1.

Sadalījuma koeficientu (P) definē kā izšķīdušās vielas līdzsvara koncentrāciju attiecību divfāzu sistēmā, ko veido divi šķīdinātāji ar savstarpēji ierobežotu šķīdību. Ja tas ir n-oktanols un ūdens:

Tā kā sadalījuma koeficients ir divu koncentrāciju attiecība, tas ir bezdimensiju lielums un parasti ir izteikts decimāllogaritma veidā.

2.

Pow ir galvenais rādītājs pētījumos par ķīmisku vielu apriti vidē un mijiedarbību ar to. Ir pierādīta ļoti nozīmīga sakarība starp vielu nejonizēto formu Pow un to bioakumulāciju zivīs. Ir arī pierādīts, ka Pow palīdz prognozēt adsorbciju augsnē un sedimentos un izveidot struktūras un aktivitātes kvantitatīvās sakarības modeli plašam bioloģiskās ietekmes spektram.

3.

Šīs testēšanas metodes sākotnējā priekšlikuma pamatā bija C. V. Eadsforth un P. Moser raksts (1). Metodes izstrādi un ESAO starplaboratoriju salīdzinošo testēšanu 1986. gadā koordinēja Vācijas Federatīvās Republikas Federālā Vides aizsardzības aģentūra (Umweltbundesamt) (2).

4.

log Pow vērtības diapazonā no – 2 līdz 4 (dažkārt līdz 5 un vairāk) (1) eksperimentāli var noteikt, izmantojot “kolbu kratīšanas” metodi (šā pielikuma A.8. nodaļa, ESAO Testēšanas norādījumi 107). HPLC metodi var lietot, ja log Pow vērtības ir diapazonā no 0 līdz 6 (1)(2)(3)(4)(5). Lai izvēlētos piemērotas standartvielas un pamatotu visus secinājumus, kas iegūti no testēšanas rezultātiem, šai metodei var būt nepieciešams noteikt aptuvenu Pow vērtību. Aprēķina metodes ir īsi izklāstītas šīs testēšanas metodes papildinājumā. HPLC darbības režīms ir izokrātisks.

5.

Pow vērtības ir atkarīgas no vides apstākļiem, piemēram, temperatūras, pH, šķīduma jonu spēka u. c., kas eksperimentā ir jānorāda pareizai Pow datu interpretēšanai. Jonizējamām vielām var izmantot citu, alternatīvu metodi (piemēram, ESAO norādījumu projektu par pH-metriskajām metodēm jonizētām vielām (6)), kas var kļūt pieejama. Kaut arī šis ESAO norādījumu projekts var būt piemērots Pow noteikšanai jonizējamām vielām, dažos gadījumos tomēr var būt atbilstošāk izmantot HPLC metodi, testēšanu veicot pie vides apstākļiem atbilstoša pH (sk. 9. punktu).

6.

Apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfijai izmanto analītiskās kolonnas ar komerciāli pieejamu cietās fāzes pildījumu, ko veido garas ogļūdeņražu ķēdes (piemēram, C8, C18), kas ķīmiski saistītas ar silīcija dioksīdu.

7.

Šādā kolonnā ievadītā viela sadalās starp kustīgo šķīdinātāja fāzi un ogļūdeņražu stacionāro fāzi, kad cauri kolonnai to nes kustīgā fāze. Vielas tiek aizturētas proporcionāli to sadalījuma koeficientam ogļūdeņražos/ūdenī; hidrofilas vielas eluējas pirmās, bet lipofilas vielas – pēdējās. Aiztures ilgums ir atkarīgs no aiztures koeficienta k, ko aprēķina saskaņā ar vienādojumu:

kur tR ir nosakāmās vielas aiztures ilgums, t0 ir tukšais laiks, t. i., vidējais laiks, kurā šķīdinātāja molekula izkļūst cauri kolonnai. Kvantitatīva analīze nav nepieciešama; jānosaka tikai aiztures ilgumi.

8.

Testējamās vielas sadalījuma koeficientu sistēmā oktanols/ūdens var aprēķināt, eksperimentāli nosakot tās aiztures koeficientu k un ievadot k vienādojumā

kur

Iepriekš norādīto vienādojumu var iegūt, veicot standartvielu oktanola/ūdens sadalījuma koeficientu logaritma lineāro regresiju pret standartvielu aiztures koeficienta logaritmu.

9.

Izmantojot apgrieztās fāzes HPLC metodi, var aprēķināt sadalījuma koeficientu log Pow diapazonā no 0 līdz 6, bet izņēmuma gadījumos to var paplašināt, lai tajā būtu iekļauts arī log Pow diapazonā no 6 līdz 10. Šādā gadījumā var būt nepieciešams pārveidot kustīgo fāzi (3). Šī metode nav izmantojama stiprām skābēm un bāzēm, metālu kompleksajiem savienojumiem, vielām, kas reaģē ar eluentu, un virsmaktīvajām vielām. Mērījumus jonizējamām vielām to nejonizētajā formā (brīva skābe vai brīva bāze) var veikt, tikai izmantojot piemērotu buferšķīdumu ar pH, kas brīvai skābei ir zemāks par pKa, bet brīvai bāzei – augstāks par pKa. Jonizējamu vielu (6) testēšanai var izmantot alternatīvu – pH-metrisko metodi (6), ja tāda ir pieejama. Ja ir noteikta log Pow vērtība, lai vielu klasificētu pēc bīstamības videi vai novērtētu vides risku, testēšana veicama tādā pH diapazonā, kas atbilst dabiskajai videi, t. i., pH diapazonā no 5,0 līdz 9.

10.

Dažos gadījumos piemaisījumi var apgrūtināt rezultātu interpretāciju smaiļu sadalījuma nenoteiktības dēļ. Maisījumiem, kuriem kādā no diapazoniem smailes nav atšķiramas, pārskatā jāiekļauj informācija par log Pow augšējo un apakšējo robežu, kā arī katras log Pow smailes laukumu ( %). Maisījumiem, ko veido homologu grupas, ir jānorāda arī vidējais svērtais log Pow (7), kas aprēķināts, izmantojot atsevišķās Pow vērtības un atbilstošās laukuma % vērtības (8). Aprēķinos jāņem vērā visas smailes, kuru laukums ir vismaz 5 % smaiļu kopējā laukuma (9):

Vidējais svērtais log Pow attiecas tikai uz vielām vai maisījumiem (piemēram, taleļļām), ko veido homologi (piemēram, alkānu rindas). Maisījumus var izmērīt, iegūstot nozīmīgus rezultātus, ar nosacījumu, ka izmantotajam analītiskajam detektoram ir vienāda jutība pret visām maisījuma vielām un ka tās iespējams pietiekami izšķirt.

11.

Pirms testēšanas sākšanas ir jāzina vielas disociācijas konstante, struktūrformula un šķīdība kustīgajā fāzē. Turklāt būtu lietderīga informācija par hidrolīzi.

12.

Lai paaugstinātu mērījumu rezultātu ticamību, noteikšana jāveic divkārši.

13.

Starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā pierādīts, ka ar HPLC un “kolbu kratīšanas” metodēm var iegūt rezultātus ± 0,5 vienību diapazonā (2). Literatūrā ir izklāstīti arī citi salīdzinošās testēšanas rezultāti (4)(5)(10)(11)(12). Korelāciju grafiki, kas veidoti standartvielām ar līdzīgu struktūru, nodrošina vispareizākos rezultātus (13).

14.

Lai noteiktu korelāciju starp vielai izmērīto aiztures koeficientu k un tās Pow vērtību, jāizveido kalibrēšanas grafiks, izmantojot mērījumus vismaz sešos punktos (sk. 24. punktu). Par piemērotu standartvielu izvēli ir atbildīgs metodes lietotājs. Parasti izvēlas standartvielas, kuru Pow vērtību diapazons iekļauj testējamās vielas log Pow, t. i., vismaz vienas standartvielas Pow būtu jābūt lielākam par testējamās vielas Pow, bet otras standartvielas Pow – mazākam par testējamās vielas Pow. Ekstrapolācija būtu veicama tikai izņēmuma gadījumos. Vēlams, lai šīs standartvielas būtu struktūras ziņā saistītas ar testējamo vielu. Kalibrēšanā izmantoto standartvielu log Pow vērtībām jābūt iegūtām, pamatojoties uz uzticamiem eksperimentu datiem. Tomēr, ja par vielām ar augstu log Pow (parasti vairāk nekā 4) nav pieejami uzticami eksperimentu dati, var izmantot aprēķinātās vērtības. Ja lieto ekstrapolētas vērtības, ir jānosaka to robežvērtība.

15.

Daudzām ķīmisko vielu grupām ir publicēti plaši log Pow vērtību saraksti (14)(15). Ja nav datu par līdzīgas struktūras vielu sadalījuma koeficientu vērtībām, var izmantot vispārīgāku kalibrēšanu, lietojot citas standartvielas. Ieteicamās standartvielas un to Pow vērtības ir norādītas 1. tabulā. Jonizējamām vielām dotās vērtības attiecas uz to nejonizēto formu. Vērtību ticamība un kvalitāte ir pārbaudīta starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā.

1. tabula.

Ieteicamās standartvielas

16.

Ja nepieciešams, testējamās vielas sadalījuma koeficientu var noteikt ar aprēķinu metodi (sk. papildinājumu) vai – attiecīgos gadījumos – izmantojot testējamās vielas šķīdības attiecību tīros šķīdinātājos.

17.

Šķidruma fāzes hromatogrāfs, kas aprīkots ar vājas pulsācijas sūkni un piemērotu detektēšanas sistēmu. UV detektors, kura viļņu garums ir 210 nm, vai RI detektors ir piemērots plašam ķīmisku vielu grupu klāstam. Polāru grupu klātbūtne stacionārajā fāzē var būtiski pasliktināt kolonnas darbības efektivitāti. Tāpēc stacionārajā fāzē jābūt iespējami mazam polāro grupu saturam (16). Var izmantot tirdzniecībā pieejamas gatavas kolonnas ar pildījumu vai mikrodaļiņu apgrieztās fāzes pildījumu. Starp injicēšanas sistēmu un analītisko kolonnu var uzstādīt aizsargkolonnu.

18.

Eluentu pirms lietošanas degazē, un tā pagatavošanai izmanto HPLC tīrības pakāpes metanolu un destilētu vai dejonizētu ūdeni. Jāizmanto izokrātiskā eluēšana. Jālieto metanola/ūdens maisījumi ar ūdens saturu vismaz 25 %. Parasti ar metanola-ūdens maisījumu 3:1 (tilpumu attiecība (v/v)) stundas laikā ar plūsmas ātrumu 1 ml/min eluējas vielas, kuru log P ir 6. Vielām, kuru log P vērtība pārsniedz 6 (un arī standartvielām) eluēšanas laiks var būt jāsamazina, samazinot kustīgās fāzes polaritāti vai kolonnas garumu.

19.

Testējamajai vielai un standartvielām jābūt šķīstošām kustīgajā fāzē pietiekamā koncentrācijā, lai tās varētu detektēt. Piedevas metanola/ūdens maisījumam izmanto tikai izņēmuma gadījumos, jo piedevu ietekmē mainās kolonnas īpašības. Šādos gadījumos ir jāpārliecinās, ka tas neietekmē testējamās vielas un standartvielu aiztures ilgumu. Ja metanola/ūdens maisījumu izmantot nevar, var lietot citus organisko šķīdinātāju un ūdens maisījumus, piemēram, etanola/ūdens, acetonitrila/ūdens vai izopropilspirta (2-propanola)/ūdens maisījumu.

20.

Jonizējamām vielām ļoti svarīgs ir eluenta pH. Tam jābūt kolonnas pH darbības diapazonā, kas parasti ir no 2 līdz 8. Ieteicams izmantot buferšķīdumus. Jānovērš sāļu nogulsnēšanās un kolonnas bojāšanās, ko izraisa daži organiskās fāzes/buferšķīdumu maisījumi. Parasti nav ieteicams augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfijā izmantot stacionārās fāzes uz silīcija dioksīda bāzes ar pH virs 8, jo bāziska kustīgā fāze var izraisīt strauju kolonnas efektivitātes pasliktināšanos.

21.

Testējamajām vielām un standartvielām jābūt pietiekami tīrām, lai hromatogrammās attiecīgajām vielām varētu skaidri noteikt smailes. Testēšanai vai kalibrēšanai izmantojamās vielas, ja iespējams, jāšķīdina kustīgajā fāzē. Ja testējamo vielu un standartvielu šķīdināšanai izmanto šķīdinātāju, kas nav kustīgā fāze, paraugu tieši pirms iešļircināšanas kolonnā atšķaida ar kustīgo fāzi.

22.

Mērījumu laikā temperatūra nedrīkst mainīties par vairāk nekā ± 1 °C.

23.

Tukšo laiku t0 var izmērīt, izmantojot organiskas vielas, kas netiek aizturētas (piemēram, tiourīnvielu vai formamīdu). Precīzāk tukšo laiku var noteikt, izmērot aptuveni septiņu homoloģiskas rindas locekļu (piem., n-alkilmetilketonu) aiztures ilgumus (17). Aiztures ilgumus tR (nC + 1) grafikā atliek pret tR (nC), kur nC ir oglekļa atomu skaits. Iegūst vienādojumam tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0 atbilstošu taisni, kur A jeb k(nC + 1)/k(nC) ir konstante. Tukšo laiku t0 aprēķina pēc krustpunkta parametra (1 – A)t0 un virziena koeficienta A.

24.

Nākamais posms ir grafiski attēlot korelāciju starp attiecīgo standartvielu log P un log k, log P vērtībām esot tuvu paredzamajai testējamās vielas vērtībai. Praksē vienlaicīgi injicē no sešām līdz desmit standartvielām. Nosaka aiztures ilgumus; tam vēlams izmantot reģistrējošu integratoru, kas savienots ar detektēšanas sistēmu. Aiztures koeficientu attiecīgos logaritmus log k grafiski attēlo kā log P funkciju. Regresijas vienādojumu aprēķināšanu veic regulāri – vismaz reizi dienā, lai varētu ņemt vērā kolonnas efektivitātes iespējamās izmaiņas.

25.

Testējamo vielu injicē vismazākajos detektējamos daudzumos. Aiztures ilgumu nosaka divos replikātos. Testējamās vielas sadalījuma koeficientu nosaka, kalibrēšanas grafikā interpolējot aprēķināto aiztures koeficientu. Ļoti zemas un ļoti augstas sadalījuma koeficienta vērtības ir jānosaka ekstrapolējot. Šādos gadījumos īpaša vērība jāveltī regresijas līnijas ticamības robežām. Ja parauga aiztures ilgums nav standartvielām noteikto aiztures ilgumu robežās, būtu jānosaka robežvērtība.

26.

Testēšanas pārskatā iekļaujama šāda informācija:

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). “Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 201 (2006. gads, pielikums labots 2011. gadā). Ir konstatēta nepieciešamība papildināt testēšanas metodi, iekļaujot papildu sugas un atjauninot to, lai izpildītu prasības attiecībā uz ķīmisko vielu bīstamības novērtējumu un klasifikāciju. Minētā dokumenta pārskatīšana ir veikta, pamatojoties uz plašo praktisko pieredzi, zinātnes attīstību attiecībā uz vielu toksisko ietekmi uz aļģēm, un plašu izmantošanu reglamentējošo noteikumu izstrādē, kas notikusi laikposmā kopš sākotnējās versijas pieņemšanas.

2.

Izmantotās definīcijas ir dotas 1. papildinājumā.

3.

Šā testa mērķis ir novērtēt ķīmiskās vielas ietekmi uz saldūdens mikroskopisko aļģu un/vai zilaļģu augšanu. Eksponenciāli augošus testa organismus periodiski audzētās kultūrās eksponē testējamajai ķīmiskajai vielai laika periodā, kas parasti ilgst 72 stundas. Lai gan tests ir diezgan īslaicīgs, tas ļauj novērtēt iedarbību uz vairākām paaudzēm.

4.

Sistēmas atbildreakcija ir augšanas ātruma samazinājums aļģu kultūru sērijās (testa vienībās), kas eksponētas dažādu koncentrāciju testējamās ķīmiskās vielas šķīdumiem. Atbildreakciju vērtē kā ekspozīcijas koncentrācijas funkciju, salīdzinot ar replikātu – ekspozīcijai nepakļauto kontrolgrupu – augšanas ātruma vidējo vērtību. Lai iegūtu pilnīgu ainu par sistēmas reakciju uz toksisko ekspozīciju (optimālo jutību), kultūrām ļauj neierobežoti eksponenciāli augt, nodrošinot pietiekami daudz barības vielu un nepārtrauktu gaismu pietiekami ilgi, lai noteiktu specifiskā augšanas ātruma samazināšanos.

5.

Augšanu un augšanas inhibēšanos kvantitatīvi nosaka, izmantojot sakarību starp aļģu biomasu un laiku. Aļģu biomasu definē kā sausnas masu uz tilpuma vienību, piemēram, miligramus aļģu uz litru testa šķīduma. Tomēr sausnas masa ir grūti mērāma, tāpēc izmanto aizstājējparametrus. Visbiežāk izmantotais aizstājējparametrs ir šūnu skaits. Citi aizstājējparametri ir šūnu tilpums, fluorescence, optiskais blīvums u. c. Ir jāzina pārrēķina koeficients starp izmērīto aizstājējparametru un biomasu.

6.

Testēšanas beigupunkts ir augšanas inhibēšanās, ko izsaka kā biomasas logaritmisko pieaugumu (vidējo specifisko augšanas ātrumu) ekspozīcijas perioda laikā. No specifiskā augšanas ātruma vidējām vērtībām, kas reģistrētas testa šķīdumu sērijā, nosaka koncentrāciju, kas rada noteiktu x % (piemēram, 50 %) augšanas ātruma inhibēšanās vērtību, un to izsaka kā ErCx (piemēram, ErC50).

7.

Šajā testēšanas metodē izmantotais papildu atkarīgais mainīgais ir ražība, kas var būt nepieciešams, lai dažās valstīs izpildītu īpašas reglamentējošas prasības. To nosaka, no biomasas apjoma ekspozīcijas perioda beigās atņemot biomasas apjomu ekspozīcijas perioda sākumā. No ražības, kas reģistrēta testa šķīdumu rindā, aprēķina koncentrāciju, kas rada noteiktu x % (piemēram, 50 %) ražības inhibēšanās vērtību, un to izsaka kā EyCx (piemēram, EyC50).

8.

Turklāt statistiski var noteikt zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC) un nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC).

9.

Informācijā par testējamo ķīmisko vielu, kas var būt noderīga, nosakot testēšanas apstākļus, ietver tās struktūrformulu, tīrību, stabilitāti gaismā, stabilitāti testa apstākļos, gaismas absorbcijas īpašības, pKa un pētījumu rezultātus par pārveidošanos, tostarp bionoārdāmību ūdenī.

10.

Jāzina testējamās ķīmiskās vielas šķīdība ūdenī, sadalījuma koeficients oktanolā/ūdenī (Pow) un tvaika spiediens, un jābūt pieejamai validētai metodei ķīmiskās vielas daudzuma kvantitatīvai noteikšanai testa šķīdumos ar zināmu atgūstamības koeficientu un detektēšanas robežu.

11.

Lai tests būtu derīgs, ir jāizpilda šādi veiktspējas kritēriji:

12.

Ķīmisko(-ās) standartvielu(-as), piemēram, 3,5-dihlorfenolu, kas izmantots starptautiskajā salīdzinošajā testēšanā (1), var lietot testēšanas metodes pārbaudei. Zaļaļģēm par ķīmisko standartvielu var izmantot arī kālija dihromātu. Ķīmiskās standartvielas testēšanu ieteicams veikt vismaz divas reizes gadā.

13.

Šo testēšanas metodi vislabāk var izmantot ūdenī šķīstošām ķīmiskajām vielām, kas testa apstākļos, visticamāk, paliks ūdenī. Lai testētu gaistošas, izteikti adsorbējošas, krāsainas ķīmiskas vielas vai ūdenī vāji šķīstošas vielas, vai arī vielas, kas var ietekmēt barības vielu vai minerālvielu pieejamību testēšanas barotnē, aprakstītā procedūra var būt jāpielāgo (piemēram, noslēgta sistēma, testēšanā izmantoto trauku kondicionēšana). Norādījumi par dažām atbilstošām izmaiņām ir sniegti avotos (2), (3) un (4).

14.

Testēšanā izmantojamajiem traukiem un citām iekārtām, kas saskaras ar testa šķīdumiem, jābūt pilnībā izgatavotiem no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla. Priekšmeti ir rūpīgi jāmazgā, lai novērstu organisko vai neorganisko kontaminantu iespējamo ietekmi uz aļģu augšanu vai testa šķīdumu sastāvu.

15.

Parasti testēšanā izmantojamie trauki ir stikla kolbas, kam jābūt pietiekami lielām, lai nodrošinātu kultūrām tilpumu, kas nepieciešams mērījumiem testēšanas laikā, kā arī pietiekamu CO2 masas pārnesi no atmosfēras (sk. 30. punktu). Jāņem vērā, ka šķidruma tilpumam ir jābūt pietiekamam, lai veiktu analītisko noteikšanu (sk. 37. punktu).

16.

Turklāt var būt nepieciešams turpmāk minētais aprīkojums vai tā daļa:

17.

Var izmantot vairākas brīvi dzīvojošu mikroskopisko aļģu un zilaļģu sugas. Ir pierādīta 2. papildinājumā uzskaitīto celmu piemērotība izmantošanai šajā metodē norādītajai testēšanas procedūrai.

18.

Izmantojot citas sugas, norāda celmu un/vai tā izcelsmi. Jāpārliecinās, ka visā testēšanas periodā noteiktajos apstākļos var nodrošināt izraudzīto testa aļģu eksponenciālu augšanu.

19.

Ieteicams izmantot divas alternatīvas barotnes: ESAO un AAP barotnes. Šo barotņu sastāvs norādīts 3. papildinājumā. Jāievēro, ka sākotnējais pH un buferspēja (spēja uzturēt nemainīgu pH) abām barotnēm ir atšķirīga. Tāpēc testu rezultāti var atšķirties atkarībā no tā, kāda barotne ir izmantota, jo īpaši tad, kad tiek testētas ķīmiskās vielas, kas jonizējas.

20.

Barotnes var būt nepieciešams modificēt noteiktiem mērķiem, piemēram, testējot metālus vai helātus veidojošas vielas vai arī veicot testēšanu pie dažādām pH vērtībām. Ja izmanto modificētas barotnes, tās sīki jāapraksta un lēmums jāpamato (3)(4).

21.

Testa kultūru sākotnējai biomasai ir jābūt vienādai visās testa kultūrās un pietiekami mazai, lai kultūra visu inkubācijas periodu varētu augt eksponenciāli, neiztērējot barības vielas. Sākotnējā biomasa, kas aprēķināta kā sausnas masa, nedrīkst pārsniegt 0,5 mg/l. Ir ieteicamas šādas šūnu sākotnējās koncentrācijas:

22.

Koncentrāciju diapazonu, kurā, visticamāk, rastos ietekme, var noteikt pēc diapazona noteikšanas testu rezultātiem. Pēdējam – galīgajam – testam jāizvēlas vismaz piecas koncentrācijas, kas sakārtotas ģeometriskā progresijā ar kvocientu, kas nepārsniedz 3,2. Testējamajām ķīmiskajām vielām, kuru koncentrācijas/reakcijas līkne ir lēzena, var būt pieļaujams augstāks kvocients. Koncentrāciju rindai būtu vēlams izraisīt aļģu augšanas ātruma inhibēšana diapazonā 5–75 %.

23.

Testēšanas plānā jāparedz katras testējamās koncentrācijas testēšana trijos replikātos. Ja NOEC noteikt nav nepieciešams, testēšanas plānu var mainīt, palielinot koncentrāciju skaitu un samazinot katras koncentrācijas replikātu skaitu. Kontrolgrupai nepieciešami vismaz trīs replikāti, bet ideāli to skaitam ir jābūt divas reizes lielākam par katra testējamās koncentrācijas varianta replikātu skaitu.

24.

Var sagatavot atsevišķu testa šķīdumu kopumu testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju analītiskai noteikšanai (sk. 36. un 38. punktu).

25.

Ja testējamās vielas šķīdināšanai lieto šķīdinātāju, testēšanas plānā iekļauj papildu kontrolgrupu, kas satur šķīdumu tādā pašā koncentrācijā, kāda izmantota testa kultūrām.

26.

Lai testa aļģes pielāgotu testēšanas apstākļiem un nodrošinātu, ka testa šķīdumu inokulācijai izmantotās aļģes atrodas eksponenciālās augšanas fāzē, 2–4 dienas pirms testa sākuma testēšanas barotnē sagatavo inokulācijas kultūru. Aļģu biomasa ir jākoriģē, lai līdz testa sākumam inokulācijas kultūrā notiktu eksponenciāla augšana. Inokulācijas kultūru inkubē tādos pašos apstākļos kā testa kultūras. Lai pārliecinātos, ka testa celms kultivēšanas apstākļos aug normāli, izmēra inokulācijas kultūras biomasas pieaugumu. Aļģu kultūru audzēšanas piemērs izklāstīts 4. papildinājumā. Lai izvairītos no šūnu vienlaicīgas dalīšanās testēšanas laikā, var būt nepieciešams veikt otro inokulācijas kultūras pavairošanas posmu.

27.

Visos testa šķīdumos jābūt vienādai augšanas barotnes un testa aļģu biomasas sākotnējai koncentrācijai. Testa šķīdumus izraudzītajās koncentrācijās parasti sagatavo, samaisot testējamās ķīmiskās vielas izejšķīdumu ar augšanas barotni un inokulācijas kultūru. Izejšķīdumu parasti gatavo, izšķīdinot ķīmisko vielu testēšanas barotnē.

28.

Šķīdinātājus, piemēram, acetonu, t-butilspirtu un dimetilformamīdu, var izmantot par nesējiem, ar ko testēšanas barotnei pievienot ķīmiskās vielas ar vāju šķīdību ūdenī (2)(3). Šķīdinātāja koncentrācija nedrīkst pārsniegt 100 μl/l, un visām testa sērijas kultūrām (tostarp kontrolgrupām) šķīdinātājs jāpievieno vienādā koncentrācijā.

29.

Testa traukus noslēdz ar gaisu caurlaidīgiem aizbāžņiem. Traukus sakrata un ievieto kultivēšanas aparātā. Testēšanas laikā aļģes jātur suspensijā un jāveicina CO2 pārnese. Šim nolūkam jāizmanto pastāvīga kratīšana vai maisīšana. Kultūras uztur temperatūrā no 21 līdz 24 °C, temperatūru kontrolējot ar ± 2 °C precizitāti. Tām sugām, kas nav ietvertas 2. papildinājumā, piemēram, tropu sugām, var būt piemērota augstāka temperatūra ar nosacījumu, ka var nodrošināt derīguma kritērijus. Kolbas ir ieteicams izvietot nejaušā secībā un katru dienu mainīt to stāvokli inkubatorā.

30.

Kontrolgrupas barotnē testēšanas laikā pH nedrīkst palielināties par vairāk nekā 1,5 vienībām. Metāliem un ķīmiskajām vielām, kas daļēji jonizējas pie testēšanas apstākļiem tuva pH, var būt nepieciešams ierobežot pH izmaiņas, lai iegūtu reproducējamus un skaidri noteiktus rezultātus. Tehniski ir iespējams nodrošināt, ka pH izmaiņas nesasniedz 0,5 vienības, nodrošinot atbilstošu CO2 masas pārneses ātrumu no apkārtējā gaisa testa šķīdumā, piemēram, palielinot kratīšanas ātrumu. Cita iespēja ir aļģēm nepieciešamā CO2 daudzuma samazināšana, samazinot sākotnējo biomasu vai saīsinot testēšanas laiku.

31.

Virsmai, uz kuras kultūras inkubē, ir jāsaņem pastāvīgs, vienmērīgs fluorescents apgaismojums, piemēram, “vēsi balts” vai “dienasgaismas”. Zaļaļģu un ciānbaktēriju celmu gaismas prasības ir atšķirīgas. Gaismas intensitāte ir jāizvēlas atbilstoši izmantotajam testa organismam. Ieteiktajām zaļaļģu sugām gaismas intensitātei testa šķīduma līmenī jābūt diapazonā no 60 līdz 120 μE · m– 2 ·s – 1, to ar piemērotu uztvērēju mērot fotosintētiski efektīvajā viļņu garumu diapazonā no 400 līdz 700 nm. Dažas sugas, jo īpaši Anabaena flos-aquae, labi aug zemākā gaismas intensitātē, un pārāk intensīvs apgaismojums radīt bojājumus. Šādām sugām vidējā gaismas intensitāte būtu jāizvēlas diapazonā no 40 līdz 60 μE·m– 2 · s– 1. (Gaismas mērinstrumentiem, kas kalibrēti luksos, vēsi baltās gaismas ekvivalents diapazonā no 4 440 līdz 8 880 lx aptuveni atbilst ieteiktajai gaismas intensitātei 60-120 μE·m– 2 · s– 1.) Gaismas intensitāte jāuztur ± 15 % robežās no gaismas vidējās intensitātes inkubācijas zonā.

32.

Testēšanas ilgums parasti ir 72 stundas. Tomēr var izmantot īslaicīgāku vai ilglaicīgāku testēšanu – ar nosacījumu, ka var izpildīt visus 11. punktā minētos derīguma kritērijus.

33.

Aļģu biomasa katrā kolbā testēšanas laikā jānosaka vismaz vienu reizi dienā. Ja mērījumus veic, izmantojot no testa šķīduma ar pipeti ņemtus nelielus tilpumus, tos nedrīkst aizstāt.

34.

Biomasu mēra, manuāli skaitot šūnas ar mikroskopu vai izmantojot daļiņu elektronisko skaitītāju (pēc šūnu skaita un/vai biotilpuma). Ja var pierādīt apmierinošu korelāciju starp mērījumu rezultātiem un biomasu visā biomasas diapazonā, kas paredzama testēšanas laikā, var izmantot alternatīvas metodes, piemēram, plūsmas citometrisko analīzi, in vitro vai in vivo hlorofila fluorescences (5)(6) vai optiskā blīvuma metodi.

35.

Testēšanas sākumā un beigās ir jāizmēra šķīdumu pH.

36.

Ja ir pieejama analītiskā metode testējamās ķīmiskās vielas noteikšanai izmantotajā koncentrāciju diapazonā, jāanalizē testa šķīdumi, lai verificētu to sākotnējās koncentrācijas un ekspozīcijas koncentrāciju uzturēšanu testēšanas laikā.

37.

Var būt pietiekami testēšanas sākumā un beigās analizēt testējamās vielas augstu un zemu koncentrāciju un koncentrāciju ap paredzamo EC50, ja ir paredzams, ka ekspozīcijas koncentrācijas testēšanas laikā mainīsies ne vairāk kā par 20 % nominālās vērtības. Ja ir maz ticams, ka koncentrācijas saglabāsies 80–120 % diapazonā no sākotnējās koncentrācijas, ir ieteicams veikt visu testa koncentrāciju analīzi testēšanas sākumā un beigās. Gaistošām, nestabilām vai izteikti adsorbējošām testējamajām ķīmiskajām vielām ekspozīcijas laikā ik pēc 24 stundām ieteicams ņemt papildu paraugus analīzei, lai labāk konstatētu testējamās ķīmiskās vielas zudumu. Šīm ķīmiskajām vielām var būt nepieciešami papildu replikāti. Visos gadījumos testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas ir jānosaka tikai vienā katras pārbaudāmās koncentrācijas replikāta traukā (vai pēc replikāta apvienoto trauku saturam).

38.

Testa vide, kas sagatavota īpaši ekspozīcijas koncentrācijas analīzei, testēšanas laikā jāapstrādā tieši tāpat kā vide, ko izmanto testēšanai, t. i., aļģu uzsēšana un inkubācija jāveic identiskos apstākļos. Ja ir nepieciešama izšķīdušās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas analīze, var būt nepieciešams atdalīt aļģes no to barotnes. Atdalīšanu ieteicams veikt centrifūgā pie relatīvi neliela paātrinājuma, kas ir pietiekams aļģu izgulsnēšanai.

39.

Ja ir pierādījumi, ka testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija visā testa laikā ir apmierinoši uzturēta ± 20 % robežās no nominālās vai izmērītās sākotnējās koncentrācijas, tad rezultātu analīzes pamatā var būt nominālās vai izmērītās sākotnējās vērtības. Ja novirze no nominālās vai izmērītās sākotnējās koncentrācijas nav ± 20 % diapazonā, rezultātu analīzes pamatā jābūt koncentrācijas vidējai ģeometriskajai vērtībai ekspozīcijas laikā vai modeļiem, kas raksturo testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas samazināšanos (3)(7).

40.

Aļģu augšanas inhibēšanās tests ir dinamiskāka testa sistēma nekā lielākā daļa citu īslaicīgo testu, ko izmanto toksiskuma noteikšanai ūdens vidē. Tāpēc var būt grūti noteikt reālās ekspozīcijas koncentrācijas, jo īpaši adsorbējošām ķīmiskajām vielām, ko testē zemās koncentrācijās. Šādā gadījumā testējamās ķīmiskās vielas izzušana no šķīduma, adsorbējoties pieaugošajā aļģu biomasā, nenozīmē tās izzušanu no testa sistēmas. Analizējot testa rezultātus, jāpārbauda, vai testēšanas gaitā līdz ar testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas pazemināšanos samazinās arī augšanas inhibēšanās. Ja tā notiek, var piemērot atbilstošu modeli, kas raksturo testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas samazināšanos (7). Ja ne, rezultātu analīzei var izmantot sākotnējās (nominālās vai izmērītās) koncentrācijas.

41.

Lai pārliecinātos par inokulācijas kultūras normālu un veselīgu izskatu, kā arī konstatētu visas aļģu izskata anomālijas (ko var izraisīt eksponēšana testējamai ķīmiskajai vielai), testa beigās jāveic izmeklējumi ar mikroskopu.

42.

Noteiktos apstākļos, piemēram, ja sākotnējais tests liecina, ka testējamajai ķīmiskajai vielai nav toksiskas ietekmes koncentrācijās līdz 100 mg/l vai līdz šķīdības robežai testēšanas barotnē (atkarībā no tā, kura no vērtībām ir mazāka), var veikt robežtestu, kurā salīdzina reakciju kontrolgrupā un vienā apstrādātajā grupā (100 mg/l vai koncentrācija, kas vienāda ar šķīdības robežu). Noteikti ieteicams, ka to apstiprina ekspozīcijas koncentrācijas analīze. Uz robežtestu attiecas visi iepriekš aprakstītie testēšanas nosacījumi un derīguma kritēriji, izņemot to, ka jābūt vismaz sešiem apstrādes replikātiem. Kontrolgrupu un apstrādes grupu atkarīgos mainīgos var analizēt, ar statistisku testu, piemēram, Stjūdenta t-testu (Student t-test) salīdzinot vidējās vērtības. Ja abu grupu dispersijas nav vienādas, jāveic atšķirīgām dispersijām pielāgots t-tests.

43.

Biomasu testa traukos var izteikt mērījumam izmantotā aizstājējparametra vienībās (piemēram, kā šūnu skaitu, fluorescenci).

44.

Lai iegūtu augšanas grafikus, tabulas veidā apkopo datus par biomasas koncentrācijām testa kultūrās un kontrolgrupās, kā arī testējamās vielas koncentrācijām un mērījumu laikiem, ko reģistrē ar precizitāti vismaz līdz veselām stundām. Šajā pirmajā posmā var būt noderīgas gan logaritmiskās, gan lineārās skalas, taču logaritmisko skalu izmantošana ir obligāta un tās kopumā labāk attēlo augšanas norises izmaiņas testēšanas laikā. Jāņem vērā, ka eksponenciāla augšana, attēlota logaritmiskā skalā, rada taisnu līniju un tās slīpums (virziena koeficients) norāda specifisko augšanas ātrumu.

45.

Izmantojot grafikus, pārbauda, vai kontrolgrupas kultūras visā testēšanas laikā eksponenciāli aug gaidāmajā ātrumā. Kritiski izvērtē visus datu punktus un grafiku izskatu, un pārbauda, vai izejas datos un procedūrās nav kļūdu. Īpašu uzmanību pievērš visiem datu punktiem, kuru šķietamā novirze sasniedz sistemātiskās kļūdas lielumu. Ja acīmredzami var konstatēt procedūrā pieļautas kļūdas vai ir ļoti iespējams, ka tādas varētu būt, attiecīgo datu punktu atzīmē kā anomālu un turpmākajā statistiskajā analīzē neiekļauj. (Ja aļģu koncentrācija vienā no diviem vai trim varianta replikātu traukiem atbilst nullei, tas, iespējams, norāda, ka trauki nav pareizi uzsēti vai nav bijuši pienācīgi iztīrīti). Testēšanas pārskatā skaidri norāda datu punkta noraidīšanas iemeslus. Pieņemami iemesli ir tikai (reti) kļūdas procedūrā un nevis vienkārši zema precizitāte. Datu statistiskās apstrādes procedūras anomālo vērtību identificēšanai šā tipa problēmām ir izmantojamas ierobežoti, un tās nevar aizstāt eksperta vērtējumu. Anomālās vērtības (atbilstoši identificētas) ieteicams atstāt starp grafikos vai tabulās attēlotajiem datu punktiem.

46.

Testa mērķis ir novērtēt testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz aļģu augšanu. Šajā testēšanas metodē ir iekļauti divu atkarīgo mainīgo apraksti, jo dažādās jurisdikcijās ir priekšroku dod atšķirīgām pieejām un ir atšķirīgas regulējuma vajadzības. Lai testēšanas rezultāti būtu pieņemami visās jurisdikcijās, ietekme ir jāizvērtē, izmantojot abus turpmāk aprakstītos atkarīgos mainīgos – a) un b).

a)    Vidējais specifiskais augšanas ātrums : šo atkarīgo mainīgo aprēķina, pamatojoties uz biomasas logaritmisko pieaugumu testēšanas laikā, un tā mērvienība ir biomasas pieaugums dienā.

b)    Ražība : šis atkarīgais mainīgais ir testēšanas beigu biomasa, no kā atņemta testēšanas sākuma biomasa.

47.

Jānorāda, ka toksiskuma vērtības, kas aprēķinātas, izmantojot šos abus atkarīgos mainīgos, nav savstarpēji salīdzināmas, un šī atšķirība jāapzinās, izmantojot testa rezultātus. Tā kā katras pieejas matemātiskais pamats ir atšķirīgs, tad, ja būs ievēroti šīs testa metodes testa nosacījumi, ECx vērtības, kuru pamatā ir vidējais specifiskais augšanas ātrums (ErCx), kopumā būs augstākas nekā rezultāti, kuru pamatā ir ražība (EyCx). To nedrīkst interpretēt kā šo abu iegūto parametru jutības atšķirību; šīs vērtības vienkārši ir matemātiski atšķirīgas. Vidējā specifiskā augšanas ātruma koncepcijas pamatā ir aļģu vispārējais eksponenciālās augšanas modelis kultūrās, kuru augšanu neierobežo; toksiskumu tajās aplēš pēc ietekmes uz augšanas ātrumu neatkarīgi no kontrolgrupas absolūtā specifiskā augšanas ātruma līmeņa, koncentrācijas–atbildreakcijas līknes virziena koeficienta vai testa ilguma. Savukārt rezultāti, kuru pamatā esošais atkarīgais mainīgais ir ražība, ir atkarīgi no visiem citiem minētajiem mainīgajiem. EyCx ir atkarīgs no katrā testā iekļauto aļģu sugu vidējā specifiskā augšanas ātruma un no maksimālā specifiskā augšanas ātruma, kas var būt atšķirīgs ne tikai katrai sugai, bet arī dažādiem aļģu celmiem. Šo atkarīgo mainīgo nevajadzētu izmantot, lai salīdzinātu dažādu aļģu sugu vai pat atšķirīgu celmu jutību pret toksikantiem. Kaut arī zinātnē priekšroku dod toksiskuma noteikšanai pēc vidējā specifiskā augšanas ātruma, lai apmierinātu dažu valstu pašreizējās regulatīvās prasības, šajā testēšanas metodē ir ietverta arī toksiskuma noteikšana pēc ražības.

48.

Konkrēta perioda vidējo specifisko augšanas ātrumu aprēķina saskaņā ar vienādojumu kā biomasas logaritmisko pieaugumu katram kontrolgrupas un apstrādes traukam [1]:

kur:

Katrā apstrādes grupā un kontrolgrupā aprēķina vidējo augšanas ātrumu un aplēš dispersiju.

49.

Visa testēšanas laika (parasti no 0. līdz 3. dienai) vidējo specifisko augšanas ātrumu aprēķina, par sākotnējo vērtību izmantojot nominālo uzsēto biomasu, nevis izmērīto sākotnējo vērtību, jo šādi parasti var panākt lielāku precizitāti. Ja biomasas mērīšanā izmantotais aprīkojums (piemēram, plūsmas citometrs) ļauj pietiekami precīzi noteikt mazo inokulācijas biomasu, var izmantot izmērīto sākotnējo biomasas koncentrāciju. Jānovērtē arī katra posma augšanas ātrums, ko aprēķina kā katras testēšanas dienas vidējo specifisko augšanas ātrumu (0.–1. diena, 1.–2. diena un 2.–3. diena) un jānoskaidro, vai kontrolgrupas augšanas ātrums saglabājas nemainīgs (sk. derīguma kritērijus, 11. punkts). Par vidējo kopējo specifisko augšanas ātrumu būtiski zemāks specifiskais augšanas ātrums pirmajā dienā var liecināt par kultūras atrašanos kavējuma fāzē, kurā tā attīstās lēni. Ja kontrolgrupas kultūrās kavējuma fāzi var saīsināt vai pat novērst, veicot pareizu mātes kultūras pavairošanu, eksponētajās kultūrās kavējuma fāze var liecināt par reģenerāciju pēc sākotnējā toksiskā stresa vai samazinātu ekspozīciju testējamās ķīmiskās vielas zuduma dēļ (tostarp sorbciju pie aļģu biomasas) pēc sākotnējās ekspozīcijas. Tādēļ var veikt augšanas ātruma novērtējumu pa posmiem, lai novērtētu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi ekspozīcijas laikā. Vidējā augšanas ātruma būtiskas atšķirības no individuālo posmu augšanas ātruma liecina par novirzi no konstantas eksponenciālas augšanas un to, ka rūpīgi jāanalizē augšanas līknes.

50.

Katram apstrādes replikāta augšanas ātruma procentuālo inhibēšanos aprēķina saskaņā ar vienādojumu [2]:

kur:

51.

Ja testa šķīdumu gatavošanai lieto šķīdinātājus, inhibēšanās procentu aprēķināšanā jāizmanto nevis kontrolgrupas bez šķīdinātājiem, bet gan kontrolgrupas ar šķīdinātājiem.

52.

Ražību aprēķina, no testa beigu biomasas atņemot testa sākuma biomasu katram kontrolgrupas un apstrādes traukam. Katrai testa koncentrācijai un kontrolgrupai jāaprēķina ražības vidējā vērtība, kā arī jānosaka dispersija. Ražības procentuālo inhibēšanos ( %Iy) katram apstrādes replikātam var aprēķināt šādi:

kur:

53.

Procentuālā inhibēšanās jāattēlo grafiski attiecībā pret testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas logaritmu un grafiks sīki jāizpēta, ignorējot tos datu punktus, kas pirmajā posmā tikuši atlasīti kā anomālas vērtības. Lai gūtu pirmo iespaidu par koncentrācijas–atbildreakcijas sakarību, manuāli vai ar datorizētu interpolāciju jānovelk gluda līnija caur datu punktiem, bet turpmāk jāizmanto detalizētāka metode, vēlams – datorizēta statistiskas metode. Atkarībā no tā, kādam nolūkam datus paredzēts izmantot, kāda ir datu kvalitāte (precizitāte) un apjoms un kāda ir datu analīzes instrumentu pieejamība, var nolemt (un dažkārt ir pilnīgi pamatoti) šajā posmā datu analīzi izbeigt un vienkārši nolasīt galvenos rādītājus EC50 un EC10 (un/vai EC20) no vizuāli piemeklētas līknes (sk. arī sadaļu par stimulējošo iedarbību). Iemesli, kas attaisno statistiskās metodes neizmantošanu ir, piemēram:

54.

Mērķis ir regresijas analīzē iegūt kādu kvantitatīvu koncentrācijas–atbildreakcijas sakarību. Kad atbildreakcijas dati linearizējoši transformēti probita, logita vai Veibula vienībās (8), iespējams izmantot svērtu lineāro regresiju, tomēr priekšroku mēdz dot nelineārām regresijas procedūrām, jo tajās vieglāk tikt galā ar neizbēgamajām datu anomālijām un novirzēm no gludiem sadalījumiem. Ja inhibēšanās vai nu tuvojas nullei, vai ir pilnīga, transformācija var šādas anomālijas samilzināt, jūtami sagrozot analīzes rezultātus (8). Būtu jāatceras, ka analīzes standartmetodes, kurās izmanto probita, logita vai Veibula transformācijas, ir domātas darbam ar binārajiem datiem (piem., izdzīvošanas/neizdzīvošanas datiem) un, lai tās būtu izmantojamas darbam ar augšanas vai biomasas datiem, tās jāmodificē. Īpašas metodes ECx vērtību noteikšanai no bezpārtraukumu datiem ir izklāstītas (9), (10) un (11) avotā. Nelineārās regresijas analīze sīkāk aprakstīta 5. papildinājumā.

55.

Lai aplēstu ECx punktveida vērtības, katram analizējamajam atkarīgajam mainīgajam jāizmanto koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība. Ja iespējams, katrai aplēstajai vērtībai jānosaka 95 % ticamības robeža. Iegūto datu atbilstība regresijas modelim jānovērtē grafiski vai statistiski. Regresijas analīze jāveic, izmantojot katrā atsevišķā replikātā iegūtās atbildreakcijas vērtības, nevis apstrādes variantu grupu vidējās vērtības. Ja tomēr nelineārās līknes pielāgošana ir sarežģīta vai to nav iespējams veikt, jo datu izkliede ir pārāk liela, šo problēmu var apiet, veicot grupas vidējo rādītāju regresiju, praktiski samazinot anomālo vērtību ietekmi. Testēšanas pārskatā jānorāda, ka izmantota šī iespēja – novirze no parastās procedūras –, jo līknes pielāgošana atsevišķu replikātu vērtībām nav sniegusi labu rezultātu.

56.

EC50 aplēses un ticamības robežas var noteikt, arī izmantojot lineāro interpolāciju ar “bootstrapping” metodi (13), ja pieejamie regresijas modeļi/metodes nav piemērotas datiem.

57.

LOEC un tādējādi NOEC aplēšanai, lai noskaidrotu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz augšanas ātrumu, ir nepieciešams salīdzināt apstrādes replikātu vidējās vērtības, izmantojot dispersijas analīzes (ANOVA) metodes. Katras koncentrācijas vidējā vērtība jāsalīdzina ar kontrolgrupas vidējo vērtību, izmantojot atbilstošu multiplās salīdzināšanas vai trenda testa metodi. Iespējams, būs noderīgs Daneta [Dunnett] vai Viljamsa [Williams] tests (12)(14)(15)(16)(17). Jānovērtē, vai ir spēkā pieņēmums par dispersijas homogenitāti, kas ir ANOVA pamatā. Šo novērtējumu var veikt grafiski vai izmantojot formālu testu (17). Piemērots ir Levena [Levene] vai Bārtleta [Bartlett] tests. Dispersijas homogenitātes pieņēmuma neatbilstību dažkārt var koriģēt, izmantojot datu logaritmisko transformāciju. Ja dispersijas heterogenitāte ir pārlieku liela un to nevar koriģēt ar transformāciju, jāveic analīze ar tādām metodēm kā descendents Džonkhīra [Jonckheere] trenda tests. Papildu norādījumus par NOEC noteikšanu sk. (11).

58.

Jaunākie sasniegumi zinātnē ir bijuši par pamatu ieteikumam atteikties no NOEC jēdziena un aizstāt to ar ECx punktveida vērtību aplēsanu ar regresiju. Šim aļģu testam nav noteikta piemērota x vērtība. Piemērots šķiet diapazons no 10 līdz 20 % (atkarībā no izraudzītā atkarīgā mainīgā), un ieteicams pārskatā iekļaut gan EC10, gan EC20.

59.

Dažkārt zemās koncentrācijās novēro augšanas stimulāciju (negatīvu inhibēšanos). To var radīt vai nu hormēze (“toksiskā stimulācija”), vai augšanu veicinošu faktoru pievienošana izmantotajai minimālajai barotnei ar testējamo vielu. Jāņem vērā, ka neorganisko barības vielu pievienošanai navajadzētu atstāt tiešu ietekmi, jo testēšanas barotnē visā testa laikā ir jābūt barības vielu pārpalikumam. Mazu stimulācijas devu EC50 aprēķinos parasti var neņemt vērā, ja vien stimulācija nav ārkārtēja. Tomēr, ja tā ir ārkārtēja vai ir jāaprēķina ECx lielums zemam x, var būt nepieciešamas īpašas metodes. Ja iespējams, no datu analīzes nevajadzētu izslēgt stimulējošas reakcijas, un, ja ar izmantojamo līknes piemeklēšanas programmatūru nav iespējams akceptēt nelielu stimulāciju, var izmantot lineāro interpolāciju ar “bootstrapping”. Ārkārtējas stimulācijas gadījumā var apsvērt hormēzes modeļa izmantošanu (18).

60.

Gaismu absorbējoši testa materiāli var samazināt augšanas ātrumu, jo noēnojums samazina pieejamās gaismas daudzumu. Šāda fiziskā ietekme ir jānodala no toksiskās ietekmes, modificējot testa apstākļus, un fiziskā ietekme ir jānorāda atsevišķi. Norādījumi ir pieejami (2) un (3).

61.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj turpmāk norādītā informācija.

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442 Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 209 (2010. gads). Šī testa metode raksturo metodi, ar kuru nosaka ķīmisku vielu iedarbību uz aktīvo dūņu sastāvā esošajiem mikroorganismiem (lielākoties baktērijām), noteiktajos apstākļos mērot to elpošanas ātrumu (oglekļa un/vai amonija oksidēšanos) dažādās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijās. Testēšanas metodes pamatā ir ETAD (Krāsvielu ražošanas nozares ekoloģijas un toksiskuma asociācija (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry)) tests (1)(2), kādreizējie ESAO Testēšanas norādījumi 209 (3) un pārskatītais ISO standarts 8192 (4). Šīs metodes mērķis ir nodrošināt ātru skrīninga metodi, ar ko iespējams novērtēt ķīmisku vielu ietekmi uz aktīvo dūņu mikroorganismiem bioloģiskās (aerobās) stadijas notekūdeņu attīrīšanas iekārtās. Šā testa rezultāti var kalpot kā rādītājs piemērotu augšanu neinhibējošu testējamo ķīmisko vielu koncentrāciju izmantošanai bionoārdīšanās testos (piemēram, šā pielikuma C.4. A-F, C.9., C.10., C12. un C.29. nodaļa, ESAO TG302C). Šādā gadījumā testu var veikt kā skrīninga testu, kas ir līdzvērtīgs diapazona atrašanas vai robežtestam (sk. 39. punktu), ņemot vērā tikai vispārējo elpošanu. Tomēr tādos vieglas bionoārdīšanās spējas testos (šā pielikuma C.4. A-F un C.29. nodaļa), kuros inokulāta koncentrācija ir ievērojami zemāka nekā šajā testēšanas metodē, šī informācija būtu jāizmanto uzmanīgi. Neinhibēšanās šajā elpošanas testā automātiski nenozīmē, ka šā pielikuma C.4. A-F vai C.29. nodaļā minētajos vieglas bionoārdīšanas spējas testos būs neinhibējoši apstākļi.

2.

Kopumā šķiet, ka elpošanas inhibēšanās tests ticis veiksmīgi izmantots kopš tā pirmās publicēšanas, tomēr dažos gadījumos ir ziņots par maldīgiem rezultātiem, piemēram, (2)(4)(5). Dažkārt konstatēts, ka ar koncentrāciju saistītās elpošanas līknes ir divfāzu, devas un atbildreakcijas grafiki ir deformēti un EC50 vērtības ir neparedzēti zemas (5). Pētījumi liecina, ka šādus rezultātus iegūst tad, ja testā izmantotās aktīvās dūņas ievērojami nitrificējas un testējamai ķīmiskajai vielai ir lielāka ietekme uz amonija oksidēšanos nekā uz vispārējo heterotrofo oksidēšanos. Tāpēc šādu maldīgu rezultātu iegūšanu var novērst, veicot papildu testēšanu ar īpašu nitrifikācijas inhibitoru. Kopējo, heterotrofisko un nitrifikācijas skābekļa uzņemšanas ātrumu atsevišķi var aprēķināt (4)(7)(8), izmērot skābekļa uzņemšanas ātrumu gan šāda inhibitora, piemēram, N-allylthiourea (ATU) klātbūtnē, gan bez tā. Tādējādi var noteikt testējamās ķīmiskās vielas inhibējošo ietekmi uz abiem procesiem un parastajā veidā aprēķināt EC50 vērtības gan organiskā oglekļa oksidācijai (heterotrofijai), gan amonija oksidācijai (nitrifikācijai). Jānorāda, ka dažos retos gadījumos N-allylthiourea inhibējošā ietekme var būt daļēji vai pilnīgi apturēta, jo tas veido kompleksus ar testējamajām ķīmiskajām vielām vai barotnes bagātinātājiem, piemēram, Cu++ joniem (6). Cu++ joni ir būtiski Nitrosomonas baktērijām, bet lielākā koncentrācijā tie toksiski.

3.

Pēdējā laikā jo īpaši Eiropas valstīs aktuāla ir kļuvusi notekūdeņu aerobai apstrādei vajadzīgā nitrifikācija, kas ir nepieciešams posms, kurā atbrīvojas no slāpekļa savienojumiem notekūdeņos, denitrificējot to gāzveida produktos; tagad ES ir noteiktas zemākas slāpekļa koncentrācijas robežvērtības apstrādātajiem efluentiem, kas tiek novadīti saņēmējā ūdensobjektā. (5)

4.

Vairumā gadījumu ar šo metodi var pienācīgi novērtēt ietekmi uz organiskā oglekļa oksidēšanās procesiem. Tomēr dažos gadījumos, lai izprastu ietekmi un interpretētu rezultātus, var būt nepieciešama tikai nitrifikācijas ietekmes pārbaude vai atsevišķi gan nitrifikācijas, gan organiskā oglekļa oksidācijas pārbaude.

5.

Elpošanas ātrumu mērkivetē ar skābekļa elektrodu, kurā atrodas aktīvo dūņu paraugs, kam ir pievienoti sintētiskie notekūdeņi, mēra pēc trīs stundu ekspozīcijas perioda. Izvērtējot reālo ekspozīcijas scenāriju, var konstatēt, ka piemērots būtu ilgāks ekspozīcijas periods. Ja testējamā viela strauji degradējas, piemēram, abiotiski (hidrolīze), vai ir gaistoša un koncentrāciju nevar pienācīgi uzturēt, līdztekus var izmantot īsāku ekspozīcijas periodu, piemēram, 30 minūtes. Katras aktīvo dūņu partijas jutību ekspozīcijas dienā pārbauda ar piemērotu ķīmisko standartvielu. Testu parasti izmanto, lai noteiktu testējamās ķīmiskās vielas ECx (piemēram, EC50) un/vai nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC).

6.

To, kādā mērā skābeļa uzņemšanu inhibē mikroorganismi, kuri oksidē organisko oglekli, var izteikt atsevišķi no tā, kā to kavē mikroorganismi, kas oksidē amoniju, mērot skābekļa uzņemšanu N-allylthiourea klātbūtnē un bez tā; N-allylthiourea ir specifisks inhibitors, kas inhibē amonija oksidāciju par nitrītu pirmās stadijas nitrificējošo baktēriju ietekmē. Šajā gadījumā procentuālo skābekļa uzņemšanas inhibēšanos aprēķina, skābekļa uzņemšanas rādītāju testējamās vielas klātbūtnē salīdzinot ar vidējo skābekļa uzņemšanas ātrumu attiecīgajās kontrolgrupās, kas nesatur testējamo vielu – gan specifiskā inhibitora N-allylthiourea klātbūtnē, gan bez tā.

7.

Jebkuru skābekļa uzņemšanu abiotiskos procesos var detektēt, nosakot tās rādītāju testējamās ķīmiskās vielas, sintētisko notekūdeņu barotnes un ūdens maisījumos, kas neietver aktīvās dūņas.

8.

Lai varētu pareizi interpretēt rezultātus, ir nepieciešama informācija par testējamās ķīmiskās vielas identifikāciju (vēlams CAS numurs), nosaukums (IUPAC), tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, tvaika spiediens, gaistamība un adsorbcijas spēja. Parasti gaistošas ķīmiskās vielas nav iespējams adekvāti testēt, ja vien netiek ievēroti īpaši nosacījumi (sk. 21. punktu).

9.

Šo testēšanas metodi var izmantot ūdenī šķīstošām, mazšķīstošām un gaistošām ķīmiskām vielām. Tomēr ne vienmēr ir iespējams iegūt EC50 vērtības tādām ķīmiskajām vielām, kuru šķīdība ir ierobežota, bet ticamus rezultātus gaistošām ķīmiskām vielām var iegūt vienīgi tad, ja ekspozīcijas perioda(-u) beigās reakcijas maisījumā ir palikusi lielākā daļa testējamās ķīmiskās vielas (piemēram, > 80 %). Ja ir kāda neskaidrība par testējamās ķīmiskās vielas stabilitāti vai tās gaistamību, jāiesniedz papildu analītiskie pamatojuma dati, lai precizētu ECx koncentrāciju.

10.

Ķīmiskās standartvielas ir regulāri jātestē, lai nodrošinātu, ka testēšanas metode un testa nosacījumi ir ticami, un lai ekspozīcijas dienā pārbaudītu katras par mikroorganismu inokulātu izmantotās aktīvo dūņu partijas jutību. Par standartinhibitoru ieteicams izmantot 3,5-dihlorfenolu (3,5-DCP), jo tas ir atzīts elpošanas inhibitors un tiek izmantots daudzos inhibīcijas/toksicitātes testu veidos (4). Arī vara (II) sulfāta pentahidrātu var izmantot par kopējās elpošanas inhibīcijas ķīmisko standartvielu (9). N-metilanilīnu var izmantot par specifisku nitrifikācijas standartinhibitoru (4).

11.

Tukšajās kontrolgrupās (bez testējamās ķīmiskās vielas vai ķīmiskās standartvielas) skābekļa uzņemšanas rādītājam nevajadzētu būt mazākam par 20 mg skābekļa uz vienu gramu aktīvo dūņu (suspendēto cietvielu daļiņu saussvars) stundā. Ja rādītājs ir mazāks, testēšana jāveic atkārtoti ar skalotām aktīvajām dūņām vai dūņām no cita avota. Skābekļa uzņemšanas rādītāja variācijas koeficients kontrolreplikātos galīgā testa beigās nedrīkst pārsniegt 30 %.

12.

2004. gadā ISO (4) rīkotajā starptautiskajā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā, kurā izmantoja aktīvās dūņas no sadzīves notekūdeņiem, 3,5-DCP EC50 tika konstatēts esam diapazonā no 2 mg/l līdz 25 mg/l kopējai elpošanai, no 5 mg/l līdz 40 mg/l heterotrofiskajai elpošanai un no 0,1 mg/l līdz 10 mg/l nitrifikācijas elpošanai. Ja 3,5-DCP EC50 neatrodas prognozētajā diapazonā, testēšana ir jāatkārto, izmantojot aktīvās dūņas no cita avota. Vara (II) sulfāta pentahidrāta EC50 būtu jābūt diapazonā no 53 līdz 155 mg/l kopējai elpošanai (9).

13.

Jāizmanto parastais laboratorijas aprīkojums un turpmāk minētais:

14.

Vienmēr jāizmanto analītiski tīri reaģenti.

15.

Parasti jāizmanto destilēts vai dejonizēts ūdens, kas satur mazāk nekā 1 mg/l IOO, izņemot gadījumus, ja ir norādīts, ka jāizmanto ūdensvada ūdens bez hlora.

16.

Barotne jāsagatavo tāda, lai tā saturētu turpmāk minētās sastāvdaļas norādītajos daudzumos:

17.

Šā šķīduma pH jābūt 7,5 ± 0,5. Ja sagatavoto barotni neizmanto uzreiz, tā jāuzglabā tumšā vietā temperatūrā no 0 °C līdz 4 °C ne ilgāk kā vienu nedēļu vai tādos apstākļos, kas neizraisa nekādas izmaiņas barotnes sastāvā. Jānorāda, ka šie sintētiskie notekūdeņi ir simtkārtīgs to notekūdeņu koncentrāts, kas aprakstīti ESAO 1976. gada 11. jūnija tehniskajā ziņojumā “Ieteicamā metode sintētiskajos mazgāšanas līdzekļos izmantoto virsmaktīvo vielu bioloģiskās noārdīšanās spējas noteikšanai” [Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents] un kam pievienots dikālija hidrogēnfosfāts.

18.

Pirms novietošanas glabāšanā barotnes sastāvdaļas var arī atsevišķi sterilizēt, vai arī peptonu un gaļas ekstraktu var pievienot tieši pirms testa sākuma. Pirms lietošanas barotni rūpīgi samaisa un, ja nepieciešams, koriģē pH līdz 7,5 ± 0,5.

19.

Ūdenī viegli šķīstošām testējamajām vielām izejšķīdums jāsagatavo tikai līdz maksimālajai šķīdībai ūdenī (nogulsnes nav pieļaujamas). Vielas, kas vāji šķīst ūdenī, maisījumi, kuru sastāvā ir vielas ar atšķirīgu šķīdību ūdenī un adsorbējošas vielas ir jāiesver tieši testēšanas traukos. Šajos gadījumos kā alternatīvu var izmantot izejšķīdumus, ja izšķīdinātās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas analītiski nosaka testēšanas traukos (pirms aktīvo dūņu pievienošanas). Ja tiek sagatavotas ūdensšķīduma frakcijas (water-accommodated fraction, WAF), svarīgi ir arī analītiski noteikt testējamās ķīmiskās vielas izšķīdinātās koncentrācijas testa traukos. Lietojot organiskos šķīdinātājus, ir jāizvairās uzlabot šķīdību ar disperģentiem/emulgatoriem. Ja ir pietiekami daudz informācijas par testējamās ķīmiskās vielas stabilitāti attiecīgajos apstākļos, var veikt izejšķīdumu un iepriekšējas maisīšanas suspensiju ultrasonikāciju, piemēram, pa nakti.

20.

Testējamā ķīmiskā viela var negatīvi ietekmēt testēšanas sistēmas pH. pH līmenis maisījumos, kas apstrādāti ar testējamo ķīmisko vielu, ir jānosaka iepriekšējā izmēģinājumā, pirms tiek uzsākta testēšana, lai noskaidrotu, vai pirms galvenās testēšanas, kā arī galvenās testēšanas dienā ir nepieciešams veikt pH korekciju. Ja nepieciešams, testējamās ķīmiskās vielas šķīdumi/suspensijas ūdenī ir jāneitralizē pirms inokulāta pievienošanas. Tomēr, tā kā neitralizēšana var izmainīt ķīmiskās vielas ķīmiskās īpašības, atkarībā no pētījuma mērķa varētu veikt papildu testēsanu, lai noskaidrotu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz dūņām bez pH korekcijas.

21.

Gaistošu ķīmisko vielu toksiskās ietekmes līmeņi, jo īpaši testos, kuros caur sistēmu pūš gaisu, var būt nepastāvīgi vielas zuduma dēļ ekspozīcijas laikā. Attiecībā uz šādām vielām jāievēro piesardzība, veicot konkrēto vielu saturošu kontrolmaisījumu vielspecifisku analīzi un mainot aerācijas režīmu.

22.

Ja par ķīmisko standartvielu izmanto 3,5-dihlorfenolu, ir jāsagatavo (15) 1,00 g 3,5-dihlorofenola šķīdums 1 000 ml ūdens. Jāizmanto silts ūdens un/vai ultrasonikācija, lai paātrinātu izšķīšanu un panāktu vajadzīgo tilpumu, kad tas ir atdzisis līdz istabas temperatūrai. Tomēr ir jānodrošina, ka ķīmiskajā standartvielā nerodas strukturālas izmaiņas. Ir jāpārbauda šķīduma pH un, ja nepieciešams, tas jākoriģē ar NaOH vai H2SO4, līdz pH sasniedz 7–8.

23.

Ja par ķīmisko standartvielu izmanto vara (II) sulfāta pentahidrātu, tas jāizmanto koncentrācijās 58 mg/l, 100 mg/l un 180 mg/l (koeficients 1,8). Vielu iesver tieši testēšanas traukos (29 – 50 – 90 mg, lai sasniegtu 500 ml kopējo tilpumu). Pēc tam to atšķaida ar 234 ml autoklavēta ūdensvada ūdens. Vara (II) sulfāta pentahidrāts ir viegli šķīstošs. Sākot testēšanu, pievieno 16 ml sintētisko notekūdeņu un 250 ml aktīvo dūņu.

24.

Jāsagatavo 2,32 g/l N-allylthiourea (ATU) izejšķīduma. Pievienojot 2,5 ml izejšķīduma inkubācijas maisījumam, kura galīgais tilpums ir 500 ml, iegūst galīgo koncentrāciju 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l); ir zināms, ka tā ir pietiekama (4), lai panāktu nitrifikācijas 100 % inhibēšanos nitrificējošās aktīvajās dūņās, kas satur 1,5 g/l suspendētu cietvielu.

25.

Dažos retos apstākļos testējamā ķīmiskā viela ar stipra reducētāja īpašībām var izraisīt izmērāmu abiotisko skābekļa patēriņu. Šādos gadījumos ir nepieciešama abiotiskā kontrolgrupa, lai atšķirtu testējamās ķīmiskās vielas abiotisko skābekļa uzņemšanu un mikroorganismu elpošanu. Abiotiskās kontrolgrupas var sagatavot, nepievienojot testa maisījumiem inokulātu. Līdzīgi arī abiotiskās kontrolgrupas bez inokulāta var izmantot tad, kad tiek veikti analītiskie palīgmērījumi, lai noteiktu sasniegto koncentrāciju testēšanas ekspozīcijas posmā, piemēram, kad tiek izmantoti tādu ķīmisku vielu izejšķīdumi, kuras vāji šķīst ūdenī, kopā ar komponentiem, kam ir atšķirīga šķīdība ūdenī. Īpašos gadījumos var būt nepieciešams sagatavot abiotisku kontrolgrupu ar sterilizētu inokulātu (piemēram, autoklavējot vai pievienojot sterilizējošus toksikantus). Dažas ķīmiskas vielas var ražot vai patērēt skābekli tikai tad, ja virsmas laukums ir pietiekami liels reakcijai, pat ja parasti šādai reakcijai ir nepieciešama daudz augstāka temperatūra vai spiediens. Tāpēc īpaša vērība būtu jāpievērš peroksīdiem. Sterilizēts inokulāts nodrošina lielu virsmas laukumu.

26.

Vispārējai lietošanai aktīvās dūņas būtu jāsavāc no tādas labi pārvaldītas notekūdeņu attīrīšanas iekārtas aerācijas baseina izvadvietas, kurā galvenokārt attīra sadzīves notekūdeņus, vai pie tvertnes izvadvietas. Atkarībā no testa mērķa var izmantot arī citus piemērotus aktīvo dūņu veidus vai avotus, piemēram, var izmantot arī laboratorijā audzētas dūņas atbilstošās suspendēto cietvielu koncentrācijās no 2 g/l līdz 4 g/l. Tomēr dūņām no dažādām attīrīšanas iekārtām parasti ir atšķirīgas īpašības un jutība.

27.

Dūņas var izmantot tādas, kādas tās ir savāktas, tomēr rupjākās daļiņas būtu jānoņem, tās neilgu laiku, piemēram, 5 līdz 15 minūtes nostādinot un nolejot augšējo slāni ar smalkajām daļiņām vai izsijājot (piemēram, ar 1 mm2 acu sietu). Dūņas var arī aptuveni 15 sekundes vai ilgāk homogenizēt maisītājā, bet jāievēro piesardzība attiecībā uz bīdes spēkiem un temperatūras izmaiņām, kas var rasties, ilgstoši maisot.

28.

Bieži ir nepieciešama dūņu skalošana, piemēram, ja endogēnās elpošanas rādītājs ir zems. Dūņas vispirms nepieciešams kādu laiku centrifugēt, lai iegūtu dzidru virsējo slāni un notekūdeņu cietvielu granulas, piemēram, 10 minūtes ar apt. 10 000 m/s2 lielu paātrinājumu. Dzidro virsējo slāni izlej, bet dūņas atkārtoti suspendē nehlorētā ūdensvada ūdenī kratot; skalošanas ūdens pēc tam ir jāatdala, atkārtojot centrifugēšanu un izliešanu. Ja nepieciešams, skalošanu un centrifugēšanu atkārto. Atkārtoti jānosaka atkalsuspendēto dūņu zināma tilpuma sausmasa un dūņas jākoncentrē, nolejot šķidrumu vai tālāk jāatšķaida ar nehlorētu ūdensvada ūdeni, lai iegūtu nepieciešamo dūņu cietvielu koncentrāciju 3 g/l. Aktīvajām dūņām pastāvīgi veicama aerācija (piemēram, 2 l/minūtē) testa temperatūrā, un ja vien iespējams, tās jāizlieto savākšanas dienā. Ja tas nav iespējams, dūņām divas papildu dienas ik dienas jāpievada sintētiskie notekūdeņi (50 ml sintētisko notekūdeņi uz litru aktīvo dūņu). Pēc tam dūņas izmanto testā, un rezultātus uzskata par derīgiem, ja to aktivitātē nav radušās būtiskas izmaiņas, ko novērtē, izmērot to endogēno heterotrofo un nitrifikācijas elpošanas ātrumu.

29.

Var rasties grūtības, ja inkubācijas perioda laikā rodas putas tādā daudzumā, ka putas un uz tām esošās dūņu daļiņas tiek izvadītas no aerācijas tvertnēm. Reizēm putu cēlonis ir sintētisko notekūdeņu klātbūtne, bet, ja testējamā ķīmiskā viela ir virsmaktīva vai satur virsmaktīvas vielas, jāparedz, ka parādīsies putas. Dūņu daļiņu zudums no testa maisījumiem radīs mākslīgi pazeminātu elpošanas rādītāju, ko kļūdaini varētu interpretēt kā inhibīcijas rezultātu. Turklāt virsmaktīvā šķīduma aerācija koncentrē virsmaktīvo vielu putu slānī; tādēļ putu zudums no testēšanas sistēmas samazina ekspozīcijas koncentrāciju. Putas var kontrolēt ar vienkāršām mehāniskām metodēm (piemēram, neregulāra manuāla maisīšana ar stikla nūjiņu) vai pievienojot silikona emulsijas pretputošanas līdzekli bez virsmaktīvās vielas, un/vai izmantojot kolbu kratīšanas aerācijas metodi. Ja problēma ir saistīta ar sintētisko notekūdeņu klātbūtni, ir jāmaina sintētisko notekūdeņu sastāvs, iekļaujot pretputošanas reaģentu, piemēram, 50 μl/l. Ja putošanu izraisa testējamā ķīmiskā viela, daudzums, kas vajadzīgs putošanas samazināšanai, būtu jānosaka maksimālajā testa koncentrācijā un pēc tam tāpat jāapstrādā katrs aerācijas trauks (tostarp tie trauki, kuros nav putu, piemēram, tukšās kontrolgrupas un standarttrauki). Ja izmanto pretputu līdzekļus, tie nedrīkst mijiedarboties ar inokulātu un/vai testējamo ķīmisko vielu.

30.

Iespējams noteikt trīs atšķirīgu skābekļa uzņemšanas veidu – kopējā, tikai heterotrofā un nitrifikācijas – inhibīciju. Parasti pietiek ar kopējā skābekļa uzņemšanas inhibīcijas mērījumu. Ietekme uz heterotrofo skābekļa uzņemšanu no organiskā oglekļa oksidēšanās un amonija oksidācijas dēļ ir vajadzīga tikai tad, ja attiecībā uz konkrētu ķīmisku vielu ir vajadzība pēc šādiem diviem atsevišķiem beigupunktiem, vai (neobligāti) ir jāizskaidro netipiskas kopējā skābekļa uzņemšanas inhibīcijas devas un atbildreakcijas saskarības līknes.

31.

Testēšana jāveic 20 ± 2 °C temperatūrā.

32.

Jāsagatavo testa maisījumi (FT, kā norādīts 1. tabulā), kas satur ūdeni, sintētiskos notekūdeņus un testējamo ķīmisko vielu, lai iegūtu atšķirīgas testējamās ķīmiskās vielas nominālās koncentrācijas (sastāvdaļu apjomu piemēru sk. 1. tabulā). Ja nepieciešams, jākoriģē pH līdz 7,5 ± 0,5, maisījumi ir jāatšķaida ar ūdeni un tiem jāpievieno inokulāts, lai traukos iegūtu vienādus beigu tilpumus un sāktu aerāciju.

33.

Maisījumi (FR) sagatavojami tieši tāpat kā testa maisījumi, tikai ar ķīmisko standartvielu, piemēram, 3,5-dihlorofenolu testējamās ķīmiskās vielas vietā.

34.

Testos, kur testa vārglāzes uzstāda secīgi intervālos, tukšos kontrolparaugus (FB) sagatavo ekspozīcijas perioda sākumā un beigās. Testos, kuros izmanto aprīkojumu, kas ļauj veikt vienlaicīgus skābekļa patēriņa mērījumus, katrā vienlaicīgās analīzes partijā ir jāiekļauj vismaz divi tukšie kontrolparaugi. Tukšie kontrolparaugi satur vienādu aktīvo dūņu un sintētiskās barotnes daudzumu, bet tajos nav iekļauta ne testējamā ķīmiskā viela, ne ķīmiskā standartviela. Tās ir jāatšķaida ar ūdeni līdz tādam pašam tilpumam kā testa un standartmaisījumi.

35.

Ja nepieciešams – piemēram, ja zināms vai iespējams, ka testējamai ķīmiskajai vielai ir stipra reducētāja īpašības – jāsagatavo maisījums FA, lai veiktu abiotiskā skābekļa patēriņa mērījumus. Maisījumā jābūt tādam pašam testējamās ķīmiskās vielas un sintētisko notekūdeņu daudzumam, kā arī tikpat lielam tilpumam kā testa maisījumam, bet tam nepievieno aktīvās dūņas.

36.

Testa maisījumus, standartmaisījumus, kā arī tukšos un abiotiskos kontrolparaugus inkubē testa temperatūrā piespiedu aerācijas apstākļos (0,5 līdz 1 l/min), lai nodrošinātu izšķīdušā skābekļa satura koncentrāciju 60–70 % un paturētu dūņu daļiņas suspendētas. Nepieciešama arī kultūru maisīšana, lai dūņu daļiņas saglabātu suspensijā. Inkubācija uzskatāma par sāktu, kad aktīvo dūņu inokulāts sākotnēji saskaras ar pārējām galīgā maisījuma sastāvdaļām. Inkubācijas noslēgumā pēc noteiktajiem ekspozīcijas periodiem, kas parasti ilgst trīs stundas, paraugi tiek izņemti, lai izmērītu izšķīdušā skābekļa koncentrācijas samazinājuma rādītāju elementā, kas paredzēts īpaši šim nolūkam (3. papildinājuma 2. attēls), vai pilnīgi piepildītā BSP pudelē. Veids, kādā tiek uzsākta inkubācija, ir atkarīgs arī no skābekļa patēriņa rādītāja mērīšanai izmantotā aprīkojuma kapacitātes. Piemēram, ja tajā ir viena skābekļa zonde, mērījumi tiek veikti atsevišķi. Šajā gadījumā dažādos maisījumus, kas nepieciešami testam ar sintētiskajiem notekūdeņiem, sagatavo, bet inokulātu nepievieno; nepieciešamo dūņu daudzumu pievieno katrā sērijas traukā. Katru inkubāciju uzsāk pēc kārtas, izmantojot ērtus laika intervālus, piemēram, ik pa 10 līdz 15 minūtēm. Mērīšanas sistēmā var būt arī vairākas zondes, kas atvieglo vairāku vienlaicīgu mērījumu veikšanu; šajā gadījumā inokulātu attiecīgajām trauku grupām var pievienot vienā laikā.

37.

Aktīvo dūņu koncentrācija visos testa, standarta un tukšajos (be ne abiotisko kontrolparaugu) maisījumos parasti ir 1,5 g/l suspendēto cietvielu. Skābekļa patēriņš ir jāmēra pēc trīs stundu ekspozīcijas perioda. Papildu 30 minūšu ekspozīcijas mērījumi jāveic pēc nepieciešamības atbilstoši 5. punktā aprakstītajam.

38.

Lai noskaidrotu dūņu spēju nitrificēties un iespējamo nitrifikācijas rādītāju, jāsagatavo tādi maisījumi (FB) kā tukšajās kontrolgrupās un papildu “kontrolgrupas” maisījumi (FN), kas arī satur N-allylthiourea 11,6 mg/l apjomā. Maisījumus aerē un inkubē 20 °C ± 2 °C temperatūrā 3 stundas. Pēc tam jāizmēra skābekļa uzņemšanas ātrums un jāaprēķina skābekļa uzņemšanas ātrums nitrifikācijas dēļ.

39.

Kad nepieciešams, var veikt provizorisku testēšanu, lai aplēstu, kāds testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju diapazons būtu izmantojams galīgā testa laikā, lai noteiktu skābekļa patēriņa inhibīciju. Testējamās ķīmiskās vielas skābekļa patēriņa inhibīcijas neesamība provizoriskajā testēšanā var arī norādīt, ka nav nepieciešams veikt galīgo testu, bet jāiekļauj provizoriskās testēšanas augstāko koncentrāciju triplikāts (parasti 1 000 mg/l, bet tas atkarīgs no datu prasībām).

1. tabula

Provizoriskās testēšanas maisījumu piemēri

40.

Tests veicams, izmantojot vismaz trīs testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas, piemēram, 10 mg/l, 100 mg/l un 1 000 mg/l, ar tukšo kontrolparaugu un, ja nepieciešams, vismaz trīs abiotiskajiem kontrolparaugiem ar augstāko testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju (piemēru sk. 1. tabulā). Ideālā variantā zemākajai koncentrācijai nevajadzētu ietekmēt skābekļa patēriņu. Ja nepieciešams, jāaprēķina skābekļa uzņemšanas un nitrifikācijas rādītājs; tad jāaprēķina inhibīcija procentos. Atkarībā no testa mērķa ir iespējams arī vienkārši noteikt robežkoncentrācijas, piemēram, 1 000 mg/l, toksicitāti. Ja šajā koncentrācijā neparādās statistiski nozīmīga toksiska ietekme, nav nepieciešama turpmāka testēšana ar lielākām vai mazākām koncentrācijām. Jāievēro, ka vielas, kas vāji šķīst ūdenī, maisījumi, kuru sastāvā ir vielas ar atšķirīgu šķīdību ūdenī, un adsorbējošas vielas ir jāiesver tieši testēšanas traukos. Šajā gadījumā tilpums, kas rezervēts testa ķīmiskās vielas izejšķīdumam, ir jāaizvieto ar atšķaidīšanas ūdeni.

41.

Tests veicams, izmantojot tādu koncentrāciju diapazonu, kas izsecināts no provizoriskās testēšanas rezultātiem. Lai iegūtu gan NOEC, gan ECx (piemēram, EC50), lielākajā daļā gadījumu ieteicami seši kontrolparaugi un piecas apstrādes koncentrācijas ģeometriskā progresijā ar pieciem replikātiem. Abiotisko kontroli nav nepieciešams atkārtot, ja provizoriskajā testēšanā nav notikusi skābekļa uzņemšana, tomēr, ja ir notikusi būtiska skābekļa uzņemšana, abiotiskie kontrolparaugi būtu jāietver katrai testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijai. Dūņu jutība jāpārbauda, izmantojot ķīmisko standartvielu 3,5-dihlorofenolu. Dūņu jutība ir jāpārbauda katrai testa sērijai, jo ir zināms, ka jutība ir svārstīga. Testa paraugi no testa traukiem vienmēr ir jāizņem pēc 3 stundām un, ja nepieciešams, papildus pēc 30 minūtēm, lai veiktu skābekļa uzņemšanas rādītāja mērījumus skābekļa elektroda elementā. No savāktajiem datiem aprēķina kontrolparaugu un testa maisījumu īpatnējos elpošanas rādītājus; pēc tam atbilstoši šeit sniegtajam 7. vienādojumam aprēķina inhibīciju procentos.

42.

Īpaša nitrifikācijas inhibitora ATU izmantošana ļauj tieši novērtēt testējamo ķīmisko vielu inhibitoro ietekmi uz heterotrofo oksidāciju, un, atņemot skābekļa uzņemšanas rādītāju ATU klātbūtnē no kopējā uzņemšanas rādītāja (bez ATU), var aprēķināt ietekmi uz nitrifikācijas rādītāju. Jāsagatavo divi reakcijas maisījumu komplekti atbilstoši testa plānam ECx vai NOEC noteikšanai, kā izklāstīts 41. punktā, bet papildus katram viena komplekta maisījumam jāpievieno ATU galīgajā koncentrācijā 11,6 mg/l; ir konstatēts, ka šāda koncentrācija pilnīgi aptur nitrifikāciju dūņās, kuru suspendēto cietvielu koncentrācijas ir līdz 3 000 mg/l (4). Pēc ekspozīcijas perioda beigām jāizmēra skābekļa uzņemšanas rādītājs; šīs tiešās vērtības parāda tikai heterotrofās elpošanas rādītāju, atšķirības starp šiem un attiecīgajiem kopējiem elpošanas rādītājiem parāda nitrifikāciju. Pēc tam var aprēķināt dažādas inhibīcijas pakāpes.

43.

Pēc ekspozīcijas perioda(-u) beigām paraugs no pirmā aerācijas trauka jāpārvieto uz skābekļa elektroda elementu (2. papildinājuma 1. attēls) un nekavējoties jāizmēra izšķīdušā skābekļa koncentrācija. Ja ir pieejama vairāku elektrodu sistēma, tad mērījumus var veikt vienlaicīgi. Ir svarīgi, lai maisīšanas (ar nosegtu magnētu) ātrums būtu tāds pats kā tad, kad elektrods kalibrēts, lai nodrošinātu, ka zonde reaģē uz skābekļa koncentrācijas izmaiņām ar minimālu aizkavēšanos un lai varētu mērījumu traukā regulāri veikt reproducējamus skābekļa mērījumus. Parasti pietiek ar dažu skābekļa elektrodu zondes sistēmu, kas pati apmaisa saturu. Laikā starp mērījumiem elements ir jāizskalo ar ūdeni. Ar paraugu var arī uzpildīt BSP pudeli (3. papildinājuma 2. attēls), kas aprīkota ar magnētisko maisītāju. Tad skābekļa zondi ar uzmavas adapteri ievieto pudeles kaklā un iedarbina magnētisko maisītāju. Abos gadījumos izšķīdušā skābekļa koncentrācijas kādu laiku pastāvīgi mēra un reģistrē, parasti 5 līdz 10 minūtes vai līdz brīdim, kad skābekļa koncentrācija nokrītas zem 2 mg/l. Elektrods ir jānoņem, maisījums jāielej atpakaļ aerācijas traukā, un jāturpina aerācija un maisīšana, ja ir nepieciešams veikt mērījumus pēc ilgākiem ekspozīcijas periodiem.

44.

Noteiktiem mērķiem var būt nepieciešams mērīt testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju testa traukos. Jānorāda, ka, ja tiek izmantoti turpmāk minēto vielu izejšķīdumi:

izšķīdusī frakcija nav zināma un nav zināma uz testa traukiem pārvietotās testējamās ķīmiskās vielas patiesā koncentrācija. Lai raksturotu ekspozīciju, ir nepieciešams veikt testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju analītisko aplēšanu. Lai to vienkāršotu, analītiskā aplēšana veicama pirms inokulāta pievienošanas. Tā kā uz testa traukiem pārvieto tikai izšķīdušās frakcijas, izmērītās koncentrācijas var būt ļoti zemas.

45.

Lai izvairītos no laikietilpīgas un dārgas analīzes, ir ieteicams vienkārši iesvērt testējamo ķīmisko vielu tieši testa traukos un turpmākajos aprēķinos norādīt sākotnēji nosvērto nominālo koncentrāciju. Diferencēšana starp testējamās ķīmiskās vielas izšķīdušajām, neizšķīdušajām vai adsorbētajām frakcijām nav nepieciešama, jo arī reālos apstākļos visas šīs frakcijas atrodas notekūdeņu attīrīšanas iekārtās un šīs frakcijas var būt atšķirīgas atkarībā no notekūdeņu sastāva. Šīs testēšanas metodes mērķis ir reālistiski aplēst koncentrāciju, kas neizraisa inhibēšanos, un tā nav piemērota tam, lai sīkāk izmeklētu, kuras frakcijas veicina aktīvo dūņu organismu inhibēšanos. Visbeidzot, arī adsorbējošās vielas ir jāiesver tieši testa traukos un trauki ir jāsilanizē, lai samazinātu zudumus adsorbcijas dēļ.

46.

Skābekļa uzņemšanas rādītājus aprēķina no izmērīto vērtību vidējās vērtības, piemēram, no lineārajām daļām līknēs, kas ataino skābekļa koncentrācijas izmaiņas laikā; aprēķinus veic tikai skābekļa koncentrācijām starp 2,0 mg/l un 7,0 mg/l, jo augstākas un zemākas koncentrācijas pašas var ietekmēt patēriņa rādītājus. Novirze koncentrāciju joslās zemāk vai augstāk par šīm vērtībām reizēm ir neizbēgama un nepieciešama, piemēram, ja elpošana ir ievērojami nomākta un tāpēc norit ļoti lēni vai ja konkrētās aktīvās dūņas elpo ļoti ātri. Tas ir pieļaujams, ja skābekļa uzņemšanas grafika paplašinātās daļas ir taisnas un to slīpums nemainās, šķērsojot 2,0 mg/l vai 7,0 mg/l O2 robežas. Jebkuras izliektas līknes daļas norāda, ka mērīšanas sistēma stabilizējas vai ka uzņemšanas rādītājs mainās, un tās nav izmantojamas elpošanas rādītāja aprēķinos. Skābekļa uzņemšanas rādītājs jāizsaka miligramos uz litru stundā (mg/lh) vai miligramos uz gramu sauso dūņu stundā (mg/gh). Skābekļa patēriņa ātrumu R, izteiktu mg/lh, var aprēķināt vai interpolēt no reģistrētā skābekļa samazinājuma līknes lineārās daļas saskaņā ar 1. vienādojumu:

kur:

47.

Īpatnējo elpošanas rādītāju (Rs) izsaka kā skābekļa daudzums, kuru patērē uz g dūņu saussvara stundā (mg/gh) atbilstoši 2. vienādojumam:

kur SS ir suspendēto cietvielu koncentrācija testa maisījumā (g/l).

48.

Atšķirīgie R indeksi, kurus var kombinēt, ir šādi:

49.

Attiecība starp kopējo elpošanu (RT), nitrifikācijas elpošanu (RN) un heterotrofo elpošanu (RH) ir norādīta 3. vienādojumā:

kur:

50.

Šī sakarība ir derīga tukšajiem paraugiem noteiktajām vērtībām (RNB, RTB, RHB), abiotiskajai kontrolgrupai (RNA, RTA, RHA) un testiem ar testējamajām ķīmiskajām vielām (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Īpatnējos skābekļa uzņemšanas rādītājus aprēķina šādi:

51.

Ja provizoriskajā testēšanā RN ir nenozīmīgs (piemēram, < 5 % no RT tukšajos kontrolparaugos), var pieņemt, ka heterotrofā skābekļa uzņemšana ir vienāda ar kopējo uzņemšanu un nitrifikācija nenotiek. Būtu vajadzīgs cits aktīvo dūņu avots, ja testos ņemtu vērā ietekmi uz heterotrofiem un nitrificējošiem mikroorganismiem. Galīgo testu veic, ja ir pierādījumi par nomāktas skābekļa uzņemšanas rādītājiem atšķirīgās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijās.

52.

Procentuālo inhibīciju IT no kopējā skābekļa patēriņa pie katras testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas aprēķina pēc 7. vienādojuma:

53.

Līdzīgā kārtā heterotrofās skābekļa uzņemšanas procentuālo inhibīciju IH pie katras testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas aprēķina pēc 8. vienādojuma:

54.

Visbeidzot, skābekļa patēriņa inhibēšanos nitrifikācijas dēļ pie katras koncentrācijas aprēķina pēc 9. vienādojuma:

55.

Skābekļa uzņemšanas procentuālo inhibēšanos atliek pret attiecīgās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas logaritmu (inhibīcijas līkne, sk. 4. papildinājuma 3. attēlu). Inhibīcijas līknes grafiski attēlo katram 3 stundu aerācijas periodam vai attiecīgi pēc 30 minūtēm. Testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas inhibē skābekļa uzņemšanu par 50 % (EC50), jāaprēķina vai jāinterpolē no līknes. Ja ir pieejami piemēroti dati, var aprēķināt vai interpolēt EC50 95 % ticamības robežas, līknes virziena koeficientu un piemērotas vērtības, ko var atzīmēt kā inhibēšanās sākumu (piemēram, EC10 vai EC20) un inhibēšanās diapazona beigas (piemēram, EC80 vai EC90).

56.

Jāievēro, attiecībā uz mainību, ko bieži novēro rezultātos, daudzos gadījumos var būt pietiekami rezultātus papildus izteikt kārtās:

57.

ECx vērtības, tostarp ar tām saistītās parametra apakšējās un augšējās 95 % ticamības robežas, aprēķina, izmantojot piemērotas statistiskās metodes (piemēram, probita analīzi, logistisko vai Veibula funkciju, saīsināto Spīrmena–Kerbera (Spearman-Kärber) metodi vai vienkāršu interpolāciju (11)). ECx iegūst, vērtību, kas atbilst x % no kontrolparaugu vidējās vērtības, ievietojot iegūtajā vienādojumā. Lai aprēķinātu EC50 vai jebkuru citu ECx, pirmsapstrādes vidējām vērtībām (x) ir jāveic regresijas analīze.

58.

Ja plānots ar statistisko analīzi noteikt NOEC, ir nepieciešama statistika par katru trauku (katrs trauks tiek uzskatīts par replikātu). Attiecīgas statistiskās metodes būtu jāizmanto atbilstoši ESAO dokumentam par Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). Parasti testējamās ķīmiskās vielas nelabvēlīgo ietekmi salīdzinājumā ar kontrolparaugu izmeklē, izmantojot vienpusēju (mazāku) hipotēžu pārbaudi pie p ≤ 0,05.

59.

Testēšanas pārskatā ietverama turpmāk norādītā informācija.

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 221 (2006. gads). Šis tests ir paredzēts, lai novērtētu ķīmisku vielu toksicitāti saldūdens ūdens augiem – ūdensziedu ģints (Lemna) augiem. Tās pamatā ir esošās metodes (1)(2)(3)(4)(5)(6), taču šeit aprakstītās metodes modificētas saskaņā ar jaunākajiem pētījumiem un konsultācijām par vairākiem būtiskiem jautājumiem. Piedāvātā metode apstiprināta starptautiskā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā (7).

2.

Testēšanas metodē aprakstīta toksiskuma noteikšana, izmantojot kupraino ūdensziedu (Lemna gibba) un mazo ūdensziedu (Lemna minor) sugas, kas ir plaši pētītas un izmantotas par objektu iepriekš minētajos standartos. Ūdensziedu ģints sugu taksonomija ir sarežģīta, jo sastopami daudzveidīgi fenotipi. Kaut arī konstatēta ūdensziedu ģenētiskā mainība toksikantu ietekmē, pašlaik nav pieejams pietiekami daudz datu par šīs mainības cēloni, lai ieteiktu konkrētu klonu, kuru izmantot šajā testēšanas metodē. Jāatzīmē, ka testēšanu neveic aksēniskā jeb sterilā kultūrā, taču testa norises laikā zināmos posmos veic pasākumus, ar kuriem pēc iespējas samazina kontamināciju ar citiem organismiem.

3.

Sniegta sīkāka informācija par testēšanas norisi gan ar testa šķīduma atjaunošanu (pusstatiskā metode un caurplūdes metode), gan arī bez šķīduma atjaunošanas (statiskā metode). Atkarībā no testēšanas mērķiem un reglamentējošām prasībām ieteicams apsvērt pusstatiskās metodes un caurplūdes metodes lietošanu, piemēram, ķīmiskajām vielām, kas ātri izdalās no šķīduma iztvaikošanas, fotonoārdīšanās, izgulsnēšanās vai bioloģiskās noārdīšanās rezultātā. Papildu norādījumi sniegti avotā (8).

4.

Izmantotās definīcijas ir dotas 1. papildinājumā.

5.

Eksponenciāli augošās ūdensziedu ģints augu kultūrām ļauj augt kā monokultūrām dažādās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijās laikā līdz septiņām dienām. Šā testa mērķis ir kvantitatīvi noteikt testējamās vielas ietekmi uz aug (u veģetatīvo augšanu konkrētā periodā, izvērtējot izvēlētos mērāmos parametrus. Ūdensziedu plātnīšu skaits ir primārais mērāmais parametrs. Jāmēra vēl vismaz viens cits parametrs (kopējā plātnīšu platība, saussvars vai svaigsvars), tāpēc ka dažas ķīmiskās vielas citus mērāmos parametrus var ietekmēt vairāk nekā plātnīšu skaitu. Lai kvantitatīvi noteiktu testējamās vielas ietekmi, augšanu testa šķīdumos salīdzina ar augšanu kontrolšķīdumos un atrod koncentrāciju, kas izraisa noteiktu augšanas inhibēšanos par x % (piemēram, 50 %), ko izsaka kā ECx (piemēram, EC50).

6.

Testa beigupunkts ir augšanas inhibīcija, ko izsaka kā mērāmā parametra (vidējā specifiskā augšanas ātruma) logaritmisko pieaugumu ekspozīcijas periodā. No specifiskā augšanas ātruma vidējām vērtībām, kas reģistrētas testa šķīdumu rindā, nosaka koncentrāciju, kas nodrošina noteikta augšanas ātruma inhibēšanos par x % (piemēram, 50 %), un to izsaka kā ErCx (piemēram, ErC50).

7.

Šajā testēšanas metodē izmantotais papildu atkarīgais mainīgais ir ražība, kas var būt nepieciešams, lai dažās valstīs izpildītu īpašas regulējuma prasības. Tas ir definēts kā mērāmais parametrs ekspozīcijas perioda beigās, no kura atņemts attiecīgs ekspozīcijas perioda sākumā izmērīts parametrs. No ražības skaitliskajām vērtībām, ko iegūst testa šķīdumu rindā, atrod koncentrāciju, kas izraisa noteiktu ražības samazināšanos par x % (piemēram, par 50 %), ko izsaka kā EyCx (piemēram, EyC50).

8.

Papildus statistiski var noteikt zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC) un nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC).

9.

Jābūt pieejamai pietiekami jutīgai analīzes metodei vielas kvantitatīvai noteikšanai testēšanas barotnē.

10.

Nosakot testēšanas apstākļus, var noderēt informācija par testējamo ķīmisko vielu – struktūrformula, tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, stabilitāte ūdenī un gaismā, pKa, Kow, tvaika spiediens un bioloģiskās noārdīšanās spēja. Šķīdību ūdenī un tvaika spiedienu var izmantot, lai aprēķinātu Henrija likuma konstanti un novērtētu, vai testa periodā iespējami būtiski testējamās ķīmiskās vielas zudumi. Tā iespējams gūt priekšstatu par to, vai jāveic īpaši pasākumi šādu zudumu kontrolei. Ja informācija par testējamās ķīmiskās vielas šķīdību un stabilitāti ir neskaidra, ieteicams to novērtēt testa apstākļos, t. i., ar barotni, temperatūru, apgaismojuma režīmu, ko izmantos testa laikā.

11.

Ja īpaši svarīga ir testēšanas barotnes pH kontrole, piemēram, ja testējamie metāli vai ķīmiskās vielas ir hidrolītiski nestabilas, barotnei ieteicams pievienot buferšķīdumu (sk. 21. punktu). Papildu norādījumi par testiem ar tādām vielām, kas grūti testējamas to fizikālķīmisko īpašību dēļ, ir sniegti (8).

12.

Lai testēšanas rezultātus atzītu par derīgiem, plātnīšu skaita divkāršošanās laikam kontrolē jābūt mazākam par 2,5 dienām (60 h), kas atbilst aptuveni septiņkārtīgam pieaugumam septiņās dienās un vidējam specifiskajam augšanas ātrumam 0,275 d-1. Izmantojot šajā testēšanas metodē aprakstītās barotnes un testa apstākļus, šo kritēriju var sasniegt statiskā testa režīmā (5). Tāpat sagaidāms, ka šo kritēriju var sasniegt, izmantojot testā pusstatisko metodi un caurplūdes metodi. Divkāršošanās laika aprēķināšana norādīta 49. punktā.

13.

Ķīmiskā(-s) standartviela(-s), piemēram, 3,5-dihlorfenols, kas izmantots starptautiskā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā (7), var testēt, lai pārbaudītu testa procedūru. Ķīmisko standartvielu ieteicams testēt vismaz divas reizes gadā vai, ja testēšana tiek veikta retāk, vienlaikus ar testējamās ķīmiskās vielas toksicitātes noteikšanu.

14.

Visām iekārtām, kas ir saskarē ar testa vidi, jābūt izgatavotām no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla. Stikla trauki, kas paredzēti kultivēšanai un testēšanai, jāattīra no ķīmiskiem kontaminantiem, kas varētu iekļūt testēšanas barotnē, un tiem jābūt steriliem. Testa traukiem jābūt pietiekami lieliem, lai dažādu koloniju plātnītes kontroles traukos varētu brīvi augt, testa beigās nepārklājoties cita ar citu. Nav būtiski, vai saknes pieskaras testa trauka dibenam, tomēr visiem testa traukiem ieteicamais minimālais dziļums ir 20 mm un minimālais tilpums 100 ml. Testa trauku izvēlei nav citas būtiskas nozīmes, ja vien tiek izpildītas minētās prasības. Par piemērotām atzītas arī atbilstoša izmēra stikla vārglāzes, kristalizatori vai Petri plates no stikla. Testa traukiem jābūt apsegtiem, lai pēc iespējas samazinātu iztvaikošanu un nejaušas kontaminācijas iespēju, vienlaikus nodrošinot nepieciešamo gaisa apmaiņu. Piemēroti ir tādi testa trauki un jo īpaši to vāki, kas nenoēno augus un nerada gaismas spektra izmaiņas.

15.

Kultūras un testa traukus nedrīkst izvietot vienkopus. Šī prasība vislabāk izpildāma, izmantojot atsevišķas audzēšanas kameras, inkubatorus vai telpas. Apgaismojums un temperatūra jākontrolē un jāuztur nemainīgā līmenī (sk. 35.–36. punktu).

16.

Šajā testā izmantojamie organismi ir kuprainais ūdenszieds (Lemna gibba) vai mazais ūdenszieds (Lemna minor). Toksiskuma noteikšanai izmantojamo ūdensziedu sugu īss apraksts dots 2. papildinājumā. Augu materiāls jāsaņem no kultūru kolekcijas, no citas laboratorijas vai jāievāc lauka apstākļos. Lauka apstākļos ievākti augi vismaz astoņas nedēļas pirms izmantošanas jāuztur kultūrā tieši tādā barotnē, kādu izmanto testēšanai. Ja augus vāc laukā, vietām, kur ievāc kultūras sākummateriālu, jābūt bez redzamiem kontaminācijas avotiem. Ja augu materiāls saņemts no citas laboratorijas vai no kultūru kolekcijas, tas jāuztur līdzīgi vismaz trīs nedēļas. Visos gadījumos jānorāda testā izmantojamā augu materiāla izcelsmes avots, suga un klons (ja zināms).

17.

Jāizmanto monokultūras, kas redzami nav kontaminētas ar citiem organismiem, piemēram, aļģēm un vienšūņiem. Veselīgi mazā ūdenszieda (L. minor) augi sastāv no kolonijām, ko veido divas līdz piecas plātnītes, bet veselīgā kuprainā ūdenszieda (L. gibba) kolonijā var būt pat septiņas plātnītes.

18.

Testā izmantojamo augu kvalitāte un vienveidīgums būtiski ietekmē testa rezultātus, tāpēc tie jāizraugās rūpīgi. Jāizmanto jauni, ātri augoši augi bez redzamiem bojājumiem vai krāsas izmaiņām (hlorozes). Labas kvalitātes kultūras pazīme ir daudz koloniju, kas sastāv no vismaz divām plātnītēm. Liels atsevišķu plātnīšu skaits liecina par vidisko stresu, piemēram, barības vielu nepietiekamību, un testēšanai augus no šādām augu kultūrām izmantot nedrīkst.

19.

Lai manipulācijas kultūras uzturēšanai varētu veikt retāk (piemēram, ja ūdensziedu testi tuvākajā laikā nav plānoti), kultūras glabā samazināta apgaismojuma apstākļos pazeminātā temperatūrā (4–10 °C). Sīkāka informācija par kultivēšanu ir dota 3. papildinājumā. Ja novērojamas aļģu vai citu organismu kontaminācijas pazīmes, jāņem ūdensziedu plātnīšu apakšparaugs, jāveic tā virsmas sterilizācija un pēc tam tas jāpārnes svaigā barotnē (sk. 3. papildinājumu). Šādā gadījumā atlikusī kontaminētā kultūra jālikvidē.

20.

Vismaz septiņas dienas pirms testēšanas sākuma pietiekamu daudzumu koloniju aseptiski pārvieto uz svaigu, sterilu barotni un 7–10 dienas kultivē testa apstākļos.

21.

Turpmāk minētas vairākas barotnes, kas ieteicamas mazā ūdenszieda (Lemna minor) un kuprainā ūdenszieda (Lemna gibba) kultivēšanai. Rūpīgi jāapsver pH buferšķīduma pievienošana testēšanas barotnēm (MOPS 4-morfolīnpropānsulfonskābe; CAS Nr. 1132-61-2 mazā ūdenszieda barotnei un NaHCO3 kuprainā ūdenszieda barotnei), ja iespējams, ka tas varētu reaģēt ar testējamo ķīmisko vielu un ietekmēt tās toksiskuma izpausmi. Var izmantot arī Steinberga (Steinberg) barotni (9), ja tā atbilst derīguma kritērijiem.

22.

Arī modificēta Zviedrijas standartos (SIS) minētā ūdensziedu barotne ieteicama mazā ūdenszieda kultivēšanai un testēšanai. Šīs barotnes sastāvs dots 4. papildinājumā.

23.

Barotne 20X – AAP, kas aprakstīta 4. papildinājumā, ieteicama kuprainā ūdenszieda kultivēšanai un testēšanai.

24.

Arī Steinberga barotne, kas aprakstīta 4. papildinājumā, ir piemērota mazā ūdenszieda kultivēšanai, un ja tā atbilst derīguma kritērijiem, izmantojama arī kuprainā ūdenszieda kultivēšanai.

25.

Testa šķīdumus parasti gatavo, atšķaidot izejšķīdumu. Testējamās ķīmiskās vielas izejšķīdumu parasti gatavo, izšķīdinot ķīmisko vielu barotnē.

26.

Lielākā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija parasti nav augstāka par vielas šķīdību ūdenī testa apstākļos. Jānorāda, ka ūdensziedi (Lemna) peld barotnes virspusē un uz tiem var iedarboties vielas, kas uzkrājas ūdens un gaisa saskares zonā (piemēram, ūdenī slikti šķīstošas vai hidrofobas vielas vai virsmaktīvās vielas). Tādos apstākļos ekspozīciju var radīt viela, kuras nav šķīdumā, un atkarībā no testējamās vielas īpašībām testa koncentrācijas var pārsniegt tās šķīdību ūdenī. No slikti šķīstošām testējamām ķīmiskajām vielām var būt jāsagatavo koncentrēti ķīmiskās vielas izejšķīdumi vai dispersijas, izmantojot organiskos šķīdinātājus vai disperģētājvielas, lai atvieglotu vielas disperģēšanu un izšķīdināšanu, dodot iespējas paaugstināt testējamās vielas dozēšanas precizitāti testēšanas barotnē. Tomēr jādara viss iespējamais, lai izvairītos no šādu materiālu lietošanas. Šīs palīgvielas – šķīdinātāji vai disperģētājvielas – nedrīkst būt fitotoksiskas. Piemēram, daži parasti izmantotie šķīdinātāji, kas nav fitotoksiski koncentrācijā virs 100 μl/l, ir acetons un dimetilformamīds. Ja lieto šķīdinātājus vai disperģētājvielas, jānorāda šo vielu gala koncentrācija un tā jāuztur minimālā līmenī (≤ 100 μl/l), un visos variantos – testējamās vielas un kontrolgrupas traukos – šķīdinātājam vai disperģētājvielai jābūt vienādā koncentrācijā. Papildu norādījumi par disperģētājvielu lietošanu ir doti (8).

27.

Piemērotu testēšanas koncentrāciju izvēlei ieteicams izmantot priekšzināšanas par testējamās ķīmiskās vielas toksiskumu ūdensziediem (Lemna), piemēram, diapazona noteikšanas testa datus. Galīgajā toksiskuma testā parasti jābūt vismaz piecām testējamām koncentrācijām, kas sakārtotas ģeometriskā progresijā. Vēlams, lai starp testa koncentrāciju kvocients nepārsniegtu 3,2, bet lielāku vērtību var izmantot tad, ja koncentrācijas–atbildreakcijas līkne ir lēzena. Ja testē mazāk nekā piecas koncentrācijas, tas ir jāpamato. Katram testējamās koncentrācijas variantam jābūt vismaz trijos replikātos.

28.

Nosakot testējamo koncentrāciju diapazonu (diapazona noteikšanai un/vai galīgajam toksiskuma testam), jāņem vērā šādi apsvērumi.

29.

Katrā testā iekļaujama kontrolgrupa, kurā ir tāda pati barotne, vienāds plātnīšu un koloniju skaits, vidiskie apstākļi, manipulācijas kā testa traukos, bet bez testējamās ķīmiskās vielas. Ja par palīgvielu lieto šķīdinātāju vai disperģētājvielu, kontrolgrupai papildus jāpievieno tas pats šķīdinātājs/disperģētājviela tieši tādā koncentrācijā kā traukos ar testējamo ķīmisko vielu. Kontrolreplikātu skaitam (arī traukiem ar šķīdinātāju, ja to lieto) jābūt vismaz tādam pašam kā katras testējamās koncentrācijas trauku skaitam, bet ideālā gadījumā divreiz lielākam par to.

30.

Ja nav nepieciešams noteikt NOEC, testēšanas plānu var mainīt, palielinot testējamo koncentrāciju skaitu un samazinot katras koncentrācijas replikātu skaitu. Taču kontrolgrupā jābūt vismaz trīs replikātiem.

31.

Kolonijas, kas sastāv no divām līdz četrām saredzamām plātnītēm, no inokulācijas kultūras aseptiskos apstākļos pārvieto uz testa traukiem, sadalot pēc nejaušās izvēles principa. Katrā testa traukā jāatrodas pavisam 9–12 plātnītēm. Plātnīšu un koloniju skaitam visos testa traukos jābūt vienādam. Šīs metodes izmantošanas pieredze un starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas dati liecina, ka trīs replikāti katrai koncentrācijai, katram replikātam sākotnēji saturot 9–12 plātnītes, ir pietiekami, lai starp koncentrācijām konstatētu aptuveni 4–7 % augšanas atšķirības inhibēšanās dēļ, rēķinot pēc augšanas ātruma (10–15 %, rēķinot pēc ražības) (7).

32.

Testa trauki inkubatorā jāizvieto pēc nejaušības principa, lai pēc iespējas samazinātu telpiskās atšķirības gaismas intensitātes vai temperatūras ziņā. Nepieciešams blokveida sadalījums vai trauku pārvietošana pēc nejaušības principa, izdarot novērojumus (vai arī trauku pārvietošana biežāk).

33.

Ja orientējošajā testā konstatē, ka testa periodā (7 dienas) testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju nav iespējams uzturēt (t. i., izmērītā koncentrācija nokrītas zem 80 % no sākotnējās koncentrācijas), ieteicams izmantot pusstatisko metodi. Šādā gadījumā kolonijas jāpārvieto svaigi sagatavotā testēšanas barotnē un kontrolšķīdumos vismaz divas reizes testa laikā (t. i., trešajā un piektajā dienā). Tas, cik bieži eksponē svaigai barotnei, atkarīgs no testējamās ķīmiskās vielas stabilitātes; lai ļoti nestabilām un gaistošām vielām uzturētu pēc iespējas nemainīgu koncentrāciju, tas var būt jādara biežāk. Dažkārt var būt jāizmanto caurplūdes pieeja (8)(10).

34.

Ekspozīcijas modeļi, kas paredz testējamo vielu izsmidzināt uz auga lapām, šajā testēšanas metodē nav aprakstīti, bet ir atrodami (11).

35.

Jāizmanto pastāvīgas silti vai vēsi baltas fluorescentas gaismas avots, kas nodrošina apgaismojuma intensitāti diapazonā 85–135 μE · m– 2s– 1, mērot fotosintēzes aktivitātei atbilstošā spektra daļā (400–700 nm) tādā pašā attālumā no gaismas avota, kādā atrodas ūdensziedu (Lemna) plātnītes (ekvivalents 6 500–10 000 luksiem). Jebkuras novirzes no izraudzītās apgaismojuma intensitātes testa zonā nedrīkst pārsniegt ± 15 % Gaismas detektēšanas un mērīšanas metodes, jo īpaši sensora veids, ietekmē izmērītās vērtības. Par labākiem atzīstami sfēriskie sensori (reaģē uz gaismu visos leņķos virs mērījumu plaknes un zem tās) un “kosinusa” sensori (reaģē uz gaismu visos leņķos virs mērījumu plaknes) salīdzinājumā ar vienvirziena sensoriem, un ar tiem var iegūt augstākus nolasījumus no šeit aprakstītā veida daudzpunktu gaismas avota.

36.

Temperatūrai testa traukos jābūt 24 ± 2 °C. Kontrolgrupas barotnē testēšanas laikā pH nedrīkst palielināties par vairāk kā 1,5 vienībām. Tomēr testēšanas rezultāti nav uzskatāmi par nederīgiem tādu noviržu dēļ, kas pārsniedz 1,5 vienības, ja tie atbilst citiem derīguma kritērijiem. Papildu uzmanība īpašos gadījumos jāvelta pH novirzēm – ja jātestē nestabilas vielas vai metāli. Sīkākus norādījumus sk. (8).

37.

Testu beidz septiņas dienas pēc augu pārvietošanas uz testa traukiem.

38.

Testēšanas sākumā jāizskaita un jāreģistrē plātnīšu skaits testa traukos, pārliecinoties, ka tiek uzskaitītas uz āru izvirzītas, skaidri saskatāmas plātnītes. Plātnīšu skaits jānosaka testa sākumā, tad vismaz vienu reizi trīs dienās ekspozīcijas periodā (t. i., vismaz divas reizes septiņu dienu periodā) un testa beigās, uzskaitot gan normālās, gan anomālās plātnītes. Jāievēro augu attīstības izmaiņas, piemēram, plātnīšu lielums, ārējais izskats, nekrozes pazīmes, hloroze, kumpainība, koloniju sadalīšanās, peldspējas zudums, kā arī saknīšu garums un izskats. Jānovēro arī būtiskas testēšanas barotnes iezīmes (piemēram, neizšķīdušas vielas, aļģu augšana testa traukā).

39.

Papildus plātnīšu skaita noteikšanai testēšanas laikā jānovērtē arī testējamās ķīmiskās vielas ietekme uz vienu (vai vairākiem) šādiem mērāmajiem parametriem:

40.

Kopējā plātnīšu laukuma noteikšanai ir tāda priekšrocība, ka to var noteikt katram testējamā varianta un kontrolgrupas traukam testa sākumā, norises gaitā un testa beigās. Saussvars un svaigsvars jānosaka testa sākumā paraugā, kas ir reprezentatīvs laboratorijas kultūrai, kuru lietos par inokulātu testa sākšanai, kā arī testa beigās augu materiālā no katra testējamā varianta un kontrolgrupas trauka. Ja plātnīšu laukums netiek mērīts, vēlams noteikt saussvaru, nevis svaigsvaru.

41.

Kopējo plātnīšu laukumu, saussvaru un svaigsvaru varu var noteikt šādi:

42.

Izmantojot statisko testēšanas plānu, pH jāmēra katrā apstrādes traukā testa sākumā un beigās. Pusstatiskā testēšanas plāna gadījumā pH jāmēra katrā “svaigā” testa šķīduma partijā pirms katras šķīduma nomaiņas, kā arī attiecīgajās “izlietoto” šķīdumu porcijās.

43.

Gaismas intensitāte jāmēra audzēšanas kamerā, inkubatorā vai telpā tādā pašā attālumā no gaismas avota, kādā atrodas ūdensziedu (Lemna) plātnītes. Mērījumi jāveic vismaz vienreiz testēšanas laikā. Barotnes temperatūras mērīšanu aizvietotājtraukā, kas novietots identiskos apstākļos audzēšanas kamerā, inkubatorā vai telpā, mēra vismaz vienreiz dienā.

44.

Testa laikā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas nosaka regulāros intervālos. Statiskajos testos minimālā prasība ir noteikt koncentrāciju testēšanas sākumā un beigās.

45.

Pusstatiskajos testos, kad nav gaidāms, ka testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija saglabāsies ± 20 % robežās no nominālās koncentrācijas, jāanalizē visi no jauna pagatavotie testa šķīdumi, kā arī tie paši šķīdumi pirms katras ievadīšanas testa traukos (sk. 33. punktu). Tomēr tādos testos, kur testējamās ķīmiskās vielas izmērītā sākotnējā koncentrācija nav ± 20 % no nominālās koncentrācijas, bet pietiekami pierādījumi liecina, ka sākotnējā koncentrācija ir atkārtojama un stabila (t. i., 80–120 % no sākotnējās koncentrācijas), ķīmiskās analīzes var veikt tikai pie pašām lielākajām un mazākajām testējamajām koncentrācijām. Visos gadījumos testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju noteikšana veicama pirms svaiga šķīduma pievienošanas vienā replikāta traukā katrai testa koncentrācijai (vai to trauku saturā, kas apvienoti replikātā).

46.

Ja izmanto caurplūdes metodi, paraugus ņem līdzīgā režīmā, kā aprakstīts pusstatiskās metodes gadījumā, tostarp ņem analīzes testēšanas sākumā, vidusposmā un beigās; veikt mērījumus “izlietotajos” šķīdumos nav lietderīgi. Šāda veida testā šķīdinātāja un testējamās ķīmiskās vielas vai testējamās ķīmiskās vielas izejšķīduma plūsmas ātrums jāpārbauda katru dienu.

47.

Ja ir pierādījumi, ka testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija ir apmierinoši uzturēta ± 20 % robežās no nominālās vai testa laikā izmērītās sākotnējās koncentrācijas, tad rezultātu analīzes pamatā var būt nominālās vai izmērītās sākotnējās vērtības. Ja novirze no nominālās vai izmērītās sākotnējās koncentrācijas nav ± 20 % diapazonā, rezultātu analīzes pamatā jābūt koncentrāciju ģeometriskai vidējai vērtībai ekspozīcijas laikā vai modeļiem, kas raksturo testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas samazināšanos (8).

48.

Noteiktos apstākļos, piemēram, kad orientējošais tests norāda, ka testējamajai ķīmiskajai vielai nav toksiskas ietekmes koncentrācijās līdz 100 mg/l vai līdz šķīdības robežai testēšanas barotnē (atkarībā no tā, kura ir zemāka), var veikt robežtestu, kurā salīdzina kontrolgrupas un vienas apstrādes grupas (100 mg/l vai koncentrācija, kas vienāda ar šķīdības robežu) atbildreakcijas. Noteikti ieteicams to apstiprināt, analizējot ekspozīcijas koncentrācijas. Uz robežtestu attiecas visi iepriekš aprakstītie testēšanas nosacījumi un derīguma kritēriji, izņemot to, ka apstrādes replikātu skaits jādubulto. Augšanu kontrolgrupā un apstrādes grupā var analizēt, izmantojot statistisku testu vidējo vērtību salīdzināšanai, piemēram, Stjūdenta t-testu.

49.

Lai noteiktu ūdensziedu plātnīšu skaita divkāršošanās laiku (Td) un pētījuma atbilstību šim derīguma kritērijam (12. punkts), aprēķiniem ar kontrolgrupas traukos iegūtiem datiem izmanto šādu formulu:

Td = ln 2/μ

kur μ ir vidējais specifiskais augšanas ātrums, ko nosaka, kā aprakstīts 54.–55. punktā.

50.

Testēšanas mērķis ir noteikt testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz ūdensziedu (Lemna) veģetatīvo augšanu. Šī testa metode ietver divus atkarīgos mainīgos, jo dažādās jurisdikcijās ir priekšroku dod atšķirīgiem parametriem un atšķiras regulējuma vajadzības. Lai testēšanas rezultāti būtu pieņemami visās jurisdikcijās, rezultāti ir jāizvērtē, izmantojot abus turpmāk aprakstītos atkarīgos mainīgos a) un b).

51.

Jānorāda, ka toksiskuma vērtības, kas aprēķinātas, izmantojot šos abus atkarīgos mainīgos, nav savstarpēji salīdzināmas, un šī atšķirība jāapzinās, izmantojot testa rezultātus. Tā kā katras pieejas matemātiskais pamats ir atšķirīgs, tad, ja būs ievēroti šīs testa metodes testa nosacījumi, ECx vērtības, kuru pamatā ir vidējais specifiskais augšanas ātrums (ErCx), kopumā būs augstākas nekā rezultāti, kuru pamatā ir ražība (EyCx). To nedrīkst interpretēt kā šo abu iegūto parametru jutības atšķirību; šīs vērtības vienkārši ir matemātiski atšķirīgas. Vidējā specifiskā augšanas ātruma koncepcijas pamatā ir ūdensziedu vispārējais eksponenciālās augšanas modelis kultūrās, kuru augšanu neierobežo; toksiskumu tajās aplēš pēc ietekmes uz augšanas ātrumu neatkarīgi no kontrolgrupas absolūtā specifiskā augšanas ātruma līmeņa, koncentrācijas–atbildreakcijas līknes virziena koeficienta vai testa ilguma. Savukārt rezultāti, kuru pamatā esošais atkarīgais mainīgais ir ražība, ir atkarīgi no visiem citiem minētajiem mainīgajiem. EyCx ir atkarīgs no katrā testā iekļauto ūdensziedu sugu vidējā specifiskā augšanas ātruma un no maksimālā specifiskā augšanas ātruma, kas var būt atšķirīgs ne tikai katrai sugai, bet arī dažādiem kloniem. Šo atkarīgo mainīgo nevajadzētu izmantot, lai salīdzinātu dažādu ūdesnziedu sugu vai pat atšķirīgu klonu jutību pret toksikantiem. Kaut arī zinātnē priekšroku dod toksiskuma noteikšanai pēc vidējā specifiskā augšanas ātruma, lai apmierinātu dažu valstu pašreizējās regulatīvās prasības, šajā testēšanas metodē ir ietverta arī toksiskuma noteikšana pēc ražības.

52.

Toksiskuma noteikšanā jāpamatojas uz plātnīšu skaitu un vēl vismaz vienu citu mērāmo parametru (plātnīšu zonas kopējā platība, saussvars vai svaigais svars), jo dažas vielas var ietekmēt citus mērāmos lielumus vairāk nekā plātnīšu skaitu. Šo ietekmi nevar noteikt, aprēķinot tikai plātnīšu skaitu.

53.

Plātnīšu skaits, kā arī jebkurš cits iegūtais mērāmais parametrs, t. i., plātnīšu zonas kopējā platība, saussvars vai svaigsvars, jāapkopo tabulā kopā ar testējamās vielas koncentrācijam katrā mērījumā. Turpmākā datu analīzē, piemēram, lai noteiktu LOEC, NOEC vai ECx, jāpamatojas uz katrā atsevišķā replikāta vērtībām, nevis katras apstrādes grupas aprēķināto vidējo vērtību.