bażi ta’ data storika ma tkunx adegwata, għandha tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni ta’ varjabbli ematoloġiċi u ta’ bijokimika klinika qabel ma jibda d-dożaġġ jew preferibbilment f’sett ta’ annimali mhux inklużi fil-gruppi ta’ esperimenti. Għan-nisa, id-data trid tiġi minn annimali li jreddgħu.
|
PATOLOĠIJA
Nekroskopija grossa
|
62.
|
L-annimali adulti kollha fl-istudju għandhom ikunu ssoġġettati għal nekroskopija profonda sħiħa u dettaljata li tkun tinkludi eżami bir-reqqa tal-wiċċ estern tal-ġisem, tal-fetħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, toraċiċi u abdominali u tal-kontenuti tagħhom. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għal-organi tas-sistema riproduttiva. In-numru ta’ siti ta’ impjantazzjoni għandu jiġi reġistrat. It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu eżaminati dakinhar tan-nekroskopija biex jiġi determinat l-istadju taċ-ċiklu estruż u tkun tista’ ssir korrelazzjoni mal-istopatoloġija tal-organi riproduttivi tan-nisa.
|
|
63.
|
It-testikoli u l-epididimidi kif ukoll il-bżieżaq tal-prostata u seminali bil-glandoli koagolanti fis-sħuħija tagħhom, tal-annimali adulti rġiel kollha għandhom jiġu mirquma minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u l-piż niedi tagħhom għandu jittieħed mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni biex jiġi evitat milli jinxfu. Barra minn hekk, il-piżijiet tal-organi fakultattivi jistgħu jinkludu l-kumpless tal-levator ani u tal-muskolu bulbokavernuż, il-glandoli ta’ Cowper u r-ras tal-pene fl-irġiel u l-ovarji f’pari (piż imxarrab) u l-utru (inkluż iċ-ċerviċi) fin-nisa; jekk inklużi, dawn il-piżijiet għandhom jinġabru mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni. L-ovarji, it-testikoli, l-epididimu, l-organi sesswali aċċessorji, u l-organi kollha li juru leżjonijiet makroskopiċi tal-annimali adulti kollha għandhom jiġu preservati.
|
|
64.
|
Għall-irġiel u għan-nisa adulti kollha u għal raġel wieħed u għal mara waħda li jkunu frieħ tal-jum 13 minn kull boton, il-glandoli tat-tirojde għandhom jiġu preservati fl-aktar medium ta’ fissazzjoni xierqa għall-eżami istopatoloġiku sussegwenti maħsub. Il-piż tat-tirojde jista’ jiġi ddeterminat wara l-fissazzjoni. It-tirqim għandu jsir ukol b’reqqa kbira u biss wara l-fissazzjoni biex tkun evitata l-ħsara lit-tessut. Il-ħsara fit-tessut tista’ tippreġudika analiżi istopatoloġika. Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn sit imsemmi eżatt qabel jew bħala parti mill-proċedura għall-ewtanażja tal-annimali, u għandhom jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa (ara l-paragrafu 56).
|
|
65.
|
Barra minn hekk, għal tal-anqas ħamest irġiel u nisa adulti, magħżula b’mod aleatorju minn kull grupp (minbarra dawk misjuba fi stat ta’ agunija u/jew ewtanizzati qabel it-terminazzjoni tal-istudju), il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-timus, il-milsa, il-moħħ u l-qalb għandhom jitraqqmu minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq u l-piż tagħhom għandu jittieħed mill-aktar fis wara d-dissezzjoni biex jiġi evitat milli jinxfu. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq kemm għat-tip ta’ tessut u kemm għall-eżaminazzjoni ispatoloġika maħsuba sussegwenti: il-leżjonijiet kbar kollha, il-moħħ (reġjuni rappreżentattivi li jinkludu ċ-ċerebru, iċ-ċerebellum u l-pons), is-sinsla tad-dahar, l-għajn, l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklużi l-irqajja’ ta’ Peyer), il-fwied, il-kliewi, l-adernali, il-milsa, il-qalb, it-timus, it-trakea u l-pulmun (preservat bl-infiħ b’fissattiv u mbagħad mgħaddas), il-gonadi (testikoli u ovarji), l-organi sesswali aċċessorji (utru u ċerviċi, epididimu, prostata, bżieżaq seminali u l-glandoli koagolanti), il-vaġina, il-borża tal-awrina, il-limfonodi (minbarra l-aktar limfonodu drenanti prossimali, għandu jittieħed limfonodu ieħor skont l-esperjenza tal-laboratorju (16)), in-nerv periferali (xjatiku jew tibjali) idealment qrib il-muskolu, il-muskolu skeletali u l-għadma, bil-mudullun (sezzjoni jew inkella aspirat tal-mudullun immuntat ġdid). Hu rrakkomandat li t-testikoli jkunu ffissati b’immersjoni fil-fissattiv ta’ Bouin jew f’dak modifikat ta’ Davidson (16) (17) (18); fissazzjoni tal-formalina mhix rakkomandata għal dawn it-tessuti. It-tunika albuġinea tista’ tittaqqab bil-mod u mhux fil-fond fiż-żewġ poli tal-organu b’labra biex jitħalla jkun hemm penetrazzjoni malajr tal-fissattiv. Is-sejbiet kliniċi u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li jkunu eżaminati tessuti addizzjonali. Għandu wkoll ikun ippreservat kull organu li x’aktarx ikun meqjus bħala organu mmirat abbażi tal-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
66.
|
It-tessuti li ġejjin jistgħu jagħtu indikazzjoni siewja għall-effetti relatati mal-endokrina: Il-gonadi (ovarji u testikoli), l-organi sesswali aċċessorji (utru li jinkludi ċerviċi, epididimu, bżieżaq seminali bi glandoli tal-koagulazzjoni, prostata dorsolaterali u ventrali), il-vaġina, il-glandola pitwitarja tal-mammiferi rġiel u l-glandola adrenali. It-tibdiliet fil-glandoli tal-mammiferi rġiel ma kinux iddokumentati b’mod suffiċjenti iżda dan il-parametru jista’ jkun sensittiv ħafna għal sustanzi b’azzjoni estroġenika. L-osservazzjoni tal-organi/tat-tessuti li mhumiex elenkati fil-paragrafu 65 hi fakultattiva.
|
|
67.
|
Frieħ mejtin u frieħ maqtula fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara, tal-anqas għandhom jiġu eżaminati bir-reqqa esternament għal anormalitajiet serji. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għall-ġenitali riproduttivi esterni li għandhom jiġu eżaminati għal sinjali ta’ żvilupp mibdul.
|
Istopatoloġija
|
68.
|
Għandha ssir istopatoloġija sħiħa fuq l-organi u t-tessuti preservati tal-annimali magħżula fil-gruppi tal-kontroll u ta’ doża għolja (b’enfasi speċjali fuq l-istadji tal-ispermatoġenesi fil-gonadi tal-irġiel u l-istopatoloġija tal-istruttura taċ-ċelloli testikolari interstizjali). Il-glandola tat-tirojde mill-frieħ u mill-annimali adulti li jifdal tista’ tiġi eżaminata meta jkun hemm bżonn. Dawn l-eżaminazzjonijiet għandhom ikunu estiżi għall-annimali tal-gruppi l-oħra ta’ dożaġġ, jekk jiġu osservati tibdiliet relatati mat-trattament fil-grupp ta’ doża għolja. Il-Gwida dwar l-istopatoloġija (10) tagħti aktar informazzjoni dwar id-dissezzjoni, il-fissazzjoni, is-sezzjonar u l-istopatoloġija ta’ tessuti endokrinali.
|
|
69.
|
Il-feriti kbar kollha għandhom jiġu eżaminati. Bħala għajnuna fl-iċċarar tal-NAOELs, l-organi fil-mira fi gruppi ta’ doża oħra għandhom jiġu eżaminati, b’mod partikolari fi gruppi li jiġi ddikjarat li juru NAOEL.
|
|
70.
|
Meta jintuża grupp satellitarju, l-istopatoloġija għandha ssir fuq tessuti u organi identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi ttrattati.
|
DATA U RAPPORTAR
Data
|
71.
|
Għandha tkun ipprovduta d-data dwar l-annimali individwali. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tinġabar f’forma tabulari, u għal kull grupp tat-test għandha turi n-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ annimali misjuba mejta matul it-test jew ewtanizzati għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta’ xi mewt jew ewtanażja, in-numru ta’ annimali fertili, in-numru ta’ nisa tqal, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inklużi l-ħin tal-ewwel darba, id-durata, u s-severità ta’ kwalunkwe effett tossiku, it-tip ta’ tibdiliet istopatoloġiċi u d-data rilevanti kollha dwar il-boton. Format tabulari tar-rapport ta’ sommarju li wera li hu tassew siewi għall-evalwazzjoni tal-effetti riproduttivu/tal-iżvilupp hu mogħti fl-Appendiċi 3.
|
|
72.
|
Meta jkun possibbli, ir-riżultati numeriċi għandhom ikunu evalwati b’metodu ta’ statistika ġeneralment aċċettabbli u adattat. Il-paraguni tal-effett tul firxa tad-doża għandhom jevitaw l-użu ta’ testijiet-t multipli. Il-metodi ta’ statistika għandhom jintgħażlu matul it-tfassil tal-istudju. Analiżi statistika tal-AGD u taż-żamma tal-beżżula għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tal-effetti fuq il-boton. Fejn xieraq, il-boton hu l-unità ta’ analiżi. Analiżi statistika tal-piż tal-ġisem tal-frieħ għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tad-daqs tal-boton. Minħabba d-dimensjonijiet limitati tal-istudju, l-analiżijiet statistiċi fil-forma ta’ testijiet għal “sinifikat” huma ta’ valur limitat għal ħafna punti ta’ tmiem, speċjalment il-punti ta’ tmiem riproduttivi. Uħud mill-aktar metodi użati ta’ spiss, speċjalment testijiet parametriċi għall-kejl tat-tendenza ċentrali, mhumiex adattati. Jekk jintużaw analiżijiet statistiċi, il-metodu magħżul għandu jkun xieraq għad-distribuzzjoni tal-varjabbli eżaminat, u jintgħażel qabel il-bidu tal-istudju.
|
Evalwazzjoni tar-riżultati
|
73.
|
Is-sejbiet ta’ dan l-istudju tat-tossiċità għandhom jiġu evalwati f’termini tal-effetti osservati, tan-nekroskopija u tas-sejbiet mikroskopiċi. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni bejn id-doża u s-sustanza kimika tat-test u l-preżenza jew l-assenza, l-inċidenza jew is-severità tal-annormalitajiet, inklużi l-feriti kbar, l-organi tal-mira identifikati, l-infertilità, l-anormalitajiet kliniċi, l-imġiba tar-riproduzzjoni u l-boton affettwati, it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem, l-effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossiċi oħra.
|
|
74.
|
Minħabba l-perjodu qasir ta’ trattament tal-irġiel, l-istopatoloġija tat-testikoli u tal-epididimu għandha tiġi kkunsidrata flimkien mad-data dwar il-fertilità meta jiġu vvalutati l-effetti riproduttivi fuq l-irġiel. L-użu ta’ data storika tal-kontroll fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp (eż. għad-daqs tal-boton, l-AGD, iż-żamma tal-beżżula, il-livelli tas-serum T4), fejn disponibbli, jista’ jkun siewi wkoll bħala għajnuna għall-interpretazzjoni tal-istudju.
|
|
75.
|
Għall-kontroll tal-kwalità huwa propost li tinġabar data storika ta’ kontroll u li għad-data numerika jkunu kkalkolati l-koeffiċjenti ta’ varjazzjoni, speċjalment għall-parametri li jkollhom rabta mad-detezzjoni tal-interferent endokrinali. Din id-data tista’ tintuża għal finijiet ta’ paragun meta jkunu evalwati studji attwali.
|
Rapport tat-test
|
76.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
|
Sustanza kimika tat-test:
|
—
|
is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli
|
|
—
|
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.
|
|
|
|
Sustanza monokostitwenti:
|
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
|
—
|
l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
|
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
|
—
|
ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
|
|
|
|
Veikolu (jekk xieraq):
|
—
|
ġustifikazzjoni għal għażla ta’ veikolu, jekk ma jkunx ilma.
|
|
|
|
L-annimali tat-test:
|
—
|
l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;
|
|
—
|
is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;
|
|
—
|
il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.
|
|
—
|
ġustifikazzjoni għal speċi jekk ma jkunx far
|
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test:
|
—
|
ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
|
|
—
|
dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjoni, l-istabbiltà u l-omoġenità miksubin tal-preparazzjoni,
|
|
—
|
dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;
|
|
—
|
konverżjoni minn dieta/konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ta’ ilma tax-xorb (ppm) għad-doża attwali (mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;
|
|
—
|
dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;
|
|
—
|
deskrizzjoni dettaljata tal-proċedura ta’ każwalizzazzjoni biex jintgħażlu l-frieħ għall-qtil, jekk jinqatlu.
|
|
|
|
Riżultati:
|
—
|
piż tal-ġisem/bidliet fil-piż tal-ġisem;
|
|
—
|
konsum ta’ ikel, u konsum ta’ ilma, jekk applikabbli;
|
|
—
|
id-data dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u d-doża, inklużi l-fertilità, il-ġestazzjoni u kwalunkwe sinjal ieħor ta’
|
|
—
|
it-tul tal-ġestazzjoni; l-effetti tossiċi jew oħra fuq ir-riproduzzjoni, l-ulied, it-tkabbir ta’ wara t-twelid, eċċ.;
|
|
—
|
natura, severità u durata ta’ osservazzjonijiet kliniċi (jekk reversibbli jew le);
|
|
—
|
attività sensorja, qawwa tal-qabda u valutazzjonijiet tal-attività motorja;
|
|
—
|
testijiet ematoloġiċi b’valuri bażi rilevanti;
|
|
—
|
testijiet ta’ bijokimika klinika b’valuri linja bażi rilevanti;
|
|
—
|
in-numru ta’ nisa adulti b’ċiklu estruż normali jew anormali u d-durata taċ-ċiklu;
|
|
—
|
in-numru ta’ twelid ħaj u ta’ telf ta’ wara l-impjantazzjoni;
|
|
—
|
in-numru ta’ frieħ b’anormalitajiet ferm viżibbli; evalwazzjoni profonda tal-ġenitali esterni, in-numru ta’ frieħ li jitwieldu żgħar ħafna;
|
|
—
|
il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;
|
|
—
|
in-numru ta’ impjantazzjonijiet, id-daqs tal-boton u l-piżijiet tal-boton fil-ħin tar-reġistrazzjoni;
|
|
—
|
id-data dwar il-piż tal-ġisem tal-frieħ
|
|
—
|
l-AGD tal-frieħ kollha (u l-piż tal-ġisem fl-jum tal-kejl tal-AGD)
|
|
—
|
iż-żamma tal-beżżula fil-frieħ irġiel,
|
|
—
|
il-livelli tal-ormon tat-tirojde, il-frieħ tal-jum 13 u l-irġiel adulti (u l-ommijiet u l-frieħ tal-jum 4 jekk jitkejlu)
|
|
—
|
il-piż tal-ġisem fis-sagrifiċċju u d-data dwar il-piż tal-organi għall-annimali ġenituri;
|
|
—
|
sejbiet dwar in-nekroskopija,
|
|
—
|
deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatoloġiċi;
|
|
—
|
id-dettalji tal-assorbiment (jekk disponibbli);
|
|
—
|
trattament ta’ statistika ta’ riżultati, fejn jixraq.
|
|
|
|
Diskussjoni tar-riżultati.
|
|
Interpretazzjoni tar-Riżultati
|
77.
|
L-istudju jipprovdi evalwazzjonijiet tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp assoċjata mal-amministrazzjoni ta’ dożi ripetuti. B’mod partikolari, peress li l-enfasi hi mixħuta kemm fuq il-punti ta’ tmiem tat-tossiċità ġenerali kif ukoll tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, ir-riżutlati tal-istudju jippermettu li ssir distinzjoni bejn l-effetti fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp li jseħħu fin-nuqqas ta’ tossiċità ġenerali u dawk li jkunu espressi biss f’livelli li jkunu tossiċi għall-annimali ġenituri wkoll (ara l-paragrafi 7-11). Jista’ jipprovdi indikazzjoni tal-ħtieġa li jsiru investigazzjonijiet ulterjuri u jista’ jipprovdi gwida fit-tfassil tal-istudji sussegwenti. Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 43 għandu jiġi kkonsultat għal għajnuna fl-interpetazzjoni tar-riżultati dwar ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp (19). Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 106 dwar l-Evalwazzjoni Istoloġika tat-Testijiet Endokrinali u Riproduttivi fir-Rodituri (16) jipprovdi informazzjoni dwar it-tħejjija u l-evalwazzjoni tal-organi (endokrinali) u tat-tiċpisiet vaġinali li jistgħu jkunu ta’ għajnuna għal dan il-metodu ta’ ttestjar.
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
OECD (1990). Dokument tas-seduta Nru 1 għall-14-il Laqgħa Konġunta tal-Chemicals Group and Management Committee. Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi
|
|
(2)
|
OECD (1992). Ir-Rapport tal-President tal-Laqgħa ta’ Esperti ad hoc dwar il-Metodi ta’ Skrinjar tat-Tossiċità Riproduttiva, Tokyo, 27-29 ta’ Ottubru, 1992. Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi
|
|
(3)
|
Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. u Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol, Sci., 19, 141-149.
|
|
(4)
|
Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. u Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol., 18, 89-95.
|
|
(5)
|
OECD (1998). Rapport tal-Ewwel Laqgħa tat-Task Force tal-OECD dwar l-Ittestjar u l-Valutazzjoni tal-Interferenti Endokrinali (EDTA), 10-11 ta’ Marzu 1998, Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi
|
|
(6)
|
OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(7)
|
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(8)
|
Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.u Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Parti B, 80 (2), 84-97.
|
|
(9)
|
Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, f’Auston C.R. u Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.
|
|
(10)
|
IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. Environmental Health Criteria Document (No 60).
|
|
(11)
|
Moser V.C., McDaniel K.M. u Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
|
|
(12)
|
Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. u Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.
|
|
(13)
|
Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609.
|
|
(14)
|
Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp u V.L. Reynolds. (1999). “Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
|
|
(15)
|
OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(16)
|
OECD (2009).Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(17)
|
Hess RA u Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. Fi: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
|
|
(18)
|
Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
|
|
(19)
|
OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(20)
|
OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET (ARA WKOLL (20) GD 150 TAL-OECD)
Androġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu.
Antiandroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu.
Antiestroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu.
Attività tal-antitirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu.
Sustanza kimika hija sustanza jew taħlita.
Tossiċità tal-iżvilupp il-manifestazzjoni tat-tossiċità riproduttiva, li tirrappreżenta disturbi strutturali jew funzjonali prenatali, perinatali u post natali fil-wild.
Doża hi l-ammont ta’ sustanza kimika tat-test mogħtija. Id-doża hi espressa bħala piż tas-sustanza kimika tat-test għal kull unità ta’ piż tal-ġisem ta’ annimal tat-test għal kull jum (eż. mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jew bħala konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta.
Dożaġġ hi terminu ġenerali li jinvolvi d-doża, il-frekwenza tagħha u d-durata tad-dożaġġ.
Tossiċità evidenti hi terminu ġenerali li jiddeskrivi sinjali ċari ta’ tossiċità wara li tkun ġiet amministrata kimika għall-ittestjar. Dawn għandhom ikunu suffiċjenti għal valutazzjoni tal-periklu u għandhom ikunu tali li żieda fid-doża amministrata tista’ tkun mistennija li tirriżulta fl-iżvilupp ta’ sinjali ta’ tossiċità estrema u probabbilment mortalità.
Indeboliment tal-fertilità tirrappreżenta disturbi tal-funzjonijiet jew tal-kapaċità riproduttivi tal-irġiel jew tan-nisa.
Tossiċità materna effetti avversi fuq nisa tqal, li jseħħu b’mod speċfiku (effett dirett) jew mhux speċifiku (effett indirett) u li jkunu relatati mal-istat ta’ tqala.
NOAEL hi l-abbrevjazzjoni għal-livell bla effett ħażin osservat. Dan hu l-ogħla livell ta’ doża fejn l-ebda sejbiet ħżiena relatati ma’ trattament ma jkunu osservati minħabba trattament.
Estroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu.
Tossiċità riproduttiva tirrappreżenta l-effetti dannużi fuq il-wild u/jew indeboliment tal-funzjonijiet jew tal-kapaċità riproduttivi tal-irġiel u tan-nisa.
Sustanza kimika tat-test hi kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
Attività tat-tirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu.
Validazzjoni hi proċess xjentifiku mfassal biex jiġu karatterizzati r-rekwiżiti u l-limitazzjonijiet operazzjonali ta’ metodu ta’ ttestjar u biex tintwera l-affidabbiltà u r-relevanza tiegħu għal skop partikolari.
Appendiċi 2
DIJAGRAMMA TAL-ISKEDA SPERIMENTALI, LI TINDIKA D-DURATA MASSIMA TAL-ISTUDJU, FUQ IL-BAŻI TA’ PERJODU SĦIĦ TA’ TGĦAMMIR FUQ 14-IL JUM
Appendiċi 3
RAPPORT SOMMARJU TABULARI TAL-EFFETTI FUQ IR-RIPRODUZZJONI/L-IŻVILUPP
|
OSSERVAZZJONIJIET
|
Valuri
|
|
Dożaġġ (unitajiet).......
|
0 (kontroll)
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
Pari mibdija (N)
|
|
|
|
|
|
|
Ċiklu estruż (tal-anqas it-tul medju u l-frekwenza taċ-ċikli irregolari)
|
|
|
|
|
|
|
Nisa li juru evidenza ta’ tgħammir (N)
|
|
|
|
|
|
|
Nisa li jilħqu t-tqala (N)
|
|
|
|
|
|
|
Jiem tal-konċepiment 1 - 5 (N)
|
|
|
|
|
|
|
Jiem tal-konċepiment 6 -...([1]
(23)
) (N)
|
|
|
|
|
|
|
Tqala≤21 jum (N)
|
|
|
|
|
|
|
Tqala = 22 jum (N)
|
|
|
|
|
|
|
Tqala ≥ 23 jum (N)
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’żgħar ħajjin imwielda (N)
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’żgħar ħajjin imwielda fil-jum 4 pp (N)
|
|
|
|
|
|
|
Impjanti/omm (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Frieħ ħajjin/omm fit-twelid (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Frieħ ħajjin/omm fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Proporzjon tas-sessi (r/n) fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Proporzjon tas-sessi (r/n) fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-boton fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-boton fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-ħlas (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-ħin tal-kejl tal-AGD (medja tal-irġiel, medja tan-nisa)
|
|
|
|
|
|
|
AGD tal-frieħ fl-istess jum wara t-twelid, fil-ħlas, fil-jum 4 (medja tal-irġiel, medja tan-nisa, nota tal-PND)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-jum 4 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Piż tal-frieħ fil-jum 13 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
Żamma tal-beżżula tal-frieħ irġiel fil-jum 13 (medja)
|
|
|
|
|
|
|
FRIEĦ ANORMALI
|
|
Ommijiet b’0
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’1
|
|
|
|
|
|
|
Ommijiet b’≥ 2
|
|
|
|
|
|
|
TELF TAL-ULIED
|
|
Impjantazzjonijiet qabel it-twelid (impjantazzjonijiet nieqes it-twelid ħaj)
|
|
Nisa b’0
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’1
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’2
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’≥ 3
|
|
|
|
|
|
|
Wara t-twelid (twelid ħaj nieqes il-ħajjin fil-jum 13 wara t-twelid)
|
|
Nisa b’0
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’1
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’2
|
|
|
|
|
|
|
Nisa b’≥ 3
|
|
|
|
|
|
B.65 METODU TA’ TTESTJAR IN VITRO TAL-BARRIERA TAL-MEMBRANA GĦALL-KORRUŻJONI TAL-ĠILDA
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 435 tal-OECD (2015). Il-korrużjoni tal-ġilda tirreferi għall-produzzjoni ta’ ħsara irreversibbli għall-ġilda li tidher bħala nekrożi viżibbli permezz tal-epidermis u fid-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test kif definita mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) u mir-Regolament tal-Unjoni Ewropea (UE) 1272/2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet (CLP) (24) Dan il-metodu ta’ ttestjar, ekwivalenti għal-linja gwida aġġornata 435 tal-OECD jipprovdi metodu ta’ ttestjar tal-barriera tal-membrana in vitro li jista’ jintuża biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi korrużivi. Il-metodu ta’ ttestjar juża membrana artifiċjali mfassla biex twieġeb għal sustanzi kimiċi korrużivi b’mod simili għall-ġilda tal-annimali in situ.
|
|
2.
|
Il-korrużività tal-ġilda tradizzjonalment ġiet ivvalutata billi tiġi applikata s-sustanza kimika tat-test għall-ġilda tal-annimali ħajjin u tiġi vvalutata l-firxa tal-ħsara fit-tessut wara perjodu fiss ta’ żmien (2). Minbarra dan il-metodu ta’ ttestjar, ġew adotatti diversi metodi ta’ ttestjar in vitro oħra bħala alternattivi (3)(4) għall-proċedura standard tal-ġilda tal-fniek in vivo (Kapitolu B.4 ta’ dan l-Anness, ekwivalenti għat-TG 404 tal-OECD) użati biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi korrużivi (2). L-istrateġija ta’ ttestjar u ta’ evalwazzjoni mqassma fuq saffi tal-GHS tan-NU għall-valutazzjoni u għall-klassifikazzjoni tal-korrużività tal-ġilda u d-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni (IATA) għall-Irritazzjoni/Korrużjoni tal-Ġilda jirrakkomandaw l-użu ta’ metodi ta’ ttestjar in vitro validati u aċċettati skont il-moduli 3 u 4 (1)(5). L-IATA jiddeskrivi diversi moduli li jiġbru fihom sorsi ta’ informazzjoni u għodod ta’ valutazzjoni, u (i) jipprovdi gwida dwar kif tintegra u tuża data eżistenti tat-testijiet u mhux tat-testijiet għall-valutazzjoni tal-potenzjali ta’ irritazzjoni tal-ġilda u ta’ korrużjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi u (ii) jipproponi approċċ fejn ikun meħtieġ ittestjar ulterjuri, inkluż meta jinstabu riżultati negattivi (5). F’dan l-approċċ modulari, ir-riżultati pożittivi mill-metodi ta’ ttestjar in vitro jistgħu jintużaw biex sustanza kimika tiġi klassifikata bħala korrużiva mingħajr il-ħtieġa ta’ ttestjar fuq l-annimali, u b’hekk jitnaqqas u jiġi rfinat l-użu ta’ annimali u jiġu evitati l-uġigħ u t-tbatija li jistgħu jseħħu jekk l-annimali jintużaw għal dan l-għan.
|
|
3.
|
Tlestew studji ta’ validazzjoni għall-mudell tal-barriera tal-membrana in vitro kummerċjalment disponibbli bħal Corrositex® (6)(7)(8), li wrew preċiżjoni ġenerali fit-tbassir tal-korrużività tal-ġilda ta’ 79 % (128/163), sensittività ta’ 85 % (76/89), u speċifiċità ta’ 70 % (52/74) għal bażi ta’ data ta’ 163 sustanza u taħlita (7). Fuq il-bażi tal-validità rikonoxxuta tiegħu, dan il-metodu ta’ riferiment validat (VRM) ġie rakkomandat biex jintuża bħala parti minn strateġija ta’ ttestjar imqassma fuq saffi għall-valutazzjoni tal-potenzjal ta’ periklu ta’ korrużjoni dermali tas-sustanzi kimiċi (5)(7). Qabel ma mudell ta’ barriera tal-membra in vitro għall-korrużjoni tal-ġilda jkun jista’ jintuża għall-finijiet regolatorji, l-ewwel għandhom jiġu determinati l-affidabbiltà, ir-rilevanza (preċiżjoni), u l-limitazzjonijiet tiegħu biex jiġi żgurat li jkun simili għal dak tal-VRM (9), f’konformità mal-istandards predefiniti tal-prestazzjoni (PS) (10). L-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data tal-OECD tiġi garantita biss wara li kwalunkwe metodu propost ġdid jew aġġornat wara l-PS ikun ġie rieżaminat u inkluż fil-linja gwida tat-test ekwivalenti tal-OECD. Bħalissa, metodu in vitro wieħed biss hu kopert mil-linja gwida tat-test 435 tal-OECD u dan il-metodu ta’ ttestjar, il-mudell disponibbli kummerċjalment Corrositex®.
|
|
4.
|
Metodi ta’ ttestjar oħra għall-ittestjar tal-korrużività tal-ġilda huma bbażati fuq l-użu ta’ ġilda umana rikostitwita (TG 431 tal-OECD) (3) u ta’ ġilda ta’ firien iżolati (TG 430 tal-OECD) (4). Din il-Linja Gwida tat-Test tipprovdi wkoll għas-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi kimiċi korrużivi fit-tliet Subkategoriji tal-GHS tan-NU ta’ korrużività u t-tliet Gruppi ta’ Imballaġġ tat-Trasport tan-NU għall-periklu ta’ korrużività. Din il-Linja Gwida tat-Test oriġinarjament ġiet adottata fl-2006 u aġġornata fl-2015 biex tirreferi għad-dokument ta’ gwida tal-IATA u tiġi aġġornata l-lista ta’ sustanzi ta’ profiċjenza.
|
DEFINIZZJONIJIET
|
5.
|
Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
6.
|
It-test deskritt f’dan il-metodu ta’ ttestjar jippermetti l-identifikazzjoni ta’ sustanzi kimiċi tat-test korrużivi u jippermetti s-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi kimiċi tat-test korrużivi skont il-GHS tan-NU/is-CLP (Tabella 1). Barra minn hekk, metodu ta’ ttestjar bħal dan jista’ jintuża biex jittieħdu deċiżjonijiet dwar il-korrużività u n-nuqqas ta’ korrużività ta’ klassijiet speċifiċi ta’ sustanzi kimiċi, eż. l-aċidi organiċi u inorganiċi, id-derivati tal-aċidi (25), u bażijiet għal ċerti finijiet ta’ ttestjar tat-trasport (7)(11)(12). Dan il-metodu ta’ ttestjar jiddeskrivi proċedura ġenerika simili għall-metodu ta’ ttestjar ta’ riferiment validat (7). Filwaqt li dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni adegwata dwar l-irritazzjoni tal-ġilda, ta’ min jinnota li t-TM B.46 (ekwivalenti għat-TG 439 tal-OECD) jindirizza b’mod speċifiku l-irritazzjoni tal-ġilda in vitro b’effett fuq is-saħħa (13). Għal evalwazzjoni sħiħa tal-effetti lokali fuq il-ġilda wara esponiment dermali wieħed, għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar l-Approċċi Integrati għall-Valutazzjoni tal-Ittestjar (5).
Tabella 1
Il-Kategorija u s-Subkategoriji ta’ Korrużivi tal-Ġilda tal-GHS tan-NU (1) (26)
|
Kategorija tal-Korrużiv (kategorija 1) (għall-awtoritajiet li ma jużawx is-subkategoriji)
|
Subkategoriji Potenzjali tal-Korrużiv (26) (għall-awtoritajiet li jużaw is-subkategoriji, inkluż ir-Regolament CLP)
|
Korrużiv f’≥ annimal (1) minn 3
|
|
Esponiment
|
Osservazzjoni
|
|
Korrużiv
|
Subkategorija 1A tal-korrużivi
|
≤ 3 minuti
|
≤ Siegħa (1)
|
|
Subkategorija 1B tal-korrużivi
|
> 3 minuti / ≤ siegħa (1)
|
≤ 14-il jum
|
|
Subkategorija 1C tal-korrużivi
|
> siegħa (1) / ≤ 4 sigħat
|
≤ 14-il jum
|
|
|
7.
|
Limitazzjoni tal-metodu ta’ riferiment validat (7) hi li ħafna sustanzi kimiċi mhux korrużivi u xi sustanzi kimiċi korrużivi jaf ma jikkwalifikawx għall-ittestjar, fuq il-bażi tar-riżultati tat-test tal-kompatibbiltà inizjali (ara l-paragrafu 13). Sustanzi kimiċi milwiema b’pH fil-medda ta’ 4,5 sa 8,5 spiss ma jikkwalifikawx għall-ittestjar; madankollu, 85 % tas-sustanzi kimiċi ttestjati f’din il-medda ta’ pH ma kinux korrużivi fit-testijiet fuq l-annimali (7). Il-metodu tal-barriera tal-membrana in vitro jista’ jintuża biex jiġu ttestjati is-solidi (solubbli jew insolubbli fl-ilma), il-likwidi (milwiema jew mhux milwiema), u l-emulsjonijiet. Madankollu, is-sustanzi kimiċi tat-test li ma jikkawżawx tibdil individwabbli fit-test tal-kompatibbiltà (jiġifieri tibdil fil-kulur fis-Sistema ta’ Detezzjoni tas-Sustanzi Kimiċi (CDS) tal-metodu ta’ ttestjar ta’ riferiment validat) ma jistgħux jiġu ttestjati bil-metodu tal-barriera tal-membrana u għandhhom jiġu ttestjati bl-użu ta’ metodi ta’ ttestjar oħra.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
8.
|
Is-sistema tat-test tinkludi żewġ komponenti: bijobarriera makromolekolari sintetika u sistema ta’ identifikazzjoni tas-sustanza kimika (CDS); dan il-metodu ta’ ttestjar jindividwa permezz tal-barriera tal-membrana tas-CDS il-ħsara kkawżata ms-sustanzi kimiċi tat-test korrużivi wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fuq is-superfiċje tal-barriera tal-membrana makromolekolari sintetika (7), probabbilment bl-istess mekkaniżmu/i ta’ korrużjoni li jopera(w) fuq il-ġilda ħajja.
|
|
9.
|
Il-penetrazzjoni tal-barriera tal-membrana (jew l-infid) tista’ titkejjel b’numru ta’ proċeduri jew b’CSD, inkluż tibdil fil-kulur ta’ kulur tal-indikatur tal-pH jew f’xi proprjetà oħra tas-soluzzjoni indikatur taħt il-barriera.
|
|
10.
|
Il-barriera tal-membrana għandha tkun determinata bħala valida, jiġifieri rilevanti u affidabbli, għall-użu maħsub tagħha. Dan jinkludi l-żgurar li l-preparati differenti jkunu konsistenti fir-rigward tal-proprjetajiet tal-barriera, eż. kapaċi jżommu barriera għal sustanzi mhux korrużivi, kapaċi jikkategorizzaw il-proprjetajiet korrużivi tas-sustanzi kimiċi fost id-diversi Subkategoriji ta’ korrużività tal-GHS tan-NU (1). Il-klassifikazzjoni assenjata hi bbażata fuq iż-żmien meħud biex sustanza kimika tippenetra minn ġol-barriera tal-membrana sas-soluzzjoni indikatur.
|
WIRI TAL-PROFIĊJENZA
|
11.
|
Qabel l-użu ta’ rutina tal-metodu tal-barriera tal-membrana in vitro, li jaderixxi ma’ dan il-metodu ta’ ttestjar, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jikklassifikaw kif suppost tnax-il Sustanza ta’ Profiċjenza rakkomandati fit-Tabella 1. F’sitwazzjonijiet li fihom sustanza elenkata ma tkunx disponibbli jew, fejn ġustifikabbli, tista’ tintuża sustanza oħra li għaliha jkun hemm data ta’ riferiment adegwata in vivo u in vitro (eż. mil-lista ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment (10)) dment li ma jiġux applikati l-istess kriterji tal-għażla bħal dawk deskritti fit-Tabella 1.
Tabella 2
Sustanzi ta’ Profiċjenza
(27)
|
Sustanza (28)
|
CASRN
|
Klassi Kimika
|
Subkategorija In Vivo tal-GHS tan-NU (29)
|
Subkategorija In Vitro tal-GHS tan-NU (29)
|
|
Diidrat tat-trifluworur tal-Boron
|
13319-75-0
|
Aċidi inorganiċi
|
1A
|
1A
|
|
Aċidu nitriku
|
7697-37-2
|
Aċidi inorganiċi
|
1A
|
1A
|
|
Pentaklorur tal-fosfru
|
10026-13-8
|
Prekursuri tal-aċidi inorganiċi
|
1A
|
1A
|
|
Klorur tal-valeril
|
638-29-9
|
Kloruri tal-aċidu
|
1B)
|
1B)
|
|
Idrossidu tas-Sodju
|
1310-73-2
|
Bażijiet inorganiċi
|
1B)
|
1B)
|
|
1-(2-Aminoetil) piperażina
|
140-31-8
|
Ammini alifatiċi
|
1B)
|
1B)
|
|
Klorur tal-benżensulfonil
|
98-09-9
|
Kloruri tal-aċidu
|
1C
|
1C
|
|
N,N-Dimetil benżilammina
|
103-83-3
|
Anilini
|
1C
|
1C
|
|
Tetraetilenpentammina
|
112-57-2
|
Ammini alifatiċi
|
1C
|
1C
|
|
Eugenol
|
97-53-0
|
Fenoli
|
NC
|
NC
|
|
Nonil akrilat
|
2664-55-3
|
Akrilati/metakrilati
|
NC
|
NC
|
|
Bikarbonat tas-sodju
|
144-55-8
|
Imluħ inorganiċi
|
NC
|
NC
|
|
PROĊEDURA
|
12.
|
Il-paragrafi li ġejjin jiddeskrivu l-komponenti u l-proċeduri ta’ metodu ta’ ttestjar tal-barriera tal-membrana artifiċjali għall-valutazzjoni tal-korrużività (7)(15), fuq il-bażi tal-VRM kurrenti, jiġifieri l-Corrositex® kummerċjalment disponibbli. Il-barriera tal-membrana u l-kompatibbiltà/l-indikatur u s-soluzzjonijiet ta’ kategorizzazzjoni jistgħu jinbnew, jitħejjew jew jinkisbu kummerċjalment bħal fil-każ tal-VRM Corrositex®. Hu disponibbli protokoll kampjun tal-metodu ta’ ttestjar għall-metodu ta’ ttestjar ta’ riferiment validat (7). L-ittestjar għandu jsir f’temperatura ambjentali (17-25 °C) u l-komponenti għandhom jikkonformaw mal-kundizzjonijiet li ġejjin.
|
Test tal-Kompatibbiltà tas-Sustanza Kimika tat-Test
|
13.
|
Qabel it-twettiq tat-test tal-barriera tal-membrana, isir test tal-kompatibbiltà biex jiġi determinat jekk is-sustanza kimika tat-test hix individwabbli mis-CDS. Jekk is-CDS ma tindividwax is-sustanza kimika tat-test, il-metodu ta’ ttestjar tal-barriera tal-membrana ma jkunx xieraq għall-evalwazzjoni tal-korrużività potenzjali ta’ dik is-sustanza kimika tat-test partikolari u għandu jintuża metodu ta’ ttestjar differenti. Is-CDS u l-kundizzjonijiet ta’ esponiment użati għat-test tal-kompatibbiltà għandhom jirriflettu l-esponiment fit-test tal-barriera tal-membrana sussegwenti.
|
Test tal-Kategorija tal-Iskala ta’ Żmien tas-Sustanza Kimika tat-Test
|
14.
|
Jekk dan ikun xieraq għall-metodu ta’ ttestjar, sustanza kimika tat-test li tkun ġiet kwalifikata mit-test tal-kompatibbiltà għandha tkun soġġetta għal test tal-kategorija tal-iskala ta’ żmien, jiġifieri test ta’ skrinjar biex issir distinzjoni bejn aċidi jew bażijiet dgħajfa u b’saħħithom. Pereżempju, fil-metodu ta’ ttestjar ta’ riferiment validat, test ta’ kategorizzazzjoni tal-iskala ta’ żmien jintuża biex jindika liema miż-żewġ skali ta’ żmien għandha tintuża fuq il-bażi ta’ jekk tiġix individwata riserva aċida jew alkalina sinifikanti. Żewġ skali ta’ żmien tal-infid differenti għandhom jintużaw għad-determinazzjoni tal-korrużività u tas-Subkategorija tal-korrużività tal-ġilda tal-GHS tan-NU, fuq il-bażi tar-riserva aċida jew alkalina tas-sustanza kimika tat-test.
|
KOMPONENTI TAL-METODU TA’ TTESTJAR TAL-BARRIERA TAL-MEMBRANA
Barriera tal-Membrana
|
15.
|
Il-barriera tal-membrana tikkonsisti f’żewġ komponenti: ġel milwiem makromolekolari proteiniku u membrana ta’ sostenn permeabbli. Il-ġel proteiniku għandu jkun impermeabbli għal-likwidi u għas-solidi iżda jista’ jġarrab korrużjoni u jsir permeabbli. Il-barriera tal-membrana mibnija bis-sħiħ għandha tinħażen f’kundizzjonijiet predeterminati murija li jipprekludu deterjorament tal-ġel, eż. tnixxif, tkabbir mikrobjali, qlib, qsim, li jkunu jiddegradaw il-prestazzjoni tiegħu. Il-perjodu ta’ ħżin aċċettabbli għandu jkun determinat u l-preparati tal-barriera tal-membrana ma għandhomx jintużaw wara dak il-perjodu.
|
|
16.
|
Il-membrana ta sostenn permeabbli tipprovdi appoġġ mekkaniku lill-ġel proteiniku matul il-proċess ta’ fformar tal-ġel u l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test. Il-membrana ta’ sostenn għandha tipprevjeni d-dendil jew il-qlib tal-ġel u għandha tkun permeabbli minnufih għas-sustanzi kimiċi tat-test kollha.
|
|
17.
|
Il-ġel proteiniku, kompost minn proteina, eż. keratina, kollaġen, jew taħlitiet ta’ proteini, li jifformaw matriċi tal-ġel, iservi bħala l-mira għas-sustanza kimika tat-test. Il-materjal proteiniku jitqiegħed fuq is-superfiċje tal-membrana ta’ sostenn u jitħalla jifforma ġel qabel ma l-barriera tal-membrana titqiegħed fuq is-soluzzjoni indikatur. Il-ġel proteiniku għandu jkun ta’ ħxuna u densità ugwali kullimkien, u mingħajr bżieżaq tal-arja jew difetti li jistgħu jaffettwaw l-integrità funzjonali tiegħu.
|
Sistema ta’ Detezzjoni tas-Sustanza Kimika (CDS)
|
18.
|
Is-soluzzjoni indikatur, li hi l-istess soluzzjoni użata għat-test tal-kompatibbiltà, għandha twieġeb għall-preżenza ta’ sustanza kimika tat-test. Għandhom jintużaw kolorant indikatur tal-pH jew taħlita ta’ koloranti, eż. aħmar kreżol u oranġjo metil li juru tibdil fil-kulur, bħala tweġiba għall-preżenza tas-sustanza kimika tat-test. Is-sistema tal-kejl tista’ tkun viżwali jew elettronika.
|
|
19.
|
Is-sistemi ta’ detezzjoni li huma żviluppati għad-detezzjoni tal-passaġġ tas-sustanza kimika tat-test mill-membrana barriera għandhom jiġu vvalutati għar-rilevanza u għall-affidabbiltà tagħhom biex tintwera l-firxa ta’ sustanzi kimiċi li jistgħu jiġu individwati u l-limiti kwantitattivi ta’ detezzjoni.
|
TWETTIQ TAT-TEST
Assemblaġġ tal-Komponenti tal-Metodu ta’ Ttestjar
|
20.
|
Il-barriera tal-membrana titqiegħed f’kunjett (jew tubu) li fih is-soluzzjoni indikatur biex il-membrana ta’ sostenn tkun f’kuntatt sħiħ mas-soluzzjoni indikatur u mingħajr ebda bużżieqa tal-arja preżenti. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi żgurat li tinżamm l-integrità tal-barriera.
|
Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
|
21.
|
Ammont xiearq tas-sustanza kimika tat-test, eż. 500 μl ta’ likwidu jew 500 mg ta’ solidu mitħun fin (7), jitqiegħed bil-galbu f’saffi fuq is-superfiċje superjuri tal-barriera tal-membrana u jitqassam b’mod ugwali. Numru xieraq ta’ repliki, eż. erba’ (7), jitħejja għal kull sustanza kimika tat-test u għall-kontrolli korrispondenti tagħha (ara l-paragrafi 23 sa 25). Jiġi rreġistrat il-ħin tal-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fuq il-barriera tal-membrana. Biex jiġi żgurat li l-ħinijiet ta’ korrużjoni qosra jiġu reġistrati bi preċiżjoni, il-ħinijiet tal-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fuq il-kunjetti tar-repliki jitqassmu fi stadji.
|
Kejl tal-Penetrazzjonijiet tal-Barriera tal-Membrana
|
22.
|
Kull kunjett jiġi ssorveljat kif xieraq u l-ħin tal-ewwel tibdil fis-soluzzjoni indikatur, jiġifieri l-penetrazzjoni tal-barriera, jiġi reġistrat, u jiġi determinat il-ħin li jgħaddi bejn l-applikazzjoni u l-penetrazzjoni tal-barriera tal-membrana.
|
Kontrolli
|
23.
|
F’testijiet li jinvolvu l-użu ta’ veikolu jew ta’ solvent bis-sustanza kimika tat-test, il-veikolu jew is-solvent għandhom ikunu kompatibbli mas-sistema tal-barriera tal-membrana, jiġifieri ma jbiddlux l-integrità tas-sistema tal-barriera tal-membrana, u ma għandhomx ibiddlu l-korrużività tas-sustanza kimika tat-test. Meta applikabbli, kontroll bis-solvent (jew veikolu) għandu jiġi ttestjat fl-istess ħin mas-sustanza kimika tat-test biex tintwera l-kompatibbiltà tas-solvent mas-sistema tal-barriera tal-membrana.
|
|
24.
|
Kontroll (korrużiv) pożittiv b’attività ta’ korrużività immedjata, eż. 110 ± 15 mg idrossidu tas-sodju (Subkategorija Korrużiva 1B tal-GHS tan-NU) (7), għandu jiġi ttestjat fl-istess ħin mas-sustanza kimika tat-test biex jiġi vvalutat jekk is-sistema tat-test hix qed taħdem b’mod aċċettabbli. It-tieni kontroll pożittiv li jkun tal-istess klassi ta’ sustanzi kimiċi bħas-sustanza kimika tat-test jista’ jkun siewi għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta’ korrużività relattiv ta’ sustanza kimika tat-test korrużiva. Għandu/għandhom jintuża(w) kontroll(i) pożittiv(i) li jkun(u) intermedjarji fil-korrużività tiegħu/tagħhom (eż. is-Subkategorija 1B tal-GHS tan-NU) biex jiġu individwati tibdiliet fil-ħin tal-penetrazzjoni li jistgħu jkunu itwal jew iqsar b’mod inaċċettabbli mill-valur referenzjarju stabbilit, li tkun indikazzjoni li s-sistema tat-test mhix qed taħdem kif suppost. Għal dan l-għan, sustanzi kimiċi estremament korrużivi (Subkategorija 1A tal-GHS tan-NU) jew mhux korrużivi ftit li xejn ikunu utli. Sustanza kimika tas-Subkategorija korrużiva 1B tal-GHS tan-NU tkun tippermetti d-detezzjoni ta’ ħin ta’ penetrazzjoni rapidu wisq jew bil-mod wisq. Korrużiv dgħajjef (Subkategorija 1C tal-GHS tan-NU) jista’ jintuża bħala kontroll pożittiv biex titkejjel il-ħila tal-metodu ta’ ttestjar li jiddistingwi b’mod konsistenti bejn sustanzi kimiċi ftit li xejn korrużivi u dawk mhux korrużivi. Indipendentement mill-approċċ użat, għandha tiġi żviluppata medda ta’ rispons tal-kontroll pożittiv aċċettabbli fuq il-bażi tal-medda storika tal-ħinijiet ta’ penetrazzjoni għall-kontroll(i) pożittiv(i) użat(i), bħal ± 2-3 devjazzjonijiet standard medji. F’kull studju, il-ħin eżatt tal-penetrazzjoni għandu jiġi determinat għall-kontroll pożittiv biex ikunu jistgħu jiġu individwati d-devjazzjonijiet barra l-medda aċċettabbli.
|
|
25.
|
Kontroll negattiv (mhux korrużiv), eż. 10 % aċidu ċitriku, 6 % aċidu propjoniku (7), ukoll għandu jiġi ttestjat fl-istess ħin mas-sustanza kimika tat-test bħala kejl ieħor tal-kontroll tal-kwalità biex tintwera l-integrità funzjonali tal-barriera tal-membrana.
|
Kriterji ta’ Aċċettabbiltà tal-Istudju
|
26.
|
Skont il-parametri tal-ħin stabbiliti għal kull waħda mis-Subkategoriji tal-korrużività tal-GHS tan-NU, il-ħin (f’minuti) li jgħaddu bejn l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test għall-barriera tal-membrana u l-penetrazzjoni tal-barriera jintuża biex titbassar il-korrużività tas-sustanza kimika tat-test. Biex studju jitqies aċċettabbli, il-kontroll pożittiv konkorrenti għandu jagħti l-ħin ta’ rispons tal-penetrazzjoni mistenni (eż. ħin ta’ penetrazzjoni ta’ 8-16-il min għall-idrossidu tas-sodju jekk jintuża bħala kontroll pożittiv), il-kontroll negattiv konkorrenti ma għandux ikun korrużiv, u, meta jkun inkluż, il-kontroll bis-solvent konkorrenti la għandu jkun korrużiv u lanqas ma għandu jbiddel il-potenzjal ta’ korrużività tas-sustanza kimika tat-test. Qabel ma jużaw b’mod sistematiku xi metodu li jkun konformi ma’ dan il-metodu ta’ ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika tagħhom, billi jużaw it-12-il sustanza rrakkomandata fit-Tabella 2. Għal metodi ġodda “me-too” żviluppati fl-ambitu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar li jkunu strutturalment u funzjonalment simili għall-metodu ta’ riferiment validat (14), għandhom jintużaw l-istandards tal-prestazzjoni predefiniti biex jintwerew l-affidabbiltà u l-preċiżjoni tal-metodu l-ġdid qabel l-użu tiegħu għall-ittestjar regolatorju (10).
|
Interpretazzjoni tar-Riżultati u tal-Klassifikazzjoni tal-Korrużività tas-Sustanzi Kimiċi tat-Test
|
27.
|
Il-ħin (f’minuti) li jgħaddi bejn l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test għall-barriera tal-membrana u l-penetrazzjoni tal-barriera jintuża biex is-sustanza kimika tat-test tiġi klassifikata f’termini tas-Subkategoriji korrużivi tal-GHS tan-NU (1) u, jekk applikabbli, tal-Grupp tal-Imballaġġ tan-NU (16). Il-valuri tal-ħin ta’ limitu għal kull waħda mit-tliet subkategoriji korrużivi huma stabbiliti għal kull metodu ta’ ttestjar propost. Id-deċiżjonijiet finali dwar il-ħinijiet ta’ limitu għandhom jikkunsidraw il-ħtieġa li tiġi minimizzata s-sottoklassifikazzjoni tal-periklu korrużiv (jiġifieri negattivi foloz). Fil-linja gwida tat-test preżenti, għandhom jintużaw il-ħinijiet ta’ limitu ta’ Corrositex® kif deskritti fit-tabella 3 peress li dan jirrappreżenta l-uniku metodu ta’ ttestjar li bħalissa jaqa’ fi ħdan il-linja gwida tat-test (7).
Tabella 3
Mudell ta’ tbassir Corrositex®
|
Ħin medju tal-penetrazzjoni (min.)
|
Tbassir tal-GHS tan-NU (32)
|
|
Sustanzi kimiċi tat-test tal-kategorija 1 (30) (determinati mit-test ta’ kategorizzazzjoni tal-metodu)
|
Sustanzi kimiċi tat-test tal-kategorija 2 (31) (determinati mit-test ta’ kategorizzazzjoni tal-metodu)
|
|
0-3 min.
|
0-3 min.
|
Korrużivi Subkategorija fakultattiva 1A
|
|
> 3 sa 60 min.
|
> 3 sa 30 min.
|
Korrużivi Subkategorija fakultattiva 1B
|
|
> 60 sa 240 min.
|
> 30 sa 60 min.
|
Korrużivi Subkategorija fakultattiva 1C
|
|
> 240 min.
|
> 60 min.
|
Mhux korrużivi
|
|
DATA U RAPPORTAR
Data
|
28.
|
Il-ħin (f’minuti) li jgħaddi bejn l-applikazzjoni u l-penetrazzjoni tal-barriera għas-sustanza kimika tat-test u l-kontroll(i) pożittiv(i) għandu jiġi rapportat f’forma tabulari bħala data dwar ir-replikati individwali, kif ukoll ifisser id-devjazzjoni standard ± għal kull prova.
|
Rapport tat-Test
|
29.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
|
Sustanza Kimika tat-Test u Sustanzi tal-Kontroll:
|
—
|
Sustanza monokostitwenti: l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
|
|
—
|
Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita: ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti;
|
|
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
|
—
|
Is-sors, in-numru tal-lott jekk disponibbli;
|
|
—
|
It-trattament tas-sustanza kimika tat-test/tas-sustanza tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (eż., it-tisħin, it-tħin);
|
|
—
|
L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, id-data ta’ limitu għall-użu, jew id-data għall-analiżi mill-ġdid, jekk magħrufa;
|
|
—
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin.
|
|
|
|
Veikolu:
|
—
|
L-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (fejn xieraq), il-volum użat;
|
|
—
|
Il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.
|
|
|
|
Il-mudell u l-protokoll tal-barriera tal-membrana in vitro użati, inklużi l-preċiżjoni u l-affidabbiltà murija
|
|
|
Kundizzjonijiet tat-Test:
|
—
|
Deskrizzjoni tal-apparat u tal-proċeduri ta’ tħejjija użati;
|
|
—
|
Sors u kompożizzjoni tal-barriera tal-membrana in vitro użati;
|
|
—
|
Kompożizzjoni u proprjetajiet tas-soluzzjoni indikatur;
|
|
—
|
Ammonti tas-sustanza kimika tat-test u sustanzi tal-kontroll;
|
|
—
|
Deskrizzjoni u ġustifikazzjoni għat-test ta’ kategorizzazzjoni tal-iskala ta’ żmien;
|
|
—
|
Metodu tal-applikazzjoni;
|
|
—
|
Ħinijiet ta’ osservazzjoni.
|
|
—
|
Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ evalwazzjoni u ta’ klassifikazzjoni applikati;
|
|
—
|
Wiri ta’ profiċjenza fit-twettiq tal-metodu ta’ ttestjar qabel użu ta’ rutina bl-ittestjar tas-sustanzi kimiċi ta’ profiċjenza.
|
|
|
|
Ir-riżultati:
|
—
|
Tabulazzjoni tad-data mhux proċessata individwali mit-test u mill-kampjuni tal-kontroll individwali għal kull replikat;
|
|
—
|
Deskrizzjonijiet ta’ effetti oħra osservati;
|
|
—
|
Il-klassifikazzjoni derivata b’referenza għall-mudell ta’ tbassir/għall-kriterji tad-deċiżjoni użati.
|
|
Diskussjoni tar-riżultati
Konklużjonijiet
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
In-Nazzjonijiet Uniti (NU) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth Revised Edition, NU New York u Ġinevra, 2013. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
|
|
(2)
|
Il-Kapitolu B.4 ta’ dan l-Anness, Irritazzjoni, Korrużjoni Dermali Akuta.
|
|
(3)
|
Il-Kapitolu B.40bis ta’ dan l-Anness, Korrużjoni tal-ġilda in vitro: metodu ta’ ttestjar tal-epidermis uman rikostitwit (RHE).
|
|
(4)
|
Il-Kapitolu B.40 ta’ dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro. Ir-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER).
|
|
(5)
|
OECD (2015). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203). Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(6)
|
Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G. u Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, 483-524.
|
|
(7)
|
ICCVAM (1999). Corrositex®. An In Vitro Test Method for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by ICCVAM, NTP and NICEATM. NIEHS, NIH Publication (No 99-4495.)
|
|
(8)
|
Gordon V.C., Harvell J.D. u Maibach H.I. (1994). Dermal Corrosion, the Corrositex® System: A DOT Accepted Method to Predict Corrosivity Potential of Test Materials. In vitro Skin Toxicology-Irritation, Phototoxicity, Sensitization. Alternative Methods in Toxicology 10, 37-45.
|
|
(9)
|
OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications. Series on testing and Assessment (No 34).
|
|
(10)
|
OECD (2014). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 435. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/PerfStand-TG430-June14.pdf.
|
|
(11)
|
ECVAM (2001). Dikjarazzjoni dwar l-Applikazzjoni tal-Assaġġ CORROSITEX® għall-Ittestjar tal-Korrużività tal-Ġilda. Il-15-il Laqgħa tal-Kumitat Konsultattiv Xjentifiku tal-ECVAM (ESAC), Ispra, l-Italja. ATLA 29, 96-97.
|
|
(12)
|
U.S. DOT (2002). Exemption DOT-E-10904 (Fifth Revision). (l-20 ta’ Settembru 2002). Washington, D.C., U.S. DOT.
|
|
(13)
|
Kapitolu B.46 ta’ dan l-Anness, Irritazzjoni tal-Ġilda In Vitro: Metodu ta’ Ttestjar tal-Epidermis Uman Rikostitwit. ICCVAM (2004). ICCVAM Recommended Performance Standards for In Vitro Test Methods for Skin Corrosion. NIEHS, NIH Publication No 04-4510. Disponibbli fuq: http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/dermal_docs/ps/ps044510.pdf.
|
|
(14)
|
U.S. EPA (1996). Method 1120, Dermal Corrosion. Disponibbli fuq: http://www.epa.gov/osw/hazard/testmethods/sw846/pdfs/1120.pdf.
|
|
(15)
|
In-Nazzjonijiet Uniti (NU) (2013). UN Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Model Regulations, 18th Revised Edition (Parti, Kapitolu 2.8), UN, 2013. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/unrec/rev18/English/Rev18_Volume1_Part2.pdf.
|
Appendiċi
DEFINIZZJONIJIET
Akkuratezza
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta’ ttestjar u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ ‘konkordanza’ sabiex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ metodu ta’ ttestjar (9).
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita.
Sistema ta’ Detezzjoni tas-Sustanza Kimika (CDS)
: Sistema ta’ kejl viżwali jew elettronika b’soluzzjoni indikatur li twieġeb għall-preżenza ta’ sustanza kimika tat-test, eż. b’tibdil f’kolorant indikatur tal-pH, jew f’taħlita ta’ koloranti, li juru tibdil fil-kulur bħala tweġiba għall-preżenza tas-sustanza kimika tat-test jew b’tipi oħra ta’ reazzjonijiet kimiċi jew elettrokimiċi.
Konkordanza
: Dan hu kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar għal metodi ta’ ttestjar li jagħtu riżultat kategoriku, u hu aspett wieħed tar-rilevanza. It-terminu kultant jintuża b’mod interkambjabbli mal-akkuratezza, u hu definit bħala l-proporzjon tas-sustanzi kimiċi kollha ttestjati li jiġu klassifikati kif suppost bħala pożittivi jew negattivi. Il-konkordanza hi ferm dipendenti fuq il-prevalenza tal-pożittivi fit-tipi ta’ sustanzi kimiċi tat-test li jkunu qed jiġu eżaminati (9).
GHS (Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi)
: Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (1).
IATA
: Approċċ Integrat għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni
Taħlita
: Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.
Sustanza monokostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).
Sustanza multikostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bit-tħallit ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.
NC
: Mhux korrużiva.
Standards tal-prestazzjoni
: Standards, ibbażati fuq metodu ta’ ttestjar validu, li jipprovdu bażi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ metodu ta’ ttestjar propost li hu simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Inklużi hemm (i) il-komponenti essenzjali tal-metodi ta’ ttestjar; (ii) lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza magħżula minn fost is-sustanzi kimiċi użati biex tintwera l-prestazzjoni aċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (iii) il-livelli simili ta’ affidabbiltà u ta’ akkuratezza, fuq il-bażi ta’ dak li nkiseb għall-metodu ta’ ttestjar validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost għandu juri meta evalwat bl-użu tal-lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza (9).
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar mal-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm il-metodu ta’ ttestjar għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ metodu ta’ ttestjar (9).
Affidabbiltà
: Kejlijiet ta’ kemm metodu ta’ ttestjar jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din hi vvalutata billi tiġi kkalkolata r-riproduċibbiltà fi ħdan laboratorju u bejn laboratorju u ieħor (9).
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta’ ttestjar. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (9).
Korrużjoni tal-ġilda in vivo
: Il-produzzjoni ta’ dannu irriversibbli fil-ġilda; jiġifieri nekrożi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test għal mhux aktar minn erba’ sigħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma kkaratterizzati minn ulċeri, fsad, qxur bid-demm, u, fit-tmiem tal-osservazzjoni fl-14-il jum, minn skulurazzjoni minħabba t-tibjid tal-ġilda, żoni sħaħ b’alopeċja, u ċikatriċi. L-istopatoloġija għandha titqies biex jiġu evalwati leżjonijiet li dwarhom hemm dubju.
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta’ ttestjar. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (9).
Sustanza
: Element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ produzzjoni, li jinduċi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mibdula l-kompożizzjoni tagħha.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
UVCB
: Sustanzi kimiċi b’kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.
B.66 ASSAĠĠI IN VITRO TA’ TRANSATTIVAZZJONI TRANSFETTATI B’MOD STABBLI BIEX JIĠU INDIVIDWATI AGONISTI U ANTAGONISTI RIĊETTURI TAL-ESTROĠENU
INTRODUZZJONI ĠENERALI
Linja Gwida tat-Test Ibbażata fuq il-Prestazzjoni tal-OECD
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 455 tal-OECD (2016). It-TG 455 hi linja gwida tat-test ibbażata fuq il-prestazzjoni (PBTG), li tiddeskrivi l-metodoloġija ta’ Assaġġi In Vitro ta’ Transattivazzjoni Transfettati b’Mod Stabbli biex jiġu individwati Agonisti u Antagonisti Riċetturi tal-Estroġenu (assaġġi TA tal-ER). Din tinkludi diversi metodi ta’ ttestjar mekkanistikament u funzjonalment simili għall-identifikazzjoni tal-agonisti u tal-antagonisti riċetturi tal-estroġenu (jiġifieri ERα, u/jew ERβ) u għandha tiffaċilita l-iżvilupp ta’ metodi ta’ ttestjar simili jew modifikati ġodda skont il-prinċipji għall-validazzjoni stabbiliti fl-OECD Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment (1). Il-metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment validati bis-sħiħ (Appendiċi 2 u Appendiċi 3) li jipprovdu l-bażi għal din il-PBTG huma:
|
—
|
L-assaġġ TA Transfettat b’Mod Stabbli (STTA) (2) bl-użu tal-linja ta’ ċelloli (h) ERα-HeLa-9903; u
|
|
—
|
L-assaġġ TA tal-ER VM7Luc (3) bl-użu tal-linja ta’ ċelloli VM7Luc4E2 (33) li b’mod predominanti jesprimi hERα b’xi kontribuzzjoni minn hERβ(4)(5).
|
Għall-iżvilupp u għall-validazzjoni ta’ assaġġi simili għall-istess punt ta’ tmiem tal-periklu, hemm disponibbli standards tal-prestazzjoni (PS) (6) (7) u dawn għandhom jintużaw. Dawn jippermettu għall-emendar puntwali tal-PBTG 455 biex l-assaġġi simili l-ġodda jkunu jistgħu jiżdiedu ma’ PBTG aġġornata; madankollu, assaġġi simili jiżdiedu bis wara rieżami u qbil mill-OECD li ntlaħqu l-istandards tal-prestazzjoni. L-assaġġi inklużi fit-TG 455 jistgħu jintużaw b’mod indiskriminat biex jiġu indirizzati r-rekwiżiti tal-pajjiżi membri tal-OECD għar-riżultati tat-testijiet dwar it-transattivazzjoni tar-riċettur tal-estroġenu filwaqt li jinkiseb benefiċċju mill-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data tal-OECD.
|
Sfond u prinċipji tal-assaġġi inklużi f’dan il-metodu ta’ ttestjar
|
2.
|
Fl-1998, l-OECD nediet attività ta’ prijorità għolja biex tirrevedi linji gwida dwar it-testijiet eżistenti, u tiżviluppa ġodda, għall-iskrinjar u għall-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi interferenti endokrinali potenzjali. Il-qafas kunċettwali (CF) tal-OECD għall-ittestjar u għall-valutazzjoni ta’ sustanzi kimiċi interferenti endokrinali potenzjali ġie rivedut fl-2012. Is-CFs oriġinali u riveduti huma inklużi bħala Annessi fid-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar Linji Gwida tat-Testijiet Standardizzati għall-Evalwazzjoni ta’ Sustanzi Kimiċi għall-Interferenza Endokrinali (8). Is-CF jinkludi ħames livelli, b’kull livell li jikkorrispondi għal livell differenti ta’ kumplessità bijoloġika. L-assaġġi tat-transattivazzjoni (TA) tal-ER deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma l-livell 2, li jinkludi assaġġi in vitro li jipprovdu data dwar il-mekkaniżmu/i/il-perkors(i) endokrinali magħżula. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu għall-assaġġi ta’ Transattivazzjoni (TA) in vitro mfassla biex jidentifikaw agonisti u antagonisti tar-riċetturi tal-estroġenu (ER).
|
|
3.
|
L-interazzjoni tal-estroġeni mal-ERs tista’ taffettwa t-traskrizzjoni tal-ġeni kkontrollati mill-estroġenu, li tista’ twassal għall-induzzjoni jew għall-inibizzjoni ta’ proċessi ċellolari, inklużi dawk neċessarji għall-proliferazzjoni taċ-ċelloli, għall-iżvilupp normali tal-fetu, u għall-funzjoni riproduttiva (9)(10)(11). Il-perturbazzjoni ta’ sistemi estroġeniċi normali jista’ jkollha l-potenzjal li tiskatta effetti avversi fuq l-iżvilupp normali (ontoġenesi), is-saħħa riproduttiva u l-integrità tas-sistema riproduttiva.
|
|
4.
|
L-assaġġi TA in vitro huma bbażati fuq interazzjoni diretta jew indiretta tas-sustanzi ma’ riċettur speċifiku li jirregola t-traskrizzjoni ta’ prodott ta’ ġene indikatur. Assaġġi bħal dawn intużaw b’mod estensiv għall-evalwazzjoni tal-espressjoni ġenika regolata minn riċetturi nukleari speċifiċi, bħall-ERs (12) (13) (14) (15) (16). Dawn ġew proposti għad-detezzjoni tat-transattivazzjoni estroġenika regolata mill-ER (17) (18) (19). Hemm tal-anqas żewġ subtipi ewlenin ta’ ERs nukleari, α u β, li huma kodifikati minn ġeni distinti. Il-proteini rispettivi għandhom funzjonijiet bijoloġiċi differenti kif ukoll distribuzzjonijiet tat-tessuti u affinitajiet għall-irbit ligandi differenti (20)(21)(22)(23)(24)(25)(26). L-ERα nukleari jimmedja r-rispons estroġeniku klassiku (27)(28)(29)(30), u għalhekk ħafna mill-mudelli li qed jiġu żviluppati bħalissa għall-kejl tal-attivazzjoni jew tal-inibizzjoni atl-ER huma speċifiċi għall-ERα. L-assaġġi jintużaw biex jidentifikaw sustanzi kimiċi li jattivaw (jew jinibixxu) l-ER wara li jsiruleganti ligandi, wara liem il-kumpless riċettur-ligand jillega ma’ elementi ta’ rispons speċifiċi tad-DNA u jittransattiva ġene indikatur, li jirriżulta f’espressjoni ċellolari akbar ta’ proteina markatur. F’dawn l-assaġġi jistgħu jintużaw risponsi indikaturi differenti. F’sistemi bbażati fuq luċiferażi, l-enzima luċiferażi tittrasaforma s-substrat luċiferin fi prodott bijoluminexxenti li jista’ jitkejjel b’mod kwantitattiv b’luminometru. Eżempji oħra ta’ indikaturi komuni huma proteina fluworexxenti u l-ġene LacZ, li jikkodifika l-β-galaktosidażi, enzima li tista’ tittrasfroma s-substrat bla kulur X-gal (5- bromo-4-kloro-indolil-galaktopiranosid) fi prodott blu li jista’ jiġi kwantifikat bi spettrofotometru. Dawn l-indikaturi jistgħu jiġu evalwati malajr u mingħajr ma jintefqu wisq flus b’kits tat-test disponibbli kummerċjalment.
|
|
5.
|
Studji ta’ validazzjoni tal-STTA u l-assaġġi tat-TA VM7Luc urew ir-rilevanza u l-affidabbiltà tagħhom għall-iskop maħsub tagħhom (3)(4)(5)(30). L-istandards tal-prestazzjoni għal assaġġi TA tal-ER ibbażati fuq il-luminexxenza li jużaw linji ta’ ċelloli tas-sider huma inklużi fir-Rapport ta’ Evalwazzjoni tal-Metodu ta’ Ttestjar tal-ICCVAM dwar il-Metodu ta’ Ttestjar LUMI-CELL® ER (TA tal-ER VM7Luc). Assaġġ In Vitro għall-Identifikazzjoni tal-Attività Agonista u Antagonista tar-Riċettur tal-Estroġenu Uman tas-Sustanzi Kimiċi (3). Dawn l-istandards tal-prestazzjoni ġew modifikati biex ikunu applikabbli kemm għall-assaġġi STTA kif ukoll TA VM7Luc (2).
|
|
6.
|
Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma deskritti fl-Appendiċi 1.
|
Ambitu u limitazzjonijiet relatati mal-assaġġi TA
|
7.
|
Dawn l-assaġġi qed jiġu proposti għall-finijiet ta’ skrinjar u ta’ prijoritizzazzjoni, iżda jistgħu jipprovdu wkoll informazzjoni mekkanistika li tista’ tintuża f’approċċ ta’ piż tal-evidenza. Dawn jindirizzaw TA indott b’irbit kimiku mal-ERs f’sistema in vitro. B’hekk, ir-riżultati ma għandhomx jiġu estrapolati direttament għas-sinjalar u għar-regolamentazzjoni kumplessi tas-sistema endokrinali intatta in vivo.
|
|
8.
|
TA medjat mill-ERs jitqies wieħed mill-mekkaniżmi ewlenin tal-interferenza endokrinali (ED), għalkemm hemm mekkaniżmi oħra li bihom tista’ sseħħ l-ED, inklużi (i) interazzjonijiet ma’ riċetturi u ma’ sistemi enzimatiċi oħra fi ħdan is-sistema endokrinali, (ii) sinteżi ormonali, (iii) attivazzjoni metabolika u/jew inattivazzjoni tal-ormoni, (iv) distribuzzjoni tal-ormoni għat-tessuti fil-mira, u (v) tneħħija tal-ormoni mill-ġisem. L-ebda wieħed mill-assaġġi taħt dan il-metodu ta’ ttestjar ma jindirizza dawn il-modalitajiet ta’ azzjoni.
|
|
9.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jindirizza l-ħila tas-sustanzi kimiċi li jattivaw (jiġifieri jaġixxu bħala agonisti) kif ukoll irażżnu (jiġifieri jaġixxu bħala antagonisti) traskrizzjoni dipendenti mill-ER. Ċerti sustanzi kimiċi jistgħu juru, b’mod dipendenti fuq it-tip ta’ ċellola, kemm attività agonista kif ukoll antagonista u huma magħrufa bħala modulaturi selettivi tar-riċetturi tal-estroġenu (SERMs). Is-sustanzi kimiċi li huma negattivi f’dawn l-assaġġi jistgħu jiġu evalwati f’assaġġ tal-irbit tal-ER qabel ma jiġi konkluż li s-sustanza kimika ma tillegax mar-riċettur. Barra minn hekk, l-assaġġi aktarx li jinformaw biss dwar l-attivtà tal-molekola omm fid-dawl tal-kapaċitajiet metabolizzanti limitati tas-sistemi ċellolari in vitro. Peress li ntużaw sustanzi singli biss matul il-validazzjoni, l-applikabbiltà għat-taħlitiet tat-test ma ġietx indirizzata. Il-metodu ta’ ttestjar xorta waħda hu teorikament applikabbli għall-ittestjar ta’ sustanzi multikostitwenti, ta’ UVCBs u ta’ taħlitiet. Qabel ma jintuża dan il-metodu ta’ ttestjar fuq sustanza multikostitwenti, UVCB jew taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
|
|
10.
|
Għal-finijiet ta’ informazzjoni, it-Tabella 1 tipprovdi r-riżultati tat-test tal-agonisti għall-34 sustanza li ġew ittestjati fiż-żewġ metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment validati bis-sħiħ deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar. Minn dawn is-sustanzi, 26 huma klassifikati bħala agonisti definittivi tal-ER u tmienja negattivi fuq il-bażi tar-rapporti ppubblikati, inklużi assaġġi in vitro għall-irbit mal-ER u t-TA, u/jew l-assaġġ uterotrofiku (2)(3)(18)(31)(32)(33)(34). It-Tabella 2 tipprovdi r-riżultati tat-test tal-antagonisti għall-15-il sustanza li ġew ittestjati fiż-żewġ metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment validati bis-sħiħ deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar. Minn dawn is-sustanzi, erbgħa huma klassifikati bħala agonisti definittivi/preżunti tal-ER u 10 negattivi fuq il-bażi tar-rapporti ppubblikati, inklużi assaġġi in vitro għall-irbit mal-ER u t-TA (2)(3)(18)(31). B’referenza għad-data miġbura fil-qosor fit-Tabella 1 u fit-Tabella 2, kien hemm qbil ta’ 100 % bejn iż-żewġ metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment dwar il-klassifikazzjonijiet tas-sustanzi kollha ħlief sustanza waħda (mifepristone) għall-assaġġ tal-antagonisti, u kull sustanza ġiet klassifikata kif suppost bħala agonist/antagonist tal-ER jew negattiva. Informazzjoni supplimentari dwar dan il-grupp ta’ sustanzi kimiċi kif ukoll sustanzi kimiċi addizzjonali ttestjati fl-assaġġi STTA u TA tal-ER VM7Luc matul l-istudji ta’ validazzjoni hi pprovduta fl-Istandards tal-Prestazzjoni għall-ERTA (6)(7), fl-Appendiċi 2 (Tabelli 1, 2 u 3).
|
Tabella 1
Ħarsa ġenerali lejn ir-Riżultati mill-Assaġġi STTA u TA tal-ER VM7Luc għas-Sustanzi Ttestjati fiż-Żewġ Assaġġi Agonisti u Klassifikati bħala Agonisti tal-ER (POŻ) jew Negattivi (NEG)
|
|
Sustanza
|
CASRN
|
Assaġġ (35) STTA
|
Assaġġ (36) TA tal-ER VM7Luc
|
Sors tad-Data għall-Klassifikazzjoni (38)
|
|
TA tal-ER Attività
|
Valur PC10 (M)
|
Valurb PC50
(2) (M)
|
Attività TA tal-ER
|
Valurb,3 EC50
(2), (37) (M)
|
TAs (34) tal-ER Oħrajn
|
ER Leganti
|
Uterotrofiċi
|
|
1
|
17ß-estradjol (1)
|
50-28-2
|
POŻ
|
< 1,00 × 10-11
|
< 1,00 × 10-11
|
POŻ
|
5,63 × 10-12
|
POŻ (227/227)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
2
|
17α-estradjol (1)
|
57-91-0
|
POŻ
|
7,24 × 10-11
|
6,44 × 10-10
|
POŻ
|
1,40 × 10-9
|
POŻ(11/11)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
3
|
17α-etinil estradjol (1)
|
57-63-6
|
POŻ
|
< 1,00 × 10-11
|
< 1,00 × 10-11
|
POŻ
|
7,31 × 10-12
|
POŻ(22/22)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
4
|
17β-trenbolon
|
10161-33-8
|
POŻ
|
1,78 × 10-8
|
2,73 × 10-7
|
POŻ
|
4,20 × 10-8
|
POŻ (2/2)
|
NT
|
NT
|
|
5
|
19-nortestosterone (1)
|
434-22-0
|
POŻ
|
9,64 × 10-9
|
2,71 × 10-7
|
POŻ
|
1,80 × 10-6
|
POŻ(4/4)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
6
|
4-kumilfenol (1)
|
599-64-4
|
POŻ
|
1,49 × 10-7
|
1,60 × 10-6
|
POŻ
|
3,20 × 10-7
|
POŻ(5/5)
|
POŻ
|
NT
|
|
7
|
4-terz-ottilfenol (1)
|
140-66-9
|
POŻ
|
1,85 × 10-9
|
7,37 × 10-8
|
POŻ
|
3,19 × 10-8
|
POŻ(21/24)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
8
|
Apiġenin (1)
|
520-36-5
|
POŻ
|
1,31 × 10-7
|
5,71 × 10-7
|
POŻ
|
1,60 × 10-6
|
POŻ(26/26)
|
POŻ
|
NT
|
|
9
|
Atrażine (1)
|
1912-24-9
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG (30/30)
|
NEG
|
NT
|
|
10
|
Bisfenol A (1)
|
80-05-7
|
POŻ
|
2,02 × 10-8
|
2,94 × 10-7
|
POŻ
|
5,33 × 10-7
|
POŻ (65/65)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
11
|
Bisfenol B (1)
|
77-40-7
|
POŻ
|
2,36 × 10-8
|
2,11 × 10-7
|
POŻ
|
1,95 × 10-7
|
POŻ(6/6)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
12
|
Butilbenżil ftalate (1)
|
85-68-7
|
POŻ
|
1,14 × 10-6
|
4,11 × 10-6
|
POŻ
|
1,98 × 10-6
|
POŻ(12/14)
|
POŻ
|
NEG
|
|
13
|
Kortikosterone (1)
|
50-22-6
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG(6/6)
|
NEG
|
NT
|
|
14
|
Koumestrol (1)
|
479-13-0
|
POŻ
|
1,23 × 10-9
|
2,00 × 10-8
|
POŻ
|
1,32 × 10-7
|
POŻ(30/30)
|
POŻ
|
NT
|
|
15
|
Daidżein (1)
|
486-66-8
|
POŻ
|
1,76 × 10-8
|
1,51 × 10-7
|
POŻ
|
7,95 × 10-7
|
POŻ(39/39)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
16
|
Dietilstilbestrol (1)
|
56-53-1
|
POŻ
|
< 1,00 × 10-11
|
2,04 × 10-11
|
POŻ
|
3,34 × 10-11
|
POŻ(42/42)
|
POŻ
|
NT
|
|
17
|
Ftalat tad-di-n-butil
|
84-74-2
|
POŻ
|
4,09 × 10-6
|
|
POŻ
|
4,09 × 10-6
|
POŻ(6/11)
|
POŻ
|
NEG
|
|
18
|
Etil paraben
|
120-47-8
|
POŻ
|
5,00 × 10-6
|
(ebda PC50)
|
POŻ
|
2,48 × 10-5
|
POŻ
|
|
NT
|
|
19
|
Estrone (1)
|
53-16-7
|
POŻ
|
3,02 × 10-11
|
5,88 × 10-10
|
POŻ
|
2,34 × 10-10
|
POŻ(26/28)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
20
|
Ġenistein (1)
|
446-72-0
|
POŻ
|
2,24 × 10-9
|
2,45 × 10-8
|
POŻ
|
2,71 × 10-7
|
POŻ(100/102)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
21
|
Ħaloperidol
|
52-86-8
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG (2/2)
|
NEG
|
NT
|
|
22
|
Kempferol (1)
|
520-18-3
|
POŻ
|
1,36 × 10-7
|
1,21 × 10-6
|
POŻ
|
3,99 × 10-6
|
POŻ(23/23)
|
POŻ
|
NT
|
|
23
|
Kepone (1)
|
143-50-0
|
POŻ
|
7,11 × 10-7
|
7,68 × 10-6
|
POŻ
|
4,91 × 10-7
|
POŻ(14/18)
|
POŻ
|
NT
|
|
24
|
Ketokonażol
|
65277-42-1
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG (2/2)
|
NEG
|
NT
|
|
25
|
Linuron (1)
|
330-55-2
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG (8/8)
|
NEG
|
NT
|
|
26
|
meso-Eżestrol (1)
|
84-16-2
|
POŻ
|
< 1,00 × 10-11
|
2,75 × 10-11
|
POŻ
|
1,65 × 10-11
|
POŻ(4/4)
|
POŻ
|
NT
|
|
27
|
Metil testosterone (1)
|
58-18-4
|
POŻ
|
1,73 × 10-7
|
4,11 × 10-6
|
POŻ
|
2,68 × 10-6
|
POŻ(5/6)
|
POŻ
|
NT
|
|
28
|
Morin
|
480-16-0
|
POŻ
|
5,43 × 10-7
|
4,16 × 10-6
|
POŻ
|
2,37 × 10-6
|
POŻ(2/2)
|
POŻ
|
NT
|
|
29
|
Noretinodrel (1)
|
68-23-5
|
POŻ
|
1,11 × 10-11
|
1,50 × 10-9
|
POŻ
|
9,39 × 10-10
|
POŻ(5/5)
|
POŻ
|
NT
|
|
30
|
p,p’-Metossiklor (1)
|
72-43-5
|
POŻ
|
1,23 × 10-6
|
(ebda PC50) (2)
|
POŻ
|
1,92 × 10-6
|
POŻ(24/27)
|
POŻ
|
POŻ
|
|
31
|
Fenobarbital (1)
|
57-30-7
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG(2/2)
|
NEG
|
NT
|
|
32
|
Reserpina
|
50-55-5
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG(4/4)
|
NEG
|
NT
|
|
33
|
Spironolattone (1)
|
52-01-7
|
NEG
|
—
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG(4/4)
|
NEG
|
NT
|
|
34
|
Testosteron
|
58-22-0
|
POŻ
|
2,82 × 10-8
|
9,78 × 10-6
|
POŻ
|
1,75 × 10-5
|
POŻ(5/10)
|
POŻ
|
NT
|
|
Abbrevjazzjonijiet: CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; M = molari; EC50 = konċentrazzjoni effettiva medjana tas-sustanza tat-test; NEG = negatttivi; POŻ = pożittivi; NT = Mhux ittestjati; PC10 (u PC50) = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza tat-test li fiha r-rispons ikun 10 % (jew 50 % għall-PC50) tar-rispons indott mill-kontroll pożittiv (E2, 1nM) f’kull pjastra.
|
Tabella 2
Tqabbil tar-Riżultati mill-Assaġġi STTA u TA tal-ER VM7Luc għas-Sustanzi Ttestjati fiż-Żewġ Assaġġi Antagonisti u Klassifikati bħala Antagonisti tal-ER (POŻ) jew Negattivi (NEG)
|
|
Sustanza (3)
|
CASRN
|
Assaġġ STTA tal-ER (40)
|
Assaġġ TA tal-ER VM7Luc (41)
|
STTA tal-ER kandidat effetti (43)
|
ICCVAM (44) Klassifikazzjoni tal-Kunsens
|
MeSH (45) Klassi Kimika
|
Klassi tal-Prodott (46)
|
|
TA tal-ER Attività
|
Valur tal-IC50
(39) (M)
|
TA tal-ER Attività
|
Valur tal-IC50
(39), (42) (M)
|
|
1
|
4-idrossitamossifen
|
68047-06-3
|
POŻ
|
3,97 × 10-9
|
POŻ
|
2,08 × 10-7
|
POŻ moderati
|
POŻ
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku
|
|
2
|
Dibenżo[a.h]antraċen
|
53-70-3
|
POŻ
|
Ebda IC50
|
POŻ
|
Ebda IC50
|
POŻ
|
PP
|
Kompost Poliċikliku
|
Sustanza Kimika tal-Laboratorju, Prodott Naturali
|
|
3
|
Mifepriston
|
84371-65-3
|
POŻ
|
5,61 × 10-6
|
NEG
|
—
|
POŻ ħfief
|
NEG
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku
|
|
4
|
Ralossifen HCl
|
82640-04-8
|
POŻ
|
7,86 × 10-10
|
POŻ
|
1,19 × 10-9
|
POŻ moderati
|
POŻ
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku
|
|
5
|
Tamossifen
|
10540-29-1
|
POŻ
|
4,91 × 10-7
|
POŻ
|
8,17 × 10-7
|
POŻ
|
POŻ
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku
|
|
6
|
17β-estradjol
|
50-28-2
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NP
|
NP
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
7
|
Apiġenin
|
520-36-5
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG
|
NEG
|
Kompost Eteroċikliku
|
Kolorant, Prodott Naturali, Intermedjarju Farmaċewtiku
|
|
8
|
Atrażina
|
1912-24-9
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG
|
NP
|
Kompost Eteroċikliku
|
Erbiċida
|
|
9
|
Ftalat tad-di-n-butil
|
84-74-2
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG
|
NEG
|
Ester, Aċidu Ftaliku
|
Ingredjent Kożmetiku, Sustanza Kimika Industrijali, Plastifikant
|
|
10
|
Fenarimol
|
60168-88-9
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
mhux ittestjat
|
NP
|
Komposti Eteroċikliċi, Pirimidina
|
Fungiċida
|
|
11
|
Flavon
|
525-82-6
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NP
|
NP
|
Flavonojde, Kompost Eletroċikliku
|
Prodott Naturali, Farmaċewtiku
|
|
12
|
Flutammid
|
13311-84-7
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NEG
|
NP
|
Ammid
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
13
|
Ġenisteina
|
446-72-0
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NP
|
NEG
|
Flavonojde, Kompost Eletroċikliku
|
Prodott Naturali, Farmaċewtiku
|
|
14
|
p-n-nonilfenol
|
104-40-5
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
mhux ittestjat
|
NEG
|
Fenol
|
Intermedjarju Kimiku
|
|
15
|
Resveratrol
|
501-36-0
|
NEG
|
—
|
NEG
|
—
|
NP
|
NEG
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Prodott Naturali
|
|
Abbrevjazzjonijiet: CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; M = molari; IC50 = konċentrazzjoni inibitorja medjana tas-sustanza tat-test; NEG = negatttivi; NP = negattivi preżunti; POŻ = pożittivi; PP = pożittivi preżunti.
|
KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER
Komponenti Essenzjali tal-Assaġġ
|
11.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar japplika għal assaġġi li jużaw riċettur tal-ERα transfettat b’mod stabbli jew endoġenu u binja ta’ ġene indikatur transfettat b’mod stabbli taħt il-kontroll ta’ element ta’ rispons tal-estroġenu wieħed jew aktar; madankollu, jistgħu jkunu preżenti riċetturi oħra bħall-ERβ. Dawn huma komponenti essenzjali tal-assaġġ.
|
Kontrolli
|
12.
|
Il-bażi għall-istandards referenzjarji konkorrenti proposti għal kull assaġġ tal-agonisti u tal-antagonisti għandha tkun deskritta. Il-kontrolli konkorrenti (negattivi, solvent, u pożittivi), kif xieraq, iservu bħala indikazzjoni li l-assaġġ hu operattiv skont il-kundizzjonijiet tat-test u jipprovdu bażi għal tqabbil bejn esperiment u ieħor; normalment dawn ikunu parti mill-kriterji ta’ aċċettabbiltà għal esperiment partikolari (1).
|
Proċeduri Standard ta’ Kontroll tal-Kwalità
|
13.
|
Il-proċeduri standard ta’ kontroll tal-kwalità għandhom jitwettqu kif deskritt għal kull assaġġ biex jiġi żgurat li l-linja ta’ ċelloli tibqa’ stabbli matul diversi passaġġi, tibqa’ ħielsa mill-mikoplażma (jiġifieri ħielsa minn kontaminazzjoni batterjali), u żżomm il-ħila li tipprovdi r-risponsi medjati mill-ER mistennija maż-żmien. Il-linji ta’ ċelloli għandhom ikomplu jiġu verifikati għall-identità korretta tagħhom kif ukoll għal kontaminanti oħra (eż. fungi, ħmira u vajrusis).
|
Wiri tal-Profiċjenza tal-Laboratorju
|
14.
|
Qabel l-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi mhux magħrufa bi kwalunkwe wieħed mill-assaġġi f’dan il-metodu ta’ ttestjar, kull laboratorju għandu juri profiċjenza fl-użu tal-assaġġ. Biex juri l-profiċjenza, kull laboratorju għandu jittestja l-14-il sustanza ta’ profiċjenza elenkati fit-Tabella 3 għall-assaġġ tal-agonisti u 10 sustanzi ta’ profiċjenza fit-Tabella 4 għall-assaġġ tal-antagonisti. Dan l-ittestjar tal-profiċjenza jikkonferma r-risponsività tas-sistema tat-test ukoll. Il-lista ta’ sustanzi ta’ profiċjenza hi subsett tas-sustanzi ta’ riferiment pprovduti fl-Istandards tal-Prestazzjoni għall-assaġġi TA tal-ER (6). Dawn is-sustanzi huma kummerċjalment disponibbli, jirrappreżentaw il-klassijiet ta’ sustanzi kimiċi assoċjati komunement mal-attività agonista jew antagonista tal-ER, jesibixxu firxa xierqa ta’ potenza mistennija għall-agonisti/antagonisti tal-ER (jiġifieri b’saħħithom sa dgħajfa) u jinkludu negattivi. L-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza għandu jerġa’ jsir tal-anqas darbtejn, f’jiem differenti. Il-profiċjenza tintwera bil-klassifikazzjoni korretta (pożittiva/negattiva) ta’ kull sustanza ta’ profiċjenza. L-ittestjar tal-profiċjenza għandu jerġa’ jsir minn kull tekniku meta jkun qed jitgħallem l-assaġġi. Skont it-tip ta’ ċellola, uħud minn dawn is-sustanzi ta’ profiċjenza jafu jġibu ruħhom bħala SERMs u juru attività kemm bħala agonisti kif ukoll bħala antagonisti. Madankollu, is-sustanzi ta’ profiċjenza huma klassifikati fit-Tabelli 3 u 4 skont l-attività predominanti magħrufa tagħhom li għandha tintuża għall-evalwazzjoni tal-profiċjenza.
|
|
15.
|
Biex tintwera l-prestazzjoni u għall-finijiet ta’ kontroll tal-kwalità, kull laboratorju għandu jiġbor bażijiet ta’ data storiċi dwar l-agonisti u l-antagonisti bi b’data ta’ riferiment standard (eż. 17β-estradjol u tamossifen), dwar is-sustanzi kimiċi tal-kontrolli pożittivi u negattivi u dwar il-kontroll bis-solvent (eż. DMSO). Bħala bidu, il-bażi ta’ data għandha tiġi ġenerata minn tal-anqas 10 sessjonijiet indipendenti tal-agonisti (eż. 17β-estradjol) u 10 sessjonijiet indipendenti tal-antagonisti (eż. tamossifen). Ir-riżultati mill-analiżijiet futuri ta’ dawn l-istandards referenzjarji u l-kontrolli bis-solvent għandhom jiżdiedu biex ikabbru l-bażi ta’ data bl-għan li jiġu żgurati konsistenza u twettiq tal-bijoassaġġ mil-laboratorju matul iż-żmien.
|
Tabella 3
Lista ta’ (14) Sustanzi ta’ Profiċjenza għall-assaġġ tal-agonisti
(47)
|
Nru (54)
|
Sustanza
|
CASRN
|
Rispons Mistenni (48)
|
Assaġġ STTA
|
Assaġġ TA tal-ER VM7Luc
|
Klassi Kimika tal-MeSH (52)
|
Klassi tal-Prodott (53)
|
|
Valur tal-PC10 (M) (49)
|
Valur tal-PC50 (M) (49)
|
Medda ta’ Konċ. tat-Test (M)
|
Valur tal-VM7Luc EC50 (M) (50)
|
L-Ogħla Konċ. għas-Sejbien tal-Medda (M) (51)
|
|
14
|
Dietilstilbestrol
|
56-53-1
|
POŻ
|
< 1,00 × 10-11
|
2,04 × 10-11
|
10-14 – 10-8
|
3,34 × 10-11
|
3,73 × 10-4
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
12
|
17α-estradjol
|
57-91-0
|
POŻ
|
4,27 × 10-11
|
6,44 × 10-10
|
10-11 – 10-5
|
1,40 × 10-9
|
3,67 × 10-3
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
15
|
meso-Eżestrol
|
84-16-2
|
POŻ
|
< 1,00 × 10-11
|
2,75 × 10-11
|
10-11 – 10-5
|
1,65 × 10-11
|
3,70 × 10-3
|
Idrokarbur (Ċikliku), Fenol
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
11
|
4-terz-Ottilfenol
|
140-66-9
|
POŻ
|
1,85 × 10-9
|
7,37 × 10-8
|
10-11 – 10-5
|
3,19 × 10-8
|
4,85 × 10-3
|
Fenol
|
Intermedjarju Kimiku
|
|
9
|
Ġenisteina
|
446-72-0
|
POŻ
|
2,24 × 10-9
|
2,45 × 10-8
|
10-11 – 10-5
|
2,71 × 10-7
|
3,70 × 10-4
|
Flavonojde, Kompost Eletroċikliku
|
Prodott Naturali, Farmaċewtiku
|
|
6
|
Bisfenol A
|
80-05-7
|
POŻ
|
2,02 × 10-8
|
2,94 × 10-7
|
10-11 – 10-5
|
5,33 × 10-7
|
4,38 × 10-3
|
Fenol
|
Intermedjarju Kimiku
|
|
2
|
Kempferolina
|
520-18-3
|
POŻ
|
1,36 × 10-7
|
1,21 × 10-6
|
10-11 – 10-5
|
3,99 × 10-6
|
3,49 × 10-3
|
Flavonojde, Kompost Eletroċikliku
|
Prodott Naturali
|
|
3
|
Ftalat tal-butilbenżil
|
85-68-7
|
POŻ
|
1,14 × 10-6
|
4,11 × 10-6
|
10-11 – 10-5
|
1,98 × 10-6
|
3,20 × 10-4
|
Aċidu Karbossiliku, Ester, Aċidu Ftaliku
|
Plastifikant, Sustanza Kimika Industrijali
|
|
4
|
p,p’- Metossiklor
|
72-43-5
|
POŻ
|
1,23 × 10-6
|
—
|
10-11 – 10-5
|
1,92 × 10-6
|
2,89 × 10-3
|
Idrokarbur (Aloġenat)
|
Pestiċida, Aġent Veterinarju
|
|
1
|
Etil paraben
|
120-47-8
|
POŻ
|
5,00 × 10-6
|
—
|
10-11 – 10-5
|
2,48 × 10-5
|
6,02 × 10-3
|
Aċidu Karbossiliku, Fenol
|
Farmaċewtiku, Preservattiv
|
|
17
|
Atrażina
|
1912-24-9
|
NEG
|
—
|
—
|
10-10 – 10-4
|
—
|
4,64 × 10-4
|
Kompost Eteroċikliku
|
Erbiċida
|
|
20
|
Spironolatton
|
52-01-7
|
NEG
|
—
|
—
|
10-11 – 10-5
|
—
|
2,40 × 10-3
|
Latton, Sterojde
|
Farmaċewtiku
|
|
21
|
Ketokonażol
|
65277-42-1
|
NEG
|
—
|
—
|
10-11 – 10-5
|
—
|
9,41 × 10-5
|
Kompost Eteroċikliku
|
Farmaċewtiku
|
|
22
|
Reserpina
|
50-55-5
|
NEG
|
—
|
—
|
10-11 – 10-5
|
—
|
1,64 × 10-3
|
Kompost Eteroċikliku Indol
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
Abbrevjazzjonijiet: CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; EC50 = konċentrazzjoni effettiva medjana tas-sustanza tat-test; NEG = negatttivi; POŻ = pożittivi; PC10 (u PC50) = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza tat-test li fiha r-rispons ikun 10 % (jew 50 % għall-PC50) tar-rispons indott mill-kontroll pożittiv (E2, 1nM) f’kull pjastra.
|
Tabella 4
Lista ta’ (10) Sustanzi ta’ Profiċjenza għall-assaġġ tal-antagonisti
|
|
Sustanza (4)
|
CASRN
|
Assaġġ STTA tal-ER (55)
|
Assaġġ TA tal-ER VM7Luc (56)
|
Effetti tal-Kandidat tal-STTA tal-ER (55)
|
ICCVAM (59) Klassifikazzjoni tal-Kunsens
|
MeSH (60) Klassi Kimika
|
Klassi tal-Prodott (61)
|
|
Attività TA tal-ER
|
IC50 (M)
|
Medda ta’ Konċ. tat-test (M)
|
Attività TA tal-ER
|
IC50
(57) (M)
|
L-Ogħla Konċ. għas-Sejbien tal-Medda (M) (58)
|
|
1
|
4-idrossitamossifen
|
68047-06-3
|
POŻ
|
3,97 × 10-9
|
10-12 – 10-7
|
POŻ
|
2,08 × 10-7
|
2,58 × 10-4
|
POŻ moderati
|
POŻ
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku
|
|
2
|
Ralossifen HCl
|
82640-04-8
|
POŻ
|
7,86 × 10-10
|
10-12 – 10-7
|
POŻ
|
1,19 × 10-9
|
1,96 × 10-4
|
POŻ moderati
|
POŻ
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku
|
|
3
|
Tamossifen
|
10540-29-1
|
POŻ
|
4,91 × 10-7
|
10-10 – 10-5
|
POŻ
|
8,17 × 10-7
|
2,69 × 10-4
|
POŻ
|
POŻ
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku
|
|
4
|
17β-estradjol
|
50-28-2
|
NEG
|
—
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
—
|
3,67 × 10-3
|
Biex ikunu negattivi (*4)
|
NP
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
5
|
Apiġenin
|
520-36-5
|
NEG
|
—
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
—
|
3,70 × 10-4
|
NEG
|
NEG
|
Kompost Eteroċikliku
|
Kolorant, Prodott Naturali, Intermedjarju Farmaċewtiku
|
|
6
|
Ftalat tad-di-n-butil
|
84-74-2
|
NEG
|
—
|
10-8 – 10-3
|
NEG
|
—
|
3,59 × 10-3
|
NEG
|
NEG
|
Ester, Aċidu Ftaliku
|
Ingredjent Kożmetiku, Sustanza Kimika Industrijali, Plastifikant
|
|
7
|
Flavon
|
525-82-6
|
NEG
|
—
|
10-8 – 10-3
|
NEG
|
—
|
4,50 × 10-4
|
Biex ikunu negattivi (*4)
|
NP
|
Flavonojde, Kompost Eletroċikliku
|
Prodott Naturali, Farmaċewtiku
|
|
8
|
Ġenisteina
|
446-72-0
|
NEG
|
—
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
—
|
3,70 × 10-4
|
Biex ikunu negattivi (*4)
|
NEG
|
Flavonojde, Kompost Eletroċikliku
|
Prodott Naturali, Farmaċewtiku
|
|
9
|
p-n-nonilfenol
|
104-40-5
|
NEG
|
—
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
—
|
4,54 × 10-4
|
mhux ittestjat
|
NEG
|
Fenol
|
Intermedjarju Kimiku
|
|
10
|
Resveratrol
|
501-36-0
|
NEG
|
—
|
10-8 – 10-3
|
NEG
|
—
|
4,38 × 10-4
|
Biex ikunu negattivi (*4)
|
NEG
|
Idrokarbur (Ċikliku)
|
Prodott Naturali
|
|
Abbrevjazzjonijiet: CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; M = molari; IC50 = konċentrazzjoni inibitorja medjana tas-sustanza tat-test; NEG = negatttivi; NP = negattivi preżunti; POŻ = pożittivi.
|
Kriterji ta’ Aċċettabbiltà tas-Sessjoni tat-Test
|
16.
|
Aċċettazzjoni jew rifjut ta’ sessjoni tat-test huma bbażati fuq l-evalwazzjoni tar-riżultati miksuba għall-istandards referenzjarji u għall-kontrolli użati għal kull esperiment. Il-valuri għall-PC50 (EC50) jew għall-IC50 għall-istandards referenzjarji għandhom jissodisfawi l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kif previst għall-assaġġ magħżul (għall-STTA ara l-Appendiċi 2, għat-TA tal-ER VM7Luc ara l-Appendiċi 3), u l-kontrolli pożittivi/negattivi kollha għandhom ikunu klassifikati kif suppost għal kull esperiment aċċettat. Il-ħila ta’ twettiq tal-assaġġ b’konsistenza għandha tintwera bl-iżvilupp u biż-żamma ta’ bażi ta’ data storika għall-istandards u għall-kontrolli referenzjarji (ara l-paragrafu 15). Id-devjazzjonijiet standard (SD) jew il-koeffiċjenti ta’ varjazzjoni (CV) għall-parametri ta’ dħul tal-kurva tal-istandards referenzjarji minn diversi esperimenti jistgħu jintużaw bħala kejl tar-riproduċibbiltà fi ħdan il-laboratorju. Barra minn hekk, għandhom jiġu rispettati l-prinċipji li ġejjin rigward il-kriterji ta’ aċċettabbiltà:
|
—
|
Id-data għandha tkun biżżejjed għal valutazzjoni kwantitattiva tal-attivazzjoni tal-ER (għall-assaġġ tal-agonisti) jew għat-trażżin tal-ER (għall-assaġġ tal-antagonisti) (jiġifieri l-effikaċja u l-potenza).
|
|
—
|
L-attività indikatur medja għall-konċentrazzjoni ta’ riferiment tal-estroġenu ta’ riferiment għandha tkun tal-anqas il-minimu speċifikat fl-assaġġi fir-rigward ta’ dak il-kontroll bil-veikolu (solvent) biex tiġi żgurata sensittività adegwata. Għall-assaġġi STTA u TA tal-ER VM7Luc, din hi erba’ darbiet dik tal-kontroll bil-veikolu medju f’kull pjastra.
|
|
—
|
Il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom jibqgħu fi ħdan il-medda ta’ solubbiltà tas-sustanzi kimiċi tat-test u ma jurux ċitotossiċità.
|
|
Analiżi tad-data
|
17.
|
Il-proċedura definita ta’ interpretazzjoni tad-data għal kull assaġġ għandha tintuża għall-klassifikazzjoni ta’ rispons pożittiv u negattiv.
|
|
18.
|
L-ilħuq tal-kriterji ta’ aċċettabbiltà (il-paragrafu 16) jindika li l-assaġġ qed jopera kif suppost, iżda ma jiżgurax li kwalunkwe sessjoni tat-test partikolari tipproduċi data preċiża. Ir-replikar tar-riżultati tal-ewwel sessjoni hu l-aħjar indikazzjoni li tkun ġiet prodotta data preċiża. Jekk żewġ sessjonijiet jagħtu riżultati riproduċibbli (eż. ir-riżultati taż-żewġ sessjonijiet ta’ test jindikaw li sustanza kimika tat-test hi pożittiva), ma hemmx bżonn li ssir it-tielet sessjoni.
|
|
19.
|
Jekk żewġ sessjonijiet ma jagħtux riżultati riproduċibbli (eż. sustanza kimika tat-test tkun pożittiva f’sessjoni minnhom u negattiva fis-sessjoni l-oħra), jew jekk ikun meħtieġ grad ogħla ta’ ċertezza rigward l-eżitu ta’ dan l-assaġġ, tal-anqas għandhom isiru tliet sessjonijiet indipendenti. F’dan il-każ, il-klassifikazzjoni hi bbażata fuq iż-żewġ riżultati konkordanti mit-tlieta.
|
Kriterji ta’ Interpretazzjoni tad-Data Ġenerali
|
20.
|
Bħalissa ma hemm ebda metodu miftiehem f’livell universali għall-interpretazzjoni tad-data tat-TA tal-ER. Madankollu, kemm il-valutazzjonijiet kwalitattivi (eż. pożittivi/negattivi) u/jew kwantitattivi (eż. EC50, PC50, IC50) tal-attività medjata bl-ER għandhom ikunu bbażati fuq data empirika u ġudizzju xjentifiku solidu. Fejn possibbli, ir-riżultati pożittivi għandhom ikunu karatterizzati kemm mill-kobor tal-effett meta mqabbel mal-kontroll bil-veikolu (solvent) jew mal-estroġen ta’ riferiment kif ukoll mill-konċentrazzjoni li fiha jseħħ l-effett (eż. EC50, PC50, RPCMax, IC50, eċċ.).
|
Rapport tat-Test
|
21.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
|
Assaġġ:
|
—
|
il-kontroll/l-istandard referenzjarju/is-sustanza kimika tat-test;
|
|
—
|
is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli;
|
|
—
|
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;
|
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;
|
|
—
|
il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.
|
|
|
|
Sustanza monokostitwenti:
|
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
|
—
|
l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
|
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
|
—
|
ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
|
|
|
|
Solvent/Veikolu:
|
—
|
il-karatterizzazzjoni (natura, fornitur u lott);
|
|
—
|
il-ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu;
|
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin.
|
|
|
|
Ċelloli:
|
—
|
it-tip u s-sors taċ-ċelloli:
|
—
|
L-ER hu espress b’mod endoġenu? Jekk le, liema riċettur(i) ġie/ġew transfettat(i)?
|
|
—
|
Il-binja/binjiet indikatur(i) użata/i (inklużi l-ispeċijiet sors);
|
|
—
|
Il-metodu ta’ transfezzjoni;
|
|
—
|
Il-metodu tal-għażla għaż-żamma ta’ transfezzjoni stabbli (fejn applikabbli);
|
|
—
|
Il-metodu ta’ transfezzjoni hu rilevanti għal linji stabbli?
|
|
|
—
|
in-numru ta’ passaġġi taċ-ċelloli (mit-taħlil);
|
|
—
|
in-numru ta’ passaġġi taċ-ċelloli fit-taħlil;
|
|
—
|
il-metodi għaż-żamma tal-kolturi taċ-ċelloli.
|
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test:
|
—
|
limitazzjonijiet tas-solubbiltà;
|
|
—
|
deskrizzjoni tal-metodi ta’ valutazzjoni tal-vijabbiltà applikati;
|
|
—
|
komposizzjoni tal-media, konċentrazzjoni tas-CO2;
|
|
—
|
konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
|
|
—
|
volum tal-veikolu u tas-sustanza kimika tat-test miżjuda;
|
|
—
|
it-temperatura tal-inkubazzjoni u l-umdità;
|
|
—
|
id-durata tat-trattament;
|
|
—
|
id-densità fil-bidu tat-trattament u matulu;
|
|
—
|
standards referenzjarji pożittivi u negattivi;
|
|
—
|
reaġenti indikaturi (isem tal-prodott, fornitur u lott);
|
|
—
|
kriterji biex is-sessjonijiet ta’ testijiet jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.
|
|
|
|
Kontroll tal-aċċettabbiltà:
|
—
|
l-induzzjonijiet tad-drabi għal kull pjastra tal-assaġġ u jekk dawn jissodisfawx il-minimu meħtieġ mill-assaġġ fuq il-bażi tal-kontrolli storiċi;
|
|
—
|
il-valuri propji għall-kriterji ta’ aċċettabbiltà, eż. log10EC50, log10PC50, logIC50 u l-valuri Hillslope, għal kontrolli pożittivi konkorrenti/standards referenzjarji.
|
|
|
|
Ir-riżultati:
|
—
|
data mhux proċessata u normalizzata;
|
|
—
|
il-livell massimu ta’ induzzjoni tad-drabi;
|
|
—
|
data dwar iċ-ċitotossiċità;
|
|
—
|
jekk teżisti, l-anqas konċentrazzjoni effettiva (LEC);
|
|
—
|
il-valuri RPCMax, PCMax, PC50, IC50 u/jew EC50, kif ikun xieraq;
|
|
—
|
ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,
|
|
—
|
analiżijiet statistiċi, jekk jeżistu, flimkien ma’ kejl tal-errur u tal-kunfidenza (eż. SEM, SD, CV jew 95 % CI) u deskrizzjoni ta’ kif inkisbu dawn il-valuri.
|
|
|
|
Diskussjoni tar-riżultati
|
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(2)
|
OECD (2015). Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 225), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(3)
|
ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method, an In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.
|
|
(4)
|
Pujol P. et al. (1998). Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer. Res., 58(23): p. 5367-73.
|
|
(5)
|
Rogers J.M. u Denison M.S. (2000). Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals, In Vitro and Molecular Toxicology: Journal of Basic and Applied Research, 13(1): p. 67-82.
|
|
(6)
|
OECD (2012). Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Agonists (for TG 455). Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 173.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(7)
|
OECD (2015). Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Antagonists. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 174.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(8)
|
OECD (2012). Guidance Document on Standardized Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(9)
|
Cavailles V. (2002). Estrogens and Receptors: an Evolving Concept. Climacteric, 5 Suppl 2: p. 20- 6.
|
|
(10)
|
Welboren W.J. et al. (2009). Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and how are they Regulated? Endocr. Relat. Cancer, 16(4): p. 1073-89.
|
|
(11)
|
Younes M. u Honma N. (2011). Estrogen Receptor Beta, Arch. Pathol. Lab. Med., 135(1): p. 63- 6.
|
|
(12)
|
Jefferson W.N., et al. (2002). Assessing Estrogenic Activity of Phytochemicals Using Transcriptional Activation and Immature Mouse Uterotrophic Responses, Journal of Chromatography B, 777(1-2): p. 179-189.
|
|
(13)
|
Sonneveld E. et al. (2006). Comparison of In Vitro and In Vivo Screening Models for Androgenic and Estrogenic Activities, Toxicol. Sci., 89(1): p. 173-187.
|
|
(14)
|
Takeyoshi M. et al. (2002). The Efficacy of Endocrine Disruptor Screening Tests in Detecting Anti- Estrogenic Effects Downstream of Receptor-Ligand Interactions, Toxicology Letters, 126(2): p. 91- 98.
|
|
(15)
|
Combes R.D. (2000). Endocrine Disruptors: a Critical Review of In Vitro and In Vivo Testing Strategies for Assessing their Toxic Hazard to Humans, ATLA Alternatives to Laboratory Animals,28(1): p. 81-118.
|
|
(16)
|
Escande A. et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol,71(10): p. 1459-69.
|
|
(17)
|
Gray L.E. Jr. (1998). Tiered Screening and Testing Strategy for Xenoestrogens and Antiandrogens, Toxicol. Lett, 102-103, 677-680.
|
|
(18)
|
EDSTAC (1998). Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee (EDSTAC) Final Report.
|
|
(19)
|
ICCVAM (2003). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.
|
|
(20)
|
Gustafsson J.Ö. (1999). Estrogen Receptor ß - A New Dimension in Estrogen Mechanism of Action, Journal of Endocrinology, 163(3): p. 379-383.
|
|
(21)
|
Ogawa S. et al. (1998). The Complete Primary Structure of Human Estrogen Receptor ß (hERß) and its Heterodimerization with ERαIn Vivo and In Vitro, Biochemical and Biophysical Research Communications, 243(1): p. 122-126.
|
|
(22)
|
Enmark E. et al. (1997). Human Estrogen Receptor ß-Gene Structure, Chromosomal Localization, and Expression Pattern, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,82(12): p. 4258-4265.
|
|
(23)
|
Ball L.J. et al. (2009). Cell Type- and Estrogen Receptor-Subtype Specific Regulation of Selective Estrogen Receptor Modulator Regulatory Elements, Molecular and Cellular Endocrinology, 299(2): p. 204-211.
|
|
(24)
|
Barkhem T. et al. (1998). Differential Response of Estrogen Receptor Alpha and Estrogen Receptor Beta to Partial Estrogen Agonists/Antagonists, Mol. Pharmacol, 54(1): p. 105-12.
|
|
(25)
|
Deroo B.J. u Buensuceso A.V. (2010). Minireview: Estrogen Receptor-ß: Mechanistic Insights from Recent Studies, Molecular Endocrinology, 24(9): p. 1703-1714.
|
|
(26)
|
Harris D.M. et al. (2005). Phytoestrogens Induce Differential Estrogen Receptor Alpha- or Beta- Mediated Responses in Transfected Breast Cancer Cells, Experimental Biology and Medicine, 230(8): p. 558-568.
|
|
(27)
|
Anderson J.N. Clark J.H. u Peck E.J.Jr. (1972). The Relationship Between Nuclear Receptor- Estrogen Binding and Uterotrophic Responses, Biochemical and Biophysical Research Communications, 48(6): p. 1460-1468.
|
|
(28)
|
Toft D. (1972). The Interaction of Uterine Estrogen Receptors with DNA, Journal of Steroid Biochemistry, 3(3): p. 515-522.
|
|
(29)
|
Gorski J. et al. (1968), Hormone Receptors: Studies on the Interaction of Estrogen with the Uterus, Recent Progress in Hormone Research, 24: p. 45-80.
|
|
(30)
|
Jensen E.V. et al. (1967), Estrogen-Receptor Interactions in Target Tissues, Archives d’Anatomie Microscopique et de Morphologie Experimentale, 56(3):p. 547-569.
|
|
(31)
|
ICCVAM (2002). Background Review Document: Estrogen Receptor Transcriptional Activation (TA) Assay. Appendix D, Substances Tested in the ER TA Assay, NIH Publication Report (No 03-4505.).
|
|
(32)
|
Kanno J. et al. (2001). The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay to Screen Compounds for In Vivo Estrogenic Responses: Phase 1, Environ. Health Persp., 109:785-94.
|
|
(33)
|
Kanno J. et al. (2003). The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay: Phase Two Dose -Response Studies, Environ. Health Persp., 111:1530-1549.
|
|
(34)
|
Kanno J. et al. (2003), The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay: Phase Two – Coded Single-Dose Studies, Environ. Health Persp., 111:1550-1558.
|
|
(35)
|
Geisinger et al. (1989) Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors, Cancer 63, 280-288.
|
|
(36)
|
Baldwin et al. (1998) BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 34, 649-654.
|
|
(37)
|
Li, Y. et al. (2014) Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant, Mol. Endo. 28, 2072-2081.
|
|
(38)
|
Rogers, J.M. u Denison, M.S. (2000) Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors: development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenic and anti-estrogenic chemicals, In Vitro & Molec. Toxicol. 13, 67-82.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET U ABBREVJAZZJONIJIET
Kriterji ta’ aċċettabbiltà
: L-istandards minimi għat-twettiq tal-kontrolli sperimentali u l-istandards referenzjarji. Il-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha għandhom jiġu ssodisfati biex esperiment jitqies validu.
Akkuratezza (konkordanza)
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tal-assaġġ u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tal-assaġġ u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ assaġġ (20).
Agonist
: Sustanza li tipproduċi rispons, eż. traskrizzjoni, meta tillega ma’ reċettur speċifiku.
Antagonist
: Tip ta’ ligand ta’ reċettur jew ta’ sustanza kimika li ma jipprovkax rispons bijoloġiku hu stess meta jillega ma’ reċettur, iżda jimblokka jew itaffi risponsi medjati minn agonist.
Attività antiestroġenika
: il-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ 17β-estradjol medjata permezz tar-riċetturi tal-estroġenu.
Morfoloġija taċ-ċelloli
: Il-forma u d-dehra ta’ ċelloli mkabbra f’monosaff fi bwejra waħda ta’ pjastra tal-koltura tat-tessuti. Ċelloli li jkunu qed jinxfu spiss juru morfoloġija anormali taċ-ċelloli.
CF
: Il-Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u għall-Evalwazzjoni tal-Interferenti Endorkinali.
Trattament bil-faħam/bid-dekstran
: Trattament ta’ serum użat f’koltura taċ-ċelloli. Trattament bil-faħam/bid-dekstran (spiss imsejjaħ “strippaġġ”) ineħħi l-ormoni endoġeni u l-proteini li jillegaw mal-ormoni.
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita.
Ċitotossiċità
: Effetti dannużi fl-istruttura jew fil-funzjoni ċellolari li finalment jistgħu jikkawżaw mewt taċ-ċelloli u jistgħu jkunu riflessi bi tnaqqis fin-numru ta’ ċelloli preżenti fil-bwejra fi tmiem il-perjodu ta’ esponiment jew tnaqqis fil-kapaċità għal kejl ta’ funzjoni ċellolari meta mqabbla mal-kontroll b’veikolu konkorrenti.
CV
: Koeffiċjent ta’ varjazzjoni
DCC-FBS
: Serum bovin fetali trattat bil-faħam miksi bid-dekstran.
DMEM
: Modifika ta’ Dulbecco tal-Medium ta’ Eagle
DMSO
: Sulfossidu tad-dimetil
E2
: 17β-estradjol
EC50
: Il-konċentrazzjoni effettiva medjana ta’ sustanza kimika tat-test.
ED
: Interferenza endokrinali
hERα
: Riċettur alfa tal-estroġenu uman
hERß
: Riċettur beta tal-estroġenu uman
EFM
: Medium ħieles mill-estroġenu. Il-Modifika ta’ Dulbecco tal-Medium ta’ Eagle (DMEM) supplimentat b’4,5 % FBS trattat bil-faħam/bid-dekstran, 1,9 % L-glutammina, u 0,9 % Pen-Strep.
ER
: Riċettur tal-Estroġenu
ERE
: Element ta’ rispons tal-estroġenu
Attività estroġenika
: Il-kapaċità ta’ sustanza kimika li timita 17β-estradjol fil-ħila tiegħu li jillega ma’ riċetturi tal-estroġenu u jattivahom. L-attività estroġenika medjata minn hERα tista’ tiġi individwata b’dan il-metodu ta’ ttestjar.
ERTA
: Trans Attivazzjoni tar-Riċettur tal-Estroġenu
FBS
: Serum bovin fetali
HeLa
: Linja ta’ ċelloli ċervikali umana immortali
HeLa9903
: Subklon taċ-ċellola HeLa li fih hERααu ġene indikatur tal-luċiferażi jkunu ġew transfettati b’mod stabbli
IC
50
: Il-konċentrazzjoni effettiva medjana ta’ sustanza kimika tat-test inibitorja.
ICCVAM
: The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods.
Riproduċibbiltà interlaboratorja
: Kejl ta’ kemm laboraotrji kwalifikati differenti, li jużaw l-istess protokoll u li jittestjaw l-istess sustanzi, jistgħu jipproduċu riżultati kwalitattivament u kwantitattivament simili. Ir-riproduċibbiltà interlaboratorja hi determinata matul il-proċessi ta’ qabel il-validazzjoni u tal-validazzjoni, u tindika kemm assaġġ jista’ jiġi trasferit b’suċċess bejn laboratorji, u din tissejjaħ ukoll riproduċibbiltà bejn laboratorji (1).
Riproduċibbiltà intralaboratorja
: Determinazzjoni ta’ kemm persuni kwalifikati fi ħdan l-istess laboratorju jistgħu jirreplikaw b’suċċess ir-riżultati billi jużaw protokoll speċifiku f’ħinijiet differenti. Din tissejjaħ ukoll “riproduċibbiltà fi ħdan il-laboratorju” (1).
LEC
: L-anqas konċentrazzjoni effettiva hi l-anqas konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li tipproduċi rispons (jiġifieri l-anqas konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li fiha l-induzzjoni tad-drabi tkun statistikament differenti mill-kontroll bil-veikolu konkorrenti).
Test me-too
: Espressjoni kollokwjali għal assaġġ li jkun strutturalment u funzjonalment simili għal metodu ta’ ttestjar ta’ riferiment validat u aċċettat. Jintuża b’mod alternanti ma’ metodu ta’ ttestjar simili.
MT
: Metallotjonein
MMTV
: Vajrus tat-Tumur Mammarju fil-Ġrieden
OHT
: 4-Idrossitamossifen
PBTG
: Linja Gwida tat-Test Ibbażata fuq il-Prestazzjoni
PC (Kontroll pożittiv)
: sustanza attiva ħafna, idealment 17ß-estradjol, li tkun inkluża fit-testijiet kollha biex tgħin fl-iżgurar ta’ funzjonament xieraq tal-assaġġ.
PC
10
: il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li fiha l-attività mkejla f’assaġġ agonist tkun 10 % tal-attività massima indotta mill-PC (E2 1’fnM għall-assaġġ STTA) f’kull pjastra.
PC
50
: il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li fiha l-attività mkejla f’assaġġ agonist tkun 50 % tal-attività massima indotta mill-PC (E2 fil-konċentrazzjoni ta’ riferiment speċifikata fil-metodu ta’ ttestjar) f’kull pjastra.
PC
Max
: il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li tinduċi l-RPCMax
Standards tal-prestazzjoni
: Standards, ibbażati fuq assaġġ validu, li jipprovdu bażi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ assaġġ propost li hu simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Inklużi hemm (1) il-komponenti essenzjali tal-assaġġ; (2) lista minima ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment magħżula minn fost is-sustanzi kimiċi użati biex tintwera l-prestazzjoni aċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (3) il-livelli komparabbli ta’ akkuratezza u ta’ affidabbiltà, fuq il-bażi ta’ dak li nkiseb għall-assaġġ validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost għandu juri meta evalwat bl-użu tal-lista minima ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment (1).
Sustanzi ta’ profiċjenza
: Subsett tas-sustanzi ta’ riferiment inklużi fl-Istandards tal-Prestazzjoni li jistgħu jintużaw mil-laboratorji biex tintwera kompetenza teknika b’metodu ta’ ttestjar standardizzat. Il-kriterji tal-għażla għal dawn is-sustanzi tipikament jinkludu li dawk jirrappreżentaw il-medda ta’ risponsi, ikunu kummerċjalment disponibbli, u jkollhom data ta’ riferiment ta’ kwalità għolja disponibbli.
Profiċjenza
: Il-ħila murija biex jitwettaq assaġġ kif suppost qabel l-ittestjar ta’ sustanza mhux magħrufa.
Estroġenu ta’ riferiment (Kontroll pożittiv, PC)
: 17β-estradjol (E2, CAS 50-28-2).
Standard ta’ riferiment
: sustanza ta’ riferiment użata biex tintwera l-adegwatezza ta’ assaġġ. 17β-estradjol hu l-istandard referenzjarju għall-assaġġi STTA u TA tal-ER VM7Luc.
Metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment
: L-assaġġi li fuqhom hi bbażata PBTG 455.
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni ta’ assaġġ mal-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm l-assaġġ għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ assaġġ (1).
Affidabbiltà
: Kejl ta’ kemm assaġġ jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduttività ta’ fost u bejn il-laboratorji.
RLU
: Unitajiet tad-Dawl Relattivi
RNA
: Aċidu Ribonuklejku
RPC
Max
: il-livell massimu ta’ rispons indott minn sustanza kimika tat-test, espress bħala perċentwal tar-rispons indott minn 1 nM E2 fuq l-istess pjastra
RPMI
: Medium RPMI 1 640 supplimentat b’0,9 % Pen-Strep u 8,0 % serum bovin fetali (FBS)
Sessjoni
: Esperiment individwali li jevalwa l-azzjoni kimika fuq l-eżitu bijoloġiku tal-assaġġ. Kull sessjoni tkun esperiment komplut fuq bwejriet repliki ta’ ċelloli pjastrati minn raggruppament komuni ta’ ċelloli fl-istess ħin.
Sessjoni indipendenti
: Esperiment separat, indipendenti li jevalwa l-azzjoni kiika fuq l-eżitu bijoloġiku tal-assaġġ, bl-użu ta’ ċelloli minn raggruppament differenti, sustanzi kimiċi dilwiti friski, imwettaq f’jiem differenti jew fl-istess jum minn persunal differenti.
SD
: Devjazzjoni standard.
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-assaġġ. Hi kejl tal-preċiżjoni għal assaġġ li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ assaġġ (1).
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal assaġġ li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ assaġġ (1).
Transfezzjoni stabbli
: Meta d-DNA jiġi transfettat f’ċelloli kolturati b’tali mod li jiġi integrat b’mod stabbli fil-ġenoma taċ-ċelloli, li jirriżulta fl-espressjoni stabbli ta’ ġeni transfettati. Kloni ta’ ċelloli transfettati stabbiliment jintgħażlu minn markaturi stabbli (eż. reżistenza għall-G418).
Assaġġ STTA
: Assaġġ ta’ Transattivazzjoni Transfettata b’Mod Stabbli, l-assaġġ ta’ attivazzjoni traskrizzjonali tal-ERα li juża l-Linja ta’ Ċelloli HeLa 9 903.
Studju
: Il-medda sħiħa ta’ ħidma sperimentali mwettqa biex tiġi evalwata sustanza waħda speċifika bl-użu ta’ assaġġ speċifiku. Studju jinkludi l-istadji kollha inklużi t-testijiet ta’ dilwizzjoni tas-sustanza tat-test fil-media tat-test, sessjonijiet preliminari ta’ sejbien tal-medda, is-sessjonijiet komprensivi neċessarji kollha, l-analiżijiet tad-data, l-assigurazzjoni tal-kwalità, il-valutazzjonijiet taċ-ċitotossiċità, eċċ. It-tlestija ta’ studju tippermetti l-klassfikazzjoni tal-attività tas-sustanza kimika tat-test fuq il-mira ta’ tossiċità (jiġifieri attiva, inattiva jew inkonklużiva) li tkun evalwata mill-assaġġ użat u stima tal-potenza relattiva għas-sustanza kimika ta’ riferiment pożittiva.
Sustanza
: Skont REACH (62), sustanza hi definita bħala element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ manifattura, li jinduċi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mibdula l-kompożizzjoni tagħha. Tintuża definizzjoni simili ħafna fil-kuntest tal-GHS tan-NU (1).
TA (Transattivazzjoni): It-tnedija tas-sinteżi tal-mRNA bħala rispons għal sinjal kimiku speċifiku, bħal irbit ta’ estroġenu mar-riċettur tal-estroġenu
Assaġġ
: Fi ħdan il-kuntest ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar, assaġġ hu waħda mill-metodoloġiji bħala validi fl-issodisfar tal-kriterji ta’ prestazzjoni spjegati. Il-komponenti tal-assaġġ jinkludu, pereżempju, il-linja ta’ ċelloli speċifika bil-kundizzjonijiet ta’ tkabbir assoċjati, il-media speċifiċi li fihom jitwettaq it-test, il-kundizzjonijiet tal-kompożizzjoni tal-pjastri, l-arranġament u d-dilwizzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test flimkien ma’ kwalunkwe miżura ta’ kontroll tal-kwalità meħtieġa oħra u l-istadji ta’ evalwazzjoni tad-data assoċjati.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
Traskrizzjoni
: Sinteżi tal-mRNA
UVCB
: Sustanzi Kimiċi b’Kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti jew Materjali Bijoloġiċi b’Reazzjoni Kumplessa
Metodu ta’ ttestjar validat
: Assaġġ li għalih ikunu tlestew studji ta’ validazzjoni biex tiġi determinata r-rilevanza (inkluża l-akkuratezza) u l-affidabbiltà għal għan speċifiku. Ta’ min jinnota li jista’ jkun li metodu ta’ ttestjar validat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f’termini ta’ akkuratezza u ta’ affidabbiltà biex jitqies aċċettabli għall-għan propost (1).
Validazzjoni
: Il-proċess li bih l-affidabbiltà u r-rilevanza ta’ approċċ, ta’ metodu, ta’ assaġġ, ta’ proċess jew ta’ valutazzjoni partikolari jkunu stabbiliti għal għan definit (1).
VC (Kontroll bil-veikolu)
: Is-solvent li jintuża biex jiġu dissolti s-sustanzi kimiċi tat-test u tal-kontroll jiġi ttestjat unikament bħala veikolu mingħajr sustanza kimika dissolta.
VM7
: Ċellola tal-adenokarċinoma immortalizzata li tesprimi b’mod endoġenu r-riċettur tal-estroġenu.
VM7Luc4E2
: Il-linja ta’ ċelloli VM7Luc4E2 ġiet derivata miċ-ċelloli tal-adenokarċinoma immortalizzati derivati mill-bniedem VM7 li jesprimu b’mod endoġenu ż-żewġ forom tar-riċettur tal-estroġenu (ERα u ERβ) u ġew transfettati b’mod stabbli bil-plażmid pGudLuc7.ERE. Dan il-plażmid fih erba’ kopji ta’ oligonukleotid sintetiku li fih l-element ta’ rispons tal-estroġenu upstream mill-promotur virali tat-tumur mammarju fil-ġrieden (MMTV) u l-ġene tal-luċiferażi tal-firefly.
Kontroll pożittiv dgħajjef
: Sustanza attiva b’mod dgħajjef magħżula mil-lista ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment li tkun inkluża fit-testijiet kollha biex tgħin fl-iżgurar ta’ funzjonament xieraq tal-assaġġ.
Appendiċi 2
ASSAĠĠ TA’ TRANSATTIVAZZJONI TAR-RIĊETTUR-Α TAL-ESTROĠENU UMAN TRANSFETTAT B’MOD STABBLI GĦAD-DETEZZJONI TA’ ATTIVITÀ AGONISTA U ANTAGONISTA TA’ SUSTANZI KIMIĊI BL-UŻU TAL-LINJA TA’ ĊELLOLI HERΑ-HELA-9903
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
1.
|
Dan l-assaġġ tat-transattivazzjoni (TA) juża l-linja ta’ ċelloli hERα-HeLa-9 903 biex jindividwa attività agonista estroġenika medjata permezz tar-riċettur alfa tal-estroġenu uman (hERα). L-istudju ta’ validazzjoni tal-Assaġġ ta’ Transattivazzjoni Transfettata b’Mod Stabbli (STTA) mill-Japanese Chemicals Evaluation and Research Institute (CERI) bl-użu tal-linja ta’ ċelloli hERα-HeLa-9 903 għad-detezzjoni ta’ attività agonista u antagonista estroġenika medjata permezz tar-riċettur alfa tal-estroġenu uman (hERα) wera r-rilevanza u l-affidabbiltà tal-assaġġ għall-għan maħsub tiegħu (1).
|
|
2.
|
Dan l-assaġġ hu mfassal b’mod speċifiku biex jindividwa TA medjata minn hERα billi jkejjel il-kemiluminexxenza bħala l-punt ta’ tmiem. Madankollu, sinjali ta’ luminexxenza medjata mhux minn riċettur ġew rapportati f’konċentrazzjonijiet ta’ fitoestroġenu ogħla minn 1 μM minħabba l-attivazzjoni eċċessiva tal-ġene indikatur tal-luċiferażi (2) (3). Filwaqt li l-kurva ta’ doża - rispons tindika li l-attivazzjoni vera tas-sistema tal-ER isseħħ f’konċentrazzjonijiet inferjuri, l-espressjoni tal-luċiferażi miksuba f’konċentrazzjonijiet ogħla ta’ fitoestroġeni jew ta’ komposti simili suspettati li jipproduċu attivazzjoni eċċessiva simili għal fitoestroġenu tal-ġene indikatur tal-luċiferażi trid tiġi eżaminata bir-reqqa f’sistemi tal-assaġġ TA tal-ER transfettati b’mod stabbli (Appendiċi 1).
|
|
3.
|
Għandhom jinqraw it-taqsimiet “INTRODUZZJONI ĠENERALI” u “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER” qabel ma dan l-assaġġ jintuża għal finijiet regolatorji. Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’din it-TG huma deskritti fl-Appendiċi 2.1.
|
PRINĊIPJU TAL-ASSAĠĠ (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
4.
|
L-assaġġ jintuża biex jissenjala rbit tar-riċettur tal-estroġenu ma’ ligand. Wara l-irbit mal-ligand, il-kumpless riċettur-ligand jittrażloka għan-nukleu fejn hu jillega elementi speċifiċi ta’ rispons tad-DNA u jittransattiva ġene indikatur tal-luċiferażi tal-firefly, li jirriżulta f’espressjoni ċellolari miżjuda tal-enzima luċiferażi. Il-luċiferin hu substrat li jiġi trasformat mill-enzima luċiferażi fi prodott tal-bijoluminexxenza li jista’ jitkejjel b’mod kwantitattiv b’luminometru. L-attività tal-luċiferażi tista’ tiġi evalwata malajr u mingħajr ma jintefqu wisq flus b’numru ta’ kits tat-test disponibbli kummerċjalment.
|
|
5.
|
Is-sistema tat-test tuża l-linja ta’ ċelloli hERα-HeLa-9 903, li hi derivata minn tumur ċervikali uman, b’żewġ binjiet imdaħħla b’mod stabbli: (i) il-binja tal-espressjoni tal-hERαα(li tikkodifika r-riċettur uman b’tul sħiħ), u (ii) binja indikatur tal-luċiferażi tal-firefly li ġġarrab ħames ripetizzjonijiet tandem ta’ Element Risponsiv għall-Estroġenu (ERE) tal-vitelloġenin xprunat minn element TATA promotur tal-metallotjonein (MT) tal-ġrieden. Intwera li l-binja tal-ġene TATA MT tal-ġrieden għandha l-aħjar prestazzjoni, u b’hekk tintuża ta’ spiss. Konsegwentement, din il-linja ta’ ċelloli hERα-HeLa-9 903 tista’ tkejjel il-ħila ta’ sustanza kimika tat-test li tinduċi transattivazzjoni medjata tal-hERα tal-espressjoni ġenika tal-luċiferażi.
|
|
6.
|
Fil-każ ta’ assaġġ tal-agonisti tal-ER, l-interpretazzjoni tad-data hi bbażata fuq jekk il-livell ta’ rispons massimu indott minn sustanza kimika tat-test jilħaqx jew jaqbiżx rispons tal-agonist ekwivalenti għal 10 % ta’ dak indott minn konċentrazzjoni li tinduċi massimalment (1 nM) tal-kontroll pożittiv (PC) 17β-estradjol (E2) (jiġifieri l-PC10). Fil-każ tal-assaġġ tal-antagonisti tal-ER, l-interpretazzjoni tad-data hi bbażata fuq jekk ir-rispons jurix tal-anqas tnaqqis ta’ 30 % fl-attività mir-rispons indott miż-żieda fil-kontroll (25 pM tal-E2) mingħajr ċitotossiċità. L-analiżi u l-interpretazzjoni tad-data huma diskussi fid-dettall fil-paragrafi 34 - 48.
|
PROĊEDURA
Linja ta’ Ċelloli
|
7.
|
Il-linja ta’ ċelloli trasferita b’mod stabbli hERα-HeLa-9 903 għandha tintuża għall-assaġġ. Il-linja ta’ ċelloli tista’ tinkiseb mill-Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank (63), wara li jiġi ffirmat Ftehim ta’ Trasferiment tal-Materjal (MTA).
|
|
8.
|
Fl-ittestjar għandhom jintużaw biss ċelloli karatterizzati bħala ħielsa minn mikoplażma. RT-PCR (Reazzjoni Katina bil-Polimerażi f’Ħin Reali) hi l-metodu tal-għażla għal detezzjoni sensittiva ta’ infezzjoni tal-mikoplażma (4) (5) (6).
|
Stabbiltà tal-linja ta’ ċelloli
|
9.
|
Biex tiġi ssorveljata l-istabbiltà ta’ linja ta’ ċelloli, E2, 7α-estradjol, 17α-metiltestosterone u kortikosteron għandhom jintużaw bħala l-istandards referenzjarji għall-assaġġ tal-agonisti u kurva sħiħa konċentrazzjoni rispons fil-medda tal-konċentrazzjoni tat-test ipprovduta fit-Tabella 1 għandha titkejjel tal-anqas darba kull darba li jsir l-assaġġ, u r-riżultati għandhom ikunu jaqblu mar-riżultati pprovduti fit-Tabella 1.
|
|
10.
|
Fil-każ ta’ assaġġ tal-antagonisti, kurvi ta’ konċentrazzjoni sħaħ għal żewġ standards referenzjarji, tamossifen u flutammid, għandhom jitkejlu b’mod simultanju ma’ kull sessjoni. Il-klassifikazzjoni kwalitattiva korretta bħala pożittiva jew negattiva għaż-żewġ sustanzi kimiċi għandha tiġi ssorveljata.
|
Koltura taċ-Ċelloli u Kundizzjonijiet tal-Pjastrament
|
11.
|
Iċ-ċelloli għandhom jinżammu f’Medium Essenzjali Minimu ta’ Eagle (EMEM) mingħajr fenol aħmar, supplimentati b’60 mg/l ta’ kanamiċina antibijotika u 10 % serum bovin fetali trattat bil-faħam miksi bid-dekstran (DCC-FBS), f’inkubatur tas-CO2 (5 % CO2) f’37±1°C. Malli jilħqu konfluwenza ta’ 75-90 %, iċ-ċelloli jistgħu jiġu subkolturati f’10 ml ta’ 0,4 x 105 – 1 x 105 ċelloli/ml għal platt tal-koltura taċ-ċelloli ta’ 100 mm. Iċ-ċelloli għandhom jiġu sospiżi b’10 % FBS-EMEM (li hu l-istess bħall-EMEM b’DCC-FBS) u mbagħad jiġu pjastrati fi bwejriet ta’ mikropjastra f’densità ta’ 1 x 104 ċelloli/(100 μl x bwejra). Imbagħad, iċ-ċelloli għandhom jiġu preinkubati f’inkubatur tas-CO2 ta’ 5 % f’37°±1°C għal tliet sigħat qabel l-esponiment għas-sustanza kimika. L-oġġetti tal-plastik għandhom ikunu ħielsa minn attività estroġenika.
|
|
12.
|
Biex tinżamm l-integrità tar-rispons, iċ-ċelloli għandhom jitkabbru għal aktar minn passaġġ wieħed mill-istokk friżat fil-media kundizzjonata u ma għandhomx jiġu kolturati għal aktar minn 40 passaġġ. Għal-linja ta’ ċelloli hERα-HeLa-9 903, dan ikun anqas minn tliet xhur. Madankollu, il-prestazzjoni taċ-ċelloli tista’ tonqos jekk jitkabbru f’kundizzjonijiet ta’ koltura mhux adatti.
|
|
13.
|
Id-DCC-FBS jista’ jitħejja kif deskritt fl-Appendiċi 2.2, jew jinkiseb minn sorsi kummerċjali.
|
Kriterji ta’ aċċettabbiltà
Standards ta’ referenza pożittivi u negattivi għall-assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
14.
|
Qabel u matul l-istudju, ir-risponsività tas-sistema tat-test għandha tiġi verifikata bl-użu tal-konċentrazzjonijiet xierqa ta’ estroġenu b’saħħtu: E2, estroġenu dgħajjef (17α-estradjol), agonist dgħajjef ħafna (17α-metiltestosteron), u sustanza negattiva (kortikosteron). Il-valuri tal-medda aċċettabbli miksuba mill-istudju ta’ validazzjoni (1) jingħataw fit-Tabella 1. Dawn l-erba’ standards referenzjarji konkorrenti għandhom ikunu inklużi ma’ kull esperiment u r-riżultati għandhom jaqgħu fi ħdan il-limiti aċċettabbli mogħtija. Jekk dan ma jkunx il-każ, il-kawża għan-nuqqas ta’ ssodisfar tal-kriterji ta’ aċċettabbiltà għandha tkun determinata (eż. immaniġġjar taċ-ċelloli, u serum u antibijotiċi għall-kwalità u għall-konċentrazzjoni) u l-assaġġ għandu jerġa’ jsir. Ladarba jintlaħqu l-kriterji ta’ aċċettabbiltà, biex tiġi żgurata varjabbiltà minima tal-valuri tal-EC50, tal-PC50 u tal-PC10, hu essenzjali li jsir użu konsistenti mill-materjali għall-kolturar taċ-ċelloli. L-erba’ standards referenzjarji konkorrenti, li għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment (imwettqa fl-istess kundizzjonijiet inklużi l-materjali, il-livell tal-passaġġi taċ-ċelloli u t-tekniċi), jistgħu jiżguraw is-sensittività tal-assaġġ għaliex il-PC10s tat-tliet standards referenzjarji pożittivi għandhom jaqgħu fi ħdan il-medda aċċettabbli, u hekk ukoll il-PC50s u l-EC50s fejn jistgħu jiġu kkalkolati (ara t-Tabella 1).
|
Tabella 1
Il-valuri tal-medda aċċettabbli tal-erba standards referenzjarji għall-assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
Isem
|
logPC50
|
logPC10
|
logEC50
|
Pendil ta’ Hill
|
Medda tat-test
|
|
17β-estradjol (E2) Nru CAS: 50-28-2
|
-11,4~-10,1
|
<-11
|
-11,3~-10,1
|
0,7~1,5
|
10-14~10-8M
|
|
17α-estradjol Nru CAS: 57-91-0
|
-9,6~-8,1
|
-10,7~-9,3
|
-9,6~-8,4
|
0,9~2,0
|
10-12~10-6M
|
|
Kortikosteron Nru CAS: 50-22-6
|
–
|
–
|
–
|
–
|
10-10~10-4M
|
|
17α-metiltestosteron Nru CAS: 58-18-4
|
-6,0~-5,1
|
-8,0~-6,2
|
–
|
–
|
10-11~10-5M
|
Standards ta’ referenza pożittivi u negattivi għall-assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
15.
|
Qabel u matul l-istudju, ir-risponsività tas-sistema tat-test għandha tiġi verifikata bl-użu tal-konċentrazzjonijiet xierqa ta’ sustanza pożittiva (Tamossifen), u ta’ sustanza negattiva (Flutammid). Il-valuri tal-medda aċċettabbli miksuba mill-istudju ta’ validazzjoni (1) jingħataw fit-Tabella 2. Dawn iż-żewġ standards referenzjarji konkorrenti għandhom ikunu inklużi ma’ kull esperiment u r-riżultati għandhom jiġu ġġudikati bħala korretti kif muri fil-kriterji. Jekk dan ma jkunx il-każ, il-kawża għan-nuqqas ta’ ssodisfar tal-kriterji għandhom ikunu determinati (eż. immaniġġjar taċ-ċelloli, u serum u antibijotiċi għall-kwalità u għall-konċentrazzjoni) u l-assaġġ għandu jerġa’ jsir. Barra minn hekk, il-valuri tal-IC50 għal sustanza pożittiva (Tamossifen) għandhom jiġu kkalkolati u r-riżultati għandhom jaqgħu fi ħdan il-limiti aċċettabbli mogħtija. Ladarba jintlaħqu l-kriterji ta’ aċċettabbiltà, biex tiġi żgurata varjabbiltà minima tal-valuri tal-IC50, hu essenzjali li jsir użu konsistenti mill-materjali għall-kolturar taċ-ċelloli. Iż-żewġ standards referenzjarji konkorrenti, li għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment (imwettaq fl-istess kundizzjonijiet inklużi l-materjali, il-livell tal-passaġġi taċ-ċelloli u tat-tekniċi), jistgħu jiżguraw is-sensittività tal-assaġġ (ara t-Tabella 2).
|
Tabella 2
Il-kriterji u l-valuri tal-medda aċċettabbli taż-żewġ standards ta’ refrenza għall-assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
Isem
|
Kriterji
|
LogIC50
|
Medda tat-test
|
|
Tamossifen Nru CAS: 10 540 -29-1
|
Pożittiv: IC50 għandu jiġi kkalkolat
|
-5,942～-7,596
|
10-10～10-5M
|
|
Flutammid Nru CAS: 13 311 -84-7
|
Negattiv: IC30 ma għandux jiġi kkalkolat
|
-
|
10-10 ～10-5M
|
Kontrolli Pożittivi u Negattivi
|
16.
|
Il-kontroll pożittiv (PC) għall-assaġġ tal-agonisti tal-ER (1 nM tal-E2) u għall-assaġġ tal-antagonisti tal-ER (10μM TAM) għandu jiġi ttestjat tal-anqas fi triplikat f’kull pjastra. Il-veikolu li jintuża biex sustanza kimika tat-test tiġi dissolta għandu jiġi ttestjat bħala kontroll b’veikolu (VC) tal-anqas fi triplikat f’kull pjastra. Minbarra dan il-VC, jekk il-PC juża veikolu differenti mis-sustanza kimika tat-test, VC ieħor għandu jiġi ttestjat tal-anqas fi triplikat fuq l-istess pjastra bil-PC.
|
Kriterji tal-kwalità għall-assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
17.
|
L-attività medja tal-luċiferażi tal-kontroll pożittiv (1 nM E2) tal-anqas għandha tkun erba’ darbiet dik tal-VC medju f’kull pjastra. Dan il-kriterju hu stabbilit fuq il-bażi tal-affidabbiltà tal-valuri tal-punt ta’ tmiem mill-istudju ta’ validazzjoni (storikament bejn erba’ darbiet u 30 darba).
|
|
18.
|
Fir-rigward tal-kontroll tal-kwalità tal-assaġġ, l-induzzjoni tad-drabi li tikkorrispondi għall-valur tal-PC10 tal-PC konkorrenti (1 nM E2) għandha tkun akbar minn 1+2SD tal-valur tal-induzzjoni tad-drabi (=1) tal-VC konkorrenti. Għall-finijiet ta’ prijoritizzazzjoni, il-valur tal-PC10 jista’ jkun siewi biex tiġi simplifikata l-analiżi tad-data meħtieġa meta mqabbla ma’ analiżi statistika. Għalkemm analiżi statistika tipprovdi informazzjoni dwar is-sinifikat, analiżi bħal din mhix parametru kwantitattiv fir-rigward tal-potenzjal ibbażat fuq il-konċentrazzjoni, u għalhekk hi anqas utli għall-finijiet ta’ prijoritizzazzjoni.
|
Kriterji tal-kwalità għall-assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
19.
|
L-attività medja tal-luċiferażi taż-żieda fil-kontroll (25 pM E2) tal-anqas għandha tkun erba’ darbiet dik tal-VC medju f’kull pjastra. Dan il-kriterju hu stabbilit fuq il-bażi tal-affidabbiltà tal-valuri tal-punt ta’ tmiem mill-istudju ta’ validazzjoni.
|
|
20.
|
Fir-rigward tal-kontroll tal-kwalità tal-assaġġ, l-attivazzjoni traskrizzjonali relattiva (RTA) ta’ 1 nM E2 għandha tkun akbar minn 100 %, l-RTA ta’ 1 μM 4-Idrossitamossifen (OHT) għandha tkun anqas minn 40,6 % u l-RTA ta’ 100 μM Diġitonina (Diġ) għandha tkun anqas minn 0 %.
Wiri tal-Profiċjenza tal-Laboratorju (ara l-paragrafu 14 u t-Tabelli 3 u 4 f’« KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER» ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar).
|
Veikolu
|
21.
|
Id-dimetil sulfossidu (DMSO), jew solvent xieraq, fl-istess konċentrazzjoni użata għall-kontrolli pożittivi u negattivi differenti u għas-sustanzi kimiċi tat-test għandu jintuża bħala l-VC konkorrenti. Is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu dissolti f’solvent li jissolubilizza dik is-sustanza kimika tat-test u li jitħallat mal-medium taċ-ċelloli. L-ilma, l-etanol (purità ta’ 95 % sa 100 %) u d-DMSO huma veikoli xierqa. Jekk jintuża d-DMSO, il-livell ma għandux jaqbeż iż-0,1 % (v/v). Għal kwalunkwe veikolu, għandu jintwera li l-volum massimu użat mhuwiex ċitotossiku u ma jinterferixxix mat-twettiq tal-assaġġ.
|
Preparazzjoni tas-Sustanzi Kimiċi tat-Test
|
22.
|
Ġeneralment, is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu dissolti fid-DMSO jew f’solvent xieraq ieħor, u jiġu dilwiti serjalment bl-istess solvent fi proporzjon komuni ta’ 1:10 biex jitħejjew soluzzjonijiet għad-dilwizzjoni mal-media.
|
Solubbiltà u Ċitotossiċità: Kunsiderazzjonijiet għas-Sejbien tal-Medda.
|
23.
|
Għandu jitwettaq test preliminari biex tiġi determinata l-medda ta’ konċentrazzjoni xierqa tas-sustanza kimika li tkun se tiġi ttestjata, u biex jiġi żgurat jekk is-sustanza kimika tat-test jistax ikollha xi problemi ta’ solubbiltà u ta’ ċitotossiċità. Għall-ewwel, is-sustanzi kimiċi jiġu ttestjati sal-konċentrazzjoni massima ta’ 1 μl/ml, 1 mg/ml, jew 1 mM, skont liema tkun l-anqas waħda. Fuq il-bażi tal-firxa ta’ ċitotossiċità jew tan-nuqqas ta’ solubbiltà osservati fit-test preliminari, l-ewwel sessjoni definita għandha tittestja s-sustanza kimika tat-test f’dilwizzjonijiet log-serjali billi tibda bil-konċentrazzjoni aċċettabbli massima (eż. 1 mM, 100μM, 10μM, eċċ.) u tiġi nnotata l-preżenza ta’ dardir jew ta’ preċipitat jew ta’ ċitotossiċità. Il-konċentrazzjonijiet fit-tieni, u jekk meħtieġa, fit-tielet sessjoni, għandhom jiġu aġġustati kif xieraq biex jikkaratterizzaw aħjar il-kurva konċentrazzjoni rispons u biex jiġu evitati konċentrazzjonijiet li jinstabu li jkunu insolubbli jew jinduċu ċitotossiċità eċċessiva.
|
|
24.
|
Għall-agonisti u għall-antagonisti tal-ER, il-preżenza ta’ livelli dejjem akbar ta’ ċitotossiċità tista’ tbiddel b’mod sinifikanti jew telimina r-rispons sigmojdali tipiku u għandha tiġi kkunsidrata meta tiġi interpretata d-data. Għandhom jintużaw metodi ta’ ttestjar taċ-ċitotossiċità li jistgħu jipprovdu informazzjoni rigward vijabbiltà ta’ 80 % taċ-ċelloli, billi jintuża assaġġ xieraq ibbażat fuq l-esperjenza tal-laboratorju.
|
|
25.
|
Jekk ir-riżultati tat-test taċ-ċitotossiċità juru li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test naqqset in-numru ta’ ċelloli b’20 % jew aktar, din il-konċentrazzjoni għandha titqies bħala ċitotissika, u l-konċentrazzjonijiet fil-konċentrazzjoni ċitotossika jew ogħla minn din għandhom jiġu esklużi mill-evalwazzjoni.
|
Esponiment għas-Sustanza Kimika u Organizzazzjoni tal-Pjastra tal-Assaġġ
|
26.
|
Il-proċedura għad-dilwizzjonijiet kimċi (Stadji 1 u 2) u għall-esponiment għaċ-ċelloli (Stadju 3) tista’ titwettaq kif ġej:
|
Stadju 1: Kull sustanza kimika tat-test għandha tiġi dilwita serjalment fid-DMSO, jew f’solvent xieraq, u tiżdied mal-bwejriet ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ biex jinkisbu konċentrazzjonijiet serjali finali kif determinati mit-test preliminari ta’ sejbien tal-medda (tipikament f’serje ta’, pereżempju, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, u 10 pM (10-3-10-11 M)) għall-ittestjar triplikat.
Stadju 2: Dilwizzjoni kimika: L-ewwel issir dilwizzjoni ta’ 1,5 μl tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent sa volum ta’ 500 μl tal-media.
Stadju 3: Esponiment kimiku taċ-ċelloli: Jiżdiedu 50 μl tad-dilwizzjoni mal-media (imħejjija fl-Istadju 2) fi bwejra tal-assaġġ li jkun fiha 104 ċelloli/100 μl/bwejra.
Il-volum finali rakkomandat tal-media meħtieġ għall kull bwejra hu ta’ 150 μl. Il-kampjuni tat-test u l-istandards referenzjarji jistgħu jiġu assenjati kif muri fit-Tabella 3 u fit-Tabella 4.
Tabella 3
Eżempju ta’ assenjament tal-konċentrazzjoni tal-pjastri tal-istandards referenzjarji fil-pjastra tal-assaġġ fl-assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
Ringiela
|
17α-metiltestosteron
|
Kortikosteron
|
17α-estradjol
|
E2
|
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
konċ 1 (10 μM)
|
→
|
→
|
100 μM
|
→
|
→
|
1 μM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
|
B
|
konċ 2 (1 μM)
|
→
|
→
|
10 μM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
|
C
|
konċ 3 (100 nM)
|
→
|
→
|
1 μM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
|
D
|
konċ 4 (10 nM)
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
|
E
|
konċ 5 (1 nM)
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
|
F
|
konċ 6 (100 pM)
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
0,1 pM
|
→
|
→
|
|
G
|
konċ 7 (10 pM)
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
0,01 pM
|
→
|
→
|
|
H
|
VC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
PC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
|
VC: Kontroll bil-veikolu (0,1 % DMSO); PC: Kontroll pożittiv (1 nM E2)
|
|
27.
|
L-istandards referenzjarji (E2, 17α-estradjol, 17-μετιλμτεστοστεροντυυκορτικοστερονκκγγανδηομαφιιυυττεστφατιαφφκυλλκσεσσφονιοοΤαβελλαΤΤΤΤΤIl-bwejriet tal-PC trattati b’1 nM ta’ E2 li jistgħu jipproduċu induzzjoni massima ta’ bwejriet ta’ E2 u ta’ VC bid-DMSO (jew b’solvent xieraq) waħdu għandhom ikunu inklużi f’kull pjastra tal-assaġġ tat-test (Tabella 4). Jekk fl-istess esperiment jintużaw ċelloli minn sorsi differenti (eż. numru ta’ passaġġi differenti, lott differenti, eċċ.), l-istandards referenzjarji għandhom jiġu ttestjati għal kull sors ta’ ċelloli.
|
Tabella 4
Eżempju ta’ assenjament tal-konċentrazzjoni tal-pjastri tas-sustanzi kimiċi tat-test u tal-kontroll tal-pjastra fil-pjastra tal-assaġġ fl-assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
Ringiela
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
Sustanza Kimika tat-Test 4
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
konċ 1 (10 μM)
|
→
|
→
|
1 mM
|
→
|
→
|
1 μM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
|
B
|
konċ 2 (1 μM)
|
→
|
→
|
100 μM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
|
C
|
konċ 3 (100 nM)
|
→
|
→
|
10 μM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
|
D
|
konċ 4 (10 nM)
|
→
|
→
|
1 μM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
|
E
|
konċ 5 (1 nM)
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
|
F
|
konċ 6 (100 pM)
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
0,1 pM
|
→
|
→
|
|
G
|
konċ 7 (10 pM)
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
0,01 pM
|
→
|
→
|
|
H
|
VC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
PC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
|
VC: Kontroll bil-veikolu (0,1 % DMSO); PC: Kontroll pożittiv (1 nM E2)
|
Tabella 5
Eżempju ta’ assenjament tal-konċentrazzjoni tal-pjastri tal-istandards referenzjarji fil-pjastra tal-assaġġ fl-assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
28.
|
Biex tiġi evalwata l-attività antagonista tas-sustanzi kimiċi, il-bwejriet tal-assaġġ li jinsabu fir-ringieli minn A sa G għandhom jiżdiedu b’25pM E2. L-istandards referenzjarji (Tamossifen u Flutammid) għandhom jiġu ttestjati f’kull sessjoni. Bwejriet tal-PC trattati b’1 nM tal-E2 li jistgħu jintużaw bħala kontroll tal-kwalità tal-linja ta’ ċelloli hERα-HeLa-9 903, bwejriet tal-VC trattati bid-DMSO (jew b’solvent xieraq), bwejriet tad-DMSO ta’ 0,1 % trattati b’żieda tad-DMSO mal-E2 miżjud li jikkorrispondu għaż-“Żieda fil-kontroll”, bwejriet trattati b’konċentrazzjoni finali ta’ 1 μM OHT u bwejriet trattati b’100 μM Diġ għandhom ikunu inklużi f’kull pjastra tal-assaġġ tat-test (Tabella 5). Pjastra tal-assaġġ sussegwenti għandha ssegwi l-istess tifsila tal-pjastra mingħajr bwejriet tal-istandards referenzjarji (Tabella 6). Jekk fl-istess esperiment jintużaw ċelloli minn sorsi differenti (eż. numru ta’ passaġġi differenti, lott differenti, eċċ.), l-istandards referenzjarji għandhom jiġu ttestjati għal kull sors ta’ ċelloli.
|
Tabella 6
Eżempju ta’ assenjament tal-konċentrazzjoni tal-pjastri tas-sustanzi kimiċi tat-test u tal-kontroll tal-pjastra fil-pjastra tal-assaġġ fl-assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
29.
|
In-nuqqas ta’ effetti tax-xfar għandu jiġi kkonfermat, kif xieraq, u jekk ikun hemm suspett ta’ effetti tax-xfar, it-tifsila tal-pjastra għandha tinbidel biex jiġu evitati t-tali effetti. Pereżempju, tista’ tintuża tifsila tal-pjastra li teskludi l-bwejriet tax-xfar.
|
|
30.
|
Wara li jiżdiedu s-sustanzi kimiċi, il-pjastri tal-assaġġ għandhom ikunu inkubati f’inkubatur tas-CO2 ta’ 5 % f’37±1oC għal 20-24 siegħa biex jinduċu l-prodotti tal-ġene indikatur.
|
|
31.
|
Se jkollhom bżonn jiġu applikati kunsiderazzjonijiet speċjali għal dawk il-komposti li jkunu volatili ħafna. F’każijiet bħal dawn, il-bwejriet tal-kontroll fil-qrib jistgħu jiġġeneraw pożittivi foloz u dan għandu jiġi kkunsidrat fid-dawl tal-valuri tal-kontroll mistennija u storiċi. Fil-ftit każijiet li fihom il-volatilità tista’ tkun ta’ tħassib, l-użu ta’ “siġillaturi tal-pjastri” jista’ jgħin biex jiżola b’mod effettiv il-bwejriet individwali matul l-ittestjar, u għaldaqstant hu rakkomandat f’każijiet bħal dawn.
|
|
32.
|
Testijiet definittivi ripetuti għall-istess sustanza kimika għandhom jitwettqu f’jiem differenti, biex tiġi żgurata indipendenza.
|
Assaġġ tal-luċiferażi
|
33.
|
Għall-assaġġ jistgħu jintużaw reaġent kummerċjali tal-assaġġ tal-luċiferażi [eż. Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega, E2510, jew ekwivalenti)] jew sistema standard ta’ assaġġ tal-luċiferażi (eż. Promega, E1500, jew ekwivalenti), dment li ma jiġux ssodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà. Ir-reaġenti tal-assaġġ għandhom jintgħażlu fuq il-bażi tas-sensittività tal-luminometru li jkun se jintuża. Meta tintuża s-sistema standard ta’ assaġġ tal-luċiferażi, għandu jintuża Reaġent tal-Liżi tal-koltura taċ-Ċeloli (eż. Promega, E1531, jew ekwivalenti) qabel ma jiżdied is-substrat. Ir-reaġent tal-luċiferażi għandu jiġi applikat skont l-istruzzjonijiet tal-manifatturi.
|
ANALIŻI TAD-DATA
Assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
34.
|
Fil-każ tal-assaġġi tal-agonisti tal-ER, biex tinkiseb l-attività traskrizzjonali relattiva għall-PC (1 nM tal-E2), is-sinjali tal-lumenixxenza mill-istess pjastra jistgħu jiġu analizzati skont l-istadji li ġejjin (proċessi matematiċi ekwivalenti oħra huma aċċettabbli wkoll):
|
Stadju 1. Ikkalkola l-valur medju għall-VC.
Stadju 2. Naqqas il-valur medju tal-VC mill-valur ta’ kull bwejra biex tinnormalizza d-data.
Stadju 3. Ikkalkola l-medja għall-PC normalizzat.
Stadju 4. Iddividi l-valur normalizzat ta’ kull bwejra fil-pjastra bil-valur medju tal-PC normalizzat (PC=100 %).
Il-valur finali ta’ kull bwejra hu l-attività traskrizzjonali relattiva għal dik il-bwejra meta mqabbla mar-rispons tal-PC.
Stadju 5. Ikkalkola l-valur medju tal-attività traskrizzjonali relattiva għal kull grupp tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test. Hemm żewġ dimensjonijiet għar-rispons: l-attività traskrizzjonali medja (rispons) u l-konċentrazzjoni li fiha jseħħ ir-rispons (ara t-taqsima li ġejja).
Kunsiderazzjonijiet tal-induzzjoni tal-EC50, tal-PC50 u tal-PC10
|
35.
|
Il-kurva sħiħa konċentrazzjoni rispons hi meħtieġa għall-kalkolu tal-EC50, iżda din mhux dejjem tkun tista’ tinkiseb jew prattika minħabba l-limitazzjonijiet tal-medda ta’ konċentrazzjoni tat-test (pereżempju minħabba problemi ta’ ċitotossiċità jew ta’ solubbiltà). Madankollu, peress li l-EC50 u l-livell massimu ta’ induzzjoni (li jikkorrispondi għall-ogħla valur tal-ekwazzjoni Hill) huma parametri informattivi, dawn il-parametri għandhom jiġu rapportati fejn possibbli. Għall-kalkolu tal-EC50 u tal-livell ta’ induzzjoni massima, għandu jintuża softwer statistiku xieraq (eż. softwer statistiku Graphpad Prism). Jekk l-ekwazzjoni loġistika Hill tkun applikabbli għad-data ta’ rispons għall-konċentrazzjoni, l-EC50 għandu jiġi kkalkolat bl-ekwazzjoni li ġejja (7):
Y=Qiegħ + (Quċċata-Qiegħ) / (1+10 exp ((log EC50 -X) x pendil ta’ Hill)) Fejn:
X hi l-logaritmu tal-konċentrazzjoni; u,
Y hi r-rispons u Y tibda fil-Qiegħ u titla’ sal-Quċċata f’kurva sigmojde. Il-qiegħ hu fiss għal żero fl-ekwazzjoni loġistika Hill.
|
|
36.
|
Għal kull sustanza kimika tat-test, għandhom jiġu pprovduti dawn li ġejjin:
L-RPCMax li hu l-livell massimu ta’ rispons indott minn sustanza kimika tat-test, espress bħala perċentwal tar-rispons indott minn 1 nM E2 fuq l-istess pjastra, kif ukoll il-PCMax (il-konċentrazzjoni assoċjata mal-RPCMax); u
Għal sustanzi kimiċi pożittivi, il-konċentrazzjonijiet li jinduċu l-PC10 u, jekk xieraq, il-PC50.
|
|
37.
|
Il-valur tal-PCx jista’ jiġi kkalkolat bl-interpolazzjoni bejn 2 punti fil-koordinat X-Y, wieħed eżatt fuq u l-ieħor eżatt taħt valur tal-PCx. Meta l-punti tad-data li jinsabu eżatt fuq u taħt il-valur tal-PCx ikollhom il-koordinati (a,b) u (c,d) rispettivament, il-valur tal-PCx jista’ jiġi kkalkolat bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
log[PCx] = log[c]+(x-d)/(d-b)
|
|
38.
|
Deskrizzjonijiet tal-valuri tal-PC huma pprovduti fil-Figura 1 ta’ hawn taħt.
Figura 1
Eżempju ta’ kif jinkisbu l-valuri tal-PC. Il-PC (1 nM of E2) hi inkluża f’kull pjastra tal-assaġġ
|
Assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
39.
|
Fil-każ tal-assaġġi tal-antagonisti tal-ER, biex tinkiseb l-attività traskrizzjonali relattiva (RTA) għaż-żieda fil-kontroll (25 pM tal-E2), is-sinjali tal-lumenixxenza mill-istess pjastra jistgħu jiġu analizzati skont l-istadji li ġejjin (proċessi matematiċi ekwivalenti oħra huma aċċettabbli wkoll):
Stadju 1. Ikkalkola l-valur medju għall-VC.
Stadju 2. Naqqas il-valur medju tal-VC mill-valur ta’ kull bwejra biex tinnormalizza d-data. Stadju 3. Ikkalkola l-medja għaż-żieda normalizzata fil-kontroll.
Stadju 4. Iddividi l-valur normalizzat ta’ kull bwejra fil-pjastra bil-valur medju taż-żieda normalizzata fil-kontroll (żieda fil-kontroll=100 %).
Il-valur finali ta’ kull bwejra hu l-attività traskrizzjonali relattiva għal dik il-bwejra meta mqabbla mar-rispons taż-żieda fil-kontroll.
Stadju 5. Ikkalkola l-valur medju tal-attività traskrizzjonali relattiva għal kull trattament.
|
Kunsiderazzjonijiet tal-induzzjoni tal-IC30 u tal-IC50
|
40.
|
Għal sustanzi kimiċi pożittivi, għandhom jiġu pprovduti l-konċentrazzjonijiet li jinduċu l-IC30 u, jekk xieraq, l-IC50.
|
|
41.
|
Il-valur tal-ICx jista’ jiġi kkalkolat bl-interpolazzjoni bejn żewġ punti fil-koordinat X-Y, wieħed eżatt fuq u l-ieħor eżatt taħt valur tal-ICx. Meta l-punti tad-data li jinsabu eżatt fuq u taħt il-valur tal-ICx ikollhom il-koordinati (c,d) u (a,b) rispettivament, il-valur tal-ICx jista’ jiġi kkalkolat bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
lin ICx = a-(b-(100-x)) (a-c) /(b-d)
Figura 2
Eżempju ta’ kif jinkisbu l-valuri tal-IC. Iż-żieda fil-kontroll (25 pM of E2) hi inkluża f’kull pjastra tal-assaġġ
RTA: attività traskrizzjonali relattiva
|
|
42.
|
Ir-riżultati għandhom ikunu bbażati fuq żewġ (jew tliet) sessjonijiet indipendenti. Jekk żewġ sessjonijiet jagħtu riżultati komparabbli u, għalhekk, riproduċibbli, ma jkunx hemm bżonn li ssir it-tielet sessjoni. Biex ikunu aċċettabbli, ir-riżultati għandhom:
|
—
|
Jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettabbiltà (ara l-Kriterji ta’ aċċettabbiltà para 14-20),
|
|
Il-Kriterji ta’ Interpretazzjoni tad-Data
Tabella 7
Kriterji għal deċiżjonijiet pożittivi u negattivi fl-assaġġ tal-agonisti tal-ER
|
Pożittiv
|
Jekk tinkiseb RPCMax li tkun ekwivalenti għal 10 % jew aktar tar-rispons tal-kontroll pożittiv f’tal-anqas tnejn minn żewġ sessjonijiet jew tnejn minn tlieta.
|
|
Negattiv
|
Jekk l-RPCMax ma tilħaqx tal-anqas l-10 % tar-rispons tal-kontroll pożittiv fi tnejn minn żewġ sessjonijiet jew fi tnejn minn tlieta.
|
Tabella 8
Kriterji għal deċiżjonijiet pożittivi u negattivi fl-assaġġ tal-antagonisti tal-ER
|
Pożittiv
|
Jekk l-IC30 tiġi kkalkolata f’tal-anqas tnejn minn żewġ sessjonijiet jew fi tnejn minn tlieta.
|
|
Negattiv
|
Jekk l-IC30 ma tiġix ikkalkolata f’żewġ sessjonijiet minn tnejn jew fi tnejn minn tlieta.
|
|
43.
|
Il-kriterji ta’ interpretazzjoni tad-data huma murija fit-Tabelli 7 u 8. Ir-riżultati pożittivi jiġu karatterizzati kemm mill-kobor tal-effett kif ukoll mill-konċentrazzjoni li fiha jseħħ l-effett. L-espressjoni tar-riżultati bħala konċentrazzjoni li fiha jintlaħqu 50 % (PC50) jew 10 % (PC10) tal-valuri tal-PC għall-assaġġ tal-agonisti, u 50 % (IC50) jew 30 % (IC30) tal-valur taż-żieda fil-kontroll hi inibita għall-assaġġ tal-antagonisti, u tilħaq dawn iż-żewġ għanijiet. Madankollu, sustanza kimika tat-test titqies li tkun pożittiva, jekk ir-rispons massimu indott mis-sustanza kimika tat-test (RPCMax) ikun ekwivalenti għal 10 % jew aktar tar-rispons tal-PC f’tal-anqas tnejn miż-żewġ sessjonijiet jew fi tnejn minn tlieta, filwaqt li sustanza kimika tat-test titqies negattiva jekk l-RPCMax ma tilħaqx tal-anqas l-10 % tar-rispons tal-kontroll pożittiv fi tnejn miż-żewġ sessjonijiet jew fi tnejn minn tlieta.
|
|
44.
|
Il-kalkoli tal-PC10, tal-PC50 u tal-PCMax fl-assaġġ tal-agonisti tal_ER u tal-IC30 u tal-IC50 fl-assaġġ tal-antagonisti tal-ER jistgħu jsiru bl-użu ta’ spreadsheet disponibbli mal-Linja Gwida tat-Test fuq is-sit web pubbliku tal-OECD (64).
|
|
45.
|
Għandu jkun biżżejjed li jinkisbu l-valuri tal-PC10 jew tal-PC50 u tal-IC30 jew tal-IC50 tal-anqas darbtejn. Madankollu, jekk il-linja bażi li tirriżulta għad-data fl-istess medda ta’ konċentrazzjoni turi varjabbiltà b’koeffiċjent għoli b’mod inaċċettabbli ta’ varjazzjoni (CV; %), id-data ma tistax titqies affidabbli u s-sors tal-varjabbiltà għolja għandu jiġi identifikat. Is-CV tat-triplikati tad-data mhux proċessata (jiġifieri data dwar l-intensità tal-luminexxenza) tal-punti ta’ data li jintużaw għall-kalkolu tal-PC10 għandu jkun anqas minn 20 %.
|
|
46.
|
L-ilħuq tal-kriterji ta’ aċċettabbiltà jindika li s-sistema tal-assaġġ qed topera kif suppost, iżda ma jiżgurax li kwalunkwe sessjoni partikolari tipproduċi data preċiża. Id-duplikazzjoni tar-riżultati tal-ewwel sessjoni hi l-aħjar garanzija li tkun ġiet prodotta data preċiża.
|
|
47.
|
Fil-każ ta’ assaġġ tal-agonisti tal-ER, fejn tkun meħtieġa aktar informazzjoni minbarra l-iskopijiet ta’ skrinjar u ta’ prijoritizzazzjoni ta’ din it-TG għal sustanzi kimiċi tat-test pożittivi, b’mod partikolari għal sustanzi kimiċi PC10-PC49, kif ukoll għal sustanzi kimiċi suspettati li jistimolaw eċċessivament il-luċiferażi, jista’ jiġi kkonfermat li l-attività osservata tal-luċiferażi hi biss rispons speċifiku għall-ERα, bl-użu ta’ antagonist tal-ERα (ara l-Appendiċi 2.1).
|
RAPPORT TAT-TEST
|
48.
|
Ara l-paragrafu 20 ta’ “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER”.
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
OECD (2015). Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 225), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(2)
|
Escande A., et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol., 71, 1 459-1 469.
|
|
(3)
|
Kuiper G.G., et al. (1998). Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta, Endocrinol., 139, 4 252-4 263.
|
|
(4)
|
Spaepen M., et al. (1992). Detection of Bacterial and Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Polymerase Chain Reaction, FEMS Microbiol. Lett., 78(1), 89-94.
|
|
(5)
|
Kobayashi H., et al. (1995). Rapid Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Enzymatic Detection of Polymerase Chain Reaction (PCR) Products, J. Vet. Med. Sci., 57(4), 769- 71.
|
|
(6)
|
Dussurget O. u Roulland-Dussoix D. (1994). Rapid, Sensitive PCR-Based Detection of Mycoplasmas in Simulated Samples of Animal Sera, Appl. Environ. Microbiol., 60(3), 953-9.
|
|
(7)
|
De Lean A., Munson P.J. u Rodbard D. (1978). Simultaneous Analysis of Families of Sigmoidal Curves: Application to Bioassay, Radioligand Assay, and Physiological Dose-Response Curves, Am. J. Physiol., 235, E97-El02.
|
Appendiċi 2.1
POŻITTIVI FOLOZ: VALUTAZZJONI TA’ SINJALI TAL-LUMINEXXENZA MEDJATI MHUX TAR-RIĊETTUR
|
1.
|
Pożittivi foloz fl-assaġġ tal-agonisti tal-ER jistgħu jiġu ġenerati minn attivazzjoni medjata mhux mill-ER tal-ġene luċiferażi, jew minn attivazzjoni diretta tal-prodott ġeniku jew tal-fluworexxenza mhux relatata. Effetti bħal dawn huma indikati minn kurva doża rispons mhux kompluta jew mhux tas-soltu. Jekk it-tali effetti jkunu suspettati, għandu jiġi eżaminat l-effett ta’ antagonist tal-ER (eż. 4- idrossitamossifen (OHT) f’konċentrazzjoni mhux tossika) fuq ir-rispons. L-antagonist pur (ICI 1827 80 jaf ma jkunx xieraq għal dan l-għan peress li konċentrazzjoni suffiċjenti ta’ ICI 1827 80 tista’ tnaqqas il-valur tal-VC, u dan jaffettwa l-analiżi tad-data.
|
|
2.
|
Biex tiġi żgurata l-validità ta’ dan l-approċċ, dawn li ġejjin għandhom jiġu ttestjati fl-istess pjastra:
|
—
|
Attività agonistika tas-sustanza kimika mhux magħrufa b’1 010 μM OHT jew mingħajr
|
|
—
|
1 nM E2 (fi triplikat) bħala PC tal-agonist
|
|
—
|
1 nM E2 + OHT (fi triplikat)
|
|
Kriterji ta’ Interpretazzjoni tad-Data
Nota: Il-bwejriet kollha għandhom ikunu trattati bl-istess konċentrazzjoni tal-veikolu.
|
—
|
Jekk l-attività agonistika tas-sustanza kimika mhux magħrufa MHIX affettwata mit-trattament bl-antagonist tal-ER, din tiġi klassifikata bħala “Negattiva”.
|
|
—
|
Jekk l-attività agonistika tas-sustanza kimika mhux magħrufa tkun inibita għalkollox, applika l-kriterji ta’ deċiżjoni.
|
|
—
|
Jekk l-attività agonistika fl-anqas konċentrazzjoni tkun ekwivalenti għar-rispons tal-PC10 jew aktar minnu, is-sustanza kimika mhux magħrufa tkun inibita b’mod ekwivalenti għar-rispons tal-PC10 jew aktar minnu. Id-differenza fir-risponsi bejn il-bwejriet mhux trattati u dawk trattati bl-antagonist tal-ER hi kkalkolata u din id-differenza għandha titqies bħala r-rispons veru u għandha tintuża għall-kalkolu tal-parametri xierqa biex tkun tista’ tittieħed deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni.
|
Analiżi tad-data
Ivverifika l-istandard tal-prestazzjoni.
Ivverifika s-CV bejn il-bwejriet trattati taħt l-istess kundizzjonijiet.
|
1.
|
Ikkalkola l-medja tal-VC
|
|
2.
|
Naqqas il-medja tal-VC mill-valur ta’ kull bwejra mhux trattata bl-OHT
|
|
3.
|
Ikkalkola l-medja tal-OHT
|
|
4.
|
Naqqas il-medja tal-VC mill-valur ta’ kull bwejra trattata bl-OHT
|
|
5.
|
Ikkalkola l-medja tal-PC
|
|
6.
|
Ikkalkola l-attività traskrizzjonali relattiva tal-bwejriet l-oħra kollha b’rabta mal-PC.a
|
Appendiċi 2.2
PREPARAZZJONI TAS-SERUM TRATTAT B’FAĦAM MIKSI BID-DEKSTRAN (DCC)
|
1.
|
It-trattament ta’ serum b’faħam miksi bid-dekstran (DCC) hu metodu ġenerali għat-tneħħija ta’ komposti estroġeniċi mis-serum li jiżdied mal-medium taċ-ċelloli, biex jiġi eskluż ir-rispons preġudikat assoċjat mal-estroġeni residwi fis-serum. B’din il-proċedura jistgħu jiġu trattati 500 ml serum bovin fetali (FBS).
|
Komponenti
|
2.
|
Se jkunu meħtieġa l-materjali u t-tagħmir li ġejjin:
|
Materjali
Faħam attivat
Dekstran:
Eżaidrat tal-klorur tal-manjeżju (MgCl2·6H2O)
Sukrożju
Soluzzjoni mewwieta 1 M HEPES (pH 7,4)
Ilma ultrapur prodott minn sistema ta’ filtri
Tagħmir
Kontenitur tal-ħġieġ awtoklavat (id-daqs għandu jiġi aġġustat kif xieraq) Ċentrifugu tal-Laboratorju Ġenerali (li jista’ jissettja t-temperatura għal 4 °C)
Proċedura
|
3.
|
Il-proċedura li ġejja hi aġġustata għall-użu ta’ tubi ċentrifugi tal-50 ml:
[Jum 1] Ħejji s-sospensjoni ta’ faħam miksi bid-dekstran b’1 l ilma ultrapur li fih 1,5 mM MgCl2, 0,25 M sukrożju, 2,5 g faħam, 0,25 g dekstran u 5 mM HEPES u ħawdu f’4 °C, matul il-lejl.
[Jum 2] Iddispensa s-sospensjoni f’tubi ċentrifugi tal-50 ml u ċċentrifuga f’10 000 rpm f’4 °C għal 10 minuti. Neħħi s-supernatant u aħżen nofs is-sediment tal-faħam f’4 °C għall-użu fil-Jum 3. Issospendi n-nofs l-ieħor tal-faħam b’FBS li jkun tħalla jinħall bil-galbu biex tiġi evitata preċipitazzjoni, u inattivat bis-sħana f’56 °C għal 30 minuta, imbagħad ittrasferixxi f’kontenitur tal-ħġieġ awtoklavat bħal flask Erlenmeyer. Ħawwad din is-sospensjoni bil-galbu f’4 °C, matul il-lejl.
[Jum 3] Iddispensa s-sospensjoni b’FBS f’tubi ċentrifugi għal ċentrifugazzjoni f’10 000 rpm f’4 °C għal 10 minuti. Iġbor l-FBS u ttrasferixxi fis-sediment tal-faħam il-ġdid imħejji u maħżun fil-Jum 2. Issospendi s-sediment tal-faħam u ħawwad din is-sospensjoni bil-galbu f’kontenitur tal-ħġieġ awtoklavat f’4 °C, matul il-lejl.
[Jum 4] Iddispensa s-sospensjoni għaċ-ċentrifugazzjoni f’10 000 rpm f’4 °C għal 10 minuti u sterlizza s-supernatant b’filtazzjoni permezz tal-filtru sterili ta’ 0,2 μm. Dan l-FBS trattat bid-DCC għandu jinħażen f’-20 °C u jista’ jintuża sa sena.
|
Appendiċi 3
ASSAĠĠ TA’ TRANSATTIVAZZJONI TAR-RIĊETTUR TAL-ESTROĠENU VM7LUC GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAL-AGONISTI U TAL-ANTAGONISTI TAR-RIĊETTUR TAL-ESTROĠENU
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
1.
|
Dan l-assaġġ juża l-linja ta’ ċelloli VM7Luc4E2 (65). Ġie validat min-National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), u mill-Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) (1). Il-linji ta’ ċelloli VM7Luc jesprimu b’mod predominanti ERα endoġenu u ammont minuri ta’ ERβ endoġenu (2) (3) (4).
|
|
2.
|
Dan l-assaġġ hu applikabbli għal firxa kbira ta’ sustanzi, dment li ma jkunux jistgħu jiġu dissolti f’sulfossidu tad-dimetil (DMSO; CASRN 67-68-5), ma jirreaġixxux ma’ DMSO jew mal-medium tat-tkabbir taċ-ċelloli, u ma jkunux ċitotossiċi fil-konċentrazzjonijiet li jkunu se jiġu ttestjati. Jekk l-użu tad-DMSO ma jkunx possibbli, jista’ jintuża veikolu ieħor bħall-etanol jew l-ilma (ara l-paragrafu 12). Il-prestazzjoni murija tal-assaġġ tal-(ant)agonisti TA tal-ER VM7Luc tissuġġerixxi li d-data ġenerata b’dan l-assaġġ tista’ tinforma mekkaniżmi ta’ azzjoni medjati bl-ER u tista’ tiġi kkunsidrata għall-prijoritizzazzjoni tas-sustanzi għall-ittestjar ulterjuri.
|
|
3.
|
Dan l-assaġġ hu mfassal b’mod speċifiku biex jindividwa TA medjata minn hERα u minn hERß billi jkejjel il-kemiluminexxenza bħala l-punt ta’ tmiem. L-użu tal-kemiluminexxenza fil-bijoassaġġi hu mifrux minħabba li l-luminexxenza għandha proporzjon għoli ta’ sinjal għall-isfond. Madankollu, l-attività tal-luċiferażi tal-firefly f’assaġġi bbażati fuq ċelloli tista’ tiġi konfuża minn sustanzi li jinibixxu l-enzima luċiferażi, u tikkawża inibizzjoni apparenti jew inkella luminexxenza miżjuda minħabba l-istabbilizzazzjoni tal-proteini. Barra minn hekk, f’ċreti assaġġi tal-ġene indikatur tal-ER ibbażati fuq il-luċiferażi, sinjali ta’ luminexxenza medjata mhux minn riċettur ġew rapportati f’konċentrazzjonijiet ta’ fitoestroġenu ogħla minn 1 μM minħabba l-attivazzjoni eċċessiva tal-ġene indikatur tal-luċiferażi. Filwaqt li l-kurva ta’ doża - rispons tindika li l-attivazzjoni vera tas-sistema tal-ER isseħħ f’konċentrazzjonijiet inferjuri, l-espressjoni tal-luċiferażi miksuba f’konċentrazzjonijiet ogħla ta’ fitoestroġeni jew ta’ komposti simili suspettati li jipproduċu attivazzjoni eċċessiva simili għal fitoestroġenu tal-ġene indikatur tal-luċiferażi trid tiġi eżaminata bir-reqqa f’sistemi tal-assaġġ TA tal-ER transfettati b’mod stabbli.
|
|
4.
|
Għandhom jinqraw “INTRODUZZJONI ĠENERALI” u “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER” qabel ma dan l-assaġġ jintuża għal finijiet regolatorji. Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma deskritti fl-Appendiċi 1.
|
PRINĊIPJU TAL-ASSAĠĠ (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
5.
|
L-assaġġ jintuża biex jindika l-irbit tal-ligand tal-ER, segwit minn traslokazzjoni tal-kumpless riċettur-ligand għan-nukleu. Fin-nukleu, il-kumpless riċettur-ligand jillega ma’ elementi speċifiċi ta’ rispons tad-DNA u jittransattiva l-ġene rapportatur (luc), li jirriżulta fil-produzzjoni ta’ luċiferażi u fl-emissjoni sussegwenti tad-dawl, li tista’ tiġi kwantifikata bl-użu ta’ luminometru. L-attività tal-luċiferażi tista’ tiġi evalwata malajr u mingħajr ma jintefqu wisq flus b’numru ta’ kits disponibbli kummerċjalment. It-TA tal-ER VM7Luc juża linja ta’ ċelloli tal-adenokarċinoma tas-sider uman risponsiva għall-ER, VM7, li ġiet transfettata b’mod stabbli b’binja indikatur tal-luc tal-firefly taħt il-kontroll ta’ erba’ elementi ta’ rispons tal-estroġenu mqiegħda upstream mill-promotur tal-vajrus tat-tumur mammarju tal-ġrieden (MMTV), biex jiġu identifikati sustanzi b’attività agonista jew antagonista tal-ER in vitro. Dan il-promotur tal-MMTV jesibixxi biss reattività inkroċjata minuri ma’ ormoni sterojde u mhux sterojde oħrajn (8). Il-kriterji għall-interpretazzjoni tad-data huma deskritti fid-dettall fil-paragrafu 41. Fil-qosor, rispons pożittiv jiġi identifikat minn kurva konċentrazzjoni rispons li jkun fiha tal-anqas tliet punti bi żbarri ta’ errur mhux imrikkba (medja ± SD), kif ukoll tibdil fl-amplitudni (unità tad-dawl relattiva normalizzata [RLU]) ta’ tal-anqas 20 % tal-valur massimali għall-istandard referenzjarju (17β-estradjol [E2; CASRN 50-28-2] għall-assaġġ tal-agonisti, raloksifen HCl [Ral; CASRN 84 449-90-1]/E2 għall-assaġġ tal-antagonisti).
|
PROĊEDURA
Linja ta’ Ċelloli
|
6.
|
Il-linja ta’ ċelloli trasferita b’mod stabbli VM7Luc4E2 għandha tintuża għall-assaġġ. Il-linja ta’ ċelloli bħalissa hi disponibbli biss bi ftehim ta’ liċenzjar tekniku mill-University of California, Davis, California, l-Istati Uniti (66), u minn Xenobiotic Detection Systems Inc., Durham, North Carolina, l-Istati Uniti (67).
|
Stabbiltà tal-Linja ta’ Ċelloli
|
7.
|
Biex jinżammu l-istabbiltà u l-integrità tal-linja ta’ ċelloli, iċ-ċelloli għandhom jitkabbru għal aktar minn passaġġ wieħed mill-istokk friżat fil-media ta’ żamma taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 9). Iċ-ċelloli ma għandhomx jiġu kolturati għal aktar minn 30 passaġġ. Għal-linja ta’ ċelloli VM7Luc4E2, 30 passaġġ se jkunu bejn wieħed u ieħor tliet xhur.
|
Koltura taċ-Ċelloli u Kundizzjonijiet tal-Pjastrament
|
8.
|
Il-proċeduri speċifikati fil-Gwida dwar Prattika Tjaba tal-Koltura taċ-Ċelloli (5) (6) għandhom jiġu segwiti biex tiġi żgurata l-kwalità tal-materjali u tal-metodi kollha biex jinżammu l-integrità, il-validità u r-riproduċibbiltà ta’ kwalunkwe ħidma mwettqa.
|
|
9.
|
Iċ-ċelloli VM7Luc4E2 jinżammu f’medium RPMI 1 640 supplimentat b’0,9 % Pen-Strep u bi 8,0 % serum bovin fetali (FBS) f’inkubatur tal-koltura tat-tessuti dedikat f’37oC ± 1oC, 90 % ± 5 % umdità, u f’5,0 % ± 1 % CO2/arja.
|
|
10.
|
Malli jilħqu konfluwenza ta’ ~80 %, iċ-ċelloli VM7Luc4E2 jiġu subkolturati u kundizzjonati għal ambjent ħieles minn estroġenu għal 48 siegħa qabel il-pjastrament taċ-ċelloli fi pjastri b’96 bwejra għall-esponiment għas-sustanzi kimiċi tat-test u għall-analiżi tal-induzzjoni dipendenti mill-estroġenu tal-attività ta’ luċiferażi. Il-medium ħieles mill-estroġenu (EFM) fih Modifika ta’ Dulbecco tal-Medium ta’ Eagle (DMEM) mingħajr fenol aħmar, supplimentat b’4,5 % FBS trattat bil-faħam/bid-dekstran, 1,9 % L-glutammina, u 0,9 % Pen-Strep. Kull oġġett tal-plastik għandu jkun ħieles minn attività estroġenika [ara l-protokoll dettaljat (7)].
|
Kriterji ta’ Aċċettabbiltà
|
11.
|
L-aċċettazzjoni jew ir-rifjut ta’ test huma bbażati fuq l-evalwazzjoni ta’ standard referenzjarju u r-riżultati tal-kontroll minn kull esperiment imwettaq fi pjastra b’96 bwejra. Kull standard referenzjarju jiġi ttestjat f’konċentrazzjonijiet multipli u hemm diversi kampjuni ta’ kull konċentrazzjoni ta’ referenza u ta’ kontroll. Ir-riżultati jitqabblu mal-kontrolli tal-kwalità (QC) għal dawn il-parametri li ġew derivati mill-bażijiet ta’ data storiċi dwar l-agonisti u l-antagonisti ġenerati minn kull laboratorju matul il-wiri tal-profiċjenza. Il-bażijiet ta’ data storiċi huma aġġornati b’valuri tal-istandards referenzjarji u tal-kontroll fuq bażi kontinwa. Tibdiliet fit-tagħmir jew fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju jistgħu jesiġu ġenerazzjoni ta’ bażijiet ta’ data storiċi aġġornati.
|
Test tal-Agonisti
Test għas-Sejbien tal-Medda
|
•
|
Induzzjoni: L-induzzjoni tal-pjastri għandha titkejjel bid-diviżjoni tal-ogħla valur medju tal-unità tad-dawl relattiva (RLU) tal-istandard referenzjarju E2 bil-valur medju tal-RLU tal-kontroll bid-DMSO. Normalment tinkiseb induzzjoni għal ħames darbiet, iżda għall-fini ta’ aċċettazzjoni, l-induzzjoni għandha tkun ekwivalenti għal erba’ darbiet jew aktar.
|
|
•
|
Riżultati tal-kontroll bid-DMSO: Il-valuri tal-RLU tal-kontroll b’solvent għandhom ikunu fi ħdan 2,5 darbiet id-devjazzjoni standard tal-valur medju storiku tal-RLU tal-kontroll b’solvent.
|
|
•
|
Esperiment li jonqos milli jilħaq wieħed mill-kriterji ta’ aċċettazzjoni għandu jiġi injorat u ripetut.
|
Test Komprensiv
Dan jinkludi l-kriterji ta’ aċċettabbiltà mit-test tas-sejba tal-medda tal-agonisti u dawn li ġejjin:
|
•
|
Ir-riżultati tal-istandards referenzjarji: Il-kurva konċentrazzjoni rispons tal-istandard referenzjarju E2 għandha tkun ta’ forma sigmojde u jkollha tal-anqas tliet valuri fi ħdan it-taqsima lineari tal-kurva konċentrazzjoni rispons.
|
|
•
|
Riżultati tal-kontroll pożittiv: Il-valuri tal-RLU tal-kontroll b’metossiklor għandhom ikunu akbar mill-medja tad-DMSO flimkien ma’ tliet darbiet id-devjazzjoni standard mill-medja tad-DMSO.
|
|
•
|
Esperiment li jonqos milli jilħaq xi wieħed mill-kriterji ta’ aċċettazzjoni għandu jiġi injorat u ripetut.
|
Test tal-Antagonisti
Test għas-Sejbien tal-Medda
|
•
|
Tnaqqis: It-tnaqqis tal-pjastri jitkejjel bid-diviżjoni tal-ogħla valur medju tal-RAL/tal-istandard referenzjarju tal-E2 bil-valur medju tal-RLU tal-kontroll bid-DMSO. Normalment jinkiseb tnaqqis ta’ ħames darbiet, iżda għall-finijiet ta’ aċċettazzjoni, it-tnaqqis għandu jkun ekwivalenti għal tliet darbiet jew aktar.
|
|
•
|
Ir-riżultati tal-kontroll b’E2: Il-valuri tal-RLU tal-kontroll b’E2 għandhom ikunu fi ħdan 2,5 darbiet id-devjazzjoni standard tal-valur medju storiku tal-RLU tal-kontroll b’E2.
|
|
•
|
Riżultati tal-kontroll bid-DMSO: Il-valuri tal-RLU tal-kontroll bid-DMSO għandhom ikunu fi ħdan 2,5 darbiet id-devjazzjoni standard tal-valur medju storiku tal-RLU tal-kontroll b’solvent.
|
|
•
|
Esperiment li jonqos milli jilħaq xi wieħed mill-kriterji ta’ aċċettazzjoni jiġi injorat u ripetut.
|
Test Komprensiv
Dan jinkludi l-kriterji ta’ aċċettazzjoni mit-test tas-sejba tal-medda tal-antagonisti u dawn li ġejjin:
|
•
|
Ir-riżultati tal-istandards referenzjarji: Il-kurva konċentrazzjoni rispons tal-istandard referenzjarju Ral/E2 għandha tkun ta’ forma sigmojde u jkollha tal-anqas tliet valuri fi ħdan it-taqsima lineari tal-kurva konċentrazzjoni rispons.
|
|
•
|
Riżultati tal-kontroll pożittiv: Il-valuri tal-RLU tal-kontroll b’tamossifen/E2 għandhom ikunu anqas mill-medja tal-kontroll b’E2 nieqes tliet darbiet id-devjazzjoni standard mill-medja tal-kontroll b’E2.
|
|
•
|
Esperiment li jonqos milli jilħaq xi wieħed mill-kriterji ta’ aċċettazzjoni jiġi injorat u ripetut.
|
Standards ta’ Referenza, Pożittivi, u Kontrolli b’Veikolu
Kontroll b’Veikolu (Assaġġi Agonisti u Antagonisti)
|
12.
|
Il-veikolu li jintuża biex is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti għandu jiġi ttestjat bħala kontroll b’veikolu. Il-veikolu użat matul il-validazzjoni tal-assaġġ TA tal-ER VM7Luc kien ta’ 1 % (v/v) dimetilsulfossidu (DMSO, CASRN 67-68-5) (ara l-paragrafu 24). Jekk jintuża veikolu ieħor li mhuwiex DMSO, l-istandards referenzjarji, il-kontrolli u s-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandhom jiġu ttestjati fl-istess veikolu, jekk dan ikun xieraq.
|
Standard ta’ Referenza (Sejbien tal-Medda tal-Agonisti)
|
13.
|
L-istandard referenzjarju hu E2 (CASRN 50-28-2). Għall-ittestjar tas-sejbien tal-medda, l-istandard ta’ refernza hu msawwar minn dilwizzjoni serjali ta’ erba’ konċentrazzjonijiet ta’ E2 (1,84 x 10-10, 4,59 x 10-11, 1,15 x 10-11 u 2,87 x 10-12 M), b’kull konċentrazzjoni ttestjata fi bwejriet duplikati.
|
Standard Referenzjarju (Inklużi l-Agonisti)
|
14.
|
E2 għall-ittestjar komprensiv hu msawwar minn dilwizzjoni serjali ta’ 1:2 li tikkonsisti fi 11-il konċentrazzjoni (li jvarjaw minn 3,67 x 10-10 sa 3,59 x 10-13 M) tal-E2 fi bwejriet duplikati.
|
Standard ta’ Referenza (Sejbien tal-Medda tal-Antagonisti)
|
15.
|
L-istandard referenzjarju hu taħlita tal-Ral (CASRN 84 449-90-1) u tal-E2 (CASRN 50-28-2). Ral/E2 rgħall-ittestjar tas-sejbien tal-medda hu msawwar minn dilwizzjoni serjali ta’ tliet konċentrazzjonijiet ta’ Ral (3,06 x 10-9, 7,67 x 10-10, u 1,92 x 10-10M) flimkien ma’ konċentrazzjoni fissa (9,18 × 10-11 M) ta’ E2 fi bwejriet duplikati.
|
Standard Referenzjarju (Inklużi l-Antagonisti)
|
16.
|
Ral/E2 għall-ittestjar komprensiv hu msawwar minn dilwizzjoni serjali ta’ 1:2 ta’ Ral (li tvarja minn 2,45x 10-8 sa 9,57 x 10-11M) flimkien ma’ konċentrazzjoni fissa (9,18 × 10-11 M) ta’ E2 li tikkonsisti f’disa’ konċentrazzjonijiet ta’ Ral/E2 fi bwejriet duplikati.
|
Kontroll Pożittiv Dgħajjef (Agonist)
|
17.
|
Il-kontroll pożittiv dgħajjef hu 9,06 x 10-6 M p,p’-metossiklor (metossiklor; CASRN 72-43-5) fl-EFM.
|
Kontroll Pożittiv Dgħajjef (Antagonist)
|
18.
|
Il-kontroll pożittiv dgħajjef jikkonsisti f’tamossifen (CASRN 10 540-29-1) 3,36 x 10-6 M b’9,18 × 10-11 M E2 fl-EFM.
|
Kontroll tal-E2 (Assaġġ tal-Antagonisti Biss)
|
19.
|
Il-kontroll tal-E2 hu 9,18 × 10-11 M E2 fl-EFM u jintuża bħala kontroll negattiv tal-linja bażi.
|
Induzzjoni tad-Drabi (Agonist)
|
20.
|
L-induzzjoni tal-attività ta’ luċiferażi tal-istandard referenzjarju (E2) titkejjel bid-diviżjoni tal-ogħla valur medju tal-RLU tal-istandard referenzjarju b’E2 bil-valur medju tal-RLU tal-kontroll bid-DMSO, u r-riżultat għandu jkun akbar minn erba’ darbiet.
|
Tnaqqis tad-Drabi (Antagonist)
|
21.
|
L-attività medja ta’ luċiferażi tal-istandard referenzjarju (Ral/E2) titkejjel bid-diviżjoni tal-ogħla valur medju tal-RLU tal-istandard referenzjarju b’Ral/E2 bil-valur medju tal-RLU tal-kontroll bid-DMSO, u għandu jkun akbar minn tliet darbiet.
Wiri tal-Profiċjenza tal-Laboratorju (ara l-paragrafu 14 u t-Tabelli 3 u 4 f’“KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER” ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar)
|
Veikolu
|
22.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu dissolti f’solvent li jissolubilizza s-sustanza kimika tat-test u li jitħallat mal-medium taċ-ċelloli. L-ilma, l-etanol (purità ta’ 95 % sa 100 %) u d-DMSO huma veikoli xierqa. Jekk jintuża d-DMSO, il-livell ma għandux jaqbeż il-1 % (v/v). Għal kwalunkwe veikolu, għandu jintwera li l-volum massimu użat mhuwiex ċitotossiku u ma jinterferixxix mat-twettiq tal-assaġġ. L-istandards referenzjarji u l-kontrolli jiġu dissolti f’solvent 100 % u mbagħad jiġi dilwiti f’konċentrazzjonijiet xierqa fl-EFM.
|
Preparazzjoni tas-Sustanzi kimiċi tat-test
|
23.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti fid-DMSO 100 % (jew solvent xieraq), u mbagħad jiġu dilwiti f’konċentrazzjonijiet xierqa fl-EFM. Is-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandhom jitħallew jekwilibraw f’temperatura ambjentali qabel ma jiġu dissolti u dilwiti. Is-soluzzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jitħejjew friski għal kull esperiment. Is-soluzzjonijiet ma għandux ikollhom preċipitat jew dardir notevoli. L-istokks ta’ standards referenzjarji u ta’ kontroll jistgħu jitħejjew bl-ingrossa; madankollu, l-istandard referenzjarju, id-dilwizzjonijiet ta’ kontroll u s-sustanzi kimiċi tat-test finali għandhom jitħejjew friski għal kull esperiment u jintużaw fi żmien 24 siegħa mit-tħejjija.
|
Solubbiltà u Ċitotossiċità: Kunsiderazzjonijiet għas-Sejbien tal-Medda
|
24.
|
L-ittestjar għas-sejbien tal-medda jikkonsisti f’dilwizzjonijiet serjali ta’ 1:10 b’seba’ punti mwettqa f’duplikati. Għall-ewwel, is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu ttestjati sal-konċentrazzjoni massima ta’ 1 mg/ml (~1 mM) għall-ittestjar tal-agonisti u ta’ 20 μg/ml (~10 μM) għall-ittestjar tal-antagonisti. Jintużaw esperimenti ta’ sejbien tal-medda biex jiġu determinati dawn li ġejjin:
|
|
—
|
Il-konċentrazzjonijiet tal-bidu tas-sustanza kimika tat-test li għandhom jintużaw matul l-ittestjar komprensiv
|
|
—
|
Id-dilwizzjonijiet (1:2 jew 1:5) tas-sustanza kimika tat-test li għandhom jintużaw matul l-ittestjar komprensiv
|
|
25.
|
Valutazzjoni tal-vijabbiltà/taċ-ċitotossiċità taċ-ċelloli hi inkluża fil-protokolli tal-assaġġ tal-agonisti u tal-antagonisti (7) u hi inkorporata fl-ittestjar għas-sejbien tal-medda u komprensiv. Il-metodu taċ-ċitotossiċità li ntuża biex tiġi vvalutata l-vijabbiltà taċ-ċelloli matul il-validazzjoni tat-TA tal-ER VM7Luc (1) kien metodu ta’ osservazzjoni viżwali kwalitattiva skalat; madankollu, jista’ jintuża metodu kwantitattiv għad-determinazzjoni taċ-ċitotossiċità (ara l-protokoll (7)). Ma tistax tintuża data minn konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test li jikkawżaw tnaqqis akbar minn 20 % fil-vijabbiltà.
|
Esponiment għas-Sustanza Kimika tat-Test u Organizzazzjoni tal-Pjastra tal-Assaġġ
|
26.
|
Iċ-ċelloli jingħaddu u jitqiegħdu fi pjastri tal-koltura tat-tessuti b’96 bwejra (2 x 105 ċelloli għal kull bwejra) f’EFM u jiġu inkubati għal 24 siegħa biex iċ-ċelloli jitħallew jaqbdu mal-pjastra. L-EFM jitneħħa u jiġi sostiwit bis-sustanzi kimiċi tat-test u ta’ referenza fl-EFM u jiġi inkubat għal 19-24 siegħa. Se jkollhom jiġu applikati kunsiderazzjonijiet speċjali għal dawk is-sustanzi li jkunu volatili ħafna peress li l-bwejriet tal-kontroll fil-viċin jistgħu jiġġeneraw riżultati pożittivi foloz. F’każjiet bħal dawn, “siġillanti tal-pjastri” jistgħu jgħinu biex effettivament jiżolaw il-bwejriet individwali matul l-ittestjar, u għalhekk huma rakkomandati.
|
Testijiet ta’ Sejbien tal-Medda
|
27.
|
L-ittestjar tas-sejbien tal-medda juża l-bwejriet kollha tal-pjastra b’96 bwejra biex jittestja sa sitt sustanzi kimiċi tat-test bħala dilwizzjonijiet serjali 1:10 b’seba’ punti f’duplikat (ara l-Figuri 1 u 2).
|
|
—
|
L-ittestjar tas-sejbien tal-medda tal-agonisti juża erba’ konċentrazzjonijiet ta’ E2 f’duplikat bħala l-istandard referenzjarju u erba’ bwejriet replikati għall-kontroll bid-DMSO.
|
|
—
|
L-ittestjar tas-sejbien tal-medda tal-antagonisti juża tliet konċentrazzjonijiet ta’ Ral/E2 b’9,18 × 10-11 M E2 f’duplikat bħala l-istandard referenzjarju bi tliet bwejriet replikati għall-kontrolli b’E2 u bid-DMSO.
|
Figura 1
Tifsila tal-Pjastra b’96 bwejra għat-Test tas-Sejbien tal-Medda tal-Agonisti
Abbrevjazzjonijiet: E2-1 sa E2-4 = konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju b’E2 (minn għoljin sa baxxi); TC1-1 sa TC1-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 1 (TC1); TC2-1 sa TC2-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 2 (TC2); TC3-1 sa TC3-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 3 (TC3); TC4-1 sa TC4-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 4 (TC4); TC5-1 sa TC5-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 5 (TC5); TC6-1 sa TC6-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 6 (TC6); VC = kontroll b’veikolu (DMSO [1 % v/v EFM.]).
Figura 2
Tifsila tal-Pjastra b’96 bwejra għat-Test tas-Sejbien tal-Medda tal-Antagonisti
Abbrevjazzjonijiet: E2 = kontroll b’E2; Ral-1 sa Ral-3 = konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju b’Raloksifen/E2 (minn għoljin sa baxxi); TC1-1 sa TC1-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 1 (TC1); TC2-1 sa TC2-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 2 (TC2); TC3-1 sa TC3-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 3 (TC3); TC4-1 sa TC4-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 4 (TC4); TC5-1 sa TC5-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 5 (TC5); TC6-1 sa TC6-7 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 6 (TC6); VC = kontroll b’veikolu (DMSO [1 % v/v EFM.]).
Nota: Is-sustanzi kimiċi tat-test kollha jiġu ttestjati fil-preżenza ta’ 9,18 × 10-11 M E2.
|
28.
|
Il-volum finali rakkomandat tal-media meħtieġ għall kull bwejra hu ta’ 200 μl. Uża biss pjastri tat-test li fihom iċ-ċelloli fil-bwejriet kollha jagħtu vijabbiltà ta’ 80 % u aktar.
|
|
29.
|
Id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-bidu għall-ittestjar komprensiv tal-
agonisti
hi deskritta fid-dettall fil-protokoll tal-agonisti (7). Fil-qosor, jintużaw il-kriterji li ġejjin:
|
|
—
|
Jekk ma jkun hemm ebda punt fil-kurva tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li jkun akbar mill-medja flimkien ma’ tliet darbiet id-devjazzjoni standard tal-kontroll bid-DMSO, l-ittestjar komprensiv isir bl-użu ta’ dilwizzjoni serjali 1:2 bi 11-il punt li tibda bil-konċentrazzjoni solubbli massima.
|
|
—
|
Jekk ikun hemm punti fil-kurva tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li jkunu akbar mill-medja flimkien ma’ tliet darbiet id-devjazzjoni standard tal-kontroll bid-DMSO, il-konċentrazzjoni tal-bidu li tkun se tintuża għall-iskema ta’ dilwizzjoni bi 11-il punt f’ittestjar komprensiv għandha tkun log ogħla mill-konċentrazzjoni li tagħti l-ogħla valur aġġustat tal-RLU fis-sejbien tal-medda. L-iskema ta’ dilwizzjoni bi 11-il punt se tkun ibbażata fuq dilwizzjonijiet 1:2 jew 1:5 skont il-kriterji li ġejjin:
|
Għandha tintuża dilwizzjoni serjali 1:2 bi 11-il punt jekk il-medda ta’ konċentrazzjoni li tirriżulta tkopri l-medda sħiħa ta’ risponsi fuq il-bażi tal-kurva ta’ rispons tal-konċentrazzjoni ġenerata fit-test tas-sejbien tal-medda. Inkella, uża dilwizzjoni ta’ 1:5.
|
|
|
—
|
Jekk sustanza kimika tat-test turi kurva konċentrazzjoni rispons bifażika fit-test tas-sejbien tal-medda, iż-żewġ fażijiet għandhom ikunu solvuti fl-ittestjar komprensiv ukoll.
|
|
30.
|
Id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-bidu għall-ittestjar komprensiv tal-
antagonisti
hi deskritta fid-dettall fil-protokoll tal-antagonisti (7). Fil-qosor, jintużaw il-kriterji li ġejjin:
|
|
—
|
Jekk ma jkun hemm ebda punt fil-kurva tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li jkun anqas mill-medja nieqes tliet darbiet id-devjazzjoni standard tal-kontroll b’E2, l-ittestjar komprensiv isir bl-użu ta’ dilwizzjoni serjali 1:2 bi 11-il punt li tibda bil-konċentrazzjoni solubbli massima.
|
|
—
|
Jekk ikun hemm punti fil-kurva tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li jkunu anqas mill-medja nieqes tliet darbiet id-devjazzjoni standard tal-kontroll b’E2, il-konċentrazzjoni tal-bidu li tkun se tintuża għall-iskema ta’ dilwizzjoni bi 11-il punt f’ittestjar komprensiv għandha tkun waħda minn dawn li ġejjin:
|
—
|
Il-konċentrazzjoni li tagħti l-anqas valur aġġustat tal-RLU fis-sejbien tal-medda
|
|
—
|
Il-konċentrazzjoni solubbli massima (Ara l-protokoll tal-antagonisti (7), Figura 14-2)
|
|
—
|
L-anqas konċentrazzjoni ċitotossika (Ara l-protokoll tal-antagonisti (7), Figura 14-3 għal eżempju relatat)
|
|
|
—
|
L-iskema ta’ dilwizzjoni bi 11-il punt se tkun ibbażata fuq serjali jew dilwizzjoni ta’ 1:2 jew 1:5 skont il-kriterji li ġejjin:
|
Għandha tintuża dilwizzjoni serjali 1:2 bi 11-il punt jekk il-medda ta’ konċentrazzjoni li tirriżulta tkopri l-medda sħiħa ta’ risponsi fuq il-bażi tal-kurva ta’ rispons tal-konċentrazzjoni ġenerata fit-test tas-sejbien tal-medda. Inkella għandha tintuża dilwizzjoni ta’ 1:5.
|
|
Testijiet Komprensivi
|
31.
|
L-ittestjar komprensiv jikkonsisti f’dilwizzjonijiet serjali bi 11-il punt (dilwizzjonijiet serjali ta’ 1:2 jew 1:5 fuq il-bażi tal-konċentrazzjoni tal-bidu għall-kriterji ta’ ttestjar komprensiv) b’kull konċentrazzjoni ttestjata fi bwejriet triplikati tal-pjastra b’96 bwejra (ara l-Figuri 3 u 4).
|
|
—
|
L-ittestjar komprensiv tal-agonisti juża 11-il konċentrazzjoni ta’ E2 f’duplikat bħala l-istandard referenzjarju. Erba’ bwejriet replikati għal-kontroll bid-DMSO u erba’ bwejriet repliki għall-kontroll b’metossiklor (9,06 x 10-6 M) jiġu inklużi f’kull pjastra.
|
|
—
|
L-ittestjar komprensiv tal-antagonisti juża disa’ konċentrazzjonijiet ta’ Ral/E2 b’9,18 × 10-11 M E2 f’duplikat bħala l-istandard referenzjarju, b’erba’ bwejriet repliki għall-kontroll b’E2 9,18 x 10-11 M, erba’ bwejriet repliki għall-kontrolli bid-DMSO, u erba’ bwejriet repliki għat-tamossifen 3,36 x 10-6M.
|
Figura 3
Tifsila tal-Pjastra b’96 bwejra għat-Test Komprensiv tal-Agonisti
Abbrevjazzjonijiet: TC1-1 sa TC1-11 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 1; TC2-1 sa TC2-11 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 2; E2-1 sa E2-11 = konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju b’E2 (minn għoljin sa baxxi); Met = kontroll pożittiv dgħajjef b’p,p’ metossiklor; VC = kontroll b’veikolu tal-EFM bid-DMSO (1 % v/v)
Figura 4
Tifsila tal-Pjastra b’96 bwejra għat-Test Komprensiv tal-Antagonisti
Abbrevjazzjonijiet: E2 = kontroll b’E2; Ral-1 sa Ral-9 = konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju b’Raloksifen/E2 (minn għoljin sa baxxi); Tam = kontroll pożittiv dgħajjef b’Tamossifen/E2; TC1-1 sa TC1-11 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 1 (TC1); TC2-1 sa TC2-11 = konċentrazzjonijiet (minn għoljin sa baxxi) tas-sustanza kimika tat-test 2 (TC2); VC = kontroll b’veikolu (DMSO [1 % v/v EFM.]).
Nota: Kif innotat, kull bwejra ta’ referenza u tat-test ikun fiha konċentrazzjoni fissa ta’ E2 (9,18 x 10-11M)
|
32.
|
Testijiet komprensivi ripetuti għall-istess sustanza kimika għandhom jitwettqu f’jiem differenti, biex tiġi żgurata indipendenza. Tal-anqas għandhom isiru żewġ testijiet komprensivi. Jekk ir-riżultati tat-testijiet jikkontradixxu lil xulxin (eż. test minnhom ikun pożittiv, u l-ieħor negattiv), jew jekk wieħed mit-testijiet ikun inadegwat, għandu jsir it-tielet test addizzjonali.
|
Kejl tal-Luminexxenza
|
33.
|
Il-luminexxenza titkejjel fil-medda ta’ 300 sa 650 nm, bl-użu ta’ luminometru tal-injezzjoni u b’softwer li jikkontrolla l-volum tal-injezzjoni u l-intervall tal-kejl (7). L-emissjoni tad-dawl minn kull bwejra hi espressa bħala RLU għal kull bwejra.
|
ANALIŻI TAD-DATA
Determinazzjoni tal-EC50 /IC50
|
34.
|
Il-valur tal-EC50 (il-konċentrazzjoni effettiva medjana ta’ sustanza kimika tat-test [agonisti]) u l-valur tal-IC50 (il-konċentrazzjoni inibitorja medjana ta’ sustanza kimika tat-test [antagonisti]) huma determinati mid-data dwar ir-rispons għall-konċentrazzjoni. Għal sustanzi kimiċi tat-test li huma pożittivi f’waħda mill-konċentrazzjonijiet jew aktar, il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tikkawża rispons medjana (IC50 jew EC50) hi kkalkolata bl-użu ta’ analiżi tal-funzjoni Hill jew ta’ alternattiva xierqa. Il-funzjoni Hill hi mudell matematiku loġistiku b’erba’ parametri relatat mal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test mar-rispons (tipikament skont kurva sigmojde) bl-użu tal-ekwazzjoni ta’ hawn taħt:
|
Fejn:
Y= rispons (jiġifieri RLUs);
X= il-logaritmu tal-konċentrazzjoni;
Il-qiegħ= ir-rispons minimu;
Il-quċċata= ir-rispons massimu;
lg EC50 (jew lg IC50)= il-logaritmu ta’ X bħala n-nofs tar-rispons bejn il-Quċċata u l-Qiegħ;
Hillslope= il-gradjent tal-kurva.
Il-mudell jikkalkola liema huma l-aktar xierqa għall-parametri tal-Quċċata, tal-Qiegħ, tal-Hillslope, u tal-IC50 u tal-EC50. Għall-kalkolu tal-valuri tal-EC50 u tal-IC50, għandu jintuża softwer statistiku xieraq (eż. softwer statistiku Graphpad PrismR).
Determinazzjoni tal-Eċċezzjonijiet Estremi
|
35.
|
Ġudizzju statistiku tajjeb jista’ jiġi ffaċilitat billi jiġi inkluż it-test-Q (iżda mhux limitat għalih biss) (ara l-protokolli tal-agonisti u tal-antagonisti (7) għad-determinazzjoni ta’ bwejriet “mhux utilizzabbli” li se jiġu esklużi mill-analiżi tad-data.
|
|
36.
|
Għal repliki tal-istandard referenzjarju b’E2 (daqs ta’ tnejn tal-kampjun), kwalunkwe valur aġġustat tal-RLU għal replika f’konċentrazzjoni partikolari ta’ E2 jitqies eċċezzjoni estrema jekk il-valur tiegħu jkun aktar minn 20 % aktar jew anqas mill-valur tal-RLU aġġustat għal dik il-konċentrazzjoni fil-bażi ta’ data storika.
|
Il-Ġbir u l-Aġġustament tad-Data tal-Luminometru għall-Ittestjar tas-Sejbien tal-Medda
|
37.
|
Id-data mhux proċessata mil-luminometru għandha tiġi trasferita fi spreadsheet mudell imfassla għall-assaġġ. Għandu jiġi determinat jekk hemmx punti ta’ data li jkunu eċċezzjonijiet estremi li jridu jitneħħew. (Ara l-Kriterji ta’ Aċċettazzjoni tat-Test għal parametri li huma determinati fl-analiżijiet). Għandhom isiru l-kalkoli li ġejjin:
|
Agonist
|
Stadju 1
|
Ikkalkola l-valur medju għall-kontroll b’veikolu (VC) DMSO.
|
|
Stadju 2
|
Naqqas il-valur medju tal-VC DMSO mill-valur ta’ kull bwejra biex tinnormalizza d-data.
|
|
Stadju 3
|
Ikkalkola l-induzzjoni medja tad-drabi għall-istandard referenzjarju (E2).
|
|
Stadju 4
|
Ikkalkola l-valur medju tal-EC50 għas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
Antagonist
|
Stadju 1
|
Ikkalkola l-valur medju għall-VC DMSO.
|
|
Stadju 2
|
Naqqas il-valur medju tal-VC DMSO mill-valur ta’ kull bwejra biex tinnormalizza d-data.
|
|
Stadju 3
|
Ikkalkola t-tnaqqis medju tad-drabi għall-istandard referenzjarju (Ral/E2).
|
|
Stadju 4
|
Ikkalkola l-valur medju għall-istandard referenzjarju b’E2.
|
|
Stadju 5
|
Ikkalkola l-valur medju tal-IC50 għas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
Il-Ġbir u l-Aġġustament tad-Data tal-Luminometru għall-Ittestjar Komprensiv
|
38.
|
Data mhux proċessata mil-luminometru għandha tiġi trasferita fi spreadsheet mudell imfassla għall-assaġġ. Għandu jiġi determinat jekk hemmx punti ta’ data li jkunu eċċezzjonijiet estremi li jridu jitneħħew. (Ara l-Kriterji ta’ Aċċettazzjoni tat-Test għal parametri li huma determinati fl-analiżijiet). Isiru l-kalkoli li ġejjin:
|
Agonist
|
Stadju 1
|
Ikkalkola l-valur medju għall-VC DMSO.
|
|
Stadju 2
|
Naqqas il-valur medju tal-VC DMSO mill-valur ta’ kull bwejra biex tinnormalizza d-data.
|
|
Stadju 3
|
Ikkalkola l-induzzjoni medja tad-drabi għall-istandard referenzjarju (E2).
|
|
Stadju 4
|
Ikkalkola l-valur medju tal-EC50 għall-E2 u għas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
Stadju 5
|
Ikkalkola l-valur medju aġġustat tal-RLU għall-metossiklor.
|
Antagonist
|
Stadju 1
|
Ikkalkola l-valur medju għall-VC DMSO.
|
|
Stadju 2
|
Naqqas il-valur medju tal-VC DMSO mill-valur ta’ kull bwejra biex tinnormalizza d-data.
|
|
Stadju 3
|
Ikkalkola l-induzzjoni medja tad-drabi għall-istandard referenzjarju (Ral/E2).
|
|
Stadju 4
|
Ikkalkola l-valur medju tal-IC50 għall-Ral/E2 u għas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
Stadju 5
|
Ikkalkola l-valur medju aġġustat tal-RLU għat-tamossifen.
|
|
Stadju 6
|
Ikkalkola l-valur medju għall-istandard referenzjarju b’E2.
|
Il-Kriterji ta’ Interpretazzjoni tad-Data
|
39.
|
It-TA tal-ER VM7Luc hu maħsub bħala parti minn approċċ tal-piż tal-evidenza biex jgħin fil-prijoritizzazzjoni tas-sustanzi għall-ittestjar tal-ED in vivo. Parti minn din il-proċedura ta’ prijoritizzazzjoni se tkun il-klassifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bħala pożittiva jew negattiva għall-attività agonista jew antagonista tal-ER. Il-kriterji ta’ deċiżjoni pożittiva u negattiva użati fl-istudju ta’ validazzjoni tat-TA tal-ER VM7Luc huma deskritti fit-Tabella 1.
|
Tabella 1
Kriterji ta’ Deċiżjoni Pożittiva u Negattiva
|
|
|
ATTIVITÀ AGONISTA
|
|
Pożittiva
|
|
—
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test kollha klassifikati bħala pożittivi għal attività agonista tal-ER għandu jkollhom kurva konċentrazzjoni-rispons li tikkonsisti f’linja bażi, segwita minn pendil pożittiv, u li tikkonkludi fi plateau jew f’quċċata. F’xi każijiet, tnejn biss minn dawn il-karatteristiċi (linja bażi–pendil jew pendil–quċċata) ikunu jistgħu jiġu definiti.
|
|
—
|
Il-linja li tiddefinixxi l-pendil pożittiv għandu jkun fiha tal-anqas tliet punti bi żbarri ta’ errur mhux imrikkba (medja ± SD). Il-punti li jifformaw il-linja bażi huma esklużi, iżda l-parti lineari tal-kurva tista’ tinkludi l-quċċata jew l-ewwel punt tal-plateau.
|
|
—
|
Klassifikazzjoni pożittiva teħtieġ amplitudni tar-rispons, id-differenza bejn il-linja bażi u l-quċċata, ta’ tal-anqas 20 % tal-valur massimali għall-istandard referenzjarju, E2 (jiġifieri 2000 RLU jew aktar meta l-valur tar-rispons massimali tal-istandards referenzjarji [E2] ikun aġġustat għal 10,000 RLU).
|
|
—
|
Jekk possibbli, valur tal-EC50 għandu jiġi kkalkolat għal kull sustanza kimika tat-test pożittiva.
|
|
|
Negattiv
|
L-RLU aġġustata medja għal konċentrazzjoni partikolari tkun fil-livell tal-valur medju tal-RLU tal-kontroll bid-DMSO flimkien ma’ tliet darbiet id-devjazzjoni standard tal-RLU bid-DMSO jew aktar.
|
|
Inadegwata
|
Data li ma tistax tiġi interpretata bħala valida għall-wiri tal-preżenza jew tal-assenza tal-attività minħabba limitazzjonijiet kwalitattivi jew kwantitattivi kbar titqies inadegwata u ma tistax tintuża biex jiġi determinat jekk is-sustanza kimika tat-test hix pożittiva jew negattiva. Is-sustanzi kimiċi għandhom jerġgħu jiġu ttestjati.
|
|
|
|
ATTIVITÀ ANTAGONISTA
|
|
Pożittiva
|
|
—
|
Id-data dwar is-sustanza kimika tat-test tipproduċi kurva konċentrazzjoni rispons li tikkonsisti f’linja bażi, li tkun segwita minn pendil negattiv.
|
|
—
|
Il-linja li tiddefinixxi l-pendil negattiv għandu jkun fiha tal-anqas tliet punti bi żbarri ta’ errur mhux imrikkba; punti li jifformaw il-linja bażi huma esklużi, iżda l-parti lineari tal-kurva tista’ tinkludi l-ewwel punt tal-plateau.
|
|
—
|
Għandu jkun hemm tnaqqis ta’ tal-anqas 20 % fl-attività mill-valur massimali għall-istandard referenzjarju, Ral/E2 (jiġifieri 8 000 RLU jew anqas meta l-valur tar-rispons massimali tal-istandard referenzjarju [Ral/E2] ikun aġġustat għal 10,000 RLU).
|
|
—
|
L-ogħla konċentrazzjonijiet mhux ċitotossiċi tas-sustanza kimika tat-test għandhom ikunu ekwivalenti għal 1x10-5 M jew anqas.
|
|
—
|
Jekk possibbli, valur tal-IC50 għandu jiġi kkalkolat għal kull sustanza kimika tat-test pożittiva.
|
|
|
Negattiva
|
Il-punti tad-data kollha huma ogħla mill-valur tal-EC80 (80 % tar-rispons tal-E2, jew 8 000 RLUs), f’konċentrazzjonijiet anqas minn 1,0 x 10-5 M.
|
|
Inadegwata
|
Id-data li ma tistax tiġi interpretata bħala valida għall-wiri tal-preżenza jew tal-assenza tal-attività minħabba limitazzjonijiet kwalitattivi jew kwantitattivi kbar titqies inadegwata u ma tistax tintuża biex jiġi determinat jekk is-sustanza kimika tat-test hix pożittiva jew negattiva. Is-sustanza kimika għandha terġa’ tiġi ttestjata.
|
|
40.
|
Ir-riżultati pożittivi jiġu karatterizzati kemm mill-kobor tal-effett kif ukoll mill-konċentrazzjoni li fiha jseħħ l-effett, fejn possibbli. L-eżempji ta’ data pożittiva, negattiva u inadegwata huma murija fil-Figuri 5 u 6.
|
Figura 5
Eżempji ta’ Agonisti: Data Pożittiva, Negattiva u Inadegwata
Linja ttikkjata tindika 20 % tar-rispons tal-E2, 2000 RLU aġġustati u normalizzati.
Figura 6
Eżempji ta’ Antagonisti: Data Pożittiva, Negattiva u Inadegwata
Linja ttikkjata tindika 80 % tar-rispons tal-Ral/E2, 8 000 RLU aġġustati u normalizzati.
Linja solida tinidka 1,00 x 10-5 M. Biex rispons jitqies pożittiva, għandu jkun anqas mil-linja tat-8 000 RLU, u f’konċentrazzjonijiet ta’ anqas minn 1,00 x 10-5M.
Il-konċentrazzjonijiet b’asterisk fil-graff mesoeżestrol jindikaw punteġġi ta’ vijabbiltà ta’ “2” jew aktar.
Ir-riżultati tat-test għall-mesoeżestrol huma meqjusa data inadegwata għaliex l-uniku rispons li hu anqas minn 8,000 RLU iseħħ f’1,00 x 10-5M.
|
41.
|
Il-kalkoli tal-EC50 u tal-IC50 jistgħu jsiru bl-użu ta’ Funzjoni Hill b’erba’ parametri (ara l-protokoll tal-agonisti u l-protokoll tal-antagonisti għal aktar dettalji (7)). L-ilħuq tal-kriterji ta’ aċċettabbiltà jindika li s-sistema qed topera kif suppost, iżda ma jiżgurax li kwalunkwe sessjoni partikolari tipproduċi data preċiża. Id-duplikazzjoni tar-riżultati tal-ewwel sessjoni hi l-aħjar garanzija li tkun ġiet prodotta data preċiża (ara l-paragrafu 19 tal-“KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER”).
|
RAPPORT TAT-TEST
|
42.
|
Ara l-paragrafu 20 ta’ “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER”.
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
ICCVAM. (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.
|
|
(2)
|
Monje P., Boland R. (2001). Subcellular Distribution of Native Estrogen Receptor α and β Isoforms in Rabbit Uterus and Ovary, J. Cell Biochem., 82(3): 467-479.
|
|
(3)
|
Pujol P., et al. (1998). Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer Res., 58(23): 5 367-5 373.
|
|
(4)
|
Weihua Z., et al. (2000). Estrogen Receptor (ER) β, a Modulator of ERα in the Uterus, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(11): 936-5 941.
|
|
(5)
|
Balls M., et al. (2006). The Importance of Good Cell Culture Practice (GCCP), ALTEX, 23(Suppl): p. 270-273.
|
|
(6)
|
Coecke S., et al. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice: a Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, Alternatives to Laboratory Animals, 33: p. 261-287.
|
|
(7)
|
ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report, The LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals, NIH Publication No 11-7 850.
|
|
(8)
|
Rogers J.M., Denison M.S. (2000). Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals, In Vitro Mol. Toxicol.,13(1):67-82.
|
|
(9)
|
Escande A., et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol., 71(10):1 459-69.
|
|
(10)
|
Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology, Chemistry and Biology,17(6):646-57.
|
|
(11)
|
Kuiper G.G, et al. (1998). Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta, Endocrinology,139(10):4 252-63.
|
|
(12)
|
Geisinger, et al. (1989). Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors, Cancer 63, 280-288.
|
|
(13)
|
Baldwin, et al. (1998). BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 34, 649-654.
|
|
(14)
|
Li, Y., et al. (2014). Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant, Mol. Endo. 28, 2072-2081.
|
|
(15)
|
Rogers, J.M. u Denison, M.S. (2000). Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors:development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenicand anti-estrogenic chemicals, In Vitro & Molec. Toxicol. 13, 67-82.
|
Appendiċi 4
ASSAĠĠ TA’ TRANSATTIVAZZJONI TAR-RIĊETTUR-Α TAL-ESTROĠENU UMAN TRANSFETTAT B’MOD STABBLI GĦAD-DETEZZJONI TA’ ATTIVITÀ AGONISTA U ANTAGONISTA TA’ SUSTANZI KIMIĊI BL-UŻU TAL-LINJA TA’ ĊELLOLI ERΑ CALUX
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
1.
|
L-assaġġ tat-transattivazzjoni tal-ERα CALUX juża l-linja ta’ ċelloli umana U2Os biex jindividwa attività agonista u antagonista estroġenika medjata permezz tar-riċettur alfa tal-estroġenu uman (hERα). L-istudju ta’ validazzjoni tal-bijoassaġġ ERα CALUX transfettat b’mod stabbli minn BioDetection Systems BV (Amsterdam, in-Netherlands) wera r-rilevanza u l-affidabbiltà tal-assaġġ għall-iskop maħsub tiegħu (1). Il-linja ta’ ċelloli ERα CALUX tesprimi ERα uman transfettat b’mod stabbli biss (2)(3).
|
|
2.
|
Dan l-assaġġ hu mfassal b’mod speċifiku biex jindividwa transattivazzjoni medjata minn hERα billi jkejjel il-bijoluminexxenza bħala l-punt ta’ tmiem. L-użu tal-bijoluminexxenza jintuża spiss fil-bijoassaġġi minħabba l-proporzjon għoli ta’ sinjal għal storbju (4).
|
|
3.
|
Konċentrazzjonijiet ta’ fitoestrġenu ogħla minn 1 μM ġew rapportati li jattivaw b’mod eċċessiv il-ġene indikatur tal-luċiferażi, li jirriżulta f’luminexxenza medjata mhux minn riċettur (5) (6) (7). Għaldaqstant, konċentrazzjonijiet ogħla ta’ fitoestroġeni jew ta’ komposti simili oħra li jistgħu jattivaw b’mod eċċessiv l-espressjoni ta’ luċiferażi, iridu jiġu eżaminati bir-reqqa f’assaġġi ta’ transattivazzjoni tal-ER transfettati b’mod stabbli (ara l-Appendiċi 2).
|
|
4.
|
Għandhom jinqraw “INTRODUZZJONI ĠENERALI” u “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER” qabel ma dan l-assaġġ jintuża għal finijiet regolatorji. Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma deskritti fl-Appendiċi 1.
|
PRINĊIPJU TAL-ASSAĠĠ (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
5.
|
Il-bijoassaġġ jintuża biex jivvaluta l-irbit tal-ligand tal-ER u t-traslokazzjoni sussegwenti tal-kumpless riċettur-ligand għan-nukleu. Fin-nukleu, il-kumpless riċettur-ligand jillega elementi speċifiċi ta’ rispons tad-DNA u jittransattiva ġene indikatur tal-luċiferażi tal-firefly, li jirriżulta f’espressjoni ċellolari miżjuda tal-enzima luċiferażi. Wara ż-żieda tas-substrat tal-luċiferażi, il-luċiferina, il-luċiferina tiġi trasformata fi prodott bijoluminexxenti. Id-dawl prodott faċilment jista’ jiġi individwat u kwantifikat bl-użu ta’ luminometru.
|
|
6.
|
Is-sistema tat-test tuża ċelloli CALUX ERα transfettati b’mod stabbli. Iċ-ċelloli CALUX ERα oriġinaw mil-linja ta’ ċelloli osteosarkoma osteoblastika umana U2OS. Iċ-ċelloli U2OS umani ġew transfettati b’mod stabbli bi 3xHRE-TATA-Luc u b’pSG5-neo-hERα bl-użu ta’ metodu ta’ kopreċipitazzjoni tal-fosfat tal-kalċju. Il-linja ta’ ċelloli tal-U2OS intgħażlet bħala l-aħjar kandidat biex isservi bħala l-linja ta’ ċelloli indikatur risponsiva tal-estroġenu (u ta’ ormon ieħor ta’ sterojde), fuq il-bażi tal-osservazzjoni li l-linja ta’ ċelloli U2OS ftit li xejn uriet attività ta’ riċettur endoġenu jew l-ebda attività affattu. L-assenza ta’ riċetturi endoġeni ġiet ivvalutata bl-użu ta’ plażmidi indikaturi tal-luċiferażi biss, li ma wrew ebda attività meta żdiedu l-ligandi tar-riċettur. Barra minn hekk, din il-linja ta’ ċelloli sostniet risponsi b’saħħithom medjati bl-ormoni meta ġew introdotti b’mod tranżjenti r-riċetturi konjati (2) (3) (8).
|
|
7.
|
L-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi għal attività estroġenika jew antiestroġenika bl-użu tal-linja ta’ ċelloli CALUX ERα jinkludi sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar u sessjonijiet komprensivi. Matul is-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar, jiġu determinati s-solubbiltà, iċ-ċitotossiċità u medda ta’ konċentrazzjoni rfinuta ta’ sustanzi kimiċi tat-test għall-ittestjar komprensiv. Matul is-sessjonijiet komprensivi, il-meded ta’ konċentrazzjoni rfinuti tas-sustanzi kimiċi tat-test jiġu ttestjati fil-bijoassaġġi ERα CALUX segwiti mill-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-agoniżmu jew għall-antagoniżmu.
|
|
8.
|
Il-kriterji għall-interpretazzjoni tad-data huma deskritti fid-dettall fil-paragrafu 59. Fil-qosor, sustanza kimika tat-test titqies pożittiva għall-agoniżmu f’każ li tal-anqas żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi tas-sustanza kimika tat-test juru rispons li jkun ekwivalenti għal 10 % jew ogħla minn 10 % tar-rispons massimu tal-istandard referenzjarju 17β-estradjol (PC10). Sustanza kimika tat-test titqies pożittiva għall-antagoniżmu f’każ li tal-anqas żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi tas-sustanza kimika tat-test juru rispons li jkun ekwivalenti għal 80 % jew anqas minn 10 % tar-rispons massimu tal-istandard referenzjarju tamossifen (PC80).
|
PROĊEDURA
Linji ta’ ċelloli
|
9.
|
Il-linja ta’ ċelloli trasferita b’mod stabbli U2OS ERα CALUX għandha tintuża għall-assaġġ. Il-linja ta’ ċelloli tista’ tinkiseb mingħand BioDetection Systems BV, Amsterdam, in-Netherlands bi ftehim ta’ liċenzjar tekniku.
|
|
10.
|
Għandhom jintużaw kolturi ta’ ċelloli ħielsa minn mikoplażma biss. Il-lottijiet taċ-ċelloli użati għandhom ikunu ċċertifikati negattivi għall-kontaminazzjoni bil-mikoplażma, jew inkella għandu jsir test tal-mikoplażma qabel l-użu. Għandu jintuża RT-PCR (Reazzjoni Katina bil-Polimerażi f’Ħin Reali) għad-detezzjoni sensittiva ta’ infezzjoni tal-mikoplażma (9).
|
Stabbiltà tal-linja ta’ ċelloli
|
11.
|
Biex jinżammu l-istabbiltà u l-integrità taċ-ċelloli CALUX, iċ-ċelloli għandhom jinħażnu f’nitroġenu likwidu (-800C). Wara li ċ-ċelloli jitħallew jinħallu biex tinbeda koltura ġdida, iċ-ċelloli għandhom jiġu subkolturati tal-anqas darbtejn qabel ma jintużaw għall-valutazzjoni tal-attività agonista u antagonista estroġenika tas-sustanzi kimiċi. Iċ-ċelloli ma għandhomx jiġu subkolturati għal aktar minn 30 passaġġ.
|
|
12.
|
Biex tiġi ssorveljata l-istabbiltà tal-linja ta’ ċelloli maż-żmien, ir-risponsività tas-sistema tat-test agonistika u antagonistika għandha tiġi verifikata bl-evalwazzjoni tal-EC50 jew tal-IC50 tal-istandard referenzjarju. Barra minn hekk, l-induzzjoni relattiva tal-kampjun tal-kontroll pożittiv (PC) u tal-kampjun tal-kontroll negattiv (NC) għandha tiġi ssorveljata. Ir-riżultati għandhom ikunu jaqblu mal-kriterji ta’ aċċettazzjoni għall-bijoassaġġ ERα CALUX agonistiku (Tabella 3C) jew antagonistiku (Tabella 4C). L-istandards referenzjarji, il-kontrolli pożittivi u dawk negattivi huma mogħtija fit-Tabella 1 u fit-Tabella 2 għall-modalità agonistika u dik antagonistika rispettivament.
|
Koltura taċ-Ċelloli u kundizzjonijiet tal-pjastrament
|
13.
|
Iċ-ċelloli U2OS għandhom jiġu kolturati f’medium tat-tkabbir (DMEM/F12 (1:1) b’fenol aħmar bħala indikatur tal-pH, suppimentat b’serum bovin fetali (7,5 %), amminoaċidi mhux essenzjali (1 %), 10 Unitajiet/ml peniċillina, sterptomiċina u ġenetiċina (G-418) bħala markatur tal-għażla). Iċ-ċelloli għandhom jitqiegħdu f’inkubatur tas-CO2 (5 % CO2) f’370C u f’100 % umdità. Meta ċ-ċelloli jilħqu konfluwenza ta’ 85-95 %, iċ-ċelloli għandhom jiġu subkolturati jew jitħejjew għaż-żriegħ fi pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra. Fil-każ imsemmi l-aħħar, iċ-ċelloli għandhom jerġgħu jiġu sospiżi f’1x105 ċelloli/ml f’medium tal-assaġġ ħieles minn estroġenu (medium DMEM/F12 (1:1) mingħajr fenol aħmar, supplimentat b’serum bovin fetali trattat bil-Faħam Miksi bid-Dekstran (5 % v/v), b’amminoaċidi mhux essenzjali (1 % v/v), b’10 Units/ml ta’ peniċillinau streptomiċina) u jiġu pjastrati fil-bwejriet tal-pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra (sospensjoni ta’ 100 μl ċelloli omoġenizzati). Iċ-ċelloli għandhom jiġu inkubati minn qabel f’inkubatur tas-CO2 (5 % CO2, 370C, 100 % umdità) għal 24 siegħa qabel l-esponiment. L-oġġetti tal-plastik għandhom ikunu ħielsa minn estroġenu.
|
Kriterji ta’ aċċettabbiltà
|
14.
|
L-attivitajiet agonistiċi u antagonistiċi tas-sustanza/i kimika/kimiċi tat-test jiġu ttestjati f’serje ta’ testijiet. Serje ta’ testijiet tikkonsisti f’massimu ta’ sitt pjastri għall-mikrotitraġġ. Kull serje ta’ testijiet fiha tal-anqas serje waħda sħiħa ta’ dilwizzjonijiet ta’ standard referenzjarju, kampjun tal-kontroll pożittiv, kampjun tal-kontroll negattiv u kontrolli b’solvent. Il-Figuri 1 u 2 jagħtu l-kompożizzjoni tal-pjastri għas-serje tat-testijiet agonistiċi u antagonistiċi.
|
|
15.
|
Kull dilwizzjoni tal-istandards ta’ refernza, tas-sustanzi kimiċi tat-test, tal-kontrolli b’solvent kollha, u tal-kontrolli pożittivi u negattivi għandha tiġi analizzata fi triplikat. Kull waħda mill-analiżijiet tat-triplikat għandha tissodisfa r-rekwiżiti mogħtija fit-Tabella 3A u fit-Tabella 4A.
|
|
16.
|
Serje kompluta ta’ dilwizzjonijiet tal-istandard referenzjarju (17β-estradjol għall-agoniżmu; tamossifen għall-antagoniżmu) titkejjel fl-ewwel pjastra f’kull serje ta’ testijiet. Biex ikunu jistgħu jitqabblu r-riżultati tal-analiżi tal-ħames pjastri għall-mikrotitraġġ li jifdal bl-ewwel pjastra għall-mikrotitraġġ li fiha l-kurva konċentrazzjoni rispons sħiħa tal-istandard referenzjarju, il-pjastri kollha għandu jkun fihom tliet kampjuni tal-kontroll: kontroll b’solvent, l-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju ttestjat, u l-konċentrazzjoni approssimata tal-EC50 (agoniżmu) jew tal-IC50 (antagoniżmu) tal-istandard referenzjarju. Il-proporzjon tal-kampjuni tal-kontroll medji fl-ewwel pjastra u fil-ħames pjastri li jifdal għandu jissodisfa r-rekwiżiti kif mogħtija fit-Tabella 3C (agoniżmu) jew fit-Tabella 4C (antagoniżmu).
|
|
17.
|
Għal kull waħda mill-pjastri għall-mikrotitraġġ fi ħdan serje ta’ testijiet, jiġi kkalkolat il-fattur-z (10). Il-fattur-z għandu jiġi kkalkolat bl-użu tar-risponsi fl-ogħla u fl-anqas konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju. Pjastra għall-mikrotitraġġ titqies valida f’każ li tkun tissodisfa r-rekwiżiti stipulati fit-Tabella 3C (agoniżmu) jew fit-Tabella 4C (antagoniżmu).
|
|
18.
|
L-istandard referenzjarju għandu juri kurva doża-rispons sigmojde. L-EC50 jew l-IC50 miksub mir-rispons tas-serje ta’ dilwizzjonijiet tal-istandard referenzjarju għandu jissodisfa r-rekwiżiti kif indikati fit-Tabella 3C (agoniżmu) jew fit-Tabella 4C (antagoniżmu).
|
|
19.
|
Kull serje ta’ testijiet għandu jkun fiha kampjun tal-kontroll pożittiv u kampjun tal-kontroll negattiv. L-induzzjoni relattiva kkalkolata tal-kampjun tal-kontroll kemm pożittiv kif ukoll dak negattiv għandha tissodisfa r-rekwiżiti kif indikati fit-Tabella 3C (agoniżmu) jew fit-Tabella 4C (antagoniżmu).
|
|
20.
|
Matul il-kejlijiet kollha, il-fattur ta’ induzzjoni tal-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju għandu jitkejjel bid-diviżjoni tal-ogħla rispons medju tal-unità tad-dawl relattiva (RLU) tal-istandard referenzjarju 17β-estradjol bir-rispons medju tal-RLU tal-kontroll b’solvent ta’ referenza. Dan il-fattur ta’ induzzjoni għandu jissodisfa r-rekwiżiti minimi għall-induzzjoni tad-drabi kif indikat fit-Tabella 3C (agoniżmu) jew fit-Tabella 4C (antagoniżmu).
|
|
21.
|
Pjastri għall-mikrotitraġġ li jissodisfaw dawn il-kriterji ta’ aċċettazzjoni msemmija hawn fuq kollha biss jitqiesu validi u jistgħu jintużaw għall-evalwazzjoni tar-rispons tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
22.
|
Il-kriterji ta’ aċċettazzjoni huma applikabbli kemm għas-sessjonijiet ta’ qabel l-iskrinjar kif ukoll għal dawk komprensivi.
|
Tabella 1
Konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju, tal-kontroll pożittiv (PC) u tal-kontroll negattiv (NC) għall-bijoassaġġ agonistiku CALUX.
|
|
Sustanza
|
CAS RN
|
Medda tat-test (M)
|
|
Standard ta’ referenza
|
17β-estradjol
|
50-28-2
|
1*10-13 - 1*10-10
|
|
Kontroll pożittiv (PC)
|
17α-metiltestosteron
|
58-18-4
|
3*10-6
|
|
Kontroll Negattiv (NC)
|
kortikosteron
|
50-22-6
|
1*10-8
|
Tabella 2
Konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju, tal-kontroll pożittiv (PC) u tal-kontroll negattiv (NC) għall-bijoassaġġ antagonistiku CALUX.
|
|
Sustanza
|
CAS RN
|
Medda tat-test (M)
|
|
Standard ta’ referenza
|
tamossifen
|
10540-29-1
|
3*10-9 - 1*10-5
|
|
Kontroll pożittiv (PC)
|
4-idrossitamossifen
|
68047-06-3
|
1*10-9
|
|
Kontroll Negattiv (NC)
|
resveratrol
|
501-36-0
|
1*10-5
|
Tabella 3
Kriterji ta’ aċċettazzjoni għall-bijoassaġġ agonistiku ERα CALUX
|
A - kampjuni individwali fuq pjastra
|
Kriterji
|
|
1
|
% SD massimu tal-bwejriet triplikati (għal NC, PC, kull dilwizzjoni tas-sustanza kimika tat-test u tal-istandard referenzjarju, ħlief C0)
|
< 15 %
|
|
2
|
% SD massimu tal-bwejriet triplikati (għal standard referenzjarju u għal kontrolli b’solvent tas-sustanza kimika tat-test (C0, SC))
|
< 30 %
|
|
3
|
Tnixxija massima ta’ LDH, bħala kejl ta’ ċitotossiċità
|
< 120 %
|
|
B - fi ħdan pjastra waħda għall-mikrotitraġġ
|
|
|
4
|
Proporzjon tal-kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju (C0; pjastra 1) u l-kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test (SC; pjastri 2 sa x)
|
0,5 sa 2,0
|
|
5
|
Proporzjon tal-appr. EC50 u l-ogħla konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju fil-pjastra 1 u l-appr. EC50 u l-ogħla konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju fil-pjastri 2 sa x (C4, C8)
|
0,70 sa 1,30
|
|
6
|
Fattur-Z għal kull pjastra
|
>0,6
|
|
C - fi ħdan sensiela waħda ta’ analiżijiet (il-pjastri kollha fi ħdan sensiela waħda)
|
|
|
7
|
Kurva sigmojde tal-istandard referenzjarju
|
Iva (17ß-estradjol)
|
|
8
|
standard referenzjarju tal-medda ta’ EC50 ta’ 17ß-estradjol
|
4*10-12 – 4*10-11 M
|
|
9
|
Induzzjoni minima tad-drabi tal-ogħla konċentrazzjoni ta’ 17ß-estradjol, fir-rigward tal-kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju.
|
5
|
|
10
|
Induzzjoni relattiva ( %) PC
|
> 30 %
|
|
11
|
Induzzjoni relattiva ( %) NC
|
<10 %
|
Appr.: approssimattiv; PC: kontroll pożittiv; NC: kontroll negattiv; SC: kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test; C0: kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju; SD: devjazzjoni standard; LDH: lattatdeidroġenażi
Tabella 4
Kriterji ta’ aċċettazzjoni għall-bijoassaġġ antagonistiku ERα CALUX
|
A - kampjuni individwali fuq pjastra
|
Kriterji
|
|
1
|
% SD massimu tal-bwejriet triplikati (għal NC, PC, kull dilwizzjoni tas-sustanza kimika tat-test u tal-istandard referenzjarju, kontroll b’solvent (C0))
|
< 15 %
|
|
2
|
% SD massimu ta’ bwejriet triplikati (għall-kontroll b’veikolu (VC) u l-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju (C8))
|
< 30 %
|
|
3
|
Tnixxija massima ta’ LDH, bħala kejl ta’ ċitotossiċità
|
< 120 %
|
|
B - fi ħdan pjastra waħda għall-mikrotitraġġ
|
|
|
4
|
Proporzjon tal-kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju (C0; pjastra 1) u l-kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test (SC; pjastri 2 sa x)
|
0,70 sa 1,30
|
|
5
|
Proporzjon tal-appr. konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju tal-IC50 fil-pjastra 1 u l-appr. konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju tal-IC50 fil-pjastri 2 sa x (C4, C8)
|
0,70 sa 1,30
|
|
6
|
Proporzjon tal-ogħla konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju fil-pjastra 1 u l-ogħla konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju fil-pjastri 2 sa x (C8)
|
0,50 sa 2,0
|
|
7
|
Fattur-Z għal kull pjastra
|
>0,6
|
|
C - fi ħdan sensiela waħda ta’ analiżijiet (il-pjastri kollha fi ħdan sensiela waħda)
|
|
|
8
|
Kurva sigmojde tal-istandard referenzjarju
|
Iva (Tamossifen)
|
|
9
|
standard referenzjarju tal-medda ta’ IC50 (Tamossifen)
|
1*10-8 - 1*10-7 M
|
|
10
|
Induzzjoni minima t’a drabi tal-kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju, fir-rigward tal-ogħla konċentrazzjoni ta’ Tamossifen.
|
2,5
|
|
11
|
Induzzjoni relattiva ( %) PC
|
<70 %
|
|
12
|
Induzzjoni relattiva ( %) NC
|
>85 %
|
Appr.: approssimattiv; PC: kontroll pożittiv; NC: kontroll negattiv; VC: kontroll b’veikolu (kontroll b’solvent mingħajr konċentrazzjoni fissa ta’ standard referenzjarju agonist); SC: kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test; C0: kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju; SD: devjazzjoni standard; LDH: lattatdeidroġenażi
Kontroll b’solvent/b’veikolu, standards referenzjarji, kontrolli pożittivi, kontrolli negattivi
|
23.
|
Kemm għas-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar kif ukoll għas-sessjonijiet komprensivi, għandhom jintużaw l-istess kontroll b’solvent/b’veikolu, standards ta’ referenza, kontrolli pożittivi u kontrolli negattivi. Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni ta’ standards referenzjarji, ta’ kontrolli pożittivi u ta’ kontrolli negattivi għandha tkun l-istess.
|
Kontrolli tas-solvent
|
24.
|
Is-solvent użat biex is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti għandu jiġi ttestjat bħala kontroll b’solvent. Dimetilsulfossidu (DMSO, 1 % (v/v); CASRN 67-68-5) intuża bħala veikolu matul il-validazzjoni tal-bijoassaġġ ERα CALUX. Jekk jintuża solvent ieħor li mhuwiex DMSO, l-istandards referenzjarji, il-kontrolli u s-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandhom jiġu ttestjati fl-istess veikolu. Jekk jogħġbok kun af li l-kontroll b’solvent għal studji antagonistiċi fih konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonist 17β-estradjol (konċentrazzjoni approssimattiva tal-EC50) Biex jiġi ttestjat is-solvent użat għall-istudji antagonistiċi, għandu jitħejja u jiġi ttestjat kontroll b’veikolu.
|
Kontroll b’veikolu (antagoniżmu)
|
25.
|
Għall-ittestjar tal-antagoniżmu, il-medium tal-assaġġ hu supplimentat b’konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonist 17β-estradjol (konċentrazzjoni approssimattiva tal-EC50). Biex jiġi ttestjat is-solvent użat għad-dissoluzzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-antagoniżmu, għandu jitħejja medium tal-assaġġ mingħajr konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonist 17β-estradjol. Dan il-kampjun tal-kontroll hu indikat bħala l-kontroll b’veikolu. Dimetilsulfossidu (DMSO, 1 % (v/v); CASRN 67-68-5) intuża bħala veikolu matul il-validazzjoni tal-bijoassaġġ ERα CALUX. Jekk jintuża solvent ieħor li mhuwiex DMSO, l-istandards referenzjarji, il-kontrolli u s-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandhom jiġu ttestjati fl-istess veikolu.
|
Standards ta’ referenza
|
26.
|
L-istandard referenzjarju agonistiku hu 17β-estradjol (Tabella 1). L-istandards referenzjarji jinkludu sensiela ta’ dilwizzjonijiet ta’ tmien konċentrazzjonijiet ta’ 17β-estradjol (1*10-13, 3*10-13, 1*10-12, 3*10-12, 6*10-12, 1*10-11, 3*10-11, 1*10-10 M).
|
|
27.
|
L-istandard referenzjarju antagonistiku hu tamossifen (Tabella 2). L-istandards referenzjarji jinkludu sensiela ta’ dilwizzjonijiet ta’ tmien konċentrazzjonijiet ta’ tamossifen (3*10-9, 1*10-8, 3*10-8, 1*10-7, 3*10-7, 1*10-6, 3*10-6, 1*10-5 M). Kull waħda mill-konċentrazzjonijiet tal-istandard referenzjarju antagonistiku tiġi koinkubata b’konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonistiku 17β-estradjol (3*10-12 M).
|
Kontroll pożittiv
|
28.
|
Il-kontroll pożittiv għall-istudji agonistiċi hu 17α-metiltestosteron (Tabella 1).
|
|
29.
|
Il-kontroll pożittiv għall-istudji antagonistiċi hu 4-idrossitamossifen (Tabella 2). Il-kontroll pożittiv antagonistiku jiġi koinkubat b’konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonistiku 17β-estradjol (3*10-12 M).
|
Kontroll negattiv
|
30.
|
Il-kontroll negattiv għall-istudji agonistiċi hu kortikosteron (Tabella 1).
|
|
31.
|
Il-kontroll negattiv għall-istudji antagonistiċi hu resveratrol (Tabella 2). Il-kontroll negattiv antagonistiku jiġi koinkubat b’konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonistiku 17β-estradjol (3*10-12 M).
|
Wiri tal-profiċjenza tal-laboratorju (ara l-paragrafu 14 u t-Tabelli 3 u 4 f’“KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER” ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar)
Veikolu
|
32.
|
Is-solvent użat biex jiġu dissolti s-sustanzi kimiċi tat-test għandu jissolubilizza s-sustanza kimika tat-test għalkollox u għandu jkun jitħallat mal-medium taċ-ċellola. DMSO, ilma u etanol (purità ta’ 95 % sa 100 %) huma solventi xierqa. F’każ li jintuża DMSO bħala solvent, il-konċentrazzjoni massima ta’ DMSO matul l-inkubazzjoni ma għandhiex taqbeż il-1 % (v/v). Qabel l-użu, is-solvent għandu jiġi ttestjat għall-assenza ta’ ċitotossiċità u ta’ interferenza mal-prestazzjoni tal-assaġġi.
|
Preparazzjoni tal-istandards referenzjarji, tal-kontrolli pożittivi, tal-kontrolli negattivi u tas-sustanzi kimiċi tat-test
|
33.
|
L-istandards referenzjarji, il-kontrolli pożittivi, il-kontrolli negattivi u s-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti fid-DMSO 100 % (jew f’solvent xieraq). Imbagħad għandhom jitħejjew dilwizzjonijiet (serjali) xierqa fl-istess solvent. Qabel ma jiġu dissolti, is-sustanzi kollha għandhom jitħallew jekwilibraw għal temperatura ambjentali. Soluzzjonijiet ewlenin imħejjija friski tal-istandards referenzjarji, tal-kontrolli pożittivi, tal-kontrolli negattivi u tas-sustanzi kimiċi tat-test ma għandux ikollhom preċipitat jew dardir notevoli. L-istokks ta’ standards referenzjarji u ta’ kontroll jistgħu jitħejjew bl-ingrossa. Is-soluzzjonijiet ewlenin tas-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jitħejjew friski qabel kull esperiment. Id-dilwizzjonijiet finali tal-istandards referenzjarji, tal-kontrolli pożittivi, tal-kontrolli negattivi u tas-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jitħejjew friski għal kull esperiment u jintużaw fi żmien 24 siegħa mit-tħejjija.
|
Is-solubbiltà, iċ-ċitotossiċità u s-sejbien tal-medda.
|
34.
|
Matul is-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar, tiġi determinata s-solubbiltà tas-sustanzi kimiċi tat-test fis-solvent tal-għażla. Titħejja konċentrazzjoni stokk massima ta’ 0,1 M. F’każ li din il-konċentrazzjoni turi problemi ta’ solubbiltà, għandhom jitħejjew anqas soluzzjonijiet ta’ stokk sakemm is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu solubilizzati għalkollox. Matul is-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar, jiġu ttestjati dilwizzjonijiet serjali ta’ 1:10 tas-sustanza kimika tat-test. Il-konċentrazzjoni massima tal-assaġġ għall-ittestjar tal-agonisti jew tal-antagonisti hi ta’ 1 mM. Wara l-iskrinjar ta’ qabel, tinkiseb medda ta’ konċentrazzjoni rfinata xierqa għas-sustanzi kimiċi tat-test li għandha tiġi ttestjata matul is-sessjonijiet komprensivi. Id-dilwizzjonijiet użati għall-ittestjar komprensiv għandhom ikunu ta’ 1x, 3x, 10x, 30x, 100x, 300x, 1000x u 3000x.
|
|
35.
|
L-ittestjar taċ-ċitotossiċità hu inklużi fil-protokoll tal-assaġġ tal-agonisti u tal-antagonisti (11). L-ittestjar taċ-ċitotossiċità hu inkorporat kemm fis-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar kif ukoll fis-sessjonijiet komprensivi. Il-metodu użat għall-valutazzjoni taċ-ċitotossiċità matul il-validazzjoni tal-bijoassaġġ ERα CALUX kien it-test tat-tnixxija tal-lattatdeidroġenażi (LDH) flimkien ma’ spezzjoni viżwali kwalitattiva taċ-ċelloli (ara l-Appendiċi 4.1) wara l-esponiment għas-sustanzi kimiċi tat-test. Madankollu, jistgħu jintużaw metodi kwantitattivi oħra għad-determinazzjoni taċ-ċitotossiċità (eż. assaġġ kalorimetriku bbażat fuq it-tetrażolju (MTT) jew bijoassaġġ CALUX taċ-ċitotossiċità). B’mod ġenerali, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test li juru tnaqqis akbar minn 20 % fil-vijabbiltà taċ-ċelloli jitqiesu ċitotossiċi u għalhekk ma jistgħux jintużaw għall-evalwazzjoni tad-data. Fir-rigward tal-assaġġ tat-tnixxija tal-LDG, il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test titqies ċitotissika meta l-perċentwal tat-tnixxija tal-LDH ikun ogħla minn 120 %.
|
Esponiment għas-sustanza kimika tat-test u organizzazzjoni tal-pjastra tal-assaġġ
|
36.
|
Wara t-tripsinizzazzjoni ta’ flask konfluwenti ta’ ċelloli kkolturati, iċ-ċelloli jerġgħu jiġu sospiżi f’1x105 ċelloli /ml f’medium tal-assaġġ ħieles minn estroġenu. Mitt μl f’ċelloli sospiżi mill-ġdid jiġu pjastrati fil-bwejriet interni ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra. Il-bwejriet ta’ barra jimtlew b’200 μl ta’ Salina Baferjata tal-Fosfat (PBS) (ara l-Figuri 1 u 2). Iċ-ċelloli pjastrati jiġu inkubati minn qabel għal 24 siegħa f’inkubatur tas-CO2 (5 % CO2, 37°C, 100 % umdità).
|
|
37.
|
Wara l-inkubazzjoni minn qabel, il-pjastri jiġu spezzjonati għal ċitotossiċità viżwali (ara l-Appendiċi 4.1) għal kontaminazzjoni u għal konfluwenza. Huma biss pjastri li ma juru ebda ċitotossiċità, kontaminazzjoni u li jkollhom tal-anqas konfluwenza ta’ 85 % li jintużaw għall-ittestjar. Il-medium għall-bwejriet interni jitneħħa bil-galbu u jiġi sostitwit b’200 μl medium tal-assaġġ ħieles mill-estroġenu li jkun fih serje ta’ dilwizzjonijiet xierqa tal-istandards referenzjarji, tas-sustanzi kimiċi tat-test, tal-kontrolli pożittivi, tal-kontrolli negattivi u tal-kontrollib’solvent (Tabella 5: studji agonisti; Tabella 6: studji antagonisti). L-istandards referenzjarji, is-sustanzi kimiċi tat-test, il-kontrolli pożittivi, il-kontrolli negattivi u l-kontrolli b’solvent kollha jiġu ttestjati fi triplikat. Fil-Figura 1 tingħata t-tifsila tal-pjastra għall-ittestjar tal-agonisti. Fil-Figura 2 tingħata t-tifsila tal-pjastra għall-ittestjar tal-antagonisti. It-tifsila tal-pjastra għall-ittestjar ta’ qabel l-iskrinjar u għall-ittestjar komprensiv hi identika. Għall-ittestjar tal-antagonisti, il-bwejriet interni kollha, ħlief għall-bwejriet tal-kontroll b’veikolu (VC), ikun fihom ukoll konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonist 17β-estradjol (3*10-12 M). Kun af li l-istandards referenzjarji C8 u C4 għandhom jiżdiedu ma’ kull pjastra tat-TC.
|
|
38.
|
Wara l-esponiment taċ-ċelloli għas-sustanzi kimiċi kollha, il-pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra għandhom jiġu inkubati għal 24 siegħa oħra f’inkubatur tas-CO2 (5 % CO2, 37°C, 100 % umdità).
|
Figura 1
Tifsila tal-pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra għall-iskrinjar ta’ qabel u għall-valutazzjoni tal-effett agonistiku.
C0 = solvent tal-istandard referenzjarju.
C(1-8) = serje ta’ dilwizzjonijiet (1-8, konċentrazzjonijiet baxxi sa għoljin) tal-istandard referenzjarju.
PC = kontroll pożittiv.
NC = kontroll negattiv.
TCx-(1-8) = dilwizzjonijiet (1-8, konċentrazzjonijiet baxxi sa għoljin) tas-sustanza kimika tat-test għas-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar u għall-valutazzjoni tal-effett agonistiku tas-sustanza kimika tat-test x.
SC = kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test (idealment l-istess solvent bħal f’C0, iżda jista’ jkun minn lott ieħor).
Ċelloli griżi: = Bwejriet ta’ barra, mimlija b’200 μl PBS.
Figura 2
Tifsila tal-pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra għall-iskrinjar antagonistiku ta’ qabel u għall-valutazzjoni tal-effett antagonistiku.
C0 = solvent tal-istandard referenzjarju.
C(1-8) = serje ta’ dilwizzjonijiet (1-8, konċentrazzjonijiet baxxi sa għoljin) tal-istandard referenzjarju.
NC = kontroll negattiv.
PC = kontroll pożittiv.
TCx-(1-8) = dilwizzjonijiet (1-8, konċentrazzjonijiet baxxi sa għoljin) tas-sustanza kimika tat-test għas-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar u għall-valutazzjoni tal-effett agonistiku tas-sustanza kimika tat-test x.
SC = kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test (idealment l-istess solvent bħal f’C0, iżda jista’ jkun minn lott ieħor).
VC = kontroll b’veikolu (kontroll b’solvent mingħajr konċentrazzjoni fissa ta’ standard referenzjarju agonist 17β-estradjol).
Ċelloli griżi: = Bwejriet ta’ barra, mimlija b’200 μl PBS.
Nota: il-bwejriet interni kollha, ħlief għall-bwejriet tal-kontroll b’veikolu (VC), ikun fihom ukoll konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonist 17β-estradjol (3,0*10-12 M)
Kejl tal-luminexxenza
|
39.
|
Il-kejl tal-luminexxenza hu deskritt fid-dettall fil-protokoll tal-assaġġ tal-agonisti u tal-antagonisti (10). Il-medium mill-bwejriet għandu jitneħħa u ċ-ċelloli għandhom jiġu liżati wara 24 siegħa inkubazzjoni biex il-membrana taċ-ċelloli tinfetaħ u tkun tista’ titkejjel l-attività tal-luċiferażi.
|
|
40.
|
Għall-kejl tal-luminexxenza, din il-proċedura teħtieġ luminometru mgħammar b’2 injetturi. Ir-reazzjoni tal-luċiferażi tinbeda b’injezzjoni tal-substrat luċiferina. Ir-reazzjoni titwaqqaf biż-żieda ta’ 0,2 M NaOH. Ir-reazzjoni titwaqqaf biex tipprevjeni l-ġarr tal-luminexxenza minn bwejra għall-oħra.
|
|
41.
|
Id-dawl emess minn kull bwejra jiġi espress bħala Unitajiet tad-Dawl Relattivi (RLUs) għal kull bwejra.
|
Sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar
|
42.
|
Ir-riżultati tal-analiżi ta’ qabel l-iskrinjar jintużaw biex tiġi determinata medda ta’ konċentrazzjoni rfinuta ta’ sustanzi kimiċi tat-test għall-ittestjar komprensiv. L-evalwazzjoni tar-riżultati tal-analiżi ta’ qabel l-iskrinjar u d-determinazzjoni tal-medda ta’ konċentrazzjoni rfinuta tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-ittestjar komprensiv hi deskritta fil-fond fil-protokoll tal-assaġġ tal-agonisti u tal-antagonisti (10). Hawnhekk jingħata sommarju qasir tal-proċeduri għad-determinazzjoni tal-medda ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-ittestjar tal-agonisti u tal-antagonisti. Ara t-Tabelli 5 u 6 għal gwida dwar it-tifsila tad-dilwizzjoni serjali.
|
L-għażla tal-konċentrazzjonijiet għall-valutazzjoni tal-effetti agonistiċi
|
43.
|
Matul is-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar, is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu ttestjati bl-użu tas-sensiliet ta’ dilwizzjonijiet kif indikati fit-Tabelli 5 (agoniżmu) u 6 (antagoniżmu). Il-konċentrazzjonijiet kollha għandhom jiġu ttestjati fi bwejriet triplikati skont it-tifsila tal-pjastra kif indikata fil-Figura 1 (agoniżmu) jew 2 (antagoniżmu).
|
|
44.
|
Huma biss ir-riżultati tal-analiżi li jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettazzjoni (Tabella 3) li jitqiesu validi u jistgħu jintużaw għall-evalwazzjoni tar-rispons tas-sustanzi kimiċi tat-test. F’każ li pjastra waħda jew aktar għall-mikrotitraġġ f’sensiela ta’ analiżi tonqos milli tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, il-pjastri rispettivi għall-mikrotitraġġ għandhom jerġgħu jiġu analizzati. F’każ li l-ewwel pjastra li jkun fiha s-serje sħiħ ta’ dilwizzjonijiet tal-istandard referenzjarju tonqos milli tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, is-serje sħaħ tat-test (sitt pjastri) ikollhom jerġgħu jiġu analizzati.
|
|
45.
|
Il-meded ta’ konċentrazzjoni inizjali tas-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu aġġustati u s-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar għandha tiġi ripetuta f’każ:
|
—
|
li tiġi osservata ċitotossiċità. Il-proċedura ta’ qabel l-iskrinjar għandha terġa’ ssir b’konċentrazzjonijiet mhux ċitotossiċi inferjuri tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
—
|
l-iskrinjar minn qabel tas-sustanza kimika tat-test ma jurix kurva ta’ doża-rispons sħiħa għaliex il-konċentrazzjonijiet ittestjati jiġġeneraw induzzjoni massima. Is-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar għandha terġa’ ssir billi jintużaw konċentrazzjonijiet inferjuri tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
|
46.
|
Meta jiġi osservat rispons validu relatat mad-doża, għandha tingħażel (l-anqas) konċentrazzjoni li fiha tiġi osservata induzzjoni massima u li ma turix ċitotossiċità. L-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li għandha tiġi ttestjata fis-sessjonijiet komprensivi, għandha tkun 3 darbiet din il-konċentrazzjoni magħżula.
|
|
47.
|
Serje sħiħa rfinuta ta’ dilwizzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandha titħejja bl-istadji tad-dilwizzjonijiet kif indikati fit-Tabella 5, billi tibda mill-ogħla konċentrazzjoni kif determinata hawn fuq.
|
|
48.
|
Sustanza kimika tat-test li ma twassalx għal xi effett agonistiku għandha tiġi ttestjata fis-sessjonijiet komprensivi billi tibda mill-ogħla konċentrazzjoni mhux tossika identifikata matul l-iskrinjar ta’ qabel.
|
L-għażla tal-konċentrazzjonijiet għall-valutazzjoni tal-effetti antagonistiċi
|
49.
|
Huma biss ir-riżultati tal-analiżi li jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettazzjoni (Tabella 4) li jitqiesu validi u jistgħu jintużaw għall-evalwazzjoni tar-rispons tas-sustanzi kimiċi tat-test. F’każ li pjastra waħda jew aktar għall-mikrotitraġġ f’sensiela ta’ analiżi tonqos milli tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, il-pjastri rispettivi għall-mikrotitraġġ għandhom jerġgħu jiġu analizzati. F’każ li l-ewwel pjastra li jkun fiha s-serje sħiħ ta’ dilwizzjonijiet tal-istandard referenzjarju tonqos milli tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, is-serje sħaħ tat-test (sitt pjastri) ikollhom jerġgħu jiġu analizzati.
|
|
50.
|
Il-meded ta’ konċentrazzjoni inizjali tas-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu aġġustati u s-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar għandha tiġi ripetuta f’każ:
|
—
|
li tiġi osservata ċitotossiċità. Il-proċedura ta’ qabel l-iskrinjar għandha terġa’ ssir b’konċentrazzjonijiet mhux ċitotossiċi inferjuri tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
—
|
l-iskrinjar minn qabel tas-sustanza kimika tat-test ma jurix kurva ta’ doża-rispons sħiħa għaliex il-konċentrazzjonijiet ittestjati jiġġeneraw inibizzjoni massima. Is-sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar għandha terġa’ ssir billi jintużaw konċentrazzjonijiet inferjuri tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
|
51.
|
Meta jinstab rispons validu relatat mad-doża, għandha tingħażel (l-anqas) konċentrazzjoni li fiha tiġi osservata inibizzjoni massima u li ma turix ċitotossiċità. L-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li għandha tiġi ttestjata fis-sessjonijiet komprensivi, għandha tkun tliet darbiet din il-konċentrazzjoni magħżula.
|
|
52.
|
Serje sħiħa rfinata ta’ dilwizzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandha titħejja bl-istadji tad-dilwizzjonijiet kif indikati fit-Tabella 6, billi tibda mill-ogħla konċentrazzjoni kif determinata hawn fuq.
|
|
53.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test li ma jwasslux għal xi effett antagonistiku għandhom jiġu ttestjati fis-sessjonijiet komprensivi billi tibda mill-ogħla konċentrazzjoni mhux tossika ttestjata matul l-iskrinjar ta’ qabel.
|
Sessjonijiet komprensivi
|
54.
|
Wara l-għażla tal-meded ta’ konċentrazzjonijiet irfinuti, is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jiġu ttestjati b’mod komprensiv bl-użu tas-sensiliet ta’ dilwizzjonijiet kif indikati fit-Tabelli 5 (agoniżmu) u 6 (antagoniżmu). Il-konċentrazzjonijiet kollha għandhom jiġu ttestjati fi bwejriet triplikati skont it-tifsila tal-pjastra kif indikata fil-Figura 1 (agoniżmu) jew 2 (antagoniżmu).
|
|
55.
|
Huma biss ir-riżultati tal-analiżi li jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettazzjoni (Tabelli 3 u 4) li jitqiesu validi u jistgħu jintużaw għall-evalwazzjoni tar-rispons tas-sustanzi kimiċi tat-test. F’każ li pjastra waħda jew aktar għall-mikrotitraġġ f’sensiela ta’ analiżi tonqos milli tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, il-pjastri rispettivi għall-mikrotitraġġ għandhom jerġgħu jiġu analizzati. F’każ li l-ewwel pjastra li jkun fiha s-serje sħiħ ta’ dilwizzjonijiet tal-istandard referenzjarju tonqos milli tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, is-serje sħaħ tat-test (sitt pjastri) ikollhom jerġgħu jiġu analizzati.
|
Tabella 5
Il-konċentrazzjoni u d-dilwizzjonijiet tal-istandards referenzjarji, tal-kontrolli u tas-sustanzi kimiċi tat-test użati għall-ittestjar tal-agonisti
|
Referenza 17β-estradjol
|
TCx - sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar
|
TCx - sessjoni komprensiva
|
Kontrolli
|
|
konċ. (M)
|
dilwizzjoni
|
dilwizzjoni
|
konċ. (M)
|
|
C0
|
0
|
TCx-1
|
10,000,000 x
|
TCx-1
|
3,000 x
|
PC
|
3*10-6
|
|
C1
|
1*10-13
|
TCx-2
|
1,000,000 x
|
TCx-2
|
1,000 x
|
NC
|
1*10-8
|
|
C2
|
3*10-13
|
TCx-3
|
100,000 x
|
TCx-3
|
300 x
|
C0
|
0
|
|
C3
|
1*10-12
|
TCx-4
|
10,000 x
|
TCx-4
|
100 x
|
SC
|
0
|
|
C4
|
3*10-12
|
TCx-5
|
1,000 x
|
TCx-5
|
30 x
|
|
|
|
C5
|
6*10-12
|
TCx-6
|
100 x
|
TCx-6
|
10 x
|
|
|
|
C6
|
1*10-11
|
TCx-7
|
10 x
|
TCx-7
|
3 x
|
|
|
|
C7
|
3*10-11
|
TCx-8
|
1 x
|
TCx-8
|
1 x
|
|
|
|
C8
|
1*10-10
|
|
|
|
|
|
|
|
TCx - sustanza kimika tat-test x
PC - kontroll pożittiv (17α-metiltestosteron)
NC - kontroll negattiv (kortikosteron)
C0 - kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju
SC - kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test
|
Tabella 6
Il-konċentrazzjoni u d-dilwizzjonijiet tal-istandards referenzjarji, tal-kontrolli u tas-sustanzi kimiċi tat-test użati għall-ittestjar tal-antagonisti
|
Referenza tamossifen
|
TCx - sessjoni ta’ qabel l-iskrinjar
|
TCx - sessjoni komprensiva
|
Kontrolli
|
|
konċ. (M)
|
dilwizzjoni
|
dilwizzjoni
|
konċ. (M)
|
|
C0
|
0
|
TCx-1
|
10,000,000 x
|
TCx-1
|
3,000 x
|
PC
|
1*10-9
|
|
C1
|
3*10-9
|
TCx-2
|
1,000,000 x
|
TCx-2
|
1,000 x
|
NC
|
1*10-5
|
|
C2
|
1*10-8
|
TCx-3
|
100,000 x
|
TCx-3
|
300 x
|
C0
|
0
|
|
C3
|
3*10-8
|
TCx-4
|
10,000 x
|
TCx-4
|
100 x
|
SC
|
0
|
|
C4
|
1*10-7
|
TCx-5
|
1,000 x
|
TCx-5
|
30 x
|
|
|
|
C5
|
3*10-
|
TCx-6
|
100 x
|
TCx-6
|
10 x
|
Agonist supplimentat
|
|
C6
|
1*10-6
|
TCx-7
|
10 x
|
TCx-7
|
3 x
|
konċ. (M)
|
|
C7
|
3*10-6
|
TCx-8
|
1 x
|
TCx-8
|
1 x
|
17β-estradjol
|
3*10-12
|
|
C8
|
1*10-5
|
|
|
|
|
|
|
|
TCx - sustanza kimika tat-test x
PC - kontroll pożittiv (4-idrossitamossifen)
NC - kontroll negattiv (resveratrol)
C0 - kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju
SC - kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test
VC - il-kontroll b’veikolu (ma fihx konċentrazzjoni fissa tal-istandard referenzjarju agonistiku 17β-estradjol (3,0*10-12 M)
|
Il-ġbir tad-data u l-analiżi tad-data
|
56.
|
Wara s-sessjonijiet ta’ skrinjar ta’ qabel u komprensivi, għandhom jiġu determinati l-EC10, l-EC50, il-PC10, il-PC50 u l-induzzjoni massima (TCxmax) ta’ sustanza kimika tat-test għall-ittestjar agonistiku. Għall-ittestjar antagonistiku, għandhom jiġu kkalkolati l-IC20, l-IC50, il-PC80, il-PC50 u l-induzzjoni minima (TCxmin). Fil-Figuri 3 (agoniżmu) u 4 (antagoniżmu) tingħata rappreżentazzjoni grafika ta’ dawn il-parametri. Il-parametri meħtieġa huma kkalkolati fuq il-bażi tal-induzzjoni relattiva ta’ kull sustanza kimika tat-test (relattiva għall-induzzjoni massima tal-istandard referenzjarju (=100 %)). Ir-rigressjoni mhux lineari (pendil varjabbli, 4 parametri) għandha tintuża għall-evalwazzjoni tad-data skont l-ekwazzjoni li ġejja:
Fejn:
X = Log tad-doża jew tal-konċentrazzjoni
Y = Rispons (induzzjoni relattiva (%))
Quċċata = Induzzjoni massima (%)
Qiegħ = Induzzjoni minima (%)
LogEC50 = Log tal-konċentrazzjoni li fiha jiġi osservat 50 % tar-rispons massimu
HillSlope = Il-fattur tal-pendil jew il-pendil ta’ Hill
|
|
57.
|
Id-data mhux proċessata mil-luminometru, espressa bħala Unitajiet tad-Dawl Relattivi (RLUs), għandha tiġi trasferita għall-ispreadsheet tal-analiżi tad-data mfassla għas-sessjonijiet ta’ qabel l-iskrinjar u komprensivi. Id-data mhux proċessata għandha tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni kif indikati fit-Tabelli 3A u 3B (agoniżmu) jew 4A u 4B (antagoniżmu). Fil-każ li d-data mhux proċessata tissodisfa l-kriterji ta’ aċċettazzjoni, jitwettqu l-istadji li ġejjin tal-kalkolu biex jiġu determinati l-parametri meħtieġa:
|
Agoniżmu
|
—
|
Naqqas l-RLU medja tal-kontroll b’solvent tal-istandard referenzjarju minn kull data tal-analiżi mhux proċessata tal-istandards referenzjarji.
|
|
—
|
Naqqas l-RLU medja għall-kontroll b’solvent tas-sustanza kimika tat-test minn kull data tal-analiżi mhux proċessata tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
—
|
Ikkalkola l-induzzjoni relattiva ta’ kull konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju. Issettja l-induzzjoni tal-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju f’100 %.
|
|
—
|
Ikkalkola l-induzzjoni relattiva ta’ kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test meta mqabbla mal-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju bħala 100 %.
|
|
—
|
Evalwa r-riżultati tal-analiżi skont rigressjoni mhux lineari (pendil varjabbli, erba’ parametri).
|
|
—
|
Iddetermina l-EC50 u l-EC10 tal-istandard referenzjarju.
|
|
—
|
Iddetermina l-EC50 u l-EC10 tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
—
|
Iddetermina l-induzzjoni relattiva massima tas-sustanza kimika tat-test (TCmax).
|
|
—
|
Iddetermina l-PC10 u l-PC50 tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
Għas-sustanzi kimiċi tat-test, kurva ta’ doża-rispons sħiħa mhux dejjem tkun tista’ tinkiseb minħabba, eż., problemi ta’ ċitotossiċità jew ta’ solubbiltà. B’hekk, l-EC50, l-EC10 u l-PC50 ma jkunux jistgħu jiġu determinati. F’dan, il-każ, il-PC10 u t-TCmax biss ikunu jistgħu jiġu determinati.
Antagoniżmu
|
—
|
Naqqas l-RLU medja tal-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju minn kull data tal-analiżi mhux proċessata tal-istandards referenzjarji.
|
|
—
|
Naqqas l-RLU medja tal-ogħla konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju minn kull data tal-analiżi mhux proċessata tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
—
|
Ikkalkola l-induzzjoni relattiva ta’ kull konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju. Issettja l-induzzjoni tal-anqas konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju f’100 %.
|
|
—
|
Ikkalkola l-induzzjoni relattiva ta’ kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test meta mqabbla mal-anqas konċentrazzjoni tal-istandard referenzjarju bħala 100 %.
|
|
—
|
Evalwa r-riżultati tal-analiżi skont rigressjoni mhux lineari (pendil varjabbli, erba’ parametri).
|
|
—
|
Iddetermina l-IC50 u l-IC20 tal-istandard referenzjarju.
|
|
—
|
Iddetermina l-IC50 u l-IC20 tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
—
|
Iddetermina l-induzzjoni relattiva minima tas-sustanza kimika tat-test (TCmin).
|
|
—
|
Iddetermina l-PC80 u l-PC50 tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
Figura 3
Ħarsa ġenerali lejn il-parametri determinati fl-assaġġ tal-agonisti
EC10 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza li fiha jiġi osservat 10 % tar-rispons massimu tagħha.
EC50 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza li fiha jiġi osservat 50 % tar-rispons massimu tagħha.
PC10 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li fiha r-rispons tagħha jkun daqs l-EC10 tal-istandard referenzjarju.
PC50 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li fiha r-rispons tagħha jkun daqs l-EC50 tal-istandard referenzjarju.
TCxmax = l-induzzjoni relattiva massima tas-sustanza kimika tat-test.
Figura 4
Ħarsa ġenerali lejn il-parametri determinati fl-assaġġ tal-antagonisti
IC20 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza li fiha jiġi osservat 80 % tar-rispons massimu tagħha (inibizzjoni ta’ 20 %).
IC50 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza li fiha jiġi osservat 50 % tar-rispons massimu tagħha (inibizzjoni ta’ 50 %).
PC80 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li fiha r-rispons tagħha jkun daqs l-IC20 tal-istandard referenzjarju.
PC50 = il-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li fiha r-rispons tagħha jkun daqs l-IC50 tal-istandard referenzjarju.
TCxmin = l-induzzjoni relattiva minima tas-sustanza kimika tat-test.
Għas-sustanzi kimiċi tat-test, kurva ta’ doża-rispons sħiħa mhux dejjem tkun tista’ tinkiseb minħabba, eż., problemi ta’ ċitotossiċità jew ta’ solubbiltà. B’hekk, l-IC50, l-IC20 u l-PC50 ma jkunux jistgħu jiġu determinati. F’dan, il-każ, il-PC20 u t-TCmin biss ikunu jistgħu jiġu determinati.
|
58.
|
Ir-riżultati għandhom ikunu bbażati fuq żewġ (jew tliet) sessjonijiet indipendenti. Jekk żewġ sessjonijiet jagħtu riżultati komparabbli u, għalhekk, riproduċibbli, ma jkunx hemm bżonn li ssir it-tielet sessjoni. Biex ikunu aċċettabbli, ir-riżultati għandhom:
|
—
|
Jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettabbiltà (ara l-paragrafi 14-22 dwar il-Kriterji ta’ aċċettabbiltà),
|
|
Kriterji ta’ Interpretazzjoni tad-Data
|
59.
|
Għall-interpretazzjoni tad-data u d-deċiżjoni dwar jekk sustanza kimika tat-test titqiesx pożittiva jew negattiva, għandhom jintużaw il-kriterji li ġejjin:
|
Għal kull sessjoni komprensiva, sustanza kimika tat-test titqies pożittiva f’każ li:
|
1
|
It-TCmax tkun ekwivalenti għal 10 % jew aktar tar-rispons massimu tal-istandard referenzjarju (REF10).
|
|
2
|
Tal-anqas żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi tas-sustanza kimika tat-test ikunu ekwivalenti għall-REF10 jew aktar minnha.
|
|
|
Għal kull sessjoni komprensiva, sustanza kimika tat-test titqies negattiva f’każ li:
|
1
|
It-TCmax ma taqbiżx l-10 % tar-rispons massimu tal-istandard referenzjarju (REF10).
|
|
2
|
Anqas minn żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi tas-sustanza kimika tat-test ikunu ekwivalenti għall-REF10 jew aktar minnha.
|
|
|
Għal kull sessjoni komprensiva, sustanza kimika tat-test titqies pożittiva f’każ li:
|
1
|
It-TCmin tkun ekwivalenti għal 80 % jew anqas tar-rispons massimu tal-istandard referenzjarju (REF80 = inibizzjoni ta’ 20 %).
|
|
2
|
Tal-anqas 2 konċentrazzjonijiet konsekuttivi tas-sustanza kimika tat-test ikunu ekwivalenti għall-REF80 jew anqas minnha.
|
|
|
Għal kull sessjoni komprensiva, sustanza kimika tat-test titqies negattiva f’każ li:
|
1
|
It-TCmin taqbeż it-80 % tar-rispons massimu tal-istandard referenzjarju (REF80 = inibizzjoni ta’ 20 %).
|
|
2
|
Anqas minn żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi tas-sustanza kimika tat-test ikunu ekwivalenti għall-REF80 jew anqas minnha.
|
|
|
|
60.
|
Biex tiġi karatterizzata l-potenza tar-rispons pożittiv ta’ sustanza kimika tat-test, il-kobor tal-effett (agoniżmu: TCmax; antagoniżmu: TCmin) u l-konċentrazzjoni li fiha jseħħ l-effett (agoniżmu: EC10, EC50, PC10, PC50; antagoniżmu: IC20, IC50, PC80, PC50) għandhom jiġu rapportati.
|
RAPPORT TAT-TEST
|
61.
|
Ara l-paragrafu 20 ta’ “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TA TAL-ER”
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
OECD (2016). Draft Validation report of the (anti-) ERα CALUX bioassay - transactivation bioassay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 240). Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi
|
|
(2)
|
Sonneveld E, Jansen HJ, Riteco JA, Brouwer A, van der Burg B. (2005). Development of androgen- and estrogen-responsive bioassays, members of a panel of human cell line-based highly selective steroid-responsive bioassays. Toxicol Sci. 83(1), 136-148.
|
|
(3)
|
Quaedackers ME, van den Brink CE, Wissink S, Schreurs RHMM, Gustafsson JA, van der Saag PT, u van der Burg B. (2001). 4-Hydroxytamoxifen trans-represses nuclear factor-kB Activity in human osteoblastic U2OS cells through estrogen receptor (ER)α and not through ERβ. Endocrinology 142(3), 1156-1166.
|
|
(4)
|
Thorne N, Inglese J u Auld DS. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology, Chemistry and Biology17(6):646-57.
|
|
(5)
|
Escande A, Pillon A, Servant N, Cravedi JP, Larrea F, Muhn P, Nicolas JC, Cavaillès V u Balaguer P. (2006). Evaluation of ligand selectivity using reporter cell lines stably expressing estrogen receptor alpha or beta. Biochem. Pharmacol., 71, 1459-1469.
|
|
(6)
|
Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, Corton JC, Safe SH, van der Saag PT, van der Burg B u Gustafsson JA. (1998). Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinol., 139, 4252-4263.
|
|
(7)
|
Sotoca AM, Bovee TFH, Brand W, Velikova N, Boeren S, Murk AJ, Vervoort J, Rietjens IMCM. (2010). Superinduction of estrogen receptor mediated gene expression in luciferase based reporter gene assays is mediated by a post-transcriptional mechanism. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 122, 204–211.
|
|
(8)
|
Sonneveld E, Riteco JAC, Jansen HJ, Pieterse B, Brouwer A, Schoonen WG, u van der Burg B. (2006). Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci., 89(1), 173–187.
|
|
(9)
|
Kobayashi H, Yamamoto K, Eguchi M, Kubo M, Nakagami S, Wakisaka S, Kaizuka M u Ishii H. (1995). Rapid detection of mycoplasma contamination in cell cultures by enzymatic detection of polymerase chain reaction (PCR) products. J. Vet. Med. Sci., 57(4), 769-771.
|
|
(10)
|
Zhang J-H, Chung TDY, u Oldenburg KR. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throuphut screening assays. J. Biomol. Scr., 4, 67-73
|
|
(11)
|
Besselink H, Middelhof I, u Felzel, E. (2014). Transactivation assay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential using ERα CALUX cells. BioDetection Systems BV (BDS). Amsterdam, in-Netherlands.
|
Appendiċi 4.1
SPEZZJONI VIŻWALI TAL-VIJABBILTÀ TAĊ-ĊELLOLI
B.67 TESTIJIET IN VITRO TAL-MUTAZZJONI ĠENETIKA FUQ ĊELLOLI TAL-MAMMIFERI BL-UŻU TAL-ĠENE TIMIDINA KINAŻI
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linji gwida tat-test 490 tal-OECD (2016). Il-metodi ta’ ttestjar jiġu rieżaminati u riveduti kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku, tal-ħtiġijiet regolatorji u tat-trattament xieraq tal-annimali. L-assaġġ tal-linfoma tal-ġrieden (MLA) u t-test TK6 bl-użu tal-lokus tat-timidina kinażi (TK) oriġinarjament kienu jinsabu fil-metodu ta’ ttestjar B.17. Imbagħad, il-Grupp ta’ Ħidma ta’ Esperti tal-MLA tal-Grupp ta’ Ħidma Internazzjonali dwar l-Ittestjar tal-Ġenotossiċità (IWGT) żviluppa rakkomandazzjonijiet armonizzati fil-livell internazzjonali għall-kriterji ta’ aċċettazzjoni tal-assaġġi u għall-interpretazzjoni tad-data għall-MLA (1)(2)(3)(4)(5), u dawn ir-rakkomandazzjonijiet huma inkorporati f’dan il-metodu ta’ ttestjar il-ġdid B.67. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu miktub għall-MLA u, minħabba li juża wkoll il-lokus tat-TK, it-test TK6. Filwaqt li l-MLA ntuża ħafna għal finijiet regolatorji, it-TK6 intuża ferm anqas spiss. Ta’ min jinnota li minkejja s-similarità bejn il-punti ta’ tmiem, iż-żewġ linji ta’ ċelloli mhumiex interkambjabbli u l-programmi regolatorji jistgħu jesprimu validament preferenza għal waħda fuq l-oħra għal użu regolatorju partikolari. Pereżempju, il-validazzjoni tal-MLA wriet ix-xerqien ta’ dan għad-detezzjoni mhux biss tal-mutazzjoni ġenika, iżda anki l-ħila ta’ sustanza kimika tat-test li tinduċi ħsara kromożomika strutturali. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu parti minn sensiela ta’ metodi ta’ ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. L-OECD żviluppat dokument li jipprovdi informazzjoni sintetika fuq l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali lejn it-tibdiliet riċenti li seħħew fil-linji gwida tat-test tal-OECD dwar it-tossiċità ġenetika (6).
|
|
2.
|
L-iskop tat-testijiet in vitro tal-mutazzjoni ġenetika fuq ċelloli tal-mammiferi hu li jindividwaw il-mutazzjonijiet ġenetiċi indotti mis-sustanzi kimiċi. Il-linji ta’ ċelloli użati f’dawn it-testijiet ikejlu l-mutazzjonijiet ’il quddiem fil-ġeni indikaturi, speċifikament il-ġene timidina kinażi endoġena (TK għaċ-ċelloli tal-bniedem u Tk għaċ-ċelloli tar-rodituri, kollettivament imsejħa TK f’dan il-metodu ta’ ttestjar). Dan il-metodu ta’ ttestjar hu maħsub biex jintuża b’żewġ linji ta’ ċelloli: il-linja ta’ ċelloli tal-linfoma tal-ġrieden L5178Y TK+/--3.7.2C (ġeneralment imsejħa L5178Y) u l-linja ta’ ċelloli linfoblastojde umana TK6 (ġeneralment imsejħa TK6). Għalkemm iż-żewġ linji ta’ ċelloli jvarjaw minħabba l-oriġini tagħhom, it-tkabbir taċ-ċelloli, l-istatus tal-p53, eċċ., it-testijiet tal-mutazzjoni ġenika TK jistgħu jitwettqu b’mod simili fiż-żewġ tipi ta’ ċelloli kif deskritt f’dan il-metodu ta’ ttestjar.
|
|
3.
|
In-natura awtosomali u eterożiguża tal-ġene timidina kinażi tippermetti d-detezzjoni ta’ kolonji vijabbli li ċ-ċelloli tagħhom ikunu nieqsa mill-enzima timidina kinażi wara l-mutazzjoni minn TK+/-
għal TK-/-
. Dan in-nuqqas jista’ jirriżulta minn avvenimenti ġenetiċi li jaffettwaw il-ġene TK inklużi ż-żewġ mutazzjonijiet ġeniċi (mutazzjonijiet puntwali, mutazzjonijiet li jibdlu l-qari tal-kodiċi ġenetiku, tħassiriet żgħar, eċċ.) u avvenimenti kromożomiċi (tħassiriet kbar, riarranġamenti kromożomali u rikombinazzjoni mitotika). Dawn l-avvenimenti msemmija l-aħħar huma espressi bħala telf tal-eterożigożità, li hu tibdil ġenetiku komuni tal-ġeni suppressur tat-tumuri fit-tumoriġenesi umana. Fit-teorija, telf tal-kromożoma sħiħa li ġġorr il-ġene TK li tirriżulta mill-indeboliment tal-fus u/jew minn nondisġunzjoni mitotika jista’ jiġi individwat fl-MLA. Tabilħaqq, taħlita ta’ analiżi ċitoġenika u molekolari turi biċ-ċar li ċerti mutanti tat-TK tal-MLA huma r-riżultat tan-nondisġunzjoni. Madankollu, il-piż tal-evidenza juri li t-testijiet tal-mutazzjoni ġenika TK ma jistgħux jindividwaw b’mod affidabbli anewġeni meta jiġu applikati kriterji standard taċ-ċitotossiċità (kif deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar) u għaldaqstant, mhuwiex xieraq li jintużaw dawn it-testijiet biex jiġu individwati anewġeni (7)(8)(9).
|
|
4.
|
Fit-testijiet tal-mutazzjoni ġenika tat-TK, jiġu ġenerati żewġ klassijiet fenotipiċi distinti ta’ mutanti tat-TK; il-mutanti li jikbru normali li jikbru bl-istess rata bħaċ-ċelloli eterożigużi tat-TK, u l-mutanti li jikbru bil-mod li jikbru b’ħinijiet ta’ rdoppjar imtawla. Il-mutanti li jikbru normali u dawk li jikbru bil-mod huma rikonoxxuti bħala mutanti ta’ kolonja kbira u ta’ kolonja żgħira fl-MLA u bħala kolonja li tidher kmieni u bħala mutanti ta’ kolonja li tidher tard fit-TK6. In-natura molekolari u ċitoġenetika ta’ mutanti tal-MLA ta’ kolonji kbar kif ukoll żgħar ġiet esplorata fid-dettall (8)(10)(11)(12)(13). In-natura molekolari u ċitoġenetika tal-mutanti li jidhru kmieni u dawk li jidhru tard tat-TK6 ġiet investigata fil-fond ukoll (14)(15)(16)(17). Mutanti li jikbru bil-mod għaż-żewġ tipi ta’ ċelloli ġarrbu ħsara ġenetika li tinvolvi ġene/i regolatorju/i tat-tkabbir putattiv qrib il-locus tat-TK li tirriżulta f’ħinijiet ta’ rdoppjar imtawla u fil-formazzjoni ta’ kolonji li jidhru tard jew żgħar (18). L-induzzjoni ta’ mutanti li jikbru bil-mod ġiet assoċjata ma’ sustanzi kimiċi li jinduċu tibdiliet strutturali kbar fil-livell kromożomiku. Ċelloli li l-ħsara tagħhom ma tinvolvix il-ġene/i regolatorju/i tat-tkabbir putattiv ħdejn il-lokus tat-TK jikbru b’rati simili għaċ-ċelloli omm u jsiru mutanti li jikbru normali. L-induzzjoni ta’ primarjament mutanti li jikbru b’mod normali hi assoċjata ma’ sustanzi kimiċi li primarjament jaġixxu bħala mutaġeni puntwali. Konsegwentement, hu essenzjali li jingħaddu kemm il-mutanti li jikbru bil-mod kif ukoll dawk li jikbru normali biex jiġu rkuprati l-mutanti kollha u tiġi pprovduta xi idea dwar it-tip(i) ta’ ħsara (mutaġeni vs. klastoġeni) indotta mis-sustanza kimika tat-test (10)(12)(18)(19).
|
|
5.
|
Il-metodu ta’ ttestjar hu organizzat biex jipprovdi informazzjoni ġenerali li tapplika kemm għall-MLA kif ukoll għat-TK6 u gwida speċjalizzata għat-testijiet individwali.
|
|
6.
|
Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
7.
|
Ġeneralment it-testijiet imwettqa in vitro jeħtieġu l-użu ta’ sors esoġenu ta’ attivazzjoni metabolika. Is-sistema esoġena ta’ attivazzjoni metabolika ma timitax għalkollox il-kundizzjonijiet in vivo.
|
|
8.
|
Għandha tingħata attenzjoni biex jiġu evitati kundizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati pożittivi artefattwali, (jiġifieri interazzjonijiet possibbli mas-sistema tat-test), mhux ikkawżati minn interazzjoni bejn is-sustanza kimika tat-test u l-materjal ġenetiku taċ-ċellola; tali kundizzjonijiet jinkludu tibdiliet fil-pH jew fl-ożmolalità, interazzjoni mal-komponenti tal-medium (20)(21) jew livelli eċċessivi ta’ ċitotossiċità (22)(23)(24). Ċitotossiċità li taqbeż il-livelli massimi rakkomandati ta’ ċitotossiċità kif definiti fil-paragrafu 28 titqies eċċessiva għall-MLA u għat-TK6. Barra minn hekk, ta’ min jinnota li s-sustanzi kimiċi tat-test li jkunu analogi tat-timidina, jew li jġibu ruħhom bħal analogi tat-timidina jistgħu jżidu l-frekwenza mutanti bit-tkabbir selettiv tal-mutanti ta’ sfond spontanji matul it-trattament taċ-ċelloli u jeħtieġu metodi ta’ ttestjar addizzjonali għal evalwazzjoni adegwata (25).
|
|
9.
|
Għal nanomaterjali manifatturati, jaf ikun hemm bżonn li jsiru adattamenti speċifiċi ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar li ma jkunux deskritti fih.
|
|
10.
|
Qabel ma jintuża dan il-metodu ta’ ttestjar għall-ittestjar ta’ taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
|
|
11.
|
Iċ-ċelloli mutanti nieqsa mill-attività enzimatika tat-timidina kinażi minħabba mutazzjoni TK
+/- għal TK
-/- huma reżistenti għall-effetti ċitostatiċi tat-trifluworotimidina (TFT) tal-analogu tal-pirimidina. Iċ-ċelloli profiċjenti huma sensittivi għat-TFT, li toħloq l-inibizzjoni tal-metaboliżmu ċellolari u twaqqaf aktar diviżjoni fiċ-ċelloli. B’hekk, iċ-ċelloli mutanti jkunu kapaċi jipproliferaw fil-preżenza tat-TFT u jifformaw kolonji viżibbli, filwaqt li ċ-ċelloli li fihom l-enzima TK ma jkunux.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
12.
|
Iċ-ċelloli f’sospensjoni jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test, kemm b’sors esoġenu ta’ attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr (ara l-paragrafu 19), għal perjodu xieraq ta’ żmien (ara l-paragrafu 33), u mbagħad jiġu subkolturati biex tiġi determinata ċ-ċitotossiċità u titħalla l-espressjoni fenotipika qabel l-għażla tal-mutant. Iċ-ċitotossiċità tiġi determinata bit-tkabbir totali relattiv (RTG—ara l-paragrafu 25) għall-MLA u mis-sopravivenza relattiva (Rs—ara l-paragrafu 26) għat-TK6. Il-kolturi ttrattati jinżammu f’medium tat-tkabbir għal perjodu ta’ żmien suffiċjenti, karatteristika ta’ kull tip ta’ ċellola (ara l-paragrafu 37), biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutazzjonijiet magħmula. Wara l-espressjoni fenotipika, il-frekwenza mutanti tiġi stabbilita biż-żrigħ ta’ għadd magħruf ta’ ċelloli f’medium li jkun fih l-aġent selettiv biex jiġu żvelati l-kolonji mutanti, u f’medium mingħajr aġent selettiv biex tiġi żvelata l-effiċjenza tal-klonazzjoni (vijabbiltà). Wara perjodu xieraq ta’ inkubazzjoni, jingħaddu l-kolonji. Il-frekwenza tal-mutanti tiġi kkalkolata fuq il-bażi tan-numru ta’ kolonji mutanti kkoreġut bl-effiċjenza tal-klonazzjoni fil-mument tal-għażla tal-mutanti.
|
DESKRIZZJONI TAL-METODU
Preparamenti
Ċelloli
|
13.
|
Għall-MLA: Minħabba li l-MLA ġie żviluppat u karatterizzatb l-użu tas-sublinja TK
+/- -3.7.2C taċ-ċelloli L5178Y, din is-sublinja speċifika trid tintuża għall-MLA. Il-linja ta’ ċelloli L5178Y ġiet derivata minn linfoma timika indotta mill-metilkolantren minn ġurdien DBA-2 (26). Clive u l-kollegi ttrattaw ċelloli L5178Y (imsejħa minn Clive bħala TK+/+ -3) bis-sulfonat tal-etilmetan u iżolaw klonu tat-TK-/- (imsejjaħ TK-/- -3.7) billi użaw il-bromodeossiuridina bħala l-aġent selettiv. Mill-klonu tat-TK-/-, klonu spontanju TK+/- (imsejjaħ TK+/- -3.7.2.) u subklonu (imsejjaħ TK+/--3.7.2C) ġew iżolati u karatterizzati għall-użu fl-MLA (27). Il-karjotip għal-linja ta’ ċelloli ġie ppubblikat (28)(29)(30)(31). In-numru tal-kromożoma modali hu 40. Hemm kromożoma metaċentrika waħda (t12;13) li għandha tingħadd bħala kromożoma waħda. Il-lokus tat-TK tal-ġurdien jinsab fit-tarf distali tal-kromożoma 11. Il-linja ta’ ċelloli L5178Y TK
+/- -3.7.2C għandha mutazzjonijiet fiż-żewġ alleli p53 u tipproduċi proteina p-53 mutanti (32) (33). L-istatus p53 tal-linja ta’ ċelloli TK+/--3.7.2C aktarx li hu responsabbli għall-ħila tat-test li jindividwa ħsara fuq skala kbira (17).
|
|
14.
|
Għat-TK6: It-TK6 hi linja ta’ ċelloli linfoblastojde umana. Il-linja ta’ ċelloli omm hi linja ta’ ċelloli trasformata b’vajrus Epstein-Barr, WI-L2, li oriġinarjament inkisbet minn tifel ta’ ħames snin bi sferoċitożi ereditarja. L-ewwel klonu iżolat, HH4, ġie mutaġenizzat b’ICR191 u ġiet ġenerata linja ta’ ċelloli eterożiguża tat-TK (34). Iċ-ċelloli TK6 huma kważi diplojdi u l-karjotip rappreżentattiv hu 47, XY, 13+, t(14; 20), t(3; 21) (35). Il-lokus tat-TK uman jinsab fil-fergħa twila tal-kromożoma 17. It-TK6 hi linja ta’ ċelloli kompetenti tal-p53, minħabba li għandha sekwenza p53 tat-tip selvaġġ fiż-żewġ alleli u tesprimi biss il-proteina p53 tat-tip selvaġġ (36).
|
|
15.
|
Kemm għall-MLA kif ukoll għat-TK6, meta l-ewwel jiġi stabbilit jew rifornit stokk prinċipali, hu rakkomandat li l-laboratorju tal-ittestjar jiżgura n-nuqqas ta’ kontaminazzjoni bil-Mikoplażma, jagħti karjotip liċ-ċelloli jew jiżbogħ il-kromożomi li jħaddnu l-lokus tat-TK, u jivverifikaw il-ħinijiet ta’ rdoppjar tal-popolazzjoni. It-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli għaċ-ċelloli użati fil-laboratorju tal-ittestjar għandu jkun stabbilit u konsistenti mal-karatteristiċi taċ-ċelloli ppubblikati (16)(19)(37). Dan l-istokk prinċipali għandu jinħażen f’-150o C jew anqas u jintuża biex jitħejjew l-istokkijiet taċ-ċelloli operatorji kollha.
|
|
16.
|
Jew qabel ma jiġi stabbilit numru kbir ta’ stokkijiet operatorji krijopreservati jew inkella eżatt qabel l-użu f’esperiment, il-koltura jaf ikollha titnaddaf miċ-ċelloli mutanti preeżistenti [sakemm il-frekwenza tal-mutanti tal-kontroll b’solvent (MF) ma tkunx diġà fi ħdan il-medda aċċettabbli—ara t-Tabella 2 għall-MLA)]. Dan jinkiseb bl-użu tal-metotreksat (amminopterina) biex jintgħażlu kontra ċelloli nieqsa mit-TK u jiżdiedu t-timidina, l-ipossantina u l-gliċina (L5178Y) jew 2’-deossiċitidina (TK6) mal-koltura biex jiġi żgurat tkabbir ottimali taċ-ċelloli kompetenti tat-TK (19)(38)(39), u (40) għat-TK6). Parir ġenerali dwar il-prattika tajba għaż-żamma tal-kolturi taċ-ċelloli kif ukoll parir speċifiku għaċ-ċelloli L5178Y u TK6 jistgħu jinkisbu minn (19)(31)(37)(39)(41). Għal laboratorji li jeħtieġu stokkijiet ta’ ċelloli prinċipali biex jibdew l-MLA jew inkella t-TK6 jew biex jiksbu stokkijiet ta’ ċelloli prinċipali ġodda, hemm disponibbli repożitorju taċ-ċelloli ta’ ċelloli karatterizzati sew (37).
|
Kundizzjonijiet tal-media tal-koltura
|
17.
|
Għaż-żewġ testijiet, għandhom jintużaw kundizzjonijiet xierqa tal-media tal-koltura u tal-inkubazzjoni (eż. reċipjenti tal-koltura, atmosfera umidifikata ta’ 5 % CO2, temperatura ta’ inkubazzjoni ta’ 37 °C) għaż-żamma tal-kolturi. Il-kolturi taċ-ċelloli dejjem għandhom jinżammu f’kundizzjonijiet li jiżguraw li jkunu qed jikbru fil-fażi log. Hu partikolarment importanti li jintgħażlu kundizzjonijiet tal-media u tal-kolturi li jiżguraw l-iżvilupp ottimali taċ-ċelloli matul il-perjodu ta’ espressjoni u klonazzjoni kemm għaċ-ċelloli mutanti kif ukoll għal dawk mhux mutanti. Għall-MLA u għat-TK6, hu importanti wkoll li l-kundizzjonijiet tal-koltura jiżguraw it-tkabbir ottimali kemm tal-mutanti tat-TK ta’ kolonji kbar/li jidhru kmieni kif ukoll ta’ kolonji żgħar/li jidhru tard. Aktar dettalji dwar il-koltura, inkluża l-ħtieġa li jissaħħan kif suppost is-serum taż-żwiemel inattivat jekk jintuża l-medium tal-RPMI matul l-għażla tal-mutanti, jistgħu jinkisbu minn (19)(31)(38)(39)(40)(42).
|
Preparazzjoni tal-kolturi
|
18.
|
Iċ-ċelloli jiġu propagati minn kolturi omm, miżrugħa fil-medium tat-tkabbir b’densità tali li l-kolturi f’sospensjonijiet jibqgħu jikbru b’mod esponenzjali matul it-trattament u l-perjodi ta’ espressjoni kollha kemm huma.
|
Attivazzjoni metabolika
|
19.
|
Għandhom jintużaw sistemi metabolizzanti esoġeni meta jintużaw ċelloli L5178Y u TK6 għaliex għandhom kapaċità metabolika endoġena inadegwata. L-aktar sistema użata spiss, li hi l-ewwel rakkomandata, sakemm ma jkunx ġustifikat mod ieħor, hi frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata minn kofatturi (S9) imħejjija mill-fwied ta’ rodituri (ġeneralment firien) trattati b’indutturi enzimatiċi bħal Aroclor 1254 (43)(44)(45) jew taħlita ta’ fenobarbital u ta’ β-naftoflavon (46)(47)(48)(49)(50)(51). Din it-taħlita msemmija l-aħħar ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta’ Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes (52) u ntwera li hi effettiva daqs Aroclor1254 għall-induzzjoni ta’ ossidażijiet b’funzjoni mħallta (45)(46)(47)(48)(49). Il-frazzjoni S9 normalment tintuża f’konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1-2 % (v/v) iżda tista’ tiżdied sa 10 % (v/v) fil-medium tat-test finali. L-għażla tat-tip u l-konċentrazzjoni ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika eżoġena jew induttur metaboliku użati tista’ tkun influwenzata mill-klassi tas-sustanzi kimiċi tat-test.
|
Preparati tas-sustanza kimika tat-test
|
20.
|
Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jiġu ppreparati f’solventi xierqa u jiġu dilwiti, jekk dan ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 21). Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistema tat-test u/jew jiġu dilwiti qabel it-trattament tas-sistema tat-test. Is-sustanzi kimiċi gassużi jew volatili tat-test għandhom jiġu ttestjati b’modifiki xierqa fil-protokolli standard, bħat-trattament f’reċipjenti tal-koltura ssiġillati (53)(54)(55). Il-preparati tas-sustanza kimika tat-test għandhom isiru eżatt qabel it-trattament, sakemm id-data dwar l-istabbiltà ma turix l-aċċettabbiltà tal-ħżin.
|
KUNDIZZJONIJIET TAT-TEST
Solventi
|
21.
|
Is-solvent għandu jingħażel biex tiġi ottimizzata s-solubbiltà tas-sustanza kimika tat-test mingħajr ma jitħalla impatt avvers fuq it-twettiq tal-assaġġ, e¿. tibdil fit-tkabbir taċ-ċelloli, effett fuq l-integrità tas-sustanza kimika tat-test, reazzjoni ma’ reċipjenti tal-koltura, indeboliment tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika. Hu rakkomandat li, kull meta dan ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta’ solvent milwiem (jew medium tat-tkabbir). Fost is-solventi ferm stabbiliti hemm l-ilma jew is-sulfossidu tad-dimetil. Ġeneralment, is-solventi organiċi ma għandhomx jaqbżu l-1 % (v/v) u s-solventi milwiema (salina jew ilma) ma għandhomx jaqbżu l-10 % (v/v) fil-medium tat-trattament finali. Jekk jintużaw solventi li ma jkunux ferm stabbiliti (eż. etanol jew aċeton), l-użu tagħhom għandu jkun sostnut minn data li tindika l-kompatibbiltà tagħhom mas-sustanzi kimiċi tat-test, mas-sistema tat-test, u n-nuqqas tagħhom ta’ tossiċità ġenetika bil-konċentrazzjoni użata. Fin-nuqqas ta’ dik id-data ta’ sostenn, importanti li jiġu inklużi kontrolli mhux trattati (ara l-Appendiċi 1, Definizzjonijiet) biex jintwera li s-solvent magħżul ma jinduċi ebda effett dannuż jew mutaġeniku.
|
KEJL TAĊ-ĊITOTOSSIĊITÀ U GĦAŻLA TAL-KONĊENTRAZZJONIJIET TAT-TRATTAMENT
|
22.
|
Meta wieħed jistabbilixxi l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, għandhom jiġu evitati konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva (ara l-paragrafu 28), il-preċipitazzjoni (ara l-paragrafu 29) fil-medium tat-tkabbir, jew bidliet ċari fil-pH jew ożmolalità (ara l-paragrafu 5). Jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tibdil ċar fil-pH tal-medium fi żmien iż-żieda, il-pH tista’ tiġi aġġustata bl-ibbaferjar tal-medium tat-trattament finali biex jiġu evitati riżultati pożittivi artefattwali u biex jinżammu l-kundizzjonijiet xierqa tal-koltura.
|
|
23.
|
L-għażla tal-konċentrazzjoni hi bbażata fuq iċ-ċitotossiċità u fuq kunsiderazzjonijiet oħra (ara l-paragrafi 27-30). Filwaqt li l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità f’test inizjali tista’ tkun siewja biex jiġu definiti aħjar il-konċentrazzjonijiet li jkunu se jintużaw fl-esperiment ewlieni, test inizjali mhuwiex meħtieġ. Anki jekk issir evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità inizjali, il-kejl taċ-ċitotossiċità għal kull koltura xorta waħda jkun meħtieġ fl-esperiment ewlieni. Jekk isir esperiment għas-sejbien tal-medda, dan għandu jkopri firxa wiesgħa ta’ konċentrazzjonijiet u jista’ jew jiġi terminat fil-jum 1 wara t-trattament jew jibqa’ għaddej matul l-espressjoni tal-jum 2 u l-għażla tal-mutanti (jekk jidher li l-konċentrazzjonijiet użati jkunu xierqa).
|
|
24.
|
Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi determinata għal kull koltura tat-test u kull koltura tal-kontroll individwali: il-metodi għall-MLA (2) u għat-TK6 (15) huma definiti bi prattika miftiehma fil-livell internazzjonali.
|
|
25.
|
Kemm għall-verżjoni tal-agar kif ukoll għall-verżjoni tal-mikropjastri tal-MLA: Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi evalwata bl-użu tat-tkabbir totali relattiv (RTG) li orġinarjament ġie definit minn Clive u Spector fl-1975 (2). Dan il-kejl jinkludi l-iżvilupp relattiv f’sospensjoni (RSG: koltura tat-test vs. kontroll b’solvent) matul it-trattament taċ-ċelloli, il-ħin tal-espressjoni u l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (RCE): koltura tat-test vs. kontroll b’solvent) fil-ħin li fih jingħażlu l-mutanti (2). Ta’ min jinnota li l-RSG jinkludi kwalunkwe telf ta’ ċelloli li jseħħ fil-koltura tat-test matul it-trattament (Ara l-Appendiċi 2 għall-formuli).
|
|
26.
|
Għal TK6: Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi evalwata bl-użu tas-sopravivenza relattiva (RS), jiġifieri l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament, aġġustata għal kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament, fuq il-bażi tal-għadd taċ-ċelloli, meta mqabbla mal-l-kontroll negattiv (assenjati sopravivenza ta’ 100 %) (Ara l-Appendiċi 2 għall-formula).
|
|
27.
|
Għandhom jiġu evalwati tal-anqas erba’ konċentrazzjonijiet tat-test (mhux inklużi l-kontrolli tas-solvent u pożittivi) li jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettabbiltà (iċ-ċitotossiċità xierqa, in-numru ta’ ċelloli, eċċ.). Filwaqt li l-użu ta’ kolturi duplikati hu rakkomandat, jistgħu jintużaw kolturi repliki jew trattati individwalment f’kull konċentrazzjoni ttestjata. Ir-riżultati miksuba għall-kolturi rreplikati f’konċentrazzjoni partikolari għandhom jiġu rrapportati b’mod separat iżda jistgħu jiġu aggregati għall-analiżi tad-data (55). Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru tossiċità baxxa jew ebda tossiċità, intervalli tal-konċentrazzjoni ta’ madwar id-doppju jew it-triplu normalment ikunu xierqa. Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet għandhom jintgħażlu biex ikopru l-medda ta’ ċitotossiċità minn dik iċ-ċitotossiċità produttiva kif deskritta fil-paragrafu 28 u inklużi konċentrazzjonijiet li fihom ikun hemm ċitotossiċità moderata u baxxa jew ebda ċitotossiċità. Ħafna sustanzi kimiċi tat-test juru kurvi konċentrazzjoni rispons wiqfin u, biex tkun koperta l-medda sħiħa taċ-ċitotossiċità jew biex jiġu studjati l-konċentrazzjoni u r-rispons fid-dettall, jaf ikun hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjonijiet spazjati aktar qrib xulxin u aktar minn erba’ konċentrazzjonijiet, speċjalment f’sitwazzjonijiet li fihom ikun hemm bżonn li jsir esperiment ripetut (ara l-paragrafu 43). L-użu ta’ aktar minn erba’ konċentrazzjonijiet jista’ jkun partikolarment importanti meta jintużaw kolturi individwali.
|
|
28.
|
Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tilħaq bejn 20 u 10 % RTG għall-MLA, u bejn 20 u 10 % RS għat-TK6 (paragrafu 67).
|
|
29.
|
Għal sustanzi kimiċi tat-test ftit li xejn solubbli li mhumiex ċitotossiċi f’konċentrazzjonijiet anqas mill-anqas konċentrazzjoni insolubbli, l-ogħla konċentrazzjoni analizzata għandha tipproduċi turbidità jew preċipitat viżibbli bl-għajnejn jew bl-għajnuna ta’ mikroskopju invertit fi tmiem it-test bis-sustanza kimika tat-test. Anki jekk iċ-ċitotossiċità sseħħ f’livelli inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, huwa rakkomandat li l-ittestjar isir f’konċentrazzjoni waħda biss li tipproduċi turbidità jew bi preċipitat viżibbli għaliex jistgħu jirriżultaw effetti artifattwali mill-preċipitat. Peress li l-MLA u t-TK6 jużaw kolturi ta’ sospensjoni, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi żgurat li l-preċipitat ma jxekkilx it-twettiq tat-test. Id-determinazzjoni tas-solubbiltà fil-medium tat-tkabbir qabel l-esperiment tista’ tkun utli wkoll.
|
|
30.
|
Jekk ma jiġu osservati ebda preċipitat jew ċitotossiċità li tillimita, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun tikkorrispondi għal 10 mM, 2 mg/ml jew 2 μl/ml, liema minnhom tkun l-anqas (57)(58). Meta s-sustanza kimika tat-test ma jkollhiex kompożizzjoni definita, eż. sustanza b’kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa [jiġifieri Sustanzi Kimiċi b’Kompożizzjoni mhux magħrufa jew Varjabbli (UVCBs)], estratti ambjentali, eċċ., il-konċentrazzjoni massima jaf ikollha bżonn tkun ogħla (eż. 5 mg/ml), fin-nuqqas ta’ biżżejjed ċitotossiċità, biex tiżdied il-konċentrazzjoni ta’ kull wieħed mill-komponenti. Madankollu, ta’ min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (59).
|
Kontrolli
|
31.
|
Għal kull kundizzjoni sperimentali għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi konkorrenti (ara l-paragrafu 21) li jikkonsistu f’solvent waħdu fil-medium tat-trattament u mmaniġġjati bl-istess mod bħall-kolturi tat-trattament.
|
|
32.
|
Kontrolli pożittivi konkorrenti huma meħtieġa biex juru l-ħila tal-laboratorju fl-identifikazzjoni ta’ mutaġeni fil-kundizzjonijiet tal-protokoll tat-test użat, l-effikaċja tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika esoġena (meta applikabbli), u biex tintwera detezzjoni adegwata ta’ mutanti tat-TK żgħar/li jidhru tard kif ukoll dawk kbar/li jidhru kmieni. Fit-tabella 1 ta’ hawn taħt jingħataw eżempji ta’ kontrolli pożittivi. Jistgħu jintużaw sustanzi ta’ kontroll pożittiv oħra, jekk ikunu ġustifikati. Peress li t-testijiet in vitro taċ-ċelloli tal-mammiferi huma standardizzati biżżejjed għal trattamenti fuq terminu qasir (minn tlieta sa erba’ sigħat) li jsiru b’mod parallel ma’ u mingħajr attivazzjoni metabolika bl-użu tal-istess durata tat-trattament, l-użu tal-kontrolli pożittivi jista’ jkun limitat għal mutaġenu li jeħtieġ attivazzjoni metabolika. F’dan il-każ, dan ir-rispons tal-kontroll pożittiv individwali se juri kemm l-attività tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika kif ukoll ir-risponsività tas-sistema tat-test. Madankollu, jekk jintuża, trattament fit-tul (jiġifieri 24 siegħa mingħajr S9) għandu jkollu l-kontroll pożittiv tiegħu stess peress li d-durata tat-trattament sejra tvarja mit-test bl-użu tal-attivazzjoni metabolika. Kull kontroll pożittiv għandu jintuża f’konċentrazzjoni waħda jew aktar li tkun mistennija tagħti żidiet riproduċibbli u individwabbli li jispikkaw biex tintwera s-sensittività tas-sistema tat-test, u r-rispons ma għandux ikun imxekkel miċ-ċitotossiċità li taqbeż il-limiti speċifikati f’dan it-TM (ara l-paragrafu 28).
|
Tabella 1
Sustanzi ta’ referenza rakkomandati għall-valutazzjoni tal-profiċjenza tal-laboratorju u għall-għażla tal-kontrolli pożittivi
|
Kategorija
|
Sustanza
|
CASRN
|
|
1. Mutaġeni attivi mingħajr attivazzjoni metabolika
|
|
Metansulfonat tal-metil
|
66-27-3
|
|
Mitomiċina C
|
50-07-7
|
|
4-Nitrokinolina-N-Ossidu
|
56-57-5
|
|
2. Mutaġeni li jeħtieġu attivazzjoni metabolika
|
|
Benżo(a)piren
|
50-32-8
|
|
Ċiklofosfammid (monoidrat)
|
50-18-0 (6055-19-2)
|
|
7,12-Dimetilbenżantraċen
|
57-97-6
|
|
3-Metilkolantren
|
56-49-5
|
PROĊEDURA
Trattament bis-sustanza kimika tat-test
|
33.
|
Ċelloli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika. L-esponiment għandu jkun għal perjodu xieraq ta’ żmien (normalment perjodu ta’ bejn tlieta u erba’ sigħat ikun adegwat). Madankollu, ta’ min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (59). Għall-MLA, f’każijiet li fihom it-trattament fuq terminu qasir irendi riżultati negattivi, u jkun hemm informazzjoni li tissuġġerixxi l-ħtieġa ta’ trattament itwal [eż. analogi nukleosidiċi, sustanzi kimiċi ftit li xejn solubbli, (5)(59)], għandha tingħata kunsiderazzjoni għat-twettiq tat-test mingħajr trattament aktar fit-tul, jiġifieri 24 siegħa mingħajr S9.
|
|
34.
|
In-numru minimu ta’ ċelloli użati għal kull koltura tat-test (tal-kontroll u trattata) f’kull stadju fit-test għandu jkun ibbażat fuq il-frekwenza mutanti spontanja. Gwida ġenerali hi li jiġu trattati u passaġġati biżżejjed ċelloli f’kull koltura tal-esperiment biex jinżammu, tal-anqas, 10 iżda, idealment, 100 mutant spontanju f’kull fażi tat-test (trattament, espressjoni fenotipika u għażla tal-mutanti) (56).
|
|
35.
|
Għall-MLA, il-frekwenza mutanti spontanja aċċettabbli rakkomandata hi ta’ bejn 35-140 × 10-6 (il-verżjoni tal-agar) u 50-170 × 10-6 (il-verżjoni tal-mikropjastri) (ara t-Tabella 2). Biex tal-anqas ikun hemm 10 u, idealment, 100 mutant spontanju li jibqgħu ħajjin wara t-trattament għal kull koltura tat-test, hemm bżonn li tal-anqas jiġu trattati 6 × 106 ċelloli. L-immirar għal dan in-numru ta’ ċelloli, u ż-żamma ta’ biżżejjed ċelloli matul l-espressjoni u l-klonazzjoni għall-għażla tal-mutanti, jipprovdu għal numru suffiċjenti ta’ mutanti spontanji (10 jew aktar) matul kull fażi tal-esperiment, anki għall-kolturi trattati f’konċentrazzjonijiet li jirriżultaw f’ċitotossiċità ta’ 90 % (kif imkejla minn RTG ta’ 10 %) (19)(38)(39).
|
|
36.
|
Għat-TK6, il-frekwenza mutanti spontanja ġeneralment tkun ta’ bejn 2 u 10 × 10-6. Biex tal-anqas ikun hemm 10 mutanti spontanji li jibqgħu ħajjin wara t-trattament għal kull koltura, hemm bżonn li tal-anqas jiġu trattati 20 × 106 ċelloli. It-trattament ta’ dan in-numru ta’ ċelloli jipprovdi għal numru suffiċjenti ta’ mutanti spontanji (10 jew aktar) anki għall-kolturi trattati f’konċentrazzjonijiet li jikkawżaw ċitotossiċità ta’ 90 % matul it-trattament (10 % RS). Barra minn hekk, numru suffiċjenti ta’ ċelloli jridu jiġu kolturati matul il-perjodu ta’ espressjoni u pjastrati għall-għażla tal-mutanti (60).
|
Il-ħin tal-espressjoni fenotipika u l-kejl taċ-ċitotossiċità u tal-frekwenza tal-mutanti
|
37.
|
Fi tmiem il-perjodu tat-trattament, iċ-ċelloli jiġu kolturati għal ħin definit biex tinkiseb espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutanti indotti ġodda; speċifiku għal kull linja ta’ ċelloli. Għall-MLA, il-perjodu tal-espressjoni fenotipika hu ta’ jumejn (2). Għat-TK6, il-perjodu tal-espressjoni fenotipika hu ta’ bejn tlieta u erbat ijiem. Jekk jintuża trattament ta’ 24 siegħa, il-perjodu ta’ espressjoni jibda wara li jintemm it-trattament.
|
|
38.
|
Matul il-perjodu tal-espressjoni fenotipika, iċ-ċelloli jiġu enumerati fuq bażi ta’ kuljum. Għall-MLA, l-għadd ta’ kuljum taċ-ċelloli jintuża biex jiġi kkalkolati t-tkabbir ta’ kuljum tas-sospensjoni (SG). Wara l-perjodu ta’ espressjoni ta’ jumejn (2), iċ-ċelloli jiġu sospiżi f’medium b’aġent selettiv u mingħajr għad-determinazzjoni tan-numri ta’ mutanti (pjastri tal-għażla) u għall-effiċjenza tal-klonazzjoni (pjastri tal-vijabbiltà), rispettivament. Għall-MLA hemm żewġ metodi aċċettabbli ndaqs għall-klonazzjoni tal-għażla tal-mutanti; wieħed juża l-agar artab u l-ieħor juża medium likwidu fi pjastri b’96 bwejra (19) (38) (39). Il-klonazzjoni fit-TK6 issir bl-użu ta’ media likwida u bi pjastra b’96 bwejra (16).
|
|
39.
|
It-trifluworotimidina (TFT) hi l-uniku aġent selettiv rakkomandat għall-mutanti tat-TK (61).
|
|
40.
|
Għall-MLA, il-pjastri tal-agar u l-mikropjastri jingħaddu wara inkubazzjoni ta’ 10-12-il jum. Għat-TK6, il-kolonji f’mikropjastri jingħataw punteġġ wara 10-14-il jum għall-mutanti li jidhru kmieni. Biex jiġu rkuprati l-mutanti tat-TK6 li jikbru bil-mod (li jidhru tard), hemm bżonn li ċ-ċelloli jiġu magħlufa mill-ġdid b’medium tat-tkabbir u b’TFT wara l-għadd tal-mutanti li jidhru kmieni u mbagħad il-pjastri jridu jiġu inkubati għal 7-10 ijiem addizzjonali (62). Ara l-paragrafi 42 u 44 għal diskussjoni dwar l-enumerazzjoni tal-mutanti tat-TK li jikbru bil-mod u normali.
|
|
41.
|
Il-kalkoli xierqa għaż-żewġ testijiet inklużi ż-żewġ metodi (agar u mikropjastri) għall-MLA jinsabu fl-Appendiċi 2. Għall-metodu tal-agar tal-MLA, il-kolonji jingħaddu u n-numru ta’ kolonji ta’ mutanti jiġu aġġustati skont l-effiċjenza tal-klonazzjoni biex tiġi kkalkolata MF. Għall-verżjoni tal-mikropjastri tal-MLA u tat-TK6, l-effiċjenza tal-klonazzjoni kemm għall-għażla kif ukoll għall-pjastri tal-effiċjenza tal-klonazzjoni tiġi determinata skont id-distribuzzjoni ta’ Poisson (63). L-MF tiġi kkalkolata minn dawn iż-żewġ effiċjenzi tal-klonazzjoni.
|
Karatterizzazzjoni tal-Kolonji tal-Mutanti
|
42.
|
Għall-MLA, jekk is-sustanza kimika tat-test tkun pożittiva (ara l-paragrafi 62-63), il-karatterizzazzjoni tal-kolonja skont id-daqs tal-kolonja jew it-tkabbir għandha ssir fuq tal-anqas waħda mill-kolturi tat-test (ġeneralment l-ogħla konċentrazzjoni pożittiva aċċettabbli) u fuq il-kontrolli negattivi u pożittivi. Jekk is-sustanza kimika tat-test tkun negattiva (ara l-paragrafu 64), il-karatterizzazzjoni tal-kolonji mutanti għandha ssir fuq il-kontrolli negattivi u pożittivi. Għall-metodu tal-mikropjastri tal-MLA, il-mutanti tal-kolonji żgħar huma definiti bħala dawk li jkopru anqas minn 25 % tad-dijametru tal-bwejra u mutanti tal-kolonji kbar huma dawk li jkopru aktar minn 25 % tad-dijametru tal-bwejra. Għall-metodu tal-agar, jintuża mezz awtomatiku li jgħodd il-kolonji biex jiġu enumerati l-kolonji tal-mutanti u jittieħed id-daqs tal-kolonji. L-approċċi għat-teħid tad-daqs tal-kolonji huma spjegati fid-dettall fid-dokumentazzjoni (19)(38)(40). Il-karatterizazzjoni tal-kolonji fuq il-kontroll negattiv u dak pożittiv hi meħtieġa biex jintwera li l-istudji jitwettqu b’mod adegwat.
|
|
43.
|
Is-sustanza kimika tat-test ma tistax tiġi determinata bħala negattiva jekk kemm il-mutanti tal-kolonji kbar kif ukoll dawk żgħar ma jkunux individwati b’mod adegwat fil-kontroll pożittiv. Il-karatterizzazzjoni tal-kolonji tista’ tintuża biex tiġi pprovduta informazzjoni ġenerali dwar il-ħila tas-sustanza kimika tat-test li tikkawża mutazzjonijiet puntwali u/jew avvenimenti kromożomiċi (il-paragrafu 4).
|
|
44.
|
TK6: Mutanti li jikbru normali u dawk li jikbru bil-mod huma differenzjati minn differenza fil-ħin ta’ inkubazzjoni (ara l-paragrafu 40). Għat-TK6, ġeneralment kemm il-mutanti li jidhru kmieni kif ukoll dawk li jidhru tard jingħataw punteġġ għall-kolturi kollha inklużi l-kontrolli negattivi u pożittivi. Il-karatterizazzjoni tal-kolonji tal-kontroll negattiv u ta’ dak pożittiv hi meħtieġa biex jintwera li l-istudji jitwettqu b’mod adegwat. Is-sustanza kimika tat-test ma tistax tiġi determinata bħala negattiva jekk kemm il-mutanti li jidhru kmieni kif ukoll dawk li jidhru tard ma jkunux individwati b’mod adegwat fil-kontroll pożittiv. Il-karatterizzazzjoni tal-kolonji tista’ tintuża biex tiġi pprovduta informazzjoni ġenerali dwar il-ħila tas-sustanza kimika tat-test li tikkawża mutazzjonijiet puntwali u/jew avvenimenti kromożomiċi (il-paragrafu 4).
|
Profiċjenza tal-laboratorju
|
45.
|
Biex tintwera biżżejjed esperjenza bit-test qabel ma jintuża għall-ittestjar ta’ rutina, il-laboratorju għandu jkun għamel sensiela ta’ esperimenti b’sustanzi pożittivi ta’ referenza li jaġixxu permezz ta’ mekkaniżmi differenti (tal-anqas waħda b’attivazzjoni metabolika u waħda mingħajr magħżula mis-sustanzi elenkati fit-Tabella 1) u diversi kontrolli negattivi (inklużi kolturi mhux trattati u diversi solventi/veikoli). Dawn ir-risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv reazzjonijiet għandhom ikunu konsistenti mad-dokumentazzjoni. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li jkollhom esperjenza, jiġifieri li jkollhom bażi ta’ data storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 47-50. Għall-MLA, il-valuri miksuba għall-kontrolli pożittivi kif ukoll għal dawk negattivi għandhom ikunu konsistenti mar-rakkomandazzjonijiet tal-IWGT (ara t-Tabella 2).
|
|
46.
|
Għażla ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv (ara t-Tabella 1 fil-paragrafu 25) għandha tiġi investigata bi trattamenti qosra u twal (jekk jintużaw trattamenti twal) fin-nuqqas ta’ attivazzjoni metabolika, u anki bit-trattament qasir fil-preżenza ta’ attivazzjoni metabolika, biex tintwera l-profiċjenza fl-iżvelar ta’ sustanzi kimiċi mutaġeniċi, biex tiġi ddeterminata l-effikaċja tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika u biex tintwera l-adegwatezza tal-kundizzjonijiet tat-tkabbir taċ-ċelloli matul it-trattament, l-espressjoni fenotipika u l-għażla tal-mutanti u tal-proċeduri tal-għoti ta’ punteġġ. Għandha tingħażel medda ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanzi magħżulin biex jingħataw żidiet riproduċibbli u marbutin mal-konċentrazzjoni li jispikkaw biex jintwerew is-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test.
|
Data storika tal-kontroll
|
47.
|
Il-laboratorju għandu jistabbilixxi:
|
—
|
Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv,
|
|
—
|
Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv (mhux trattat, solvent).
|
|
|
48.
|
Meta għall-ewwel tinkiseb id-data għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi konkorrenti għandhom ikunu konsistenti mad-data tal-kontroll negattiv ippubblikata. Peress li tiżdied aktar data sperimentali mad-distribuzzjoni tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi konkorrenti għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta’ kontroll ta’ 95 % ta’ dik id-distribuzzjoni (64)(65).
|
|
49.
|
Il-bażi ta’ data storika tal-kontrolli negattivi tal-laboratorju għall-ewwel għandha tinbena b’minimu ta’ 10 esperimenti iżda idealment tkun tikkonsisti f’tal-anqas 20 esperiment imwettqin f’kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta’ kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (65), biex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-data tal-kontroll pożittiv u negattiv tagħhom, u biex juru li l-metodoloġija hi “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom (66). Aktar dettalji u rakkomandazzjonijiet dwar kif tibni u tuża d-data storika jistgħu jinkisbu mid-dokumentazzjoni (64).
|
|
50.
|
Id-data ta’ kontroll negattiv għandha tikkonsisti fi frekwenzi mutanti minn kolturi individwali jew idealment repliki kif deskritt fil-paragrafu 27. Idealment, il-kontrolli negattivi konkorrenti għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta’ kontroll ta’ 95 % tad-distribuzzjoni tal-bażi ta’ data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-data tal-kontroll negattiv toħroġ mil-limitu ta’ kontroll ta’ 95 %, din tista’ titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll dment li din id-data ma tkunx eċċezzjoni estrema, ikun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 49) u jkun hemm evidenza ta’ ebda żball tekniku jew uman.
|
|
51.
|
Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-konsistenza tad-data mal-bażijiet ta’ data tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta’ bażi ta’ data storika ġdida tal-kontroll.
|
DATA U RAPPORTAR
Preżentazzjoni tar-riżultati
|
52.
|
Il-preżentazzjoni tad-data għall-MLA kif ukoll għat-TK6 għandha tinkludi, għall-kolturi trattati kif ukoll għal dawk tal-kontroll, id-data meħtieġa għall-kalkolu taċ-ċitotossiċità (RTG jew RS, rispettivament) u tal-frekwenzi mutanti, kif deskritti hawn taħt.
|
|
53.
|
Għall-MLA, id-data tal-kolturi individwali għandha tiġi pprovduta għall-RSG, għall-RTG, għall-effiċjenza tal-klonazzjoni fil-mument tal-għażla tal-mutanti u għan-numru ta’ kolonji ta’ mutanti (għall-verżjoni tal-agar) jew għan-numru ta’ bwejriet vojta (għall-verżjoni tal-mikropjastri). L-MF għandha tiġi espressa bħala numru ta’ ċelloli mutanti għal kull miljun ċellola li tibqa’ ħajja. Jekk ir-rispons ikun pożittiv, l-MFs ta’ kolonji żgħar u kbar (u/jew il-perċentwal tal-MF totali) għandhom jingħataw għal tal-anqas konċentrazzjoni waħda tas-sustanza kimika tat-test (ġeneralment l-ogħla konċentrazzjoni pożittiva) u għall-kontrolli negattivi u pożittivi. Fil-każ ta’ rispons negattiv, l-MF tal-kolonji żgħar u kbar għandha tingħata għall-kontroll negattiv u għall-kontroll pożittiv.
|
|
54.
|
Għat-TK6, id-data dwar il-kolturi individwali għandha tiġi pprovduta għall-RS, għall-effiċjenza tal-klonazzjoni fil-mument tal-għażla tal-mutanti u għan-numru ta’ bwejriet vojta għall-mutanti li jidhru kmieni u dawk li jidhru tard. L-MF għandha tiġi espressa bħala numru ta’ ċelloli mutanti għal kull numru ta’ ċelloli li jibqgħu ħajjin, u għandha tinkludi l-MF totali kif ukoll l-MF (u/jew il-perċentwal tal-MF totali) tal-mutanti li jidhru kmieni u tard.
|
Kriterji ta’ Aċċettabbiltà
|
55.
|
Kemm għall-MLA kif ukoll għat-TK6, għandhom jiġu ssodisfati l-kriterji li ġejjin qabel ma jiġu determinati r-riżultati ġenerali għal sustanza kimika tat-test speċifika:
|
—
|
Saru żewġ kundizzjonijiet sperimentali (trattament qasir b’attivazzjoni metabolika u mingħajr - ara l-paragrafu 33) sakemm waħda ma rriżultatx f’riżultati pożittivi.
|
|
—
|
Għandu jkun analizzabbli numru adegwat ta’ ċelloli u ta’ dożi (ara l-paragrafi 27, 34-36).
|
|
—
|
Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla konċentrazzjoni huma konsistenti ma’ dawk deskritti fil-paragrafi 28-30.
|
|
Il-kriterji ta’ aċċettabbiltà għall-kontrolli negattivi u pożittivi
|
56.
|
L-analiżi mill-Grupp ta’ Ħidma ta’ Esperti tal-MLA tal-IWGT ta’ ammont estensiv ta’ data dwar l-MLA sarrfet f’kunsens internazzjonali għal kriterji ta’ aċċettabbiltà speċifiċi għall-MLA (1)(2)(3)(4)(5). Għaldaqstant, dan il-metodu ta’ ttestjar jipprovdi rakkomandazzjonijiet speċifiċi għad-determinazzjoni tal-aċċettabbiltà tal-kontrolli negattivi u pożittivi u għall-evalwazzjoni tar-riżultati ta’ sustanzi individwali fl-MLA. It-TK6 għandha bażi ta’ data ferm iżgħar u ma saritilhiex evalwazzjoni minn grupp ta’ ħidma.
|
|
57.
|
Għall-MLA, kull esperiment għandu jiġi evalwat dwar jekk il-kontroll mhux trattat/b’solvent jissodisfax il-kriterji ta’ aċċettazzjoni tal-Grupp ta’ Ħidma dwar l-MLA tal-IWGT ((4) u t-Tabella 2, hawn taħt): (1) għall-MF (kun af li l-MFs aċċettabbli tal-IWGT huma differenti għall-verżjonijiet tal-agar u tal-mikropjastri tal-MLA), (2) għall-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) fil-ħin tal-għażla tal-mutanti u (3) għall-iżvilupp f’sospensjoni (SG) għall-kontroll b’solvent (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli).
Tabella 2
Il-kriterji ta’ aċċettabbiltà għall-MLA
|
Parametru
|
Metodu tal-Agar Artab
|
Metodu tal-Mikropjastri
|
|
Frekwenza Mutanti
|
35 – 140 × 10-6
|
50 – 170 × 10-6
|
|
Effiċjenza tal-Klonazzjoni
|
65 - 120 %
|
65 - 120 %
|
|
Żvilupp f’Sospensjoni
|
8 – 32 darba (trattament ta’ 3-4 sigħat) 32 – 180 darba (trattament ta’ 24 sigħat, jekk isir)
|
8 – 32 darba (trattament ta’ 3-4 sigħat) 32 – 180 darba (trattament ta’ 24 sigħat, jekk isir)
|
|
|
58.
|
Għall-MLA, kull test għandu jkun evalwat ukoll dwar jekk il-kontroll(i) pożittiv(i) jissodisfax/jissodisfawx tal-anqas wieħed miż-żewġ kriterji ta’ aċċettazzjoni li ġejjin żviluppati mill-grupp ta’ ħidma tal-IWGT:
|
—
|
Il-kontroll pożittiv għandu juru żieda assoluta fl-MF totali, jiġifieri żieda ta’ aktar mill-MF ta’ sfond spontanja [MF indotta (IMF)] ta’ tal-anqas 300 × 10-6. Tal-anqas 40 % tal-IMF għandha tkun riflessa fl-MF tal-kolonja ż-żgħira.
|
|
—
|
Il-kontroll pożittiv għandu żieda fl-MF tal-kolonja ż-żgħira ta’ tal-anqas 150 × 10-6 ogħla minn dik li dehret fil-kontroll mhux trattat/b’solvent konkorrenti (IMF ta’ kolonja żgħira ta’ 150 × 10-6).
|
|
|
59.
|
Għat-TK6, test ikun aċċettabbli jekk il-kontroll negattiv konkorrenti jitqies aċċettabbli għaż-żieda fil-bażi ta’ data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju kif deskritt fil-paragrafi 48-49. Barra minn hekk, il-kontrolli negattivi konkorrenti (ara l-paragrafu 32) għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma’ dawk iġġenerati fil-bażi ta’ data storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv konkorrenti.
|
|
60.
|
Għaż-żewġ testijiet, il-limitu superjuri taċ-ċitotossiċità osservat fil-koltura tal-kontroll pożittiv għandu jkun l-istess bħal dak tal-kolturi sperimentali. Jiġifieri, l-RTG/RS ma għandhiex tkun anqas minn 10 %. Biżżejjed li tintuża konċentrazzjoni waħda (jew waħda mill-konċentrazzjonijiet tal-kolturi tal-kontroll pożittiv jekk tintuża aktar minn konċentrazzjoni waħda) biex jintwera li ġew issodisfati l-kriterji ta’ aċċettazzjoni għall-kontroll pożittiv. Barra dan, l-MF tal-kontroll pożittiv trid tkun fi ħdan il-medda aċċettabbli stabbilita għal-laboratorju.
|
Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati
|
61.
|
Għall-MLA, il-Grupp ta’ Ħidma Espert tal-IWGT dwar il-Linfoma fil-Ġrieden (4) għamel ħidma importanti dwar ir-rilevanza bijoloġika u l-kriterji għal rispons pożittiv. Għaldaqstant, dan il-metodu ta’ ttestjar jipprovdi rakkomandazzjonijiet speċifiċi għall-interpretazzjoni tar-riżultati tas-sustanzi kimiċi tat-test mill-MLA (ara l-paragrafi 62-64). It-TK6 għandha bażi ta’ data ferm iżgħar u ma saritilhiex evalwazzjoni minn grupp ta’ ħidma. Għaldaqstant, ir-rakkomandazzjonijiet għall-interpretazzjoni tad-data għat-TK6 huma mogħtija f’termini aktar ġenerali (ara l-paragrafi 65-66). Rakkomandazzjonijiet addizzjonali japplikaw għaż-żewġ testijiet (ara l-paragrafi 67-71).
|
MLA
|
62.
|
Approċċ għad-definizzjoni tar-risponsi pożittiv u negattivi hu rakkomandat biex jiġi żgurat li l-MF miżjuda hi bijoloġikament rilevanti. Minflok l-analiżi statistika ġeneralment użata għal testijiet oħra, dan jibbaża fuq l-użu ta’ frekwenza mutanti indotta predefinita (jiġifieri żieda fl-MF ogħla mill-kontroll konkorrenti), imsejħa l-Fattur ta’ Evalwazzjoni Globali (GEF), li hu bbażat fuq l-analiżi tad-distribuzzjoni tad-data dwar l-MF tal-kontroll negattiv mil-laboratorji parteċipanti (4). Għall-verżjoni tal-agar tal-MLA, il-GEF hu ta’ 90 × 10-6 u għall-verżjoni tal-mikropjastri tal-MLA, il-GEF hu ta’ 126 × 10-6.
|
|
63.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li tkun pożittiva biċ-ċar jekk, f’xi waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali eżaminati (ara l-paragrafu 33), iż-żieda fl-MF ogħla mill-isfond konkorrenti taqbeż il-GEF u ż-żied tkun relatata mal-konċentrazzjoni (eż. bl-użu ta’ test tat-tendenzi). Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li kapaċi tinduċi mutazzjoni f’din is-sistema tat-test.
|
|
64.
|
Dment li ma jiġux issodisati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li tkun negattiva ċara jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali eżaminati kollha (ara l-paragrafu 33), ma jkun hemm ebda rispons relatat mal-konċentrazzjoni jew, jekk ikun hemm żieda fl-MF, din ma taqbiżx il-GEF. Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi mutazzjonijiet f’din is-sistema tat-test.
|
TK6
|
65.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi pożittiva ċara jekk, fi kwalunkwe waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali analizzati (ara l-paragrafu 33):
|
—
|
tal-anqas waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti
|
|
—
|
iż-żieda hi relatata mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b’test xieraq tat-tendenzi (ara l-paragrafu 33)
|
|
—
|
kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa’ barra mid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson; ara l-paragrafu 48).
|
Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi mutazzjoni f’din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-aktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mid-dokumentazzjoni (66)(67).
|
|
66.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi negattiva ċara jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali eżaminati kollha (ara l-paragrafu 33):
|
—
|
l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti,
|
|
—
|
ma hemm l-ebda żieda marbuta mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b’test xieraq tat-tendenzi
|
|
—
|
ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson; ara l-paragrafu 48).
|
Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi mutazzjonijiet f’din is-sistema tat-test.
|
Għall-MLA kif ukoll għat-TK6:
|
67.
|
Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tilħaq RTG/RS ta’ bejn 20 u 10 %. Il-kunsens hu li għandha tingħata attenzjoni meta jiġu interpretati riżultati pożittivi li jinstabu biss f’RTG/RS ta’ bejn 20 u 10 % u riżultat ma jitqiesx pożittiv jekk iż-żieda fl-MF tkun seħħet biss f’RTG/RS ta’ 10 % jew anqas (jekk evalwati) (2) (59).
|
|
68.
|
Hemm xi ċirkustanzi li fihom informazzjoni addizzjonali tista’ tassisti fid-determinazzjoni li sustanza kimika tat-test ma tkunx mutaġenika meta ma jkun hemm ebda koltura li turi valur tal-RTG ta’ bejn 10-20 % RTG/RS. Dawn is-sitwazzjonijiet huma spjegati kif ġej: (1) Ma jkun hemm ebda evidenza ta’ mutaġeniċità (eż. ebda rispons għad-doża, ebda frekwenza mutanti ogħla minn dawk li dehru fil-meded tal-kontroll negattiv konkorrenti jew tal-isfond storiku, eċċ.) f’sensiela ta’ punti ta’ data fi ħdan RTG/RS ta’ 100 % sa 20 % u jkun hemm tal-anqas punt ta’ data wieħed bejn RTG/RS ta’ 20 u 25 %. (2) Ma jkun hemm ebda evidenza ta’ mutaġeniċità (eż. ebda rispons għad-doża, ebda frekwenza mutanti ogħla minn dawk li dehru fil-meded tal-kontroll negattiv konkorrenti jew tal-isfond storiku, eċċ.) f’sensiela ta’ punti ta’ data bejn RTG/RS ta’ 100 % sa 25 % u jkun hemm ukoll punt ta’ data negattiv ftit anqas minn RTG/RS ta’ 10 %. F’dawn iż-żewġ sitwazzjonijiet, ikun jista’ jiġi konkluż li s-sustanza kimika tat-test hi negattiva.
|
|
69.
|
Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta’ rispons posittiv jew negattiv ċar.
|
|
70.
|
F’każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar kif spjegat hawn fuq u/jew biex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta’ riżultat, id-data għandha tiġi evalwata b’ġudizzju espert u/jew b’investigazzjonijiet ulterjuri. It-twettiq ta’ esperiment ripetut possibilment bl-użu tal-kundizzjonijiet sperimentali [eż. spazjar tal-konċentrazzjonijiet biex tiżdied il-probabbiltà ta’ kisba ta’ punti ta’ data fi ħdan il-medda ta’ RTG/RS ta’ 10-20 %, l-użu ta’ kundizzjonijiet oħra tal-attivazzjoni metabolika (jiġifieri l-konċentrazzjoni tal-S9 jew l-oriġini tal-S9) u d-durata tat-trattament] jista’ jkun utli.
|
|
71.
|
F’każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta’ data jipprekludi milli tinħareġ konklużjoni ta’ riżultati pożittivi jew negattivi. Għaldaqstant, ir-rispons tas-sustanza kimika tat-test għandu jiġi konkluż bħala ekwivoku (interpretat bħala bl-istess probabbiltà li jkun pożittiv jew negattiv).
|
RAPPORT TAT-TEST
|
72.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
|
Sustanza kimika tat-test:
|
—
|
is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli;
|
|
—
|
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;
|
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;
|
|
—
|
il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.
|
|
|
Sustanza monokostitwenti:
|
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
|
—
|
l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
|
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
|
—
|
ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
|
|
|
|
|
Solvent:
|
—
|
ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent;
|
|
—
|
il-perċentwal ta’ solvent fil-medium tat-tkabbir finali.
|
|
|
|
Ċelloli:
|
|
Għal kolturi prinċipali tal-Laboratorju:
|
—
|
it-tip u s-sors taċ-ċelloli, u l-istorja fil-laboratorju tal-ittestjar;
|
|
—
|
il-karatteristiċi tal-karjotip u/jew in-numru modali tal-kromożomi;
|
|
—
|
il-metodi għaż-żamma tal-kolturi taċ-ċelloli;
|
|
—
|
l-assenza tal-mikoplażma;
|
|
—
|
il-ħinijiet għall-irdoppjar taċ-ċelloli.
|
|
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test:
|
—
|
il-ħsieb wara l-għażla tal-konċentrazzjonijiet u n-numru ta’ kolturi taċ-ċelloli; inklużi, eż., data dwar iċ-ċitotossiċità u limitazzjonijiet għas-solubbiltà;
|
|
—
|
il-kompożizzjoni tal-media, il-konċentrazzjoni ta’ CO2, il-livell ta’ umdità;
|
|
—
|
il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test espressa bħala konċentrazzjoni finali fil-medium tat-tkabbir (eż. μg jew mg/ml jew mM tal-medium tat-tkabbir);
|
|
—
|
il-konċentrazzjoni (u/jew il-volum) ta’ solvent u s-sustanza kimika tat-test miżjuda fil-medium tat-tkabbir;
|
|
—
|
it-temperatura ta’ inkubazzjoni;
|
|
—
|
il-ħin ta’ inkubazzjoni;
|
|
—
|
id-durata tat-trattament;
|
|
—
|
id-densità taċ-ċellula waqt it-trattament;
|
|
—
|
it-tip u l-kompożizzjoni tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika (is-sors ta’ S9, il-metodu ta’ preparazzjoni tat-taħlita ta’ S9, il-konċentrazzjoni jew il-volum ta’ taħlita ta’ S9 u l-S9 fil-medium tat-tkabbir finali, il-kontrolli tal-kwalità tal-S9);
|
|
—
|
is-sustanzi tal-kontroll pożittiv u negattiv, il-konċentrazzjonijiet finali għal kull kundizzjoni tat-trattament;
|
|
—
|
it-tul tal-perjodu ta’ espressjoni (inkluż in-numru ta’ ċelluli miżrugħa, u skedi ta’ subkolturi u ta’ tagħlif, jekk ikun xieraq);
|
|
—
|
l-identità tal-aġent selettiv u l-konċentrazzjoni tiegħu;
|
|
—
|
għall-MLA, il-verżjoni użata (tal-agar jew tal-mikropjastri) għandha tkun indikata
|
|
—
|
il-kriterji għall-aċċettabbiltà tat-testijiet;
|
|
—
|
il-metodi użati biex jingħadd in-numru ta’ ċelloli vijabbli u mutanti;
|
|
—
|
il-metodi użati għall-kejl taċ-ċitotossiċità;
|
|
—
|
kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti għaċ-ċitotossiċità u l-metodu użat;
|
|
—
|
id-durata tal-ħinijiet ta’ inkubazzjoni wara l-pjastrament;
|
|
—
|
definizzjoni ta’ kolonji li dwarhom jitqiesu l-qies u t-tip (inklużi kriterji għal kolonji “żgħar” u “kbar”, kif xieraq);
|
|
—
|
il-kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;
|
|
—
|
il-metodi użati biex jiġu stabbiliti l-pH, l-ożmolalità, jekk issir, u l-preċipitazzjoni, jekk rilevanti.
|
|
|
|
Ir-riżultati:
|
—
|
in-numru ta’ ċelloli ttrattati u n-numru ta’ ċelloli subkolturati għal kull koltura;
|
|
—
|
il-parametri tat-tossiċità (RTG għall-MLA u RS għat-TK6);
|
|
—
|
is-sinjali ta’ preċipitazzjoni u l-ħin tad-determinazzjoni;
|
|
—
|
in-numru ta’ ċelloli pjastrati f’medium selettiv u mhux selettiv;
|
|
—
|
in-numru ta’ kolonji f’medium mhux selettiv u n-numru ta’ kolonji reżistenti f’medium selettiv, u l-frekwenzi mutanti relatati;
|
|
—
|
is-sejbien tal-qies tal-kolonja għall-kontrolli negattivi u pożittivi u jekk is-sustanza kimika tat-test tkun pożittiva, tal-anqas konċentrazzjoni waħda, u l-frekwenzi mutanti relatati;
|
|
—
|
ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,
|
|
—
|
id-data tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv (konċentrazzjonijiet u solventi) konkorrenti;
|
|
—
|
id-data tal-kontroll negattiv storiku (solvent) u pożittiv (konċentrazzjonijiet u solventi) bil-meded, bil-medji u bid-devjazzjonijiet standard; in-numru ta’ testijiet li fuqhom huma bbażati l-kontrolli storiċi;
|
|
—
|
analiżijiet statistiċi (għal kolturi individwali u għal repliki raggruppati jekk xieraq), u l-valuri p jekk ikun hemm; u għall-MLA, l-evalwazzjoni tal-GEF.
|
|
|
|
Diskussjoni tar-riżultati
|
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
Moore, M.M., Honma, M. Clements, J. (Rapporteur), Awogi, T., Bolcsfoldi, G., Cole, J., Gollapudi, B., Harrington-Brock, K., Mitchell, A., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Ouldelhkim, M-C., San, R., Shimada, H. u Stankowski, L.F. Jr. (2000). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus (TK) Gene Mutation Assay: International Workshop on Genotoxicity Test Procedures (IWGTP) Workgroup Report, Environ. Mol. Mutagen., 35 (3): 185-190.
|
|
(2)
|
Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Harrington-Brock, K., Awogi, T., Bolcsfoldi, G., Cifone, M., Collard, D., Fellows, M., Flanders, K., Gollapudi, B., Jenkinson, P., Kirby, P., Kirchner, S., Kraycer, J., McEnaney, S., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Oliver, Ouldelhkim, M-C., Pant, K., Preston, R., Riach, C., San, R., Shimada, H. u Stankowski, L.F. Jr. (2002). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus Gene Mutation Assay: Follow-Up International Workshop on Genotoxicity Test Procedures, New Orleans, Louisiana, (April 2000), Environ. Mol. Mutagen., 40 (4): 292-299.
|
|
(3)
|
Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Cifone, M., Delongchamp, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Jenkinson, P., Kirby, P., Kirchner, S., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Ouldelhkim, M-C., Pant, K., Preston, R., Riach, C., San, R., Stankowski, L.F. Jr., Thakur, A., Wakuri, S. u Yoshimura, I. (2003). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus Gene Mutation Assay: International Workshop (Plymouth, UK) on Genotoxicity Test Procedures Workgroup Report, Mutation Res., 540: 127-140.
|
|
(4)
|
Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Burlinson, B., Cifone, M., Clarke, J., Delongchamp, R., Durward, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Hou, S., Jenkinson, P., Lloyd, M., Majeska, J., Myhr, B., O’Donovan, M., Omori, T., Riach, C., San, R., Stankowski, L.F. Jr., Thakur, A.K., Van Goethem, F., Wakuri, S. u Yoshimura, I. (2006). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Gene Mutation Assay: Follow-Up Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Tests – Aberdeen, Scotland, 2003 – Assay Acceptance Criteria, Positive Controls, and Data Evaluation, Environ. Mol. Mutagen., 47 (1): 1-5.
|
|
(5)
|
Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Burlinson, B., Cifone, M., Clarke, J., Clay, P., Doppalapudi, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Hou, S., Jenkinson, P., Muster, W., Pant, K., Kidd, D.A., Lorge, E., Lloyd, M., Myhr, B., O’Donovan, M., Riach, C., Stankowski, L.F. Jr., Thakur A.K. u Van Goethem, F. (2007). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Mutation Assay: Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Testing, San Francisco, 2005, Recommendations for 24-h Treatment, Mutation. Res., 627 (1): 36-40.
|
|
(6)
|
OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Pariġi.
|
|
(7)
|
Fellows M.D., Luker, T., Cooper, A. u O’Donovan, M.R. (2012). Unusual Structure-Genotoxicity Relationship in Mouse Lymphoma Cells Observed with a Series of Kinase Inhibitors. Mutation, Res., 746 (1): 21-28.
|
|
(8)
|
Honma, M., Momose, M., Sakamoto, H., Sofuni, T. u Hayashi, M. (2001). Spindol Poisons Induce Allelic Loss in Mouse Lymphoma Cells Through Mitotic Non-Disjunction. Mutation Res., 493 (1-2): 101-114.
|
|
(9)
|
Wang, J., Sawyer, J.R., Chen, L., Chen, T., Honma, M., Mei, N. u Moore, M.M. (2009). The Mouse Lymphoma Assay Detects Recombination, Deletion, and Aneuploidy, Toxicol. Sci.., 109 (1): 96-105.
|
|
(10)
|
Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A., u Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. National. Academy. Sci. USA, 87 (1): 51-55.
|
|
(11)
|
Hozier, J., Sawyer, J., Moore, M., Howard, B. u Clive, D. (1981). Cytogenetic Analysis of the L5178Y/TK+/- Leads to TK-/- Mouse Lymphoma Mutagenesis Assay System, Mutation Res., 84 (1): 169-181.
|
|
(12)
|
Hozier, J., Sawyer, J., Clive, D. u Moore, M.M. (1985). Chromosome 11 Aberrations in Small Colony L5178Y TK-/- Mutants Early in their Clonal History, Mutation Res., 147 (5): 237-242.
|
|
(13)
|
Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. u Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151 (1): 161-174.
|
|
(14)
|
Liber H.L., Call K.M. u Little J.B. (1987). Molecular and Biochemical Analyses of Spontaneous and X-Ray-Induced Mutants in Human Lymphoblastoid Cells. Mutation Res., 178 (1): 143-153.
|
|
(15)
|
Li C.Y., Yandell D.W. u Little J.B. (1992). Molecular Mechanisms of Spontaneous and Induced Loss of Heterozygosity in Human Cells In Vitro. Somat. Cell Mol. Genet., 18 (1): 77-87.
|
|
(16)
|
Honma M., Hayashi M. u Sofuni T. (1997). Cytotoxic and Mutagenic Responses to X-Rays and Chemical Mutagens in Normal and P53-Mutated Human Lymphoblastoid Cells. Mutation. Res., 374 (1): 89-98.
|
|
(17)
|
Honma, M., Momose, M., Tanabe, H., Sakamoto, H., Yu, Y., Little, J.B., Sofuni, T. u Hayashi, M. (2000). Requirement of Wild-Type P53 Protein for Maintenance of Chromosomal Integrity. Mol. Carcinogen., 28 (4): 203-14.
|
|
(18)
|
Amundson S.A. u Liber H.L. (1992). A Comparison of Induced Mutation at Homologous Alleles of the TK Locus in Human Cells. II. Molecular Analysis of Mutants. Mutation Res., 267 (1): 89-95.
|
|
(19)
|
Schisler M.R., Moore M.M. u Gollapudi B.B. (2013). In Vitro Mouse Lymphoma (L5178Y TK+/- -3.7.2C) Forward Mutation Assay. In Protocols in Genotoxicity Assessment A. Dhawan u M. Bajpayee (Eds.), Springer Protocols, Humana Press: 27-50.
|
|
(20)
|
Long, L.H., Kirkland, D., Whitwell, J. u Halliwell, B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634 (1-2): 177-183.
|
|
(21)
|
Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I. u Marzin, D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutagen., 49 (6): 439-452.
|
|
(22)
|
Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion Concentrations. Environ. Mutagen., 8 (6): 879-886.
|
|
(23)
|
Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. u Okumura, K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268 (2): 297-305.
|
|
(24)
|
Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr, Brusick, D., Ashby, J. u Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. Mutation Res., 257: 147-204.
|
|
(25)
|
Wang J., Heflich R.H. u Moore M.M. (2007). A Method to Distinguish Between the De Novo Induction of Thymidine Kinase Mutants and the Selection of Pre-Existing Thymidine Kinase Mutants in the Mouse Lymphoma Assay. Mutation Res., 626 (1-2): 185-190.
|
|
(26)
|
Fischer, G.A. (1958). Studies on the Culture of Leukemic Cells In Vitro. Ann. N.Y. Academy Sci., 76: 673-680.
|
|
(27)
|
Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. u Brown, M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/– Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutation Res., 59(1): 61-108.
|
|
(28)
|
Sawyer, J., Moore, M.M., Clive, D. u Hozier, J. (1985). Cytogenetic Characterization of the L5178Y TK+/- 3.7.2C Mouse Lymphoma Cell Line, Mutation Res., 147 (5): 243-253.
|
|
(29)
|
Sawyer J.R., Moore M.M. u Hozier J.C. (1989). High-Resolution Cytogenetic Characterization of the L5178Y TK+/- Mouse Lymphoma Cell Line, Mutation Res., 214 (2): 181-193.
|
|
(30)
|
Sawyer, J.R., Binz, R.L., Wang, J. u Moore, M.M. (2006). Multicolor Spectral Karyotyping of the L5178Y TK+/--3.7.2C Mouse Lymphoma Cell Line, Environ. Mol. Mutagen., 47 (2): 127-131.
|
|
(31)
|
Fellows, M.D., McDermott, A., Clare, K.R., Doherty, A. u Aardema, M.J. (2014). The Spectral Karyotype of L5178Y TK+/- Mouse Lymphoma Cells Clone 3.7.2C and Factors Affecting Mutant Frequency at the Thymidine Kinase (TK) Locus in the Microtitre Mouse Lymphoma Assay, Environ. Mol. Mutagen., 55 (1): 35-42.
|
|
(32)
|
Storer, R.D., Jraynak, A.R., McKelvey, T.W., Elia, M.C., Goodrow, T.L. u DeLuca, J.G. (1997). The Mouse Lymphoma L5178Y TK+/- Cell Line is Heterozygous for a Codon 170 Mutation in the P53 Tumor Suppressor Gene. Mutation. Res., 373 (2): 157-165.
|
|
(33)
|
Clark L.S., Harrington-Brock, K., Wang, J., Sargent, L., Lowry, D., Reynolds, S.H. u Moore, M.M. (2004). Loss of P53 Heterozygosity is not Responsible for the Small Colony Thymidine Kinase Mutant Phenotype in L5178Y Mouse Lymphoma Cells. Mutagen., 19 (4): 263-268.
|
|
(34)
|
Skopek T.R., Liber, H.L., Penman, B.W. u Thilly, W.G. (1978). Isolation of a Human Lymphoblastoid Line Heterozygous at the Thymidine Kinase Locus: Possibility for a Rapid Human Cell Mutation Assay. Biochem. Biophys. Res. Commun., 84 (2): 411-416.
|
|
(35)
|
Honma M. (2005). Generation of Loss of Heterozygosity and its Dependency on P53 Status in Human Lymphoblastoid Cells. Environ. Mol. Mutagen., 45 (2-3): 162-176.
|
|
(36)
|
Xia, F., Wang, X., Wang, Y.H., Tsang, N.M., Yandell, D.W., Kelsey, K.T. u Liber, H.L. (1995). Altered P53 Status Correlates with Differences in Sensitivity to Radiation-Induced Mutation and Apoptosis in Two Closely Related Human Lymphoblast Lines. Cancer. Res., 55 (1): 12-15.
|
|
(37)
|
Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, A. Sutter, D.J. Kirkland (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Il-manuskritt għadu qed jitħejja).
|
|
(38)
|
Lloyd M. u Kidd D. (2012). The Mouse Lymphoma Assay. Springer Protocols: Methods in Molecular Biology 817, Genetic Toxicology Principles and Methods, ed. Parry and Parry, Humana Press. ISBN, 978-1-61779-420-9, 35-54.
|
|
(39)
|
Mei N., Guo X. u Moore M.M. (2014). Methods for Using the Mouse Lymphoma Assay to Screen for Chemical Mutagenicity and Photo-Mutagenicity. Fi: Optimization in Drug Discover: In Vitro Methods: Yan Z u Caldwell(Eds) , 2nd Edition, GW; Humana Press, Totowa, NJ.
|
|
(40)
|
Liber H.L. u Thilly W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploidhuman Lymphoblasts. Mutation Res., 94 (2): 467-485.
|
|
(41)
|
Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, OW., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G. u Stokes, W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. ATLA, 33 (3): 261-287.
|
|
(42)
|
Moore M.M. u Howard B.E. (1982). Quantitation of Small Colony Trifluorothymidine-Resistant Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells in RPMI-1640 Medium, Mutation Res., 104 (4-5): 287-294.
|
|
(43)
|
Ames B.N., McCann J. u Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31 (6): 347-364.
|
|
(44)
|
Maron D.M. u Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113 (3-4): 173-215.
|
|
(45)
|
Natarajan, A.T., Tates, A.D, Van Buul, P.P.W., Meijers, M. u De Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens After Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37 (1): 83-90.
|
|
(46)
|
Matsuoka A., Hayashi M. u Ishidate M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66 (3): 277-290.
|
|
(47)
|
Ong T.M., et al. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4 (1): 55-65
|
|
(48)
|
Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. u Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen., 7 (3): 175-177.
|
|
(49)
|
Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. u Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. Fi: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres F.J., et al. (Eds, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
|
|
(50)
|
Galloway S.M., et al. (1994). Report from Working Group on In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312 (3): 241-261.
|
|
(51)
|
Johnson T.E., Umbenhauer D.R. u Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/Beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28 (1): 51-59.
|
|
(52)
|
UNEP (2001). Il-Konvenzjoni ta’ Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes, Programm tan-Nazzjonijiet Uniti għall-Ambjent (UNEP).
|
|
(53)
|
Krahn D.F., Barsky F.C. u McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. Fi: Genotoxic Effects of Airborne Agents Tice R.R., Costa D.L.and Schaich K.M. (Eds.). New York, Plenum, pp. 91–103.
|
|
(54)
|
Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. u Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen., 5 (6): 795-801.
|
|
(55)
|
Asakura M., Sasaki T., Sugiyama T., Arito H., Fukushima, S. u Matsushima, T. (2008). An Improved System for Exposure of Cultured Mammalian Cells to Gaseous Compounds in the Chromosomal Aberration Assay. Mutation Res., 652 (2): 122-130.
|
|
(56)
|
Arlett C.F., et al. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. Fi: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Ed.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.
|
|
(57)
|
Morita T., Honma M. u Morikawa K. (2012). Effect of Reducing the Top Concentration Used in the In Vitro Chromosomal Aberration Test in CHL Cells on the Evaluation of Industrial Chemical Genotoxicity. Mutation Res., 741 (1-2): 32-56.
|
|
(58)
|
Brookmire L., Chen J.J. u Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay. Environ. Mol. Mutagen., 54 (1): 36-43.
|
|
(59)
|
USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Disponibbli fuq: [https://www.federalregister.gov/a/2012-13774].
|
|
(60)
|
Honma M. u Hayashi M. (2011). Comparison of In Vitro Micronucleus and Gene Mutation Assay Results for P53-Competent Versus P53-Deficient Human Lymphoblastoid Cells. Environ. Mol. Mutagen., 52 (5): 373-384.
|
|
(61)
|
Moore-Brown, M.M., Clive, D., Howard, B.E., Batson, A.G. u Johnson, K.O. (1981). The Utilization of Trifluorothymidine (TFT) to Select for Thymidine Kinase-Deficient (TK-/-) Mutants from L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res., 85 (5): 363-378.
|
|
(62)
|
Liber H.L., Yandell D.W. u Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HRPT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK locus. Mutation Res., 216 (1): 9-17.
|
|
(63)
|
Furth E.E., Thilly, W.G., Penman, B.W., Liber, H.L. u Rand, W.M. (1981). Quantitative Assay for Mutation in Diploid Human Lymphoblasts Using Microtiter Plates. Anal. Biochem., 110 (1): 1-8.
|
|
(64)
|
Hayashi, M, Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J. u Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation Res., 723 (2): 87-90.
|
|
(65)
|
Ryan T.P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. John Wiley and Sons, New York 2nd Edition.
|
|
(66)
|
OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 199.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(67)
|
Fleiss J.L., Levin B. u Paik M.C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET
Anewġenu
: Kwalunkwe sustanza kimika jew proċess li, meta jinteraġġixxu mal-komponenti taċ-ċiklu tad-diviżjoni taċ-ċellola mitotika u mejotika, iwasslu għal anewplojdija f’ċelloli jew f’organiżmi.
Anewplojdija
: Kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta’ diplojdi (jew aplojdi) normali ta’ kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta’ kromożomi (poliplojdija).
Mutaġeni li jissostitwixxu l-koppji tal-bażijiet
: Sustanzi kimiċi li jikkawżaw sostituzzjoni tal-koppji tal-bażijiet fid-DNA.
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita.
Effiċjenza tal-klonazzjoni
: Il-perċentwal ta’ ċelloli pjastrati f’densità baxxa li kapaċi jikbru f’kolonja li tista’ tingħadd.
Klastoġenu
: Kwalunkwe sustanza kimika jew proċess li jikkawżaw aberrazzjonijiet kromożomiċi f’popolazzjonijiet ta’ ċelloli jew ta’ organiżmi.
Ċitotossiċità
: Għall-assaġġi koperti f’dan il-metodu ta’ ttestjar, iċ-ċitotossiċità hi identifikata bħala tnaqqis fit-tkabbir totali relattiv (RTG) jew fis-sopravivenza relattiva (RS) għall-MLA u għat-TK6, rispettivament.
Mutazzjoni ’l quddiem
: Mutazzjoni ta’ ġene mit-tip parentali għall-forma mutanti li tkun toħloq alterazzjoni jew telf tal-attività enzimatika jew tal-funzjoni tal-proteina kodifikata.
Mutaġeni li jibdlu l-qari tal-kodiċi ġenetiku
: Sustanzi li jikkawżaw iż-żieda jew it-tħassir ta’ koppji tal-bażijiet individwali jew multipli fil-molekula tad-DNA.
Ġenotossiċi
: Terminu ġenerali li jinkludi kull tip ta’ ħsara fid-DNA jew kromożomika, inkluż ksur tad-DNA, addotti, riarranġamenti, mutazzjonijiet, aberrazzjonijiet kromożomiċi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta’ effetti ġenotossiċi jirriżultaw f’mutazzjonijiet jew fi ħsara kromożomika stabbli.
Rikombinament mitotiku
: Matul il-mitożi, ir-rikombinament bejn kromatidi omologi li possibilment jirriżulta fl-induzzjoni ta’ ksur tal-ħajta doppja tad-DNA jew f’telf ta’ eterożigożità.
Mutaġeniċi
: Jipproduċu tibdil ereditarju ta’ sekwenza/i tal-koppja ta’ bażijiet tad-DNA f’ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet kromożomiċi).
Frekwenza mutanti (MF)
: L-għadd ta’ ċelloli mutanti osservati diviż bl-għadd ta’ ċelloli vijabbli.
Ħin tal-espressjoni fenotipika
: Il-ħin wara t-trattament li matulu l-alterazzjoni ġenetika tkun fissa fi ħdan il-ġenom u kwalunkwe prodott tal-ġeni preeżistenti jitbattal sal-punt li l-karatteristika fenotipika tinbidel.
Sopravivenza relattiva (RS)
: RS tintuża bħala l-kejl taċ-ċitotossiċità relatata mat-trattament fit-TK6. Din hi l-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) relattiva taċ-ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament taċ-ċelloli aġġustata skont kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament meta mqabbla mal-effiċjenza tal-klonazzjoni tal-kontroll negattiv.
Żvilupp relattiv f’sospensjoni (RSG)
: Għall-MLA, l-iżvilupp relattiv f’sospensjoni totali fuq jumejn tal-koltura tat-test meta mqabbel mal-iżvilupp f’sospensjoni totali fuq jumejn tal-kontroll negattiv/b’solvent (Clive u Spector, 1975). L-RSG għandu jinkludi l-iżvilupp relattiv tal-koltura tat-test meat mqabbla mal-kontroll negattiv/b’solvent matul il-perjodu tat-trattament.
Żvilupp totali relattiv (RTG)
: L-RTG jintuża bħala l-kejl taċ-ċitotossiċità relatata mat-trattament fl-MLA. Hu kejl tal-iżvilupp relattiv (għall-kontroll tal-veikolu) tal-kolturi tat-test matul il-fażijiet tat-trattament, tal-espressjoni fuq jumejn u tal-klonazzjoni tal-għażla tal-mutanti tat-test. L-RSG ta’ kull koltura tat-test jiġi moltiplikat bl-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva tal-koltura tat-test fil-ħin tal-għażla tal-mutanti u hu espress relattiv għall-effiċjenza tal-klonazzjoni tal-kontroll negattiv/b’solvent (Clive u Spector, 1975).
Frazzjoni tal-fwied S9
: Supernatant ta’ omoġenat tal-fwied wara ċentrifugazzjoni ta’ 9 000g, jiġifieri estratt minn fwied mhux proċessat
Taħlita ta’ S9
: Taħlita tal-frazzjoni S9 tal-fwied u tal-kofatturi neċessarji għall-attività tal-enzimi metaboliċi.
Żvilupp f’sospensjoni (SG)
: Iż-żieda tad-drabi fin-numru ta’ ċelloli matul il-fażijiet tat-trattament u tal-espressjoni tal-MLA. L-SG hu kkalkolat bil-moltiplikazzjoni taż-żieda tad-drabi fil-jum 1 biż-żieda tad-drabi fil-jum 2 għat-trattament qasir (tlieta jew erba’ sigħat). Jekk jintuża trattament fuq 24 siegħa, l-SG ikun iż-żieda tad-drabi matul it-trattament fuq 24 siegħa moltiplikat biż-żidiet tad-drabi fil-jiem 1 u 2 tal-espressjoni.
Kontroll b’solvent
: Terminu ġenerali li jiddefinixxi l-kolturi tal-kontroll li jirċievu s-solvent waħdu użat biex jiddisolvi s-sustanza kimika tat-test.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
Kontrolli mhux trattati
: Kontrolli mhux trattati huma kolturi li ma jirċievu ebda trattament (jiġifieri la sustanza kimika tat-test u lanqas solvent) iżda jiġu proċessati bl-istess mod bħall-kolturi li jirċievu s-sustanza kimika tat-test.
Appendiċi 2
FORMULI
Ċitotossiċità
Għaż-żewġ verżjonijiet (tal-agar u tal-mikropjastri) tal-MLA
Iċ-ċitotossiċità hi definita bħala l-Iżvilupp Totali Relattiv (RTG) li jinkludi l-Iżvilupp Relattiv f’Sospensjoni (RSG) matul il-perjodu ta’ espressjoni ta’ jumejn u l-Effiċjenza Relattiva tal-Klonazzjoni (RCE) miksuba fil-ħin tal-għażla tal-mutanti. RTG, RSG u RCE lkoll huma espressi bħala perċentwal.
Kalkolu tal-RSG: L-Iżvilupp f’Sospensjoni wieħed (SG1) hu r-rata ta’ żvilupp bejn il-jum 0 u l-jum 1 (konċentrazzjoni taċ-ċelloli fil-jum 1 / konċentrazzjoni taċ-ċelloli fil-jum 0) u l-Iżvilupp f’Sospensjoni tnejn (SG2) hu r-rata ta’ żvilupp bejn il-jum 1 u l-jum 2 (konċentrazzjoni taċ-ċelloli fil-jum 2 / konċentrazzjoni taċ-ċelloli fil-jum 1). L-RSG hu l-SG totali (SG1 x SG2) għall-koltura trattata meta mqabbla mal-kontroll mhux trattat/b’solvent. Jiġifieri: RSG = [SG1(test) x SG2(test)] / [SG1(control) x SG2(control)] L-SG1 għandu jiġi kkalkolat mill-konċentrazzjoni taċ-ċelloli inizjali użata fil-bidu tat-trattament taċ-ċelloli. Dan jagħti rendikont għal kwalunkwe ċitotossiċità differenzjali li sseħħ fil-koltura/i tat-test matul it-trattament taċ-ċelloli.
L-RCE hi l-effiċjenza relattiva tal-klonazzjoni tal-koltura tat-test meta mqabbla mal-effiċjenza relattiva tal-klonazzjoni tal-kontroll mhux trattat/b’solvent miksuba fil-ħin tal-għażla tal-mutanti.
Żvilupp Totali Relattiv (RTG):
RTG=RSG x RCE
TK6
Sopravivenza Relattiva (RS):
Iċ-ċitotossiċità hi evalwata bis-sopravivenza relattiva, jiġifieri l-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) taċ-ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament aġġustata skont kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament meta mqabbla mal-effiċjenza tal-klonazzjoni f’kontrolli negattivi (assenjati sopravivenza ta’ 100 %). L-aġġustament għat-telf ta’ ċelloli matul it-trattament jista’ jiġi kkalkolat bħala:
L-RS aġġustata għal koltura ttrattata b’sustanza kimika tat-test tiġi kkalkolata bħala:
IFrekwenza mutanti kemm għall-MLA kif ukoll għat-TK6
Il-frekwenza mutanti (MF) hi l-effiċjenza tal-klonazzjoni tal-kolonji mutanti f’medium selettiv (CEM) aġġustata bl-effiċjenza tal-klonazzjoni f’medium mhux selettiv fil-ħin tal-għażla tal-mutanti (CEV). Jiġifieri, MF=CEM/CEV. Il-kalkolu ta’ dawn iż-żewġ effiċjenzi tal-klonazzjoni hu deskritt hawn taħt għall-metodi ta’ klonazzjoni tal-agar u tal-mikropjastri.
Verżjoni tal-Agar tal-MLA: Fil-verżjoni tal-agar artab tal-MLA, in-numru ta’ kolonji fil-pjastra tal-għażla tal-mutanti (CM) u n-numru ta’ kolonji fil-pjastra mhux magħżula jew tal-effiċjenza tal-klonazzjoni (għadd tal-vijabbli) (CV) jinkisbu bl-għadd dirett tal-kloni. Meta 600 ċellola jiġu pjastrati għall-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) għall-pjastri tal-għażla tal-mutanti (CEM) u l-pjastri mhux magħżula jew tal-effiċjenza tal-klonazzjoni (għadd tal-vijabbli) (CEV) u 3 x 106 ċelloli jintużaw għall-għażla tal-mutanti,
CEM = CM / (3 x 106) = (CM / 3) x 10-6
CEV = CV / 600
Verżjoni tal-Mikropjastri tal-MLA u tat-TK6:
Fil-verżjoni tal-mikropjastri tal-MLA, CM u CV huma determinati bħala l-moltiplikazzjoni tan-numru totali ta’ mikropjastri (TW) u n-numru probabbli ta’ kolonji għal kull bwejra (P) fil-mikropjastri.
CM = PM x TWM
CV = PV x TWV
Mit-terminu żero tad-distribuzzjoni Poisson (Furth et al., 1981), il-P jingħata permezz ta’
P = - ln (EW / TW)
Fejn, EW huma l-bwejriet vojta u TW huma l-bwejriet totali. Għalhekk,
CEM = CM / TM = (PM x TWM) / TM
CEV = CV / TV = (PV x TWV) / TV
Għall-verżjoni tal-mikropjastri tal-MLA, il-frekwenzi mutanti ta’ kolonji żgħar u kbar jiġu kkalkolati b’mod identiku, bl-użu tan-numru rilevanti ta’ bwejriet vojta għal kolonji żgħar u kbar.
Għat-TK6, il-frekwenzi mutanti ta’ kolonji żgħar u kbar huma bbażati fuq il-mutanti li jidhru kmieni u li jidhru tard.
B.68 METODU TA’ TTESTJAR IN VITRO B’ESPONIMENT GĦAL ĦIN QASIR GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI i) TA’ SUSTANZI KIMIĊI LI JINDUĊU ĦSARA SERJA LILL-GĦAJNEJN U ii) TA’ SUSTANZI KIMIĊI LI MA JEĦTIĠUX KLASSIFIKAZZJONI GĦALL-IRRITAZZJONI TAL-GĦAJNEJN JEW GĦAL ĦSARA SERJA LILL-GĦAJNEJN
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 491 tal-OECD (2017). Il-metodu ta’ ttestjar b’Esponiment għal Ħin Qasir (STE) hu metodu in vitro li jista’ jintuża f’ċerti ċirkustanzi u b’limitazzjonijiet speċifiċi għall-klassifikazzjoni tal-periklu u għat-tikkettar tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn kif ukoll dawk li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal ħsara serja lill-għajnejn jew għal irritazzjoni tal-għajnejn, kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) u mir-Regolament 1272/2008 tal-Unjoni Ewropea (UE) dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet (CLP) (68).
|
|
2.
|
Għal ħafna snin, il-potenzjal ta’ periklu għall-għajnejn tas-sustanzi kimiċi ġie evalwat primarjament bl-użu ta’ test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (TM B.5 (8), ekwivalenti għat-TG 405 tal-OECD). Ġeneralment hu aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test alternattiv in vitro uniku mhu se jkun jista’ jieħu post bis-sħiħ it-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek biex ibassar il-medda sħiħa ta’ risponsi ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn għall-klassijiet differenti ta’ sustanzi kimiċi. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta’ metodi ta’ ttestjar alternattivi użati fi ħdan strateġija ta’ ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test fuq l-għajnejn tal-fniek (2). L-approċċ minn fuq għal isfel hu mfassal għall-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi li jistgħu jkunu mistennija, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, li jkollhom potenzjal għoli ta’ irritazzjoni jew li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn. Għall-kuntrarju, l-approċċ minn isfel għal fuq hu mfassal għall-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi li jistgħu jkunu mistennija, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, li ma jikkawżawx irritazzjoni tal-għajnejn suffiċjenti biex ikunu jeħtieġu klassifikazzjoni. Filwaqt li l-metodu ta’ ttestjar tal-STE mhuwiex meqjus li hu sostitut assolut għat-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek, hu xieraq biex jintuża bħala parti minn stratepija ta’ ttestjar sekwenzjali għall-klassifikazzjoni u għat-tikkettar regolatorji, bħall-approċċ minn fuq għal isfel/minn isfel għal fuq, biex jiġu identifikati mingħajr testijiet ulterjuri (i) sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (GHS tan-NU/Kategorija 1 tas-CLP) u (ii) sustanzi kimiċi (esklużi sustanzi ferm volatili u kull sustanza kimika solida oħra li mhix tensjoattiva) li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew għall-ħsara serja lill-għajnejn (GHS tan-NU/Ebda Kategorija tas-CLP) (1)(2). Madankollu, sustanza kimika li la tkun imbassra li tikkawża ħsara serja lill-għajnejn (GHS tan-NU/Kategorija 1 tas-CLP) u lanqas tal-GHS tan-NU/tal-Ebda Kategorija tas-CLP (ma tinduċix ħsara serja lill-għajnejn u lanqas irritazzjoni tal-għajnejn) skont il-metodu ta’ ttestjar STE tkun teħtieġ testijiet addizzjonali biex tiġi stabbilita klassifikazzjoni definittiva. Barra minn hekk, għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel l-użu tal-STE f’approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta’ klassifikazzjoni oħrajn li mhumiex il-GHS tan-NU/is-CLP. L-għażla tal-aktar metodu ta’ ttestjar xieraq u l-użu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar għandhom jiġu kkunsidrati fil-kuntest tad-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar Approċċi Integrati dwar l-Ittestjar u l-Valutazzjoni għal Ħsara Serja lill-Għajnejn u l-Irritazzjoni tal-għajnejn (14).
|
|
3.
|
L-iskop ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar hu li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajnejn fuq il-bażi tal-ħila tagħha li tinduċi ċitotossiċità fil-Metodu ta’ ttestjar b’Esponiment għal Ħin Qasir. L-effett ċitotossiku tas-sustanzi kimiċi fuq iċ-ċelloli epiteljali korneali hu modalità ta’ azzjoni (MOA) importanti li twassal għal ħsara fl-epitelju korneali u għal irritazzjoni tal-għajnejn. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli fil-metodu ta’ ttestjar tal-STE hi vvalutata bil-kejl kwantitattiv, wara l-estrazzjoni miċ-ċelloli, ta’ melħ tal-formażan blu prodott miċ-ċelloli ħajjin b’konverżjoni enzimatika tal-kolorant vitali MTT (bromur tat-3-(4,5-Dimetiltjażol-2-il)-2,5-difeniltetrażolju), magħruf ukoll bħala Bromur tat-Tetrażolju Blu Tjoażolil (3). Il-vijabbiltà taċ-ċelloli miksuba titqabbel mal-kontroll b’solvent (vijabbiltà relattiva) u tintuża biex jiġi stmat il-periklu potenzjali għall-għajnejn tas-sustanza kimika tat-test. Sustanza kimika tat-test tiġi klassifikata bħala tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP meta ż-żewġ konċentrazzjonijiet ta’ 5 % u ta’ 0,05 % jirriżultaw f’vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ 70 % jew anqas (≤). Għall-kuntrarju, sustanza kimika tiġi mbassra bħala ta’ Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP meta ż-żewġ konċentrazzjonijiet ta’ 5 % u ta’ 0,05 % jirriżultaw f’vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ aktar minn (>) 70 %.
|
|
4.
|
It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża f’dan il-metodu ta’ ttestjar biex jirreferi għal dak li jiġi ttestjat u mhux b’rabta mal-applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE għall-ittestjar ta’ sustanzi u/jew ta’ taħlitiet. Id-definizzjonijiet huma pprovduti f’dan l-Appendiċi.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
5.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu bbażat fuq protokoll żviluppat minn Kao Corporation (4), u kien is-suġġett ta’ żewġ studji ta’ validazzjoni differenti: wieħed mill-Validation Committee of the Japanese Society for Alternative to Animal Experiments (JSAAE) (5) u l-ieħor mill-Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM) (6). NICEATM/ICCVAM għamlu rieżami bejn il-pari fuq il-bażi tar-rapporti tal-istudji ta’ validazzjoni u dokumenti ta’ rieżami ta’ sfond fuq il-metodu ta’ ttestjar (7).
|
|
6.
|
Meta dan jintuża biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP (1), id-data miksuba bil-metodu ta’ ttestjar tal-STE fuq 125 sustanza kimika (inklużi sustanzi kif ukoll taħlitiet), uriet akkuratezza ġenerali ta’ 83 % (104/125), rata ta’ pożittivi foloz ta’ 1 % (1/86), u rata ta’ negattivi foloz ta’ 51 % (20/39) meta mqabbel mat-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (7). Ir-rata ta’ negattivi foloz miksuba mhix kritika f’dan il-kuntest, peress li s-sustanzi kimiċi tat-test kollha li jinduċu vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ ≤ 70 % f’konċentrazzjoni ta’ 5 % u > 70 % f’0,05 % ikunu ttestjati b’mod sussegwenti b’metodi ta’ ttestjar in vivo oħra validati b’mod adegwat jew, bħala l-aħħar istanza, fit-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji u skont l-istrateġija ta’ ttestjar sekwenzjali u l-approċċi tal-piż tal-evidenza rakkomandati bħalissa (1) (8). Primarjament ġew ittestjati sustanzi monokostitwenti, għalkemm jeżisti wkoll ammont limitat ta’ data fuq l-ittestjar ta’ taħlitiet. Il-metodu ta’ ttestjar xorta waħda hu teknikament applikabbli għall-ittestjar ta’ sustanzi u ta’ taħlitiet multikostitwenti. Madankollu, qabel ma jintuża dan il-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. Il-metodu ta’ ttestjar tal-STE ma wera ebda nuqqas speċifiku ieħor meta ntuża biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi tat-test bħall-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/is-CLP. L-investigaturi jistgħu jikkunsidraw li jużaw dan il-metodu ta’ ttestjar fuq sustanzi kimiċi tat-test, li fih vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ ≤ 70 % kemm fil-konċentrazzjoni ta’ 5 % kif ukoll ta’ 0,05 % għandha tiġi aċċettata bħala indikatur ta’ rispons li jinduċi ħsara serja lill-għajnejn li għandu jiġi klassifikat bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP mingħajr testijiet ulterjuri.
|
|
7.
|
Meta dan jintuża biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u għal ħsara serja lill-għajnejn (jiġifieri Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP), id-data miksuba bil-metodu ta’ ttestjar tal-STE fuq 130 sustanza kimika (inklużi sustanzi kif ukoll taħlitiet), uriet akkuratezza ġenerali ta’ 85 % (110/130), rata ta’ negattivi foloz ta’ 12 % (9/73), u rata ta’ pożittivi foloz ta’ 19 % (11/57) meta mqabbel mat-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (7). Jekk sustanzi ferm volatili u sustanzi solidi għajr it-tensjoattivi jiġu esklużi mis-sett tad-data, l-akkuratezza ġenerali titjieb għal 90 % (92/102), ir-rata ta’ negattivi foloz għal 2 % (1/54), u l-pożittivi foloz għal 19 % (9/48) (7). Konsegwentement, in-nuqqasijiet potenzjali tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE, meta jintuża biex jidenifika sustanzi kimiċi tat-test li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u għal ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP) huma rata għolja ta’ negattivi foloz għal i) sustanzi volatili ħafna bi pressjoni tal-fwar ta’ aktar minn 6 kPa u ii) Sustanzi kimiċi solidi (sustanzi u taħlitiet) għajr tensjoattivi u taħlitiet komposti minn tensjoattivi biss. Sustanzi kimiċi bħal dawn huma esklużi mid-dominju tal-applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE (7).
|
|
8.
|
Minbarra s-sustanzi kimiċi msemmija fil-paragrafu 6 u 7, is-sett ta’ data ġenerat mill-metodu ta’ ttestjar tal-STE fih ukoll data interna dwar 40 taħlita li, meta mqabbla mat-test tal-għajnejn in vivo Draize, wera akkuratezza ta’ 88 % (35/40), rata ta’ pożittivi foloz ta’ 50 % (5/10), u rata ta’ negattivi foloz ta’ 0 % (0/30) għat-tbassir ta’ taħlitiet li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont is-sistemi ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU/tas-CLP (9). Għaldaqstant, il-metodu ta’ ttestjar tal-STE jista’ jiġi applikat biex jidentifika taħlitiet bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP f’approċċ minn isfel għal fuq bl-eċċezzjoni ta’ taħlitiet ta’ solidi għajr dawk komposti minn tensjoattivi biss bħala estensjoni tal-limitazzjoni tiegħu għal sustanzi solidi. Barra minn hekk, taħlitiet li fihom sustanzi bi pressjoni tal-fwar ogħla min 6kPa għandhom jiġu evalwati b’attenzjoni biex jiġu evitati sottopreviżjonijiet potenzjali, u għandhom ikunu ġustifikati fuq bażi ta’ każ b’każ.
|
|
9.
|
Il-metodu ta’ ttestjar tal-STE ma jistax jintuża għall-identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test bħall-Kategorija 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP, jew tal-Kategorija 2A (irritazzjoni tal-għajnejn) jew 2B (irritazzjoni ħafifa tal-għajnejn) tal-GHS tan-NU, minħabba n-numru konsiderevoli ta’ sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP sottoprevisti bħala l-Kategorija 2, 2A, jew 2B u sustanzi kimiċi ta’ Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP previsti b’mod eċċessiv bħala tal-Kategorija 2, 2A, jew 2B (7). Għal dan il-għan, jista’ jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b’metodu xieraq ieħor.
|
|
10.
|
Il-metodu ta’ ttestjar tal-STE hu xieraq għal sustanzi kimiċi tat-test li jiġu dissolti jew sospiżi b’mod uniformi għal tal-anqas ħames minuti f’salina fiżjoloġika, 5 % sulfossidu tad-dimetil (DMSO) f’salina, jew f’żejt minerali. Il-metodu ta’ ttestjar tal-STE mhuwiex xieraq għal sustanzi kimiċi tat-test li huma insolubbli jew li ma jistgħux jiġu sospiżi b’mod uniformi għal tal-anqas ħames minuti f’salina fiżjoloġika, 5 % DMSO f’salina, jew f’żejt minerali. L-użu ta’ żejt minerali fil-metodu ta’ ttestjar tal-STE hu possibbli minħabba l-esponiment għal ħin qasir. Għaldaqstant, il-metodu ta’ ttestjar tal-STE hu xieraq għat-tbassir tal-potenzjal ta’ periklu għall-għajnejn ta’ sustanzi kimiċi tat-test insolubbli fl-ilma (eż. alkoħols jew ketoni xaħmin b’katina twila) dment li dawn ma jkunux jistgħu jitħalltu f’tal-anqas wieħed mit-tliet solventi proposti hawn fuq (4).
|
|
11.
|
It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża f’dan il-metodu ta’ ttestjar biex jirreferi għal dak li jkun qed jiġi ttestjat (69) u mhux b’rabta mal-applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE għall-ittestjar ta’ sustanzi u/jew ta’ taħlitiet.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
12.
|
Il-metodu ta’ ttestjar tal-STE hu bbażat fuq assaġġ in vitro bbażat fuq iċ-ċitotossiċità li jsir fuq monosaff konfluwenti ta’ ċelloli tal-Kornea tal-Fenek ta’ Statens Seruminstitut (SIRC), kolturati f’mikropjastra tal-polikarbonat b’96 bwejra (4). Wara esponiment għal ħames minuti għal sustanza kimika tat-test, iċ-ċitotossiċità tiġi mkejla b’mod kwantitattiv bħala l-vijabbiltà relattiva taċ-ċelloli tal-SIRC bl-użu tal-assaġġ tal-MTT (4). Il-vijabbiltà mnaqqsa taċ-ċelloli tintuża biex tbassar l-effetti avversi potenzjali li jwasslu għal ħsara okulari.
|
|
13.
|
Ġie rrapportat li 80 % ta’ soluzzjoni mqattra f’għajn fenek jiġi elimenat permezz tal-borża konġuntivali fi żmien tliet sa erba’ minuti, filwaqt li aktar minn 80 % ta’ soluzzjoni mqattra f’għajn bniedem jiġi eliminat fi żmien minuta sa tnejn (10). Il-metodu ta’ ttestjar tal-STE jipprova japprossima dawn il-ħinijiet ta’ esponiment u jagħmel użu miċ-ċitotossiċità bħala punt ta’ tmiem għall-valutazzjoni tal-firxa tal-ħsara għaċ-ċelloli tal-SIRC wara esponiment għal ħames minuti għas-sustanza kimika tat-test.
|
WIRI TAL-PROFIĊJENZA
|
14.
|
Qabel l-użu ta’ rutina tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE deskritt f’dan il-metodu ta’ ttestjar, li jaderixxi ma’ dan il-metodu ta’ ttestjar, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jikklassifikaw kif suppost ħdax-il sustanza rakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi ntgħażlu biex jirrappreżentaw il-medda sħiħa ta’ risponsi għal ħsara serja lill-għajnejn jew għal irritazzjoni tal-għajnejn fuq il-bażi tar-riżultati ta’ testijiet in vivo fuq għajnejn il-fniek (TG 405) u s-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU/tas-CLP (1). Kriterji tal-għażla oħra inkludew li s-sustanzi għandhom ikunu kummerċjalment disponibbli, li għandu jkun hemm data ta’ referenza in vivo ta’ kwalità għolja, u li għandu jkun hemm disponibbli data in vitro ta’ kwalità għolja mill-metodu ta’ ttestjar (3). F’sitwazzjonijiet li fihom sustanza elenkata ma tkunx disponibbli jew, fejn ġustifikabbli, tista’ tintuża sustanza oħra li għaliha jkun hemm data ta’ referenza adegwata in vivo u in vitro disponibbli dment li ma jintużawx l-istess kriterji bħal dawk deskritti hawn.
Tabella 1
Lista ta’ Sustanzi ta’ Profiċjenza
|
Sustanza
|
CASRN
|
Klassi kimika (70)
|
Stat fiżiku
|
Kat. In Vivo tal-GHS tan-NU/tas-CLP (71)
|
Solvent fit-test tal-STE
|
Kat. tal-STE tal-GHS tan-NU/tas-CLP
|
|
Klorur tal-benżalkonju (10 %, milwiem)
|
8001-54-5
|
Kompost tal-onju
|
Likwidi
|
Kategorija 1
|
Salina
|
Kategorija 1
|
|
Triton X-100 (100 %)
|
9002-93-1
|
Eter
|
Likwidi
|
Kategorija 1
|
Salina
|
Kategorija 1
|
|
Aħmar Aċidu 92
|
18472-87-2
|
Kompost eteroċikliku; Kompost tal-bromur; Kompost tal-klorur
|
Solidu
|
Kategorija 1
|
Salina
|
Kategorija 1
|
|
Idrossidu tas-sodju
|
1310-73-2
|
Alkali; Sustanza kimika inorganika
|
Solidu
|
Kategorija 1 (72)
|
Salina
|
Kategorija 1
|
|
Butirolatton
|
96-48-0
|
Latton; Kompost eteroċikliku
|
Likwidi
|
Kategorija 2A (Kategorija 2 fis-CLP)
|
Salina
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
|
1-Ottanol
|
111-87-5
|
Alkoħol
|
Likwidi
|
Kategorija 2A/B (73) (Kategorija 2 fis-CLP)
|
Żejt Minerali
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
|
Ċiklopentanol
|
96-41-3
|
Alkoħol; Idrokarbur, ċikliku
|
Likwidi
|
Kategorija 2A/B (74) (Kategorija 2 fis-CLP)
|
Salina
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
|
2-Etossietil aċetat
|
111-15-9
|
Alkoħol; Eter
|
Likwidi
|
Ebda Kategorija
|
Salina
|
Ebda Kategorija
|
|
Dodekan
|
112-40-3
|
Idrokarbur, aċikliku
|
Likwidi
|
Ebda Kategorija
|
Żejt Minerali
|
Ebda Kategorija
|
|
Metilisobutilketon
|
108-10-1
|
Ketone
|
Likwidi
|
Ebda Kategorija
|
Żejt Minerali
|
Ebda Kategorija
|
|
Sulfat tal-1,1-Dimetilgwanidina
|
598-65-2
|
Amidina; Kompost tal-kubrit
|
Solidu
|
Ebda Kategorija
|
Salina
|
Ebda Kategorija
|
|
Abbrevjazzjonijiet: RN tas-CAS = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi
|
|
PROĊEDURA
Preparazzjoni tal-Monosaff Ċellolari
|
15.
|
Il-linja ta’ ċelloli tal-kornea tal-fniek, SIRC, għandha tintuża għat-twettiq tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE. Hu rakkomandat li ċ-ċelloli tal-SRC jinkisbu minn bank taċ-ċelloli kwalifikat sew, bħall-American Type Culture Collection CCL60.
|
|
16.
|
Iċ-ċelloli SRC huma kolturati f’37 °C f’5 % CO2 u atmosfera umidifikata fi flask tal-koltura li fih medium tat-tkabbir li jinvolvi medium essenzjali minimu ta’ Eagle (MEM) supplimentat b’10 % serum bovin fetali (FBS), 2 mM L-glutammina, 50–100 unità/ml peniċillina u 50–100 μg/ml streptomiċina. Iċ-ċelloli li saru konfluwenti fil-flask tal-koltura għandhom jiġu separati bl-użu tas-soluzzjoni tal-aċidu tripsina-etilendijamminatetraaċetiku, bl-użu ta’ scraper taċ-ċelloli jew mingħajr. Iċ-ċelloli jiġu propagati (eż. minn tnejn sa tliet passaġġi) fi flask tal-koltura qabel ma jintużaw għall-ittestjar ta’ rutina, u ma għandhomx isirulhom aktar minn 25 passaġġ mit-taħlil.
|
|
17.
|
Iċ-ċelloli li jkunu lesti biex jintużaw għat-test tal-STE mbagħad jitħejjew fid-densità xierqa u jinżergħu fi pjastri b’96 bwejra. Id-densità rakkomandata tat-tiżrigħ taċ-ċelloli hi ta’ 6,0 × 103 ċelloli għal kull bwejra meta ċ-ċelloli jintużaw erbat ijiem wara t-tiżrigħ, jew 3,0 × 103 ċelloli għal kull bwejra meta ċ-ċelloli jintużaw ħamest ijiem wara t-tiżrigħ, f’volum tal-koltura ta’ 200 μl. Iċ-ċelloli użati għat-test tal-STE li jinżergħu f’medium tat-tkabbir fid-densità xierqa jilħqu konfluwenza ta’ aktar minn 80 % fil-ħin tal-ittestjar, jiġifieri erba’ jew ħamest ijiem wara t-tiżrigħ.
|
Applikazzjoni tas-Sustanzi Kimiċi tat-Test u tas-Sustanzi tal-Kontroll
|
18.
|
L-ewwel għażla tas-solvent għad-dissoluzzjoni jew għas-sospensjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test hi s-salina fiżjoloġika. Jekk is-sustanza kimika tat-test turi solubbiltà baxxa jew ma tkunx tista’ tiġi dissolta jew sospiża b’mod uniformi għal tal-anqas ħames minuti f’salina, 5 % DMSO (CAS#67-68-5) f’salina tintuża bħala s-solvent tat-tieni għażla. Għal sustanzi kimiċi tat-test li ma jkunux jistgħu jiġu dissolti jew sospiżi b’mod uniformi għal tal-anqas ħames minuti f’salina jew f’5 % DMSO f’salina, jintuża żejt minerali (CAS#8042-47-5) bħala solvent tat-tielet għażla.
|
|
19.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti jew sospiżi b’mod uniformi fis-solvent magħżul f’konċentrazzjoni ta’ 5 % (w/w) u jiġu dilwiti ulterjorment b’dilwizzjoni serjali ta’ 10 darbiet għal konċentrazzjoni ta’ 0,5 % u 0,05 %. Kull sustanza kimika tat-test għandha tiġi ttestjata f’konċentrazzjonijiet ta’ 5 % kif ukoll ta’ 0,05 %. Ċelloli kolturati fil-pjastra b’96 bwejra huma esposti għal 200 μl/bwejra f’konċentrazzjoni ta’ 5 % jew ta’ 0,05 % tas-soluzzjoni (jew sospensjoni) tas-sustanza kimika tat-test, għal ħames minuti f’temperatura ambjentali. Is-sustanzi kimiċi tat-test (sustanzi monokostitwenti jew sustanzi jew taħlitiet multikostitwenti) jitqiesu bħala sustanzi nodfa u dilwiti jew sospiżi skont il-metodu, indipendentement mill-purità tagħhom.
|
|
20.
|
Il-medium tat-tkabbir deskritt fil-paragrafu 16 jintuża bħala kontroll b’medium f’kull pjastra ta’ kull ripetizzjoni. Barra minn hekk, iċ-ċelloli jiġu esposti wkoll għal kampjuni b’kontroll b’solvent f’kull pjastra ta’ kull ripetizzjoni. Is-solventi elenkati fil-paragrafu 18 ġew ikkonfermati li ma għandhom ebda effett avvers fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli SIRC.
|
|
21.
|
Fil-metodu ta’ ttestjar tal-STE, għandu jintuża 0,01 % Sulfat tal-lauril tas-sodju (SLS) f’salina bħala kontroll pożittiv f’kull pjastra ta’ kull ripetizzjoni. Biex tiġi kkalkolata l-vijabbiltà taċ-ċelloli tal-kontroll pożittiv, kull pjastra ta’ kull ripetizzjoni trid tinkludi wkoll kontroll b’solvent salina.
|
|
22.
|
Inbjank hu neċessarju biex jiġi determinat il-kumpens għad-densità ottika u għandu jsir fuq bwejriet li jkun fihom salina baferjata bil-fosfat biss, iżda ebda kalċju u manjeżju (PBS-) jew ċelloli.
|
|
23.
|
Kull kampjun (sustanza kimika tat-test f’5 % u f’0,05 %, il-kontroll b’medium, il-kontroll b’solvent, u l-kontroll pożittiv) għandu jiġi ttestjat f’kull ripetizzjoni bl-esponiment taċ-ċelloli għal 200 μl tas-sustanza kimika tat-test jew tal-kontroll xierqa għal ħames minuti f’temperatura ambjentali.
|
|
24.
|
Sustanzi ta’ riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanzi kimiċi mhux magħrufa ta’ klassi speċifika ta’ sustanzi kimiċi jew ta’ prodotti jikkawżaw irritazzjoni okulari, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta’ irritazzjoni relattiva ta’ irritant okulari fi ħdan medda speċifika ta’ risponsi irritanti.
|
Kejl tal-Vijabbiltà taċ-Ċelloli
|
25.
|
Wara l-esponiment, iċ-ċelloli jinħaslu darbtejn b’200 μl PBS u tiżdied 200 μl soluzzjoni tal-MTT (0,5 mg MTT/ml medium tat-tkabbir). Wara ħin ta’ reazzjoni ta’ sagħtejn f’inkubatur (37°C, 5 % CO2), is-soluzzjoni tal-MTT tiġi dekantata, il-formażan MTT jiġi estratt billi jiżdiedu 200 μl aċidu isopropanol idrokloriku 0,04 N għal 60 minuta fid-dlam f’temperatura ambjentali, u l-assorbanza tas-soluzzjoni tal-formażan MTT titkejjel f’570 nm b’apparat għall-qari tal-pjastri. L-intereferenza tas-sustanzi kimiċi tat-test mal-assaġġ tal-MTT (minn koloranti jew riduċenti diretti tal-MTT) isseħħ biss jekk jinżamm ammont sinifikanti ta’ sustanzi kimiċi tat-test fis-sistema tat-test wara t-tlaħliħ wara l-esponiment, li hu l-każ għall-kornea umana Rikostitwita 3D jew tat-Tessuti tal-epidermis uman rikostitwit iżda mhuwiex rilevanti għall-kolturi ta’ ċelloli 2D użati għall-metodu ta’ ttestjar tal-STE.
|
Interpretazzjoni tal-Mudell tar-Riżultati u tat-Tbassir
|
26.
|
Il-valuri tad-densità ottika (OD) miksuba għal kull sustanza kimika tat-test imbagħad jintużaw biex tiġi kkalkolata l-vijabbiltà taċ-ċelloli għall-kontroll b’solvent, li tiġi stabbilita għal 100 %. Il-vijabbiltà relattiva taċ-ċelloli tiġi espressa bħala perċentwal u tinkiseb bid-diviżjoni tal-OD tas-sustanza kimika tat-test bl-OD tal-kontroll b’solvent wara t-tnaqqis tal-OD tal-inbjank miż-żewġ valuri.
B’mod simili, il-vijabbiltà relattiva taċ-ċelloli ta’ kull kontroll b’solvent tiġi espressa bħala perċentwal u tinkiseb bid-diviżjoni tal-OD ta’ kull kontroll b’solvent bl-OD tal-kontroll b’medium wara t-tnaqqis tal-OD tal-inbjank miż-żewġ valuri.
|
|
27.
|
Għandhom isiru tliet ripetizzjonijiet indipendenti, b’kull waħda li jkun fiha tliet bwejriet repliki (jiġifieri, n=9). Il-medja aritmetika tat-tliet bwejriet għal kull sustanza kimika tat-test u kontroll b’solvent f’kull ripetizzjoni indipendenti tintuża biex tiġi kkalkolata l-medja aritmetika tal-vijabbiltà relattiva taċ-ċelloli. Il-medja aritmetika finali tal-vijabbiltà taċ-ċelloli tiġi kkalkolata mit-tliet ripetizzjonijiet indipendenti.
|
|
28.
|
Il-valuri ta’ limitu tal-vijabbiltà taċ-ċelloli għall-identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP) u tas-sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew għal ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP) jingħataw hawnhekk.
|
Tabella 2
Mudell tat-tbassir tal-metodu ta’ ttestjar tal-STE
|
Vijabbiltà taċ-ċelloli
|
Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU/tas-CLP
|
Applikabbiltà
|
|
F’5 %
|
F’0,05 %
|
|
> 70 %
|
> 70 %
|
Ebda Kategorija
|
Sustanzi u taħlitiet, bl-eċċezzjoni ta’: i) sustanzi ferm volatili bi pressjoni tal-fwar ta’ aktar minn 6 kPa (75) u ii) Sustanzi kimiċi solidi (sustanzi u taħlitiet) għajr tensjoattivi u taħlitiet komposti minn tensjoattivi biss
|
|
≤ 70 %
|
> 70 %
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
Mhux applikabbli
|
|
≤ 70 %
|
≤ 70 %
|
Kategorija 1
|
Sustanzi u taħlitiet (76)
|
Kriterji tal-Aċċettazzjoni
|
29.
|
Ir-riżultati tat-test huma ġudikati bħala aċċettabbli meta jiġu ssodisfati l-kriterji kollha li ġejjin:
|
a)
|
Id-densità ottika tal-kontroll b’medium (espost għal medium tat-tkabbir) għandha tkun ta’ 0,3 jew aktar wara t-tnaqqis tad-densità ottika tal-inbjank.
|
|
b)
|
Il-vijabbiltà tal-kontroll b’solvent għandha tkun 80 % jew aktar relattiva għall-kontroll b’medium. Jekk jintużaw diversi kontrolli b’solvent f’kull ripetizzjoni, kull wieħed minn dawk il-kontrolli għandu juri vijabbiltà taċ-ċelloli akbar minn 80 % biex jiġu kwalitifkati s-sustanzi kimiċi tat-test ittestjati b’dawk is-solventi.
|
|
c)
|
Il-vijabbiltà taċ-ċelloli miksuba bil-kontroll pożittiv (0,01 % SLS) għandha tkun fi ħdan żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika. Il-limiti ta’ aċċettazzjoni superjuri u inferjuri għall-kontroll pożittiv għandhom jiġu aġġornati b’mod frekwenti, jiġifieri kull tliet xhur, jew kull darba li jsir test aċċettabbli f’laboratorji fejn it-testijiet isiru b’mod mhux frekwenti (jiġifieri anqas minn darba f’xahar). Meta laboratorju ma jlestix numru suffiċjenti ta’ esperimenti biex tiġi stabbilita distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll pożittiv, hu aċċettabbli li jintużaw il-limiti ta’ aċċettazzjoni superjuri u inferjuri stabbiliti mill-iżviluppatur tal-metodu, jiġifieri bejn 21,1 % u 62,3 % skont id-data storika tal-laboratorju tiegħu, filwaqt li tinbena distribuzzjoni interna matul l-ewwel testijiet ta’ rutina.
|
|
d)
|
Id-devjazzjoni standard tal-vijabbiltà finali taċ-ċelloli derivata minn tliet ripetizzjonijiet indipendenti għandha tkun anqas minn 15 % għall-konċentrazzjoni ta’ 5 % kif ukoll ta’ 0,05 % tas-sustanza kimika tat-test.
Jekk ma jiġix issodisfat wieħed jew aktar minn dawn il-kriterji, ir-riżultati għandhom jiġu injorati u jsiru tliet ripetizzjonijiet indipendenti oħra.
|
|
DATA U RAPPORTAR
Data
|
30.
|
Id-data għal kull bwejra individwali (eż. il-valuri tal-vijabbiltà taċ-ċelloli) ta’ kull ripetizzjoni kif ukoll il-medja ġenerali, l-SD, u l-klassfikazzjoni jridu jiġu rapportati.
|
Rapport tat-Test
|
31.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
|
Sustanza Kimika tat-Test u Sustanzi tal-Kontroll
|
—
|
Sustanza monokostitwenti: l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i tar-reġistru tas-CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħra;
|
|
—
|
Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita: Karatterizzazzjoni sa fejn possibbli skont, pereżempju, l-identità kimika (ara aktar ’il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti (ara aktar ’il fuq) tal-kostitwenti, sa fejn disponibbli;
|
|
—
|
L-istat fiżiku, il-volatilità, il-pH, il-LogP, il-piż molekulari, il-klassi kimika, u proprjetajiet fiżikokimiċi addizzjonali rilevanti għat-twettiq tal-istudju, sa fejn disponibbli;
|
|
—
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
|
|
—
|
It-trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
—
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli.
|
|
|
|
Kundizzjonijiet u Proċeduri tal-Metodu ta’ Ttestjar
|
—
|
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju;
|
|
—
|
Deskrizzjoni tal-metodu ta’ ttestjar użat;
|
|
—
|
Il-linja ta’ ċelloli użata, is-sors tagħha, in-numru ta’ passaġġi u l-konfluwenza taċ-ċelloli użati għall-ittestjar;
|
|
—
|
Dettalji tal-proċedura tat-test użata;
|
|
—
|
In-numru ta’ ripetizzjonijiet u ta’ repliki użati;
|
|
—
|
Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test użati (jekk differenti minn dawk rakkomandati);
|
|
—
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
—
|
Id-durata tal-esponiment għas-sustanza kimika tat-test (jekk differenti minn dik rakkomandata);
|
|
—
|
Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test;
|
|
—
|
Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ evalwazzjoni u ta’ deċiżjoni użati;
|
|
—
|
Referenza għall-medja tal-kontroll pożittiv storiku u għad-Devjazzjoni Standard (SD):
|
|
—
|
- Wiri ta’ profiċjenza tal-laboratorju fit-twettiq tal-metodu ta’ ttestjar (eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza) jew bil-wiri ta’ prestazzjoni riproduċibbli tal-metodu ta’ ttestjar maż-żmien.
|
|
|
|
Riżultati
|
—
|
Għal kull sustanza kimika tat-test u sustanza tal-kontroll, u kull konċentrazzjoni ttestjata, it-tabulazzjoni għandha tingħata għall-valuri indivdiwali tal-OD għal kull bwejra replikata, għall-valuri medji aritmetiċi tal-OD għal kull ripetizzjoni indipendenti, il- % tal-vijabbiltà taċ-ċelloli għal kull ripetizzjoni indipendenti, u l- % medju aritmetiku finali tal-vijabbiltà taċ-ċelloli u l-SD fit-tliet ripetizzjonijiet;
|
|
—
|
Ir-riżultati għall-medium, għas-solvent u għall-kontroll pożittiv li juru kriterji xierqa ta’ aċċettazzjoni tal-istudji;
|
|
—
|
Deskrizzjoni ta’ effetti oħra osservati;
|
|
—
|
Il-klassifikazzjoni ġenerali derivata b’referenza għall-mudell ta’ tbassir/għall-kriterji tad-deċiżjoni użati.
|
|
|
|
Diskussjoni tar-Riżultati
|
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
Nazzjonijiet Uniti NU (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition. New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
|
|
(2)
|
Scott L, et al. (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-Up and Top-Down Approaches. Toxicol. In Vitro 24, 1-9.
|
|
(3)
|
Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to 7 Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63.
|
|
(4)
|
Takahashi Y, et al. (2008). Development of the Short Time Exposure (STE) Test: an In Vitro Eye Irritation Test Using SIRC Cells. Toxicol. In Vitro 22,760-770.
|
|
(5)
|
Sakaguchi H, et al. (2011). Validation Study of the Short Time Exposure (STE) Test to Assess the Eye Irritation Potential of Chemicals. Toxicol. In Vitro 25,796-809.
|
|
(6)
|
Kojima H, et al. (2013). Second-Phase Validation of Short Time Exposure Tests for Assessment of Eye Irritation Potency of Chemicals. Toxicol. In Vitro 27, pp.1855-1869.
|
|
(7)
|
ICCVAM (2013). Short Time Exposure (STE) Test Method Summary Review Document, NIH. Disponibbli fuq: [http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/ocutox_docs/STE-SRD-NICEATM-508.pdf].
|
|
(8)
|
Il-Kapitolu B.5 ta’ dan l-Anness, Irritazzjoni/Korrużjoni Akuta tal-Għajnejn.
|
|
(9)
|
Saito K, et al. (2015). Predictive Performance of the Short Time Exposure Test for Identifying Eye Irritation Potential of Chemical Mixtures.
|
|
(10)
|
Mikkelson TJ, Chrai SS u Robinson JR. (1973). Altered Bioavailability of Drugs in the Eye Due to Drug-Protein Interaction. J. Pharm. Sci.1648-1653.
|
|
(11)
|
ECETOC (1998). Eye Irritation Reference Chemicals Data Bank. Technical Report (No 48. (2)), Brussels, Belgium.
|
|
(12)
|
Gautheron P, et al. (1992). Bovine Corneal Opacity and Permeability Test: an In Vitro Assay of Ocular Irritancy. Fundam Appl Toxicol. 18, 442-449.
|
|
(13)
|
OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34). Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(14)
|
OECD (2017). Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 263). Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
Appendiċi
DEFINIZZJONIJIET
Akkuratezza
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta’ ttestjar u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ metodu ta’ ttestjar (13).
Sustanza ta’ riferiment
: Sustanza użata bħala standard għall-paragun ma’ sustanza kimika tat-test. Sustanza ta’ riferiment għandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità strutturali u funzjonali għsll-klassi ta’ sustanzi ttestjati; (iii) karatteristiċi fiżiċi/kimiċi magħrufa; (iv) data ta’ sostenn dwar l-effetti magħrufa, u (v) il-potenza magħrufa fil-medda tar-rispons mixtieq.
Approċċ Minn Isfel Għal Fuq
: Approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika tat-test suspettata li ma teħtieġx klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta’ sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni (eżitu negattiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu pożittiv)
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita.
Irritazzjoni tal-għajnejn
: Il-produzzjoni ta’ tibdil fl-għajnejn wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test fil-wiċċ ta’ wara tal-għajn, li jkun kompletament reversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma’ “effetti reversibbli fuq l-għajnejn” u mal-Kategorija 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP.
Rata ta’ negattivi foloz
: Il-proporzjon ta’ sustanzi kimiċi pożittivi kollha identifikati b’mod falz bħala negattivi minn metodu ta’ ttestjar. Dan hu wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.
Rata ta’ foloz pożittivi
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi kollha identifikati b’mod falz bħala pożittivi minn metodu ta’ ttestjar. Dan hu wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.
Periklu
: Proprjetà inerenti ta’ aġent jew ta’ sitwazzjoni li għandha l-potenzjal li tikkawża effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
Kontroll b’medium
: Replika mhux trattata li fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b’kampjuni trattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn biex jiġi determinat jekk is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
Taħlita
: Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.
Sustanza monokostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).
MTT
: Bromur tat-3-(4,5-Dimetiltjażol-2-il)-2,5-difeniltetrażolju; Bromur tat-tetrażolju tal-blu tjażolil.
Sustanza multikostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bit-tħallit ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.
OD
: Densità Ottika.
Kontroll pożittiv
: Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattata b’sustanza li jkun magħruf li tinduċi rispons pożittiv. Biex jiġi żgurat li l-varjabbiltà fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista’ tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test mal-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ metodu ta’ ttestjar (10).
Affidabbiltà
: Kejlijiet ta’ kemm metodu ta’ ttestjar jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbbiltà fl-istess u bejn il-laboratorji u r-ripetibbiltà fl-istess laboratorju (13).
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (10).
Ħsara serja lill-għajnejn
: Il-produzzjoni ta’ ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew ta’ tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika tat-test fuq is-superfiċje tal-għajn, li ma jkunux riversibbli għalkollox fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma’ “effetti irreversibbli fuq l-għajn” u mal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP.
Kontroll b’solvent/veikolu
: Kampjun mhux trattat li fih il-komponenti kollha ta’ sistema tat-test, inkluż is-solvent jew il-veikolu li jiġi proċessat mal-kampjuni trattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħra biex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent jew veikolu. Meta jiġi ttestjat ma’ kontroll b’medium konkorrenti, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent jew il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (13).
Sustanza
: Element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ produzzjoni, li jinduċi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mibdula l-kompożizzjoni tagħha.
Tensjoattiv
: Imsejjaħ ukoll aġent tensjoattiv, dan hu sustanza kimika, bħal deterġent, li tista’ tnaqqas it-tensjoni tas-superfiċje ta’ likwidu u b’hekk tippermettilu jtella’ r-ragħwa jew jippenetra solidi; hu magħruf ukoll bħala aġent li jxarrab.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar.
Strateġija ta’ ttestjar sekwenzjali
: Strateġija ta’ ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi rieżaminata, f’ordni speċifiku, permezz ta’ proċess tal-piż tal-evidenza f’kull livell biex jiġi determinat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta’ irritazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test jista’ jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta’ irritazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test ma jkunx jista’ jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta’ ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista’ ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.
Approċċ Minn Fuq Għal Isfel
: approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika tat-test suspettata li tikkawża ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta’ sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (eżitu pożittiv) minn sustanzi kimiċi oħra (eżitu negattiv).
Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
: Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (1).
Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP
: Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.
Kategorija 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP
: Ara “Irritazzjoni tal-għajnejn”.
Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP
: Sustanzi kimiċi li mhumiex klassifikati bħala tal-Kategorija 1 jew 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP (jew tal-Kategorija 2A jew 2B tal-GHS tan-NU).
UVCB
: sustanzi b’kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.
B.69 METODU TA’ TTESTJAR TAL-EPITELJU BĦALL-KORNEA UMANA RIKOSTITWITA (RhCE) GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TA’ SUSTANZI KIMIĊI LI MA JEĦTIĠUX KLASSIFIKAZZJONI U TIKKETTAR GĦALL-IRRITAZZJONI TAL-GĦAJNEJN JEW GĦAL ĦSARA SERJA LILL-GĦAJNEJN
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 492 tal-OECD (2017). Ħsara serja lill-għajnejn tirreferi għall-produzzjoni ta’ ħsara fit-tessut tal-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test fuq is-superfiċje anterjuri tal-għajn, li ma jkunux riversibbli għalkollox fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni, kif definita mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU) (1) u mir-Regolament tal-Unjoni Ewropea (UE) 1272/2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet (CLP) (77). Skont il-GHS tan-NU u s-CLP ukoll, irritazzjoni tal-għajnejn tirreferi għall-produzzjoni ta’ tibdil fl-għajnejn wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test fil-wiċċ ta’ wara tal-għajn, li jkun kompletament reversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn huma klassifikati bħala tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU u tas-CLP, filwaqt li dawk li jinduċu irritazzjoni tal-għajnejn huma klassifikati bħala tal-Kategorija 2 tal-GHS tan-NU u tas-CLP. Is-sustanzi kimiċi tat-test mhux klassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew għal ħsara serja lill-għajnejn huma definiti bħala dawk li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU u tas-CLP, jiġifieri huma msejħa bħala tal-Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU u tas-CLP.
|
|
2.
|
Il-valutazzjoni ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn tipikament kienet tinvolvi l-użu ta’ annimali tal-laboratorju (TM B.5 (2)). L-għażla tal-aktar metodu ta’ ttestjar xieraq u l-użu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar għandhom jiġu kkunsidrati fil-kuntest tad-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar Approċċi Integrati dwar l-Ittestjar u l-Valutazzjoni għal Ħsara Serja lill-Għajnejn u l-Irritazzjoni tal-għajnejn (39).
|
|
3.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jiddeskrivi proċedura in vitro li tippermetti li jiġu identifikati sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li ma jeħtiġux klassifikazzjoni u tikkettar għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew għal ħsara serja lill-għajnejn skont il-GHS tan-NU u s-CLP. Juża l-epitelju bħall-kornea umana rikostitwita (RhCE) li jimita mill-qrib il-proprjetajiet istoloġiċi, morfoloġiċi, bijokimiċi u fiżjoloġiċi tal-epitelju korneali uman. Ġew validati erba’ metodi ta’ ttestjar in vitro oħra, meqjusa xjentifikament validi u adottati bħala t-TM B.47 (3), B.48 (4), B.61 (5) u B.68 (6) biex jindirizzaw il-punt ta’ tmiem tas-saħħa tal-bniedem ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn.
|
|
4.
|
F’dan il-metodu ta’ ttestjar huma inklużi żewġ testijiet validati li jużaw mudelli RhE kummerċjalment disponibbli. Saru studji ta’ validazzjoni għall-valutazzjoni ta’ irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn (7)(8)(9)(10)(11)(12)(13) bl-użu ta’ EpiOcular™ Eye Irritation Test (EIT) u ta’ SkinEthic™ Human Corneal Epithelium (HCE) Eye Irritation Test (EIT). Kull wieħed minn dawn it-testijiet jagħmel użu minn binjiet ta’ tessut tal-RhCE kummerċjalment disponibbli bħala sistema tat-test, li huma riferiti fit-test li ġej bħala l-Metodi ta’ Referenza Validati – VRM 1 u VRM2, rispettivament. Minn dawn l-istudji ta’ validazzjoni u mir-rieżami bejn il-pari indipendenti tagħhom (9)(12), ġie konkluż li EpiOcular™ EIT u SkinEthic™ HCE EIT kapaċi jidentifikaw kif suppost sustanzi kimiċi (kemm sustanzi kif ukoll taħlitiet) li ma jeħtiġux klassifikazzjoni u tikkettar għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew għall-ħsara serja lill-għajnejn skont il-GHS tan-NU, u t-testijiet ġew rakkomandati bħala xjentifikament validi għal dak l-iskop (13).
|
|
5.
|
Bħalissa ġeneralment hu aċċettat li, fil-futur qarib, ebda metodu ta’ ttestjar in vitro uniku mhu se jkun jista’ jieħu post bis-sħiħ it-test tal-għajnejn in vivo Draize (2)(14) biex ibassar il-medda sħiħa ta’ risponsi ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn għall-klassijiet differenti ta’ sustanzi kimiċi. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta’ diversi metodi ta’ ttestjar alternattivi fi ħdan strateġiji ta’ ttestjar (sekwenzjali) bħall-approċċ minn Isfel għal Fuq/minn Fuq għal Isfel jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn għalkollox (15). L-approċċ minn Isfel għal Fuq (15) hu mfassal biex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija ma tikkawżawx irritazzjoni tal-għajnejn suffiċjenti biex teħtieġ klassifikazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Fuq għal Isfel (15) hu mfassal biex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija tikkawża ħsara serja lill-għajnejn. EpiOcular™ EIT u SkinEthic™ HCE EIT huma rakkomandati biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew għall-ħsara serja lill-għajnejn skont (Ebda Kategorija) il-GHS tan-NU/is-CLP mingħajr ittestjar ulterjuri, fi ħdan strateġija ta’ ttestjar bħall-approċċ minn Isfel għal Fuq/minn Fuq għal Isfel suġġerit minn Scott et al. eż. bħala pass inizjali f’approċċ minn Isfel għal Fuq jew bħala wieħed mill-aħħar passi f’approċċ minn Fuq għal Isfel (15). Madankollu, EpiOcular™ EIT u SkinEthic™ HCE EIT mhumiex maħsuba biex jagħmlu distinzjoni bejn il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP (ħsara serja lill-għajnejn) u l-Kategorija 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP (irritazzjoni tal-għajnejn). Din id-differenzazzjoni se jkollha bżonn tiġi indirizzata minn saff ieħor ta’ strateġija tat-test (15). B’hekk, sustanza kimika tat-test li tiġi identifikata bħala waħda li teħtieġ klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn b’EpiOcular™ EIT jew SkinEthic™ HCE EIT se tkun teħtieġ ittestjar addizzjonali (in vitro u/jew in vivo) biex tinkiseb konklużjoni definittiva (Ebda Kategorija, Kategorija 2 jew Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP), billi jintuża, eż., it-TM B.47, B.48, B.61 jew B.68.
|
|
6.
|
L-iskop ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar hu li jiddeskrivi l-proċedura użata għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajnejn fuq il-bażi tal-ħila tagħha li tinduċi ċitotossiċità f’binja tat-tessut tal-RhCE, kif imkejla mill-assaġġ tal-MTT (16) (ara l-paragrafu 21). Il-vijabbiltà tat-tessut tal-RhCE wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test hi determinata meta dawn jitqabblu ma’ tessuti trattati bis-sustanza tal-kontroll negativ (% vijabbiltà), u mbagħad tintuża biex jitbassar il-potenzjal ta’ periklu tas-sustanza kimika tat-test għall-għajnejn.
|
|
7.
|
Hemm standards tal-prestazzjoni (17) disponibbli biex jiffaċilitaw il-validazzjoni ta’ testijiet in vitro ġodda jew modifikati bbażati fuq l-RhCE simili għal EpiOcular™ EIT u għal SkinEthic™ HCE EIT, skont il-prinċipji tad-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 34 (18), u jippermettu għall-emendar puntwali tat-TG 492 tal-OECD għall-inklużjoni tagħhom. Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data (MAD) skont il-ftehim tal-OECD se tkun garantita biss għal testijiet validati skont l-istandards tal-prestazzjoni, jekk dawn it-testijiet ikunu ġew rieżaminati u inklużi fil-linja gwida tat-test korrispondenti mill-OECD.
|
DEFINIZZJONIJIET
|
8.
|
Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
9.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu bbażat fuq binjiet tat-tessuti tal-RhCE tridimensjonali kummerċjali li huma prodotti bl-użu ta’ keratinoċiti epidermali umani primarji (jiġifieri EpiOcular™ OCL-200) jew ċelloli epiteljali korneali immortalizzati umani (jiġifieri SkinEthic™ HCE/S). Il-binjiet tat-tessuti EpiOcular™ OCL-200 u SkinEthic™ HCE/S RhCE huma simili għall-istruttura tridimensjonali tal-epitelju korneali in vivo u huma prodotti bl-użu ta’ ċelloli mill-ispeċijiet ta’ interess (19)(20). Barra minn hekk, it-testijiet ikejlu b’mod dirett iċ-ċitotossiċità li tirriżulta mill-penetrazzjoni tas-sustanza kimika permezz tal-kornea u mill-produzzjoni ta’ ħsara fiċ-ċelloli u fit-tessuti; ir-rispons ċitotossiku mbagħad jiddetermina l-eżitu in vivo ġenerali ta’ ħsara serja lill-għajnejn/ta’ irritazzjoni tal-għajnejn. Il-ħsara fiċ-ċelloli tista’ sseħħ b’diversi modalitajiet ta’ azzjoni (ara l-paragrafu 20), iżda ċ-ċitotossiċità taqdi rwol mekkanistiku importanti, jekk mhux dak primarju, fid-determinazzjoni tar-rispons ġenerali ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn ta’ sustanza kimika, muri in vivo primarjament minn opaċità korneali, irite, ħmura konġuntivali u/jew kemożi konġuntivali, indipendentement mill-proċessi fiżikokimiċi li huma fil-bażi tal-ħsara fit-tessuti.
|
|
10.
|
Medda wiesgħa ta’ sustanzi kimiċi, li tkopri varjetà kbira ta’ tipi ta’ sustanzi kimiċi, ta’ klassijiet ta’ sustanzi kimiċi, ta’ piżijiet molekolari, ta’ LogPs, ta’ strutturi ta’ sustanzi kimiċi, eċċ., ġiet ittestjata fl-istudju ta’ validazzjoni li hu l-bażi ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar. Il-bażi ta’ data ta’ validazzjoni ta’ EpiOcular™ EIT kien fiha 113-il sustanza kimika b’kollox, li jkopru 95 grupp funzjonali organiku differenti skont analiżi tas-sett ta’ għodod tal-QSAR tal-OECD (8). Il-maġġoranza ta’ dawn is-sustanzi kimiċi kienet tirrappreżenta sustanzi monokostitwenti, iżda diversi sustanzi multikostitwenti (inklużi 3 omopolimeri, 5 kopolimeri u 10 kważi polimeri) ġew inklużi wkoll fl-istudju. F’termini tal-istat fiżiku u tal-Kategoriji tal-GHS tan-NU/tas-CLP, il-113-il sustanza kimika ttestjati ġew distribwiti kif ġej: 13-il likwidu tal-Kategorija 1, 15-il solidu tal-Kategorija 1, 6 likwidi tal-Kategorija 2A, 10 solidi tal-Kategorija 2A, 7 likwidi tal-Kategorija 2B, 7 solidi tal-Kategorija 2B, 27 likwidu ta’ Ebda Kategorija u 28 solidu ta’ Ebda Kategorija (8). Il-bażi ta’ data ta’ validazzjoni ta’ SkinEthic™ HCE EIT kien fiha 200 sustanza kimika b’kollox, li jkopru 165 grupp funzjonali organiku differenti (8)(10)(11). Il-maġġoranza ta’ dawn is-sustanzi kimiċi kienet tirrappreżenta sustanzi monokostitwenti, iżda diversi sustanzi multikostitwenti (inklużi 10 polimeri) ġew inklużi wkoll fl-istudju. F’termini tal-istat fiżiku u tal-Kategoriji tal-GHS tan-NU/tas-CLP, il-200-il sustanza kimika ttestjati ġew distribwiti kif ġej: 27 likwidu tal-Kategorija 1, 24 solidu tal-Kategorija 1, 19-il likwidu tal-Kategorija 2A, 10 solidi tal-Kategorija 2A, 9 likwidi tal-Kategorija 2B, 8 solidi tal-Kategorija 2B, 50 likwidu ta’ Ebda Kategorija u 53 solidu ta’ Ebda Kategorija (10)(11).
|
|
11.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu applikabbli għal sustanzi u għal taħlitiet, u għal solidi, għal likwidi, għal semisolidi u għal xama’. Il-likwidi jistgħu jkunu jew ma jkunux milwiema; is-solidi jistgħu jkunu jew ma jkunux solubbli fl-ilma. Kull meta dan ikun possibbli, is-solidi għandhom jiġu mitħuna fi trab fin qabel ma jiġu applikati; mhu meħtieġ ebda pretrattament ieħor tal-kampjun. Il-gassijiet u l-aerosols ma ġewx ivvalutati fi studju ta’ validazzjoni. Filwaqt li huwa mifhum li dawn jistgħu jiġu ttestjati billi tintuża t-teknoloġija tal-RhCE, il-metodu ta’ ttestjar attwali ma jippermettix l-ittestjar ta’ gassijiet u ta’ aerosols.
|
|
12.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test li jassorbu d-dawl fl-istess medda bħal MTT formażan (naturalment jew wara t-trattament) u s-sustanzi kimiċi tat-test li kapaċi jnaqqsu direttament l-MTT tal-kulurant vitali (għal MTT formażan) jistgħu jinterferixxu mal-kejlijiet tal-vijabbiltà tat-tessut u jkollhom bżonn l-użu ta’ kontrolli adattati għall-korrezzjonijiet. It-tip ta’ kontrolli adattati li jistgħu jkunu meħtieġa se jvarja skont it-tip ta’ interferenza prodotta mis-sustanza kimika tat-test u l-proċedura użata biex jiġi kwantifikat l-MTT formażan (ara l-paragrafi 36-42).
|
|
13.
|
Ir-riżultati ġenerati fl-istudji ta’ prevalidazzjoni (21)(22) u ta’ validazzjoni sħiħa (8)(10)(11) urew li kemm EpiOcular™ EIT kif ukoll SkinEthic™ HCE EIT huma trasferibbli għal laboratorji meqjusa li jkunu għadhom ġodda fit-twettiq tal-assaġġi u li huma wkoll riproduċibbli fi ħdan u bejn il-laboratorji. Fuq il-bażi ta’ dawn l-istudji, il-livell ta’ riproduċibbiltà f’termini ta’ konkordanza tat-tbassiriet li jistgħu jkunu mistennija minn EpiOcular™ EIT minn data dwar 113-il sustanza kimika hu fl-ordni ta’ 95 % fi ħdan il-laboratorji u ta’ 93 % bejn il-laboratorji. Il-livell ta’ riproduċibbiltà f’termini ta’ konkordanza tat-tbassiriet li jistgħu jkunu mistennija minn SkinEthic™ HCE EIT minn data dwar 120 sustanza kimika hu fl-ordni ta’ 92 % fi ħdan il-laboratorji u ta’ 95 % bejn il-laboratorji.
|
|
14.
|
EpiOcular™ EIT jista’ jintuża biex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn skont is-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU u s-CLP. Fid-dawl tad-data miksuba fl-istudju ta’ validazzjoni (8), EpiOcular™ EIT għandu akkuratezza ġenerali ta’ 80 % (fuq il-bażi ta’ 112-il sustanza kimika), sensittività ta’ 96 % (fuq il-bażi ta’ 57 sustanza kimika), rata ta’ negattivi foloz ta’ 4 % (fuq il-bażi ta’ 57 sustanza kimika), speċifiċità ta’ 63 % (fuq il-bażi ta’ 55 sustanza kimika) u rata ta’ pożittivi foloz ta’ 37 % (fuq il-bażi ta’ 55 sustanza kimika), meta mqabbel mad-data ta’ referenza tat-test in vivo fuq għajnejn il-fniek (TM B.5) (2)(14) klassifikata skont is-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU u tas-CLP. Studju li fih 97 formulazzjoni agrokimika likwida ġew ittestjati b’EpiOcular™ EIT wera prestazzjoni simili tal-metodu ta’ ttestjar għal dan it-tip ta’ taħlitiet kif miksuba fl-istudju ta’ validazzjoni (23). Is-97 formulazzjoni kienu distribwiti kif ġej: 21 tal-Kategorija 1, 19 tal-Kategorija 2A, 14 tal-Kategorija 2B u 43 tal-Ebda Kategorija, klassifikati skont is-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU fuq il-bażi ta’ data ta’ referenza tat-test in vivo fuq għajnejn il-fniek (TM B.5) (2)(14). Inkisbu akkuratezza ġenerali ta’ 82 % (fuq il-bażi ta’ 97 formulazzjoni), sensittività ta’ 91 % (fuq il-bażi ta’ 54 formulazzjoni), rata ta’ negattivi foloz ta’ 9 % (fuq il-bażi ta’ 54 formulazzjoni), speċifiċità ta’ 72 % (fuq il-bażi ta’ 43 formulazzjoni) u rata ta’ pożittivi foloz ta’ 28 % (fuq il-bażi ta’ 43 formulazzjoni) (23).
|
|
15.
|
SkinEthic™ HCE EIT jista’ jintuża biex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn skont is-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU u s-CLP. Fid-dawl tad-data miksuba fl-istudju ta’ validazzjoni (10)(11), SkinEthic™ HCE EIT għandu akkuratezza ġenerali ta’ 84 % (fuq il-bażi ta’ 200 sustanza kimika), sensittività ta’ 95 % (fuq il-bażi ta’ 97 sustanza kimika), rata ta’ negattivi foloz ta’ 5 % (fuq il-bażi ta’ 97 sustanza kimika), speċifiċità ta’ 72 % (fuq il-bażi ta’ 103 sustanzi kimiċi) u rata ta’ pożittivi foloz ta’ 28 % (fuq il-bażi ta’ 103 sustanzi kimiċi), meta mqabbel mad-data ta’ referenza tat-test in vivo fuq għajnejn il-fniek (TM B.5) (2)(14) klassifikata skont is-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU u tas-CLP.
|
|
16.
|
Ir-rati ta’ negattivi foloz miksuba biż-żewġ testijiet tal-RhCE, b’sustanzi jew inkella b’taħlitiet, jaqgħu fi ħdan il-probabbiltà ġenerali ta’ 12 % li s-sustanzi kimiċi jiġu identifikati bħala tal-Kategorija 2 tal-GHS tan-NU u tas-CLP u tal-Ebda Kategorija tas-CLP mit-test in vivo tal-għajnejn Draize, f’testijiet ripetuti; dan hu dovut għall-varjabbiltà inerenti fi ħdan it-test tal-metodu (24). Ir-rati ta’ pożittivi foloz miksuba biż-żewġ metodi ta’ ttestjar tal-RhCE b’sustanzi jew inkella b’taħlitiet mhumiex kritiċi fil-kuntest ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar peress li s-sustanzi kimiċi tat-test kollha li jipproduċu vijabbiltà tat-tessuti daqs jew anqas mil-limiti stabbiliti (ara l-paragrafu 44) se jkunu jeħtieġu ttestjar ulterjuri b’metodi ta’ ttestjar in vitro oħra, jew bħala l-aħħar rikors fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta’ strateġija ta’ ttestjar sekwenzjali f’approċċ ta’ piż tal-evidenza. Dawn il-metodi ta’ ttestjar jistgħu jintużaw għat-tipi kollha ta’ sustanzi kimiċi, li bihom għandu jinkiseb riżultat negattiv talli sustanza kimika ma tiġix klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn u għal ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NUu tas-CLP). Għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel l-użu ta’ EpiOcular™ EIT u ta’ SkinEthic™ HCE EIT skont skemi ta’ klassifikazzjoni oħrajn li mhumiex il-GHS tan-NU/is-CLP.
|
|
17.
|
Limitazzjoni ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar hu li ma jippermettix għal diskriminazzjoni bejn irritazzjoni tal-għajn/effetti riversibbli fuq l-għajn (Kategorija 2) u ħsara serja lill-għajn/effetti irriversibbli fuq l-għajn (Kategorija 1) kif definiti mill-GHS tan-NU u mis-CLP, u lanqas bejn irritanti tal-għajn (Kategorija 2A fakultattiva) u irritanti ħfief tal-għajn (Kategorija 2B fakultattiva), kif definiti mill-GHS tan-NU (1). Għal dawn l-għanijiet ikun meħtieġ ittestjar ulterjuri b’metodi ta’ ttestjar in vitro oħra.
|
|
18.
|
It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża f’dan il-metodu ta’ ttestjar biex jirreferi għal dak li jkun qed jiġi ttestjat (78) u mhux b’rabta mal-applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar tal-RhCE għall-ittestjar ta’ sustanzi u/jew ta’ taħlitiet.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
19.
|
Is-sustanza kimika tat-test tiġi applikata fuq il-ġilda ta’ tal-anqas żewġ binjiet tat-tessut tal-RhCE tridimensjonali u l-vijabbiltà tat-tessuti titkejjel wara l-esponiment u perjodu inkubazzjoni ta’ wara t-trattament. It-tessuti tal-RhCE jiġu rikostitwiti minn keratinoċiti epidermali umani primarji jew minn ċelloli epiteljali korneali immortalizzati umani, li jkunu ġew kolturati għal diversi ġranet biex jifformaw epitelju skwamuż differenzjat ħafna u stratifikat li jkun morfoloġikament simili għal dak li jinstab fil-kornea umana. Il-binja tat-tessut tal-RhCE EpiOcular™ tikkonsisti f’tal-anqas 3 saffi vijabbli ta’ ċelloli u f’wiċċ mhux keratinizzat, u turi struttura bħall-kornea analoga għal dik misjuba in vivo. Il-binja tat-tessuti tal-RhCE SkinEthic™ HCE tikkonsisti f’tal-anqas 4 saffi vijabbli ta’ ċelloli li jinkludu ċelloli bażali kolonnari, ċelloli transizzjonali tal-ġwienaħ u ċelloli skwamużi superfiċjali simili għal dawk tal-epitelju korneali uman normali (20)(26).
|
|
20.
|
Ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn indotta kimikament, manifestata in vivo primarjament minn opaċità korneali, minn irite, minn ħmura konġuntivali u/jew minn kemożi konġuntivali, hi r-riżultat ta’ diversi avvenimenti li jibdew bil-penetrazzjoni tas-sustanza kimika fil-kornea u/jew fil-konġuntiva u bil-produzzjoni ta’ ħsara fiċ-ċelloli. Il-ħsara fiċ-ċelloli tista’ sseħħ b’diversi modalitajiet ta’ azzjoni, li jinkludu: liżi tal-membrana taċ-ċelloli (eż. minn tensjoattivi, minn solventi organiċi); koagulazzjoni ta’ makromolekoli (b’mod partikolari proteini) (eż. minn tensjoattivi, minn solventi organiċi, minn alkalis u minn aċidi); saponifikazzjoni ta’ lipidi (eż. minn alkali); u alkilazzjoni jew interazzjonijiet kovalenti oħra b’makromolekoli (eż. minn bliċis, perossidi u alkilaturi) (15)(27)(28). Madankollu, intwera li ċ-ċitotossiċità taqdi rwol mekkanistiku importanti, jekk mhux primarju, fid-determinazzjoni tar-rispons ġenerali għall-ħsara serja lill-għajnejn/għall-irritazzjoni tal-għajnejn ta’ sustanza kimika, indipendentement mill-proċessi fiżikokimiċi li huma l-bażi tal-ħsara fit-tessut (29)(30). Barra minn hekk, il-potenzjal ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn ta’ sustanza kimika hu primarjament determinat mill-firxa ta’ korriment inizjali (31), li tikkorrelata mal-firxa ta’ mewt ta’ ċelloli (29) u mal-firxa tar-risponsi sussegwenti u tal-eżiti eventwali (32). B’hekk, irritanti ħfief ġeneralment jaffettwat biss l-epitelju korneali superfiċjali, l-irritanti ħfief u moderata jagħmlu ħsara primarjament lill-epitelju u lill-istroma superfiċjali u l-irranti severi jagħmlu ħsara lill-epitelju, lill-istroma fonda u kultant lill-endotelju korneali (30)(33). Il-kejl tal-vijabbiltà tal-binja tat-tessuti tal-RhCE wara l-esponiment topiku għal sustanza kimika tat-test biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU u tas-CLP) hu bbażat fuq is-suppożizzjoni li s-sustanzi kimiċi kollha li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn jew irritazzjoni tal-għajnejn jinduċu ċitotossiċità fl-epitelju korneali u/jew fil-konġuntiva.
|
|
21.
|
Il-vijabbiltà tat-tessuti tal-RhCE titkejjel b’konverżjoni enzimatika tal-kulurant vitali MTT [Bromur tat-3-(4,5-Dimetiltjażol-2-il)-2,5- difeniltetrażolju; Bromur tat-tetrażolju tal-blu tjażolil; Numru CAS 298-93-1] miċ-ċelloli vijabbli tat-tessut f’melħ tal-formażan MTT blu li jitkejjel b’mod kwantitattiv wara l-estrazzjoni mit-tessuti (16). Sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni u tikkettar (Ebda Kategorija) tal-GHS tan-NU/tas-CLP huma identifikati bħala dawk li ma jnaqqsux il-vijabbiltà tat-tessuti f’livell anqas minn limitu definit (jiġifieri vijabbiltà tat-tessuti ta’ > 60 %, f’EpiOcular™ EIT u fi SkinEthic™ HCE EITL (79), jew ta’ > 50 %, fi SkinEthic™ HCE EITS (80)) (ara l-paragrafu 44).
|
WIRI TAL-PROFIĊJENZA
|
22.
|
Qabel l-użu ta’ rutina ta’ testijiet tal-RhCE għal finijiet regolatorji, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jbassru kif suppost il-ħmistax-il sustanza kimika ta’ profiċjenza elenkati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi kimiċi ntgħażlu mis-sustanzi kimiċi użati fl-istudji ta’ validazzjoni tal-VRMs (8)(10)(11). L-għażla, sa fejn possibbli, tinkludi sustanzi kimiċi li: (i) ikopru stati fiżiċi differenti; (ii) ikopru l-medda sħiħa ta’ risponsi in vivo ta’ ħsara serja lill-għajnejn/irritazzjoni tal-għajnejn fuq il-bażi ta’ riżultati ta’ kwalità għolja miksuba fit-test in vivo ta’ referenza fuq għajnejn il-fniek (TM B.5) (2)(14) u s-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (jiġifieri l-Kategoriji 1, 2A, 2B jew Ebda Kategorija) (1) u s-sistema ta’ klassifikazzjoni tas-CLP (jiġifieri l-Kategoriji 1, 2 jew Ebda Kategorija); (iii) ikopru d-diversi fatturi in vivo tal-klassifikazzjoni (24)(25); (iv) huma rappreżentattivi tal-klassijiet kimiċi użati fl-istudju ta’ validazzjoni (8)(10)(11); (v) ikopru rappreżentazzjoni tajba u wiesgħa ta’ gruppi funzjonali organiċi (8)(10)(11); (vi) għandhom strutturi kimiċi li huma definiti sew (8)(10)(11); (vii) huma kkuluriti u/jew riduċenti diretti tal-MTT; (viii) ipproduċew riżultati riproduċibbli fil-metodi ta’ ttestjar tal-RhCE matul il-validazzjonijiet tagħhom; (ix) tbassru kif suppost mill-metodi ta’ ttestjar tal-RhCE matul l-istudji ta’ validazzjoni tagħhom; (x) ikopru l-medda sħiħa ta’ risponsi in vitro fuq il-bażi ta’ data ta’ kwalità għolja tal-metodi ta’ ttestjar tal-RhCE (vijabbiltà ta’ 0 sa 100 %); (xi) huma kummerċjalment disponibbli; u (xii) mhumiex assoċjati ma’ spejjeż projbittivi ta’ xiri u/jew ta’ rimi. F’sitwazzjonijiet li fihom sustanza kimika elenkata ma tkunx disponibbli jew ma tkunx tista’ tintuża għal raġunijiet ġustifikati oħra, tista’ tintuża sustanza kimika oħra li tissodisfa l-kriterji deskritti hawn fuq, eż. mis-sustanzi kimiċi użati fil-validazzjoni tal-VRM. Madankollu, devjazzjonijiet bħal dawn għandhom ikunu ġustifikati.
Tabella 1
Lista ta’ sustanzi kimiċi ta’ profiċjenza
|
Isem Kimiku
|
CASRN
|
Grupp Funzjonali Organiku (81)
|
Stat Fiżiku
|
Vijabbiltà tal-VRM1 (%) (82)
|
Vijabbiltà tal-VRM2 (%) (83)
|
Tbassir tal-VRM
|
Riduċent tal-MTT
|
Interf. tal-kulur
|
|
Kategorija In Vivo 1 (84)
|
|
|
Metiltjoglikolat
|
2365-48-2
|
Ester tal-aċidu karbossiliku; Tjoalkoħol
|
L
|
10,9±6,4
|
5,5±7,4
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
Y (b’saħħtu)
|
L
|
|
Akrilat tal-idrossietil
|
818-61-1
|
Akrilat; Alkoħol
|
L
|
7,5±4,7 (85)
|
1,6±1,0
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
L
|
|
2,5-Dimetil-2,5-eżanedjol
|
110-03-2
|
Alkoħol
|
S
|
2,3±0,2
|
0,2±0,1
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
L
|
|
Ossalat tas-sodju
|
62-76-0
|
Aċidu ossokarbossiliku
|
S
|
29,0±1,2
|
5,3±4,1
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
L
|
|
Kategorija In Vivo 2A (84)
|
|
|
2,4,11,13-Tetraażatetradekan-diimidammid, N,N″-bis(4-klorofenil)-3,12-diimino-, di-D-glukonat (20 %, milwiem) (86)
|
18472-51-0
|
Aloġenur eteroċikliku aromatiku; Aloġenur tal-aril; Grupp tad-diidrossil; Gwanidina
|
L
|
4,0±1,1
|
1,3±0,6
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
Y (dgħajjef)
|
|
Benżoat tas-sodju
|
532-32-1
|
Aril; Aċidu karbossiliku
|
S
|
3,5±2,6
|
0,6±0,1
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
L
|
|
Kategorija In Vivo 2B (84)
|
|
|
Dietil toluammid
|
134-62-3
|
Benżammid
|
L
|
15,6±6,3
|
2,8±0,9
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
L
|
|
2,2-Dimetil-3-metilenbiċiklo [2.2.1] ettan
|
79-92-5
|
Alkan, ramifikat b’karbonju terzjarju; Alken; Biċikloettan; Karboċikli bi ċrieki pont; Ċikloalkan
|
S
|
4,7±1,5
|
15,8±1,1
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
L
|
L
|
|
Ebda Kategorija In Vivo
(84)
|
|
|
1-Etil-3-metilimidażolju etilsulfat
|
342573-75-5
|
Alkossi; Melħ tal-ammonju; Aril; Imidażol; Sulfat
|
L
|
79,9±6,4
|
79,4±6,2
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
Eter tad-dikaprilil
|
629-82-3
|
Alkossi; Eter
|
L
|
97,8±4,3
|
95,2±3,0
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
Butossidu tal-piperonil
|
51-03-6
|
Alkossi; Benżodiossol; Benżil; Eter
|
L
|
104,2±4,2
|
96,5±3,5
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
Żejt tar-riġnu idroġenat tal-glikol tal-polietilen (PEG-40)
|
61788-85-0
|
Aċilal; Alkoħol; Allil; Eter
|
Viskuż
|
77,6±5,4
|
89,1±2,9
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
1-(4-Klorofenil)-3-(3,4-diklorofenil) urea
|
101-20-2
|
Aloġenur eteroċikliku aromatiku; Aloġenur tal-aril; Derivati tal-urea
|
S
|
106,7±5,3
|
101,9±6,6
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
2,2′-Metilen-bis-(6-(2H-benżotriażol-2-il)-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenol)
|
103597-45-1
|
Alkan ramifikat b’karbonju kwaternarju; Aromatiku karboċikliku fuż; Eteroċikli saturati fużi; Komposti kwinojdi prekursuri; terz-Butil
|
S
|
102,7±13,4
|
97,7±5,6
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
Tetrafluworoborat tal-potassju
|
14075-53-7
|
Melħ Inorganiku
|
S
|
88,6±3,3
|
92,9±5,1
|
Ebda Kat
|
L
|
L
|
|
Abbrevjazzjonijiet:
CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; GHS tan-NU = Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (1); VRM1 = Metodu ta’ Referenza Validat, EpiOcular™ EIT; VRM2 = Metodu ta’ Referenza Validat, SkinEthic™ HCE EIT; Interf. tal-kulur = interferenza tal-kulur bil-kejl tal-assorbanza standard (Densità Ottika (OD)) tal-formażan MTT.
|
|
|
23.
|
Bħala parti mill-ittestjar tal-profiċjenza, hu rrakkomandat li l-utenti jivverifikaw il-karatteristiċi ta’ protezzjoni tat-tessuti wara li dawn jiġu riċevuti kif speċifikat mill-produttur tal-binja tat-tessuti tal-RhCE (ara l-paragrafi 25, 27 u 30). Dan hu ta’ importanza partikolari jekk it-tessuti jintbagħtu minn distanzi twal / jekk idumu biex jaslu. Ladarba test ikun ġie stabbilit b’suċċess u tkun inkisbet u ntweriet profiċjenza fl-użu tiegħu, verifika bħal din ma għandhiex tkun meħtieġa fuq bażi ta’ rutina. Madankollu, meta jintuża test b’rutina, hu rakkomandat li jibqgħu jiġu vvalutati l-karatteristiċi ta’ protezzjoni f’intervalli regolari.
|
PROĊEDURA
|
24.
|
It-testijiet li bħalissa huma koperti minn dan il-metodu ta’ ttestjar huma l-metodi xjentifikament validi ta’ EpiOcular™ EIT u ta’ SkinEthic™ HCE EIT (9) (12)(13), imsejħa bħala l-Metodu ta’ Referenza Validat (VRM1 u VRM2, rispettivament). Il-Proċeduri Operattivi Standard (SOP) għall-metodi ta’ ttestjar tal-RhCE huma disponibbli u għandhom jitħaddmu meta jiġu implimentati u jintużaw il-metodi ta’ ttestjar f’laboratorju (34)(35). Il-paragrafi li ġejjin u l-Appendiċi 2 jiddeskrivu l-komponenti u l-proċeduri ewlenin tat-testijiet tal-RhCE.
|
KOMPONENTI TAL-METODU TA’ TTESTJAR TAL-RHCE
Kundizzjonijiet ġenerali
|
25.
|
Iċ-ċelloli rilevanti miksuba mill-bniedem għandhom jintużaw biex jiġi rikostitwit it-tessut tridimensjonali tal-epitelju li jixbah il-kornea, li għandu jkun kompost minn ċelloli stratifikati b’mod progressiv iżda mhux kornifikati. Il-binja tat-tessuti tal-RhCE titħejja f’inserzjonijiet b’membrana sintetika poruża li minnha n-nutrijenti jkunu jistgħu jgħaddu għaċ-ċelloli. Għandu jkun hemm diversi saffi ta’ ċelloli epiteljali vijabbli mhux keratinizzati fl-epitelju rikostitwit li jixbah il-kornea. Il-binja tat-tessuti tal-RhCE għandu jkollha s-superfiċje epiteljali f’kuntatt dirett mal-arja biex ikun jista’ jseħħ esponiment topiku dirett tas-sustanzi kimiċi tat-test b’mod simili għal kif l-epitelju korneali jkun espost in vivo. Il-binja tat-tessuti tal-RhCE għandha tifforma barriera funzjonali b’robustezza suffiċjenti biex tirreżisti l-penetrazzjoni rapida ta’ sustanzi ta’ referenza ċitotissiċi, eż. Triton X-100 jew dodeċilsulfat tas-sodju (SDS). Il-funzjoni ta’ protezzjoni għandha tintwera u tista’ tiġi vvalidata b’determinazzjoni tal-ħin ta’ esponiment meħtieġ biex titnaqqas il-vijabbiltà tat-tessuti b’50 % (ET50) mal-applikazzjoni ta’ sustanza ta’ referenza f’konċentrazzjoni speċifikata u fissa (eż. 100 μl ta’ 0,3 % (v/v) Triton X-100), jew il-konċentrazzjoni li fiha sustanza ta’ referenza tnaqqas il-vijabbiltà tat-tessuti b’50 % (IC50) wara ħin ta’ esponiment fiss (eż. trattament ta’ 30 minuta b’50 μl SDS) (ara l-paragrafu 30). Il-proprjetajiet ta’ konteniment tal-binja tat-tessuti tal-RhCE għandhom jipprevjenu l-passaġġ tas-sustanza kimika tat-test madwar it-tarf tat-tessut vijabbli, li jista’ jwassal għal mudellar ħażin tal-esponiment korneali. Iċ-ċelloli derivati mill-bniedem użati biex tiġi stabbilita l-binja ta’ tessuti tal-RhCE għandhom ikunu ħielsa minn kontaminazzjoni b’batterji, b’vajrusis, b’mikoplażma, u b’fungi. L-isterilità tal-binja tat-tessuti għandha tiġi verifikata mill-fornitur għall-assenza ta’ kontaminazzjoni b’fungi u b’batterji.
|
Kundizzjonijiet funzjonali
Vijabbiltà
|
26.
|
L-assaġġ użat għall-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà tat-tessut hu l-assaġġ MTT (16). Iċ-ċelloli vijabbli tal-mudell ta’ tessut tal-RhCE jnaqqsu l-MTT tal-kulurant vitali fi preċipitat tal-blu MTT formażan, li mbagħad jiġi estratt mit-tessut bl-użu tal-isopropanol (jew solvent simili). L-MTT formażan estratt jista’ jiġi kwantifikat bl-użu ta’ kejl tal-assorbanza standard (Densità Ottika (OD)) jew bi proċedura ta’ spettrofotometrija tal-HPLC/UPLC (36). L-OD tas-solvent ta’ estrazzjoni waħedha għandha tkun żgħira biżżejjed, jiġifieri OD < 0,1. L-utenti tal-binja tat-tessuti tal-RhCE għandhom jiżguraw li kull lott mill-binja tat-tessuti tal-RhCE użat jissodisfa l-kriterji definiti għall-kontroll negattiv. Il-meded ta’ aċċettabbiltà għall-valuri tal-OD tal-kontroll negattiv għall-VRMs jingħataw fit-Tabella 2. Utent tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC għandu juża l-meded tal-OD tal-kontroll negattiv ipprovduti fit-Tabella 2 bħala l-kriterju ta’ aċċettazzjoni għall-kontroll negattiv. Għandu jiġi dokumentat fir-rapport tat-test li t-tessuti ttrattati bis-sustanza tal-kontroll negattiv huma stabbli fil-koltura (jipprovdu kejl tal-vijabbiltà tat-tessuti simili) sakemm idum il-perjodu ta’ esponiment tat-test. Il-produttur tat-tessuti għandu jsegwi proċedura simili bħala parti mir-rilaxx tal-lott tat-tessuti tal-kontroll tal-kwalità, iżda f’dan il-każ jistgħu jkunu japplikaw kriterji ta’ aċċettazzjoni differenti minn dawk speċifikati fit-Tabella 2. Medda ta’ aċċettabbiltà (limitu superjuri u inferjuri) għall-valuri tal-OD tal-kontroll negattiv (fil-kundizzjonijiet tal-metodu ta’ ttestjar tal-QC) għandha tiġi stabbilita mill-iżviluppatur/fornitur tal-binja tat-tessuti tal-RhCE.
|
Tabella 2
Il-meded ta’ aċċettabbiltà għall-valuri tal-OD tal-kontroll negattiv (għall-utenti tat-test)
|
Test
|
Limitu inferjuri ta’ aċċettabbiltà
|
Limitu superjuri ta’ aċċettabbiltà
|
|
EpiOcular™ EIT (OCL-200) – VRM1 (kemm għall-protokolli tal-likwidi kif ukoll tas-solidi)
|
> 0,8 (87)
|
< 2,5
|
|
SkinEthic™ HCE EIT (HCE/S) – VRM2 (kemm għall-protokolli tal-likwidi kif ukoll tas-solidi)
|
> 1,0
|
≤ 2,5
|
Funzjoni ta’ protezzjoni
|
27.
|
Il-binja tat-tessuti tal-RhCE għandha tkun folta u robusta biżżejjed biex tirreżisti l-penetrazzjoni rapida tas-sustanzi ta’ referenza ċitotossiċi, kif stmati, eż., minn ET50 (Triton X-100) jew minn IC50 (SDS) (Tabella 3). Il-funzjoni ta’ protezzjoni ta’ kull lott tal-binja tat-tessuti tal-RhCE użat għandha tintwera mill-iżviluppatur/bejjiegħ tal-binja tat-tessuti tal-RhCE mal-provvista tat-tessuti lill-utent finali (ara l-paragrafu 30).
|
Morfoloġija
|
28.
|
L-eżaminazzjoni istoloġika tal-binja tat-tessuti tal-RhCE għandha turi l-istruttura tal-epitelju li tixbah il-kornea umana (inklużi tal-anqas tliet saffi ta’ ċelloli epiteljali vijabbli u superfiċje mhux keratinizzata). Għall-VRMs, il-morfoloġija xierqa ġiet stabbilita mill-iżviluppatur/fornitur u għalhekk ma għandhiex bżonn terġa’ tintwera minn utent ta’ metodu ta’ ttestjar għal kull lott tat-tessut użat.
|
Riproduċibbiltà
|
29.
|
Ir-riżultati tal-kontrolli pożittivi u negattivi tal-metodu ta’ ttestjar għandhom juru r-riproduċibbiltà maż-żmien.
|
Kontroll tal-kwalità (QC – Quality Control)
|
30.
|
Il-binja tat-tessuti tal-RhCE għandha tintuża biss jekk l-iżviluppatur/il-fornitur juri li kull lott mill-binja tat-tessuti tal-RhCE użat jissodisfa l-kriterji tat-tnedija tal-produzzjoni definiti, fosthom dawk għall-vijabbiltà (paragrafu 26) u l-funzjoni ta’ protezzjoni (paragrafu 27) huma l-aktar rilevanti. Medda ta’ aċċettabbiltà (limiti superjuri u inferjuri) għall-funzjonijiet ta’ protezzjoni kif imkejla mill-EC50 jew mill-IC50 (ara l-paragrafi 25 u 26) għandha tiġi stabbilita mill-iżviluppatur/fornitur tal-binja tat-tessuti tal-RhCE. Il-medda ta’ aċċettabbiltà tal-ET50 u tal-IC50 użata bħala kriterju għar-rilaxx tal-lottijiet tal-QC mill-iżviluppatur/fornitur tal-binjiet tat-tessuti tal-RhCE (użati fil-VRMs) hi mogħtija fit-Tabella 3. Id-data li turi konformità mal-kriterji kollha tar-rilaxx tal-produzzjoni għandha tiġi pprovduta mill-iżviluppatur/fornitur tal-binja tat-tessuti tal-RhCE lill-utenti tal-metodu ta’ ttestjar biex dawn ikunu jistgħu jinkludu din l-informazzjoni fir-rapport tat-test. Huma biss riżultati prodotti b’tessuti li jissodisfaw dawn il-kriterji ta’ rilaxx tal-produzzjoni kollha li jistgħu jiġu aċċettati għat-tbassir affidabbli ta’ sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni u tikkettar għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew għall-ħsara serja lill-għajnejn skont il-GHS tan-NU/is-CLP.
|
Tabella 3
Kriterju tar-rilaxx tal-lottijiet tal-QC
|
Test
|
Limitu inferjuri ta’ aċċettabbiltà
|
Limitu superjuri ta’ aċċettabbiltà
|
|
EpiOcular™ EIT (OCL-200) – VRM1 (100 μl ta’ 0,3 % (v/v) Triton X-100)
|
ET50 = 12,2 min
|
ET50 = 37,5 min
|
|
SkinEthic™ HCE EIT (HCE/S) – VRM2 (trattament ta’ 30 b’50 μl SDS)
|
IC50 = 1 mg/ml
|
IC50 = 3,2 mg/ml
|
Applikazzjoni tas-Sustanzi Kimiċi tat-Test u tal-Kontroll
|
31.
|
Tal-anqas għandhom jintużaw żewġ repliki tat-tessuti għal kull sustanza kimika tat-test u għal kull sustanza tal-kontroll f’kull sessjoni. Jintużaw żewġ protokolli differenti tat-trattament, wieħed għal sustanzi kimiċi tat-test likwidi u wieħed għal sustanzi kimiċi tat-test solidi (34)(35). Kemm għall-metodi kif ukoll għall-protokolli, is-superfiċje tal-binja tat-tessuti għandha tiġi mxarrba b’Salina Baferjata tal-Fosfat ta’ Dulbecco ħielsa minn kalċju u manjeżju (DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+) qabel l-applikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test, biex jiġu imitati l-kundizzjonijiet imxarrba tal-għajn umana. It-trattament tat-tessuti titnieda bl-esponiment għas-sustanza/i kimika/kimiċi tat-test u għas-sustanzi tal-kontroll. Għaż-żewġ protokolli tat-trattament fiż-żewġ VRMs, għandu jiġi applikat ammont suffiċjenti tas-sustanza kimika tat-test jew tas-sustanza tal-kontroll biex tinkwesa b’mod uniformi s-superfiċje epiteljali filwaqt li tiġi evitata doża infinita (ara l-paragrafi 32 u 33) (Appendiċi 2).
|
|
32.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test li jistgħu jiġu pipettati f’temperatura ta’ 37 °C jew f’temperaturi inferjuri (bl-użu ta’ pipetta bi spostament pożittiv, jekk meħtieġa) jiġu trattati bħala likwidi fil-VRMs, inkella dawn għandhom jiġu trattati bħala solidi (ara l-paragrafu 33). Fil-VRMs, is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jitferrxu b’mod ugwali fuq is-superfiċje tat-tessut (jiġifieri applikazzjoni minima ta’ 60 μl/cm2) (ara l-Appendiċi 2, (33)(34)). Effetti kapillari (effetti ta’ tensjoattivi) li jistgħu jseħħu minħabba l-volumi baxxi applikati għall-inserzjoni (fuq is-superfiċje tat-tessuti) għandhom jiġu evitati sa fejn possibbli biex jiġi garantit id-dożaġġ korrett tat-tessut. Tessuti trattati b’sustanzi kimiċi likwidi tat-test jiġu inkubati għal 30 min f’kundizzjonijiet standard tal-koltura (37±2 °C, 5±1 % CO2, ≥ 95 % RH). Fi tmiem il-perjodu ta’ esponiment, is-sustanza kimika likwida tat-test u s-sustanzi tal-kontroll għandhom jitneħħew bil-galbu mis-superfiċje tat-tessuti bi tlaħliħ estensiv b’DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+ f’temperatura ambjentali. Dan l-istadju ta’ tlaħliħ jiġi segwit minn tgħaddis ta’ wara l-esponiment f’medium frisk f’temperatura ambjentali (biex titneħħa kwalunkwe sustanza kimika tat-test assorbita fit-tessut) għal perjodu predefinit ta’ żmien li jvarja skont il-VRM użat. Għall-VRM1 biss, inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment f’medium frisk f’kundizzjonijiet tal-koltura standard tiġi applikata qabel it-twettiq tal-assaġġ MTT (ara l-Appendiċi 2, (34)(35)).
|
|
33.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test li ma jistgħux jiġu pipettati f’temperaturi sa 37 °C jiġu trattati bħala solidi fil-VRMs. L-ammont ta’ sustanza kimika tat-test applikat għandu jkun suffiċjenti biex tiġi koperta s-superfiċje sħiħa tat-tessut, jiġifieri tal-anqas għandha tintuża applikazzjoni ta’ 60 mg/cm2 (Appendiċi 2). Kull meta dan ikun possibbli, is-solidi għandhom jiġu ttestjati bħala trab fin. Tessuti trattati b’sustanzi kimiċi solidi tat-test jiġu inkubati għal perjodu ta’ żmien predefinit (skont il-VRM użat) f’kundizzjonijiet tal-koltura standard (ara l-Appendiċi 2, (34)(35)). Fi tmiem il-perjodu ta’ esponiment, is-sustanza kimika solida tat-test u s-sustanzi tal-kontroll għandhom jitneħħew bil-galbu mis-superfiċje tat-tessuti bi tlaħliħ estensiv b’DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+ f’temperatura ambjentali. Dan l-istadju ta’ tlaħliħ jiġi segwit minn tgħaddis ta’ wara l-esponiment f’medium frisk f’temperatura ambjentali (biex titneħħa kwalunkwe sustanza kimika tat-test assorbita fit-tessut) għal perjodu predefinit ta’ żmien li jvarja skont il-VRM użat, u inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment f’medium frisk f’kundizzjonijiet tal-koltura standard, qabel ma jitwettaq l-assaġġ tal-MTT (ara l-Appendiċi 2, (34)(35)).
|
|
34.
|
Għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi u pożittivi konkorrenti f’kull sessjoni biex jintwera li l-vijabbiltà (determinata bil-kontroll negattiv) u s-sensittività (determinata bil-kontroll pożittiv) tat-tessuti huma fi ħdan meded ta’ aċċettazzjoni definiti fuq il-bażi ta’ data storika. Il-kontroll negattiv konkorrenti jipprovdi wkoll il-linja bażi (vijabbiltà tat-tessuti ta’ 100 %) bie tiġi kkalkolata l-vijabbiltà perċentwali relattiva tat-tessuti trattati bis-sustanza kimika tat-test (%Viabilitytest). Is-sustanzi tal-kontroll pożittiv rakkomandata biex tintuża bil-VRMs hi l-aċetat tal-metil nadif (Nru tas-CAS 79-20-9, kummerċjalment disponibbli mingħand eż. Sigma-Aldrich, Kat# 45997; likwidu). Is-sustanzi tal-kontroll negattiv rakkomandati biex jintużaw bil-VRM1 u bil-VRM2 huma H2O ultrapur u DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+, rispettivament. Dawn kienu s-sustanzi tal-kontroll użati fl-istudji ta’ validazzjoni tal-VRMs u huma dawk li għalihom teżisti l-aktar data storika. L-użu ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv jew negattiv alternattivi xierqa għandu jkun ġustifikat b’mod xjentifiku u adegwat. Il-kontrolli negattivi u pożittivi għandhom jiġu ttestjati bl-istess protokoll(i) bħal dak/dawk użat(i) għas-sustanzi kimiċi tat-test inklużi fis-sessjoni (jiġifieri għal-likwidi u/jew għas-solidi). Din l-applikazzjoni għandha tiġi segwita mill-esponiment għat-trattament, mit-tlaħliħ, minn tgħaddis ta’ wara l-esponiment, u minn inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment fejn applikabbli, kif deskritti għall-kontrolli mwettqa b’mod konkorrenti għas-sustanzi kimiċi likwidi tat-test (ara l-paragrafu 32) jew għal kontrolli mwettqa b’mod konkorrenti fuq sustanzi kimiċi solidi tat-test (ara l-paragrafu 33), qabel it-twettiq tal-assaġġ tal-MTT (ara l-paragrafu 35) (34)(35). Sett wieħed biss ta’ kontrolli negattivi u pożittivi hu biżżejjed għas-sustanzi kimiċi tat-test kollha tal-istess stat fiżiku (likwidi jew solidi) inklużi fl-istess sessjoni.
|
Kejl tal-Vijabbiltà tat-Tessuti
|
35.
|
L-assaġġ tal-MTT hu metodu kwantitattiv standardizzat (16) li għandu jintuża biex ikejjel il-vijabbiltà tat-tessuti taħt dan il-metodu ta’ ttestjar. Hu kompatibbli mal-użu f’bini ta’ tessut tridimensjonali. L-assaġġ tal-MTT jitwettaq wara l-perjodu ta’ inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment. Fil-VRMs, il-kampjun tal-binja tat-tessuti tal-RhCE jitqiegħed f’soluzzjoni ta’ 0,3 ml MTT f’1 mg/ml għal 180±15-il min f’kundizzjonijiet standard tal-koltura. L-MTT tal-kulurant vitali jiġi ridott fi preċipitat tal-formażan MTT blu biċ-ċelloli vijabbli tal-binja tat-tessuti tal-RhCE. Imbagħad, il-prodott tal-formażan MTT blu preċipitat jiġi estratt mit-tessut bl-użu ta’ volum xieraq ta’ isopropanol (jew ta’ solvent simili) (34)(35). It-tessuti ttestjati b’sustanzi kimiċi likwidi tat-test għandhom jiġu estratti mill-quċċata u mill-qiegħ tat-tessuti, filwaqt li t-tessuti ttestjati b’sustanzi kimiċi solidi tat-test u b’likwidi kkuluriti għandhom jiġu estratti mill-qiegħ tat-tessut biss (biex tiġi minimizzata kwalunkwe kontaminazzjoni potenzjali tas-soluzzjoni ta’ estrazzjoni tal-isopropanol bi kwalunkwe sustanza kimika tat-test li tista’ tkun għadha fuq it-tessut). It-tessuti ttestjati b’sustanzi kimiċi likwidi tat-test li ma jinqalgħux minnufih jistgħu jiġu estratti wkoll mill-qiegħ tat-tessut biss. Is-sustanzi tal-kontroll negattiv u pożittiv ittestjati b’mod konkorrenti għandhom jiġu trattati b’mod simili għas-sustanza kimika tat-test. Il-formażan MTT estratt jista’ jiġi kwantifikat jew b’kejl tal-assorbanza standard (OD) f’570 nm bl-użu ta’ filtru band pass ta’ massimu ta’ ±30 nm jew bl-użu ta’ proċedura ta’ spettrofotometrija tal-HPLC/UPLC (ara l-paragrafu 42) (11)(36).
|
|
36.
|
Il-proprjetajiet ottiċi tas-sustanza kimika tat-test jew l-azzjoni kimika ta’ din fuq l-MTT jistgħu jinterferixxu mal-kejl tal-formażan MTT u dan jista’ jwassal għal stima falza tal-vijabbiltà tat-tessut. Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jinterferixxu mal-kejl tal-formażan MTT, jew bi tnaqqis dirett tal-MTT fi blu formażan MTT u/jew b’interferenza tal-kulur jekk is-sustanza kimika tat-test tassorbi, b’mod naturali jew minħabba l-proċeduri ta’ trattament, fl-istess medda tal-OD bħall-formażan MTT (jiġifieri madwar 570 nm). Il-kontrolli minn qabel għandhom isiru qabel l-ittestjar biex ikunu jistgħu jiġu identifikati r-riduċenti potenzjali diretti tal-MTT u/jew is-sustanzi kimiċi li jinterferixxu mal-kulur u għandhom jintużaw kontrolli addizzjonali biex tiġi identifikata u kkoreġuta interferenza potenzjali mit-tali sustanzi kimiċi tat-test (ara l-paragrafi 37-41). Dan hu partikolarment importanti meta sustanza kimika speċifika tat-test ma titneħħiex għalkollox mill-binja tat-tessuti tal-RhCE bit-tlaħliħ jew meta din tippenetra l-epitelju li jixbah il-kornea u għalhekk tkun preżenti fil-binjiet tat-tessuti tal-RhCE meta jitwettaq l-assaġġ tal-MTT. Għal sustanzi kimiċi tat-test li jassorbu d-dawl fl-istess medda bħall-formażan MTT (b’mod naturali jew wara t-trattament), li mhumiex kompatibbli mal-kejl tal-assorbanza standard (OD) tal-formażan MTT minħabba interferenza qawwija wisq, jiġifieri assorbiment qawwi f’570±30 nm, tista’ tintuża proċedura ta’ spettrofotometrija tal-HPLC/UPLC biex jitkejjel il-formażan MTT (ara l-paragrafi 41 u 42) (11)(36). Spjegazzjoni dettaljata dwar kif għandhom jiġu individwati u kkoreġuti tnaqqis u interferenzi diretti tal-MTT permezz ta’ aġenti koloranti hi disponibbli fl-SOPs tal-VRMs (34)(35). Flowcharts illustrattivi li jipprovdu gwida dwar kif tidentifika u timmaniġġja riduċenti diretti tal-MTT u/jew sustanzi kimiċi interferenti tal-kulur għall-VRM1 u għall-VRM2 huma pprovduti wkoll fl-Appendiċijiet III u IV rispettivament.
|
|
37.
|
Biex tiġi identifikata interferenza potenzjali mis-sustanzi kimiċi tat-test li jassorbu d-dawl fl-istess medda bħall-formażan MTT (b’mod naturali jew wara t-trattament) u tittieħed deċiżjoni dwar il-ħtieġa ta’ kontrolli addizzjonali, is-sustanza kimika tat-test tiżdied mal-ilma u/jew mal-isopropanol u tiġi inkubata għal ħin xieraq f’temperatura ambjentali (ara l-Appendiċi 2, (34)(35)). Jekk is-sustanza kimika tat-test fl-ilma u/jew fl-isopropanol tassorbi biżżejjed dawl fil-medda ta’ 570±20 nm għall-VRM1 (ara l-Appendiċi 3), jew jekk tinkiseb soluzzjoni kkulurita meta s-sustanza kimika tat-test titħallat mal-ilma għall-VRM 2 (ara l-Appendiċi 4), is-sustanza kimika tat-test tiġi preżunta li tinterferixxi mal-kejl tal-assorbanza standard (OD) tal-formażan MTT u għandhom isiru kontrolli ulterjuri tal-koloranti jew, inkella, għandha tintuża proċedura ta’ spettrofotometrija tal-HPLC/UPLC f’liema każ dawn il-kontrolli ma jkunux meħtieġa (ara l-paragrafi 41 u 42 u l-Appendiċijiet III u IV)(34)(35). Meta jsir il-kejl tal-assorbanza standard (OD), kull sustanza kimika tat-test interferenti għandha tiġi applikata fuq tal-anqas żewġ repliki tat-tessut vijabbli, li ssirilhom il-proċedura sħiħa ta’ ttestjar iżda jiġu inkubati b’medium minflok b’soluzzjoni tal-MTT matul l-istadju tal-inkubazzjoni tal-MTT biex jiġġeneraw kontroll tal-kulur mhux speċifiku f’tessuti ħajjin (NSCliving) (34)(35). Il-kontroll tal-NSCliving irid jitwettaq fl-istess ħin bħall-ittestjar tas-sustanza kimika tat-test ikkulurita u, f’każ ta’ ttestjar multiplu, irid jitwettaq kontroll indipendenti tal-NSCliving li għandu jsir b’kull test imwettaq (f’kull sessjoni) minħabba l-varjabbiltà bijoloġika inerenti tat-tessuti ħajjin. Il-vijabbiltà vera tat-tessuti tiġi kkalkolata bħala: il-vijabbiltà tat-tessuti perċentwali miksuba b’tessuti ħajjin esposti għas-sustanza kimika tat-test interferenti u inkubati bis-soluzzjoni MTT (%Viabilitytest) nieqes il-kulur mhux speċifiku perċentwali miksub bit-tessuti ħajjin esposti għas-sustanza kimika tat-test interferenti u inkubati b’medium mingħajr MTT, imwettqa fl-istess ħin bħat-test li jkun qed jiġi kkoreġut (%NSCliving), jiġifieri l-Vijabbiltà vera tat-tessut = [ %Viabilitytest] - [%NSCliving].
|
|
38.
|
Biex jiġu identifikati r-ridutturi diretti tal-MTT, kull sustanza kimika tat-test għandha tiżdied ma’ soluzzjoni MTT preparata ġdida. Jiżdied ammont xieraq tas-sustanza kimika tat-test ma’ soluzzjoni tal-MTT u t-taħlita tiġi inkubata għal madwar tliet sigħat f’kundizzjonijiet standard tal-koltura (ara l-Appendiċijiet III u IV)(34)(35). Jekk it-taħlita ta’ MTT li fiha s-sustanza kimika tat-test (jew is-sospensjoni għal sustanzi kimiċi tat-test insolubbli) issir blu/vjola, is-sustanza kimika tat-test tkun preżunta li tnaqqas b’mod dirett l-MTT u għandha ssir verifika funzjonali oħra fuq il-binjiet tat-tessuti tal-RhCE mhux vijabbli, indipendentement mill-użu tal-kejl tal-assorbanza standard (OD) jew ta’ proċedura tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC. Din il-verifika funzjonali addizzjonali tħaddem tessuti maqtula li jkollhom biss attività metabolika residwa iżda jassorbu u jżommu s-sustanza kimika tat-test b’mod simili bħal tessuti vijabbli. It-tessuti maqtula tal-VRM1 jitħejjew b’esponiment għal temperatura baxxa (“qtil bil-friża”). It-tessuti maqtula tal-VRM2 jitħejjew b’inkubazzjoni fit-tul (eż. tal-anqas 24±1 siegħa) f’ilma segwita minn ħżin f’temperatura baxxa (“maqtula bl-ilma”). Kull sustanza kimika tat-test li tnaqqas l-MTT tiġi applikata fuq tal-anqas żewġ repliki tat-tessut maqtula li ssirilhom il-proċedura sħiħa ta’ ttestjar biex jiġi ġenerat kontroll ta’ tnaqqis mhux speċifiku tal-MTT (NSMTT) (34)(35). Kontroll tal-NSMTT wieħed hu biżżejjed għal kull sustanza kimika tat-test indipendentement min-numru ta’ testijiet/sessjonijiet indipendenti mwettqa. Il-vijabbiltà vera tat-tessuti tiġi kkalkolata bħala: il-vijabbiltà tat-tessuti perċentwali miksuba b’tessuti ħajjin esposti għar-riduċent tal-MTT (%Viabilitytest) nieqes it-tnaqqis tal-MTT mhux speċifiku perċentwali miksub bit-tessuti maqtula esposti għall-istess riduttur tal-MTT, ikkalkolat b’rabta mas-sessjoni ta’ kontroll negattiv b’mod konkorrenti għat-test li jkun qed jiġi kkoreġut (%NSMTT), jiġifieri l-Vijabbiltà vera tat-tessut = [ %Viabilitytest] - [ %NSMTT].
|
|
39.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test li jiġu identifikati bħala li jipproduċu kemm interferenza tal-kulur (ara l-paragrafu 37) kif ukoll tnaqqis dirett tal-MTT (ara l-paragrafu 38) se jkunu jeħtieġu wkoll it-tielet sett ta’ kontrolli meta jitwettaq il-kejl tal-assorbanza standard (OD), minbarra l-kontrolli tal-NSMTT u tal-NSCliving deskritti fil-paragrafi ta’ qabel. Normalment dan ikun il-każ b’sustanzi kimiċi tat-test ikkuluriti skuri li jassorbu dawl fil-medda ta’ 570±30 nm (eż. blu, vjola, suwed) minħabba li l-kulur intrinsiku tagħhom ixekkel il-valutazzjoni tal-kapaċità tagħhom li jnaqqsu b’mod dirett l-MTT kif deskritt fil-paragrafu 38. Dan iġiegħel l-użu ta’ kontrolli tal-NSMTT, b’mod predefinit, flimkien mal-kontrolli tal-NSCliving. Is-sustanzi kimiċi tat-test li għalihom jitwettqu kemm il-kontrolli tal-NSMTT u tal-NSCliving jistgħu jiġu assorbiti u jinżammu kemm minn tessuti ħajjin kif ukoll minn dawk maqtula. Għalhekk, f’dan il-każ, il-kontroll tal-NSMTT jaf ma jikkoreġix biss għat-tnaqqis potenzjali dirett tal-MTT mis-sustanza kimika tat-test,iżda anki għall-interferenza tal-kulur li tirriżulta mill-assorbiment u miż-żamma tas-sustanza kimika tat-test mit-tessuti maqtula. Dan jista’ jwassal għal korrezzjoni doppja għall-interferenza tal-kulur peress li l-kontroll tal-NSCliving diġà jikkoreġi għall-interferenza tal-kulur li tirriżulta mill-assorbiment u miż-żamma tas-sustanza kimika tat-test mit-tessuti ħajjin. Biex tiġi evitata korrezzjoni doppja possibbli għall-interferenza tal-kulur, irid isir it-tielet kontroll għal kulur mhux speċifiku f’tessuti maqtula (NSCkilled) (ara l-Appendiċijiet III u IV)(34)(35). F’dan il-kontroll addizzjonali, is-sustanza kimika tat-test tiġi applikata fuq tal-anqas żewġ repliki tat-tessuti maqtula, li ssirilhom il-proċedura tal-ittestjar sħiħa iżda jiġu inkubati b’medium minflok is-soluzzjoni tal-MTT matul l-istadju tal-inkubazzjoni tal-MTT. Kontroll tal-NSCkilled wieħed hu biżżejjed għal kull sustanza kimika tat-test indipendentement min-numru ta’ testijiet/sessjonijiet indipendenti mwettqa, iżda għandu jsir fl-istess ħin mal-kontroll tal-NSMTT u bl-istess lott ta’ tessuti. Il-vijabbiltà vera tat-tessuti tiġi kkalkolata bħala: il-vijabbiltà tat-tessuti perċentwali miksuba b’tessuti ħajjin esposti għas-sustanza kimika tat-test (%Viabilitytest) nieqes %NSMTT nieqes %NSCliving
biż-żieda tal-kulur mhux speċifiku perċentwali miksub bit-tessuti maqtula esposti għas-sustanza kimika tat-test interferenti u inkubati b’medium mingħajr MTT, ikkalkolati b’rabta mas-sessjoni tal-kontroll negattiv imwettqa fl-istess ħin bħat-test li jkun qed jiġi kkoreġut (%NSCkilled), jiġifieri l-Vijabbiltà vera tat-tessut = [ %Viabilitytest] - [ %NSMTT] - [%NSCliving] + [%NSCkilled].
|
|
40.
|
Hu importanti li jiġi nnotat li r-riduzzjoni mhux speċifika tal-MTT u l-interferenzi mhux speċifiċi tal-kulur jistgħu jiżdiedu meta l-OD (meta jsiru kejlijiet tal-assorbanza standard) tal-estratt tat-tessuti ogħla mill-medda ta’ linearità tal-ispettrofotometru u li r-riduzzjoni mhux speċifika tal-MTT tista’ wkoll iżżid l-erja tal-quċċata tal-formażan MTT (meta jsiru kejlijiet tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC) tal-estratt tat-tessut f’livell ogħla mill-medda ta’ linearità tal-ispettrofotometru. Fuq din il-bażi, hu importanti li kull laboratorju jiddetermina l-medda tal-linearità tal-OD/tal-erja tal-quċċata tal-ispettrofotometru tiegħu, eż., bil-formażan tal-MTT (CAS # 57360-69-7), disponibbli kummerċjalment mingħand, eż. Sigma-Aldrich (Kat# M2003), qabel il-bidu tal-ittestjar tas-sustanzi kimiċi tat-test għal finijiet regolatorji.
|
|
41.
|
Il-kejl tal-assorbanza standard (OD) bl-użu ta’ spettrofotometru hu xieraq biex jiġu vvalutati r-riduċenti diretti tal-MTT u s-sustanzi kimiċi tat-test interferenti tal-kulur, meta l-interferenza osservata mal-kejl tal-formażan MTT ma tkunx qawwija wisq (jiġifieri l-ODs tal-estratti tat-tessut miksuba bis-sustanza kimika tat-test mingħajr ebda korrezzjoni għal riduzzjoni diretta tal-MTT u/jew għal interferenza tal-kulur ikunu fi ħdan il-medda lineari tal-ispettrofotometru). Minkejja dan, ir-riżultati għas-sustanzi kimiċi tat-test li jipproduċu %NSMTT u/jew %NSCliving ≥ 60 % (VRM1, u VRM2 għall-protokoll tal-likwidi) jew 50 % (VRM2 għall-protokoll tas-solidi) tal-kontroll negattiv għandhom jittieħdu b’attenzjoni peress li dan hu l-limitu stabbilit użat fil-VRMs biex jiġu distinti s-sustanzi kimiċi klassifikati minn dawk mhux klassifikati (ara l-paragrafu 44). Madankollu, l-assorbanza standard (OD) ma tistax titkejjel meta l-interferenza mal-kejl tal-formażan MTT tkun qawwija wisq (jiġifieri twassal għal ODs mhux ikkoreġuti tal-estratti tat-tessut tat-test li jaqgħu barra mill-medda lineari tal-ispettrofotometru). Sustanzi kimiċi tat-test kuluriti jew sustanzi kimiċi tat-test li jieħdu l-kulur f’kuntatt mal-ilma jew mal-isopropanol li jinterferixxu b’wisq qawwa mal-kejl tal-assorbanza standard (OD) tal-formażan MTT xorta waħda jistgħu jiġu vvalutati bl-użu tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC (ara l-Appendiċijiet III u IV). Dan għaliex is-sistema tal-HPLC/UPLC tippermetti s-separazzjoni tal-formażan MTT mis-sustanza kimika qabel il-kwantifikazzjoni tiegħu (36). Għal din ir-raġuni, il-kontrolli tal-NSCliving jew tal-NSCkilled qatt ma jkunu meħtieġa meta tintuża l-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC, indipendentement mis-sustanza kimika li tkun qed tiġi ttestjata. Il-kontrolli tal-NSMTT xorta waħda għandhom jintużaw jekk is-sustanza kimika tat-test tkun suspettata li tnaqqas l-MTT b’mod dirett (wara l-proċedura deskritta fil-paragrafu 38). Il-kontrolli tal-NSMTT għandhom jintużaw ukoll bis-sustanzi kimiċi tat-test li jkollhom (intrinsiku jew li jidher meta jkunu fl-ilma) kulur li jimpedixxi l-valutazzjoni tal-kapaċità tagħhom ta’ tnaqqis dirett tal-MTT kif deskritta fil-paragrafu 38. Meta tintuża l-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC biex jitkejjel il-formażan MTT, il-vijabbiltà tat-tessuti perċentwali tiġi kkalkolata bħala l-ogħla erja perċentwali tal-formażan MTT miksuba b’tessuti ħajjin esposti għas-sustanza kimika tat-test meta mqabbla mal-ogħla erja tal-formażan MTT miksuba bil-kontroll negattiv konkorrenti. Għal sustanzi kimiċi tat-test li kapaċi jnaqqsu l-MTT b’mod dirett, il-vijabbiltà vera tat-tessut tiġi kkalkolata bħala: %Viabilitytest
nieqes %NSMTT, kif deskritta fl-aħħar sentenza tal-paragrafu 38. Finalment, ta’ min jinnota li r-riduċenti diretti tal-MTT jew riduċenti diretti tal-MT li jkunu interferenti tal-kulur ukoll, li jinżammu fit-tessuti wara t-trattament u jnaqqsu l-MTT b’tant saħħa li jwasslu għal ODs (bl-użu ta’ kejl standard tal-ODs) jew l-ogħla erjas (bl-użu tal-ispettrofotometrija tal-UPLC/HPLC) tal-estratti tat-tessuti ttestjati li jaqgħu barra mill-medda tal-linearità tal-ispettrofotometru ma jistgħux jiġu vvalutati b’metodi ta’ ttestjar tal-RhCE, għalkemm dawn ikunu mistennija jseħħu f’sitwazzjonijiet rari ħafna biss.
|
|
42.
|
L-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC tista’ tintuża bit-tipi kollha ta’ sustanzi kimiċi tat-test (ikkuluriti, mhux ikkuluriti, riduċenti tal-MTT u mhux riduċenti tal-MTT) għall-kejl tal-formażan MTT (11)(36). Minħabba d-diversità tas-sistema tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC, mhuwiex fattibbli li kull utent jistabbilixxi l-istess eżatt kundizzjonijiet tas-sistema. B’hekk, il-kwalifikazzjoni tas-sistema tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC għandha tintwera qabel l-użu tagħha għall-kwantifikazzjoni tal-formażan MTT mill-estratti tat-tessuti bl-issodisfar tal-kriterji ta’ aċċettazzjoni għal sett ta’ parametri standard ta’ kwalifikazzjoni fuq il-bażi ta’ dawk deskritti fil-gwida tal-Food and Drug Administration tal-Istati Uniti għall-industrija fuq il-validazzjoni tal-metodi bijoanalitiċi (36) (38). Dawn il-parametri importanti u l-kriterji ta’ aċċettazzjoni tagħhom jintwerew fl-Appendiċi 5. Ladarba jiġu ssodisfati l-kriterji ta’ aċċettazzjoni definiti fl-Appendiċi 5, is-sistema tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC titqies kwalifikata u lesta biex tkejjel il-formażan MTT fil-kundizzjonijiet sperimentali deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar.
|
Kriterji ta’ Aċċettazzjoni
|
43.
|
Għal kull sessjoni li tuża l-lottijiet tat-tessut tal-RhCE li ssodisfaw il-kontroll tal-kwalità (ara l-paragrafu 30), tessuti relatati mas-sustanza tal-kontroll negattiv għandhom jesibixxu OD li tirrifletti l-kwalità tat-tessuti li segwew il-konsenja, l-istadji tar-riċevuta u l-proċessi tal-protokolli kollha u ma għandhomx ikunu barra mil-limiti stabbiliti storikament deskritti fit-Tabella 2 (ara l-paragrafu 26). B’mod simili, tessuti trattati bis-sustanzi tal-kontroll pożittiv, jiġifieri l-aċetat tal-metil, għandhom juru vijabbiltà medja tat-tessut ta’ < 50 % meta mqabbla mal-kontroll negattiv fil-FRM1 bi protokolli tal-likwidi jew tas-solidi, u ta’ ≤ 30 % (protokoll tal-likwidi) jew ta’ ≤ 20 % (protokoll tas-solidi) meta mqabbla mal-kontroll negattiv fil-VRM2, u b’hekk jirriflettu l-ħila tat-tessuti li jwieġbu għal sustanza kimika tat-test irritanti fil-kundizzjonijiet tal-metodu ta’ ttestjar (34)(35). Il-varjabbiltà bejn ir-repliki tat-tessuti tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll għandha taqa’ fi ħdan il-limiti aċċettati (jiġifieri d-differenza tal-vijabbiltà bejn żewġ repliki ta’ tessuti għandha tkun anqas minn 20 % jew id-devjazzjoni standard (SD) bejn tliet repliki tat-tessuti ma għandhiex taqbeż it-18 %). Jekk il-kontroll negattiv jew il-kontroll pożittiv inkluż f’sessjoni jkun barra mill-meded aċċettati, is-sessjoni titqies “mhix kwalifikata” u għandha tiġi ripetuta. Jekk il-varjabbiltà bejn ir-repliki tat-tessuti ta’ sustanza kimika tat-test tkun barra mill-medda aċċettata, it-test irid jitqies “mhux kwalifikat” u s-sustanza kimika tat-test għandha terġa’ tiġi ttestjata.
|
Interpretazzjoni tal-Mudell tar-Riżultati u Tbassir
|
44.
|
Il-valuri tal-OD/il-quċċata tal-erjas miksuba bl-estratti tat-tessut tar-repliki għal kull sustanza kimika tat-test għandhom jintużaw biex tiġi kkalkolata l-vijabbiltà medja perċentwali tat-tessut (medja bejn ir-repliki tat-tessut) normalizzata għall-kontroll negattiv, li hi stabbilita għal 100 %. Il-valur ta’ limitu perċentwali għall-vijabbiltà tat-tessut għall-identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew għal ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU u tas-CLP) hu mogħti fit-Tabella 4. B’hekk, ir-riżultati għandhom jiġu interpretati kif ġej:
|
—
|
Is-sustanza kimika tat-test tiġi identifikata bħala li ma teħtieġx klassifikazzjoni u tikkettar (Ebda Kategorija) tal-GHS tan-NU/tas-CLP jekk il-vijabbiltà perċentwali medja tat-tessuti wara l-esponiment u l-inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment tkun aktar (>) mill-valur ta’ limitu perċentwali stabbilit tal-vijabbiltà tat-tessut, kif muri fit-Tabella 4. F’dan il-każ, ma jkun meħtieġ ebda ttestjar ulterjuri f’metodi ta’ ttestjar oħra.
|
|
—
|
Jekk il-vijabbiltà perċentwali medja tat-tessuti wara l-esponiment u l-inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment tkun anqas minn jew daqs (≤) il-valur ta’ limitu perċentwali stabbilit tal-vijabbiltà tat-tessut, ma jkun jista’ jsir ebda tbassir, kif muri fit-Tabella 4. F’dan il-każ, ittestjar ulterjuri b’metodi ta’ ttestjar oħra jkun meħtieġ minħabba li l-metodi ta’ ttestjar tal-RhCE juru ċertu numru ta’ riżultati tal-pożittivi foloz (ara l-paragrafi 14-15) u ma jistgħux jiddistingwu bejn il-Kategoriji 1 u 2 tal-GHS tan-NU u tas-CLP (ara l-paragrafu 17).
|
Tabella 4
Mudelli tat-Tbassir skont il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU u tas-CLP
|
VRM
|
Ebda Kategorija
|
Ma tista’ ssir ebda previżjoni
|
|
VRM 1 - EpiOcular™ EIT (għaż-żewġ protokolli)
|
Vijabbiltà medja tat-tessut ta’ > 60 %
|
Vijabbiltà medja tat-tessut ta’ ≤ 60 %
|
|
VRM 2 - SkinEthic™ HCE EIT (għall-protokoll tal-likwidi)
|
Vijabbiltà medja tat-tessut ta’ > 60 %
|
Vijabbiltà medja tat-tessut ta’ ≤ 60 %
|
|
VRM2 - SkinEthic™ HCE EIT (għall-protokoll tas-solidi)
|
Vijabbiltà medja tat-tessut ta’ > 50 %
|
Vijabbiltà medja tat-tessut ta’ ≤ 50 %
|
|
|
45.
|
Test wieħed magħmul minn tal-anqas żewġ repliki tat-tessuti għandu jkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta r-riżultat ikun inekwivokabbli. Madankollu, f’każijiet ta’ riżultati li joqorbu ħafna lejn il-limitu, bħal pereżempju kejl irreplikat mhux konkordanti u/jew il-vijabbiltà perċentwali medja tat-tessut ugwali għal 60±5 % (VRM1, u VRM2 għall-protokoll tal-likwidi) jew 50±5 % (VRM2 għall-protokoll tas-solidi), għandu jiġi kkunsidrat it-tieni test, kif ukoll it-tielet wieħed f’każ ta’ riżultati mhux konkordanti bejn l-ewwel żewġ testijiet.
|
|
46.
|
Valuri ta’ limitu perċentwali differenti tal-vijabbiltà tat-tessut li jiddistingwu s-sustanzi kimiċi tat-test klassifikati minn dawk mhux klassifikati jistgħu jiġu kkunsidrati għal tipi speċifiċi ta’ taħlitiet, fejn xieraq u ġustifikabbli, biex tiżdied il-prestazzjoni ġenerali tal-metodu ta’ ttestjar għal dawk it-tipi ta’ taħlitiet (ara l-paragrafu 14). Is-sustanzi kimiċi ta’ referenza jistgħu jkunu siewja għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta’ ħsara serja lill-għajnejn/ta’ irritazzjoni tal-għajnejn ta’ sustanzi kimiċi tat-test jew ta’ klassi ta’ prodotti mhux magħrufa, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv ta’ tossiċità okulari ta’ sustanza kimika klassifikata fi ħdan medda speċifika ta’ risponsi pożittivi.
|
DATA U RAPPORTAR
Data
|
47.
|
Id-data minn tessuti ta’ repliki individwali f’sessjoni (eż. valuri tal-OD/erjas tal-quċċata tal-formażan MTT u d-data tal-vijabbiltà tat-tessuti perċentwali kkalkolata għas-sustanza kimika tat-test u għall-kontrolli, u t-tbassir finali tal-metodu ta’ ttestjar tal-RhCE) għandha tiġi rapportata f’forma tabulari għal kull sustanza kimika tat-test, inkluża d-data minn testijiet ripetuti, kif xieraq. Barra minn hekk, għandha tiġi rapportata l-vijabbiltà perċentwali medja tat-tessut u d-differenza fil-vijabbiltà bejn żewġ repliki ta’ tessuti (jekk n=2 tessuti replikati) għal kull sustanza kimika tat-test u kontroll individwali. Kwalunkwe interferenza osservata ta’ sustanza kimika tat-test mal-kejl tal-formażan MTT permezz tat-tnaqqis dirett tal-MTT u/jew tal-interferenza kkulurita għandha tiġi rapportata għal kull sustanza kimika ttestjata.
|
Rapport tat-Test
|
48.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
Sustanza Kimika tat-Test
|
|
Sustanza monokostitwenti
|
—
|
L-identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i tar-reġistru tas-CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħra;
|
|
—
|
L-istat fiżiku, il-volatilità, il-pH, il-LogP, il-piż molekulari, il-klassi kimika, u proprjetajiet fiżikokimiċi addizzjonali rilevanti għat-twettiq tal-istudju, sa fejn disponibbli;
|
|
—
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
—
|
It-trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (eż. tisħin, tħin);
|
|
—
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli.
|
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita
|
—
|
Karatterizzazzjoni sa fejn possibbli skont, pereżempju, l-identità kimika (ara aktar ’il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti (ara aktar ’il fuq) tal-kostitwenti, sa fejn disponibbli;
|
|
—
|
L-istat fiżiku u proprjetajiet fiżikokimiċi addizzjonali rilevanti għat-twettiq tal-istudju, sa fejn disponibbli;
|
|
—
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
—
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
—
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli.
|
|
Sustanzi tal-Kontroll Pożittiv u Negattiv
|
—
|
L-identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i tar-reġistru tas-CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħra;
|
|
—
|
L-istat fiżiku, il-volatilità, il-piż molekolari, il-klassi kimika, u proprjetajiet fiżikokimiċi addizzjonali rilevanti għat-twettiq tal-istudju, sa fejn disponibbli;
|
|
—
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
—
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
—
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
—
|
Ġustifikazzjoni għall-użu ta’ kontroll negattiv differenti li mhuwiex H20 ultrapur jew DPBS ħielsa minn Ca 2+/Mg2+, jekk applikabbli;
|
|
—
|
Ġustifikazzjoni għall-użu ta’ kontroll pożittiv differenti li mhuwiex aċetat tal-metil nadif, jekk applikabbli;
|
|
—
|
Referenza għar-riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv u negattiv li juru kriterji xierqa ta’ aċċettazzjoni tas-sessjoni.
|
Informazzjoni dwar l-Isponser u l-Faċilità tat-Test
|
—
|
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju.
|
|
—
|
Il-Binja tat-Tessuti tal-RhCE u l-Protokoll Użati (filwaqt li tiġi pprovduta r-raġuni għall-għażliet, jekk applikabbli)
|
Il-Kundizzjonijiet tal-Metodu ta’ Ttestjar
|
—
|
Il-binja tat-tessuti tal-RhCE użata, inkluż in-numru tal-lott;
|
|
—
|
It-tul ta’ mewġa u l-band pass (jekk applikabbli) użati għall-kwantifikazzjoni tal-formażan MTT, u l-medda tal-linearità tal-apparat tal-kejl (eż. spettrofotometru);
|
|
—
|
Deskrizzjoni tal-metodu użat għall-kwantifikazzjoni tal-formażan MTT;
|
|
—
|
Deskrizzjoni tas-sistema tal-ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC użata, jekk applikabbli;
|
|
—
|
Informazzjoni ta’ appoġġ kompluta għall-binja tat-tessuti tal-RhCE speċifika użata inkluża l-prestazzjoni tagħha. Din għandha tinkludi, iżda ma għandhiex tkun limitata għal:
|
i)
|
Il-kontroll tal-kwalità tal-vijabbiltà (fornitur)
|
|
ii)
|
Il-vijabbiltà fil-kundizzjonijiet tal-metodu ta’ ttestjar (utent);
|
|
iii)
|
Il-kontroll tal-kwalità tal-funzjoni ta’ protezzjoni;
|
|
iv)
|
Il-morfoloġija, jekk disponibbli;
|
|
v)
|
Ir-riproduċibbiltà u l-kapaċità ta’ tbassir;
|
|
vi)
|
Kontrolli oħra tal-kwalità (QC) tal-binja tat-tessuti tal-RhCE, jekk disponibbli;
|
|
|
—
|
Referenza għad-data storika tal-binja tat-tessuti tal-RhCE. Din għandha tinkludi, iżda ma għandhiex tkun limitata għal: Aċċettabbiltà tad-data dwar il-QC b’referenza għad-data storika tal-lott;
|
|
—
|
Dikjarazzjoni li l-faċilità ta’ ttestjar uriet profiċjenza fl-użu tal-metodu ta’ ttestjar qabel l-użu ta’ rutina bl-ittestjar tas-sustanzi kimiċi ta’ profiċjenza;
|
Kriterji ta’ Aċċettazzjoni tas-Sessjoni u tat-Test
|
—
|
Il-medji tal-kontrolli pożittivi u negattivi u l-meded tal-aċċettazzjoni fuq il-bażi tad-data storika;
|
|
—
|
Il-varjabbiltà aċċettabbli bejn ir-repliki tat-tessuti għall-kontrolli pożittivi u negattivi;
|
|
—
|
Il-varjabbiltà aċċettabbli bejn ir-repliki tat-tessuti għas-sustanza kimika tat-test;
|
Proċedura tat-Test
|
—
|
Id-ettalji tal-proċedura tat-test użata,
|
|
—
|
Id-ożi tas-sustanza kimika tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll użati;
|
|
—
|
Id-urata u temperatura tal-perjodi ta’ esponiment, tat-tgħaddis ta’ wara l-esponiment u tal-inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment (fejn applikabbli);
|
|
—
|
Id-eskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika fil-proċedura tat-test;
|
|
—
|
L-indikazzjoni tal-kontrolli użati għal riduċenti diretti tal-MTT u/jew sustanzi kimiċi tat-test li jerħu l-kulur, jekk applikabbli;
|
|
—
|
In-numru ta’ repliki tat-tessuti użati għal kull sustanza kimika tat-test u kontroll (kontroll pożittiv, kontroll negattiv, NSMTT, NSCliving u NSCkilled, jekk applikabbli);
|
Riżultati
|
—
|
Tabultazzjoni tad-data minn sustanzi kimiċi tat-test u minn sustanzi tal-kontroll individwali, għal kull sessjoni (inklużi esperimenti ripetuti fejn applikabbli) u kull kejl tar-repliki, inklużi l-valur tal-OD jew l-ogħla erja tal-formażan MTT, il-vijabbiltà tat-tessuti perċentwali, il-vijabbiltà perċentwali medja tat-tessuti, id-Differenza bejn ir-repliki tat-tessuti jew l-SD, u t-tbassir finali;
|
|
—
|
Jekk applikabbli, ir-riżultati tal-kontrolli użati għar-riduċenti diretti tal-MTT u/jew is-sustanzi kimiċi tat-test ikkuluriti inklużi l-valur tal-OD jew l-ogħla erja tal-formażan MTT, %NSMTT, %NSCliving, %NSCkilled, id-Differenza bejn ir-repliki tat-tessuti jew l-SD, il-vijabbiltà perċentwali korretta finali tat-tessut, u t-tbassir finali;
|
|
—
|
Ir-riżultati miksuba bis-sustanza/i kimika/kimiċi tat-test u bis-sustanzi tal-kontroll b’rabta mas-sessjoni definita u mal-kriterji ta’ aċċettazzjoni tat-test;
|
|
—
|
Deskrizzjoni ta’ effetti oħra osservati, eż. il-kolorazzjoni tat-tessuti minn sustanza kimika tat-test ikkulurita;
|
Diskussjoni tar-Riżultati
Konklużjoni
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
NU (2015). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). ST/SG/AC.10/30/Rev.6, Sixth Revised Edition, New York and Geneva: United Nations. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/English/ST-SG-AC10-30-Rev6e.pdf.
|
|
(2)
|
Il-Kapitolu B.5 ta’ dan l-Anness, Irritazzjoni/Korrużjoni Akuta tal-Għajnejn.
|
|
(3)
|
Il-Kapitolu B.47 ta’ dan l-Anness, Metodu ta’ Ttestjar tal-Opaċità u l-Permeabbiltà tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta’ i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.
|
|
(4)
|
Il-Kapitolu B.48 ta’ dan l-Anness, Metodu ta’ Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta’ i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni.
|
|
(5)
|
Il-Kapitolu B.61 ta’ dan l-Anness, Il-Metodu ta’ Ttestjar tat-Tnixxija ta’ Fluworexxina għall-Identifikazzjoni ta’ Korrużivi Okulari u ta’ Irritanti Severi.
|
|
(6)
|
Il-Kapitolu B.68 ta’ dan l-Anness, Metodu ta’ Ttestjar In Vitro b’Esponiment għal Ħin Qasir għall-Identifikazzjoni ta’ i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.
|
|
(7)
|
Freeman, S.J., Alépée N., Barroso, J., Cole, T., Compagnoni, A., Rubingh, C., Eskes, C., Lammers, J., McNamee, P., Pfannenbecker, U., Zuang, V. (2010). Prospective Validation Study of Reconstructed Human Tissue Models for Eye Irritation Testing. ALTEX 27, Special Issue 2010,261-266.
|
|
(8)
|
EC EURL ECVAM (2014). The EURL ECVAM - Cosmetics Europe prospective validation study of Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE)-based test methods for identifying chemicals not requiring classification and labelling for serious eye damage/eye irritation: Validation Study Report. EUR 28125 EN; doi:10.2787/41680. Disponibbli fuq: http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC100280.
|
|
(9)
|
EURL ECVAM Science Advisory Committee (2014). ESAC Opinion on the EURL ECVAM Eye Irritation Validation Study (EIVS) on EpiOcular™ EIT and SkinEthic™ HCE u studju relatat ta’ Cosmetics Europe dwar HPLC/UPLC-spectrophotometry as an alternative endpoint detection system for MTT-formazan. Opinjoni tal-ESAC Nru 2014-03 tas-17 ta’ Novembru 2014; EUR 28173 EN; doi: 10.2787/043697 Tħassir Disponibbli fuq: http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103702.
|
|
(10)
|
Alépée, N., Leblanc, V., Adriaens, E., Grandidier, M.H., Lelièvre, D, Meloni, M., Nardelli, L., Roper, C.S, Santirocco, E., Toner, F., Van Rompay, A., Vinall, J., Cotovio, J. (2016). Multi-laboratory validation of SkinEthic HCE test method for testing serious eye damage/eye irritation using liquid chemicals. Toxicol. In Vitro 31, 43-53.
|
|
(11)
|
Alépée, N., Adriaens, E., Grandidier, M.H., Meloni, M., Nardelli, L., Vinall, C.J., Toner, F., Roper, C.S, Van Rompay, A.R., Leblanc, V., Cotovio, J. (2016). Multi-laboratory evaluation of SkinEthic HCE test method for testing serious eye damage/eye irritation using solid chemicals and overall performance of the test method with regard to solid and liquid chemicals testing. Toxicol. In Vitro 34, 55-70.
|
|
(12)
|
EURL ECVAM Science Advisory Committee (2016). ESAC Opinion on the SkinEthic™ Human Corneal Epithelium (HCE) Eye Irritation Test (EIT). Opinjoni tal-ESAC Nru 2016-02 tal-24 ta’ Ġunju 2016; EUR 28175 EN; doi: 10.2787/390390 Tħassir Disponibbli fuq: http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103704.
|
|
(13)
|
EC EURL ECVAM (2016). Recommendation on the Use of the Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Methods for Identifying Chemicals not Requiring Classification and Labelling for Serious Eye Damage/Eye Irritation According to UN GHS. (Il-Manuskritt Għadu Qed Jitħejja).
|
|
(14)
|
Draize, J.H., Woodard, G., Calvery, H.O. (1944). Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. Journal of Pharmacol. and Exp. Therapeutics 82, 377-390.
|
|
(15)
|
Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., Zuang, V. (2010). A Proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace In Vivo Studies Using Bottom-Up and Top-Down Approaches. Toxicol. In Vitro 24, 1-9.
|
|
(16)
|
Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63.
|
|
(17)
|
OECD (2016). Series on Testing and Assessment No 216: Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Cornea-Like Epithelium (RhCE) Test Methods for Identifying Chemicals not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage, Based on the Validated Reference Methods EpiOcular™ EIT and SkinEthic™ HCE EIT described in TG 492. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(18)
|
OECD (2005). Series on Testing and Assessment No 34: Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(19)
|
Kaluzhny, Y., Kandárová, H., Hayden, P., Kubilus, J., d’Argembeau-Thornton, L., Klausner, M. (2011). Development of the EpiOcular™ Eye Irritation Test for Hazard Identification and Labelling of Eye Irritating Chemicals in Response to the Requirements of the EU Cosmetics Directive and REACH Legislation. Altern. Lab. Anim. 39, 339-364.
|
|
(20)
|
Nguyen, D.H., Beuerman, R.W., De Wever, B., Rosdy, M. (2003). Three-dimensional construct of the human corneal epithelium for in vitro toxicology. Fi: Salem, H., Katz, S.A. (Eds), Alternative Toxicological Methods, CRC Press, pp. 147-159.
|
|
(21)
|
Pfannenbecker, U., Bessou-Touya, S., Faller, C., Harbell, J., Jacob, T., Raabe, H., Tailhardat, M., Alépée, N., De Smedt, A., De Wever, B., Jones, P., Kaluzhny, Y., Le Varlet, B., McNamee, P., Marrec-Fairley, M., Van Goethem, F. (2013). Cosmetics Europe multi-laboratory pre-validation of the EpiOcular™ reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol. In Vitro 27, 619-626.
|
|
(22)
|
Alépée, N., Bessou-Touya, S., Cotovio, J., de Smedt, A., de Wever, B., Faller, C., Jones, P., Le Varlet, B., Marrec-Fairley, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., van Goethem, F., McNamee, P. (2013). Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the SkinEthic™ Reconstituted Human Corneal Epithelium Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol. In Vitro 27, 1476-1488.
|
|
(23)
|
Kolle, S.N., Moreno, M.C.R., Mayer, W., van Cott, A., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. (2015). The EpiOcular™ Eye Irritation Test is the Method of Choice for In Vitro Eye Irritation Testing of Agrochemical Formulations: Correlation Analysis of EpiOcular™ Eye Irritation Test and BCOP Test Data to UN GHS, US EPA and Brazil ANIVSA Classifications. Altern. Lab. Anim. 43, 1-18.
|
|
(24)
|
Adriaens, E., Barroso, J., Eskes, C., Hoffmann, S., McNamee, P., Alépée, N., Bessou-Touya, S., De Smedt, A., De Wever, B., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Zuang, V. (2014). Retrospective Analysis of the Draize Test for Serious Eye Damage/Eye Irritation: Importance of Understanding the In Vivo Endpoints Under UN GHS/EU CLP for the Development and Evaluation of In Vitro Test Methods. Arch. Toxicol. 88, 701-723.
|
|
(25)
|
Barroso, J., Pfannenbecker, U., Adriaens, E., Alépée, N., Cluzel, M., De Smedt, A., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Templier, M., McNamee, P. (2017). Cosmetics Europe compilation of historical serious eye damage/eye irritation in vivo data analysed by drivers of classification to support the selection of chemicals for development and evaluation of alternative methods/strategies: the Draize eye test Reference Database (DRD). Arch. Toxicol. 91, 521-547.
|
|
(26)
|
Meloni, M., De Servi, B., Marasco, D., Del Prete, S. (2011). Molecular mechanism of ocular surface damage: Application to an in vitro dry eye model on human corneal epithelium. Molecular Vision 17, 113-126.
|
|
(27)
|
Hackett, R.B., McDonald, T.O. (1991). Eye Irritation. F’Advances in Modern Toxicology: Dermatoxicology Marzulli F.N.u Maibach H.I. (Eds.), 4th Edition, pp. 749–815. Washington, DC, USA: Hemisphere Publishing Corporation.
|
|
(28)
|
Fox, D.A., Boyes, W.K. (2008). Toxic Responses of the Ocular and Visual System. In Cassaret and Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons Klaassen C.D.(Ed.), 7th Edition, pp. 665–697. Withby, ON, Canada: McGraw-Hill Ryerson.
|
|
(29)
|
Jester, J.V., Li, H.F., Petroll, W.M., Parker, R.D., Cavanagh, H.D., Carr, G.J., Smith, B., Maurer, J.K. (1998). Area and Depth of Surfactant Induced Corneal Injury Correlates with Cell Death. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 922-936.
|
|
(30)
|
Maurer, J.K., Parker, R.D., Jester, J.V. (2002). Extent of Corneal Injury as the Mechanistic Basis for Ocular Irritation: Key Findings and Recommendations for the Development of Alternative Assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36, 106-117.
|
|
(31)
|
Jester, J.V., Li, L., Molai, A., Maurer, J.K. (2001). Extent of Corneal Injury as a Mechanistic Basis for Alternative Eye Irritation Tests. Toxicol. In Vitro 15, 115-130.
|
|
(32)
|
Jester, J.V., Petroll, W.M., Bean, J., Parker, R.D., Carr, G.J., Cavanagh, H.D., Maurer, J.K. (1998). Area and Depth of Surfactant-Induced Corneal Injury Predicts Extent of Subsequent Ocular Responses. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2610-2625.
|
|
(33)
|
Jester, J.V. (2006). Extent of Corneal Injury as a Biomarker for Hazard Assessment and the Development of Alternative Models to the Draize Rabbit Eye Test. Cutan. Ocul. Toxicol. 25, 41-54.
|
|
(34)
|
EpiOcular™ EIT SOP, Version 8 (5 ta’ Marzu 2013). EpiOcular™ EIT for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals. Disponibbli fuq: [https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index].
|
|
(35)
|
SkinEthic™ HCE EIT SOP, Version 1. (20 ta’ Lulju 2015). SkinEthic™ HCE Eye Irritation Test (EITL for Liquids, EITS for Solids) for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals. Disponibbli fuq: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index.
|
|
(36)
|
Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., McNamee, P. (2015). Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT-Reduction Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29, 741-761.
|
|
(37)
|
Kaluzhny, Y., Kandárová, H., Handa, Y., DeLuca, J., Truong, T., Hunter, A., Kearney, P., d’Argembeau-Thornton, L., Klausner, M. (2015). EpiOcular™ Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern. Lab Anim. 43, 101-127.
|
|
(38)
|
US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Mejju 2001. Disponibbli fuq: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf.
|
|
(39)
|
OECD (2017). Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Series on Testing and Assessment No 263. ENV Publications, Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET
Akkuratezza
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta’ ttestjar u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar u wieħed mill-aspetti ta’ “rilevanza”. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ metodu ta’ ttestjar (18).
Sustanza kimika ta’ referenza
: Sustanza kimika użata bħala standard għall-paragun ma’ sustanza kimika tat-test. Sustanza kimika ta’ riferiment għandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli għall-identifikazzjoni u għall-karatterizzazzjoni tagħhom; (ii) similarità strutturali, funzjonali u/jew tal-klassi tas-sustanza kimika jew tal-prodott għas-sustanza/i kimika/kimiċi li tkun/ikunu qed tiġi/jiġu ttestjata/i; (iii) il-karatteristiċi fiżikokimiċi magħrufa; (iv) data ta’ appoġġ dwar effetti magħrufa; u (v) il-potenza magħrufa fl-iskala tar-rispons mixtieq.
Approċċ Minn Isfel għal Fuq
: Approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika tat-test suspettata li ma teħtieġx klassifikazzjoni u tikkettar għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta’ sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni u tikkettar (eżitu negattiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu pożittiv).
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita.
Konkordanza
: Ara “Akkuratezza”.
Kornea
: Il-parti trasparenti tal-parti ta’ quddiem tal-boċċa tal-għajn li tiksi l-iris u l-pupilla u tħalli d-dawl jgħaddi għal ġol-parti interna tal-għajn.
CV
: Koeffiċjent ta’ Varjazzjoni.
Dev
: Devjazzjoni.
EIT
: Test tal-Irritazzjoni tal-Għajnejn.
EURL ECVAM
: Laboratorju ta’ Referenza tal-Unjoni Ewropea għal Alternattivi għall-Ittestjar fuq l-Annimali.
Irritazzjoni tal-għajnejn
: Il-produzzjoni ta’ tibdiliet fl-għajnejn wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test fil-wiċċ ta’ wara tal-għajn, li jkunu kompletament reversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma’ “Effetti reversibbli fuq l-għajnejn” u mal-Kategorija 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP”.
ET50
: Ħin tal-esponiment meħtieġ biex il-vijabbiltà tat-tessuti titnaqqas b’50 % mal-applikazzjoni ta’ sustanza kimika ta’ riferiment f’konċentrazzjoni speċifikata fissa.
Rata ta’ negattivi foloz
: Il-proporzjon ta’ sustanzi pożittivi kollha identifikati b’mod falz bħala negattivi minn metodu ta’ ttestjar. Dan hu wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.
Rata ta’ pożittivi foloz
: Il-proporzjon tas-sustanzi negattivi kollha identifikati b’mod falz bħala pożittivi minn metodu ta’ ttestjar. Dan hu wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.
Periklu
: Proprjetà inerenti ta’ aġent jew ta’ sitwazzjoni li għandha l-potenzjal li tikkawża effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
HCE
: Epitelju Korneali Uman ta’ SkinEthic™.
HPLC
: Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja.
IC50
: Konċentrazzjoni li fiha sustanza kimika ta’ riferiment tnaqqas il-vijabbiltà tat-tessuti b’50 % wara ħin ta’ esponiment fis (eż. trattament ta’ 30 minuta bl-SDS).
Doża infinita
: Ammont tas-sustanza kimika tat-test applikata għall-binja tat-tessuti tal-RhCE lil hinn mill-ammont meħtieġ biex tinkesa b’mod sħiħ u uniformi s-superfiċje tal-epiteljali.
Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn
: Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.
LLOQ
: Limitu Inferjuri ta’ Kwantifikazzjoni.
LogP
: Logaritmu tal-koeffiċjent ta’ partizzjoni tal-ottanol/ilma
Taħlita
: Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.
Sustanza monokostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).
Sustanza multikostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bit-tħallit ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.
MTT
: Bromur tat-3-(4,5-Dimetiltjażol-2-il)-2,5-difeniltetrażolju; Bromur tat-tetrażolju tal-blu tjażolil.
Kontroll negattiv
: Kampjun li jkun fih il-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattata b’sustanza li jkun magħruf li ma tinduċix rispons pożittiv fis-sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b’kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn u jintuża biex tiġi determinata l-vijabbiltà tat-tessut ta’ 100 %.
Mhux ikklassifikati
: Sustanzi kimiċi li mhumiex klassifikati għall-Irritazzjoni tal-għajnejn (Kategorija 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP, Kategorija 2A jew 2B tal-GHS tan-NU) jew Ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP). Interkambjabbli ma’ “Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/tas-CLP”.
NSCkilled
: Kulur Mhux Speċifiku f’tessuti maqtula.
NSCliving
: Kulur Mhux Speċifiku f’tessuti ħajjin.
NSMTT
: Tnaqqis fl-MTT Mhux Speċifiku.
OD
: Densità Ottika.
Standards tal-prestazzjoni
: Standards, ibbażati fuq metodu ta’ ttestjar validat li tqies xjentifikament validu, li jipprovdu bażi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ metodu ta’ ttestjar propost li hu simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Hemm inklużi: (i) il-komponenti essenzjali tal-metodi ta’ ttestjar; (ii) lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza magħżula minn fost is-sustanzi kimiċi użati biex tintwera l-prestazzjoni aċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (iii) il-livelli komparabbli ta’ akkuratezza u ta’ affidabbiltà, fuq il-bażi ta’ dak li nkiseb għall-metodu ta’ ttestjar validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost għandu juri meta evalwat bl-użu tal-lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza (18).
Kontroll pożittiv
: Kampjun li jkun fih il-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattata b’sustanza li jkun magħruf li tinduċi rispons pożittiv fis-sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b’kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn. Biex jiġi żgurat li l-varjabbiltà fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista’ tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test mal-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ metodu ta’ ttestjar (18).
Affidabbiltà
: Kejlijiet ta’ kemm metodu ta’ ttestjar jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbbiltà fl-istess u bejn il-laboratorji u r-ripetibbiltà fl-istess laboratorju (18).
Test ta’ sostituzzjoni
: Test li hu mfassal biex jieħu post test li hu f’użu ta’ rutina u aċċettat għall-identifikazzjoni tal-perikli u/jew għall-valutazzjoni tar-riskji, u li ġie determinat li jipprovdi protezzjoni ekwivalenti jew imtejba tas-saħħa tal-bniedem jew tal-annimali jew tal-ambjent, skont kif ikun applikabbli, meta mqabbel mat-test aċċettat, għas-sitwazzjonijiet u għas-sustanzi kimiċi ta’ ttestjar possibbli kollha (18).
Riproduċibbiltà
: Il-qbil bejn ir-riżultati miksub mill-ittestjar ripetut tal-istess sustanza kimika tat-test bl-użu tal-istess protokoll tat-test (Ara “Affidabbiltà”) (18).
Effetti reversibbli fuq l-għajnejn
: Ara “Irritazzjoni tal-għajnejn”.
RhCE
: Epitelju bħall-Kornea Umana Rikostitwit.
Sessjoni
: Sessjoni tikkonsisti f’sustanza kimika tat-test waħda jew aktar ittestjata flimkien ma’ kontroll negattiv u ma’ kontroll pożittiv.
SD
: Devjazzjoni Standard.
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi tat-test pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (18).
Ħsara serja lill-għajnejn
: Il-produzzjoni ta’ ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew ta’ tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza tat-test fuq is-superfiċje anterjuri tal-għajn, li ma jkunux riversibbli għalkollox fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma’ “Effetti irreversibbli fuq l-għajn” u mal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU u tas-CLP”.
Proċeduri Operattivi Standard (SOP)
: Proċeduri formali miktuba li jiddeskrivu fid-dettall kif għandhom jitwettqu operazzjonijiet speċifiċi ta’ rutina, u speċifiċi għat-testijiet, tal-laboratorju. Dawn huma meħtieġa mill-GLP.
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi tat-test negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (18).
Sustanza
: Element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ produzzjoni, li jinduċi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mibdula l-kompożizzjoni tagħha.
Test
: Sustanza kimika tat-test waħda testjata b’mod konkorrenti f’minimu ta’ żewġ repliki ta’ tessuti kif definiti fl-SOP korrispondenti.
Vijabbiltà tat-tessuti
: Il-parametru li jkejjel l-attività sħiħa tal-popolazzjoni ċellulari f’tessut rikostitwit bħala l-ħila tagħha li tnaqqas l-MTT tal-kolorant vitali, li, skont il-punt ta’ tmiem imkejjel u d-disinn tat-test użat, jikkorrispondi għall-għadd totali u/jew għall-vitalità taċ-ċelloli ħajjin.
Approċċ Minn Fuq Għal Isfel
: Approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika suspettata li tikkawża ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta’ sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (eżitu pożittiv) minn sustanzi kimiċi oħra (eżitu negattiv).
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
Strateġija ta’ ttestjar sekwenzjali
: Strateġija ta’ ttestjar sekwenzjali, li tuża l-metodi ta’ ttestjar f’sekwenza. L-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi rieżaminata, f’kull saff, permezz ta’ proċess tal-piż tal-evidenza f’kull livell biex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss fl-istrateġija. Jekk il-potenzjal/potenza ta’ periklu ta’ sustanza kimika tat-test jista’ jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti f’saff partikolari, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor (18).
ULOQ
: Limitu Superjuri ta’ Kwantifikazzjoni.
Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
: Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (1).
Kategorija 1 tal-GHS tan-NU u tas-CLP
: Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.
Kategorija 2 tal-GHS tan-NU u tas-CLP
: Ara “Irritazzjoni tal-għajnejn”.
Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU u tas-CLP
: Sustanzi kimiċi li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni bħala tal-Kategorija 1 jew 2 tal-GHS tan-NU/tas-CLP (jew tal-Kategorija 2A jew 2B tal-GHS tan-NU). Interkambjabbli ma’ “Mhux Klassifikati”.
UPLC
: Kromatografija Likwida ta’ Prestazzjoni Għolja Ħafna.
UVCB
: sustanzi b’kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.
Metodu ta’ ttestjar validu
: Metodu ta’ ttestjar meqjus li għandu biżżejjed rilevanza u affidabbiltà għal skop speċifiku u li hu bbażat fuq prinċipji xjentifiċi sodi. Metodu ta’ ttestjar qatt ma jkunx validu f’sens assolut, iżda biss b’rabta ma’ skop definit (18).
Metodu ta’ ttestjar validat
: Metodu ta’ ttestjar li għalih ikunu tlestew studji ta’ validazzjoni biex jiġu determinati r-rilevanza (inkluża l-akkuratezza) u l-affidabbiltà għal għan speċifiku. Ta’ min jinnota li jista’ jkun li metodu ta’ ttestjar validat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f’termini ta’ akkuratezza u ta’ affidabbiltà biex jitqies aċċettabli għall-għan propost (18).
VRM
: Metodu ta’ Riferiment Validat.
VRM1
: EpiOcular™ EIT jissejjaħ il-Metodu ta’ Riferiment Validat 1.
VRM2
: SkinEthic™ HCE EIT jissejjaħ il-Metodu ta’ Riferiment Validat 2.
Piż tal-evidenza
: Il-proċess ta’ kunsiderazzjoni tal-aspetti pożittivi u negattivi ta’ diversi biċċiet ta’ informazzjoni biex tinħareġ u tiġi appoġġata konklużjoni rigward il-potenzjal ta’ periklu ta’ sustanza kimika.
Appendiċi 2
KOMPONENTI EWLENIN TAT-TEST GĦAT-TESTIJIET TAL-RHCE VALIDATI GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TA’ SUSTANZI KIMIĊI LI MA JEĦTIĠUX KLASSIFIKAZZJONI U TIKKETTAR GĦALL-IRRITAZZJONI TAL-GĦAJNEJN JEW GĦAL ĦSARA SERJA LILL-GĦAJNEJN
|
Komponenti tat-Test
|
EpiOcular™ EIT
(VRM 1)
|
SkinEthic™ HCE EIT
(VRM 2)
|
|
Protokolli
|
Likwidi
(pipettabbli f’37±1°C jew f’temperaturi anqas għal 15-il min)
|
Solidi
(mhux pipettabbli)
|
Likwidi u viskużi
(pipettabbli)
|
Solidi
(mhux pipettabbli)
|
|
Superfiċje tal-mudell
|
0,6 cm2
|
0,6 cm2
|
0,5 cm2
|
0,5 cm2
|
|
Numru ta’ repliki tat-tessuti
|
Tal-anqas 2
|
Tal-anqas 2
|
Tal-anqas 2
|
Tal-anqas 2
|
|
Kontroll ta’ qabel għall-interferenza tal-kulur
|
50 μl + 1 ml H2O għal 60 min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH (sustanzi kimiċi tat-test mhux ikkuluriti), jew 50 μl + 2 ml isopropanol imħallat għal 2-3h f’RT ((sustanzi kimiċi tat-test ikkuluriti)
|
jekk l-OD tas-sustanza kimika tat-test f’570±20 nm, wara t-tnaqqis tal-OD għall-isopropanol jew għall-ilma tkun > 0,08 (li tikkorrispondi għal madwar 5 % tal-OD medja tal-kontroll negattiv), għandhom isiru kontrolli adattati ħajjin.
|
|
50 mg + 1 ml H2O għal 60 min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
(sustanzi kimiċi tat-test mhux ikkuluriti) u/jew
50 mg + 2 ml isopropanol imħallat għal 2-3h f’RT (sustanzi kimiċi tat-test ikkuluriti u mhux ikkuluriti)
|
jekk l-OD tas-sustanza kimika tat-test f’570±20 nm wara t-tnaqqis tal-OD għall-isopropanol jew għall-ilma tkun > 0,08 (li tikkorrispondi għal madwar 5 % tal-OD medja tal-kontroll negattiv), għandhom isiru kontrolli adattati ħajjin.
|
|
10 μl + 90 μl H2O imħallta għal 30±2 min f’Temperatura Ambjentali (RT, 18-28oC)
|
jekk is-sustanza kimika tat-test tieħu l-kulur, għandhom isiru kontrolli adattati ħajjin
|
|
10 mg + 90 μl H2O imħallta għal 30±2 min f’RT
|
jekk is-sustanza kimika tat-test tieħu l-kulur, għandhom isiru kontrolli adattati ħajjin
|
|
|
Kontroll ta’ qabel għat-tnaqqis dirett tal-MTT
|
soluzzjoni ta’ 50 μl + 1 ml MTT 1 mg/ml għal 180±15-il min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
jekk is-soluzzjoni ssir blu/vjola, għandhom isiru kontrolli adattati maqtula bil-friża
(bħala kontroll negattiv jintuża 50 μl ilma dejonizzat sterili f’soluzzjoni ta’ MTT)
|
|
soluzzjoni ta’ 50 mg+ 1 ml MTT 1 mg/ml għal 180±15-il min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
jekk is-soluzzjoni ssir blu/vjola, għandhom isiru kontrolli adattati maqtula bil-friża
(bħala kontroll negattiv jintuża 50 μl ilma dejonizzat sterili f’soluzzjoni ta’ MTT)
|
|
soluzzjoni ta’ 30 μl + 300 μl MTT 1 mg/ml għal 180± 15-il min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
jekk is-soluzzjoni ssir blu/vjola, għandhom isiru kontrolli adattati maqtula bl-ilma
(bħala kontroll negattiv jintuża 30 μl ilma dejonizzat sterili f’soluzzjoni ta’ MTT)
|
|
30 mg + 300 μl MTT soluzzjoni ta’ 1 mg/ml għal 180± 15-il min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
jekk is-soluzzjoni ssir blu/vjola, għandhom isiru kontrolli adattati maqtula bl-ilma
(bħala kontroll negattiv jintuża 30 μl ilma dejonizzat sterili f’soluzzjoni ta’ MTT)
|
|
|
Qabel it-trattament
|
20 μl DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
għal 30 ± 2 min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH, protetta mid-dawl.
|
20 μl DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
għal 30 ± 2 min f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH, protetta mid-dawl.
|
-
|
-
|
|
Dożi u applikazzjoni tat-trattament
|
50 μl (83,3 μl/cm2)
|
50 mg (83,3 mg/cm2) bl-użu ta’ għodda kalibrata (eż. mgħarfa livellata kalibrata biex iżżomm 50 mg klorur tas-sodju).
|
10 μl DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+ + 30 ± 2 μl (60 μl/cm2)
Għal viskużi, uża xibka tan-najlon
|
30 μl DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+ + 30 ± 2 mg (60 mg/cm2)
|
|
Ħin u temperatura tal-esponiment
|
30 min (± 2 min)
f’medium tat-tkabbir
f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
6 sigħat (± 0,25 h)
f’medium tat-tkabbir
f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
30 min (± 2 min)
f’medium tat-tkabbir
f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
4 sigħat (± 0,1 h)
f’medium tat-tkabbir
f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
|
Tlaħliħ f’temperatura ambjentali
|
tliet darbiet f’100 ml DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
|
tliet darbiet f’100 ml DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
|
20 ml DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
|
25 ml DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
|
|
Tgħaddis ta’ wara l-esponiment
|
12-il min (± 2 min) f’RT f’medium tat-tkabbir
|
25 min (± 2 min) f’RT f’medium tat-tkabbir
|
30 min (± 2 min) f’37oC, 5 % CO2, 95 % RH f’medium tat-tkabbir
|
30 min (± 2 min) f’RT f’medium tat-tkabbir
|
|
Inkubazzjoni ta’ wara l-esponiment
|
120 min (± 15-il min) f’medium tat-tkabbir f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
18-il siegħa (± 0,25 ta’ siegħa) f’medium tat-tkabbir f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
ebda
|
18-il siegħa (± 0,5 ta’ siegħa) f’medium tat-tkabbir f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
|
Kontroll negattiv
|
50 μl H2O
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
50 μl H2O
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
30 ± 2μl DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
30 ± 2μl DPBS ħielsa minn Ca2+/Mg2+
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
|
Kontroll pożittiv
|
50 μl Aċetat tal-metil
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
50 μl Aċetat tal-metil
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
30 ± 2μl Aċetat tal-metil
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
30 ± 2μl Aċetat tal-metil
Ittestjat b’mod konkorrenti
|
|
Soluzzjoni MTT
|
300 μl 1 mg/ml
|
300 μl 1 mg/ml
|
300 μl 1 mg/ml
|
300 μl 1 mg/ml
|
|
Ħin u temperatura tal-esponiment
|
180 min (± 15-il min) f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
180 min (± 15-il min) f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
180 min (± 15-il min) f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
180 min (± 15-il min) f’37±2oC, 5±1 % CO2, ≥95 % RH
|
|
Solvent ta’ estrazzjoni
|
2 ml isopropanol
(estrazzjoni mill-quċċata u mill-qiegħ tal-inserzjoni b’perforazzjoni tat-tessut)
|
2 ml isopropanol
(estrazzjoni mill-qiegħ tal-inserzjoni b’perforazzjoni tat-tessut)
|
1,5 ml isopropanol
(estrazzjoni mill-quċċata u mill-qiegħ tal-inserzjoni)
|
1,5 ml isopropanol
(estrazzjoni mill-qiegħ tal-inserzjoni)
|
|
Ħin u temperatura tal-estrazzjoni
|
2-3 h bit-tħawwid (~120 rpm) f’RT jew matul il-lejl f’4-10°C
|
2-3 h bit-tħawwid (~120 rpm) f’RT jew matul il-lejl f’4-10°C
|
4 h bit-tħawwid (~120 rpm) f’RT jew tal-anqas matul il-lejl mingħajr tħawwid f’4-10°C
|
Tal-anqas sagħtejn (2 h) bit-tħawwid (~120 rpm) f’RT
|
|
Qari tal-OD
|
570 nm (550 - 590 nm)
mingħajr filtru ta’ riferiment
|
570 nm (550-590 nm)
mingħajr filtru ta’ riferiment
|
570 nm (540 - 600 nm)
mingħajr filtru ta’ riferiment
|
570 nm (540 - 600 nm)
mingħajr filtru ta’ riferiment
|
|
Kontroll tal-Kwalità tat-Tessuti
|
Trattament b’100 μl ta’ 0,3 % (v/v) Triton X-100
12,2 min ≤ ET50 ≤ 37,5 min
|
Trattament b’100 μl ta’ 0,3 % (v/v) Triton X-100
12,2 min ≤ ET50 ≤ 37,5 min
|
Trattament ta’ 30 min b’SDS (50 μl)
1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,5 mg/ml
|
Trattament ta’ 30 min b’SDS (50 μl)
1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,2 mg/ml
|
|
Kriterji tal-Aċċettazzjoni
|
|
1.
|
L-OD medja tar-repliki tat-tessuti trattati bil-kontroll negattiv għandha tkun > 0,8 u < 2,5
|
|
2.
|
Il-vijabbiltà medja tar-repliki tat-tessuti esposti għal 30 min bil-kontroll pożittiv, espressa bħala % tal-kontroll negattiv, għandha tkun < 50 %
|
|
3.
|
Id-differenza tal-vijabbiltà bejn żewġ repliki ta’ tessuti għandha tkun anqas minn 20 %.
|
|
|
1.
|
L-OD medja tar-repliki tat-tessuti trattati bil-kontroll negattiv għandha tkun > 0,8 u < 2,5
|
|
2.
|
Il-vijabbiltà medja tar-repliki tat-tessuti esposti għal 6 sigħat bil-kontroll pożittiv, espressa bħala % tal-kontroll negattiv, għandha tkun < 50 %
|
|
3.
|
Id-differenza tal-vijabbiltà bejn żewġ repliki ta’ tessuti għandha tkun anqas minn 20 %.
|
|
|
1.
|
L-OD medja tar-repliki tat-tessuti trattati bil-kontroll negattiv għandha tkun > 1,0 u ≤ 2,5
|
|
2.
|
Il-vijabbiltà medja tar-repliki tat-tessuti esposti għal 30 min bil-kontroll pożittiv, espressa bħala % tal-kontroll negattiv, għandha tkun ≤ 30 %
|
|
3.
|
Id-differenza tal-vijabbiltà bejn żewġ repliki ta’ tessuti għandha tkun anqas minn 20 %.
|
|
|
1.
|
L-OD medja tar-repliki tat-tessuti trattati bil-kontroll negattiv għandha tkun > 1,0 u ≤ 2,5
|
|
2.
|
Il-vijabbiltà medja tar-repliki tat-tessuti esposti għal 4 sigħat bil-kontroll pożittiv, espressa bħala % tal-kontroll negattiv, għandha tkun ≤ 20 %
|
|
3.
|
Id-differenza tal-vijabbiltà bejn żewġ repliki ta’ tessuti għandha tkun anqas minn 20 %.
|
|
Appendiċi 3
FLOWCHART ILLUSTRATTIVA LI TIPPROVDI GWIDA DWAR KIF TIDENTIFIKA U TIMMANIĠĠJA RIDUĊENTI DIRETTI TAL-MTT U/JEW SUSTANZI KIMIĊI INTERFERENTI TAL-KULUR, FUQ IL-BAŻI TAL-SOP TAL-VRM1
Appendiċi 4
FLOWCHART ILLUSTRATTIVA LI TIPPROVDI GWIDA DWAR KIF TIDENTIFIKA U TIMMANIĠĠJA RIDUĊENTI DIRETTI TAL-MTT U/JEW SUSTANZI KIMIĊI INTERFERENTI TAL-KULUR, FUQ IL-BAŻI TAL-SOP TAL-VRM2
Appendiċi 5
PARAMETRI EWLENIN U KRITERJI TA’ AĊĊETTAZZJONI GĦALL-KWALIFIKAZZJONI TA’ SISTEMA TA’ SPETTROFOTOMETRIJA TAL-HPLC/UPLC GĦALL-KEJL TAL-FORMAŻAN MTT ESTRATT MILL-BINJIET TAT-TESSUTI TAL-RHCE
|
Parametru
|
Protokoll Derivat mill-Gwida tal-FDA (36)(38)
|
Kriterji tal-Aċċettazzjoni
|
|
Selettività
|
Analiżi tal-isopropanol, inbjank ħaj (estratt tal-isopropanol minn binjiet tat-tessuti tal-RhCE ħajjin mingħajr ebda trattament), inbjank mejjet (estratt tal-isopropanol minn binjiet tat-tessuti tal-RhCE maqtula mingħajr ebda trattament), u ta’ kolorant (eż. blu metilen)
|
Areainterference ≤ 20 % ta’ AreaLLOQ
(88)
|
|
Preċiżjoni
|
Kontrolli tal-Kwalità (jiġifieri formażan MTT f’1,6 μg/ml, 16 μg/ml u 160 μg/ml ) fl-isopropanol (n=5)
|
CV ≤ 15 % jew ≤ 20 % għal-LLOQ
|
|
Preċiżjoni
|
Kontrolli tal-Kwalità fl-isopropanol (n=5)
|
%Dev ≤ 15 % jew ≤ 20 % għal-LLOQ
|
|
Effett tal-Matriċi
|
Kontrolli tal-Kwalità fl-inbjank ħaj (n=5)
|
85 % ≤ Effett tal-Matriċi % ≤ 115 %
|
|
Riport
|
Analiżi tal-isopropanol wara ULOQ (89) standard
|
Areainterference ≤ 20 % tal-AreaLLOQ
|
|
Riproduċibbiltà (dakinhar)
|
3 kurvi tal-kalibrar indipendenti (fuq il-bażi ta’ 6 dilwizzjonijiet ta’ 1/3 konsekuttivi ta’ formażan MTT fl-isopropanol mill-ULOQ, jiġifieri 200 μg/ml);
Kontrolli tal-Kwalità fl-isopropanol (n=5)
|
Kurvi ta’ Kalibrazzjoni: %Dev ≤ 15 % jew ≤ 20 % għal-LLOQ
Kontrolli tal-Kwalità: %Dev ≤ 15 % u CV ≤ 15 %
|
|
Riproduċibbiltà (bejn ġranet differenti)
|
Jum 1: Kurva ta’ kalibrazzjoni 1 u Kontrolli tal-Kwalità fl-isopropanol (n=3)
Jum 2: Kurva ta’ kalibrazzjoni 1 u Kontrolli tal-Kwalità fl-isopropanol (n=3)
Jum 3: Kurva ta’ kalibrazzjoni 1 u Kontrolli tal-Kwalità fl-isopropanol (n=3)
|
|
Stabbiltà fuq Terminu Qasir tal-Formażan MTT fl-Estratt tat-Tessuti tal-RhCE
|
Kontrolli tal-Kwalità fl-inbjank ħaj (n=3) analizzati dakinhar tal-preparazzjoni u wara 24 siegħa ta’ ħżin f’temperatura ambjentali
|
%Dev ≤ 15 %
|
|
Stabbiltà fit-Tul tal-Formażan MTT fl-Estratt tat-Tessuti tal-RhCE, jekk meħtieġa
|
Kontrolli tal-Kwalità fl-inbjank ħaj (n=3) analizzati dakinhar tal-preparazzjoni u wara diversi jiem ta’ ħżin f’-20°C
|
%Dev ≤ 15 %
|
B.70 ASSAĠĠI IN VITRO TAR-RIĊETTUR TAL-ESTROĠENU RIKOMBINANTI UMAN (hrER) BIEX JIĠU INDIVIDWATI SUSTANZI KIMIĊI B’AFFINITÀ GĦALL-IRBIT TAL-ER
INTRODUZZJONI ĠENERALI
Linja Gwida tat-Test Ibbażata fuq il-Prestazzjoni tal-OECD
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 493 tal-OECD (2015). It-TG 493 hi linja gwida tat-test ibbażata fuq il-prestazzjoni (PBTG), li tiddeskrivi l-metodoloġija għall-assaġġi in vitrorikombinanti umani biex jiġu individwati sustanzi b’affinità għall-irbit tar-riċettur tal-estroġenu (assaġġi tal-irbit tal-hrER). Din tinkludi żewġ assaġġi mekkanistikament u funzjonalment simili għall-identifikazzjoni tal-leganti tar-riċettur tal-estroġenu (jiġifieri ERα) u għandha tiffaċilita l-iżvilupp ta’ assaġġi simili jew modifikati ġodda skont il-prinċipji għall-validazzjoni stabbiliti fl-OECD Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment (1). Il-metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment validati bis-sħiħ (l-Appendiċi 2 u l-Appendiċi 3) li jipprovdu l-bażi għal din il-PBTG huma:
|
—
|
L-Assaġġ tal-Irbit tar-Riċettur tal-Estroġenu (ER) In Vitro ta’ Freyberger-Wilson (FW) bl-Użu ta’ ERα Rikombinanti Uman b’Tul Sħiħ (2), u
|
|
—
|
L-Assaġġ tal-Irbit tar-Riċettur tal-Estroġenu In Vitro bl-Użu ta’ Proteina tad-Dominju tal-Irbit tal-Ligand Rikombinanti tal-Chemical Evaluation and Research Institute (CERI) (2).
|
L-istandards tal-prestazzjoni (PS) (3) huma disponibbli biex jiffaċilitaw l-iżvilupp u l-validazzjoni ta’ metodi ta’ ttestjar simili għall-istess punt ta’ tmiem tal-periklu u jippermettu għall-emendar puntwali tal-PBTG 493 biex assaġġi simili ġodda jkunu jistgħu jiżdiedu ma’ PBTG aġġornata. Madankollu, assaġġi ta’ testijiet simili jiżdiedu biss wara rieżami u qbil mill-OECD li ntlaħqu l-istandards tal-prestazzjoni. L-assaġġi inklużi fit-TG 493 jistgħu jintużaw b’mod indiskriminat biex jiġu indirizzati r-rekwiżiti tal-pajjiżi membri tal-OECD għar-riżultati tat-testijiet dwar l-irbit tar-riċettur tal-estroġenu filwaqt li jinkiseb benefiċċju mill-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data tal-OECD.
|
Sfond u prinċipji tal-assaġġi inklużi f’dan il-metodu ta’ ttestjar
|
2.
|
Fl-1998, l-OECD nediet attività ta’ prijorità għolja biex tirrevedi l-linji gwida dwar it-testijiet eżistenti, u tiżviluppa linji gwida ġodda, għall-iskrinjar u għall-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi interferenti endokrinali potenzjali. Il-qafas kunċettwali (CF) tal-OECD għall-ittestjar u għall-valutazzjoni ta’ sustanzi kimiċi interferenti endokrinali potenzjali ġie rivedut fl-2012. Is-CFs oriġinali u riveduti huma inklużi bħala Annessi fid-Dokument ta’ Gwida dwar Linji Gwida tat-Testijiet Standardizzati għall-Evalwazzjoni ta’ Sustanzi Kimiċi għall-Interferenza Endokrinali (4). Is-CF jinkludi ħames livelli, b’kull livell li jikkorrispondi għal livell differenti ta’ kumplessità bijoloġika. L-assaġġi tal-irbit tal-ER deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma l-livell 2, li jinkludi “assaġġi in vitro li jipprovdu data dwar il-mekkaniżmu/i/il-perkors(i) endokrinali magħżula”. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu għall-assaġġi tal-irbit tar-riċettur in vitro mfassla biex jidentifikaw ligandi għar-riċettur alfa tal-estroġenu uman (ERα).
|
|
3.
|
Ir-rilevanza tal-assaġġ tal-irbit tal-ER in vitro għall-funzjonijiet bijoloġiċi ntweriet biċ-ċar. L-assaġġi tal-irbit tal-ER huma mfassla biex jidentifikaw sustanzi kimiċi li għandhom il-potenzjal li jinterferixxu l-perkors tal-ormon estroġenu, u ntużaw b’mod estensiv matul l-aħħar żewġ deċennji għall-karatterizzazzjoni tad-distribuzzjoni tat-tessut tal-ER kif ukoll biex jiġu identifikati l-agonisti/antagonisti tal-ER. Dawn l-assaġġi jirriflettu l-interazzjoni ligand-riċettur li hi l-ewwel pass tal-perkors ta’ senjalar tal-estroġenu u essenzjali għall-funzjoni ta’ riproduzzjoni fil-vertebrati kollha.
|
|
4.
|
L-interazzjoni tal-estroġeni mal-ERs tista’ taffettwa t-traskrizzjoni tal-ġeni kkontrollati mill-estroġenu u jinduċu effetti mhux ġenomiċi, li tista’ twassal għall-induzzjoni jew għall-inibizzjoni ta’ proċessi ċellolari, inklużi dawk neċessarji għall-proliferazzjoni taċ-ċelloli, għall-iżvilupp normali tal-fetu, u għall-funzjoni riproduttiva (5) (6) (7). Il-perturbazzjoni ta’ sistemi estroġeniċi normali jista’ jkollha l-potenzjal li tiskatta effetti avversi fuq l-iżvilupp normali (ontoġenesi), is-saħħa riproduttiva u l-integrità tas-sistema riproduttiva. Senjalar mhux adatt tal-ER jista’ jwassal għal effetti bħal riskju akbar ta’ kanċer dipendenti fuq l-ormoni, fertilità indebolita, u alterazzjonijiet fit-tkabbir u fl-iżvilupp tal-fetu (8).
|
|
5.
|
Assaġġi tal-irbit in vitro huma bbażati fuq interazzjoni diretta ta’ sustanza ma’ sit speċifiku ta’ rbit tal-ligand tar-riċettur li jirregola t-traskrizzjoni tal-ġene. Il-komponent ewlieni tal-assaġġ tal-irbit tar-riċettur alfa tal-estroġenu rikombinanti uman (hrERα) ikejjel il-ħila ta’ ligand radjotikkettat ([3H]17β-estradjol) li jorbot mal-ER fil-preżenza ta’ konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test (jiġifieri kompetitur). Sustanzi kimiċi tat-test li fihom affinità għolja għall-ER jikkompetu mal-ligand radjotikkettat f’konċentrazzjoni inferjuri meta mqabbla ma’ dawk is-sustanzi kimiċi b’affinità inferjuri għar-riċettur. Dan l-assaġġ jikkonsisti f’żewġ komponenti ewlenin: esperiment ta’ rbit tas-saturazzjoni biex jiġu karatterizzati l-parametri ta’ interazzjoni riċettur-ligand u tiġi dokumentata l-ispeċifiċità tal-ER, segwit minn esperiment tal-irbit kompetittiv li jikkaratterizza l-kompetizzjoni bejn sustanza kimika tat-test u ligand radjotikkettat għall-irbit mal-ER.
|
|
6.
|
Studji ta’ validazzjoni tas-CERI u l-assaġġi tal-irbit tal-FW urew ir-rilevanza u l-affidabbiltà tagħhom għall-iskop maħsub tagħhom (2).
|
|
7.
|
Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma deskritti fl-Appendiċi 1.
|
Ambitu u limitazzjonijiet relatati mal-assaġġi tal-irbit tar-riċettur
|
8.
|
Dawn l-assaġġi qed jiġu proposti għall-finijiet ta’ skrinjar u ta’ prijoritizzazzjoni, iżda jistgħu jipprovdu wkoll informazzjoni għal avveniment ta’ inizjazzjoni molekolari (MIE) li tista’ tintuża f’approċċ ta’ piż tal-evidenza. Dawn jindirizzaw l-irbit kimiku mad-dominju tal-irbit tal-ligand tal-ERα f’sistema in vitro. B’hekk, ir-riżultati ma għandhomx jiġu estrapolati direttament għas-sinjalar u għar-regolamentazzjoni kumplessi tas-sistema endokrinali intatta in vivo.
|
|
9.
|
L-irbit tal-ligand naturali, 17β-estradjol, hu l-ewwel pass f’sensiela ta’ avvenimenti molekulari li tattiva t-traskrizzjoni tal-ġeni fil-mira u, finalment, tintemm b’tibdil fiżjoloġiku (9). B’hekk, l-irbit mad-dominju tal-irbit tal-ligand tal-ERα hu meqjus wieħed mill-mekkaniżmi ewlenin tal-interruzzjoni endokrinali (ED) medjata tal-ER, għalkemm hemm mekkaniżmi oħra li permezz tagħhom tista’ sseħħ l-ED, inklużi (i) interazzjonijiet mas-siti tal-ERα li mhumiex iż-żona tal-irbit tal-ligand, (ii) interazzjonijiet ma’ riċetturi oħra rilevanti għas-senjalar tal-estroġenu, riċettur tal-estroġenu akkoppjat tal-ERβ u tal-proteina-G, riċetturi oħra u sistemi enzimatiċi fi ħdan is-sistema endokrinali, (iii) sinteżi tal-ormoni, (iv) attivazzjoni metabolika u/jew inattivazzjoni tal-ormoni, (v) distribuzzjoni tal-ormoni biex jimmiraw lejn tessuti, u (vi) ikklerjar tal-ormoni mill-ġisem. L-ebda wieħed mill-assaġġi taħt dan il-metodu ta’ ttestjar ma jindirizza dawn il-modalitajiet ta’ azzjoni.
|
|
10.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar jindirizza l-ħila tas-sustanzi li jorbtu mal-ERα umana u ma jagħmilx distinzjoni bejn agonisti jew antagonisti tal-ERα. Dawn l-assaġġi ma jindirizzawx avvenimenti downstream ulterjuri bħat-traskrizzjoni tal-ġeni jew tibdiliet fiżjoloġiċi. Peress li ntużaw sustanzi monokostitwenti singli biss matul il-validazzjoni, l-applikabbiltà għat-taħlitiet tat-test ma ġietx indirizzata. L-assaġġi xorta waħda huma teorikament applikabbli għall-ittestjar ta’ sustanzi multikostitwenti u taħlitiet. Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
|
|
11.
|
Is-sistemi ta’ riċetturi ħielsa miċ-ċelloli ma għandhom ebda kapaċità metabolika intrinsika u ma ġewx validati flimkien mas-sistemi enzimatiċi metaboliċi. Madankollu, jista’ jkun possibbli li attività metabolika tiġi inkorporata f’disinn ta’ studju iżda dan ikun jeħtieġ sforzi ta’ validazzjoni ulterjuri.
|
|
12.
|
Sustanzi kimiċi li jistgħu jiddenaturaw il-proteina (jiġifieri proteina tar-riċettur), bħal tensjoattivi jew sustanzi kimiċi li jistgħu jbiddlu l-pH tal-bafer tal-assaġġ, ma jistgħux jiġu ttestjati jew jistgħu jiġu ttestjati biss f’konċentrazzjonijiet nieqsa minn interazzjonijiet bħal dawn. Inkella, il-medda ta’ konċentrazzjonijiet li tista’ tiġi ttestjata fl-assaġġi għal sustanza kimika tat-test hi limitata mis-solubbiltà ta’ din fil-bafer tal-assaġġ.
|
|
13.
|
Għal-finijiet ta’ informazzjoni, it-Tabella 1 tipprovdi r-riżultati tat-test għall-24 sustanza li ġew ittestjati fiż-żewġ assaġġi validati bis-sħiħ deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar. Minn dawn is-sustanzi, 17 huma klassifikati bħala leganti tal-ER u 6 bħala mhux leganti fuq il-bażi tar-rapporti ppubblikati, inklużi assaġġ tal-attivazzjoni traskrizzjonali tal-ER u/jew l-assaġġ uterotrofiku (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). B’referenza għad-data miġbura fil-qosor fit-Tabella 1, kien hemm qbil ta’ kważi 100 % bejn iż-żewġ assaġġi dwar il-klassifikazzjonijiet tas-sustanzi kollha sa 10-4M, u kull sustanza ġiet klassifikata kif suppost bħala legant tal-ER jew mhux legant tal-ER. Informazzjoni supplimentari dwar dan il-grupp ta’ sustanzi kif ukoll sustanzi addizzjonali ttestjati fl-assaġġi tal-irbit tal-ER matul l-istudji ta’ validazzjoni hi pprovduta fl-Istandards tal-Prestazzjoni għall-assaġġ tal-irbit tal-hrER (3), fl-Appendiċi 2 (Tabelli 1, 2 u 3).
Tabella 1
Klassifikazzjoni tas-sustanzi bħala leganti jew mhux leganti tal-ER meta ttestjati fl-Assaġġi tal-Irbit tal-hrER FW u CERI meta mqabbla mar-rispons mistenni
|
|
Isem is-sustanza
|
CAS RN
|
Rispons Mistenni
|
Assaġġ FW
|
Assaġġ CERI
|
Sustanza Kimika MESH Klassi
|
Klassi tal-Prodott
|
|
|
Konċentrazzjoni Medda (M)
|
Klassifikazzjoni
|
Konċentrazzjoni Medda (M)
|
Klassifikazzjoni
|
|
1
|
17β-Estradjol
|
50-28-2
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Legant
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
2
|
Noretinodrel
|
68-23-5
|
Legant
|
3×10-9 – 30×10-4
|
Legant
|
3×10-9 – 30×10-4
|
Legant
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
3
|
Noretindron
|
68-22-4
|
Legant
|
3×10-9 – 30×10-4
|
Legant
|
3×10-9 – 30×10-4
|
Legant
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
4
|
Ftalat tad-di-n-butil
|
84-74-2
|
Mhux legant (*5)
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant (*6)
(1)
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant (*6)
(1)
|
Idrokarbur (ċikliku), Ester
|
Plastifikant, Sustanza Intermedja
|
|
5
|
DES
|
56-53-1
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Idrokarbur (Ċikliku), Fenol
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
6
|
17α-etinilestradjol
|
57-63-6
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
7
|
Mmeso-Eżestrol
|
84-16-2
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Idrokarbur (Ċikliku), Fenol
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
8
|
Ġenisteina
|
446-72-0
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Idrokarbur (eteroċikliku), Flavonojd
|
Prodott Naturali
|
|
9
|
Ekwol
|
531-95-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Metabolit tal-Fitoestroġenu
|
Prodott Naturali
|
|
10
|
Butil paraben (n butil-4-idrossibenżoat)
|
94-26-8
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Paraben
|
Preservattiv
|
|
11
|
Nonilfenol (taħlita)
|
84852-15-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Alkilfenol
|
Kompost Intermedju
|
|
12
|
o,p’-DDT
|
789-02-6
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Organoklorur
|
Insettiċida
|
|
13
|
Kortikosteron
|
50-22-6
|
Mhux legant (*5)
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux legant
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant
|
Sterojde
|
Prodott Naturali
|
|
14
|
Zearalenon
|
17924-92-4
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Idrokarbur (eteroċikliku), Latton
|
Prodott Naturali
|
|
15
|
Tamossifen
|
10540-29-1
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Idrokarbur, (Ċikliku)
|
Farmaċewtiku, Aġent Veterinarju
|
|
16
|
5α-diidrotestosteron
|
521-18-6
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Sterojde, Nonfenoliku
|
Prodott Naturali
|
|
17
|
Bisfenol A
|
80-05-7
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Fenol
|
Intermedjarju Kimiku
|
|
18
|
4-n-ettilfenol
|
1987-50-4
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Ekwivoku (5)
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Alkilfenol
|
Intermedja
|
|
19
|
Kepon (Klordekon)
|
143-50-0
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Idrokarbur, (Aloġenat)
|
Pestiċida
|
|
20
|
Benż(a)antraċen
|
56-55-3
|
Mhux Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Mhux Legant (6)
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Mhux Legant (6)
|
Idrokarbur Aromatiku
|
Intermedja
|
|
21
|
Enterolatton
|
78473-71-9
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Legant
|
Fitoestroġenu
|
Prodott Naturali
|
|
22
|
Proġesteron
|
57-83-0
|
Mhux legant (*5)
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant
|
Sterojde
|
Prodott Naturali
|
|
23
|
Ottiltrietossisilan
|
2943-75-1
|
Mhux legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Mhux Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Mhux Legant
|
Silan
|
Modifikatur tas-Superfiċje
|
|
24
|
Atrażina
|
1912-24-9
|
Mhux legant (*5)
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Mhux Legant
|
Kompost eteroċikliku
|
Erbiċida
|
|
KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrER
Komponenti Essenzjali tal-Assaġġ
|
14.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar japplika għal assaġġi li jużaw riċettur tal-ER u ligand b’saħħtu biżżejjed għar-reċettur li jista’ jintuża bħala markatur/traċċatur għall-assaġġ u jista’ jiġi spostat b’konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test. L-assaġġi leganti fihom iż-żewġ komponenti ewlenin li ġejjin: 1) irbit tas-saturazzjoni u 2) irbit kompetittiv. L-assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni jintuża biex jiġu kkonfermati l-ispeċifiċità u l-attività tal-preparati tar-riċettur, filwaqt li l-esperiment tal-irbit kompetittiv jintuża biex tiġi evalwata l-ħila ta’ sustanza kimika tat-test li torbot mal-hrER.
|
Kontrolli
|
15.
|
Il-bażi għall-estroġenu u għall-kontrolli ta’ riferiment konkorrenti proposti għandha tkun deskritta. Kontrolli konkorrenti (solvent (veikolu), pożittiv (legant tal-ER; affinità b’saħħitha u dgħajfa), negattiv (mhux legant)), kif xieraq, iservu bħala indikazzjoni li l-assaġġ hu operattiv skont il-kundizzjonijiet tat-test u jipprovdu bażi għal tqabbil bejn esperiment u ieħor; normalment dawn ikunu parti mill-kriterji ta’ aċċettabbiltà għal esperiment partikolari (1). Kurvi sħaħ ta’ konċentrazzjoni għall-estroġenu u għall-kontrolli ta’ riferiment (jiġifieri legant dgħajjef u mhux legant) għandhom jintużaw fi pjastra waħda matul kull sessjoni. Il-pjastri l-oħra kollha għandu jkun fihom: 1) konċentrazzjoni għolja (bejn wieħed u ieħor spostament sħiħ ta’ ligand radjotikkettat) u medja (madwar l-IC50) ta’ kull E2 u legant dgħajjef fit-triplikat; 2) kontroll b’solvent u irbit mhux speċifiku, kull wieħed fi triplikat.
|
Proċeduri Standard ta’ Kontroll tal-Kwalità
|
16.
|
Il-proċeduri standard ta’ kontroll tal-kwalità għandhom isiru kif deskritt għal kull assaġġ biex jiġu żgurati riċetturi attivi, il-konċentrazzjonijiet kimiċi korretti, li l-limiti ta’ tolleranza jibqgħu stabbli f’diversi repliki, u li tinżamm il-ħila li jiġu pprovduti r-risponsi mistennija ta’ rbit tal-ER maż-żmien.
|
Wiri tal-Profiċjenza tal-Laboratorju
|
17.
|
Qabel l-ittestjar ta’ sustanza kimika mhux magħrufa bi kwalunkwe wieħed mill-assaġġi skont dan il-metodu ta’ ttestjar, kull laboratojru għandu juri profiċjenza fl-użu tal-assaġġ billi jagħmel assaġġi tas-saturazzjoni biex jikkonferma l-ispeċifiċità u l-attività tal-preparazzjoni tal-ER, u l-assaġġi tal-irbit kompetittiv mal-estroġenu u mal-kontrolli ta’ riferiment (legant dgħajjef u mhux legant). Bażi ta’ data storika bir-riżultati għall-estroġenu u għall-kontrolli ta’ riferiment ġenerata minn bejn tlieta u ħames esperimenti indipendenti mwettqa f’jiem differenti għandha tkun stabbilita mil-laboratorju. Dawn l-esperimenti se jkunu l-bażi għall-estroġenu ta’ riferiment u għall-kontrolli storiċi għal-laboratorju u se jintużaw bħala valutazzjoni parzjali tal-aċċettabbiltà tal-assaġġ għal sessjonijiet futuri.
|
|
18.
|
Ir-risponsività tas-sistema tat-test tiġi kkonfermata wkoll bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza elenkati fit-Tabella 2. Il-lista ta’ sustanzi ta’ profiċjenza hi subsett tas-sustanzi ta’ riferiment pprovduti fl-Istandards tal-Prestazzjoni għall-assaġġi tal-irbit tal-ER (3). Dawn is-sustanzi huma kummerċjalment disponibbli, jirrappreżentaw il-klassijiet ta’ sustanzi kimiċi assoċjati komunement mal-attività tal-irbit tal-ER, jesibixxu firxa xierqa ta’ potenza mistennija għal-leganti tal-ER (jiġifieri b’saħħtu sa dgħajjef) u għal dawk mhux leganti (jiġifieri negattivi). Għal kull sustanza ta’ profiċjenza, il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom ikopru l-medda pprovduta fit-Tabella 2. Għandhom isiru tal-anqas tliet esperimenti għal kull sustanza u r-riżultati għandhom ikunu konformi mal-attività kimika mistennija. Kull esperiment għandu jsir b’mod indipendenti (jiġifieri b’dilwizzjonijiet friski ta’ riċettur, ta’ sustanzi kimiċi, u ta’ reaġent), bi tliet repliki għal kull konċentrazzjoni. Il-profiċjenza tintwera bil-klassifikazzjoni korretta (pożittiva/negattiva) ta’ kull sustanza ta’ profiċjenza. L-ittestjar tal-profiċjenza għandu jsir minn kull tekniku meta jkun qed jitgħallem l-assaġġi.
Tabella 2
Lista ta’ kontrolli u ta’ sustanzi ta’ profiċjenza għall-assaġġi tal-irbit kompetittiv tal-hrER
(90)
|
Nru
|
Isem is-sustanza
|
RN tas-CAS (91)
|
Rispons Mistenni (92)
(93)
|
Medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test (M)
|
Klassi kimika tal-MeSH (94)
|
Klassi tal-prodott (95)
|
|
Kontrolli (Estroġenu ta’ referenza, legant dgħajjef, mhux legant)
|
|
1
|
17-εστραδφολ
|
50-28-2
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent veterinarju
|
|
2
|
Noretinodrel (jew) Noretindron
|
68-23-5 (jew) 68-22-4
|
Legant
|
3×10-9 – 30×10-6
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent veterinarju
|
|
3
|
Ottiltrietossisilan
|
2943-75-1
|
Mhux legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Silan
|
Modifikatur tas-superfiċje
|
|
Sustanzi ta’ profiċjenza (95)
|
|
4
|
Dietilstilbestrol
|
56-53-1
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Idrokarbur (ċikliku), Fenol
|
Farmaċewtiku, Aġent veterinarju
|
|
5
|
17α-etinilestradjol
|
57-63-6
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Sterojde
|
Farmaċewtiku, Aġent veterinarju
|
|
6
|
meso-Eżestrol
|
84-16-2
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Idrokarbur (ċikliku), Fenol
|
Farmaċewtiku, Aġent veterinarju
|
|
7
|
Tamossifen
|
10540-29-1
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Idrokarbur (ċikliku)
|
Farmaċewtiku, Aġent veterinarju
|
|
8
|
Ġenisteina
|
446-72-0
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Kompost eteroċikliku, Flavonojd,
|
Prodott naturali
|
|
9
|
Bisfenol A
|
80-05-7
|
Legant
|
1×10-10 – 1×10-3
|
Fenol
|
Intermedjarju kimiku
|
|
10
|
Żearalonon
|
17924-92-4
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-3
|
Kompost eteroċikliku, Latton
|
Prodott Naturali
|
|
11
|
Butil paraben
|
94-26-8
|
Legant
|
1×10-11 – 1×10-3
|
Aċidu karbossiliku, Fenol
|
Preservattiv
|
|
12
|
Atrażina
|
1912-24-9
|
Mhux legant
|
1×10-11 – 1×10-6
|
Kompost eteroċikliku
|
Erbiċida
|
|
13
|
Ftalat tad-di-n-butil (DBP) (96)
|
84-74-2
|
Mhux legant (97)
|
1×10-10 – 1×10-4
|
Idrokarbur (ċikliku), Ester
|
Plastifikant, Sustanza intermedja
|
|
14
|
Kortikosteron
|
50-22-6
|
Mhux legant
|
1×10-11 – 1×10-4
|
Sterojde
|
Prodott naturali
|
|
L-ittestjar tas-Solubbiltà u s-Sejbien tal-Medda ta’ Konċentrazzjonijiet għas-Sustanzi Kimiċi tat-Test
|
19.
|
Għandu jsir test preliminari biex jiġi determinat il-limitu tas-solubbiltà għal kull sustanza kimika tat-test u biex tiġi identifikata l-medda ta’ konċentrazzjoni xierqa li għandha tintuża meta jsir it-test. Il-limitu tas-solubbiltà ta’ kull sustanza kimika tat-test għandu jiġi determinat inizjalment fis-solvent u jiġi kkonfermat b’mod ulterjuri fil-kundizzjonijiet tal-assaġġ. Il-konċentrazzjoni finali ttestjata fl-assaġġ ma għandhiex taqbeż il-1 mM. L-ittestjar għas-sejbien tal-medda jikkonsisti f’kontroll b’solvent flimkien ma’ tmien dilwizzjonijiet serjali tal-log, li jibdew bil-konċentrazzjoni massima aċċettabbli (eż. 1 mM jew anqas, fuq il-bażi tal-limitu tas-solubbiltà), u l-preżenza ta’ dardir jew ta’ preċipitat innotat. Il-konċentrazzjonijiet fit-tieni u fit-tielet esperimenti għandhom jiġu aġġustati kif xieraq biex tiġi karatterizzata aħjar il-kurva konċentrazzjoni rispons.
|
Kriterji ta’ Aċċettabbiltà tas-Sessjoni tat-Test
|
20.
|
Aċċettazzjoni jew rifjut ta’ sessjoni tat-test huma bbażati fuq l-evalwazzjoni tar-riżultati miksuba għall-estroġenu u għall-kontroll referenzjali użati għal kull esperiment. L-ewwel, għall-pjastra nru 1, il-kurvi sħaħ tal-konċentrazzjoni għall-kontrolli ta’ riferiment minn kull esperiment għandhom jissodisfaw il-miżuri tal-prestazzjoni b’parametri tad-dħul ta’ kurva (eż. IC50 u Hillslope) fuq il-bażi tar-riżultati rapportati għall-protokolli rispettivi għall-assaġġi CERI u FW (Appendiċi 2 u 3), u d-data storika tal-kontroll mil-laboratorju li jwettaq it-test. Il-kontrolli kollha (estroġenu ta’ referenza, legant dgħajjef, u mhux legant) għandhom jiġu klassifikati kif suppost għal kull esperiment. It-tieni, il-kontrolli fuq il-pjastri sussegwenti kollha jridu jiġu vvalutati għall-konsistenza mal-pjastra nru 1. Medda suffiċjenti ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandha tintuża biex tiġi definita biċ-ċar il-quċċata tal-kurva tal-irbit kompetittiv. Il-varjabbiltà bejn ir-repliki f’kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test kif ukoll bejn it-tliet sessjonijiet indipendenti għandha tkun raġonevoli u xjentifikament difendibbli. Il-ħila ta’ twettiq tal-assaġġ b’konsistenza għandha tintwera bl-iżvilupp u biż-żamma ta’ bażi ta’ data storika għall-estroġenu u għall-kontrolli referenzjali. Id-devjazzjonijiet standard (SD) jew il-koeffiċjenti ta’ varjazzjoni (CV) għall-parametri ta’ dħul tal-kurvi tal-estroġenu u tal-legant dgħajjef tal-kontroll referenzjali minn diversi esperimenti jistgħu jintużaw bħala kejl tar-riproduċibbiltà fi ħdan il-laboratorju. Għandu jiġi applikat ġudizzju professjonali meta jiġu rieżaminati r-riżultati tal-kontroll tal-pjastra minn kull sessjoni kif ukoll għal kull sustanza kimika tat-test.
Barra minn hekk, għandhom jiġu rispettati l-prinċipji li ġejjin rigward il-kriterji ta’ aċċettazzjoni:
|
—
|
Id-data għandha tkun suffiċjenti biex issir valutazzjoni kwantitattiva tal-irbit tal-ER
|
|
—
|
Il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom jibqgħu fi ħdan il-medda ta’ solubbiltà tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
Analiżi tad-data
|
21.
|
Il-proċedura definita ta’ analiżi tad-data għas-saturazzjoni u d-data dwar l-irbit kompetittiv għandhom jaderixxu mal-prinċipji ewlenin għall-karatterizzazzjoni tal-interazzjonijiet riċettur-ligand. Tipikament, id-data dwar l-irbit tas-saturazzjoni tiġi analizzata bl-użu ta’ mudell ta’ rigressjoni mhux lineari li jqis l-irbit totali u mhux speċifiku. Tista’ tkun meħtieġa korrezzjoni għat-tnaqqis tal-ligand (eż. Swillens, 1995 (19)) meta jiġu determinati l-Bmax u l-Kd. Id-data minn assaġġi tal-irbit kompetittiv tipikament tiġi trasformata (eż. irbit speċifiku perċentwali u konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test) (log M)). Stimi tal-log (IC50) għal kull sustanza kimika tat-test għandhom jiġu determinati bl-użu ta’ softwer xieraq ta’ dħul ta’ kurva nonlineari għad-dħul f’ekwazzjoni ta’ Hill b’erba’ parametri. Wara analiżi inizjali, għandhom isiru rieżami tal-parametri ta’ dħul ta’ kurva u rieżami viżwali ta’ kemm id-data dwar l-irbit tidħol fil-kurva ta’ rbit kompetittiv ġenerata. F’ċerti każijiet, tista’ tkun meħtieġa analiżi addizzjonali biex jinkiseb l-aħjar dħul ta’ kurva (eż. ristrezzjoni tal-quċċata u/jew tal-qiegħ tal-kurva, l-użu tar-regola tal-10 %, ara l-Appendiċi 4 u r-Referenza 2 (Taqsima III.A.2).
|
|
22.
|
L-ilħuq tal-kriterji ta’ aċċettabbiltà (paragrafu 20) jindika li s-sistema tal-assaġġ qed topera kif suppost, iżda ma jiżgurax li kwalunkwe test partikolari jipproduċi data preċiża. Ir-replikar tar-riżultati korretti tal-ewwel test hu l-aħjar indikazzjoni li tkun ġiet prodotta data preċiża.
|
Kriterji ta’ Interpretazzjoni tad-Data Ġenerali
|
23.
|
Bħalissa ma hemm ebda metodu miftiehem f’livell universali għall-interpretazzjoni tad-data dwar l-irbit tal-ER. Madankollu, kemm il-valutazzjonijiet kwalitattivi (eż. legant/mhux legant) u/jew kwantitattivi (eż. log IC50, Affinità Relattiva għall-Irbit (RBA), eċċ.) tal-attività medjata bl-hrER għandhom ikunu bbażati fuq data empirika u ġudizzju xjentifiku solidu.
|
Rapport tat-Test
|
24.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
Assaġġ:
Il-kontroll/Ir-riferiment/Is-sustanza kimika tat-test
|
—
|
is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli
|
|
—
|
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;
|
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;
|
|
—
|
il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.
|
Sustanza monokostitwenti:
|
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
|
—
|
l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru tas-CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
|
Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
|
—
|
ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
|
Solvent/Veikolu:
|
—
|
il-karatterizzazzjoni (natura, fornitur u lott);
|
|
—
|
il-ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu;
|
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;
|
Riċetturi:
|
—
|
is-sors tar-riċetturi (fornitur, Nru tal-katalogu, lott, speċi tar-riċettur, konċentrazzjoni attiva tar-riċettur ipprovduta mill-fornitur, ċertifikazzjoni mingħand il-fornitur)
|
|
—
|
karatterizzazzjoni tar-riċetturi (inklużi r-riżultati tal-irbit tas-saturazzjoni): Kd, Bmax,
|
|
—
|
fornitur, Nru tal-katalogu., lott, attività speċifika
|
Il-kundizzjonijiet tat-test:
|
—
|
limitazzjonijiet tas-solubbiltà skont il-kundizzjonijiet tal-assaġġ;
|
|
—
|
il-kompożizzjoni tal-bafer tal-irbit;
|
|
—
|
il-konċentrazzjoni tar-riċettur;
|
|
—
|
il-konċentrazzjoni tat-traċċatur (jiġifieri ligand radjotikkettat);
|
|
—
|
il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
|
|
—
|
il-veikolu perċentwali fl-assaġġ finali;
|
|
—
|
it-temperatura u l-ħin tal-inkubazzjoni;
|
|
—
|
il-metodu tal-irbit/tas-separazzjoni libera;
|
|
—
|
il-kontrolli pożittivi u negattivi/l-istandards referenzjarji;
|
|
—
|
il-kriterji biex it-testijiet jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;
|
Kontroll tal-aċċettabbiltà:
|
—
|
il-valuri attwali tal-IC50 u tal-Hillslope għall-kontrolli pożittivi konkorrenti/għas-sustanzi referenzjali;
|
Ir-riżultati:
|
—
|
data mhux proċessata u marbuta/libera;
|
|
—
|
kontroll tal-konferma tad-denaturazzjoni, jekk xieraq;
|
|
—
|
jekk teżisti, l-anqas konċentrazzjoni effettiva (LEC);
|
|
—
|
il-valuri tal-RBA u/jew tal-IC50 kif xieraq;
|
|
—
|
ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,
|
|
—
|
analiżijiet statistiċi, jekk jeżistu, flimkien ma’ kejl tal-errur u tal-kunfidenza (eż. SEM, SD, CV jew CI ta’ 95 %) u deskrizzjoni ta’ kif inkisbu dawn il-valuri;
|
Diskussjoni tar-riżultati:
|
—
|
applikazzjoni tar-regola tal-10 %
|
Konklużjoni
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(2)
|
OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 226), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(3)
|
OECD (2015). Performance Standards for Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 222), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(4)
|
OECD (2012). Guidance Document on Standardized Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(5)
|
Cavailles V. (2002). Estrogens and Receptors: an Evolving Concept, Climacteric, 5 Suppl 2: p.20-6.
|
|
(6)
|
Welboren W.J., et al. (2009). Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and How are they Regulated? Endocr. Relat. Cancer., 16(4): p. 1073-89.
|
|
(7)
|
Younes M. u Honma N. (2011). Estrogen Receptor Beta, Arch. Pathol. Lab. Med., 135(1): p. 63-6.
|
|
(8)
|
Diamanti-Kandarakis et al. (2009). Endocrine-Disrupting Chemicals: an Endocrine Society Sci. Statement, Endo Rev 30(4):293-342.
|
|
(9)
|
ICCVAM (2002). Background Review Document. Current Status of Test Methods for Detecting Endocrine Disruptors: In Vitro Estrogen Receptor Binding Assays. (NIH Publication No 03-4504). National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC.
|
|
(10)
|
ICCVAM (2003). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.
|
|
(11)
|
ICCVAM (2006). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.
|
|
(12)
|
Akahori Y. et al. (2008). Relationship Between the Results of In Vitro Receptor Binding Assay to Human Estrogen Receptor Alpha and In Vivo Uterotrophic Assay: Comparative Study with 65 Selected Chemicals, Toxicol. In Vitro, 22(1): 225-231.
|
|
(13)
|
OECD (2007). Additional Data Supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in Rodents, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 67), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(14)
|
Takeyoshi, M. (2006). Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity - The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line, Chemicals Evaluation and Research Institute (CERI): Ġappun. p. 1-188.
|
|
(15)
|
Yamasaki, K; Noda, S; Imatanaka, N; Yakabe, Y. (2004). Comparative Study of the Uterotrophic Potency of 14 Chemicals in a Uterotrophic Assay and their Receptor-Binding Affinity, Toxicol. Ittri, 146: 111-120.
|
|
(16)
|
Kummer V; Maskova, J; Zraly, Z; Neca, J; Simeckova, P; Vondracek, J; Machala, M. (2008). Estrogenic Activity of Environmental Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Uterus of Immature Wistar Rats. Toxicol. Ittri, 180: 213-221.
|
|
(17)
|
Gozgit, JM; Nestor, KM; Fasco, MJ; Pentecost, BT; Arcaro, KF. (2004). Differential Action of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons on Endogenous Estrogen-Responsive Genes and on a Transfected Estrogen-Responsive Reporter in MCF-7 Cells. Toxicol. and Applied Pharmacol., 196: 58-67.
|
|
(18)
|
Santodonato, J. (1997). Review of the Estrogenic and Antiestrogenic Activity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Relationship to Carcinogenicity. Chemosphere, 34: 835-848.
|
|
(19)
|
Swillens S (1995). Interpretation of Binding Curves Obtained with High Receptor Concentrations: Practical Aid for Computer Analysis, Mol Pharmacol 47(6):1197-1203.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET U ABBREVJAZZJONIJIET
Ir-Regola tal-10 %
: L-għażla li mill-analiżijiet jiġu esklużi l-punti tad-data fejn il-medja tar-repliki għal-limitu speċifiku tal-[3H]17β-estradjol tkun 10 % jew aktar minn dik osservata għall-valur medju f’konċentrazzjoni inferjuri (ara l-Appendiċi 4).
Kriterji ta’ aċċettabbiltà
: L-istandards minimi għat-twettiq tal-kontrolli sperimentali u l-istandards referenzjarji. Il-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha għandhom jiġu ssodisfati biex esperiment jitqies validu.
Akkuratezza (konkordanza)
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tal-assaġġ u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tal-assaġġ u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ assaġġ (1).
CF
: Il-Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u għall-Evalwazzjoni tal-Interferenti Endorkinali.
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita.
CV
: Koeffiċjent ta’ varjazzjoni
E2
: 17β-estradjol
ED
: Interferenza endokrinali
hERα:
: Riċettur alfa tal-estroġenu uman
ER
: Riċettur tal-Estroġenu
Attività estroġenika
: Il-kapaċità ta’ sustanza kimika li timita 17β-estradjol fil-ħila tiegħu li jorbot riċetturi tal-estroġenu. L-irbit mal-hERα jista’ jiġi individwat b’dan il-metodu ta’ ttestjar.
IC
50
: Il-konċentrazzjoni effettiva medjana ta’ sustanza kimika tat-test inibitorja.
ICCVAM
: The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods.
Riproduċibbiltà interlaboratorja
: Kejl ta’ kemm laboraotrji kwalifikati differenti, li jużaw l-istess protokoll u li jittestjaw l-istess sustanzi, jistgħu jipproduċu riżultati kwalitattivament u kwantitattivament simili. Ir-riproduċibbiltà interlaboratorja hi determinata matul il-proċessi ta’ qabel il-validazzjoni u tal-validazzjoni, u tindika kemm assaġġ jista’ jiġi trasferit b’suċċess bejn laboratorji, u din tissejjaħ ukoll riproduċibbiltà bejn laboratorji (1).
Riproduċibbiltà intralaboratorja
: Determinazzjoni ta’ kemm persuni kwalifikati fi ħdan l-istess laboratorju jistgħu jirreplikaw b’suċċess ir-riżultati billi jużaw protokoll speċifiku f’ħinijiet differenti. Din tissejjaħ ukoll “riproduċibbiltà fi ħdan il-laboratorju” (1).
LEC
: L-anqas konċentrazzjoni effettiva hi l-anqas konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tipproduċi rispons (jiġifieri l-anqas konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li fiha l-induzzjoni tad-drabi tkun statistikament differenti mill-kontroll b’veikolu konkorrenti).
Test me-too
: Espressjoni kollokwjali għal assaġġ li jkun strutturalment u funzjonalment simili għal metodu ta’ ttestjar ta’ riferiment validat u aċċettat. Jintuża b’mod alternanti ma’ metodu ta’ ttestjar simili
PBTG
: Linja Gwida tat-Test Ibbażata fuq il-Prestazzjoni
Standards tal-prestazzjoni
: Standards, ibbażati fuq metodu ta’ ttestjar validat, li jipprovdu bażi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ assaġġ propost li hu simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Inklużi hemm (1) il-komponenti essenzjali tal-assaġġ; (2) lista minima ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment magħżula minn fost is-sustanzi kimiċi użati biex tintwera l-prestazzjoni aċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (3) il-livelli komparabbli ta’ akkuratezza u ta’ affidabbiltà, fuq il-bażi ta’ dak li nkiseb għall-assaġġ validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost għandu juri meta evalwat bl-użu tal-lista minima ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment (1).
Sustanzi ta’ profiċjenza
: Subsett tas-Sustanzi ta’ riferiment inklużi fl-Istandards tal-Prestazzjoni li jistgħu jintużaw mil-laboratorji biex tintwera kompetenza teknika b’assaġġ standardizzat. Il-kriterji tal-għażla għal dawn is-sustanzi tipikament jinkludu li dawk jirrappreżentaw il-medda ta’ risponsi, ikunu kummerċjalment disponibbli, u jkollhom data ta’ riferiment ta’ kwalità għolja disponibbli.
Profiċjenza
: Il-ħila murija biex jitwettaq assaġġ kif suppost qabel l-ittestjar ta’ sustanza mhux magħrufa.
Estroġenu ta’ riferiment
: 17ß-estradjol (E2, CAS 50-28-2).
Metodi ta’ ttestjar ta’ riferiment
: L-assaġġi li fuqhom hi bbażata PBTG 493.
RBA
: Affinità Relattiva għall-Irbit. L-RBA ta’ sustanza tiġi kkalkolata bħala perċentwal tal-log (IC50) għas-sustanza relattiva għal-log (IC50) għal 17β-estradjol
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni ta’ assaġġ mal-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm l-assaġġ għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-preċiżjoni (konkordanza) ta’ metodu ta’ ttestjar) (1).
Affidabbiltà
: Kejl ta’ kemm assaġġ jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduttività ta’ fost u bejn il-laboratorji.
SD
: Devjazzjoni standard.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
Metodu ta’ ttestjar validat
: Assaġġ li għalih ikunu tlestew studji ta’ validazzjoni biex tiġi determinata r-rilevanza (inkluża l-akkuratezza) u l-affidabbiltà għal għan speċifiku. Ta’ min jinnota li jista’ jkun li metodu ta’ ttestjar validat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f’termini ta’ akkuratezza u ta’ affidabbiltà biex jitqies aċċettabli għall-għan propost (1).
Validazzjoni
: Il-proċess li bih l-affidabbiltà u r-rilevanza ta’ approċċ, ta’ metodu, ta’ assaġġ, ta’ proċess jew ta’ valutazzjoni partikolari jkunu stabbiliti għal għan definit (1).
Appendiċi 2
L-ASSAĠĠI IN VITRO TAL-IRBIT TAS-SATURAZZJONI U KOMPETITTIV TAR-RIĊETTUR TAL-ESTROĠENU (ERΑ) TA’ FREYBERGER-WILSON BL-UŻU TAL-ERΑ RIKOMBINANTI B’TUL SĦIĦ
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
1.
|
Dan l-assaġġ in vitro tal-irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv tar-Riċettur tal-Estroġenu (ERα) juża r-riċettur uman b’tul sħiħ ERα(hrERα) li hu prodott f’ċelloli ta’ insetti infettati bil-bakulovajrus u iżolat minnhom. Il-protokoll, żviluppat minn Freyberger u Wilson, għadda minn studju ta’ validazzjoni multilaboratorju internazzjonali (2) li wera r-rilevanza u l-affidabbiltà tiegħu għall-iskop maħsub tal-assaġġ.
|
|
2.
|
Dan l-assaġġ hu proċedura ta’ skrinjar għall-identifikazzjoni ta’ sustanzi li jistgħu jorbtu mal-hrERα b’tul sħiħ. Jintuża biex jiddetermina l-ħila ta’ sustanza kimika tat-test li tikkompeti ma’ 17β-estradjol għall-irbit mal-hrERα. Ir-riżultati kwantitattivi tal-assaġġ jistgħu jinkludu l-IC50 (kejl tal-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test meħtieġa biex jiġi spostat nofs l-[3H]-17β-estradjol mill-hrERα) u l-affinitajiet għall-irbit relattiv tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-hrERα meta mqabbel ma’ 17β-estradjol. Għall-finijiet ta’ skrinjar tas-sustanzi kimiċi, ir-riżultati kwalitattivi aċċettabbli tal-assaġġ jistgħu jinkludu klassifikazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test bħala leganti tal-hrERα, mhux leganti, jew ekwivoċi fuq il-bażi tal-kriterji deskritti għall-kurvi tal-irbit.
|
|
3.
|
L-assaġġ juża ligand radjuattiv li jeħtieġ liċenzja tal-materjali radjuattivi għal-laboratorju. Il-proċeduri kollha b’radjoisotopi u b’sustanzi kimiċi perikolużi għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri deskritti mil-leġiżlazzjoni nazzjonali.
|
|
4.
|
Għandhom jinqraw INTRODUZZJONI ĠENERALI u KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrER qabel ma dan l-assaġġ jintuża għal finijiet regolatorji. Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’din it-TG huma deskritti fl-Appendiċi 1.
|
PRINĊIPJI TAL-ASSAĠĠ (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
5.
|
L-assaġġ tal-irbit tal-hrERα jkejjel il-ħila ta’ ligand radjotikkettat ([3H]17β-estradjol) li jorbot mal-ER fil-preżenza ta’ konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test (jiġifieri kompetitur). Sustanzi kimiċi tat-test li fihom affinità għolja għall-ER jikkompetu mal-ligand radjotikkettat f’konċentrazzjoni inferjuri meta mqabbla ma’ dawk is-sustanzi kimiċi b’affinità inferjuri għar-riċettur.
|
|
6.
|
Dan l-assaġġ jikkonsisti f’żewġ komponenti ewlenin: esperiment ta’ rbit tas-saturazzjoni biex jiġu karatterizzati l-parametri ta’ interazzjoni riċettur-ligand, segwit minn esperiment tal-irbit kompetittiv li jikkaratterizza l-kompetizzjoni bejn sustanza kimika tat-test u ligand radjotikkettat għall-irbit mal-ER.
|
|
7.
|
L-iskop tal-esperiment tal-irbit tas-saturazzjoni hu li jikkaratterizza lott partikolari ta’ riċetturi għall-affinità u n-numru tal-irbit bi tħejjija għall-esperiment tal-irbit kompetittiv. L-esperiment tal-irbit tas-saturazzjoni jkejjel, taħt kundizzjonijiet ta’ ekwilibriju, l-affinità ta’ konċentrazzjoni fissa tar-riċettur tal-estroġenu għal-ligand naturali tiegħu (rappreżentat mill-kostanti ta’ dissoċjazzjoni, Kd), u l-konċentrazzjoni tas-siti attivi tar-riċettur (Bmax).
|
|
8.
|
L-esperiment tal-irbit kompetittiv ikejjel l-affinità ta’ sustanza biex tikkompeti ma’ [3H]17β-estradjol għall-irbit mal-ER. L-affinità hi kwantifikata mill-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li, f’ekwilibriju, tinibixxi 50 % tal-irbit speċifiku tal-[3H]17β-estradjol (imsejħa l-konċentrazzjoni inibitorja 50 % jew IC50). Din tista tiġi evalwata wkoll bl-użu tal-affinità relattiva għall-irbit (RBA, relattiva għall-IC50 tal-estradjol imkejla b’mod separat fl-istess sessjoni). L-esperiment tal-irbit kompetittiv ikejjel l-irbit ta’ [3H]17β-estradjol f’konċentrazzjoni fissa fil-preżenza ta’ firxa wiesgħa (tmien ordnijiet ta’ kobor) tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test. Imbagħad id-data tiddaħħal, fejn possibbli, biex tifforma l-ekwazzjoni ta’ Hill (Hill, 1910) li tiddeskrivi l-ispostament tar-radjoligand minn legant kompetittiv ta’ sit wieħed. Il-firxa tal-ispostament tal-estradjol radjotikkettat fl-ekwilibriju tintuża biex is-sustanza kimika tat-test tiġi karatterizzata bħala legant, mhux legant, jew waħda li tiġġenera rispons ekwivoku.
|
PROĊEDURA
Wiri ta’ Prestazzjoni Aċċettabbli tal-Proteina tal-hrERα
|
9.
|
Qabel it-twettiq ta’ rutina tal-assaġġi tal-irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv, għandu jintwera li kull lott ġdid tal-hrERα jkollu prestazzjoni korretta fil-laboratorju fejn se jintuża. Għandu jintuża proċess imqassam fuq żewġ stadji biex tintwera l-prestazzjoni. Dawn l-istadji huma dawn li ġejjin:
|
—
|
Agħmel assaġġ tal-irbit ta’ [3H]-17β-estradjol tas-saturazzjoni biex turi l-ispeċifiċità u s-saturazzjoni tal-hrERα. Analiżi ta’ rigressjoni nonlineari ta’ din id-data (eż. BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) u l-plott Scatchard sussegwenti għandha tiddokumenta l-affinità għall-irbit tal-hrERα ta’ [3H]-17β-estradjol (Kd) u n-numru ta’ riċetturi (Bmax) għal kull lott tal-hrERα.
|
|
—
|
Agħmel assaġġ tal-irbit kompetittiv billi tuża s-sustanzi tal-kontroll (estroġenu ta’ riferiment (17β-estradjol)), legant dgħajjef (eż. noretinodrel jew noretindron), u mhux legant (ottiltrietossisilan, OTES). Kull laboratorju għandu jistabbilixxi bażi ta’ data storika biex jiddokumenta l-konsistenza tal-IC50 u ta’ valuri rilevanti oħra għall-estroġenu ta’ riferiment u għal-legant dgħajjef fost l-esperimenti u l-lottijiet differenti tal-hrERα. Il-parametri tal-kurvi tal-irbit kompetittiv għas-sustanzi tal-kontroll għandhom ikunu fi ħdan il-limiti tal-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % (ara t-Tabella 1) li ġew żviluppati bl-użu tad-data mil-laboratorji li ħadu sehem fl-istudju ta’ validazzjoni għal dan l-assaġġ (2).
|
|
Tabella 1
Kriterji tal-prestazzjoni żviluppati għall-estroġenu ta’ riferiment u għal-legant dgħajjef, Assaġġ FW tal-Irbit tal-hrER.
|
Sustanza
|
Parametru
|
Medja (7)
|
Devjazzjoni Standard X (n)
|
Intervall ta’ Kunfidenza ta’ 95 % (8)
|
|
Limitu Inferjuri
|
Limitu Superjuri
|
|
17β-estradjol
|
Quċċata ( %)
|
100,44
|
10,84 (67)
|
97,8
|
103,1
|
|
Qiegħ ( %)
|
0,29
|
1,25 (67)
|
-0,01
|
0,60
|
|
Pendil ta’ Hill
|
-1,06
|
0,20 (67)
|
-1,11
|
-1,02
|
|
LogIC50 (M)
|
-8,92 (9)
|
0,18 (67)
|
-8,97
|
-8,88
|
|
Noretinodrel
|
Quċċata ( %)
|
99,42
|
8,90 (68)
|
97,27
|
101,60
|
|
Qiegħ ( %)
|
2,02
|
3,42 (68)
|
1,19
|
2,84
|
|
Pendil ta’ Hill
|
-1,01
|
0,38 (68)
|
-1,10
|
-0,92
|
|
Log IC50 (M)
|
-6,39
|
0,27 (68)
|
-6,46
|
-6,33
|
|
Noretindronc
(9)
|
Quċċata ( %)
|
96,14
|
8,44 (27)
|
92,80
|
99,48
|
|
Qiegħ ( %)
|
2,38
|
5,02 (27)
|
0,40
|
4,37
|
|
Pendil ta’ Hill
|
-1,41
|
0,32 (27)
|
-1,53
|
-1,28
|
|
LogIC50(M)
|
-5,73
|
0,27 (27)
|
-5,84
|
-5,62
|
Wiri tal-profiċjenza tal-laboratorju
|
10.
|
Ara l-paragrafi 17 u 18 u t-Tabella 2 fKOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrERta’ dan il-metodu ta’ ttestjar. Kull assaġġ (irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv) għandu jikkonsisti fi tliet sessjonijiet indipendenti (jiġifieri b’dilwizzjonijiet friski ta’ riċettur, ta’ sustanzi kimiċi, u ta’ reaġenti) f’jiem differenti, u kull sessjoni għandu jkun fiha tliet repliki.
|
Determinazzjoni tal-Konċentrazzjoni tar-Riċettur (hrERα)
|
11.
|
Il-konċentrazzjoni tar-riċettur attiv tvarja ftit skont il-lott u l-kundizzjonijiet tal-ħżin. Għalhekk, għandha tiġi determinata l-konċentrazzjoni tar-riċettur attiv kif riċevuta mingħand il-fornitur. Din trendi l-konċentrazzjoni xierqa tar-riċettur attiv fil-ħin tas-sessjoni.
|
|
12.
|
Skont il-kundizzjonijiet li jikkorrispondu għall-irbit kompetittiv (jiġifieri 1 nM [3H]-estradjol), konċentrazzjonijiet nominali ta’ riċettur ta’ 0,25, ta’ 0,5, ta’ 0,75, u ta’ 1 nM għandhom jiġu inkubati fl-assenza (irbit totali) u fil-preżenza (irbit mhux speċifiku ta’ 1 μM estradjol mhux tikkettat. L-irbit speċifiku, ikkalkolat bħala d-differenza tal-irbit totali u mhux speċifiku, jiġi plottjat kontra l-konċentrazzjoni nominali tar-riċettur. Il-konċentrazzjoni tar-riċettur li tagħti valuri tal-irbit speċifiċi li jikkorrispondu għal 20 % tar-radjotikketta miżjuda hi relatata mal-konċentrazzjoni nominali korrispondenti tar-riċettur, u din il-konċentrazzjoni tar-riċettur għandha tintuża għall-esperimenti tal-irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv. Spiss, konċentrazzjoni finali tal-hrER ta’ 0,5 nM se tkun konformi ma’ din il-kundizzjoni.
|
|
13.
|
Jekk il-kriterju ta’ 20 % ma jkunx jista’ jiġi ssodisfat ripetutament, il-kompożizzjoni tal-esperiment għandha tiġi verifikata għal żbalji potenzjali. Nuqqas ta’ lħuq tal-kriterju ta’ 20 % jista’ jindika li ftit li xejn ikun hemm riċettur attiv fil-lott rikombinanti, u mbagħad ikollu jiġi kkunsidrat l-użu ta’ lott ieħor tar-riċettur.
|
Assaġġ tas-saturazzjoni
|
14.
|
Tmien konċentrazzjonijiet li jiżdiedu dejjem aktar ta’ [3H]17β-estradjol għandhom jiġu evalwati fi triplikat, skont it-tliet kundizzjonijiet li ġejjin (ara t-Tabella 2):
|
—
|
Fin-nuqqas ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat u l-preżenza ta’ ER. Din hi d-determinazzjoni tal-irbit totali skont il-kejl tar-radjuattività fil-bwejriet li jkollhom [3H]17β-estradjol biss.
|
|
—
|
Fil-preżenza ta’ konċentrazzjoni eċċessiva għal 1 000 darba ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat fuq 17β-estradjol tikkettat u fil-preżenza tal-ER. L-intenzjoni ta’ din il-kundizzjoni hi li tissatura s-siti attivi tal-irbit b’17β-estradjol mhux tikkettat, u bil-kejl tar-radjuattività fil-bwejriet, tiddetermina l-irbit mhux speċifiku. Kwalunkwe estradjol jaħraq li jifdal li jista’ jorbot mar-riċettur jitqies li jkun jorbot ma’ sit mhux speċifiku peress li l-estradjol kiesaħ għandu jkun f’konċentrazzjoni għolja tant li jintrabat mas-siti speċifiċi disponibbli kollha fuq ir-riċettur.
|
|
—
|
Fin-nuqqas ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat u l-assenza tal-ER (determinazzjoni tar-radjuattività totali)
|
|
Preparazzjoni ta’ [3H]-17β-estradjol u ta’ soluzzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettati
|
15.
|
Id-dilwizzjonijiet ta’ [3H]-17β-estradjol għandhom jitħejjew billi jiżdied bafer tal-assaġġ sa soluzzjoni ewlenija ta’ 12-il nM ta’ [3H]-17β-estradjol biex jinkisbu konċentrazzjonijiet li inizjalment ivarjaw minn 0,12nM sa 12 nM. Billi jiżdiedu 40 μl ta’ dawn is-soluzzjonijiet għall-bwejriet tal-assaġġ rispettivi ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra (f’volum finali ta’ 160 μl), jinkisbu l-konċentrazzjonijiet tal-assaġġ finali, li jvarjaw bejn 0,03 u 3,0 nM. Preparazzjoni tal-bafer tal-assaġġ, tas-soluzzjoni ewlenija ta’ [3H]-17β-estradjol u tad-dilwizzjonijiet u d-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet huma deskritti fid-dettall fil-protokoll FW (2).
|
|
16.
|
Id-dilwizzjonijiet ta’ soluzzjonijiet etanoloġiċi ta’ 17β-estradjol għandhom jitħejjew billi jiżdied bafer tal-assaġġ biex jinkisbu tmien konċentrazzjonijiet waħda akbar mill-oħra li inizjalment ivarjaw bejn 0,06 μM u 6 μM. Billi jiżdiedu 80 μl ta’ dawn is-soluzzjonijiet fil-bwejriet tal-assaġġ rispettivi ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra (f’volum finali ta’ 160 μl), jinkisbu l-konċentrazzjonijiet tal-assaġġ finali, li jvarjaw bejn 0,03μM u 3μM. Il-konċentrazzjoni finali ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat fil-bwejriet individwali tal-assaġġ tal-irbit mhux speċifiku għandha tkun 1 000 darba l-konċentrazzjoni ta’ [3H]-17β- estradjol tikkettat. Il-preparazzjoni tad-dilwizzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat hi deskritta fid-dettall fil-protokoll FW (2).
|
|
17.
|
Għandha tintuża l-konċentrazzjoni nominali tar-riċettur li tagħti l-irbit speċifiku ta’ 20±5 % (ara l-paragrafi 12-13). Is-soluzzjoni tal-hrERα għandha titħejja eżatt qabel l-użu.
|
|
18.
|
Il-pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra jitħejjew kif muri fit-Tabella 2, bi tliet repliki għal kull konċentrazzjoni. Eżempju ta’ konċentrazzjoni tal-pjastri u ta’ assenjament tal-volum ta’ [3H]-17β-estradjol, ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat, tal-bafer u tar-riċettur hu pprovdut fl-Appendiċi 2.2.
|
Tabella 2
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit tas-Saturazzjoni
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
A
|
0,03 nM [3H] E2 + ER
|
0,06 nM [3H] E2 + ER
|
0,08 nM [3H] E2 + ER
|
0,10 nM [3H] E2 + ER
|
Irbit Totali (Solvent)
|
|
B
|
0,30 nM [3H] E2 + ER
|
0,60 nM [3H] E2 + ER
|
1,0 nM [3H] E2 + ER
|
3,0 nM [3H] E2 + ER
|
|
C
|
|
|
|
|
|
|
D
|
0,03 nM [3H] E2 + ER + 0,03 μM E2
|
0,06 nM [3H] E2 + ER + 0,06 μM E2
|
0,08 nM [3H] E2 + ER + 0,08 μM E2
|
0,10 nM [3H] E
2
+ ER
+ 0,10 μM E
2
|
Irbit Mhux Speċifiku
|
|
E
|
0,30 nM [3H] E2 + ER + 0,30 μM E2
|
0,60 nM [3H] E2 + ER + 0,60 μM E2
|
1,0 nM [
3
H] E2 + ER
+ 1,0 μM E
2
|
3,0 nM [3H] E2 + ER + 3,0 μM E2
|
|
|
F
|
|
|
|
|
|
|
G
|
|
|
|
|
|
|
H
|
|
|
|
|
|
|
[3H] E2:: [3H]-17β-estradjol
ER:: riċettur tal-estroġenu
E2:: 17β-estradjol mhux tikkettat
|
|
19.
|
Il-pjastri għall-mikrotitraġġ tal-assaġġ għandhom jiġu inkubati f’2° sa 8°C għal 16 sa 20 siegħa u jitqiegħdu fuq rotatur matul il-perjodu ta’ inkubazzjoni.
|
Kejl ta’ [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα
|
20.
|
[3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα għandu jiġi separat minn [3H]-17β-Estradjol ħieles billi tiżdied sospensjoni ta’ 80 μl DCC kiesaħ f’kull pjastra, filwaqt li l-pjastri għall-mikrotitraġġ jitħawdu għal 10 minuti u jiġu ċentrifugati għal 10 minuti f’madwar 2 500 RPM. Biex tiġi minimizzata d-dissoċjazzjoni tal-[3H]-17β-estradjol marbut mill-hrERα matul dan il-proċess, hu estremament importanti li l-bafers u l-bwejriet tal-assaġġ jinżammu f’bejn 2 u 8°C u li kull stadju jitwettaq malajr. Xejker għall-pjastri għall-mikrotitraġġ hu neċessarju biex il-pjastri jiġu proċessati b’mod effiċjenti u veloċi.
|
|
21.
|
Imbagħad 50 μl supernatant li fih [3H]-17β-estradjol marbut mal-hrERα għandu jittieħed b’attenzjoni estrema, biex tiġi evitata kwalunkwe kontaminazzjoni tal-bwejriet bil-mess tad-DCC, u għandu jitqiegħed fuq it-tieni pjastra għall-mikrotitraġġ.
|
|
22.
|
Imbagħad 200 μl fluwidu ta’ xintillazzjoni, li kapaċi jikkonverti l-enerġija kinetika tal-emissjonijiet nukleari f’enerġija tad-dawl, għandu jiżdied f’kull bwejra (A1-B12 u D1 sa E12). Il-bwejriet G1-H12 (identifikati bħala dpms totali) jirrappreżentaw dilwizzjonijiet serjali ta’ [3H]-17β-estradjol (40 μl) li għandhom jitwasslu direttament fil-fluwidu ta’ xintillazzjoni fil-bwejriet tal-pjastra tal-kejl kif indikat fit-Tabella 3, jiġifieri dawn il-bwejriet fihom biss 200 μl fluwidu ta’ xintillazzjoni u d-dilwizzjoni xierqa ta’ [3H]-17β-estradjol. Dawn il-miżuri juru kemm [3H]-17β-estradjol f’dpms żdied ma’ kull sett ta’ bwejriet għall-irbit totali u għall-irbit mhux speċifiku.
|
Tabella 3
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit tas-Saturazzjoni, Kejl tar-Radjuattività
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
A
|
0,03 nM [3H] E2 + ER
|
0,06 nM [3H] E2 + ER
|
0,08 nM [3H] E2 + ER
|
0,10 nM [3 H] E2 + ER
|
Irbit Totali (Solvent)
|
|
B
|
0,30 nM [3H] E2 + ER
|
0,60 nM [3H] E2 + ER
|
1,0 nM [3H] E2 + ER
|
3,0 nM [3H] E2 + ER
|
|
C
|
|
|
|
|
|
|
D
|
0,03 nM [3H] E2 + ER + 0,03 μM E2
|
0,06 nM [3H] E2 + ER + 0,06 μM E2
|
0,08 nM [3H] E2 + ER + 0,08 μM E2
|
0,10 nM [3H] E
2
+ ER
+ 0,10 μM E
2
|
Irbit Mhux Speċifiku
|
|
E
|
0,30 nM [3H] E2 + ER + 0,30 μM E2
|
0,60 nM [3H] E2 + ER + 0,60 μM E2
|
1,0 nM [
3
H] E2 + ER
+ 1,0 μM E
2
|
3,0 nM [3H] E2 + ER + 3,0 μM E2
|
|
F
|
|
|
|
|
|
|
G
|
0,03 nM [3H] E
2 (dpms totali)
|
0,06 nM [3H] E
2
|
0,08 nM [3H] E
2
|
0,10 nM [3H] E
2
|
Dpms totali (*7)
|
|
H
|
0,30 nM [3H] E2
|
0,60 nM [3H] E2
|
1,0 nM [3H] E2
|
3,0 nM [3H] E2
|
|
[3H] E2:: [3H]-17β-estradjol
ER:: riċettur tal-estroġenu
E2:: 17β-estradjol mhux tikkettat
dpms:: diżintegrazzjonijiet fil-minuta
|
|
23.
|
Il-kejl għandu jibda wara tal-anqas sagħtejn u l-ħin tal-għadd għandu jkun ta’ 40 minuta għal kull bwejra. L-apparat li jkejjel ix-xintillazzjoni tal-pjastri għall-mikrotitraġġ għandu jintuża għad-determinazzjoni tad-dpm/bwejra b’korrezzjoni għall-estinzjoni. Inkella, jekk ma jkunx hemm apparat disponibbli għall-kejl tax-xintillazzjoni għal pjastra għall-mikrotitraġġ, il-kampjuni jistgħu jitkejlu f’apparat konvenzjonali għall-kejl. F’dawn il-kundizzjonijiet, jista’ jiġi kkunsidrat tnaqqis fil-ħin tal-għadd.
|
Assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
24.
|
L-assaġġ tal-irbit kompetittiv ikejjel l-irbit ta’ konċentrazzjoni waħda ta’ [3H]-17β- estradjol fil-preżenza ta’ konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test. Għandhom jintużaw tliet repliki konkorrenti f’kull konċentrazzjoni fi ħdan sessjoni waħda. Barra minn hekk, għandhom isiru tliet sessjonijiet mhux konkorrenti għal kull sustanza kimika ttestjata. L-assaġġ għandu jsir fi pjastra waħda jew aktar għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra
|
Kontrolli
|
25.
|
Meta jsir l-assaġġ, is-solvent u l-kontrolli konkorrenti (jiġifieri l-estroġenu referenzjarju, il-legant dgħajjef, u dak mhux legant) għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment. Kurvi sħaħ ta’ konċentrazzjoni għall-estroġenu u għall-kontrolli ta’ riferiment (jiġifieri legant dgħajjef u mhux legant) għandhom jintużaw fi pjastra waħda matul kull sessjoni. Il-pjastri l-oħra kollha għandu jkun fihom (i) konċentrazzjoni għolja (spostament massimu) u medja (bejn wieħed u ieħor l-IC50) kull waħda ta’ E2 u ta’ legant dgħajjef fi triplikat; (ii) kontroll b’solvent u irbit mhux speċifiku, tal-anqas kull wieħed fi triplikat. Il-proċeduri għat-tħejjija tal-bafer tal-assaġġ, tal-kontrolli, ta’ [3H]-17β-estradjol, ta’ hrERα u tas-soluzzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test huma deskritti fir-Referenza 2 (Anness K, ara l-Protokoll tal-Assaġġ FW).
|
Kontroll b’solvent:
|
26.
|
Il-kontroll b’solvent jindika li s-solvent ma jinteraġixxix mas-sistema tat-test u jkejjel ukoll l-irbit totali (TB). L-etanol hu s-solvent preferut. Inkella, jekk l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli fl-etanol, jista’ jintuża DMSO. Il-konċentrazzjoni ta’ etanol jew ta’ DMSO, jekk użat, fil-bwejriet finali hi ta’ 1,5 % u ma tistax taqbeż it-2 %.
|
Kontroll bil-bafer:
|
27.
|
Il-kontroll bil-bafer (BC) la għandu jkun fih solvent u lanqas is-sustanza kimika tat-test, iżda għandu jkun fih il-komponenti l-oħra kollha tal-assaġġ. Ir-riżultati tal-kontroll bil-bafer jitqabblu mal-kontroll b’solvent biex jiġi verifikat li s-solvent użat ma jaffettwax is-sistema tal-assaġġ.
|
Legant b’saħħtu (estroġenu ta’ riferiment)
|
28.
|
17β-estradjol (CAS 50-28-2) hu l-ligand endoġenu u jorbot b’affinità għolja mal-ER, subtip tal-alfa. Kurva standard li tuża 17β-estradjol mhux tikkettat għandha titħejja għal kull assaġġ tal-irbit kompetittiv tal-hrERα, biex tkun tista ssir valutazzjoni tal-varjabbiltà meta jsir l-assaġġ maż-żmien fi ħdan l-istess laboratorju. Tmien soluzzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat għandhom jitħejjew fl-etanol, bil-konċentrazzjonijiet fil-bwejriet tal-assaġġ li jvarjaw minn 100 nM – 10 pM (-7[logM] sa -11[logM]), imqassma kif ġej: (-7[logM], -8[logM], -8,5[logM], -9[logM], - 9,5[logM], -10[logM], -11[logM]). L-ogħla konċentrazzjoni ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat (1 μM) isservi wkoll bħala l-indikatur tal-irbit mhux speċifiku. Din il-konċentrazzjoni hi distinta bit-tikketta NSB fit-Tabella 4 għalkemm hi wkoll parti mill-kurva standard.
|
Legant dgħajjef
|
29.
|
Legant dgħajjef (noretinodrel (CAS68-23-5) jew noretindron (CAS 68-22-4)) għandu jkun inkluż biex tintwera s-sensittività ta’ kull esperiment u tkun tista’ ssir valutazzjoni tal-varjabbiltà meta jsir l-assaġġ maż-żmien. Tmien soluzzjonijiet tal-legant dgħajjef għandhom jitħejjew fl-etanol, bil-konċentrazzjonijiet fil-bwejriet tal-assaġġ li jvarjaw minn 3 nM sa 30 μM (-8,5[logM] sa -4,5[logM]), imqassma kif ġej: -4,5[logM], -5[logM], -5,5[logM], -6[logM], -6,5[logM], -7[logM],-7,5[logM], -8,5[logM].
|
Mhux legant
|
30.
|
Ottiltrietossisilan (OTES, CAS 2943-75-1) għandu jintuża bħala l-kontroll negattiv (mhux legant). Dan jipprovdi garanzija li l-assaġġ kif imwettaq isib meta s-sustanzi kimiċi tat-test ma jorbtux mal-hrERα. Tmien soluzzjonijiet ta’ mhux legant għandhom jitħejjew fl-etanol, bil-konċentrazzjonijiet fil-bwejriet tal-assaġġ li jvarjaw minn 0,1nM sa 1 000 μM (-10[logM] sa -3[logM]), f’inkrementi tal-log. Il-ftalat tad-di-n-butil (DBP) jista’ jintuża bħala mhux legant tal-kontroll alternattiv. Is-solubbiltà massima tiegħu ntweriet li hi -4[logM].
|
Konċentrazzjoni tal-hrERα
|
31.
|
Għandu jintuża l-ammont tar-riċettur li jagħti l-irbit speċifiku ta’ 20±5 % ta’ 1 nM radjoligand (ara l-paragrafi 12-13 tal-Appendiċi 2). Is-soluzzjoni tal-hrERα għandha titħejja eżatt qabel l-użu.
|
[3H]-17β-estradjol
|
32.
|
Il-konċentrazzjoni ta’ [3H]-17β-estradjol fil-bwejriet tal-assaġġ għandha tkun ta’ 1,0 nM.
|
Sustanzi Kimiċi tat-Test
|
33.
|
L-ewwel nett, hemm bżonn li jsir test tas-solubbiltà biex jiġi determinat il-limitu tas-solubbiltà għal kull sustanza kimika tat-test u biex tiġi identifikata l-medda ta’ konċentrazzjoni xierqa li għandha tintuża meta jsir il-protokoll tat-test. Il-limitu tas-solubbiltà ta’ kull sustanza kimika tat-test għandu jiġi determinat inizjalment fis-solvent u jiġi kkonfermat b’mod ulterjuri fil-kundizzjonijiet tal-assaġġ. Il-konċentrazzjoni finali ttestjata fl-assaġġ ma għandhiex taqbeż il-1 mM. L-ittestjar għas-sejbien tal-medda jikkonsisti f’kontroll b’solvent flimkien ma’ tmien dilwizzjonijiet serjali tal-log, li jibdew bil-konċentrazzjoni massima aċċettabbli (eż. 1 mM jew anqas, fuq il-bażi tal-limitu tas-solubbiltà), u l-preżenza ta’ dardir jew ta’ preċipitat innotat (ara wkoll il-paragrafu 35). Is-sustanza kimika tat-test għandha tiġi ttestjata bl-użu tal-kurvi spazjati tal-konċentrazzjoni bi tmien logs kif definiti mit-test preċedenti ta’ sejbien tal-medda. Il-konċentrazzjonijiet fit-tieni u fit-tielet esperimenti għandhom jiġu aġġustati kif xieraq biex tiġi karatterizzata aħjar il-kurva konċentrazzjoni rispons.
|
|
34.
|
Id-dilwizzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandhom jitħejjew fis-solvent xieraq (ara l-paragrafu 26 tal-Appendiċi 2). Jekk l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli fl-etanol jew fid-DMSO, u ż-żieda ta’ aktar solvent tkun tirriżulta f’konċentrazzjoni tas-solvent ogħla mil-limitu aċċettabbli fit-tubu finali, l-ogħla konċentrazzjoni tista’ titnaqqas għall-anqas konċentrazzjoni li jmiss. F’dan il-każ, konċentrazzjoni addizzjonali tista’ tiżdied fil-limitu inferjuri tas-serje ta’ konċentrazzjonijiet. Konċentrazzjonijiet oħra fis-serje għandhom jibqgħu l-istess.
|
|
35.
|
Is-soluzzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandhom jiġu ssorveljati bir-reqqa meta jiżdiedu mal-bwejra tal-assaġġ, peress li s-sustanza kimika tat-test tista’ tfur barra maż-żieda fil-bwejra tal-assaġġ. Id-data għall-bwejriet kollha li fihom il-preċipitat għandha tkun eskluża mid-dħul ta’ kurva, u r-raġuni għall-esklużjoni tad-data għandha tiġi nnotata.
|
|
36.
|
Jekk hemm informazzjoni eżistenti preċedenti minn sorsi oħra li jipprovdu log(IC50) ta’ sustanza kimika tat-test, jista jkun xieraq li d-dilwizzjonijiet jitqassmu ġeometrikament (jiġifieri 0,5 unitajiet ta’ log madwar il-log mistenni log(IC50). Ir-riżultat finali għandu jirrifletti tifrix suffiċjenti tal-konċentrazzjonijiet fuq iż-żewġ naħat tal-log(IC50), inklużi l-quċċata u l-qiegħ, b’tali mod li l-kurva tal-irbit tkun tista tiġi karatterizzata b’mod adegwat.
|
Organizzazzjoni tal-pjastra tal-assaġġ
|
37.
|
Il-pjastri għall-mikrotitraġġ tikkettatti għandhom jitħejjew b’kunsiderazzjoni ta’ inkubazzjonijiet sestupli b’kodiċijiet għall-kontroll b’solvent, bl-ogħla konċentrazzjoni tal-estroġenu referenzjarju li sservi wkoll bħala l-indikatur tal-irbit mhux speċifiku (NSB), u bil-kontroll b’bafer u b’kunsiderazzjoni tal-inkubazzjonijiet triplikati bil-kodiċijiet għal kull waħda mit-tmien konċentrazzjonijiet tal-kontroll li ma jorbotx (ottiltrietossisilan), bis-seba’ konċentrazzjonijiet inferjuri għall-estroġenu referenzjarju, bit-tmien livelli tad-doża tal-konċentrazzjonijiet tal-legant dgħajjef, u bit-tmien konċentrazzjonijiet ta’ kull sustanza kimika tat-test (TC). Tifsila indikattiva tad-dijagramma tal-pjastra għall-kurvi sħaħ tal-konċentrazzjoni għall-estroġenu u għall-kontroll referenzjarji hi mogħtija hawn taħt fit-Tabella 4. Jintużaw pjastri addizzjonali għall-mikrotitraġġ għas-sustanzi kimiċi tat-test u dawn għandhom jinkludu kontrolli tal-pjastra (jiġifieri 1) u konċentrazzjoni għolja (spostament massimu) u medja (madwar l-IC50) kull waħda ta’ E2 u legant dgħajjef fi triplikat; 2) kontroll b’solvent u irbit mhux speċifiku, kull wieħed f’sestuplu (Tabella 5). Eżempju ta’ worksheet tat-tifsila tal-pjastra għall-mikrotitraġġ tal-assaġġ kompetittiv bl-użu ta’ tliet sustanzi kimiċi tat-test mhux magħrufa hu pprovdut fl-Appendiċi 2.3. Il-konċentrazzjonijiet indikati fit-Tabelli 4 u 5 huma l-konċentrazzjonijiet finali tal-assaġġ. Il-konċentrazzjoni masisma għall-E2 għandha tkun ta’ 1×10-7 M u għal-legant dgħajjef għandha tintuża l-ogħla konċentrazzjoni użata għal-legant dgħajjef fil-pjastra 1. Il-konċentrazzjoni tal-IC50 trid tiġi determinata mil-laboratorju fuq il-bażi tal-bażi ta’ data tal-kontroll storiku tiegħu. Hu mistenni li dan il-valur ikun simili għal dak osservat fl-istudji ta’ validazzjoni (ara t-Tabella 1).
|
Tabella 4
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv, Kurvi Sħaħ ta’ Konċentrazzjoni għal Estroġenu u għal Kontrolli Referenzjarji (Pjastra 1)
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TB (Solvent biss)
|
TB (Solvent biss)
|
NSB
|
NSB
|
|
B
|
E2 (1×10-7)
|
E2 (1×10-8)
|
E2 (1×10-8,5)
|
E2 (1×10-9)
|
|
C
|
E2 (1×10-9,5)
|
E2 (1×10-10)
|
E2 (1×10-11)
|
Inbjank (*8)
|
|
D
|
NE (1×10-4,5)
|
NE (1×10-5)
|
NE (1×10-5,5)
|
NE (1×10-6)
|
|
E
|
NE (1×10-6,5)
|
NE (1×10-7)
|
NE (1×10-7,5)
|
NE (1×10-8,5)
|
|
F
|
OTES (1×10-3)
|
OTES (1×10-4)
|
OTES (1×10-5)
|
OTES (1×10-6)
|
|
G
|
OTES (1×10-7)
|
OTES (1×10-8)
|
OTES (1×10-9)
|
OTES (1×10-10)
|
|
H
|
Inbjank (għal dak jaħraq) (*9)
|
Inbjank (għal dak jaħraq) (*9)
|
Kontroll bil-bafer
|
Kontroll bil-bafer
|
|
F’dan l-eżempju, il-legant dgħajjef hu noretinodrel (NE)
|
Tabella 5
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv, Kurvi Sħaħ ta’ Konċentrazzjoni għas-Sustanzi Kimiċi tat-Test u għall-Kontrolli tal-Pjastri.
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TB (Solvent biss)
|
TB (Solvent biss)
|
NSB
|
NSB
|
|
B
|
TC1 (1×10-3)
|
TC1 (1×10-4)
|
TC1 (1×10-5)
|
TC1 (1×10-6)
|
|
C
|
TC1 (1×10-7)
|
TC1 (1×10-8)
|
TC1 (1×10-9)
|
TC1 (1×10-10)
|
|
D
|
TC2 (1×10-3)
|
TC2 (1×10-4)
|
TC2 (1×10-5)
|
TC2 (1×10-6)
|
|
E
|
TC2 (1×10-7)
|
TC2 (1×10-8)
|
TC2 (1×10-9)
|
TC2 (1×10-10)
|
|
F
|
TC3 (1×10-3)
|
TC3 (1×10-4)
|
TC3 (1×10-5)
|
TC3 (1×10-6)
|
|
G
|
TC3 (1×10-7)
|
TC3 (1×10-8)
|
TC3 (1×10-9)
|
TC3 (1×10-10)
|
|
H
|
NE (IC50)
|
NE (1×10-4,5)
|
E2 (IC>50)
|
E2 (1×10-7)
|
|
F’dan l-eżempju, il-legant dgħajjef hu noretinodrel (NE)
|
Tlestija tal-assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
38.
|
Kif muri fit-Tabella 6, għandhom jiżdiedu fil-bwejriet 80 μl tal-kontroll b’solvent, tal-kontroll bil-bafer, tal-estroġenu referenzjarju, tal-legant dgħajjef, tal-mhux legant, u tas-sustanzi kimiċi tat-test imħejjija f’bafer tal-assaġġ. Imbagħad, f’kull bwejra għandha tiżdied soluzzjoni ta’ 4 nM [3H]-17β-estradjol. Wara rotazzjoni bil-galbu għal 10 sa 15-il minuta bejn 2° sa 8°C, għandha tiżdied soluzzjoni ta’ 40 μl hrERα. Il-pjastri għall-mikrotitraġġ tal-assaġġ għandhom jiġu inkubati f’2° sa 8°C għal 16 sa 20 siegħa u jitqiegħdu fuq rotatur matul il-perjodu ta’ inkubazzjoni.
|
Tabella 6
Volum tal-Komponenti tal-Assaġġ għall-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv tal-hrER, Pjastri għall-Mikrotitraġġ
|
Volum (μl)
|
Kostitwent
|
|
80
|
17β-estradjol mhux tikkettat, noretinodrel, OTES, sustanzi kimiċi tat-test, solvent jew bafer
|
|
40
|
soluzzjoni ta’ 4 nM [3H]-17β-estradjol
|
|
40
|
soluzzjoni ta’ hrERα, konċentrazzjoni kif determinata
|
|
160
|
Volum totali f’kull bwejra tal-assaġġ
|
|
39.
|
Imbagħad għandha ssir il-kwantifikazzjoni ta’ [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα, wara separazzjoni ta’ [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα minn [3H]-17β-Estradjol ħieles billi tiżdied sospensjoni ta’ 80 μl DCC kiesaħ f’kull bwejra, kif deskritt fil-paragrafi 20-23 għall-assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni.
|
|
40.
|
Il-bwejriet H1-6 (identifikati bħala inbjank (għal dawk jaħarqu) fit-tabella 4) jirrappreżentaw id-dpms tal-estradjol tikkettat [3H] f’40 μl. L-alikwota ta’ 40 μl għandha titwassal direttament fil-fluwidu ta’ xintillazzjoni fil-bwejriet H1 – H6.
|
Kriterji ta’ aċċettabbiltà
Assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni
|
41.
|
Il-kurva tal-irbit speċifiku għandha tilħaq plateau hekk kif jintużaw konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ [3H]-17β-estradjol, li tindika saturazzjoni tal-hrERα bil-ligand.
|
|
42.
|
Il-ligand speċifiku f’1 nM [3H]-17β-estradjol għandu jkun ġewwa l-medda aċċettabbli ta’ 15 % sa 25 % tar-radjuattività totali mkejla medja miżjuda fis-sessjonijiet. Ħruġ ħafif okkażjonali barra minn din il-medda hu aċċettabbli, iżda jekk is-sessjonijiet ikunu konsistentement barra din il-medda jew medda partikolari tkun ferm barra din il-medda, il-konċentrazzjoni tal-proteina għandha tiġi aġġustata u l-assaġġ tas-saturazzjoni għandu jerġa’ jsir.
|
|
43.
|
Id-data għandha tipproduċi plott Scatchard lineari.
|
|
44.
|
L-irbit mhux speċifiku ma għandux ikun eċċessiv. Il-valur għall-irbit mhux speċifiku tipikament għandu jkun ta’ <35 % tal-irbit totali. Madankollu, il-proporzjon jista’ kultant jaqbeż dan il-limitu meta titkejjel dpm baxxa ħafna għall-anqas konċentrazzjoni ta’ 17β-Estradjol radjotikkettat ittestjat.
|
Assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
45.
|
Konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat għandhom jispostaw [3H]-17β-estradjol mir-riċettur b’mod konsistenti b’irbit kompetittiv f’sit wieħed.
|
|
46.
|
Il-valur tal-IC50 għall-estroġenu ta’ riferiment (jiġifieri 17β-estradjol) għandu jkun bejn wieħed u ieħor daqs il-konċentrazzjoni molari ta’ [3H]-17β-estradjol flimkien ma’ Kd determinat mill-assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni.
|
|
47.
|
L-irbit speċifiku totali għandu jkun konsistentement fi ħdan il-medda aċċettabbli ta’ 20 ± 5 % meta l-konċentrazzjoni mkejla medja tar-radjuattività totali miżjuda f’kull bwejra tkun ta’ 1 nM fis-sessjonijiet. Ħruġ ħafif okkażjonali barra minn din il-medda hu aċċettabbli, iżda jekk is-sessjonijiet ikunu konsistentement barra din il-medda jew medda partikolari tkun ferm barra din il-medda, il-konċentrazzjoni tal-proteina għandha tiġi aġġustata.
|
|
48.
|
Is-solvent ma għandux ibiddel is-sensittività jew ir-riproduċibbiltà tal-assaġġ. Ir-riżultati tal-kontroll bis-solvent (bwejriet tat-TB) jitqabblu mal-kontroll bil-bafer biex jiġi verifikat li s-solvent użat ma jaffettwax is-sistema tal-assaġġ. Ir-riżultati tat-TB u tal-kontroll bil-Bafer għandhom ikunu komparabbli jekk ma jkun hemm ebda effett tas-solvent fuq l-assaġġ.
|
|
49.
|
Il-mhux legant ma għandux jisposta aktar minn 25 % tal-[3H]-17β-estradjol mill-hrERα meta jiġi ttestjat sa 10-3 M (OTES) jew 10-4 M (DBP).
|
|
50.
|
Il-kriterji tal-prestazzjoni ġew żviluppati għall-estroġenu ta’ referenza u għal żewġ leganti dgħajfin (eż. noretinodrel, noretindron) bl-użu tad-data mill-istudju ta’ validazzjoni tal-Assaġġ FW tal-Irbit tal-hrER (Anness N ta’ Riferiment 2). L-intervalli ta’ kunfidenza ta’ 95 % huma pprovduti għal (n) +/- SD medja għas-sessjonijiet tal-kontroll kollha bejn il-laboratorji li jieħdu sehem fl-istudju ta’ validazzjoni. L-intervalli ta’ kunfidenza ta’ 95 % ġew ikkalkolati għall-parametri ta’ dħul ta’ kurva (jiġifieri l-quċċata, il-qiegħ, Hillslope, logIC50) għall-estroġenu referenzjarju u għal-leganti dgħajfin u għal-log10RBA tal-leganti dgħajfin relattivi għall-estroġenu referenzjarju u huma pprovduti bħala kriterji tal-prestazzjoni għall-kontrolli pożittivi. It-Tabella 1 tipprovdi l-meded mistennija għall-parametri ta’ dħul ta’ kurva li jistgħu jintużaw bħala kriterji tal-prestazzjoni. Fil-prattika, il-medda tal-IC50 tista’ tvarja ftit fuq il-bażi tal-Kd tal-preparazzjoni tar-riċettur u tal-konċentrazzjoni tal-ligand.
|
|
51.
|
Ma ġie żviluppat ebda kriterju tal-prestazzjoni għall-parametri ta’ dħul ta’ kurva għas-sustanzi kimiċi tat-test minħabba l-firxa vasta ta’ sustanzi kimiċi tat-test potenzjali eżistenti u l-varjazzjoni fl-affinitajiet u fl-eżiti potenzjali (eż. Kurva sħiħa, kurva parzjali, ebda dħul ta’ kurva). Madankollu, għandu jiġi applikat ġudizzju professjonali meta jiġu rieżaminati r-riżultati minn kull sessjoni għal kull sustanza kimika tat-test. Medda suffiċjenti ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandha tintuża biex tiġi definita biċ-ċar il-quċċata (eż. 90 - 100 % tal-irbit) tal-kurva kompetittiva. Il-varjabbiltà bejn ir-repliki f’kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test kif ukoll bejn it-3 sessjonijiet mhux konkorrenti għandha tkun raġonevoli u xjentifikament difendibbli. Il-kontrolli minn kull sessjoni għal sustanza kimika tat-test għandhom joqorbu lejn il-kejlijiet tal-prestazzjoni rrapportati għal dan l-assaġġ FW u jkunu konsistenti mad-data storika tal-kontrolli minn kull laboratorju rispettiv.
|
ANALIŻI TAD-DATA
Assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni
|
52.
|
Jitkejjel l-irbit totali kif ukoll dak mhux speċifiku. Minn dawn il-valuri, l-irbit speċifiku tal-konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ [3H]-17β-estradjol f’kundizzjonijiet ta’ ekwilibriju jiġi kkalkolat bit-tnaqqis tal-mhux speċifiku mit-total. Graff tal-irbit speċifiku kontra l-konċentrazzjoni ta’ [3H]-17β-estradjol għandha tilħaq plateau għall-irbit speċifiku massimu li tindika saturazzjoni tal-hrERα bl-[3H]-17β-estradjol. Barra minn hekk, l-analiżi tad-data għandha tiddokumenta l-irbit ta’ [3H]-17β- estradjol ma’ sit ta’ rbit wieħed b’affinità għolja. L-irbit mhux speċifiku, totali u speċifiku għandu jintwera fuq kurva tal-irbit tas-saturazzjoni. Analiżi ulterjuri ta’ din id-data għandha tuża analiżi ta’ rigressjoni mhux lineari (eż. BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) b’wiri finali tad-data bħala plot Scatchard.
|
|
53.
|
L-analiżi tad-data għandha tiddetermina l-Bmax u l-Kd mid-data dwar l-irbit totali biss, bl-użu tas-suppożizzjoni li l-irbit mhux speċifiku hu lineari, sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni għall-użu ta’ metodu differenti. Barra minn hekk, ir-rigressjoni robusta għandha tintuża meta jiġi determinat l-aħjar dħul sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni. Il-metodu magħżul għar-rigressjoni robusta għandu jiġi ddikjarat. Il-korrezzjoni għat-tnaqqis tal-ligand (eż. bl-użu tal-metodu ta’ Swillens 1995) dejjem għandha tintuża meta jiġu determinati l-Bmax u l-Kd mid-data dwar l-irbit tas-saturazzjoni.
|
Assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
54.
|
Il-kurva tal-irbit kompetittiv tiġi plottjata bħala irbit speċifiku ta’ [3H]-17β-estradjol kontra l-konċentrazzjoni (unitajiet tal-log10) tal-kompetitur. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tinibixxi 50 % tal-irbit speċifiku massimu ta’ [3H]-17β hi l-valur tal-IC50.
|
|
55.
|
Stimi tal-valuri tal-log (IC50) għall-kontrolli pożittivi (eż. estroġenu referenzjarju u legant dgħajjef) għandhom jiġu determinati bl-użu ta’ softwer xieraq ta’ dħul ta’ kurva nonlineari għad-dħul f’ekwazzjoni ta’ Hill b’erba’ parametri (eż. BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995). Il-quċċata, il-qiegħ, il-pendil u l-log(IC50) ġeneralment għandhom jitħallew mhux ristretti meta jiddaħħlu dawn il-kurvi. Ir-rigressjoni robusta għandha tintuża meta jiġi determinat l-aħjar dħul sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni. Ma għandhiex tintuża korrezzjoni għat-tnaqqis tal-ligand. Wara l-analiżi inizjali, kull kurva tal-irbit għandha tiġi rieżaminata biex jiġi żgurat dħul xieraq fil-mudell. L-affinità relattiva għall-irbit (RBA) għal-legant dgħajjef għandha tiġi kkalkolata bħala perċentwal tal-log (IC50) għal-legant dgħajjef relattiv għal-log (IC50) għal 17β-estradjol. Ir-riżultati mill-kontrolli pożittivi u mill-kontroll mhux legant għandhom jiġu evalwati bl-użu tal-miżuri tal-prestazzjoni tal-assaġġ fil-paragrafi 45-50 f’dan l-Appendiċi 2.
|
|
56.
|
Id-data għas-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandha tiġi analizzata bl-użu ta’ approċċ skont l-istadju biex jiġi żgurat li d-data tiġi analizzata kif xieraq u li kull kurva tal-irbit kompetittiv tiġi klassifikata kif suppost. Hu rakkomandat li kull sessjoni għal sustanza kimika tat-test għall-ewwel issirilha analiżi tad-data standardizzata li tkun identika għal dik użata għall-estroġenu referenzjarju u għall-kontrolli tal-legant dgħajjef (ara l-paragrafu 55 aktar ’il fuq). Ladarba titlesta, għandhom isiru rieżami tekniku tal-parametri ta’ dħul tal-kurva kif ukoll rieżami viżwali ta’ kemm qed tidħol sew id-data fil-kurva tal-irbit kompetittiv ġenerata għal kull sessjoni. Matul dan ir-rieżami tekniku, l-osservazzjonijiet ta’ tnaqqis dipendenti fuq il-konċentrazzjoni fil-perċentwal ta’ [3H]-17β-estradjol marbut b’mod speċifiku, varjabbiltà baxxa fost ir-repliki tekniċi f’kull konċentrazzjoni kimika, u l-konsistenza fil-parametri mdaħħla fost it-tliet sessjonijiet huma indikazzjoni tajba li l-assaġġ u l-analiżijiet tad-data saru kif suppost.
|
Interpretazzjoni tad-data
|
57.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà, sustanza kimika tat-test titqies li tkun legant għall-hrERα jekk kurva tal-irbit tkun tista’ tiddaħħal u l-anqas punt fil-kurva tar-rispons fi ħdan il-medda tad-data jkun anqas minn 50 % (Figura 1).
|
|
58.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li mhix legant għall-hrERα jekk:
|
—
|
Kurva tal-irbit tkun tista’ tiddaħħal u l-anqas punt fil-kurva tar-rispons imdaħħla fi ħdan il-medda tad-data jkun ogħla minn 75 %, jew
|
|
—
|
Kurva tal-irbit ma tkunx tista’ tiddaħħal u l-anqas irbit perċentwali medju mhux illixxat fost il-gruppi ta’ konċentrazzjoni fid-data jkun ogħla minn 75 %.
|
|
|
59.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test jitqiesu ekwivoċi jekk ma tiġi ssodisfata l-ebda waħda mill-kundizzjonijiet ta’ hawn fuq (eż. l-anqas punt fil-kurva tar-rispons imdaħħla jkun bejn 76 – 51 %).
|
Tabella 7
Kriterji għall-assenjazzjoni tal-klassifikazzjoni fuq il-bażi tal-kurva tal-irbit kompetittiv għal sustanza kimika tat-test.
|
Klassifikazzjoni
|
Kriterji
|
|
Leganta
|
Kurva tal-irbit tista’ tiddaħħal.
L-anqas punt fil-kurva tar-rispons fi ħdan il-medda tad-data hu anqas minn 50 %.
|
|
Mhux Legantb
|
Jekk tista’ tiddaħħal kurva tal-irbit,
l-anqas punt fil-kurva tar-rispons imdaħħla fi ħdan il-medda tad-data hu akbar minn 75 %.
Jekk ma tistax tiddaħħal kurva tal-irbit,
l-anqas irbit perċentwali medju mhux illixxat fost il-gruppi ta’ konċentrazzjoni fid-data hu ogħla minn 75 %.
|
|
Ekwivokac
|
Kwalunkwe sessjoni li tista’ tiġi ttestjata la hi legant u lanqas mhux legant
(eż. L-anqas punt fil-kurva mdaħħla tar-rspons hu bejn 76 – 51 %).
|
Figura 1
Eżempji ta’ klassifikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test bl-użu ta’ kurva tal-irbit kompetittiv.
|
60.
|
Diversi sessjonijiet imwettqa fi ħdan laboratorju għal sustanza kimika tat-test jiġu kombinati bl-assenjazzjoni ta’ valuri numeriċi għal kull sessjoni u bit-teħid tal-medja bejn is-sessjonijiet kif muri fit-Tabella 8. Ir-riżultati għas-sessjonijiet kombinati fi ħdan kull laboratorju jitqabblu mal-klassifikazzjoni mistennija għal kull sustanza kimika tat-test.
|
Tabella 8
Il-metodu għall-klassifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bl-użu ta’ diversi sessjonijiet fi ħdan laboratorju
|
Biex jiġi assenjat valur għal kull sessjoni:
|
|
|
Klassifikazzjoni
|
Valur Numeriku
|
|
Legant
|
2
|
|
Ekwivoka
|
1
|
|
Mhux legant
|
0
|
|
Biex tiġi klassifikata medja ta’ valur numeriku fuq diversi sessjonijiet:
|
|
|
Klassifikazzjoni
|
Valur Numeriku
|
|
Legant
|
Medja ≥ 1,5
|
|
Ekwivoka
|
0,5 ≤ Medja < 1,5
|
|
Mhux legant
|
Medja < 0,5
|
RAPPORT TAT-TEST
|
61.
|
Ara l-paragrafu 24 ta’ “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrER” ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
|
Appendiċi 2.1
LISTA TA’ TERMINI
[3H]E2
: 17β-Estradjol radjotikkettat bi tritju
DCC
: Faħam miksi bid-dekstran
E2
: 17β-estradjol mhux tikkettat (inert)
Bafer tal-assaġġ
: 10 mM Tris, 10 mg Albumina tas-Serum tal-Bovini /ml, 2 mM DTT, 10 % gliċerol, 0,2 mM lewpeptina, pH 7,5
hrERα
: Riċettur alfa tal-estroġenu rikombinanti uman
Replika
: Waħda mid-diversi bwejriet li jkun fihom l-istess kontenut fl-istess konċentrazzjonijiet u li jiġu ttestjati b’mod konkorrenti fi ħdan sessjoni waħda. F’dan il-protokoll, kull konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test tiġi ttestjata fi triplikat; jiġifieri, hemm tliet repliki li jiġu assaġġati fl-istess ħin f’kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.
Sessjoni
: Sett sħiħ ta’ bwejriet ta’ assaġġ ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ f’sessjoni konkorrenti li jipprovdi l-informazzjoni neċessarja kollha biex jiġi karatterizzat l-irbit ta’ sustanza kimika tat-test mal-hrERα (viz., it-total [3H]-17β-estradjol miżjud fil-bwejra tal-assaġġ, l-irbit massimu ta’ [3H]-17β-estradjol mal-hrERα, l-irbit mhux speċifiku, u l-irbit totali f’diversi konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test). Sessjoni tista’ tikkonsisti fi bwejra tal-assaġġ waħda biss (jiġifieri replika) għal kull konċentrazzjoni, iżda peress li dan il-protokoll jeħtieġ assaġġar fi triplikat, sessjoni waħda tikkonsist fi tliet bwejriet tal-assaġġ għal kull konċentrazzjoni. Barra minn hekk, dan il-protokoll jeħtieġ tliet sessjonijiet indipendenti (jiġifieri mhux konkorrenti) għal kull sustanza kimika.
Appendiċi 2.2
ASSAĠĠ TIPIKU TAS-SATURAZZJONI TA’ [3H]-17Β-ESTRADJOL BI TLIET BWEJRIET REPLIKI
|
Assaġġ Tipiku tas-Saturazzjoni ta’ [3H]-17β-Estradjol bi Tliet Bwejriet Repliki
|
|
Pożizzjoni
|
Replika
|
Kodiċi tat-Tip ta’ Bwejra
|
Konċentrazzjoni Inizjali ta’ E2 Jaħraq (nM)
|
Volum ta’ E2 Jaħraq (μl)
|
Konċentrazzjoni Finali ta’ E2 Jaħraq (nM)
|
Konċentrazzjoni Inizjali ta’ E2 Kiesaħ (μM)
|
Volum ta’ E2 Kiesaħ (μl)
|
Konċentrazzjoni Finali ta’ E2 Kiesaħ (μM)
|
Volum tal-Bafer (μl)
|
Volum tar-Riċettur (μl)
|
Volum totali fil-bwejriet
|
|
A1
|
1
|
H
|
0,12
|
40
|
0,03
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A2
|
2
|
H
|
0,12
|
40
|
0,03
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A3
|
3
|
H
|
0,12
|
40
|
0,03
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A4
|
1
|
H
|
0,24
|
40
|
0,06
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A5
|
2
|
H
|
0,24
|
40
|
0,06
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A6
|
3
|
H
|
0,24
|
40
|
0,06
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A7
|
1
|
H
|
0,32
|
40
|
0,08
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A8
|
2
|
H
|
0,32
|
40
|
0,08
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A9
|
3
|
H
|
0,32
|
40
|
0,08
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A10
|
1
|
H
|
0,40
|
40
|
0,10
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A11
|
2
|
H
|
0,40
|
40
|
0,10
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
A12
|
3
|
H
|
0,40
|
40
|
0,10
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B1
|
1
|
H
|
1,20
|
40
|
0,30
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B2
|
2
|
H
|
1,20
|
40
|
0,30
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B3
|
3
|
H
|
1,20
|
40
|
0,30
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B4
|
1
|
H
|
2,40
|
40
|
0,60
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B5
|
2
|
H
|
2,40
|
40
|
0,60
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B6
|
3
|
H
|
2,40
|
40
|
0,60
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B7
|
1
|
H
|
4,00
|
40
|
1,00
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B8
|
2
|
H
|
4,00
|
40
|
1,00
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B9
|
3
|
H
|
4,00
|
40
|
1,00
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B10
|
1
|
H
|
12,00
|
40
|
3,00
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B11
|
2
|
H
|
12,00
|
40
|
3,00
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
B12
|
3
|
H
|
12,00
|
40
|
3,00
|
—
|
—
|
—
|
80
|
40
|
160
|
|
D1
|
1
|
HC
|
0,12
|
40
|
0,03
|
0,06
|
80
|
0,03
|
—
|
40
|
160
|
|
D2
|
2
|
HC
|
0,12
|
40
|
0,03
|
0,06
|
80
|
0,03
|
—
|
40
|
160
|
|
D3
|
3
|
HC
|
0,12
|
40
|
0,03
|
0,06
|
80
|
0,03
|
—
|
40
|
160
|
|
D4
|
1
|
HC
|
0,24
|
40
|
0,06
|
0,12
|
80
|
0,06
|
—
|
40
|
160
|
|
D5
|
2
|
HC
|
0,24
|
40
|
0,06
|
0,12
|
80
|
0,06
|
—
|
40
|
160
|
|
D6
|
3
|
HC
|
0,24
|
40
|
0,06
|
0,12
|
80
|
0,06
|
—
|
40
|
160
|
|
D7
|
1
|
HC
|
0,32
|
40
|
0,08
|
0,16
|
80
|
0,08
|
—
|
40
|
160
|
|
D8
|
2
|
HC
|
0,32
|
40
|
0,08
|
0,16
|
80
|
0,08
|
—
|
40
|
160
|
|
D9
|
3
|
HC
|
0,32
|
40
|
0,08
|
0,16
|
80
|
0,08
|
—
|
40
|
160
|
|
D10
|
1
|
HC
|
0,40
|
40
|
0,10
|
0,2
|
80
|
0,1
|
—
|
40
|
160
|
|
D11
|
2
|
HC
|
0,40
|
40
|
0,10
|
0,2
|
80
|
0,1
|
—
|
40
|
160
|
|
D12
|
3
|
HC
|
0,40
|
40
|
0,10
|
0,2
|
80
|
0,1
|
—
|
40
|
160
|
|
E1
|
1
|
HC
|
1,20
|
40
|
0,30
|
0,6
|
80
|
0,3
|
—
|
40
|
160
|
|
E2
|
2
|
HC
|
1,20
|
40
|
0,30
|
0,6
|
80
|
0,3
|
—
|
40
|
160
|
|
E3
|
3
|
HC
|
1,20
|
40
|
0,30
|
0,6
|
80
|
0,3
|
—
|
40
|
160
|
|
E4
|
1
|
HC
|
2,40
|
40
|
0,60
|
1,2
|
80
|
0,6
|
—
|
40
|
160
|
|
E5
|
2
|
HC
|
2,40
|
40
|
0,60
|
1,2
|
80
|
0,6
|
—
|
40
|
160
|
|
E6
|
3
|
HC
|
2,40
|
40
|
0,60
|
1,2
|
80
|
0,6
|
—
|
40
|
160
|
|
E7
|
1
|
HC
|
4,00
|
40
|
1,00
|
2
|
80
|
1
|
—
|
40
|
160
|
|
E8
|
2
|
HC
|
4,00
|
40
|
1,00
|
2
|
80
|
1
|
—
|
40
|
160
|
|
E9
|
3
|
HC
|
4,00
|
40
|
1,00
|
2
|
80
|
1
|
—
|
40
|
160
|
|
E10
|
1
|
HC
|
12,00
|
40
|
3,00
|
6
|
80
|
3
|
—
|
40
|
160
|
|
E11
|
2
|
HC
|
12,00
|
40
|
3,00
|
6
|
80
|
3
|
—
|
40
|
160
|
|
E12
|
3
|
HC
|
12,00
|
40
|
3,00
|
6
|
80
|
3
|
—
|
40
|
160
|
|
G1
|
1
|
Jaħraq
|
0,12
|
40
|
0,03
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G2
|
2
|
Jaħraq
|
0,12
|
40
|
0,03
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G3
|
3
|
Jaħraq
|
0,12
|
40
|
0,03
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G4
|
1
|
Jaħraq
|
0,24
|
40
|
0,06
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G5
|
2
|
Jaħraq
|
0,24
|
40
|
0,06
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G6
|
3
|
Jaħraq
|
0,24
|
40
|
0,06
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G7
|
1
|
Jaħraq
|
0,32
|
40
|
0,08
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G8
|
2
|
Jaħraq
|
0,32
|
40
|
0,08
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G9
|
3
|
Jaħraq
|
0,32
|
40
|
0,08
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G10
|
1
|
Jaħraq
|
0,40
|
40
|
0,10
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G11
|
2
|
Jaħraq
|
0,40
|
40
|
0,10
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
G12
|
3
|
Jaħraq
|
0,40
|
40
|
0,10
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H1
|
1
|
Jaħraq
|
1,20
|
40
|
0,30
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H2
|
2
|
Jaħraq
|
1,20
|
40
|
0,30
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H3
|
3
|
Jaħraq
|
1,20
|
40
|
0,30
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H4
|
1
|
Jaħraq
|
2,40
|
40
|
0,60
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H5
|
2
|
Jaħraq
|
2,40
|
40
|
0,60
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H6
|
3
|
Jaħraq
|
2,40
|
40
|
0,60
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H7
|
1
|
Jaħraq
|
4,00
|
40
|
1,00
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H8
|
2
|
Jaħraq
|
4,00
|
40
|
1,00
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H9
|
3
|
Jaħraq
|
4,00
|
40
|
1,00
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H10
|
1
|
Jaħraq
|
12,00
|
40
|
3,00
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H11
|
2
|
Jaħraq
|
12,00
|
40
|
3,00
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
H12
|
3
|
Jaħraq
|
12,00
|
40
|
3,00
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
40
|
|
Kun af li l-bwejriet “jaħarqu” jkunu vojta matul l-inkubazzjoni. L-40 μl jiżdiedu biss għall-għadd tax-xintillazzjoni.
|
Appendiċi 2.3:
TIFSILA TAL-BWEJRIET TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT KOMPETITTIV
|
Pjastra
|
Pożizzjoni
|
Replika
|
Tip ta’ bwejra
|
Kodiċi tal-bwejra
|
Kodiċi tal-konċentrazzjoni
|
Konċentrazzjoni Inizjali tal-Kompetitur (M)
|
Stokk tal-hrER (μl)
|
Volum tal-Bafer (μl)
|
Volum tat-Traċċatur (E2 Jaħraq) (μL)
|
Volum mill-pjastra tad-dilwizzjoni (μL)
|
Volum Finali (μl)
|
Konċentrazzjoni Finali tal-Kompetitur (M)
|
|
S
|
A1
|
1
|
irbit totali
|
TB
|
TB1
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A2
|
2
|
irbit totali
|
TB
|
TB2
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A3
|
3
|
irbit totali
|
TB
|
TB3
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A4
|
1
|
irbit totali
|
TB
|
TB4
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A5
|
2
|
irbit totali
|
TB
|
TB5
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A6
|
3
|
irbit totali
|
TB
|
TB6
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A7
|
1
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A8
|
2
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A9
|
3
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A10
|
1
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A11
|
2
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A12
|
3
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
B1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S1
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
B2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S1
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
B3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S1
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
B4
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S2
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
B5
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S2
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
B6
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S2
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
B7
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S3
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
B8
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S3
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
B9
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S3
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
B10
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S4
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
B11
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S4
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
B12
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S4
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
C1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S5
|
6,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-10
|
|
S
|
C2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S5
|
6,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-10
|
|
S
|
C3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S5
|
6,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-10
|
|
S
|
C4
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S6
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
C5
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S6
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
C6
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S6
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
C7
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S7
|
2,00E-11
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-11
|
|
S
|
C8
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S7
|
2,00E-11
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-11
|
|
S
|
C9
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S7
|
2,00E-11
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-11
|
|
S
|
C10
|
1
|
inbjank
|
inbjank
|
B1
|
-
|
-
|
160
|
-
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
C11
|
2
|
inbjank
|
inbjank
|
B2
|
-
|
-
|
160
|
-
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
C12
|
3
|
inbjank
|
inbjank
|
B3
|
-
|
-
|
160
|
-
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
D1
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP1
|
6,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
D2
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP1
|
6,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
D3
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP1
|
6,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
D4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP2
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
S
|
D5
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP2
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
S
|
D6
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP2
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
S
|
D7
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP3
|
6,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-06
|
|
S
|
D8
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP3
|
6,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-06
|
|
S
|
D9
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP3
|
6,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-06
|
|
S
|
D10
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP4
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
D11
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP4
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
D12
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP4
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
E1
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
E2
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
E3
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
E4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
2,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
E5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
2,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
E6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
2,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
E7
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-08
|
|
S
|
E8
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-08
|
|
S
|
E9
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-08
|
|
S
|
E10
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
E11
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
E12
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
F1
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-03
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
S
|
F2
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-03
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
S
|
F3
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-03
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
S
|
F4
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-04
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
S
|
F5
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-04
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
S
|
F6
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-04
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
S
|
F7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
F8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
F9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
F10
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
F11
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
F12
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
G1
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
G2
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
G3
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
G4
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
G5
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
G6
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
G7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
G8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
G9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
G10
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
-
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
G11
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
-
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
G12
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
-
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
H1
|
1
|
jaħraq
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H2
|
1
|
jaħraq
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H3
|
1
|
jaħraq
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H4
|
1
|
jaħraq
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H5
|
1
|
jaħraq
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H6
|
1
|
jaħraq
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H7
|
1
|
kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H8
|
1
|
kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H9
|
1
|
kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H10
|
1
|
kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H11
|
1
|
kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H12
|
1
|
kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
Kun af li l-bwejriet “jaħarqu” jkunu vojta matul l-inkubazzjoni. L-40 μl jiżdiedu biss għall-għadd tax-xintillazzjoni.
|
Tifsila tal-Bwejriet tal-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv
|
|
Pjastra
|
Pożizzjoni
|
Replika
|
Tip ta’ bwejra
|
Kodiċi tal-Bwejra
|
Kodiċi tal-Konċentrazzjoni
|
Konċentrazzjoni Inizjali tal-Kompetitur (M)
|
Stokk tal-hrER (μL)
|
Volum tal-Bafer (μL)
|
Volum tat-Traċċatur (E2 Jaħraq) (μL)
|
Volum mill-pjastra tad-dilwizzjoni (μL)
|
Volum Finali (μl)
|
Konċentrazzjoni Finali tal-Kompetitur (M)
|
|
P1
|
A1
|
1
|
irbit totali
|
TB
|
TBB1B1
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A2
|
2
|
irbit totali
|
TB
|
TB2
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A3
|
3
|
irbit totali
|
TB
|
TB3
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A4
|
1
|
irbit totali
|
TB
|
TB4
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A5
|
2
|
irbit totali
|
TB
|
TB5
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A6
|
3
|
irbit totali
|
TB
|
TB6
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A7
|
1
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A8
|
2
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A9
|
3
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A10
|
1
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A11
|
2
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A12
|
3
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
B1
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
B2
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
B3
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
B4
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
B5
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
B6
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
B7
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
B8
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
B9
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
B10
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
B11
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
B12
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
C1
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
C2
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
C3
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
C4
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C5
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C6
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C7
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C8
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C9
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C10
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
C11
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
C12
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 1
|
TC1
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
D1
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
D2
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
D3
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
D4
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
D5
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
D6
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
D7
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
D8
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
D9
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
D10
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
D11
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
D12
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E1
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E2
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E3
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E4
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
6
|
-
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
E5
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
6
|
-
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
E6
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
6
|
-
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
E7
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
7
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
E8
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
7
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
E9
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
7
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
E10
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
8
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
E11
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
8
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
E12
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 2
|
TC2
|
8
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
F1
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
F2
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
F3
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
F4
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
F5
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
F6
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
F7
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F8
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F9
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F10
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F11
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F12
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
G1
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
G2
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
G3
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
G4
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
G5
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
G6
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
G7
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
G8
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
G9
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
G10
|
1
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
G11
|
2
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
G12
|
3
|
Sustanza Kimika tat-Test 3
|
TC3
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
H1
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H2
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H3
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
|
1,00E-4,5
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
|
1,00E-4,5
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
|
1,00E-4,5
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H7
|
1
|
E2 kiesaħ S
|
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H8
|
2
|
E2 kiesaħ S
|
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H9
|
3
|
E2 kiesaħ S
|
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H10
|
1
|
E2 kiesaħ S
|
|
|
1,00 E-7
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H11
|
2
|
E2 kiesaħ S
|
|
|
1,00 E-7
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H12
|
3
|
E2 kiesaħ S
|
|
|
1,00 E-7
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
Appendiċi 3
L-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAR-RIĊETTUR TAL-ESTROĠENU IN VITRO BL-UŻU TA’ PROTEINA TAD-DOMINJU TAL-IRBIT TAL-LIGAND TAL-ERΑ RIKOMBINANTI TAL-CHEMICAL EVALUATION AND RESEARCH INSTITUTE (CERI).
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
1.
|
Dan l-assaġġ in vitro tal-irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv tar-Riċettur tal-Estroġenu (Erα) juża dominju tal-irbit tal-ligand (LBD) tal-ERα uman (hrERα). Din il-binja tal-proteina ġiet prodotta mill-Chemicals Evaluation Research Institute (CERI), fil-Ġappun, u teżisti bħala proteina ta’ fużjoni ta’ glutatjon-S-transferażi (GST), u hi espressa fl-E. coli. Il-protokoll CERI għadda minn studju ta’ validazzjoni multilaboratorju internazzjonali (2) li wera r-rilevanza u l-affidabbiltà tiegħu għall-iskop maħsub tal-assaġġ.
|
|
2.
|
Dan l-assaġġ hu proċedura ta’ skrinjar għall-identifikazzjoni ta’ sustanzi li jistgħu jorbtu mal-hrERα. Jintuża biex jiddetermina l-ħila ta’ sustanza kimika tat-test li tikkompeti ma’ 17β-estradjol għall-irbit mal-hrERα-LBD. Ir-riżultati kwantitattivi tal-assaġġ jistgħu jinkludu l-IC50 (kejl tal-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test meħtieġa biex jiġi spostat nofs l-[3H]-17β-estradjol mill-hrERα) u l-affinitajiet għall-irbit relattiv tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-hrERα meta mqabbel ma’ 17β-estradjol. Għall-finijiet ta’ skrinjar tas-sustanzi kimiċi, ir-riżultati kwalitattivi aċċettabbli tal-assaġġ jistgħu jinkludu klassifikazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test bħala leganti tal-hrERα, mhux leganti, jew ekwivoċi fuq il-bażi tal-kriterji deskritti għall-kurvi tal-irbit.
|
|
3.
|
L-assaġġ juża ligand radjuattiv li jeħtieġ liċenzja tal-materjali radjuattivi għal-laboratorju. Il-proċeduri kollha b’radjoisotopi u b’sustanzi kimiċi perikolużi għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri deskritti mil-leġiżlazzjoni nazzjonali.
|
|
4.
|
Għandhom jinqraw “INTRODUZZJONI ĠENERALI” u “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrER” qabel ma dan l-assaġġ jintuża għal finijiet regolatorji. Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet użati f’din it-TG huma deskritti fl-Appendiċi 1.
|
PRINĊIPJI TAL-ASSAĠĠ (ARA WKOLL INTRODUZZJONI ĠENERALI)
|
5.
|
L-assaġġ tal-irbit tal-hrERα jkejjel il-ħila ta’ ligand radjotikkettat ([3H]17β-estradjol) li jorbot mal-ER fil-preżenza ta’ konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test (jiġifieri kompetitur). Sustanzi kimiċi tat-test li fihom affinità għolja għall-ER jikkompetu mal-ligand radjotikkettat f’konċentrazzjoni inferjuri meta mqabbla ma’ dawk is-sustanzi kimiċi b’affinità inferjuri għar-riċettur.
|
|
6.
|
Dan l-assaġġ jikkonsisti f’żewġ komponenti ewlenin: esperiment ta’ rbit tas-saturazzjoni biex jiġu karatterizzati l-parametri ta’ interazzjoni riċettur-ligand, segwit minn esperiment tal-irbit kompetittiv li jikkaratterizza l-kompetizzjoni bejn sustanza kimika tat-test u ligand radjotikkettat għall-irbit mal-ER.
|
|
7.
|
L-iskop tal-esperiment tal-irbit tas-saturazzjoni hu li jikkaratterizza lott partikolari ta’ riċetturi għall-affinità u n-numru tal-irbit bi tħejjija għall-esperiment tal-irbit kompetittiv. L-esperiment tal-irbit tas-saturazzjoni jkejjel, taħt kundizzjonijiet ta’ ekwilibriju, l-affinità ta’ konċentrazzjoni fissa tar-riċettur tal-estroġenu għal-ligand naturali tiegħu (rappreżentat mill-kostanti ta’ dissoċjazzjoni, Kd), u l-konċentrazzjoni tas-siti attivi tar-riċettur (Bmax).
|
|
8.
|
L-esperiment tal-irbit kompetittiv ikejjel l-affinità ta’ sustanza biex tikkompeti ma’ [3H]17β-estradjol għall-irbit mal-ER. L-affinità hi kwantifikata mill-konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test li, f’ekwilibriju, tinibixxi 50 % tal-irbit speċifiku tal-[3H]17β-estradjol (imsejħa l-“konċentrazzjoni inibitorja 50 %” jew IC50). Din tista’ tiġi evalwata wkoll bl-użu tal-affinità relattiva għall-irbit (RBA, relattiva għall-IC50 tal-estradjol imkejla b’mod separat fl-istess sessjoni). L-esperiment tal-irbit kompetittiv ikejjel l-irbit ta’ [3H]17β-estradjol f’konċentrazzjoni fissa fil-preżenza ta’ firxa wiesgħa (tmien ordnijiet ta’ kobor) tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test. Imbagħad id-data tiddaħħal, fejn possibbli, biex tifforma l-ekwazzjoni ta’ Hill (Hill, 1910) li tiddeskrivi l-ispostament tar-radjoligand minn legant kompetittiv ta’ sit wieħed. Il-firxa tal-ispostament tal-estradjol radjotikkettat fl-ekwilibriju tintuża biex is-sustanza kimika tat-test tiġi karatterizzata bħala legant, mhux legant, jew waħda li tiġġenera rispons ekwivoku.
|
PROĊEDURA
Wiri ta’ Prestazzjoni Aċċettabbli tal-Proteina tal-hrERα
|
9.
|
Qabel it-twettiq ta’ rutina tal-assaġġi tal-irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv, għandu jintwera li kull lott ġdid tal-hrERα jkollu prestazzjoni korretta fil-laboratorju fejn se jintuża. Għandu jintuża proċess imqassam fuq żewġ stadji biex tintwera l-prestazzjoni. Dawn l-istadji huma dawn li ġejjin:
|
—
|
Agħmel assaġġ tal-irbit ta’ [3H]-17β-estradjol tas-saturazzjoni biex turi l-ispeċifiċità u s-saturazzjoni tal-hrERα. Analiżi ta’ rigressjoni nonlineari ta’ din id-data (eż. BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) u l-plott Scatchard sussegwenti għandha tiddokumenta l-affinità għall-irbit tal-hrERα ta’ [3H]-17β-estradjol (Kd) u n-numru ta’ riċetturi (Bmax) għal lott partikolari tal-hrERα.
|
|
—
|
Agħmel assaġġ tal-irbit kompetittiv billi tuża s-sustanzi tal-kontroll (estroġenu ta’ riferiment (17β-estradjol), legant dgħajjef (eż. noretinodrel jew noretindron), u mhux legant (ottiltrietossisilan, OTES). Kull laboratorju għandu jistabbilixxi bażi ta’ data storika biex jiddokumenta l-konsistenza tal-IC50 u tal-valuri rilevanti għall-estroġenu ta’ riferiment u għal-legant dgħajjef fost l-esperimenti u l-lottijiet differenti tal-hrERα. Barra minn hekk, il-parametri tal-kurvi tal-irbit kompetittiv għas-sustanzi tal-kontroll għandhom ikunu fi ħdan il-limiti tal-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % (ara t-Tabella 1) li ġew żviluppati bl-użu tad-data mil-laboratorji li ħadu sehem fl-istudju ta’ validazzjoni għal dan l-assaġġ (2).
|
Tabella 1
Kriterji tal-prestazzjoni żviluppati għall-estroġenu ta’ riferiment u għal-legant dgħajjef, Assaġġ CERI tal-Irbit tal-hrER.
|
Sustanza
|
Parametru
|
Medja (10)
|
Devjazzjoni Standard(n)
|
Intervall ta’ Kunfidenza ta’ 95 % (11)
|
|
Limitu Inferjuri
|
Limitu Superjuri
|
|
17β-estradjol
|
Quċċata
|
104,74
|
13,12 (70)
|
101,6
|
107,9
|
|
Qiegħ
|
0,85
|
2,41 (70)
|
0,28
|
1,43
|
|
HillSlope
|
–1,22
|
0,20 (70)
|
–1,27
|
–1,17
|
|
LogIC50
|
–8,93
|
0,23 (70)
|
–8,98
|
–8,87
|
|
Noretinodrel
|
Quċċata
|
101,31
|
10,55 (68)
|
98,76
|
103,90
|
|
Qiegħ
|
2,39
|
5,01 (68)
|
1,18
|
3,60
|
|
HillSlope
|
–1,04
|
0,21 (68)
|
–1,09
|
–0,99
|
|
LogIC50
|
–6,19
|
0,40 (68)
|
–6,29
|
–6,10
|
|
Noretindron (12)
|
Quċċata
|
92,27
|
7,79 (23)
|
88,90
|
95,63
|
|
Qiegħ
|
16,52
|
10,59 (23)
|
11,94
|
21,10
|
|
Pendil ta’ Hill
|
–1,18
|
0,32 (23)
|
–1,31
|
–1,04
|
|
LogIC50
|
–6,01
|
0,54 (23)
|
–6,25
|
–5,78
|
|
Wiri tal-profiċjenza tal-laboratorju
|
10.
|
Ara l-paragrafi 17 u 18 u t-Tabella 2 f’“KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrER” ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar. Kull assaġġ (irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv) għandu jikkonsisti fi tliet sessjonijiet indipendenti (jiġifieri b’dilwizzjonijiet friski ta’ riċettur, ta’ sustanzi kimiċi, u ta’ reaġenti) f’jiem differenti, u kull sessjoni għandu jkun fiha tliet repliki.
|
Determinazzjoni tal-Konċentrazzjoni tar-Riċettur (hrERα)
|
11.
|
Il-konċentrazzjoni tar-riċettur attiv tvarja ftit skont il-lott u l-kundizzjonijiet tal-ħżin. Għalhekk, għandha tiġi determinata l-konċentrazzjoni tar-riċettur attiv kif riċevuta mingħand il-fornitur. Din trendi l-konċentrazzjoni xierqa tar-riċettur attiv fil-ħin tas-sessjoni.
|
|
12.
|
Skont il-kundizzjonijiet li jikkorrispondu għall-irbit kompetittiv (jiġifieri 0,5 nM [3H]-estradjol), konċentrazzjonijiet nominali ta’ riċettur ta’ 0,1, ta’ 0,2, ta’ 0,4, u ta’ 0,6 nM għandhom jiġu inkubati fl-assenza (irbit totali) u fil-preżenza (irbit mhux speċifiku ta’ 1 μM estradjol mhux tikkettat. L-irbit speċifiku, ikkalkolat bħala d-differenza tal-irbit totali u mhux speċifiku, jiġi plottjat kontra l-konċentrazzjoni nominali tar-riċettur. Il-konċentrazzjoni tar-riċettur li tagħti valuri tal-irbit speċifiċi li jikkorrispondu għal 40 % tar-radjotikketta miżjuda hi relatata mal-konċentrazzjoni korrispondenti tar-riċettur, u din il-konċentrazzjoni tar-riċettur għandha tintuża għall-esperimenti tal-irbit tas-saturazzjoni u kompetittiv. Spiss, konċentrazzjoni finali tal-hrER ta’ 0,2 nM se tkun konformi ma’ din il-kundizzjoni.
|
|
13.
|
Jekk il-kriterju ta’ 40 % ma jkunx jista’ jiġi ssodisfat ripetutament, il-kompożizzjoni tal-esperiment għandha tiġi verifikata għal żbalji potenzjali. Nuqqas ta’ lħuq tal-kriterju ta’ 40 % jista’ jindika li ftit li xejn ikun hemm riċettur attiv fil-lott rikombinanti, u mbagħad ikollu jiġi kkunsidrat l-użu ta’ lott ieħor ta’ riċettur.
|
Assaġġ tas-saturazzjoni
|
14.
|
Tmien konċentrazzjonijiet li jiżdiedu dejjem aktar ta’ [3H]17β-estradjol għandhom jiġu evalwati fi triplikat, skont it-tliet kundizzjonijiet li ġejjin (ara t-Tabella 2):
|
a.
|
Fin-nuqqas ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat u l-preżenza ta’ ER. Din hi d-determinazzjoni tal-irbit totali skont il-kejl tar-radjuattività fil-bwejriet li jkollhom [3H]17β-estradjol biss.
|
|
b.
|
Fil-preżenza ta’ konċentrazzjoni eċċessiva għal 2000 darba ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat fuq 17β-estradjol tikkettat u fil-preżenza tal-ER. L-intenzjoni ta’ din il-kundizzjoni hi li tissatura s-siti attivi tal-irbit b’17β-estradjol mhux tikkettat, u bil-kejl tar-radjuattività fil-bwejriet, tiddetermina l-irbit mhux speċifiku. Kwalunkwe estradjol jaħraq li jifdal li jista’ jorbot mar-riċettur jitqies li jkun jorbot ma’ sit mhux speċifiku peress li l-estradjol kiesaħ għandu jkun f’konċentrazzjoni għolja tant li jintrabat mas-siti speċifiċi disponibbli kollha fuq ir-riċettur.
|
|
c.
|
Fin-nuqqas ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat u l-assenza tal-ER (determinazzjoni tar-radjuattività totali)
|
Preparazzjoni ta’ [3H]-17β-estradjol, ta’ soluzzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettati u tal-hrERα
|
15.
|
Soluzzjoni ta’ 40 nM ta’ [3H]-17β-estradjol għandha titħejja minn soluzzjoni ewlenija ta’ 1 μM ta’ [3H]-17β-estradjol fid-DMSO billi jiżdiedu DMSO (biex jitħejjew 200 nM) u bafer tal-assaġġ f’temperatura ambjentali (biex jitħejjew 40 nM). Bl-użu ta’ din is-soluzzjoni ta’ 40 nM, titħejja s-sensiela ta’ dilwizzjonijiet ta’ [3H]-17β-estradjol, li jvarjaw minn 0,313 nM sa 40 nM b’bafer tal-assaġġ f’temperatura ambjenatli (kif rappreżentata fil-linja 12 tat-Tabella 2). Il-konċentrazzjonijiet finali tal-assaġġ, li jvarjaw minn 0,0313 sa 4,0 nM jinkisbu billi jiżdiedu 10 μl ta’ dawn is-soluzzjonijiet fil-bwejriet tal-assaġġ rispettivi ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra (ara t-Tabelli 2 u 3), Il-preparazzjoni tal-bafer tal-assaġġ, il-kalkolu tas-soluzzjoni ewlenija oriġinali ta’ [3H]-17β-estradjol fuq il-bażi tal-attività speċifika tagħha, il-preparazzjoni tad-dilwizzjonijiet u d-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet huma deskritti fid-dettall fil-protokoll CERI (2).
|
|
16.
|
Id-dilwizzjonijiet ta’ soluzzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat għandhom jitħejjew minn soluzzjoni ewlenija ta’ 1 nM 17β-estradjol billi jiżdied bafer tal-assaġġ biex jinkisbu tmien konċentrazzjonijiet waħda akbar mill-oħra li inizjalment ivarjaw bejn 0,625 μM u 80 μM, Il-konċentrazzjonijiet finali tal-assaġġ, li jvarjaw minn 0,0625 sa 8 μM jinkisbu billi jiżdiedu 10 μl ta’ dawn is-soluzzjonijiet fil-bwejriet tal-assaġġ rispettivi ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra dedikata għall-kejl tal-irbit mhux speċifiku (ara t-Tabelli 2 u 3), Il-preparazzjoni tad-dilwizzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat hi deskritta fid-dettall fil-protokoll CERI (2).
|
|
17.
|
Għandha tintuża l-konċentrazzjoni tar-riċettur li tagħti l-irbit speċifiku ta’ 40±10 % (ara l-paragrafi 12-13). Is-soluzzjoni tal-hrERα għandha titħejja b’bafer tal-assaġġ kiesaħ silġ eżatt qabel l-użu, jiġifieri wara li jkunu tħejjew il-bwejriet kollha għall-irbit totali, għall-irbit mhux speċifiku u għal-ligand jaħraq waħdu.
|
|
18.
|
Il-pjastri għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra jitħejjew kif muri fit-Tabella 2, bi 3 repliki għal kull konċentrazzjoni ta’ [3H]-17β-estradjol. Assenjament tal-volum ta’ [3H]-17β-estradjol, ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat, tal-bafer u tar-riċettur hu pprovdut fit-Tabella 3.
Tabella 2
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit tas-Saturazzjoni
|
|
1 (*10)
|
2 (*10)
|
3 (*10)
|
4 (*10)
|
5 (*10)
|
6 (*10)
|
7 (*10)
|
8 (*10)
|
9 (*10)
|
10
|
11 (*11)
|
12 (*11)
|
|
Għall-kejl tat-TB
|
Għall-kejl tal-NSB
|
Għad-determinazzjoni tal-ligand jaħraq waħdu
|
|
Dilwizzjonijiet tal-E2 mhux tikkettati għall-kolonni 4-6 tal-pjastri
|
Dilwizzjonijiet ta’ [3H]E2 għall-kolonni 1-9 tal-pjastri
|
|
A
|
0,0313 nM [ 3H] E2+ ER
|
0,0313 nM [3H] E2+ 0,0625 μM E2+ ER
|
0,0313 nM
|
|
0,625 μM
|
0,313 nM
|
|
B
|
0,0625 nM [3H] E2+ ER
|
0,0625 nM [3H] E2+ 0,125 μM E2+ ER
|
0,0625 nM
|
|
1,25 μM
|
0,625 nM
|
|
C
|
0,125 nM [3H] E2+ ER
|
0,125 nM [3H] E2+ 0,25 μM E2+ ER
|
0,125 nM
|
|
2,5 μM
|
1,25 nM
|
|
D
|
0,250 nM [3H] E2+ ER
|
0,250 nM [3H] E2+ 0,5 μM E2+ ER
|
0,250 nM
|
|
5 μM
|
2,5 nM
|
|
E
|
0,50 nM [ H] E2+ ER
|
0,50 nM [3H] E2+ 1 μM E2+ ER
|
0,50 nM
|
|
10 μM
|
5 nM
|
|
F
|
1,00 nM [3H] E2+ ER
|
1,00 nM [3H] E2+ 2 μM E2+ ER
|
1,00 nM
|
|
20 μM
|
10 nM
|
|
G
|
2,00 nM [3H] E2+ ER
|
2,00 nM [3H] E2+ 4 μM E2+ ER
|
2,00 nM
|
|
40 μM
|
20 nM
|
|
H
|
4,00 nM [3H] E2+ ER
|
4,00 nM [3H] E2+ 8 μM E2+ ER
|
4,00 nM
|
|
80 μM
|
40 nM
|
|
TB
|
:
|
irbit totali,
|
|
NSB
|
:
|
irbit mhux speċifiku
|
|
[3H] E2
|
:
|
[3H]17β-estradjol
|
|
E2
|
:
|
17β-estradjol mhux tikkettat
|
|
Tabella 3
Volumi tar-Reaġent għall-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tas-Saturazzjoni
|
Numru tal-Linja
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7 (*12)
|
8 (*12)
|
9 (*12)
|
|
Stadji tal-Preparazzjoni
|
Bwejriet tat-TB
|
Bwejriet tal-NSB
|
Ligand Jaħraq Waħdu
|
|
Volum tal-komponenti għall-bwejriet ta’ reazzjoni ta’ fuq u l-ordni għaż-żieda
|
Bafer
|
60 μl
|
50 μl
|
90 μl
|
|
E2 mhux tikkettat mil-linja 11 fit-Tabella2
|
-
|
10 μl
|
-
|
|
[3H]E2 mil-linja12 fit-Tabella2
|
10 μl
|
10 μl
|
10 μl
|
|
hrERα
|
30 μl
|
30 μl
|
-
|
|
Volum ta’ reazzjoni totali
|
100 μl
|
100 μl
|
100 μl
|
|
Inkubazzjoni
|
WARA REAZZJONI TA’ INKUBAZZJONI TA’ SAGĦTEJN (2)
|
Kwantifikazzjoni tar-radjuattività eżatt wara l-preparazzjoni. Ebda inkubazzjoni
|
|
Trattament b’0,4 % DCC
|
Iva
|
Iva
|
Nru
|
|
Volum ta’ 0,4 % DCC
|
100 μl
|
100 μl
|
-
|
|
Filtrazzjoni
|
Iva
|
Iva
|
Nru
|
|
KEJL TAD-DPMS
|
|
Volum tal-kwantifikazzjoni miżjud mat-taħlita ta’ xintillazzjoni
|
100 μl (*13)
|
100 μl (*13)
|
50 μl
|
|
|
19.
|
Pjastri għall-mikrotitraġġ tal-assaġġ għad-determinazzjoni tal-irbit totali u tal-irbit mhux speċifiku għandhom jiġu inkubati f’temperatura ambjentali (22°C sa 28°C) għal sagħtejn.
|
|
Kejl ta’ [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα
|
20.
|
Wara l-perjodu ta’ inkubazzjoni ta’ sagħtejn, [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα għandu jiġi separat minn [3H]-17β-Estradjol ħieles billi tiżdied sospensjoni ta’ 100μl 0,4 % DCC kiesaħ silġ fil-bwejriet. Imbagħad il-pjastri għandhom jitqiegħdu fuq is-silġ għal 10 minuti u t-taħlita ta’ reazzjoni u s-sospensjoni ta’ DCC għandhom jiġu ffiltrati, bi trasferiment f’filtru tal-pjastri għall-mikrotitraġġ, biex jitneħħa d-DCC. Imbagħad għandhom jiżdiedu 100 μl tal-filtrat mal-fluwidu ta’ xintillazzjoni fil-kunjetti tal-LSC għad-determinazzjoni tad-disintegrazzjoni fil-minuta (dpms) għal kull kunjett bl-għadd tax-xintillazzjoni tal-likwidi.
|
|
21.
|
Inkella, jekk ma jkunx hemm filtru tal-mikropjastri disponibbli, it-tneħħija tad-DCC tista’ tinkiseb b’ċentrifugrazzjoni. Imbagħad 50 μl supernatant li fih [3H]-17β-estradjol marbut mal-hrERα għandu jittieħed b’attenzjoni estrema, biex tiġi evitata kwalunkwe kontaminazzjoni tal-bwejriet bil-mess tad-DCC, u għandu jintuża għall-għadd tax-xintillazzjoni.
|
|
22.
|
Il-kundizzjoni tal-ligand jaħraq waħdu tintuża għad-determinazzjoni tad-diżintegrazzjoni fil-minuta (dpm) ta’ [3H]-17β-estradjol miżjud fil-bwejriet tal-assaġġ. Ir-radjuattività għandha tiġi kwantifikata eżatt wara l-preparazzjoni. Dawn il-bwejriet ma għandhomx jiġu inkubati u ma għandhomx jiġu ttrattati b’sospensjoni tad-DCC iżda l-kontenut tagħhom għandu jitwassal direttament fil-fluwidu tax-xintillazzjoni. Dawn il-miżuri juru kemm [3H]-17β-estradjol f’dpms żdied ma’ kull sett ta’ bwejriet għall-irbit totali u għall-irbit mhux speċifiku.
|
Assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
23.
|
L-assaġġ tal-irbit kompetittiv ikejjel l-irbit ta’ konċentrazzjoni waħda ta’ [3H]-17β- estradjol fil-preżenza ta’ konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test. Għandhom jintużaw tliet repliki konkorrenti f’kull konċentrazzjoni fi ħdan sessjoni waħda. Barra minn hekk, għandhom isiru tliet sessjonijiet mhux konkorrenti għal kull sustanza kimika ttestjata. L-assaġġ għandu jsir fi pjastra waħda jew aktar għall-mikrotitraġġ b’96 bwejra.
|
Kontrolli
|
24.
|
Meta jsir l-assaġġ, is-solvent u l-kontrolli konkorrenti (jiġifieri l-estroġenu referenzjarju, il-legant dgħajjef, u dak mhux legant) għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment. Kurvi sħaħ ta’ konċentrazzjoni għall-estroġenu u għall-kontrolli ta’ riferiment (jiġifieri legant dgħajjef u mhux legant) għandhom jintużaw fi pjastra waħda matul kull sessjoni. Il-pjastri l-oħra kollha għandu jkun fihom (i) konċentrazzjoni għolja (spostament massimu, jiġifieri bejn wieħed u ieħor spostament sħiħ tal-ligand radjotikkettat) u medja (bejn wieħed u ieħor l-IC50) ta’ E2 u ta’ legant dgħajjef fi triplikat; (ii) kontroll b’solvent u irbit mhux speċifiku, kull wieħed fi triplikat. Il-proċeduri għat-tħejjija tal-bafer tal-assaġġ, ta’ [3H]-17β-estradjol, ta’ hrERα u tas-soluzzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test huma deskritti fil-fond fil-protokoll CERI (2).
|
Kontrolli tas-solvent:
|
25.
|
Il-kontroll b’solvent jindika li s-solvent ma jinteraġixxix mas-sistema tat-test u jkejjel ukoll l-irbit totali (TB). DMSO hu s-solvent preferut. Inkella, jekk l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli fid-DMSO, jista’ jintuża l-etanol. Il-konċentrazzjoni tad-DMSO fil-bwejriet tal-assaġġ finali għandha tkun ta’ 2,05 % u tista’ tiżdied sa 2,5 % fil-każ ta’ nuqqas ta’ solubbiltà tas-sustanza kimika tat-test. Konċentrazzjonijiet ta’ DMSO ogħla minn 2,5 % ma għandhomx jintużaw minħabba l-interferenza ta’ konċentrazzjonijiet ogħla tas-solvent mal-assaġġ. Għal sustanzi kimiċi tat-test li ma jkunux solubbli fid-DMSO, iżda solubbli fl-etanol, jista’ jintuża massimu ta’ 2 % etanol fl-assaġġ mingħajr interferenza.
|
Kontroll bil-bafer:
|
26.
|
Il-kontroll bil-bafer (BC) la għandu jkun fih solvent u lanqas is-sustanza kimika tat-test, iżda għandu jkun fih il-komponenti l-oħra kollha tal-assaġġ. Ir-riżultati tal-kontroll bil-bafer jitqabblu mal-kontroll b’solvent biex jiġi verifikat li s-solvent użat ma jaffettwax is-sistema tal-assaġġ.
|
Legant b’saħħtu (estroġenu ta’ riferiment)
|
27.
|
17β-estradjol (CAS 50-28-2) hu l-ligand endoġenu u jorbot b’affinità għolja mal-ER, subtip tal-alfa. Kurva standard li tuża 17β-estradjol mhux tikkettat għandha titħejja għal kull assaġġ tal-irbit kompetittiv tal-hrERα, biex tkun tista’ ssir valutazzjoni tal-varjabbiltà meta jsir l-assaġġ maż-żmien fi ħdan l-istess laboratorju. Tmien soluzzjonijiet ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat għandhom jitħejjew fid-DMSO u f’bafer tal-assaġġ, b’konċentrazzjonijiet finali fil-bwejriet tal-assaġġ li għandhom jintużaw għall-kurva standard imqassma kif ġej: 10–6, 10–7, 10–8, 10–8,5, 10–9, 10–9,5, 10–10, 10–11 M. L–ogħla konċentrazzjoni ta’ 17β–estradjol (1 μM) mhux tikkettat għandha sservi bħala l-indikatur tal-irbit mhux speċifiku. Din il-konċentrazzjoni hi distinta bit-tikketta “NSB” fit-Tabella 4 għalkemm hi wkoll parti mill-kurva standard.
|
Legant dgħajjef
|
28.
|
Legant dgħajjef (noretinodrel (CAS68-23-5), jew inkella, noretindron (CAS 68-22-4)) għandu jkun inkluż biex tintwera s-sensittività ta’ kull esperiment u tkun tista’ ssir valutazzjoni tal-varjabbiltà meta jsir l-assaġġ maż-żmien. Tmien soluzzjonijiet tal-legant dgħajjef għandhom jitħejjew fid-DMSO u f’bafer tal-assaġġ, b’konċentrazzjonijiet finali fil-bwejriet tal-assaġġ kif ġej: 10–4,5, 10–5,5, 10–6, 10–6,5, 10–7, 10–7,5, 10–8 u 10–9 M.
|
Mhux legant
|
29.
|
L-ottitrietossisilan (OTES, CAS 2943-75-1) għandu jintuża bħala l-kontroll negattiv (mhux legant). Dan jipprovdi garanzija li l-assaġġ kif imwettaq isib sustanzi kimiċi tat-test li ma jorbtux mal-hrERα. Tmien soluzzjonijiet tal-mhux legant għandhom jitħejjew fid-DMSO u f’bafer tal-assaġġ, b’konċentrazzjonijiet finali fil-bwejriet tal-assaġġ kif ġej: 10–3,10–4, 10–5, 10–6, 10–7, 10–8, 10–9, 10–10 M. Il–ftalat tad–di–n–butil (DBP, CAS 84-72-2) jista’ jintuża bħala mhux legant alternattiv, iżda jiġi ttestjat sa 10–4M biss. Is-solubbiltà massima ta’ DBP fl-assaġġ intweriet li hi 10–4M.
|
Konċentrazzjoni tal-hrERα
|
30.
|
Għandu jintuża l-ammont tar-riċettur li jagħti l-irbit speċifiku ta’ 40±10 % (ara l-paragrafi 12-13 tal-Appendiċi 3). Is-soluzzjoni ta’ hrERα għandha titħejja b’dilwizzjoni tal-hrERα funzjonali f’bafer tal-assaġġ kiesaħ silġ, eżatt qabel l-użu.
|
[3H]-17β-estradjol
|
31.
|
Il-konċentrazzjoni finali ta’ [3H]-17β-estradjol fil-bwejriet tal-assaġġ għandha tkun ta’ 0,5 nM.
|
Sustanzi Kimiċi tat-Test
|
32.
|
L-ewwel nett, hemm bżonn li jsir test tas-solubbiltà biex jiġi determinat il-limitu tas-solubbiltà għal kull sustanza kimika tat-test u biex tiġi identifikata l-medda ta’ konċentrazzjoni xierqa li għandha tintuża meta jsir il-protokoll tat-test. Il-limitu tas-solubbiltà ta’ kull sustanza kimika tat-test għandu jiġi determinat inizjalment fis-solvent u mbagħad jiġi kkonfermat b’mod ulterjuri fil-kundizzjonijiet tal-assaġġ. Il-konċentrazzjoni finali ttestjata fl-assaġġ ma għandhiex taqbeż il-1mM. L-ittestjar għas-sejbien tal-medda jinkludi kontroll b’solvent flimkien ma’ tal-anqas tmien dilwizzjonijiet serjali tal-log, li jibdew bil-konċentrazzjoni massima aċċettabbli (eż. 1 mM jew anqas, fuq il-bażi tal-limitu tas-solubbiltà), u l-preżenza ta’ dardir jew ta’ preċipitat innotat (ara wkoll il-paragrafu 35 tal-Appendiċi 3). Ladarba tiġi determinata l-medda ta’ konċentrazzjonijiet, sustanza kimika tat-test għandha tiġi ttestjata bl-użu ta’ tmien konċentrazzjonijiet tal-log spazjati kif xieraq kif definit fit-test preċedenti tas-sejbien tal-medda. Il-konċentrazzjonijiet ittestjati fit-tieni u fit-tielet esperimenti għandhom jiġu aġġustati ulterjorment kif xieraq biex tiġi karatterizzata aħjar il-kurva konċentrazzjoni rispons, jekk ikun hemm bżonn.
|
|
33.
|
Id-dilwizzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandhom jitħejjew fis-solvent xieraq (ara l-paragrafu 25 tal-Appendiċi 3). Jekk l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli fid-DMSO jew fl-etanol, u ż-żieda ta’ aktar solvent tkun tirriżulta f’konċentrazzjoni tas-solvent ogħla mil-limitu aċċettabbli fit-tubu finali, l-ogħla konċentrazzjoni tista’ titnaqqas għall-anqas konċentrazzjoni li jmiss. F’dan il-każ, konċentrazzjoni addizzjonali tista’ tiżdied fil-limitu inferjuri tas-serje ta’ konċentrazzjonijiet. Konċentrazzjonijiet oħra fis-serje għandhom jibqgħu l-istess.
|
|
34.
|
Is-soluzzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandhom jiġu ssorveljati bir-reqqa meta jiżdiedu mal-bwejra tal-assaġġ, peress li s-sustanza kimika tat-test tista’ tfur barra maż-żieda fil-bwejra tal-assaġġ. Id-data għall-bwejriet kollha li fihom il-preċipitat għandha tkun eskluża mid-dħul ta’ kurva, u r-raġuni għall-esklużjoni tad-data għandha tiġi nnotata.
|
|
35.
|
Jekk hemm informazzjoni eżistenti preċedenti minn sorsi oħra li jipprovdu log(IC50) ta’ sustanza kimika tat-test, jista’ jkun xieraq li d-dilwizzjonijiet jitqassmu ġeometrikament aktar qrib tal-log(IC50) mistenni (jiġifieri 0,5 unitajiet tal-log). Ir-riżultati finali għandhom juru biżżejjed tifrix tal-konċentrazzjonijiet fuq iż-żewġ naħat tal-log(IC50), inklużi l-“quċċata” u l-“qiegħ”, b’tali mod li l-kurva tal-irbit tkun tista’ tiġi karatterizzata b’mod adegwat.
|
Organizzazzjoni tal-pjastra tal-assaġġ
|
36.
|
Il-pjastri għall-mikrotitraġġ tikkettatti għandhom jitħejjew bl-użu ta’ inkubazzjonijiet sestupli għall-kontroll b’solvent, bl-ogħla konċentrazzjoni tal-estroġenu referenzjarju (E2) li sservi wkoll bħala l-indikatur tal-irbit mhux speċifiku (NSB), bil-kontroll b’bafer, u inkubazzjonijiet triplikati għal kull waħda mit-tmien konċentrazzjonijiet tal-kontroll li ma jorbotx (ottiltrietossisilan), bis-seba’ konċentrazzjonijiet inferjuri għall-estroġenu referenzjarju (E2), bit-tmien konċentrazzjonijiet tal-legant dgħajjef (noretinodrel jew noretindron), u bit-tmien konċentrazzjonijiet ta’ kull sustanza kimika tat-test (TC). Tifsila indikattiva tad-dijagramma tat-tifsila tal-pjastra għall-kurvi sħaħ tal-konċentrazzjoni għall-estroġenu u għall-kontrolli referenzjarji hi mogħtija hawn taħt fit-Tabella 4. Jintużaw pjastri addizzjonali għall-mikrotitraġġ għas-sustanza kimika tat-test u dawn għandu jkun fihom kontrolli tal-pjastra (jiġifieri (i) konċentrazzjoni għolja (spostament massimu) u medja (madwar l-IC50) ta’ E2 u legant dgħajjef fi triplikat; ii) kontroll b’solvent (bħala rbit totali) u irbit mhux speċifiku, kull wieħed f’sestuplu (Tabella 5). Eżempju ta’ worksheet tat-tifsila tal-pjastra għall-mikrotitraġġ tal-assaġġ kompetittiv bl-użu ta’ tliet sustanzi kimiċi tat-test mhux magħrufa hu pprovdut fl-Appendiċi 3.3. Il-konċentrazzjonijiet indikati fil-worksheet kif ukoll fit-Tabelli 4 u 5 jirreferu għall-konċentrazzjonijiet finali użati f’kull bwejra tal-assaġġ. Il-konċentrazzjoni massima għall-E2 għandha tkun ta’ 1×10-7 M u għal-legant dgħajjef għandha tintuża l-ogħla konċentrazzjoni użata għal-legant dgħajjef fil-pjastra 1. Il-konċentrazzjoni tal-IC50 trid tiġi determinata mil-laboratorju fuq il-bażi tal-bażi ta’ data tal-kontroll storiku tiegħu. L-aspettattia hi li dan il-valur ikun simili għal dak osservat fl-istudji ta’ validazzjoni (ara t-tabella 1).
|
Tabella 4
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv, Kurvi Sħaħ ta’ Konċentrazzjoni għal Estroġenu u għal Kontrolli Referenzjarji (Pjastra 1)
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
Kontroll bil-Bafer u Kontroll Pożittiv (E2)
|
Pożittiv Dgħajjef (Noretinodrel)
|
Kontroll Negattiv (OTES)
|
TB u NSB
|
|
A
|
Inbjank (*14)
|
1×10–9 M
|
1×10–10 M
|
TB (kontroll b’solvent) (2,05 % DMSO)
|
|
B
|
E2 (1×10–11 M)
|
1×10–8 M
|
1×10–9 M
|
|
C
|
E2 (1×10–10 M)
|
1×10–7,5 M
|
1×10–8 M
|
NSB (10–6 M E2)
|
|
D
|
E2 (1×10–9,5 M)
|
1×10–7 M
|
1×10–7 M
|
|
E
|
E2 (1×10–9 M)
|
1×10–6,5 M
|
1×10–6 M
|
Kontroll bil–bafer
|
|
F
|
E2 (1×10–8,5 M)
|
1×10–6 M
|
1×10–5 M
|
|
G
|
E2 (1×10–8 M)
|
1×10–5,5 M
|
1×10–4 M
|
Inbjank (għal dak jaħraq) (*15)
|
|
H
|
E2 (1×10–7 M)
|
1×10–4,5 M
|
1×10–3 M
|
Tabella 5
Tifsila tal-Pjastra għall-Mikrotitraġġ tal-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv, Pjastri Addizzjonali għas-Sustanzi Kimiċi tat-Test (TC) u għall-Kontrolli tal-Pjastri.
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
Sustanza Kimika tat-Test-1 (TC-1)
|
Sustanza Kimika tat-Test-2 (TC-2)
|
Sustanza Kimika tat-Test-3 (TC-3)
|
Kontrolli
|
|
A
|
TC-1 (1×10–10 M)
|
TC-2 (1×10–10 M)
|
TC-3 (1×10–10 M)
|
E2 (1×10–7M)
|
|
B
|
TC-1 (1×10–9 M)
|
TC-2 (1×10–9 M)
|
TC-3 (1×10–9 M)
|
E2 (IC50)
|
|
C
|
TC-1 (1×10–8 M)
|
TC-2 (1×10–8 M)
|
TC-3 (1×10–8 M)
|
NE (1×10
–4,5
M)
|
|
D
|
TC-1 (1×10–7 M)
|
TC-2 (1×10–7 M)
|
TC-3 (1×10–7 M)
|
NE (IC50)
|
|
E
|
TC-1 (1×10–6 M)
|
TC-2 (1×10–6 M)
|
TC-3 (1×10–6 M)
|
NSB (10–6 M E2)
|
|
F
|
TC-1 (1×10–5 M)
|
TC-2 (1×10–5 M)
|
TC-3 (1×10–5 M)
|
|
G
|
TC-1 (1×10–4 M)
|
TC-2 (1×10–4 M)
|
TC-3 (1×10–4 M)
|
TB (Kontroll b’solvent)
|
|
H
|
TC-1 (1×10–3 M)
|
TC-2 (1×10–3 M)
|
TC-3 (1×10–3 M)
|
|
F’dan l-eżempju, il-legant dgħajjef hu noretinodrel (NE)
|
Tlestija tal-assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
37.
|
Bwejriet tal-eċċezzjonar għall-irbit totali u inbjanki (għall-jaħarqu), kif murija fit-Tabella 6, 50 μl tal-bafer tal-assaġġ għandhom jitqiegħdu f’kull bwejra, u għandhom jitħalltu ma’ 10 μl kontroll b’solvent, estroġenu referenzjarju (E2), legant dgħajjef, mhux legant, u sustanzi kimiċi tat-test, rispettivament, 10 μl ta’ soluzzjoni ta’ 5 nM [3H]-17β-estradjol. Imbagħad, soluzzjoni ta’ 30μl riċettur kiesaħ silġ iddaħħlet f’kull pjastra u tħalltet bil-galbu. Is-soluzzjoni tal-hrERα għandha tkun l-aħħar reaġent miżjud. Il-pjastri għall-mikrotitraġġ tal-assaġġ għandhom jiġu inkubati f’temperatura ambjentali (22° sa 28°C) għal sagħtejn (2).
Tabella 6
Volum tal-Komponenti tal-Assaġġ għall-Assaġġ tal-Irbit Kompetittiv tal-hrER, Pjastri għall-Mikrotitraġġ
|
Stadji tal-Preparazzjoni
|
Għajr bwejriet tat-TB
|
Bwejriet tat-TB
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
|
Volum tal-komponenti għall-bwejriet ta’ reazzjoni ta’ fuq u l-ordni għaż-żieda
|
Bafer tal-assaġġ f’Temperatura Ambjentali
|
50 μl
|
60 μl
|
90 μl
|
|
E2 mhux tikkettat, legant dgħajjef, mhux legant, solvent u sustanzi kimiċi tat-test (*16)
|
10 μl
|
-
|
-
|
|
[3H]-17β-estradjol għall-kisba tal-konċentrazzjoni finali ta’ 0,5 nM (jiġifieri 5 nM)
|
10 μl
|
10 μl
|
10 μl
|
|
konċentrazzjoni tal-rERα kif determinata (ara l-paragrafi 12-13)
|
30 μl
|
30 μl
|
-
|
|
Volum totali f’kull bwejra tal-assaġġ
|
100 μl
|
100 μl
|
100 μl
|
|
|
38.
|
Imbagħad għandha ssir il-kwantifikazzjoni ta’ [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα, wara separazzjoni ta’ [3H]-17β-Estradjol marbut mal-hrERα minn [3H]-17β-Estradjol ħieles billi tiżdied sospensjoni ta’ 100 μl DCC kiesaħ silġ f’kull bwejra, kif deskritt fil-paragrafi 21-23 tal-Appendiċi 3 għall-assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni.
|
|
39.
|
Il-bwejriet G10-12 u H10-12 (identifikati bħala inbjank (għal dawk jaħarqu) fit-Tabella 4) jirrappreżentaw id-dpms tal-estradjol tikkettat [3H] f’10 μl. L-alikwota ta’ 10 μl għandha titwassal direttament fil-fluwidu ta’ xintillazzjoni.
|
Kriterji ta’ aċċettabbiltà
Assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni
|
40.
|
Il-kurva tal-irbit speċifiku għandha tilħaq plateau hekk kif jintużaw konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ [3H]-17β-estradjol, li tindika saturazzjoni tal-hrERα bil-ligand.
|
|
41.
|
Il-ligand speċifiku f’0,5 nM [3H]-17β-estradjol għandu jkun ġewwa l-medda aċċettabbli ta’ 30 % sa 50 % tar-radjuattività totali mkejla medja miżjuda fis-sessjonijiet. Ħruġ ħafif okkażjonali barra minn din il-medda hu aċċettabbli, iżda jekk is-sessjonijiet ikunu konsistentement barra din il-medda jew medda partikolari tkun ferm barra din il-medda, il-konċentrazzjoni tal-proteina għandha tiġi aġġustata u l-assaġġ tas-saturazzjoni għandu jerġa’ jsir.
|
|
42.
|
Id-data għandha tipproduċi plott Scatchard lineari.
|
|
43.
|
L-irbit mhux speċifiku ma għandux ikun eċċessiv. Il-valur għall-irbit mhux speċifiku tipikament għandu jkun ta’ <35 % tal-irbit totali. Madankollu, il-proporzjon jista’ kultant jaqbeż dan il-limitu meta titkejjel dpm baxxa ħafna għall-anqas konċentrazzjoni ta’ 17β-estradjol radjotikkettat ittestjat.
|
Assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
44.
|
Konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ 17β-estradjol mhux tikkettat għandhom jispostaw [3H]-17β-estradjol mir-riċettur b’mod konsistenti b’irbit kompetittiv f’sit wieħed.
|
|
45.
|
Il-valur tal-IC50 għall-estroġenu ta’ riferiment (jiġifieri 17β-estradjol) għandu jkun bejn wieħed u ieħor daqs il-konċentrazzjoni molari ta’ [3H]-17β-estradjol flimkien ma’ Kd determinat mill-assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni.
|
|
46.
|
L-irbit speċifiku totali għandu jkun konsistentement fi ħdan il-medda aċċettabbli ta’ 40 ± 10 % meta l-konċentrazzjoni mkejla medja tar-radjuattività totali miżjuda f’kull bwejra tkun ta’ 0,5 nM fis-sessjonijiet. Ħruġ ħafif okkażjonali barra minn din il-medda hu aċċettabbli, iżda jekk is-sessjonijiet ikunu konsistentement barra din il-medda jew medda partikolari tkun ferm barra din il-medda, il-konċentrazzjoni tal-proteina għandha tiġi aġġustata.
|
|
47.
|
Is-solvent ma għandux ibiddel is-sensittività jew ir-riproduċibbiltà tal-assaġġ. Ir-riżultati tal-kontroll bis-solvent (bwejriet tat-TB) jitqabblu mal-kontroll bil-bafer biex jiġi verifikat li s-solvent użat ma jaffettwax is-sistema tal-assaġġ. Ir-riżultati tat-TB u tal-kontroll bil-Bafer għandhom ikunu komparabbli jekk ma jkun hemm ebda effett tas-solvent fuq l-assaġġ.
|
|
48.
|
Il-mhux legant ma għandux jisposta aktar minn 25 % tal-[3H]-17β-estradjol mill-hrERα meta jiġi ttestjat sa 10–3 M (OTES) jew 10–4 M (DBP).
|
|
49.
|
Il-kriterji tal-prestazzjoni ġew żviluppati għall-estroġenu ta’ referenza u għal żewġ leganti dgħajfin (eż. noretinodrel, noretindron) bl-użu tad-data mill-istudju ta’ validazzjoni għall-Assaġġ CERI tal-Irbit tal-hrER (Anness N ta’ riferiment 2). L-intervalli ta’ kunfidenza ta’ 95 % huma pprovduti għal ± SD (n) tas-sessjonijiet tal-kontroll kollha bejn erba’ laboratorji li ħadu sehem fl-istudju ta’ validazzjoni. L-intervalli ta’ kunfidenza ta’ 95 % ġew ikkalkolati għall-parametri ta’ dħul ta’ kurva (jiġifieri l-quċċata, il-qiegħ, Hillslope u Log IC50) għall-estroġenu referenzjarju u għal-leganti dgħajfin, għal-Log10RBA tal-leganti dgħajfin relattivi għall-estroġenu referenzjarju. It-Tabella 1 tipprovdi l-meded mistennija għall-parametri ta’ dħul ta’ kurva li jistgħu jintużaw bħala kriterji tal-prestazzjoni. Fil-prattika, il-medda tal-IC50 tista’ tvarja ftit fuq il-bażi tal-Kd derivat minn esperimenti tal-preparazzjoni tar-riċettur u tal-konċentrazzjoni tal-ligand użati għall-assaġġ.
|
|
50.
|
Ma ġie żviluppat ebda kriterju tal-prestazzjoni għall-parametri ta’ dħul ta’ kurva għas-sustanzi kimiċi tat-test minħabba l-firxa vasta ta’ sustanzi kimiċi tat-test potenzjali eżistenti u l-varjazzjoni fl-affinitajiet u fl-eżiti potenzjali (eż. Kurva sħiħa, kurva parzjali, ebda dħul ta’ kurva). Madankollu, għandu jiġi applikat ġudizzju professjonali meta jiġu rieżaminati r-riżultati minn kull sessjoni għal kull sustanza kimika tat-test. Medda suffiċjenti ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandha tintuża biex tiġi definita biċ-ċar il-quċċata (eż. 90 - 100 % tal-irbit) tal-kurva kompetittiva. Il-varjabbiltà bejn ir-repliki f’kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test kif ukoll bejn it-tliet sessjonijiet mhux konkorrenti għandha tkun raġonevoli u xjentifikament difendibbli. Il-kontrolli minn kull sessjoni għal sustanza kimika tat-test għandhom joqorbu lejn il-kejlijiet tal-prestazzjoni rrapportati għal dan l-assaġġ CERI u jkunu konsistenti mad-data storika tal-kontrolli minn kull laboratorju rispettiv.
|
ANALIŻI TAD-DATA
Assaġġ tal-irbit tas-saturazzjoni
|
51.
|
Jitkejjel l-irbit totali kif ukoll dak mhux speċifiku. Minn dawn il-valuri, l-irbit speċifiku tal-konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ [3H]-17β-estradjol f’kundizzjonijiet ta’ ekwilibriju jiġi kkalkolat bit-tnaqqis tal-mhux speċifiku mit-total. Graff tal-irbit speċifiku kontra l-konċentrazzjoni ta’ [3H]-17β-estradjol għandha tilħaq plateau għall-irbit speċifiku massimu li tindika saturazzjoni tal-hrERα bl-[3H]-17β-estradjol. Barra minn hekk, l-analiżi tad-data għandha tiddokumenta l-irbit ta’ [3H]-17β- estradjol ma’ sit ta’ rbit wieħed b’affinità għolja. L-irbit mhux speċifiku, totali u speċifiku għandu jintwera fuq kurva tal-irbit tas-saturazzjoni. Analiżi ulterjuri ta’ din id-data għandha tuża analiżi ta’ rigressjoni mhux lineari (eż. BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) b’wiri finali tad-data bħala plot Scatchard.
|
|
52.
|
L-analiżi tad-data għandha tiddetermina l-Bmax u l-Kd mid-data dwar l-irbit totali biss, bl-użu tas-suppożizzjoni li l-irbit mhux speċifiku hu lineari, sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni għall-użu ta’ metodu differenti. Barra minn hekk, ir-rigressjoni robusta għandha tintuża meta jiġi determinat l-aħjar dħul sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni. Il-metodu magħżul għar-rigressjoni robusta għandu jiġi ddikjarat. Il-korrezzjoni għat-tnaqqis tal-ligand (eż. bl-użu tal-metodu ta’ Swillens 1995) dejjem għandha tintuża meta jiġu determinati l-Bmax u l-Kd mid-data dwar l-irbit tas-saturazzjoni.
|
Assaġġ tal-irbit kompetittiv
|
53.
|
Il-kurva tal-irbit kompetittiv tiġi plottjata bħala irbit speċifiku ta’ [3H]-17β-estradjol kontra l-konċentrazzjoni (unitajiet tal-log10) tal-kompetitur. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tinibixxi 50 % tal-irbit speċifiku massimu ta’ [3H]-17β hi l-valur tal-IC50.
|
|
54.
|
Stimi tal-valuri tal-log (IC50) għall-kontrolli pożittivi (eż. estroġenu referenzjarju u legant dgħajjef) għandhom jiġu determinati bl-użu ta’ softwer xieraq ta’ dħul ta’ kurva nonlineari għad-dħul f’ekwazzjoni ta’ Hill b’erba’ parametri (eż. BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995). Il-quċċata, il-qiegħ, il-pendil u l-log(IC50) ġeneralment għandhom jitħallew mhux ristretti meta jiddaħħlu dawn il-kurvi. Ir-rigressjoni robusta għandha tintuża meta jiġi determinat l-aħjar dħul sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni. Ma għandhiex tintuża korrezzjoni għat-tnaqqis tal-ligand. Wara l-analiżi inizjali, kull kurva tal-irbit għandha tiġi rieżaminata biex jiġi żgurat dħul xieraq fil-mudell. L-affinità relattiva għall-irbit (RBA) għal-legant dgħajjef għandha tiġi kkalkolata bħala perċentwal tal-log (IC50) għal-legant dgħajjef relattiv għal-log (IC50) għal 17β-estradjol. Ir-riżultati mill-kontrolli pożittivi u mill-kontroll mhux legant għandhom jiġu evalwati bl-użu tal-miżuri tal-prestazzjoni tal-assaġġ fil-paragrafi 44-49 ta’ dan l-Appendiċi 3.
|
|
55.
|
Id-data għas-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandha tiġi analizzata bl-użu ta’ approċċ skont l-istadju biex jiġi żgurat li d-data tiġi analizzata kif xieraq u li kull kurva tal-irbit kompetittiv tiġi klassifikata kif suppost. Hu rakkomandat li kull sessjoni għal sustanza kimika tat-test għall-ewwel issirilha analiżi tad-data standardizzata li tkun identika għal dik użata għall-estroġenu referenzjarju u għall-kontrolli tal-legant dgħajjef (ara l-paragrafu 54 ta’ dan l-Appendiċi 3). Ladarba titlesta, għandhom isiru rieżami tekniku tal-parametri ta’ dħul tal-kurva kif ukoll rieżami viżwali ta’ kemm qed tidħol sew id-data fil-kurva tal-irbit kompetittiv ġenerata għal kull sessjoni. Matul dan ir-rieżami tekniku, l-osservazzjonijiet ta’ tnaqqis dipendenti fuq il-konċentrazzjoni fil-perċentwal ta’ [3H]-17β-estradjol marbut b’mod speċifiku, varjabbiltà baxxa fost ir-repliki tekniċi f’kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, u l-konsistenza fil-parametri mdaħħla fost it-tliet sessjonijiet huma indikazzjoni tajba li l-assaġġ u l-analiżijiet tad-data saru kif suppost.
|
Interpretazzjoni tad-data
|
56.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà, sustanza kimika tat-test titqies li tkun legant għall-hrERα jekk kurva tal-irbit tkun tista’ tiddaħħal u l-anqas punt fil-kurva tar-rispons fi ħdan il-medda tad-data jkun anqas minn 50 % (Figura 1).
|
|
57.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li mhix legant għall-hrERα jekk:
|
—
|
Kurva tal-irbit tkun tista’ tiddaħħal u l-anqas punt fil-kurva tar-rispons imdaħħla fi ħdan il-medda tad-data jkun ogħla minn 75 %, jew
|
|
—
|
Kurva tal-irbit ma tkunx tista’ tiddaħħal u l-anqas irbit perċentwali medju mhux illixxat fost il-gruppi ta’ konċentrazzjoni fid-data jkun ogħla minn 75 %.
|
|
|
58.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test jitqiesu ekwivoċi jekk ma tiġi ssodisfata l-ebda waħda mill-kundizzjonijiet ta’ hawn fuq (eż. l-anqas punt fil-kurva tar-rispons imdaħħla jkun bejn 76 – 51 %).
|
Tabella 7
Kriterji għall-assenjazzjoni tal-klassifikazzjoni fuq il-bażi tal-kurva tal-irbit kompetittiv għal sustanza kimika tat-test.
|
Klassifikazzjoni
|
Kriterji
|
|
Leganta
|
Kurva tal-irbit tista’ tiddaħħal.
L-anqas punt fil-kurva tar-rispons fi ħdan il-medda tad-data hu anqas minn 50 %.
|
|
Mhux Legantb
|
Jekk tista’ tiddaħħal kurva tal-irbit,
l-anqas punt fil-kurva tar-rispons imdaħħla fi ħdan il-medda tad-data hu akbar minn 75 %.
Jekk ma tistax tiddaħħal kurva tal-irbit,
l-anqas irbit perċentwali medju mhux illixxat fost il-gruppi ta’ konċentrazzjoni fid-data hu ogħla minn 75 %.
|
|
Ekwivoċic
|
Kwalunkwe sessjoni li tista’ tiġi ttestjata la hi legant u lanqas mhux legant
(eż. L-anqas punt fil-kurva mdaħħla tar-rspons hu bejn 76 – 51 %).
|
Figura 1
Eżempji ta’ klassifikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test bl-użu ta’ kurva tal-irbit kompetittiv.
|
59.
|
Diversi sessjonijiet imwettqa fi ħdan laboratorju għal sustanza kimika tat-test jiġu kombinati bl-assenjazzjoni ta’ valuri numeriċi għal kull sessjoni u bit-teħid tal-medja bejn is-sessjonijiet kif muri fit-Tabella 8. Ir-riżultati għas-sessjonijiet kombinati fi ħdan kull laboratorju jitqabblu mal-klassifikazzjoni mistennija għal kull sustanza kimika tat-test.
|
Tabella 8
Il-metodu għall-klassifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bl-użu ta’ diversi sessjonijiet fi ħdan laboratorju
|
Biex jiġi assenjat valur għal kull sessjoni:
|
|
Klassifikazzjoni
|
Valur Numeriku
|
|
Legant
|
2
|
|
Ekwivoċi
|
1
|
|
Mhux legant
|
0
|
|
Biex tiġi klassifikata medja ta’ valur numeriku fuq diversi sessjonijiet:
|
|
Klassifikazzjoni
|
Valur Numeriku
|
|
Legant
|
Medja ≥ 1,5
|
|
Ekwivoċi
|
0,5 ≤ Medja < 1,5
|
|
Mhux legant
|
Medja < 0,5
|
RAPPORT TAT-TEST
|
60.
|
Ara l-paragrafu 24 ta’ “KOMPONENTI TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT TAL-hrER” ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
|
Appendiċi 3.1
LISTA TA’ TERMINI
[3H]E2
: 17β-Estradjol radjotikkettat bi tritju
DCC
: Faħam miksi bid-dekstran
E2
: 17β-estradjol mhux tikkettat (inert)
Bafer tal-assaġġ
: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, li fih 1 mM EDTA, 1mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 % Gliċerol, 0,2 mM Lewpeptina, 1 mM Ditjotreitol u 10 mg/ml Albumina tas-Serum tal-Bovini
hrERα
: Riċettur alfa tal-estroġenu rikombinanti uman (dominju li jorbot tal-ligand)
Replika
: Waħda mid-diversi bwejriet li jkun fihom l-istess kontenut fl-istess konċentrazzjonijiet u li jiġu ttestjati b’mod konkorrenti fi ħdan sessjoni waħda. F’dan il-protokoll, kull konċentrazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test tiġi ttestjata fi triplikat; jiġifieri, hemm tliet repliki li jiġu assaġġati fl-istess ħin f’kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.
Sessjoni
: Sett sħiħ ta’ bwejriet ta’ assaġġ ta’ pjastra għall-mikrotitraġġ f’sessjoni konkorrenti li jipprovdi l-informazzjoni neċessarja kollha biex jiġi karatterizzat l-irbit ta’ sustanza kimika tat-test mal-hrERα (viz., it-total [3H]-17β-estradjol miżjud fil-bwejra tal-assaġġ, l-irbit massimu ta’ [3H]-17β-estradjol mal-hrERα, l-irbit mhux speċifiku, u l-irbit totali f’diversi konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test). Sessjoni tista’ tikkonsisti fi bwejra tal-assaġġ waħda biss (jiġifieri replika) għal kull konċentrazzjoni, iżda peress li dan il-protokoll jeħtieġ assaġġar fi triplikat, sessjoni waħda tikkonsist fi tliet bwejriet tal-assaġġ għal kull konċentrazzjoni. Barra minn hekk, dan il-protokoll jeħtieġ tliet sessjonijiet indipendenti (jiġifieri mhux konkorrenti) għal kull sustanza kimika.
Appendiċi 3.2
TIFSILA TAL-BWEJRIET TAL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT KOMPETITTIV
|
Pjastra
|
Pożizzjoni
|
Replika
|
Tip ta’ bwejra
|
Kodiċi tal-Bwejra
|
Kodiċi tal-Konċentrazzjoni
|
Konċentrazzjoni Inizjali tal-Kompetitur (M)
|
Stokk tal-hrER (μl)
|
Volum tal-Bafer (μl)
|
Volum tat-Traċċatur (E2 Jaħraq) (μL)
|
Volum mill-pjastra tad-dilwizzjoni (μL)
|
Volum Finali (μl)
|
Konċentrazzjoni Finali tal-Kompetitur (M)
|
|
S
|
A1
|
1
|
Inbjank
|
BK
|
BK1
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
S
|
A2
|
2
|
Inbjank
|
BK
|
BK2
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
S
|
A3
|
3
|
Inbjank
|
BK
|
BK3
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
S
|
B1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S1
|
1,00E-10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-11
|
|
S
|
B2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S1
|
1,00E-10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-11
|
|
S
|
B3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S1
|
1,00E-10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-11
|
|
S
|
C1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S2
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
C2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S2
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
C3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S2
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
D1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S3
|
3,16E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-10
|
|
S
|
D2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S3
|
3,16E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-10
|
|
S
|
D3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S3
|
3,16E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-10
|
|
S
|
E1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S4
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
E2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S4
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
E3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S4
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
F1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S5
|
3,16E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-09
|
|
S
|
F2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S5
|
3,16E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-09
|
|
S
|
F3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S5
|
3,16E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-09
|
|
S
|
G1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S6
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
G2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S6
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
G3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S6
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
H1
|
1
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S7
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
H2
|
2
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S7
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
H3
|
3
|
E2 kiesaħ
|
S
|
S7
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
A4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP1
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
A5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP1
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
A6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP1
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
B4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP2
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
B5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP2
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
B6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP2
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
C4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP3
|
3,16E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-08
|
|
S
|
C5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP3
|
3,16E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-08
|
|
S
|
C6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP3
|
3,16E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-08
|
|
S
|
D4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
E4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP5
|
3,16E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-07
|
|
S
|
E5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP5
|
3,16E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-07
|
|
S
|
E6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP5
|
3,16E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-07
|
|
S
|
F4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
F5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
F6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
G4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP7
|
3,16E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-06
|
|
S
|
G5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP7
|
3,16E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-06
|
|
S
|
G6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP7
|
3,16E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-06
|
|
S
|
H4
|
1
|
noretinodrel
|
NE
|
WP8
|
3,16E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-05
|
|
S
|
H5
|
2
|
noretinodrel
|
NE
|
WP8
|
3,16E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-05
|
|
S
|
H6
|
3
|
noretinodrel
|
NE
|
WP8
|
3,16E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-05
|
|
S
|
A7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
A8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
A9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
B7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
B8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
B9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
C7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
C8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
C9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
D7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
E7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
E8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
E9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
F7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
S
|
F8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
S
|
F9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
S
|
G7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
S
|
G8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
S
|
G9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
S
|
H7
|
1
|
OTES
|
L
|
OTES8DBP7
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
S
|
H8
|
2
|
OTES
|
L
|
OTES88
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
S
|
H9
|
3
|
OTES
|
L
|
OTES8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
S
|
A10
|
1
|
irbit totali
|
TB
|
TB1
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
A11
|
2
|
irbit totali
|
TB
|
TB2
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
A12
|
3
|
irbit totali
|
TB
|
TB3
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
B10
|
4
|
irbit totali
|
TB
|
TB4
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
B11
|
5
|
irbit totali
|
TB
|
TB5
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
B12
|
6
|
irbit totali
|
TB
|
TB6
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
C10
|
1
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S1
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
C11
|
2
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S2
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
C12
|
3
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S3
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
D10
|
4
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S4
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
D11
|
5
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
D12
|
6
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
E10
|
1
|
Kontroll bil-bafer
|
BC
|
BC1
|
—
|
—
|
100
|
—
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
E11
|
2
|
Kontroll bil—bafer
|
BC
|
BC2
|
—
|
—
|
100
|
—
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
E12
|
3
|
Kontroll bil—bafer
|
BC
|
BC3
|
—
|
—
|
100
|
—
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
F10
|
4
|
Kontroll bil—bafer
|
BC
|
BC4
|
—
|
—
|
100
|
—
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
F11
|
5
|
Kontroll bil—bafer
|
BC
|
BC5
|
—
|
—
|
100
|
—
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
F12
|
6
|
Kontroll bil—bafer
|
BC
|
BC6
|
—
|
—
|
100
|
—
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
G10 (*17)
|
1
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
Jaħraq
|
H1
|
—
|
90
|
—
|
10
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
G11 (*17)
|
2
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
Jaħraq
|
H2
|
—
|
90
|
—
|
10
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
G12 (*17)
|
3
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
Jaħraq
|
H3
|
—
|
90
|
—
|
10
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
H10 (*17)
|
4
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
Jaħraq
|
H4
|
—
|
90
|
—
|
10
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
H11 (*17)
|
5
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
Jaħraq
|
H5
|
—
|
90
|
—
|
10
|
—
|
100
|
—
|
|
S
|
H12
|
6
|
Inbjank (għal dak jaħraq)
|
Jaħraq
|
H6
|
—
|
90
|
—
|
10
|
—
|
100
|
—
|
|
P1
|
A1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
B1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
D1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
G1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
H1
|
1
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H2
|
2
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H3
|
3
|
Mhux magħruf 1
|
U1
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
A4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
B4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
D4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
G4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
H4
|
1
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H5
|
2
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H6
|
3
|
Mhux magħruf 2
|
U2
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
A7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
B7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
D7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
G7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
H7
|
1
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H8
|
2
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H9
|
3
|
Mhux magħruf 3
|
U3
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
A10
|
1
|
E2 tal-Kontroll (mass)
|
S
|
E2max1
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-07
|
|
P1
|
A11
|
2
|
E2 tal-Kontroll (mass)
|
S
|
E2max2
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-07
|
|
P1
|
A12
|
3
|
E2 tal-Kontroll (mass)
|
S
|
E2max3
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-07
|
|
P1
|
B10
|
1
|
E2 tal-Kontroll (IC50)
|
S
|
E2IC501
|
E2IC50x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
E2IC50
|
|
P1
|
B11
|
2
|
E2 tal-Kontroll (IC50)
|
S
|
E2IC502
|
E2IC50x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
E2IC50
|
|
P1
|
B12
|
3
|
E2 tal-Kontroll (IC50)
|
S
|
E2IC503
|
E2IC50x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
E2IC50
|
|
P1
|
C10
|
1
|
NE tal-Kontroll (mass)
|
S
|
Nemax1
|
1,00E-3,5
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-4,5
|
|
P1
|
C11
|
2
|
NE tal-Kontroll (mass)
|
S
|
Nemax2
|
1,00E-3,5
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-4,5
|
|
P1
|
C12
|
3
|
NE tal-Kontroll (mass)
|
S
|
Nemax3
|
1,00E-3,5
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-4,5
|
|
P1
|
D10
|
1
|
NE tal-Kontroll (IC50)
|
S
|
NEIC501
|
NEIC50 x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
NEIC50
|
|
P1
|
D11
|
2
|
NE tal-Kontroll (IC50)
|
S
|
NEIC502
|
NEIC50 x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
NEIC50
|
|
P1
|
D12
|
3
|
NE tal-Kontroll (IC50)
|
S
|
NEIC503
|
NEIC50 x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
NEIC50
|
|
P1
|
E10
|
1
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S1
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E11
|
2
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S2
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E12
|
3
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S3
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F10
|
4
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S4
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F11
|
5
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F12
|
6
|
E2 kiesaħ (għoli)
|
NSB
|
S6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
G10
|
1
|
irbit totali
|
TB
|
TB1
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
G11
|
2
|
irbit totali
|
TB
|
TB2
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
G12
|
3
|
irbit totali
|
TB
|
TB3
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
H10
|
4
|
irbit totali
|
TB
|
TB4
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
H11
|
5
|
irbit totali
|
TB
|
TB5
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
H12
|
6
|
irbit totali
|
TB
|
TB6
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
Appendiċi 4
KUNSIDERAZZJONIJIET GĦALL-ANALIŻI TAD-DATA MILL-ASSAĠĠ TAL-IRBIT KOMPETITTIV TAL-HRER
|
1.
|
L-assaġġ tal-irbit kompetittiv tal-hrERα jkejjel l-irbit ta’ konċentrazzjoni waħda ta’ [3H]-17β- estradjol fil-preżenza ta’ konċentrazzjonijiet dejjem akbar ta’ sustanza kimika tat-test. Il-kurva tal-irbit kompetittiv tiġi plottjata bħala irbit speċifiku ta’ [3H]-17β-estradjol kontra l-konċentrazzjoni (unitajiet tal-log10) tal-kompetitur. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tinibixxi 50 % tal-irbit speċifiku massimu ta’ [3H]-17β hi l-IC50.
|
Analiżi tad-Data għall-Estroġenu Referenzjarju u għal-Legant Dgħajjef (1)
|
2.
|
Id-data mis-sessjonijiet tal-kontroll huma trasferomati (jiġifieri l-irbit speċifiku perċentwali ta’ [3H]-17β-estradjol u l-konċentrazzjoni tal-log tas-sustanza kimika tal-kontroll) għall-analiżi ulterjuri. Stimi tal-valuri tal-log (IC50) għall-kontrolli pożittivi (eż. estroġenu referenzjarju u legant dgħajjef) għandhom jiġu determinati bl-użu ta’ softwer xieraq ta’ dħul ta’ kurva nonlineari għad-dħul f’ekwazzjoni ta’ Hill b’erba’ parametri (eż. BioSoft; GraphPad Prism) (2). Il-quċċata, il-qiegħ, il-pendil u l-log(IC50) tipikament jistgħu jitħallew mhux ristretti meta jiddaħħlu dawn il-kurvi. Ir-rigressjoni robusta għandha tintuża meta jiġi determinat l-aħjar dħul sakemm ma tingħatax ġustifikazzjoni. Il-metodu magħżul għar-rigressjoni robusta għandu jiġi ddikjarat. Korrezzjoni għat-tnaqqis tal-ligand ma kinitx meħtieġa għall-assaġġi tal-hrER FW jew CERI, iżda tista’ tiġi kkunsidrata jekk tkun meħtieġa. Wara l-analiżi inizjali, kull kurva tal-irbit għandha tiġi rieżaminata biex jiġi żgurat dħul xieraq fil-mudell. L-affinità relattiva għall-irbit (RBA) għal-legant dgħajjef tista’ tiġi kkalkolata bħala perċentwal tal-log (IC50) għal-legant dgħajjef relattiv għal-log (IC50) għal 17β-estradjol. Ir-riżultati għall-kontrolli pożittivi u għall-kontroll tal-mhux legant għandhom jiġu evalwati bl-użu tal-kejlijiet tal-prestazzjoni tal-assaġġ u tal-kriterji ta’ aċċettabbiltà kif deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar (paragrafu 20), fl-Appendiċi 2 (Assaġġ FW, paragrafi 41-51) u fl-Apendiċi 3 (Assaġġ CERI, paragrafi 41-51). Eżempji ta’ tliet sessjonijiet għall-estroġenu referenzjarju u għal-legant dgħajjef huma murija fil-Figura 1.
|
Figura 1
Eżempji tal-kurvi tal-irbit kompetittiv għall-estroġenu referenzjarju u għal-legant dgħajjef tal-kontroll.
Analiżi tad-Data għas-Sustanzi Kimiċi tat-Test
|
3.
|
Id-data għas-sustanzi kimiċi tat-test kollha għandha tiġi analizzata bl-użu ta’ approċċ skont l-istadju biex jiġi żgurat li d-data tiġi analizzata kif xieraq u li kull kurva tal-irbit kompetittiv tiġi klassifikata kif suppost. Kull sessjoni għal sustanza kimika tat-test għall-ewwel għandha ssirilha analiżi tad-data standardizzata li tkun identika għal dik użata għall-estroġenu referenzjarju u għall-kontrolli tal-legant dgħajjef. Ladarba titlesta, għandhom isiru rieżami tekniku tal-parametri ta’ dħul tal-kurva kif ukoll rieżami viżwali ta’ kemm qed tidħol sew id-data fil-kurva tal-irbit kompetittiv ġenerata għal kull sessjoni. Matul dan ir-rieżami tekniku, l-osservazzjonijiet ta’ tnaqqis dipendenti fuq il-konċentrazzjoni fil-perċentwal ta’ [3H]-17β-estradjol marbut b’mod speċifiku, varjabbiltà baxxa fost ir-repliki tekniċi f’kull konċentrazzjoni kimika, u l-konsistenza fil-parametri mdaħħla fost it-tliet sessjonijiet huma indikazzjoni tajba li l-assaġġ u l-analiżijiet tad-data saru kif suppost. Għandu jiġi applikat ġudizzju professjonali meta jiġu rieżaminati r-riżultati minn kull sessjoni għal sustanza kimika tat-test, u d-data użata biex kull sustanza kimika tat-test tiġi klassifikata bħala legant jew mhux legant għandha tkun xjentifikament difendibbli.
|
|
4.
|
Kultant jista’ jkun hemm eżempji ta’ data li teħtieġ attenzjoni addizzjonali biex tkun tista’ tiġi analizzata u interpretata kif xieraq id-data dwar l-irbit tal-hrER. Studji fil-passat kienu urew każijiet li fihom l-analiżi u l-interpretazzjoni tad-data dwar l-irbit tar-riċettur kompetittiv jistgħu jkunu kumplikati minħabba rpiljar tal-irbit speċifiku perċentwali meta jiġu ttestjati sustanzi kimiċi fl-ogħla konċentrazzjonijiet (Figura 2). Din hi problema magħrufa sew li nstabet meta ntużaw protokolli għal numru ta’ assaġġi tal-irbit tar-riċettur kompetittiv (3). F’dawn il-każijiet, jiġi osservat rispons dipendenti fuq il-konċentrazzjoni f’konċentrazzjonijiet inferjuri, iżda hekk kif il-konċentrazzjoni tal-approċċi tas-sustanza kimika tat-test toqrob lejn il-limitu tas-solubbiltà, l-ispostament ta’ [3H]17β-estradjol ma jkomplix jonqos. F’dawn il-każijiet, id-data għall-konċentrazzjonijiet ogħla tindika li ntlaħaq il-limitu bijoloġiku tal-assaġġ. Pereżempju, dan il-fenomenu ħafna drabi jiġi assoċjati mal-insolubbiltà kimika u mal-preċipitazzjoni f’konċentrazzjonijiet għoljin, jew jista’ jkun ukoll riflessjoni ta’ qbiż tal-kapaċità tal-faħam miksi bid-dekstran biex jinqabad il-ligand radjotikkettat mhux marbut matul il-proċedura ta’ separazzjoni fl-ogħla konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika. L-inklużjoni ta’ dawn il-punti tad-data meta tiddaħħal id-data dwar l-irbit kompetittiv f’kurva sigmojde kultant tista’ twassal għal klassifikazzjoni ħażina tal-potenzjal ta’ rbit tal-ER għal sustanza kimika tat-test (Figura 2). Biex dan jiġi evitat, il-protokoll għall-assaġġi tal-irbit tal-hrER FW u CERI jinkludi għażla li mill-analiżijiet jiġu esklużi punti tad-data fejn il-medja tar-repliki għall-irbit speċifiku perċentwali ta’ [3H]17β-estradjol tkun 10 % jew aktar ogħla mill-medja osservata f’konċentrazzjoni inferjuri (jiġifieri dik li komunement tissejjaħ ir-regola tal-10 %). Din ir-regola tista’ tintuża darba biss għal kurva partikolari, u jrid ikun jifdal data għal tal-anqas sitt konċentrazzjonijiet b’tali mod li tkun tista’ tiġi klassifikata kif suppost il-kurva.
|
Figura 2
Eżempji, Kurvi tal-Irbit Kompetittiv bl-Użu tar-Regola tal-10 % u mingħajr.
|
5.
|
L-użu xieraq tar-regola tal-10 % għall-korrezzjoni ta’ dawn il-kurvi għandu jiġi kkunsidrat bil-galbu u riżervat għal dawk il-każijiet li fihom ikun hemm indikazzjoni b’saħħitha ta’ legant tal-hrER. Matul it-twettiq tal-esperimenti għall-istudju ta’ validazzjoni tal-Assaġġ tal-Irbit tal-hrER FW, ġie osservat li r-regola tal-10 % kultant kellha konsegwenza mhux intenzjonata u imprevista. Is-sustanzi kimiċi li ma interaġixxux mar-riċettur (jiġifieri mhux leganti veri) spiss urew varjabbiltà madwar l-irbit tar-radjoligandi ta’ 100 % li kienet aktar minn 10 % fil-medda ta’ konċentrazzjonijiet ittestjati. Jekk l-anqas valur inzerta kien f’konċentrazzjoni baxxa, id-data mill-konċentrazzjonijiet ogħla kollha potenzjalment setgħet titħassar mill-analiżi bl-użu tar-regola tal-10 %, għalkemm dawk il-konċentrazzjonijiet jistgħu jkunu siewja fl-istabbiliment tal-fatt li s-sustanza kimika mhix legant. Il-Figura 3 turi eżempji li fihom l-użu tar-regola tal-10 % ma tkunx adattata.
|
Figura 3
Eżempji, Data dwar l-Irbit Kompetittiv Fejn l-Użu tar-Regola tal-10 % Ma Jkunx Adattat.
REFERENZI
|
(1)
|
OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 226), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
|
(2)
|
Motulsky H. u Christopoulos A. (2003). The law of mass action, In Fitting Models to Biological Data Using Linear and Non-linear Regression. GraphPad Software Inc., San Diego, CA, pp 187-191. Www.graphpad.com/manuals/Prism4/RegressionBook.pdf
|
|
(3)
|
Laws SC, Yavanhxay S, Cooper RL, Eldridge JC. (2006). Nature of the Binding Interaction for 50 Structurally Diverse Chemicals with Rat Estrogen Receptors. Toxicological Sci. 94(1):46-56.
|
B.71 ASSAĠĠI IN VITRO DWAR IS-SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA LI JINDIRIZZA L-AVVENIMENT EWLIENI FL-ATTIVAZZJONI TAĊ-ĊELLOLI DENDRITIĊI FUQ IL-PERKORS TAL-EŻITU AVVERS (AOP) GĦAS-SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA
INTRODUZZJONI ĠENERALI
Attivazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar ibbażat fuq l-avveniment ewlieni taċ-ċelloli dendritiċi
|
1.
|
Sentizzatur tal-ġilda jirreferi għal sustanza li se twassal għal rispons allerġiku wara kuntatt mal-ġilda kif definit mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU) (1) u mir-Regolament tal-Unjoni Ewropea (UE) 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (100). Hemm qbil ġenerali dwar l-avvenimenti bijoloġiċi ewlenin li jwasslu għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda. L-għarfien kurrenti dwar il-mekkaniżmi kimiċi u bijoloġiċi assoċjati mas-sensitizzazzjoni tal-ġilda nġabar fil-qosor bħala Perkors tal-Eżitu Avvers (AOP) skont il-programm tal-OECD dwar l-AOP (2), li jibda bl-avveniment ta’ tnedija molekulari permezz, l-avvenimenti intermedji sal-effett avvers, jiġifieri dermatite ta’ kuntatt allerġiku. F’dan il-każ, l-avveniment ta’ tnedija molekulari (jiġifieri l-ewwel avveniment ewlieni) hu l-irbit kovalenti tas-sustanzi elettrofiliċi maċ-ċentri nukleofiliċi fil-proteini tal-ġilda. It-tieni avveniment ewlieni f’dan l-AOP iseħħ fil-keratinoċiti u jinkludi risponsi infjammatorji kif ukoll tibdiliet fl-espressjoni tal-ġeni assoċjati mal-pekorsi tas-sinjalar taċ-ċelloli speċifiċi bħall-perkorsi dipendenti fuq l-element ta’ rispons tal-antiossidanti/elettrofili (ARE). It-tielet avveniment ewlieni hu l-attivazzjoni ta’ ċelloli dendritiċi (DC), tipikament ivvalutata bl-espressjoni ta’ markaturi tal-wiċċ taċ-ċelloli, ta’ kemikini u ta’ ċitokini speċifiċi. Ir-raba’ avveniment ewlieni hu l-attivazzjoni u l-proliferazzjoni taċ-ċelloli-T, li hu vvalutat b’mod indirett fl-Assaġġ tal-Linfonodi Lokali (LLNA) (3).
|
|
2.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 442E tal-OECD (2017). Dan jiddeskrivi l-assaġġi in vitro li jindirizzaw il-mekkaniżmi deskritti taħt l-avveniment ewlieni fl-attivazzjoni taċ-ċelloli dendritiċi tal-AOP għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (2). It-TM jinkludi testijiet li għandhom jintużaw għas-sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u dawk li mhumiex sensitizzaturi skont il-GHS tan-NU u s-CLP.
|
|
It-testijiet deskritti f’dan it-TM huma:
|
—
|
It-Test tal-Attivazzjoni tal-Linji ta’ Ċelloli Umani (h-CLAT)
|
|
—
|
It-Test ta’ attivazzjoni tal-linja ta’ ċelloli U937 (U-SENS™)
|
|
—
|
L-Assaġġ tal-Ġene Indikatur Interlewkin-8 (assaġġ IL-8 Luc)
|
|
|
|
3.
|
It-testijiet inklużi f’dan il-metodu ta’ ttestjar u fit-TG korrispondenti tal-OECD jistgħu jvarjaw b’rabta mal-proċedura użata biex jiġu ġenerati d-data u r-riżultati mkejla iżda jistgħu jintużaw b’mod indiskriminat biex jindirizzaw ir-rekwiżiti tal-pajjiżi għar-riżultati tat-testijiet dwar l-Avveniment Ewlieni fuq l-attivazzjoni ta’ ċelloli dendritiċi tal-AOP għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda filwaqt li jittieħed benefiċċju mill-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data tal-OECD.
|
Sfond u prinċipji tat-testijiet inklużi fil-metodu ta’ ttestjar ibbażat fuq l-avvenimenti ewlenin
|
4.
|
Normalment, il-valutazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda kienet tinvolvi l-użu ta’ annimali tal-laboratorju. Il-metodi klassiċi li jużaw fniek tal-indi, it-Test ta’ Massimizzazzjoni tal-Fniek tal-Indi (GMPT) ta’ Magnusson u ta’ Kligman u t-Test Buehler (TM B.6) (4), jistudjaw kemm il-fażi ta’ induzzjoni kif ukoll il-fażi ta’ eliċitazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda. It-testijiet murini, l-LLNA (TM B.42) (3) u ż-żewġ modifiki mhux radjoattivi tiegħu, LLNA: DA (TM B.50) (5) u LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51) (6), ilkoll jivvalutaw ir-rispons tal-induzzjoni b’mod esklużiv, u ġew aċċettati wkoll peress li jagħtu vantaġġ fuq it-testijiet fuq il-ħnieżer tal-indi f’termini tat-trattament xieraq tal-annimali flimkien ma’ kejl oġġettiv tal-fażi ta’ induzzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda.
|
|
5.
|
Dan l-aħħar ġew adottati metodi ta’ ttestjar in chemico u in vitro b’bażi mekkanistika li jindirizzaw l-ewwel avveniment ewlieni (TM B.59; l-Assaġġ Dirett tar-Reattività tal-Peptidi (7)), u t-tieni avveniment ewlieni (TM B.60; Metodu ta’ Ttestjar tal-Luċiferażi ARE-Nrf2 (8)) tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda għall-kontribuzzjoni għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta’ periklu tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi.
|
|
6.
|
Testijiet deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar jew jikkwantifikaw it-tibdil fl-espressjoni tal-markatur(i) tas-superfiċje taċ-ċelloli assoċjat mal-proċess ta’ attivazzjoni tal-monoċiti u d-DC wara l-esponiment għas-sensitizzaturi (eż. CD54, CD86) jew it-tibdiliet fl-espressjoni ta’ IL-8, ċitokina assoċjata mal-attivazzjoni tad-DC. Is-sensitizzaturi tal-ġilda ġew irrapportati li jinduċu l-espressjoni ta’ markaturi tal-membrana taċ-ċelloli bħal CD40, CD54, CD80, CD83, u CD86 minbarra l-induzzjoni ta’ ċitokini proinfjammatorji, bħal IL-1β u TNF-α, u diversi kemokini li jinkludu IL-8 (CXCL8) u CCL3 (9) (10) (11) (12), assoċjati mal-attivazzjoni tad-DC (2).
|
|
7.
|
Madankollu, peress li l-attivazzjoni tad-DC tirrappreżenta biss avveniment ewlieni wieħed tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (2) (13), l-informazzjoni ġenerata bit-testijiet li jkejlu l-markaturi tal-attivazzjoni tad-DC waħedha jaf ma tkunx biżżejjed biex tinħareġ konklużjoni dwar il-preżenza jew l-assenza tal-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi. Għaldaqstant, id-data ġenerata bit-testijiet deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar hi proposta biex issostni d-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP) u dawk li mhumiex sensitizzaturi meta jintużaw fi ħdan Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni (IATA), flimkien ma’ informazzjoni komplimentari rilevanti oħra, eż. derivata minn assaġġi in vitro li jindirizzaw avvenimenti ewlenin oħra tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda kif ukoll metodi mhux tal-ittestjar, li jinkludu read-across minn analogi kimiċi (13). Eżempji tal-użu tad-data ġenerata b’dawn it-testijiet fi ħdan l-Approċċi Definiti, jiġifieir approċċi standardizzati kemm b’rabta mas-sett ta’ sorsi ta’ informazzjoni użati kif ukoll fil-proċedura applikata għad-data biex jinkiseb it-tbassir, ġew ippubblikati (13) u jistgħu jitħaddmu bħala elementi siewja fi ħdan IATA.
|
|
8.
|
It-testijiet deskritti f’dan il-metodu ta’ ttestjar ma jistgħux jintużaw waħedhom, u lanqas biex jissubkategorizzaw is-sensitizzaturi tal-ġilda fis-subkategoriji 1A u 1B kif definiti mill-GHS/mis-CLP tan-NU, għall-awtoritajiet li jimplimentaw dawn iż-żewġ subkategoriji fakultattivi, u lanqas biex titbassar il-potenza għal deċiżjonijiet dwar il-valutazzjonijiet tas-sikurezza. Madankollu, skont il-qafas regolatorju, riżultati pożittivi ġenerati b’dawn il-metodi jistgħu jintużaw waħedhom biex jikklassifikaw sustanza kimika fil-kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP.
|
|
9.
|
It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża f’dan il-metodu ta’ ttestjar biex jirreferi għal dak li jkun qed jiġi ttestjat (101) u mhux b’rabta mal-applikabbiltà tat-testijiet għall-ittestjar ta’ sustanzi monokostitwenti, ta’ sustanzi multikostitwenti u/jew ta’ taħlitiet. Bħalissa hemm disponibbli informazzjoni limitata dwar l-applikabbiltà tat-testijiet għal sustanzi/taħlitiet multikostitwenti (14) (15). It-testijiet xorta waħda huma teknikament applikabbli għall-ittestjar ta’ sustanzi multikostitwenti u taħlitiet. Madankollu, qabel ma jintuża dan il-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex (102). Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. Barra minn hekk, meta jiġu ttestjati sustanzi multikostitwenti jew taħlitiet, għandha tingħata kunsiderazzjoni lill-interferenza possibbli tal-kostitwenti ċitotissiċi bir-risponsi osservati.
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
In-Nazzjonijiet Uniti (2015) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Sixth revised edition. New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponibbli fuq: https://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/06files_e.html.
|
|
(2)
|
OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=ENV/JM/MONO(2012)10/PART1&docLanguage=En.
|
|
(3)
|
Il-Kapitolu B.42 ta’ dan l-Anness: L-Assaġġ tal-Linfonodi Lokali.
|
|
(4)
|
Il-Kapitolu B.6 ta’ dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-Ġilda.
|
|
(5)
|
Il-Kapitolu B.50 ta’ dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-Ġilda. L-Assaġġ tal-Linfonodi Lokali. DA.
|
|
(6)
|
Il-Kapitolu B.51 ta’ dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-Ġilda. L-Assaġġ tal-Linfonodi Lokali. BrdU-ELISA.
|
|
(7)
|
Il-Kapitolu B.59 ta’ dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-Ġilda In Chemico: Assaġġ Dirett tar-Reattività tal-Peptidi (DPRA).
|
|
(8)
|
Il-Kapitolu B.60 ta’ dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-Ġilda In Vitro: Metodu ta’ Ttestjar tal-Luċiferażi ARE-Nrf2.
|
|
(9)
|
Steinman RM. (1991). The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9:271-96.
|
|
(10)
|
Caux C, Vanbervliet B, Massacrier C, Azuma M, Okumura K, Lanier LL, u Banchereau J. (1994). B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med 180:1841-7.
|
|
(11)
|
Aiba S, Terunuma A, Manome H, u Tagami H. (1997). Dendritic cells differently respond to haptens and irritants by their production of cytokines and expression of co-stimulatory molecules. Eur J Immunol 27:3031-8.
|
|
(12)
|
Aiba S, Manome H, Nakagawa S, Mollah ZU, Mizuashi M, Ohtani T, Yoshino Y, u Tagami. H. (2003). p38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinases play distinct roles in the activation of dendritic cells by two representative haptens, NiCl2 and DNCB. J Invest Dermatol 120:390-8.
|
|
(13)
|
OECD (2016). Series on Testing & Assessment No 256: Guidance Document On The Reporting Of Defined Approaches And Individual Information Sources To Be Used Within Integrated Approaches To Testing And Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Anness 1 u Anness 2. ENV/JM/HA(2016)29. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: https://community.oecd.org/community/iatass.
|
|
(14)
|
Ashikaga T, Sakaguchi H, Sono S, Kosaka N, Ishikawa M, Nukada Y, Miyazawa M, Ito Y, NishiyamaN, Itagaki H. (2010). A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests: the human cell-line activation test (h-CLAT) versus the local lymph node assay (LLNA). Altern. Lab. Anim. 38, 275-284.
|
|
(15)
|
Piroird, C., Ovigne, J.M., Rousset, F., Martinozzi-Teissier, S., Gomes, C., Cotovio, J., Alépée, N. (2015). The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29, 901-916.
|
Appendiċi 1
SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IT-TEST TAL-ATTIVAZZJONI TAL-LINJI TA’ ĊELLOLI UMANI (H-CLAT)
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
1.
|
L-h-CLAT jikkwantifika t-tibdiliet fl-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli assoċjati mal-proċess ta’ attivazzjoni tal-monoċiti u taċ-ċelloli dendritiċi (DC) (jiġifieri CD86 u CD54), fil-linja ta’ ċelloli tal-lewkimja monoċitika umana THP-1, wara esponiment għas-sensitizzaturi (1)(2). Il-livelli ta’ espressjoni mkejla tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 u tas-CD54 imbagħad jintużaw għas-sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u n-nonsensitizzaturi.
|
|
2.
|
L-h-CLAT ġie evalwat fi studju ta’ validazzjoni koordinat mil-Laboratorju ta’ Referenza tal-Unjoni Ewropea għal Alternattivi għall-Ittestjar fuq l-Annimali (EURL ECAAM) u f’rieżami bejn il-pari indipendenti sussegwenti mill-Kumitat Konsultattiv Xjentifiku tal-EURL ECVAM (ESAC). B’kunsiderazzjoni tal-evidenza disponibbli kollha u tal-input mir-regolaturi u mill-partijiet ikkonċernati, l-h-CLAT kien rakkomandat mill-EURL ECVAM (3) biex jintuża bħala parti minn IATA b’sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi u n-nonsensitizzaturi għall-fini tal-klassifikazzjoni u tat-tikkettar tal-perikli. Eżempji tal-użu tad-data tal-h-CLAT flimkien ma’ informazzjoni oħra huma rrapportati fid-dokumentazzjoni (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11).
|
|
3.
|
L-h-CLAT wera li kien trasferibbli għal-laboratorji esperjenzati f’tekniki tal-koltura taċ-ċelloli u fl-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. Il-livell ta’ riproduċibbiltà fil-previżjonijiet li jistgħu jkunu mistennija mit-test hu fl-ordni ta’ 80 % fi ħdan il-laboratorji u bejn il-laboratorji (3)(12). Ir-riżultati ġġenerati fl-istudju ta’ validazzjoni (13) u fi studji ppubblikati oħra (14) b’mod ġenerali jindikaw li, meta mqabbla mar-riżultati tal-LLNA, l-akkuratezza fid-distinzjoni tas-sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kat. 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP) min-nonsensitizzaturi hi ta’ 85 % (N=142) b’sensittività ta’ 93 % (94/101) u bi speċifiċità ta’ 66 % (27/41) (fuq il-bażi ta’ analiżi mill-ġdid minn EURL ECVAM (12) b’kunsiderazzjoni tad-data eżistenti kollha u mingħajr ma jiġu kkunsidrati r-riżultati negattivi għal sustanzi kimiċi b’Log Kow akbar minn 3,5 kif deskritt fil-paragrafu (4). Il-previżjonijiet ta’ negattivi foloz bl-h-CLAT għandhom probabbiltà akbar li jikkonċernaw sustanzi kimiċi li juru potenza baxxa sa moderata tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri s-subkategorija 1B tal-GHS tan-NU/tas-CLP) minn sustanzi kimiċi li juru potenza għolja tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri s-subkategorija 1A tal-GHS tan-NU/tas-CLP) (4)(13)(15). Meħuda kollha f’daqqa, din l-informazzjoni tindika l-utilità tal-metodu h-CLAT biex jikkontribwixxi għall-identifikazzjoni tal-perikli ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda. Madankollu, il-valuri tal-akkuratezza mogħtija hawnhekk għall-h-CLAT bħala test waħdu huma indikattivi biss peress li t-test għandu jiġi kkunsidrat flimkien ma’ sorsi oħra ta’ informazzjoni fil-kuntest ta’ IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 7 u 8 fl-Introduzzjoni ġenerali. Barra minn hekk, meta jiġu evalwati metodi mhux fuq l-annimali għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, ta’ min jiftakar li t-test LLNA kif ukoll testijiet oħra fuq l-annimali jaf ma jirriflettux is-sitwazzjoni sħiħa fil-bniedem.
|
|
4.
|
Fuq il-bażi tad-data disponibbli bħalissa, intwera li l-metodu h-CLAT hu applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test li jkopru firxa ta’ gruppi funzjonali organiċi, ta’ mekkaniżmi ta’ reazzjoni, ta’ potenza tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (kif stabbiliti fi studji in vivo) u ta’ proprjetajiet fiżikokimiċi (3)(14)(15). Il-metodu tal-h-CLAT hu applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test solubbli jew li jifformaw dispersjoni stabbli (jiġifieri kollojde jew sospensjoni li fiha s-sustanza kimika tat-test ma tistabbilixxix ruħha u lanqas ma tissepara mis-solvent/mill-veikolu f’fażijiet differenti) f’solvent/veikolu xieraq (ara l-paragrafu 14). Is-sustanzi kimiċi tat-test b’Log Kow akbar minn 3,5 għandhom tendenza li jipproduċu riżultati negattivi foloz (14). Għaldaqstant, riżultati negattivi b’sustanzi kimiċi tat-test b’Log Kow akbar minn 3,5 ma għandhomx jiġu kkunsidrati. Madankollu, riżultati pożittivi miksuba b’sustanzi kimiċi tat-test b’Log Kow akbar minn 3,5 xorta waħda jistgħu jintużaw biex isostnu l-identifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bħala sensitizzatur tal-ġilda. Barra minn hekk, minħabba l-kapaċità metabolika limitata tal-linja ta’ ċelloli użata (16) u minħabba l-kundizzjonijiet tal-esperiment, proapteni (jiġifieri sustanzi li jeħtieġu attivazzjoni enzimatika, pereżempju enzimi P450) u preapteni (jiġifieri sustanzi attivati b’ossidazzjoni) b’mod partikolari dawk b’rata baxxa ta’ ossidazzjoni jistgħu jipprovdu riżultati negattivi wkoll fl-h-CLAT (15). Is-sustanzi kimiċi tat-test fluworexxenti jistgħu jiġu vvalutati bl-h-CLAT (17), iżda sustanzi kimiċi tat-test fluworexxenti b’saħħithom li jeħilsu l-istess tul ta’ mewġa bħal istjoċjanat tal-fluworexxeina (FITC) jew bħala jodur tal-propidju (PI), jinterferixxu mad-detezzjoni ċitometrika tal-fluss u b’hekk ma jistgħux jiġu evalwati kif suppost bl-użu ta’ antikorpi konjugati tal-FITC jew bl-użu tal-PI. F’każ bħal dan, antikorpi oħra taggjati bil-fluworokromu jew markaturi oħra taċ-ċitotossiċità, rispettivament, jistgħu jintużaw dment li jkun jista’ jintwera li jipprovdu riżultati simili bħall-antikorpi taggjati bl-FITC (ara l-paragrafu 24) jew il-PI (ara l-paragrafu 18), eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 1-2. Fid-dawl ta’ dan ta’ hawn fuq, riżultati negattivi għandhom jiġu interpretati fil-kuntest tal-limitazzjonijiet iddikjarati u flimkien ma’ sorsi oħra ta’ informazzjoni fi ħdan il-kuntest tal-IATA. F’każijiet li fihom ikun hemm evidenza li turi n-nuqqas ta’ applikabbiltà tal-metodu h-CLAT għal kategoriji speċifiċi oħra ta’ sustanzi kimiċi tat-test, dan ma għandux jintuża għal dawk il-kategoriji speċifiċi.
|
|
5.
|
Kif deskritt aktar ’il fuq, il-metodu h-CLAT isostni d-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u n-nonsensitizzaturi. Madankollu, għandu l-potenzjal li jikkontribwixxi għall-valutazzjoni tal-potenza ta’ sensitizzazzjoni (4)(5)(9) ukoll meta jintuża f’approċċi integrati bħall-IATA. Minkejja dan, hemm bżonn li jsir aktar xogħol, idealment fuq il-bażi ta’ data mill-bniedem, biex jiġi stabbilit kif ir-riżultati tal-h-CLAT jistgħu jinformaw valutazzjoni tal-potenza.
|
|
6.
|
Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.1.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
7.
|
Il-metodu h-CLAT hu assaġġ in vitro li jikkwantifika t-tibdiliet fl-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli (jiġifieri CD86 u CD54) fuq linja ta’ ċelloli tal-lewkimja monoċitika umana, iċ-ċelloli THP-1, wara esponiment għal 24 siegħa għas-sustanza kimika tat-test. Dawn il-molekuli tas-superfiċje huma markaturi tipiċi ta’ attivazzjoni tat-THP-1 monoċitika u jistgħu jimitaw attivazzjoni tad-DC, li taqdi rwol kritiku fil-priming taċ-ċellola-T. It-tibdiliet fl-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje jitkejlu b’ċitometrija tal-fluss wara tilwin taċ-ċelloli b’antikorpi taggjati bil-fluworokromu. Il-kejl taċ-ċitotossiċità jsir fl-istess ħin ukoll biex jiġi vvalutat jekk s-sovraregolazzjoni tal-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje sseħħx f’konċentrazzjonijiet subċitotossiċi. L-intensità relattiva tal-fluworexxenza tal-markaturi tas-superfiċje mqabbla mal-kontroll b’solvent/b’veikolu hi kkalkolata u tintuża fil-mudell tat-tbassir (ara l-paragrafu 26), b’sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi u n-nonsensitizzaturi.
|
WIRI TAL-PROFIĊJENZA
|
8.
|
Qabel ma jużaw it-test deskritt f’dan l-Appendiċi tal-metodu ta’ ttestjar B.71 bħala rutina, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jużaw l-10 sustanzi ta’ profiċjenza elenkati fl-Appendiċi 1.2. Barra minn hekk, l-utenti tat-test għandhom iżommu bażi ta’ data storika tad-data ġenerata bil-kontrolli tar-reattività (ara l-paragrafu 11) u bil-kontrolli pożittivi u b’solvent/b’veikolu (ara l-paragrafi 20-22), u jużaw din id-data biex jikkonfermaw ir-riproduċibbiltà tat-test fil-laboratorju tagħhom tinżamm maż-żmien.
|
PROĊEDURA
|
9.
|
Dan it-test hu bbażat fuq il-protokoll nru 158 (18) tal-h-CLAT DataBase service on ALternative Methods to animal experimentation (DB-ALM) li jirrappreżenta l-protokoll użat għall-istudju ta’ validazzjoni koordinat mill-EURL ECVAM. Hu rakkomandat li dan il-protokoll jintuża meta jiġi implimentat u jintuża l-metodu h-CLAT fil-laboratorju. Din li ġejja hi deskrizzjoni tal-komponenti u tal-proċeduri ewlenin għall-metodu h-CLAT, li jinvolvi żewġ stadji: assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża u kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54.
|
Tħejjija taċ-ċelloli
|
10.
|
Il-linja ta’ ċelloli tal-lewkimja monoċitika umana, THP-1, għandha tintuża għat-twettiq tal-metodu h-CLAT. Hu rakkomandat li ċ-ċelloli (TIB-202™) jinkisbu minn bank taċ-ċelloli kwalifikat sew, bħall-American Type Culture Collection.
|
|
11.
|
Iċ-ċelloli THP-1 huma kolturati f’37°C f’5 % CO2 u atmosfera umidifikata f’medium RPMI-1640 supplimentat b’10 % serum bovin fetali (FBS), 0,05 mM 2-merkaptoetanol, 100 unità/ml peniċillina u 100 μg/ml streptomiċina. L-użu tal-peniċilina u tal-istreptomiċina fil-medium tat-tkabbir jista’ jiġi evitat. Madankollu, f’każ bħal dan l-utenti għandhom jivverifikaw li l-assenza ta’ antibijotiċi fil-medium tat-tkabbir ma jkollha ebda impatt fuq ir-riżultati, pereżempju billi jittestjaw is-sustanzi ta’ profiċjenza elenkati fl-Appendiċi 1.2. Fi kwalunkwe każ, biex jimminimizzaw ir-riskju ta’ kontaminazzjoni, għandhom jiġu segwiti prattiki tajbin tal-koltura taċ-ċellola indipendentement mill-preżenza jew mill-assenza ta’ antibijotiċi fil-medium tat-tkabbir taċ-ċelloli. Iċ-ċelloli THP-1 jinżergħu bħala rutina kull jumejn/tlieta bid-densità ta’ 0,1 sa 0,2 × 106 ċelloli/ml. Dawn għandhom jinżammu f’densitajiet minn 0,1 sa 1,0 × 106 ċelloli/ml. Qabel ma jintużaw għall-ittestjar, iċ-ċelloli għandhom jiġu kwalifikati billi jsir kontroll tar-reattività. Il-kontroll tar-reattività taċ-ċelloli għandu jsir bl-użu tal-kontrolli pożittivi, it-2,4-dinitroklorobenżen (DNCB) (Nru CAS 97-00-7, ≥ 99 % purità) u s-sulfat tan-nikil (NiSO4) (Nru CAS 10101-97-0, ≥ 99 % purità) u tal-kontroll negattiv, l-aċidu lattiku (LA) (Nru CAS 50-21-5, ≥ 85 % purità), ġimagħtejn wara li jinħallu. Kemm id-DNCB kif ukoll l-NiSO4 għandhom jipproduċu rispons pożittiv tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 kif ukoll CD54, u l-LA għandu jipproduċi rispons negattiv tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 kif ukoll CD54. Huma biss iċ-ċelloli li jgħaddu mill-kontroll tar-reattività li jintużaw għall-assaġġ. Iċ-ċelloli jistgħu jiġu propagati sa xahrejn wara li jinħallu. In-numru tal-passaġġ ma għandux jaqbeż it-30. Il-kontroll tar-reattività għandu jsir skont il-proċeduri deskritti fil-paragrafi 20-24.
|
|
12.
|
Għall-ittestjar, iċ-ċelloli THP-1 jinżergħu f’densità ta’ 0,1 × 106 ċelloli/ml jew ta’ 0,2 × 106 ċelloli/ml, u jiġu prekolturati fi flasks tal-koltura għal 72 siegħa jew għal 48 siegħa, rispettivament. Importanti li d-densità taċ-ċelloli fil-flask tal-koltura eżatt wara l-perjodu ta’ qabel il-koltura tkun konsistenti kemm jista’ jkun f’kull esperiment (billi tintuża waħda miż-żewġ kundizzjonijiet ta’ prekoltura deskritti hawn fuq), għaliex id-densità taċ-ċelloli fil-flask tal-koltura eżatt wara l-prekoltura tista’ taffettwa l-espressjoni ta’ CD86/CD54 indotta minn allerġeni (19). Fil-jum tal-ittestjar, iċ-ċelloli miġbura mill-flask tal-koltura jerġgħu jiġu sospiżi b’medium tat-tkabbir frisk f’2 × 106 ċelloli/ml. Imbagħad, iċ-ċelloli jiġu distribwiti fi pjastra b’qiegħ ċatt b’24 bwejra (500 μl 1 × 106 ċelloli/bwejra) jew fi pjastra b’qiegħ ċatt b’96 bwejra (80 μl 1,6 × 105 ċelloli/bwejra).
|
Assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża
|
13.
|
Assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża jsir għad-determinazzjoni tas-CV75, li hi l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li tirriżulta f’vijabbiltà ta’ 75 % taċ-ċelloli meta mqabbla mal-kontroll b’solvent/b’veikolu. Il-valur tas-CV75 jintuża biex tiġi determinata l-konċentrazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test għall-kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54 (ara l-paragrafi 20-24).
|
Tħejjija tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
14.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test u s-sustanzi tal-kontroll jitħejjew dakinhar tal-ittestjar. Għall-metodu h-CLAT, is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti jew dispersi b’mod stabbli (ara wkoll il-paragrafu 4) f’salina jew f’medium bħala l-ewwel għażliet ta’ solvent/veikolu jew f’sulfossidu tad-dimetil (DMSO, ≥ 99 % purità) bħala t-tieni għażla ta’ solvent/veikolu jekk is-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli jew ma tifformax dispersjoni stabbli fiż-żewġ solventi/veikoli preċedenti, għal konċentrazzjonijiet finali ta’ 100 mg/ml (f’salina jew f’medium) jew ta’ 500 mg/ml (f’DMSO). Solventi/veikoli oħra li mhumiex dawk deskritti hawn fuq jistgħu jintużaw jekk tiġi pprovduta raġuni xjentifika suffiċjenti. L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/fil-veikolu finali għandha tiġi kkunsidrata.
|
|
15.
|
Mis-soluzzjonijiet ewlenin ta’ 100 mg/ml (f’salina jew f’medium) jew ta’ 500 mg/ml (f’DMSO) tas-sustanzi kimiċi tat-test, għandhom jitwettqu l-passi ta’ dilwizzjoni li ġejjin:
|
|
—
|
Għas-salina jew għall-medium bħala solvent/veikolu: Jitħejjew tmien soluzzjonijiet ewlenin (tmien konċentrazzjonijiet), b’dilwizzjonijiet serjali ta’ darbtejn bl-użu tas-solvent/veikolu korrispondenti. Dawn is-soluzzjonijiet ewlenin ikomplu jiġu dilwiti 50 darba f’medium tat-tkabbir (soluzzjonijiet għall-użu). Jekk l-ogħla konċentrazzjoni finali fil-pjastra ta’ 1 000 μg/ml ma tkunx tossika, il-konċentrazzjoni massima għandha terġa’ tiġi determinata billi jsir test ġdid taċ-ċitotossiċità. Il-konċentrazzjoni finali fil-pjastra ma għandhiex taqbeż il-5 000 μg/ml għal sustanzi kimiċi tat-test dissolti jew dispersi b’mod stabbli f’salina jew f’medium.
|
|
—
|
Għal DMSO bħala solvent/veikolu. Jitħejjew tmien soluzzjonijiet ewlenin (tmien konċentrazzjonijiet), b’dilwizzjonijiet serjali ta’ darbtejn bl-użu tas-solvent/veikolu korrispondenti. Dawn is-soluzzjonijiet ewlenin ikomplu jiġu dilwiti 250 darba f’medium tat-tkabbir (soluzzjonijiet għall-użu). Il-konċentrazzjoni finali fil-pjastra ma għandhiex taqbeż l-1 000 μg/ml anki jekk din il-konċentrazzjoni ma tkunx tossika.
|
Is-soluzzjonijiet għall-użu finalment jintużaw għall-esponiment billi jiżdied volum ugwali ta’ soluzzjoni għall-użu fil-volum tas-sospensjoni taċ-ċelloli THP-1 fil-pjastra (ara wkoll il-paragrafu 17) biex tinkiseb dilwizzjoni ulterjuri ta’ darbtejn (normalment, il-medda finali tal-konċentrazzjonijiet fil-pjastra tkun ta’ 7,81–1 000 μg/ml).
|
16.
|
Il-kontroll b’solvent/b’veikolu użat fil-metodu h-CLAT hu l-medium tat-tkabbir (għal sustanzi kimiċi tat-test solubilizzati jew dispersi b’mod stabbli (ara l-paragrafu 4) b’medium jew b’salina) jew DMSO (għal sustanzi kimiċi tat-test solubilizzati jew dispersi b’mod stabbli f’DMSO) ittestjat f’konċentrazzjoni finali waħda fil-pjastra ta’ 0,2 %. Dan issirlu l-istess dilwizzjoni bħal dik deskritta għas-soluzzjonijiet għall-użu fil-paragrafu 15.
|
Applikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
17.
|
Il-medium tat-tkabbir jew is-soluzzjonijiet għall-użu deskritti fil-paragrafi 15 u 16 jitħalltu 1:1 (v/v) mas-sospensjonijiet taċ-ċelloli mħejjija fil-pjastra b’qiegħ ċatt b’24 bwejra jew b’96 bwejra (ara l-paragrafu 12). Imbagħad il-pjastri trattati jiġu inkubati għal 24±0,5 siegħa f’37°C f’5 % CO2. Għandha tingħata attenzjoni biex tiġi evitata l-evaporazzjoni ta’ sustanzi kimiċi tat-test volatili u kontaminazzjoni kroċjata bejn bwejriet minn sustanzi kimiċi tat-test, eż. billi l-pjastra tiġi ssiġillata qabel l-inkubazzjoni bis-sustanzi kimiċi tat-test (20).
|
Tilwin bil-jodur tal-propidju (PI)
|
18.
|
Wara esponiment għal 24±0,5 siegħa, iċ-ċelloli jiġu trasferiti f’tubi tal-kampjun u jinġabru b’ċentfigurazzjoni. Is-supernatanti jintremew u ċ-ċelloli li jifdal jiġu sospiżi mill-ġdid b’200 μl (fil-każ ta’ 96 bwejra) jew b’600 μl (fil-każ ta’ 24 bwejra) salina baferjata bil-fosfat li jkun fiha 0,1 % albumina tas-serum tal-bovini (bafer tat-tilwin). 200 μl sospensjoni taċ-ċelloli tiġi trasferita fi pjastra b’qiegħ għat-tond b’96 bwejra (fil-każ ta’ 96 bwejra) jew f’mikrotubu (fil-każ ta’ 24 bwejra) u tinħasel darbtejn b’200 μl (fil-każ ta’ 96 bwejra) jew b’600 μl (fil-każ ta’ 24 bwejra) ta’ bafer tat-tilwin. Finalment, iċ-ċelloli jerġgħu jiġu sospiżi f’bafer tat-tilwin (eż. 400 μl) u tiżdied soluzzjoni tal-PI (eż. 20 μl) (pereżempju l-konċentrazzjoni finali tal-PI tkun ta’ 0,625 μg/ml). Jistgħu jintużaw markaturi oħra taċ-ċitotossiċità, bħal 7-Amminoaċtinomiċina D (7-AAD), Tripan blu jew oħrajn jekk it-tilwin alternattiv ikun jista’ jintwera li jipprovdi riżultati simili bħall-PI, pereżempju bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 1.2.
|
Kejl taċ-ċitotossiċità b’ċitometrija tal-flus u bi stima tal-valur tas-CV75
|
19.
|
It-teħid tal-PI jiġi analizzat bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss bil-kanal ta’ akkwiżizzjoni FL-3. B’kollox jinkisbu 10 000 ċellola ħajja (negattivi għall-PI). Il-vijabbiltà taċ-ċelloli tista’ tiġi kkalkolata bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja mill-programm ta’ analiżi taċ-ċitometru. Meta l-vijabbiltà taċ-ċelloli tkun baxxa, għandhom jinkisbu sa 30 000 ċellola inklużi ċ-ċelloli mejtin. Inkella, id-data tista’ tinkiseb għal minuta waħda wara t-tnedija tal-analiżi.
Il-valur tas-CV75 (ara l-paragrafu 13), jiġifieri konċentrazzjoni li turi 75 % tas-sopravivenza taċ-ċelloli THP-1 (ċitotossiċità ta’ 25 %), jiġi kkalkolat b’interpolazzjoni lineari tal-log bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
Fejn:
a hu l-valur minimu tal-vijabbiltà taċ-ċelloli ogħla minn 75 %
c hu l-valur massimu tal-vijabbiltà taċ-ċelloli anqas minn 75 %
b u d huma l-konċentrazzjonijiet li juru l-valur tal-vijabbiltà taċ-ċelloli a u c rispettivament
Jistgħu jintużaw approċċi oħra biex tinkiseb is-CV75 dment li jintwera li dawn ma jkollhom ebda impatt fuq ir-riżultati (eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza).
|
Kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54
Tħejjija tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
20.
|
Is-solvent/il-veikolu xieraq (salina, medium jew DMSO; ara l-paragrafu 14) jintuża biex jiddisolvi jew jiddispersa b’mod stabbli is-sustanzi kimiċi tat-test. Is-sustanzi kimiċi tat-test l-ewwel jiġu dilwiti għall-konċentrazzjoni li tikkorrispondi għall-100 darba (għas-salina jew għall-medium) jew għall-500 darba (għal DMSO) tal-1,2 × CV75 determinata fl-assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża (ara l-paragrafu 19). Jekk is-CV75 ma tkunx tista’ tiġi determinata (jiġifieri ma tiġix osservata ċitotossiċità suffiċjenti fl-assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża), l-ogħla konċentrazzjoni solubbli jew dispersa stabbliment tas-sustanza kimika tat-test mħejjija b’kull solvent/veikolu għandha tintuża bħala l-konċentrazzjoni tat-tluq. Jekk jogħġbok kun af li l-konċentrazzjoni finali fil-pjastra ma għandhiex taqbeż il-5 000 μg/ml (fil-każ ta’ salina jew ta’ medium) jew l-1 000 μg/ml (fil-każ ta’ DMSO). Imbagħad isiru dilwizzjonijiet serjali ta’ 1,2 darbiet bl-użu tas-solvent/tal-veikolu korrispondenti biex jinkisbu s-soluzzjonijiet ewlenin (tmien konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 100×1,2 × CV75 sa 100×0,335 × CV75 (għas-salina jew għall-medium) jew minn 500×1,2 × CV75 sa 500×0,335 × CV75 (għal DMSO)) li għandhom jiġu ttestjati fil-metodu h-CLAT (ara l-protokoll DB-ALM Nru 158 għal eżempju tal-iskema ta’ dożaġġ). Imbagħad, is-soluzzjonijiet ewlenin jiġu dilwiti aktar għal 50 darba (għas-salina jew għall-medium) jew għal 250 darba (għal DMSO) fil-medium tat-tkabbir (soluzzjonijiet għall-użu). Dawn is-soluzzjonijiet huma dawk finalment użati għall-esponiment b’fattur finali ulterjuri ta’ dilwizzjonijiet għal darbtejn fil-pjastra. Jekk ir-riżultati ma jissodisfawx il-kriterji ta’ aċċettazzjoni deskritti fil-paragrafi 29 u 30 rigward il-vijabbiltà taċ-ċelloli, l-assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża jista’ jerġa’ jsir biex tiġi determinata CV75 aktar preċiża. Jekk jogħġbok kun af li pjastri b’24 bwejra biss jistgħu jintużaw għall-kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54.
|
|
21.
|
Il-kontroll b’solvent/b’veikolu jitħejja kif deskritt fil-paragrafu 16. Il-kontroll pożittiv użat fil-metodu h-CLAT hu DNCB (ara l-paragrafu 11), li għalih jitħejjew soluzzjonijiet ewlenin f’DMSO u jiġu dilwiti kif deskritt għas-soluzzjonijiet ewlenin fil-paragrafu 20. DNCB għandu jintuża bħala l-kontroll pożittiv għall-kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54 f’konċentrazzjoni waħda finali fil-pjastra (tipikament 4,0 μg/ml). Biex tinkiseb konċentrazzjoni ta’ 4,0 μg/ml ta’ DNCB fil-pjastra, titħejja soluzzjoni ewlenija ta’ 2 mg/ml ta’ DNCB f’DMSO u tkompli tiġi dilwita għal 250 darba b’medium tat-tkabbir għal soluzzjoni għall-użu ta’ 8 μg/ml. Inkella, is-CV75 ta’ DNCB, li tiġi determinata f’kull faċilità tat-test, tista’ tintuża wkoll bħala l-konċentrazzjoni tal-kontroll pożittiv. Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi xierqa oħra jekk ikun hemm data storika disponibbli biex jiġu derivati kriterji ta’ aċċettazzjoni ta’ sessjonijiet komparabbli. Għal kontrolli pożittivi, il-konċentrazzjoni finali waħda fil-pjastra ma għandhiex taqbeż il-5 000 μg/ml (fil-każ ta’ salina jew ta’ medium) jew l-1 000 μg/ml (fil-każ ta’ DMSO). Il-kriterji ta’ aċċettazzjoni ta’ sessjoni huma l-istess bħal dawk deskritti għas-sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 29), ħlief għall-aħħar kriterju ta’ aċċettazzjoni peress li l-kontroll pożittiv jiġi ttestjat f’konċentrazzjoni waħda.
|
Applikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
22.
|
Għal kull sustanza kimika tat-test u sustanza tal-kontroll, hu meħtieġ esperiment wieħed biex tinkiseb previżjoni. Kull esperiment jikkonsisti f’tal-anqas żewġ sessonijiet indipendenti għall-kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54 (ara l-paragrafu 26-28). Kull sessjoni indipendenti ssir f’jum differenti jew fl-istess jum dment li għal kull sessjoni: a) jitħejjew soluzzjonijiet ewlenin u soluzzjonijiet użati friski indipendenti tas-sustanza kimika tat-test u tas-soluzzjonijiet tal-antikorpi u b) jintużaw ċelloli miġbura indipendentement (jiġifieri ċ-ċelloli jridu jinġabru minn flasks tal-koltura differenti); madankollu, iċ-ċelloli jistgħu jkunu ġejjin mill-istess passaġġ. Sustanzi kimiċi tat-test u sustanzi tal-kontroll imħejjija bħala soluzzjonijiet għall-użu (500 μl) jitħalltu ma’ 500 μl ta’ ċelloli sospiżi (1x106 ċelloli) fi proporzjon ta’ 1:1, u ċ-ċelloli jiġu inkubati għal 24±0,5 siegħa kif deskritt fil-paragrafi 20 u 21. F’kull sessjoni, replika waħda għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u tas-sustanza tal-kontroll hi biżżejjed għaliex tbassir jinkiseb minn tal-anqas żewġ sessjonijiet indipendenti.
|
It-tilwin u l-analiżi taċ-ċelloli
|
23.
|
Wara 24±0,5 siegħa ta’ esponiment, iċ-ċelloli jiġu trasferiti minn pjastra b’24 bwejra f’tubi tal-kampjun, jinġabru b’ċentrifugrazzjoni u mbagħad jinħaslu darbtejn b’1ml ta’ bafer tat-tilwin (jekk ikun hemm bżonn jistgħu jitwettqu passi addizzjonali tal-ħasil). Wara l-ħasil, iċ-ċelloli jiġu mblokkati b’600 μl soluzzjoni tal-imblokkar (bafer tat-tilwin li fih 0,01 % (w/v) globulina (frazzjoni ta’ Cohn II, III, umana; SIGMA, #G2388-10G jew ekwivalenti)) u inkubati f’4°C għal 15-il min. Wara l-imblokkar, iċ-ċelloli jinqasmu fi tliet alikwoti ta’ 180 μl fi pjastra b’qiegħ fit-tond b’96 bwejra jew f’mikrotubu.
|
|
24.
|
Wara ċ-ċentrifugrazzjoni, iċ-ċelloli jitlewnu b’50 μl ta’ antikorpi anti-CD86, anti-CD54 jew IgG1 tal-ġrieden (isotip) tikkettati bl-FITC f’4°C għal 30 min. L-antikorpi deskritti fil-protokoll h-CLAT DB-ALM nru 158 (18) għandhom jintużaw b’dilwizzjoni ta’ 3:25 v/v (għas-CD86 (BD-PharMingen, #555657; Klonu: Fun-1)) jewta’ 3:50 v/v (għas-CD54 (DAKO, #F7143; Klonu: 6,5B5) u IgG1 (DAKO, #X0927)) b’bafer tat-tilwin. Dawn il-fatturi ta’ dilwizzjoni tal-antikorpi ġew definiti mill-iżviluppaturi tat-testijiet bħala dawk li jipprovdu l-aħjar proporzjon minn sinjal għal storbju. Fuq il-bażi tal-esperjenza tal-iżviluppaturi tat-test, l-intensità tal-fluworexxenza tal-antikorpi normalment tkun konsistenti bejn lottijiet differenti. Madankollu, l-utenti jistgħu jikkunsidraw it-titrazzjoni tal-antikorpi fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju tagħhom stess biex jiddefinixxu l-aħjar konċentrazzjonijiet għall-użu. Antikorpi anti-CD86 u/jew anti-CD54 oħra taggjati bil-fluworokromu jistgħu jintużaw jekk jista’ jintwera li dawn jipprovdu riżultati simili bħall-antikorpi konjugati bl-FITC, pereżempju bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 1.2. Ta’ min jinnota li t-tibdil tal-klonu jew tal-fornitur tal-antikorpi kif deskritt fil-protokoll h-CLAT DB-ALM nru 158 (18) jista’ jaffettwa r-riżultati. Wara l-ħasil darbtejn jew aktar b’150 μl bafer tat-tilwin, iċ-ċelloli jerġgħu jiġu sospiżi f’bafer tat-tilwin (eż. 400 μl), u tiżdied is-soluzzjoni tal-PI (eż. 20 μl biex tinkiseb konċentrazzjoni finali ta’ 0,625 μg/ml) jew soluzzjoni ta’ markatur ieħor taċ-ċitotossiċità (ara l-paragrafu 18). Il-livelli ta’ espressjoni tas-CD86 u tas-CD54, u l-vijabbiltà taċ-ċelloli, jiġu analizzati bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss.
|
DATA U RAPPORTAR
Evalwazzjoni tad-data
|
25.
|
L-espressjoni tas-CD86 u tas-CD54 tiġi analizzat bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss bil-kanal ta’ akkwiżizzjoni FL-1. Fuq il-bażi tal-intensità ġeometrika medja tal-fluworexxenza (MFI), l-intensità relattiva tal-fluworexxenza (RFI) tas-CD86 u tas-CD54 għaċ-ċelloli tal-kontroll pożittiv (ctrl) u trattati bis-sustanza kimika tiġi kkalkolata skont l-ekwazzjoni li ġejja:
Il-vijabbiltà taċ-ċelloli miċ-ċelloli tal-kontroll bl-isotip (ctrl) (li jitlewnu b’antikorpi tal-IgG1 tal-ġrieden (isotip)) tiġi kkalkolata wkoll skont l-ekwazzjoni deskritta fil-paragrafu 19.
|
Mudell ta’ tbassir
|
26.
|
Għall-kejl tal-espressjoni ta’ CD86/CD54, kull sustanza kimika tat-test tiġi ttestjata f’tal-anqas żewġ sessjonijiet indipendenti biex jinkiseb tbassir wieħed (POŻITTIV jew NEGATTIV). Tbassir h-CLAT jitqies POŻITTIV jekk tal-anqas tiġi ssodisfata waħda mill-kundizzjonijiet li ġejjin fi 2 minn 2 sessjonijiet indipendenti jew f’tal-anqas 2 minn 3, inkella t-tbassir h-CLAT jitqies NEGATTIV (Figura 1):
|
|
—
|
L-RFI tas-CD86 tkun daqs jew akbar minn 150 % fi kwalunkwe konċentrazzjoni ttestjata (b’vijabbiltà taċ-ċelloli ≥ 50 %);
|
|
—
|
L-RFI tas-CD54 tkun daqs jew akbar minn 200 % fi kwalunkwe konċentrazzjoni ttestjata (b’vijabbiltà taċ-ċelloli ≥ 50 %).
|
|
27.
|
Fuq il-bażi ta’ dan li ntqal hawn fuq, jekk l-ewwel żewġ sessjonijiet it-tnejn ikunu pożittivi għas-CD86 u/jew it-tnejn ikunu pożittivi għas-CD54, it-tbassir h-CLAT jitqies POŻITTIV u ma jkunx hemm bżonn li ssir it-tielet sessjoni. B’mod simili, jekk l-ewwel żewġ sessjonijiet ikunu negattivi għaż-żewġ markaturi, it-tbassir h-CLAT jitqies NEGATTIV (b’kunsiderazzjoni dovuta tad-dispożizzjonijiet tal-paragrafu 30) mingħajr il-bżonn tat-tielet sessjoni. Madankollu, jekk l-ewwel żewġ sessjonijiet ma jkunux jaqblu għal tal-anqas wieħed mill-markaturi (CD54 jew CD86), ikun hemm bżonn tat-tielet sessjoni u t-tbassir finali jkun ibbażat fuq ir-riżultat tal-maġġoranza tat-tliet sessjonijiet individwali (jiġifieri 2 minn 3). F’dan ir-rigward, ta’ min jinnota li jekk isiru żewġ sessjonijiet indipendenti u waħda minnhom biss tkun pożittiva għas-CD86 (minn hawn ’il quddiem imsejħa P1) u l-oħra tkun pożittiva biss għas-CD54 (minn hawn ’il quddiem imsejħa P2), ikun hemm bżonn li ssir it-tielet sessjoni. Jekk din it-tielet sessjoni tkun negattiva għaż-żewġ markaturi (minn hawn ’il quddiem imsejħa N), it-tbassir h-CLAT jitqies NEGATTIV. Min-naħa l-oħra, jekk it-tielet sessjoni tkun pożittiva għal wieħed mill-markaturi (P1 jew P2) jew għaż-żewġ marktaturi (minn hawn ’il quddiem imsejħa P12), t
Figura 1: Mudell tat-tbassir użat fil-metodu h-CLAT. Tbassir h-CLAT għandu jitqies fil-kuntest ta’ IATA u skont id-dispożizzjoni tal-paragrafi 7 u 8 fl-Introduzzjoni ġenerali.
P1: sessjoni b’CD86 pożittiv biss; P2; sessjoni b’CD54 pożittiv biss; P12: sessjoni b’CD86 kif ukoll CD54 pożittivi; N: sessjoni mingħajr CD86 u CD54 pożittivi. *Il-kaxex juru t-taħlitiet rilevanti tar-riżultati mill-ewwel żewġ sessjonijiet, indipendentement mill-ordni li fiha jistgħu jinkisbu. #Il-kaxex juru t-taħlitiet rilevanti ta’ riżultati mit-tliet sessjonijiet fuq il-bażi tar-riżultati miksuba fl-ewwel żewġ sessjonijiet murija fil-kaxxa ta’ hawn fuq, iżda ma jirriflettux l-ordni li fiha jistgħu jinkisbu. |
|
28.
|
Għas-sustanzi kimiċi tat-test imbassra bħala POŻITTIVI bl-h-CLAT, b’mod fakultattiv jistgħu jiġu determinati żewġ valuri tal-Konċentrazzjonijiet Effettivi (EC), l-EC150 għas-CD86 u l-EC200 għas-CD54, jiġifieri l-konċentrazzjoni li fiha s-sustanzi kimiċi tat-test jinduċu RFI ta’ 150 jew ta’ 200. Dawn il-valuri tal-EC potenzjalment jistgħu jikkontribwixxu għall-valutazzjoni tal-potenza tas-sensitizzazzjoni (9) meta jintużaw f’approċċi integrati bħall-IATA (4) (5) (6) (7) (8). Dawn jistgħu jiġu kkalkolati bl-ekwazzjonijiet li ġejjin:
EC 150 (for CD86) = Bconc
+ [(150 - BRFI
)/ARFI - BRFI
) × (Aconc - Bconc
)]
EC 200 (for CD86) = Bconc
+ [(200 - BRFI
)/ARFI - BRFI
) × (Aconc - Bconc
)]
fejn
Aconc hi l-anqas konċentrazzjoni f’μg/ml bl-RFI > 150 (CD86) jew 200 (CD54)
Bconc hi l-ogħla konċentrazzjoni f’μg/ml bl-RFI < 150 (CD86) jew 200 (CD54)
ARFI hi l-RFI fl-anqas konċentrazzjoni bl-RFI > 150 (CD86) jew 200 (CD54)
BRFI hi l-RFI fl-ogħla konċentrazzjoni bl-RFI < 150 (CD86) jew 200 (CD54)
Għall-fini ta’ derivazzjoni aktar preċiża tal-valuri tal-EC150 u tal-EC200, jistgħu jkunu meħtieġa tliet sessjonijiet indipendenti għall-kejl tal-espressjoni tas-CD86/CD54. Imbagħad il-valuri finali tal-EC150 u tal-EC200 jiġu determinati bħala l-valur medjan tal-ECs ikkalkolati mit-tliet sessjonijiet indipendenti. Meta tnejn biss mit-tliet sessjonijiet indipendenti jissodisfaw il-kriterji għall-pożittività (ara l-paragrafi 26-27), tiġi adottata l-ogħla waħda mill-EC150 jew mill-EC200 taż-żewġ valuri kkalkolati.
|
Kriterji ta’ aċċettazzjoni
|
29.
|
Għandhom jiġu ssodisfati l-kriterji ta’ aċċettazzjoni li ġejjin meta jintuża l-metodu h-CLAT (22) (27).
|
|
—
|
Il-vijabbiltajiet taċ-ċelloli tal-medium u l-kontrolli b’solvent/b’veikolu għandhom ikunu akbar minn 90 %.
|
|
—
|
Fil-kontroll b’solvent/b’veikolu, il-valuri tal-RFI tas-CD86 kif ukoll tas-CD54 ma għandhomx jaqbżu l-kriterji pożittivi (CD86 RFI ≥ 150 % u CD54 RFI ≥ 200 %). Il-valuri tal-RFI tal-kontroll b’solvent/b’veikolu jiġu kkalkolati bl-użu tal-formula deskritta fil-paragrafu 25 (MFI tas-sustanza kimika għandha tiġi sostitwita bMFI tas-solvent/tal-veikolu, u MFI tas-solvent/tal-veikolu għandha tiġi sostitwita bMFI ta’ kontroll (b’medium)).
|
|
—
|
Għall-kontrolli b’medium kif ukoll dawk b’solvent/b’veikolu, il-proporzjon tal-MFI tas-CD86 kif ukoll tas-CD54 għall-kontroll b’isotip għandu jkun > 105 %.
|
|
—
|
Fil-kontroll pożittiv (DNCB), il-valuri tal-RFI tas-CD86 kif ukoll tas-CD54 għandhom jissodisfaw il-kriterji pożittivi (CD86 RFI ≥ 150 u CD54 RFI ≥ 200) u l-vijabbiltà taċ-ċelloli għandha tkun akbar minn 50 %.
|
|
—
|
Għas-sustanza kimika tat-test, il-vijabbiltà taċ-ċelloli għandha tkun akbar minn 50 % f’tal-anqas erba’ konċentrazzjonijiet ittestjati f’kull sessjoni.
|
|
30.
|
Ir-riżultati negattivi jkunu aċċettabbli biss għal sustanzi kimiċi tat-test li jesibixxu vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ anqas minn 90 % fl-ogħla konċentrazzjoni ttestjata (jiġifieri 1,2 × CV75 skont l-iskema ta’ dilwizzjonijiet serjali deskritta fil-paragrafu 20). Jekk il-vijabbiltà taċ-ċelloli f’1,2 × CV75 tkun daqs jew akbar minn 90 %, ir-riżultat negattiv għandu jiġi injorat. F’dan il-każ, hu rakkomandat li wieħed jipprova jirfina l-għażla tad-doża billi jirrepeti d-determinazzjoni tas-CV75. Ta’ min jinnota li meta jintużaw 5 000 μg/ml f’salina (jew f’medium jew f’solventi/veikoli oħra), 1 000 μg/ml f’DMSO jew l-ogħla konċentrazzjoni solubbli bħala l-konċentrazzjoni massimali tat-test ta’ sustanza kimika tat-test, riżultat negattiv ikun aċċettabbli anki jekk il-vijabbiltà taċ-ċelloli tkun akbar minn 90 %.
|
Rapport tat-test
|
31.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja.
|
|
Sustanza kimika tat-test
|
Sustanza monokostitwenti
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Id-dehra fiżika, il-Log Kow, is-solubbiltà fl-ilma, is-solubbiltà fid-DMSO, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
It-trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita
|
Karatterizzazzjoni sa fejn possibbli, eż. bl-identità kimika (ara aktar ’il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti (ara aktar ’il fuq) tal-kostitwenti, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, is-solubbiltà fid-DMSO u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
|
|
Il-piż molekulari jew il-piż molekulari apparenti fil-każ ta’ taħlitiet/polimeri b’kompożizzjonijiet magħrufin jew informazzjoni oħra rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
|
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
|
|
Kontrolli
|
Kontroll pożittiv
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Id-dehra fiżika, il-Log Kow is-solubbiltà fl-ilma, is-solubbiltà fid-DMSO, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli u fejn applikabbli;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
It-trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Referenza għar-riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv li juru kriterji xierqa ta’ aċċettazzjoni tas-sessjoni, jekk applikabbli.
|
|
|
|
Kontroll negattiv u b’solvent/b’veikolu
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali f’każ li jintuża solvent/veikolu ieħor li ma jkunx fost dawk imsemmijin fil-Linja Gwida tat-Test u sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test
|
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju;
|
|
Deskrizzjoni tat-test użat;
|
|
Il-linja ta’ ċelloli użata, il-kundizzjonijiet tal-ħżin u s-sors tagħha (eż. il-faċilità mnejn inkisbet);
|
|
Iċ-ċitometrija tal-fluss użata (eż. il-mudell), inklużi l-issettjar tal-istrumenti, il-globulina, l-antikorpi u l-markatur taċ-ċitotossiċità użat;
|
|
Il-proċedura użata biex tintwera l-profiċjenza tal-laboratorju fit-twettiq tat-test bl-ittestjar ta’ sustanzi ta’ profiċjenza, u l-proċedura użata biex tintwera prestazzjoni riproduċibbli tat-test maż-żmien, eż. data storika tal-kontroll u/jew data storika tal-kontrolli tar-reattività.
|
|
|
Kriterji ta’ aċċettazzjoni tat-test
|
Il-valuri tal-vijabbiltà taċ-ċelloli, tal-MFI u tal-RFI miksuba bil-kontroll b’solvent/b’veikolu meta mqabbla mal-meded ta’ aċċettazzjoni;
|
|
Il-valuri tal-vijabbiltà taċ-ċelloli u tal-RFI miksuba bil-kontroll pożittiv meta mqabbla mal-meded ta’ aċċettazzjoni;
|
|
Il-vijabbiltà taċ-ċelloli tal-konċentrazzjonijiet ittestjati kollha tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
|
Il-proċedura tat-test
|
In-numru ta’ sessjonijiet użati;
|
|
Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika, l-applikazzjoni u l-ħin ta’ esponiment użat (jekk ikun differenti minn dak rakkomandat)
|
|
Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ evalwazzjoni u deċiżjoni użati;
|
|
Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test.
|
|
|
Ir-riżultati
|
Tabulazzjoni tad-data, inklużi s-CV75 (jekk applikabbli), il-valuri ġeometriċi tal-MFI, tal-RFI u tal-vijabbiltà taċ-ċelloli, il-valuri tal-EC150/EC200 (jekk applikabbli) miksuba għas-sustanza kimika tat-test u għall-kontroll pożittiv f’kull sessjoni, u indikazzjoni tal-klassifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test skont il-mudell tat-tbassir;
|
|
Deskrizzjoni ta’ kull osservazzjoni rilevanti oħra osservata, jekk applikabbli.
|
|
|
Diskussjoni tar-riżultati
|
Diskussjoni tar-riżultati miksubin bil-metodu h-CLAT;
|
|
Kunsiderazzjoni tar-riżultati tat-test fil-kuntest ta’ IATA, jekk ikun hemm informazzjoni rilevanti oħra disponibbli.
|
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
Ashikaga T, Yoshida Y, Hirota M, Yoneyama K, Itagaki H, Sakaguchi H, Miyazawa M, Ito Y, Suzuki H, Toyoda H. (2006). Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines: The human Cell Line Activation Test (h-CLAT) I. Optimization of the h-CLAT protocol. Toxicol. In Vitro 20, 767-773.
|
|
(2)
|
Miyazawa M, Ito Y, Yoshida Y, Sakaguchi H, Suzuki H. (2007). Phenotypic alterations and cytokine production in THP-1 cells in response to allergens. Toxicol. In Vitro 21, 428-437.
|
|
(3)
|
EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for skin sensitisation testing. Aċċessibbli fuq: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations
|
|
(4)
|
Takenouchi O, Fukui S, Okamoto K, Kurotani S, Imai N, Fujishiro M, Kyotani D, Kato Y, Kasahara T, Fujita M, Toyoda A, Sekiya D, Watanabe S, Seto H, Hirota M, Ashikaga T, Miyazawa M. (2015). Test battery with the human cell line activation test, direct peptide reactivity assay and DEREK based on a 139 chemical data set for predicting skin sensitizing potential and potency of chemicals. J Appl Toxicol. 35, 1318-1332.
|
|
(5)
|
Hirota M, Fukui S, Okamoto K, Kurotani S, Imai N, Fujishiro M, Kyotani D, Kato Y, Kasahara T, Fujita M, Toyoda A, Sekiya D, Watanabe S, Seto H, Takenouchi O, Ashikaga T, Miyazawa M. (2015). Evaluation of combinations of in vitro sensitization test descriptors for the artificial neural network-based risk assessment model of skin sensitization. J Appl Toxicol. 35, 1333-1347.
|
|
(6)
|
Bauch C, Kolle SN, Ramirez T, Fabian E, Mehling A, Teubner W, van Ravenzwaay B, Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potencials. Regul Toxicol Parmacol. 63, 489-504.
|
|
(7)
|
Van der Veen JW, Rorije E, Emter R, Natch A, van Loveren H, Ezendam J. (2014). Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul Toxicol Pharmacol. 69, 371-379.
|
|
(8)
|
Urbisch D, Mehling A, Guth K, Ramirez T, Honarvar N, Kolle S, Landsiedel R, Jaworska J, Kern PS, Gerberick F, Natsch A, Emter R, Ashikaga T, Miyazawa M, Sakaguchi H. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul Toxicol Parmacol. 71, 337-351.
|
|
(9)
|
Jaworska JS, Natsch A, Ryan C, Strickland J, Ashikaga T, Miyazawa M. (2015). Bayesian integrated testing strategy (ITS) for skin sensitization potency assessment: a decision support system for quantitative weight of evidence and adaptive testing strategy. Arch Toxicol. 89, 2355-2383.
|
|
(10)
|
Strickland J, Zang Q, Kleinstreuer N, Paris M, Lehmann DM, Choksi N, Matheson J, Jacobs A, Lowit A, Allen D, Casey W. (2016). Integrated decision strategies for skin sensitization hazard. J Appl Toxicol. DOI 10.1002/jat.3281.
|
|
(11)
|
Nukada Y, Ashikaga T, Miyazawa M, Hirota M, Sakaguchi H, Sasa H, Nishiyama N. (2012). Prediction of skin sensitization potency of chemicals by human Cell Line Activation Test (h-CLAT) and an attempt at classifying skin sensitization potency. Toxicol. In Vitro 26, 1150-60.
|
|
(12)
|
EC EURL ECVAM (2015). Re-analysis of the within and between laboratory reproducibility of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT). Aċċessibbli fuq: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-human-cell-line-activation-test-h-clat-for-skin-sensitisation-testing
|
|
(13)
|
EC EURL ECVAM (2012). human Cell Line Activation Test (h-CLAT) Validation Study Report Aċċessibbli fuq: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations
|
|
(14)
|
Takenouchi O, Miyazawa M, Saito K, Ashikaga T, Sakaguchi H. (2013). Predictive performance of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for lipophilic with high octanol-water partition coefficients. J. Toxicol. Sci. 38, 599-609.
|
|
(15)
|
Ashikaga T, Sakaguchi H, Sono S, Kosaka N, Ishikawa M, Nukada Y, Miyazawa M, Ito Y, NishiyamaN, Itagaki H. (2010). A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests: the human cell-line activation test (h-CLAT) versus the local lymph node assay (LLNA). Altern. Lab. Anim. 38, 275-284.
|
|
(16)
|
Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch Toxicol 87, 1683-1969.
|
|
(17)
|
Okamoto K, Kato Y, Kosaka N, Mizuno M, Inaba H, Sono S, Ashikaga T, Nakamura T, Okamoto Y, Sakaguchi H, Kishi M, Kuwahara H, Ohno Y. (2010). The Japanese ring study of a human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for predicting skin sensitization potential (6th report): A study for evaluating oxidative hair dye sensitization potential using h-CLAT. AATEX 15, 81-88.
|
|
(18)
|
DB-ALM (INVITTOX) (2014). Protocol 158: human Cell Line Activation Test (h-CLAT), 23pp. Aċċessibbli fuq: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
|
|
(19)
|
Mizuno M, Yoshida M, Kodama T, Kosaka N, Okamato K, Sono S, Yamada T, Hasegawa S, Ashikaga T, Kuwahara H, Sakaguchi H, Sato J, Ota N, Okamoto Y, Ohno Y. (2008). Effects of pre-culture conditions on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) results; Results of the 4th Japanese inter-laboratory study. AATEX 13, 70-82.
|
|
(20)
|
Sono S, Mizuno M, Kosaka N, Okamoto K, Kato Y, Inaba H, , Nakamura T, Kishi M, Kuwahara H, Sakaguchi H, Okamoto Y, Ashikaga T, Ohno Y. (2010). The Japanese ring study of a human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for predicting skin sensitization potential (7th report): Evaluation of volatile, poorly soluble fragrance materials. AATEX 15, 89-96.
|
|
(21)
|
OECD (2005). Guidance Document No 34 on The Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi, Franza, 2005, 96 pp.
|
|
(22)
|
OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No 168. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=ENV/JM/MONO(2012)10/PART1&docLanguage=En
|
|
(23)
|
In-Nazzjonijiet Uniti (2013) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition. New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
|
|
(24)
|
ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No 87).
|
|
(25)
|
Ashikaga T, Sakaguchi H, Okamoto K, Mizuno M, Sato J, Yamada T, Yoshida M, Ota N, Hasegawa S, Kodama T, Okamoto Y, Kuwahara H, Kosaka N, Sono S, Ohno Y. (2008). Assessment of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for Skin Sensitization; Results of the First Japanese Inter-laboratory Study. AATEX 13, 27-35.
|
Appendiċi 1.1
DEFINIZZJONIJIET
Akkuratezza
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tat-test u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tat-test u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ test (21).
AOP (Passaġġ tal-Eżitu Avvers)
: sekwenza ta’ avvenimenti mill-istruttura kimika ta’ sustanza kimika fil-mira jew grupp ta’ sustanzi kimiċi simili permezz tal-avveniment ta’ inizjazzjoni molekulari għal eżitu ta’ interess in vivo (22).
Sustanzi kimiċi
: Sustanza jew taħlita
CV75
: Il-konċentrazzjoni stmata li turi vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ 75 %.
EC150
: il-konċentrazzjonijiet li juru l-valuri tal-RFI ta’ 150 fl-espressjoni ta’ CD86
EC200
: il-konċentrazzjonijiet li juru l-valuri tal-RFI ta’ 200 fl-espressjoni ta’ CD54
Ċitometrija tal-fluss
: teknika ċitometrika li fiha ċ-ċelloli sospiżi fi fluwidu jiffluwixxu waħda, waħda permezz ta’ fokus ta’ dawl tal-eċitament, li jitferrex f’mudelli karatteristiċi għaċ-ċelloli u għall-komponenti tagħhom; iċ-ċelloli spiss jiġu tikkettati b’markaturi fluworexxenti biex id-dawl l-ewwel jiġi assorbit imbagħad jinħeles fi frekwenzi differenti.
Periklu
: Proprjetà inerenti ta’ aġent jew ta’ sitwazzjoni li għandha l-potenzjal li tikkawża effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
IATA (Approċċ Integrat għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni)
: Approċċ strutturat użat għall-identifikazzjoni ta’ perikli (potenzjal), għall-karatterizzazzjoni tal-perikli (potenza) u/jew għall-valutazzjoni tas-sikurezza (potenzjal/potenza u esponiment ) ta’ sustanza kimika jew ta’ grupp ta’ sustanzi kimiċi, li jintegra b’mod strutturat u jiżen id-data rilevanti kollha biex jinforma deċiżjoni regolatorja dwar il-periklu u/jew ir-riskju u/jew il-ħtieġa potenzjali għal ittestjar immirat ulterjuri li, għaldaqstant, ikun minimu.
Kontroll b’medium
: Replika mhux ittrattata li fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b’kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn biex jiġi determinat jekk is-solvent/il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
Taħlita
: Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.
Sustanza monokostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).
Sustanza multikostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bl-amalgamar ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.
Kontroll pożittiv
: Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattata b’sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Biex jiġi żgurat li l-varjabbiltà fir-rispons tal-kontroll pożittiv tul iż-żmien tkun tista’ tiġi vvalutata, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
Preapteni
: sustanzi kimiċi li jsiru sensitizzaturi permezz ta’ trasformazzjoni abijotika
Proapteni
: sustanzi kimiċi li jeħtiġu attivazzjoni enzimatika biex jeħilsu l-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda
Intensità relattiva tal-fluworexxenza (RFI)
: Valuri relattivi tal-intensità medja ġeometrika tal-fluworexxenza (MFI) f’ċelloli trattati bis-sustanza kimika meta mqabbla mal-MFI f’ċelloli trattati b’solvent/b’veikolu.
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test għall-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ test (21).
Affidabbiltà
: Kejlijiet ta’ kemm test jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbbiltà fl-istess u bejn il-laboratorarji u r-ripetibbiltà fl-istess laboratorju (21).
Sessjoni
: Sessjoni tikkonsisti f’sustanza kimika tat-test waħda jew aktar ittestjata flimkien ma’ kontroll negattiv u ma’ kontroll b’solvent/b’veikolu.
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal test li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ test (21).
Bafer tat-tilwin
: Salina baferjata b’fosfat li fiha 0,1 % albumina tas-serum tal-bovini.
Kontroll b’solvent/b’veikolu
: Kampjun mhux trattat li fih il-komponenti kollha ta’ sistema tat-test ħlief tas-sustanza kimika tat-test, iżda li jinkludi s-solvent/il-veikolu li jintuża. Jintuża biex jiġi stabbilit ir-rispons tal-linja bażi għall-kampjuni trattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta jew dispersa stabbliment fl-istess solvent/veikolu. Meta jiġi ttestjat ma’ kontroll b’medium konkorrenti, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent/il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal test li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ test (14).
Sustanza
: Element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ produzzjoni, li jinduċi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mingħajr ma tinbidel il-kompożizzjoni tagħha.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu.
Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
: Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (23).
UVCB
: sustanzi ta’ kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.
Test validu
: Test meqjus li għandu biżżejjed rilevanza u affidabbiltà għal skop speċifiku u li hu bbażat fuq prinċipji xjentifiċi sodi. Test qatt ma jkunx validu f’sens assolut, iżda biss b’rabta ma’ skop definit (21).
Appendiċi 1.2
SUSTANZI TA’ PROFIĊJENZA
Qabel l-użu ta’ rutina tat-test deskritt f’dan l-Appendiċi tal-metodu ta’ ttestjar B.71, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jiksbu b’mod korrett it-tbassir mistenni tal-h-CLAT għall-10 sustanzi rakkomandati fit-Tabella 1 u billi jiksbu l-valuri tas-CV70, tal-EC150 u tal-EC200 li jaqgħu fi ħdan il-medda ta’ referenza rispettiva għal tal-anqas 8 mill-10 sustanzi ta’ profiċjenza. Is-sustanzi ta’ profiċjenza ntgħażlu biex jirrappreżentaw il-firxa ta’ risponsi għal perikli ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda. Kriterji tal-għażla oħra kienu li s-sustanzi jkunu disponibbli kummerċjalment, u li jkun hemm disponibbli data ta’ riferiment in vivo ta’ kwalità għolja kif ukoll data in vitro ta’ kwalità għolja bil-metodu h-CLAT. Barra minn hekk, hemm data ta’ riferiment ippubblikata disponibbli għall-metodu h-CLAT (3) (14).
Tabella 1
Sustanzi rakkomandati biex tintwera profiċjenza teknika bil-metodu h-CLAT
|
Sustanzi ta’ Profiċjenza
|
CASRN
|
Stat fiżiku
|
Tbassir in vivo
(103)
|
Medda ta’ Riferiment ta’ CV75 f’μg/ml (104)
|
Riżultati tal-h-CLAT għal CD86 (Medda ta’ Riferiment ta’ EC150 f’μg/ml) (104)
|
Riżultati tal-h-CLAT għal CD54 (Medda ta’ Riferiment ta’ EC200 f’μg/ml) (104)
|
|
2,4-Dinitroklorobenżen
|
97-00-7
|
Solidu
|
Sensitizzatur (estrem)
|
2-12
|
Pożittiv (0,5-10)
|
Pożittiv (0,5-15)
|
|
4-Fenilenediammina
|
106-50-3
|
Solidu
|
Sensitizzatur (b’saħħtu)
|
5-95
|
Pożittiv (<40)
|
Negattiv (>1,5) (105)
|
|
Sulfat tan-nikil
|
10101-97-0
|
Solidu
|
Sensitizzatur (moderat)
|
30-500
|
Pożittiv (<100)
|
Pożittiv (10-100)
|
|
2-Merkaptbenżotjażol
|
149-30-4
|
Solidu
|
Sensitizzatur (moderat)
|
30-400
|
Negattiv (>10) (105)
|
Pożittiv (10-140)
|
|
R(+)-Limonen
|
5989-27-5
|
Likwidu
|
Sensitizzatur (dgħajjef)
|
>20
|
Negattiv (>5) (105)
|
Pożittiv (<250)
|
|
Urea tal-imidażolidinil
|
39236-46-9
|
Solidu
|
Sensitizzatur (dgħajjef)
|
25-100
|
Pożittiv (20-90)
|
Pożittiv (20-75)
|
|
Isopropanol.
|
67-63-0
|
Likwidu
|
Mhux sensitizzatur
|
>5 000
|
Negattiv (>5 000 )
|
Negattiv (>5 000 )
|
|
Gliċerol
|
56-81-5
|
Likwidu
|
Mhux sensitizzatur
|
>5 000
|
Negattiv (>5 000 )
|
Negattiv (>5 000 )
|
|
Aċidu lattiku
|
50-21-5
|
Likwidu
|
Mhux sensitizzatur
|
1500-5 000
|
Negattiv (>5 000 )
|
Negattiv (>5 000 )
|
|
4-aċidu aminobenżojku
|
150-13-0
|
Solidu
|
Mhux sensitizzatur
|
>1 000
|
Negattiv (>1 000 )
|
Negattiv (>1 000 )
|
|
Abbrevjazzjonijiet: RN tas-CAS = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi
|
Appendiċi 2
SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IT-TEST TA’ ATTIVAZZJONI TAL-LINJA TA’ ĊELLOLI U937 (U-SENS™)
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
1.
|
It-test U-SENS™ jikkwantifika t-tibdil fl-espressjoni ta’ markatur tas-superfiċje taċ-ċelloli assoċjat mal-proċess ta’ attivazzjoni tal-monoċiti u taċ-ċelloli dendritiċi (DC) (jiġifieri CD86), fil-linja ta’ ċelloli tal-linfoma istjoċitika umana U937, wara esponiment għas-sensitizzaturi (1). Il-livelli ta’ espressjoni mkejla tal-markatur tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 fil-linja ta’ ċelloli U937 imbagħad jintużaw għas-sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u n-nonsensitizzaturi.
|
|
2.
|
It-test U-SENS™ ġie evalwat fi studju tal-validazzjoni (2) koordinat minn L’Oreal u wara sarlu rieżami bejn il-pari indipendenti mill-Kumitat Xjentifiku Konsultattiv (ESAC) tal-Laboratorju ta’ Riferiment tal-Unjoni Ewropea għall-Alternattivi għall-Ittestjar fuq l-Annimali (EURL ECVAM) (3). B’kunsiderazzjoni tal-evidenza disponibbli kollha u tal-input mir-regolaturi u mill-partijiet ikkonċernati, il-U-SENS™ kien rakkomandat mill-EURL ECVAM (4) biex jintuża bħala parti minn IATA b’sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi u n-nonsensitizzaturi għall-fini ta’ klassifikazzjoni u ta’ tikkettar tal-perikli. Fid-dokument ta’ gwida tagħha dwar ir-rapportar ta’ approċċi strutturata għall-integrazzjoni tad-data u għas-sorsi ta’ informazzjoni individwali użati fi ħdan IATA għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, bħalissa l-OECD qed tiddiskuti numru ta’ studji tal-każ li jiddeskrivu strateġiji ta’ ttestjar u mudelli ta’ tbassir differenti. Wieħed mill-approċċi definiti differenti hu bbażat fuq l-assaġġ U-SENS (5). Eżempji tal-użu ta’ data ta’ U-SENS™ flimkien ma’ informazzjoni oħra, inkluża data storika u data umana valida eżistenti (6), huma rapportati wkoll f’postijiet oħra fid-dokumentazzjoni (4) (5) (7).
|
|
3.
|
It-test U-SENS™ wera li kien trasferibbli għal-laboratorji esperjenzati f’tekniki tal-koltura taċ-ċelloli u fl-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. Il-livell ta’ riproduċibbbiltà fil-previżjonijiet li jistgħu jkunu mistennija mit-test hu fl-ordni ta’ 90 % u 84 % fi ħdan il-laboratorji u bejn il-laboratorji, rispettivament (8). Ir-riżultati ġġenerati fl-istudju ta’ validazzjoni (8) u fi studji ppubblikati oħra (1) b’mod ġenerali jindikaw li, meta mqabbla mar-riżultati tal-LLNA, l-akkuratezza fid-distinzjoni tas-sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kat. 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP) min-nonsensitizzaturi hi ta’ 86 % (N=166) b’sensittività ta’ 91 % (118/129) u bi speċifiċità ta’ 65 % (24/37). Meta mqabbla mar-riżultati umani, l-akkuratezza fid-distinzjoni tas-sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kat. 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP) min-nonsensitizzaturi hi ta’ 77 % (N=101) b’sensittività ta’ 100 % (58/58) u bi speċifiċità ta’ 47 % (20/43). Il-previżjonijiet ta’ negattivi foloz imqabbla mal-LLNA bil-U-SENS™ għandhom probabbiltà akbar li jikkonċernaw sustanzi kimiċi li juru potenza baxxa sa moderata tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri s-subkategorija 1B tal-GHS tan-NU/tas-CLP) minn sustanzi kimiċi li juru potenza għolja tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri s-subkategorija 1A tal-GHS tan-NU/tas-CLP) (1) (8) (9). Meħuda kollha f’daqqa, din l-informazzjoni tindika l-utilità tat-test U-SENS™ biex jikkontribwixxi għall-identifikazzjoni tal-perikli ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda. Madankollu, il-valuri tal-akkuratezza mogħtija hawnhekk għall-U-SENS™ bħala test waħdu huma indikattivi biss peress li t-test għandu jiġi kkunsidrat flimkien ma’ sorsi oħra ta’ informazzjoni fil-kuntest ta’ IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 7 u 8 fl-Introduzzjoni ġenerali. Barra minn hekk, meta jiġu evalwati metodi mhux fuq l-annimali għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, ta’ min jiftakar li t-test LLNA kif ukoll testijiet oħra fuq l-annimali jaf ma jirriflettux is-sitwazzjoni sħiħa fil-bniedem.
|
|
4.
|
Fuq il-bażi tad-data disponibbli bħalissa, intwera li t-test U-SENS™ kien applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test (inklużi ingredjenti kożmetiċi, eż. preservattivi, tensjoattivi, attivi, koloranti) li jkopru firxa ta’ gruppi funzjonali organiċi, ta’ proprjetajiet fiżikokimiċi, ta’ potenza ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda (kif determinata fi studji in vivo) u tal-ispettru ta’ mekkaniżmi ta’ reazzjoni magħruf li jkunu assoċjati ma’ sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri aċċettatur ta’ Michael, formazzjoni bażi ta’ Schiff, aġent ta’ trasferiment tal-aċil, sostituzzjoni nukleofilika bimolekultari [SN2], jew sostituzzjoni aromatika nukleofilika [SNAr]) (1) (8) (9) (10). It-test U-SENS™ hu applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test li huma solubbli jew li jifformaw dispersjoni stabbli (jiġifieri kollojde jew sospensjoni li fiha s-sustanza kimika tat-test ma tistabbilixxix ruħha u lanqas ma tissepara mis-solvent/mill-veikolu f’fażijiet differenti) f’solvent/veikolu xieraq (ara l-paragrafu 13). Sustanzi kimiċi fis-sett tad-data rapportat bħala preapteni (jiġifieri sustanzi attivati b’ossidazzjoni) jew proapteni (jiġifieri sustanzi li jeħtieġu attivazzjoni enzimatika, pereżempju permezz tal-enzimi P450) tbassru kif suppost mill-U-SENS™ (1) (10). Sustanzi li jinterferixxu mal-membrana jistgħu jwasslu għal riżultatipożittivi foloz minħabba żieda mhux speċifika ta’ espressjoni ta’ CD86, hekk kif tlieta minn seba’ pożittivi foloz relatati mal-klassifikazzjoni ta’ riferiment in vivo kienu tensjoattivi (1). B’hekk, riżultati pożittivi b’tensjoattivi għandhom jiġu kkunsidrati bil-galbu filwaqt li riżultati negattivi b’tensjoattivi xorta waħda jistgħu jintużaw b’sostenn tal-identifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bħala mhux sensitizzatur. Is-sustanzi kimiċi tat-test fluworexxenti jistgħu jiġu vvalutati bil-U-SENS™ (1), iżda sustanzi kimiċi tat-test fluworexxenti b’saħħithom li jeħilsu l-istess tul ta’ mewġa bħal istjoċjanat tal-fluworexxeina (FITC) jew bħala jodur tal-propidju (PI), jinterferixxu mad-detezzjoni ċitometrika tal-fluss u b’hekk ma jistgħux jiġu evalwati kif suppost bl-użu ta’ antikorpi konjugati tal-FITC (negattiv falz potenzjali) jew bl-użu tal-PI (il-vijabbiltà ma tistax titkejjel). F’każ bħal dan, antikorpi oħra taggjati bi fluworokromu jew markaturi oħra taċ-ċitotossiċità, rispettivament, jistgħu jintużaw dment li jkun jista’ jintwera li jipprovdu riżultati simili bħall-antikorpi taggjati bl-FITC jew il-PI (ara l-paragrafu 18), eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 2.2. Fid-dawl ta’ dan ta’ hawn fuq, ir-riżultati pożittivi b’tensjoattivi u r-riżultati negattivi b’sustanzi kimiċi tat-test fluworexxenti b’saħħithom għandhom jiġu interpretati fil-kuntest tal-limitazzjonijiet iddikjarati u flimkien ma’ sorsi oħra ta’ informazzjoni fi ħdan il-kuntest tal-IATA. F’każijiet li fihom ikun hemm evidenza li turi n-nuqqas ta’ applikabbiltà tat-test U-SENS™ għal kategoriji speċifiċi oħra ta’ sustanzi kimiċi tat-test, dan ma għandux jintuża għal dawk il-kategoriji speċifiċi.
|
|
5.
|
Kif deskritt aktar ’il fuq, it-test U-SENS™ isostni d-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u n-nonsensitizzaturi. Madankollu, għandu l-potenzjal li jikkontribwixxi għall-valutazzjoni tal-potenza ta’ sensitizzazzjoni ukoll meta jintuża f’approċċi integrati bħall-IATA. Minkejja dan, hemm bżonn li jsir aktar xogħol, idealment fuq il-bażi ta’ data mill-bniedem, biex jiġi stabbilit kif ir-riżultati tal-U-SENS™ jistgħu jinformaw valutazzjoni tal-potenza.
|
|
6.
|
Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 2.1.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
7.
|
It-test U-SENS™ hu assaġġ in vitro li jikkwantifika t-tibdiliet fl-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 fuq linja ta’ ċelloli tal-linfoma istjoċitika umana, iċ-ċelloli U937, wara esponiment għal 45±3 sigħat għas-sustanza kimika tat-test. Il-markatur tas-superfiċje CD86 hu markatur tipiku minnhom tal-attivazzjoni tal-U937. Is-CD86 hu magħruf bħala molekula kostimolatorja li tista’ timita l-attivazzjoni monoċitika, li taqdi rwol kritiku fil-primazzjoni taċ-ċelloli-T. It-tibdiliet fl-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 jitkejlu b’ċitometrija tal-fluss wara tilwin taċ-ċelloli, tipikament b’antikorpi tikkettati (bl-FITC) tal-istjoċjanat tal-fluworexxeina. Il-kejl taċ-ċitotossiċità jsir fl-istess ħin ukoll (eż. bl-użu tal-PI) biex jiġi vvalutat jekk s-sovraregolazzjoni tal-espressjoni tal-markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli CD86 isseħħx f’konċentrazzjonijiet subċitotossiċi. L-indiċi ta’ stimolazzjoni (S.I.) tal-markatur tas-superfiċje taċ-ċelloli mqabbel mal-kontroll b’solvent/b’veikolu hu kkalkolat u jintuża fil-mudell tat-tbassir (ara l-paragrafu 19), b’sostenn tad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi u n-nonsensitizzaturi.
|
WIRI TAL-PROFIĊJENZA
|
8.
|
Qabel ma jużaw it-test deskritt f’dan l-Appendiċi tal-metodu ta’ ttestjar B.71 bħala rutina, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jużaw l-10 Sustanzi ta’ Profiċjenza elenkati fl-Appendiċi 11 f’konformità mal-Prattiki Tajba tal-Metodi in vitro (11). Barra minn hekk, l-utenti tat-test għandhom iżommu bażi ta’ data storika tad-data ġenerata bil-kontrolli tar-reattività (ara l-paragrafu 11) u bil-kontrolli pożittivi u b’solvent/b’veikolu (ara l-paragrafi 15-16), u jużaw din id-data biex jikkonfermaw ir-riproduċibbiltà tat-test fil-laboratorju tagħhom tinżamm maż-żmien.
|
PROĊEDURA
|
9.
|
Dan it-test hu bbażat fuq il-protokoll nru 183 (12) tal-U-SENS™ DataBase service on ALternative Methods to animal experimentation (DB-ALM). Għandhom jitħaddmu l-Proċeduri Operatorji Standard (SOP) meta jiġi implimentat u meta jintuża t-test U-SENS™ fil-laboratorju. Tista’ tintuża sistema awtomatizzata biex isir il-U-SENS™ jekk ikun jista’ jintwera li din tipprovdi riżultati simili, pereżempju bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 2.2. Din li ġejja hi deskrizzjoni tal-komponenti u tal-proċeduri ewlenin għat-test U-SENS™.
|
Tħejjija taċ-ċelloli
|
10.
|
Il-linja ta’ ċelloli tal-linfoma istjoċitika umana, U937 (13), għandha tintuża għat-twettiq tat-test U-SENS™. Iċ-ċelloli (klonu CRL1593.2) għandhom jinkisbu minn bank taċ-ċelloli kwalifikat sew, bħall-American Type Culture Collection.
|
|
11.
|
Iċ-ċelloli U937 huma kolturati f’37°C f’5 % CO2 u atmosfera umidifikata f’medium RPMI-1 640 supplimentat b’10 % serum tal-għoġġiela fetali (FCS), 2 mM L-glutammina, 100 unità/ml peniċillina u 100 μg/ml streptomiċina (medium komplut). Iċ-ċelloli U937 jiġu passaġġati bħala rutina kull jumejn/tlieta bid-densità ta’ 1,5 jew 3 × 105 ċelloli/ml, rispettivament. Id-densità taċ-ċelloli ma għandhiex taqbeż it-2 × 106 ċelloli/ml u l-vijabbiltà taċ-ċelloli mkejla bl-esklużjoni tal-blu tirpan għandha tkun ≥ 90 % (ma għandhiex tiġi applikata fl-ewwel passaġġ wara t-taħlil). Qabel ma jintużaw għall-ittestjar, kull lott ta’ ċelloli, ta’ FCS jew ta’ antikorp għandu jiġi kwalifikat billi jsir kontroll tar-reattività. Il-kontroll tar-reattività taċ-ċelloli għandu jsir bl-użu tal-kontroll pożittiv, l-aċidu pikrilsulfoniku (2,4,6-Trinitro-benżen-aċidu sulfoniku: TNBS) (CASRN 2 508-19-2, ≥ 99 % purità), u l-kontroll negattiv, aċidu lattiku (LA) (CASRN 50-21-5, ≥ 85 % purità), tal-anqas ġimgħa wara t-taħlil. Għall-kontroll tar-reattività, għandhom jiġu ttestjati sitt konċentrazzjonijiet finali għal kull wieħed miż-2 kontrolli (TNBS: 1, 12,5, 25, 50, 75, 100μg/ml u LA: 1, 10, 20, 50, 100, 200μg/ml). TNBS solubilizzat f’medium komplut għandu jipproduċi rispons pożittiv u relatat mal-konċentrazzjoni tas-CD86 (eż. meta konċentrazzjoni pożittiva, S.I. tas-CD86 ≥ 150, tkun segwita minn konċentrazzjoni b’S.I. tas-CD86 li jibqa’ jiżdied), u LA solubilizzat f’medium komplut għandu jipproduċi rispons negattiv tas-CD86 (ara l-paragrafu 21). Hu biss il-lott ta’ ċelloli li jgħaddi mill-kontroll tar-reattività darbtejn li għandu jintuża għall-assaġġ. Iċ-ċelloli jistgħu jiġu propagati sa seba’ ġimgħat wara li jinħallu. In-numru tal-passaġġ ma għandux jaqbeż il-21. Il-kontroll tar-reattività għandu jsir skont il-proċeduri deskritti fil-paragrafi 18-22.
|
|
12.
|
Għall-ittestjar, iċ-ċelloli U937 jinżergħu f’densità ta’ 3 x 105 ċelloli/ml jew 6 × 105 ċelloli/ml, u jiġu prekolturati fi flasks tal-koltura għal jumejn jew għal jum (1), rispettivament. Jistgħu jintużaw kundizzjonijiet prekolturati oħra differenti minn dawk deskritti hawn fuq jekk tiġi pprovduta raġuni xjentifika suffiċjenti u jekk ikun jista’ jintwera li dawn jipprovdu riżultati simili, pereżempju bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 2.2. Fil-jum tal-ittestjar, iċ-ċelloli miġbura mill-flask tal-koltura jerġgħu jiġu sospiżi b’medium tat-tkabbir frisk f’5 × 105 ċelloli/ml. Imbagħad, iċ-ċelloli jitqassmu fi pjastra b’qiegħ ċatt b’96 bwejra b’100 μl (densità finali taċ-ċelloli ta’ 0,5 × 105 ċelloli/bwejra).
|
Tħejjija tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
13.
|
Il-valutazzjoni tas-solubbiltà ssir qabel l-ittestjar. Għal dan l-għan, is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti jew dispersi b’mod stabbli f’konċentrazzjoni ta’ 50 mg/ml f’medium komplut bħala s-solvent tal-ewwel għażla jew id-dimetil sulfossidu (DMSO, ≥ 99 % purità) bħala s-solvent/il-veikolu tat-tieni għażla jekk is-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli fis-solvent/fil-veikolu tal-medium komplut. Għall-ittestjar, is-sustanza kimika tat-test tiġi dissolta sa konċentrazzjoni finali ta’ 0,4 mg/ml f’medium komplut jekk is-sustanza kimika tkun solubbli f’dan is-solvent/il-veikolu. Jekk is-sustanza kimika tkun solubbli f’DMSO biss, is-sustanza kimika tiġi dissolta f’konċentrazzjoni ta’ 50 mg/ml. Solventi/veikoli oħra li mhumiex dawk deskritti hawn fuq jistgħu jintużaw jekk tiġi pprovduta raġuni xjentifika suffiċjenti. L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/fil-veikolu finali għandha tiġi kkunsidrata.
|
|
14.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test u s-sustanzi tal-kontroll jitħejjew dakinhar tal-ittestjar. Minħabba li ma jsirx assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża, għall-ewwel sessjoni għandhom jiġu ttestjati sitt konċentrazzjonijiet finali (1, 10, 20, 50, 100 u 200 μg/ml) fis-solvent/fil-veikolu korrispondenti f’medium komplut jew inkella f’medium ta’ 0,4 % DMSO. Għas-sessjonijiet sussegwenti, b’bidu miż-0,4 mg/ml f’medium komplut jew b’50 mg/ml f’DMSO, is-soluzzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test, tal-anqas jitħejjew 4 soluzzjonijiet għall-użu (jiġifieri tal-anqas 4 konċentrazzjonijiet) bl-użu tas-solvent/tal-veikolu korrispondenti. Is-soluzzjonijiet għall-użu finalment jintużaw għat-trattament billi jiżdied volum ugwali ta’ sospensjoni taċ-ċelloli U937 (ara l-paragrafu 11 aktar ’il fuq) mal-volum tas-soluzzjoni għall-użu fil-pjastra biex tinkiseb dilwizzjoni ulterjuri ta’ darbtejn (12). Il-konċentrazzjonijiet (tal-anqas erba’ konċentrazzjonijiet) għal kwalunkwe sessjoni ulterjuri jintgħażlu fuq il-bażi tar-riżultati individwali tas-sessjonijiet preċedenti kollha (8). Il-konċentrazzjonijiet finali utilizzabbli huma ta’ 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 u 200 μg/ml. Il-konċentrazzjoni finali massima hi ta’ 200 μg/ml. Fil-każ li jiġi osservat valur pożittiv tas-CD86 f’1 μg/ml, 0,1 μg/ml tiġi evalwata biex tinstab il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test li ma tinduċix is-CD86 f’livell ogħla mil-limitu pożittiv. Għal kull sessjoni, l-EC150 (konċentrazzjoni li fiha sustanza kimika tilħaq il-limitu pożittiv ta’ CD86 ta’ 150 %, ara l-paragrafu 19) tiġi kkalkolata jekk jiġi osservat rispons pożittiv għall-konċentrazzjoni tas-CD86. Meta s-sustanza kimika tat-test tinduċi rispons pożittiv għas-CD86 li ma jkunx relatat mal-konċentrazzjoni, il-kalkolu tal-EC150 jaf ma jkunx rilevanti kif deskritt fil-protokoll nru 183 (12) tad-DB-ALM tal-U-SENS™. Għal kull sessjoni, is-CV70 (konċentrazzjoni li fiha sustanza kimika tilħaq il-limitu ta’ ċitotossiċità ta’ 70 %, ara l-paragrafu 19) tiġi kkalkolata kull fejn possibbli (12). Biex jiġi investigat l-effett tar-rispons għal konċentrazzjoni ta’ żieda fis-CD86, kwalunkwe konċentrazzjoni mill-konċentrazzjonijiet utilizzabbli għandha tingħażel eżatt f’nofs l-EC150 (jew l-ogħla konċentrazzjoni mhux ċitotossika negattiva tas-CD86) u s-CV70 (jew l-ogħla konċentrazzjoni awtorizzata, jiġifieri 200 μg/ml). Tal-anqas għandhom jiġu ttestjati 4 konċentrazzjonijiet għal kull sessjoni b’tal-anqas żewġ konċentrazzjonijiet li jkunu komuni għas-sessjoni(jiet) preċedenti, għall-finijiet ta’ tqabbil.
|
|
15.
|
Il-kontroll b’solvent/b’veikolu użat fit-test U-SENS™ hu medium komplut (għal sustanzi kimiċi tat-test solubilizzati jew dispersi b’mod stabbli f’medium komplut) (ara l-paragrafu 4) jew 0,4 % DMSO f’medium komplut (għal sustanzi kimiċi tat-test solubilizzati jew dispersi b’mod stabbli fid-DMSO).
|
|
16.
|
Il-kontroll pożittiv użat fit-test U-SENS™ hu TNBS (ara l-paragrafu 11), imħejji f’medium komplut. TNBS għandu jintuża bħala l-kontroll pożittiv għall-kejl tal-espressjoni ta’ CD86 f’konċentrazzjoni waħda finali fil-pjastra (50 μg/ml) li trendi > 70 % tal-vijabbiltà taċ-ċelloli. Biex tinkiseb konċentrazzjoni ta’ 50 μg/ml ta’ TNBS fil-pjastra, soluzzjoni ewlenija ta’ 1 M (jiġifieri 293 mg/ml) ta’ TNBS f’medium komplut titħejja u tkompli tiġi dilwita għal 2 930 darba b’medium komplut għal soluzzjoni għall-użu ta’ 100 μg/ml. L-aċidu lattiku (LA, CAS 50-21-5) għandu jintuża bħala l-kontroll negattiv f’200 μg/ml solubilizzat f’medium komplut (minn soluzzjoni ewlenija ta’ 0,4 mg/ml). F’kull pjastra ta’ kull sessjoni, jitħejjew tliet repliki ta’ kontroll mhux trattat ta’ medium komplut, ta’ kontroll b’solvent/b’veikolu, u ta’ kontrolli negattivi u pożittivi (12). Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi xierqa oħra jekk ikun hemm data storika disponibbli biex jiġu derivati kriterji ta’ aċċettazzjoni ta’ sessjonijiet komparabbli. Il-kriterji ta’ aċċettazzjoni tas-sessjoni huma l-istess bħal dawk deskritti għas-sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 12).
|
Applikazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
17.
|
Il-kontroll b’solvent/b’veikolu jew is-soluzzjonijiet għall-użu deskritti fil-paragrafi 14-16 jitħalltu 1:1 (v/v) mas-sospensjonijiet taċ-ċelloli mħejjija fil-pjastra b’qiegħ ċatt b’96 bwejra (ara l-paragrafu 12). Imbagħad il-pjastri trattati jiġu inkubati għal 45±3 siegħa f’37°C f’5 % CO2. Qabel l-inkubazzjoni, il-pjastri jiġu ssiġillati b’membrana semipermeabbli, biex jiġu evitati evaporazzjoni ta’ sustanzi kimiċi tat-test volatili u kontaminazzjoni kroċjata bejn ċelloli trattati bis-sustanzi kimiċi tat-test (12).
|
Tilwin taċ-ċelloli
|
18.
|
Wara esponiment għal 45±3 siegħa, iċ-ċelloli jiġu trasferiti fi pjastra għall-mikrotitraġġ forma ta’ V u jinġabru b’ċentfigurazzjoni. L-interferenza tas-solubbiltà hi definita bħala kristalli jew taqtiriet osservati taħt il-mikroskopju 45 ± 3 sigħat wara t-trattament (qabel it-tilwin taċ-ċelloli). Is-supernatanti jintremew u ċ-ċelloli li jifdal jinħaslu darba b’100 μl salina baferjata tal-fosfat (PBS) kiesħa silġ li jkun fiha 5 % serum tal-għoġġiela fetali (bafer tat-tilwin). Wara ċ-ċentrifugrazzjoni, iċ-ċelloli jerġgħu jiġu sospiżi b’100 μl bafer tat-tilwin u jitlewnu b’5 μl (eż. 0,25 μg) antikorpi anti-CD86 tikkettati bl-FITC jew tal-IgG1 (isotip) tal-ġrieden f’4°C għal 30 min protetti mid-dawl. Għandhom jintużaw l-antikorpi deskritti fil-protokoll nru 183 tad-DB-ALM ta’ U-SENS™ (12) (għal CD86: BD-PharMingen #5556 57 Klonu: Fun-1, jew Caltag/Invitrogen # MHCD8601 Klonu: BU63; u għal IgG1; BD-PharMingen #5557 48, jew Caltag/Invitrogen # GM4992). Fuq il-bażi tal-esperjenza tal-iżviluppaturi tat-test, l-intensità tal-fluworexxenza tal-antikorpi normalment tkun konsistenti bejn lottijiet differenti. Kloni oħra jew fornitur ieħor tal-antikorpi li jgħaddu mill-kontroll tar-reattività jistgħu jintużaw għall-assaġġ (ara l-paragrafu 11). Madankollu, l-utenti jistgħu jikkunsidraw it-titrazzjoni tal-antikorpi fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju tagħhom stess biex jiddefinixxu l-aħjarkonċentrazzjoni għall-użu. Tista’ tintuża sistema oħra ta’ identifikazzjoni, eż. antikorpi anti-CD86 taggjati bil-fluworokromu, jekk jista’ jintwera li din tipprovdi riżultati simili bħall-antikorpi konjugati bl-FITC, pereżempju bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 2.2. Wara l-ħasil b’100 μl bafer tat-tilwin darbtejn u darba b’100 μl PBS kiesħa silġ, iċ-ċelloli jerġgħu jiġu sospiżi f’PBS kiesħa silġ (eż. 125 μl għal kampjuni li jiġu analizzati manwalment tubu, tubu, jew 50 μl bl-użu ta’ pjastra tal-awtokampjunar) u tiżdied soluzzjoni tal-PI (konċentrazzjoni finali ta’ 3 μg/ml). Jistgħu jintużaw markaturi oħra taċ-ċitotossiċità, bħal 7-Amminoaċtinomiċina D (7-AAD) jew Tripan blu jekk it-tilwin alternattiv ikun jista’ jintwera li jipprovdi riżultati simili bħall-PI, pereżempju bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza fl-Appendiċi 2.2.
|
Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss
|
19.
|
Il-livell ta’ espressjoni tas-CD86 u l-vijabbiltà taċ-ċelloli jiġu analizzati bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss. Iċ-ċelloli jintwerew fi ħdan dot plot tad-daqs (FSC) u tal-granularità (SSC) stabbilita għall-iskala log biex tiġi identifikata biċ-ċar il-popolazzjoni fl-ewwel gate R1 u jiġu eliminati l-fdalijiet. Jinkiseb total fil-mira ta’ 10 000 ċellola fil-gate R1 għal kull bwejra. Iċ-ċelloli mill-istess gate R1 jintwerew fi ħdan dot pot FL3 jew FL4 / SSC. Iċ-ċelloli vijabbli jiġu delineati billi titqiegħed it-tieni gate R2 li tagħżel il-popolazzjoni taċ-ċelloli negattivi għall-jodur tal-propidju (kanal FL3 jew FL4). Il-vijabbiltà taċ-ċelloli tista’ tiġi kkalkolata bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja mill-programm ta’ analiżi taċ-ċitometru. Meta l-vijabbiltà taċ-ċelloli tkun baxxa, ikunu jistgħu jinkisbu sa 20 000 ċellola inklużi ċ-ċelloli mejtin. Inkella, id-data tista’ tinkiseb għal minuta waħda wara t-tnedija tal-analiżi.
Imbagħad il-perċentwal ta’ ċelloli pożittivi għall-FL1 jitkejjel fost dawn iċ-ċelloli vijabbli li jkunu ġew gated fl-R2 (fi ħdan l-R1). L-espressjoni tas-superfiċje taċ-ċeloli tas-CD86 tiġi analizzata f’dot plot FL1 / SSC li tkun gated fuq ċelloli vijabbli (R2).
Għall-medium komplut / għall-bwejriet tal-IgG1, il-markatur tal-analiżi jiġi stabbilit qrib il-popolazzjoni ewlenija biex il-kontrolli tal-medium komplut ikollhom IgG1 fi ħdan iż-żona fil-mira ta’ 0,6 sa 0,9 %.
L-interferenza tal-kulur hi definita bħala ċaqliq tad-dot plot tal-IgG1 tikkettat bl-FITC (S.I. Ġeo Medju tal-FL1 tal-IgG1 ≥ 150 %).
L-indiċi ta’ stimolazzjoni (S.I.) tas-CD86 għaċ-ċelloli tal-kontrolli (mhux trattati jew f’0,4 % DMSO) u għaċ-ċelloli trattati b’sustanza kimika jiġi kkalkolat skont l-ekwazzjoni li ġejja:.
% taċ-ċelloli tal-kontroll mhux trattati bl-IgG1+: imsejjaħ bħala l-perċentwal taċ-ċelloli IgG1 pożittivi għall-FL1 definiti bil-markatur tal-analiżi (medda aċċettata ta’ ≥ 0,6 % u < 1,5 %, ara l-paragrafu 22) fost iċ-ċelloli mhux trattati vijabbli.
% taċ-ċelloli tal-kontroll/trattati bl-IgG1+/CD86+: imsejjaħ il-perċentwal ta’ ċelloli IgG1/CD86 pożittivi għall-FL1 imkejjel mingħajr ma jiċċaqlaq il-markatur tal-analiżi fost iċ-ċelloli tal-kontroll/trattati vijabbli.
|
DATA U RAPPORTAR
Evalwazzjoni tad-data
|
20.
|
Il-parametri li ġejjin huma kkalkolati fit-test U-SENS™: Il-valur tas-CV70, jiġifieri konċentrazzjoni li turi 70 % tas-sopravivenza taċ-ċelloli U937 (30 % ċitotossiċità) u l-valur tal-EC150, jiġifieri l-konċentrazzjoni li fiha s-sustanzi kimiċi tat-test jinduċu indiċi ta’ stimolazzjoni (S.I.) tas-CD86 ta’ 150 %.
Is-CV70 hi kkalkolata b’interpolazzjoni lineari tal-log bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
CV70 = C1 + [(V1 - 70) / (V1 – V2) * (C2 – C1)]
Fejn:
V1 hu l-valur minimu tal-vijabbiltà taċ-ċelloli ogħla minn 70 %
V2 hu l-valur massimu tal-vijabbiltà taċ-ċelloli anqas minn 70 %
C1 u C2 huma l-konċentrazzjonijiet li juru l-valur tal-vijabbiltà taċ-ċelloli V1 u V2 rispettivament.
Jistgħu jintużaw approċċi oħra biex tinkiseb is-CV70 dment li jintwera li dawn ma jkollhom ebda impatt fuq ir-riżultati (eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta’ profiċjenza).
Is-EC150 hi kkalkolata b’interpolazzjoni lineari tal-log bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
EC150 = C1 + [(150 – S.I.1) / (S.I.2 – S.I.1) * (C2 – C1)]
Fejn:
C1 hi l-ogħla konċentrazzjoni f’μg/ml b’CD86 S.I. < 150 % (S.I. 1)
C2 hi l-anqas konċentrazzjoni f’μg/ml b’CD86 S.I. ≥ 150 % (S.I. 2)
Il-valuri tal-EC150 u tas-CV70 jiġu kkalkolati
|
—
|
għal kull sessjoni: il-valuri individwali tal-EC150 u tas-CV70 jintużaw bħala għodod biex jiġi investigat l-effett ta’ rispons għall-konċentrazzjoni taż-żieda ta’ CD86 (ara l-paragrafu 14).
|
|
—
|
fuq il-bażi tal-vijabbiltajiet medji, tiġi determinata s-CV70 ġenerali (12),
|
|
—
|
fuq il-bażi tal-S.I. medju tal-valuri tas-CD86, l-EC150 ġenerali tiġi determinata għas-sustanza kimika tat-test prevista bħala POŻITTIVA bil-U-SENS™ (ara l-paragrafu 21) (12).
|
|
Mudell ta’ tbassir
|
21.
|
Għall-kejl tal-espressjoni tas-CD86, kull sustanza kimika tat-test tiġi ttestjata f’tal-anqas erba’ konċentrazzjonijiet u f’tal-anqas żewġ sessjonijiet indipendenti biex jinkiseb tbassir wieħed (NEGATTIV jew POŻITTIV).
|
—
|
Il-konklużjoni individwali ta’ sessjoni ta’ U-SENS™ titqies NEGATTIVA (minn hawn ’il quddiem imsejħa N) jekk l-S.I. tas-CD86 ikun anqas minn 150 % fil-konċentrazzjonijiet mhux ċitotossiċi kollha (vijabbiltà taċ-ċelloli ≥ 70 %) u jekk ma tiġi osservata ebda interferenza (ċitotossiċità, solubbiltà: ara l-paragrafu 18 jew kulur: ara l-paragrafu 19 indipendentement mill-konċentrazzjonijiet mhux ċitotossiċi li fihom tiġi individwata l-interferenza. Fil-każijiet l-oħra kollha: S.I. ta’ CD86 ta’ 150 % jew ogħla u/jew interferenzi osservati, il-konklużjoni individwali ta’ sessjoni ta’ U-SENS™ titqies Pożittiva (minn hawn ’il quddiem imsejħa P).
|
|
—
|
Tbassir ta’ U-SENS™ jitqies NEGATTIV jekk tal-anqas żewġ sessjonijiet indipendenti jiġu negattivi (N) (Figura 1). Jekk l-ewwel żewġ sessjonijiet it-tnejn ikunu negattivi (N), it-tbassir ta’ U-SENS™ jitqies NEGATTIV u ma jkunx hemm bżonn li ssir it-tielet sessjoni.
|
|
—
|
Tbassir ta’ U-SENS™ jitqies POŻITTIV jekk tal-anqas żewġ sessjonijiet indipendenti jiġu pożittivi (P) (Figura 1). Jekk l-ewwel żewġ sessjonijiet it-tnejn ikunu pożittivi (P), it-tbassir ta’ U-SENS™ jitqies POŻITTIV u ma jkunx hemm bżonn li ssir it-tielet sessjoni.
|
|
—
|
Peress li ma jsirx assaġġ ta’ individwazzjoni tad-doża, hemm eċċezzjoni jekk, fl-ewwel sessjoni, l-S.I. ta’ CD86 ikun 150 % jew akbar fl-ogħla konċentrazzjoni mhux ċitotossika biss. Imbagħad is-sessjoni titqies MHUX KONKLUŻIVA (NC), u konċentrazzjonijiet addizzjonali (bejn l-ogħla konċentrazzjoni mingħajr ċitotossiċità u l-anqas konċentrazzjoni ta’ ċitotossiċità - ara l-paragrafu 20) għandhom jiġu ttestjati f’sessjonijiet addizzjonali. F’każ li sessjoni tiġi identifikata bħala NC, tal-anqas għandhom isiru żewġ sessjonijiet addizzjonali, u r-raba’ sessjoni f’każ li t-tieni u t-tielet sessjonijiet ma jkunux jaqblu (N u/jew P indipendentement) (Figura 1). Sessjonijiet ta’ segwitu jitqiesu pożittivi anki jekk konċentrazzjoni ċitotossika waħda biss tagħti CD86 ta’ 150 % jew aktar, peress li l-issettjar tal-konċentrazzjoni ġie aġġustat għas-sustanza kimika tat-test speċifika. It-tbassir finali jkun ibbażat fuq ir-riżultat tal-maġġoranza tat-tliet jew tal-erba’ sessjonijiet individwali (jiġifieri tnejn minn tlieta jew tnejn minn erbgħa) (Figura 1).
|
Figura 1: Mudell ta’ tbassir użat fit-test U-SENS™ Tbassir U-SENS™ għandu jitqies fil-kuntest ta’ IATA u skont id-dispożizzjoni tal-paragrafu 4 u tal-paragrafi 7, 8 u 9 tal-Introduzzjoni ġenerali.
N: Sessjoni b’ebda CD86 pożittiv jew interferenza osservati;
P: Sessjoni b’CD86 pożittiv jew interferenza/i osservati;
NC: Mhux Konklużiva. L-ewwel sessjoni b’Ebda Konklużjoni meta s-CD86 ikun pożittiv fl-ogħla konċentrazzjoni mhux ċitotossika biss;
#: Konklużjoni individwali Mhux Konklużiva (NC) attribwita biss għall-ewwel sessjoni twassal b’mod awtomatiku għall-ħtieġa li ssir it-tielet sessjoni biex tintlaħaq maġġoranza ta’ konklużjonijiet Pożittivi (P) jew Negattivi (N) f’tal-anqas żewġ sessjonijiet indipendenti minn tlieta.
$: #Il-kaxex juru t-taħlitiet rilevanti ta’ riżultati mit-tliet sessjonijiet fuq il-bażi tar-riżultati miksuba fl-ewwel żewġ sessjonijiet murija fil-kaxxa ta’ hawn fuq.
°: #Il-kaxex juru t-taħlitiet rilevanti ta’ riżultati mill-erba’ sessjonijiet fuq il-bażi tar-riżultati miksuba fl-ewwel tliet sessjonijiet murija fil-kaxxa ta’ hawn fuq.
|
Kriterji ta’ aċċettazzjoni
|
22.
|
Għandhom jiġu ssodisfati l-kriterji ta’ aċċettazzjoni li ġejjin meta jintuża t-test U-SENS™ (12).
|
—
|
Fi tmiem il-perjodu ta’ esponiment ta’ 45±3 sigħat, il-vijabbiltà medja taċ-ċelloli U937 mhux trattati fi triplikat kellha tkun > 90 % u ma tiġi osservata ebda deriva fl-espressjoni tas-CD86. L-espressjoni bażali tas-CD86 ta’ ċelloli U937 mhux trattati kellha taqa’ fi ħdan il-medda ta’ ≥ 2 % u ≤ 25 %.
|
|
—
|
Meta jintuża DMSO bħala solvent, il-validità tal-kontroll b’veikolu DMSO tiġi vvalutata bil-kalkolu tal-S.I. ta’ DMSO meta mqabbel ma’ ċelloli mhux trattati, u l-vijabbiltà medja taċ-ċelloli triplikati kellha tkun > 90 %. Il-kontroll b’veikolu DMSO jkun validu jekk il-valur medju tal-S.I. tas-CD86 fi triplikat tiegħu jkun iżgħar minn 250 % tal-medja tal-S.I. as-CD86 fi triplikat taċ-ċelloli U937 mhux trattati.
|
|
—
|
Is-sessjonijiet jitqiesu validi jekk tal-anqas tnejn minn tliet valuri tal-IgG1 taċ-ċelloli U937 mhux trattati jaqgħu fi ħdan il-medda ta’ ≥ 0,6 % u < 1,5 %.
|
|
—
|
Il-kontroll negattiv (aċidu lattiku) ittestjat b’mod konkorrenti jitqies validu jekk tal-anqas tnejn mit-tliet repliki jkunu negattivi (S.I. tas-CD86 < 150 %) u mhux ċitotossiċi (vijabbiltà taċ-ċelloli ≥ 70 %).
|
|
—
|
Il-kontroll pożittiv (TNBS) jitqies validu jekk tal-anqas tnejn mit-tliet repliki jkunu pożittivi (S.I. tas-CD86 ≥ 150 %) u mhux ċitotossiċi (vijabbiltà taċ-ċelloli ≥ 70 %).
|
|
Rapport tat-test
|
23.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja.
|
Sustanza Kimika tat-Test
Sustanza monokostitwenti
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà f’medium komplut, is-solubbiltà fid-DMSO, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test;
|
Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita:
|
Karatterizzazzjoni sa fejn possibbli, eż. bl-identità kimika (ara aktar ’il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti (ara aktar ’il fuq) tal-kostitwenti, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà f’medium komplut, is-solubbiltà fid-DMSO, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
|
|
Il-piż molekulari jew il-piż molekulari apparenti fil-każ ta’ taħlitiet/polimeri b’kompożizzjonijiet magħrufin jew informazzjoni oħra rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
|
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
|
Kontrolli
Kontroll pożittiv
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fid-DMSO, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli u fejn applikabbli;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Referenza għar-riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv li juru kriterji xierqa ta’ aċċettazzjoni tas-sessjoni, jekk applikabbli.
|
Kontroll negattiv u b’solvent/b’veikolu
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali f’każ li jintuża solvent/veikolu ieħor li ma jkunx fost dawk imsemmijin fil-Linja Gwida tat-Test u sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
|
Kundizzjonijiet tat-test
|
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju;
|
|
Deskrizzjoni tat-test użat;
|
|
Il-linja ta’ ċelloli użata, il-kundizzjonijiet tal-ħżin u s-sors tagħha (eż. il-faċilità mnejn inkisbet);
|
|
Iċ-ċitometrija tal-fluss użata (eż. il-mudell), inklużi l-issettjar tal-istrumenti, l-antikorpi u l-markatur taċ-ċitotossiċità użat;
|
|
Il-proċedura użata biex tintwera l-profiċjenza tal-laboratorju fit-twettiq tat-test bl-ittestjar ta’ sustanzi ta’ profiċjenza, u l-proċedura użata biex tintwera prestazzjoni riproduċibbli tat-test maż-żmien, eż. data storika tal-kontroll u/jew data storika tal-kontrolli tar-reattività.
|
|
|
Kriterji ta’ Aċċettazzjoni tat-Test
|
Il-valuri tal-vijabbiltà taċ-ċelloli u tal-S.I. tas-CD86 miksuba bil-kontroll b’solvent/b’veikolu meta mqabbla mal-meded ta’ aċċettazzjoni;
|
|
Il-valuri tal-vijabbiltà taċ-ċelloli u tas-S.I. miksuba bil-kontroll pożittiv meta mqabbla mal-meded ta’ aċċettazzjoni;
|
|
Il-vijabbiltà taċ-ċelloli tal-konċentrazzjonijiet ittestjati kollha tas-sustanza kimika tat-test.
|
|
|
Il-proċedura tat-test
|
In-numru ta’ sessjonijiet użati;
|
|
Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika, l-applikazzjoni u l-ħin ta’ esponiment użat (jekk ikun differenti minn dak rakkomandat)
|
|
Id-durata tal-esponiment;
|
|
Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ evalwazzjoni u deċiżjoni użati;
|
|
Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test.
|
|
|
Ir-riżultati
|
Tabulazzjoni tad-data, inklużi s-CV70 (jekk applikabbli), l-S.I., il-valuri tal-vijabbiltà taċ-ċelloli, il-valuri tal-EC150 (jekk applikabbli) miksuba għas-sustanza kimika tat-test u għall-kontroll pożittiv f’kull sessjoni, u indikazzjoni tal-klassifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test skont il-mudell tat-tbassir;
|
|
Deskrizzjoni ta’ kull osservazzjoni rilevanti oħra osservata, jekk applikabbli.
|
|
|
Diskussjoni tar-Riżultati
|
Diskussjoni tar-riżultati miksuba bit-test U-SENS™;
|
|
Kunsiderazzjoni tar-riżultati tat-test fil-kuntest ta’ IATA, jekk ikun hemm informazzjoni rilevanti oħra disponibbli.
|
|
Konklużjonijiet
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
Piroird, C., Ovigne, J.M., Rousset, F., Martinozzi-Teissier, S., Gomes, C., Cotovio, J., Alépée, N. (2015). The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29, 901-916.
|
|
(2)
|
EURL ECVAM (2017). The U-SENS™ test method Validation Study Report. Dan huwa disponibbli mis-sit web li ġej: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations
|
|
(3)
|
EC EURL ECVAM (2016). ESAC Opinion No 2016-03 on the L’Oréal-coordinated study on the transferability and reliability of the U-SENS™ test method for skin sensitisation testing. EUR 28 178 EN; doi 10.2 787/8157 37. Disponibbli fuq: [http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103705].
|
|
(4)
|
EC EURL ECVAM (2017). EURL ECVAM Recommendation on the use of non-animal approaches for skin sensitisation testing. EUR 28 553 EN; doi 10.2 760/5889 55. Disponibbli fuq: https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/eur-scientific-and-technical-research-reports/eurl-ecvam-recommendation-use-non-animal-approaches-skin-sensitisation-testing.
|
|
(5)
|
Steiling, W. (2016). Safety Evaluation of Cosmetic Ingredients Regarding their Skin Sensitization Potential. doi:10.3390/cosmetics3020014.Cosmetics 3, 14.
|
|
(6)
|
OECD (2016). Guidance Document on The Reporting of Defined Approaches and Individual Information Sources to be Used Within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Series on Testing & Assessment No 256, ENV/JM/MONO(2016)29. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: [ http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.
|
|
(7)
|
Urbisch, D., Mehling, A., Guth, K., Ramirez, T., Honarvar, N., Kolle, S., Landsiedel, R., Jaworska, J., Kern, P.S., Gerberick, F., Natsch, A., Emter, R., Ashikaga, T., Miyazawa, M., Sakaguchi, H. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul. Toxicol. Pharmacol. 71, 337-351.
|
|
(8)
|
Alépée, N., Piroird, C., Aujoulat, M., Dreyfuss, S., Hoffmann, S., Hohenstein, A., Meloni, M., Nardelli, L., Gerbeix, C., Cotovio, J. (2015). Prospective multicentre study of the U-SENS test method for skin sensitization testing. Toxicol In Vitro 30, 373-382.
|
|
(9)
|
Reisinger, K., Hoffmann, S., Alépée, N., Ashikaga, T., Barroso, J., Elcombe, C., Gellatly, N., Galbiati, V., Gibbs, S., Groux, H., Hibatallah, J., Keller, D., Kern, P., Klaric, M., Kolle, S., Kuehnl, J., Lambrechts, N., Lindstedt, M., Millet, M., Martinozzi-Teissier, S., Natsch, A., Petersohn, D., Pike, I., Sakaguchi, H., Schepky, A., Tailhardat, M., Templier, M., van Vliet, E., Maxwell, G. (2014). Systematic evaluation of non-animal test methods for skin sensitisation safety assessment. Toxicol. In Vitro 29, 259-270.
|
|
(10)
|
Fabian, E., Vogel, D., Blatz, V., Ramirez, T., Kolle, S., Eltze, T., van Ravenzwaay, B., Oesch, F., Landsiedel, R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1 683-1 696.
|
|
(11)
|
OECD. (2018). Draft Guidance document: Good In Vitro Method Practices (GIVIMP) for the Development and Implementation of In Vitro Methods for Regulatory Use in Human Safety Assessment. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/OECD Final Draft GIVIMP.pdf.
|
|
(12)
|
DB-ALM (2016). Protocol no 183: Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS™), 33pp. Dan huwa disponibbli mis-sit web li ġej: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/].
|
|
(13)
|
Sundström, C., Nilsson, K. (1976). Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int. J. Cancer 17, 565-577.
|
|
(14)
|
OECD (2005). Series on Testing and Assessment No. 34: Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.
|
|
(15)
|
In-Nazzjonijiet Uniti (2015) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). ST/SG/AC.10/30/Rev.6, Sixth Revised Edition, New York & Geneva: United Nations Publications. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/English/ST-SG-AC10-30-Rev6e.pdf.
|
|
(16)
|
OECD (2012). Series on Testing and Assessment No 168: The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.
|
|
(17)
|
ECETOC (2003). Technical Report No 87: Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals, Brussels. Disponibbli fuq: https://ftp.cdc.gov/pub/Documents/OEL/06. %20Dotson/References/ECETOC_2003-TR87.pdf.
|
Appendiċi 2.1
DEFINIZZJONIJIET
Akkuratezza
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tat-test u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tat-test u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ test (14).
AOP (Perkors tal-Eżitu Avvers)
: sekwenza ta’ avvenimenti mill-istruttura kimika ta’ sustanza kimika fil-mira jew grupp ta’ sustanzi kimiċi simili permezz tal-avveniment ta’ inizjazzjoni molekulari għal eżitu ta’ interess in vivo (15).
Rispons għall-konċentrazzjoni tas-CD86
: Hemm dipendenza tal-konċentrazzjoni (jew rispons għall-konċentrazzjoni) meta konċentrazzjoni pożittiva (S.I. tas-CD86 ≥ 150) tkun segwita minn konċentrazzjoni b’S.I. li jiżdied tas-CD86.
Sustanzi kimiċi
: Sustanza jew taħlita
CV70
: Il-konċentrazzjoni stmata li turi vijabbiltà taċ-ċelloli ta’ 70 %.
Deriva
: Deriva hi definita i) mill-valur ikkoreġut tal-%CD86+ tar-replika tal-kontroll mhux trattat 3 ikun anqas minn 50 % tal-medja tal-valur ikkoreġut tal-%CD86+ tar-repliki tal-kontroll mhux trattat 1 u 2; u ii) mill-valur ikkoreġut tal-%CD86+ tar-replika tal-kontroll negattiv 3 ikun anqas minn 50 % tal-medja tal-valur ikkoreġut tal-%CD86+ tar-repliki tal-kontroll negattiv 1 u 2.
EC150
: il-konċentrazzjonijiet stmati li juru l-S.I. ta’ 150 % tal-espressjoni tas-CD86.
Ċitometrija tal-fluss
: teknika ċitometrika li fiha ċ-ċelloli sospiżi fi fluwidu jiffluwixxu waħda, waħda permezz ta’ fokus ta’ dawl tal-eċitament, li jitferrex f’mudelli karatteristiċi għaċ-ċelloli u għall-komponenti tagħhom; iċ-ċelloli spiss jiġu tikkettati b’markaturi fluworexxenti biex id-dawl l-ewwel jiġi assorbit imbagħad jinħeles fi frekwenzi differenti.
Periklu
: Proprjetà inerenti ta’ aġent jew ta’ sitwazzjoni li għandha l-potenzjal li tikkawża effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
IATA (Approċċ Integrat għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni)
: Approċċ strutturat użat għall-identifikazzjoni ta’ perikli (potenzjal), għall-karatterizzazzjoni tal-perikli (potenza) u/jew għall-valutazzjoni tas-sikurezza (potenzjal/potenza u esponiment ) ta’ sustanza kimika jew ta’ grupp ta’ sustanzi kimiċi, li jintegra b’mod strutturat u jiżen id-data rilevanti kollha biex jinforma deċiżjoni regolatorja dwar il-periklu u/jew ir-riskju u/jew il-ħtieġa potenzjali għal ittestjar immirat ulterjuri li, għaldaqstant, ikun minimu.
Taħlita
: Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.
Sustanza monokostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).
Sustanza multikostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bl-amalgamar ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.
Kontroll pożittiv
: Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattata b’sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Biex jiġi żgurat li l-varjabbiltà fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista’ tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
Preapteni
: sustanzi kimiċi li jsiru sensitizzaturi permezz ta’ trasformazzjoni abijotika, eż. permezz ta’ ossidazzjoni.
Proapteni
: sustanzi kimiċi li jeħtiġu attivazzjoni enzimatika biex jeħilsu l-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda.
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test għall-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzjoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ test (14).
Affidabbiltà
: Kejlijiet ta’ kemm test jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbbiltà fl-istess u bejn il-laboratorarji u r-ripetibbiltà fl-istess laboratorju (14).
Sessjoni
: Sessjoni tikkonsisti f’sustanza kimika tat-test waħda jew aktar ittestjata flimkien ma’ kontroll negattiv u ma’ kontroll b’solvent/b’veikolu.
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal test li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ test (14).
S.I.
: Indiċi ta’ Stimolazzjoni. Valuri relattivi tal-intensità medja ġeometrika tal-fluworexxenza f’ċelloli trattati bis-sustanza kimika meta mqabbla ma’ ċelloli trattati b’solvent.
Kontroll b’solvent/veikolu
: Kampjun mhux trattat li fih il-komponenti kollha ta’ sistema tat-test ħlief tas-sustanza kimika tat-test, iżda li jinkludi s-solvent/il-veikolu li jintuża. Jintuża biex jiġi stabbilit ir-rispons tal-linja bażi għall-kampjuni trattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta jew dispersa stabbliment fl-istess solvent/veikolu. Meta jiġi ttestjat ma’ kontroll b’medium konkorrenti, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent/il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal test li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ test (14).
Bafer tat-tilwin
: Salina baferjata bil-fosfat li fiha 5 % serum tal-għoġġiela fetali.
Sustanza
: Element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ produzzjoni, li jinduċi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mibdula l-kompożizzjoni tagħha.
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan it-test.
Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
: Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (16).
UVCB
: sustanzi ta’ kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.
Test validu
: Test meqjus li għandu biżżejjed rilevanza u affidabbiltà għal skop speċifiku u li hu bbażat fuq prinċipji xjentifiċi sodi. Test qatt ma jkunx validu f’sens assolut, iżda biss b’rabta ma’ skop definit (18).
Appendiċi 2.2
SUSTANZI TA’ PROFIĊJENZA
Qabel l-użu ta’ rutina tat-test deskritt f’dan l-Appendiċi tal-metodu ta’ ttestjar B.71, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jiksbu b’mod korrett it-tbassir mistenni ta’ U-SENS™ għall-10 sustanzi rakkomandati fit-Tabella 1 u billi jiksbu l-valuri tas-CV70 u tal-EC150 li jaqgħu fi ħdan il-medda ta’ referenza rispettiva għal tal-anqas 8 mill-10 sustanzi ta’ profiċjenza. Is-sustanzi ta’ profiċjenza ntgħażlu biex jirrappreżentaw il-firxa ta’ risponsi għal perikli ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda. Kriterji tal-għażla oħra kienu li s-sustanzi jkunu disponibbli kummerċjalment, u li jkun hemm disponibbli data ta’ riferiment in vivo ta’ kwalità għolja kif ukoll data in vitro ta’ kwalità għolja bit-test U-SENS™. Barra minn hekk, hemm data ta’ riferiment ippubblikata disponibbli għat-test U-SENS™ (1) (8).
Tabella 1
Sustanzi rakkomandati biex tintwera profiċjenza teknika bit-test U-SENS™
|
Sustanzi ta’ profiċjenza
|
CASRN
|
Stat fiżiku
|
Tbassir in vivo
(106)
|
U-SENS Solvent/Veikolu
|
U-SENS Medda ta’ Riferiment ta’ CV70 f’μg/ml (107)
|
U-SENS Medda ta’ Riferiment ta’ EC150 f’μg/ml (107)
|
|
4-Fenilenediammina
|
106-50-3
|
Solidu
|
Sensitizzatur (b’saħħtu)
|
Medium komplut (108)
|
<30
|
Pożittiv (≤10)
|
|
Aċidu sulfoniku pikril
|
2508-19-2
|
Likwidu
|
Sensitizzatur (b’saħħtu)
|
Medium komplut
|
>50
|
Pożittiv (≤50)
|
|
Dietilmaleat
|
141-05-9
|
Likwidu
|
Sensitizzatur (moderat)
|
DMSO
|
10-100
|
Pożittiv (≤20)
|
|
Resorċinol
|
108-46-3
|
Solidu
|
Sensitizzatur (moderat)
|
Medium komplut
|
>100
|
Pożittiv (≤50)
|
|
Alkoħol ċinnamiku
|
104-54-1
|
Solidu
|
Sensitizzatur (dgħajjef)
|
DMSO
|
>100
|
Pożittiv (10-100)
|
|
4-Allilanisol
|
140-67-0
|
Likwidu
|
Sensitizzatur (dgħajjef)
|
DMSO
|
>100
|
Pożittiv (<200)
|
|
Sakkarina
|
81-07-2
|
Solidu
|
Mhux sensitizzatur
|
DMSO
|
>200
|
Negattiv (>200)
|
|
Gliċerol
|
56-81-5
|
Likwidu
|
Mhux sensitizzatur
|
Medium komplut
|
>200
|
Negattiv (>200)
|
|
Aċidu lattiku
|
50-21-5
|
Likwidu
|
Mhux sensitizzatur
|
Medium komplut
|
>200
|
Negattiv (>200)
|
|
Aċidu saliċiliku
|
69-72-7
|
Solidu
|
Mhux sensitizzatur
|
DMSO
|
>200
|
Negattiv (>200)
|
|
Abbrevjazzjonijiet: RN tas-CAS = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi
|
Appendiċi 3
SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: ASSAĠĠ IL-8 LUC
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
|
1.
|
Għall-kuntrarju ta’ assaġġi li janalizzaw l-espressjoni ta’ markaturi tas-superfiċje taċ-ċelloli, l-assaġġ IL8-Luc jikkwantifika t-tibdiliet fl-espressjoni tal-IL-8, ċitokina assoċjata mal-attivazzjoni ta’ ċelloli dendritiċi (DC). Fil-linja ta’ ċelloli indikatur IL-8 derivata mit-THP-1 (THP-G8, stabbilita mil-linja ta’ ċelloli tal-lewkimja monoċitika akuta umana THP-1), l-espressjoni tal-IL-8 titkejjel wara l-esponiment għal sensitizzaturi (1). Imbagħad l-espressjoni tal-luċiferażi tintuża biex tgħin fid-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u n-nonsensitizzaturi.
|
|
2.
|
L-assaġġ IL-8 ġie evalwat fi studju ta’ validazzjoni (2) imwettaq mill-Japanese Centre for the Validation of Alternatives Methods (JaCVAM), mill-Ministeru tal-Ekonomija, tal-Kummerċ u tal-Industrija (METI), u mill-Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments (JSAAE) u mbagħad ġie soġġett għal rieżami bejn il-pari indipendenti (3) taħt l-awspiċji tal-JaCVAM u tal-Ministeru tas-Saħħa, tax-Xogħol u tas-Sigurtà Soċjali (MHLW) bl-appoġġ tal-International Cooperation on Alternative Test Methods (ICATM). B’kunsiderazzjoni tal-evidenza disponibbli kollha u tal-input mir-regolaturi u mill-partijiet ikkonċernati, l-assaġġ IL-8 LUC hu meqjus siewi bħala parti minn IATA għad-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi u n-nonsensitizzaturi għall-fini ta’ klassifikazzjoni u ta’ tikkettar tal-perikli. Eżempji tal-użu tad-data tal-assaġġ IL-8 Luc flimkien ma’ informazzjoni oħra huma rapportati fid-dokumentazzjoni (4) (5) (6).
|
|
3.
|
L-assaġġ IL-8 Luc wera li kien trasferibbli għal laboratorji esperjenzati fil-koltura taċ-ċelloli u fil-ġestjoni tal-luċiferażi. Ir-riproduċibbiltajiet fi ħdan u bejn il-laboratorji kienu ta’ 87,7 % u ta’ 87,5 %, rispettivament (2). Data ġenerata fl-istudju ta’ validazzjoni (2) u xogħol ippubblikat ieħor (1) (6) turi li kontra l-LLNA, l-assaġġ IL-8 Luc iġġudika 118 minn 143 sustanza kimika bħala pożittivi jew negattivi u ġġudika 25 sustanza kimika bħala inkonklużivi u l-akkuratezza tal-assaġġ IL-8 Luc fid-distinzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda (Kat. 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP) min-nonsensitizzaturi (Ebda Kat. tal-GHS tan-NU/tas-CLP) hi ta’ 86 % (101/118) b’sensittività ta’ 96 % (92/96) u bi speċifiċità ta’ 41 % (9/22). Esklużi sustanzi li jaqgħu barra d-dominju ta’ applikabbiltà deskritt hawn taħt (paragrafu 5), l-assaġġ IL-8 Luc iġġudika 113 minn 136 sustanza kimika bħala pożittivi jew negattivi u ġġudika 23 sustanza kimika bħala inkonklużivi u l-akkuratezza tal-assaġġ IL-8 Luc hi ta’ 89 % (101/103) b’sensittività ta’ 96 % (92/96) u bi speċifiċità ta’ 53 % (9/17). Bl-użu tad-data umana ċċitata f’Urbisch et al. (7), l-assaġġ IL-8 Luc iġġudika 76 minn 90 sustanza kimika bħala pożittivi jew negattivi u ġġudika 14-il sustanza kimika bħala inkonklużivi u l-akkuratezza hi ta’ 80 % (61/76) is-sensittività hi ta’ 93 % (54/58) u l-ispeċifiċità hi ta’ 39 % (7/18). Esklużi sustanzi li jaqgħu barra d-dominju ta’ applikabbiltà, l-assaġġ IL-8 Luc iġġudika 71 minn 84 sustanza kimika bħala pożittivi jew negattivi u ġġudika 13-il sustanza kimika bħala inkonklużivi u l-akkuratezza hi ta’ 86 % (61/71) b’sensittività ta’ 93 % (54/58) u bi speċifiċità ta’ 54 % (7/13). Il-previżjonijiet ta’ negattivi foloz bl-assaġġ IL-8 Luc għandhom probabbiltà akbar li jseħħu b’sustanzi kimiċi li juru potenza baxxa/moderata tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (subkategorija 1B tal-GHS tan-NU/tas-CLP) minn dawk b’potenza għolja (subkategorija 1A tal-GHS tan-NU/tas-CLP) (6). F’daqqa, l-informazzjoni ssostni rwol għall-assaġġ IL-8 Luc fl-identifikazzjoni ta’ perikli ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda. L-akkuratezza mogħtija għall-assaġġ IL-8 Luc bħala test waħdu hi indikattiva biss peress li t-test għandu jiġi kkunsidrat flimkien ma’ sorsi oħra ta’ informazzjoni fil-kuntest ta’ IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 7 u 8 fl-Introduzzjoni ġenerali. Barra minn hekk, meta jiġu evalwati testijiet mhux fuq l-annimali għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, ta’ min jiftakar li l-LLNA kif ukoll testijiet oħra fuq l-annimali jaf ma jirriflettux is-sitwazzjoni sħiħa fil-bniedem.
|
|
4.
|
Fuq il-bażi tad-data disponibbli bħalissa, intwera li l-assaġġ IL-8 Luc hu applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test li jkopru firxa ta’ gruppi funzjonali organiċi, ta’ mekkaniżmi ta’ reazzjoni, ta’ potenza tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (kif stabbiliti fi studji in vivo) u ta’ proprjetajiet fiżikokimiċi (2) (6).
|
|
5.
|
Għalkemm l-assaġġ IL-8 Luc juża X-VIVOTM 15 bħala solvent, hu evalwa korrettament sustanzi kimiċi b’Log Kow >3,5 u dawk b’solubbiltà fl-ilma ta’ madwar 100 μg/ ml kif ikkalkolati b’EPI SuiteTM u l-prestazzjoni tiegħu biex jindividwa sensitizzaturi b’solubbiltà batuta fl-ilma hi aħjar minn dik tal-assaġġ IL-8 Luc bl-użu tas-sulfossidu tad-dimetil (DMSO) bħala solvent (2). Madankollu, riżultati negattivi għas-sustanzi kimiċi tat-test li mhumiex dissolti f’20 mg/ml jistgħu jipproduċu riżultati ta’ negattivi foloz minħabba n-nuqqas ta’ ħila tagħhom li jiddisolvu f’X-VIVOTM 15. Għaldaqstant, riżultati negattivi għal dawn is-sustanzi kimiċi ma għandhomx jiġu kkunsidrati. Fl-istudju ta’ validazzjoni ġiet osservata rata għolja ta’ negattivi foloz għall-anidridi. Barra minn hekk, minħabba l-kapaċità metabolika limitata tal-linja ta’ ċelloli (8) u l-kundizzjonijiet esperimentali, il-proapteni (sustanzi li jeħtieġu attivazzjoni metabolika) u l-preapteni (sustanzi attivati bl-ossidazzjoni tal-arja) jistgħu jagħtu riżultati negattivi fl-assaġġ. Madankollu, għalkemm ir-riżultati negattivi għal pre/proapteni suspettati għandhom jiġu interpretati b’attenzjoni, l-assaġġ IL-8 Luc iġġudika korrettament 11 minn 11-il preapten, 6/6 proapteni, u 6/8 pre/proapteni fis-sett ta’ data tal-assaġġ IL-8 Luc (2). Fuq il-bażi tar-rieżami komprensiv riċenti fuq tliet testijiet mhux fuq l-annimali (id-DPRA, il-KeratinoSens™ u l-h-CLAT) biex jiġu individwati pre u proapteni (9), u fuq il-bażi tal-fatt li ċ-ċelloli THP-G8 użati fl-assaġġ IL-8 Luc huma linja ta’ ċelloli derivata mit-THP-1 li tintuża fl-h-CLAT, l-assaġġ IL-8 Luc jista’ jikkontribwixxi wkoll biex tiżdied is-sensittività ta’ testijiet mhux fuq l-annimali biex jindividwaw pre u proapteni fit-taħlita ta’ testijiet oħra. It-tensjoattivi ttestjati s’issa taw riżultati pożittivi (foloz) indipendentement mit-tip tagħhom (eż. katjoniċi, anjoniċi jew nonjoniċi). Finalment sustanzi kimiċi li jinterferixxu mal-luċiferażi jistgħu jħawdu l-attività/il-kejl tagħha, u jikkawżaw inibizzjoni apparenti jew luminexxenza akbar (10). Pereżempju, konċentrazzjonijiet ta’ fitoestroġenu akbar minn 1μM ġew rapportati li jinterferixxu ma’ sinjali ta’ luminexxenza f’assaġġi oħra tal-ġene indikatur abbażi tal-luċiferażi minħabba sovrattivazzjoni tal-ġene indikatur tal-luċiferażi. Bħala konsegwenza, l-espressjoni tal-luċiferażi miksuba f’konċentrazzjonijiet għoljin ta’ fitoestroġeni jew ta’ komposti suspettati li jipproduċu attivazzjoni simili għall-fitoestroġenu tal-ġene indikatur tal-luċiferażi trid tiġi eżaminata bir-reqqa (11). Fuq il-bażi ta’ dan li ntqal hawn fuq, tensjoattivi, anidridi u sustanzi kimiċi li jinterferixxu mal-luċiferażi jaqgħu barra mid-dominju ta’ applikabbiltà ta’ dan l-assaġġ. F’każijiet li fihom ikun hemm evidenza li turi n-nuqqas ta’ applikabbiltà tal-assaġġ IL-8 Luc għal kategoriji speċifiċi oħra ta’ sustanzi kimiċi tat-test, it-test ma għandux jintuża għal dawk il-kategoriji speċifiċi.
|
|
6.
|
Kif deskritt aktar ’il fuq, l-assaġġ IL-8 Luc isostni d-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda u n-nonsensitizzaturi. Hu meħtieġ aktar xogħol, idealment fuq il-bażi ta’ data umana, biex jiġi determinat jekk ir-riżultati tal-IL-8 Luc jistgħux jikkontribwixxu għall-valutazzjoni tal-potenza meta meqjusa flimkien ma’ sorsi ta’ informazzjoni oħra.
|
|
7.
|
Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 3.1.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
8.
|
L-assaġġ IL-8 jagħmel użu minn linja ta’ ċelloli tal-lewkimja monoċitika umana THP-1 li nkisbet mingħand l-American Type Culture Collection (Manassas, VA, l-Istati Uniti). Bl-użu ta’ din il-linja ta’ ċelloli, id-Dept. of Dermatology, Tohoku University School of Medicine, stabbilixxa linja ta’ ċelloli indikatur tal-IL-8 derivata mit-THP-1, THP-G8, li tħaddan fiha l-ġeni tal-luċiferażi Luċiferażi Stabbli Oranġjo (SLO) u l-Luċiferażi Stabbli Ħamra (SLR) taħt il-kontroll tal-IL-8 u promoturi tal-gliċeraldeid 3-fosfat deidroġenasi (GAPDH), rispettivament (1). Dan jippermetti l-kejl kwantitattiv tal-induzzjoni tal-ġeni tal-luċiferażi bid-detezzjoni tal-luminexxenza minn substrati tal-luċiferażi ferm stabbiliti li jipproduċu d-dawl bħala indikatur tal-attività tal-IL-8 u tal-GAPDH fiċ-ċelloli wara l-esponiment għal sustanzi kimiċi sensitizzanti.
|
|
9.
|
Is-sistema ta’ assaġġ b’kulur doppju tinvolvi luċiferażi li temetti l-oranġjo (SLO; λmass = 580 nm) (12) għall-espressjoni ġenika tal-promotur tal-IL-8 kif ukoll luċiferażi li temetti l-aħmar (SLR; λmass = 630 nm) (13) għall-espressjoni ġenika tal-promotur tal-kontroll intern, GAPDH. Iż-żewġ luċiferażijiet jemettu kuluri differenti malli jirreaġixxu mal-luċiferina-d tal-fireflies u l-luminexxenza tagħhom titkejjel b’mod simultanju f’reazzjoni bi stadju wieħed billi l-emissjoni tiġi diviża mit-taħlita tal-assaġġ bl-użu ta’ filtru ottiku (14) (Appendiċi 3.2).
|
|
10.
|
Iċ-ċelloli THP-G8 huma trattati għal 16-il siegħa bis-sustanza kimika tat-test, u wara dan jitkejlu l-attività tal-luċiferażi tal-SLO (SLO-LA) li tirrifletti l-attività promotur tal-IL-8 u l-attività tal-luċiferażi tal-SLR (SLR-LA) li tirrifletti l-attività promotur tal-GAPDH. Biex l-abbrevjazzjonijiet ikunu jistgħu jinftiehmu faċilment, SLO-LA u SLR-LA huma msemmija IL8LA u GAPLA, rispettivament. It-Tabella 1 tagħti deskrizzjoni tat-termini assoċjati mal-attività tal-luċiferażi fl-assaġġ IL-8 Luc. Il-valuri mkejla jintużaw biex tiġi kkalkolata l-IL8LA normalizzata (nIL8LA), li hi l-proporzjon tal-IL8LA għall-GAPLA; l-induzzjoni tal-nIL8LA (Ind-IL8LA), li hi l-proporzjon tal-medji aritmetiċi tal-valuri mkejla kwadrupli tal-nIL8LA taċ-ċelloli THP-G8 trattati b’sustanza kimika tat-test u l-valuri tal-nIL8LA taċ-ċelloli THP-G8 mhux trattati; u l-inibizzjoni tal-GAPLA (inh-GAPLA), li hi l-proporzjon tal-medji aritmetiċi tal-valuri mkejla kwadrupli tal-GAPLA taċ-ċelloli THP-G8 trattati b’sustanza kimika tat-test u l-valuri tal-GAPLA taċ-ċelloli THP-G8 mhux trattati, u użati bħala indikatur għaċ-ċitotossiċità.
Tabella 1
Deskrizzjoni tat-termini assoċjati mal-attività tal-luċiferażi fl-assaġġ IL-8 Luc
|
Abbrevjazzjonijiet
|
Definizzjoni
|
|
GAPLA
|
Attività ta’ luċiferażi tal-SLR li tirrifletti l-attività promotur tal-GAPDH
|
|
IL8LA
|
Attività ta’ luċiferażi tal-SLO li tirrifletti l-attività promotur tal-IL-8
|
|
nIL8LA
|
IL8LA / GAPLA
|
|
Ind-IL8LA
|
nIL8LA taċ-ċelloli THP-G8 trattati b’sustanzi kimiċi / nIL8LA taċ-ċelloli mhux trattati
|
|
Inh-GAPLA
|
GAPLA tat-THP-G8 trattati b’sustanzi kimiċi / GAPLA taċ-ċelloli mhux trattati
|
|
CV05
|
L-anqas konċentrazzjoni tas-sustanza kimika li fiha Inh-GAPLA ssir < 0,05.
|
|
|
11.
|
L-istandards tal-prestazzjoni (PS) (15) huma disponibbli biex tiġi faċilitata l-validazzjoni tat-testijiet modifikati in vitro tal-luċiferażi tal-IL-8 simili għall-assaġġ IL-8 Luc u jippermettu l-emendar fil-ħin tal-Linja Gwida tat-Test 442E tal-OECD għall-inklużjoni tagħhom. Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data (MAD) mill-OECD se tkun garantita biss għal testijiet validati skont il-PS, jekk dawn it-testijiet ikunu ġew rieżaminati u inklużi fil-Linja Gwida tat-Test 442E mill-OECD (16).
|
WIRI TAL-PROFIĊJENZA
|
12.
|
Qabel ma jużaw it-test deskritt f’dan l-Appendiċi tal-metodu ta’ ttestjar B.71 bħala rutina, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jużaw l-10 Sustanzi ta’ Profiċjenza elenkati fl-Appendiċi 3.3 f’konformità mal-Prattiki Tajba tal-Metodi in vitro (11). Barra minn hekk, l-utenti tat-test għandhom iżommu bażi ta’ data storika tad-data ġenerata bil-kontrolli tar-reattività (ara l-paragrafu 15) u bil-kontrolli pożittivi u b’solvent/b’veikolu (ara l-paragrafi 21-24), u jużaw din id-data biex jikkonfermaw ir-riproduċibbiltà tat-test fil-laboratorju tagħhom tinżamm maż-żmien.
|
PROĊEDURA
|
13.
|
Il-Proċedura Operattiva Standard (SOP) għall-assaġġ IL-8 Luc hi disponibbli u għandha titħaddem meta jitwettaq it-test (18). Il-laboratorji li lesti li jwettqu t-test jistgħu jiksbu l-linja ta’ ċelloli rikombinanti THP-G8 mill-GPC Lab. Co. Ltd.,Tottori, il-Ġappun, wara li jiffirmaw Ftehim ta’ Trasferiment tal-Materjal (MTA) f’konformità mal-kundizzjonijiet tal-mudell tal-OECD. Il-paragrafi li ġejjin jipprovdu deskrizzjoni tal-komponenti u tal-proċeduri ewlenin tal-assaġġ.
|
Tħejjija taċ-ċelloli
|
14.
|
Il-linja ta’ ċelloli THP-G8 mill-GPC Lab. Co. Ltd., Tottori, il-Ġappun, għandha tintuża għat-twettiq tal-assaġġ IL-8 Luc (ara l-paragrafi 8 u 13). Malli jiġu riċevuti, iċ-ċelloli jiġu propagati (2-4 passiġġieri) u jinħażnu ffriżati bħala stokk omoġenu. Iċ-ċelloli minn dan l-istokk jistgħu jiġu propagati sa massimu ta’ 12-il passaġġ jew sa massimu ta’ 6 ġimgħat. Il-medium użat għall-propagazzjoni hu l-medium tat-tkabbir RPMI-1640 li fih 10 % serum tal-bovini fetali (FBS), soluzzjoni antibijotika/antimikotika (100U/ml peniċillina G, 100μg/ml streptomiċina u 0,25μg/ml amfoteriċina B f’0,85 % salina) (eż. GIBCO Cat#15240-062), 0,15μg/ml Puromiċina (eż. CAS:58-58-2) u 300μg/ml G418 (eż. CAS:108321-42-2).
|
|
15.
|
Qabel ma jintużaw għall-ittestjar, iċ-ċelloli għandhom jiġu kwalifikati billi jsir kontroll tar-reattività. Dan il-kontroll għandu jsir ġimgħa/ġimagħtejn jew 2-4 passaġġi wara t-taħlil, bl-użu tal-kontroll pożittiv, 4-nitrobenżil bromur (4-NBB) (CAS:100-11-8, ≥ 99 % purità) u l-kontroll negattiv, aċidu lattiku (LA) (CAS:50-21-5, ≥85 % purità). 4-NBB għandu jipproduċi rispons pożittiv għall-Ind-IL8LA (≥1,4), filwaqt li l-LA għandu jipproduċi rispons negattiv għall-Ind-IL8LA (<1,4). Huma biss iċ-ċelloli li jgħaddu mill-kontroll tar-reattività li jintużaw għall-assaġġ. Il-kontroll għandu jsir skont il-proċeduri deskritti fil-paragrafi 22-24.
|
|
16.
|
Għall-ittestjar, iċ-ċelloli THP-G8 jinżergħu f’densità ta’ 2 sa 5 × 105 ċelloli/ml, u jiġu prekolturati fi flasks tal-koltura għal għal 48 sa 96 siegħa. Fil-jum tat-test, iċ-ċelloli miġbura mill-flask tal-koltura jinħaslu bl-RPMI-1640 li jkun fih 10 % FBS mingħajr ebda antibijotiku, u mbagħad jerġgħu jiġu sospiżi b’RPMI-1640 li jkun fih 10 % FBS mingħajr ebda antibijotiku f’1 × 106 ċelloli/ml. Imbagħad, iċ-ċelloli jitqassmu fi pjastra sewda b’qiegħ ċatt b’96 bwejra (eż. Costar Cat#3603) b’50μl (5 × 104 ċelloli/bwejra).
|
Tħejjija tas-sustanza kimika tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
|
17.
|
Is-sustanza kimika tat-test u s-sustanzi tal-kontroll jitħejjew dakinhar tal-ittestjar. Għall-assaġġ IL-8 Luc, is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti f’X-VIVOTM 15, medium ħieles mis-serum disponibbli kummerċjalment (Lonza, 04-418Q), għall-konċentrazzjoni finali ta’ 20 mg/ml. X-VIVOTM 15 jiżdied ma’ 20 mg tas-sustanza kimika tat-test (indipendentement mis-solubbiltà tas-sustanza kimika) f’tubu tal-mikroċentrifugazzjoni u jinġieb għal volum ta’ 1ml u mbagħad jiġi vortiċifikat bis-saħħa u jitħawwad fuq rotor b’veloċità massima ta’ 8 rpm għal 30 min f’temperatura ambjentali ta’ madwar 20oC. Barra minn hekk, jekk is-sustanzi kimiċi solidi jibqgħu insolubbli, it-tubu jiġi sonikat sakemm is-sustanza kimika tiddisolvi kompletament jew tiġi dispersa b’mod stabbli. Għal sustanzi kimiċi tat-test solubbli f’X-VIVOTM 15, is-soluzzjoni tiġi dilwita b’fattur ta’ 5 b’X-VIVOTM 15 u tintuża bħala soluzzjoni ewlenija ta’ X-VIVOTM 15 tas-sustanza kimika tat-test (4 mg/ml). Għal sustanzi kimiċi tat-test mhux solubbli f’X-VIVOTM 15, it-taħlita terġa’ tiġi rotata għal tal-anqas 30 min, u mbagħad ċentrifugata fi 15,000 rpm (≈20000g) għal 5 min; is-supernatant li jirriżulta jintuża bħala soluzzjoni ewlenija X-VIVOTM 15 tas-sustanza kimika tat-test. Għandha tiġi pprovduta motivazzjoni xjentifika għall-użu ta’ solventi oħra, bħal DMSO, ilma, jew il-medium tat-tkabbir. Il-proċedura dettaljata għad-dissoluzzjoni tas-sustanzi kimiċi hi murija fl-Appendiċi 3.5. Is-soluzzjonijiet ta’ X-VIVOTM 15 deskritti fil-paragrafi 18-23 jitħalltu 1:1 (v/v) mas-sospensjonijiet taċ-ċelloli mħejjija fi pjastra sewda b’qiegħ ċatt b’96 bwejra (ara l-paragrafu 16).
|
|
18.
|
L-ewwel sessjoni tat-test għandha l-għan li tiddetermina l-konċentrazzjoni ċitotossika u li teżamina l-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi. Bl-użu ta’ X-VIVOTM 15, id-dilwizzjonijiet serjali tas-soluzzjonijiet ewlenin ta’ X-VIVOTM 15 tas-sustanzi kimiċi tat-test isiru b’fattur ta’ dilwizzjoni ta’ tnejn (ara l-Appendiċi 3.5) bl-użu ta’ blokk tal-assaġġ b’96 bwejra (eż. Costar Cat#EW-01729-03). Imbagħad, 50 μl/bwejra tas-soluzzjoni dilwita tiżdied ma’ 50 μl tas-sospensjoni taċ-ċelloli fi pjastra sewda b’qiegħ ċatt b’96 bwejra. B’hekk, għal sustanzi kimiċi tat-test li huma solubbli f’X-VIVO TM 15, il-konċentrazzjonijiet finali tas-sustanzi kimiċi tat-test ivarjaw minn 0,002 sa 2 mg/ml (Appendiċi 3.5). Għal sustanzi kimiċi tat-test li mhumiex solubbli f’X-VIVO TM 15 f’20 mg/ml, fatturi ta’ dilwizzjoni li jvarjaw minn 2 sa 210 biss jiġu determinati, għalkemm il-konċentrazzjonijiet finali attwali tas-sustanzi kimiċi tat-test jibqgħu inċerti u jiddependu mill-konċentrazzjoni saturata tas-sustanzi kimiċi tat-test fl-X-VIVO TM 15.
|
|
19.
|
F’sessjonijiet tat-test sussegwenti (jiġifieri t-tieni, it-tielet u r-raba’ repliki), is-soluzzjoni ewlenija ta’ X-VIVOTM issir fil-konċentrazzjoni 4 darbiet ogħla mill-konċentrazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelloli 05 (CV05; l-anqas konċentrazzjoni li fiha l-Inh-GAPLA ssir < 0,05) fl-ewwel esperiment. Jekk Inh-GAPLA ma tonqosx f’livell anqas minn 0,05 fl-ogħla konċentrazzjoni fl-ewwel sessjoni, is-soluzzjoni ewlenija ta’ X-VIVOTM 15 issir fl-ogħla konċentrazzjoni tal-ewwel sessjoni. Il-konċentrazzjoni ta’ CV05 tiġi kkalkolata bid-diviżjoni tal-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ewlenija fl-ewwel sessjoni b’fattur ta’ dilwizzjoni għas-CV05 (X) (fattur ta’ dilwizzjoni CV05 (X); il-fattur ta’ dilwizzjoni meħtieġ biex tiġi dilwita soluzzjoni ewlenija għas-CV05) (ara l-Appendiċi 3.5). Għal sustanzi tat-test mhux solubbli f’X-VIVO f’20 mg/ml, is-CV05 tiġi determinata bil-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ewlenija × 1/X. Għas-sessjonijiet 2 sa 4, it-tieni soluzzjoni ewlenija titħejja bħala 4 × CV05 (Appendiċi 3.5).
|
|
20.
|
Dilwizzjonijiet serjali tat-tieni soluzzjonijiet ewlenin ta’ X-VIVOTM 15 jitħejjew b’fattur ta’ dilwizzjoni ta’ 1,5 bl-użu ta’ blokka tal-assaġġ b’96 bwejra. Imbagħad, 50 μl/bwejra tas-soluzzjoni dilwita tiżdied ma’ 50 μl tas-sospensjoni taċ-ċelloli fil-bwejriet ta’ pjastra sewda b’qiegħ ċatt b’96 bwejra. Kull konċentrazzjoni ta’ kull sustanza kimika tat-test għandha tiġi ttestjata f’erba’ bwejriet. Imbagħad il-kampjuni jitħalltu fuq xejker tal-pjastri u jiġu inkubati għal 16-il siegħa f’37oC u f’5 % CO2, u wara dan titkejjel l-attività tal-luċiferażi kif deskritt hawn taħt.
|
|
21.
|
Il-kontroll b’solvent hu t-taħlita ta’ 50 μl/bwejra ta’ X-VIVOTM 15 u 50 μl/bwejra ta’ sospensjoni taċ-ċelloli fl-RPMI-1640 li jkun fih 10 % FBS.
|
|
22.
|
Il-kontroll pożittiv rakkomandat hu 4-NBB. 20 mg ta’ 4-NBB jitħejja f’tubu tal-mikrofuġju ta’ 1,5-ml, li miegħu jiżdied sa 1 ml X-VIVOTM 15. It-tubu jiġi vortiċifikat bis-saħħa u jitħawwad fuq rotor b’veloċità massima ta’ 8 rpm għal tal-anqas 30 min. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f’20000g għal 5 min, is-supernatant jiġi dilwit b’fattur ta’ 4 b’X-VIVOTM 15, u 500 μl tas-supernatant dilwit jiġi trasferit fi bwejra fi blokka tal-assaġġ b’96 bwejra. Is-supernatant dilwit jiġi dilwit aktar b’X-VIVOTM 15 f’fatturi ta’ 2 u 4, u tiżdied 50 μl tas-soluzzjoni ma’ 50 μl tas-sospensjoni taċ-ċelloli THP-G8 fil-bwejriet ta’ pjastra sewda b’qiegħ ċat b’96 bwejra (Appendiċi 3.6). Kull konċentrazzjoni tal-kontroll pożittiv għandha tiġi ttestjata f’erba’ bwejriet. Il-pjastra titheżżeż fuq xejker tal-pjastri, u tiġi inkubata f’inkubatur tas-CO2 għal 16-il siegħa (37oC, 5 % CO2), u wara dan l-attività tal-luċiferażi titkejjel kif deskritt fil-paragrafu 29.
|
|
23.
|
Il-kontroll negattiv rakkomandat hu l-LA. 20 mg LA mħejji f’tubu tal-mikrofuġju ta’ 1,5-ml, li miegħu jiżdied sa 1 ml (20 mg/ ml) X-VIVOTM 15. Soluzzjoni ta’ 20 mg/ml LA tiġi dilwita b’fattur ta’ 5 b’X-VIVOTM 15 (4 mg/ml); 500 μl ta’ din is-soluzzjoni 4 mg/ml LA tiġi trasferita fi bwejra ta’ blokka tal-assaġġ b’96 bwejra. Din is-soluzzjoni tiġi dilwita b’fattur ta’ 2 b’X-VIVOTM 15 u mbagħad terġa’ tiġi dilwita b’fattur ta’ 2 biex tipproduċi soluzzjonijiet ta’ 2 mg/ml u ta’ 1 mg/ml. 50 μl ta’ dawn it-tliet soluzzjonijiet u l-kontroll b’veikolu (X-VIVOTM 15) jiżdiedu ma’ 50 μl ta’ sospensjoni taċ-ċelloli THP-G8 fil-bwejriet ta’ pjastra sewda b’qiegħ ċatt b’96 bwejra. Kull konċentrazzjoni tal-kontroll negattiv tiġi ttestjata f’erba’ bwejriet. Il-pjastra titheżżeż fuq xejker tal-pjastri, u tiġi inkubata f’inkubatur tas-CO2 għal 16-il siegħa (37oC, 5 % CO2), u wara dan l-attività tal-luċiferażi titkejjel kif deskritt fil-paragrafu 29.
|
|
24.
|
Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi jew negattivi xierqa oħra jekk ikun hemm data storika disponibbli biex jiġu derivati kriterji ta’ aċċettazzjoni ta’ sessjonijiet komparabbli.
|
|
25.
|
Għandha tingħata attenzjoni biex tiġi evitata l-evaporazzjoni ta’ sustanzi kimiċi tat-test volatili u kontaminazzjoni kroċjata bejn bwejriet minn sustanzi kimiċi tat-test, eż. billi l-pjastra tiġi ssiġillata qabel l-inkubazzjoni bis-sustanzi kimiċi tat-test.
|
|
26.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test u l-kontroll b’solvent jeħtieġu minn tnejn sa erba’ sessjonijiet biex jinkiseb tbassir pożittiv jew negattiv (ara t-Tabella 2). Kull sessjoni ssir f’ġurnata differenti b’soluzzjoni ewlenija ġdida ta’ X-VIVOTM 15 tas-sustanzi kimiċi tat-test u ta’ ċelloli miġbura indipendentement. Iċ-ċelloli jistgħu jkunu ġejjin mill-istess passaġġ.
|
Kejlijiet tal-attività tal-luċiferażi
|
27.
|
Il-luminexxenza titkejjel bl-użu ta’ luminometru tal-mikropjastri b’96 bwejra mgħammra b’filtri ottiċi, eż. Phelios (ATTO, Tokyo, il-Ġappun), Tristan 941 (Berthold, Bad Wildbad, il-Ġermanja) u s-serje ARVO (PerkinElmer, Waltham, MA, l-Istati Uniti). Il-luminometru jrid jiġi kalibrat għal kull test biex tiġi żgurata riproduċibbiltà (19). Il-luċiferażijiet rikombinanti li jemettu l-oranġjo u l-aħmar huma disponibbli għal dan il-kalibrar.
|
|
28.
|
100μl tar-reaġent tal-assaġġ tal-Luċiferażi msaħħan bil-lest Tripluc® (Tripluc) jiġi trasferit f’kull bwejra tal-pjastra li jkun fiha s-sospensjoni taċ-ċelloli trattata b’sustanza kimika jew mingħajr. Il-pjastra titheżżeż għal 10 min f’temperatura ambejntali ta’ madwar 20oC. Il-pjastra titqiegħed fil-luminometru biex titkejjel l-attività tal-luċiferażi. Il-bijoluminexxenza titkejjel għal 3 sek kull waħda fin-nuqqas (F0) u fil-preżenza (F1) tal-filtru ottiku. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni għall-użu ta’ ssettjar alternattiv, eż. skont il-mudell tal-luminometru użat.
|
|
29.
|
Il-parametri għal kull konċentrazzjoni jiġu kkalkolati mill-valuri mkejla, eż. IL8LA, GAPLA, nIL8LA, Ind-IL8LA, Inh-GAPLA, ±SD medja tal-IL8LA, ±SD medja tal-GAPLA, ±SD medja tal-nIL8LA, ±SD medja tal-Ind-IL8LA, ±SD medja tal-Inh-GAPLA, u l-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % tal-Ind-IL8LA. Id-definizzjonijiet tal-parametri użati f’dan il-paragrafu huma pprovduti fl-Appendiċijiet 3.1 u 3.4.
|
|
30.
|
Qabel il-kejl, id-diskriminazzjoni tal-kulur f’assaġġi indikatur b’diversi kuluri ġeneralment tinkiseb bl-użu ta’ detetturi (luminometru u apparati għall-qari tal-pjastri) mgħammra b’filtri ottiċi, bħal filtri sharp-cut (long-pass jew short-pass) jew filtri band-pass. Il-koeffiċjenti ta’ trażmissjoni tal-filtri għal kull kulur tas-sinjali tal-bijoluminexxenza għandhom jiġu kalibrati qabel kull test, skont l-Appendiċi 3.2.
|
DATA U RAPPORTAR
Evalwazzjoni tad-Data
|
31.
|
Il-kriterji għal deċiżjoni pożittiva/negattiva jeħtieġu li f’kull sessjoni:
|
—
|
tbassir tal-assaġġ IL-8 Luc jiġi ġġudikat pożittiv jekk sustanza kimika tat-test ikollha Ind-IL8LA ≥ 1,4 u l-limitu inferjuri tal-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % tal-Ind-IL8LA ≥ 1,0
|
|
—
|
tbassir tal-assaġġ IL-8 Luc jiġi ġġudikat negativ jekk sustanza kimika tat-test ikollha Ind-IL8LA < 1,4 u/jew il-limitu inferjuri tal-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % tal-Ind-IL8LA < 1,0
|
|
Mudell ta’ tbassir
|
32.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test li jipprovdu żewġ riżultati pożittivi minn fost l-1el, it-2ni, it-3et jew ir-4a sessjoni jiġu identifikati bħala pożittivi filwaqt li dawk li jagħtu tliet riżultati negattivi minn fost l-1el, it-2ni, it-3et jew ir-4a sessjoni jiġu identifikati bħala supponuti negattivi (Tabella 2). Fost is-sustanzi kimiċi supponuti negattivi, is-sustanzi kimiċi li jiġu dissolti f’20 mg/ml ta’ X-VIVOTM 15 huma ġġudikati bħala negattivi, filwaqt li s-sustanzi kimiċi li ma jiġux dissolti f’20 mg/ml ta’ X-VIVOTM 15 ma għandhomx jiġu kkunsidrati (Figura 1).
Tabella 2
Kriterji għall-identifikazzjoni tal-pożittivi u tas-supponuti negattivi
|
L-1el sessjoni
|
It-2ni sessjoni
|
It-3et sessjoni
|
Ir-4a sessjoni
|
Tbassir finali
|
|
Pożittiv
|
Pożittiv
|
–
|
–
|
Pożittiv
|
|
Negattiv
|
Pożittiv
|
–
|
Pożittiv
|
|
Negattiv
|
Pożittiv
|
Pożittiv
|
|
Negattiv
|
Supponut Negattiv
|
|
Negattiv
|
Pożittiv
|
Pożittiv
|
–
|
Pożittiv
|
|
Negattiv
|
Pożittiv
|
Pożittiv
|
|
Negattiv
|
Supponut Negattiv
|
|
Negattiv
|
Pożittiv
|
Pożittiv
|
Pożittiv
|
|
Negattiv
|
Supponut Negattiv
|
|
Negattiv
|
–
|
Supponut Negattiv
|
|
Figura 1
Mudell ta’ tbassir għall-ġudizzju finali
Kriterji ta’ aċċettazzjoni
|
33.
|
Għandhom jiġu ssodisfati l-kriterji ta’ aċċettazzjoni li ġejjin meta jintuża l-assaġġ IL-8 Luc:
|
—
|
Ind-IL8LA għandha tkun aktar minn 5,0 f’tal-anqas konċentrazzjoni waħda tal-kontroll pożittiv, 4-NBB, f’kull sessjoni.
|
|
—
|
Ind-IL8LA għandha tkun anqas minn 1,4 fi kwalunkwe konċentrazzjoni tal-kontroll negattiv, aċidu lattiku, f’kull sessjoni.
|
|
—
|
Id-data mill-pjastri li għalihom il-GAPLA tal-bwejriet tal-kontroll b’ċelloli u bi Tripluc iżda mingħajr sustanzi kimiċi tkun anqas minn 5 darbiet dik ta’ bwejra li jkun fiha l-medium tat-test biss (50 μl/bwejra RPMI-1640 li jkun fih 10 % FBS u 50 μl/bwejra X-VIVOTM 15) għandha tiġi rifjutata.
|
|
—
|
Id-data mill-pjastri li għalihom l-Inh-GAPLA tal-konċentrazzjonijiet kollha tas-sustanzi kimiċi tat-test jew tal-kontroll tkun anqas minn 0,05 għandha tiġi rifjutata. F’dan il-każ, l-ewwel test għandu jiġi ripetut biex l-ogħla konċentrazzjoni finali tat-test ripetutt tkun l-anqas konċentrazzjoni finali tat-test preċedenti.
|
|
Rapport tat-test
|
34.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
|
Sustanzi kimiċi tat-test
Sustanza monokostitwenti:
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.;
|
|
It-trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Is-solubbiltà f’X-VIVOTM 15. Għal sustanzi kimiċi li huma insolubbli f’X-VIVOTM 15, jekk jiġux osservati preċipitazzjoni jew flotazzjoni wara ċ-ċentrifugazzjoni;
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test jekk ma jintużax X-VIVOTM 15.
|
Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita:
|
Karatterizzazzjoni sa fejn possibbli, eż. bl-identità kimika (ara aktar ’il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti (ara aktar ’il fuq) tal-kostitwenti, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
|
|
Il-piż molekulari jew il-piż molekulari apparenti fil-każ ta’ taħlitiet/polimeri b’kompożizzjonijiet magħrufin jew informazzjoni oħra rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
|
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Is-solubbiltà f’X-VIVOTM 15. Għal sustanzi kimiċi li huma insolubbli f’X-VIVOTM 15, jekk jiġux osservati preċipitazzjoni jew flotazzjoni wara ċ-ċentrifugazzjoni;
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli.
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu għal kull sustanza kimika tat-test jekk ma jintużax X-VIVOTM 15.
|
|
|
Kontrolli
Kontroll pożittiv:
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli u fejn applikabbli;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
|
|
Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
|
|
Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Referenza għar-riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv li juru kriterji xierqa ta’ aċċettazzjoni, jekk applikabbli.
|
Kontroll negattiv:
|
Identifikazzjoni kimika, bħall-isem/ismijiet IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, u/jew identifikaturi oħrajn;
|
|
Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
|
|
Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, il-piż molekulari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali f’każ li jintużaw kontrolli negattivi oħra li ma jkunux fost dawk imsemmijin fil-Linja Gwida tat-Test u sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabbiltà, sa fejn ikunu disponibbli;
|
|
Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent għal kull sustanza kimika tat-test;
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test
|
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju;
|
|
Deskrizzjoni tat-test użat;
|
|
Il-linja ta’ ċelloli użata, il-kundizzjonijiet tal-ħżin u s-sors tagħha (eż. il-faċilità mnejn inkisbet);
|
|
In-numru tal-lott u l-oriġini tal-FBS, isem il-fornitur, in-numru tal-lott tal-pjastra sewda b’qiegħ ċatt b’96 bwejra, u n-numru tal-lott tar-reaġent Tripluc;
|
|
In-numru ta’ passaġġi u d-densità taċ-ċelloli użati għall-ittestjar;
|
|
Il-metodu ta’ għadd taċ-ċelloli għat-tiżrigħ qabel l-ittestjar u l-miżuri meħudin biex tiġi żgurata distribuzzjoni omoġena tan-numru ta’ ċelloli;
|
|
Il-luminometru użat (eż. il-mudell), inklużi l-issettjar tal-istrument, is-substrat ta’ luċiferażi użat, u wiri tal-kejlijiet ta’ luminexxenza xierqa fuq il-bażi tat-test tal-kontroll deskritt fl-Appendiċi 3.2;
|
|
Il-proċedura użata biex tintwera l-profiċjenza tal-laboratorju biex iwettaq it-test (eż. billi jiġu ttestjati s-sustanzi ta’ profiċjenza) jew biex tintwera prestazzjoni riproduċibbli tat-test matul iż-żmien.
|
|
|
Il-proċedura tat-test
|
In-numru ta’ repliki u ta’ sessjonijiet imwettqa;
|
|
Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test, il-proċedura ta’ applikazzjoni u l-ħin ta’ esponiment (jekk ikunu differenti minn dawk rakkomandati);
|
|
Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ evalwazzjoni u ta’ deċiżjoni użati;
|
|
Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ aċċettazzjoni tal-istudju użati;
|
|
Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test.
|
|
|
Ir-riżultati
|
Il-kejlijiet tal-IL8LA u tal-GAPLA;
|
|
Il-kalkoli għall-nIL8LA, għall-Ind-IL8LA, u għall-Inh-GAPLA;
|
|
L-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % tal-Ind-IL8LA;
|
|
Graff li turi l-kurvi ta’ doża-rispons għall-induzzjoni tal-attività tal-luċiferażi u għall-vijabbiltà;
|
|
Deskrizzjoni ta’ kull osservazzjoni rilevanti oħra osservata, jekk applikabbli.
|
|
|
Diskussjoni tar-riżultati
|
Diskussjoni tar-riżultati miksuba bl-assaġġ IL-8 Luc;
|
|
Kunsiderazzjoni tar-riżultati tal-assaġġ fil-kuntest ta’ IATA, jekk ikun hemm informazzjoni rilevanti oħra disponibbli.
|
|
Konklużjoni
|
DOKUMENTAZZJONI
|
(1)
|
Takahashi T, Kimura Y, Saito R, Nakajima Y, Ohmiya Y, Yamasaki K, u Aiba S. (2011). An in vitro test to screen skin sensitizers using a stable THP-1-derived IL-8 reporter cell line, THP-G8. Toxicol Sci 124:359-69.
|
|
(2)
|
OECD (2017). Validation report for the international validation study on the IL-8 Luc assay as a test evaluating the skin sensitizing potential of chemicals conducted by the IL-8 Luc Assay. Series on Testing and Assessment No 267, ENV/JM/MONO(2017)19. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.
|
|
(3)
|
OECD (2017). Report of the Peer Review Panel for the IL-8 Luciferase (IL-8 Luc) Assay for in vitro skin sensitisation. Series on Testing and Assessment No 258, ENV/JM/MONO(2017)20. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.
|
|
(4)
|
OECD (2016) Guidance Document On The Reporting Of Defined Approaches And Individual Information Sources To Be Used Within Integrated Approaches To Testing And Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Series on Testing & Assessment No 256, ENV/JM/MONO(2016)29. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.
|
|
(5)
|
van der Veen JW, Rorije E, Emter R, Natsch A, van Loveren H, u Ezendam J. (2014). Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul Toxicol Pharmacol 69:371-9.
|
|
(6)
|
Kimura Y, Fujimura C, Ito Y, Takahashi T, Nakajima Y, Ohmiya Y, u Aiba S. (2015). Optimization of the IL-8 Luc assay as an in vitro test for skin sensitization. Toxicol In Vitro 29:1816-30.
|
|
(7)
|
Urbisch D, Mehling A, Guth K, Ramirez T, Honarvar N, Kolle S, Landsiedel R, Jaworska J, Kern PS, Gerberick F, et al. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul Toxicol Pharmacol 71:337-51.
|
|
(8)
|
Ashikaga T, Sakaguchi H, Sono S, Kosaka N, Ishikawa M, Nukada Y, Miyazawa M, Ito Y, Nishiyama N, u Itagaki H. (2010). A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests: the human cell-line activation test (h-CLAT) versus the local lymph node assay (LLNA). Alternatives to laboratory animals: ATLA 38:275-84.
|
|
(9)
|
Patlewicz G, Casati S, Basketter DA, Asturiol D, Roberts DW, Lepoittevin J-P, Worth A and Aschberger K (2016) Can currently available non-animal methods detect pre and pro haptens relevant for skin sensitisation? Regul Toxicol Pharmacol, 82:147-155.
|
|
(10)
|
Thorne N, Inglese J, u Auld DS. (2010). Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol 17:646-57.
|
|
(11)
|
OECD (2016). Test No 455: Performance-Based Test Guideline for Stably Transfected Transactivation In Vitro Assays to Detect Estrogen Receptor Agonists and Antagonists, OECD Publishing, Pariġi. http://dx.doi.org/10.1787/9789264265295-en.
|
|
(12)
|
Viviani V, Uchida A, Suenaga N, Ryufuku M, u Ohmiya Y. (2001). Thr226 is a key residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases. Biochem Biophys Res Commun 280:1286-91.
|
|
(13)
|
Viviani VR, Bechara EJ, u Ohmiya Y. (1999). Cloning, sequence analysis, and expression of active Phrixothrix railroad-worms luciferases: relationship between bioluminescence spectra and primary structures. Biochemistry 38:8271-9.
|
|
(14)
|
Nakajima Y, Kimura T, Sugata K, Enomoto T, Asakawa A, Kubota H, Ikeda M, u Ohmiya Y. (2005). Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. Biotechniques 38:891-4.
|
|
(15)
|
OECD (2017). To be published - Performance Standards for the assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation IL-8 luc test methods. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. OECD, Pariġi, Franza
|
|
(16)
|
OECD (2005). Guidance Document the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, OECD Series on Testing and Assessment No 34. OECD, Pariġi, Franza.
|
|
(17)
|
OECD (2018). Draft Guidance document: Good In Vitro Method Practices (GIVIMP) for the Development and Implementation of In Vitro Methods for Regulatory Use in Human Safety Assessment. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/OECD Final Draft GIVIMP.pdf.
|
|
(18)
|
JaCVAM (2016). IL-8 Luc assay protocol, Disponibbli fuq. http://www.jacvam.jp/en_effort/effort02.html.
|
|
(19)
|
Niwa K, Ichino Y, Kumata S, Nakajima Y, Hiraishi Y, Kato D, Viviani VR, u Ohmiya Y. (2010). Quantum yields and kinetics of the firefly bioluminescence reaction of beetle luciferases. Photochem Photobiol 86:1046-9.
|
|
(20)
|
OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins, Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 168. OECD, Pariġi, Franza.
|
|
(21)
|
In-Nazzjonijiet Uniti (2015). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Sixth revised edition. New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
|
Appendiċi 3.1
DEFINIZZJONIJIET
Akkuratezza
: Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tat-test u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tat-test u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ konkordanza biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ test (16).
AOP (Passaġġ tal-Eżitu Avvers)
: Sekwenza ta’ avvenimenti mill-istruttura kimika ta’ sustanza kimika fil-mira jew grupp ta’ sustanzi kimiċi simili permezz tal-avveniment ta’ inizjazzjoni molekulari għal eżitu ta’ interess in vivo (22).
Sustanza kimika
: Sustanza jew taħlita
CV05
: Il-vijabbiltà taċ-ċelloli 05, jiġifieri l-konċentrazzjoni minima li fiha s-sustanzi kimiċi juru anqas minn 0,05 tal-Inh-GAPLA.
FInSLO-LA
: Abbrevjazzjoni użata fir-rapport ta’ validazzjoni u fil-pubblikazzjonijiet preċedenti rigward l-assaġġ IL-8 Luc biex tirreferi għall-Ind-IL8LA. Ara Ind-IL8LA għad-definizzjoni.
GAPLA
: Attività tal-Luċiferażi tal-Luċiferażi Ħamra Stabbli (SLR) (λmass = 630 nm), regolata mill-promotur tal-GAPDH u turi l-vijabbiltà taċ-ċelloli u n-numru ta’ ċelloli vijabbli.
Periklu
: Proprjetà inerenti ta’ aġent jew ta’ sitwazzjoni li għandha l-potenzjal li tikkawża effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
IATA (Approċċ Integrat għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni)
: Approċċ strutturat użat għall-identifikazzjoni ta’ perikli (potenzjal), il-karatterizzazzjoni tal-perikli (potenza) u/jew valutazzjoni tas-sikurezza (potenzjal/potenza u esponiment ) ta’ sustanza kimika jew ta’ grupp ta’ sustanzi kimiċi, li jintegra b’mod strutturat u jiżen id-data rilevanti kollha biex jinforma deċiżjoni regolatorja dwar il-periklu u/jew ir-riskju u/jew il-ħtieġa potenzjali għal ittestjar immirat ulterjuri li, għaldaqstant, ikun minimu.
II-SLR-LA
: Abbrevjazzjoni użata fir-rapport ta’ validazzjoni u fil-pubblikazzjonijiet preċedenti rigward l-assaġġ IL-8 Luc biex tirreferi għall-Inh-GAPLA. Ara Inh-GAPLA għad-definizzjoni.
IL-8 (Interlewkina-8)
: Ċitokina derivata minn ċelloli endoteljali, minn fibroblasti, minn keratinoċiti, minn makrofagi, u minn monoċiti li tikkawża kemotassi tan-newtrofili u tal-linfoċiti taċ-ċelloli-T.
IL8LA
: Attività tal-Luċiferażi tal-Luċiferażi Oranġjo Stabbli (SLO) (λmass = 580 nm), regolata mill-promotur tal-IL-8.
Ind-IL8LA
: Induzzjoni ta’ drabi tal-nIL8LA. Tinkiseb bid-diviżjoni tal-nIL8LA taċ-ċelloli THP-G8 trattati b’sustanzi kimiċi b’dik ta’ ċelloli THP-G8 mhux stimolati u tirrappreżenta l-induzzjoni tal-attività tal-promotur tal-IL-8 mis-sustanzi kimiċi.
Inh-GAPLA
: Inibizzjoni tal-GAPLA. Tinkiseb bid-diviżjoni tal-GAPLA tat-THP-G8 trattati b’sustanzi kimiċi b’GAPLA ta’ THP-G8 mhux trattati u tirrappreżenta ċ-ċitotossiċità tas-sustanzi kimiċi.
Limitu minimu ta’ induzzjoni (MIT)
: l-anqas konċentrazzjoni li fiha sustanza kimika tissodisfa l-kriterji pożittivi
Taħlita
: Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.
Sustanza monokostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).
Sustanza multikostitwenti
: Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn wieħed mill-kostitwenti ewlenin ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bl-amalgamar ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.
nIL8LA
: L-attività tal-luċiferażi SLO li tirrifletti l-attività promotur tal-IL-8 (IL8LA) normalizzata bl-attività tal-luċiferażi SLR li tirrifletti l-attività promotur tal-GAPDH (GAPLA). Din tirrappreżenta l-attività promotur tal-IL-8 wara li tikkunsidra l-vijabbiltà taċ-ċelloli jew in-numru ta’ ċelloli.
nSLO-LA
: Abbrevjazzjoni użata fir-rapport ta’ validazzjoni u fil-pubblikazzjonijiet preċedenti rigward l-assaġġ IL-8 Luc biex tirreferi għall-nIL8LA. Ara nIL8LA għad-definizzjoni.
Kontroll pożittiv
: Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattata b’sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Biex jiġi żgurat li l-varjabbiltà fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista’ tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
Preapteni
: Sustanzi kimiċi li jsiru sensitizzaturi permezz ta’ trasformazzjoni abijotika.
Proapteni
: Sustanzi kimiċi li jeħtiġu attivazzjoni enzimatika biex jeħilsu l-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda.
Rilevanza
: Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test għall-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ test (16).
Affidabbiltà
: Kejlijiet ta’ kemm test jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbbiltà fl-istess u bejn il-laboratorarji u r-ripetibbiltà fl-istess laboratorju (16).
Sessjoni
: Sessjoni tikkonsisti f’sustanza kimika tat-test waħda jew aktar ittestjata flimkien ma’ kontroll negattiv u ma’ kontroll b’solvent/b’veikolu.
Sensittività
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal test li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ test (16).
SLO-LA
: Abbrevjazzjoni użata fir-rapport ta’ validazzjoni u fil-pubblikazzjonijiet preċedenti rigward l-assaġġ IL-8 Luc biex tirreferi għall-IL8LA. Ara IL8LA għad-definizzjoni.
SLR-LA
: Abbrevjazzjoni użata fir-rapport ta’ validazzjoni u fil-pubblikazzjonijiet preċedenti rigward l-assaġġ IL-8 Luc biex tirreferi għall-GAPLA. Ara GAPLA għad-definizzjoni.
Kontroll b’solvent/veikolu
: Kampjun mhux trattat li fih il-komponenti kollha ta’ sistema tat-test ħlief tas-sustanza kimika tat-test, iżda li jinkludi s-solvent/il-veikolu li jintuża. Jintuża biex jiġi stabbilit ir-rispons tal-linja bażi għall-kampjuni trattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta jew dispersa stabbliment fl-istess solvent/veikolu. Meta jiġi ttestjat ma’ kontroll b’medium konkorrenti, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent/il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
Speċifiċità
: Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hi kejl tal-preċiżjoni għal test li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ test (16).
Sustanza
: Elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksuba bi kwalunkwe proċess ta’ manifattura tal-produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabbiltà tal-prodott u ta’ kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, iżda eskluż kwalunkwe solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabbiltà tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha.
Tensjoattiv
: Imsejjaħ ukoll aġent tensjoattiv, dan huwa sustanza, bħal deterġent, li tista’ tnaqqas it-tensjoni tas-superfiċje ta’ likwidu u b’hekk tippermettilu jtella’ r-ragħwa jew jippenetra solidi; hu magħruf ukoll bħala aġent li jxarrab. (TG437)
Sustanza kimika tat-test
: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu.
THP-G8
: Linja ta’ ċelloli indikatur IL-8 użata fl-assaġġ IL-8 Luc. Il-linja ta’ ċelloli umana qisha makrofagu, THP-1, ġiet transfettata fil-ġeni tal-luċiferażi SLO u SLR taħt il-kontroll tal-promoturi tal-IL-8 u tal-GAPDH, rispettivament.
Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
: Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (21).
UVCB
: sustanzi ta’ kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.
Metodu ta’ ttestjar validu
: Test meqjus li għandu biżżejjed rilevanza u affidabbiltà għal skop speċifiku u li hu bbażat fuq prinċipji xjentifiċi sodi. Test qatt ma jkunx validu f’sens assolut, iżda biss b’rabta ma’ skop definit.
Appendiċi 3.2
IL-PRINĊIPJU TAL-KEJL TAL-ATTIVITÀ TAL-LUĊIFERAŻI U D-DETERMINAZZJONI TAL-KOEFFIĊJENTI TA’ TRAŻMISSJONI TAL-FILTRU OTTIKU GĦALL-SLO U GĦALL-SLR
Sistema ta’ Assaġġ b’Diversi Indikaturi -Tripluc- tista’ tintuża b’luminometru tat-tip tal-mikropjastri b’sistema ta’ detezzjoni b’diversi kuluri, li jista’ jitqabbdilha filtru ottiku (eż. Phelios AB-2350 (ATTO), ARVO (PerkinElmer), Tristar LB941 (Berthold)). Il-filtru ottiku użat fil-kejl hu filtru long jew short pass ta’ 600–620 nm, jew filtru band pass ta’ 600–700 nm.
Il-kejl ta’ luċiferażijiet b’żewġ kuluri b’filtru ottiku.
Dan hu eżempju bl-użu ta’ Phelios AB-2350 (ATTO). Dan il-luminometru hu mgħammar b’filtru long pass ta’ 600 nm (R60 HOYA Co., 600 nm LP, Filtru 1) għall-qsim tal-luminexxenza tal-SLO (λmass = 580 nm) u tal-SLR (λmass = 630 nm).
Biex jiġu determinati l-koeffiċjenti ta’ tarżmissjoni tal-LP ta’ 600 nm, l-ewwel, bl-użu tal-enzimi tal-luċiferażi SLO u SLR purifikati, kejjel i) l-intensità tal-bijoluminexxenza tal-SLO u tal-SLR mingħajr filtru (F0), ii) l-intensità tal-bijoluminexxenza tal-SLO u tal-SLR li tgħaddi minn LP ta’ 600 nm (Filgru 1), u iii) ikkalkola l-koeffiċjenti ta’ trażmissjoni tal-LP ta’ 600 nm għall-SLO u għall-SLR elenkati hawn taħt.
|
Transmission coefficients
|
Abbreviation
|
Definition
|
|
SLO
|
Filter 1 Transmission coefficients
|
=κOR60
|
The filter’s transmission coefficient for the SLO
|
|
SLR
|
Filter 1 Transmission coefficients
|
κRR60
|
The filter’s transmission coefficient for the SLR
|
Meta l-intensità tal-SLO u tal-SLR fil-kampjun tat-test jiġu definiti bħala O u R, rispettivament, i) l-intensità tad-dawl mingħajr filtru (kollox ottiku) F0 u ii) l-intensità tad-dawl li jittrażmetti mil-LP ta’ 600 nm (Filtru 1) F1 jiġu deskritti kif muri hawn taħt.
F0=O+R
F1=κOR60 x O + κRR60 x R
Dawn il-formuli jistgħu jiġu spjegat kif ġej:
Imbagħad bl-użu tal-fatturi ta’ trażmittenza kkalkolati (κOR60 u κRR60) u l-F0 u l-F1 imkejla, tkun tista’ tikkalkola l-valur O u R kif ġej:
Il-materjali u l-metodi għad-determinazzjoni tal-fattur ta’ trażmittanza
|
(1)
|
Reaġenti
Enzimi tal-luċiferażi purifikati individwali:
|
Enzima tal-SLO purifikata lijofilizzata
|
|
Enzima tal-SLR purifikata lijofilizzata
|
|
(li għax-xogħol ta’ validazzjoni nkisbu mill-GPC Lab. Co. Ltd., Tottori, il-Ġappun mal-linja ta’ ċelloli THP-G8)
|
Reaġent tal-assaġġ:
|
Reaġent tal-assaġġ tal-Luċiferażi Tripluc® (pereżempju minn TOYOBO Cat#MRA-301)
|
Medium: għall-assaġġ tal-luċiferażi (30 ml, maħżuna f’2 – 8°C)
|
|
Reaġent
|
Konċ.
|
Konċ. finali fil-medium
|
Ammont meħtieġ
|
|
RPMI-1640
|
-
|
-
|
27 ml
|
|
FBS
|
-
|
10 %
|
3 ml
|
|
(2)
|
Tħejjija tas-soluzzjoni tal-enzimi
Iddisolvi l-enzima tal-luċiferażi purifikata lijofilizzata f’tubu billi żżid 200 μl ta’ 10 ~ 100 mM Tris/HCl jew Hepes/HCl (pH 7,5 ~ 8,0) supplimentat b’10 % (w/v) gliċerol, iddividi s-soluzzjoni tal-enzima f’alikwoti ta’ 10 μl f’tubi li jintremew ta’ 1,5 ml u aħżinhom fi friżer f’-80°C. Is-soluzzjoni tal-enzima ffriżata tista’ tintuża sa sitt xhur wara. Meta tintuża, żid 1 ml medium għall-assaġġ tal-luċiferażi (RPMI-1640 b’10 % FBS) f’kull tubu li jkun fih is-soluzzjonijiet tal-enzimi (soluzzjoni tal-enzimi dilwita) u żommhom fuq is-silġ biex tipprevjeni d-diżattivazzjoni.
|
|
(3)
|
Kejl tal-bijoluminexxenza
Ħoll ir-reaġent tal-assaġġ tal-Luċiferażi Tripluc® (Tripluc) u żommu f’temperatura ambejntali f’banjumarija jew f’temperatura tal-arja ambjentali. Ixgħel il-luminometru 30 min qabel ma tibda l-kejl biex tħalli l-fotomoltiplikatur jistabbilizza. Ittrasferixxi 100 μl tas-soluzzjoni tal-enzima dilwita fi pjastra sewda b’96 bwejra (qiegħ ċatt) (il-kampjun ta’ riferiment tal-SLO għal #B1, #B2, #B3, il-kampjun ta’ riferiment tal-SLR għal #D1, #D2, #D3). Imbagħad ittrasferixxi 100 μl ta’ Tripluc imsaħħan minn qabel f’kull bwejra tal-pjastra li jkun fiha s-soluzzjoni tal-enzima dilwita bl-użu ta’ pipetman. Ħawwad il-pjastra għal 10 min f’temperatura ambjentali (madwar 25°C) billi tuża xejker tal-pjastri. Neħħi l-bżieżaq mis-soluzzjonijiet fil-bwejriet jekk jitilgħu. Qiegħed il-pjastra fil-luminumetru biex tkejjel l-attività tal-luċiferażi. Il-bijoluminexxenza titkejjel għal 3 sek kull waħda fin-nuqqas (F0) u fil-preżenza (F1) tal-filtru ottiku.
Il-koeffiċjent ta’ trażmissjoni tal-filtru ottiku ġie kkalkolat kif ġej:
Koeffiċjent ta’ trażmissjoni (SLO (κOR60))= (#B1 tal-F1+ #B2 tal-F1+ #B3 tal-F1) / (#B1 tal-F0+ #B2 tal-F0+ #B3 tal-F0)
Koeffiċjent ta’ trażmissjoni (SLR (κRR60))= (#D1 tal-F1+ #D2 tal-F1+ #D3 tal-F1) / (#D1 tal-F0+ #D2 tal-F0+ #D3 tal-F0)
Il-fatturi kkalkolati tat-trażmittenza jintużaw għall-kejlijiet kollha eżegwiti bl-użu tal-istess luminometru.
|
Kontroll tal-kwalità tat-tagħmir
Għandhom jintużaw il-proċeduri deskritti fil-protokoll IL-8 Luc (18).
Appendiċi 3.3
SUSTANZI TA’ PROFIĊJENZA
Qabel l-użu ta’ rutina tat-test deskritt f’dan l-Appendiċi tal-metodu ta’ ttestjar B.71, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jiksbu t-tbassir mistenni tal-assaġġ IL-8 Luc għad-disa’ sustanzi rakkomandati fit-Tabella 1 u billi jiksbu l-valuri li jaqgħu fi ħdan il-medda ta’ referenza rispettiva għal tal-anqas tmienja mid-disa’ sustanzi ta’ profiċjenza (magħżula biex jirrappreżentaw il-medda ta’ risponsi għall-perikli ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda). Kriterji tal-għażla oħra kienu li s-sustanzi jkunu disponibbli kummerċjalment, u li jkun hemm disponibbli data ta’ riferiment in vivo ta’ kwalità għolja kif ukoll data in vitro ta’ kwalità għolja bl-assaġġ IL-8 Luc. Barra minn hekk, hemm data ta’ riferiment ippubblikata disponibbli għall-assaġġ IL-8 Luc (6) (1).
Tabella 1
Sustanzi rakkomandati biex tintwera profiċjenza teknika bl-assaġġ IL-8 Luc
|
Sustanzi ta’ profiċjenza
|
Numru tas-CAS
|
Stat
|
Solubbiltà f X-VIVO15 f’20 mg/ml
|
Tbassir in vivo
(109)
|
Tbassir tal-IL-8 Luc (110)
|
Medda ta’ riferiment (μg/ml) (111)
|
|
|
CV05
(112)
|
IL-8 Luc MIT (113)
|
|
2,4-Dinitroklorobenżen
|
97-00-7
|
Solidu
|
Insolubbli
|
Sensitizzatur (Estrem)
|
Pożittiv
|
2,3-3,9
|
0,5-2,3
|
|
Formaldeid
|
50-00-0
|
Likwidu
|
Solubbli
|
Sensitizzatur (B’saħħtu)
|
Pożittiv
|
9-30
|
4-9
|
|
2-Merkaptobenżotjażol
|
149-30-4
|
Solidu
|
Insolubbli
|
Sensitizzatur (Moderat)
|
Pożittiv
|
250-290
|
60-250
|
|
Etilendiammina
|
107-15-3
|
Likwidu
|
Solubbli
|
Sensitizzatur (Moderat)
|
Pożittiv
|
500-700
|
0,1-0,4
|
|
Dimetakilat tal-Etileneglikol
|
97-90-5
|
Likwidu
|
Insolubbli
|
Sensitizzatur (Dgħajjef)
|
Pożittiv
|
>2000
|
0,04-0,1
|
|
4-Allilanisol (Estragol)
|
140-67-0
|
Likwidu
|
Insolubbli
|
Sensitizzatur (Dgħajjef)
|
Pożittiv
|
>2000
|
0,01-0,07
|
|
Sulfat tal-istreptomiċina
|
3810-74-0
|
Solidu
|
Solubbli
|
Mhux sensitizzatur
|
Negattiv
|
>2000
|
>2000
|
|
Gliċerol
|
56-81-5
|
Likwidu
|
Solubbli
|
Mhux sensitizzatur
|
Negattiv
|
>2000
|
>2000
|
|
Isopropanol
|
67-63-0
|
Likwidu
|
Solubbli
|
Mhux sensitizzatur
|
Negattiv
|
>2000
|
>2000
|
|
Abbrevjazzjonijiet: Nru tas-CAS = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi
|
Appendiċi 3.4
INDIĊIJIET U KRITERJI TA’ ĠUDIZZJU
nIL8LA (nSLO-LA)
Ir-ripetizzjoni nru j (j = 1-4) tal-konċentrazzjoni nru i (i = 0-11) titkejjel għall-IL8LA (SLO-LA) u għall-GAPLA (SLR-LA) rispettivament. L-IL8LA normalizzata, imsejħa nIL8LA (nSLO-LA), u hi definita bħala:
nIL8LAij = IL8LAij/GAPLAij
Din hi l-unità bażika tal-kejl f’dan l-assaġġ.
Ind-IL8LA (FInSLO-LA)
Iż-żieda ta’ drabi tal-nIL8LA medja (nSLO-LA) għar-ripetizzjoni tal-konċentrazzjoni nru i mqabbla magħha fil-konċentrazzjoni 0, Ind-IL8LA, hi l-kejl primarju ta’ dan l-assaġġ. Dan il-proporzjon hu miktub bil-formula li ġejja:
Il-laboratorju prinċipali ppropona li valur ta’ 1,4 jikkorrispondi għal riżultat pożittiv għas-sustanza kimika ttestjata. Dan il-valur hu bbażat fuq l-investigazzjoni tad-data storika tal-laboratorju prinċipali. It-tim ta’ ġestjoni tad-data mbagħad uża dan il-valur fil-fażijiet kollha tal-istudju ta’ validazzjoni. L-eżitu primarju, Ind-IL8LA, hu l-proporzjon ta’ żewġ medji aritmetiċi kif murija fl-ekwazzjoni.
Intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % (CI ta’ 95 %)
L-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % (CI ta’ 95 %) fuq il-bażi tal-proporzjon jista’ jiġi stmat li juri l-preċiżjoni ta’ dan il-kejl tal-eżitu primarju. Il-limitu inferjuri tas-CI ta’ 95 % ≥ 1 jindika li l-nIL8LA bil-konċentrazzjoni nru i hi ferm akbar minn dik bil-kontroll b’solvent. Hemm diversi modi biex jinbena s-CI ta’ 95 %. Aħna użajna l-metodu magħruf bħala t-teorema ta’ Fieller f’dan l-istudju. Din it-teorima tal-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % tinkiseb mill-formula li ġejja:
Fejn
hi l-perċentil ta’ 97,5 tad-distribuzzjoni ċentrali t bil-ν tal-grad ta’ libertà, fejn
Inh-GAPLA (II-SLR-LA)
L-Inh-GAPLA hi l-proporzjon tal-GAPLA medja (SLR-LA) għar-ripetizzjoni tal-konċentrazzjoni nru i meta mqabbla ma’ dik bil-kontroll b’solvent, u din tinkiteb permezz ta’
Peress li l-GAPLA hi d-denominatur tal-nIL8LA, valur estremament żgħir jikkawża varjazzjoni kbira fl-nIL8LA. Għaldaqstant, valuri tal-Ind-IL8LA b’valur estremament żgħir tal-Inh-GAPLA (anqas minn 0,05) jistgħu jitqiesu li għandhom preċiżjoni baxxa.
Appendiċi 3.5
L-ISKEMA TAL-METODI BIEX JIĠU DISSOLTI SUSTANZI KIMIĊI GĦALL-ASSAĠĠ IL-8 LUC.
|
(a)
|
Għal sustanzi kimiċi dissolti f’X-VIVOTM 15 f’20 mg/ml
|
|
(b)
|
Għal sustanzi kimiċi insolubbli f’X-VIVOTM 15 f’20 mg/ml
|
Appendiċi 3.6
L-ISKEMA TAL-METODU BIEX JIĠI DISSOLT 4-NBB GĦALL-KONTROLL POŻITTIV TAL-ASSAĠĠ IL-8 LUC.
” |
