ANNESS I

METODI TA' TEĦID TA' KAMPJUNI

1.   GĦAN U SKOP

Kampjuni maħsubin għall-kontroll uffiċjali ta' l-għalf, għandhom jittieħdu skont il-metodi deskritti hawn taħt. Kampjuni miksubin b'dan il-mod għandhom jiġu kkunsidrati bħala rappreżentattivi tal-porzjonijiet li ttieħdu kampjuni minnhom.

2.   UFFIĊJALI LI JIEĦDU L-KAMPJUNI

Il-kampjuni għandhom jittieħdu minn uffiċjali awtorizzati għal dak l-iskop mill-Istati Membri.

3.   DEFINIZZJONIJIET

Porzjon kampjun: Kwantità ta' prodott li jikkostitwixxi unità, u li għandu karatteristiċi preżunti li huma uniformi.

Kampjun inkrimentali: Kwantità meħuda minn punt wieħed fil-porzjon li ttieħed kampjun minnu.

Kampjun aggregat: Aggregat ta' kampjuni inkrimentali meħudin mill-istess porzjon li ttieħed kampjun minnu.

Kampjun imnaqqas: Parti rappreżentattiva tal-kampjun aggregat miksuba minn tal-aħħar bi proċess ta' tnaqqis.

Kampjun finali: Parti tal-kampjun imnaqqas jew tal-kampjun aggregat omoġenizzat

4.   APPARAT

4.1.

L-apparat għat-teħid ta' kampjuni jrid ikun magħmul minn materjal li ma jikkontaminax il-prodotti li jridu jittieħdu kampjuni minnhom. Dan l-apparat jista' jkun approvat uffiċjalment mill-Istati Membri.

4.2.   Apparat rakkomandat għat-teħid ta' kampjuni minn għalf solidu

4.2.1.   It-teħid ta' kampjuni b'mod manwali

4.2.1.1.

Pala b'qiegħ ċatt bi ġnub vertikali.

4.2.1.2.

Lanzetta għat-teħid ta' kampjuni b'qasma twila jew kompartimenti. Il-qisien tal-lanzetta għat-teħid ta' kampjuni jridu jkunu adattati għall-karatteristiċi tal-porzjon bħala kampjun (fond tal-kontenitur, id-dimensjonijiet tal-ixkora eċċ) u għad-daqs tal-partikoli tal-għalf.

4.2.2.   Teħid ta' kampjuni b'mod mekkaniku

Apparat mekkaniku approvat jista' jintuża għat-teħid ta' kampjuni tal-għalf mobbli.

4.2.3.   Diviżur

Apparat imfassal sabiex jaqsam il-kampjun f'partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs jista' jintuża sabiex jittieħdu kampjuni inkrimentali u għall-preparazzjoni ta' kampjuni mnaqqsa u finali.

5.   ĦTIĠIET KWANTITATTIVI

5.A.	Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti ddistribwiti b'mod uniformi fl-għalf
5.A.1.	Porzjon li ttieħed kampjun minnu Id-daqs tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu jrid ikun tali li kull waħda mill-partijiet kostitwenti tiegħu tista' ttittieħed bħala kampjun.
5.A.2.	Kampjuni inkrimentali
5.A.2.1.	Għalf maħlul:	Numru minimu ta' kampjuni inkrimentali:
5.A.2.1.1.	Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li ma jaqbżux it-2,5 tunnellati metriċi	Sebgħa
5.A.2.1.2.	Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jaqbżu t-2,5 tunnellati metriċi	√ 20 darba n-numru ta' tunnellati metriċi li jiffurmaw il-porzjon li ttieħed kampjun minnu (*), sa massimu ta' 40 kampjun inkrimentali
5.A.2.2.	Għalf ippakkettjat:	Numru minimu ta' pakketti li għandhom jittieħdu kampjuni minnhom (**):
5.A.2.2.1.	Pakketti ta' aktar minn kg waħda:
5.A.2.2.1.1.	Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' pakkett sa erba' pakketti	il-pakketti kollha
5.A.2.2.1.2.	Porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' ħames pakketti sa 16-il pakkett	erbgħa
5.A.2.2.1.3.	Porzjonijiet li ttieħed kampjun minnhom ta' aktar minn 16-il pakkett	√ numru ta' pakketti li jiffurmaw il-porzjon bħala kampjun (*), sa massimu ta' 20 pakkett
5.A.2.2.2.	Pakketti li ma jaqbżux 1 kg	erbgħa
5.A.2.3.	Għalf likwidu jew semi-likwidu:	Numru minimu ta' kontenituri li għandhom jittieħdu kampjuni minnhom (**):
5.A.2.3.1.	Kontenituri ta' aktar minn litru:
5.A.2.3.1.1.	porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' kontenitur wieħed sa erba' kontenituri	il-kontenituri kollha
5.A.2.3.1.2.	porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' ħames kontenituri sa 16-il kontenitur	erbgħa
5.A.2.3.1.3.	porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom ta' aktar minn 16-il kontenitur	√ in-numru ta' kontenituri li jiffurmaw il-porzjon li ttieħed kampjun minnu (*), sa massimu ta' 20 kontenitur
5.A.2.3.2.	Kontenituri li ma jaqbżux litru wieħed	erbgħa
5.A.2.4.	Blokok tal-għalf u licks minerali	Numru minimu ta' blokok jew licks li jridu jittieħdu kampjuni minnhom (**): Blokka jew lick waħda għal kull porzjon bħala kampjun ta' 25 unità, sa massimu ta' erba' blokok jew licks
5.A.3.	Kampjun aggregat Għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu hemm bżonn ta' kampjun aggregat wieħed. L-ammont totali ta' kampjuni inkrimentali li jiffurmaw il-kampjun aggregat m'għandux ikun inqas mis-segwenti:
5.A.3.1.	Għalf maħlul	4 kg
5.A.3.2.	Għalf ippakkettjat:
5.A.3.2.1.	pakketti ta' aktar minn 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2.	pakketti li ma jaqbżux 1 kg	piż tal-kontenut ta' erba' pakketti oriġinali
5.A.3.3.	Għalf likwidu jew semi-likwidu:
5.A.3.3.1.	kontenituri ta' aktar minn litru	erba' litri
5.A.3.3.2.	kontenituri li ma jaqbżux il-litru	Volum tal-kontenuti ta' erba' kontenituri oriġinali
5.A.3.4.	Blokok tal-għalf jew licks minerali:
5.A.3.4.1.	kull waħda b'piż ta' aktar minn 1 kg	4 kg
5.A.3.4.2.	kull waħda b'piż ta' mhux aktar minn 1 kg	piż ta' erba' blokok jew licks oriġinali
5.A.4.	Kampjuni finali Il-kampjun aggregat jagħti l-kampjuni finali mat-tnaqqis meta neċessarju. L-analiżi ta' mill-inqas kampjun finali wieħed hija meħtieġa. L-ammont fil-kampjun finali għall-analiżi m'għandux ikun inqas mis-segwenti:
	Għalf solidu	500 g
	Għalf likwidu jew semi-likwidu	500 ml
5.B.	Fir-rigward tal–kontroll ta' sustanzi jew prodotti mhux mixtieqa li x'aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, bħal aflatossiċi, rye ergot, il-pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'għalf dirett (***)
5.B.1.	Porzjon kampjun: ara 5.A.1.
5.B.2.	Kampjuni inkrimentali
5.B.2.1.	Għalf maħlul: ara 5.A.2.1.
5.B.2.2.	Għalf ippakkettjat:	Numru minimu ta' pakketti għandhom jittieħdu kampjuni minnhom:
5.B.2.2.1.	porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jikkonsistu f'pakkett sa erba' pakketti	il-pakketti kollha
5.B.2.2.2.	porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jikkonsistu f'ħames sa 16-il pakkett	erbgħa
5.B.2.2.3.	porzjonijiet li ttieħdu l-kampjuni minnhom li jikkonsistu f'aktar minn 16-il pakkett	√ in-numru ta' pakketti li jiffurmaw il-porzjon li ttieħed kampjun minnu (*), sa massimu ta' 40 pakkett
5.B.3.	Kampjuni Aggregati In-numru ta' kampjuni aggregati jvarja mad-daqs tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu. In-numru minimu ta' kampjuni aggregati għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu huwa mogħti hawn taħt. Il-piż totali tal-kampjuni inkrimentali li jiffurmaw kull kampjun aggregat m'għandux ikun inqas minn 4 kg
5.B.3.1.	Għalf maħlul
	Piż tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu f'tunnellati metriċi:	Numru minimu ta' kampjuni aggregati għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu:
	sa 1	1
	aktar minn 1 u sa 10	2
	aktar minn 10 u sa 40	3
	Aktar minn 40	4
5.B.3.2.	Għalf ippakkjat
	Daqs tal-porzjon li ttieħed kampjun minnu f'numru ta' pakketti:	Numru minimu ta' kampjuni aggregati għal kull porzjon li ttieħed kampjun minnu:
	1 sa 16	1
	17 sa 200	2
	201 sa 800	3
	Aktar minn 800	4
5.B.4.	Kampjuni finali Kull kampjun aggregat jagħti l-kampjuni finali mat-tnaqqis. L-analiżi ta' mill-inqas kampjun finali wieħed għal kull kampjun aggregat hija meħtieġa. Il-piż tal-kampjun finali għall-analiżi ma jistax ikun inqas minn 500 g.

6.   ISTRUZZJONIJIET GĦAT-TEĦID, IL-PREPARAZZJONI U L-IPPAKKJAR TAL-KAMPJUNI

6.1.   Ġenerali

Il-kampjun għandu jittieħed u jiġi ppreparat malajr kemm jista' jkun waqt li wieħed iżomm f'moħħu l-prekawzjonijiet neċessarji sabiex jiġi assigurat li l-prodott la jinbidel u lanqas jiġi ikkontaminat. Strumenti kif ukoll is-superfiċi u l-kontenituri maħsubin biex jirċievu kampjuni għandhom ikunu nodfa u xotti.

6.2.   Kampjuni inkrimentali

6.2.A.   Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti ddistribwiti b'mod uniformi fl-għalf

Kampjuni inkrimentali jridu jittieħdu b'mod każwali matul il-porzjon ikkampjunat kollu u bejn wieħed u ieħor jridu jkunu tal-istess daqs.

6.2.A.1.   Għalf maħlul

Trid issir diviżjoni immaġinarja tal-porzjon kampjun f'numru ta' partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs. Numru ta' partijiet li jikkorrispondu għan-numru ta' partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs meħtieġa skont 5.A.2 għandhom jintagħżlu b'mod każwali u tal-inqas irid jittieħed kampjun wieħed minn dawn il-partijiet.

Fejn ikun hemm bżonn, it-teħid ta' kampjuni jista' jsir meta l-porzjon kampjun ikun qiegħed jiġi spustjat (jitgħabba jew jinħatt).

6.2.A.2.   Għalf ippakkjat

Wara li jkunu ntagħżlu n-numru ta' pakketti meħtieġa għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f 5.A.2, parti mill-kontenut ta' kull pakkett għandha titneħħa permezz ta' lanzetta jew pala. Fejn meħtieġ, il-kampjuni għandhom jittieħdu wara li l-pakketti jitbattlu separatament. Kull biċċa sħiħa għandha titkisser, jekk ikun hemm bżonn, billi tinfired u mbagħad titpoġġa lura fil-kampjuni, separatament f'kull kampjun aggregat.

6.2.A.3.   Għalf likwidu jew semi-likwidu omoġenju jew omoġjenizzabbli

Wara li jkun intagħżel in-numru ta' kontenituri meħtieġa għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f 5.A.2, jekk ikun hemm bżonn, il-kontenuti għandhom jiġu omoġjenizzati u jittieħed ammont minn kull kontenitur.

Il-kampjuni inkrimentali jistgħu jittieħdu meta l-kontenut ikun qiegħed jitbattal.

6.2.A.4.   Għalf likwidu jew semi-likwidu mhux omoġenizzabbli

Wara li jkun intagħżel in-numru meħtieġ ta' kontenituri għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f 5.A.2., il-kampjuni għandhom jittieħdu minn livelli differenti.

Jistgħu wkoll jittieħdu kampjuni meta l-kontenut ikun qiegħed jitbattal imma l-ewwel frazzjonijiet għandhom jintremew.

Fi kwalunkwe każ il-volum totali meħud m'għandux ikun inqas minn 10 litri.

6.2.A.5.   Blokok tal-għalf u licks minerali

Wara li jkun intgħażel in-numru ta' blokok jew licks meħtieġa għat-teħid ta' kampjuni kif indikat f5.A.2, tittieħed parti minn kull blokka jew lick.

6.2.B.   Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti mhux mixtieqa li x'aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, bħal aflatossiċi, rye ergot, il-pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'materjal tal-għalf.

Trid issir diviżjoni immaġinarja tal-porzjon kampjun f'numru ta' partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs, li tikkorrispondi għan-numru ta' kampjuni aggregati msemmija f 5.B.3. Jekk dan in-numru huwa aktar minn wieħed, in-numru totali ta' kampjuni inkrimentali msemmija f 5.B.2 għandu jkun distribwit bejn wieħed u ieħor ugwalment fuq il-partijiet differenti. Wara ħu kampjuni ta' bejn wieħed u ieħor l-istess daqs (1)btali mod li l-ammont totali fil-kampjuni ma jkunx inqas mill-kwantità minima ta' 4 kg meħtieġa għal kull kampjun aggregat. Kampjuni inkrimentali meħuda minn partijiet differenti ma għandhomx jiġu aggregati.

6.3.   Preparazzjoni ta' kampjuni aggregati

6.3.A.   Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti distribwiti uniformement fl-għalf

Il-kampjuni inkrimentali għandhom jitħalltu biex jagħmlu kampjun aggregat wieħed.

6.3.B.   Fir-rigward tal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti mhux mixtieqa li x'aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf, bħal aflatoxins, rye ergot, pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'materjali tal-għalf

Il-kampjuni inkrimentali minn kull parti tal-porzjon kampjun għandhom jitħalltu u għandhom jittieħdu n-numru ta' kampjuni aggregati imsemmija f'5.B.3, waqt li tingħata attenzjoni għall-oriġini ta' kull kampjun aggregat.

6.4.   Preparazzjoni tal-kampjuni finali

Il-materjal f'kull kampjun aggregat għandu jitħallat b'reqqa sabiex jinkiseb kampjun omoġenizzat (2). Jekk ikun hemm bżonn, il-kampjun aggregat għandu l-ewwel jiġi mnaqqas għal tal-anqas 2 kg jew żewġ litri (kampjun imnaqqas) jew bl-użu ta' diviżur mekkaniku jew bl-użu ta' diviżur awtomatiku jew bil-metodu tal-qsim f'erba' partijiet.

Wara, għandhom jiġu preparati tal-inqas tliet kampjuni finali, ta' bejn wieħed u ieħor l-istess ammont u li jkunu konformi mal-ħtiġiet kwantitattivi ta' 5.A.4 jew 5.B.4. Kull kampjun għandu jitpoġġa f'kontenitur xieraq. għandhom jittieħdu l-prekawzjonijiet kollha meħtieġa sabiex jiġi evitat bdil fil-kompożizzjoni tal-kampjun, il-kontaminazzjoni jew adulterazzjoni li tista' sseħħ waqt il-ġarr jew il-ħżin.

6.5.   Ippakkjar tal-kampjuni finali

Il-kontenituri jew il-pakketti għandhom jiġu ssiġillati u ttikkettjati (it-tikketta kollha trid tkun inkorporata fis-siġill) b'tali mod li ma jkunux jistgħu jinfetħu mingħajr ma ssir ħsara lis-siġill.

7.   REĠISTRU TAT-TEĦID TA' KAMPJUNI

Irid jinżamm reġistru ta' kull teħid ta' kampjun, li jippermetti li kull porzjon kampjun tkun identifikata b'mod ċar.

8.   DESTINAZZJONI TAL-KAMPJUNI

Għal kull kampjun aggregat, irid jintbagħat tal-inqas kampjun finali wieħed lill-laboratorju analitiku awtorizzat malajr kemm jista' jkun, flimkien mal-informazzjoni neċessarja għall-analista.

---

(*)  Fejn in-numru miksub huwa frazzjoni, dan għandu jiġi mqarreb għan-numru sħiħ li jmiss.

(**)  Għall-pakketti jew kontenituri li l-kontenut tagħhom ma jaqbiżx 1 kg jew litru wieħed u għal blokok jew licks li ma jiżnux aktar minn 1 kg kull wieħed, kampjun inkrimentali għandu jkun il-kontenuti ta' pakkett jew kontenitur oriġinali wieħed, blokka waħda jew lick waħda.

(***)  Il-metodi previsti f'5A huma għal użu fil-kontroll ta' aflatossiċi, rye ergot, pjanta tar-riġnuwa u crotalaria f'għalf komplet u komplementari.

(1)  Għal għalf ippakkettjat, parti mill-kontenut tal-pakketti li għandu jittieħed kampjun minnhom għandha titneħħa, bl-użu ta' lanzetta jew pala, wara li l-pakketti jkunu tbattlu separatament, jekk neċessarju.

(2)  B'mod separat, il-biċċiet sħaħ f'kull kampjun aggregat għandhom jitkissru (jekk ikun hemm bżonn, billi jinfirdu u jitpoġġew lura fil-kampjun).

ANNESS II

DISPOŻIZZJONIJIET ĠENERALI DWAR IL-METODI GĦALL-ANALIŻI TAL-GĦALF

A.   PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUNI GĦALL-ANALIŻI

1.   Skop

Il-proċeduri deskritti hawn taħt jikkonċernaw il-preparazzjoni għall-analiżi tal-kampjuni finali, mibgħuta fil-laboratorji tal-kontroll wara t-teħid ta' kampjuni skont id-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.

Dawn il-kampjuni jridu jiġu ppreparati b'tali mod li l-ammonti li jintiżnu, kif imsemmija fil-metodi tal-analiżi, jkunu omoġenji u rappreżentattivi tal-kampjuni finali.

2.   Prekawzjonijiet li jridu jittieħdu

Il-proċedura ta' preparazzjoni tal-kampjun li trid tiġi segwita tiddependi fuq il-metodi ta' analiżi użati. għalhekk huwa importanti ferm li l-proċedura segwita għall-preparazzjoni tal-kampjun tkun waħda xierqa għall-metodu ta' analiżi użat.

L-operazzjonijiet neċessarji kollha jridu jsiru b'tali mod li sa fejn ikun possibbli tiġi evitata kemm il-kontaminazzjoni tal-kampjun kif ukoll kull bidla fil-kompożizzjoni tiegħu.

It-tħin, it-taħlit u l-mogħdija minn passatur għandhom isiru kemm jista' jkun malajr b'espożizzjoni minima tal-kampjun għall-arja u d-dawl. M'għandhomx jintużaw imtieħen u grinders li jistgħu jsaħħnu l-kampjun b'mod apprezzabbli.

It-tħin manwali huwa rakkomandat għall-għalf li huwa partikolarment sensittiv għas-sħana. Trid tingħata attenzjoni wkoll sabiex jiġi assigurat li l-apparat innifsu ma jkunx sors ta' kontaminazzjoni tal-elementi ta' traċċa.

Jekk il-preparazzjoni ma tistax issir mingħajr bidliet sostanzjali fl-umdità tal-kampjun, iddetermina l-kontenut likwidu qabel u wara l-preparazzjoni skont il-metodu stabbilit f'Parti A tal-Anness III.

3.   Proċedura

Aqsam il-kampjun f'subkampjuni adegwati billi tuża tekniki adegwati għall-qsim bħal impalar alternattiv, it-tqallib stazzjonarju jew ċirkolari. Il-coning u l-qsim f'erba biċċiet mhuwiex rakkomandat għax dawn jistgħu jipprovdu subkampjuni bi probabbiltà għolja ta' żball fil-qsim. Żomm il-kampjun għar-referenza f'kontenitur xieraq, nadif, xott, li għandu għatu li ma tgħaddix arja minnu, u pprepara s-subkampjuni għall-analiżi ta' almenu 100 g kif indikat hawn taħt.

3.1.   Għalf li jista' jintaħan kif inhu

Sakemm ma jkunx speċifikat b'mod ieħor fil-metodi tal-analiżi, jekk ikun hemm bżonn, wara t-tħin, għaddi l-kampjun kollu minn passatur b'xibka kwadra b'toqob ta' 1 mm (skont ir-rakkomandazzjoni ISO R565). Evita li titħan iż-żejjed.

Ħallat il-kampjun mgħoddi minn passatur u iġbru f'kontenitur xieraq, nadif, xott, li għandu għatu li ma tgħaddix arja minnu. Erġa' ħallat immedjatament qabel ma tiżen l-ammont għall-analiżi.

3.2.   Għalf li jista' jintaħan wara li jinxef

Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor fil-metodi tal-analiżi, nixxef il-kampjun sabiex tniżżel l-umdità tiegħu għal-livell ta' 8 sa 12 %, skont il-proċedura preliminari ta' tnixxif deskritta fil-punt 4.3 tal-metodu ta' determinazzjoni tal-umdità imsemmi f'Parti A tal-Anness III. Wara kompli kif indikat fit-taqsima 3.1.

3.3.   Għalf likwidu jew semi-likwidu

Iġbor il-kampjun f'kontenitur xieraq, nadif, xott, li għandu għatu li ma tgħaddix arja minnu. Ħallat sewwa eżatt qabel ma tiżen l-ammont għall-analiżi.

3.4.   Għalf ieħor

Kampjuni li ma jistgħux jiġu ppreparati skont waħda mill-proċeduri msemmija hawn fuq, għandhom jiġu ttrattati bi kwalunkwe proċedura oħra li tassigura li l-ammonti li ntiżnu għall-analiżi jkunu omoġenji u rappreżentattivi tal-kampjuni finali.

4.   Ħżin tal-kampjuni

Il-kampjuni jridu jinħażnu f'temperatura li ma tibdilx il-kompożizzjoni tagħhom. Il-kampjuni intenzjonati għall-analiżi ta' vitamini jew sustanzi li huma partikolarment sensittivi għad-dawl għandhom jinħażnu f'kontenituri tal-ħġieġ kannella.

B.   DISPOŻIZZJONIJIET RELATATI MAR-REAĠENTI U L-APPARAT UŻAT FIL-METODI TAL-ANALIŻI

1.

Sakemm mhux speċifikat b'mod ieħor fil-metodi tal-analiżi, ir-reaġenti analitiċi kollha jridu jkunu analitikament puri (a.p.). Meta ssir analiżi għal traċċi, il-purità tar-reaġenti trid tiġi iċċekkjata b'test blank. Skont ir-riżultati miksuba, jista' jkun hemm bżonn ta' aktar purifikazzjoni tar-reaġenti.

2.

Kull operazzjoni li tinvolvi l-preparazzjoni ta' soluzzjonijiet, sustanza dilwita, tlaħliħ jew ħasil imsemmija fil-metodi ta' analiżi mingħajr indikazzjoni għan-natura tas-solvent jew id-dilwent użat, timplika li jrid jintuża l-ilma. Bħala regola ġenerali, l-ilma jrid jiġi demineralizzat jew distillat. F'każijiet partikolari indikati fil-metodi tal-analiżi, irid jiġi sottomess għal proċeduri speċjali ta' purifikazzjoni.

3.

Minħabba l-apparat li normalment jinstab f'laboratorji ta' kontroll, dawk l-istrumenti u apparat li huma speċjali jew li jeħtieġu użu speċifiku biss huma imsemmija fil-metodi ta' analiżi. Dawn iridu jkunu nodfa, speċjalment meta jkun meħtieġ li jiġu determinati ammonti żgħar ta' sustanzi.

C.   APPLIKAZZJONI TAL-METODI TA' ANALIŻI U ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

1.   Proċedura ta' estrazzjoni

Diversi metodi jiddeterminaw proċedura ta' estrazzjoni speċifika. Bħala regola ġenerali, jistgħu jiġu applikati proċeduri oħrajn ta' estrazzjoni apparti l-proċedura msemmija, bil-kundizzjoni li tkun ingħatat prova li l-proċedura ta' estrazzjoni użata għandha l-effikaċja tal-estrazzjoni ekwivalenti għall-massa analizzata bħalma għandha l-proċedura msemmija fil-metodu.

2.   Proċedura ta' tindif

Diversi metodi jiddeterminaw proċedura speċifika ta' tindif. Bħala regola ġenerali, jistgħu jiġu applikati proċeduri oħra ta' tindif apparti l-proċedura msemmija, bil-kundizzjoni li tkun ingħatat prova li l-proċedura ta' tindif użata tirriżulta f'riżultati analitiċi ekwivalenti għall-matriċi analizzata bħall-proċedura msemmija fil-metodu.

3.   Rappurtaġġ tal-metodu ta' analiżi użat

Ġeneralment, metodu wieħed ta' analiżi huwa stabbilit għad-determinazzjoni ta' kull sustanza fl-għalf. Fejn jingħataw ħafna metodi, il-metodu partikolari użat mill-laboratorju ta' kontroll irid ikun indikat fuq ir-rapport tal-analiżi.

4.   Numru ta' determinazzjonijiet

Ir-riżultat mogħti fir-rapport tal-analiżi għandu jkun il-valur medju miksub minn tal-inqas żewġ determinazzjonijiet, li jkunu saru fuq porzjonijiet separati tal-kampjun u ta' ripetibilità sodisfaċenti.

Madankollu, f'każ ta' analiżi ta' sustanzi mhux mixtieqa, jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni ikun sostanzjalment (> 50 %) inqas mill-ispeċifikazzjoni li trid tiġi kkontrollata, m'hemmx bżonn ta' determinazzjonijiet addizzjonali, bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta' kwalità xierqa.

Fil-każ tal-kontroll tal-kontenut iddikjarat ta' sustanza jew ingredjent, jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni jikkonferma l-kontenut iddikjarat, jiġifieri r-riżultat analitiku jaqa' fi ħdan il-marġni ta' varjazzjoni aċċettabbli tal-kontenut iddikkjarat, m'hemm bżonn tal-ebda determinazzjoni addizzjonali, bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta' kwalità xierqa.

F'ċerti każijiet dan il-marġni ta' varjazzjoni aċċettabbli huwa definit f'leġiżlazzjoni bħalma hemm fid-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE (1)

5.   Rappurtaġġ tar-riżultat analitiku

Ir-riżultat analitiku għandu jiġi mfisser bil-mod stabbilit fil-metodu ta' analiżi għal numru xieraq ta' ċifri sinifikanti u jekk ikun hemm bżonn, għandu jiġi kkoreġut għall-kontenut likwidu tal-kampjun finali qabel il-preparazzjoni.

6.   Inċertezza tal-kejl u r-rata ta' rkuprar fil-każ ta' analiżi ta' sustanzi mhux mixtieqa.

Rigward is-sustanzi mhux mixtieqa fi ħdan it-tifsira tad-Direttiva 2002/32/KE, inkluż dijossini u PCBs simili għad-dijossini, prodott intenzjonat għall-għalf tal-annimali għandu jitqies bħala mhux konformi mal-kontenut massimu stabbilit, jekk ir-riżultat analitiku jitqies li jaqbeż il-kontenut massimu filwaqt li tiġi kkunsidrata kemm l-inċertezza tal-kejl imwessa' kif ukoll il-korrezzjoni għall-irkupru. Sabiex tiġi analizzata l-konformità, tintuża l-konċentrazzjoni analizzata wara li tiġi kkoreġuta għall-irkupru u wara t-tnaqqis tal-inċertezza tal-kejl imwessa'. Din il-proċedura hija applikabbli biss f'każijiet fejn il-metodu tal-analiżi jippermetti l-istima tal-inċertezza tal-kejl u l-korrezzjoni għall-irkupru (eż. Mhux possibbli fil-każ ta' analiżi mikroskopika).

Ir-riżultat analitiku għandu jiġi rappurtat kif ġej (sakemm il-metodu ta' analiżi użat jippermetti li tiġi stmata l-inċertezza tal-kejl u r-rata tal-irkupru):

(a)	ikkoreġut għall-irkupru, bil-livell ta' rkuprar ikun indikat. Il-korrezzjoni għall-irkupru mhix neċessarja fil-każ li r-rata tal-irkupru tkun bejn 90 – 110 %.

(b)	bħala “x +/- U”, fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl imwessa', billi jintuża fattur ta' kopertura ta' 2 li jagħti livell ta' fiduċja ta' madwar 95 %.

Madankollu, jekk ir-riżultat tal-analiżi huwa sostanzjalment (> 50 %) inqas mill-ispeċifikazzjoni li trid tiġi kkontrollata, u bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri xierqa ta' kwalità, u l-analiżi sservi biss l-iskop li tiġi ċċekkjata l-konformità mad-dispożizzjonijiet legali, ir-riżultat analitiku jista' jiġi rrappurtat mingħar korrezzjoni għall-irkupru u f'dawn il-każijiet, ir-rappurtaġġ tar-rata tal-irkupru u l-inċertezza tal-kejl jistgħu jitħallew barra.

---

(1)  ĠU L 86, 6.4.1979, p. 30.

ANNESS III

METODI TA' ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-KOMPOŻIZZJONI TAL-MATERJALI TAL-GĦALF U L-GĦALF KOMPOST

A.   DETERMINAZZJONI TAL-UMDITÀ

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-umdità fl-għalf. Fil-każ ta' għalf li jkun fih sustanzi volatili, bħall-aċidi organiċi, għandu jiġi osservati li ammont sinifikanti ta' sustanzi volatili wkoll jiġi determinat flimkien mal-umdità.

Dan ma jkoprix l-analiżi ta' prodotti tal-ħalib bħala materjal għall-għalf, l-analiżi ta' sustanzi minerali u taħlitiet fil-maġġoranza komposti minn sustanzi minerali, l-analiżi ta' xaħmijiet u żjut mill-annimali u mill-ħxejjex jew l-analiżi taż-żerriegħa taż-żejt u frott żejtni.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jitnixxef taħt kundizzjonijiet speċifikati li jvarjaw skont in-natura tal-għalf. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin. Huwa neċessarju li tagħmel tnixxif preliminari meta tkun qed titratta ma' għalf solidu li li għandu kontenut ta' umdità għoli.

3.   Apparat

3.1.

Kraxer magħmul minn materjal li ma jassorbix l-umdità u li jkun faċli biex jitnaddaf, jippermetti tifrik rapidu u ndaqs mingħajr ma jipproduċi sħana apprezzabbli, sa fejn possibbli jipprevjeni l-kuntatt mal-arja ta' barra u jissodisfa l-ħtiġiet stabbiliti f'4.1.1. u 4.1.2. (e.ż. taħħana-mikro tal-martell jew imkessħa bl-ilma, taħħana f'forma ta' koni li jistgħu jiġu żarmati, taħħana li jaħdmu bil-mod jew dawk b'roti bis-snien).

3.2.

Miżien analitiku, preċiż sa 1 mg.

3.3.

Kontenituri xotti magħmulin minn metall li ma jissaddadx jew tal-ħġieġ bl-għotien li jassiguraw għeluq li ma tgħaddix arja minnu, superfiċje ta' fejn isir ix-xogħol li jippermetti li l-kampjun għat-test jinfirex f'madwar 0,3 g/cm2.

3.4.

Forn isotermiku li jissaħħan bl-elettriku (± 2 oC) ventilat kif suppost u li jassigura regolazzjoni rapida tat-temperatura (1).

3.5.

Forn tal-vakum li jisħon bl-elettriku li jista' jkun aġġustat armat b'pompa għaż-żejt u/jew b'mekkaniżmu li jintroduċi arja xotta sħuna jew aġent li jnixxef (eż. ossidu tal-kalċju).

3.6.

Dessikatur b'metall oħxon perforat jew pjanċa tal-porċellana, li fiha aġent li jnixxef b'mod effiċjenti.

4.   Proċedura

N.B.	L-operazzjonijiet deskritti f'din it-taqsima jridu jsiru immedjatament wara li jinfetħu l-pakketti tal-kampjuni. Tal-inqas, l-analiżi trid issir darbtejn.

4.1.   Preparazzjoni

4.1.1.   Għalf għajr dak imniżżel taħt 4.1.2 u 4.1.3

Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Jekk ikun hemm bżonn, farrak jew aqsam b'tali mod li tevita kwalunkwe varjazzjoni fl-umdità (ara 6).

4.1.2.   Ċereali u xgħir u barli mitħun oħxon

Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Itħan f'partikoli li minnhom tal-inqas 50 % jgħaddu minn passatur b'malji ta' 0,5 mm u ma jibqax iktar minn 10 % skart f'passatur tond b'malji ta' 1 mm

4.1.3.   Għalf f'forma likwida jew pejst, għalf kompost fil-maġġoranza minn żjut u xaħmijiet

Ħu madwar 25 g mill-kampjun, iżen sal-eqreb 10 mg, żid kwantità xierqa ta' ramel anidridu miżun sal-eqreb 10 mg u ħallat sakemm jinkiseb prodott omoġenju.

4.2.   Tnixxif

4.2.1.   Għalf aparti dak taħt 4.2.2 u 4.2.3

Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 1 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 103 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Ħallih ħa jinxef għal madwar erba' sigħat ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 103 oC. Erġa' poġġi l-għatu fuq il-kontenitur, u neħħih mill-forn u ħallih jibred għal madwar 30 sa 45 minuta fid-dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.

Għal għalf kompost fil-maġġoranza minn żjut u xaħmijiet, nixxef fil-forn għal 30 minuta oħra b'temperatura ta' 130 oC. Id-differenza bejn użin u ieħor m'għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-umdità.

4.2.2.   Ċereali, dqiq, xgħir u barli mitħun oħxon u qamħ mitħun mhux raffinat

Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun mitħun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 130 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Ħallih ha jinxef għal sagħtejn ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 130 oC. Erġa' poġġi l-għatu fuq il-kontenitur, u neħħih mill-forn u ħallih jibred għal madwar 30 sa 45 minuta fid-dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.

4.2.3.

Għalf kompost li fih aktar minn 4 % sukrożju jew lattożju: materjal tal-għalf bħal ħarrub, prodotti taċ-ċereali idrolizzati, żerriegħa tax-xgħir, laqx tal-pitravi imnixxef, sustanzi li jdubu tal-ħut u taz-zokkor; għalf kompost li fih aktar minn 25 % melħ minerali inkluż l-ilma tal-kristallazzjoni. Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn tal-arja (3.5) li huwa diġà msaħħan sa bejn 80 oC u 85 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Tella' l-pressjoni sa 100 Torr u ħallih ħa jinxef f'din il-pressjoni għal madwar erba' sigħat, jew f'kurrent ta' arja taħraq u niexfa jew bl-użu ta' aġent li jnixxef (madwar 300 g għal 20 kampjun). F'każ li tuża dan tal-aħħar, skonnettja l-pompa tal-arja meta tintlaħaq il-pressjoni preskritta. Ikkalkula l-ħin tat-tnixxif mill-mument meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 80 oC sa 85 oC. B'attenzjoni erġa' ġib il-forn lura għall-pressjoni atmosferika. Iftaħ il-forn, poġġi l-għatu fuq il-kontenitur minnufih, neħħi l-kontenitur mill-forn, ħallih ħa jibred għal 30 sa 45 minuta f'dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg. Nixxef għal 30 minuta oħra fil-forn vakwu b'temperatura ta' 80 oC sa 85 oC u erġa' iżen. Id-differenza bejn iż-żewġ piżijiet m'għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-umdità.

4.3.   Tnixxif preliminari

4.3.1.   Għalf aparti dak taħt 4.3.2

Għalf solidu b'umdità għolja li jagħmel it-tħin diffiċli għandu jkun soġġett għal tnixxif preliminari kif ġej:

Iżen 50 g tal-kampjun mhux imfarrak sal-eqreb 10 mg (jekk ikun hemm bżonn, għalf kompressat jew agglomerat jista' jinqasam b'mod każwali) f'kontenitur adattat (eż. platt tal-aluminju 20 × 12 cm b'xifer ta 0,5 cm). Ħallih ħa jinxef f'forn b'60 oC sa 70 oC sakemm l-umdità tkun tnaqqset għal bejn 8 % u 12 %. Neħħih mill-forn u ħallih ħa jibred mikxuf fil-laboratorju għal siegħa u iżen sal-eqreb 10 mg. Farrak immedjatament kif indikat f'4.1.1 u nixxef kif indikat f'4.2.1 jew 4.2.3 skont in-natura tal-għalf.

4.3.2.   Ċereali

Qamħ b'umdità ta' aktar minn 17 % irid ikun soġġett għal tnixxif preliminari kif ġej:

Iżen 50 g qamħ mhux mitħun sal-eqreb 10 mg f'kontenitur adattat (eż. platt tal-aluminju 20 × 12 cm b'xifer ta 0,5 cm). Ħallih ħa jinxef f'forn ta' 130 oC għal 5 sa 7 minuti. Neħħih mill-forn u ħallih ħa jibred mikxuf fil-laboratorju għal sagħtejn u iżen sal-eqreb 10 mg. Farrak immedjatament kif indikat f'4.1.2 u nixxef kif indikat f'4.2.2.

5.   Kalkolu tar-riżultati.

L-umdità (X), bħala perċentwal tal-kampjun, hija kkalkulata billi jintużaw il-formoli li ġejjin:

5.1.   Tnixxif mingħajr tnixxif preliminari

fejn:

m	=	piż inizjali fi grammi, tal-kampjun għat-test,
m0	=	piż fi grammi, tal-kampjun għat-test imnixxef.

5.2.   Tnixxif bi tnixxif preliminari

fejn:

m	=	piż inizjali fi grammi, tal-kampjun għat-test,
m1	=	piż fi grammi, tal-kampjun għat-test wara t-tnixxif preliminari,
m2	=	piż fi grammi, tal-kampjun għat-test war t-tifrik jew it-tħin,
m0	=	piż fi grammi, tal-kampjun għat-test imnixxef.

5.3.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li saru fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn 0,2 % tal-valur assolut tal-umdità.

6.   Osservazzjoni

Jekk jidher li hemm bżonn tat-tifrik u jekk dan jidher li jibdel l-umdità tal-prodott, ir-riżultati tal-analiżi tal-komponenti tal-għalf iridu jiġu korretti skont l-umdità tal-kampjun fl-istat inizjali tiegħu.

B.   DETERMINAZZJONI TAL-UMDITÀ FIX-XAĦMIJIET U Ż-ŻJUT TAL-ANNIMALI U L-ĦXEJJEX

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-ilma u sustanzi volatili fiż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jitnixxef għal piż kostanti (it-telf fil-piż bejn żewġ piżijiet suċċessivi jrid ikun inqas jew ugwali għal 1 mg) f'103 oC. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin.

3.   Apparat

3.1.

Dixx b'qiegħ ċatt, magħmul minn materjal li jiflaħ għall-korrużjoni, b'dijametru ta' 8 sa 9 cm u għoli bejn wieħed u ieħor 3 cm.

3.2.

Termometru b'bozza rinfurzata u b'tubu ta' espansjoni fit-tarf ta' fuq, immarkat minn madwar 80 oC sa mill-anqas 110 oC, u twil madwar 10 cm.

3.3.

Banju tar-ramel jew hot-plate tal-elettriku.

3.4.

Dessikatur, li fih aġent li jnixxef effiċjenti.

3.5.

Miżien analitiku.

4.   Proċedura

Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun omoġenizzat, fid-dixx xott li jkun intiżen minn qabel (3.1) bit-termometru fih (3.2). Saħħan fuq il-banju tar-ramel jew fuq il-hot-plate (3.3), filwaqt li tħawwad kontinwament sabiex it-temperatura tilħaq 90 oC f'madwar 7 minuti.

Naqqas is-sħana, filwaqt li tinnota l-frekwenza li biha l-bżieżaq jitilgħu mill-qiegħ tad-dixx. It-temperatura m'għandhiex taqbeż il-105 oC. Kompli ħawwad, aqla' mill-qiegħ tad-dixx sakemm ma jibqgħux jiffurmaw aktar bżieżaq.

Sabiex tassigura l-eliminazzjoni kompluta tal-umdità, erġa' saħħan għal diversi drabi għal 103 oC ± 2 oC, berred sa 93 oC bejn it-tisħin suċċessiv. Imbagħad ħallih jiksaħ sat-temperatura tal-ambjent fid-dessikatur (3.4) u iżen. Irrepeti din l-operazzjoni sakemm it-telf fil-piż bejn żewġ piżijiet suċċessivi ma tkunx aktar minn 2 mg.

N.B.	Żieda fil-piż tal-kampjun wara tisħin ripetut tindika ossidazzjoni tax-xaħam, u f'dan il-każ ikkalkula r-riżultat mill-użin li jkun sar immedjatament qabel ma beda jiżdied il-piż.

5.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-umdità (X), bħala perċentwali tal-kampjun, jiġi kkalkulat permezz tal-formula segwenti:

fejn:

m	=	piż, fi grammi, tal-kampjun għat-test;
m1	=	piż, fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu qabel jissaħħan;
m2	=	piż fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu wara li jissaħħan.

Riżultati inqas minn 0,05 % jridu jiġu rrekordjati bħala “inqas minn 0,05 %”.

Ripetibbiltà

Id-differenza fl-umdità bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li jkunu saru fuq l-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu 0,05 %, f'valur assolut.

C.   DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAL-PROTEINA MHUX RAFFINATA

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-kontenut tal-proteina mhux raffinata fl-għalf fuq il-bażi tal-kontenut tan-nitroġenu, iddeterminat skont il-metodu Kjeldahl.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa diġerit bl-aċidu sulfuriku fil-preżenza ta' katalista. Is-soluzzjoni aċidika hija magħmula alkalina b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju. L-ammonja hija distillata u miġbura fi kwantità mkejla ta' aċidu sulfuriku li l-eċċess tagħha huwa titrat b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju.

Inkella, l-ammonja libera hija distillata f'eċċess ta' soluzzjoni ta' aċidu boriku, segwita minn titrazzjoni b'soluzzjoni ta' aċidu idrokloriku jew aċidu sulfuriku.

3.   Reaġenti

3.1.

Sulfat tal-potassju.

3.2.

Katalist: copper (II) oxide CuO jew copper (II) sulphate pentahydrate, CuSO4 5H2O.

3.3.

Frak taż-żingu.

3.4.

Aċidu sulfuriku, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Aċidu sulfuriku, soluzzjoni volumetrika standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indikatur tal-metil aħmar; dewweb 300 mg metil aħmar f'100 ml etanol, , σ = 95–96 % (v/v).

3.9.

Soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (Jista' jintuża l-grad tekniku) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni volumetrika standard c (NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni volumetrika standard c (NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Ħaffiefa mfarrka, maħsula fl-aċidu idrokloriku u mogħTija n-nar.

3.13.

Acetanilide (m.p. = 114 oC, N-kontenut = 10,36 %).

3.14.

Sukrożju (ħieles min-nitroġenu).

3.15.

Aċidu boriku (H3BO3).

3.16.

Soluzzjoni tal-indikatur tal-metil aħmar: dewweb 100 mg metil aħmar f'100 ml etanol jew metanol.

3.17.

Soluzzjoni ta' bromocresol aħdar: dewweb 100 mg bromocresol aħdar f'100 ml etanol jew metanol.

3.18.

Soluzzjoni tal-aċidu boriku (10 g/l sa 40 g/l skont l-apparat użat) Meta tiġi applikata l-aħħar ditezzjoni kolorimetrika, l-indikaturi metil aħmar u l-bromocresol iridu jiżdiedu mas-soluzzjonijiet tal-aċidu boriku. Jekk jiġi ppreparat 1 l aċidu boriku, qabel jiġi aġġustat il-volum, għandhom jiżdiedu 7 ml soluzzjoni tal-indikatur metil aħmar (3.16) u 10 ml soluzzjoni ta' bromocresol aħdar (3.17). Il-pH tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku tista' tvarja minn lott għal lott skont l-ilma użat. Ħafna drabi jkun hemm bżonn ta' aġġustament b'volum żgħir ta' alkali sabiex tinkiseb risposta pożittiva. Nota: Iż-żieda ta' 3 ml sa 4 ml NaOH (3.11) f'1 l ta' 10 g/l aċidu boriku ġeneralment tagħti aġġustamenti tajbin. Aħżen is-soluzzjoni f'temperatura ambjentali u waqt il-ħażna, ipproteġġi s-soluzzjoni mid-dawl u sorsi ta' dħaħen tal-ammonja.

3.19

Soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku c(HCl) = 0,10 mol/l. Nota: jistgħu jintużaw konċentrazzjonijiet oħra ta' soluzzjonijiet volumetriċi (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, u 3.19), jekk isir tajjeb għalihom fil-kalkoli. Il-konċentrazzjonijiet għandhom dejjem ikunu mfissra sa erba' postijiet deċimali.

4.   Apparat

Apparat adattat sabiex issir id-diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni skont il-proċedura Kjeldahl.

5.   Proċedura

5.1.   Digestjoni

Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb 0,001 g u qiegħed il-kampjun fil-kunjett tal-apparat tad-diġestjoni. Żid 15 g sulfat tal-potassju (3.1.), kwantità adatta tal-katalist (3.2) (0,3 sa 0,4 g copper (II) oxide jew 0,9 sa 1,2 g copper (II) sulphate pentahydrate), 25 ml aċidu sulfuriku (3.4) u jekk meħtieġ, ftit frak tal-ħaffiefa (3.12) u ħallat.

Saħħan il-kunjett moderatament għall-ewwel, jekk ikun hemm bżonn ħawdu minn żmien għal żmien sakemm il-massa tkun ikkarbonizzata u r-ragħwa tkun sparixxiet; imbagħad saħħan b'mod aktar intensiv sakemm il-likwidu jkun qiegħed jagħli sew. It-tisħin huwa adegwat jekk l-aċidu li jkun qiegħed jagħli jikkondensa fuq il-ħajt tal-kunjett. Tħallix li l-ġnub jisħnu żżejjed u li partikoli organiċi jeħlu magħhom.

Meta s-soluzzjoni ssir ċara u ħadra ċara, kompli għalli għal sagħtejn oħra, u wara ħalliha ħa tibred.

5.2.   Distillazzjoni

Bil-mod, żid biżżejjed ilma sabiex tassigura li s-sulfati jdubu kompletament. Ħalli ħa jibred u wara, jekk ikun hemm bżonn, żid ftit trab taż-żingu (3.3). Kompli skont 5.2.1. jew 5.2.2.

5.2.1.   Distillazzjoni f'aċidu sulfuriku

Fil-kunjett tal-ġbir tal-apparat għad-distillazzjoni poġġi kwantità mkejla eżatta ta' 25 ml aċidu sulfuriku (3.5) jew (3.7) skont il-kontenut preżunt tan-nitroġenu. Żid ftit qtar ta' indikatur tal-metil aħmar (3.8).

Qabbad il-kunjett tad-diġestjoni mal-kondensatur tal-apparat għad-distillazzjoni u għaddas it-tarf tal-kondensatur fil-likwidu li jinsab fil-kunjett tal-ġbir għal fond ta' madwar 1 cm (ara l-osserv azzjoni 8.3). Bil-mod, ferra' 100 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.9) fil-kunjett għad-diġestjoni mingħajr telf ta' ammonja (ara osservazzjoni 8.1). Saħħan il-kunjett sakemm l-ammonja tkun iddistillat.

5.2.2.   Distillazzjoni f'aċidu boriku

Fejn it-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat issir manwalment, tapplika l-proċedura msemmija hawn taħt. Fejn l-unità tad-distillazzjoni hija kompletament awtomatika biex tinkludi t-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat, segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-operazzjoni tal-unità tad-distillazzjoni.

Poġġi l-kunjett tal-ġbir li fih 25 ml sa 30 ml tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (3.18) taħt il-ħruġ tal-kondensatur b'tali mod li t-tubu tal-ġarr ikun taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni ta' aċidu boriku żejda. Irranġa l-unità tad-distillazzjoni biex tagħti 50 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.9). Irranġa l-unità tad-distillazzjoni skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur u ddistilla ‘l barra l-ammonja li nħelset biż-żieda tas-soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju. Iġbor id-distillat fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku riċevitriċi. L-ammont ta' distillat (ħin tad-distillazzjoni bil-fwar) jiddependi mill-ammont ta' nitroġenu fil-kampjun. Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Nota:

F'unità għad-distillazzjoni semi-awtomatika, iż-żieda tal-eċċess ta' idrossidu tas-sodju u d-distillazzjoni bil-fwar isiru awtomatikament.

5.3.   Titrazzjoni

Ipproċedi skont 5.3.1. jew 5.3.2.

5.3.1.   Aċidu sulfuriku

Fil-kunjett tal-ġbir ittitra l-eċċess tal-aċidu sulfuriku b'soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju (3.10 jew 3.11) skont il-konċentrazzjoni ta' aċidu sulfuriku użat, sakemm jintlaħaq il-punt finali.

5.3.2.   Aċidu boriku

Ittitra l-kontenut tal-kunjett tal-ġbir bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku (3.19) jew bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu sulfuriku (3.6) billi tuża buretta u aqra l-ammont ta' titrant użat.

Meta tiġi applikata l-aħħar ditezzjoni kolorimetrika, il-punt finali jintlaħaq mal-ewwel traċċa tal-kulur roża fil-kontenut. Ivvaluta l-qari tal-buretta sal-eqreb 0,05 ml. Stirrer plate manjetika jew ditettur fotometriku jistgħu jgħinu sabiex tara l-punt finali.

Dan jista' jsir awtomatikament billi jintuża distillatur tal-fwar b'titrazzjoni awtomatika.

Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur biex tħaddem id-distillatur speċifiku jew distillatur/titratur.

Nota:

Meta tintuża sistema ta' titrazzjoni awtomatika, it-titrazzjoni tibda immedjatament wara li tibda d-distillazzjoni u tintuża 1 % tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (3.18). Fejn titħaddem unità tad-distillazzjoni kompletament awtomatika, it-titrazzjoni awtomatika tal-ammonja tista' ssir bid-ditezzjoni tal-punt finali billi tintuża sistema ta' potentiometric pH. F'dan il-każ jintuża titratur awtomatiku b'pH-miter. Il-pH-miter għandu jkun ikkalibrat sewwa fil-medda ta' pH 4 sa pH 7 bi proċeduri ta' kalibrar ta' pH normali fil-laboratorju. Il-punt finali ta' pH tat-titrazzjoni jintlaħaq f'pH 4,6, billi huwa l-ogħla punt fil-kurva tat-titrazzjoni (punt ta' inflezzjoni).

5.4.   Test blank

Biex tikkonferma li r-reaġenti m'għandhomx nitroġenu, agħmel test blank (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) billi tuża 1 g sukrożju (3.14) minflok il-kampjun.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kalkoli jsiru skont 6.1 jew 6.2.

6.1.   Kalkolu tat-titrazzjoni skont 5.3.1

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

Vo	=	hija l-volum (ml) ta' NaOH (3.10 jew 3.11) użat fit-test blank.
V1	=	hija l-volum (ml) ta' NaOH (3.10 or 3.11) użat fil-kampjun tat-titrazzjoni.
c	=	hija l-konċentrazzjoni (mol/l) ta' idrossidu tas-sodju (3.10 jew 3.11).
m	=	hija l-piż (g) tal-kampjun.

6.2   Kalkolu tat-titrazzjoni skont 5.3.2

6.2.1.   Titrazzjoni bl-aċidu idrokloriku

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

m	=	hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test;
c	=	hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta' aċidu idrokloriku (3.19);
V0	=	hija l-volum (f'ml) ta' aċidu idrokloriku użat għat-test blank;
V1	=	hija l-volum (f'ml) ta' aċidu idrokloriku użat għall-porzjon għat-test.

6.2.2.   Titrazzjoni bl-aċidu sulfuriku

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

m	=	hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test;
c	=	hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta' aċidu sulfuriku (3.6);
V0	=	hija l-volum (f'ml) ta' aċidu sulfuriku (3.6) użat għat-test blank;
V1	=	hija l-volum (f'ml) ta'aċidu sulfuriku (3.6) użat għall-porzjon għat-test.

7.   Verifika tal-metodu

7.1.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu:

—	0,2, f'valur assolut għall-kontenut mhux raffinat ta' proteini ta' inqas minn 20 %;

—	1,0 %, relattiv għall-ogħla valur, għall-kontenut mhux raffinat ta' proteini ta' mhux inqas minn 20 % u mhux aktar minn 40 %;

—	0,4, f'valur assolut, għall-kontenut mhux raffinat ta' proteini ta' aktar minn 40 %.

7.2.   Preċiżjoni

Agħmel l-analiżi (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) fuq 1,5 sa 2,0 g acetanilide (3.13) fil-preżenza ta' 1 g sukrożju (3.14); 1 g acetanilide tikkonsma 14,80 ml aċidu sulfuriku (3.5). L-irkupru jrid ikun tal-inqas 99 %.

8.   Osservazzjonijiet

8.1.

L-apparat jista' jkun tat-tip manwali, semi-awtomatiku jew awtomatiku. Jekk l-apparat jeħtieġ it-trasferiment bejn diġestjoni u distillazzjoni, dan it-trasferiment għandu jitwettaq mingħajr telf. Jekk il-kunjett tal-apparat tad-distillazzjoni ma jkunx iffittjat b'lenbut għat-tifrigħ żid l-idrossidu tas-sodju immedjatament qabel ma tqabbad il-kunjett mal-kondensatur, waqt li tferra' l-likwidu bil-mod mal-ġnub tal-kondensatur.

8.2.

Jekk id-diġestjoni tissolidifika, erġa' ibda d-determinazzjoni billi tuża ammont akbar ta' aċidu sulfuriku (3.4) minn dak speċifikat hawn fuq.

8.3.

Għall-prodotti b'kontenut baxx ta' nitroġenu, il-volum tal-aċidu sulfuriku (3.7) li għandu jitqiegħed fil-kunjett tal-ġbir jista' jitnaqqas, fejn meħtieġ, sa 10 jew 15 ml u jiżdied sa 25 ml bl-ilma.

8.4.

Għal analiżi ta' rutina, jistgħu jiġu applikati metodi ta' analiżi alternattivi għad-determinazzjoni ta' proteina mhux raffinata iżda l-metodu Kjeldahl deskritt f'din il-Parti C huwa l-metodu ta' referenza. L-ekwivalenti tar-riżultati miksubin bil-metodu alternattiv, (eż. DUMAS) imqabbla mal-metodu ta' referenza, jridu jintwerew individwalment għal kull massa. Billi r-riżultati miksubin b'metodu alternattiv, jistgħu jvarjaw xi ftit mir-riżultati miksubin bil-metodu ta' referenza anke wara li tkun ġiet ivverifikata l-ekwivalenza, fir-rapport analitiku jrid jissemma' l-metodu ta' analiżi għad-determinazzjoni tal-proteina mhux raffinata.

D.   DETERMINAZZJONI TA' UREA

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' urea fl-għalf.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jiġi sospiż fl-ilma b'aġent li jiċċara. Is-sospensjoni tiġi filtrata. Il-kontenut tal-urea tal-filtrat jiġi stabbilit wara ż-żieda ta' 4-dimethylaminobenzaldehyde (4-DMAB) billi titkejjel id-densità ottika f'wavelength ta' 420 nm.

3.   Reaġenti

3.1.

Soluzzjoni ta' 4-dimethylaminobenzaldehyde: dewweb 1,6 g ta' 4-DMAB f'100 ml ta' 96 % etanol u żid 10 ml aċidu idrokloriku ((ρ201,19 g/ml). Dan ir-reaġent iżomm għal perjodu massimu ta' ġimagħtejn.

3.2.

Soluzzjoni Carrez I: fl-ilma dewweb 21,9 g zinc acetate, Zn(CH3COO)2 2H2O u 3 g aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.3.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g potassium ferrocyanide, K4 Fe (CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Karbonju attiv li ma jassorbix l-urea (irid jiġi vverifikat).

3.5.

0,1 % soluzzjoni (w/v) ta' urea.

4.   Apparat

4.1.

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

4.2.

Test tubes: 160 × 16 mm b'tappijiet tal-ħġieġ mitħun.

4.3.

Spettrofotometru.

5.   Proċedura

5.1.   Analiżi tal-kampjun

Iżen 2 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 500 ml 1g karbonju attiv(3.4). Żid 400 ml ilma u 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal madwar 30 sekonda u żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3). Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza. Żid sal-volum bl-ilma, ħawwad u ffiltra.

Neħħi 5 ml tal-filtrati trasparenti bla kulur, qiegħed f'test tubes b'tappijiet tal-ħġieġ mitħun, żid 5 ml ta' soluzzjoni 4-DMAB (3.1) u ħawwad. Qiegħed it-tubi f'banju bl-ilma sħun f'temperatura ta' 20 oC (+/- 4 oC). Wara ħmistax-il minuta kejjel id-densità ottika tas-soluzzjoni tal-kampjun bl-ispettrofotometru f'420 nm. Qabbel is-soluzzjoni tat-test blank tar-reaġenti.

5.2.   Kurva ta' kalibrar

Neħħi volumi ta' 1, 2, 4, 5 u 10 ml tas-soluzzjoni tal-urea (3.5), qiegħed f'kunjetti volumettriċi ta' 100 ml u żid sal-volum bl-ilma. Neħħi 5 ml minn kull soluzzjoni, żid 5 ml ta' soluzzjoni ta' 4-DMAB (3.1) f'kull wieħed minnhom, omoġenizza u kejjel id-densità ottika kif murija fuq meta mqabbla mas-soluzzjoni ta' kontroll li jkun fiha 5 ml ta' 4-DMAB u 5 ml ilma ħieles mill-urea. Ipplottja l-kurva ta' kalibrar.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Stabbilixxi l-ammont ta' urea fil-kampjun permezz tal-kurva ta' kalibrar.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

Fil-każ ta' kontenuti ta' urea li jaqbżu t-3 %, naqqas il-kampjun sa 1 g jew żid is-soluzzjoni oriġinali bl-ilma sabiex ma jkunx hemm aktar minn 50 mg urea f'500 ml.

7.2.

Fil-każ ta' kontenuti baxxi ta' urea, żid il-kampjun sakemm il-filtrat jibqa' trasparenti u bla kulur.

7.3.

Jekk il-kampjun ikun fih komponenti nitroġeni sempliċi bħal ma huma amino acids, id-densità ottika għandha titkejjel f'435 nm.

E.   DETERMINAZZJONI TA' BAŻIJIET VOLATILI TAN-NITROĠENU

I.   BIL-MIKRODIFFUŻJONI

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-kontenut ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu, imfissra bħala ammonja, fl-għalf.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt bl-ilma u s-soluzzjoni kjarifikata u ffiltrata. Il-bażijiet volatili tan-nitroġenu huma spustjati bil-mikrodiffużjoni bl-użu ta' soluzzjoni ta' karbonat tal-potassju, miġburin f'soluzzjoni ta' aċidu boriku u titrat b'aċidu sulfuriku.

3.   Reaġenti

3.1.

20 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid.

3.2.

L-indikatur: dewweb 33 mg bromokresol aħdar u 65 mg metil aħmar f'100 ml 95 %-96 % (v/v) etanol.

3.3.

Is-soluzzjoni tal-aċidu boriku: f'kunjett iggradat ta' 1 l dewweb 10g aċidu boriku f'200 ml ta' 95 %-96 % (v/v) etanol u 700 ml ilma. Żid 10 ml tal-indikatur (3.2.). Ħallat u, jekk neċessarju, aġġusta l-kulur tas-soluzzjoni għal aħmar ċar billi tiżdied soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju. 1 ml ta' din is-soluzzjoni tiffissa massimu ta' 300 μg ta' NH3.

3.4.

Soluzzjoni saturata tal-karbonat tal-potassju: dewweb 100 g karbonat tal-potassju f'100 ml ilma jagħli. Ħallih jiksaħ, iffiltra.

3.5.

Aċidu sulfuriku 0,01 mol/litru.

4.   Apparat

4.1.

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 r.p.m.

4.2.

Ċelloli tal-ħġieġ jew tal-plastik Conway (ara t-tpinġija).

4.3.

Mikroburetti ggradati f'1/100 ml.

5.   Proċedura

Iżen 10 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u qiegħed ma' 100 ml ilma f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħallat fit-tazza għal 30 minuta. Żid 50 ml ta' soluzzjoni ta' trichloroacetic acid (3.1), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad bis-saħħa u ffiltra minn filtru mmewweġ.

Bl-użu ta' pipetta, introduċi 1 ml soluzzjoni ta' aċidu boriku (3.3) fil-parti ċentrali taċ-ċellola Conway u 1 ml tal-kampjun iffiltrat fil-parti ta' fuq taċ-ċellola. għatti parzjalment bl-għatu bix-xaħam. Ferra' 1 ml tas-soluzzjoni tal-karbonat tal-potassju saturat (3.4) malajr fil-parti ta' fuq u agħlaq l-għatu sabiex iċ-ċellola tkun issiġillata kontra d-dħul tal-arja. Dawwar iċ-ċellola b'attenzjoni fi pjan orizzontali sabiex jitħalltu ż-żewġ reaġenti. Ħalliha inkubata għal mill-inqas erba' sigħat f'temperatura ambjentali jew għal siegħa f'40 oC.

Bl-użu ta' mikroburetta (4.3), ittitra l-bażijiet volatili fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku bl-aċidu sulfuriku (3.5).

Wettaq test blank bl-użu tal-istess proċedura imma mingħajr kampjun li għandu jiġi analizzat.

6.   Kalkolu tar-riżultati

1 ml ta' H2SO40,01 mol/litru jikkorrispondi għal 0,34 mg ammonja.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

—	10 %, f'valur relattiv, għal kontenut tal-ammonja ta' inqas minn 1,0 %;

—	0,1 %, f'valur assolut, għal kontenuti tal-ammonja ta' 1,0 % jew iktar.

7.   Osservazzjoni

Jekk il-kontenut tal-ammonja tal-kampjun ikun aktar minn 0,6 %, iddilwixxi l-filtrat inizjali.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   BID-DISTILLAZZJONI

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu, imfisser bħala ammonja, f'ħut mitħun li ma jkun fih prattikament ebda urea. Huwa applikabbli biss għal kontenuti tal-ammonja ta' inqas minn 0,25 %.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt bl-ilma u s-soluzzjoni kjarifikata u ffiltrata. Il-bażijiet volatili tan-nitroġenu huma spustjati fil-punt ta' togħlija billi jiżdied l-ossidu tal-manjeżju u miġbura fi kwantità speċifika ta' aċidu sulfuriku, li l-eċċess tiegħu huwa titrat lura b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju.

3.   Reaġenti

3.1.

20 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid.

3.2.

Ossidu tal-manjeżju.

3.3.

Emulsjoni kontra r-ragħwa (eż. silicone).

3.4.

Aċidu sulfuriku 0,05 mol/litru.

3.5.

Soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru.

3.6.

0,3 % (w/v) soluzzjoni tal-metil aħmar f'95 %-96 % (v/v) etanol.

4.   Apparat

4.1.

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 r.p.m.

4.2.

Apparat ta' distillazzjoni tat-tip Kjeldahl.

5.   Proċedura

Iżen 10 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u qiegħed ma' 100 ml ilma f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħallat fit-tazza għal 30 minuta. Żid 50 ml ta' soluzzjoni ta' trichloroacetic acid (3.1), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad bis-saħħa u ffiltra minn filtru mmewweġ.

Ħu kwantità ta' filtrat ċar xieraq għall-kontenut preżunt ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu (100ml huwa normalment xieraq). Iddilwixxi sa 200 ml u żid 2 ossidu tal-manjeżju (3.2) u ftit qtar ta' emulsjoni li ma tagħmilx ragħwa (3.3). Is-soluzzjoni għandha tkun alkalina għal karta litmus; inkella żid ftit ossidu tal-manjeżju (3.2). Kompli skont 5.2 u 5.3 tal-metodu tal-analiżi għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-proteina mhux raffinata (Parti C ta' dan l-Anness).

Wettaq test blank bl-użu tal-istess proċedura imma mingħajr kampjun li għandu jiġi analizzat.

6.   Kalkolu tar-riżultati

1 ml ta' H2SO40,05 mol/litru jikkorrispondi għal 1,7 mg ammonja.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn, f'valur relattiv, 10 % ammonja.

F.   DETERMIMAZZJONI TA' AMINO ACIDS (BARRA TRYPTOPHAN)

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu determinati l-amino acids ħielsa (sintetiċi u naturali) u totali (marbutin b'peptides u ħielsa) fl-għalf, bl-użu ta' analizzatur tal-amino acid. Dan japplika għall-amino acids li ġejjin: cycs(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidne, isoleucine, leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine u valine.

Il-metodu ma jiddistingwix bejn l-imluħa tal-amino acids u ma jistax jagħmel distinzjoni bejn il-forom D u L tal-amino acids. M'huwiex validu għad-determinazzjoni ta' analogi ta' tryptophan jew hydroxy ta' amino acids.

2.   Prinċipju

2.1.   Amino acids ħielsa

L-amino acids ħielsa jinħarġu b'aċidu idrokloriku dilwit. Makromolekuli nitroġeniċi koestratti jiġu ppreċipitati bis-sulfosalicylic acid u jitneħħew billi jiġu ffiltrati. Is-soluzzjoni ffiltrata tiġi aġġustata għal pH 2,20. L-amino acids jiġu sseparati bi kromatografija ta' skambju tal-jonji u jiġu ddeterminati permezz ta' reazzjoni man-ninhydrin b'ditezzjoni fotometrika f'570 nm.

2.2.   Amino acids totali

Il-proċedura magħżula tiddependi fuq l-amino acids li jkunu qegħdin jiġu investigati. Is-Cyst(e)ine u l-methionine għandhom jiġu ossidizzati għal cysteic acid u methionine sulphone rispettivament qabel ma ssir l-idroliżi. It-tyrosine għandu jiġi ddeterminat f'hydrolysates ta' kampjuni mhux ossidizzati. L-amino acids l-oħra kollha li huma mniżżlin fil-paragrafu 1 jistgħu jiġu ddeterminati kemm fil-kampjun ossidizzat kif ukoll f'dak li mhuwiex ossidizzat.

L-ossidizzazzjoni ssir f'0 oC b'taħlita ta' performic acid/phenol. Ir-reaġent li jkun fadal jiġi dekompost b'sodium disulphate. Il-kampjun ossidizzat jew mhux ossidizzat jiġi idrolizzat bl-aċidu idrokloriku (3.20) għal 23 siegħa. Il-hydrolysate jiġi aġġustat għal pH 2,20. L-amino acids jiġu sseparati bi kromatografija ta' skambju tal-jonji u jiġu ddeterminati permezz ta' reazzjoni man-ninhydrin b'ditezzjoni fotometrika f'570 nm (440 nm għall-proline).

3.   Reaġenti

Għandu jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta' kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS).

3.1.

Hydrogen peroxide, w (w/w) = 30 %.

3.2.

Formic acid, w (w/w) = 98 – 100 %.

3.3.

Phenol.

3.4.

Sodium disulphite.

3.5.

Idrossidu tas-sodju.

3.6.

5-Sulfosalicylic acid dihydrate.

3.7.

Aċidu idrokloriku, densità bejn wieħed u ieħor 1,18 g/ml.

3.8.

tri-Sodium citrate dihydrate.

3.9.

2,2'-Thiodiethanol (thiodiglycol).

3.10.

Sodium chloride.

3.11.

Ninhydrin.

3.12.

Petroleum ħafif, jiftaħ jagħli bejn 40 – 60 oC.

3.13.

Norleucine, jew komponent ieħor xieraq għall-użu bħala standard intern.

3.14.

Gass tan-nitroġenu (< 10 ppm ossiġnu).

3.15.

1-Octanol.

3.16.

Amino acids.

3.16.1.

Sustanzi standard imniżżlin fil-paragrafu 1. Komponenti puri li ma jkunx fihom ilma tal-kristallizzazzjoni. Nixxef taħt vakwu fuq P2O5 jew H2SO4 għal ġimgħa (1) qabel l-użu.

3.16.2.

Cysteic acid.

3.16.3.

Methionine sulphone.

3.17.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 7,5 mol/l: Dewweb 300 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l.

3.18.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 1 mol/l: Dewweb 40 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l.

3.19.

Soluzzjoni ta' Formic acid-phenol: Ħallat 889 g formic acid (3.2) ma' 111 g ilma u żid 4,73 g phenol (3.3).

3.20.

Taħlita ta' hydrolysis, c = 6 mol HCl/l li jkun fih 1 g phenol/l: Żid 1 g phenol (3.3) sa 492 ml HCl (3.7) u żid bl-ilma sakemm ikollok 1 l.

3.21.

Taħlita għall-estrazzjoni, c = 0,1 mol HCl/l li jkun fiha 2 % thiodiglycol: Ħu 8,2 ml HCl (3.7), żid bejn wieħed u ieħor 900 ml ilma, żid 20 ml thiodiglycol (3.9) u żid bl-ilma sakemm ikollok 1 l, (tħallatx 3.7 u 3.9 direttament).

3.22.

5-Sulfosalicylic acid, ß = 6 %: Dewweb 60 g 5-sulfosalicylic acid (3.6) fl-ilma u imla sakemm ikollok 1 l.

3.23.

Taħlita għall-ossidizzazzjoni (Performic acid-phenol): Ħallat 0,5 ml hydrogen peroxide (3.1) ma' 4,5 ml soluzzjoni ta' formic acid-phenol (3.19) f'tazza żgħira. Poġġi f'inkubatur f'temperatura ta' bejn 20-30 oC għal madwar siegħa (1hr) sabiex tifforma l-performic acid, imbagħad kessaħ f'banju tal-ilma bis-silġ (15-il minuta) qabel ma żżid mal-kampjun. Attenzjoni: Evita l-kuntatt mal-ġilda u ilbes ilbies protettiv.

3.24.

Citrate buffer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Dewweb 19,61 g sodium citrate (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g phenol (3.3) u 16,50 ml HCl (3.7) f'bejn wieħed u ieħor 800 ml ilma. Aġġusta l-pH għal 2,20. Żid sa 1 l bl-ilma.

3.25.

Elution buffers, ippreparati skont il-kundizzjonijiet tal-analizzatur użat (4.9).

3.26.

Reaġent tan-ninhydrin, ippreparat skont il-kundizzjonijiet tal-analizzatur użat (4.9).

3.27.

Soluzzjonijiet standard tal-amino acids. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitpoġġew taħt temperatura ta' 5 oC.

3.27.1.

Soluzzjoni standard ta' amino acids (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml minn kull wieħed fl-aċidu idrokloriku. Jista' jinkiseb kummerċjalment

3.27.2.

Soluzzjoni stokk standard ta' cysteic acid u methionine sulphone, c = 1,25 μmol/ml. Dewweb 0,2115 g cysteic acid (3.16.2) u 0,2265 g methionine sulphone (3.16.3) f'citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat tal-1 l u imla sal-marka bis-citrate buffer. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 12-il xahar. Din is-soluzzjoni ma tinużax jekk is-soluzjoni standard (3.27.1) ikun fiha cysteic acid u methionine sulphone.

3.27.3.

Soluzzjoni standard tal-istandard intern eż. norleucine, C = 20 μmol/ml. Dewweb 0,6560 g norleucine (3.13) f'citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat u imla sa 250 ml bis-citrate buffer. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 6 xhur.

3.27.4.

Soluzzjoni ta' kalibrar ta' amino acids standard biex jintużaw ma' hydrolysates, c = 5nmol/50μl cysteic acid u methionine sulphone u c = 10 nmml/50 μl tal-amino acids l-oħra. Dewweb 2,2 g sodium chloride (3.10) f'tazza ta' 100 ml ma' 30 ml citrate buffer (3.24). Żid 4,00 ml soluzzjoni standard tal-amino acids (3.27.1), 4,00 ml soluzzjoni standard cysteic acid u methionine sulphone (3.27.2) u 0,50 ml soluzzjoni stokk standard tal-istandard intern (3.27.3) jekk intuża. Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-idrossidu tas-sodju (3.18). Ittrasferixxi kwantittivament f'kunjett iggradat ta' 50ml u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24) u ħawwad. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 3 xhur. Ara wkoll l-osservazzjonijiet 9.1

3.27.5.

Soluzzjoni ta' kalibrar tal-amino acids standard għall-użu mal-hydrolysates ippreparati skont il-paragrafu 5.3.3.1. u għall-użu mal-estratti (5.2). Is-soluzzjoni ta' kalibrar tiġi ppreparata skont 3.27.4 mingħajr sodium chloride. Aħżnu f'temperatura taħt il-5 oC għal mhux aktar minn 3 xhur.

4.   Apparat

4.1.

Kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 jew 250 ml li għandu reflux condenser imwaħħal miegħu.

4.2.

Kunjett tal-ħġieġ borosilicate 100 ml bit-tapp bil-kamin b'kisja ta' gomma/teflon (eż. Duran, Schott) sabiex jintuża fil-forn.

4.3.

Forn b'ventilazzjoni sfurzata u regolatur tat-temperatura bi preċiżjoni aqwa minn + 2 oC.

4.4.

miter tal-pH (tliet postijiet deċimali).

4.5.

Filtru tal-membrana (0,22 μm).

4.6.

Magna ċentrifuga.

4.7.

Evaporatur tat-tip rotary vacuum.

4.8.

Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika.

4.9.

Analizzatur tal-amino acids jew apparat HPLC b'kolonna għall-iskambju tal-jonji, tagħmir għan-ninhydrin, post column derivatization u ditettur fotometriku. Il-kolonna timtela b'sulfonated polystyrene resins li huma kapaċi li jisseparaw l-amino acidsi minn xulxin u minn materjali li huma ninhydrin-positive. Iċ-ċirkolazzjoni fit-tubi tal-buffer u tan-ninhydrin hija pprovduta minn pompi li għandhom stabilità ta' ċirkolazzoni ta' ±0,5 % fil-perjodu li jkopri kemm it-test tal-kalibrar standard kif ukoll l-analiżi tal-kampjun. B'xi ftit analizzatturi tal-aċidu amminiku, jistgħu jintużaw proċeduri li fihom, il-hydrolysate għandu konċentrazzjoni ta' sodju ta' c = 0,8 mol/l u li jkun fih il-formic acid li jifdal mill-istadju tal-ossidazzjoni. Oħrajn ma jagħtux separazzjoni sodisfaċenti ta' ċerti amino acidsi jekk il-hydrolysate ikun fih wisq formic acid u/jew konċentrazzjonijiet għoljin ta' sodium ion. F'dan il-każ il-volum ta' aċidu jitnaqqas permezz ta' evaporazzjoni għal bejn wieħed u ieħor 5 ml wara l-idroliżi u qabel l-aġġustament tal-pH. L-evaporazzjoni għandha ssir f'vakwu f'temperatura massima ta' 40 oC.

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b'malji ta' 0,5 mm. Kampjuni bi kwantità għolja ta' umdità jridu jew jitnixxfu bl-arja f'temperatura li ma tkunx aktar minn 50 oC jew jitnixxfu bil-friża qabel ma jintaħnu. Kampjuni b'kontenut għoli ta' xaħam għandhom jiġu estratti b'żejt ħafif mhux raffinat (3.12) qabel ma jintaħnu.

5.2.   Determinazzjoni ta' Amino Acids Ħielsa fl-għalf u Taħlit li jkun sar minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,2 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun ippreparat (5.1), f'kunjett koniku u żid 100,0 ml mit-taħlita tal-estrazzjoni (3.21). Ħawwad it-taħlita għal 60 minuta bl-użu ta' shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku (4.8). Ħalli s-sediment joqgħod u itfa' bil-pipetta 10,0 mis-supernatant solution f'tazza ta' 100 ml.

Żid 5,0 ml soluzzjoni ta' sulfosalicylic acid (3.22), mat-taħwid u kompli ħawwad bl-għajnuna ta' stirrer manjetika għal 5 minuti. Iffiltra jew iċċentrifuga s-supernatant sabiex jitneħħa kull preċipitat. Qiegħed 10,0 ml mis-soluzzjoni li tirriżulta f'tazza ta' 100 ml u aġġusta l-pH għal 2,20 bl-użu ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18), ittrasferixxi għal kunjett volumetriku ta' volum xieraq bl-użu ta' citrate buffer (3.24), u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24).

Jekk qiegħed jintuża standard intern, żid 1,00 ml mill-istandard intern (3.27.3) għal kull 100 ml soluzzjoni finali u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24).

Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.

Jekk l-estratti m'humiex qegħdin jiġu eżaminati, għandhom jinħażnu taħt il-5 oC.

5.3.   Determinazzjoni tal-Amino Acids Totali

5.3.1.   Ossidazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g mill-kampjun ippreparat (5.1) fi:

—	kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 ml (4.1) għall-idroliżi miftuħa (5.3.2.3) jew,

—	kunjett ta' 250 ml bil-qiegħ tond (4.1) jekk hi meħtieġa konċentrazzjoni baxxa ta' sodju (5.3.3.1) jew,

—	kunjett ta' 100 ml b'tapp bil-kamin (4.2), (għall-idroliżi magħluqa 5.3.2.4).

Il-porzjon tal-kampjun miżun għandu jkollu kontenut ta' nitroġenu ta' bejn wieħed u ieħor 10 mg u umdità ta' mhux aktar minn 100 mg.

Qiegħed il-kunjett/flixkun f'banju ilma bis-silġ u kessaħ sa 0 oC, żid 5 ml mit-taħlita ta' ossidazzjoni (3.23) u ħawwad bi spatula tal-ħġieġ bil-ponta mgħawġa. Issiġilla l-kunjett/flixkun li fih l-ispatula b'rita li ma jgħaddix arja minnha, qiegħed il-banju bl-ilma bis-silġ li fih ir-reċipjent issiġillat fi friġġ f'temperatura ta' 0 oC u ħalli għal 16-il siegħa. Wara 16-il siegħa neħħi mill-friġġ u ddekomponi r-reaġent eċċessiv tal-ossidazzjoni biż-żieda ta' 0,84 g sodium disulphite (3.4).

Ipproċedi għal 5.3.2.1.

5.3.2.   Idroliżi

5.3.2.1.    Idroliżi ta' kampjuni ossidizzati

Mal-kampun ossidizzat ippreparat skont 5.3.1 żid 25 ml taħlita ta' idroliżi (3.20) u oqgħod attent li tlaħlaħ ir-residwu tal-kampjun li jeħel mal-ġnub tar-reċipjent u tal-ispatula.

Skont il-proċedura ta' idroliżi li qiegħda tintuża, kompli skont 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Idroliżi ta' kampjuni li m'humiex ossidizzati

Iżen f'kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 ml jew 250 ml (4.1) jew kunjett ta' 100 ml bit-tapp bil-kamin (4.2), sal-eqreb 0,2 mg, minn0,1 sa 1 g tal-kampjun ippreparat (5.1). Il-porzjon miżun tal-kampjun għandu jkollu kontenut ta' nitroġenu ta' bejn wieħed u ieħor 10 mg. B'attenzjoni żid 25 ml tat-taħlita tal-idroliżi (3.20) u ħallat mal-kampjun.. Kompli skont 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Idroliżi miftuħa

Żid 3 żibeġ tal-ħġieġ mat-taħlita fil-kunjett (ippreparat skont 5.3.2.1 jew 5.3.2.2) u għalli kontinwament taħt reflux għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, aħsel il-kondensatur b'5 ml citrate buffer (3.24). Skonnettja l-kunjett u kessħu f'banju ta' silġ.

Kompli skont 5.3.3.

5.3.2.4.    Idroliżi magħluqa

Poġġi l-kunjett li jkun fih it-taħlita ppreparata f'konformità ma' 5.3.2.1 jew 5.3.2.2 f'forn (4.3) f'temperatura ta' 110 oĊ. Waqt l-ewwel siegħa sabiex tipprevjeni milli tiżdied il-pressjoni (minħabba l-evoluzzjoni ta' sustanzi li fihom il-gass) u sabiex tipprevjeni xi splużjoni, poġġi t-tapp bil-kamin fuq ir-reċipjent. Tagħlaqx ir-reċipjent bit-tapp. Wara siegħa, agħlaq ir-reċipjent bit-tapp u ħallih fil-forn (4.3) għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, neħħi l-kunjett mill-forn, iftaħ it-tapp tal-kunjett b'attenzjoni u poġġi l-kunjett f'banju ta' ilma bis-silġ. Ħallih jiksaħ.

Skont il-proċedura għall-aġġustament tal-pH (5.3.3), ittrasferixxi kwantitattivament il-kontenuti tal-kunjett f'tazza ta' 250 ml jew kunjett ta' 250 ml bil-qiegħ tond bl-użu ta' citrate buffer (3.24).

Kompli skont 5.3.3.

5.3.3.   Aġġustament tal-pH

Skont it-tolleranza tas-sodju tal-analizzatur tal-amino acids (4.9), kompli skont 5.3.3.1 jew 5.3.3.2 għall-aġġustament tal-pH.

5.3.3.1.    Għal Sistemi Kromatografiċi (4.9) li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju:

Huwa rrakkomandat li tintuża soluzzjoni stokk standard interna (3.27.3) meta jintużaw l-analizzaturi tal-amino acids li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju (meta l-volum tal-aċidu jkollu jitnaqqas).

F'dan il-każ, żid 2,00 ml mis-soluzzjoni stokk standard interna (3.2-7.3) mal-hydrolysate qabel l-evaporazzjoni.

Żid 2 qatriet 1-octanol (3.15) mal-hydrolysate miksub f'konformità mal-paragrafu 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

Bl-użu ta' evaporatur rotanti (4.7) naqqas il-volum sa 5-10 ml f'vakwu f'temperatura ta' 40 oC. Jekk il-volum aċċidentalment jitnaqqas għal inqas minn 5 ml il-hydrolysate għandu jintrema u l-analiżi terġa' tibda.

Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18) u kompli għall-paragrafu 5.3.4.

5.3.3.2.    Għall-Analizzaturi ta' Amino Acids l-oħrajn kollha (4.9)

Ħu l-hydrolysates miksuba f'konformità ma' 5.3.2.3 jew 5.3.2.4 u nnewtralizzahom parzjalment billi żżid filwaqt li tħawwad b'attenzjoni, 17-il ml soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (3.17) filwaqt li tiżgura li t-temperatura tinżamm taħt l-40 oC.

Aġġusta l-pH għal 2,20 f'temperatura ambjentali bl-użu tas-soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (3.17) u finalment soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18). Kompli għal 5.3.4.

5.3.4.   Kampjun ta' soluzzjoni għall-kromatografija

Ittrasferixxi kwantittivament il-hydrolysate bil-pH aġġustat (5.3.3.1 jew 5.3.3.2) bis-citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat ta' 200 ml, u imla sal-marka bil-buffer (3.24).

Jekk ma ntużax diġà standard intern, żid 2,00 ml standard intern (3.27.3) u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24). Ħawwad sew.

Kompli għall-istadju tal-kromatografija (5.4).

Jekk il-kampjuni tas-soluzzjonijiet ma jkunux sejrin jiġu eżaminati dakinhar stess għandhom jinħażnu taħt il-5 oC.

5.4.   Kromatografija

Qabel il-kromatografija ġib l-estratt (5.2) jew tal-hydrolysate (5.3.4) għal temperatura ambjentali. Ħawwad it-taħlita u ffiltra ammont xieraq minn filtru tal-membrana ta' 0,22 μm (4.5). Is-soluzzjoni ċara li tirriżulta tiġi soġġetta għal kromatografija ta' skambju tal-jonji bl-użu ta' analizzatur tal-amino acid (4.9).

L-injezzjoni tista' ssir b'mod manwali jew awtomatiku. Huwa importanti li tiżdied l-istess kwantità tas-soluzzjoni ±0,5 % mal-kolonna għall-analiżi tal-istandards u kampjuni ħlief meta jintuża standard intern, u li l-proporzjonijiet ta' sodju: amino acid fis-soluzzjonijiet standard u kampjuni huma simili kemm jista' jkun.

B'mod ġenerali, il-frekwenza tal-provi tal-kalibrar tiddependi fuq l-istabilità tar-reaġent tan-ninhydrin u s-sistema analitika. L-istandard jew il-kampjun jiġi dilwit bis-citrate buffer (3.24) sabiex jagħti erja tal-ogħla livell tal-istandard ta' 30-200 % tal-erja tal-ogħla livell tal-kampjun tal-amino acid.

Il-kromatografija tal-amino acids tvarja ftit skont it-tip tal-analizzatur u r-raża użati. Is-sistema magħżula għandha tkun kapaċi tissepara l-amino acids minn xulxin u mill-materjali li huma pożittivi fin-ninhydrin. Fil-medda tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika għandha tagħti rispons lineari għat-tibdil fl-ammonti ta' amino acids miżjudin mal-kolonna.

Waqt l-istadju tal-kromatografija japplikaw il-proporzjonijiet tal-inqas: l-ogħla livell imsemmija hawn taħt, meta tiġi analizzata soluzzjoni ekwimolari (tal-amino acids li qegħdin jiġu stabbiliti). Is-soluzzjoni ekwimolari għandu jkollha mill-inqas 30 % tat-tagħbija massima ta' kull amino acid li jista' jitkejjel amino acid (4.9).

Għas-separazzjoni tat-threonine-serine, il-proporzjon tal-inqas:l-ogħla livell minn żewġ amino acids li huma overlapping fuq il-kromatogramma ma għandux ikun aktar minn 2:10 (jekk jiġu ddeterminati biss is-cyst(e)ine, methionine, threonine u lysine, separazzjoni insuffiċjenti mill-ogħla livelli (qċaċet) qrib xulxin tinfluwenza d-determinazzjoni b'mod ħażin). għall-amino acids l-oħrajn kollha, is-separazzjoni għandha tkun aħjar minn 1:10.

Is-sistema għandha tiżgura li l-lysine huwa sseparat mill-“lysine artifacts” u ornithine.

6.   Kalkolu tar-riżultati

L-erja tal-kampjun u l-ogħla livelli standard jitkejlu għal kull amino acid individwali u jiġi kkalkulat l-ammont (X), fi g amino acid għal kull kg tal-kampjun.

Jekk jintuża standard intern immultiplika bi:

A	=	erja tal-ogħla livell, hydrolysate jew estratt
B	=	erja tal-ogħla livell, soluzzjoni standard ta' kalibrar
C	=	erja tal-ogħla livell, standard intern f'hydrolysate jew estratt
D	=	erja tal-ogħla livell, standard intern, soluzzjoni ta' kalibrar standard
M	=	piż molekulari tal-amino acid li qiegħed jiġi ddeterminat
c	=	konċentrazzjoni ta' standard f'μmol/ml
m	=	piż tal-kampjun (g) (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk huwa mnixxef jew bix-xaħam imneħħi)
V	=	ml hydrolysate totali (5.3.4) jew kalkolu f'ml tal-volum tal-estratt totali dilwit (6.1)

Kemm is-cystine kif ukoll is-cysteine t-tnejn huma ddeterminati bħala cicteic acid fil-hydrolysates ta' kampjun ossidizzat, iżda huma kkalkulati bħala cystine (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) billi jintuża M 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

Il-methionine huwa ddeterminat bħala methionine sulphone f'hydrolysates ta' kampjun ossidizzat iżda kkalkulat bħala methionine billi jintuża M tal-methionine: 149,21 g/mol.

Methionine ħieles miżjud huwa ddeterminat wara l-estrazzjoni bħala methionine, għall-kalkolu jintuża l-istess M.

6.1.

Il-volum totali dilwit ta' estratti (F) għad-determinazzjoni ta' amino acids ħielsa (5.2) huwa kkalkulat kif ġej: V = volum ta' estratt finali

7.   Evalwazzjoni tal-metodu

Il-metodu ġie ttestjat f'interparagun f'livell internazzjoni fl-1990 billi intużaw erba' tipi differenti ta' għalf (għalf tal-majjali mħallat, kompost tal-brojlers, konċentrazzjoni ta' proteini, taħlit minn qabel). Ir-riżultati, wara eliminazzjoni ta' dawk li jvarjaw ħafna, ta' devjazzjoni medja u standard huma mogħtija fit-tabelli f'dan il-punt:

Medji f'g/kg

Materjal għar-referenza	Amino Acid
	Threonine	Cyst(e)ine	Methionine	Lysine
Għalf tal-majjali mħallat	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Kompost għall-brojlers	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Konċentrat ta' proteini	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Taħlit minn qabel	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = Numru ta' laboratorji parteċipanti

7.1.   Ripetibbiltà

Ir-ripetibilità mfissra bħala “Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju” tal-interparagun imsemmi hawn fuq hija mogħtija fit-tabella ta' hawn taħt:

Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju (Sr) fi g/kg

Materjal għar-referenza	Amino Acid
	Threonine	Cyst(e)ine	Methionine	Lysine
Għalf tal-majjali mħallat	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Kompost għall-brojlers	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Konċentrat ta' proteini	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Taħlit minn qabel	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = Numru ta' laboratorji parteċipanti

Koeffiċjent ta' Varjazzjoni ( %) għal Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju (Sr)

Materjal għar-referenza	Amino Acid
	Threonine	Cyst(e)ine	Methionine	Lysine
Għalf tal-majjali mħallat	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Kompost għall-brojlers	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Konċentrat ta' proteini	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Taħlit minn qabel	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = Numru ta' laboratorji parteċipanti

7.2   Riproduċibilità

Ir-riżultati għal bejn id-devjazzjoni standard tal-laboratorju mill-interparagun imsemmi hawn fuq huma mogħtija fit-tabella ta' hawn taħt:

Devjazzjoni Standard Bejn il-Laboratorji (SR) f'g/kg

Materjal għar-referenza	Amino Acid
	Threonine	Cyst(e)ine	Methionine	Lysine
Għalf tal-majjali mħallat	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Kompost għall-brojlers	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Konċentrat ta' proteini	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Taħlit minn qabel	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = Numru ta' laboratorji parteċipanti

Koeffiċjent ta' varjazzjoni ( %) għad-Devjazzjoni Standard Bejn il-Laboratorji (SR)

Materjal għar-referenza	Amino Acid
	Threonine	Cyst(e)ine	Methionine	Lysine
Għalf tal-majjali mħallat	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Kompost għall-brojlers	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Konċentrat ta' proteini	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Taħlit minn qabel	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = Numru ta' laboratorji parteċipanti

8.   Użu ta' materjali għar-referenza

L-applikazzjoni korretta tal-metodu għandha tiġi vverifikata billi jsir kejl ripetut ta' materjali għar-referenza ċċertifikati meta huma disponibbli. Huwa rrakommandat kalibrar b'soluzzjoni ta' kalibrar ċċertifikata ta' amino acids.

9.   Osservazzjonijiet

9.1.

Minħabba differenzi bejn l-analizzaturi tal-amino acids il-konċentrazzjonijiet finali tas-soluzzjonijiet ta' kalibrar tal-amino acids standard (ara 3.27.4 u 3.27.5) u tal-hydrolysate (ara 5.3.4) għandhom jittieħdu bħala gwida. Ir-rispons lineari varju tal-apparat għandu jiġi ċċekkjat għall-amino acids kollha. Is-soluzzjoni standard tiġi dilwita bis-citrate buffer sabiex tagħti l-ogħla livelli f'nofs il-medda.

9.2.

Fejn jintuża apparat ta' kromatografija b'likwidi ta' prestazzjoni għolja sabiex jiġu analizzati l-hydrolysates, il-kundizzjonijiet sperimentali għandhom jiġu ottimizzati f'konformità mar-rakkommandazzjonijiet tal-manifattur.

9.3.

Billi jiġi applikat il-metodu għall-għalf li jkun fih aktar minn 1 % ta' chloride (konċentrat, għalf minerali, għalf supplimentari) l-istima tal-methionine tista' tirriżulta f'waħda baxxa u jkun jeħtieġ li jsir trattament speċjali.

G.   DETERMINAZZJONI TA' TRYPTOPHAN

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmel possibbli d-determinazzjoni tat-tripotofan totali u ħieles fl-għalf. Ma jagħmilx distinzjoni bejn il-forom D- u L-.

2.   Prinċipju

Għad-determinazzjoni ta' tryptophan totali, il-kampjun jiġi idrolizzat f'kundizzjonijiet alkalini ma' soluzzjoni ta' barium hydroxide saturata u msaħħna sa 110 oC għal 20 siegħa. Wara jiżdied l-istandard ta' idroliżi interna.

Għad-determinazzjoni ta' tryptophan ħieles, il-kampjun huwa estratt taħt kundizzjonijiet aċidi ħfief fil-preżenza ta' standard intern.

It-tryptophan u l-istandard intern fil-hydrolysate jew fl-estratt huma determinati bl-HPLC b'ditezzjoni fluworexxenti.

3.   Reaġenti

3.1.

Irid jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta' kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS/cm).

3.2.

Is-sustanza standard: tryptophan (purità/kontenut ≥ 99 %) imnixxef taħt vakwu fuq phosphorous pentoxide.

3.3.

Sustanza standard interna: α-methyl-tryptophan (purità/kontenut ≥ 99 %), imnixxef taħt vakum fuq phosphorous pentoxide.

3.4.

Barium hydroxide octa-hydrate (għandha tingħata attenzjoni sabiex il-Ba(OH)2 .8 H2O ma jiġix espost b'mod eċċessiv għall-arja sabiex tiġi evitata l-formazzjoni ta' BaCO3, li jista jiddisturba d-determinazzjoni) (ara l-osservazzjoni 9.3).

3.5.

Idrossidu tas-sodju.

3.6.

Ortho-phosphoric acid, w (w/w) = 85 %.

3.7.

Aċidu idrokloriku, ρ201,19 g/ml.

3.8.

Metanol, ekwivalenti għall-grad HPLC.

3.9.

Petroleum ħafif, medda ta' togħlija 40 – 60 oĊ.

3.10.

Soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju, c = 1 mol/l: Dewweb 40,0 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sa 1 l bl-ilma (3.1).

3.11.

Aċidu idrokloriku, c= 6 mol/l: Ħu 492 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma.

3.12.

Aċidu idrokloriku, c= 1 mol/l: Ħu 82 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma.

3.13.

Aċidu idrokloriku, c= 0,1 mol/l: Ħu 8,2 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma.

3.14.

Ortho-phosphoric acid, c = 0,5 mol/l: Ħu 34 ml ortho-phosphoric acid (3.6) u imla sa 1 l bl-ilma (3.1).

3.15.

Soluzzjoni konċentrata ta' tryptophan (3.2), c = 2,50 μmol/ml: F'kunjett volumetriku ta' 500 ml dewweb 0,2553 g tryptophan (3.2) fl-aċidu idrokloriku (3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idrokloriku (3.13). Aħżen f'-18 oC għal massimu ta' 4 ġimgħat.

3.16.

Soluzzjoni standard konċentrata interna, c = 2,50 μmol/ml: F'kunjett volumetriku ta' 500 ml dewweb 0,2728 g α-methyl-tryptophan (3.3) fl-aċidu idrokloriku (3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idrokloriku (3.13). Aħżen f'-18 oC għal massimu ta' 4 ġimgħat.

3.17.

Soluzzjoni standard ta' kalibrar ta' tryptophan u standard intern: Ħu 2.00 ml ta' soluzzjoni konċentrata ta' tryptophan (3.15), u 2,00 ml ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (α-metil-tryptophan) (3.16). Ħallat bl-ilma (3.1) u l-metanol (3.8) għal bejn wieħed u ieħor l-istess volum u għal bejn wieħed u ieħor l-istess konċentrazzjoni ta' metanol (10-30 %) bħall-hydrolysate lest. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu. Ipproteġi mid-dawl tax-xemx dirett waqt l-operazzjoni.

3.18.

Acetic acid

3.19.

1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol.

3.20.

Ethanolamine w (w/w) > 98 %.

3.21.

Soluzjoni ta' 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) f'100 ml metanol (3.8)

3.22.

Fażi mobbli għal HPLC: 3,00 g aċidu aċetiku (3.18) + 900 ml ilma (3.1) +50,0 ml soluzzjoni (3.21) ta' 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol (3.19) fil-metanol (3.8) (1g/100ml). Aġġusta pH għal 5,00 bl-użu ta' etanolamina (3.20). Imla sa 1 000 ml bl-ilma (3.1).

4.   Apparat

4.1.

Apparat HPLC bid-ditettur spektrofluworimetriku.

4.2.

Kolonna għal kromatografija b'likwidi, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm ippakkjar, jew ekwivalenti.

4.3.

Miter tal-pH.

4.4.

Kunjett tal-polypropylene, kapaċità 125 ml, bl-għonq wiesa' u b'tapp bil-kamin.

4.5.

Filtru membrana, 0,45 μm.

4.6.

Autoclave, 110 (± 2) oC, 1,4 (0,1) bar.

4.7.

Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika.

4.8.

Vortex mixer.

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni ta' kampjuni

Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b'malji ta' 0,5 mm. Kampjuni bi kwantità għolja ta' umdità jridu jew jitnixxfu bl-arja f'temperatura li ma tkunx aktar minn 50 oC jew jitnixxfu bil-friża qabel ma jintaħnu. Kampjuni b'kontenut għoli ta' xaħam iridu jiġu estratti b'petroleum ħafif (3.9) qabel ma jintaħnu.

5.2.   Determinazzjoni ta' tryptophan ħieles (estratt)

Iżen sal-eqreb 1 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun separat (5.1), f'kunjett konikali. Żid 100,0 ml aċidu idrokloriku (3.13) u 5,00 ml soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16). Ħawwad għal 60 min. bl-użu tax-shaker mekkaniku jew stirrer manjetika (4.7). Ħalli s-sediment joqgħod u bil-pipetta tella' 10,0 ml tas-soluzzjoni supernatant f'beaker. Żid 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14). Aġġusta l-pH sa 3 bl-użu ta' idrossidu tas-sodju (3.10). Żid metanol suffiċjenti (3.8) biex tinkiseb konċentrazzjoni ta' bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f'kunjett volumetriku ta' volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum neċessarju għall-kromatografija (bejn wieħed u ieħor l-istess volum bħall-kalibrar ta' soluzzjoni standard (3.17)).

Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.

Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-estratti kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-estratti fl-istess ġurnata, l-estratti jistgħu jinħażnu f'5 oC għal massimu ta' 3 ijiem.

5.3.   Determinazzjoni ta' tryptophan totali (hydrolysate)

Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun separat (5.1) f'kunjett tal-polypropylene (4.4). Il-porzjon tal-kampjun li jkun intiżen irid ikollu kontenut ta' nitroġenu ta' madwar 10 mg. Żid 8,4 g barium hydroxide octa-hydrate (3.4) u 10 ml ilma. Ħallat fuq mixer vortex (4.8) jew stirrer manjetika (4.7). Ħalli il-kalamita miksija bit-teflon fit-taħlita. Aħsel il-ġnub tar-reċipjent b'4 ml ilma. Poġġi t-tapp u agħlaq kemxejn il-kunjett. Ittrasferixxi f'autoclave (4.6) bl-ilma jagħli u ħallih għall-fwar għal 30-60 minuta. Agħlaq l-autoclave u awtoklava f'110 (± 2) oC għal 20 siegħa.

Qabel tiftaħ l-autoclave baxxi t-temperatura għal ftit taħt il-100 oC. Sabiex tiġi evitata kristallizzazzjoni ta' Ba(OH)2 .8 H2O, żid it-taħlita sħuna bi 30 ml ilma li jkun għadu f'temperatura ambjentali. Ħawwad bil-mod. Żid 2,00 ml soluzzjoni standard interna (α-methyl-tryptophan) konċentrata (3.16). Berred ir-reċipjenti fuq banju ilma/silġ għal 15-il minuta.

Wara żid 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14). Żomm ir-reċipjent fil-banju li jberred u nnewtralizza b'HCl (3.11) waqt li tħawwad u aġġusta l-pH għal 3,0 bl-użu ta' HCl (3.12). Żid metanol suffiċjenti biex tagħti konċentrazzjoni ta' bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f'kunjett volumetriku ta' volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum definit neċessarju għal kromatografija (pereżempju 100 ml). Iż-żieda ta' metanol ma tridx tikkawza preċipitazzjoni.

Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.

Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-hydrolysates kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-hydrolysates fl-istess ġurnata, jistgħu jinħażnu f'5 oC għal massimu ta' 3 ijiem.

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

Il-kundizzjonijiet li jmiss għal eluzzjoni iżokratika huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn, diment li jagħtu riżultati ekwivalenti (ara wkoll l-osservazzjonijiet 9.1 u 9.2):

Kolonna kromatografika likwida (4.2):	125 mm × 4 mm, C18, 3 μm ippakkjar, jew ekwivalenti
Temperatura tal-kolonna:	Temperatura ambjentali
Fażi mobbli (3.22):	3,00  g aċidu aċetiku (3.18) + 900 ml ilma (3.1) + soluzzjoni 50,0  ml (3.21) ta' 1.1.1-trichloro-2-methyl-2-propanol (3.19) f'metanol (3.8) (1 g/100 ml). Aġġusta pH għal 5,00 permezz ta' etanolamina (3.20). Imla sa 1 000  ml bl-ilma (3.1)
Rata ta' tnixxija:	1 ml/min
Ħin totali tal-proċedura:	bejn wieħed u ieħor 34 min
Wavelength tad-ditezzjoni:	eċċitazzjoni: 280 nm, emissjoni: 356 nm.
Volum tal-injezzjoni	20 μl

6.   Kalkolu tar-riżultati

L-ammont ta' tryptophan (X), fi g għal kull kampjun ta' 100g huwa kkalkulat.

A	=	l-ikbar erja ta' standard intern, soluzzjoni standard ta' kalibrar (3.17)
B	=	l-ikbar erja ta' tryptophan, estratt (5.2) jew hydrolysate (5.3)
V1	=	volum f'ml (2 ml) ta' soluzzjoni ta' tryptophan konċentrat (3.15) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17)
c	=	konċentrazzjoni f'μmol/ml (= 2,50) ta' soluzzjoni ta' tryptophan konċentrat (3.15) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17)
V2	=	volum f'ml ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fl-estrazzjoni (5.2) (= 5,00 ml) jew għall-hydrolysate (5.3) (= 2,00 ml)
C	=	żona ta' livelli l-għolja ta' standard intern, estratt (5.2) jew hydrolysate (5.3)
D	=	l-ikbar erja ta' tryptophan, soluzzjoni standard ta' kalibrar (3.17)
V3	=	volum f'ml (= 2,00 ml) ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17)
m	=	piż ta' kampjun fi g (irranġat għall-piż oriġinali jekk imnixxef u/jew bix-xaħam imneħħi)
M	=	piż molari ta' tryptophan (= 204,23 g/mol)

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 10 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

8.   Riżultati ta' studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE (ir-4 interparagun), fejn ġew analizzati tliet kampjuni min 12-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għal idroliżi. Saru għadd ta' analiżi (5) replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

	Kampjun 1 Għalf għall-ħnieżer	Kampjun 2 Għalf għall-ħnieżer imsaħħaħ b'L-tryptophan	Kampjun 3 Għalf konċentrat għall-ħnieżer
L	12	12	12
n	50	55	50
Medja [g/kg]	2,42	3,40	4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [ %]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [ %]	6,3	6,0	2,2

L	=	numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati
n	=	numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon)
sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
SR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
r	=	ripetibilità
R	=	riproduċibilità
CVr	=	koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %
CVR	=	koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

Ġie organizzat studju kollaborattiv Komunitarju ieħor (it-3 interparagun) fejn żewġ kampjuni ġew analizzati minn 13-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għall-estrazzjoni ta' tryptophan ħieles. Saru għadd ta' analiżi (5) replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

	Kampjun 4 Taħlita ta' qamħ u soja	Kampjun 5 Taħlita ta' qamħ u soja (= kampjun 4) b'żieda ta' tryptophan (0,457 g/kg1)
L	12	12
n	55	60
Medja [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [ %]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [ %]	4,71	5,11

L	=	numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati
n	=	numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon)
sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
SR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
r	=	ripetibilità
R	=	riproduċibilità
CVr	=	koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %
CVR	=	koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

Ġie organizzat studju ta' interparagun Komunitarju ieħor li fih ġew analizzati erba' kampjuni minn 7 laboratorji għall-għanijiet ta' ċertifikazzjoni ta' tryptophan għall-idroliżi. Ir-riżultati huma mogħtija hawn taħt. Saru 5 analiżijiet replikati fuq kull kampjun.

	Kampjun 1 Għalf tal-ħnieżer imħallat (CRM 117)	Kampjun 2 Ħut mitħun b'xaħam baxx (CRM 118)	Kampjun 3 Soybean mitħun (CRM 119)	Kampjun 4 Trab ta' ħalib xkumat (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Medja [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [ %]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [ %]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati
n	=	numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon)
sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
SR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
r	=	ripetibilità
R	=	riproduċibilità
CVr	=	koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %
CVR	=	koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

9.   Osservazzjonijiet

9.1.

Jekk issegwi kundizzjonijiet kromatografiċi speċjali tista' tikseb separazzjonijiet aħjar bejn tryptophan u α-metil-tryptophan. Eluzzjoni isokratika segwita bi gradient column cleaning: Kolonna għal kromatografija b'likwidi: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm ippakkjar, jew ekwivalenti Temperatura tal-kolonna: 32 oC Fażi mobbli : A: 0,01 mol/l KH2PO4/Methanol, 95+5 (V+V). B: Metanol Programm tal-gradient: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Rata ta' tnixxija: 1,2 ml/min Ħin totali tal-proċedura: bejn wieħed u ieħor 33 min

9.2.

Il-kromatografija tvarja skont it-tip ta' HPLC u tal-materjal tal-ippakkjar tal-kolonna użat. Is-sistema magħżula trid tkun kapaċi tagħti separazzjoni ta' linja bażi bejn it-tryptophan u l-istandard intern. Madankollu huwa importanti li prodotti ta' degradazzjoni jiġu separati mit-tryptophan u l-istandard intern. Hydrolysates mingħajr standard intern iridu jitħaddmu sabiex tiġi ċċekjata l-linja bażi taħt l-istandard intern għal impuritajiet. Huwa importanti li l-ħin ta' tħaddim ikun twil biżżejjed għall-eluzzjoni ta' kull prodott ta' degradazzjoni, inkella l-livelli għoljin ta' eluzzjoni jistgħu jinterferixxu ma' tħaddim kromatografiku sussegwenti. Fil-medda tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika trid tagħti risposta lineari. Ir-risposta lineari trid titkejjel b'konċentrazzjoni kostanti (in-normal) tal-istandard intern u l-konċentrazzjonijiet li jvarjaw ta' tryptophan. Huwa importanti li l-kejl tal-ogħla livelli kemm tal-istandard intern kif ukoll tat-tryptophan ikunu fl-iskala lineari tas-sistema HPLC/sistema ta' fluworexxenza. Jekk il-livell/i tat-tryptophan u/jew l-ogħla livelli standard interni ma jkunux żgħar ħafna jew kbar ħafna l-analiżijiet jridu jiġu ripetuti b'qies ta' kampjun ieħor u/jew bil-volum finali mibdul.

9.3.

Barium hydroxide Biż-żmien, il-barium hydroxide jsir aktar diffiċli biex jiġi dilwit. Dan jirriżulta f'soluzzjoni mhux ċara għad-determinazzjoni tal-HPLC, li tista' tipproduċi riżultati baxxi għal tryptophan.

H.   ID-DETERMINAZZJONI TA' ŻJUT U XAĦMIJIET MHUX RAFFINATI

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta' żjut u xaħmijiet mhux raffinati fl-għalf. Dan il-metodu ma jkoprix l-analiżi taż-żrieragħ taż-żejt u frott oleaġinuż.

L-użu taż-żewġ proċeduri deskritti hawn taħt jiddependi min-natura u l-kompożizzjoni tal-għalf u r-raġuni li għaliha qiegħda ssir l-analiżi.

1.1.   Proċedura A – Żjut u xaħmijiet mhux raffinati estratti direttament

Dan il-metodu huwa applikabbli għall-għalf li ġej mill-pjanti barra dawk inklużi fi ħdan l-iskop tal-Proċedura B.

1.2.   Proċedura B – Żjut u xaħmijiet mhux raffinati totali

Dan il-metodu japplika għal materjal tal-għalf li ġej mill-annimali u għall-għalf kompost kollu. Dan irid jintuża għall-materjal kollu li minnhom iż-żjut u x-xaħmijiet ma jistgħux jiġu estratti kompletament mingħajr idroliżi qabel (eż. glutina, ħmira, proteini tal-patata u prodotti soġġetti għal proċessi bħall-estrużjoni, flaking u tisħin).

1.3.   Interpretazzjoni tar-riżultati

Fil-każijiet kollha fejn jinkiseb riżultat ogħla permezz tal-Proċedura B u mhux Proċedura A, ir-riżultat miksub mill-Proċedura B għandu jkun aċċettat bħala l-valur veru.

2.   Prinċipju

2.1.   Proċedura A

Il-kampjun huwa estratt bil-petroleum ħafif. Is-solvent jiġi ddistillat u r-residwu mnixxef u miżun.

2.2.   Proċedura B

Il-kampjun huwa trattat b'tisħin b'aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni hija mkessħa u ffiltrata. Ir-residwu jinħasel u jitnixxef u huwa sottomess għad-determinazzjoni skont il-Proċedura A.

3.   Reaġenti

3.1.

Petroleum ħafif, jiftaħ jagħli: 40 – 60 oC. Il-valur tal-bromine jrid ikun inqas minn 1 u r-residwu wara l-evaporazzjoni jrid ikun inqas minn 2 mg/100 ml.

3.2.

Sodium sulfate, anidru.

3.3.

Aċidu idrokloriku, c = 3 mol/l.

3.4.

Assistenza għall-filtrazzjoni, eż. Kieselgur, Hyflo-supercel.

4.   Apparat

4.1.

Apparat għall-estrazzjoni. Jekk għandu siphon (apparat Soxhlet), ir-rata ta' rifluss trid tkun tali li tipproduċu madwar 10 ċikli kull siegħa; jekk fuq it-tip non-siphoning, ir-rata ta' rifluss trid tkun madwar 10 ml fil-minuta.

4.2.

Thimble ta' estrazzjoni, meħlusin minn materjal li jinħall f'petroleum ħafif u li jkollu porosità konsistenti mal-ħtiġiet ta' punt 4.1.

4.3.

Forn li jnixxef, jew forn vakwu issettjat f'75 ± 3 oC jew forn tal-arja issettjat f'100 ± 3 oC.

5.   Proċedura

5.1.   Proċedura A (ara punt 8.1)

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u ttrasferih f'thimble ta' estrazzjoni (4.2) u għatti b'biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam.

Qiegħed it-thimble f'estrattur (4.1) u għamel l-estrazzjoni għal sitt sigħat b'petroleum ħafif (3.1). Iġbor l-estratt tal-petroleum ħafif f'kunjett xott miżun li fih biċċiet ta' ġebla ħaffiefa (2).

Iddistilla s-solvent. Nixxef ir-residwu u żomm il-kunjett għal siegħa u nofs fil-forn li jnixxef (4.3). Kessaħ f'dessikatur u iżen. Erġa' nixxef għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż taż-żjut u tax-xaħmijiet jibqa' kostanti (telf fil-piż bejn iż-żewġ kejlijiet tal-piż suċċessivi għandu jkun inqas minn jew ugwali għal 1 mg).

5.2.   Proċedura B

Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg (ara 8.2) u qiegħed f'beaker ta' 400 ml jew kunjett koniku ta' 300 ml. Żid 100 ml hydrochlorc acid (3.3) u biċċiet ta' ġebla ħaffiefa. għatti l-beaker b'watch glass jew waħħal reflux condenser mal-kunjett. Wassal it-taħlita sakemm tagħli bil-mod fuq fjamma baxxa jew hot plate u żommha hekk għal siegħa. Tħallix il-prodott jeħel mal-ġnub tal-kontenitur.

Kessaħ u żid kwantità ta' għajnuna għall-filtrazzjoni (3.4) biżżejjed biex tipprevjeni xi telf ta' żejt u xaħam tul il-filtrazzjoni. Iffiltra minn karta filtru doppja, niedja, ħielsa mix-xaħam. Aħsel ir-residwu f'ilma kiesaħ sakemm jinkiseb filtrat newtrali. Ikkontrolla li l-filtrat ma jkunx fih xi żejt jew xaħam. Il-preżenza tagħhom fil-filtrat tindika li l-kampjun għandu jiġi estratt b'petroleum ħafif, permezz tal-Proċedura A, qabel l-idroliżi.

Qiegħed il-karta filtru doppja li jkun fiha r-residwu fuq watch glass u nixxef għal siegħa u nofs fil-forn tal-arja (4.3) f'100 ± 3 oC.

Qiegħed il-karta tal-filtru doppja li fiha r-residwu niexef f'thimble ta' estrazzjoni (4.2), u għatti b'biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam. Poġġi t-thimble f'estrattur (4.1) u ipproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu tal-punt 5.1.

6.   Espressjoni tar-riżultat

Esprimi l-piż tar-residwu bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m'għandhomx jaqbżu:

—	0,2 %, f'valur assolut, għall-kontenut ta' żjut u xaħmijiet mhux raffinati inqas minn 5 %,

—	4,0 % fir-rigward tal-ogħla riżultat għall-kontenut ta' 5 sa 10 %,

—	0,4 % f'valur assolut, għall-kontenut ogħla minn 10 %.

8.   Osservazzjonijiet

8.1.

Għal prodotti b'kontenut għoli ta' żjut u xaħmijiet u li huma diffiċli biex tagħsar jew mhux xierqa biex jittieħed minnhom kampjun tat-test imnaqqas u omoġenju, ipproċedi kif ġej. Iżen 20 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u ħallat ma' 10 g jew iktar sodium sulfate anidridu (3.2). għamel l-estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.1) kif indikat f'5.1. Żid l-estratt miksub għal 500 ml b'petroleum ħafif (3.1) u ħawwad. Ħu 50 ml tas-soluzzjoni u qiegħed f'kunjett żgħir, niexef, miżun li fih biċċiet ta' ġebla ħaffiefa. Iddistilla s-solvent, nixxef u pproċedi kif indikat fl-aħħar paragrafu ta' 5.1. Elimina s-solvent mir-residwu tal-estrazzjoni li jkun baqa' fit-thimble u għasar ir-residwu għal irquqija ta' 1 mm, reġġa' lura l-prodott għat-thimble ta' estrazzjoni (iżżidx is-sodium sulfate), u ipproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu ta' 5.1. Ikkalkula l-kontenut ta' żjut u xaħmijiet bħala perċentwali tal-kampjun, billi tuża l-formula li ġejja: (10m1 + m2) × 5 fejn: m1 = piż fi grammi tar-residwu wara l-ewwel estrazzjoni (il-parti alikwotta tal-estratt), m2 = piż fi grammi tar-residwu wara t-tieni estrazzjoni.

8.2.

Fil-każ ta' prodotti li għandhom kontenut baxx ta' żejt u xaħam, il-kampjun għat-test jista' jiżdied sa 5 g.

8.3.

Ikel tal-annimali domestiċi li fih kontenut għoli ta' ilma jista' jkollu bżonn jitħallat ma' sodium sulfate anidridu qabel l-idroliżi u l-estrazzjoni skont il-Proċedura B.

8.4.

F'paragrafu 5.2. jista' jkun aktar effettiv li tuża ilma sħun minflok ilma kiesaħ sabiex taħsel ir-residwu wara l-filtrazzjoni.

8.5.

Għal xi għalf, il-ħin ta' tnixxif ta' 1.5 siegħa, jista' jkun estiż. It-tnixxif eċċessiv għandu jiġi evitat billi dan jista' jwassal għal riżultati baxxi. Jista' jintuża wkoll forn microwave.

8.6.

L-estrazzjoni minn qabel skont il-Proċedura A qabel l-idroliżi u l-estrazzjoni mill-ġdid skont il-Proċedura B hija rakkomandata jekk il-kontenut taż-żejt/xaħam mhux raffinati huwa aktar minn 15 %. Sa ċertu punt, dan jiddependi fuq in-natura taż-żejt/xaħam fl-għalf.

I.   DETERMINAZZJONI TA' FIBRA MHUX RAFFINATA

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli sabiex jiġu stabbiliti s-sustanzi organiċi neqsin mix-xaħam fl-għalf li ma jinħallux fil-mezzi aċidużi u alkalini u li huma konvenzjonalment deskritti bħala fibra mhux raffinata.

2.   Prinċipju

Il-kampjun, bix-xaħam imneħħi fejn meħtieġ, huwa trattat suċċessivament b'soluzzjonijiet li jkunu qiegħdin jagħlu ta' aċidu sulfuriku u potassium hydroxide. Il-fdalijiet huma sseparati permezz ta' filtrazzjoni bl-użu ta' filtru ta' ħġieġ sintered maħsul, ixxuttat, miżun u magħmul irmied fi ħdan il-medda ta' 475 u 500 oC. It-telf fil-piż li jirriżulta mill-proċess tal-irmied jikkorrispondi mal-fibra mhux raffinata preżenti fit-test tal-kampjun.

3.   Reaġenti

3.1.

Aċidu sulfuriku, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Aġent għal kontra r-ragħwa (eż. n-octanol).

3.3.

Għajnuna għall-filtrazzjoni (Celite 545 jew ekwivalenti), imsaħħna fuq 500 oC għal erba' sigħat (8.6).

3.4.

Aċetun.

3.5.

Petroleum ħafif li jagħli bejn 40 sa 60 oC.

3.6.

Aċidu idrokloriku, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Soluzzjoni tal-potassium hydroxide, c = 0,23 mol/l.

4.   Apparat

4.1.

L-unità tat-tisħin għal diġestjoni ma' aċidu sulfuriku jew soluzzjoni ta' potassium hydroxide, mgħammra b'appoġġ għall-griġjol tal-filtru (4.2) u pprovduta b'tubu ta' żbokk li jkollu tapp għall-iżbokk tal-likwidu u l-vakwu, possibbilment b'arja kkumpressata. Qabel ma tintuża, l-unità għandha tissaħħan kuljum minn qabel b'ilma jagħli għal ħames minuti.

4.2.

Griġjol tal-filtru tal-ħġieġ b'daqs tal-pora tal-platt b'filtru tal-ħġieġ sintered fjusjat ta' bejn 40-90μm. Qabel l-ewwel użu, saħħan sa 500 oC għal ftit minuti u berred (8.6).

4.3.

Ċilindru ta' mill-inqas 270ml b'kondensatur reflux, adatt għall-għali.

4.4.

Forn imnixxef b'termostat.

4.5.

Muffle furnace bit-termostat.

4.6.

Unità ta' estrazzjoni li tikkonsisti minn platt ta' appoġġ għall-griġjol tal-filtru (4.2) u b'pajp tal-iżvujtar b'tapp għall-vakwu u għall-iżbokk tal-likwidu.

4.7.

L-anelli tal-għaqid għall-armar tal-unità tat-tisħin (4.1), il-griġjol (4.2) u ċ-ċilindru (4.3) u għall-armar tal-unità kiesħa tal-estrazzjoni (4.6) u l-griġjol.

5.   Proċedura

Iżen 1g tal-kampjun preparat sal-eqreb 1 mg u poġġih fil-griġjol (4.2), (ara l-osservazzjonijiet 8.1, 8.2 u 8.3) u żid 1 g ta' għajnuna għall-filtrazzjoni (3.3).

Għaqqad l-unità tat-tisħin (4.1) u l-filtru (4.2), u wara waħħal iċ-ċilindru (4.3) mal-griġjol. Ferra' 150 ml aċidu sulfuriku jagħli (3.1) ġewwa ċ-ċilindru magħqud u l-griġjol u jekk meħtieġ żid ftit qtar tal-aġent għal kontra r-ragħwa (3.2).

Ġib il-likwidu jagħli għal bejn 5 ± 2 minuti u għalli bil-qawwa għal 30 minuta eżatt.

Iftaħ it-tapp għall-pajp tal-ftuħ (4.1) u, taħt vakwu, iffiltra l-aċidu sulfuritiku mill- filtru tal-griġjol u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 30ml ilma jagħli, filwaqt li tiżgura li r-residwu jiġi ffiltrat xott wara kull ħasla.

Agħlaq it-tapp ta' ftuħ u ferra' 150ml tas-soluzzjoni tagħli ta' potassium hydroxide (3.7) fiċ-ċilindru magħqud u fil-griġjol u żid ftit qatriet ta' aġent kontra r-ragħwa (3.2). Ġib il-likwidu sal-punt li jagħli fi żmien 5 ± 2 minuti u għalli bis-saħħa għal 30 minuta preċiż. Iffiltra u rrepeti l-proċedura tal-ħasil użata għall-pass tal-aċidu sulfuriku.

Wara l-ħasla u t-tnixxif finali, skonnettja l-griġjol u l-kontenut tiegħu u erġa' qabbdu mal-unità ta' estrazzjoni kiesħa (4.6). Applika l-vakwu u aħsel ir-residwu fil-griġjol bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 25ml ta' aċetun (3.4) filwaqt li tiżgura li r-residwi jiġu ffiltrati xotti wara kull ħasla.

Nixxef il-griġjol għal piż kostanti fil-forn f'temperatura ta' 130 oC. Wara kull nixfa berred fid-dessikatur u iżen mill-ewwel. Poġġi l-griġjol ġewwa forn muffle u agħmel f'irmied għal użin kostanti (it-telf fil-piż bejn użin u ieħor għandu jkun 2 mg jew inqas) f'475 u 500 oC għal mill-inqas 30 minuta.

Wara kull tisħin, qabel tiżen, l-ewwel kessaħ fil-forn u wara fid-dessikatur.

Agħmel test blank mingħajr il-kampjun. It-telf fl-użin li jirriżulta mill-irmied ma għandux ikun aktar minn 4 mg.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-fibra mhux raffinata bħala perċentwal tal-kampjun huwa mogħti mill-espressjoni:

fejn:

m	=	piż tal-kampjun fi g;
m0	=	it-telf ta' piż wara li ssir irmied matul id-determinazzjoni, fi grammi;
m1	=	it-telf ta' piż wara li ssir irmied matul it-test blank, fi grammi.

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn iż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

—	0,6 % fil-valur assolut għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata inqas minn 10 %,

—	6 % fir-rigward tal-ogħla riżultat, għall-kontenuti tal-fibra mhux raffinata daqs jew aktar minn 10 %.

8.   Osservazzjonijiet

8.1.

L-għalf li jkun fih aktar minn 10 % xaħam mhux raffinat għandu jkollu x-xaħam imneħħi qabel l-analiżi bil-petroleum ħafif (3.5). għaqqad il-griġjol tal-filtru (4.2) u l-kontenuti tiegħu mal-estrazzjoni kiesħa tal-unità (4.6) u applika l-vakwu u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 30 ml ta' petroleum ħafif, filwaqt li tiżgura li r-residwu jibqa' xott. għaqqad il-griġjol u l-kontenuti tiegħu mal-unità tat-tisħin (4.1) u kompli kif deskritt skont 5.

8.2.

L-għalf li jkollu fih xaħmijiet li ma jistgħux jiġu estratti direttament mill-petroleum ħafif (3.5) għandu jkollu x-xaħam imneħħi kif muri fi 8.1 u għandu jerġa' jkollu x-xaħam imneħħi wara l-għali mal-aċidu. Wara l-għali mal-aċidu u l-ħasil sussegwenti għaqqad il-griġjol u l-kontenuti tiegħu mal-unità kiesħa tal-estrazzjoni (4.6) u aħsel għal tliet darbiet bi 30ml aċetun segwit minn tliet ħasliet oħra bi 30 ml petroleum ħafif. Iffiltra taħt vakwu sakemm ikun niexef u kompli l-analiżi kif deskritt skont 5, billi tibda mit-trattament bil-potassium hydroxide.

8.3.

Jekk l-għalf ikun fih aktar minn 5 % karbonati, espressi bħala calcium carbonate, għandek tgħaqqad il-griġjol (4.2) mal-kampjun tal-użin mal-unità tat-tisħin (4.1). Aħsel il-kampjun għal tliet darbiet bi 30 ml aċidu idrokloriku (3.6). Wara kull żieda ħalli l-kampjun joqgħod għal xi minuta qabel ma tiffiltra. Aħsel darba bi 30 ml ilma u mbagħad kompli kif deskritt skont 5.

8.4.

Jekk jintuża apparat bil-forma wieqfa (bosta griġjoli mehmużin mal-istess unità tat-tisħin) ma jkunu jistgħu jsiru l-ebda żewġ determinazzjonijiet individwali fuq l-istess kampjun għall-analiżi fl-istess serje.

8.5.

Jekk wara t-togħlija jkun diffiċli li tiffiltra s-soluzzjonijiet aċidużi u bażiċi, uża l-arja kkompressata permezz tal-pajp tat-tbattil tal-unità tat-tisħin u mbagħad kompli ffiltra.

8.6.

It-temperatura għall-irmied ma għandhiex tkun aktar minn 500 oC sabiex tkun tista' testendi l-ħajja tal-griġjoli ffiltrati tal-ħġieġ. għandha tingħata l-attenzjoni meħtieġa sabiex ikun evitat ix-xokk eċċessiv tas-sħana matul iċ-ċikli tat-tisħin u tat-tkessiħ.

J.   DETERMINAZZJONI TAZ-ZOKKOR

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-ammont ta' zokkor ta' riduzzjoni u zokkor totali wara inverżjoni, imfisser bħala glukożju jew fejn xieraq bħala sukrożju, b'konverżjoni bil-fattur 0,95. Huwa applikabbli għal għalf kompost. Metodi speċjali huma pprovduti għal għalf ieħor. Fejn meħtieġ, il-lattożju għandu jitkejjel separatament u jitqies meta jiġu kkalkolati r-riżultati.

2.   Prinċipju

Iz-zokkor huwa estratt f'etanol dilwit; is-soluzzjoni tiġi ċċarata bis-soluzzjonijiet Carrez I u II. Wara li jiġi eliminat l-etanol, il-kwantitajiet qabel u wara l-inverżjoni huma stabbiliti mill-metodu Luff-Schoorl.

3.   Reaġenti

3.1.

40 % (v/v) soluzzjoni ta' etanol densità: 0,948 g/ml f'temperatura ta' 20 oC, newtralizzata għall-phenolphthalein.

3.2.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g zinc acetate Zn (CH3COO)2 2H2O u 3 g aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.3.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta' potassium ferrocyanide K4Fe (CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Soluzzjoni ta' 0,1 % (w/v) metil oranġo.

3.5.

Aċidu idrokloriku 4 mol/litru.

3.6.

Aċidu idrokloriku 0,1 mol/litru.

3.7.

Soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru.

3.8.

Reaġent Luff-Schoorl: Waqt li tħawwad b'attenzjoni, ferra' s-soluzzjoni tal-aċidu ċitriku (3.8.2) fis-soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (3.8.3). Żid is-soluzzjoni tas-sulfat tar-ram (3.8.1) u żid sa 1 l bl-ilma. Ħalliħa toqgħod matul il-lejl u ffiltra. Ivverifika l-konċentrazzjoni tar-reaġent hekk miksub (Cu 0,05 mol/litre; Na2 CO3 1 mol/litru), ara l-aħħar paragrafu ta' (5.4). Il-pH tas-soluzzjoni għandu jkun bejn wieħed u ieħor 9,4.

3.8.1.

Soluzzjoni tas-sulfat tar-ram: dewweb 25 g sulfat tar-ram Cu SO4 5H2O, ħieles mill-ħadid, f'100 ml ilma.

3.8.2.

Soluzzjoni ta' aċidu ċitriku: dewweb 50 g citric acid, C6H8O7·H2O f'50 ml ilma

3.8.3.

Soluzzjoni ta' karbonat tas-sodju: dewweb 143,8 g karbonat tas-sodju anidridu f'bejn wieħed u ieħor 300 ml ilma sħun. Ħallih jiksaħ.

3.9.

Soluzzjoni ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru.

3.10.

Soluzzjoni tal-lamtu: żid taħlita ta' 5 g lamtu li jinħall fi 30 ml ilma ma' 1 l ilma jagħli. għalli għal tliet minuti, ħallieħ jiksaħ u jekk ikun meħtieġ żid 10 mg mercuric iodide bħala preżervattiv.

3.11.

Aċidu sulfuriku 3 mol/litru.

3.12.

Soluzzjoni ta' jodur tal-potassju, 30 % (w/v).

3.13.

Frak ta' ħaffiefa mgħolli fl-aċidu idrokloriku, maħsul fl-ilma u mnixxef.

3.14.

3-methylbutan-l-ol.

4.   Apparat

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

5.   Proċedura

5.1.   Estrazzjoni tal-kampjun

Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 250 ml. Żid 200 ml etanol (3.1) u ħawwad fit-tazza għal siegħa. Żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 30 sekonda. Żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3) u erġa' ħawwad għal minuta. Żid sal-volum bl-etanol (3.1), omoġenizza u ffiltra. Neħħi 200 ml tal-filtrat u evapora sa bejn wieħed u ieħor nofs il-volum sabiex telimina l-parti l-kbira tal-etanol. Ittrasferixxi r-residwu tal-evaporazzjoni kwantitattivament f'kunjett volumetriku ta' 200 ml billi tuża l-ilma sħun, kessaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra jekk ikun meħtieġ. Din is-soluzzjoni tintuża biex jiġi stabbilit l-ammont ta' zokkor ta' riduzzjoni u, wara l-inverżjoni, l-ammonti totali taz-zokkor.

5.2.   Determinazzjoni ta' zokkor ta' riduzzjoni

Permezz ta' pipetta, neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li jkun fiha inqas minn 60 mg ta' zokkor ta' riduzzjoni espress bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b'ilma distillat u stabbilixxi l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat huwa mfisser bħala perċentwal tal-kontenut ta' glukożju fil-kampjun.

5.3.   Determinazzjoni ta' zokkor totali wara l-inverżjoni

Permezz ta' pipetta ħu 50 ml tas-soluzzjoni u ttrasferiha f'kunjett volumetriku ta' 100 ml. Żid ftit qatriet ta' soluzzjoni ta' metil oranġo (3.4) u mbagħad, b'attenzjoni u waqt li tħawwad il-ħin kollu, żid l-aċidu idrokloriku (3.5) sakemm il-likwidu jsir aħmar sew. Żid 15 ml aċidu idrokloriku (3.6), daħħal il-kunjett f'banju bil-misħun jagħli sew u żommu hemm għal tletin minuta. Kessaħ malajr sa bejn wieħed u ieħor 20 oCu żid 15 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.7). Żid sa 100 ml bl-ilma u omoġenizza. Neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li fiha inqas minn 60 mg zokkor ta' riduzzjoni mfisser bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b'ilma distillat u stabbilixxi l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat huwa mfisser bħala perċentwal ta' glukożju jew, fejn xieraq, sukrożju, billi timmultiplika bil-fattur 0,95.

5.4.   Titrazzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl

Permezz ta' pipetta, ħu 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.8) u ittrasferih f'kunjett Erlenmeyer tat-300ml; żid eżattament 25 ml tas-soluzzjoni ċċarata taz-zokkor. Żid 2 granuli ta' ħaffiefa (3.13), saħħan, waqt li tħawwad bl-idejn, fuq fjamma mikxufa ta' għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f'bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Qiegħed l-Erlenmeyer minnufih fuq xibka tal-wajer miksija bl-asbestos b'toqba b'dijametru ta' bejn wieħed u ieħor 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tiġi regolata b'tali mod li l-qiegħ tal-Erlenmeyer biss jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f'ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:

Żid 10 ml ta' soluzzjoni ta' potassium iodide (3.12) u minnufih wara (b'attenzjoni, minħabba r-riskju ta' produzzjoni ta' ħafna ragħwa) żid 25 ml ta' aċidu sulfuriku (3.11). Ittitra b'soluzzjoni tat-tiosulfat tas-sodju (3.9) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (3.10) u lesti t-titrazzjoni.

Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b'mod eżatt ta' 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.8) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (3.12) u 25 ml aċidu sulfuriku (3.11) mingħajr ma tgħalli.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Permezz tat-tabella, stabbilixxi l-ammont ta' glukożju f'mg li jikkorrespondi għad-differenza bejn il-valuri taż-żewġ titrazzjonijiet, espressi bħala mg ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru. Agħti r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Proċeduri speċjali

7.1.

Fil-każ ta' għalf b'kontenut għoli ta' għasel iswed u għalf ieħor li mhuwiex partikolarment omoġenju, iżen 20 g u qegħedhom ma' 500 ml ilma f'kunjett volumetriku tal-1 l. Ħawwad għal siegħa fit-tumbler. Iċċara permezz tar-reaġenti Carrez 1 (3.2) u II (3.3) kif deskritti taħt 5.1, din id-darba iżda b'erba' darbiet il-kwantitajiet ta' kull reaġent. Żid sal-volum bi 80 % etanol (v/v). Omoġenizza u ffiltra. Elimina l-etanol kif deskritt taħt 5.1. Jekk ma hemm l-ebda lamtu dextrinised, żid sal-volum b'ilma distillat.

7.2.

Fil-każ ta' għasel iswed u għalf li għandu ammont kbir ta' zokkor u li huma kważi ħielsa mil-lamtu (ħarrub, cossettes tal-pitravi mnixxfa eċċ.), iżen 5 g, poġġi f'kunjett volumettriku ta' 250 ml, żid 200 ml ilma distillat u ħawwad fit-tumbler għal siegħa, jew aktar jekk ikun meħtieġ. Iċċara bir-reaġenti Carrez I (3.2) u II (3.3) kif deskritti f'5.1. Żid sal-volum bl-ilma kiesaħ, omoġenizza u ffiltra. Sabiex jiġi stabillit l-ammont totali ta' zokkor, kompli kif deskritt taħt 5.3.

8.   Osservazzjonijiet

8.1.

Sabiex ma jkunx hemm produzzjoni ta' ragħwa huwa rakkomandabbli li żżid (minkejja l-volum) bejn wieħed u ieħor 1 ml ta' 3-methylbutan-l-ol (3.14) qabel ma tgħalli bir-reaġent Luff-Schoorl.

8.2.

Id-differenza bejn il-kontenut totali ta' zokkor wara l-inverżjoni, espress bħala glukożju, u l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni, espress bħala glukożju, immultiplikat b'0,95, tagħti l-perċentwali tal-kontenut ta' sukrożju.

8.3.

Sabiex jiġi stabbilit il-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni, minbarra lattożju, jistgħu jiġu adottati żewġ metodi:

8.3.1.

Għal kalkolazzjoni approssimattiva, immultiplika b'0,675 il-kontenut tal-lattożju stabbilit permezz ta' metodu differenti ta' analiżi u naqqas ir-riżultat miksub mill-kontenut taz-zokkor ta' riduzzjoni.

8.3.2.

Għal kalkolu eżatt ta' zokkor ta' riduzzjoni, minbarra lattożju, l-istess kampjun irid jintuża għaż-żewġ determinazzjonijiet finali. Waħda mill-analiżi ssir fuq parti mis-soluzzjoni miksuba taħt 5.1, l-oħra fuq parti mis-soluzzjoni miksuba matul l-istabbiliment ta' lattożju permezz tal-metodu stabbilit għal dak il-għan (wara fermentazzjoni u kjarifikazzjoni taż-żewġ tipi l-oħra taz-zokkor). Fiż-żewġ każijiet l-ammont ta' zokkor preżenti huwa stabbilit permezz tal-metodu Luff-Schoorl u kkalkolat f'mg ta' glukożju. Wieħed mill-valuri huwa mnaqqas mill-ieħor u d-differenza hija espressa bħala perċentwal tal-kampjun. Eżempju: Iż-żewġ volumi meħudin jikkorrespondu, għal kull determinazzjoni, għal kampjun ta' 250 mg. Fl-ewwel każ, huma kkunsmati 17 ml ta' soluzzjoni ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru li jikkorrispondu għal 44,2 mg glukożju; fit-tieni, 11 ml, li jikkorrespondu għal 27,6 mg glukożju. Id-differenza hija ta' 16,6 mg glukożju. Il-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni (minbarra lattożju), ikkalkolat bħala glukożju, huwa għalhekk:

Tabella ta' valuri għal 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl

ml ta' Na2 S2 O30,1 mol/litru, tisħin għal żewġ minuti, togħlija għal għaxar minuti

Na2 S2 O3 0,1 mol/litru	Glukożju, fruttożju zokkor invertit C6 H12 O6		Lattożju C12 H22 O11		Maltożju C12 H22 O11		Na2 S2 O3 0,1 mol/litru
ml	mg	differenza	mg	differenza	mg	differenza	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   DETERMINAZZJONI TAL-LATTOŻJU

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' lattożju fl-għalf li jkun fih aktar minn 0,5 % ta' lattożju.

2.   Prinċipju

Iz-zokkor huwa maħlul fl-ilma. Is-soluzzjoni tiġi suġġetta għall-fermentazzjoni permezz tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae li tħalli l-lattożju intatt. Wara l-kjarifika u l-filtrazzjoni, il-kontenut tal-lattożju jiġi stabbilit permezz tal-metodu Luff-Schoorl.

3.   Reaġenti

3.1.

Sospensjoni ta' Saccharomyces cerevisiae: poġġi 25 g ħmira friska f'100 ml ta' ilma. Is-sospensjoni żżomm għal perjodu massimu ta' ġimgħa fi friġġ.

3.2.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta' aċetat taż-żingu, Zn (CH3 COO)2 2H2O u 3 g ta' aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.3.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta' potassium ferrocyanide K4Fe (CN)6 3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Reaġent Luff-Schoorl: Waqt li tħawwad b'attenzjoni, itfa' s-soluzzjoni ta' aċidu ċitriku (3.4.2) fis-soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju (3.4.3). Żid is-soluzzjoni tas-sulfat tar-ram (3.4.1) u żid sa 1 l bl-ilma. Ħalliħa toqgħod matul il-lejl u ffiltra. Ivverifika l-konċentrazzjoni tar-reaġent hekk miksub (Cu 0,05 mol/litre; Na2 CO3 1 mol/litru). Il-pH tas-soluzzjoni għandu jkun bejn wieħed u ieħor 9,4.

3.4.1.

Soluzzjoni tas-sulfat tar-ram: dewweb 25 g sulfat tar-ram Cu SO4 5H2O ħieles mill-ħadid, f'100 ml ilma.

3.4.2.

Soluzzjoni ta' aċidu ċitriku: dewweb 50 g aċidu ċitriku C6H8O7 · H2O f'50 ml ilma.

3.4.3.

Soluzzjoni ta' karbonat tas-sodju: dewweb 143,8 g karbonat tas-sodju anidridu f'bejn wieħed u ieħor 300 ml ilma sħun. Ħallih jiksaħ.

3.5.

Frak ta' ħaffiefa mgħolli fl-aċidu idrokloriku, maħsul fl-ilma u mnixxef.

3.6.

Soluzzjoni ta' jodur tal-potassju, 30 % (w/v).

3.7.

Aċidu sulfuriku 3 mol/litru.

3.8.

Soluzzjoni ta' tiosulfat tas-sodju 0,1 mol/litru.

3.9.

Soluzzjoni tal-lamtu: żid taħlita ta' 5 g lamtu li jinħall fi 30 ml ilma ma' 1 l ilma jagħli. għalli għal tliet minuti, ħalliha tiksaħ, u jekk ikun meħtieġ żid 10 mg jodur merkuriku bħala preservattiv.

4.   Apparat

Banju bl-ilma b'termostat issettjat f'temperatura ta' 38 – 40 oC.

5.   Proċedura

Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed dan il-porzjon tal-kampjun f'kunjett volumetriku ta' 100 ml. Żid 25 sa 30 ml ilma. Qiegħed il-kunjett f'banju b'misħun jagħli għal tletin minuta u mbagħad kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 35 oC. Żid 5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1) u omoġenizza. Ħalli l-kunjett joqgħod għal sagħtejn f'banju marija, f'temperatura ta' 38 – 40 oC. Kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 20 oC.

Żid 2,5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal tletin sekonda, imbagħad żid 2,5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3) u erġa' ħawwad għal tletin sekonda. Żid sa 100 ml bl-ilma, ħawwad u ffiltra. Permezz ta' pipetta, neħħi ammont ta' filtrat li ma jaqbiżx il-25 ml u li preferibbilment ikun fih minn 40 sa 80 mg ta' lattożju u ttrasferixxi f'kunjett Erlenmeyer ta' 300 ml. Jekk ikun meħtieġ, żid il-volum sa 25 ml bl-ilma.

Wettaq test blank bl-istess mod b'5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1). Stabbilixxi l-kontenut tal-lattożju skont Luff-Schoorl, kif ġej: żid eżattament 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl (3.4) u żewġ granuli ħaffiefa (3.5). Ħawwad bl-idejn waqt li ssaħħan fuq fjamma mikxufa ta' għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f'bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Qiegħed l-Erlenmeyer minnufih fuq xibka tal-wajer miksija bl-asbestos b'toqba b'dijametru ta' bejn wieħed u ieħor 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tiġi regolata b'tali mod li l-qiegħ tal-Erlenmeyer biss jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f'ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:

Żid 10 ml ta' soluzzjoni tal-jodur tal-potassju (3.6) u minnufih wara (b'attenzjoni, minħabba fir-riskju ta' produzzjoni ta' ħafna ragħwa) żid 25 ml aċidu sulfuriku (3.7). Ittitra b'soluzzjoni tat-tiosulfat tas-sodju (3.8) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (3.9) u lesti t-titrazzjoni.

Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b'mod eżatt ta' 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.4) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (3.6) u 25 ml aċidu sulfuriku (3.7) mingħajr ma tgħalli.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Permezz tat-tabella hawn mehmuża, stabbilixxi l-ammont ta' lattożju f'mg li jikkorrispondi għad-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ titrazzjonijiet, imfissra bħala ml ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru.

Agħti r-riżultat miksub bħala lattożju anidru bħala perċentwali tal-kampjun.

7.   Osservazzjoni

Għall-prodotti li jkun fihom aktar minn 40 % ta' zokkor fermentabbli, uża aktar minn 5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1).

Tabella tal-valuri għal 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl

ml ta' Na2 S2 O30,1 mol/litru, tisħin għal żewġ minuti, togħlija għal għaxar minuti

Na2 S2 O3 0,1 mol/litru	Glukożju, fruttożju zokkor invertit C6 H12 O6		Lattożju C12 H22 O11		Maltożju C12 H22 O11		Na2 S2 O3 0,1 mol/litru
ml	mg	differenza	mg	differenza	mg	differenza	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   DETERMINAZZJONI TAL-LAMTU

– METODU POLARIMETRIKU –

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-livelli ta' lamtu u ta' prodotti ta' degradazzjoni tal-lamtu b'piż molekulari għoli fl-għalf, bil-għan li tiġi ċċekkjata l-konformità mal-valur tal-enerġija ddikjarat (dispożizzjonijiet fl-Anness VII) u d-Direttiva tal-Kunsill 96/25/KE (3).

2.   Prinċipju

Il-metodu jinkludi żewġ determinazzjonijiet. Fl-ewwel waħda, il-kampjun jiġi trattat u mħallat bl-aċidu idrokloriku dilwit. Wara li jiċċara u li ssir il-filtrazzjoni, ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni titkejjel permezz tal-polarimetrija.

Fit-tieni wieħed, il-kampjun jiġi estratt b'40 % etanol. Wara l-aċidifikazzjoni tal-filtrat b'aċidu idrokloriku, l-iċċarar u l-filtrazzjoni, titkejjel ir-rotazzjoni ottika bħal fil-każ tal-ewwel determinazzjoni.

Id-differenza bejn iż-żewġ kejlijiet, immultiplikata b'fattur magħruf, tagħti l-kontenut tal-lamtu tal-kampjun.

3.   Reaġenti

3.1.

Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku, 25 % (w/w) densità: 1,126 g/ml.

3.2.

Soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku 1,13 % (w/v) Il-konċentrazzjoni għandha tiġi vverifikata permezz ta' titrazzjoni bl-użu ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju 0,1 mol/litru fil-preżenza ta' 0,1 % (w/v) metil aħmar f'94 % (v/v) etanol. għan-newtralizzazzjoni hemm bżonn ta' 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/litru.

3.3.

Soluzzjoni Carrez I: Dewweb 21,9 g zinc acetate Zn(CH3COO)2 2H2O u 3g aċidu aċetiku inġazzat fl-ilma. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.4.

Soluzzjoni Carrez II: Dewweb 10,6 g potassium ferrocyanide K4 Fe(CN)6 3H2O fl-ilma. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.5.

Soluzzjoni ta' etanol, 40 % (v/v), densità: 0,948 g/ml f''20 oC.

4.   Apparat

4.1.

250 ml kunjett erlenmeyer b'ġonta tal-ħġieġ matt standard u b'kondensatur reflux.

4.2.

Polarimetru jew sakkarimetru.

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Għaffeġ il-kampjun sakemm ikun fin biżżejjed biex jgħaddi kollu kemm hu minn passatur b'toqob tondi ta' 0,5 mm.

5.2.   Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika totali (P jew S) (ara osservazzjoni 7.1)

Iżen 2,5 g tal-kampjun mgħaffeġ sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett iggradat ta' 100 ml. Żid 25 ml aċidu idrokloriku (3.2), ħawwad biex tikseb distribuzzjoni uniformi tal-kampjun tat-test u żid 25 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.2). Daħħal il-kunjett f'banju bl-ilma jagħli waqt li tħawwad sew u sod għall-ewwel tliet minuti biex tevita l-formazzjoni ta' agglomerati. Il-kwantità ta' ilma fil-banju tal-ilma għandha tkun suffiċjenti biex il-banju jibqa' jagħli meta l-kunjett jiddaħħal fih. Il-kunjett m'għandux jinħareġ mill-banju meta jkun qed jitħawwad. Eżattament wara 15-il minuta, neħħi mill-banju, żid 30 ml ilma kiesaħ u kessaħ minnufih sa 20 oC.

Żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez I (3.3) u ħawwad għal madwar 30 sekonda. Imbagħad żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez II (3.4) u erġa' ħawwad għal 30 sekonda. Żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u iffiltra. Jekk il-filtrat ma jkunx ċar għal kollox (ħaġa rari), irrepeti d-determinazzjoni bl-użu ta' kwantità akbar tas-soluzzjonijiet Carrez I u II, pereżempju 10 ml.

Kejjel ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni f'tubu ta' 200 mm bil-polarimetru jew bis-sakkimetru.

5.3.   Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika (P' jew S') ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg, qiegħed fil-kunjett iggradat ta' 100 ml u żid bejn wieħed u ieħor 80 ml etanol (3.5) (ara osservazzjoni 7.2). Ħalli l-kunjett jiksaħ għal siegħa 1 f'temperatura ambjentali; matul dan il-ħin ħawwad sew f'sitt okkażjonijiet biex il-kampjun tat-test jitħallat sew mal-etanol. Żid sal-volum bl-etanol (3.5), ħallat u iffiltra.

Iġbed b'pipetta 50 ml tal-filtrat (li jikkorrispondi għal 2,5 g tal-kampjun) f'kunjett Erlenmeyer ta' 250 ml, żid 2,1 ml aċidu idrokloriku (3.1) u ħawwad sew. Iffittja l-kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer u daħħal dan tal-aħħar fil-banju bl-ilma jagħli. Eżattament wara 15-il minuta, neħħi l-kunjett Erlenmeyer mill-banju, ittrasferixxi l-kontenut għall-kunjett iggradat ta' 100 ml, u laħlaħ bi ftit ilma kiesaħ u kessaħ sa 20 oC.

Iċċara billi tuża s-soluzzjonijiet Carrez I (3.3) u II (3.4), żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza, iffiltra u kejjel ir-rotazzjoni ottika kif indikat fit-2 u fit-3 paragrafi tal-5.2.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-lamtu bħala perċentwali ( %) tal-kampjun huwa kalkolat kif ġej:

6.1.   Kejl skont il-polarimetrija

P	=	Rotazzjoni ottika totali fi gradi
P'	=	Rotazzjoni ottika fi gradi ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol (V/V)
	=	Rotazzjoni ottika speċifika ta' lamtu pur. Il-valuri numeriċi. Il-valuri D numeriċi aċċettati b'mod konvenzjonali għal dan il-fattur huma kif ġejjin: + 185,9 o: lamtu tar-ross + 185,7 o: lamtu tal-patata + 184,6 o: lamtu tal-qamħirrun + 182,7 o: lamtu tal-qamħ + 181,5 o: lamtu tax-xgħir + 181,3 o: lamtu tal-ħafur + 184,0 o: tipi oħra ta' lamtu u taħlitiet ta' lamtu f'għalf kompost

6.2.   Kejl permezz ta' sakkarimetru

S	=	Rotazzjoni ottika totali fi gradi sakkarimetriċi
S'	=	Rotazzjoni ottika fi gradi sakkarimetriċi ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol (v/v)
N	=	Piż fi g ta' sukrożju f'100 ml ta' ilma li jagħti rotazzjoni ottika ta' 100 grad sakkarimetriku f'tubu ta' 200 mm. 16,29 g għal sakkarimetri Franċiżi, 26,00 g għal sakkarimetri Ġermaniżi, 20,00 g għal sakkarimetri varji. = Rotazzjoni ottika speċifika ta' lamtu pur (ara 6.1.)

6.3.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun iktar minn 0,4, f'valur assolut, għall-kontenut ta' lamtu ta' inqas minn 40 % u 1 % f'valur relattiv, għall-kontenut ta' lamtu ta' 40 % jew aktar.

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

Jekk il-kampjun ikun fih aktar minn 6 % ta' karbonati, ikkalkolati f'termini ta' calcium carbonate, dawn għandhom jinqerdu bi trattament bi kwantità xierqa ta' aċidu sulfuriku imħallat qabel ma tiġi stabbilita r-rotazzjoni ottika totali.

7.2.

Fil-każ ta' prodotti b'kontenut għoli ta' lattożju, bħas-serum tal-ħalib tat-trab jew ħalib tat-trab xkumat, ipproċedi kif ġej wara li żżid 80 ml ta' etanol (3.5). Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett u daħħal dan tal-aħħar fil-banju tal-ilma f'50 oC għal 30 minuta. Ħallih jiksaħ u kompli l-analiżi kif indikat f'5.3.

7.3.

Il-materjal tal-għalf li ġej, meta jkun preżenti f'ammonti sinifikanti fl-għalf, huwa magħruf li joħloq interferenzi waqt id-determinazzjoni tal-kontenut tal-lamtu permezz tal-metodu polarimetriku u għalhekk jista' jwassal għal riżultati mhux korretti: — (zokkor) prodotti tal-pitravi bħal (zokkor) polpa tal-pitravi, (zokkor) ġulepp tal-pitravi, (zokkor) polpa tal-pitravi – magħmula ġulepp, (zokkor) vinasse tal-pitravi, (pitravi) zokkor; — polpa taċ-ċitru; — żerriegħa tal-kittien; expeller taż-żerriegħa tal-kittien; żerriegħa tal-kittien estratta; — żerriegħa tal-kolza; expeller taż-żerriegħa tal-kolza; żerriegħa tal-kolza estratta; qxur taż-żerriegħa tal-kolza; — żerriegħa tal-ġirasol; żerriegħa tal-ġirasol estratta; żerriegħa tal-ġirasol parzjalment mingħajr il-qoxra, estratta; — expeller tal-kopra; kopra estratta; — polpa tal-patata; — ħmira ddeidratata; — prodotti mogħnija bl-inulina (eż. Biċċiet ta' qaqoċċ ta' Ġerusalemm u qaqoċċ ta' Ġerusalemm mitħun); — greaves.

M.   DETERMINAZZJONI TA' RMIED MHUX RAFFINAT

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-kontenut ta' rmied mhux raffinat fl-għalf.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jiġi magħmul f'irmied f'temperatura ta' 550 oC; ir-residwu jintiżen.

3.   Reaġenti

20 % (w/v) soluzzjoni ta' nitrat tal-ammonja.

4.   Apparat

4.1.

Hot-plate.

4.2.

Muffle-furnace tal-elettriku bit-termostat.

4.3.

Griġjoli biex isir l-irmied magħmula mis-silica, porċellana jew mill-platinu f'għamla rettangolari (60 × 40 × 25 mm) jew tondi (dijametru: 60 sa 75 mm, għoli: 20 sa 40 mm).

5.   Proċedura

Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun (2,5 fil-każ ta' prodotti li għandhom tendenza li jintefħu) u qiegħdu fi griġjol għall-irmied wara li l-ewwel ikun issaħħan f'550 oC, imkessaħ u tnaqqaslu l-piż fi proporzjon mal-piż tal-kontenitur. Qiegħed il-griġjol fuq il-hotplate u saħħan gradwalment sakemm is-sustanza tikkarbonizza. Agħmel irmied skont 5.1 u 5.2.

5.1.

Daħħal il-griġjol fil-muffle-furnace kalibrat f'temperatura ta' 550 oC. Żomm din it-temperatura sakemm jinkiseb irmied abjad, griż ċar jew ħamrani li jidher li huwa ħieles minn partikoli li jkun fihom il-karbonju. Qiegħed il-griġjol f'dessikatur, ħallih jiksaħ u iżen minnufih.

5.2.

Daħħal il-griġjol fil-muffle-furnace kalibrat f'temperatura ta' 550 oC. Agħmel irmied għal 3 sigħat. Qiegħed il-griġjol f'dessikatur, ħallih jiksaħ u iżen minnufih. Erġa' agħmel irmied għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż tal-irmied jibqa' kostanti (telf fil-piż bejn żewġ wiżniet suċċessivi jrid ikun inqas minn jew ugwali għal 1 mg).

6.   Kalkolu tar-riżultati

Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

L-irmied ta' sustanzi li huma diffiċli biex isiru rmied għandu jiġi soġġett għall-proċess ta' produzzjoni ta' rmied inizjali ta' mill-inqas tliet sigħat, imkessaħ u mbagħad jiżdied miegħu ftit taqtir ta' 20 % soluzzjoni ta' nitrat tal-ammonja (b'attenzjoni, sabiex jiġi evitat it-tixrid tal-irmied jew il-formazzjoni ta' għoqiedi). Kompli kkalċina wara li tnixxef fil-forn. Irrepeti l-proċess kif meħtieġ sakemm il-produzzjoni tal-irmied titlesta.

7.2.

Fil-każ ta' sustanzi li huma reżistenti għat-trattament deskritt taħt 7.1, ipproċedi kif ġej: wara l-produzzjoni tal-irmied ta' tliet sigħat, qiegħed l-irmied f'ilma sħun u ffiltra minn filtru żgħir, ħieles mill-irmied. Agħmel l-irmied mill-filtru u l-kontenuti tiegħu fil-griġjol oriġinali. Qiegħed il-filtrat fi griġjol imkessaħ, evapora sakemm jinxef, għamel irmied minnu u iżen.

7.3.

Fil-każ ta' żjut u xaħmijiet, iżen b'mod preċiż kampjun ta' 25 g fi griġjol ta' daqs xieraq. Ikkarbonizza billi tqabbad is-sustanza bi strixxa ta' karta tal-filtru ħielsa mill-irmied. Wara li jkun qabad, xarrab bl-inqas ilma possibbli. Nixxef u għamlu rmied kif deskritt taħt 5.

N.   DETERMINAZZJONI TA' RMIED LI MA JINĦALLX FL-AĊIDU IDROKLORIKU

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' sustanzi minerali fl-għalf li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku. Jistgħu jintużaw żewġ metodi, skont in-natura tal-kampjun.

1.1.

Metodu A: jgħodd għal għalf mhux imħallat u organiku u għall-maġġoranza tal-għalf kompost;

1.2.

Metodu B: jgħodd għal komposti u taħlitiet minerali u għal għalf kompost li l-kontenut tagħhom f'sustanzi li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku, kif stabbilit minn Metodu A, huwa aktar minn 1 %.

2.   Prinċipju

2.1.

Metodu A: il-kampjun jiġi magħmul irmied, l-irmied jitgħalla fl-aċidu idrokloriku u r-residwu li ma jinħallx jiġi iffiltrat u jintiżen.

2.2.

Metodu B: il-kampjun jiġi ittrattat bl-aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni tiġi ffiltrata, ir-residwu jkun magħmul irmied u l-irmied miksub ittrattat skont il-Metodu A.

3.   Reaġenti

3.1.

Aċidu idrokloriku 3 mol/litru.

3.2.

20 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid.

3.3.

1 % soluzzjoni (w/v) ta' trichloroacetic acid.

4.   Apparat

4.1.

Hot plate.

4.2.

Muffle-furnace tal-elettriku bit-termostat.

4.3.

Griġjoli biex isir l-irmied magħmulin mis-silica, porċellana jew mill-platinu f'għamla rettangolari (60 × 40 × 25 mm) jew tondi (dijametru: 60 sa 75 mm, għoli: 20 sa 40 mm).

5.   Proċedura

5.1.   Metodu A

Ipproduċi rmied mill-kampjun permezz tal-metodu deskritt għad-determinazzjoni ta' rmied mhux raffinat. Irmied miksub minn dik l-analiżi jista' jintuża wkoll.

Qiegħed l-irmied f'beaker ta' 250 sa 400 ml billi tuża 75 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1). Ħallih jiftaħ jagħli bil-mod u għalli bil-mod għal ħmistax-il minuta. Iffiltra s-soluzzjoni sħuna minn karta tal-filtru ħielsa mill-irmied u aħsel ir-residwu b'ilma sħun sakemm ir-reazzjoni tal-aċidu ma tidhirx aktar. Nixxef il-filtru li fih ir-residwu u għamlu rmied fi griġjol li jkun tnaqqaslu l-piż fi proporzjon mat-toqol (tared) tal-kontenitur f'temperatura ta' mhux inqas minn 550 oC u mhux aktar minn 700 oC. Kessaħ f'dessikatur u iżen.

5.2.   Metodu B

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u poġġih f'tazza ta' 250 sa 400 ml. Żid 25 ml ta' ilma u 25 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1) suċċessivament, ħawwad u stenna sakemm tieqaf l-effervexxenza. Żid 50 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.1). Stenna sakemm jieqaf xi rilaxx ta' gass imbagħad qiegħed it-tazza f'banju bl-ilma jagħli u żommha hemm għal tletin minuta jew aktar, jekk ikun meħtieġ, sabiex xi lamtu li jista' jkun preżenti jiġi idrolizzat sew. Iffiltra waqt li jkun sħun minn filtru ħieles mill-irmied u aħsel il-filtru f'50 ml ta' ilma sħun (ara osservazzjoni 7). Qiegħed il-filtru li jkun fih ir-residwu u għamlu rmied fi griġjol biex isir rmied f'temperatura ta' mhux inqas minn 550 oC u mhux aktar minn 700 oC. Qiegħed l-irmied f'tazza ta' 250 sa 400 ml bl-użu ta' 75 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1); kompli kif deskritt fit-tieni subparagrafu tal-5.1.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare. Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Osservazzjoni

Jekk il-filtrazzjoni tkun diffiċli erġa' ibda l-analiżi, billi tibdel il-50 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1) ma' 50 ml ta' 20 % trichloroacetic acid (3.2) u aħsel il-filtru f'soluzzjoni sħuna ta' 1 % trichloroacetic acid (3.3).

O.   DETERMINAZZJONI TAL-KARBONATI

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-ammont ta' karbonati, konvenzjonalment espress bħala calcium carbonate fil-biċċa l-kbira tal-għalf.

Iżda f'ċerti każijiet (pereżempju, iron carbonate) għandu jintuża metodu speċjali.

2.   Prinċipju

Il-karbonati huma dekomposti f'aċidu idrokloriku; il-carbon dioxide rilaxxat huwa miġbur f'tubu ggradat, u l-volum tiegħu mqabbel ma' dak rilaxxat taħt l-istess kundizzjonijiet permezz ta' kwantità magħrufa ta' calcium carbonate.

3.   Reaġenti

3.1.

Aċidu idrokloriku, densità 1,10 g/ml.

3.2.

Calcium carbonate.

3.3.

Aċidu sulfuriku, bejn wieħed u ieħor 0,05 mol/litru, kulurit b'metil aħmar.

4.   Apparat

Apparat Scheibler-Dietrich (ara d-dijagramma) jew apparat ekwivalenti.

5.   Proċedura

Skont il-kontenut tal-karbonat tal-kampjun, iżen porzjon tal-kampjun kif muri hawn taħt:

—	0,5 g għall-prodotti li jkun fihom minn 50 sa 100 % ta' karbonati, imfissra bħala calcium carbonate;

—	1 g għall-prodotti li jkun fihom minn 40 sa 50 % ta' karbonati, imfissra bħala calcium carbonate;

—	2 sa 3 g għal prodotti oħra.

Qiegħed il-porzjon tal-kampjun fil-kunjett speċjali (4) tal-apparat, mgħammar b'tubu żgħir ta' materjal li ma jinkisirx li jkun fih 10 ml aċidu idrokloriku (3.1), u qabbad il-kunjett mal-apparat. Dawwar il-vit ta' bi tlieta (5) sabiex it-tubu (1) jaqbad ma' barra. Bl-użu tat-tubu mobbli (2), li huwa mimli b'aċidu sulfuriku ikkulurit (3.3) u mqabbad mat-tubu ggradat (1), ġib il-livell tal-likwidu sal-marka żero. Dawwar il-vit (5) sabiex tqabbad it-tubi (1) u (3) u vverifika li l-livell huwa fuq iż-żero.

Ħalli l-aċidu idrokloriku joħroġ (3.1) bil-mod fuq il-porzjon tal-kampjun, waqt li tmejjel il-kunjett (4). Agħmel il-pressjoni indaqs billi tbaxxi t-tubu (2). Ħawwad il-kunjett (4) sakemm ir-rilaxx tal-carbon dioxide ikun waqaf għal kollox.

Reġġa' lura l-pressjoni billi tirritorna l-likwidu lura sal-istess livell fit-tubi (1) u (2). Wara ftit minuti, meta l-volum tal-gass isir kostanti, ħu l-qari.

Wettaq test ta' kontroll fl-istess kundizzjonijiet fuq 0,5 g ta' calcium carbonate (3.2).

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut ta' karbonati, imfisser bħala calcium carbonate, huwa kkalkolat permezz tal-formula:

fejn:

X	=	% (w/w) ta' karbonati fil-kampjun, espress bħal karbonat tal-kalċju,
V	=	ml ta' CO2 rilaxxat mill-porzjon tal-kampjun m,
V1	=	ml ta' CO2 rilaxxat minn 0,5 g ta'CaCO,
m	=	piż, fi grammi, tal-porzjon tal-kampjun.

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

Meta l-porzjon tal-kampjun jiżen aktar minn 2 g, l-ewwel qiegħed 15 ml ta' ilma distillat fil-kunjett (4) u ħawwad qabel ma tibda t-test. Uża l-istess volum ta' ilma għat-test ta' kontroll.

7.2.

Jekk l-apparat użat ikollu volum differenti minn dak tal-apparat Scheibler-Dietrich, il-porzjonijiet meħuda mill-kampjun u mis-sustanza ta' kontroll u l-kalkolu tar-riżultati għandhom jiġu addattati kif jixraq.

P.   DETERMINAZZJONI TAL-FOSFRU TOTALI

METODU FOTOMETRIKU

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-fosfru totali fl-għalf. Huwa partikolarment adattat għal-analiżi ta' prodotti bi kwantitajiet żgħar ta' fosfru fihom. F'ċerti każijiet (prodotti b'ħafna fosfru), jista' jintuża metodu gravimetriku.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa mineralizzat, jew b'kombustjoni niexfa (fil-każ ta' għalf organiku) jew b'diġestjoni ta' aċidu (fil-każ ta' komposti minerali u l-għalf likwidu), u mqiegħda f'soluzzjoni ta' aċidu. Is-soluzzjoni hija trattata b'reaġent molybdovanadate. Id-densità ottika tas-soluzzjoni s-safra hekk iffurmata hija mkejjla fin spektrofotometru f' 430 mm.

3.   Reaġenti

3.1.

Calcium carbonate.

3.2.

Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,10 g/ml (bejn wieħed u ieħor 6 mol/litru).

3.3.

Aċidu nitriku, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Aċidu nitriku, ρ20 = 1,38 sa 1,42 g/ml.

3.5.

Aċidu sulfuriku, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Aġent Molybdovanadate: ħallat 200 ml soluzzjoni ta' ammonium heptamolybdate (3.6.1), 200 ml soluzzjoni ta' ammonium monovanadate (3.6.2) u 134 ml ta' aċidu nitriku (3.4) f'kunjett tal-1 l ggradat. Żid sal-volum bl-ilma.

3.6.1.

Soluzzjoni ta' ammonium: dewweb f'ilma jaħraq 100 g ta' ammonium heptamolybdate (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Żid 10 ml ammonja (Densità 0,91 g/mlu żid sa 1 l bl-ilma.

3.6.2.

Soluzzjoni tal-ammonium monovanadate: dewweb 2,35 g ammonium monovanadate NH4VO3 f'400 ml ilma jaħraq. Waqt li tħawwad kontinwament, żid bil-mod 20ml ta' aċidu nitriku dilwit (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O u żid sa 1 l bl-ilma.

3.7.

Soluzzjoni standard ta' 1 mg fosfru għal kull ml: dewweb 4,387 g potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 fl-ilma. Żid sa 1 l bl-ilma.

4.   Apparat

4.1.

Griġjoli tas-silika jew tal-porċellana għall-irmied.

4.2.

Muffle-furnace elettriku bit-termostat stabbilit f'550 oC.

4.3.

kunjett Kjeldahl ta' 250 ml.

4.4.

Kunjetti ggradati u pipetti ta' preċiżjoni.

4.5.

Spettrofotometru.

4.6.

Test tubes b'dijametru ta' madwar 16mm, b'tappijiet gradati għal dijametru ta' 14,5 mm; jesgħu: 25 sa 30 ml.

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni

Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif indikat f'5.1.1 jew 5.1.2.

5.1.1.   Il-proċedura tas-soltu

Iżen 1 g jew iktar tal-kampjun sal-eqreb 1 mg. Qiegħed il-kampjun tat-test fi Kjeldahl kunjett, żid 20ml aċidu sulfuriku (3.5), ħallat sabiex is-sustanza tiġi kompletament imprenjata bl-aċidu u sabiex tippreveniha milli teħel mal-ġnub tal-kunjett, saħħan u żommha fil-punt tat-togħlija għal 10 minuti. Ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid 2 ml ta' aċidu nitriku (3.4), saħħan bil-mod, ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid ftit iktar aċidu nitriku (3.4) u erġa' għalli. Irrepeti din il-proċedura sakemm tikseb soluzzjoni mingħajr kulur. Kessaħ, żid ftit ilma, ferra' l-likwidu f'kunjett iggradat b'500ml, u laħlaħ fil-kunjett Kjeldahl b'ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.

5.1.2.   Kampjuni li fihom sustanzi organiċi u ħielsa minn calcium u magnesium dihydrogen phosphates

Iżen madwar 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg fi griġjol tal-irmied. Ħallat il-kampjun tat-test sakemm jagħqad kompletament ma' 1g calcium carbonate (3.1). Ħallih sakemm isir irmied fil-forn f'550 oC sakemm jinkiseb irmied abjad jew griż (ftit faħam ma jimpurtax). Ittrasferixxi l-irmied għal beaker ta' 250 ml. Żid 20 ml ilma u aċidu idrokloriku (3.2) sakemm jieqaf il-gass. Żid 10 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.2). Qiegħed il-beaker f'banju tar-ramel u evapora sakemm niexef biex is-silika issir insolubbli. Erġa' dewweb ir-residwu f'10ml ta' aċidu nitriku (3.3) u għalli fil-banju tar-ramel għal 5 minuti mingħajr ma jevapora sakemm jinxef. Ferra' l-likwidu f'kunjett iggradat ta' 500 ml, u laħlaħ il-beaker diversi drabi b'ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.

5.2.   L-iżvilupp tal-kolorazzjoni u l-kejl tad-densità ottika

Iddilwixxi parti ta' alikwot tal-filtrat miksuba b'5.1.1 jew 5.1.2 sabiex tikseb konċentrazzjoni tal-fosfru ta' mhux iktar minn 40 μg/ml. Poġġi 10 ml ta' din is-soluzzjoni f'test-tube (4.6) u żid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f'20 oC. Kejjel id-densità ottika fi spettrofotometru f'430 nm kontra soluzzjoni miksuba billi żżid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (3.6) sa 10 ml ilma.

5.3.   Kurva ta' kalibrar

Mis-soluzzjoni standard (3.7) ipprepara soluzzjonijiet li jkun fihom rispettivament 5, 10, 20, 30 u 40 μg fosfru għal kull ml. Ħu 10 ml minn kull waħda minn dawn is-soluzzjonijiet u żid magħhom 10 ml tal-aġent tal-molybdovanadate (3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f'20 oC. Kejjel id-densità ottika kif indikat f'5.2. Segwi l-kurva ta' kalibrar billi tipplottja d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet korrispondenti ta' fosfru. għal konċentrazzjonijiet bejn 0 u 40 μg/ml, il-kurva tkun lineari.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-ammont tal-fosfru fil-kampjun tat-test billi tuża l-kurva ta' kalibrar.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

—	3 %, f'valur relattiv, għall-kontenuti tal-fosfru ta' inqas minn 5 %;

—	0,15 %, f'valur assolut, għall-kontenuti tal-fosfru ta' 5 % jew iktar.

Q.   DETERMINAZZJONI TA' KLORIN MINN KLORUR

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat l-ammont ta' klorin fi klorur li jinħall fl-ilma, imfisser b'mod konvenzjonali bħala sodium chloride. Huwa applikabbli għall-għalf kollu.

2.   Prinċipju

Il-kloruri jinħallu fl-ilma. Jekk il-prodott ikun fih materjal organiku dan jiġi ċċarat. Is-soluzzjoni tiġi kemm kemm aċidifikata bl-aċidu nitriku u l-kloruri jiġu preċipitati fil-forma ta' silver chloride permezz ta' soluzzjoni ta' silver nitrate. In-nitrat tal-fidda żejjed huwa titrat b'soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate, bil-metodu ta' Volhard.

3.   Reaġenti

3.1.

Soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate 0,1 mol/litru.

3.2.

Soluzzjoni ta' silver nitrate 0,1 mol/litre.

3.3.

Soluzzjoni saturata ta' ammonium ferric sulphate (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.

Aċidu nitriku, densità: 1,38 g/ml.

3.5.

Diethyl ether.

3.6.

Aċetun.

3.7.

Soluzzjoni Carrez I: dewweb fl-ilma 21,9 g ta' zinc acetate, Zn (CH3COO)2·2H2O u 3 g ta' aċidu aċetiku inġazzat. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.8.

Soluzzjoni Carrez II: dewweb fl-ilma 10,6 g ta' potassium ferrocyanide K4Fe(CN)6·3H2O. Żid għal 100 ml bl-ilma.

3.9.

Karbonju attiv, ħieles mill-kloruri u li ma jassorbihomx.

4.   Apparat

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni

Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif muri f'5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3.

Fl-istess ħin wettaq test blank mingħajr il-kampjun li jrid jiġi analizzat.

5.1.1.   Kampjuni ħielsa minn materjal organiku

Iżen sal-eqreb mg kampjun ta' mhux aktar minn 10 g u li jkun fih mhux aktar minn 3 g ta' klorin fil-forma ta' klorur. Qiegħed ma' 400 ml ilma f'kunjett volumetriku ta' 500 ml f'temperatura ta' bejn wieħed u ieħor 20 oC. Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.

5.1.2.   Kampjuni li jkun fihom materjal organiku, minbarra l-prodotti elenkati taħt 5.1.3.

Iżen bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 500 ml ma' 1 g karbonju attiv. Żid 400 ml ilma f' temperatura ta' bejn wieħed u ieħor 20 oC u 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.7), ħawwad għal 30 sekonda u mbagħad żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.8). Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.

5.1.3.   Għalf imsajjar, kejkijiet tal-kittien u dqiq, prodotti bi dqiq tal-kittien għoli u prodotti oħra b'muċilaġni għoli jew sustanzi kollojdali (pereżempju, lamtu iddextrinat)

Ipprepara s-soluzzjoni kif deskritt taħt 5.1.2 imma tiffiltrax. Ferra minn kunjett għall-ieħor (jekk meħtieġ iċċentrifuga), neħħi 100 ml tal-likwidu li jitla' fil-wiċċ u ttrasferixxi f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħawwad ma' aċeton (3.6) u żid sal-volum b'dan is-solvent, omoġenizza u ffiltra.

5.2.   Titrazzjoni

Permezz ta' pipetta, ittrasferixxi f'kunjett Erlenmayer minn 25 ml sa 100 ml tal-filtrat (skont il-kontenut ta' klorin preżunt) miksub kif deskritt taħt 5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3. Il-porzjon li jiġi diviż bl-eżatt ma jridx ikun fih aktar minn 150 mg ta' klorin (Cl). Żid bl-ilma kif meħtieġ sa mhux inqas minn 50 ml, żid 5 ml ta' aċidu nitriku (3.4.), 20 ml ta' soluzzjoni saturata ta' ammonium ferric sulphate (3.3) u żewġ taqtiriet ta' soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate (3.1) ittrasferiti permezz ta' buretta mimlija sal-marka taż-żero. Permezz ta' buretta, ittrasferixxi s-soluzzjoni tas-silver nitrate (3.2) b'tali mod li jinkisbu 5 ml żejda. Żid 5 ml ta' etere diethyl (3.5) u ħawwad bis-saħħa sabiex il-preċipitat jaqgħad. Ittitra s-silver nitrate żejjed mas-soluzzjoni tal-ammonium thiocyanate (3.1) sakemm il-kulur kannella fl-aħmar idum għal minuta.

6.   Kalkolu tar-riżultati

L-ammont ta' klorin (X), imfisser bħala % ta' sodium chloride huwa kkalkolat permezz tal-formola segwenti:

fejn:

V1	=	ml ta' soluzzjoni ta' silver nitrate 0,1 mol/l miżjuda
V2	=	ml ta' soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate 0,1 mol/l użata għat-titrazzjoni
m	=	piż tal-kampjun.

Jekk it-test blank jindika li s-soluzzjoni tas-silver nitrate 0,1 mol/l ġiet ikkunsmata naqqas dan il-valur mill-volum (V1 - V2).

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

It-titrazzjoni tista' titwettaq wkoll permezz ta' potentiometry;

7.2.

Fil-każ ta' prodotti li għandhom ammont kbir ta' żjut u xaħmijiet fihom, l-ewwel neħħi x-xaħam b'diethyl ether jew b'petroleum ħafif;

7.3.

Fil-każ ta' ikel mill-ħut, it-titrazzjoni tista' ssir bil-metodu Mohr.

---

(1)  Għat-tnixxif ta' ċereali, dqiq, xgħir u barli mitħun oħxon u qamħ mitħun mhux raffinat, il-forn irid ikollu kapaċità termali tali li, meta jkun issettjat minn qabel għal 131 oC dan jerġa' lura għal dik it-temperatura f'inqas minn 45 minuta wara li n-numru massimu ta' kampjuni għat-test ikunu tpoġġew ġewwa sabiex jitnixxfu flimkien. Il-ventilazzjoni trid tkun b'tali mod li meta jitpoġġew b'kemm jiflaħ kampjuni ta' qamħ komuni, ir-riżultati jvarjaw b'inqas minn 0,15 % minn dawk miksuba wara erba' sigħat ta' tnixxif.

(2)  Meta ż-żejt jew ix-xaħam ikollu jgħaddi minn testijiet sussegwenti, issostitwixxi l-biċċiet tal-ġebla ħaffiefa b'żibeġ tal-ħġieġ.

(3)  ĠU L 125, 23.5.1996, p. 35.

ANNESS IV

METODI TA’ ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-LIVELL TA’ ADDITTIVI AWTORIZZATI FL-GĦALF

(A)   DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA A

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ vitamina A (retinol) fl-għalf u f’taħlitiet minn qabel. Il-vitamina A tinkludi l-alkoħol all-trans-retinyl u cis-isomers tagħha li huma ddeterminati b’dan il-metodu. The content of vitamin A is expressed in International Units (IU) per kg. IU wieħed jikkorrispondi mal-attività ta’ 0,300 μg all-trans-vitamin A alkoħol jew 0,344 μg ta’ all-trans-vitamin A acetate jew 0,550 μg all-trans-vitamin A palmitate.

Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2 000 IU vitamina A/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina A hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina A huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (RP-HPLC) bl-użu ta’ UV jew ditettur tal-fluworexxenza. Il-parametri kromatografiċi huma magħżula sabiex ma jkunx hemm separazzjoni bejn l-all-trans- vitamin A alkoħol u cis isomers tiegħu.

3.   Reaġenti

3.1.

Etanol, σ = 96 %

3.2.

Petroleum ħafif, medda ta’ togħlija 40 oC – 60 oC

3.3.

Metanol

3.4.

Soluzzjoni ta’ potassium hydroxide, c = 50 g/100 ml

3.5.

Soluzzjoni ta’ sodium ascorbate, c = 10 g/100 ml (ara l-osservazzjoni 7.7)

3.6.

Sodium sulphide, Na2S x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1.

Soluzzjoni tas-sodium sulphide, c = 0,5 mol/l fi glycerol, ß = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-osservazzjonijiet 7.8)

3.7.

Soluzzjoni ta’ phenolphthalein, c = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1)

3.8.

2-Propanol

3.9.

Fażi mobbli għal HPLC: taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata.

3.10.

Nitroġenu, bla ossiġenu

3.11.

All-trans-vitamin A acetate, extra pur, ta’ attività ċertifikata, pereżempju 2,80 × 106 IU/g

3.11.1.

Soluzzjoni tal-istokk tal-all-trans-vitamin A acetate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ aċetat ta’ vitamina A (3.11) f’kunjett ta’ 100 ml iggradat. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.1.

3.12.

All-trans-vitamin A palmitate, extra pur, ta’ attività ċertifikata, pereżempju 1,80 × 106 IU/g.

3.12.1.

Soluzzjoni tal-istokk tal-all-trans-vitamin A palmitate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 80 mg ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.2.

3.13.

2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara l-osservazzjonijiet 7.5)

4.   Apparat

4.1.

Evaporatur rotanti b’vakwu

4.2.

Oġġetti tal-ħġieġ ambra

4.2.1.

Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass

4.2.2.

Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml

4.2.3.

Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass

4.2.4.

Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass

4.3.

Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għall-pajp tat-tmigħ tal-gass

4.4.

Karta filtru mitwija għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.

Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni

4.5.1.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi, 250 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta’ 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti (kriterju ta’ prestazzjoni: ogħla livell wieħed biss għar-retinol isomers kollha fil-kundizzjonijiet-HPLC)

4.5.2.

Ditettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli

4.6.

Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz

4.7.

Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku

4.8.

Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn:

4.8.1.

Ċilindru tal-ħġieġ li jesa’ 1 l iffitjat bl-għonq u b’tapp tal-ground glass

4.8.2.

Insert tal-ground glass mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni.

5.   Proċedura

Nota:

Il-Vitamina A hija sensitiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina A.

5.2.   Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina A, iżen sal-eqreb 1 mg, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3.   Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1.   Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.

5.3.2.   Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.

5.4.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.10) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ vitamina A trid tkun fil-medda ta’ 5 IU/ml sa 30 IU/ml).

5.5.   Determinazzjoni permezz HPLC

Il-vitamina A tissepara fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni titkejjel permezz ta’ ditettur bl-UV (325 nm) jew ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm, emissjoni: 475 nm) (4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.9). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromografija b’likwidi (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ippakkjar jew ekwivalenti
Fażi mobbli (3.9):	Taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v).
Rata ta’ tnixxija:	1 – 2 ml/min
Ditettur (4.5.2):	Ditettur tal-UV (325 nm) jew Ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm/emissjoni: 475 nm)

5.6.   Kalibrar

5.6.1.   Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ standard tax-xogħol

Ippipetta 20 ml ta’ soluzzjoni ta’ aċetat tal-vitamina A maħżuna (3.11.1) jew 20 ml tas-soluzzjoni ta’ palmitat tal-vitamina A maħżuna (3.12.1) f’kunjett konikali jew tal-qiegħ ċatt li jesa’ 500 ml (4.2.1) u idrolizzah kif spjegat fil-5.2, imma mingħajr żieda ta’ BHT. Sussegwentament agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif (3.2). Evapora 100 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u erġa’ dewweb ir-residwi f’10,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 560 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont il-5.6.3.3. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’kunjett iggradat ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita hija 56 IU vitamina A għal kull ml.

5.6.2.   Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 5,0 u 10,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,8, 5,6, 14,0 u 28,0 IU vitamina A għal kull ml.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Billi tuża l-medji tal-għoli tal-ogħla livelli (erjas) ipplottja grafika ta’ kalibrar li tikkunsidra r-riżultati tal-kontroll tal-UV (5.6.3.3).

5.6.3.   Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjonijiet standard

5.6.3.1.   Soluzzjoni stokk tal-aċetat tal-vitamina A

Ippipetta 2,0 ml tas-soluzzjoni stokk tal-aċetat ta’ vitamina A (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ aċetat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

( għall-aċetat tal-vitamina A=1 530 f’326 nm fi 2-propanol)

5.6.3.2.   Soluzzjoni stokk tal-palmitat ta’ vitamina A

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita ta’ palmitat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

( għal palmitat tal-vitamina A=957 fi 326 nm f’2-propanoli)

5.6.3.3.   Soluzzjoni ta’ standard ta’ ħidma ta’ vitamina A

Ippipetta 3,0 ml tas-soluzzjoni ta’ vitamina A mhux dilwita, preparata skont 5.6.1 f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Ippipetta 5,0 ml ta’ din is-soluzzjoni f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E325 × 18,3

( għal alkoħol tal-vitamina A=1 821 fi 325 nm f’2-propanol)

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli maħsub (żona) tal-livelli l-għolja tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’IU/ml b’referenza għall-grafika ta’ kalibrar (5.6.2).

Il-kontenut tal-vitamina A w f’IU/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[UI/kg]

fejn:

c	=	konċentrazzjoni tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’IU/ml
V1	=	volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’ml
V2	=	volum tal-alikwot meħud f’5.4 f’ml
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina A huwa utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ karigi ta’ saponifikazzjonijiet (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC.

7.2.

Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam.

7.3.

Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni.

7.4.

Biż-żejt tal-fwied tal-bakkaljaw u xaħmijiet puri oħra il-ħin ta’ saponifikazzjoni jrid jiġi estiż għal 45 – 60 minuta.

7.5.

Hydroquinone jista’ jintuża minflok BHT.

7.6.

Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ retinol isomers hija possibbli. Iżda f’dak il-każ l-għoli (erjas) tal-ogħla livelli kollha tas-cis u trans iżomeri jridu jingħaddu għall-kalkoli.

7.7.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg ascorbic acid minflok soluzzjoni ta’ sodium ascorbate.

7.8.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sodium sulphide.

7.9.

F’każijiet ta’ analiżi ta’ vitamina A fi prodotti li jissostitwixxu l-ħalib, trid tingħata attenzjoni speċjali: — fis-saponifikazzjoni (5.2): minħabba l-ammont ta’ xaħam preżenti fil-kampjun, jista’ jkun hemm bżonn li jiżdied ammont tas-soluzzjoni ta’ potassium hydroxide (3.4); — fl-estrazzjoni (5.3): minħabba l-preżenza ta’ emulsjonijiet, jista’ jkun hemm bżonn ta’ addattament tal-proporzjon 2:1 tal-ilma/etanol. Biex tiċekkja jekk il-metodu ta’ analiżi applikat jiġġenerax riżultati affidabbli fuq din il-matriċi speċifika (sostitut tal-ħalib), irid jiġi applikat test tal-irkupru fuq porzjon għat-test addizzjonali. Jekk ir-rata ta’ rkupru hija inqas minn 80 %, ir-riżultat analitiku jrid jiġi emendat għall-irkupru.

8.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % meta mqabbla mal-ogħla riżultat.

9.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv  (1)

	Taħlit minn qabel	Taħlit minn qabel kompost	Konċentrat ta’ mineral	Għalf tal-proteina	Qażquż
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
Medja [IU/kg]	17,02 x 106	1,21 x 106	537 100	151 800	18 070
sr [IU/kg]	0,51 x 106	0,039 x 106	22 080	12 280	682
r [IU/kg]	1,43 x 106	0,109 x 106	61 824	34 384	1 910
CVr [ %]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
sR [IU/kg]	1,36 x 106	0,069 x 106	46 300	23 060	3 614
R [IU/kg]	3,81 x 106	0,193 x 106	129 640	64 568	10 119
CVR [ %]	8,0	6,2	8,6	15	20

L	=	numru ta’ laboratorji
n	=	numru ta’ valuri singoli
sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
sR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
r	=	ripetibilità
R	=	riproduċibilità
CVr	=	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità
CVR	=	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

(B)   DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA E

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell tal-vitamina E fl-għalf u l-t-taħlitiet lesti minn qabel. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa mfisser bħala mg DL-α-tocopherol acetate għal kull kg. 1 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate jikkorrispondi għal 0,91 mg mg DL-α-tocopherol (vitamina E).

Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 2 mg vitamina E/kg. Dan il-limitu ta’ kwantifikazzjoni jinkiseb biss b’ditettur tal-fluworexxenza. B’ditettur bl-UV, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa biss 10 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina E hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa determinat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (EK-FGLK) bl-użu ta’ ditettur bl-UV jew fluworexxenti.

3.   Reaġenti

3.1.

Etanol, σ = 96 %

3.2.

Petroleum ħafif, medda ta’ togħlija 40 oC – 60 oC

3.3.

Metanol

3.4.

Soluzzjoni ta’ potassium hydroxide, c = 50 g/100 ml

3.5.

Soluzzjoni ta’ sodium ascorbate, c = 10 g/100 ml (ara l-osservazzjoni 7.7)

3.6.

Sodium sulphide, Na2S x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1.

Soluzzjoni ta’ sodium sulphide, c = 0,5 mol/l fi gliċerol, β = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-osservazzjonijiet 7.8)

3.7.

Soluzzjoni ta’ phenolphthalein, c = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1)

3.8.

Fażi mobbli għal HPLC: taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata.

3.9.

Nitroġenu, bla ossiġenu

3.10.

DL-α-tocopherol acetate, extra pur, ta’ attività ċertifikata

3.10.1.

Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tocopherol acetate. (Kontroll UV ara 5.6.1.3; stabbilizzazzjoni ara l-osservazzjonijijiet 7.4).

3.11.

DL-α-tocopherol, extra pur, ta’ attività attestata

3.11.1.

Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tocopherol: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tocopherol (3.11) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tocopherol. (Kontroll UV ara 5.6.2.3; stabbilizzazzjoni ara l-osservazzjonijijiet 7.4).

3.12.

2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara l-osservazzjonijiet 7.5)

4.   Apparat

4.1.

Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.2.

Oġġetti tal-ħġieġ ambra

4.2.1.

Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass

4.2.2.

Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml

4.2.3.

Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass

4.2.4.

Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass

4.3.

Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għall-pajp tat-tmigħ tal-gass

4.4.

Karta filtru mitwija għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.

Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni

4.5.1.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi, 250 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta’ 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti

4.5.2.

Ditettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli

4.6.

Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz

4.7.

Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku

4.8.

Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn:

4.8.1.

Ċilindru tal-ħġieġ li jesa’ 1 l iffitjat bl-għonq u b’tapp tal-ground glass

4.8.2.

Insert tal-ground glass mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni.

5.   Proċedura

Nota:

Il-Vitamina E hija sensittiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina E.

5.2.   Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina E, iżen sal-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.12), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3.   Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1.   Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.

5.3.2.    Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.

5.4.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.9) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ DL-α-tocopherol trid tkun fil-medda ta’ 5 μg/ml sa 30 μg/ml).

5.5.   Determinazzjoni permezz HPLC

Vitamina E hija separata fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni hija mkejla permezz ta’ ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 295 nm, emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm) (4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.8). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromografija b’likwidi (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm, ippakkjar jew ekwivalenti
Fażi mobbli (3.8):	Taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v).
Rata ta’ tnixxija:	1 – 2 ml/min
Ditettur (4.5.2)	Ditettur fluworexxenti (eċitazzjoni: 295 nm/emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm)

5.6.   Kalibrar (DL-α-tocopherol acetate jew DL-α-tocopherol)

5.6.1.   DL-α-tocopherol acetate standard

5.6.1.1.   Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 25 ml tas-soluzzjonita’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) f’kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt ta’ 500 ml (4.2.1) u idrolizza kif spjegat f’5.2. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif. Evapora 25 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u erġa’ dewweb ir-residwi f’25,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 45,5 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 50 μg DL-α-tocopherol acetate għal kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.1.2.   Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,5, 5,0, 10,0 u 25,0 μg DL-α-tocopherol acetate, eż. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml u 2,28 μg/ml DL-α-tocopherol.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.1.3.   Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1)

Iddilwixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm.

L-assorbiment massimu għandu jkun f’284nm:

 = 43,6 at 284 nm f’etanol

F’din it-taħlita irid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,84 sa 0,88.

5.6.2.   DL-α-tocopherol standard

5.6.2.1.   Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 2 ml tas-soluzzjoni stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, dewweb fil-metanol (3.3) u imla sal-marka bil-metanol. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 40 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 44,0 μg DL-α-tocopherol acetate kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.2.2.   Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. L-inqas konċentrazzjonijiet ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,0, 4,0, 8,0 u 20,0 μg/ml DL-α-tocopherol, i. e. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml u 22,0 μg/ml DL-α-tocopherol acetate.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.2.3.   Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ tocopherol-DL-α (3.11.1)

Iddilwixxi 2,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm. L-assorbiment massimu għandu jkun f’292nm:

 = 75,8 at 292 nm f’etanol

F’din it-taħlita jrid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,6.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun stabbilixxi l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml (ikkalkolata bħala α-tocopherol acetate) b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.6.1.2 jew 5.6.2.2).

Il-kontenut tal-vitamina E w f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni tal-vitamina E (bħala α-tocopherol acetate) tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) μg/ml
V1	=	volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4), f’ml
V2	=	volum tal-alikwot meħud f’(5.4), f’ml
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Osservazzjonijiet

7.1.

Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina E jista’ jkun utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ saponifikazzjonijiet-kargati (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC.

7.2.

Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam.

7.3.

Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni.

7.4.

Wara l-kejl spettrofotometriku tad-DL-α-tocopherol acetate jew tas-soluzzjoni tad-DL-α-tocopherol skont 5.6.1.3 jew 5.6.2.3 rispettivament żid bejn wieħed u ieħor 10 mg BHT (3.12) għas-soluzzjoni (3.10.1 jew 3.10.2) u żomm is-soluzzjoni fi friġġ (tul ta’ ħażna massima ta’ 4 gimgħat).

7.5.

Hydroquinone jista’ jintuża minflok BHT.

7.6.

Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ α-, β-, γ- and δ-tocopherol hija possibbli.

7.7.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg ascorbic acid minflok soluzzjoni ta’ sodium ascorbate.

7.8.

Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sodium sulphide.

7.9.

L-aċetat tal-vitamina E jidrolizza malajr taħt kundizzjonijiet alkaliniċi u għalhekk huwa sensittiv ħafna għall-ossidazzjoni, b’mod speċjali fil-preżenza ta’ elementi ta’ traċċa bħall-ħadid jew ram. Fil-każ tad-determinazzjoni ta’ vitamina E f’taħlitiet lesti minn qabel f’livelli ogħla minn 5 000 mg/kg, id-degradazzjoni tal-vitamina E tista’ tkun il-konsegwenza. għalhekk metodu HPLC inkluż diġestjoni enzimatika tal-formulazzjoni tal-vitamina E mingħajr il-fażi ta’ saponifikazzjoni bl-alkalina għandu jkun rakkomandat għall-konferma.

8.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

9.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv  (2)

	Taħlit minn qabel	Taħlit minn qabel tal-proteina	Konċentrat ta’ mineral	Għalf tal-proteina	Qażquż
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
medja [mg/kg]	17 380	1 187	926	315	61,3
sr [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr [ %]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
sR mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR [ %]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	=	numru ta’ laboratorji
n	=	numru ta’ valuri singoli
sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
sR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
r	=	ripetibilità
R	=	riproduċibilità
CVr	=	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità
CVR	=	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

(C)   DETERMINAZZJONI TA’ OLIGOELEMENTI – ĦADID, RAM, MANGANIŻ U ŻINGU

1.   Għan u skop

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-elementi traċċa ta’ ħadid, ram, manganiż u żingu fl-għalf. Il-limiti ta’ kwantifikazzjoni huma:

—	ħadid (Fe): 20 mg/kg

—	ram (Cu): 10 mg/kg

—	manganiż (Mn): 20 mg/kg

—	żingu (Zn): 20 mg/kg

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa mdaħħal fis-soluzzjoni fl-aċidu idrokloriku wara l-qerda tal-materja organika, jekk ikun hemm. L-elementi ħadid, ram, manganiż u żingu jiġu stabbiliti, wara dilwizzjoni xierqa, bl-atomic absorption spectrometry.

3.   Reaġenti

Kummenti ta’ introduzzjoni

Għall-preparazzjoni tar-reaġenti u soluzzjonijiet analitiċi uża ilma ħieles mill-cations li għandhom jiġu stabbiliti, akkwistati jew b’distillar doppju tal-ilma jew f’tazza tal- borosilicate jew lampik tal-kwartz jew bi trattament doppju fuq raża ta’ skambju ta’ jonji.

Ir-reaġenti għandhom ikunu mill-anqas ta’ grad analitiku. Il-ħelsien mill-element li għandu jiġi stabbilit għandu jkun ivverifikat f’esperiment blank. Jekk meħtieġ, ir-reaġenti għandhom jiġu ppurifikati aktar.

Minflok is-soluzzjonijiet standard deskritti hawn taħt, jistgħu jintużaw soluzzjonijiet standard kummerċjali diment li dawn ikunu garantiti u jkunu ġew ivverifikati qabel l-użu.

3.1.

Aċidu idrokloriku. (d:1,19 g/ml).

3.2.

Aċidu idrokloriku. (6 mol/litru).

3.3.

Aċidu idrokloriku. (0,5 mol/litru).

3.4.

Aċidu idrofluworiku 38 sa 40 % (v/v) li jkollu element ta’ kontenut ta’ ħadid (Fe) ta’ inqas minn 1 mg/litru u residwu wara l-evaporazzjoni ta’ inqas minn 10 mg (bħala sulfat)/litru

3.5.

Aċidu sulfuriku. (d: 1,84 g/ml).

3.6.

Perossidu tal-idroġenu. (bejn wieħed u ieħor 100 volum ta’ ossiġenu (30 % bil-piż)).

3.7.

Soluzzjoni standard tal-ħadid (1 000 μg Fe/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: dewweb 1g ta’ fil tal-ħadid f’200 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), żid 16 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (3.6) u żid sa litru bl-ilma.

3.7.1.

Soluzzjoni ta’ ħidma standard tal-ħadid (100 μg Fe/ml) ippreparata billi parti waħda tas-soluzzjoni standard (3.7) tiġi dilwita ma’ 9 partijiet ilma.

3.8.

Soluzzjoni standard tar-ram (1 000 μg Cu/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: — dewweb 1 g ram f’għamla ta’ trab (a.p.) fi 25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), żid 5 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (3.6) u żid sa litru bl-ilma

3.8.1.

Soluzzjoni ta’ ħidma standard tar-ram (10 μg Cu/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.8) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma.

3.9.

Soluzzjoni standard tal-manganiż (1 000 μg Mn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: — dewweb 1 g ta’ manganiż f’għamla ta’ trab f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma.

3.9.1.

Soluzzjoni ta’ ħidma standard tal-manganiż (10 μg Mn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.9) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma.

3.10.

Soluzzjoni standard taż-żingu (1 000 μg Zn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: — dewweb 1 g ta’ żingu f’għamla ta’ strixxa jew folja f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma.

3.10.1.

Soluzzjoni standard taż-żingu (10 μg Zn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.10) ma’ 9 partijiet ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni riżultanti ma’ 9 partijiet ta’ ilma.

3.11.

Soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu: dewweb 12 g ta’ ossidu tal-lantanu f’150 ml ilma, żid 100 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma.

4.   Apparat

4.1.

Muffle furnace b’regolatur tat-temperatura u preferibbilment b’reġistru.

4.2.

L-apparat tal-ħġieġ għandu jkun tat-tip ta’ borosilikat reżistenti u huwa rrakomandat li jintuża apparat li jkun riżervat esklussivament għad-determinazjoni ta’ elementi ta’ traċċa.

4.3.

Atomic absorption spectrophotometer li jissodisfa l-ħtiġiet tal-metodu fir-rigward tas-sensittività u preċiżjoni fil-medda meħtieġa.

5.   Proċedura  (3)

5.1.   Kampjuni li fihom materjal organiku

5.1.1.   L-irmied u l-preparazzjoni tas-soluzzjoni għal analiżi  (4)

5.1.1.1.

Poġġi 5 sa 10 g ta’ kampjun miżun sal-eqreb 0,2 mg fi griġjol tal-kwartz jew tal-platinum (ara n-Nota (b)), nixxef f’forn f’105 oC u daħħal il-griġjol fil-muffle furnace kiesaħ (4.1). Agħlaq il-forn (ara n-Nota (c)) u gradwalment tella’ t-temperatura għal 450 sa 475 oC f’ħin ta’ 90 minuta. Żomm din it-temperatura għal 4 sa 16-il siegħa (eż. matul il-lejl) biex tneħħi l-materjal faħmi u imbagħad iftaħ il-forn u ħallih jibred (ara Nota (d)). Xarrab l-irmied bl-ilma u poġġihom f’beaker ta’ 250 ml. Aħsel il-griġjol b’total ta’ madwar 5 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1) u żid dan tal-aħħar bil-mod u b’attenzjoni fil-beaker (jista’ jkun hemm reazzjoni vigoruża minħabba l-formazzjoni tad-CO2). Żid l-aċidu idrokloriku (3.1) bit-taqtir b’aġitazzjoni sakemm l-effervexxenza tieqaf għal kollox. Evapora sakemm jixxotta, waqt li kultant tħawwad b’virga tal-ħġieġ. Wara żid 15 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2) mar-residwu segwit b’madwar 120 ml ilma. Ħawwad bil-virga tal-ħġieġ, li għandha titħalla fil-beaker, u għatti t-tazza b’watch-glass. Wassal bil-mod sat-togħlija u żomm il-punt tat-togħlija sakemm ebda rmied ma jkun jidher jinħall iktar. Iffiltra fuq karta tal-filtru ħielsa minn kull irmied u iġbor il-filtrat f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml. Aħsel il-beaker u iffiltra b’5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku jaħraq (3.2) u darbtejn b’ilma jagħli. Imla l-kunjett volumetriku sal-marka bl-ilma (konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru).

5.1.1.2.

Jekk ir-residwu fil-filtru jidher iswed (karbonju), erġa’ poġġih fil-forn u agħmlu mill-ġdid f’irmied f’450 sa 475 oC. Dan il-proċess ta’ rmied, li jeħtieġ biss ftit sigħat (madwar tlieta sa ħames sigħat), ikun intemm meta l-irmied jidher abjad jew kważi abjad. Dewweb ir-residwu f’madwar 2 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1), evapora sakemm jixxotta u żid 5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2). Saħħan, iffiltra s-soluzzjoni fil-kunjett volumetriku u imla sal-marka b’ilma (Konċentrazzjoni tal-HCl madwar 0,5 mol/litru). Noti: (a) Fid-determinazzjoni ta’ elementi ta’ traċċa huwa importanti li toqgħod attent għar-riskji ta’ kontaminazzjoni, b’mod partikolari b’żingu, ram u ħadid. għal din ir-raġuni, it-tagħmir użat fil-preparazzjoni tal-kampjuni għandu jkun ħieles minn dawn il-metalli. Biex jitnaqqas ir-riskju ġenerali ta’ kontaminazzjoni, aħdem f’atmosfera ħielsa mit-trab b’tagħmir skrupolużament nadif u apparat tal-ħġieġ maħsul b’galbu. Id-determinazzjoni ta’ żingu hija partikolarment sensittiva għal ħafna tipi ta’ kontaminazzjoni, eż. minn apparat tal-ħġieġ, reaġenti, trab, eċċ. (b) Il-piż tal-kampjun li jkun jeħtieġ li jsir irmied huwa kkalkolat mill-kontenut approssimattiv ta’ elementi ta’ traċċa tal-għalf fir-rigward tas-sensittività tal-ispettrofotometru użat. għal ċertu għalf li jkollu ftit elementi ta’ traċċa, jista’ jkun meħtieġ li tibda b’kampjun ta’ 10 sa 20 g u żżid għal soluzzjoni finali ta’ 100 ml biss. (ċ) L-operazzjoni ta’ rmied għandha titwettaq f’forn magħluq mingħajr dħul ta’ arja jew ossiġenu. (d) It-temperatura indikata mil-pijrometru m’għandhiex tkun aktar minn 475 oC.

5.1.2.   Determinazzjoni spettrofotometrika

5.1.2.1.   Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar

Għal kull wieħed mill-elementi li jeħtieġ jiġi determinat, ipprepara mis-soluzzjonijiet standard tax-xogħol kif mogħtija fil-punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 u 3.10.1 medda ta’ soluzzjonijiet ikkalibrati, kull soluzzjoni kalibrata jkollha konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru u (fil-każijiet ta’ ħadid, manganiż u żingu) konċentrazzjoni ta’ lanthanum chloride ekwivalenti għal 0,1 % La (w/v).

Il-konċentrazzjonijiet ta’ elementi ta’ traċċa magħżula jridu jkunu fil-medda ta’ sensittività tal-ispettrofotometru użat. It-tabelli ta’ hawn taħt juru, permezz ta’ eżempju, il-kompożizzjoni ta’ meded tipiċi ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar; iżda jiddependi fuq it-tip u s-sensittività tal-ispettrofotometru wżat jista’ jkun meħtieġ li jintgħażlu konċentrazzjonijiet oħrajn.

Ħadid

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

Ram

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.8.1) (1 ml = 10 μg Fe)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Manganiż

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

Żingu

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

5.1.2.2.   Preparazzjoni ta’ soluzzjoni għal analiżi

Għad-determinazzjoni ta’ ram, is-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 tista’ normalment tintuża direttament. Jekk meħtieġ, sabiex twassal il-konċentrazzjoni tagħha fi ħdan il-medda tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar, porzjon alikwot jista’ jkun imseffed f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml u miżjud sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3).

Għad-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu, seffed porzjon alikwot tas-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml, żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u wassal sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3) ara wkoll punt 8 “Osservazjoni”).

5.1.2.3.   Esperiment blank

L-esperiment blank għandu jinkludi l-passi kollha stabbiliti fil-proċedura ħlief li l-materjal tal-kampjun jitħalla barra. Is-soluzjoni tal-kalibrar “0” m’għandhiex tintuża bħala l-blank.

5.1.2.4.   Kejl tal-assorbiment atomiku

Kejjel l-assorbiment atomiku tal-soluzzjonijiet tal-kalibrar u tas-soluzzjoni li għandha tkun analizzata billi tuża fjamma tal-aċitelena ta’ ossiġinazzjoni tal-arja f’dawn il-“wavelengths” segwenti:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Wettaq kull kejl erba’ darbiet.

5.2.   Għalf minerali

Jekk il-kampjun ma jkun fih ebda materjal organiku, m’hemmx għalfejn issir l-operazzjoni ta’ rmied qabel. Ipproċedi kif deskritt fil-punt 5.1.1.1. billi tibda mit-tieni paragrafu. L-evaporazzjoni bil-hydrofluoric acid tista’ titħalla barra.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Permezz ta’ kurva ta’ kalibrar, ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ elementi ta’ traċċa fis-soluzzjoni li għandha tiġi analizzata u uri r-riżultat f’milligrammi ta’ elementi ta’ traċċa għal kull kilogramma tal-kampjun (ppm).

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jaqbżu:

—	5 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-element ta’ traċċa kkonċernat sa massimu ta’ 50 mg/kg;

—	10 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati minn 50 u sa massimu 100 mg/kg;

—	10 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati minn 100 u sa massimu ta’ 200 mg/kg;

—	5 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati aktar minn 200 mg/kg.

8.   Osservazzjoni

Il-preżenza ta’ kwantitajiet kbar ta’ fosfati tista’ tfixkel id-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu. Interferenza bħal din għandha tiġi kkoreġuta biż-żieda ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11). Jekk, madankollu, fil-kampjun, il-proporzjon tal-piż Ca + mg/P huwa > 2, iż-żieda tas-soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) mas-soluzzjoni għall-analiżi u għas-soluzzjoni ta’ kalibrar tista’ titħalla barra.

(D)   DETERMINAZZJONI TA’ HALOFUGINONE

DL-trans-7-bromo-6-chloro-3- [3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromide

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ halofuginone fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.

2.   Prinċipju

Wara t-trattament b’ilma jaħraq, halofuginone jiġi estratt bħala l-bażi libera fl-ethyl acetate u sussegwentament imqassam bħala l-hydrochloride f’soluzzjoni ta’ aċidu milwiem. Dan l-estratt jiġi ppurifikat bi kromotografia tal-iskambju tal-jonji. Il-kontenut tal-halofuginone huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC/MGKL) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

3.1.

Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.2.

Amberlite XAD-2 resin

3.3.

Ammonium acetate

3.4.

Ethyl acetate

3.5.

Aċidu aċetiku, inġazzat

3.6.

Sustanza standard tal-halofuginone (DL-trans-7-brome-6-chloro-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl] quinazoline-4-(3H)-one hydrobromide, E 764)

3.6.1.

Soluzzjoni standard ta’ stokk ta’ halofuginone, 100 μg/ml Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ halofuginone (3.6) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, dewweb f’soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate (3.18), żid sal-marka bis-soluzzjoni buffer u ħawwad. Din it-taħlita tibqa’ stabbli għal tliet ġimgħat f’5 oC jekk merfugħa fid-dlam.

3.6.2.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar F’serje ta’ kunjetti ikkalibrati ta’ 100 ml, ittrasferixxi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.6.1). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.21) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom konċentrazzjonijiet ta’ 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 mg/ml ta’ halofuginone rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu.

3.7.

Aċidu idrokloriku (ρ20 bejn wieħed u ieħor 1,16 g/ml).

3.8.

Metanol

3.9.

Silver nitrate

3.10.

Sodium ascorbate

3.11.

Sodium carbonate

3.12.

Sodium chloride

3.13.

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt)

3.14.

Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.15.

Soluzzjoni ta’ sodium carbonate, c = 10 g/100 ml

3.16.

Soluzzjoni ta’ sodium chloride-sodium carbonate saturata, c = 5 g/100 ml Dewweb 50 g ta’ sodium carbonate (3.11) fl-ilma, iddilwa sa 1 l u żid bil-klorur tas-sodju (3.12) sakemm is-soluzzjoni tkun saturata.

3.17.

Aċidu idrokloriku, bejn wieħed u ieħor 0,1 mol/l Iddilwixxi 10 ml ta’ HCl (3.7) bl-ilma sa 1 l.

3.18.

Soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate, bejn wieħed u ieħor 0,25 mol/l Dewweb 19,3 g ammonium acetate (3.3) u 30 ml aċidu aċetiku (3.5) fl-ilma (3.14) u ddilwixxi sa 1 l.

3.19.

Preparazzjoni ta’ amberlite XAD-2 raża Aħsel kwantità xierqa ta’ Amberlite (3.2) bl-ilma sakemm il-joni tal-klorur kollha jitneħħew, kif indikat b’test tas-silver nitrate (3.20) magħmul fuq il-fażi milwiema mwarrba. Imbagħad aħsel ir-raża b’50 ml metanol (3.8), armi l-metanol u żomm ir-raża taħt il-metanol frisk.

3.20.

Soluzzjoni tas-silver nitrate, bejn wieħed u ieħor 0,1 mol/l Dewweb 0,17 g ta’ silver nitrate (3.9) f’10 ml ilma.

3.21.

Fażi mobbli HPLC Ħallat 500 ml aċetronil (3.1) ma’ 300 ml ta’ soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate (3.18) u 1 200 ml tal-ilma (3.14). Aġġusta l-pH għal 4,3 billi tuża l-aċidu aċetiku (3.5). Iffiltra minn filtru ta’ 0,22 m (4.8) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b’ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). Din is-soluzzjoni tibqa’ stabbli għal xahar, jekk tinħażen fid-dlam f’reċipjent magħluq.

4.   Apparat

4.1.

Banju ultrasoniku

4.2.

Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.3.

Ċentrifuga

4.4.

Tagħmir tal-HPLC b’ditettur tal-ultravjola b’wavelength varjabbli jew ditettur diode-array.

4.4.1.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi, ippakkjar ta’ 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm, jew kolonna ekwivalenti

4.5.

Kolonna tal-ħġieġ (300 mm × 10 mm) mgħammra b’filtru tal-ħġieġ sileċju bi stopcock

4.6.

Filtri tal-fibra tal-ħġieiġ, b’dijametru ta’ 150 mm

4.7.

Filtri tal-membrana, 0,45 μm

4.8.

Filtri tal-membrana, 0,22 μm

5.   Proċedura

Nota	Halofuginone bħala l-bażi libera huwa instabbli fis-soluzzjonijiet alkalini u tal-ethyl acetate. M’għandux jibqa’ fl-ethyl acetate għal iżjed minn 30 minuta.

5.1.   Ġenerali

5.1.1.

Għalf blank għandu jiġi analizzat għall-verifika li la halofuginone u lanqas is-sustanzi interferenti ma jkunu preżenti.

5.1.2.

Għandu jitwettaq test tal-irkupru billi jiġi analizzat l-għalf blank li jkun ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ halofuginone, simili għal dak preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ sa livell ta’ 3 mg/kg, żid 300 μl tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.6.1) sa 10 g tal-għalf blank, ħallat u stenna għal 10 minuti qabel ma tipproċiedi bil-pass tal-estrazzjoni (5.2). Nota: għall-għanijiet ta’ dan il-metodu, l-għalf blank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u fl-analiżi m’għandux jinstab halofuginone.

5.2.   Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,1 g, 10 g mill-kampjun ippreparat, ġewwa tubu ċentrifugu tal-200 ml, żid 0,5 g ta’ sodium ascorbate (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) u 20 ml ilma u ħawwad. Qiegħed it-tubu għal 5 minuti f’banju bl-ilma (80 oC). Wara li jibred għat-temperatura ambjentali, żid 20 ml ta’ taħlita tas-sodium carbonate (3.15) u ħawwad. Żid minnufih 100 ml tal-ethyl acetate (3.4) u ħawwad bis-saħħa bl-idejn għal 15 il-sekonda. Imbagħad qiegħed it-tubu għal tliet minuti fil-banju ultrasoniku (4.1) u ħoll ftit it-tapp. Iċċentrifuga għal żewġ minuti u ferra’ l-fażi tal-ethyl acetate minn filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.6), għal f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml. Irrepeti l-estrazzjoni tal-kampjun bit-tieni porzjon ta’ 100 ml tal-ethyl acetate. Aħsel l-estratti miġmugħin għal minuta b’50 ml ta’ soluzzjoni ta’ sodium chloride saturated sodium carbonate (3.16) u armi s-saff milwiem.

Islet is-saff organiku għal minuta (1) b’50 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.17). għaddi s-saff aċiduż il-baxx f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 250 ml. Erġa’ islet is-saff organiku għal 1,5 minuti b’50 ml ieħor ta’ aċidu idrokloriku u għaqqad mal-ewwel estratt. Aħsel l-estratti magħqudin billi ddawwar għal bejn wieħed u ieħor 10 sekondi ma’ 10 ml tal-ethyl acetate (3.4).

Ittrasferixxi b’mod kwantitattiv is-saff milwiem għal kunjett b’qiegħ tond ta’ 250 ml u armi l-fażi organika. Evapora l-ethyl acetate kollu li jkun baqa’ mit-taħlita aċiduża bl-użu tal-evaporatur bil-pelikola rotanti (4.2). It-temperatura tal-banju bl-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Taħt vakwu ta’ bejn wieħed u ieħor of 25 mbar l-ethyl acetate kollu li jifdal għandu jitneħħa fi żmien 5 minuti fi 38 oC.

5.3.   Tindifa

5.3.1.   Preparazzjoni tal-kolonna tal-Amberlit

Kolonna XAD-2 tiġi ppreparata għal kull estratt tal-kampjun. Ittrasferixxi 10 g tal-Amberlit ippreparat (3.19) f’kolonna tal-ħġieġ (4.5) bil-metanol (3.8). Żid plagg żgħir tas-suf tal-ħġieġ mal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Battal il-metanol mill-kolonna u aħsel ir-raża b’100 ml ilma, filwaqt li twaqqaf in-nixxija hekk kif il-likwidu jilħaq il-parti tal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Ħalli l-kolonna tekwilibra ruħha għal 10 minuti qabel l-użu. Qatt tħalli l-kolonna tixxotta.

5.3.2.   Tindif tal-kampjun

Ittrasferixxi l-estratt (5.2) b’mod kwantitattiv lejn il-wiċċ tal-kolonna tal-Amberlit ippreparat (5.3.1) u saffi, filwaqt li twarrab it-tisfija. Ir-rata tat-tisfija m’għadhiex tkun aktar minn 20 ml/min. Laħlaħ il-kunjett bil-qiegħ tond b’20 ml hydrochlorid acid (3.17) u uża dan biex tlaħlaħ il-kolonna tar-raża. Onfoħ il-barra b’nixxija ta’ arja xi taħlita aċiduża li tkun baqgħet. Armi l-likwidu użat fil-ħasil. Żid 100 ml metanol (3.8) mal-kolonna u ħalli 5 sa 10 ml tal-ħasil, filwaqt li tiġbor is-soluzzjoni tal-ħasil f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Ħalli l-metanol li jkun baqa’ jekwilibra mar-raża għal 10 minuti u kompli t-tlaħliħ b’rata li ma taqbiżx 20 ml/min, u iġbor it-tlaħliħ fl-istess kunjett bil-qiegħ tond. Evapora l-metanol fuq l-evaporatur tal-pellikola rotanti (4.2), it-temperatura tal-banju tal-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Ittrasferixxi l-fdal b’mod kwantitattiv f’kunjett ikkalibrat ta’ 10 ml billi tuża l-fażi mobbli (3.21). Wassal sal-marka bil-fażi mobbli u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.7). Aħżen din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1.   Parametri

Il-kundizzjonijiet segwenti huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn basta dawn jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),

Fażi mobbli HPLC (3.21),

Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/min.

Wavelength tad-ditezzjoni: 243 nm

Volum tal-injezzjoni: 40 sa 100 μl.

Ivverifika l-istabbilità tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 3,0 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli (jew erjas) u ż-żmien ta’ żamma kostanti.

5.4.2.   Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) bosta drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar bl-użu tal-aqwa għoljiet jew żoni tal-medja tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala l-axxiżi.

5.4.3.   Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum bħal dak meħud għas-soluzzjoni tal-kalibrar u iddetermina l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli (iż-żona) tal-halofuginone.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, mill-medja tal-għoli (erja) tal-ogħla livelli ta’ halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun bis-soluzzjoni kampjun b’referenza għall-graff tal-kalibrar (5.4.2).

Il-kontenut tal-halofuginone w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c	:	konċentrazzjoni tal-halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml,
m	:	piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista’ tiġi ikkonfermata b’ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ dittetur tad-diode-array li bih huma mqabbla l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 6,0 μg/ml.

7.1.1.   Ko-kromatografija

Estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2). L-ammont ta’ halofuginone miżjud għandu jkun simili għal-ammont ikkalkolat ta’ halofuginone misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-halofuginone miżjud biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jitiqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll it-taħlit tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli masimu, għandha tkun madwar ± 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2.   Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)	il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni tad-diode-array, din hija tipikament fi ħdan ± 2 nm;

(b)

bejn 225 u 300 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru ‘fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard;

(c)

bejn 225 u 300 nm, l-ispettri tal-parti ’il fuq, tal-apiċi u tal-parti ’l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhiex tkun aktar minn 0,5 mg/kg għall-kontenut ta’ halofuginone sa 3 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv (5) li fih ġew analizzati tliet kampjuni minn tmien laboratorji.

Riżultati

	Kampjun A (blank) Mal-wasla	Kampjun B (Mitħun)		Kampjun C(Pritkuni)
		Mal-wasla	Wara xahrejn	Mal-wasla	Wara xahrejn
Medja [mg/kg]	ND	2,80	2,42	2,89	2,45
SR [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR [ %]	—	16	18	14	17
Rec. [ %]		86	74	88	75

ND	=	mhux rilevat
SR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
CVR	=	ko-effiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità ( %)
Rec.	=	irkupru ( %)

E.   DETERMINAZZJONI TA’ ROBENIDINE

1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-livelli ta’ robenidine fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt b’metanol aċidifikat. L-estratt jitnixxef u porzjon alikwot ikun soġġett għal tindifa sewwa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. Robenidine jitneħħa bil-ħasil mill-kolonna bil-metanol, konċentrat, u miżjud sa volum xieraq b’fażi mobbli. Il-kontenut ta’ robenidine jiġi stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja (HPLC – High performance liquid chromatography) b’fażi riversjata bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

3.1.

Metanol

3.2.

Metanol aċidifikat Ittrasferixxi 4,0 ml aċidu idrokloriku (ρ20 = 1,18 g/ml) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.1) u ħawwad. Din is-soluzzjoni għandha titħejja friska qabel l-użu.

3.3.

Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.4.

Passatur molekulari Tat-tip 3A, minn 8 sa 12-il malja (malji ta’ 1,6 – 2,5 mm, alumino-silicate kristallin, dijametru tal-pori 0,3 mm).

3.5.

Attività aċiduża tal-ossidu tal-aluminju grad I tal-kromatografija b’kolonna Ittrasferixxi 100 g ossidu tal-aluminju f’kontenitur adatt u żid 2,0 ml ilma. Poġġi t-tapp u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 20 minuta. Aħżen f’kontenitur li għandu t-tapp magħluq sew.

3.6.

Soluzzjoni tal-potassium dihydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Dewweb 3,40 g ta’ potassium dihydrogen phosphate fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka u ħawwad.

3.7.

Soluzzjoni tad-di-sodium hydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Dewweb 3,55 g ta’ di-sodium hydrogen phosphate anidru (jew 4,45 g ta’ dihydrate jew 8,95 g ta’ dodecahydrate) fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 l, żid sal-marka u ħawwad.

3.8.

Fażi mobbli tal-HPLC Ħawwad flimkien ir-reaġenti li ġejjin:   650 ml acetonitrile (3.3),   250 ml ilma (ekwivalenti għall-grad tal-HPLC),   50 ml soluzzjoni tal-potassium di-hydrogen phosphate (3.6),   50 ml soluzzjoni tad-di-sodium hydrogen phosphate (3.7). Għaddi minn filtru ta’ 0,22 μm (4.6) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni, (eżempju permezz ta’ ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti).

3.9.

Sustanza standard Robenidine pur: 1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride.

3.9.1.

Soluzzjoni ta’ stokk standard ta’ Robenidine: 300 μg/ml Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 30 mg ta’ sustanza standard ta’ robenidine (3.9). Dewweb f’metanal aċidifikat (3.2) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam.

3.9.2.

Soluzzjoni standard intermedjarja ta’ Robenidine: 12 μg/ml Ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 250 ml, żid sal-marka b’fażi mobbli (3.8) u ħawwad. geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam.

3.9.3.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar F’serje ta’ kunjetti kkalibrati ta’ 50 ml, ittrasferixxi 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 u 25,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedja (3.9.2). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.8) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 u 6,0 μg/ml ta’ robenidine rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu.

3.10.

Ilma ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

4.   Apparat

4.1.

Kolonna tal-ħġieġ Mibnija mill-ħġieġ tal-ambra mgħamra bi stopcock u b’reċipjent li jesa’ bejn wieħed u ieħor 150 ml, dijametru intern ta’ 10 sa 15 mm, tul ta’ 250 mm.

4.2.

Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika

4.3.

Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.4.

Tagħmir HPLC b’ditettur tal-ultravjola b’wavelength varjabbli jew ditettur tad-diode array li jaħdem fil-medda ta’ bejn 250 u 400 mm

4.4.1.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi: ippakkjar 300 mm × 4 mm, C18 10 μm jew ekwivalenti

4.5.

Karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman gF/A jew ekwivalenti)

4.6.

Filtri tal-membrana, 0,22 μm

4.7.

Filtri tal-membrana, 0,45 μm

5.   Proċedura

Nota:

Robenidine huwa sensittiv għad-dawl. għandhom jintużaw oġġetti tal-ħġieġ tal-ambra fl-operazzjonijiet kollha.

5.1.   Ġenerali

5.1.1.

Għalf blank għandu jkun analizzat biex ikun iċċekkjat li la robenidine u lanqas is-sustanzi li jikkaġunaw interferenza ma jkunu preżenti.

5.1.2.

Għandu jsir eżami ta’ rkuprar billi ssir analiżi tal-għalf blank (5.1.1) li jkun ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ robenidine, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 60 mg/kg, ittrasferixxi 3,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.9.1) f’kunjett konikali tal-250 ml. Evapora s-soluzzjoni sa c. 0,5 ml fi fluss tan-nitroġenu. Żid 15 g tal-għalf blank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2). Nota: Għall-għanijiet ta’ dan il-metodu, l-għalf blank għandu jkun tat-tip simili għal dak tal-kampjun u mill-analiżi robenidine m’għandux jinstab.

5.2.   Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,01g, bejn wieħed u ieħor 15 g tal-kampjun ippreparat. Ittrasferixxi għal kunjett konikali ta’ 250 ml u żid 100,0 ml ta’ metanal aċidifikat (3.2), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal siegħa fuq ix-shaker (4.2). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.5) u iġbor il-filtrat kollu f’kunjett konikali ta’ 150 ml. Żid passatur molekulari ta’ 7,5 g (3.4), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal ħames minuti. Iffiltra minnufih minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ. Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta’ purifikazzjoni (5.3).

5.3.   Purifikazzjoni

5.3.1.   Preparazzjoni tal-kolonna ta’ aluminium-oxide

Daħħal plagg żgħir ta’ suf tal-ħġieġ fil-parti t’isfel tal-kolonna tal-ħġieġ (4.1) u għafsu l-isfel bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ. Iżen 11,0 g tal-aluminium oxide ippreparat (3.5) u ttrasferixxi fil-kolonna. għandha tingħata attenzjoni biex titnaqqas kemm jista’ jkun l-espożizzjoni għall-arja matul din il-fażi. Taptap bil-mod il-kolonna mgħobbija fil-parti t’isfel tagħha biex l-aluminium-oxide joqgħod.

5.3.2.   Purifikazzjoni tal-kampjun

Ittrasferixxi fil-kolonna bil-pipetta 5,0 ml tal-estratt tal-kampjun ippreparat f’(5.2). Serraħ il-ponta tal-pipetta qrib il-ħajt tal-kolonna u ħalli s-soluzzjoni tkun assorbita fuq l-aluminium oxide. Neħħi bil-ħasil robenidine mill-kolonna billi tuża 100 ml methanol (3.1), b’rata ta’ fluss ta’ 2 sa 3 ml/minuta u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Evapora s-soluzzjoni tal-metanol sakemm jinxef taħt pressjoni mnaqqsa f’40 oC permezz ta’ evaporatur b’pellikola rotanti (4.3). Erġa’ dewweb ir-residwu f’3 sa 4 ml ta’ fażi mobbli (3.8) u ttrasferixxi b’mod kwantitattiv f’kunjett iggradat ta’ 10 ml. Laħlaħ il-kunjett b’diversi porzjonijiet ta’ 1 sa 2 ml tal-fażi mobbli u ttrasferixxi dawn it-tlaħliħiet fil-kunjett iggradat. Żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn 0,45 mm (4.7). Erfa’ din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1.   Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),

Fażi mobbli tal-HPLC (3.8),

Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/minuta,

Wavelength tad-ditettur: 317 nm,

Volum tal-injezzjoni: 20 sa 50 μl.

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, billi tinjetta s-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) li fiha 3,6 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli u l-ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.4.2.   Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) diversi drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-kurva tal-kalibrar bl-użu tal-medja tal-ogħla livelli jew erjas tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’mg għal kull ml bħala axxiżi.

5.4.3.   Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tar-robenidine.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli ta’ robenidine tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.4.2).

Il-kontenut ta’ robenidine w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni ta’ robenidine tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml,
m	=	piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tistà tigi kkonfermata b'ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.9.3) li fiha 6 μg/ml.

7.1.1.   Ko-kromatografija

Estratt kampjun jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3). L-ammont ta’ robenidine miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat ta’ robenidine misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-ogħla livell ta’ robenidine biss għandu jiżdied wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f’bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2.   Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)	il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni diode-array, din tipikament hija bejn wieħed u ieħor fi ħdan 2 nm;

(b)

bejn 250 u 400 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru ‘fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard;

(c)

bejn 250 u 400 nm, l-ispettri tal-parti ’il fuq, tal-apiċi u tal-parti ’l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhiex taqbeż l-10 % tal-ogħla riżultat għal kontenut ta’ robenidine ogħla minn 15 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 85 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE li fih, erba’ kampjuni tal-għalf tat-tjur u tal-fniek, f’forma mitħun jew ta’ pritkuni kienu analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella hawn taħt:

	Tjur		Fniek
	Mitħun	Pritkuni	Mitħun	Pritkuni
Medja [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
sr [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr [ %]	5,4	4,5	3,3	4,1
SR [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR [ %]	16,1	12,0	10,6	9,7
Recovery [ %]	90,0	93,3	87,2	80,2

sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
CVr	=	koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %
SR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
CVR	=	koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

(F)   DETERMINAZZJONI TA’ DICLAZURIL

(+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phenyl] acetonitrile.

1.   Għan u skop

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ diclazuril fl-għalf u f’taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 0,1 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 0,5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Wara ż-żieda ta’ standard intern, il-kampjun jiġi estratt b’metanol aċidifikat. għall-għalf, l-alikwot tal-estratt huwa ppurifikat fuq cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 . Id-diclazuril jinħareġ mill-cartridge b’taħlita ta’ metanol aċidifikat u ilma. Wara l-evaporazzjoni, ir-residwu jinħall f’DMF/ilma. għal taħlitiet lesti minn qabel, l-estratt huwa evaporat u r-residwu jinħall f’DMF/ilma. Il-kontenut tad-diclazuril huwa stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata b’ternary gradient (HPLC) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

3.1.

Ilma, ekwivalenti għall-grad ta’ HPLC

3.2.

Ammonium acetate

3.3.

Tetrabutylammonium hydrogen sulphate (TBHS)

3.4.

Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.5.

Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.6.

N, N-dimethylformamide (DMF)

3.7.

Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8.

Is-sustanza standard: diclazuril II-24 : (+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl) phenyl] acetonitrile b’purità garantita, E771.

3.8.1.

Soluzzjoni standard ta’ stokk ta' diclazuril, 500 g/ml. Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard ta’ diclazuril (3.8) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.8.2.

Soluzzjoni standard Diclazuril, 50 μg/ml. Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.

Sustanza standard interna: 2,6 dichloro-α-(4-chlorophenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2 (3H) – yl) α-methylbenzene-acetonitrile

3.9.1.

Soluzzjoni standard ta’ stokk interna, 500 μg/ml. Iżen sal-eqreb 0,1 mg 25 mg tas-sustanza standard interna (3.9) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.2.

Soluzzjoni standard interna, 50 μg/ml. Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard interna maħżuna (3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.3.

Soluzzjoni standard interna għal taħlitiet lesti minn qabel, p/1 000 mg/ml (p = kontenut nominali ta’ diclazuril f’taħlita lesta minn qabel f’mg/kg). Iżen sal-eqreb 0,1 mg p/10 mg tas-sustanza standard interna f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’DMF (3.6) f’banju ultrasoniku (4.6), żid sal-marka b’DMF u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.10.

Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 2 g/ml. Ippipetta 2,00 ml soluzzjoni standard ta’ diclazuril (3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 16 ml DMF (3.6), żid sal-marka bl-ilma u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.11.

Cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 , e.g. Bond Elut, daqs: 1 cc, piż sorbenti: 100 mg.

3.12.

Solvent tal-estrazzjoni: acidified methanol. Ippipetta 5,0 ml aċidu idrokloriku (3.7) f’1 000 ml metanol (3.5), u ħallat.

3.13.

Fażi mobbli għall-HPLC

3.13.1.

Elwent A: soluzzjoni ta’ ammonium acetate – tetrabutylammonium hydrogen sulphate. Dewweb 5 g ammonium acetate (3.2) u 3,4 g TBHS (3.3) f’1 000 ml ilma (3.1) u ħallat.

3.13.2.

Elwent B: acetonitrile (3.4).

3.13.3.

Elwent C: metanol (3.5).

4.   Apparat

4.1.

Shaker mekkaniku

4.2.

Tagħmir għal HPLC ta’ ternary gradient

4.2.1.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi, Hypersil ODS, ippakkjar ta’ 3 m, 100 mm x 4,6 mm, jew ekwivalenti.

4.2.2.

Ditettur bil-UV b’aġġustament varjabbli ta’ wavelength jew ditettur diode array

4.3.

Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.4.

Filtru tal-membrana, 0,45 μm.

4.5.

Manifold b’vakwu.

4.6.

Banju ultrasoniku

5.   Proċedura

5.1.   Ġenerali

5.1.1.   Għalf blank

Għalf blank għandu jiġi analizzat sabiex jiġi kkontrollat li la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. L-għalf blank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti m’għandhom jiġu rilevati.

5.1.2.   Test tal-irkupru

Għandu jtiwettaq test tal-irkupru billi jkun analizzat l-għalf blank li jkun ġie imsaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ diclazuril simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 1 mg/kg, żid 0,1 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) għal 50 g ta’ għalf blank, ħallat sewwa u ħalli għal 10 min, u erġa’ ħallat għal diversi drabi qabel ma tipproċedi (5.2.).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ diclazuril, simili għal dik diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2.   Estrazzjoni

5.2.1.   Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g bejn wieħed u ieħor 50 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku ta’ 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita fuq ix-shaker (4.1) tul il-lejl. Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 20 ml tas-supernatant fil-kontenitur adattat tal-ħġieġ u ddilwa b’20 ml ilma. Itrasferixxi din is-soluzzjoni fuq cartridge tal-estrazzjoni (3.11), u għaddi minn vakwu (4.5.). Aħsel il-cartridge b’25ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 65 + 35 (V + V). Armi l-frazzjonijiet miġbura u elwixxi l-komposti b’25 ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 80 + 20 (V + V). Evapora din il-frazzjoni sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Dewweb ir-residwu f’1,0 ml DMF (3.6), żid 1,5 ml ilma (3.1) u ħallat. Iffiltra minn filtru tal-membrana (4.4). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2.   Taħlitiet lesti minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g bejn wieħed u ieħor 1 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.3), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita tul il-lejl fuq ix-shaker (4.1). Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 10 000/p ml (p = kontenut nominali ta’ diclazuril fit-taħlita lesta minn qabel f’mg/kg) tas-supernatant f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ daqs adattat. Evapora sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Erġa’ dewweb ir-residwu f’10,0 ml DMF (3.6), żid 15,0 ml ilma (3.1) u ħallat. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1.   Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.2.1.):	100 mm × 4,6  mm, Hypersil ODS, ippakkjar ta’ 3 μm, jew simili
Fażi mobbli :	Elwent A (3.13.1):	Soluzzjoni fl-ilma ta’ ammonium acetate u tetrabutyl-ammonium Sulfat tal-idroġenu
	Elwent B (3.13.2):	acetonitrile
	Elwent C (3.13.3):	metanol
Mod ta’ eluzzjoni :	— inklinazzjoni lineari — kundizzjonijiet inizjali: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — wara 10 minuti ggrada s-soluzzjoni għal 30 minuta għal: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Aħsel b’B għal 10 min.
Rata ta’ tnixxija:	1,5 – 2 ml/min
Volum tal-injezzjoni:	20 μl
Wavelength tad-ditettur:	280 nm

Ikkontrolla l-istabbilità tas-sistema kromatografika billi tinjetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10), li jkun fiha 2 g/ml, sakemm jintlaħqu ogħla livelli u ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.3.2.   Soluzzjoni tal-kalibrar

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) għal diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.

5.3.3.   Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni kampjun (5.2.1. jew 5.2.2.) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.

6.   Kalkolu tar-riżultati

6.1.   L-Għalf

Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

hd, s	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1)
hi, s	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1)
hd, c	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)
hi, c	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)
cd, c	=	il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni ta’ kalibrar f’g/ml (3.10)
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g.
V	=	il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 (jiġifieri 2,5 ml)

6.2.   Taħlitiet lesti minn qabel

Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

hd, c	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)
hi, c	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)
hd, s	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2)
hi, s	=	l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2)
cd, c	=	il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar f’μg/ml (3.10)
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g.
V	=	il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 (jiġifieri 25 ml)
p	=	il-kontenut nominali ta’ diclazuril fi mg/kg fit-taħlita lesta minn qabel

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża ditettur ta’ diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10).

7.1.1.   Ko-kromatografija

Kampjun estratt (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrar (3.10). L-ammont ta’ diclazuril miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ diclazuril li jinstab fl-estratt tal-kampjun

L-għoli tal-ogħla livell ta’ diclazuril u l-ogħla livell tal-istandard intern biss għandhom jitjiebu wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-ogħla livell tad-diclazuril jew tal-ogħla livell tal-istandard intern tal-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ.

7.1.2.   Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a)	Il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġini determinata bis-saħħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni b’diode array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm.

(b)

Bejn 230 u 320 nm, il-kampjun u l-ispettri standard irreġistrati fl-apiċi tal-ogħla livell tal-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta’ 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju għandu jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u fl-ebda punt osservat il-punt ta’ devjazzjoni bejn iż-żewġ spettra ma għandu jaqbeż 15 % tal-assorbiment tal-analit standard.

(c)

Bejn 230 u 320 nm, l-ispettri tal-parti tiela’ ’l fuq, tal-apiċi u tal-parti nieżla ’l isfel tal-ogħla livell prodotti mill-kampjun tal-estratt m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta’ 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-ogħla apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

—	30 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diclazuril minn 0,5 mg/kg sa 2,5 mg/kg

—	0,75 mg/kg għall-kontenuti ta’ diclazuril bejn 2,5 mg/kg u 5 mg/kg

—	15 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diclazuril ta’ aktar minn 5 mg/kg

7.3.   Irkupru

Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati 5 kampjuni minn 11-il laboratorju. Dawn il-kampjuni kienu jikkonsistu minn żewġ taħlitiet lesti minn qabel; waħda kienet imħallta b’matriċi organika (O 100) u l-oħra b’matriċi inorganika (A 100). Il-kontenut teoretiku huwa 100 mg diclazuril għal kull kg. It-tliet taħlitiet tal-għalf għat-tjur saru minn 3 produtturi differenti (NL) (L1/Z1/K1). Il-kontenut teoretiku huwa 1 mg diclazuril għal kull kg. Il-laboratorji ngħataw struzzjonijiet biex janalizzaw kull wieħed mill-kampjuni għal darba jew darbtejn. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista’ tinstab fil-Journal of AOAC International, Volum 77, Nru 6, 1994, p. 1359-1361). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

	Kampjun 1 A 100	Kampjun 2 O 100	Kampjun 3 L1	Kampjun 4 Z1	Kampjun 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Medja	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
Sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr ( %)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR ( %)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Kontenut nominali mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	numru ta’ laboratorji
n	=	numru ta’ valuri singoli
Sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibbiltà
CVr	=	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità
SR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
CVR	=	koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

9.   Osservazzjonijiet

Ir-reazzjoni ta’ diclazuril jeħtieġ li tkun intweriet preċedentament bħala lineari tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet imkejla.

(G)   DETERMINAZZJONI TA’ LASALOCID SODIUM

Melħ tas-sodju ta ’ polyether monocarboxylic acid prodott bi Streptomyces lasaliensis

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ lasalocid sodium fl-għalf u taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 5 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 10 mg/kg.

2.   Prinċipju

Lasalocid sodium huwa estratt minn kampjun ta’ metanol aċidifikat u stabbilit mill-kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta’ ditettur spettrofluworimetriku.

3.   Reaġenti

3.1.

Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)

3.2.

Orthophosphoric acid, w (w/w) = 85 %

3.3.

Soluzzjoni ta’ orthophosphoric, c = 20 % Iddilwixxi 23,5 ml ta’ orthophosphoric acid (3.2) għal 100 ml ilma.

3.4.

6-Methyl-2-heptylamine (1,5-dimethylhexylamine), w (w/w) = 99 %

3.5.

Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.6.

Aċidu idrokloriku, densità = 1,19 g/ml

3.7.

Soluzzjoni ta’ phosphate buffer, c = 0,01 mol/l Dewweb 1,36 g ta’ KH2PO4 (3.1) f’500 ml ta’ ilma (3.11), żid 3,5 ml ta’ orthophosphoric acid (3.2) u 10,0 ml ta’ 6-methyl-2-heptylamine (3.4). Aġġusta l-pH għal 4,0 b’soluzzjoni ta’ orthophosphoric acid (3.3) u ddilwa sa 1 000 ml bl-ilma (3.11).

3.8.

Metanol aċidifikat Ittrasferixxi 5,0 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.6) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka bil-metanol (3.5) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.9.

Fażi HPLC mobbli, soluzzjoni phosphate buffer-methanol 5 + 95 (V + V) Ħallat 5ml tas-soluzzjoni tal-phosphate buffer (3.7) ma’ 95 ml ta’ metanol (3.5).

3.10.

Sustanza standard tal-lasalocid sodium b’purità ggarantita, C34H53O8Na (melħ tas-sodju tal-aċidu polyether monocarboxylic prodott bi Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1.

Soluzzjoni standard ta’ stokk ta' Lasalocid sodium, 500 μg/ml Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg lasalocid sodium (3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’metanol aċidifikat (3.8), żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.2.

Soluzzjoni standard intermedja ta' Lasalocid sodium, 50 μg/ml Iġbed b’pipetta 10,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.10.1) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.3.

Soluzzjonijiet ta’ kalibrar F’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 50 ml ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedjarja (3.10.2). Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrespondu għal 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 μg lasalocid sodium għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski qabel l-użu.

3.11.

Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

4.   Apparat

4.1.

Banju ultrasoniku (jew banju tal-ilma li jiċċaqlaq) bil-kontroll tat-temperatura

4.2.

Filtri membrana, 0,45 μm.

4.3.

Tagħmir tal-HPLC b’sistema ta’ injezzjoni, adattat għall-injettar ta’ volumi ta’ 20 l.

4.3.1.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi 125 mm x 4mm, b’fażi riversjata C18, ippakkjar ta’ 5 μm jew ekwivalenti

4.3.2.

Spettrofluworimetru b’aġġustament tal-wavelength varjabbli ta’ wavelengths ta’ eċċitazzjoni u ta’ emissjoni

5.   Proċedura

5.1.   Ġenerali

5.1.1.   Għalf blank

Biex isir l-eżami tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analizzat kampjun blank biex jiġi ivverifikat li la lasalocid sodium u lanqas sustanzi ta’ tfixkil ma jkunu preżenti. Il-kampjun blank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u m’għandux ikun hemm lasalocid sodium jew sustanzi tat-tfixkil.

5.1.2.   Test tal-irkupru

L-eżami tal-irkupru għandu jsir bl-analiżi tal-kampjun blank li kien ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ lasalocid sodium, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tal-istandard tal-istokk (3.10.1) f’kunjett koniku ta’ 250ml u evapora s-soluzzjoni għal madwar 0,5 ml. Żid 50 g tal-kampjun blank, ħawwad sew u ħalli għal 10 minuti filwaqt li tħallat għal bosta drabi qabel ma tkompli bil-pass tal-estrazzjoni (5.2).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ il-kampjun li għandu jkun analizzat jiġi msaħħaħ bi kwantità ta’ lasalocid sodium simili għal dik li diġà hemm preżenti fil-kampjun. Dan l-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2.   Estrazzjoni

5.2.1.   Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, minn 5 g sa 10 g tal-kampjun f’kunjett koniku ta’ 250 ml b’tapp. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) b’pipetta. Poġġi t-tapp b’mod laxk u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Ħallih joqgħod għal madwar siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2) f’reċipjent xieraq. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2.   Taħlitiet lesti minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g madwar 2 g ta’ taħlit lest minn qabel mhux mitħun f’kunjett iggradat ta’ 250 ml. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett u l-kontenut f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat kollox sew. Ħallih joqgħod għal siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2). Żid volum xieraq tal-filtrat ċar b’metanol aċidifikat (3.8) biex tkun prodotta soluzzjoni finali tal-eżami li jkun fiha madwar 4 μg/ml ta’ lasalocid sodium. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1.   Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħra, sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b'likwidi (4.3.1.):	125 mm × 4 mm, fażi riversjata C18, 5 μm ippakkjar, jew ekwivalenti
Fażi mobbli (3.9):	Taħlita ta’ soluzzjoni ta’ phosphate buffer (3.7) u metanol (3.5), 5 + 95 (V + V)
Rata ta’ tnixxija:	1,2 ml/min
Wavelengths ta’ ditezzjoni:
Eċċitazzjoni:	310 nm
Emissjoni:	419 nm
Volum tal-injezzjoni:	20 μl

Ivverifika l-istabbilta tas-sistema kromatografika, injetta s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10.3) li fiha 4,0 μgg/ml bosta drabi, sakemm jinkisbu l-ogħla livelli (jew erjas) u ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.3.2.   Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3) bosta drabi u stabbilixxi l-medja tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar billi tuża l-medji tal-ogħla livelli (meded) bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet li jikkorrispondu fi μg/ml bħala l-axxiżi.

5.3.3.   Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratti tal-kampjun miksubin fi 5.2.1 jew 5.2.2 bosta drabi, uża l-istess volum kif meħud fis-soluzzjoni ta’ kalibrar u stabbilixxi l-medja tal-ogħla livelli (meded) tal-ogħla livelli tas-sodju lasaloċidu.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-medja tal-ogħla livelli (meded) prodotti mill-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.3.3) stabbilixxi l-konċentrazzjoni ta’ lasalocid sodium (μg/ml) b’riferenza għall-graff ta’ kalibrar.

6.1.   Għalf

Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.1) fi μg/ml
V1	=	volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 f’ml (jiġifieri 100)
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

6.2.   Taħlitiet lesti minn qabel

Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c	=	il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.2) fi μg/ml
V2	=	il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 f’ml (jiġifieri 250)
f	=	il-fattur ta’ dilwizzjoni skont 5.2.2
m	=	il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

Il-metodi bbażati fuq l-ispettrofluworometrija huma inqas soġġetti għal interferenza minn dawk li fihom tintuża d-ditezzjoni bl-UV. L-identità tal-analizzat tista’ tiġi ikkonfermata bil-ko-kromatografija.

7.1.1.   Ko-kromatografija

L-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3). L-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ lasalocid sodium li jinstab fl-estratt tal-kampjun. L-għoli tal-ogħla livell tal-lasalocid sodium biss għandu jittejjeb wara li jitqies l-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud u d-dilwizzjoni tal-estratt. L-akbar wisa’, f’nofs l-għoli, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-akbar wisa’ oriġinali prodott mill-estratt mhux imsaħħaħ tal-kampjun.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

—	15 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ lasalocid sodium minn 30 mg/kg sa 100 mg/kg;

—	15 mg/kg għall-kontenuti ta’ lasalocid sodium minn 100 mg/kg sa 200 mg/kg

—	7,5 % fir-rigward tal-ogħla valur għall-kontenuti ta’ lasalocid sodium ta’ aktar minn 200 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għall-kampjun (blank) imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-anqas 80 %. għall-kampjuni msaħħa ta’ taħlit lest minn qabel, l-irkupru għandu jkun ta’ mill-inqas 90 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv (*) li fih, 2 taħlitiet lesti minn qabel (kampjuni 1 u 2) u 5 kampjuni ta’ għalf (kampjuni 3 – 7) ġew analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

	Kampjun 1 Taħlita lesta minn qabel għat-tiġieġ	Kampjun 2 Taħlita lesta minn qabel għad-dundjani	Kampjun 3 Prietken għad-dundjani	Kampjun 4 Frak għat-tiġieġ	Kampjun 5 Għalf għad-dundjani	Kampjun 6 Għalf għat-tjur A	Kampjun 7 Għalf għat-tjur B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Medja [mg/kg]	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
sr [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr [ %]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
sR [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR [ %]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Kontenut nominali [mg/kg]	5 000  (**)	16 000  (**)	80 (**)	105 (**)	120 (**)	50 (***)	35 (***)

L	=	numru ta’ laboratorji
n	=	numru ta’ riżultati singoli
sr	=	devjazzjoni standard tar-ripetibilità
sR	=	devjazzjoni standard tar-riproduċibilità
CVr	=	koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %
CVR	=	koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

---

(1)  Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2)  Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA)

(3)  Jistgħu jintużaw metodi ta’ diġestjoni oħrajn diment li dawn ikunu wrew li jwasslu għal riżultati simili (bħad-diġestjoni permezz tal-pressa bil-micowave).

(4)  Għalf aħdar (frisk jew imnixxef) jista’ jkun fih ammonti kbar ta’ silika tal-ħaxix, li tista’ żżomm fiha elementi ta’ traċċa u għandha titneħħa. Għal kampjuni ta’ dan l-għalf, għalhekk, għandha tiġi segwita l-proċedura modifikata segwenti. Wettaq operazjoni 5.1.1.1 sal-fażi tal-filtrazjoni. Aħsel il-karta tal-filtru, li jkun fiha r-residwu mhux maħlul, darbtejn b’ilma jagħli u poġġiha fi griġjol tal-kwarz jew tal-platinum. Ixgħel il-muffle furnace (4.1) b’temperatura taħt il-550 oC sakemm il-materjal faħmi kollu jkun sparixxa għal kollox. Ħallih jibred, żid ftit qtar ta’ ilma segwit b’10 sa 15 ml ta’ hydrofluoric acid (3.4) u evapora sakemm jinxef f’madwar 150 oC. Jekk tibqa’ xi silika fir-residwu, dewweb mill-ġdid fi ftit millilitri ta’ hydrofluoric acid (3.4) u evapora sakemm jixxotta. Żid ħames taqtiriet ta’ sulphuric acid (3.5) u saħħan sakemm ma jibqa’ l-ebda fwar abjad. Wara ż-żieda ta’ 5 ml ta’ 6 mol/litru hydrochloric acid (3.2) u madwar 30 ml ta’ ilma, saħħan, iffiltra s-soluzzjoni f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml u wassal sal-marka b’ilma (konċentrazzjoni ta’ HCI ta’ madwar 0,5 mol/l). Imbagħad ipproċedi bid-determinazzjoni minn punt 5.1.2.

(5)  The Analyst 108, 1983, pp. 1252 sa 1256

(*)  Analyst, 1995, 120, pp.2175-2180

(**)  kontenut iddikjarat mill-manifattur.

(***)  għalf ippreparat fil-laboratorju.