(1)

Fil-Parti A, jiżdied il-Kapitolu li ġej:

“A.25   KOSTANTI TA' DISSOĊJAZZJONI FL-ILMA (METODU TA' WINKLER — METODU SPETTROFOTOMETRIKU — METODU KONDUTTOMETRIKU)

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 112 (1981) tal-OECD

Prerekwiżiti

Informazzjoni ta' gwida

Dikjarazzjonijiet kwalifikati

Dokumenti standard

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq metodi mogħtijin fir-referenzi elenkati fit-taqsima “Tagħrif” u fil-Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA tat-18 ta' Awwissu, 1978.

METODU — INTRODUZZJONI, SKOP, KAMP TA' APPLIKAZZJONI, RILEVANZA, APPLIKAZZJONI U LIMITI TAT-TEST

Id-dissoċjazzjoni ta' sustanza fl-ilma hija ta' importanza fil-valutazzjoni tal-impatt tagħha fuq l-ambjent. Tirregola l-forma tas-sustanza li min-naħa tagħha tistabbilixxi l-imġiba u t-trasport tagħha. Tista' taffettwa l-adsorbiment tas-sustanza kimika fuq il-ħamriji u s-sedimenti u l-assorbiment fiċ-ċelloli bijoloġiċi.

Definizzjonijiet u unitajiet

Id-dissoċjazzjoni hija l-qsim irriversibbli f'żewġ speċijiet kimiċi jew iktar li jistgħu jkunu joniċi. Ġeneralment il-proċess ikun indikat bi

RX ⇌ R ++ X –

u l-kostant ta' ekwilibriju tal-konċentrazzjoni li jirregola r-reazzjoni huwa

Pereżempju, fil-każ partikolari li fih R huwa idroġenu (is-sustanza hija aċidu), il-kostant huwa

jew

Sustanzi ta' referenza

Is-sustanzi ta' referenza li ġejjin mhux bilfors jintużaw fil-każijiet kollha meta tiġi investigata sustanza ġdida. Primarjament jiġu pprovduti sabiex kultant ikun jista' jiġi kkalibrat il-metodu u sabiex tingħata l-possibbiltà li jitqabblu r-riżultati meta jiġi applikat metodu ieħor.

Tajjeb li wieħed ikollu sustanza b'bosta pKs kif indikat fil-Prinċipju tal-metodu, hawn taħt. Sustana bħal din tista' tkun:

Il-prinċipju tal-metodu ta' ttestjar

Il-proċess kimiku deskritt ġeneralment ftit ikun dipendenti mit-temperatura fil-medda ta' temperaturi rilevanti għall-ambjent. Id-determinazzjoni tal-kostant ta' dissoċjazzjoni teħtieġ kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-forom dissoċjati u mhux dissoċjati tas-sustanza kimika. Bl-għarfien tal-istekjometrija tar-reazzjoni ta' dissoċjazzjoni indikata fid-Definizzjonijiet u unitajiet, iktar 'il fuq, jista' jiġi stabbilit il-kostant it-tajjeb. Fil-każ partikolari deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar, is-sustanza qiegħda ġġib ruħha bħala aċidu jew bażi, u d-determinazzjoni tista' ssir l-aħjar billi jiġu stabbiliti l-konċentrazzjonijiet rilevanti tal-forom jonizzati u mhux jonizzati tas-sustanza u l-pH tas-soluzzjoni. Ir-relazzjoni bejn dawn it-termini tingħata fl-ekwazzjoni għall-pKa f'Definizzjonijiet u unitajiet, iktar 'il fuq. Ċerti sustanzi jesibixxu iktar minn kostant ta' dissoċjazzjoni wieħed u jistgħu jiġu żviluppati ekwazzjonijiet simili. Uħud mill-metodi deskritti hawnhekk huma adattati wkoll għal dissoċjazzjoni mhux aċida/bażi.

Kriterji tal-kwalità

Ripetibbiltà

Il-kostant ta' dissoċjazzjoni għandu jiġi rreplikat (tal-inqas tliet determinazzjonijiet) għal unità fi ħdan ± 0.1 unità log.

DESKRIZZJONI TAL-PROĊEDURI TA' TEST

Hemm żewġ approċċi bażiċi għad-determinazzjoni tal-pKa. Wieħed jinvolvi titrazzjoni ta' ammont magħruf ta' sustanza b'aċidu jew bażi standard, kif xieraq; l-ieħor jinvolvi l-istabbiliment tal-konċentrazzjoni relattiva tal-forom jonizzati u mhux jonizzati u d-dipendenza tagħha mill-pH.

Preparamenti

Il-metodi bbażati fuq dawk il-prinċipji jistgħu jiġu kklassifikati bħala proċeduri ta' titrazzjoni, ta' spettrofotometrija u ta' konduttometrija.

Soluzzjonijiet tat-test

Għall-metodu ta' Winkler u l-metodu konduttometriku, is-sustanza kimika għandha tiġi dissolta f'ilma distillat. Għal metodi spettrofotometriċi u oħrajn, jintużaw soluzzjonijiet mewwieta. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma għandhiex taqbeż l-inqas wieħed bejn 0.01 M jew nofs il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni, u l-iktar forma pura disponibbli tas-sustanza għandha tintuża fit-tiswir tas-soluzzjonijiet. Jekk is-sustanza jkollha solubilità medja, tista' tiġi dissolta f'ammont żgħir ta' solvent li jitħallat mal-ilma qabel ma jiżdiedu l-konċentrazzjonijiet indikati hawn fuq.

Is-soluzzjonijiet għandhom jiġu vverifikati għall-preżenza ta' emulsjonijiet bl-użu ta' raġġ ta' Tyndall, speċjalment jekk jintuża kosolvent sabiex tissaħħaħ is-solubilità. Meta jintużaw soluzzjonijiet mewwieta, il-konċentrazzjoni tal-bafer ma għandhiex taqbeż iż-0.05 M.

Kundizzjonijiet tat-test

Temperatura

It-temperatura għandha tiġi kkontrollata sa tal-inqas ± 1 °C. Id-determinazzjoni idealment għandha ssir f'20 °C.

Jekk ikun hemm suspett ta' dipendenza sinifikanti fuq it-temperatura, id-determinazzjoni għandha ssir f'tal-inqas żewġ temperaturi oħrajn. L-intervalli tat-temperatura għandhom ikunu ta' 10 °C f'dan il-każ u l-kontroll tat-temperatura ± 0.1 °C.

Analiżijiet

Il-metodu sejjer jiġi stabbilit mill-għamla tas-sustanza li tkun qiegħda tiġi ttestjata. Irid ikun sensittiv biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu stabbiliti l-ispeċijiet differenti f'kull konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tat-test.

It-twettiq tat-test

Il-metodu ta' Winkler

Is-soluzzjoni tat-test tiġi stabbilita b'titrazzjoni bis-soluzzjoni bażi jew aċida standard kif xieraq, billi titkejjel il-pH wara kull żieda ta' soluzzjoni titrata. Għandhom isiru minimu ta' 10 żidiet addizzjonali qabel il-punt ta' ekwivalenza. Jekk l-ekwilibriju jintlaħaq malajr biżżejjed, jista' jintuża potentjometru tar-reġistrazzjoni. Għal dan il-metodu, kemm il-kwantità totali tas-sustanza kif ukoll il-konċentrazzjoni tagħha jridu jkunu magħrufin bl-eżatt. Iridu jittieħdu prekawzjonijiet sabiex jiġi eskluż id-diossidu tal-karbonju. Dettalji dwar il-proċedura, il-prekawzjonijiet, u l-kalkolu jingħataw f'testijiet standard, eż. referenzi (1), (2), (3), (4).

Il-metodu spettrofotometriku

Tul tal-mewġa jinstab meta l-forom jonizzati u mhux jonizzati tas-sustanzi jkollhom koeffiċjenti ta' estinzjoni konsiderevolment differenti. L-ispettru ta' assorbiment tal-UV/VIS jinkiseb minn soluzzjonijiet ta' konċentrazzjoni kostanti taħt kundizzjoni tal-pH li fiha s-sustanza essenzjalment ma tkunx jonizzata u kompletament jonizzata u f'bosta pHs intermedji. Dan jista' jsir, jew billi jiżdiedu inkrementi ta' aċidu kkonċentrat (bażi) ma' volum relattivament kbir ta' soluzzjoni tas-sustanza f'bafer b'bosta komponenti, inizjalment f'pH għolja (baxxa) (ref. 5), jew billi jiżdiedu volumi ndaqs ta' soluzzjoni ewlenija tas-sustanza, pereżempju fl-ilma, il-metanol, ma' volumi kostanti ta' bosta soluzzjonijiet mewwieta li jkopru l-medda ta' pH mixtieqa. Mill-valuri tal-pH u l-assorbiment fit-tul tal-mewġa magħżula, jiġi kkalkolat numru suffiċjenti ta' valuri għall-pKa billi tintuża dejta minn tal-inqas 5 pHs meta s-sustanza tkun tal-inqas 10 fil-mija u inqas minn 90 fil-mija jonizzata. Id-dettalji sperimentali ulterjuri u l-metodu ta' kalkolu jintgħataw fir-referenza (1).

Il-metodu konduttometriku

Bl-użu ta' ċellola ta' kostant żgħir u magħruf taċ-ċellola, titkejjel il-konduttività ta' soluzzjoni ta' madwar 0.1 M tas-sustanza f'ilma tal-konduttività. Jitkejlu wkoll il-konduttivitajiet ta' numru ta' dilwizzjonijiet li jsiru bi preċiżjoni ta' din is-soluzzjoni. Il-konċentrazzjoni titnaqqas bin-nofs kull darba, u s-serje għandha tkopri tal-inqas ordni ta' kobor fil-konċentrazzjoni. Il-konduttività ta' limitazzjoni f'dilwizzjoni infinita tinstab billi jsir esperiment simili b'melħ NA u bl-estrapolazzjoni. Imbagħad il-grad ta' dissoċjazzjoni jkun jista' jiġi kkalkolat mill-konduttività ta' kull soluzzjoni bl-użu tal-ekwazzjoni Onsager, u b'hekk bl-użu tal-Liġi ta' Dilwizzjoni Ostwald jista' jiġi kkalkolat il-kostant ta' dissoċjazzjoni bħala K = α2C/(1 – α) fejn C hija l-konċentrazzjoni f'moli kull litru u α hija l-frazzjoni dissoċjata. Iridu jittieħdu prekawzjonijiet sabiex jiġi eskluż is-CO2. Id-dettalji sperimentali ulterjuri u l-metodu ta' kalkolu jintgħataw fit-testi standard u fir-referenzi (1), (6) u (7).

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

Il-metodu ta' Winkler

Il-pKa hija kkalkolata għal 10 punti mkejlin fuq il-kurva ta' titrazzjoni. Jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u d-devjazzjoni standard tat-tali valuri pKa. Plott tal-pH kontra l-volum tal-bażi jew l-aċidu standard għandha tkun inkluża flimkien ma' preżentazzjoni f'tabelli.

Il-metodu spettrofotometriku

L-assorbiment u l-pH huma mqegħdin f'tabella minn kull spettru. Tal-inqas ħames valuri għall-pKa huma kkalkolati mill-punti ta' data tal-ispettri intermedji, u jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u dik standard ta' dawn ir-riżultati wkoll.

Il-metodu konduttometriku

Il-konduttività ekwivalenti Λ hija kkalkolata għal kull konċentrazzjoni tal-aċidu u għal kull konċentrazzjoni ta' taħlita ta' ekwivalenti ta' aċidu, flimkien ma' 0.98 ekwivalenti ta' idrossidu tas-sodju mingħajr karbonat. L-aċidu huwa eċċessiv sabiex jiġi evitat OH– eċċessiv minħabba l-idroliżi. 1/Λ tiġi pplottjata kontra Λ _ tal-melħ tista' tinstab bl-estrapolazzjoni għal konċentrazzjoni żero.

Λo tal-aċidu tista' tiġi kkalkolata billi jintużaw il-valuri tat-tagħrif għal H+ u Na+. Il-pKa tista' tiġi kkalkolata minn α = Λi /Λo u Ka = α2C/(1 – α) għal kull konċentrazzjoni. Valuri aħjar għall-Ka jistgħu jinkisbu billi jsiru korrezzjonijiet għall-mobilità u l-attività. Għandhom jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u d-devjazzjoni standard tal-valuri pKa.

Rapport tat-test

Id-dejta mhux ipproċessata u l-valuri pKa kkalkolati kollha għandhom jiġu sottomessi flimkien mal-metodu ta' kalkolu (idealment f'forma ta' tabelli, kif issuġġerit fir-ref. 1) u hekk ukoll il-parametri statistiċi deskritti iktar 'il fuq. Għall-metodi ta' Winkler, għandhom jingħataw id-dettalji tal-istandardizzazzjoni tas-soluzzjonijiet titrati.

Għall-metodu spettrofotometriku, għandhom jiġu sottomessi l-ispettri kollha. Għall-metodu konduttometriku, għandhom jiġu rrapportati d-dettalji tad-determinazzjoni tal-kostant taċ-ċelloli. Għandha tingħata informazzjoni dwar it-teknika użata, il-metodi analitiċi u l-għamla ta' kwalunkwe bafer użat.

Għandha tiġi rrapportata t-temperatura (jew temperaturi) tat-test.

TAGĦRIF

(2)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.5 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.5   IRRITAZZJONI AKUTA TAL-GĦAJNEJN/KORRUŻJONI

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 405 tal-OECD (2012). Il-linji gwida tat-test tal-OECD għall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi jiġu riveduti kull ċertu żmien sabiex jiġi żgurat li dawn jirriflettu l-aħjar xjenza disponibbli. Fir-reviżjonijiet preċedenti ta' din il-linja gwida tat-test, inxteħtet attenzjoni speċjali fuq it-titjib permezz tal-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza kimika tat-test sabiex ikunu evitati testijiet żejda fuq l-annimali tal-laboratorju u b'hekk jiġi indirizzat it-tħassib dwar it-trattament xieraq tal-annimali. TG 405 (adottata fl-1981 u aġġornata fl-1987, l-2002, u l-2012) tinkludi r-rakkomandazzjoni li qabel ma jitwettaq it-test in vivo deskritt għal irritazzjoni akuta tal-għajnejn/korrużjoni, għandha ssir analiżi tal-piż tal-evidenza (1) fuq id-dejta rilevanti eżistenti. Meta ma jkunx hemm biżżejjed dejta disponibbli, huwa rakkomandat li dawn jiġu żviluppati bl-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (2) (3). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet in vitro vvalidati u aċċettabbli u hija pprovduta bħala suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar. Għall-fini tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (2), strateġija ta' ttestjar integrata hija inkluża fil-Gwida tal-ECHA rilevanti wkoll (21). L-ittestjar fl-annimali għandu jsir biss jekk jiġi stabbilit li dan huwa neċessarju wara li jiġu kkunsidrati l-metodi alternattivi disponibbli, u l-użu ta' dan jitqies xieraq. F'dan iż-żmien li fih qiegħed jiġi abbozzat dan il-metodu ta' ttestjar aġġornat, hemm każijiet li fihom l-użu ta' dan il-metodu ta' ttestjar għadu neċessarju jew meħtieġ minn ċerti oqfsa regolatorji.

L-aħħar aġġornament iffoka l-iktar fuq l-użu ta' analġeżiċi u anestetiċi mingħajr ma jitħalla impatt fuq il-kunċett u l-istruttura bażiċi tal-linja gwida tat-test. ICCVAM (3) u bord xjentifiku internazzjonali indipendenti ta' evalwazzjoni bejn il-pari rrevedew l-utilità u l-limitazzjonijiet tal-użu spiss ta' anestetiċi topiċi, analġeżiċi sistemiċi u punti ta' tmiem umanitarji matul l-ittestjar in vivo tas-sikurezza tal-irritazzjoni okulari (12). Ir-reviżjoni kkonkludiet li l-użu ta' anestetiċi topiċi u analġeżiċi sistemiċi jista' jevita ħafna mill-uġigħ u t-tbatija jew kull uġigħ u tbatija bla ma jaffettwa l-eżitu tat-test, u rrakkomandat li dawn is-sustanzi jintużaw dejjem. Dan il-metodu ta' ttestjar jieħu f'kunsiderazzjoni din ir-reviżjoni. Anestetiċi topiċi, analġeżiċi sistemiċi, u punti ta' tmiem umanitarji għandhom jintużaw ta' spiss matul l-ittestjar in vivo tal-korrużjoni u l-irritazzjoni akuta tal-għajnejn. L-eċċezzjonijiet għall-użu tagħhom għandhom ikunu ġġustifikati. L-irfinamenti deskritti f'dan il-metodu sejrin inaqqsu b'mod sostanzjali jew jevitaw l-uġigħ u t-tbatija tal-annimali f'ħafna mis-sitwazzjonijiet ta' ttestjar fejn ikun għad hemm bżonn li jsir ittestjar in vivo tas-sikurezza okulari.

L-immaniġġjar preventiv ibbilanċjat tal-uġigħ għandu jinkludi (i) pretrattament ta' rutina b'anestetiku topiku (eż. proparacaine jew tetracaine) u analġeżiku sistemiku (eż. buprenorphine), (ii) skeda ta' rutina ta' wara t-trattament tal-analġeżija sistemika (eż. buprenorphine u meloxicam), (iii) osservazzjoni, monitoraġġ u reġistrazzjoni skedati tal-annimali għal sinjali kliniċi ta' uġigħ u/jew tbatija, u (iv) osservazzjoni, monitoraġġ u reġistrazzjoni skedati tal-għamla, is-severità u l-progressjoni ta' kull korriment marbut mal-għajnejn. Huma pprovduti iktar dettalji fil-proċeduri aġġornati deskritti iktar 'il quddiem. Wara l-għoti tas-sustanza kimika tat-test, ma għandu jiġi applikat l-ebda anestetiku jew analġeżiku topiku addizzjonali sabiex tiġi evitata interferenza mal-istudju. L-analġeżiċi b'attività antiinfjammatorja (eż. meloxicam) ma għandhomx jiġu applikati b'mod topiku, u d-dożi użati b'mod sistemiku ma għandhomx jinterferixxu ma' effetti okulari.

Id-definizzjonijiet huma stabbiliti fl-Appendiċi għall-metodu ta' ttestjar.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija kif ukoll tat-trattament xieraq tal-annimali, testijiet in vivo ma għandhomx jiġu kkunsidrati qabel ma tkun ġiet evalwata d-dejta disponibbli kollha rilevanti għall-potenzjal ta' korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn mis-sustanza f'analiżi tal-piż tal-evidenza. Tali dejta għandha tinkludi evidenza minn studji eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrużjoni/irritazzjoni ta' sustanza jew taħlita waħda jew iktar strutturalment relatata, id-dejta li turi aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza kimika (4) (5), u r-riżultati minn testijiet in vitro jew ex vivo vvalidati u aċċettati għall-korrużjoni tal-ġilda u l-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn (6) (13) (14) (15) (16) (17). L-istudji setgħu ġew konklużi qabel l-analiżi tal-piż tal-evidenza, jew bħala riżultat tagħha.

Għal ċerti sustanzi kimiċi, tali analiżi tista' tindika l-ħtieġa għal studji in vivo dwar il-potenzjal tas-sustanza kimika għal korrużjoni/irritazzjoni okulari. F'dawn il-każijiet kollha, qabel ma jiġi kkunsidrat l-użu tat-test in vivo tal-għajnejn, idealment l-ewwel għandu jsir u jiġi evalwat studju tal-effetti in vitro u/jew in vivo ta' korrużjoni tal-ġilda tas-sustanza kimika skont l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzjali fil-metodu ta' ttestjar B.4 (7) jew l-istrateġija ta' ttestjar integrat deskritta fil-Gwida tal-ECHA (21).

Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali, li tinkludi t-twettiq ta' testijiet validati in vitro jew ex vivo tal-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn, hija inkluża bħala Suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar u, għall-fini tar-REACH, fil-Gwida tal-ECHA (21). Huwa rakkomandat li din l-istrateġija ta' ttestjar tkun segwita qabel ma jinbdew it-testijiet in vivo. Għal sustanzi kimiċi ġodda, huwa rakkomandat approċċ gradwali ta' ttestjar għall-iżvilupp ta' dejta xjentifikament solida fuq il-korrużjoni/irritazzjoni tas-sustanza kimika. Għal sustanzi kimiċi eżistenti b'dejta mhux suffiċjenti dwar il-korrużjoni/irritazzjoni tal-ġilda u l-għajnejn, l-istrateġija tista' tintuża sabiex timla l-vojt fin-nuqqas ta' dejta. L-użu ta' strateġija jew proċedura ta' ttestjar differenti, jew id-deċiżjoni li ma jintużax approċċ gradwali ta' ttestjar, għandhom ikunu ġustifikati.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST IN VIVO

Wara pretrattament b'analġeżiku sistemiku u l-induzzjoni ta' anesteżija topika xierqa, is-sustanza kimika li trid tiġi ttestjata hija applikata f'doża waħda għal waħda mill-għajnejn tal-annimal tal-esperiment; l-għajn mhux trattata isservi bħala l-kontroll. Il-grad tal-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn huwa evalwat billi jiġu kklassifikati l-leżjonijiet tal-konġuntiva, tal-kornea u tal-iris, f'intervalli speċifiċi. Effetti oħrajn fl-għajn u l-effetti sistemiċi avversi huma deskritti wkoll sabiex jipprovdu evalwazzjoni sħiħa tal-effetti. It-tul ta' żmien tal-istudju għandu jkun biżżejjed sabiex tkun evalwata r-reversibilità jew l-irreversibilità tal-effetti.

Annimali li juru sinjali ta' tbatija u/jew uġigħ severi fi kwalunkwe stadju tat-test jew leżjonijiet konsistenti mal-punti ta' tmiem umanitarji deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar (ara l-Paragrafu 26) għandhom jinqatlu b'mod umanitarju, u s-sustanza kimika għandha tiġi vvalutata kif xieraq. Il-kriterji għat-teħid tad-deċiżjoni sabiex jinqatlu b'mod umanitarju annimali fi stat ta' agunija jew tbatija severa huma spjegati f'dokument ta' Gwida tal-OECD (8).

IL-PREPARAMENTI GĦAT-TEST IN VIVO

L-għażla tal-ispeċijiet

Il-fenek albino huwa l-annimal tal-laboratorju preferut, u jintużaw annimali adulti żgħażagħ b'saħħithom. Għandha tingħata raġuni għall-użu ta' razez jew speċijiet oħrajn.

Preparazzjoni tal-annimali

Iż-żewġ għajnejn ta' kull annimal sperimentali magħżul b'mod provviżorju għat-testijiet għandhom ikunu eżaminati fi żmien 24 siegħa qabel ma jibda t-test. Ma għandhomx jintużaw annimali li juru irritazzjoni fl-għajnejn, difetti okulari, jew li korriment korneali preeżistenti.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf

L-annimali għandhom jinżammu f'gaġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun ta' 20 °C (± 3 °C) għall-fniek. Filwaqt li l-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas ta' 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għandha tiġi evitata intensità eċċessiva tad-dawl. Għall-għalf, jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.

PROĊEDURA TAT-TEST

L-użu ta' anestetiċi topiċi u analġeżiċi sistemiċi

Huma rakkomandati l-proċeduri li ġejjin sabiex jiġu evitati jew minimizzati l-uġigħ u t-tbatija fil-proċeduri ta' ttestjar tas-sikurezza okulari. Minflok, jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi li ġew stabbiliti li jipprovdu evitar jew tnaqqis ekwivalenti jew aħjar tal-uġigħ u t-tbatija.

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Is-sustanza kimika tat-test għandha titqiegħed fil-ħofra konġuntivali ta' waħda mill-għajnejn ta' kull annimal wara li l-kappell t'isfel tal-għajn jinġibed bil-galbu lil hinn mill-boċċa tal-għajn. Imbagħad il-kpiepel jinżammu bil-galbu magħluqin għal madwar sekonda sabiex jiġi evitat it-telf tal-materjal. L-għajn l-oħra, li tibqa' mingħajr trattament, isservi ta' kontroll.

Irrigazzjoni

L-għajnejn tal-annimali tat-test ma għandhomx jinħaslu għal tal-inqas 24 siegħa wara l-instillazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, ħlief għas-solidi (ara l-paragrafu 18), u fil-każ ta' effetti korrużivi jew irritanti immedjati. Wara 24 siegħa, tista' ssir tlaħliħa sewwa jekk jitqies li din hija xierqa.

L-użu ta' grupp satellita ta' annimali għall-investigazzjoni tal-infuwenza tal-ħasil mhuwiex rakkommandat, sakemm ma jkunx xjetifikament ġustifikat. Jekk ikun meħtieġ grupp satellita, għandhom jintużaw żewġt ifniek. Il-kundizzjonijiet tal-ħasil għandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, eż. il-ħin tal-ħasil; il-kompożizzjoni u t-temperatura tas-soluzzjoni tal-ħasil; id-durata, il-volum u l-veloċità tal-applikazzjoni.

Livell tad-doża

(1)   L-ittestjar tal-likwidi

Għat-testijiet tal-likwidi, tintuża doża ta' 0.1 ml. Ma għandhomx jintużaw sprejs bil-pompa għall-instillazzjoni diretta tas-sustanza kimika fl-għajn. L-isprej tal-likwidu għandu jitneħħa u jinġabar f'kontenitur qabel l-instillazzjoni ta' 0,1 ml fl-għajn.

(2)   L-ittestjar tas-solidi

Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, pejsts, u sustanzi partikolati, l-ammont użat għandu jkollu volum ta' 0.1 ml jew piż ta' mhux aktar minn 100 mg. Is-sustanza kimika tat-test għandha tkun mitħuna fi trab fin. Il-volum tal-materjal solidu għandu jitkejjel wara li jkun kumpattat b'ġentilezza, eż. b'taptip fuq il-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza kimika solida tat-test ma tkunx tneħħiet mill-għajn tal-annimal tat-test b'mekkaniżmi fiżjoloġiċi fl-ewwel punt tal-ħin tal-osserazzjoni ta' siegħa wara t-trattament, l-għajn tista' titlaħlaħ b'ilma salin jew distillat.

(3)   L-ittestjar ta' aerosoli

Huwa rakkommandat li l-isprejs bil-pompa u l-aerosoli kollha jinġabru qabel l-instillazzjoni fl-għajn. L-unika eċċezzjoni hija għas-sustanzi kimiċi f'kontenituri tal-aerosoli b'pressjoni għolja, li ma jistgħux jinġabru minħabba l-vaporizzazzjoni. F'dawn il-każijiet, l-għajn għandha tinżamm miftuħa, u s-sustanza kimika tat-test tingħata fl-għajn f'tagħfisa sempliċi ta' madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm direttament quddiem l-għajn. Din id-distanza tista' tvarja jiddependi mill-pressjoni tal-isprej u l-kontenuti tiegħu. Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma ssirx ħsara lill-għajn mill-pressjoni tal-isprej. F'każijiet xierqa, jista' jkun hemm il-ħtieġa li jkun evalutat il-potenzjal ta' ħsara “mekkanika” tal-għajn mill-qawwa tal-isprej.

Tista' tinħareġ stima tad-doża minn aerosol billi t-test jiġi ssimulat kif ġej: is-sustanza kimika tiġi sprejjata fuq karta tal-użin minn fetħa d-daqs ta' għajn ta' fenek imqiegħda direttament quddiem il-karta. Iż-żieda fil-piż tal-karta tintuża sabiex jiġi kkalkolat l-ammont sprejjat fl-għajn. Għal sustanzi kimiċi volatili, id-doża tista' tkun ikkalkolata bl-użin ta' kontenitur riċevitur qabel u wara t-tneħħija tas-sustanza kimika tat-test.

It-test inizjali (test in vivo tal-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn bl-użu ta' annimal wieħed)

Huwa ferm rakkomandat li t-test in vivo jsir inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed (ara s-Suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar: Strateġija ta' Ttestjar Sekwenzali għall-Irritazzjoni u l-Korrużjoni tal-Għajnejn). L-osservazzjonijiet għandhom jippermettu li jiġu stabbiliti s-severità u r-reversibilità qabel ma jsir it-test konfermatorju f'annimal ieħor.

Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza kimika tkun korrużiva jew severament irritanti għall-għajn bl-użu tal-proċedura deskritta, ma għandhomx isiru aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari.

Test konfermatorju (test in vivo tal-irritazzjoni tal-għajn b'annimali addizzjonali)

Jekk ma jkunx osservat effett korrużiv jew irritanti severament fit-test inizjali, ir-rispons irritanti jew negattiv għandu jiġi kkonfermat bl-użu ta' massimu ta' żewġ annimali addizzjonali. Jekk jiġi osservat effett irritanti fit-test inizjali, huwa rakkomandat li t-test konfermatorju jsir b'mod sekwenzjali f'annimal wieħed wara l-ieħor, minflok ma jiġu esposti żewġ annimali addizzjonali fl-istess ħin. Jekk it-tieni annimal juri effetti korrużivi jew irritanti severi, it-test m'għandux jitkompla. Jekk ir-riżultati mit-tieni annimal ikunu biżżejjed sabiex jippermettu li tiġi stabbilita klassifikazzjoni tal-periklu, ma għandu jsir ebda test ieħor.

Perjodu ta' osservazzjoni

Id-durata tal-perjodu ta' osservazzjoni għandha tkun biżżejjed sabiex ikunu evalwati l-kobor u r-reversibilità tal-effetti osservati. Madankollu, l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk l-annimal juri sinjali kontinwi ta' uġigħ jew tbatija severi (8). Sabiex tkun stabbilita r-reversibilità tal-effetti, l-annimali għandhom ikunu osservati normalment għal 21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test. Jekk ir-reversibilità tidher qabel 21 jum, l-esperiment għandu jkun terminat f'dak il-waqt.

Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-għajn

L-għajnejn għandhom jiġu evalwati b'mod komprensiv għall-preżenza jew l-assenza ta' leżjonijiet okulari siegħa wara t-TCA, segwita minn evalwazzjonijiet li tal-inqas isiru ta' kuljum. L-annimali għandhom jiġu evalwati bosta drabi kuljum għall-ewwel 3 ijiem sabiex jiġi żgurat li d-deċiżjonijiet dwar it-terminazzjoni jittieħdu fil-ħin. L-annimali tat-test għandhom jiġu evalwati b'rutina għad-durata sħiħa tal-istudju għal sinjali kliniċi ta' uġigħ u/jew tbatija (eż. mess jew ħakk ripetut tal-għajn, teptip eċċessiv tal-għajnejn, dmugħ eċċessiv) (9) (10) (11) tal-inqas darbtejn kuljum, b'tal-inqas 6 sigħat bejn l-osservazzjonijiet, jew iktar spiss jekk ikun hemm bżonn. Dan huwa neċessarju sabiex (i) l-annimali jiġu vvalutati b'mod adegwat għal evidenza ta' uġigħ u tbatija sabiex jittieħdu deċiżjonijiet informati fuq il-ħtieġa li jiżdied id-dożaġġ tal-analġeżiċi u (ii) l-annimali jiġu vvalutati għal evidenza ta' punti ta' tmiem umanitarji stabbiliti sabiex jittieħdu deċiżjonijiet informati dwar jekk huwiex xieraq li l-annimali jingħataw ewtanażija umanitarja, u sabiex jiġi żgurat li t-tali deċiżjonijiet jittieħdu fil-ħin. It-tilwin bil-fluworexxeina għandu jintuża ta' spiss u għandu jintuża bijomikroskopju korneali meta jitqies li dan huwa xiearq (eż. għall-valutazzjoni tal-fond tal-korriment meta jkun hemm ulċerazzjoni korneali) bħala għajnuna fid-detezzjoni u l-kejl tal-ħsara okulari, u sabiex jiġi evalwat jekk intlaħqux il-kriterji tal-punt ta' tmiem stabbiliti għall-ewtanażja umanitarja. Jistgħu jinġabru ritratti diġitali tal-leżjonijiet osservati għal referenza u sabiex jiġi pprovdut rekord permanenti tal-firxa ta' ħsara okulari. L-annimali għandhom jinżammu fit-test mhux aktar milli meħtieġ ladarba tinkiseb l-informazzjoni definita. L-annimali li juru uġigħ jew tbatija severi għandhom jinqatlu b'mod umanitarju mingħajr dewmien, u s-sustanza kimika għandha tiġi vvalutata kif xieraq.

L-annimali bil-leżjonijiet tal-għajnejn li ġejjin wara l-instillazzjoni għandhom jinqatlu b'mod umanitarju (irreferi għat-Tabella 1 għal deskrizzjoni tal-gradi tal-leżjonijiet): perforazzjoni korneali jew ulċerazzjoni korneali sinifikanti inkluża stafiloma; demm fil-kompartiment anterjuri tal-għajn; opaċità korneali tal-grad 4; assenza ta' rifless tad-dawl (grad 2 tar-rispons iridjali) li tippersisti għal 72 siegħa; ulċerazzjoni tal-membrana konġuntivali; nekrożi tal-membrana konġuntivali jew nittitanti; jew tqaxxir. Dan għaliex, ġeneralment, tali leżjonijiet ma jkunux reversibbli. Barra minn hekk, huwa rakkomandat li l-leżjonijiet okulari li ġejjin jistgħu jintużaw bħala punti ta' tmiem umanitarji sabiex jiġu terminati l-istudji qabel tmiem il-perjodu ta' osservazzjoni skedat ta' 21 jum. Dawn il-leżjonijiet jitqiesu bħala prekursuri ta' korrimenti irritanti jew korrużivi u korrimenti li mhumiex mistennijin li jitilqu sa tmiem il-perjodu ta' osservazzjoni ta' 21 jum: fond sever tal-korriment (eż. ulċerazzjoni korneali li testendi lil hinn mis-saffi superfiċjali tal-istroma), qerda tal-limbus > 50 % (kif evidenzjata minn tibjid tat-tessut konġuntivali), u infezzjoni severa tal-għajn (nixxija purulenti). Taħlita ta': vaskularizzazzjoni tal-wiċċ tal-kornea (jiġifieri pannu korneali); żona ta' tilwin bil-fluworexxeina li ma tonqosx maż-żmien skont valutazzjoni li ssir kuljum; u/jew nuqqas ta' riefiteljalizzazzjoni 5 ijiem wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test jistgħu jitqiesu wkoll bħala kriterji potenzjalment siewja li jinfluwenzaw id-deċiżjoni klinika dwar it-terminazzjoni bikrija tal-istudju. Madankollu, dawn is-sejbiet waħedhom mhumiex biżżejjed sabiex jiġġustifikaw terminazzjoni bikrija tal-istudju. Ladarba jkunu ġew identifikati effetti okulari severi, għandu jiġi kkonsultat veterinarju tal-annimali tal-laboratorju inkarigat jew ikkwalifikat jew persunal imħarreġ sabiex jidentifika l-leżjonijiet kliniċi għal eżami kliniku sabiex jistabbilixxi jekk it-taħlita ta' dawn l-effetti jiġġustifikax terminazzjoni bikrija tal-istudju. Il-gradi ta' reazzjoni okulari (konġuntivi, kornea u iris) għandhom jinkisbu u jiġu rreġistrati wara siegħa, 24, 48 u 72 siegħa wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (Tabella 1). L-annimali li ma jiżviluppawx leżjonijiet okulari jistgħu jiġu terminati mhux aktar qabel 3 ijiem wara l-instillazzjoni. L-annimali b'leżjonijiet okulari li mhumiex severi għandhom ikunu osservati sakemm ifiqu l-leżjonijiet, jew għal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun terminat. L-osservazzjonijiet għandhom isiru u jiġu rreġistrati f'tal-inqas siegħa, 24 siegħa, 48 siegħa, 72 siegħa, 7 ijiem, 14-il jum, u 21 jum sabiex jiġi stabbilit l-istatus tal-leżjonijiet, u r-reversibilità jew l-irreversibilità tagħhom. Għandhom isiru osservazzjonijiet iktar frekwenti jekk ikun hemm bżonn sabiex jiġi stabbilit jekk l-annimal tat-test għandux jiġi ewtanizzat minħabba kunsiderazzjonijiet umanitarji jew jitneħħiex mill-istudju minħabba riżultati negattivi

Il-gradi tal-leżjonijiet okulari (Tabella 1) għandhom jiġu rreġistrati f'kull eżami. Kwalunkwe leżjoni oħra fl-għajn (eż. pannu korneali, tilwin, bidliet fil-kompatiment anterjuri) jew effett sistemiku avvers għandhom jiġu rrapportati wkoll.

L-eżami tar-reazzjonijiet jista' jkun iffaċilitat bl-użu tal-loupe binokulari, lampa tal-ferq tal-id, bijomikroskopju, jew xi apparat xieraq ieħor. Wara r-reġistrazzjoni tal-osservazzjonijiet wara 24 siegħa, l-għajnejn jistgħu jerġgħu jiġu eżaminati bl-għajnuna tal-fluworexxeina.

L-iggradar tar-risponsi okulari huwa neċċessarjament suġġettiv. Sabiex tkun imħeġġa l-armonizzazzjoni fl-iggradar tar-rispons okulari u sabiex ikunu megħjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fit-twettiq tall-osservazzjonijiet u tal-interpretazzjoni tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet irid ikun imħarreġ b'mod adegwat fis-sistema tal-punteġġ użata.

DEJTA U RAPPORTAR

Evalwazzjoni tar-riżultati

Il-klassifikazzjonijiet tal-irritazzjoni okulari għandhom jiġu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-leżjonijiet, u r-reversibilità jew in-nuqqas ta' reversibilità tagħhom. Il-klassifikazzjonijiet individwali ma jirrapreżentawx standard assolut għall-proprjetajiet irritanti ta' sustanza kimika, minħabba li jiġu evalwati effetti oħrajn tas-sustanza kimika tat-test ukoll. Minflok, il-klassifikazzjonijiet individwali għandhom jitqiesu bħala valuri ta' referenza u jagħmlu sens biss meta jkunu sostnuti b'deskrizzjoni sħiħa u evalwazzjoni tal-osservazzjonijiet kollha.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Interpretazzjoni tar-riżultati

L-estrapolazzjoni tar-riżultati tal-istudji dwar l-irritazzjoni tal-għajn fl-annimali tal-laboratorju għall-bnedmin hija valida biss sa ċertu punt limitat. F'ħafna każijiet, il-fenek albino huwa iktar sensittiv mill-bnedmin għal irritanti jew korrużivi okulari.

Għandha tingħata attenzjoni għall-interpretazzjoni tad-dejta sabiex tkun eskluża irritazzjoni li tirriżulta minn infezzjoni sekondarja.

TAGĦRIF

Tabella 1

L-iggradar tal-leżjonijiet okulari

SUPPLIMENT GĦALL-METODU TA' TTESTJAR B.5  (4)

STRATEĠIJA TA' TTESTJAR SEKWENZALI GĦALL-IRRITAZZJONI U L-KORRUŻJONI TAL-GĦAJNEJN).

Kunsiderazzjonijiet ġenerali

Fl-interessi ta' xjenza valida u t-trattament xieraq tal-annimali, huwa importanti li jkun evitat l-użu bla bżonn tal-annimali, u li jitnaqqas l-ittestjar li aktarx li jipproduċi risponsi severi fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza kimika relatata mal-potenzal tagħha ta' irritazzjoni/korrużjoni okulari għandha tkun evalwata qabel ma jiġi kkunsidrat l-ittestjar in vivo. Jaf diġà jkun hemm biżżejjed evidenza sabiex sustanza kimika tat-test tkun tista' tiġi kklassifikata fir-rigward tal-potenzjal tagħha ta' irritazzjoni jew korrużjoni tal-għajnejn mingħajr il-ħtieġa li jsiru testijiet fuq annimali tal-laboratorju. Għalhekk, l-użu ta' analiżi tal-piż tal-evidenza u strateġija ta' ttestjar sekwenzjali sejjer inaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo, speċjalment jekk is-sustanza kimika aktarx li tipproduċi risponsi severi.

Huwa rakkommandat li tintuża analiżi tal-piż tal-evidenza għall-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti li tappartjeni għas-sustanzi ta' irritazzjoni u korrużjoni tal-għajnejn u sabiex jiġi stabbilit jekk għandhomx isiru studji addizzjonali, apparti minn studji in vivo fuq l-għajnejn, sabiex jgħinu fil-karatterizzazzjoni tat-tali potenzjal. Meta jkunu meħtieġa aktar studji, huwa rakkommandat li tintuża l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali sabiex tiġi żviluppata d-dejta sperimentali rilevanti. Għal sustanzi li ma jkollhom l-ebda storja ta' ttestjar, għandha tintuża l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali sabiex tiġi żviluppata d-dejta meħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korrużjoni/irritazzjoni tagħhom għall-għajnejn. L-istrateġija ta' ttestjar inizjali deskritta f'dan is-Suppliment ġiet żviluppata f'sessjoni ta' ħidma tal-OECD (1). Imbagħad kompliet tiġi kkonfermata u elaborata fis-Sistema ta' Klassifikazzjoni Integrata Armonizzata għall-Effetti fuq is-Saħħa tal-Bniedem u l-Ambjent tas-Sustanzi Kimiċi, kif approvata mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat dwar is-Sustanzi Kimiċi u l-Grupp ta' Ħidma dwar is-Sustanzi Kimiċi, f'Novembru 1998 (2), u aġġornata minn grupp ta' esperti tal-OECD fl-2011.

Għad li din l-istrateġija ta' ttestjar mhijiex parti integrata mill-metodu ta' ttestjar B.5, tesprimi l-approċċ rakkomandat għad-determinazzjoni tal-proprjetajiet ta' irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn. Dan l-approċċ jirrappreżenta kemm l-aħjar prattika kif ukoll il-parametru referenzjarju etiku għall-ittestjar in vivo għall-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn. Il-metodu ta' ttestjar jipprovdi gwida għat-twettieq tat-test in vivo u jiġbor fih il-fatturi li għandhom ikunu indirizzati qabel ma jkun ikkunsidrat tali test. L-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali tipprovdi approċċ tal-piż tal-evidenza għall-evalwazzjoni ta' dejta eżistenti dwar il-proprjetajiet ta' irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn tas-sustanzi kimiċi u approċċ sekwenzjali għall-ġenerazzjoni tad-dejta rilevanti dwar sustanzi li dwarhom hemm bżonn li jsiru studji addizzjonali jew li dwarhom ma sar l-ebda studju. L-istrateġija l-ewwel tinkludi t-twettiq ta' testijiet in vitro jew ex vivo vvalidati u aċċettati u mbagħad ta' studji TM B.4 f'ċirkustanzi speċifiċi (3) (4).

Deskrizzjoni tal-istrateġija ta' ttestjar gradwali

Qabel ma jitwettqu t-testijiet bħala parti mill-istrateġija ta' ttestjar sekwenżjali (Figura), l-informazzjoni kollha disponibbli għandha tkun evalwata sabiex jiġi stabbilit hemmx bżonn li jsir ittestjar in vivo fuq l-għajnejn. Għalkemm tista' tinkiseb informazzjoni sinifikanti mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (eż. pH estrema), għandha tiġi vvalutata l-informazzjoni kollha eżistenti. Id-dejta rilevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza kimika inkwistjoni, u tal-analogi strutturali tagħha, għandha tiġi evalutata fit-teħid tad-deċiżjoni tal-piż tal-evidenza, u għandu jiġi ppreżentat ir-raġunar wara d-deċiżjoni. L-enfasi ewlenija għandha tinxteħet fuq dejta eżistenti dwar il-bniedem u l-annimali rigward is-sustanza kimika, segwita mill-eżitu tal-ittestjar in vitro jew ex vivo. Studji in vivo ta' sustanzi kimiċi korrużivi għandhom ikunu evitati, kull meta dan ikun possibbli. Il-fatturi meqjusa għall-istrateġija tat-testijiet jinkludu:

STRATEĠIJA GĦALL-ITTESTJAR U L-EVELWAZZJONI TA' IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TAL-GĦAJNEJN

TAGĦRIF

(3)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.10 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.10   Test In Vitro Ta' Aberrazzjoni Kromożomika Fil-Mammiferi

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 473 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).

L-iskop tat-test in vitro ta' aberrazzjoni kromożomika huwa li jidentifika s-sustanzi kimiċi li jikkawżaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali f'kulturi ta' ċelloli tal-mammiferi (2) (3) (4). L-aberrazzjonijiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomiċi jew kromatidi. Tista' sseħħ piloplojdija (inkluża endoreduplikazzjoni) f'assaġġi tal-aberrazzjoni kromożomika in vitro. Filwaqt li l-anewġeni jistgħu jinduċu l-poliplojdija, il-poliplojdija waħedha ma tindikax potenzjal anewġeniku u tista' tindika sempliċi perturbazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli jew ċitotossiċità (5). It-test mhuwiex imfassal sabiex ikejjel l-anewplojdija. Sabiex jiġi verifikat hemmx anewplojdija, ikun rakkomandat test in vitro tal-mikronukleu (6).

It-test in vitro ta' aberrazzjoni kromożomika jista' juża kulturi ta' linji ta' ċelloli stabbiliti jew kulturi ta' ċelloli primarji ta' oriġini mill-bniedem jew minn rodituri. Iċ-ċelloli użati għandhom jintgħażlu fuq il-bażi tal-abilità ta' tkabbir fil-kultura, l-istabilità tal-karjotip (inkluż in-numru ta' kromożomi) u l-frekwenza spontanja tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi (7). Bħalissa, id-dejta disponibbli ma tippermettix li jinħarġu rakkomandazzjonijiet assoluti iżda tissuġġerixxi li, meta jiġu evalwati l-perikli kimiċi, huwa importanti li jiġu kkunsidrati l-istatus p53, l-istabilità ġenetika (karjotip), il-kapaċità ta' tiswija tad-DNA u l-oriġini (minn rodituri jew mill-bniedem) taċ-ċelloli magħżulin għall-ittestjar. Għalhekk, dawk li jużaw dan il-metodu ta' ttestjar huma mħeġġin jikkunsidraw l-influwenza ta' dawn il-karatteristiċi u karatteristiċi oħrajn taċ-ċelloli fuq il-prestazzjoni ta' linja ta' ċelloli fis-sejbien tal-induzzjoni ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi, peress li l-għarfien dejjem qiegħed jiżdied f'dan il-qasam.

Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

It-testijiet li jsiru in vitro ġeneralment jirrekjedu l-użu ta' sors eżoġeniku ta' attivazzjoni metabolika sakemm iċ-ċelloli ma jkunux metabolikament kompetenti fir-rigward tas-sustanzi kimiċi tat-test. Is-sistema eżoġena ta' attivazzjoni metabolika ma timitax għalkollox il-kundizzjonijiet in vivo. Wieħed għandu joqgħod attent li jevita kundizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati pożittivi artifiċjali, jiġifieri ħsara fil-kromożomi mhux ikkaġunata minn interazzjoni diretta bejn is-sustanzi kimiċi tat-test u l-kromożomi; tali kundizzjonijiet jinkludu bidliet fil-pH jew l-ożmolalità (8) (9) (10), interazzjoni ma' komponenti medji (11) (12) jew livelli eċċessivi ta' ċitotossiċità (13) (14) (15) (16).

Dan it-test jintuża sabiex jaqbad aberrazzjonijiet kromożomiċi li jistgħu jirriżultaw minn avvenimenti klastoġeniċi. L-analiżi ta' induzzjoni ta' aberrazzjoni kromożomika għandha ssir bl-użu ta' ċelloli fil-metafażi. Għalhekk, huwa essenzjali li ċ-ċelloli għandhom jiksbu l-mitożi kemm f'kulturi ttrattati kif ukoll f'dawk mhux ittrattati. Għal nanomaterjali manifatturati, jaf ikun hemm bżonn li jsiru adattamenti speċifiċi ta' dan il-metodu ta' ttestjar li ma jkunux deskritti fih.

Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Il-kulturi ta' ċelloli ta' oriġini umana jew minn mammiferi oħrajn huma esposti għas-sustanza kimika tat-test kemm b'sors eżoġenu ta' attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr dan is-sors sakemm ma jintużawx ċelloli b'kapaċità metabolizzanti adegwata (ara l-paragrafu 13). F'intervalli prestabbiliti kif xieraq wara li l-kulturi ta' ċelloli jibdew jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test, dawn jiġu ttrattati b'inibitur tal-metafażi (eż. kolċemid jew kolċisina), miġbur u mlewwen, u ċ-ċelloli tal-metafażi jiġu analizzati bil-mikroskopju għall-preżenza ta' aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u tat-tip kromożomiku

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Ċelloli

Tista' tintuża firxa ta' linji ta' ċelloli (eż. Ovarji tal-Hamster Ċiniż (CHO), pulmun tal-Hamster Ċiniż V79, Pulmun tal-Hamster Ċiniż (CHL)/IU, TK6) jew kulturi ta' ċelloli primarji, inklużi linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem jew ta' mammiferi oħrajn (7). L-għażla tal-linji ta' ċelloli għandha tkun iġġustifikata xjentifikament. Meta jintużaw ċelloli prmiarji, għal raġunijiet ta' trattament xieraq tal-annimali, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' ċelloli primarji ta' oriġini umana meta dan ikun fattibbli u dawn għandhom jiġu kampjunati skont il-prinċipji u r-regolamenti etiċi umani. Il-linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem għandhom jinkisbu mingħand individwi żgħażagħ (madwar 18-35 sena) li ma jpejpux u li ma għandhom ebda marda magħrufa jew li ma kinux esposti riċentement għal aġenti ġenotossiċi (eż. sustanzi kimiċi, radjazzjonijiet jonizzanti) f'livelli li jżidu l-inċidenza ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi. Dan jiżgura li l-inċidenza ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi tibqa' baxxa u konsistenti. L-inċidenza bażi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi tiżdied mal-età, u din it-tendenza hija iktar evidenti fin-nisa milli fl-irġiel (17) (18). Jekk jinġabru flimkien ċelloli mingħand iktar minn donatur wieħed, għandu jiġi speċifikat l-għadd ta' donaturi. Hemm bżonn li jintwera li ċ-ċelloli nqasmu sa mill-bidu nett tat-trattament bis-sustanza kimika tat-test sal-kampjunar taċ-ċelloli. Il-kulturi taċ-ċelloli jinżammu f'fażi ta' tkabbir taċ-ċelloli esponenzjali (linji ta' ċelloli) jew jiġu stimolati sabiex jinqasmu (kulturi primarji ta' linfoċiti), sabiex jesponu ċ-ċelloli fi stadji differenti taċ-ċiklu taċ-ċelloli, peress li jaf ma tkunx magħrufa s-sensittività tal-istadji taċ-ċelloli għas-sustanzi kimiċi. Iċ-ċelloli primarji li jeħtieġu stimolazzjoni b'aġenti mitoġeniċi sabiex jinqasmu ġeneralment ma jibqgħux sinkronizzati matul l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test (eż. linfoċiti umani wara stimolazzjoni mitoġenika ta' 48 siegħa). L-użu ta' ċelloli sinkronizzati matul it-trattament mhuwiex rakkomandat, iżda jista' jkun aċċettabbli jekk ikun iġġustifikat.

Il-kundizzjonijiet tal-media tal-kultura

Għandhom jintużaw kundizzjonijiet xierqa tal-media tal-kultura u tal-inkubazzjoni (reċipjenti tal-kultura, atmosfera umidifikata ta' 5 % CO2 jekk xieraq, temperatura ta' inkubazzjoni ta' 37 °C) għaż-żamma tal-kulturi. Il-linji ta' ċelloli għandhom jiġu verifikati b'mod regolari għall-istabilità tal-għadd ta' kromożomi modali u l-assenza ta' kontaminazzjoni tal-Mikoplażma (7) (19), u ċ-ċelloli ma għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati jew jekk jinbidel l-għadd ta' kromożomi modali. It-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli tal-linji ta' ċelloli jew il-kulturi prmiarji użati fil-laboratorju tat-testijiet għandu jkun stabbilit u konsistenti mal-karatteristiċi taċ-ċelloli ppubblikati (20).

Preparazzjoni tal-kulturi

Linji ta' ċelloli: iċ-ċelloli huma propagati minn kulturi omm, imqegħdin fil-medium tal-kultura f'densità b'tali mod li ċ-ċelloli f'sospensjonijiet jew f'monosaffi jibqgħu jikbru b'mod esponenzjali sal-ħin tal-ġbir (eż. għandha tiġi evitata konfluwenza għal ċelloli li jikbru f'monosaffi).

Linfoċiti: demm sħiħ ittrattat b'antikoagulant (eż. eparina) jew linfoċiti separati jiġu kulturati (eż. għal 48 siegħa għal linfoċiti umani) fil-preżenza ta' mitoġenu [eż. fitoemagglutinina (PHA) għal linfoċiti umani] sabiex tiġi indotta diviżjoni taċ-ċelloli qabel l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test.

Attivazzjoni metabolika

Għandhom jintużaw sistemi metabolizzanti eżoġeni meta jintużaw ċelloli b'kapaċità metabolika endoġena inadegwata. L-iktar sistema użata spiss li hija l-ewwel rakkomandata, sakemm ma jkunx stipulat b'mod ieħor, hija frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata minn kofatturi (S9) imħejjija mill-fwied ta' rodituri (ġeneralment firien) ittrattati b'indutturi enzimatiċi bħal Aroclor 1254 (21) (22) (23) jew taħlita ta' fenobarbital u β-naftoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). Din it-taħlita msemmija l-aħħar ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta' Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes (30) u ntwera li hija effettiva daqs Aroclor 1254 għall-induzzjoni ta' ossidażijiet b'funzjoni mħallta (24) (25) (26) (28). Il-frazzjoni S9 normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1 sa 2 % (v/v) iżda tista' tiżdied sa 10 % (v/v) fil-medium tat-test finali. L-użu ta' prodotti li jnaqqsu l-indiċi mitotiku, speċjalment prodotti ta' kumplessazzjoni tal-kalċju (31) għandu jiġi evitat matul it-trattament. L-għażla tat-tip u l-konċentrazzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena jew induttur metaboliku użati tista' tkun influwenzata mill-klassi tas-sustanzi kimiċi li jiġu ttestjati.

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jiġu ppreparati f'solventi xierqa u jiġu dilwiti, jekk dan ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 23). Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistema tat-test u/jew jiġu dilwiti qabel it-trattament tas-sistema tat-test. Is-sustanzi kimiċi gassużi jew volatili tat-test għandhom jiġu ttestjati b'modifiki xierqa fil-protokolli standard, bħat-trattament f'reċipjenti tal-kultura ssiġillati (32) (33) (34). Il-preparamenti tas-sustanza kimika tat-test għandhom isiru eżatt qabel it-trattament, sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin.

Kundizzjonijiet tat-test

Solventi

Is-solvent għandu jingħażel sabiex tiġi ottimizzata s-solubilità tas-sustanza kimika tat-test mingħajr ma jitħalla impatt avvers fuq it-twettiq tal-assaġġ, eż. bidla fit-tkabbir taċ-ċelloli, effett fuq l-integrità tas-sustanza kimika tat-test, reazzjoni ma' reċipjenti tal-kultura, indeboliment tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Huwa rakkomandat li, kull meta dan ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent milwiem (jew medium tal-kultura). Pereżempju, fost is-solventi ferm stabbiliti hemm l-ilma jew is-sulfossidu tad-dimetil. Ġeneralment, is-solventi organiċi ma għandhomx jaqbżu l-1 % (v/v) u s-solventi milwiema (salina jew ilma) ma għandhomx jaqbżu l-10 % (v/v) fil-medium tat-trattament finali. Jekk jintużaw solventi mhux ferm stabbiliti (eż. etanol jew aċeton), l-użu tagħhom għandu jkun sostnut minn dejta li tindika l-kompatibilità tagħhom mas-sustanzi kimiċi tat-test, is-sistema tat-test u n-nuqqas tagħhom ta' tossiċità ġenetika fil-konċentrazzjoni użata. Fin-nuqqas ta' dik id-dejta ta' sostenn, importanti li jiġu inklużi kontrolli mhux ittrattati (ara l-Appendiċi 1) sabiex jintwera li s-solvent magħżul ma jinduċi ebda effett dannuż jew klastoġeniku.

Il-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità u l-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-trattament

Meta wieħed jistabbilixxi l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, għandhom jiġu evitati konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva (ara l-paragrafu 22), il-preċipitazzjoni fil-medium tal-kultura (ara l-paragrafu 23), jew bidliet ċari fil-pH jew ożmolalità (ara l-paragrafu 5). Jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna bidla ċara fil-pH tal-medium fi żmien iż-żieda, il-pH tista' tiġi aġġustata bl-ibbaferjar tal-medium tat-trattament finali sabiex jiġu evitati riżultati pożittivi artifattwali u sabiex jinżammu l-kundizzjonijiet xierqa tal-kultura.

Il-kejliet tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jsiru sabiex ikun żgurat li biżżejjed ċelloli ttrattati jkunu jilħqu l-fażi tal-mitożi waqt it-test u li t-trattamenti jsiru fil-livelli xierqa ta' ċitotossiċità (ara l-paragrafi 18 u 22). Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi stabbilita b'attivazzjoni metabolika u mingħajr fl-esperiment ewlieni bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' mewt u tkabbir taċ-ċelloli. Filwaqt li l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità f'test inizjali tista' tkun siewja sabiex jiġu definiti aħjar il-konċentrazzjonijiet li sejrin jintużaw fl-esperiment ewlieni, test inizjali mhuwiex obbligatorju. Jekk isir, ma għandux isir minflok il-kejl taċ-ċitotossiċità fl-esperiment ewlieni.

L-Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) jew iż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) huma metodi xierqa għall-valutazzjoni taċ-ċitotossiċità f'testijiet ċitoġenetiċi (13) (15) (35) (36) (55) (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli). Fil-każ ta' trattament fit-tul u ħinijiet tal-kampjunar wara l-bidu tat-trattament li jkunu itwal minn darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali (jiġifieri itwal minn 3 darbiet it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli b'kollox), l-RPD jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità (37). F'dawn iċ-ċirkustanzi, l-RICC tista' tipprovdi kejl aħjar jew inkella l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità wara darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali tkun stima siewja bl-użu tal-RPD.

Għal linfoċiti f'kulturi primarji, filwaqt li l-indiċi mitotiku (MI) huwa kejl tal-effetti ċitotossiċi/ċitostatiċi, huwa influwenzat mill-ħin li jitkejjel fih wara t-trattament, il-mitoġenu użat u t-tkissir taċ-ċiklu ċellulari possibbli. Madankollu, l-MI huwa aċċettabbli għaliex kejliet oħrajn taċ-ċitotossiċità jistgħu jkunu diffiċli u imprattiċi u jaf ma jkunux japplikaw għall-popolazzjoni fil-mira ta' linfoċiti li jikbru bħala tweġiba għall-istimolazzjoni tal-PHA.

Filwaqt li l-RICC u l-RPD għal-linji ta' ċelloli u l-MI għall-kultura primarja ta' linfoċiti huma l-parametri rakkomandati taċ-ċitotossiċità, indikaturi oħrajn (eż. l-integrità taċ-ċelloli, l-apoptożi, in-nekrożi, iċ-ċiklu taċ-ċelloli) jistgħu jipprovdu informazzjoni addizzjonali siewja.

Għandhom jiġu evalwati tal-inqas tliet konċentrazzjonijiet tat-test (mhux inklużi l-kontroll tas-solvent u pożittivi) li jissodisfaw il-kriterji ta' aċċettabilità (iċ-ċitotossiċità xierqa, in-numru ta' ċelloli, eċċ.). Ikun xi jkun it-tip taċ-ċelloli (linji ta' ċelloli jew kulturi primarji ta' linfoċiti), jistgħu jintużaw kulturi rreplikati jew kulturi uniċi ttrattati f'kull konċentrazzjoni ttestjata. Filwaqt li l-użu ta' kulturi duplikati huwa rakkomandat, kulturi uniċi huma aċċettabbli wkoll diment li jingħata punteġġ lill-istess numru totali ta' ċelloli għal kulturi uniċi jew kulturi duplikati. L-użu ta' kulturi waħedhom huwa ta' rilevanza partikolari meta jiġu vvalutati iktar minn 3 konċentrazzjonijiet (ara l-paragrafu 31). Ir-riżultati miksubin fil-kulturi rreplikati indipendenti f'konċentrazzjoni partikolari jistgħu jinġabru flimkien għall-analiżi tad-dejta (38). Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru tossiċità baxxa jew ebda tossiċità, intervalli tal-konċentrazzjoni ta' madwar id-doppju jew it-tripplu normalment ikunu xierqa. Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet tat-test magħżulin għandhom ikopru firxa minn dik iċ-ċitotossiċità produttiva kif spjegat fil-paragrafu 22 u jinkludu konċentrazzjonijiet li fihom ikun hemm ċitotossiċità moderata u baxxa jew ebda ċitotossiċità. Ħafna sustanzi kimiċi tat-test juru kurvi konċentrazzjoni rispons wiqfin u, sabiex tinkiseb dejta f'ċitotossiċità baxxa u moderata jew sabiex tiġi studjata r-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons f'dettall, sejjer ikun hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjoni spazjati iktar qrib xulxin u/jew iktar minn tliet konċentrazzjonijiet (kulturi waħedhom jew repliki), speċjalment f'sitwazzjonijiet li fihom ikun hemm bżonn li jsir esperiment ripetut (ara l-paragrafu 47).

Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tikseb ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % bl-użu tal-parametri rakkomandati dwar iċ-ċitotossiċità (jiġifieri tnaqqis fl-RICC u l-RPD għal linji ta' ċelloli u tnaqqis fl-MI għal kulturi primarji ta' linfoċiti għal 45± 5 % tal-kontroll negattiv parallel). Wieħed għandu joqgħod attent meta jinterpreta riżultati pożittivi li mbagħad jistgħu jinstabu li huma fil-parti superjuri ta' din il-firxa ta' ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % (13).

Għal sustanzi kimiċi tat-test ftit li xejn solubbli li mhumiex ċitotossiċi f'konċentrazzjonijiet inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, l-ogħla konċentrazzjoni analizzata għandha tipproduċi turbidità jew preċipitat viżibbli bl-għajnejn jew bl-għajnuna ta' mikroskopju invertit fi tmiem it-test bis-sustanza kimika tat-test. Anki jekk iċ-ċitotossiċità sseħħ f'livelli inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, huwa rakkomandat li l-ittestjar isir f'konċentrazzjoni waħda biss li tipproduċi turbidità jew bi preċipitat viżibbli għaliex jistgħu jirriżultaw effetti artifattwali mill-preċipitat. Fil-konċentrazzjoni li tipproduċi preċipitat, għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi żgurat li l-preċipitat ma jxekkilx it-twettiq tat-test (eż. tilwin jew punteġġar). Id-determinazzjoni tas-solubilità fil-medium tal-kultura qabel l-esperiment tista' tkun utli.

Jekk ma jiġu osservati ebda preċipitat jew ċitotossiċità li tillimita, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun tikkorrispondi għal 10 mM, 2 mg/ml jew 2 μl/ml, liema minnhom tkun l-inqas (39) (40) (41). Meta s-sustanza kimika tat-test ma jkollhiex kompożizzjoni definita, eż. sustanza b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, il-prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew il-materjal bijoloġiku (UVCB) (42), estratt ambjentali eċċ, il-konċentrazzjoni massima jaf trid tkun ogħla (eż. 5 mg/ml), fin-nuqqas ta' ċitotossiċità suffiċjenti, sabiex tiżdied il-konċentrazzjoni ta' kull wieħed mill-komponenti. Madankollu, ta' min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (43).

Kontrolli

Għal kull ħin tal-ġbir għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 15), li jikkonsistu f'solvent waħdu fil-medium tat-trattament u ttrattat bl-istess mod bħall-kulturi tat-trattament.

Kontrolli pożittivi paralleli huma meħtieġa sabiex juru l-ħila tal-laboratorju fl-identifikazzjoni ta' klastoġeni fil-kundizzjonijiet tal-protokoll tat-test użat u l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena, meta applikabbli. Fit-Tabella 1 ta' hawn taħt jingħataw xi eżempji ta' kontrolli pożittivi. Jistgħu jintużaw sustanzi kimiċi ta' kontroll pożittiv oħrajn, jekk ikunu ġġustifikati. Peress li t-testijiet in vitro taċ-ċelloli tal-mammiferi huma standardizzati biżżejjed, l-użu tal-kontrolli pożittivi jista' jkun limitat għal klastoġenu li jeħtieġ attivazzjoni metabolika. Diment li dan isir fl-istess ħin mat-test mhux attivat bl-użu tal-istess durata tat-trattament, ir-rispons tal-kontroll pożittiv uniku sejjer juri kemm l-attività tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika u kemm hija risponsiva s-sistema tat-test. Madankollu, trattament fit-tul (mingħajr S9) għandu jkollu l-kontroll pożittiv tiegħu stess peress li d-durata tat-trattament sejra tvarja mit-test bl-użu tal-attivazzjoni metabolika. Kull kontroll pożittiv għandu jintuża f'konċentrazzjoni waħda jew iktar mistennija li toffri żidiet riproduċibbli u identifikabbli fuq l-isfond sabiex tintwera s-sensittività tas-sistema tat-test (jiġifieri l-effetti huma ċari iżda ma jikxfux minnufih l-identità tal-lametti kodifikati lill-qarrej), u r-rispons ma għandux ikun f'riskju minħabba ċitotossiċità li taqbeż il-limiti speċifikati fil-metodu ta' ttestjar.

Tabella 1.

Sustanzi kimiċi ta' referenza rakkomandati għall-valutazzjoni tal-għarfien tal-laboratorju u għall-għażla tal-kontrolli pożittivi.

PROĊEDURA

Trattament bis-sustanza kimika tat-test

Ċelloli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika.

Żmien il-ġbir tal-kulturi

Għal evalwazzjoni dettaljata, li tkun meħtieġa sabiex jiġi konkluż eżitu negattiv, għandhom isiru t-tliet kundizzjonijiet sperimentali kollha kemm huma li ġejjin bl-użu ta' trattament fuq terminu qasir b'attivazzjoni metabolika u mingħajrha u trattament fit-tul mingħajr attivazzjoni metabolika (ara l-paragrafi 43, 44 u 45):

F'każ li xi waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali ta' hawn fuq twassa għal rispons pożittiv, jaf ma jkunx hemm bżonn li jiġi investigat xi wieħed mir-reġimi tat-trattament l-oħrajn.

Preparazzjoni tal-kromożomi

Il-kulturi taċ-ċelloli jiġu ttrattati b'kolċemid jew kolċisina normalment għal siegħa sa tliet sigħat qabel il-ġbir. Kull kultura ta' ċelloli tinġabar u tiġi proċessata separatament għall-preparazzjoni tal-kromożomi. Il-preparazzjoni tal-kromożomi tinvolvi t-trattament ipotoniku taċ-ċelloli, il-fissazzjoni u t-tilwin. Fil-monosaffi, iċ-ċelloli mitotiċi (identifikabbli għaliex huma tondi u maqlugħin mill-wiċċ) jistgħu jkunu preżenti fl-aħħar tat-trattament ta' bejn 3 u 6 sigħat. Minħabba li dawn iċ-ċelloli mitotiċi jistgħu jinqalgħu faċilment, jistgħu jintilfu meta jitneħħa l-medium li jkun fih is-sustanza kimika tat-test. Jekk hemm evidenza ta' żieda sostanzjali fin-numru ta' ċelloli mitotiċi meta mqabbla mal-kontrolli, xi ħaġa li tindika inibizzjoni mitotika, iċ-ċelloli għandhom jinġabru b'ċentrifugazzjoni u jiżdiedu lura mal-kulturi, sabiex jiġi evitat milli jintilfu ċelloli li huma f'mitożi, u f'riskju ta' aberrazzjoni kromożomika, f'ħin il-ġbir.

Analiżi

Il-lametti kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel ma ssir analiżi mikroskopika għal aberrazzjonijiet kromożomiċi. Billi l-proċeduri ta' fissazzjoni spiss jirriżultaw fi proporzjon ta' ċelloli fil-metafażi li tilfu kromożomi, iċ-ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru modali +/– 2.

Tal-inqas 300 metafażi mifruxin sew għandhom jingħaddu għal kull konċentrazzjoni u kontroll sabiex jiġi konkluż li sustanza kimika tat-test hija negattiva biċ-ċar (ara l-paragrafu 45). It-300 ċellola għandhom ikunu maqsumin indaqs bejn ir-repliki, meta jintużaw kulturi rreplikati. Meta jintużaw kulturi waħedhom għal kull konċentrazzjoni (ara l-paragafu 21), għandhom jingħaddu tal-inqas 300 metafażi mifruxin sew f'din il-kultura waħedha. L-għadd ta' 300 ċellola għandu l-vantaġġ li jżid is-saħħa statistika tat-test u, barra minn hekk, rari jiġu osservati valuri żero (mistennijin li jkunu 5 % biss) (44). In-numru ta' metafażijiet magħdudin jista' jitnaqqas meta jiġu osservati numri kbar ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi u s-sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva b'mod ċar.

Għandhom jingħaddu ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomiċi strutturali, li jinkludu u jeskludu distakki. Il-ksur u d-distakki huma definiti fl-Appendiċi 1 skont (45) (46). Aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku għandhom jiġu rreġistrati għalihom u jiġu kklassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Il-proċeduri li jintużaw fil-laboratorju għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġin sew fl-għoti ta' punteġġi u huma evalwati bejn il-pari, jekk xieraq.

Għalkemm l-għan tat-test huwa li jinkixfu aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, huwa importanti li wieħed jirreġistra l-frekwenzi tal-poliplojdija u l-endoreduplikazzjoni meta jseħħu dawn l-avvenimenti. (Ara l-paragrafu 2).

Il-profiċjenza tal-laboratorju

Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza bit-test qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun għamel sensiela ta' esperimenti b'sustanzi kimiċi pożittivi ta' referenza li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi differenti u bosta kontrolli negattivi (bl-użu ta' bosta solventi/veikoli). Dawn ir-risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv reazzjonijiet għandhom ikunu konsistenti mat-tagħrif. Dan mhuwiex applikabbli għal laboratorju li għandhom esperjernza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafu 37.

Għandha tiġi investigata firxa ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (ara t-Tabella 1 fil-paragrafu 26) bi trattamenti qosra u twal fin-nuqqas ta' attivazzjoni metabolika, u anki bi trattament qasir fil-preżenza ta' attivazzjoni metabolika, sabiex tintwera l-ħila li jinqabdu sustanzi kimiċi klastoġeniċi u tiġi stabbilita l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Għandha tingħażel medda ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi magħżulin sabiex jingħataw żidiet riproduċibbli u marbutin mal-konċentrazzjoni fuq l-isfond sabiex jintwerew is-sensittività u l-firxa dinamika tas-sistema tat-test.

Dejta storika tal-kontroll

Il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni (44) (47). Id-database storika tal-kontrolli negattivi tal-laboratorju għall-ewwel għandha tinbena b'minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment tkun tikkonsisti f'tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (48)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom (44). Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (47).

Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-konsistenza tagħha mad-databases tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll.

Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi minn kultura waħedha jew is-somma tal-kulturi rreplikati kif deskritti fil-paragrafu 21. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (44) (47). Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 37) u evidenza ta' nuqqas ta' żball tekniku jew uman.

DEJTA U RAPPORTAR

Preżentazzjoni tar-riżultati

Il-perċentwal ta' ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomika strutturali għandu jiġi evalwat. L-aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku kklassifikat skont is-sottotipi (ksur, skambji) għandhom jiġu elenkati b'mod separat bin-numri u l-frekwenzi tagħhom għall-kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Id-distakki jiġu rreġistrati u rrapportati separatament u ma jiddaħħlux fil-frekwenza ta' aberrazzjonijiet totali. Il-perċentwal ta' poliplojdija u/jew ċelloli endoreduplikati jiġi rrapportat meta jiġi osservat.

Għandhom jiġu rreġistrati l-miżuri paralleli ta' ċitotossiċità għall-kulturi tal-kontroll ittrattat, negattiv u pożittiv kollha fl-esperiment(i) tal-aberrazzjonijiet ewlenin.

Għandha tiġi pprovduta dejta dwar il-kultura individwali. Barra minn hekk, id-dejta kollha għandha tinġabar taħt forma ta' tabella.

Kriterji ta' Aċċettabilità

L-aċċettazzjoni ta' test hija bbażata fuq il-kriterji li ġejjin:

Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk, fi kwalunkwe waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali analizzati (ara l-paragrafu 28):

Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f'ċelloli kulturati tal-mammiferi f'din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (49) (50) (51).

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali analizzati kollha (ara l-paragrafu 28):

Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f'ċelloli kulturati tal-mammiferi f'din is-sistema tat-test.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.

F'każ li r-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar kif spjegat hawn fuq jew sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat, id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri. L-ikklassifikar ta' ċelloli addizzjonali (fejn xieraq) jew it-twettiq ta' esperiment ripetut possibilment bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment (eż. spazjar tal-konċentrazzjonijiet, kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika oħrajn (jiġifieri konċentrazzjoni S9 jew oriġini S9)) jista' jkun siewi.

F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta' dejta sejjer jipprekludi l-ħruġ ta' konklużjoni ta' riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, ir-rispons tas-sustanza kimika tat-test sejjer jiġi konkluż bħala ekwivoku.

Żieda fin-numru ta' ċelloli poliplojdi tista' tindika li s-sustanzi kimiċi tat-test għandhom il-potenzjal li jinibixxu l-proċessi mitotiċi u jwasslu aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi (52). Żieda fin-numru ta' ċelloli bi kromożżomi endoreduplikati tista' tindika li s-sustanzi kimiċi tat-test għandhom il-potenzjal li jinibixxu l-progress taċ-ċiklu taċ-ċelloli (53) (54) (ara l-paragrafu 2). Għaldaqstant, l-inċidenza ta' ċelloli poliplojdi u ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandha tiġi rreġistrata b'mod separat.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

TAGĦRIF

(4)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.11 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.11   Test Tal-Aberrazzjoni Fil-Kromożomi Tal-Mudullun Tal-Mammiferi

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 475 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).

It-test in vivo tal-aberrazzjoni fil-kromożomi tal-mudullun tal-mammiferi huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għad li jvarja bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetiċi u l-proċessi ta' tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-risponsi. Assaġġ in vivo huwa siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro.

It-test in vivo ta' aberrazzjoni kromożomika fil-mammiferi jintuża sabiex jinstabu aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali indotti mis-sustanzi kimiċi tat-test fiċ-ċelloli tal-mudullun tal-annimali, normalment rodituri (2) (3) (4) (5). L-aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomiċi jew kromatidi. Filwaqt li l-maġġoranza ta' aberrazzjonijiet ġenotossiċi indotti bis-sustanzi kimiċi huma tat-tip kromatid, jistgħu jseħħu aberrazzjonijiet tat-tip kromożomiku wkoll. Il-ħsara kromożomika u l-avvenimenti relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm evidenza sostanzjali li, meta dawn il-leżjonijiet u l-avvenimenti relatati jikkaġunaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri, dawn ikunu involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u sistemi sperimentali. Tista' sseħħ piloplojdija (inkluża endoreduplikazzjoni) f'assaġġi tal-aberrazzjoni kromożomika in vivo. Madankollu, żieda fil-poliplojdija waħedha ma tindikax potenzjal anewġeniku u tista' tindika sempliċi perturbazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli jew ċitotossiċità. It-test mhuwiex imfassal sabiex ikejjel l-anewplojdija. Test in vivo tal-mikronukleu fl-eritroċiti mammiferi (Kapitolu B.12 ta' dan l-Anness) jew it-test in vitro tal-mikronukleu taċ-ċelloli tal-mammiferi (Kapitolu B.49 ta' dan l-Anness) ikunu t-testijiet in vivo u in vitro, rispettivament, rakkomandati għas-sejbien ta' anewplojdija.

Id-definizzjonijiet tat-terminoloġija użata huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

F'dan it-test spiss jintużaw rodituri, iżda f'ċerti każijiet jista' jkun hemm speċijiet oħrajn li jkunu xierqa, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament. Il-mudullun huwa t-tessut fil-mira ta' dan it-test, peress li huwa tessut ferm vaskularizzat u fih popolazzjoni ta' ċelluli b'ċiklu rapidu li jistgħu jkunu faċilment iżolati u pproċessati. Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex firien u ġrieden. Jekk jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri, huwa rakkomandat li l-kejl tal-aberrazzjoni kromożomika tal-mudullun jiġi integrat f'test xieraq ieħor tat-tossiċità.

Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, mhumiex sejrin jilħqu t-tessut fil-mira, jaf ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.

Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR

L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa ta' esponiment u jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju fi żmien xieraq wara t-trattament. Qabel l-ewtanażija, l-annimali jiġu ttrattati b'inibitur tal-metafażi (eż. kolċisina jew kolċemid). Imbagħad isiru preparazzjonijiet tal-kromożomi miċ-ċelloli tal-mudullun u dawn jitlewnu, u ċ-ċelluli fil-metafażi jiġu analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi.

VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU

Investigazzjonijiet tal-Profiċjenza

Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza fit-twettiq tal-assaġġ qabel ma jintuża għal testijiet ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun wera li għandu l-ħila li jirriproduċi r-riżultati mistennijin mid-dejta ppubblikata (eż. (6)) għal frekwenzi ta' aberrazzjonijiet kromożomatiċi b'tal-inqas żewġ sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin indotti minn dożi baxxi ta' kontrolli pożittivi), bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u b'kontrolli tal-veikolu/solvent kompatibbli (ara l-paragrafu 22). Dawn l-esperimenti għandhom jużaw dożi li jagħtu żidiet riproduċibbli u relatati mad-dożi u juru s-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test fit-tessut ta' interess (il-mudullun) u jużaw il-metodu tal-punteġġ li sejjer jitħaddem fil-laboratorju. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 10-14.

Dejta Storika tal-Kontroll

Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni. Id-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju għandha tkun statistikament robusta sabiex tiġi żgurata l-ħila tal-laboratorju sabiex jivvaluta d-distribuzzjoni tad-dejta tal-kontroll negattiv tiegħu. It-tagħrif jissuġġerixxi li jista' jkun hemm bżonn ta' minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment ikun hemm tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (7)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (8).

Meta l-laboratorju ma jagħmilx numru kbir biżżejjed ta' esperimenti sabiex jistabbilixxi distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 11) matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza (deskritti fil-paragrafu 9), jista' jiġi aċċettat li d-distribuzzjoni tinbena matul l-ewwel testijiet ta' rutina. Dan l-approċċ għandu jsegwi r-rakkomandazzjonijiet stipulati fit-tagħrif (8) u r-riżultati tal-kontroll negattiv miksubin f'dawn l-esperimenti għandhom jibqgħu konsistenti mad-dejta ppubblikata tal-kontroll negattiv.

Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-impatt tagħha fuq kemm id-dejta li tirriżulta tibqa' konsistenti mad-database storika eżistenti tal-kontroll tal-laboratorju. Inkonsistenzi kbar biss għandhom jirriżultaw fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll, fejn il-ġudizzju tal-esperti jistabbilixxi li tvarja mid-distribuzzjoni ta' qabel (ara l-paragrafu 11). Matul l-istabbiliment mill-ġdid, jaf ma jkunx hemm bżonn ta' database sħiħa tal-kontroll negattiv sabiex ikun jista' jsir test propju, diment li l-laboratorju jkun jista' juri li l-valuri tal-kontroll negattiv parallel tiegħu jibqgħu konsistenti mad-database ta' qabel jew mad-dejta ppubblikata korrispondenti.

Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza tal-aberrazzjoni kromożomika strutturali (esklużi d-distakki) f'kull annimal. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 11) u ebda evidenza ta' żball tekniku jew uman.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Għażla ta' speċi tal-annimali

Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom. Il-firien jintużaw l-iktar spiss, għad li l-ġrieden jistgħu jkunu adattati wkoll. Tista' tintuża kwalunkwe speċi ta' mammiferi xierqa oħra, jekk tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika fir-rapport.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali

Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li, idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, għandha tkun tal-inqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa f'gaġġa) tal-istess sess u grupp tat-trattament jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f'gaġeġ solidi mal-art bl-arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika.

Preparazzjoni tal-annimali

Normalment jintużaw annimali adulti żgħar b'saħħithom (għal rodituri, idealment 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll), u dawn jiġu assenjati b'mod aleatorju għall-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b'mod uniku bl-użu ta' metodu umanitarju u l-inqas invasiv possibbli (eż. b'ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b'titqib fil-widnejn jew fis-swaba') u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.

Preparazzjoni tad-dożi

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.

Solvent/veikolu

Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użati, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta' solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetilċelluloża, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda aberrazzjoni strutturali jew effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll tas-solvent/veikolu.

Kontrolli

Kontrolli pożittivi

Normalment għandu jkun inkluż grupp ta' annimali ttrattati b'sustanza kimika tal-kontroll pożittiv ma' kull test. Dan jista' jiġi rrinunzjat meta l-laboratorju tal-ittestjar ikollu profiċjenza murija fit-twettiq tat-test u jkun stabbilixxa medda storika tal-kontroll pożittiv. Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv parallel inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin) għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fl-ikklassifikar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta' referenza xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b'mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar) fil-laboratorju fejn isir it-test; pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.

Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b'mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fuq il-livell spontanju. Id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv jingħata b'rotta differenti mis-sustanza kimika tat-test, bl-użu ta' skeda tat-trattament differenti, u li l-kampjunar iseħħ biss f'waqt partikolari biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi, meta xieraq. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.

Tabella 1

Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv

Kontrolli negattivi

L-annimali tal-grupp tal-kontroll negattiv għandhom ikunu inklużi f'kull ħin tal-kampjunar u l-bqija jiġu mmaniġġjati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, ħlief li ma jirċivux trattament bis-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent/veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi dan is-solvent/il-veikolu. Madankollu, jekk jintwera li hemm varjabbiltà konsistenti bejn l-annimali u frekwenzi ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet strutturali permezz ta' dejta storika tal-kontroll negattiv f'kull waqt tal-kampjunar għal-laboratorju tal-ittestjar, jaf ikun hemm bżonn ta' kampjunar wieħed biss għall-kontroll negattiv. Meta jintuża kampjunar wieħed għall-kontrolli negattivi, għandu jkun l-ewwel waqt tal-kampjun użat fl-istudju.

PROĊEDURA

In-numru u s-sess tal-annimali

B'mod ġenerali, ir-rispons tal-mikronukleu huwa simili bejn l-annimali rġiel u nisa (9) u mhuwiex mistenni li dan sejjer iseħħ ukoll għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali; għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess. Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, it-tossiċità tal-mudullun, eċċ. inkluż, eż. studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.

Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp. Fejn l-esponiment umana għas-sustanzi kimiċi tista' tkun speċifika għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju fil-mudullun f'żewġ waqtiet tal-kampjunar bi tliet gruppi tad-doża u grupp tal-kontroll negattiv parallel, flimkien ma' grupp tal-kontroll pożittiv (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ 45 annimal.

Livelli tad-doża

Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa diġà disponibbli sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni (10). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li sejra tiġi tollerata mingħajr evidenza ta' tossiċità li tillimita l-istudju, b'rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, billi tiġi indotta dipressjoni tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika), iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (11).

L-ogħla doża tista' tiġi definita wkoll bħala doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità għall-mudullun.

Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara trattament fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.

Sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-inqas tliet livelli ta' dożi ġeneralment separati b'fattur ta' 2, iżda mhux ikbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-dejta eżistenti, l-ogħla doża għal amministrazzjoni waħda għandha tkun ta' 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (il-mudullun) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.

Test tal-limitu

Jekk l-esperimenti għat-tiftix tal-medda, jew dejta eżistenti minn razez ta' annimali relatati, jindikaw li reġim tat-trattament ta' tal-inqas id-doża limitu (deskritta hawn taħt) ma jipproduċi ebda effett tossiku osservabbli (inkluż ebda dipressjoni tal-proliferazzjoni tal-mudullun jew evidenza oħra ta' ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' studji in vitro tal-ġenotossiċità jew dejta minn sustanzi kimiċi relatati strutturalment, f'dak il-każ jaf ma jitqiesx neċessarju li jsir studju sħiħ li juża tliet livelli tad-doża, diment li jkun intwera li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tilħaq it-tessut fil-mira (il-mudullun). F'dawn il-każijiet, livell tad-doża wieħed, fid-doża limitu, jista' jkun biżżejjed. Għal perjodu ta' amministrazzjoni ta' > 14-il jum, id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.

Amministrazzjoni tad-dożi

Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta intiża ta' esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta' dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 33-34). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw massimu ta' 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan għandu jkun iġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment jipproduċu effetti aggravati f'konċentrazzjonijiet ikbar, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandu jitnaqqas kemm jista' jkun billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiġi żgurata amministrazzjoni ta' volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.

Skeda tat-trattament

Normalment is-sustanzi kimiċi tat-test jingħataw bħala trattament wieħed, iżda jistgħu jingħataw bħala doża maqsuma (jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, jew meta s-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ jew tmiem l-esponiment.

Ftit li xejn hemm dejta disponibbli dwar l-adegwatezza ta' protokoll ta' doża ripetuta għal dan it-test. Madankollu, fiċ-ċirkustanzi li fihom ikun xieraq li jiġi integrat dan it-test b'test dwar it-tossiċità b'doża ripetuta, wieħed għandu joqgħod attent li jevita milli jintilfu ċelloli mitotiċi bi ħsara fil-kromożomi, xi ħaġa li tista' sseħħ b'dożi tossiċi. Integrazzjoni bħal din tkun aċċettabbli meta l-ogħla doża tkun ikbar jew daqs id-doża limitu (ara l-paragrafu 29) u grupp tad-doża jingħata d-doża limitu għad-durata tal-perjodu tat-trattament. It-test tal-mikronukleu (il-metodu ta' ttestjar B.12) għandu jitqies bħala t-test in vivo tal-għażla għal aberrazzjonijiet kromożomiċi meta tkun mixtieqa integrazzjoni ma' studji oħrajn.

Għandhom jittieħdu kampjuni tal-mudullun f'żewġ ħinijiet separati wara trattamenti uniċi. Għal rodituri, l-ewwel intervall ta' kampjunar għandu jkun il-ħin neċessarju sabiex jgħaddu darba u nofs it-tul taċ-ċiklu normali taċ-ċelloli (b'dan tal-aħħar li normalment ikun 12-18-il siegħa wara l-perjodu tat-trattament). Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test kif ukoll l-effetti tagħha fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-ċelloli jistgħu jaffettwaw il-ħin ottimali sabiex wieħed jintebaħ bl-aberrazzjoni kromożomika, huwa rakkomandat li jittieħed kampjun ieħor 24 siegħa wara li jkun ittieħed l-ewwel kampjun. Fl-ewwel ħin tal-kampjunar, il-gruppi kollha tad-doża għandhom jiġu ttrattati u jinġabru kampjuni għall-analiżi; madankollu, fil-ħin(ijiet) tal-kampjunar iktar tard, l-ogħla doża biss trid tingħata. Jekk jintużaw reġimi tad-dożi ta' iktar minn ġurnata fuq il-bażi ta' ġustifikazzjoni xjentifika, ġeneralment għandu jintuża ħin tal-kampjunar wieħed sa madwar darba u nofs it-tul taċ-ċiklu normali taċ-ċelloli wara t-trattament finali.

Wara t-trattament u qabel il-ġbir tal-kampjun, l-annimali jingħataw injezzjoni intraperitoneali b'doża xierqa ta' inibitur tal-metafażi (eż. kolċemid jew kolċisina), u l-kampjuni jinġabru f'intervall xieraq wara. Għall-ġrieden, dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 qabel il-ġbir u, għall-firien, huwa sagħtejn sa 5 sigħat. Iċ-ċelloli jinġabru mill-mudullun u jitkabbru, jiġu ffissati u mlewna, u analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi (12).

Osservazzjonijiet

Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta' dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b'doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-inqas ġimgħa, il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-inqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (11).

Esponiment tat-tessut fil-mira

Għandu jittieħed kampjun tad-demm f'ħin(ijiet) xieraq sabiex ikunu jistgħu jiġu mixtarra l-livelli ta' plażma tas-sustanzi kimiċi tat-test bil-għan li jintwera li seħħet l-esponiment tal-mudullun, meta dan ikun iġġustifikat u meta ma jkunx hemm dejta oħra dwar l-esponiment (ara l-paragrafu 44).

Preparazzjoni tal-mudullun u tal-kromożomi

Eżatt wara l-ewtanażja umanitarja, jittieħdu ċelloli tal-mudullun mill-femori jew mit-tibji tal-annimali, imbagħad dawn jiġu esposti għal soluzzjoni ipotonika u jiġu ffissati. Imbagħad iċ-ċelloli fil-metafażi jitferrxu fuq lametti u jiġu mlewnin billi jintużaw metodi stabbiliti (ara (3) (12)).

Analiżi

Il-lametti kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel l-analiżi u għandhom jitqassmu b'mod aleatorju sabiex min jaqrahom ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament.

L-indiċi mitotiku għandu jiġi stabbilit bħala miżura ta' ċitotossiċita f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal għal kull annimal trattat għall-annimali ttrattati (inklużi kontrolli pożittivi), mhux ittrattati jew l-annimali tal-kontroll negattiv tal-veikolu/solvent kollha.

Għandhom jiġu analizzati tal-inqas 200 metafażi għal kull annimal għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, inklużi u esklużi distakki (6). Madankollu, jekk id-database storika tal-kontroll negattiv tindika li l-frekwenza medja ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali hija <1 % fil-laboratorju tal-ittestjar, għandu jiġi kkunsidrat l-ikklassifiar ta' ċelloli addizzjonali. Aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku għandhom jiġu rreġistrati għalihom u jiġu kklassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Il-proċeduri li jintużaw fil-laboratorju għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġin sew fl-għoti ta' punteġġi u huma evalwati bejn il-pari, jekk xieraq. Fid-dawl tal-fatt li l-proċeduri ta' preparazzjoni tal-lametti spiss jirriżultaw fil-ksur ta' sehem mill-metafażijiet li jirriżulta fit-telf ta' kromożomi, iċ-ċelloli li jingħataw punteġġ għandu jkun fihom għadd ta' ċentromeri ta' mhux inqas minn 2n±2, fejn n hija n-numru aplojdi ta' kromożomi għal dik l-ispeċi.

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. L-indiċi mitotiku, l-għadd ta' ċelloli tal-metafażi li ngħataw punteġġ, in-numru ta' aberrazzjonijiet għal kull ċellola fil-metafażi u l-perċentwal ta' ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomika strutturali għandhom jiġu evalwati għal kull annimal. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Id-distakki, kif ukoll iċ-ċelloli poliplojdi u ċ-ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandhom jiġu rreġistrati b'mod separat. Il-frekwenza tad-distakki tiġi rrapportata iżda, ġeneralment, ma tkunx inkluża fl-analiżi tal-frekwenza totali ta' aberrazzjonijiet strutturali. Jekk ma hemmx evidenza ta' differenza fir-rispons bejn is-sessi, id-dejta tista' tingħaqad f'daqqa għall-analiżi statistika. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità tal-annimali u s-sinjali kliniċi wkoll.

Kriterji ta' Aċċettabilità

Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabilità tat-test:

Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:

Jekk l-ogħla doża biss tiġi eżaminata f'mument tal-kampjunar partikolari, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel u r-riżultati jaqgħu barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson). Ir-rakkomandazzjonijiet għall-metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (13). Meta ssir analiżi tar-rispons għad-doża, għandhom jiġu analizzati tal-inqas tliet gruppi tad-doża. It-testijiet statistiċi għandhom jużaw l-annimal bħala l-unità sperimentali. Ir-riżultati pożittivi fit-test għall-aberrazzjonijiet kromożomiċi jindikaw li s-sustanza kimika tat-test tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mudullun tal-ispeċi ttestjata.

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:

Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (13). Evidenza ta' esponiment tal-mudullun għal sustanza kimika tat-test tista' tinkludi dipressjoni tal-indiċi mitotiku jew kejl tal-livelli ta' plażma jew tad-demm tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test. Fil-każ ta' amministrazzjoni fil-vina, ma hemmx bżonn ta' evidenza ta' esponiment. Inkella, tista' tintuża dejta ADME, miksuba fi studju indipendenti bl-użu tal-istess rotta u l-istess speċi, sabiex jintwera li seħħ esponiment tal-mudullun. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, fil-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza kimika tat-test ma tinduċix aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mudullun tal-ispeċi ttestjata.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.

F'każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat (eż. żieda batuta jew limitata), id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri tal-esperimenti eżistenti mwettqin. F'ċerti każijiet, l-analiżi ta' iktar ċelloli jew it-twettiq ta' esperiment ripetut bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment jistgħu jkunu siewja.

F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, id-dejta sejra tipprekludi konklużjoni li s-sustanza kimika tat-test tipproduċi riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku.

Il-frekwenzi ta' metafażijiet endoreduplikati u poliplojdi fost il-metafażijiet totali għandhom jiġu rreġistrati b'mod separat. Żieda fin-numru ta' ċelloli poliplojdi/endoreduplikati tista' tindika li s-sustanza kimika tat-test għandha l-potenzjal li tinibixxi l-proċessi mitotiċi jew il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 3).

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sommarju

TAGĦRIF

(5)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.12 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.12   Test Tal-Mikronukleu Fl-Eritroċiti Mammiferi

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 474 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).

It-test in vivo tal-mikronukleu tal-mammiferi huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għad li jvarja bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetiċi u l-proċessi ta' tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-risponsi. Assaġġ in vivo huwa siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro.

It-test in vivo tal-mikronukleu tal-mammiferi jintuża għall-qbid ta' ħsara indotta mis-sustanza kimika tat-test fil-kromożomi jew l-apparat mitotiku tal-eritroblasti. It-test jevalwa l-formulazzjoni tal-mikronukleu fl-eritroċiti tal-kampjun jew fil-mudullun jew fiċ-ċelloli tad-demm periferali tal-annimali, normalment rodituri.

L-għan tat-test tal-mikronukleu huwa li jidentifika sustanzi kimiċi li jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mikronukleji li jkun fihom biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.

Meta eritroblast tal-mudullun jiżviluppa f'eritroċita immatura (kultant imsejħa wkoll retikuloċita jew eritroċita polikromatika), in-nukleu ewlieni jiġi estruż; kwalunkwe mikronukleu li ġie fformat jista' jitħalla fiċ-ċitoplażma. Il-viżwalizzazzjoni jew id-detezzjoni tal-mikronukleji hija ffaċilitata f'dawn iċ-ċelloli għax ma għandhomx nukleu ewlieni. Żieda fil-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati f'annimali ttrattati hija indikazzjoni ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jew numeriċi indotti.

Eritroċiti mikronukleati fformati ġodda jiġu identifikati u kkwantifikati bit-tilwin segwit minn punteġġar viżwali bl-użu ta' mikroskopju, jew b'analiżi awtomatizzata. L-għadd ta' biżżejjed eritroċiti immaturi fid-demm periferali jew fil-mudullun ta' annimali adulti huwa ffaċilitat ħafna bl-użu ta' pjattaforma tal-punteġġar awtomatizzata. Dawn il-pjattaformi huma alternattivi aċċettabbli għall-evalwazzjoni manwali (2). Studji komparattivi wrew li t-tali metodi, li jużaw standards tal-kalibraġġ xierqa, jistgħu jipprovdu riproduċibbilità u sensittività aħjar bejn il-laboratorji u fi ħdan il-laboratorji mill-ikklassifikar manwali bil-mikroskopju (3) (4). Sistemi awtomatizzati li jistgħu jkejlu l-frekwenzi tal-eritroċiti mikronukleati jinkludu, iżda mhumiex limitati għal, ċitometri tal-fluss (5), pjattaformi tal-analiżi tal-immaġnijiet (6) (7), u ċitometri ta' skennjar bil-laser (8).

Għad li dan normalment ma jsirx bħala parti mit-test, il-frammenti tal-kromożomi jistgħu jiġu distinti minn kromożomi sħaħ permezz ta' għadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal-preżenza jew l-assenza ta' kinetoċoru jew DNA ċentometriku, li t-tnejn li huma huma karatteristiċi ta' kromożomi intatti. L-assenza ta' kinetoċoru jew DNA ċentometriku tindika li l-mikronukleu fih biss frammenti ta' kromożomi, filwaqt li l-preżenza tindika telf ta' kromożomi.

Id-definizzjonijiet tat-terminoloġija użata huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Il-mudullun ta' rodituri adulti żgħar huwa t-tessut fil-mira għal ħsara ġenetika fit-test peress li l-eritroċiti huma prodotti f'dan it-tessut. Il-kejl tal-mikronukleji f'eritroċiti immaturi fid-demm periferali huwa aċċettabbli fi speċijiet mammiferi oħrajn li għalihom intweriet sensittività adegwata għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jikkaġunaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jew numeriċi f'dawn iċ-ċelloli (b'induzzjoni tal-mikronukleji f'eritroċiti immaturi) u ġiet ipprovduta ġustifikazzjoni xjentifika. Il-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati hija l-punt ta' tmiem ewlieni. Il-frekwenza tal-eritroċiti maturi li fihom mikronukleji fid-demm periferali tista' tintuża wkoll bħala punt ta' tmiem fi speċijiet mingħajr selezzjoni splenika b'saħħitha kontra ċelloli mikronukleati u meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal perjodu li jaqbeż it-tul tal-ħajja tal-eritroċita fl-ispeċijiet użati (eż. 4 ġimgħat jew iktar fil-ġurdien).

Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, mhumiex sejrin jilħqu t-tessut fil-mira, jaf ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.

Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR

L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa. Jekk jintuża l-mudullun, l-annimali jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju f'ħin(ijiet) xieraq wara t-trattament, il-mudullun jiġi estratt, u jsiru l-preparazzjonijiet u t-tilwin (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Meta jintuża demm periferali, id-demm jinġabar f'ħinijiet xierqa wara t-trattament u jsiru l-preparazzjonijiet u t-tilwin (12) (16) (17) (18). Meta t-trattament jingħata b'mod akut, importanti li jingħażlu l-ħinijiet tal-ġbir tal-mudullun jew tad-demm li fihom tista' tiġi identifikata l-induzzjoni relatata mat-trattament ta' eritroċiti immaturi mikronukleati. Fil-każ ta' kampjunar tad-demm periferali, irid ikun għadda wkoll biżżejjed żmien sabiex dawn l-avvenimenti jidhru fid-demm li jiċċirkola. Il-preparati jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji, jew b'viżwalizzazzjoni bl-użu ta' mikroskopju, analiżi tal-immaġnijiet, iċ-ċitometrija tal-fluss, jew b'ċitometrija ta' skennjar bil-laser.

VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU

Investigazzjonijiet tal-Profiċjenza

Sabiex jiġi stabbilit li hemm biżżejjed esperjenza fit-twettiq tal-assaġġ qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun wera li għandu l-ħila li jirriproduċi r-riżultati mistennijin mid-dejta ppubblikata (17) (19) (20) (21) (22) għall-frekwenzi tal-mikronukleu b'tal-inqas żewġ sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin indotti minn dożi baxxi ta' kontrolli pożittivi), bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u b'kontrolli tal-veikolu/solvent kompatibbli (ara l-paragrafu 26). Dawn l-esperimenti għandhom jużaw dożi li jagħtu żidiet riproduċibbli u relatati mad-dożi u juru s-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test fit-tessut ta' interess (il-mudullun jew id-demm periferali) u jużaw il-metodu tal-punteġġ li sejjer jitħaddem fil-laboratorju. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 14-18.

Dejta Storika tal-Kontroll

Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni. Id-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju għandha tkun statistikament robusta sabiex tiġi żgurata l-ħila tal-laboratorju sabiex jivvaluta d-distribuzzjoni tad-dejta tal-kontroll negattiv tiegħu. It-tagħrif jissuġġerixxi li jista' jkun hemm bżonn ta' minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment ikun hemm tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (23)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (24).

Meta l-laboratorju ma jagħmilx numru kbir biżżejjed ta' esperimenti sabiex jistabbilixxi distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 15) matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza (deskritti fil-paragrafu 13), jista' jiġi aċċettat li d-distribuzzjoni tinbena matul l-ewwel testijiet ta' rutina. Dan l-approċċ għandu jsegwi r-rakkomandazzjonijiet stipulati fit-tagħrif (24) u r-riżultati tal-kontroll negattiv miksubin f'dawn l-esperimenti għandhom jibqgħu konsistenti mad-dejta ppubblikata tal-kontroll negattiv.

Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-impatt tagħha fuq kemm id-dejta li tirriżulta tibqa' konsistenti mad-database storika eżistenti tal-kontroll tal-laboratorju. Inkonsistenzi kbar biss għandhom jirriżultaw fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll, fejn il-ġudizzju tal-esperti jistabbilixxi li tvarja mid-distribuzzjoni ta' qabel (ara l-paragrafu 15). Matul l-istabbiliment mill-ġdid, jaf ma jkunx hemm bżonn ta' database sħiħa tal-kontroll negattiv sabiex ikun jista' jsir test propju, diment li l-laboratorju jkun jista' juri li l-valuri tal-kontroll negattiv parallel tiegħu jibqgħu konsistenti mad-database ta' qabel jew mad-dejta ppubblikata korrispondenti.

Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza eritroċiti immaturi mikronukleati f'kull annimal. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 15) u ebda evidenza ta' żball tekniku jew uman.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Għażla ta' speċi tal-annimali

Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom. Jistgħu jintużaw ġrieden, firien jew speċijiet mammiferi xierqa oħrajn. Meta jintuża demm periferali, irid jiġi stabbilit li t-tneħħija splenika ta' ċelloli mikronukleati miċ-ċirkulazzjoni ma tqegħidx f'riskju d-detezzjoni ta' mikronukleji indotti fl-ispeċi magħżula. Dan intwera biċ-ċar għad-demm periferali tal-ġrieden u l-firien (2). Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex firien u ġrieden. Jekk jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri, huwa rakkomandat li l-kejl tal-mikronukleji indotti jiġi integrat f'test xieraq ieħor tat-tossiċità.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali

Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li, idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, għandha tkun tal-inqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa f'gaġġa) tal-istess sess u grupp tat-trattament jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f'gaġeġ solidi mal-art bl-arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika.

Preparazzjoni tal-annimali

Normalment jintużaw annimali adulti żgħar b'saħħithom (għal rodituri, idealment 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll), u dawn jiġu assenjati b'mod aleatorju għall-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b'mod uniku bl-użu ta' metodu umanitarju u l-inqas invasiv possibbli (eż. b'ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b'titqib fil-widnejn jew fis-swaba') u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.

Preparazzjoni tad-dożi

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.

Kundizzjonijiet tat-test

Solvent/veikolu

Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli tad-doża użati, u ma għandux ikun kapaċi li joħloq reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta' solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetilċelluloża, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda mikronukleu u effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll tas-solvent/veikolu.

Kontrolli

Kontrolli pożittivi

Normalment għandu jkun inkluż grupp ta' annimali ttrattati b'sustanza kimika tal-kontroll pożittiv ma' kull test. Dan jista' jiġi rrinunzjat meta l-laboratorju tal-ittestjar ikollu profiċjenza murija fit-twettiq tat-test u jkun stabbilixxa medda storika tal-kontroll pożittiv. Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv parallel inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin jew kampjuni ta' sospensjoni taċ-ċelloli, kif ikun xieraq għall-metodu tal-punteġġar) għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fil-punteġġar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta' referenza xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b'mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar); pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.

Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b'mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenza tal-mikronukleji fuq il-livell spontanju. Meta ssir klassifikazzjoni manwali bil-mikroskopju, id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv jingħata b'rotta differenti mis-sustanza kimika tat-test, bl-użu ta' skeda tat-trattament differenti, u li l-kampjunar iseħħ biss f'waqt partikolari biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi, meta xieraq. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.

Tabella 1

Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.

Sustanzi Kimiċi u CASRN

Metansulfonat tal-etil [CASRN 62-50-0]

Metansulfonat tal-metil [CASRN 66-27-3]

Nitrosurea tal-etil [CASRN 759-73-9]

Mitomiċina C [CASRN 50-07-7]

Ċiklofosfamida (monoidrat) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietilenmelamina [CASRN 51-18-3]

Kolċisina [CASRN 64-86-8] jew Vinblastina [CASRN 865-21-4] — bħal anewġeni

Kontrolli negattivi

L-annimali tal-grupp tal-kontroll negattiv għandhom ikunu inklużi f'kull ħin tal-kampjunar u l-bqija jiġu mmaniġġjati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, ħlief li ma jirċivux trattament bis-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent/veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi dan is-solvent/il-veikolu. Madankollu, jekk jintwera li hemm varjabbiltà konsistenti bejn l-annimali u frekwenzi ta' ċelloli b'mikronukleji permezz ta' dejta storika tal-kontroll negattiv f'kull waqt tal-kampjunar għal-laboratorju tal-ittestjar, jaf ikun hemm bżonn ta' kampjunar wieħed biss għall-kontroll negattiv. Meta jintuża kampjunar wieħed għall-kontrolli negattivi, għandu jkun l-ewwel waqt tal-kampjun użat fl-istudju.

Jekk jintuża demm periferali, kampjun ta' qabel it-trattament jista' jiġi aċċettat minflok kontroll negattiv parallel għal studji fuq terminu qasir meta d-dejta li tirriżulta tkun konsistenti mad-database storika tal-kontroll għal-laboratorju tal-ittestjar. Intwera li għall-firien, il-kampjunar ta' volumi żgħar (eż. taħt il-100 μl/jum) qabel it-trattament għandu impatt minimu fuq il-frekwenza tal-isfond tal-mikronukleji (25).

PROĊEDURA

In-numru u s-sess tal-annimali

B'mod ġenerali, ir-rispons tal-mikronukleu huwa simili bejn l-annimali rġiel u, għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess (26). Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, it-tossiċità tal-mudullun, eċċ. inkluż, eż. fi studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.

Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp. Fejn l-esponiment uman għas-sustanzi kimiċi jista' jkun speċifiku għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju fil-mudullun imwettaq skont il-parametri stabbiliti fil-paragrafu 37 bi tliet gruppi tad-doża u kontrolli negattivi u pożittivi paralleli (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ bejn 25 u 35 annimal.

Livelli tad-doża

Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa diġà disponibbli sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni (27). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li sejra tiġi tollerata mingħajr evidenza ta' tossiċità li tillimita l-istudju, b'rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, billi tiġi indotta dipressjoni tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika, iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (28)).

L-ogħla doża tista' tiġi identifikata wkoll bħala doża li tipproduċi tossiċità fil-mudullun (eż. tnaqqis fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali fil-mudullun jew id-demm periferali ta' iktar minn 50 %, iżda mhux għal inqas minn 20 % tal-valur tal-kontroll). Madankollu, meta jiġu analizzati ċ-ċelloli pożittivi għas-CD71 fiċ-ċirkulazzjoni tad-demm periferali (jiġifieri biċ-ċitometrija tal-fluss), din il-frazzjoni bikrija ħafna ta' eritroċiti immaturi twieġeb għall-isfidi tossiċi iktar malajr mill-koorti ikbar pożittiva għall-RNA ta' eritroċiti immaturi. Għaldaqstant, it-tossiċità ikbar tista' ssir evidenti f'disinni tal-esponiment akut li jeżaminaw il-frazzjoni ta' eritroċiti immaturi pożittivi għas-CD71 meta mqabbla ma' dawk li jidentifikaw eritroċiti immaturi fuq il-bażi tal-kontenut tal-RNA. Għal din ir-raġuni, meta l-esperimenti jużaw ħamest ijiem tat-trattament jew inqas, l-ogħla livell tad-doża għas-sustanzi kimiċi tat-test li jikkaġunaw tossiċità jista' jiġi definit bħala d-doża li tikkaġuna tnaqqis statistikament sinifikanti fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi pożittivi għas-D71 fost l-eritroċiti totali iżda mhux inqas minn 5 % tal-valur tal-kontroll (29).

Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara għoti fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.

Sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-inqas tliet livelli ta' dożi ġeneralment separati b'fattur ta' 2, iżda mhux ikbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-dejta eżistenti, l-ogħla doża għal perjodu ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew iktar għandha tkun ta' 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum, jew għal perjodi ta' amministrazzjoni ta' inqas minn 14-il jum, 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (il-mudullun) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.

Test tal-limitu

Jekk l-esperimenti għat-tiftix tal-medda, jew dejta eżistenti minn razez ta' annimali relatati, jindikaw li reġim tat-trattament ta' tal-inqas id-doża limitu (deskritta hawn taħt) ma jipproduċi ebda effett tossiku osservabbli (inkluż ebda dipressjoni tal-proliferazzjoni tal-mudullun jew evidenza oħra ta' ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' studji in vitro tal-ġenotossiċità jew dejta minn sustanzi kimiċi relatati strutturalment, f'dak il-każ jaf ma jitqiesx neċessarju li jsir studju sħiħ li juża tliet livelli tad-doża, diment li jkun intwera li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tilħaq it-tessut fil-mira (il-mudullun). F'dawn il-każijiet, livell tad-doża wieħed, fid-doża limitu, jista' jkun biżżejjed. Meta l-għoti jsir għal 14-il jum jew iktar, id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' għoti ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija ta' 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.

Amministrazzjoni tad-dożi

Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta intiża ta' esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta' dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 37). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw massimu ta' 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan għandu jkun iġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment jipproduċu effetti aggravati f'konċentrazzjonijiet ikbar, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandu jitnaqqas kemm jista' jkun billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiġi żgurata amministrazzjoni ta' volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.

Skeda tat-trattament

Idealment, isiru 2 trattamenti jew iktar, mogħtijin f'intervalli ta' 24 siegħa, speċjalment meta dan it-test jiġi integrat fi studji oħrajn dwar it-tossiċità. Inkella, jistgħu jingħataw trattamenti waħedhom, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament (eż. sustanzi kimiċi tat-test li jkunu magħrufin li jimblokkaw iċ-ċiklu taċ-ċelloli). Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw ukoll bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, jew meta s-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ jew tmiem l-esponiment.

It-test jista' jsir fi ġrieden jew firien b'wieħed minn dawn it-tliet modi:

Jistgħu jintużaw reġimi oħrajn tad-dożaġġ jew tal-kampjunar meta dawn ikunu rilevanti u xjentifikament iġġustifikati, u sabiex tiġi ffaċilitata l-integrazzjoni ma' testijiet oħrajn tat-tossiċità.

Osservazzjonijiet

Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta' dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b'doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-inqas ġimgħa, il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-inqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (28). F'ċerti ċirkustanzi, it-temperatura tal-ġisem tal-annimali tista' tiġi ssorveljata, peress li ipertermja u ipotermja indotti mit-trattament ġew implikati fil-produzzjoni ta' riżultati spurji (32) (33) (34).

Esponiment tat-tessut fil-mira

Għandu jittieħed kampjun tad-demm f'ħin(ijiet) xieraq sabiex ikunu jistgħu jiġu mixtarra l-livelli ta' plażma tas-sustanzi kimiċi tat-test bil-għan li jintwera li seħħet l-esponiment tal-mudullun, meta dan ikun iġġustifikat u meta ma jkunx hemm dejta oħra dwar l-esponiment (ara l-paragrafu 48).

Preparazzjoni tal-mudullun / tad-demm

Normalment iċ-ċelloli tal-mudullun jinkisbu mill-femori jew mit-tibji tal-annimali, eżatt wara l-ewtanażja umanitarja. Spiss, iċ-ċelloli jitneħħew, jitħejjew u jitlewnu bl-użu tal-metodi stabbiliti. Jistgħu jinkisbu volumi żgħar ta' demm periferali, skont l-istandards adegwati dwar it-trattament xieraq tal-annimali, jew bl-użu ta' metodu li jippermetti li l-annimal tat-test jibqa' ħaj, bħall-fsad mill-vina tad-denb jew vina xierqa oħra, jew b'titqiba kardijaka jew kampjunar minn vina kbira fil-fażi tal-ewtanażja tal-annimal. Kemm għal eritroċiti miksubin mill-mudullun kif ukoll dawk mid-demm periferali, skont il-metodu ta' analiżi, iċ-ċelloli jista' jsirilhom tilwin sopravitali minnufih (16) (17) (18), isiru l-preparazzjonijiet tal-istrixxi li mbagħad jitlewnu għall-mikroskopju, jew inkella jiġu ffissati u jitlewnu kif xieraq għall-analiżi biċ-ċitometrija tal-fluss. L-użu ta' tilwin speċifiku tad-DNA [eż. oranġjo tal-akridina (35) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)] jista' jelimina xi wħud mill-artifatti assoċjati mal-użu ta' tilwin mhux speċifiku għad-DNA. Dan il-vantaġġ ma jipprekludix l-użu ta' tilwin konvenzjonali (eż. Giemsa għall-analiżi bil-mikroskopju). Jistgħu jintużaw ukoll sistemi addizzjonali [eż. kolonni taċ-ċelluloża li jneħħu ċelloli nukleati (37) (38)] diment li jkun intwera li dawn is-sistemi huma kompatibbli mal-preparazzjoni tal-kampjun fil-laboratorju.

Meta dawn il-metodi jkunu applikabbli, jistgħu jintużaw antikorpi antikinetoċori (39), FISH b'sondi tad-DNA panċentromeriċi (40) jew tikkettar in situ mogħti primer bi primers speċifiċi għall-panċetromeri, flimkien mal-kontrotilwin xieraq tad-DNA (41), sabiex tiġi identifikata n-natura tal-mikronukleji (kromożoma/framment kromożomika) sabiex jiġi stabbilit jekk il-mekkaniżmu tal-induzzjoni tal-mikronukleu huwiex dovut għal attività klastoġenika u/jew anewġenika. Jistgħu jintużaw metodi oħrajn għal divrenzjar bejn il-klastoġeni u l-anewġeni jekk ikun intwera li dawn huma effettivi.

Analiżi (manwali u awtomatizzata)

Il-lametti jew il-kampjuni għall-analiżi kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel kull xorta ta' analiżi u għandhom jitqassmu b'mod aleatorju sabiex min jaqrahom manwalment ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament; it-tali kodifikazzjoni mhijiex neċessarja meta jintużaw sistemi ta' klassifikazzjoni awtomatizzati li ma jeħtiġux spezzjoni viżwali u li ma jistgħux jiġu affettwati minn preġudizzju tal-operatur. Il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali (immaturi + maturi) tiġi stabbilita għal kull annimal billi jingħaddu għall-inqas 500 eritroċiti għall-mudullun u 2 000 eritroċiti għad-demm periferali (42). Għandu jingħata punteġġ lil mill-inqas 4 000 eritroċiti immaturi għall-inċidenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati (43). Jekk id-database storika tal-kontroll negattiv tindika li l-frekwenza medja ta' sfond ta' eritroċiti immaturi mikronukleati hija ta' < 0.1 % fil-laboratorju tal-ittestjar, għandu jiġi kkunsidrat l-għoti ta' punteġġ lil ċelloli addizzjonali. Meta jiġu analizzati l-kampjuni, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għall-eritroċiti totali fl-annimali tat-trattament ma għandux ikun inqas minn 20 % tal-proporzjon tal-kontroll tal-veikolu/solvent meta l-punteġġar isir bil-mikroskopju u mhux inqas minn madwar 5 % tal-proporzjon tal-kontroll tal-veikolu/solvent meta l-punteġġar tal-eritroċiti immaturi tas-CD71+ isir b'metodi ċitometriċi (ara l-paragrafu 31) (29). Pereżempju, għal assaġġ tal-mudullun mogħti punteġġ bil-mikroskopju, jekk il-proporzjon tal-kontroll tal-eritroċiti immaturi fil-mudullun ikun ta' 50 %, il-limitu superjuri tat-tossiċità jkun 10 % eritroċiti immaturi.

Peress li l-milsa tal-firien taħtaf u teqred l-eritroċiti mikronukleati, sabiex tinżamm sensittività għolja tal-assaġġ meta jiġi analizzat id-demm periferali tal-firien, idealment l-analiżi tal-eritroċiti immaturi mikronukleati tiġi ristretta għall-iżgħar frazzjoni. Meta jintużaw metodi tal-analiżi awtomatizzati, dawn l-iktar eritroċiti immaturi jistgħu jiġu identifikati fuq il-bażi tal-kontenut għoli ta' RNA tagħhom, jew il-livell għoli ta' riċetturi tat-transferrina (CD71+) espress fuq il-wiċċ tagħhom (31). Madankollu, paragun dirett tal-metodi ta' tilwin differenti wera li jistgħu jinkisbu riżultati sodisfaċenti b'bosta metodi, inkluż it-tilwin konvenzjonali bl-oranġjo tal-akridina (3) (4).

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. Għal kull annimal li jiġi analizzat għandhom jiġu elenkati separatament in-numru ta' eritroċiti immaturi li jingħaddu, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, u n-numru ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali. Meta l-ġrieden jiġu ttrattati kontinwament għal 4 ġimgħat jew iktar, id-dejta dwar in-numru u l-proporzjon ta' eritroċiti maturi mikronukleati għandha tingħata wkoll jekk tinġabar. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità tal-annimali u s-sinjali kliniċi wkoll.

Kriterji ta' Aċċettabilità

Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabilità tat-test:

Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:

Jekk l-ogħla doża biss tiġi eżaminata f'mument tal-kampjunar partikolari, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel u r-riżultati jaqgħu barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson). Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (44) (45) (46) (47). Meta ssir analiżi tar-rispons għad-doża, għandhom jiġu analizzati tal-inqas tliet gruppi tad-doża. It-testijiet statistiċi għandhom jużaw l-annimal bħala l-unità sperimentali. Ir-riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li sustanza kimika tat-test tinduċi mikronukleji li huma r-riżultat ta' ħsara fil-kromożomi jew ħsara fl-apparat mitotiku fl-eritroblasti tal-ispeċi tat-test. F'każ li fih ikun sar test sabiex jinqabdu ċentromeri fi ħdan mikronukleji, sustanza kimika tat-test li tipproduċi mikronukleji li fihom ċentromeri (DNA ċentromeriku jew kinetoċoru, li jindika telf ta' kromożoma sħiħa) hija evidenza li s-sustanza kimika tat-test hija anewġen.

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:

Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (44) (45) (46) (47). Evidenza ta' esponiment tal-mudullun għal sustanza kimika tat-test tista' tinkludi dipressjoni tal-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għal maturi jew kejl tal-livelli ta' plażma jew tad-demm tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test. Fil-każ ta' għoti fil-vina, ma hemmx bżonn ta' evidenza tal-esponiment. Inkella, tista' tintuża dejta ADME, miksuba fi studju indipendenti bl-użu tal-istess rotta u l-istess speċi, sabiex jintwera li seħħ esponiment tal-mudullun. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, fil-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix mikronukleji fl-eritroċiti immaturi tal-ispeċi tat-test.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.

F'każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat (eż. żieda batuta jew limitata), id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri tal-esperimenti eżistenti mwettqin. F'ċerti każijiet, l-analiżi ta' iktar ċelloli jew it-twettiq ta' esperiment ripetut bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment jistgħu jkunu siewja.

F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, id-dejta sejra tipprekludi konklużjoni li s-sustanza kimika tat-test tipproduċi riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

TAGĦRIF

(6)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.15.

(7)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.16.

(8)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.18.

(9)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.19.

(10)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.20.

(11)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.24.

(12)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.47 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.47   Metodu tat-Test tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 437 tal-OECD (2013). Il-metodu tat-test tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini ġie evalwat mill-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), fl-2006 u l-2010 (1)(2). Fl-ewwel evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (1). Fit-tieni evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) mhux klassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (2). Id-database tal-validazzjoni tal-BCOP kien fiha 113-il sustanza u 100 taħlita b'kollox (2)(3). Minn dawn l-evalwazzjonijiet u r-reviżjoni bejn il-pari tagħhom, ġie konkluż li l-metodu ta' ttestjar jista' jidentifika kif suppost sustanzi kimiċi (kemm sustanzi kif ukoll taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1) kif ukoll dawk li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (4) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (7) u, għaldaqstant, ġie approvat bħala xjentifikament validu għal dawn iż-żewġ skopijiet. Ħsara serja lill-għajnejn hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Is-sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn huma klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU. Is-sustanzi kimiċi mhux ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn huma definiti bħala dawk li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU, jiġifieri huma msejħin bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU. Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użu rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP fuq il-bażi tal-evalwazzjonijiet tiegħu. Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni oriġinali tal-2009 u l-verżjoni aġġornata tal-2013 tal-linja gwida tat-test tal-OECD jikkonċernaw, iżda mhumiex limitati għal: l-użu tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont il-GHS tan-NU (paragrafi 2 u 7); kjarifiki fuq l-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għall-ittestjar ta' alkoħols, ketoni u solidi (paragrafi 6 u 7) u ta' sustanzi u taħlitiet (paragrafu 8); kjarifiki fuq kif għandhom jiġu testjati sustanzi tensjoattivi u taħlitiet li fihom tensjoattivi (paragrafu 28); aġġornamenti u kjarifiki dwar il-kontrolli pożittivi (paragrafi 39 u 40); aġġornament tal-kriterji dwar id-deċiżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP (paragrafu 47); aġġornament tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju (paragrafu 48); aġġornament fl-elementi tar-rapport tat-test (paragrafu 49); aġġornament tal-Appendiċi 1 dwar id-definizzjonijiet; iż-żieda tal-Appendiċi 2 tal-kapaċità ta' previżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP skont id-diversi sistemi ta' klassifikazzjoni; aġġornament tal-Appendiċi 3 fuq il-lista ta' sustanzi kimiċi tal-profiċjenza; u aġġornament tal-Appendiċi 4 dwar l-apparat fejn titqiegħed il-kornea tal-BCOP (paragrafu 1) u dwar l-opaċitometru (paragrafi 2 u 3).

Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test Draize in vivo tal-għajnejn sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta' diversi metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn (5). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (5) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Isfel għal Fuq (5) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika ma tkunx mistennija tikkaġuna biżżejjed irritazzjoni tal-għajnejn sabiex tkun teħtieġ li tiġi kklassifikata. Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u fi ħdan limitazzjonijiet speċifiċi għall-klassifikazzjoni tal-periklu għall-għajnejn u t-tikkettar ta' sustanzi kimiċi. Filwaqt li ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut awtonomu għat-test in vivo tal-għajnejn fuq il-fniek, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat bħala pass inizjali fi ħdan strateġija ta' ttestjar, bħall-approċċ minn Fuq għal Isfel issuġġerit minn Scott et al. (5) sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, mingħajr ma jsiru iktar testijiet (4). Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat ukoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mill-GHS tan-NU (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (4) fi ħdan strateġija ta' ttestjar bħall-approċċ minn Isfel għal Fuq (5). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex prevista li tikkaġuna ħsara serja lill-għajnejn jew bħala mhux klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn bil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP tkun teħtieġ iktar testijiet (in vitro u/jew in vivo) sabiex tistabbilixxi klassifikazzjoni definittiva.

L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajen kif imkejjel mill-ħila tagħha li tinduċi opaċità jew żieda fil-permeabilità f'kornea bovina iżolata. L-effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu bi: (i) trażmissjoni mnaqqsa tad-dawl (opaċità), u (ii) żieda fil-passaġġ tal-kulurant fluworexxein tas-sodju (permeabilità). Il-valutazzjonijiet tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornea wara esponiment għas-sustanza kimika tat-test jingħaqdu għall-kisba ta' Punteġġ tal-Irritazzjoni In Vitro (IVIS), li jintuża sabiex jiġi kklassifikat il-livell ta' irritazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.

Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP tal-ICCVAM (6)(7), li oriġinarjament kien żviluppat minn informazzjoni miksuba mill-Istitut għall-protokoll tax-Xjenzi in vitro (IIVS) u l-Protokoll 124 tal-INVITTOX (8). Dan tal-aħħar jirrappreżenta l-protokoll użat għall-istudju ta' prevalidazzjoni sponsorjat mill-Komunità Ewropea li sar fl-1997-1998. Dawn iż-żewġ protokolli kienu bbażati fuq il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP irrapportat għall-ewwel darba minn Gautheron et al. (9).

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn kif definiti mill-GHS tan-NU, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati taħt il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU (4). Meta jintuża għal dan il-għan, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 79 % (150/191), rata ta' foloz pożittivi ta' 25 % (32/126), rata ta' foloz negattivi ta' 14 % (9/65), meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo tal-għajnejn tal-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3) (ara l-Appendiċi 2, Tabella 1). Meta s-sustanzi kimiċi tat-test fi ħdan ċerti klassijiet ta' sustanzi kimiċi (jiġifieri alkoħols, ketoni) jew fiżiċi (jiġifieri solidi) jiġu esklużi mid-database, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 85 % (111/131), rata ta' foloz pożittivi ta' 20 % (16/81), rata ta' foloz negattivi ta' 8 % (4/50) għas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3). In-nuqqasijiet potenzjali tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' foloz pożittivi għal alkoħols u ketoni u r-rata għolja ta' foloz negattivi għal solidi osservati fid-database dwar il-validazzjoni (1)(2)(3). Madankollu, peress li mhux l-alkoħols u l-ketoni kollha huma mbassra b'mod eċċessiv mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP u wħud huma mbassrin kif suppost bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, dawn iż-żewġ gruppi funzjonali organiċi ma jitqisux li jaqgħu barra mid-dominju ta' applikabilità tal-metodu ta' ttestjar. Huwa f'idejn l-utent ta' dan il-metodu ta' ttestjar li jiddeċiedi jekk previżjoni eċċessiva possibbli ta' alkoħol jew keton tistax tiġi aċċettat jew jekk għandhomx isiru iktar testijiet f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Rigward ir-rati ta' foloz negattivi għas-solidi, ta' min jinnota li s-solidi jistgħu jwasslu għal kundizzjonijiet varjabbli u ta' esponiment estrem fit-test Draize in vivo tal-irritazzjoni tal-għajnejn, li jitsgħu jirriżultaw fi previżjonijiet irrilevanti tal-potenzjal ta' irritazzjoni veru tagħhom (10). Ta' min jinnota wkoll li l-ebda wieħed mill-foloz negattivi identifikati fid-database tal-validazzjoni tal-ICCVAM (2)(3), fil-kuntest ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), ma rriżulta f'IVIS ≤ 3, li huwa l-kriterju użat sabiex sustanza kimika tat-test tiġi identiifkata bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU. Barra minn hekk, f'dan il-kuntest il-foloz negattivi tal-BCOP mhumiex kritiċi peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jipproduċu 3 < IVIS ≤ 55 imbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn, jew bħala l-aħħar alternattiva fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Peress li ċerti sustanzi kimiċi solidi huma previsti kif suppost mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, dan l-istat fiżiku lanqas ma jitqies li ma jaqax taħt id-dominju tal-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar. L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ IVIS > 55 għandu jiġi aċċettat bħala indikatur ta' rispons inkluża ħsara serja lill-għajnejn li għandu jiġi klassifikat bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU mingħajr ma jsiru iktar testijiet. Madankollu, kif diġà ntqal, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols jew il-ketoni għandhom jiġu interpretati b'ċerta kawtela minħabba potenzjal ta' tbassir żejjed.

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4). Meta jintuża għal dan il-għan, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 69 % (135/196), rata ta' foloz pożittivi ta' 69 % (61/89), rata ta' foloz negattivi ta' 0 % (0/107), meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo tal-għajnejn tal-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3) (ara l-Appendiċi 2, Tabella 2). Ir-rata ta' foloz pożittivi miksuba (sustanzi kimiċi ta' Ebda Kategorija tal-GNS tan-NU li in vivo jipproduċi IVIS > 3, ara l-paragrafu 47) hija konsiderevolment għolja, iżda mhijiex kritika f'dan il-kuntest peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jipproduċu 3 < IVIS ≤ 55 imbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn, jew bħala l-aħħar alternattiva fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma juri ebda nuqqas speċifiku għall-ittestjar ta' alkoħols, ketoni u solidi meta l-iskop ikun li jiġu identifikati sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (3). L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ riżultat negattiv (IVIS ≤ 3) għandu jiġi aċċettat bħala indikatur li ma hemm bżonn ta' ebda klassifikazzjoni (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU). Peress li l-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jidentifika korrettament 31 % biss mis-sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, dan il-metodu ta' ttestjar ma għandux ikun l-ewwel għażla sabiex jinbeda approċċ minn Isfel għal Fuq (5), jekk ikun hemm metodi in vitro validati u aċċettati oħrajn b'sensittività għolja simili iżda speċifiċità għolja għad-dispożizzjoni.

Id-database tal-validazzjoni tal-BCOP kien fiha 113-il sustanza u 100 taħlita b'kollox (2)(3). Għaldaqstant, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jitqies applikabbli għall-ittestjar taż-żewġ sustanzi u taħlitiet.

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP mhuwiex rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2 jew Kategorija 2A tal-GHS tan-NU) jew sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala ftit irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2B tal-GHS tan-NU) minħabba n-numru konsiderevoli ta' sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU bħala sustanzi kimiċi tal-Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU u ta' Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU sovraklassifikati bħala Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU(2)(3). Għal dan il-għan, jista' jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b'metodu xieraq ieħor.

Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn bovini u korneji bovini għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali dderivati mill-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Huwa rakkomandat li jittieħdu l-prekawzjonijiet universali tal-laboratorju (11).

Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jqisx feriti konġuntivali u iridali, jindirizza l-effetti korneali, li huma kawża primarja tal-klassifikazzjoni in vivo meta titqies il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU. Ir-reversibilità tal-feriti korneali ma tistax tiġi evalwata per se fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. Ġie propost, abbażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża sabiex jiġu identifikati xi tipi ta' effetti riversibbli (12). Madankollu, hemm bżonn ta' iktar għarfien xjentifiku sabiex nifhmu kif iseħħu effetti irreversibbli mhux marbtin ma' ferita inizjali ta' livell għoli. Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jippermettix li ssir valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment okulari.

Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kull ċertu żmien iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati. Pereżempju, l-istopatoloġija tista' tkun potenzjalment siewja meta jkun hemm bżonn ta' karatterizzazzjoni iktar kompluta tal-ħsara fil-kornea. Ki spjegat fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 160 (13), dawk li jużawh huma mħeġġin jippreservaw il-kornei u jħejju kampjuni għall-istopatoloġija li jistgħu jintużaw sabiex jiġu żviluppati database u kriterji dwar id-deċiżjonijiet li jistgħu jkomplu jtejbu l-preċiżjoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment jistabbilixxi dan il-metodu ta' ttestjar, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 3. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP qabel ma jissottometti dejta tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq perjodu qasir tal-funzjoni fiżjoloġika u bijokimika normali tal-kornea tal-bovini in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza kimika tat-test tiġi vvalutata minn kejl kwantitattiv ta' bidliet fl-opaċità u l-permeabilità tal-kornea permezz ta' opaċitometru u spettrofotometru ta' dawl viżibbli, rispettivament. Iż-żewġ tipi ta' kejl jintużaw sabiex jiġi kkalkolat IVIS, li jintuża sabiex tiġi assenjata kategorija ta' klassifikazzjoni tal-periklu ta' irritazzjoni in vitro għat-tbassir tal-potenzjal ta' irritazzjoni okulari tas-sustanza kimika tat-test in vivo (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni fil-paragrafu 48).

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP juża kornei iżolati mill-għajnejn ta' bhejjem li jkunu għadhom kemm inqatlu. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. Il-permeabilità titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' żebgħa fluworexxeina tas-sodju li jgħaddi min-naħa għall-oħra tal-ħxuna kollha tal-kornea, kif individwat fil-medium fil-kavità posterjuri. Is-sustanzi kimiċi tat-test, li jiġu introdotti fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, jiġu applikati fis-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. L-Appendiċi 4 tipprovdi deskrizzjoni u dijagramma tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea użat fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. L-apparat fejn titqiegħed il-kornea jista' jinxtara minn sorsi differenti jew jista' jinbena.

Is-Sors u l-Età tal-Għajnejn tal-Bovini u l-Għażla tal-Ispeċijiet tal-Annimali

Bhejjem mibgħuta l-biċċeriji tipikament jinqatlu jew għall-konsum mill-bniedem jew inkella għal użi kummerċjali oħrajn. Bħala sors ta' korneji għall-użu fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jintużaw biss l-annimali b'saħħithom li jitqiesu xierqa sabiex jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem. Minħabba li l-bhejjem għandhom skala wiesgħa ta' piżijiet, skont ir-razza, l-età u s-sess, mhemmx piż irrakkomandat għall-annimal meta jiġi biex jinqatel.

Meta jintużaw għajnejn minn annimali ta' età differenti jistgħu jirriżultaw varjazzjonijiet fid-dimensjonijiet tal-kornea. Korneji b'dijametru orizzontali > 30.5 mm u valuri tal-ħxuna ċentrali tal-kornea (CCT) ≥ 1 100 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom aktar minn tmien snin, filwaqt li dawk b'dijametru orizzontali < 28.5 mm u CCT < 900 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom anqas minn ħames snin (14). Minħabba f'hekk, tipikament ma jintużawx għajnejn minn bhejjem li jkollhom aktar minn 60 xahar. Għajnejn minn bhejjem li jkollhom anqas minn 12-il xahar tradizzjonalment ma ntużawx għaliex l-għajnejn ikunu għadhom qegħdin jiżviluppaw u l-ħxuna tal-kornea u d-dijametru tal-kornea jkunu iżgħar b'mod konsiderevoli minn dawk irrapportati għall-għajnejn mill-bhejjem adulti. Madankollu, l-użu ta' kornei minn annimali żgħar (jiġifieri ta' età minn 6 xhur sa 12-il xahar) huwa permess minħabba li hemm xi vantaġġi, bħal pereżempju disponibilità akbar, skala dejqa ta' etajiet, u inqas perikli marbuta ma' esponiment potenzjali tal-ħaddiema għall-Enċefalopatija Sponġiforma Bovina (15). Minħabba li aktar evalwazzjoni tal-effett tad-daqs jew il-ħxuna tal-kornea fuq is-sensibilità għal sustanzi kimiċi korrużivi u irritanti tkun utli, l-utenti huma mħeġġin jirrapportaw stima tal-età u/jew il-piż tal-annimali li jipprovdu l-korneji użati fi studju.

Ġbir u Trasport tal-Għajnejn lejn il-Laboratorju

L-għajnejn jinġabru mill-impjegati tal-biċċerija. Sabiex jiġu minimizzati l-ħsara mekkanika u tipi oħrajn ta' ħsara lill-għajnejn, l-għajnejn għandhom jiġu enukleati mill-iktar fis wara l-mewt u jitkessħu minnufih wara l-enukleazzjoni u matul it-trasport. Sabiex jiġi evitat l-esponiment tal-għajnejn għal sustanzi kimiċi potenzjalment irritanti, il-ħaddiema tal-biċċerija ma għandhomx jużaw deterġent meta jlaħalħu ras l-annimal.

L-għajnejn għandhom jingħaddsu kompletament f'Soluzzjoni tal-Melħ Ekwilibrata mkessħa ta' Hanks, (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) f'reċipjent ta' daqs adattat, u ttrasportati lejn il-laboratorju b'mod li kemm jista' jkun inaqqas id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. Minħabba li l-għajnejn jinġabru waqt il-proċess tal-qatla, dawn jistgħu jiġu esposti għad-demm u għal materjali bijoloġiċi oħrajn, inklużi batterji u mikroorganiżmi oħrajn. Għalhekk huwa importanti li jiġi żgurat li r-riskju ta' kontaminazzjoni jitnaqqas kemm jista' jkun (eż. billi r-reċipjent li jkun fih l-għajnejn jinżamm fuq silġ imxarrab, billi jiżdiedu antibijotiċi fl-HBSS li tintuża għall-ħżin tal-għajnejn waqt it-trasport [eż. 100 IU/mL ta' peniċillina u 100 μg/ml ta' streptomiċina]).

L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-għajnejn u l-użu tal-kornei fil-BCOP għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipikament għandhom jinġabru u jintużaw fl-istess ġurnata) u għandu jintwera li dan ma jikkompromettix ir-riżultati tal-assaġġ. Dawn ir-riżultati huma bbażati fuq il-kriterji tal-għażla għall-għajnejn, kif ukoll ir-risponsi tal-kontrolli pożittivi u negattivi. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.

Il-Kriterji tal-Għażla għall-Għajnejn Użati fil-Metodu ta' Ttestjar tal-BCOP

Malli jaslu fil-laboratorju, l-għajnejn jiġu eżaminati bir-reqqa għad-difetti inklużi żieda fl-opaċità, grif u neovaskularizzazzjoni. Għandhom jintużaw biss il-korneji minn għajnejn li ma jkollhom l-ebda difett ta' dan it-tip.

Il-kwalità ta' kull kornea tiġi evalwata wkoll fi stadji li jiġu aktar 'il quddiem fl-assaġġ. Korneji li għandhom opaċità ikbar minn seba' unitajiet tal-opaċità jew ekwivalenti għall-opaċitometru u apparati fejn titqiegħed il-kornea wara perjodu ta' ekwilibrazzjoni inizjali ta' siegħa għandhom jintremew (NOTA: l-opaċitometru għandu jiġi kkalibrat bi standards tal-opaċità li jintużaw sabiex jiġu stabbiliti l-unitajiet tal-opaċità, ara l-Appendiċi 4).

Kull grupp tat-trattament (sustanza kimika tat-test, kontrolli negattivi u pożittivi paralleli) jikkonsisti minn minimu ta' tliet għajnejn. Fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandhom jintużaw tliet korneji għall-kontroll negattiv. Minħabba li l-korneji kollha jinqatgħu barra mill-globu sħiħ, u jitqiegħdu fil-kavitajiet tal-korneji, il-manipulazzjoni tagħhom tista' tirriżulta f'artefatti fil-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-korneji individwali (inkluż il-kontroll negattiv). Barra minn hekk, il-valuri tal-opaċità u l-permeabilità mill-korneji tal-kontroll negattiv jintużaw biex jikkoreġu l-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornei ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u l-kornei ttrattati bil-kontroll pożittiv fil-kalkoli tal-IVIS.

PROĊEDURA

Preparazzjoni tal-Għajnejn

Korneji li ma jkollhom l-ebda difett jiġu dissezzjonati b'tali mod li jibqa' minn 2 sa 3 mm ta' xifer tal-isklerotika sabiex jgħin il-manipulazzjoni sussegwenti, u dan isir b'attenzjoni sabiex tiġi evitata kwalunkwe ħsara fl-epitelju u l-endotelju. Korneji iżolati jitqiegħdu f'apparat fejn titqiegħed il-kornea ddisinjat speċjalment għal dan il-għan li jikkonsisti f'kavitajiet anterjuri u posterjuri, li jkunu f'kuntatt mal-ġenb epiteljali u l-ġenb endoteljali tal-kornea, rispettivament. Iż-żewġ kavitajiet jimtlew sax-xifer bil-Medium Essenzjali Minimu ta' Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) mingħajr fenol aħmar (l-ewwel il-kavità posterjuri), filwaqt li jiġi żgurat li ma jifformawx bżieżaq. L-apparat imbagħad jiġi kkalibrat għal tal-anqas siegħa f'temperatura ta' 32 ± 1 °C sabiex il-korneji jekwilibraw mal-medium u jiksbu kemm jista' jkun possibbli attività metabolika normali (it-temperatura approssimattiva tas-superfiċje tal-kornea in vivo hija 32 °C).

Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, EMEM frisk, mingħajr fenol aħmar u msaħħan minn qabel jiżdied fiż-żewġ kavitajiet u jittieħed l-ewwel qari tal-valuri tal-opaċità għal kull kornea. Kwalunkwe kornea li turi ħsara makroskopika fit-tessut (eż. grif, pigmentazzjoni, neovaskularizzazzjoni) jew opaċità ikbar minn seba' unitajiet tal-opaċità jew ekwivalenti għall-opaċitometru u l-apparati fejn titqiegħed il-kornea użati jintremew. Tal-inqas tliet korneji jintgħażlu bħala korneji tal-kontroll negattiv (jew solvent). Imbagħad, il-korneji li jifdal jiġu ddistribwiti fi grupp tat-trattament u tal-kontroll pożittiv.

Minħabba li l-kapaċità tas-sħana tal-ilma hija ogħla minn dik tal-arja, l-ilma jipprovdi kundizzjonijiet ta' temperatura aktar stabbli għall-inkubazzjoni. Għalhekk, huwa rrakkomandat l-użu ta' banju tal-ilma sabiex l-apparat fejn titqiegħed il-kornea u l-kontenut tiegħu jinżammu f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. Madankollu, jistgħu jintużaw ukoll inkubaturi tal-arja, filwaqt li jittieħdu prekawzjonijiet sabiex tinżamm l-istabilità tat-temperatura (eż., billi l-apparat u l-media jissaħħnu minn qabel).

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Jintużaw żewġ protokolli ta' trattament, wieħed għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi (solidi jew likwidi), u ieħor għal solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi.

Il-likwidi jiġu ttestjati meta ma jkunux dilwiti. Semisolidi, kremi u x-xema' tipikament jiġu ttestjati bħala likwidi. Sustanzi tensjoattivi puri jiġu ttestjati f'konċentrazzjoni ta' 10 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għal konċentrazzjonijiet ta' dilwizzjoni alternattivi. Taħlitiet li fihom aġenti tensjoattivi jistgħu jiġu ttestjati mhux dilwiti jew dilwiti f'konċentrazzjoni xierqa skont ix-xenarju tal-esponiment rilevanti in vivo. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għall-konċentrazzjoni ttestjata. Il-kornei jiġu esposti għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi għal 10 minuti. L-użu ta' ħinijiet oħrajn ta' esponiment għandu jkun ibbażat fuq raġuni xjentifika xierqa. Jekk jogħġbok ara l-Appendiċi 1 għal definizzjoni ta' taħlita tensjoattiva u taħlita li fiha aġent tensjoattiv.

Solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi tipikament jiġu ttestjati bħala soluzzjonijiet jew sospensjonijiet f'konċentrazzjoni ta' 20 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. F'ċerti ċirkostanzi u b'ġustifikazzjoni xjentifika xierqa, is-solidi jistgħu jiġu ttestjati puri b'applikazzjoni diretta fuq is-superfiċje tal-kornea permezz tal-metodu tal-kavità miftuħa (ara l-paragrafu 32). Il-korneji jiġu esposti għas-solidi għal erba' sigħat, iżda bħalma jsir għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi, jistgħu jintużaw ħinijiet ta' esponiment alternattivi fuq il-bażi ta' raġuni xjentifika xierqa.

Jistgħu jintużaw metodi ta' trattament differenti, skont in-natura fiżika u l-karatteristiċi kimiċi (eż. solidi, likwidi, likwidi viskużi jew mhux viskużi) tas-sustanza kimika tat-test. Il-fattur kritiku huwa li jiġi żgurat li s-sustanza kimika tat-test tkopri b'mod xieraq is-superfiċje tal-epitelju u li titneħħa b'mod xieraq waqt l-istadji tat-tlaħliħ. Metodu tal-kavità magħluqa tipikament jintuża għal sustanz kimiċi tat-test li jvarjaw minn likwidi mhux viskużi għal likwidi viskużi ftit, filwaqt li metodu tal-kavità miftuħa tipikament jintuża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi semiviskużi għal likwidi viskużi u għal solidi puri.

Fil-metodu tal-kavità magħluqa, ammont tas-sustanza kimika tat-test (750 μl) li jkun biżżejjed biex ikopri l-kavità anterjuri jiġi introdott minn ġot-toqob tad-dożaġġ fuq is-superfiċje ta' fuq tal-kavità, u t-toqob sussegwentement jiġu ssiġillati bit-tappieri tal-kavità waqt l-esponiment. Huwa importanti li jiġi żgurat li kull kornea tiġi esposta għas-sustanza kimika tat-test għall-intervall tal-ħin xieraq.

Fil-metodu tal-kavità miftuħa, iċ-ċirku li jsakkar it-tieqa u t-tieqa tal-ħġieġ jitneħħew mill-kavità anterjuri qabel ma jibda t-trattament. Il-kontroll jew is-sustanza kimika tat-test (750 μl, jew biżżejjed sustanza kimika tat-test biex tiksi l-kornea għalkollox) jiġu applikati direttament fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea permezz ta' mikropipetta. Jekk ikun diffiċli li tuża l-pipetta għas-sustanza kimika tat-test, is-sustanza kimika tat-test tista' tiġi kkargata bil-pressa f'pipetta bi spostament pożittiv sabiex tgħin fid-dożaġġ. Il-ponta tal-pipetta bi spostament pożittiv, tiddaħħal fil-ponta tad-distribuzzjoni tas-siringa sabiex il-materjal ikun jista' jinġibed fil-ponta tal-pipetta taħt pressjoni. Imbagħad jeħtieġ li l-pistun tal-pipetta jinġibed 'il fuq fl-istess waqt li l-pistun tas-siringa jingħafas 'l isfel. Jekk fil-ponta tal-pipetta jiffurmaw xi bżieżaq tal-arja, is-sustanza kimika tat-test għandha titneħħa (tinħareġ 'il barra) u l-proċess jiġi ripetut sa mal-ponta timtela mingħajr ma jkun hemm bżieżaq tal-arja. Jekk ikun meħtieġ, tista' tintuża siringa normali (mingħajr labra) minħabba li din tippermetti l-kejl ta' volum akkurat tas-sustanza kimika tat-test u applikazzjoni eħfef fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. Wara d-dożaġġ, it-tieqa tal-ħġieġ terġa' titqiegħed fuq il-kavità anterjuri biex terġa' tinħoloq sistema magħluqa.

Inkubazzjoni ta' Wara l-Esponiment

Wara l-perjodu ta' esponiment, is-sustanza kimika tat-test, is-sustanza kimika tal-kontroll negattiv, jew tal-kontroll pożittiv jitneħħew mill-kavità anterjuri u l-epitelju jinħaslu tal-inqas tliet darbiet (jew sakemm ma tkun tista' tiġi osservata l-ebda evidenza viżiva tas-sustanza kimika tat-test) bl-EMEM (li jkun fih il-fenol aħmar). Medium li jkun fih il-fenol aħmar jintuża għat-tlaħliħ minħabba li bidla fil-kulur tal-fenol aħmar tista' tiġi mmonitorjata sabiex tiġi ddeterminata l-effikaċja tat-tlaħliħ ta' sustanzi kimiċi tat-test aċidużi jew alkalini. Il-korneji jinħaslu aktar minn tliet darbiet jekk il-fenol aħmar jibqa' jibdel il-kulur (isfar jew vjola), jew is-sustanza kimika tat-test tkun għadha viżibbli. Ladarba l-medium ma jibqagħlux sustanza kimika tat-test, il-kornei jitlaħalħu għall-aħħar darba bl-EMEM (mingħar fenol aħmar). L-EMEM (mingħajr fenol aħmar) jintuża għall-aħħar tlaħliħa sabiex jiġi żgurat li l-fenol aħmar jitneħħa kompletament mill-kavità anterjuri qabel ma titkejjel l-opaċità. Imbagħad il-kavità anterjuri terġa' timtela b'EMEM frisk mingħajr fenol aħmar.

Għal-likwidi jew l-aġenti tensjoattivi, wara t-tlaħliħ, il-korneji jiġu inkubati għal sagħtejn oħra f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. F'ċerti ċirkostanzi ħin itwal ta' inkubazzjoni wara l-esponiment jista' jkun utli u jista' jiġi kkunsidrati fuq bażi ta' każ b'każ. Korneji ttrattati b'solidi jitlaħalħu kompletament fi tmiem il-perjodu tal-esponiment li jdum erba' sigħat, iżda ma jeħtiġux aktar inkubazzjoni.

Fi tmiem il-perjodu ta' inkubazzjoni wara l-esponiment għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi u fi tmiem il-perjodu tal-esponiment ta' erba' sigħat għas-solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, jiġu rreġistrati l-opaċità u l-permeabilità ta' kull kornea. Barra minn hekk, kull kornea tiġi osservata b'mod viżiv u l-osservazzjonijiet pertinenti jiġu rreġistrati (eż. tqaxxir tat-tessuti, sustanza kimika tat-test residwa, opaċità mhux uniformi). Dawn l-osservazzjonijiet jistgħu jkunu importanti għaliex jistgħu jiġu riflessi minn varjazzjonijiet fil-qari tal-valuri tal-opaċitometru.

Sustanzi Kimiċi tal-Kontroll

Kontrolli negattivi jew tas-solvent/tal-veikolu u kontrolli pożittivi paralleli jiġu inklużi f'kull esperiment.

Meta sustanza likwida tiġi ttestjata f'100 %, kontroll negattiv (eż., soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 % jew ilma distillat) jiġi inkluż fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti ta' tmiem tal-assaġġ. Dan jiżgura wkoll li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx b'mod li mhux xieraq f'rispons irritanti.

Meta jiġi ttestjat likwidu dilwit, aġent tensjoattiv jew solidu fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP, jiġi inkluż grupp tal-kontroll tas-solvent/tal-veikolu parallel sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti ta' tmiem tal-assaġġ. Jista' jintuża biss solvent/veikolu li jkun intwera li ma għandu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.

Sustanza kimika magħrufa li tinduċi rispons pożittiv hija inkluża bħala kontroll pożittiv parallel f'kull esperiment sabiex tiġi verifikata l-integrità tas-sistema tat-test u t-twettiq korrett ta' dan. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll pożittiv tista' tiġi vvalutata, id-daqs tar-reazzjoni irritanti ma għandux ikun eċċessiv.

Eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test likwidi huma 100 % etanol jew 100 % dimetilformamid. Eżempju ta' kontroll pożittiv għal sustanzi kimiċi tat-test huwa 20 % w/v imidażol f'0.9 % soluzzjoni tal-klorur tas-sodju.

Is-sustanzi kimiċi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanzi kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew tal-prodotti jikkawżaw irritazzjoni okulari, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni okulari fi ħdan skala speċifika ta' risponsi ta' sustanzi irritanti.

Punti ta' Tmiem Imkejlin

L-opaċità tiġi stabbilita mill-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' opaċitometru, li jagħti valuri ta' opaċità fuq skala kontinwa.

Il-permeabilità tiġi stabbilita mill-ammont taż-żebgħa fluworexxeina tas-sodju li tippenetra s-saffi kollha taċ-ċelloli tal-kornea (jiġifieri l-epitelju fuq is-superfiċje esterna tal-kornea għal ġol-endotelju fuq is-superfċije interna tal-kornea). Millilitru ta' soluzzjoni ta' fluworexxeina tas-sodju (4 jew 5 mg/ml meta jiġu ttestjati likwidi jew aġenti tensjoattivi jew solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, rispettivament) jiżdied fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, li tkun f'kuntatt mal-ġenb epiteljali tal-kornea, filwaqt li l-kavità posterjuri, li tkun f'kuntatt mal-ġenb endoteljali tal-kornea, timtela b'EMEM frisk. Imbagħad l-apparat jiġi inkubat f'pożizzjoni orizzontali għal 90 ± 5 min fi 32 ± 1 °C. L-ammont ta' fluworexxeina tas-sodju li jgħaddi għal ġol-kavità posterjuri jitkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' spettrofotometru UV/VIS. Kejl spettrofotometriku evalwat f'490 nm jiġi rreġistrat bħala densità ottika (OD490) jew valuri ta' assorbità li jitkejlu fuq skala kontinwa. Il-valuri ta' permeabilità tal-fluworexxeina jiġu stabbiliti bl-użu ta' valuri ta' OD490 fuq il-bażi ta' spettrofotometru viżibbli li juża traġitt ottiku standard ta' 1 cm.

Inkella jista' jintuża qarrej tal-folja tal-mikrotitrazzjoni b'96 bwejra diment li; (i) tkun tista' tiġi stabbilita l-iskala ta' valuri lineari tal-qarrej tal-folja għad-determinazzjoni tal-valuri tal-fluworexxeina OD490; u (ii), jintuża l-volum it-tajjeb ta' kampjuni ta' fluworexxeina fil-folja b'96 bir sabiex jinkisbu valuri OD490 ekwivalenti għat-traġitt okulari standard ta' 1 cm (dan jista' jkun jeħtieġ bir sħiħ [normalment 360μl]).

DEJTA U RAPPORTAR

Evalwazzjoni tad-Dejta

Ladarba l-valuri (OD490) tal-opaċità u l-permeabilità medja jkunu ġew ikkoreġuti għall-opaċità tal-isfond u l-valuri OD490 tal-permeabilità tal-kontroll negattiv, il-valuri medji OD490 tal-opaċità u l-permeabilità għal kull grupp ta' trattament għandhom jiġu kkombinati f'formula dderivata empirikament sabiex jiġi kkalkulat punteġġ tal-irritanza in vitro (IVIS) għal kull grupp tat-trattament kif ġej:

IVIS = valur medju tal-opaċità + (15 × valur OD490 medju tal-permeabilità)

Sina et al. (16) irrapportaw li din il-formula ġiet idderivata matul studji interni u bejn laboratorji. Id-dejta ġġenerata għal sensiela ta' 36 kompost fi studju fost bosta laboratorji ġiet soġġetta għal analiżi b'varjabbli mutlipli sabiex tiġi ddeterminata l-ekwazzjoni tal-aqwa adattament bejn id-dejta in vivo u dik in vitro. Ix-xjentisti f'żewġ kumpaniji separati għamlu din l-analiżi u waslu għal ekwazzjonijiet kważi identiċi.

Il-valuri tal-opaċità u tal-permeabilità għandhom jiġu evalwati wkoll b'mod indipendenti sabiex jiġi ddeterminat jekk sustanza kimika tat-test tkunx ipprovokat korrużività jew irritazzjoni severa permezz ta' wieħed biss miż-żewġ punti ta' tmiem (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni).

Kriterji tad-Deċiżjoni

Il-valuri limitu tal-IVIS għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) u sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) jingħataw hawnhekk:

Kriterji ta' Aċċettazzjoni tal-Istudju

Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontroll pożittiv jagħti IVIS li jkun fi ħdan żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika attwali, li tiġi aġġornata tal-anqas kull tliet xhur, jew kull darba li jitwettaq test aċċettabbli f'laboratorji fejn it-testijiet ma jitwettqux b'mod frekwenti (jiġifieri anqas minn darba fix-xahar). Ir-reazzjonijiet mill-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-medium għandhom jirriżultaw f'valuri ta' opaċità u permeabilità li jkunu anqas mill-ogħla limiti stabbiliti għall-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-isfond għall-korneji bovini ttrattati bil-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-veikolu rispettiv. Sessjoni waħda ta' ttestjar magħmula minn tal-inqas tliet korneji għandha tkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta l-klassifikazzjoni li tirriżulta tkun inekwivokabbli. Madankollu, f'każijiet ta' riżultati mhux ċari fl-ewwel sensiela ta' testijiet, għandha tiġi kkunsidrata t-tieni sensiela ta' testijiet (iżda mhux bilfors), kif ukoll it-tielet waħda fil-każ ta' riżultati tal-IVIS medju li ma jaqblux bejn l-ewwel żewġ sensiliet ta' testijiet. F'dan il-kuntest, riżultat fl-ewwel sensiela ta' testijet jitqies li mhuwiex ċar jekk il-previżjonijiet mit-3 korneji ma jkunux jaqblu, b'tali mod li:

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, jekk tkun rilevanti għat-twettiq tal-istudju:

TAGĦRIF

Appendiċi 4

L-APPARAT TAL-BCOP FEJN TITQIEGĦED IL-KORNEA

L-apparat tal-BCOP fejn titqiegħed il-kornea huwa magħmul minn materjal inerti (eż. polipropilen). L-apparat huwa magħmul minn żewġ nofsijiet (kavità anterjuri u oħra posterjuri), u għandu żewġ kavitajiet interni ċilindriċi simili. Kull kavità hija mfassal sabiex tiflaħ volum ta' madwar 5 ml u tintemm f'tieqa tal-ħġieġ, li minnha jiġu rreġistrati l-kejliet tal-opaċità. Kull waħda mill-kavitajiet interni għandha dijametru ta' 1,7 cm u fond ta' 2,2 cm (11). Iċ-ċirku-o jitqiegħed fil-kavità posterjuri biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Il-korneji jitqiegħdu bil-parti tal-endotelju tħares 'l isfel fuq iċ-ċirku-o tal-kavitajiet posterjuri u l-kavitajiet anterjuri jitqiegħdu fuq il-parti tal-epitelju tal-korneji. Il-kavitajiet jinżammu f'posthom permezz ta' tliet viti tal-azzar inossidabbli li jinsabu fuq it-truf esterni tal-kavità. Fl-aħħar parti ta' kull kavità nsibu tieqa tal-ħġieġ li tista' titneħħa sabiex ikun hemm aċċess faċli għall-kornea. Ċirku-o jitqiegħed ukoll bejn it-tieqa tal-ħġieġ u l-kavità biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Żewġ toqbiet fil-parti ta' fuq ta' kull kavità jippermettu l-introduzzjoni u t-tneħħija tal-medium u s-sustanzi kimiċi tat-test. Dawn jingħalqu b'tappijiet tal-lastku waqt il-perjodi ta' trattament u ta' inkubazzjoni. It-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea għandha l-potenzjal li tinbidel peress li l-effetti ta' xedd u kedd jew il-ġmigħ ta' residwi kimiċi speċifiċi fit-toqob tal-kavità interna jew fuq it-twieqi tal-ħġieġ jistgħu jaffettwaw it-tifrix jew ir-riflettanza tad-dawl. Il-konsegwenza tista' tkun żidiet jew tnaqqisiet fit-trażmissjoni tad-dawl bażi (u, b'mod kuntrarju, il-valuri tal-opaċità bażi) minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, u tista' tkun evidenti peress li bidliet sinifikanti fil-kejliet inizjali bażi mistennijin tal-opaċità tal-kornea fil-kavitajiet individwali (jiġifieri l-valuri tal-opaċità tal-kornea inizjali f'apparati speċifiċi individwali tal-kornea jistgħu jvarjaw spiss b'iktar minn 2 jew 3 unitajiet tal-opaċità mill-valuri bażi mistennijin). Kull laboratorju għandu jikkunsidra jistabbilixxix programm għall-evalwazzjoni ta' tibdiliet fit-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, skont in-natura tal-kimiki ttestjati u l-frekwenza tal-użu tal-kavitajiet. Sabiex jiġu stabbiliti l-valuri bażi, l-apparati fejn titqiegħed il-kornea jistgħu jiġu vverifikati qabel ma jsir użu ta' rutina billi jitkejlu l-valuri tal-opaċità bażi (jew it-trażmissjoni tad-dawl) tal-kompartimenti b'medium komplut, mingħajr kornei. Imbagħad, l-apparati li jżommu l-korneji jiġu verifikati b'mod perjodiku għal tibdiliet fit-trażmissjoni tad-dawl matul il-perjodi tal-użu. Kull laboratorju jista' jistabbilixxi l-frekwenza għall-verifika tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea, fuq il-bażi tas-sustanzi kimiċi ttestjati, il-frekwenza tal-użu, u l-osservazzjonijiet tat-tibdiliet fil-valuri bażi tal-opaċità tal-kornea. Jekk jiġu osservati tibdiliet notevoli fit-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, iridu jiġu kkunsidrati proċeduri xierqa ta' tindif u/jew illostrar tal-wiċċ ta' ġewwa tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea jew is-sostituzzjoni ta' dawn.

Apparat fejn titqiegħed il-kornea: dijagramma bi spjega tal-installazzjoni

(13)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.48 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.48   Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 438 tal-OECD (2013). Il-metodu ta' ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati (ICE) ġie evalwat mill-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), fl-2006 u l-2010 (1) (2) (3). Fl-ewwel evalwazzjoni, l-ICE ġie approvat bħala metodu ta' ttestjar xjentifikament validu għall-użu bħala test ta' skrinjar sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1), kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) (2) (4) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (12). Fit-tieni evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-ICE ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi mhux ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn kif definita mill-GHS tan-NU (3) (4). Ir-riżultati mill-istudju ta' validazzjoni u r-rakkomandazzjonijiet tal-bord ta' evalwazzjoni bejn il-pari żammew ir-rakkomandazzjoni oriġinali għall-użu tal-ICE għall-klassifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), peress li d-database disponibbli baqgħet l-istess mill-validazzjoni tal-ICCVAM oriġinali. F'dak l-istadju, ma ġiet issuġġerita ebda rakkomandazzjoni ulterjuri għal espansjoni tad-dominju ta' applikabilità tal-ICE sabiex ikunu inklużi kategoriji oħrajn. Saret rievalwazzjoni tas-sett ta' dejta in vitro u in vivo użat fl-istudju ta' validazzjoni b'enfasi fuq l-evalwazzjoni tal-utilità tal-ICE sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (5). Din ir-rievalwazzjoni kkonkludiet li l-metodu ta' ttestjar tal-ICE jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn kif definita mill-GHS tan-NU (4) (5). Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użi rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE fuq il-bażi ta' dawn l-evalwazzjonijiet. Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni oriġinali tal-2009 u l-verżjoni aġġornata tal-2013 tal-linja gwida tat-test tal-OECD jinkludu, iżda mhumiex limitati għal: l-użu tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont is-Sistema ta' Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU, aġġornament fl-elementi tar-rapport tat-test, aġġornament tal-Appendiċi 1 dwar id-definizzjonijiet, u aġġornament tal-Appendiċi 2 dwar is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza.

Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test Draize in vivo tal-għajnejn sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta' diversi metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn (6). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (7) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Isfel għal Fuq (7) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika ma tkunx mistennija tikkaġuna biżżejjed irritazzjoni tal-għajnejn sabiex tkun teħtieġ li tiġi kklassifikata. Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u fi ħdan limitazzjonijiet speċifiċi kif deskritti fil-paragrafi 8 sa 10 għall-klassifikazzjoni tal-periklu għall-għajnejn u t-tikkettar ta' sustanzi kimiċi. Filwaqt li ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut awtonomu għat-test in vivo tal-għajnejn fuq il-fniek, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat bħala pass inizjali fi ħdan strateġija ta' ttestjar, bħall-approċċ minn Fuq għal Isfel issuġġerit minn Scott et al. (7) sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, mingħajr ma jsiru iktar testijiet (4). Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa rakkomandat ukoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mill-GHS tan-NU (Ebda Kategorija, NC) (4) u għalhekk jista' jintuża bħala l-ewwel pass fi ħdan approċċ ta' strateġija ta' ttestjar minn Isfel għal Fuq (7). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex prevista li tikkaġuna ħsara serja lill-għajnejn jew bħala mhux klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn bil-metodu ta' ttestjar tal-ICE tkun teħtieġ iktar testijiet (in vitro u/jew in vivo) sabiex tistabbilixxi klassifikazzjoni definittiva. Barra minn hekk, għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel ma l-ICE jintuża f'approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta' klassifikazzjoni oħrajn li mhumiex il-GHS tan-NU.

L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajen kif imkejjel mill-ħila tagħha li tinduċi jew le tossiċità f'għajn enukleata ta' tiġieġa. Effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu permezz ta' (i) valutazzjoni kwalitattiva tal-opaċità, (ii) valutazzjoni kwalitattiva tal-ħsara għall-epitelju fuq il-bażi tal-applikazzjoni tal-fluworexxeina fl-għajn (żamma tal-fluworexxeina), (iii) kejl kwantitattiv ta' żieda fil-ħxuna (nefħa), u (iv) evalwazzjoni kwalitattiva ta' ħsara morfoloġika makroskopika fis-superfiċje. Il-valutazzjonijiet tal-opaċità, tan-nefħa, u tal-ħsara fil-kornea wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test jiġu vvalutati b'mod individwali u jiġu kkombinati sabiex tiġi dderivata Klassifikazzjoni tal-Irritazzjoni tal-Għajnejn.

Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll issuġġerit fid-Dokument ta' Gwida 160 tal-OECD (8), li ġie żviluppat b'segwitu għal studju ta' validazzjoni internazzjonali tal-ICCVAM (1) (3) (9), b'kontribuzzjonijiet mingħand iċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi, u d-Dipartiment tat-Tossikoloġija u l-Farmakoloġija Applikata tat-TNO Kwalità tal-Ħajja (in-Netherlands). Il-protokoll huwa bbażat fuq informazzjoni miksuba minn protokolli ppubblikati, kif ukoll il-protokoll attwali użat mit-TNO (10) (11) (12) (13) (14).

Saru testijiet fuq firxa wiesgħa ta' sustanzi kimiċi fil-validazzjoni li hija l-bażi ta' dan il-metodu ta' ttestjar u d-database empirika tal-istudju ta' validazzjoni rriżultaw f'152 sustanza kimika inklużi 72 sustanza u 80 taħlita (5). Il-metodu ta' ttestjar huwa applikabbli għal solidi, likwidi, emulsjonijiet u ġellijiet. Il-likwidi jistgħu jkunu jew ma jkunux milwiema; is-solidi jistgħu jkunu jew ma jkunux solubbli fl-ilma. Il-gassijiet u l-aerosols għadhom ma ġewx eżaminati fi studju ta' validazzjoni.

Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE jista' jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati taħt il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU (4). Meta jintużaw għal dan il-għan, il-limitazzjonijiet identifikati għall-metodu ta' ttestjar tal-ICE huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' foloz pożittivi għal alkoħols u r-rati għoljin ta' foloz negattivi għal solidi u aġenti tensjoattivi (1) (3) (9). Barra minn hekk, f'dan il-kuntest ir-rati ta' foloz negattivi (tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU identifikati li mhumiex tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) mhumiex kritiċi peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jiġu negattivi mbagħad jiġu ttestjati b'test(ijiet) in vitro vvalidat b'mod adegwat ieħor, jew bħala l-aħħar alternattiva, fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Ta' min jinnota li s-solidi jistgħu jwasslu għal kundizzjonijiet varjabbli u ta' esponiment estrem fit-test Draize in vivo tal-irritazzjoni tal-għajnejn, li jitsgħu jirriżultaw fi previżjonijiet irrilevanti tal-potenzjal ta' irritazzjoni veru tagħhom (15). L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ riżultat pożittiv għandu jiġi aċċettat bħala indikatur ta' ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri klassifikazzjoni bħala tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU mingħajr ma jsiru iktar testijiet. Madankollu, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols għandhom jiġu interpretati b'ċerta kawtela minħabba r-riskju ta' tbassir eċċessiv.

Meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), il-metodu ta' ttestjar tal-ICE għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 86 % (120/140), rata ta' foloz pożittivi ta' 6 % (7/113) u rata ta' foloz negattivi ta' 48 % (13/27) meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo fuq għajnejn il-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5).

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4). Għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel ma l-ICE jintuża f'approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta' klassifikazzjoni oħrajn. Dan il-metodu ta' ttestjar jista' jintuża għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, fejn riżultat negattiv jista' jiġi aċċettat għan-nuqqas ta' klassifikazzjoni ta' sustanza kimika għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn. Madankollu, fuq il-bażi ta' riżultat wieħed mid-database tal-validazzjoni, żebgħa antifouling li fiha solvent organiku tista' tkun sottovalutata fil-previżjonijiet (5).

Meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn, il-metodu ta' ttestjar tal-ICE għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 82 % (125/152), rata ta' foloz pożittivi ta' 33 % (26/79) u rata ta' foloz negattivi ta' 1 % (1/73) meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo fuq għajnejn il-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5). Meta s-sustanzi kimiċi tat-test fi ħdan ċerti klassijiet (jiġifieri antifouling żebgħat li fiha solvent organiku) jiġu esklużi mid-database, il-preċiżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE hija ta' 83 % (123/149), ir-rata ta' foloz pożittivi 33 % (26/78), u r-rata ta' foloz negattivi ta' 0 % (0/71) għas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5).

Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE mhuwiex rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala irritanti għall-għajnejn (jiġifieri Kategorija 2 jew Kategorija 2A tal-GHS tan-NU) jew sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala ftit irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2B tal-GHS tan-NU) minħabba n-numru konsiderevoli ta' sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU bħala sustanzi kimiċi tal-Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU u ta' Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU sovraklassifikati bħala Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU. Għal dan il-għan, jista' jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b'metodu xieraq ieħor.

Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn tat-tiġieġ għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali derivati mill-bnedmin jew l-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Huwa rakkomandat li jittieħdu l-prekawzjonijiet universali tal-laboratorju (16).

Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-ICE ma jqisx feriti konġuntivali u iridali kif evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritazzjoni okulari fil-fniek, dan jindirizza l-effetti korneali, li huma kawża primarja tal-klassifikazzjoni in vivo meta titqies il-Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU. Barra dan, għalkemm ir-reversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax tiġi evalwata per se fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE, ġie propost, fuq il-bażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża sabiex jiġu identifikati uħud mit-tipi ta' effetti irreversibbli (17). B'mod partikolari, hemm bżonn ta' iktar għarfien xjentifiku sabiex nifhmu kif iseħħu effetti irreversibbli mhux marbtin ma' ferita inizjali ta' livell għoli. Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jippermettix li ssir valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment okulari.

Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kull ċertu żmien iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati. Pereżempju, l-istopatoloġija tista' tkun potenzjalment siewja meta jkun hemm bżonn ta' karatterizzazzjoni iktar kompluta tal-ħsara fil-kornea. Sabiex jevalwaw din il-possibbiltà, dawk li jużawh huma mħeġġin jippreservaw l-għajnejn u jħejju kampjuni għall-istopatoloġija li jistgħu jintużaw sabiex jiġu żviluppati database u kriterji dwar id-deċiżjonijiet li jistgħu jkomplu jtejbu l-preċiżjoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar. L-OECD żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-użu ta' metodi ta' ttestjar tat-tossiċità okulari in vitro, li jinkludi proċeduri dettaljati dwar il-ġbir ta' kampjuni tal-istopatoloġija u informazzjoni dwar fejn għandhom tiġi sottomessa dejta dwar il-kampjuni u/jew l-istopatoloġija (8).

Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qiegħed jistabbilixxi dan l-assaġġ, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 2. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE qabel ma jissottometti dejta tal-ICE għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq terminu ta' żmien qasir fuq għajnejn it-tiġieġ in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza kimika tat-test tiġi vvalutata bid-determinazzjoni tan-nefħa, l-opaċità u ż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea. Filwaqt li l-aħħar żewġ parametri jinvolvu valutazzjoni kwalitattiva, analiżi tan-nefħa fil-kornea tipprovdi valutazzjoni kwantitattiva. Kull kejl jiġi kkonvertit f'punteġġ kwantitattiv użat għall-kalkolu ta' Indiċi tal-Irritazzjoni Kumplessiv, jew inkella jiġi assenjat kategorizzazzjoni kwalitattiva li tintuża sabiex tiġi assenjata klassifikazzjoni tal-periklu okulari in vitro, jew bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU jew bħala mhux klassifikat fil-GHS tan-NU. Imbagħad jista' jintuża wieħed minn dawn l-eżiti sabiex jitbassar il-potenzjal ta' ħsara serja lill-għajnejn in vivo jew ebda rekwiżit għall-klassifikazzjoni ta' periklu għall-għajnejn ta' sustanza kimika tat-test (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni). Madankollu, ma tista' tingħata ebda klassifikazzjoni għal sustanzi kimiċi li mhumiex previsti li jikkaġunaw ħsara serja lill-għajnejn jew li mhumiex ikklassifikati bil-metodu ta' ttestjar tal-ICE (ara l-paragrafu 11).

Sors u Età ta' Għajnejn it-Tiġieġ

Storikament, għal dan l-assaġġ intużaw għajnejn li jkunu ttieħdu mit-tiġieġ minn biċċerija fejn jinqatlu għall-konsum mill-bniedem, u b'hekk ġiet eliminata l-ħtieġa ta' annimali tal-laboratorju. Jintużaw biss għajnejn ta' annimali b'saħħithom li huma xierqa sabiex jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem.

Għalkemm ma twettaq l-ebda studju kontrollat għall-valutazzjoni tal-età ideali tat-tiġieġ, l-età u l-piż tat-tiġieġ użati storikament f'dan il-metodu ta' ttestjar huma dawk ta' tiġieġ tar-rebbiegħa li tradizzjonalment jiġu pproċessati minn biċċerija tat-tjur (jiġifieri bejn wieħed u ieħor ta' età ta' 7 ġimgħat, u piż ta' 1.5 — 2.5 kg).

Ġbir u Trasport tal-Għajnejn lejn il-Laboratorju

L-irjus għandhom jitneħħew immedjatament wara s-sedazzjoni tat-tiġieġ, ġeneralment b'xokk elettriku u inċiżjoni tal-għonq għall-fsada. Għandu jiġi lokalizzat sors lokali ta' tiġieġ qrib il-laboratorju sabiex l-irjus tat-tiġieġ jiġu ttrasferiti mill-biċċerija sal-laboratorju malajr biżżejjed sabiex kemm jista' jkun jonqos/tonqos id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-irjus tat-tiġieġ u t-tqegħid tal-għajnejn fil-kavità tas-superfużjoni wara l-enuklerazzjoni għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (normalment fi żmien sagħtejn) sabiex jiġi żgurat li jintlaħqu l-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-assaġġ. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.

Minħabba l-fatt li l-għajnejn jiġu ddissektjati fil-laboratorju, l-irjus intatti jiġu ttrasportati mill-biċċerija f'temperatura ambjentali (normalment bejn 18 °C u 25 °C) f'kaxex tal-plastik umdifikati b'karti mxarrba b'soluzzjoni iżotonika ta' ilma bil-melħ.

Il-Kriterji tal-Għażla u n-Numru ta' Għajnejn Użati fl-ICE

Għajnejn li jkollhom punteġġ għoli ta' tilwin bil-fluworexxeina (jiġifieri > 0.5) jew punteġġ għoli ta' opaċità fil-kornea (jiġifieri > 0.5) wara li jitneħħew mill-ħofra tal-għajn jitwarrbu.

Kull grupp tat-trattament u tal-kontroll pożittiv parallel jikkonsisti minn tal-anqas tliet għajnejn. Il-grupp tal-kontrolli negattivi jew il-kontroll tas-solvent (jekk jintuża solvent li ma jkunx salina) jikkonsisti minn tal-anqas għajn waħda.

Fil-każ ta' materjali solidi li jwasslu għal eżitu ta' NC tal-GHS, huwa rakkomandat li tintuża t-tieni sensiela ta' tliet għajnejn sabiex jiġi kkonfermat jew miċħud ir-riżultat negattiv.

PROĊEDURA

Preparazzjoni tal-Għajnejn

Il-kappell tal-għajn jinqata' barra b'ħafna attenzjoni sabiex ma ssir l-ebda ħsara fil-kornea. L-integrità tal-kornea tiġi vvalutata malajr b'qatra fluworexxeina tas-sodju 2 % (w/v) li tiġi applikata fuq is-superfiċje tal-kornea għal ftit sekondi, u mbagħad titlaħlaħ b'salina iżotonika. Imbagħad l-għajnejn ittrattati bil-fluworexxeina jiġu eżaminati b'mikroskopju korneali sabiex jiġi żgurat li l-kornea ma jkollha l-ebda ħsara (jiġifieri punteġġi taż-żamma tal-fluworexxeina u tal-opaċità tal-kornea ≤ 0.5).

Jekk l-għajn ma jkollha l-ebda ħsara, tinqata' mill-kranju b'attenzjoni kbira sabiex ma ssir l-ebda ħsara lill-kornea. Il-boċċa tal-għajn tinġibed mill-orbita billi wieħed iżomm sod il-membrana nittitanti b'forċipi kirurġiċi, u l-muskoli tal-għajn jinqatgħu b'imqass mgħawweġ u b'ponta spuntata. Huwa importanti li wieħed jevita li jikkawża ħsara fil-kornea minħabba pressjoni eċċessiva (jiġifieri artefatti ta' kompressjoni.)

Meta l-għajn titneħħa mill-orbita, porzjon viżibbli tan-nerv ottiku għandu jibqa' mwaħħal. Ladarba titneħħa mill-orbita, l-għajn titqiegħed fuq kuttunar assorbenti u l-membrana nittitanti u tessut konnettiv ieħor jinqatgħu.

L-għajn imneħħija mill-ħofra tagħha titqiegħed fuq klamp tal-azzar inossidabbli b'tali mod li l-kornea tkun f'pożizzjoni vertikali. Imbagħad il-klamp jiġi ttrasferit f'kavità fl-apparat tas-superfużjoni (18). Il-klampijiet għandhom jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni b'tali mod li l-kornea sħiħa tiġi fornita bid-drip salina iżotonika (3-4 taqtiriet fil-minuta jew 0.1 sa 0.15 ml/min). Il-kavitajiet tal-apparat tas-superfużjoni għandu jkollhom temperatura kkontrollata ta' 32 ± 1.5 °C. L-Appendiċi 3 jipprovdi dijagramma ta' apparat tipiku tas-superfużjoni u l-klampijiet tal-għajnejn, li jistgħu jinxtraw jew jinbnew. L-apparat jista' jitbiddel sabiex jissodisfa l-ħtiġijiet ta' laboratorju individwali (eż. biex jakkomoda għadd differenti ta' għajnejn).

Wara li jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni, l-għajnejn jerġgħu jiġu eżaminati b'mikroskopju tal-kornea sabiex jiġi żgurat li ma tkun saritilhom l-ebda ħsara waqt il-proċedura tad-dissezzjoni. Il-ħxuna tal-kornea fil-quċċata tal-kornea għandha titkejjel ukoll issa bl-użu tal-apparat li jkejjel il-fond fuq il-mikroskopju korneali. Għajnejn b'; (i) punteġġ ta' żamma ta' fluworexxeina ta' > 0.5; (ii) opaċità korneali > 0,5; jew, (iii), kwalunkwe sinjal addizzjonali ta' ħsara għandhom jiġu ssostitwiti. Għal għajnejn li ma jintremewx fuq il-bażi ta' kwalunkwe wieħed minn dawn il-kriterji, għajnejn individwali bi ħxuna tal-kornea li tiddevja b'aktar minn 10 % mill-valur medju għall-għajnejn kollha għandhom jintremew. L-utenti għandhom ikunu konxji li l-mikroskopji korneali jistgħu jagħtu kejl differenti tal-ħxuna tal-kornea jekk l-issettjar tal-wisgħa tal-fetħa jkun differenti. Il-wisgħa tal-fetħa għandha tkun stabbilita għal 0,095 mm.

Ladarba l-għajnejn kollha jiġu eżaminati u approvati, l-għajnejn jiġu inkubati għal madwar 45 sa 60 minuta sabiex jiġu ekwilibrati mas-sistema tat-test qabel id-dożaġġ. Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, jiġi rreġistrat il-punt żero ta' referenza għall-ħxuna u l-opaċità tal-kornea sabiex iservi bħala bażi (jiġifieri ħin = 0). Il-punteġġ tal-fluworexxeina ddeterminat fid-dissezzjoni jintuża bħala l-ewwel kejl għal dak il-punt ta' tmiem.

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Eżatt wara l-kejl tal-punt żero ta' referenza, l-għajn (fl-apparat fejn titqiegħed) titneħħa mill-apparat tas-superfużjoni, titqiegħed f'pożizzjoni orizzontali, u s-sustanza kimika tat-test tiġi applikata fuq il-kornea.

Sustanzi kimiċi tat-test likwidi tipikament jiġu ttestjati mhux iddilwiti, iżda jistgħu jiġu ddilwiti jekk dan jitqies neċessarju (eż. bħala parti mit-tfassil tal-istudju). Is-solvent preferut għas-sustanzi kimiċi tat-test dilwiti huwa s-salina fiżjoloġika. Madankollu, jistgħu jintużaw solventi alternattivi ukoll f'kundizzjonijiet ikkontrollati, iżda għandu jintwera li dawn ikunu solventi xierqa biex jintużaw minflok is-salina fiżjoloġika.

Sustanzi kimiċi tat-test likwidi jiġu applikati fuq il-kornea b'tali mod li s-superfiċje sħiħa tal-kornea tkun miksija b'mod indaqs bis-sustanza kimika tat-test; il-volum standard huwa ta' 0.03 ml.

Jekk possibbli, is-sustanzi kimiċi tat-test solidi għandhom jintaħnu f'mehrież u lida, sa ma jkunu kemm jista' jkun fini, jew f'għodda tat-tħin komparabbli. It-trab jiġi applikat fuq il-kornea b'tali mod li l-kornea tkun miksija b'mod uniformi bis-sustanza kimika tat-test; l-ammont standard huwa ta' 0.03 gm.

Is-sustanza kimika tat-test (likwida jew solida) tiġi applikata għal 10 sekondi u mbagħad titlaħlaħ minn fuq l-għajn bis-salina iżotonika (madwar 20 ml) f'temperatura ambjentali. Imbagħad l-għajn (fl-apparat fejn titqiegħed) terġa' titqiegħed fl-apparat tas-superfużjoni fil-pożizzjoni wieqfa oriġinali. Jekk ikun hemm bżonn, jista' jsir iktar tlaħliħ wara l-applikazzjoni ta' 10 sek u f'punti ta' żmien sussegwenti (eż. jekk jinstabu residwi ta' sustanza kimika tat-test fuq il-kornea). B'mod ġenerali, l-ammont ta' salina li tintuża b'mod addizzjonali għat-tlaħliħ mhuwiex kritiku, iżda l-osservazzjoni tal-aderenza tas-sustanza kimika mal-kornea hija importanti.

Sustanzi Kimiċi tal-Kontroll

Kontrolli negattivi jew tas-solvent/veikolu paralleli u kontrolli pożittivi għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment.

Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati likwidi f'100 % jew solidi, tintuża salina fiżjoloġika bħala l-kontroll negattiv parallel fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE sabiex jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx bla bżonn f'rispons irritanti.

Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati likwidi ddilwiti, fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE jiġi inkluż grupp ta' kontrolli tas-solvent/veikolu parallel sabiex jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx bla bżonn f'rispons irritanti. Skont il-paragrafu 31, jista' jintuża biss solvent/veikolu li jkun intwera li ma jkollu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.

F'kull esperiment jiġi inkluż irritant għall-għajnejn magħruf sabiex jiġi vverifikat li jkun ġie kkawżat rispons xieraq. Minħabba li l-assaġġ ICE qed jintuża f'dan il-metodu ta' ttestjar biex jidentifika sustanzi kimiċi korrużivi jew irritanti severi, il-kontroll pożittiv għandu jkun sustanza ta' referenza li tikkawża rispons sever f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons sever ma għandux ikun eċċessiv. Għandha tiġi ġġenerata biżżejjed dejta in vitro għall-kontroll pożittiv sabiex għall-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi kkalkolata skala ta' valuri ddefiniti statistikament li tkun aċċettabbli. Jekk ma jkunx hemm disponibbli dejta storika xierqa tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE għal kontroll pożittiv partikolari, jista' jkun meħtieġ li jsiru studji li jipprovdu din l-informazzjoni.

Eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test likwidi huma l-aċidu aċetiku 10 % jew il-klorur tal-benżalkonju 5 %, filwaqt li eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test solidi huma l-idrossidu tas-sodju jew l-imidażol.

Is-sustanzi kimiċi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanzi kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew tal-prodotti jikkawżaw irritazzjoni okulari, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni okulari fi ħdan skala speċifika ta' risponsi ta' sustanzi irritanti.

Punti ta' Tmiem Imkejlin

Il-korneji ttrattati jiġu evalwati qabel it-trattament u mbagħad fit-30, fil-75, fil-120, fil-180 u fil-240 minuta (± 5 minuti) wara t-tlaħliħa ta' wara t-trattament. Dawn il-punti tal-ħin jipprovdu għadd xieraq ta' kejl tul il-perjodu tat-trattament ta' erba' sigħat, filwaqt li jħallu biżżejjed ħin jgħaddi bejn kejl u ieħor sabiex isiru l-osservazzjonijiet neċessarji li għandhom isiru għall-għajnejn kollha.

Il-punti ta' tmiem evalwati għall-opaċità, in-nefħa, iż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea u l-effetti morfoloġiċi (eż. tħaffir jew illaxkar tal-epitelju). Il-punti ta' tmiem kollha, bl-eċċezzjoni taż-żamma tal-fluworexxeina (li tiġi ddeterminata biss qabel it-trattament u 30 minuta wara l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test) jiġu ddeterminati f'kull wieħed mill-punti tal-ħin imsemmija hawn fuq.

It-teħid ta' ritratti huwa rrakkomandat għad-dokumentazzjoni tal-opaċità, iż-żamma tal-fluworexxeina, l-effetti morfoloġiċi fil-kornea u, jekk issir, l-istopatoloġija.

Wara l-eżami finali wara erba' sigħat, l-utenti huma mħeġġin jippreservaw l-għajnejn f'fissativ xieraq (eż. formalina bbaferjata newtrali) għal eżami istopatoloġiku possibbli (ara l-paragrafu 14 u r-referenza (8) għal iktar dettalji).

In-nefħa fil-kornea tiġi ddeterminata mill-kejl tal-ħxuna fil-kornea li jsir permezz ta' pakimetru ottiku fuq mikroskopju korneali. In-nefħa tiġi espressa bħala perċentwal u tiġi kkalkolata mill-kejl tal-ħxuna tal-kornea skont il-formula li ġejja:

Il-perċentwal medju tan-nefħa fil-kornea għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkolat għall-punti tal-ħin ta' osservazzjoni kollha. Fuq il-bażi tal-ogħla punteġġ medju għan-nefħa fil-kornea, kif jiġi osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin, jingħata punteġġ tal-kategorija għal kull sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 51).

L-opaċità korneali tiġi evalwata billi tintuża l-iktar parti tal-kornea opaċifikata b'densità għall-punteġġar kif muri fit-Tabella 1. Il-valur medju tal-opaċità fil-kornea għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkolat għall-punti tal-ħin ta' osservazzjoni kollha. Fuq il-bażi tal-ogħla punteġġ medju għall-opaċità fil-kornea, kif jiġi osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin, jingħata punteġġ tal-kategorija għal kull sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 51).

Tabella 1

Punteġġi tal-opaċità tal-kornea.

Iż-żamma tal-fluworexxeina tiġi evalwata fil-punt tal-ħin ta' osservazzjoni ta' 30 minuta biss kif muri fit-Tabella 2. Il-valur medju taż-żamma tal-fluworexxeina għall-għajnejn kollha tat-test jiġi kkalkolat għall-punt tal-ħin osservat ta' 30 minuta, u jintuża għall-punteġġ kumplessiv tal-kategorija għal kull sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 51).

Tabella 2

Punteġġi taż-żamma tal-fluworexxeina.

Effetti morfoloġiċi inkluż “tħaffir” taċ-ċelloli tal-epitelju tal-kornea, “illaxkar” tal-epitelju, “taħrix” tas-superfiċje tal-kornea u “twaħħi” tas-sustanza kimika tat-test mal-kornea. Dawn is-sejbiet jistgħu jvarjaw fis-severità u jistgħu iseħħu b'mod simultanju. Il-klassifikazzjoni ta' dawn is-sejbiet hija soġġettiva skont l-interpretazzjoni tal-investigatur.

DEJTA U RAPPORTAR

Evalwazzjoni tad-Dejta

Ir-riżultati tal-opaċità, in-nefħa, u ż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea għandhom jiġu evalwati b'mod separat sabiex tinħoloq klassi separata għal kull punt ta' tmiem. Imbagħad il-klassijiet tal-ICE għal kull punt ta' tmiem jiġu kkombinati sabiex tinħoloq Klassifikazzjoni tal-Irritazzjoni għal kull sustanza kimika tat-test.

Kriterji tad-Deċiżjoni

Ladarba jkun ġie evalwat kull punt ta' tmiem, il-klassijiet tal-ICE jistgħu jiġu assenjati fuq il-bażi ta' skala ta' valuri ddeterminata minn qabel. L-interpretazzjoni tan-nefħa tal-kornea (it-Tabella 3), l-opaċità (it-Tabella 4), u ż-żamma tal-fluworexxeina (it-Tabella 5) bl-użu ta' erba' klassijiet tal-ICE ssir skont l-iskali murijin hawn taħt. Ta' min jinnota li l-punteġġi tan-nefħa tal-kornea murija fit-Tabella 3 huma applikabbli biss jekk il-ħxuna titkejjel b'mikroskopju korneali (pereżempju Haag-Streit BP900) b'apparat tal-kejl tal-fond Nru 1 u ssettjar tal-wisgħa tal-ferq ta' 9, jiġifieri 0,095 mm. L-utenti għandhom ikunu konxji li l-mikroskopji korneali jistgħu jagħtu kejl differenti tal-ħxuna tal-kornea jekk l-issettjar tal-wisgħa tal-fetħa jkun differenti.

Tabella 3

Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għan-nefħa tal-kornea.

Tabella 4

Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għall-opaċità.

Tabella 5

Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għaż-żamma medja tal-fluworexxeina.

Il-klassifikazzjoni in vitro għal sustanza kimika tat-test hija vvalutata billi tinqara l-klassifikazzjoni tal-GHS li tikkorrispondi għat-taħlita ta' kategoriji miksuba għal nefħa korneali, opaċità korneali, u żamma tal-fluworexxeina kif deskritti fit-Tabella 6.

Tabella 6

Klassifikazzjonijiet in vitro kumplessivi.

Kriterji ta' Aċċettazzjoni tal-Istudju

Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontrolli negattivi jew tal-veikolu/solvent paralleli u l-kontrolli pożittivi paralleli jiġu identifikati bħala Mhux Ikklassifikati taħt il-GHS u tal-Kategorija 1 tal-GHS, rispettivament.