31.1.2018 |
MT |
Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea |
L 26/14 |
REGOLAMENT TA' IMPLIMENTAZZJONI TAL-KUMMISSJONI (UE) 2018/150
tat-30 ta' Jannar 2018
li jemenda r-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240 f'dak li għandu x'jaqsam mal-metodi għall-analiżi u għall-evalwazzjoni tal-kwalità tal-ħalib u tal-prodotti tal-ħalib li huma eliġibbli għall-intervent pubbliku u għall-għajnuna għall-ħżin privat
IL-KUMMISSJONI EWROPEA,
Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,
Wara li kkunsidrat ir-Regolament (UE) Nru 1306/2013 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-17 ta' Diċembru 2013 dwar il-finanzjament, il-ġestjoni u l-monitoraġġ tal-politika agrikola komuni u li jħassar ir-Regolamenti tal-Kunsill (KEE) Nru 352/78, (KE) Nru 165/94, (KE) Nru 2799/98, (KE) Nru 814/2000, (KE) Nru 1290/2005 u (KE) Nru 485/2008 (1), u b'mod partikulari l-Artikolu 62(2)(i) tiegħu,
Billi:
(1) |
Ir-Regolament Delegat tal-Kummissjoni (UE) 2016/1238 (2) u r-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240 (3) jistabbilixxu r-regoli għall-intervent pubbliku u għall-għajnuna għall-ħżin privat. Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 273/2008 (4) jistabbilixxi l-metodi li għandhom jiġu applikati biex tiġi vvalutata l-konformità tal-ħalib u tal-prodotti tal-ħalib mar-rekwiżiti tal-eliġibbiltà għall-intervent pubbliku u għall-għajnuna għall-ħżin privat stabbiliti f'dawk ir-Regolamenti. |
(2) |
Fid-dawl tal-iżviluppi tekniċi fil-metodoloġija li tintuża għall-analiżi u għall-evalwazzjoni tal-kwalità tal-ħalib u tal-prodotti tal-ħalib, jenħtieġ li jsir tibdil sostanzjali sabiex jiġu ssimplifikati r-referenzi għall-istandards tal-ISO u sabiex jingħataw referenzi aġġornati għalihom. Fl-interess taċ-ċarezza u tal-effiċjenza, u filwaqt li jitqiesu l-estent tal-emendi fid-dispożizzjonijiet tar-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 273/2008 u n-natura teknika tagħhom, jenħtieġ li d-dispożizzjonijiet rilevanti ta' dak ir-Regolament jiddaħħlu fir-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240. |
(3) |
Sabiex tkun żgurata l-konformità mal-istandards u l-metodi l-ġodda fl-Istati Membri kollha, jenħtieġ li l-laboratorji jingħataw biżżejjed żmien biex jirrevedu l-proċeduri tagħhom u jibdew japplikaw il-metodi aġġornati. |
(4) |
Għalhekk jenħtieġ li r-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240 jiġi emendat kif xieraq. |
(5) |
Fl-interess taċ-ċertezza legali, jenħtieġ li r-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 273/2008 jitħassar. |
(6) |
Il-miżuri previsti f'dan ir-Regolament huma skont l-opinjoni tal-Kumitat għall-Organizzazzjoni Komuni tas-Swieq Agrikoli, |
ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:
Artikolu 1
Ir-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240 huwa emendat kif ġej:
(1) |
l-Artikolu 4 huwa emendat kif ġej:
|
(2) |
jiddaħħal l-Artikolu 60a li ġej: “Article 60a Dispożizzjoni speċifika dwar il-kontrolli marbutin mal-intervent pubbliku u mal-għajnuna għall-ħżin privat għall-ħalib u għall-prodotti tal-ħalib 1. L-eliġibbiltà tal-butir, tat-trab tal-ħalib xkumat u tal-ġobon biex tingħata l-għajnuna għall-ħżin privat għalihom għandha tiġi stabbilita skont il-metodi stabbiliti fl-Annessi VI, VII u VIII rispettivament. Dawk il-metodi għandhom jiġu stabbiliti b'referenza għall-aħħar verżjonijiet tal-istandards Ewropej jew tal-istandards internazzjonali rilevanti, skont il-każ, li jkunu fis-seħħ tal-inqas sitt xhur qabel l-ewwel jum tal-perjodu tal-intervent pubbliku ddefinit fl-Artikolu 12 tar-Regolament (UE) Nru 1308/2013. 2. Ir-riżultati tal-kontrolli li jitwettqu billi jiġu applikati l-metodi stabbiliti f'dan ir-Regolament għandhom jiġu evalwati skont l-Anness IX.”; |
(3) |
l-Annessi huma emendati skont l-Anness ta' dan ir-Regolament. |
Artikolu 2
Ir-Regolament (KE) Nru 273/2008 qed jitħassar.
Artikolu 3
Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fis-seba' jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu f'Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.
Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha.
Magħmul fi Brussell, it-30 ta' Jannar 2018.
Għall-Kummissjoni
Il-President
Jean-Claude JUNCKER
(1) ĠU L 347, 20.12.2013, p. 549.
(2) Ir-Regolament Delegat tal-Kummissjoni (UE) 2016/1238 tat-18 ta' Mejju 2016 li jissupplimenta r-Regolament (UE) Nru 1308/2013 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill fir-rigward tal-intervent pubbliku u l-għajnuna għall-ħżin privat (ĠU L 206, 30.7.2016, p. 15).
(3) Ir-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240 tat-18 ta' Mejju 2016 li jistabbilixxi regoli għall-applikazzjoni tar-Regolament (UE) Nru 1308/2013 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill fir-rigward ta' intervent pubbliku u ta' għajnuna għall-ħżin privat (ĠU L 206, 30.7.2016, p. 71).
(4) Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 273/2008 tal-5 ta' Marzu 2008 li jistipula regoli dettaljati għall-applikazzjoni tar-Regolament tal-Kunsill (KE) Nru 1255/1999 fir-rigward ta' metodi għall-analiżi u għall-evalwazzjoni tal-kwalità tal-ħalib u tal-prodotti tal-ħalib (ĠU L 88, 29.3.2008, p. 1).
ANNESS
L-Annessi tar-Regolament ta' Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) 2016/1240 huma emendati kif ġej:
(1) |
l-Anness IV huwa emendat kif ġej:
|
(2) |
fl-Anness V tiddaħħal il-Parti Ia li ġejja: “PARTI IA Metodi għall-analiżi tat-trab tal-ħalib xkumat għall-intervent pubbliku
Appendiċi I TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT: DETERMINAZZJONI KWANTITATTIVA TAL-FOSFATIDILSERINA U TAL-FOSFATIDILETANOLAMINA Metodu: kromatografija likwida ta' rendiment għoli (HPLC) f'fażi inversa 1. SKOP U KAMP TA' APPLIKAZZJONI Il-metodu jiddeskrivi proċedura għad-determinazzjoni kwantitattiva tal-fosfatidilserina (PS) u tal-fosfatidiletanolamina (PE) fit-trab tal-ħalib xkumat u huwa adattat għad-detezzjoni tas-solidi tax-xorrox tal-butir fit-trab tal-ħalib xkumat. 2. DEFINIZZJONI Kontenut ta' fosfatidilserina u ta' fosfatidiletanolammina: il-frazzjoni tal-massa tas-sustanza stabbilita billi tintuża l-proċedura speċifikata hawnhekk. Ir-riżultat huwa mogħti bħala milligrammi ta' dipalmitojl tal-fosfatidiletanolammina (PEDP) għal kull 100 gramma trab. 3. PRINĊIPJU TAL-METODU L-estrazzjoni tal-aminofosfolipidi bil-metanol mit-trab tal-ħalib rikostitwit. Id-determinazzjoni tal-fosfatidilserina u tal-fosfatidiletanolammina bħala derivati tal-o-ftaldialdeid (OPA) permezz tal-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (HPLC) f'fażi inversa (RP) u tad-detezzjoni tal-fluworexxenza. Il-kwantifikazzjoni tal-kontenut ta' fosfatidilserina u ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test b'referenza għal kampjun standard li jkun fih ammont magħruf ta' PEDP. 4. REAĠENTI Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku rikonoxxut. L-ilma għandu jkun iddistillat jew ikun tal-inqas pur b'mod ekwivalenti, sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor. 4.1. Materjal standard: PEDP, li jkun mill-anqas 99 % pur Nota: Il-materjal standard għandu jinħażen f'temperatura ta' – 18 °C. 4.2. Reaġenti għat-tħejjija tal-kampjun standard u għat-tħejjija tal-kampjun għat-test 4.2.1. Metanol tal-grad HPLC 4.2.2. Kloroform tal-grad HPLC 4.2.3. Monoidroklorur tat-triptamina 4.3. Reaġenti għad-derivatizzazzjoni tal-o-ftaldialdeid 4.3.1. Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni ta' ilma ta' 12 M 4.3.2. Aċidu boriku, soluzzjoni ta' ilma ta' 0,4 M aġġustata għal pH 10,0 bl-idrossidu tas-sodju (4.3.1) 4.3.3. 2-merkaptoetanol 4.3.4. O-ftaldialdeid (OPA) 4.4. Solventi ta' elwizzjoni tal-HPLC 4.4.1. Is-solventi ta' elwizzjoni għandhom jitħejjew bl-użu ta' reaġenti tal-grad HPLC. 4.4.2. Ilma tal-grad HPLC 4.4.3. Metanol ta' purità fluworometrika ttestjata 4.4.4. Tetraidrofuran 4.4.5. Diidroġenufosfat tas-sodju 4.4.6. Aċetat tas-sodju 4.4.7. Aċidu aċetiku. 5. APPARAT 5.1. Miżien analitiku, li jiżen sal-eqreb milligramma (1) u li jkollu riżoluzzjoni ta' 0,1 mg 5.2. Bekkijiet ta' 25 ml u ta' 100 ml 5.3. Pipetti ta' millilitru (1 ml) u ta' 10 ml 5.4. Ħawwad manjetiku 5.5. Pipetti gradwati ta' 0,2 ml, ta' 0,5 ml u ta' 5 ml 5.6. Flasks volumetriċi ta' 10 ml, ta' 50 ml u ta' 100 ml 5.7. Siringi ta' 20 ml u ta' 100 ml 5.8. Banju ultrasoniku 5.9. Magna ċentrifuga, li taħdem f'27 000 × g 5.10. Fjali tal-ħġieġ ta' madwar 5 ml 5.11. Ċilindru gradwat ta' 25 ml 5.12. Miter tal-pH, preċiż sa 0,1 unitajiet tal-pH 5.13. Tagħmir tal-HPLC 5.13.1. Sistema ta' ppumpjar bi gradjent, li taħdem f'1,0 ml kull minuta f'200 bar 5.13.2. Apparat li jieħu l-kampjuni b'mod awtomatiku b'kapaċità ta' derivatizzazzjoni 5.13.3. Ħiter tal-kolonna, li jżomm il-kolonna f'temperatura ta' 30 °C ± 1 °C 5.13.4. Detettur tal-fluworexxenza, li jaħdem f'tul ta' mewġa tal-eċitazzjoni ta' 330 nm u f'tul ta' mewġa tal-emissjoni ta' 440 nm 5.13.5. Integratur jew softwer tal-ipproċessar tad-dejta li jkejjel l-erja tal-quċċata 5.13.6. Kolonna “LiChrospher® — 100” (ta' 250 b'4,6 mm) jew kolonna ekwivalenti ppakkjata bl-ottadeċilsilan (C 18), b'daqs tal-partiċelli ta' 5 μm. 6. TEĦID TAL-KAMPJUNI Il-kampjuni għandhom jittieħdu skond l-istandard ISO 707. 7. PROĊEDURA 7.1. Tħejjija tas-soluzzjoni standard interna 7.1.1. Iżen 30,0 ± 0,1 mg ta' monoidroklorur tat-triptamina (4.2.3) ġo flask volumetriku ta' 100 ml (5.6) u żid sal-marka bil-metanol (4.2.1) 7.1.2. Bil-pipetta (5.3) poġġi millilitru ta' din is-soluzzjoni ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6) u żid sal-marka bil-metanol (4.2.1) sabiex tikseb konċentrazzjoni tat-triptamina ta' 0,15 mM. 7.2. Tħejjija tas-soluzzjoni tal-kampjun għat-test 7.2.1. Iżen 1,000 ± 0,001 g tal-kampjun tat-trab tal-ħalib xkumat ġo bekk ta' 25 ml (5.2). Bil-pipetta (5.3) żid 10 ml ta' ilma ddistillat f'40 °C ± 1 °C u ħawwad b'ħawwad manjetiku (5.4) għal 30 minuta biex tħoll kull boċċa li jista' jkun hemm 7.2.2. Bil-pipetta (5.5) poġġi 0,2 ml tal-ħalib rikostitwit ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6), żid 100 μl mis-soluzzjoni tat-triptamina ta' 0,15 mM (7.1) b'siringa (5.7) u żid sal-volum bil-metanol (4.2.1). Ħallat b'attenzjoni billi taqilbu u tissonikah (5.8) għal 15-il minuta 7.2.3. Għaddih mill-magna ċentrifuga (5.9) f'27 000 g × g għal 10 minuti u iġbor is-supernatant fi fjala tal-ħġieġ (5.10) Nota: Is-soluzzjoni tal-kampjun għat-test għandha tinħażen f'temperatura ta' 4 °C sa ma ssir l-analiżi tal-HPLC. 7.3. Tħejjija tas-soluzzjoni standard esterna 7.3.1. Iżen 55,4 mg ta' PEDP (4.1) ġo flask volumetriku ta' 50 ml (5.6) u żid madwar 25 ml ta' kloroform (4.2.2) billi tuża ċilindru gradwat (5.11). Saħħan il-flask magħluq sa ma dan jilħaq temperatura ta' 50 °C ± 1 °C u ħallat b'attenzjoni sakemm jinħall il-PEDP. Berred il-flask sa ma dan jilħaq temperatura ta' 20 °C, żid sal-volum bil-metanol (4.2.1) u ħallat billi taqilbu 7.3.2. Bil-pipetta (5.3) poġġi millilitru ta' din is-soluzzjoni ġo flask volumetriku ta' 100 ml (5.6) u żid sal-volum bil-metanol (4.2.1). Bil-pipetta (5.3) poġġi millilitru ta' din is-soluzzjoni ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6), żid 100 μl (5.7) mis-soluzzjoni tat-triptammina ta' 0,15 mM (7.1) u żid sal-volum bil-metanol (4.2.1). Ħallat billi taqilbu Nota: Is-soluzzjoni tal-kampjun ta' referenza għandha tinħażen f'temperatura ta' 4 °C sa ma ssir l-analiżi tal-HPLC. 7.4. Tħejjija tar-reaġent tad-derivatizzazzjoni Iżen 225,0 ± 0,1 mg tal-OPA (4.3.4) ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6), żid 0,5 ml (5.5) ta' metanol (4.2.1) u ħawwad b'attenzjoni biex tħoll l-OPA. Żid sal-marka b'soluzzjoni tal-aċidu boriku (4.3.2) u żid 20 μl ta' 2-merkaptoetanol (4.3.3) b'siringa (5.7). Nota: Ir-reaġent tad-derivatizzazzjoni għandu jinħażen f'temperatura ta' 4 °C fi fjala tal-ħġieġ kannella u jibqa' stabbli ġimgħa. 7.5. Determinazzjoni bl-HPLC 7.5.1. Solventi ta' elwizzjoni (4.4) Solvent A: Soluzzjoni ta' diidroġenufosfat tas-sodju ta' 0,3 mM u soluzzjoni ta' aċetat tas-sodju ta' 3 mM (aġġustata għal pH ta' 6,5 ± 0,1 bl-aċidu aċetiku): metanol: tetraidrofuran = 558:440:2 (v/v/v) Solvent B: metanol 7.5.2. Gradjent ta' elwizzjoni ssuġġerit:
Nota: Jista' jkun li l-gradjent ta' elwizzjoni jkun irid jinbidel xi ftit biex tinkiseb ir-riżoluzzjoni murija fil-Figura 1. Temperatura tal-kolonna: 30 °C. 7.5.3. Volum tal-injezzjoni: 50 μl ta' reaġent tad-derivatizzazzjoni u 50 μl ta' soluzzjoni tal-kampjun 7.5.4. Ekwilibrazzjoni tal-kolonna Qabbad is-sistema kuljum, laħlaħ il-kolonna b'100 % tas-solvent B għal 15-il minuta, imbagħad issettjaha għal A:B = 40:60 u ekwilibraha b'millilitru għal kull minuta għal 15-il minuta. Agħmel prova inbjank billi tinjetta l-metanol (4.2.1). Nota: Qabel ma l-kolonna tinħażen fit-tul, laħlaħha bil-metanol:kloroform = 80:20 (v/v) għal 30 minuta. 7.5.5. Iddetermina l-kontenut ta' fosfatidilserina u l-kontenut ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test 7.5.6. Wettaq is-sekwenza tal-analiżi kromatografiċi u żomm l-istess ħin bejn prova u oħra sabiex tikseb ħinijiet ta' retenzjoni kostanti. Injetta s-soluzzjoni standard esterna (7.3) kull 5 sa 10 soluzzjonijiet tal-kampjun għat-test sabiex tikkalkula l-fattur tar-rispons. Nota: Naddaf il-kolonna billi tlaħlaħha b'100 % tas-solvent B (7.5.1) għal mill-inqas 30 minuta kull 20 sa 25 prova. 7.6. Mod ta' integrazzjoni 7.6.1. Il-quċċata tal-PEDP Il-PEDP jiġi elwit bħala quċċata waħda. Ikkalkula l-erja tal-quċċata permezz ta' integrazzjoni “valley-to-valley”. 7.6.2. Il-quċċata tat-triptamina It-triptamina tiġi elwita bħala quċċata waħda (ara Figura 1). Iddetermina l-erja tal-quċċata permezz ta' integrazzjoni “valley-to-valley”. 7.6.3. Gruppi ta' qċaċet tal-fosfatidilserina u tal-fosfatidiletanolammina Bil-kundizzjonijiet deskritti (Figura 1), il-fosfatidilserina (PS) tiġi elwita bħala żewġ qċaċet ewlenin li ma jkunux riżolti għalkollox ippreċeduti minn quċċata minuri. Il-fosfatidiletanolammina (PE) tiġi elwita bħala tliet qċaċet ewlenin li ma jkunux riżolti għalkollox. Iddetermina l-erja kollha ta' kull grupp ta' qċaċet u bħala linja bażi ħu dik murija fil-Figura 1. 8. KALKOLU TAR-RIŻULTATI U ESPRESSJONI TAGĦHOM Il-kontenut ta' fosfatidilserina u ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test għandu jiġi kkalkulat kif ġej: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)) fejn:
9. PREĊIŻJONI TAL-METODU Nota: Il-valuri tar-ripetibbiltà ġew ikkalkulati skont l-Istandard Internazzjonali tal-IDF (*). 9.1. Ripetibbiltà Id-devjazzjoni standard relattiva tar-ripetibbiltà, li tesprimi l-varjabbiltà tar-riżultati analitiċi indipendenti li l-istess operatur jikseb bl-użu tal-istess apparat bl-istess kundizzjonijiet u fuq l-istess kampjun għat-test f'intervall qasir taż-żmien, ma għandhiex taqbeż it-2 % b'mod relattiv. Jekk jinkisbu żewġ determinazzjonijiet b'dawn il-kundizzjonijiet, id-differenza relattiva bejn iż-żewġ riżultati ma għandhiex tkun ta' iktar minn 6 % tal-medja aritmetika tar-riżultati. 9.2. Riproduċibbiltà Jekk l-operaturi jiksbu żewġ determinazzjonijiet f'laboratorji differenti bl-użu ta' apparat differenti u b'kundizzjonijiet differenti, għall-analiżi tal-istess kampjun għat-test, id-differenza relattiva bejn iż-żewġ riżultati ma għandhiex tkun ta' iktar minn 11 % tal-medja aritmetika tar-riżultati. 10. BIBLIJOGRAFIJA 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., “Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Figura 1 Profil tal-HPLC tad-derivati tal-OPA tal-fosfatidilserina (PS) u tal-fosfatidiletanolammina (PE) f'estratt tal-metanol tat-trab tal-ħalib xkumat rikostitwit. Qed jiġi rrappurtat il-mod ta' integrazzjoni tal-qċaċet tal-PS, tal-PE u tat-triptamina (l-istandard intern)
Appendiċi II ID-DETEZZJONI TAX-XORROX TAT-TAMES FIT-TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT GĦALL-ĦŻIN PUBBLIKU BID-DETERMINAZZJONI TAL-KASEINOMAKROPEPTIDI PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA LIKWIDA TA' RENDIMENT GĦOLI (L-HPLC) 1. SKOP U KAMP TA' APPLIKAZZJONI Dan il-metodu jippermetti d-detezzjoni tax-xorrox tat-tames fit-trab tal-ħalib xkumat maħsub għall-ħżin pubbliku bid-determinazzjoni tal-kaseinomakropeptidi. 2. REFERENZA L-Istandard Internazzjonali ISO 707 - “Milk and milk products – Guidance on sampling” (“Ħalib u prodotti tal-ħalib – Gwida dwar it-teħid tal-kampjuni”). 3. DEFINIZZJONI Il-kontenut ta' solidi tax-xorrox tat-tames huwa ddefinit bħala l-perċentwali skont il-massa kif stabbilit mill-kontenut ta' kaseinomakropeptidi bil-proċedura deskritta. 4. PRINĊIPJU
5. REAĠENTI Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku rikonoxxut. L-ilma li jintuża għandu jkun iddistillat jew ikun tal-inqas pur b'mod ekwivalenti. 5.1. Soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku Ħoll 240 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku (CCl3COOH) fl-ilma u żid sa 1 000 ml. Is-soluzzjoni għandha tkun ċara u bla kulur. 5.2. Soluzzjoni tal-elwent ta' pH 6,0 Ħoll 1,74 g ta' idroġenufosfat tad-dipotassju (K2HPO4), 12,37 g ta' diidroġenufosfat tal-potassju (KH2PO4) u 21,41 g ta' sulfat tas-sodju (Na2SO4) f'madwar 700 ml ilma. Jekk ikun hemm bżonn aġġusta s-soluzzjoni sa pH ta' 6,0, billi tuża soluzzjoni ta' aċidu fosforiku jew ta' idrossidu tal-potassju. Żid sa 1 000 ml bl-ilma u omoġenizza. Nota: Il-kompożizzjoni tal-elwent tista' tiġi aġġornata biex tikkonforma maċ-ċertifikat tal-istandards jew tar-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur tal-materjal tal-ippakkjar tal-kolonna. Qabel tużaha, għaddi s-soluzzjoni tal-elwent minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm. 5.3. Solvent tat-tlaħliħ Ħallat volum wieħed ta' aċetonitril (CH3CN) ma' disa' volumi ilma. Qabel tużaha, għaddi t-taħlita minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm. Nota: Jista' jintuża kwalunkwe solvent ieħor tat-tlaħliħ b'effett ta' batteriċida li ma jnaqqasx l-effiċjenza tar-riżoluzzjoni tal-kolonni. 5.4. Kampjuni standard 5.4.1. Trab tal-ħalib xkumat li jissodisfa r-rekwiżiti ta' dan ir-Regolament (jiġifieri [0]) 5.4.2. L-istess trab tal-ħalib xkumat adulterat b'5 % (m/m) trab tax-xorrox tat-tip tat-tames li jkollu kompożizzjoni standard (jiġifieri [5]). 6. APPARAT 6.1. Miżien analitiku 6.2. Magna ċentrifuga fakultattiva li tilħaq forza ċentrifugali ta' 2 200 gramma, mgħammra b'tubi taċ-ċentrifugazzjoni magħluqin b'għatu jew b'tapp li jesgħu madwar 50 ml 6.3. Xejker mekkaniku 6.4. Ħawwad manjetiku 6.5. Imbiebet tal-ħġieġ b'dijametru ta' madwar 7 cm 6.6. Karti filtru ta' filtrazzjoni medja b'dijametru ta' madwar 12,5 cm 6.7. Tagħmir tal-filtrazzjoni magħmul mill-ħġieġ b'filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm 6.8. Pipetti gradwati li minnhom jgħaddu 10 ml (tal-Klassi A tal-istandard ISO 648 jew tal-istandard ISO/R 835), jew sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 10,0 ml f'żewġ minuti 6.9. Sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 20,0 ml ta' ilma f'temperatura ta' madwar 50 °C 6.10. Banjumarija termostatiku ssettjat f'temperatura ta' 25C ± 0,5 °C 6.11. Tagħmir tal-HPLC, magħmul minn dan li ġej:
7. TEĦID TAL-KAMPJUNI 7.1. Il-kampjuni għandhom jittieħdu skont il-proċedura stabbilita fl-Istandard Internazzjonali ISO 707. Madanakollu, l-Istati Membri jistgħu jużaw metodu ieħor tat-teħid tal-kampjuni, dejjem jekk dan ikun konformi mal-prinċipji tal-istandard imsemmi hawn fuq 7.2. Aħżen il-kampjun f'kundizzjonijiet li jaqtgħu barra kull taħsir jew tibdil fil-kompożizzjoni. 8. PROĊEDURA 8.1. Tħejjija tal-kampjun għat-test Ittrasferixxi t-trab tal-ħalib għal ġo kontenitur li jkun jesa' madwar id-doppju tal-volum tat-trab, li jkollu għatu li ma tgħaddix l-arja minnu. Agħlaq il-kontenitur mill-ewwel. Ħallat it-trab tal-ħalib sewwa permezz ta' inverżjoni ripetuta tal-kontenitur. 8.2. Porzjon tal-kampjun għat-test Iżen 2,000 g ± 0,001 g tal-kampjun għat-test f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni (6.2) jew fi flask magħluq adattat (50 ml). 8.3. Tneħħija tax-xaħam u tal-proteini 8.3.1. Żid 20,0 ml ta' misħun (b'temperatura ta' 50 °C) mal-porzjon tal-kampjun għat-test. Ħoll it-trab billi tħawdu għal ħames minuti bl-użu ta' xejker mekkaniku (6.3). Qiegħed it-tubu fil-banjumarija (6.10) u ħallih jekwilibra ruħu sa ma jilħaq temperatura ta' 25 °C 8.3.2. F'żewġ minuti żid 10,0 ml tas-soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku (5.1) li jkollha temperatura ta' madwar 25 °C, filwaqt li tħawwad bil-qawwa bl-għajnuna ta' ħawwad manjetiku (6.4). Qiegħed it-tubu f'banjumarija (6.10) u ħallih għal 60 minuta 8.3.3. Għaddi s-soluzzjoni mill-magna ċentrifuga (6.2) f'2 200 g għal 10 minuti, jew għaddiha minn ġo karta filtru (6.6), u armi l-ewwel 5 ml tal-filtrat. 8.4. Determinazzjoni permezz tal-kromatografija 8.4.1. Injetta 15 sa 30 μl ta' supernatant jew ta' filtrat (8.3.3) imkejjel b'mod preċiż fit-tagħmir tal-HPLC (6.11) li jkun qiegħed jaħdem b'rata tal-fluss ta' 1,0 ml ta' soluzzjoni tal-elwent (5.2) kull minuta. Nota 1: Tista' tintuża rata oħra tal-fluss skont id-dijametru intern tal-kolonni li jintużaw jew l-istruzzjonijiet tal-manifattur tal-kolonna. Nota 2: Laħlaħ il-kolonni bl-ilma waqt kull interruzzjoni. Is-soluzzjoni tal-elwent (5.2) tħalliha qatt fihom. Qabel kull interruzzjoni ta' aktar minn 24 siegħa, laħlaħ il-kolonni bl-ilma, imbagħad aħsilhom bis-soluzzjoni (5.3) għal mill-anqas tliet sigħat b'rata tal-fluss ta' 0,2 ml kull minuta. 8.4.2. Ir-riżultati tal-analiżi kromatografika tal-kampjun għat-test [E] jinkisbu fil-forma ta' kromatogramma li fiha kull quċċata hija identifikata mill-ħin ta' retenzjoni tagħha (RT), kif ġej:
L-għażla tal-kolonna (jew tal-kolonni) tista' taffettwa l-ħinijiet ta' retenzjoni tal-qċaċet individwali b'mod konsiderevoli. L-integratur (6.11.6) jikkalkula awtomatikament l-erja A ta' kull quċċata:
Huwa essenzjali li tiġi eżaminata d-dehra ta' kull kromatogramma qabel ma ssir l-interpretazzjoni kwantitattiva sabiex tiġi identifikata kull anomalija li jista' jkun hemm minħabba xi ħsara fl-apparat jew fil-kolonni jew minħabba l-oriġini u n-natura tal-kampjun li jkun qed jiġi analizzat. F'każ ta' dubju, irrepeti l-analiżi. 8.5. Kalibrazzjoni 8.5.1. Applika eżatt l-istess proċedura deskritta fil-punti 8.2 sa 8.4.2 għall-kampjuni standard (5.4) Uża soluzzjonijiet li jkunu tħejjew dak il-ħin, għaliex is-CMP jiddegradaw f'ambjent li jkun 8 % trikloroaċetiku. Hu stmat li, f'temperatura ta' 30 °C, ikun hemm telf ta' 0,2 % kull siegħa. 8.5.2. Qabel id-determinazzjoni tal-kampjuni permezz tal-kromatografija, ikkundizzjona l-kolonni billi tinjetta b'mod ripetut il-kampjun standard (5.4.2) fis-soluzzjoni (8.5.1) sakemm l-erja tal-quċċata u l-ħin ta' retenzjoni tiegħu li jikkorrispondu għas-CMP ikunu kostanti. 8.5.3. Iddetermina l-fatturi tar-rispons R billi tinjetta l-istess volum ta' filtrati (8.5.1) bħal dak użat għall-kampjuni. 9. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI 9.1. Metodu tal-kalkolu u formuli 9.1.1. Kalkolu tal-fatturi tar-rispons R:
fejn:
fejn:
9.1.2. Kalkolu tal-erja relattiva tal-qċaċet fil-kampjun [E]:
fejn:
9.1.3. Kalkolu tal-ħin relattiv ta' retenzjoni tal-quċċata III fil-kampjun [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) fejn:
9.1.4. L-esperimenti wrew li hemm relazzjoni lineari bejn il-ħin relattiv ta' retenzjoni tal-quċċata III, jiġifieri RRTIII[E] u l-perċentwali ta' trab tax-xorrox miżjud sa 10 %.
L-inċertezza permessa għall-valuri ta' RRTIII hija ta' ± 0,002. Normalment il-valur ta' RRTIII[0] ftit jiddevja minn 1,034. Il-valur jista' joqrob lejn l-1,000, imma dejjem għandu jkun iktar minn hekk, skont il-kundizzjoni tal-kolonni. 9.2. Kalkolu tal-perċentwali ta' trab tax-xorrox tat-tames fil-kampjun: W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0,9)] fejn:
9.3. Preċiżjoni tal-proċedura 9.3.1. Ripetibbiltà Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet li l-istess analista jwettaq fl-istess ħin jew wieħed wara l-ieħor malajr bl-użu tal-istess apparat fuq materjal identiku tat-testijiet, ma għandhiex taqbeż iż-0,2 % m/m. 9.3.2. Riproduċibbiltà Id-differenza bejn żewġ riżultati speċifiċi indipendenti, miksubin f'żewġ laboratorji differenti fuq materjal identiku tat-testijiet, ma għandhiex taqbeż iż-0,4 % m/m. 9.4. Interpretazzjoni 9.4.1. Assumi li m'hemmx xorrox jekk l-erja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri SIII[E], espressa fi grammi ta' xorrox tat-tames għal kull 100 g tal-prodott, hija ta' ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9) fejn:
9.4.2. Jekk l-erja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri SIII[E], tkun ta' > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) u l-erja relattiva tal-quċċata II, jiġifieri SII[E], tkun ta' ≤ 160, iddetermina l-kontenut ta' xorrox tat-tames hekk kif indikat fil-punt 9.2. 9.4.3. Jekk l-erja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri SIII[E], tkun ta' > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) u l-erja relattiva tal-quċċata II, jiġifieri SII[E], tkun ta' ≤ 160, iddetermina l-kontenut totali ta' proteini (P %), u mbagħad eżamina l-graffs 1 u 2. 9.4.3.1. Id-dejta li nkisbet wara li ġew analizzati l-kampjuni tat-trab tal-ħalib xkumat mhux adulterat b'kontenut totali għoli ta' proteini nġabret fil-graffs 1 u 2. Il-linja kontinwa tirrappreżenta r-rigressjoni lineari, li l-koeffiċjenti tagħha jiġu kkalkulati billi jintuża l-metodu tal-inqas kaxex. Il-linja dritta miksura tistabbilixxi l-limitu massimu tal-erja relattiva tal-quċċata III, u bil-probabbiltà li dan il-limitu ma jinqabiżx f'90 % tal-każijiet. L-ekwazzjonijiet għal-linji dritti miksurin fil-graffs 1 u 2 huma:
rispettivament, fejn:
Dawn l-ekwazzjonijiet huma ekwivalenti għaċ-ċifra ta' 1,3 msemmija fil-punt 9.2. Id-differenza (T1 u T2) bejn l-erja relattiva SIII[E] li tkun instabet u l-erja relattiva SIII tingħata permezz tal-ekwazzjonijiet li ġejjin: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)].
Il-kontenut ta' xorrox tat-tames jiġi kkalkulat bl-użu tal-formula li ġejja: W = T2 + 0,91 fejn: 0,91 hija d-distanza fuq l-assi vertikali bejn il-linja dritta sħiħa u l-linja dritta miksura.
Appendiċi III DETERMINAZZJONI TAS-SOLIDI TAX-XORROX TAT-TAMES FIT-TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT 1. SKOP: ID-DETEZZJONI TAŻ-ŻIEDA TA' SOLIDI TAX-XORROX TAT-TAMES FIT-TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT 2. REFERENZI: L-ISTANDARD INTERNAZZJONALI ISO 707 3. DEFINIZZJONI Il-kontenut ta' solidi tax-xorrox tat-tames huwa ddefinit bħala l-perċentwali skont il-massa hekk kif stabbilit mill-kontenut ta' kaseinomakropeptidi bil-proċedura deskritta. 4. PRINĊIPJU Il-kampjuni jiġu analizzati għall-kaseinomakropeptide A permezz tal-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (l-HPLC) f'fażi inversa. Ir-riżultat jiġi evalwat b'referenza għall-kampjuni standard magħmulin minn trab tal-ħalib xkumat li jkun fih perċentwali ta' trab tax-xorrox li jkun magħruf jew li ma jkunx magħruf. Meta jinkisbu riżultati ogħla minn 1 % (m/m), ifisser li fil-kampjun ikun hemm is-solidi tax-xorrox tat-tames. 5. REAĠENTI Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku rikonoxxut. L-ilma li jintuża għandu jkun iddistillat jew ikun tal-inqas pur b'mod ekwivalenti. L-aċetonitril għandu jkun ta' kwalità spettroskopika jew tal-HPLC. 5.1. Soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku Ħoll 240 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku (CCl3COOH) fl-ilma u żid sa 1 000 ml. Is-soluzzjoni għandha tkun ċara u bla kulur. 5.2. Elwenti A u B Elwent A: 150 ml ta' aċetonitril (CH3CN), 20 ml ta' isopropanol (CH3CHOHCH3) u 1,00 ml ta' aċidu trifluworoaċetiku (TFA, CF3COOH) jitqiegħdu ġo flask volumetriku ta' 1 000 ml. Żid sa 1 000 ml bl-ilma. Elwent B: 550 ml ta' aċetonitril, 20 ml ta' isopropanol u 1,00 ml ta' TFA jitqiegħdu ġo flask volumetriku ta' 1 000 ml. Żid sa 1 000 ml bl-ilma. Qabel tużaha, għaddi s-soluzzjoni tal-elwent minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm. 5.3. Konservazzjoni tal-kolonna Wara l-analiżi, il-kolonna titlaħlaħ bl-elwent B (permezz ta' gradjent) u wara titlaħlaħ bl-aċetonitril (permezz ta' gradjent għal 30 minuta). Il-kolonna tinħażen fl-aċetonitril. 5.4. Kampjuni standard 5.4.1. Trab tal-ħalib xkumat li jissodisfa r-rekwiżiti għall-ħżin pubbliku (jiġifieri [0]). 5.4.2. L-istess trab tal-ħalib xkumat adulterat b'5 % (m/m) trab tax-xorrox tat-tip tat-tames li jkollu kompożizzjoni standard (jiġifieri [5]). 5.4.3. L-istess trab tal-ħalib xkumat adulterat b'50 % (m/m) trab tax-xorrox tat-tip tat-tames li jkollu kompożizzjoni standard (jiġifieri [50]). 6. APPARAT 6.1. Miżien analitiku 6.2. Magna ċentrifuga fakultattiva li tilħaq forza ċentrifugali ta' 2 200 gramma, mgħammra b'tubi taċ-ċentrifugazzjoni magħluqin b'għatu jew b'tapp li jkunu jesgħu madwar 50 ml 6.3. Xejker mekkaniku 6.4. Ħawwad manjetiku 6.5. Imbiebet tal-ħġieġ b'dijametru ta' madwar 7 cm 6.6. Karti filtru ta' filtrazzjoni medja b'dijametru ta' madwar 12,5 cm 6.7. Tagħmir tal-filtrazzjoni magħmul mill-ħġieġ b'filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm 6.8. Pipetti gradwati li minnhom jgħaddu 10 ml (tal-Klassi A tal-istandard ISO 648 jew tal-istandard ISO/R 835), jew sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 10,0 ml f'żewġ minuti 6.9. Sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 20,0 ml ta' ilma f'temperatura ta' madwar 50 °C 6.10. Banjumarija termostatiku ssettjat f'temperatura ta' 25C ± 0,5 °C 6.11. Tagħmir tal-HPLC, magħmul minn dan li ġej:
7. TEĦID TAL-KAMPJUNI 7.1. Il-kampjuni għandhom jittieħdu skont il-proċedura stabbilita fl-Istandard Internazzjonali ISO 707. Madanakollu, l-Istati Membri jistgħu jużaw metodu ieħor tat-teħid tal-kampjuni, dejjem jekk dan ikun konformi mal-prinċipji tal-istandard imsemmi hawn fuq 7.2. Aħżen il-kampjun f'kundizzjonijiet li jaqtgħu barra kull taħsir jew tibdil fil-kompożizzjoni. 8. PROĊEDURA 8.1. Tħejjija tal-kampjun għat-test Ittrasferixxi t-trab tal-ħalib għal ġo kontenitur li jkun jesa' madwar id-doppju tal-volum tat-trab, li jkollu għatu li ma tgħaddix l-arja minnu. Agħlaq il-kontenitur mill-ewwel. Ħallat it-trab tal-ħalib sewwa permezz ta' inverżjoni ripetuta tal-kontenitur. 8.2. Porzjon tal-kampjun għat-test Iżen 2,00 g ± 0,001 g tal-kampjun għat-test f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni (6.2) jew fi flask magħluq adattat (50 ml). Nota: Fil-każ tat-taħlitiet, iżen ammont tal-kampjun għat-test hekk li l-porzjon tal-kampjun bix-xaħam imneħħi minnu jkun jikkorrispondi għal 2,00 g. 8.3. Tneħħija tax-xaħam u tal-proteini 8.3.1. Żid 20,0 ml ta' misħun (b'temperatura ta' 50 °C) mal-porzjon tal-kampjun għat-test. Ħoll it-trab billi tħawdu għal ħames minuti bl-użu ta' xejker mekkaniku (6.3). Qiegħed it-tubu fil-banjumarija (6.10) u ħallih jekwilibra ruħu sa ma jilħaq temperatura ta' 25 °C 8.3.2. F'żewġ minuti żid b'mod kostanti 10,0 ml tas-soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku (5.1) li jkollha temperatura ta' madwar 25 °C, filwaqt li tħawwad bil-qawwa bl-għajnuna ta' ħawwad manjetiku (6.4). Qiegħed it-tubu f'banjumarija (6.10) u ħallih għal 60 minuta 8.3.3. Għaddi s-soluzzjoni mill-magna ċentrifuga (6.2) f'2 200 g għal 10 minuti, jew għaddiha minn ġo karta filtru (6.6), u armi l-ewwel 5 ml tal-filtrat. 8.4. Determinazzjoni permezz tal-kromatografija 8.4.1. Il-metodu tal-HPLC f'fażi inversa jeskludi l-possibbiltà li jkun hemm riżultati pożittivi foloz minħabba l-preżenza tat-trab tax-xorrox aċiduż tal-butir. 8.4.2. Qabel titwettaq l-analiżi permezz tal-HPLC f'fażi inversa, għandhom jittejbu kemm jista' jkun il-kundizzjonijiet tal-gradjent. Għas-sistemi bi gradjent li jkollhom volum mejjet ta' madwar 6 ml (il-volum mill-punt fejn is-solventi jiltaqgħu sal-volum tal-loop tal-injettatur, b'dan inkluż), 26 minuta ± 2 minuti hu l-aħjar ħin ta' retenzjoni għas-CMPA. Għas-sistemi bi gradjent li jkollhom volum mejjet iktar baxx (pereżempju ta' 2 ml), għandhom jittieħdu 22 minuta bħala l-aħjar ħin ta' retenzjoni. Ħu soluzzjonijiet tal-kampjuni standard (5.4) b'50 % xorrox tat-tames u mingħajru. Injetta 100 μl ta' supernatant jew ta' filtrat (8.3.3) fit-tagħmir tal-HPLC li jkun qiegħed jaħdem bil-kundizzjonijiet tal-gradjent esploratorju mogħtija fit-Tabella 1. Tabella 1 Il-kundizzjonijiet tal-gradjent esploratorju biex tittejjeb kemm jista' jkun il-kromatografija
Jekk wieħed iqabbel iż-żewġ kromatogrammi, wieħed għandu jsib fejn tinsab il-quċċata tas-CMPΑ. Bl-użu tal-formula mogħtija hawn taħt, tista' tiġi kkalkulata l-kompożizzjoni inizjali tas-solvent li għandha tintuża għall-gradjent normali (ara l-punt 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11 fejn:
8.4.3. Ħu soluzzjonijiet tal-kampjuni għat-test Injetta 100 μl ta' supernatant jew ta' filtrat (8.3.3) imkejjel b'mod preċiż fit-tagħmir tal-HPLC li jkun qiegħed jaħdem b'rata tal-fluss ta' 1,0 ml ta' soluzzjoni tal-elwent (5.2) kull minuta. Il-kompożizzjoni tal-elwent fil-bidu tal-analiżi tinkiseb mill-punt 8.4.2. Normalment din tkun qrib ta' A:B = 76:24 (5.2). Eżatt wara l-injezzjoni jinbeda gradjent lineari, li wara 27 minuta jispiċċa f'żieda ta' 5 % fil-perċentwali ta' B. Wara jinbeda gradjent lineari, li f'ħames minuti jġib il-kompożizzjoni tal-elwent għal 90 % ta' B. Din il-kompożizzjoni tinżamm għal ħames minuti, imbagħad, permezz ta' gradjent lineari, f'ħames minuti tinbidel għal dik tal-bidu. L-injezzjoni li jkun imiss tkun tista' ssir kwarta wara li jkunu ntlaħqu l-kundizzjonijiet tal-bidu, skont il-volum intern tas-sistema ta' ppumpjar. Nota 1: Il-ħin ta' retenzjoni tas-CMPA għandu jkun ta' 26 minuta ± 2 minuti. Dan jista' jintlaħaq billi tvarja l-kundizzjonijiet tal-bidu u tat-tmiem tal-ewwel gradjent. Madanakollu, id-differenza fil-perċentwali B fil-kundizzjonijiet tal-bidu u fil-kundizzjonijiet tat-tmiem tal-ewwel gradjent għandha tibqa' ta' 5 % ta' B. Nota 2: L-elwenti għandu jitneħħilhom biżżejjed gass u għandhom ukoll jinżammu nieqsa mill-gass. Dan huwa essenzjali biex is-sistema ta' ppumpjar bi gradjent taħdem sewwa. Id-devjazzjoni standard tal-ħin ta' retenzjoni tal-quċċata tas-CMPA għandha tkun ta' inqas minn 0,1 ta' minuta (n = 10). Nota 3: Il-kampjun ta' referenza [5] għandu jiġi injettat kull ħames kampjuni u jintuża biex jiġi kkalkulat fattur ġdid tar-rispons R (9.1.1). 8.4.4. Ir-riżultati tal-analiżi kromatografika tal-kampjun għat-test (E) jinkisbu fil-forma ta' kromatogramma li fiha l-quċċata tas-CMPA tiġi identifikata mill-ħin ta' retenzjoni tagħha ta' madwar 26 minuta. L-integratur (6.11.6) jikkalkula awtomatikament l-għoli tal-quċċata, H, tal-quċċata tas-CMPA. F'kull kromatogramma għandu jiġi ċċekkjat fejn tinsab il-linja bażi. L-analiżi jew l-integrazzjoni għandha ssir mill-ġdid jekk il-linja bażi tkun ġiet lokalizzata ħażin. Nota: Jekk il-quċċata tas-CMPA tkun imbiegħda biżżejjed mill-qċaċet l-oħrajn għandha tintuża l-allokazzjoni tal-linja bażi “valley-to valley”, inkella għandek tiġbed linji perpendikulari għal linja bażi komuni, li għandha tibda f'punt li jkun qrib il-quċċata tas-CMPA (u b'hekk mhux fil-ħin t = 0 minuti).Uża l-istess tip ta' integrazzjoni għall-istandard u għall-kampjuni u, jekk tuża linja bażi komuni, iċċekkja li din tkun konsistenti fl-istandard u fil-kampjuni. Huwa essenzjali li tiġi eżaminata d-dehra ta' kull kromatogramma qabel ma ssir l-interpretazzjoni kwantitattiva sabiex tiġi identifikata kull anomalija li jista' jkun hemm minħabba xi ħsara fl-apparat jew fil-kolonna jew minħabba l-oriġini u n-natura tal-kampjun li jkun qed jiġi analizzat. F'każ ta' dubju, irrepeti l-analiżi. 8.5. Kalibrazzjoni 8.5.1. Applika eżatt il-proċedura deskritta fil-punti 8.2 sa 8.4.4 għall-kampjuni standard (5.4.1 sa 5.4.2). Uża soluzzjonijiet li jkunu tħejjew dak il-ħin, għaliex is-CMP jiddegradaw f'ambjent ta' 8 % ta' aċidu trikloroaċetiku f'temperatura ambjentali. F'temperatura ta' 4 °C, is-soluzzjoni tibqa' stabbli għal 24 siegħa. Fil-każ ta' xi serje twila ta' analiżi, tajjeb li jintuża tilar imberred għall-kampjuni fl-injettatur awtomatiku. Nota: Il-punt 8.4.2. jista' jitħalla barra jekk il-perċentwali B fil-kundizzjonijiet tal-bidu jkun magħruf mill-analiżi li jkunu saru qabel. Il-kromatogramma tal-kampjun ta' referenza [5] għandha tkun l-istess bħal dik murija fil-Figura 1. F'din il-figura, qabel il-quċċata tas-CMPA hemm żewġ qċaċet żgħar. Huwa essenzjali li tinkiseb separazzjoni simili. 8.5.2. Qabel id-determinazzjoni tal-kampjuni permezz tal-kromatografija, injetta 100 μl tal-kampjun standard mingħajr xorrox tat-tames [0] (5.4.1) Fil-kromatogramma ma għandux ikun hemm quċċata fil-ħin ta' retenzjoni tal-quċċata tas-CMPA. 8.5.3. Iddetermina l-fatturi tar-rispons R billi tinjetta l-istess volum ta' filtrat (8.5.1) bħal dak użat għall-kampjuni. 9. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI 9.1. Metodu tal-kalkolu u formuli 9.1.1. Kalkolu tal-fattur tar-rispons R: Il-quċċata tas-CMPA: R = W/H fejn:
9.2. Kalkolu tal-perċentwali ta' trab tax-xorrox tat-tames fil-kampjun W(E) = R × H(E) fejn:
Jekk il-valur ta' W(E) ikun ikbar minn 1 % u d-differenza bejn il-ħin ta' retenzjoni u dak tal-kampjun standard [5] tkun ta' inqas minn 0,2 ta' minuta, allura fil-kampjun hemm is-solidi tax-xorrox tat-tames. 9.3. Preċiżjoni tal-proċedura 9.3.1. Ripetibbiltà Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet li l-istess analista jwettaq fl-istess ħin jew wieħed wara l-ieħor malajr bl-użu tal-istess apparat fuq materjal identiku tat-testijiet, ma għandhiex taqbeż iż-0,2 % m/m. 9.3.2. Riproduċibbiltà Mhux stabbilita. 9.3.3. Linearità Minn 0 sa 16 % ta' xorrox tat-tames għandha tinkiseb relazzjoni lineari b'koeffiċjent tal-korrelazzjoni ta' > 0,99. 9.4. Interpretazzjoni Il-limitu ta' 1 % jinkludi l-inċertezza minħabba r-riproduċibbiltà. Figura 1 L-istandard Ni—4.6
|
(3) |
jiżdiedu l-Annessi li ġejjin: “ ANNESS VI Metodi għall-analiżi tal-butir li jkun jinsab fil-ħżin privat
ANNESS VII Metodi għall-analiżi tat-trab tal-ħalib xkumat li jkun jinsab fil-ħżin privat
ANNESS VIII Metodi għall-analiżi tal-ġobon li jkun jinsab fil-ħżin privat
Appendiċi METODU GĦAD-DETEZZJONI TAL-ĦALIB U TAL-KASEINAT TAL-BAQAR FIL-ĠOBON MAGĦMUL MILL-ĦALIB TAN-NAGĦAĠ, MILL-ĦALIB TAL-MOGĦOŻ JEW MILL-ĦALIB TAL-BUFLU JEW MINN TAĦLITA TA' ĦALIB TAN-NAGĦAĠ, TA' ĦALIB TAL-MOGĦOŻ U TA' ĦALIB TAL-BUFLU 1. SKOP Id-detezzjoni tal-ħalib u tal-kaseinat tal-baqar fil-ġobon magħmul mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu permezz tal-iffukar iżoelettriku tal-kaseini γ wara l-plażminoliżi. 2. KAMP TA' APPLIKAZZJONI Il-metodu huwa adattat għad-detezzjoni sensittiva u speċifika tal-ħalib u tal-kaseinat tal-baqar, ittrattati bis-sħana jew le, f'ġobon frisk u mmaturat magħmul mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu. Huwa mhuwiex adattat għad-detezzjoni tal-adulterazzjoni tal-ħalib u tal-ġobon permezz tal-konċentrati tal-proteini tax-xorrox tal-ħalib tal-baqar ittrattati bis-sħana. 3. PRINĊIPJU TAL-METODU 3.1. L-iżolament tal-kaseini mill-ġobon u l-istandards ta' referenza 3.2. It-taħlil tal-kaseini iżolati u s-sottomissjoni għall-qsim permezz tal-plażmina (EC.3.4.21.7) 3.3. Iffukar iżoelettriku tal-kaseini ttrattati bil-plażmina fil-preżenza tal-urea u t-tilwin tal-proteini 3.4. L-evalwazzjoni tal-profili tal-kaseini γ2 u γ3 imlewna (prova tal-preżenza tal-ħalib tal-baqar) billi l-profil miksub mill-kampjun jitqabbel ma' dawk miksubin fl-istess ġell mill-istandards ta' referenza li jkun fihom 0 % u 1 % ħalib tal-baqar. 4. REAĠENTI Sakemm ma jkunx indikat mod ieħor, għandhom jintużaw biss sustanzi kimiċi ta' grad analitiku. L-ilma għandu jkun iddistillat darbtejn jew ikun pur b'mod ekwivalenti. Nota: Id-dettalji li ġejjin japplikaw għall-ġellijiet tal-poliakrilammid li jitħejjew f'laboratorju u li jkun fihom l-urea, li jkunu kbar 265 mm b'125 mm b'0.25 mm. Fejn jintużaw ġellijiet ta' daqsijiet u ta' tipi oħrajn, għandu mnejn ikollhom jiġu aġġustati l-kundizzjonijiet tas-separazzjoni. Iffukar iżoelettriku 4.1. Reaġenti għall-produzzjoni tal-ġellijiet tal-poliakrilammid li jkun fihom l-urea 4.1.1. Soluzzjoni ewlenija tal-ġell Ħoll:
fl-ilma u żid sa 100 ml u erfa' s-soluzzjoni fi flixkun tal-ħġieġ kannella fil-friġġ. Nota: Tista' tinxtara soluzzjoni tal-akrilammid/BIS imħallta lesta biex tintuża b'mod preferenzjali minflok il-piżijiet iffissati tal-akrilammidi newrotossiċi li qed jiġu kkwotati. Meta t-tali soluzzjoni jkun fiha 30 % w/v ta' akrilammid u 0,8 % w/v ta' BIS, għall-formulazzjoni għandu jintuża volum ta' 16,2 ml minflok il-piżijiet iffissati. Is-soluzzjoni ewlenija tibqa' stabbli għal perjodu massimu ta' għaxart ijiem; jekk din ikollha konduttività ta' aktar minn 5 μS, iddejonizzaha billi tħawwadha ma' 2 g ta' amberlit MB-3 għal 30 minuta, imbagħad għaddiha minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm. 4.1.2. Soluzzjoni tal-ġell Ħejji soluzzjoni tal-ġell billi tħallat l-addittivi u l-amfoliti (*) mas-soluzzjoni ewlenija tal-ġell (ara l-punt 4.1.l):
Ħallat is-soluzzjoni tal-ġell u ħalli l-gass joħroġ minnha għal żewġ sa tliet minuti f'banju ultrasoniku jew f'vakwu. Nota: Ħejji s-soluzzjoni tal-ġell eżatt qabel tferragħha (ara l-punt 6.2). 4.1.3. Soluzzjonijiet tal-katalizzaturi 4.1.3.1. N, N, N′ N′ — tetrametiletilendiammina (Temed) 4.1.3.2. Persulfat tal-ammonju (PER) ta' 40 % w/v: Ħoll 800 mg ta' PER fl-ilma u żid sa 2 ml. Nota: Dejjem uża soluzzjoni tal-PER li tkun għadha kemm tħejjiet. 4.2. Fluwidu ta' kuntatt Kerosin jew paraffina likwida 4.3. Soluzzjoni anodika Ħoll 5,77 g ta' aċidu fosforiku (ta' 85 % w/w) fl-ilma u żidu bl-ilma sa ma jkollok 100 ml. 4.4. Soluzzjoni katodika Ħoll 2,00 g ta' idrossidu tas-sodju fl-ilma u żidu bl-ilma sa ma jkollok 100 ml. Tħejjija tal-kampjun 4.5. Reaġenti għall-iżolament tal-proteini 4.5.1. Aċidu aċetiku dilwit (25,0 ml ta' aċidu aċetiku glaċjali miżjud sa 100 ml bl-ilma) 4.5.2. Diklorometan 4.5.3. Aċeton 4.6. Soluzzjoni mewwieta għat-taħlil tal-proteini Ħoll:
fl-ilma u żid sa 50 ml. Nota: Erfa' s-soluzzjoni fil-friġġ; din tibqa' stabbli għal perjodu massimu ta' ġimgħa. 4.7. Reaġenti għall-qsim tal-kaseini permezz tal-plażmina 4.7.1. Soluzzjoni mewwieta tal-karbonat tal-ammonju Ittitra għal pH 8 soluzzjoni tal-idroġenukarbonat tal-ammonju ta' 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml ilma) li jkun fiha l-aċidu etilendiamminatetraaċetiku ta' 0,05 mol/l (l-EDTA, 1,46 g/100 ml) permezz ta' soluzzjoni tal-karbonat tal-ammonju ta' 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml ilma) li jkun fiha 0,05 mol/l ta' EDTA. 4.7.2. Plażmina bovina (EC.3.4.21.7), b'attività ta' mill-inqas 5 U/ml 4.7.3. Soluzzjoni tal-aċidu aminokaprojku għall-inibizzjoni enzimatika Ħoll 2,624 g ta' aċidu aminokaprojku (aċidu 6-amino-n-eżanojku) f'100 ml ta' etanol ta' 40 % (v/v). 4.8. Standards 4.8.1. L-Istitut tal-Materjali u l-Kejl ta' Referenza tal-Kummissjoni, li jinsab f'B-2440 Geel, il-Belġju, għandu għad-dispożizzjoni standards ta' referenza ċċertifikati ta' taħlita tal-ħalib xkumat tal-mogħoż u tan-nagħaġ mizjud bit-tames li fiha 0 % u 1 % ħalib tal-baqar 4.8.2. Tħejjija tal-istandards temporanji għal-laboratorju tal-ħalib tal-buflu miżjud bit-tames li fih 0 % u 1 % ħalib tal-baqar Il-ħalib xkumat jitħejja billi l-ħalib tal-baqar jew tal-buflu bl-ingrossa u mhux ipproċessat jingħadda għal 20 minuta minn magna ċentrifuga f'temperatura ta' 37 °C b'2 500 g. Wara li t-tubu u l-kontenut tiegħu jitberrdu malajr malajr sa ma jilħqu temperatura ta' 6 sa 8 °C, is-saff ta' fuq tax-xaħam jitneħħa kompletament. Biex jitħejja l-istandard ta' 1 % żid 5,00 ml ta' ħalib xkumat tal-baqar ma' 495 ml ta' ħalib xkumat tal-buflu f'bekk ta' litru u aġġusta l-pH għal 6,4 billi żżid l-aċidu lattiku dilwit (ta' 10 % w/v). Aġġusta t-temperatura għal 35 °C u żid 100 μl ta' tames tal-għoġol (attività tat-tames ta' 1: 10 000, jiġifieri ta' madwar 3 000 U/ml), ħawwad għal minuta u mbagħad ħalli l-bekk mgħotti għal siegħa b'fojl tal-aluminju f'temperatura ta' 35 °C sabiex tkun tista' tifforma l-baqta. Wara li tkun iffurmat il-baqta, il-ħalib kollu miżjud bit-tames jiġi lijofilizzat mingħajr ma jiġi omoġenizzat minn qabel u mingħajr ma jitneħħilu x-xorrox. Wara li jiġi lijofilizzat, jintaħan irqiq biex isir trab omoġenju. Biex jitħejja l-istandard ta' 0 %, għandha ssir l-istess proċedura bl-użu tal-ħalib xkumat pur tal-buflu. L-istandards għandhom jinħażnu f'temperatura ta' – 20 °C. Nota: Huwa rrakkomandat li tiġi ċċekkjata l-purità tal-ħalib tal-buflu permezz tal-iffukar iżoelettriku tal-kaseini ttrattati bil-plażmina qabel jitħejjew l-istandards. Reaġenti għat-tilwin tal-proteini 4.9. Fissativ Ħoll 150 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku fl-ilma u żid sa 1 000 ml. 4.10. Soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin Żid l-ilma ddistillat ma' 500 ml ta' metanol u 200 ml ta' aċidu aċetiku glaċjali sa ma jkollok 2 000 ml. Nota: Ħejji s-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin kuljum; din tista' titħejja billi tħallat l-istess volumi tas-soluzzjonijiet ewlenin tal-metanol ta' 50 % (v/v) u tal-aċidu aċetiku glaċjali ta' 20 % (v/v). 4.11. Soluzzjonijiet għat-tilwin 4.11.1. Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni ewlenija nru 1) Ħoll 3,0 g ta' Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) f'1 000 ml ta' metanol ta' 90 % (v/v) billi tuża ħawwad manjetiku (għal madwar 45 minuta) u għaddi s-soluzzjoni minn ġo żewġ filtri mitwijin ta' veloċità medja. 4.11.2. Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni ewlenija nru 2) Ħoll 5,0 g ta' sulfat tar-ram pentaidrat f'1 000 ml ta' aċidu aċetiku ta' 20 % (v/v). 4.11.3. Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni biex taħdem biha) Ħallat flimkien 125 ml minn kull waħda mis-soluzzjonijiet ewlenin (4.11.1, 4.11.2) eżatt qabel it-tilwin. Nota: Is-soluzzjoni għat-tilwin għandha titħejja dakinhar li tkun se tintuża. 5. °C 5.1. Ħġiġiet (ta' 265 mm b'125 mm b'4 mm); romblu tal-lasktu (wiesa' 15-il cm); mejda tal-livellar 5.2. Folja fejn jitqiegħed il-ġell (ta' 265 mm b'125 mm) 5.3. Folja li sservi ta' għata (ta' 280 mm b'125 mm). Qabbad strixxa tejp li jwaħħal (ta' 280 mm b'6 mm b'0,25 mm) ma' kull naħa twila ta' din il-folja (ara l-Figura 1) 5.4. Kamra tal-iffukar elettriku bi pjanċa tat-tkessiħ (pereżempju ta' 265 mm b'125 mm) u provvista tal-elettriku adattata (ta' ≥ 2,5 kV) jew apparat awtomatiku tal-elettroforeżi 5.5. Krijostatu taċ-ċirkolazzjoni, ikkontrollat b'mod termostatiku f'temperatura ta' 12-il °C ± 0,5 °C 5.6. Magna ċentrifuga li tista' tiġi aġġustata sa 3 000 g 5.7. Strixxi tal-elettrodi (twal ≥ 265 mm) 5.8. Fliexken tal-plastik tat-taqtir għas-soluzzjonijiet anodiċi u katodiċi 5.9. Applikaturi tal-kampjuni (ta' 10 mm b'5 mm, b'karta filtru tal-visk jew b'adsorbiment baxx tal-proteini) 5.10. Dixxijiet tal-azzar inossidabbli jew tal-ħġieġ għat-tilwin u għat-tneħħija tat-tilwin (pereżempju tilari għall-għodod ta' 280 mm b'150 mm) 5.12. Omoġenizzatur bil-vireg aġġustabbli (b'xaft b'dijametru ta' 10 mm), li jkollu spid ta' bejn 8 000 u 20 000 rotazzjoni kull minuta 5.13. Ħawwad manjetiku 5.14. Banju ultrasoniku 5.15. Welder tar-riti 5.16. Mikropipetti ta' 25 μl 5.17. Konċentratur b'vakwu jew apparat għal-lijofilizzazzjoni 5.18. Banjumarija kkontrollat b'mod termostatiku li jista' jiġi aġġustat għal temperatura ta' 35 °C u ta' 40 °C ± 1 °C b'xejker 5.19. Densitometru li kapaċi jaqra f'medda tal-frekwenza ta' λ = 634 nm 6. PROĊEDURA 6.1. Tħejjija tal-kampjun 6.1.1. Iżolament tal-kaseini Iżen ammont li huwa ekwivalenti għal massa niexfa ta' 5 g ta' ġobon jew tal-istandards ta' referenza f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni ta' 100 ml, żid 60 ml ilma ddistillat u omoġenizza l-kampjun b'omoġenizzatur bil-vireg (bi spid ta' bejn 8 000 u 10 000 rotazzjoni kull minuta). Aġġusta l-kampjun bl-aċidu aċetiku dilwit (4.5.1) biex il-pH jiġi ta' 4,6 u għaddih mill-magna ċentrifuga (fi 3 000 g għal ħames minuti). Ferra' x-xaħam u x-xorrox, omoġenizza r-residwu bi spid ta' 20 000 rotazzjoni kull minuta f'40 ml ta' ilma ddistillat aġġustat bl-aċidu aċetiku dilwit (4.5.1) biex il-pH jiġi ta' 4,5, żid 20 ml ta' diklorometan (4.5.2), erġa' omoġenizza l-kampjun u għaddih mill-magna ċentrifuga (fi 3 000 g għal ħames minuti). Neħħi bi spatula s-saff tal-kaseina li jkun qiegħed bejn il-fażi milwiema u dik organika (ara l-Figura 2) u battal iż-żewġ fażijiet. Omoġenizza mill-ġdid il-kaseina f'40 ml ta' ilma ddistillat (ara hawn fuq) u 20 ml ta' diklorometan (4.5.2) u għaddiha mill-magna ċentrifuga. Irrepeti din il-proċedura sakemm iż-żewġ fażijiet ta' estrazzjoni jitilfu l-kulur (darbtejn jew tlieta). Omoġenizza r-residwu tal-proteini b'50 ml ta' aċeton (4.5.3) u għaddih minn ġo karta filtru mitwija ta' veloċità medja. Aħsel ir-residwu fuq il-filtru b'żewġ porzjonijiet separati ta' 25 ml ta' aċeton kull darba u ħallih jinxef għall-arja jew f'kurrent tan-nitroġenu, imbagħad itħnu fin f'mehrież. Nota: L-iżolati mnixxfin tal-kaseina għandhom jinżammu f'temperatura ta' – 20 °C. 6.1.2. Qsim tal-kaseini β permezz tal-plażmina biex jiġu intensifikati l-kaseini γ Xerred 25 mg tal-kaseini iżolati (6.1.1) f'0,5 ml ta' soluzzjoni mewwieta tal-karbonat tal-ammonju (4.7.1) u omoġenizza għal 20 minuta billi tuża, pereżempju, trattament ultrasoniku. Saħħan għal 40 °C u żid 10 μl ta' plażmina (4.7.2), ħallat u inkuba għal siegħa f'temperatura ta' 40 °C filwaqt li ċċaqlaq b'mod kontinwu. Biex tinibixxi l-enzima, żid 20 μl ta' soluzzjoni tal-aċidu aminokaprojku (4.7.3), imbagħad żid 200 mg ta' urea solida u 2 mg ta' ditijotreitol. Nota: Biex il-faxex iffukati tal-kaseina jkunu iktar simmetriċi, huwa rrakkomandat li s-soluzzjoni tiġi lijofilizzata wara li jiżdied l-aċidu aminokaprojku u li mbagħad ir-residwi jinħallu f'0,5 ml ta' soluzzjoni mewwieta għat-taħlil tal-proteini (4.6). 6.2. Tħejjija tal-ġellijiet tal-poliakrilammid li jkun fihom l-urea Bl-għajnuna ta' ftit taqtiriet tal-ilma, irrombla l-folja fejn jitqiegħed il-ġell (5.2) għal fuq ħġieġa (5.1), filwaqt li tneħħi l-ilma żejjed b'kartaxuga jew b'tixju. Irrombla l-folja li sservi ta' għata (5.3) bis-separaturi (0,25 mm) fuq ħġieġa oħra bl-istess mod. Qiegħed il-ħġieġa b'mod orizzontali fuq mejda tal-livellar. Żid 10 μl ta' Temed (4.1.3.1) mas-soluzzjoni tal-ġell li tkun ħejjejt u li minnha tkun neħħejt l-arja (4.1.2), ħawwadha u żid 10 μl ta' soluzzjoni tal-PER (4.1.3.2), ħallatha sewwa u ferra' s-soluzzjoni mill-ewwel b'mod unit fiċ-ċentru tal-folja li sservi ta' għata. Qiegħed naħa waħda tal-ħġieġa tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell (bin-naħa tal-folja 'l isfel) fuq il-ħġieġa tal-folja li sservi ta' għata u baxxiha bil-mod il-mod għal fuqha biex tifforma rita tal-ġell uniformi u mingħajr bżieżaq bejn il-folji (ara l-Figura 3). Niżżel b'attenzjoni l-ħġieġa tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell kompletament billi tuża spatula rqiqa u poġġilha tliet ħġiġiet oħra fuqha biex iservu ta' piż. Wara li titlesta l-polimerizzazzjoni (proċess li jieħu madwar 60 minuta), neħħi l-ġell polimerizzat għal fuq il-folja fejn jitqiegħed il-ġell flimkien mal-folja li sservi ta' għata billi tiftaħ il-ħġiġiet minn ma' xulxin. Naddaf in-naħa ta' wara tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell b'attenzjoni biex tneħħi r-residwi tal-ġell u l-urea. Iwweldja s-“sandwiċ tal-ġell” biex tifforma tubu tar-rita u erfa' dan it-tubu fil-friġġ (għal perjodu massimu ta' sitt ġimgħat). Nota: Il-folja li sservi ta' għata bis-separaturi tista' terġa' tintuża. Il-ġell tal-poliakrilammid jista' jinqata' f'biċċiet iżgħar, li huwa rrakkomandat meta jkun hemm ftit kampjuni jew f'każ li jintuża apparat awtomatiku tal-elettroforeżi (żewġ ġellijiet ta' daqs ta' 4,5 cm b'5 cm). 6.3. Iffukar iżoelettriku Issettja t-termostat tat-tkessiħ f'temperatura ta' 12-il °C. Imsaħ in-naħa ta' wara tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell bil-kerosin (4.2), imbagħad itfa' ftit taqtiriet tal-kerosin fiċ-ċentru tal-blokka tat-tkessiħ. Wara rrombla s-“sandwiċ tal-ġell” fuqha, bin-naħa fejn jitqiegħed il-ġell 'l isfel, filwaqt li toqgħod attent li tevita l-bżieżaq. Imsaħ il-kerosin żejjed li jista' jkun hemm u neħħi l-folja li sservi ta' għata. Xarrab l-istrixxi tal-elettrodi bis-soluzzjonijiet tal-elettrodi (4.3 u 4.4), aqtagħhom skont it-tul tal-ġell u poġġihom fil-pożizzjonijiet ipprovduti (f'distanza ta' 9,5 cm mill-elettrodi). Kundizzjonijiet għall-iffukar iżoelettriku: 6.3.1. Daqs tal-ġell ta' 265 mm b'125 mm b'0,25 mm
Nota: Jekk tinbidel il-ħxuna jew il-wisa' tal-ġellijiet, il-valuri tal-kurrent u tal-potenza għandhom jiġu aġġustati b'mod xieraq (pereżempju rdoppja l-valuri tal-kurrent elettriku u tal-potenza jekk jintuża ġell ta' 265 × 125 × 0,5 mm). 6.3.2. Eżempju ta' programm ta' vultaġġ għall-apparat awtomatiku tal-elettroforeżi (żewġ ġellijiet ta' 5,0 cm b'4,5 cm), bl-elettrodi mingħajr strixxi applikati direttament għall-ġell.
Qiegħed l-applikatur tal-kampjuni fl-istadju 2 f'0 Vh. Neħħi l-applikatur tal-kampjuni fl-istadju 2 f'30 Vh. 6.4. Tilwin tal-proteini 6.4.1. Iffissar tal-proteini Neħħi l-istrixxi tal-elettrodi immedjatament wara li twaqqaf il-magna u poġġi l-ġell immedjatament f'dixx għat-tilwin jew għat-tneħħija tat-tilwin li jkun mimli b'200 ml ta' fissativ (4.9); ħallih hemm għal 15-il minuta, filwaqt li ċċaqalqu l-ħin kollu. 6.4.2. Hasil u tilwin tal-ħġieġa tal-ġell Skula kompletament il-fissativ u aħsel il-ħġieġa tal-ġell darbtejn għal 30 sekonda kull darba b'100 ml tas-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin (4.10). Ferra' s-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin u imla d-dixx b'250 ml ta' soluzzjoni għat-tilwin (4.11.3); ħalliha tieħu l-kulur għal 45 minuta filwaqt li ċċaqlaqha bil-mod. 6.4.3. Tneħħija tat-tilwin mill-ħġieġa tal-ġell Ferra' s-soluzzjoni għat-tilwin, aħsel il-ħġieġa tal-ġell darbtejn bl-użu ta' 100 ml soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin (4.10) kull darba, imbagħad ċaqlaqha b'200 ml soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin għal 15-il minuta u rrepeti l-istadju tat-tneħħija tat-tilwin mill-anqas darbtejn jew tlieta sakemm l-isfond jiċċara u jkun tilef il-kulur. Imbagħad laħlaħ il-ħġieġa tal-ġell bl-ilma ddistillat (2 × 2 minuti) u ħalliha tinxef għall-arja (għal sagħtejn sa tliet sigħat) jew nixxifha b'hairdryer (għal 10 sa 15-il minuta). Nota 1: Eżegwixxi t-twaħħil, il-ħasil, it-tilwin u t-tneħħija tat-tilwin f'temperatura ta' 20 °C. Tużax temperaturi għoljin. Nota 2: Jekk ikun ippreferut tilwin tal-fidda aktar sensittiv (pereżempju Kit tat-Tilwin tal-Fidda, Proteini (“Silver Staining Kit, Protein”), Pharmacia Biotech, Nru tal-Kodiċi 17-1150-01), kampjuni ta' kaseina ttrattati bil-plażmina għandhom jiġu dilwiti b'5 mg/ml. 7. EVALWAZZJONI L-evalwazzjoni ssir billi jitqabblu l-profili tal-proteini tal-kampjun mhux magħruf mal-istandards ta' referenza dwar l-istess ġell. Id-detezzjoni tal-ħalib tal-baqar fil-ġobon mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż u mill-ħalib tal-buflu u minn taħlitiet ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu ssir permezz tal-kaseini γ2 u γ3, li l-punti iżoelettriċi tagħhom ivarjaw bejn pH 6,5 u pH 7,5 (il-Figuri 4 a u b u l-Figura 5). Il-limitu ta' detezzjoni huwa ta' anqas minn 0,5 %. 7.1. Stima viżwali Għall-evalwazzjoni viżwali tal-ammont ta' ħalib bovin, huwa rrakkomandat li jiġu aġġustati l-konċentrazzjonijiet tal-kampjuni u tal-istandards biex jinkiseb l-istess livell ta' intensità tal-kaseini γ2 u γ3 ovini, kaprini u/jew tal-bufli (ara “γ2 E, G, B” u“γ3 E, G, B” fil-Figuri 4 a u b u fil-Figura 5). Wara dan, l-ammont ta' ħalib bovin (anqas, daqs jew aktar minn 1 %) fil-kampjun mhux magħruf jista' jiġi aġġudikat direttament billi l-intensità tal-kaseini γ2 u γ3 bovini (ara “γ2 C” u“γ3 C” fil-Figuri 4 a u b u fil-Figura 5) titqabbel ma' dawk tal-istandards ta' referenza ta' 0 % u ta' 1 % (nagħaġ, mogħoż) jew mal-istandards temporanji għal-laboratorju (bufli). 7.2. Stima densitometrika Jekk tkun disponibbli, applika d-densitometrija (5.19) għall-kejl tal-proporzjon tal-erja tal-quċċata tal-kaseini γ2 u γ3 bovini ma' dik tal-kaseini γ2 u γ3 ovini, kaprini u/jew tal-bufli (ara l-Figura 5). Qabbel dan il-valur mal-proporzjon tal-erja tal-quċċata tal-kaseini γ2 u γ3 tal-istandard ta' referenza ta' 1 % (nagħaġ, mogħoż) jew mal-istandard temporanju għal-laboratorju (bufli) analizzat fuq l-istess ġell. Nota: Il-metodu jaħdem b'mod sodisfaċenti jekk ikun hemm sinjal pożittiv ċar għall-kaseini γ2 u γ3 bovini fl-istandard ta' referenza ta' 1 % iżda mhux fl-istandard ta' referenza ta' 0 %. Jekk le, ottimizza l-proċedura billi ssegwi bi preċiżjoni d-dettalji tal-metodu. Kampjun jitqies li huwa pożittiv jekk il-kaseini γ2 u γ3 bovini jew il-proporzjonijiet tal-erja tal-quċċata korrispondenti jkunu daqs il-livell tal-istandard ta' referenza ta' 1 % jew akbar minnu. 8. BIBLIJOGRAFIJA Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.,“Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins”. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L., “A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting”. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.,“Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier”. Fi: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989). Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P., “Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen”. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Radola B.J., “Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films”. Electrophoresis 1, 43-56 (1980). Figura 1 Tpinġija skematika tal-folja li sservi ta' għata
Figura 2 Saff ta' kaseina sospiż bejn il-fażi milwiema u dik organika wara ċ-ċentrifugazzjoni
Figura 3 It-teknika tal-“flapping” għall-ikkastjar ta' ġellijiet tal-poliakrilammid irqaq ħafna
a = it-tejp separatur (ta' 0,25 mm); b = il-folja li sservi ta' għata (5.3); c, e = il-ħġiġiet (5.1); d = soluzzjoni tal-ġell (4.1.2); f = il-folja fejn jitqiegħed il-ġell (5.2). Figura 4a Iffukar iżoelettriku ta' kaseini minn ħalib tan-nagħaġ u tal-mogħoż li fih ammonti differenti ta' ħalib tal-baqar, ittrattati bil-plażmina.
% CM = il-perċentwali ta' ħalib tal-baqar, C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż. Qed jintwera n-nofs ta' fuq tal-ġell IEF. Figura 4b Iffukar iżoelettriku tal-kaseini mill-ġobon magħmul minn taħlitiet ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu li jkun fihom ammonti differenti ta' ħalib tal-baqar u li jkunu ġew ittrattati bil-plażmina.
% CM = il-perċentwali ta' ħalib tal-baqar; 1 + = kampjun li fih 1 % ta' ħalib tal-baqar u spajkjat b'kaseina bovina pura f'nofs il-linja. C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż, B = bufli. Qed tintwera d-distanza totali ta' separazzjoni tal-ġell IEF. Figura 5 Soprapożizzjoni tad-densitogrammi tal-istandards (STD) u tal-kampjuni tal-ġobon magħmul minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ u ta' ħalib tal-mogħoż wara l-iffukar iżoelettriku
a, b = standards li fihom 0 u 1 % ħalib tal-baqar; c-g = kampjuni tal-ġobon li fihom 0, 1, 2, 3 u 7 % ħalib tal-baqar. C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż. In-nofs ta' fuq tal-ġell IEF ġie skannjat b'λ = 634 nm. ANNESS IX Evalwazzjoni tal-analiżi 1. Garanzija tal-kwalità L-analiżi għandha titwettaq minn laboratorji maħtura skont l-Artikolu 12 tar-Regolament (KE) Nru 882/2004 (**) jew maħtura mill-awtoritajiet kompetenti tal-Istat Membru. 2. Teħid tal-kampjuni u tilwim dwar ir-riżultati tal-analiżi
Appendiċi Evalwazzjoni tal-konformità ta' konsenja mal-limitu legali 1. Prinċipju F'każ li l-leġiżlazzjoni dwar l-intervent pubbliku u l-ħżin privat tistabilixxi proċeduri ta' teħid tal-kampjuni, dawn il-proċeduri għandhom jiġu segwiti. Fil-każijiet l-oħra kollha għandu jintuża kampjun ta' mill-anqas tliet unitajiet ta' kampjuni meħudin b'mod aleatorju mill-konsenja mibgħuta għall-kontroll. Jista' jitħejja kampjun kompost. Ir-riżultat miksub għandu jitqabbel mal-limiti legali permezz ta' kalkolu ta' intervall ta' kunfidenza ta' 95 % ugwali għad-doppju tad-devjazzjoni standard, fejn id-devjazzjoni standard rilevanti tkun tiddependi fuq jekk (1) il-metodu jkunx ġie vvalidat fl-ambitu tal-kollaborazzjoni internazzjonali b'valuri għal σr u σR, jew (2) fil-każ ta' validazzjoni interna, tkunx ġiet ikkalkulata r-riproduċibbiltà interna. Dan l-intervall ta' kunfidenza mbagħad ikun ugwali għall-inċertezza fil-kejl tar-riżultat. 2. Il-metodu huwa vvalidat fl-ambitu tal-kollaborazzjoni internazzjonali F'dan il-każ id-devjazzjoni standard tar-ripetibbiltà σr u d-devjazzjoni standard tar-riproduċibbiltà σR ikunu ġew stabbiliti u l-laboratorju jkun jista' juri l-konformità mal-karatteristiċi tar-rendiment tal-metodu vvalidat. Ikkalkula l-medja aritmetika tal-kejl ripetut n drabi. Ikkalkula l-inċertezza tal-kejl estiża (k = 2) ta' bħala
Jekk ir-riżultat finali x tal-kejl ikun ġie kkalkulat bl-użu tal-formula tat-tip x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 jew x = y 1/y 2 f'dawn il-każijiet għandhom jiġu segwiti l-proċeduri normali għall-ikkombinar tad-devjazzjonijiet standard. Il-konsenja titqies li ma tkunx konformi mal-limitu legali superjuri UL jekk ; inkella titqies li tkun konformi mal-UL. Il-konsenja titqies li ma tkunx konformi mal-limitu legali inferjuri LL jekk ; inkella titqies li tkun konformi mal-LL. 3. Validazzjoni interna b'kalkolu tad-devjazzjoni standard interna tar-riproduċibbiltà F'każijiet fejn jintużaw metodi li mhumiex speċifikati f'dan ir-Regolament u fejn ma jkunux ġew stabbiliti miżuri ta' preċiżjoni, għandha titwettaq validazzjoni interna. Fil-formuli għall-kalkolu tal-inċertezza tal-kejl estiża U, minflok σr u σ R , għandhom jintużaw id-devjazzjoni standard interna tar-ripetibbiltà sir u d-devjazzjoni standard interna tar-riproduċibbiltà si R rispettivament. Ir-regoli li għandhom jiġu segwiti biex tiġi stabbilita l-konformità mal-limitu legali huma kif stabbiliti fil-punt 1. Madanakollu, jekk il-konsenja titqies li ma tkunx konformi mal-limitu legali, il-kejl għandu jiġi ripetut bil-metodu speċifikat f'dan ir-Regolament u r-riżultat jiġi evalwat skont il-punt 1.
” |
(1) L-aġenzija tal-pagamenti għandha tapprova l-metodu li għandu jintuża.
(2) Tista' ssir analiżi sistematika tal-partiċelli maħruqin. Madanakollu, dejjem għandha ssir it-tali analiżi jekk ma jkunu twettqu l-ebda kontrolli sensorji.
(3) L-aġenzija tal-pagamenti għandha tapprova l-metodu li għandu jintuża (wieħed minnhom jew it-tnejn li huma).
(4) L-aġenzija tal-pagamenti għandha tapprova l-metodu li għandu jintuża.
(5) Il-kontrolli sensorji għandhom jitwettqu meta jitqies li jkun hemm bżonnhom wara li ssir analiżi tar-riskji li tkun approvata mill-aġenzija tal-pagamenti.
(6) L-aġenzija tal-pagamenti għandha tapprova l-metodu li għandu jintuża.
(7) Applikazzjoni tal-kampjun: Wara l-iffukar minn qabel (l-istadju 1) il-pipetta 18 μl tal-kampjun u s-soluzzjonijiet standard fuq l-applikaturi tal-kampjuni (10 × 5 mm), poġġihom fuq il-ġell f'intervalli mbiegħda 1 mm minn xulxin u 5 mm lonġitudinalment mill-anodu u agħfas ftit. Eżegwixxi l-iffukar bl-użu tal-kundizzjonijiet t'hawn fuq, filwaqt li tneħħi bl-attenzjoni l-applikaturi tal-kampjuni wara 60 minuta ta' ffukar tal-kampjun.