Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2004/73/KE tad-29 ta' April 2004 li tadatta għall-progress tekniku għad-29 darba d-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE dwar l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi li jirrigwardjaw il-klassifikazzjoni, l-ippakkjar u t-tikkettjar ta' sustanzi perikolużiTest b'relevanza għaż-ŻEE.

CS.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
ET.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
HU.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
LT.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
LV.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
MT.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
PL.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
SK.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757
SL.ES Chapter 13 Volume 34 P. 448 - 757

Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2004/73/KE

tad-29 ta' April 2004

li tadatta għall-progress tekniku għad-29 darba d-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE dwar l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi li jirrigwardjaw il-klassifikazzjoni, l-ippakkjar u t-tikkettjar ta' sustanzi perikolużi

(Test b'relevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea,

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta' Ġunju 1967 dwar l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolament u tad-disposizzjonijiet amministrattivi li jirrigwardjaw il-klassifikazzjoni, l-ippakkjar u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi [1] u partikolarment l-Artikolu 28 tagħha,

Billi:

(1) L-Anness I tad-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE fih lista ta' sustanzi perikolużi, flimkien mal-partikolaritajiet tal-klassifikazzjoni u l-ittikkettjar ta' kull sustanza. Dik il-lista teħtieġ li tkun aġġornata sabiex tinkludi aktar sustanzi notifikati ġodda u aktar sustanzi eżistenti kif ukoll tadatta l-kitbiet eżistenti għall-progress tekniku bħal ma hija l-istabbilizzazzjoni tal-limiti tal-konċentrazzjoni ambjentali dwar ċerti sustanzi. Għalhekk huwa wkoll meħtieġ li jkunu mħassra l-kitbiet għal ċerti sustanzi u li kitbiet oħrajn ikunu maqsumin minħabba li l-klassifikazzjoni mhix aktar applikabbli għas-sustanzi kollha skond dawk il-kitbiet.. It-tikkettjar tas-sustanzi li jkun fihom il-1,3 butadiene għandu jkun mibdul sabiex jirrefletti li s-sustanza għandha tkun klassifikata bħala muraġena b'din id-Direttiva preżenti.

(2) L-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE jistabbilixxi l-metodi għad-determinazzjoni tal-propjetajiet fiżikokimiku, għat-tossiċità u l-ekotossiċita ta' sustanzi u preparazzjonijiet. Huwa xieraq li jkun emendat dak l-Anness sabiex ikun akkwistat tnaqqis għall-minimu tan-numru ta' l-annimali wżati għall-iskopijiet ta' l-esperimenti, bi qbil mad-Direttiva tal-Kunsdill 86/609/KEE ta' l-24 ta' Novembru 1986 dwar l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi ta' l-Istati Membri f'dak li jirrigwardja l-protezzjoni ta' l-annimali wżati għal skopijiet ta' l-esperimenti u wkoll dawk xjentifiċi [2]. Il-metodi dwar it-tossiċità orali subkronika fil-Kapitoli B.1., B.4., B.5., B.31. u B.35., għandhom ikunu reveduti kif xieraq. Aktar minn hekk, il-Kapitolu B.42 għandu jkun miżjud ma l-Anness V sabiex jagħmel disponibbli metodu raffinat dwar it-tossiċità orali subkronika. Finalment, il-Kapitolu A.21 dwar il-propjetajiet fiżiko-kimiku, il-Kapitolu B.43 dwar it-tossiċità orali subkronika u l-Kapitoli C.21 sa C.24 dwar it-tossiċità ambjentali għandhom ikunu miżjuda sabiex jippermettu għad-determinazzjoni tal-propjetajiet li s'issa għandhom mkux koperti biż-żejjed bil-Metodi fl-Anness V.

(3) Il-miżuri li hemm provvediment dwarhom f'din id-Direttiva huma bi qbil ma l-opinjoni tal-Kumitat dwar l-Adattazzjoni għall-Progress Tekniku tad-Direttivi għall-Eliminazzjoni tal-Barrieri Tekniċi għall-Kummerċ fis-Sustanzi u l-Preparazzjonijiet Perikolużi.

ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA

Artikolu 1

Id-Direttiva 67/548/KEE hija emendata kif ġej:

1. L-Anness I huwa emendat kif ġej:

a) In-nota K fil-prefazju hija mibdula bit-test elenkat fl-Anness 1A;

b) Il-kitbiet korrespondenti għall-kitbiet stabbiliti fl-Anness 1B ta' din id-Direttiva huma mibdula bit-test elenkat f'dak l-Anness;

c) Il-kitbiet stabbiliti fl-Anness 1C ta' din id-Direttiva huma miżjuda bi qbil ma l-ordni tal-kitbiet kif elenkati fl-Anness I tad-Direttiva 67/548/KEE;

d) Il-kibiet bl-indiċi tan-numri 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 u 613-130-00-3 huma mħassra;

e) Il-kitba bl-indiċi tan-numru 048-002-00-0 hija mibdula bil-kitbiet bl-indiċi tan-numri 048-002-00-0 u 048-011-00-X kif elenkati fl-Anness 1D ta' din id-Direttiva;

f) Il-kitba bl-indiċi tan-numru 609-006-00-3 hija mibdula bil-kitbiet bl-indiċi tan-numri 609-006-00-3 u 609-065-00-5 kif elenkati fl-Anness 1D ta' din id-Direttiva;

g) Il-kitba bl-indiċi tan-numru 612-039-00-6 hija mibdula bil-kitbiet bl-indiċi tan-numri 612-039-00-6 u 612-207-00-9 kif elenkati fl-Anness 1D ta' din id-Direttiva.

2. L-Anness V huwa emendat kif ġej:

a) it-test elenkat fl-Anness 2A ta' din id-Direttiva huwa miżjud bħala il-Kapitolu A.21;

b) Il-Kapitolu B.1 bis huwa mibdul bit-test elenkat fl-Anness 2B ta' din id-Direttiva;

c) Il-Kapitolu B.1 tris huwa mibdul bit-test elenkat fl-Anness 2C ta' din id-Direttiva;

d) Il-Kapitolu B.4 huwa mibdul bit-test elenkat fl-Anness 2D ta' din id-Direttiva;

e) Il-Kapitolu B.5 huwa mibdul bit-test elenkat fl-Anness 2E ta' din id-Direttiva;

f) Il-Kapitolu B.31 huwa mibdul bit-test elenkat fl-Anness 2F ta' din id-Direttiva;

g) Il-Kapitolu B.35 huwa mibdul bit-test elenkat fl-Anness 2G ta' din id-Direttiva;

h) It-test elenkat fl-Anness 2H ta' din id-Direttiva huwa miżjud bħala il-Kapitolu B.42 u B.43;

i) It-test elenkat fl-Anness 2I ta' din id-Direttiva huwa miżjud bħala il-Kapitolu C.21 u C.24.

Artikolu 2

1. L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex ikunu konformi ma din id-Direttiva sal-31 ta' Ottubru 2005, l-aktar tard. Huma għandhom minnufih jikkomunikaw lejn il-Kummissjoni t-test ta' dawk id-disposizzjonijiet u tabella ta' korrelazzjoni bejn dawk id-disposizzjonijiet u din id-Direttiva. Meta l-Istati Membri jadottaw dawn id-disposizzjonijiet, dawn għandhom ikollhom referenza għal din id-Direttiva jew inkella jkunu akkumpanjati b'tali referenza fl-okkażżjoni tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. L-Istati Membri għandhom jiddeterminaw kif tali referenza għandha ssir.

2. L-Istati Membri għandhom jikkomunikaw mal-Kummissjoni d-disposizzjonijiet ewlenija tal-liġi nazzjonali li huma jadottaw fil-qasam kopert b'din id-Direttiva.

Artikolu 3

Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fit-tnejn-u-għoxrin jum ta' wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea.

Artikolu 4

Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri.

Magħmula fi Brussell, nhar id-29 ta' April 2004.

Għall-Kummissjoni

Margot Wallström

Membru tal-Kummisjoni

[1] ĠU 196, 16.8.1967, p. 1. Id-Direttiva kif l-aħħar emendata bir-Regolament (KE) Nru 807/2003/ (ĠU L 122, 16.5.2003, p. 36).

[2] ĠU L 358, 18.12.1986, p. 1. Id-Direttiva kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 2003/65/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (ĠU L 230, 16.9.2003, p. 32).

--------------------------------------------------

1. ANNESS IA

"Nota K:

Il-klassifikazzjoni bħala karċjoġenika jew mutaġenika mhux bil-fors li tkun applikabbli jew ikun jista jiġi muri li s-sustanza jkun fiha anqas minn 0,1 % w/w 1,3 butadjen (Einecs Nru: 203-450-8). Jekk is-sustanza ma tkunx klassifikata bħala karċjoġenika jew mutaġenika, mill-anqas il-pażijiet-S (2-)19-16 għandhom ikunu applikabbli. Din in-nota hija applikabbli għal ċerti sustanzi komplessi akkwistati miż-żejt, ta' l-Anness 1."

--------------------------------------------------

ANNESS 2A

A.21. PROPJETAJIET OSSIDIZZANTI (LIKWIDI)

1. METODU

1.1 INTRODUZZJONI

Dan il-metodu tat-test huwa ddisinjat sabiex ikejjel il-potenzal ta' sustanza likwida li żżid ir-rata tal-ħruq jew l-intensità tal-ħruq ta' sustanza kombustibbli, jew li tifforma taħlita ma sustanza kombustibbli li tieħu n-nar b'mod spontanju, meta it-tnejn ikunu kompletament imħallta. Dan huwa bbażat fuq it-test tan-NU dwar likwidi ossidizzanti (1) u huwa ekwivalenti għalih. B'dana kollu, minħabba li dan il-metodu A.21 huwa primarjament iddisinjat li jissodisfa l-ħtiġiet tad-Direttiva 67/548, il-paragun ma sustanza waħda ta' referenza huwa meħtieg. It-testijiet u l-paragun ma sustanzi addizzjonali ta' referenza jistgħu ikunu meħtieġa meta r-riżultati tat-test ikunu mistennija li jintużaw għal skopijiet oħrajn [1]

Dan it-test mhux bil-fors li jkun imwettaq meta l-eżami tal-formula struttrali jistabbilixxi lil hinn minn kull dubbju raġjonevoli li s-sustanza ma tkunx tista li jkollha reazzjoni eżotermika ma materjal kombustibbli.

Huwa utili li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar il-potenzal tal-propjetajiet splussivi tas-sustanza qabel ma jkun imwettaq it-test.

Dan it-test mhux applikabbli għal solidi, gassijiet, splussivi jew sustanzi li huma ferm fjammabbli,

Jew inkella għal perossidi organiċi. Dan it-test jista ma jsirx meta r-riżultati għat-test ta' sustanza fit-test tal-NU dwar likwidi ossidanti (1) ikunu diġa disponibbli.

1.2 DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET

Iż-żieda fil-ħin tal-pressa medja hija l-medja tal-ħinijiet imkejla dwar taħlita li tkun fit-test sabiex tipproċi żieda fil-pressa minn 690 kPa sa 2070 kPa aktar minn dik atmosferika.

1.3 SUSTANZA TA' REFERENZA

65 % (w/w) aċidu nitriku akweju (grad analitiku) huwa meħtieġ bħala sustanza ta' referenza [2].

L-aħjar, jekk l-esperiment jipprevedi li r-riżultati ta' dan it-test jistgħu eventwalment ikunu wżati għal skopiojiet oħrajn, l-ittestjar ta' sustanzi ta' referenza addizzjonali jistgħu wkoll ikunu xierqa [3] [4].

1.4 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Il-likwidu fit-test ikun imħawwad b'relattività ta' 1: 1, bil-massa, maa ċellulożi fibuża u introdott fir-reċipjent tal-pressjoni. Jekk waqt it-taħlit jew wat il-mili jkun hemm tkebbis spontanju, l-ebda test ieħor ma jkun meħtieġ.

Jekk it-tkebbis spontanju ma jseħħx, it-test kollu għandu jkun imwettaq. It-taħlita tkun imsaħħna f'reċipjent tal-pressjoni u l-ħin medju ikun irreġistrat għall-pressa li titla minn 690 kPa sa 2070 kPa aktar mill-pressjoni atmorferika. Dan ikun imqabbel maż-żieja fil ħin ta' pressjoni medja għat-taħlita 1: 1 tas-sustanza(i) ta' referenza maċ-ċellulożi.

1.5 KRITERJA TAL-KWALITÁ

F'serje ta' ħames provi fuq sustanza waħda l-ebda riżultati m'għandhom jiddiferixxu b'aktar minn 30 % mill-medja aritmetika. Ir-riżultati li jiddiferixxu b'aktar minn 30 % minn dik il-medja għandhom ikunu mwarrba, il-proċedura tat-taħlit jew tal-mili tkun imtejba u t-test irrepetut.

1.6 DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.1 Preparazzjoni

1.6.1.1 Sustanza kombustibbli

Sustanza xotta, fibruża, biċ-ċellulożi b'fibra b'tul ta' bejn 50 u 250 μm u diametru medju ta' 25 μm [5], tkun użata bħala l-materjal kombustibbli. Din tkun imnixxfa lejn piż kostanti f'saff ta' mhux aktar minn 25 mm ħxuna fi 105 °C għal 4 siegħat u miżmumha f'dessikatur, bid-dessikant, sakem tibred u tkun meħtieġa għall-użu. Il-konenut ta' l-ilma taċ-ċellulożi xotta għandu jkun ta' anqas minn 0,5 % bil-massa xotta [6]. Jekk meħtieġ, il-ħin tat-tnixxif għandu jkun imtawwal sabiex ikun milħuq dan il-livell [7]. L-istess lott ta' ċellulożi għandu jkun użat ma tul it-test kollu.

1.6.1.2 Apparat

1.6.1.2.1 Reċipjent tal-pressjoni

Reċipjent tal-pressjoni huwa meħtieġ. Ir-reċipjent jikkonsisti minn reċipjent ċilindiku tal-pressjoni ta' l-azzar 89 mm tul u 60 mm diametru estern (ara l-figura 1). Iż-żewġ ċattri jkunu magħroka b'mod mekkaniku fuq in-naħar opposti (titnaqqas it-transversa tar-reċipjent għal 50 mm) sabiex ikun faċilitat it-twaħħil tan-niċċa tat-tkebbis u tat-tapp tal-vent. Ir-reċipjent, li jkun ċirkonfernza nterna ta' 20 mm diametru ikun internament ribattut f'kull tarf għal fond ta' 19 mm u mogħti l-kamin sabiex jaċċetta 1. British Standard Pipe (BSP) jew l-ekwivalenti metriku. It-teħid tal-pressjoni, fil-għamla ta' driegħ laterali, ikun invitat fuq il-wiċċ tal-kurva tar-reċipjent tal-pressjoni, 35 mm minn tarf wieħed u 90o miċ-ċattri l-magħruka. Il-buq għal dan ikun imħaffer għal fond ta' 12 mm u mogħti l-kamin sabiex jaċċetta ½. BSP (jew metriku ekwivalenti)fit-tarf l-ieħor tad-driegħ. Jekk meħtieġ, siġill inert ikun imwaħħal sabiex jassigura siġill li ma jgħaddix gass minnu. Id-driegħ tal-ġemb jestendi għall-55 mm lil hinn mil-qafas tar-reċipjent tal-pressjoni u jkollu l-ħofra nterna ta' 6 mm. It-tarf tad-driegħ tal-ġemb ikun ribattut u bil-kamin sabiex jaċċetta transuċenti tal-pressjoni tat-tip bid-diaframma. Kwalunkwe apparat li jkejjel il-pressjoni jista jkun użat bastali dan ma jkunx affettwat bill-gassijiet sħan jew bid-dikomposizzjoni tal-prodotti u li jkun kapaċi li jirrispondi għal rati ta' żieda fil-pressjoni ta' 690-2070 kPa f'mhux aktar minn 5ms.

It-tarf l-aktar bogħod mid-driegħ tal-ġemb tar-reċipjent tal-pressjoni ikun magħluq fit-tapp ta' l-isparar li jkun mgħammar b'żewg elettrodi, wieħed insulat minn ġewaa, u l-ieħor imwaħħal ma l-earth, mal-buq taċ-ċilindru. It-tarf l-ieħor tar-reċipjent tal-pressjoni ikun magħluq b'diska li tinfaqha (pressjoni tat-tfaqqiegħ f'madwar 2200 kPa) miżmumha fil-post b'buq taż-żamma li jkollu l-ħofra ta' 20 mm. Jekk meħtieġ, siġill inert ikun użat mal-buq ta' l-isparar sabiex jassihura rabta sewwa li ma jgħaddix gass minnha. Strippa ta' sostenn (il-figura 2) isservi sabiex iżżomm l-assemblea fil-posizzjoni tajba matul l-użu. Dan normalment ikun jinkludi pjanċa ta' azzar artab bil-kejl ta' 235 mm × 184 mm × 6 mm u 185 mm tul b'sezzjoni mħaffra kwadra (S.H.S.) 70 mm × 70 mm × 4 mm.

Sezzjoni tkun maqtuha minn kull wieħed mill-ġnub opposti fit-tarf ta' S.H.S. hekk li l-istruttura jkollha żewġ saqajn bil-ġemb ċatt li fuqha tistrieh kaxxa intatta bi 86 mm tul li tirriżulta fis-sezzjoni. It-truf ta' dawn il-ġnub ċatti huma maqtuha lejn aangolu ta' 60o mal-lat orizzontali u iwweldjati mal-pjanċa tal-qiegħ. Qasma bil-kejl ta' 22 mm wisa' x 46 mm fond tkun maqtuha b'mod mekkaniku fuq naħa waħda fit-tarf ta' fuq tas-sezzjoni tal-qiegħ hekk li l-assemblkea tar-reċipjent tal-pressjoni tkun imniżżla, it-tarf tal-buq ta' l-isparar imdaħħal l-ewwel, fil-kaxxa tas-sostenn tas-sezzjoni, bid-driegħ tal-ġemb akkomodat f'dik il-qasma. Biċċa azzar 30 mm wisa' u 6 mm ħoxna tkun iwweldjata mal-wiċċ intern l-aktar baxx tas-sezzjoni tal-kaxxa sabiex taġixxa bħala spazzatura. Żewġ skorfini farfett, bil-kamin fuq il-wiċċ oppost, iservu sabiex iżommi r-reċipjent tal-pressjoni f'posizzjoni soda. Żewġ stripp 12 mm wisa' minn azzar 6 mm ħxuna, iwweldjati mal-biċċiet tal-ġemb li jesporġaw mil-bażi tal-kaxxa tas-sezzjoni, jappoġġaw ir-reċipjent tal-pressjonu minn taħt.

1.6.1.2.2 Sistema tat-tkebbis

Is-sistema tat-tkebbis tikkonsisti minn fil tal-Ni/Cr twil 25 cm b'diametru ta' 0,6 mm u reżistenza ta' 3.85 ohm/m. Il-fil ikun mibrum, bl-użu ta' virga b'diametru ta' 5 mm, fil-għamla rrumblata u marbut mal-buq ta' l-elettrodi ta' l-isparar. L-irrumblat għandu jkollu waħa mill-konfigurazzjonijiet murija fil-figura 3. Id-distanza bejn il-quegħ tar-reċipjent u l-parti t'isfel ta' l-irrumblat tat-tkebbis għandha tkun 20 mm. Jekk l-elettrodi ma jkunux aġġustabbli, it-trufijiet tal-fil tat-tkebbis bejl l-irrumbat u l-qiegħ tar-reċipjent għandhom ikunu insulati b'komma ċeramika. Il-fil ikun imsaħħan b'kurrent kostanti elettriku li jkun jista jformi mill-anqas 10 A.

1.6.2 It-twettieq tat-test [8]

L-apparat, assemblat kollu kemm hu bit-transuċitur tal-pressjoni u s-sistema tas-sħana imma mingħajr il-plattiba li tinfaqa', li jitqiegħed kollu f'postu, ikunu sostnut bit tarf tal-buq ta' l-isparar in-naħa t'isfel. 2.5 g mill-likwidu tat-test ikun imħallat ma 2.5 g taċ-ċellulożi mnixfa f'garafina tal-ħġieġ bl-użu ta' virga tal-ħġieġ għat-taħwid [9]. Bħala prekwazzjoni kontra l-periklu, it-taħwid għandu jkun imwettaq wara tarka tas-sigurtà li tkun bejn l-operatur u t-taħlita. Jekk it-taħlita titkebbes matul it-taħwid jew waqt il-mili, il-kumplament tat-test ma jkunx meħtieġ. It-taħlita tkun miżjuda, xi porzjonijiet żgħar u bit-taptip, lejn ir-reċipjent tal-pressjoni waqt li jkun assigurat li t-taħlita tkun ippakkjata madwar l-imgerbeb tat-tkebbis u li tkun f'kuntatt tajjeb miegħu. Huwa importanti li t-tgerbib ma jkunx mgħaffeġ waqt il-proċess ta' l-ippakkjar minħabba li dan jista jwassal għal riżultati ħżiena [10]. Il-plattina ti tinfaqa' titqigħed f'posta u l-buq taż-żamma invitat sewwa. Ir-reċipjent kif imħejji jkun trasferit għal fuq it-trepid ta' l-isparar, bil-plattina li tinfaqa' fuq in-naħa ta' fuq, u r-reċipjent għandu jkun lokalizzat f'armarju xieraq, imsaħħaħ u mħares kontra d-duħħan jew inkella f'ċellola ta' l-isprar. Il-fornimet ta' l-elettriku jkun marbut mat-trufijiet esterni tal-buq ta' l-isparar u jkunu applikat 10 A. Il-ħin ta' bejn il-bidu tat-taħlita u ta' meta jkun mixgħul l-elettriku m'għandux jeċċedi l-10 minuti.

Is-sinjal prodott nit-transuċenti tal-pressjoni ikunu irreġistrat fuq sistema xierqa li tippermetti kemm l-evalwazzjoni u l-ġenerazzjoni ta' reġistrazzjoni permanenti tal-profil taż-żmien mal-pressjoni hekk kif akkwistata (e.g. reġistratur tansjenti ma reġistratur ta' fuq il-karta). It-taħlita tkun imsaħħna sakem il-plattina li tinfaqa' tinkiser jew sa kemm mill anqas ikunu għaddew 60 s. Jekk il-plattina li tinfaqa' ma tinkisirx, it-taħlita għandha titħalla li tibdred qabel ma, b'galbu kbir, l-apparat ikun żarmat, billi jittieħdu l-prekwazzjonijiet għal xi pressurizzazzjoni li tista sseħħ. Ħames provi għandhom ikunu mwettqa bis-sustanza tat-test u bis-sustanza(i) tar-referenza. Il-ħin meħtieġ sabiex il-pressjoni titla minn 690 kPa sa 2070 kPa aktar mill-pressjoni atmosferika għandu jkun innotat. Il-medja tal-ħin fiż-żieda tal-pressjoni tkun ikkalkolata.

F'ċerti każi, is-sustanzi jistgħu jiġġeneraw għoli ta' pressjoni (għolja wisq jew baxxa wisq), minħabba r-reazzjonijiet kimiċi li ma jkunux jikkaratterizzaw il-propjetajiet assidanti tas-sustanza. F'dan il-każi, jista jkun meħtieġ li jkun repetut it-test b'sustanza inerta, e.g. diatomit (kieselguhr), minflok iċ-ċellulożi, sabiex tkun kjarifikata n-natura tar-reazzjoni.

2. DATA

Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm għas-sustanza tat-test u wkoll għas-sustanza(i) ta' referenza.

Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni għat-testijiet b'sustanza inerta, jekk imwettqa.

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm għas-sustanza tat-test u wkoll għas-sustanza(i) ta' referenza jkunu ikkalkolati.

Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni għat-testijiet b'sustanza inerta, (jekk imwettqa) jkunu ikkalkolati.

Uħud mill-eżempji tar-riżultati huma murija fit-Tabella 1

Tabella 1.

Eżempji tar-riżultati [14]

Sustanza [13] | Żidea fil-ħim tal-pressjoni medja għal taħlita 1:1 maċ-ċelolite (ms) |

Dikromat ta' l-ammonjum, taħlita akweja saturata | 20800 |

Nitrat tal-kalċju, taħlita akweja saturata | 6700 |

Nitrat ferriku, taħlita akweja saturata | 4133 |

Perklorat tal-litjum, taħlita akweja saturata | 1686 |

Perklorat tal-magneżjum, taħlita akweja saturata | 777 |

Nitrat tan-nikil, taħlita akweja saturata | 6250 |

Aċidu nitriku, 65 % | 4767 [11] |

Aċidu perkoriku, 50 % | 121 [11] |

Aċidu perkoriku, 55 % | 59 |

Nitrat tal-potassjum, taħlita akweja saturata | 26690 |

Nitrat tal-fidda, taħlita akweja saturata | – [12] |

Klorat tas-sodju, taħlita akweja saturata | 2555 [11] |

Nitrat tas-sodju, taħlita akweja saturata | 4133 |

Sustanza inerta | |

Ilma: Ċellulite | – [12] |

3. RAPPORT

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

- l-identità, il-komposizzjoni, il-purità, etc., tas-sustanza tat-test;

- il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;

- il-proċedura użata għat-tnixxif taċ-ċellulożi;

- il-kontenut ta' l-ilma użat fiċ-ċellulożi;

- ir-riżultati tal-kejl;

- ir-riżultati mit-testijiet b'sustanza inerta, jekk ikun hemm;

- il-ħinijiet medji kif ikkalkolati taż-żieda fil-pressjoni;

- xi devjazzjonijiet minn dan il-metodu u r-raġunijiet dwar dawn;

- l-informazzjoni addizzjonali kollha, jew ir-rimarki, dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati;

3.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI [15]

Ir-riżultati tat-test huma studjata fuq il-bażi ta':

a) jekk it-taħlita tas-sustamnza tat-test u ċ-ċellulożi jkunux jitkebbsu b'mod spontanju; u

b) il-paragun fil-ħin medju meħtieġ sabiex il-pressjoni titla minn 690 kPa għal 2070 kPa, imqabbel mas-sustanza(i) ta' referenza.

Sustanza likwida għandha tkun meqjusa bħala ossidanti, meta:

a) taħlita 1: 1, bil-massa, tas-sustanza u ċ-ċellulożi titkebbes b'mod spontanju; jew

b) taħlita 1: 1, bil-massa, tas-sustanza u ċ-ċellulożi turi żieda fil-ħin tal-medja tal-pressjoni li tkun anqas minn jew egwali għal, iż-żieda fil-ħin għal taħlita 1: 1. bil-massa, ta' 65 % (w/w) aċidu nitriku akweju u ċ-ċellulożi.

Sabiex ikunu evitati riżultati pożittivi foloz, ir-riżultati akkwistati meta jseħħ it-test tas-sustanza mal-materjal inert, għandhom ukoll ikunu meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. It-tielet edizjoni riveduta. Pubblikazzjoni tal-NU, Nru.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, paġna 342. Test O.2: Test għall-likwidu ossidanti

+++++ TIFF +++++

Reċipjent tal-Pressjoni

(A) Il-qafas tar-reċipjent tal-pressjoni

(B) Il-buq li jżomm il-plattinali tinfaqa'

(D) Ċirku minn ċomb artab

(E) Il-plattina li tinfaqa'

(F) Id-driegħ tal-ġemb

(G) Ir-ras tat-transduiċitur tal-pressjoni

(H) Iċ-ċirku

(J) L-elettrodi bl-insulazzjoni

(K) L-elettrodu ma l-earth

(L) Insulazzjoni

(M) Kona ta' l-azzar

(N) Il-kanal li jobrom iċ-ċirku

+++++ TIFF +++++

(A) It-tkebbib tat-tkebbis

(B) Insulazzjoni

(D) Il-buq ta' l-isparar

Nota:

Kwalunkwe waħda minn dawn il-konfigurazzjonijiet tista tkun użata.

[1] Bħal, per eżempju, fil-qafas tar-regolamenti tan-NU dwar it-trasport.

[2] L-aċidu għandu jkun titrat qabel it-test sabiex tkun konfermata l-konċentrazzjoni tiegħu.

[3] Bħal, per eżempju, fil-qafas tar-regolamenti tan-NU dwar it-trasport.

[4] E.g.: 50 % (w/w) aċidu perkloriku u 40 % (w/w) klorat tas-sodju huma wżata fir-referenza 1.

[5] e.g. Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, numru tal-katalogu 4021 050.

[6] Ikkonfermat bi titrazzjoni (e.g.) Karl-Fisher.

[7] B'mod alternattiv, dan il-kontenut ta' l-ilma jista wkoll ikun akkwistat bi (e.g.) sħana sa 105 °C fil-vakwu għal 24 siegħa.

[8] Taħlitiet ta' ossidanti maċ-ċellulożi għandhom ikunu ittrattati bħala potenzalment splussivi u mqandla f'kura kbira.

[9] Fil-prattika dan jista jseħħ bill-preparazzjoni ta' taħlita 1: 1 tal-likwidu imġejji għat-test u iċ-ċellulożi f'ammont akbar minn dak meħtieġ għall-prova u għat-trasferiment ta' 5 ± 0.1 g lejn ir-reċipjent tal-pressjoni. It-taħlita għandha tkun ippreparata friska għal kull prova.

[10] Partikolarment, il-kuntatt bejn id-dawrien tal-biswit tat-tkebbib għandu jkun evitat.

[11] Valur medju mill-provi komparattivi tal-laboratorju

[12] Pressjoni massima ta' 2070 kPa mhux milħuqha

[13] It-taħlitiet saturati għandhom ikunu ippreparati fi 20 °C

[14] Ara r-referenza (1) għall-klassifikazzjoni skond l-iskema tat-traspoprt tal-NU

[15] Ara r-referenza 1 dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati skond ir-regolamenti tat-trasport tan-NU, bl-użu ta' diversi sustanzi ta' referenza.

--------------------------------------------------

ANNESS 2B

B.1 bis. TOSSIĊITÁ ORALI AKUTA - PROĊEDURA GĦAL DOŻA FISSA

1. METODU

Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti għal OECD TG 420 (2001)

1.1 INTRODUZZJONI

Il-metodi tradizzjonali għall-istudju tat-tossiċità akuta bl-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni. Fil-1984, resqien ġdid dwar it-testijiet tat-tossiċità akuta kien ġie suġġerit mill-British Toxocology Society li huwa ibbażat fuq l-amministrazzjoni f'serje ta' livelli ta' dożi fissi (1). Ir-resqien evita l-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni, u minflok straħ fuq l-osservazzjonijiet ta' sinjali ċari tat-tossiċità f'wieħed mis-serje ta' livelli ta' dożi fissi. Bsegwiment ta' studji in vivo tal-validazzjoni fil-UK (2) u f'medda internazzjonali (3), ilk-proċedura kienet adottata bħala metodu tat-test fil-1992. Sussegwentament, il-propjetajiet statistiċi tal-Proċedura ta' Doża Fissa kienu ġew evalwati bl-użu ta' mudelli matematiċi f'serje ta' studji (4) (5) (6). Flimkien, l-istudji in vivo u l-mudellar kienu were li l-proċedura hija riproduċibbli, bl-użu anqas ta' annimali u tikkawża anqas tbagħtija mill-metodi tradizzjonali u hija kapaċi li tiggrada s-sustanzi f'manjera simili mal-metodi l-oħrajn tat-testijiet tat-tossiċità akuta.

Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwar it-Testijiet tat-Tossiċità Akuta Orali (7). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-Metodu tat-test B.1 bis.

Huwa prinċipju tal-metodu li fl-istudju ewlieni dożi tossiċi moderati biss ikunu użati, u li l-amministrazzjoni tad-dożi li jkunu mistenna bħala letali għandhom ikunu evitati. Ukoll, id-dożi li huma magħrufa bħala li jikkawżaw uġiegħ u tqallib żejjed, minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew ta' irritazzjoni qawwija, ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu amministrati. Annimali moridondi, jew annimali li ovvjament ikunu bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tqallib sever u dewwiemi għandhom ikunu maqtula b'mod uman, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mezz bħal dawk l-annimalili jkunu mietu waqt it-test. Il-kriterja ta' kif tittieħed id-deċiżjoni sabiex ikunu maqtula l-annimali moribondi jew dawk li jkunu fi tbagħtija kbira, u l-gwida għar-rikonoxximent ta' mewt prevista jew mistennija, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat 98).

Il-metodu jipprovdi informazzjoni dwar il-propjetajiet perikolużi u jippermetti li s-sustanza tkun iggradata u ikklassifikata skond il-Globally Harmonised System (GHS) (Sistema Armonizzata Globali) għall-klassifika ta' kimika li toħloq tossiċità akuta (9).

Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identifikaazzjoni u l-istruttura kimika tas-sustanza; il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' xi testijiet oħrajn in vitro jew in vivo dwar is-sustanza' id-dettalji tossikoloġiċi dwar sustanzi struttalment relatati; u l-użu(i) antiċipati tas-sustanza. Din l-informazzjoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana, u li jkun jgħin fil-għażla ta' doża xierqa għal-bidu.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Tossiċita akuta orali: Tirreferi għall-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża waħda ta' sustanza jew dożi multipli, matul 24 siegħa.

Mewt imdewwma: Tfisser li l-annimal ma jkunx u ma jidhirx moribond fi żmien 48 siegħa, imma li jmut aktar tard matul il-perijodu ta' osservazzjoni ta' 14 il-jum.

Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test li tkun amministrata. Id-doża hija espressa bħala l-piż tas-susatanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (e.g. mg/kg).

Tossiċità evidenti: Hija terminoloġija ġenerali li tiddeskrivi sinjali ċari tat-tossiċita bħala segwiment ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test (ara (3) għall-eżempji) bħal ma hija d-doża fissa segwenti aktar għolja li toħloq uġiegħ waqqi jew sinjali dewwiema ta' tbagħtija qawwija, l-istatus ta' moribond (il-kriterja hija ippreżentatha fil-Humane Endpoints Guidance Document (8) (Dokument ta' Gwida dwar l-Għanijiet Umani)), jew li l-probabbiltà ta' mortalità f'bosta annimali tista tkun mistennija.

GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. (Sistema tal-Klassifikazzjoni Armonizzata Globali dwar Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi.) Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), il-Kumitat tan-NU ta' l-Esperti dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni ta' periklu) u kordinata mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC).

Mewt iminenti: Meta l-istat ta' moribond jew mewt ikun mistenni qabel il-ħin ta' l-osservazzjoni segwenti ippjanata. Sinjali indikattivi ta' dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni laterali, mimduda, u roda. (Ara d-Dokument ta' Gwida dwar l-Umanita Immirata (8) għal aktar dettalji).

LD50 (doża letali medja): Hija akkwistata b'mod statistiku minn doża waħda ta' sustanza li tista tkun mistennija li tikkaġuna mewt f'50 fil-mijja ta' l-annimali meta amministrati permezz tar-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).

Limitu tad-doża: Tirreferi għal doża fil-litu l-aktar għoli tagħha waqt it-testijiet (2000 jew 5000 mg/kg).

L-istat moribondi: Huwa l-istat ta' qabel il-mewt jew ta' l-inabbiltà tas-sopravivenza, anki jekk ikun hemm trattament. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).

Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbilta li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).

1.3 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Gruppi ta' annimali ta' sess wieħed huma mogħtija doża fi proċedura mtarrġa bl-użu ta' dożi fissi ta' 5, 50, 300 u 2000 mg/kg (eċċezzjonalment għal doża fissa addizzjonali ta' 5000 mg/kg li tika tkun ikkonsidrata, ara s-sezzjoni 1.6.2). Il-livell inizjali tad-doża huwa magħżul fuq il-bażi ta' l-istudju tas-sejbien bħala d-doża mistennija li tipproduċi xi sinjali ta' tassiċità mingħajr ma toħloq l-effetti ta' tossiċità severa jew tal-mortalita. Is-sinjali kliniċi u l-kondizzjonijiet assoċjati ma l-uġiegħ, sofferenza, u mewt iminenti, huma deskritti fid-dettall fi Gwida OECD separata, id-Dokument (8). L-annimali jistgħu jingħataw doża aktar għolja jew aktar baxxa, jiddependi mill-preżenza jew in-nuqqas ta' sinjali ta' tossiċità jew mortalità. Din il-proċedura tinżamm sakemm id-doża li toħloq tossiċità evidenti jew ta' mewt waħda jew aktar, ikunu identifikati, jew meta l-ebda effetti ma jkunu jidhru fid-doża l-aktar għolja jew meta l-imwiet iseħħu fid-doża l-aktar baxxa.

1.4 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

L-ispeċje preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċje oħrajn ta' annimali gerriema tista tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili 97). Dan huwa minħabba li l-istħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (10). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta.

Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.

1.4.2 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 °C (± 3 °C). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12 il-siegħa dawl, 12 il-siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu wżati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.

1.4.3 Preparazzjoni ta' l-annimali

1.4.4 Preparazzjoni tad-dożi

Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista jkun ikkonsidrat. Fir-rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (e.g. żejt tal-qamħ-ir-rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il-karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ippreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbilità tal-preparazzjoni matul il-perijodu ta' l-użu tkun magħruha u turi li tkun aċċettabbli.

1.5 PROĊEDURA

1.5.1 Amministrazzjoni tad-dożi

Is-sustanza tat-tes hija amministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi inubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhuix tas-solti li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perijodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.

L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (e.g. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perijodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun amministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun amministrata, l-ikel jista jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun amministrata fi frazzjonijiet matul perijodu ta' żmien, jista jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perijodu.

1.5.2 Studju ta' l-osservazzjoni

L-iskop ta' l-istudju ta' l-osservazzjoni huwa li jippermetti l-għażla xierqa tad-doża tal-bidu li tintuża fl-istudju ewlieni. Is-sustanza tat-test hija amministrata lill-annimali singoli b'manjera sekwenzali skond il-karti tan-nixxija fl-Anness 1. L-istudju ta' l-osservazzjoni ikunu komplut meta d-deċiżjoni dwar il-bidu tad-doża għall-istudju ewlieni tkun tista tittieħed (jew jekk il-mewt tkun apparenti fid-doża l-baxxa kif stabbilita).

Id-doża tal-bidu għall-istudju ta' l-oisservazzjoni hija magħżulha minn livelli fissi ta' dożi ta' 5, 50, 300 u 2000 mg/kg bħala doża mistennija li tipproduċi tossiċità evidenti ibbażata, meta possibbli, fuq evidenza mid-dettalji in vivo u in vitro mill-istess kimika jew il-kimiċi ta' struttura relatata. Fin-nuqqas ta' tali informazzjoni, id-doża tal-bidu għandha tkun 3000 mg/kg.

Perijodu ta' mill-anqas 24 siegħa għandu jkun imħolli bejn l-għoti tad-doża lil kull annimal. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal mil anqas 14 il-jum.

B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5000 mg/kg tista tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 3). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-benessere ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2000-5000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.

Fil-każi meta annimal ikun ittestjat fil-livell l-aktar baxx ta' doża fissa (5 mg/kg) fl-istudju ta' l-osservazzjoni imut, il-proċeduira normali hija li jkun terminat l-istudju u li s-sustanza tkun assanjata għal-GHS, Kategorija 1 (kif muri fl-Anness 1). B'dana kollu, jekk aktar konferma tal-klassifika tkun meħtieġa, proċedura supplementari voluntarja tista tkun imwettqa, kif ġej: It-tieni annimal ikunu mogħti d-doża fi 5 mg/kg. Jekk dan it-tieni annimal imut, allura il-Kategorija 1 GHS tkun ikkonfermata u l-istudju jkun terminat immedjetament. Jekk it-tieni annimali jibqa ħaj, allura massimu ta' tlett annimali addizjnonali ikunu mogtoja d-doża ta' 5 mg/kg. Minħabba li jkun hemm riskju kbir ta' mortalità, dawn l-annimali għandhom ikunu mogjħtija d-doża b'mod sekwenzali sabiex ikun imħares il-benessere ta' l-annimali. Fl-intervall ta' ħin bejn kull doża għal kull annimal għandu jkun suffiċjenti sabiex ikun stabbilit jekk l-annimal preċedenti jkunx sejjer jibqa ħaj. Jekk isseħħ it-tieni mewt, is-sekwenza tad-doża għandha tkun terminata immedjetament u l-ebda annimali oħrajn ma jingħataw id-doża. Minħabba l-okkorrenza tat-tieni mewt (irrispettivemanet min-numru ta' l-annimali ittestjati fil-waqt tat-terminazzjoni) tidħol fl-eżitu A (2 jew aktar imwiet), ir-regola tal-klassifika ta' l-Anness 2 fi 5 mg/kg doża fissa tkun segwita (il-Kategorija 1 jew ikun hemm 2 jew aktar imwiet, jew il-Kategorija 2 jekk ikun hemm mhux aktar minn mewt waħda). B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.

1.5.3 Studju ewlieni

1.5.3.1 Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi

L-azzjoni li għandha tittieħed b'segwiment tat-testijiet fid-doża tal-livell tal-bidu hija indikata fil-karti nixxija fl-Anness 2. Waħda mit-tlett azzjonijiet tkun meġtieġa; jew li jieqfu t-testijiet u li tkun assenjata l-klassifikazzjoni tal-klassi tal-periklu xierqa, it-test f'doża ta' livell għola jew test f'doża f'livell aktar baxx. B'dana kollu, għall-protezzjoni ta' l-annimali, livell ta' doża li jikkaġuna l-mewt fl-istudju ta' l-osservazzjoni m'għandhiex tkun użata mill-ġdid fl-idtudjnu ewlieni (ara l-Anness 2). L-esperjenza wriet li r-riżultat probabbli fil-livell tad-doża tal-bidu ikun dak li s-sustanza tista tkun klassifikata u li l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa.

Total ta' ħames annimali ta' sess wieħes ikun normalment użat għal kull livell ta' doża investigata. Il-ħames annimali għandhom ikunu magħmula minn annimal wieħed mill-istudju ta' l-osservazzjoni li jkun ħa doża fil-livell magħżul flimkien ma erba annimali addizzjonali oħrajn (apparti, ħaġa mhux tas-soltu, jekk il-livell tad-doża użat ma kienx inkluż fl-istudju ta' l-osservazzjoni).

L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament. Perijodu ta' minn 3 sa 4 ijiem bejn id-dożi f'kull livell huma rakkommandabbli, jekk maħtieġ, sabiex jippermetti għall-osservazzjoni tat-tossiċità mdewma. L-intervall tal-ħin jista jkun aġġustat kif xieraq, e.g., fil-każ ta' reazzjoni mhux konklussiva.

Meta l-użu tad-doża l-aktar għolja ta' 5000 mg/kg ikun ikkonsidrat, il-proċedura kif elenkata fl-Anness 3 għandha tkun segwita (ara wkoll is-sezzjoni 1.6.2).

1.5.3.2 Test tal-limitu

It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta ftit jew l-ebda informazzjoni ma tkun disponibbli dwar it-tossiċità tagħha, jew meta l-materjal tat-test ikun mistenni li huwa tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq.

Bl-użu tal-proċedura normali, studju ta' l-osservazzjoni li jibda b'doża ta' 2000 mg/kg (jew b'mod eċċezzjonali 5000 mg/kg) segwit b'doża fuq erba annimali oħrajn f'dan il-livell iservi bħala test rtal-limitu għal din il-linja ta' gwida.

1.6 OSSERVAZZJONIJIET

L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perdodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14 il-jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benessera ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħin ta' l-iskoppjar u t-tul tal-perijodu ta' l-irkupru, u jista b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet ta' meta jidhru jew jisparixxu s-sinjali tat-tossiċità huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewwma (11). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematikament irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.

Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, diarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (8). L-annimali misjuba f'kondizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista jkun possibbli.

1.6.1 Piż tal-ġisem

Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun amministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.

1.6.2 Patoloġija

L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benessera ta' l-annimali0 għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl-annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista tforni informazzjoni utili.

2. DATA

Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda ma dan, id-dettalji kollha għandhom ikunu miġbura f'sommarju, li juru għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali użati, in-numru ta' annimali ji jkollhom sinjali ta' tossiċità, in-numru ta' annimali li jisntabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u l-korsa tal-ħin ta' l-effetti tossiċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s-sejbiet tan-nekropsija.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika, il-purità, u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l-iżomerizzazzjoni);

- dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.

Mezz (jekk applikabbli):

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test:

- speċje/tipi użati;

- l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;

- in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili);

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test:

- dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;

- dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata id-doża;

- dettalji dwar il-kwal;ità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);

- ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.

Riżultati:

- tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-doża għal kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, inklużi l-effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti);

- tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;

- il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u il-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;

- id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;

- il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali;

- is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.

Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 ġhttp://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.htmlħ.

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

--------------------------------------------------

ANNESS 2C

"B.1 tris. TOSSIĊITÁ ORALI AKUTA - METODU TAL-KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 423 (2001)

1.1 INTRODUZZJONI

Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta (1) kif stabbilit f'dan it-test huwa l-proċedura sussegwenti ma l-użu ta' 3 annimali ta' sess wieħed għal kull pass. Jiddependi mill-mortalità u/jew l-istat ta' modibondi li jkunu fih l-annimali, bħala medja 2-3 passi jkunu meħtieġa sabiex jippermeti li jsir ġudizju dwar it-tossiċità akuta tas-sustanza tat-test. Din il-proċedura hija ripreoduċibbli, tuża ftit annimali u hija kapaċi li tiggrada sustanzi b'manjera simili għall-metodi l-oħrajn tat-testijiet dwar it-tossiċità akuta. Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta huwa bbażat fuq evalwazzjonijiet biometriċi (2) (3) (4) (5) b'dożi fissi, separati b'mod adekwat sabiex jippermettu li sustanza tkun iggradata għall-iskopijiet tal-klassifika u ta' l-assessjar tal-periklu. Il-metodu kif adottat fil-1996 kien ġie validat b'mod estensiv in vivo bi tqabbil mad-dettalji JD50 akkwistati mil-letteratura, kemm nazzjonali (6) u dik internazzjonali (7).

Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwat it-Testijiet tat-Tossiċità Orali Akuta (8). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-metodu tat-test B. 1 tris.

Test substances, at doses that are known to cause marked pain and distress due to corrosive or severely irritant actions, need not be administered. Is-sustanzi tat-test, fid-dożi li huma magħrufa li jikkaġunaw uġiegħ qawwi u tbagħtija minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew severament irritanti, ma jistgħux ikunu amministrati. Moribund animals, or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress shall be humanely killed, and are considered in the interpretation of the test results in the same way as animals that died on test. Annimali fl-għafja tal-mewt, jew annimali avvjament bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tbagħtija qawwija għandhom ikun u maqtula b'mod umanitarju, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mod bħal dawk l-annimali li jmutu matul it-test. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula l-annimali fl-għafja tal-mewt jew dawk li jkunu jbagħtu ħafna, u l-gwida dwar ir-rikonoxximent ta' mewt mistennija jew prevista, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (9).

Dan il-metodu jutilizza dożi definiti bil-quddiem u r-riżultati jippermettu li sustanza tkun gradata u klassifikata skond is-Sistema Globali Armonizzata għall-klassifika ta' kimiċi li jikkaġinaw tossiċità akuta (10).

Bħala prinċipju, il-metodu mhux intiż li jippermetti l-kalkolu ta' LD50 preċiża, imma fil-fatt jipperemetti għad-determinazzjoni ta' medded ta' esposizzjoni definita meta l-letalità tkun mistennija minħabba li l-mewt ta' proporzjoni ta' l-annimali tkun xosrta waħda l-għan finali ewlieni ta' dan it-test. Il-metodu jippermetti għad-determinazzjoni tal-valur LD50 biss meta mill-anqas żewġ dożi jirriżultaw f'mortalità għola minn 0 % u anqas minn 100 %. L-użu ta' għażla ta' dożi definiti bil-quddiem, independentament mis-sustanza tat-test, bil-klassifika espliċitament marbuta man-numri ta' l-annimali osservati f'diversi sitwazzjonijiet ittejjeb l-opportunità għar-rapurtaġġ ta' bejn laboratorju u laboratorju, b'konsistenza u repatabbilità.

Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza, il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultat ta' xi testijiet oħrajn in vivo jew in vitro dwar is-sustanza; id-dettalji tossikoloġiċi dwar is-sustanzi strutturament relatati; u l-użu antiċipat tas-sustanza. Din l-informazzjhoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana u li jkun ta' għajnuna fl-għażla tad-doża tal-bidu l-aktar xierqa.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Tossiċita akuta orali: Tirreferi għal dawk l-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża singola ta' sustanza jew ta' dożi multipli mogħtija matul 24 siegħa.

Mewt imdewwma: Tfisser li annimal ma jmutx u ma jkunx jidher f'għafja tal-mewt fi żmien 48 siegħa imma li jmut aktar tard matul il-perijodu ta' l-osservazzjoni ta' 14 il-jum.

Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif amministrata. Id-doża hija espressa bħala piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal ittestjat (e.g. mg/kg).

GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. Is-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata għal Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi. Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), Il-Kumitat ta' Esperti tal-NU dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni perikoluża) u l-kordinazzjoni mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC).

Imwiet imminenti: Meta l-istat fl-għafja tal-mewt jew il-mewt ikunu mistennija qabel il-ħin ippjanat segwenti ta' l-osservazzjoni. Sinjali indikattivi għal dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni ta' serħan fuq il-ġemb, mitluqa fuq darhom, u tkekix (Ara d-Dokument ta' Gwida ta' l-Għan Finali b'mod Umanitarju (9) għal aktar dettalji).

LD50 (doża orali medja ta' l-mwiet): Hija doża akkwistata b'mod statistiku ta' sustanza li tista tkun mistennija li tikkaġuna l-mewt fi 50 fil-mija ta' l-annimali meta amminsitrata bir-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).

Doża b'limitu: Tirreferi għad-doża fil-limitu l-aktar għoli tat-testijiet (2000 jew 5000 mg/kg).

Stat moribund (fl-għafja tal-mewt): Huwa l-istat li jwassal għall-mewt jew ta' nuqqas ta' kapaċità għal ħajja, anki jekk ittrattat (ara d-Dokument ta' Gwida dwar it-Tmiem Finali b'mod Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).

Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).

1.3 IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Huwa l-prinċipju tat-test li, ibbażat fuq il-proċedura ta' pass b'pass, bl-użu ta' numru minimu ta' annimali kull pass, informazzjoni suffiċjenti tkun akkwista dwar it-tossiċità akuta tas-sustanza tat-test sabiex tiffaċilita l-klassifika tagħha. Is-sustanza hija ammenistrata b'mod orali fuq grupp ta' annimali esperimentali b'waħda mid-dożi definiti. Is-sustanza hija ittestjata bl-użu tal-proċedura tal-pass b'pass, kull pass jutilizza tlett annimali ta' sess wieħed (normalment nisa). In-nuqqas jew il-preżenza ta' mortalità relatata mal-kompost ta' l-anniamli bid-doża. Ta' l-ewwel pass tkun tiddetermina l-pass segwenti, i.e.:

- l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa,

- id-doża fuq tlett annimali, bl-istess doża,

- id-doża fuq tlett annimali addizzjonali fil-livell aktar għoli segwenti jew fil-livell aktar baxx preċedenti.

Id-dettalji tal-proċedura tat-test huma deskritti fl-Anness I. Il-metodu ikun jiffaċilita ġudizju fir-rigward tal-klassifika ta' sustanza tat-test lejn waħda mis-serje tal-klassijiet ta' tossiċità definiti bil-valuri fissi LD-50 bħala waqfien.

1.4 DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.4.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

L-ispeċje preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċje oħrajn ta' annimali gerriema tista tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (9). Dan huwa minħabba li l-istħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (11). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta.

1.4.2 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

1.4.3 Preparazzjoni ta' l-annimali

1.4.4 Preparazzjoni tad-dożi

Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista jkun ikkonsidrat. Fir-rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (e.g. żejt tal-qamħ-ir-rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il-karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ppreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbilità tal-preparazzjoni matul il-perijodu ta' l-użu tkun magħruha u turi li tkun aċċettabbli.

1.5 PROĊEDURA

1.5.1 Amministrazzjoni tad-dożi

1.5.2 Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi

Tlett annimali huma wżati għal kull pass. Il-livell tad-doża li għandu jkun użat bħala d-doża tal-bidu jkun magħżul minn wieħed minn erba livelli fissi, 5, 50, 300 u 2000 mg/kg piż tal-ġisem. Il-livell tad-doża tal-bidu għandu jkun dak li jkun l-aktar probabbli li jipproduċi mortalità f'uħud mill-animali li jkunu reċevew id-doża. Il-karti tan-nixxija ta' l-Anness 1 jiddeskrivu l-proċedura li għandha tkun segwita għal kull waħda mid-dożi tal-bidu. B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.

Meta l-jknformazzjoni disponibbli tissuġġerixxi li l-lortalità pjuttost li ma sseħħx fl-għola livell tal-bidu (2000 mg/kg piż tal-ġisem), allura test tal-limitu għandu jkun imwettaq. Meta ma jkunx hemm informazzjoni dwar xi sustanza li għandha tkun ittestjata, għal raġunijiet tal-benessere ta' l-annimali, huwa rakkommandabbli li jsir użu minn doża tal-bidu ta' 300 mg/kg piż tal-ġisem.

B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5000 mg/kg tista tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 2). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-benessere ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2000-5000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.

1.5.3 Test tal-limitu

It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta jkun ftit jew l-ebda informazzjoni dwar. It-tossiċità tagħha, jew li fiha l-materjal tat-test ikun mistenni li jirriżulta tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq.

Test tal-limitu f'doża waħda fil-livell ta' 2000 mg/kg piż tal-ġisem jista jitwettaq fu1q sitt annimali (tlett annimali kull pass). B'mod eċċezzjonali, test tal-limitu b'doża waħda fil-livell ta' 5000 mg/kg jista jkun imwettaq fuq tlett annimali (ara l-Anness 2). Jekk il-mortalità tat-test relatata mas-sustanza tirriżulta, aktar testijiet fil-livell preċedenti aktar baxx jista jkun hemm il-ħtieġa li jitwettqu.

1.6 OSSERVAZZJONIJIET

L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perdodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14 il-jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benessera ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħil ta' l-iskoppjar u t-tul tal-perijodu ta' l-irkupru, u jista b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-hinijiet li fihom is-sinjali tat-tassiċit) jkunu apparaenti jew li jisparixxu huma. Importanti, speċjalment meta jkun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewma (12). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematikament irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.

1.6.1 Piż tal-ġisem

1.6.2 Patoloġija

L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benessera ta' l-annimali għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl-annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista tforni informazzjoni utili.

2. DATA

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika, il-purità, u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l-iżomerizzazzjoni);

- dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.

Mezz (jekk applikabbli):

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test:

- speċje/tipi wżati;

- l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;

- in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili);

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test:

- dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;

- dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata d-doża;

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);

- ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.

Riżultati:

- tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;

- il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u l-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;

- id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;

- il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali;

- is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.

Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http:// webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."

--------------------------------------------------

ANNESS 2D

B. 4. TOSSIĊITÁ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TAL-ĠILDA

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 404 (2002)

1.1 INTRODUZZJONI

Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu aġġornat, attenzjoni speċjali kienet mogħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li jikkonċerna l-benessere ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il-metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn deskritt għat-test in vivo dwar il-korrużjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, l-analiżi ta' l-evidenza peżata għandu jkun imwettaq skond id-dettalji relevanti eżistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffiċċjenti, dawn jistgħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (1). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli ta' vitro u kemm provvediment dwarha bħala Anness ta' dan il-metodu. B'żieda, meta xieraq, l-applikazzjoni suċċessiva, minflok simultanja, tat-tlett impjastri tat-test fuq l-annimal, fit-test inizjali in vivo, hija rakkommandata.

Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija u tal-benessere ta' l-annimali, testijiet in vivo m'għandhomx iseħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza jkunu ġew evalwati b'analiżi tal-peżar bl-evidenza. Tali dettalji għandhom jinkludu evidenza minn studju eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza waħda struttarament relatati u it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza (2) (3), u r-riżultati minn testijiet validati u aċċettati kemm in vitro jew ex vivo (4) (5) (5a). Din l-analiżi għandha tnaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo dwar is-sustanzi b'korrossività/irritazzjoni tal-ġilda li dwarha evidenza suffiċjenti tkun diġa eżistenti minn studju oħrajn rigward iż-żewġ għanijiet aħħarija.

Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta testijiet validati u aċċettabbli, in vitro jew ex vivo, dwar il-korrożjoni/irritazzjoni, hija inkluża bħala Anness għal dan il-metodu. L-istrateġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod unanimu, mill-parteċipanti ta' laqgħa ta' studju ta' l-OECD (6), u kienet ġiet adottata bħala l-istrateġija rakkommandata tat-testijiet fis-Sistema Armonizzata Globali għall-Klassifika ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (7). Huwa rakkommandabbli li din l-istrateġija tat-testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet in vivo. Għal sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il-korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. Għal sustanzi eżistenti b'informazzjoni mhux suffiċjenti dwar il-korrożjoni/irritazzjoni tal-ġilda, l-istrateġija għanha tkun użata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad-dettalji. L-użu ta' strateġija jew proċedura differenti tat-testijiet, jew ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, għandha tkun ġustifikata.

Jekk determinazzjoni tal-korrossività jew irritazzjoni ma tkuns tista ssir bl-użu ta' l-analiżi tal-peżar ta' l-evidenza, konsistenti mal-istrateġija sekwenzali tat-testijiet, test in vivo għandu jkun ikkonsidrat (ara l-Anness).

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Irritazzjoni dermali (tal-ġilda): Hija l-produzzjoni ta' ħsara riversibbli tal-ġilda bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza taat-test għal sa 4 siegħat.

Korrożjoni dermali 9tal-ġilda): Hija l-produzzjoni ta' ħsara irrevirsibbli tal-ġilda nekrożi viżibbli mill-epidermis u sa ġewwa d-dermis, bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test għal sa 4 siegħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma tipifikati b'ulċeri, nixxija ta' demm, qoxra bid-demm, u, fit-tmiem ta' l-osservazzjoni matul 14 il-jum, b'tibdil tal-kulur minħabba l-bjudija tal-ġilda, żoni sħaħ bi alopecia u farretti. Il-ħispatoloġija għandha tkun ikkonsidrata sabiex tevalwa feriti dubbjużi.

1,3 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Is-sustanza li għandha tkun ittestjata hija applikata f'doża singola mal-ġilda ta' annimal sperimentli; żoni tal-ġilda mhux trattati ta' l-annimal tat-test iservu għall-kontroll. Il-grad tal-korrożjoni/irritazzjoni ikun moqri u rreġistrat matul intervalli speċifiċi u jkun aktar deskritt sabiex jipprovdi evalwazzjoni sħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju gġandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati.

L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew uġiegħ severi, fi kwalunkwe waqt tat-test, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista tinstgħab fir-referenza (8).

1.4 DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1 Preparazzjoni tat-test in vivo

1.4.1.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek żgħażagħ adulti huma wżati. Ir-raġuni għall-użu ta' speċje oħrajn għandha tkun mogħtija.

1.4.1.2 Preparazzjoni ta' l-annimali

Madwar 24 siegħa qabel it-test, is-suf għandu jkun imneħħi bi tqaxxir taż-żona dorsali minn fuq id-dhar ta' l-annimali. Kura għandha tingħata li jkunu evitati xi brix tal-ġilda, u biss l-anniamli li huma b'saħħithom, b'ġilda ntatta, għandhom ikunu wżati.

Uħul mit-tip tal-fniek għandho irqajja folti ta' suf li huma aktar prominenti f'ċerti żminijiet tas-sena. Tali żoni ta' tkabbir ta' suf folt m'għandhomx ikunu wżati bħala s-siti tat-testijiet.

1.4.1.3 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

L-annimali għandhom jinzammi f'gaġġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 20 °C (± 3 °C), għall-fniek. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12 il-siegħa dawl, 12 il-siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu wżati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.

1.4.2 Proċedura tat-test

1.4.2.1 L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test

Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata fuq żona żgħira (madwar 6 cm2) tal-ġilda u miksija b'biċċa garża, li tinżamm fil-post bi stikk mhux irritanti. Fil-każi meta l-applikazzjoni diretta ma tkunx possibbli (e.g. likwidi u ċerti dlik), is-sustanza tat-test għandha l-ewwel tkun applikata fuq biċċa garża, li imbagħad tkun applikata mal-ġilda. Il-biċċa għandha tinżamm f'kuntatt ħafif mal-ġilda permezz ta' faxxa adattata semi-okklussiva, għal matul il-perijodu ta' l-esposizzjoni. Jekk is-sustanza tat-test tkun applikata fuq biċċa, din għandha tkun imwaħħla mal-ġilda b'tali mod li jkun hemm kuntatt tajjeb u distribuzzjoni uniformi tas-sustanza mal-ġilda. Aċċess mill-annimal lejn il-biċċa, jew l-inġestjoni li t-teħid man-nifs tas-sustanza tat-test m'għandux jitħalla li jseħħ.

Is-sustanzi likwidi huwa ġeneralment użati mingħajr ma jkunu mrattba. Meta jsiru t-testijiet ta' solidi (li jistgħu ikunu pulverizzati, jekk hekk ikun meqjus bħala meħtieġ), is-sustanza tat-test għandha tkun niedja b'ammont żgħit ilma (jew, meta meħtieġ, b'xi likwidu adattat ieħor) li jkun suffiċjenti sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta likwidi oħrajn apparti milli l-ilma jkunu wżati, l-influwenza potenzali tal-likwidu fuq l-irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza tat-test għand tkun ferm minima, jekk ikun hemm.

Fit-tmiem tal-perijodu ta' l-esposizzjoni, li normalment ikun ta' 4 siegħat, is-sustanza residwa tat-test għandha tkun imneħħija, meta prattikabbli, bl-użu ta' ilma jew b'xi solvent xieraq mingħajr ma jbiddel ir-reazzjoni eżistenti jew l-integrità ta' l-epidermis.

1.4.2.2 Livell tad-doża

Doża ta' 0.5 ml likwidu jew 0.5 g solidu jew dlik hija applikata maż-żona tat-test.

1.4.2.3 It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korrożjoni dermali bl-użu ta' annimal wieħed)

Huwa ferm rakkommandabbli li t-test in vivo jkun imwettaq inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed, speċjalment meta s-sustanza tkun issusspetata li jkollha potenzal korrossiv. Dan huwa skond l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali (ara l-Anness 1).

Meta sustanza tkun ġiet iġġudikata bħala korrossiva fuq il-bażi ta' l-analiżi ta' l-evidenza peżata, l-ebda aktar testijiet fuq l-annimali ma jkunu meħtieġa. Għal bosta mis-sustanzi li huma issusspettati bħala korrossivi, aktar testijiet in vivo ma jkunux normalment meħtieġa. B'dana kollu, f'dawk il-każi meta informazzjoni addizzjonali tinħass li tkun meħtieġa minħabba l-evidenza mhux suffiċjenti, testijiet limitati ta' l-annimali jistgħu jitwettqu bl-użu ta' dan il-metodu: Sa tlett biċċiet tat-test huma applikati b'mod sekwenzali fuq l-annimal. L-ewwel biċċa tkun imneħħija wara tlett minuti. Jekk l-ebda reazzjoni tal-ġilda ma tkun osservata, it-tieni biċċa tkun applikata u mneħħija wara siegħa. Jekk l-osservazzjonijiet f'dan l-istadju jindikaw li l-esposizzjoni tista titħalla b'mod umanitarju, allura t-test ikun estiż għal erba' siegħat, it-tielet biċċa tkun applikata u mneħħija wara erba' siegħat, u r-reazzjoni tkun gradata.

Jekk effett korrossiv ikun osservat wara kwalunkwe mit-tlett esposizzjonijiet sekwenzali, it-test ikun immedjetament terminat. Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat wara li l-aħħar biċċa tkun imneħħija, l-annimal ikun osservat għal 14 il-jum, sakemm il-korrożjoni ma tkunx żviluppat f'xi punt aktar kmieni.

F'dawk il-każi li fihom is-sustanza tat-test ma tkunx mistennija li tipproduċi korrożjoni imma li tista tkun irritanti, biċċa waħda għandha tkun applikata ma annimal wieħed għal erba' siegħat.

1.4.2.4 Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni tal-ġilda b'annimali addizzjonali)

Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat fit-test inizjali, l-irritant jew ir-reazzjoni negattiva għandhom ikunu ikkonfermati bl-użu ta' żewġ annimali oħrajn, kull wieħed b'biċċa waħda, għal perijodu ta' esposizzjoni ta' erba' siegħat. Jekk effett irritanti jkun osservat fit-test inizjali, it-test konfermatorju jista jitwettaq b'mod sekwenzali, jew bl-esposizzjoni ta' żewġ annimali simultanjament. Fil-każ eċċezzjoni, li fih it-test inizjali ma jkunx imwettaq, tnejn jew tlett annimali jistgħu ikunu ittrattati b'biċċa waħda, li tkun imneħħija wara erba' siegħat. Meta żewġ annimali huma wżati, jekk it-tnejn li huma juru l-istess reazzjoni, l-ebda testijiet oħrajn ma huma meħtieġa. Inkella, it-tielet annimal ikun ukoll ittestjat. Reazzjonijiet ekwoviċi ikunu jeħtieġu avalwazzjoni bl-użu ta' annimali addizzjonali.

1.4.2.5 Perijodu ta' osservazzjoni

It-tul ta' żmien ta' l-istudju gġandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbiltà jew in-nuqqas ta' riversabbiltà ta' l-effetti osservati. B'dana kollu l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' uġiegħ jew tbagħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti tar-riversabbilità, l-annimali għandhom ikunu osservati sa 14 il-jum wara t-tneħħija tal-biċċiet. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel l-14 il-jum, l-esperiment għandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.

1.4.2.6 Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda

L-annimali kollha għandhom ikunu eżaminati għal sinjali ta' eritema u odema, u r-reazzjoni rreġistrati wara 60 minuta, u imbagħad fi 24, 48 u 72 siegħa, wara t-tneħħija tal-biċċa. Għat-test inizjali fuq annimal wieħed, is-sit tat-test ikun ukoll eżaminat immedjetament wara li l-biċċ tkun imneħħija. Ir-reazzjoni dermali huma ggradati u rreġistrati skond il-gradi fit-tabella ta' hawn taħt. Jekk ikun hemm ħsara għall-ġilda li ma tistgħax tkunidentifikata bħala irritazzjoni jew korrożjoni wara 72 siegħa, l-osservazzjonijiet jistgħu ikunu meħtieġa sal-jum 14 sabiex tkun determinata r-riversibbiltà ta' l-effetti. B'żieda ma l-osservazzjonijiet ta' l-irritazzjoni, l-effetti tossiċi kollha, bħal ma huma n-nuqqas ta' xaħam min taħt il-ġilda, u xi effett kuntrarji sistematiċi (e.g., l-effetti fuq sinjali kliniċi ta' tossiċità u l-piż tal-ġisem), għandhom ikunu deskritti bis-sħiħ u rreġistrati. L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha tkun ikkonsidrata sabiex tikklarifika r-reazzjonijiet b'mod ekwivoku.

Il-gradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda hija neċċessarjament suġġestiva. Sabiex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni tal-ġilda u sabiex ikunu mgħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fiż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet jeħtieġu li jkunu adekwatament imħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif użata (ara t-Tabella ta' hawn taħt). Gwida illustrata dwar l-iggradar ta' l-irritazzjoni tal-ġilda u feriti oħrajn tista tkun ta' għajnuna (9).

2. DATA

2.1 PREŻENTAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu miġbura f'sommarju f'għamla tabulari fir-rapport finali tat-test u għandhom ikopru l-punti kollha elenkati fis-sezzjoni 3.1.

2.2 EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma jkunux jirrapreżentaw norma assoluta għall-propjetajiet irritanti ta' xi materjaa, minħabba li effetti oħrajn tal-materjal taat-test huma wkoll evalwati. Minflok, marki individwali għandhom ikunu meqjusa bħala valuri ta' referenza, li jeħtieġu li jkunu evalwati flimkien ma l-osservazzjonijiet l-oħrajn kolha li jirriżultaaw mill-istudju.

Ir-riversibbilità tal-feriti dermali għandha wkoll tkun ikkunsidrata fl-evalwazzjoni tar-reazzjoni irritanti. Meta r-reazzjonijiet bħal ma huma l-alopeċja (żoma limitat), iperkeratożi, iperplażja u qxur, jippersistu fit-tmiem talk-perijodu ta' 14 il-jum osservazzjoni, is-sustanza tat-test għandha tkun meqjusha bħala irritanti.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Raġġunar dwar it-test in vivi: Analiżi ta' l-evidenza mal-piż ra' informazzjoni pre-eżistenti qabel it-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' testijiet sekwenzali:

- deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;

- informazzjoni akkwistat f’kull stadju ta’ l-istrateġija ta’ l-ittestjar;

- deskrizzjoni tat-testijiet in vitru kif imwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;

- analiżi ta’ l-evidenza peżata għat-twettieq ta’ l-istudju in vivo

Is-sustanza tat-test:

- dettalji ta’ l-identifikazzjoni (e.g., numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot)purity);

- in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (e.g. pH, volatilità, solubilità, stabbilità);

- jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti.

Mezz:

- l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;

- il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.

Annimali tat-test:

- l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta’ l-annimali apparti milli fniek albino;

- in-numru ta’ l-annimaali għal kull sess;

- il-piżijiet ta’ l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil-konklużjoni tat-test;

- l-età fil-bidu ta’ l-istudju;

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test:

- it-teknika taal-preparazzjoni tas-sit tal-biċċa;

- id-dettalji tal-materjali użat fil-biċċa u t-teknika tat-twaħħil tal-biċċa;

- dettalji dwar il-preparazzjoni, l-applikazzjoni u t-tneħħija tas-susrtanza tat-test.

Riżultati:

- tabulazzjoni tal-marki tar-reazzjoni/korrożjoni għal kull annimal fil-punti kollha tal-ħin tal-kejl;

- deskrizzjonijiet tal-feriti kollha, kif osservati;

- deskrizzjoni narrattiva tan-natura u l-grad ta’ l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservati, u xi sejbiet ħistopatoloġiċi;

- id-deskrizzjoni ta’ xi Danni lokali oħrajn (e.g., tneħħija taax-xaħam minn taħt il-ġilda) u l-effetti sistematiċi b’żieda ma l-irritazzjoni jew il-korrożjoni dermali.

Diskussjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). 1. L-istudju ECVAM tal-validazzjoni internazzjonali dwar testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.

(5o) Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda

(6) Programm ta’ Linji ta’ Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta’ Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li kien inżamm fi Solna, l-Isvezjam fit-22 – 24 ta’ Jannar 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta’ Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Dokument ta’ Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l-Użu ta’ Sinjali Kliniċi bħala għanijiet finali umanitarji għall-annimali Sperimenti Użati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Saħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Serje dwar it-Testijiet u l-Assessjar Nru. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/ monos.htm).

(9) EPA (1990). Atlas tal-Feriti Dermali, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. ;(Disponibbli ma talba minn għand is-Segretarjat ta’ l-OECD).

TABELLA I: IGGRADAR TAR-REAZZJONIJIET TAL-ĠILDA

Il-Formazzjoni ta’ l-Eritema u l-Eskar

L-ebda eritema … | 0 |

Eritema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) … | 1 |

Eritema definita sewwa … | 2 |

Eritima moderata jew severa … | 3 |

Eritema severa (ħmura ta’ laħam nej) għall-formazzjoni ta’ l-eskar għall-prevenzjoni ta’ l-eritema gradata … | 4 |

Massimu possibbli: 4 |

Formazzjoni ta’ l-odema

L-ebda oredma … | 0 |

Odema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) … | 1 |

Odema ħafifa (it-trufijiet taż-żona definiti sewwa b’ħanek definit) … | 2 |

Odema moderata (imqabbża b’madwar 1 mm). … | 3 |

dema severa (imqabbża b’aktar minn 1 mm u testendi lil hinn miż-żona esposta) … | 4 |

Massimu possibbli: 4 |

L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha titwettaq sabiex tikklarifika r-reazzjonijiet b’mod ekwoviku.

--------------------------------------------------

ANNESS 2E

B. 5. TOSSIĊITÁ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TA' L-GĦAJNEJN

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 405 (2002)

1.1 INTRODUZZJONI

Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu aġġornat, attenzjoni speċjali kienet mogħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li jikkonċerna l-benessere ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il-metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn deskritt għat-est in vivo dwar il-korrużjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, l-analiżi ta' l-evidenza peżata għandu jkun imwettaq skond id-dettalji relevanti eżistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffiċċjenti, dawn jistgħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (2). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi it-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli ta' vitro u kemm provvediment dwarha bħala Anness ta' dan il-metodu. B'żieda, l-użu tat-test in vivo ta' l-irritazzjoni/korrużjoni dermali, sabiex ikun hemm tbassir tal-korrużjoni ta' l-għajnejn qabel il--konsiderazzjoni tat-test in vivo ta' l-għajnejn, huwa rakkommandabbli.

Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija u tal-benessere ta' l-annimali, testijiet in vivo m'għandhomx iseħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza jkunu ġew evalwati b'analiżi tal-peżar bl-evidenza. Tali dettalji għandhom jinkludu evidenza minn studju eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza waħda struttarament relatati u it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza (2) (3), u r-riżultati minn testijiet validati u aċċettati kemm in vitro jew ex vivo (4) (5) (5a). L-istudji setgħu kienu ġew imwetta preċedentament għal-, jew bħala riżultat ta'. L-analiżi ta' l-evidenza peżata.

Għal-ċerti sustanzi, tali analiżi tista tindika l-ħtieġa għal studji in vivo dwar il-potenzal tas-sustanza għal korrożjoni/irritazzjoni okulari. F'tali każi, qabel ma jkun ikkunsidrat l-użu tat-test in vivo fuq l-għajnejn, studju preferibbilemt in vivo ta' l-effetti dermali mis-sustanza għandu jkun l-ewwel nett imwettaq u evalwat bi qbil mal-metodu tat-testijiet B.4 (7). L-applikazzjoni ta' l-analiżi ta' l-evidenża peżata u ta' l-istrateġija sekwenzali tat-testijiet għandhom inaqqsu l-ħtieġa tat-testijiet in vivo dwar il-korrossività/irritazzjoni ta' l-għajnejn mis-sustanza li dwarha evidenza suffiċjenti tkun diġa teżisti minn studju oħrajn. Jekk id-determinazzjoni tal-potenzal tal-korrożjoni jew l-irritazzjoni ta' l-għajnejn ma tistgħax issir bl-istrateġija tat-testijier sekwenzali, anki wara t-twettieq ta' studju in vivo tal-korrożjoni u l-irritazzjoni dermali, test in vivi tal-korrożjoni/irritazzjoni ta' l-għajnejn jista jkun imwettaq.

Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli, in vitro jew ex vivo, dwar il-korrożjoni/irritazzjoni, hija inkluża bħala Anness għal dan il-metodu. L-istrateġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod unanimu, mill-parteċipanti ta' laqgħa ta' studju ta' l-OECD (8), u kienet ġiet adottata bħala l-istrateġija rakkommandata tat-testijiet fis-Sistema Armonizzata Globali għall-Klassifika ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (9). Huwa rakkommandabbli li din l-istrateġija tat-testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet in vivo. Għal sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il-korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. Għal sustanzi eżistenti b'informazzjoni mhux suffiċjenti dwar il-korrożjoni/irritazzjoni tal-ġilda, l-istrateġija għanha tkun użata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad-dettalji. L-użu ta' strateġija jew proċedura differenti tat-testijiet, jew ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, għandha tkun ġustifikata.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Irritazzjoni għal għajnejn: Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil-għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal-part esterna ta' l-għajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.

Korrożjoni ta' l-għajnejn: Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil-għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal-part esterna ta' l-għajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.

1.3 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Is-sustanza tat-test hija applikata f'doża singola ma waħda mill-għajnejn ta' l-annimal tal-prova; l-għajn mhux trattata isservi bħala kontroll. Il-grad ta' l-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajn huwa evalwat billi jkunu immarkati l-feriti ta' konġunktiva, l-kornea, u l-iris, matul intervalli speċifiċi. Effetti oħrajn fil-għajn u l-effetti kuntrarji sistematiċi huma wkoll deskritti sabiex jipprovdu evalwazzjoni sħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati.

1.4 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1 Preparazzjoni tat-test in vivo

1.4.1.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek żgħażagħ adulti huma wżati. Ir-raġuni għall-użu ta' speċje oħrajn għandha tkun mogħtija.

1.4.1.2 Preparazzjoni ta' l-annimali

Iż-żewġ għajnejn ta' kull annumal sperimentali proviżjonalment magħżul għat-testijiet għandu jkun eżaminat fi żmien 24 siegħa qabel ma jibda t-test. L-annimali li juru irritazzjoni fl-għajnejn, difetti okulari, jew li ħsara korneali pre-eżistenti m'għandhomx ikunu wżati.

1.4.1.3 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

1.4.2 Proċedura tat-test

1.4.2.1 L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test

Is-sustanza tat-test għandha tkun imqiegħda fuq il-ħofra konġunktivali ta' waħda mill-għajnejn ta' kull annimal wara li l-għatu tan-naħa t'isfel ta' l-għajn ikun inġibed lil himm mill-boċċa ta' l-għajn. Il-għotjien jkunu imbagħad b'ġentilezza miżmuma flimkien għal madwar sekonda sabiex ikun prevenut it-telf tal-materjal. L-għajn l-oħra, li tibqa mingħajr trattament, isservi bħala kontroll.

1.4.2.2 Irrigazzjoni

L-għajnejn ta' l-annimali tat-test m'għandhomx ikunu maħsula għal mill-anqas 24 siegħa wara li tkun saret l-istallazzjoni tas-sustanza tat-test, apparti milli fil-każ ta' solidi (ara s-sezzjoni 1.4.2.3.2), u fil-każ ta' effetti korrossivi jew irritanti immedjati. Wara 24 siegħa, hasla sewwa tista ssir jekk dan ikun meqjus bħala xieraq.

L-użu ta' grupp satellit ta' annimali għall-inverigazzjoni ta' l-infuwenza tal-ħasil mhux rakkommandabbi, sakemm ma jkunx xjetifikament ġustifikat. Jekk grupp satellit ikun meħtieġ, għandhom ikunu wżati żewġt ifniek. Il-kondizzjonijiet tal-ħasil gġandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, e.g., il-ħiun tal-ħasil; il-komposizzjoni u t-temperatura tat-taħlita tal-ħasil; it-tul ta' żmien, il-volum, u l-veloċità ta' l-applikazzjoni.

1.4.2.3 Livell tad-doża

1.4.2.3.1 It-testijiet tal-likwidi

Għat-testijiet tal-likwidi, doża ta' 0.1 ml hija wżata. Tbexxix bil-pompa m'għandux ikunu użat għall-istallazzjoni diretta ġewwa il-għajn. It-tbexxix tal-likwidu għandu jkun imneħħi u miġbur f'kontenitur qabel ma jkun installat 0.1 ml ġewwa l-għajn.

1.4.2.3.2 Testijiet tas-solidi

Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, dlik, u sustanzi partikolati, l-ammont użat għandu jkollu volum ta' 0.1 ml jew ġiż ta' mhux aktar minn 100 mg. Il-materjal tat-test għandu jkun mitħun fi trab fin. Il-volum tal-materjal solidu għandu jkun imkejjel wara li jkun kumpatt b'ġentilezza, e.g., bit-tektik tal-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza solida tat-test ma tkun ġiet imneħħija mill-għajn ta' l-annimal tat-tesr b'mekkaniżmi fiżjoloġiċi waqt l-ewwel punt fil-ħin ta' l-osserazzjoni ta' siegħa wara t-trattament, il-għajn tista tkun imlaħalħa b'ilma bil-melħ jew distillat.

1.4.2.3.3 Testijiet ta' aerosols

Huwa rakkommandat li t-tbexxix kollu bil-pompa u l-aerosols ikun miġbur qabel l-istallazzjoni ġewwa l-għajn. L-eċċezzjoni waħda hija għas-sustanzi f'kontenituri aerosol taħt pressjoni, li ma jistgħux ikunu miġbura minħabba l-vaporizzazzjoni. F'tali każi, l-għajn għandha tinżamm miftuħha, u s-sustanza tat-test amministrata fuq l-għajn bi spunt wieħed għal madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm, direttament minn quddiem il-għajn. Din id-distanza tista tvarja jiddependi mill-pressa tat-tbexxix u l-kontenuti. Kura għandha tittieħed li ma ssirx ħsara lill-għajn mill-pressa tat-tbexxix. F'każi xierqa, jista jkun hemm il-ħtieġa li jkun evalutat il-potenzal dwar ħsara "mekkaanika" ta' l-għajn mill-qawwa tat-tbexxix.

Estimi tad-doża minn aerosol jistgħu isiru bit-test tas-simulazzjoni kif ġej: Is-sustanza hija mbexxa fuq karta ta' l-użin minn fetħa d-daqs ta' għajn ta' fenek imqiegħda direttament qabel il-karta. Iż-żieda fil-piż tal-karta hija wżata sabiex ikun ikkalkolat l-ammont imbexxex fuq il-għajn. Għal sustanzi volatili, id-doża tista tkun ikkalkolata bl-użin ta' kontenitur riċevitur qabel u wara t-tneħħija tal-matyerjal tat-test.

1.4.2.4 It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajn bl-użu ta' annimal wieħed)

Kif spjegat fl-istrateġija sekwenzali tat-testijiet (ara l-Anness 1), huwa ferm rakkommandabbli li t-test in vivo ikun imwettaq inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed.

Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva għall-għajnejn bl-użu tal-proċedura deskritta, aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari ma jkunx meħtieġa.

1.4.2.5 Anastesija lokali

L-anastesija lokali tista tkun użata fuq il-bażi ta' każ b'każ. Jekk l-analiżi ta' l-evidenza peżata jindika li s-sustanza jkollha l-potenzal li tikkaġuna l-uġiegħ, jew jekk test inizzjali juri li reazzjoni ta' uġiegħ tkun tirriżulta, anastesija lokali tista tkun użata qabel l-istallazzjoni tas-sustanza tat-test. It-tip, il-konċentrazzjoni, u d-doża ta' l-anastesija lokali għandhom ikunu magħżula bir-reqqa sabiex jassiguraw li d-differenzi fir-reazzjoni għas-sustanza tat-test ma jkunux jirriżultaw mill-użu tiegħu. Il-għajn tal-kontrol għandha bl-istess mod tkun anastetizzata.

1.4.2.6 Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni ta' l-għajn b'annimali addizzjonali)

Jekk effett korrossic ma jkunx osservat fit-test inizjali, ir-reazzjoni irritanti jew negattiva għandha tkun ikkonfermata bl-użu ta' sa żewġ annimali addizzjonali. Jekk effett irritanti sever ikun osservat fit-test inizjali li jindika l-possibbiltà ta' effett qawwi (mhux riversibbli) fit-testijiet konformatorji, huwa rakkommandat li t-test konformatorju jkun imwettaq b'manjera sekwenzali fuq annimal wieħed kull darba, pjuttost milli l-esposizzjoni ta' żewġ annimali b'mod simultanju. Jekk it-tieni annimal jiżvela effetti severi korrossivi jew irritanti, it-test m'gġandux jitkompla. Annimali addizzjonali jistgħu ikunu meħtieġa sabiex jikkonfermaw ir-reazzjonijiet ħfief jew moderati ta' l-irritant.

1.4.2.7 Perijodu ta' osservazzjoni

It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati. B'dana kollum l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' uġiegħ jew tbagħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti riversibbli, l-annimali għandhom ikunu osservati normalment għal 21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel l-21 il-jum, l-esperiment għandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.

1.4.2.7.1 Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet ta' l-għajn

L-għajnejn għandhom ikunu eżaminati fi 1, 24, 48 u 72 siegħa wara l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. L-annimali għandhom jinżammu fit-test mhux aktar milli meħtieġ la darba informazzjoni definita tkun ġiet akkwistata. L-annimali li juru kon tinwament uġiegħ u tbagħtija severa għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk, mingħajt dewmien, u s-sustana tkun assessjata kif applikabbli. L-annimali b'dawn il-feriti ta' l-għajnejn wara li jkun kellhom l-istallazzjoni għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk: Xi toqba fil-kornea jew ulċera sinifikanti tal-kornea, inkluża s-stafiloma; demm fil-parti anterjuri ta' l-għajn; opaċità grad 4 tal-kornea li tippersisti għal 48 siegha; nuqqas ta' reazzjoni għad-dawl (nuqqas ta' reazzjoni radiali grad 2) li tippersisti għal 72 siegha; ulċera fil-membrana konjunktivali; nekrożi tal-membrana konjunktivali jew niktitanti; jew qoxra mejta. Dan huwa minħabba l-fatt li tali feriti, ġeneralment, ma humiex riversibbli.

L-annimali li ma jiżviluppawx feriti okulari jistgħu ikunu mneħħija mhux aktar kmieni minn 3 ijiem wara l-istallazzjoni. L-annimali b'feriti ħfief jew moderati għandhom ikunu osservati sakemm il-ferita tkun fieqet, jew għal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun terminat. L-osservazzjonijiet għandhom ikunu mwettqa fi 7, 14, u 21 jum sabiex ikun determinat l-istat tal-feriti, u r-riversabbiltà jew in-non-riversabbiltà tagħhom.

Il-gradi tar-reazzjoni okkulati (konġunktiva, kornea u iris) għandhom ikunu irreġistrati wara kull eżami (Tabella I). Xi feriti oħrajn ta' l-għajnejn (e.g. imtappna, imtebba) jew effetti ħżiena sistematiċi għandhom ukoll ikunu rrapurtati.

L-eżami tar-reazzjonijiet jistgħu ikunu faċilitati bl-użu tal-loupe binokulari, lampa-maqsuma ta' l-idejn, biomikroskopju, jew xi apparat ieħor xieraq. Wara r-reġistrazzjoni ta' l-osservazzjoni fi 24 siegħa, il-għajnejn jistgħu wkoll ikunu eżaminati bil-għajnuna tal-florixxin.

Il-gradar tar-reazzjonijiet okulari hija neċċessarjament suġġestiva. Sabiex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni okulari u sabiex ikunu mgħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fiż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni tagħhom, il-persunall li jwettaq l-osservazzjonijiet jeħtieġu li jkunu adekwatament imħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif użata ara t-Tabella ta' hawn taħt).

2. DATA

2.2 EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma jkunux jirrapreżentaw norma assoluta għall-propjetajiet irritanti ta' xi materja, minħabba li effetti oħrajn tal-materjal tat-test huma wkoll evalwati. Minflok, il-marki individwali għandhom ikunu riveduti bħala valuri ta' referenza u jagħmlu sens biss meta jkunu sostnuti b'deskrizzjoni sħiħa u l-evalwazzjoni ta' l-osservazzjonijiet kollha.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Raġunar dwar it-test in vivi: Analiżi ta' l-evidenza peżata ta' informazzjoni pre-eżistenti qabel it-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' testijiet sekwenzali:

- deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;

- informazzjoni akkwistat f'kull stadju ta' l-istrateġija ta' l-ittestjar;

- deskrizzjoni tat-testijiet in vitru kif imwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;

- deskrizzjoni ta' l-istudju in vivo dwar l-irritazzjoni/korrożjoni dermali li jkun ġie mwettaq, inklużi r-riżultati akkwistati;

- analiżi ta' l-evidenza peżata għat-twettieq ta' l-istudju in vivo

Is-sustanza tat-test:

- dettalji ta' l-identifikazzjoni (e.g., numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot);

- in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (e.g. pH, volatilità, solubilità, stabbilità, reattività fl-ilma);

- jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti;

- jekk anastesija lokali tkun ġiet użata, l-identifikazzjoni, il-purità, it-tip, id-doża, u l-potenzal ta' interazzjoni mas-sustanza tat-test.

Mezz:

- l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;

- il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.

Annimali tat-test:

- l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta' l-annimali apparti milli fniek albino;

- l-età ta' kull annimal fil-bidu ta' l-istudju;

- in-numru ta' l-annimali ta' kull sess użati fit-test u fil-grupp ta' kontroll (jekk meħtieġ);

- il-piżijiet ta' l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil-konklużjoni tat-test;

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Riżultati:

- deskrizzjoni tal-metodu użat biex tkun immarkata l-irritazzjoni f'kull ħil ta' l-osservazzjoni (e.g., lampa maqsuma ta' l-idejn, bimikroskopju, florexxin);

- tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni dwar l-irritamnt/korrosiv għal kull annimali f'kull ħin ta' l-osservazzjoni jew sa kemm kull animal ikun tneħħa mit-test;

- deskrizzjoni narrattiva tal-grad u n-natura ta' l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservata';

- deskrizzjoni ta' xi ferita oħra osservata fil-għajn (e.g., vaskularizzazzjoni, formazzjoni imtappna, waħħalija, tgħagħjja);

- deskrizzjoni ta' effetti ħżiena mhux okulari, lokali u sistematiċi, u s-sejbiet ħistopatoloġiċi, jekk ikun hemm.

Diskussjoni tar-riżultati.

3.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

L-estrapolazzjoni tar-rżultati ta' l-istudji dwar l-irritazzjoni ta' l-għajn li jkun twettqu fuq l-annimali tal-laboratorju lejn bnedmin umani hija valida biss sa grad limitat. F'ħafna każi, il-fenek albimo huwa iktar sensittiv mill-bnedmin dwar l-irritanti okulari jew għall-korrossivi.

Attenzjoni għandha tingħata fl-interpretazzjoni tad-dettalji sabiex tkun eskluża xi irritazzjoni li tirriżulta minn infezzjoni sekondarjaa.

4. REFERENZI

(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.

6a. Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda

(7) Metodu tat-testijiet B.4. Tossiċità akuta Irritazzjoni/korrużjoni dermali.

(8) Programm ta' Linji ta' Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm).

(10) Dokument ta' Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l-Użu ta' Sinjali Kliniċi bħala għanijiet finali umanitarji għall-annimali Sperimenti Użati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Saħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Publikazzjonijiet. Serje dwar it-Testijiet u l-Istudju Nru. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

TABELA I: RAZVRŠČANJE OČESNIH LEZIJ V STOPNJE

Roženica

Motnost: stopnja gostote (odčitati jo je treba na najbolj gostem gostejšem predelu) [1] |

Ni gnojenja ali motnosti … | 0 |

Razpršene ali obširne površine motnosti ( ki niso rahla motnost običajnega leska, delci šarenice jasno vidni) … | 1 |

Prosojna površina razločna brez težav; delci šarenice rahlo zatemnjeni … | 2 |

Spodnja površina: delci šarenica se ne razločijo; velikost zenice se komajda razloči … | 3 |

Motna roženica: šarenica se ne razloči zaradi motnosti … | 4 |

Največ možnih: 4 |

Šarenica

Normalna … | 0 |

Opazno poglobljene gube, naval krvi, otekanje, zmerna hiperemija okoli roženice; ali injekcija; šarenica reagira na svetlobo (počasna reakcija se upošteva kot učinek) … | 1 |

Krvavitev, resno propadanje ali odsotnost reakcije na svetlobo … | 2 |

Največ možnih: 2 |

Očesne veznice

Rdečina (nanaša se na veznice vek in nabrekle veznice, z izjemo roženice in šarenice) |

Normalna … | 0 |

Nekaj krvnih žil je hiperemičnih (injicirano) … | 1 |

Razpršena, škrlatna barva; posamezne žile niso zlahka razločne … | 2 |

Razširjena goveja rdečina … | 3 |

Največ možnih: 3 |

Kemoterapija

Otekanje (nanaša se na veke in/ali žmurke) |

Normalno … | 0 |

Nekoliko otečeno nad normalnim … | 1 |

Očitno otečeno, z delnim zavihanjem vek navzven … | 2 |

Otečeno, z napol zaprtimi vekami … | 3 |

Otečeno, z več kakor napol zaprtimi vekami … | 4 |

Največ možnih: 4 |

[1] Predel motnosti roženice je treba navesti.

--------------------------------------------------

ANNESS 2F

B.31. STUDJU TAT-TOSSIĊITÁ FL-IŻVILUPP PRENATALI

1. METODU

Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni għal OECD TG 414 (2001)

1.1 INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' l-ittestjar żviluppanti tat-tossiċità huwa iddisinjat li jipprovdi informazzjoni ġenerali li tikkonċerna l-effetti ta' l-esposizzjoni prenatalifuq annimal tqil waqt it-test u fuq l-organiżmu żviluppanti in utero; dan jista jinkludi l-assessjar ta' l-effetti maternali kif ukoll il-mewt, anormalitjiet strutturali, jew it-tkabbir mibdul tal-fetu. Id-difetti funzjonali, għalkemm parti importanti fl-iżvilupp, ma humiex parti integrali ta' dan il-metodu tat-test. Dawn jistgħu ikunu ittestjati għal studju separat jew bħala żieda ma dan l-istudju bl-użu tal-metodu tat-test għal newrotossiċità ta' l-iżvilupp. Għall-informazzjoni dwar it-testijiet għal defiċjenzi funzjonali u l-effetti l-oħrajm ta' wara t-twelid, il-Metodu tat-Test għal studju tat-tossiċità riproduttiva ta' żewġ ġenerazzjonijiet u l-istudju għal newrotossiċità ta' l-iżvilupp għandu jkun ikkonsultat skond kif xieraq.

Dan il-metodu tat-test jista jeħtieġ adattazzjoni speċifika f'każi individwali fuq il-bażi ta' tagħrif speċifiku fuq, e.g., il-propjetajiet fiżikokimiċi jew tossikoloġiċi tas-sustanza tat-test. Tali adattazzjoni hija aċċettabbli, meta evidenza xjentifika konvinċenti tissuġġerixxi li l-adattazzjoni tkun twassal għal test aktar informattiv. F'tali każ, din l-evidenza xjentifika għandha tkun dokumentata bir-teqqa fir-rapport ta' l-istudju.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Tossikoloġijata' l-iżvilupp: l-istudju ta' l-effetti ħżiena fuq l-organiżmi ta' l-iżvilupp li jistgħu jirriżultaw mill-esposizzjoni qabel il-konċepiment, matul żvilupp ta qabel it-twelid, jew ta' wara t-twelid għaż-żmien mal-maturutà sesswali. Il-manifestazzjonijiet maġġuri tat-tossiċità ta' l-iżvilupp jinkludu, 1) il-mewt ta' l-organiżmu, 2) l-annormalità strutturali, 3) tibdil fit-tkabbir, u 4) defiċjenza funzjonali. It-tossikoloċija ta' l-iżvilupp kienet preċedentament ta' spiss referuta bħala teratolġija.

Effett ħażin: Kwalunkwe alterazzjoni relatata mat-trattament minn linja bażi li tnaqqas l-abbiltà ta' l-organiżmu li jibqa ħaj, li jirripriduċi jew li jadatta għall-ambjent. Fir-rigward tat-tossoloġija ta' l-iżvilupp, meqjusha fis-sens l-aktar wiesa, din tinkludi kwalunkwe effett li jinterferixxi mal-iżvilupp normali tal-conceptus, kemm qabel u wara t-twelid.

Tkabbir mibdul: Tibdil fl-organu naxxenti jew fil-piż tal-ġisem jew fid-daqs.

Alterazzjonijiet (annormalitajiet): Alterazzjonijiet strutturali fl-iżvilupp li jinkludu kemm il-malformazzjonijiet u wkoll varjazzjonijiet (28).

Malformazzjoni/Annormalità Maġġuri: Tibdil strutturali ikkunsidrat bħala detrimentali għall-annimal (jista wkoll ikunu letali) u hija normalment rari.

Varjazzjoni/Annormalità Minuri: Tibdil strutturali meqjus bħala li jkollu ftit jew l-ebda effett strutturali fuq l-annimal; jista jkun temporanju jew jista jseħħ relattivament ta' spiss fil-popolozzjoni tal-kontroll.

Konċepiment: Is-summa tad-derivattivi ta' ovum fertilizzat fi kwalunkwe stadju ta' l-iżvilupp mill-fertilizzazzjoni sat-twelid, inklużi l-membrani extra-embrijoniċi kif ukoll l-embriju jew il-fetu.

Implantazzjoni (nidazzjoni): It-twaħħil tal-blastoċista ma l-inforra epiteljali ta' l-uteru, inkluż il-penetrazzjoni tagħha mill-epiteljum uterin, u t-twaħħil tagħha fil-endometrrijum.

Embriju: l-istadju kmieni jew żviluppanti ta' kwalunkwe organiżmu, speċjalment l-iżvilupp tal-prodott tal-fertilizzazzjoni tal-bajda wara l-assi t-twila tkun tidher u sakemm l-istrutturi maġġuri kollha jkunu preżenti.

Embijotossiċità: Detrimentali għall-istruttura normali, l-iżvilupp, it-tkabbir, u/jew il-viabbilità ta' embrijun.

Fetu: Il-wild mhux imwieled fil-perijodu post-embrijoniku.

Fetutossiċità: Detrimentali għall-istruttura normali, l-iżvilupp, it-tkabbir, u/jew il-viabbilità tal-fetu.

Abort: It-twarrib ta' qabel il-waqt mill-uteru tal-prodotti tal-konċepiment: ta' l-embrijun jew ta' fetu mhux-viabbli/

Reżorpzjoni: Konċepiment li, wara li jkun ġie impjantant fl-uteru, sussegwentament imut u jkun, jew kien, assorbit mill-ġdid.

Reżorpzjoni kmieni: Evidenza ta' l-implant mingħajr embrijun/fetu rikonoxxibbli.

Reżorpzjoni tard: Embrijun jew fetu mejjet b;tibdiliet esterni deġenerattivi.

NOAEL: Abbrevjazzjoni għal-livell ta' l-ebda effett avvers ma huwa osservabbli (no-observed-adverse-effect level) u hija l-għola doża jew livell ta' esposizzjoni meta l-ebda sejbiet avversi realatati mat-trattament ma jkunu osservati.

1.3 SUSTANZA TA' REFERENZA

Xejn

1.4 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Normalment, is-sustanzaa tat-test hija amministrata fuq annimali tqal għal mill-anqas mill-impjantazzjoni sa jum wieħed qabel il-jum skedat tal-qatla, li għandu jkun qrib kemm jista jkun possibbli għall-jum normali tal-ħlas mingħajr ir-riskju ta' informazzjoni li tirriżulta minn ħlas kmieni. Il-metodu tat-test mhux intiż li jeżamina biss il-perijodu ta' l—rganoġenesi, (e.g. il-jiem 5-15 fl-annimal gerriemi, u l-jiem 6-18 fil-fenek) imma wkoll l-effettu mill-pre-impjantazzjoni, meta xieraq, mutul il-perijodu kollu tal-ġestjoni sal-jum ta' qabel is-sezzjoni ċesarja. Ftit qabel is-sezzjoni ċesarjaa, il-femminili jkunu maqtula, il-kontenuti ta l-utru jkunu eżaminati, u l-fetu huma evalwati għan anomalitajiet esterni viżibbli u għal nisġiet rotob u tibdiliet skeletali.

1,5 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.5.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

Huwa rrakkommandat li t-testijiet ikunu mwettqa fuq l-ispeċje l-aktar relevanti, u li l-ispeċje u r-razzez tal-laboratorju li huma normalment użati fit-testijiet dwar it-tossiċità fl-iżvilupp prenatali, jkunu wżati. L-ispeċje ta' l-anniamli gerriema preferuta huja l-far u l-ispeċje ta' annimali mhux ġeggiema huwa l-fenek. Ġustifikazzjoni għandha tkun ipprovduta jekk ikun użat xi speċje ieħor.

1.5.2 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

It-temperatura tal-kamra ta' fejn jinżammu l-annimali ta' l-esperiment għandha tkun 22 oC (± 3o) għall-annimali gerriema u 18 °C (± 3°) għall-fniek. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12 il-siegħa dawl, 12 il-siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu wżati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.

Il-proċeduri ta' l-akkompanjament għandhom jitwettqu f'gaġġeg adatti għal dak l-iskop. Meta gaġġeg separati għall-annimali fl-akkompanjament huma preferuti, iż-żamma ta' numru żgħt f'ġagga waħda huwa wkoll aċċettabbli.

1.5.3 Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali b'saħħithom. Li jkunu ġew akklamatizzati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju għal mil anqas 5 ijiem u li ma jkunux ġew suġġetti għal proċeduri preċedenti sperimentali, għandhom ikunu wżati. L-annimali tat-test għandhom ikunu karatterizzati bħala speċje, razza, sorsi, seww, piż u/jew l-età. L-annimali tal-gruppi kollha tat-test għandhom, kemm jista jkun prattikabbli, ikunu ta' piż u età uniformi. Femmini adulti żgħażagħ li jkunu għadu ma weldux għandhom ikunu wżati f'kull livell ta' doża. Il-femminili għandhom ikunu mgħammra ma maskili ta' l-istess speċje u razza, u t-tgħammir ma l-ulied għandu jkun evitat. Għall-annimali gerriema, il-jum 0 tal-gestazzjoni huwa l-jum li fih il-buq vaġinali u/jew l-isperma huma osservati; għall-fniek il-jum 0 huwa normalment il-jum tal-coitus jew ta' l-inseminazzjoni artifiċjali, jekk tkun użata dik it-teknika. In-nisa mgħammra għandhom ikunu aassenjati b'mod mingħajr preġudizju lejn gruppi tal-kontroll u t-trattament. Il-gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. Kull annimal għandu jkun assenjat numru uniku ta' l-identifikazzjoni. In-nisa mgħammra għandhom ikunu assenjati b'manjera mingħajr preġudizzju lejn il-gruppi ta' kontroll u tat-trattament, u jekk in-nisa jkunu mgħammra f'lottijiet, l-annimali ta' kull lott għandhom ikunu imqassma b'mod egwali matul il-gruppi. Bl-istess mod, in-nisa seminati mill-istess raġel għandhom ikunu mqassma b'mod egwali matul il-gruppi.

1,6 PROĊEDURA

1.6.1 In-numru u s-sess ta' l-annimali

Kull grupp tat-test u tal-kontroll għandu jinkludi numru suffiċjenti ta' femminili li jirriżulta f'madwar 20 annimal femmini bis-sita ta' l-implantazzjoni fin-nekropsija. Gruppi ta' anqas minn 16 il-annimal bis-sita ta' l-implantazzjoni jista ma jkunx xieraq. Il-mortalià materna mhux neċessarjament tinvalida l-istudju, basta li din ma tkunx teċċedi madwar 10 %.

1.6.2 Preparazzjoni tad-dożi

Jekk il-mezz jew l-adittiv l-ieħor ikun użat sabiex jiffaċilita d-doża, konsiderazzjoni għandha tkun mogħtija għal dawn il-karatteristiċi li ġejjin: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimiċi tas-sustanza tat-test li jistgħu joħolqu bidla fil-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ima jew ta' l-istat nutrizzjonali ta' l-annimali. Il-mezza la għandu jkun żviluppatament tossiku u l-anqas li jkollu effetti fuq ir-riproduzzjoni.

1.6.3 Id-Doża

Normalment, is-sustanza tat-test għandha tkun amministrata ta' kull jum mill-impjantazzjoni (e.g., il-jum 5 minn wara t-tgħammir) sal jum ta' qabel is-sezzjoni neċessarju kif skedata. Jekk l-istudji preliminarji, meta disponibbli, ma jkunux jindikaw potenzjal għoli dwar it-telf pre-impjantazzjoni, it-trattament jista jkun estiż li jinkludi l-perijodu intier tal-ġestjoni, mit-tgħamir sal-jum ta' qabel il-qatla skedata. Huwa ben magħruf li tqandil mhux sewwa jew xi taħbit matul it-tqala jista jirriżulta f'telf prenatali. Sabiex ikun hemm ħarsien kontra t-telf prenatali minn fatturi li ma humiex relatati mat-trattament, tqandil bla ħtieġa ta' annimali tqal kif ukoll taħbit minn fatturi barranija bħal ma huma l-ħsejjes għandhom ikunu evitati.

Mill-anqas tlett livelli ta' dożi u l-kontroll simultanju għandhom ikunu wżati. Annimali b'saħħithom għandhom ikunu aassenjati b'mod mingħajr preġudizju lejn gruppi tal-kontroll u t-trattament. Il-livelli tad-doża għandhom ikunu mqassma sabiex jipproduċu l-effetti tossiċi tal-grad tat-tossiċità. Sakemm ma jkunx hemm limitazzjoni tal-propjetajiet tan-natura fiżika/limika jew bioloġika tas-sustanza tat-test, l-għola doża għandha tkun magħżula bil-għan li jkunu introdotti xi tossiċità ta' l-iżvilupp u/jew materna (sinjali kliniċi jew tnaqqis fil-piż tal-ġisem) imma mhux mewt jew sofferenza akuta. Mill-anqas livell ta' doża waħda intermedja għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi osservati. Il-livell l-aktyar baxx m'għandux jipproduċi xi evidenza la ta' tossiċità materna u l-anqas ta' l-iżvilupp. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża għandha tkun magħżulha bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-doża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Tnejn- sa erba intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-użu ta' intervalli ferm twal (e.g. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożi. Għalkemm l-istebbeliment tal-NOAEL materni huwa l-għan, l-istudji li ma jistabbilixxux tali livell jistgħu wkoll ikunu aċċettabbli 91).

Livelli ta' dożi għandhom ikunu magħżula billi tkun meqjusa xi informazzjoni eżistenti kif ukoll l-informazzjoni addizzjonali dwar il-metaboliżmu u t-tossikukinetiċi tas-sustanza tat-test jew tal-materjali relatati. Din l-infomazzjoni għandha wkoll tgħin fid-demostrazzjoni ta' l-adekwatezza ta' l-amministrazzjoni tad-dożar.

Grupp ta' kontroll konkorrenti għandu jkun użat. Dan il-grupp għandu jkun grupp ta' kontroll ittrattat taparsi jew mezz ta' grupp ta' kontroll jekk mezz ikun użat fl-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-gruppi kollha għandhom ikunu amministrati l-istess volum jew tas-sustanza tat-test jew tal-mezz. L-annimali fil-grupp(i) tal-kontroll għandhom ikunu mqandla bl-istess manjiera bħal l-annimali fil-grupp tat-test. Il-gruppi bil-mezz ta' kontroll għandhom jirċievu l-mezz fl-għola ammont użat (bħal fil-gruppi ta' l-anqas trattament).

1.6.4 Test tal-limitu

Jekk test f'doża ta' livell wieħed ta' mill-anqas 1000 mg/kg piż tal-ġisem/jum b'amministrazzjoni orali. Li jutilizza l-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma tipproduċi leba tossiċità osservabbli la fl-annimali tqal u l-anqas fil-proġenji tagħhom u jekk effett ma jkunx mistenni kif ibbażat fuq l-informazzjoni eżistenti (e.g., minn taħlitiet strutturament u/jew metabilakament relatati), allura studju sħiħ bl-użu ta' dożi fi tlett livelli għandu mnejn ikunu ikkonsidrat bħala mhux meħtieġ. L-isposizzjoni umana mistennija tista tindika il-ħtieġa għal-livell ta' doża orali għola li tkun użata fit-test tal-limitu. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, bħal ma huwa t-teħid man-nifs jew l-applikazzjoni dermali, il-propjetajiet fiżikukimiċi tas-sustanza tat-test ta' spiss jistgħu jindikaw u jillimtaw il-massimu tal-livell attenibbli għall-esposizzjoni (per eżempju, l-applikazzjoni dermali m'għandhiex toħloq tossiċità lokali severa).

1.6.5 Amministrazzjoni tad-dożi

Is-sustanza tat-test jew il-mezz normalment huwa amministrat bi intubazzjoni orali. Jekk tkun użata rotta oħra ta' l-amministrazzjoni, min jagħmel it-test għandu jipprovdi ġustifikazzjoni u raġjonar għal dik l-għażla, u modifiki xierqa jistgħu li jkunu meħtieġa (2) (3) (4). Is-sustanza tat-test għandha tkun amministrata bejn wieħed u ieħor fl-istess ħin ta' kull jum.

Id-doża lil annimali individwali għandha normalment tkun ibbażata fuq id-determinazzjoni tal-piż tal-ġisem kif l-aktar riċenti disponibbli. B'dana kollu, attenzjoni għandha tkun eżerċitata meta tkun aġġustata d-doża ma tul l-aħħar parti tremestra tat-tqala. Informazzjoni eżistenti għandha tkun użata għall-għażla tad-doża sabiex tipprevjeni eċċess tat-tossiċità materna. B'dana kollu, jekk eċċess ta' tissiċità jkun innutat fin-nisa ittrattati, dawk l-annimali għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk. Jekk diveri annimali tqal juru sinjali ta' tossiċità eċċessiva, konsiderazzjoni għandha tingħata għat-terminazzjoni ta' dak il-grupp fid-doża. Jekk is-sustanza tkun amministrata b'ikel sfurzat, dan għandu preferibbilment ikun mogħti bħala doża waħda lill-annimali bl-użu ta' tubu lejn l-istinku jew xi canula ta' l-intubazzjoni xierqa. Il-volum massimu ta' likwidu li jista jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux jeċċedi 1 ml/100 g piż tal-ġisem, apparti fil-każ ta' taħlitiet akweji meta 2 ml/100 g piż tal-ġisem jista jkun użat. Meta jkun użat iż-żejt tal-qamħ-ir-rum, il-volum m'għandux jeċċedi 0.4 ml.100 g piż tal-ġisem. Varjabbilità fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjonijiet sabiex ikun assigurat volum kostanti matul il-livelli kollha tad-dożi.

1.6.6 Osservazzjoni tan-nisa

Osservazzjonijiet kliniċi għandhom jitwettqu u jkunu rreġistrati mill-anqas darba kull jum, preferibbilment fl-istess hin(ijiet) billi jkun ikkonsidrat il-perijodu l-aktar probabbli ta' l-effetti antiċipati ta' wara d-doża. Il-kondizzjoni ta' l-annimali għandha tkun irreġistrata, inkluża l-mortalità, l-għafja tal-mewt, tibdil pertinenti fl-imġieba, u s-sinjali kollha ta' tossiċita barranija.

1.6.7 Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel

L-annimali għandhom ikunu miżuna fil-jum 0 tal-ġestazzjoni jew mhux aktar tard mill-jum 3 tal-ġestazzjoni jekk annimali mgħammra skond iż-żmien huma fornuti min fekundament barrani, fl-ewwel jum tad-dpża, mill-anqas kull 3 ijiem matul il-perijodu tad-doża u fil-jum tal-mewt kif skedata.

Il-konsum ta' l-ikel għandu jkun irreġistrat f'intervalli ta' tlett ijiem u għandu jkun jikkonċidi mal-jiem tad-determinazzjoni tal-piż tal-ġisem.

1.6.8 Eżaminazzjoni ta' wara l-mewt

In-nisa għandhom ikunu maqtula jum qabel il-jum mistenni tal-ħlas. Femminili li juri sinjali ta' abort jew ħlas prematur għall-iskeda tal-qatla għandhom ikunu maqtula u suġġetti għal eżaminazzjoni makroskopika bir-reqqa.

Filwaqt tat-terminazzjoni jew tal-mewt matul l-istudju, il-mara tqila għandha tkun eżaminata b'makroskopiki għal xi annormalitajiet strutturali jew tibdilied patoloġiċi. L-evalwazzjoni tan-nisa matul is-sezzjon ċesarja u l-analiżi sussegwenti tal-fetu għandha tkun imwettqa, preferibbilment, mingħajr tagħrif dwar il-grupp tat-trattament, sabiex jitnaqqas il-preġudizzju.

1.6.9 L-eżami tal-kontenuti uterini

Immedjetament wara t-terminazzjoni jew malli jkun possibbli wara l-mewt, l-uteri għandhom ikunu mneħħija u l-istat tat-tqala ta' l-annimal aċċertat. L-uteri li jidhru mhux bit-tqala għandhom ikunu aktar eżaminati (e.g. bit-tiċpis bis-sulfid ta' l-ammonju għall-annimali gerriema u t-tiċpis Salewski jew b'metodu alternattiv xieraq għall-fniek) sabiex ikun konfermat l-istatus mhux tat-tqala (5).

Uteri tqal jinkludu l-għonq ta' l-uteri għandhom ikunu miżuna. Il-piżijiet ta' l-uteri tqal m'għandhomx ikunu akkwistati minn annimali misjuba mejta waqt l-istudju.

In-numru ta' corpora lutea għandu jkun determinat għall-annimali tqal.

Il-kontenuti ta' l-uteri għandhom ikunu eżaminati għan-numru ta' embrijuni jew imwiet tal-feti jew feti viabbli. Il-grad ta' riassorbazzjoni għandu jkun deskritt sabiex ikun ikkalkolat il-ġin relattiv tal-mewt tal-conceptus (ara s-sezzjoni 1.2).

1.6.10 L-eżami tal-feti

Is-sess u l-piż tal-ġisem ta' kull fetu għandhom ikunu determinati.

Kull fetu għandu jkun eżaminat għal tibdiliet esterni (6).

Il-feti għandhom ikunu eżaminati għal tibdiliet skeletali u tal-partijiet rotob (e.g. varjazzjonijiet u maformazzjonijiet jew anomaliji) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Kategorizzazzjoni ta' l-alterazzjonijiet tal-feti hija preferibbli imma mhux meħtieġa. Meta ssir il-kategorizzazzjoni, il-kriterja għad-definizzjoni ta' kull kategorija għandha tkun kjarament mistqarra. Attenzjoni partikolari għandha tingħata għall-passaġġ riproduttiv li għandu jkun eżaminat għal sinjali ta' żvilupp mibdul.

Għall-annimali gerriema, madwar nofs kull lott tal-feti għandu jkun ippreparat u eżaminat għal tibdil skeletali. Il-kumplament għandu jkun preparat u eżaminat għal tibdil fil-partijiet rotob, bl-użu ta' metodi aċċettati u xierqa b'sezzjonament serjali jew b'teknina bil-għaqal ta' dissessjoni grossa.

Għall-annimali mhux gerriema, e.g. fniek, il-feti kollha għandhom ikunu eżaminati kemm għall-partijiet rotob u wkoll għal alterazzjonijiet skeletali. L-iġsma ta' dawn il-feti huma evalwati b'dissessjoni galbata għal tibdil fil-partijiet rotob, li jistgħu jinkludu proċeduri għal aktar evalwazzjoni ta' l-istruttura kardijaka interna (25). Ir-rjus ta' nofs il-heti eżaminati b'dan il-mod għandhom ikunu mneħħija u ipproċessati għal evalwazzjoni ta' alterazzjonijiet fil-partijiet rotob (inklużi l-għajnejn, il-moħħ, il-passaġġi nażali u l-ilsien), l-użu ta' metodi normali ta' sezzjonar serjali (26) jew metodu egwalment sensittiv. L-iġsma ta' dawn il-feti u l-kumplament tal-feti intatti għandhom ikunu ipproċessati u eżaminati għal tibdil skeletali, bl-utilizzazzjoni ta' l-istess metodi kif deskritti għall-annimali gerriema.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Id-dettalji għandhom ikunu irrapurati individwalment għan-nisa kif ukoll għall-wild tagħhom u miġbura b'sommarju f'għamla tabulari, li juru għal kull grupp tat-test u għal kull ġenerazzjoni, in-numru ta' l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta' xi mewt jew qtil umanitarju, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossiċità kif osservati, inkluż il-ħin ta' meta tkun skoppjat, it-tul ta' żmien, u s-severità ta' xi effetti tossiċi, it-tiġ ta' l-osservazzjonijiet ta' l-embrijuni/feti, u l-informazzjoni l-oħra kollha dwar it-traabi l-oħrajn.

Riżultati numeriċi għandhom ikun evalwati b'metodu statistiku xieraq bl-użu tal-grupp ta' wild bħala unità tad-dettalji għall-analiżi. Metodu statistiku ġeneralment aċċettabbli għandu jkun użat, il-metodi statistiċi għandhom ikunu magħżula bħala parti mid-disinn għall-istudju u għandhom ikunu ġġustifikati. L-informazzjoni mill-annimali li jmutu qabel il-qtil skedat għandha wkol tkun irrapurtata. Dik l-informazzjoni tista tkun inkluża fil-mezzi tal-grupp meta relevanti. Relevanza mid-dettalji akkwistati minn tali annimali, u għalhekk l-inklużjoni jew l-esklużjoni minn xi mess ta' grupp(i), għandha tkun iġġustifikata u iġġudikata fuq bażi individwali.

2.2 EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Is-sejbiet ta' l-istudju tat-Tossiċità fl-Iżvilupp Prenatali għandhom ikunu evalwati f'termini ta' l-effetti osservati. L-evalwazzjoni għandha tinkludi din l-informazzjoni li ġejja:

- riżultati tat-test materni u tal-embriju/fetu, inkluża l-avalwazzjoni tar-relazzjoni, jew tan-nuqqas tagħha, bejn l-esposizzjoni ta' l-annimali għas-sustanza tat-test u l-inċidenza u s-severità tas-sejbiet kollha;

- ktiterja użata għall-kategorizzazzjoni esterna tal-fetu, il-partijiet rotob, u l-alterazzjonijiet skeletali, jekk il-kategorizzazzjoni tkun seħħet;

- meta xieraq, id-dettalji stpriċi tal-kontroll sabiex iqawwu l-interpretazzjoni tar-riżultati ta' l-istidju;

- in-numri użati fil-kalkolu tal-persentaġġi kollha jew ta' l-indiċi';

- analiżi statistika adekwata tas-sejbiet ta' l-istudju, meta xieraq, li għandha tinkludi informazzjoni suffiċjenti dwar il-metodu ta' l-analiżi, sabiex riveditur/statistiku independenti jkun jista jevalwa mill-ġdid jew jerġa jibni l-analiżi;

Fi kwalunkwe studju li juri n-nuqqas ta' xi effetti tossiċi, aktar investigazzjonijiet sabiex tkun stabbilita l-assorbazzjoni u l-biodisponabbiltà tas-sustanza tat-test għandhom ikunu meqjusa.

2.3 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Studju tat-tossiċità fl-iżvilupp prenatali jkun jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' esposizzjoni repetuta lejn sustanza matul it-tqala, fuq in-nisa, u l-iżvilupp intra-utru tal-wild tagħhom. Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu interpretatai b'konnessjoni mas-sejbier mill-istudji subkroniku, riproduttivi, tossikokinetiċi u studji oħrajn. La darba l-enfasi tkun kemm fuq it-tossiċita enerali f'termini ta' tossiċita materna u wkoll fuq it-tossiċità fl-iżvilupp fil-għan finali, ir-riżultati ta' l-istudju jkunu jippermettu sa ċertu limitu għal diskriminazzjoni bejn l-effetti ta' l-iżvilupp li jseħħu fin-nuqqas ta' tossiċità ġenerali u dawk li huma imdaħħla biss f'livelli li huma wkoll tossiċi għall-annimal matern (27).

3. RAPPORTAĠĠ

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni speċifika li ġejja:

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;

- l-identifikazzjoni, inklud in-numru CAS jekk magħruf/stabbilit;

- purità.

Mezz (jekk applikabbli):

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test:

- speċje u t-tipi użati;

- in-numru u l-età ta' l-annimali;

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc;

- il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.

Kondizzjonijiet tat-test:

- ir-raġjonar għal-livell tad-doża magħżula;

- dettalji dwar is-sustanza tat-test, fomulazzjoni/preparazzjoni tad-dieta, Il-konċentrazzjoni akkwistata, l-istabbilità u l-omoġenità tal-preparazzjoni;

- dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;

- skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni (ppm) lejn doża attwali 9mg/kg il-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;

- kondizzjonijiet ambjentali;

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.

Riżultati:

Dettalji tar-reazzjoni tossika materna bid-doża, li tinkludi, imma mhux limitata għal-:

- in-numru ta' l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali li jkunu baqgħu ħajjin, in-numru ta' nisa tqal, u n-numru ta' aborti, in-numru ta' annimali li jweldu kmieni;

- il-jum tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali jkunux baqgħu ħajjin sakem maqtula;

- dettalji mill-annimali li ma jkunux baqgħu ħajjin tal-qtil skedat għandu jkun irrapurtat imam mhux inkluż fil-paraguni statisticċi inter-grupp;

- il-jum ta' l-osservazzjoni ta' kull sinjal annormali kliniku u l-korsa sussegwenti tiegħu;

- il-piż tal-ġisem, tibdil fil-piż tal-ġisem u l-piż ta' l-utru bil-ħobla, inkluż, b'mod voluntarju, it-tibdil fil-piż tal-ġiesm korreġut għall-piż ta' l-utru bil-ħobla;

- il-konsum ta' l-ikel u, jekk imkejjel, il-konsum ta' l-ilma;

- is-sejbiet tan-nekopsija, inkluż il-piż ta' l-utru;

- NOAEL valuri għall-effetti materni u ta' l-iżvilupp għandhom ikunu irraportati.

L-għanijiet finali ta' l-iżvilupp bid-doża għal grupp ta' frieħ bl-impjanti, inklużi:

- in-numru ta' corpora lutea;

- in-numru ta' implantazzjonijiet, in-numru u l-persentaġġ ta' feti ħajjin u mejta u r-reassorbazzjonijiet;

- in-numru l-persentaġġ ta' telf pre- u post-implantazzjoni.

L-għanijiet finali ta' l-iżvilupp bid-doża għal grupp ta' frieħ b'feti ħajjin, inklużi:

- in-numru u l-persentaġġ ta' frieħ ħajjin;

- relattività tas-sess;

- il-piż tal-ġisem tal-fetu, preferibbilment bis-sess u bis-sessi flimkien;

- alterazzjonijiet esterni, partijiet rotob, u malformazzjoni skeletali u alterazzjoni relevanti oħrajn;

- kriterja għall-kategorizzazzjoni jekk xierqa;

- in-numru totali u l-persentaġġ ta' feti u frieħ b'xi alterazzjoni esterna, partijiet rotob jew skeletali, kif ukoll it-tipi u l-inċidenzi ta' anomaliji individwali u alterazzjonijiet oħrajn relevanti.

Diskussjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.

(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386- 398.

(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1-8.

(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.

(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie 247:367.

(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.

(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.

(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32;:381-391.

(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.

(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.

(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291-306.

(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313- 320.

(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;:398-408.

(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.

(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.

(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.

(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.

(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.

(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.

(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.

(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.

(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.

(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.

(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.

(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.

(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.

(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.

(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.'

--------------------------------------------------

ANNESS 2G

B.35. STUDJU TAT-TOSSIĊITÁ REPRODUTTIVA FUQ ŻEWĠ ĠENERAZZJONIJIET

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika għal OECD TG 416 (2001)

1.1 INTRODUZZJONI

Dan il-metodu għal testijiet riproduttivi fuq żewġ ġenerazzjonijiet huwa iddisinjat li jipprovdi informazzjomni ġenerali li tikkonċerna l-effetti tas-sustanza tat-test fuq l-integrità u l-imġieba tas-sistemi riproduttivi ta' l-irġiel u n-nisa, inkluża l-funzjoni gonadali, iċ-ċiklu ta' l-estru, l-imġieba tat-tgħammir, il-konċepiment, il-ġestazzjoni, il-parturazzjoni, il-lattazzjoni, u l-ftim, u it-rtkabbir u l-iżvilupp tal-wild. L-istudju jista wkoll jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti tas-sustanza tat-test fuq il-morbidità ta' frieħ għadhom jitwieldu, il-mortalità, u d-dettalji preliminarji fuq l-iżvilupp tossiku ta' qabel it-twelid u ta' wara t-twelid u jservi bħala gwida għal testijiet sussegwenti. B'żieda ma l-istudju tat-tkabbir u l-iżvilupp tal-ġenerazzjoni F1, dan il-metodu tat-test huwa wkoll intiż li jassessja l-integrità u l-imġieba tas-sistemi riproduttivi maskili u femminili kif ukoll it-tkabbir u l-iżvilupp tal-ġenerazzjoni F2. Għal aktar informazzjoni dwar l-iżvilupp tossiku u d-defiċjenzi funzjonali, jew partijiet addizzjonali ta' l-istudju jistgħu inkorporati f'dan il-protokoll, b'konsulta mal-metodi tat-tossiċità ta' l-iżvilupp u/jew in-newrotassiċità ta' l-iżvilupp kif xieraq, jew inkella dawk i—miri finali jistgħu ikunu studjati fi studji separati, bl-użu ta' metodi xierqa tat-test.

1.2 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Is-sustanza tat-test hija amministrata f'dożi gradwali lil diversi gruppi maskili u femminili. L-irġiel tal-ġenerazzjoni P għandhom ikollhom id-doża waqt li jkunu jikbru u għal mill-anqas ċiklu speratoġenetiku sħiħ wieħed (madwar 56 jum fil-ġrieden u 70 jum fil-firien) sabiex ikunu misjuba l-effetti ħżiena fuq l-ispermatoġeneżi. L-effetti fuq l-isperma huma determinati bin-numru ta' parametri ta' l-isperma (e.g., mortfoloġija u l-motilità ta' l-isperma) u l-preparazzjoni tan-nisġiet u ħistopatoloġija dettaljata. Jekk dettalji dwar l-ispermatoġeneżi jkunu disponibbli minn studju preċedenti dwar doża repetuta ta' tul ta' żmien suffuiċjenti, e.g. studju ta' 90 jum, l-irġiel tal-ġenerazzjoni P m'humiex meħtieġa li jkunu nklużi fl-evalwazzjoni. Huwa rakkommandabbli, b'dana kollu, li l-kampjuni jew ir-reġistrazzjoni diġitali ta' l-isperma tal-ġeberazzjoni P jkunu maħżuna, sabiex jiffaċlitaw evalwazzjoni fil-quddiem. Femminili tal-ġenerazzjoni P għandhom ikollhom id-doża matul it-tkabbir u għal diversi ċikli sħaħ ta' l-estru sabiex ikunu żvelati xi effetti ħżiena fuq in-normalità taċ-ċiklu ta' l-estru mis-sustanza tat-test. Is-sustanza tat-test hija amministrata lill-annimali parenti (P) matul it-tgħammir, matul it-tqala riżultanti, u matul il-ftim tal-wild tagħhom F1. Fil-ftim, l-amministrazzjoni tas-sustanza jitkompla lejn il-wild F1 matul it-tkabbir tagħhom lejn il-maturità, it-tgħammir u l-produzzjoni tal-ġenerazzjoni F2, sakemm il-ġenerazzjoni F2 tkun imfattma.

Osservazzjonijiet kliniċi u l-eżaminazzjonijiet patoloġiċi huma mwettqa fuq l-annimali kollha għal sinjali tat-tossiċità b'emfasi speċjali dwar l-effetti fuq l-integrità u l-imġieba tas-sistemi riproduttivi maskili u femminili u dwar it-tkabbir u l-iżvilupp tal-wild tagħhom.

1.3 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.3.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

Il-far huwa l-ispeċje preferut għat-testijiet. Jekk ikunu wżati speċje oħrajn, ġustifikazzjoni għandha tkun mogħtija u l-modifika xierqa ikunu meħtieġa. Tipi b'fekundità baxxa jew li huma sew magħrufa li għandhom inċidenza għolja ta' difetti fl-iżvilupp m'għandhomx ikunu wżati. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali wżati għandha tkun minima u ma teċċedix 20 % tal-piż medju ta' kull sess.

1.3.2 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 °C (± 3 °C). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12 il-siegħa dawl, 12 il-siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu wżati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista tkun influwenzata bil-ħtieġa li tkun assigurata inter-taħlita xierqa tas-sustanza tat-test meta amministrata b'dan il-metodu.

L-annimali jistgħu jinżammu individwalment jew li jkunu f'gaġġa bħala grupp żgħir ta' l-istess sess. Il-proċeduri ta' l-akkompanjament għandhom jitwettqu f'gaġġeg adatti għal dak l-iskop. Wara l-evidenza tal-kopulazzjoni, in-nisa mgħammra għandhom jinzammu waħda kull gaġġa fil-gaġġeg tal-maternità sa kemm iwelldu. Firien mgħammra jistgħu wkoll jinżammu fi gruppiu żgħat u imbagħad ikunu separati minn jum sa tnejn qabel il-parturazzjoni. L-annimali mgħammra għandhom ikunu ipprovduti bil-materjali xierqa u definiti sabiex ikunu jistgħu jippreparaw il-bejta, meta l-parturazzjoni tkun fil-qrib.

1.3.3 Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali b'saħħithom, li jkunu ġew akklamatizzati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju għal mil anqas 5 ijiem u li ma jkunux ġew suġġetti għal proċeduri preċedenti sperimentali, għandhom ikunu wżati. L-annimali tat-test għandhom ikunu karatterizzati bħala speċje, razza, sorsi, seww, piż u/jew l-età. Kwalunkwe relazzjonijiet bejn l-aħwa fost l-annimali għandha tkun magħrufa sabiex it-tgħammir bejn l-aħwa jkun evitat. L-annimali għandhom ikunu assenjati kif jinzerta lejn il-grupp tal-kuntroll u tat-trattament (stratifikazzjoni bil-piż tal-ġisem hija rakkommandabbli). Il-gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. Kull annimal għandu jkun assenjat numru uniku ta' l-identifikazzjoni. Għall-ġenerazzjoni P, dan għandu jsir qabel ma tibda d-doża. Għall-ġenertazzjoni F1, dan għandu jsir mat-ftim ta' dawk l-annimali li jkunu magħżula għat-tgħammir. Reġistri li jindikaw l-origini tal-botom għandhom jinżammu għall-annimali F1 kollha magħżula. B'żieda, identifikazzjoni individwali tal-frieħ malajr kemm jista jkun possibbli malli jitwieldu hija rakkommandabbli, meta l-użin tal-frieħ individwali jew tat-testijiet funzjonali jkunu ikkonsidrati.

L-annimali parenti (p) għandhom ikunu f'età ta' madwar 5 sa 9 ġimghat qabel il-bidu tad-doża. L-annimali tal-gruppi kollha tat-test għandhom, kemm jista jkun prattikabbli, ikunu ta' piż u età uniformi.

1.4 PROĊEDURA

1.4.1 In-numru u s-sess ta' l-annimali

Kull grupp tat-test u tal-kontroll għandu jinkludi numru suffiċjenti ta' annimali sabiex iforni, preferibbilment mhux anqas minn 20 mara tqila, jew qrib tal-parturazzjoni. Għal sustanzi li jikkaġunaw effetti mhux mixtieqa kif relatati mat-trattament (e.g. sterilità, tossiċità eċċessiva f'doża għolja), dan jista ma jkunx possibbli. L-għan huwa li jipproduċi tqalat biż-żejjed sabiex jassiguraw evalwazzjoni li tagħmel sens dwar il-potenzal tas-sustanza li taffettwa l-fertilità, it-tqala jew l-imġieba materna u wkoll l-irdiegħ, it-tkabbir u l-iżvilupp tal-wild F1 mill-konċepiment sal-maturità, u l-iżvilupp tal-botom tagħhom (F2) sa kemm ikunu mfattma. Għalhekk, nuqqas li jkun milħuq in-numru mixtieq ta' annimali tqal (i.e. 20) mhux neċessarjament jiżvalida l-istudju u għandu jkun evalwat fuq il-bażi ta' każ b'każ.

1.4.2 Preparazzjoni tad-dożi

Huwa rakkommandat li s-sustanza tat-test tkun amministrata oralment (ma l-ikel, ma l-ilma tax-xorb, jew b'ikel sfurzat) sakemm rotta oħra ta' l-amministrazzjoni (e.g. dermali jew man-nifs) tkun ikkonsidrata aktar xierqa.

1.4.3 Id-Doża

Mill-anqas tlett livelli ta' dożi u l-kontroll simultanju għandhom ikunu wżati. Sakemm ma tkunx limitata bin-natura fiżiko-kimika jew fl-effetti bioloġiċi tas-sustanza tat-test, l-għola livell ta' doża għandu jkun magħżul bil-għan li jinduċi tossiċità imma mhux il-mewt jew xi sofferenza qawwija. Fil-każ ta' mewt mhux mistennija, l-istudji b'rata ta' mortalità ta' anqas minn madwar 10 fil-mijja fl-annimali parentali (P) tkun normalment xorta waħda aċċettabbli. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża għandha tkun magħżulha bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-doża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Tnejn- sa erba intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-użu ta' intervalli ferm twal (e.g. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożi. Għal-studju djetarji, l-ibtervall tad-doża m'għanduk ikun ta' aktar minn tlett darbiet. Il-livelli tad-doża għandhom ikunu magħżula billi tkun meqjusa l-informazzjoni eżistenti tat-tossiċità, speċjalment ir-riżultati minn studji repetuti tad-doża. Kwalunkwe informazzjoni disponibbli dwar il-mataboliżmu u l-kinetiki tal-kompost tat-test jew tal-materjali relatati għandhom ukoll ikunu ikkunsidrati. Din l-infomazzjoni għandha wkoll tgħin fid-demostrazzjoni ta' l-adekwatezza ta' L-amministrazzjoni tad-dożar.

Dan il-grupp għandu jkun grupp ta' kontroll ittrattat taparsi jew mezz ta' grupp ta' kontroll jekk mezz ikun użat fl-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Apparti milli għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ukoll ikunu mqandla b'manjera identika għas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk ikun użat mezz, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi il-mezz fl-għola volum użat. Jek sustanza tat-test hija amministrata ma l-ikel, u toħloq tnaqqis ta' l-ammont djetarju jew ta' l-utilizzazzjoni, allura l-użu ta' grupp ta' kontroll mitmugħa bħala par jista jkun ikkunsidrat bħala meħtieġ. L-informazzjoni alternattiv minn studji tal-kontroll iddisinjati għall-evalwazzjoni ta' l-effetti ta' konsum imnaqqas ta' l-ikel fuq il-parametri riproduttivi tista tkun użata minflok il-grupp konkorrenti li jkunu mitmugħa bħala par.

Konsiderazzjoni għandha tkun mogħtija lil dawn il-karatteristiċi li ġejjin dwar il-mezz jew xi addittivi oħrajn: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimiċi tas-sustanza tat-test li jistgħu joħolqu bidla fil-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ilma jew ta' l-istat nutrizzjonali ta' l-annimali.

1.4.4 Test tal-limitu

Jekk studju orali f'livell ta' doża waħda ta' mill-anqas 1000 mg/kg piż tal-ġisem/kull jum jew, għall-amministrazzjoni ta' l-ikel jew ilma tax-xorb, persentaġġ ekwivalenti fid-dieta jew fl-ima tax-xorb bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi osservabbli la fl-annimali parentali u l-anqas fil-wild tagħhom u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija kif ibbażata fuq informazzjoni minn komposti strutturament u/jew metabolikament relatati, allura studju sħiħ bl-użu ta' diversi livelli tad-doża jistgħu ikunu meqjusa bħala mhux meħtieġa. It-test tal-limitu huwa applikabbli apparti minn meta l-eposizzjoni umana tindika il-ħtieġa għal doża orali għola fil-livell użat. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, bħal ma hija l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza tat-test, bħal kemm tinħall, ta' spiss tista tindika u tillimita l-livell massimu attenibbli ta' l-esposizzjoni.

1.4.5 Amministrazzjoni tad-dożi

L-annimali għandhom jingħataw id-doża bis-sustanza tat-test fuq il-bażi ta' 7-ijiem-fil-ġimgħa. Ir-rotta orali ta' l-amministrazzjoni (ma l-ikel, fl-ilma tax-xorb, jew bi tmiegħ sfurżat) hija preferuta. Jekk rotta oħra ta' l-amministrazzjoni hija wżata, ġustifikazzjoni għandha tkun ipprovduta, u l-modifika xierqa jistgħu ikunu meħtieġa. L-annimali kollha għandhom jingħataw id-doża bl-istess metodu matul il-perijodu sperimentali kif xieraq. Meta s-sustanza tat-test tkun amministrata bi tmiegħ sfurzat, dan għandu jsir bl-użu ta' tubu ta' l-istonku. Il-volum ta' likwidu amministrat f'darba waħda m'għandux jeċċedi 1 ml.100 g piż tal-ġisem (4.4 ml/100 g piż tal-ġisem huwa l-massimu għaż-żejt tal-qamħ-ir-rum), apparti milli fil-każ ta' taħlitiet akweji meta 2 ml/100 g piż tal-ġisem jista jkun użat. Apparti milli għal sustanzi irritanti jew korrossivi, li normalment ikununjiżvelaw effetti eżasperanti b'konċentrazzjonijiet għola, varjabbilità fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni sabiex tassigura volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża. Fl-istudju bit-tmiegħ sfurzat, il-frieħ ikunu normalment jirċievu biss is-sustanza tat-test b'mod inderett minn meta jkunu jerdgħu, sakemm id-doża diretta tkun tibda għalihom meta jkunu miftuma. Fl-istudji tat-dieta jew ta' l-ilma tax-xorb, il-frieħ ikunu addizzjonalment jirċievu s-sustanza tat-test direttament meta huma jibdew jieklu waħedhom matul l-aħħar ġimgha tal-perijodu tal-lattazzjoni.Għal sustanzi amministrati permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, huwa importanti li jkun assigurat li l-kwantitajiet tas-sustanza tat-test kif involuti ma jkunux jinterferixxu nat-nutriment normali jew mal-bilanċ ta' l-ilma. Meta s-sustanza tat-test tkun amministrata fid-dieta, konċentrazzjoni djetarja kostanti (ppm) jew livell ta' doża kostanti f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal, jista jkun użat; il-mod alternattiv użat għandu jkun speċifikat. Għal sustanza amministrata bi tmiegħ sfurzat, id-doża għandha tkun mogħtija f'ħinijiet simili ta' kull jum, u aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa sabiex jinżamm livell kostanti ta' doża f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal. Informazzjoni rigward id-distribuzzjoni plaċentali għandha tkun ikkonsidrata meta tkun aġġustata d-doża fi tmiegħ sfurzat ibbażżata fuq il-piż.

1.4.6 Skedi sperimentali

Id-doża ta' kull jum ta' l-irġiel u n-nisa parentali (P) għandha tibda meta dawn ikollhom età ta' 5 sa 9 ġimghat. Id-doża ta' kull jum fl-irġiel u n-nisa F1 għandha tibda meta jkunu miftuma; din għandha tkun imfakkra fil-każi ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, esposizzjoni diretta tal-frieħ F1 għas-sustanza tat-test tista diġa tkun seħħet matul il-perijodu tal-lattazzjoni. Għaż-żewġ sessi (P u F1), id-doża għandha tibqa għal mill-anqas 10 ġimghat qabel il-perijodu tat-tgħammir. Id-doża tinżamm kontinwa għaż-żewġ sessi matul il-perijodu ta' ġimgħatejn waqt it-tgħammir. L-irgiel għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk u eżaminati meta ma jkunux aktar meħtieġa għall-assessjar ta' l-effetti riproduttivi. Rigward in-nisa parentali (P), id-doża għandha tinżamm kostanti matul it-tqala u sal-ftim tal-frieħ F1. Konsiderazzjoni għandha tingħata għall-modifiki fl-iskeda tad-doża ibbażati fuq l-informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test, inklużi d-dettalji eżistenti tat-tossiċità, l-induzzjoni tal-metaboliżmu jew tal-bio-akkumulazzjoni. Id-doża lil annimali individwali għandha normalment tkun ibbażata fuq id-determinazzjoni tal-piż tal-ġisem kif l-aktar riċenti disponibbli. B'dana kollu, attenzjoni għandha tkun eżerċitata meta tkun aġġustata d-doża matul l-aħħar parti tremestra tat-tqala. It-trattament ta' l-irġiel u n-nisa P u F1 għandha tibqa sat-terminu.L-irġiel u n-nisa P u F1 adulti kollha għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk meta ma jkunux aktar meħtieġa dwar l-assessjar ta' l-effetti riproduttivi. Il-frieħ F1 mhux magħżula għat-tgħammir u l-frieħ kollha F2 għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk wara li jkunu nfatmu.

1.4.7 Priċedura tat-tgħammir

1.4.7.1 It-tgħammir parentali (P)

Għal kull tgħammir, kull mara għandha tkun imqiegħda ma raġel wieħed mill-istess livell ta' doża (tgħammir 1: 1) sakemm iseħħ il-kopulazzjoni jew wara li jkunu skadew 2 ġimghat. Ta' kull jum, in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta' sperma jew ta' buq vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala huwa definit bħala l-jum ta' meta buq vaġinali jew sperma jkunu misjuba. Fil-każ li l-par ma jirnexxix, it-tgħammir mill-ġdid ta' nisa ma rġiel diġa ippruvari ta' l-istess grupp jista jkun ikkunsidrat. Pari mgħammra għandhom ikunu kjarament identifikati f'dik id-data. It-tgħammir ta' aħwa għandu jkun evitat.

1.4.7.2 Tgħammir F1

Għat-tgħammir ta' l-ulied F1, mill-anqas raġel wieħed u mara waħda għandhom ikunu magħżula mal-ftiem minn kull boton għal tgħammir ma frieħ oħrajn ta' l-istess livell ta' doża imma minn boton differenti, sabiex jipproduċu l-ġenerazzjoni F2. L-għażla tal-frieħ minn kull boton għandha tkun kif jinzerta meta l-ebda differrenzi sinifikanti ma jkunu osservati fil-piż tal-ġisem jew fid-dehra, bejn is-sieħba fl-istess botom. Fil-każ li differrenzi jkunu osservati, l-aħjar rapreżentattivi minn kull botom għandhom ikunu magħżula. B'mod pragmatiku, dan l-aħjar isir fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem imma jista jkun aktar xieraq fuq il-bażi ta' l-apparenza. Il-wild F1 m'għandux ikun mgħammar sakemm ikunu laħqu l-maturità sesswali kollha. Pari mingħajr proġenità għandhom ikunu evalwati sabiex tkun determinata l-kawża apparenti ta' l-infertilità. Dan jista jinvolvi tali proċeduri bħala opportunitajiet addizzjonali saniex jitgħammru ma nisa jew irġiel oħrajn li diġa kienu taw provam b'eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi riproduttivi, u l-eżaminazzjoni ċikli ta' l-eteru jew ta' l-ispermatoġeneżi.

1.4.7.3 It-tieni tgħammir

F'ċerti okkażżjonijiet, bħala ma huma aterazzjoni relatati mat-trattament fid-daqs tal-botom jew fl-osservazzjoni ta' effett ekwivoku fl-ewwel tgħamir, huwa rakkommandabbli li l-adulti P jew F1 ikunu mgħammra mill-ġdid sabiex jipproduċu it-tieni botom. Huwa rakkommandabbli li jkunu mgħammra mill-ġdid in-nisa u l-irġiel, li ma jkunux ipproduċew botom meta mgħammra ma oħrajn diġa bi prova mis-sess oppost. Jekk il-produzzjoni tat-tieni botom tkun meqjusha bħala meħtieġa f'waħda mill-ġenerazzjonijiet, l-annimali għandhom ikunu m,għammra mill-ġdid fi żmien madwar ġimgħa wara l-ftim ta' l-aħħar botom.

1.4.7.4 Id-daqs tal-botom

L-annimali għandhom jitħallew li jipproduċu l-botom b'mod normali u li jkabbru t-tfal tagħhom sal-ftim. Standardizzazzjoni tad-daqs tal-botom hija volontarja. Meta ssir l-istansardizzazzjoni, il-metodu wżat għandu jkun deskritt fid-dettall.

1.5 OSSERVAZZJONIJIET

1.5.1 Osservazzjonijiet kliniċi

Ossevazzjoni klinika ġenerali għandha ssir ta' kull jum u, fil-każ ta' tmiegħ tad-doża b'mod sfurzat, il-ħin tiegħu għandu jkun meqjus fl-għola perijodu antiċipat ta' l-effetti ta' wara d-doża. Tibdiliet fl-imġieba, sinjali ta' parturazzjoni diffiċli jew imtawwla u s-sinjali kollha ta' tossiċità għandhom ikunu irreġistrati. B'żieda, eżaminazzjoni aktar dettaljata ta' kull annimal għandha tkun imwettqa fuq bażi ta' mill-anqas darba fil-ġimgħa u tista tkun imwettqa b'mod konvenjenti fl-okkażżjoni ta' meta l-annimal ikun miżun. Darbtejn kull jum, matul tmiem il-ġimgħa darba kull jum, meta xieraq, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u l-mortalità.

1.5.2 Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel/ilma fl-annimali parenti

L-annimali parentali (P u F1) għandhom ikunu miżuna fl-ewwel jum tad-doża u mill-anqas darba fil-ġimgħa minn hemm il-quddiem. Nisa parentali (P u F1) għandhom ikunu miżuna bħala minimu fil-jiem tal-gestjoni 0, 7, 14, u 20 jew 21, u matul il-jiem meta jreddgħu jew fl-istess jiem bħal meta jsir l-użin tal-botom u fil-jum ta' meta l-annimali jkunu maqtula. Dawn l-osserbazzjonijiet għandhom ikunu irrapurtati individwalment għal kull annimal adult. Matul il-pperijodi ta' qabel it-tgħammir u tal-ġestjoni, il-konsum ta' l-ikel għandu jkun imkejjel mill-anqas darba fil-ġimgħa. Il-konsum ta' l-ilma għandu jkun imkejjel bħala minimu jekk is-sustanza tat-test tkun amministrata fl-ilma.

1.5.3 Iċ-ċikli esteru

It-tul taċ-ċiklu esteru u n-normalità huma evalwati fin-nisa P u F1 b'ti1pisa vaġinali qabel ma jsir it-tgħammir, u l-aħjar waqt it-tgħammir, sakemm tkun instabet evidenza tat-tgħammir. Meta jkunu akkwistati ċ-ċelloli vaġinali ċervikali, attenzjoni għandha tingħata sabiex ikun evitat li ċaqlieq tal-mukuża u sussegwentament, l-induzzjoni ta' psewdo-tqala (1).

1.5.4 Parametri ta' l-isperma

L-irġiel P u F1 kollha, waqt it-teminazzjoni, il-piż tat-testis u ta' l-epididimi għandu jkun irreġistrat u kull wieħed mill-organi preservati għal eżaminazzjoni ħistopatoloġika (ara s-sezzjoni 1.5.7, 1.5.8.1). Minn subset ta' mill-anqas għaxrt irġiel ta' kull grupp P u F1, il-kumplament tat-testes u l-epididimidi għandhom ikunu wżati għall-ennumerazzjoni ta' l-ispermatidi omoġenizzazzjoni-reżistenti u tar-riservi ta' l-isperma tal-cauda epididimali, rispettivament. Għall-istess subset ta' rġile, l-isperma mill-cauda epididymides jew vas deferens għandhom ikunu miġbura għall-evalwazzjoni tal-motilità ta' l-isperma u l-morfoloġija ta' l-isperma. Jekk l-effetti relatati mat-trattament huma osservati jew meta jkun hemm evidenza minn studji oħrajn ta' effetti possibbli fuq l-ispermatoġeneżi, l-evalwazzjoni ta' l-isperma tista tkun imwettqa fuq l-irġiel kollha f'kull grupp ta' doża; altrimenti l-enumerazzjoni tista tkun ristretta fuq l-irġiel P u F1 tal-kontroll u dawk ta' doża għolja.

In-numru totali ta' spermatidi testikulari reżistenti-omogenizzazzjoni u l-isperma cauda epididimali għandhom ikunu innumerati (2) (3). Ir-riservi ta' l-isperma cauda jistgħu ikunu derivati mill-konċentrazzjoni u l-volum ta' l-isperma f'sospenzjoni wżata sabiex ikunu mwettqa kompletament l-evalwazzjonijiet kwalitattivi, u n-numru ta' sperma rkuprat minn tgħaffiġ u/jew omoġenizzazzjoni sussegwenti tal-kumplament tal-materja cauda. L-enumerazzjoni għandha tkun imwettqa fuq subset magħżul ta' rġiel tal-gruppi ta' dożi kollha immedjetament wara l-qtil ta' l-annimali sakemm ma jkunx hemm ir-rekordings bil-video jew diġitali, jew sakemm il-kampjuni jkunu ffriżati għal analiżi aktar tard. F'dawn il-każi, il-grupp tal-kontrolli u tad-doża għolja għandhom ikunu analiżżati l-ewwel. Jekk l-ebda effetti reletatati mat-trattament (e.g., effetti fuq l-għadd ta' l-isperma, il-motilità, jew il-morfoloġija) jkunu jidhru, il-gruppi tad-dożi l-oħrajn ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu analizzati. Meta l-effetti relatati mat-trattament ikunu innotati fil-grupp ta' doża għolja, allura l-gruppi fid-doża aktar baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati.

Il-motilità epididimala (jew ductus deferens) għandha tkun evalwata jew irreġistrata fuq video immedjetament wara s-sagrifiċju. L-isperma għandha tkun irkuprata waqt li tkun minimiżżata l-ħsaram u mrattba għall-analiżi tal-motilità bl-użu ta' metodi accettabbli (4). Il-persentaġġ ta' sperma motilment progressiva għandu jkun determinat jew suġġettivament jew inkella oġġettivament. Meta l-analiżi ta' moviment mgħajjun mill-computer hija mwettqa (5) (6) (7) (8) (9) (10) id-derivazzjoni tal-motilità progressive tkun tistrieħ fuq il-għatbiet definiti bl-użu għal passaġġ ta' veloċità medja u l-linja dritta jew l-indiċi lineari. Jekk il-kampjunu jkun ġew fotografi fuq videotape (11) jew l-immapini ikunu b'mod ieħor reġistrati fil-waqt tan-nekropsija, analiżi sussegwenti biss ta' l-irġiel P u F1 tal-kontroll u ta' doża għolja tista tkun imwettqa, sakemm ma jkunx osdservati l-effetti relatati mat-trattament; f'dak il-każ, il-gruppi tad-doża l-baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati. Fin-nuqqas ta' imaġġini video jew diġitali, il-kampjuni kollha fil-gruppi tat-trattament għandhom ikunu analiżżati man-nekropsija.

Evalwazzjoni morfoloġika tal-kampjun ta' l-isperma epididimali (jew van deferens) għandha tkun imwettqa. L-isperma (jew mill-anqas 200 kull kampjun) għandha tkun eżaminata kif stabbilita, preparazzjonijiet niedja (12) u klassifikata bħala jew normali in annormali. L-eżempji ta' l-annormalitajiet ta' l-isperma morfoloġika jkunu jindikaw fużjoni, irjus iżolati, u rjus u/jew denb mingħajr forma. L-evalwazzjoni għandha tkun imwettqa fuq subjet ta' rġile magħżula fil-gruppi tad-dożi kollha jew immedkjetament wara l-qtil ta' l-annimali, jew, ibbażati fuq ir-rekordings tal-video jew diġitali, f'ħin aktar tard. It-tiċpis, la darna stabbilit, jista wkoll ikun moqri aktar tard. F'dawn il-każi, il-grupp tal-kontrolli u tad-doża għolja għandhom ikunu analiżżati l-ewwel. Jekk l-ebda effetti reletatati mat-trattament (e.g., effetti fuq l-għadd ta' l-isperma, il-motilità, jew il-morfoloġija) jkunu jidhru, il-gruppi tad-dożi l-oħrajn ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu analizzati. Meta l-effetti relatati mat-trattament ikunu innotati fil-grupp ta' doża għolja, allura l-gruppi fid-doża aktar baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati.

Jekk uħud mill-parametri ta' hawn fuq dwar l-evalwazzjoni ta' l-isperma jkunu diġa ġew eżaminati bħala parti minn studju sistematiku tat-tossiċità ta' mill-anqas 90 jum, dawn ma jkunu neċċessarjament jeħtieġu li jkunu repetuti fl-istidju ta' żewġ ġenerazzjonijiet. l-kampjuni jew ir-reġistrazzjoni diġitali ta' l-isperma tal-ġeberazzjoni P jkunu maħżuna, sabiex jiffaċlitaw evalwazzjoni fil-quddiem.

1.5.5 Il-wild

Kull botom għandu jkun eżaminat malajr kemm jista jkun possibbli wara l-ħlas (jum tal-attazzjoni 0) sabiex ikun stabbilit in-numru u s-sess tal-frieħ, imweldin mejta, imweldin ħajjin, u il-preżenza ta' annomalitajiet kbar. Frieħ misjuba mejta fil-jum), jekk mhux maċerati, għandhom preferibbilment ikunu eżaminati għal difetti possibbli u l-kawża tal-mewt, u għandhom ikunu preservati. Frieħ ħajjin għandhom ikunu magħduda u miżuna individwalment mat-twelid (jum 0 tal-lattazzjoni) jew fil-jum 1, u fil-jiem regolati ta' l-użin minn hemm il-quddiem, e.g., fil-jiem 4, 7, 14, u 21 tal-lattazzjoni. Annormalitajiet fiżiċi jew ta' l-imġieba osservati fl-ommijiet jew fil-frieħ għandhom ikunu reġistrati.

L-iżvilupp fiżiku tal-frieħ għandu jkun irreġistrat l-aktar biż-żieda fil-piż tal-ġisem. Parametri fiżiċi oħrajn (e.g. il-fetħa ta' l-għajnejn u l-widnejn, il-ħruġ tas-snien, it-tkabbir tax-xagħar) jista jformi informazzjoni supplementari, imma dawn id-dettalji għandhom preferibbilment ikunu evalwati fil-kuntest tad-dettalji tal-maturità sesswali (e.g. l-età u l-piż tal-ġisem jew il-fetħa vaġinali jew is-separazzjoni balano-preputial) (14). Investigazzjonijiet funzjonali (e.g. attivita motorili, funzjoni sensitorja, ontoġenija relfettiva) tal-ferħ F1 qabel u/jew wara l-ftim, partikolarment dawk relatati mal-maturità sesswali, huma rakkommandati jekk tali investigazzjonijiet ma jkunux inklużi fi studju separati. L-età tal-ftuħ vaġinali u s-separazzjoni prepuzjali għandha tkun determinata għal dawk imfatma F1 magħżula għat-tgħammir, Distanza anoġenitali għandha tkun imkejla fil-jum 0 ta' wara t-twelid fil-frieħ F2 jekk istigata b'alterazzjonijiet fir-relattività tas-sess F1 jew bil-kalkolu tal-maturità sesswali.

Osservazzjonijiet funzjonali jistgħu ikunu mħollija barra fi gruppi li altrimentri jiżvelaw sinjali ċari ta' effetti ħżiena (e.g., tnaqqis sinifikanti fl-akkwist tal-piż, etc.). Jekk l-investigazzjonijiet funzjonali jkunu mwettqa, dawn m'għandhomx isiru fuq il-frieħ magħżula għat-tgħammir.

1.5.6 Nekropsija maġġuri

Fil-waqt tat-terminazzjoni jew tal-mewt matul l-istudji, l-annimali parentali kollha (P u F1), il-frieħ kollha b'annormalitajiet esterni jew sinjali kliniċi, kif ukoll wieħed magħżul b'mod kif jinzerta, ferħ/sess/botom, miż-żewġ ġenerazzjonijiet F1 u F2, għandu jkun eżaminat b'mod makroskopiku għal xi annormlitajiet structurali jew tibdil patiloġiku. Attenzjoni speċjali għandha tingħata lill-organi tas-sistema riproduttiva. Il-frieħ li jinqatlu b'mod umanesk f'kondizzjoni morbonda u l-frieħ mejta, meta ma jkunux maċerati, għandhom ikunu eżaminati għal difetti possibbli u/jew il-kawża tal-mewt, u ippreservati.

L-uteri tan-nisa li jkun għadhom mhux mgħammra għandhom ikunu eżaminati, f'tali majera li ma tikkompromettix l-evalwazzjoni ħistopatoloġika, għall-preżenza u n-numru ta' siti ta' l-implantazzjoni.

1.5.7 Il-piż ta' l-organi

Fil-waqt tat-terminazzjoni, il-piż tal-ġisem u l-piż ta' dawn l-organi li ġejjin fl-annimali P u F1 parentali kollha għandu jkun determinat (l-organi bħala pari għandhom ikunu miżuna individwalment):

- l-utru, l-ovarji;

- it-testi, l-epididimidi (total u cauda);

- il-prostata';

- il-bużżieqa seminali bil-glandoli koaġjulanti u l-fluwidi tagħhom u l-prostata (bħala unità waħda);

- il-moħħ, il-fwied, il-kliewi, il-milsa, il-glandola pitwarja, it-tirojde u l-glandoli adrenali u dawk l-organi fil-mira kif maagħrufa.

Il-piżijiet ta' l-iġsma fit-terminazzjoni għandhom ikunu determinati għall-frieħ Fċ u F2 li huma magħżula għan-nekropsija. Dawn l-organi li ġejjin minn ferħ/sess/botom magħżula kif jinzerta (ara s-sezzjoni 1.5.6) għandhom ikuinu miżuna. Il-moħħ, il-milsa u t-timu.

Ir-riżultati tan-nekropsija ġenerali u l-piż ta' l-organi għandhom ikunu assessjati fil-kuntest ma l-osservazzjonijiet magħmula fi studji oħrajn ta' dożi repetuti, meta prattikabbli.

1.5.8 Ħistopatoloġija

1.5.8.1 Annimali parentali

L-organi u l-biċċiet li ġejjin ta' l-annimali parentali (P u F1), jew il-kampjuni rapreżentattivi tagħhom, għandhom ikun stabbiliti u maħżuna f'medja xierqa għall-eżaminazzjoni ħistopatoloġika.

- il-vaġina, L-utru bil-għonq, u l-ovarji (ippreservati ħo fissant xieraq);

- waħda mit-testi (ippreservata fil-fissattiv Bouis jew komparabbli), waħda minn ħaġa: epididima, l-borża seminali, l-prostata, u l-glandola koaġjulanti;

- oragnu(i) tal-mira preċedentament identifikati mill-annimali kollha P u F1 li huma magħżula għat-tgħammir.

Ħistopatoloġija sħiħa tal-organi u l-biċċiet presevati elenkati hawn fuq għandha tkun imwettqa għad-dożi l-għoljin kollha u l-annimali P u F1 magħżula għat-tgħammir. L-eżaminazzjoni ta' l-ovarji fl-annimali P hija voluntarja. L-organi li juru tibdiliet relatati mat-trattament għandhom ukoll ikunu eżaminati fil-gruppi tad-doża l-baxxa u l-medja sabiex jgħinu fl-eluċidazzjoni tal-NOAEL. B'żieda, l-organi riproduttivi fl-annimali tad-doża baxxa u medja li huma issusspettati b'fertilità mnaqqsa, e.g., dawk li ma jirnexxilhomx jitgħammru, li jkunu tqal, l-irgiel li ma jimpregnawx, jew li jwelldu frieħ b'saħħithom, jew dawk li ċ-ċikliċità estera jew in-numru ta' l-isperma, l-motilità, jew il-mofoloġija tagħhom kienet affettwata, għandhom ikunu suġġetti għal evalwazzjoni ħistopatoloġika. Il-ferita kbar kollha bħal ma huma l-atrofija jew it-tumuri għandhom ikunu eżaminati.

Eżaminazzjoni ħistopatoloġika testikulati dettaljata (e.g, bl-użu tal-fissattiv Bouin, it-twaħħil bill-paraaffin u s-sezzonijiet transervsjali ta' 4-5 μm ħxuna) għandhom ikunu mwettqa sabiex ikunu identifikati l-effetti relatati mat-trattament bħal ma huma l-ispermatidi miżmuma, is-saffi jew it-tipi nieqsa mil-ġermi taċ-ċelloli, iċ-ċelloli kbar multinukleati jew it-tgħaffiġ taċ-ċelloli spermatoġeniċi fil-lumen (14). L-eżami ta' l-epididimi intatta għandu jinkludi il-kaput, il-korp u l-kaanula, li jista jkun imwettaq bl-evalwazzjoni tas-sezzjoni lonġitudinali. L-epididimi għandha tkun evalutata għall-infiltrazzjoni lewkoċita, tibdil fil-prevalenza tat-tipi taċ-ċelloli, it-tipi ta' ċelloli aberrenti, u l-isperma patoġikitożi. Il-PAS u t-tbgħajja ħematossilini jistgħu ikunu wżati għall-eżaminazzjoni ta' l-organi riproduttivi maskili.

L-ovarju postlaktatjonali għandu jkollu l-folliki primordjali u tat-tkabbir kif ukoll il-corpora lutea l-kbira tal-lattazzjoni. L-eżaminazzjoni ħistopatoloġika għandha tiżvela t-tnaqqis kwalitattiv tal-popolazzjoni tal-follika primordjali. Evalwazzjoni kwantitattiva tal-folliki primordjali għandha tkun imwettqa għall-femminili F1; in-numru ta' l-annimali, l-għażla tas-sezzjoni ovarja, u s-sezzjoni tad-daqs tal-kampjun għandha tkun statistikament xierqa għall-proċedura ta' l-evalwazzjoni użata. L-eżaminazzjoni għandha tinkludi l-ennumerazzjoni tan-numru tal-folliki primordjali, li jistgħu ikunu aggrupparti mal-filliki ż-żgħar tat-tkabbir, għal paragun ta' l-ovarji ittrattati u tal-kontrol (15) (16) (17) (18) (19).

1.5.8.2 Frieħ mhux miftuma

Il-partijiet ferm annormali u l-organi tal-mira mill-frieħ kollha b'annormallitajiet esterni jew sinjali kliniċi, kif ukoll minn wieħed mill-grupp ferħ/sess/botom magħżul kif jinzerta miż-żewġ ġenerazzjonijiet F1 u F2 li ma jkunux ġew magħżula għat-tgħammir, għandhom ikunu iffissati u maħġżuna f'medja xierqa għall-eżaminazzjoni ħistopatoloġika. Il-karatteristika sħiħa ħistopatoloġika tal-partijiet ippreservati għandha tkun imwettqa b'enfasi speċjali dwar l-organi tas-sistema reproduttiva.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Metodu statistiku ġeneralment aċċettabbli għandu jkun użat' il-metodi statistiċi għandhom ikunu magħżula bħala parti mid-disinn għall-istudju u għandhom ikunu iġġustifikati. Il-mudelli statistiċi bir-reazzjoni tad-doża jistgħu ikunu utili għad-data ta' l-analiżi. Ir-rapport għandu jinkludi informazzjoni suffiċjenti dwar il-metodu ta' l-analiżi u l-programm tal-kompjuter użat, hekk li riveditur/statistiku independenti jkun jista jevalwa mill-ġdid u jikkostitwixxi mill-ġdid l-analiżi.

2.2 EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Is-sejbiet ta' dan l-istudju tat-tossiċità riproduttiva fuq żewġ ġenerazzjhonijiet għandu jkun evalutat f'termini ta' l-effetti osservati, inklużi s-sejbiet tan-nekropsija u mikroskopiċi. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni, jew in-nuqqas tagħha, bejn id-doża u s-sustanza tat-test u l-preżenza jew l-assenza, l-inċidenza jew is-sevirità ta' l-annormalitajiet, inklużi l-feriti kbar, l-organi tal-mira identifikati, il-fertilità affettwata, l-annormalitajiet kliniċi, l-imġieba tar-riproduzzjoni u l-botom affettwati, it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem, l-effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossiċi oħrajn. Il-propjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza tat-test, u meta disponibbli, id-dettalji tossikokinetiċi għandhom ikunu meqjusa fil-konsiderazzjoni meta jkunu evalutati r-riżultati tat-test.

Test tat-tossiċità riproduttiva imwettqa kif suppost għandu jipprovdi estimi sodisfaċenti tal-livbell bla ebda effett u rikonoxximent ta' l-effeti ħżiena fuq ir-riproduzzjoni, l-parturizzjoni, il-lattazzjoni, l-iżvilupp postnatli inkluż it-tbakkir u l-iżvilupp sesswali.

2.3 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Studju tat-tossiċita riproduttiva fuq żewġ ġenerazzjonijiet għandu jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' l-esposizzjoni ripetuta ta' sustanza matul il-fażijiet kollha taċ-ċiklu riproduttiv. Partikolarment, l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar il-parametri riproduttivi, u dwar l-iżvilupp, it-tlabbir, il-maturità u s-sopravvivenza tal-frieħ. Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu interpretatai b'konnessjoni mas-sejbier mill-istudji subkroniku, riproduttivi, tossikokinetiċi u studji oħrajn. Ir-riżultati ta' dan l-istudju jistgħu ikunu wżati fl-assessjar tal-ħtieġa ta' aktar testijiet tal-kimika. L-estrapolazzjoni tar-riżultati ta' l-istudju mal-bniedem hija valida sa grad limitat. Dawn huma l-aħjar użati sabiex jipprovdu informazzjoni dwar il-livelli-mingħajr-effett u l-esposizzjoni umana (20) (21) (22) (23).

3. RAPPORTAĠĠ

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;

- dettalji ta' l-identifikazzjoni;

- purità.

Mezz (jekk applikabbli):

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test:

- speċje/tipi użati;

- in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.;

- il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.

Kondizzjonijiet tat-test:

- ir-raġjonar għal-livell tad-doża magħżula;

- dettalji tat-test tal-preparazzjoni tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza, il-konċentazzjonijiet;

- l-istabbilità u l-omoġenità tal-preparazzjoni;

- dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;

- skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni (ppm) lejn doża attwali 9mg/kg il-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.

Riżultati:

- il-konsum ta' l-ikel. Il-konsum ta' l-ilma, jekk disponibbli, l-effikaċja ta' l-ikel (iż-żieda fil-piż tal-ġisem għal kull gramma ikel ikkunsmat), u l-konsum tal-materjal tat-test għall-annimali P u F1, apparti milli għall-perijodu tal-koabitazzjoni u għal mill-anqas l-aħħar terz tal-lattazzjoni;

- id-dettalji ta' l-assorbazzjoni (jekk disponibbli);

- id-dettalji tal-piż tal-ġisem dwar l-annimali P u Fċ magħżula għat-tgħammir;

- id-dettalji tal-piż tal-botom u l-frieħ individwali;

- il-piż tal-ġsem fil-waqt li jkunu sagrifikati u l-piż assolut u rtelattiv ta' l-organi għall-annimali parentali;

- in-natura, s-severità u t-tul ta' l-osservazzjonijiet kliniċi (sew jekk reversibbli u anki jekk le);

- il-jum tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali jkunux baqgħu ħajjin sakem maqtula;

- dettalji tar-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża, inklużi l-indiċi tat-tgammir, il-fertilità, il-ġestazzjoni, it-twelid, il-viabbilità, u l-lattazzjoni; ir-rapport għandu jindika n-numri użati fil-kalkoli ta' dawn l-indiċi;

- l-effetti tossiċi jew oħrajn fuq ir-riproduzzjoni, il-frieħ, it-tbabbir ta' wara t-twelid, etc.;

- is-sejbiet tan-nekropsija;

- deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;

- in-numru ta' nisa P u F1 fiċ-ċiklu normali u t-tul taċ-ċiklu;

- it-total tan-numru ta' l-isperma cauda epididimali, il-persentaġġ progressive tal-motilità ta' l-isperma, il-persentaġġ morfoloġikament normali, u l-persentaġġ ta' l-ispetma b'kull annormalità identifikata;

- iż-żmien satotgħammir, inklużi n-numru ta' jiem sakem isir it-tgħammir;

- it-tul tal-ġestjoni;

- in-numri ta' l-impjantazzjonijiet, corpora lutea, id-daqs tal-botom;

- in-numru ta' twelid ħajjin u t-telf tal-post-impjantazzjoni;

- in-numru ta' frieħ b'annormalitajiet ferm viżibbli, jekk determinati bin-numru tal-botom, għandu jkun irraportat;

- dettalji dwar l-aċċenni fiżiċi fil-frieħ u l-informazzjoni l-oħra ta' l-iżvilupp post natali; l-aċċenni fiżiċi evalwati għandhom ikunu ġustifikati;

- dettalji dwar l-osservazzjonijiet funzjonali fil-frieħ u l-adulti, kif applikabbli;

- trattamentv statistiku tar-riżultati, meta xieraq.

Diskussjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet, inklużi l-valuri NOAEL għall-effetti materni u fuq il-frieħ.

4. REFERENZI

(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.

(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.

(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.

(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39 44.

(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237- 244.

(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267-273.

(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.

(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.

(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.

(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.

(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.

(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.

(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.

(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.

(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.

(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.

(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.

(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.

(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.

(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.

(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.

(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.

--------------------------------------------------

ANNESS 2H

B.42. SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA: ASSAĠĠ LOKALI TAN-NODULA TAL-LIMFA

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 429 (2002)

1.1 INTRODUZZJONI

L-Assaġġ Lokali tan-Nodula tal-Limfa (LLNA) kien ġie validat b'mod suffiċjenti u aċċettat sabiex jiġġustifika l-adozzjoni tiegħu bħal Metodu ġdid (1) (2) (3). Dan huwa t-tieni metodu għall-assaġġ tas-sensitizzazzjoni potenzali tal-ġilda minn kimika fl-annimali. Il-metodu l-ieħor (B.6) jutilizza t-testijiet tal-fniek ta' l-indi, notevolment it-test tal-massimizzazzjoni tal-fenek ta' l-indi u t-test Buehles (4).

Il-LLNA tipprovdi metodu alternattiv għall-identifikazzjoni tal-kimika sensitizzanti tal-ġilda u għall-konferma li l-kimika ma jkollhiex potenzal sinifikanti li toħloq sensitizzazzjoni tal-ġilda. Dan mhux neċċessarjament jimplika li fil-każi kollha l-LLNA għandha tkun użata minflok it-test tal-fenek ta' l-indi, imma pjuttost li l-assaġġ huwa ta' meritu egwali u li jista jkun użat bħala alternattiva li fiha r-riżultati pożittivu u negattivi, ġeneralment, ma jkunux jeħtieġu aktar konferma.

Il-LLNA tipprovdi ċerti vantaġġi f'dak li jirrigwardja kemm il-progress xjentifiku u wkoll il-benessere ta' l-annimali. Din tistudja l-pażjio ta' l-induzzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda u tipprovdi dettalji kwantitattivi xierqa għall-assaġġ tar-reazzjoni tad-doża. Id-dettalji tal-validazzjoni tal-LLMA u r-reviżjoni tax-xogħol assoċċjat magħha kienu ġew ippubblikati (5) (6) (7) (8). B'żieda, għandu jkun innutat li s-sensitizzaturi ħfief/moderati, li huma rakkommandati bħala sustanzi adatti ta' kontroll pożittiv għall-metodi tat-test fuq il-fenek ta' l-indi, huma wkoll xierqa għall-użu mal-LLNA (6) (8) (9).

Il-LLNA hija metodu vivo u, bħala konsegwenza, ma teliminax l-użu ta' l-annimali fl-assaġġ ta' l-attività tal-kuntatt sensitizzanti. Din għandha, b'dana kollu, l-potenzal li tnaqqas in-numru ta' l-annimali meħtieġa għal dan l-iskop. Aktar minn hekk, l-LLNA toffri raffinar sostanzjali tal-mod ta' kif l-annimali huma wżati għat-testijiet sensitizzanti tal-kuntatt. L-LLNA hija ibbażata fuq il-konsiderazzjoni ta' l-avvenimenti immunoloġiċi stimulati bil-kimika matul il-fażi induttiva tas-sensitizzazzjoni. Kontra t-testijiet l-fenek ta' l-indi, l-LLNA ma teħtieġx li r-reazzjonijiet ta' l-ipesensittività dermali indotti bi sfida jkunu eluċidati. Aktar minn hekk, l-LLNA ma teħtieġx l-użu ta' aġġuvant, bħal fil-każ tat-test tal-massimizzazzjoni tal-fenek ta' l-indi. Għalhekk, l-LLNA tnaqqas it-tbagħtija ta' l-annimali. Minkejja l-vantaġġi tal-LLNA fuq it-testijiet tradizjonali tal-fenek ta' l-indi, għandu jkun rikonoxxut li hemm ċerti limitazzjonijiet li jistgħu ikunu jeħtieġu l-użu tat-testijiet tradizzjonali tal-fenek ta' l-indi (e.g., sejbiet negattivi foloz fil-LLNA ma ċerti metalli, sejbiet pożittivi foloz ma ċerti irritanti tal-ġilda (10).

Ara wkoll l-Introduzzjoni Parti B.

1.2 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Il-prinċipju bażiku li jaċċenna l-LLNA huwa li s-sensitizzaturi jinduċu proliferazzjoni primarja tal-limfokiti fin-nodula lumfika li s-saffi s-sit ta' l-applikazzjoni kimika. Din il-prolifikazzjoni hija proporzjonali għad-doża applikata (u għall-qawwa ta' l-allerġeni) u tipprovdi mezz sempliċi għall-akkwist ta' sensitizzazzjoni oġġettiva, u kejl kwantitattiv. L-LLNA tagħmel l-assaġġ ta' din il-proliferazzjoni b'relazzjoni mar-reazzjoni tad-doża li fiha l-gruppi tat-test tal-proliferazzjoni huma ipparagunati ma dawk fil-mezzi tal-kontroll ittrattati. Ir-relattività tal-proliferazzjoni fil-gruppi ittrattati ma dik tal-kontrol bil-mezzi, imsemmija l-Indiċi Stimulanti, hija determinata, u għandha tkun mill-anqas tlieta qabel ma test ta' sustanza jista jkun aktar evalwat bħala sensitizzatur potenzali tal-ġilda. Il-metodi deskritti hawn huma ibbażati fuq l-użu tat-tikkettjar raduattiv sabiex ikejjel il-proliferazzjoni taċ-ċelloli. B'dana kollu, għanijiet finali oħrajn dwar l-assaġġ tal-proliferazzjoni jistgħu ikunu wżatu basta li jkun hemm ġustifikazzjoni u sosstenn xjentifiku xieraq, inklużi l-kwotazzjonijiet kollha u d-deskrizzjoni tal-metodoloġija.

1.3 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.3.1 Preparazzjonijiet

1.3.1.1 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

L-annimali għandhom jinzammi f'gaġġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 °C (± 3 °C). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12 il-siegħa dawl, 12 il-siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu wżati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.

1.3.1.2 Preparazzjoni ta' l-annimali

L-animmali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mil anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju. Qabel il-bidu at-trattament, l-annimali kollha huma eżaaminati sabiex ikun assigurat li huma ma jkollhom l-ebda feriti osservabbli fuq il-ġilda.

1.3.2 Kondizzjonijiet tat-test

1.3.2.1 Annimali sperimentali

Il-ġurdien huwa l-ispeċje ta' l-għażla għal dan it-test. Ġrieden femminili adulti żgħażagħ tat-tip CBA/Ca jew CBA/J, li jkunu għadhom mhux mgħammra u mhux tqal, huma wżati. Fil-bidu ta' l-istudju, l-annimali għandhom ikollhom età ta' 8-12 ġimghat, u l-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u li ma teċċedix 20 % tal-piż medju. Tipi oħrajn u rġiel jistgħu ikunu wżati meta dettalji suffiċjenti jkunu ġenerati sabiex juru li d-differenti sinifikanti ta' tip u/jew speċifiku għas-sess fir-reazzjonijiet LLNA ma jkunux jeżistu.

1.3.2.2 Verifika ta' l-affidabbilità

Kontrolli pożittivi huma wżati sabiex juru l-imġieba xierqa ta' l-assaġġ u l-kompetenza tal-laboratorju li jwettaq l-assaġġ b'suċċess. Il-kontroll pożittiv għandu jipproduċi reazzjoni LLNA pożittiva fil-livell ta' l-esposizzjoni mistenni li jagħti żieda fl-indiċi stimulanti (SI) >3 matul il-grupp ta' komntroll negattiv. Id-doża tal-kontroll pożittiv għandha tkun magħżulha hekk li l-induzzjoni tkun ċara imma mhux eċċessiva. Is-sustanzi preferuti huma hexyl cinnamic aldehyde (CAS Nru 101-86-0, EINECS Nru 202-983- 3) u mercaptobenzothiazole (CAS Nru 149-30-4, EINECS Nru 205-736-8). Jista jkun hemm ċirkostanzi li fihom, meqjusa ġustifikazzjoni adekwata, sustannzi oħrajn ta' kontroll, li jilħqu l-kriterja ta' hawn fuq, jistgħu ikunu wżati. Waqt li normalment grupp ta' kontroll pożittiv jista jkun meħtieġ f'kull assaġġ, jista jkun hemm sitwazzjonijiet li fihom il-laboratorji tat-test irid ikollhom dettalji disponibbli dwar il-kontroll pożittiv storiku sabiex juru konsistenza ta' reazzjoni sodisfaċenti matul perijodu ta' sitt xhur jew ta' aktar żmien fit-tul. F'dawk is-sitwazzjonijiet, testjar anqas ta' spiss b'kontrolli pożittivi jista jkun xieraq f'intervalli ta' mhux aktar minn 6 xhur. Għalkemm is-sustanza tal-kontroll pożittiv għandha tkun ittestjata f'mezz li huwa magħruf li jeliċita reazzjoni konsistenti (e.g., l-aċetun: żejt taż-żebbuġa), jista jkun hemm ċerti sitwazzjonijiet regolatorji li fihom it-testijiet b'mezz mhux regolari (formulazzjoni klinika/kemikament relevanti) tkun ukoll meħtieġa. F'tali sitwazzjoni l-interazzjoni possibbli ta' kontroll pożittiv b'dan il-mezz mhux-konvenzjonali għandha tkun ittestjata.

1.3.2.3 In-Numru ta' annimali, il-livelli tad-doża u l-għażla tal-mezz.

Minimu ta' erba annimali huwa wżat għal kull grupp ta' doża, b'minimu ta' tlett konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, flimkien ma grupp ta' kontroll negattiv, ittrattat biss bil-mezz tas-sustanza tat-test, u, kif xieraq, kontroll pożittiv. F'dawk il-każi li fihom dettalji individwali ta' l-annimali għandhom ikunu miġbura, minimu ta' ħames annimali għal kull doża huma wżati. Apparti filli fl-assenza ta' trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi ta' kontroll għandhom ikunu mqandla u ittrattati b'manjera identika bħal l-annimali fil-gruppi tat-trattament.

L-għażla tad-doża u l-mezz għandha tkun ibbażata fuq ir-rakkommandazzjonijiet mogħtija fir-referenza (1). Id-dożi huma magħżula mis-serje ta' konċentrazzjoni 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0.5 % etc. Dettalji eżistenti dwar it-tossiċità akuta u l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu ikkunsidrati, meta disponibbli, fil-għażla ta' tlett konċentrazzjonijiet konsekuttivi sabiex l-għola konċemntrazzjoni tkabbar l-esposizzjoni waqt li tevita tossiċità sistematika u irrittazzjoni lokali eċċessiva tal-ġilda (2) (11).

Il-mezz għandu jkun magħżul fuq il-bażi tal-massimizzazzjoni tal-konċentazzjonijiet tat-test u ta' kemm jinħall f'likwidu, waqt li jipproduċi taħlita/sospenzjoni xierqa għall-applikazzjoni tasd-sustanza tat-test. Fl-ordni ta' preferenza, il-mezzi rakkommandati huma l-aċetun.żejt taż-żebbuġa (4:1 v/v), dimethylformamide, methyl ethyl ketone, propylene glycol u dimethyl sulphoxide (2) (10), imam oħrajn jistgħu ikunu wżati jekk raġġjonar xjentifiku suffiċjenti jkunipprovdut. F'ċerti sitwazzjonijiet, jista jkun meħtieġ li jsir użu minn solvent kemikament relevanti jew il-formulazzjoni kummerċjali li fiha s-sustanza tat-test hija marketed bħala kontroll addizzjonali. Kura partikolari għandha tingħata sabiex ikun assigurat li l-materjali idrofiliċi jkunu inkorporati fis-sistema tal-mezz, li xxarrab il-ġilda u ma ċċarċarx immdjetament. Għalhekk, il-mezzi kompletament akweji għandhom ikunu evitati.

1.3.3 Proċedura tat-test

1.3.3.1 Skeda sperimentali

L-iskeda sperimentali ta' l-assaġġ hija kif ġej:

Jum 1:

Identifika individwalment u rreġistra l-piż ta' kull annimal. Iftaħ applikazzjoni ta' 25μl tat-trattib xieraq tas-sustanza tat-test, il-mezz waħdu, jew il-kontroll pożittiv (kif xieraq), tal-warrani ta' kull widna.

Jiem 2 u 3:

Irrepeti l-proċedura ta' l-applikazzjoni mwettqa fil-jum 1.

Jiem 4 u 5:

L-ebda trattament.

Jum 6:

Irreġistra l-piż ta' kull annimal. Injetta 250μl (PBS) salin-fosfat-mewwieti li jkun fiha 20 μCi (7.4e + 8 Bq) ta' 3H-methyl thymidine fil-ġriedem kollha tat-test u tal-kontroll via il-vina tad-demb. B'mod alternattiv innjetta 250 μL PBS li jkun fiha 2 μCi (7.4e + 7 Bq) ta' 125I-iododeoxyuridine u 10-5 M fluorodeoxyuridine fil-ġrieden kollha via il-vina tad-demb

Ħames siegħat wara l-annimali jkunu maqtula. It-tisfija tan-nodoli limpiċi awrikulati minn kull widna hija mposta u miġbura fil-PBS għal kull grupp sperimentali (ir-resqien tal-grupp miġbur tat-trattament); b'mod alternattiv, il-pari tan-nodulti tal-limpi mill-annimali individwali jistgħu ikunu imposti u miġbura fil-PBS għal kull annimal (ir-resqien ta' l-annimal individwali). Dettalji u disinji ta' l-identifikazzjoni tad-nodula u tad-dissezzjoni jistgħu jinstabu fl-Anness I tar-referenza 10.

1.3.3.2 Il-preparazzjoni tas-sospenzjonijiet taċ-ċelloli

Sospenzjoni ta' ċellola waħda taċ-ċelloli tan-noduli limpiċi (LNC) jew mill-gruppi tat-trattament miġbur jew b'mod bilaterali minn annimali individwali, hija ippreparat b'mekkaniżamu ġentili ta' disaggreggazzjoni minn 200 μm-mesh garża ta' l-azzar inossidabbli. Iċ-ċelloli tan-nodoli limpiċi huma maħsula darbtejn b'eċċess ta' PBS u preċipitati bi 5 % aċidu trikloraċetiku (TCA) fi 4 °C għal 18il-siegħa (2). Gerbubi ikunu jew ri-sospiżi fi 1 ml TCA u trasferiti lejn fjali xintillanti li jkun fihom 10 ml ta' likwidu xintillanti għall-għadd ta' 3H, jew trasferiti direttament lejn tubi ta' l-għadd tal-gamma għal għadd ta' 125I.

1.3.3.3 Determinazzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli (radjoattività inkorporata)

L-inkorporazzjoni ta' 3H-methyl thymidine hija mkejjla bil ß-għadd tax-xintillazzjoni bħala disintegrazzjonijiet kull minuta (DPM). L-inkorporazzjoni ta' 125I-iododeoxyuridine hija mkejjla bil-għadd 125I u wkoll hija espressa bħala DPM. Jiddependi mir-resqien użat, l-inkorporazzjoni għandha tkun espressa bħala DPM/grupp tat-trattament (ir-resqien aggruppat) jew il-DPM/annimal (ir-resqien individwali).

1.3.3.4 Osservazzjonijiet

1.3.3.4.1 Osservazzjonijiet kliniċi

L-annimali għandhom ikunu osservati bir-reqqa darba kull jum għal xi sinjali kliniċi, jew ta' l-irritazzjoni lokali fis-sit ta' l-applikazzjoni jew tat-tossiċità sistematika. L-osservazzjonijiet kollha huma sistematikament irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.

1.3.3.4.2 Il-piż ta' l-iġsma

Kif mistqarr fis-sezzjoni 1.3.3.1, il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu mkejjla fil-bidu tat-test u fil-qtil skedat ta' l-annimali.

1.3.4 Kalkolu tar-riżultati

Ir-riżultati huma espressi fl-Indiċi tas-Stimulazzjoni (SI). Meta jsir użu mir-resqien ta' l-aggruppament, il-SI huwa akkwistat bid-diviżjoni ta' l-inkorporazzjoni radjoarriba aggruppata għal kull grupp ta' trattament tal-grupp bl-inkorporazzjoni tal-mezz ta' kontroll aggruppat; dan jirrendi il-medja SI. Meta jisr użu mir-resqien individwali, l-SI hija akkwistata bid-diviżjoni tal-medja DPM/annimal fi ħdan kull grupp tas-sustanza tat-test u l-grupp ta' kontroll pożittiv bil-medja tad-DPM/annimal għas-solvent/mezz tal-grupp ta' kontroll. Il-medja SI għal kontrolli tal-mezzi ittrattati hija mbagħad 1.

L-użu tar-resqien individwali għall-kalkolu tal-SI ikun jiffaċilita l-imġieba ta' l-analiżi statistika tad-dettalji. Fl-għażla tal-metodu xieraq ta' l-analiżi statistika, l-investigatur għandu jżomm f'moħħu l-possibbiltà ta' inegwalitajiet ta' varjanzi u l-problemi relati l-oħtajn li jistgħu jenħtieġu t-trasformazzjoni tad-dettalji jew l-analiżi statistika mhux-parametrika. Resqien adekwat għall-interpretazzjoni tad-dettalji huwa li tkun evalwata l-informazzjoni individwali tal-kontrolli ittratti u tal-mezz, u li takkwista dawn mill-aħjar doża xierqa fil-kurva tar-reazzjoni, billi jkunu meqjusa l-limiti tar-reabbilità (8) (12) (13). B'dana kollu, l-investigatur għandu jkun ferm attent għall-possibbiltà ta' "reazzjonijiet" barranija għall-annimali individwali fi ħdan grupp li jkunu jeħtieġu l-kejl aalternattiv tar-reazzjoni (e.g., il-medjan pjuttost milli l-medja) jew l-eliminazzjoni ta' l-effetti barranija. Il-proċess tad-deċiżjoni fir-rigward ta' reazzjoni pożittiva jinkludi l-indiċi stimulanti = 3 flimkien mal-konsiderazzjoni tar-reazzjoni mad-doża u, meta xieraq, is-sinifikanza statistika (3) (6) (8) (12) (14).

Jekk ikun meħtieġ li jkunu kjarifikati r-riżultati akkwistati, konsiderazzjoni għandha tun mogħtija għad-diversi propjetajiet tas-sustanza tat-test, inkluż jekk din ikollhiex relazzjoni strutturali ma sensitizzaturi magħrufa tal-ġilda, sew jekk toħloq irritazzjoni eċċessiva tal-ġilda u n-natura tar-reazzjoni tad-doza kif tidher. Dawn u konsiderazzjonijiet oħrajn huma diskussi fid-dettal x'imkien ieħor f'dan id-dokument (7).

2. DATA

Id-data għandha titħabbar f'sommarju f'għamla tabulari li juri l-medja tal-valuri DPM individwali u l-indiċi stimulanti għal kull doża (inkluż il-kontroll tal-mezz) tal-grupp.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Is-sustanza tat-test:

- dettalji ta' l-identifikazzjoni (e.g., numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot purity);

- in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (e.g. pH, volatilità, solubilità, stabbilità);

- jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti.

Mezz:

- l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;

- il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.

Annimali tat-test:

- it-tip ta' ġrieden użati;

- l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.;

- in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;

Kondizzjonijiet tat-test:

- id-dettalji tal-preparazzjoni tas-sustanza tat-test u l-applikazzjoni;

- ġustifikazzjoni ta' l-għażla tad-doża, inklużi r-riżultati minn studju ta' medda ta' sejbiet, jekk imwettaq; il-konċentrazzjonijiet tal-mess u s-sustanza tat-test u l-ammont totali tas-sustanza applikata;

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);

Verifika ta' l-affidabbilità:

- sommarju tar-riżultati ta' l-aħħar verifika affidabbli, inkluża l-informazzjoni dwar is-sustanza, il-konċentrazzjoni u l-mezz użat.

- kontroll pożittiv u negattiv konkorrenti u/jew storiku ta' l-indormazzjoni dwar il-laboratorju tat-testijiet

Riżultati:

- piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tad-doża u fil-qtil skedat;

- tabella tal-medja (resqien aggruppat) u individwali (resqien individwali) tal-valuri DPM kif ukoll il-medda tal-valuri għaż-żewġ resqien u l-indiċi tas-stimulazzjoni għal kull doża (inkluż il-kontroll tal-mezz) tal-grupp;

- analiżi statistika meta xieraq;

- il-ħin tal-korsa ma meta jiskoppja u s-sinjali tat-tossiċità, inkluża l-irritazzjoni dermali fil-post ta' l-amministrazzjoni, jekk ikun hemm, għal kull annimal.

Diskussjoni tar-riżultati:

- Kommentarju qasir tar-riżultati, l-analiżi tar-reazzjoni tad-doża, l-analiżi statistika, meta xieraq, bil-konklużjoni dwar jekk is-sustanza tat-test għandhiex tkun meqjusha bħala sensitizzanti għall-ġilda.

4. REFERENZI

(1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.

(2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.

(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.

(4) Metodu tat-testijiet B,6.

(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.

(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.

(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.

(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.

(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.

(10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99- 4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).

(11) Metodu tat-testijiet B.4.

(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.

(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.

(14) Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.

B.43. STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSIĊITÁ FL-ANNIMALI GERRIEMA

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalenti għal OECD TG 424 (1997)

Dan il-Metodu tat-test kien ġie ddisinjat sabiex jakkwista l-informazzjoni meħtieġa ħalli jikkonferma jew aktar jikkaratterizza l-potenzal tan-newrotossiċità ta' kimika f'annimali adulti. Jista jkun jew imwettaq flimkien mal-Metodi tat-Test eżistenti dwar l-istudji tat-tossiċità għal doża repetuta jew li jkun imwettaq bħala studju separat. Huwa rakkommandat li il-OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1) jkun ikkonsultat sabiex jgħin fid-disinn ta' l-istudji bbażati fuq dan il-metodu ta' Test. Dan huwa partikolarment importanti meta modifiki ta' l-osservazzjonijiet u tal-proċeduri tat-test kif rakkommandat għall-użu b'rutina ta' dan il-metodu jkunu kkonsidrati. Id-Dokument ta' Gwida kien ġie ippreparat sabiex jiffaċilita l-għażla ta' proċeduri oħrajn tat-test għall-użu f'ċirkostanzi speċifiċi. L-assess ta' l-iżvilupp newrotossiku mhux is-suġġett ta' dan il-Metodu.

1.1 INTRODUZZJONI

Fl-assess u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi tal-kimika, huwa importanti li jkun ikkonsidrat il-potenzal ta' l-effetti newrotossiċi. Diġa fil-Metodu tat-test dwar tossiċità sistematika għal doża repetuta, jinkludi osservazzjonijiet li jħarsu dwar in-newrotossiċità potenzali. Dan il-Metodu ta' Test jista jkun użat dabiex jiddisinja studju ħalli jakkwista aktar informazzjoni dwar, jew jikkonferma, l-effetti newrotossiċi, osservati fl-istudji tat-tossiċità sistematika f'doża repetuta. B'dana kollu, konsiderazzjoni dwar in-newrotossiċità potenzali ta' klassijiet ta' kimika jistgħu jissuġġerixxu li dawn jistgħu ikunu evalwati aħjar bl-użu ta' dan il_metodu mingħajr indikazzjonijiet preċedenti tan-newrotossiċità potenzali minn studji tat-tossiċità sistematika minn doża repetuta. Uħud mill-konsiderazzjonijiet jinklu, per eżempju:

l-osservazzjoni ta' sinjali newroloġiċi jew feriti newropatoloġiċi fl-istudji tossiċi apparti milli l-istudji tat-tossiċità sustematika f'doża repetura, jew

relazzjoni strutturali jew informazzjoni oħra li torbothom ma newrotossikanti magħrufa.

B'żieda jista jkun hemm okkażżjonijiet oħrajn meta l-użu ta' dan il_metodu ta' test jista jkun xieraq; għal aktar dettalji ara (1).

Dan il-Metodu kien ġie żviluppat sabiex ikun jista jiġi mfassal ħalli jilħaq il-ħtiġiet partikolari sabiex jikkonferma l-ħistopatoloġija speċifika u n-newrotossiċità ta' l-imġieba ta' kimika kif ukoll jipprovdi karatterizzazzjoni u kwantifikazzjoni tar-reazzjonijiet newrotossiċi.

Fil-passat, in-newrotossiċità kienet imqabbla man-newropatija li tinvolvi feriti newropatoloġiċi jew disfunzjonijiet newroloġiċi, bħala ma huma attakk ta' puplesija, paraliżi jew roda. Għalkemm in-newropatija hija manifestazzjoni importanti tan-newrotossiċità, issa huwa ċar li hemm ħafna sinjali oħrajn tat-tossiċità tas-sistema nervuża (e.g. it-telf tal-kordinament muturili, it-tnaqqis sensitorju, id-disfunzjonijiet fil-tgħallim u l-memorja) li jistgħu ma jkunux riflessi fl-istudji newropatiċi jew ta' tipi oħraajn.

Dan il-Metodu ta' Test newrotossiku huwa iddisinjat sabiex jiżvela newro-imġieba maġġuri u l-effetti newropatholoġiċi f'annimali gerriema adulti. Waqt l-effetti ta' l-imġieba, anki fin-nuqqas ta' tibdiliet morfoloġiċi, jistgħu jirreflettu fuq l-impatt ħażin ta' l-organiżmi, mhux it-tibdiliet ta' l-imġieba kollha huma speċifiċi għas-sistema nervuża. Għalhekk, xi tibdiliet osservati għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni mad-dettalji ħistopatoloġiċi, ħematoloġiċi jew biokemikali korrelattivi kif ukoll l-informazzjoni dwar tipi oħrajn tat-tossiċità sistematika. It-testijiet meħtieġa b'dan il-metodu sabiex jipprovdu karatterizzazzjoni u kwantifikazzjoni tar-reazzjonijiet newrotossiċi jinkludu proċeduri ħistopatoloġiċi jew ta' l-imġieba speċifiċi li jitgħu aktar ikunu appoġġjati minn investigazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi u/jew biokimiċi (1) (2) (3) (4).

In-newrotossikanti jistgħu jaġixxu fuq numru ta' miri fi ħdan is-sistema nervuża u b'varjetà ta' mekkaniżmi. La darba l-ebda medda ta' testijiet ma hija kapaċi li tassessja fil-profond il-potenzal newrotossiku tas-sustanzi kollha, jista jkun meħtieġ li jkunu utilizzati testijiet in vivo jew in vitro oħrajn speċifiċi għat-tip tan-bewrotossiċità osservata jew antiċipata.

Dan il-Metodu tat-Test jista jkun użat ukoll, b'konnessjoni mal-gwida stabbilita fid-Dokument ta' Gwida OECD dwar l-Istrateġiji u l-Metodi tat-testijiet Newrotossiċi (1) li huma iddisinjati bħala intiżi li aktar jikkaratterizzaw jew iżidu s-sensittività tal-kwantifikazzjoni tar-reazzjoni tad-doża sabiex ikun hemm estimi aħjar tal-livell ta' l-effet mhux-osservat-ħażin jew li jissustanzja perikoli magġrufa jew issusspetati tal-kimika. Per eżempju, l-istudji jistgħu ikunu iddisinjati li jidentifikaw u jevaljaw il-mekkaniżmi newrotossiċi jew li jissupplementaw l-informazzjoni diġa disponibbli mill-użu tal-proċeduri bażiċi fl-osservazzjoni newro-imġieba u newropatoloġiċi. Tali studji mhux bilfors li jiddupplikaw l-informazzjoni li tkun ġiet ġenerata mill-użu tal-proċeduri normali rakkommandati f'dan il-metodu jekk tali dettalji jkunu diġa disponibbli u li ma humiex meqjusa bħala meħtieġa għall-interpretazzjoni tar-riżultati ta' l-istudju.

Dan l-istudju newrotossiku, meta wżat waħdu jew flimkien ma oħrajn, jipprovdi informazzjoni li tista:

tidentifika jekk is-sistema nervuża tkun affettwata b'mod permanenti jew riversibbli mill-kimika ittestjata';

tikkontiribwixxi l-karatterizzazzjoni tat-tibdiliet fis-sistema nervuża assoċċjati ma l-esposizzjoni lejn il-kimika, u dwar ir-rikonoxximent tal-mekkaniżmu bażiku;

tiddetermina ir-relazzjoni tad-doża u tar-reazzjoni tal-ħin sabiex ikun ikkalkolat il-livell ta' l-effett ħażin mhux-osservat (li jista jkun użat sabiex jistabbilixxi kriterja b'sigurtà għall-kimika).

Dan il-Metodu ta' Test juża amministrazzjoni orali tas-sustanza tat-test. Rotot oħrajn ta' l-amministrazzjoni (e.g. dermali jew man-nifs) jistgħu ikunu aktar xierqa, u jistgħu jeħtieġu modifika għall-proċessi rakkommandati. Konsiderazzjonijiet ta' l-għażla tar-rotta ta' l-amministrazzjoni jkunu jiddependu mill-profil ta' l-esposizzjoni umana u l-informazzjoni disponibbli, tossikoloġika jew kinetika.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Effett ħażin: Kwalunkwe alterazzjoni relatata mat-trattament minn linja bażi li tnaqqas l-abbiltà ta' l-organiżmu li jibqa ħaj, li jirripriduċi jew li jadatta għall-ambjent.

Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif amministrata. Id-doża hija espressa bħala piż (g. Mg) jew bħala piż tas-sustanza tat-test għal kul unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (e.g. mg/Kg), jew bħala konċentrazzjonijiet dietarju kostanti 9ppm).

Dożaġġ: Huwa terminu ġenerali li jinklużi d-doża, il-frekwenza tagħha u t-tul taż-żmien tad-dożaġġ.

Newrotossiċità: Hija it-tibdil ħażin fl-istruttura jew fil-funzjoni tas-sistema nervuża li tirriżulta minn esposizzjoni lejn aġent kimiku, bioloġiku jew fiżiku.

Newrotassikant: Huwa l-aġent kimiku, bioloġiku jew fiżiku li jkollu l-potenzal li joħloq in-newrotossiċità.

NOAEL: Hija l-abbrevjazzjoni għall-livell ta' l-ebda effett avvers ma huwa osservabbli (no-observed-adverse-effect level) u hija l-għola doża jew livell ta' esposizzjoni meta l-ebda sejbiet avversi realatati mat-trattament ma jkunu osservati.

1.3 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Il-kimika tat-test hija amministrata bir-rotta orali matul medda ta' dożi lil diversi gruppi ta' annimali gerriema tal-laboratorju. Dożi repetuti huma normalment maħtieġa, u r-regola tad-dożaġġ tista tkun 18 jum, subkronika (90 jum) jew kronika (sena jew aktar). Il-proċeduri stabbilitu f'dan il-Metodu ta' test jistgħu wkoll ikunu wżati għall-istudju tan-newrotossiċità akuta. L-annimali huma ittestjati sabiex jippermettu s-sejbien jew il-karatterizzazzjoni ta' l-imġieba u/jew l-annormalitajiet newroloġiċi. Medda ta' mġieba li tista tkun affettwata bin-newrotossikanti hija assessjata matul kull perijodu ta' l-osservazzjoni. Fl-aħħar tat-test, subset ta' annimali ta' kull sess minn kull grupp huma mxerrda in situ u s-sezzjonijiet tal-moħħ, l-ispina dorsaali, u n-nervi periferali huma ippreparati u eżaminati.

Meta l-istudju jkun imwettaq bħala studju independenti sabiex jevalwa n-newrotossiċità jew li jikkaratterizza l-effetti newrotossiċi, l-annimali f'kull grupp ma li jkunux użati għat-tixrid u l-ħistopatoloġija sussegwenti 9ara t-Tabella 1) jista jkun użat għall-proċeduri newro-imġieba speċifika, n-newropatoloġija, in-newrokimika jew elettrofiżjoloġiċi li jistgħu jissuplementaw l-informazzjoni akkwistat mill-eżaminazzjonijiet normali meħtieġa b'daan il-Metodu (1). Dawn il-proċeduri supplementaji jistgħu ikunu partikolarment utili meta l-osservazzjonijiet empiriċi jew l-effetti mistennija jindikaw tip jew mira speċifika tan-newrotossiċità ta' kimika. B'mod alternattiv, il-kumplament ta' l-annimaali jistgħu ikunu wżati għal evalwazzjonijiet bħal dawk mitluba fil-Metodi tat-testijiet għal studji tat-tossiċità f'doża repetuta fl-annimali gerriema.

Meta l-proċeduri ta' dan il-Metodu ta' Test huma miġbura ma dawk tal-metodi ta' testijiet oħrajn, numru suffiċċjenti ta' annimali huwa meħtieġ sabiex jissodisfa l-ħtiġiet għall-osservazzjonijiet taż-żewġ studji.

1.4 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

L-ispeċje preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċje oħrajn ta' annimali gerriema tista tkun użata. Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Id-dożaġġ għandu normalment jibda malajr kemm jista jkun possibbli wara l-ftim, preferibbilemnt mhux aktar tard minn meta l-annimali jkollhom sitt ġimghat, u, fi kwalunkwe każ, qabel ma l-annimali jkunu għalqu d-disa' ġimghat. B'dana kollu, meta dan l-istudju jseħħ flimkien ma studji oħrajn, din il-ħtieġa ta' l-età tista tkun teħtieġ aġġustament. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali wżati għandha tkun minima u ma teċċedix 20 % tal-piż medju ta' kull sess. Meta studju ta' doża repetita ftul qasir ta' żmien ikun imwettaq bħala preliminarju għal studju f'terminu fit-tul, l-annimali mill-istess tiġ u sorsi għandhom ikunu wżati fiż-żewġ studji.

1.4.2 Il-kondizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 °C (± 3 °C). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12 il-siegħa dawl, 12 il-siegħa dlam. Ħsejjes għoljin intermittenti għandhom jinżammu għall-anqas possibbli. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu wżati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista tkun influwenzata bil-ħtieġa li tkun assigurata inter-taħlita xierqa tas-sustanza tat-test meta amministrata b'dan il-metodu. L-annimali jistgħu jinżammu individwalment jew li jkunu f'gaġġa bħala grupp żgħir ta' l-istess sess.

1.4.3 Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali żgħażagħ b'saħħithom ikunu assenjati kif jinzerta għal gruppi ta' trattament u tal-kontroll. Il-gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. L-annimali huma identifikati b'mod uniku u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mill-anqas (5) ħamest ijiem qabel il-bidu ta' l-istudju sabiex jippermetti għall-akklamitizzazzjoni lejn il-kondizzjonijiet tal-laboratorju.

1.4.4 Rotta ta' l-amministrazzjoni u l-preparazzjoni tad-dożi

Dan il-Metodu ta' Test juża amministrazzjoni orali tas-sustanza tat-test. L-amminstrazzjoni orali tista tkun bi tmiegħ sfurzat, ma l-ikel, jew fl-ilma tax-xorb, jew b'kapsuli. Rotot oħrajn ta' l-amministrazzjoni (e.g. dermali jew man-nifs) jistgħu ikunu aktar xierqa, u jistgħu jeħtieġu modifika għall-proċessi rakkommandati. Konsiderazzjonijiet ta' l-għażla tar-rotta ta' l-amministrazzjoni jkunu jiddependu mill-profil ta' l-esposizzjoni umana u l-informazzjoni disponibbli, tossikoloġika jew kinetika. Ir-raġġjunar għall-għażla tar-rotta ta' l-aamministrazzjoni kif ukoll il-modifiki li jirriżultaw għall-proċeduri ta' dan il-metodu ta' test għandhom ikun indikati.

Meta meħtieġ, is-sustanza tat-test tkun imdewwba jew sospiża f'mezz xieraq. Huwa rakkommandat li, kull meta possibbli, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni akwea tkun meqjusa bħala l-ewwel għażla, sewgeita bil-konsiderazzjoni ta' taħlita/emulsjoni fiż-żejt (e.g. żejt tal-qamħ-ir-rum) w imbagħad b'xi taħlita oħra f'mezzi oħrajn. Il-karatteristiċi tossiċi tal-mezz għandhom ikun u magħrufa. B'żieda, konsiderazzjoni għandha tingħata għal dawn il-karatteristiċi li ġejjin dwar il-mezz: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimiċi tas-sustanza tat-test li jistgħu joħolqu bidla fil-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ima jew ta' l-istat nutrizzjonali ta' l-annimali.

1.5 PROĊEDURI

1.5.1 Numru u sess ta' l-annimali

Meta l-istudju jkun imwettaq bħala studju separat, mill-anqas 20 annimal (10 nisa u 10 irġiel) għandhom ikunu wżati għal kull grupp tad-doża u tal-kontroll għall-evalwazzjoni ta' l-osservazzjonijiet dettaljarti kliniċi u funzjonali. Mill-anqas ħamest irġiel u ħames nisa, magħżula minn dawk l-10 tirġiel u l-għaxar nisa, għandhom ikunu mxerrda in situ u wżati għall-newroħistopatoloġija dettaljata fit-tmiem ta' l-istudju. Fil-każi meta numru limitat biss ta' annimali jkunu mogħti d-doża fil-grupp osservat għas-sinjal ta' l-effetti newrotossiċi, konsiderazzjoni għandha tkun mogħtija għall-inklużjoni ta' dawn l-annimali f'dawk magħżula għat-tixrid. Meta l-istudju jkun imwettaq flimien ma l-istudju tat-tossiċità ta' doża repetuta, numru adekwat ta' annimali għandu jkun użat sabiex jilħaq l-għanijiet taż-żewġ studju. In-numru minimu ta' annimali f'kull grupp għad-diversi ġemgħat ta' studji huwa mogħti fit-tabella 1. Jekk sa dan it-tant ikun hemm qtil jew gruppi ta' rkupru għall-osservazzjoni tar-riversabbiltà, l-persistenza jew l-okkorrenza mdewma ta' l-effetti tossiċi ta' wara t-trattament, ikunu ippjanati jew meta osservazzjonijiet supplementarji jkunu ikkonsidrati, allura n-numru ta' l-annimali għandu jkun miżjud sabiex jassigura li n-numru ta' l-anniamli meħtieġa għall-osservazzjoni u l-ħistopatoloġija jkunu disponibbli.

1.5.2 Grupp ta' trattament u tal-kontroll

Mill-anqas tlett gruppi ta' doża u grupp tal-kontroll għandhom ġeneralment ikunu użati, imma jekk mill-assessjar ta' informazzjoni oħra, l-ebda effetti ma jkunu mistennija fid-doża repetuta ta' 1000 mg/kg piż tal-ġisem/jum, tast ta' limitu jkunu jkun imwettaq. Jekk ma jkun hemm l-ebda informazzjoni disponibbli, medda ta' studju tas-sejbien tista tkun imwettqa sabiex tgħin fid-determinazzjoni tad-dożi li għandhom ikunu wżati. Apparti milli għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ukoll ikunu mqandla b'manjera identika għas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk ikun użat mezz, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi il-mezz fl-għola volum użat.

1.5.3 Verifika ta' l-affidabbiltà

Il-laboratorju li jwettaq l-istudju għandu jippreżenta informazzjoni li turi il-kapaċità tiegħu li jwettaq l-istudju u s-sensittività tal-proċeduri użati. Tali informazzjoni għandha tipprovdi evidenza ta' l-abbiltà li jiżvela u jikkwantifika, kif xieraq, tibdiliet fl-għanijiet finali differenti kif rakkommandati għall-osservazzjoni, bħal ma huma sinjali awtomatiki, reattività sensorja, is-saħħa tal-qabda fid-dirgħajn u s-saqajn u l-attività motorili. L-informazzjoni dwar il-kimika li tikkawża tipi differenti ta' reazzjonijiet newrotossiċi u jistgħu ikunu wżati bħala kontroll pożittiv tas-sustanzi jista jinstgħab fir-referenzi 2 sa 9. L-informazzjoni storika tista tkun użata jekk l-aspetti essenzali tal-proċeduri. Sperimentali jibqgħu l-istess. Aġġornament perjodiku ta' l-informazzjoni storika huwa rakkommandat. Informazzjoni ġdida li turi s-sensittività kontinwa tal-proċeduri għandha tkun żviluppata meta uħud mill-elementi essenzali ta' l-imġieba tat-test jew tal-proċeduri tkun ġiet mibdula mill-laboratorju li jwettaq l-istudji.

1.5.4 L-għażla tad-doża

Il-livelli tad-doża għandhom ikunu magħżula billi tkun meqjusa xi informazzjoni preċedentament osservata tat-tossiċità u l-kinetika disponibbli għall-kompost tat-test jew tal-materjali relatati. L-għola livell tad-doża għandu jkun magħżul bil-għan li jinduċi effetti newrotossiċi jew effetti ċari sistematikament tossiċi. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża għandha tkun magħżulha bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-doża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Bħala prinċipju, il-livelli tad-doża għandhom ikunu hekk stabbiliti sabiex primarjament l-effetti tossiċi fuq is-sistema nervuża jistgħu ikunu distingwiti mill-effetti relatati mat-tossiċità sistematika. Tnejn- sa erba intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-użu ta' intervalli ferm twal (e.g. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożi. Meta jkun hemm estimi raġjonevili ta' esposizzjoni umana, dan għandu jkun meqjus.

1.5.5 Test tal-limitu

Jekk l-istudju fl-livell ta' doża ta' mill-anqas 1000 mg/kg piż tal-ġisem.kull jum, li juża l-proċeduri deskritti, ma jipproduċi l-ebda effetti newrotossiċi u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija meta ibbażata fuq l-informazzjoni mill-komposti strutturament relatati, allura studju sħiħ li juża tlett livelli ta' dożi jista li ma jkunx meqjus bħala meħtieġ. L-isposizzjoni umana mistennija tista tindika il-ħtieġa għal-livell ta' doża orali għola li tkun użata fit-test tal-limitu. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, bħal ma hija l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza tat-test, bħal kemm tinħall, ta' spiss tista tindika u tillimita l-livell massimu attenibbli ta' l-esposizzjoni. Għat-twettieq ta' studju akut orali, id-doża tat-test tal-limitu għandha tkun ma mill-anqas 2000 mg/kg.

1.5.6 Amministrazzjoni tad-dożi

L-annimali huma mogħtija d-doża bis-sustanza tat-test, ta' kull jum, sebat ijiet kull ġimgħa, għal perijodu ta' mill-anqas 28 jum; l-użu tar-regola tad-doża ta' ħamest ijiem jew perijodu ta' esposizzjoni aqsar, jeħtieġ li jkunu ġustifikati. Is-sustanza tat-test hija amministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi inubazzjoni canula xierqa. Il-volum massimu ta' likwidu li jista jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux jeċċedi 1 ml/100 g piż tal-ġisem. b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem jista jkun ikkonsidrat. Apparti milli għal sustanzi irritanti jew korrossivi, li normalment ikununjiżvelaw effetti eżasperanti b'konċentrazzjonijiet għola, varjabbilità fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni sabiex tassigura volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.

Għal sustanzi amministrati permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, huwa importanti li jkun assigurat li l-kwantitajiet tas-sustanza tat-test kif involuti ma jkunux jinterferixxu man-nutriment normali jew mal-bilanċ ta' l-ilma. Meta s-sustanza tat-test tkun amministrata fid-dieta, konċentrazzjoni djetarja kostanti (ppm) jew livell ta' doża kostanti f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal, jista jkun użat; il-mod alternattiv użat għandu jkun speċifikat. Għal sustanza amministrata bi tmiegħ sfurzat, id-doża għandha tkun mogħtija f'ħinijiet simili ta' kull jum, u aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa sabiex jinżamm livell kostanti ta' doża f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal. Meta l-istudju tad-doża repetuta ikun użat bħala preliminarju għal studju f'terminu fit-tul, dieta simili għandha tkun użata fiż-żeġ studji. F'ċirkostanzi mhuix tas-solti li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perijodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.

1.6 OSSERVAZZJONIJIET

1.6.1 Frekwenza ta' l-osservazzjonijiet u t-testijiet

Fi studji ta' doża repetuta, il-perijodu ta' l-osservazzjoni għandu jkopri l-perijodu tad-dożaġġ. Fi studju akuti, perijodu ta' 14 il-jum post-trattament, għandu jkun osservat. Għall-annimali fi gruppi satteliti li huma miżmuma mingħajr esposizzjoni matul perijodu tal-post-trattament, l-osservazzjonijiet għandhom ikopru wkoll dan il-perijodu.

L-osservazzjonijiet għandhom isiru fi frekwenza suffiċjenti sabiex iqawwu l-probabbilità tas-sejbien ta' xi annormalitajiet fl-imġieba u/jew fin-newroloġija. L-osservazzjonijiet għandhom, preferibbilment, isiru fl-istess ħinijiet ta' kull jum b'konsiderazzjoni mogħtija għall-perijodu l-aktar qawwi ta' l-effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-frekwenza ta' l-osservazzjonijiet kliniċi u tat-testijiet funzjonali huma miġbura f'sommarju fit-Tabella 2. Jekk informazzjoni kinetika jew informazzjoni oħra minn studji preċedenti tindika il-ħtieġa ta' l-użu ta' punti differenti tal-ħon, it-testijiet jew il-perijodu post-osservazzjoni, skeda alternattiva għandha tkun adotta sabiex tkun akkwistata l-informazzjoni massima. Ir-raġunar għal tibdil ta' l-iskeda għandu jkun ipprovdut.

1.6.1.1 Osservazzjonijiet dwar il-kondizzjonijiet ġenerali tas-saħħa u tal-mortalità/morbidità

L-annimali kollha għandhom ikunu osservati bir-reqqa mill-anqas darba kull jum fir-rigward tal-kondizzjoni tas-saħħa tagħhom kif ukoll mill-anqas darbtejn kull jum dwar il-morbidità u l-moralità.

1.6.1.2 Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati

Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati għandhom isiru fuq l-annimali kollha magħżula għal dan l-iskop (ara t-Tabella 1), darba qabel l-ewwel esposizzjoni (sabiex jippermetti għal paraguni fi ħdan is-suġġett), u f'ħinijiet differenti minn hemm il-quddiem, jiddependi mit-tul ta' l-istudju (ara t-Tabella 2). Osservazzjoni kliniċi dettaljati fuq gruppi satellita ta' l-irkupru għandhom isiru fit-tmiem tal-perijodu ta' l-irkupru. Osservazzjoni kliniċi dettaljati għandhom isiru il-barra mill-gaġġa ta' fejn jinżammu f'arena normali. Dawn għandhom ikunu reġistrati bir-reqqa bl-użu ta' sistemi tal-marki li jinkludi kriterja jew skali tal-marki għal kull kejl fl-osservazzjonijiet. Il-kriterja jew l-iskali użati għandhom ikunu spliċitament definiti mil-laboratorju tat-test. Sforz għandu jsir sabiex jassigura li l-varjazzjonijiet fil-kondizzjonijiet tat-test ikunu minimi (mhux sistematikament relatati mat-trattament) u li l-osservazzjonijiet ikunu mwettqa minn osservaturi mħarrġa li ma jkunux konxi bit-trattament attwali.

Huwa rakkommandat li l-osservazzjonijiet ikunu mwettqa f'għamla strutturali li fiha kriterja ben definita (inkluża d-definizzjoni tal-"medda" normali) ikunu sistematikament applikati ma kull annimal fuq waqt ta' l-osservazzjon. Il-"medda normali" għandha tkun adekwatament dokumentata. Is-sinjali osservati kollha għandhom ikunu reġistrati. Kull meta prattikabbli, il-magnitudini tas-sinjali osservati għandhom ukoll ikunu rekordjati. L-osservazzjonijiet kliniċi għandhom jinkludu, imma ma jkunx limitati għall-ambjament fil-ġilda, fis-suf, fl-għajnejn, fil-membrani mukożi, fl-okkorrenza tas-sekrazzjonijiet u tal-ħmieġ u l-attività awtomatika (e.g., lakrimazzjoni, piloerezzjoni, id-daqs tal-pupilla, għamla repiratorja mhux normali u/jew in-nifs mill-ħalq, xi sinjali mhux tas-soltu ta' l-urina jew tal-qlalet, u urina b'kulur stramb).

Xi reazzjonijiet mhux tas-soltu fir-rigward tal-pożissjoni tal-ġisem, il-livell ta' l-attività (e.g., tnaqqis jew żieda fl-esplorazzjoni fl-arena normali) u l-kordinament tal-moviment, għandhom ukoll ikunu innotati. Tibdil fil-mixi (e.g., xengil, atassja), il-posizzjoni (e.g., b'darhom mgħawweġ) u r-reattività għat-tqandil, it-tqegħid jew stimulu ambjentali oħraajn, kif ukoll il-preżenta ta' movimenti kloniċi jew toniċi, konvulżjonijiet jew rogħda, stereotipi (e.g., kura żejda, movimenti mhux normali tar-ras, dawrien repetittiv) jew imġieba stramba (e.g., gdim jew li jilgħaqu b'mod eċċessiv, mutilazzjoni tagħhom stess, mixi lura, vokalizzazzjoni) jew aggressjoni għandhom ikunu rekordjati.

1.6.1.3 testijiet funzjonali

L-istess bħall-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati, it-testijiet funzjonali għandhom ukoll ikunu mwettqa qabel l-esposizzjoni preċedenti u ta' spiss minn hemm il-quddiem fuq l-annimali kollha magħżula għal dan l-iskop (ara t-Tabella 1) Il-frekwenza tat-testijiet funzjonali hija wkoll dipendenti fuq it-tul ta' l-istudju (ara t-Tabella 2). B'żieda mal-perijodi ta' l-osservazzjoni kif elenkati fit-Tabella 2, l-osservazzjonijiet funzjonali fuq gruppi satellita ta' l-irkupru għandhom ukoll isiru malajr kemm jista jkun possibbli lejn il-qtil tat-terminazzjoni. It-testijiet funzjonali għandhom jinkludu ir-reattività sensitorja għall-istimu ta' diversi modalitajiet, e.g., l-istimuli awditorji, viżwali u proprjoseptivi (5)(6)(7)), bl-assaġġ tal-forza tad-dirgħajn u s-saqajn (8) u l-assaġġ ta' l-attività motorili (9). L-attività motorili għandha tkun imkejjla b'apparat awtomatiku li jkun kapaċi jiżvela kemm it-tnaqqis u wkoll iż-żidiet fl-attività. Jekk tkun użata sistema definita oħra, din għandha tkun kwantitattiva u s-sensittività u l-affiddabbilità tagħha għandhom ikunu demonstrati. Kull apparat għandu jkun ittestjat sabiex jassigura affiddabbilità matul iż-żmien u li jkun konsistenti bejn l-apparati. Aktar dettalji tal-proċeduri li jistgħu ikunu segwiti huma mogħtija fir-referenzi rispettivi. Jekk ma jkun hemm l-ebda informazzjoni (e.g., attività strutturali, dettalji epidemjoloġiċim studju tossikoloġiċi oħrajn(sabiex jindikaw l-effetti newrotossiċi potenzali, l-inklużjoni ta' aktar testijiet speċjalizzati tal-funzjoni sensitorja u motorili jew tat-tgħallim u tal-memorja, sabiex jeżaminaw dawn l-effetti possibbli f'aktar dettall, għandhom ikunu ikkonsidrati. Aktar informazzjoni dwar testijiet speċjalizzati u l-użu tagħhom hija disponibbli fi (1). B'mod eċċezzjonali, l-annimali li jiżvelaw sinjali ta' tossiċità sal-limitu li din tkun sinifikament tfixkel it-test funzjonali, dawn jistgħu jitħallew barra mit-test. Ġustifikazzjoni għall-eliminazzjoni ta' l-annimali minn test funzjonali għandha tkun ipprovduta.

1.6.2 Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel/ilma

Għal studju ta' sa 90 jum, l-annimali kollha għandhom ikunu miżuna mill-anqas darba fil-ġimgħa u l-kejl għandu jittieħed tal-konsum ta' l-ikel (konsum ta' l-ilma, meta s-sustanza tat-test hija amministrata b'dik il-medja) mill-anqas darba fil-ġimgħa. Għal studji fit-tul, l-annimali kollha għandhom ikunu miżuna mill-anqas darba fil-ġimgħa għall-ewwel 13 il-ġimgħa u mill-anqas kull 4 ġimgħat minn hemm il-quddiem. Il-kejl għandu jsir fuq il-konsum ta' l-ikel (il-konsum ta' l-ilma, meta s-sustanza tat-test hija amministrata b'dik il-medja) mill-anqas darba fil-ġimgħa għall-ewwel 13 il-ġimgħa u imbagħad f'madwar intervalli ta' tlett-xhur, sakemm l-istat tas-saħħa jew tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem jiddettaw mod ieħor.

1.6.3 Optalmoloġija

Għal studji itwal minn 28 jum, l-eżaminazzjoni optalmoloġika, bl-użu ta' optalmoskopju jew strument ekwivalenti addattat, għandha ssir qabel l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test u fit-terminazzjoni ta' l-istudju, preferibbilment fuq l-annimali kollha, imma mill-anqas fuq l-annimali f'doża għolja u l-gruppi ta' kontroll. Jekk tibdiliet fl-għajnejn ikunu żvelati, jew, jekk sinjali kliniċi jindikaw il-ħtieġa, l-annimali kollha għandhom ikunu ezaminati. Għal studji fit-tul, eżaminazzjoni optalmoloġika għandha titwettaq mat-13 il-ġimgħa. L-eżaminazzjonijiet optalmoloġiċi ma humiex meħtieġa jekk din l-informazzjoni tkun diġa disponibbli minn studji oħrajn ta' tul simili u f'livelli ta' doża simili.

1.6.4 Ħematoloġija u l-biokemistrija klinika

Meta l-istudju newrtossiku jkun imwettaq flimkien ma studju tossiku sistematiku b'doża repetuta, l-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi u d-determinazzjoni tal-biokemistrija klinika għandhom jitwattqu kif elenkat fil-Metodu rispettiv ta' l-istudju tossiku sistematiku. Il-ġbir tal-kampjuni għandu jkun imwettaq b'tali mod li xi effetti potenzali fuq in-newro-imġieba jkunu minimizzati.

1.6.5 Ħistopatoloġija

L-eżaminazzjoni newropatoloġika għandha tkun iddisinjata sabiex tikkumplementa u testendi l-opsservazzjonijiet magħmula matul il-fażi in vivo ta' l-istudju. Siltiet minn mill-anqas 5 annimali/sess/grupp (ara t-Tabella 1 u l-paragrafu li ġej) għandhom jitwettqu in situ, bl-użu ta' perfużjoni ġenerali rikonoxxuta u t-teknika tal-fissazzjoni (ara r-refernza 3, il-kapitolu 5 u r-referenza 4, il-kapitolu 50). Kwalunkwe tibdiliet kbar osservabbli għandhom ikunu irreġistrati. Meta l-istudju jkun imwettaq bħala aspett ta' l-istudju waħdu dwar in-newrotossiċità hew sabiex jikkaratterizza l-effetti newrotossiċi, il-kumplament ta' l-anniamli jistgħu ikunu wżati jew għal newro-imġieba speċifika (10) (11), newropatoloġija (10) (11) (12) (13), mewrokimika (10) (11) (14) (15) jew elettropsikoloġija (10) (11) (16) (17), proċeduri li jistgħu jissupplementaw il-proċeduri u l-eżaminazzjonijiet deskritti hemmhekk, jew sabiex iżidu in-numru ta' suġġetti eżaminati għall-ħistopatoloġija. Dawn il-proċeduri supplementaji jistgħu ikunu partikolarment utili meta l-osservazzjonijiet empiriċi jew l-effetti mistennija jindikaw tip jew mira speċifika tan-newrotossiċità ta' kimika. B'mod alternattiv, il-kumplament ta' l-annimali jistgħu wkoll ikunu wżati għal evalwazzjoni patoloġiċi ta' rutina kif deskritt fil-Metodu għal studju ta' doża repetuta.

Proċedura ta' tbgħajja ġenerali, bħal ma hija l-ħematossilin u l-eosin (H&E), għandha tkun imwettqa fuq il-kampjuni tal-biċċiet kollha mgħaddsa fil-paraffin, u eżaminazzjoni mikroiskopika għandha tkun imwettqa. Jekk ikunu osservati sinjali ta' newropatija periferali, jew jekk dawn ikunu issusspetati, kampjuni mgħaddsa fil-plastika tan-nisġa tal-nervu periferali, għandha tkun eżaminata. Sinjali kliniċi jistgħu wkoll jissuġġerixxi siti addizzjonali għall-eżaminazzjoni jew l-użu ta' proċeduri speċjali tat-tbgħajja. Gwida dwar siti addizzjonali tista tinsab fi (3) (4). Tbgħajja speċjali xierqa sabiex jurutipi speċifiċi tat-tibdil patoloġiku jistgħu wkoll ikunu ta' għajnuna (18).

Sezzjonijiet rapreżentattivi tas-sistema nervuża ċentrali u periferali għandhom ikunu eżaminati b'mod ġistoloġiku (ara r-referenza 3, il-kapitolu 5 u r-referenza 4, il-kapitolu 50). Iż-żoni eżaminati għandhom normalment jinkludu: Il-parti ta' quddiem tal-moħħ, iċ-ċentru tal-cerebrum, inkluża sezzjoni matul il-hippocampus, il-moħħ fin-nofs, il-cerebellum, il-pons, il-medulla oblongata, l-għajnejn bin-nerv ottiku u r-retina, l-ispina dorsali u t-tinfieħ ċervikali u lumbari, il-ganġilja ta' l-għerq dorsali, il-fibri dorsali u vetrali, in-nerv xjatiku prossimali, in-nerv tibjali prossimati (fl-irkoppa) u n-nerv tibjali fil-friegħi tal-musolu tal-pexxun. L-ispina dorsali u s-sezzjonijiet tan-nervi periferali għandhom jinkludu s-sezzjonijiet laterali jew transversjali u lonġitudinali. Attenzjoni għandha tkun mogħtija għas-sistema vaskulaturali u nervuża. Kampjun tal-muskolu skeletali, partikolarment il-muskolu tal-pexxun, għandu wkoll ikun eżaminat. Attenzjoni speċjali għandha tingħata lis-siti bi struttura ċellullari u fibruża u d-disinn fil-CNS u il-PNS magħrufa li huma partikolarment affettwati bin-newrotossikanti,

Gwida dwar l-alterazzjonijiet newropatologikali li tipikament jirriżultaw minn esposizzjoni tossika jistgħu jinstabu fir-referenzi (3) (4). Eżmai ta' pass b'pass tal-kampjuni tal-biċċiet huwa rakkommandat li fih is-sezzjonijiet minn grupp ta' doża għolja jkunu l-ewwel paragunati ma dawk tal-grupp ta' kontroll. Jekk l-ebda tibdiliet newropatoloġikali ma jkunu osservati fil-kampjuni minn dawn il-gruppi, analiżi sussegwenti ma tkunx meħtieġa. Jekk alterazzjonijiet newropatoloġiċi jkunu osservati fil-grupp ta' doża għolja, il-kampjun minn kull nisġiet potenzalment affettwati, mill-gruppi tad-doża medja jew baxxa, għandhom imbagħad ikunu kodifiklati u sekwenzalment eżaminati.

Jekk xi evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġikali tkun misjuba fl-eżaminazzjoni kwalitattiva, allura it-tieni eżaminazzjoni għandha tkun imwettqa fuq ir-reġjuni kollha tas-sistema nervuża li turi dawn l-alterazzjonijiet. Sezzjonijiet mill-gruppi tad-dożi kollha minn kull reġjun potenzalment affettwat għandhom ikunu kodifikati u eżaminati kif jinzerta mingħajr ma tkun magħrufa l-kodiċi. Il-frekwenza u s-severità ta' kull ferita għandha tkun reġistrata. Wara li r-reġjuni kollha mill-gruppi tad-dożi kollha jkunu ġew iggradati, il-kodiċi tista tkun żvelata ul-analiżi statistika mwettqa sabiex tevalwa r-relazzjonijiet doża-reazzjoni. Eżempji tal-gradi differenti tas-severità ta' kull ferita għandhom ikunu deskritti.

Is-sejbiet newroġatoloġiċi għandhom ikunu evalwati fil-kuntest ta' l-osservazzjoni u l-kejl ta' l-imġieba, kif ukoll xi informazzjoni oħra mill-istudji preċedenti u konkorrenti tat-tossiċità sistematika dwar is-sustanza tat-test.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda, l-informazzjoni kollha għandha tkun miġbura f'sommarju, f'għamla tubulati, li turi għal kull test jew għal kull grupp, in-numru ta' l-annimali fil-bisu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta waqt it-test jew dawk maqtula għal raġunijiet umanitarji, u l-ħin tal-mewt jew tal-qtil umanitarju, in-numru li juru sinjali ta' tassiċità, deskrizzjoni tas-sinjali tat-tossiċità osservati, inkluż il-ħin ta' meta jiskoppjaw, it-tul tal-ħin, it-tip u s-sevirità ta' effetti tossiċi, in-numru ta' l-annimali li jkollhom feriti, inklużi t-tipi u s-severità tal-feriti.

2.2 EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Is-sejbiet ta' l-istudju għandhom ikunu evalwati f'termini ta' l-inċidenza, severità u korrelazzjoni ta' l-effetti newro-imġieba u newropatoloġiċi (l-effetti bewrokimiċi jew elettrofiżjoloġiċi kif ukoll jekk l-eżaminazzjonijiet supplementari huma nklużi) u xi effetti ħżiena oħrajn li jkunu osservati. Meta possibbli, r-riżultati numeriċi għandhom ikunu evalwati bil-metodu xieraq u ġeneralment statistikament aċċettabbli. Il-motodi statistiċi għandhom ikunu magħżula matul id-disinn ta' l-istudju.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika (inklużi l-propjetajiet iżomeriċi, l-purità u fiżikokimiċi);

- dettalji ta' l-identifikazzjoni.

Mezz (jekk applikabbli):

- il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.

Annimali tat-test:

- speċje/tipi użati;

- in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;

- is-sorsi, il-kondizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc;

- il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.

Kondizzjonijiet tat-test:

- dettalji dwar is-sustanza tat-test, fomulazzjoni/preparazzjoni tad-dieta, Il-konċentrazzjoni akkwistata, l-istabbilità u l-omoġenità tal-preparazzjoni;

- speċifikazzjonijiet tad-dożi amministrati, inklużi d-dettalji tal-mezz, il-volum u l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;

- dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;

- ir-raġjonar għal-livell tad-doża magħżula;

- ir-raġġjonar tar-rotta u t-tul ta' żmien ta' l-esposizzjoni;

- skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni (ppm) lejn doża attwali (mg/kg il-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.

Osservazzjoni u proċedura tat-test:

- dettalji ta' l-assenjar ta' l-annimali lejn kull grupp u tat-tixrid tas-sub-gruppi;

- dettalji tas-sistemi tal-marki, inkluża l-kriterja għall-iskali tal-marki dwar kull kejl fl-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati;

- dettalji dwar it-testijiet funzjonali għar-reattività sensitorja lejn l-istimuli ta' modalitajiet differenti (e.g., awditorji, viżwali u proprjoċettivi); għall-assessjar tal-forza tal-qabda tad-driegħ jew tas-sieq; għall-assessjar ta' l-attività motorili (inklużi dettalji ta' apparat awtomatiku sabiex jiżvela l-attività); u l-proċeduri l-oħrajn kif użati;

- dettalji ta' l-eżaminazzjonijiet optalmoloġiċi u, jekk xieraq, l-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi u t-testijiet kliniċi tal-biokemistrija bil-valuri relavanti tal-bidu;

- dettalji għall-proċeduri newroimġieba, newropatoloġija, newrokimika je w elettrofiżjoloġiċi speċifiċi.

Riżultati:

- il-piż tal-ġisem/tibdiliet fil-piż tal-ġisem, inklużi l-piż tal-ġisem mal-qatla;

- il-konsum ta' l-ikel u l-konsum ta' l-ilma, kif xieraq;

- dettalji tar-reazzjoni tossika bis-sess u l-livell tad-doża, inklużi sinjali ta' tossiċità jew mortalità;

- in-natura, is-severità u t-tul ta' żmien (il-waqt ta' meta jiskoppja u l-korsa sussegwenti) ta' l-osservazzjonijiet kliniċi (sew jekk riversibbli u anki jekk le);

- deskrizzjoni dettaljata tar-riżultati kollha tat-test funzjonali;

- is-sejbiet tan-nekropsija;

- deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha, newroimġieba, newropatoloġikali, u newrokimiċi jew elettrofiżjoloġiċi, jekk disponibbli;

- id-dettalji ta' l-assorbazzjoni u l-metaboliżmu, (jekk disponibbli);

- trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq.

Diskussjoni tar-riżultati:

- informazzjoni dwar ir-reazzjoni mad-doża;

- relazzjoni ma xi effetti tossiċi oħrajn lejn konklużjoni dwar il-potenzal newrotossiku tal-kimika tat-test;

- il-livell ta' l-ebda effett ħazin ma jkun osservat.

Konklużjonijiet:

- stqarrija speċifika dwar il-globalità newrotossika tal-kimika tat-test hija nkorraġġita.

4. REFERENZI

(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.

(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.

(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.

(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/ London.

(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.

(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.

(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.

(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.

(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.

(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.

(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.

(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.

(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.

(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.

(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.

(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.

(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742.

(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

Tabella 1

Numru minimu ta' annimali meħtieġa għal kull grupp meta l-istudju newrotossiku ikun imwettaq separatament jew flimkien ma studji oħrajn

| STUDJU NEWROTOSSIKU IMWETTAQ BĦALA: |

Studju separat | Studju flimkien mal-istudju ta' 28 jum | Studju flimkien mal-istudju ta' 90 jum | Studju flimkien mal-istudju dwar it-tossiċità kronika |

Numru ta' annimali magħżula għall-osservazzjonijiet ta' dożi tossiċi repetuti/subkroniċi/koroniċi, il-ħematoloġija, il-biokemistrija klinika, il-ħispatoloġija, etc., kif indikat fil-Linji ta' Gwida rispettivi. | | 5 maskili u 5 femminili | 10 [1] maskili u 10 femminili [1] | 20 [1] maskili u 20 femminili [1] |

Tabella 2.

Frekwenza ta' l-osservazzjonijiet kliniċi u tat-testijiet funzjonali

Tip ta' l-osservazzjoni | It-tul ta' l-istudju |

| | Akut | 28 jum | 90 jum | Kroniku |

Fl-annimali magħżula għall-osservazzjonijiet funzjonali | Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati | Qabel l-ewwel esposizzjoniFi żmien 8 siegħat mid-doża fl-estimi tal-ħin l-aktar effettivFil-jum 7 u 14 ta' wara d-doża | Qabel l-ewwel esposizzjoniDarba fil-ġimgħa minn hem mil-quddiem | Qabel l-ewwel esposizzjoniDarba matul l-ewwel u t-tieni ġimgħa ta' l-esposizzjoniDarba fix-xhar minn hemm il-quddiem | Qabel l-ewwel esposizzjoniDarba fit-tmiem ta' l-ewwel xhar ta' l-esposizzjoniDarba kull tlett xhur, minn hemm il-quddiem |

Testijiet funzjonali | Qabel l-ewwel esposizzjoniFi żmien 8 siegħat mid-doża fl-estimi tal-ħin l-aktar effettivFil-jum 7 u 14 ta' wara d-doża | Qabel l-ewwel esposizzjoniMatul ir-raba' ġimgha tat-trattament, kemm jista jkun qrib possibbli lejn it-tmiem tal-perijodu ta' l-esposizzjoni | Qabel l-ewwel esposizzjoniDarba matul l-ewwel u t-tieni ġimgħa ta' l-esposizzjoniDarba fix-xhar minn hemm il-quddiem | Qabel l-ewwel esposizzjoniDarba fit-tmiem ta' l-ewwel xhar ta' l-esposizzjoniDarba kull tlett xhur, minn hemm il-quddiem |

--------------------------------------------------

ANNESS 2I

C.21. MIKROORGANIŻMI TAL-ĦAMRIJA: TEST TAT-TRASFORMAZZJONI TAN-NITROĠENU

1. METODU

Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni għal OECD TG 216 (2000)

1.1 INTRODUZZJONI

Dan il-Metodu tat-Testijiet jiddiskrivi metodu tal-laboratorju iddisinjat sabiex jinvestiga l-effetti fit-tul ta' kimiċi, wara esposizzjoni waħda, dwar l-attività tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu fil-mikroorganiżmi tal-ħamrija It-test huwa prinċipalment ibbażat fuq ir-rakkommandazzjonijiet ta' l-Organizzazzjoni għall-Protezzjoni tal-Pjanti Ewropej u tal-Mediterran (1). B'dana kollu, Linji ta' Gwida oħrajn, inklużi dawk tal-Biologische Bundesanstalt tal-Ġermanja (2), il-US Environmental Protection Agency (3) il-SETAC (4) u International Organization for Standardization (ISO) (5), kienu wkoll meqjusa. Laqgħa ta' ħidma tal-OECD dwar is-Selezzjoni tal-ħamrija/sediment li kienet inżammet fi Belgirate, l-Italja, fil-1995 (6) qabel dwar in-numru u t-tipi tal-ħamrija għall-użu f'dan it-test. Rakkommandazzjonijiet dwar il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-kampjun tal-ħamrija huma ibbażati fus id-Dokument ta' Gwida ISO (7) u r-rakkommandazzjonijiet mil-Laqgħa ta' Ħidma ta' Beligrate. Fl-assaġġ u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi tas-sustanzi tat-test, determinazzjoni ta' l-effetti fuq l-attività mikrobjali tal-ħamrija tista tkun meħtieġa, e.g., meta l-informazzjoni dwar l-effetti potenzali min-naħa tal-protezzjoni tal-prodotti ta' l-uċuħ fuq il-mikroflora tal-ħamrija huma meħtieġa jew meta l-espożixxjoni ta' mikroorganiżmi tal-ħamrija lejn kimiċi apparti milli l-prodotti tal-protezzjoni tal-ħamrija, jkunu mistennija. It-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa mwettaq sabiex jiddetermina l-effetti ta' tali kimiċi fuq il-mikroflora tal-ħamrija. Jekk l-agrikimiċi (e.g., il-prodotti talk-protezzjoni tal-ħamrija, l-fertilizzanti, u l-kimiċi tal-foresterija) huma ittestjati, kemm it-trasformazzjoni tan-nitroġenu u wkoll it-testijiet tat-trasformazzjoni tal-karbonu, huma mwettqa. Jekk dawk li ma humiex l-agrokimiċi huma ittestjati, it-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa suffiċjenti. B'dana kollu, jekk il-valuri EC50 tat-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu għal tali kimiċi jidħol fi ħdan il-medda miosjuba għal inibituri tan-nitrifikazzjoni kummerċjalment disponibbli (e.g. nitrapyrin), test tat-trasformazzjoni tal-karbondu jista jkun imwettaq sabiex tkun akkwistata aktar informazzjoni.

Il-ħamrija tikkonsisti minn komponenti ħajjin u mhux-ħajjin li jeżistu f'taħlitiet kumplessi u eteroġenji. Il-mikroorganiżmi għandhom parti ta' rwol impoprtanti fit-tfarrik u t-traformazzjoni tal-meterja organika f'ħamrija fertili b'ħafna speċje jikkontribwixxu għal diversi aspetti tal-fertilià tal-ħamrija. Kwalunkwe interferenza fit-tul ma dawn il-proċessi biokimiċi jista jkollha l-potenzal li tinterferixxi maċ-ċiklu tan-nutrient u dan jista jibdel il-fertilità tal-ħamrija. It-trasformazzjoni tal-karbonju u n-nitroġenu isseħħ fil-ħamrija fertili kollha. Għalkemm il-kommunitajiet mikrobjali responsabbli għal dawn il-proċessi jiddifferixxu bejn ħamrija u oħra, il-mezzi tat-trasformazzjoni huma essenzalment l-istess.

Dan il-Metodu ta' Testijiet kif deskritt huwa iddisinjat sabiex jiżvela l-effetti ħżiena ta' terminu fit-tul ta' sustanza dwar il-proċess tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu f'ħamrija erobika tal-wiċċ. Dan il-Metodu tat-test jippermetti wkoll l-estimi ta' l-effetti tas-sustanzi fuq it-trasformazzjoni tal-karbonju mill-mikroflora tal-ħamrija. Il-formazzjoni tan-nitrat isseħħ sussegwentament għad-deġenerazzjoni tar-rabtiet karbonju-nitroġenu. Għalhekk, jekk rati egwali tal-produzzjoni tan-nitroġenu jkunu misjuba f'ħamrija ittrattata u tal-kontroll, dan huma ferm probabbli minħabba li l-passaġġi tad-degradazzjoni maġġura tal-karbonju huma intatti u funzjonali. Is-substrata magħżulha għat-test (tagħsida luċerna fi trab) għandha telattività favorevoli ta' karbonju u nitroġenu (normalment bejn 12/1 u 16/1). Minħabba dan, in-nuqqas ta' karbonju huma aġevolat matul it-test u jekk il-kommunitajiet mikrobjali huma bil = ħsara kinn xi kimika, dawn jistgħu jirkupraw fi żmien 100 jum.

It-testijiet li minnhoma dn il-metodu ta' testijiet kien ġie żviluppat kienu primarjament iddisinjati għal sustanzi li dwarhom l-ammont li jilħaq il-ħamrija setgħa jkun antiċipat. Dan hu l-każ, per eżempju, għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ li dwarhom ir-rata ta' l-applikazzjoni fl-għelieqi hija magħrufa. Għall-agrokimiki, it-testijiet ta' żewġ dożi relevanti għar-rata antiċipata jew imbassra ta' l-applikazzjoni huma suffiċjenti. L-agrokimiċi jistgħu ikunu ittestjati bħala ingredjenti attivi (a.i.) jew prodotti formulati. B'dana kollu, it-test mhux limitat għall-agrokimiċi. Bit-tibdil kemm ta' l-ammonti tas-sustamnza tat-test applikata fil-ħamrija, u il-mod ta' kif l-informazzjoni hija evalwata, it-test jista wkoll ikunu użat għal kimiċi li dwarhom l-ammont mistenni li jilħaq il-ħamrija ma jkunx maghruf. Għalhekk, bil-kimiċi apparti milli l-agrokimiċi, l-effetti ta' serje ta' konċentrazzjonijiet dwar it-trasformazzjoni tan-nitroġenu, huma determinati. L-informazzjoni minn dawn it-testijiet hija użata sabiex tipprepara il-kurva tad-doża-reazzjoni u tikkalkola il-valuri Ecx, meta x hija definita bħala % effett.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Trasformazzjoni tan-nitroġenu: Hija d-deghradazzjoni aħħarija mill-mikroorganiżmi tal-materja organika li jkun fiha n-nitroġenu, via l-proċess ta' l-ammonifikazzjoni u n-nitrifikazzjoni, lejn in-nitrat inorganiku tal-prodott finali rispettivament.

Ecx (Konċentrazzjoni Effettiva): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fxi persentaġġ inibizzjoni tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu lejn nitrat.

EC50 (Konċentrazzjoni Effettiva Medjana): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fi 50 persentaġġ (50 %) inibizzjoni tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu lejn nitrat.

1.3 SUSTANZI TA' REFERENZA

Xejn

1.4 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Ħamrija mgħarbla hija emendata ma tgħasida tal-pjanti li ssir trab u jew ittrattata bis-sustanza tat-test jew imħollija mhux ittrattata (kontroll). Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, minimu ta' żewġ konċentrazzjonijiet tat-test huma rakkommandati u dawn għandhom ikunu magħżula b'reazzjoni ma l-għola konċentrazzjoni antiċipata fl-għalqa. Wara 0, 7, 14 il-jum u 28 jum ta' l-inkubazzjoni, kampjuni ta' ħamrija ittrattata u tal-kontroll huma estratti bis-solvent xieraq, u l-kwantitajiet ta' nitrat fl-estratti huma determinati. Ir-rata tal-formazzjoni tan-nitrat fil-kampjuni ittratti huwa paragunata mar-rata fil-Kontrolli, u d-fevjazzjoni perċentwali ta' dik ittrattata mill-kontrol hija ikkalkolata. It-testijiet kollha jkunu mill-anqas ta' 28 jum. Jekk, fit-28 jum, id-differenzi bejn il-ħamrija ittrattata u dik mhux ittrattata huma egwali jew akbar minn 25 %, il-kejl jitkompla sa massimu ta' 100 jum. Jekk agrokimiċi huma ittestjati, serje ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma miżjuda mal-kampjuni tal-ħamrija, u l-kwantitajiet tan-nitrat iffurmat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma mkejjla wara 28 jum ta' inkubazzjoni. Ir-riżultati mit-testijiet b'konċentrazzjonijiet multipli huma analizzati bl-użu ta' mudell regressiv, u l-valuri Ecx huma ikkalkolati (i.e. EC50, EC25 u/jew EC10). Ara definizzjonijiet.

1.5 IL-VALIDITÁ TAT-TEST

L-evalwazzjonijiet tar-riżultati tat-test ma l-agrokimiċi huma bbażati fuq relattivament differenzi żgħar (i.e. medja ta' valur ± 25 %) bejn il-konċentrazzjonijiet nitriċi fil-ħamrija tal-kontroll u f'dik ittrattata, għalhekk varjazzjonijiet kbar fil-kontrolli jistgħu iwasslu għal riżultati foloz. Għalhekk, il-varjazzjoni bejn kampjunu mġedda tal-kontroll għandha tkun ta' anqas minn ± 15 %.

1.6 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.1. Apparat

Il-kontenituri tat-test użati huma magħmula minn materjal kemikament inert. Dawn għandhom ikunu ta' daqs xieraq b'konformità mal-proċedura wżata għall-inkubazzjoni tal-ħamrija. i.e. l-inkubazzjoni fil-massa jew bħala serje individwai ta' kampjuni tal-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.7.1.2). Attenzjoni qawwija għandha tingħata sabiex ikun min imizzat it-telf ta' l-ilma u li jkun imħolli l-iskambu tal-gass matul it-test (e.g. il-kontenituri tat-test jistgħu ikunu mogħttija b'folja tal-polyethylene mtaqqba). Meta jkunu ittestjati sustanzi volatili, kontenituri li jistgħu ikunu issiġġalati u li ma jgħaddix gass minnhom għandhom ikunu wżati. Dawn għandhom ikunu ta' daqs li madwar kwart tal-volum tagħhom ikun mimli bil-kampjun tal-ħamrija.

Apparat normali tal-laboratorju, inkluż dan li ġej, huwa wżat:

- apparat ta' l-aġitazzjoni:: ċelċieka mekkanika jew apparat ekwivalenti;

- ċentrifuga (3000 g) jew apparat tal-filtrazzjoni (bl-użu tal-karta tal-filtru ħilesa min-nitrat);

- strument ta' sensittivit adekwata u tar-riproduċċibbiltà għall-analiżi tan-nitrat.

1.6.2 L-għażla u n-numu ta' ħamrija

Ħamrija waħda hija wżata. Il-karatteristiċi rakkommandati tal-ħamrija huma kif ġej:

- kontenut tar-ramel: Mhux inqas minn 50 % imma mhux iktar minn 75 %;

- pH: 5,5 - 7,5;

- kontenut tal-karbonju organiku: 0.5 - 1.5 %;

- il-biomassa mikrobjali għandha tkun imkejjla (8)(9) u l-pkontenut tal-karbonju tagħha għandu jkun ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali tal-ħamrija.

F'bosta każi, ħamrija b'dawn il-karatteristiċi tirrapreżenta l-għar każ ta' sitwazzjoni, la darba l-adsorbazzjoni tal-kimika tat-test hija l-minimu u d-disponnabbiltà tagħha lejn il-mikroflora hija l-massimu. B'konsehwenza, it-testijiet b'ħamrija oħra huma, ġeneralemnt, mhux meħtieġa. B'dana kollu, f'ċerti ċirkostanzi, e.g. meta l-użu maġġuri antiċipat tas-sustanza tat-test f'ħamrija partikolari, bħal ma huma l-ħamrija aċiduża tal-foresti, jew għal kimiċi ikkargati elettrostatikament, jista jkun meħtieġ li tintuża ħamrija addizzjonali.

1.6.3 Il-ġbir u l-ħażna tal-kampjunu tal-ħamrija

1.6.3.1 Il-ġbir

L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-għalqa minn fejn il-ħamrija tat-test hija miġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji jinkludu l-lokalità eżatta, il-kisi veġitali, id-dati tat-trattament bil-prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti organiċi u mhux-organiċi, żidiet ta' materjali bioloġiċi jew kontaminazzjonijiet aċċidentali. Is-sit magħżul għall-ġbir tal-ħamrija għandu jkun wieħed li jippermetti użu f'terminu twil. Mergħat permanenti, għelieqi b'uċuħ annwali taċ-ċereali (apparti mill-qamħ-ir-rum) jew dawk moghtija d-demel b'żergħat iffullata, huma tajbin. Il-għażla tas-sit tal-kampjunar m'għandhiex tkun ġiet trattata bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ għam mill-anqas sena qabel il-kampjunar. Ukoll, l-ebda fertilizzant organiku ma jkun ġie applikat għal mill-anqas sitt xhur. L-użu ta' fertilizzant minerali huwa aċċettabbli biss meta, b'konformità mal-ħtiġiet tal-kampjuni ta' l-uċuħ u tal-ħamrija, m'għandhomx ikunu miġbura għal mill-anqas tlett xhur wara l-applikazzjoni tal-fertilizzant. L-użu ta' ħamrija trattata bil-fertilizzanti li għandhom effetti bioċidali magħrufa (e.g. is-sijanamid tal-kalċju) għandu jkun evitat.

Il-kampjuni tal-ħamrija għandhom ikunu trasportati bl-użu ta' kontenituri u skond kondizzjonijiet tat-temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet inizjali tal-ħamrija ma jkunux sinifikament mibdula.

1.6.3.2 Ħażna

L-użu ta' ħamrija miġbura friska mill-għelieqi huwa ippreferut. Jekk ħażna fil-laboratorju ma tistgħax tkun evitata, il-ħamrija tista tkun maħżuna fid-dlam 4 ± 2 °C għal massimu ta' tlett xhur. Matul il-ħażna tal-ħamrija, il-kondizzjonijiet erobiċi għandhom ikunu assigurati. Jekk il-ħamrija tkun miġbura minn żoni ta' fejn din tkun iffriżata għal mill-anqas tlett xhur tas-sena, il-ħażna għal sitt xhur fi - 18 °C sa - 22 °C tista tkun ikkonsidrata. Il-biomassa mikrobjali tal-ħamrija maħżuna hija mkejjla qabel kull esperiment u l-karbonju fil-biomassa għandu jkun mill-anqas 1 % tal-kontenut totali tal-karbonju organiku fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.2).

1.6.4 Tqandil u l-preparazzjoni tal-ħamrija għat-test

1.6.4.1 Pre-inkubazzjoni

Jekk il-ħamrija kienet maħżunha (ara s-sezzjoni 1.6.3.2), pre-inkubazzjoni hija rakkommandata għal perijodu ta' bejn 2 u 28 jum. It-temperatura u l-umidità tal-kontenut tal-ħamrija matul il-pre-inkubazzjoni għandhom ikunu simili għal dik użata fit-test (ara s-sezzjonijiet 1.6.4.2 u 1.7.1.3).

1.6.4.2 Karatteristiċi fiżiko-kimiċi

Il-ħamrija hija manwalment imnaddfa minn oġġeti kbar (e.g. ġebel, partijiet ta' pjanti, etc.) u imbagħad magħrbla fin-nieda mingħajt tnixxif eċċessiv lejn daqs ta' partiċelli ta' anqas minn jew egwali għal 2 mm. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kampjun tal-ħamrija għandu jkun aġġustat b'ilma distillat jew dejonizzat lejn valur ta' bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma.

1.6.4.3 Amendi b'substrata organika

Il-ħamrija għandha tkun emendata b'substrata organika xierqa, e.g. tgħasida mrammla luċerna-ħaxix-ħadranija (il-komponent ewlieni: Medicago sativa) b'relattività C/N ta' bejn 12/1 u 16/1. Ir-relattività rakkommandata tal-ħamrija luċerna hija ta' 5 g luċern kull kilogramma ta' ħamrija (piz xott).

1.6.5 Preparazzjoni tas-sustanza tat-test għall-applikazzjoni mal-ħamrija

Is-sustanza tat-test hija normalment applikata bl-użu ta' trasportatur. It-trasportatur jista jkun ilma (għal sustanzi li jinħallu fl-ilma) jew solidu inert bħal ma huwa ramel fin tal-kwartz (daqs tal-partiċella: 0.1-0.5 mm). Trasportaturi likwidi apparti mill-ilma (e.g. solventi organiċi bħal ma huma l-aċetun, il-kloroforma) għandhom ikunu evitati la darba dawn jistgħu joħolqu ħsara għall-mikroflora. Jekk ir-ramel ikunu użat bħala trasportatur, dan jista jkun m iksi bis-sustanza tat-test imdewba jew sospiża f'solvent xieraq. F'tali każi, is-solvent għandu jkun imneħħi bl-evaporazzjoni qabel it-taħlit mal-ħamrija. Għall-aħjar distribuzzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija, relattività ta' 10 g ramel ma kull kilogramma ta' ħamrija (piż xott) huwa rakkommandabbli. Kampjuni tal-kontroll huma ittrattati b'ammont ekwivalenti ta' ilmaa u/jew ramel kwartz biss.

Meta jkunu ittestjati kemikali volatili, it-telf matul it-trattament għandu jkun evitat sa kemm dan ikun possibbli u tentattiv għandu jsir sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja fil-ħamrija (e.g. is-sustanza tat-test għandha tkun injettata fil-ħamrija minn diversi postijiet).

1.6.6 Konċentrazzjonijiet tat-test

Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, mill-anqas żewġ konċentrazzjonijiet għandhom ikunu wżati. Il-konċentrazzjoni l-baxxa għandha tirrifletti mill-anqas l-ammont massimu mistenni li jilħaq il-ħamrija waqt kondizzjonijiet prattiċi, fil-waqt li l-konċentrazzjoni l-għolja għandha tkun mutiplu tal-konċentrazzjoni l-baxxa. Il-konċentrazzjonijiet ta' sustanza tat-test miżjuda mal-ħamrija huma kkalkolati billi tkun preżunta inkorporazzjoni uniformi sa fond ta' 5 cm u l-massa tal-ħamrija f'densità ta' 1.5. Għall-agrokimiċi li huma applikati direttament mal-ħamrija, jew għal kimiċi li dwarhom il-kwantità li tilħaq il-ħamrija tista tkun prevista, il-konċentrazzjonijiet tat-test irrakkommandati huma l-massimu Predicted Environmental Concentration (PEC) (Konċentrazzjoni Ambjentali Mbassra) u ħames darbiet dik il-konċentrazzjoni. Is-sustanzi li huma mistennija li jkunu applikati diversi drabi mal-ħamrija fi staġun wieħed għandhom ikunu ittestjati fil-konċemntrazzjonijiet derivati mill-multiplikazzjoni tal-PEC bin-numru massimu antiċipat ta' l-applikazzjonijiet. L-għoila konċentrazzjoni ittestjata, b'dana kollu, m'għandhiex teċċedi għaxar darbiet il-massimu tar-rata ta' applikazzjoni waħda. Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, serje ġeometrikuta' mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet għandu jkun użat. Il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom ikopru l-medda meħtieġa tal-valuri ECx.

1.7 L-IMĠIEBA TAT-TEST

1.7.1 Il-kondizzjonijiet ta' l-esposizzjoni

1.7.1.1 It-trattament u l-kontrol

Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża fi tlett porzjonijiet ta' piż egwali. Żewġ porzjonijiet huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih il-prodott, u l-ieħor huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-prodott (kontroll). Minimu ta' tlett repliki kemm għall ħamrija ittrattata u wkol mhux ittrattata huma rakkommandati. Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża f'sitt porzjonijiet ta' piż egwali. Ħmasa mill-kampjunu huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih is-sustanza tat-test, u s-sitt kampjun huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-kimika. Tlett replikati taż-żewħ trattamenti u tal-kontroll huma rakkommandati. Attenzjoni għandha tingħata sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja tas-sustanza tat-test fil-kampjunu tal-ħamrija ittrattata. Matul it-taħlit, l-ikkumpattjar jew gerbubi mgħaqqda għandhom ikunu evitati.

1.7.1.2 L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija

L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija tista titwettaq b'żewġ modi: Bħala kampjuni fil-massa ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata jew f'serje ta' sub-kampjuni individwali u ta' daqs egwali ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata. B'dana kollu, meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali. Meta l-ħamrija tkun inkubata fil-massa, kwantitajiet kbar ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata huma ippreparati u s-sub-kampjuni għall-analiżi huma miġbura kif meħtieġ matul it-test. L-ammont inizjalment ippreparat għal kull trattament u kontroll jiddependi mid-daqs tas-sub-kampjuni, in-numru ta' repliki użati għall-analiżi u n-numru massimu antiċipat tad-drabi tal-kampjunar. Il-ħamrija inkubata fil-massa għamndha tkun imħallta sewwa qabel is-sub-kampjuni. Meta l-ħamrija hija inkubata f'serje individwali ta' ħamrija, kull ħamrija ittrattata jew mhux trattata fil-massa hija diviża fin-numru meħtieġ ta' sub-kampjuni, u dawn huma utilizzati kif meħtieġ. Fl-esperimenti ta' meta tnejn jew aktar ħinijiet tal-kampjunar jistgħu ikunu antiċipati, sub-kampjuni biż-żejjed għandhom ikunu ippreparati sabiex ikun hemm abbastanza għar-replikati kollha u d-drabi tal-kampjunar kollu. Mill-anqas tlett kampjuni tar-replikati tal-ħamrija tat-test għandhom ikunu inkubati permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi (ara s-sezzjoni 1.7.1.1). Matul it-testijiet kollha, kontenituri xierqa, bi spazju fil-wiċċ suffiċjenti, għandhom ikunu użati sabiex ikunu evitati l-kondizzjonijiet anerobiċi. Meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali.

1.7.1.3 Il-kondizzjonijiet u t-tul tat-testijiet

It-test huwa mwettaq fid-dlam f'temepratura tal-kamra ta' 20 ± 2 °C. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kamjuni tal-ħamrija għandu jkun miżmum matul it-test għal bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.4.2) b'medda ta' ± 5 %. Ilma distillat jew deonizzat jista jkun miżjud kif meħtieġ.

It-tul minimu tat-testijiet huwa 28 jum. Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, ir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma mqabbla. Jekk dawn ikunu differenti b'aktar minn 25 % fil-jum 28, it-test jitkompla sakemm differenza egwali għal, jew anqas minn 25 % tkun akkwistata, jew għal massimu ta' 100 jum, liema minnhom ikun l-aqsar. Għal dawk li ma humiex agrokimiċi, it-test ikun terminat wara 28 jum. Fil-jum 28, il-kwantitajiet tan-nitrat fil-kampjuni tal-ħamrija ittrattata jew tal-kontroll huma determinati u l-valuri ECx ikunu ikkalkolati.

1.7.2 Kampġjunaar u analiżi tal-ħamrija

1.7.2.1 Kampjunar skedat tal-ħamrija

Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-kampjuni tal-ħamrija huma analiżżati għan-nitrat fil-jiem 0, 7, 14 u 28. jekk test imtawwal ikun meħtieġ, aktar kejl għandu jseħħ f'intervalli ta' 14 il-jum, wara l-jum 28.

Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test huma wżati u l-kampjuni tal-ħamrija huma analiżżati għan-nitrat fil-bidu (jum 0) u fit-tmiem tal-perijodu ta' l-esposizzjoni (28 jum). Kejl intermedju, e.g. fil-jum 7, jista jkun miżjud jekk dan ikun meqjus bħala meħtieġ. L-informazzjoni akkwistata fil-jum 28 hija użata għad-determinazzjoni tal-valux ECx dwar il-kimika. Jekk mixtieq, l-informazzjoni mill-jum 0 tal-kampjuni tal-kontroll jistgħu ikunu wżati sabiex jirraportaw il-kwanitità inizjali tan-nitrat fil-ħamrija.

1.7.2.2 L-analiżi tal-kampjuni tal-ħamrija

L-ammont ta' nitrat iffurmat f'kull replika trattata jew tal-kontroll huwa determinat f'kull waqt tal-kampjunar. In-nitrat huwa estratt mill-ħamrija biċ-ċekċik tal-kampjun b'solvent xieraq ta' l-estrazzjoni, e.g. taħlita ta' 0.1 M klorid tal-putassa. Relattività ta' 5 ml tat-taħlita KC1 kull gramma piż xott ekwivalenti tal-ħamrija huwa rakkommandat. Sabiex tkun imtejba l-estrazzjoni, il-kontenituri li jkunu bil-ħamrija u t-taħlita ta' l-estrazzjoni m'għandhomx ikunu aktar minn nofshom mimlija. It-taħlitiet huma mċekċka fi 150 rpm għal 60 minuta. It-taħlitiet ikunu ċentrifugati jew filtrati u l-fażijiet likwidi huma analiżżati għan-nitrat. Estratti likwisi ħielsa minn partiċelli jistgħu ikunu maħżuna qabel l-analiżi fi - 20 ± 5 °C sa sitt xhur.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Jekk it-testijiet huma mwettqa b'agrokimiċi, il-kwalità yan-nitrat iffurmat f'kull replika tal-kampjun tal-ħamrija għandha tkun irreġistrata, u l-valuri medji tar-replikati kollha għandhom ikunu ipprovduti f'għamla tabulari. Ir-rati tat-trasformazzjoni tan-nbitroġenu għandhom ikunu evalwati b'metodi xierqa u ġeneralment aċċettabbli (e.g. Test-F, 5 % livell sinifikanti). Il-kwantitajiet ta' nitrat iffurmat huma espressi fi mg nitrat/kg piż xott tal-ħamrija/kull jum. Ir-rata tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull trattament hija mqabbla ma dik tal-kontroll, u l-persentaġġ tad-devjazzjoni mill-kontroll hija ikkaalkolata.

Jekk it-testijiet huma mwettqa b'dawk li ma humiex agrokimiċi, il-kantità ta' nitrat iffurmat f'kull replika huwa determinat, u l-kurva doża-reazzjoni hija ippreparata għall-estimi tal-valuri ECx. Il-kwantitajiet ta' nitrat (i.e. mg nitrat.kg piż xottv tal-ħamrija) misjuba fil-kampjuni ittrattati wara 28 jum huma mqabbla ma dak misjun fil-kontroll. Minn din l-informazzjoni, il-% tal-valuri ta' l-inibizzjoni għal kull konċentrazzjoni tat-test huma ikkalkolati.Dawn il-persentaġġi huma mpinġija kontra l-konċentrazzjoni, u l-proċeduri statistiċi huma mbagħad użati għall-kalkolu tal-valuri ECx. Limiti ta' l-affidabbilità (p = 0.95) għal ECx ikkalkolati huma wkoll determinati bl-użu tal-proċeduri normali (10) (11) (12).

Is-sustanzi tat-test li jkollhom kwantitajiet għoljin ta' nitroġenu jistgħu jikkontribwixxu għall-kwantitajiet taa' nitrat iffurmat matul it-test. Jekk dawn is-sustanzi huma ittestjati f'konċentrazzjoni għolja (e.g. kimika li hija mistennija li tkun użata f'applikazzjonijiet repetuti) kontrolli xierqa għandhom ikunu nklużi fit-test (i.e. il-ħamrija flimkien mas-sustanza tat-test imma mingħajr it-tgħasida tal-pjanti). Dettalji minn dawn il-kontrolli għandhom ikunu nklużi fil-kalkoli tal-ECx.

2.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Meta r-riżultati mit-testijiet bl-agrokimiċi huma evalwati, u d-differenza fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat bejn it-trattament baxx (i.e. il-massimu tal-konċentrazzjoni prevista) u l-kontroll tkun egwali għal, jew anqas minn 25 % fi kwalunkwe kampjun fil-waqt wara l-jum 28, il-prodott jista jkun evalwat bħala li jkollu infuwenza f'terminu fit-tul fuq it-trasformazzjoni tan-nitroġenu fil-ħamrija. Meta r-riżultati mit-testijiet bil-kimiċi apparti milli l-agrokimiċi huma evalwatim il-valuri EC50, EC25 u/jew EC19 huma wżati.

3. RAPPORTAĠĠ

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Identifikazzjoni sġiġa tal-ġamrija użata, inkluż:

- refernza ġeografika tas-sit (latitudini, lonġitudini);

- informazzjoni dwar l-istorja tas-sit (i.e. il-koperta veġittiva, it-trattamenti bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ, trattamenti bil-fertilizzanti, kontaminazzjoni aċċidentali, etc.);

- is-sekwenza ta' l-użu (e.g. ħamrija agrikola, foresta, etc.);

- il-fond tal-kampjunar (cm);

- il-kontenut ramel/ħama'/tafal (% tal-piż);

- pH (fl-ilma);

- kontenut tal-karbonju organiku (% piż xott);

- kontenut tan-nitroġenu organiku (% piż xott);

- il-konċentrazzjoni inizjali tan-nitrat (mg nitrat kg piż xott);

- kappaċità ta' l-iskambju tal-jonju (mmol/kg);

- biomassa mikrobjali f'termini ta' persentaġġ tal-karbonju organiku totali;

- referenza għall-metodi użati għad-determinazzjoni ta' kull parametru;

- l-informazzjoni li tirrigwardja il-ġbir u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija;

- dettalji tal-pri-inkubazzjoni tal-ħamrija, jekk ikun hemm.

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;

- l-informazzjoni ta' l-identifikazzjoni kimika, meta relevanti, inkluża l-formula strutturali, il-purità (i.e. għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ il-persentaġġ ta' l-ingredjent attiv), il-kontenut tan-nitroġenu.

Substrata:

- is-sorsi tas-substrata'

- il-komposizzjoni (i.e. tgħasida luċerna, it-tgħasida luċerna-ħaxix-ħdura);

- kontenut tal-karbonju u tan-nitroġenu (% piż xott);

- id-daqs ta' l-imgħarbel (mm).

Kondizzjonijiet tat-test:

- dettalji ta' l-emenda tal-ħamrija b'substrata organika;

- in-numru tal-konċentrazzjonijiet fil-kimika tat-test użata u, meta xieraq, ġustifikazzjoni tal-konċentrazzjonijiet magħżula;

- dettalji ta' l-applikazzjoni tas-substrata tat-test fil-ħamrija;

- temperature ta' l-inkubazzjoni;

- il-kontenut ta' l-umidità fil-bidu u matul it-test;

- il-metodu użat ta' l-inkubazzjoni tal-ħamrija (i.e. bħala massa jew bħala serje ta' subkampjuni individwali);

- in-numru ta' replikati;

- id-drabi tal-kampjuna;

- il-metodu użat għall-estrazzjoni tan-nitrat mill-ħamrija.

Riżultati:

- proċedura analitika u l-apparat użat fl-analiżi tan-nitrat;

- dettalji tabulate, inklużi il-valuri individwali u medji għall-kejl tan-nitrat;

- il-varjazzjoni bejn ir-replikati fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll;

- spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet imwettqa fil-kalkoli, jekk relevanti;

- il-varjazzjoni perċentwali fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull waqt tal-kampjunar, jekk xieraq, il-limitu ta' l-affidibbilità tal-valur EC50 b'95 fil-mijja affidibbilità, ECx oħrajn (i.e. EC25 jew EC19) b'intervalli ta' l-affidibbilità, u grafika tal-kurva doża-reazzjoni;

- riżultati statitiċi tat-trattament;

- l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jkunu ta' għajnuna fl-interpretazzjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI

(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.

(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).

(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.

(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality - Biological Methods.

(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 janvier 1995.

(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrateinduced respiration method.

(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.

(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.

(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

C.22. MIKROORGANIŻMI TAL-ĦAMRIJA: TEST TAT-TRASFORMAZZJONI TAL-KARBONJU

1. METODU

Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni għal OECD TG 217 (2000)

1.1 INTRODUZZJONI

Dan il-Metodu tat-testijiet jiddeskrivi metodu tal-laboratorju iddisnjat sabiex jinvestiga l-effetti potenzjoni f'terminu fit-tul ta' esposizzjoni singola tal-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ u possibbilment kemikali oħrajn fuq l-attività tat-trasformazzjoni tal-karbomnju f'mikroorgaiżmi tal-ħamrija. It-test huwa prinċipalment ibbażat fuq ir-rakkommandazzjonijiet ta' l-Organizzazzjoni għall-Protezzjoni tal-Pjanti Ewropej u tal-Mediterran (1). B'dana kollu, Linji ta' Gwida oħrajn, inklużi dawk tal-Biologische Bundesanstalt tal-Ġermanja (2), il-US Environmental Protection Agency (3) il-SETAC (4), kienu wkoll meqjusa. Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-Għażla tal-Ħamrija/Sediment li nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (5) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. Rakkommandazzjonijiet għall-ġbir, tqandil u l-ħażna tal-kampjun tal-ħamrija huma ibbażai fuq Dokument ta' Gwida ISO (6) u r-rakkomandazzjonijiet tal-Laqgħa ta' Ħidma ta' Belgirate.

Fl-assaġġ u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi tas-sustanzi tat-test, determinazzjoni ta' l-effetti fuq l-attività mikrobjali tal-ħamrija tista tkun meħtieġa, e.g., meta l-informazzjoni dwar l-effetti potenzjali min-naħa tal-protezzjoni tal-prodotti ta' l-uċuħ fuq il-mikroflora tal-ħamrija huma meħtieġa jew meta l-espożizzjoni ta' mikroorganiżmi tal-ħamrija lejn kimiċi apparti milli l-prodotti tal-protezzjoni tal-ħamrija, jkunu mistennija. It-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa mwettaq sabiex jiddetermina l-effetti ta' tali kimiċi fuq il-mikroflora tal-ħamrija. Jekk l-agrikimiċi (e.g., il-prodotti tal-protezzjoni tal-ħamrija, l-fertilizzanti, u l-kimiċi tal-foresterija) huma ittestjati, kemm it-trasformazzjoni tan-nitroġenu u wkoll it-testijiet tat-trasformazzjoni tal-karbonu, huma mwettqa. Jekk dawk li ma humiex l-agrokimiċi huma ittestjati, it-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa suffiċjenti. B'dana kollu, jekk il-valuri EC50 tat-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu għal tali kimiċi jidħol fi ħdan il-medda misjuba għal inibituri tan-nitrifikazzjoni kummerċjalment disponibbli (e.g. nitrapyrin), test tat-trasformazzjoni tal-karbondu jista jkun imwettaq sabiex tkun akkwistata aktar informazzjoni.

Dan il-Metodu ta' Testijiet kif deskritt huwa iddisinjat sabiex jiżvela l-effetti ħżiena ta' terminu fit-tul ta' sustanza dwar il-proċess tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu f'ħamrija erobika tal-wiċċ. It-test huwa sensittiv għal kambju fid-daqs u l-attività tal-kommunitajiet mikrobjali responsabbli għat-trasformazzjoni tal-karbonju la darba jissuġġetti dawn il-kommunitajiet kemm lejn l-impenn kemikali u wkoll għal nuqqas gravi ta' karbonju. Ħamrija mramma baxxa f'materja organika hija wżata. Din il-ħamrija hija ittrattata bis-sustanza tat-test u inkubata permezz tal-kondizzjonijiet li jippermettu mataboliżmu mikrobjali mħaffef. Permezz ta' dawn il-kondizzjonijiet, sorsi ta' karbonju faċilment disponibbli fil-ħamrija huma malajr eżawriti. Dan jikkaġuna skarzezza tal-karbonju li kemm jiqtol iċ-ċelloli mikrobjali u wkoll jinduċi rqad u/jew sporlazzjoni. Jekk it-test ikun imwettaq għal aktar minn 28 jum, is-somma ta' dawn ir-reazzjonijiet tista tkun imkejjla bi (ħamrija mhux trattata) kontrolli bħala telf progressiv tal-biomassa mikrobjali metabolikament attiva (7). Jekk il-biomassa tal-ħammrija mċaħħda mill-karbonju, skond il-kondizzjonijiet tat-test, hija affettwata bil-preżenza ta' kimika, jista jkun il-każ li din ma terġal lura lejn l-istess livell bħal fil-kontroll. Għalhekk, disturnazi ikkaġunati bis-sustanza tat-test fi kwalunkwe hin matul it-test ta' spiss iddum sat-tmiem tat-test.

It-testijiet li minnhom dan il-metodu ta' testijiet kien ġie żviluppat kienu primarjament iddisinjati għal sustanzi li dwarhom l-ammont li jilħaq il-ħamrija setgħa jkun antiċipat. Dan hu l-każ, per eżempju, għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ li dwarhom ir-rata ta' l-applikazzjoni fl-għelieqi hija magħrufa. Għall-agrokimiki, it-testijiet ta' żewġ dożi relevanti għar-rata antiċipata jew imbassra ta' l-applikazzjoni huma suffiċjenti. L-agrokimiċi jistgħu ikunu ittestjati bħala ingredjenti attivi (a.i.) jew prodotti formulati. B'dana kollu, it-test mhux limitat għall-kimiċi b'konċentrazzjonijiet ambjentali prevedibbli. Bit-tibdil kemm ta' l-ammonti tas-sustamnza tat-test applikata fil-ħamrija, u l-mod ta' kif l-informazzjoni hija evalwata, it-test jista wkoll ikunu wżat għal kimiċi li dwarhom l-ammont mistenni li jilħaq il-ħamrija ma jkunx maghruf. Għalhekk, bil-kimiċi apparti milli l-agrokimiċi, l-effetti ta' serje ta' konċentrazzjonijiet dwar it-trasformazzjoni tal-karbonju, huma determinati. L-informazzjoni minn dawn it-testijiet hija wżata sabiex tipprepara l-kurva tad-doża-reazzjoni u tikkalkola l-valuri Ecx, meta hija definita bħala % effett.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Trasformazzjoni tal-karbonju: Hija d-degradazzjoni minn mikroorganiżmi ta' materja organika li tifforma il-prodott aħħari inorganiku tad-diossidu taal-karbonju.

ECx (Konċentrazzjoni Effettiva): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fi x persentaġġ inibizzjoni tat-trasformazzjoni tal-karbonju lejn diossidu tal-karbonju.

EC50 (Konċentrazzjoni Effettiva Medjana): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fi 50 fil-mijja inibizzjoni tat-trasformazzjoni tal-karbonju lejn diossidu tal-karbonju.

1.3 SUSTANZI TA' REFERENZA

Xejn

1.4 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Il-ħamrija magħrbla hija jew ittrattata bis-sustanza tat-test jew imħollija mhux ittrattata (kontroll). Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, minimu ta' żewġ konċentrazzjonijiet tat-test huma rakkommandati u dawn għandhom ikunu magħżula b'reazzjoni ma l-għola konċentrazzjoni antiċipata fl-għalqa. Wara 0, 7, 14 u 28 jum ta' inkubazzjoni, kampjuni ta' ħamrija ittrattata u tal-kontroll huma mħallta bil-glukożju, u r-rati tar-respirazzjoni indotti mill-glukożju huma mkejjla għal 12 il-siegħa konsekuttivi. Ir-rate tar-respirazzjoni huma espressi bħala diossidu tal-karbonju rilaxxat (mg diossidu tal-karbonju/kd ħamrija xotta/fis-siegħa) jew ossiġenu ikkunsmat (mg ossiġenu/kg ħamrija/siegħa). Ir-rata medja tar-respirazzjoni fil-kampjuni tal-ħamrija ittrattata hima mqabbla ma dik fil-kontroll u d-devjazzjoni perċentwali tal-ħamrija ittrattata minn dik tal-kontroll hija ikkalkolata. It-testijiet kollha jkunu mill-anqas ta' 28 jum. Jekk, fit-28 jum, id-differenzi bejn il-ħamrija ittrattata u dik mhux ittrattata huma egwali jew akbar minn 25 %, il-kejl jitkompla sa massimu ta' 100 jum. Jekk kimiċi oħrajn aapparti milli l-agrokimiċi huma ittestjati, serje ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma miżjuda mal-kampjuni tal-ħamrija, u r-rati tar-respirazzjoni indotti mill-glukożju (i.e. il-medja tal-kwantitajiet tad-diossidu tal-karbonju iffurmat jew l-ossiġenu ikkunsm,at) huma imkejja wara 28 jum. Ir-riżultati mit-testijiet b'konċentrazzjonijiet multipli huma analizzati bl-użu ta' mudell regressiv, u l-valuri Ecx huma kkalkolati (i.e. EC50, EC25 u/jew EC10). Ara definizzjonijiet.

1.5 IL-VALIDITÁ TAT-TEST

L-evalwazzjonijiet tar-riżultati tat-test ma l-agrokimiċi huma bbażati fuq relattivament differenzi żgħar (i.e. medja ta' valur ± 25 %) bejn il-konċentrazzjonijiet nitriċi fil-ħamrija tal-kontroll u f'dik ittrattata, għalhekk varjazzjonijiet kbar fil-kontrolli jistgħu iwasslu għal riżultati foloz. Għalhekk, il-varjazzjoni bejn kampjuni mġedda tal-kontroll għandha tkun ta' anqas minn ± 15 %.

1.6 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.1. Apparat

Il-kontenituri tat-test użati huma magħmula minn materjal kemikament inert. Dawn għandhom ikunu ta' daqs xieraq b'konformità mal-proċedura wżata għall-inkubazzjoni tal-ħamrija. i.e. l-inkubazzjoni fil-massa jew bħala serje individwai ta' kampjuni tal-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.7.1.2). Attenzjoni qawwija għandha tingħata sabiex ikun minimizzat it-telf ta' l-ilma u li jkun imħolli l-iskambu tal-gass matul it-test (e.g. il-kontenituri tat-test jistgħu ikunu mogħttija b'folja tal-polyethylene mtaqqba). Meta jkunu ittestjati sustanzi volatili, kontenituri li jitgħu ikunu issiġġillati u li ma jgħaddix gass minnhom għandhom ikunu wżati. Dawn għandhom ikunu ta' daqs li madwar kwart tal-volum tagħhom ikun mimli bil-kampjun tal-ħamrija.

Għad-determinazzjoni tar-respirazzjoni indotta mill-glukożju, sistemi ta' inkubazzjoni u strumenti għall-kejl tal-produzzjoni tad-diossidu tal-karbonju jew tal-konsum ta' l-ossiġenu huma meħtieġa. Eżempji ta' tali sistemi u strumenti huma misjuba fil-letteratura (8) (9) (10) (11).

1.6.2 L-għażla u n-numu ta' ħamrija

Ħamrija waħda hija wżata. Il-karatteristiċi rakkommandati tal-ħamrija huma kif ġej:

- kontenut tar-ramel: Mhux inqas minn 50 % imma mhux iktar minn 75 %.

- pH: 5.5-7.5;

- kontenut tal-karbonju organiku: 0.5-1.5 %;

- il-biomassa mikrobjali għandha tkun imkejjla (12)(13) u l-pkontenut tal-karbonju tagħha għandu jkun ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali tal-ħamrija.

1.6.3 Il-ġbir u l-ħażna tal-kampjunu tal-ħamrija

1.6.3.1 Il-ġbir

Il-kampjunar għandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, perijodi twal (itwal minn 30 jum) ta' nixfa jew ta' stgħadir bl-ilma. Għal ħamrija maħruta, il-kampjuni għandhom jinġabru minn fond ta' 1 sa 20 cm l-isfel. Għall art tal-mergħa (art fil-ħaxix) jew ħamrija oħra meta l-ħrit ma jseħħx,atul perijodi twal (f'mill-anqas staġun wieħed tat-tkabbir), il-fond massimu tal-kampjunar jista jkun kemm xejn aktar minn 20 cm (e.g. sa 25 cm). Il-kampjuni tal-ħamrija għandhom ikunu ittrasportati bl-użu ta' kontenituri u skond kondizzjonijiet tat-temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet inizjali tal-ħamrija ma jkunus sinifikament mibdula.

1.6.3.2 Ħażna

L-użu ta' ħamrija miġbura friska mill-għelieqi huwa ippreferut. Jekk ħażna fil-laboratorju ma tistgħax tkun evitata, il-ħamrija tista tkun maħżuna fid-dlam 4 ± 2 °C għal massimu ta' tlett xhur. Matul il-ħażna tal-ħamrija, il-kondizzjonijiet erobiċi għandhom ikunu assigurati. Jekk il-ħamrija tkun miġbura minn żoni ta' fejn din tkun iffriżata għal mill-anqas tlett xhur tas-sena, il-ħażna għal sitt xhur fi - 18 °C tista tkun ikkonsidrata. Il-biomassa mikrobjali tal-ħamrija maħżuna hija mkejjla qabel kull esperiment u l-karbonju fil-biomassa għandu jkun mill-anqas 1 % tal-kontenut totali tal-karbonju organiku fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.2).

1.6.4 Tqandil u l-preparazzjoni tal-ħamrija għat-test

1.6.4.1 Pre-inkubazzjoni

Jekk il-ħamrija kienet maħżunha (ara s-sezzjoni 1.6.4.2 u 1.7.1.3), pre-inkubazzjoni hija rakkommandata għal perijodu ta' bejn 2 u 28 jum. It-temperatura u l-umidità tal-kontenut tal-ħamrija matul il-pre-inkubazzjoni għandhom ikunu simili għal dik użata fit-test (ara s-sezzjonijiet 1.6.4.2 u 1.7.1.3).

1.6.4.2 Karatteristiċi fiżiko-kimiċi

Il-ħamrija hija manwalment imnaddfa minn oġġeti kbar (e.g. ġebel, partijiet ta' pjanti, etc.) u imbagħad magħrbla fin-nieda mingħajt tnixxif eċċessiv lejn daqs ta' partiċelli ta' anqas minn jew egwali għal 2 mm. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kampjun tal-ħamrija għandu jkun aġġustat b'ila distillat jew dejonizzat lejn valur ta' bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma.

1.6.5 Preparazzjoni tas-sustanza tat-test għall-applikazzjoni mal-ħamrija

Is-sustanza tat-test hija normalment applikata bl-użu ta' trasportatur. It-trasportatur jista jkun ilma (għal sustanzi li jinħallu fl-ilma) jew solidu inert bħal ma huwa ramel fin tal-kwartz (daqs tal-partiċella: 0.1-0,5 mm). Trasportaturi likwidi apparti mill-ilma (e.g. solventi organiċi bħal ma huma l-aċetun, il-kloroforma) għandhom ikunu evitati la darba dawn jistgħu joħolqu ħsara għall-mikroflora. Jekk ir-ramel ikunu użat bħala trasportatur, dan jista jkun m iksi bis-sustanza tat-test imdewba jew sospiża f'solvent xieraq. F'tali każi, is-solvent għandu jkun imneħħi bl-evaporazzjoni qabel it-taħlit mal-ħamrija. Għall-aħjar distribuzzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija, relattività ta' 10 g ramel ma kull kilogramma ta' ħamrija (piż xott) huwa rakkommandabbli. Kampjuni tal-kontroll huma ittrattati b'ammont ekwivalenti ta' ilmaa u/jew ramel kwartz biss.

1.6.6 Konċentrazzjonijiet tat-test

Jekk il-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ jew kimiċi oħrajn b'konċentrazzjonijiet ambjentali prevedibbli huma ittestjati, mill-anqas żewġ konċentrazzjonijiet għandhom ikunu wżati. Il-konċentrazzjoni l-baxxa għandha tirrifletti mill-anqas l-ammont massimu mistenni li jilħaq il-ħamrija waqt kondizzjonijiet prattiċi, fil-waqt li l-konċentrazzjoni l-għolja għandha tkun mutiplu tal-konċentrazzjoni l-baxxa. Il-konċentrazzjonijiet ta' sustanza tat-test miżjuda mal-ħamrija huma ikkalkolati billi tkun preżunta inkorporazzjoni uniformi sa fond ta' 5 cm u l-massa tal-ħamrija f'densità ta' 1.5. Għall-agrokimiċi li huma applikati direttament mal-ħamrija, jew għal kimiċi li dwarhom il-kwantità li tilħaq il-ħamrija tista tkun prevista, il-konċentrazzjonijiet tat-test irrakkommandati huma l-massimu Predicted Environmental Concentration (PEC) (Konċentrazzjoni Ambjentali Mbassra) u ħames darbiet dik il-konċentrazzjoni. Is-sustanzi li huma mistennija li jkunu applikati diversi drabi mal-ħamrija fi staġun wieħed għandhom ikunu ittestjati fil-konċemntrazzjonijiet derivati mill-multiplikazzjoni tal-PEC bin-numru massimu antiċipat ta' l-applikazzjonijiet. L-għoila konċentrazzjoni ittestjata, b'dana kollu, m'għandhiex teċċedi għaxar darbiet il-massimu tar-rata ta' applikazzjoni waħda.

Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, serje ġeometrikuta' mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet għandu jkun użat. Il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom ikopru l-medda meħtieġa tal-valuri ECx.

1.7 L-IMĠIEBA TAT-TEST

1.7.1 Il-kondizzjonijiet ta' l-esposizzjoni

1.7.1.1 It-trattament u l-kontrol

Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża fi tlett porzjonijiet ta' piż egwali. Żewġ porzjonijiet huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih il-prodott, u l-ieħor huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-prodott (kontroll). Minimu ta' tlett repliki kemm għall ħamrija ittrattata u wkol mhux ittrattata huma rakkommandati. Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża f'sitt porzjonijiet ta' piż egwali. Ħmasa mill-kampjunu huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih is-sustanza tat-test, u s-sitt kampjun huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-kimika. Tlett replikati taż-żewġ trattamenti u tal-kontroll huma rakkommandati. Attenzjoni għandha tingħata sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja tas-sustanza tat-test fil-kampjunu tal-ħamrija ittrattata. Matul it-taħlit, l-ikkumpattjar jew gerbubi mgħaqqda għandhom ikunu evitati.

1.7.1.2 L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija

L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija tista titwettaq b'żewġ modi: Bħala kampjuni fil-massa ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata jew f'serje ta' subkampjuni individwali u ta' daqs egwali ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata. B'dana kollu, meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali. Meta l-ħamrija tkun inkubata fil-massa, kwantitajiet kbar ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata huma ippreparati u s-sub-kampjuni għall-analiżi huma miġbura kif meħtieġ matul it-test. L-ammont inizjalment ippreparat għal kull trattament u kontroll jiddependi mid-daqs tas-sub-kampjuni, in-numru ta' repliki użati għall-analiżi u n-numru massimu antiċipat tal-ħinijiet tal-kampjunar. Il-ħamrija inkubata fil-massa għamndha tkun imħallta sewwa qabel is-sub-kampjuni. Meta l-ħamrija hija inkubata f'serje individwali ta' ħamrija, kull ħamrija ittrattata jew mhux trattata fil-massa hija diviża fin-numru meħtieġ ta' sub-kampjuni, u dawn huma utilizzati kif meħtieġ. Fl-esperimenti meta tnejn jew aktar drabi tal-kampjunar jistgħu ikunu antiċipati, sub-kampjuni biż-żejjed għandhom ikunu ippreparati sabiex iqisu ir-replikati kollha u l-waqtiet kollha tal-kampjunar. Mill-anqas tlett kampjuni tar-replikati tal-ħamrija tat-test għandhom ikunu inkubati permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi (ara s-sezzjoni 1.7.1.1). Matul it-testijiet kollha, kontenituri xierqa, bi spazju fil-wiċċ suffiċjenti, għandhom ikunu użati sabiex ikunu evitati l-kondizzjonijiet anerobiċi. Meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali.

1.7.1.3 Il-kondizzjonijiet u t-tul tat-testijiet

It-tul minimu tat-testijiet huwa 28 jum. Jekk agrokimiċi huma ittestjati, il-kantitajiet tad-diossidu tal-karbonju rilaxxat jew ta' lk-ossiġenu ikkunsmat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma paragunati. Jekk dawn ikunu differenti b'aktar minn 25 % fil-jum 28, it-test jitkompla sakemm differenza egwali għal, jew anqas minn 25 % tkun akkwistata, jew għal massimu ta' 100 jum, liema minnhom ikun l-aqsar. Għal dawk li ma humiex agrokimiċi, it-test ikun terminat wara 28 jum. Fil-jum 28, il-kwantitajiet tan-nitrat fil-kampjuni tal-ħamrija ittrattata jew tal-kontroll huma determinati u l-valuri ECx ikunu ikkalkolati.

1.7.2 Kampġjunaar u analiżi tal-ħamrija

1.7.2.1 Kampjunar skedat tal-ħamrija

1.7.2.2 Kejl tar-rati tar-respirazzjoni indotti mill-glukożju

L-ammont ta' nitrat iffurmat f'kull replika trattata jew tal-kontroll huwa determinat f'kull waqt tal-kampjunar. Il-kampjuni tal-ħamrija huma mħallta ma ammint suffiċjenti ta' glukożju sabiex iħeġġeġ reazzjoni immedjata ta' respirazzjoni massima. L-ammont ta' glukożju meħtieġ sabiex iħeġġeġ ir-reazzjoni respiratorja massima minn ħamrija partikolari jista jkun determinat b'test preliminarju li jutilizza serje ta' konċentrazzjonijiet ta' glukożju (14). B'dana kollu, għal ħamrija mrammla bi 0.5-1.5 % karbonju organiku, 2000 mg sa 2000 mg glukożju kull kg piż tal-ħamrija xotta huwa normalment suffiċjenti. Il-glukożju jistgħa jkun mitħun fi trab mar-ramel kwarz nadif (10 gramel/kd piż tal-ħamrija xotta) u imħallta b'mod omoġeniku mal-ħamrija.

Il-kampjuni tal-ħamrija emendata bil-glukożju hija inkubata f'apparat xieraq għall-kejl tar-rati tar-respirazzjoni, jew kontinwament, kull siegħa, jew kull sagħtejn (ara s-sezzjoni 1.6.1) fi 20 ± 2 °C. Id-diossidu tal-karbonju rilaxxat jew l-ossiġenu ikkunsmat huwa mkejjel għal 12 il-siegħa konsekuttivi u l-kejl għandu jibda malajr kemm jista jkun possibbli, i.w. fi żmien 1 sa 2 siegħat wara s-supplement tal-glukożju. Il-kwantitajiet totali tad-diossidu tal-karbonju rilaxxata jew l-ossiġenu ikkunsmat matul it-12 il-siegħa huma mkejjla u r-rati medja tar-respirazzjoni huma determinati.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Jekk it-testijiet huma mwettqa b'agrokimiċi, il-kwalità tad-diossidu tal-karbonju rilaxxat minn, jew l-ossiġenu ikkunsmat f'kull replika tal-kampjun tal-ħamrija għandha tkun irreġistrata, u l-valuri medji tar-replikati kollha għandhom ikunu ipprovduti f'għamla tabulari. Ir-riżultati għandhom ikunu evalwatu b'metodi statistiċi xierqa u ġeneralment aċċettabbli (e.g. Test-F, 5 % livell sinifikanti). Ir-rati tar-respirazzjoni indotti bil-glukożju huma espressi fi mg diossidu tal-karbonju/kd piż tal-ħamrija xotta/siegħa jew mg ossiġenu/piż tal-ħamrija xotta/siegħa. Il-medja tar-rata tal-formazzjoni tad-diossidu tal-karbonju jew il-medja tar-rata tal-konsum ta' l-ossiġenu f'kull trattament huma mqabbla ma dawk tal-kontroll, u d-devjazzjoni perċentwali mill-kontroll hija ikkalakolata.

Jekk it-testijiet huma mwettqa b'dawk li ma humiex agrokimiċi, il-kantità ta' nitrat iffurmat f'kull replika huwa determinat, u l-kurva doża-reazzjoni hija ippreparata għall-estimi tal-valuri ECx. Ir-rati tar-respirazzjoni indotta bil-glukożju (i.e. mg diossidu tal-karbonju/kg piż tal-ħamrija xotta.siegħa jew mg ossiġenu/piż tal-ħamrija xotta.siegħa) misjuba fil-kampjuni ittrattati wara 28 jum huma mqabblaa ma dawk misjuba fil-kontroll. Minn din l-informazzjoni, il-% tal-valuri ta' l-inibizzjoni għal kull konċentrazzjoni tat-test huma ikkalkolati. Dawn il-persentaġġi huma mpinġija kontra l-konċentrazzjoni, u l-proċeduri statistiċi huma mbagħad użati għall-kalkolu tal-valuri ECx. Limiti ta' l-affidabbilità (p = 0.95) għal ECx ikkalkolati huma wkoll determinati bl-użu tal-proċeduri normali (15) (16) (17).

2.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Meta r-riżultati mit-testijiet bl-agrokimiċi huma evalwati, u d-differenza fir-rati tal-formazzjoni tar-respirazzjoni bejn it-trattament baxx (i.e. il-massimu tal-konċentrazzjoni prevista) u l-kontroll tkun egwali għal, jew anqas minn 25 % fi kwalunkwe kampjun fil-waqt wara l-jum 28, il-prodott jista jkun evalwat bħala li jkollu infuwenza f'terminu fit-tul fuq it-trasformazzjoni tal-karbonju fil-ħamrija. Meta r-riżultati minn testijiet b'kimiċi apparti milli l-agrokimiċi huma evalwati, il-Valuri EC50, EC25 u/jew EC10 huma wżati.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Identifikazzjoni sġiġa tal-ġamrija wżata, inkluż:

- refernza ġeografika tas-sit (latitudini, lonġitudini);

- informazzjoni dwar l-istorja tas-sit (i.e. il-koperta veġittiva, it-trattamenti bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ, trattamenti bil-fertilizzanti, kontaminazzjoni aċċidentali, etc.);

- is-sekwenza ta' l-użu (e.g. ħamrija agrikola, foresta, etc.);

- il-fond tal-kampjunar (cm);

- il-kontenut ramel/ħama'/tafal (% tal-piż);

- pH (fl-ilma);

- kontenut karbonju organiku (% piż xott);

- kontenut tan-nitroġenu organiku (% piż xott);

- kappaċità ta' l-iskambju tal-jonju (mmol/kg);

- biomassa mikrobjali f'termini ta' persentaġġ tal-karbonju organiku totali;

- referenza għall-metodi użati għad-determinazzjoni ta' kull parametru;

- l-informazzjoni li tirrigwardja il-ġbir u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija;

- dettalji tal-pri-inkubazzjoni tal-ħamrija, jekk ikun hemm.

Is-sustanza tat-test:

- in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;

Kondizzjonijiet tat-test:

- dettalji ta' l-emenda tal-ħamrija b'substrata organika;

- in-numru tal-konċentrazzjonijiet fil-kimika tat-test użata u, meta xieraq, ġustifikazzjoni tal-konċentrazzjonijiet magħżula;

- dettalji ta' l-applikazzjoni tas-substrata tat-test fil-ħamrija;

- temperature ta' l-inkubazzjoni;

- il-kontenut ta' l-umidità fil-bidu u matul it-test;

- il-metodu użat ta' l-inkubazzjoni tal-ħamrija (i.e. bħala massa jew bħala serje ta' subkampjuni individwali);

- in-numru ta' replikati;

- id-drabi tal-kampjunar.

Riżultati:

- metodu u apparat użat għall-kejl tar-rati tar-respirazzjoni;

- dettalji tabulate, inklużi l-valuri individwali u medji għall-kwantitajiet tad-diossidu tal-karbonju jew ta' l-ossiġenu;

- il-varjazzjoni bejn ir-replikati fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll;

- spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet imwettqa fil-kalkoli, jekk relevanti;

- il-varjazzjoni perċentwali fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull waqt tal-kampjunar, jekk xieraq, il-limitu ta' l-affidibbilità tal-valur EC50 b'95 fil-mijja affidibbilità, ECx oħrajn (i.e. EC25 jew EC10) b'intervalli ta' l-affidibbilità, u grafika tal-kurva doża-reazzjoni;

- trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq;

- l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jkunu ta' għajnuna fl-interpretazzjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI

(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.

(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).

(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.

(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora". Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.

(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.

(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.

(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(11) Heinemeye,r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.

(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrateinduced respiration method.

(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.

(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.

(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.

(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

C.23. TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIL-ĦAMRIJA

1. METODU

Dan il-Metodu tat-Test huwa replika għal OECD TG 307 (2002)

1.1 INTRODUZZJONI

Dan il-Metodu tat-test huwa ibbażat fuq linji ta' gwida eżistenti (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Dan il-metodu deskritt f'dan il-metodu tat-test huwa iddisinjat għall-evalwazzjoni tat-trasformazzjoni erobika u anerobika tal-kimiċi fil-ħamrija. L-esperimenti huma mwettqa sabiex ikun determinat (i) ir-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test, u (ii) in-natura u r-rata tal-formazzjoni u t-tnaqqis tat-traformazzjoni tal-prodotti li dwarhom il-pjanti u l-organiżmi fil-ħamrija jistgħu ikunu esposti. Tali studji huma meħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati fil-ħamrija jew li huma pjuttost li jilħqu l-ambjent tal-ħamrija. Ir-riżultati ta' tali studji fil-laboratorju jistgħu wkoll ikunu wżati sabiex jiżviluppaw il-protokolli tal-kampjunar u ta' l-analiżi fl-oqsma ta' studju relatati.

L-istudji erobiċi u anerobiċi ma tip wieħed ta' ħamrija huma ġeneralment suffiċjenti għall-evalwazzjoni tal-passaġġi tat-trasformazzjoni (8) (10) (11). Ir-rati tat-trasformazzjoni għandhom ikunu determinati f'mill-anqas tlett ħamrija addizzjonali (8) (10).

Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-Għażla tal-Ħamrija/Sediment li nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (10) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. It-tipi tal-ħamrija ittestjati għandhom ikunu rapreżentattivi tal-kondizzjonijiet ambjentali ta' fejn l-użu jew ir-rilaxx ikun sjjer iseħħ. Per eżempju, il-kimiċili jistgħu ikunu rilaxxati fi klimi subtropikali sa tropikali għandhom ikunu ittestjati bil-Ferrasoli jew in-Nitrasoli (sistema FAO). Il-Laqgħa ta' Ħidma kienet ukoll għamlet rakkommandazzjonijiet li jirrigawrjaw il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija, ibbażari fuq il-Linja ta' Gwida ISO (15). L-użu tal-ħamrija mistgħadra (tar-ross) hija wkoll ikkunsidrata f'dan il-metodu.

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Is-sustanza tat-test: Kwalunkwe sustanza, sew jekk kompost oriġinali jew il-prodotti relevanti tat-trasformazzjoni.

Prodotti tat-trasformazzjoni: Is-sustanzi kollha li jirriżultaw mir-reazzjonijiet tat-trasformazzjoni biotiċi jew abiotiċi tas-sustanza tat-test, inklużi il-CO2 u l-prodotti li huma marbuta mar-residwi.

Residwi marbuta: "Residwi marbuta" tirrapreżemnta komposti fil-ħamrija, pjanti jew annimali, li jippersistu fil-matriċi fil-għamla ta' sustanza oriġinali jew tal-prodotti metaboliti/trasformazzjoni wara l-estrazzjoni. Il-metodu ta' l-estrazzjoni m'għandux sostanzjalment jibdel il-komposti nfushom jew l-istruttura tal-matriċi. In-natura tar-rabta tista tkun kjarifikata parzjalment bil-metodi ta' l-estrazzjoni tat-tibdil-tal-matriċi u b'tekniċi analitiċi sofistikati. Sal-lum, per eżempju, ir-rabtiet kovalenti joniċi u sorptivi, kif ukoll l-ingassar, kienu ġew identifikati b'dan il-mod. Ġeneralment, il-formazzjoni tar-residwi marbuta tnaqqas il-bioaċċessibbiltà u l-biodisponabbiltà sinifikament (12) (Modifikati minn IUPAC 1984 (13)).

Trasformazzjoni erobika: Reazzjonijiet li jseħħu fil-preżenza ta' l-ossiġenu molekulari (14).

Trasformazzjoni anerobika: Reazzjonijiet li jseħħu fl-esklużjoni ta' l-ossiġenu molekulari (14).

Ħamrija: Hija taħlita ta' kostitwenti kimiċi minerali u organiċi, dawn ta' l-aħħar ikun fihom komposti ta' kontenut għoli tal-karbonju u n-nitroġenu u ta' piżijiet molekulari għoljin, animali b'organiżmi żgħat (l-aktar mikro-). Il-ħamrija tista tkun imqandla f'żewġ stati:

(a) mhux disturbata, kif tkun żviluppat matul iż-żmien, f'saffi karatteristiċi tat-tipi tal-varjetà tal-ħamrija;

(b) disturbata, kif normalment tinsab f'għelieqi ħarratija jew kif isseħħ meta l-kampjuni huma miġbura bit-tħaffir u kif użata f'dan il-metodu ta' test (14).

Mineralizzazzjoni: Hija d-degradazzjoni kompleta ta' kompost organiku lejn CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, u CH4, CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet anerobiċi. Fil-kuntest ta' dan il-metodu taa' test, meta kompost bit-tikketta-14C ikun użat, il-mineralizzazzjoni tfisser dehradazzjoni estensiva li matula atomu tal-karbonu tikkettjat ikun ossidizzat bil-rilaxx ta' l-ammont xieraq ta' 14CO2 (14).

Nofs-ħajja: t0.5, huwa l-ħin meħtieġ għal 50 % trasformazzjoni tas-sustanza tat-test meta t-trasformazzjoni tista tkun deskritta bil-kinetiċi ta' l-ewwel ordni; din hija independenti mill-konċentrazzjoni.

DT50 (Għibien Ħin 50): Huwa l-ħin li fih il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 50 %; din hija differenti min-nofs-ħajja t0.5 meta t-trasformazzjoni ma tkunx issegwi il-kinetiċi ta' l-ewwel ordni.

DT75 (Għibien Ħin 75): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 75 %.

DT90 (Għibien Ħin 90): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 90 %.

1.3 SUSTANZI TA' REFERENZA

Is-sustanzi ta' referenza għandhom ikunu wżati għall-karetterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti bil-metodi spektroskopiċi u kromatografiċi.

1.4 L-APPLIKABBILTÁ TAT-TEST

Il-metodu huwa applikabbli għas-sustanzi kimiċi kollha (mhux ittikkettjati jew radjotikkettjati) li dwarhom metodu analitiku b'eżattezza u sensittività suffiċjenti huma disponibbli. Dan huwa applikabbli għal komposti kemm xejn volatili, mhux volatili, li jinħallu fl-ilma jew li ma jinħallux fl-ilma. It-test m'għandux ikun applikat lejn kimiċi li huma ferm volatili minn ġewwa l-ħamrija (e.g., fumiganti, solventi organiċi) u għalhekk ma jistgħux jinżammu fil-ħamrija skond il-kondizzjonijiet sperimentali ta' dan it-test.

1.5 INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST

Sustanza tat-test mhux-ittikkettjata jew ittikkettjata tista tkun użata sabiex tkejjel ir-rata tat-trasformazzjoni. Il-materjal tikkettjat huwa meħtieġ għall-istudju tal-passaġġ tat-trasformazzjoni u sabiex ikun stabbilit il-bilanċ tal-massa. Tikkettjar-14C huwa raakkommandat imma l-użu ta' iżotopi oħrajn bħal ma huma 13C, 15N, 3H, 32P, jistgħu wkoll ikunu utili. Sa kemm huwa possibbli, it-tikketta għandha tkun imqiegħda fil-parti(jiet) l-aktar stabbli tal-molekolu [1]. Il-Purità tas-sustanza tat-test għandha tkun mill-anqas 95 %.

Qabel ma jitwettaq test dwar it-trasformazzjoni eronika u amerobika fil-ħamrija, l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza tat-test għandha tkun disponibbli.

(a) solubilità fl-ilma (il-Metodu A.6);

(b) solubilità f'solventi organiċi;

(d) il-koeffiċjent tal-qsim n–oktano/ilma (il-Metodu A.8);

(e) stabbilità kimika fid-dlam (idroliżi) (il-Metodu C.7);

(f) pKa jekk il-molekolu jkun probabbli għal protonazzjoni jew deportonazzjoni (OECD Linja ta' Gwida 112) (16).

Informazzjhoni utili oħra tista tinkludi dettalji dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test fuq il-mikro-organiżmi tal-ħamrija (il-Metodi tat-Testijiet C.21 u C.22) (16).

Il-metodi analitiċi (inklużi l-metodi ta' l-estrazzjoni u tat-tindif) għall-kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tat-traformazzjoni tal-prodotti tagħha, għandhom ikunu disponibbli.

1.6 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Il-kampjuni tal-ħamrija huma ittrattati bis-sustanza tat-test u inkubati fid-dlam f'garafini tat-tip biometriċi jew f'sistemi ta' nixxija kontinwa skond il-kondizzjonijiet kontrollati tal-laboratorju (f'temepratura u l-umidità tal-ħamrija kostanti). Wara intervalli ta' ħin xieraq, il-kampjuni tal-ħamrija huma estratti u analizzati mis-sustanza oriġinali u għall-prodotti tat-trasformazzjoni. Prodotti volatili huma wkoll, miġbura għall-analiżi bl-użu ta' apparati xierqa ta' l-assorbazzjoni. Bl-użu tal-materjal tikkettjat-14C, ir-rati varji tal-mineralizzazzjoni tas-sustanza tat-test jistgħu ikunu mkejjla bin-nassa evoluta 14CO2 u l-bilanċ tal-massa, inkluża l-formazzjoni ta' residwi marbuta mal-ħamrija, jisgħu ikunu stabbiliti.

1.7 KRITERJA TAL-KWALITÁ

1.7.1 Irkupru

L-estrazzjoni u l-analiżi ta', mill-anqas, nofs il-kampjunu duplikati tal-ħamrija, wara ż-żieda tas-sustanza tat-test, tagħti l-ewwel indikazzjoni tar-repetabbiltà tal-metodu nalitiku u ta' l-uniformità tal-proċedura ta' l-applikazzjoni għas-sustanza tat-test. L-irkupri fi stadji aktar tard ta' l-esperimenti huma mogħtija bil-bilanċi rispettivi tal-massa. L-irkupri għandhom ikunu fil-medda ta' minn 90 % sa 110 % tal-kimiċi ittikkettjati (8) u minn 70 % sa 110 % għal kimiċi mhux ittikkettjati (3).

1.7.2. Ir-repettabbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku

Ir-repetabbilità tal-metodu analitiku (eskluża l-peffiċjenza ta' l-estrazzjoni inizjali) sabiex tkun kwantifikata s-sustanza tat-test u tat-trasformazzjoni tal-prodotti tista tkun verifikata b'analiżi dupplikata ta' l-istess estratt tal-ħamrija, inkubat għal tul ta' żmien biżżejjed għall-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.

Il-limitu ta' sejbien (limit of detection (LOD)) tal-metodu analitiku għas-sustanza tat-test u għat-trasformazzjoni tal-prodotti għandu jkun mill-anqas 0.01 mg.kg-1 ħamrija (bħala sustanza tat-test) jew 1& tad-doża applikata, liema minnhom hija l-anqas. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni (limit of quantification (LOQ)) għandu wkoll ikun speċifikat.

1.7.3 L-eżatezza tad-dettalji tat-trasformazzjoni

Analaiżi regressiva tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test bħala funzjoni tal-ħin, tagħti informazzjoni xierqa dwar l-affiddabbilità tal-kurva tat-trasformazzjoni u tippermetti il-kolkolu tal-limiti affidabbli ta' nofs-ħajjiet (fil-każ ta' psewdo kinetiċi ta' l-ewwel ordni) jew il-valuri DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90.

1.8 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.8.1. Apparat u reaġenti kimiċi

Is-sistemi ta' l-inkubazzjoni jikkonsistu minn sistemi statiċi magħluqa jew sistemi xierqa ta' nixxija kontinwa (7)(17). Eżempji ta' l-apparat xieraq ta' nixxija kontinwa fil-ħamrija u l-garafina tat-tip-biometriku huma murija fil-Fihuri 1 u 2, rispettivament. Iż-żewġ tipi tas-sistemi ta' l-inkubazzjoni għandhom vantaġġi u limitazzjonijiet (7)(17).

Apparat normali tal-laboratorju huwa meħtieġ, u speċjalment dan li ġej:

- Strumenti analitiċi bħal ma huma l-apparat GLC, HPLC, TLC, inklużi s-sistemi xierqa ta' sejbien għall-analiżi ta' sustanzi radjo-tikketta jew mhux-tikketta jew metodu tat-trattib ta' l-iżotopi inversi;

- Strumenti għall-iskopijiet ta' l-identifikazzjoni (e.g. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR, etc.);

- Strument ta' l-għadd tal-likwidu xintillanti;

- Ossidizzatur għall-kombustjoni tal-materjal radjo-attiv;

- Ċentrifuga;

- Apparat ta' l-estrazzjoni (per eżempju, tubi taċ-ċentrifuga għal estrazzjoni fil-kiesaħ u apparat Soxhlet għal estrazzjoni kontinwa taħt ir-refluss);

- Strumentazzjoni għall-konċentrazzjoni tat-taħlitiet u l-estratti (e.g. evaporator rotanti);

- Banju ta' l-ilma;

- Apparat mekkaniku tat-taħlit (e.g. maagna li tagħġen, ħallati rotanti).

Ir-reaġenti kimiċi użati jinklusu, per eżempju:

- NaOH, grad analitiku, 2 mol . dm-3, jew bażi oġra xierqa (e.g. KOH, ethanolamine);

- H2SO4, grad analitiku, 0.05 mol . dm-3;

- Ethylene glycol, grad analitiku;

- Materjali solidi ta' l-assorbazzjoni bħal ma huma l-ġir tas-soder u l-buqi tal-polyurethane;

- Solventi organiċi, grad analitiku, bħal ma hu l-aċetun, il-metanol, etc.;

- Likwidu tax-xintillazzjoni.

1.8.2 L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test

Għal żieda ma, u d-distribuzzjoni fil-ħamrija, is-sustanza tat-test tista tkun imdewwba fl-ilma (deonizzat jew distillat) jew, meta meħtieġ, f'ammonti minimi ta' aċetun jew solventi organiċi oħrajn (6) li fihom is-sustanza tat-test tkun tinħall u stabbli b'mod suffiċjenti. B'dana kollu, l-ammont ta' solvent magħżul m'għandux ikollu influwenza sinifikanti fuq l-attività mikrobjali tal-ħamrija (ara s-sezzjonijiet 1.5 u 1.9.2-1.9.3) L-użu ta' solventi li jfixklu l-attività mikrobjali, bħal ma huma l-kloroform, id-diklorometanju u solventi ħaloġenizzati oħrajn, għandu jkun evitat.

Is-sustanza tat-test tista wkoll tkun miżjuda bħala solidu, e.g. mħallta mar-ramel kwatrz (6) jek f'test żgħir ta' sub-kampjun tal-ħamrija li tkun ġiet imnixxfa fl-arja u sterilizzata. Jekk is-sustanza tat-test hija miżjuda bl-użu ta' solvent, is-solvent għandu jkun imġolli li jevapora qabel ma s-sub-kampjun hekk miżjud ikun imħallat mal-kampjun oriġinali mhux-sterili tal-ħamrija.

Għal kimiċi ġenerali, li r-rotta maġġura tad-dħul tagħhom fil-ħamrija hija matul l-applikazzjoni tal-ħama' tad-drenaġġ/mill-ħmieġ ta' l-annimali, is-sustanza tat-test għandha l-ewwel tkun miżjuda mal-ħama' li imbagħad tkun miżjuda mal-kampjun tal-ħamrija. (ara s-sezzjonijiet 1.9.2 u 1.9.3)

L-użu ta' prodotti formulati mhux, bħala rutina, rakkommandat. B'dana kollu, e.g. għal sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu, l-użu ta' materjal; formulat jista jkun alternattiva xierqa.

1.8.3 Il-ħamrija

1.8.3.1 L-għażla tal-ħamrija

Għad-determinazzjoni tal-passaġġ tat-trasformazzjoni, ħamrija rapreżentattiva tista tkun użata' ħamrija grassa mrammla jew ħamrija grassa bil-ħama' jew ħamrija grassa jew ramel grass (skond il-klassifikazzjoni FAO u USDA 18) bi pH ta' 5.5-8.0, kontenut karboniku organiku ta' 0.5-2.5 % u biomassa mikrobjali ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali hija rakkommandata (10).

Għall-istudji tar-rata tat-trasformazzjoni mill-anqas tlett żidiet tal-ħamrija għandhom ikunu wżati li jirrapreżentaw medda ta' ħamrija relevanti. Il-ħamrija għandha tvarja fil-kontenut karboniku organiku, pH, kontenut tat-tafal u l-biomassa mikrobjali (10).

Il-ħamrija kollha għandha tkun karatterizzata, mill-anqas, għal tiswir (% ramel, % ħama', % tafal) (skond il-klassifikazzjoni FAO u ESDA (18)), pH, kapaċità ta' skambju tal-jonji, karbonju organiku, densità tal-massa, karatteristiċi taż-żamma ta' l-ilma [2] u l-biomassa mikrobjali (biss għal studju erobiċi). Informazzjoni addizzjonali dwar il-propjetajiet tal-ħamrija jistgħu ikunu utili fl-interpretazzjoni tar-riżultati. Għad-determinazzjoni tal-karatteristiċi tal-ħamrija, il-metodi rakkommandati fir-referenzi (19) (20) (21) (22) (23) jistgħu ikunu wżati. Il-biomassa mikrobjali għandha tkun determinata bl-użu tar-respirazzjoni indotta-fis-sub-strata (substrate-induced respiration (SIR)) il-metodu (25) (26) jew metodi alternattivi (20).

1.8.3.2 Ġbir, tqandil, u l-ħażna tal-ħamrija

Il-ħamrija għandha tkun miġbura friska mill-għalqa (mill-orizzont A jew mis-saff tal-wiċċ f'20 cm) b'kontenut ta' l-ilma fil-ħamrija li jiffaċilita l-għarbiel. Għal ħamrija oħra apparti milli dik mistgħadra, il-kampjunar għandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, perijodi twal (> 30 jum) ta' nixfa, ġlata jew mifqugħa bl-ilma (14). Il-kampjuni għandhom ikunu trasportati b'manjera li tnaqqas it-tibdiliet fil-kontenut ta' l-ilma fil-ħamrija u għandhom jinżammi fid-dlam b'aċċess liberu ta' arja, kemm jista jkun possibbli. Borża tal-plastik, kemm xejn marbuta, hija ġeneralment adekwata għal dan l-iskop.

Il-ħamrija għandha tkun proċessata malajr kemm jista jkun possibbli wara l-kampjunar. Veġitazzjoni, fawna kbira tal-ħamrija u ġebel għandhom ikunu mneħħija qabel ma l-ħamrija tkun mogħddija minn għarbiel ta' 2 mm li jneħħli ġebel żgħar, fawna u l-frak tal-pjanti. Tnixxif estensiv u t-tisħiq tal-ħamrija, qabel l-għarbiel, għandhom ikunu evitati (15).

Meta il-kampjunar fil-għalqa jkun diffiċli fix-xitwa (il-ħamrija iffriżta jew koperta f'saffi ta' borra), din għandha tinġabar mil-ħamrija tal-lott maħżuna f'serra b'koperta ta' pjanti (e.g. ħaxix jew taħlita ta' ħaxix u silla) L-istudji bil-ħamrija miġbura friska mill-għalqa huma ferm prefereuti, imma jekk il-ħamrija miġbura u ipproċessata ikunu tiġi maħżuna qabel il-bidu ta' l-istudju, il-kondizzjonijiet tal-ħażna għandhom ikunu adekwati u biss għal-limitu ta' żmien (4 ± 2 °C għal massimu ta' tlett xhur) sabiex jinżamm l-attività mikrobjali [3]. Struzzjonijiet dettaljati dwar il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-ħamrija, li għandha tkun użata fl-esperimenti tal-biotrasformazzjoni, jistgħu jinstabu fi (8) (10) (15) (26) (27).

Qamel ma l-ħamrija ipproċċessata tkun użata f'dan it-test, din għandha tkun l-ewwel inkubata sabiex tippermetti l-ġerminazzjoni u t-tneħħija taż-żrieragħ, u sabiex ikun stabbilit mill-ġdid l-ekwilibriju tal-metaboliżmu mikrobjali bħala segwiment tal-kambju mill-kampjunar jew mill-kondizzjonijiet tal-ħażna lejn il-kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni. Perijodu ta' qabel l-inkubazzjoni ta' bejn 2 u 28 jum, li jqarreb it-temperatura u l-kondizzjonijiet ta' l-umidità tat-test attwali huma ġeneralment adekwati (15).Iż-żmien tal-ħażna u ta' qabel l-inkubazzjoni, flimkien, m'għandhomx jeċċedu t-tlett xhur.

1.9 L-IMĠIEBA TAT-TEST

1.9.1 Kondizzjonijiet tat-test

1.9.1.1 Temperatura tat-test

Matul il-perijodu kollu tat-test, il-ħamrija għandha tkun inkubata fid-dlam f'temperatura kostanti li tirrapreżenta l-kondizzjonijiet klimatiċi ta' fejn l-użu jew ir-rilaxx ikun sejjer iseħħ. Temperatura ta' 20 ± 2 °C hija rakkommandata għas-sustanzi kollha tat-test li jistgħu jilħqu t-temperatura klimatika tal-ħamrija. It-temperatura għandha tkun sorveljata.

Dwar il-kimiċi applikati jew rilaxxati fi klimi kesħin (e.g. pajjiżi tat-tramunta, matul il-perijodi tal-ħarifa/xitwa), kampjuni addizzjonali tal-ħamrija għandhom ikunu inkubati imma f'temperatura aktar baxxa (e.g. 10 ± 2 °C).

1.9.1.2 Il-kontenut ta' l-umidità

Għat-testijiet tat-trasformazzjoni permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, il-kontenut ta' l-umidità tal-ħamrija [4] għandu jkun aġġustat lejn u miżmum fi pF bejn 2.0 u 2.5 (3). Il-kontenut ta' l-umidità fil-ħamrija huwa espress bħala massa ta' l-ilma għal kull massa ta' ħamrija xotta u għandu jkun ikkontrollat regolarment (e.g. f'intevalli ta' ġimgħatejn) bl-użin fil-garafini ta' l-inkubazzjoni u t-talf ta' l-ilma kumpensdat biż-żieda ta' l-ilma (preferibbilment ilma tal-vit sterilizzat mill-filtru). Attenzjoni għandha tingħata sabiex ikunu prevenuti jew minimizzati t-telf tas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni bil-volatilizzazzjoni u/jew il-fotodegradazzjoni (jekk ikun hemm) matul iż-żieda ta' l-umidità.

Għat-testijiet tat-trasformazzjoni fil-kondizzjonijiet anerobiċi u mistgħadra, il-ħamrija tkun saturata bl-ilma mfawwar.

1.9.1.3 Kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni erobika

Fis-sistimi tan-nixxija kontinwa, il-kondizzjonijiet erobiċi ikunu miżmuma bit-tlaħliħ intermittenti jew bil-ventilazzjoni kontinwa b'arja umidifikata. Fil-garafini biometriċi, skambju ta' l-arja jkun miżmum b'diffużjoni.

1.9.1.4 Kondizzjonijiet erobiċi sterili

Sabiex tkun akkwistat l-informazzjoni dwar ir-releavanza tat-trasformazzjon abjotika tas-sustanza tat-test, kampjunu tal-ħamrija jistgħu ikunu sterilizzati (għall-metodi ta' l-isterilizzazzjoni ara r-referenzi 16 u 29), ittrattati bis-sustanza sterili tat-test (e.g. żieda ta' taħlita matul filtru sterili) u mogħtija l-arja bl-użu ta' arja sterili umidifikata kif deskritt fis-sezzjoni 1.9.1.3, Għal ħamrija mistgħadra, ħamrija u ilma għandhom ikunu sterilizzati u l-inkubazzjoni għandha tkun imwettqa kif deskritt fis-sezzjoni 1.9.1.6.

1.9.1.5 Kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni anerobika

Sabiex ikunu stabbiliti l-kondizzjonijiet amerobiċi, il-ħamrija ittrattata mis-sustanza tat-test u unkubata fil-kondizzjonijiet erobiċi għal 30 jum jew għal "nofs-ħajja" waħda jew DT50 (liema minnhom ikun l-iqsar) hija mbagħad mistgħadra fl-ilma (saff ta' 1-3 ilma) u s-sistema ta' l-inkubazzjoni mlaħilħa b'gass inert (e.g. nitroġenu jew argonu) [5]. Is-sistema tat-test għandha tippermetti l-kejl bħal ma huma pH, konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu u l-potenzal redox u tinkludi l-apparati tan-nassa għal prodotti volatili. Sistema tat-tip biometrika għandha tkun magħluqha sabiex tevita id-dħul ta' l-arja bid-diffużjoni.

1.9.1.6 Kondizzjonijiet ta' l-ikubazzjoni fil-mistgħadar

Sabiex tkun studjata t-trasformazzjoni tal-ħamrija fl-għelieqi mistgħadra tar-ross, il-ħamrija tkun mifquha fl-ilma b'saff ta' madwar 1-5 cm u s-sustanza tat-test tkun applikata mal-fażi ta' l-ilma (9). Ħamrija b'fond ta' mill-anqas 5 cm hija rakkomandabbli. Is-sistema hija ventilata bl-arja permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, il-pH, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu u l-potenzal tar-redox fis-saff akweju għandhom ikunu sorveljati u irraportati. Perijodu ta' pre-inkubazzjoni ta' mil anqas ġimghatejn huwa meħtieġ qabel ma jibdew l-istudji tat-trasformazzjoni (ara s-sezzjoni 1.8.3.2).

1.9.1.7 It-tul tat-test

Ir-rata u l-passaġġ ta' l-istudji għandhom normalment ma jeċċedux 120 jum [6] (3) (6) (8), minħabba li wara dan, tnaqqis fl-attività mikrobjali tal-ħamrija mal-mogħdija taż-żmien tkun mistennija f'sistema artifiċjali tal-laboratorju li tkun iżolata mit-tiġdid naturali. Meta meħtieġ għall-karatterizzazzjoni tat-tnaqqis fis-sustanza tat-test u fil-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni maġġuri, l-istudji jistgħu ikomplu għal perijodi itwal (e.g. 6 jew 12 il-xahar) (8). Perijodi itwal ta' inkubazzjoni għandhom ikunu ġustifikati fir-rapport tat-test u akkumpanjati bil-kejl tal-biomassa matul u fit-tmiem ta' dawn il-perijodi.

1.9.2 It-twettieq tat-test

Madwar 50 sa 200 g ħamrija (piż xott bażiku) ikun imqiegħed f'kull garafina ta' l-inkubazzjoni (ara l-Figuri 1 u 2 fl-AŻnness 3) u l-ħamrija ittrattata bis-sustanza tat-test b'wieħed mill-metodi deskritti fis-sezzjoni 1.8.2. Meta s-solventi organiċi huma wżati għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test, dawn għandhom ikunu mneħħija mill-ħamrija bl-evaporazzjoni. Il-ħamrija tkun kompletament imħallta bi spatula u/jew biċ-ċekċik tal-garafina. Jekk l-istudju jkun imwettaq fil-kondizzjonijiet ta' għalqa mistgħadra, il-ħamrija u l-ilma għandhom ikunu mħallta sewwa wara l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Siltiet żgħar (e.g. 1 g) tal-ħamrija ittrattata għandhom ikunu analizzati għas-sustanza tat-test sabiex tkun verifikata distribuzzjoni uniformi. Għal metodu alternattiv, ara hawn taħt.

It-trattament għandu jkun jikorrespondi għall-għola rata ta' l-applikazzjoni tal-prodott għall-protezzjoni ta' l-uċuħ kif rakkommandat fl-istruzzjonijiet ta' l-użu u l-inkorporazzjoni uniformi sa fond xieraq fil-għalqa (e.g. is-saff ta' fuq,10 cm [7] tal-ħamrija). Per eżempju, għall-kimiċi tat-tħaddir jew tal-ħamrija applikati mingħajr inkorporazzjoni, il-fond xieraq għall-kalkolazzjoni ta' kemm kimika għandha tkun miżjuda ma kull garafina huwa 2.5 cm. Għal ħamrija inkorporata bil-kimiċi, il-fond xieraq huwa l-fond ta' l-inkorporazzjoni speċifikat fl-istruzzjonijiet ta' l-użu. Għal kimiċi ġenerali, ir-rata ta' l-applikazzjoni għandha tkun ikkalkolata fuq il-bażi tar-rotta l-aktar relevanti tad-dħul; per eżempju, meta r-rotta ewlenija tal-dħul fil-ħamrija hija mil-ħama' tad-drenaġġ, il-kimika għandha tkun dożata fil-ħama' f'konċentrazzjoni li tirrefletti l-konċentrazzjoni mistennija tal-ħama' u l-ammont ta' ħama' miżjud mal-ħamrija għandu jirrefletti t-tgħabija normali tal-ħama' mal-ħamrija agrikola. Jekk din il-konċentreazzjoni ma tkunx għola biżżejjed sabiex tidentifika l-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni, inkubazzjoni separata tal-kampjunu tal-ħamrija li jkun fiha rati għoljinm jista jkun ta' għajnuna, imma rati eċċessivi li jinfluwenzaw il-funzjonijiet mikrobjali għandhom ikunu evitati (ara s-sezzjonijiet 1.5 u 1.8.2).

B'mod alternattiv, lott kbit (i.e. 1 sa 2 kg) ta' ġamrija jista jkun ittrattat bis-sustanza tat-test, imħalta bil-galbu f'magna xierqa tat-taħlit u imbagħad trasferita f'porzjonijiet żgħat ta' 50 sa 200 g fil-garafini ta' l-inkubazzjoni (per eżempju bl-użu tal-qsim tal-kampjun). Siltiet żgħar (e.g. 1 g) tal-ħamrija ittrattata għandhom ikunu analizzati għas-sustanza tat-test sabiex tkun verifikata distribuzzjoni uniformi. Tali proċedura hija preferibbli la darba tippermetti għal aktar distribuzzjoni uniformi tas-sustanza tat-test fil-ħamrija.

Ukoll, kampjuni mhux trattati huma inkubati permezz ta' l-istess kondizzjonijiet (erobiċi) bħall-kampjuni trattati bis-sustanza tat-test. Dawn il-kampjuni huma wżati għall-kejl tal-biomassa matul u fit-tmiem ta' l-istudji.

Meta s-sustanza tat-test hija applikata mal-ħamrija mdewwba fl-solvent(i) organiċi, kampjuni tal-ħamrija ittrattat bl-istess ammont ta' solvent(i) huma inkubati bl-istess kondizzjonijiet (erobiċi) bħall-kampjuni ittrattati bis-sustanza tat-test. Dawn il-kampjuni huma wżati għall-kejl tal-biomassa, inizjalment, matul u fit-tmiem ta' l-istudji sabiex jivverifikaw l-effetti tas-solvent(i) fuq il-biomassa mikrobjali.

Il-garafini li jkun fihom ħamrija ittratta huma jew imwaħħla mas-sistema tan-nixxija kontinwa deskritta fil-Figura 1 jew magħluqa mal-kolobba ta' l-assorbozzjoni murija fil-Figura 2 (ara l-Anness 3).

1.9.3 Kampjunar u kejl

Garafini doppji ta' l-inkubazzjoni huma mneħħija fl-intervalli xierqa tal-ħin u l-kampjuni tal-ħamrija estratti bis-solventi xierqa ta' polarità differenti u analizzati għas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni. Studju iddisinjat sewwa jinkludi garafini suffiċjenti hekk li żewġ garafini jkunu sagrifikati f'kull darba tal-kampjunar. Ukoll, it-taħlitiet ta' l-assorbazzjoni jew il-materjali solidi ta' l-assorbazzjoni ikunu mneħħija f'intervalli varji tal-ħin (intervalli ta' sebat ijiet matul l-ewwel xhar u intervalli ta' 17 il-jum wara xhar) matul u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni ta' kull kampjun tal-ħamrija, u analizzati għall-prodotti volatili. Apparti mil-kampjun tal-ħamrija miġbur direttament wara l-applikazzjoni (jum 9 tal-kampjunar) mill-anqas 5 punti addizzjonali tal-kampjunar għandhom ikunu nklużi. L-intervalli taż-żmien għandhom ikunu magħżula b'tali mod li l-għamla tat-tnaqqis tas-sustanza tat-test u l-għamla tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni jistgħu ikunu stabbiliti (e.g. 0, 1, 3, 7 tijiem; 2, 3 ġimghat; 1, 3, 3 xhur, etc.).

Meta jsir użu mis-sustanza tat-test tikkettjata-14C, radjoattività mhux-estrattibbli tkun kwantifikata bil-kombustjoni u l-bilanċ tal-massa tkun ikkalkolata għal kull intervall tal-kampjunar.

Fil-każ ta' l-inkubazzjoni anerobika u mistgħadra, il-fażijiet tal-ħamrija u ta' l-ilma huma analizzati flimkien għas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni jew separatament bil-filtrazzjoni jew biċ-ċentrifugazzjoni qabel l-estrazzjoni u l-analiżi.

1.9.4 Tetijiet ottiċi

l-istudju erobiċi, mhux-sterili, f'temperaturi addizzjonali u umidità tal-ħamrija, jistgħu ikunu utili għall-kalkolu ta' l-influwenza tat-temperatura u l-umidità tal-ħamrija fuq ir-rati tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha fil-ħamrija.

Aktar karatterizzazzjoni tar-radjoattività mhux-estrattibbli tista tkun ipprovata bl-użu ta', per eżempju, estrazzjoni superfiċjali likwida.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

L-ammonti tas-sustanza tat-test, tal-prodotti tat-trasformazzjoni, is-sustanżi volatili (fi % biss) u huma mhux-estrattibbli għandhom ikunu murija bħala % tal-konċentrazzjoni inizjalment applikata u, meta xieraq, bħala mg.kg-1 ħamrija (ibbażata fuq il-piż tal-ħamrija xorra) għal kull interval tal-kampjunar. Bilanċ tal-massa għandu jkun muri f'persentaġġ tal-konċentrazzjoni inizjalmeent applikata għal kull intervall tal-kampjunar. Preżentazzjoni grafika tal-konċentrazzjonijiet tas-susstanza tat-test kontra ż-żmien tkun tippermetti kalkolu tan-nofs-ħajja tat-trasformazzjoni tagħha jew DT50. Prodotti ta' trasformazzji maġġuri għandhom ikunu identifikati u l-konċentrazzjonijiet tagħhom għandhom ukoll ikunu pinġuti kontra ż-żmien sabiex juru r-rati tal-formazzjoni t-tnaqqis tagħhom. Prodott ta' trasformazzjoni maġġuri huwa kwalunkwe prodott li jirrapreżenta = 10 % tad-doża applikataa fi kwalunkwe waqt matul l-istudju.

Il-prodotti volatili kin ingastati jagħtu xi indikazzjoni tal-potenzal volatili ta' sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha mill-ħamrija.

Determinazzjonijiet aktar eżatti ta' nofs-ħajja jew tal-valuri DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90 għandhom ikunu akkwistati bl-applikazzjoni xierqa tal-kalkoli bil-mudell kinetiku. Il-valuri ta' nofs-ħajja u DT50 għandhom ikunu irrappurtati flimkien mad-deskrizzjoni tal-mudell użat, l-ordni tal-kinetiċi u l-koeffiċjent tad-determinazzjoni (r2). Kinetiċi ta' l-ewwel ordni huwa preferutu, sakemm r2 < 0.7. Jekk xieraq, il-kalkoli għandhom ukoll ikunu applikati għall-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni. Eżempji ta' mudelli xierqa huma deskritti fir-referenzi 31 sa 35.

Fil-każ ta' studji ta' rati mwettqa f'diversi temperaturi, ir-rati tat-trasformazzjoni għandhom ikunu deskritti bħala funzjoni tat-temperatura fi ħdan il-medda tat-temperatura sperimentali bl-użu tar-relazzjoni Arrhenius, bil-formula:

k =

jew

lnk =

Meta 1n A u B huma kostanti regrassivi mill-inteċessjoni u ż-żurżieqa, rispettivament, tal-linja ta' l-aħjar posizzjoni ġenerata minn regressjoni lineari 1n k kontra 1/T, k hija r-rata kostanti fit-temperatura t u T hija t-temperatura fi Kelvin. Attenzjoni għandha tingħata għall-medda limitata tat-temperatura li fiha ir-relazzjoni Arrehenius tkun valida fil-każ tat-trasformazzjoni li tkun irregolata bl-azzjoni mikrobjali.

2.2 EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Għalkemm l-istudji huma mwettqa f'sistema artifiċjali tal-laboratorju, ir-riżultati jkunu jippermettu kalkolu tar-rata tat-traformazzjoni tas-sustanza tat-test u wkoll tar-rata tal-formazzjoni u tat-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni skond il-kondizzjonijiet fl-għalqa (36)(37).

Studju tal-passaġġ tat-trasformazzjonni tas-sustanza tat-test jipprovdi informazzjoni dwar il-mezz li bih is-sustanza aapplikata hija strutturament mibdula fil-ħamrija bir-razzjoni kimika u mikrobjali.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi:

Is-sustanza tat-test:

- l-isem komuni, l-isem kimiku, in-numru CAS, il-formula strutturali (bl-indikazzjoni tal-posizzjoni tat-tikketti meta materjal radjo-tikkettjat ikun użat) u l-propjetajiet fiżiċi-kemikali relevanti (ara s-sezzjoni 1.5);

- il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanza tat-test;

- il-purità tar-radjokimika tal-kimika tikkettjata u l-attività speċifika (meta xieraq);

Sustanzi ta' referenza:

- l-isem kimiku u l-istruttura tas-sustanzi ta' referenza kif użati għall-karatterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tal-prodott tat-trasformazzjoni;

Ħamrija tat-test:

- dettalji tas-sit tal-ġbir;

- id-data u l-proċedura tal-kampjunar tal-ħamrija;

- properties of soils, such as pH, organic carbon content, texture (% sand, % silt, % clay), cation exchange capacity, bulk density, water retention characteristic, and microbial biomass;

- it-tul tal-ħażna tal-ħamrija u l-kondizzjonijiet tal-ħażna (jekk maħżuna);

Kondizzjonijiet tat-test:

- id-dati tat-twettieq ta' l-istudji;

- l-ammont tas-sustanza tat-test applikata'

- is-solventi użati u l-metodu ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test;

- il-piż tal-ħamrija inizjalment ittrattata u kampjunata matul kull interval għall-analiżi;

- deskrizzjoni tas-sistema użata għall-inkubazzjoni;

- rati tan-nixxijiet ta' l-arja (għal sistemi biss ta' nixxija kontinwa);

- it-temperatura ta' l-apparat sperimentali;

- il-kontenut ta' l-umidità tal-ħamrija matul l-inkubazzjoni;

- il-biomassa mikrobjali inizjali, matul u fit-tmiem ta' l-istudji erobiċi;

- pH, il-konċentazzjoni ta' l-ossiġenu u l-potenzal inizjali redox, matul u fit-tmiem ta' l-istudji erobiċi u tal-mistgħadar;

- Metodu/i tal-pestrazzjoni;

- metodi għall-kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni, fil-ħamrija u l-materjali ta' l-assorbazzjoni;

- in-numru ta' replikati u n-numru ta' kontrolli.

Riżultati:

- riżultat tad-determinazzjoni ta' l-attività mikrobjali;

- ir-repettabbilità u s-sensittività tal-metodi analitiċi wżati;

- ir-rati ta' l-irkupru (% valuri għal studju validu huma mogħtija fis-sezzjoni 1.7.1);

- ir-riżultati tat-tabelli espresssi fi % tad-doża inizjali applikata u bħala mg.kg-1 ħamrija (fuq il-bażi ta' piż xott);

- il-bilanċ tal-massa, matul u qrib it-tmiem ta' l-istudji;

- il-karatterizzazzjoni ta' radjoattivita (marbuta) mhux strattibbli jew tar-residwi fil-ħamrija;

- kwantifikazzjoni tal-CO2 rilaxxat u ta' komposti volatili oħrajn;

- grafika tal-konċentrazzjonijiet tal-ħamrija versus is-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni;

- in-nofs-ħajja jew DT50, DT75 u DT90 tas-sustanza tat-test u, meta xieraq, dwar il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni li huma inklużi fil-limiti ta' l-affidibilità;

- kalkolu tar-rata tad-degradazzjoni abjotika permezz ta' kondizzjonijiet sterili;

- kalkolu tal-kinetiċi tat-trasformazzjoni għas-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni;

- il-passaġġi proponuti tat-trasformazzjoni, meta xieraq;

- diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati;

- dettalji ġenerali (i.e. kromatogrammi tal-kampjun, kampjun tar-rati tal-kalkoli tat-trasformazzjoni u l-mezzi użati għall-identifikazzjoni tal-prodotti tat-traformazzjoni).

4. REFERENZI

(1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.

(3) l-Unjoni Ewropea (EU) (1995). Id-Direttiva tal-Kunsill 95/36/KE ta' l-14 ta' Lulju 1995 li temenda d-Direttiva 91/414/KEE li tirrigwarda t-tqegħid fis-suq ta' prodotti għall-protezzjoni tal-pjanti. L-Anness II, il-Parti A ul-Anness III, il-Parti A: Id-Destin u l-Imġieba fl-Ambjent.

(4) Il-Kummissjoni Olandiża għar-Reġistrazzjoni tal-Pestiċidi (1995). L-Applikazzjoni għar-reġistrazzjoni tal-pestiċidi. Sezzjoni G: L-imġieba tal-prodott u l-metabolitajiet tiegħu fil-ħamrija, l-ilma u l-arja.

(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus.

(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil - Part 1: Aerobic conditions.

(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.

(9) MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil - Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).

(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.

(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).

(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).

(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(16) L-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE.

(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.

(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.

(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.

(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.

(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.

(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.

(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and biotransformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.

(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).

(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).

(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.

(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.

(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.

(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135- 172.

(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 39, 188-204.

(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, 47-60.

(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.

(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.

ANNESS 1

TENZJONI TA' L-ILMA, KAPAĊITÁ TA' L-GĦALQA (FC) U L-KAPAĊITÀ TAŻ-ŻAMMA TA' L-ILMA (WHC) [1]

L-għoli tal-kolonna ta' l-ilma | pF [2] | bar [3] | Rimarki |

107 | 7 | 104 | Ħamrija xotta |

1,6.104 | 4,2 | 16 | Il-punt tal-mitbiela |

104 | 4 | 10 |

103 | 3 | 1 |

6.102 | 2,8 | 0,6 |

3,3.102 | 2,5 | 0,33 [4] | Il-medda tal-kapaċità ta' l-għalqa [5] WHC (approsimazzjoni) Ħamrija mistgħadra bl-ilma |

102 | 2 | 0,1 |

60 | 1,8 | 0,06 |

33 | 1,5 | 0,033 |

10 | 1 | 0,01 |

1 | 0 | 0,001 |

It-tenzjoni ta' l-ilma hija mkejjla fi cm tal-kolonna ta' l-ilma jew fi bar. Minħabba il-medda kbira tat-tenzjoni tal-ġbid, din hija espressa sempliċement bħala valur pF li huwa ekwivalenti għal-logaritmu ta' cm kolonna ta' l-ilma.

Il-kapaċità ta' l-għalqa hija definita bħala l-ammont ta' ilma li jista jkun maħżun kontra l-gravità minn ħamrija naturali, jumejn wara l-itwal perijodu ta' xita jew wara irrigazzjoni suffiċjenti hija determinata f'ħamrija mhux imqallba, in situ fil-għalqa. Il-kejl hu b'hekk mhux applikabbli għall-kampjuni tal-ħamrija imqallba fil-laboratorju. Il-valuri FC li jkunu determinati f'ħamrija mqallba jistgħu juru varjazzjonijiet sistematiċi kbar.

Il-kapaċità taż-żamma ta' l-ilma (Water holding capacity (WHC)) hija determinata fil-laboratorju b'ħamrija mqallba u mhux imqallba bis-saturazzjoni ta' kolonna ħamrija bl-ilma bit-trasport kapillari. Huwa partikolarment utili għal ħamrija mqallba u jista jkun sa 30 % akbar mill-kapaċità ta' l-għalqa (1) Huwa wkoll, b'mod sperimentali, aktar faċli li jkunu determinati b'mod affidabbli l-valuri FC.

ANNESS 2

KONTENUTI TA' L-UMIDITÁ FIL-ĦAMRIJA (g ilma kull 100 g ħamrija xotta) TAD-DIVERSI TIPI TA' ĦAMRIJA MINN PAJJIŻI VARJI

Umidità fil-ħamrija | Kontenut fi | Tip tal-ħamrija skond il-pajjiż |

| | WHC (1) [1] | pF = 1,8 | pF = 2,5 |

Ramel | Ġermanja | 28,7 | 8,8 | 3,9 |

Ramel tafli | Ġermanja | 50,4 | 17,9 | 12,1 |

Ramel tafli | Svizzera | 44,0 | 35,3 | 9,2 |

Ħama' taflija | Svizzera | 72,8 | 56,6 | 28,4 |

Tafal biċ-ċappa | Brażil | 69,7 | 38,4 | 27,3 |

Tafal biċ-ċappa | Ġappun | 74,4 | 57,8 | 31,4 |

Tafal imrammel | Ġappun | 82,4 | 59,2 | 36,0 |

Ħama' taflija | USA | 47,2 | 33,2 | 18,8 |

Tafal imrammel | USA | 40,4 | 25,2 | 13,3 |

ANNESS 3

1: | Valvola tal-labra |

2: | Flixkun tal-ħasil tal-gass li jkun fih l-ilma |

3: | Ultra-membrana (kondizzjonijiet sterili biss), daqs tal-pori 0.2 μm |

4: | Garafina tal-metaboliżmu tal-ħamrija (mifquha bl-ilma biss għall-kondizzjonijiet anerobiċi u mistgħadra) |

5: | Nassa ta' l-etilin glikol għal komposti volatili ta' l-ossiġenu |

6: | Nassa ta' l-aċidu sulfuriku għal komposti volatili alkalini |

7, 8: | Nassa ta' l-idrossidu tas-sosju għal CO2 & aċidi oħrajn volatili |

9: | Arloġġ tan-nixxija. |

+++++ TIFF +++++

(1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.

(2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.

(3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.

C.24. TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIS-SEDIMENT TAS-SISTEMI AKWATIĊI

1. METODU

Dan il-Metodu tat-Test huwa replika għal OECD TG 308 (2002)

1.1 INTRODUZZJONI

Il-kimiċi jistgħu jidħlu fl-ilmijiet tal-wiċċ, kemm baxxi u kemm fil-fond b'tali rotat bħala applikazzjoni diretta, skular tat-tbexxix, skular, soffija, drenaġġ, disposizzjoni ta' l-iskart, industria, effluwent domestiku jew agrikolu u d-deposizzjoni atmosferika. Dan il-Metodu ta' test jiddeskrivi l-metodu tal-laboratorju sabiex jassessja t-trasformazzjoni erobika u anerobika tal-kimiċi organiċi fis-sistema tas-sediment akwatiku. Dan il-Metodu tat-test huwa ibbażat fuq Linji ta' Gwida eżistenti (1) (2) (3) (4) (5) (6). Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-Għażla tal-Ħamrija/Sediment li nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (7) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. Il-Laqgħa ta' Ħidma kienet ukoll għamlet rakkommandazzjonijiet li jirrigarjaw il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija, ibbażari fuq il-Linja ta' Gwida ISO (8). Tali studji huma meħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati fil-ħamrija jew li huma pjuttost li jilħqu l-ambjent tal-ħamrija.

Il-kondizzjonijiet fis-sistemi tas-sedeiment akwatiku naturali ta' spiss huma erobiċi fil-fażi ta' l-ilma tal-wiċċ. Is-saff tal-wiċċ tas-sediment jista jkun jew erobiku jew anerobiku, waqt li sediment aktar fond, normalment ikun anerobiku. Sabiex ikunu inklużi dawn il-possibbiltajiet kollha, iż-żewġ testijiet erobiċi u anerobiċi huma deskritti f'dan id-dokument. It-test erobiku jistimula kolonna erobika ta' l-ilma fuq saff ta' sediment erobiku li jkun fil-qiegħ b'xaqliba anerobika. It-test anerobiku jistimula sistema kompleta tas-sediment-ta'-l-ilma anerobiku. Jekk iċ-ċirkostanzi jindikaw li huwa meħtieġ li jkun hemm devjazzjoni sinifikanti minn dawn ir-rakommandazzjonijiet, per eżempju bl-użu tal-qalba tas-sediment jew tas-sedimenti li jistgħu kienu ġew esposti għas-sustanza tat-test, metodi oħrajn huma disponibbli għal dan l-iskop (9).

1.2 DEFINIZZJONIJIET

Standard International (SI) units (unitajiet tan-Norma Internazzjonali) għandhom ikunu wżati fi kwalunkwe każ.

Is-sustanza tat-test: Kwalunkwe sustanza, sew jekk kompost oriġinali jew il-prodotti relevanti tat-trasformazzjoni.

Prodotti tat-trasformazzjoni: Is-sustanzi kollha li jirriżultaw mir-reazzjonijiet tat-trasformazzjoni biotiċi jew abiotiċi tas-sustanza tat-test, inklużi iċ-CO2 u l-prodotti li huma marbuta mar-residwi.

Trasformazzjoni erobika: (ossidazzjoni): Reazzjonijiet li jseħħu fil-preżenza ta' l-ossiġenu molekulari (12).

Trasformazzjoni anerobika: (tnaqqis): Reazzjonijiet li jseħħu fl-esklużjoni ta' l-ossiġenu molekulari (12).

Ilmijiet naturali: Huma l-ilmijiet tal-wiċċ akkwistati min għadajjar, xmajjar, nixxijat, etc.

Sediment: Hija taħlita ta' kostitwenti kimiċi minerali u organiċi, dawn ta' l-aħħar ikun fihom komposti ta' kontenut għoli tal-karbonju u n-nitroġenu u ta' piżijiet molekulari għoljin. Dan huwa depożitat b'ilma naturali u jifforma interfażi ma dak l-ilma.

Mineralizzazzjoni: Hija d-degradazzjoni kompleta ta' kompost organiku lejn CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, u CH4, CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet anerobiċi. Fil-kuntest ta' dan il-metodu tat-test, meta kompost bit-tikketta-14C ikun użat, il-mineralizzazzjoni tfisser dehradazzjoni estensiva li matula atomu tal-karbonu tikkettjat ikun ossidizzat bil-rilaxx ta' l-ammont xieraq ta' 14CO2 (14).

t0.5, huwa l-ħin meħtieġ għal 50 % trasformazzjoni tas-sustanza tat-test meta t-trasformazzjoni tista tkun deskritta bil-kinetiċi ta' l-ewwel ordni; din hija independenti mill-konċentrazzjoni.

DT50 (Għibien Ħin 50): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 50 %.

DT75 (Għibien Ħin 75): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 75 %.

DT90 (Għibien Ħin 90): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 90 %.

1.3 SUSTANZI TA' REFERENZA

Is-sustanzi ta' referenza għandhom ikunu wżati għall-karetterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti bil-metodi spektroskopiċi u kromatografiċi.

1.4 INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST

Sustanza tat-test mhux-ittikkettjata jew ittikkettjata tista tkun użata sabiex tkejjel ir-rata tat-trasformazzjoni, għalkemm materjal tikkettjat huwa preferut. Il-materjal tikkettjat huwa meħtieġ għall-istudju tal-passaġġ tat-trasformazzjoni u sabiex ikun stabbilit il-bilanċ tal-massa. Tikkettjar-14C huwa rakkomandat imma l-użu ta' iżotopi oħrajn bħal ma huma 13C, 15N, 3H, 32P, jistgħu wkoll ikunu utili. Sa kemm huwa possibbli, it-tikketta għandha tkun imqiegħda fil-parti(jiet) l-aktar stabbli tal-molekolu [8]. Il-Purità tal-kimika u/jew tar-radjo-kimika tas-sustanza tat-test għandha tkun mill-anqas 95 %.

Qabel jitwettaq it-test, l-informazzjoni li ġejja, dwar is-sustanza tat-test, għandha tkun disponibbli:

(a) solubilità fl-ilma (il-Metodu A.6);

(b) solubilità f'solventi organiċi;

(d) il-koeffiċjent tal-qsim n–oktano/ilma (il-Metodu A.8);

(e) koeffiċjent ta' l-adsorbazzjoni (Kd, Kf jew Koc, meta xieraq) (il-Metodu C.18);

(f) idroliżi 9il-Metodu C.7);

(g) kostant tad-disassoċjazzjoni (pKa) (Linja ta' Gwida OECD 112) (13);

(h) struttura kemikali tas-sustanza tat-test u l-posizzjoni tat-tikketta(i)-iżotpika, jekk applikabbli.

Nota:

It-temperatura li fiha dawn il-kejl kienu saru għandha tkun rappurtata.

Informazzjoni utili oħra tista tinkludi dettalji dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test fuq il-mikroorganiżmi, dettalji diġa disponibbli u/jew biodegradabbiltà inerenti, u dettalji dwar trasformazzjoni erobika u anerobika fil-ħamrija.

1.5 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Il-metodu deskritt f'dan it-test jutilizza sistema tas-sediment akwatiku erobiku u anerobiku (ara l-Anness 1) li tippermetti:

(i) il-kejl tar-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test f'sistema ta' sediment ta' l-ilma,

(ii) il-kejl tar-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test fis-sediment,

(iii) il-kejl tar-rata tal-mineralizzazzjoni tas-suistanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha (meta tikkettjata-C14, is-sustanza tat-test hija użata),

(iv) l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti tat-trasformazzjoni fil-fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment, inkluż il-bilanċ tal-massa (meta sustanza tat-test, tikkettjata, tkun użata),

(v) il-kejl tad-distrubuzzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha bejn iż-żewġ fażijiet matul perijodu ta' l-inkubazzjoni fid-dlam (sabiex ikun evitat, per eżempju, it-tnibbit ta' l-alga) f'temperatur kostanti. Il-valuri nofs-ħajja, DT50, DT75 u DT90 huma determinati meta l-informazzjonu hekk teħtieġ, imma m'għandhiex tkun estrapolata wisq lura lejn perijodu sperimentali (ara s-sezzjoni 1.2).

Mill-anqas żewġ sedimenti u l-imijiet assoċċjati tagħhom huma meħtieġa għaż-żewġ studji erobiċi u anerobiċi rispettivament 97). B'dana kollu, jista jkun hemm każi meta aktar minn żewġ sedimenti għandhom ikunu wżati, per eżempju, dwar kimika li tista tkun preżenti f'ambjenti ta' l-ilma frisk u/jew marini.

1.6 L-APPLIKABBILTÁ TAT-TEST

Dan il-metodu kien ġie applikat, s'issa, sabiex jistudja t-trasformazzjoni f'ilma frisk u sedimenti, imma l-prinċipju jista wkoll ikun applikat għal sistemi estwarini/marini. Dan mhux adattat biex jistimu kondizzjonijiet f'ilma mexxej (e.g. xmajjar) jew fil-baħar miftuħ.

1.7 KRITERJA TAL-KWALITÁ

1.7.1 Irkupru

L-estrazzjoni u l-analiżi ta', mill-anqas, nofs il-kampjunu duplikati ta' l-ima u tal-ħamrija, wara ż-żieda tas-sustanza tat-test, tagħti l-ewwel indikazzjoni tar-repetabbiltà tal-metodu analitiku u ta' l-uniformità tal-proċedura ta' l-applikazzjoni għas-sustanza tat-test. L-irkupri fi stadji aktar tard ta' l-esperimenti huma mogħtija bil-bilanċi rispettivi tal-massa (meta materjal tikkettjat ikunu wżat). L-irkupri għandhom ikunu fil-medda ta' minn 90 % sa 110 % tal-kimiċi ittikkettjati (6) u minn 70 % sa 110 % għal kimiċi mhux ittikkettjati.

1.7.2. Ir-repettabbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku

Ir-repetabbilità tal-metodu analitiku (eskluża l-peffiċjenza ta' l-estrazzjoni inizjali) sabiex tkun kwantifikata s-sustanza tat-test u tat-trasformazzjoni tal-prodotti tista tkun verifikata b'analiżi dupplikata ta' l-istess estratt tal-ħamrija, inkubat għal tul ta' żmien biż-żejjed għall-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.

Il-limitu ta' sejbien (limit of detection (LOD)) tal-metodu analitiku għas-sustanza tat-test u għat-trasformazzjoni tal-prodotti għandu jkun mill-anqas 0.01 mg.kg-1 ħamrija (bħala sustanza tat-test) jew 1 % tad-doża applikata, liema minnhom hija l-anqas. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni (limit of quantification (LOQ)) għandu wkoll ikun speċifikat.

1.7.3 L-eżatezza tad-dettalji tat-trasformazzjoni

Analiżi regressiva tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test bħala funzjoni tal-ħin, tagħti informazzjoni xierqa dwar l-affiddabbilità tal-kurva tat-trasformazzjoni u tippermetti il-kolkolu tal-limiti affidabbli ta' nofs-ħajjiet (fil-każ ta' psewdo kinetiċi ta' l-ewwel ordni) jew il-valuri DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90.

1.8 DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.8.1 Sistema u apparat tat-test

L-istudju għandu jkun jkun imwettaq fl-kontenuturi tal-ħġieġ (e.g. flixkien, tubi taċ-ċentrifuga), sakemm informazzjoni preliminari (bħal ma huwa l-koeffiċjent tal-qasmi n-oktanol-ilma, id-dettaltji tas-sopzjoni, etc.) tkun tindika li s-sustanza tat-test tista tkun teħel mal-ħġieġ, f'liema każ, materjal alternattiv (bħala ma hu t-teflon) għandu mnejn ikun ikkonsidrat. Meta s-sustanza tat-test hija magħrufa li teħel mal-ħġieġ, jista jkun possibbli li titnaqqas din il-problema bl-użu ta' wieħed jew aktar minn dawn il-metodi li ġejjin:

- iddetermina l-massa tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni kif sorbiti mal-ħġieġ;

- assigura ħasla bis-solvent ta' l-oġġetti kollha tal-ħġieġ fit-tmiem tat-test;

- l-użu ta' prodotti formulati (ara wkoll is-sezzjoni 1.9.2);

- uża ammont miżjud tal-ko-solvent bħala żieda tas-sustanza tat-test mas-sistema; jekk ko-solvent ikun użat, dan għandu jkun ko-solvent li ma jkunx idewweb is-sustanza tat-test.

Eżempji ta' apparat xieraq, i.e. sistemi tal-ħġieġ b'nixxija kontinwa u tat-tip biometriku, huma murija fl-Annessi 2 u 3, rispettivament (14). Sistemi utili oħrajn ta' l-inkubazzjoni huma deskritti fir-referenza 15. Id-disinn ta' l-apparat sperimentali għandu jippermetti l-iskambju ta' l-arja jew tan-nitroġenu u tal-prodotti volatili li jkunu ġew maqbuda. Il-qisien ta' l-apparat għandu jkun tali li l-ħtiġiet tat-test ikun hemm konformità magħhom (ara s-sezzjoni 1.9.1). Il-ventilazzjoni tista tkun ipprovduta jew bi bżieżaq ġentili jew bill-passaġġ ta' l-arja jew tan-nitroġenu minn fuq wiċċ l-ilma. F'dan il-każ ta' l-aħħar, taħwid ġentili ta' l-ilma minn fuq jista jkun rakkommadabbli għal distribuzzjoni aħjar ta' l-ossiġenu jew tan-nitroġenu fl-ilma. Arja ħielsa minn CO2 m'għandhiex tkun użata minħabba li dan jirriżulta f'żidiet fil-pH ta' l-ilma. Fi kwalunkwe każ, it-tqallib tas-sediment mhux mixtieq u għandu jkun evitat, sa kemm ikun possibbli. Kimiċi kemm xejn volatili għandhom ikunu ittestjati f'sistema tip-ta'-barometru b'taħwid ġentili tal-wiċċ ta' l-ilma. Kontenituri magħluqa, bi spazju fil-wiċċ ta', jew l-arja atmosferika jew tan-nitroġenu, u fjali interni għal-qbil ta' prodotti volatili, jistgħu wkoll ikunu wżati (16). Skambju regolari tal-gass fl-ispazju huwa meħtieġ fit-test erobiku sabiex jikkumpensa għall-konsum ta' l-ossiġenu mill-biomassa.

Nasses xierqa għall-ġbir tal-prodotti volatili tat-trasformazzjoni jinkludu, imma mhux ristertti għal, 1 mol.dm-3 taħlitiet ta' l-idrossidu tal-putassa jew ta' l-idrossidu tas-sodju, għad-diossidu tal-karbonju [9] u tal-glikol etiliniku, l-etanolamin jew 2 % paraffin fi xilene għal komposti organiċi. Volatili ffurmati permezz ta' kondizzjonijiet anerobiċi, bħal ma huwa l-metanju, jistgħu ikunu miġbura, per eżempju, b'għarbiel molekulari. Tali volatili jistgħu ikunu maħruqa, per eżempju, iċ-CO2 li jgħaddi mill-gass matul tubu tal-kwart mimli bi CuO f'temperatura ta' 900 °C u li jiġbor iċ-CO2 iffurmat f'assorbatur bl-alkali (17).

Strumentazzjoni tal-laboratorju għal analiżi kimika tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni hija meħtieġa (i.e. kromatografija likwida tal-gass (GLC), kromatografija likwida ta' mġieba qawwija (HPLC), kromatografija tas-saff irqieq (TLC), spektroskopju tal-massa (MS), spektroskopju tal-kromatografija-tal-massa tal-gass (GC-MS), spektrometru tal-kromatografija tal-massa likwida (LC-MS), reżonanza manjetika nukleari (NMR), eyc.) inklużi s-sistemi tas-sejbien għal kimiċi radjotikkettjati jew mhux tikkettjati, kif xieraq. Meta materjal radjo-tikkettjat ikun użat bħala għadd tax-xintillazzjoni tal-likwidu u ossidizzatur tal-kombustjoni (għall-kombustjoni ta' kampjuni tas-sediment qabel l-analiżi tar-radjo-attività) ikun ukoll meħtieġ.

Apparat normali ieħor tal-laboratorju, għal determinazzjonijiet fiżiko-kimiċi u bioloġiċi (ara s-sezzjoni Tabella 1, is-sezzjoni 1.8.2.2(l-oġġetti tal-ħġieġ, il-kimiċi u r-reaġenti huma meħtieġa, kif xieraq.

1.8.2 L-għażla u n-numru ta' sedimenti akwatiċi

Is-siti tal-kampjunar għandhom ikunu magħżula skond l-iskop tat-test, f'xi sitwazzjoni partikolari. Fl-għażla tas-siti tal-kampjunar, l-istorja fl-isfond, agrikola, indistriali jew domestika dwar il-wesgħa tal-ġbir u ta' l-ilmijiet fin-naħa ta' fuq, għandhom ikunu ikkunsidrati. Is-sedimenti m'għandhomx ikunu wżati jekk ikunu ġew kontaminati bis-sustanza tat-test jew bl-istrutturi analogi tagħha matul l-4 snin preċedenti.

1.8.2.1 L-għażla tas-sediment

Żewġ sedimenti huma normalment użati għall-istudju erobiċi (7). Iż-żewġ sedimenti magħżula għandhom ikunu differenti fir-rigward tal-kontenut tal-karbonju organiku u fil-formazzjoni tagħhom. Sediment wieħed għandu jkollu kontenut għoli ta' karbonju organiku (.5-7.5 %) u ta' formazzjoni fina, is-sediment l-ieħor għandu jkollu kontut baxx tal-karbonju organiku (0.5-2.5 %) u formazzjoni rozza. Id-differenza bejn il-kontenuti tal-karbonu organiku għandha, normalment, tkun ta' mill-anqas 2 %. "Formnazzjoni fina" hija definita bħala (tafal + ħama') [10] kontenut ta > 50 % u "formazzjoni rozza" hija definita bħala (tafal + ħama') kontenut ta' < 50 %. Id-differenza fil-kontenut (tafal + ħama') għaż-żewġ sedimenti għandha normalment tkun mill-anqas 20 %. Fil-każi, meta l-kimika tista wkoll tilħaq l-ilmijiet marittimi, mill-anqas waħda mis-sistemi tas-sediment ta' l-ilma għandha tkun ta' oriġini marittima.

Għal studju strettament anerobiku, żewġ sedimenti (inklużi l-imijiet assoċjati tagħhom) għandhom ikunu miġbura minn żoni anerobiċi tal-partijiet ta' l-ilma tal-wiċċ (7). Iż-żewġ fażijiet tas-sediment u ta' l-ilma għandhom ikunu mqanda u ittrasportati bir-reqqa bl-esklużjoni ta' l-ossiġenu.

Parametri oħrajn jistgħu ikunu importanti fil-għażla tas-sedimenti u għandhom ikunu ikkunsidrati fuq il-bażi ta' każ b'każ. Per eżempju, il-medda pH tas-sedimenti tkun importanti għall-kimiċi tat-testijiet li dwarhom trasformazzjoni u/jew sorpzjoni jistgħu ikunu pH-dipendenti. Id-dipendenza-pH tas-sorpzjoni tista tkun riflessa bil-pKa tas-sustanza tat-test.

1.8.2.2 Karatterizzazzjoni tal-kampjuni tas-sedimenti ta' l-ilma

Parametri ewlenija li għandhom ikunu mkejla u inklużi fir-rapport (b'referenza għall-metodu wżat) kemm għall-ilma u għas-sediment, u l-istadju tat-test li fih dawk il-parametri għandhom ikunu determinati, huma miġbura f'sommarju fit-Tabella ta' hawn taħt. Għall-informazzjoni, il-metodi tas-sejbin għad-determinazzjoni ta' dawn il-parametri huma mogħtija fir-referenzi (18) (19) (20) (21).

B'żieda, parametri oħrajn jistħu li jkunu metieġa li jkunu mkejla u nklużi fir-rapport fuq il-bażi ta' każ b'każ (e.g. għall-ila frisk: Partiċelli, alkalinità, toqol. Kondittività, NO3/PO4 (relattività u valuri individwali); għas-sedimenti: Il-kapaċità ta' l-iskambju tal-jonji, il-kapaċità taż-żamma ta' l-ilma, Il-karbonat, in-nitroġenu u l-fosfru totali; u għas-sistemi marittimi: Salinità). L-analiżi tas-sedimenti u l-ilma għan-nitrat, is-sulfat u l-ħadid bio-disponibbli, u l-ossibbiltà ta' aċċettaturu elettroni oħrajn tista tkun utili fl-assaġġ tal-kondizzjonijiet redox, speċjalment b'relazzjoni mat-trasformazzjoni anerobika.

Parametri tal-kejl għall-karatterizzazzjoni tal-kampjunu fis-sediment ta' l-ilma (7)(22)(23)

Parametru | Stadju tal-proċedura tat-test |

Ilma

Oriġini/sorsi | × | | | | | |

temperatura | × | | | | | |

pH | × | | × | × | × | × |

TOC | | | × | × | | × |

O2-konċentrazzjoni [11] | × | | × | × | × | × |

Potenzal Redox [11] | | | × | × | × | × |

Sediment

Oriġini/sorsi | × | | | | | |

Il-fond tas-saff | × | | | | | |

pH | | × | × | × | × | × |

Distribuzzjon i tad-daqs tal-partiċelli | | × | | | | |

TOC | | × | × | × | | × |

Biomassa mikrobjali [12] | | × | | × | | × |

Potenzal Redox [11] | Osservazzjonijiet (lewn/rieħa) | | × | × | × | × |

1.8.3 Ġbira, Tqandil u Ħażna

1.8.3.1 Il-ġbir

L-abbozz tal-gwida ISO dwar il-kampjunar tas-sediment tal-qiegħ 98 għandu jkun użat għall-kampjunar tas-sediment. Kampjuni tas-sediment għandhom ikunu miġbura mis-saff intier ta' fuq, 5 sa 10 cm, tas-sediment. L-ilma assoċjat għandu jkun miġbur mill-istess sit jew lokalità u fl-istess waqt bħas-sediment. Għal studju anerobiku, il-ġbir tal-kampjuni tas-sediment u ta' l-ilma assoċjat u t-trasportazzjoni tagħhom għandu jkun bl-esklużjomni ta' l-ossiġenu (28) (ara s-sezzjoni 1.8.2.1). Uħud mill-apparati tal-kampjunar huma deskritti fil-litteratura (8) (23).

1.8.3.2 Tqandil

Is-sediment huwa separat mill-ilma permezz tal-filtrazzjoni u s-sediment ikun magħrbel fl-undità minn għarbiel ta' 2 mm bl-użu ta' l-ilma eċċessiv tal-lokalita, li imbagħad ikunu mormi. Imbagħad, ammonti magħrufa ta' sedimenti u ilma huma mħallta fir-relattività mixtieqa (ara s-sezzjoni 1.9.1) f'garafini ta' l-inkubazzjoni u ippreparati għall-perijodu ta' l-akklamizzazzjoni (ara s-sezzjoni 1.8.4). Għal studju anerobiku, il-passi kollha tat-tqandil għandhom iseħħu bl-esklużjoni ta' l-ossiġenu (29) (30) (31) (32) (33).

1.8.3.3 Ħażna

L-użu ta' kampjun frisk tas-sediment u l-ilma huwa ferm rakkommandabbli, imma jekk ħażna tkun meħtieġa, Is-sediment u l-ilma għandhom ikunu magħrbla kif deskritt hawn fuq u maħżuna flimkien, mifqugħa bl-ilma (6-10 cm saff ta' ilma), fid-dlam, fi 4 ± 2 °C4 għal massimu ta' [13] ġimghat (7)(8)(23). Il-kampjuni li huma ntiżi għal studji erobiċi għandhom ikunu maħżuna b'aċċess liberu ta' arja 9e.g. f'kontenituri miftħa), waqt li dawk għal studji erobiċi bl-esklużjoni ta' l-ossiġenu. L-iffriżar tas-sediment u l-ilma u waqt l-inxif tas-sediment m'għandux iseħħ matul it-trasportazzjoni u l-ħażna.

1.8.4 Preparazzjoni tal-kampjuni sediment/ilma għat-test

Perijodu ta' akklamitazzjoni għandu jseħħ qabel iż-żieda tas-sustanza tat-test, b'kull kampjun ta' sediment/ilma jkun miqiegħed fir-reċipjent ta' l-unkubazzjoni li għandu jkun użat għat-test ewlieni, u l-akklamizzazzjoni tkun imwettqa skond l-istess kondizzjonijiet bħal fit-test ta' l-inkubazzjoni (ara s-sezzjoni 1.9.1). Il-perijodu ta' l-akklimizzazzjoni huwa ż-żmien meħtieġ għal stabbilità raġjonevoli tas-sistema kif rifless bil-pH, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu fl-ilma, il-potenzal tar-redox tas-sediment u l-ilma, u l-fażijiet tas-separazzjoni makroskopika. Il-perijodu ta' l-akklamizzazzjoni għandu normalment idem bejn ġimgħa waħda u ġimgħatejn u m'għandux jeċċedi erba' ġimghat. Ir-riżultati tad-determinazzjonijiet imwettqa matul dan il-perijodu għandhom ikunu nlkużi fir-rapport.

1.9 L-IMĠIEBA TAT-TEST

1.9.1 Kondizzjonijiet tat-test

It-test għandu jkun imwettaq fl-apparat ta' l-inkubazzjoni (ara s-sezzjoni ċ.8.1) b'relattività tal-volum ta' l-ilma mas-sedimet ta' bejn 3:1 u 4:1, u saff tas-sediment ta' 2.5 cm (± 0,5 cm) (4). Ammont minimu ta' 50 g ta' sediment (bażi ta' piż xott) kull reċipjent ta' l-inkubazzjoni huwa rakkommandat.

It-test għandu jkun imwettaq fid-dlam, b'temperatura kostanti fil-medda ta' 1- sa 30 °C. Temperatura ta' (20 ± 2) °C hija xierqa. Meta xieraq, temperatura addizzjonali aktar baxxa (e.g. 10 °C) tista tkun meqjusha fuq il-bażi ta' każ b'każ, jiddependi mill-informazzjoni meħtieġa mit-test. It-temperatura ta' l-inkubazzjoni għandha tkun sorveljata u nkluża fir-rapport.

1.9.2 It-trattament u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test

Konċentrazzjoni waħda tal-kimika tat-test hija wżata [14]. Għall-kimiċi tal-protezzjoni ta' l-uċuġ applikati direttament lejn is-saffi ta' l-ilma, id-doża massima tat-tikketta għandha tkun meqjusa bħala, ir-rata massima ta' l-applikazzjoni ikkalkolata fuq il-bażi taż-żona tal-wiċċ ta' l-ilma fir-reċipjent tat-test. Fil-każi l-oħrajn kollha, il-konċemtrazzjoni li trid tkun użata għandha tkun ibbażata fuq previżjonijiet mill-emissjonijiet ambjentali. Attenzjoni għandha tingħata sabiex tkun assigurata li konċentrazzjoni adekwata tas-sustanza tat-test tkun applikata sabiex tikkaratterizza r-rotta tat-trasformazzjoni u tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni. Jista jkun meħtieġ li jkunu applikati dożi aktar għoljin (e.g. 19-il darba) f'sitwazzjonijiet meta l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test ikunu qrib il-limitu tas-sejbien fil-bidu ta' l-istudji u/jew meta prodotti ta' trasformazzjoni maġġuri ma jkunux faċli li jkunu misjuba meta preżenti fi 10 % tar-rata ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. B'dana kollu, jekk konċentrazzjonijiet għola tat-test huma wżati, dawn m'għandhox ikollhom effett ħażin sinifikanti fuq l-attività mikrobjali tas-sistema ilma-sediment. Sabiex tkun akkwistat konċentrazzjoni kostanti tas-susstanza tat-test fir-reċipjenti ta' qisien differenti, aġġustament tal-kwantità tal-materjal applikat jista jkun meqjus bħala xieraq, ibbażat fuq il-fond tal-kolonna ta' l-ilma fir-reċipjent b'relazzjoni mal-fond ta' l-ilma fl-għalqa (li huwa preżunt li huwa 100 cm, imma fond ieġor jista jkun użat). Ara l-Anness 4 għal eżempju tal-kalkolazzjoni.

Idealment, is-sustanza tat-test għandha tkun applikata bħala taħlita akweja ġewwa l-fażi ta' l-ilma tas-sistema tat-test. Jekk ma jkunx jista jsir mod ieħor, l-użu ta' ammonti anqas ta' solventi li jitħaltu ma l-ilma (bħal ma huma l-aċetun, l-etanol) huwa permisibbli għall-applikazzjoni u d-distribuzzjoni tas-sustanza tat-test, imma dan m'għandux jeċċedi 1 % v/v u m'għandux ikollu effeti ħżiena fuq l-attività mikrobjali tas-sistema tat-test. Attenzjoni għandha tingħata fil-ġenerazzjoni tat-taħlita akweja tas-sustanza tat-test – l-użu ta' kolonni ġenerati u t-taħlit minn qabel jista jkun xieraq sabiex tkun assigurata omoġenità kompluta. B'segwiment taż-żieda tat-taħlita akweja mas-sistema tat-test, taħvid ġentili tal-fażi ta' l-ilma huwa rakkommandat, li jqanqal is-sediment mill-anqas possibbli.

L-użu ta' prodotti formulati mhux normalment rakkommandat minħabba li l-ingredjenti tal-formulazzjoni jistgħu jaffettwaw is-sustanza tat-test u/jew tal-prodotti tat-trasformazzjoni bejn il-fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment. B'dana kollu, e.g. għal sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu, l-użu ta' materjal formulat jista jkun alternattiva xierqa.

In-numru ta' reċipjenti ta' l-inkubazzjoni jiddependi min-numru ta' drabi tal-kampjunar (ara s-sezzjoni 1.9.3). Numru suffiċjenti tas-sistemi tat-test għandhom ikunu nklużi sabiex żewġ sistemi jistgħu ikunu sagrifikati f'kull waqt tal-kampjunar. Meta l-unitajiet tal-kontroll ta' kull sistema tas-sediment akwatiku jkunu wżati, dawn m'għandhomx ikunu ittrattati bis-sustanza tat-test. L-unitajiet tal-kontroll jistgħu ikunu wżati għad-determinazzjoni tal-biomassa mikrobjali tas-sediment u tal-karbonju organiku totali ta' l-ilma u tas-sediment fit-tmiem ta' l-istudju. Iż-żewġ unitajiet tal-komntroll (i.e. unità tal-kontroll waħda ta' kull sediment akwatiku) jistgħu ikunu wżati sabiex jissorveljaw il-parametri meħtieġa fis-sediment u fl-ilma matul il-perjodu ta' l-akklamitizzazzjoni (ara t-Tabella fis-sezzjoni 1.8.2.2). Żewġ unitajiet addizzjonali tal-kontroll għandhom ikunu nklużi fil-każ li sustanza tat-test tkun applikata permezz ta' solvent li jkejjel l-effetti ħżiena fuq l-attività mikrobjali tas-sistema tat-test.

1.9.3 It-tul taż-żmien u l-kampjunar tat-test

It-tul ta' l-esperiment m'għandux normalment jeċċedi 100 jum (6), u għandu jkompli sa kemm il-passaġġ tal-gradazzjoni u l-għamla tad-distrubuzzjoni ta' l-ilma/sediment tkun stabbilita jew meta 90 % tas-sustanza tat-test tkun dissipata fit-trasformazzjoni u/jew il-volatilizzazzjoni. In-numru ta' waqtiet tal-kampjunar għandhom ikunu mill-anqas sitta (inkluż il-ħin żero), bi studju preliminarji voluntarju (ara s-sezzjoni 1.9.4) ikunu wżat sabiex tkun stabbilit r-regola xierqa tal-kampjunar u tat-tul tat-test, sakemm informazzjoni suffiċjenti ma tkunx diġa disponibbli dwar is-sustanza tat-test minn studju preċendenti. Għal sustanzi tat-test idrofobiċim punti addizzjonali tal-kampjunar matul il-perijodu inizjali ta' l-istudju jistgħu ikunu meħtieġa sabiex tkun determinata r-rata tad-distribuzzjoni bejn il-fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment.

Filwaqtiet xierqa tal-kampjunar, ir-reċipjenti kollha ta' l-inkubazzjoni (dupplikat) huma mneħħija għall-analiżi. Is-sediment u l-ilma tal-wiċċ huma analizzati separatament [15]. L-ilma tal-wiċċ għandu jkun imneħħi bil-galbu b'ċaqlieq mill-anqas tas-sediment. L-estrazzjoni u l-karatterizzazzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni għandhom isegwu l-proċeduri analitiċi xierqa. Attenzjoni għandha tingħata għat-tneħħija tal-materjal li jkun jkun ġie assorbit mar-reċipjent ta' l-inkubazzjoni jew mat-tibi ta' l-interkonnessjoni wżati li jaqbdu l-volatili.

1.9.4 Test preliminarju voluntarju

Jekk ir-regolazzjoni tat-tul u tal-kampjunar ma jistgħux ikunu ikkalkolati minn studju relevanti oħrajn dwar is-sustanza tat-test, studju preliminari voluntarju jista jkun meqjus bħala xieraq, li għandu jkun imwettaq bl-użu ta' l-istess kondizzijonijiet tat-test proponuti għall-istudju definittiv. Kondizzjonijiet sperimentali relevanti u r-riżultati mit-test preliminarju, jekk imwettaq, għandhom ikunu rraportati fil-qosor.

1.9.5 Kejl u analiżi

Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u l-prodotti tat-trasformazzjoni f'kull waqt tal-kampjunar fl-ilma u fis-sediment għandhom ikunu mkejjla u rraportati (bħala konċentrazzjoni u bħala persentaġġ ta' l-applikat). Ġeneralment, il-prodotti tat-trasformazzjoni misjuba fl-10 % tar-radjoattività applikata fis-sistema totali ta' ilma-sediment fi kwalunkwe waqt tal-kampjunar għandhom ikunu identifikati, sakemm ma jkunx raġjonevolment ġustifikat mod ieħor. Il-prodotti tat-trasformazzjoni li dwarhom il-konċentrazzjonjiet huma kontinwament miżjuda matul l-istudju għandhom ukoll ikunu ikkonsidrati għall-identifikazzjoni, anki jekk il-konċentrazzjonijiet tagħhom ma jkunux jeċċedu l-limitu mogħti hawn fuq, minħabba li dan jista jindika persistenza. Dan ta' l-aħħar għandu jkun ikkonsidrat fuq il-bażi ta' każ b'każ, bil-ġustifikazzjoni tkun ipprovduta fir-rapport.

Ir-riżultati mis-sistemi tal-qbid tal-gassijiet/volatili (CO2 u oħrajn, i.e. komposti organiċi volatili) għandhom ikunu rrapurtati f'kull waqt tal-kampjunat. Ir-rati tal-mineralizzazzjoni għandhom ikunu rrapurtati. Residwi mhux estrattibbli (marbuta) fis-sediment għandhom ikunu irrapurtati f'kull punt tal-kampjunar.

2. DATA

2.1 TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Il-bilanċ jew l-irkupru tal-massa totali (ara s-sezzjoni 1.7.1) tar-radjoattività miżjuda għandhom ikunu ikkalkolati f'kull waqt tal-kampjunar. Ir-riżultati għandhom ikunu irrapurtati bħala persentaġġ tar-radjoattività miżjuda. Id-distribuzzjoni tar-radjoattività bejn l-ilma u s-sediment għanda tkun irrapurtata bħala konċentrazzjonijiet u persentaġġi, f'kull waqt tal-kampjunar.

In-nofs-ħajja, il-DT50 u, jekk xieraq, il-DT75 u il-DT90 tas-sustanza tat-test għandhom ikunu ikkalkolati flimkien mal-limiti ta' affidibbilità tagħhom (ara s-sezzjoni 1.7.3). L-informazzjoni dwar ir-rata tad-dissipazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma u fis-sediment tista tkun akkwistata mill-użu ta' l-għodda xierqa ta' l-evalwazzjoni. Dawn jistgħu ivarjaw mill-applikazzjoni tal-kinetiċi ta' psewdo-l-ewwel-ordni, tat-teknika li timxi mal-kurva emprika li tapplika għal soluzzjonijiet grafiċi jew numeriċi u l-assaġġ aktar kumpless bl-użu, per eżempju, tal-mudelli ta' kompartiment singolu jew multiplu. N Aktar dettalji jistgħu ikunu akkwistati mill-letteratura relevanti kif ippubblikata (35)(36)(37). In-nofs-ħajja, il-DT50 u, jekk xieraq, il-DT75 u il-DT90 tas-sustanza tat-test għandhom ikunu ikkalkolati flimkien mal-limiti ta' affidibbilità tagħhom (ara s-sezzjoni 1.7.3). L-informazzjoni dwar ir-rata tad-dissipazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma u fis-sediment tista tkun akkwistata mill-użu ta' l-għodda xierqa ta' l-evalwazzjoni. Dawn jistgħu ivarjaw mill-applikazzjoni tal-kinetiċi ta' psewdo-l-ewwel-ordni, tat-teknika li timxi mal-kurva emprika li tapplika għal soluzzjonijiet grafiċi jew numeriċi u l-assaġġ aktar kumpless bl-użu, per eżempju, tal-mudelli ta' kompartiment singolu jew multiplu.

Ir-resqien kollu għandu s-saħħa u d-debbolizzi tiegħu u jvarja konsiderevolment fil-komplessità, Preżunzjoni tal-kinetiċi ta' l-ewwel ordni tista ssir b'simplifikazzjoni żejda tal-proċessi tad-degradazzjoni u tad-distribuzzjoni, imma meta possibbli li tagħti terminu (ir-rata kostanti jew nofs-ħajja) li faċilment ikunu jifthiemu u l-valur fil-mudellar tas-simulazzjoni u l-kalkolu tal-konċentrazzjonijiet ambjentali previsti. Resqien empiriku jew trasformazzjonijiet lineari jistgħu jirriżultaw fi dħul aħjar tal-kurvi mad-dettall u għalhekk jippermettu estimi aħjar tan-nofs-ħajja, DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90. L-użu tal-kostanti derivati, b'dana kollu huwa limitat. Mudelli kumpartimentali jistgħu jiġġeneraw numru ta' kostanti utili ta' valur fir-riskju ta' l-assaġġ li jiddeskrivi r-rata tad-degradazzjoni f'kumpartimenti differenti u d-distribuzzjoni tal-kimika. Dawn għandhom ukoll ikunu wżati għall-estimi tal-kostanti tar-rata għall-formazzjoni u d-degradazzjoni ta' prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni. Fil-każi kollha, il-metodu wżat għandu jkun ġustifikat u min jagħmel l-esperiment għandu juri b'mod grafiku u/jew l-istatistika ta' dħul aħjar.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1 RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Is-sustanza tat-test:

- il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanza tat-test;

- il-purità tar-radjokimika tal-kimika tikkettjata u l-attività speċifika (meta xieraq);

Sustanzi ta' referenza:

- l-isem kimiku u l-istruttura tas-sustanzi ta' referenza kif użati għall-karatterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tal-prodott tat-trasformazzjoni;

Sedimenti u ilmijiet tat-test:

- il-lokalità u d-deskrizzjoni tas-sit(i) tal-kampjunar tas-sediment akwatiku, inkluża, jekk possibbli, l-istorja tal-kontaminazzjoni;

- l-informazzjoni kollha li tirrigwardja il-ġbir, il-ħażna (jekk ikun hemm) u l-akklamizzazzjoni tas-sistemi ta' l-ilma/sediment;

- karatteristiċi tal-kampjunar ilma-sediment kif elenkati fit-Tabella fis-sezzjoni 1.8.2.2.

Kondizzjonijiet tat-test:

- is-sistema tat-test użata (e.g. in-nixxija kontinwa, il-biometrika, il-mezz tal-ventilazzjoni, il-metodu tat-taħwid, il-volum ta' l-ilma, il-massa tas-sediment, il-ħxuna kemm tas-saff ta' l-ilma u tas-sediment, il-qisiem tar-reċipjenti tat-test, etc.);

- l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test għas-sistema tat-test: Il-konċentrazzjoni tat-test kif użata, in-numri ta' repliki u l-modula tal-kontrolli ta' l-applikazzjoni tas-sustanzaa tat-test (e.g. l-użu tas-solvent jekk ikun hemm), etc.;

- temperatura ta' l-inkubazzjoni;

- id-drabi tal-kampjuna;

- il-metodi ta' l-estrazzjoni u l-effiċċjenzi kif ukoll il-metodi analitiċi u l-limiti tas-sejbien;

- il-metodi għall-karatterizzazzjoni/identifikazzjoni tal-prodotti tat-trasformazzjoni;

- devjazzjonijiet mill-protokoll tat-test jew mill-kondizzjonijiet tat-test, matul l-istudju.

Riżultati:

- dettalji fi stat oriġinali tal-figuri li jirrapreżentaw analiżi (id-dettalj kollha fi stat oriġinali għandhom ikunu maħżuna fl-arkivji-GLP);

- ir-repettabbilità u s-sensittività tal-metodi analitiċi użati;

- ir-rati ta' l-irkupru (% valuri għal studju validu huma mogħtija fis-sezzjoni 1.7.1);

- tabelli tar-riżultati espressi bħala % tad-doza applikata u fi mg.kg-1 fl-ilma, sediment u s-sistema totali (% biss) għas-sustanza tat-test u, jekk xieraq, għall-prodotti tat-trasformazzjoni u tar-radjoattività mhux-estrattibbli;

- il-bilanċ tal-massa, matul u qrib it-tmiem ta' l-istudji;

- rapreżentazzjoni grafika tat-trasformazzjoni fl-ilma u l-frazzjonijiet tas-sediment u fis-sistema totali (inkluża l-mineralizzazzjoni);

- rati tal-mineralizzazzjoni;

- in-nofs-ħajja, il-FT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90 tas-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-proddotti tat-trasfirmazzjoni maġġuri inklużi fil-limiti ta' l-affidabbilità fl-ilma, fis-sediment u fis-sistema totali;

- kalkolu tal-kinetiċi tat-trasformazzjoni għas-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni;

- il-passaġġi proponuti tat-trasformazzjoni, meta xieraq;

- diskussjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI

(1) Linja ta' Gwida BBA għall-eżaminazzjoni tal-protetturi tal-pjanti fil-progress tar-reġistrazzjoni. (1990). Parti IV, Sezzjoni 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Il-Ġermanja.

(2) Kummissjoni għar-reġistrazzjoni tal-pestiċidi: L-Applikazzjoni għar-reġistrazzjoni tal-pestiċidi. (1991). Part G. Imġieba tal-prodott u l-metabiżmi tiegħu fil-ħamrija, fl-ilma u fl-arja, Sezzjoni G.2.1 (a). L-Olanda.

(3) MAFF Direttorat dwar is-Sigurtà tal-Pestiċidi. (1992). Linja ta' Gwida prelimari għall-imġieba tat-testijiet dwar il-biodegrabbilità tal-pestiċidi f'sistemi naturali ta' sediment/ilma. Ref No SC 9046. Renju Unit.

(4) Agrikoltura Kanada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) - Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.

(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.

(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.

(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality - Sampling - Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.

(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.

(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).

(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).

(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC - Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.

(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.

(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.

(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.

(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.

(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.

(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.

(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038- 1039.

(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop "A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests", 3-4 July 1991.

(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.

(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.

(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.

(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.

(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.

(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.

(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.

(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.

(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.

(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.

(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.

(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.

(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 39, 187-203.

(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 33, 47-60.

(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference - Pest and Diseases, pp 1349-1354.

[1] Per eżempju, jekk is-sustanza tat-test ikun fiha ċirku wieħed, it-tikkettjar fuq dan iċ-ċirku huwa meħtieġ; jekk is-sustanza jkun fiha tnejn jew aktar ċrieki, studji separati jistgħu ikunu meħtieġa għall-evalwazzjoni tad-destin ta' kull ċirku tikkettjat u sabiex tkun akkwistati informazzjoni utili dwar il-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.

[2] Il-karatteristiċi taż-żamma ta' l-ilma fil-ħamrija jistgħu ikunu mkejla bħala l-kapaċità ta' l-għalqa, bħala l-kapaċità tal-qasam jew bħala it-tenzjoni tal-ġibda ta' l-ilma (pF). Għal spjegazzjonijiet wara l-Anness 1. Għandu jkun irraportat fir-rapport tat-test jekk il-karatteristiċi taż-żamma ta' l-ilma u d-densità tal-massa tal-ħamrija kienux ġew determinati minn kampjuni ta' għalqa mhux disturbata jew f'waħda disturbata (kampjuni proċessati).

[3] Ir-riżultati ta' riċerka riċenti jindikaw li l-ħamrija minn żoni temperati jistgħu wkoll ikunu maħżuna fi –20 °C għal aktar minn tlett xhur (28)(29) mingħajr telf sinifikati ta' l-attivita mikrobjali.

[4] Il-ħamrija m'għandha la tkun imxarrba ż-żejjed u l-anqas xotta ż-żejjed, sabiex tinżamm arjazzjoni adekwata u n-nutriment tal-mikroflora tal-ħamrija. Il-kontenuti umidi rakkommandati għat-tkabbir ottimu mikrobjali jvarja bejn 40-60 % tal-kapaċita taż-żamma ta' l-ilma (water holding capacity (WHC)) u minn 0.1-0.33 bar (6). Din il-medda ta' l-aħħar hija ekwivalenti għal medda-pF ta' 2.0 – 2.5. Il-kontenuti tipiċi ta' l-umidità tad-diversi tipi ta' ħamrija huma moghtija fl-Anness 2.

[5] Il-kondizzjonijiet erobiċi huma dominanti fil-ħamrija tal-wiċċ u anki fil-ħamrija ta' taħt il-wiċċ bħal ma hu mhuri fil-proġett ta' riċerka sponsorjat mill-UE (K. Takagi at al. (1992). Diversità u attività mikrobjali fil-ħamrija ta' taħt: Metodi, siti fl-għelieqi, varjazzjonijiet staġjonali fit-temperaturi fil-ħamrija fis-saff ta' taħt u l-kontenuti ta' l-oosiġenu. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden). Il-kondizzjonijiet anerobiċi jistgħu iseħħu biss okkażjonalmemnt matul l-għarar tal-ħamrija wara xita qawwija jew meta l-kondizzjoni tal-mistgħadar huma stabbiliti fl-għelieqi tar-ross.

[6] Studju erbiċi jistgħu ikunu mwaqqfa ferm qabel il-129 jum, basta li l-passaġġ finali tat-trasformazzjoni u l-mineralizzazzjoni aħħarija jkunu kjarament milħuqa f'dak iż-żmien. It-terminazzjoni tat-test hija possibbli wra 120 jum, jew meta mill-anqas 90 % tas-sustanza tat-test tkun trasformata, imma biss jekk mill-anqas 5 % CO2 jkun iffurmat.

[7] Kalkolu tal-konċentrazzjoni inizjali fuq il-bażi ta' żona bl-użu ta' din l-ekwazzjoni kif ġej:Ctlamg/kgtla = Akg/ha·106mg/kg1m·104m2/ha·dkgtla/m3Cħamrija (Csoil) = konċentrazzjoni inizjali fil-ħamrija (mg.kg-1)A = Ir-rata ta' l-applikazzjoni (kg.ha-1); 1 = il-ħxuna tas-saff tal-ħamrija fl-għalqa (m); d = id-densità tal-massa xotta tal-ħamrija (kg.m-3).Bħala regola komuni, ir-rata ta' l-applikazzjoni ta' 1 kg.ha-1 tirriżulta f'konċentrazzjoni tal-ħamrija ta' madwar 1 mg.kg-1 fi saff ta'10 cm (tassumi densità tal-massa ta' 1 g . cm-3).

[1] Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.

[2] pF = il-log ta' cm tal-kolonna ta' l-ilma.

[3] 1 bar = 105 Pa.

[4] Tikkorrespondi għall-approsimazzjoni ta' kolonna ta' l-ilma ta' 19 % fil-ħamrija, 35 % fit-taflija u 45 % fit-tafal

[5] Il-kapaċità ta' l-għalqa mhux kostanti imam jvarja skond it-tip tal-ħamrija bejn 1.5 u 2.5 pF.

[1] Il-kapaċità taż-żamma ta’ l-ilma

[8] For example, if the substance contains one ring, labelling on this ring is required; if the test substance contains two or more rings, separate studies may be needed to evaluate the fate of each labelled ring and to obtain suitable information on formation of transformation products.

[9] Minħabba li dawn it-taħlitiet ta' l-assorbazzjoni alkalina jassorbaw ukoll id-diossidu tal-karbonju mill-arja tal-ventilazzjoni u dik iffurmata bir-respirazzjoni f'esperimenti erobiċi, dawn jeħtieġ li jkunu skambjati f'intervalli regolari sabiex tkun evitata s-saturazzjoni tagħhom u b'hekk it-telf tal-kapaċità ta' l-assorbazzjoni tagħhom.

[10] (Tafal + ħama') hija l-frazzjoni minerali tas-sediment b'daqs ta' partiċella ta' < 50 μm

[11] Riżultati minn riċerka riċenti kienu wrew li l-kejl tal-konċentrazzjonijiet ta' l-ossiġenu fl-ilma u tal-potenzali ta' redox la għandhom valur mekkanistiku u l-anqas predeċittiv f'dak li għandu x'jaqsam mat-tkabbir u l-iżvilupp tal-popolazzjonijiet mikrobjali fl-ilmijiet tal-wiċċ li huma ikkonċernati (24)(25). Id-determinazzjoni tat-talba għal ossiġeni biokimiku (BOD, fil-kamjunar fl-għelieqi, fil-bidu u fit-tmiem tat-test) u tal-konċentrazzjonijiet ta' nutrienti mikro/makru Ca, Mg u Mn (fil-bidu u fit-tmiem tat-test) fl-ilma u fil-kejl ta' l-N totali u P totali fis-sedimenti (fil-kamjunar fil-għalqa u fit-tmiem tat-test) jistgħu ikunu godod aħjar għall-interpretazzjoni u l-evalwazzjoni tar-rati erobiċi tal-biotrasformazzjoni u r-rotot.

[12] Il-metodu tar-rata tar-respirazzjoni mikrubjali (26), il-metodu tal-fumigazzjoni (27) u l-kejl ta' l-għadd ta' plati (e.g. batterja, aktinomiċati, fungi u kolonji totali) għal studju erobiċi; ir-rata tal-metanoġeneżi għal studji anerobiċi.

[13] Studji riċenti wrew li l-ħażna fi 4 °C tista twassal għal tnaqqis tal-kontenut tal-karbonju organiku tas-sediment li jitsa possibbilment jirriżulta fi tnaqqis ta' l-attività mikrobjali (34).

[14] Test bit-tieni konċentrazzjoni jista jkun utili għal kimiċi li jilħqu l-uċuħ ta' l-ilmijiet minn rottot differenti tad-dħul li jirriżultaw f'konċentrazzjonijiet sinifikament differenti, sa kemm il-konċentrazzjoni l-baxxa tista tkun analizzata b'eżatezza suffiċjenti.

[15] Fil-każi meta re-ossidizzazzjoni mħaffa tal-prodotti tat-trasformazzjoni anerobika jista jseħħ faċilment, il-kondizzjonijiet anerobiċi għandhom jinżammu matul il-kampjunar u l-analiżi.

--------------------------------------------------

32004L0073