li temenda l-Anness D tad-Direttiva tal-Kunsill 64/432/KEE fir-rigward tat-testijiet dijanjostiċi għal-lewkożi enżootika bovina

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 64/432/KEE tas-26 ta’ Ġunju 1964 dwar il-problemi tas-saħħa tal-annimali li jaffetwaw il-kummerċ ta' annimali bovini u suwini ġewwa l-Komunità (1), u b’mod partikolari l-Artikolu 16 tagħha,

It-Taqsima II tal-Anness V mad-Direttiva 64/432/KE hija sostitwita bit-test fl-Anness ma' din id-Deċiżjoni.

ANNESS

Il-Kapitolu II tal-Anness li jinsab mad-Direttiva 64/432/KEE hija mibdula b’dan li ġej:

“KAPITOLU II

TESTIJIET GĦAL-LEWKOŻI ENŻOOTIKA BOVINA

It-testijiet għal-lewkożi enżootika bovina għandhom jitwettqu permezz ta’ test bl-agar ġel għal diffużjoni immuni (AGID) taħt il-kondizzjonijiet deskritti fit-Taqsimiet A u B jew mill-assay immunosorbenti marbut mal-enżimi (ELISA) taħt il-kondizzjonijiet deskritti fit-Taqsima C. It-test bl-agar ġel għal diffużjoni immuni jista’ jintuża biss biex jiġu ttestjati kampjuni individwali. Jekk ir-riżultati tat-testijiet ikunu s-suġġett ta’ sfida sostanzjata kif jixraq, għandu jsir kontroll addizzjonali permezz ta’ test bl-agar ġel għal diffużjoni immuni.

L-AGID u l-ELISA għandhom jiġu standardizzati kontra s-serum E05, li se jsir is-serum standard uffiċjali tal-UE, li jrid jiġi pprovdut mill-:

Friedrich-Loeffler-Institut

Federal Research Institute for Animal Health

OIE Reference Laboratory for Enzootic Bovine Leukosis (EBL)

Südufer 10

17493 Greifswald — Insel Riems

Il-Ġermanja.

A. Test bl-agar ġel għal diffużjoni immuni għal lewkożi enżootika bovina

L-antiġenu li għandu jintuża fit-test għandu jinkludi fih glikoproteini tal-virus tal-lewkożi bovina. L-antiġenu għandu jiġi standardizzat kontra s-serum E05.

L-Istituti tal-Istat, il-laboratorji nazzjonali ta’ referenza jew l-istituti uffiċjali maħtura skont l-Artikolu 6a biex jikkoordinaw l-istandards u l-metodi tad-dijanjosi tat-testijiet għal-lewkożi enżootika bovina għandhom ikunu responsabbli għall-kalibrar tal-antiġenu standard użat fil-laboratorju kontra s-serum E05.

L-antiġeni standard użati fil-laboratorju għandhom jintbagħtu mill-inqas darba fis-sena lill-istituti tal-Istat, il-laboratorji nazzjonali ta’ referenza jew l-istituti uffiċjali indikati skont l-Artikolu 6a, għall-ittestjar kontra s-serum standard E05. Barra minn din l-istandardizzazzjoni, l-antiġenu li jkun qed jintuża jista’ jiġi kkalibrat skont il-metodu deskritt fit-Taqsima B.

Ir-reaġenti tat-testijiet għandhom jikkonsistu minn:

(a)	antiġenu: l-antiġenu għandu jkun fih il-glikoproteini speċifiċi tal-virus tal-lewkożi enżootika bovina li ġie standardizzat kontra s-serum E05;

(b)	is-serum tat-test;

(c)	serum pożittiv ta’ kontroll magħruf;

(d)

ġel agar:

—	0,8 % agar,

—	8,5 % NaCl,

—	0,05 M Tris-buffer pH 7,2,

—	15 ml ta’ dan l-agar għandu jiġi introdott f’petri dish b’dijametru ta’ 85 mm, li jirriżulta f’fond ta’ 2,6 mm ta’ agar.

Mudell tat-test ta’ seba’ fondijiet mingħajr kontenut niedi għandu jinqata’ fl-agar mal-qiegħ tal-platt; il-mudell għandu jikkonsisti f’fond ċentrali wieħed u sitt fondijiet f’ċirku madwaru.

Dijametru ta’ fond ċentrali: 4 mm

Dijametru ta’ fondijiet periferiċi: 6 mm

Distanza bejn il-fondijiet ċentrali u dawk periferiċi: 3 mm

Il-fond ċentrali ghandu jimtela bl-antiġenu standard. Il-fondijiet ċentrali 1 u 4 deskritti fil-B.3 huma mimlija bis-serum pożittiv magħruf; il-fondijiet 2, 3, 5 u 6 bis-sera tat-test. Il-fondijiet għandhom jimtlew sakemm il-meniscus jisparixxi.

Dan jirriżulta fil-kisba tal-kwantitajiet li ġejjin:

—	antiġenu: 32 μl,

—	serum tal-kontroll: 73 μl,

—	serum tat-test: 73 μl.

L-inkubazzjoni għandha tkun ta’ 72 siegħa f’temperatura normali tal-kamra (20 sa 27 °C) f’ kamra umda magħluqa.

It-test jista’ jinqara f’24 u 48 siegħa iżda ma jistax jinkiseb riżultat qabel 72 siegħa:

(a)	serum tat-test ikun pożitiv jekk jifforma linja ta’ preċipitazzjoni speċifika mal-antiġenu tal-virus tal-lewkożi bovina (VLB) u jifforma linja kompluta ta’ identitá mas-serum tal-kontroll;

(b)	serum tat-test huwa negattiv jekk ma jifformax linja speċifika ta’ preċipitazzjoni mal-antiġenu VLB u ma jgħawwiġx il-linja tas-serum ta’ kontroll;

(c)

ir-reazzjoni ma tistax tiġi kkunsidrata konklużiva jekk hija:

(i)	tgħawweġ il-linja tas-serum ta’ kontroll lejn l-antiġenu VLB mingħajr ma tifforma linja ta’ preċipitazzjoni viżibbli mal-antiġenu; jew

(ii)	jekk ma tkunx tista tinqara la bħala negattiva u lanqas bħala pożittiva.

F’reazzjonijiet inkonklużivi t-test jista’ jiġi ripetut u jiġi utilizzat serum ikkonċentrat.

10.

Kull konfigurazzjoni jew mudell ieħor ta’ fond jista’ jiġi utilizzat sakemm is-serum E05 diluwit 1:10 f’serum negattiv jista’ jiġi intraċċat bħala pożittiv.

B. Metodu għall-istandardizzazzjoni tal-antiġenu

Is-soluzzjonijiet u l-materjali meħtieġa:

(a)	40 ml ta’ 1,6 % agarose f’ 0,05 M Tris/HCl buffer, pH 7,2 b’ 8,5 % NaCl;

(b)	15 ml ta’ serum tal-lewkożi bovina, li għandu antikorp biss ta’ glikoproteini tal-virus tal-lewkożi bovini, ddiluwit 1:10 f’ 0,05 M Tris/HCI buffer, pH 7,2 b’ 8,5 % NaCl;

(c)	15 ml ta’ serum tal-lewkożi bovina, li għandu antikorp biss għall-glikoproteini tal-virus tal-lewkożi bovina, ddiluwit 1:5 f’ 0,05 M Tris/HCI buffer, pH 7,2 b’ 8,5 % NaCl;

(d)	erba’ kontenituri petri tal-plastik b’dijametru ta’ 85 mm;

(e)	punch b’ dijametru ta’ 4 sa 6 mm;

(f)	antiġenu ta’ referenza;

(g)	l-antiġenu li għandu jiġi standardizzat;

(h)	banju tal-ilma (56 °C).

Il-Proċedura:

Ħoll l-agarose (1,6 %) fit-Tris/HCI buffer billi ssaħħan b’attenzjoni sa temperatura ta’ 100 °C. Qiegħed f’banju tal-ilma b’56 °C għal madwar siegħa. Barra minn hekk, qiegħed id-diluwizzjonijiet tas-serum tal-lewkożi bovina f’banju ta’ l-ilma b’temperatura ta’ 56 °C.

Issa ħallat 15 ml tal-56 °C tas-soluzzjoni agarose mal-15 ml tas-serum tal-lewkożi bovina (1:10), ħawwad malajr u ferra 15 ml f’kull wieħed miż-żewġ kontenituri petri. Erġa’ rrepeti din il-proċedura bis-serum tal-lewkożi bovina ddiluwit 1:5,

Meta jibbies l-agarose, isiru t-toqob fih kif ġej:

Iż-żieda tal-antigen

(a)

kontenituri petri 1 u 3:

(i)	il-fond A - antiġenu ta’ referenza mhux diluwit,

(ii)	il-fond B - 1:2 antigenu ta’ referenza diluwit,

(iii)

il-fondijiet Ċ u E - antiġenu ta’ referenza,

(iv)	il-fond D - antiġenu tat-test mhux diluwit.

(b)

kontenituri petri 2 u 4:

(i)	il-fond A - antiġenu tat-test mhux diluwit,

(ii)	il-fond B - 1:2 antiġenu tat-test diluwit,

(iii)

il-fond C - 1:4 antiġenu tat-test diluwit,

(iv)	il-fond D - 1:8 antiġenu tat-test diluwit.

Istruzzjonijiet Addizzjonali:

(a)	l-esperiment jitwettaq b’żewġ diluwizzjonijiet tas-serum (1:5 u 1:10) sabiex tinkiseb l-aħjar preċipitazzjoni;

(b)	jekk id-dijametru tal-preċipitazzjoni huwa żgħir wisq biż-żewġ diluwizzjonijiet, allura s-serum għandu jiġi diluwit iktar;

(c)	jekk id-dijametru tal-preċipitazzjoni fiż-żewġ diluwizzjonijiet huwa kbir wisq u bla saħħa, allura għandu jintagħżel is-serum l-aktar baxx;

(d)	il-konċentrazzjoni finali tal-agarose għandha tkun 0,8 %; dik tas-sera 5 u 10 % rispettivament;

(e)	ipprepara d-dijametri mkejla bis-sistema koordinata li ġejja. Id-diluwizzjoni tal-antiġenu li għandha tiġi ttestjata bl-istess djametru bħall-antiġenu ta’ referenza hija d-diluwizzjoni tal-operazzjoni.

C. Assay immunosorbenti marbuta mal-Enżimi (ELISA) għall-intraċċar tal-lewkożi enżootika bovina

Il-materjal u r-reagenti li għandhom jintużaw huma kif ġej:

(a)	microplates ta’ fażi solida, cuvettes jew kwalunkwe fażi solida oħra;

(b)

l-antiġenu huwa ffissat mal-fażi solida bl-għajnuna jew mingħajra ta’ antikorpi poliklonali jew monoklonali sabiex jinqabdu. Jekk l-antiġenu jkun miksi direttament mal-fażi solida, il-kampjuni kollha tat-test li jagħtu reazzjonijiet pożittivi għandhom jerġgħu jiġu ttestjati kontra l-antiġenu ta’ kontroll. L-antiġenu ta’ kontroll għandu jkun identiku għall-antiġenu bl-eċċezzjoni li dawk l-antiġeni VLB huma assenti. Jekk antikorpi li jinqabdu huma miksija b’fażi solida, l-antikorpi m’għandhomx jirreaġixxu għal antiġeni li mhumiex antiġeni VLB;

(c)	il-likwidu bijoloġiku li għandu jiġi ttestjat;

(d)	kontroll korrispondenti pożittiv u negattiv;

(e)	akkoppjat;

(f)	substrat addattat għall-enżima użata;

(g)	soluzzjoni ta’ waqfien, jekk meħtieġ;

(h)	soluzzjonijiet għad-diluwizzjoni tal-kampjuni tat-test għall-preparazzjonijiet tar-riaġenti u għall-ħasil;

(i)	sistema ta’ qari li hija xierqa għas-substrat użat.

L-istandardizzazzjoni u s-sensittività tat-test

Is-sensittività tal-ELISA għandha tkun ta’ tali livell li s-serum E5 jimmarka pożittiv meta jiġi diluwit 10 darbiet (kampjuni ta’ serum) jew 250 darba (kampjuni tal-ħalib) aktar mid-diluwizzjoni miksuba minn kampjuni individwali meta dawn jiddaħħlu f’ġabriet ta’ kampjuni. F’assays fejn kampjuni (serum u ħalib) huma ttestjati individwalment is-serum E4 diluwit 1 sa 10 (f’serum negattiv) jew 1 sa 250 (f’ħalib negattiv) għandu jimmarka pożittiv meta ttestjat fl-istess diluwizzjoni tal-assay kif użat għall-kampjuni tat-test individwali. L-istituti uffiċjali elenkati f’A.2 ikunu responsabbli għall-kontroll tal-kwalità tal-metodu ELISA, u partikolarment sabiex jiġi determinat, għal kull lott ta’ produzzjoni, in-numru ta’ kampjuni li għandu jinġabar fuq il-bażi tal-għadd miksub għas-serum E4.

Kondizzjonijiet għall-użu tat-test Elisa għal-lewkożi enżootika bovina.

(a)	L-ELISA jistgħu jintużaw fil-kampjuni tas-serum u tal-ħalib.

(b)

Meta l-ELISA jiġu użati għall-fini ta’ ċertifikazzjoni skont l-Artikolu 6(2)(c) jew għall-istabbiliment jew iż-żamma tal-istatus tal-merħla skont l-Anness D(I), il-ġabra tal-kampjuni tas-serum għandu jsir b’mod illi r-riżultati tat-test ikunu jistgħu jiġu relatati bla ebda dubju ta’ xejn mal-annimali individwali inklużi fit-taħlita. Kull test ta’ konferma għandu jsir fuq il-kampjuni ta’ serum meħuda mill-annimali individwali.

(c)

Meta l-ELISA jintużaw fuq kampjun ta’ ħalib miġbur mill-ħalib bulk (jiġifieri li mhux fil-ġarar) dan il-kampjun għandu jittieħed mill-ħalib miġbur minn merħla li għallinqas ikun hemm 30 % minn merħla tal-baqar qegħdin jeħilbu. Kull test ta’ konferma għandu jsir fuq il-kampjuni ta’ serum meħuda mill-annimali individwali.”