26.9.2019   

LV

Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis

L 247/1


KOMISIJAS REGULA (ES) 2019/1390

(2019. gada 31. jūlijs),

ar kuru, pielāgojot tehnikas attīstībai, groza pielikumu Regulai (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOMISIJA,

ņemot vērā Līgumu par Eiropas Savienības darbību,

ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH), un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, Direktīvu 93/67/EEK, Direktīvu 93/105/EK un Direktīvu 2000/21/EK (1), un jo īpaši tās 13. panta 2. punktu,

tā kā:

(1)

Komisijas Regulā (EK) Nr. 440/2008 (2) ir noteiktas Regulas (EK) Nr. 1907/2006 izpildē izmantojamās testēšanas metodes ķimikāliju fizikālķīmisko īpašību, toksiskuma un ekotoksiskuma noteikšanai.

(2)

Ekonomiskās sadarbības un attīstības organizācija (OECD) izstrādā harmonizētas un starptautiski saskaņotas testēšanas vadlīnijas, kas domātas ķimikāliju testēšanai regulatīviem nolūkiem. OECD regulāri izdod jaunas un pārstrādātas testēšanas vadlīnijas, kurās ņemta vērā zinātnes attīstība šajā jomā.

(3)

Lai ņemtu vērā tehnikas attīstību un pēc iespējas samazinātu eksperimentu vajadzībām izmantoto dzīvnieku skaitu atbilstīgi Regulas (EK) Nr. 1907/2006 13. panta 2. punktam, un tā kā ir pieņemtas attiecīgas OECD testēšanas vadlīnijas, būtu jānosaka divas jaunas testēšanas metodes, ar ko novērtē ekotoksiskumu, un deviņas jaunas testēšanas metodes, ar ko nosaka toksisko iedarbību uz cilvēka veselību, kā arī septiņas testēšanas metodes būtu jāatjaunina. Vienpadsmit no minētajām metodēm attiecas uz in vitro testiem, ar kuriem nosaka ādas un acu kairinājumu/koroziju, ādas sensibilizāciju, genotoksiskumu un ietekmi uz endokrīno sistēmu. Ierosinātie grozījumi ir apspriesti ar ieinteresētajām personām.

(4)

Tāpēc Regula (EK) Nr. 440/2008 būtu attiecīgi jāgroza.

(5)

Šajā regulā noteiktie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi atbilstīgi Regulas (EK) Nr. 1907/2006 133. pantam izveidotā komiteja,

IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.

1. pants

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza saskaņā ar šīs regulas pielikumu.

2. pants

Šī regula stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs.

Briselē, 2019. gada 31. jūlijā

Komisijas vārdā –

priekšsēdētājs

Jean-Claude JUNCKER


(1)  OV L 396, 30.12.2006., 1. lpp.

(2)  Komisijas 2008. gada 30. maija Regula (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) (OV L 142, 31.5.2008., 1. lpp.).


PIELIKUMS

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza šādi:

(1)

Pielikuma B daļā B.4. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.4.   AKŪTS ĀDAS KAIRINĀJUMS/KOROZIJA (KODĪGA IEDARBĪBA UZ ĀDU)

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 404 (2015) aprakstītajam. ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas tiek regulāri pārskatītas, lai nodrošinātu, ka tās atspoguļo zinātnes jaunākās atziņas. Pārskatot ESAO TG Nr. 404, īpaši uzmanīgi tika apsvērts, ko iespējams uzlabot dzīvnieku labturības aspektos, kā arī izvērtēta visa par testējamo ķimikāliju jau esošā informācija, lai nebūtu jāveic lieka testēšana ar laboratorijas dzīvniekiem. Atjauninātajā ESAO TG Nr. 404 (sākotnēji pieņemta 1981. gadā, pārstrādāta 1992., 2002. un 2015. gadā) ir atsauce uz Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion (IATA) (Norādījumu dokuments par integrētām pieejām testēšanai un novērtēšanai attiecībā uz ādas kairinājumu/koroziju) (1), kurā testēšanai attiecībā uz ādas kairinājumu un ādas koroziju ierosināta modulāra pieeja. IATA apraksta vairākus moduļus, kuros tiek grupēti informācijas avoti un analīzes rīki, un, pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un, otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (1). Bez tam attiecīgā gadījumā minētā vadlīnija ieteic sākotnējā in vivo testā trīs kompreses dzīvniekam aplicēt nevis vienlaikus, bet secīgi.

2.

Ādas kairinājuma un korozijas definīcijas sniegtas šīs testēšanas metodes apraksta papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

3.

Tiklab zinātnes kā dzīvnieku labturības interesēs ir neveikt testēšanu in vivo, iekams visi dati, kas relevanti attiecībā uz testējamās ķimikālijas potenciālajām ādai kodīgajām/kairinošajām īpašībām, nav izvērtēti Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Corrosion and Irritation (Norādījumu dokumentā par integrētu pieeju ādas korozijas un kairinājuma testēšanu un novērtēšanu), proti, tā trijās daļās un attiecīgajos moduļos (1) aprakstītajā pierādījumsvara (WoE) analīzē. Īsumā — 1. daļā noteikts, ka esošos datus aplūko septiņos moduļos, kuri aptver datus par cilvēku, in vivo pētījumos iegūtos datus, attiecīgos in vitro datus, datus par fizikālķīmiskajām īpašībām (piem., pH, jo īpaši stiprs skābums vai sārmainums) un datus, kas iegūti ar metodēm, kuras neparedz testēšanu. 2. daļa nosaka, kā izdarāma WoE analīze. Ja WoE analīze joprojām nesniedz skaidrus rezultātus, jāveic 3. daļā aprakstītā papildu testēšana, sākot ar in vitro metodēm, bet in vivo testēšana jāizmanto kā pēdējā iespēja. Tātad šāda analīze mazina nepieciešamību veikt in vivo testēšanu attiecībā uz tādu testējamo ķimikāliju kodīgajām/kairinošajām īpašībām, attiecībā uz kurām par šiem diviem beigupunktiem pietiekami daudz datu jau iegūts citos pētījumos.

IN VIVO TESTA PRINCIPS

4.

Uz eksperimenta dzīvnieku ādas aplicē vienu devu testējamās ķimikālijas. Par kontroli izmanto tā paša testā izmantotā dzīvnieka ādas neskartās daļas. Nosaka kairinājuma/korozijas pakāpi, ko ar noteiktiem starplaikiem nolasa, novērtē ar atzīmēm un ietekmes pilnīgai izvērtēšanai apraksta sīkāk. Pētījuma ilgumam jābūt tādam, lai varētu novērtēt novērotās ietekmes atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu.

5.

Dzīvnieki, kuriem jebkurā testa posmā novērojamas pastāvīgas stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, humāni jānonāvē, un testējamā ķimikālija attiecīgi jānovērtē. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu humāni nonāvēt mirstošus dzīvniekus un dzīvniekus, kam ir smagas ciešanas, sniegti atsevišķā norādījumu dokumentā (2).

SAGATAVOŠANĀS IN VIVO TESTAM

Dzīvnieku sugas izraudzīšanās

6.

Piemērotākais laboratorijas dzīvnieks ir albīnais trusis, un izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Ja izmanto citu sugu dzīvniekus, tas attiecīgi jāpamato.

Dzīvnieku sagatavošana

7.

Apmēram 24 stundas pirms testa dzīvniekiem ķermeņa mugurdaļā rūpīgi nocērpj apmatojumu. Jāraugās ādu nesaskrāpēt un jāizmanto tikai dzīvnieki ar veselu un nebojātu ādu.

8.

Dažām trušu līnijām ir bieza apspalvojuma vietas, kas zināmos gadalaikos kļūst izteiktākas. Šādas vietas, kur apmatojums uz ķermeņa ir ļoti blīvs, testēšanai neizmanto.

Turēšanas un barošanas apstākļi

9.

Dzīvnieki jātur atsevišķi. Eksperimenta trušu telpas temperatūra ir 20 °C (± 3 °C). Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams nepārsniegt 70 %, jāorientējas uz 50–60 %. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas — tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim.

TESTA PROCEDŪRA

Testējamās ķimikālijas aplicēšana

10.

Testējamo ķimikāliju aplicē uz nelielas ādas virsmas platības (apmēram 6 cm2), kuru pārklāj ar marles kompresi, ko piestiprina ar nekairinošu plāksteri. Ja tieša aplicēšana nav iespējama (piem., šķidrumiem vai daļai pastu), testējamo ķimikāliju vispirms pārnes uz marles kompreses, kuru pēc tam aplicē uz ādas. Kompresei jāpieguļ ādai, taču ne blīvi, un to panāk, ekspozīcijas laikā izmantojot attiecīgu puspiegulošu pārsēju. Ja testējamo ķimikāliju pārnes uz kompresi, tā ādai jāpiestiprina tā, lai ķimikālijai ar ādu būtu laba saskare un tā uz ādas būtu sadalīta vienmērīgi. Jāpanāk, ka dzīvnieks kompresei nevar pieskarties, tādējādi izslēdzot iespēju, ka testējamā ķimikālija tiek ieēsta vai ieelpota.

11.

Šķidras testējamās ķimikālijas parasti pārbauda neatšķaidītas. Testējot cietas vielas (kuras, ja uzskata par nepieciešamu, var saberzt pulverī), testējamā ķimikālija jāsamitrina ar mazāko daudzumu ūdens (vai, ja nepieciešams, cita piemērota nesēja), ar ko pietiek, lai panāktu labu saskari ar ādu. Ja ūdens vietā izmanto citus nesējus, testētās ķimikālijas izraisītā ādas kairinājumā nesēja ietekmei, ja tāda vispār ir, jābūt iespējami minimālai.

12.

Ekspozīcijas perioda (parasti četras stundas) beigās testējamās ķimikālijas atliekas no ādas noņem, ja iespējams, ar ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, kas neietekmē izveidojušos atbildreakciju un nebojā epidermu.

Devas līmenis

13.

Uz testa anatomiskās vietas aplicē 0,5 ml šķidruma vai 0,5 g cietas vielas vai pastas.

Sākotnējais tests (ādas kairinājuma/korozijas in vivo tests ar vienu dzīvnieku)

14.

Ja uz pierādījumsvara analīzes vai agrākas in vitro testēšanas pamata par attiecīgo testējamo ķimikāliju nospriests, ka tā ir kodīga, kairinoša vai nav klasificēta, tālāka in vivo testēšana parasti nav vajadzīga. Tomēr, ja tiek uzskatīts, ka vajadzīgi papildu dati, in vivo testu sākotnēji parasti izdara ar vienu dzīvnieku, izmantojot šādu pieeju. Vienam dzīvniekam secīgi aplicē trīs testa kompreses. Pirmo kompresi noņem pēc trim minūtēm. Ja nopietnu ādas reakciju nenovēro, citā vietā aplicē otru kompresi, ko noņem pēc stundas. Ja novērojumi šajā testa posmā liecina, ka ekspozīciju iespējams humāni paildzināt līdz četrām stundām, uzliek trešo kompresi, ko noņem pēc četrām stundām, un novērtē atbildreakciju.

15.

Ja pēc kādas no trim secīgām ekspozīcijām tiek novērota kodīga ietekme, testu nekavējoties beidz. Ja pēc pēdējās kompreses noņemšanas kodīgu ietekmi nenovēro, dzīvnieku novēro vēl 14 dienas, ja vien korozija neizveidojas jau pirms šā laika beigām.

16.

Ja netiek gaidīts, ka testējamā ķimikālija būs kodīga, bet tā var būt kairinoša, vienam dzīvniekam uz četrām stundām aplicē vienu kompresi.

Apstiprinošs tests (ādas kairinājuma in vivo tests, kurā izmanto papildu dzīvniekus)

17.

Ja sākotnējā testā kodīga ietekme nav novērota, kairinājuma atbildreakcija vai tās neesība jāapstiprina, izmantojot ne vairāk kā divus papilddzīvniekus, kuriem katram aplicē vienu kompresi, ko tur četras ekspozīcijas stundas. Ja sākotnējā testā novērota kairinoša ietekme, apstiprinājuma testu var veikt secīgi vai divus papildzīvniekus eksponējot vienlaicīgi. Izņēmuma gadījumā, kur sākotnējs tests netiek veikts, diviem vai trijiem dzīvniekiem aplicē vienu kompresi, ko noņem pēc četrām stundām. Ja izmanto divus dzīvniekus un atbildreakcija abiem ir vienāda, turpmāka testēšana nav nepieciešama. Pretējā gadījumā jāveic testi ar vēl vienu dzīvnieku. Neskaidru reakciju izvērtēšanai var būt nepieciešams izmantot papildu dzīvniekus.

Novērošanas periods

18.

Ar novērošanas periodu jāpietiek, lai varētu pilnīgi izvērtēt novērotās ietekmes atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču eksperiments vienmēr jāpārtrauc jebkurā brīdī, kad dzīvniekiem parādās pastāvīgu smagu sāpju vai ciešanu pazīmes. Lai novērtētu ietekmes atgriezeniskumu, pēc komprešu noņemšanas dzīvnieki vēl līdz 14 dienas ilgi jānovēro. Ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 14 dienu perioda beigām, eksperiments tajā brīdī jābeidz.

Klīniskie novērojumi un ādas reakciju pakāpes

19.

Visiem dzīvniekiem eritēmas un tūskas pazīmes jāpārbauda un atbildreakcija ar atzīmi jānovērtē 60 minūtes pēc tampona noņemšanas un vēl pēc 24, 48 un 72 stundām. Sākotnējā testā ar vienu dzīvnieku tūlīt pēc kompreses noņemšanas apskata arī testa anatomisko vietu. Ādas reakcijas novērtē pa pakāpēm un reģistrē pēc zemāk dotās pakāpju tabulas. Ja ir ādas bojājums, ko pēc 72 stundām nevar identificēt par kairinājumu vai koroziju, tad, lai noteiktu, vai ietekme ir atgriezeniska, novērošana var būt jāturpina līdz 14. dienai. Papildus kairinājuma novērojumam pilnīgi jāraksturo un jāreģistrē arī jebkāda tāda lokāla toksiska ietekme kā ādas attaukošanās un jebkāda sistēmiski kaitīga ietekme (piem., ietekme uz toksiskuma klīniskajām pazīmēm un ķermeņa masas pārmaiņām). Jāapsver, vai neskaidru atbildreakciju precizēšanai neveikt histopatoloģiskus izmeklējumus.

20.

Ādas reakciju iedalīšana pakāpēs neizbēgami ir subjektīva. Lai veicinātu ādas reakciju pakāpju saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītam par izmantojamo atzīmju sistēmu (sk. tabulu zemāk). Var noderēt ilustrēti norādījumi par ādas kairinājuma un citu bojājumu pakāpēm (3).

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

21.

Pētījuma rezultāti testēšanas galīgajā pārskatā jāapkopo tabulas veidā, aptverot visus 24. punkta sarakstā norādītos jautājumus.

Rezultātu izvērtēšana

22.

Ādas kairinājuma novērtējuma atzīmes jāizvērtē kopsakarā ar bojājumu dabu un smagumu un to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētās novērtējuma atzīmes nav absolūts materiāla kairinošo īpašību standarts, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla cita veida ietekme. Individuālās novērtējuma atzīmes būtu uzskatāmas par bāzesvērtībām, kuras jāizvērtē kombinācijā ar visiem citiem pētījumā veiktajiem novērojumiem.

23.

Kairinājuma atbildreakcijas izvērtēšanā jāņem vērā, vai ādas bojājumi ir atgriezeniski. Ja tādas reakcijas kā apmatojuma zaudējums (ierobežotā platībā), hiperkeratoze (ādas pārragošanās), hiperplāzija un plaisāšana saglabājas līdz 14 dienu ilga novērošanas perioda beigām, testējamā ķimikālija jāuzskata par kairinošu.

Testēšanas pārskats

24.

Testēšanas pārskatā jānorāda šāda informācija.

 

In vivo testēšanas pamatojums:

jau esošu testēšanas datu, arī ar secīgas testēšanas stratēģiju iegūtu rezultātu pierādījumsvara analīze;

relevantu agrākā testēšanā iegūtu datu apraksts;

katrā testēšanas stratēģijas posmā iegūtie dati;

izdarīto in vitro testu apraksts, arī detalizēta informācija par procedūrām un ar testējamajām vielām un standartvielām iegūtajiem rezultātiem;

in vivo pētījuma veikšanai nepieciešamā pierādījumsvara analīze.

 

Testējamā ķimikālija:

vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. c.;

daudzkomponentu vielas, maisījumi un vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kuras ir kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli (UVCB): iespējami izsmeļoši raksturotas pēc to komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām;

izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;

avots, no kura dzīvnieki saņemti, sērijas numurs, ja zināms;

testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana) ja tāda veikta;

testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;

glabāšanas apstākļi.

 

Nesējs:

identifikācija, koncentrācija (attiecīgā gadījumā), izmantotais tilpums;

nesēja izraudzīšanās pamatojums.

 

Testa dzīvnieks (dzīvnieki):

izmantotais celms/līnija, izraudzīšanās pamatojums gadījumos, kur neizmanto albīnos trušus;

katra dzimuma dzīvnieku skaits;

katra dzīvnieka masa testa sākumā un beigās;

vecums pētījuma sākumā;

avots, no kura dzīvnieki saņemti, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.

 

Testēšanas nosacījumi:

kompreses vietas sagatavošanas paņēmiens;

detalizēta informācija par izmantotajiem kompreses materiāliem un kompreses uzlikšanas paņēmienu;

detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas sagatavošanu, aplicēšanu un noņemšanu.

 

Rezultāti:

tabulā apkopotas atzīmes par katram dzīvniekam novēroto kairinājuma/korozijas veida atbildreakciju visos mērītajos laika punktos;

visu novēroto bojājumu apraksts;

stāstījumveida apraksts par novērotā kairinājuma vai korozijas dabu un pakāpi un jebkādi histopatoloģiski konstatējumi;

papildus ādas kairinājuma vai korozijas aprakstam — apraksts par vēl citu nelabvēlīgu vietēju (piem., ādas attaukošanās) vai sistēmisku ietekmi.

 

Rezultātu iztirzājums

 

Secinājumi

LITERATŪRA

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organistion for Economic Cooperation and Development, Paris.

Tabula

Ādas reakcijas klasificēšana

Eritēmas nav…

0

Ļoti neliela eritēma (tikko manāma)…

1

Labi saskatāma eritēma…

2

Vidēja līdz smaga eritēma…

3

Smaga eritrēma (liellopa gaļas sarkanums) ar izveidojušos nekrotisku kreveli, kas liedz iespēju noteikt eritēmas pakāpi…

4

Maksimālie iespējamie punkti: 4

Tūskas nav…

0

Ļoti neliela tūska (tikko manāma)…

1

Neliela tūska (skarto vietu viegli noteikt pēc izteikta pietūkuma)…

2

Vidēja tūska (pietūkums apm. 1 mm)…

3

Smaga tūska (pietūkums vairāk nekā 1 mm, arī aiz eksponētā ādas laukuma)…

4

Maksimālie iespējamie punkti: 4

Neskaidras atbildreakcijas var precizēt ar histopatoloģiskiem izmeklējumiem.

Papildinājums

DEFINĪCIJAS

Ķimikālija ir viela vai maisījums.

Ādas kairinājums ir atgriezenisks ādas bojājums, kas rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz laiku līdz četrām stundām.

Ādas korozija ir neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar zemādu un rodas, testējamo ķimikāliju uz ādas aplicējot līdz četrām stundām. Reakcijām uz kodīgumu parasti ir raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.

Testējamā ķimikālija ir jebkura viela vai maisījums, ko testē ar šo testēšanas metodi.;

(2)

Pielikuma B daļā B.17. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.17.   ZĪDĪTĀJU ŠŪNU GĒNU MUTĀCIJU IN VITRO TESTI AR GĒNIEM HPRT UN XPRT

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 476 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, mainīgo regulatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Šī pašreizējā pārstrādātā TM B.17 versija atspoguļo gandrīz trīsdesmitgadīgu pieredzi šā testa veikšanā un arī rezultātus, kas gūti, izstrādājot atsevišķu jaunu metodi zīdītāju šūnu gēnu mutāciju in vitro testiem, kuros izmanto timidīna kināzes gēnu. TM B.17 pieder pie ģenētiski toksikoloģiskās testēšanas metožu sērijas. ESAO izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par jaunākajiem ESAO genotoksicitātes testēšanas vadlīnijas grozījumiem (1).

2.

Šā zīdītāju šūnu gēnu mutāciju in vitro testa nolūks ir detektēt ķimikāliju izraisītas gēnu mutācijas. Ar šajos testos izmantotajām šūnu līnijām mēra turpvērstas mutācijas, kas notiek ar reportiergēniem — endogēnisko hipoksantīna–gvanīna fosforiboziltransferāzes gēnu (grauzēju šūnu Hprt, cilvēka šūnu HPRT; šajā testēšanas metodes aprakstā tie apvienoti saukti par gēnu Hprt un HPRT testu) un ksantīna–gvanīna fosforiboziltransferāzes transgēnu (gpt) (tas saukts par XPRT testu). HPRT un XPRT mutāciju testi detektē dažāda spektra ģenētiskus notikumus. Papildus ar šo HPRT testu detektētajiem mutatīvajiem notikumiem (piem., bāzu pāra maiņas mutācijām, nolasīšanas fāzes nobīdēm, mazām delēcijām un insercijām) transgēna gtp autosomālā lokalizācija var dot iespēju detektēt mutācijas, kas radušās no lielām HRPT testā nedetektētām delēcijām un varbūt arī mitotiskām rekombinācijām, jo gēns Hprt atrodas X hromosomā (2) (3) (4) (5) (6) (7). Regulatīviem nolūkiem pašlaik XPRT izmanto mazāk nekā HPRT testu.

3.

Izmantotās definīcijas ir sniegtas 1. pielikumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

4.

In vitro testos metaboliskai aktivācijai parasti jāizmanto eksogēnisks avots. Eksogēniskā metaboliskās aktivācijas sistēma in vivo apstākļus atdarina nepilnīgi.

5.

Būtu jāraugās, lai nerodas tādi apstākļi (proti, varbūtēja mijiedarbība ar testēšanas sistēmu), kas novestu pie artefaktuāli pozitīviem rezultātiem, kurus nerada tieša testējamo ķimikāliju un šūnas ģenētiskā materiāla mijiedarbība; pie tādiem apstākļiem pieder arī pH vai osmolalitātes pārmaiņas (8) (9) (10), mijiedarbība ar barotnes komponentiem (11) (12) vai pārāk augsti citotoksicitātes līmeņi (13). HPRT testā par pārāk augstiem uzskata līmeņus, kas pārsniedz 19. punktā definētos ieteicamos augšējos citotoksicitātes līmeņus.

6.

Pirms šo testēšanas metodi izmanto attiecībā uz maisījumu, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga.

TESTA PRINCIPS

7.

Mutantšūnas, kurām Hprt fermenta darbība HPRT testā vai xprt fermenta darbība XPRT testā neizpaužas, ir rezistentas pret purīna analoga 6-tiogvanīna (TG) citostatisko ietekmi. Hprt (HPRT testā) vai gpt (XPRT testā) standartšūnas ir jutīgas pret TG, kurš inhibē šūnu vielmaiņu un šūnām aptur tālāku dalīšanos. Tātad mutantšūnas TG klātbūtnē spēj proliferēt, turpretī normālas šūnas, kas satur Hprt (HPRT testā) vai gpt (XPRT testā) fermentu, to nespēj.

8.

Šūnas, kas ir suspensijā vai vienslāņa kultūrās, uz piemērotu laiku (3–6 stundām) gan ar eksogēnisku metaboliskas aktivācijas avotu, gan bez tā (sk. 14. punktu) eksponē testējamajai ķimikālijai, bet pēc tam kultivē apakškultūrās, lai varētu noteikt citotoksicitāti un lai pirms mutantu atlasīšanas varētu notikt fenotipiskā ekspresija (14), (15), (16), (17). Citotoksicitāti nosaka pēc relatīvās izdzīvotības (RS), t. i., pēc klonēšanās efektivitātes, ko izmēra tūlīt pēc apstrādes un koriģē attiecībā uz jebkādiem apstrādes laikā notikušiem šūnu zudumiem salīdzinājumā ar negatīvo kontroli (18. punkts un 2. papildinājums). Kultūras, kas apstrādātas, barotnē tur pietiekami ilgu laiku (katra veida šūnām tas ir savs), lai būtu iespējama gandrīz optimāla izraisīto mutāciju fenotipiskā ekspresija (parasti vismaz 7–9 dienas). Kad notikusi fenotipiskā ekspresija, nosaka mutantu biežumu, noteiktu skaitu šūnu izsējot tādā barotnē, kas satur selektīvo līdzekli, ar kuru detektē mutantu kolonijas, un barotnē bez selektīvā līdzekļa, pēc kuras nosaka klonēšanās efektivitāti (dzīvotspēju). Pēc piemērota inkubēšanas laika kolonijas saskaita. Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantu koloniju skaita, ko koriģē atbilstoši klonēšanās efektivitātei mutantu selekcijas laikā.

METODES APRAKSTS

Preparāti

Šūnas

9.

HPRT un XPRT testiem jāizmanto tādu tipu šūnas, kam apliecināts jutīgums pret ķīmiskiem mutagēniem, augsta klonēšanās efektivitāte, stabils kariotips un stabils spontānu mutantu biežums. Pie HPRT testam visbiežāk izmantotajām šūnām pieder Ķīnas kāmja šūnu CHO, CHL un V79 līnija, peļu limfomas šūnas L5178Y un cilvēka limfoblastu šūnas TK6 (18) (19). No CHO atvasinātās šūnas AS52, kam ir transgēns gpt (bet gēns Hprt ir deletēts), izmanto XPRT testā (20) (21); HPRT testu ar šūnām AS52 nevar veikt, jo hprt gēni ir deletēti. Citu šūnu līniju izmantošana jāpamato un jāvalidē.

10.

Šūnu līnijām regulāri jāpārbauda, vai modālais hromosomu skaits ir stabils un vai nav notikusi kontaminācija ar mikoplazmu (22) (23), un, ja konstatē mikoplazmu vai ja modālais hromosomu skaits ir mainījies, šūnas nav izmantojamas. Jānosaka, kāds ir testēšanas laboratorijā izmantoto šūnu normālais cikla ilgums, un tam jāsakrīt ar publicētajiem šūnu raksturlielumiem. Jāpārbauda arī spontāno mutantu biežums šūnu izejkultūrā, un, ja tas nav pieņemams, kultūra nav izmantojama.

11.

Pirms kultūras izmanto šajā testā, tās var būt jāattīra no jau esošām mutantšūnām, piem., HPRT testa vajadzībām kultivējot HAT barotnē, bet XPRT testa vajadzībām — MPA barotnē (5) (24) (sk. 1. papildinājumu). Attīrītās šūnas iespējams saglabāt krioniski un pēc tam atkausēt, lai izmantotu par darba kultūrām. Tikko atkausētu darba kultūru var sākt testam izmantot, kad sasniegts parastais dubultošanās laiks. Izdarot XPRT testu, parastas šūnu AS52 kultūras gadījumā būtu jāizmanto apstākļi, kas garantē transgēna gpt saglabāšanos (20).

Barotne un kultivēšanas apstākļi

12.

Kultūru uzturēšanai jāizmanto attiecīgas barotnes un attiecīgi inkubācijas apstākļi (kultivēšanas trauki, mitrināta atmosfēra ar CO2 koncentrāciju 5 %, inkubācijas temperatūra 37 °C). Šūnu kultūras vienmēr būtu jātur tādos apstākļos, lai būtu nodrošināts, ka augšana notiek eksponenciālā fāzē. Īpaši svarīgi ir izraudzīties tādu barotni un tādus kultivēšanas apstākļus, kuri nodrošina šūnu optimālu augšanu ekspresijas periodā un gan mutantšūnām, gan nemutējušām šūnām — optimālu klonēšanās efektivitāti.

Kultūru sagatavošana

13.

Šūnu līnijas tiek pavairotas no izejkultūrām, ko kultūras barotnē iesēj tādā blīvumā, lai apstrādes periodā un ekspresijas periodā šūnas suspensijās vai vienslāņa kultūrās joprojām augtu eksponenciāli (piem., attiecībā uz šūnām vienslāņa kultūrās jāizvairās no konfluences).

Metaboliskā aktivācija

14.

Ja strādā ar šūnām, kuru endogēniskā metaboliskā kapacitāte nav pietiekama, jāizmanto eksogēniskas metaboliskās aktivācijas sistēmas. Visplašāk izmantotā sistēma, kuru iesaka pēc noklusējuma, ja vien nav pamata izmantot citu, ir ar kofaktoru papildināta postmitohondriālā frakcija (S9) no grauzēju (parasti žurku) aknām, kas apstrādātas ar tādām fermentus inducējošām vielām kā Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) vai fenobarbitāls kombinācijā ar β-naftoflavonu (29) (30) (31) (32). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgajiem organiskajiem piesārņotājiem (33) un jauktas funkcijas oksidāžu inducēšanā izrādījusies tikpat iedarbīga kā Aroclor 1254 (29) (31). S9 frakciju parasti izmanto koncentrācijā 1–2 % (tilp./tilp.), bet galīgajā testa barotnē koncentrāciju var paaugstināt līdz 10 % (tilp./tilp.). To, kādu eksogēniskās metaboliskās aktivācijas sistēmas vai metaboliskā inducētāja veidu un koncentrāciju izraugās, var ietekmēt testējamo vielu klase (34) (35) (36).

Testējamās ķimikālijas sagatavošana

15.

Cietas testējamās ķimikālijas jāsagatavo attiecīgos šķīdinātājos un attiecīgā gadījumā pirms šūnu apstrādes jāatšķaida (sk. 16. punktu). Šķidras testējamās ķimikālijas var testa sistēmai pievienot tieši un/vai pirms testa sistēmas apstrādes atšķaidīt. Gāzveida vai gaistošas testējamās ķimikālijas vēlams testēt pēc attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtos kultivēšanas traukos (37) (38). Testējamās ķimikālijas preparāti jāpagatavo tieši pirms apstrādes, ja vien dati par stabilitāti neliecina, ka tos var glabāt.

TESTA APSTĀKĻI

Šķīdinātāji

16.

Šķīdinātājs jāizvēlas tā, lai testējamo ķimikāliju šķīdību optimizētu, šķīdinātājam negatīvi neietekmējot testa norisi, piem., nemainot šūnu augšanu, neskarot testējamās ķimikālijas integritāti, nereaģējot ar kultivēšanas traukiem, nepasliktinot metaboliskās aktivācijas sistēmu. Ja vien iespējams, ieteicams vispirms apsvērt, vai neizmantot šķīdinātāju (vai kultūras barotni) uz ūdens bāzes. Plaši atzīti šķīdinātāji, piemēram, ir ūdens un dimetilsulfoksīds. Galīgajā apstrādes barotnē organiskajiem šķīdinātājiem parasti nevajadzētu pārsniegt 1 % (tilp./tilp.), bet šķīdinātājiem uz ūdens bāzes (sālsūdens vai ūdens) — 10 % (tilp./tilp.). Ja tiek izmantoti ne tik plaši atzīti šķīdinātāji (piem., etanols vai acetons), to izmantošana jāpamato ar datiem, kas apliecina, ka tie sader ar testējamo ķimikāliju un ar testa sistēmu un ka izmantotajā koncentrācijā tiem nepiemīt genotoksicitāte. Ja šādu apliecinošu datu nav, svarīgi ir izmantot arī neapstrādātas kontroles (sk. 1. papildinājumu), lai ar tām pierādītu, ka izraudzītais šķīdinātājs nerada nekādu deletējošu vai mutagēnisku ietekmi.

Citotoksicitātes mērīšana un ekspozīcijas koncentrāciju izraudzīšanās

17.

Nosakot augstāko testējamās ķimikālijas koncentrāciju, neizraugās koncentrācijas, kas spēj izraisīt tādas artefaktuāli pozitīvas atbildreakcijas kā pārmērīga citotoksicitāte (sk. 20. punktu), nogulsnes barotnē (sk. 21. punktu) vai manāmas pH vai osmolalitātes pārmaiņas (sk. 5. punktu). Ja testējamā ķimikālija pievienošanas brīdī manāmi maina barotnes pH, lai nepieļautu artefaktuāli pozitīvus rezultātus un saglabātu pienācīgus kultivēšanas apstākļus, pH var koriģēt, galīgajā apstrādes barotnē pievienojot buferšķīdumu.

18.

Koncentrācijas izraugās pēc citotoksicitātes un citiem apsvērumiem (sk. 20.–22. punktu). Kaut arī citotoksicitātes izvērtēšana sākotnējā testā var noderēt, lai sekmīgāk noteiktu galvenajā eksperimentā izmantojamās koncentrācijas, sākotnējais tests nav jāveic obligāti. Pat ja citotoksicitāte izvērtēta jau no sākuma, galvenajā eksperimentā tā joprojām jānosaka katrai kultūrai. Citotoksicitāti izvērtē pēc RS, proti, pēc to šūnu klonēšanās efektivitātes (CE), kuras tūlīt pēc apstrādes uzsētas uz platēm, CE koriģējot pēc negatīvo kontroļu (kurām izdzīvotība ir 100 %) klonēšanās efektivitātes, sk. formulu 2. papildinājumā.

19.

Jāizvērtē vismaz četras testa koncentrācijas (nerēķinot šķīdinātāju un pozitīvās kontroles), kas atbilst pieņemamības kritērijiem (attiecīga citotoksicitāte, šūnu skaits u. c.). Lai gan ir ieteicams izmantot kultūru dublikātus, ar katru testa koncentrāciju var izmantot vai nu replikātus, vai atsevišķas apstrādātas kultūras. Ar vienas noteiktas koncentrācijas atsevišķajām replikātu kultūrām iegūtie rezultāti pārskatā būtu jāatspoguļo atsevišķi, bet datu analīzes vajadzībām tos drīkst apkopot (17). Attiecībā uz testējamām ķimikālijām, ar kurām tiek uzrādīta neliela citotoksicitāte vai tās nav, parasti noderēs koncentrācijas intervāli ar koeficientu aptuveni no 2 līdz 3. Citotoksicitātes gadījumā izraudzītajām testa koncentrācijām jāaptver gan koncentrācijas, kuras rada citotoksicitāti, gan koncentrācijas, ar kurām citotoksicitāte ir vidēja, neliela vai tās vispār nav. Daudzām testējamajām ķimikālijām ir novērojama stāva koncentrācijatkarīgās atbildreakcijas līkne, un, lai aptvertu visu citotoksicitātes diapazonu vai lai detalizēti izpētītu devas un atbildreakcijas sakarību, var būt nepieciešams izmantot koncentrācijas ar tuvākiem intervāliem un vairāk nekā četras koncentrācijas, jo īpaši situācijās, kur eksperiments jāatkārto (sk. 43. punktu). Izmantot vairāk nekā 4 koncentrācijas var būt īpaši svarīgi, ja jāizmanto atsevišķas kultūras.

20.

Ja maksimālās koncentrācijas pamatā ir citotoksicitāte, ar augstāko koncentrāciju būtu jācenšas panākt RS diapazonā no 20–10 %. Piesardzīgi būtu jāinterpretē pozitīvi rezultāti, kas konstatēti tikai ar RS 10 % vai zemāku (43. punkts).

21.

Kas attiecas uz mazšķīstošām testējamām ķimikālijām, kuras pie koncentrācijām, kas zemākas par zemāko nešķīstošās frakcijas koncentrāciju, nav citotoksiskas, pie augstākās analizētās koncentrācijas pēc apstrādes ar testējamo ķimikāliju jārodas ar neapbruņotu aci vai ar invertēto mikroskopu redzamai duļķainībai vai nogulsnēm. Pat ja citotoksicitāte novērojama pie koncentrācijas, kas pārsniedz zemāko nešķīstošās frakcijas koncentrāciju, ieteicams testēt tikai vienu koncentrāciju, pie kuras rodas duļķainība vai acīm redzamas nogulsnes, jo nogulsnes var rezultātus ietekmēt artefaktuāli. Darbojoties ar koncentrāciju, pie kuras rodas nogulsnes, būtu jācenšas nodrošināt, ka nogulsnes neietekmē testa izdarīšanu. Var būt lietderīgi pirms eksperimenta noteikt šķīdību kultūras barotnē.

22.

Ja nogulsnes vai ierobežojoša citotoksicitāte netiek novēroti, augstākajai testa koncentrācijai jāatbilst 10 mM, 2 mg/ml vai 2 μl/ml atkarībā no tā, kura ir zemāka (39) (40). Ja testējamās ķimikālijas sastāvs nav noteikts, piem., tā ir viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, tā ir komplekss reakcijas produkts vai bioloģisks materiāls (t.i., ķīmiska viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs (UVCB)), (41), vides ekstrakti u. tml., gadījumos, kur netiek novērota pietiekama citotoksicitāte, augstākā koncentrācija var būt jāpalielina (piem, 5 mg/mL), lai būtu panākta augstāka katra komponenta koncentrācija. Tomēr jāpiebilst, ka attiecībā uz cilvēku zālēm šīs prasības var būt citādas (42).

Kontroles

23.

Paralēlas negatīvās kontroles (sk. 16. punktu), proti, tikai šķīdinātājs apstrādes barotnē, ar ko rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādātajām kultūrām, ir ikviena eksperimenta nosacījums.

24.

Lai varētu pierādīt laboratorijas spēju izmantotā testa protokola apstākļos identificēt mutagēnus un — attiecīgā gadījumā — eksogēniskās metaboliskās aktivācijas sistēmas efektivitāti, ir vajadzīgas paralēlas pozitīvās kontroles. Pozitīvo kontroļu piemēri sniegti zemāk 1. tabulā. Var izmantot alternatīvas pozitīvās kontrolvielas, ja tas pamatoti. Tā kā ģenētiski toksikoloģiskie zīdītāju šūnu in vitro testi ir pietiekami standartizēti, testus, kuros izmanto apstrādi ar eksogēnisku metabolisku aktivāciju un bez tās, drīkst izdarīt tikai ar pozitīvu kontroli, kas prasa metabolisku aktivāciju. Šajā gadījumā viena vienīga pozitīva kontroles atbildreakcija apliecinās gan metaboliskās aktivācijas sistēmas darbību, gan testa sistēmas reaģētspēju. Lai pierādītu testa sistēmas jutīgumu, katra pozitīvā kontrole būtu jāizmanto ar vienu vai vairākām tādām koncentrācijām, ar kurām gaidāma reproducējama un detektējama palielināšanās salīdzinājumā ar fonu, turklāt atbildreakciju nedrīkstētu kompromitēt citotoksicitāte, kas pārsniedz šai testēšanas metodei specificētās robežas (sk. 20. punktu).

1. tabula

References ķimikālijas, ko ieteicams izmantot laboratorijas kompetences novērtēšanai un pozitīvo kontroļu izraudzīšanās vajadzībām

Nosacījums attiecībā uz metabolisko aktivāciju

Lokuss

Viela un CAS numurs

Eksogēniska metaboliska aktivācija nenotiek

Hprt

Etilmetānsulfonāts [CAS Nr. 62-50-0] Etilnitrozurea [CAS Nr. 759-73-9] 4-nitrohinolīna 1-oksīds [CAS Nr. 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrīns [CAS Nr. 3930-19-6] Mitomicīns C [CAS Nr. 50-07-7]

Ar eksogēnisku metabolisku aktivāciju

Hprt

3-metilholantrēns [CAS Nr. 56-49-5] 7,12-dimetilbenzantracēns [CAS Nr. 57-97-6] Benz[a]pirēns [CAS Nr. 50-32-8]

 

xprt

Benz[a]pirēns [CAS Nr. 50-32-8]

PROCEDŪRA

Apstrāde ar testējamo ķimikāliju

25.

Proliferējošas šūnas ar testējamo ķimikāliju apstrādā gan metaboliskās aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Ekspozīcijai jāilgst attiecīgu laiku (parasti pietiek ar 3–6 stundām).

26.

Minimālais šūnu skaits, ko izmanto katrai testa kultūrai (gan kontrolkultūrai, gan apstrādātai kultūrai), katrā testa posmā jābalsta uz spontāno mutantu biežumu. Vispārīgs princips ir šūnas apstrādāt un pasāžām ņemt tādā skaitā, lai visās testa fāzēs katrā kultūrā saglabātos vismaz 10 spontāni mutanti (17). Parasti spontāno mutantu biežums ir 5–20 × 10-6. Lai spontāno mutantu biežums būtu 5 × 10-6 un lai pietiekams spontāno mutantu skaits (10 vai vairāk) saglabātos arī kultūrās, ko apstrādes laikā apstrādā ar koncentrācijām, kuras rada 90 % citotoksicitāti (10 % RS), jāapstrādā vismaz 20 × 106 šūnas. Turklāt pietiekamā skaitā (bet nekādā gadījumā mazāk par 2 miljoniem) jābūt arī šūnām, ko kultivē ekspresijas periodā un mutantu selekcijas nolūkā uzsēj uz platēm (17).

Fenotipiskās ekspresijas laiks un mutantu biežuma mērīšana

27.

Pēc apstrādes perioda šūnas kultivē, lai izpaustos mutantu fenotips. Lai notiktu gandrīz optimāla jauninducētu Hprt un xprt mutantu fenotipiskā ekspresija, parasti pietiek ar minimālo laiku 7 līdz 9 dienas (43) (44). Šajā periodā pastāvīgi veido šūnu apakškultūras, lai visu laiku saglabātos eksponenciāla augšana. Kad fenotipiskā ekspresija notikusi, šūnas pārsēj barotnē ar selektīvo līdzekli (6-tiogvanīnu) un bez tā, lai attiecīgi varētu noteikt mutantu skaitu un klonēšanās efektivitāti selekcijas laikā. Šajā pārsēšanā vienslāņa kultūrām var izmantot trauciņus, bet šūnām suspensijā — mikroiedobju plates. Mutantu selekcijas vajadzībām šūnas jāuzsēj tādā blīvumā, lai būtu garantēta optimāla mutantu izguve (proti, lai nevarētu notikt metaboliska sadarbība) (17). Plates inkubē optimālai koloniju augšanai atbilstošu laiku (piem., 7–12 dienas) un kolonijas saskaita. Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantu koloniju skaita, ko koriģē atbilstoši klonēšanās efektivitātei mutantu selekcijas laikā (formulas sk. 2. papildinājumā).

Laboratorijas kompetence

28.

Lai pirms testa pastāvīgas izmantošanas iegūtu pietiekamu vajadzīgo pieredzi, laboratorijai jābūt veikušai eksperimentu sēriju ar pozitīvās kontroles references vielām, kam ir dažādi iedarbības mehānismi (tās izraugās no 1. tabulas saraksta un vismaz vienai no tām jābūt tādai, kas ir aktīva ar metabolisku aktivāciju, un vienai — aktīvai bez tās), un ar dažādām negatīvajām kontrolēm (izmantojot dažādus šķīdinātājus/nesējus). Šo pozitīvo un negatīvo kontroļu atbildreakcijām jāsaskan ar literatūras datiem. Tas neattiecas uz laboratorijām, kurām pieredze jau ir, t. i., kuru rīcībā ir vēsturiska datubāze, kāda aprakstīta 30.–33. punktā.

29.

Lai varētu pierādīt, ka laboratorija ir kompetenta detektēt mutagēniskas ķimikālijas, noteikt metaboliskās aktivācijas sistēmas darbībspēju un pierādīt, ka šūnu augšanas apstākļi apstrādes laikā, fenotipiskā ekspresija un mutantu selekcija, kā arī atzīmju likšanas procedūras atbilst vajadzīgajam, pozitīvas kontroles vielu (sk. 1. tabulu 25. punktā) izlase jāpēta gan bez metaboliskas aktivācijas, gan ar to. Lai varētu pierādīt testa sistēmas jutību un dinamisko diapazonu, jāizraugās tāds izlases ķimikāliju koncentrāciju diapazons, kurā pieaugumi virs fona līmeņa būs reproducējami un ar koncentrāciju saistīti.

Vēsturisko kontroļu dati

30.

Laboratorijai jānosaka:

vēsturisks pozitīvo kontroļu diapazons un sadalījums,

vēsturisks negatīvo (neapstrādātu, ar šķīdinātāju) kontroļu diapazons un sadalījums.

31.

Pirmo reizi iegūstot datus par vēsturisku negatīvo kontroļu sadalījumu, paralēlām negatīvajām kontrolēm jāatbilst publicētajiem datiem par kontrolēm (22). Kontroļu sadalījumam tiekot papildinātam ar jauniem eksperimentu datiem, paralēlajām negatīvajām kontrolēm ideālā gadījumā jābūt minētā sadalījuma 95 % kontrolrobežās (17) (45) (46).

32.

Laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāze sākotnēji jāveido ar vismaz 10 eksperimentiem, bet vēlams, lai tajā būtu vismaz 20 eksperimenti, kas veikti salīdzināmos eksperimentēšanas apstākļos. Lai varētu noteikt, cik mainīgi ir laboratorijas pozitīvo un negatīvo kontroļu dati, un parādīt, ka laboratorijā šī metodika “tiek kontrolēta” (46), laboratorijām jāizmanto tādas kvalitātes kontroles metodes kā kontroldiagrammas (piem., C diagrammas vai X joslu diagrammas (47)). Papildu ieteikumi par vēsturisko datu izveidi un izmantošanu (t. i., kritēriji datu iekļaušanai vēsturiskajos datos un izslēgšanai no tiem un konkrēta eksperimenta pieņemamības kritēriji) atrodami literatūrā (45).

33.

Negatīvo kontroļu datiem vajadzētu būt mutantu biežumam atsevišķās vai, ieteicams, replikātu kultūrās; sk. aprakstu 23. punktā. Paralēlajām negatīvajām kontrolēm ideālā gadījumā jābūt laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāzes sadalījuma 95 % kontrolrobežās (17) (45) (46). Tādus paralēlo negatīvo kontroļu datus, kas ir ārpus 95 % kontrolrobežas, iekļaušanai vēsturiskajā kontroļu sadalījumā var pieņemt tikai tad, ja šie dati nav pārmērīgi anomālas vērtības un ja ir pierādījumi, ka testa sistēma “tiek kontrolēta” (sk. augstāk) un nav gadījusies ne tehniska kļūme, ne cilvēka kļūda.

34.

Jebkādas eksperimenta protokola pārmaiņas jāapsver, ņemot vērā to atbilstību laboratorijas esošajām vēsturisko kontroļu datubāzēm. Jebkādu būtisku neatbilstību gadījumā jāveido jauna vēsturisko kontroļu datubāze.

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Rezultātu izklāsts

35.

Rezultātu izklāstā jāiekļauj visi citotoksicitātes aprēķināšanai vajadzīgie dati (izteikti kā RS). Gan datos par apstrādātajām kontrolēm, gan par kontrolkultūrām jāiekļauj šūnu skaits pēc apstrādes beigām, tūlīt pēc apstrādes uzsēto šūnu skaits un koloniju skaitīšanas rezultāti (vai attiecībā uz mikroiedobju metodi — tādu iedobju skaits, kurās koloniju nav). Katras kultūras RS ieteicams izteikt kā procentu attiecībā pret paralēlo šķīdinātāja kontroli (definīcijas sk. 1. papildinājumā).

36.

Rezultātu izklāstā jāiekļauj visi mutantu biežuma aprēķināšanai vajadzīgie dati. Gan datos par apstrādātajām kultūrām, gan datos par kontrolkultūrām jāiekļauj: 1) gan ar selekcijas līdzekli, gan bez tā uz platēm uzsēto šūnu skaits (brīdī, kad šūnas uzsēj mutantu selekcijai) un 2) gan attiecībā uz platēm ar selektīvo līdzekli, gan platēm bez selektīvā līdzekļa — saskaitīto koloniju skaits (vai attiecībā uz mikroiedobju metodi, tādu iedobju skaits, kurās koloniju nav) Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantu koloniju skaita (uz platēm ar selektīvu līdzekli), kas koriģēts atbilstoši klonēšanās efektivitātei (uz platēm bez selekcijas līdzekļa). Mutantu biežums būtu jāizteic kā mutantšūnu skaits uz miljonu dzīvotspējīgu šūnu (definīcijas sk. 1. papildinājumā).

37.

Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Turklāt visus datus apkopo tabulas veidā.

Pieņemamības kritēriji

38.

Testa pieņemamības pamatā ir šādi kritēriji:

paralēlā negatīvā kontrole tiek uzskatīta par pieņemamu iekļaušanai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāzē saskaņā ar 33. punktu;

paralēlās pozitīvās kontroles (sk. 24. punktu) inducē atbildreakcijas, kas atbilst tām, kuras ģenerētas vēsturiskajā pozitīvo kontroļu datubāzē iekļautajās kontrolēs, un izsaka statistiski ievērojamu pieaugumu salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli;

testēšana notikusi ar diviem eksperimentēšanas nosacījumiem (t.i., ar metabolisko aktivāciju un bez tās), ja vien vienā no tiem rezultāti nav bijuši pozitīvi (sk. 25. punktu);

šūnas un koncentrācijas bijušas analizējamas pietiekamā skaitā (25., 26. un 19. punkts);

maksimālās koncentrācijas izraudzīšanās kritēriji atbilst 20., 21. un 22. punktā aprakstītajam.

Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana

39.

Ja visi pieņemamības kritēriji ir izpildīti, testējamo ķimikāliju par viennozīmīgi pozitīvu uzskata tad, ja ar kādu no izvērtētajiem eksperimentēšanas nosacījumiem:

vismaz vienai no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums;

šo palielinājumu izvērtējot ar attiecīgu trenda testu, konstatējams, ka tas saistīts ar devu;

kāds no rezultātiem ir ārpus vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā; sk. 33. punktu).

Ja visi šie kritēriji ir izpildīti, šajā testēšanas sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija kultivētās zīdītāju šūnās spēj izraisīt gēnu mutācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami literatūrā (46) (48).

40.

Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju par viennozīmīgi negatīvu uzskata tad, ja ne ar vieniem no izvērtētajiem eksperimentēšanas nosacījumiem:

ne ar vienu no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli nav novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums;

ar attiecīgu trenda testu nav konstatējams ar koncentrāciju saistīts palielinājums,

visi rezultāti ir vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma robežās (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā); sk. 33. punktu).

Tādā gadījumā šajā testa sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija nespēj kultivētās zīdītāju šūnās izraisīt gēnu mutācijas.

41.

Nepārprotami pozitīva vai negatīva atbildreakcija nav obligāti jāverificē.

42.

Ja atbildreakcija nav atbilstoši iepriekš rakstītajam nedz nepārprotami negatīva, nedz nepārprotami pozitīva vai lai varētu labāk noteikt rezultāta bioloģisko relevantumu, šie dati jāizvērtē ekspertam un/vai jāturpina pētīt. Var būt lietderīgi izdarīt atkārtotu eksperimentu ar modificētiem nosacījumiem (piem., koncentrāciju intervāls, atšķirīgi metaboliskās aktivācijas nosacījumi (proti, S9 koncentrācija vai S9 avots]).

43.

Retos gadījumos datu kopums pat pēc sīkākas izpētes neļauj izdarīt secinājumu par pozitīviem vai negatīviem rezultātiem. Tāpēc būtu jāsecina, ka testējamās ķimikālijas atbildreakcija bijusi neskaidra (to vienlīdz varbūtīgi ir interpretēt gan kā pozitīvu, gan kā negatīvu).

Testēšanas pārskats

44.

Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.

 

Testējamā ķimikālija:

avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;

pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināms;

testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināms;

pH, osmolalitātes un nogulšņu mērījums barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota (attiecīgā gadījumā).

 

Vienkomponenta viela:

izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;

ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.

 

Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:

iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.

 

Šķīdinātājs:

šķīdinātāja izraudzīšanās pamatojums;

šķīdinātāja īpatsvars galīgajā kultūras barotnē.

 

Šūnas:

 

attiecībā uz laboratorijas pamatkultūrām:

kultūru tips, šūnu līniju avots;

pasāžu skaits, ja uzzināms, un to vēsture attiecīgajā laboratorijā;

kariotipiskās īpašības un/vai modālais hromosomu skaits;

šūnu kultūru audzēšanas metodes;

mikoplazmas neesība;

šūnu dubultošanās laiks.

 

Testa nosacījumi:

koncentrāciju izvēles un kultūru skaita izraudzīšanās pamatojums, piem., citotoksicitātes dati un šķīdības ierobežojumi;

barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija, mitruma līmenis;

testējamās ķimikālijas koncentrācija, izteikta kā galīgā koncentrācija kultūras barotnē (piem., kultūras barotnes μg vai mg/ml vai mM);

barotnē pievienotā šķīdinātāja un testējamās ķimikālijas koncentrācija (un/vai tilpums);

inkubācijas temperatūra;

inkubācijas laiks;

apstrādes ilgums;

šūnu blīvums apstrādes laikā;

metaboliskās aktivācijas sistēmas veids un sastāvs (S9 avots, S9 maisījuma sagatavošanas metode, S9 maisījuma koncentrācija vai tilpums un S9 koncentrācija vai tilpums galīgajā barotnē, S9 kvalitātes kontroles);

attiecībā uz katru no apstrādes nosacījumiem — pozitīvās un negatīvās kontroles vielas, galīgās koncentrācijas;

fenotipiskās ekspresijas periods (norādot uzsēto šūnu skaitu, subkultūras un attiecīgā gadījumā barošanas grafiku);

selektīvā līdzekļa identitāte un koncentrācija;

testu pieņemamības kritēriji;

dzīvotspējīgo šūnu un mutantšūnu skaitīšanas metodes;

citotoksicitātes mērīšanas metodes;

jebkāda citotoksicitātei un izmantotajai metodei relevanta papildinformācija;

inkubācijas laiks pēc uzsēšanas;

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai pētījuma rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs;

pH, osmolalitātes un izgulsnēšanās noteikšanai izmantotās metodes.

 

Rezultāti:

par katru kultūru — apstrādāto šūnu un apakškultūrām izmantoto šūnu skaits;

citotoksicitātes mērījumi un citi novērojumi, ja tādi ir;

izgulsnēšanās pazīmes un noteikšanas laiks;

selektīvā un neselektīvā barotnē uzsēto šūnu skaits;

koloniju skaits neselektīvajā barotnē un rezistento koloniju skaits selektīvajā barotnē, saistītais mutantu biežums;

ja iespējams, koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība;

paralēlās negatīvās (šķīdinātājs) un pozitīvās kontroles dati (koncentrācijas un šķīdinātāji);

vēsturisko negatīvo (šķīdinātājs) un pozitīvo kontroļu dati ar diapazoniem, vidējām vērtībām, standartnovirzēm un ticamības intervālu (piem., 95 %), kā arī datu skaits;

statistiskās analīzes (par atsevišķām kultūrām un attiecīgā gadījumā par apkopotiem replikātiem) un p-vērtības, ja tādas ir.

 

Rezultātu iztirzājums

 

Secinājumi

LITERATŪRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Available upon request from the Organisation for Economic Cooperation and Development.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Available at: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

1. papildinājums

DEFINĪCIJAS

Bāzu pāru maiņas mutagēni: ķimikālijas, kas izraisa DNS bāzu pāru maiņu.

Ķimikālija: viela vai maisījums.

Klonēšanās efektivitāte: to zemā blīvumā uzsēto šūnu procents, no kurām var izaugt pieskaitāma kolonija.

Koncentrācijas: testējamās ķimikālijas galīgās koncentrācijas kultūras barotnē.

Citotoksicitāte: attiecībā uz testiem, ko aptver šī testēšanas metode, citotoksicitāte ir apstrādāto šūnu relatīvās izdzīvotības samazinājums salīdzinājumā ar negatīvo kontroli (sk. attiecīgo punktu).

Turpvērsta mutācija: tāda gēna mutācija no vecāktipa uz mutantformu, kura maina vai izdzēš iekodētā proteīna fermentatīvo darbību vai tā funkciju.

Nolasīšanas fāzes nobīdes mutagēni: ķimikālijas, kas DNS molekulā izraisa viena vai vairāku bāzu pāru pievienošanos vai izzušanu.

Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, arī DNS pārrāvumus, aduktus, pārkārtojumus, mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai noturīgus hromosomu bojājumus.

HAT barotne: barotne, kuras sastāvā ir hipoksantīns, aminopterīns un timidīns un kuru izmanto Hprt mutantu attīrīšanai.

Mitotiska rekombinācija: mitozes laikā notiekoša homoloģisku hromatīdu rekombinācija, kuras rezultātā var inducēties DNS dubultpavedienu pārtraukumi vai zust heterozigotāte.

MPA barotne: barotne, kuras sastāvā ir ksantīns, adenīns, timidīns, aminopterīns un mikofenolskābe un kuru izmanto Xprt mutantu attīrīšanai.

Mutagēnisks: tāds, kas pārmantojami maina vienu vai vairākas DNS bāzu pāru sekvences gēnos vai hromosomu struktūru (hromosomu aberācijas).

Mutantu biežums (MF): konstatēto mutantu koloniju skaits, kas dalīts ar selektīvā barotnē uzsēto šūnu skaitu un pārrēķināts atbilstoši klonēšanās efektivitātei (vai dzīvotspējai) selekcijas laikā.

Fenotipiskās ekspresijas laiks: tas laiks pēc apstrādes, kad ģenētiskā pārmaiņa nostiprinās genomā un jebkādi līdzšinējie gēna produkti tiktāl izsīkst, ka mainās arī fenotipiskā pazīme.

Relatīvā izdzīvotība (RS) : RS izmanto par apstrādes izraisītas citotoksicitātes mēru. RS ir tūlīt pēc apstrādes uzsētu šūnu klonēšanās efektivitāte (CE), kas pārrēķināta atbilstoši jebkādam šūnu zudumam apstrādes laikā, salīdzinājumā ar klonēšanās efektivitāti negatīvajās kontrolēs (tajās konstatēto izdzīvotību pieņem par 100 %).

Aknu S9 frakcijas: ar 9 000g centrifugēta aknu homogenāta supernatants, t. i., jēlu aknu ekstrakts.

S9 maisījums: aknu S9 frakcijas un metaboliskajai fermentatīvajai darbībai nepieciešamo kofaktoru maisījums.

Šķīdinātāja kontrole: vispārīgs termins, ar ko definē kontroles kultūras, kuras saņem vienīgi testējamās ķimikālijas šķīdināšanai izmantoto šķīdinātāju.

Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

Neapstrādāta kontrole: kultūras, kuras neapstrādā (t. i., ne ar testējamo ķimikāliju, ne ar šķīdinātāju), bet ar kurām paralēli izdara tādas pašas manipulācijas kā ar kultūrām, kuras apstrādā ar testējamo ķimikāliju.

UVCB: ķīmiskas vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti un bioloģiski materiāli.

2. papildinājums

CITOTOKSICITĀTES UN MUTANTU BIEŽUMA NOTEIKŠANAS FORMULAS

Citotoksicitāti izvērtē pēc relatīvās izdzīvotības, proti, pēc to šūnu klonēšanās efektivitātes (CE), kuras tūlīt pēc apstrādes uzsētas uz platēm, CE koriģējot atbilstoši negatīvo kontroļu klonēšanās efektivitātei (kurām izdzīvotība ir 100 %), sk. RS formulu zemāk.

Koriģēto CE ar testējamo ķimikāliju apstrādātai kultūrai aprēķina šādi:

Formula

RS ar testējamo ķimikāliju apstrādātai kultūrai aprēķina šādi:

Formula

Mutantu biežums ir mutantu koloniju klonēšanās efektivitāte selektīvā barotnē, dalīta ar klonēšanās efektivitāti neselektīvā barotnē; abas efektivitātes mērītas vienai un tai pašai kultūrai selekcijas brīdī.

Formula

Ja klonēšanās efektivitātes noteikšanai izmanto plates:

CE = koloniju skaits / uz plates uzsēto šūnu skaits

Ja klonēšanās efektivitātes noteikšanai izmanto mikroiedobju plates:

Koloniju skaitu uz vienu mikroiedobju plates iedobi raksturo ar Puasona sadalījumu.

klonēšanās efektivitāte = -LnP(0) / vienā iedobē uzsēto šūnu skaits

-LnP(0) ir varbūtīgais tukšo iedobju skaits no apsēto iedobju skaita, un to apraksta ar formulu

LnP(0)= -Ln (tukšo iedobju skaits / apsēto iedobju skaits);

(3)

Pielikuma B daļā B.22. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.22   GRAUZĒJU DOMINANTO LETĀLO MUTĀCIJU TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 478 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, mainīgo regulatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Šī modificētā testēšanas metodes versija atspoguļo vairāk nekā trīsdesmit gadu pieredzi šā testa veikšanā un šā testa potenciālu tikt integrētam vai kombinētam ar tādiem citiem toksiskuma testiem kā pētījumi par ontoģenētisko un reproduktīvo toksicitāti vai genotoksicitāti; tomēr šā testa ierobežojumu dēļ, kā arī tādēļ, ka tajā izmanto daudz dzīvnieku, to paredzēts izmantot nevis par primāru metodi, bet gan par papildu testēšanas metodi, kuru var izmantot tad, ja regulatīvās prasības neatstāj citu alternatīvu. Ja toksiskumu testē kombinēti, iespējams būtiski samazināt testos izlietoto dzīvnieku skaitu. ESAO nesen izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par jaunākajiem ESAO genotoksicitātes testēšanas vadlīnijas grozījumiem (1).

2.

Dominanto letālo mutāciju (DL) testa nolūks ir izpētīt, vai ķimikālijas neizraisa mutācijas, kuru cēlonis ir hromosomu aberācijas dīgļšūnās. Dominanto letālo mutāciju tests genotoksicitātes novērtēšanai ir relevants arī tāpēc, ka, lai gan dažādām sugām in vivo metabolisms, farmakokinētika un DNS reparācijas procesi var atšķirties, šie faktori tomēr ir aktīvi un piedalās atbildreakcijā. DL mutācijas inducēšanās pēc tam, kad testa dzīvnieks eksponēts testējamai ķimikālijai, liecina, ka ķimikālija skārusi dīgļaudus.

3.

DL mutācijas izraisa embrija vai augļa nāvi. DL mutācijas inducēšanās pēc tam, kad testa dzīvnieks eksponēts testējamai ķimikālijai, liecina, ka ķimikālija skārusi dīgļšūnas.

4.

DL tests ir relevants beigupunkts cilvēka apdraudējuma un pa dīgļlīniju nodotu ģenētisku slimību riska prognozēšanā un noder tam, lai ar somatisku in vivo beigupunktu palīdzību apstiprinātu pozitīvus testu rezultātus. Tomēr šim testam vajag daudz dzīvnieku un tas ir darbietilpīgs; tāpēc tā veikšana ir ļoti dārga un patērē daudz laika. Tā kā dominantu letālu mutāciju spontānais biežums ir diezgan augsts, šā testa jutīgums nelielu mutāciju biežuma palielinājumu detektēšanā parasti ir ierobežots.

5.

Galveno terminu definīcijas sniegtas 1. papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

6.

Šo testu visbiežāk izdara ar pelēm (2) (3) (4), taču dažos gadījumos, ja tas zinātniski pamatoti, var būt lietderīgi izmantot tādas citas sugas kā žurka (5) (6) (7) (8). Parasti DL ir lielu hromosomālu aberāciju (strukturālu un skaitlisku anomāliju) rezultāts (9) (10) (11), taču nevar izslēgt gēnu mutācijas. DL mutācija ir tāda tieši dīgļšūnā radusies vai agrīnā embrijā pēc apaugļošanas konstatēta mutācija, kura neizraisa gametas disfunkciju, bet ir apaugļotajai olšūnai vai augošajam embrijam letāla.

7.

Atsevišķus tēviņus attiecīgos intervālos secīgi pāro ar iepriekš nepārotām mātītēm. Pēc apstrādes notikušo pārošanās reižu skaits ir atkarīgs no DL pētījuma galanolūka (23. punkts), un tam jābūt tādam, lai būtu drošība, ka attiecībā uz DL ir izvērtētas visas vīrišķo dīgļšūnu nobriešanas fāzes (12).

8.

Ja ir pierādījumi, ka testējamā ķimikālija vai tās metabolīts vai metabolīti sēkliniekos nenokļūs, šo testu izmantot nav lietderīgi.

TESTA PRINCIPS

9.

Parasti tēviņus attiecīgā ekspozīcijas ceļā eksponē testējamai ķimikālijai un pāro ar neapstrādātām iepriekš nepārotām mātītēm. Izmantojot secīgus pārošanas intervālus, var testēt dažādu tipu dīgļšūnas. Kad pēc pārošanas pagājis attiecīgs laiks, mātītes eitanazē un tām izpēta dzemdi, lai noteiktu implantējušos augļu un nedzīvo un dzīvo embriju skaitu. Testējamas ķimikālijas dominanto letalitāti nosaka, dzīvo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti apstrādātajā grupā salīdzinot ar dzīvo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti nesēja/šķīdinātāja kontrolgrupā. Pārsvars, kāds nedzīvo implantējušos augļu skaitam uz vienu mātīti apstrādātajā grupā ir pār nedzīvo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti kontrolgrupā, atspoguļo testējamās ķimikālijas inducēto pēcimplantācijas zudumu. Pēcimplantācijas zudumu aprēķina, nosakot nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu apstrādātajā grupā un to salīdzinot ar nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu kontrolgrupā. Pirmsimplantācijas zudumu var aplēst, salīdzinot, kāds apstrādātajā grupā un kontrolgrupā ir dzelteno ķermeņu skaits mīnus implantējušos augļu kopskaits vai arī implantējušos augļu kopskaits uz vienu mātīti.

LABORATORIJAS KOMPETENCES VERIFICĒŠANA

10.

Kompetence šā testa veikšanā jāpierāda, demonstrējot spēju reproducēt dominanto letālo mutāciju biežumu no publicētiem datiem (piem., (13) (14) (15) (16) (17) (18)) ar tādām pozitīvo kontroļu vielām (arī ja atbildreakcijas ir vājas) kā 1. tabulas sarakstā norādītās un ar nesēju kontrolēm un iegūstot negatīvo kontroļu biežumus, kas atbilst pieņemamam datu diapazonam 1 (sk. atsauces augstāk) vai laboratorijas vēsturisko kontroļu sadalījumam, ja tāds pieejams.

METODES APRAKSTS

Preparāti

Dzīvnieku sugas izraudzīšanās

11.

Jāizmanto veseli dzimumnobrieduši tipisku laboratorijas celmu dzīvnieki. Parasti izmanto peles, bet var būt lietderīgi izmantot arī žurkas. Var izmantot arī jebkuras citas piemērotas sugas zīdītājus, ja vien pārskatā tas tiek zinātniski pamatots.

Dzīvnieku turēšanas un barošanas apstākļi

12.

Attiecībā uz grauzējiem telpā, kurā tur eksperimenta dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C) temperatūrai. Relatīvajam mitrumam ideālā gadījumā jābūt 50–60 %, bet katrā ziņā vismaz 40 % un, vēlams, ne augstākam par 70 %, izņemot telpu uzkopšanas laiku. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas — tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim. Barības izvēli var ietekmēt vajadzība tai piemaisīt testējamo ķimikāliju, ja ķimikāliju ievada šādā ceļā. Pirms apstrādes vai pārošanas, ja netiek gaidīts vai novērots, ka grauzēji izturēsies agresīvi, tos ieteicams turēt mazās viendzimuma grupās (ne vairāk kā pa pieci), vēlams, būros ar cietu grīdu un ar attiecīgi bagātinātu vidi. Ja tas zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi.

Dzīvnieku sagatavošana

13.

Veselus un dzimumnobriedušus pieaugušus tēviņus un mātītes nejaušināti sadala kontrolgrupās un apstrādes grupās. Katru dzīvnieku unikālā veidā identificē, izmantojot humānu, minimāli invazīvu metodi (piem., apgredzenojot, izmantojot krotālijas, ievietojot mikroshēmu vai izmantojot biometrisko identificēšanu, bet ne apgriežot ausis vai pirkstus) un vismaz piecas dienas aklimatizē laboratorijas apstākļiem. Būrus izvieto tā, lai būru novietojuma varbūtējā ietekme būtu iespējami maza. Nedrīkst pieļaut pozitīvās kontroles un testējamās ķimikālijas šķērskontaminēšanos. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ±20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi.

Devu sagatavošana

14.

Pirms dzīvniekiem dod devas, cietas testējamās ķimikālijas jāizšķīdina vai jāsuspendē attiecīgos šķīdinātājos vai nesējos vai jāpievieno uzturam vai dzirdināmajam ūdenim. Šķidras testējamās ķimikālijas var dot tādas pašas vai pirms devu došanas atšķaidīt. Inhalatīvas ekspozīcijas vajadzībām testējamās ķimikālijas atkarībā no to fizikālķīmiskajām īpašībām var būt gāzes, tvaiku vai cietu/šķidru daļiņu aerosola veidā. Ja vien dati par testējamās ķimikālijas preparātu stabilitāti neliecina, ka tos var uzglabāt, un nav noteikti pareizi glabāšanas nosacījumi, jāizmanto svaigi pagatavoti preparāti.

Testa nosacījumi

Šķīdinātājs/nesējs

15.

Lietotajās devās šķīdinātājam vai nesējam nedrīkst būt toksiskas ietekmes un nedrīkst būt aizdomas, ka tas spēj reaģēt ar testējamo ķimikāliju. Citu, mazāk izplatītu šķīdinātāju vai nesēju izmantošana jāpamato ar atsauces datiem par to saderību. Ieteicams vienmēr, kad vien iespējams, vispirms apsvērt, vai neizmantot šķīdinātāju vai nesēju uz ūdens bāzes. Plaši izmantoti saderīgi šķīdinātāji/nesēji ir, piem., ūdens, fizioloģiskais šķīdums, metilcelulozes šķīdums, karboksimetilcelulozes nātrija sāls šķīdums, olīveļļa un kukurūzas eļļa.

Pozitīvās kontroles

16.

Būtu vienmēr jāizmanto paralēlas pozitīvas kontroles dzīvnieki, ja vien laboratorija nav apliecinājusi kompetenci testa veikšanā un vēl nesen (piem., pēdējo piecu gadu laikā) testu izmantojusi regulāri. Tomēr pozitīvās kontroles dzīvnieki nav jāapstrādā tādā pašā apstrādes ceļā kā dzīvnieki, kas saņem testējamo ķimikāliju; nav arī jāņem paraugi no visiem pārošanas intervāliem. Pozitīvās kontroles vielām jābūt tādām, par kurām zināms, ka testam izmantotajos apstākļos tās rada DL. Izņemot apstrādi, ar kontrolgrupu dzīvniekiem jārīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

17.

Pozitīvās kontroles vielu devas jāizraugās tā, lai tās konsekventi radītu pozitīvu ietekmi, kura izpaužas kā dominantas letālas mutācijas, taču lai šī ietekme būtu vāja vai vidēja, tādējādi paverot iespēju kritiski izvērtēt testa veiktspēju un jutīgumu. Pozitīvās kontroles vielu un attiecīgu devu piemēri sniegti 1. tabulā.

1. tabula

Pozitīvās kontroles vielu piemēri

Viela [CAS Nr.]

(atsauces Nr.)

Iedarbīgo devu diapazons (mg/kg)

(grauzēju suga)

Devu došanas laiks (dienas)

Trietilēnmelamīns [51-18-3] (15)

0,25 (pelēm)

1

Ciklofosfamīds [50-18-0] (19)

50–150 (pelēm)

5

Ciklofosfamīds [50-18-0] (5)

25–100 (žurkām)

1

Etilmetānsulfonāts [62-50-0] (13)

100–300 (pelēm)

5

Monomērakrilamīds [79-06-1] (17)

50 (pelēm)

5

Hlorambucils [305-03-3] (14)

25 (pelēm)

1

Negatīvās kontroles

18.

Katrā paraugošanas reizē jābūt arī negatīvās kontroles dzīvniekiem, ko apstrādā tikai ar šķīdinātāju vai nesēju, bet pārējās darbības izdara tāpat kā ar grupām, kam dotas devas (20). Ja nav vēsturisku vai publicētu kontroldatu, kas liecinātu, ka izraudzītais šķīdinātājs/nesējs neierosina DL vai citu kaitīgu iedarbību, katrā paraugošanas reizē jābūt arī neapstrādātiem kontroldzīvniekiem, lai varētu konstatēt, cik pieņemami ir nesēju izmantot par kontrolvielu.

PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits

19.

Atsevišķus tēviņus attiecīgos iepriekš noteiktos intervālos (piem., ar nedēļas intervālu, 21. un 23. punkts) secīgi pāro ar, vēlams, vienu atsevišķu iepriekš nepārotu mātīti. Tēviņu skaits grupā būtu iepriekš jānosaka tā, lai ar to pietiktu (kombinācijā ar katrā pārošanas intervālā pāroto mātīšu skaitu) tādas statistiskas jaudas iegūšanai, kāda vajadzīga, lai detektētu, ka DL biežums vismaz dubultojas (44. punkts).

20.

Ar statistiskās jaudas aprēķiniem būtu iepriekš jānosaka, ar kādu mātīšu skaitu uz vienu pārošanas intervālu būs iespējams detektēt, ka DL biežums vismaz dubultojas (proti, tikdaudz grūsnu mātīšu, lai būtu iegūti vismaz 400 implantējušies augļi) (20) (21) (22) (23) un lai būtu gaidāms vismaz viens nedzīvs implantējies auglis uz analizējamo vienību (t.i. vienai devai atbilstošo pārošanas grupu) (24).

Devu došanas periods un pārošanas intervāli

21.

Pārošanas intervālu skaits pēc apstrādes ir atkarīgs no apstrādes grafika un ar to būtu jānodrošina, ka attiecībā uz DL inducēšanos jāizvērtē visas vīrišķo dīgļšūnu nobriešanas fāzes (12) (25). Kas attiecas uz vienu apstrādi, proti, līdz piecām devu došanas reizēm dienā, ir ieteicams, lai pēc pēdējās apstrādes ar nedēļu ilgiem intervāliem notiktu 8 (peļu) vai 10 (žurku) pārošanās. Ja devu došanas reizes ir vairākas, proporcionāli devu došanas perioda paildzināšanai var samazināt pārošanas intervālu skaitu, taču saglabājot mērķi izvērtēt visas spermatoģenēzes fāzes (piem., ja eksponēšana ilgusi 28 dienas, peļu gadījumā visu spermatoģenēzes fāžu izvērtēšanai pietiek tikai ar 4 pārošanas reizēm nedēļā). Visi apstrādes un pārošanas grafiki būtu zinātniski jāpamato.

22.

Mātītes būtu jāatstāj kopā ar tēviņiem vismaz vienu estrālo ciklu (piem., gan pelēm, gan žurkām vienu estrālo ciklu aptver viena nedēļa). Mātītes, kas kādā nedēļu ilgā intervālā nav pārojušās, var izmantot vēlākam pārošanas intervālam. Tās var arī atstāt, līdz pārošanās notikusi, par ko liecina sperma vagīnā vai vagināla korķa esība.

23.

Izmantotā ekspozīcija un pārošanas režīms ir atkarīgi no DL pētījuma galanolūka. Ja mērķis ir noteikt, vai kāda konkrēta ķimikālija pati par sevi inducē DL mutācijas, atzīts paņēmiens ir eksponēt dzīvniekus visā spermatoģenēzes ciklā (piem., pelei 7 nedēļas, 5–7 apstrādes nedēļā) un pārot tos vienreiz tā noslēgumā. Tomēr, ja mērķis ir apzināt pret DL inducēšanos jutīgo dīgļšūnu tipu, priekšroka dodama vienreizējai vai piecas dienas ilgai ekspozīcijai, kam seko pārošana reizi nedēļā.

Devu līmeņi

24.

Iepriekšējs diapazona noteikšanas pētījums, kas jāizdara tāpēc, ka nav devas izvēlei piemērotu datu, jāveic tajā pašā laboratorijā, izmantojot to pašu sugu, celmu, dzimumu un apstrādes režīmu, kas tiks izmantoti galvenajā testā (26). Pētījuma mērķim jābūt noskaidrot maksimālo panesamo devu (MTD), kas ir lielākā pieļaujamā deva, kura pētījuma ilgumam atbilstošā laikā ir panesama bez pētījumu ierobežojošu toksiskuma pazīmju izraisīšanas (piem., inducē anormālu izturēšanos vai reakcijas, nelielu ķermeņa masas samazināšanos vai citotoksicitāti hematopoētiskajā sistēmā, bet neizraisa nāvi vai tādas sāpju, ciešanu vai diskomforta pazīmes, kā dēļ būtu humāni jāizdara eitanāzija (27)).

25.

MTD arī nedrīkst nelabvēlīgi ietekmēt pārošanās rezultativitāti (21).

26.

Testējamās ķimikālijas, kuras zemā netoksiskā devā iedarbojas bioloģiski specifiski (tādas kā hormoni un mitogēni), un ķimikālijas, kurām ir ļoti izteiktas toksikokinētiskās īpašības, var būt šo devu noteikšanas kritēriju izņēmumi un tātad attiecībā uz devām var būt jānovērtē atsevišķi.

27.

Lai iegūtu informāciju par devas–atbildreakcijas sakarību, pilnīgā pētījumā jāiekļauj negatīva kontrolgrupa un vismaz trīs devu līmeņi, kuru atstatuma koeficients parasti ir 2, bet nepārsniedz 4. Ja testējamai ķimikālijai diapazona noteikšanas pētījumā toksiskums neizpaužas vai ķimikālijas toksiskums neizpaužas uz esošo datu pamata, lielākajai vienreizējai devai jābūt 2 000 mg uz kg ķermeņa masas. Ja testējamai ķimikālijai toksiskums tomēr izpaužas, MTD jābūt augstākajai ievadītajai devai un izmantotajiem devu līmeņiem būtu jāaptver diapazons no maksimālās devas līdz devai, kas ir maztoksiska vai netoksiska. Attiecībā uz netoksiskām ķimikālijām robeždeva devu došanas periodam 14 dienas vai vairāk ir 1 000 mg uz kg ķermeņa masas dienā, bet devu došanas periodiem, kas nesasniedz 14 dienas, — 2 000 mg uz kg ķermeņa masas dienā.

Devu došana

28.

Testi jāplāno, ņemot vērā iespējamo cilvēka ekspozīcijas ceļu. Kā pamatotus var izraudzīties dažādus ekspozīcijas ceļus, piem., ar uzturu, ar dzirdināmo ūdeni, ievadīšanu zemādas audos, intravenozu ievadīšanu, vietēju aplikāciju, ieelpošanu, perorālu uzņemšanu (ar gavāžu) vai implantāciju. Jebkurā gadījumā ceļš jāizraugās tā, lai mērķaudiem nodrošinātu pietiekamu ekspozīciju. Parasti nav ieteicama intraperitoneāla injekcija, jo cilvēkam šāds ekspozīcijas ceļš nav raksturīgs, un tā būtu jāizmanto tikai ar konkrētu zinātnisko pamatojumu. Ja testējamo ķimikāliju piejauc barībai vai dzirdināmam ūdenim, jo īpaši vienreizējas devas gadījumā, jāgādā, lai starp pārtikas un ūdens patēriņu un pārošanu paietu pietiekami daudz laika, lai būtu iespējams detektēt ietekmes (sk. 31. punktu). Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt ar gavāžu vai injekciju, atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa masas, izņemot ūdens šķīdumus, kuru gadījumā var lietot ne vairāk kā 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Ja izmanto lielāku tilpumu (ja dzīvnieku labturības tiesību akti to atļauj), tas jāpamato. Testa tilpuma mainība būtu jāsamazina līdz minimumam, koncentrāciju koriģējot tā, lai visos devu līmeņos tilpuma attiecība pret ķermeņa masu saglabātos konstanta.

Novērojumi

29.

Vismaz reizi dienā, vēlams — vienā un tajā pašā laikā vai laikos un ņemot vērā, kurā periodā pēc devu došanas gaidāms ietekmju maksimums, testa dzīvniekiem jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi un jāreģistrē novērotās klīniskās pazīmes. Devas došanas periodā visus dzīvniekus vismaz divreiz dienā novēro attiecībā uz morbiditāti un mirstību. Visi dzīvnieki jānosver pētījuma sākumā, atkārtotas devas pētījumos pēc tam vismaz reizi nedēļā, kā arī eitanazēšanas brīdī. Vismaz reizi nedēļā jāmēra barības patēriņš. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar dzirdināmo ūdeni, ūdens patēriņš jāmēra katru reizi, kad ūdens tiek mainīts, un vismaz reizi nedēļā. Dzīvnieki, kam ar neletālām pazīmēm izpaužas pārlieks toksiskums, pirms testa perioda beigām būtu jāeitanazē (27).

Audu ievākšana un pārstrāde

30.

Mātītes eitanazē otrajā grūtniecības pusē 13. grūsnības dienā (GD) pelēm un 14.–15. GD žurkām. Izmeklē dzemdi attiecībā uz dominantām letālām ietekmēm, nosakot implantējušos augļu skaitu, dzīvo un mirušo embriju skaitu un dzelteno ķermeņu skaitu.

31.

Lai saskaitītu dzeltenos ķermeņus, atsedz dzemdes ragus un olnīcas; izņem, skaita un nosver augļus. Jāraugās, lai tiktu pamanītas rezorbcijas, ko var aizsegt dzīvi augļi; visas rezorbcijas jāuzskaita. Dokumentē augļu mirstību. Dokumentē arī veiksmīgi apaugļojušos mātīšu skaitu, kopējo implantāciju un pirmsimplantācijas zudumu skaitu, kā arī pēcimplantācijas mirstību (ieskaitot agrīnas un vēlīnas rezorbcijas gadījumus). Turklāt redzamos augļus var vismaz 2 nedēļas saglabāt Buina fiksācijas šķīdumā, fiksējot lielas ārējas kroplības (28) un tādējādi gūstot papildinformāciju par testējamā līdzekļa reproduktīvo un ontoģenētisko ietekmi.

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Rezultātu apstrāde

32.

Dati jāapkopo tabulā, norādot pāroto tēviņu skaitu, grūsno mātīšu skaitu, kā arī to mātīšu skaitu, kurām nav iestājusies grūtniecība. Katras pārošanās rezultāti līdz ar katra tēviņa un mātītes identitāti jāatspoguļo atsevišķi. Attiecībā uz katru mātīti jāreģistrē pārošanas intervāls, apstrādāto tēviņu devu līmenis un dzīvo un nedzīvo implantējušos augļu skaits.

33.

Pēcimplantācijas zudumu aprēķina, nosakot nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu apstrādātajā grupā un to salīdzinot ar nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret augļu kopskaitu nesēja/šķīdinātāja kontrolgrupā.

34.

Pirmsimplantācijas zudumu var aprēķināt pēc dzelteno ķermeņu un implantējušos augļu skaita starpības vai pēc implantējušos augļu vidējā skaita samazinājuma vienā dzemdē salīdzinājumā ar kontroles dzīvnieku pārošanās rezultātiem. Ja aplēš pirmsimplantācijas zudumu, tas jānorāda ziņojumā.

35.

Dominanto letālo koeficientu aplēš šādi: (nāves gadījumi pēc implantācijas / kopējās implantācijas uz vienu mātīti) × 100.

36.

Pārskatā jāatspoguļo 29. punktā minētie toksiskuma un klīnisko pazīmju dati.

Pieņemamības kritēriji

37.

Testa pieņemamību nosaka, pamatojoties uz šādiem kritērijiem:

paralēlā negatīvā kontrole atbilst publicētajām vēsturisko negatīvo kontroļu datu normām un laboratorijas vēsturiskajiem kontroļu datiem, ja tādi ir (sk. 10. un 18. punktu);

paralēlās pozitīvās kontroles inducētā reakcija atbilst publicētajām vēsturisko pozitīvo kontroļu datu normām vai laboratorijas vēsturisko pozitīvo kontroļu datubāzei, ja tāda ir, un salīdzinājumā ar negatīvajām kontrolēm ir iegūts statistiski būtisks palielinājums (sk. 17. un 18. punktu);

ir izanalizēts pietiekams kopējo implantējušos augļu un devu skaits (20. punkts);

maksimālās devas izraudzīšanās kritēriji atbilst 24. un 27. punktā aprakstītajiem.

Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana

38.

Lai iegūtu devas un atbildreakcijas izanalizēšanai pietiekamus datus, jāizanalizē vismaz trīs grupas, kas saņēmušas devas.

39.

Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi pozitīvu, ja:

vismaz vienai no testa devām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,

attiecībā uz vismaz vienu no eksperimenta nosacījumiem (piem., pārošanas intervāls viena nedēļa) palielinājums, to attiecīgā testā izvērtējot, ir saistīts ar devu un

kāds no iegūtajiem rezultātiem ir ārpus pieņemamā negatīvo kontroļu datu diapazona vai ārpus laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā), ja tāds pieejams.

Šajā gadījumā tiek uzskatīts, ka testējamā ķimikālija testa dzīvnieku dīgļšūnās spēj inducēt dominantas letālas mutācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm sniegti 44. punktā, citas ieteicamas statistiskas pieejas var atrast arī literatūrā (20) (21) (22) (24) (29). Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību jāuzskata dzīvnieks.

40.

Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi negatīvu, ja:

ne ar vienu no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli nav novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,

ne ar vienu no eksperimenta nosacījumiem nav novērojams ar devu saistīts palielinājums un

visi rezultāti ir pieņemamajā negatīvo kontroļu datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu (ja tādi pieejami) diapazonā (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā).

Šajā gadījumā tiek uzskatīts, ka testējamā ķimikālija testa dzīvnieku dīgļšūnās nespēj inducēt dominantas letālas mutācijas.

41.

Nepārprotami pozitīva vai nepārprotami negatīva atbildreakcija nav jāverificē.

42.

Ja atbildreakcija nav viennozīmīgi negatīva vai viennozīmīgi pozitīva un lai varētu vieglāk noskaidrot kāda rezultāta bioloģisko nozīmīgumu (piem., neizteikts palielinājums vai robežgadījums), dati būtu jāizvērtē, izmantojot ekspertu spriedumus un/vai tālāku izmeklēšanu, kurā izmanto jau esošos eksperimentu datus, piem., spriež, vai pozitīvais rezultāts ir ārpus negatīvo kontroļu datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu pieņemamības diapazona (30).

43.

Retos gadījumos pat pēc sīkākas izskatīšanas datu kopums neļauj secināt, vai testējamā ķimikālija rada pozitīvus vai negatīvus rezultātus, un tad uzskata, ka rezultāti ir neskaidri.

44.

Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību ieteicams uzskatīt tēviņu. Lai gan skaitīšanas datu (piem., implantējušos augļu skaits uz vienu mātīti) sadalījums var būt pēc Puasona, un/vai īpatsvara (piem., nedzīvo implantējušos augļu procentuālās daļas) sadalījums var būt binomiāls, tomēr bieži gadās, ka šādiem datiem ir palielināta dispersija (31). Tātad statistiskajā analīzē vispirms, izmantojot tādus dispersijas testus kā Kokrana binomiālās mainības tests (32) vai Tarona C(α) tests binomiālās palielinātās dispersijas noteikšanai, vajadzētu testēt, vai dispersija nav palielināta / nepietiekama(31) (33). Ja nekonstatē novirzi no binomiālā sadalījuma, pa devu līmeņiem proporcionālas tendences var testēt ar Kokrana–Ārmitidža tendenčtestu (34), savukārt pārveida salīdzinājumus ar kontrolgrupu — ar Fišera precīzo testu (35). Līdzīgi, nekonstatējot novirzi no Puasona sadalījuma, var ar Puasona regresijas metodi (36) testēt skaitījuma tendences, bet pārveida salīdzinājumus ar kontrolgrupu — Puasona modeļa kontekstā, izmantojot pāru kontrastus (36). Ja konstatē būtiski palielinātu vai pazeminātu dispersiju, ieteicams izmantot neparametriskas metodes (23) (31). Pie tām pieder tādi ranžējoši testi kā Džonkhīra–Terpstras tendenčtests (37) un Manna–Vitnija testi (38) pārveida salīdzinājumiem ar nesēja/šķīdinātāja kontroles grupu, kā arī permutāciju testi, atkārtotu paraugošanu testi vai bootstrap testi tendenču konstatēšanai un pārveida salīdzinājumiem ar kontrolgrupu (31) (39).

45.

Pozitīvi DL testa rezultāti liecina, ka testējamā ķimikālija devu saņēmuša testētās sugas tēviņa dīgļšūnām ir genotoksiska.

46.

Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus atbildreakcijas bioloģiskā nozīmīguma izvērtēšanai (40).

Testēšanas pārskats

47.

Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.

Kopsavilkums

 

Testējamā ķimikālija:

avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;

pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma;

testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināmas;

pH, osmolalitātes un nogulšņu mērījums barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota (attiecīgā gadījumā).

 

Vienkomponenta viela:

izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;

ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.

 

Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:

iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un sastāvdaļu relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.

 

Testējamās ķimikālijas sagatavošana:

nesēja izraudzīšanās pamatojums;

testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināmas;

barības, dzirdināmā ūdens vai inhalācijas preparātu sagatavošana;

preparātu analītiska noteikšana (piem., stabilitāte, homogenitāte, nominālās koncentrācijas), ja tāda veikta.

 

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija un izraudzīšanās pamatojums;

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums;

avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.;

dzīvnieku unikālās identificēšanas metode;

īslaicīgiem pētījumiem: tēviņu individuālā masa testa sākumā un beigās; par nedēļu ilgākiem pētījumiem: individuālā masa pētījuma laikā un barības patēriņš. Norāda katras grupas dzīvnieku ķermeņa masas diapazonu, vidējo vērtību un standartnovirzi.

 

Testēšanas nosacījumi:

pozitīvās un negatīvās (nesēja/šķīdinātāja) kontroles dati;

devu diapazona noteikšanas pētījuma dati;

devu līmeņa izraudzīšanās pamatojums;

detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas sagatavošanu;

detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas devu došanu;

ievadīšanas ceļa izraudzīšanās pamatojums;

metodes, ar kādām mēra testējamās vielas toksiskumu dzīvniekiem, ja tādas ir, arī histopatoloģiskas vai hematoloģiskas analīzes un dzīvnieku novērošanas un svēršanas biežums;

ja rezultāti ir negatīvi, ar kādām metodēm verificēts, ka testējamā ķimikālija nonākusi mērķaudos vai vispārējā asinsritē;

faktiskā deva (mg uz kg ķermeņa masas dienā), kas aprēķināta pēc testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ppm) barībā / dzirdināmajā ūdenī un pēc uzņemtā daudzuma (attiecīgā gadījumā);

detalizēta informācija par barības un ūdens kvalitāti;

detalizēta informācija par krātiņa vides bagātinājumu;

detalizēts apstrādes un paraugošanas grafiku apraksts un izraudzīšanās pamatojums;

atsāpināšanas metode;

eitanāzijas metode;

audu izolēšanas un saglabāšanas procedūras;

visu komplektu un reaģentu avots un sērijas numuri (attiecīgā gadījumā);

DL skaitīšanas metodes;

pārošanas grafiks;

pārošanas veiksmīguma noteikšanas metode;

eitanazēšanas laiks;

DL ietekmju novērtējuma atzīmju kritēriji, ieskaitot dzelteno ķermeni, implantācijas gadījumus, rezorpcijas gadījumus un pirmsimplantācijas zudumus, dzīvos implantējušos augļus, nedzīvos implantējušos augļus.

 

Rezultāti:

dzīvnieka stāvoklis pirms testa perioda un tā laikā, arī toksiskuma pazīmes;

tēviņu ķermeņa masa devu došanas un pārošanas periodos;

pāroto mātīšu skaits;

ja iespējams, devas–atbildreakcijas sakarība;

tagadējie un vēsturiskie negatīvas kontroles dati ar diapazoniem, vidējām vērtībām un standartnovirzēm;

tagadējie pozitīvās kontroles dati;

tabulā apkopoti dati par katru mātīti, arī: dzelteno ķermeņu skaits katrai mātītei; implantāciju skaits katrai mātītei; resorpcijas gadījumu un pirmsimplantēšanās bojāejas gadījumu skaits katrai mātītei; dzīvo implantējušos augļu skaits katrai mātītei; nedzīvo implantējušos augļu skaits katrai mātītei; augļu svars;

augstāk minēto datu summa par katru pārošanas periodu un devu, norādot dominanto letālo mutāciju biežumu;

izmantotā statistiskā analīze un metodes.

 

Rezultātu iztirzājums

 

Secinājums.

LITERATŪRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group “Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)

Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)

James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)

Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

1. papildinājums

DEFINĪCIJAS

Ķimikālija: viela vai maisījums.

Dzeltenais ķermenis: hormonus izdalošs veidojums, kas olnīcā izveidojies olšūnas pamesta folikula vietā. Dzelteno ķermeņu skaits olnīcās atbilst ovulējušo olšūnu skaitam.

Dominanta letāla mutācija: mutācija, kas notiek dīgļšūnā vai nostiprinās pēc apaugļošanās un izraisa embrija vai augļa nāvi.

Auglības koeficients: pāroto grūsno mātīšu skaits uz visu pāroto mātīšu skaitu.

Pārošanas intervāls: laiks starp ekspozīcijas beigām un apstrādātu tēviņu pārošanu. Kontrolējot šo intervālu, iespējams izvērtēt ķimikāliju ietekmi uz dažādu tipu dīgļšūnām. Pelēm, kuras pāro 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. un 8. nedēļā pēc ekspozīcijas beigām, tiek mērīta ietekme uz spermu, kondensētajiem spermatīdiem, apaļajiem spermatīdiem, pahitēnas spermatocītiem, agrīnajiem spermatocītiem, spermatogonijiem, kas diferencējušies, spermatogonijiem, kas diferencējas, un dīgļšūnu spermatogonijiem.

Pirmsimplantācijas zudums: dzelteno ķermeņu un implantējušos augļu skaita starpība. To var aplēst, arī salīdzinot kopējo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti devu grupās un kontroles grupās.

Pēcimplantācijas zudums: nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecība apstrādātajā grupā salīdzinājumā ar nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu kontrolgrupā.

Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

UVCB: ķīmiska viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kura ir komplekss reakcijas produkts vai bioloģisks materiāls.

2. papildinājums

ZĪDĪTĀJU SPERMATOGENĒZES LAIKI

Image 1

1. attēls: Peļu, žurku un cilvēka vīrišķo dīgļšūnu attīstības ilguma (dienās) salīdzinājums. Ar ēnojumu iezīmētajos periodos nenotiek DNS reparācija.

Augstāk sniegts peļu, žurku un cilvēka spermatogenēzes shematisks attēls (avots Adler, 1996). Pie spermatogonijiem, kas diferencējušies, pieder: A atsevišķie; A sapārotie; A sarindotie spermatogoniji (Hess and de Franca, 2008). Par īstajām cilmes šūnām uzskata A atsevišķos spermatogonijus; tāpēc, lai novērtētu ietekmi uz cilmes šūnām, no testējamās ķimikālijas pēdējās injekcijas līdz pārošanai jāpaiet vismaz 49 dienām.

ATSAUCES

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

(4)

Pielikuma B daļā B.23. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.23.   ZĪDĪTĀJU SPERMATOGONIJU HROMOSOMU ABERĀCIJU TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 483 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, mainīgo regulatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Šis modificētais testēšanas metodes variants atspoguļo ilggadēju pieredzi šā testa veikšanā un šā testa potenciālu tikt integrētam vai kombinētam ar citiem toksiskuma vai genotoksicitātes pētījumiem. Ja toksiskumu testē kombinēti, iespējams būtiski samazināt testos izlietoto dzīvnieku skaitu. Šī testēšanas metode pieder pie ģenētiski toksikoloģiskās testēšanas metožu sērijas. ESAO nesen izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par neseniem ESAO genotoksicitātes testēšanas vadlīnijas grozījumiem (1).

2.

Zīdītāju spermatogoniju hromosomu aberāciju in vivo testā nosaka vielas, kas zīdītāju spermatogonijos rada strukturālas hromosomu aberācijas (1) (2) (3) (4) (5). Dominanto letālo mutāciju tests genotoksicitātes novērtēšanai ir relevants arī tāpēc, ka dažādām sugām in vivo metabolisms, farmakokinētika un DNS reparācijas procesi gan var atšķirties, tomēr šie faktori ir aktīvi un piedalās atbildreakcijā. Šī testēšanas metode nav izstrādāta skaitlisku anomāliju mērīšanai; šo testu tam parasti neizmanto.

3.

Šis tests mēra strukturālas hromosomu aberācijas (gan hromosomtipa, gan hromatīdtipa) spermatogoniju dīgļšūnu dalīšanās procesā un tātad gaidāms, ka tas spēj prognozēt pārmantojamu mutāciju inducēšanos šajās dīgļšūnās.

4.

Galveno terminu definīcijas sniegtas papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

5.

Šajā testā parasti izmanto grauzējus, bet dažos gadījumos ir lietderīgi izmantot citas sugas, ja tas ir zinātniski pamatoti. Grauzēju sēklinieku citoģenētiskos standartpreparātos tiek ģenerēta mitotiska (spermatogoniji) un mejotiska (spermatocīti) metafāze. Balstoties uz hromosomu morfoloģiju, identificē mitotisko un mejotisko metafāzi (4). Šis citoģenētiskais in vivo tests detektē strukturālas hromosomu aberācijas spermatogoniju mitozē. Šai metodei nav citu mērķšūnu.

6.

Lai spermatogoniju šūnās varētu detektēt hromatīdtipa aberācijas, pirms nākamajās šūnu dalīšanās reizēs šīs aberācijas pārvēršas par hromosomtipa aberācijām, jāizpēta pirmā mitotiskā šūnu dalīšanās pēc apstrādes. Papildu informāciju par apstrādātiem spermatocītiem var iegūt, diakinēzes I metafāzē un II metafāzē attiecībā uz strukturālām aberācijām analizējot mejotiskas hromosomas.

7.

Sēkliniekos atrodas vairāku paaudžu spermatogoniji (5), un šo dažādo tipu dīgļšūnām jutība pret apstrādi ar kādu ķimikāliju var izpausties individuālā diapazonā. Tātad detektētās aberācijas ir apstrādāto spermatogoniju šūnu populāciju agregēta atbildreakcija. Sēklinieku preparātos lielākā daļa mitotisko šūnu ir B spermatogoniji, kuriem šūnas cikls ir apmēram 26 h (3).

8.

Ja ir pierādījumi, ka testējamā ķimikālija, tās metabolīts vai metabolīti sēkliniekos nenokļūs, šo testu izmantot nav lietderīgi.

TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS

9.

Dzīvniekus attiecīgā ekspozīcijas ceļā eksponē testējamai ķimikālijai un pēc apstrādes pienācīgā laikā eitanazē. Pirms eitanāzijas dzīvniekiem ievada metafāzi apturošu vielu (piem., kolhicīnu vai Colcemid®)). Tad no dzimumšūnām pagatavo hromosomu preparātus, ko iekrāso, un nosaka hromosomu aberācijas metafāzes šūnām.

LABORATORIJAS KOMPETENCES VERIFICĒŠANA

10.

Šā testa izpildes kompetence būtu jāapliecina, pierādot spēju ar 1. tabulā norādītajām pozitīvajām kontrolvielām (arī ar tādām, uz kurām ir vāja atbildreakcija) reproducēt gaidāmo spermatogoniju strukturālo hromosomu aberāciju biežumu un iegūt tādu negatīvo kontroļu biežumu, kas atbilst pieņemtajam kontroldatu diapazonam publicētajā literatūrā (piem., (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) vai laboratorijas vēsturisko kontroļu sadalījumam, ja tāds ir.

METODES APRAKSTS

Preparāti

Dzīvnieku sugas izraudzīšanās

11.

Jāizmanto veseli, jauni pieauguši tipisku laboratorijas celmu dzīvnieki. Parasti izmanto peļu tēviņus; tomēr var izmantot citu attiecīgu zīdītāju sugu tēviņus, ja tas zinātniski pamatoti un lai būtu iespējams šā testa izpildi apvienot ar citu testēšanas metodi. Ja grauzēju vietā izmanto citas sugas, to izmantošana pārskatā zinātniski jāpamato.

Dzīvnieku turēšanas un barošanas apstākļi

12.

Attiecībā uz grauzējiem telpā, kurā tur eksperimenta dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C) temperatūrai. Ideālā gadījumā relatīvajam mitrumam jābūt 50–60 %, bet katrā ziņā vismaz 40 % un, vēlams, ne augstākam par 70 %, izņemot telpu uzkopšanas laiku. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas — tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas uzturu ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim. Uztura izvēli var ietekmēt vajadzība tam piemaisīt testējamo ķimikāliju, ja ķimikāliju ievada šādā ceļā. Ja netiek gaidīts vai novērots, ka grauzēji izturēsies agresīvi, tos ieteicams turēt mazās viendzimuma grupās (ne vairāk kā pa pieci), vēlams, būros ar cietu grīdu un attiecīgi bagātinātu vidi. Ja tas zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi.

Dzīvnieku sagatavošana

13.

Veselīgus jaunus pieaugušus tēviņus (devu došanas sākumā 8–12 nedēļas vecus) nejaušināti iedala kontroles grupās un grupās, kas saņem devas. Katru dzīvnieku unikālā veidā identificē, izmantojot humānu, minimāli invazīvu metodi (piem., apgredzenojot, izmantojot krotālijas, ievietojot mikroshēmu vai izmantojot biometrisko identificēšanu, bet ne apgriežot ausis vai pirkstus) un vismaz piecas dienas aklimatizē laboratorijas apstākļiem. Būrus izvieto tā, lai būru novietojuma varbūtējā ietekme būtu iespējami maza. Nav pieļaujama pozitīvās kontroles un testējamās ķimikālijas šķērskontaminēšanās. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas individuālajām atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ±20 %.

Devu sagatavošana

14.

Pirms dzīvniekiem dod devas, cietas testējamās ķimikālijas jāizšķīdina vai jāsuspendē attiecīgos šķīdinātājos vai nesējos vai jāpievieno uzturam vai dzirdināmajam ūdenim. Šķidras testējamās ķimikālijas var dot tādas pašas vai pirms devas došanas atšķaidīt. Inhalatīvas ekspozīcijas vajadzībām testējamās ķimikālijas atkarībā no fizikālķīmiskajām īpašībām var būt gāzes, tvaiku vai cietu/šķidru daļiņu aerosola veidā. Ja vien dati par testējamās ķimikālijas preparātu stabilitāti neliecina, ka tos var uzglabāt, un ja vien no tiem neizriet pareizie glabāšanas nosacījumi, jāizmanto svaigi pagatavoti preparāti.

Testa apstākļi — šķīdinātājs/nesējs

15.

Lietotajās devās šķīdinātājam vai nesējam nedrīkst būt toksiskas ietekmes un tas nedrīkst būt spējīgs reaģēt ar testējamo ķimikāliju. Citu, mazāk izplatītu šķīdinātāju vai nesēju izmantošana jāpamato ar atsauces datiem par to saderību. Kad vien iespējams, vispirms ieteicams izmantot šķīdinātājus vai nesējus uz ūdens bāzes. Plaši izmantoti saderīgi šķīdinātāji/nesēji ir, piem., ūdens, fizioloģiskais šķīdums, metilcelulozes šķīdums, karboksimetilcelulozes nātrija sāls šķīdums, olīveļļa un kukurūzas eļļa. Ja nav pieejami vēsturiski vai publicēti kontroļu dati, kas apliecinātu, ka izvēlētais atipiskais šķīdinātājs/nesējs neinducē strukturālas hromosomu aberācijas un tam nav citādas kaitīgas ietekmes, jāveic sākotnējs pētījums, lai noteiktu šķīdinātāja/nesēja kontroles pieņemamību.

Pozitīvās kontroles

16.

Būtu vienmēr jāizmanto paralēlas pozitīvas kontroles dzīvnieki, ja vien laboratorija nav apliecinājusi kompetenci testa veikšanā un vēl nesen (piem., pēdējo piecu gadu laikā) testu izmantojusi regulāri. Ja nav paralēlas pozitīvas kontrolgrupas, katrā eksperimentā jāparedz novērtēšanas kontroles (fiksēti un neiekrāsoti priekšmetstikliņi). To var panākt, pētījumā ar atzīmēm novērtējot arī attiecīgus etalonparaugus, kas saglabāti pēc iegūšanas kādā atsevišķā pozitīvās kontroles eksperimentā, ko testējošā laboratorija izdara regulāri (piem., ik 6–18 mēnešus), piem., kompetences testēšanā un pēc tam regulāri pēc vajadzības.

17.

Pozitīvās kontroles vielām stabili jārada detektējams tādu šūnu biežuma pieaugums, kurās strukturālās hromosomu aberācijas pārsniedz spontāno līmeni. Pozitīvās kontroles devas izvēlas tā, lai to ietekme būtu skaidri redzama, tomēr vērtētājam nebūtu uzreiz redzama kodēto paraugu identitāte. Pozitīvās kontroles vielu piemēri norādīti 1. tabulā.

1. tabula

Pozitīvās kontroles vielu piemēri

Vielas [CAS Nr.] (atsauces Nr.)

Ciklofosfamīds (monohidrāts) [CAS Nr. 50-18-0 (CAS Nr. 6055-19-2)] (9)

Streptonigrīns [CAS Nr. 108-91-8] (7)

Mitomicīns C [CAS Nr. 50-07-7] (6)

Monomērakrilamīds [CAS Nr. 79-06-1] (10)

Trietilēnmelamīns [CAS Nr. 51-18-3] (8)

Negatīvās kontroles

18.

Katrā paraugošanas reizē jābūt arī negatīvās kontroles dzīvniekiem, ko apstrādā tikai ar šķīdinātāju vai nesēju, bet pārējās darbības izdara tāpat kā ar grupām, kam dotas devas. Ja nav vēsturisku vai publicētu kontroldatu, kas liecinātu, ka izraudzītais šķīdinātājs/nesējs neierosina hromosomu aberācijas un tam nav citādas kaitīgas ietekmes, katrā paraugošanas reizē jābūt arī neapstrādātiem kontroldzīvniekiem, lai varētu konstatēt, cik pieņemami ir nesēju izmantot par kontrolvielu.

PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits

19.

Pētījuma sākumā būtu jānosaka grupu lielums tā, lai katrā grupā būtu vismaz 5 tēviņi. Šādu dzīvnieku skaitu uzskata par pietiekamu adekvātas statistiskās jaudas nodrošināšanai (proti, lai parasti būtu iespējams ar 80 % varbūtību nozīmīguma līmenī 0,05 detektēt vismaz hromosomu aberāciju biežuma dubultošanos pie negatīvās kontroles līmeņa 1 % vai augstāka.) (3) (11). Orientējošs piemērs parastām prasībām attiecībā uz dzīvnieku maksimālo skaitu: pētījumā ar divām paraugošanas reizēm izmanto trīs devu grupas un paralēlu negatīvo kontrolgrupu, kā arī pozitīvo kontrolgrupu (pieci viena dzimuma dzīvnieki katrā grupā); būtu nepieciešami 45 dzīvnieki.

Devu došanas grafiks

20.

Testējamo ķimikāliju parasti dod vienreiz (proti, kā vienreizēju devu); var izmantot citus devu režīmus, ja vien tie ir zinātniski pamatoti.

21.

No grupas, kurā pārbauda lielāko devu, paraugus pēc devas došanas ņem divās paraugošanas reizēs. Tā kā testējamās(-o) ķimikālijas(-u) uzņemšanai un metabolizēšanai, kā arī tās iedarbībai uz šūnas cikla kinētiku vajadzīgais laiks var ietekmēt hromosomu aberāciju noteikšanas optimālo laiku, ieteicama viena agrīna un viena vēla paraugošanas reize apmēram 24 un 28 stundas pēc devas došanas. Izņemot lielāko devu, paraugošanu ieteicams izdarīt agri, 24 stundas (par B spermatogonija šūnas cikla laiku īsāks vai ar to vienāds laiks, tāpēc optimizējas varbūtība, ka būs iespējams novērtēt pirmās pēcapstrādes metafāzes) pēc devas došanas, ja vien nav zināms cits, piemērotāks un pamatots paraugošanas laiks.

22.

Var izmantot citus paraugošanas laikus. Piemēram, kas attiecas uz ķimikālijām, kuras rada no S neatkarīgu ietekmi, lietderīgs var būt agrāks paraugošanas laiks (t.i., agrāk nekā pēc 24 stundām).

23.

Var izmantot tādu apstrādes režīmu ar atkārtotām devām, kāds rodas apvienojumā ar cita beigupunkta testu, kurā izmantots devu došanas periods 28 dienas (piem., TM B.58); tomēr, lai būtu iespējami atšķirīgi paraugošanas laiki, būtu vajadzīgas vēl citas dzīvnieku grupas. Tātad katrā gadījumā zinātniski jāpamato šāda grafika lietderība.

24.

Pirms eitanazēšanas dzīvniekiem intraperitoniāli injicē attiecīgu devu metafāzi apturošas vielas (piem. Colcemid® vai kolhicīnu). Pēc tam ar attiecīgiem intervāliem no dzīvniekiem ņem paraugus. Pelēm un žurkām šis intervāls ir aptuveni 3 – 5 stundas.

Devu līmeņi

25.

Ja veic iepriekšēju diapazona noteikšanas pētījumu, jo nav piemērotu datu, kas palīdzētu izraudzīties devu, tas jāveic tajā pašā laboratorijā, izmantojot to pašu sugu, celmu, dzimumu un devu došanas režīmu, kas tiks izmantots galvenajā pētījumā, un ievērojot ieteikumus par devu diapazona noteikšanas pētījumu izpildi (12). Šajā pētījumā būtu jāorientējas uz maksimālās panesamās devas (MTD) apzināšanu; MTD definē kā devu, kura pētījuma ilgumam atbilstošā laikā izraisa nelielu toksisku ietekmi (piem., anormāla izturēšanās vai reakcijas, neliels ķermeņa masas samazinājums vai citotoksicitāte hematopoētiskajā sistēmā), bet neizraisa nāvi vai tādas sāpju, ciešanu vai diskomforta pazīmes, kā dēļ dzīvnieki būtu jāeitanazē (13).

26.

Augstāko devu var definēt arī kā devu, kura kaut kādā veidā liecina par toksiskumu spermatogoniju šūnām (piem., samazinās spermatogoniju mitožu attiecība pret pirmo un otro mejotisko metafāzi). Šim samazinājumam nevajadzētu pārsniegt 50 %.

27.

Testējamās ķimikālijas, kuras zemā netoksiskā devā iedarbojas bioloģiski specifiski (tādas kā hormoni un mitogēni), un ķimikālijas, kurām ir ļoti izteiktas toksikokinētiskās īpašības, var būt šo devu noteikšanas kritēriju izņēmumi un tātad attiecībā uz devām var būt jānovērtē atsevišķi.

28.

Lai iegūtu informāciju par atbildreakciju uz devu, pilnīgā pētījumā jābūt negatīvai kontrolgrupai (18. punkts) un vismaz trijiem devu līmeņiem, kuru atstatuma koeficients parasti ir 2, bet nepārsniedz 4. Ja diapazona noteikšanas pētījumā testējamā ķimikālija toksicitāti nerada vai to nerada saskaņā ar esošajiem datiem, lielākajai vienreizējai devai jābūt 2 000 mg uz kg ķermeņa masas. Ja testējamai ķimikālijai toksiskums tomēr izpaužas, MTD jābūt augstākajai ievadītajai devai un izmantotajiem devu līmeņiem būtu jāaptver diapazons no maksimālās devas līdz devai, kas ir maztoksiska vai netoksiska. Ja pie visiem testētajiem devu līmeņiem tiek novērota toksiska ietekme uz mērķaudiem (t.i., sēkliniekiem), ieteicams veikt vēl vienu pētījumu ar netoksiskām devām. Pētījumos, kuros plānots pilnīgāk raksturot kvantitatīvo atbildreakciju uz devu, var būt nepieciešams izmantot papildu devu grupas. Atsevišķiem testējamo ķimikāliju veidiem (piem., cilvēku zālēm), uz kuriem attiecas konkrētas prasības, šīs robežas var būt mainīgas. Ja testējamā ķimikālija rada toksicitāti, būtu jāizraugās robeždeva plus divas zemākas devas (kā aprakstīts iepriekš). Robeždeva devu došanas periodam 14 dienas vai vairāk ir 1 000 mg uz kg ķermeņa masas dienā, bet devu došanas periodiem, kas nesasniedz 14 dienas, — 2 000 mg uz kg ķermeņa masas dienā.

Devu došana

29.

Testi jāplāno, ņemot vērā iespējamo cilvēka ekspozīcijas ceļu. Tāpēc kā pamatotus var izvēlēties tādus ekspozīcijas ceļus kā, piem., ar uzturu, ar dzirdināmo ūdeni, ievadīšanu zemādas audos, intravenozu ievadīšanu, perorālu uzņemšanu (ar gavāžu), inhalāciju vai implantāciju. Jebkurā gadījumā ceļš jāizraugās tā, lai mērķaudiem nodrošinātu pietiekamu ekspozīciju. Ja vien intraperitoneāla injekcija nav zinātniski pamatota, tā parasti nav ieteicama, jo cilvēkam šāds ekspozīcijas ceļš nav raksturīgs. Ja testējamo ķimikāliju piejauc barībai vai dzirdināmam ūdenim, jo īpaši vienreizējas devas gadījumā, jāgādā, lai starp pārtikas un ūdens patēriņu un paraugošanu paietu pietiekami daudz laika, lai būtu iespējams detektēt ietekmes (sk. 33. punktu). Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt ar gavāžu vai injekciju, atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa masas, izņemot ūdens šķīdumus, kuru gadījumā var lietot ne vairāk kā 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Ja izmanto lielāku tilpumu (ja dzīvnieku labturības tiesību akti to atļauj), tas jāpamato. Testa tilpuma mainība būtu jāsamazina līdz minimumam, koncentrāciju koriģējot tā, lai visos devu līmeņos tilpuma attiecība pret ķermeņa masu saglabātos konstanta.

Novērojumi

30.

Vismaz reizi dienā, vēlams — vienā un tajā pašā laikā vai laikos un ņemot vērā, kurā periodā pēc devu došanas gaidāms ietekmju maksimums, testa dzīvniekiem jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi un jāreģistrē novērotās klīniskās pazīmes. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz morbiditāti un mirstību. Pētījuma sākumā, atkārtotas devas pētījumos vismaz reizi nedēļā un eitanāzijas laikā visi dzīvnieki jānosver. Pētījumos, kuri ilgst vismaz vienu nedēļu, vismaz reizi nedēļā jāmēra barības patēriņš. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar dzirdināmo ūdeni, ūdens patēriņš jāmēra katru reizi, kad ūdens tiek mainīts, un vismaz reizi nedēļā. Dzīvnieki, kam ar neletālām pazīmēm izpaužas pārlieks toksiskums, pirms testa perioda beigām būtu jāeitanazē (13).

Hromosomu preparātu sagatavošana

31.

Tūlīt pēc eitanazēšanas no viena vai abiem sēkliniekiem iegūst dīgļšūnu suspensijas, ko apstrādā ar hipotonisku šķīdumu un fiksē saskaņā ar vispārpieņemtiem protokoliem (piem., (2) (14) (15)). Šūnas pēc tam uzklāj uz priekšmetstikliņiem un krāso (16) (17). Visi priekšmetstikliņi būtu jāapzīmē ar kodu, lai vērtētājam nebūtu pieejama to identitāte.

Analīze

32.

Par katru dzīvnieku būtu jāsaskaita vismaz 200 izteikti izplatījušos metafāžu (3) (11). Ja vēsturiskās negatīvās kontroles biežums ir < 1 %, statistiskās jaudas palielināšanai novērtēšanā par vienu dzīvnieku būtu jānovērtē vairāk nekā 200 šūnu (3). Būtu jāizmanto krāsošanas paņēmieni, ar kuriem iespējams identificēt centromēru.

33.

Hromatīdtipa un hromosomtipa aberācijas jāreģistrē atsevišķi un jāklasificē pa apakštipiem (pārrāvumi, apmaiņas). Pārtraukumi būtu jāatspoguļo ziņojumā, bet nebūtu jāņem vērā, nosakot, vai kāda ķimikālija būtiski palielina tādu šūnu incidenci, kurām vērojamas hromosomu aberācijas. Laboratorijā izmantojamām procedūrām būtu jānodrošina, ka hromosomu aberācijas analizē labi apmācīti vērtētāji. Apzinoties, ka priekšmetstikliņu sagatavošanas procedūrā daļa metafāzes šūnu bieži vien tiek bojātas un hromosomas zaudē, centromēru skaitam novērtētajās šūnās jābūt vismaz 2n± 2, kur n ir attiecīgās sugas haploidālais hromosomu skaits.

34.

Testa nolūks gan ir detektēt strukturālas hromosomu aberācijas, tomēr, ja novēro tādus notikumus kā poliploidālas šūnas vai šūnas ar endoreduplicētām hromosomām, arī to biežumu ir svarīgi atspoguļot (sk. 44. punktu.

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Rezultātu apstrāde

35.

Datus par katru dzīvnieku apkopo tabulas veidā. Katram dzīvniekam nosaka šūnu skaitu, kurās ir strukturālas hromosomu aberācijas, kā arī hromosomu aberāciju skaitu uz vienu šūnu. Hromatīdtipa un hromosomtipa aberācijas, kas klasificētas pēc apakštipa (pārrāvumi, apmaiņas) sarakstā jānorāda atsevišķi, minot skaitu un biežumu eksperimenta grupās un kontrolgrupās. Atsevišķi dokumentē pārtraukumus. Ziņojumā pārtraukumu biežumu atspoguļo, tomēr strukturālo aberāciju kopējā biežuma analīzē to parasti neiekļauj. Ziņojumā atspoguļo gan poliploīdijas, gan/vai to šūnu īpatsvaru, kam ir endoreduplicētas hromosomas, ja šādas parādības ir.

36.

Pārskatā jāatspoguļo 30. punktā minētie toksiskuma un klīnisko pazīmju dati.

Pieņemamības kritēriji

37.

Testa pieņemamību nosaka, pamatojoties uz šādiem kritērijiem:

paralēlā negatīvā kontrole atbilst publicētajām normām, kas attiecas uz vēsturisko negatīvo kontroļu datiem (parasti gaida, ka hromosomu aberācijas būs vērojamas > 0 % un ≤ 1,5 % šūnu) un laboratorijas vēsturiskajiem kontroļu datiem (sk. 10. un 18. punktu).

paralēlās pozitīvās kontrolēs inducētā reakcija atbilst publicētajām vēsturisko pozitīvo kontroļu datu normām vai laboratorijas vēsturisko pozitīvo kontroļu datubāzei, ja tāda ir, un salīdzinājumā ar negatīvajām kontrolēm ir iegūts statistiski būtisks palielinājums (sk. 17. un 18. punktu);

ir izanalizēts pietiekams šūnu un devu skaits (sk. 28. punktu un 32. punktu).

maksimālās devas izraudzīšanās kritēriji atbilst 25. un 26. punktā aprakstītajiem.

38.

Ja novēro gan mitozi, gan mejozi, par citotoksicitātes mēru visiem devu saņēmušajiem un negatīvās kontroles dzīvniekiem būtu jāizraugās spermatogoniju mitožu attiecība pret pirmo un otro mejotisko metafāzi apkopotā paraugā, kas ir 100 dalošās šūnas uz katru dzīvnieku. Ja novēro tikai mitozi, katram dzīvniekam nosaka mitotisko indeksu vismaz 1 000 šūnām.

Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana

39.

Lai iegūtu devas un atbildreakcijas izanalizēšanai pietiekamus datus, jāizanalizē vismaz trīs grupas, kas saņēmušas devas.

40.

Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi pozitīvu, ja:

vismaz vienai no testa devām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,

vismaz vienā paraugošanas reizē palielinājums ir devatkarīgs un

kāds no šiem rezultātiem ir ārpus pieņemamā negatīvo kontroļu datu diapazona vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā), ja tādas ir.

Šajā gadījumā tiek uzskatīts, ka testējamā ķimikālija testa dzīvnieku spermatogoniju šūnās spēj inducēt hromosomu aberācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami arī literatūrā (11) (18). Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību jāuzskata dzīvnieks.

41.

Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi negatīvu, ja:

ne ar vienu no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli nav novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,

ne ar vienu no eksperimenta nosacījumiem nav novērojams ar devu saistīts palielinājums un

visi rezultāti ir pieņemamajā negatīvo kontroļu datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu (ja tādi pieejami) diapazonā (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā).

Testējamo ķimikāliju šajā testa sistēmā tad uzskata par nespējīgu inducēt hromosomu aberācijas kultivētās zīdītāju šūnās. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami arī literatūrā (11) (18). Negatīvs rezultāts neizslēdz iespējamību, ka ķimikālija varbūt inducē hromosomu aberācijas vēlākās, nepētītās ontoģenēzes fāzēs vai gēnu mutācijas.

42.

Nepārprotami pozitīva vai nepārprotami negatīva atbildreakcija nav jāverificē.

43.

Ja atbildreakcija nav nepārprotami negatīva vai pozitīva un lai varētu vieglāk noskaidrot kāda rezultāta bioloģisko nozīmīgumu (piem., neizteikts palielinājums vai robežgadījums), dati būtu jāizvērtē, izmantojot ekspertu slēdzienus un/vai tālāku izmeklēšanu, kurā izmanto jau esošos eksperimentu datus, piem., jāapsver, vai pozitīvais rezultāts ir ārpus negatīvās kontroles datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu pieņemamības diapazona (19).

44.

Retos gadījumos pat pēc sīkākas izskatīšanas datu kopums neļauj secināt, vai testējamā ķimikālija rada pozitīvus vai negatīvus rezultātus, un tad uzskata, ka rezultāti ir neskaidri.

45.

Poliploidālo šūnu skaita palielināšanās var norādīt, ka testējamai ķimikālijai ir potenciāls inhibēt mitotiskos procesus un inducēt skaitliskas hromosomu aberācijas (20). Ja palielinās tādu šūnu skaits, kam ir endoreduplicētas hromosomas, tas var liecināt, ka testējamajai ķimikālijai ir potenciāls inhibēt šūnu cikla norisi (21) (22); tas ir vēl cits, no mitotisku procesu inhibēšanas atšķirīgs mehānisms, kā hromosomās tiek inducētas skaitliskas pārmaiņas (sk. 2. punktu). Tāpēc poliploidālo šūnu incidence un tādu šūnu incidence, kam ir endoreduplicētas hromosomas, jādokumentē atsevišķi.

Testēšanas pārskats

46.

Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.

 

Kopsavilkums

 

Testējamā ķimikālija:

avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;

pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma;

testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināmas;

pH, osmolalitātes un nogulšņu mērījums barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota (attiecīgā gadījumā).

 

Vienkomponenta viela:

izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;

ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.

 

Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:

iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un sastāvdaļu relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.

 

Testējamās ķimikālijas sagatavošana:

nesēja izraudzīšanās pamatojums;

testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā;

barības, dzirdināmā ūdens vai inhalācijas preparātu sagatavošana;

preparātu analītiska noteikšana (piem., stabilitāte, homogenitāte, nominālās koncentrācijas), ja tāda veikta.

 

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/celms un tā izmantošanas pamatojums;

dzīvnieku skaits un vecums;

avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.;

dzīvnieku unikālās identificēšanas metode;

īslaicīgiem pētījumiem: dzīvnieku individuālā masa testa sākumā un beigās; par nedēļu ilgākiem pētījumiem: individuālā masa pētījuma laikā un barības patēriņš. Norāda katras grupas dzīvnieku ķermeņa masas diapazonu, vidējo vērtību un standartnovirzi.

 

Testēšanas nosacījumi:

pozitīvās un negatīvās (nesēja/šķīdinātāja) kontroles dati;

diapazona noteikšanas testa rezultāti, ja tas veikts;

devu līmeņa izraudzīšanās pamatojums;

ievadīšanas ceļa izraudzīšanās pamatojums;

detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas sagatavošanu;

detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas devu došanu;

nonāvēšanas laika pamatojums;

metodes, ar kādām mēra testējamās vielas toksiskumu dzīvniekiem, ja tādas ir, arī histopatoloģiskas vai hematoloģiskas analīzes un dzīvnieku novērošanas un svēršanas biežums;

ja rezultāti ir negatīvi, ar kādām metodēm verificēts, ka testējamā ķimikālija nonākusi mērķaudos vai vispārējā asinsritē;

faktiskā deva (mg uz kg ķermeņa masas dienā), kas aprēķināta pēc testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ppm) barībā / dzirdināmajā ūdenī un pēc uzņemtā daudzuma (attiecīgā gadījumā);

detalizēta informācija par barības un ūdens kvalitāti;

detalizēts apstrādes un paraugošanas grafiku apraksts un izraudzīšanās pamatojums;

eitanāzijas metode;

atsāpināšanas metode (ja tāda izmantota);

audu izolēšanas procedūras;

metafāzes apturēšanai izmantojamās ķimikālijas identifikācija, tās koncentrācija un apstrādes ilgums;

priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes;

aberāciju atzīmju kritēriji;

analizēto šūnu skaits uz vienu dzīvnieku;

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.

 

Rezultāti

dzīvnieka stāvoklis pirms testa perioda un tā laikā, arī toksiskuma pazīmes;

ķermeņa un orgānu masa nonāvēšanas brīdī (ja devas dotas vairākreiz, ķermeņa masas fiksējumi devu došanas režīma laikā);

toksiskuma pazīmes;

mitotiskais indekss;

spermatogoniju šūnu mitožu attiecība pret pirmo un otro mejotisko metafāzi vai citas mērķaudos vērojamas liecības par eksponētību;

aberāciju veids un skaits, ko norāda katram dzīvniekam atsevišķi;

kopējais aberāciju skaits katrā grupā, vidējās vērtības un standartnovirzes;

to šūnu skaits katrā grupā, kam ir aberācijas, vidējās vērtības un standartnovirzes;

ja iespējams, devas–atbildreakcijas sakarība;

izmantotā statistiskā analīze un metodes;

līdztekus veiktās negatīvās kontroles dati;

vēsturiskie negatīvo kontroļu dati ar diapazoniem, vidējām vērtībām, standartonovirzēm un ticamības intervālu 95 % (kur tādi pieejami) vai publicētie vēsturiskie negatīvo kontroļu dati, kurus izmanto attiecībā uz šā testa rezultātu pieņemamību;

paralēlās pozitīvās kontroles dati;

ploīdijas pārmaiņas, ja tādas tiek novērotas, arī poliploidālo un/vai endoreduplicēto šūnu biežums.

 

Rezultātu iztirzājums

 

Secinājumi

LITERATŪRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(14)

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413. (4) Pielikuma B daļā B.23. nodaļu aizstāj ar šādu:

Papildinājums

DEFINĪCIJAS

Aneiploīdija: novirze no normālā diploidālā (vai haploidālā) hromosomu skaita par vienu vai vairākām atsevišķām hromosomām, bet ne veselu hromosomu komplektu vai komplektiem (poliploīdija).

Centromēra: hromosomas rajons(-i), ar kuru(-iem) šūnas dalīšanās laikā saistās vārpstas šķiedras, nodrošinot meithromosomu pareizu pārvietošanos uz meitšūnu poliem.

Ķimikālija: viela vai maisījums.

Hromosomu daudzveidība: hromosomu formu (piem., metacentriskas, akrocentriskas u. tml.) un lielumu daudzveidība.

Hromatīdtipa aberācija: strukturāls hromosomas bojājums, kas izpaužas kā atsevišķas hromatīdas pārrāvums vai hromatīdu pārrāvums un savienošanās.

Hromosomtipa aberācija: strukturāls hromosomas bojājums, kas izpaužas kā abu hromatīdu pārrāvums vai pārrāvums un savienošanās vienā un tajā pašā vietā.

Klastogēns: jebkura ķimikālija, kas izraisa strukturālas hromosomālas aberācijas šūnu vai organismu populācijās.

Pārtraukums: ahromatisks bojājums, kas mazāks par vienas hromatīdas platumu un saistīts ar ļoti nelielu hromatīdisku nobīdi.

Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, arī pārrāvumus, delēcijas, aduktus, nukleotīdu modifikācijas un sasaistes, pārkārtojumus, gēnu mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai pastāvīgus hromosomu bojājumus.

Mitotiskais indekss (MI): metafāzē esošu šūnu skaita attiecība pret šūnu kopējo skaitu populācijā; raksturo attiecīgās populācijas proliferācijas pakāpi.

Mitoze: šūnas kodola dalīšanās process, kuru parasti sīkāk iedala šādās stadijās: profāze, prometafāze, metafāze, anafāze un telofāze.

Mutagēnisks: tāds, kas pārmantojami maina vienu vai vairākas DNS bāzu pāru sekvences gēnos vai hromosomu struktūru (hromosomu aberācijas).

Skaitliska anomālija: testam izmantojamajiem dzīvniekiem raksturīgā parastā hromosomu skaita pārmaiņas.

Poliploīdija: haploidālā hromosomu skaita (n) daudzkārtnis (t.i., 3n, 4n utt.), izņemot diploidālo skaitu.

Strukturālas pārmaiņas: hromosomas struktūras pārmaiņas, kas detektējamas, ar mikroskopu apskatot šūnas to dalīšanās metafāzē, un kas izpaužas kā delēcijas un fragmentācija.

Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

UVCB: Ķīmiskas vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kuras ir kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli

(5)

Pielikuma B daļā B.40. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.40.   ĀDAS KOROZIJA IN VITRO: TRANSKUTĀNĀS ELEKTRISKĀS PRETESTĪBAS (TEP) TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 430 (2015) aprakstītajam. Ādas korozija ir nepārejošs ādas bojājums, kas izpaužas kā tāda redzama nekroze visā epidermā, kura ietiecas dermā un radusies pēc tam, kad uz ādas aplicēta testējamā ķimikālija [atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula) (1)]. Šajā atjauninātajā testēšanas metodē B.40 aprakstīta in vitro procedūra, kas dod iespēju saskaņā ar ANO GHS (1) un ar CLP identificēt nekodīgas un kodīgas vielas.

2.

Kodīgumu ādai parasti novērtē, izmantojot laboratorijas dzīvniekus (TM B.4, kas ekvivalenta ESAO TG Nr. 404, kura sākotnēji pieņemta 1981. gadā un pārstrādāta 1992., 2002. un 2015. gadā) (2). Papildus pašreizējai testēšanas metodei B.40, attiecībā uz to, kā testēt ķimikāliju potenciālu izraisīt ādas koroziju, validētas un kā TM B.40a (ekvivalenta ESAO TG 431) (3) un TM B.65 (ekvivalenta ESAO TG 435) (4) pieņemtas ir citas in vitro testēšanas metodes, ar kurām vajadzības gadījumā iespējams arī identificēt kodīgu ķimikāliju apakškategorijas. Vairākas tādas in vitro testēšanas metodes kā TM B.56 (ekvivalenta ESAO TG 439 (5)) ir pieņemtas izmantošanai ādas kairinājuma testēšanā. ESAO norādījumu dokuments par Integrētu testēšanas un novērtēšanas pieeju (IATA) attiecībā uz ādas koroziju un kairinājumu apraksta vairākus moduļus, kādos grupēti informācijas avoti un analīzes instrumenti, un, pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un, otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (6).

3.

Šis testēšanas metodes apraksts pievēršas tādam cilvēkveselības beigupunktam kā ādas korozija. Metodes pamatā ir žurkas ādas transkutānās elektriskās pretestības (TEP) tests, kurā, izmantojot ādas diskus, kodīgas vielas tiek atpazītas pēc to spējas izraisīt stratum corneum normālā veseluma un barjerfunkcijas zudumu. Attiecīgā ESAO testēšanas vadlīnija sākotnēji pieņemta 2004. gadā un 2015. gadā atjaunināta, lai ietvertu atsauci uz IATA norādījumu dokumentu.

4.

Lai izvērtētu regulatīvām vajadzībām veiktu ādas korozijas testēšanu in vitro, tika izdarīti pirmsvalidācijas pētījumi (7), pēc kuriem tika veikts oficiāls validācijas pētījums attiecībā uz tādu žurkas ādas TEP testēšanas metodi, ar ko novērtē kodīgumu ādai (8) (9) (10) (11). Šo pētījumu iznākums bija ieteikums TEP testēšanas metodi (kas ir noteikta par validēto references metodi, VRM) izmantot regulatīvām vajadzībām kodīguma ādai novērtēšanā in vivo (12) (13 (14).

5.

Pirms kādu piedāvātu līdzīgu vai modificētu in vitro TEP testēšanas metodi, kas nav VRM, attiecībā uz ādas koroziju iespējams izmantot regulatīvām vajadzībām, saskaņā ar veiktspējas standartu (PS) (15) prasībām būtu jānosaka tās ticamība, relevantums (pareizība) un piedāvātā lietojuma ierobežojumi, lai būtu drošība par tās līdzību VRM. ESAO datu savstarpējā atzīšana (Mutual acceptance of data) būs garantēta tikai tad, kad jebkāda jauna ierosināta vai atjaunināta VS atbilstoša testēšanas metode būs pārskatīta un iekļauta attiecīgajā ESAO testēšanas vadlīnijā.

DEFINĪCIJAS

6.

Izmantotās definīcijas sniegtas papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

7.

Validācijas pētījums (10) un citi publicēti pētījumi (16) (17) liecina, ka žurkas ādas TEP testēšanas metode spēj ādai kodīgas un nekodīgas vielas 122 vielu datubāzē atšķirt ar kopējo jutību 94 % (51/54) un specifiskumu 71 % (48/68).

8.

Šī testēšanas metode attiecas uz ādas koroziju in vitro. Ar tās palīdzību iespējams saskaņā ar ANO GHS / CLP identificēt nekodīgas un kodīgas testējamās ķimikālijas. Kā pierāda validācijas pētījumi (8) (9) (10) (11), viens šīs testēšanas metodes ierobežojums ir tāds, ka ar to nav iespējams kodīgas vielas un maisījumus sadalīt apakškategorijās atbilstoši ANO GHS vai CLP. Tāpēc šīs testēšanas metodes izmantošanas veids būs atkarīgs no piemērojamā tiesiskā regulējuma. Šī testēšanas metode gan pietiekami neinformē par ādas kairinājumu, taču jānorāda, ka tādai ietekmei uz veselību kā ādas kairinājums īpaši pievēršas TM B.46. Attiecībā uz to, kā pilnīgi izvērtēt lokālo ietekmi uz ādu pēc vienreizējas dermālas ekspozīcijas, jāizmanto ESAO norādījumu dokuments par integrētajām testēšanas un novērtēšanas pieejām (IATA) (6).

9.

Validēšanā, kas ir pamatā šai testēšanas metodei, testēts daudz dažādu ķimikāliju, galvenokārt vielu, un validācijas pētījuma empīriskajā datubāzē bija pat 60 vielas, kas aptver daždažādas ķimikāliju klases (8)(9). Raugoties pēc kopējiem datiem, kas pieejami, šī testēšanas metode ir piemērojama plašam ķimikāliju klašu un agregātstāvokļu klāstam, ieskaitot šķidrumus, puscietas un cietas vielas, kā arī vaskus. Tomēr, tā kā attiecībā uz specifiskiem agregātstāvokļiem testējami objekti ar piemērotiem atsauces datiem nav viegli pieejami, jānorāda, ka validēšanā tikuši novērtēti samērā nedaudzi vaski un kodīgas cietas vielas. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumi; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja pierādījumi liecina, ka šī testēšanas metode kādai konkrētai vielu kategorijai nav izmantojama, to attiecībā uz konkrēto minēto kategoriju neizmanto. Turklāt, balstoties uz šīs testēšanas metodes izmantojamību attiecībā uz vielām, tiek uzskatīts, ka tā izmantojama arī attiecībā uz maisījumiem. Tomēr maisījumi aptver plašu kategoriju un sastāvu spektru un patlaban par maisījumu testēšanu sevišķi daudz informācijas nav pieejams, tāpēc, ja var pierādīt, ka kādai konkrētai maisījumu kategorijai (piemēram, saskaņā ar stratēģiju, ko piedāvā Eskes u. c., 2012. g.) (18) attiecīgā testēšanas metode nav izmantojama, šo testēšanas metodi šai konkrētajai maisījumu kategorijai nevajag izmantot. Pirms attiecībā uz maisījumu izmanto šo testēšanas metodi, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga. Validācijas pētījumos vēl nav vērtētas gāzes un aerosoli (8) (9). Kaut arī jādomā, ka vispār gāzes un aerosolus ar TEP tehnoloģiju testēt ir iespējams, ar pašreizējo testēšanas metodi tos testēt nevar.

TESTA PRINCIPS

10.

Testēšanas sistēmā ar diviem nodalījumiem, kurus vienu no otra nodala ādas diski, testējamo vielu uz laiku līdz 24 stundām aplicē šo ādas disku epidermālajai virsmai. Ādas diskus ņem no humāni nonāvētām 28–30 dienas vecām žurkām. Kodīgas ķimikālijas identificē pēc to spējas izraisīt stratum corneum normālā veseluma un barjerfunkcijas zudumu, ko mēra kā TEP pazemināšanos zem sliekšņlīmeņa (16) (sk. 32. punktu). Žurkas ādas TEP vajadzībām ir izraudzīta robežvērtība 5kΩ, balstoties uz plašiem datiem par lielu ķīmisko vielu klāstu, kur lielākā daļa vērtību nepārprotami bijusi vai nu par šo vērtību krietni augstāka (bieži vien > 10 kΩ), vai krietni zemāka (parasti < 3 kΩΩ) (16). Testējamās ķimikālijas, kas dzīvniekiem nerada ādas koroziju, bet ir vai nav kairinošas, TEP vērtību parasti nepazemina zemāk par šo robežvērtību. Bez tam, ja izmanto citus ādas preparātus vai citu aparatūru, robežvērtība var mainīties, tāpēc var būt vajadzīga papildu validācija.

11.

Testēšanas procedūrā, ar ko apstiprinoši testē pozitīvus TEP rezultātus, ieskaitot vērtības apΩ, tiek iekļauts krāsvielas saistīšanas solis. Krāsvielas saistīšanas solī tiek noteikts, vai jonu caurlaidības palielinājumu izraisījusi fiziska stratum corneum noārdīšanās. Ir apliecināts, ka TEP metode, kurā izmanto žurkas ādu, spēj prognozēt kodīgumu B.4. testēšanas metodē, ko in vivo īsteno ar trušiem (2).

KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA

12.

Pirms šai testēšanas metodei atbilstošo žurkas ādas TEP testēšanas metodi sākt izmantot regulāri, laboratorijām būtu jāpierāda tehniskā kompetence, pareizi saklasificējot 1. tabulā ieteiktās standartvielas. Gadījumos, kur kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama vai kur tas attaisnojami, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati (piem., vielu no references ķimikāliju saraksta (16)), ja vien tiek izmantoti tie paši 1. tabulā aprakstītie izraudzīšanās kritēriji.

1. tabula

Standartvielu (2) saraksts

Viela

CAS Nr.

Ķimikāliju klase (3)

ANO GHS/CLP Kategorijas, kuru pamatā ir in vivo rezultāti (4)

VRM Kategorijas, kuru pamatā ir in vitro rezultāti

Agregātstāvoklis

pH (5)

In vivo kodīgas vielas

N,N’-dimetil dipropilēntriamīns

10563-29-8

organiska bāze

1.A

6 × K

Š

8,3

1,2-diaminopropāns

78-90-0

organiska bāze

1.A

6 × K

Š

8,3

sērskābe (10 %)

7664-93-9

neorganiska skābe

(1.A/)1.B/1.C

5 × K 1 × NK

Š

1,2

kālija hidroksīds (10 % ūd.)

1310-58-3

neorganiska bāze

(1.A/)1.B/1.C

6 × K

Š

13,2

oktānskābe (kaprilskābe)

124-07-2

organiska skābe

2.B/1.C

4 × K 2 × NK

Š

3,6

2-terc-butilfenols

88-18-6

fenols

2.B/1.C

4 × K 2 × NK

Š

3,9

In vivo nekodīgas vielas

izostearīnskābe

2724-58-5

organiska skābe

NK:

6 × NK

Š

3,6

4-amino-1,2,4-triazols

584-13-4

organiska bāze

NK

6 × NK

KV

5,5

fenetilbromīds

103-63-9

elektrofīla viela

NK

6 × NK

Š

3,6

4-(metiltio)-benzaldehīds

3446-89-7

elektrofīla viela

NK

6 × NK

Š

6,8

1,9-dekadiēns

1647-16-1

neitrāla organiska viela

NK

6 × NK

Š

3,9

tetrahloretilēns

127-18-4

neitrāla organiska viela

NK

6 × NK

Š

4,5

Saīsinājumi: aq = uz ūdens bāzes; CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs; VRM = validēta references metode; K = kodīga; NK = nekodīga.

PROCEDŪRA

13.

Uz žurkas ādas TEP balstītās ādas korozijas testēšanas metodes sakarā ir pieejamas darba standartprocedūras (SOP) (19). Šīs testēšanas metodes aptvertajām uz žurkas ādas TEP ādas balstītajām korozijas testēšanas metodēm būtu jāatbilst šādiem nosacījumiem:

Dzīvnieki

14.

Būtu jāizmanto žurka, jo tās ādas jutība pret vielām šajā testēšanas metodē ir jau iepriekš pierādīta (10) un žurka ir vienīgais oficiāli validētais ādas avots (8) (9). Sevišķi liela nozīme ir žurku vecumam (laikā, kad ņem ādu) un līnijai, lai būtu droši, ka apmatojuma folikulas ir snaudas fāzē, kāda ir pirms pieauguša dzīvnieka apmatojuma augšanas sākšanās.

15.

Jauniem, apmēram 22 dienas veciem (atvasināti no Wistar vai līdzīga līnija) žurku vīrišķā vai sievišķā dzimuma īpatņiem uzmanīgi nocērp muguras un sānu apmatojumu. Pēc tam dzīvniekus, rūpīgi slaukot, mazgā, cirpto vietu iemērcot antibiotiku šķīdumā (kas satur, piemēram, streptomicīnu, penicilīnu, hloramfenikolu un amfotericīnu koncentrācijā, kura iedarbīgi inhibē baktēriju augšanu). Trešajā vai ceturtajā dienā pēc pirmās mazgāšanas dzīvniekus atkal mazgā ar antibiotikām, un tos izmanto triju dienu laikā pēc otrās mazgāšanas, kad pēc apmatojuma noņemšanas stratum corneum ir atjaunojies.

Ādas disku preparātu sagatavošana

16.

28–30 dienu vecumā dzīvniekus humāni nonāvē; vecums ir kritiski svarīgs. Tad ņem katra dzīvnieka muguras un sānu ādu, no kuras atdala zemādas taukus, tos uzmanīgi atslāņojot. Izgriež ādas diskus ar diametru apm. 20 mm. Ja pierādīts, ka pozitīvo un negatīvo kontroļu dati ir līdzvērtīgi datiem, kas iegūti, izmantojot svaigu ādu, āda var būt glabāta līdz disku izmantošanas brīdim.

17.

Ādas disku novieto uz viena PTFE (politetrafluoretilēna) caurulītes gala tā, lai epidermālā virsma būtu kontaktā ar caurulīti. Pāri caurulītes galam ādas fiksēšanai uzmauc gumijas gredzenu, liekos audus nogriež. Pēc tam gumijas gredzena piestiprinājuma vietu PTFE caurulītei hermetizē, rūpīgi apziežot ar vazelīnu. Caurulīti ar atsperīgu spaili nostiprina receptora kamerā, kurā ir MgSO4 šķīdums (154 mM) (1. attēls). Ādas diskam jābūt pilnīgi iegremdētam MgSO4 šķīdumā. No vienas žurkas ādas var iegūt 10–15 diskus. Caurulītes un gredzena izmēri norādīti 2. attēlā.

18.

Pirms sākt testēšanu, katra dzīvnieka ādai izdara kvalitātes kontroles procedūru, proti, izmēra divu ādas disku TEP. Lai pārējos diskus varētu izmantot testēšanas metodes vajadzībām, abu disku pretestībai jāpārsniedz 10 kΩ. Ja pretestība nesasniedz 10 kΩ, šīs ādas diski nav derīgi.

Testējamās ķimikālijas un kontrolvielu aplicēšana

19.

Katrā izpildes reizē (eksperimentā) jāizmanto paralēlas pozitīvas un negatīvas kontroles, lai būtu nodrošināta adekvāta eksperimenta modeļa veiktspēja. Katrā izpildes reizē (eksperimentā) jāizmanto tikai viena dzīvnieka ādas diski. Pozitīvai un negatīvai kontrolei ieteicams izmantot attiecīgi 10 M sālsskābes un ūdens.

20.

Šķidras testējamās vielas (150 μl) vienmērīgi aplicē uz epidermālās virsmas caurulītes iekšpusē. Testējot cietus materiālus, uz diska vienmērīgi aplicē tikdaudz cietās vielas, lai visa epidermālā virsma būtu pārklāta. Uz cietās vielas virsmas pievieno dejonizētu ūdeni (150μl) un cauruli viegli sakrata. Lai panāktu maksimālu saskari ar ādu, cietas vielas var būt jāuzsilda līdz 30 ° C, lai testējamo ķimikāliju izkausētu, padarītu mīkstāku vai sasmalcinātu, iegūstot granulveida vai pulverveida materiālu.

21.

Katrai testējamai ķimikālijai un kontrolķimikālijai katrā testa izpildes reizē (eksperimentā) izmanto trijus ādas diskus. Testējamās ķimikālijas aplicē uz 24 stundām 20–23 °C temperatūrā. Testējamo ķimikāliju noņem ar ūdensvada ūdens strūklu, kura temperatūra nepārsniedz istabas temperatūru, skalošanu beidzot, kad vairāk materiāla nav noņemams.

TEP mērīšana

22.

Ādas pretestību mēra kā TEP, izmantojot Vitstona tiltu zemsprieguma maiņstrāvas režīmā (18). Tilta vispārīgie parametri ir darba spriegums 1–3 V, sinusoīdas veida vai taisnstūrveida maiņstrāva ar frekvenci 50–1 000 Hz un mērījumu diapazons vismaz 0,1–30 kΩ. Ar validēšanai izmantoto mērtiltu virknes vai paralēlajā slēgumā tika mērīta induktivitāte, kapacitāte un pretestība attiecīgi līdz 2 000 H, 2 000 μF un 2 MΩ pie frekvences 100 Hz vai 1 kHz. TEP kodīguma testa vajadzībām mērījumi tiek atspoguļoti virknes slēgumam kā pretestība pie frekvences 100 Hz. Pirms elektriskās pretestības mērīšanas samazina ādas virsmas spraigumu, pievienojot tādu tilpumu 70 % etanola, lai būtu pārklāta epiderma. Pēc dažām sekundēm etanolu no caurulītes izlej un audus hidratē, pievienojot 3 ml MgSO4 šķīduma (154 mM). Mērtilta elektrodus novieto abās ādas diska pusēs, lai izmērītu ādas disku pretestību kΩ (1. attēls). Elektroda izmēri un elektroda daļas garums zem turētāja spailes aplūkojami 2. attēlā. Iekšējā elektroda turētāja spaile pretestības mērīšanas laikā balstās uz PTFE caurules, lai nodrošinātu, ka MgSO4 šķīdumā pastāvīgi ir iegremdēts vienāds elektroda garums. Ārējais elektrods receptora kamerā tiek ievietots tādā veidā, ka elektrods balstās pret kameras dibenu. Attālums starp atsperes spaili un PTFE caurulītes apakšu nedrīkst mainīties (2. attēls), jo šis attālums ietekmē iegūto pretestības vērtību. Tātad attālumam starp iekšējo elektrodu un ādas disku jābūt nemainīgam un iespējami mazam (1–2 mm).

23.

Par 20 kΩ augstāku izmērītās pretestības vērtību var radīt arī uz ādas diska epidermālās virsmas palikušas testējamās ķimikālijas paliekas. Šo pārklājumu pilnīgāk likvidēt var mēģināt, piemēram, PTFE caurulīti hermētiski aizspiežot ar cimdotu īkšķi un apm. 10 sekundes pakratot; MgSo4 šķīdumu izlej un pretestības mērīšanu atkārto ar svaigu MgSO4 šķīdumu.

24.

Iegūtās TEP vērtības var būt ietekmējuši testēšanai izmantotās aparatūras raksturlielumi, izmēri un eksperimenta procedūra. Kodīguma slieksnis 5 kΩ atvasināts, izmantojot datus, kas iegūti ar šajā metodes aprakstā norādīto specifisko aparatūru un procedūru. Ja tiek grozīti testēšanas nosacījumi vai ja izmanto citu aparatūru, var būt piemērojamas citas sliekšņvērtības un kontrolvērtības. Tādējādi metodika un pretestības sliekšņvērtības jākalibrē, testējot virkni standartvielu, kuras izraugās no validācijas pētījumā izmantoto vielu klāsta (8) (9) vai pētāmajām vielām līdzīgu ķimikāliju klašu vielām. Piemērotu standartvielu komplekss ir norādīts 1. tabulā.

Krāsvielu saistīšanas metodes

25.

Saskarē ar noteiktiem nekodīgiem materiāliem pretestība var samazināties zem robežvērtības 5 kΩ, paverot iespēju joniem izkļūt caur stratum corneum un vēl samazinot elektrisko pretestību (9). Piemēram, neitrālas organiskās vielas un virsmaktīvas vielas (deterģenti, emulgatori u. c.) var noņemt ādas lipīdus, palielinot membrānas joncaurlaidību. Tāpēc, ja ar šādām ķimikālijām iegūtās TEP vērtības ir apmēram 5 kΩ vai mazākas, bet saskatāma ādas bojājuma nav, kontrolaudiem un apstrādātajiem audiem jānoteic krāsvielas penetrācija, lai noskaidrotu, vai iegūtās TEP vērtības ir ādas caurlaidības paaugstināšanās vai ādas korozijas rezultāts (7) (9). Pēdējā gadījumā, ja ir stratum corneum pārrāvumi, audu slāni zem ādas virsmas ātri penetrē un nokrāso uz tās aplicēta krāsviela sulforodamīns B. Minētā krāsviela ir stabila pret ļoti daudzu ķīmisko vielu iedarbību, kā arī ir stabila turpmāk aprakstītajā ekstrakcijas procedūrā.

Krāsvielas sulforodamīna B aplicēšana un noņemšana

26.

Pēc TEP noteikšanas magnija sulfāta šķīdumu no caurulītes izlej un uzmanīgi apskatās, vai ādai nav acīmredzamu bojājumu. Ja acīmredzama liela bojājuma (piem., perforācijas) nav, katra ādas diska epidermālajai virsmai uz divām stundām aplicē 150 μl 10 % (masa/tilp.) krāsvielas sulfurodamīna (skābais sarkanais 52; C.I. 45100; CAS numurs 3520-42-1) šķīduma destilētā ūdenī. Lai visu lieko/nesaistīto krāsvielu noņemtu, ādas diskus pēc tam apmēram 10 sekundes skalo ar ūdensvada ūdeni, kura temperatūra nepārsniedz istabas temperatūru. Katru ādas disku no PTFE caurulītes piesardzīgi izņem un ievieto mēģenē (piemēram, 20 ml stikla scintilācijas mēģenē) ar dejonizētu ūdeni (8 ml). Mēģenes uzmanīgi 5 minūtes krata, lai noņemtu vēl jebkādu nesaistītu krāsvielu. Pēc tam skalošanas procedūru atkārto, tad ādas diskus izņem un ievieto mēģenēs ar 5 ml nātrija dodecilsulfāta (NDS) 30 % šķīdumu destilētā ūdenī un 60 °C temperatūrā inkubē līdz nākamajai dienai.

27.

Pēc inkubācijas visus ādas diskus izņem un atmet, bet šķīdumu 8 minūtes centrifugē 21 °C temperatūrā (relatīvais centrbēdzes spēks ~ 175 × g). Paraugu, kurā ir 1 ml supernatanta, 1:5 (tilp./tilp) (t. i., 1 ml + 4 ml) atšķaida ar 30 % (masa/tilp) NDS šķīdumu destilētā ūdenī. Mēra šķīduma optisko blīvumu (OB) pie 565 nm.

Krāsvielas satura aprēķināšana

28.

Krāsvielas sulforodamīna B saturu diskā aprēķina pēc OB vērtībām (9) (sulforodamīna B krāsvielas molārās ekstinkcijas koeficients pie 565 nm = 8,7 × l04; molekulmasa = 580). Krāsvielas saturu katram ādas diskam nosaka, izmantojot attiecīgo kalibrēšanas līkni, un pēc tam replikātiem aprēķina krāsvielas vidējo saturu.

Pieņemamības kritēriji

29.

Vidējie TEP rezultāti ir derīgi, ja paralēlās pozitīvās un negatīvās kontroles vērtības atbilst diapazoniem, kas attiecībā uz šo metodi ir pieņemami testēšanas laboratorijā. Pieņemamie pretestības diapazoni attiecībā uz iepriekš aprakstīto metodoloģiju un aparātu ir norādīti šajā tabulā:

Kontrole

Viela

Pretestības diapazons (KΩ)

pozitīvā

1 M sālsskābes

0,5–1,0

negatīvā

Destilēts ūdens

10–25

30.

Vidējie krāsvielas saistīšanas rezultāti derīgi ar nosacījumu, ka paralēlo kontroļu vērtības atbilst diapazoniem, kas attiecībā uz šo metodi ir pieņemami. Ieteicamie pieņemamie krāsvielas satura diapazoni kontrolvielām, kuras izmanto ar augstāk aprakstīto metodoloģiju un aparatūru, norādīti šajā tabulā:

Kontrole

Viela

Krāsvielas satura diapazons (μg/disks)

pozitīvā

1 M sālsskābes

40–100

negatīvā

Destilēts ūdens

15–35

Rezultātu interpretēšana

31.

Šo testēšanas metodi optimizējot, noteikta, pirmsvalidācijas fāzē testēta un oficiālā validācijas pētījumā apstiprināta tika TEP robežvērtība, pie kuras kodīgas ķimikālijas tiek nošķirtas no nekodīgām.

32.

Ar ANO GHS / CLP asociētais prognozēšanas modelis attiecībā uz ādas korozijas testēšanas metodi, kas balstās uz žurkas ādas TEP ir sniegts zemāk:

Uzskatāms, ka testējamā ķimikālija uz ādu kodīgi neiedarbojas:

i)

ja attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtā vidējā TEP vērtība ir lielāka par (>) 5 kΩ vai

ii)

attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtā vidējā TEP vērtība ir mazāka par vai vienāda ar (>) 5 kΩ un

ādas diski nav acīmredzami bojāti (piem., perforēti) un

vidējais krāsvielas saturs uz disku ir mazāks par (<) vidējo krāsvielas saturu uz disku, kāds ir paralēlajai 10 M HCl pozitīvajai kontrolei (attiecībā uz pozitīvās kontroles vērtībām sk. 30. punktu).

Uzskatāms, ka testējamā ķimikālija uz ādu iedarbojas kodīgi:

i)

ja attiecībā uz šo testējamo ķimikāliju vidējā TEP vērtība ir mazāka par vai vienāda ar (≤) 5 kΩ un šie ādas diski ir acīmredzami bojāti (piem., perforēti) vai

ii)

attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtā vidējā TEP vērtība ir mazāka par vai vienāda ar (>) 5 kΩ un

ādas diski nav acīmredzami bojāti (piem., perforēti), bet

vidējais krāsvielas saturs uz disku ir lielāks par vai vienāds ar (≥) vidējo krāsvielas saturu uz disku, kāds ir paralēlajai 10 M HCl pozitīvajai kontrolei (attiecībā uz pozitīvajām kontrolvērtībām sk. 30. punktu).

33.

Vienai atsevišķai testēšanas reizei (eksperimentam) ar vismaz trim ādas disku replikātiem jābūt pietiekamai gadījumos, kur testējamās ķīmiskās vielas klasifikācija ir nepārprotama. Tomēr ja rezultāti ir uz robežas, piemēram, replikātu mērījumiem trūkst konkordances un/vai vidējais TEP ir 5 ± 0,5 kΩ, jāapsver, vai nav vajadzīga otrā testēšanas reize (eksperiments), kā arī vai nav vajadzīga trešā, ja abu pirmo divu testēšanas reižu (eksperimentu) rezultāti nesakrīt.

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Dati

34.

Attiecīgā gadījumā testējamās ķimikālijas pretestības vērtības (kΩ) un krāsvielas satura vērtības (μg uz disku) būtu jāatspoguļo tabulas veidā, ieskaitot datus par katru atsevišķo replikāta disku katrā testēšanas reizē (eksperimentā) un vidējās vērtības ± standartnovirze. Jāatspoguļo visi eksperimentu atkārtojumi. Attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju ziņojumā būtu jāatspoguļo novērotie ādas disku bojājumi.

Testēšanas pārskats

35.

Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.

 

Testējamā ķimikālija un kontroles ķimikālijas:

vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. c.;

daudzkomponentu vielas, UVCB un maisījumi iespējami izsmeļoši raksturotas pēc to komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām;

izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;

avots, no kura dzīvnieki saņemti, sērijas numurs, ja zināms;

testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana), ja tāda veikta;

testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;

glabāšanas apstākļi.

 

Testa dzīvnieki:

izmantotā līnija un dzimums;

par donordzīvniekiem izmantoto dzīvnieku vecums;

avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.;

detalizēta informācija par ādas preparātu sagatavošanu.

 

Testēšanas nosacījumi:

testēšanas iekārtu kalibrēšanas līknes;

krāsvielas saistīšanas testa izpildes kalibrācijas līknes, OB mērīšanai izmantotās vērtības un attiecīgā gadījumā mērierīces (piem., spektrofotometra) OB linearitātes diapazons;

detalizēta informācija par TEP mērīšanai izmantoto testēšanas procedūru;

attiecīgā gadījumā — detalizēta informācija par krāsvielas saistīšanas noteikšanai izmantoto procedūru;

testā izmantotās devas, ekspozīcijas perioda vai periodu ilgums un ekspozīcijas temperatūra vai temperatūras;

detalizēta informācija par mazgāšanas procedūru, ko izmanto pēc ekspozīcijas perioda;

uz vienu testējamo ķimikāliju un uz kontrolēm (pozitīvo un negatīvo kontroli) izmantoto replicēto ādas disku skaits;

testa procedūras modifikāciju apraksts, ja tādas bijušas;

norāde uz modeļa vēsturiskajiem datiem. No tiem jānorāda vismaz:

i)

pozitīvās un negatīvās kontroles TEP vērtību (izteiktas kΩ) pieņemamība ar norādi uz pozitīvās un negatīvās kontroles pretestības diapazoniem,

ii)

pozitīvās un negatīvās kontroles krāsvielas satura vērtību (izteiktas μg/disc) pieņemamība ar norādi uz pozitīvās un negatīvās kontroles krāsvielas satura diapazoniem,

iii)

testa rezultātu pieņemamība ar norādi uz ādas disku replikātu vēsturisko mainību;

izmantoto lēmuma pieņemšanas kritēriju / prognozēšanas modeļa apraksts.

 

Rezultāti:

tabulas veidā apkopoti TEP un krāsas saistīšanas testu (attiecīgā gadījumā) dati par atsevišķām testējamām ķimikālijām un kontrolēm, sniegti par katru testēšanas reizi (eksperimentu) un katru ādas diska replikātu (pa atsevišķiem dzīvniekiem un atsevišķiem ādas paraugiem, vidējās vērtības, standartnovirze un variācijas koeficients;

apraksts par jebkādu novērotu ietekmi;

atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognozēšanas modeli un/vai lēmuma pieņemšanas kritēriju.

 

Rezultātu iztirzājums

 

Secinājumi

LITERATŪRA

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Chapter B.4 of this Annex, Acute Dermal Irritation, Corrosion.

(3)

Chapter B.40bis of this Annex, In Vitro Skin Model.

(4)

Chapter B.65 of this Annex, In Vitro Membrane Barrier Test Method.

(5)

Chapter B.46 of this Annex, In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.

1. Attēls

Zurkas Zdas Tep Testa Aparāts

Image 2

2. Attēls

Politetrafluoretilēna (PFTE) Caurulītes, Receptora Kameras Un Elektrodu Izmēri

Image 3

Attēlotā aparāta darbības kritiskie faktori:

PTFE caurulītes iekšējais diametrs,

elektrodu garumam attiecībā pret PTFE caurulīti un receptora kameru jābūt tādam, lai elektrodi nepieskartos ādas diskam un lai elektroda standartgarums būtu saskarē ar MgSO4 šķīdumu,

MgSO4 šķīduma līmenim receptora kamerā jābūt tādam, lai attiecībā uz šķidruma līmeni PTFE caurulītē līmenis būtu kā 1. attēlā,

lai elektriskās pretestības mērījums patiesi atspoguļotu ādas īpašības, ādas diskam jābūt pietiekami labi fiksētam pie PTFE caurulītes.

Papildinājums

DEFINĪCIJAS

Pareizība : pakāpe, kādā testēšanas metodes rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas mērs un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pašā nozīmē kā terminu “konkordantums”, ar to saprotot testēšanas metodes pareizo iznākumu īpatsvaru (20).

K : kodīga.

Ķimikālija : viela vai maisījums.

Konkordantums : tādas testēšanas metodes veiktspējas mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži vien izmanto tādā pašā nozīmē kā terminu “pareizība”, ar to saprotot visu to testēto ķimikāliju īpatsvaru, kas pareizi klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas. Konkordantums lielā mērā ir atkarīgs no to pozitīvo rezultātu prevalences, kādi iegūti attiecībā uz pētāmajiem testējamo ķimikāliju veidiem (20).

GHS (Ķīmisko vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma): : sistēma, kas piedāvā ķimikāliju (vielu un maisījumu) klasifikāciju pa standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi (1).

IATA : integrētā testēšanas un novērtēšanas pieeja.

Maisījums : maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairākām vielām.

Vienkomponenta viela : tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vismaz 80 % (masa/masa) veido viena galvenā sastāvdaļa.

Daudzkomponentu viela : tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu vielas tiek iegūtas ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.

NK : nekodīgs.

OD : optiskais blīvums.

PK : pozitīvā kontrole, replikāts, kurā ir visi testēšanas sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar vielu, par ko zināms, ka tā inducē pozitīvu atbildreakciju. Lai būtu iespējams novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārāk liela.

Veiktspējas standarti (VS) : uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst: ((i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; (ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī iii), uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — tādi paši ticamības un pareizības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar novērtējamo testēšanas metodi, to izvērtējot ar references vielām no minimālā saraksta.

Relevantums : parametrs, kas raksturo testēšanas metodes un interesējošās ietekmes sakarību un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Pakāpe, kādā ar testēšanas metodi var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (20).

Ticamība : parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē, izmantojot vienu un to pašu protokolu, kādu testēšanas metodi vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās ilgākā laika nogrieznī var izmantot reproducējami. To novērtē, aprēķinot intralaboratorisko un interlaboratorisko reproducējamību (20).

Jutība : tas, cik liela daļa no visām pozitīvajām/aktīvajām ķimikālijām ar šo testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tas ir tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (20).

Ādas korozija in vivo : neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar dermu un radusies pēc tam, kad testējamā viela uz ādas aplicēta līdz četrām stundām. Tipiskas reakcijas uz kodīgumu ir čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.

Specifiskums : tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām ķimikālijām ar testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (20).

Viela : ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.

(Testēšanas) reize : atsevišķas testējamās ķimikālijas paralēla testēšana ar vismaz trijiem replicētiem ādas diskiem.

Testējamā ķimikālija : jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

Transkutānā elektriskā pretestība (TEP) : ādas elektriskās pretestības mērs, kas izteikts kiloomos (kΩ). Vienkārša un robusta metode, kā novērtē barjerfunkciju, ar Vitstona tilta palīdzību reģistrējot jonu pāreju caur ādu.

UVCB : vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.;

(6)

pielikuma B daļas B.40a nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.40.a   ĀDAS KOROZIJA IN VITRO: REKONSTRUĒTAS CILVĒKA EPIDERMAS RhE TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 431 (2016) aprakstītajam. Ādas korozija ir nepārejošs ādas bojājums, kas izpaužas kā tāda redzama nekroze visā epidermā, kura ietiecas dermā un radusies pēc tam, kad uz ādas aplicēta testējamā ķimikālija [atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula) (6)]. Šīs atjauninātās testēšanas metodes B.40a aprakstā raksturota in vitro procedūra, kas dod iespēju saskaņā ar ANO GHS (1) un ar CLP identificēt nekodīgas un kodīgas vielas. Ar tās palīdzību kodīgas vielas ir iespējams arī daļēji iedalīt apakškategorijās.

2.

Ķimikāliju ādas korozijas radīšanas potenciāla novērtēšana parasti bijusi saistīta ar laboratorijas dzīvnieku izmantošanu (TM B.4, līdzvērtīga ESAO TG 404; sākotnēji pieņemta 1981. g. un pārskatīta 1992., 2002. un 2015. g. (2). Lai testētu ķimikāliju potenciālu izraisīt ādas koroziju, bez pašreizējās testēšanas metodes B.40a validētas un pieņemtas ir tādas citas in vitro testēšanas metodes kā TM B.40a (ekvivalenta ESAO TG 430) (3) un TM B.65 (ekvivalenta ESAO TG 435) (4). Turklāt ādas kairinājuma potenciāla testēšanai ir pieņemta in vitro TM B.46 (ekvivalenta ESAO TG 439) (5). ESAO norādījumu dokuments par integrētu testēšanas un novērtēšanas pieeju (IATA) attiecībā uz ādas koroziju un kairinājumu apraksta vairākus moduļus, kādos grupēti informācijas avoti un analīzes instrumenti, un pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (6).

3.

Šis testēšanas metodes apraksts pievēršas tādam cilvēkveselības beigupunktam kā ādas korozija. Tas paredz izmantot rekonstruētu cilvēka epidermu (RhE) (iegūta no nepārveidotiem no cilvēka atvasinātiem epidermas keratinocītiem), kura tuvu atdarina cilvēka ādas augšējo slāņu jeb epidermas, histoloģiskās, morfoloģiskās, bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības. Attiecīgā testēšanas vadlīnija sākotnēji pieņemta 2004. gadā, 2013. gadā atjaunināta, lai tajā iekļautu papildu testēšanas metodes, kurās izmantoti RhE modeļi un paredzēta iespēja šīs metodes izmantot, lai uz tām balstītu kodīgu ķimikāliju iedalīšanu apakškategorijās, kā arī 2015. gadā atjaunināta, lai ietvertu atsauci uz IATA norādījumu dokumentu un ieviestu alternatīvu procedūru, ko izmanto dzīvotspējas mērīšanai.

4.

Šajā testēšanas metodē ir iekļauti četri validēti komerciāli pieejami RhE modeļi. Ir veikti pirmsvalidācijas pētījumi(7), pēc kuriem izdarīts oficiāls validācijas pētījums par ādas korozijas (8)(9)(10) novērtēšanu (11) (12) attiecībā uz diviem komerciāli pieejamiem testa modeļiem, EpiSkin™ Standard Model (SM) un EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (tālākajā tekstā saukti par validētajām references metodēm — VRM). Šo pētījumu iznākumā radās ieteikums, ka divas iepriekš minētās VRM varētu izmantot regulatīvām vajadzībām, lai kodīgas (C) vielas atšķirtu no nekodīgām (NC) vielām, un ka turklāt EpiSkin™ var izmantot par atbalstu kodīgu vielu iedalīšanā apakškategorijās (13) (14) (15). Saskaņā ar validāciju, kas balstās uz PS, līdzīgus rezultātus kā VRM EpiDerm™ ir uzrādījuši vēl divi citi komerciāli pieejami in vitro ādas korozijas RhE testa modeļi (16) (17) (18). Tie ir SkinEthic™ RHE (7) un epiCS® (agrākais nosaukums EST-1000), un arī tos var regulatīviem nolūkiem izmantot kodīgu vielu atšķiršanai no nekodīgām vielām (19)(20). Pēcvalidācijas pētījumi, ko RhE modeļa izstrādātāji 2012. līdz 2014. gadā izdarījuši ar precizētu protokolu, ar kura palīdzību tika koriģēta interference, ko rada testējamo ķimikāliju izraisīta nespecifiska MTT redukcija, uzlaboja gan C/NC atšķiršanas veiktspēju, gan atbalstu kodīgo vielu iedalīšanai apakškategorijās (21) (22). Ar EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un EpiCS® iegūtie pēcvalidācijas dati ir tālāk statistiski izanalizēti, lai apzinātu alternatīvus prognozēšanas modeļus, kas uzlabojuši prognozētspēju attiecībā uz apakškategorizēšanu (23).

5.

Pirms kādu piedāvātu līdzīgu vai modificētu in vitro RhE testēšanas metodi, kas nav VRM, attiecībā uz ādas koroziju iespējams izmantot regulatīvām vajadzībām, saskaņā ar veiktspējas standartu (PS) (24) prasībām, kuras aprakstītas saskaņā ar ESAO norādījumu dokumenta Nr. 34 (25) principiem būtu jānosaka tās ticamība, relevantums (pareizība) un piedāvātā lietojuma ierobežojumi, lai būtu drošība par tās līdzību VRM. Datu savstarpējā atzīšana (Mutual acceptance of data) būs garantēta tikai tad, ja visas jaunierosinātās vai atjauninātās VS atbilstošās testēšanas metodes būs pārskatītas un iekļautas attiecīgajā testēšanas vadlīnijā. Minētajā testēšanas vadlīnijā iekļautos testa modeļus var izmantot, lai, turklāt izmantojot datu savstarpējās atzīšanas priekšrocības, apmierinātu valstu prasības attiecībā uz testu rezultātiem, kas iegūti ar kādu in vitro testēšanas metodi ādas korozijas noteikšanai.

DEFINĪCIJAS

6.

Izmantotās definīcijas ir sniegtas 1. pielikumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

7.

Ar šīs testēšanas palīdzību iespējams saskaņā ar ANO GHS / CLP identificēt nekodīgas un kodīgas vielas un maisījumus. Šī testēšanas metode tālāk atbalsta kodīgu vielu un maisījumu apakškategorizēšanu ANO GHS (1) atbilstošā izvēles 1.A apakškategorijā un 1.B un 1.C apakškategorijas kombinācijā (21) (22) (23). Šo testēšanas metodi ierobežo nelielais labi zināmu 1.C apakškategorijas in vivo ādai kodīgu ķimikāliju kopums, tāpēc ar tās palīdzību saskaņā ar ANO GHS un ar CLP savstarpēji nošķirt “kodīgs ādai” 1.B un 1.C apakškategoriju nav iespējams. Iedalīšana apakškategorijās ir iespējama ar testēšanas modeļiem EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS® testa modeļiem (proti, 1.A apakškategorija attiecībā pret 1.B un 1.C apakškategoriju un attiecībā pret NK).

8.

Validācijā, kas atbalsta šajā testēšanas metodes aprakstā ietvertos testēšanas modeļus, kuri tiek izmantoti nekodīgu un kodīgu vielu identificēšanai, ķimikālijas ir testētas plašā klāstā, kurā galvenokārt pārstāvētas atsevišķas vielas; validācijas pētījuma empīriskajā datubāzē bija 60 ķimikāliju un tā aptvēra plašu ķimikāliju klašu klāstu (8) (9) (10). Testēšanas metodes izstrādātāji izdarīja testēšanu, kurā tika pierādīta testa jutība, specifiskums, pareizība un intralaboratoriskā reproducējamība tādām vajadzībām kā iedalīšana apakškategorijās, un rezultātus pārskatīja ESAO (21) (22) (23). Raugoties pēc pieejamiem vispārējiem datiem, šī testēšanas metode ir piemērojama plašam ķimikāliju klašu un agregātstāvokļu klāstam, ieskaitot šķidrumus, puscietas un cietas vielas, kā arī vaskus. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumi; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja iespējams, cietas vielas pirms aplicēšanas jāsamaļ smalkā pulverī; nekāda cita priekšapstrāde paraugam nav vajadzīga. Ja pierādījumi liecina, ka šie testa modeļi kādai konkrētai testēšanas metodes apraksta aptvertai testējamo ķimikāliju kategorijai nav izmantojama, to attiecībā uz minēto konkrēto kategoriju neizmanto. Turklāt, paplašinot šīs testēšanas metodes izmantojamību attiecībā uz vielām, tiek uzskatīts, ka tā izmantojama arī attiecībā uz maisījumiem. Tomēr, ņemot vērā, ka maisījumi aptver plašu kategoriju un sastāva spektru un patlaban pieejams tikai nedaudz informācijas par maisījumu testēšanu, tad, ja var pierādīt testēšanas metodes nepiemērojamību konkrētai maisījumu kategorijai (piemēram, saskaņā ar stratēģiju, kas piedāvāta (26)), attiecīgo testēšanas metodi minētajai konkrētajai maisījumu kategorijai neizmanto. Pirms attiecībā uz maisījumu izmanto šo testēšanas metodi, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga. Validācijas pētījumos vēl nav vērtēti gāzes un aerosoli (8) (9) (10). Kaut arī jādomā, ka vispār gāzes un aerosolus ar RhE tehnoloģiju testēt ir iespējams, ar pašreizējo testēšanas metodi tos testēt nevar.

9.

Testējamās ķimikālijas, kas gaismu absorbē tādā pašā diapazonā kā MTT formazāns, un testējamās ķimikālijas, kas vitālo krāsvielu MTT spēj tieši reducēt (līdz MTT formazānam), var ietekmēt audu dzīvotspējas mērījumus un tādēļ koriģēšanai var būt nepieciešams izmantot pielāgotas kontroles. Tas, kāda veida pielāgotas kontroles var būt vajadzīgas, var mainīties atkarībā no tā, kāda veida interferenci testējamā ķimikālija rada, un atkarībā no MTT formazāna mērīšanai izmantotās procedūras (sk. 25.–31. punktu).

10.

Lai arī ar šo testēšanas metodi nevar iegūt pietiekamu informāciju par ādas kairinājumu, jānorāda, ka tādai ietekmei uz veselību kā ādas kairinājums in vitro īpaši pievēršas TM B.46, kura balstās uz to pašu RhE testēšanas sistēmu, lai gan tai ir cits protokols (5). Attiecībā uz to, kā pilnīgi izvērtēt lokālo ietekmi uz ādu pēc vienreizējas dermālas ekspozīcijas, jāizmanto ESAO norādījumu dokuments par integrētajām testēšanas un novērtēšanas pieejām (6). Šajā IATA pieejā, pirms apsver, vai neveikt testēšanu ar dzīviem dzīvniekiem, izdara in vitro testus uz kodīgumu ādai (tādus, kā doti šajā metodes aprakstā) un kairinājumu ādai, Ir atzīts, ka cilvēka ādas izmantošanai jāatbilst nacionālām un starptautiskām ētikas normām un nosacījumiem.

TESTA PRINCIPS

11.

Testējamo ķimikāliju vietēji aplicē uz trīsdimensiju RhE modeļa, kuru veido nepārveidoti cilvēka epidermas keratinocīti, kas kultivēti tā, lai veidotos labi diferencēts daudzslāņains cilvēka epidermas modelis. Tai ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, kā arī vairākslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir reprezentatīva galvenajām lipīdu klasēm in vivo.

12.

RhE testēšanas metodes pamatā ir premisa, ka kodīgas ķimikālijas difūzijas vai erozijas ceļā spēj izkļūt cauri stratum corneum un ka tās ir citotoksiskas apakšā esošo slāņu šūnām. Šūnu dzīvotspēju mēra pēc vitālās krāsvielas MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolila zilais tetrazolija bromīds; CAS Nr. 298-93-1] fermentatīvās pārvēršanās par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu kvantitatīvi nosaka audu ekstraktā (27). Kodīgas ķimikālijas identificē pēc to spējas šūnu dzīvotspēju samazināt zem noteiktām sliekšņvērtībām (sk. 35. un 36. punktu). Ir parādīts, ka uz RhE balstītā ādas korozijas testēšanas metode spēj prognozēt trušiem saskaņā ar TM B.4 novērtētu ādas korozijas ietekmi in vivo (2).

KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA

13.

Pirms kādu no četriem šai testēšanas metodei atbilstošajiem validētajiem RhE testa modeļiem sāk izmantot regulāri, laboratorijām ieteicams pierādīt tehnisko kompetenci, pareizi saklasificējot divpadsmit 1. tabulas sarakstā norādītās standartvielas. Ja izmanto metodi, kura paredzēta sīkākai klasificēšanai, jāpierāda arī, ka pareizi tiek veikta iedalīšana apakškategorijās. Gadījumos, kur kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama vai kur tas attaisnojami, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati (piem., vielu no references ķimikāliju saraksta (24)), ja vien tiek izmantoti tie paši 1. tabulā aprakstītie izraudzīšanās kritēriji.

1. tabula

Standartvielu (8) saraksts

Viela

CAS Nr.

Ķimikāliju klase (9)

ANO GHS/CLP kat. uz in vivo rezultātu bāzes (10)

VRM kat. uz in vitro rezultātu (11) bāzes

MTT Reducētājs (12)

Agregāt-stāvoklis

1.A kategorija, In Vivo kodīgas vielas

brometiķskābe

79-08-3

organiska skābe

1.A

(3) 1.A

CV

bora trifluorīddihidrāts

13319-75-0

neorganiska skābe

1.A

(3) 1.A

Š

fenols

108-95-2

fenols

1.A

(3) 1.A

CV

dihloracetil-hlorīds

79-36-7

elektrofīla viela

1.A

(3) 1.A

Š

Apakškategoriju 1B-un-1C kombinācija, In Vivo kodīgas vielas

glioksilskābes monohidrāts

563-96-2

organiska skābe

1B-un-1C

(3) 1B-un-1C

S

pienskābe

598-82-3

organiska skābe

1B-un-1C

(3) 1B-un-1C

L

etanolamīns

141-43-5

organiska bāze

1B

(3) 1B-un-1C

viskoza viela

hlorūdeņražskābe (14,4 %)

7647-01-0

neorganiska skābe

1.B-un-1.C

(3) 1.B-un-1.C

L

in vivo nekodīgas vielas (vielas, kas nav kodīgas)

fenetilbromīds

103-63-9

elektrofīla viela

NK

(3) NK

Š

4-amino-1,2,4-triazols

584-13-4

organiska bāze

NK

(3) NK

CV

4-(metiltio)-benzaldehīds

3446-89-7

elektrofīla viela

NK

(3) NK

Š

laurīnskābe

143-07-7

organiska skābe

NK

(3) NK

CV

Saīsinājumi: CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs VRM = validēta references metode; NK = nekodīga viela; CV = cieta viela; Š = šķidrums.

14.

Kompetences pierādīšanā lietotājam ieteicams pēc audu saņemšanas verificēt, ka to barjerīpašības atbilst RhE modeļa ražotāja dotajai specifikācijai. Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audu sūtījums piegādāts no tālienes vai piegāde bijusi ilga. Kad testēšanas metode sekmīgi apgūta un kompetence tās izmantošanā pierādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt katru reizi. Tomēr, ja testēšanas metodi izmanto parastajā praksē, barjerfunkciju ieteicams joprojām novērtēt regulāri.

PROCEDŪRA

15.

Tālāk vispārīgi aprakstīti šīs testēšanas metodes aptverto ādas korozijas novērtēšanai paredzēto RhE testēšanas modeļu komponenti un procedūras. RhE modeļus, kas atzīti par zinātniski derīgiem izmantošanai šajā testēšanas metodē, proti, modeļus EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE un epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), var iegūt no komerciāliem piegādātājiem. Attiecībā uz šiem četriem RhE modeļiem ir pieejamas darba standartprocedūras (SOP), un pārskats par šo modeļu testēšanas metodes galvenajiem komponentiem sniegts 2. papildinājumā. Jebkuru no šiem modeļiem īstenojot un izmantojot laboratorijā, ieteicams iepazīties ar attiecīgo SOP. Testēšanai ar šīs testēšanas metodes aptvertajiem četriem RhE testēšanas modeļiem būtu jāatbilst tālāk minētajiem nosacījumiem.

RHE TESTĒŠANAS METODES KOMPONENTI

Vispārīgie nosacījumi

16.

Epitēlija rekonstruēšanai jāizmanto nepārveidoti cilvēka keratinocīti. Zem funkcionējoša stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt vairākslāņainam, ar tādu esenciālo lipīdu profilu, lai izveidotos funkcionāla barjera, kura ir pietiekami robusta, lai nepieļautu citotoksisku etalonķimikāliju, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrēšanos. Barjerfunkcija būtu uzskatāmi jāpierāda, un šo funkciju iespējams novērtēt, vai nu nosakot, pie kādas koncentrācijas etalonķimikālija pēc noteikta ekspozīcijas laika par 50 % samazina audu dzīvotspēju (IC50), vai nosakot, kāds ekspozīcijas laiks vajadzīgs, lai pēc tam, kad konkrētā noteiktā koncentrācijā aplicēta etalonķimikālija (sk. 18. punktu), par 50 % samazinātos šūnu dzīvotspēja (ET 50). RhE modeļa aizturētājīpašībām jābūt tādām, lai ap stratum corneum esošais materiāls nenokļūtu dzīvotspējīgos audos, kā dēļ var tikt nepareizi modelēta ādas ekspozīcija. RhE modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu vai sēnītēm.

Funkcionālie nosacījumi

Dzīvotspēja

17.

Audu dzīvotspējas kvantitatīvai noteikšanai izmanto MTT testu (27). RhE audu modeļa dzīvotspējīgās šūnas vitālo krāsvielu MTT spēj reducēt par zilas krāsas MTT formazāna nogulsnēm, kuras pēc tam no audiem tiek ekstrahētas ar izopropanola (vai līdzīga šķīdinātāja) starpniecību. Jau paša ekstrakcijas šķīduma optiskajam blīvumam (OB) jābūt pietiekami zemam, t. i., OB < 0,1. Ekstrahēto MTT formazānu kvantitatīvi var izteikt, vai nu izmantojot standartabsorbcijas OB mērīšanu, vai HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (38). RhE modeļa lietotājiem jānodrošina, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst negatīvās kontroles vajadzībām definētajiem kritērijiem. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānosaka negatīvās kontroles OB vērtību pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība). Četru validēto šajā testēšanas metodē iekļauto RhE testa modeļu negatīvās kontroles OB vērtību pieņemamības diapazoni ir norādīti 2. tabulā. HPLC/UPLC spektrofotometrijas lietotājam par negatīvās kontroles pieņemšanas kritēriju jāizmanto 2. tabulā norādītie negatīvās kontroles OB diapazoni. Jādokumentē, vai visā ekspozīcijas periodā ar negatīvo kontroli apstrādātie audi kultūrā ir stabili (uzrāda tādus pašus OB rādītājus).

2. tabula

Partijas kvalitātes kontrolei paredzētie negatīvās kontroles optiskā blīvuma vērtību pieņemamības diapazoni

 

Apakšējā pieņemamības robežvērtība

Augšējā pieņemamības robežvērtība

EpiSkin™

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Barjerfunkcija

18.

Stratum corneum un tā lipīdsastāvam jābūt pietiekamam, lai nepieļautu noteiktu citotoksisku etalonķimikāliju, piemēram, SDS vai Triton X-100, strauju penetrēšanos, un to nosaka ar IC 50 vai ET 50 (3. tabula). RhE modeļa izstrādātājam/tirgotājam, piegādājot audus galalietotājam, jāpierāda katras izmantotā RhE modeļa partijas barjerfunkcija (sk. 21. punktu).

Morfoloģija

19.

RhE modelis būtu histoloģiski jāizmeklē, pierādot, ka tam ir vairākslāņu struktūra, kas ir tāda pati kā cilvēka epidermas struktūra un satur stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum un stratum corneum, un cilvēka epidermas lipīdprofilam līdzīgs lipīdprofils. RhE modeļa izstrādātājam/tirgotājam, piegādājot audus galalietotājam, jāiesniedz katras izmantotā RhE modeļa partijas histoloģisks izmeklējums, kas pierāda, ka tam piemīt vajadzīgā audu morfoloģija (sk. 21. punktu).

Reproducējamība

20.

Testēšanas metodes lietotājiem būtu jāpierāda šo testēšanas metožu reproducējamība, tās izmantojot ilgākā laika nogrieznī ar pozitīvajām un negatīvajām kontrolēm. Turklāt šī testēšanas metode būtu jāizmanto tikai tad, ja RhE modeļa izstrādātājs/piegādātājs sagādā datus, kas pierāda metodes reproducējamību, to izmantojot ilgākā laika nogrieznī ar kodīgām un nekodīgām ķimikālijām no, piem., kontrolvielu saraksta (1. tabula). Ja kādu no testēšanas metodēm izmanto iedalīšanai apakškategorijās, jāpierāda arī reproducējamība attiecībā uz iedalīšanu apakškategorijās.

Kvalitātes kontrole (QC)

21.

RhE modelis jāizmanto tikai tad, ja izstrādātājs/piegādātājs pierādījis, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst definētajiem produkcijas pieņemamības kritērijiem, kuru vidū svarīgākie ir dzīvotspēja (17. punkts), barjerfunkcija (18. punkts) un morfoloģija (19. punkts). Šos datus dara pieejamus testēšanas metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju varētu iekļaut testēšanas pārskatā. Kodīgu vielu klasificēšanā uzticamām prognozēm der tikai rezultāti, kas iegūti ar kvalitātes kontrolē pieņemtām audu partijām. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība). Pieņemamības diapazoni attiecībā uz četriem validētajiem testa modeļiem ir norādīti 3. tabulā.

3. tabula

Partiju caurlaišanas QC kritēriji

 

Apakšējā pieņemamības robežvērtība

Augšējā pieņemamības robežvērtība

EpiSkin™ (18 stundas ilga apstrāde ar SDS (33).

IC 50 = 1,0 mg/ml

IC 50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100)(34)

ET 50 = 4,0 stundas

ET 50 = 8,7 stundas

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100)(35)

ET 50 = 4,0 stundas

ET 50 = 10,0 stundas

epiCS® (1 % Triton X-100)(36)

ET 50 = 2,0 stundas

ET 50 = 7,0 stundas

Testējamās ķimikālijas un kontrolķimikāliju aplicēšana

22.

Uz katru testējamo ķimikāliju un kontrolēm un katru ekspozīcijas laiku jāizmanto vismaz divi audu replikāti. Testējamās ķīmiskās vielas, kas ir šķidrumi vai cietas vielas, uz epidermas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, t. i., vismaz 70 μl/cm2 vai 30 mg/cm2, raugoties, lai netiktu testēta nefiksēta deva. Atkarībā no modeļa, lai nodrošinātu iespējami labāku testējamās vielas saskari ar epidermas virsmu, testējot cietas vielas, epidermas virsma vispirms jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni, un tikai tad var aplicēt vielu (34) (35) 36) (37). Ja vien iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Aplicēšanas metodei jābūt testējamai ķimikālijai piemērotai (sk., piem., atsauces (34–37)). Ekspozīcijas perioda beigās testējamā ķimikālija no epidermas virsmas rūpīgi jānoskalo ar buferšķīdumu uz ūdens bāzes vai 0,9 % NaCl šķīdumu. Atkarībā no tā, kurš no četriem validētajiem RhE testēšanas modeļiem tiek izmantots, uz katru testējamo ķimikāliju tiek izmantot divi vai trīs ekspozīcijas laiki (attiecībā uz visiem četriem derīgajiem RhE modeļiem 3 min un 1 h; attiecībā uz EpiSkin™ papildu ekspozīcijas laiks četras stundas). Atkarībā no izmantotā RhE testēšanas modeļa un novērtētā ekspozīcijas perioda, inkubācijas temperatūra ekspozīcijas laikā var variēt no istabas temperatūras līdz pat 37 °C.

23.

Katrā izpildes reizē jāizmanto paralēlā negatīvā kontrole un pozitīvā kontrole (PC), lai pierādītu, ka audu dzīvotspēja (izmanto negatīvās kontroles), barjerfunkcija un no tās izrietošais audu jutīgums (izmanto PC) ietilpst noteiktā vēsturiskā pieņemamības diapazonā. Ierosinātās pozitīvās kontroles ķimikālijas atkarībā no izmantotā RhE modeļa ir ledus etiķskābe vai 8N KOH. Jāņem vērā, ka 8N KOH ir tiešs MTT reducētājs, attiecībā uz kuru varētu būt vajadzīgas 25. un 26. punktā aprakstītās pielāgotās kontroles. Ieteicamās negatīvās kontroles vielas ir 0,9 % NaCl šķīdums vai ūdens.

Šūnu dzīvotspējas mērījumi

24.

Šūnu dzīvotspējas mērīšanai šajā testēšanas metodē būtu jāizmanto MTT tests, kas ir kvantitatīvs tests (27). Audu paraugu uz 3 stundām ievieto attiecīgas koncentrācijas (piemēram, 0,3–1 mg/ml) MTT šķīdumā. Pēc tam iegūtās zilas krāsas formazāna nogulsnes ekstrahē ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ar frekvenču joslas filtru, kura maksimums ir± 30 nm, vai izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 30. un 31. punktu) (38).

25.

Testējamās ķimikālijas ar MTT testu var interferēties, MTT tieši reducējoties līdz zilajam formazānam un/vai notiekot krāsu interferencei, ja testējamajai ķimikālijai absorbcija dabiski vai apstrādes procedūru rezultātā notiek tajā pašā OB diapazonā kā formazānam (570 ± 30 nm, galvenokārt zilas un violetas ķimikālijas). Būtu jāizmanto tādas papildu kontroles, kurās detektē un ievērtē šādu testējamo ķimikāliju izraisītu potenciālo interferenci, kā, piemēram, nespecifiskās MTT redukcijas kontrole (NSMTT kontrole) un nespecifiskas krāsas kontrole (NSC kontrole) (sk. 26. līdz 30. punktu). Tas ir īpaši svarīgi tad, ja kāda konkrēta testējamā ķimikālija no audiem netiek pilnīgi noskalota vai izkļūst caur epidermu un tātad brīdī, kad tiek veikts dzīvotspējas tests ar MTT, atrodas šajos audos. Detalizēts apraksts, kā ievērtēt tiešo MTT reducēšanos un krāsvielu radītas interferences, atrodams testa modeļiem paredzētajās SOP (34) (35) (36) (37).

26.

Lai noteiktu tiešus MTT reducētājus, katra testējamā ķimikālija jāpievieno svaigi sagatavotai MTT “barotnei” (34) (35) (36) (37). Ja testējamo ķimikāliju saturošais MTT maisījums iekrāsojas zils/violets, uzskata, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, un neatkarīgi no tā, vai mēra standartabsorbciju (OB) vai izdara HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru, tālāk jāizdara funkcionāla pārbaude ar dzīvnotnespējīgu epidermu. Šajā papildu funkcionālajā pārbaudē izmanto nonāvētus audus, kam piemīt tikai reziduāla metaboliska aktivitāte, taču testējamo ķimikāliju tie absorbē līdzīgā daudzumā kā dzīvotspējīgi audi. Katru MTT reducētāju ķimikāliju uz vienu ekspozīcijas laiku aplicē vismaz diviem nonāvētu audu replikātiem, ar kuriem veic pilnu ādas korozijas testu. Pēc tam aprēķina audu faktisko dzīvotspēju, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar MTT reducētājam eksponētiem dzīviem audiem, atņemot procentuālo nespecifisko MTT redukciju, kas iegūta ar tam pašam MTT reducētājam eksponētiem nonāvētiem audiem un aprēķināta attiecībā pret negatīvo kontroli, kura izpildīta paralēli koriģējamam testam (% NSMTT).

27.

Lai noteiktu iespējamo interferenci, ko rada krāsainas testējamās ķimikālijas vai testējamās ķimikālijas, kuras saskarē ar ūdeni vai izopropanolu iekrāsojas, un izlemtu, vai nav vajadzīgas papildu kontroles, jāizdara testējamās ķimikālijas spektrālanalīze ūdenī (ekspozīcijas vide) un/vai izopropanolā (ekstrakcijas šķīdums). Ja testējamā ķimikālija ūdenī un/vai izopropanolā absorbē gaismu 570 ± 30 nm diapazonā, jāizdara vēl papildu kontroles ar krāsvielām vai arī jāizmanto HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūra, kuras gadījumā kontroles nav vajadzīgas (sk. 30. un 31. punktu). Mērot standartabsorbciju OB, katru interferējošo krāsaino testējamo ķimikāliju vienā ekspozīcijas laikā aplicē uz vismaz diviem dzīvotspējīgu audu replikātiem, kuriem izdara visu ādas korozijas testu, taču, lai iegūtu nespecifiskas krāsas (NSCliving ) kontroli, MTT inkubācijas solī tos inkubē barotnē, nevis MTT šķīdumā. Sakarā ar to, ka dzīviem audiem piemīt bioloģiska mainība, par katru krāsaino testējamo ķimikāliju katrā izpildes reizē uz ekspozīcijas laiku jābūt paralēlai kontrolei NSCliving . Pēc tam aprēķina audu faktisko dzīvotspēju, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar interferējošai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un MTT šķīdumā inkubētiem dzīviem audiem, atņemot procentuālo nespecifisko krāsu, kas iegūta ar interferējošai testējamai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, kuri paralēli koriģējamam testam inkubēti barotnē bez MTT (%NSCliving ).

28.

Mērot tādu testējamo ķimikāliju standartabsorbciju OB, par kurām konstatēts, ka tās gan tieši reducē MTT (sk. 26. punktu), gan izraisa krāsu interferenci (sk. 27. punktu), papildus iepriekšējos punktos aprakstītajām kontrolēm NSMTT un NSCliving jābūt arī kādam trešajam kontroļu kopumam. Tas parasti attiecas uz MTT testā interferējošām tumšas (piem., zilas, violetas, melnas) krāsas testējamajām ķimikālijām, jo raksturīgās krāsas dēļ ir grūti novērtēt to spēju tieši reducēt MTT, kā aprakstīts 26. punktā. Šīs testējamās ķimikālijas var piesaistīties gan dzīviem, gan nonāvētiem audiem, un tāpēc ar kontroli var NSMTT koriģēt ne tikai iespējamu tiešu MTT redukciju, ko izraisījusi testējamā ķimikālija, bet arī krāsas interferenci, ko radījusi testējamās ķimikālijas piesaistīšanās nonāvētajiem audiem. Tādējādi koriģēšana attiecībā uz krāsas interferenci var notikt dubultā, jo krāsas interference, ko radījusi testējamās ķimikālijas saistīšanās ar dzīviem audiem, jau tiek koriģēta ar kontroli NSCliving . Lai nepieļautu varbūtību, ka krāsas interference tiek koriģēta divreiz, jāizdara trešā kontrole attiecībā uz nespecifisku krāsu nonāvētajos audos (NSCkilled). Šajā papildu kontrolē testējamo ķimikāliju uz katru ekspozīcijas laiku aplicē vismaz diviem nonāvēto audu replikātiem, kam veic visu testēšanas procedūru, taču MTT inkubācijas posmā tos inkubē nevis MTT šķīdumā, bet gan barotnē. Neatkarīgi no veikto testu/izpildes reižu skaita attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju pietiek ar vienu kontroli NSCkilled , taču tā jāizdara paralēli kontrolei NSMTT un, ja iespējams, ar to pašu audu partiju. Pēc tam aprēķina audu faktisko dzīvotspēju, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, atņemot % NSMTT un % NSCliving un pieskaitot procentuālo nespecifisko krāsu, kas iegūta ar interferējošai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un barotnē bez MTT inkubētiem nonāvētajiem audiem un aprēķināta attiecībā pret negatīvo kontroli, kura izpildīta paralēli koriģējamam testam (% NSCkilled ).

29.

Svarīgi ievērot, ka nespecifiskas MTT redukcijas un nespecifiskas krāsas interferenču dēļ var tikt iegūti audu ekstrakta rādījumi, kas pārsniedz spektrofotometra linearitātes diapazonu. Tādēļ katrai laboratorijai, pirms regulatīvos nolūkos sākt testēt testējamas ķimikālijas, jānosaka sava spektrofotometra linearitātes diapazons, izmantojot komerciāli pieejamu MTT formazānu (CAS Nr. 57360-69-7). Ja tādu audu ekstraktu optiskais blīvums, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju, neveicot korekciju attiecībā uz tiešu MTT redukciju un/vai krāsas interferenci, ir spektrofotometra lineārā diapazona robežās vai ar testējamo ķimikāliju iegūtā nekoriģētā procentuālā dzīvotspēja jau ir ≤ 50 %, tiešo MTT reducētāju un interferējošas krāsas testējamo ķimikāliju novērtēšanai ar spektrofotometru ir lietderīgi mērīt standartabsorbciju (OB). Tomēr rezultāti attiecībā uz tādām testējamām ķimikālijām, kurām % NSMTT un/ vai % NSCliving > 50 % no negatīvās kontroles, jāinterpretē piesardzīgi.

30.

Attiecībā uz testējamām krāsainām ķimikālijām, kuras standartabsorbcijas (OB) mērījumiem nav piemērotas, jo pārāk stipri interferē ar MTT testu, MTT formazāna mērīšanai var izmantot alternatīvo HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 31. punktu) (37). HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēma dod iespēju MTT formazānu pirms tā kvantitatīvas noteikšanas atdalīt no testējamās ķimikālijas (38). Tāpēc neatkarīgi no testējamās ķimikālijas, ja tiek izmantota HPLC/UPLC spektrofotometrija, NSCliving vai NSCkilled kontroles nav jāveic. Taču, ja ir aizdomas, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, vai tai ir krāsa, kas traucē novērtēt ķimikālijas spēju tieši reducēt MTT (kā aprakstīts 26. punktā), ir jāizmanto NSMTT kontroles. MTT formazāna mērīšanai izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju, kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, procentuālo attiecību pret MTT formazāna smailes laukumu, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli, aprēķina audu procentuālo dzīvotspēju. Attiecībā uz testējamām ķimikālijām, kas spēj tieši reducēt MTT, audu faktisko dzīvotspēju aprēķina, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, atņemot % NSMTT. Visbeidzot jāatzīmē, ka nav iespējams novērtēt tādus tiešus MTT reducētājus, kuri arī var radīt krāsas interferenci, kuri pēc apstrādes saglabājas audos un kuri MTT reducē tik spēcīgi, ka testētā audu ekstrakta OB (izmantojot standarta OB mērīšanu) vai smailes laukumi (izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju) pārsniedz spektrofotometra linearitātes diapazonu, taču šādi gadījumi ir ļoti reti.

31.

Ar jebkāda veida testējamām ķimikālijām (krāsainas, bezkrāsainas, MTT reducētājas un MTT nereducētājas) MTT formazāna mērīšanai var izmantot arī HPLC/UPLC spektrofotometriju (38). Tā kā HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas ir daudzveidīgas, pirms HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu MTT formazānu no audu ekstraktiem, būtu jāpierāda minētās sistēmas kvalifikācija, izpildot pieņemamības kritērijus, kas noteikti attiecībā uz tādu kvalifikācijas standartparametru kopumu, kuru pamatā ir ASV Pārtikas un zāļu pārvaldes izstrādātās nozares vadlīnijās par bioanalītisko metožu validēšanu aprakstītie parametri (38) (39). Šie galvenie parametri un to pieņemamības kritēriji ir norādīti 4. papildinājumā. Kad 4. papildinājumā noteiktie pieņemamības kritēriji izpildīti, HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu uzskata par kvalificētu un gatavu tam, lai noteiktu MTT formazāna daudzumu, ievērojot šīs testēšanas metodes aprakstā sniegtos eksperimentēšanas nosacījumus.

Pieņemamības kritēriji

32.

Attiecībā uz jebkuru testēšanas metodi, kurā tiek izmantoti derīgi RhE modeļi, ar negatīvo kontroli apstrādātu audu optiskajam blīvumam vajadzētu atbilst 2. tabulā aprakstīto audu kvalitātei un tas nedrīkstētu būt mazāks par vēsturiski noteiktajām robežvērtībām. Ar PK, proti, ledus etiķskābi vai 8N KOH apstrādātajiem audiem būtu jāatspoguļo audu spēja reaģēt uz kodīgu ķimikāliju apstākļos, kur ievēroti testēšanas modeļa nosacījumi (sk. 2. papildinājumu). Testējamai ķimikālijai un/vai kontrolķimikālijām izmantoto audu replikātu mainībai jābūt robežās, kas pieņemtas attiecībā uz katru derīgo RhE modeli izvirzītajās prasībās (sk. 2. papildinājumu) (piem., divu audu replikātu mainības starpība nedrīkst pārsniegt 30 %). Ja kādā izpildes reizē iekļautā negatīvā kontrole vai pozitīvā kontrole ir ārpus pieņemtajiem diapazoniem, izpildes reizi uzskata par nederīgu un tā jāatkārto. Ja ārpus definētā diapazona ir mainība attiecībā uz testējamām ķimikālijām, tās jātestē atkārtoti.

Rezultātu interpretēšana un prognozēšanas modelis

33.

Par katru testējamo ķimikāliju iegūtās OB vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu procentuālā īpatsvara aprēķināšanai salīdzinājumā ar negatīvo kontroli, kurai to pieņem par 100 %. Ja izmanto HPLC/UPLC spektrofotometriju, audu procentuālo dzīvotspēju aprēķina kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, procentuālo attiecību pret MTT formazāna smailes laukumu, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli. Procentuālās šūnu dzīvotspējas robežvērtības, kas korozīvas testējamās ķimikālijas šķir no nekorozīvām (vai dod iespēju atšķirt dažādas kodīgu vielu apakškategorijas), attiecībā uz katru šīs testēšanas metodes aptverto testa modeli ir definētas zemāk 35. un 36. punktā un šīs vērtības būtu jāizmanto rezultātu interpretēšanai.

34.

Ja rezultātā iegūtā klasifikācija nav nepārprotama, attiecībā uz testējamu ķimikāliju vajadzētu pietikt ar vienu testēšanas izpildes reizi, kurā ietilpst vismaz divi audu replikāti. Tomēr, ja rezultāti ir uz robežas, piemēram, ja nesakrīt replikātu mērījumi, var apsvērt, vai neveikt otru izpildes reizi, bet, ja divu pirmo izpildes reižu rezultāti nesakrīt, arī trešo.

35.

Ar ANO GHS / CLP asociētais prognozēšanas modelis attiecībā uz EpiSkin™ ādas korozijas testēšanas modeli (9)(34)(22), ir sniegts 4. tabulā.

4. tabula

EpiSkin™ prognozēšanas modelis

Pa ekspozīcijas laikpunktiem mērītā dzīvotspēja (t = 3, 60 un 240 minūtes)

Prognoze, ko aplūko

Pēc 3 min ekspozīcijas < 35 %

kodīga:

fakultatīvā 1.A apakškategorija (*1)

Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 35 % UN

pēc 60 min ekspozīcijas < 35 %

VAI

pēc 60 min ekspozīcijas ≥ 35 % UN

pēc 240 min ekspozīcijas < 35 %

kodīga:

fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija

pēc 240 min ekspozīcijas ≥ 35 %

nekodīga

36.

Ar ANO GHS/CLP klasifikācijas sistēmu asociētajiem ādas korozijas testēšanas modeļiem EpiDerm™ SCT (10)(23)(35), SkinEthic™ RHE (17)(18) (23) (36), un epiCS® (16)(23)(37) 5. tabula sniedz prognozēšanas modeļus.

5. tabula

EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS®

Pa ekspozīcijas laikpunktiem mērītā dzīvotspēja (t = 360 minūtes)

Prognoze, ko aplūko

1. SOLIS attiecībā uz EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS®

Pēc 3 min ekspozīcijas < 50 %

kodīga

Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 50 % UN Pēc 60 min ekspozīcijas < 15 %

kodīga

Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 50 % UN Pēc 60 min ekspozīcijas ≥ 15 %

nekodīga

2. SOLIS attiecībā uz EpiDerm™ SCT sakarā ar vielām, kas 1. solī identificētas kā kodīgas

Pēc 3 min ekspozīcijas < 25 %

fakultatīvā 1.A apakškategorija *

Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 25 %

fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija

2. SOLIS attiecībā uz SkinEthic™ RHE sakarā ar vielām, kas 1. solī identificētas kā kodīgas

Pēc 3 min ekspozīcijas < 18 %

fakultatīvā 1.A apakškategorija *

Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 18 %

fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija

2. SOLIS attiecībā uz epiCS® sakarā ar vielām, kas 1. solī identificētas kā kodīgas

Pēc 3 min ekspozīcijas < 15 %

fakultatīvā 1.A apakškategorija *

Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 15 %

fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Dati

37.

Par katru testu, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, visus datus par atsevišķajiem audu replikātiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, datus par testējamās vielas ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un tās klasifikācijas datus) apkopo tabulas veidā. Turklāt ziņojumā attiecībā uz katru testu būtu jāiekļauj audu replikātu dzīvotspējas un mainības koeficienta vidējās vērtības un diapazoni. Par katru testējamo ķimikāliju ziņojumā jāatspoguļo tiešu MTT reducētāju vai testējamu krāsainu ķimikāliju novērotā mijiedarbība ar MTT reaģentu.

Testēšanas pārskats

38.

Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.

 

Testējamās un kontroles ķimikālijas:

Vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.

Daudzkomponentu vielas, UVCB un maisījumi: iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.

izskats, šķīdība ūdenī un papildu relevantās fizikālķīmiskās īpašības;

avots, no kura dzīvnieki saņemti, sērijas numurs, ja zināms;

testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana), ja tāda veikta;

testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;

glabāšanas apstākļi.

 

Izmantotais RhE modelis un protokols un attiecīgās izvēles pamatojums (attiecīgā gadījumā)

 

Testa apstākļi:

izmantotais RhE modelis (arī sērijas numurs);

MTT kvantitatīvajai noteikšanai izmantotās mērierīces (piemēram, spektrofotometra) kalibrēšanas dati, viļņa garums un frekvenču joslas filtrs (attiecīgā gadījumā), un mērierīces linearitātes diapazons;

MTT formazāna kvantitatīvajai noteikšanai izmantotās metodes apraksts;

HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas kvalifikācijas apraksts (attiecīgā gadījumā);

pietiekama papildinformācija par izmantoto konkrēto RhE modeli, arī tā veiktspēju. No tiem jānorāda vismaz:

i)

dzīvotspēja,

ii)

barjerfunkcija,

iii)

morfoloģija,

iv)

reproducējamība un prognozēšanas spēja,

v)

modeļa kvalitātes kontroles (QC);

norāde uz modeļa vēsturiskajiem datiem. No tiem jānorāda vismaz kvalitātes kontroles datu pieņemamība attiecībā uz vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem,

Apliecināta testēšanas metodes izmantošanas kompetence, kas pirms attiecīgās testēšanas metodes regulāras izmantošanas pierādīta, testējot standartvielas.

 

Testa procedūra:

detalizēta informācija par izmantoto testēšanas procedūru (arī par mazgāšanas procedūrām, ko izmanto pēc ekspozīcijas perioda);

izmantotās testējamās ķimikālijas un kontrolķimikāliju devas;

ekspozīcijas laiks vai laiki un temperatūra vai temperatūras;

attiecībā uz tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamām krāsojošām ķimikālijām izmantotās kontroles; norādes (attiecīgā gadījumā);

uz katru testējamo ķimikāliju un kontrolēm (pozitīvā kontrole, negatīvā kontrole un NSMTT, NSCliving un NSCkilled, attiecīgā gadījumā) izmantoto audu replikātu skaits uz vienu ekspozīcijas laiku;

apraksts par lēmuma pieņemšanas kritēriju / prognozēšanas modeli, kas izmantots, pamatojoties uz lietoto RhE modeli;

apraksts par jebkādām testa procedūras (arī mazgāšanas procedūru) modifikācijām.

 

Izpildes reizes un testa pieņemamības kritēriji:

pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un pieņemamības diapazoni, kas balstīti uz vēsturiskajiem datiem;

pieņemamā mainība pozitīvām un negatīvām kontrolēm izmantojamiem audu replikātiem;

pieņemamā mainība testējamai ķimikālijai izmantojamiem audu replikātiem.

 

Rezultāti:

tabulās apkopoti dati par atsevišķām testējamām ķimikālijām un kontrolēm par katru ekspozīcijas laiku, katru izpildes reizi un katru replikāta mērījumu, norādot arī OB vai MTT formazāna smailes laukumu, audu procentuālo dzīvotspēju, audu vidējo procentuālo dzīvotspēju, replikātu atšķirības, standartnovirzi un/vai mainības koeficientu (attiecīgā gadījumā);

attiecīgā gadījumā to kontroļu rezultāti, kas izmantotas tiešiem MTT reducētājiem un/vai krāsojošām testējamām ķimikālijām, norādot arī OB vai MTT formazāna smailes laukumu, % NSMTT, % NSCliving , % NSCkilled , standartnovirzi un/vai mainības koeficientu (attiecīgā gadījumā) un audu galīgo pareizo procentuālo dzīvotspēju;

rezultāti, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju (ķimikālijām) un kontrolķimikālijām, salīdzinājumā ar noteiktajiem izpildes reizes un testa pieņemamības kritērijiem;

citu novērotu ietekmju apraksts;

atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognozēšanas modeli un/vai lēmuma pieņemšanas kritēriju.

 

Rezultātu iztirzājums

 

Secinājumi

LITERATŪRA

(1)

UN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth Revised Edition, UN New York and Geneva. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

(2)

Chapter B.4 of this Annex, Acute Dermal Irritation, Corrosion.

(3)

Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion.

(4)

Chapter B.65 of this Annex, In Vitro Membrane Barrier Test Method.

(5)

Chapter B.46 of this Annex, In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.

(6)

OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23:219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol.In Vitro 12:471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for SkinCorrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in Vitro 12:483-524.

(10)

Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. and Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.

(11)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. et Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129-147.

(12)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological TestMethods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(13)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(14)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(15)

EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21 March 2000.

(16)

Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. and Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1 000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol.In Vitro 19: 925-929.

(17)

Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., and Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20: 547-559.

(18)

Tornier C., Roquet M. and Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379-1385.

(19)

EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17 November 2006.

(20)

EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12 June 2009.

(21)

OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(22)

Alépée N., Grandidier M.H., and Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28:131-145.

(23)

Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., and Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29:2055-2080.

(24)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris

(25)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(26)

Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62:393-403.

(27)

Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55-63.

(28)

Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. In: In Vitro Skin Toxicology. Rougier A.,. Goldberg A.M and Maibach H.I. (Eds): 133-140.

(29)

Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. and Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol.in Vitro 8:889 - 891.

(30)

Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J and Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211 - 225.

(31)

Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. and Thivolet J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310-319.

(32)

Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS and Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163-171.

(33)

Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF and Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747-756.

(34)

EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

(35)

EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation's Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

(36)

SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

(37)

EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1 000 (epiCS® ) CellSystems.

(38)

Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., and McNamee P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741-761.

(39)

US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (May 2001). Available at: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

1. papildinājums

DEFINĪCIJAS

Pareizība : pakāpe, kādā testēšanas metodes rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no relevantuma aspektiem. Ar šo terminu, tāpat kā terminu “konkordantums”, bieži vien saprot testa pareizo rezultātu īpatsvaru (25).

Šūnu dzīvotspēja : parametrs, kas raksturo šūnu populācijas kopējo aktivitāti, piemēram, šūnu mitohondriju dehidrogenāžu spēju reducēt vitālo krāsvielu MTT (3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolilzilais), kas atkarībā no nosakāmā testēšanas beigupunkta un izmantotā testēšanas plāna korelē ar dzīvo šūnu kopējo skaitu un/vai dzīvotspēju.

Ķimikālija : viela vai maisījums.

Konkordantums : tādas testēšanas metodes veiktspējas mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pašā nozīmē kā terminu “pareizība”, ar to saprotot visu to testēto ķimikāliju īpatsvaru, kas pareizi klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas. Konkordantums ir lielā mērā atkarīgs no to pozitīvo rezultātu prevalences, kādi iegūti attiecībā uz pētāmajiem testējamo ķimikāliju veidiem (25).

ET 50 : parametrs, ko var aprēķināt pēc ekspozīcijas laika, kas pēc specifiskas noteiktas koncentrācijas etalonķimikālijas aplicēšanas nepieciešams šūnu dzīvotspējas samazināšanai par 50 % (sk. arī IC 50).

GHS(Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma) : sistēma, kas piedāvā ķimikāliju (vielu un maisījumu) klasifikāciju pa standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi(1).

HPLC. : augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfija.

IATA : integrētā testēšanas un novērtēšanas pieeja.

IC 50 : parametrs, ko var aprēķināt pēc etalonķimikālijas koncentrācijas, pie kuras audu dzīvotspēja pēc noteikta ekspozīcijas laika samazinās par 50 % (IC 50) (sk. arī ET 50).

Nefiksēta deva : uz epidermas aplicētas testējamās ķimikālijas daudzums, kas lielāks par epidermas virsmas pilnīgai un vienmērīgai pārklāšanai nepieciešamo daudzumu. Maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairāk vielām, kuras tajā savstarpēji nereaģē.

Vienkomponenta viela : tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vismaz 80 % (masa/masa) veido viena galvenā sastāvdaļa.

MTT : 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; tiazolilzilā tetrazolija bromīds.

Daudzkomponentu viela: : tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu vielas tiek iegūtas ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.

NK : nekodīgs.

Kontrole NSCkilled : nespecifiskas krāsas kontrole nonāvētos audos.

Kontrole NSCliving : nespecifiskas krāsas kontrole dzīvos audos.

NSMTT : nespecifiskā MTT redukcija.

OB : optiskais blīvums.

PK : pozitīvā kontrole, proti, replikāts, kurā ir visi testēšanas sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar ķimikāliju, par ko zināms, ka tā izraisa pozitīvu atbildreakciju. Lai būtu iespējams novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārāk liela.

Veiktspējas standarti (VS) : uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst: (i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; (ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī iii), uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — tādi paši pareizības un ticamības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar novērtējamo testēšanas metodi, to izvērtējot ar references vielām no minimālā saraksta (25).

Relevantums : parametrs, kas raksturo testēšanas metodes un interesējošās ietekmes sakarību un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (25).

Ticamība : parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē, izmantojot vienu un to pašu protokolu, kādu testēšanas metodi vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās ilgākā laika nogrieznī var izmantot reproducējami. To novērtē, aprēķinot intralaboratorisko un interlaboratorisko reproducējamību (25).

Izpildes reize : reize, kurā vienu vai vairākas ķimikālijas testē paralēli negatīvai kontrolei un pozitīvai kontrolei.

Jutība : tas, cik liela daļa no visām pozitīvajām/aktīvajām ķimikālijām ar šo testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tas ir pareizības mērs testēšanas metodei, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (25).

Ādas korozija in vivo : neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar zemādu un rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz ādas uz laiku līdz četrām stundām. Reakcijām uz kodīgumu parasti ir raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.

Specifiskums : tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām ķimikālijām ar testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (25).

Viela : ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.

Testējamā ķimikālija: : jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

UPLC : īpaši augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfija.

UVCB : vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.

2. papildinājums

ĀDAS KOROZIJAS TESTĒŠANAS VAJADZĪBĀM VALIDĒTO RHE TESTĒŠANAS MODEĻU GALVENIE KOMPONENTI

Testēšanas modeļa komponenti

EpiSkinTM

EpiDermTM SCT

SkinEthicTM RHE

epiCS®

Modeļa virsma

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

Audu replikātu skaits

uz ekspozīcijas laiku vismaz 2

uz ekspozīcijas laiku 2–3

uz ekspozīcijas laiku vismaz 2

uz ekspozīcijas laiku vismaz 2

Apstrādes devas un aplicēšana

Šķidrumi un viskozas vielas: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2)

Cietas vielas: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5μl NaCl šķīduma (9 g/l)

Vaskainas/lipīgas vielas: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) ar neilona tīkliņu

Šķidrumi: 50 μl (79,4 μl/cm2) ar neilona tīkliņu vai bez tā

Testējamās ķimikālijas pirmstestēšanas saderība ar neilona tīkliņu

Puscietas vielas: 50 μl (79.4 μl/cm2)

Cietas vielas: 25 μl H2O (vai attiecīgā gadījumā vairāk) + 25 mg (39,7 mg/cm2)

Vaski: plakanu “diskveida” gabalu (diametrā apm. 8. mm) novieto uz salvetes, kas samitrināta ar 15 μl H2O.

šķidrumi un viskozas vielas: 40 μl ± 3μl (80 μl/cm2) ar neilona tīkliņu

Testējamās ķimikālijas pirmstestēšanas saderība ar neilona tīkliņu

cietas vielas: 20 μl ± 2μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2)

vaskainas/lipīgas vielas: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) ar neilona tīkliņu

šķidrumi: 50 μl (83,3 μl/cm2) ar neilona tīkliņu

Testējamās ķimikālijas pirmstestēšanas saderība ar neilona tīkliņu

puscietas vielas: 50 μl (83,3 μl/cm2)

cietas vielas: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (vai attiecīgā gadījumā vairāk)

vaskainas vielas: plakanu “diskveida” gabalu (diametrā apm. 8. mm) novieto uz salvetes, kas samitrināta ar 15 μl H2O.

Priekšpārbaude attiecībā uz tiešo MTT reducēšanos

50 μl (šķidruma) vai 20 mg (cietas vielas)+ 2 ml MTT

0,3 mg/ml šķīduma uz 180 ± 5 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem ūdensapstrādātiem audiem

50 μl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas)+ 1 ml MTT

1 mg/ml šķīduma uz 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem

40 μl (šķidruma) vai 20 mg (cietas vielas)+ 1 ml MTT

1 mg/ml šķīduma uz 180 ± 15 min 37 °C temperatūrā pie 5 % CO2, , gaisa relatīvais mitrums 95 %

→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem

50 μl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas)+ 1 ml MTT

1 mg/ml šķīduma uz 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem

Priekšpārbaude attiecībā uz krāsas interferenci

10 μl (šķidruma) vai 10 mg (cietas vielas) + 90 μl H2O, maisīts 15 min istabas temperatūrā

→ ja šķīdums iekrāsojas, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem

50 μl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas) + 300 μl H2O uz 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

→ ja šķīdums iekrāsojas, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem

40 μl (šķidruma) vai 20 mg (cietas vielas) + 300 μl H2O, maisīts 60 min istabas temperatūrā

→ ja testējamā ķimikālija ir krāsaina, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem

50 μl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas) + 300 μl H2O uz 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

→ ja šķīdums iekrāsojas, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem

Ekspozīcijas laiks un temperatūra

3 min, 60 min (± 5 min) un 240 min (± 10 min)

vēdināmā skapī istabas temperatūrā (IT, 18–28oC)

3 min istabas temperatūrā un 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

3 min istabas temperatūrā un 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

3 min istabas temperatūrā un 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

Skalošana

25 ml 1 x fosfātu fizioloģiskais buferšķīdums (2 ml / izsviešana)

20 reižu ar pastāvīgu maigu strūklu 1 x fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma

20 reižu ar pastāvīgu maigu strūklu 1 x fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma

20 reižu ar pastāvīgu maigu strūklu 1 x fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma

Negatīvā kontrole

50 μl NaCl šķīduma (9 g/l)

testēta ar katru ekspozīcijas laiku

50 μl H2O

testēta ar katru ekspozīcijas laiku

40 μl H2O

testēta ar katru ekspozīcijas laiku

50 μl H2O

testēta ar katru ekspozīcijas laiku

Pozitīvā kontrole

50 μl ledus etiķskābes

testēšana tikai 4 stundas

50 μl 8N KOH

testēta ar katru ekspozīcijas laiku

40 μl 8N KOH

testēšana tikai 1 stundu

50 μl 8N KOH

testēta ar katru ekspozīcijas laiku

MTT šķīdums

2 ml 0,3 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

MTT inkubācijas laiks un temperatūra

180 min (± 15 min) 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

180 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

180 min (± 15 min) 37oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

180 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %

Ekstrahēšanas šķīdinātājs

500 μl paskābināta izopropanola

(0,04 N HCl izopropanolā)

(pilnīgi iegremdēti izolēti audi).

2 ml izopropanola

(ekstrahē no iegremdētā materiāla augšpuses un apakšpuses)

1,5 ml izopropanola

(ekstrahē no iegremdētā materiāla augšpuses un apakšpuses)

2 ml izopropanola

(ekstrahē no iegremdētā materiāla augšpuses un apakšpuses)

Ekstrahēšanas laiks un temperatūra

istabas temperatūrā pa nakti, aizsargāti no gaismas

bez kratīšanas istabas temperatūrā pa nakti vai ar kratīšanu istabas temperatūrā 120 min (~120 rpm)

bez kratīšanas istabas temperatūrā pa nakti vai ar kratīšanu istabas temperatūrā 120 min (~120 rpm)

bez kratīšanas istabas temperatūrā pa nakti vai ar kratīšanu istabas temperatūrā 120 min (~120 rpm)

Optiskā blīvuma lasījumi

570 nm (545 – 595 nm) bez references filtra

570 nm (vai 540 nm) bez references filtra

570 nm (540 – 600 nm) bez references filtra

540 – 570 nm bez references filtra

Audu kvalitātes kontrole

18 stundas ilga apstrāde ar SDS

1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml

apstrāde ar 1 % Triton X-100

4,08 stundas ≤ ET 50 ≤ 8,7 stundas

apstrāde ar 1 % Triton X-100

4,0 stundas ≤ ET 50 ≤ 10,0 stundas

apstrāde ar 1 % Triton X-100

2,0 stundas ≤ ET 50 ≤ 7,0 stundas

Pieņemamības kritēriji

1.

Ar negatīvo kontroli (NaCl) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,6 and ≤ 1,5

2.

Tādiem audu replikātiem, kas 4 stundas eksponēti pozitīvajā kontrolē (ledus etiķskābe), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt ≤ 20 %

3.

Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % un attiecībā uz OB ≥ 0,3, šo divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirība nedrīkstētu pārsniegt 30 %.

1.

Ar negatīvo kontroli (H2O) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,8 and ≤ 2,8

2.

Tādiem audu replikātiem, kas 1 stundu eksponēti pozitīvajā kontrolē (8N KOH), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt ≤ 15 %

3.

Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % mainības koeficientiem (CV) starp audu replikātiem jābūt ≤ 30 %.

1.

Ar negatīvo kontroli (H2O) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,8 and ≤ 3,0

2.

Tādiem audu replikātiem, kas 1 stundu (un attiecīgā gadījumā 4 stundas) eksponēti pozitīvajā kontrolē (8N KOH), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt < ≤ 15 %

3.

Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % un attiecībā uz OB ≥ 0,3, šo divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirība nedrīkstētu pārsniegt 30 %

<