2009R0152 — MT — 17.07.2014 — 004.001

---

Dan id-dokument ġie magħmul bil-ħsieb li jintuża bħala għodda ta’ dokumentazzjoni u l-istituzzjonijiet ma jassumu l-ebda responsabbiltà għall-kontenut tiegħu

►B	REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 152/2009 tas-27 ta' Jannar 2009 li jistabbilixxi l-metodi ta' teħid ta' kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf (Test b’relevanza għaż-ŻEE) (ĠU L 054, 26.2.2009, p.1)

Emendat bi:

		Il-Ġurnal Uffiċjali
		No	page	date
M1	REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) Nru 278/2012 tat-28 ta’ Marzu 2012	L 91	8	29.3.2012
►M2	REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) Nru 51/2013 tas-16 ta’ Jannar 2013	L 20	33	23.1.2013
►M3	REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) Nru 691/2013 tad-19 ta’ Lulju 2013	L 197	1	20.7.2013
►M4	REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) Nru 709/2014 tal-20 ta' Ġunju 2014	L 188	1	27.6.2014

---

▼B

REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 152/2009

tas-27 ta' Jannar 2009

li jistabbilixxi l-metodi ta' teħid ta' kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf

(Test b’relevanza għaż-ŻEE)

▼M3

Artikolu 1

Il-kampjunar għall-kontroll uffiċjali tal-għalf, b’mod partikolari biex jiġu ddeterminati l-kostitwenti, inkluż materjal li fih organiżmi ġenetikament modifikati (GMOs), jikkonsisti minnhom jew jiġi prodott minnhom, l-addittivi tal-għalf kif definiti fir-Regolament (KE) Nru 1831/2003 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill ( 20 ), u s-sustanzi mhux mixtieqa kif definiti fid-Direttiva 2002/32/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill ( 21 ), għandu jsir skont il-metodi stabbiliti fl-Anness I.

Il-metodu ta’ kampjunar stabbilit fl-Anness I huwa applikabbli biex jiġi kkontrollat l-għalf bil-għan li jiġu ddeterminati r-residwi mill-pestiċidi kif definit fir-Regolament (KE) Nru 396/2005 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill ( 22 ) u biex tiġi vverifikata l-konformità mar-Regolament (UE) Nru 619/2011.

▼B

Artikolu 2

Il-preparazzjoni tal-kampjuni għall-analiżi u l-espressjoni tar-riżultati għandha ssir skont il-metodi stabbiliti fl-Anness II.

Artikolu 3

L-analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf għandha ssir bl-użu tal-metodi stabbiliti fl-Anness III (Metodi ta' analiżi biex tiġi kkontrollata l-kompożizzjoni tal-materjal tal-għalf u l-għalf kompost), fl-Anness IV (Metodi ta' analiżi biex jiġi kkontrollat il-livell ta' addittivi awtorizzati fl-għalf) u fl-Anness VI (Metodi ta' analiżi għad-determinazzjoni ta' kostitwenti li ġejjin mill-annimali għall-kontroll uffiċjali tal-għalf).

Artikolu 4

Il-valur ta' enerġija tal-għalf kompost għat-tjur għandu jiġi kkalkulat skont l-Anness VII.

Artikolu 5

Il-metodi ta' analiżi għall-kontroll tal-preżenza illegali ta' addittivi li m’għadhomx awtorizzati fl-għalf stabbiliti fl-Anness VIII għandhom jintużaw għal skopijiet ta' konferma.

Artikolu 6

Id-Direttivi 71/250/KEE, 71/393/KEE, 72/199/KEE, 73/46/KEE, 76/371/KEE, 76/372/KEE, 78/633/KEE, 81/715/KEE, 84/425/KEE, 86/174/KEE, 93/70/KEE, 93/117/KE, 98/64/KE, 1999/27/KE, 1999/76/KE, 2000/45/KE, 2002/70/KE u 2003/126/KE huma revokati.

Ir-referenzi għad-Direttivi revokati għandhom jiġu interpretati bħala referenzi għal dan ir-Regolament u għandhom jinqraw skont it-tabelli ta' korrelazzjoni fl-Anness IX.

Artikolu 7

Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum ta' wara l-pubblikazzjoni tiegħu f’Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.

Dan għandu japplika mis-26 ta' Awwissu 2009.

Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u għandu japplika direttament fl-Istati Membri kollha.

▼M3

---

ANNESS I

METODI TA’ KAMPJUNAR

1.   L-GĦAN U L-KAMP TA’ APPLIKAZZJONI

Il-kampjuni intiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf għandhom jittieħdu skont il-metodi deskritti hawn taħt. Il-kampjuni miksubin b’dan il-mod jitqiesu rappreżentattivi tal-porzjonijiet kampjunati.

L-għan tal-kampjunar rappreżentattiv hu li tinkiseb frazzjoni żgħira minn lott b’mod li meta tiġi ddeterminata xi karatteristika partikolari ta’ din il-frazzjoni, din tkun tirrappreżenta l-valur medju tal-karatteristika tal-lott. Il-kampjunar mil-lott isir billi ripetutament jittieħdu kampjuni inkrimentali minn għadd ta’ punti partikolari mil-lott. Dawn il-kampjuni inkrimentali jiġu kkumbinati billi jitħalltu hekk li jiffurmaw kampjun wieħed biex minnu jiġu ppreparati kampjuni rappreżentattivi finali permezz ta’ qsim rappreżentattiv.

Jekk minn spezzjoni viżiva l-porzjonijiet tal-għalf li jkunu se jiġu kampjunati jkunu jidhru ta’ kwalità differenti mill-bqija tal-għalf mill-istess lott, dawn il-porzjonijiet jiġu separati mill-bqija tal-għalf u jiġu ttrattati bħala sublott separat. Jekk ma jkunx possibbli li l-għalf jiġi diviż f’sublottijiet separati, l-għalf jiġi kampjunat bħallikieku hu lott wieħed. F’każijiet bħal dawn, dan irid jissemma fir-rapport dwar il-kampjunar.

Meta l-għalf kampjunat skont id-dispożizzjonijiet ta’ dan ir-Regolament jiġi ddeterminat li ma jissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, u jkun parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni, jiġi preżunt li dan japplika għall-għalf kollu f’dak il-lott, kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma jirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

2.   DEFINIZZJONIJIET

—

Lott : kwantità identifikata ta’ għalf iddikjarata li għandha karatteristiċi komuni, bħalma huma l-oriġini, il-varjetà, it-tip ta’ imballaġġ, il-pakkettist, l-ispeditur jew it-tikkettar, u fil-każ ta’ proċess tal-produzzjoni, unità ta’ produzzjoni minn impjant wieħed bl-użu ta’ parametri tal-produzzjoni uniformi jew numru ta’ tali unitajiet, meta jkunu prodotti f’ordni kontinwa u maħżuna flimkien,

—	Porzjon kampjunat : lott jew parti identifikata mil-lott jew mis-sublott,

—	Kampjun issiġillat : kampjun issiġillat b’tali mod li ma jkun possibbli l-ebda aċċess għall-kampjun mingħajr ma jitkisser jew jitneħħa s-siġill,

—	Kampjun inkrimentali : kwantità meħuda minn punt wieħed fil-porzjon kampjunat,

—	Kampjun aggregat : aggregat ta’ kampjuni inkrimentali meħudin mill-istess porzjon kampjunat,

—	Kampjun ridott : parti minn kampjun aggregat, miksuba minnu bi proċess ta’ riduzzjoni rappreżentattiva,

—	Kampjun finali : parti mill-kampjun ridott jew mill-kampjun aggregat omoġenizzat,

—	Kampjun tal-laboratorju : kampjun intenzjonat għal-laboratorju (kif jasal fil-laboratorju) u jista’ jkun il-kampjun finali, ridott jew dak aggregat.

3.   DISPOŻIZZJONIJIET ĠENERALI

4.   APPARAT

4.1.	L-apparat għall-kampjunar irid ikun magħmul minn materjal li ma jikkontaminax il-prodotti li jridu jiġu kampjunati. Apparat li huwa intiż biex jintuża iktar minn darba jrid ikun wieħed li faċli jitnaddaf biex tkun evitata l-kontaminazzjoni kroċjata.

4.2.

Apparat rakkomandat għall-kampjunar minn għalf solidu 4.2.1.    Kampjunar manwali 4.2.1.1.   Pala b’qiegħ ċatt bil-ġnub weqfin. 4.2.1.2. Paletta tal-kampjunar b’qasma twila jew bil-kompartimenti. Il-qisien tal-paletta tal-kampjunar iridu jkunu adattati għall-karatteristiċi tal-porzjon kampjunat (il-fond tal-kontenitur, id-dimensjonijiet tal-ixkora, eċċ.) u għad-daqs tal-partikoli tal-għalf. Fil-każ li l-paletta tal-kampjunar ikollha bosta fetħiet, sabiex jiġi żgurat li l-kampjun jittieħed minn postijiet differenti fil-paletta, il-fetħiet għandhom ikunu separati permezz ta’ kompartimenti jew ta’ fetħiet imtawla, waħda viċin l-oħra. 4.2.2.    Kampjunar mekkaniku Għall-kampjunar ta’ għalf fi fluss jista’ jintuża apparat mekkaniku adattat. “Adattat” tfisser li tal-anqas tiġi kampjunata s-sezzjoni kollha tal-għalf fi fluss. Il-kampjunar tal-għalf fi fluss (fi fluss mgħaġġel) jista’ jitwettaq permezz ta’ mekkaniżmi awtomatiċi għall-kampjunar. 4.2.3.    Diviżur Jekk possibbli u jekk ikun f’loku, biex jiġu ppreparati kampjuni ridotti b’mod rappreżentattiv, għandu jintuża apparat imfassal biex jiddividi l-kampjun f’partijiet bejn wieħed u ieħor indaqs.

5.   REKWIŻITI KWANTITATTIVI DWAR L-GĦADD TA’ KAMPJUNI INKRIMENTALI

5.1.    Rekwiżiti kwantitattivi rigward kampjuni inkrimentali b’rabta mal-kontroll ta’ sustanzi jew ta’ prodotti ddistribwiti b’mod uniformi fl-għalf

5.1.1.    Għalf solidu mhux imballaġġat

5.1.2.    Għalf likwidu mhux imballaġġat

5.1.3.    Għalf imballaġġat

L-għalf (solidu u likwidu) jista’ jkun imballaġġat f’boroż, xkejjer, laned, bramel, eċċ. li fit-tabella jissemmew bħala unitajiet. L-unitajiet kbar (≥ 500 kg jew litru) iridu jiġu kampjunati skont id-dispożizzjonijiet previsti għall-għalf mhux imballaġġat (ara l-punti 5.1.1 u 5.1.2)

5.1.4.    Blokok tal-għalf u licks minerali

Mill-inqas jittieħed kampjun minn blokka jew lick għal kull porzjon kampjunat ta’ 25 unità, sa massimu ta’ erba’ blokok jew licks.

Għal blokok jew licks li ma jiżnux aktar minn 1 kg kull wieħed, kampjun inkrimentali għandu jkun il-kontenut ta’ blokka waħda jew lick waħda.

5.1.5.    Għalf oħxon/foraġġ

5.2.    Rekwiżiti kwantitattivi rigward kampjuni inkrementali b’rabta mal-kontroll ta’ kostitwenti jew sustanzi li x’aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fl-għalf

Dawn ir-rekwiżiti kwantitattivi b’rabta ma’ kampjuni inkrimentali jridu jintużaw fis-sitwazzjonijiet li ġejjin:

Fil-każ li l-awtorità ta’ kontroll jiġiha suspett qawwi li t-tali distribuzzjoni mingħajr uniformità sseħħ ukoll fil-każ ta’ kontaminazzjoni kroċjata minn kostitwent jew sustanza f’għalf kompost, ikunu jistgħu jiġu applikati r-rekwiżiti kwantitattivi kif stipulati fit-tabella ta’ hawn taħt.

5.3.    Rekwiżiti kwantitattivi fir-rigward ta’ kampjuni inkrimentali fil-każ ta’ lottijiet kbar ħafna

Fil-każ ta’ porzjonijiet kampjun kbar ħafna (porzjonijiet kampjun > 500 tunnellata), l-għadd ta’ kampjuni inkrimentali li għandu jittieħed = 40 kampjun inkrimentali + √tunnellati fejn jidħol il-kontroll ta’ sustanzi jew prodotti ddistribwiti b’mod uniformi fl-għalf, jew 100 kampjun inkrimentali + √tunnellati fejn jidħol il-kontroll ta’ kostitwenti jew sustanzi li x’aktarx jiġu distribwiti mingħajr uniformità fil-materjal tal-għalf.

6.   REKWIŻITI KWANTITATTIVI FIR-RIGWARD TA’ KAMPJUN AGGREGAT

7.   REKWIŻITI KWANTITATTIVI FIR-RIGWARD TA’ KAMPJUNI FINALI

Kampjuni finali

Hija meħtieġa l-analiżi ta’ mill-inqas kampjun finali wieħed. L-ammont fil-kampjun finali li jkun se jiġi analizzat ma għandux ikun inqas minn kif ġej:

8.   METODU TA’ KAMPJUNAR GĦAL LOTTIJIET KBAR ĦAFNA JEW LOTTIJIET MAĦŻUNA JEW TRASPORTAT B’MOD LI MA JKUNX FATTIBBLI LI JSIR KAMPJUNAR TAL-LOTT KOLLU

8.1.    Prinċipji ġenerali

Jekk il-mod ta’ trasport jew ta’ ħażna ta’ lott ma jippermettix li jittieħdu kampjuni inkrimentali mil-lott kollu, il-kampjunar ta’ tali lottijiet preferibbilment għandu jsir meta l-lott ikun fi fluss.

Fil-każ ta’ mħażen kbar intiżi biex jaħżnu l-għalf, l-operaturi għandhom jiġu inkoraġġuti jinstallaw tagħmir fil-maħżen li jippermetti l-kampjunar (awtomatiku) mil-lott kollu maħżun.

Fil-każ li jiġu applikati l-proċeduri ta’ kampjunar previsti f’dan il-Kapitolu 8, l-operatur tan-negozju tal-għalf jew ir-rappreżentant tiegħu jiġi infurmat dwar il-proċedura tal-kampjunar. Jekk din il-proċedura ta’ kampjunar tiġi kkontestata mill-operatur tan-negozju tal-għalf jew mir-rappreżentant tiegħu, l-operatur tan-negozju tal-għalf jew ir-rappreżentant tiegħu għandhom jippermettu lill-awtorità kompetenti tieħu kampjuni mil-lott kollu bi spejjeż tagħhom.

8.2.    Lottijiet kbar trasportati bil-baħar

8.2.1.    Kampjunar dinamiku ta’ lottijiet kbar trasportati bil-baħar

Il-kampjunar ta’ lottijiet kbar fuq il-bastimenti preferibbilment isir filwaqt li l-prodott ikun fi fluss (kampjunar dinamiku).

Il-kampjunar isir għal kull stiva (entità li tkun tista’ tiġi separata fiżikament). L-istivi madankollu jiġu mbattla parzjalment, waħda wara l-oħra, biex is-separazzjoni fiżika inizjali ma tibqax hemm wara t-trasferiment tal-lottijiet f’faċilitajiet tal-ħżin. Il-kampjunar għalhekk jista’ jsir skont is-separazzjoni fiżika inizjali jew skont is-separazzjoni wara t-trasferiment fil-faċilitajiet tal-ħżin.

Il-ħatt ta’ vapur jista’ jdum diversi jiem. Normalment, il-kampjunar isir f’intervalli regolari tul il-perjodu kollu li fih ikun għaddej il-ħatt. Madankollu mhux dejjem ikun fattibbli jew f’loku li jkun hemm spettur uffiċjali preżenti waqt il-kampjunar tul l-operazzjoni kollha tal-ħatt. Għaldaqstant, il-kampjunar jitħalla jsir fuq parti (porzjon kampjunat) mil-lott kollu. L-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jiġi stabbilit billi jittieħed kont tad-daqs tal-porzjon kampjunat.

Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

Anke jekk il-kampjun uffiċjali jittieħed b’mod awtomatiku, il-preżenza ta’ spettur hija neċessarja. Madankollu, meta l-kampjunar awtomatiku jsir skont parametri ddeterminati minn qabel u li ma jkunux jistgħu jinbidlu waqt il-kampjunar, u l-kampjuni inkrimentali jinġabru f’reċipjent issiġillat b’mod li jelimina kull possibbiltà ta’ frodi, il-preżenza ta’ spettur allura tkun meħtieġa biss fil-bidu tal-kampjunar, kull darba li r-reċipjent tal-kampjuni jkun irid jinbidel u fi tmiem il-kampjunar.

8.2.2.    Kampjunar tal-lottijiet trasportati bil-baħar permezz ta’ kampjunar statiku

Jekk il-kampjunar isir b’mod statiku, tkun trid tiġi applikata l-istess proċedura kif prevista fil-faċilitajiet ta’ ħżin (sajlos) aċċessibbli minn fuq (ara l-punt 8.4.1).

Il-kampjunar isir fuq il-parti aċċessibbli (minn fuq) tal-lott/stiva. L-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jiġi stabbilit billi jittieħed kont tad-daqs tal-porzjon kampjunat. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.3.    Il-kampjunar ta’ lottijiet kbar maħżuna fi mħażen

Għaldaqstant, il-kampjunar irid isir fuq il-parti aċċessibbli tal-lott. L-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jiġi stabbilit billi jittieħed kont tad-daqs tal-porzjon kampjunat. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.4.    Il-kampjunar ta’ faċilitajiet ta’ ħażna (sajlos)

8.4.1.    Il-kampjunar minn sajlos (faċilment) aċċessibbli minn fuq

Il-kampjunar irid isir fuq il-parti aċċessibbli tal-lott. L-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jiġi stabbilit billi jittieħed kont tad-daqs tal-porzjon kampjunat. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.4.2.    Il-kampjunar minn sajlos mhux aċċessibbli minn fuq (sajlos magħluqa)

8.4.2.1.    Sajlos mhux aċċessibbli minn fuq (sajlos magħluqa) ta’ > 100 tunnellata

Għalf maħżun f’sajlos bħal dawn ma jistax jitteħidlu kampjun b’mod statiku. Għalhekk, jekk l-għalf maħżun fis-sajlo jrid jittieħed kampjun minnu u ma hemm l-ebda possibbiltà li l-kunsinna tiċċaqlaq, irid isir ftehim mal-operatur li hu jrid jinforma l-ispettur dwar meta jkun se jinħatt is-sajlo hekk li l-kampjunar isir meta l-għalf ikun fi fluss.

8.4.2.2.    Sajlos mhux aċċessibbli minn fuq (sajlos magħluqa) ta’ < 100 tunnellata

Il-proċedura tal-kampjunar tinvolvi li f’kontejner tiġi rilaxxata kwantità ta’ bejn 50 u 100 kg biex imbagħad jittieħed il-kampjun minnha. Id-daqs tal-kampjun aggregat jikkorrispondi mal-lott kollu u l-għadd ta’ kampjuni inkrimentali jikkorrispondu mal-kwantità rilaxxata mis-sajlo għal ġo reċipjent biex jittieħed kampjun minnha. Meta jittieħed kampjun minn parti minn lott ta’ għalf tal-istess klassi jew deskrizzjoni u jinstab li dik il-parti mil-lott ma tissodisfax ir-rekwiżiti tal-UE, jiġi preżunt li l-għalf kollu f’dak il-lott huwa affettwat bl-istess mod, u dan kemm-il darba minn valutazzjoni dettaljata ma tirriżulta l-ebda evidenza li l-bqija tal-lott jonqos milli jissodisfa r-rekwiżiti tal-UE.

8.5.    Kampjunar ta’ għalf mhux imballaġġat, u f’kontenituri kbar u magħluqa

Spiss, dawn il-lottijiet ikun jista’ jittieħed kampjun minnhom biss wara li jinħattu. F’ċerti każi ma jkunx possibbli li jinħattu fil-post li jaslu fih mal-importazzjoni jew fejn jiġu kkontrollati, u għalhekk il-kampjunar għandu jsir meta jinħattu dawn il-kontenituri.

9.   STRUZZJONIJIET GĦAT-TEĦID, IL-PREPARAZZJONI U L-IMBALLAĠĠ TAL-KAMPJUNI

9.1.    Ġenerali

Il-kampjuni jridu jittieħdu u jiġu ppreparati kemm jista’ jkun malajr filwaqt li wieħed iżomm f’moħħu l-prekawzjonijiet neċessarji biex ikun żgurat li l-prodott la jinbidel u lanqas jiġi kkontaminat. Kemm l-istrumenti kif ukoll is-superfiċji u l-kontenituri maħsuba biex jiġu f’kuntatt mal-kampjuni għandhom ikunu nodfa u xotti.

9.2.    Kampjuni inkrimentali

Mill-porzjon kampjunat kollu jridu jittieħdu kampjuni inkrimentali b’mod aleatorju, u bejn wieħed u ieħor iridu jkunu tal-istess daqs.

Id-daqs tal-kampjun inkrimentali jkun mill-inqas 100 gramma, inkella 25 gramma fil-każ ta’ għalf oħxon jew foraġġ bi gravità speċifika baxxa.

Meta jkunu jridu jittieħdu inqas minn 40 kampjun inkrimentali, skont ir-regoli dwar il-proċedura tal-kampjunar stabbiliti fil-punt 8, id-daqs tal-kampjuni inkrimentali jiġi ddeterminat skont id-daqs mitlub għall-kampjun aggregat li jkun irid jittieħed (ara l-punt 6).

Fil-każ tal-kampjunar ta’ lottijiet żgħar ta’ għalf imballaġġat fejn, skont ir-rekwiżiti kwantitattivi, ikun irid jittieħed numru limitat ta’ kampjuni inkrimentali, kampjun inkrimentali jkun kostitwit mill-kontenut ta’ unità waħda oriġinali li l-kontenut tagħha ma jkunx jaqbeż il-1 kg jew litru.

Fil-każ ta’ kampjunar ta’ għalf imballaġġat u magħmul minn unitajiet żgħar (eż. < 250 g), id-daqs tal-kampjun inkrimentali jiddependi mid-daqs tal-unità.

9.2.1.    Għalf mhux imballaġġat

Fejn ikun hemm bżonn, it-teħid ta’ kampjuni jista’ jsir meta l-porzjon kampjunat ikun qiegħed jiġi spustjat (jitgħabba jew jinħatt).

9.2.2.    Għalf imballaġġat

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ unitajiet għall-kampjunar, kif indikat fil-Kapitolu 5, parti mill-kontenut ta’ kull pakkett titneħħa permezz ta’ paletta jew pala. Fejn ikun meħtieġ, il-kampjuni jittieħdu wara li l-unitajiet jitbattlu separatament.

9.2.3.    Għalf likwidu jew semilikwidu, omoġenju jew omoġenizzabbli

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ unitajiet għall-kampjunar, kif indikat fil-Kapitolu 5, jekk ikun meħtieġ il-kontenut jiġi omoġenizzat u jittieħed ammont minn kull unità.

Il-kampjuni inkrimentali jistgħu jittieħdu meta l-kontenut ikun qiegħed jinħatt.

9.2.4.    Għalf likwidu jew semilikwidu mhux omoġenizzabbli

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ unitajiet għall-kampjunar, kif indikat fil-Kapitolu 5, jittieħdu kampjuni minn livelli differenti.

Jistgħu wkoll jittieħdu kampjuni meta l-kontenut ikun qiegħed jinħatt imma l-ewwel frazzjonijiet għandhom jintremew.

F’kull każ, il-volum totali meħud ma għandux ikun inqas minn 10 litri.

9.2.5.    Blokok tal-għalf u licks minerali

Wara li jkun intgħażel l-għadd meħtieġ ta’ blokok jew licks għall-kampjunar kif indikat fil-Kapitolu 5, tista’ tittieħed parti minn kull blokka jew lick. F’każ ta’ suspett ta’ blokka jew lick mhux omoġenja, bħala kampjun tista’ tittieħed il-blokka jew il-lick sħiħa.

Għal blokok jew licks li ma jiżnux aktar minn 1 kg kull wieħed, jittieħed bħala kampjun inkrimentali il-kontenut ta’ blokka waħda jew lick waħda.

9.3.    Preparazzjoni tal-kampjuni aggregati

Il-kampjuni inkrimentali jitħalltu biex jagħmlu kampjun aggregat wieħed.

9.4.    Preparazzjoni tal-kampjuni finali

Il-materjal fil-kampjun aggregat jitħallat tajjeb ( 23 ).

9.5.    Imballaġġ tal-kampjuni

Il-kontenituri jew il-pakketti għandhom jiġu ssiġillati u ttikkettjati b’tali mod li ma jkunux jistgħu jinfetħu mingħajr ma ssir ħsara lis-siġill. It-tikketta trid tkun inkorporata għalkollox fis-siġill.

9.6.    L-ispedizzjoni ta’ kampjuni fil-laboratorju

Il-kampjun għandu jintbagħat mingħajr telf ta’ żmien lil-laboratorju analitiku magħżul, flimkien mal-informazzjoni essenzjali għall-analista.

10.   REĠISTRAZZJONI TAL-KAMPJUNI

Kull kampjun irid jiġi reġistrat, hekk li kull porzjon kampjunat u d-daqs tiegħu jiġu identifikati b’mod ċar.

Ir-reġistrazzjoni għandha tinkludi kull devjazzjoni mill-proċedura tal-kampjunar kif previst f’dan ir-Regolament.

Barra milli tkun disponibbli għal-laboratorju uffiċjali ta’ kontroll, ir-reġistrazzjoni trid tkun disponibbli wkoll għall-operatur tan-negozju tal-għalf u/jew il-laboratorju magħżul mill-operatur tan-negozju tal-għalf.

---

ANNESS II

DISPOŻIZZJONIJIET ĠENERALI DWAR IL-METODI TA’ ANALIŻI TAL-GĦALF

A.   PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUNI GĦALL-ANALIŻI

1.    L-iskop

Il-proċeduri deskritti hawn taħt jikkonċernaw il-preparazzjoni għall-analiżi tal-kampjuni mibgħuta fil-laboratorji tal-kontroll wara l-proċess tal-kampjunar skont id-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.

Il-kampjuni tal-laboratorju jridu jiġu ppreparati b’tali mod li l-ammonti li jintiżnu, kif stipulat fil-metodi ta’ analiżi, ikunu omoġenji u jirrappreżentaw il-kampjuni finali.

2.    Prekawzjonijiet li jridu jittieħdu

Il-proċedura li trid tiġi segwita tiddependi mill-metodi ta’ analiżi li jridu jintużaw, u mill-kostitwenti jew is-sustanzi li jkunu se jiġu kkontrollati. Għalhekk huwa importanti ferm li wieħed jiżgura li l-proċedura tal-preparazzjoni tal-kampjun segwita tkun adattata għall-metodu ta’ analiżi użat u għall-kostitwenti jew is-sustanzi li jkunu se jiġu kkontrollati.

L-operazzjonijiet neċessarji kollha jridu jsiru b’tali mod li kemm jista’ jkun tiġi evitata kemm il-kontaminazzjoni tal-kampjun u kemm kull bidla fil-kompożizzjoni tiegħu.

It-tħin, it-taħlit u l-għarbil għandhom isiru kemm jista’ jkun malajr hekk li l-kampjun kemm jista’ jkun ma jkunx espost għall-arja u d-dawl, jew inkella verament mill-inqas. M’għandhomx jintużaw imtieħen u moli li jistgħu jsaħħnu l-kampjun b’mod sinifikanti.

It-tħin manwali huwa rakkomandat fil-każ ta’ għalf li jkun partikolarment sensittiv għas-sħana. Wieħed irid joqgħod attent u jiżgura li l-apparat innifsu ma jkunx sors ta’ kontaminazzjoni.

Jekk il-preparazzjoni ma tkunx tista’ ssir mingħajr ma taffettwa b’mod sostanzjali l-kontenut umdu tal-kampjun, iddetermina l-kontenut umdu qabel u wara l-preparazzjoni skont il-metodu stabbilit fil-Parti A tal-Anness III.

3.    Proċedura

3.1.    Proċedura ġenerali

L-alikwota tat-test tittieħed mill-kampjun finali. Il-metodu ta’ formazzjoni ta’ konu u ta’ qsim f’erba’ partijiet mhux rakkomandat għax dan jista’ jwassal għal alikwoti tat-test bi probabbiltà għolja ta’ żball fil-qsim.

3.1.1.    Għalf li jista’ jintaħan kif inhu

3.1.2.    Għalf li jista’ jintaħan wara li jinxef

3.1.3.    Għalf likwidu jew semilikwidu

3.1.4.    Għalf ieħor

3.2.    Il-proċedura speċifika f’każ ta’ eżami bi spezzjoni viżiva jew bil-mikroskopija jew f’każijiet fejn jiġi omoġenizzat il-kampjun aggregat sħiħ

4.    Ħżin tal-kampjuni

Il-kampjuni jridu jinħażnu f’temperatura li ma tibdilx il-kompożizzjoni tagħhom. Il-kampjuni intenzjonati għall-analiżi ta’ vitamini jew sustanzi li huma partikolarment sensittivi għad-dawl għandhom jinħażnu b’mod li l-kampjun ma jiġix affettwat ħażin mid-dawl.

B.   DISPOŻIZZJONIJIET MARBUTA MAR-REAĠENTI U MAL-APPARAT UŻAT FIL-METODI TA’ ANALIŻI

C.   APPLIKAZZJONI TAL-METODI TA’ ANALIŻI U L-ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

1.    Proċedura ta’ estrazzjoni

Hemm diversi metodi li jiddeterminaw proċedura ta’ estrazzjoni speċifika. Bħala regola ġenerali, jistgħu jiġu applikati proċeduri oħrajn ta’ estrazzjoni apparti l-proċedura msemmija, bil-kundizzjoni li tkun ingħatat prova li l-proċedura ta’ estrazzjoni użata hija ekwivalenti f’dik li effiċjenza fl-estrazzjoni għall-matriċi analizzata bħall-proċedura msemmija fil-metodu.

2.    Proċedura ta’ tindif

Hemm diversi metodi li jiddeterminaw proċedura speċifika ta’ tindif. Bħala regola ġenerali, jistgħu jiġu applikati proċeduri oħra ta’ tindif apparti l-proċedura msemmija, bil-kundizzjoni li tkun ingħatat prova li l-proċedura ta’ tindif użata twassal għal riżultati analitiċi ekwivalenti għall-matriċi analizzata bħall-proċedura msemmija fil-metodu.

3.    In-numru ta’ determinazzjonijiet

Fil-każ tal-analiżi ta’ sustanzi mhux mixtieqa, jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni ikun sostanzjalment (> 50 %) inqas mill-ispeċifikazzjoni li trid tiġi kkontrollata, m’hemmx bżonn ta’ determinazzjonijiet addizzjonali, bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta’ kwalità xierqa. F’każijiet oħra jkun hemm bżonn ta’ analiżi duplikata (it-tieni determinazzjoni) u dan sabiex tiġi eskluża l-possibbiltà ta’ kontaminazzjoni kroċjata interna jew li, bi żball, jitħawwad kampjun ma’ ieħor. Biex tkun verifikata l-konformità tintuża l-medja taż-żewġ determinazzjonijiet, u dan filwaqt li jittieħed kont tal-inċertezza tal-kejl.

Fil-każ tal-kontroll tal-kontenut iddikjarat ta’ sustanza jew ingredjent, jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni jikkonferma l-kontenut iddikjarat, jiġifieri jekk ir-riżultat analitiku jaqa’ fil-marġni ta’ varjazzjoni aċċettabbli tal-kontenut iddikjarat, ma jkun hemm bżonn tal-ebda determinazzjoni addizzjonali, u dan bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta’ kwalità addattati. F’każijiet oħra jkun hemm bżonn ta’ analiżi duplikata (it-tieni determinazzjoni) u dan sabiex tiġi eskluża l-possibbiltà ta’ kontaminazzjoni kroċjata interna jew li, bi żball, jitħawwad kampjun ma’ ieħor. Biex tkun verifikata l-konformità tintuża l-medja taż-żewġ determinazzjonijiet, u dan filwaqt li jittieħed kont tal-inċertezza tal-kejl.

F’ċerti każijiet dan il-marġni ta’ varjazzjoni aċċettabbli huwa definit fil-leġiżlazzjoni bħalma hu l-każ fir-Regolament (KE) Nru 767/2009 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-13 ta’ Lulju 2009 dwar it-tqegħid fis-suq u l-użu ta’għalf, li jemenda r-Regolament tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (KE) Nru 1831/2003 u li jħassar id-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE, id-Direttiva tal-Kummissjoni 80/511/KEE, id-Direttivi tal-Kunsill 82/471/KEE, 83/228/KEE, 93/74/KEE, 93/113/KE u 96/25/KE u d-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 2004/217/KE ( 26 ).

4.    Rappurtaġġ tal-metodu ta’ analiżi użat

Ir-rapport tal-analiżi għandu jsemmi l-metodu ta’ analiżi użat.

5.    Rappurtaġġ tar-riżultat analitiku

Ir-riżultat analitiku għandu jiġi espress bil-mod stabbilit fil-metodu ta’ analiżi, f’numru xieraq ta’ ċifri sinifikanti, u jekk ikun hemm bżonn, għandu jiġi kkoreġut skont il-kontenut umdu tal-kampjun finali qabel il-preparazzjoni.

6.    Inċertezza tal-kejl u r-rata ta’ rkupru fil-każ ta’ analiżi ta’ sustanzi mhux mixtieqa.

Rigward is-sustanzi mhux mixtieqa fit-tifsira tad-Direttiva 2002/32/KE, prodott intenzjonat għall-għalf tal-annimali għandu jitqies mhux konformi mal-kontenut massimu stabbilit, kemm-il darba r-riżultat analitiku, b’relazzjoni mal-għalf b’kontenut umdu ta’ 12 %, jitqies li jaqbeż il-kontenut massimu filwaqt li jittieħed kont kemm tal-inċertezza tal-kejl estiża kif ukoll tal-korrezzjoni għall-irkupru. Sabiex tiġi analizzata l-konformità, tintuża l-konċentrazzjoni analizzata wara li tiġi kkoreġuta għall-irkupru u wara t-tnaqqis tal-inċertezza tal-kejl estiża. Din il-proċedura hija applikabbli biss f’każijiet fejn il-metodu ta’ analiżi jippermetti l-istima tal-inċertezza tal-kejl u l-korrezzjoni għall-irkupru (eż. mhux possibbli fil-każ ta’ analiżi mikroskopika).

Ir-riżultat analitiku għandu jiġi rappurtat kif ġej (sakemm il-metodu ta’ analiżi użat jippermetti li tiġi stmata l-inċertezza tal-kejl u r-rata ta’ rkupru):

Madankollu, jekk ir-riżultat tal-analiżi jkun sostanzjalment (> 50 %) inqas mill-ispeċifikazzjoni li trid tiġi kkontrollata, u bil-kundizzjoni li jiġu applikati l-proċeduri ta’ kwalità addattati, u l-analiżi sservi biss l-iskop li tiġi ċċekkjata l-konformità mad-dispożizzjonijiet legali, ir-riżultat analitiku jista’ jiġi rrappurtat mingħajr korrezzjoni għall-irkupru u, f’dawn il-każijiet, ir-rappurtaġġ tar-rata tal-irkupru u l-inċertezza tal-kejl jistgħu jitħallew barra.

▼B

---

ANNESS III

METODI TA' ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-KOMPOŻIZZJONI TAL-MATERJALI TAL-GĦALF U L-GĦALF KOMPOST

A.   DETERMINAZZJONI TAL-UMDITÀ

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-umdità fl-għalf. Fil-każ ta' għalf li jkun fih sustanzi volatili, bħall-aċidi organiċi, għandu jiġi osservati li ammont sinifikanti ta' sustanzi volatili wkoll jiġi determinat flimkien mal-umdità.

Dan ma jkoprix l-analiżi ta' prodotti tal-ħalib bħala materjal għall-għalf, l-analiżi ta' sustanzi minerali u taħlitiet fil-maġġoranza komposti minn sustanzi minerali, l-analiżi ta' xaħmijiet u żjut mill-annimali u mill-ħxejjex jew l-analiżi taż-żerriegħa taż-żejt u frott żejtni.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jitnixxef taħt kundizzjonijiet speċifikati li jvarjaw skont in-natura tal-għalf. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin. Huwa neċessarju li tagħmel tnixxif preliminari meta tkun qed titratta ma' għalf solidu li li għandu kontenut ta' umdità għoli.

3.   Apparat

4.   Proċedura

N.B.	L-operazzjonijiet deskritti f'din it-taqsima jridu jsiru immedjatament wara li jinfetħu l-pakketti tal-kampjuni. Tal-inqas, l-analiżi trid issir darbtejn.

4.1.   Preparazzjoni

4.1.1.    Għalf għajr dak imniżżel taħt 4.1.2 u 4.1.3

Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Jekk ikun hemm bżonn, farrak jew aqsam b'tali mod li tevita kwalunkwe varjazzjoni fl-umdità (ara 6).

4.1.2.    Ċereali u xgħir u barli mitħun oħxon

Ħu tal-inqas 50 g mill-kampjun. Itħan f'partikoli li minnhom tal-inqas 50 % jgħaddu minn passatur b'malji ta' 0,5 mm u ma jibqax iktar minn 10 % skart f'passatur tond b'malji ta' 1 mm

4.1.3.    Għalf f'forma likwida jew pejst, għalf kompost fil-maġġoranza minn żjut u xaħmijiet

Ħu madwar 25 g mill-kampjun, iżen sal-eqreb 10 mg, żid kwantità xierqa ta' ramel anidridu miżun sal-eqreb 10 mg u ħallat sakemm jinkiseb prodott omoġenju.

4.2.   Tnixxif

4.2.1.    Għalf aparti dak taħt 4.2.2 u 4.2.3

Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 1 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 103 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Ħallih ħa jinxef għal madwar erba' sigħat ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 103 oC. Erġa' poġġi l-għatu fuq il-kontenitur, u neħħih mill-forn u ħallih jibred għal madwar 30 sa 45 minuta fid-dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.

Għal għalf kompost fil-maġġoranza minn żjut u xaħmijiet, nixxef fil-forn għal 30 minuta oħra b'temperatura ta' 130 oC. Id-differenza bejn użin u ieħor m'għandhiex tkun aktar minn 0,1 % tal-umdità.

4.2.2.    Ċereali, dqiq, xgħir u barli mitħun oħxon u qamħ mitħun mhux raffinat

Iżen kontenitur (3.3) bl-għatu sal-eqreb 0,5 mg. Fil-kontenitur miżun, iżen sal-eqreb 1 mg, madwar 5 g tal-kampjun mitħun u xerred b'mod uniformi. Poġġi l-kontenitur mingħajr l-għatu fil-forn li jkun diġà msaħħan sa 130 oC. Sabiex it-temperatura tal-forn tinżamm milli tinżel ħafna, introduċi l-kontenitur malajr kemm jista' jkun. Ħallih ha jinxef għal sagħtejn ikkalkolati mill-ħin meta t-temperatura tal-forn terġa' lura għal 130 oC. Erġa' poġġi l-għatu fuq il-kontenitur, u neħħih mill-forn u ħallih jibred għal madwar 30 sa 45 minuta fid-dessikatur (3.6) u iżen sal-eqreb 1 mg.

4.3.   Tnixxif preliminari

4.3.1.    Għalf aparti dak taħt 4.3.2

Għalf solidu b'umdità għolja li jagħmel it-tħin diffiċli għandu jkun soġġett għal tnixxif preliminari kif ġej:

Iżen 50 g tal-kampjun mhux imfarrak sal-eqreb 10 mg (jekk ikun hemm bżonn, għalf kompressat jew agglomerat jista' jinqasam b'mod każwali) f'kontenitur adattat (eż. platt tal-aluminju 20 × 12 cm b'xifer ta 0,5 cm). Ħallih ħa jinxef f'forn b'60 oC sa 70 oC sakemm l-umdità tkun tnaqqset għal bejn 8 % u 12 %. Neħħih mill-forn u ħallih ħa jibred mikxuf fil-laboratorju għal siegħa u iżen sal-eqreb 10 mg. Farrak immedjatament kif indikat f'4.1.1 u nixxef kif indikat f'4.2.1 jew 4.2.3 skont in-natura tal-għalf.

4.3.2.    Ċereali

Qamħ b'umdità ta' aktar minn 17 % irid ikun soġġett għal tnixxif preliminari kif ġej:

Iżen 50 g qamħ mhux mitħun sal-eqreb 10 mg f'kontenitur adattat (eż. platt tal-aluminju 20 × 12 cm b'xifer ta 0,5 cm). Ħallih ħa jinxef f'forn ta' 130 oC għal 5 sa 7 minuti. Neħħih mill-forn u ħallih ħa jibred mikxuf fil-laboratorju għal sagħtejn u iżen sal-eqreb 10 mg. Farrak immedjatament kif indikat f'4.1.2 u nixxef kif indikat f'4.2.2.

5.   Kalkolu tar-riżultati.

L-umdità (X), bħala perċentwal tal-kampjun, hija kkalkulata billi jintużaw il-formoli li ġejjin:

5.1.   Tnixxif mingħajr tnixxif preliminari

fejn:

m

=

piż inizjali fi grammi, tal-kampjun għat-test,

m0

=

piż fi grammi, tal-kampjun għat-test imnixxef.

5.2.   Tnixxif bi tnixxif preliminari

fejn:

m

=

piż inizjali fi grammi, tal-kampjun għat-test,

m1

=

piż fi grammi, tal-kampjun għat-test wara t-tnixxif preliminari,

m2

=

piż fi grammi, tal-kampjun għat-test war t-tifrik jew it-tħin,

m0

=

piż fi grammi, tal-kampjun għat-test imnixxef.

5.3.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li saru fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn 0,2 % tal-valur assolut tal-umdità.

6.   Osservazzjoni

Jekk jidher li hemm bżonn tat-tifrik u jekk dan jidher li jibdel l-umdità tal-prodott, ir-riżultati tal-analiżi tal-komponenti tal-għalf iridu jiġu korretti skont l-umdità tal-kampjun fl-istat inizjali tiegħu.

B.   DETERMINAZZJONI TAL-UMDITÀ FIX-XAĦMIJIET U Ż-ŻJUT TAL-ANNIMALI U L-ĦXEJJEX

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-ilma u sustanzi volatili fiż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jitnixxef għal piż kostanti (it-telf fil-piż bejn żewġ piżijiet suċċessivi jrid ikun inqas jew ugwali għal 1 mg) f'103 oC. It-telf fil-piż huwa ddeterminat bl-użin.

3.   Apparat

4.   Proċedura

Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun omoġenizzat, fid-dixx xott li jkun intiżen minn qabel (3.1) bit-termometru fih (3.2). Saħħan fuq il-banju tar-ramel jew fuq il-hot-plate (3.3), filwaqt li tħawwad kontinwament sabiex it-temperatura tilħaq 90 oC f'madwar 7 minuti.

Naqqas is-sħana, filwaqt li tinnota l-frekwenza li biha l-bżieżaq jitilgħu mill-qiegħ tad-dixx. It-temperatura m'għandhiex taqbeż il-105 oC. Kompli ħawwad, aqla' mill-qiegħ tad-dixx sakemm ma jibqgħux jiffurmaw aktar bżieżaq.

Sabiex tassigura l-eliminazzjoni kompluta tal-umdità, erġa' saħħan għal diversi drabi għal 103 oC ± 2 oC, berred sa 93 oC bejn it-tisħin suċċessiv. Imbagħad ħallih jiksaħ sat-temperatura tal-ambjent fid-dessikatur (3.4) u iżen. Irrepeti din l-operazzjoni sakemm it-telf fil-piż bejn żewġ piżijiet suċċessivi ma tkunx aktar minn 2 mg.

N.B.	Żieda fil-piż tal-kampjun wara tisħin ripetut tindika ossidazzjoni tax-xaħam, u f'dan il-każ ikkalkula r-riżultat mill-użin li jkun sar immedjatament qabel ma beda jiżdied il-piż.

5.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-umdità (X), bħala perċentwali tal-kampjun, jiġi kkalkulat permezz tal-formula segwenti:

fejn:

m

=

piż, fi grammi, tal-kampjun għat-test;

m1

=

piż, fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu qabel jissaħħan;

m2

=

piż fi grammi, tad-dixx bil-kontenuti tiegħu wara li jissaħħan.

Riżultati inqas minn 0,05 % jridu jiġu rrekordjati bħala “inqas minn 0,05 %”.

Ripetibbiltà

Id-differenza fl-umdità bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li jkunu saru fuq l-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu 0,05 %, f'valur assolut.

C.   DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAL-PROTEINA MHUX RAFFINATA

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-kontenut tal-proteina mhux raffinata fl-għalf fuq il-bażi tal-kontenut tan-nitroġenu, iddeterminat skont il-metodu Kjeldahl.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa diġerit bl-aċidu sulfuriku fil-preżenza ta' katalista. Is-soluzzjoni aċidika hija magħmula alkalina b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju. L-ammonja hija distillata u miġbura fi kwantità mkejla ta' aċidu sulfuriku li l-eċċess tagħha huwa titrat b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju.

Inkella, l-ammonja libera hija distillata f'eċċess ta' soluzzjoni ta' aċidu boriku, segwita minn titrazzjoni b'soluzzjoni ta' aċidu idrokloriku jew aċidu sulfuriku.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

Apparat adattat sabiex issir id-diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni skont il-proċedura Kjeldahl.

5.   Proċedura

5.1.   Digestjoni

Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb 0,001 g u qiegħed il-kampjun fil-kunjett tal-apparat tad-diġestjoni. Żid 15 g sulfat tal-potassju (3.1.), kwantità adatta tal-katalist (3.2) (0,3 sa 0,4 g copper (II) oxide jew 0,9 sa 1,2 g copper (II) sulphate pentahydrate), 25 ml aċidu sulfuriku (3.4) u jekk meħtieġ, ftit frak tal-ħaffiefa (3.12) u ħallat.

Saħħan il-kunjett moderatament għall-ewwel, jekk ikun hemm bżonn ħawdu minn żmien għal żmien sakemm il-massa tkun ikkarbonizzata u r-ragħwa tkun sparixxiet; imbagħad saħħan b'mod aktar intensiv sakemm il-likwidu jkun qiegħed jagħli sew. It-tisħin huwa adegwat jekk l-aċidu li jkun qiegħed jagħli jikkondensa fuq il-ħajt tal-kunjett. Tħallix li l-ġnub jisħnu żżejjed u li partikoli organiċi jeħlu magħhom.

Meta s-soluzzjoni ssir ċara u ħadra ċara, kompli għalli għal sagħtejn oħra, u wara ħalliha ħa tibred.

5.2.   Distillazzjoni

Bil-mod, żid biżżejjed ilma sabiex tassigura li s-sulfati jdubu kompletament. Ħalli ħa jibred u wara, jekk ikun hemm bżonn, żid ftit trab taż-żingu (3.3). Kompli skont 5.2.1. jew 5.2.2.

5.2.1.    Distillazzjoni f'aċidu sulfuriku

Fil-kunjett tal-ġbir tal-apparat għad-distillazzjoni poġġi kwantità mkejla eżatta ta' 25 ml aċidu sulfuriku (3.5) jew (3.7) skont il-kontenut preżunt tan-nitroġenu. Żid ftit qtar ta' indikatur tal-metil aħmar (3.8).

Qabbad il-kunjett tad-diġestjoni mal-kondensatur tal-apparat għad-distillazzjoni u għaddas it-tarf tal-kondensatur fil-likwidu li jinsab fil-kunjett tal-ġbir għal fond ta' madwar 1 cm (ara l-osserv azzjoni 8.3). Bil-mod, ferra' 100 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.9) fil-kunjett għad-diġestjoni mingħajr telf ta' ammonja (ara osservazzjoni 8.1). Saħħan il-kunjett sakemm l-ammonja tkun iddistillat.

5.2.2.    Distillazzjoni f'aċidu boriku

Fejn it-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat issir manwalment, tapplika l-proċedura msemmija hawn taħt. Fejn l-unità tad-distillazzjoni hija kompletament awtomatika biex tinkludi t-titrazzjoni tal-kontenut tal-ammonja fid-distillat, segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-operazzjoni tal-unità tad-distillazzjoni.

Poġġi l-kunjett tal-ġbir li fih 25 ml sa 30 ml tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (3.18) taħt il-ħruġ tal-kondensatur b'tali mod li t-tubu tal-ġarr ikun taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni ta' aċidu boriku żejda. Irranġa l-unità tad-distillazzjoni biex tagħti 50 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.9). Irranġa l-unità tad-distillazzjoni skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur u ddistilla ‘l barra l-ammonja li nħelset biż-żieda tas-soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju. Iġbor id-distillat fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku riċevitriċi. L-ammont ta' distillat (ħin tad-distillazzjoni bil-fwar) jiddependi mill-ammont ta' nitroġenu fil-kampjun. Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Nota:

F'unità għad-distillazzjoni semi-awtomatika, iż-żieda tal-eċċess ta' idrossidu tas-sodju u d-distillazzjoni bil-fwar isiru awtomatikament.

5.3.   Titrazzjoni

Ipproċedi skont 5.3.1. jew 5.3.2.

5.3.1.    Aċidu sulfuriku

Fil-kunjett tal-ġbir ittitra l-eċċess tal-aċidu sulfuriku b'soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju (3.10 jew 3.11) skont il-konċentrazzjoni ta' aċidu sulfuriku użat, sakemm jintlaħaq il-punt finali.

5.3.2.    Aċidu boriku

Ittitra l-kontenut tal-kunjett tal-ġbir bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu idrokloriku (3.19) jew bis-soluzzjoni volumetrika standard tal-aċidu sulfuriku (3.6) billi tuża buretta u aqra l-ammont ta' titrant użat.

Meta tiġi applikata l-aħħar ditezzjoni kolorimetrika, il-punt finali jintlaħaq mal-ewwel traċċa tal-kulur roża fil-kontenut. Ivvaluta l-qari tal-buretta sal-eqreb 0,05 ml. Stirrer plate manjetika jew ditettur fotometriku jistgħu jgħinu sabiex tara l-punt finali.

Dan jista' jsir awtomatikament billi jintuża distillatur tal-fwar b'titrazzjoni awtomatika.

Segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur biex tħaddem id-distillatur speċifiku jew distillatur/titratur.

Nota:

Meta tintuża sistema ta' titrazzjoni awtomatika, it-titrazzjoni tibda immedjatament wara li tibda d-distillazzjoni u tintuża 1 % tas-soluzzjoni tal-aċidu boriku (3.18). Fejn titħaddem unità tad-distillazzjoni kompletament awtomatika, it-titrazzjoni awtomatika tal-ammonja tista' ssir bid-ditezzjoni tal-punt finali billi tintuża sistema ta' potentiometric pH. F'dan il-każ jintuża titratur awtomatiku b'pH-miter. Il-pH-miter għandu jkun ikkalibrat sewwa fil-medda ta' pH 4 sa pH 7 bi proċeduri ta' kalibrar ta' pH normali fil-laboratorju. Il-punt finali ta' pH tat-titrazzjoni jintlaħaq f'pH 4,6, billi huwa l-ogħla punt fil-kurva tat-titrazzjoni (punt ta' inflezzjoni).

5.4.   Test blank

Biex tikkonferma li r-reaġenti m'għandhomx nitroġenu, agħmel test blank (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) billi tuża 1 g sukrożju (3.14) minflok il-kampjun.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kalkoli jsiru skont 6.1 jew 6.2.

6.1.   Kalkolu tat-titrazzjoni skont 5.3.1

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

Vo

=

hija l-volum (ml) ta' NaOH (3.10 jew 3.11) użat fit-test blank.

V1

=

hija l-volum (ml) ta' NaOH (3.10 or 3.11) użat fil-kampjun tat-titrazzjoni.

c

=

hija l-konċentrazzjoni (mol/l) ta' idrossidu tas-sodju (3.10 jew 3.11).

m

=

hija l-piż (g) tal-kampjun.

6.2   Kalkolu tat-titrazzjoni skont 5.3.2

6.2.1.    Titrazzjoni bl-aċidu idrokloriku

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

m

=

hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test;

c

=

hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta' aċidu idrokloriku (3.19);

V0

=

hija l-volum (f'ml) ta' aċidu idrokloriku użat għat-test blank;

V1

=

hija l-volum (f'ml) ta' aċidu idrokloriku użat għall-porzjon għat-test.

6.2.2.    Titrazzjoni bl-aċidu sulfuriku

Il-kontenut tal-proteina mhux raffinata, imfisser bħala perċentwali skont il-piż, huwa kkalkulat skont il-formula segwenti:

fejn:

m

=

hija l-piż (g) tal-porzjon għat-test;

c

=

hija l-konċentrazzjoni (mol/l) tas-soluzzjoni volumetrika standard ta' aċidu sulfuriku (3.6);

V0

=

hija l-volum (f'ml) ta' aċidu sulfuriku (3.6) użat għat-test blank;

V1

=

hija l-volum (f'ml) ta'aċidu sulfuriku (3.6) użat għall-porzjon għat-test.

7.   Verifika tal-metodu

7.1.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu:

7.2.   Preċiżjoni

Agħmel l-analiżi (diġestjoni, distillazzjoni u titrazzjoni) fuq 1,5 sa 2,0 g acetanilide (3.13) fil-preżenza ta' 1 g sukrożju (3.14); 1 g acetanilide tikkonsma 14,80 ml aċidu sulfuriku (3.5). L-irkupru jrid ikun tal-inqas 99 %.

8.   Osservazzjonijiet

D.   DETERMINAZZJONI TA' UREA

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' urea fl-għalf.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jiġi sospiż fl-ilma b'aġent li jiċċara. Is-sospensjoni tiġi filtrata. Il-kontenut tal-urea tal-filtrat jiġi stabbilit wara ż-żieda ta' 4-dimethylaminobenzaldehyde (4-DMAB) billi titkejjel id-densità ottika f'wavelength ta' 420 nm.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Analiżi tal-kampjun

Iżen 2 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 500 ml 1g karbonju attiv(3.4). Żid 400 ml ilma u 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal madwar 30 sekonda u żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3). Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza. Żid sal-volum bl-ilma, ħawwad u ffiltra.

Neħħi 5 ml tal-filtrati trasparenti bla kulur, qiegħed f'test tubes b'tappijiet tal-ħġieġ mitħun, żid 5 ml ta' soluzzjoni 4-DMAB (3.1) u ħawwad. Qiegħed it-tubi f'banju bl-ilma sħun f'temperatura ta' 20 oC (+/- 4 oC). Wara ħmistax-il minuta kejjel id-densità ottika tas-soluzzjoni tal-kampjun bl-ispettrofotometru f'420 nm. Qabbel is-soluzzjoni tat-test blank tar-reaġenti.

5.2.   Kurva ta' kalibrar

Neħħi volumi ta' 1, 2, 4, 5 u 10 ml tas-soluzzjoni tal-urea (3.5), qiegħed f'kunjetti volumettriċi ta' 100 ml u żid sal-volum bl-ilma. Neħħi 5 ml minn kull soluzzjoni, żid 5 ml ta' soluzzjoni ta' 4-DMAB (3.1) f'kull wieħed minnhom, omoġenizza u kejjel id-densità ottika kif murija fuq meta mqabbla mas-soluzzjoni ta' kontroll li jkun fiha 5 ml ta' 4-DMAB u 5 ml ilma ħieles mill-urea. Ipplottja l-kurva ta' kalibrar.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Stabbilixxi l-ammont ta' urea fil-kampjun permezz tal-kurva ta' kalibrar.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Osservazzjonijiet

E.   DETERMINAZZJONI TA' BAŻIJIET VOLATILI TAN-NITROĠENU

I.   BIL-MIKRODIFFUŻJONI

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-kontenut ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu, imfissra bħala ammonja, fl-għalf.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt bl-ilma u s-soluzzjoni kjarifikata u ffiltrata. Il-bażijiet volatili tan-nitroġenu huma spustjati bil-mikrodiffużjoni bl-użu ta' soluzzjoni ta' karbonat tal-potassju, miġburin f'soluzzjoni ta' aċidu boriku u titrat b'aċidu sulfuriku.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Iżen 10 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u qiegħed ma' 100 ml ilma f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħallat fit-tazza għal 30 minuta. Żid 50 ml ta' soluzzjoni ta' trichloroacetic acid (3.1), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad bis-saħħa u ffiltra minn filtru mmewweġ.

Bl-użu ta' pipetta, introduċi 1 ml soluzzjoni ta' aċidu boriku (3.3) fil-parti ċentrali taċ-ċellola Conway u 1 ml tal-kampjun iffiltrat fil-parti ta' fuq taċ-ċellola. għatti parzjalment bl-għatu bix-xaħam. Ferra' 1 ml tas-soluzzjoni tal-karbonat tal-potassju saturat (3.4) malajr fil-parti ta' fuq u agħlaq l-għatu sabiex iċ-ċellola tkun issiġillata kontra d-dħul tal-arja. Dawwar iċ-ċellola b'attenzjoni fi pjan orizzontali sabiex jitħalltu ż-żewġ reaġenti. Ħalliha inkubata għal mill-inqas erba' sigħat f'temperatura ambjentali jew għal siegħa f'40 oC.

Bl-użu ta' mikroburetta (4.3), ittitra l-bażijiet volatili fis-soluzzjoni tal-aċidu boriku bl-aċidu sulfuriku (3.5).

Wettaq test blank bl-użu tal-istess proċedura imma mingħajr kampjun li għandu jiġi analizzat.

6.   Kalkolu tar-riżultati

1 ml ta' H2SO40,01 mol/litru jikkorrispondi għal 0,34 mg ammonja.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

7.   Osservazzjoni

Jekk il-kontenut tal-ammonja tal-kampjun ikun aktar minn 0,6 %, iddilwixxi l-filtrat inizjali.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   BID-DISTILLAZZJONI

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu, imfisser bħala ammonja, f'ħut mitħun li ma jkun fih prattikament ebda urea. Huwa applikabbli biss għal kontenuti tal-ammonja ta' inqas minn 0,25 %.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt bl-ilma u s-soluzzjoni kjarifikata u ffiltrata. Il-bażijiet volatili tan-nitroġenu huma spustjati fil-punt ta' togħlija billi jiżdied l-ossidu tal-manjeżju u miġbura fi kwantità speċifika ta' aċidu sulfuriku, li l-eċċess tiegħu huwa titrat lura b'soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Iżen 10 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u qiegħed ma' 100 ml ilma f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħallat fit-tazza għal 30 minuta. Żid 50 ml ta' soluzzjoni ta' trichloroacetic acid (3.1), żid sal-volum bl-ilma, ħawwad bis-saħħa u ffiltra minn filtru mmewweġ.

Ħu kwantità ta' filtrat ċar xieraq għall-kontenut preżunt ta' bażijiet volatili tan-nitroġenu (100ml huwa normalment xieraq). Iddilwixxi sa 200 ml u żid 2 ossidu tal-manjeżju (3.2) u ftit qtar ta' emulsjoni li ma tagħmilx ragħwa (3.3). Is-soluzzjoni għandha tkun alkalina għal karta litmus; inkella żid ftit ossidu tal-manjeżju (3.2). Kompli skont 5.2 u 5.3 tal-metodu tal-analiżi għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-proteina mhux raffinata (Parti C ta' dan l-Anness).

Wettaq test blank bl-użu tal-istess proċedura imma mingħajr kampjun li għandu jiġi analizzat.

6.   Kalkolu tar-riżultati

1 ml ta' H2SO40,05 mol/litru jikkorrispondi għal 1,7 mg ammonja.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn, f'valur relattiv, 10 % ammonja.

F.   DETERMIMAZZJONI TA' AMINO ACIDS (BARRA TRYPTOPHAN)

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu determinati l-amino acids ħielsa (sintetiċi u naturali) u totali (marbutin b'peptides u ħielsa) fl-għalf, bl-użu ta' analizzatur tal-amino acid. Dan japplika għall-amino acids li ġejjin: cycs(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidne, isoleucine, leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine u valine.

Il-metodu ma jiddistingwix bejn l-imluħa tal-amino acids u ma jistax jagħmel distinzjoni bejn il-forom D u L tal-amino acids. M'huwiex validu għad-determinazzjoni ta' analogi ta' tryptophan jew hydroxy ta' amino acids.

2.   Prinċipju

2.1.   Amino acids ħielsa

L-amino acids ħielsa jinħarġu b'aċidu idrokloriku dilwit. Makromolekuli nitroġeniċi koestratti jiġu ppreċipitati bis-sulfosalicylic acid u jitneħħew billi jiġu ffiltrati. Is-soluzzjoni ffiltrata tiġi aġġustata għal pH 2,20. L-amino acids jiġu sseparati bi kromatografija ta' skambju tal-jonji u jiġu ddeterminati permezz ta' reazzjoni man-ninhydrin b'ditezzjoni fotometrika f'570 nm.

2.2.   Amino acids totali

Il-proċedura magħżula tiddependi fuq l-amino acids li jkunu qegħdin jiġu investigati. Is-Cyst(e)ine u l-methionine għandhom jiġu ossidizzati għal cysteic acid u methionine sulphone rispettivament qabel ma ssir l-idroliżi. It-tyrosine għandu jiġi ddeterminat f'hydrolysates ta' kampjuni mhux ossidizzati. L-amino acids l-oħra kollha li huma mniżżlin fil-paragrafu 1 jistgħu jiġu ddeterminati kemm fil-kampjun ossidizzat kif ukoll f'dak li mhuwiex ossidizzat.

L-ossidizzazzjoni ssir f'0 oC b'taħlita ta' performic acid/phenol. Ir-reaġent li jkun fadal jiġi dekompost b'sodium disulphate. Il-kampjun ossidizzat jew mhux ossidizzat jiġi idrolizzat bl-aċidu idrokloriku (3.20) għal 23 siegħa. Il-hydrolysate jiġi aġġustat għal pH 2,20. L-amino acids jiġu sseparati bi kromatografija ta' skambju tal-jonji u jiġu ddeterminati permezz ta' reazzjoni man-ninhydrin b'ditezzjoni fotometrika f'570 nm (440 nm għall-proline).

3.   Reaġenti

Għandu jintuża ilma ddistillat darbtejn jew ilma ta' kwalità ekwivalenti (konduttività < 10 μS).

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b'malji ta' 0,5 mm. Kampjuni bi kwantità għolja ta' umdità jridu jew jitnixxfu bl-arja f'temperatura li ma tkunx aktar minn 50 oC jew jitnixxfu bil-friża qabel ma jintaħnu. Kampjuni b'kontenut għoli ta' xaħam għandhom jiġu estratti b'żejt ħafif mhux raffinat (3.12) qabel ma jintaħnu.

5.2.   Determinazzjoni ta' Amino Acids Ħielsa fl-għalf u Taħlit li jkun sar minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,2 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun ippreparat (5.1), f'kunjett koniku u żid 100,0 ml mit-taħlita tal-estrazzjoni (3.21). Ħawwad it-taħlita għal 60 minuta bl-użu ta' shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku (4.8). Ħalli s-sediment joqgħod u itfa' bil-pipetta 10,0 mis-supernatant solution f'tazza ta' 100 ml.

Żid 5,0 ml soluzzjoni ta' sulfosalicylic acid (3.22), mat-taħwid u kompli ħawwad bl-għajnuna ta' stirrer manjetika għal 5 minuti. Iffiltra jew iċċentrifuga s-supernatant sabiex jitneħħa kull preċipitat. Qiegħed 10,0 ml mis-soluzzjoni li tirriżulta f'tazza ta' 100 ml u aġġusta l-pH għal 2,20 bl-użu ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18), ittrasferixxi għal kunjett volumetriku ta' volum xieraq bl-użu ta' citrate buffer (3.24), u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24).

Jekk qiegħed jintuża standard intern, żid 1,00 ml mill-istandard intern (3.27.3) għal kull 100 ml soluzzjoni finali u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24).

Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.

Jekk l-estratti m'humiex qegħdin jiġu eżaminati, għandhom jinħażnu taħt il-5 oC.

5.3.   Determinazzjoni tal-Amino Acids Totali

5.3.1.    Ossidazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g mill-kampjun ippreparat (5.1) fi:

Il-porzjon tal-kampjun miżun għandu jkollu kontenut ta' nitroġenu ta' bejn wieħed u ieħor 10 mg u umdità ta' mhux aktar minn 100 mg.

Qiegħed il-kunjett/flixkun f'banju ilma bis-silġ u kessaħ sa 0 oC, żid 5 ml mit-taħlita ta' ossidazzjoni (3.23) u ħawwad bi spatula tal-ħġieġ bil-ponta mgħawġa. Issiġilla l-kunjett/flixkun li fih l-ispatula b'rita li ma jgħaddix arja minnha, qiegħed il-banju bl-ilma bis-silġ li fih ir-reċipjent issiġillat fi friġġ f'temperatura ta' 0 oC u ħalli għal 16-il siegħa. Wara 16-il siegħa neħħi mill-friġġ u ddekomponi r-reaġent eċċessiv tal-ossidazzjoni biż-żieda ta' 0,84 g sodium disulphite (3.4).

Ipproċedi għal 5.3.2.1.

5.3.2.    Idroliżi

5.3.2.1.    Idroliżi ta' kampjuni ossidizzati

Mal-kampun ossidizzat ippreparat skont 5.3.1 żid 25 ml taħlita ta' idroliżi (3.20) u oqgħod attent li tlaħlaħ ir-residwu tal-kampjun li jeħel mal-ġnub tar-reċipjent u tal-ispatula.

Skont il-proċedura ta' idroliżi li qiegħda tintuża, kompli skont 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Idroliżi ta' kampjuni li m'humiex ossidizzati

Iżen f'kunjett bil-qiegħ tond ta' 100 ml jew 250 ml (4.1) jew kunjett ta' 100 ml bit-tapp bil-kamin (4.2), sal-eqreb 0,2 mg, minn0,1 sa 1 g tal-kampjun ippreparat (5.1). Il-porzjon miżun tal-kampjun għandu jkollu kontenut ta' nitroġenu ta' bejn wieħed u ieħor 10 mg. B'attenzjoni żid 25 ml tat-taħlita tal-idroliżi (3.20) u ħallat mal-kampjun.. Kompli skont 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Idroliżi miftuħa

Żid 3 żibeġ tal-ħġieġ mat-taħlita fil-kunjett (ippreparat skont 5.3.2.1 jew 5.3.2.2) u għalli kontinwament taħt reflux għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, aħsel il-kondensatur b'5 ml citrate buffer (3.24). Skonnettja l-kunjett u kessħu f'banju ta' silġ.

Kompli skont 5.3.3.

5.3.2.4.    Idroliżi magħluqa

Poġġi l-kunjett li jkun fih it-taħlita ppreparata f'konformità ma' 5.3.2.1 jew 5.3.2.2 f'forn (4.3) f'temperatura ta' 110 oĊ. Waqt l-ewwel siegħa sabiex tipprevjeni milli tiżdied il-pressjoni (minħabba l-evoluzzjoni ta' sustanzi li fihom il-gass) u sabiex tipprevjeni xi splużjoni, poġġi t-tapp bil-kamin fuq ir-reċipjent. Tagħlaqx ir-reċipjent bit-tapp. Wara siegħa, agħlaq ir-reċipjent bit-tapp u ħallih fil-forn (4.3) għal 23 siegħa. Meta titlesta l-idroliżi, neħħi l-kunjett mill-forn, iftaħ it-tapp tal-kunjett b'attenzjoni u poġġi l-kunjett f'banju ta' ilma bis-silġ. Ħallih jiksaħ.

Skont il-proċedura għall-aġġustament tal-pH (5.3.3), ittrasferixxi kwantitattivament il-kontenuti tal-kunjett f'tazza ta' 250 ml jew kunjett ta' 250 ml bil-qiegħ tond bl-użu ta' citrate buffer (3.24).

Kompli skont 5.3.3.

5.3.3.    Aġġustament tal-pH

Skont it-tolleranza tas-sodju tal-analizzatur tal-amino acids (4.9), kompli skont 5.3.3.1 jew 5.3.3.2 għall-aġġustament tal-pH.

5.3.3.1.    Għal Sistemi Kromatografiċi (4.9) li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju:

Huwa rrakkomandat li tintuża soluzzjoni stokk standard interna (3.27.3) meta jintużaw l-analizzaturi tal-amino acids li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju (meta l-volum tal-aċidu jkollu jitnaqqas).

F'dan il-każ, żid 2,00 ml mis-soluzzjoni stokk standard interna (3.2-7.3) mal-hydrolysate qabel l-evaporazzjoni.

Żid 2 qatriet 1-octanol (3.15) mal-hydrolysate miksub f'konformità mal-paragrafu 5.3.2.3 jew 5.3.2.4.

Bl-użu ta' evaporatur rotanti (4.7) naqqas il-volum sa 5-10 ml f'vakwu f'temperatura ta' 40 oC. Jekk il-volum aċċidentalment jitnaqqas għal inqas minn 5 ml il-hydrolysate għandu jintrema u l-analiżi terġa' tibda.

Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18) u kompli għall-paragrafu 5.3.4.

5.3.3.2.    Għall-Analizzaturi ta' Amino Acids l-oħrajn kollha (4.9)

Ħu l-hydrolysates miksuba f'konformità ma' 5.3.2.3 jew 5.3.2.4 u nnewtralizzahom parzjalment billi żżid filwaqt li tħawwad b'attenzjoni, 17-il ml soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (3.17) filwaqt li tiżgura li t-temperatura tinżamm taħt l-40 oC.

Aġġusta l-pH għal 2,20 f'temperatura ambjentali bl-użu tas-soluzzjoni tas-idrossidu tas-sodju (3.17) u finalment soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.18). Kompli għal 5.3.4.

5.3.4.    Kampjun ta' soluzzjoni għall-kromatografija

Ittrasferixxi kwantittivament il-hydrolysate bil-pH aġġustat (5.3.3.1 jew 5.3.3.2) bis-citrate buffer (3.24) f'kunjett iggradat ta' 200 ml, u imla sal-marka bil-buffer (3.24).

Jekk ma ntużax diġà standard intern, żid 2,00 ml standard intern (3.27.3) u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24). Ħawwad sew.

Kompli għall-istadju tal-kromatografija (5.4).

Jekk il-kampjuni tas-soluzzjonijiet ma jkunux sejrin jiġu eżaminati dakinhar stess għandhom jinħażnu taħt il-5 oC.

5.4.   Kromatografija

Qabel il-kromatografija ġib l-estratt (5.2) jew tal-hydrolysate (5.3.4) għal temperatura ambjentali. Ħawwad it-taħlita u ffiltra ammont xieraq minn filtru tal-membrana ta' 0,22 μm (4.5). Is-soluzzjoni ċara li tirriżulta tiġi soġġetta għal kromatografija ta' skambju tal-jonji bl-użu ta' analizzatur tal-amino acid (4.9).

L-injezzjoni tista' ssir b'mod manwali jew awtomatiku. Huwa importanti li tiżdied l-istess kwantità tas-soluzzjoni ± 0,5 % mal-kolonna għall-analiżi tal-istandards u kampjuni ħlief meta jintuża standard intern, u li l-proporzjonijiet ta' sodju: amino acid fis-soluzzjonijiet standard u kampjuni huma simili kemm jista' jkun.

B'mod ġenerali, il-frekwenza tal-provi tal-kalibrar tiddependi fuq l-istabilità tar-reaġent tan-ninhydrin u s-sistema analitika. L-istandard jew il-kampjun jiġi dilwit bis-citrate buffer (3.24) sabiex jagħti erja tal-ogħla livell tal-istandard ta' 30-200 % tal-erja tal-ogħla livell tal-kampjun tal-amino acid.

Il-kromatografija tal-amino acids tvarja ftit skont it-tip tal-analizzatur u r-raża użati. Is-sistema magħżula għandha tkun kapaċi tissepara l-amino acids minn xulxin u mill-materjali li huma pożittivi fin-ninhydrin. Fil-medda tal-operazzjoni, is-sistema kromatografika għandha tagħti rispons lineari għat-tibdil fl-ammonti ta' amino acids miżjudin mal-kolonna.

Waqt l-istadju tal-kromatografija japplikaw il-proporzjonijiet tal-inqas: l-ogħla livell imsemmija hawn taħt, meta tiġi analizzata soluzzjoni ekwimolari (tal-amino acids li qegħdin jiġu stabbiliti). Is-soluzzjoni ekwimolari għandu jkollha mill-inqas 30 % tat-tagħbija massima ta' kull amino acid li jista' jitkejjel amino acid (4.9).

Għas-separazzjoni tat-threonine-serine, il-proporzjon tal-inqas:l-ogħla livell minn żewġ amino acids li huma overlapping fuq il-kromatogramma ma għandux ikun aktar minn 2:10 (jekk jiġu ddeterminati biss is-cyst(e)ine, methionine, threonine u lysine, separazzjoni insuffiċjenti mill-ogħla livelli (qċaċet) qrib xulxin tinfluwenza d-determinazzjoni b'mod ħażin). għall-amino acids l-oħrajn kollha, is-separazzjoni għandha tkun aħjar minn 1:10.

Is-sistema għandha tiżgura li l-lysine huwa sseparat mill-“lysine artifacts” u ornithine.

6.   Kalkolu tar-riżultati

L-erja tal-kampjun u l-ogħla livelli standard jitkejlu għal kull amino acid individwali u jiġi kkalkulat l-ammont (X), fi g amino acid għal kull kg tal-kampjun.

Jekk jintuża standard intern immultiplika bi:

A

=

erja tal-ogħla livell, hydrolysate jew estratt

B

=

erja tal-ogħla livell, soluzzjoni standard ta' kalibrar

C

=

erja tal-ogħla livell, standard intern f'hydrolysate jew estratt

D

=

erja tal-ogħla livell, standard intern, soluzzjoni ta' kalibrar standard

M

=

piż molekulari tal-amino acid li qiegħed jiġi ddeterminat

c

=

konċentrazzjoni ta' standard f'μmol/ml

m

=

piż tal-kampjun (g) (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk huwa mnixxef jew bix-xaħam imneħħi)

V

=

ml hydrolysate totali (5.3.4) jew kalkolu f'ml tal-volum tal-estratt totali dilwit (6.1)

Kemm is-cystine kif ukoll is-cysteine t-tnejn huma ddeterminati bħala cicteic acid fil-hydrolysates ta' kampjun ossidizzat, iżda huma kkalkulati bħala cystine (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) billi jintuża M 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

Il-methionine huwa ddeterminat bħala methionine sulphone f'hydrolysates ta' kampjun ossidizzat iżda kkalkulat bħala methionine billi jintuża M tal-methionine: 149,21 g/mol.

Methionine ħieles miżjud huwa ddeterminat wara l-estrazzjoni bħala methionine, għall-kalkolu jintuża l-istess M.

7.   Evalwazzjoni tal-metodu

Il-metodu ġie ttestjat f'interparagun f'livell internazzjoni fl-1990 billi intużaw erba' tipi differenti ta' għalf (għalf tal-majjali mħallat, kompost tal-brojlers, konċentrazzjoni ta' proteini, taħlit minn qabel). Ir-riżultati, wara eliminazzjoni ta' dawk li jvarjaw ħafna, ta' devjazzjoni medja u standard huma mogħtija fit-tabelli f'dan il-punt:

7.1.   Ripetibbiltà

Ir-ripetibilità mfissra bħala “Fi ħdan id-Devjazzjoni Standard tal-Laboratorju” tal-interparagun imsemmi hawn fuq hija mogħtija fit-tabella ta' hawn taħt:

7.2   Riproduċibilità

Ir-riżultati għal bejn id-devjazzjoni standard tal-laboratorju mill-interparagun imsemmi hawn fuq huma mogħtija fit-tabella ta' hawn taħt:

8.   Użu ta' materjali għar-referenza

L-applikazzjoni korretta tal-metodu għandha tiġi vverifikata billi jsir kejl ripetut ta' materjali għar-referenza ċċertifikati meta huma disponibbli. Huwa rrakommandat kalibrar b'soluzzjoni ta' kalibrar ċċertifikata ta' amino acids.

9.   Osservazzjonijiet

G.   DETERMINAZZJONI TA' TRYPTOPHAN

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmel possibbli d-determinazzjoni tat-tripotofan totali u ħieles fl-għalf. Ma jagħmilx distinzjoni bejn il-forom D- u L-.

2.   Prinċipju

Għad-determinazzjoni ta' tryptophan totali, il-kampjun jiġi idrolizzat f'kundizzjonijiet alkalini ma' soluzzjoni ta' barium hydroxide saturata u msaħħna sa 110 oC għal 20 siegħa. Wara jiżdied l-istandard ta' idroliżi interna.

Għad-determinazzjoni ta' tryptophan ħieles, il-kampjun huwa estratt taħt kundizzjonijiet aċidi ħfief fil-preżenza ta' standard intern.

It-tryptophan u l-istandard intern fil-hydrolysate jew fl-estratt huma determinati bl-HPLC b'ditezzjoni fluworexxenti.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni ta' kampjuni

Il-kampjun jintaħan biex jgħaddi minn passatur b'malji ta' 0,5 mm. Kampjuni bi kwantità għolja ta' umdità jridu jew jitnixxfu bl-arja f'temperatura li ma tkunx aktar minn 50 oC jew jitnixxfu bil-friża qabel ma jintaħnu. Kampjuni b'kontenut għoli ta' xaħam iridu jiġu estratti b'petroleum ħafif (3.9) qabel ma jintaħnu.

5.2.   Determinazzjoni ta' tryptophan ħieles (estratt)

Iżen sal-eqreb 1 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun separat (5.1), f'kunjett konikali. Żid 100,0 ml aċidu idrokloriku (3.13) u 5,00 ml soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16). Ħawwad għal 60 min. bl-użu tax-shaker mekkaniku jew stirrer manjetika (4.7). Ħalli s-sediment joqgħod u bil-pipetta tella' 10,0 ml tas-soluzzjoni supernatant f'beaker. Żid 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14). Aġġusta l-pH sa 3 bl-użu ta' idrossidu tas-sodju (3.10). Żid metanol suffiċjenti (3.8) biex tinkiseb konċentrazzjoni ta' bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f'kunjett volumetriku ta' volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum neċessarju għall-kromatografija (bejn wieħed u ieħor l-istess volum bħall-kalibrar ta' soluzzjoni standard (3.17)).

Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.

Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-estratti kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-estratti fl-istess ġurnata, l-estratti jistgħu jinħażnu f'5 oC għal massimu ta' 3 ijiem.

5.3.   Determinazzjoni ta' tryptophan totali (hydrolysate)

Iżen sal-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun separat (5.1) f'kunjett tal-polypropylene (4.4). Il-porzjon tal-kampjun li jkun intiżen irid ikollu kontenut ta' nitroġenu ta' madwar 10 mg. Żid 8,4 g barium hydroxide octa-hydrate (3.4) u 10 ml ilma. Ħallat fuq mixer vortex (4.8) jew stirrer manjetika (4.7). Ħalli il-kalamita miksija bit-teflon fit-taħlita. Aħsel il-ġnub tar-reċipjent b'4 ml ilma. Poġġi t-tapp u agħlaq kemxejn il-kunjett. Ittrasferixxi f'autoclave (4.6) bl-ilma jagħli u ħallih għall-fwar għal 30-60 minuta. Agħlaq l-autoclave u awtoklava f'110 (± 2) oC għal 20 siegħa.

Qabel tiftaħ l-autoclave baxxi t-temperatura għal ftit taħt il-100 oC. Sabiex tiġi evitata kristallizzazzjoni ta' Ba(OH)2 .8 H2O, żid it-taħlita sħuna bi 30 ml ilma li jkun għadu f'temperatura ambjentali. Ħawwad bil-mod. Żid 2,00 ml soluzzjoni standard interna (α-methyl-tryptophan) konċentrata (3.16). Berred ir-reċipjenti fuq banju ilma/silġ għal 15-il minuta.

Wara żid 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14). Żomm ir-reċipjent fil-banju li jberred u nnewtralizza b'HCl (3.11) waqt li tħawwad u aġġusta l-pH għal 3,0 bl-użu ta' HCl (3.12). Żid metanol suffiċjenti biex tagħti konċentrazzjoni ta' bejn 10 u 30 % metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi f'kunjett volumetriku ta' volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum definit neċessarju għal kromatografija (pereżempju 100 ml). Iż-żieda ta' metanol ma tridx tikkawza preċipitazzjoni.

Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn 0,45 μm filtru membrana (4.5) qabel l-injezzjoni fuq il-kolonna tal-HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skont il-paragrafu 5.4.

Ipproteġi s-soluzzjoni standard u l-hydrolysates kontra d-dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli li tanalizza l-hydrolysates fl-istess ġurnata, jistgħu jinħażnu f'5 oC għal massimu ta' 3 ijiem.

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

Il-kundizzjonijiet li jmiss għal eluzzjoni iżokratika huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn, diment li jagħtu riżultati ekwivalenti (ara wkoll l-osservazzjonijiet 9.1 u 9.2):

6.   Kalkolu tar-riżultati

L-ammont ta' tryptophan (X), fi g għal kull kampjun ta' 100g huwa kkalkulat.

A

=

l-ikbar erja ta' standard intern, soluzzjoni standard ta' kalibrar (3.17)

B

=

l-ikbar erja ta' tryptophan, estratt (5.2) jew hydrolysate (5.3)

V1

=

volum f'ml (2 ml) ta' soluzzjoni ta' tryptophan konċentrat (3.15) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17)

c

=

konċentrazzjoni f'μmol/ml (= 2,50) ta' soluzzjoni ta' tryptophan konċentrat (3.15) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17)

V2

=

volum f'ml ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fl-estrazzjoni (5.2) (= 5,00 ml) jew għall-hydrolysate (5.3) (= 2,00 ml)

C

=

żona ta' livelli l-għolja ta' standard intern, estratt (5.2) jew hydrolysate (5.3)

D

=

l-ikbar erja ta' tryptophan, soluzzjoni standard ta' kalibrar (3.17)

V3

=

volum f'ml (= 2,00 ml) ta' soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.17)

m

=

piż ta' kampjun fi g (irranġat għall-piż oriġinali jekk imnixxef u/jew bix-xaħam imneħħi)

M

=

piż molari ta' tryptophan (= 204,23 g/mol)

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 10 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

8.   Riżultati ta' studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE (ir-4 interparagun), fejn ġew analizzati tliet kampjuni min 12-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għal idroliżi. Saru għadd ta' analiżi (5) replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

L

=

numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati

n

=

numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon)

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r

=

ripetibilità

R

=

riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR

=

koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

Ġie organizzat studju kollaborattiv Komunitarju ieħor (it-3 interparagun) fejn żewġ kampjuni ġew analizzati minn 13-il laboratorju biex jiġi ċċertifikat il-metodu għall-estrazzjoni ta' tryptophan ħieles. Saru għadd ta' analiżi (5) replikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

L

=

numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati

n

=

numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon)

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r

=

ripetibilità

R

=

riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR

=

koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

Ġie organizzat studju ta' interparagun Komunitarju ieħor li fih ġew analizzati erba' kampjuni minn 7 laboratorji għall-għanijiet ta' ċertifikazzjoni ta' tryptophan għall-idroliżi. Ir-riżultati huma mogħtija hawn taħt. Saru 5 analiżijiet replikati fuq kull kampjun.

L

=

numru ta' laboratorji li ssottomettew riżultati

n

=

numru ta' riżultati singoli miżmuma wara li ġew eliminati outliers (identifikati mill-outlier test ta' Cochran, Dixon)

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r

=

ripetibilità

R

=

riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR

=

koeffiċjenti għal varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

9.   Osservazzjonijiet

H.   ID-DETERMINAZZJONI TA' ŻJUT U XAĦMIJIET MHUX RAFFINATI

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut ta' żjut u xaħmijiet mhux raffinati fl-għalf. Dan il-metodu ma jkoprix l-analiżi taż-żrieragħ taż-żejt u frott oleaġinuż.

L-użu taż-żewġ proċeduri deskritti hawn taħt jiddependi min-natura u l-kompożizzjoni tal-għalf u r-raġuni li għaliha qiegħda ssir l-analiżi.

1.1.   Proċedura A – Żjut u xaħmijiet mhux raffinati estratti direttament

Dan il-metodu huwa applikabbli għall-għalf li ġej mill-pjanti barra dawk inklużi fi ħdan l-iskop tal-Proċedura B.

1.2.   Proċedura B – Żjut u xaħmijiet mhux raffinati totali

Dan il-metodu japplika għal materjal tal-għalf li ġej mill-annimali u għall-għalf kompost kollu. Dan irid jintuża għall-materjal kollu li minnhom iż-żjut u x-xaħmijiet ma jistgħux jiġu estratti kompletament mingħajr idroliżi qabel (eż. glutina, ħmira, proteini tal-patata u prodotti soġġetti għal proċessi bħall-estrużjoni, flaking u tisħin).

1.3.   Interpretazzjoni tar-riżultati

Fil-każijiet kollha fejn jinkiseb riżultat ogħla permezz tal-Proċedura B u mhux Proċedura A, ir-riżultat miksub mill-Proċedura B għandu jkun aċċettat bħala l-valur veru.

2.   Prinċipju

2.1.   Proċedura A

Il-kampjun huwa estratt bil-petroleum ħafif. Is-solvent jiġi ddistillat u r-residwu mnixxef u miżun.

2.2.   Proċedura B

Il-kampjun huwa trattat b'tisħin b'aċidu idrokloriku. Is-soluzzjoni hija mkessħa u ffiltrata. Ir-residwu jinħasel u jitnixxef u huwa sottomess għad-determinazzjoni skont il-Proċedura A.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Proċedura A (ara punt 8.1)

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg u ttrasferih f'thimble ta' estrazzjoni (4.2) u għatti b'biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam.

Qiegħed it-thimble f'estrattur (4.1) u għamel l-estrazzjoni għal sitt sigħat b'petroleum ħafif (3.1). Iġbor l-estratt tal-petroleum ħafif f'kunjett xott miżun li fih biċċiet ta' ġebla ħaffiefa ( 28 ).

Iddistilla s-solvent. Nixxef ir-residwu u żomm il-kunjett għal siegħa u nofs fil-forn li jnixxef (4.3). Kessaħ f'dessikatur u iżen. Erġa' nixxef għal 30 minuta sabiex tassigura li l-piż taż-żjut u tax-xaħmijiet jibqa' kostanti (telf fil-piż bejn iż-żewġ kejlijiet tal-piż suċċessivi għandu jkun inqas minn jew ugwali għal 1 mg).

5.2.   Proċedura B

Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg (ara 8.2) u qiegħed f'beaker ta' 400 ml jew kunjett koniku ta' 300 ml. Żid 100 ml hydrochlorc acid (3.3) u biċċiet ta' ġebla ħaffiefa. għatti l-beaker b'watch glass jew waħħal reflux condenser mal-kunjett. Wassal it-taħlita sakemm tagħli bil-mod fuq fjamma baxxa jew hot plate u żommha hekk għal siegħa. Tħallix il-prodott jeħel mal-ġnub tal-kontenitur.

Kessaħ u żid kwantità ta' għajnuna għall-filtrazzjoni (3.4) biżżejjed biex tipprevjeni xi telf ta' żejt u xaħam tul il-filtrazzjoni. Iffiltra minn karta filtru doppja, niedja, ħielsa mix-xaħam. Aħsel ir-residwu f'ilma kiesaħ sakemm jinkiseb filtrat newtrali. Ikkontrolla li l-filtrat ma jkunx fih xi żejt jew xaħam. Il-preżenza tagħhom fil-filtrat tindika li l-kampjun għandu jiġi estratt b'petroleum ħafif, permezz tal-Proċedura A, qabel l-idroliżi.

Qiegħed il-karta filtru doppja li jkun fiha r-residwu fuq watch glass u nixxef għal siegħa u nofs fil-forn tal-arja (4.3) f'100 ± 3 oC.

Qiegħed il-karta tal-filtru doppja li fiha r-residwu niexef f'thimble ta' estrazzjoni (4.2), u għatti b'biċċa tajjara ħielsa mix-xaħam. Poġġi t-thimble f'estrattur (4.1) u ipproċedi kif indikat fit-tieni u fit-tielet paragrafu tal-punt 5.1.

6.   Espressjoni tar-riżultat

Esprimi l-piż tar-residwu bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m'għandhomx jaqbżu:

8.   Osservazzjonijiet

I.   DETERMINAZZJONI TA' FIBRA MHUX RAFFINATA

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli sabiex jiġu stabbiliti s-sustanzi organiċi neqsin mix-xaħam fl-għalf li ma jinħallux fil-mezzi aċidużi u alkalini u li huma konvenzjonalment deskritti bħala fibra mhux raffinata.

2.   Prinċipju

Il-kampjun, bix-xaħam imneħħi fejn meħtieġ, huwa trattat suċċessivament b'soluzzjonijiet li jkunu qiegħdin jagħlu ta' aċidu sulfuriku u potassium hydroxide. Il-fdalijiet huma sseparati permezz ta' filtrazzjoni bl-użu ta' filtru ta' ħġieġ sintered maħsul, ixxuttat, miżun u magħmul irmied fi ħdan il-medda ta' 475 u 500 oC. It-telf fil-piż li jirriżulta mill-proċess tal-irmied jikkorrispondi mal-fibra mhux raffinata preżenti fit-test tal-kampjun.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Iżen 1g tal-kampjun preparat sal-eqreb 1 mg u poġġih fil-griġjol (4.2), (ara l-osservazzjonijiet 8.1, 8.2 u 8.3) u żid 1 g ta' għajnuna għall-filtrazzjoni (3.3).

Għaqqad l-unità tat-tisħin (4.1) u l-filtru (4.2), u wara waħħal iċ-ċilindru (4.3) mal-griġjol. Ferra' 150 ml aċidu sulfuriku jagħli (3.1) ġewwa ċ-ċilindru magħqud u l-griġjol u jekk meħtieġ żid ftit qtar tal-aġent għal kontra r-ragħwa (3.2).

Ġib il-likwidu jagħli għal bejn 5 ± 2 minuti u għalli bil-qawwa għal 30 minuta eżatt.

Iftaħ it-tapp għall-pajp tal-ftuħ (4.1) u, taħt vakwu, iffiltra l-aċidu sulfuritiku mill- filtru tal-griġjol u aħsel ir-residwu bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 30ml ilma jagħli, filwaqt li tiżgura li r-residwu jiġi ffiltrat xott wara kull ħasla.

Agħlaq it-tapp ta' ftuħ u ferra' 150ml tas-soluzzjoni tagħli ta' potassium hydroxide (3.7) fiċ-ċilindru magħqud u fil-griġjol u żid ftit qatriet ta' aġent kontra r-ragħwa (3.2). Ġib il-likwidu sal-punt li jagħli fi żmien 5 ± 2 minuti u għalli bis-saħħa għal 30 minuta preċiż. Iffiltra u rrepeti l-proċedura tal-ħasil użata għall-pass tal-aċidu sulfuriku.

Wara l-ħasla u t-tnixxif finali, skonnettja l-griġjol u l-kontenut tiegħu u erġa' qabbdu mal-unità ta' estrazzjoni kiesħa (4.6). Applika l-vakwu u aħsel ir-residwu fil-griġjol bi tliet porzjonijiet konsekuttivi ta' 25ml ta' aċetun (3.4) filwaqt li tiżgura li r-residwi jiġu ffiltrati xotti wara kull ħasla.

Nixxef il-griġjol għal piż kostanti fil-forn f'temperatura ta' 130 oC. Wara kull nixfa berred fid-dessikatur u iżen mill-ewwel. Poġġi l-griġjol ġewwa forn muffle u agħmel f'irmied għal użin kostanti (it-telf fil-piż bejn użin u ieħor għandu jkun 2 mg jew inqas) f'475 u 500 oC għal mill-inqas 30 minuta.

Wara kull tisħin, qabel tiżen, l-ewwel kessaħ fil-forn u wara fid-dessikatur.

Agħmel test blank mingħajr il-kampjun. It-telf fl-użin li jirriżulta mill-irmied ma għandux ikun aktar minn 4 mg.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-fibra mhux raffinata bħala perċentwal tal-kampjun huwa mogħti mill-espressjoni:

fejn:

m

=

piż tal-kampjun fi g;

m0

=

it-telf ta' piż wara li ssir irmied matul id-determinazzjoni, fi grammi;

m1

=

it-telf ta' piż wara li ssir irmied matul it-test blank, fi grammi.

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn iż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

8.   Osservazzjonijiet

J.   DETERMINAZZJONI TAZ-ZOKKOR

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-ammont ta' zokkor ta' riduzzjoni u zokkor totali wara inverżjoni, imfisser bħala glukożju jew fejn xieraq bħala sukrożju, b'konverżjoni bil-fattur 0,95. Huwa applikabbli għal għalf kompost. Metodi speċjali huma pprovduti għal għalf ieħor. Fejn meħtieġ, il-lattożju għandu jitkejjel separatament u jitqies meta jiġu kkalkolati r-riżultati.

2.   Prinċipju

Iz-zokkor huwa estratt f'etanol dilwit; is-soluzzjoni tiġi ċċarata bis-soluzzjonijiet Carrez I u II. Wara li jiġi eliminat l-etanol, il-kwantitajiet qabel u wara l-inverżjoni huma stabbiliti mill-metodu Luff-Schoorl.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

5.   Proċedura

5.1.   Estrazzjoni tal-kampjun

Iżen 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 250 ml. Żid 200 ml etanol (3.1) u ħawwad fit-tazza għal siegħa. Żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 30 sekonda. Żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3) u erġa' ħawwad għal minuta. Żid sal-volum bl-etanol (3.1), omoġenizza u ffiltra. Neħħi 200 ml tal-filtrat u evapora sa bejn wieħed u ieħor nofs il-volum sabiex telimina l-parti l-kbira tal-etanol. Ittrasferixxi r-residwu tal-evaporazzjoni kwantitattivament f'kunjett volumetriku ta' 200 ml billi tuża l-ilma sħun, kessaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra jekk ikun meħtieġ. Din is-soluzzjoni tintuża biex jiġi stabbilit l-ammont ta' zokkor ta' riduzzjoni u, wara l-inverżjoni, l-ammonti totali taz-zokkor.

5.2.   Determinazzjoni ta' zokkor ta' riduzzjoni

Permezz ta' pipetta, neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li jkun fiha inqas minn 60 mg ta' zokkor ta' riduzzjoni espress bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b'ilma distillat u stabbilixxi l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat huwa mfisser bħala perċentwal tal-kontenut ta' glukożju fil-kampjun.

5.3.   Determinazzjoni ta' zokkor totali wara l-inverżjoni

Permezz ta' pipetta ħu 50 ml tas-soluzzjoni u ttrasferiha f'kunjett volumetriku ta' 100 ml. Żid ftit qatriet ta' soluzzjoni ta' metil oranġo (3.4) u mbagħad, b'attenzjoni u waqt li tħawwad il-ħin kollu, żid l-aċidu idrokloriku (3.5) sakemm il-likwidu jsir aħmar sew. Żid 15 ml aċidu idrokloriku (3.6), daħħal il-kunjett f'banju bil-misħun jagħli sew u żommu hemm għal tletin minuta. Kessaħ malajr sa bejn wieħed u ieħor 20 oCu żid 15 ml ta' soluzzjoni ta' idrossidu tas-sodju (3.7). Żid sa 100 ml bl-ilma u omoġenizza. Neħħi mhux aktar minn 25 ml tas-soluzzjoni li fiha inqas minn 60 mg zokkor ta' riduzzjoni mfisser bħala glukożju. Jekk ikun meħtieġ, żid sa 25 ml b'ilma distillat u stabbilixxi l-kontenut ta' zokkor ta' riduzzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl. Ir-riżultat huwa mfisser bħala perċentwal ta' glukożju jew, fejn xieraq, sukrożju, billi timmultiplika bil-fattur 0,95.

5.4.   Titrazzjoni permezz tal-metodu Luff-Schoorl

Permezz ta' pipetta, ħu 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.8) u ittrasferih f'kunjett Erlenmeyer tat-300ml; żid eżattament 25 ml tas-soluzzjoni ċċarata taz-zokkor. Żid 2 granuli ta' ħaffiefa (3.13), saħħan, waqt li tħawwad bl-idejn, fuq fjamma mikxufa ta' għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f'bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Qiegħed l-Erlenmeyer minnufih fuq xibka tal-wajer miksija bl-asbestos b'toqba b'dijametru ta' bejn wieħed u ieħor 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tiġi regolata b'tali mod li l-qiegħ tal-Erlenmeyer biss jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f'ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:

Żid 10 ml ta' soluzzjoni ta' potassium iodide (3.12) u minnufih wara (b'attenzjoni, minħabba r-riskju ta' produzzjoni ta' ħafna ragħwa) żid 25 ml ta' aċidu sulfuriku (3.11). Ittitra b'soluzzjoni tat-tiosulfat tas-sodju (3.9) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (3.10) u lesti t-titrazzjoni.

Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b'mod eżatt ta' 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.8) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (3.12) u 25 ml aċidu sulfuriku (3.11) mingħajr ma tgħalli.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Permezz tat-tabella, stabbilixxi l-ammont ta' glukożju f'mg li jikkorrespondi għad-differenza bejn il-valuri taż-żewġ titrazzjonijiet, espressi bħala mg ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru. Agħti r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Proċeduri speċjali

8.   Osservazzjonijiet

K.   DETERMINAZZJONI TAL-LATTOŻJU

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' lattożju fl-għalf li jkun fih aktar minn 0,5 % ta' lattożju.

2.   Prinċipju

Iz-zokkor huwa maħlul fl-ilma. Is-soluzzjoni tiġi suġġetta għall-fermentazzjoni permezz tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae li tħalli l-lattożju intatt. Wara l-kjarifika u l-filtrazzjoni, il-kontenut tal-lattożju jiġi stabbilit permezz tal-metodu Luff-Schoorl.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

Banju bl-ilma b'termostat issettjat f'temperatura ta' 38 – 40 oC.

5.   Proċedura

Iżen 1 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed dan il-porzjon tal-kampjun f'kunjett volumetriku ta' 100 ml. Żid 25 sa 30 ml ilma. Qiegħed il-kunjett f'banju b'misħun jagħli għal tletin minuta u mbagħad kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 35 oC. Żid 5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1) u omoġenizza. Ħalli l-kunjett joqgħod għal sagħtejn f'banju marija, f'temperatura ta' 38 – 40 oC. Kessaħ għal bejn wieħed u ieħor 20 oC.

Żid 2,5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.2) u ħawwad għal tletin sekonda, imbagħad żid 2,5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.3) u erġa' ħawwad għal tletin sekonda. Żid sa 100 ml bl-ilma, ħawwad u ffiltra. Permezz ta' pipetta, neħħi ammont ta' filtrat li ma jaqbiżx il-25 ml u li preferibbilment ikun fih minn 40 sa 80 mg ta' lattożju u ttrasferixxi f'kunjett Erlenmeyer ta' 300 ml. Jekk ikun meħtieġ, żid il-volum sa 25 ml bl-ilma.

Wettaq test blank bl-istess mod b'5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1). Stabbilixxi l-kontenut tal-lattożju skont Luff-Schoorl, kif ġej: żid eżattament 25 ml ta' reaġent Luff-Schoorl (3.4) u żewġ granuli ħaffiefa (3.5). Ħawwad bl-idejn waqt li ssaħħan fuq fjamma mikxufa ta' għoli medju u ħalli l-likwidu jiftaħ jagħli f'bejn wieħed u ieħor żewġ minuti. Qiegħed l-Erlenmeyer minnufih fuq xibka tal-wajer miksija bl-asbestos b'toqba b'dijametru ta' bejn wieħed u ieħor 6 cm dijametru li taħtha tkun inxtegħlet fjamma. Il-fjamma għandha tiġi regolata b'tali mod li l-qiegħ tal-Erlenmeyer biss jissaħħan. Iffittja kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer. għalli għal eżattament għaxar minuti. Kessaħ minnufih f'ilma kiesaħ u wara bejn wieħed u ieħor ħames minuti ttitra kif ġej:

Żid 10 ml ta' soluzzjoni tal-jodur tal-potassju (3.6) u minnufih wara (b'attenzjoni, minħabba fir-riskju ta' produzzjoni ta' ħafna ragħwa) żid 25 ml aċidu sulfuriku (3.7). Ittitra b'soluzzjoni tat-tiosulfat tas-sodju (3.8) sakemm jitfaċċa kulur isfar matt, żid l-indikatur tal-lamtu (3.9) u lesti t-titrazzjoni.

Wettaq l-istess titrazzjoni fuq taħlita mkejla b'mod eżatt ta' 25 ml tar-reaġent Luff-Schoorl (3.4) u 25 ml ilma, wara li żżid 10 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (3.6) u 25 ml aċidu sulfuriku (3.7) mingħajr ma tgħalli.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Permezz tat-tabella hawn mehmuża, stabbilixxi l-ammont ta' lattożju f'mg li jikkorrispondi għad-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ titrazzjonijiet, imfissra bħala ml ta' sodium thiosulphate 0,1 mol/litru.

Agħti r-riżultat miksub bħala lattożju anidru bħala perċentwali tal-kampjun.

7.   Osservazzjoni

Għall-prodotti li jkun fihom aktar minn 40 % ta' zokkor fermentabbli, uża aktar minn 5 ml ta' sospensjoni tal-ħmira (3.1).

L.   DETERMINAZZJONI TAL-LAMTU

– METODU POLARIMETRIKU –

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-livelli ta' lamtu u ta' prodotti ta' degradazzjoni tal-lamtu b'piż molekulari għoli fl-għalf, bil-għan li tiġi ċċekkjata l-konformità mal-valur tal-enerġija ddikjarat (dispożizzjonijiet fl-Anness VII) u d-Direttiva tal-Kunsill 96/25/KE ( 29 ).

2.   Prinċipju

Il-metodu jinkludi żewġ determinazzjonijiet. Fl-ewwel waħda, il-kampjun jiġi trattat u mħallat bl-aċidu idrokloriku dilwit. Wara li jiċċara u li ssir il-filtrazzjoni, ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni titkejjel permezz tal-polarimetrija.

Fit-tieni wieħed, il-kampjun jiġi estratt b'40 % etanol. Wara l-aċidifikazzjoni tal-filtrat b'aċidu idrokloriku, l-iċċarar u l-filtrazzjoni, titkejjel ir-rotazzjoni ottika bħal fil-każ tal-ewwel determinazzjoni.

Id-differenza bejn iż-żewġ kejlijiet, immultiplikata b'fattur magħruf, tagħti l-kontenut tal-lamtu tal-kampjun.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Għaffeġ il-kampjun sakemm ikun fin biżżejjed biex jgħaddi kollu kemm hu minn passatur b'toqob tondi ta' 0,5 mm.

5.2.   Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika totali (P jew S) (ara osservazzjoni 7.1)

Iżen 2,5 g tal-kampjun mgħaffeġ sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett iggradat ta' 100 ml. Żid 25 ml aċidu idrokloriku (3.2), ħawwad biex tikseb distribuzzjoni uniformi tal-kampjun tat-test u żid 25 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.2). Daħħal il-kunjett f'banju bl-ilma jagħli waqt li tħawwad sew u sod għall-ewwel tliet minuti biex tevita l-formazzjoni ta' agglomerati. Il-kwantità ta' ilma fil-banju tal-ilma għandha tkun suffiċjenti biex il-banju jibqa' jagħli meta l-kunjett jiddaħħal fih. Il-kunjett m'għandux jinħareġ mill-banju meta jkun qed jitħawwad. Eżattament wara 15-il minuta, neħħi mill-banju, żid 30 ml ilma kiesaħ u kessaħ minnufih sa 20 oC.

Żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez I (3.3) u ħawwad għal madwar 30 sekonda. Imbagħad żid 5 ml tas-soluzzjoni Carrez II (3.4) u erġa' ħawwad għal 30 sekonda. Żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u iffiltra. Jekk il-filtrat ma jkunx ċar għal kollox (ħaġa rari), irrepeti d-determinazzjoni bl-użu ta' kwantità akbar tas-soluzzjonijiet Carrez I u II, pereżempju 10 ml.

Kejjel ir-rotazzjoni ottika tas-soluzzjoni f'tubu ta' 200 mm bil-polarimetru jew bis-sakkimetru.

5.3.   Determinazzjoni tar-rotazzjoni ottika (P' jew S') ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg, qiegħed fil-kunjett iggradat ta' 100 ml u żid bejn wieħed u ieħor 80 ml etanol (3.5) (ara osservazzjoni 7.2). Ħalli l-kunjett jiksaħ għal siegħa 1 f'temperatura ambjentali; matul dan il-ħin ħawwad sew f'sitt okkażjonijiet biex il-kampjun tat-test jitħallat sew mal-etanol. Żid sal-volum bl-etanol (3.5), ħallat u iffiltra.

Iġbed b'pipetta 50 ml tal-filtrat (li jikkorrispondi għal 2,5 g tal-kampjun) f'kunjett Erlenmeyer ta' 250 ml, żid 2,1 ml aċidu idrokloriku (3.1) u ħawwad sew. Iffittja l-kondensatur reflux mal-kunjett Erlenmeyer u daħħal dan tal-aħħar fil-banju bl-ilma jagħli. Eżattament wara 15-il minuta, neħħi l-kunjett Erlenmeyer mill-banju, ittrasferixxi l-kontenut għall-kunjett iggradat ta' 100 ml, u laħlaħ bi ftit ilma kiesaħ u kessaħ sa 20 oC.

Iċċara billi tuża s-soluzzjonijiet Carrez I (3.3) u II (3.4), żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza, iffiltra u kejjel ir-rotazzjoni ottika kif indikat fit-2 u fit-3 paragrafi tal-5.2.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut tal-lamtu bħala perċentwali ( %) tal-kampjun huwa kalkolat kif ġej:

6.1.   Kejl skont il-polarimetrija

P

=

Rotazzjoni ottika totali fi gradi

P'

=

Rotazzjoni ottika fi gradi ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol (V/V)

=

Rotazzjoni ottika speċifika ta' lamtu pur. Il-valuri numeriċi. Il-valuri D numeriċi aċċettati b'mod konvenzjonali għal dan il-fattur huma kif ġejjin: +185,9o: lamtu tar-ross +185,7o: lamtu tal-patata +184,6o: lamtu tal-qamħirrun +182,7o: lamtu tal-qamħ +181,5o: lamtu tax-xgħir +181,3o: lamtu tal-ħafur +184,0o: tipi oħra ta' lamtu u taħlitiet ta' lamtu f'għalf kompost

6.2.   Kejl permezz ta' sakkarimetru

S

=

Rotazzjoni ottika totali fi gradi sakkarimetriċi

S'

=

Rotazzjoni ottika fi gradi sakkarimetriċi ta' sustanzi li jdubu f'40 % etanol (v/v)

N

=

Piż fi g ta' sukrożju f'100 ml ta' ilma li jagħti rotazzjoni ottika ta' 100 grad sakkarimetriku f'tubu ta' 200 mm. 16,29 g għal sakkarimetri Franċiżi, 26,00 g għal sakkarimetri Ġermaniżi, 20,00 g għal sakkarimetri varji. = Rotazzjoni ottika speċifika ta' lamtu pur (ara 6.1.)

6.3.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma għandhiex tkun iktar minn 0,4, f'valur assolut, għall-kontenut ta' lamtu ta' inqas minn 40 % u 1 % f'valur relattiv, għall-kontenut ta' lamtu ta' 40 % jew aktar.

7.   Osservazzjonijiet

M.   DETERMINAZZJONI TA' RMIED MHUX RAFFINAT

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-kontenut ta' rmied mhux raffinat fl-għalf.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jiġi magħmul f'irmied f'temperatura ta' 550 oC; ir-residwu jintiżen.

3.   Reaġenti

20 % (w/v) soluzzjoni ta' nitrat tal-ammonja.

4.   Apparat

5.   Proċedura

Iżen sal-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun (2,5 fil-każ ta' prodotti li għandhom tendenza li jintefħu) u qiegħdu fi griġjol għall-irmied wara li l-ewwel ikun issaħħan f'550 oC, imkessaħ u tnaqqaslu l-piż fi proporzjon mal-piż tal-kontenitur. Qiegħed il-griġjol fuq il-hotplate u saħħan gradwalment sakemm is-sustanza tikkarbonizza. Agħmel irmied skont 5.1 u 5.2.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Osservazzjonijiet

N.   DETERMINAZZJONI TA' RMIED LI MA JINĦALLX FL-AĊIDU IDROKLORIKU

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' sustanzi minerali fl-għalf li ma jinħallux fl-aċidu idrokloriku. Jistgħu jintużaw żewġ metodi, skont in-natura tal-kampjun.

2.   Prinċipju

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Metodu A

Ipproduċi rmied mill-kampjun permezz tal-metodu deskritt għad-determinazzjoni ta' rmied mhux raffinat. Irmied miksub minn dik l-analiżi jista' jintuża wkoll.

Qiegħed l-irmied f'beaker ta' 250 sa 400 ml billi tuża 75 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1). Ħallih jiftaħ jagħli bil-mod u għalli bil-mod għal ħmistax-il minuta. Iffiltra s-soluzzjoni sħuna minn karta tal-filtru ħielsa mill-irmied u aħsel ir-residwu b'ilma sħun sakemm ir-reazzjoni tal-aċidu ma tidhirx aktar. Nixxef il-filtru li fih ir-residwu u għamlu rmied fi griġjol li jkun tnaqqaslu l-piż fi proporzjon mat-toqol (tared) tal-kontenitur f'temperatura ta' mhux inqas minn 550 oC u mhux aktar minn 700 oC. Kessaħ f'dessikatur u iżen.

5.2.   Metodu B

Iżen 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u poġġih f'tazza ta' 250 sa 400 ml. Żid 25 ml ta' ilma u 25 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1) suċċessivament, ħawwad u stenna sakemm tieqaf l-effervexxenza. Żid 50 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.1). Stenna sakemm jieqaf xi rilaxx ta' gass imbagħad qiegħed it-tazza f'banju bl-ilma jagħli u żommha hemm għal tletin minuta jew aktar, jekk ikun meħtieġ, sabiex xi lamtu li jista' jkun preżenti jiġi idrolizzat sew. Iffiltra waqt li jkun sħun minn filtru ħieles mill-irmied u aħsel il-filtru f'50 ml ta' ilma sħun (ara osservazzjoni 7). Qiegħed il-filtru li jkun fih ir-residwu u għamlu rmied fi griġjol biex isir rmied f'temperatura ta' mhux inqas minn 550 oC u mhux aktar minn 700 oC. Qiegħed l-irmied f'tazza ta' 250 sa 400 ml bl-użu ta' 75 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1); kompli kif deskritt fit-tieni subparagrafu tal-5.1.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Ikalkula l-piż tar-residwu billi tnaqqas it-tare. Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

7.   Osservazzjoni

Jekk il-filtrazzjoni tkun diffiċli erġa' ibda l-analiżi, billi tibdel il-50 ml ta' aċidu idrokloriku (3.1) ma' 50 ml ta' 20 % trichloroacetic acid (3.2) u aħsel il-filtru f'soluzzjoni sħuna ta' 1 % trichloroacetic acid (3.3).

O.   DETERMINAZZJONI TAL-KARBONATI

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit l-ammont ta' karbonati, konvenzjonalment espress bħala calcium carbonate fil-biċċa l-kbira tal-għalf.

Iżda f'ċerti każijiet (pereżempju, iron carbonate) għandu jintuża metodu speċjali.

2.   Prinċipju

Il-karbonati huma dekomposti f'aċidu idrokloriku; il-carbon dioxide rilaxxat huwa miġbur f'tubu ggradat, u l-volum tiegħu mqabbel ma' dak rilaxxat taħt l-istess kundizzjonijiet permezz ta' kwantità magħrufa ta' calcium carbonate.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

Apparat Scheibler-Dietrich (ara d-dijagramma) jew apparat ekwivalenti.

5.   Proċedura

Skont il-kontenut tal-karbonat tal-kampjun, iżen porzjon tal-kampjun kif muri hawn taħt:

Qiegħed il-porzjon tal-kampjun fil-kunjett speċjali (4) tal-apparat, mgħammar b'tubu żgħir ta' materjal li ma jinkisirx li jkun fih 10 ml aċidu idrokloriku (3.1), u qabbad il-kunjett mal-apparat. Dawwar il-vit ta' bi tlieta (5) sabiex it-tubu (1) jaqbad ma' barra. Bl-użu tat-tubu mobbli (2), li huwa mimli b'aċidu sulfuriku ikkulurit (3.3) u mqabbad mat-tubu ggradat (1), ġib il-livell tal-likwidu sal-marka żero. Dawwar il-vit (5) sabiex tqabbad it-tubi (1) u (3) u vverifika li l-livell huwa fuq iż-żero.

Ħalli l-aċidu idrokloriku joħroġ (3.1) bil-mod fuq il-porzjon tal-kampjun, waqt li tmejjel il-kunjett (4). Agħmel il-pressjoni indaqs billi tbaxxi t-tubu (2). Ħawwad il-kunjett (4) sakemm ir-rilaxx tal-carbon dioxide ikun waqaf għal kollox.

Reġġa' lura l-pressjoni billi tirritorna l-likwidu lura sal-istess livell fit-tubi (1) u (2). Wara ftit minuti, meta l-volum tal-gass isir kostanti, ħu l-qari.

Wettaq test ta' kontroll fl-istess kundizzjonijiet fuq 0,5 g ta' calcium carbonate (3.2).

6.   Kalkolu tar-riżultati

Il-kontenut ta' karbonati, imfisser bħala calcium carbonate, huwa kkalkolat permezz tal-formula:

fejn:

X

=

% (w/w) ta' karbonati fil-kampjun, espress bħal karbonat tal-kalċju,

V

=

ml ta' CO2 rilaxxat mill-porzjon tal-kampjun m,

V1

=

ml ta' CO2 rilaxxat minn 0,5 g ta'CaCO,

m

=

piż, fi grammi, tal-porzjon tal-kampjun.

7.   Osservazzjonijiet

P.   DETERMINAZZJONI TAL-FOSFRU TOTALI

METODU FOTOMETRIKU

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi determinat il-kontenut tal-fosfru totali fl-għalf. Huwa partikolarment adattat għal-analiżi ta' prodotti bi kwantitajiet żgħar ta' fosfru fihom. F'ċerti każijiet (prodotti b'ħafna fosfru), jista' jintuża metodu gravimetriku.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa mineralizzat, jew b'kombustjoni niexfa (fil-każ ta' għalf organiku) jew b'diġestjoni ta' aċidu (fil-każ ta' komposti minerali u l-għalf likwidu), u mqiegħda f'soluzzjoni ta' aċidu. Is-soluzzjoni hija trattata b'reaġent molybdovanadate. Id-densità ottika tas-soluzzjoni s-safra hekk iffurmata hija mkejjla fin spektrofotometru f' 430 mm.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni

Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif indikat f'5.1.1 jew 5.1.2.

5.1.1.    Il-proċedura tas-soltu

Iżen 1 g jew iktar tal-kampjun sal-eqreb 1 mg. Qiegħed il-kampjun tat-test fi Kjeldahl kunjett, żid 20ml aċidu sulfuriku (3.5), ħallat sabiex is-sustanza tiġi kompletament imprenjata bl-aċidu u sabiex tippreveniha milli teħel mal-ġnub tal-kunjett, saħħan u żommha fil-punt tat-togħlija għal 10 minuti. Ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid 2 ml ta' aċidu nitriku (3.4), saħħan bil-mod, ħalliha tiksaħ kemm kemm, żid ftit iktar aċidu nitriku (3.4) u erġa' għalli. Irrepeti din il-proċedura sakemm tikseb soluzzjoni mingħajr kulur. Kessaħ, żid ftit ilma, ferra' l-likwidu f'kunjett iggradat b'500ml, u laħlaħ fil-kunjett Kjeldahl b'ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.

5.1.2.    Kampjuni li fihom sustanzi organiċi u ħielsa minn calcium u magnesium dihydrogen phosphates

Iżen madwar 2,5 g tal-kampjun sal-eqreb 1 mg fi griġjol tal-irmied. Ħallat il-kampjun tat-test sakemm jagħqad kompletament ma' 1g calcium carbonate (3.1). Ħallih sakemm isir irmied fil-forn f'550 oC sakemm jinkiseb irmied abjad jew griż (ftit faħam ma jimpurtax). Ittrasferixxi l-irmied għal beaker ta' 250 ml. Żid 20 ml ilma u aċidu idrokloriku (3.2) sakemm jieqaf il-gass. Żid 10 ml oħra ta' aċidu idrokloriku (3.2). Qiegħed il-beaker f'banju tar-ramel u evapora sakemm niexef biex is-silika issir insolubbli. Erġa' dewweb ir-residwu f'10ml ta' aċidu nitriku (3.3) u għalli fil-banju tar-ramel għal 5 minuti mingħajr ma jevapora sakemm jinxef. Ferra' l-likwidu f'kunjett iggradat ta' 500 ml, u laħlaħ il-beaker diversi drabi b'ilma sħun. Ħallih jiksaħ, żid sal-volum bl-ilma, omoġenizza u ffiltra.

5.2.   L-iżvilupp tal-kolorazzjoni u l-kejl tad-densità ottika

Iddilwixxi parti ta' alikwot tal-filtrat miksuba b'5.1.1 jew 5.1.2 sabiex tikseb konċentrazzjoni tal-fosfru ta' mhux iktar minn 40 μg/ml. Poġġi 10 ml ta' din is-soluzzjoni f'test-tube (4.6) u żid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f'20 oC. Kejjel id-densità ottika fi spettrofotometru f'430 nm kontra soluzzjoni miksuba billi żżid 10 ml tar-reaġent tal-molybdovanadate (3.6) sa 10 ml ilma.

5.3.   Kurva ta' kalibrar

Mis-soluzzjoni standard (3.7) ipprepara soluzzjonijiet li jkun fihom rispettivament 5, 10, 20, 30 u 40 μg fosfru għal kull ml. Ħu 10 ml minn kull waħda minn dawn is-soluzzjonijiet u żid magħhom 10 ml tal-aġent tal-molybdovanadate (3.6). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal mill-inqas 10 minuti f'20 oC. Kejjel id-densità ottika kif indikat f'5.2. Segwi l-kurva ta' kalibrar billi tipplottja d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet korrispondenti ta' fosfru. għal konċentrazzjonijiet bejn 0 u 40 μg/ml, il-kurva tkun lineari.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-ammont tal-fosfru fil-kampjun tat-test billi tuża l-kurva ta' kalibrar.

Esprimi r-riżultat bħala perċentwal tal-kampjun.

Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

Q.   DETERMINAZZJONI TA' KLORIN MINN KLORUR

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat l-ammont ta' klorin fi klorur li jinħall fl-ilma, imfisser b'mod konvenzjonali bħala sodium chloride. Huwa applikabbli għall-għalf kollu.

2.   Prinċipju

Il-kloruri jinħallu fl-ilma. Jekk il-prodott ikun fih materjal organiku dan jiġi ċċarat. Is-soluzzjoni tiġi kemm kemm aċidifikata bl-aċidu nitriku u l-kloruri jiġu preċipitati fil-forma ta' silver chloride permezz ta' soluzzjoni ta' silver nitrate. In-nitrat tal-fidda żejjed huwa titrat b'soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate, bil-metodu ta' Volhard.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

Mixer (tazza): bejn wieħed u ieħor 35 sa 40 rpm.

5.   Proċedura

5.1.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni

Skont in-natura tal-kampjun, ipprepara soluzzjoni kif muri f'5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3.

Fl-istess ħin wettaq test blank mingħajr il-kampjun li jrid jiġi analizzat.

5.1.1.    Kampjuni ħielsa minn materjal organiku

Iżen sal-eqreb mg kampjun ta' mhux aktar minn 10 g u li jkun fih mhux aktar minn 3 g ta' klorin fil-forma ta' klorur. Qiegħed ma' 400 ml ilma f'kunjett volumetriku ta' 500 ml f'temperatura ta' bejn wieħed u ieħor 20 oC. Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.

5.1.2.    Kampjuni li jkun fihom materjal organiku, minbarra l-prodotti elenkati taħt 5.1.3.

Iżen bejn wieħed u ieħor 5 g tal-kampjun sal-eqreb mg u qiegħed f'kunjett volumetriku ta' 500 ml ma' 1 g karbonju attiv. Żid 400 ml ilma f' temperatura ta' bejn wieħed u ieħor 20 oC u 5 ml ta' soluzzjoni Carrez I (3.7), ħawwad għal 30 sekonda u mbagħad żid 5 ml ta' soluzzjoni Carrez II (3.8). Ħawwad għal tletin minuta fit-tazza, żid sal-volum, omoġenizza u ffiltra.

5.1.3.    Għalf imsajjar, kejkijiet tal-kittien u dqiq, prodotti bi dqiq tal-kittien għoli u prodotti oħra b'muċilaġni għoli jew sustanzi kollojdali (pereżempju, lamtu iddextrinat)

Ipprepara s-soluzzjoni kif deskritt taħt 5.1.2 imma tiffiltrax. Ferra minn kunjett għall-ieħor (jekk meħtieġ iċċentrifuga), neħħi 100 ml tal-likwidu li jitla' fil-wiċċ u ttrasferixxi f'kunjett iggradat ta' 200 ml. Ħawwad ma' aċeton (3.6) u żid sal-volum b'dan is-solvent, omoġenizza u ffiltra.

5.2.   Titrazzjoni

Permezz ta' pipetta, ittrasferixxi f'kunjett Erlenmayer minn 25 ml sa 100 ml tal-filtrat (skont il-kontenut ta' klorin preżunt) miksub kif deskritt taħt 5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3. Il-porzjon li jiġi diviż bl-eżatt ma jridx ikun fih aktar minn 150 mg ta' klorin (Cl). Żid bl-ilma kif meħtieġ sa mhux inqas minn 50 ml, żid 5 ml ta' aċidu nitriku (3.4.), 20 ml ta' soluzzjoni saturata ta' ammonium ferric sulphate (3.3) u żewġ taqtiriet ta' soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate (3.1) ittrasferiti permezz ta' buretta mimlija sal-marka taż-żero. Permezz ta' buretta, ittrasferixxi s-soluzzjoni tas-silver nitrate (3.2) b'tali mod li jinkisbu 5 ml żejda. Żid 5 ml ta' etere diethyl (3.5) u ħawwad bis-saħħa sabiex il-preċipitat jaqgħad. Ittitra s-silver nitrate żejjed mas-soluzzjoni tal-ammonium thiocyanate (3.1) sakemm il-kulur kannella fl-aħmar idum għal minuta.

6.   Kalkolu tar-riżultati

L-ammont ta' klorin (X), imfisser bħala % ta' sodium chloride huwa kkalkolat permezz tal-formola segwenti:

fejn:

V1

=

ml ta' soluzzjoni ta' silver nitrate 0,1 mol/l miżjuda

V2

=

ml ta' soluzzjoni ta' ammonium thiocyanate 0,1 mol/l użata għat-titrazzjoni

m

=

piż tal-kampjun.

Jekk it-test blank jindika li s-soluzzjoni tas-silver nitrate 0,1 mol/l ġiet ikkunsmata naqqas dan il-valur mill-volum (V1 - V2).

7.   Osservazzjonijiet

---

ANNESS IV

METODI TA’ ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-LIVELL TA’ ADDITTIVI AWTORIZZATI FL-GĦALF

(A)   DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA A

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ vitamina A (retinol) fl-għalf u f’taħlitiet minn qabel. Il-vitamina A tinkludi l-alkoħol all-trans-retinyl u cis-isomers tagħha li huma ddeterminati b’dan il-metodu. The content of vitamin A is expressed in International Units (IU) per kg. IU wieħed jikkorrispondi mal-attività ta’ 0,300 μg all-trans-vitamin A alkoħol jew 0,344 μg ta’ all-trans-vitamin A acetate jew 0,550 μg all-trans-vitamin A palmitate.

Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2 000 IU vitamina A/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina A hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina A huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (RP-HPLC) bl-użu ta’ UV jew ditettur tal-fluworexxenza. Il-parametri kromatografiċi huma magħżula sabiex ma jkunx hemm separazzjoni bejn l-all-trans- vitamin A alkoħol u cis isomers tiegħu.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Nota:

Il-Vitamina A hija sensitiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina A.

5.2.   Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina A, iżen sal-eqreb 1 mg, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3.   Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1.    Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.

5.3.2.    Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.

5.4.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.10) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ vitamina A trid tkun fil-medda ta’ 5 IU/ml sa 30 IU/ml).

5.5.   Determinazzjoni permezz HPLC

Il-vitamina A tissepara fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni titkejjel permezz ta’ ditettur bl-UV (325 nm) jew ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm, emissjoni: 475 nm) (4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.9). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.

5.6.   Kalibrar

5.6.1.    Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ standard tax-xogħol

Ippipetta 20 ml ta’ soluzzjoni ta’ aċetat tal-vitamina A maħżuna (3.11.1) jew 20 ml tas-soluzzjoni ta’ palmitat tal-vitamina A maħżuna (3.12.1) f’kunjett konikali jew tal-qiegħ ċatt li jesa’ 500 ml (4.2.1) u idrolizzah kif spjegat fil-5.2, imma mingħajr żieda ta’ BHT. Sussegwentament agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif (3.2). Evapora 100 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u erġa’ dewweb ir-residwi f’10,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 560 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont il-5.6.3.3. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’kunjett iggradat ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita hija 56 IU vitamina A għal kull ml.

5.6.2.    Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 5,0 u 10,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,8, 5,6, 14,0 u 28,0 IU vitamina A għal kull ml.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Billi tuża l-medji tal-għoli tal-ogħla livelli (erjas) ipplottja grafika ta’ kalibrar li tikkunsidra r-riżultati tal-kontroll tal-UV (5.6.3.3).

5.6.3.    Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjonijiet standard

5.6.3.1.    Soluzzjoni stokk tal-aċetat tal-vitamina A

Ippipetta 2,0 ml tas-soluzzjoni stokk tal-aċetat ta’ vitamina A (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ aċetat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

(

 għall-aċetat tal-vitamina A=1 530 f’326 nm fi 2-propanol)

5.6.3.2.    Soluzzjoni stokk tal-palmitat ta’ vitamina A

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita ta’ palmitat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

(

 għal palmitat tal-vitamina A=957 fi 326 nm f’2-propanoli)

5.6.3.3.    Soluzzjoni ta’ standard ta’ ħidma ta’ vitamina A

Ippipetta 3,0 ml tas-soluzzjoni ta’ vitamina A mhux dilwita, preparata skont 5.6.1 f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Ippipetta 5,0 ml ta’ din is-soluzzjoni f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E325 × 18,3

(

 għal alkoħol tal-vitamina A=1 821 fi 325 nm f’2-propanol)

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli maħsub (żona) tal-livelli l-għolja tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’IU/ml b’referenza għall-grafika ta’ kalibrar (5.6.2).

Il-kontenut tal-vitamina A w f’IU/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[UI/kg]

fejn:

c

=

konċentrazzjoni tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’IU/ml

V1

=

volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’ml

V2

=

volum tal-alikwot meħud f’5.4 f’ml

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Osservazzjonijiet

8.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % meta mqabbla mal-ogħla riżultat.

9.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv ( 30 )

L

=

numru ta’ laboratorji

n

=

numru ta’ valuri singoli

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

sR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r

=

ripetibilità

R

=

riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

CVR

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

(B)   DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA E

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell tal-vitamina E fl-għalf u l-t-taħlitiet lesti minn qabel. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa mfisser bħala mg DL-α-tocopherol acetate għal kull kg. 1 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate jikkorrispondi għal 0,91 mg mg DL-α-tocopherol (vitamina E).

Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 2 mg vitamina E/kg. Dan il-limitu ta’ kwantifikazzjoni jinkiseb biss b’ditettur tal-fluworexxenza. B’ditettur bl-UV, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa biss 10 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina E hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa determinat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (EK-FGLK) bl-użu ta’ ditettur bl-UV jew fluworexxenti.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Nota:

Il-Vitamina E hija sensittiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1.   Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina E.

5.2.   Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina E, iżen sal-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.12), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3.   Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1.    Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.

5.3.2.    Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.

5.4.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.9) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ DL-α-tocopherol trid tkun fil-medda ta’ 5 μg/ml sa 30 μg/ml).

5.5.   Determinazzjoni permezz HPLC

Vitamina E hija separata fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni hija mkejla permezz ta’ ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 295 nm, emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm) (4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.8). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.

5.6.   Kalibrar (DL-α-tocopherol acetate jew DL-α-tocopherol)

5.6.1.    DL-α-tocopherol acetate standard

5.6.1.1.    Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 25 ml tas-soluzzjonita’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) f’kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt ta’ 500 ml (4.2.1) u idrolizza kif spjegat f’5.2. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif. Evapora 25 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u erġa’ dewweb ir-residwi f’25,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 45,5 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 50 μg DL-α-tocopherol acetate għal kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.1.2.    Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,5, 5,0, 10,0 u 25,0 μg DL-α-tocopherol acetate, eż. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml u 2,28 μg/ml DL-α-tocopherol.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.1.3.    Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1)

Iddilwixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm.

L-assorbiment massimu għandu jkun f’284nm:

 = 43,6 at 284 nm f’etanol

F’din it-taħlita irid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,84 sa 0,88.

5.6.2.    DL-α-tocopherol standard

5.6.2.1.    Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 2 ml tas-soluzzjoni stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, dewweb fil-metanol (3.3) u imla sal-marka bil-metanol. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 40 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 44,0 μg DL-α-tocopherol acetate kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.2.2.    Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. L-inqas konċentrazzjonijiet ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,0, 4,0, 8,0 u 20,0 μg/ml DL-α-tocopherol, i. e. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml u 22,0 μg/ml DL-α-tocopherol acetate.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.2.3.    Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ tocopherol-DL-α (3.11.1)

Iddilwixxi 2,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm. L-assorbiment massimu għandu jkun f’292nm:

 = 75,8 at 292 nm f’etanol

F’din it-taħlita jrid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,6.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun stabbilixxi l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml (ikkalkolata bħala α-tocopherol acetate) b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.6.1.2 jew 5.6.2.2).

Il-kontenut tal-vitamina E w f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c

=

il-konċentrazzjoni tal-vitamina E (bħala α-tocopherol acetate) tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) μg/ml

V1

=

volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4), f’ml

V2

=

volum tal-alikwot meħud f’(5.4), f’ml

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Osservazzjonijiet

8.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

9.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv ( 31 )

L

=

numru ta’ laboratorji

n

=

numru ta’ valuri singoli

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

sR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

r

=

ripetibilità

R

=

riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

CVR

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

(C)   DETERMINAZZJONI TA’ OLIGOELEMENTI – ĦADID, RAM, MANGANIŻ U ŻINGU

1.   Għan u skop

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-elementi traċċa ta’ ħadid, ram, manganiż u żingu fl-għalf. Il-limiti ta’ kwantifikazzjoni huma:

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa mdaħħal fis-soluzzjoni fl-aċidu idrokloriku wara l-qerda tal-materja organika, jekk ikun hemm. L-elementi ħadid, ram, manganiż u żingu jiġu stabbiliti, wara dilwizzjoni xierqa, bl-atomic absorption spectrometry.

3.   Reaġenti

Kummenti ta’ introduzzjoni

Għall-preparazzjoni tar-reaġenti u soluzzjonijiet analitiċi uża ilma ħieles mill-cations li għandhom jiġu stabbiliti, akkwistati jew b’distillar doppju tal-ilma jew f’tazza tal- borosilicate jew lampik tal-kwartz jew bi trattament doppju fuq raża ta’ skambju ta’ jonji.

Ir-reaġenti għandhom ikunu mill-anqas ta’ grad analitiku. Il-ħelsien mill-element li għandu jiġi stabbilit għandu jkun ivverifikat f’esperiment blank. Jekk meħtieġ, ir-reaġenti għandhom jiġu ppurifikati aktar.

Minflok is-soluzzjonijiet standard deskritti hawn taħt, jistgħu jintużaw soluzzjonijiet standard kummerċjali diment li dawn ikunu garantiti u jkunu ġew ivverifikati qabel l-użu.

4.   Apparat

5.   Proċedura ( 32 )

5.1.   Kampjuni li fihom materjal organiku

5.1.1.    L-irmied u l-preparazzjoni tas-soluzzjoni għal analiżi ( 33 )

5.1.2.    Determinazzjoni spettrofotometrika

5.1.2.1.    Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar

Għal kull wieħed mill-elementi li jeħtieġ jiġi determinat, ipprepara mis-soluzzjonijiet standard tax-xogħol kif mogħtija fil-punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 u 3.10.1 medda ta’ soluzzjonijiet ikkalibrati, kull soluzzjoni kalibrata jkollha konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru u (fil-każijiet ta’ ħadid, manganiż u żingu) konċentrazzjoni ta’ lanthanum chloride ekwivalenti għal 0,1 % La (w/v).

Il-konċentrazzjonijiet ta’ elementi ta’ traċċa magħżula jridu jkunu fil-medda ta’ sensittività tal-ispettrofotometru użat. It-tabelli ta’ hawn taħt juru, permezz ta’ eżempju, il-kompożizzjoni ta’ meded tipiċi ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar; iżda jiddependi fuq it-tip u s-sensittività tal-ispettrofotometru wżat jista’ jkun meħtieġ li jintgħażlu konċentrazzjonijiet oħrajn.

5.1.2.2.    Preparazzjoni ta’ soluzzjoni għal analiżi

Għad-determinazzjoni ta’ ram, is-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 tista’ normalment tintuża direttament. Jekk meħtieġ, sabiex twassal il-konċentrazzjoni tagħha fi ħdan il-medda tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar, porzjon alikwot jista’ jkun imseffed f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml u miżjud sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3).

Għad-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu, seffed porzjon alikwot tas-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml, żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u wassal sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3) ara wkoll punt 8 “Osservazjoni”).

5.1.2.3.    Esperiment blank

L-esperiment blank għandu jinkludi l-passi kollha stabbiliti fil-proċedura ħlief li l-materjal tal-kampjun jitħalla barra. Is-soluzjoni tal-kalibrar “0” m’għandhiex tintuża bħala l-blank.

5.1.2.4.    Kejl tal-assorbiment atomiku

Kejjel l-assorbiment atomiku tal-soluzzjonijiet tal-kalibrar u tas-soluzzjoni li għandha tkun analizzata billi tuża fjamma tal-aċitelena ta’ ossiġinazzjoni tal-arja f’dawn il-“wavelengths” segwenti:

Wettaq kull kejl erba’ darbiet.

5.2.   Għalf minerali

Jekk il-kampjun ma jkun fih ebda materjal organiku, m’hemmx għalfejn issir l-operazzjoni ta’ rmied qabel. Ipproċedi kif deskritt fil-punt 5.1.1.1. billi tibda mit-tieni paragrafu. L-evaporazzjoni bil-hydrofluoric acid tista’ titħalla barra.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Permezz ta’ kurva ta’ kalibrar, ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ elementi ta’ traċċa fis-soluzzjoni li għandha tiġi analizzata u uri r-riżultat f’milligrammi ta’ elementi ta’ traċċa għal kull kilogramma tal-kampjun (ppm).

7.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jaqbżu:

8.   Osservazzjoni

Il-preżenza ta’ kwantitajiet kbar ta’ fosfati tista’ tfixkel id-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu. Interferenza bħal din għandha tiġi kkoreġuta biż-żieda ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11). Jekk, madankollu, fil-kampjun, il-proporzjon tal-piż Ca + mg/P huwa > 2, iż-żieda tas-soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) mas-soluzzjoni għall-analiżi u għas-soluzzjoni ta’ kalibrar tista’ titħalla barra.

(D)   DETERMINAZZJONI TA’ HALOFUGINONE

DL-trans-7-bromo-6-chloro-3- [3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromide

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ halofuginone fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.

2.   Prinċipju

Wara t-trattament b’ilma jaħraq, halofuginone jiġi estratt bħala l-bażi libera fl-ethyl acetate u sussegwentament imqassam bħala l-hydrochloride f’soluzzjoni ta’ aċidu milwiem. Dan l-estratt jiġi ppurifikat bi kromotografia tal-iskambju tal-jonji. Il-kontenut tal-halofuginone huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC/MGKL) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Nota	Halofuginone bħala l-bażi libera huwa instabbli fis-soluzzjonijiet alkalini u tal-ethyl acetate. M’għandux jibqa’ fl-ethyl acetate għal iżjed minn 30 minuta.

5.1.   Ġenerali

5.2.   Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,1 g, 10 g mill-kampjun ippreparat, ġewwa tubu ċentrifugu tal-200 ml, żid 0,5 g ta’ sodium ascorbate (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) u 20 ml ilma u ħawwad. Qiegħed it-tubu għal 5 minuti f’banju bl-ilma (80 oC). Wara li jibred għat-temperatura ambjentali, żid 20 ml ta’ taħlita tas-sodium carbonate (3.15) u ħawwad. Żid minnufih 100 ml tal-ethyl acetate (3.4) u ħawwad bis-saħħa bl-idejn għal 15 il-sekonda. Imbagħad qiegħed it-tubu għal tliet minuti fil-banju ultrasoniku (4.1) u ħoll ftit it-tapp. Iċċentrifuga għal żewġ minuti u ferra’ l-fażi tal-ethyl acetate minn filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.6), għal f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml. Irrepeti l-estrazzjoni tal-kampjun bit-tieni porzjon ta’ 100 ml tal-ethyl acetate. Aħsel l-estratti miġmugħin għal minuta b’50 ml ta’ soluzzjoni ta’ sodium chloride saturated sodium carbonate (3.16) u armi s-saff milwiem.

Islet is-saff organiku għal minuta (1) b’50 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.17). għaddi s-saff aċiduż il-baxx f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 250 ml. Erġa’ islet is-saff organiku għal 1,5 minuti b’50 ml ieħor ta’ aċidu idrokloriku u għaqqad mal-ewwel estratt. Aħsel l-estratti magħqudin billi ddawwar għal bejn wieħed u ieħor 10 sekondi ma’ 10 ml tal-ethyl acetate (3.4).

Ittrasferixxi b’mod kwantitattiv is-saff milwiem għal kunjett b’qiegħ tond ta’ 250 ml u armi l-fażi organika. Evapora l-ethyl acetate kollu li jkun baqa’ mit-taħlita aċiduża bl-użu tal-evaporatur bil-pelikola rotanti (4.2). It-temperatura tal-banju bl-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Taħt vakwu ta’ bejn wieħed u ieħor of 25 mbar l-ethyl acetate kollu li jifdal għandu jitneħħa fi żmien 5 minuti fi 38 oC.

5.3.   Tindifa

5.3.1.    Preparazzjoni tal-kolonna tal-Amberlit

Kolonna XAD-2 tiġi ppreparata għal kull estratt tal-kampjun. Ittrasferixxi 10 g tal-Amberlit ippreparat (3.19) f’kolonna tal-ħġieġ (4.5) bil-metanol (3.8). Żid plagg żgħir tas-suf tal-ħġieġ mal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Battal il-metanol mill-kolonna u aħsel ir-raża b’100 ml ilma, filwaqt li twaqqaf in-nixxija hekk kif il-likwidu jilħaq il-parti tal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Ħalli l-kolonna tekwilibra ruħha għal 10 minuti qabel l-użu. Qatt tħalli l-kolonna tixxotta.

5.3.2.    Tindif tal-kampjun

Ittrasferixxi l-estratt (5.2) b’mod kwantitattiv lejn il-wiċċ tal-kolonna tal-Amberlit ippreparat (5.3.1) u saffi, filwaqt li twarrab it-tisfija. Ir-rata tat-tisfija m’għadhiex tkun aktar minn 20 ml/min. Laħlaħ il-kunjett bil-qiegħ tond b’20 ml hydrochlorid acid (3.17) u uża dan biex tlaħlaħ il-kolonna tar-raża. Onfoħ il-barra b’nixxija ta’ arja xi taħlita aċiduża li tkun baqgħet. Armi l-likwidu użat fil-ħasil. Żid 100 ml metanol (3.8) mal-kolonna u ħalli 5 sa 10 ml tal-ħasil, filwaqt li tiġbor is-soluzzjoni tal-ħasil f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Ħalli l-metanol li jkun baqa’ jekwilibra mar-raża għal 10 minuti u kompli t-tlaħliħ b’rata li ma taqbiżx 20 ml/min, u iġbor it-tlaħliħ fl-istess kunjett bil-qiegħ tond. Evapora l-metanol fuq l-evaporatur tal-pellikola rotanti (4.2), it-temperatura tal-banju tal-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Ittrasferixxi l-fdal b’mod kwantitattiv f’kunjett ikkalibrat ta’ 10 ml billi tuża l-fażi mobbli (3.21). Wassal sal-marka bil-fażi mobbli u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.7). Aħżen din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1.    Parametri

Il-kundizzjonijiet segwenti huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn basta dawn jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),

Fażi mobbli HPLC (3.21),

Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/min.

Wavelength tad-ditezzjoni: 243 nm

Volum tal-injezzjoni: 40 sa 100 μl.

Ivverifika l-istabbilità tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 3,0 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli (jew erjas) u ż-żmien ta’ żamma kostanti.

5.4.2.    Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) bosta drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar bl-użu tal-aqwa għoljiet jew żoni tal-medja tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala l-axxiżi.

5.4.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum bħal dak meħud għas-soluzzjoni tal-kalibrar u iddetermina l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli (iż-żona) tal-halofuginone.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, mill-medja tal-għoli (erja) tal-ogħla livelli ta’ halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun bis-soluzzjoni kampjun b’referenza għall-graff tal-kalibrar (5.4.2).

Il-kontenut tal-halofuginone w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c

:

konċentrazzjoni tal-halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml,

m

:

piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista’ tiġi ikkonfermata b’ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ dittetur tad-diode-array li bih huma mqabbla l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2). L-ammont ta’ halofuginone miżjud għandu jkun simili għal-ammont ikkalkolat ta’ halofuginone misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-halofuginone miżjud biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jitiqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll it-taħlit tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli masimu, għandha tkun madwar ± 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2.    Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhiex tkun aktar minn 0,5 mg/kg għall-kontenut ta’ halofuginone sa 3 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv ( 34 ) li fih ġew analizzati tliet kampjuni minn tmien laboratorji.

ND

=

mhux rilevat

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR

=

ko-effiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità ( %)

Rec.

=

irkupru ( %)

E.   DETERMINAZZJONI TA’ ROBENIDINE

1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-livelli ta’ robenidine fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt b’metanol aċidifikat. L-estratt jitnixxef u porzjon alikwot ikun soġġett għal tindifa sewwa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. Robenidine jitneħħa bil-ħasil mill-kolonna bil-metanol, konċentrat, u miżjud sa volum xieraq b’fażi mobbli. Il-kontenut ta’ robenidine jiġi stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja (HPLC – High performance liquid chromatography) b’fażi riversjata bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Nota:

Robenidine huwa sensittiv għad-dawl. għandhom jintużaw oġġetti tal-ħġieġ tal-ambra fl-operazzjonijiet kollha.

5.1.   Ġenerali

5.2.   Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,01g, bejn wieħed u ieħor 15 g tal-kampjun ippreparat. Ittrasferixxi għal kunjett konikali ta’ 250 ml u żid 100,0 ml ta’ metanal aċidifikat (3.2), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal siegħa fuq ix-shaker (4.2). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.5) u iġbor il-filtrat kollu f’kunjett konikali ta’ 150 ml. Żid passatur molekulari ta’ 7,5 g (3.4), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal ħames minuti. Iffiltra minnufih minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ. Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta’ purifikazzjoni (5.3).

5.3.   Purifikazzjoni

5.3.1.    Preparazzjoni tal-kolonna ta’ aluminium-oxide

Daħħal plagg żgħir ta’ suf tal-ħġieġ fil-parti t’isfel tal-kolonna tal-ħġieġ (4.1) u għafsu l-isfel bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ. Iżen 11,0 g tal-aluminium oxide ippreparat (3.5) u ttrasferixxi fil-kolonna. għandha tingħata attenzjoni biex titnaqqas kemm jista’ jkun l-espożizzjoni għall-arja matul din il-fażi. Taptap bil-mod il-kolonna mgħobbija fil-parti t’isfel tagħha biex l-aluminium-oxide joqgħod.

5.3.2.    Purifikazzjoni tal-kampjun

Ittrasferixxi fil-kolonna bil-pipetta 5,0 ml tal-estratt tal-kampjun ippreparat f’(5.2). Serraħ il-ponta tal-pipetta qrib il-ħajt tal-kolonna u ħalli s-soluzzjoni tkun assorbita fuq l-aluminium oxide. Neħħi bil-ħasil robenidine mill-kolonna billi tuża 100 ml methanol (3.1), b’rata ta’ fluss ta’ 2 sa 3 ml/minuta u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Evapora s-soluzzjoni tal-metanol sakemm jinxef taħt pressjoni mnaqqsa f’40 oC permezz ta’ evaporatur b’pellikola rotanti (4.3). Erġa’ dewweb ir-residwu f’3 sa 4 ml ta’ fażi mobbli (3.8) u ttrasferixxi b’mod kwantitattiv f’kunjett iggradat ta’ 10 ml. Laħlaħ il-kunjett b’diversi porzjonijiet ta’ 1 sa 2 ml tal-fażi mobbli u ttrasferixxi dawn it-tlaħliħiet fil-kunjett iggradat. Żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn 0,45 mm (4.7). Erfa’ din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1.    Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),

Fażi mobbli tal-HPLC (3.8),

Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/minuta,

Wavelength tad-ditettur: 317 nm,

Volum tal-injezzjoni: 20 sa 50 μl.

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, billi tinjetta s-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) li fiha 3,6 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli u l-ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.4.2.    Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) diversi drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-kurva tal-kalibrar bl-użu tal-medja tal-ogħla livelli jew erjas tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’mg għal kull ml bħala axxiżi.

5.4.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tar-robenidine.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli ta’ robenidine tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.4.2).

Il-kontenut ta’ robenidine w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c

=

il-konċentrazzjoni ta’ robenidine tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml,

m

=

piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tistà tigi kkonfermata b'ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.9.3) li fiha 6 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Estratt kampjun jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3). L-ammont ta’ robenidine miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat ta’ robenidine misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-ogħla livell ta’ robenidine biss għandu jiżdied wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f’bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2.    Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhiex taqbeż l-10 % tal-ogħla riżultat għal kontenut ta’ robenidine ogħla minn 15 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 85 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE li fih, erba’ kampjuni tal-għalf tat-tjur u tal-fniek, f’forma mitħun jew ta’ pritkuni kienu analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella hawn taħt:

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr

=

koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR

=

koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

(F)   DETERMINAZZJONI TA’ DICLAZURIL

(+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phenyl] acetonitrile.

1.   Għan u skop

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ diclazuril fl-għalf u f’taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 0,1 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 0,5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Wara ż-żieda ta’ standard intern, il-kampjun jiġi estratt b’metanol aċidifikat. għall-għalf, l-alikwot tal-estratt huwa ppurifikat fuq cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 . Id-diclazuril jinħareġ mill-cartridge b’taħlita ta’ metanol aċidifikat u ilma. Wara l-evaporazzjoni, ir-residwu jinħall f’DMF/ilma. għal taħlitiet lesti minn qabel, l-estratt huwa evaporat u r-residwu jinħall f’DMF/ilma. Il-kontenut tad-diclazuril huwa stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata b’ternary gradient (HPLC) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Ġenerali

5.1.1.    Għalf blank

Għalf blank għandu jiġi analizzat sabiex jiġi kkontrollat li la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. L-għalf blank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti m’għandhom jiġu rilevati.

5.1.2.    Test tal-irkupru

Għandu jtiwettaq test tal-irkupru billi jkun analizzat l-għalf blank li jkun ġie imsaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ diclazuril simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 1 mg/kg, żid 0,1 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) għal 50 g ta’ għalf blank, ħallat sewwa u ħalli għal 10 min, u erġa’ ħallat għal diversi drabi qabel ma tipproċedi (5.2.).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ diclazuril, simili għal dik diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2.   Estrazzjoni

5.2.1.    Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g bejn wieħed u ieħor 50 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku ta’ 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita fuq ix-shaker (4.1) tul il-lejl. Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 20 ml tas-supernatant fil-kontenitur adattat tal-ħġieġ u ddilwa b’20 ml ilma. Itrasferixxi din is-soluzzjoni fuq cartridge tal-estrazzjoni (3.11), u għaddi minn vakwu (4.5.). Aħsel il-cartridge b’25ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 65 + 35 (V + V). Armi l-frazzjonijiet miġbura u elwixxi l-komposti b’25 ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 80 + 20 (V + V). Evapora din il-frazzjoni sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Dewweb ir-residwu f’1,0 ml DMF (3.6), żid 1,5 ml ilma (3.1) u ħallat. Iffiltra minn filtru tal-membrana (4.4). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2.    Taħlitiet lesti minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g bejn wieħed u ieħor 1 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.3), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita tul il-lejl fuq ix-shaker (4.1). Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 10 000/p ml (p = kontenut nominali ta’ diclazuril fit-taħlita lesta minn qabel f’mg/kg) tas-supernatant f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ daqs adattat. Evapora sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Erġa’ dewweb ir-residwu f’10,0 ml DMF (3.6), żid 15,0 ml ilma (3.1) u ħallat. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1.    Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Ikkontrolla l-istabbilità tas-sistema kromatografika billi tinjetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10), li jkun fiha 2 g/ml, sakemm jintlaħqu ogħla livelli u ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.3.2.    Soluzzjoni tal-kalibrar

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) għal diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.

5.3.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni kampjun (5.2.1. jew 5.2.2.) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.

6.   Kalkolu tar-riżultati

6.1.   L-Għalf

Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

hd, s

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1)

hi, s

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1)

hd, c

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)

hi, c

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)

cd, c

=

il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni ta’ kalibrar f’g/ml (3.10)

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g.

V

=

il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 (jiġifieri 2,5 ml)

6.2.   Taħlitiet lesti minn qabel

Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

hd, c

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)

hi, c

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10)

hd, s

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2)

hi, s

=

l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2)

cd, c

=

il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar f’μg/ml (3.10)

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g.

V

=

il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 (jiġifieri 25 ml)

p

=

il-kontenut nominali ta’ diclazuril fi mg/kg fit-taħlita lesta minn qabel

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża ditettur ta’ diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10).

7.1.1.    Ko-kromatografija

Kampjun estratt (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrar (3.10). L-ammont ta’ diclazuril miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ diclazuril li jinstab fl-estratt tal-kampjun

L-għoli tal-ogħla livell ta’ diclazuril u l-ogħla livell tal-istandard intern biss għandhom jitjiebu wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-ogħla livell tad-diclazuril jew tal-ogħla livell tal-istandard intern tal-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ.

7.1.2.    Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

7.3.   Irkupru

Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati 5 kampjuni minn 11-il laboratorju. Dawn il-kampjuni kienu jikkonsistu minn żewġ taħlitiet lesti minn qabel; waħda kienet imħallta b’matriċi organika (O 100) u l-oħra b’matriċi inorganika (A 100). Il-kontenut teoretiku huwa 100 mg diclazuril għal kull kg. It-tliet taħlitiet tal-għalf għat-tjur saru minn 3 produtturi differenti (NL) (L1/Z1/K1). Il-kontenut teoretiku huwa 1 mg diclazuril għal kull kg. Il-laboratorji ngħataw struzzjonijiet biex janalizzaw kull wieħed mill-kampjuni għal darba jew darbtejn. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista’ tinstab fil-Journal of AOAC International, Volum 77, Nru 6, 1994, p. 1359-1361). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

L

=

numru ta’ laboratorji

n

=

numru ta’ valuri singoli

Sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibbiltà

CVr

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

9.   Osservazzjonijiet

Ir-reazzjoni ta’ diclazuril jeħtieġ li tkun intweriet preċedentament bħala lineari tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet imkejla.

(G)   DETERMINAZZJONI TA’ LASALOCID SODIUM

Melħ tas-sodju ta ’ polyether monocarboxylic acid prodott bi Streptomyces lasaliensis

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ lasalocid sodium fl-għalf u taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 5 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 10 mg/kg.

2.   Prinċipju

Lasalocid sodium huwa estratt minn kampjun ta’ metanol aċidifikat u stabbilit mill-kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta’ ditettur spettrofluworimetriku.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Ġenerali

5.1.1.    Għalf blank

Biex isir l-eżami tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analizzat kampjun blank biex jiġi ivverifikat li la lasalocid sodium u lanqas sustanzi ta’ tfixkil ma jkunu preżenti. Il-kampjun blank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u m’għandux ikun hemm lasalocid sodium jew sustanzi tat-tfixkil.

5.1.2.    Test tal-irkupru

L-eżami tal-irkupru għandu jsir bl-analiżi tal-kampjun blank li kien ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ lasalocid sodium, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tal-istandard tal-istokk (3.10.1) f’kunjett koniku ta’ 250ml u evapora s-soluzzjoni għal madwar 0,5 ml. Żid 50 g tal-kampjun blank, ħawwad sew u ħalli għal 10 minuti filwaqt li tħallat għal bosta drabi qabel ma tkompli bil-pass tal-estrazzjoni (5.2).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ il-kampjun li għandu jkun analizzat jiġi msaħħaħ bi kwantità ta’ lasalocid sodium simili għal dik li diġà hemm preżenti fil-kampjun. Dan l-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2.   Estrazzjoni

5.2.1.    Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, minn 5 g sa 10 g tal-kampjun f’kunjett koniku ta’ 250 ml b’tapp. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) b’pipetta. Poġġi t-tapp b’mod laxk u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Ħallih joqgħod għal madwar siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2) f’reċipjent xieraq. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2.    Taħlitiet lesti minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g madwar 2 g ta’ taħlit lest minn qabel mhux mitħun f’kunjett iggradat ta’ 250 ml. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett u l-kontenut f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat kollox sew. Ħallih joqgħod għal siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2). Żid volum xieraq tal-filtrat ċar b’metanol aċidifikat (3.8) biex tkun prodotta soluzzjoni finali tal-eżami li jkun fiha madwar 4 μg/ml ta’ lasalocid sodium. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1.    Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħra, sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Ivverifika l-istabbilta tas-sistema kromatografika, injetta s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10.3) li fiha 4,0 μgg/ml bosta drabi, sakemm jinkisbu l-ogħla livelli (jew erjas) u ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.3.2.    Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3) bosta drabi u stabbilixxi l-medja tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar billi tuża l-medji tal-ogħla livelli (meded) bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet li jikkorrispondu fi μg/ml bħala l-axxiżi.

5.3.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratti tal-kampjun miksubin fi 5.2.1 jew 5.2.2 bosta drabi, uża l-istess volum kif meħud fis-soluzzjoni ta’ kalibrar u stabbilixxi l-medja tal-ogħla livelli (meded) tal-ogħla livelli tas-sodju lasaloċidu.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-medja tal-ogħla livelli (meded) prodotti mill-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.3.3) stabbilixxi l-konċentrazzjoni ta’ lasalocid sodium (μg/ml) b’riferenza għall-graff ta’ kalibrar.

6.1.   Għalf

Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c

=

il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.1) fi μg/ml

V1

=

volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 f’ml (jiġifieri 100)

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

6.2.   Taħlitiet lesti minn qabel

Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c

=

il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.2) fi μg/ml

V2

=

il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 f’ml (jiġifieri 250)

f

=

il-fattur ta’ dilwizzjoni skont 5.2.2

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

Il-metodi bbażati fuq l-ispettrofluworometrija huma inqas soġġetti għal interferenza minn dawk li fihom tintuża d-ditezzjoni bl-UV. L-identità tal-analizzat tista’ tiġi ikkonfermata bil-ko-kromatografija.

7.1.1.    Ko-kromatografija

L-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3). L-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ lasalocid sodium li jinstab fl-estratt tal-kampjun. L-għoli tal-ogħla livell tal-lasalocid sodium biss għandu jittejjeb wara li jitqies l-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud u d-dilwizzjoni tal-estratt. L-akbar wisa’, f’nofs l-għoli, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-akbar wisa’ oriġinali prodott mill-estratt mhux imsaħħaħ tal-kampjun.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

7.3.   Irkupru

Għall-kampjun (blank) imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-anqas 80 %. għall-kampjuni msaħħa ta’ taħlit lest minn qabel, l-irkupru għandu jkun ta’ mill-inqas 90 %.

8.   Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv ( 35 ) li fih, 2 taħlitiet lesti minn qabel (kampjuni 1 u 2) u 5 kampjuni ta’ għalf (kampjuni 3 – 7) ġew analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

L

=

numru ta’ laboratorji

n

=

numru ta’ riżultati singoli

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

sR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

CVR

=

koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

---

ANNESS V

METODI TA ANALIŻI BIEX JIĠU KKONTROLLATI S-SUSTANZI MHUX MIXTIEQA FL-GĦALF

(A)   DETERMINAZZJONI TA' GOSSYPOL LIBERU U TOTALI

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-livelli ta' gossypol liberu, gossypol totali u sustanzi kimikament relatati fiż-żerriegħa tal-qoton, smida taż-żerriegħa tal-qoton u kejk ta' żerriegħa tal-qoton u f’għalf kompost li fih dawn il-materjali tal-għalf fejn huma preżenti aktar minn 20 mg/kg ta' gossypol liberu, gossypol totali u sustanzi kimikament relatati.

2.   Prinċipju

Il-gossypol jiġi estratt fil-preżenza ta' 3-aminopropan-1-ol, jew b’taħlita ta' propan-2-ol u hexane, għall-istabbiliment ta' gossypol liberu, jew b’dimethylformamide, għall-istabbiliment tal-gossypol totali. Il-gossypol huwa kkonvertit bl-anilina f’gossypol-dianiline, li d-densità ottika tiegħu hija mkejla f’440 nm.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.    Kampjun tat-test

L-ammont tal-kampjun tat-test jiddependi fuq il-kontenut preżunt ta' gossypol tal-kampjun. Huwa preferibbli li taħdem b’kampjun żgħir tat-test u ammont relattivament kbir ta' partijiet ta' alikwoti tal-filtrat, sabiex tikseb biżżejjed gossypol biex ikun jista’ jsir kejl fotometriku preċiż. għad-determinazzjoni ta' gossypol liberu fiż-żerriegħa tal-qoton, smida miż-żerriegħa tal-qoton u kejk ta' żerriegħa tal-qoton, il-kampjun tat-test m’għandux jaqbeż 1 g; għall-għalf kompost jista’ jkun sa 5g. Parti alikwota ta' 10 ml tal-filtrat hija adatta għall-parti ’l kbira tal-każijiet; għandu jkun fiha bejn 50 u 100 μg gossypol. għad-determinazzjoni tal-gossypol totali, il-kampjun tat-test għandu jkun ta' bejn 0,5 u 5 g, sabiex parti alikwota ta' 2 ml tal-filtrat ikun fiha bejn 40 u 200 μg gossypol.

L-analiżi għandha ssir f’temperatura ambjentali ta' madwar 20 oC.

5.2.    Determinazzjoni ta' gossypol liberu

Poġġi l-kampjun tat-test f’kunjett ta' 250 ml bl-għonq bil-ħġieġ matt, bil-qiegħ tal-kunjett miksi bi ħġieġ imfarrak. Permezz ta' pipetta, żid 50 ml tas-solvent A (3.2), agħlaq il-kunjett u ħawwad għal siegħa fl-apparat tat-taħlit. Iffiltra minn filtru niexef u iġbor il-filtrat f’kunjett żgħir bl-għonq tal-ħġieġ matt. Matul il-filtrazzjoni għatti l-lembut b’watch glass.

Iġbed b’pipetta partijiet alikwotti identiċi li jkun fihom bejn 50 u 100 μg ta' gossypol f’kull wieħed minn żewġ kunjetti ggradati ta' 25 ml (A u B). Fejn meħtieġ żid sal-volum b’10 ml ta' solvent A (3.2). Imbagħad żid il-kontenuti tal-kunjett (A) sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1). Din is-soluzzjoni għandha tintuża bħala soluzzjoni ta' referenza li kontriha titkejjel is-soluzzjoni tal-kampjun.

Iġbed b’pipetta 10 ml tas-solvent A (3.2) f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti ggradati l-oħra ta' 25 ml (C u D). Żid il-kontenuti tal-kunjett (c) sal-volum bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Din is-soluzzjoni għandha tintuża bħala soluzzjoni ta' referenza li kontriha titkejjel is-soluzzjoni tat-test blank.

Żid 2 ml tal-anilina (3.4) f’kull wieħed mill-kunjetti (D) u (N). Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli biex tiżviluppa l-kulur. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita tal-propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa.

Stabbilixxi d-densità ottika tat-test blank tas-soluzzjoni (D) billi tqabbel mas-soluzzjoni ta' referenza (c), u d-densità ottika tal-kampjun tas-soluzzjoni (B) billi tqabbel is-soluzzjoni (A) ta' referenza, fl-ispettrometru f’440 nm bl-użu ta' ċelluli tal-ħġieġ ta' 1 cm.

Naqqas id-densità tas-soluzzjoni tal-kampjun blank minn dik tas-soluzzjoni tal-kampjun (= densità ottika korretta). Minn dan il-valur ikkalkula l-kontenut liberu ta' gossypol kif indikat f’6.

5.3.    Determinazzjoni tal-gossypol totali

Qiegħed kampjun tat-test li jkun fih minn 1 sa 5 mg gossypol f’kunjett iggradat ta' 50 ml u żid 10 ml tas-solvent B (3.3). Fl-istess waqt, ipprepara test blank, billi tqiegħed 10 ml tas-solvent B (3.3) f’kunjett ieħor iggradat ta' 50 ml. Saħħan iż-żewġ kunjetti għal 30 minuta fuq banju bl-ilma jagħli. Kessaħ sat-temperatura ambjentali u żid il-kontenuti ta' kull kunjett sal-volum bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Omoġenizza u ħalliha toqgħod għal bejn 10 u 15-il minuta, imbagħad iffiltra u iġbor il-filtrati fil-kunjetti bl-għonq matt.

Iġbed b’pipetta 2 ml tal-kampjun tal-filtrat f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti ggradati ta' 25 ml, u 2 ml tal-filtrat tat-test blank f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti l-oħra ta' 25 ml. Żid il-kontenuti tal-kunjett wieħed minn kull serje sa 25 ml bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1). Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jintużaw bħala s-soluzzjonijiet ta' referenza.

Żid 2 ml ta' anilina (3.4) f’kull wieħed miż-żewġ kunjetti l-oħra. Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli biex tiżviluppa l-kulur. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid għal 25 ml bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa.

Iddetermina d-densità ottika kif indikat fil-5.2 għal gossypol liberu. Minn dan il-valur ikkalkula l-kontenut totali ta' gossypol kif indikat f'6.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Ir-riżultati jistgħu jiġu ikkalkulati jew mid-densità ottika speċifika (6.1) jew b’referenza għall-kurva ta' kalibrar (6.2).

6.1.    Mid-densità ottika speċifika

Id-densitajiet ottiċi speċifiċi, taħt il-kundizzjonijiet deskritti, għandhom ikunu dawn li ġejjin:

Il-kontenut liberu jew totali tal-gossypol tal-kampjun huwa kalkulat bl-użu tal-formula segwenti:

fejn:

E

=

id-densità ottika korretta, kif indikat fil-5.2;

p

=

il-kampjun tat-test fi g;

a

=

il-parti alikwota tal-filtrat f’ml.

6.2.    Mill-kurva ta' kalibrar

6.2.1.    Gossypol liberu

Ipprepara 2 serje ta' ħames kunjetti ggradati ta' 25 ml. Iġbed b’pipetta alikwotti ta' 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 u 10,0 ml ta' soluzzjoni A ta' gossypol standard (3.5) f’kull waħda mis-serje ta' kunjetti. Żid sal-volumi b’10 ml tas-solvent A (3.2). Qabbel kull serje ma' kunjett iggradat ta' 25 ml li jkun fih biss 10 ml tas-solvent A (3.2) (test blank).

Żid il-volum tal-kunjetti tal-ewwel serje (inkluż il-kunjett tat-test blank) sa 25 ml bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1) (serje ta' referenza).

Żid 2 ml anilina (3.4) f’kull kunjett tat-tieni serje (inkluż il-kunjett għat-test blank). Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli biex tiżviluppa l-kulur. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa (serje standard).

Kif indikat f’5.2, iddetermina d-densità ottika tas-soluzzjonjiet fis-serje standard billi tqabbel mas-soluzzjonijiet li jikkorrispondu fis-serje ta' referenza. Niżżel il-kurva ottika billi tevalwa d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet ta' gossypol (f/μg).

6.2.2.    Gossypol totali

Ipprepara sitt kunjetti ggradati ta' 50 ml. Fl-ewwel kunjett qiegħed 10 ml tas-solvent B (3.3), u fl-oħrajn 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 u 10,0 ml ta' soluzzjoni B standard ta' gossypol (3.6) rispettivament. Żid il-kontenut ta' kull kunjett sa 10 ml bis-solvent B (3.3). Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1) u omoġenizza.

Qiegħed 2,0. ml ta' dawn is-soluzzjonijiet f’kull wieħed miż-żewġ serje ta' kunjetti ggradati ta' 25 ml. Żid il-kontenuti tal-fliexken fl-ewwel serje sa 25 ml bit-taħlita ta' propan-2-ol-hexane (3.1) (serje ta' referenza).

Żid 2 ml anilina (3.4) f’kull kunjett tat-tieni serje. Saħħan għal 30 minuta fuq banju tal-misħun jagħli. Kessaħ għat-temperatura ambjentali, żid sal-volum bit-taħlita propan-2-ol-hexane (3.1), omoġenizza u ħalliha toqgħod għal siegħa (serje standard).

Kif indikat f’5.2, iddetermina d-densità ottika tas-soluzzjonjiet fis-serje standard billi tqabbel mas-soluzzjonijiet li jikkorrispondu fis-serje ta' referenza. Niżżel il-kurva ottika billi tevalwa d-densitajiet ottiċi kontra l-kwantitajiet ta' gossypol (f/μg).

6.3.    Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

▼M4

(B)   DETERMINAZZJONI TAL-LIVELLI TA' DIOSSINI (PCDD/PCDF) U TA' PCB

KAPITOLU I

Metodi ta' teħid ta' kampjuni u interpretazzjoni tar-riżultati analitiċi

1.    Għan u Skop

Il-kampjuni maħsuba għall-kontroll uffiċjali tal-livelli ta' dpoliklorodibenżo-p-diossina (PCDDs), poliklorodibenżofuran (PCDFs), poliklorobifenili (PCB) ( 36 ) simili għad-diossini u PCB li ma humiex simili għad-diossini fl-għalf għandhom jittieħdu skont id-dispożizzjonijiet tal-Anness I. Għandhom jiġu applikati r-rekwiżiti kwantitattivi f'relazzjoni mal-kontroll ta' sustanzi jew prodotti mqassma uniformament fl-għalf kif stipulat fil-punt 5.1 tal-Anness I. Aggregazzjoni ta' kampjuni li tkun inkisbet għandha tiġi kkunsidrata bħala rappreżentattiva tal-materjal li minnu tkun ittieħdet. Għandha tiġi stabbilita konformità mal-livelli massimi stipulati fid-Direttiva 2002/32/KE fuq bażi tal-livelli ddeterminati fil-kampjuni tal-laboratorju.

Għall-finijiet ta' din il-Parti B, id-definizzjonijiet miġjuba fl-Anness I mad-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 2002/657/KE ( 37 ) għandhom japplikaw.

Minbarra dawk id-definizzjonijiet, id-definizzjonijiet li ġejjin għandhom japplikaw għall-finijiet ta' din il-parti B:

2.    Konformità tal-lott jew tas-sublott mal-livell massimu

2.1.    Fir-rigward ta' PCB mhux simili għad-diossini

Il-lott ikun konformi mal-livell massimu jekk ir-riżultat analitiku ma jaqbiżx il-livell massimu ta' PCB li mhumiex simili għad-diossini stipulati mid-Direttiva 2002/32/KE, meta wieħed jikkunsidra l-inċertezza tal-kejl.

Il-lott ma jkunx konformi mal-livell massimu jekk ir-riżultat analitiku tal-livell superjuri ( 38 ) ikkonfermat minn analiżi duplikata ( 39 ) jaqbeż il-livell massimu stipulat mid-Direttiva 2002/32/KE, meta wieħed jikkunsidra l-inċertezza tal-kejl. Biex tkun verifikata l-konformità tintuża l-medja taż-żewġ determinazzjonijiet, u dan filwaqt li jittieħed kont tal-inċertezza tal-kejl.

L-inċertezza tal-kejl għandha tiġi kkunsidrata skont wieħed minn dawn l-approċċi:

Il-paragrafi 1, 2 u 3 għandhom japplikaw għar-riżultat analitiku miksub fuq il-kampjun għall-kontroll uffiċjali. Fil-każ ta' analiżi għal skopijiet ta' difiża jew ta' referenza, għandhom japplikaw ir-regoli nazzjonali.

2.2.    Rigward PCDD/F u PCB simili għad-diossini

Il-lott ikun jaqbel mal-livelli massimi jekk ir-riżultat ta' analiżi waħda,

Għal assaġġ tal-iskrinjar għandu jkun stabbilit valur ta' limitu għal deċiżjonijiet dwar il-konformità tal-kampjuni mal-livelli massimi rispettivi stipulati jew għal PCDD/PCDFs, jew inkella għas-somma ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini.

Il-lott ma jkunx konformi mal-livell massimu jekk ir-riżultat analitiku tal-livell superjuri ( 40 ) miksub permezz ta' metodu konfermatorju u kkonfermat minn analiżi duplikata jaqbeż il-livell massimu stipulat mid-Direttiva 2002/32/KE, meta wieħed jikkunsidra l-inċertezza tal-kejl ( 41 ). Biex tkun verifikata l-konformità tintuża l-medja taż-żewġ determinazzjonijiet, u dan filwaqt li jittieħed kont tal-inċertezza tal-kejl.

L-inċertezza tal-kejl għandha tiġi kkunsidrata skont wieħed minn dawn l-approċċi:

Il-paragrafi minn 1 sa 4 għandhom japplikaw għar-riżultati analitiċi miksuba fuq il-kampjun għall-kontroll uffiċjali. Fil-każ ta' analiżi għal skopijiet ta' difiża jew ta' referenza, għandhom japplikaw ir-regoli nazzjonali.

3.    Riżultati li jaqbżu l-limiti ta' azzjoni kif stipulati fl-Anness II mad-Direttiva 2002/32/KE

Il-limiti ta' azzjoni jservu ta' għodda għas-selezzjoni ta' kampjuni f'dawk il-każijiet fejn huwa meħtieġ li jkun identifikat sors ta' kontaminazzjoni u sabiex jittieħdu miżuri biex din titnaqqas jew tiġi eliminata. Il-metodi ta' skrinjar għandhom jistabbilixxu valuri ta' limitu għas-selezzjoni ta' dawk il-kampjuni. F'każ li jkunu meħtieġa sforzi sinifikanti biex ikun identifikat is-sors u biex il-kontaminazzjoni titnaqqas jew tiġi eliminata, jista' jkun xieraq li tiġi konfermata l-qabża fil-limiti ta' azzjoni hija kkonfermata minn analiżi duplikata permezz ta' metodu ta' konferma u b'kunsiderazzjoni tal-inċertezza tal-kejl ( 42 ).

KAPITOLU II

Preparazzjoni ta' kampjuni u rekwiżiti għall-metodi ta' analiżi użati fil-kontroll uffiċjali tal-livelli ta' diossini (PCDD/PCDF) u ta' PCB simili għad-diossini fl-għalf

1.    Kamp tal-applikazzjoni

Ir-rekwiżiti stipulati f'dan il-Kapitolu għandhom jiġu applikati meta l-għalf ikun analizzat għall-kontroll uffiċjali tal-livelli sostituti 2,3,7,8 ta' poliklorodibenżo-p-diossini u poliklorodibenżofurani (PCDD/Fs) u poliklorobifenili simili għad-diossini (PCB simili għad-diossini) u għal skopijiet regolatorji oħra.

Il-monitoraġġ tal-preżenza ta' PCDD/Fs u PCB simili għad-diossini fl-għalf jista' jsir għal żewġ tipi differenti ta' metodi analitiċi:

2.    Sfond

Għall-kalkolu tal-konċentrazzjonijiet tal-Ekwivalent ta' Tossiċità (TEQ), il-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi individwali f'kampjun partikolari għandhom jiġu mmultiplikati mal-Fattur ta' Ekwivalenza ta' Tossiċità (TEF) rispettiv tagħhom (ara n-nota ta' qiegħ il-paġna (42)  tal-Kapitolu I) u sussegwentament magħduda biex jinkiseb it-total tal-konċentrazzjoni tal-komposti simili għad-diossini espressa bħala TEQs.

Għall-finijiet ta' din il-Parti B, il-limitu speċifiku aċċettat ta' kwantifikazzjoni ta' konġeneri individwali jfisser il-kontenut l-aktar baxx tal-analita li jista' jitkejjel b'ċertezza statistika raġonevoli, li jissodisfa l-kriterji ta' identifikazzjoni kif deskritti fl-istandards rikonoxxuti internazzjonalment, pereżempju, fl-istandard EN 16215:2012 (Għalf għall-annimali — Determinazzjoni tad-diossini u PCB simili għad-diossini permezz tal-GC-HRMS u ta' PCB indikaturi permezz tal-GC-HRMS) u/jew il-metodi EPA 1613 u 1668 kif riveduti.

Il-limitu ta' kwantifikazzjoni ta' konġeneru individwali jista' jiġi identifikat bħala

Metodi ta' skrinjar bijoanalitiċi mhumiex se jagħtu riżultati f'livell ta' konġeneru imma biss indikazzjoni ( 43 ) tal-livell TEQ, espress bħala Ekwivalenti Bijoanalitiċi (BEQ) sabiex ikun magħruf il-fatt li f'estratt ta' kampjuni, mhux il-komposti kollha preżenti li jipproduċu rispons f'test jistgħu jobdu r-rekwiżiti kollha tal-prinċipju TEQ.

Il-metodi ta' skrinjar u konfermatorji jistgħu jiġu applikati biss għall-kontroll ta' ċerti matriċi jekk il-metodi huma sensittivi biżżejjed biex jinstabu livelli b'mod li wieħed jista' joqgħod fuqhom fil-limitu ta' azzjoni jew il-livell massimu.

3.    Rekwiżiti għall-assigurazzjoni tal-kwalità

3.1.	Għandhom jittieħdu miżuri sabiex tkun evitata l-kontaminazzjoni trasversali f'kull stadju tal-proċedura tat-teħid ta' kampjuni u tal-analiżi.

3.2.

Il-kampjuni għandhom jinħażnu u jiġu ttrasportati f'kontenituri tal-ħġieġ, aluminju, polipropilen jew polietilen adattati għall-ħżin mingħajr ebda influwenza fuq il-livelli ta' PCDD/PCDFs u ta' PCB simili għad-diossini fil-kampjuni. Fdalijiet ta' trab tal-karti għandhom jitneħħew mill-kontenitur tal-kampjun.

3.3.	Il-ħażna u t-trasport tal-kampjuni għandhom jitwettqu b'mod li jżomm l-integrità tal-kampjun tal-għalf.

3.4.

Sa fejn huwa rilevanti, kull kampjun tal-laboratorju għandu jkun mitħun fin u mħallat sew permezz ta' proċess li jkun intwera li jista' jikseb omoġenizzazzjoni kompluta (pereżempju tħin li jgħaddi minn arbiel ta' 1 mm). Il-kampjuni għandhom jitnixxfu qabel ma jiġu mitħuna jekk il-kontenut umdu jkun għoli wisq.

3.5.	Għandu jsir kontroll tar-reaġenti, tal-oġġetti tal-ħġieġ u tat-tagħmir għall-possibbiltà ta' influwenza tar-riżultati bbażati fuq it-TEQ jew il-BEQ.

3.6.	Għandha ssir analiżi inbjank billi titwettaq il-proċedura analitika kollha filwaqt li jitħalla barra l-kampjun biss.

3.7.

Għall-metodi bijoanalitiċi, l-oġġetti kollha tal-ħġieġ u s-solventi użati fl-analiżi għandhom ikunu ttestjati biex ikunu ħielsa minn komposti li jistgħu jfixklu d-detezzjoni tal-komposti fil-mira fil-medda ta' ħidma. L-oġġetti tal-ħġieġ għandhom jitlaħalħu b'solventi jew jissaħnu f'temperaturi adattati biex ineħħu kull traċċa ta' PCDD/PCDFs, komposti simili għad-diossini u komposti li jinterferixxu, mill-wiċċ tagħhom.

3.8.	Il-kwantità ta' kampjuni użata għall-estrazzjoni għandha tkun biżżejjed biex tissodisfa r-rekwiżiti b'kunsiderazzjoni ta' medda ta' ħidma baxxa biżżejjed inkluż il-konċentrazzjonijiet tal-livell massimi jew il-limitu ta' azzjoni.

3.9.	Il-proċeduri speċifiċi ta' preparazzjoni tal-kampjun użati għall-prodotti meqjusa għandhom isegwu l-linji gwida aċċettati internazzjonalment.

4.    Rekwiżiti għal-laboratorji

4.1.

B'konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (KE) Nru 882/2004, il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati minn korp rikonoxxut li jopera skont il-Gwida ISO 58 biex jiżgura li dawn qegħdin japplikaw assigurazzjoni ta' kwalità analitika. Il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati skont l-istandard EN ISO/IEC 17025.

4.2.	Il-profiċjenza tal-laboratorju għandha tiġi ppruvata permezz tal-parteċipazzjoni kontinwa b'suċċess fi studji interlaboratorji għad-determinazzjoni ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini fil-matriċi tal-għalf rilevanti u fil-meded ta' konċentrazzjoni.

4.3.	Il-laboratorji li japplikaw metodi ta' skrinjar għall-kontroll ta' rutina għandhom jistabbilixxu kooperazzjoni mill-qrib ma' laboratorji li japplikaw il-metodi konfermatorji, kemm għall-kontroll ta' kwalità kif ukoll għall-konferma tar-riżultat analitiku ta' kampjuni suspettużi.

5.    Ħtiġiet bażiċi li għandhom ikunu ssodisfati għall-proċedura analitika għal diossini (PCDD/PCDFs) u PCB simili għad-diossini.

5.1.    Medda ta' ħidma baxxa u limiti ta' kwantifikazzjoni

Għal PCDD/PCDFs, il-kwantitajiet li jistgħu jinstabu għandhom ikunu fil-medda femtogramm superjuri (10–15 g) minħabba t-tossiċità estrema ta' xi wħud minn dawn il-komposti. Għall-biċċa l-kbira tal-konġeneri tal-PCB, il-limitu ta' kwantifikazzjoni fil-medda tan-nanogramm (10–9 g) diġà huwa biżżejjed. Għall-kejl tal-konġeneri ta' PCB simili għad-diossini li huma aktar tossiċi (b'mod partikolari konġeneri sostituti mhux orto) il-livell inferjuri tal-medda ta' ħidma għandu jilħaq il-livelli pikogramm (10–12 g). Għall-kumplament tal-konġeneri ta' PCB il-limitu ta' kwantifikazzjoni fil-medda tan-nanogramm (10–9 g) huwa suffiċjenti.

5.2.    Selettività għolja (speċifiċità)

5.2.1.

Hija meħtieġa distinzjoni bejn il-PCDD/PCDFs u l-PCB simili għad-diossini, u ħafna komposti oħra li huma koestratti u li possibbilment komposti li jinterferixxu, preżenti f'konċentrazzjonijiet sa diversi ordnijiet ta' magnitudni ogħla minn dawk tal-analiti ta' interess. Għall-metodi ta' GC-MS, hija meħtieġa differenza fost il-konġeneri varji, bħal pereżempju bejn it-tossiċità (pereżempju, is-sbatax-il sostitut 2,3,7,8 PCDD/PCDFs u 12-il PCB simili għad-diossini) u konġeneri oħrajn.

5.2.2.

Il-metodi bijoanalitiċi għandhom ikunu kapaċi jsibu l-komposti fil-mira bħala s-somma ta' PCDD/PCDFs, u/jew PCB simili għad-diossini. It-tindif tal-kampjun għandu jimmira li jneħħi l-komposti li jikkawżaw riżultati ta' nuqqas ta' konformità falza jew il-komposti li jistgħu jnaqqsu r-rispons u jikkawżaw riżultati ta' konformità falza.

5.3.    L-akkuratezza kbira (eżattezza u preċiżjoni, irkupru apparenti tat-test bijoloġiku)

5.3.1.

Għall-metodi GC-MS, id-determinazzjoni għandha tipprovdi stima valida tal-konċentrazzjoni effettiva f'kampjun. Eżattezza għolja hija meħtieġa biex tkun evitata ċ-ċaħda ta' riżultat ta' analiżi ta' kampjun abbażi ta' affidabbiltà baxxa tal-livell TEQ determinat. L-eżattezza hija espressa bħala l-verità (id-differenza bejn il-valur medju mkejjel għall-analita f'materjal iċċertifikat u l-valur iċċertifikat tiegħu, li huwa espress bħala perċentwal ta' dan il-valur) u l-preċiżjoni (RSDR id-devjazzjoni standard relattiva kkalkolata mir-riżultati ġġenerati f'kondizzjonijiet ta' riproduċibilità).

5.3.2.

Għall-metodi bijoanalitiċi, għandu jiġi ddeterminat l-irkupru apparenti tat-test bijoloġiku. L-irkupru apparenti tal-bijoassaġġ ifisser il-livell BEQ ikkalkulat mill-kurva tal-kalibrazzjoni tat-TCDD jew il-PCB 126 korretta għall-inbjank u mbagħad diviża bil-livell TEQ determinat mill-metodu konfermatorju. Dan għandu l-għan li jikkoreġi fatturi bħat-telf ta' PCDD/PCDFs u komposti simili għad-diossini waqt l-estrazzjoni u l-istadji tat-tindif, komposti koestratti li jżidu jew inaqqsu r-rispons (effetti agonistiċi u antagonistiċi), il-kwalità tal-aġġustament tal-kurva, jew id-differenzi bejn il-Fattur ta' Ekwivalenza Tossikà (TEF) u l-valuri tal-Potenza Relattiva (REP). L-irkupru apparenti tal-bijoassaġġ huwa kkalkulat minn kampjuni ta' referenza adattati bi profili ta' konġeneri rappreżentattivi madwar il-livell ta' interess.

5.4.    Il-validazzjoni fil-medda tal-livell massimu u l-miżuri ġenerali tal-kontroll tal-kwalità

5.4.1.

Il-laboratorji għandhom juru t-twettiq ta' metodu fil-medda tal-livell massimu, pereżempju 0,5x, 1x u 2x il-livell massimu b'koeffiċjenti aċċettabbli ta' varjazzjoni għall-analiżi ripetuta, waqt il-proċedura ta' validazzjoni u waqt l-analiżi ta' rutina.

5.4.2.

Għandhom jitwettqu regolarment kontrolli inbjank u esperimenti miżjuda jew analiżi tal-kampjuni ta' kontroll (preferibbilment, jekk ikun possibbli, materjal ta' referenza ċċertifikat) bħala miżuri interni ta' kontroll tal-kwalità. Għandhom jiġu rrekordjati u ċċekkjati it-tabelli għall-kontroll tal-kwalità tal-kontrolli inbjank, tal-esperimenti ta' taħlit jew tal-analiżi tal-kontroll tal-kampjuni biex ikun żgurat li r-rendiment analitiku huwa skont ir-rekwiżiti.

5.5.    Limitu ta' kwantifikazzjoni

5.5.1.

Għal metodu ta' skrinjar bijoanalitiku, l-istabbiliment tal-limitu ta' kwantifikazzjoni (LOQ) mhuwiex rekwiżit indispensabbli imma l-metodu għandu jipprova li jista' jagħmel differenza bejn il-valur inbjank u l-valur ta' limitu. Meta jingħata l-livell BEQ, għandu jiġi stabbilit livell ta' rappurtar biex ikollu x'jaqsam ma' kampjuni li juru rispons taħt dan il-livell. Il-livell ta' rappurtar għandu jintwera li hu differenti mill-kampjuni inbjank tal-proċedura mill-inqas b'fattur ta' tlieta, b'rispons taħt il-medda ta' ħidma. Għalhekk għandu jiġi kkalkulat mill-kampjuni li fihom il-komposti fil-mira madwar il-livell minimu meħtieġ, u mhux minn proporzjon S/N jew minn assaġġ inbjank.

5.5.2.

Il-LOQ għall-metodu ta' konferma għandu jkun ta' madwar wieħed minn ħamsa tal-livell massimu.

5.6.    Kriterji analitici

Għal riżultati ta' min joqgħod fuqhom mill-metodi ta' konferma jew tal-iskrinjar, għandhom jintlaħqu l-kriterji li ġejjin fil-firxa tal-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni għall-valur tat-TEQ jew il-BEQ, rispettivament, kemm jekk determinati bħala total tat-TEQ (bħala somma ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini) kemm jekk separatament għall-PCDD/PCDFs u għall-PCB simili għad-diossini:

5.7.    Rekwiżiti speċifiċi għal metodi ta' skrinjar

5.7.1.

Għall-iskrinjar jistgħu jintużaw kemm il-metodi GC-MS kif ukoll dawk bijoanalitiċi. Għall-metodi GC-MS għandhom jintlaħqu r-rekwiżiti stipulati fil-punt 6. Għall-metodi bijoanalitiċi msejsa fuq iċ-ċelloli hemm stipulati rekwiżiti speċifiċi fil-punt 7.

5.7.2.

Il-laboratorji li japplikaw metodi ta' skrinjar għall-kontroll ta' rutina ta' kampjuni għandhom jistabbilixxu kooperazzjoni mill-qrib ma' laboratorji li japplikaw il-metodu konfermatorju.

5.7.3.

Ir-rendiment tal-metodu ta' skrinjar irid jiġi vverifikat matul l-analiżi ta' rutina, mill-kontroll tal-kwalità tal-analiżi u mill-validazzjoni kontinwa tal-metodu. Għandu jkun hemm programm kontinwu għall-kontroll ta' riżultati konformi.

5.7.4.

Iċċekkjar għall-possibilità ta' suppressjoni tar-rispons taċ-ċellola u taċ-ċitossiċità. 20 % tal-estratti tal-kampjun għandhom jitkejlu fi skrinjar ta' rutina biż-żieda ta' 2,3,7,8-TCDD jew mingħajrha, b'konformità mal-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni, biex jiġi ċċekkjat jekk ir-rispons huwiex imħassar minn sustanzi li jinterferixxu, li jinsabu fl-estratt tal-kampjun. Il-konċentrazzjoni mkejla tal-kampjun miżjud għandha titqabbel mas-somma tal-konċentrazzjoni tal-estratt mhux miżjud u tingħadd mal-konċentrazzjoni taż-żieda. Jekk din il-konċentrazzjoni mkejla tkun aktar minn 25 % anqas mill-konċentrazzjoni kkalkulata (is-somma), dan ikun indikazzjoni ta' potenzjalità ta' suppressjoni tas-sinjal u l-kamjun rispettiv għandu jintbgħat għand il-GC-HRMS għal analiżi konfermatorja. Ir-riżultati għandhom jiġu mmonitorjati f'tabelli ta' kontroll tal-kwalità.

5.7.5.

Kontroll ta' kwalità fuq kampjuni konformi: Madwar 2 sa 10 % tal-kampjuni konformi, skont il-matriċi tal-kampjun u l-esperjenza tal-laboratorju, għandhom jiġu kkonfermati permezz tal-GC-HRMS.

5.7.6.

Id-determinazzjoni ta' rati ta' konformità falza mid-dejta tal-kontroll ta' kwalità: Għandha tiġi determinata r-rata ta' riżultati ta' konformità falza mill-iskrinjar tal-kampjuni anqas jew aktar mil-limitu massimu jew il-livell ta' azzjoni. Ir-rati attwali ta' konformità falza għandhom ikunu inqas minn 5 %. Meta jkun hemm disponibbli minimu ta' 20 riżultat konfermat għal kull matriċi jew grupp ta' matriċi mill-kontroll tal-kwalità ta' kampjuni konformi, għandhom isiru konklużjonijiet minn din il-bażi ta' dejta dwar ir-rata ta' konformità falza. Ir-riżultati mill-kampjuni analizzati fil-provi interlaboratorji jew waqt każijiet ta' kontaminazzjoni, li jkopru medda ta' konċentrazzjoni sa pereżempju ta' 2x il-livell massimu (ML), jistgħu jiġu inklużi wkoll fil-minimu ta' 20 riżultat għall-evalwazzjoni tar-rata ta' konformità falza. Il-kampjuni għandhom ikopru l-profili ta' konġeneri l-aktar frekwenti, li jirrappreżentaw diversi sorsi. Għalkemm l-iskrinjar tal-assaġġ għandu preferenzjalment ikollu l-iskop li jsib il-kampjuni li jaqbżu l-limitu ta' azzjoni, il-kriterju biex jiddetermina r-rati ta' konformità falza huwa l-livell massimu, b'kunsiderazzjoni tal-inċertezza tal-kejl tal-metodu konfermatorju.

5.7.7.

Kampjuni mill-iskrinjar potenzjalment mhux konformi għandhom dejjem jiġu vverifikati permezz ta' rianaliżi sħiħa tal-kampjun oriġinali b'metodu ta' analiżi konfermatorju. Dawn il-kampjuni jistgħu jintużaw ukoll biex tiġi evalwata r-rata ta' riżultati ta' nuqqas ta' konformità falza. Għal metodi ta' skrinjar, ir-rata ta' riżultati ta' nuqqas ta' konformità falza għandha tkun il-frazzjoni ta' riżultati kkonfermati li huma konformi skont l-analiżi konfermatorja, waqt li fi skrinjar li sar qabel il-kampjun ikun ġie ddikjarat bħala potenzjalment mhux konformi. L-evalwazzjoni tal-vantaġġ tal-metodu ta' skrinjar għandha tkun ibbażata fuq it-tqabbil tal-kampjuni b'nuqqas ta' konformità falza man-numru totali ta' kampjuni ċċekkjati. Din ir-rata għandha tkun baxxa biżżejjed sabiex l-użu ta' għodda ta' skrinjar jibqa' wieħed vantaġġjuż.

5.7.8.

Il-metodi bijoanalitiċi għandhom jipprovdu, għall-inqas f'kundizzjonijiet ta' validazzjoni, indikazzjoni valida tal-livell TEQ, ikkalkolat u espress bħala BEQ. Għall-metodi bijoanalitiċi mwettqa f'kundizzjonijiet ta' ripetibilità wkoll, l-RSDr bejn laboratorju u ieħor tkun tipikament iżgħar mir-riproduċibilità RSDR.

6.    Rekwiżiti speċifiċi għal metodi gc-ms li għandhom jiġu ssodisfati għal raġunijiet ta' konferma u ta' skrinjar

6.1.    Differenzi aċċettabbli bejn ir-riżultati superjuri u inferjuri tad-WHO-TEQ

Id-differenza bejn il-livell superjuri u l-livell inferjuri ma għandhiex teċċedi l-20 % għal konferma ta' qbiż tal-livell massimu jew f'każ ta' bżonn, tal-limiti ta' azzjoni.

6.2.    Kontroll tal-irkupri

6.2.1.

Għandha titwettaq żieda ta' standards interni għal PCDD/PCDF 2,3,7,8-sostituti bil-kloru ttikkettjati 13C u ta' standards interni għall-PCB simili għad-diossini ttikkettjati 13C, fil-bidu nett tal-metodu analitiku eż. qabel l-estrazzjoni sabiex tkun ivvalidata l-proċedura analitika. Għall-anqas konġeneru wieħed għal kull wieħed mill-gruppi omologi tetra sa ottaklorinat għall-PCDD/PCDFs u għall-anqas konġeneru wieħed għal kull grupp omologu għall-PCB simili għad-diossini għandhom jiġu miżjuda (alternattivament, għall-anqas konġeneru wieħed għal kull funzjoni magħżula, rreġistrata għall-jone bl-ispettrometrija ta' massa użat għall-monitoraġġ ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini). Fil-każ ta' metodi konfermatorji, għandhom jintużaw is-17-il standard intern għal PCDD/PCDF 2,3,7,8-sostituti ttikkettjati 13C kollha u t-12-il standard intern għall-PCB simili għad-diossini ttikkettjati 13C kollha.

6.2.2.

Għandhom jiġu determinati wkoll fatturi ta' rispons relattivi għal dawk il-konġeneri li għalihom mhu miżjud l-ebda analogu ttikkettat bi 13C, bl-użu ta' soluzzjonijiet ta' kalibrazzjoni xierqa.

6.2.3.

Għal għalf ta' oriġini mill-pjanti u għal għalf ta' oriġini mill-annimali li jkun fih anqas minn 10 % ta' xaħam, iż-żieda ta' standards interni hija obbligatorja qabel l-estrazzjoni. Għal għalf ta' oriġini mill-annimali li jkun fih aktar minn 10 % ta' xaħam, l-istandards interni jistgħu jiġu magħduda qabel jew wara l-estrazzjoni tax-xaħam. Għandha titwettaq validazzjoni xierqa tal-effiċjenza tal-estrazzjoni, skont l-istadju li fih huma introdotti l-istandards interni u skont jekk ir-riżultati humiex irrapportati abbażi tal-prodott jew tax-xaħam.

6.2.4.

Qabel l-analiżi GC-MS, għandhom ikunu miżjuda standard wieħed (1) jew tnejn (2) tal-irkupru (surrogat).

6.2.5.

Il-kontroll tal-irkupru huwa neċessarju. Għal metodi konfermatorji, l-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu fil-medda ta' minn 60 sa 120 %. L-irkupri ogħla jew aktar baxxi mill-kongeneri individwali, b'mod partikolari għal xi dibenżo-p-diossini ettaklorinati u ottaklorinati u xi dibenżofurani, għandhom ikunu aċċettabbli b'kundizzjoni li l-kontribuzzjoni tagħhom lill-valur TEQ ma taqbiżx l-10 % tal-valur totali tat-TEQ (ibbażat fuq is-somma tal-PCDD/PCDF u tal-PCB simili għad-diossini). Għal metodi ta' skrinjar GC-MS, l-irkupri għandhom ikunu fil-medda ta' minn 30 sa 140 %.

6.3.    Tneħħija ta' sustanzi li jinterferixxu

6.4.    Kalibrazzjoni b'kurva standard

Il-medda tal-kurva ta' kalibrazzjoni għandha tkopri l-medda rilevanti tal-livell massimu jew il-limiti ta' azzjoni.

6.5.    Kriterji speċifiċi għal metodi konfermatorji

7.    Rekwiżiti speċifiċi għall-metodi bijoanalitiċi

Il-metodi bijoanalitiċi huma metodi msejsa fuq l-użu ta' prinċipji bijoloġiċi bħal assaġġi bbażati fuq iċ-ċelloli, assaġġi bbażati fuq ir-riċevituri jew immunoassaġġi. Il-punt 7 preżenti jistabbilixxi rekwiżiti għall-metodi bijoanalitiċi b'mod ġenerali.

Il-metodu ta' skrinjar bħala prinċipju jikklassifika kampjun bħala konformi jew suspettat li ma jikkonformax. Għal dan il-għan, il-livell BEQ ikkalkolat jitqabbel mal-valur ta' limitu (ara l-punt 7.3). Kampjuni taħt il-valur ta' limitu huma ddikjarati konformi, kampjuni daqs jew 'il fuq mill-valur ta' limitu huma suspettati li mhumiex konformi, u għalhekk jeħtieġu analiżi permezz tal-metodu konfermatorju. Fil-prattika, il-livell BEQ li jikkorrispondi għal 2/3 tal-livell massimu jista' jservi bħala valur ta' limitu sakemm jiżgura rata ta' konformità falza taħt il-5 % u rata aċċettabbli għal riżultati ta' nuqqas ta' konformità falza. B'livelli massimi separati għal PCDD/Fs u għas-somma ta' PCDD/Fs u PCB simili għad-diossini, l-iċċekkjar tal-konformità tal-kampjuni mingħajr frazzjonament jirrikjedi valuri ta' limitu ta' bijoassaġġi adattati għall-PCDD/F. Għall-iċċekkjar ta' kampjuni li jaqbżu l-livelli ta' azzjoni, bħala valur ta' limitu ikun adattat perċentwal xieraq tal-limitu ta' azzjoni rispettiv.

Barra minn hekk, fil-każ ta' ċerti metodi bijoanalitiċi, jista' jingħata livell indikattiv espress f'BEQ għal kampjuni fil-medda ta' ħidma u li jaqbeż il-limitu ta' rappurtar (ara l-punti 7.1.1 u 7.1.6).

7.1.    Evalwazzjoni tar-rispons għat-test

7.1.1.   Rekwiżiti ġenerali

7.1.2.   Il-kalibrazzjoni

7.1.2.1.   Kalibrazzjoni b'kurva standard

7.1.2.2.   Kalibrazzjoni bil-kampjuni ta' referenza

Minflok, kurva ta' kalibrazzjoni ppreparata minn tal-anqas erba' (4) kampjuni ta' referenza (ara l-punt 7.2.4: jistgħu jintużaw matriċi inbjank waħda, u tliet kampjuni ta' referenza f'0,5x, 1,0x u 2,0x il-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni) biex b'hekk jitneħħa l-bżonn ta' korrezzjoni għall-inbjank u l-irkupru. F'dan il-każ, ir-rispons tat-test li jikkorrispondi ma' 2/3 tal-livell massimu (ara l-punt 7.3) jista' jiġi kkalkulat direttament minn dawn il-kampjuni u użat bħala valur ta' limitu. Għall-iċċekkjar ta' kampjuni li jaqbżu l-livelli ta' azzjoni, bħala valur ta' limitu ikun adattat perċentwal xieraq ta' dawn il-limiti ta' azzjoni.

7.1.3.   Determinazzjoni separata ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini

L-estratti jistgħu jinqasmu fi frazzjonijiet li jkun fihom PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini, li jippermettu indikazzjoni separata ta' livelli TEQ (f'BEQ) ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini. Għandha tintuża preferibbilment kurva ta' kalibrazzjoni standard tal-PCB 126 biex jiġu evalwati r-riżultati għall-frazzjoni li fiha l-PCB simili għad-diossini.

7.1.4.   Irkupri apparenti tal-bijoassaġġi

L-“irkupru apparenti tal-bijoassaġġi” għandu jiġi kkalkulat minn kampjuni ta' referenza adattati bi profili ta' konġeneri rappreżentattivi madwar il-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni u espressi bħala perċentwal tal-livell BEQ imqabbel mal-livell TEQ. Id-differenzi bejn il-fatturi tat-TEF ( 44 ) u tar-REP għal PCB simili għad-diossini jistgħu joħolqu rkupri apparenti baxxi għal PCB simili għad-diossini meta mqabbla ma' PCDD/PCDFs, skont it-tip ta' assaġġ u TEF użati. Għalhekk, jekk issir determinazzjoni separata ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini, l-irkupri apparenti tal-bijoassaġġ għandu jkun: għal PCB simili għad-diossini 20 % sa 60 %, għal PCDD/PCDFs 50 % sa 130 % (il-meded japplikaw għall-kurva ta' kalibrazzjoni ta' TCDD). Peress li l-kontribuzzjoni ta' PCB simili għad-diossini għas-somma ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini tista' tvarja bejn il-matriċi u l-kampjuni differenti, l-irkupri apparenti tal-bijoassaġġ għas-somma tal-PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini jirriflettu dawn il-meded u għandhom ikunu bejn 30 % u 130 %. Kull implikazzjoni ta' reviżjoni sostanzjali ta' valuri TEF għal-leġiżlazzjoni tal-Unjoni għall-PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini teħtieġ ir-reviżjoni ta' dawn il-meded.

7.1.5.   Kontroll tal-irkupri għat-tindif

It-telf ta' komposti waqt it-tindif għandu jiġi ċċekkjat matul il-validazzjoni. Il-kampjun inbjank miżjud b'taħlita ta' konġeneri differenti għandu jiġi ppreżentat għat-tindif (mill-inqas n = 3) u l-irkupru u l-varjabbiltà għandhom jiġu ċċekkjati permezz ta' metodu konfermatorju. L-irkupru għandu jkun bejn 60 % u 120 % speċjalment għal konġeneri li jikkontribwixxu aktar minn 10 % għal-livell TEQ f'diversi taħlitiet.

7.1.6.   Limitu ta' Rappurtar

Meta jiġu rrappurtati l-livelli BEQ, għandu jiġi ddeterminat il-limitu ta' rappurtar minn kampjuni ta' matriċi rilevanti li jinvolvu profili ta' konġeneri tipiċi iżda mhux mill-kurva ta' kalibrazzjoni tal-istandards minħabba l-preċiżjoni baxxa fil-medda inferjuri tal-kurva. L-effetti tal-estrazzjoni u tat-tindif għandhom jiġu kkunsidrati. Il-limitu ta' rappurtar għandu jkun iffissat tal-anqas b'fattur ta' tlieta 'l fuq mill-proċedura inbjank.

7.2.    Użu ta' kampjuni ta' referenza

7.2.1.

Il-kampjuni ta' referenza għandhom jirrappreżentaw matriċi ta' kampjun, profili ta' konġeneri u meded ta' konċentrazzjoni għal PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini madwar il-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni.

7.2.2.

Kull serje ta' testijiet għandha tinkludi matriċi inbjank, u fejn dan mhux possibbli, proċedura inbjank, u kampjun ta' referenza fil-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni. Dawn il-kampjuni għandhom jiġu estratti u ttestjati fl-istess ħin taħt kundizzjonijiet identiċi. Il-kampjun ta' referenza għandu juri rispons elevat ċar imqabbel mal-kampjun inbjank, biex b'hekk ikun żgurat li t-test ikun adattat. Dawn il-kampjuni jistgħu jintużaw għall-korrezzjonijiet tal-inbjank u tal-irkupru.

7.2.3.

Il-kampjuni ta' referenza magħżulin biex issir korrezzjoni ta' rkupru għandhom ikunu rappreżentattivi għat-test tal-kampjuni, li jfisser li l-profili tal-konġeneri ma jistgħux iwasslu għal sottovalutazzjoni tal-livelli.

7.2.4.

Il-kampjuni żejda ta' referenza, eż. b'0,5x u 2x il-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni għandhom jiġu inklużi sabiex juru r-rendiment korrett tat-test fil-medda ta' interess għall-kontroll tal-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni. Meta mpoġġija flimkien, dawn il-kampjuni jistgħu jintużaw biex ikunu kkalkulati l-livelli BEQ fil-kampjuni għat-test (ara l-punt 7.1.2.2).

7.3.    Determinazzjoni tal-valuri ta' limitu

Ir-relazzjoni bejn ir-riżultati bijoanalitiċi fil-BEQ u r-riżultati mill-metodu konfermatorju fit-TEQ għandha tiġi stabbilita, pereżempju permezz ta' esperimenti ta' kalibrazzjoni adattata għall-matriċi, li jinvolvu kampjuni ta' referenza miżjuda b'0, 0,5x, 1x u 2x il-livell massimu (ML), b'6 ripetizzjonijiet fuq kull livell (n = 24). Jistgħu jiġu stmati fatturi ta' korrezzjoni (inbjank u rkupru) minn din ir-relazzjoni imma dawn għandhom jiġu ċċekkjati skont il-punt 7.2.2.

Għandhom jiġu stabbiliti valuri ta' limitu għal deċiżjonijiet dwar konformità ta' kampjuni ma' livelli massimi jew għall-kontroll ta' limiti ta' azzjoni, jekk rilevanti, mal-livelli massimi jew il-limitu ta' azzjoni rispettiv iffissat jew għall-PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini waħidhom jew inkella għas-somma ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini. Dawn huma rrappreżentati mill-punt tat-tmiem inferjuri tad-distribuzzjoni tar-riżultati bijoanalitiċi (ikkoreġuti għall-inbjank u għall-irkupru) u jikkorrispondu mal-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju msejjes fuq livell ta' kunfidenza ta' 95 %, li jimplika rata ta' konformità falza ta' < 5 %, u fuq RSDR < 25 %. Il-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju huwa l-livell massimu, meta titqies l-inċertezza tal-kejl.

Il-valur ta' limitu (f'BEQ) jista' jiġi kkalkulat skont wieħed mill-approċċi stipulati fil-punti 7.3.1, 7.3.2 u 7.3.3 (ara l-Figura 1).

7.3.1.

L-użu tal-faxxa inferjuri tal-intervall ta' previżjoni ta' 95 % fil-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju: fejn: BEQDL BEQ jikkorrispondi mal-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju, li huwa l-livell massimu u jinkludi l-inċertezza tal-kejl sy,x devjazzjoni standard residwa t α,f = m – 2 Fattur student (α = 5 %, f = gradi ta' libertà, b'naħa waħda) m numru totali ta' punti ta' kalibrazzjoni (indiċi j) n numru ta' ripetizzjonijiet f'kull livell xi Konċentrazzjoni fil-kampjun (f'TEQ) tal-punt ta' kalibrazzjoni i stabbilit minn metodu konfermatorju medja tal-konċentrazzjonijiet (f'TEQ) tal-kampjuni kollha ta' kalibrazzjoni parametru globali kwadrat, i = indiċi għall-punt ta' kalibrazzjoni i

7.3.2.

Il-kalkolu mir-riżultati bijoanalitiċi (kkoreġuti għall-irkupru u inbjank) ta' analiżi multipla tal-kampjuni (n > 6) ikkontaminati fil-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju, bħala l-punt tat-tmiem inferjuri tad-distribuzzjoni tad-dejta fil-valur BEQ medju korrispondenti: Valur ta' limitu = BEQDL – 1,64 × SDR fejn: SDR devjazzjoni standard tar-riżultati tat-test bijoloġiku f'BEQDL, imkejla f'kundizzjonijiet ta' riproduċibilità fil-laboratorju

7.3.3.

Il-kalkolu bħala valur medju tar-riżultati bijoanalitiċi (f'BEQ, ikkoreġuti għall-inbjank u l-irkupru) minn analiżi multipla tal-kampjuni (n > 6) ikkontaminati f'2/3 tal-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni, imsejjes fuq l-osservazzjoni li dan il-livell se jkun madwar il-valur ta' limitu ddeterminat skont il-punt 7.3.1 jew il-punt 7.3.2: Figura 1 Il-kalkolu tal-valuri ta' limitu msejjes fuq livell ta' kunfidenza ta' 95 % li jimplika rata ta' konformità falza < 5 %, u RSDR < 25 %: 1. mill-faxxa inferjuri tal-intervall ta' previżjoni ta' 95 % fil-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju, 2. mill-analiżi multipli tal-kampjuni (n> 6) kontaminati fil-limitu ta' deċiżjoni tal-metodu konfermatorju bħala l-punt tat-tmiem inferjuri tad-distribuzzjoni tad-dejta (rappreżentat fil-figura bħala kurva forma ta' qanpiena) fil-valur medju BEQ korrispondenti.

7.3.4.

Restrizzjonijiet għall-valuri ta' limitu Il-valuri ta' limitu msejsa fuq il-BEQ ikkalkolati minn RSDR miksuba waqt il-validazzjoni bl-użu ta' numru limitat ta' kampjuni bi profili ta' konġeneri/matriċi differenti jistgħu jkunu ogħla mil-livelli massimi jew limiti ta' azzjoni msejsa fuq it-TEQ minħabba preċiżjoni aħjar minn dik miksuba f'analiżi ta' rutina fejn irid jiġi kkontrollat spettru mhux magħruf ta' profili ta' konġeneri potenzjali. F'dawn il-każijiet, il-valuri ta' limitu għandhom jiġu kkalkolati b'RSDR = 25 %, jew preferibbilment, b'żewġ terzi tal-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni.

7.4.    Karatteristiċi tar-rendiment

7.4.1.

Billi ma jista' jintuża l-ebda standard intern fil-metodi bijoanalitiċi, għandhom isiru testijiet fuq ir-ripetibilità tal-metodi bijoanalitiċi sabiex tinkiseb informazzjoni dwar id-devjazzjoni standard f'serje ta' testijiet u bejniethom. Ir-ripetibilità għandha tkun inqas minn 20 %, u r-riproduċibilità bejn laboratorju u ieħor għandha tkun inqas minn 25 %. Dan għandu jkun imsejjes fuq il-livelli kkalkulati f'BEQ wara l-korrezzjoni tal-inbjank u l-irkupru.

7.4.2.

Bħala parti mill-proċess ta' validazzjoni, it-test għandu juri distinzjoni bejn kampjun inbjank u livell fil-valur ta' limitu, kif ukoll jippermetti l-identifikazzjoni ta' kampjuni ogħla mill-valur ta' limitu korrispondenti (ara l-punt 7.1.2).

7.4.3.

Għandhom jiġu definiti l-komposti fil-mira, l-interferenzi potenzjali u l-livelli massimi tollerabbli inbjank.

7.4.4.

Il-perċentwal tad-devjazzjoni standard fir-rispons jew fil-konċentrazzjoni kkalkolata mir-rispons (possibbli biss fil-medda ta' ħidma) ta' determinazzjoni tripla ta' estratt tal-kampjun, ma għandux ikun ogħla minn 15 %.

7.4.5.

Ir-riżultati mhux ikkoreġuti tal-kampjun(i) ta' referenza espressi f'BEQ (l-inbjank u l-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni) għandhom jintużaw għall-evalwazzjoni tar-rendiment tal-metodu bijoanalitiku tul perjodu ta' żmien kostanti.

7.4.6.

Tabelli għall-kontroll ta' kwalità għal proċeduri inbjank u kull tip ta' kampjun ta' referenza għandhom jiġu rrekordjati u ċċekkjati biex ikun żgurat li r-rendiment analitiku huwa skont ir-rekwiżiti, b'mod partikolari għall-proċeduri inbjank fir-rigward tad-differenza minima mitluba meta mqabbla mal-limitu inferjuri tal-medda ta' ħidma u għall-kampjuni ta' referenza fir-rigward tar-riproduċibilità fil-laboratorju. Il-proċeduri inbjank għandhom jiġu kkontrollati b'mod li meta jitnaqqsu jiġu evitati r-riżultati b'konformità falza.

7.4.7.

Ir-riżultati tal-kampjuni suspettużi miksuba bl-analiżi tal-metodi konfermatorji u bejn 2 u 10 % tal-kampjuni konformi (minimu ta' 20 kampjun għal kull matriċi) għandhom jinġabru u jintużaw biex issir evalwazzjoni tal-metodu ta' skrinjar u r-relazzjoni bejn il-BEQ u t-TEQ. Din il-bażi ta' dejta tista' tintuża għall-evalwazzjoni mill-ġdid tal-valuri ta' limitu applikabbli f'kampjuni ta' rutina għall-matriċi vvalidati.

7.4.8.

Ir-rendiment b'suċċess tal-metodu jista' jintwera wkoll permezz ta' parteċipazzjoni fil-provi interlaboratorji. Ir-riżultati mill-kampjuni analizzati fil-provi interlaboratorji, li jkopru sa medda ta' konċentrazzjoni ta' eż. 2x il-livell massimu, jistgħu jiġu inklużi wkoll fl-evalwazzjoni tar-rata ta' konformità falza, jekk laboratorju jkun jista' juri r-rendiment b'suċċess tiegħu. Il-kampjuni għandhom ikopru l-profili ta' konġeneri l-aktar frekwenti, li jirrappreżentaw diversi sorsi.

7.4.9.

Matul inċidenti ta' kontaminazzjoni, il-valuri ta' limitu jistgħu jiġu evalwati mill-ġdid, filwaqt li jirriflettu l-matriċi u l-profili ta' konġeneri ta' dan l-inċident uniku.

8.    Rappurtar tar-riżultati

8.1.    Metodi konfermatorji

8.1.1.

Safejn tippermetti l-proċedura analitika użata, ir-riżultati analitiċi għandhom jinkludu l-livelli tal-konġeneri individwali ta' PCDD/PCDF u ta' PCB simili għad-diossini u jiġu rrapportati bħala livell inferjuri, livell superjuri u livell medju sabiex ikun inkluż il-massimu tat-tagħrif fir-rappurtar tar-riżultati u b'hekk tkun tista' ssir l-interpretazzjoni tar-riżultati skont rekwiżiti speċifiċi.

8.1.2.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCDD/PCDFs u l-PCB simili għad-diossini.

8.1.3.

L-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu disponibbli f'każ li l-irkupri jkunu barra l-medda msemmija fil-punt 6.2.5, f'każ li jinqabeż il-livell massimu (f'każ hekk, l-irkupri għal waħda miż żewġanaliżi duplikati) u fuq talba f'każijiet oħra.

8.1.4.

Peress li fid-deċiżjoni dwar il-konformità tal-kampjun għandha tittieħed in konsiderazzjoni l-inċertezza tal-kejl, dan il-parametru għandu jkun disponibbli. Għaldaqstant, ir-riżultati analitiċi għandhom jiġu rrapportati bħala x +/- U fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl estiża bl-użu ta' fattur ta' kopertura ta' 2 li jagħti livell ta' kunfidenza ta' madwar 95 %. Fil-każ ta' determinazzjoni separata ta' PCDD/PCDFs u ta' PCB simili għad-diossini, għas-somma ta' PCDD/PCDFs u PCB simili għad-diossini għandha tintuża s-somma tal-istima tal-inċertezza estiża tar-riżultati analitiċi separati tal-PCDD/PCDFs u tal-PCB simili għad-diossini.

8.1.5.

Jekk tiġi kkunsidrata l-inċertezza tal-kejl permezz tal-applikazzjoni ta' CCα (kif deskritt fil-punt 2.2 tal-Kapitolu I ta' din il-parti B), dan il-parametru għandu jiġi rrappurtat.

8.1.6.

Ir-riżultati għandhom jiġu espressi fl-istess unitajiet u tal-anqas bl-istess numru ta' figuri sinifikanti bħala l-livelli massimi stabbiliti mid-Direttiva 2002/32/KE.

8.2.    Metodi ta' skrinjar bijoanalitiċi

8.2.1.

Ir-riżultat tal-iskrinjar għandu jkun espress bħala “konformi” jew “suspettat li mhuwiex konformi” (“suspettat”).

8.2.2.

Barra minn hekk, jista' jingħata riżultat ta' PCDD/PCDF u/jew PCB simili għad-diossini espress f'BEQ, u mhux f'TEQ.

8.2.3.

Kampjuni b'rispons taħt il-limitu ta' rappurtar għandhom ikunu espressi bħala “taħt il-limitu ta' rappurtar”.

8.2.4.

Għal kull tip ta' matriċi ta' kampjun, ir-rapport għandu jsemmi l-livell massimu jew il-limitu ta' azzjoni li fuqu tkun imsejsal-evalwazzjoni.

8.2.5.

Ir-rapport għandu jsemmi t-tip ta' test applikat, il-prinċipju bażiku tat-test u t-tip ta' kalibrazzjoni.

8.2.6.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCDD/PCDFs u l-PCB simili għad-diossini.

8.2.7.

F'każ ta' kampjuni suspettati li ma jkunux konformi, ir-rapport irid jinkludi nota dwar l-azzjoni li trid tittieħed. Huwa meħtieġ li l-konċentrazzjoni ta' PCDD/Fs u s-somma ta' PCDD/Fs u PCB simili għad-diossini f'dawk il-kampjuni b'livelli elevati tkun iddeterminata/ikkonfermata permezz ta' metodu konfermatorju.

KAPITOLU III

Preparazzjoni tal-kampjun u rekwiżiti għall-metodi tal-analiżi użati fil-kontroll uffiċjali tal-livelli ta' PCB li mhumiex simili għad-diossini (PCB # 28, 52, 101, 138, 153, 180)

1.    Kamp tal-applikazzjoni

Dawn ir-rekwiżiti stipulati f'dan il-Kapitolu għandhom jiġu applikati meta l-għalf ikun analizzat għall-kontroll uffiċjali tal-livelli ta' poliklorobifenili mhux simili għad-diossini (PCB mhux simili għad-diossini) u għal skopijiet regolatorji oħra.

2.    Metodi ta' detezzjoni applikabbli

Kromatografija b'fażi gassuża/Detezzjoni tal-Qabda tal-Elettron (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS jew metodi ekwivalenti.

3.    Identifikazzjoni u konferma tal-analiti ta' interess

3.1.	Ħin ta' żamma relattiv b'rabta mal-istandards interni jew standards ta' referenza (devjazzjoni aċċettabbli ta' +/- 0,25 %).

3.2.

Għandha tkun ikkonfermata s-separazzjoni permezz ta' kromatografija b'fażi gassuża tas-sitt PCB indikaturi kollha (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 u PCB 180) minn sustanzi li jinterferixxu, speċjalment PCB ta' koelużjoni, b'mod partikolari jekk il-livelli tal-kampjuni jkunu fil-medda tal-limiti legali u n-nonkonformità trid tiġi kkonfermata. [Konġeneri li spiss jinstabu li jikkoelutaw huma pereżempju PCB 28/31, PCB 52/69 u PCB 138/163/164. Fil-każ ta' GC-MS għandhom jiġu kkunsidrati wkoll interferenzi potenzjali ta' frammenti ta' konġeneri aktar klorinati.]

3.3.

Rekwiżiti għal tekniki ta' GC-MS Monitoraġġ ta' mill-inqas: (a) żewġ joni speċifiċi għal HRMS; (b) żewġ joni speċifiċi ta' m/z > 200 jew tliet joni speċifiċi ta' m/z > 100 għal LRMS; (c) prekursur wieħed u żewġ joni tal-prodotti għall-MS-MS. Il-massimu tat-tolleranzi permessi għall-proporzjonijiet ta' abbundanza għall-mases tal-frammenti magħżula: Id-devjazzjoni relattiva tal-proporzjon ta' abbundanza tal-frammenti ta' massa magħżula minn abbundanza teoretika jew standard ta' kalibrazzjoni għall-jon fil-mira (il-jon mmonitorjat l-aktar abbundanti) tal-jon jew joni kwalifikaturi: Intensità relattiva tal-jon jew joni kwalifikaturi meta mqabbla mal-jon fil-mira GC-EI-MS (devjazzjoni relattiva) GC-CI-MS, GC-MSn (devjazzjoni relattiva) > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20 % sa 50 % ± 15 % ± 25 % > 10 % sa 20 % ± 20 % ± 30 % ≤ 10 % ± 50 % (1) ± 50 % (1) (1)   Numru suffiċjenti ta' frammenti ta' massa b'intensità relattiva > 10 % disponibbli, għalhekk mhux rakkomandabbli li tintuża/jintużaw jona/joni kwalifikanti b'intensità relattiva ta' anqas minn 10 % meta mqabbla mal-jon fil-mira.

3.4.	Rekwiżiti għal tekniki tal-GC-ECD Riżultati li jaqbżu t-tolleranza għandhom jiġu kkonfermati ma' żewġ kolonni tal-GC f'fażijiet stazzjonarji ta' polarità differenti.

4.    Dimostrazzjoni tar-rendiment tal-metodu

Ir-rendiment tal-metodu għandu jiġi vvalidat fil-medda tal-livell massimu (0,5 sa darbtejn il-livell massimu) b'koeffiċjent ta' varjazzjoni aċċettabbli għal analiżi ripetuta (ara r-rekwiżiti għall-preċiżjoni intermedjarja fil-punt 9).

5.    Limitu ta' kwantifikazzjoni

Il-valuri inbjank ma għandhomx ikunu ogħla minn 30 % tal-livell ta' kontaminazzjoni li jikkorrispondi mal-livell massimu ( 45 ).

6.    Kontroll tal-kwalità

Kontrolli regolari inbjank, analiżi ta' kampjuni miżjuda, kampjuni ta' kontroll ta' kwalita, parteċipazzjoni fi studji interlaboratorji dwar matriċi rilevanti.

7.    Kontroll tal-irkupri

7.1.	Għandhom jintużaw standards interni adattati bi proprjetajiet fiżikokimiċi li jikkomparaw ma' analiti ta' interess.

7.2.	Iż-żieda ta' standards interni: Adeżjoni ta' prodotti (qabel il-proċess ta' estrazzjoni u tindif).

7.3.

Ir-rekwiżiti għall-metodi bl-użu tal-konġeneri tas-sitt PCB indikaturi kollha ttikkettati b'isotopu: (a) ir-riżultati għandhom jiġu kkoreġuti għall-irkupri tal-istandards interni; (b) l-irkupri ta' standards interni b'tikketta isotopu għandhom ikunu bejn 50 u 120 %; (c) irkupri anqas jew aktar għal konġeneri individwali b'kontribuzzjoni għas-somma tas-sitt PCB indikaturi taħt l-10 % huma aċċettabbli.

7.4.

Ir-rekwiżiti għall-metodi fejn ma jintużawx is-sitt standards interni kollha ttikkettati b'isotopu jew standards interni oħra: (a) l-irkupru ta' standard(s) intern(i) għandu jiġi kkontrollat għal kull kampjun; (b) l-irkupri ta' standard(s) intern(i) għandhom ikunu bejn 60 u 120 %; (c) ir-riżultati għandhom jiġu kkoreġuti għall-irkupri tal-istandards interni.

7.5.	L-irkupri tal-konġeneri mhux ittikkettati għandhom jiġu ċċekkjati permezz ta' kampjuni miżjuda jew kampjuni ta' kontroll tal-kwalità b'konċentrazzjonijiet fil-medda tal-livell massimu. L-irkupri ta' dawn il-konġeneri għandhom ikunu kkunsidrati aċċettabbli, jekk huma bejn is-70 u l-120 %.

8.    Rekwiżiti għal-laboratorji:

B'konformità mad-dispożizzjonijiet tar-Regolament (KE) Nru 882/2004, il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati minn korp rikonoxxut li jopera skont il-Gwida ISO 58 biex jiżgura li dawn qegħdin japplikaw assigurazzjoni ta' kwalità analitika. Il-laboratorji għandhom ikunu akkreditati skont l-istandard EN ISO/IEC 17025.

9.    Karatteristiċi tar-rendiment: kriterji għas-somma tas-sitt PCB indikaturi fil-livell massimu

10.    Rappurtar tar-riżultati

10.1.

Safejn tippermetti l-proċedura analitika użata, ir-riżultati analitiċi għandhom jinkludu l-livelli tal-konġeneri individwali tal-PCB u jiġu rrapportati bħala livell inferjuri, livell superjuri u livell medju sabiex ikun inkluż il-massimu tat-tagħrif fir-rappurtar tar-riżultati u b'hekk tkun tista' ssir l-interpretazzjoni tar-riżultati skont rekwiżiti speċifiċi.

10.2.

Ir-rapport għandu jinkludi fih il-metodu użat għall-estrazzjoni tal-PCB u l-lipidi.

10.3.

L-irkupri tal-istandards interni individwali għandhom ikunu disponibbli f'każ li l-irkupri jkunu barra mill-medda msemmija fil-punt 7, f'każ li jinqabeż il-livell massimu u fuq talba f'każijiet oħra.

10.4.

Billi għandha titqies l-inċertezza tal-kejl meta tittieħed deċiżjoni dwar il-konformità tal-kampjun, dan il-parametru għandu jkun disponibbli wkoll. Għaldaqstant, ir-riżultati analitiċi għandhom jiġu rrapportati bħala x +/- U fejn x hija r-riżultat analitiku u U hija l-inċertezza tal-kejl estiża bl-użu ta' fattur ta' kopertura ta' 2 li jagħti livell ta' fiduċja ta' madwar 95 %.

10.5.

Jekk tiġi kkunsidrata l-inċertezza tal-kejl permezz tal-applikazzjoni ta' CCα (kif deskritt fil-punt 2.1 tal-Kapitolu I), dan il-parametru għandu jiġi rrappurtat.

10.6.

Ir-riżultati għandhom jiġu espressi fl-istess unitajiet u tal-anqas bl-istess numru ta' figuri sinifikattivi bħala l-livelli massimi stabbiliti mid-Direttiva 2002/32/KE.

▼M2

---

ANNESS VI

METODI TA’ ANALIŻI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAl-KOSTITWENTI TA’ ORIĠINI MILL-ANNIMALI GĦALL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-GĦALF

1.   L-GĦAN U L-KAMP TA’ APPLIKAZZJONI

Id-determinazzjoni tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali fl-għalf għandha ssir permezz ta’ mikroskopija ottika jew ta’ reazzjoni katina tal-polimerażi (PCR) skont id-dispożizzjonijiet stabbiliti f’dan l-Anness.

Dawn iż-żewġ metodi jagħmluha possibbli li tiġi individwata l-preżenza tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali f’materjali tal-għalf u fl-għalf kompost. Madankollu, dawn ma jagħmluhiex possibbli li jiġi kkalkolat l-ammont ta’ dawn il-kostitwenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost. Iż-żewġ metodi għandhom limitu ta’ individwazzjoni ta’ inqas minn 0,1 % (w/w).

Il-metodu PCR jagħmilha possibbli li jiġi identifikat il-grupp tassonomiku tal-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost.

Dawn il-metodi għandhom japplikaw għall-kontroll tal-applikazzjoni tal-projbizzjonijiet stabbiliti fl-Artikolu 7(1) u fl-Anness IV għar-Regolament (KE) Nru 999/2001 u fl-Artikolu 11(1) tar-Regolament (KE) Nru 1069/2009.

Skont it-tip ta’ għalf li qed jiġi ttestjat, dawn il-metodi jistgħu jintużaw, fi protokoll operazzjonali uniku wieħed, jew waħedhom jew flimkien skont il-proċeduri operattivi standard (SOP) stabbiliti mil-laboratorju ta’ referenza tal-UE għall-proteini tal-annimali fl-għalf (EURL-AP) u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu ( 46 ).

2.   IL-METODI

2.1.    Mikroskopija ottika

2.1.1.    Il-prinċipju

Il-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali li jistgħu jkunu preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost mibgħuta għall-analiżi huma identifikati fuq il-bażi tal-karatteristiċi tipiċi u identifikabbli mikroskopikament bħall-fibri tal-muskoli u partiċelli oħra tal-laħam, il-qarquċa, l-għadam, il-qrun, ix-xagħar, il-lanżit, id-demm, ir-rix, il-qxur tal-bajd, ix-xewk u l-qxur tal-ħut.

2.1.2.    Ir-reaġenti u t-tagħmir

2.1.2.1.   Ir-reaġenti

2.1.2.1.1.   Aġent ta’ konċentrazzjoni

2.1.2.1.1.1.   Tetrakloroetilen (gravità speċifika 1,62)

2.1.2.1.2.   Ir-reaġent għat-tilwin

2.1.2.1.2.1.

Soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina (dewweb 2,5 ml 1M aċidu idrokloriku f’100 ml ilma u żid 200 mg Aħmar Alżarin ma’ din is-soluzzjoni)

2.1.2.1.3.   Il-mezzi tal-immuntar

2.1.2.1.3.1.   Lissija (NaOH 2,5 % w/v jew KOH 2,5 % w/v)

2.1.2.1.3.2.   Gliċerol (mhux dilwit, viskożità: 1 490 cP)

2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskożità: 1 200 cP) jew raża bi proprjetajiet ekwivalenti għall-preparazzjoni tas-slajd permanenti

2.1.2.1.4.   Il-mezzi tal-immuntar bi proprjetajiet tat-tilwin

2.1.2.1.4.1.

Is-soluzzjoni lugol (dewweb 2 g jodur tal-potassju f’100 ml ilma u żid 1 g jodur filwaqt li tħawwad ta’ spiss)

2.1.2.1.4.2.

Ir-reaġent ċistina (2 g aċetat taċ-ċomb, 10 g NaOH/100 ml ilma)

2.1.2.1.4.3.

Ir-reaġent Fehling (ippreparat qabel l-użu minn partijiet indaqs (1/1) ta’ żewġ soluzzjonijiet ewlenin A u B. Soluzzjoni A: Dewweb 6,9 g sulfat tar-ram (II) pentaidrat f’100 ml ilma. Soluzzjoni B: dewweb 34,6 g tartrat tal-potassju u tas-sodju, tetraidrat u 12 g NaOH f’100 ml ilma)

2.1.2.1.4.4.

Tetrametilbenżidina/Perossidu tal-idroġenu. (dewweb 1 g 3,3’,5,5’ tetrametilbenżidina (TMB) f’100 ml aċidu aċetiku glaċjali u 150 ml ilma. Qabel l-użu, ħallat 4 partijiet ta’ din is-soluzzjoni TMB ma’ parti waħda 3 % perossidu tal-idroġenu)

2.1.2.1.5.   L-aġenti tat-tlaħliħ

2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (grad tekniku)

2.1.2.1.5.2.   Aċeton (grad tekniku)

2.1.2.1.6.   Ir-reaġent għall-ibbliċjar

2.1.2.1.6.1.   Is-soluzzjoni kummerċjali ipoklorit tas-sodju (9 – 14 % kloru attiv)

2.1.2.2.   It-tagħmir

2.1.2.2.1.   Miżien analitiku bi preċiżjoni ta’ 0,001 g

2.1.2.2.2.   Tagħmir tat-tħin: mitħna - jew mehrież

2.1.2.2.3.   Għeriebel bi xbieki kwadri ta’ 0,25 mm u 1 mm wisa’

2.1.2.2.4.

Il-lenbut għas-separazzjoni koniku tal-ħġieġ b’kontenut ta’ 250 ml b’tapp tal-ħġieġ matt jew tat-Teflon fil-qiegħ tal-lenbut. Id-dijametru tal-fetħa tat-tapp għandu jkun ≥ 4 mm. Alternattivament, jista’ jintuża bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment b’kundizzjoni li l-laboratorju jkun wera li l-livelli ta’ individwazzjoni huma ekwivalenti għal dawk miksuba bl-użu tal-lenbut għas-separazzjoni koniku tal-ħġieġ.

2.1.2.2.5.

L-isterjomikroskopju li jkopri mill-inqas firxa ta’ manjetizzazzjoni finali bejn 6,5 × u 40 ×

2.1.2.2.6.

Mikroskopju kompost li jkopri mill-inqas firxa ta’ manjetizzazzjoni finali bejn 100 × u 400 × bi sfond ċar permezz tat-trażmissjoni tad-dawl. Jistgħu jintużaw ukoll id-dawl polarizzat u l-kuntrast interferenzjali differenzjali

2.1.2.2.7.

L-oġġetti tal-ħġieġ standard tal-laboratorju

2.1.2.2.8.

It-tagħmir għall-preparazzjoni tas-slajd: is-slajds tal-mikroskopju klassiċi, is-slajds vojta, il-coverslips (20 × 20 mm), il-pinzetti, l-ispatula fina

2.1.3.    It-teħid ta’ kampjuni u l-preparazzjoni tal-kampjuni

2.1.3.1.   It-teħid tal-kampjuni

Għandu jintuża kampjun rappreżentattiv, meħud b’konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.

2.1.3.2.   Il-prekawzjonijiet li jridu jittieħdu

Sabiex tiġi evitata t-transkontaminazzjoni tal-laboratorju, it-tagħmir kollu li jista’ jerġa’ jintuża għandu jitnaddaf bir-reqqa qabel ma jintuża. Il-biċċiet tal-lenbut għas-separazzjoni għandu jiġi żarmat qabel it-tindif. Il-biċċiet tal-lenbut għas-separazzjoni u l-oġġetti tal-ħġieġ għandhom jinħaslu minn qabel bl-idejn u mbagħad jinħaslu fil-magna tal-ħasil. L-għeriebel għandhom jitnaddfu permezz ta’ xkupilja bix-xagħar sintetiku u iebes. Huwa rrakomandat li l-għeriebel jitnaddfu bl-aċeton u bl-arja kkompressata wara t-tgħarbil tal-materjal xaħmi bħall-ħut mitħun.

2.1.3.3.   Il-preparazzjoni tal-kampjuni għajr ix-xaħam jew iż-żejt

2.1.3.3.1.

It-tnixxif tal-kampjun: il-kampjuni b’kontenut ta’ umdità > 14 % għandhom jitnixxfu qabel ma jiġu trattati.

2.1.3.3.2.

Tgħarbil minn qabel tal-kampjun: Huwa rakkomandat it-tgħarbil minn qabel f’1 mm ta’ għalf granulat u qlub u biex sussegwentement jiġu ppreparati u analizzati ż-żewġ frazzjonijiet li rriżultaw bħala kampjuni distinti.

2.1.3.3.3.

It-teħid ta’ sottokampjuni u t-tħin: għandu jittieħed is-sottokampjun ta’ mill-inqas 50 g tal-kampjun għall-analiżi u sussegwentement mitħun.

2.1.3.3.4.

L-estrazzjoni u l-preparazzjoni tas-sediment: porzjon ta’ 10 g (bi preċiżjoni sa 0,01 g) tas-sottokampjun mitħun għandu jiġi trasferit fil-lenbut għas-separazzjoni jew fil-bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment u għandu jiġi miżjud 50 ml ta’ tetrakloroetilen. Il-porzjon trasferit fil-lenbut għandu jkun limitat għal 3 g fil-każ tal-ħut mitħun jew prodotti tal-annimali puri oħrajn, ingredjenti minerali jew taħlitiet lesti minn qabel li jiġġeneraw aktar minn 10 % tas-sediment. It-taħlita għandha tiġi mħawda vigorożament għal mill-inqas 30 sekonda u għandu jiġi miżjud bir-reqqa mill-inqas 50 ml aktar ta’ tetrakloroetilen waqt il-ħasil tal-wiċċ ta’ ġewwa tal-lenbut biex titneħħa kull partiċella li tkun imwaħħla. It-taħlita li tirriżulta għandha titħalla toqgħod għal mill-anqas 5 minuti qabel ma s-sediment jiġi sseparat billi jinfetaħ it-tapp. Jekk jintuża bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment, it-taħlita għandha mbagħad titħawwad vigorożament għal mill-anqas 15-il sekonda u kull partiċella mwaħħla mal-ġenb tal-bekk għandha tinħasel bir-reqqa biex titneħħa mill-wiċċ ta’ ġewwa b’mill-inqas 10 ml ta’ tetrakloroetilen nadif. It-taħlita għandha titħalla toqgħod għal 3 minuti u mbagħad terġa’ titħawwad għal 15-il sekonda u kull partiċella mal-ġenb tal-bekk għandha tinħasel bir-reqqa biex titneħħa minn mal-wiċċ ta’ ġewwa b’mill-inqas 10 ml ta’ tetrakloroetilen nadif. It-taħlita li tirriżulta għandha titħalla toqgħod għal mill-anqas 5 minuti u mbagħad il-frazzjoni likwida titneħħa u tintrama b’dikantazzjoni bir-reqqa, filwaqt li tingħata attenzjoni biex ma jintilef l-ebda sediment. Is-sediment għandu jitnixxef u sussegwentement jintiżen (bi preċiżjoni sa 0,001 g). Jekk aktar minn 5 % tas-sediment jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.

2.1.3.3.5.

L-estrazzjoni u l-preparazzjoni tal-flotate: wara l-irkupru tas-sediment permezz tal-metodu deskritt hawn fuq, għandu jifdal żewġ fażijiet fil-lenbut għas-separazzjoni: waħda likwida magħmula minn tetrakloroetilen u waħda solida magħmula minn materjal li jżomm fil-wiċċ. Din il-fażi solida hija l-flotate u għandha tiġi rkuprata billi t-tetrakloroetilen jitferra ‘l barra kompletament mil-lenbut billi jinfetaħ it-tapp. Billi jinqaleb il-lenbut għas-separazzjoni, il-flotate għandu jiġi trasferit f’dixx Petri kbir u mnixxef bl-arja f’kabinett għad-dħaħen. Jekk aktar minn 5 % tal-flotate jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.

2.1.3.3.6.

Preparazzjoni tal-materja prima: għandu jitħejja porzjon ta’ mill-anqas 5 g tas-sottokampjun mitħun. Jekk aktar minn 5 % tal-materjal jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.

2.1.3.4.   Il-preparazzjoni ta’ kampjuni li jikkonsistu f’xaħam jew żejt

Il-protokoll li ġej għandu jiġi segwit għall-preparazzjoni ta’ kampjuni li jikkonsistu f’xaħam jew żejt:

2.1.3.5.   L-użu ta’ reaġenti għat-tilwin

Sabiex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni korretta tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali, l-operatur jista’ juża r-reaġenti għat-tilwin matul il-preparazzjoni tal-kampjun skont il-linji gwida maħruġa mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

Fil-każ li tintuża s-soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina għat-tilwin tas-sediment, għandu japplika l-protokoll li ġej:

2.1.4.    L-eżami mikroskopiku

2.1.4.1.   Il-preparazzjoni tas-slajd

Għandhom jiġu ppreparati slajds mikroskopiċi mis-sediment u, skont l-għażla tal-operatur, jew mill-flotate jew mill-materja prima. Fil-każ li jintuża t-tgħarbil matul il-preparazzjoni tal-kampjun, għandhom jiġu ppreparati ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw (dik fina u dik mhux raffinata). Il-porzjonijiet tat-test ta’ frazzjonijiet mifruxa fuq is-slajds għandhom ikunu rappreżentattivi tal-frazzjoni sħiħa.

Għandu jiġi ppreparat numru suffiċjenti ta’ slajds sabiex jiġi żgurat li jista’ jitwettaq il-protokoll ta’ eżami komplut kif stabbilit fil-punt 2.1.4.2.

Is-slajds mikroskopiċi għandhom jiġu mmuntati bil-mezz tal-immuntar adegwat skont l-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu. Is-slajds għandhom ikunu mgħottija b’coverslips.

2.1.4.2.   Il-protokolli ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fl-għalf kompost u fil-materjal tal-għalf

Is-slajds mikroskopiċi ppreparati għandhom jiġu osservati skont il-protokolli ta’ oservazzjoni stabbiliti fil-dijagramma 1 għall-għalf kompost u għall-materjali tal-għalf għajr il-ħut mitħun pur, jew fid-dijagramma 2 għall-ħut mitħun pur.

L-osservazzjonijiet mikroskopiċi għandhom jitwettqu billi jintuża mikroskopju kompost fuq is-sediment u, skont l-għażla tal-operatur, jew fuq il-flotate jew fuq il-materja prima. L-isterjomikroskopju jista’ jintuża flimkien mal-mikroskopju kompost għall-frazzjonijiet mhux raffinati. Kull slajd għandha tiġi skrinjata kompletament f’diversi manjetizzazzjonijiet.

In-numri minimi ta’ slajds li għandhom jiġu osservati f’kull stadju tal-protokoll ta’ osservazzjoni għandhom jiġu rrispettati rigorożament ħlief meta l-materjal kollu tal-frazzjoni ma jkunx jippermetti li jintlaħaq in-numru ta’ slajds stipulat. Għandhom jiġu osservati mhux aktar minn 6 slajds għal kull determinazzjoni.

Sabiex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni tan-natura u l-oriġini tal-partiċelli, l-operatur jista’ juża għodod ta’ appoġġ bħal sistemi ta’ appoġġ għad-deċiżjonijiet, il-libreriji tal-immaġnijiet u l-kampjuni ta’ referenza.

2.1.4.3.   In-numru ta’ determinazzjonijiet

Jekk wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokoll ta’ osservazzjoni stabbilit fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, ma tiġi individwata l-ebda partiċella tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut), ma tkun meħtieġa l-ebda determinazzjoni addizzjonali u r-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.1.

Jekk, wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokolli ta’ osservazzjoni stabbiliti fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, in-numru totali tal-partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut) individwat ikun ivarja minn 1 sa 5, għandha ssir it-tieni determinazzjoni minn sottokampjun ġdid ta’ 50 g. Jekk, wara din it-tieni determinazzjoni, in-numru ta’ partiċelli tal-annimali ta’ din in-natura partikolari jkun ivarja minn 0 sa 5, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tinuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.2., jew inkella għandha ssir it-tielet determinazzjoni minn sottokampjun ġdid ta’ 50 g. Madankollu, jekk wara l-ewwel u t-tieni determinazzjoni, it-total ta’ partiċelli ta’ natura partikolari individwat matul iż-żewġ determinazzjonijiet ikun ogħla minn 15, ma tkun meħtieġa l-ebda determinazzjoni addizzjonali u r-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat direttament billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3. Jekk, wara t-tielet determinazzjoni, it-total ta’ partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari individwat matul it-tliet determinazzjonijiet ikun ogħla minn 15, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tinuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3. Inkella, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.2.

Jekk wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokolli ta’ osservazzjoni stabbiliti fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, jiġu individwati aktar minn 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut), ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3.

2.1.5.    L-espressjoni tar-riżultati

Meta jirrapporta r-riżultati, il-laboratorju għandu jindika fuq liema tip ta’ materjal tkun twettqet l-analiżi (is-sediment, il-flotate jew il-materja prima) u kemm ikunu saru determinazzjonijiet.

Ir-rapport tal-laboratorju għandu jinkludi mill-anqas l-informazzjoni dwar il-preżenza ta’ kostitwenti miksuba mill-annimali terrestri u mill-ħut.

Is-sitwazzjonijiet differenti għandhom jiġu rrapportati b’dawn il-modi:

2.1.5.1.

Ma tiġi individwata l-ebda partiċella tal-annimali ta’ natura partikolari: — sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ma ġiet individwata l-ebda partiċella miksuba minn annimali terrestri fil-kampjun ippreżentat, — sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ma ġiet individwata l-ebda partiċella miksuba mill-ħut fil-kampjun ippreżentat,

2.1.5.2.

Jiġu individwati bħala medja bejn 1 u 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari: — sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, mhux aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-annimali terrestri għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [għadam, qarquċa, muskolu, xagħar, qrun …]. Din il-preżenza ta’ livell baxx, li tkun taħt il-limitu ta’ indivdwazzjoni tal-metodu mikroskopiku, tfisser li ma jistax jiġi eskluż ir-riskju ta’ riżultat pożittiv falz. Jew, kif rilevanti, — sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, mhux aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-ħut għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [xewk tal-ħut, qxur tal-ħut, qarquċa, muskolu, otolit, garġi …]. Din il-preżenza ta’ livell baxx, li tkun taħt il-limitu ta’ individwazzjoni tal-metodu mikroskopiku, tfisser li ma jistax jiġi eskluż ir-riskju ta’ riżultat pożittiv falz. Fil-każ ta’ tgħarbil minn qabel tal-kampjun, ir-rapport tal-laboratorju għandu jsemmi f’liema frazzjoni (frazzjoni mgħarbla, frazzjoni granulata jew qlub) ġew individwati l-partiċelli tal-annimali kemm-il darba l-individwazzjoni tal-partiċelli tal-annimali fil-frazzjoni mgħarbla biss tista’ tkun sinjal ta’ kontaminazzjoni ambjentali.

2.1.5.3.

Jiġu individwati bħala medja aktar minn 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari — sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-annimali terrestri għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [għadam, qarquċa, muskolu, xagħar, qrun …]. Jew, kif rilevanti, — sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-ħut għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [xewk tal-ħut, qxur tal-ħut, qarquċa, muskolu, otolit, garġi …]. Fil-każ ta’ tgħarbil minn qabel tal-kampjun, ir-rapport tal-laboratorju għandu jsemmi f’liema frazzjoni (frazzjoni mgħarbla, frazzjoni granulata jew qlub) ġew individwati l-partiċelli tal-annimali kemm-il darba l-individwazzjoni tal-partiċelli tal-annimali fil-frazzjoni mgħarbla biss tista’ tkun sinjal ta’ kontaminazzjoni ambjentali.

2.2.    Il-PCR

2.2.1.    Il-prinċipju

Il-frammenti tal-aċidu deossiribonukleiku (DNA) ta’ oriġini mill-annimali li jistgħu jkunu preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost, jiġu individwati b’teknika ta’ amplifikazzjoni ġenetika permezz tal-PCR, li timmira lejn is-sekwenzi tad-DNA speċifiku għall-ispeċi.

Il-metodu tal-PCR l-ewwel jirrikjedi stadju tal-estrazzjoni tad-DNA. Wara għandu jiġi applikat l-istadju tal-amplifikazzjoni għall-estrazzjoni tad-DNA miksuba b’dan il-mod, sabiex jiġu individwati l-ispeċi tal-annimali li jinsabu fil-mira tat-test.

2.2.2.    Ir-reaġenti u t-tagħmir

2.2.2.1.   Ir-reaġenti

2.2.2.1.1.   Ir-reaġenti għall-istadju tal-estrazzjoni tad-DNA

Għandhom jintużaw biss ir-reaġenti approvati mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

2.2.2.1.2.   Ir-reaġenti għall-istadju ta’ amplifikazzjoni ġenetika

2.2.2.1.2.1.   Il-primers u s-sondi

Għandhom jintużaw biss primers u sondi b’sekwenzi ta’ oligonukleotidi vvalidati mill-EURL-AP ( 47 ).

2.2.2.1.2.2.   Il-Master Mix

Għandhom jintużaw biss soluzzjonijiet tal-Master Mix li ma jkunx fihom reaġenti suxxettibbli li jwasslu għal riżultati foloz minħabba l-preżenza ta’ DNA tal-annimali ( 48 ).

2.2.2.1.2.3.   Ir-reaġenti ta’ dekontaminazzjoni

2.2.2.1.2.3.1.   Is-soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku (0,1N)

2.2.2.1.2.3.2.   Il-bliċ (is-soluzzjoni tal-ipoklorit tas-sodju f’0,15 % ta’ kloru attiv)

2.2.2.1.2.3.3.   Ir-reaġenti mhux korrużivi għad-dekontaminazzjoni tal-apparat li jiswa l-flus bħal imwieżen analitiċi (eż. id-DNA EraseTM tal-MP Biomedicals)

2.2.2.2.   It-tagħmir

2.2.2.2.1.   Miżien analitiku bi preċiżjoni ta’ 0,001 g

2.2.2.2.2.   It-tagħmir tat-tħin

2.2.2.2.3.   Ċiklatur termali li jippermetti li ssir PCR f’ħin reali

2.2.2.2.4.   Mikroċentrifugu għal tubi mikrofugi

2.2.2.2.5.   Sett ta’ mikropipetti li tippermetti li jitferra’ minn 1 μl sa 1 000 μl

2.2.2.2.6.

Oġġetti tal-plastik standard għall-bijoloġija molekulari: tubi mikrofugi, kontenituri tal-plastik bil-filtru għall-mikropipetti, platti adattati għaċ-ċiklatur termali.

2.2.2.2.7.

Friżers għall-ħżin tal-kampjuni u tar-reaġenti

2.2.3.    It-teħid ta’ kampjuni u l-preparazzjoni tal-kampjuni

2.2.3.1.   It-teħid ta’ kampjuni

Għandu jintuża kampjun rappreżentattiv, meħud b’konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.

2.2.3.2.   Il-preparazzjoni tal-kampjun

Il-preparazzjoni tal-kampjuni tal-laboratorju sal-estrazzjoni tad-DNA għandhom jikkonformaw mar-rekwiżiti fl-Anness II. Għandu jittieħed sottokampjun ta’ mill-inqas 50 g tal-kampjun għall-analiżi u sussegwentement jiġi mitħun.

Il-preparazzjoni tal-kampjun għandha titwettaq f’kamra differenti minn dawk maħsuba għall-estrazzjoni tad-DNA u għar-reazzjonijiet ta’ amplifikazzjoni ġenetika kif deskritt minn ISO 24276.

Għandhom jiġu preparati żewġ porzjonijiet tat-test ta’ mill-inqas 100 mg kull waħda.

2.2.4.    L-estrazzjoni tad-DNA

L-estrazzjoni tad-DNA għandha titwettaq fuq kull porzjon tat-test ippreparata bl-użu tal-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

Għandhom jiġu preparati żewġ kontrolli tal-estrazzjoni għal kull serje ta’ estrazzjonijiet kif deskritt minn ISO 24276.

2.2.5.    Amplifikazzjoni ġenetika

L-amplifikazzjoni ġenetika għandha titwettaq billi jintużaw il-metodi vvalidati għal kull speċi li tirrikjedi l-identifikazzjoni. Dawn il-metodi huma stipulati fl-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu. Kull estratt tad-DNA għandu jiġi analizzat mill-inqas f’żewġ dilwizzjonijiet differenti sabiex tiġi evalwata l-inibizzjoni.

Għandhom jiġu preparati żewġ kontrolli ta’ amplifikazzjoni għal kull speċi fil-mira kif deskritt minn ISO 24276.

2.2.6.    L-interpretazzjoni u l-espressjoni tar-riżultati

Meta jirrapporta r-riżultati, il-laboratorju għandu jindika mill-inqas il-piż tal-porzjonijiet tat-test użati, it-teknika tal-estrazzjoni użata, in-numru ta’ determinazzjonijiet imwettqa u l-limitu ta’ individwazzjoni tal-metodu.

Ir-riżultati ma għandhomx jiġu interpretati u rrappurtati jekk il-kontroll pożittiv tal-estrazzjoni tad-DNA u l-kontrolli pożittivi tad-DNA fil-mira ma jipprovdux riżultati pożittivi għall-ispeċi li qed tiġi ttestjata filwaqt li l-kontroll tar-reaġent ta’ amplifikazzjoni jkun negattiv.

Fil-każ li r-riżultati miż-żewġ porzjonijiet tat-test ma jkunux konsistenti, għandu jiġi ripetut mill-inqas l-istadju tal-amplifikazzjoni ġenetika. Jekk il-laboratorju jissuspetta li l-estratti tad-DNA jistgħu jkunu l-kważa tal-inkonsistenza, għandha titwettaq estrazzjoni ġdida tad-DNA segwita minn amplifikazzjoni ġenetika qabel ma jiġu interpretati r-riżultati.

L-espressjoni finali tar-riżultati għandha tissejjes fuq l-integrazzjoni u l-interpretazzjoni tar-riżultati taż-żewġ porzjonijiet tat-test skont l-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.

2.2.6.1.   Ir-riżultat negattiv

Ir-riżultat negattiv għandu jiġi rrappurtat kif ġej:

Ma ġie indivdwat l-ebda DNA minn X fil-kampjun ippreżentat (fejn X huwa l-ispeċi tal-annimal jew il-grupp tal-ispeċi tal-annimal li jinsab fil-mira tat-test).

2.2.6.2.   Ir-riżultat pożittiv

Ir-riżultat pożittiv għandu jiġi rrappurtat kif ġej:

Ġie individwat id-DNA minn X fil-kampjun ippreżentat (fejn X huwa l-ispeċi tal-annimal jew il-grupp tal-ispeċi tal-annimal li jinsab fil-mira tat-test).

▼B

---

ANNESS VII

IL-METODU SABIEX IKUN IKKALKOLAT IL-VALUR TAL-ENERĠIJA TAL-GĦALF TAT-TJUR

1.   Il-metodu tal-kalkolu u l-espressjoni tal-valur tal-enerġija

Il-valur tal-enerġija tal-għalf kompost tat-tjur għandu jiġi kkalkolat bi qbil mal-formula mniżżla hawn taħt fuq il-bażi tal-perċentwali ta' ċerti komponenti analitiċi tal-għalf. Dan il-valur għandu jitfisser f'megajoules (MJ) tal-enerġija metabolizzabbli (ME), f'nitroġenu kkorreġut, għal kull kilogram ta' għalf kompost:

MJ/kg ta' ME = 0,1551 x % ta' proteina mhux raffinata + 0,3431 × % xaħam + 0,1669 × % ta' lamtu + 0,1301 × % tat-totali taz-zokkor (imfissra bħala sukrożju)

2.   Tolleranzi applikabbli għall-valuri dikjarati

Jekk l-ispezzjoni uffiċjali turi diskrepanza (il-valur tal-għalf tal-annimali miżjud jew imnaqqas) bejn ir-riżultat tal-ispezzjoni u l-valur iddikjarat tal-enerġija, għandha tiġi permessa tolleranza minima ta' 0,4 MJ/kg ta' ME.

3.   Espressjoni tar-riżultat

Wara l-applikazzjoni tal-formula ta' hawn fuq, ir-riżultat miksub għandu jingħata sa post deċimali wieħed.

4.   It-teħid ta' kampjuni u l-metodi ta' analiżi

L-għażla tal-kampjuni tal-għalf kompost u d-determinazzjoni tal-kontenut tal-komponenti analitiċi indikati fil-metodu tal-kalkoli għandhom isiru skont metodi tal-għażla tal-kampjuni tal-Komunità u skont metodi analitiċi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf rispettivament.

Is-segwenti għandhom jiġu applikati:

---

ANNESS VIII

METODI TA' ANALIŻI BIEX JIĠU KKONTROLLATI L-PREŻENZI ILLEGALI TA' ADDITTIVI LI M'GĦADHOMX AWTORIZZATI FL-GĦALF

(A)   DETERMINAZZJONI TA' METHYL BENZOQUATE

7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta' methyl benzoquate fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-methyl benzoquate huwa estratt mill-kampjun b'soluzzjoni ta' methanolic methanesulfonic acid. L-estratt jiġi purifikat bil-dichloromethane, bil-kromatografija ta' skambju tal-joni u mbagħad darb'oħra b'dichloromethane. Il-kontenut tal-methyl benzoquate huwa determinat minn kromatografija b'likwidi ta' prestazzjoni għolja b'fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta' ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Ġenerali

5.2.   Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun ippreparat u ttrasferixxi għal kunjett koniku tal-250 ml. Żid 100,0 ml tas-soluzzjoni ta' methanesulfonic acid (3.4) u ħawwad b'mod mekkaniku (4.1) għal 30 minuta. għaddi s-soluzzjoni minn karta filtru u żomm il-filtrat għall-istadju tal-qsim likwidu-likwidu (5.3).

5.3.   Qsim likwidu-likwidu

Ittrasferixxi f'lenbut ta' separazzjoni ta' 500 ml li fih 100 ml tas-soluzzjoni ta' aċidu idrokloriku (3.5), 25,0 ml tal-filtrat miksub f'(5.2). Żid 100 ml tal-dichloromethane (3.1) fil-lenbut u ħawwad għal minuta. Ħalli s-safef jinfirdu u skula s-saff l-aktar baxx (dichloromethane) f'kunjett b'qiegħ tond ta' 500 ml. Irripeti l-estrazzjoni tal-fażi milwiema b'żewġ porzjonijiet oħra ta' 40 ml ta' dichloromethane u ħallat dawn mal-ewwel estratt fil-kunjett b'qiegħ tond. Evapora l-estratt tad-dichloromethane sakemm jinxef fuq l-evaporatur b'sistema rotanti (4.2) li jaħdem taħt pressjoni mnaqqsa f'40 oC. Dewweb ir-residwu fil-kunjett f'minn 20 sa 25 ml tal-metanol (3.2), agħlaq il-kunjett u żomm l-estratt kollu għall-kromotografija tal-iskambju tal-joni (5.4).

5.4.   Il-kromatografija tal-iskambju tal-joni

5.4.1.    Preparazzjoni tal-kolonna tal-bdil ta' cation

Daħħal tapp tal-ħġieġ f'forma ta' fibri fini fil-qiegħ l-aktar baxx tal-kolonna tal-ħġieġ (4.3). Ipprepara taħlita ta' 5,0 g tar-raża tal-iskambju ta' cation trattata (3.6) b'50 ml tal-aċidu idrokloriku (3.5), ferra' fil-kolonna tal-ħġieġ u ħalliha toqgħod. Skula l-aċidu żejjed eżattament għal fuq il-wiċċ tar-raża u aħsel il-kolonna bl-ilma sakemm l-effluwent huwa newtrali għall-karta tat-tornasol. Ittrasferixxi 50 ml tal-metanol (3.2) għal fuq il-kolonna u ħallih joskula 'l isfel sal-wiċċ tar-raża.

5.4.2.    Kromatografija bil-kolonni

Permezz ta' pipetta, ittrasferixxi b'attenzjoni l-estratt miksub f'(5.3) għal fuq il-kolonna. Laħlaħ il-beaker b'qiegħ tond b'5 sa 10 ml tal-metanol (3.2) u ttrasferixxi dawn il-ħasliet għall-kolonna. Skula l-estratt sal-wiċċ tar-raża u aħsel il-kolonna b'50 ml tal-metanol, waqt li tiżgura li r-rata tal-fluss ma taqbiżx il-5ml kull minuta. Armi l-effluwent. Neħħi bil-ħasil il-methyl benzoquate mill-kolonna bl-użu ta' 150 ml tas-soluzzjoni methanesulfonic acid (3.4) u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa bl-elużjoni mill-kolonna f'kunjett konikali ta' 250 ml.

5.5.   Qsim likwidu-likwidu

Ittrasferixxi s-soluzzjoni li titneħħa bl-elużjoni miksuba f'(5.4.2) f'lenbut ta' separazzjoni ta' 1 l. Laħlaħ il-kunjett koniku b'5 sa 10 ml tal-methanol (3.2) u ħallat il-ħasliet mal-kontenuti tal-lenbut ta' separazzjoni. Żid 300 ml aċidu idrokloriku (3.5) u 130 ml dichloromethane (3.1). Ħawwad għal 1 minuta u stenna sakemm jisseparaw il-fażijiet. Skula s-saff l-aktar baxx (dichloromethane) fil-kunjett b'qiegħ tond ta' 500 ml. Irripeti l-estrazzjoni tal-fażi milwiema b'żewġ porzjonijiet oħra ta' 70-ml tad-dichloromethane u ħallat dawn l-estratti mal-ewwel estratt fil-kunjett b'qiegħ tond.

Evapora l-estratt tad-dichloromethane sakemm jinxef fuq l-evaporatur b'sistema rotanti (4.2) li jaħdem taħt pressjoni mnaqqsa f'40o C. Dewweb ir-residwu fil-kunjett b'bejn wieħed u ieħor 5 ml tal-metanol (3.2) u ttrasferixxi din is-soluzzjoni b'mod kwantitattiv għal kunjett iggradat ta' 10 ml. Laħlaħ il-beaker b'qiegħ tond b'1 sa 2 ml tal-metanol u ttrasferixxi dawn il-ħasliet għall-kunjett iggradat. Wassal sal-marka bil-metanol u ħawwad. Tiġi ffiltrata porzjoni aliquot mill-filtru membrana (4.6). Żomm din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.6).

5.6.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.6.1.    Parametri

Il-kundizzjonijiet segwenti qegħdin jiġu offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħra sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, b'injezzjoni tas-soluzzjoni ta' kalibrar (3.7.3) li fiha 4 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-aqwa għoli jew żoni kostanti u l-ħinijiet ta' żamma.

5.6.2.    Graff ta' kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta' kalibrar (3.7.3) għal diversi drabi u kejjel l-aqwa għoli (l-erji) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta' kalibrar bl-użu tal-aqwa għoljiet jew żoni tal-medja tas-soluzzjonijiet ta' kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f'μg għal kull ml bħala l-axxiżi.

5.6.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.5) għal diversi drabi, bl-użu tal-istess volum bħal dak li ttieħed għas-soluzzjonijiet ta' kalibrar u ddetermina l-aqwa għoli (l-erja) medja tal-aqwa tal-methyl benzoquate.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f'μg/ml mill-għoli (l-erja) medja tal-aqwa tal-methyl benzoquate tas-soluzzjoni tal-kampjun b'referenza għall-graff ta' kalibrar (5.6.2).

Il-kontenut tal-methyl benzoquate w (mg/kg) tal-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c

=

konċentrazzjoni tal-methyl benzoquate tas-soluzzjoni tal-kampjun f'μg/ml,

m

=

piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista' tiġi kkonfermata bil-ko-kromatografija, jew bl-użu ta' ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni ta' kalibrar (3.7.3) li fiha 10 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

L-estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq tas-soluzzjoni standard intermedja (3.7.2). L-ammont ta' methyl benzoquate miżjud għandu jixbah lill-ammont stmat tal-methyl benzoquate fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-ogħla livell ta' methyl-benzoquate biss għandu jissaħħaħ wara li jitqies kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f'bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa' oriġinali.

7.1.2.    Ditezzjoni b'diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m'għandhomx jaqbżu: l-10 % fir-rigward għar-riżultat ogħla għall-kontenuti tal-methyl benzoquate bejn 4 u 20 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 90 %.

8.   Riżultati ta' studju kollaborattiv

Ħames kampjuni kienu analizzati minn 10 laboratorji. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun.

ND

=

mhux rilevat

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr

=

koeffiċjent ta' varjazzjoni tar-ripetibbiltà, %

sR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR

=

koeffiċjent ta' varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

(B)   DETERMINAZZJONI TA' OLAQUINDOX

2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxide

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell ta' olaquindox fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun jiġi estratt b'taħlita ta' ilma u metanol. Il-kontenut ta' olaquindox jiġi ddeterminat bi kromatografija b'likwidi ta' prestazzjoni għolja b'fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta' ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Nota:

Olaquindox huwa sensittiv għad-dawl. Wettaq il-proċeduri taħt dawl baxx jew uża oġġetti tal-ħġieġ kulur ambra.

5.1.   Ġenerali

5.2.   Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 50 g mill-kampjun. Ittrasferixxi f'kunjett koniku ta' 1 000 ml, żid 100 ml metanol (3.1) u poġġi l-kunjett għal 5 minuti f'banju ultrasoniku (4.1). Żid 410 ml ilma u ħalli fil-banju ultrasoniku għal 15-il minuta oħra. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku, ħawwdu għal 30 minuta fix-shaker (4.2) u ffiltra minn filtru mitwi. Ittrasferixxi 10,0 ml mill-filtrat f'kunjett iggradat ta' 20 ml, imla sal-marka bl-ilma u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.4). (Ara 9. Osservazzjoni) Kompli għad-Determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1.    Parametri:

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Iċċekkja l-istabbilità tas-sistema kromatografika, billi tinjetta ħafna drabi s-soluzzjoni ta' kalibrar (3.5.3) li fiha 2,5 μg/ml, sakemm jinkisbu ogħla livelli u ħinijiet ta' żamma kostanti.

5.3.2.    Graff ta' kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.5.3) ħafna drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħal livelli (żoni) għal kull kalibrar. Ipplottja graff tal-kalibrar billi tuża l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f'g/ml bħala l-axxiżi.

5.3.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-kampjun tal-estratt (5.2) ħafna drabi billi tuża' l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta' kalibrar u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta' olaquindox.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għolji medju (erja) tal-ogħla livelli ta' olaquindox tas-soluzzjoni kampjun stabbilixxi l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f'μg/ml b'referenza għall-graff ta' kalibrar (5.3.2).

Il-kontenut ta' olaquindox w f'mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja:

fejn:

c

=

konċentrazzjoni ta' olaquindox tal-estratt tal-kampjun (5.2) f'g/ml

m

=

piż tal-kampjun tat-test fi g (5.2)

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista' tiġi kkonfermata permezz ta' ko-kromatografija, jew billi jintuża' ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettra tal-kampjun estratt (5.2) u s-soluzzjoni ta' kalibrar (3.5.3) li fiha 5,0 g/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Kampjun estratt (5.2) jissaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq mis-soluzzjoni ta' kalibrar (3.5.3). L-ammont ta' olaquindox miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta' olaquindox li jinsab fil-kampjun estratt.

L-għoli tal-ogħla livelli tal-olaquindox biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwit tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħla livell, f'nofs l-għoli tiegħu, għandu jkun fi ħdan 10 % tal-wisa' oriġinali tal-quċċata ta' olaquindox tal-kampjun estratt mhux imsaħħaħ.

7.1.2.    Ditezzjoni b'diode array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet paralelli li jkunu saru fuq l-istess kampjun m'għandhiex taqbeż il-15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat għall-kontenuti ta' olaquindox bejn 10 u 200 mg/kg.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 90 %.

8.   Riżultati ta' studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE li fih erba' kampjuni ta' għalf tal-qżieqeż li jinkludu għalf blank ġew analizzati minn 13-il laboratorju. Ir-riżultati huma mogħtija hawn taħt:

L

=

numru ta' laboratorji

n

=

numru ta' valuri singoli

Sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVr

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

CVR

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

9.   Osservazzjoni

Għalkemm il-metodu ma ġiex ivvalidat għal għalf li fih aktar minn 100 mg/kg ta' olaquindox, jista' jkun possibbli li jinkisbu riżultati sodisfaċenti billi jittieħed piż iżgħar tal-kampjun u/jew billi l-estratt jiġi dilwit (5.2) sabiex tintlaħaq konċentrazzjoni fi ħdan il-medda tal-graff ta' kalibrar (5.3.2).

(C)   DETERMINAZZJONI TAL-AMPROLJU

1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methyl-pyridinium chloride hydrochloride

1.   Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell tal-amprolju fl-għalf u f'taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta' ditezzjoni huwa 1 mg/kg, il-limitu ta' kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt b'taħlita ta' ilma u metanol. Wara dilwizzjoni bil-fażi mobbli u l-filtrazzjoni bil-membrana, il-kontenut tal-amprolju huwa determinat permezz ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja bi skambju katoniku (HPLC), bl-użu ta' ditettur bl-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

5.1.   Ġenerali

5.1.1.    Għalf blank

Biex isir it-test tal-irkupru (5.1.2) għandu jkun analizzat għalf blank biex jiġi vverifikat li la l-amprolju u lanqas is-sustanzi li jinterferixxu ma jkunu preżenti. L-għalf blank m'għandux ikun ta' tip simili għal dak tal-kampjun u l-amprolju jew inkella s-sustanzi intereferenti m'għandhomx ikunu rilevati.

5.1.2    Test tal-irkupru

Għandu jsir test tal-irkupru bl-analiżi tal-għalf blank li jkun ġie msaħħan b'żieda ta' kwantità ta' amprolju, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Sabiex jiġi msaħħaħ il-livell ta' 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni ta' stokk standard, (3.7.1) għal kunjett koniku ta' 250 ml u ħalliha tevapora għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml. Żid 50 g tal-għalf blank, ħawwad sewwa u ħalli għal 10 minuti u erġa' ħawwad ħafna drabi qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista' jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta' żieda standard. F'dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa msaħħaħ bi kwantità ta' amprolju simili għal dak diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista' jiġi kkalkolat permezz tat-tnaqqis.

5.2.   Estrazzjoni

5.2.1.    Taħlitiet lesti minn qabel (kontenut < 1 % amprolju) u għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, 5 sa 40 g tal-kampjun, jiddependi fuq il-kontenut tal-amprolju, f'kunjett koniku ta' 500 ml u żid 200 ml tas-solvent tal-estrazzjoni (3.8). Qiegħed il-kunjett f'banju ultrasoniku (4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa (1) fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.5). Iddilwixxi l-alikwot tal-estratt bil-fażi mobbli (3.6) għall-kontenut tal-amprolju ta' 0,5sa 2 μ/ml u ħawwad (ara l-osservazzjoni 9.3). Iffiltra 5 sa 10ml ta' din is-soluzzjoni dilwita minn filtru tal-membrana (4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2.    Taħlitiet lesti minn qabel (kontenut ≥ 1 % amprolju)

Iżen sal-eqreb 0,001 g, 1 sa 4 g tat-taħlita lesta minn qabel, jiddependi fuq il-kontenut tal-amprolju, f'kunjett koniku ta' 500ml u żid 200ml tas-solvent tal-estrazzjoni (3.8). Qiegħed il-kunjett f'banju ultrasoniku (4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-kunjett mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa (1) fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.5). Iddilwixxi l-alikwot tal-estratt bil-fażi mobbli (3.6) b'kontenut tal-amprolju ta' 0,5 sa 2 g/ml u ħawwad. Iffiltra 5 sa 10ml ta' din is-soluzzjoni dilwita minn filtru tal-membrana (4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1.    Parametri:

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, u injetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3) li fiha 1,0 μg/ml, sakemm jintlaħqu għoljiet u ħinijiet ta' żamma kostanti.

5.3.2.    Graff ta' kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3) diversi drabi u ddetermina l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff tal-kalibrar billi tuża l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f'g/ml bħala l-axxiżi.

5.3.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-kampjun tal-estratt (5.2) ħafna drabi billi tuża' l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta' kalibrar u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta' amprolium.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tal-amprolju tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f'g/ml b'referenza għall-graff tal-kalibrar (5.3.2).

Il-kontenut ta' amprolium w f'mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja:

[mg/kg]

fejn:

V

=

il-volum tal-estratt tas-solvent(3.8) f'ml skont 5.2 (jiġifieri 200 ml)

c

=

konċentrazzjoni ta' amprolium tal-estratt tal-kampjun (5.2) f'μg/ml

f

=

il-fattur ta' dilwizzjoni skont 5.2

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista' tiġi kkonfermata bil-ko-kromatografija, jew billi jintuża ditettur ta' diode array li bih jitqabblu l-ispettra tal-estratt tal-kampjun (5.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3) li jkun fiha 2,0 g/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Estratt kampjun (5.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq ta' soluzzjoni tal-kalibrar (3.7.3). L-ammont tal-amprolju miżjud għandu jkun simili għall-ammont tal-amprolju li jinstab fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-ogħla livelli tal-amprolju biss għandu jiġi mtejjeb wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-diluwizzjoni tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħla livell, f'nofs l-għoli tagħha, għandu jkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa' oriġinali tal-ogħla livell tal-amprolju tal-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ.

7.1.2.    Ditezzjoni b'diode array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fl-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn:

7.3.   Irkupru

Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 90 %.

8.   Riżultati ta' studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati tliet tipi ta' għalf tat-tjur (il-kampjun 1-3), għalf minerali wieħed (il-kampjun 4) u taħlita waħda minn qabel (il-kampjun 5). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja

L

=

numru ta' laboratorji

n

=

numru ta' valuri singoli

sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

sR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

9.   Osservazzjonijiet

(D)   DETERMINAZZJONI TA' KARBADOKS

Methyl 3-(2-quinoxalinylmethylene)carbazate N1,N4-dioxide

1.   Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta' karbadoks fl-għalf, taħlitiet lesti minn qabel u preparazzjonijiet. Il-limitu ta' ditezzjoni huwa 1 mg/kg. Il-limitu ta' kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2.   Prinċipju

Il-kampjun huwa ekwilibrat bl-ilma u estratt bil-metanol-acetonitrile. għall-għalf, porzjon alikwot tal-estratt iffiltrat jiġi soġġett għal tindifa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. għal taħlitiet lesti minn qabel u preparazzjonijiet, porzjon alikwot tal-estratt iffiltrat jiġi dilwit għal konċentrazzjoni xierqa bl-ilma, bil-metanol u bl-acetonitrile. Il-kontenut tal-karbadoks jiġi ddeterminat bi kromatografija b'likwidi bi prestazzjoni għolja b'fażi riversjata (HPLC – reversed-phase high-performance liquid chromatography) bl-użu ta' ditettur bil-UV.

3.   Reaġenti

4.   Apparat

5.   Proċedura

Nota	Il-karbadoks huwa sensittiv għad-dawl. Wettaq il-proċeduri kollha f'dawl baxx jew uża apparat tal-ħġieġ ambra jew apparat tal-ħġieġ imgeżwer fil-fojl jew fl-aluminju.

5.1.   Ġenerali

5.1.1.    Għalf blank

Biex isir it-test tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analizzat għalf blank biex jiġi kkontrollat li la l-karbadoks u lanqas is-sustanzi li jinterferixxu ma jkunu preżenti. L-għalf blank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, il-karbadoks jew is-sustanzi interferenti m'għandhomx jiġu rilevati.

5.1.2.    Test tal-irkupru

Test tal-irkupru għandu jitwettaq bl-analiżi tal-għalf blank (5.1.1) li jkun ġie imsaħħaħ biż-żieda ta' kwantità ta' karbadoks, simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f'livell ta' 50 mg/kg, ittrasferixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni standard ta' stokk (3.11.1) f'kunjett koniku ta' 200 ml. Evapora s-soluzzjoni għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml f'banju tan-nitroġenu. Żid 10 g tal-għalf blank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista' jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta' żieda standard. F'dan il-każ, il-kampjun huwa msaħħaħ bi kwantità ta' karbadoks, simili għal dak diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista' jiġi kkalkolat permezz ta' tnaqqis.

5.2.   Estrazzjoni

5.2.1.    Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, 10 g tal-kampjun u ittrasferixxi għal kunjett koniku ta' 200 ml. Żid 15,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 35,0 ml metanol-acetonitrile (3.5), agħlaq b'tapp u ħawwad għal 30 minuta fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2). Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta' purifikazzjoni (5.3).

5.2.2.    Taħlitiet lesti minn qabel (0,1 – 2,0 %)

Iżen sal-eqreb 0,01 g, 1 g tal-kampjun mhux mitħun u ttrasferixxi għal kunjett koniku ta' 200 ml. Żid 15,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 35,0 ml metanol-acetonitrile (3.5), agħlaq b'tapp u ħawwad għal 30 minuta fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetika (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2).

Ippipetta alikwot tal-filtrat f'kunjett kalibrat ta' 50 ml. Żid 15,0 ml ilma, żid sal-marka bil-metanol-acetonitrile (3.5) u ħallat. Il-konċentrazzjoni karbadoks tas-soluzzjoni finali għandha tkun bejn wieħed u ieħor 10 μg/ml. L-alikwot huwa ffiltrat minn filtru ta' 0,45 μm (4.6).

Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.2.3.    Preparati (> 2 %)

Iżen sal-eqreb 0,01 g, 0,2 g tal-kampjun mhux mitħun u ttrasferixxi għal kunjett koniku ta' 250 ml. Żid 45,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 105,0 ml metanol-acetonitrile (3.5), agħlaq b'tapp u omoġenizza. Issonika (4.7) l-kampjun għal 15-il minuta u wara ħawwdu jew dawwru bi stirrer għal 15-il minuta (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2).

Iddilwixxi l-alikwot tal-filtrat b'taħlita ta' ilma-metanol-acetonitrile (3.12) għal konċentrazzjoni finali tal-karbadoks ta' 10-15 g/ml (għal preparat ta' 10 %, il-fattur tad-dilwizzjoni huwa 10). L-alikwot huwa ffiltrat minn filtru ta' 0,45 μm (4.6).

Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.3.   Purifikazzjoni

5.3.1.    Preparazzjoni tal-kolonna ta' aluminium oxide

Iżen 4 g aluminium oxide (3.4) u ttrasferih għall-kolonna tal-ħġieġ (4.3).

5.3.2.    Purifikazzjoni tal-kampjun

Applika 15 ml tal-estratt iffiltrat (5.2.1) għall-kolonna tal-aluminium oxide u warrab l-ewwel 2 ml tal-elwat. Iġbor il-5 ml li jmiss u ffiltra l-alikwot minn filtru ta' 0,45 m (4.6).

Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4.   Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1.    Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, u injetta għal diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.11.2) li jkun fiha 5,0 g/ml, sakemm jintlaħqu ogħla livell (erjas) u ħinijiet ta' żamma kostanti.

5.4.2.    Graff ta' kalibrar

Injetta kull waħda mis-soluzzjoni ta' kalibrar (3.11.2) għal diversi drabi u ddetermina l-għoli tal-ogħla livelli (żoni) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-graff tal-kalibrar billi tuża l-għoli medju tal-ogħla livelli jew l-erjas tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti f'g/ml bħala l-axxiżi.

5.4.3.    Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt kampjun [(5.3.2) għall-għalf, (5.2.2) għal taħlitiet lesti minn qabel u (5.2.3) għal preparati] diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) tal-ogħla livelli tal-karbadoks.

6.   Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (żona) tal-ogħla livelli tal-karbadoks tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tal-carbadox tas-soluzzjoni kampjun f'g/ml b'referenza għall-graff ta' kalibrar (5.4.2).

6.1.   Għalf

Il-kontenut tal-karbadoks “w” (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c

=

il-konċentrazzjoni tal-karbadoks tal-estratt tal-kampjun (5.3.2) fi g/ml,

V1

=

il-volum tal-estrazzjoni f'ml (jiġifieri 50)

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

6.2.   Taħlitiet lesti minn qabel u preparati

Il-kontenut tal-karbadoks “w” (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c

=

il-konċentrazzjoni tal-karbadoks tal-estratt tal-kampjun (5.2.2 jew 5.2.3) fi g/ml,

V2

=

il-volum tal-estrazzjoni f'ml (jiġifieri 50 għal taħlitiet lesti minn qabel; 150 għal preparati).

f

=

fattur ta' dilwent skont 5.2.2 (taħlitiet lesti minn qabel) jew 5.2.3 (preparati)

m

=

il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7.   Validazzjoni tar-riżultati

7.1.   Identità

L-identità tal-analit tista' tkun ikkonfermata bil-ko-kromatografija, jew billi jintuża ditettur ta' diode array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.11.2) li fiha 10,0 g/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Estratt kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta' ammont xieraq ta' soluzzjoni ta' kalibrar (3.11.2). L-ammont tal-karbadoks miżjud għandu jkun simili għall-ammont stmat ta' karbadoks li jinstab fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-ogħla livell tal-karbadoks biss għandu jiġi mtejjeb wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa' tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f'bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa' oriġinali.

7.1.2.    Ditezzjoni b'diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2.   Ripetibbiltà

Għal kontenuti ta' 10 mg/kg u ogħla, id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m'għandhiex tkun aktar minn 15 % fir-rigward tar-riżultat l-aktar għoli.

7.3.   Irkupru

Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 90 %.

8.   Riżultati ta' studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih, 6 tipi ta' għalf, 4 taħlitiet lesti minn qabel u 3 preparati ġew analizzati minn 8 laboratorji. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista' tinsab fil-Journal of the AOAC, Volume 71, 1988, p. 484-490). Ir-riżultati (esklużi dawk barra l-limitu) jidhru hawn taħt:

L

=

numru ta' laboratorji

n

=

numru ta' valuri singoli

Sr

=

devjazzjoni standard tar-ripetibilità

CVr

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità

SR

=

devjazzjoni standard tar-riproduċibilità

CVR

=

koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

---

ANNESS IX

KORRELAZZJONIJIET IMSEMMIJA F'ARTIKOLU 6

1.   Direttiva 71/250/KEE

2.   Direttiva 71/393/KEE

3.   Direttiva 72/199/KEE

4.   Direttiva 73/46/KEE

5.   Direttiva 76/371/KEE

6.   Direttiva 76/372/KEE

7.   Direttiva 78/633/KEE

8.   Direttiva 81/715/KEE

9.   Direttiva 84/425/KEE

10.   Direttiva 86/174/KEE

11.   Direttiva 93/70/KEE

12.   Direttiva 93/117/KE

13.   Direttiva 98/64/KE

14.   Direttiva 1999/27/KE

15.   Direttiva 1999/76/KE

16.   Direttiva 2000/45/KE

17.   Direttiva 2002/70/KE

18.   Direttiva 2003/126/KE

---

( 1 ) ĠU L 165, 30.4.2004, p. 1, ikkoreġut bil-ĠU L 191, 28.5.2004, p. 1.

( 2 ) ĠU L 155, 12.7.1971, p. 13.

( 3 ) ĠU L 279, 20.12.1971, p. 7.

( 4 ) ĠU L 123, 29.5.1972, p. 6.

( 5 ) ĠU L 83, 30.3.1973, p. 21.

( 6 ) ĠU L 102, 15.4.1976, p. 1.

( 7 ) ĠU L 102, 15.4.1976, p. 8.

( 8 ) ĠU L 206, 29.7.1978, p. 43.

( 9 ) ĠU L 257, 10.9.1981, p. 38.

( 10 ) ĠU L 238, 6.9.1984, p. 34.

( 11 ) ĠU L 130, 16.5.1986, p. 53.

( 12 ) ĠU L 234, 17.9.1993, p. 17.

( 13 ) ĠU L 329, 30.12.1993, p. 54.

( 14 ) ĠU L 257, 19.9.1998, p. 14.

( 15 ) ĠU L 118, 6.5.1999, p. 36.

( 16 ) ĠU L 207, 6.8.1999, p. 13.

( 17 ) ĠU L 174, 13.7.2000, p. 32.

( 18 ) ĠU L 209, 6.8.2002, p. 15.

( 19 ) ĠU L 339, 24.12.2003, p. 78.

( 20 ) ĠU L 268, 18.10.2003, p. 29.

( 21 ) ĠU L 140, 30.5.2002, p. 10.

( 22 ) ĠU L 70, 16.3.2005, p. 1.

( 23 ) Jekk ikun hemm xi ċapep, dawn iridu jiġu mfarrka (jekk ikun hemm bżonn billi jinħallu u jitpoġġew lura fil-kampjun).

( 24 ) Ħlief fil-każ ta’ għalf oħxon jew foraġġ bi gravità speċifika baxxa.

( 25 ) Ħlief fil-każ ta’ għalf oħxon jew foraġġ bi gravità speċifika baxxa.

( 26 ) ĠU L 229, 1.9.2009, p. 1.

( 27 ) Għat-tnixxif ta' ċereali, dqiq, xgħir u barli mitħun oħxon u qamħ mitħun mhux raffinat, il-forn irid ikollu kapaċità termali tali li, meta jkun issettjat minn qabel għal 131 oC dan jerġa' lura għal dik it-temperatura f'inqas minn 45 minuta wara li n-numru massimu ta' kampjuni għat-test ikunu tpoġġew ġewwa sabiex jitnixxfu flimkien. Il-ventilazzjoni trid tkun b'tali mod li meta jitpoġġew b'kemm jiflaħ kampjuni ta' qamħ komuni, ir-riżultati jvarjaw b'inqas minn 0,15 % minn dawk miksuba wara erba' sigħat ta' tnixxif.

( 28 ) Meta ż-żejt jew ix-xaħam ikollu jgħaddi minn testijiet sussegwenti, issostitwixxi l-biċċiet tal-ġebla ħaffiefa b'żibeġ tal-ħġieġ.

( 29 ) ĠU L 125, 23.5.1996, p. 35.

( 30 ) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 31 ) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA)

( 32 ) Jistgħu jintużaw metodi ta’ diġestjoni oħrajn diment li dawn ikunu wrew li jwasslu għal riżultati simili (bħad-diġestjoni permezz tal-pressa bil-micowave).

( 33 ) Għalf aħdar (frisk jew imnixxef) jista’ jkun fih ammonti kbar ta’ silika tal-ħaxix, li tista’ żżomm fiha elementi ta’ traċċa u għandha titneħħa. Għal kampjuni ta’ dan l-għalf, għalhekk, għandha tiġi segwita l-proċedura modifikata segwenti. Wettaq operazjoni 5.1.1.1 sal-fażi tal-filtrazjoni. Aħsel il-karta tal-filtru, li jkun fiha r-residwu mhux maħlul, darbtejn b’ilma jagħli u poġġiha fi griġjol tal-kwarz jew tal-platinum. Ixgħel il-muffle furnace (4.1) b’temperatura taħt il-550 oC sakemm il-materjal faħmi kollu jkun sparixxa għal kollox. Ħallih jibred, żid ftit qtar ta’ ilma segwit b’10 sa 15 ml ta’ hydrofluoric acid (3.4) u evapora sakemm jinxef f’madwar 150 oC. Jekk tibqa’ xi silika fir-residwu, dewweb mill-ġdid fi ftit millilitri ta’ hydrofluoric acid (3.4) u evapora sakemm jixxotta. Żid ħames taqtiriet ta’ sulphuric acid (3.5) u saħħan sakemm ma jibqa’ l-ebda fwar abjad. Wara ż-żieda ta’ 5 ml ta’ 6 mol/litru hydrochloric acid (3.2) u madwar 30 ml ta’ ilma, saħħan, iffiltra s-soluzzjoni f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml u wassal sal-marka b’ilma (konċentrazzjoni ta’ HCI ta’ madwar 0,5 mol/l). Imbagħad ipproċedi bid-determinazzjoni minn punt 5.1.2.

( 34 ) The Analyst 108, 1983, pp. 1252 sa 1256

( 35 ) Analyst, 1995, 120, pp.2175-2180

( 36 ) Tabella tat-TEF (= fatturi ta' ekwivalenza tossika) għal diossini, furani u PCB simili għad-diossini:

It-TEFs tad-WHO għall-valutazzjoni tar-riskju għall-bnedmin imsejsa fuq il-konklużjonijiet tal-laqgħa ta' esperti tal-Programm Internazzjonali dwar is-Sigurtà tas-Sustanzi Kimiċi (IPCS) tal-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa — (WHO), li saret f'Ġinevra f'Ġunju 2005 (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicoloigical Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Taqsiriet użati: “T” = tetra; “Pe” = penta; “Hx” = eża; “Hp” = epta; “O” = okta; “CDD” = klorodibenżodiossin; “CDF” = klorodibenżofuran; “CB” = klorobifenil.

( 37 ) Id-Deċiżjoni 2002/657/KE tal-Kummissjoni tal-14 ta' Awwissu 2002 li jimplimenta d-Direttiva tal-Kunsill 96/23/KE rigward il-ħidma ta' metodi analitiċi u l-interpretazzjoni tar-riżultati (ĠU L 221, 17.8.2002, p. 8).

( 38 ) Il-kunċett tal-“livell superjuri” (upperbound) jeħtieġ l-użu tal-limitu ta' kwantifikazzjoni għall-kontribuzzjoni ta' kull konġeneru mhux kwantifikat. Il-kunċett tal-“livell inferjuri” (lower-bound) jeħtieġ l-użu ta' żero għall-kontribuzzjoni ta' kull konġeneru mhux kwantifikat. Il-kunċett tal-“livell medju” (mediumbound) jeħtieġ l-użu ta' nofs il-limitu ta' kwantifikazzjoni meta tiġi kkalkulata l-kontribuzzjoni ta' kull konġeneru mhux kwantifikat.

( 39 ) B'mod ġenerali, japplikaw ir-rekwiżiti għal analiżi duplikata kif previst fl-Anness II, Kapitolu C punt 3. Madankollu, fil-każ tal-metodi konfermatorji bl-użu ta' standard intern bit-tikketta 13C għall-analiti rilevanti, tkun meħtieġa analiżi duplikata jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni li tapplika t-tali metodi konfermatorji ma jkunx konformi. L-analiżi duplikata hija neċessarja biex tiġi eskluża l-possibbiltà ta' kontaminazzjoni kroċjata jew xi taħwida aċċidentali tal-kampjuni. Fil-każ li l-analiżi ssir fil-qafas ta' inċident ta' kontaminazzjoni, il-konferma b'analiżi duplikata tista' tiġi eliminata f'każ li l-kampjuni magħżulin għall-analiżi huma konnessi, permezz tat-traċċabbiltà, mal-inċident ta' kontaminazzjoni u l-livell misjub ikun konsiderevolment ogħla mil-livell massimu.

( 40 ) Il-kunċett tal-“livell superjuri” jeħtieġ li jintuża l-limitu ta' kwantifikazzjoni għall-kontribuzzjoni ta' kull konġenru mhux kwantifikat għall-Ekwivalent ta' Tossiċità (TEQ). Il-kunċett tal-“livell inferjuri” jeħtieġ l-użu taż-żero għall-kontribuzzjoni ta' kull konġeneru mhux kwantifikat għat-TEQ. Il-kunċett ta' “limitu medju” jeħtieġ l-użu ta' nofs il-limitu ta' kwantifikazzjoni billi tiġi kkalkulata l-kontribuzzjoni ta' kull konġenru mhux kwantifikat għat-TEQ.

( 41 ) B'mod ġenerali, japplikaw ir-rekwiżiti għal analiżi duplikata kif previst fl-Anness II, Kapitolu C punt 3. Madankollu, fil-każ tal-metodi konfermatorji bl-użu ta' standard intern bit-tikketta 13C għall-analiti rilevanti, tkun meħtieġa analiżi duplikata jekk ir-riżultat tal-ewwel determinazzjoni li tapplika t-tali metodi konfermatorji ma jkunx konformi. L-analiżi duplikata hija neċessarja biex tiġi eskluża l-possibbiltà ta' kontaminazzjoni kroċjata jew xi taħwida aċċidentali tal-kampjuni. Fil-każ li l-analiżi ssir fil-qafas ta' inċident ta' kontaminazzjoni, il-konferma b'analiżi duplikata tista' tiġi eliminata f'każ li l-kampjuni magħżulin għall-analiżi huma konnessi, permezz tat-traċċabbiltà, mal-inċident ta' kontaminazzjoni u l-livell misjub ikun konsiderevolment ogħla mil-livell massimu.

( 42 ) Spjegazzjoni identika u r-rekwiżiti għall-analiżi tal-kontroll duplikata tal-limiti ta' azzjoni kif imsemmi fin-nota ta' qiegħ il-paġna (42)  għal-livelli massimi.

( 43 ) Il-metodi bijoanalitiċi mhumiex speċifiċi għal dawk il-konġeneri inklużi fl-iskema TEF. Komposti oħra attivi fl-AhR marbuta strutturalment jistgħu jkunu preżenti fl-estratt ta' kampjun li jikkontribwixxi għal rispons ġenerali. Għaldaqstant, ir-riżultati bijoanalitiċi ma jistgħux ikunu stima iżda pjuttost indikazzjoni tal-livell TEQ fil-kampjun.

( 44 ) Ir-rekwiżiti attwali huma msejsa fuq it-TEFs ippubblikati fi: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 45 ) Hu rakkomandat ferm li jkun hemm kontribuzzjoni aktar baxxa tal-livell inbjank tar-reaġent għal-livell ta' kontaminant f'kampjun. Il-laboratorju huwa responsabbli għall-kontroll tal-varjazzjoni tal-livelli inbjank, b'mod partikolari, jekk il-livelli inbjank huma mnaqqsa.

( 46 ) http://eurl.craw.eu/

( 47 ) Il-lista ta’ dawn il-primers u s-sondi għal kull speċi tal-annimali fil-mira tat-test hija disponibbli fuq il-websajt tal-EURL-AP.

( 48 ) Eżempji ta’ Master Mixes li huma funzjonali huma disponibbli fuq il-websajt tal-EURL-AP.