“ANNESS VI

METODI TA’ ANALIŻI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAl-KOSTITWENTI TA’ ORIĠINI MILL-ANNIMALI GĦALL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-GĦALF

1.   L-GĦAN U L-KAMP TA’ APPLIKAZZJONI

Id-determinazzjoni tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali fl-għalf għandha ssir permezz ta’ mikroskopija ottika jew ta’ reazzjoni katina tal-polimerażi (PCR) skont id-dispożizzjonijiet stabbiliti f’dan l-Anness.

Dawn iż-żewġ metodi jagħmluha possibbli li tiġi individwata l-preżenza tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali f’materjali tal-għalf u fl-għalf kompost. Madankollu, dawn ma jagħmluhiex possibbli li jiġi kkalkolat l-ammont ta’ dawn il-kostitwenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost. Iż-żewġ metodi għandhom limitu ta’ individwazzjoni ta’ inqas minn 0,1 % (w/w).

Il-metodu PCR jagħmilha possibbli li jiġi identifikat il-grupp tassonomiku tal-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost.

Dawn il-metodi għandhom japplikaw għall-kontroll tal-applikazzjoni tal-projbizzjonijiet stabbiliti fl-Artikolu 7(1) u fl-Anness IV għar-Regolament (KE) Nru 999/2001 u fl-Artikolu 11(1) tar-Regolament (KE) Nru 1069/2009.

Skont it-tip ta’ għalf li qed jiġi ttestjat, dawn il-metodi jistgħu jintużaw, fi protokoll operazzjonali uniku wieħed, jew waħedhom jew flimkien skont il-proċeduri operattivi standard (SOP) stabbiliti mil-laboratorju ta’ referenza tal-UE għall-proteini tal-annimali fl-għalf (EURL-AP) u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu (1).

2.   IL-METODI

2.1.   Mikroskopija ottika

2.1.1.   Il-prinċipju

Il-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali li jistgħu jkunu preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost mibgħuta għall-analiżi huma identifikati fuq il-bażi tal-karatteristiċi tipiċi u identifikabbli mikroskopikament bħall-fibri tal-muskoli u partiċelli oħra tal-laħam, il-qarquċa, l-għadam, il-qrun, ix-xagħar, il-lanżit, id-demm, ir-rix, il-qxur tal-bajd, ix-xewk u l-qxur tal-ħut.

2.1.2.   Ir-reaġenti u t-tagħmir

2.1.2.1.   Ir-reaġenti

2.1.2.1.1.   Aġent ta’ konċentrazzjoni

2.1.2.1.1.1.   Tetrakloroetilen (gravità speċifika 1,62)

2.1.2.1.2.   Ir-reaġent għat-tilwin

2.1.2.1.2.1.   Soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina (dewweb 2,5 ml 1M aċidu idrokloriku f’100 ml ilma u żid 200 mg Aħmar Alżarin ma’ din is-soluzzjoni)

2.1.2.1.3.   Il-mezzi tal-immuntar

2.1.2.1.3.1.   Lissija (NaOH 2,5 % w/v jew KOH 2,5 % w/v)

2.1.2.1.3.2.   Gliċerol (mhux dilwit, viskożità: 1 490 cP)

2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskożità: 1 200 cP) jew raża bi proprjetajiet ekwivalenti għall-preparazzjoni tas-slajd permanenti

2.1.2.1.4.   Il-mezzi tal-immuntar bi proprjetajiet tat-tilwin

2.1.2.1.4.1.   Is-soluzzjoni lugol (dewweb 2 g jodur tal-potassju f’100 ml ilma u żid 1 g jodur filwaqt li tħawwad ta’ spiss)

2.1.2.1.4.2.   Ir-reaġent ċistina (2 g aċetat taċ-ċomb, 10 g NaOH/100 ml ilma)

2.1.2.1.4.3.   Ir-reaġent Fehling (ippreparat qabel l-użu minn partijiet indaqs (1/1) ta’ żewġ soluzzjonijiet ewlenin A u B. Soluzzjoni A: Dewweb 6,9 g sulfat tar-ram (II) pentaidrat f’100 ml ilma. Soluzzjoni B: dewweb 34,6 g tartrat tal-potassju u tas-sodju, tetraidrat u 12 g NaOH f’100 ml ilma)

2.1.2.1.4.4.   Tetrametilbenżidina/Perossidu tal-idroġenu. (dewweb 1 g 3,3’,5,5’ tetrametilbenżidina (TMB) f’100 ml aċidu aċetiku glaċjali u 150 ml ilma. Qabel l-użu, ħallat 4 partijiet ta’ din is-soluzzjoni TMB ma’ parti waħda 3 % perossidu tal-idroġenu)

2.1.2.1.5.   L-aġenti tat-tlaħliħ

2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (grad tekniku)

2.1.2.1.5.2.   Aċeton (grad tekniku)

2.1.2.1.6.   Ir-reaġent għall-ibbliċjar

2.1.2.1.6.1.   Is-soluzzjoni kummerċjali ipoklorit tas-sodju (9 – 14 % kloru attiv)

2.1.2.2.   It-tagħmir

2.1.2.2.1.   Miżien analitiku bi preċiżjoni ta’ 0,001 g

2.1.2.2.2.   Tagħmir tat-tħin: mitħna - jew mehrież

2.1.2.2.3.   Għeriebel bi xbieki kwadri ta’ 0,25 mm u 1 mm wisa’

2.1.2.2.4.   Il-lenbut għas-separazzjoni koniku tal-ħġieġ b’kontenut ta’ 250 ml b’tapp tal-ħġieġ matt jew tat-Teflon fil-qiegħ tal-lenbut. Id-dijametru tal-fetħa tat-tapp għandu jkun ≥ 4 mm. Alternattivament, jista’ jintuża bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment b’kundizzjoni li l-laboratorju jkun wera li l-livelli ta’ individwazzjoni huma ekwivalenti għal dawk miksuba bl-użu tal-lenbut għas-separazzjoni koniku tal-ħġieġ.

Il-lenbut għas-separazzjoni

2.1.2.2.5.   L-isterjomikroskopju li jkopri mill-inqas firxa ta’ manjetizzazzjoni finali bejn 6,5 × u 40 ×

2.1.2.2.6.   Mikroskopju kompost li jkopri mill-inqas firxa ta’ manjetizzazzjoni finali bejn 100 × u 400 × bi sfond ċar permezz tat-trażmissjoni tad-dawl. Jistgħu jintużaw ukoll id-dawl polarizzat u l-kuntrast interferenzjali differenzjali

2.1.2.2.7.   L-oġġetti tal-ħġieġ standard tal-laboratorju

2.1.2.2.8.   It-tagħmir għall-preparazzjoni tas-slajd: is-slajds tal-mikroskopju klassiċi, is-slajds vojta, il-coverslips (20 × 20 mm), il-pinzetti, l-ispatula fina

2.1.3.   It-teħid ta’ kampjuni u l-preparazzjoni tal-kampjuni

2.1.3.1.   It-teħid tal-kampjuni

Għandu jintuża kampjun rappreżentattiv, meħud b’konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.

2.1.3.2.   Il-prekawzjonijiet li jridu jittieħdu

Sabiex tiġi evitata t-transkontaminazzjoni tal-laboratorju, it-tagħmir kollu li jista’ jerġa’ jintuża għandu jitnaddaf bir-reqqa qabel ma jintuża. Il-biċċiet tal-lenbut għas-separazzjoni għandu jiġi żarmat qabel it-tindif. Il-biċċiet tal-lenbut għas-separazzjoni u l-oġġetti tal-ħġieġ għandhom jinħaslu minn qabel bl-idejn u mbagħad jinħaslu fil-magna tal-ħasil. L-għeriebel għandhom jitnaddfu permezz ta’ xkupilja bix-xagħar sintetiku u iebes. Huwa rrakomandat li l-għeriebel jitnaddfu bl-aċeton u bl-arja kkompressata wara t-tgħarbil tal-materjal xaħmi bħall-ħut mitħun.

2.1.3.3.   Il-preparazzjoni tal-kampjuni għajr ix-xaħam jew iż-żejt

2.1.3.3.1.    It-tnixxif tal-kampjun: il-kampjuni b’kontenut ta’ umdità > 14 % għandhom jitnixxfu qabel ma jiġu trattati.

2.1.3.3.2.    Tgħarbil minn qabel tal-kampjun: Huwa rakkomandat it-tgħarbil minn qabel f’1 mm ta’ għalf granulat u qlub u biex sussegwentement jiġu ppreparati u analizzati ż-żewġ frazzjonijiet li rriżultaw bħala kampjuni distinti.

2.1.3.3.3.    It-teħid ta’ sottokampjuni u t-tħin: għandu jittieħed is-sottokampjun ta’ mill-inqas 50 g tal-kampjun għall-analiżi u sussegwentement mitħun.

2.1.3.3.4.    L-estrazzjoni u l-preparazzjoni tas-sediment: porzjon ta’ 10 g (bi preċiżjoni sa 0,01 g) tas-sottokampjun mitħun għandu jiġi trasferit fil-lenbut għas-separazzjoni jew fil-bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment u għandu jiġi miżjud 50 ml ta’ tetrakloroetilen. Il-porzjon trasferit fil-lenbut għandu jkun limitat għal 3 g fil-każ tal-ħut mitħun jew prodotti tal-annimali puri oħrajn, ingredjenti minerali jew taħlitiet lesti minn qabel li jiġġeneraw aktar minn 10 % tas-sediment. It-taħlita għandha tiġi mħawda vigorożament għal mill-inqas 30 sekonda u għandu jiġi miżjud bir-reqqa mill-inqas 50 ml aktar ta’ tetrakloroetilen waqt il-ħasil tal-wiċċ ta’ ġewwa tal-lenbut biex titneħħa kull partiċella li tkun imwaħħla. It-taħlita li tirriżulta għandha titħalla toqgħod għal mill-anqas 5 minuti qabel ma s-sediment jiġi sseparat billi jinfetaħ it-tapp.

Jekk jintuża bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment, it-taħlita għandha mbagħad titħawwad vigorożament għal mill-anqas 15-il sekonda u kull partiċella mwaħħla mal-ġenb tal-bekk għandha tinħasel bir-reqqa biex titneħħa mill-wiċċ ta’ ġewwa b’mill-inqas 10 ml ta’ tetrakloroetilen nadif. It-taħlita għandha titħalla toqgħod għal 3 minuti u mbagħad terġa’ titħawwad għal 15-il sekonda u kull partiċella mal-ġenb tal-bekk għandha tinħasel bir-reqqa biex titneħħa minn mal-wiċċ ta’ ġewwa b’mill-inqas 10 ml ta’ tetrakloroetilen nadif. It-taħlita li tirriżulta għandha titħalla toqgħod għal mill-anqas 5 minuti u mbagħad il-frazzjoni likwida titneħħa u tintrama b’dikantazzjoni bir-reqqa, filwaqt li tingħata attenzjoni biex ma jintilef l-ebda sediment.

Is-sediment għandu jitnixxef u sussegwentement jintiżen (bi preċiżjoni sa 0,001 g). Jekk aktar minn 5 % tas-sediment jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.

2.1.3.3.5.    L-estrazzjoni u l-preparazzjoni tal-flotate: wara l-irkupru tas-sediment permezz tal-metodu deskritt hawn fuq, għandu jifdal żewġ fażijiet fil-lenbut għas-separazzjoni: waħda likwida magħmula minn tetrakloroetilen u waħda solida magħmula minn materjal li jżomm fil-wiċċ. Din il-fażi solida hija l-flotate u għandha tiġi rkuprata billi t-tetrakloroetilen jitferra ‘l barra kompletament mil-lenbut billi jinfetaħ it-tapp. Billi jinqaleb il-lenbut għas-separazzjoni, il-flotate għandu jiġi trasferit f’dixx Petri kbir u mnixxef bl-arja f’kabinett għad-dħaħen. Jekk aktar minn 5 % tal-flotate jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.

2.1.3.3.6.    Preparazzjoni tal-materja prima: għandu jitħejja porzjon ta’ mill-anqas 5 g tas-sottokampjun mitħun. Jekk aktar minn 5 % tal-materjal jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.

2.1.3.4.   Il-preparazzjoni ta’ kampjuni li jikkonsistu f’xaħam jew żejt

Il-protokoll li ġej għandu jiġi segwit għall-preparazzjoni ta’ kampjuni li jikkonsistu f’xaħam jew żejt:

—	jekk ix-xaħam huwa solidu, dan għandu jiġi msaħħan fil-forn sakemm isir likwidu;

—	bl-użu ta’ pipetta, għandu jiġi trasferit 40 ml ta’ xaħam jew żejt mill-qiegħ tal-kampjun lejn tubu taċ-ċentrifugazzjoni;

—	iċċentrifuga għal 10 minuti f’4 000 r.p.m.;

—	jekk ix-xaħam ikun solidu wara ċ-ċentrifugazzjoni, dan għandu jiġi msaħħan fil-forn sakemm isir likwidu;

—	irrepeti ċ-ċentrifugazzjoni għal 5 minuti f’4 000 r.p.m.;

—	bl-użu ta’ mgħarfa żgħira jew spatula, għandhom jiġu trasferiti nofs l-impuritajiet dekantati għas-slajds mikroskopiċi għal eżami, u l-Gliċerol huwa rakkomandat bħala l-mezz tal-immuntar;

—	l-impuritajiet li jkun fadal għandhom jintużaw għall-preparazzjoni tas-sediment kif deskritt fil-punt 2.1.3.3..

2.1.3.5.   L-użu ta’ reaġenti għat-tilwin

Sabiex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni korretta tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali, l-operatur jista’ juża r-reaġenti għat-tilwin matul il-preparazzjoni tal-kampjun skont il-linji gwida maħruġa mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

Fil-każ li tintuża s-soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina għat-tilwin tas-sediment, għandu japplika l-protokoll li ġej:

—	is-sediment imnixxef għandu jiġi trasferit f’test tube tal-ħġieġ u mlaħlaħ darbtejn b’madwar 5 ml ta’ etanol (kull darba għandu jintuża vortiċi ta’ 30 sekonda, is-solvent għandu jitħalla joqgħod għal madwar minuta u 30 sekonda u mbagħad imferra’ ‘l barra);

—

is-sediment għandu jiġi bbliċjat billi jiżdied mill-anqas 1 ml tas-soluzzjoni ipoklorit tas-sodju. Ir-reazzjoni għandha titħalla tissokta għal 10 min. It-tubu għandu jimtela bl-ilma, is-sediment għandu jitħalla joqgħod minn 2 sa 3 minuti, u l-ilma u l-partiċelli sospiżi għandhom jitferrgħu ‘l barra bil-mod;

—	is-sediment għandu jitlaħlaħ darbtejn aktar b’madwar 10 ml ta’ ilma (għandu jintuża vortiċi għal 30 sekonda, jitħalla joqgħod, u l-ilma jitferra’ ‘l barra kull darba);

—

Għandhom jiżdiedu bejn 2 u 10 taqtiriet tas-soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina u t-taħlita għandha titħawwad bil-qawwi. Ir-reazzjoni għandha titħalla sseħħ għal 30 sekonda u s-sediment ikkulurit għandu jitlaħlaħ darbtejn b’madwar 5 ml etanol segwit bi tlaħliħa waħda bl-aċeton (kull darba għandu jintuża vortiċi ta’ 30 sekonda, is-solvent għandu jitħalla joqgħod għal madwar minuta u mferra’ ‘l barra);

—	is-sediment ikkulurit għandu jitnixxef.

2.1.4.   L-eżami mikroskopiku

2.1.4.1.   Il-preparazzjoni tas-slajd

Għandhom jiġu ppreparati slajds mikroskopiċi mis-sediment u, skont l-għażla tal-operatur, jew mill-flotate jew mill-materja prima. Fil-każ li jintuża t-tgħarbil matul il-preparazzjoni tal-kampjun, għandhom jiġu ppreparati ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw (dik fina u dik mhux raffinata). Il-porzjonijiet tat-test ta’ frazzjonijiet mifruxa fuq is-slajds għandhom ikunu rappreżentattivi tal-frazzjoni sħiħa.

Għandu jiġi ppreparat numru suffiċjenti ta’ slajds sabiex jiġi żgurat li jista’ jitwettaq il-protokoll ta’ eżami komplut kif stabbilit fil-punt 2.1.4.2.

Is-slajds mikroskopiċi għandhom jiġu mmuntati bil-mezz tal-immuntar adegwat skont l-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu. Is-slajds għandhom ikunu mgħottija b’coverslips.

2.1.4.2.   Il-protokolli ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fl-għalf kompost u fil-materjal tal-għalf

Is-slajds mikroskopiċi ppreparati għandhom jiġu osservati skont il-protokolli ta’ oservazzjoni stabbiliti fil-dijagramma 1 għall-għalf kompost u għall-materjali tal-għalf għajr il-ħut mitħun pur, jew fid-dijagramma 2 għall-ħut mitħun pur.

L-osservazzjonijiet mikroskopiċi għandhom jitwettqu billi jintuża mikroskopju kompost fuq is-sediment u, skont l-għażla tal-operatur, jew fuq il-flotate jew fuq il-materja prima. L-isterjomikroskopju jista’ jintuża flimkien mal-mikroskopju kompost għall-frazzjonijiet mhux raffinati. Kull slajd għandha tiġi skrinjata kompletament f’diversi manjetizzazzjonijiet.

In-numri minimi ta’ slajds li għandhom jiġu osservati f’kull stadju tal-protokoll ta’ osservazzjoni għandhom jiġu rrispettati rigorożament ħlief meta l-materjal kollu tal-frazzjoni ma jkunx jippermetti li jintlaħaq in-numru ta’ slajds stipulat. Għandhom jiġu osservati mhux aktar minn 6 slajds għal kull determinazzjoni.

Sabiex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni tan-natura u l-oriġini tal-partiċelli, l-operatur jista’ juża għodod ta’ appoġġ bħal sistemi ta’ appoġġ għad-deċiżjonijiet, il-libreriji tal-immaġnijiet u l-kampjuni ta’ referenza.

Dijagramma 1

Il-protokoll ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fl-għalf kompost u fil-materjal tal-għalf, għajr il-ħut mitħun

YES

Grinding process of sample insures 95 % of particles ≤ 0.50 mm

NO

Sieving on 0.25 mm mesh

3 slides from sediment + 1 slide from flotate or raw material

3 slides from < 0.25 mm sediment + 1 slide < 0.25 mm flotate or raw material

> 5 animal particles of same nature detected?

YES

sample declared according to point 2.1.5.3 for FISH

repetition of analysis according to point 2.1.4.3

YES

> 5 animal particles of same nature detected?

NO

> 5

Number of fish particles?

≤ 5

NO

1 slide from sediment

FISH

1 slide from > 0.25 mm sediment

> 5 animal particles of same nature detected?

YES

nature of animal particles?

YES

> 5 animal particles of same nature detected?

NO

TERRESTRIAL

NO

1 slide from rotate or raw material

> 5

Number of terrestrial particles?

≤ 5

1 slide from > 0.25 mm flotate or raw material

animal particles detected?

YES

sample declared according to point 2.1.5.3 for TERRESTRIAL ANIMAL

repetition of analysis according to point 2.1.4.3

YES

animal particles detected?

NO

sample declared according to point 2.1.5.1

NO

Dijagramma 2

Il-Protokoll ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fil-ħut mitħun

YES

Grinding process insures 95% of particles ≤ 0.50 mm

NO

Sieving on 0.25 mm mesh

3 slides from sediment

3 slides from < 0.25 mm sediment

> 5 terrestrial particles detected?

YES

YES

> 5 terrestrial particles detected?

NO

sample declared according to point 2.1.5.3 for TERRESTRIAL ANIMAL

NO

2 slides from sediment

> 5

2 slides from > 0.25 mm sediment

> 5 terrestrial particles detected?

YES

Number of terrestrial particles?

YES

> 5 terrestrial particles detected?

NO

≤ 5

NO

1 slide from flotate or raw material

repetition of analysis according to point 2.1.4.3

1 slide from < 0.25 mm flotate or raw material

terrestrial particles detected?

YES

YES

terrestrial particles detected?

NO

sample declared according to point 2.1.5.1 for TERRESTRIAL ANIMAL

NO

2.1.4.3.   In-numru ta’ determinazzjonijiet

Jekk wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokoll ta’ osservazzjoni stabbilit fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, ma tiġi individwata l-ebda partiċella tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut), ma tkun meħtieġa l-ebda determinazzjoni addizzjonali u r-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.1.

Jekk, wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokolli ta’ osservazzjoni stabbiliti fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, in-numru totali tal-partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut) individwat ikun ivarja minn 1 sa 5, għandha ssir it-tieni determinazzjoni minn sottokampjun ġdid ta’ 50 g. Jekk, wara din it-tieni determinazzjoni, in-numru ta’ partiċelli tal-annimali ta’ din in-natura partikolari jkun ivarja minn 0 sa 5, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tinuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.2., jew inkella għandha ssir it-tielet determinazzjoni minn sottokampjun ġdid ta’ 50 g. Madankollu, jekk wara l-ewwel u t-tieni determinazzjoni, it-total ta’ partiċelli ta’ natura partikolari individwat matul iż-żewġ determinazzjonijiet ikun ogħla minn 15, ma tkun meħtieġa l-ebda determinazzjoni addizzjonali u r-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat direttament billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3. Jekk, wara t-tielet determinazzjoni, it-total ta’ partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari individwat matul it-tliet determinazzjonijiet ikun ogħla minn 15, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tinuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3. Inkella, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.2.

Jekk wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokolli ta’ osservazzjoni stabbiliti fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, jiġu individwati aktar minn 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut), ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3.

2.1.5.   L-espressjoni tar-riżultati

Meta jirrapporta r-riżultati, il-laboratorju għandu jindika fuq liema tip ta’ materjal tkun twettqet l-analiżi (is-sediment, il-flotate jew il-materja prima) u kemm ikunu saru determinazzjonijiet.

Ir-rapport tal-laboratorju għandu jinkludi mill-anqas l-informazzjoni dwar il-preżenza ta’ kostitwenti miksuba mill-annimali terrestri u mill-ħut.

Is-sitwazzjonijiet differenti għandhom jiġu rrapportati b’dawn il-modi:

2.1.5.1.   Ma tiġi individwata l-ebda partiċella tal-annimali ta’ natura partikolari:

—	sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ma ġiet individwata l-ebda partiċella miksuba minn annimali terrestri fil-kampjun ippreżentat,

—	sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ma ġiet individwata l-ebda partiċella miksuba mill-ħut fil-kampjun ippreżentat,

2.1.5.2.   Jiġu individwati bħala medja bejn 1 u 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari:

—

sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, mhux aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-annimali terrestri għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [għadam, qarquċa, muskolu, xagħar, qrun …]. Din il-preżenza ta’ livell baxx, li tkun taħt il-limitu ta’ indivdwazzjoni tal-metodu mikroskopiku, tfisser li ma jistax jiġi eskluż ir-riskju ta’ riżultat pożittiv falz.

Jew, kif rilevanti,

—

sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, mhux aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-ħut għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [xewk tal-ħut, qxur tal-ħut, qarquċa, muskolu, otolit, garġi …]. Din il-preżenza ta’ livell baxx, li tkun taħt il-limitu ta’ individwazzjoni tal-metodu mikroskopiku, tfisser li ma jistax jiġi eskluż ir-riskju ta’ riżultat pożittiv falz.

Fil-każ ta’ tgħarbil minn qabel tal-kampjun, ir-rapport tal-laboratorju għandu jsemmi f’liema frazzjoni (frazzjoni mgħarbla, frazzjoni granulata jew qlub) ġew individwati l-partiċelli tal-annimali kemm-il darba l-individwazzjoni tal-partiċelli tal-annimali fil-frazzjoni mgħarbla biss tista’ tkun sinjal ta’ kontaminazzjoni ambjentali.

2.1.5.3.   Jiġu individwati bħala medja aktar minn 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari

—	sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-annimali terrestri għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [għadam, qarquċa, muskolu, xagħar, qrun …].

Jew, kif rilevanti,

—	sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-ħut għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [xewk tal-ħut, qxur tal-ħut, qarquċa, muskolu, otolit, garġi …].

Fil-każ ta’ tgħarbil minn qabel tal-kampjun, ir-rapport tal-laboratorju għandu jsemmi f’liema frazzjoni (frazzjoni mgħarbla, frazzjoni granulata jew qlub) ġew individwati l-partiċelli tal-annimali kemm-il darba l-individwazzjoni tal-partiċelli tal-annimali fil-frazzjoni mgħarbla biss tista’ tkun sinjal ta’ kontaminazzjoni ambjentali.

2.2.   Il-PCR

2.2.1.   Il-prinċipju

Il-frammenti tal-aċidu deossiribonukleiku (DNA) ta’ oriġini mill-annimali li jistgħu jkunu preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost, jiġu individwati b’teknika ta’ amplifikazzjoni ġenetika permezz tal-PCR, li timmira lejn is-sekwenzi tad-DNA speċifiku għall-ispeċi.

Il-metodu tal-PCR l-ewwel jirrikjedi stadju tal-estrazzjoni tad-DNA. Wara għandu jiġi applikat l-istadju tal-amplifikazzjoni għall-estrazzjoni tad-DNA miksuba b’dan il-mod, sabiex jiġu individwati l-ispeċi tal-annimali li jinsabu fil-mira tat-test.

2.2.2.   Ir-reaġenti u t-tagħmir

2.2.2.1.   Ir-reaġenti

2.2.2.1.1.   Ir-reaġenti għall-istadju tal-estrazzjoni tad-DNA

Għandhom jintużaw biss ir-reaġenti approvati mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

2.2.2.1.2.   Ir-reaġenti għall-istadju ta’ amplifikazzjoni ġenetika

2.2.2.1.2.1.   Il-primers u s-sondi

Għandhom jintużaw biss primers u sondi b’sekwenzi ta’ oligonukleotidi vvalidati mill-EURL-AP (2).

2.2.2.1.2.2.   Il-Master Mix

Għandhom jintużaw biss soluzzjonijiet tal-Master Mix li ma jkunx fihom reaġenti suxxettibbli li jwasslu għal riżultati foloz minħabba l-preżenza ta’ DNA tal-annimali (3).

2.2.2.1.2.3.   Ir-reaġenti ta’ dekontaminazzjoni

2.2.2.1.2.3.1.   Is-soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku (0,1N)

2.2.2.1.2.3.2.   Il-bliċ (is-soluzzjoni tal-ipoklorit tas-sodju f’0,15 % ta’ kloru attiv)

2.2.2.1.2.3.3.   Ir-reaġenti mhux korrużivi għad-dekontaminazzjoni tal-apparat li jiswa l-flus bħal imwieżen analitiċi (eż. id-DNA EraseTM tal-MP Biomedicals)

2.2.2.2.   It-tagħmir

2.2.2.2.1.   Miżien analitiku bi preċiżjoni ta’ 0,001 g

2.2.2.2.2.   It-tagħmir tat-tħin

2.2.2.2.3.   Ċiklatur termali li jippermetti li ssir PCR f’ħin reali

2.2.2.2.4.   Mikroċentrifugu għal tubi mikrofugi

2.2.2.2.5.   Sett ta’ mikropipetti li tippermetti li jitferra’ minn 1 μl sa 1 000 μl

2.2.2.2.6.   Oġġetti tal-plastik standard għall-bijoloġija molekulari: tubi mikrofugi, kontenituri tal-plastik bil-filtru għall-mikropipetti, platti adattati għaċ-ċiklatur termali.

2.2.2.2.7.   Friżers għall-ħżin tal-kampjuni u tar-reaġenti

2.2.3.   It-teħid ta’ kampjuni u l-preparazzjoni tal-kampjuni

2.2.3.1.   It-teħid ta’ kampjuni

Għandu jintuża kampjun rappreżentattiv, meħud b’konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.

2.2.3.2.   Il-preparazzjoni tal-kampjun

Il-preparazzjoni tal-kampjuni tal-laboratorju sal-estrazzjoni tad-DNA għandhom jikkonformaw mar-rekwiżiti fl-Anness II. Għandu jittieħed sottokampjun ta’ mill-inqas 50 g tal-kampjun għall-analiżi u sussegwentement jiġi mitħun.

Il-preparazzjoni tal-kampjun għandha titwettaq f’kamra differenti minn dawk maħsuba għall-estrazzjoni tad-DNA u għar-reazzjonijiet ta’ amplifikazzjoni ġenetika kif deskritt minn ISO 24276.

Għandhom jiġu preparati żewġ porzjonijiet tat-test ta’ mill-inqas 100 mg kull waħda.

2.2.4.   L-estrazzjoni tad-DNA

L-estrazzjoni tad-DNA għandha titwettaq fuq kull porzjon tat-test ippreparata bl-użu tal-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

Għandhom jiġu preparati żewġ kontrolli tal-estrazzjoni għal kull serje ta’ estrazzjonijiet kif deskritt minn ISO 24276.

—	kontroll tal-estrazzjoni in bjank,

—	kontroll tal-estrazzjoni tad-DNA pożittiv.

2.2.5.   Amplifikazzjoni ġenetika

L-amplifikazzjoni ġenetika għandha titwettaq billi jintużaw il-metodi vvalidati għal kull speċi li tirrikjedi l-identifikazzjoni. Dawn il-metodi huma stipulati fl-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu. Kull estratt tad-DNA għandu jiġi analizzat mill-inqas f’żewġ dilwizzjonijiet differenti sabiex tiġi evalwata l-inibizzjoni.

Għandhom jiġu preparati żewġ kontrolli ta’ amplifikazzjoni għal kull speċi fil-mira kif deskritt minn ISO 24276.

—	għandu jintuża kontroll pożittiv tad-DNA fil-mira għal kull platt jew serje ta’ testijiet tal-PCR,

—	għandu jintuża kontroll tar-reaġent ta’ amplifikazzjoni (imsejjaħ ukoll kontroll negattiv) għal kull platt jew serje ta’ testijiet tal-PCR.

2.2.6.   L-interpretazzjoni u l-espressjoni tar-riżultati

Meta jirrapporta r-riżultati, il-laboratorju għandu jindika mill-inqas il-piż tal-porzjonijiet tat-test użati, it-teknika tal-estrazzjoni użata, in-numru ta’ determinazzjonijiet imwettqa u l-limitu ta’ individwazzjoni tal-metodu.

Ir-riżultati ma għandhomx jiġu interpretati u rrappurtati jekk il-kontroll pożittiv tal-estrazzjoni tad-DNA u l-kontrolli pożittivi tad-DNA fil-mira ma jipprovdux riżultati pożittivi għall-ispeċi li qed tiġi ttestjata filwaqt li l-kontroll tar-reaġent ta’ amplifikazzjoni jkun negattiv.

Fil-każ li r-riżultati miż-żewġ porzjonijiet tat-test ma jkunux konsistenti, għandu jiġi ripetut mill-inqas l-istadju tal-amplifikazzjoni ġenetika. Jekk il-laboratorju jissuspetta li l-estratti tad-DNA jistgħu jkunu l-kważa tal-inkonsistenza, għandha titwettaq estrazzjoni ġdida tad-DNA segwita minn amplifikazzjoni ġenetika qabel ma jiġu interpretati r-riżultati.

L-espressjoni finali tar-riżultati għandha tissejjes fuq l-integrazzjoni u l-interpretazzjoni tar-riżultati taż-żewġ porzjonijiet tat-test skont l-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

2.2.6.1.   Ir-riżultat negattiv

Ir-riżultat negattiv għandu jiġi rrappurtat kif ġej:

Ma ġie indivdwat l-ebda DNA minn X fil-kampjun ippreżentat (fejn X huwa l-ispeċi tal-annimal jew il-grupp tal-ispeċi tal-annimal li jinsab fil-mira tat-test).

2.2.6.2.   Ir-riżultat pożittiv

Ir-riżultat pożittiv għandu jiġi rrappurtat kif ġej:

Ġie individwat id-DNA minn X fil-kampjun ippreżentat (fejn X huwa l-ispeċi tal-annimal jew il-grupp tal-ispeċi tal-annimal li jinsab fil-mira tat-test).”