ANNESS

WERREJ

1.	MASSA SKONT IL-VOLUM F’20 °C U DENSITÀ RELATTIVA F’20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) – Metodu Tip I

2.	EVALWAZZJONI PERMEZZ TA' REFRAKTOMETRIJA TAL-KONTENUT TAZ-ZOKKOR TAL-MOSTI, TAL-MOSTI KONĊENTRATI U TAL-MOSTI KONĊENTRATI RETTIFIKATI (OIV-AS2-02-SUCREF) – Metodu Tip I

3.	TOTAL TAL-ESTRATT NIEXEF (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Total tal-materja niexfa – Metodu Tip I

4.	DETERMINAZZJONI TAR-RAPPORT IŻOTOPIKU 18O/16O TAL-ILMA TAL-INBEJJED (OIV-AS-2-09-MOUO18) – Metodu Tip II

5.	INDIĊI TA’ FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – Metodu Tip IV

6.	GLUKOŻJU U FRUTTOŻJU (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – Metodu Tip II

7.	DOŻAĠĠ TAZ-ZOKKOR PERMEZZ TA’ HPLC (SUKROŻJU) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – Metodu Tip II

8.	DETEZZJONI TAL-ARRIKKIMENT TAL-MOSTI TAL-GĦENEB, TAL-MOSTI TAL-GĦENEB KONĊENTRATI, TAL-MOSTI TAL-GĦENEB KONĊENTRATI RETTIFIKATI U TAL-INBEJJED BL-APPLIKAZZJONI TAR-REŻONANZA MANJETIKA NUKLEARI TAD-DEWTERJU (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – Metodu Tip I

9.	QAWWA ALKOĦOLIKA BIL-VOLUM (OIV-AS-312-01-TALVOL) – Metodu Tip I

10.	DETERMINAZZJONI TAL-PROPORZJON IŻOTOPIKU 13C/12C PERMEZZ TAL-ISPEKTROMETRIJA TAL-MASSA IŻOTOPIKA TAL-ETANOL TAL-INBID JEW TAL-ETANOL MIKSUB PERMEZZ TAL-FERMENTAZZJONI TAL-MOSTI, TAL-MOSTI KONĊENTRATI JEW TAL-MOSTI KONĊENTRATI RETTIFIKATI (OIV-AS-312-06-ETHANO) – Metodu Tip II

11.	AĊIDITÀ TOTALI (OIV-AS-313-01-ACITOT) – Metodu Tip I

12.	AĊIDITÀ VOLATILI (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – Metodu Tip I

13.	AĊDU ĊITRIKU (OIV-AS-313-09-ACIENZ) – Metodu Tip II

14.	AĊDU SORBIKU (OIV-AS-313-14-ACISOR) – Metodu Tip IV

15.	pH (OIV-AS-313-15-PH) – Metodu Tip I

16.	DOŻAĠĠ SIMULTANJU TAL-ASCORBIC ACID I TAD-D-ISO-ASCORBIC ACID PERMEZZ TA’ HPLC U DETEZZJONI UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) – Metodu Tip II

17.	CARBON DIOXIDE (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – Metodu Tip II

18.	DOŻAĠĠ TAL- CARBON DIOXIDE FL-INBID PERMEZZ TAL-METODU MANOMETRIKU (OIV-AS314-04-CO2MAN) – Metodu Tip II

19.	KEJL TAL-PRESSJONI ŻEJDA TAL-INBEJJED SPUMANTI U EFFERVEXXENTI (OIV-AS-314-02-SURPRES) – Metodu Tip I

20.	Dożaġġ tal-lisożima fl-inbid permezz ta’ HPLC (OIV-AS-315-14) – Metodu Tip IV

21.	SULFATI (OIV-AS-321-05-SULFAT) – Metodu Tip II

22.	ĦADID (OIV-AS-322-05-FER) – Metodu Tip IV

23.	RAM (OIV-AS 322-06) – Metodu Tip IV

24.	SULPHUR DIOXIDE (OIV-AS-323-04-DIOSU) – Metodu Tip II

1   MASSA SKONT IL-VOLUM F’20 °C U DENSITÀ RELATTIVA F’20 ° (OIV-AS2-01-MASVOL) – METODU TIP I

1.   DEFINIZZJONIJIET

Il-massa skont il-volum hija l-kwozjent tal-massa ta’ ċertu volum ta’ inbid jew ta’ most f’20 °C b’dan il-volum. Din tiġi espressa fi grammi għal kull millilitru u s-simbolu tagħha huwa ρ20 °C.

Id-densità relattiva f’20 °C jew densità 20 °C/20 °C hija r-rabta espressa bħala numru deċimali, tal-massa ta’ ċertu volum ta’ inbid jew ta’ most f’20 °C mal-massa tal-istess volum ta’ ilma fl-istess temperatura. Is-simbolu tagħha huwa .

2.   PRINĊIPJU TAL-METODI

Il-massa skont il-volum u d-densità relattiva f’20 °C huma ddeterminati fuq il-kampjun għat-testijiet:

jew permezz tal-piknometrija: metodu ta’ referenza,

jew permezz tad-densimetrija bil-bilanċ idrostatiku jew permezz tad-densimetrija elettronika.

Rimarka

Għad-determinazzjonijiet preċiżi ħafna, il-massa skont il-volum għandha tiġi korretta għall-effett tas-sulphur dioxide.

ρ20 °C	=	ρ′20 °C – 0,0006 × S
ρ20 °C	=	massa skont il-volum korretta
ρ′20 °C	=	massa skont il-volum osservata
S	=	kwantità totali ta’ sulphur dioxide fi g/l

3.   TRATTAMENT PRELIMINARI TAL-KAMPJUN

Jekk l-inbid jew il-most ikun fih kwantitajiet sinifikanti ta’ carbon dioxide, neħħi ħafna minnu billi tħawwad 250 ml ta’ inbid fi flixkun ta’ 1 000 ml, jew permezz tal-filtrazzjoni taħt pressjoni mnaqqsa b’2 g ta’ tajjar mpoġġija f’tubu ta’ estensjoni.

4.   METODU TA’ REFERENZA

4.1.   Apparat

Apparat tas-soltu tal-laboratorju, u b’mod partikolari:

4.1.1.   Piknometru (1), tal-Pyrex ta’ b’kapaċità ta’ madwar 100 ml b’termometru li jinqala’ b’ġonta tal-ħġieġ immattjat ikkalibrat f'għexieren ta' gradi minn 10 sa 30 °C. Dan it-termometru għandu jkun ittestjat (Dijagramma 1).

Dan il-piknometru għandu tubu fil-ġenb twil 25 mm, b’dijametru intern ta’ 1 mm l-aktar, li jispiċċa b’ġonta ta’ għamla konika mmattjata. Dan it-tubu tal-ġenb jista’ jkun mgħotti b’“tapp ta’ riżerva” li jikkonsisti f’tubu mmattjat ta’ għamla konika, li jintemm f’parti mtawwla. Dan it-tapp iservi bħala post ta’ espansjoni.

Iż-żewġ ġonot tal-ħġieġ immattjat tal-apparat għandhom isiru b’attenzjoni kbira.

4.1.2.   Fjaskett tat-tara bl-istess volum estern (sa mill-inqas 1 ml) bħall-piknometru u ta’ massa ugwali għall-massa tal-piknometru mimli b’likwidu ta’ densità ta’ 1,01 [soluzzjoni ta’ 2 għal kull 100 (m/v) ta’ sodium chloride].

Kontenitur insulat għas-sħana li jadatta b’mod eżatt għall-forma tal-piknometru.

4.1.3.   Miżien b’żewġt itwaġen ta’ mill-inqas 300 g u sensittiv għal kull deċima ta’ milligramma,

jew,

miżien b’taġen wieħed ta’ mill-inqas 200 g, sensittiv għal kull deċima ta’ milligramma.

4.2.   Kalibrazzjoni tal-piknometru

Il-kalibrazzjoni tal-piknometru tinvolvi li jiġu stabbiliti l-karatterisitċi li ġejjin:

—	il-fjaskett tat-tara vojt,

—	il-volum f’20 °C,

—	il-massa ta’ ilma f’20 °C.

4.2.1.   Użu ta’ miżien b’żewġt itwaġen

Poġġi il-fjaskett tat-tara fuq it-taġen tax-xellug tal-miżien u l-piknometru nadif u niexef bit-“tapp ta’ riżerva” tiegħu fuq it-taġen tal-lemin, u iżen billi ħdejn il-piknometru żżid piżijiet immarkati: ħalli p tkun il-grammi.

Imla bir-reqqa il-piknometru b’ilma ddistillat f’temperatura ambjentali, poġġi t-termometru f’postu; b’attenzjoni imsaħ il-pikonmetru u poġġih fil-kontenitur insulat għas-sħana; ħawdu billi teqleb il-kontenitur sakemm it-temperatura fuq it-termometru tkun kostanti. Iffissa l-piknometru eżatt livell max-xifer ta’ fuq tat-tubu tal-ġenb. Imsaħ dan it-tubu tal-ġenb, poġġi t-tapp ta’ riżerva; aqra t-temperatura t °C b’attenzjoni u possibilment ikkorreġiha għall-ineżattezzi tal-iskala tat-termometru. Iżen il-piknometru mimli bl-ilma, ħalli p′ tkun il-massa fi grammi meħtieġa biex jiġi stabbilit l-bilanċ.

Kalkoli

It-tara tal-piknometru vojt: Tara vojta= p + m m= massa ta’ arja li tinsab fil-piknometru m= 0,0012 (p – p′).

Volum f’20 °C: V20 °C= (p + m – p′) × Ft Ft= fattur meħud mit-Tabella I għat-temperatura t °C V20 °C għandu jkun magħruf sa ± 0,001 ml.

Massa tal-ilma f’20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= massa skont il-volum tal-ilma f’20 °C.

4.2.2.   Użu ta’ miżien b’taġen wieħed

Stabbilixxi:

—	il-massa tal-piknometru nadif u niexef: P

—	il-massa tal-piknometru mimli bl-ilma f’t °C: P1 billi ssegwi l-indikazzjonijiet deskritti fil-punt 4.2.1

—	il-massa tal-fjaskett tat-tara: T0

Kalkoli

Tara tal-piknometru vojt:

Tara vojta= P – m, m= massa ta’ arja li tinsab fil-piknometru m= 0,0012 (P1 – P)

Volum f’20 °C: V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft Ft= fattur meħud mit-Tabella I għat-temperatura t °C.

Il-volum f’20 °C għandu jkun magħruf sa ± 0,001 ml.

Massa tal-ilma f’20 °C: M20 °C= V20 °C · 0,998203 0,998203= massa skont il-volum tal-ilma f’20 °C

4.3.   Teknika tal-kejl

4.3.1.   Użu ta’ miżien b’żewġt itwaġen

Iżen il-piknometru mimli bil-kampjun imħejji għat-test (punt 3) billi ssegwi l-indikazzjonijiet deskritti fil-punt 4.2.1.

Ħalli p″ tkun il-massa fi grammi li tikseb il-bilanċ f’t °C.

Massa tal-likwidu li jinsab fil-piknometru = p + m – p″

Massa skont il-volum apparenti f’t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/V20 °C

Ikkalkola l-massa skont il-volum f’20 °C permezz ta’ waħda mit-tabelli ta’ korrezzjoni hawn taħt, skont in-natura tal-likwidu li jkun qiegħed jiġi studjat: inbid mhux ħelu (Tabella II), most naturali jew konċentrat (Tabella III), inbid ħelu (Tabella IV).

Id-densità 20 °C/20 °C tal-inbid hija espessa billi tiġi diviża l-massa skont il-volum f’20 °C b’0,998203.

4.3.2.   Użu ta’ miżien b’taġen wieħed

Iżen il-fjaskett tara, ħalli T1 tkun il-massa tiegħu

Ikkalkola dT = T1 – T0

Massa tal-piknometru vojt fil-ħin meta jkun qiegħed isir il-kejl = P – m + dT

Iżen il-piknometru mimli bil-kampjun imħejji għat-test (punt 3) billi ssegwi l-indikazzjonijiet deskritti fil-punt 4.2.1. Ħalli P2 tkun il-massa tiegħu f’t °C.

Massa tal-likwidu li jinsab fil-piknometru f’t °C = P2 – (P – m + dT)

Massa skont il-volum apparentt f’t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT))/V20 °C

Ikkalkola l-massa skont il-volum f’20 °C tal-likwidu li qiegħed jiġi studjat: inbid mhux ħelu, most naturali u konċentrat, inbid ħelu, kif inhu indikat fil-punt 4.3.1.

Id-densità 20 °C/20 °C hija miksuba billi tiġi diviża l-massa skont il-volum f’20 °C b’0,998203.

4.3.3.   Ir-repetibbiltà fuq il-massa skont il-volum:

għall-inbejjed mhux ħelwin u spumanti: r = 0,00010

għall-inbejjed ħelwin: r = 0,00018

4.3.4.   Ir-riproduċibbiltà fuq il-massa skont il-volum:

għall-inbejjed mhux ħelwin u spumanti: R = 0,00037

għall-inbejjed ħelwin: R = 0,00045

TABELLA I

Fatturi F

li bihom trid timmultiplika l-massa tal-ilma li jkun fih il-piknometru tal-Pyrex f’t  o C, biex tikkalkola l-volum tal-piknometru f’20  o C

[Irreferi għat-Tabella I tal-Anness II tal-metodu AS2 - 01 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

TABELLA II

Korrezzjonijiet c tat-temperatura fuq il-massa skont il-volum tal-inbejjed mhux ħelwin u tal-inbejjed mhux ħelwin mingħajr alkoħol, imkejla f’piknometru tal-Pyrex f’t oC, biex tasal sa 20 oC

[Irreferi għat-Tabella II tal-Anness II tal-metodu AS2 - 01 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000)

– jekk t °C hija inqas minn 20 °C + jekk t °C hija aktar minn 20 °C

TABELLA III

Korrezzjonijiet c tat-temperatura fuq il-massa skont il-volum tal-mosti naturali u tal-mosti konċentrati, imkejla f’t oC permezz ta’ piknometru tal-Pyrex, biex ir-riżultat jilħaq 20 oC

[Irreferi għat-Tabella III tal-Anness II tal-metodu AS2 - 01 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000)

– jekk t °C hija inqas minn 20 °C + jekk t °C hija aktar minn 20 °C

TABELLA IV

Korrezzjonijiet c tat-temperatura fuq il-massa skont il-volum tal-inbejjed bi 13 % vol. u wkoll li jkun fihom residwu ta’ zokkor imkejla permezz ta’ piknometru tal-Pyrex, f’t o biex tasal sa 20 oC

[Irreferi għat-Tabella IV tal-Anness II tal-metodu AS2 - 01 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000)

– jekk t °C hija inqas minn 20 °C + jekk t °C hija aktar minn 20 °C

2   EVALWAZZJONI PERMEZZ TA' REFRAKTOMETRIJA TAL-KONTENUT TAZ-ZOKKOR TAL-MOSTI, TAL-MOSTI KONĊENTRATI U TAL-MOSTI KONĊENTRATI RETTIFIKATI (OIV-AS2-02-SUCREF) – METODU TIP I

1.   PRINĊIPJU TAL-METODU

L-indiċi refrattiv f’20 °C, espress bħala indiċi assolut jew bħala perċentwal f’massa ta’ sukrożju, huwa mogħti fit-Tabella li tikkkorrispondi biex jinkiseb il-kontenut ta’ zokkor fi grammi għal kull litru u fi grammi għal kull kilogramma tal-mosti, tal-mosti konċentrati u tal-most konċentrat rettifikat.

2.   APPARAT

2.1.   Refrattometru tat-tip Abbé

Ir-refrattometru użat għandu jkollu skala li tindika:

—	jew il-perċentwal f’massa ta’ sukrożju sa 0,1 %,

—	jew l-indiċi refrattiv sa erba’ postijiet deċimali.

Ir-refrattometru għandu jkollu termometru li l-iskala tiegħu testendi mill-inqas minn + 15 °C sa + 25 °C u b’arranġament sabiex jiċċirkola l-ilma li jippermetti li jsir kejl f’temperatura ta’ 20 °C ± 5 °C.

L-istruzzjonijiet ta' kif jaħdem dan l-istrument għandhom jiġu segwiti b'mod strett, b'mod partikolari għar-rigward tal-kalibrazzjoni u s-sors tad-dawl.

3.   TĦEJJIJA TAL-KAMPJUN

3.1.   Mosti u mosti konċentrati

Għaddi l-mosti, jekk ikun meħtieġ, minn garża niexfa mitwijja f’erbgħa u, wara li tneħħi l-ewwel qatriet tal-filtrat, wettaq id-determinazzjoni fuq il-prodott iffiltrat.

3.2.   Mosti konċentrati rettifikati

Uża, skont il-konċentrazzjoni tiegħu, jew il-most konċentrat rettifikat, jew is-soluzzjoni miksuba billi żżid 200 g ta’ most konċentrat rettifikat bl-ilma sabiex jilħaq piż ta’ 500 g kull piż imkejjel eżatt.

4.   PROĊEDURA

Saħħan il-kampjun sa temperatura viċin l-20 °C. Poġġi kampjun tat-test żgħir fuq il-priżma ta’ taħt tar-refrattometru filwaqt li tiżgura li, peress li l-priżmi huma pressati kontra xulxin, il-kampjun tat-test jgħatti l-wiċċ tal-ħġieġa b’mod uniformi, u ħu l-kejl b’mod konformi mal-istruzzjonijiet tal-użu tal-apparat użat.

Aqra l-perċentwal skont l-massa tas-sukrożju sa 0,1 % jew aqra l-indiċi refrattiv sa erba’ postijiet deċimali.

Agħmel mill-inqas żewġ kalkoli fuq l-istess kampjun imħejji. Ħu nota tat-temperatura t °C.

5.   KALKOLI

5.1.   Korrezzjoni tat-temperatura

5.1.1.   Strumenti kkalibrati f’% ta’ massa ta’ sukrożju: uża t-Tabella I għall-korrezzjoni tat-temperatura.

5.1.2.   Strumenti kkalibrati f’indiċi refrattiv; sib l-indiċi mkejjel f’t °C fit-Tabella II biex tikseb (kolonna I) il-valur li jikkorrispondi tal-perċentwal f’massa ta’ sukrożju f’t °C. Dan il-valur għandu jiġi korreġut għat-temperatura u espress f’medja ta’ 20 °C tat-Tabella I.

5.2.   Kontenut taz-zokkor tal-mosti u tal-mosti konċentrati

Sib il-perċentwali fil-massa ta’ sukrożju f’20 °C fit-Tabella II biex tikseb il-kontenut ta’ zokkor fi grammi għal kull litru u fi grammi għal kull kilogramma. Il-kontenut ta’ zokkor huwa espress f’zokkor invertit sa post deċimali wieħed.

5.3.   Kontenut ta’ zokkor tal-most konċentrat rettifikat

Sib il-perċentwal fil-massa ta’ sukrożju f’20 °C fit-Tabella III biex tikseb il-kontenut ta’ zokkor fi grammi għal kull litru u fi grammi għal kull kilogramma. Il-kontenut taz-zokkor huwa espress f’zokkor invertit sa post deċimali wieħed.

Jekk il-kejl ikun sar fuq il-most konċentrat rettifikat dilwit, immultiplika r-riżultat mal-fattur tat-taħlit bl-ilma.

5.4.   Indiċi refrattiv tal-mosti, tal-mosti konċentrati u tal-mosti konċentrati rettifikati

Sib il-perċentwal fil-massa tas-sukrożju f' 20 °C fit-Tabella II biex tikseb l-indiċi refrattiv f’20 °C. Dan l-indiċi huwa espress sa erba’ postijiet deċimali.

Note: Il-qawwa alkoħolika tal-mosti, tal-mosti konċentrati u tal-mosti konċentrati rettifikati tista’ tiġi stabbilita bl-użu tat-Tabella ta’ korrispondenza li tinsab fl-Anness I tar-Regolament (KE) Nru 1623/2000 tal-Kummissjoni tal-25 ta’ Lulju 2000 (ĠUKE L 194, 31 ta’ Lulju 2000)

TABELLA I

Korrezzjoni li għandha issir metal-perċentwal skond il-massa tas-sukrożju jkun ġie kkalkolat f'temperatura differenti minn 20 °C

[irreferi għat-Tabella I tal-Anness tal-metodu AS2 - 02 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

TABELLA II

Tabella li tagħti l-kontenut taz-zokkor tal-mosti u tal-mosti konċentrati fi grammi għal kull litru u fi grammi għal kull kilogramma, ikkalkolat permezz ta’ refrattometru kkalibrat, jew f’perċentwal fil-massa tas-sukrożju f’20 °C, jew f’indiċi refrattiv f’20 °C. Il-massa skont il-volum f’20 °C hija mogħtija wkoll.

[irreferi għat-Tabella II tal-Anness tal-metodu AS2 - 02 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

TABELLA III

Tabella li tagħti l-kontenut taz-zokkor tal-mosti konċentrati rettifikati fi grammi għal kull litru u fi grammi għal kull kilogramma, ikkalkolat permezz ta’ refrattometru kkalibrat, jew f’perċentwal fil-massa tas-sukrożju f’20 °C, jew f’indiċi refrattiv f’20 °C. Il-massa skont il-volum f’20 °C hija mogħtija wkoll.

[irreferi għat-Tabella III tal-Anness tal-metodu AS2 - 02 deskritt fil-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

3   TOTAL TAL-ESTRATT NIEXEF (OIV-AS-2-03-EXTSEC) TOTAL TAL-MATERJA NIEXFA – METODU TIP I

1.   DEFINIZZJONI

It-total tal-estratt niexef jew it-total tal-materja niexfa huwa magħmul mis-sustanzi kollha li, taħt kundizzjonijiet fiżiċi speċifiki, ma jiżvintawx. Dawn il-kundizzjonijiet fiżiċi għandhom jiġu stabbiliti b’mod li s-sustanzi li jagħmlu dan l-estratt jgħaddu mill-inqas alterazzjoni possibbli.

L-estratt ta’ mingħajr zokkor huwa d-differenza bejn it-total tal-estratt niexef u t-total taz-zokkor.

L-estratt imnaqqas huwa d-differenza bejn it-total tal-estratt niexef u t-total taz-zokkor li jaqbeż 1 g/l, tal-potassium sulphate li jaqbeż 1 g/l, tal-mannitol jekk hemm, u tas-sustanzi kimiċi kollha li jistgħu jiġu miżjuda mal-inbid.

L-estratt li jifdal huwa l-estratt mingħajr zokkor mingħajr l-aċidità fissa, espressa bħala aċdu tartariku.

L-estratt huwa espress fi grammi għal kull litru u għandu jiġi kkalkolat sal-eqreb 0,5 g.

2.   PRINĊIPJU TAL-METODU

[Id-deskrizzjoni ta’ dan il-metodu ta’ analiżi qiegħda tiġi aġġornata mill-korpi tal-OIV. Din sejra tiġi ppubblikata f’Komunikazzjoni futura tal-Kummissjoni malli test aġġornat jiġi ppubblikat mill-OIV fl-edizzjoni 2010 tal-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV. Bħala eżempju, sakemm toħroġ il-pubblikazzjoni, wieħed jista’ jirreferi għall-Kapitolu 4 tal-Anness tar-Regolament (KEE) Nru 2676/90 tal-Kummissjoni.]

4   DETERMINAZZJONI TAR-RAPPORT IŻOTOPIKU 18O/16O DE TAL-ILMA TAL-INBEJJED (OIV-AS-2-09-MOUO18) – METODU TIP II

(p.m.)

[Id-deskrizzjoni ta’ dan il-metodu ta’ analiżi qiegħda tiġi aġġornata mill-korpi tal-OIV. Din sejra tiġi ppubblikata f’Komunikazzjoni futura tal-Kummissjoni malli test aġġornat jiġi ppubblikat mill-OIV fl-edizzjoni 2010 tal-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV. Bħala eżempju, sakemm toħroġ il-pubblikazzjoni, wieħed jista’ jirreferi għall-Kapitolu 43 tal-Anness tar-Regolament (KEE) Nru 2676/90 tal-Kummissjoni.]

5   INDIĊI TA’ FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – METODU TIP IV

1.   DEFINIZZJONI

L-indiċi ta’ Folin-Ciocalteu huwa r-riżultat miksub mill-applikazzjoni tal-metodu deskritt hawn taħt.

2.   PRINĊIPJU

Il-komposti fenoliċi kollha tal-inbid huma ossidizzati mir-reaġent ta’ Folin-Ciocalteu. Dan tal-aħħar huwa magħmul minn taħlita ta’ phosphotungstic acid (H3PW12O40) u phosphomolybdic acid (H3PMo12O40) li huwa mnaqqas, wara l-ossidazzjoni tal-fenoli, biex jirriżulta f’taħlita ta’ tungsten blue oxides (W8O23) u ta’ molybdenum (Mo8O23).

Il-kolorazzjoni blu prodotta għandha assorbiment massimu ta’ madwar 750 nm. Din hija proporzjonata mal-kwantità ta’ komposti fenoliċi.

3.   REAĠENTI

Ir-reaġenti għandhom ikunu ta’ kwalità analitika. L-ilma użat għandu jkun ilma distillat jew ilma ta’ purità ekwivalenti.

3.1.   Reaġent ta’ Folin-Ciocalteu

Dan ir-reaġent jinsab kummerċjalment f’forma lesta għall-użu. Jista’ jiġi mħejji bil-mod li ġej: dewweb 100 g ta’ sodium tungstate (Na2WO4 , 2H2O) u 25 g ta’ sodium molybdate (Na2MoO4 , 2H2O) f’700 ml ilma distillat; żid 50 ml ta’ 85 % aċdu fosforiku (ρ20 = 1,71 g/ml), 100 ml aċdu idrokloriku konċentrat (ρ20 = 1,19 g/ml). Għalli u ħalliħ jagħli għal 10 siegħat taħt kundizzjonijiet reflussi, imbagħad żid 150 g lithium sulphate (Li2SO4, H2O), ftit qtar ta’ bromu u erġa’ għalli għal 15-il minuta. Kessaħ u żid ilma distillat sakemm jilħaq litru.

3.2.   Sodium carbonate (Na2CO3) anidruż f’forma ta’ soluzzjoni 20 % (m/v).

4.   APPARAT

Apparat tas-soltu tal-laboratorju, u b’mod partikolari:

4.1.   Kunjetti volumetriċi ta’ 100 ml.

4.2.   Spettrofotometru li huwa kapaċi jaħdem f’750 nm.

5.   PROĊEDURA

5.1.   Għall-inbejjed ħomor

F’kunjett volumetriku ta’ 100 ml (punt 4.1), poġġi filwaqt li tirrispettal-ordni li ġej:

ml inbid dilwit sa 1/5

ml ilma distillat

ml reaġent ta’ Folin-Ciocalteu (3.1)

ml soluzzjoni ta’ sodium carbonate (3.2)

Żid sa 100 ml bl-ilma distillat.

Ħawwad sabiex tomoġenizza. Stenna 30 minuta sabiex ir-reazzjoni tistabbilizza ruħha. Ikkalkola l-assorbiment f’750 nm minn 1 ċm meta mqabbel ma’ kampjun ta’ kontroll imħejji bl-ilma distillat minflok inbid.

Jekk l-assorbiment ma jkunx madwar 0,3, għandha tinbidel id-dilwizzjoni tal-inbid.

5.2.   Għall-inbejjed bojod

Aħdem bl-istess kundizzjonijiet, b’1 ml ta’ inbid mhux dilwit.

5.3.   Għall-mosti konċentrati rettifikati

5.3.1.   Tħejjija tal-kampjun

Uża s-soluzzjoni li għandha kontenut ta’ zokkor ta’ 25 għal kull 100 (m/m) (25 ° Brix) imħejja kif inhuwa indikat fil-kapitolu “pH”, fil-punt 4.1.2.

5.3.2.   Kejl

Ipproċedi kif deskritt fil-każ tal-inbejjed ħomor (punt 5.1) fuq kampjun ta’ 5 ml imħejji skont il-punt 5.3.1 filwaqt li tkejjel l-assorbiment billi tqabbel ma’ kampjun ta’ kontroll imħejji b’5 ml ta’ soluzzjoni ta’ zokkor invertit b’25 għal kull 100 (m/m).

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

6.1.   Metodu tal-kalkolu

Ir-riżultat huwa espress fil-forma ta’ indiċi miksub billi timmultiplika l-assorbiment b’100 għall-inbejjed ħomor dilwiti sa 1/5 (jew bil-fattur li jikkorrispondi għad-dilwizzjoni użata) u b’20 għall-inbejjed bojod. Għall-mosti konċentrati rettifikati, l-assorbenza għandha tiġi mmultiplikata b’16.

6.2.   Repetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ 2 kalkoli magħmula b’mod simultanju jew malajr wieħed wara l-ieħor mill-istess analista m’għandhiex tkun aktar minn 1.

Repetibbiltà tajba tar-riżultati tiddependi fuq l-użu ta’ apparat (kunjetti volumetriċi u kontenituri tal-ispettrofotometru) perfettament nadif.

6   GLUKOŻJU U FRUTTOŻJU (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – METODU TIP II

1.   DEFINIZZJONI

Il-glukożju u l-fruttożju jistgħu jiġu kkalkolati individwalment b'metodu enżimatiku, bl-uniku skop illi jiġi kkalkolat il-proporzjon ta’ glukożju/fruttożju.

2.   PRINĊIPJU

Il-glukożju u l-fruttożju jiġu fosforilati permezz tal-adenosine triphosphate (ATP) matul reazzjoni enżimatika katalizzata permezz tal-hexokinase (HK) u tipproduċi glucose-6-phosphate (G6P) u fructose-6-phosphate (F6P):

glukożju + ATP←→G6P + ADP

fruttożju + ATP←→F6P + ADP

Għall-ewwel il-glucose-6-phosphate jiġi ossidizzat fi gluconate-6-phosphate permezz tan-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) fil-preżenza tal-enżima glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Il-kwantità ta’ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate mnaqqas (NADPH) li tinħoloq tikkorrispondi għall-kwantità ta’ glucose-6-phosphate u għalhekk għal dik tal-glukożju.

G6P + NADP+ Gluconate-6-phosphate + NADPH + H +

Huwa n-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate mnaqqas li jiġi mkejjel minn kemm jiġi assorbit f’340 nm.

Fit-tmiem ta’ din ir-reazzjoni, il-fructose-6-phosphate jinbidel permezz tal-azzjoni tal-phosphoglucose-isomerase (PGI) f’glucose-6-phosphate:

F6P←→G6P

Il-glucose-6-phosphate għal darba oħra jirreaġixxi man-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate biex jagħti gluconate-6-phosphate u nicotinamide adenine dinucleotide phosphate mnaqqas; dan tal-aħħar jiġi mkejjel.

3.   APPARAT

—

Spettofotometru li jippermetti li jittieħed kejl sa 340 nm, assorbiment massimu tal-NADPH. Rigward qisien assoulti (mingħajr medda ta’ kalibrazzjoni, iżda referenza għall-koeffiċjent ta’ estinzjoni tal-NADPH), l-iskali tat-tul tal-mewġa u tal-assorbimenti tal-apparat għandhom jiġu kkontrollati. Jekk ma jkunx disponibbli, uża spettofotometru li juża sors bi spettru li mhuwiex kontinwu li jippermetti li jsiru l-qisien f’334 nm jew f’365 nm.

—	Kontenituri tal-ħġieġ ta’ passaġġ ottiku ta’ 1 ċm jew kontenituri ta’ użu wieħed.

—	Pipetti għal test enżimatiku ta’ 0,02 – 0,05 – 0,1 – 0,2 ml.

4.   REAĠENTI

4.1.   Soluzzjoni 1: buffer (triethanolamine 0,3 M; pH = 7,6; 4 ×-10–3M f’Mg2+): dewweb 11,2 g ta’ triethanolamine chlorhydrate (C2H5)3N , HCl) u 0,2 g ta’ Mg SO4, 7 H2O f’150 ml ilma distillat, żid madwar 4 ml ta’ soluzzjoni 5 M sodium hydroxide (NaOH) biex tikseb pH ugwali għal 7,6 u tilħaq 200 ml.

Din is-soluzzjoni buffer tista’ tinżamm għal 4 ġimgħat f’+ 4 °C.

4.2.   Soluzzjoni 2: soluzzjoni ta’ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (madwar 11,5 10–3-M): dewweb 50 mg nicotinamide adenine dinucleotide phosphate disodium f’5 ml ilma distillat darbtejn.

Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm għal erba’ ġimgħat f'+ 4 °C.

4.3.   Soluzzjoni 3: soluzzjoni ta adenosine-5′-triphosphate (madwar 81 × 10–3M): dewweb 250 mg disodium adenosine-5′-triphosphate u 250 mg sodium hydrogenocarbonate Na H CO3 f’5 ml ilma distillat darbtejn.

Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm għal erba’ ġimgħat f'+ 4 °C.

4.4.   Soluzzjoni 4: Hexokinase/glucose-6-phosphate-deshydrogenase: ħallat 0,5 ml hexokinase (2 mg ta’ proteina/ml jiġifieri 280 U/ml) u 0,5 ml glucose-6-phosphate-deshydrogenase (1 mg ta’ proteina għal kull ml).

Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm għal sena f'+ 4 °C.

4.5.   Soluzzjoni 5: Phosphoglucose-isomerase (2 mg ta’ proteina għal kull ml jiġifieri 700 U/ml). Is-sospensjoni tintuża mingħajr dilwizzjoni.

Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm għal sena f'+ 4 °C.

Rimarka:

Ir-reaġenti kollha meħtieġa għal dan id-dożaġġ huma kummerċjalizzati.

5.   PROĊEDURA

5.1.   Tħejjija tal-kampjun

Skont il-kwantità stmata ta’ glukożju + fruttożju għall kull litru, wettaq id-dilwizzjonijiet li ġejjin:

Kejl f’340 u 334 nm	Kejl f'365 nm	Dilwizzjoni bl-ilma	Fattur F ta’ dilwizzjoni
Sa 0,4 g/l	Sa 0,8 g/l	—	—
Sa 4,0 g/l	Sa 8,0 g/l	1 + 9	10
Sa 10,0 g/l	Sa 20,0 g/l	1 + 24	25
Sa 20,0 g/l	Sa 40,0 g/l	1 + 49	50
Sa 40,0 g/l	Sa 80,0 g/l	1 + 99	100
Aktar minn 40,0 g/l	Aktar minn 80,0 g/l	1 + 999	1 000

5.2.   Dożaġġ

Bl-ispettofotometru aġġustat fuq it-tul tal-mewġa ta’ 340 nm, ħu qisien billi tuża l-arja (bla kontenitur fil-passaġġ ottiku) jew l-ilma bħala referenza.

Temperatura 20 sa 25 °C.

F’2 kontenituri ta’ passaġġ ottiku ta’ 1 ċm, poġġi:

	Kampjun ta’ kontroll	Kampjun għad- dożaġġ
Soluzzjoni 1 (4.1) (meħuda sa 20 °C)	2,50 ml	2,50 ml
Soluzzjoni 2 (4.2)	0,10 ml	0,10 ml
Soluzzjoni 3 (4.3)	0,10 ml	0,10 ml
Kampjun li għalih trid tiġi kkalkolata d-doża		0,20 ml
Ilma distillat darbtejn	0,20 ml

Ħallatt u wara madwar 3 minuti aqra l-assorbiment tas-soluzzjonijiet (A1). Agħti bidu għar-reazzjoni billi żżid:

Soluzzjoni 4 (4.4)

0,02 ml

0,02 ml

Ħawwad; stenna 15-il minuta; wettaq il-kejl tal-assorbiment u ara li r-reazzjoni tkun waqfet wara 2 minuti (A2).

Żid minnufih:

Soluzzjoni 5 (4.5)

0,02 ml

0,02 ml

Ħawwad; aqra wara 10 minuti; ara li r-reazzjoni tkun waqfet wara 2 minuti (A3).

Ikkalkola d-differenzi tal-assorbiment:

A2 – A1 li tikkorrispondi għall-glukożju,

A3 – A2 tikkorrispondi għall-fruttożju,

Għall-kampjun ta’ kontroll u d-dożaġġ.

Ikkalkola d-differenza ta’ assorbiment tal-kampjun ta’ kontroll (Δ AT) minn dak tal-kampjun tad-dożaġġ (Δ AD) u stabbilixxi:

għall-glukożju: Δ AG = Δ AD – Δ AT

għall-fruttożju: Δ AF = Δ AD – Δ AT

Rimarka:

Il-ħin meħtieġ għall-azzjoni tal-enżimi jista’ jvarja minn lott għall-ieħor. Huwa mogħti hawn fuq biss bħala eżempju. Huwa rrakkomandat li dan jiġi kkalkolat għal kull lott.

5.3.   Espressjoni tar-riżultati

5.3.1.   Kalkolu

Il-formola ġenerali sabiex jiġu kkalkolati l-konċentrazzjonijiet hija din li ġejja:

C= ((V × PM)/(ε × d × v × 1 000)) × ΔA (g/l)

V= volum tat-test (ml)

v= volum tal-kampjun (ml)

PM= massa molekulari tas-sustanza li għaliha trid tiġi kkalkolata d-doża

d= passaġġ ottiku tal-kontenitur (ċm)

ε= koeffiċjent ta’ assorbiment tal-NADPH f’340 nm = 6,3 (mmole.–1 x l x cm–1)

V= 2,92 ml għad-dożaġġ tal-glukożju

V= 2,94 ml għad-dożaġġ tal-fruttożju

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Wieħed jikseb:

għall-glukożju: C (g/l) = 0,417 × ΔAG

għall-fruttożju: C (g/l) = 0,420 × ΔAF

Jekk tkun saret dilwizzjoni matul it-tħejjija tal-kampjun, immultiplika r-riżultat bil-fattur F.

Rimarka:

Jekk il-qisien ittieħdu fit-tul tal-mewġa 334 jew 365 nm, jinkisbu:

—	kejl fi 334 nm: ε = 6,2 (mmole–1 × l × cm–1) għall-glukożju: C (g/l) = 0,425 × ΔAG għall-fruttożju: C (g/l) = 0,428 × ΔAF

—	kejl fi 365 nm: ε = 3,4 (mmole–1 × l × cm–1) għall-glukożju: C (g/l) = 0,773 × ΔAG għall-fruttożju: C (g/l) = 0,778 × ΔAF

5.3.2.   Repetibbiltà (r)

r= 0,056 xi

5.3.3.   Riproduċibbiltà (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= kontenut ta’ glukożju jew fruttożju fi grammi għal kull litru.

7   DOŻAĠĠ TAZ-ZOKKOR PERMEZZ TA’ HPLC (SUKROŻJU) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – METODU TIP II

(p.m.)

[Id-deskrizzjoni ta’ dan il-metodu ta’ analiżi qiegħda tiġi aġġornata mill-korpi tal-OIV. Din sejra tiġi ppubblikata f’Komunikazzjoni futura tal-Kummissjoni malli test aġġornat jiġi ppubblikat mill-OIV fl-edizzjoni 2010 tal-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV. Bħala eżempju, sakemm toħroġ din il-pubblikazzjoni, wieħed jista’ jirreferi għall-paragrafu 3 tal-kapitolu 6 tal-Anness tar-Regolament (KEE) Nru 2676/90 tal-Kummissjoni.]

8   DETEZZJONI TAL-ARRIKKIMENT TAL-MOSTI TAL-GĦENEB, TAL-MOSTI TAL-GĦENEB IKKONĊENTRATI, TAL-MOSTI TAL-GĦENEB IKKONĊENTRATI RETTIFIKATI U TAL-INBEJJED BL-APPLIKAZZJONI TAR-REŻONANZA MANJETIKA NUKLEARI TAD-DEWTERJU (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – METODU TIP I

(p.m.)

[Id-deskrizzjoni ta’ dan il-metodu ta’ analiżi qiegħda tiġi riveduta mill-korpi xjentifiċi tal-OIV. Din tiġi ppubblikata f’Komunikazzjoni tal-Kummissjoni malli test definittiv jiġi adottat mill-Assemblea Ġenerali tal-OIV. Bħala eżempju, sakemm tittieħed din id-deċiżjoni tal-OIV, wieħed jista’ jirreferi għall-kapitolu 8 tal-Anness tar-Regolament (KEE) Nru 2676/90 tal-Kummissjoni.]

9   QAWWA ALKOĦOLIKA BIL-VOLUM (OIV-AS-312-01-TALVOL) – MÉTHODES TYPE I

(p.m.)

[Id-deskrizzjoni ta’ dan il-metodu ta’ analiżi qiegħda tiġi aġġornata mill-korpi tal-OIV. Din sejra tiġi ppubblikata f’Komunikazzjoni futura tal-Kummissjoni malli test aġġornat jiġi ppubblikat mill-OIV fl-edizzjoni 2010 tal-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV. Bħala eżempju, sakemm toħroġ din il-pubblikazzjoni tal-OIV, wieħed jista’ jirreferi għall-kapitolu 3 tal-Anness tar-Regolament (KEE) Nru 2676/90 tal-Kummissjoni.]

10   DETERMINAZZJONI TAL-PROPORZJON IŻOTOPIKU 13C/12C PERMEZZ TAL-ISPEKTROMETRIJA TAL-MASSA IŻOTOPIKA TAL-ETANOL TAL-INBID JEW TAL-ETANOL MIKSUB PERMEZZ TAL-FERMENTAZZJONI TAL-MOSTI, TAL-MOSTI KKONĊENTRATI JEW TAL-MOSTI KKONĊENTRATI RETTIFIKATI (OIV-AS-312-06-ETHANO) – METODU TIP II

1.   AMBITU

Il-metodu jippermetti l-kejl tal-proporzjoni iżotopiku 13C/12C tal-etanol tal-inbid u ta’ dak tal-etanol miksub wara l-fermentazzjoni tal-prodotti derivati tad-dielja (most, most konċentrat, most konċentrat rettifikat).

2.   REFERENZI TA’ STANDARDIZZAZZJONI

ISO:	5725:1994 “Affidibbiltà tal-metodi ta’ prova — Determinazzjoni tar-repetibbiltà u tar-riproduċibbiltà ta’ metodu ta’ prova standardizzat bi provi interlaboratorji”.
V-PDB:	Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0, 0112372).
Metodu OIV AS-311-O5-ENRRMN	“Detezzjoni tal-arrikkiment tal-mosti, tal-mosti konċentrati, tal-mosti konċentrati rettifikati u tal-inbejjed b’applikazzjoni tar-reżonanza manjetika nukleari tad-dewterju (RMN-FINS)”.

3.   TERMINI U DEFINIZZJONIJIET

13C/12C	:	Proporzjon tal-iżotopi tal-karbonju 13 (13C) u tal-karbonju 12 (12C) għal kampjun speċifiku.
δ13C	:	kontenut ta’ karbonju 13 (13C) espress fi partijiet f’kull elf (‰).
RMN-FINS	:	Frazzjonament iżotopiku naturali speċifiku studjat permezz tar-reżonanza manjetika nukleari.
V-PDB	:	Vienna-Pee-Dee Belemnite. Il-PDB, referenza primarja għall-kejl tal-varjazzjonijiet naturali tal-kontenuti iżotopiċi tal-karbonju 13, kien calcium carbonate li kien ġej minn gwardja ta' belemnit Cretaċju mill-Pee Dee Formation fi South Carolina (USA). Il-proporzjon iżotopiku tiegħu 13C/12C jew RPDB huwa RPDB = 0,0112372. Il-PDB ġie eżawrit żmien ilu, iżda baqgħet ir-referenza primarja biex jiġu espressi l-varjazzjonijiet naturali tal-kontenuti iżotopiċi tal-karbonju 13, li magħha jiġi kkalibrat l-materjal ta’ referenza, disponibbli fl-Aġenzija Internazzjonali tal-Enerġija Atomika (IAEA) fi Vjenna (l-Awstrija). Id-determinazzjonijiet iżotopiċi tal-abbundanza naturali ta’ karbonju 13 għalhekk jiġu espressi, b’konvenzjoni, b’relazzjoni mal-V-PDB.
m/z	:	Relazzjoni tal-massa mal-piż.

4.   PRINĊIPJU

Matul il-fotosinteżi, l-assimilazzjoni tal-carbon dioxide mill-pjanti issir skont żewġ tipi ewlenin ta’ metaboliżmu li huma l-metaboliżmu C3 (ċiklu ta’ Calvin) u l-metaboliżmu C4 (Hatch u Slack). Dawn iż-żewġ mekkaniżmi ta’ fotosinteżi għandhom frazzjonament iżotopiku differenti. Għalhekk, il-prodotti li ġejjin mill-pjanti C4, bħal m’huma z-zokkor u l-akoħol derivat permezz tal-fermentazzjoni, għandhom kontenut ta’ karbonju 13 aktar għoli minn dawk tal-analogi tagħhom li ġejjin minn pjanti C3. Il-parti l-kbira tal-pjanti bħad-dielja u l-pitravi taz-zokkor jaqgħu taħt il-grupp C3. Il-kannamieli taz-zokkor u l-qamħirrum jaqgħu taħt il-grupp C4. Il-kejl tal-kontenut ta’ karbonju 13 għalhekk jippermetti d-detezzjoni u l-evalwazzjoni taz-zokkor ta’ oriġini C4 (zokkor tal-kannamieli jew l-iżoglukożju tal-qamħirrum) miżjud mal-prodotti derivati tal-għeneb (mosti tal-għeneb, inbejjed, eċċ.). L-informazzjoni dwar il-kontenut ta’ karbonju 13 flimkien ma’ dik miksuba mill-RMN-FINS tippermetti wkoll il-kwantifikazzjoni taż-żieda ta’ taħlitiet ta’ zokkor jew alkoħol li ġejjin minn pjanti C3 u C4.

Il-kontenut ta’ karbonju 13 huwa kkalkolat permezz tal-carbon dioxide li jirriżulta mill-kombustjoni sħiħa tal-kampjun. L-abbundanza tal-iżotopomeri ewlenin tal-mases 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 et 12C17O16O) u 46 (12C16O18O), li jirriżultaw mit-taħlitiet differenti possibbli tal-iżotopi 18O, 17O, 16O, 13C u 12C, hija kkalkolata mill-kurrenti joniċi mkejla fuq tliet kolletturi differenti ta’ spettrometru ta’ massa iżotopika. Il-kontribuzzjonijiet tal-iżotopomeri 13C17O16O et 12C17O2 jistgħu jiġu mwarrba minħabba l-abbundanza dgħajfa ħafna tagħhom. Il-kurrent joniku għal m/z = 45 huwa kkoreġut għall-kontribuzzjoni ta’ 12C17O16O li hija kkalkolata skont l-intensità tal-kurrent mkejjel għal m/z = 46 filwaqt li jiġu kkunsidrati l-abbundanzi relattivi ta’ 18O u 17O (il-korrezzjoni Craig). It-tqabbil ma’ referenza kkalibrata skont ir-referenza internazzjonali V-PDB jippermetti l-kalkolu tal-kontenut ta’ karbonju 13 fuq l-iskala relattiva δ13C.

5.   REAĠENTI

Il-materjali u l-konsumabbli jiddependu mill-apparat (6) użat mill-laboratorju. Is-sistemi ġeneralment użati huma dawk bbażati fuq l-analizzatur elementari. Dan jista’ jkun mgħammar biex jiddaħħlu kampjuni mpoġġija f’kapsuli tal-metall issiġillati, jew għall-injezzjoni ta’ kampjuni likwidi permezz ta’ septum bl-użu ta’ siringa.

Skont it-tip ta’ strument użat, jistgħu jintużaw il-materjali ta’ referenza, ir-reaġenti u l-konsumabbli li ġejjin:

—	materjali ta’ referenza

—	disponibbli mill-IAEA: Isem Materjal δ13 C kontra V-PDB (9) — IAEA-CH-6 sukrożju –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 polyethylene –31,8 ‰ — NBS22 żejt –29,7 ‰ — USGS24 graffit –16,1 ‰

—	disponibbli mill-Istitut tal-Materjali u l-Kejl ta' Referenza (IRMM) ta’ Geel (BE): Isem Materjal δ13C kontra V-PDB (9) — CRM/BCR 656 alkoħol tal-inbid –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 glukożju –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 soluzzjoni idroalkoħolika (TAV 12 %) –26,72 %

—	Kampjun standard ta’ ħidma li għandu proporzjon 13C/12C magħruf ikkalibrat b’paragun mal-materjali ta’ referenza internazzjonali.

—

Il-lista indikattiva ta’ konsumabbli hawn taħt hija stabbilita għas-sistemi bi fluss kontinwu: — elju għall-analiżi (CAS 07440-59-7), — ossiġenu għall-analiżi (CAS 07782-44-7), — carbon dioxide għall-analiżi, użat bħala gass ta’ referenza sekondarju għall-kontenut ta’ karbonju 13 (CAS 00124-38-9), — reaġent ta’ ossidazzjoni għall-forn tas-sistema ta’ kombustjoni, pereżempju copper oxide (II) għall-analiżi elementari (CAS 1317-38-0), — dessikant biex jelimina l-ilma prodott mill-kombustjoni, pereżempju anidron għall-analiżi elementari (magnesium perchlorate) (CAS 10034-81-8) (mhux meħtieġ għall-apparat li huwa mgħammar b’sistema ta’ tneħħija tal-ilma permezz ta’ cyrotrapping jew bl-użu ta’ kapillarju permeabbli b’mod selettiv).

6.   APPARAT U TAGĦMIR

6.1.   Spettometru tal-massa tal-proporzjon iżotopiku (isotope ratio mass spectrometer -IRMS)

Spettometru tal-massa tal-proporzjon iżotopiku (IRMS), li jippermetti li jiġi kkalkolat il-kontenut relattiv ta’ 13C fil-gass CO2 f’abbundanza naturali bi preċiżjoni interna ta’ 0,05 ‰ jew aħjar espressa f’valur relattiv (punt 9). Il-preċiżjoni interna hawnhekk hija definita bħala d-differenza bejn żewġ qisien tal-istess kampjun ta’ CO2. L-ispettometru tal-massa, li jintuża għall-kejl tal-proporzjonijiet iżotopiċi, huwa ġeneralment mgħammar b’kollettur tripplu biex ikejjel b’mod simultanju l-intensitajiet għal m/z = 44, 45 u 46. L-ispettometru tal-massa tal-proporzjon iżotopiku għandu jew ikun mgħammar b’sistema ta’ introduzzjoni doppja, biex ikejjel wieħed wara l-ieħor il-kampjun magħruf u kampjun ta’ referenza, jew inkella juża sistema integrata li twettaq il-kombustjoni kwantitattiva tal-kampjuni u tissepara l-carbon dioxide mill-prodotti l-oħra ta’ kombustjoni qabel il-kejl fl-ispettometru tal-massa.

6.2.   Apparat ta’ kombustjoni

Apparat ta’ kombustjoni li huwa kapaċi jikkonverti kwantitattivament l-etanol f’carbon dioxide u jneħħi l-prodotti kollha l-oħra ta’ kombustjoni inkluż l-ilma mingħajr l-ebda frazzjonament iżotopiku. L-apparat jista’ jkun jew sistema bi fluss kontinwu integrat mal-istrumentazzjoni tal-ispettometru tal-massa (punt 6.2.1), jew inkella sistema ta’ kombustjoni awtonoma (punt 6.2.2). L-apparat għandu jippermetti li tinkiseb preċiżjoni mill-inqas ekwivalenti għal dik indikata fil-punt 11.

6.2.1.   Sistemi bi fluss kontinwu

Dawn huma magħmula jew minn analizzatur elementari, jew inkella minn kromatografu fil-fażi ta’ gass mgħammar b’sistema ta’ kombustjoni li ssir f’sensiela.

Għas-sistemi mgħammra għall-introduzzjoni tal-kampjuni mpoġġija ġo kapsuli metalliċi, jintuża t-tagħmir tal-laboratorju li ġej:

—	mikrosiringa jew mikropipetta volumetrika bi truf xierqa,

—	miżien bi skala ta’ qari sa 1 μg jew aħjar,

—	pinzetta għall-għeluq fil-kapsuli,

—	kapsuli tal-landa għall-kampjuni likwidi,

—	kapsuli tal-landa għall-kampjuni solidi.

Rimarka:

biex jiġu limitati r-riskji ta’ evaporazzjoni tal-kampjuni tal-etanol, huwa possibbli li jitpoġġa materjal assorbenti fil-kapsuli (pereżempju chromosorb W 45-60 mesh) li qabel ikun ġie vverifikat b’kejl mingħajr kampjun li ma jkunx fih kwantità sinifikattiva ta’ karbonju li tista’ tbiddel il-qisien.

Waqt l-użu ta’ analizzatur elementari mgħammar b’injettur għal-likwidi jew fil-każ ta’ sistema ta’ tħejjija permezz tal-kromatografija-kombustjoni, jintuża t-tagħmir tal-laboratorju li ġej:

—	siringa għal-likwidi,

—	fliexken mgħammra b’sistema ta’ għeluq li ma tippermettix li tidħol l-arja u ta’ septa inerta.

It-tagħmir tal-laboratorju indikat fil-listi hawn fuq huma eżempji u x’aktarx jiġi sostitwit b’tagħmir ieħor ta’ prestazzjoni ekwivalenti skont it-tip ta’ apparat ta’ kombustjoni u ta’ spettrometrija tal-massa użata mill-laboratorju.

6.2.2.   Sistemi awtonomi ta’ tħejjija

F’dan il-każ, il-kampjuni ta’ carbon dioxide li jirriżultaw mill-kombustjoni tal-kampjuni li għandhom jiġu analizzati u l-kampjuni ta’ referenza huma miġbura f’ampulli li imbagħad jingħaqdu mas-sistema doppja ta’ dħul tal-ispettometru biex issir l-analiżi iżotopika. Bosta tipi ta’ apparati ta’ kombustjoni deskritti fil-letteratura jistgħu jintużaw:

—	sistema magħluqa ta’ kombustjoni mimlija b’gass tal-ossiġenu li jiċċirkola,

—	analizzatur elementari bi fluss ta’ elju u tal-ossiġenu,

—	ampula ssiġillata tal-ħġieġ mimlija bil-copper oxide (II) bħala aġent ta’ ossidazzjoni.

7.   TĦEJJIJA TAL-KAMPJUNI GĦAT-TESTIJIET

L-etanol għandu jiġi estratt mill-inbid qabel id-determinazzjoni iżotopika. Din l-estrazzjoni ssir bid-distilazzjoni tal-inbid kif deskritt fil-punt 3.1 tal-metodu (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

Fil-każ tal-most tal-għeneb, tal-most tal-għeneb konċentrat u tal-most tal-għeneb konċentrat rettifikat, iz-zokkor għandu jiġi ffermentat f’etanol l-ewwel kif deskritt fil-punt 3.2 tal-metodu (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8.   PROĊEDURA

L-istadji kollha ta’ tħejjija għandhom isiru mingħajr l-ebda telf sinifikattiv ta’ etanol bl-evaporazzjoni għax dan ibiddel il-kompożizzjoni iżotopika tal-kampjun.

Id-deskrizzjoni li ġejja tirreferi għall-proċeduri li jintużaw ġeneralment għall-kombustjoni tal-kampjuni ta’ etanol permezz tas-sistemi awtomatiċi ta’ kombustjoni kummerċjali. Kwalunkwe metodu ieħor, li jiżgura li l-kampjun ta’ etanol huwa kwantitattivament mibdul f’carbon dioxide mingħajr l-ebda telf b’evaporazzjoni tal-etanol jista’ jkun xieraq għat-tħejjija ta’ carbon dioxide għall-analiżi iżotopika.

Proċedura sperimentali bbażata fuq l-użu ta’ analizzatur elementari:

a)

it-tpoġġija fil-kapsuli tal-kampjuni: — uża kapsuli, pinzetta u tilar ta’ tħejjija nodfa, — ħu kapsula tad-daqs xieraq billi tuża l-pinzetta, — daħħal il-volum meħtieġ ta’ likwidu fil-kapsula billi tuża l-mikropipetta, — Rimarka: 3,84 mg etanol assolut jew 4,17 mg distillat li għandu qawwa alkoħolika ta’ 92 % m/m huma meħtieġa biex tikseb 2 mg ta’ karbonju. Il-kwantità xierqa ta’ distillat għandu jkun kkalkulat bl-istess mod skont il-kwantità ta’ karbonju meħtieġa skont is-sensittività tal-istrumentazzjoni tal-ispettometru tal-massa. — erġa’ agħlaq il-kapsula billi tuża l-pinzetta, — kull kapsula għandha tkun magħluqa b’mod li żgur ma tidħolx arja. Jekk le, din għandha tintrema u għandha titħejja mill-ġdid kapsula ġdida, — għal kull kampjun, ipprepara żewġ kapsuli, — poġġi l-kapsuli fil-post xieraq fuq it-tilar tat-trasportatur awtomatiku tal-kampjuni tal-analizzatur elementari. Kull kapsula għandha tiġi identifikata bir-reqqa permezz ta’ numru tal-ordni, — poġġi b’mod sistematiku l-kapsuli li fihom ir-referenzi ta’ ħidma fil-bidu u fl-aħħar tas-serje ta’ kampjuni, — daħħal b’mod regolari kampjuni ta’ kontroll fis-serje ta’ kampjuni;

b)

il-kontroll u l-aġġustament tal-istrumentazzjoni tal-analiżi elementari u tal-ispettrometrija tal-massa — aġġusta t-temperatura tal-fran tal-analizzatur elementari u l-flussi tal-gass tal-elju u tal-ossiġenu għal kombustjoni ottimali tal-kampjun, — ivverifika li m’hemmx ħruġ fis-sistema ta’ analiżi elementari u ta’ spettometrija tal-massa (pereżempju billi tikkontrolla l-kurrent joniku għal m/z = 28 li jikkorrispondi għal N2), — aġġustal-ispettometru tal-massa biex tkejjel l-intensitajiet tal-kurrenti joniċi għal m/z = 44, 45 u 46, — ivverifika s-sistema permezz ta’ kampjuni ta’ kontroll magħrufa qabel ma tibda l-kejl fuq il-kampjuni;

c)

it-twettiq ta’ serje ta’ qisien Il-kampjuni mpoġġija fuq it-trasportatur awtomatiku ta’ kampjuni tal-analizzatur elementari (jew tal-kromatografu) jiddaħħlu wara xulxin. Il-carbon dioxide ta’ kull kombustjoni ta’ kampjun huwa maħsul b’solvent lejn l-ispettometru tal-massa li jkejjel il-kurrenti joniċi. Il-kompjuter li huwa mqabbad mal-istrumentazzjoni jirrekordja l-intensitajiet tal-kurrenti joniċi u jikkalkola l-valuri δ għal kull kampjun (punt 9).

9.   KALKOLU

L-għan tal-metodu huwa li jiġi kkalkolat il-proporzjon iżotopiku 13C/12C tal-etanol estratt mill-inbid jew minn prodotti derivati tal-għeneb wara l-fermentazzjoni. Il-proporzjon iżotopiku 13C/12C jista’ jiġi espress permezz tad-differenza teigħu meta mqabbel ma’ referenza ta’ ħidma. Id-differenza iżotopika karbonju 13 (δ 13C) hija imbagħad ikkalkolata fuq skala delta għal kull elf (δ/1 000) bi tqabbil tar-riżultati miksuba għall-kampjun li għandu jitkejjel kontra dawk tar-referenza ta’ ħidma li tkun ġiet ikkalibrata minn qabel b’paragun mar-referenza primarja internazzjonali (V-PDB). Il-valuri δ 13C huma espressi b’relazzjoni mar-referenza ta’ ħidma b’mod konformi ma’:

δ13Cech/ref ‰ = 1 000 × (Rech-Rref)/Rref

fejn Rech u Rref huma rispettivament il-proporzjonijiet iżotopiċi 13C/12C tal-kampjun u dawk tal-carbon dioxide użat bħala gass ta’ referenza.

Il-valuri δ 13C għalhekk huma espressi b’rabta mal-V-PDB b’mod konformi ma’:

δ13Cech/V-PDB ‰ = δ13Cech/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cech/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

fejn δ13Cref/V-PDB hija d-differenza iżotopika kkalkolata minn qabel għar-referenza ta’ ħidma mqabbla mal-V-PDB.

Waqt il-kejl f’sensiela, jistgħu jiġu osservati xi ftit differenzi dovuti mill-varjazzjoni tal-kundizzjonijiet strumentali. F’dan il-każ, il-δ 13C tal-kampjuni għandhom jiġu korretti skont id-differenza bejn ill-valur δ13C mkejjel għar-referenza tal-ħidma u l-valur reali tiegħu, ikkalibrat minn qabel mal-V-PDB bi tqabbil ma’ wieħed mill-materjali ta’ referenza internazzjonali. Bejn żewġ qisien tar-referenza tal-ħidma, id-differenza, u għalhekk il-korrezzjoni li għandha tiġi applikata għar-riżultati tal-kampjuni, jistgħu jitqiesu bħala lineari. Ir-referenza tal-ħidma għandu jitkejjel fil-bidu u fit-tmiem ta’ kull serje ta’ kampjuni. Korrezzjoni imbagħad tista’ tiġi kkalkolata għal kull kampjun permezz ta’ interpolazzjoni lineari.

10.   L-IŻGURAR TAL-KWALITÀ U L-KONTROLL

Ikkontrolla li l-valur 13C għar-referenza ta’ ħidma ma jkunx differenti b’aktar minn 0,5 ‰ tal-valur użat. Jekk dan ma jkunx il-każ, ir-regolazzjoni tal-istrumentazzjoni tal-ispettometru għandha tiġi kkontrollata u possibbilment aġġustata mill-ġdid.

Għal kull kampjun, ivverifika li d-differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ kapsuli mkejla wara xulxin huwa inqas minn 0,3 ‰. Ir-riżultat finali għal kampjun speċifiku għalhekk huwa l-valur medju taż-żewġ kapsuli. Jekk id-differenza hija aktar minn 0,3 ‰, il-kejl għandu jerġa’ jsir.

Kontroll tal-funzjonament tajjeb tal-kejl jista’ jkun ibbażat fuq l-intensità tal-kurrent joniku għal m/z = 44 li huwa proporzjonali għall-kwantità ta’ karbonju injettata fl-analizzatur elementari. F’kundizzjonijiet normali, l-intensità ta’ dan il-kurrent joniku għandu jkun prattikament konsistenti għall-kampjuni li qegħdin jiġu analizzati. Differenza sinifikattiva għandha twassal li wieħed jissusspetta li kien hemm evaporazzjoni tal-etanol (perżempju kapsula mhux issiġillata sewwa) jew instabilità tal-analizzatur elementari jew tal-ispettometru tal-massa.

11.   KARATTERISTIĊI TAL-PRESTAZZJONI TAL-METODU (PREĊIŻJONI)

Sar l-ewwel studju kollaborattiv (punt 11.1) fuq distillati li kellhom alkoħols li ġejjin mill-inbid, u alkoħols tal-kannamieli u tal-pitrava kif ukoll taħlitiet differenti ta’ dawn it-tlieta. Peress li dan l-istudju ma qiesx l-istadju tad-distillazzjoni, ġiet ikkunsidrata wkoll xi informazzjoni kumplimentari li ġejja minn testijiet interlaboratorji oħra mwettqa fuq inbejjed (punt 11.2), u b’mod partikolari ċirkwiti ta’ testijiet tal-profiċjenza (punt 11.3), għall-qisien iżotopiċi. Ir-riżultati juru li s-sistemi differenti ta’ distillazzjoni użati f’kundizzjonijiet sodisfaċenti, u b’mod partikolari dawk li japplikaw għall-qisien RMN-FINS, ma jagħtux varjabbiltà sinifikattiva għall-kalkoli δ13C tal-etanol tal-inbid. Il-parametri ta’ affidabbiltà li ġew osservati għall-inbejjed huma kważi identiċi għal dawk li nkisbu waqt l-istudju kollaborattiv (punt 11.1) fuq id-distillati.

11.1.   Studju kollaborattiv fuq id-distillati

Sena tat-test interlaboratorji:	1996
Numru ta’ laboratorji:	20
Numru ta’ kampjuni:	6 kampjuni aleatorji (double blind)
Analita:	δ13C tal-etanol

Kodiċi tal-kampjuni	Alkoħol li ġej mill-inbid	Alkoħol li ġej mill-pitrava	Alkoħol li ġej mill-kannamieli
A & G	80 %	10 %	10 %
B & C	90 %	10 %	0 %
D & F	0 %	100 %	0 %
E & I	90 %	0 %	10 %
H & K	100 %	0 %	0 %
J & L	0 %	0 %	100 %

Kampjuni	A/G	B/C	D/F	E/I	H/K	J/L
Numru ta’ laboratorji magħżula wara l-eliminazzjoni tar-riżultati żbaljati	19	18	17	19	19	19
Numru ta’ riżultati aċċettati	38	36	34	38	38	38
Valur medju (δ13C) ‰	–25,32	–26,75	–27,79	–25,26	–26,63	–12,54
Sr2	0,0064	0,0077	0,0031	0,0127	0,0069	0,0041
Differenza-standard tar-repetibbiltà (Sr) ‰	0,08	0,09	0,06	0,11	0,08	0,06
Limitu tar-repetibbiltà r (2,8 × Sr) ‰	0,22	0,25	0,16	0,32	0,23	0,18
SR 2	0,0389	0,0309	0,0382	0,0459	0,0316	0,0584
Differenza-standard tar-riproduċibbiltà (SR) ‰	0,20	0,18	0,20	0,21	0,18	0,24
Limitu tar-riproduċibbiltà R (2,8 × SR) ‰	0,55	0,49	0,55	0,60	0,50	0,68

11.2.   Studju interlaboratorji fuq żewġ inbejjed u alkoħol wieħed

Sena tat-test interlaboratorji:	1996
Numru ta’ laboratorji:	14 għad-distillazzjoni tal-inbejjed li minnhom 7 ukoll għall-kejl δ 13C tal-etanol tal-inbejjed, 8 għall-kejl δ 13C tal-kampjun ta’ alkoħol
Numru ta’ kampjuni:	3 (inbid abjad TAV 9,3 % vol., inbid abjad ta’ TAV 9,6 % vol. u alkoħol ta’ qawwa ta’ 93 % m/m)
Analita:	δ 13C tal-etanol

Kampjuni	Inbid aħmar	Inbid abjad	Alkoħol
Numru ta’ laboratorji	7	7	8
Numru ta’ riżultati aċċettati	7	7	8
Valur medju (δ 13C) ‰	–26,20	–26,20	–25,08
Il-varjanza tar-riproduċibbiltà SR 2	0,0525	0,0740	0,0962
Differenza-standard tar-riproduċibbiltà (SR) ‰	0,23	0,27	0,31
Limitu tar-riproduċibbiltà R (2,8 × SR) ‰	0,64	0,76	0,87

Intużaw sistemi differenti ta’ distillazzjoni mil-laboratorji li ħadu sehem. Il-kalkoli iżotopiċi δ 13C imwettqa f’laboratorju wieħed fuq id-distillati kollha li ngħataw lura mill-parteċipanti ma juru la valur żbaljati u lanqas valur distint b’mod sinifikati tal-valuri medji. Il-varjanza tar-riżultati (S2 = 0,0059) tista’ titqabbel mal-varjanzi tar-repetibbiltà Sr2 tal-istudju kollaborattiv fuq id-distillati (punt 11.1).

11.3.   Riżultati tal-eżerċizzji taċ-ċirkwiti ta’ profiċjenza għat-testijiet iżotopiċi

Minn Diċembru 1994, qegħdin jiġu organizzati b’mod regolari eżerċizzji ta’ profiċjenza internazzjonali għall-kalkoli iżotopiċi fuq l-inbejjed u l-alkoħols (distillati ta’ TAV 96 % vol). Ir-riżultati jippermettu lil-laboratorji li qegħdin jieħdu sehem li jikkontrollaw il-kwalità tal-analiżi tagħhom. L-użu statistiku tar-riżultati jippermetti l-evalwazzjoni tal-varjabbiltà tal-kalkoli f’kundizzjonijiet ta’ riproduċibbiltà u għalhekk jippermetti li jiġu stmati l-parametri tal-varjanza u tal-limitu tar-riproduċibbiltà. Ir-riżultati miksuba għall-kalkoli δ 13C tal-etanol tal-inbejjed u distillati huma miġbura fil-qosor fit-Tabella li ġejja:

Data	Inbejjed				Distillati
	N	SR	SR 2	R	N	SR	SR 2	R
Diċembru 1994	6	0,210	0,044	0,59	6	0,151	0,023	0,42
Ġunju 1995	8	0,133	0,018	0,37	8	0,147	0,021	0,41
Diċembru 1995	7	0,075	0,006	0,21	8	0,115	0,013	0,32
Marzu 1996	9	0,249	0,062	0,70	11	0,278	0,077	0,78
Ġunju 1996	8	0,127	0,016	0,36	8	0,189	0,036	0,53
Settembru 1996	10	0,147	0,022	0,41	11	0,224	0,050	0,63
Diċembru 1996	10	0,330	0,109	0,92	9	0,057	0,003	0,16
Marzu 1997	10	0,069	0,005	0,19	8	0,059	0,003	0,16
Ġunju 1997	11	0,280	0,079	0,78	11	0,175	0,031	0,49
Settembru 1997	12	0,237	0,056	0,66	11	0,203	0,041	0,57
Diċembru 1997	11	0,127	0,016	0,36	12	0,156	0,024	0,44
Marzu 1998	12	0,285	0,081	0,80	13	0,245	0,060	0,69
Ġunju 1998	12	0,182	0,033	0,51	12	0,263	0,069	0,74
Settembru 1998	11	0,264	0,070	0,74	12	0,327	0,107	0,91
Medja meħuda		0,215	0,046	0,60		0,209	0,044	0,59
N : numru ta’ laboratorji li kienu qegħdin jieħdu sehem.

11.4.   Limiti ta’ repetibbiltà u ta’ riproduċibbiltà

Id-dejta tad-diversi eżerċizzji interlaboratorji ppreżentati fit-Tabelli preċedenti għalhekk jippermettu li jiġu stabbiliti għal dan il-metodu, filwaqt li jiġi inkluż ukoll l-istadju tad-distillazzjoni, il-limiti ta’ repetibbiltà u ta’ riproduċibbiltà li ġejjin:

Limitu ta’ repetibbiltà r: 0,24

Limitu ta’ riproduċibbiltà R: 0,6.

11   AĊIDITÀ TOTALI (OIV-AS-313-01-ACITOT) – METODU TIP I

1.   DEFINIZZJONI

L-aċidità totali hija s-somma tal-aċiditajiet titrabbli metal-pH jittella’ għal 7 permezz taż-żieda ta’ soluzzjoni alkalina standard.

Il-carbon dioxide mhuwiex inkluż fl-aċidità totali.

2.   PRINĊIPJU TAL-METODU

Titrazzjoni potenzjometrika jew titrazzjoni fil-preżenza ta’ bromothymol blue bħala indikatur tat-tmiem tar-reazzjoni bi tqabbil ma’ standard ta’ kolorazzjoni.

3.   REAĠENTI

3.1.   Soluzzjoni buffer pH 7,0:

Monopotassium phosphate KH2PO4: 107,3 g

Soluzzjoni M ta’ sodium hydroxide (NaOH): 500 ml

Ilma sa: 1 000 ml.

Is-soluzzjonijiet buffer ta’ referenza li jinsabu fil-kummerċ jistgħu jintużaw ukoll.

3.2.   Soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (NaOH).

3.3.   Soluzzjoni ta’ bromothymol blue bi 4 g/l.

Bromothymol blue (C27H28Br2O5S)	4 g
Alkoħol newtrali 96 % vol. …	200 ml
Wara s-solubilizzazzjoni żid:
Ilma mingħajr CO2 …	200 ml
Soluzzjoni M ta’ sodium hydroxide
kwantità biżżejjed għall kisba ta’ kulur blu-aħdar (pH 7)…	7,5 ml
Ilma sa	1 000 ml

4.   APPARAT

4.1.   Pompa tal-ilma taħt vakum.

4.2.   Fjaskett taħt vakum ta’ 500 ml.

4.3.   Potenzjometru bi skala gradata f'valuri pH, u elettrodi. L-elettrodu tal-ħġieġ għandu jinżamm f'ilma distillat. L-elettrodu bil-calomel-potassium chloride saturat għandu jinżamm f' soluzzjoni saturata ta’ potassium chloride. L-aktar li jintuża huwa elettrodu konġunt, żommu f’ilma distillat.

4.4.   Tankijiet ta’ għamla ċilindrika ta’ kapaċità ta’ 50 ml (għall-inbejjed) u ta’ kapaċità ta’ 100 ml (għall-mosti konċentrati rettifikati).

5.   PROĊEDURA

5.1.   Tħejjija tal-kampjun

5.1.1.   Għall-inbejjed

Tneħħija tal-carbon dioxide. Poġġi madwar 50 ml inbid ġo fjaskett taħt vakum, ħawwad u fl-istess ħin oħloq il-vakum permezz tal-pompa tal-ilma taħt vakum. Ħawwad għal bejn 1 u 2 minuti.

5.1.2.   Għall-mosti konċentrati rettifikati

Poġġi 200 g most konċentrat rettifikat imwieżen b’mod eżatt f’flixkun tond ikkalibrat ta’ 500 ml. Żid sal-marka bl-ilma. Omoġenizzah.

5.2.   Titrazzjoni potenzjometrika

5.2.1.   Kalibrazzjoni tal-miter pH

Il-kalibrazzjoni tal-miter tal-pH issir f’20 °C billi jiġu segwiti l-indikazzjonijiet mogħtija għall-apparat li qiegħed jintuża mas-soluzzjoni buffer ta’ pH 7,00 f’20 °C.

5.2.2.   Teknika ta’ kejl

Ġo tank ta’ għamla ċilindrika (punt 4.4) poġġi volum ta’ kampjun, imħejji kif indikat fil-punt 5.1, ugwali għal 10 ml għall-inbejjed u għal 50 ml għall-mosti konċentrati rettifikati. Żid madwar 10 ml ilma distillat u ferra s-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide mill-buretta (punt 3.2) sakemm il-pH jasal sa 7 f’20 °C. Iż-żieda tas-soluzzjoni alkalina għandu jsir bil-mod u s-soluzzjoni għandha titħawwad il-ħin kollu. Ħalli n tkun in-numru ta’ millilitri ta’ NaOH 0,1 M miżjuda.

5.3.   Titrazzjoni b'indikatur (bromothymol blue)

5.3.1.   Test minn qabel: stabbiliment tal-istandard ta’ kolorazzjoni

Ġo tank ta’ għamla ċilindrika (punt 4.4), poġġi 25 ml ilma distillat mgħolli, 1 ml soluzzjoni ta’ bromothymol blue (punt 3.3) u volum imħejji kif indikat fil-punt 5.1 ugwali għal 10 ml għall-inbejjed u għal 50 ml għal mosti konċentrati rettifikati. Żid is-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (punt 3.2) sakemm jinkiseb kulur blu-aħdar. Żid 5 ml tas-soluzzjoni buffer pH 7 (3.1).

5.3.2.   Dożaġġ

Ġo tank ta’ għamla ċilindrika (punt 4.4), poġġi 30 ml ilma distillat mgħolli, 1 ml soluzzjoni ta’ bromothymol blue (punt 3.3), volum ta’ kampjun imħejji kif indikat fil-punt 5.1 ugwali għal 10 ml għall-inbejjed u għal 50 ml għal mosti konċentrati rettifikati. Żid is-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (punt 3.2) sakemm jinkiseb kulur identiku għal dak miksub fit-test minn qabel (punt 5.3.1). Ħalli n tkun in-numru ta’ millilitri ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide 0,1 M miżjuda.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

6.1.   Metodu tal-kalkolu

6.1.1.   Għall-inbejjed

L-aċidità totali espressa f'milliekwivalenti għal kull litru għandha tkun:

A = 10 n

Tingħata b’post deċimali wieħed.

L-aċidità totali espressa fi grammi ta’ aċdu tartariku għal kull litru għandha tkun:

A′ = 0,075 × A

Tingħata b’post deċimali wieħed.

6.1.2.   Għall-mosti konċentrati rettifikati

—	L-aċidità totali espressa f'milliekwivalenti għal kull kilogramma ta’ most konċentrat rettifikat: a = 5 × n

—	L-aċidità totali espressa f'milliekwivalenti għal kull kilogramma tat-total taz-zokkor: — A = (500 × n)/P — P = kontenut f’100 (m/m) ta’ zokkor totali.

Din hija espressa b’post deċimali wieħed.

6.2.   Repetibbiltà (r) għat-titrazzjoni bl-indikatur(5.3)

r	=	0,9 me/l
r	=	0,07 g aċdu tartariku/l

għall-inbejjed bojod, rosé u ħomor.

6.3.   Riproduċibbiltà (R) għat-titrazzjoni bl-indikatur (5.3)

Għall-inbejjed bojod u rosé: R = 3,6 me/l R = 0,3 g aċdu tartariku/l.

Għall-inbejjed ħomor: R = 5,1 me/l R = 0,4 g aċdu tartariku/l.

12   AĊIDITÀ VOLATILI (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – METODU TIP I

1.   DEFINIZZJONI

L-aċidità volatili hija magħmula mill-aċidi li jaqgħu taħt is-serje aċetika li jinsabu fl-inbid fl-istat ħieles u fl-istat immellaħ.

2.   PRINĊIPJU TAL-METODU

Titrazzjoni tal-aċidi volatili mifruda mill-inbid permezz ta’ kurrent ta’ fwar tal-ilma u r-rettifikazzjoni tal-fwar.

Jitneħħa il-carbon dioxide mill-inbid minn qabel.

L-aċidità tas-sulphur dioxide ħieles u tas-sulphur dioxide mgħaqqad iddistillati f’dawn il-kundizzjonijiet għandha titneħħa mill-aċidità tad-distillat.

L-aċidità tal-aċdu sorbiku li jista’ jiġi miżjud mal-inbid għandha wkoll titneħħa.

Rimarka:

Parti ml-aċdu saliċiliku użat f’ċerti pajjiżi biex jiġu stabbilizzati l-inbejjed qabel l-analiżi jerġa’ jinsab fid-distillat. Huwa meħtieġ li tiġi kkalkolata d-doża tiegħu u jiġi mnaqqas mill-aċidità. Il-metodu tad-dożaġġ huwa mogħti fil-paragrafu 7 ta’ dan il-kapitolu.

3.   REAĠENTI

3.1.   Aċdu tartariku kristallizzat (C4H6O6)

3.2.   Soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (NaOH)

3.3.   Soluzzjoni ta’ phenolphthalein bi kwantità ta’ 1 f’kull 100 fl-alkoħol ta’ 96 % vol. newtrali

3.4.   Aċdu idrokloriku (ρ20 = 1,18 f’1,19 g/ml) dilwit 1/4 (v/v)

3.5.   Soluzzjoni 0,005 M ta’ jodju (I2)

3.6.   Potassium iodide kristallizzat (Kl)

3.7.   Lamtu likwidu bi kwantità ta’ 5 g/l:

Ħoll 5 g ta’ lamtu ġo madwar 500 ml ilma. Għallih waqt li tħawwad u ibqa’ għallih għal 10 minuti; żid 200 g ta’ sodium chloride. Wara li jiksaħ żidu sakemm jilħaq litru.

3.8.   Soluzzjoni saturata ta’ sodium sodium borate (Na2B4O7, 10 H2O), jiġifieri madwar 55 g/l f’20 °C.

4.   APPARAT

4.1.   Apparat għas-separazzjoni tal-partikoli bil-fwar tal-ilma magħmul minn:

1)	ġeneratur tal-fwar tal-ilma; il-fwar prodott għandu jkun ħieles minn carbon dioxide;

2)	tank mimli likwidu li jintuża biex jiġu newtralizzati jew fejn jinqabdu l-gassijiet (barbotur);

3)	kolonna ta’ rettifikazzjoni;

4)	likwidu refriġeranti.

Dan l-apparat għandu jissodisfa t-tliet testijiet li ġejjin:

a)	fil-barbotur poġġi 20 ml ilma mgħolli; iġbor 250 ml ta’ distillat u żidu b’0,1 ml ta’ soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (punt 3.2) u II qatriet tas-soluzzjoni ta’ phenolphthalein (punt 3.3); il-kulur roża għandu jkun stabbli għal mill-inqas 10 sekondi (fwar tal-ilma mingħajr carbon dioxide).

b)	Fil-barbotur poġġi 20 ml soluzzjoni 0,1 M ta’ aċdu aċetiku. Iġbor 250 ml ta’ distillat. Ittitra mas-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (punt 3.2). Il-volum imferra għandu jkun mill-inqas ugwali għal 19,9 ml. (Aċdu aċetiku isseparat bil-fwar ≥ 99,5 %).

c)	Fil-barbotur poġġi 20 ml ta’ soluzzjoni M ta’ aċdu lattiku. Iġbor 250 ml ta’ distillat u ttitra l-aċidità bis-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (punt 3.2).

Il-volum imferra għandu jkun inqas jew ugwali għal 1,0 ml (Aċdu lattiku distillat ≤ 0,5 %).

Kull apparat jew kull teknika li tissodisfa dawn it-testijiet jkun apparat jew teknika uffiċjali internazzjonali.

4.2.   Pompa tal-ilma taħt vakum.

4.3.   Fjaskett taħt vakum.

5.   PROĊEDURA

5.1.   Tħejjija tal-kampjun: tneħħija tal-carbon dioxide.

Poġġi madwar 50 ml inbid ġo fjaskett taħt vakum; ħawwad u fl-istess ħin oħloq il-vakum billi tuża l-pompa tal-ilma taħt vakum. Għandek tkompli tħawwad għal 1 sa 2 minuti.

5.2.   Separazzjoni tal-partikoli bil-fwar tal-ilma.

Poġġi 20 ml inbid li minnu tneħħa l-carbon dioxide kif indikat fil-punt 5.1 fil-barbotur. Żid madwar 0,5 g aċdu tartariku (punt 3.1). Iġbor mill-inqas 250 ml distillat.

5.3.   Titrazzjoni

Ittira permezz tas-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide (punt 3.2) fil-preżenza ta’ II qatriet ta’ soluzzjoni ta’ phenolphthalein (punt 3.3), ħalli n ml ikun il-volum imferra.

Żid IV qatriet aċdu idrokloriku dilwit 1/4 (3.4), 2 ml lamtu likwidu (punt 3.7) u xi kristalli ta’ potassium iodide (punt 3.6). Ittitra s-sulphur dioxide ħieles bis-soluzzjoni 0,005 M ta’ jodju (punt 3.5). Ħalli n′ ml ikun il-volum imferra.

Żid is-soluzzjoni saturata ta’ sodium borate (punt 3.8) sakemm jerġa’ jidher il-kulur roża. Ittitra s-sulphur dioxide mgħaqqad permezz tas-soluzzjoni 0,005 M ta’ jodju (punt 3.5). Ħalli n“ ml ikun il-volum imferra.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

6.1.   Metodu tal-kalkolu

L-aċidità volatili espressa f'milliekwivalenti għal kull litru b’post deċimali wieħed għandha tkun:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

L-aċidità volatili espressa fi grammi ta’ aċdu aċetiku għal kull litru b’2 postijiet deċimali għandha tkun:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

6.2.   Repetibbiltà (r)

r	=	0,7 me/l
r	=	0,04 g aċdu aċetiku/l.

6.3.   Riproduċibbiltà (R)

R	=	1,3 me/l
R	=	0,08 g aċdu aċetiku/l.

6.4.   Inbid li jkun miżjud bl-aċdu sorbiku

Peress li l-aċdu sorbiku jista’ jiġi sseparat bil-fwar tal-ilma sa 96 % għal volum ta’ distillat ta’ 250 ml, l-aċidità tiegħu għandha titnaqqas mill-aċidità volatili, bl-għarfien li 100 mg aċdu sorbiku jikkorrispondu għal aċidità ta’ 0,89 milliekwivalenti, jew ta’ 0,053 g aċdu aċetiku u bl-għarfien tal-kontenut ta’ aċdu sorbiku (mg/l) ikkalkolat b’metodi oħra.

7.   DOŻAĠĠ TAL-AĊDU SALIĊILIKU LI JINSAB FID-DISTILLAT TAL-AĊIDITÀ VOLATILI

7.1.   Prinċipju

Wara d-dożaġġ tal-aċidità volatili u l-korrezzjoni tas-sulphur dioxide, il-preżenza ta’ aċdu saliċiliku hija kkaratterizzata, wara l-aċidifikazzjoni, mill-kulur vjola li jidher wara li jiġi miżjud melħ tal-ħadid III.

Id-dożaġġ ta’ aċdu saliċiliku li jinsab fid-distillat bl-aċidità volatili jsir fuq distillat ieħor tal-istess volum bħal dak li fuqu sar id-dożaġġ tal-aċidità volatili. F’dan id-distillat, l-aċdu saliċiliku huwa kkalkolat b’metodu kolorimetriku ta’ tqabbil. Dan jiġi mnaqqas mill-aċidità tad-distillat tal-aċidità volatili.

7.2.   Reaġenti

7.2.1.   Aċdu idrokloriku (HCl) (ρ20 = 1,18 f’1,19 g/ml).

7.2.2.   Thiosulfate tas-sodju (Na2 S2 O3, 5 H2O) 0,1 M.

7.2.3.   Soluzzjoni ta’ iron sulphate III u ammonium sulphate [Fe2 (SO4)3, (NH4)2 SO4 × 24 H2O] f’10 p. 100 (m/v).

7.2.4.   Soluzzjoni ta’ sodium salicylate 0,01 M. Soluzzjoni li fiha 1,60 g/l ta’ sodium salicylate (Na C7 H5 O3).

7.3.   Proċedura

7.3.1.   Karatterizzazzjoni tal-aċdu saliċiliku fid-distillat tal-aċidità volatili.

Minnufih wara d-dożaġġ tal-aċidità volatili u l-korrezzjoni tas-sulphur dioxide ħieles u mgħaqqad, fil-fjaskett ta’ għamla konika żid 0,5 ml aċdu idrokloriku (punt 7.2.1), 3 ml tas-soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium thiosulphate (punt 7.2.2) u 1 ml tas-soluzzjoni ta’ iron sulphate III u ammonium sulphate (punt 7.2.3).

Fil-preżenza ta’ aċdu saliċiliku, jibda jidher kulur vjola.

7.3.2.   Dożaġġ tal-aċdu saliċiliku

Fuq il-fjaskett ta’ għamla konika ta’ qabel, indika b’marka ta’ referenza l-volum tad-distillat. Żvojta u laħlaħ il-fjaskett.

Agħmel separazzjoni bil-fwar tal-ilma ta’ kampjun ta’ analiżi ġdid ta’ 20 ml inbid u iġbor id-distillat ġo fjaskett ta’ għamla konika sal-marka ta’ referenza. Żid 0,3 ml aċdu idrokloriku pur (punt 7.2.1) u 1 ml tas-soluzzjoni ta’ iron sulphate III u ammonium sulphate (punt 7.2.3). Il-kontenut tal-fjaskett ta’ għamla konika jinbidel f’kulur vjola.

Ġo fjaskett ta’ għamla konika identiku bħal dak li għandu l-marka ta’ referenza, poġġi ilma distillat sal-istess livell bħal dak tad-distillat. Żid 0,3 ml aċdu idrokloriku pur (punt 7.2.1), 1 ml soluzzjoni ta’ iron sulphate III u ammonium sulphate (punt 7.2.3). Ferra s-soluzzjoni ta’ sodium salicylate 0,01 M (punt 7.2.4) fil-burette sakemm tikseb kulur vjola tal-istess intensità bħal dik tal-fjaskett ta’ għamla konika li fih id-distillat tal-inbid.

ħalli n′′′, tkun in-numru ta’ millilitri mferra.

7.4.   Korrezzjoni tal-aċidità volatili

Naqqas il-volum 0,1 × n′′′ mill-volum n ml ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide 0,1 M użata biex tiġi titrata l-aċidità tad-distillat waqt id-dożaġġ tal-aċidità volatili.

13   AĊDU ĊITRIKU (OIV-AS-313-09-ACIENZ) – METODU TIP II

1.   PRINĊIPJU TAL-METODU

L-aċdu ċitriku jinbidel f’oxaloacetate u acetate f’reazzjoni ikkatalizzata permezz ta’ citrate lyase (CL):

Citrate ←→ oxaloacetate + acetate

Fil-preżenza tal-malate dehydrogenase (MDH) u tal-lactate dehydrogenase (LDH), l-oxaloacetate u d-derivat tiegħu tat-tneħħija ta’ carbon dioxide, il-pyruvate, huma mnaqqsa f’L-malate u L-lactate bin-nicotinamide adenine dinucleotide mnaqqas (NADH):

Oxaloacetate + NADH + H+ ←→ L-malate + NAD+

Pyruvate + NADH + H+ ←→ L-lactate + NAD+

Il-kwantità ta’ NADH ossidat f’NAD+ f’dawn ir-reazzjonijiet huwa proporzjonali għas-citrate preżenti. L-ossidazzjoni tal-NADH hija mkejla permezz tat-tnaqqis tal-assorbiment tagħha fit-tul tal-mewġa 340 nm.

2.   REAĠENTI

2.1.   Buffer pH 7,8

(glycylglycine 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10–3M)

Ħoll 7,13 g glycylglycine f’madwar 70 ml d'ilma distillat darbtejn.

Aġġusta l-pH għal 7,8 b’madwar 13 ml soluzzjoni ta’ sodium hydroxide 5 M; żid 10 ml soluzzjoni ta’ zinc chloride ZnCl2, b’80 mg ġo 100 ml u żid sa 100 ml b’ilma distillat darbtejn.

Is-soluzzjoni tibqa’ stabbli għal mill-inqas 4 ġimgħat f’+ 4 °C.

2.2.   Soluzzjoni ta’ nicotinamide adenine dinucleotide mnaqqas (NADH), madwar 6.10–3 M, ħoll 30 mg NADH u 60 mg NaHCO3 ma’ 6 ml ilma distillat darbtejn.

2.3.   Soluzzjoni ta’ malate dehydrogenase/lactate dehydrogenase, (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

Agħmel taħlita ta’ 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ta’ soluzzjoni ta’ ammonium sulphate (3,2 M) u 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Din is-sospensjoni tibqa’ stabbli għal mill-inqas sena f’+ 4 °C.

2.4.   Citrate-lyase CL (5 mg ta’ proteina/ml). Ħoll 168 mg lyophilisate f’1 ml ilma kiesaħ silġ. Is-soluzzjoni tibqa stabbli għal mill-inqas ġimgħa f’+ 4 °C u għal mill-inqas 4 ġimgħat meta tiġi ffriżata.

Huwa rakkomandat li tipproċedi, qabel id-dożaġġ, għall-verifika tal-attività tal-enżima.

2.5.   Polyvinylpolypyrolidone (PVPP)

Rimarka: Ir-reaġenti kollha meħtieġa għal dan id-dożaġġ huma kummerċjalizzati.

3.   APPARAT

3.1.   Spettrofotometru li jippermetti li jsiru qisien f’340 nm, assorbiment massimu tal-NADH.

Jekk dan ma jkunx disponibbli, fotometru bi spettru mhux kontinwu li jippermetti li jsiru qisien f’334 nm jew f’365 nm. Rigward il-qisien assoluti ta’ assorbiment (mingħajr medda ta’ kalibrazzjoni, iżda referenza għall-koeffiċjent ta’ estinzjoni tal-NADH), l-iskali tat-tul tal-mewġa u tal-assorbimenti tal-apparat għandhom ikunu kkontrollati.

3.2.   Kontenituri tal-ħġieġ ta’ passaġġ ottiku ta’ 1 ċm jew kontenituri ta’ użu wieħed.

3.3.   Mikropipetti li jippermettu li jittieħdu volumi minn 0,02 sa 2 ml.

4.   TĦEJJIJA TAL-KAMPJUN

Id-dożaġġ tas-citrate isir ġeneralment direttament fuq l-inbid mingħajr ma jitneħħa l-kulur minn qabel u mingħajr dilwizzjoni, b’kundizzjoni li l-kontenut ta’ aċdu ċitriku ikun inqas minn 400 mg/l. Jekk le, agħmel dilwizzjoni tal-inbid b’mod li l-konċentrazzjoni tas-citrate tkun bejn 20 u 400 mg/l (kwantità ta’ citrate fil-kampjun tat-test inkluża bejn 5 μg u 80 μg).

Għall-inbid aħmar li huwa rikk f’komposti fenoliċi, huwa rakkomandat li tittrattah minn qabel permezz tal-PVPP:

Poġġi f’suspensjoni fl-ilma madwar 0,2 g ta’ PVPP, ħallih joqgħod għal 15-il minuta. Iffiltrah b’filtru mitwi.

Ma’ 10 ml inbid impoġġi ġo fjaskett ta’ għamla konika ta’ 50 ml, żid il-PVPP umdu li jkun ittieħed bl-ispatula minn fuq il-filtru. Ħawwad għal 2 sa 3 minuti. Iffiltra.

5.   PROĊEDURA

Bl-ispettrofotometru irregolat fuq it-tul tal-mewġa 340 nm, il-qisien tal-assorbiment isiru fil-kontenituri ta’ 1 ċm, l-assorbiment żero tkun irregolata b’paragun mal-arja (l-ebda kontenitur fuq il-passaġġ ottiku). Fil-kontenituri ta’ ħxuna ta’ 1 ċm, poġġi:

	Kampjun ta’ kontroll	Kampjun tad-dożaġġ
Soluzzjoni 2.1	1,00 ml	1,00 ml
Soluzzjoni 2.2	0,10 ml	0,10 ml
Kampjun	—	0,20 ml
Ilma distillat darbtejn	2,00 ml	1,80 ml
Soluzzjoni 2.3	0,02 ml	0,02 ml

Ħawwad, wara madwar 5 minuti, aqra l-assorbimenti tas-soluzzjonijiet ta’ kontroll u tad-dożaġġ (A1).

Żid:

Soluzzjoni 2.4

0,02 ml

0,02 ml

Ħawwad; stenna t-tmiem tar-reazzjoni (madwar 5 minuti) u aqra l-assorbimenti tas-soluzzjonijiet ta’ kontroll u tad-dożaġġ (A2).

Ikkalkola d-differenzi tal-assorbimenti (A1 – A2) tal-kampjun ta’ kontroll u tal-kampjun tad-dożaġġ.

Naqqas id-differenza tal-assorbimenti tal-kampjun ta’ kontroll mid-differenza tal-assorbimenti tal-kampjun tad-dożaġġ:

ΔA = ΔA D – ΔAT

Rimarka: Il-ħin meħtieġ biex jaġixxu l-enżimi jista’ jvarja minn lott għall-ieħor. Huwa mogħti hawn fuq biss bħala eżempju. Huwa rakkomandat li tikkalkolah għal kull lott.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Il-kontenut ta’ aċdu ċitriku huwa mogħti, f’milligrammi għal kull litru (mg/l) mingħajr deċimali.

6.1.   Metodu tal-kalkolu

Il-konċentrazzjoni f’milligrammi għal kull litru hija mogħtija permezz tal-formula ġenerali:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

V	=	volum tat-test f’millilitri (hawnhekk 3,14 ml)
v	=	volum tal-kampjun f’millilitri (hawnhekk 0,2 ml)
P.M	=	massa molekulari tas-sustanza li għaliha trid tiġi kkalkolata d-doża (hawnhekk, aċdu ċitriku anidruż = 192,1)
d	=	passaġġ ottiku tal-kontenitur f’ċentimetri (hawnhekk 1 ċm)
ε	=	koeffiċjent ta’ assorbiment tal-NADH; f’340 nm,
ε	=	6,3 mmole– 1 × l × ċm– 1.

Jinkiseb:

C = 479 × ΔA

Jekk tkun saret dilwizzjoni waqt it-tħejjija tal-kampjun, immultiplika r-riżultat bil-fattur tad-dilwizzjoni.

Rimarka: f’334 nm: C = 488 × Δ A (ε = 6,2 mmole– 1 × l × ċm– 1)

f’365 nm: C = 887 × Δ A (ε = 3,4 mmole– 1 × l × ċm– 1)

6.2.   Repetibbiltà (r)

Kontenut ta’ aċdu ċitriku inqas minn 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Kontenut ta’ aċdu ċitriku aktar minn 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3.   Riproduċibbiltà (R)

Kontenut ta’ aċdu ċitriku inqas minn 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Kontenut ta’ aċdu ċitriku aktar minn 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14   AĊDU SORBIKU (OIV-AS-313-14-ACISOR) – METODU TIP IV

1.   PRINĊIPJU TAL-METODI

1.1.   Metodu tad-dożaġġ permezz tal-ispettrofotometrija ta’ assorbiment fl-ultraviolet

Id-doża ta’ aċdu sorbiku (trans, trans, 2,4 - hexadienoic acid) estratt b’separazzjoni bil-fwar tal-ilma hija kkalkolata fid-distillat tal-inbid permezz tal-ispettrofotometrija ta’ assorbiment fil-ultraviolet. Is-sustanzi li jaffettwaw il-livell ta’ assorbiment fl-ultraviolet huma eliminati bl-evaporazzjoni fin-niexef tal-kampjun tat-test tad-distillat li huwa ftit alkalinizzat b’soluzzjoni ta’ calcium hydroxide. Il-kontenuti ta’ inqas minn 20 mg/l għandhom jiġu kkonfermati bil-karatterizzazzjoni permezz tal-kromatografija f’safef irqaq (sensittività: 1 mg/l).

1.2.   Metodu tad-dożaġġ permezz tal-kromatografija tal-gass

Id-doża ta’ aċdu sorbiku estratt fl-ethyl ether hija kkalkolata permezz tal-kromatografija fil-fażi tal-gass fil-preżenza ta’ standard intern.

1.3.   Metodu ta’ riċerka ta’ traċċi permezz tal-kromatografija f’saff irqiq

L-aċdu sorbiku estratt fl-ethyl ether huwa sseparat e permezz tal-kromatografija f’saff irqiq u l-konċentrazzjoni tiegħu hija evalwata semi-kwantitattivament.

2.   METODU TAL-DOŻAĠĠ PERMEZZ TAL-ISPETTROFOTOMETRIJA TA’ ASSORBIMENT FL-ULTRAVIOLET

2.1.   Reaġenti

2.1.1.   Aċdu tartariku, (C4H6O6) kristallizzat.

2.1.2.   Soluzzjoni ta’ calcium hydroxide, Ca (OH)2 madwar 0,02 M.

2.1.3.   Soluzzjoni ta’ referenza ta’ aċdu sorbiku b’20 mg f’kull litru.

Ħoll 20 mg aċdu sorbiku, C6H8O2 f’madwar 2 ml ta’ soluzzjoni 0,1 M ta’ sodium hydroxide. Ferra f’kunjett volumetriku ta’ 1 000 ml, imla sal-marka ta’ referenza bl-ilma. Tista’ wkoll tħoll 26,8 mg potassium sorbate, C6H7KO2 fl-ilma u żid sa 1 000 ml bl-ilma.

2.2.   Apparat

2.2.1.   Apparat għas-separazzjoni tal-partikoli bil-fwar tal-ilma (ara “Aċidità volatili”).

2.2.2.   Banju tal-ilma f’100 °C.

2.2.3.   Spettrofotometru li jippermetti qisien fit-tul tal-mewġa ta’ 256 nm b’kontenituri tal- kwartz quartz b’passaġġ ottiku ta’ 1 ċm.

2.3.   Proċedura

2.3.1.   Distillazzjoni

Poġġi 10 ml inbid ġol-barbotur tal-apparat ta’ separazzjoni bil-fwar tal-ilma, żid minn 1 sa 2 g aċdu tartariku (2.1.1). Iġbor 250 ml ta’ distillat.

2.3.2.   Tħejjija tal-kurvatura ta' kalibrazzjoni

Ipprepara permezz ta’ dilwizzjonijiet bl-ilma mis-soluzzjoni ta’ referenza (punt 2.1.3) erba’ soluzzjonijiet ta’ referenza dilwiti li jittitraw rispettivament 0,5 – 1 – 2,5 u 5 mg aċdu sorbiku għal kull litru; kejjel bl-ispettrofotometru l-assorbimenti rispettivi tagħhom f’256 nm meta mqabbla mal-ilma distillat. Fassal il-kurvatura tal-varjazzjonijiet tal-assorbiment skont il-konċentrazzjonijiet tas-soluzzjonijiet. Il-varjazzjoni hija lineari.

2.3.3.   Dożaġġ

F’kapsula ta’ dijametru ta’ 55 mm poġġi 5 ml ta’ distillat, żid 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ calcium hydroxide (punt 2.1.2). Evapora fin-niexef fuq banju tal-ilma jagħli.

Ittratta r-reżidwu bi ftit millilitri ta’ ilma distillat, poġġih kwantitattivament f’kunjett volumetriku ta’ 20 ml u żid sal-marka ta’ referenza bl-ilma tat-tlaħliħ. Kejjel l-assorbiment f’256 nm bl-ispettrofotometru bi tqabbil ma’ soluzzjoni ta’ kontroll miksuba b’dilwizzjoni sa 20 ml bl-ilma ta’ 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ calcium hydroxide (punt 2.1.2).

Niżżel il-valur tal-assorbiment imkejjel fuq in-naħa tal-lemin tal-kalibrazzjoni, naqqas il-konċentrazzjoni C tas-soluzzjoni f’aċdu sorbiku.

Rimarka: Fil-prattika ġenerali, din l-evaporazzjoni fin-niexef tista’ ma titqiesx. Agħmel direttament il-kejl tal-assorbiment fuq id-distillat dilwit sa ¼ meta mqabbel mal-ilma distillat.

2.4.   Espressjoni tar-riżultati

2.4.1.   Metodu tal-kalkolu

Il-konċentrazzjoni f’aċdu sorbiku tal-inbid espressa f’milligrammi għal kull litru hija ugwali għal:

100 × C

C = konċentrazzjoni f’aċdu sorbiku tas-soluzzjoni analizzata permezz tal-ispettrofotometrija, espressa f’milligrammi għal kull litru.

3.   METODU TAL-DOŻAĠĠ PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA FIL-FAŻI TAL-GASS

3.1.   Reaġenti

3.1.1.   Ethyl ether, (C2H5)2O distillat fil-ħin tal-użu.

3.1.2.   Soluzzjoni tal-istandard intern: soluzzjoni ta’ undecanoic acid, C11H22O2 fl-etanol b’95 għal kull 100 (vol.) b’konċentrazzjoni ta’ 1 g għal kull litru.

3.1.3.   Soluzzjoni akwea ta’ sulphuric acid, H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml) dilwita 1/3 (v/v).

3.2.   Apparat

3.2.1.   Kromatografu fil-fażi ta’ gass mgħammar bi strument ta’ detezzjoni bil-jonizzazzjoni tal-fjamma u b’kolonna tal-istainless steel (4 m × ta’ pulzier) ittrattata minn qabel bid-dimethyldichlorosilane u ppakkjata fil-fażi wieqfa, magħmula minn taħlita ta’ diethylene glycol succinate (5 %) u aċdu fosforiku (1 %) (DEGS- H3 PO4) jew minn taħlita ta’ diethylene glycol adipate (7 %) u aċdu fosforiku (1 %) (DEGA — H3 PO4) stabbilizzata fuq malja tal-Gaschrom Q 80 — 100.

Għat-trattament bid-dimethyldichlorosilane (DMDCS), għaddi mill-kolonna soluzzjoni b’konċentrazzjoni ta’ 2 sa 3 g ta’ DMDCS fit-toluene. Aħsel minnufih il-kolonna bil-metanol; għaddi kurrent ta’ nitroġenu, imbagħad ta’ hexane u wara dan kurrent ieħor ta’ nitroġenu. Imbagħad imliha.

Kundizzjonijiet tal-operazzjoni:

Temperatura tal-forn: 175 °C.

Temperatura tal-injettur u tal-istrument ta’ detezzjoni: 230 °C.

Gass vettur: nitroġenu (fluss 20 ml/min.).

3.2.2.   Mikrosiringa ta’ 10 mikrolitri ta’ kapaċità kkalibrata b’0,1 mikrolitru.

Rimarka: Tipi oħra ta’ kolonni jistgħu wkoll jippermettu separazzjoni tajba, b’mod partikolari l-kolonna kapillari (pereżempju, FFAP).

Il-proċedura deskritta hawn taħt hija mogħtija bħala eżempju.

3.3.   Proċedura

3.3.1.   Tħejjija tal-kampjun li għandu jiġi analizzat

F’tubu tal-ħġieġ ta’ kapaċità ta’ madwar 40 ml u b’tapp tal-ħġieġ matt ferra 20 ml inbid, żid 2 ml soluzzjoni tal-istandard intern ( punt 3.1.2) u 1 ml ta’ soluzzjoni dilwita ta’ sulphuric acid (punt 3.1.3).

Wara li tħawwad billi taqleb ta’ taħt fuq ħafna drabi wara xulxin, żid mal-kontenut tat-tubu 10 ml ethyl ether (punt 3.1.1). Oħroġ l-aċdu sorbiku fil-fażi organika billi tħawwad it-tubu matul 5 minuti. Ħallih joqgħod.

3.3.2.   Tħejjija tas-soluzzjoni ta’ referenza

Agħżel inbid li l-kromatogramma tal-estratt bl-etere tiegħu juri l-ebda quċċata li tikkorrispondi mal-eluzzjoni tal-aċdu sorbiku; f’dan l-inbid itfa’ kwantità kbira ta’ aċdu sorbiku bil-konċentrazzjoni ta’ 100 mg għal kull litru. Ittratta 20 ml tal-kampjun imħejji b’dan il-mod skont il-proċedura deskritta fil-punt 3.3.1.

3.3.3.   Kromatografija

Injetta wara xulxin fil-kromatografu permezz ta’ mikrosiringa 2 μl tal-fażi tal-estratt tal-etere miksub kif indikat fil-punt 3.3.2 u 2 μl tal-fażi tal-estratt tal-etere miksub kif indikat fil-punt 3.3.1.

Irrekordja l-kromatogrammi rispettivi; ivverifika l-identità tal-ħinijiet ta’ retenzjoni rispettivi tal-aċdu sorbiku u tal-standard intern. Kejjel l-għoli (jew il-wiċċ) ta’ kull quċċata rrekordjata.

3.4.   Espressjoni tar-riżultati

3.4.1.   Metodu tal-kalkolu

Il-konċentrazzjoni f’aċdu sorbiku tal-inbid analizzat, espressa f’milligrammi għal kull litru, hija ugwali għal:

100 × (h/H) × (l/i)

H= għoli tal-quċċata tal-aċdu sorbiku fis-soluzzjoni ta’ referenza

h= għoli tal-quċċata tal-aċdu sorbiku fil-kampjun li għandu jiġi analizzat

l= għoli tal-quċċata tal-standard intern fis-soluzzjoni ta’ referenza

i= għoli tal-quċċata tal-standard intern fil-kampjun li għandu jiġi analizzat

Rimarka: Il-konċentrazzjoni f’aċdu sorbiku tista’ tiġi kkalkolata bl-istess mod minn qisien tal-uċuħ tal-quċċati ripettivi.

15   PH (OIV-AS-313-15-PH) – METODU TIP I

1.   PRINĊIPJU

Kejl tad-differenza fil-potenzjal bejn żewġ elettrodi mgħaddsa fil-likwidu li jkun qiegħed jiġi studjat. Wieħed minn dawn elettrodi għandu potenzjal li huwa funzjoni stabbilita tal-pH tal-likwidu, l-ieħor għandu potenzjal fiss u magħruf u jikkostitwixxi l-elettrodu ta’ referenza.

2.   APPAREILS

2.1.   Miter tal-pH bi skala kalibrata f'unitajiet ta’ pH li jipperemtti li jsiru qisien sa mill-inqas 0,05 unità.

2.2.   Elettrodi:

2.2.1.   Elettrodu tal-ħġieġ, li għandu jinżamm fl-ilma distillat.

2.2.2.   Elettrodu ta’ referenza bil-calomel-potassium chloride saturat, li għandu jinżamm f’soluzzjoni saturata ta’ potassium chloride.

2.2.3.   Jew elettrodu mgħaqqad li għandu jinżamm fl-ilma distillat.

3.   REAĠENTI

3.1.   Soluzzjonijiet buffer:

3.1.1.   Soluzzjoni saturata ta’ potassium acid tartrate. Soluzzjoni li fiha mill-inqas 5,7 g/l ta’ potassium acid tartrate (C4H5KO6), f’20 °C. Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm għal xahrejn fil-preżenza ta’ 0,1 g thymol għal 200 ml.

pH	3,57 f’20 °C 3,56 f’25 °C 3,55 f’30 °C

3.1.2.   Soluzzjoni 0,05 M ta’ potassium acid phthalate. Soluzzjoni li fiha 10,211 g/l potassium acid phthalate (C8H5KO4), f’20 °C. (Żmien massimu li tista’ tinżamm: xahrejn).

pH	3,999 f’15 °C 4,003 f’20 °C 4,008 f’25 °C 4,015 à 30 °C

3.1.3.   Soluzzjoni li fiha:

Monopotassium phosphate, KH2 PO4 …	3,402 g
Dipotassium phosphate, K2 H PO4 …	4,354 g
Ilma sa…	1 l

(Żmien massimu li tista’ tinżamm: xahrejn)

pH	6,90 f’15 °C 6,88 f’20 °C 6,86 f’25 °C 6,85 à 30 °C

Rimarka: Is-soluzzjonijiet buffer ta’ referenza fil-kummerċ jistgħu jintużaw ukoll.

4.   PROĊEDURA

4.1.   Tħejjija tal-kampjun li għandu jiġi analizzat

4.1.1.   Għall-mosti u għall-inbid

Aħdem direttament fuq il-most jew l-inbid.

4.1.2.   Għall-mosti konċentrati rettifikati

Żid il-most konċentrat rettifikat bl-ilma biex tikseb konċentrazzjoni ta’ 25 ± 0,5 għal total ta’ 100 (m/m) ta’ zokkor (25 o Brix).

Jekk P hija l-kontenut għal total ta’ 100 (m/m) ta’ zokkor fil-most konċentrat rettifikat, iżen massa ugwali għal 2 500/P

u żid sa 100 g bl-ilma. L-ilma użat għandu jkollu konduttività aktar baxxa minn 2 microsiemens għal kull ċentimetru.

4.2.   Tpoġġija tal-apparat fuq żero

It-tpoġġija fuq żero għandha ssir qabel kull kejl, billi ssegwi l-indikazzjonijiet mogħtija għall-apparat li qiegħed jintuża.

4.3.   Kalibrazzjoni tal-miter pH

Il-kalibrazzjoni ssir f’20 °C billi ssegwi l-indikazzjonijiet mogħtija għall-apparat li qiegħed jintuża mas-soluzzjonijiet buffer ta’ pH 6,88 u 3,57 f’20 °C.

Uża s-soluzzjoni buffer ta’ pH 4,00 f’20 °C biex tikkontrolla l-kalibrazzjoni tal-iskala.

4.4.   Kejl

Għaddas l-elettrodu fil-kampjun analizzat li t-temperatura tiegħu għandha tkun bejn 20 u 25 °C u kemm jista’ jkun qrib lejn 20 °C. Aqra direttament fuq l-iskala l-valur tal-pH.

Agħmel mill-inqas żewġ kalkoli fuq l-istess kampjun.

Bħala riżultat ħu l-medja aritmetika tal-kalkoli.

5.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Il-pH tal-most, tal-inbid jew tas-soluzzjoni bi 25 għal kull 100 (m/m) (25 °Brix) tal-most konċentrat rettifikat huwa espress b’żewġ postijiet deċimali.

16   DOŻAĠĠ SIMULTANJU TAL-ASCORBIC ACID I TAD-D-ISO-ASCORBIC ACID PERMEZZ TA’ HPLC U DETEZZJONI UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) – METODU TIP II

1.   INTRODUZZJONI

L-ascorbic acid huwa antiossidant naturalment preżenti f’lista twila ta’ oġġetti tal-ikel. Il-kwantità normali ta’ ascorbic acid fl-għeneb tonqos meta jiġu elaborati l-mosti u matul il-vinifikazzjoni. Jista’ jiġi miżjud mal-mosti u mal-inbejjed sa ċerti limiti.

Il-metodu deskritt ġie vvalidat fil-qafas ta’ testijiet interlaboratorji, minn analiżi ta’ kampjuni ta’ inbid bi kwantitajiet miżjuda ta’ L-ascorbic acid u d'D-iso-ascorbic-acid rispettivament ta’ 30 mg/l sa 150 mg/l u ta’ 10 mg/l sa 100 mg/l.

2.   QASAM TA’ APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu huwa appropjat għad-dożaġġ simultanju tal-ascorbic acid u tad-D-iso-ascorbic acid (erythorbic acid) fl-inbid permezz tal-kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja u detezzjoni UV f’medda minn 3 sa 150 mg/l.

Għall-kontenuti ta’ aktar minn 150 mg/l, huwa meħtieġ li l-kampjun jiġi dilwit.

3.   PRINĊIPJU

Il-kampjuni huma direttament injettati fis-sistema HLPC wara filtrazzjoni fuq membrana. L-analiti huma sseparati fuq kolonna fil-fażi invertita u jiġu sottomessi għal detezzjoni UV f’266 nm. Il-kwantifikazzjoni tal-ascorbic acid u tad-D-iso-ascorbic-acid issir bi tqabbil ma’ standard estern.

Rimarka: Il-kolonni u l-kundizzjonijiet ta’ funzjonament huma mogħtija bħala eżempju. Tipi oħra ta’ kolonni jistgħu wkoll jiżguraw separazzjoni tajba.

4.   REAĠENTI U PRODOTTI

4.1.   Reaġenti

4.1.1.   n-octylamine, purità ≥ 99,0 %

4.1.2.   Sodium acetate × 3 H2O, purità ≥ 99,0 %

4.1.3.   Aċdu aċetiku pur, 100 %

4.1.4.   Aċdu fosforiku, ta’ madwar 25 %

4.1.5.   Oxalic acid, purità ≥ 99,0 %

4.1.6.   Ascorbate oxydase

4.1.7.   L-ascorbic acid, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8.   D-iso-ascorbic-acid, purità ≥ 99,0 %

4.1.9.   Ilma distillat darbtejn

4.1.10.   Metanol, p.A. 99,8 %

4.2.   Tħejjija tal-fażi mobbli

4.2.1.   Soluzzjonijiet għall-fażi mobbli

Ħejji s-soluzzjonijiet li ġejjin għall-fażi mobbli:

4.2.1.1.   12,93 g n-octylamine f’100 ml metanol

4.2.1.2.   68,05 g sodium acetate x 3 H2O f’500 ml ilma distillat darbtejn

4.2.1.3.   12,01 g aċdu aċetiku pur f’200 ml ilma distillat darbtejn

4.2.1.4.   Soluzzjoni buffer (pH 5,4): 430 ml soluzzjoni ta’ sodium acetate (4.2.1.2) u 70 ml soluzzjoni ta’ aċdu aċetiku (4.2.1.3)

4.2.2.   Tħejjija tal-fażi mobbli

Żid 5 ml soluzzjoni ta’ n-octylamine (4.2.1.1) f’madwar 400 ml ilma distillat darbtejn f’beaker. Aġġusta din is-soluzzjoni fuq pH ta’ 5,4 sa 5,6, billi żżid aċdu fosforiku ta’ 25 % (4.1.4.) qatra qatra. Żid 50 ml tas-soluzzjoni buffer (4.2.1.4) u ttrasferixxi l-kompost f’kunjett volumetriku ta’ 1 000 ml, imbagħad żidu bl-ilma distillat darbtejn. Qabel l-użu, il-fażi mobbli għandha tiġi ffiltrata b’membrana (ċelluloża riġenerata ta’ 0,2 μm) u jekk possibbli ttrattata bil-gass tal-elju (għal madwar 10 minuti) skont il-ħtiġijiet tas-sistema HLPC li qiegħda tintuża.

4.3.   Tħejjija tas-soluzzjoni standard

Rimarka:

Is-soluzzjonijiet standard kollha (soluzzjoni ewlenija 4.3.1. u soluzzjonijiet ta’ ħidma 4.3.2) għandhom jiġu mħejja kuljum u preferibbilment miżmuma ġo friġġ qabel l-injezzjoni.

4.3.1.   Tħejjija tas-soluzzjoni ewlenija (1 mg/ml)

Ipprepara soluzzjoni akwea ta’ oxalic acid ta’ 2 % u neħħi l-ossiġenu li jinsab maħlul fiha billi tgħaddiha min-nitroġenu.

Iżen eżattament 100 mg L-ascorbic acid u 100 mg D-iso-ascorbic-acid f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml, u imlih b’soluzzjoni akwea ta’ oxalic acid ta’ 2 %.

4.3.2.   Tħejjija tas-soluzzjonijiet ta’ ħidma

Għas-soluzzjonijiet ta’ ħidma, żid is-soluzzjoni ewlenija (4.3.1) sal-konċentrazzjonijiet mextieqa bis-soluzzjoni ta’ 2 % oxalic acid. Huma rakkomandati konċentrazzjonijiet ta’ bejn 10 mg/L u 120 mg/L. Pereżempju 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl 1 200 μl f’10 ml, li jikkorrispondu għal 10, 20, 40, 80 u 120 mg/l.

5.   APPARAT

Apparat tas-soltu tal-laboratorju, b’mod partikolari it-tagħmir li ġej:

5.1.   Pompa HLPC

5.2.   Injettur loop ta’ 20 μl

5.3.   Strument għad-detezzjoni tal-UV

6.   KAMPJUNAR

Xi kampjuni tal-inbid jiġu ffiltrati fuq membrana ta’ dijametru tal-pori ta’ 0,2 μm qabel l-injezzjoni.

Għall-kontenuti ta’ aktar minn 150 mg/L, huwa meħtieġ li l-kampjun jiġi dilwit.

7.   PROĊEDURA

7.1.   Kundizzjonijiet ta’ użu tas-sistema HLPC

Injetta fl-apparat kromatografiku 20 μl tal-kampjun iffiltrat fuq membrana.

Prekolonna	:	pereżempju Nucleosil 120 C18 (4 ċm × 4 mm × 7 μm)
Kolonna	:	pereżempju Nucleosil 120 C18 (25 ċm × 4 mm × 7 μm)
Volum ta’ injezzjoni	:	20 μl
Fażi mobbli	:	ara 4.22, isocratic
Fluss	:	1 ml/min
Detezzjoni UV	:	266 nm
Ċiklu ta’ tlaħliħ	:	mill-inqas 30 ml ilma distillat darbtejn u warahj 30 ml metanol u 30 ml acetonitrile

7.2.   Identifikazzjoni/Konferma

L-identifikazzjoni tal-quċċati ssir permezz tat-tqabbil tal-ħinijiet ta’ retenzjoni tal-istandards u tal-kampjuni. Bis-sistema kromatografika deskritta bħala eżempju, il-ħinijiet ta’ retenzjoni huma rispettivament 7,7 min għal-L-ascorbic acid u 8,3 min għad-D-iso-ascorbic-acid (ara d-Dijagramma 1, kromatogramma A).

Biex tikkonferma r-riżultati pożittivi, dawn il-kampjuni għandhom jiġu trattati bi spatula ta’ ascorbate oxydase u mkejla mill-ġdid (ara d-Dijagramma 1, kromatogramma B).

Minħabba d-degradazzjoni tal-ascorbic acid u tadD-iso-ascorbic-acid ipprovokata mill-ascorbate oxydase, l-ebda forma ta’ mewġa m’għandha tinsab fil-ħin ta’ retenzjoni tal-ascorbic acid u tad-D-iso-ascorbic-acid. Fil-każ ta’ detezzjoni ta’ quċċati parassiti, il-wiċċ tagħhom għandu jiġi kkunsidrat fil-kalkolu tal-konċentrazzjoni tal-analiti.

Rimarka: Huwa rakkomandat li jiġu analizzati l-kampjuni ttrattati bl-ascorbate oxydase fit-tmiem ta’ sekwenza segwita b’ċiklu ta’ tlaħliħ biex jitneħħew il-fdalijiet ta’ ascorbate oxydase tal-kolonna, għax jekk ma jsirx dan l-L-ascorbic acid u d-D-iso-ascorbic-acid jistgħu jinbiddlu mill-fdalijiet ta’ ascorbate oxydase waqt il-kejl HPLC u dan jista’ jaffettwa r-riżultat.

8.   KALKOLI

Ipprepara kurvatura ta’ kalibrazzjoni mis-soluzzjonijiet ta’ ħidma (4.3.2). Skont il-metodu tal-istandard estern, il-kwantifikazzjoni tal-ascorbic acid u tad-D-iso-ascorbic-acid titwettaq billi jiġu mkejla l-uċuħ tal-quċċati u jiġu mqabbla mal-konċentrazzjoni li tikkorrispondi fuq il-kurvatura ta’ kalibrazzjoni.

Espressjoni tar-riżultati

Ir-riżultati huma espressi b’post deċiżmali wieħed f’mg/L ta’ l-ascorbic acid u ta’ D-iso-ascorbic-acid rispettivament (pereżempju 51,3 mg/L).

Għal kontenuti ta’ aktar minn 150 mg/L, ikkunsidra d-dilwizzjoni.

9.   AFFIDABBILTÀ

Il-metodu ġie ttestjat fil-qafas ta’ test interlaboratorju organizzat fl-1994 mill-ex Uffiċċju Federali tal-Iġjene Pubblika (Bundesgesundheitsamt, il-Ġermanja), li fih ħadu sehem 27 laboratorju. Il-programm tat-test interlaboratorju segwa l-§ 35 tal-liġi Ġermaniża dwar l-oġġetti tal-ikel, li ġiet aċċettata mill-O.I.V sal-introduzzjoni tal-protokoll l-ġdid (OENO 6/2000).

L-istudju ġie mwettaq fuq erba’ kampjuni differenti ta’ inbid - żewġ inbejjed bojod u żewġ inbejjed ħomor – b’ħames repetizzjonijiet ta’ kull kampjun miltuba. Billi ma kienx possibbli li jiġu mħejja kampjuni b’stabbiltà biżżejjed tal-anliti (veloċitajiet ta’ degradazzjoni differenti), ġie deċiż li jintbagħtu lill-parteċipanti kwantitajiet fissi ta’ sustanzi standard puri kif ukoll il-kampjuni tal-inbid. Il-laboratorji rċevew l-istruzzjoni li jittrasferixxu l-istandards kwantitattivament fil-kampjuni tal-inbid u janalizzawhom minnufih. Volumi minn 30 sa 150 mg/L għal-L-ascorbic acid u minn 10 sa 100 mg/L għad-D-iso-ascorbic-acid ġew analizzati. Ir-riżultati dettaljati tal-istudju huma ppreżentati fl-ANNESS ippubblikat mill-OIV. L-evalwazzjoni ġiet imwettqa skont DIN/ISO 5725 (verżjoni 1988).

Id-differenzi standard ta’ repetibbiltà (sr) u ta’ riproduċibbiltà (sR) kienu jikkorrispondu mal-konċentrazzjonijiet ta’ L-ascorbic acids u ta’ D-iso-ascorbic-acid. Il-parametru ta’ preċiżjoni reali jista’ jiġi kkalkolat permezz tal-ekwazzjonijiet li ġejjin:

L-ascorbic acid sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: konċentrazzjoni ta’ L-ascorbic acid (mg/l)

D-iso-ascorbic-acid sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: konċentrazzjoni ta’ D-iso-ascorbic-acid (mg/l)

Eżempju:

50 mg/l d'D-iso-ascorbic-acid sr = 1,0 mg/l

sR = 5,2 mg/L

10.   KARATTERISTIĊI OĦRA TAL-ANALIŻI

10.1.   Limitu ta’ detezzjoni

Il-limitu ta’ detezzjoni ta’ dan il-metodu ġie stmat għal 3 mg/L għal-L-ascorbic acid u d-D-iso-ascorbic-acid.

10.2.   Preċiżjoni

L-irkupru medju kkalkolat mit-test interlaboratorju mwettaq fuq erba’ kampjuni (ara l-ANNESS ippubblikat fil-Kompendju tal-OIV) kien:

—	100,6 % għal-L-ascorbic acid

—	103,3 % għad-D-iso-ascorbic-acid

17   CARBON DIOXIDE (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – METODU TIP II

1.   PRINĊIPJU TAL-METODU

1.1.   Għall-inbejjed mingħajr gass (pressjoni żejda ta’ CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)  (2)

Il-volum ta’ inbid meħud mill-kampjun li jitniżżel sa qrib iż-0 °C jiġi mferra’ f’eċċess suffiċjenti ta’ soluzzjoni ttitrata ta’ sodium hydroxide biex jintlaħaq pH ta’ 10-11. It-titrazzjoni ssir b’soluzzjoni aċida fil-preżenza ta’ carbonic anhydrase. Il-kontenut ta’ carbon dioxide jiġi mnaqqas mill-volum imferra biex il-pH jinbidel minn 8,6 (forma acid carbonate) sa 4,0 (carbonic acid). Titrazzjoni ta’ kontroll imwettqa fl-istess kundizzjonijiet fuq l-inbid migħajr il-carbon dioxide tippermetti li jiġi kkunsidrat il-volum ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide kkunsmat mill-aċidi tal-inbid.

1.2.   Għall-inbejjed effervexxenti u l-inbejjed spumanti

Il-kampjun ta’ inbid li għandu jiġi analizzat jitniżżel sa qrib il-punt tal-iffriżar tiegħu. Wara li jittieħed ċertu volum li għandu jintuża bħala kontroll wara t-tneħħija tal-carbon dioxide, il-bqija tal-flixkun jiġi alkalinizzat biex jiġi stabbilizzat is-CO2 kollu taħt il-forma ta’ Na2CO3. It-titrazzjoni ssir b’soluzzjoni aċida fil-preżenza ta’ carbonic anhydrase. Il-kontenut ta’ carbon dioxide jiġi mnaqqas mill-volum ta’ soluzzjoni aċida imferra biex il-pH jinbidel minn 8,6 (forma acid carbonate) sa pH 4,0 (carbonic acid). Titrazzjoni ta’ kontroll imwettqa fl-istess kundizzjonijiet fuq l-inbid migħajr il-carbon dioxide tippermetti li jiġi kkunsidrat il-volum ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide kkunsmat mill-aċidi tal-inbid.

2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU

2.1.   Għall-inbejjed mingħajr gass (pressjoni żejda ta’ carbon dioxide ≤ 0,5 × 105 Pa).

2.1.1.   Apparat

2.1.1.1.   Ħawwad manjetiku.

2.1.1.2.   Miter tal-pH.

2.1.2.   Reaġenti

2.1.2.1.   Soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (NaOH), 0,1 M.

2.1.2.2.   Soluzzjoni ta’ sulphuric acid (H2SO4), 0,05 M.

2.1.2.3.   Soluzzjoni ta’ carbonic anhydrase bi gramma għal kull litru.

2.1.3.   Proċedura

Kessaħ il-kampjun tal-inbid sa madwar 0 °C kif ukoll il-pipetta ta’ 10 ml li ser tintuża biex jittieħed il-kampjun.

Poġġi f’kontenitur ta’ għamla ċilindrika ta’ 100 ml, 25 ml soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (punt 2.1.2.1); żid 2 qatriet ta’ soluzzjoni akwea ta’ carbonic anhydrase (punt 2.1.2.3). Ġo din poġġi 10 ml inbid bil-pipetta mkessħa sa 0 °C.

Poġġi l-kontenitur ċilindriku fuq il-ħawwad manjetiku, poġġi l-elettrodu u l-virga manjetiku f’posthom u ħawwad b’mod moderat.

Meta l-likwidu jerġa’ lura għat-temperatura tal-kamra, ferra bil-mod is-soluzzjoni ta’ sulphuric acid (punt 2.1.2.2) sal-pH 8,6.

Kompli ferra s-sulphuric acid (punt 2.1.2.2) sal-pH 4,0. Ħalli n ml ikun il-volum użat bejn il-pH 8,6 u 4,0.

Barra minn hekk ipproċedi għat-tneħħija tas-CO2 fuq madwar 50 ml tal-kampjun tal-inbid billi tħawwad taħt vakum għal 3 minuti, billi ssaħħan il-fjaskett f’banju tal-ilma f’madwar 25 °C.

Applika l-proċedura ta’ hawn fuq għal 10 ml ta’ inbid mingħajr carbon dioxide: ħalli n′ ml ikun il-volum użat.

2.1.4.   Espressjoni tar-riżultati

1 ml soluzzjoni titrata ta’ sulphuric acid 0,1 M jikkorrispondi għal 4,4 mg CO2.

Il-kwantità ta’ CO2 fi grammi għal kull litru ta’ inbid hija mogħtija bi

0,44 (n – n′)

Din tiġi espressa b’żewġ postijiet deċimali.

Rimarka: Għall-inbejjed li ma jkollhomx ħafna CO2 (CO2 < 1 g/l), iż-żieda ta’ carbonic anhydrase biex tikkatalizza l-idrazzjoni tas-CO2 mhijiex meħtieġa.

2.2.   Għall-inbejjed effervexxenti u l-inbejjed spumanti

2.2.1.   Apparat

2.2.1.1.   Ħawwad manjetiku.

2.2.1.2.   Miter tal-pH.

2.2.2.   Reaġenti

2.2.2.1.   Soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (NaOH), bi 50 għal kull 100 (m/m).

2.2.2.2.   Soluzzjoni ta’ sulphuric acid (H2SO4), 0,05 M.

2.2.2.3.   Soluzzjoni ta’ carbonic anhydrase bi gramma għal kull litru.

2.2.3.   Proċedura

Fuq il-flixkun tal-inbid li għandu jiġi analizzat, agħmel marka ta’ referenza fuq il-post fejn jilħaq il-likwidu u kessaħ sakemm jibda’ jibbies.

Ħalli l-flixkun jisħon ftit, filwaqt li tħawwdu, sakemm jisparixxu l-kristalli tas-silġ.

Iftaħ il-fluxkun malajr u ġo tubu tat-testijiet ikkalibrat, poġġi 45 sa 50 ml inbid li ser jintuża għad-dożaġġ ta’ kontroll. Il-volum estratt minn dan it-teħid ta’ kampjun, v ml, jiġi kkalkolat bil-qari fuq it-tubu tat-testijiet wara li jerġa’ lura għat-temperatura ambjentali tiegħu.

Żid, minnufih wara li jittieħed il-kampjun, 20 ml soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (punt 2.2.2.1) ġo flixkun ta’ kapaċità ta’ 750 ml.

Stenna sakemm l-inbid jerġa’ lura għat-temperatura ambjentali tiegħu.

Ġo kontenitur ċilindriku ta’ 100 ml poġġi 30 ml ilma distillat mgħolli u 2 qatriet tas-soluzzjoni ta’ carbonic anhydrase ( punt 2.2.2.3). Ġo dan żid 10 ml inbid alkalinizzat.

Poġġi l-kontenitur fuq il-mixer manjetiku, poġġi l-elettrodu u l-virga manjetiku f’posthom u ħawwad b’mod moderat.

Ferra bil-mod is-soluzzjoni ta’ sulphuric acid (punt 2.2.2.2) sal-pH 8,6.

Kompli ferra s-sulphuric acid (punt 2.2.2.2) sal-pH 4,0. Ħalli n ml ikun il-volum użat bejn il-pH 8,6 u 4,0.

Barra minn hekk ipproċedi għat-tneħħija tas-CO2 fil-v ml ta’ inbid, li nżamm għad-dożaġġ ta’ kontroll, billi tħawwad taħt vakum għal 3 minuti, billi ssaħħan il-fjaskett f’banju tal-ilma f’madwar 25 °C. Poġġi 10 ml inbid mingħajr carbon dioxide f’30 ml ilma distillat mogħlli, żid 2 sa 3 qatriet ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (punt 2.2.2.1) biex il-pH jilħaq 10-11. Imbagħad applika l-proċedura ta’ hawn fuq. Ħalli n′ ml, ikun il-volum ta’ sulphuric acid 0,05 M imferra.

2.2.4.   Espressjoni tar-riżultati

1 ml soluzzjoni ta’ sulphuric acid 0,05 M jikkorrispondi għal 4,4 mg ta’ CO2.

Żvojta l-flixkun mill-inbid alkalinizzat u kkalkola b’eżatezza ta’ madwar 1 ml il-volum inizjali tal-inbid billi terġa’ timliħ bl-ilma sal-marka ta’ referenza, ħalli dan ikun V ml.

Il-kwantità ta’ CO2 fi grammi għal kull litru ta’ inbid hija mogħtija kif ġej:

0,44(n – n′) × ((V – v + 20)/(V – v))

Din hija espressa b’żewġ postijiet deċimali.

2.3.   Kalkolu tal-pressjoni żejda teoretika

Il-pressjoni żejda f’20 °C, Paph20, espressa f’pascals, hija mogħtija bil-formula:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

fejn:

Q	:	teneur en grammes de CO2 par litre de vin
A	:	qawwa alkoħolika tal-inbid f’20 °C
S	:	kontenut ta’ zokkor tal-inbid fi grammi għal kull litru
Patm	:	pressjoni atmosferika, espressa f’pascals

18   DOŻAĠĠ TAL-CARBON DIOXIDE FL-INBID PERMEZZ TAL-METODU MANOMETRIKU (OIV-AS314-04-CO2MAN) – METODU TIP II

(p.m.)

[Id-deskrizzjoni ta’ dan il-metodu ta’ analiżi qiegħda tiġi aġġornata mill-korpi tal-OIV. Din sejra tiġi ppubblikata f’Komunikazzjoni futura tal-Kummissjoni malli test aġġornat jiġi ppubblikat mill-OIV fl-edizzjoni 2010 tal-Kompendju tal-Metodi Internazzjonali ta’ Analiżi tal-OIV]

19   KEJL TAL-PRESSJONI ŻEJDA TAL-INBEJJED SPUMANTI U EFFERVEXXENTI (OIV-AS-314-02-SURPRES) – METODU TIP I

1.   PRINĊIPJU

Wara li tistabbilizza ruħha t-temperatura u jitħawwad il-flixkun, il-pressjoni żejda titkejjel bl-użu ta’ afrometru (gejġ tal-pressjoni). Hija espressa f’Pascals (Pa) (metodu tat-tip I). Il-metodu japplika wkoll għall-inbejjed spumanti bil-gass miżjud u għal dawk effervexxenti bil-gass miżjud.

2.   APPARAT

L-apparat li jkejjel il-pressjoni żejda fil-fliexken tal-inbejjed spumanti u effervexxenti jissejjaħ afrometru. Dan għandu għamliet differenti skont it-tappijiet li jintużaw biex jingħalaq il-flixkun (kapsula tal-metall, kapsula forma ta’ kuruna, tapp tas-sufra jew tal-plastik).

2.1.   Għall-fliexken li għandhom kapsula

Huwa magħmul fi tliet partijiet (Dijagramma 1):

—

il-parti ta’ fuq (jew kamin bil-labra) hija magħmula minn manometru, ċirku li jissikka bl-id, kamin bla tmiem li jgħaddi għall-parti tan-nofs, u labra li tgħaddi minn ġol-kapsula. Il-labra għandha toqba laterali li tgħaddi l-pressjoni lill-manometru. Ġonta tiżgura li kollox ikun issiġillat fuq il-kapsula tal-flixkun.

—	il-parti tan-nofs (jew l-iskorfina) tintuża biex tiċċentra l-parti ta’ fuq. Hija tinvita ruħha fil-parti t’isfel b’mod li l-apparat kollu jinżamm sod fuq il-flixkun

—	il-parti t’isfel (jew morsa) tkun mgħammra bi xprun li jiżżerżaq taħt iċ-ċirku tal-flixkun, b’mod li jinżamm l-apparat kollu. Hemm ċrieki adattati għal kull tip ta’ flixkun.

2.2.   Għall-fliexken li għandhom tapp

Huwa magħmul minn żewġ partijiet (Dijagramma 2):

—	Il-parti ta’ fuq hija identika għall-apparat ta’ qabel; madankollu, il-labra hija itwal. Din tal-aħħar hija magħmula minn tubu twil u vojt li f’tarf minnu hemm ponta biex tgħin il-labra tidħol fit-tapp. Din il-ponta tista’ tinqala’ u taqa’ fl-inbid ladarba t-tapp jittaqqab

—	il-parti ta’ taħt hija magħmula minn skorfina u bażi li sserraħ fuq it-tapp. Din għandha erba’ viti li jissikkaw sabiex kollox jinżamm fuq it-tapp.

Rimarki dwar il-manometri li jinsabu ma’ dawn iż-żewġ tipi ta’ apparat:

—	dawn jistgħu jkunu jew makkaniċi b’tubu tat-tip Bourdon inkella sensuri diġitali pjeżoelettriċi. Fl-ewwel każ, it-tubu tat-tip Bourdon għandu jkun tal-istainless steel.

—	huma kkalibrati f’pascals (abbrevjazzjoni Pa). Għall-inbejjed spumanti, huwa aktar prattiku li wieħed juża 105 pascals (105 Pa) jew kilopascal (kPa) bħala unità

—

jista’ jkun hemm klassijiet differenti. Il-klassi ta’ manometru hija l-preċiżjoni tal-qari meta mqabbel mal-iskala sħiħa espressa f’perċentwali (pereżempju: manometru 1 000 kPa klassi 1, tfisser il-pressjoni massima użata 1 000 kPa, qari sa ± 10 kPa). Il-klassi 1 hija rakkomandata għal kejl aktar preċiż.

3.   PROĊEDURA

Il-kejl irid isir fuq fliexken li t-temperatura tagħhom tkun ilha stabbli mill-inqas għal 24 siegħa. Wara li jiġu minfuda l-kuruna, it-tapp tas-sufra jew tal-plastik, il-flixkun irid jitqanqal bil-qawwi sakemm tintlaħaq pressjoni kostanti, sabiex ikun jista’ jseħħ il-qari.

3.1.   Għall-fliexken bil-kapsuli

Żerżaq l-ixprun tal-morsa taħt iċ-ċirku tal-flixkun. Issikka l-iskorfina sakemm l-apparat kollu jkun sod fuq il-flixkun. Il-parti ta’ fuq imbagħad tiġi ssikkata fl-iskorfina. Sabiex ma jkunx hemm telf ta’ gass it-titqib tal-kapsula għandu jsir malajr kemm jista’ jkun, sabiex il-ġonta tiġi tmiss mal-kapsula. Il-flixkun imbagħad irid jitħawwad tajjeb sakemm tintlaħaq pressjoni kostanti sabiex iseħħ il-qari.

3.2.   Għall-fliexken bit-tapp

Poġġi ponta fit-tarf tal-labra. Qiegħed l-apparat kollu fuq it-tapp. Issikka l-erba’ viti fuq it-tapp. Issikka l-parti ta’ fuq (il-labra tidħol fit-tapp). Il-ponta għandha taqa’ fil-flixkun sabiex il-pressjoni tkun tista’ tgħaddi għall-manometru. Il-qari jsir wara li l-flixkun jitħawwad tajjeb sakemm tintlaħaq pressjoni kostanti. Iġbor il-ponta wara li tkun għamilt il-qari.

4.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Il-pressjoni żejda f’20 °C (Paph20) hija espressa f’pascals (Pa) jew f’kilopascals (kPa). Din għandha tkun konformi mal-preċiżjoni tal-manometru (pereżempju: 6,3 × 105 Pa jew 630 kPa u mhux 6,33 × 105 Pa jew 633 kPa għal manometru 1 000 kPa bi skala sħiħa, ta’ klassi 1).

Meta t-temperatura tal-kejl hija differenti minn 20 °C, wieħed għandu jagħmel korrezzjoni billi l-pressjoni mkejla tiġi mmultiplikata bil-koeffiċjent xieraq (ara t-Tabella 1).

Tabella 1

Il-proporzjon bejn il-pressjoni żejda Paph20 ta’ inbid effervexxenti jew spumanti f’20 °C u l-pressjoni żejda Papht f’temperatura t

°C
0	1,85
1	1,80
2	1,74
3	1,68
4	1,64
5	1,59
6	1,54
7	1,50
8	1,45
9	1,40
10	1,36
11	1,32
12	1,28
13	1,24
14	1,20
15	1,16
16	1,13
17	1,09
18	1,06
19	1,03
20	1,00
21	0,97
22	0,95
23	0,93
24	0,91
25	0,88

5.   VERIFIKA TAR-RIŻULTATI

Il-metodu tad-determinazzjoni diretta tal-parametri fiżiċi (metodu tal-kriterji tat-tip I)

Il-verifika tal-afrometri

L-afrometri għandhom jiġu vverifikati b’mod regolari (mill-inqas darba fis-sena).

Il-verifika ssir permezz ta’ bank ta’ kalibrazzjoni. Dan jippermetti li wieħed iqabbel il-manometru li għandu jiġi ttestjat ma’ manometru ta’ referenza, ta’ klassi aktar għolja, aġġustat mal-istandards nazzjonali, mibni b’mod parallel. Il-kontroll jintuża biex jitqabblu l-valuri indikati miż-żewġ apparati għal-livelli ta’ pressjonijiet li jitilgħu u jinżlu. Jekk ikun hemm differenza bejn dawn it-tnejn, hemm vit għall-irregolar li jippermetti li jsiru l-korrezzjonijiet meħtieġa.

Il-laboratorji u l-korpi awtorizzati huma kollha mgħammra b’tali bankijiet ta’ kalibrazzjoni; dawn huma wkoll disponibbli mingħand il-manifatturi tal-manometri.

20   DOŻAĠĠ TAL-LISOŻIMA FL-INBID PERMEZZ TA’ HPLC (OIV-AS-315-14) – METODU TIP IV

1.   INTRODUZZJONI

Huwa aħjar li għal-lisożima jintuża metodu analitiku mhux ibbażat fuq l-attività tal-enżimi.

2.   AMBITU

Dan il-metodu jippermetti l-kwantifikazzjoni tal-lisożima (mg ta’ proteina/l) preżenti fl-inbejjed bojod u ħomor indipendentement mill-attività tal-enżimi (li tista’ tiġi kompromessa minn denaturazzjoni parzjali jew minn fenomeni ta’ komplessazzjoni u ta’ kopreċipitazzjonijiet) tal-matriċi.

3.   DEFINIZZJONI

Il-kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja (HPLC) toffri approċċ analitiku bbażat fuq l-interazzjoni tat-tip steriku, polari jew ta’ assorbiment bejn il-fażi stazzjonarja u l-analita u, għalhekk, mhux marbut mal-attività tal-enżima reali tal-proteina.

4.   PRINĊIPJU

L-analiżi titwettaq permezz tal-kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja (HPLC) bl-assoċjazzjoni ta’ strument ta’ detezzjoni spettrofotometriku u strument ta’ detezzjoni spettroflorometriku. Il-kontenut mhux magħruf tal-kampjun tal-inbid huwa kkalkolat skont il-wiċċ tal-quċċata kromatografika bl-użu tal-metodoloġija ta’ kalibrazzjoni esterna.

5.   REAĠENTI

5.1.   Solventi u soluzzjonijiet

Acetonitrile (CH3CN) għall-analiżi HPLC

Trifluoroaċdu aċetiku (TFA) pur

Ilma dionizzat għall-analiżi HPLC

Soluzzjoni standard: aċdu tartariku 1 g/l, Ethyl alcohol 10 % v/v aġġustat għal pH 3,2 b’potassium tartrate newtrali

5.2.   Elwenti

A	:	CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 %
B	:	CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3.   Soluzzjonijiet ta’ referenza

Minn 1 sa 250 mg/L lisożima standard maħlul fis-soluzzjoni ta’ mudell billi jitħawwad b’mod kontinwu għal mill-inqas 12-il siegħa.

6.   TAGĦMIR

6.1.   Apparat HPLC b’sistema ta’ pompa prevista biex titwettaq gradjent ta’ eluzzjoni

6.2.   Kompartament għal kolonna termostatika (forn)

6.3.   Strument ta’ detezzjoni spettrofotometriku assoċjat ma’ strument ta’ detezzjoni spettroflorometriku

6.4.   Injettur loop, 20 μL

6.5.   Kolonna polimera b’fażi invertita bi gruppi funzjonali fenoli (dijametru tal-pori = 1 000 Å, limitu ta’ esklużjoni = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 ċm × 4,6 mm ID, bħala eżempju

6.6.   Prekolonna tal-istess materjal tal-kolonna, Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 ċm × 3,2 mm ID, bħala eżempju

7.   TĦEJJIJA TAL-KAMPJUN

Il-kampjuni tal-inbid jiġi aċidifikati permezz ta’ HCl (10 M) dilwit sa’ 1/10 u ffiltrati b’filtru tan-najlon li l-pori tiegħu jkollhom dijametru ta’ 0,22 μm, 5 minuti wara ż-żieda. L-analiżi kromatografika titwettaq minnufih wara l-filtrazzjoni.

8.   KUNDIZZJONIJIET TAL-PROĊEDURA

8.1.   Fluss tal-elwent: 1 ml/min

8.2.   Temperatura tal-kolonna: 30 °C

8.3.   Detezzjoni spettrofotometrika: 280 nm

8.4.   Detezzjoni spettroflorometrika: λ ex = 276 nm ; λ em = 345 nm ; Żieda = 10

8.5.   Programm tal-gradjent ta’ eluzzjoni

Ħin (min)	Sol A%	Sol B%	gradjent
0	100	0
			Iżokratika
3	100	0
			Lineari
10	65	35
			Iżokratika
15	65	35
			Lineari
27	40,5	59,5
			Lineari
29	0	100
			Iżokratika
34	0	100
			Lineari
36	100	0
			Iżokratika
40	100	0

8.6.   Ħin medju ta’ retenzjoni tal-lisożima: 25,50 minuti

9.   KALKOLU

Is-soluzzjonijiet ta’ referenza li jkollhom il-konċentrazzjonijiet li ġejjin ta’ lisożima huma analizzati t-tripplu: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/L. Fuq kull kromatogramma, l-erjas tal-quċċata li tikkorrispondi għal-lisożima jitniżżlu fuq dijagramma skont il-konċentrazzjonijiet tagħhom rispettivi sabiex jinkisbu l-linji ta’ rigressjoni espressi bil-formula Y = ax+b. Il-koeffiċjent ta’ determinazzjoni r2 għandu jkun > 0,999.

10.   KARATTERISTIĊI TAL-METODU

Bl-għan li tiġi evalwata l-kapaċità tal-metodu għall-objettiv imressaq, sar studju ta’ valutazzjoni filwaqt li tqiesu l-linearità, il-limiti ta’ detezzjoni u ta’ kwantifikazzjoni, u l-preċiżjoni tal-metodu. Dan il-parametru tal-aħħar ġie ddeterminat billi ġie definit il-livell ta’ preċiżjoni u tal-eżatezza tal-metodu.

	Medda ta’ linearità (mg/L)	Kurvatura tal-linja	Koeffiċjent tal-kalkolu (r2)	LD (mg/l)	LK (mg/l)	Repetibbiltà (n=5) RSD %			Riproduċibbiltà (n=5) RSD %
						Std1	V.R.2	V.B.3	Std1
UV	5-250	3 786	0,9993	1,86	6,20	4,67	5,54	0,62	1,93
FLD	1-250	52 037	0,9990	0,18	0,59	2,61	2,37	0,68	2,30

Tabella 1: Dejta relatata mal-karatteristiċi tal-metodu: Std1 soluzzjoni standard ; V.R.2 inbid aħmar; V.B.3 inbid abjad

10.1.   Linearità tal-metodu

Fuq il-bażi tar-riżultati miksuba grazzi għall-anliżi ta’ rigressjoni lineari, il-metodu deher li kien lineari għall-meded indikati fit-Tabella 1.

10.2.   Limitu ta’ detezzjoni u ta’ kwantifikazzjoni

Il-limitu ta’ detezzjoni (LD) u l-limitu ta’ kwantifikazzjoni (LK) ġew ikkalkolati bħala s-sinjal ekwivalenti għal rispettivament 3 darbiet u 10 darbiet il-ħoss tal-isfond kromatografiku f’kundizzjonijiet ta’ ħidma fuq matriċi reali (Tabella 1).

10.3.   Preċiżjoni tal-metodu

Il-parametri meqjusa huma r-repetibbiltà u r-riproduċibbiltà. It-Tabella 1 tindika l-valuri ta’ dawn il-parametri (espressi bħala % tad-differenza standard tal-qisien ripetuti b’konċentrazzjonijiet differenti) li nqraw fuq is-soluzzjoni standard, fuq inbid abjad u fuq inbid aħmar.

10.4.   Eżatezza tal-metodu

Il-perċentwal tal-irkupru ġie kkalkolat fuq is-soluzzjonijiet standard li fihom 5 u 50 mg/L lisożima, miżjuda b’kwantità speċifika ta’ lisożima, kif indikat fit-Tabella li ġejja.

	[C] inizjali nominali (mg/l)	Żieda (mg/l)	[C] teorika (mg/l)	[C] misjuba (mg/l)	Differenza standard	Irkupru %
UV 280 nm	50	13,1	63,1	62,3	3,86	99
FD	50	13,1	63,1	64,5	5,36	102
UV 280 nm	5	14,4	19,4	17,9	1,49	92,1
FD	5	14,4	19,4	19,0	1,61	97,7

21   SULFATI (OIV-AS-321-05-SULFAT) – METODU TIP II

1.   PRINĊIPJU TAL-METODI

1.1.   Metodu ta’ referenza

Preċipitazzjoni tal-barium sulphate u użin. Il-barium phosphate li jippreċipita fl-istess kundizzjonijiet huwa eliminat permezz ta’ ħasla tas-sediment bl-aċdu idrokloriku.

Għall-mosti jew għall-inbejjed li fihom ħafna sulphur dioxide, hija preskritta d-desolfitazzjoni minn qabel permezz tat-togħlija fil-kenn mill-arja.

1.2.   Metodu rapidu ta’ test

Il-klassifikazzjoni tal-inbejjed f’bosta kategoriji permezz ta’ metodu msejħa tal-limiti, ibbażata fuq il-preċipitazzjoni tal-barium sulphate b’soluzzjoni titrata ta’ jone tal-barium.

2.   METODU TA’ REFERENZA

2.1.   Reaġenti

2.1.1.   Aċdu idrokloriku f’soluzzjoni 2 M.

2.1.2.   Barium chloride f’soluzzjoni ta’ 200 g/l ta’ BaCl2, 2H2O.

2.2.   Proċedura

2.2.1.   F’każ ġenerali

Ġo tubu ta’ ċentrifugazzjoni ta’ 50 ml, poġġi 40 ml ta’ kampjun li għandu jiġi analizzat; żid 2 ml aċdu idrokloriku 2 M u 2 ml soluzzjoni ta’ barium chloride ta’ 200 g/l; ħawwad b’virga tal-ħġieġ; laħlaħ il-virga bi ftit ilma distillat u ħallih joqgħod għal 5 minuti. Iċċentrifuga għal 5 minuti, imbagħad ferra’ b’attenzjoni l-likwidu supernatanti mingħajr is-sediment.

Wara aħsel is-sediment ta’ barium sulphate billi tipproċedi bil-mod li ġej: żid 10 ml aċdu idrokloriku 2 M, poġġi s-sediment f’suspensjoni u ċċentrifuga għal 5 minuti. Issepara bi prekawzjoni l-likwidu supernatanti. Irrepeti darbtejn il-ħasil tas-sediment fl-istess kundizzjonijiet b’15 ml ilma distillat kull darba.

Ferra’ kwantitattivament filwaqt li tlaħlaħ, bl-ilma distillat, is-sediment f’kapsula tal-platinu kkalibrata u poġġih fuq banju tal-ilma f’100 °C biex jevapora sakemm jiġi niexef. Is-sediment imnixxef jiġi kkalċinat bosta drabi għal ftit ħin fuq fjamma sakemm jinkiseb residwu abjad. Ħallih jiksaħ f’dessikatur u iżnu.

Ħalli m tkun il-massa f’milligrammi ta’ barium sulphate miksuba.

2.2.2.   F’każ partikolari: mosti solfatati u inbid b’kontenut għoli ta’ sulphur dioxide

Ipproċedi minn qabel għat-tneħħija tas-sulphur dioxide.

Ġo fjaskett ta’ għamla konika ta’ 500 ml, mgħammar b’ampula b’tapp u b’tubu ta’ rilaxx, poġġi 25 ml ilma u 1 ml aċdu idrokloriku pur (ρ20 = 1,15 – 1,18 g/ml). Għalli din is-soluzzjoni biex tneħħi l-arja u poġġi 100 ml inbid għal kull ampula b’tapp, filwaqt li żżommha tagħli. Kompli t-togħlija sakemm il-volum tal-likwidu li jinsab fil-fjaskett ta’ għamla konika jonqos sa madwar 75 ml u ferrgħu kwantitattivament, wara li jiksaħ f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml. Żid sal-marka tal-gejġ bl-ilma. Ipproċedi għad-dożaġġ tas-sulfati fuq kampjun tat-test ta’ 40 ml, kif inhu indikat fil-punt 2.2.1.

2.3.   Espressjoni tar-riżultati

2.3.1.   Kalkoli

Il-kontenut ta’ sulfati, espress f’milligrammi għal kull litru ta’ potassium sulphate, K2SO4, huwa:

18,67 × m

Il-kontenut tal-most jew tal-inbid f’sulfati huwa espress f’milligrammi għal kull litru ta’ potassium sulphate, mingħajr post deċimali.

2.3.2.   Repetibbiltà

sa 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

madwar 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3.   Riproduċibbiltà

sa 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

madwar 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22   ĦADID (OIV-AS-322-05-FER) – METODU TIP IV

1.   PRINĊIPJU TAL-METODI

METODU TA’ REFERENZA

Wara li jiġi dilwit b’mod xieraq l-inbid u l-eliminazzjoni tal-alkoħol, il-ħadid jiġi kkalkolat direttament permezz tal-ispettrofotometrija ta’ assorbiment atomiku.

METODU KOMUNI

Wara l-mineralizzazzjoni tal-inbid bil-perhydrol, il-ħadid li jinsab fl-istat ta’ ħadid III jinbidel fl-istat ta’ ħadid II u huwa kkalkolat permezz tal-kolorazzjoni ħamra li jagħti bl-orthophenanthroline.

2.   METODU TA’ REFERENZA

2.1.   Reaġenti

2.1.1.   Soluzzjoni standard ikkonċentrata ta’ ħadid III b’qawwa ta’ 1 g għal kull litru.

Uża soluzzjoni standard tal-kummerċ b’1 g/l. Din is-soluzzjoni tista’ titħejja billi tħoll 8,6341 g iron sulphate III u ammonium (FeNH4(SO4)2, 12H2O) fl-ilma distillat ftit aċidifikat bl-aċdu idrokloriku M u billi żżid il-volum sa litru.

2.1.2.   Soluzzjoni standard dilwita ta’ ħadid b’qawwa ta’ 100 milligrammi għal kull litru.

2.2.   Apparat

2.2.1.   Evaporatur li jdur b’banju tal-ilma bit-temperatura kkontrollata.

2.2.2.   Spettrofotometru ta’ assorbiment atomiku mgħammar b’burner tal-arja u tal-acetylene.

2.2.3.   Lampa tal-katodi vojta tal-ħadid.

2.3.   Proċedura

2.3.1.   Tħejjija tal-kampjun

Neħħi l-alkoħol tal-inbid billi tnaqqas il-konċentrazzjoni tal-volum tal-kampjun san-nofs permezz ta’ evaporatur li jdur (50-60 °C). Żid l-ilma distillat sakemm terġa’ tasal sal-volum inizjali.

Jekk ikun meħtieġ wettaq dilwizzjoni minn qabel id-dożaġġ.

2.3.2.   Kalibrazzjoni

F’ħames kunjetti volumetriċi ta’ 100 ml, poġġi 1 - 2 - 3 - 4 - 5 ml tas-soluzzjoni tal-ħadid b’100 milligrammi għal kull litru (punt 2.1.2) u żid sa 100 ml bl-ilma distillat. Is-soluzzjonijiet imħejja għandhom qawwa ta’ 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg ta’ ħadid għal kull litru rispettivament.

Dawn is-soluzzjonijiet jinżammu ġewwa fliexken tal-polyethylene.

2.3.3.   Dożaġġ

Agħżel it-tul tal-mewġa 248,3 nm. Irregola ż-żero tal-iskala tal-assorbimenti bl-ilma distillat. Iġbed direttament il-kampjun dilwit fil-burner tal-ispettrofotometru imbagħad is-soluzzjonijiet-standard wara xulxin imħejja kif indikat fil-punt 2.3.2. Niżżel l-assorbimenti. Wettaq il-kalkoli darbtejn.

2.4.   Espressjoni tar-riżultati

2.4.1.   Metodu tal-kalkolu

Immarka l-kurvatura tal-varjazzjoni tal-assorbiment skont il-konċentrazzjoni ta’ ħadid tas-soluzzjonijiet standard. Ikkopja l-valur medju tal-assorbiment miksub għall-kampjun tal-inbid dilwit fuq din il-kurvatura u kkalkola l-konċentrazzjoni ta’ ħadid C.

Il-konċentrazzjoni ta’ ħadid espressa f’milligrammi għal kull litru ta’ inbid b’post deċimali wieħed tkun:

C × F

F = fattur ta’ dilwizzjoni.

23   RAM (OIV-AS 322-06) – METODU TIP IV

1.   PRINĊIPJU TAL-METODU

Użu tal-ispettrofotometrija ta’ assorbiment atomiku.

2.   APPARAT

2.1.   Kapsula tal-platinu.

2.2.   Spettrofotometru ta’ assorbiment atomiku.

2.3.   Lampa tal-katodi vojta tar-ram.

2.4.   Gass tal-alimentazzjoni: arja/acetylene jew nitrous oxide/ acetylene.

3.   REAĠENTI

3.1.   Ram metall.

3.2.   Aċdu nitriku konċentrat 65 % (HNO3, ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.   Aċdu nitriku dilwit 1/2 (v/v).

3.4.   Soluzzjoni tar-ram ta’ 1 g/l

Uża soluzzjoni standard tar-ram tal-kummerċ, ta’ 1 g/l. Din is-soluzzjoni tista’ titħejja billi tiżen 1 000 g ta’ ram metall u titrasferixxih kwantitattivament f’kunjett volumetriku ta’ 1 000 ml. Żid ftit aċdu nitriku dilwit 1/2 (3.3), fi kwantità strettament suffiċjenti biex tħoll il-metall, żid 10 ml aċdu nitriku konċentrat (3.2), żid sal-marka ta’ referenza bl-ilma distillat darbtejn.

3.5.   Soluzzjoni tar-ram ta’ 100 mg/l

Ħu 10 ml tas-soluzzjoni 3.4 u poġġihom f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml filwaqt li żżid il-volum bl-ilma distillat darbtejn.

4.   PROĊEDURA

4.1.   Tħejjija tal-kampjun u dożaġġ tar-ram

Iġbor 20 ml tal-kampjun, poġġihom ġo kunjett volumetriku ta’ 100 ml u żid sal-marka ta’ referenza bl-ilma distillat darbtejn. Immodifika d-dilwizzjoni jekk ikun meħtieġ.

Aqra fl-ispettrofotometru ta’ assorbiment atomiku l-assorbiment tal-kampjun dilwit, fit-tul tal-mewġa 324,8 nm, wara li tkun irregolajt iż-żero tal-iskala tal-assorbimenti bl-ilma distillat. Jekk ikun meħtieġ ħejji dilwizzjoni xierqa bl-ilma distillat darbtejn.

4.2.   Stabbiliment tal-kurvatura ta’ kalibrazzjoni

Iġbor 0,5 - 1 - 2 ml soluzzjoni (punt 3.5) (100 mg ta’ ram f’kull litru), poġġihom f’kunjetti volumetriċi ta’ 100 ml u żid il-volum bl-ilma distillat darbtejn; is-soluzzjonijiet miksuba jkun fihom rispettivament 0,5 - 1 - 2 mg/l ram. Bil-valuri tal-assorbimenti ta’ dawn is-soluzzjonijiet, mkejla kif deskritt fil-punt 4.1., ibni l-kurvatura ta’ kalibrazzjoni.

5.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Niżżel l-assorbiment li tkun qrajt għall-kampjun tal-inbid dilwit fuq il-kurvatura ta’ kalibrazzjoni u aqra l-konċentrazzjoni C f’mg/l.

Jekk F huwa l-fattur ta’ dilwizzjoni, il-kontenut tar-ram fl-inbid f’milligrammi għal kull litru huwa: F × C.

Dan jingħata b’2 postijiet deċimali.

Rimarki:

a)	Is-soluzzjonijiet għall-istabbiliment tal-kurvatura ta’ kalibrazzjoni u d-dilwizzjonijiet tal-kampjun madankollu għandhom jintgħażlu skont is-sensittività tal-apparat użat u l-konċentrazzjoni tar-ram preżenti fil-kampjun.

b)

Għall-konċentrazzjonijiet dgħajfa ħafna tar-ram fil-kampjun, il-proċedura hija din li ġejja: poġġi 100 ml kampjun ġo kapsula tal-platinu, evaporah f’banju tal-ilma f’100 °C sakemm il-konsistenza tiegħu tkun simili għal dik ta’ ġulepp, żid 2,5 ml ta’ aċdu nitriku konċentrat qatra qatra (punt 3.2) filwaqt li tipprova tgħatti il-qiegħ kollu tal-kapsula. Ipproċedi bi prekawzjoni għall-inċinerazzjoni tar-residwu fuq hot plate tal-elettriku jew inkella fuq fjamma żgħira; imbagħad daħħal il-kapsula ġo forn li jkollu kavità interna fejn it-temperatura tkun aktar baxxa (muffle kiln) irregolat fuq 500 °C ± 25 °C, ħalliha għal madwar siegħa. Wara li tiksaħ, xarrab l-irmied b’1 ml aċdu nitriku konċentrat (punt 3.2) filwaqt li tgħaffiġhom b’virga żgħira tal-ħġieġ, evaporah u erġa aħarqu bħal qabel. Erġa’ poġġi l-kapsula fil-forn għal 15-il minuta; irrepeti dan it-trattament mill-inqas tliet darbiet bil-aċdu nitriku konċentrat. Agħmel l-irmied solubbli billi fil-kapsula żżid 1 ml aċdu nitriku konċentrat (punt 3.2) u 2 ml ilma distillat darbtejn; ferrgħu f’kunjett volumetriku ta’ 10 ml. Aħsel il-kapsula tliet darbiet b’2 ml ilma distillat darbtejn kull darba, żid sal-marka ta’ referenza bl-ilma distillat darbtejn. Ipproċedi għad-dożaġġ kif indikat f’4.1. billi tuża l-10 ml ta’ soluzzjoni; qis il-fattur ta’ konċentrazzjoni għall-espressjoni tar-riżultati.

24   SULPHUR DIOXIDE (OIV-AS-323-04-DIOSU) – METODU TIP II

1.   DEFINIZZJONIJIET

Insejħu sulphur dioxide, is-sulphur dioxide preżenti fil-most jew l-inbid fil-forom li ġejjin: H2SO3, H SO3 li l-bilanċ bejn dawn il-forom huwa funzjoni ta' pH u temperatura:

H2SO3. ←→ H+ + HSO3 –

H2SO3 jirrapreżenta s-sulphur dioxide molekulari.

Sulphur dioxide totali huwa il-forom differenti kollha ta’ sulphur dioxide preżenti fl-inbid fl-istat ħieles jew mħallat mal-kostitwenti tiegħu.

2.   SULPHUR DIOXIDE ĦIELES U TOTALI

2.1.   Prinċipju tal-metodi

2.1.1.   Metodu ta’ referenza

2.1.1.1.   Għall-inbejjed u l-mosti

Is-sulphur dioxide jinġarr permezz ta’ kurrent ta’ arja jew ta’ nitroġenu; jiġi ffissat u ossidizzat billi jingħadda minn soluzzjoni dilwita u newtrali ta’ hydrogen peroxide. Is-sulphuric acid li jifforma jiġi kkalkolat b’soluzzjoni titrata ta’ sodium hydroxide. Is-sulphur dioxide ħieles jiġi estratt mill-inbid permezz ta’ trasferiment fil-kiesaħ (10 °C).

Is-sulphur dioxide total jiġi estratt mill-inbid permezz ta’ trasferiment fis-sħana (madwar 100 °C).

2.1.1.2.   Għall-mosti konċentrati rettifikati

Is-sulphur dioxide total jiġi estratt permezz ta’ trasferiment fis-sħana (madwar 100 °C) mill-most konċentrat rettifikat dilwit minn qabel.

2.1.2.   Metodu rapidu ta’ test (għall-inbejjed u l-mosti)

Is-sulphur dioxide ħieles huwa kkalkolat permezz ta’ titrazzjoni jodometrika diretta.

Is-sulphur dioxide mħallat jiġi kkalkolat, wara, permezz ta’ titrazzjoni jodometrika wara idroliżi alkalina. Meta jiġi miżjud mas-sulphur dioxide ħieles, jippermetti li jinkiseb is-sulphur dioxide totali.

2.2.   Metodu ta’ referenza

2.2.1.   Apparat

2.2.1.1.   L-apparat użat għandu jkun konformi mal-istampa hawn taħt, b’mod partikolari fir-rigward tar-refriġeratur.

It-tubu minn fejn jidħol il-gass fil-barbotur B jispiċċa bi sfera żgħira ta’ dijametru ta’ 1 ċm b’20 toqba ta’ dijametru ta’ 0,2 mm madwar l-akbar ċirkonferenza orizzontali tagħha. Wieħed jista’ jpoġġi pjanċa tal-ħġieġ sinterizzat fit-tarf tiegħu wkoll li tiżgura l-formazzjoni ta’ numru kbir ta’ bżieżaq żgħar ħafna u b’hekk ikun hemm kuntatt tajjeb bejn il-fażijiet tal-gass u likwidi.

Il-fluss tal-gass minn ġewwa l-apparat għandu jkun madwar 40 l/h. Il-flixkun fuq il-lemin tal-apparat huwa maħsub sabiex jillimita d-depressjoni kkaużata mill-pompa tal-ilma għal 20 sa 30 ċm ilma. Sabiex tkun tista’ tirregola din id-depressjoni b’mod li l-fluss ikun tajjeb, għandu jiġi installat flowmeter b’tubu semikapillari bejn il-barbotur u l-flixkun.

2.2.1.2.   Mikroburetta.

2.2.2.   Reaġenti

2.2.2.1.   Aċdu fosforiku b’85 għal kull 100 (H3PO4) (ρ20 = 1,71 g/ml).

2.2.2.2.   Soluzzjoni ta’ hydrogen peroxide b’9,1 g ta’ H2O2/l (3 volumi).

2.2.2.3.   Reaġent indikatur:

methyl red …	100 mg
methylene-blue …	50 mg
alkoħol b’volum ta’ 50 % …	100 ml

2.2.2.4.   Soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (NaOH), 0,01 M.

2.2.3.   Dożaġġ tas-sulphur dioxide ħieles

2.2.3.1.   Proċedura

L-inbid għandu jinżamm f’20 °C ġo flixkun mimli u bit-tapp għal jumejn qabel id-dożaġġ.

—	Fil-barbotur B, poġġi minn 2 sa 3 ml ta’ soluzzjoni ta’ hydrogen peroxide (punt 2.2.2.2) 2 qatriet ta’ reaġent indikatur u nnewtralizza s-soluzzjoni ta’ hydrogen peroxide bis-soluzzjoni 0,01 M ta’ sodium hydroxide (punt 2.2.2.4). Adatta dan il-barbotur għall-apparat.

—	Fil-flixkun tond A ta’ 250 ml tal-apparat ta’ trasferiment, poġġi 50 ml tal-kampjun u 15 ml aċdu fosforiku (punt 2.2.2.1). Poġġi l-flixkun tond f’postu.

—	Għaddi bżieżaq tal-arja (jew tan-nitroġenu) għal 15-il minuta. Is-sulphur dioxide ħieles trasferit huwa ossidizzat f’sulphuric acid. Aqla’ l-barbotur mill-apparat u ttitra l-aċidu li forma ruħu bis-soluzzjoni ta’ sodium hydroxide 0,01 M (punt 2.2.2.4). Ħalli n tkun in-numru ta’ millilitri użati.

2.2.3.2.   Espressjoni tar-riżultati

Is-sulphur dioxide ħieles huwa espress f’milligrammi għal kull litru (mg/l) mingħajr post deċimali.

2.2.3.2.1.   Kalkolu

Sulphur dioxide ħieles f’milligrammi għal kull litru: 6,4 n.

2.2.4.   Dożaġġ tas-sulphur dioxide totali

2.2.4.1   Proċedura

2.2.4.1.1.   Għall-mosti konċentrati rettifikati, uża s-soluzzjoni miksuba billi jiġi dilwit il-kampjun li għandu jiġi analizzat sa 40 għal kull 100 (m/v) kif inhu indikat fil-kapitolu “Aċidità totali” fil-punt 5.1.2. Fil-flixkun tond A ta’ 250 ml tal-apparat ta’ trasferiment, poġġi 50 ml ta’ din is-soluzzjoni u 5 ml aċdu fosforiku (punt 2.2.2.1). Poġġi l-flixkun tond f’postu.

2.2.4.1.2.   Għall-inbejjed u għall-mosti

Kontenut preżunt tal-kampjun ≤ 50 mg/l SO2 totali. Fil-flixkun tond A ta’ 250 ml tal-apparat ta’ trasferiment, poġġi 50 ml tal-kampjun u 15 ml aċdu fosforiku (punt 2.2.2.1). Poġġi l-flixkun tond f’postu.

Kontenut preżunt tal-kampjun ≥ 50 mg/l de SO2 totali. Fil-flixkun tond A ta’ 100 ml tal-apparat ta’ trasferiment, poġġi 20 ml tal-kampjun u 5 ml aċdu fosforiku (punt 2.2.2.1). Poġġi l-flixkun tond f’postu.

Fil-barbotur B poġġi minn 2 sa 3 ml tas-soluzzjoni ta’ hydrogen peroxide (punt 2.2.2.2), innewtralizzaha bħal qabel, għalli l-inbid li jkun qiegħed fil-flixkun tond A permezz ta’ fjamma żgħira ta’ tul ta’ 4 sa 5 ċm li għandha tmiss il-qiegħ tal-flixkun tond direttament. Tpoġġix taħt il-flixkun tond malja metallika, iżda poġġih fuq diska b'toqba b'dijametru ta’ 30 mm. B’hekk tiġi evitata l-piroliżi tas-sustanzi estratti tal-inbid fuq il-ħitan tal-flixkun tond.

Kompli għalli sakemm tgħaddi l-kurrent tal-arja (jew tan-nitroġenu). F’15-il minuta, is-sulphur dioxide totali jiġi trasferit u ossidizzat. Ikkalkola s-sulphuric acid li jkun ifforma mis-soluzzjoni 0,01 M ta’ sodium hydroxide (punt 2.2.2.4).

Ħalli n tkun in-numru ta’ millilitri użati.

2.2.4.2.   Espressjoni tar-riżultati

Is-sulphur dioxide totali huwa espress f’milligrammi għal kull litru (mg/l) rispettivament f’milligrammi għal kull kilogramma (mg/kg) taz-zokkor totali mingħajr post deċimali.

2.2.4.2.1.   Kalkolu

—	Għall-inbejjed u għall-mosti Sulphur dioxide totali f’milligrammi għal kull litru. — Kampjuni li ma fihomx ħafna sulphur dioxide (kampjun tat-test 50 ml): 6,4 × n — Kampjuni oħra (kampjun tat-test 20 ml): 16 × n

—	Għall-mosti konċentrati rettifikati Sulphur dioxide f’milligrammi għal kull kilo ta’ zokkor totali (kampjun tat-test 50 ml kampjun imħejji) (punt 2.2.4.1.1): (1600 × n)/P P = kontenut għal 100 (m/m) f’zokkor totali

2.2.3.4.2.   Repetibbiltà (r)

Kontenut < 50 mg/l (kampjun tat-test ta’ 50 ml), r = 1 mg/l

Kontenut > 50 mg/l (kampjun tat-test ta’ 20 ml), r = 6 mg/l

2.2.3.4.3.   Riproduċibbiltà (R)

Kontenut < 50 mg/l (kampjun tat-test ta’ 50 ml), R = 9 mg/l

Kontenut > 50 mg/l (kampjun tat-test ta’ 20 ml), R = 15 mg/l

---

(1)  Jista’ jintuża kwalunkwe piknometru b’karatteristiċi ekwivalenti.

(2)  105 pascal (Pa) = 1 bar.