ANNESS
METODU ENŻIMATIKU GĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAL-LAMTU FIL-PREPARAZZJONIJIET UŻATI FL-GĦALF TA' L-ANNIMALI BL-UŻU TAL-KROMATOGRAFIJA TA' LIKWIDI BI PRESSJONI GĦOLJA (HPLC)
1. Skop
Dan il-metodu jiddeskrivi l-kalkolu enżimatiku tal-kontenut tal-lamtu fl-għalf ta' l-annimali. Il-kontenut tal-lamtu hu mnissel mill-kalkolu kwantitattiv tal-glukows wara l-brejkdawn enżimatiku tal-lamtu preżenti fi glukows. Il-glukows kollu mkejjel hu kkunsidrat li jkun ġie mil-lamtu, li jkun hemm fil-kampjun.
2. Definizzjonijiet
F'dan il-metodu, ikun determinat il-kontenut tal-lamtu u brejkdawn tal-prodotti b'massa molekolari għolja, li ma jinħallux f'40 % etanol. Il-kontenut tal-lamtu hu espress f'% (m/m).
3. Prinċipju
Il-kampjuni huma omoġenizzati bit-tħin. Il-kampjun jinħasel b'40 % etanol biex ikunu eliminati zokkrijiet li jinħallu u prodotti li jinħallu tad-dekompożizzjoni tal-lamtu.
L-enżima termostabbli alfa-amilażi hija miżjuda mas-sospensjoni. Din l-enżima tkisser il-lamtu f'temperatura ta' 100 °Ċ fi ktajjen iżgħar, kemm jekk il-lamtu ikun qiegħed jinħall jew le. Ċapep kbar ta' lamtu jitkissru bil-mod ħafna.
Għalhekk hu neċessarju li l-kampjuni jinħallu għal kollox jew ikunu preżenti f'forma ta' sospensjoni li jkollha biċċiet sħaħ żgħar ħafna.
Imbagħad tiżdied it-tieni enżima amiloglukosidażi, li tidrolizza l-ktajjen iddegredati tal-glukows fi glukows f'temperatura ta' 60 °Ċ.
Wara li jiċċara l-likwidu fejn il-proteini, ix-xaħmijiet u l-fdalijiet preżenti jkunu twarrbu wara t-tisfija, tinkiseb soluzzjoni ċara li tkun tista' tintuża għall-HPLC.
Issir separazzjoni taz-zokkrijiet preżenti mill-HPLC.
4. Reaġenti u materjali oħra
Uża reaġenti ta' grad analitiku rikonoxxut u ilma demineralizzat.
4.1. Etanol 40 % vol. fl-ilma
4.2. Glukows, min. 99 %.
4.3. Soluzzjoni ta' Amiloglukosidażi (1,4-alfa-D-Glukan glukoidrolażi) mill-Aspergillus niger (attivita' enżimatika > 5 000 U/ml). Ħażna f'temperatura ta' madwar 4 °C
Alternattivament, jista' jintuża wkoll trab ta' l-amiloglukosidażi.
4.4. Alfa-amilażi termostabbli (1,4-alfa-D-Glukan glukoidrolażi). Ħażna f'temperatura ta' madwar 4 °Ċ.
4.5. Aċetat deidrat taż-żingu, p.a.
4.6. Eksaċjanuferrat tal-potassju (II) (Potassium hexacyanoferrate (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), ekstra pur.
4.7. Aċetat tas-sodju anidru, p.a..
4.8. Aċtu aċetiku glaċjali, 100 % (v/v).
4.9. Bafer ta' l-aċetat tas-sodju (0,2 mol/l).
Iżen 16,4 gramma ta' aċetat tas-sodju (4.7) f'biker tal-ħġieġ. Ħoll fl-ilma u laħlaħ ġo flixkun volumetriku ta' 1 000 ml. Iddilwixxi bl-ilma sal-marka u rranġa l-pH għall-4,7 b’aċtu aċetiku (bl-użu ta' strument tal-pH (5.11)). Din is-soluzzjoni tista' tintuża sa massimu ta' 6 xhur f'temperatura tal-ħażna ta' 4 °Ċ .
4.10. Soluzzjoni ta' l-amiloglukosidażi (attivita' enżimatika > 250 U/ml)
Ipprepara soluzzjoni ta' 5 ml ta' soluzzjoni ta' amiloglukosidażi (4.3) jew 660 mg ta' trab ta' amiloglukosidażi b'volum finali ta' 100 ml billi jintuża bafer ta' l-aċetat tas-sodju (4.9). Ipprepara mill-ewwel.
4.11. Soluzzjoni ta' referenza.
Ipprepara soluzzjonijiet tal-glukows fl-ilma, kif użat konvenzjonalment fl-analiżi HPLC.
4.12. Reaġent għat-tisfija/l-iċċarar (Carrez I).
Ħoll 219,5 gramma ta' aċetat taż-żingu (4.5) fl-ilma f'biker tal-ħġieġ. Laħlaħ ġo flixkun volumetriku ta' l-1 000 ml, żid 30 ml aċtu aċetiku (4.8). Ħawwad sew u żid bl-ilma. Din is-soluzzjoni tista' tintuża sa massimu ta' 6 xhur meta maħżuna f'temperatura ambjentali ta' ġewwa.
Reaġenti oħra tat-tisfija, ekwivalenti għal soluzzjoni ta' Carrez, jistgħu jintużaw.
4.13. Reaġent għat-tisfija/l-iċċarar (Carrez II)
Ħoll 106,0 gramma Eksaferroċjanur tal-potassju (II) (4.6) (potassium hexacyanoferrate (II)) fl-ilma f'biker tal-ħġieġ. Laħlaħ ġo flixkun volumetriku ta' l-1 000 ml. Ħallat sew u żid bl-ilma. Din is-soluzzjoni tista' tintuża sa massimu ta' 6 xhur meta maħżuna f'temperatura ambjentali ta' ġewwa.
Reaġenti oħra tat-tisfija, ekwivalenti għal soluzzjoni ta' Carrez, jistgħu jintużaw.
4.14. Fażi mobbli:
Hija ppreparata fażi mobbli li tkun tista' tintuża konvenzjonalment fl-analiżi HPLC taz-zokkor. Fil-każ ta' użu tal-kolonna bil-ġel tas-silika aminopropil eż., fażi mobbli komuni hi taħlita ta' ilma HPLC iggradat u aċetonitrile.
5. Apparat
5.1. Apparat tal-laboratorju standard tal-ħġieġ.
5.2. Ċentrifuga li tagħti 1 000 g jew aktar (ikkalkulata fiċ-ċentru tat-tubu).
5.3. Tubi tal-ħġieġ tal-100 ml għaċ-ċentrifuga.
5.4. Aġitatur manjetiku.
5.5. Vireg manjetiċi.
5.6. Filtri skanalati, eż. 185 mm.
5.7. Filtri tas-siringi, 0,45 μm, adattati għal soluzzjonijiet milwiema.
5.8. Vjali għall-ikkampjunar adattati għall-kampjunatur awtomatiku HPLC.
5.9. Fliexken volumetriċi tal-100 ml.
5.10. Siringi tal-plastik, 5 u 10 ml.
5.11. Miter tal-pH.
5.12. Banju ta' l-ilma bit-termostat, li jista' jkun irregolat għal 60 °Ċ u 100 °Ċ.
5.13. Pjanċi għat-tisħin bl-aġitaturi manjetiċi.
5.14. Apparat ta' l-HPLC.
5.14.1. Pompa, tajba għall-pulsazzjoni-żero.
5.14.2. Kampjunatur awtomatiku.
5.14.3. Kolonna u prekolonna, adattati għall-analiżi taz-zokkor.
5.14.4. Forn vertikali, firxa ta' temperatura bejn dik ambjentali ta' ġewwa u l-40 °Ċ.
5.14.5. Ditekter, tajjeb għall-analiżi taz-zokkor, eż., Ditekter għall-Indiċi Refrattiv.
5.14.6. Sistema ta' integrazzjoni.
6. Proċedura
6.1. Ġenerali
Il-kampjuni huma analizzati wieħed wieħed.
6.2. Preparazzjoni tal-kampjun għall-diversi tipi ta' prodotti
Il-prodott huwa omoġenizzat bit-tħin.
6.3. Porzjon kampjun
Il-kontenut tal-lamtu hu stmat bl-għajnuna tad-dikjarazzjoni ta' l-ingredjenti. L-ammont tal-kampjun (miżun sa 0.1 mg eżatt) jista' jkun stmat minn:
6.4. Id-determinazzjoni vojta
Il-vojt hu determinat billi ssirlu analiżi kompluta (kif deskritta f'6.5), mingħajr ma jiżdiedlu kampjun. Ir-riżultat tad-determinazzjoni vojta jintuża fil-kalkolu tal-kontenut tal-lamtu (7.1).
6.5. L-analiżi
6.5.1. It-tħejjija tal-kampjuni
Ħallat il-kampjun billi ċċaqilqu jew tħawdu. Il-porzjon magħżul għall-eżami (6.3) jintiżen f'tubu ċentrifugu (5.3) u jiżdiedu 50 ml etanol 40 % (4.1). Ħawwad fl-aġitatur manjetiku għall-20 minuta f'temperatura ambjentali ta' ġewwa. Ħalli l-virga manjetika fit-tubu u ċċentrifuga għal ħames minuti. Onfoħ bil-galbu u neħħi l-fażi likwida (eż., b'pipetta Pasteur). Irrepeti din il-proċedura ta' estrazzjoni b'25 ml etanol għal darbtejn (4.1). Ittrasferixxi r-residwu ġo flixkun volumetriku ta' 100 ml (5.9) b'madwar 70 ml ilma. Wara li tħoll jew tissospendi, żid 100 mikrolitru ta' alfa-amilażi termostabbli (4.4) u saħħan f'temperatura ta' 100 °Ċ għall-siegħa, eż. f'banju ta' l-ilma (5.12). Berred għal temperatura ta' 60 °Ċ f'banju ta' l-ilma, u żid 5 ml ta' soluzzjoni ta' amiloglukosidażi (4.10). Poġġi l-flixkun għall-30 min ġo banju ta' l-ilma f'temperatura ta' 60 °Ċ. Berred għal temperatura ambjentali ta' ġewwa, iċċara l-kampjun billi żżid 1 ml Carrez I (4.12), ħawwad u mbagħad żid 1 ml Carrez II (4.13). Carrez I u II jistgħu jkunu miżjuda qabel jew wara t-tberrid. Iddilwixxi bl-ilma sal-marka, omoġenizza u ffiltra s-soluzzjoni b'filtru skanalat (5.6). Iġbor l-estratt tal-kampjun.
6.5.2. L-ipproċessar ta' l-estratti tal-kampjuni
Iffiltra l-estratti minn filtru tad-diska (5.7) b'siringa (5.10) li kienet imlaħalħa qabel bl-estratt. Iġbor il-filtrati ġo vjali (5.8).
Nota: Il-filtru tad-diska jista' jintuża ħafna drabi. Irid jitlaħlaħ bl-estratt li jmiss biex tkun evitata kontaminazzjoni ta' l-estratt ta' qabel.
6.6. Il-kromatografija
L-HPLC hija magħmula konvenzjonalment għall-analiżi taz-zokkrijiet. Peress li l-kampjuni huma estratti bl-etanol/ilma, il-glukows hu z-zokkor prinċipali li jrid ikun analizzat. Jekk l-analiżi HPLC turi traċċi ta' maltosju, din tista' tindika konverżjoni mhux kompluta tal-lamtu.
7. Kalkolu u tifsira tar-riżultati
7.1. Il-kalkolu tar-riżultati HPLC
Mir-riżultati ta' l-analiżi HPLC, il-kontenut (%, m/m) tal-glukows hu kkalkulat. Is-soluzzjoni enżimatika ta' l-amiloglukosidażi (4.3) hi stabilizzata bil-glukows. Barra minn hekk, l-alfa-amilażi termostabbli (4.4) hi stabilizzata bis-sukrows, li tista' tkun parzjalment mibdula fi glukows b'attivita' ta' l-invertażi ta' l-amiloglukosidażi. Għalhekk, il-kejl tal-konċentrazzjoni tal-glukows (%, m/v) irid ikun ikkoreġut għall-konċentrazzjoni tal-glukows (%, m/v) fil-vojt. Il-kontenut tal-glukows (%, m/m) ikkoreġut għall-vojt huwa imbagħad ikkalkulat mill-korrezzjoni tal-konċentrazzjoni tal-glukows, il-piż tal-kampjun u l-ikkalibrar mas-soluzzjonijiet ta' referenza (4.11).
7.2. Il-kalkolu tal-kontenut tal-lamtu
Il-kontenut tal-lamtu (%, m/m) hu kkalkulat mill-kontenut tal-glukows (%, m/m) wara l-korrezzjoni tal-vojt.
Kontenut tal-lamtu = 0,9 * korrezzjoni tal-glukows
8. Preċiżjoni
8.1. Test interlaboratorjali
Id-dettalji tat-test interlaboratorjali fuq il-preċiżjoni tal-metodu huma miġbura fil-qosor f'8.4.
8.2. Ripetibbiltà
Id-differenza assoluta bejn żewġ riżultati tat-testijiet singoli indipendenti, miksuba bl-użu ta' l-istess metodu fuq materjal identiku għal test fl-istess laboratorju mill-istess operatur bl-użu ta' l-istess apparat f'perijodu qasir ta' żmien, tkun f'mhux aktar minn 5 % tal-każijiet akbar mil-limitu tar-ripetibbiltà ta' 1,1 % (m/m). Il-limitu ta' ripetibbilta' hu mnissel minn riżultati miġbura minn test interlaboratorjali (ara 8.4).
8.3. Riproduċibilita'
Id-differenza assoluta bejn żewġ riżultati tat-testijiet singoli, miksuba bl-użu ta' l-istess metodu fuq materjal identiku fl-laboratorji differenti minn operaturi differenti bl-użu ta' apparat differenti, tkun f'mhux aktar minn 5 % tal-każijiet akbar mill-limitu tar-riproduċibbilita' ta' 3,7 % (m/m). Il-limitu ta' riproduċibbilita' hu mnissel minn riżultati miġbura minn test interlaboratorjali (ara 8.4).
8.4. Riżultati tat-test interlaboratorjali
Test interlaboratorjali kien sar fl-2005 u l-2006 bil-parteċipazzjoni tal-laboratorji Ewropej tad-Dwana. Dan it-test twettaq skond l-ISO 5725 u l-protokoll IUPAC (W. Horwitz, Pure and Applied Chemistry, vol. 67, 1995, p. 331-343). Id-data ta' preċiżjoni mogħtija fit-tabella hawn taħt:
Riżultati ta' statistika mill-istudju interlaboratorjali
|
|
Kampjun |
|||||||||||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
||||||||||||||||
|
L-għadd ta' laboratorji wara l-eliminazzjoni ta' dawk barra l-limitu |
25 |
26 |
26 |
25 |
24 |
|||||||||||||||
|
L-għadd ta' riżultati aċċettati |
50 |
52 |
52 |
50 |
48 |
|||||||||||||||
|
Kontenut medju tal-lamtu (%, m/m) |
31,2 |
14,4 |
25,1 |
12,9 |
27,8 |
|||||||||||||||
|
Devjazzjoni standard ta’ ripetibbiltà sr (%, m/m) |
0,4 |
0,3 |
0,6 |
0,2 |
0,3 |
|||||||||||||||
|
Limitu ta' ripetibbilità r (%, m/m) |
1,1 |
0,8 |
1,7 |
0,7 |
0,9 |
|||||||||||||||
|
Devjazzjoni standard ta’ riproduċibiltà sR (%, m/m) |
1,7 |
0,8 |
1,7 |
0,9 |
1,3 |
|||||||||||||||
|
Limitu ta' riproduċibilità R (%, m/m) |
4,8 |
2,2 |
4,7 |
2,5 |
3,7 |
|||||||||||||||
|
Kampjuni
|
||||||||||||||||||||