1.3.2016   

LV

Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis

L 54/1


KOMISIJAS REGULA (ES) 2016/266

(2015. gada 7. decembris),

ar kuru, pielāgojot tehnikas attīstībai, groza Regulu (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOMISIJA,

ņemot vērā Līgumu par Eiropas Savienības darbību,

ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, Direktīvu 93/67/EEK, Direktīvu 93/105/EK un Direktīvu 2000/21/EK (1), un jo īpaši tās 13. panta 2. punktu,

tā kā:

(1)

Komisijas Regulā (EK) Nr. 440/2008 (2) ir noteiktas Regulas (EK) Nr. 1907/2006 piemērošanai izmantojamās testēšanas metodes ķīmisko vielu fizikālķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanai.

(2)

Lai ņemtu vērā tehnikas attīstību un lai gādātu, ka saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvu 2010/63/ES (3) tiek samazināts eksperimentu vajadzībām izmantoto dzīvnieku skaits, Regulu (EK) Nr. 440/2008 ir nepieciešams atjaunināt, tajā iekļaujot jaunas un atjauninātas testēšanas metodes, ko nesen pieņēmusi ESAO. Dokumenta projekts ir apspriests ar ieinteresētajām personām.

(3)

Šis pielāgojums ietver divdesmit testēšanas metodes: viena no tām ir jauna metode fizikālķīmiskas īpašības noteikšanai, vienpadsmit ir jaunas testēšanas metodes, trīs ir atjauninātas testēšanas metodes ekotoksiskuma novērtēšanai un piecas ir jaunas testēšanas metodes, ar kurām novērtē apriti vidē un mijiedarbību ar to.

(4)

Tādēļ attiecīgi būtu jāgroza Regula (EK) Nr. 440/2008.

(5)

Šajā regulā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi atbilstoši Regulas (EK) Nr. 1907/2006 133. pantam izveidotā komiteja,

IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.

1. pants

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza saskaņā ar šīs regulas pielikumu.

2. pants

Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs.

Briselē, 2015. gada 7. decembrī

Komisijas vārdā –

priekšsēdētājs

Jean-Claude JUNCKER


(1)  OV L 396, 30.12.2006., 1. lpp.

(2)  Komisijas 2008. gada 30. maija Regula (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) (OV L 142, 31.5.2008., 1. lpp.).

(3)  Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (OV L 276, 20.10.2010., 33. lpp.).


PIELIKUMS

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza šādi:

1)

Pielikuma sākumā pirms A daļas iekļauj šādu piezīmi:

“Piezīme.

Pirms kādu turpmāk norādīto testēšanas metodi izmanto tam, lai testētu daudzkomponentu vielu (MCS), nezināma vai mainīga sastāva vielu, kompleksu reakcijas produktu vai bioloģisku materiālu (UVCB) vai maisījumu, un gadījumos, kad tās piemērotība MCS, UVCB vai maisījumu testēšanai nav norādīta attiecīgajā tekstēšanas metodē, ir jāapsver, vai attiecīgā metode ir piemērota paredzētajam normatīvās regulēšanas nolūkam.

Ja šo testēšanas metodi izmanto MCS, UVCB vai maisījuma testēšanai, atbilstoši iespējām ir jāsniedz pietiekami daudz informācijas par tā sastāvu, piemēram, tā sastāvdaļu ķīmiskie nosaukumi, to kvantitatīvais saturs un maisījumā iekļauto vielu attiecīgās īpašības.”;

2)

pievieno šādu A.24. nodaļu:

A.24.   SADALĪJUMA KOEFICIENTS (N-OKTANOLS/ŪDENS), AUGSTAS IZŠĶIRTSPĒJAS ŠĶIDRUMHROMATOGRĀFIJAS (HPLC) METODE

IEVADS

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 117 (2004. gads).

1.

Sadalījuma koeficientu (P) definē kā izšķīdušās vielas līdzsvara koncentrāciju attiecību divfāzu sistēmā, ko veido divi šķīdinātāji ar savstarpēji ierobežotu šķīdību. Ja tas ir n-oktanols un ūdens:

Formula

Tā kā sadalījuma koeficients ir divu koncentrāciju attiecība, tas ir bezdimensiju lielums un parasti ir izteikts decimāllogaritma veidā.

2.

Pow ir galvenais rādītājs pētījumos par ķīmisku vielu apriti vidē un mijiedarbību ar to. Ir pierādīta ļoti nozīmīga sakarība starp vielu nejonizēto formu Pow un to bioakumulāciju zivīs. Ir arī pierādīts, ka Pow palīdz prognozēt adsorbciju augsnē un sedimentos un izveidot struktūras un aktivitātes kvantitatīvās sakarības modeli plašam bioloģiskās ietekmes spektram.

3.

Šīs testēšanas metodes sākotnējā priekšlikuma pamatā bija C. V. Eadsforth un P. Moser raksts (1). Metodes izstrādi un ESAO starplaboratoriju salīdzinošo testēšanu 1986. gadā koordinēja Vācijas Federatīvās Republikas Federālā Vides aizsardzības aģentūra (Umweltbundesamt) (2).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

4.

log Pow vērtības diapazonā no – 2 līdz 4 (dažkārt līdz 5 un vairāk) (1) eksperimentāli var noteikt, izmantojot “kolbu kratīšanas” metodi (šā pielikuma A.8. nodaļa, ESAO Testēšanas norādījumi 107). HPLC metodi var lietot, ja log Pow vērtības ir diapazonā no 0 līdz 6 (1)(2)(3)(4)(5). Lai izvēlētos piemērotas standartvielas un pamatotu visus secinājumus, kas iegūti no testēšanas rezultātiem, šai metodei var būt nepieciešams noteikt aptuvenu Pow vērtību. Aprēķina metodes ir īsi izklāstītas šīs testēšanas metodes papildinājumā. HPLC darbības režīms ir izokrātisks.

5.

Pow vērtības ir atkarīgas no vides apstākļiem, piemēram, temperatūras, pH, šķīduma jonu spēka u. c., kas eksperimentā ir jānorāda pareizai Pow datu interpretēšanai. Jonizējamām vielām var izmantot citu, alternatīvu metodi (piemēram, ESAO norādījumu projektu par pH-metriskajām metodēm jonizētām vielām (6)), kas var kļūt pieejama. Kaut arī šis ESAO norādījumu projekts var būt piemērots Pow noteikšanai jonizējamām vielām, dažos gadījumos tomēr var būt atbilstošāk izmantot HPLC metodi, testēšanu veicot pie vides apstākļiem atbilstoša pH (sk. 9. punktu).

METODES PRINCIPS

6.

Apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfijai izmanto analītiskās kolonnas ar komerciāli pieejamu cietās fāzes pildījumu, ko veido garas ogļūdeņražu ķēdes (piemēram, C8, C18), kas ķīmiski saistītas ar silīcija dioksīdu.

7.

Šādā kolonnā ievadītā viela sadalās starp kustīgo šķīdinātāja fāzi un ogļūdeņražu stacionāro fāzi, kad cauri kolonnai to nes kustīgā fāze. Vielas tiek aizturētas proporcionāli to sadalījuma koeficientam ogļūdeņražos/ūdenī; hidrofilas vielas eluējas pirmās, bet lipofilas vielas – pēdējās. Aiztures ilgums ir atkarīgs no aiztures koeficienta k, ko aprēķina saskaņā ar vienādojumu:

Formula

kur tR ir nosakāmās vielas aiztures ilgums, t0 ir tukšais laiks, t. i., vidējais laiks, kurā šķīdinātāja molekula izkļūst cauri kolonnai. Kvantitatīva analīze nav nepieciešama; jānosaka tikai aiztures ilgumi.

8.

Testējamās vielas sadalījuma koeficientu sistēmā oktanols/ūdens var aprēķināt, eksperimentāli nosakot tās aiztures koeficientu k un ievadot k vienādojumā

Formula

kur

a, b

=

lineārās regresijas koeficienti.

Iepriekš norādīto vienādojumu var iegūt, veicot standartvielu oktanola/ūdens sadalījuma koeficientu logaritma lineāro regresiju pret standartvielu aiztures koeficienta logaritmu.

9.

Izmantojot apgrieztās fāzes HPLC metodi, var aprēķināt sadalījuma koeficientu log Pow diapazonā no 0 līdz 6, bet izņēmuma gadījumos to var paplašināt, lai tajā būtu iekļauts arī log Pow diapazonā no 6 līdz 10. Šādā gadījumā var būt nepieciešams pārveidot kustīgo fāzi (3). Šī metode nav izmantojama stiprām skābēm un bāzēm, metālu kompleksajiem savienojumiem, vielām, kas reaģē ar eluentu, un virsmaktīvajām vielām. Mērījumus jonizējamām vielām to nejonizētajā formā (brīva skābe vai brīva bāze) var veikt, tikai izmantojot piemērotu buferšķīdumu ar pH, kas brīvai skābei ir zemāks par pKa, bet brīvai bāzei – augstāks par pKa. Jonizējamu vielu (6) testēšanai var izmantot alternatīvu – pH-metrisko metodi (6), ja tāda ir pieejama. Ja ir noteikta log Pow vērtība, lai vielu klasificētu pēc bīstamības videi vai novērtētu vides risku, testēšana veicama tādā pH diapazonā, kas atbilst dabiskajai videi, t. i., pH diapazonā no 5,0 līdz 9.

10.

Dažos gadījumos piemaisījumi var apgrūtināt rezultātu interpretāciju smaiļu sadalījuma nenoteiktības dēļ. Maisījumiem, kuriem kādā no diapazoniem smailes nav atšķiramas, pārskatā jāiekļauj informācija par log Pow augšējo un apakšējo robežu, kā arī katras log Pow smailes laukumu ( %). Maisījumiem, ko veido homologu grupas, ir jānorāda arī vidējais svērtais log Pow (7), kas aprēķināts, izmantojot atsevišķās Pow vērtības un atbilstošās laukuma % vērtības (8). Aprēķinos jāņem vērā visas smailes, kuru laukums ir vismaz 5 % smaiļu kopējā laukuma (9):

Formula

Vidējais svērtais log Pow attiecas tikai uz vielām vai maisījumiem (piemēram, taleļļām), ko veido homologi (piemēram, alkānu rindas). Maisījumus var izmērīt, iegūstot nozīmīgus rezultātus, ar nosacījumu, ka izmantotajam analītiskajam detektoram ir vienāda jutība pret visām maisījuma vielām un ka tās iespējams pietiekami izšķirt.

INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO VIELU

11.

Pirms testēšanas sākšanas ir jāzina vielas disociācijas konstante, struktūrformula un šķīdība kustīgajā fāzē. Turklāt būtu lietderīga informācija par hidrolīzi.

KVALITĀTES KRITĒRIJI

12.

Lai paaugstinātu mērījumu rezultātu ticamību, noteikšana jāveic divkārši.

Atkārtojamība: log Pow vērtībai, kas iegūta, veicot atkārtotus mērījumus vienādos apstākļos un izmantojot tādus pašus standartvielu kopumus, ir jābūt ± 0,1 log vienības diapazonā.

Reproducējamība: ja mērījumi tiek atkārtoti, izmantojot atšķirīgus standartvielu kopumus, rezultāti var atšķirties. Parasti korelācijas koeficients R attiecībai starp log k un log Pow standartvielu kopumam ir apmēram 0,9, kas atbilst log Pow oktanola/ūdens sadalījuma koeficientam, kas ir ± 0,5 log vienības.

13.

Starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā pierādīts, ka ar HPLC un “kolbu kratīšanas” metodēm var iegūt rezultātus ± 0,5 vienību diapazonā (2). Literatūrā ir izklāstīti arī citi salīdzinošās testēšanas rezultāti (4)(5)(10)(11)(12). Korelāciju grafiki, kas veidoti standartvielām ar līdzīgu struktūru, nodrošina vispareizākos rezultātus (13).

STANDARTVIELAS

14.

Lai noteiktu korelāciju starp vielai izmērīto aiztures koeficientu k un tās Pow vērtību, jāizveido kalibrēšanas grafiks, izmantojot mērījumus vismaz sešos punktos (sk. 24. punktu). Par piemērotu standartvielu izvēli ir atbildīgs metodes lietotājs. Parasti izvēlas standartvielas, kuru Pow vērtību diapazons iekļauj testējamās vielas log Pow, t. i., vismaz vienas standartvielas Pow būtu jābūt lielākam par testējamās vielas Pow, bet otras standartvielas Pow – mazākam par testējamās vielas Pow. Ekstrapolācija būtu veicama tikai izņēmuma gadījumos. Vēlams, lai šīs standartvielas būtu struktūras ziņā saistītas ar testējamo vielu. Kalibrēšanā izmantoto standartvielu log Pow vērtībām jābūt iegūtām, pamatojoties uz uzticamiem eksperimentu datiem. Tomēr, ja par vielām ar augstu log Pow (parasti vairāk nekā 4) nav pieejami uzticami eksperimentu dati, var izmantot aprēķinātās vērtības. Ja lieto ekstrapolētas vērtības, ir jānosaka to robežvērtība.

15.

Daudzām ķīmisko vielu grupām ir publicēti plaši log Pow vērtību saraksti (14)(15). Ja nav datu par līdzīgas struktūras vielu sadalījuma koeficientu vērtībām, var izmantot vispārīgāku kalibrēšanu, lietojot citas standartvielas. Ieteicamās standartvielas un to Pow vērtības ir norādītas 1. tabulā. Jonizējamām vielām dotās vērtības attiecas uz to nejonizēto formu. Vērtību ticamība un kvalitāte ir pārbaudīta starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā.

1. tabula.

Ieteicamās standartvielas

 

CAS Nr.

Standartviela

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanons

(metiletilketons)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetilpiridīns

0,5

 

3

62-53-3

Anilīns

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilīds

1,0

 

5

100-51-6

Benzilspirts

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksifenols;

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoksietiķskābe

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenols

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenols

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benzonitrils

1,6

 

11

140-29-4

Fenilacetonitrils

1,6

 

12

589-18-4

4-metilbenzilspirts

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenons

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenols

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobenzoskābe

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-hloranilīns

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenzols

1,9

 

18

104-54-1

Cinamilspirts

(kanēļspirts)

1,9

 

19

65-85-0

Benzoskābe

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-krezols

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Kanēļskābe

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anizols

2,1

 

23

93-58-3

Metilbenzoāts

2,1

 

24

71-43-2

Benzols

2,1

 

25

99-04-7

3-metilbenzoskābe

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-hlorfenols

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trihloretilēns

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazīns

2,6

 

29

93-89-0

Etilbenzoāts

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-dihlorbenzonitrils

2,6

 

31

535-80-8

3-hlorbenzoskābe

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluols

2,7

 

33

90-15-3

1-naftols

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dihloranilīns

2,8

 

35

108-90-7

Hlorbenzols

2,8

 

36

1746-13-0

Alilfenilēteris

2,9

 

37

108-86-1

Brombenzols

3,0

 

38

100-41-4

Etilbenzols

3,2

 

39

119-61-9

Benzofenons

3,2

 

40

92-69-3

4-fenilfenols

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timols

3,3

 

42

106-46-7

1,4-dihlorbenzols

3,4

 

43

122-39-4

Difenilamīns

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalīns

3,6

 

45

93-99-2

Fenilbenzoāts

3,6

 

46

98-82-8

Izopropilbenzols

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-trihlorfenols

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenils

4,0

 

49

120-51-4

Benzilbenzoāts

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sek-butilfenols

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-trihlorbenzols

4,2

 

52

143-07-7

Dodekānskābe

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenilēteris

4,2

 

54

85-01-8

Fenantrēns

4,5

 

55

104-51-8

n-butilbenzols

4,6

 

56

103-29-7

Dibenzils

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenilpiridīns

4,9

 

58

206-44-0

Fluorantēns

5,1

 

59

603-34-9

Trifenilamīns

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

METODES APRAKSTS

Sadalījuma koeficienta orientējoši aprēķini

16.

Ja nepieciešams, testējamās vielas sadalījuma koeficientu var noteikt ar aprēķinu metodi (sk. papildinājumu) vai – attiecīgos gadījumos – izmantojot testējamās vielas šķīdības attiecību tīros šķīdinātājos.

Aprīkojums

17.

Šķidruma fāzes hromatogrāfs, kas aprīkots ar vājas pulsācijas sūkni un piemērotu detektēšanas sistēmu. UV detektors, kura viļņu garums ir 210 nm, vai RI detektors ir piemērots plašam ķīmisku vielu grupu klāstam. Polāru grupu klātbūtne stacionārajā fāzē var būtiski pasliktināt kolonnas darbības efektivitāti. Tāpēc stacionārajā fāzē jābūt iespējami mazam polāro grupu saturam (16). Var izmantot tirdzniecībā pieejamas gatavas kolonnas ar pildījumu vai mikrodaļiņu apgrieztās fāzes pildījumu. Starp injicēšanas sistēmu un analītisko kolonnu var uzstādīt aizsargkolonnu.

Kustīgā fāze

18.

Eluentu pirms lietošanas degazē, un tā pagatavošanai izmanto HPLC tīrības pakāpes metanolu un destilētu vai dejonizētu ūdeni. Jāizmanto izokrātiskā eluēšana. Jālieto metanola/ūdens maisījumi ar ūdens saturu vismaz 25 %. Parasti ar metanola-ūdens maisījumu 3:1 (tilpumu attiecība (v/v)) stundas laikā ar plūsmas ātrumu 1 ml/min eluējas vielas, kuru log P ir 6. Vielām, kuru log P vērtība pārsniedz 6 (un arī standartvielām) eluēšanas laiks var būt jāsamazina, samazinot kustīgās fāzes polaritāti vai kolonnas garumu.

19.

Testējamajai vielai un standartvielām jābūt šķīstošām kustīgajā fāzē pietiekamā koncentrācijā, lai tās varētu detektēt. Piedevas metanola/ūdens maisījumam izmanto tikai izņēmuma gadījumos, jo piedevu ietekmē mainās kolonnas īpašības. Šādos gadījumos ir jāpārliecinās, ka tas neietekmē testējamās vielas un standartvielu aiztures ilgumu. Ja metanola/ūdens maisījumu izmantot nevar, var lietot citus organisko šķīdinātāju un ūdens maisījumus, piemēram, etanola/ūdens, acetonitrila/ūdens vai izopropilspirta (2-propanola)/ūdens maisījumu.

20.

Jonizējamām vielām ļoti svarīgs ir eluenta pH. Tam jābūt kolonnas pH darbības diapazonā, kas parasti ir no 2 līdz 8. Ieteicams izmantot buferšķīdumus. Jānovērš sāļu nogulsnēšanās un kolonnas bojāšanās, ko izraisa daži organiskās fāzes/buferšķīdumu maisījumi. Parasti nav ieteicams augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfijā izmantot stacionārās fāzes uz silīcija dioksīda bāzes ar pH virs 8, jo bāziska kustīgā fāze var izraisīt strauju kolonnas efektivitātes pasliktināšanos.

Šķīdināmās vielas

21.

Testējamajām vielām un standartvielām jābūt pietiekami tīrām, lai hromatogrammās attiecīgajām vielām varētu skaidri noteikt smailes. Testēšanai vai kalibrēšanai izmantojamās vielas, ja iespējams, jāšķīdina kustīgajā fāzē. Ja testējamo vielu un standartvielu šķīdināšanai izmanto šķīdinātāju, kas nav kustīgā fāze, paraugu tieši pirms iešļircināšanas kolonnā atšķaida ar kustīgo fāzi.

Testēšanas apstākļi

22.

Mērījumu laikā temperatūra nedrīkst mainīties par vairāk nekā ± 1 °C.

Tukšā laika t0 noteikšana

23.

Tukšo laiku t0 var izmērīt, izmantojot organiskas vielas, kas netiek aizturētas (piemēram, tiourīnvielu vai formamīdu). Precīzāk tukšo laiku var noteikt, izmērot aptuveni septiņu homoloģiskas rindas locekļu (piem., n-alkilmetilketonu) aiztures ilgumus (17). Aiztures ilgumus tR (nC + 1) grafikā atliek pret tR (nC), kur nC ir oglekļa atomu skaits. Iegūst vienādojumam tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0 atbilstošu taisni, kur A jeb k(nC + 1)/k(nC) ir konstante. Tukšo laiku t0 aprēķina pēc krustpunkta parametra (1 – A)t0 un virziena koeficienta A.

Regresijas vienādojums

24.

Nākamais posms ir grafiski attēlot korelāciju starp attiecīgo standartvielu log P un log k, log P vērtībām esot tuvu paredzamajai testējamās vielas vērtībai. Praksē vienlaicīgi injicē no sešām līdz desmit standartvielām. Nosaka aiztures ilgumus; tam vēlams izmantot reģistrējošu integratoru, kas savienots ar detektēšanas sistēmu. Aiztures koeficientu attiecīgos logaritmus log k grafiski attēlo kā log P funkciju. Regresijas vienādojumu aprēķināšanu veic regulāri – vismaz reizi dienā, lai varētu ņemt vērā kolonnas efektivitātes iespējamās izmaiņas.

TESTĒJAMĀS VIELAS POW NOTEIKŠANA

25.

Testējamo vielu injicē vismazākajos detektējamos daudzumos. Aiztures ilgumu nosaka divos replikātos. Testējamās vielas sadalījuma koeficientu nosaka, kalibrēšanas grafikā interpolējot aprēķināto aiztures koeficientu. Ļoti zemas un ļoti augstas sadalījuma koeficienta vērtības ir jānosaka ekstrapolējot. Šādos gadījumos īpaša vērība jāveltī regresijas līnijas ticamības robežām. Ja parauga aiztures ilgums nav standartvielām noteikto aiztures ilgumu robežās, būtu jānosaka robežvērtība.

DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA

Testēšanas pārskats

26.

Testēšanas pārskatā iekļaujama šāda informācija:

ja noteikts – sadalījuma koeficienta provizoriskā (aplēstā) vērtība, aplēstās vērtības un izmantotā metode; un – ja izmantota aprēķina metode – tās pilns apraksts, tostarp datubāzes identifikācija un detalizēta informācija par struktūrelementu izraudzīšanos;

testējamās vielas un standartvielas tīrība, struktūrformula un CAS numurs,

iekārtas un darba apstākļu apraksts: analītiskā kolonna, aizsargkolonna,

kustīgā fāze, detektēšanas veids, temperatūras diapazons, pH;

eluēšanās profili (hromatogrammas);

tukšais laiks un tā noteikšanas paņēmiens;

kalibrēšanai izmantoto standartvielu aiztures dati un literatūrā norādītās log Pow vērtības;

pielāgotās regresijas līnijas dati (log k pret log Pow) un līnijas korelācijas koeficients, tostarp ticamības intervāli;

testējamās vielas vidējais aiztures laiks un interpolētā log Pow vērtība,

maisījumiem: eluēšanās profila hromatogramma ar noteiktajām robežvērtībām aprēķinos neiekļaujamo smaiļu laukumam;

log Pow vērtības attiecībā pret log Pow smailes laukuma procentuālo vērtību;

aprēķini, kas veikti, izmantojot regresijas līniju;

vidējās svērtās log Pow vērtības, ja tās ir aprēķinātas.

LITERATŪRA

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). “Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Papildinājums

POW aprēķina metodes

IEVADS

1.

Šajā papildinājumā sniegts īss ieskats Pow aprēķināšanā. Papildu informāciju sk. mācību grāmatās (1)(2).

2.

Aprēķinātās Pow vērtības izmanto turpmāk minētajiem nolūkiem:

lai izlemtu, kuru eksperimentālo metodi izmantot: “kolbu kratīšanas” metodi, ja log Pow vērtība ir no – 2 līdz 4, vai HPLC metodi, ja log Pow vērtība ir no 0 līdz 6;

lai izraudzītos HPLC metodes lietošanas apstākļus (standartvielas, metanola/ūdens attiecību);

lai pārbaudītu ar eksperimentālajām metodēm iegūto vērtību ticamību;

lai veiktu aplēses, ja nav iespējams izmantot eksperimentālās metodes.

Aprēķina metožu principi

3.

Šajā dokumentā norādīto aprēķina metožu pamatā ir molekulu teorētiska sadalīšana atbilstošos struktūrelementos ar zināmu log Pow izmaiņu soli. Vielas kopējo log Pow aprēķina, summējot atsevišķo struktūrelementu vērtības un veicot korekciju – ņemot vērā iekšmolekulāro mijiedarbību. Struktūrelementu konstantes un korekcijas koeficienti ir atrodami (1)(2)(3)(4)(5)(6). Daļu no tiem regulāri atjaunina (3).

Aprēķināto vērtību ticamība

4.

Parasti aprēķinu metodes ticamība pazeminās, paaugstinoties testējamās vielas struktūras sarežģītībai. Vienkāršām molekulām ar nelielu molekulmasu un vienu vai divām funkcionālajām grupām ar dažādām sadalīšanas metodēm noteiktās log Pow vērtības var atšķirties no eksperimentāli noteiktajām par 0,1 līdz 0,3 vienībām. Kļūdas robežas lielums ir atkarīgs no struktūrelementu konstanšu ticamības, kā arī iespējas identificēt iekšmolekulāro mijiedarbību (piemēram, ūdeņraža saites) un korekcijas koeficientu pareizas lietošanas. Jonizējamām vielām ir jāņem vērā to lādiņš un jonizācijas pakāpe (10).

Fudžitas-Henša (Fujita-Hansch) π-metode

5.

Hidrofobā aizvietotāja konstanti π, ko sākotnēji ieviesa Fudžita et al. (7), definē šādi:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

kur PhX ir aromātiskais atvasinājums, bet PhH – sākotnējā viela.

piemēram,

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-metode galvenokārt ir lietojama aromātiskajiem savienojumiem. π- vērtības ir pieejamas lielam skaitam aizvietotāju (4)(5).

Rekera (Rekker) metode

6.

Izmantojot Rekera metodi (8), log Pow vērtību aprēķina saskaņā ar šādu vienādojumu:

Formula

kur ai ir attiecīgo struktūrelementu skaits molekulā, bet fi – struktūrelementa log Pow palielinājums. Mijiedarbību raksturojošos vienādojuma locekļus var izteikt vienas konstantes Cm (tā dēvētās “maģiskās konstantes”) integrāļa daudzkārtņa veidā. Struktūrelementu konstantes fi un Cm noteiktas ar daudzfaktoru regresijas analīzi, izmantojot 1 054 eksperimentāli iegūtas Pow vērtības 825 vielām (6)(8). Mijiedarbību raksturojošos locekļus nosaka atbilstoši literatūrā (6)(8)(9) aprakstītajiem noteikumiem.

Henša–Leo (Hansch-Leo) metode

7.

Izmantojot Henša–Leo metodi (4), log Pow vērtību aprēķina saskaņā ar šādu vienādojumu:

Formula

kur fi ir struktūrelementa konstante, Fj – korekcijas koeficients, ai un bj – attiecīgo struktūrelementu skaits molekulā. Ar mēģinājumu un kļūdu metodi, izmantojot eksperimentāli noteiktās Pow vērtības, iegūts atomu un grupu struktūrelementu vērtību, kā arī korekcijas koeficientu Fj saraksts. Korekcijas koeficienti ir iedalīti vairākās klasēs (1)(4). Lai ņemtu vērā visus nosacījumus un korekcijas koeficientus, ir izstrādāta īpaša programmatūra (3).

KOMBINĒTĀ METODE

8.

Sarežģītām molekulām log Pow aprēķinus var ievērojami uzlabot, ja molekulu dala lielākos struktūrelementos, kuriem noteiktas ticamas log Pow vērtības, kas iegūtas no tabulām (3)(4) vai eksperimentāli. Šādu struktūrelementu (heterociklu, antrahinona, azobenzola) novērtēšanā pēc tam var papildus izmantot Henša π vērtības vai ar Rekera vai Henša–Leo metodēm noteiktās struktūrelementu konstantes.

Piezīmes

i)

Aprēķinu metodes daļēji vai pilnīgi jonizētiem savienojumiem var izmantot tikai tad, ja ir ņemti vērā nepieciešamie korekcijas koeficienti.

ii)

Ja var pieņemt, ka savienojumā ir iekšmolekulāras ūdeņraža saites, jālieto attiecīgie korekcijas koeficienti (apmēram + 0,6 līdz + 1,0 log Pow vienības) (1). Norādes par šādu saišu esību var iegūt, izmantojot molekulu struktūras telpiskos modeļus vai spektroskopijas datus.

iii)

Ja savienojumam iespējamas vairākas tautomērās formas, aprēķinus izdara iespējamākajai no tām.

iv)

Rūpīgi jāievēro izmaiņas struktūrelementu konstanšu tabulās.

LITERATŪRA PAR APRĒĶINA METODĒM

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

(3)

C.3 nodaļas tekstu aizstāj ar šādu:

C.3.   SALDŪDENS AĻĢU UN CIĀNBAKTĒRIJU (ZILAĻĢU) AUGŠANAS INHIBĒŠANĀS TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 201 (2006. gads, pielikums labots 2011. gadā). Ir konstatēta nepieciešamība papildināt testēšanas metodi, iekļaujot papildu sugas un atjauninot to, lai izpildītu prasības attiecībā uz ķīmisko vielu bīstamības novērtējumu un klasifikāciju. Minētā dokumenta pārskatīšana ir veikta, pamatojoties uz plašo praktisko pieredzi, zinātnes attīstību attiecībā uz vielu toksisko ietekmi uz aļģēm, un plašu izmantošanu reglamentējošo noteikumu izstrādē, kas notikusi laikposmā kopš sākotnējās versijas pieņemšanas.

2.

Izmantotās definīcijas ir dotas 1. papildinājumā.

TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS

3.

Šā testa mērķis ir novērtēt ķīmiskās vielas ietekmi uz saldūdens mikroskopisko aļģu un/vai zilaļģu augšanu. Eksponenciāli augošus testa organismus periodiski audzētās kultūrās eksponē testējamajai ķīmiskajai vielai laika periodā, kas parasti ilgst 72 stundas. Lai gan tests ir diezgan īslaicīgs, tas ļauj novērtēt iedarbību uz vairākām paaudzēm.

4.

Sistēmas atbildreakcija ir augšanas ātruma samazinājums aļģu kultūru sērijās (testa vienībās), kas eksponētas dažādu koncentrāciju testējamās ķīmiskās vielas šķīdumiem. Atbildreakciju vērtē kā ekspozīcijas koncentrācijas funkciju, salīdzinot ar replikātu – ekspozīcijai nepakļauto kontrolgrupu – augšanas ātruma vidējo vērtību. Lai iegūtu pilnīgu ainu par sistēmas reakciju uz toksisko ekspozīciju (optimālo jutību), kultūrām ļauj neierobežoti eksponenciāli augt, nodrošinot pietiekami daudz barības vielu un nepārtrauktu gaismu pietiekami ilgi, lai noteiktu specifiskā augšanas ātruma samazināšanos.

5.

Augšanu un augšanas inhibēšanos kvantitatīvi nosaka, izmantojot sakarību starp aļģu biomasu un laiku. Aļģu biomasu definē kā sausnas masu uz tilpuma vienību, piemēram, miligramus aļģu uz litru testa šķīduma. Tomēr sausnas masa ir grūti mērāma, tāpēc izmanto aizstājējparametrus. Visbiežāk izmantotais aizstājējparametrs ir šūnu skaits. Citi aizstājējparametri ir šūnu tilpums, fluorescence, optiskais blīvums u. c. Ir jāzina pārrēķina koeficients starp izmērīto aizstājējparametru un biomasu.

6.

Testēšanas beigupunkts ir augšanas inhibēšanās, ko izsaka kā biomasas logaritmisko pieaugumu (vidējo specifisko augšanas ātrumu) ekspozīcijas perioda laikā. No specifiskā augšanas ātruma vidējām vērtībām, kas reģistrētas testa šķīdumu sērijā, nosaka koncentrāciju, kas rada noteiktu x % (piemēram, 50 %) augšanas ātruma inhibēšanās vērtību, un to izsaka kā ErCx (piemēram, ErC50).

7.

Šajā testēšanas metodē izmantotais papildu atkarīgais mainīgais ir ražība, kas var būt nepieciešams, lai dažās valstīs izpildītu īpašas reglamentējošas prasības. To nosaka, no biomasas apjoma ekspozīcijas perioda beigās atņemot biomasas apjomu ekspozīcijas perioda sākumā. No ražības, kas reģistrēta testa šķīdumu rindā, aprēķina koncentrāciju, kas rada noteiktu x % (piemēram, 50 %) ražības inhibēšanās vērtību, un to izsaka kā EyCx (piemēram, EyC50).

8.

Turklāt statistiski var noteikt zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC) un nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC).

INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶĪMISKO VIELU

9.

Informācijā par testējamo ķīmisko vielu, kas var būt noderīga, nosakot testēšanas apstākļus, ietver tās struktūrformulu, tīrību, stabilitāti gaismā, stabilitāti testa apstākļos, gaismas absorbcijas īpašības, pKa un pētījumu rezultātus par pārveidošanos, tostarp bionoārdāmību ūdenī.

10.

Jāzina testējamās ķīmiskās vielas šķīdība ūdenī, sadalījuma koeficients oktanolā/ūdenī (Pow) un tvaika spiediens, un jābūt pieejamai validētai metodei ķīmiskās vielas daudzuma kvantitatīvai noteikšanai testa šķīdumos ar zināmu atgūstamības koeficientu un detektēšanas robežu.

TESTA DERĪGUMS

11.

Lai tests būtu derīgs, ir jāizpilda šādi veiktspējas kritēriji:

kontrolgrupu biomasai 72 stundu laikā eksponenciāli jāpieaug vismaz 16-kārtīgi. Tas atbilst specifiskajam augšanas ātrumam 0,92 dienas–1. Visbiežāk izmantoto sugu augšanas ātrums parasti ir ievērojami augstāks (sk. 2. papildinājumu). Šis kritērijs var netikt izpildīts, ja izmanto sugas, kas aug lēnāk nekā tās, kas uzskaitītas 2. papildinājumā. Tādā gadījumā testēšanas laiku pagarina, lai iegūtu vismaz 16-kārtīgu pieaugumu kontrolgrupās, visu testa laiku saglabājot eksponenciālu augšanu. Šo testēšanas periodu var samazināt vismaz līdz 48 stundām, lai uzturētu neierobežotu eksponenciālu pieaugumu testēšanas laikā tik ilgi, līdz ir sasniegts minimālais ekponenciāla pieauguma koeficients 16;

katrā posmā specifiskā augšanas ātruma variācijas koeficienta vidējā vērtība (0–1, 1–2 un 2–3 dienā 72 stundu testiem) kontrolgrupām (sk. 1. papildinājumu par variācijas koeficientu) nedrīkst pārsniegt 35 %. Par katra posma specifiskā augšanas ātruma aprēķināšanu sk. 49. punktu. Šis kritērijs attiecas uz kontrolgrupu replikātu variācijas koeficientu vidējo vērtību;

vidējā specifiskā augšanas ātruma variācijas koeficients replikātu kontrolgrupu kultūrās visā testēšanas laikā nedrīkst pārsniegt 7 %, ja testēšanā lieto Pseudokirchneriella subcapitata un Desmodesmus subspicatus. Citām, testēšanā retāk izmantotām sugām šai vērtībai nevajadzētu pārsniegt 10 %.

ĶĪMISKĀ STANDARTVIELA

12.

Ķīmisko(-ās) standartvielu(-as), piemēram, 3,5-dihlorfenolu, kas izmantots starptautiskajā salīdzinošajā testēšanā (1), var lietot testēšanas metodes pārbaudei. Zaļaļģēm par ķīmisko standartvielu var izmantot arī kālija dihromātu. Ķīmiskās standartvielas testēšanu ieteicams veikt vismaz divas reizes gadā.

TESTA IZMANTOJAMĪBA

13.

Šo testēšanas metodi vislabāk var izmantot ūdenī šķīstošām ķīmiskajām vielām, kas testa apstākļos, visticamāk, paliks ūdenī. Lai testētu gaistošas, izteikti adsorbējošas, krāsainas ķīmiskas vielas vai ūdenī vāji šķīstošas vielas, vai arī vielas, kas var ietekmēt barības vielu vai minerālvielu pieejamību testēšanas barotnē, aprakstītā procedūra var būt jāpielāgo (piemēram, noslēgta sistēma, testēšanā izmantoto trauku kondicionēšana). Norādījumi par dažām atbilstošām izmaiņām ir sniegti avotos (2), (3) un (4).

TESTĒŠANAS METODES APRAKSTS

Aprīkojums

14.

Testēšanā izmantojamajiem traukiem un citām iekārtām, kas saskaras ar testa šķīdumiem, jābūt pilnībā izgatavotiem no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla. Priekšmeti ir rūpīgi jāmazgā, lai novērstu organisko vai neorganisko kontaminantu iespējamo ietekmi uz aļģu augšanu vai testa šķīdumu sastāvu.

15.

Parasti testēšanā izmantojamie trauki ir stikla kolbas, kam jābūt pietiekami lielām, lai nodrošinātu kultūrām tilpumu, kas nepieciešams mērījumiem testēšanas laikā, kā arī pietiekamu CO2 masas pārnesi no atmosfēras (sk. 30. punktu). Jāņem vērā, ka šķidruma tilpumam ir jābūt pietiekamam, lai veiktu analītisko noteikšanu (sk. 37. punktu).

16.

Turklāt var būt nepieciešams turpmāk minētais aprīkojums vai tā daļa:

kultūras audzēšanas iekārta: skapis vai kamera, kurā var uzturēt izraudzīto inkubācijas temperatūru ar precizitāti ± 2 °C;

gaismas mērinstrumenti: jāņem vērā, ka gaismas intensitātes mērīšanas metode un jo īpaši uztvērēja (kolektora) veids var ietekmēt mērījuma vērtību. Mērījumus ieteicams veikt, izmantojot sfērisku (4 π) uztvērēju (kas reaģē uz tiešo un atstaroto gaismu no visiem leņķiem virs un zem mērīšanas plaknes) vai 2 π uztvērēju (kas reaģē uz gaismu no visiem leņķiem virs mērīšanas plaknes);

iekārtas aļģu biomasas noteikšanai. Šūnu skaitu, kas ir visbiežāk izmantotais aļģu biomasas aizstājējparametrs, var noteikt, lietojot daļiņu elektronisko skaitītāju, mikroskopu ar skaitīšanas kameru vai arī plūsmas citometru. Citus biomasas aizstājējparametrus var mērīt, izmantojot plūsmas citometru, fluorimetru, spektrofotometru vai kolorimetru. Ir lietderīgi izmantot pārrēķināšanas koeficientu šūnu skaita pārrēķināšanai sausnas masā. Lai ar spektrofotometru iegūtu derīgus mērījumus, ja biomasas koncentrācija ir maza, var būt nepieciešams izmantot kivetes ar vismaz 4 cm optisko ceļu.

Testa organismi

17.

Var izmantot vairākas brīvi dzīvojošu mikroskopisko aļģu un zilaļģu sugas. Ir pierādīta 2. papildinājumā uzskaitīto celmu piemērotība izmantošanai šajā metodē norādītajai testēšanas procedūrai.

18.

Izmantojot citas sugas, norāda celmu un/vai tā izcelsmi. Jāpārliecinās, ka visā testēšanas periodā noteiktajos apstākļos var nodrošināt izraudzīto testa aļģu eksponenciālu augšanu.

Audzēšanas barotne

19.

Ieteicams izmantot divas alternatīvas barotnes: ESAO un AAP barotnes. Šo barotņu sastāvs norādīts 3. papildinājumā. Jāievēro, ka sākotnējais pH un buferspēja (spēja uzturēt nemainīgu pH) abām barotnēm ir atšķirīga. Tāpēc testu rezultāti var atšķirties atkarībā no tā, kāda barotne ir izmantota, jo īpaši tad, kad tiek testētas ķīmiskās vielas, kas jonizējas.

20.

Barotnes var būt nepieciešams modificēt noteiktiem mērķiem, piemēram, testējot metālus vai helātus veidojošas vielas vai arī veicot testēšanu pie dažādām pH vērtībām. Ja izmanto modificētas barotnes, tās sīki jāapraksta un lēmums jāpamato (3)(4).

Biomasas sākotnējā koncentrācija

21.

Testa kultūru sākotnējai biomasai ir jābūt vienādai visās testa kultūrās un pietiekami mazai, lai kultūra visu inkubācijas periodu varētu augt eksponenciāli, neiztērējot barības vielas. Sākotnējā biomasa, kas aprēķināta kā sausnas masa, nedrīkst pārsniegt 0,5 mg/l. Ir ieteicamas šādas šūnu sākotnējās koncentrācijas:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103– 104 šūnas/ml

Desmodesmus subspicatus

2–5 × 103 šūnas/ml

Navicula pelliculosa

104 šūnas/ml

Anabaena flos-aquae

104 šūnas/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 šūnas/ml

Testējamās vielas koncentrācijas

22.

Koncentrāciju diapazonu, kurā, visticamāk, rastos ietekme, var noteikt pēc diapazona noteikšanas testu rezultātiem. Pēdējam – galīgajam – testam jāizvēlas vismaz piecas koncentrācijas, kas sakārtotas ģeometriskā progresijā ar kvocientu, kas nepārsniedz 3,2. Testējamajām ķīmiskajām vielām, kuru koncentrācijas/reakcijas līkne ir lēzena, var būt pieļaujams augstāks kvocients. Koncentrāciju rindai būtu vēlams izraisīt aļģu augšanas ātruma inhibēšana diapazonā 5–75 %.

Replikāti un kontrolgrupas

23.

Testēšanas plānā jāparedz katras testējamās koncentrācijas testēšana trijos replikātos. Ja NOEC noteikt nav nepieciešams, testēšanas plānu var mainīt, palielinot koncentrāciju skaitu un samazinot katras koncentrācijas replikātu skaitu. Kontrolgrupai nepieciešami vismaz trīs replikāti, bet ideāli to skaitam ir jābūt divas reizes lielākam par katra testējamās koncentrācijas varianta replikātu skaitu.

24.

Var sagatavot atsevišķu testa šķīdumu kopumu testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju analītiskai noteikšanai (sk. 36. un 38. punktu).

25.

Ja testējamās vielas šķīdināšanai lieto šķīdinātāju, testēšanas plānā iekļauj papildu kontrolgrupu, kas satur šķīdumu tādā pašā koncentrācijā, kāda izmantota testa kultūrām.

Inokulācijas kultūras sagatavošana

26.

Lai testa aļģes pielāgotu testēšanas apstākļiem un nodrošinātu, ka testa šķīdumu inokulācijai izmantotās aļģes atrodas eksponenciālās augšanas fāzē, 2–4 dienas pirms testa sākuma testēšanas barotnē sagatavo inokulācijas kultūru. Aļģu biomasa ir jākoriģē, lai līdz testa sākumam inokulācijas kultūrā notiktu eksponenciāla augšana. Inokulācijas kultūru inkubē tādos pašos apstākļos kā testa kultūras. Lai pārliecinātos, ka testa celms kultivēšanas apstākļos aug normāli, izmēra inokulācijas kultūras biomasas pieaugumu. Aļģu kultūru audzēšanas piemērs izklāstīts 4. papildinājumā. Lai izvairītos no šūnu vienlaicīgas dalīšanās testēšanas laikā, var būt nepieciešams veikt otro inokulācijas kultūras pavairošanas posmu.

Testa šķīdumu sagatavošana

27.

Visos testa šķīdumos jābūt vienādai augšanas barotnes un testa aļģu biomasas sākotnējai koncentrācijai. Testa šķīdumus izraudzītajās koncentrācijās parasti sagatavo, samaisot testējamās ķīmiskās vielas izejšķīdumu ar augšanas barotni un inokulācijas kultūru. Izejšķīdumu parasti gatavo, izšķīdinot ķīmisko vielu testēšanas barotnē.

28.

Šķīdinātājus, piemēram, acetonu, t-butilspirtu un dimetilformamīdu, var izmantot par nesējiem, ar ko testēšanas barotnei pievienot ķīmiskās vielas ar vāju šķīdību ūdenī (2)(3). Šķīdinātāja koncentrācija nedrīkst pārsniegt 100 μl/l, un visām testa sērijas kultūrām (tostarp kontrolgrupām) šķīdinātājs jāpievieno vienādā koncentrācijā.

Inkubācija

29.

Testa traukus noslēdz ar gaisu caurlaidīgiem aizbāžņiem. Traukus sakrata un ievieto kultivēšanas aparātā. Testēšanas laikā aļģes jātur suspensijā un jāveicina CO2 pārnese. Šim nolūkam jāizmanto pastāvīga kratīšana vai maisīšana. Kultūras uztur temperatūrā no 21 līdz 24 °C, temperatūru kontrolējot ar ± 2 °C precizitāti. Tām sugām, kas nav ietvertas 2. papildinājumā, piemēram, tropu sugām, var būt piemērota augstāka temperatūra ar nosacījumu, ka var nodrošināt derīguma kritērijus. Kolbas ir ieteicams izvietot nejaušā secībā un katru dienu mainīt to stāvokli inkubatorā.

30.

Kontrolgrupas barotnē testēšanas laikā pH nedrīkst palielināties par vairāk nekā 1,5 vienībām. Metāliem un ķīmiskajām vielām, kas daļēji jonizējas pie testēšanas apstākļiem tuva pH, var būt nepieciešams ierobežot pH izmaiņas, lai iegūtu reproducējamus un skaidri noteiktus rezultātus. Tehniski ir iespējams nodrošināt, ka pH izmaiņas nesasniedz 0,5 vienības, nodrošinot atbilstošu CO2 masas pārneses ātrumu no apkārtējā gaisa testa šķīdumā, piemēram, palielinot kratīšanas ātrumu. Cita iespēja ir aļģēm nepieciešamā CO2 daudzuma samazināšana, samazinot sākotnējo biomasu vai saīsinot testēšanas laiku.

31.

Virsmai, uz kuras kultūras inkubē, ir jāsaņem pastāvīgs, vienmērīgs fluorescents apgaismojums, piemēram, “vēsi balts” vai “dienasgaismas”. Zaļaļģu un ciānbaktēriju celmu gaismas prasības ir atšķirīgas. Gaismas intensitāte ir jāizvēlas atbilstoši izmantotajam testa organismam. Ieteiktajām zaļaļģu sugām gaismas intensitātei testa šķīduma līmenī jābūt diapazonā no 60 līdz 120 μE · m– 2 ·s – 1, to ar piemērotu uztvērēju mērot fotosintētiski efektīvajā viļņu garumu diapazonā no 400 līdz 700 nm. Dažas sugas, jo īpaši Anabaena flos-aquae, labi aug zemākā gaismas intensitātē, un pārāk intensīvs apgaismojums radīt bojājumus. Šādām sugām vidējā gaismas intensitāte būtu jāizvēlas diapazonā no 40 līdz 60 μE·m– 2 · s– 1. (Gaismas mērinstrumentiem, kas kalibrēti luksos, vēsi baltās gaismas ekvivalents diapazonā no 4 440 līdz 8 880 lx aptuveni atbilst ieteiktajai gaismas intensitātei 60-120 μE·m– 2 · s– 1.) Gaismas intensitāte jāuztur ± 15 % robežās no gaismas vidējās intensitātes inkubācijas zonā.

Testēšanas ilgums

32.

Testēšanas ilgums parasti ir 72 stundas. Tomēr var izmantot īslaicīgāku vai ilglaicīgāku testēšanu – ar nosacījumu, ka var izpildīt visus 11. punktā minētos derīguma kritērijus.

Mērījumi un analītiskā noteikšana

33.

Aļģu biomasa katrā kolbā testēšanas laikā jānosaka vismaz vienu reizi dienā. Ja mērījumus veic, izmantojot no testa šķīduma ar pipeti ņemtus nelielus tilpumus, tos nedrīkst aizstāt.

34.

Biomasu mēra, manuāli skaitot šūnas ar mikroskopu vai izmantojot daļiņu elektronisko skaitītāju (pēc šūnu skaita un/vai biotilpuma). Ja var pierādīt apmierinošu korelāciju starp mērījumu rezultātiem un biomasu visā biomasas diapazonā, kas paredzama testēšanas laikā, var izmantot alternatīvas metodes, piemēram, plūsmas citometrisko analīzi, in vitro vai in vivo hlorofila fluorescences (5)(6) vai optiskā blīvuma metodi.

35.

Testēšanas sākumā un beigās ir jāizmēra šķīdumu pH.

36.

Ja ir pieejama analītiskā metode testējamās ķīmiskās vielas noteikšanai izmantotajā koncentrāciju diapazonā, jāanalizē testa šķīdumi, lai verificētu to sākotnējās koncentrācijas un ekspozīcijas koncentrāciju uzturēšanu testēšanas laikā.

37.

Var būt pietiekami testēšanas sākumā un beigās analizēt testējamās vielas augstu un zemu koncentrāciju un koncentrāciju ap paredzamo EC50, ja ir paredzams, ka ekspozīcijas koncentrācijas testēšanas laikā mainīsies ne vairāk kā par 20 % nominālās vērtības. Ja ir maz ticams, ka koncentrācijas saglabāsies 80–120 % diapazonā no sākotnējās koncentrācijas, ir ieteicams veikt visu testa koncentrāciju analīzi testēšanas sākumā un beigās. Gaistošām, nestabilām vai izteikti adsorbējošām testējamajām ķīmiskajām vielām ekspozīcijas laikā ik pēc 24 stundām ieteicams ņemt papildu paraugus analīzei, lai labāk konstatētu testējamās ķīmiskās vielas zudumu. Šīm ķīmiskajām vielām var būt nepieciešami papildu replikāti. Visos gadījumos testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas ir jānosaka tikai vienā katras pārbaudāmās koncentrācijas replikāta traukā (vai pēc replikāta apvienoto trauku saturam).

38.

Testa vide, kas sagatavota īpaši ekspozīcijas koncentrācijas analīzei, testēšanas laikā jāapstrādā tieši tāpat kā vide, ko izmanto testēšanai, t. i., aļģu uzsēšana un inkubācija jāveic identiskos apstākļos. Ja ir nepieciešama izšķīdušās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas analīze, var būt nepieciešams atdalīt aļģes no to barotnes. Atdalīšanu ieteicams veikt centrifūgā pie relatīvi neliela paātrinājuma, kas ir pietiekams aļģu izgulsnēšanai.

39.

Ja ir pierādījumi, ka testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija visā testa laikā ir apmierinoši uzturēta ± 20 % robežās no nominālās vai izmērītās sākotnējās koncentrācijas, tad rezultātu analīzes pamatā var būt nominālās vai izmērītās sākotnējās vērtības. Ja novirze no nominālās vai izmērītās sākotnējās koncentrācijas nav ± 20 % diapazonā, rezultātu analīzes pamatā jābūt koncentrācijas vidējai ģeometriskajai vērtībai ekspozīcijas laikā vai modeļiem, kas raksturo testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas samazināšanos (3)(7).

40.

Aļģu augšanas inhibēšanās tests ir dinamiskāka testa sistēma nekā lielākā daļa citu īslaicīgo testu, ko izmanto toksiskuma noteikšanai ūdens vidē. Tāpēc var būt grūti noteikt reālās ekspozīcijas koncentrācijas, jo īpaši adsorbējošām ķīmiskajām vielām, ko testē zemās koncentrācijās. Šādā gadījumā testējamās ķīmiskās vielas izzušana no šķīduma, adsorbējoties pieaugošajā aļģu biomasā, nenozīmē tās izzušanu no testa sistēmas. Analizējot testa rezultātus, jāpārbauda, vai testēšanas gaitā līdz ar testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas pazemināšanos samazinās arī augšanas inhibēšanās. Ja tā notiek, var piemērot atbilstošu modeli, kas raksturo testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas samazināšanos (7). Ja ne, rezultātu analīzei var izmantot sākotnējās (nominālās vai izmērītās) koncentrācijas.

Citi novērojumi

41.

Lai pārliecinātos par inokulācijas kultūras normālu un veselīgu izskatu, kā arī konstatētu visas aļģu izskata anomālijas (ko var izraisīt eksponēšana testējamai ķīmiskajai vielai), testa beigās jāveic izmeklējumi ar mikroskopu.

Robežtests

42.

Noteiktos apstākļos, piemēram, ja sākotnējais tests liecina, ka testējamajai ķīmiskajai vielai nav toksiskas ietekmes koncentrācijās līdz 100 mg/l vai līdz šķīdības robežai testēšanas barotnē (atkarībā no tā, kura no vērtībām ir mazāka), var veikt robežtestu, kurā salīdzina reakciju kontrolgrupā un vienā apstrādātajā grupā (100 mg/l vai koncentrācija, kas vienāda ar šķīdības robežu). Noteikti ieteicams, ka to apstiprina ekspozīcijas koncentrācijas analīze. Uz robežtestu attiecas visi iepriekš aprakstītie testēšanas nosacījumi un derīguma kritēriji, izņemot to, ka jābūt vismaz sešiem apstrādes replikātiem. Kontrolgrupu un apstrādes grupu atkarīgos mainīgos var analizēt, ar statistisku testu, piemēram, Stjūdenta t-testu (Student t-test) salīdzinot vidējās vērtības. Ja abu grupu dispersijas nav vienādas, jāveic atšķirīgām dispersijām pielāgots t-tests.

DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA

Augšanas līkņu grafiska attēlošana

43.

Biomasu testa traukos var izteikt mērījumam izmantotā aizstājējparametra vienībās (piemēram, kā šūnu skaitu, fluorescenci).

44.

Lai iegūtu augšanas grafikus, tabulas veidā apkopo datus par biomasas koncentrācijām testa kultūrās un kontrolgrupās, kā arī testējamās vielas koncentrācijām un mērījumu laikiem, ko reģistrē ar precizitāti vismaz līdz veselām stundām. Šajā pirmajā posmā var būt noderīgas gan logaritmiskās, gan lineārās skalas, taču logaritmisko skalu izmantošana ir obligāta un tās kopumā labāk attēlo augšanas norises izmaiņas testēšanas laikā. Jāņem vērā, ka eksponenciāla augšana, attēlota logaritmiskā skalā, rada taisnu līniju un tās slīpums (virziena koeficients) norāda specifisko augšanas ātrumu.

45.

Izmantojot grafikus, pārbauda, vai kontrolgrupas kultūras visā testēšanas laikā eksponenciāli aug gaidāmajā ātrumā. Kritiski izvērtē visus datu punktus un grafiku izskatu, un pārbauda, vai izejas datos un procedūrās nav kļūdu. Īpašu uzmanību pievērš visiem datu punktiem, kuru šķietamā novirze sasniedz sistemātiskās kļūdas lielumu. Ja acīmredzami var konstatēt procedūrā pieļautas kļūdas vai ir ļoti iespējams, ka tādas varētu būt, attiecīgo datu punktu atzīmē kā anomālu un turpmākajā statistiskajā analīzē neiekļauj. (Ja aļģu koncentrācija vienā no diviem vai trim varianta replikātu traukiem atbilst nullei, tas, iespējams, norāda, ka trauki nav pareizi uzsēti vai nav bijuši pienācīgi iztīrīti). Testēšanas pārskatā skaidri norāda datu punkta noraidīšanas iemeslus. Pieņemami iemesli ir tikai (reti) kļūdas procedūrā un nevis vienkārši zema precizitāte. Datu statistiskās apstrādes procedūras anomālo vērtību identificēšanai šā tipa problēmām ir izmantojamas ierobežoti, un tās nevar aizstāt eksperta vērtējumu. Anomālās vērtības (atbilstoši identificētas) ieteicams atstāt starp grafikos vai tabulās attēlotajiem datu punktiem.

Atkarīgie mainīgie

46.

Testa mērķis ir novērtēt testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz aļģu augšanu. Šajā testēšanas metodē ir iekļauti divu atkarīgo mainīgo apraksti, jo dažādās jurisdikcijās ir priekšroku dod atšķirīgām pieejām un ir atšķirīgas regulējuma vajadzības. Lai testēšanas rezultāti būtu pieņemami visās jurisdikcijās, ietekme ir jāizvērtē, izmantojot abus turpmāk aprakstītos atkarīgos mainīgos – a) un b).

a)    Vidējais specifiskais augšanas ātrums : šo atkarīgo mainīgo aprēķina, pamatojoties uz biomasas logaritmisko pieaugumu testēšanas laikā, un tā mērvienība ir biomasas pieaugums dienā.

b)    Ražība : šis atkarīgais mainīgais ir testēšanas beigu biomasa, no kā atņemta testēšanas sākuma biomasa.

47.

Jānorāda, ka toksiskuma vērtības, kas aprēķinātas, izmantojot šos abus atkarīgos mainīgos, nav savstarpēji salīdzināmas, un šī atšķirība jāapzinās, izmantojot testa rezultātus. Tā kā katras pieejas matemātiskais pamats ir atšķirīgs, tad, ja būs ievēroti šīs testa metodes testa nosacījumi, ECx vērtības, kuru pamatā ir vidējais specifiskais augšanas ātrums (ErCx), kopumā būs augstākas nekā rezultāti, kuru pamatā ir ražība (EyCx). To nedrīkst interpretēt kā šo abu iegūto parametru jutības atšķirību; šīs vērtības vienkārši ir matemātiski atšķirīgas. Vidējā specifiskā augšanas ātruma koncepcijas pamatā ir aļģu vispārējais eksponenciālās augšanas modelis kultūrās, kuru augšanu neierobežo; toksiskumu tajās aplēš pēc ietekmes uz augšanas ātrumu neatkarīgi no kontrolgrupas absolūtā specifiskā augšanas ātruma līmeņa, koncentrācijas–atbildreakcijas līknes virziena koeficienta vai testa ilguma. Savukārt rezultāti, kuru pamatā esošais atkarīgais mainīgais ir ražība, ir atkarīgi no visiem citiem minētajiem mainīgajiem. EyCx ir atkarīgs no katrā testā iekļauto aļģu sugu vidējā specifiskā augšanas ātruma un no maksimālā specifiskā augšanas ātruma, kas var būt atšķirīgs ne tikai katrai sugai, bet arī dažādiem aļģu celmiem. Šo atkarīgo mainīgo nevajadzētu izmantot, lai salīdzinātu dažādu aļģu sugu vai pat atšķirīgu celmu jutību pret toksikantiem. Kaut arī zinātnē priekšroku dod toksiskuma noteikšanai pēc vidējā specifiskā augšanas ātruma, lai apmierinātu dažu valstu pašreizējās regulatīvās prasības, šajā testēšanas metodē ir ietverta arī toksiskuma noteikšana pēc ražības.

Vidējais augšanas ātrums

48.

Konkrēta perioda vidējo specifisko augšanas ātrumu aprēķina saskaņā ar vienādojumu kā biomasas logaritmisko pieaugumu katram kontrolgrupas un apstrādes traukam [1]:

Formula

[1],

kur:

μi-j

ir vidējais specifiskais augšanas ātrums laika periodā no i līdz j;

Xi

ir biomasa laikā i;

Xj

ir biomasa laikā j.

Katrā apstrādes grupā un kontrolgrupā aprēķina vidējo augšanas ātrumu un aplēš dispersiju.

49.

Visa testēšanas laika (parasti no 0. līdz 3. dienai) vidējo specifisko augšanas ātrumu aprēķina, par sākotnējo vērtību izmantojot nominālo uzsēto biomasu, nevis izmērīto sākotnējo vērtību, jo šādi parasti var panākt lielāku precizitāti. Ja biomasas mērīšanā izmantotais aprīkojums (piemēram, plūsmas citometrs) ļauj pietiekami precīzi noteikt mazo inokulācijas biomasu, var izmantot izmērīto sākotnējo biomasas koncentrāciju. Jānovērtē arī katra posma augšanas ātrums, ko aprēķina kā katras testēšanas dienas vidējo specifisko augšanas ātrumu (0.–1. diena, 1.–2. diena un 2.–3. diena) un jānoskaidro, vai kontrolgrupas augšanas ātrums saglabājas nemainīgs (sk. derīguma kritērijus, 11. punkts). Par vidējo kopējo specifisko augšanas ātrumu būtiski zemāks specifiskais augšanas ātrums pirmajā dienā var liecināt par kultūras atrašanos kavējuma fāzē, kurā tā attīstās lēni. Ja kontrolgrupas kultūrās kavējuma fāzi var saīsināt vai pat novērst, veicot pareizu mātes kultūras pavairošanu, eksponētajās kultūrās kavējuma fāze var liecināt par reģenerāciju pēc sākotnējā toksiskā stresa vai samazinātu ekspozīciju testējamās ķīmiskās vielas zuduma dēļ (tostarp sorbciju pie aļģu biomasas) pēc sākotnējās ekspozīcijas. Tādēļ var veikt augšanas ātruma novērtējumu pa posmiem, lai novērtētu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi ekspozīcijas laikā. Vidējā augšanas ātruma būtiskas atšķirības no individuālo posmu augšanas ātruma liecina par novirzi no konstantas eksponenciālas augšanas un to, ka rūpīgi jāanalizē augšanas līknes.

50.

Katram apstrādes replikāta augšanas ātruma procentuālo inhibēšanos aprēķina saskaņā ar vienādojumu [2]:

Formula

[2],

kur:

%Ir

=

vidējā specifiskā augšanas ātruma inhibēšanās procentos;

μC

=

vidējā specifiskā augšanas ātruma vidējā vērtība (μ) kontrolgrupā;

μT

=

apstrādes replikāta vidējais specifiskais augšanas ātrums.

51.

Ja testa šķīdumu gatavošanai lieto šķīdinātājus, inhibēšanās procentu aprēķināšanā jāizmanto nevis kontrolgrupas bez šķīdinātājiem, bet gan kontrolgrupas ar šķīdinātājiem.

Ražība

52.

Ražību aprēķina, no testa beigu biomasas atņemot testa sākuma biomasu katram kontrolgrupas un apstrādes traukam. Katrai testa koncentrācijai un kontrolgrupai jāaprēķina ražības vidējā vērtība, kā arī jānosaka dispersija. Ražības procentuālo inhibēšanos ( %Iy) katram apstrādes replikātam var aprēķināt šādi:

Formula

[3]

kur:

%Iy

=

ražības procentuālā inhibēšanās;

YC

=

kontrolgrupas ražības vidējā vērtība;

YT

=

konkrēta apstrādes replikāta ražības vērtība.

Koncentrācijas–atbildreakcijas līknes grafiska attēlošana

53.

Procentuālā inhibēšanās jāattēlo grafiski attiecībā pret testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas logaritmu un grafiks sīki jāizpēta, ignorējot tos datu punktus, kas pirmajā posmā tikuši atlasīti kā anomālas vērtības. Lai gūtu pirmo iespaidu par koncentrācijas–atbildreakcijas sakarību, manuāli vai ar datorizētu interpolāciju jānovelk gluda līnija caur datu punktiem, bet turpmāk jāizmanto detalizētāka metode, vēlams – datorizēta statistiskas metode. Atkarībā no tā, kādam nolūkam datus paredzēts izmantot, kāda ir datu kvalitāte (precizitāte) un apjoms un kāda ir datu analīzes instrumentu pieejamība, var nolemt (un dažkārt ir pilnīgi pamatoti) šajā posmā datu analīzi izbeigt un vienkārši nolasīt galvenos rādītājus EC50 un EC10 (un/vai EC20) no vizuāli piemeklētas līknes (sk. arī sadaļu par stimulējošo iedarbību). Iemesli, kas attaisno statistiskās metodes neizmantošanu ir, piemēram:

dati nav piemēroti, lai ar datorizētām metodēm radītu vēl ticamākus rezultātus, nekā var iegūt ar ekspertu slēdzienu – šādā gadījumā dažas datorprogrammas pat var nespēt radīt uzticamus risinājumus (iterācijas var nekonverģēt u. c.);

stimulētas augšanas reakcijas nevar atbilstoši apstrādāt, izmantojot pieejamās datorprogrammas (sk. turpmāk).

Statistiskās metodes

54.

Mērķis ir regresijas analīzē iegūt kādu kvantitatīvu koncentrācijas–atbildreakcijas sakarību. Kad atbildreakcijas dati linearizējoši transformēti probita, logita vai Veibula vienībās (8), iespējams izmantot svērtu lineāro regresiju, tomēr priekšroku mēdz dot nelineārām regresijas procedūrām, jo tajās vieglāk tikt galā ar neizbēgamajām datu anomālijām un novirzēm no gludiem sadalījumiem. Ja inhibēšanās vai nu tuvojas nullei, vai ir pilnīga, transformācija var šādas anomālijas samilzināt, jūtami sagrozot analīzes rezultātus (8). Būtu jāatceras, ka analīzes standartmetodes, kurās izmanto probita, logita vai Veibula transformācijas, ir domātas darbam ar binārajiem datiem (piem., izdzīvošanas/neizdzīvošanas datiem) un, lai tās būtu izmantojamas darbam ar augšanas vai biomasas datiem, tās jāmodificē. Īpašas metodes ECx vērtību noteikšanai no bezpārtraukumu datiem ir izklāstītas (9), (10) un (11) avotā. Nelineārās regresijas analīze sīkāk aprakstīta 5. papildinājumā.

55.

Lai aplēstu ECx punktveida vērtības, katram analizējamajam atkarīgajam mainīgajam jāizmanto koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība. Ja iespējams, katrai aplēstajai vērtībai jānosaka 95 % ticamības robeža. Iegūto datu atbilstība regresijas modelim jānovērtē grafiski vai statistiski. Regresijas analīze jāveic, izmantojot katrā atsevišķā replikātā iegūtās atbildreakcijas vērtības, nevis apstrādes variantu grupu vidējās vērtības. Ja tomēr nelineārās līknes pielāgošana ir sarežģīta vai to nav iespējams veikt, jo datu izkliede ir pārāk liela, šo problēmu var apiet, veicot grupas vidējo rādītāju regresiju, praktiski samazinot anomālo vērtību ietekmi. Testēšanas pārskatā jānorāda, ka izmantota šī iespēja – novirze no parastās procedūras –, jo līknes pielāgošana atsevišķu replikātu vērtībām nav sniegusi labu rezultātu.

56.

EC50 aplēses un ticamības robežas var noteikt, arī izmantojot lineāro interpolāciju ar “bootstrapping” metodi (13), ja pieejamie regresijas modeļi/metodes nav piemērotas datiem.

57.

LOEC un tādējādi NOEC aplēšanai, lai noskaidrotu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz augšanas ātrumu, ir nepieciešams salīdzināt apstrādes replikātu vidējās vērtības, izmantojot dispersijas analīzes (ANOVA) metodes. Katras koncentrācijas vidējā vērtība jāsalīdzina ar kontrolgrupas vidējo vērtību, izmantojot atbilstošu multiplās salīdzināšanas vai trenda testa metodi. Iespējams, būs noderīgs Daneta [Dunnett] vai Viljamsa [Williams] tests (12)(14)(15)(16)(17). Jānovērtē, vai ir spēkā pieņēmums par dispersijas homogenitāti, kas ir ANOVA pamatā. Šo novērtējumu var veikt grafiski vai izmantojot formālu testu (17). Piemērots ir Levena [Levene] vai Bārtleta [Bartlett] tests. Dispersijas homogenitātes pieņēmuma neatbilstību dažkārt var koriģēt, izmantojot datu logaritmisko transformāciju. Ja dispersijas heterogenitāte ir pārlieku liela un to nevar koriģēt ar transformāciju, jāveic analīze ar tādām metodēm kā descendents Džonkhīra [Jonckheere] trenda tests. Papildu norādījumus par NOEC noteikšanu sk. (11).

58.

Jaunākie sasniegumi zinātnē ir bijuši par pamatu ieteikumam atteikties no NOEC jēdziena un aizstāt to ar ECx punktveida vērtību aplēsanu ar regresiju. Šim aļģu testam nav noteikta piemērota x vērtība. Piemērots šķiet diapazons no 10 līdz 20 % (atkarībā no izraudzītā atkarīgā mainīgā), un ieteicams pārskatā iekļaut gan EC10, gan EC20.

Augšanas stimulācija

59.

Dažkārt zemās koncentrācijās novēro augšanas stimulāciju (negatīvu inhibēšanos). To var radīt vai nu hormēze (“toksiskā stimulācija”), vai augšanu veicinošu faktoru pievienošana izmantotajai minimālajai barotnei ar testējamo vielu. Jāņem vērā, ka neorganisko barības vielu pievienošanai navajadzētu atstāt tiešu ietekmi, jo testēšanas barotnē visā testa laikā ir jābūt barības vielu pārpalikumam. Mazu stimulācijas devu EC50 aprēķinos parasti var neņemt vērā, ja vien stimulācija nav ārkārtēja. Tomēr, ja tā ir ārkārtēja vai ir jāaprēķina ECx lielums zemam x, var būt nepieciešamas īpašas metodes. Ja iespējams, no datu analīzes nevajadzētu izslēgt stimulējošas reakcijas, un, ja ar izmantojamo līknes piemeklēšanas programmatūru nav iespējams akceptēt nelielu stimulāciju, var izmantot lineāro interpolāciju ar “bootstrapping”. Ārkārtējas stimulācijas gadījumā var apsvērt hormēzes modeļa izmantošanu (18).

Netoksiska augšanas inhibēšana

60.

Gaismu absorbējoši testa materiāli var samazināt augšanas ātrumu, jo noēnojums samazina pieejamās gaismas daudzumu. Šāda fiziskā ietekme ir jānodala no toksiskās ietekmes, modificējot testa apstākļus, un fiziskā ietekme ir jānorāda atsevišķi. Norādījumi ir pieejami (2) un (3).

TESTĒŠANAS PĀRSKATS

61.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj turpmāk norādītā informācija.

 

Testējamā ķīmiskā viela:

fizikālās īpašības un attiecīgās fizikālķīmiskās īpašības, tostarp ūdensšķīdības robežas;

ķīmiskās vielas identifikācijas dati (piemēram, CAS numurs), tostarp tīrības pakāpe (piemaisījumi).

 

Testa suga:

celms, piegādātājs vai avots un izmantotie kultivēšanas apstākļi.

 

Testa apstākļi:

testa sākuma un beigu datums un tā ilgums;

testēšanas plāna apraksts: testa trauki, kultūru tilpums, biomasas blīvums testēšanas sākumā;

barotnes sastāvs;

testa koncentrācijas un replikāti (piemēram, replikātu skaits, testa koncentrāciju skaits un izmantotā ģeometriskā progresija);

testa šķīdumu sagatavošanas apraksts, tostarp šķīdinātāju izmantošana u. c.

kultūras audzēšanas iekārta;

gaismas intensitāte un kvalitāte (avots, homogenitāte);

temperatūra;

testētās koncentrācijas: nominālās testa koncentrācijas un visi to analīžu rezultāti, ar kuriem nosaka testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju testa traukos. Pārskatā iekļaujama arī informācija par metodes atgūstamības efektivitāti un kvantitatīvās noteikšanas robežu testa matricā;

visas atkāpes no šīs testēšanas metodes;

biomasas noteikšanas metode un pierādījumi par korelāciju starp izmērīto parametru un saussvaru.

 

Rezultāti:

visu apstrādes replikātu pH vērtības testa sākumā un beigās;

biomasa katrā kolbā katrā mērījumu punktā un biomasas mērīšanas metode;

augšanas līknes (biomasas izmaiņu grafisks attēlojums attiecībā pret laiku);

aprēķinātie atbildreakcijas mainīgie katram apstrādes replikātam, to vidējās vērtības un replikātu variācijas koeficienti;

koncentrācijas/ietekmes sakarības grafisks attēlojums;

atkarīgo mainīgo, piemēram, EC50, EC10, EC20 toksicitātes aplēšana un ar tiem saistītie ticamības intervāli. Ja aprēķina LOEC un NOEC, norāda arī tos, kā arī to aprēķināšanai lietotās statistiskās metodes;

ja ir izmantota ANOVA, detektējamais iedarbības apmērs (piemēram, mazākā nozīmīgā atšķirība);

apstrādes replikātos konstatētā augšanas stimulēšana;

cita konstatētā ietekme, piemēram, aļģu morfoloģiskās izmaiņas;

rezultātu iztirzājums, minot arī jebkādu ietekmi uz testēšanas rezultātiem, kuras iemesls ir atkāpes no šīs testēšanas metodes.

LITERATŪRA

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442 Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1. papildinājums

Definīcijas

Attiecībā uz minēto testa metodi izmanto šādas definīcijas un saīsinājumus.

 

Biomasa ir dzīvo organismu sausā masa populācijā, un to var izteikt kā attiecību pret noteiktu tilpumu; piemēram, mg aļģu litrā testa šķīduma. Parasti “biomasa” ir definēta kā masa, bet šajā testā vārds tiek lietots, lai apzīmētu masu tilpumā. Šajā testā parasti tiek mērīti arī biomasas aizstājējparametri, piemēram, šūnu skaits, fluorescence u. c., un tādējādi termina “biomasa” lietojums attiecas arī uz aizstājējparametriem.

 

Ķīmiska viela ir viela vai to maisījums.

 

Variācijas koeficients ir parametra svārstību bezdimensiju mērs, ko izsaka kā attiecību starp standartnovirzi un vidējo. To var izteikt arī procentos. Vidējā specifiskā augšanas ātruma vidējais variācijas koeficients replikātu kontrolgrupu kultūrās aprēķināms šādi:

1.

vidējā specifiskā augšanas ātruma variācijas koeficientu % aprēķina, izmantojot attiecīgā replikāta dienas / katra posma augšanas ātrumu;

2.

vidējo vertību aprēķina, izmantojot visus 1. punktā minētos lielumus, lai iegūtu vidējo dienas / katra posma specifiskā augšanas ātruma variācijas koeficientu replikātu kontrolgrupu kultūrās.

 

ECx ir testēšanas barotnē izšķīdinātas testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kuras rezultāts ir testa organismu augšanas samazinājums par x % (piemēram, par 50 %) noteiktā ekspozīcijas periodā (skaidri jānorāda, ja tas atšķiras no pilna vai normāla testa ilguma). Lai nepārprotami norādītu EC vērtību, kas iegūta no augšanas ātruma vai ražības, izmanto simbolu “ErC” augšanas ātrumam, bet “EyC” – ražībai.

 

Augšanas barotne ir pilnīga sintētiska kultūras barotne, kurā aug testa aļģes, kad tās tiek eksponētas testējamai ķīmiskajai vielai. Testējamo ķīmisko vielu parasti izšķīdina testēšanas barotnē.

 

Augšanas ātrums (vidējais specifiskais augšanas ātrums) ir biomasas logaritmiskais pieaugums ekspozīcijas laikā.

 

Zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC) ir zemākā testētā koncentrācija, pie kuras novērotajai ķīmiskajai vielai noteiktā ekspozīcijas laikposmā novēro statistiski nozīmīgu samazinošu ietekmi uz augšanu (pie p < 0,05), salīdzinot ar kontrolgrupu. Tomēr visām testa koncentrācijām, kas pārsniedz LOEC, jāuzrāda kaitīga ietekme, kura ir vienāda ar vai lielāka par to, kas novērojama pie LOEC. Ja ir neiespējami nodrošināt šos abus nosacījumus, jāsniedz izsmeļošs izskaidrojums, kā izraudzīta LOEC (un tādējādi NOEC).

 

Nenovērojamās ietekmes koncentrācija (NOEC) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas ir tieši zem LOEC koncentrācijas.

 

Atkarīgais mainīgais ir mainīgais, ar ko aplēš toksicitāti un ko, izmantojot dažādas aprēķina metodes, iegūst no jebkuriem izmērītajiem parametriem, kuri raksturo biomasu. Šai testa metodei atkarīgie mainīgie ir augšanas ātrums un ražība, kurus iegūst, tieši izmērot biomasu vai kādu no tās aizstājējparametriem.

 

Specifiskais augšanas ātrums ir atkarīgs mainīgais, ko definē kā novērojamā parametra (šajā testēšanas metodē – biomasas) naturālo logaritmu starpības dalījumu ar attiecīgā perioda ilgumu.

 

Testējamā ķīmiskā viela ir jebkura viela vai to maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

 

Ražība ir mērījuma mainīgā vērtība ekspozīcijas perioda beigās, no kuras atņemta mērījuma mainīgā vērtība ekspozīcijas perioda sākumā, lai izteiktu biomasas pieaugumu testēšanas laikā.

2. papildinājums

Celmi, kuru derīgums testēšanai pierādīts

Zaļaļģes

 

Pseudokirchneriella subcapitata (iepriekšējais nosaukums: Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (iepriekšējais nosaukums: Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Diatomejas

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Zilaļģes

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Celmu ieguves avoti

Ieteiktie celmi ir pieejami kā vienaļģes kultūras no šādām kolekcijām (alfabētiskā secībā):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110–2209

USA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

UK

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

GERMANY

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA

Ieteikto sugu izskats un īpašības

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Izskats

Izliektas, savītas atsevišķas šūnas

Ovālas, lielākoties atsevišķas šūnas

Nūjiņas

Ovālu šūnu virknes

Nūjiņas

Izmērs (garums × platums) μm

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Šūnas tilpums (μm3/šūna)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Sausas šūnas svars (mg/šūna)

2–3 × 10– 8

3–4 × 10– 8

3–4 × 10– 8

1–2 × 10– 8

2–3 × 10- 9

Augšanas ātrums (4) (diena– 1)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Īpaši norādījumi par ieteicamo testa sugu kultivēšanu un uzturēšanu

Pseudokirchneriella subcapitata un Desmodesmus subspicatus

Šīs zaļaļģes kopumā ir viegli audzējamas dažādās barotnēs. Informācija par piemērotām barotnēm ir pieejama no kultūru kolekcijām. Šūnas parasti attīstās atsevišķi, un šūnu blīvumu var viegli izmērīt ar daļiņu elektronisko skaitītāju vai mikroskopu.

Anabaena flos-aquae

Izejkultūras uzturēšanai var izmantot dažādas barotnes. Īpaši svarīgi ir neļaut periodiskajai kultūrai atjaunojoties pāriet no logaritmiskās augšanas fāzes nākamajā fāzē, jo tas apgrūtina kultūras ataudzēšanu.

Anabaena flos-aquae veido cieši saistītu šūnu ķēdes. Šo agregātu izmēri var atšķirties atkarībā no kultivēšanas apstākļiem. Lai biomasas noteikšanā izmantotu mikroskopu vai daļiņu elektronisko skaitītāju, šie agregāti var būt jāsadala.

Lai samazinātu skaitīšanas rezultātu mainību, ķēdes var izjaukt, apakšparaugus sonicējot. Ja sonikācijas ilgums pārsniedz ķēžu sadalīšanai nepieciešamo, tā šūnas var iznīcināt. Katra apstrādes replikāta sonikācijas intensitātei un ilgumam jābūt vienādam.

Lai kompensētu mainīgumu, ir ar hemocitometru jāizskaita pietiekami daudz lauku (vismaz 400 šūnas). Tas uzlabo mikroskopiskās blīvuma noteikšanas ticamību.

Lai noteiktu kopējo Anabaena šūnu tilpumu, pēc šūnu ķēžu sadalīšanas ar piesardzīgi veiktu sonifikāciju var izmantot daļiņu elektronisko skaitītāju. Sonifikācijas enerģijai ir jābūt tādai, lai šūnas nesabojātu.

Lai testa trauku inokulācijai izmantotā aļģu suspensija būtu labi sajaukta un homogēna, maisīšanai izmanto vorteksu vai līdzīgu piemērotu metodi.

Testa trauki ir jānovieto uz kratītājplatformas, kas izdara orbitālas vai turp/atpakaļ svārstības apm. 150 reizes minūtē. Lai mazinātu Anabaena tendenci veidot pikas, var veikt maisīšanu ar pārtraukumiem. Ja ir izveidojušās pikas, jāpārliecinās, ka biomasas mērījumiem ņemtie paraugi ir reprezentatīvi. Pirms paraugu ņemšanas var būt nepieciešama enerģiska kratīšana, lai izjauktu aļģu pikas.

Synechococcus leopoliensis

Izejkultūras uzturēšanai var izmantot dažādas barotnes. Informācija par piemērotām barotnēm ir pieejama no kultūru kolekcijām.

Synechococcus leopoliensis attīstās kā atsevišķas nūjiņveida šūnas. Šūnas ir ļoti sīkas, līdz ar to biomasu ir grūti mērīt, skaitīšanai izmantojot mikroskopu. Ieteicams izmantot elektroniskos daļiņu skaitītājus, ar ko var saskaitīt pat apmēram 1 μm lielas daļiņas. Var izmantot arī in vitro fluorometriskos mērījumus.

Navicula pelliculosa

Izejkultūras uzturēšanai var izmantot dažādas barotnes. Informācija par piemērotām barotnēm ir pieejama no kultūru kolekcijām. Jāievēro, ka barotnei jāpievieno silikāts.

Navicula pelliculosa noteiktos augšanas apstākļos var veidot agregātus. Izdaloties lipīdiem, aļģu šūnas dažkārt akumulējas virsmas plēvē. Šajos apstākļos jāveic īpaši pasākumi, lai, ņemot apakšparaugus biomasas noteikšanai, iegūtu reprezentatīvus paraugus. Iespējams, būs nepieciešama intensīva kratīšana, piemēram, izmantojot vorteksu.

3. papildinājums

Augšanas barotne

Var izmantot kādu no šīm divām barotnēm:

ESAO barotne: sākotnējā ESAO TG 201 barotne, arī saskaņā ar ISO 8692;

ASV EPA barotne AAP, kas ir saskaņā arī ar ASTM.

Sagatavojot šīs barotnes, jāizmanto reaģenta vai analītiskās tīrības pakāpes vielas un dejonizēts ūdens.

AAP barotnes (ASV EPA) un ESAO TG 201 barotņu sastāvs

Komponents

AAP

ESAO

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2· 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

EDTA molārā attiecība pret dzelzi nedaudz pārsniedz vienu. Tas novērš dzelzs nogulsnēšanos un vienlaikus līdz minimumam samazina smago metālu jonu helātu veidošanos.

Testos ar diatomeju Navicula pelliculosa abām barotnēm ir jāpievieno Na2SiO3 · 9H20, lai iegūtu koncentrāciju 1,4 mg Si/l.

Barotnes pH iegūst, līdzsvarojot barotnes karbonātu sistēmu un CO2 parciālo spiedienu atmosfēras gaisā. Aptuvenā sakarība starp pH pie 25 °C un bikarbonāta molāro koncentrāciju ir šāda:

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (ASV EPA barotne); 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (ESAO barotne).

Testa barotnes elementu sastāvs

Elements

AAP

ESAO

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

ESAO barotnes sagatavošana

Barības viela

Koncentrācija izejšķīdumā

1. izejšķīdums:

makroelementi

NH4 · Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

2. izejšķīdums:

dzelzs

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

3. izejšķīdums:

mikroelementi

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2 H2O

7 mg/l

4. izejšķīdums:

bikarbonāts

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Izejšķīdumu sterilizē ar membrānfiltrāciju (vidējais poras diametrs 0,2 μm) vai autoklavējot (120 · C, 15 min). Šķīdumi uzglabājami tumsā 4 °C temperatūrā.

2. un 4. izejšķīdumu neapstrādā autoklāvā, bet sterilizē, izmantojot membrānfiltrāciju.

Barotni sagatavo, ūdenim pievienojot atbilstošu 1.–4. izejšķīduma tilpumu:

 

Pievieno apm. 500 ml sterila ūdens:

 

10 ml 1. izejšķīduma;

 

1 ml 2. izejšķīduma;

 

1 ml 3. izejšķīduma;

 

1 ml 4. izejšķīduma.

 

Papildina ar sterilizētu ūdeni līdz 1 000 ml.

Jādod pietiekami daudz laika, lai starp barotni un atmosfēru līdzsvarotos CO2, ja nepieciešams, vairākas stundas tajā pūšot sterilu, filtrētu gaisu.

ASV EPA barotnes sagatavošana

1.

Pievienot 1 ml katra 2.1.–2.7. punktā minētā izejšķīduma aptuveni 900 ml dejonizēta vai destilēta ūdens un atšķaidīt līdz 1 litram.

2.

Makroelementu izejšķīdumus izgatavo, turpmāk minētās vielas izšķīdinot 500 ml dejonizēta vai destilēta ūdens. 2.1., 2.2., 2.3. un 2.4. apakšpunktā minētos reaģentus var apvienot vienā izejšķīdumā.

2.1.

NaNO3

12,750 g.

2.2.

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3.

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2.4.

Mikroelementu izejšķīdums (sk.3. punktu).

2.5.

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6.

K2HPO4

0,522 g.

2.7.

NaHCO3

7,500 g.

2.8.

Na2SiO3 · 9H2O

Sk. 1. piezīmi.

1. piezīme. Izmanto tikai diatomeju sugu testēšanai. Var pievienot tieši (202,4 mg) vai ar izejšķīdumu, lai iegūtu 20 mg/l Si galīgo koncentrāciju barotnē.

3.

Mikroelementu izejšķīdumu izgatavo, turpmāk minētās vielas izšķīdinot 500 ml dejonizēta vai destilēta ūdens.

3.1.

H3BO3

92,760 mg.

3.2.

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3.3.

ZnCl2

1,635 mg.

3.4.

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3.5.

CoCl2·6H2O

0,714 mg.

3.6.

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg.

3.7.

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg.

3.8.

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [Dinātrija (etilēndinitrilo) tetraacetāts].

3.9.

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg. Sk. 2. piezīmi.

2. piezīme. Izmanto tikai diatomeju sugu izejkultūru barotnēs.

4.

Koriģēt pH līdz 7,5 ± 0,1 ar 0,1 N vai 1,0 N NaOH vai HCl.

5.

Barotne jāielej sterilā konteinerā, filtrējot caur 0,22 μm membrānfiltru, ja tiks izmantots daļiņu skaitītājs, vai 0,45 μm filtru, ja daļiņu skaitītājs netiks izmantots.

6.

Līdz lietošanai barotni glabā tumsā apmēram 4 °C temperatūrā.

4. papildinājums

Aļģu audzēšanas metodes piemērs

Vispārīgi apsvērumi

Turpmāk izklāstītās audzēšanas metodes mērķis ir iegūt aļģu kultūras toksicitātes testiem.

Jāizmanto piemērotas metodes, lai nodrošinātu, ka aļģu kultūras netiek inficētas ar baktērijām. Var būt vēlams izmantot aksēniskas kultūras, bet būtiski ir izveidot un lietot vienaļģes kultūras.

Visas darbības ir jāveic sterilos apstākļos, lai izvairītos no kontaminācijas ar baktērijām vai citām aļģēm.

Iekārtas un materiāli

Sk. sīkāk testēšanas metodes sadaļā “Aprīkojums”.

Aļģu kultūru iegūšanas metodes

Barības vielu šķīdumu (barotņu) sagatavošana

Visus barotnē esošos barības vielu sāļus sagatavo koncentrētu izejšķīdumu veidā un glabā tumšā un vēsā vietā. Šos šķīdumus sterilizē filtrējot vai autoklavējot.

Barotni sagatavo, pievienojot pareizo izejšķīduma daudzumu sterilam, destilētam ūdenim, rūpējoties, lai tas netiktu inficēts. Cietajām barotnēm pievieno 0,8 procentus agara.

Izejkultūra

Izejkultūras ir nelielas aļģu kultūras, ko regulāri pārnes svaigā barotnē izmantošanai par testa sākotnējo materiālu. Ja šīs kultūras neizmanto regulāri, tās svītrās uzsēj mēģenēs uz slīpagara. Tās pārnes uz svaigu barotni vismaz vienu reizi divos mēnešos.

Izejkultūras audzē koniskās kolbās, kas satur atbilstošo barotni (tilpums: apmēram 100 ml). Ja aļģes tiek inkubētas 20 °C temperatūrā ar nepārtrauktu apgaismojumu, pārnešanu nepieciešams veikt reizi nedēļā.

Pārnešanas laikā daļu “vecās” kultūras ar sterilām pipetēm pārnes kolbā ar svaigu barotni tā, lai strauji augošām sugām sākotnējā koncentrācija būtu apmēram 100 reižu mazāka nekā vecajā kultūrā.

Sugas augšanas ātrumu var noteikt, izmantojot augšanas līkni. Ja tā ir zināma, ir iespējams aplēst blīvumu, kuru sasniedzot, kultūra ir jāpārnes uz jauno barotni. Tas jāveic pirms kultūras bojāejas stadijas iestāšanās.

Priekškultūra

Priekškultūra ir paredzēta tāda aļģu daudzuma iegūšanai, kas piemērots testējamo kultūru inokulēšanai. Priekškultūru inkubē attiecīgā testa apstākļos un izmanto tās eksponenciālās augšanas fāzē, parasti pēc 2–4 dienu ilgas inkubācijas. Ja aļģu kultūras satur deformētas vai anormālas šūnas, tās izmantot nevar.

5. papildinājums

Datu analīze, izmantojot nelineāru regresiju

Vispārīgi apsvērumi

Atbildreakcija aļģu testos un citos mikroorganismu augšanas testos – biomasas pieaugums – ir nepārtraukts vai metrisks mainīgais lielums – procesa ātrums, ja izmanto augšanas ātrumu, vai tā integrālis laikā, ja izmanto biomasu. Abi lielumi ir attiecināmi pret atbilstošo vidējo atbildreakciju kontrolgrupu replikātos, kas nav eksponēti un parāda maksimālo atbildreakciju radītajos apstākļos, kuros gaisma un temperatūra aļģu testēšanā ir primāri noteicošie faktori. Sistēma ir sadalīta vai homogēna, un biomasu var uzskatīt par nepārtrauktu masu, neņemot vērā atsevišķas šūnas. Šādas sistēmas atbildreakcijas dispersijas sadalījums ir saistīts tikai ar eksperimenta faktoriem (parasti tos raksturo kļūdu lognormāls vai normāls sadalījums). Tas atšķiras no parastajām biotestēšanasatbild reakcijām ar binārajiem datiem, kuru gadījumā atsevišķu organismu tolerance (parasti binomiāli sadalīta) bieži tiek uzskatīta par dominējošo dispersijas sastāvdaļu. Šajā gadījumā kontrolgrupas atbildreakcijas ir nulles vai fona līmenī.

Parasti normalizēta vai relatīva atbildreakcija r monotoni samazinās no 1 (nulles inhibīcija) līdz 0 (100 % inhibīcija). Jāievēro, ka ar katru atbildreakciju ir saistīta kļūda un ka šķietamu negatīvu inhibēšanos var aprēķināt tikai nejaušas kļūdas dēļ.

Regresijas analīze

Modeļi

Regresijas analīzes mērķis ir kvantitatīvi attēlot koncentrācijas–atbildreakcijas līkni matemātiskās regresijas funkcijas Y = f (C) veidā vai – visbiežāk – F(Z), kur Z = log C. Ja tā tiek lietota apgriezti C = f– 1 (Y), var aprēķināt ECx vērtības, tostarp EC50, EC10 un EC20, un to 95 % ticamības robežas. Ir pierādījies, ka vairākas vienkāršas matemātiskas funkcijas sekmīgi var raksturot aļģu augšanas inhibēšanās testos iegūtās koncentrāciju un atbildreakciju sakarības. Šīs funkcijas ietver, piemēram, logistisko funkciju, nesimetrisko Veibula funkciju un lognormālā sadalījuma funkciju, kas veido sigmoidālās līknes, asimptotiski tuvojoties nullei pie C → 0 un vienam pie C → bezgalība.

Nepārtrauktu sliekšņa funkciju modeļu (piemēram, Koijmana [Kooijman]) modelis “populācijas augšanas inhibēšanās aprēķinam”, ko izstrādājis Koijmans et el. 1996. gadā) ir nesen piedāvāts modelis vai alternatīva asimptotiskajiem modeļiem. Šajā modelī tiek pieņemts, ka koncentrācijām nav ietekmes zem noteikta sliekšņa EC0+, ko aplēš, ekstrapolējot koncentrācijas–atbildreakcijas sakarību, lai šķērsotu koncentrācijas asi, izmantojot vienkāršu nepārtrauktu funkciju, kuru sākuma punktā nevar diferencēt.

Jāņem vērā, ka analīze var būt vienkārša atlikuma kvadrātu summas samazināšana (pieņemot pastāvīgu dispersiju) vai arī svērto kvadrātu summa, ja dispersijas heterogenitāte ir kompensēta.

Procedūra

Procedūra kopumā ir šāda. Jāatlasa piemērots funkcijas vienādojums Y = f(C) un jāievieto tajā dati, izmantojot nelineāro regresiju. Ieteicams izmantot mērījumus no katras kolbas, nevis replikātu vidējās vērtības, lai no datiem iegūtu pēc iespējas vairāk informācijas. Tomēr, ja dispersija ir liela, pieredze liecina, ka replikātu vidējās vērtības var sniegt noturīgākas matemātiskās aplēses, kuras mazāk ietekmē sistēmiskas kļūdas datos, kādas saglabājas, izmantojot katru atsevišķo datu punktu.

Grafiski attēlo piemeklēto līkni, attēlo izmērītos datus un pārbauda līknes atbilstību. Šim nolūkam īpaši noderīgs rīks var būt atlikumu analīze. Ja izvēlētā funkcionālā sakarība, kas atbilst koncentrācijai un atbildreakcijai, pietiekami labi neattēlo visu līkni vai kādu nozīmīgu tās daļu, piemēram, atbildreakciju pie zemām koncentrācijām, jāizvēlas cita līknes alternatīva, piemēram, simetriskās līknes vietā jāizvēlas nesimetriskā Veibula funkcija. Negatīva inhibēšanās var radīt problēmas, piemēram, ar log-normāla sadalījuma funkciju, un var būt jāizmanto alternatīva regresijas funkcija. Šādām negatīvām vērtībām nav ieteicams piešķirt nulles vai zemu pozitīvu vērtību, jo tas sagroza kļūdu sadalījumu. Lai aplēstu EClowx, dažas līknes daļas, piemēram, zemas inhibēšanās daļu, var būt pietderīgi piemeklēt atsevišķi. Izmantojot piemeklēto vienādojumu (ar “apgriezto aplēšanu”, C = f– 1(Y)), aprēķina ECx raksturīgās punktvērtības, un testēšanas pārskatā norāda vismaz aplēsto EC50 un vienu vai divas aplēstās EClow x vērtības. Veiktajos testos iegūtā pieredze liek secināt, ka aļģu testa precizitāte parasti ļauj pietiekami pareizi aplēst vērtības pie 10 % inhibīcijas, ja datu punktu skaits ir pietiekams, – izņemot gadījumus, kad zemas koncentrācijas stimulē augšanu, līdz ar to darbojoties kā maldinošs faktors. EC20 aplēses bieži vien ir precīzākas nekā EC10 aplēses, jo EC20 parasti atrodas aptuveni centrālās koncentrācijas–atbildreakcijas līknes lineārajā daļā. Dažkārt augšanas stimulēšanas dēļ ir grūti interpretēt EC10. Tāpēc, kaut arī EC10 parasti var noteikt ar pietiekamu pareizību, ir ieteicams pārskatā ietvert arī EC20.

Svēruma koeficienti

Eksperimenta dispersija parasti nav konstanta, un tā tipiski ietver proporcionalitātes elementu, tāpēc parasti izdevīgāk ir veikt svērto regresiju. Šajā analīzē parasti pieņem dispersijai apgriezti proporcionālus svēruma koeficientus:

Wi = 1/Var(ri)

Daudzas regresijas programmas ļauj veikt svērto regresijas analīzi ar tabulā norādītiem svēruma koeficientiem. Ērtības labad svēruma koeficienti jānormalizē, tos reizinot ar n/Σ wi (n ir datu punktu skaits), lai to summa būtu viens.

Atbildreakciju normalizēšana

Normalizēšana pēc kontrolgrupas vidējās atbildreakcijas rada dažas principiālas problēmas un diezgan komplicētu dispersijas struktūru. Dalot atbildreakcijas ar vidējo kontrolgrupas atbildreakciju inhibīcijas procentuālās vērtības iegūšanai, tiek ieviesta papildu kļūda, ko rada kontrolgrupas vidējās vērtības kļūda. Ja vien šī kļūda nav nenozīmīgi maza, svēruma koeficienti regresijā un ticamības robežās ir jākoriģē, lai tie kovariētu ar kontrolgrupu (Dreipers un Smits [Draper and Smith], 1981). Jāievēro, ka kontrolgrupas vidējai atbildreakcijai ir jābūt aplēstai precīzi, lai līdz minimumam samazinātu relatīvās atbildreakcijas kopējo dispersiju. Šī dispersija ir šāda:

(apakšējais indekss i attiecas uz koncentrācijas līmeni i, bet apakšējais indekss 0 – uz kontrolgrupām)

Yi = relatīvā atbildreakcija = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

ar dispersiju Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

(∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 un (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2,

ar datiem, kas atbilst normālajam sadalījumam mi un m0 replikātiem: Var(ri) = σ2/mi,

tādējādi kopējā relatīvā atbildreakcijas Yi dispersija ir

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 2 · m0

Kontrolgrupas vidējās vērtības kļūda ir apgriezti proporcionāla kontrolreplikātu vidējā skaita kvadrātsaknei, un dažreiz ir pamatoti iekļaut vēsturiskos datus, tādējādi būtiski samazinot kļūdu. Alternatīva procedūra ir neveikt datu normalizēšanu, bet gan pielāgot absolūtās atbildreakcijas, tostarp kontrolgrupas atbildreakcijas datus, bet kontrolgrupas atbildreakcijas vērtību ieviešot kā papildu parametru piemeklēšanai ar nelineāro regresiju. Atšķirībā no parastā divu parametru regresijas vienādojuma, šai metodei jāpiemeklē trīs parametri, tāpēc nepieciešams vairāk datu punktu nekā nelineārajai regresijai, kurā izmantoti dati, kas normalizēti, izmantojot iepriekš noteiktu kontrolgrupas atbildreakciju.

Ticamības intervālu apgrieztās vērtības

Nelineāras regresijas ticamības intervālu aprēķināšana, izmantojot apgriezto aplēšanu, ir diezgan sarežģīta un nav pieejama parastajās datorprogrammu paketēs, ko izmanto statistisko aprēķinu veikšanai. Aptuvenās ticamības robežas nosaka, izmantojot standarta nelineārās regresijas programmas ar atkārtotu parametrizāciju (Brūss [Bruce] un Ferštēgs [Versteeg], 1992), kas ietver matemātisko vienādojumu pārveidošanu, izmantojot vēlamās punktu vērtības, piemēram, EC10 un EC50 par aplēšamajiem parametriem. (Šī funkcija ir I = f (α, β, koncentrācija), un nepieciešams izmantot definīcijas sakarības f (α, β, EC10) = 0,1 un f (α, β, EC50) = 0,5, lai f (α, β, koncentrācija) aizstātu ar ekvivalentu funkciju g (EC10, EC50, koncentrācija).

Tiešāku aprēķinu (Andersens et al. (Andersen et al), 1998) veic, izmantojot sākotnējo vienādojumu kopā ar Teilora ekspansiju ap vidējām ri un r0 vērtībām.

Nesen popularitāti ir ieguvušas “bootstrap” metodes. Šajās metodēs dispersijas empīriskā sadalījuma aplēšanai izmanto mērījumu datus un biežu atkārtotu paraugu ņemšanu, kam izmanto nejaušo skaitļu ģeneratoru.

ATSAUCES

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R.D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

(4)

C.11. nodaļu aizstāj ar šādu tekstu:

C.11.   AKTĪVO DŪŅU ELPOŠANAS INHIBĒŠANĀS TESTS (OGLEKĻA UN AMONIJA OKSIDĒŠANĀS)

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 209 (2010. gads). Šī testa metode raksturo metodi, ar kuru nosaka ķīmisku vielu iedarbību uz aktīvo dūņu sastāvā esošajiem mikroorganismiem (lielākoties baktērijām), noteiktajos apstākļos mērot to elpošanas ātrumu (oglekļa un/vai amonija oksidēšanos) dažādās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijās. Testēšanas metodes pamatā ir ETAD (Krāsvielu ražošanas nozares ekoloģijas un toksiskuma asociācija (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry)) tests (1)(2), kādreizējie ESAO Testēšanas norādījumi 209 (3) un pārskatītais ISO standarts 8192 (4). Šīs metodes mērķis ir nodrošināt ātru skrīninga metodi, ar ko iespējams novērtēt ķīmisku vielu ietekmi uz aktīvo dūņu mikroorganismiem bioloģiskās (aerobās) stadijas notekūdeņu attīrīšanas iekārtās. Šā testa rezultāti var kalpot kā rādītājs piemērotu augšanu neinhibējošu testējamo ķīmisko vielu koncentrāciju izmantošanai bionoārdīšanās testos (piemēram, šā pielikuma C.4. A-F, C.9., C.10., C12. un C.29. nodaļa, ESAO TG302C). Šādā gadījumā testu var veikt kā skrīninga testu, kas ir līdzvērtīgs diapazona atrašanas vai robežtestam (sk. 39. punktu), ņemot vērā tikai vispārējo elpošanu. Tomēr tādos vieglas bionoārdīšanās spējas testos (šā pielikuma C.4. A-F un C.29. nodaļa), kuros inokulāta koncentrācija ir ievērojami zemāka nekā šajā testēšanas metodē, šī informācija būtu jāizmanto uzmanīgi. Neinhibēšanās šajā elpošanas testā automātiski nenozīmē, ka šā pielikuma C.4. A-F vai C.29. nodaļā minētajos vieglas bionoārdīšanas spējas testos būs neinhibējoši apstākļi.

2.

Kopumā šķiet, ka elpošanas inhibēšanās tests ticis veiksmīgi izmantots kopš tā pirmās publicēšanas, tomēr dažos gadījumos ir ziņots par maldīgiem rezultātiem, piemēram, (2)(4)(5). Dažkārt konstatēts, ka ar koncentrāciju saistītās elpošanas līknes ir divfāzu, devas un atbildreakcijas grafiki ir deformēti un EC50 vērtības ir neparedzēti zemas (5). Pētījumi liecina, ka šādus rezultātus iegūst tad, ja testā izmantotās aktīvās dūņas ievērojami nitrificējas un testējamai ķīmiskajai vielai ir lielāka ietekme uz amonija oksidēšanos nekā uz vispārējo heterotrofo oksidēšanos. Tāpēc šādu maldīgu rezultātu iegūšanu var novērst, veicot papildu testēšanu ar īpašu nitrifikācijas inhibitoru. Kopējo, heterotrofisko un nitrifikācijas skābekļa uzņemšanas ātrumu atsevišķi var aprēķināt (4)(7)(8), izmērot skābekļa uzņemšanas ātrumu gan šāda inhibitora, piemēram, N-allylthiourea (ATU) klātbūtnē, gan bez tā. Tādējādi var noteikt testējamās ķīmiskās vielas inhibējošo ietekmi uz abiem procesiem un parastajā veidā aprēķināt EC50 vērtības gan organiskā oglekļa oksidācijai (heterotrofijai), gan amonija oksidācijai (nitrifikācijai). Jānorāda, ka dažos retos gadījumos N-allylthiourea inhibējošā ietekme var būt daļēji vai pilnīgi apturēta, jo tas veido kompleksus ar testējamajām ķīmiskajām vielām vai barotnes bagātinātājiem, piemēram, Cu++ joniem (6). Cu++ joni ir būtiski Nitrosomonas baktērijām, bet lielākā koncentrācijā tie toksiski.

3.

Pēdējā laikā jo īpaši Eiropas valstīs aktuāla ir kļuvusi notekūdeņu aerobai apstrādei vajadzīgā nitrifikācija, kas ir nepieciešams posms, kurā atbrīvojas no slāpekļa savienojumiem notekūdeņos, denitrificējot to gāzveida produktos; tagad ES ir noteiktas zemākas slāpekļa koncentrācijas robežvērtības apstrādātajiem efluentiem, kas tiek novadīti saņēmējā ūdensobjektā. (5)

4.

Vairumā gadījumu ar šo metodi var pienācīgi novērtēt ietekmi uz organiskā oglekļa oksidēšanās procesiem. Tomēr dažos gadījumos, lai izprastu ietekmi un interpretētu rezultātus, var būt nepieciešama tikai nitrifikācijas ietekmes pārbaude vai atsevišķi gan nitrifikācijas, gan organiskā oglekļa oksidācijas pārbaude.

TESTA METODES PRINCIPS

5.

Elpošanas ātrumu mērkivetē ar skābekļa elektrodu, kurā atrodas aktīvo dūņu paraugs, kam ir pievienoti sintētiskie notekūdeņi, mēra pēc trīs stundu ekspozīcijas perioda. Izvērtējot reālo ekspozīcijas scenāriju, var konstatēt, ka piemērots būtu ilgāks ekspozīcijas periods. Ja testējamā viela strauji degradējas, piemēram, abiotiski (hidrolīze), vai ir gaistoša un koncentrāciju nevar pienācīgi uzturēt, līdztekus var izmantot īsāku ekspozīcijas periodu, piemēram, 30 minūtes. Katras aktīvo dūņu partijas jutību ekspozīcijas dienā pārbauda ar piemērotu ķīmisko standartvielu. Testu parasti izmanto, lai noteiktu testējamās ķīmiskās vielas ECx (piemēram, EC50) un/vai nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC).

6.

To, kādā mērā skābeļa uzņemšanu inhibē mikroorganismi, kuri oksidē organisko oglekli, var izteikt atsevišķi no tā, kā to kavē mikroorganismi, kas oksidē amoniju, mērot skābekļa uzņemšanu N-allylthiourea klātbūtnē un bez tā; N-allylthiourea ir specifisks inhibitors, kas inhibē amonija oksidāciju par nitrītu pirmās stadijas nitrificējošo baktēriju ietekmē. Šajā gadījumā procentuālo skābekļa uzņemšanas inhibēšanos aprēķina, skābekļa uzņemšanas rādītāju testējamās vielas klātbūtnē salīdzinot ar vidējo skābekļa uzņemšanas ātrumu attiecīgajās kontrolgrupās, kas nesatur testējamo vielu – gan specifiskā inhibitora N-allylthiourea klātbūtnē, gan bez tā.

7.

Jebkuru skābekļa uzņemšanu abiotiskos procesos var detektēt, nosakot tās rādītāju testējamās ķīmiskās vielas, sintētisko notekūdeņu barotnes un ūdens maisījumos, kas neietver aktīvās dūņas.

INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶĪMISKO VIELU

8.

Lai varētu pareizi interpretēt rezultātus, ir nepieciešama informācija par testējamās ķīmiskās vielas identifikāciju (vēlams CAS numurs), nosaukums (IUPAC), tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, tvaika spiediens, gaistamība un adsorbcijas spēja. Parasti gaistošas ķīmiskās vielas nav iespējams adekvāti testēt, ja vien netiek ievēroti īpaši nosacījumi (sk. 21. punktu).

TESTA METODES LIETOJAMĪBA

9.

Šo testēšanas metodi var izmantot ūdenī šķīstošām, mazšķīstošām un gaistošām ķīmiskām vielām. Tomēr ne vienmēr ir iespējams iegūt EC50 vērtības tādām ķīmiskajām vielām, kuru šķīdība ir ierobežota, bet ticamus rezultātus gaistošām ķīmiskām vielām var iegūt vienīgi tad, ja ekspozīcijas perioda(-u) beigās reakcijas maisījumā ir palikusi lielākā daļa testējamās ķīmiskās vielas (piemēram, > 80 %). Ja ir kāda neskaidrība par testējamās ķīmiskās vielas stabilitāti vai tās gaistamību, jāiesniedz papildu analītiskie pamatojuma dati, lai precizētu ECx koncentrāciju.

ĶĪMISKĀS STANDARTVIELAS

10.

Ķīmiskās standartvielas ir regulāri jātestē, lai nodrošinātu, ka testēšanas metode un testa nosacījumi ir ticami, un lai ekspozīcijas dienā pārbaudītu katras par mikroorganismu inokulātu izmantotās aktīvo dūņu partijas jutību. Par standartinhibitoru ieteicams izmantot 3,5-dihlorfenolu (3,5-DCP), jo tas ir atzīts elpošanas inhibitors un tiek izmantots daudzos inhibīcijas/toksicitātes testu veidos (4). Arī vara (II) sulfāta pentahidrātu var izmantot par kopējās elpošanas inhibīcijas ķīmisko standartvielu (9). N-metilanilīnu var izmantot par specifisku nitrifikācijas standartinhibitoru (4).

DERĪGUMA KRITĒRIJI UN REPRODUCĒJAMĪBA

11.

Tukšajās kontrolgrupās (bez testējamās ķīmiskās vielas vai ķīmiskās standartvielas) skābekļa uzņemšanas rādītājam nevajadzētu būt mazākam par 20 mg skābekļa uz vienu gramu aktīvo dūņu (suspendēto cietvielu daļiņu saussvars) stundā. Ja rādītājs ir mazāks, testēšana jāveic atkārtoti ar skalotām aktīvajām dūņām vai dūņām no cita avota. Skābekļa uzņemšanas rādītāja variācijas koeficients kontrolreplikātos galīgā testa beigās nedrīkst pārsniegt 30 %.

12.

2004. gadā ISO (4) rīkotajā starptautiskajā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā, kurā izmantoja aktīvās dūņas no sadzīves notekūdeņiem, 3,5-DCP EC50 tika konstatēts esam diapazonā no 2 mg/l līdz 25 mg/l kopējai elpošanai, no 5 mg/l līdz 40 mg/l heterotrofiskajai elpošanai un no 0,1 mg/l līdz 10 mg/l nitrifikācijas elpošanai. Ja 3,5-DCP EC50 neatrodas prognozētajā diapazonā, testēšana ir jāatkārto, izmantojot aktīvās dūņas no cita avota. Vara (II) sulfāta pentahidrāta EC50 būtu jābūt diapazonā no 53 līdz 155 mg/l kopējai elpošanai (9).

TESTĒŠANAS METODES APRAKSTS

Testa trauki un iekārtas

13.

Jāizmanto parastais laboratorijas aprīkojums un turpmāk minētais:

a)

testa trauki, piemēram, 1 000 ml vārglāzes, kas satur 500 ml reakcijas maisījuma (sk. Nr. 5 1. attēlā);

b)

elements un stiprinājumi izšķīdušā skābekļa mērīšanai; piemērots skābekļa elektrods; slēgts elements, kurā pēc parauga ievietošanas nepaliek brīva vieta, un reģistrēšanas iekārta (piemēram, 2. papildinājuma 1. attēls, Nr. 7, 8, 9); kā alternatīvu var izmantot BSP pudeli ar piemērotu uzmavas adapteri skābekļa elektroda gaisnecaurlaidīgai piestiprināšanai pie pudeles kakla (sk. 3. papildinājuma 2. attēlu). Lai izvairītos no izspiestā šķidruma zuduma, kad tiek ievadīts skābekļa elektrods, ir ieteicams vispirms caur uzmavu ievietot piltuvi vai stikla mēģeni vai izmantot traukus ar zvanveida malām. Abos gadījumos jāizmanto magnētiskais maisītājs vai cita maisīšanas metode, piemēram, zonde, kura pati apmaisa saturu;

c)

magnētiskie maisītāji un bīdstieņi, kas pārklāti ar inertu materiālu, izmantošanai mērījumu kamerā un/vai testa traukos;

d)

aerācijas ierīce: ja nepieciešams, saspiestais gaiss jāizlaiž caur piemērotu filtru, lai attīrītu to no putekļiem un eļļām, kā arī caur mazgāšanas pudelēm, kurās ir ūdens, lai gaisu mitrinātu. Trauku saturs jāaerē ar Pastēra pipetēm vai citām aerācijas ierīcēm, kas neadsorbē ķīmiskas vielas. Lai nodrošinātu pietiekamu skābekļa piegādi dūņām un novērstu problēmas ar tām ķīmiskajām vielām, kas rada pārmērīgi daudz putu, ir gaistošas un tāpēc notiek to zudums, vai kuras ir grūti disperģēt, tās aerējot ar gaisa ievadi, var izmantot orbitālo šeikeri, kura riņķošanas ātrums ir diapazonā no 150 līdz 250 rpm kolbām ar, piemēram, 2 000 ml tilpumu. Testēšanas sistēma parasti sastāv no vairākām vārglāzēm, kuras pastāvīgi aerē un uzstāda secīgi (piemēram, ik pa 10–15 minūšu intervāliem), bet pēc tam secīgi analizē. Var izmantot arī validētas mērierīces, kas ļauj veikt vienlaicīgu aerāciju un skābekļa patēriņa ātruma mērījumus maisījumos;

e)

pH mērītājs;

f)

centrifūga, nespecializēta, uz galda novietojama centrifūga dūņu centrifugēšanai ar kapacitāti 10 000 m/s2.

Reaģenti

14.

Vienmēr jāizmanto analītiski tīri reaģenti.

Ūdens

15.

Parasti jāizmanto destilēts vai dejonizēts ūdens, kas satur mazāk nekā 1 mg/l IOO, izņemot gadījumus, ja ir norādīts, ka jāizmanto ūdensvada ūdens bez hlora.

Mākslīgo notekūdeņu barotne

16.

Barotne jāsagatavo tāda, lai tā saturētu turpmāk minētās sastāvdaļas norādītajos daudzumos:

peptons

16 g

gaļas ekstrakts (vai atbilstošs dārzeņu ekstrakts)

11 g

urīnviela

3 g

nātrija hlorīds (NaCl)

0,7 g

kalcija hlorīda dihidrāts (CaC12, 2H2O)

0,4 g

magnija sulfāta heptahidrāts (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

bezūdens kālija monohidrogēnfosfāts (K2HPO4)

2,8 g

destilēts vai dejonizēts ūdens līdz 1 litram

 

17.

Šā šķīduma pH jābūt 7,5 ± 0,5. Ja sagatavoto barotni neizmanto uzreiz, tā jāuzglabā tumšā vietā temperatūrā no 0 °C līdz 4 °C ne ilgāk kā vienu nedēļu vai tādos apstākļos, kas neizraisa nekādas izmaiņas barotnes sastāvā. Jānorāda, ka šie sintētiskie notekūdeņi ir simtkārtīgs to notekūdeņu koncentrāts, kas aprakstīti ESAO 1976. gada 11. jūnija tehniskajā ziņojumā “Ieteicamā metode sintētiskajos mazgāšanas līdzekļos izmantoto virsmaktīvo vielu bioloģiskās noārdīšanās spējas noteikšanai” [Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents] un kam pievienots dikālija hidrogēnfosfāts.

18.

Pirms novietošanas glabāšanā barotnes sastāvdaļas var arī atsevišķi sterilizēt, vai arī peptonu un gaļas ekstraktu var pievienot tieši pirms testa sākuma. Pirms lietošanas barotni rūpīgi samaisa un, ja nepieciešams, koriģē pH līdz 7,5 ± 0,5.

Testējamā ķīmiskā viela

19.

Ūdenī viegli šķīstošām testējamajām vielām izejšķīdums jāsagatavo tikai līdz maksimālajai šķīdībai ūdenī (nogulsnes nav pieļaujamas). Vielas, kas vāji šķīst ūdenī, maisījumi, kuru sastāvā ir vielas ar atšķirīgu šķīdību ūdenī un adsorbējošas vielas ir jāiesver tieši testēšanas traukos. Šajos gadījumos kā alternatīvu var izmantot izejšķīdumus, ja izšķīdinātās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas analītiski nosaka testēšanas traukos (pirms aktīvo dūņu pievienošanas). Ja tiek sagatavotas ūdensšķīduma frakcijas (water-accommodated fraction, WAF), svarīgi ir arī analītiski noteikt testējamās ķīmiskās vielas izšķīdinātās koncentrācijas testa traukos. Lietojot organiskos šķīdinātājus, ir jāizvairās uzlabot šķīdību ar disperģentiem/emulgatoriem. Ja ir pietiekami daudz informācijas par testējamās ķīmiskās vielas stabilitāti attiecīgajos apstākļos, var veikt izejšķīdumu un iepriekšējas maisīšanas suspensiju ultrasonikāciju, piemēram, pa nakti.

20.

Testējamā ķīmiskā viela var negatīvi ietekmēt testēšanas sistēmas pH. pH līmenis maisījumos, kas apstrādāti ar testējamo ķīmisko vielu, ir jānosaka iepriekšējā izmēģinājumā, pirms tiek uzsākta testēšana, lai noskaidrotu, vai pirms galvenās testēšanas, kā arī galvenās testēšanas dienā ir nepieciešams veikt pH korekciju. Ja nepieciešams, testējamās ķīmiskās vielas šķīdumi/suspensijas ūdenī ir jāneitralizē pirms inokulāta pievienošanas. Tomēr, tā kā neitralizēšana var izmainīt ķīmiskās vielas ķīmiskās īpašības, atkarībā no pētījuma mērķa varētu veikt papildu testēsanu, lai noskaidrotu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz dūņām bez pH korekcijas.

21.

Gaistošu ķīmisko vielu toksiskās ietekmes līmeņi, jo īpaši testos, kuros caur sistēmu pūš gaisu, var būt nepastāvīgi vielas zuduma dēļ ekspozīcijas laikā. Attiecībā uz šādām vielām jāievēro piesardzība, veicot konkrēto vielu saturošu kontrolmaisījumu vielspecifisku analīzi un mainot aerācijas režīmu.

Ķīmiskā standartviela

22.

Ja par ķīmisko standartvielu izmanto 3,5-dihlorfenolu, ir jāsagatavo (15) 1,00 g 3,5-dihlorofenola šķīdums 1 000 ml ūdens. Jāizmanto silts ūdens un/vai ultrasonikācija, lai paātrinātu izšķīšanu un panāktu vajadzīgo tilpumu, kad tas ir atdzisis līdz istabas temperatūrai. Tomēr ir jānodrošina, ka ķīmiskajā standartvielā nerodas strukturālas izmaiņas. Ir jāpārbauda šķīduma pH un, ja nepieciešams, tas jākoriģē ar NaOH vai H2SO4, līdz pH sasniedz 7–8.

23.

Ja par ķīmisko standartvielu izmanto vara (II) sulfāta pentahidrātu, tas jāizmanto koncentrācijās 58 mg/l, 100 mg/l un 180 mg/l (koeficients 1,8). Vielu iesver tieši testēšanas traukos (29 – 50 – 90 mg, lai sasniegtu 500 ml kopējo tilpumu). Pēc tam to atšķaida ar 234 ml autoklavēta ūdensvada ūdens. Vara (II) sulfāta pentahidrāts ir viegli šķīstošs. Sākot testēšanu, pievieno 16 ml sintētisko notekūdeņu un 250 ml aktīvo dūņu.

Specifiskais nitrifikācijas inhibitors

24.

Jāsagatavo 2,32 g/l N-allylthiourea (ATU) izejšķīduma. Pievienojot 2,5 ml izejšķīduma inkubācijas maisījumam, kura galīgais tilpums ir 500 ml, iegūst galīgo koncentrāciju 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l); ir zināms, ka tā ir pietiekama (4), lai panāktu nitrifikācijas 100 % inhibēšanos nitrificējošās aktīvajās dūņās, kas satur 1,5 g/l suspendētu cietvielu.

Abiotiskā kontrolgrupa

25.

Dažos retos apstākļos testējamā ķīmiskā viela ar stipra reducētāja īpašībām var izraisīt izmērāmu abiotisko skābekļa patēriņu. Šādos gadījumos ir nepieciešama abiotiskā kontrolgrupa, lai atšķirtu testējamās ķīmiskās vielas abiotisko skābekļa uzņemšanu un mikroorganismu elpošanu. Abiotiskās kontrolgrupas var sagatavot, nepievienojot testa maisījumiem inokulātu. Līdzīgi arī abiotiskās kontrolgrupas bez inokulāta var izmantot tad, kad tiek veikti analītiskie palīgmērījumi, lai noteiktu sasniegto koncentrāciju testēšanas ekspozīcijas posmā, piemēram, kad tiek izmantoti tādu ķīmisku vielu izejšķīdumi, kuras vāji šķīst ūdenī, kopā ar komponentiem, kam ir atšķirīga šķīdība ūdenī. Īpašos gadījumos var būt nepieciešams sagatavot abiotisku kontrolgrupu ar sterilizētu inokulātu (piemēram, autoklavējot vai pievienojot sterilizējošus toksikantus). Dažas ķīmiskas vielas var ražot vai patērēt skābekli tikai tad, ja virsmas laukums ir pietiekami liels reakcijai, pat ja parasti šādai reakcijai ir nepieciešama daudz augstāka temperatūra vai spiediens. Tāpēc īpaša vērība būtu jāpievērš peroksīdiem. Sterilizēts inokulāts nodrošina lielu virsmas laukumu.

Inokulāts

26.

Vispārējai lietošanai aktīvās dūņas būtu jāsavāc no tādas labi pārvaldītas notekūdeņu attīrīšanas iekārtas aerācijas baseina izvadvietas, kurā galvenokārt attīra sadzīves notekūdeņus, vai pie tvertnes izvadvietas. Atkarībā no testa mērķa var izmantot arī citus piemērotus aktīvo dūņu veidus vai avotus, piemēram, var izmantot arī laboratorijā audzētas dūņas atbilstošās suspendēto cietvielu koncentrācijās no 2 g/l līdz 4 g/l. Tomēr dūņām no dažādām attīrīšanas iekārtām parasti ir atšķirīgas īpašības un jutība.

27.

Dūņas var izmantot tādas, kādas tās ir savāktas, tomēr rupjākās daļiņas būtu jānoņem, tās neilgu laiku, piemēram, 5 līdz 15 minūtes nostādinot un nolejot augšējo slāni ar smalkajām daļiņām vai izsijājot (piemēram, ar 1 mm2 acu sietu). Dūņas var arī aptuveni 15 sekundes vai ilgāk homogenizēt maisītājā, bet jāievēro piesardzība attiecībā uz bīdes spēkiem un temperatūras izmaiņām, kas var rasties, ilgstoši maisot.

28.

Bieži ir nepieciešama dūņu skalošana, piemēram, ja endogēnās elpošanas rādītājs ir zems. Dūņas vispirms nepieciešams kādu laiku centrifugēt, lai iegūtu dzidru virsējo slāni un notekūdeņu cietvielu granulas, piemēram, 10 minūtes ar apt. 10 000 m/s2 lielu paātrinājumu. Dzidro virsējo slāni izlej, bet dūņas atkārtoti suspendē nehlorētā ūdensvada ūdenī kratot; skalošanas ūdens pēc tam ir jāatdala, atkārtojot centrifugēšanu un izliešanu. Ja nepieciešams, skalošanu un centrifugēšanu atkārto. Atkārtoti jānosaka atkalsuspendēto dūņu zināma tilpuma sausmasa un dūņas jākoncentrē, nolejot šķidrumu vai tālāk jāatšķaida ar nehlorētu ūdensvada ūdeni, lai iegūtu nepieciešamo dūņu cietvielu koncentrāciju 3 g/l. Aktīvajām dūņām pastāvīgi veicama aerācija (piemēram, 2 l/minūtē) testa temperatūrā, un ja vien iespējams, tās jāizlieto savākšanas dienā. Ja tas nav iespējams, dūņām divas papildu dienas ik dienas jāpievada sintētiskie notekūdeņi (50 ml sintētisko notekūdeņi uz litru aktīvo dūņu). Pēc tam dūņas izmanto testā, un rezultātus uzskata par derīgiem, ja to aktivitātē nav radušās būtiskas izmaiņas, ko novērtē, izmērot to endogēno heterotrofo un nitrifikācijas elpošanas ātrumu.

29.

Var rasties grūtības, ja inkubācijas perioda laikā rodas putas tādā daudzumā, ka putas un uz tām esošās dūņu daļiņas tiek izvadītas no aerācijas tvertnēm. Reizēm putu cēlonis ir sintētisko notekūdeņu klātbūtne, bet, ja testējamā ķīmiskā viela ir virsmaktīva vai satur virsmaktīvas vielas, jāparedz, ka parādīsies putas. Dūņu daļiņu zudums no testa maisījumiem radīs mākslīgi pazeminātu elpošanas rādītāju, ko kļūdaini varētu interpretēt kā inhibīcijas rezultātu. Turklāt virsmaktīvā šķīduma aerācija koncentrē virsmaktīvo vielu putu slānī; tādēļ putu zudums no testēšanas sistēmas samazina ekspozīcijas koncentrāciju. Putas var kontrolēt ar vienkāršām mehāniskām metodēm (piemēram, neregulāra manuāla maisīšana ar stikla nūjiņu) vai pievienojot silikona emulsijas pretputošanas līdzekli bez virsmaktīvās vielas, un/vai izmantojot kolbu kratīšanas aerācijas metodi. Ja problēma ir saistīta ar sintētisko notekūdeņu klātbūtni, ir jāmaina sintētisko notekūdeņu sastāvs, iekļaujot pretputošanas reaģentu, piemēram, 50 μl/l. Ja putošanu izraisa testējamā ķīmiskā viela, daudzums, kas vajadzīgs putošanas samazināšanai, būtu jānosaka maksimālajā testa koncentrācijā un pēc tam tāpat jāapstrādā katrs aerācijas trauks (tostarp tie trauki, kuros nav putu, piemēram, tukšās kontrolgrupas un standarttrauki). Ja izmanto pretputu līdzekļus, tie nedrīkst mijiedarboties ar inokulātu un/vai testējamo ķīmisko vielu.

TESTĒŠANAS PROCEDŪRA

30.

Iespējams noteikt trīs atšķirīgu skābekļa uzņemšanas veidu – kopējā, tikai heterotrofā un nitrifikācijas – inhibīciju. Parasti pietiek ar kopējā skābekļa uzņemšanas inhibīcijas mērījumu. Ietekme uz heterotrofo skābekļa uzņemšanu no organiskā oglekļa oksidēšanās un amonija oksidācijas dēļ ir vajadzīga tikai tad, ja attiecībā uz konkrētu ķīmisku vielu ir vajadzība pēc šādiem diviem atsevišķiem beigupunktiem, vai (neobligāti) ir jāizskaidro netipiskas kopējā skābekļa uzņemšanas inhibīcijas devas un atbildreakcijas saskarības līknes.

Testa apstākļi

31.

Testēšana jāveic 20 ± 2 °C temperatūrā.

Testa maisījumi

32.

Jāsagatavo testa maisījumi (FT, kā norādīts 1. tabulā), kas satur ūdeni, sintētiskos notekūdeņus un testējamo ķīmisko vielu, lai iegūtu atšķirīgas testējamās ķīmiskās vielas nominālās koncentrācijas (sastāvdaļu apjomu piemēru sk. 1. tabulā). Ja nepieciešams, jākoriģē pH līdz 7,5 ± 0,5, maisījumi ir jāatšķaida ar ūdeni un tiem jāpievieno inokulāts, lai traukos iegūtu vienādus beigu tilpumus un sāktu aerāciju.

Standartmaisījumi

33.

Maisījumi (FR) sagatavojami tieši tāpat kā testa maisījumi, tikai ar ķīmisko standartvielu, piemēram, 3,5-dihlorofenolu testējamās ķīmiskās vielas vietā.

Tukšie kontrolparaugi

34.

Testos, kur testa vārglāzes uzstāda secīgi intervālos, tukšos kontrolparaugus (FB) sagatavo ekspozīcijas perioda sākumā un beigās. Testos, kuros izmanto aprīkojumu, kas ļauj veikt vienlaicīgus skābekļa patēriņa mērījumus, katrā vienlaicīgās analīzes partijā ir jāiekļauj vismaz divi tukšie kontrolparaugi. Tukšie kontrolparaugi satur vienādu aktīvo dūņu un sintētiskās barotnes daudzumu, bet tajos nav iekļauta ne testējamā ķīmiskā viela, ne ķīmiskā standartviela. Tās ir jāatšķaida ar ūdeni līdz tādam pašam tilpumam kā testa un standartmaisījumi.

Abiotiskā kontrolgrupa

35.

Ja nepieciešams – piemēram, ja zināms vai iespējams, ka testējamai ķīmiskajai vielai ir stipra reducētāja īpašības – jāsagatavo maisījums FA, lai veiktu abiotiskā skābekļa patēriņa mērījumus. Maisījumā jābūt tādam pašam testējamās ķīmiskās vielas un sintētisko notekūdeņu daudzumam, kā arī tikpat lielam tilpumam kā testa maisījumam, bet tam nepievieno aktīvās dūņas.

Vispārīgas procedūras un mērījumi

36.

Testa maisījumus, standartmaisījumus, kā arī tukšos un abiotiskos kontrolparaugus inkubē testa temperatūrā piespiedu aerācijas apstākļos (0,5 līdz 1 l/min), lai nodrošinātu izšķīdušā skābekļa satura koncentrāciju 60–70 % un paturētu dūņu daļiņas suspendētas. Nepieciešama arī kultūru maisīšana, lai dūņu daļiņas saglabātu suspensijā. Inkubācija uzskatāma par sāktu, kad aktīvo dūņu inokulāts sākotnēji saskaras ar pārējām galīgā maisījuma sastāvdaļām. Inkubācijas noslēgumā pēc noteiktajiem ekspozīcijas periodiem, kas parasti ilgst trīs stundas, paraugi tiek izņemti, lai izmērītu izšķīdušā skābekļa koncentrācijas samazinājuma rādītāju elementā, kas paredzēts īpaši šim nolūkam (3. papildinājuma 2. attēls), vai pilnīgi piepildītā BSP pudelē. Veids, kādā tiek uzsākta inkubācija, ir atkarīgs arī no skābekļa patēriņa rādītāja mērīšanai izmantotā aprīkojuma kapacitātes. Piemēram, ja tajā ir viena skābekļa zonde, mērījumi tiek veikti atsevišķi. Šajā gadījumā dažādos maisījumus, kas nepieciešami testam ar sintētiskajiem notekūdeņiem, sagatavo, bet inokulātu nepievieno; nepieciešamo dūņu daudzumu pievieno katrā sērijas traukā. Katru inkubāciju uzsāk pēc kārtas, izmantojot ērtus laika intervālus, piemēram, ik pa 10 līdz 15 minūtēm. Mērīšanas sistēmā var būt arī vairākas zondes, kas atvieglo vairāku vienlaicīgu mērījumu veikšanu; šajā gadījumā inokulātu attiecīgajām trauku grupām var pievienot vienā laikā.

37.

Aktīvo dūņu koncentrācija visos testa, standarta un tukšajos (be ne abiotisko kontrolparaugu) maisījumos parasti ir 1,5 g/l suspendēto cietvielu. Skābekļa patēriņš ir jāmēra pēc trīs stundu ekspozīcijas perioda. Papildu 30 minūšu ekspozīcijas mērījumi jāveic pēc nepieciešamības atbilstoši 5. punktā aprakstītajam.

Dūņu spēja nitrificēties

38.

Lai noskaidrotu dūņu spēju nitrificēties un iespējamo nitrifikācijas rādītāju, jāsagatavo tādi maisījumi (FB) kā tukšajās kontrolgrupās un papildu “kontrolgrupas” maisījumi (FN), kas arī satur N-allylthiourea 11,6 mg/l apjomā. Maisījumus aerē un inkubē 20 °C ± 2 °C temperatūrā 3 stundas. Pēc tam jāizmēra skābekļa uzņemšanas ātrums un jāaprēķina skābekļa uzņemšanas ātrums nitrifikācijas dēļ.

Testa plāns

Diapazona noteikšanas tests

39.

Kad nepieciešams, var veikt provizorisku testēšanu, lai aplēstu, kāds testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju diapazons būtu izmantojams galīgā testa laikā, lai noteiktu skābekļa patēriņa inhibīciju. Testējamās ķīmiskās vielas skābekļa patēriņa inhibīcijas neesamība provizoriskajā testēšanā var arī norādīt, ka nav nepieciešams veikt galīgo testu, bet jāiekļauj provizoriskās testēšanas augstāko koncentrāciju triplikāts (parasti 1 000 mg/l, bet tas atkarīgs no datu prasībām).

1. tabula

Provizoriskās testēšanas maisījumu piemēri

Reaģents

Sākotnējā koncentrācija

Testējamās ķīmiskās vielas izejšķīdums

10 g/l

Sintētiskās barotnes izejšķīdums

Sk. 16. punktu.

Aktīvo dūņu izejsuspensija

3 g/l suspendēto cietvielu

Maisījumu sastāvdaļas

Devas testēšanas traukos (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Testējamās ķīmiskās vielas izejšķīdums (ml)

(19. līdz 21. punkts)

0,5

5

50

0

50

Sintētisko notekūdeņu izejšķīdums (ml)

(16. punkts)

16

16

16

16

16

Aktīvo dūņu suspensija (ml)

(26. līdz 29. punkts)

250

250

250

250

0

Ūdens

(15. punkts)

233,5

229

184

234

434

Kopējais maisījumu tilpums (ml)

500

500

500

500

500

Koncentrācijas maisījumā

 

 

 

 

 

Testa suspensija (mg/l)

Aktīvās dūņas

10

100

1 000

0

1 000

(suspendētās cietvielas) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Tests veicams, izmantojot vismaz trīs testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas, piemēram, 10 mg/l, 100 mg/l un 1 000 mg/l, ar tukšo kontrolparaugu un, ja nepieciešams, vismaz trīs abiotiskajiem kontrolparaugiem ar augstāko testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju (piemēru sk. 1. tabulā). Ideālā variantā zemākajai koncentrācijai nevajadzētu ietekmēt skābekļa patēriņu. Ja nepieciešams, jāaprēķina skābekļa uzņemšanas un nitrifikācijas rādītājs; tad jāaprēķina inhibīcija procentos. Atkarībā no testa mērķa ir iespējams arī vienkārši noteikt robežkoncentrācijas, piemēram, 1 000 mg/l, toksicitāti. Ja šajā koncentrācijā neparādās statistiski nozīmīga toksiska ietekme, nav nepieciešama turpmāka testēšana ar lielākām vai mazākām koncentrācijām. Jāievēro, ka vielas, kas vāji šķīst ūdenī, maisījumi, kuru sastāvā ir vielas ar atšķirīgu šķīdību ūdenī, un adsorbējošas vielas ir jāiesver tieši testēšanas traukos. Šajā gadījumā tilpums, kas rezervēts testa ķīmiskās vielas izejšķīdumam, ir jāaizvieto ar atšķaidīšanas ūdeni.

Galīgais tests

Kopējās skābekļa uzņemšanas inhibīcija

41.

Tests veicams, izmantojot tādu koncentrāciju diapazonu, kas izsecināts no provizoriskās testēšanas rezultātiem. Lai iegūtu gan NOEC, gan ECx (piemēram, EC50), lielākajā daļā gadījumu ieteicami seši kontrolparaugi un piecas apstrādes koncentrācijas ģeometriskā progresijā ar pieciem replikātiem. Abiotisko kontroli nav nepieciešams atkārtot, ja provizoriskajā testēšanā nav notikusi skābekļa uzņemšana, tomēr, ja ir notikusi būtiska skābekļa uzņemšana, abiotiskie kontrolparaugi būtu jāietver katrai testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijai. Dūņu jutība jāpārbauda, izmantojot ķīmisko standartvielu 3,5-dihlorofenolu. Dūņu jutība ir jāpārbauda katrai testa sērijai, jo ir zināms, ka jutība ir svārstīga. Testa paraugi no testa traukiem vienmēr ir jāizņem pēc 3 stundām un, ja nepieciešams, papildus pēc 30 minūtēm, lai veiktu skābekļa uzņemšanas rādītāja mērījumus skābekļa elektroda elementā. No savāktajiem datiem aprēķina kontrolparaugu un testa maisījumu īpatnējos elpošanas rādītājus; pēc tam atbilstoši šeit sniegtajam 7. vienādojumam aprēķina inhibīciju procentos.

Diferenciācija starp heterotrofo elpošanu un nitrifikāciju

42.

Īpaša nitrifikācijas inhibitora ATU izmantošana ļauj tieši novērtēt testējamo ķīmisko vielu inhibitoro ietekmi uz heterotrofo oksidāciju, un, atņemot skābekļa uzņemšanas rādītāju ATU klātbūtnē no kopējā uzņemšanas rādītāja (bez ATU), var aprēķināt ietekmi uz nitrifikācijas rādītāju. Jāsagatavo divi reakcijas maisījumu komplekti atbilstoši testa plānam ECx vai NOEC noteikšanai, kā izklāstīts 41. punktā, bet papildus katram viena komplekta maisījumam jāpievieno ATU galīgajā koncentrācijā 11,6 mg/l; ir konstatēts, ka šāda koncentrācija pilnīgi aptur nitrifikāciju dūņās, kuru suspendēto cietvielu koncentrācijas ir līdz 3 000 mg/l (4). Pēc ekspozīcijas perioda beigām jāizmēra skābekļa uzņemšanas rādītājs; šīs tiešās vērtības parāda tikai heterotrofās elpošanas rādītāju, atšķirības starp šiem un attiecīgajiem kopējiem elpošanas rādītājiem parāda nitrifikāciju. Pēc tam var aprēķināt dažādas inhibīcijas pakāpes.

Mērījumi

43.

Pēc ekspozīcijas perioda(-u) beigām paraugs no pirmā aerācijas trauka jāpārvieto uz skābekļa elektroda elementu (2. papildinājuma 1. attēls) un nekavējoties jāizmēra izšķīdušā skābekļa koncentrācija. Ja ir pieejama vairāku elektrodu sistēma, tad mērījumus var veikt vienlaicīgi. Ir svarīgi, lai maisīšanas (ar nosegtu magnētu) ātrums būtu tāds pats kā tad, kad elektrods kalibrēts, lai nodrošinātu, ka zonde reaģē uz skābekļa koncentrācijas izmaiņām ar minimālu aizkavēšanos un lai varētu mērījumu traukā regulāri veikt reproducējamus skābekļa mērījumus. Parasti pietiek ar dažu skābekļa elektrodu zondes sistēmu, kas pati apmaisa saturu. Laikā starp mērījumiem elements ir jāizskalo ar ūdeni. Ar paraugu var arī uzpildīt BSP pudeli (3. papildinājuma 2. attēls), kas aprīkota ar magnētisko maisītāju. Tad skābekļa zondi ar uzmavas adapteri ievieto pudeles kaklā un iedarbina magnētisko maisītāju. Abos gadījumos izšķīdušā skābekļa koncentrācijas kādu laiku pastāvīgi mēra un reģistrē, parasti 5 līdz 10 minūtes vai līdz brīdim, kad skābekļa koncentrācija nokrītas zem 2 mg/l. Elektrods ir jānoņem, maisījums jāielej atpakaļ aerācijas traukā, un jāturpina aerācija un maisīšana, ja ir nepieciešams veikt mērījumus pēc ilgākiem ekspozīcijas periodiem.

Testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas verifikācija

44.

Noteiktiem mērķiem var būt nepieciešams mērīt testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju testa traukos. Jānorāda, ka, ja tiek izmantoti turpmāk minēto vielu izejšķīdumi:

ūdenī vāji šķīstošas vielas;

maisījumi, kuros ir sastāvdaļas ar atšķirīgu šķīdību ūdenī;

vielas ar labu šķīdību ūdenī, bet gadījumos, kad izejšķīduma koncentrācija ir tuvu maksimālajai šķīdībai ūdenī,

izšķīdusī frakcija nav zināma un nav zināma uz testa traukiem pārvietotās testējamās ķīmiskās vielas patiesā koncentrācija. Lai raksturotu ekspozīciju, ir nepieciešams veikt testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju analītisko aplēšanu. Lai to vienkāršotu, analītiskā aplēšana veicama pirms inokulāta pievienošanas. Tā kā uz testa traukiem pārvieto tikai izšķīdušās frakcijas, izmērītās koncentrācijas var būt ļoti zemas.

45.

Lai izvairītos no laikietilpīgas un dārgas analīzes, ir ieteicams vienkārši iesvērt testējamo ķīmisko vielu tieši testa traukos un turpmākajos aprēķinos norādīt sākotnēji nosvērto nominālo koncentrāciju. Diferencēšana starp testējamās ķīmiskās vielas izšķīdušajām, neizšķīdušajām vai adsorbētajām frakcijām nav nepieciešama, jo arī reālos apstākļos visas šīs frakcijas atrodas notekūdeņu attīrīšanas iekārtās un šīs frakcijas var būt atšķirīgas atkarībā no notekūdeņu sastāva. Šīs testēšanas metodes mērķis ir reālistiski aplēst koncentrāciju, kas neizraisa inhibēšanos, un tā nav piemērota tam, lai sīkāk izmeklētu, kuras frakcijas veicina aktīvo dūņu organismu inhibēšanos. Visbeidzot, arī adsorbējošās vielas ir jāiesver tieši testa traukos un trauki ir jāsilanizē, lai samazinātu zudumus adsorbcijas dēļ.

DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA

Skābekļa uzņemšanas rādītāju aprēķināšana

46.

Skābekļa uzņemšanas rādītājus aprēķina no izmērīto vērtību vidējās vērtības, piemēram, no lineārajām daļām līknēs, kas ataino skābekļa koncentrācijas izmaiņas laikā; aprēķinus veic tikai skābekļa koncentrācijām starp 2,0 mg/l un 7,0 mg/l, jo augstākas un zemākas koncentrācijas pašas var ietekmēt patēriņa rādītājus. Novirze koncentrāciju joslās zemāk vai augstāk par šīm vērtībām reizēm ir neizbēgama un nepieciešama, piemēram, ja elpošana ir ievērojami nomākta un tāpēc norit ļoti lēni vai ja konkrētās aktīvās dūņas elpo ļoti ātri. Tas ir pieļaujams, ja skābekļa uzņemšanas grafika paplašinātās daļas ir taisnas un to slīpums nemainās, šķērsojot 2,0 mg/l vai 7,0 mg/l O2 robežas. Jebkuras izliektas līknes daļas norāda, ka mērīšanas sistēma stabilizējas vai ka uzņemšanas rādītājs mainās, un tās nav izmantojamas elpošanas rādītāja aprēķinos. Skābekļa uzņemšanas rādītājs jāizsaka miligramos uz litru stundā (mg/lh) vai miligramos uz gramu sauso dūņu stundā (mg/gh). Skābekļa patēriņa ātrumu R, izteiktu mg/lh, var aprēķināt vai interpolēt no reģistrētā skābekļa samazinājuma līknes lineārās daļas saskaņā ar 1. vienādojumu:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

kur:

Q1

ir skābekļa koncentrācija lineārās fāzes izraudzītās daļas sākumā (mg/l);

Q2

ir skābekļa koncentrācija lineārās fāzes izraudzītās daļas beigās (mg/l);

Δt

ir laika intervāls starp šiem mērījumiem (min).

47.

Īpatnējo elpošanas rādītāju (Rs) izsaka kā skābekļa daudzums, kuru patērē uz g dūņu saussvara stundā (mg/gh) atbilstoši 2. vienādojumam:

Rs = R/SS

(2)

kur SS ir suspendēto cietvielu koncentrācija testa maisījumā (g/l).

48.

Atšķirīgie R indeksi, kurus var kombinēt, ir šādi:

S

īpatnējais rādītājs

T

kopējais elpošanas rādītājs

N

nitrifikācijas noteiktais rādītājs

H

heterotrofās elpošanas noteiktais rādītājs

A

abiotisko procesu noteiktais rādītājs

B

rādītājs, kura pamatā ir tukšie testi (vidējā vērtība)

Nitrifikācijas noteiktās skābekļa uzņemšanas rādītāja aprēķināšana

49.

Attiecība starp kopējo elpošanu (RT), nitrifikācijas elpošanu (RN) un heterotrofo elpošanu (RH) ir norādīta 3. vienādojumā:

RN = RT – RH

(3)

kur:

RN

ir nitrifikācijas noteiktā skābekļa uzņemšana (mg/lh);

RT

ir izmērītais skābekļa uzņemšanas rādītājs tukšajā kontrolparaugā (bez ATU; FB) (mg/lh);

RH

ir izmērītais skābekļa uzņemšanas rādītājs tukšajā kontrolparaugā ar pievienotu ATU (FN) (mg/lh).

50.

Šī sakarība ir derīga tukšajiem paraugiem noteiktajām vērtībām (RNB, RTB, RHB), abiotiskajai kontrolgrupai (RNA, RTA, RHA) un testiem ar testējamajām ķīmiskajām vielām (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Īpatnējos skābekļa uzņemšanas rādītājus aprēķina šādi:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Ja provizoriskajā testēšanā RN ir nenozīmīgs (piemēram, < 5 % no RT tukšajos kontrolparaugos), var pieņemt, ka heterotrofā skābekļa uzņemšana ir vienāda ar kopējo uzņemšanu un nitrifikācija nenotiek. Būtu vajadzīgs cits aktīvo dūņu avots, ja testos ņemtu vērā ietekmi uz heterotrofiem un nitrificējošiem mikroorganismiem. Galīgo testu veic, ja ir pierādījumi par nomāktas skābekļa uzņemšanas rādītājiem atšķirīgās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijās.

Procentuālās inhibīcijas aprēķināšana

52.

Procentuālo inhibīciju IT no kopējā skābekļa patēriņa pie katras testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas aprēķina pēc 7. vienādojuma:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Līdzīgā kārtā heterotrofās skābekļa uzņemšanas procentuālo inhibīciju IH pie katras testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas aprēķina pēc 8. vienādojuma:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Visbeidzot, skābekļa patēriņa inhibēšanos nitrifikācijas dēļ pie katras koncentrācijas aprēķina pēc 9. vienādojuma:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Skābekļa uzņemšanas procentuālo inhibēšanos atliek pret attiecīgās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas logaritmu (inhibīcijas līkne, sk. 4. papildinājuma 3. attēlu). Inhibīcijas līknes grafiski attēlo katram 3 stundu aerācijas periodam vai attiecīgi pēc 30 minūtēm. Testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas inhibē skābekļa uzņemšanu par 50 % (EC50), jāaprēķina vai jāinterpolē no līknes. Ja ir pieejami piemēroti dati, var aprēķināt vai interpolēt EC50 95 % ticamības robežas, līknes virziena koeficientu un piemērotas vērtības, ko var atzīmēt kā inhibēšanās sākumu (piemēram, EC10 vai EC20) un inhibēšanās diapazona beigas (piemēram, EC80 vai EC90).

56.

Jāievēro, attiecībā uz mainību, ko bieži novēro rezultātos, daudzos gadījumos var būt pietiekami rezultātus papildus izteikt kārtās:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l līdz 10 mg/l

EC50

10 mg/l līdz 100 mg/l

EC50

> 100 mg/l

Rezultātu interpretēšana

ECx

57.

ECx vērtības, tostarp ar tām saistītās parametra apakšējās un augšējās 95 % ticamības robežas, aprēķina, izmantojot piemērotas statistiskās metodes (piemēram, probita analīzi, logistisko vai Veibula funkciju, saīsināto Spīrmena–Kerbera (Spearman-Kärber) metodi vai vienkāršu interpolāciju (11)). ECx iegūst, vērtību, kas atbilst x % no kontrolparaugu vidējās vērtības, ievietojot iegūtajā vienādojumā. Lai aprēķinātu EC50 vai jebkuru citu ECx, pirmsapstrādes vidējām vērtībām (x) ir jāveic regresijas analīze.

NOEC aplēšana

58.

Ja plānots ar statistisko analīzi noteikt NOEC, ir nepieciešama statistika par katru trauku (katrs trauks tiek uzskatīts par replikātu). Attiecīgas statistiskās metodes būtu jāizmanto atbilstoši ESAO dokumentam par Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). Parasti testējamās ķīmiskās vielas nelabvēlīgo ietekmi salīdzinājumā ar kontrolparaugu izmeklē, izmantojot vienpusēju (mazāku) hipotēžu pārbaudi pie p ≤ 0,05.

Testēšanas pārskats

59.

Testēšanas pārskatā ietverama turpmāk norādītā informācija.

 

Testējamā ķīmiskā viela:

vispārpieņemtais nosaukums, ķīmiskais nosaukums, CAS numurs, tīrības pakāpe;

testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās īpašības (piemēram, log Kow, šķīdība ūdenī, tvaika spiediens, Henrija konstante (H) un iespējamā informācija par testējamās ķīmiskās vielas apriti vidē un mijiedarbību ar to, piemēram, adsorbciju pie aktīvajām dūņām).

 

Testēšanas sistēma

avots, notekūdeņu attīrīšanas iekārtas darbības apstākļi un influents, koncentrācija, aktīvo dūņu pirmapstrāde un uzturēšana.

 

Testa apstākļi:

testa temperatūra, pH līmenis testēšanas laikā un ekspozīcijas fāzes (fāžu) laikā.

 

Rezultāti:

īpatnējais skābekļa patēriņš kontrolparaugos (mg O2/(g dūņu × h));

visi izmērītie dati, inhibēšanās līkne(-s) un EC50 aprēķina metode;

EC50 un, ja iespējams, 95 procentu ticamības robežas, iespējams, EC20, EC80; iespējams, NOEC un izmantotās statistiskās metodes, ja EC50 nav nosakāms;

kopējā un attiecīgā gadījumā heterotrofā un nitrifikācijas inhibīcija;

abiotiskā skābekļa uzņemšana fizikālķīmiskajā kontrolparaugā (ja tādu izmanto);

ķīmiskās standartvielas nosaukums un ar šo vielu iegūtie rezultāti;

visi novērojumi un novirzes no standartprocedūras, kam varētu būt bijusi ietekme uz rezultātu.

LITERATŪRA

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1. papildinājums

Definīcijas

Šai metodei ir piemērojamas turpmāk norādītās terminu definīcijas.

 

Ķīmiska viela ir viela vai to maisījums.

 

ECx (ietekmes koncentrācija, pie kuras ietekme ir x %) ir koncentrācija, kas konkrētā ekspozīcijas periodā uz testa organismiem atstāj x % ietekmi salīdzinājumā ar kontrolgrupu. Piemēram, EC50 ir aplēstā koncentrācija, kas noteiktā ekspozīcijas periodā atstāj ietekmi uz testa beigupunktu 50 procentos no eksponētās populācijas.

 

NOEC (nenovērojamās ietekmes koncentrācija) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, pie kuras nav novērojama ietekme. Šajā testā koncentrācijai, kas atbilst NOEC, dotā ekspozīcijas periodā nav statistiski nozīmīgas ietekmes (p < 0,05), salīdzinot ar kontrolparaugu.

 

Testējamā ķīmiskā viela ir jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

2. papildinājums

1. attēls.   Mērījumu ierīces piemēri

Image

Skaidrojums

1

aktīvās dūņas

2

sintētiskā barotne

3

testējamā ķīmiskā viela

4

gaiss

5

maisīšanas trauks

6

magnētiskais maisītājs

7

skābekļa mērelements

8

skābekļa elektrods

9

skābekļa mērierīce

10

reģistrators

3. papildinājums

2. attēls.   Mērījumu ierīces piemērs, kurā izmanto BSP noteikšanas pudeli

Image

Skaidrojums

1

testa trauks

2

skābekļa elektrods

3

skābekļa mērierīce

4. papildinājums

3. attēls.   Inhibīcijas līkņu piemērs

Image

Leģenda

X

3,5-dihlorofenola koncentrācija (mg/l)

Y

inhibīcija ( %)

Image

heterotrofās elpošanas noteikta inhibēšanās, izmantojot nitrificējošas dūņas

Image

nitrifikācijas noteikta inhibēšanās, izmantojot nitrificējošas dūņas

(5)

C.26 nodaļu aizstāj ar šādu:

C.26   ŪDENSZIEDU (LEMNA) SUGU AUGŠANAS INHIBĒŠANĀS TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 221 (2006. gads). Šis tests ir paredzēts, lai novērtētu ķīmisku vielu toksicitāti saldūdens ūdens augiem – ūdensziedu ģints (Lemna) augiem. Tās pamatā ir esošās metodes (1)(2)(3)(4)(5)(6), taču šeit aprakstītās metodes modificētas saskaņā ar jaunākajiem pētījumiem un konsultācijām par vairākiem būtiskiem jautājumiem. Piedāvātā metode apstiprināta starptautiskā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā (7).

2.

Testēšanas metodē aprakstīta toksiskuma noteikšana, izmantojot kupraino ūdensziedu (Lemna gibba) un mazo ūdensziedu (Lemna minor) sugas, kas ir plaši pētītas un izmantotas par objektu iepriekš minētajos standartos. Ūdensziedu ģints sugu taksonomija ir sarežģīta, jo sastopami daudzveidīgi fenotipi. Kaut arī konstatēta ūdensziedu ģenētiskā mainība toksikantu ietekmē, pašlaik nav pieejams pietiekami daudz datu par šīs mainības cēloni, lai ieteiktu konkrētu klonu, kuru izmantot šajā testēšanas metodē. Jāatzīmē, ka testēšanu neveic aksēniskā jeb sterilā kultūrā, taču testa norises laikā zināmos posmos veic pasākumus, ar kuriem pēc iespējas samazina kontamināciju ar citiem organismiem.

3.

Sniegta sīkāka informācija par testēšanas norisi gan ar testa šķīduma atjaunošanu (pusstatiskā metode un caurplūdes metode), gan arī bez šķīduma atjaunošanas (statiskā metode). Atkarībā no testēšanas mērķiem un reglamentējošām prasībām ieteicams apsvērt pusstatiskās metodes un caurplūdes metodes lietošanu, piemēram, ķīmiskajām vielām, kas ātri izdalās no šķīduma iztvaikošanas, fotonoārdīšanās, izgulsnēšanās vai bioloģiskās noārdīšanās rezultātā. Papildu norādījumi sniegti avotā (8).

4.

Izmantotās definīcijas ir dotas 1. papildinājumā.

TESTA PRINCIPS

5.

Eksponenciāli augošās ūdensziedu ģints augu kultūrām ļauj augt kā monokultūrām dažādās testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijās laikā līdz septiņām dienām. Šā testa mērķis ir kvantitatīvi noteikt testējamās vielas ietekmi uz aug (u veģetatīvo augšanu konkrētā periodā, izvērtējot izvēlētos mērāmos parametrus. Ūdensziedu plātnīšu skaits ir primārais mērāmais parametrs. Jāmēra vēl vismaz viens cits parametrs (kopējā plātnīšu platība, saussvars vai svaigsvars), tāpēc ka dažas ķīmiskās vielas citus mērāmos parametrus var ietekmēt vairāk nekā plātnīšu skaitu. Lai kvantitatīvi noteiktu testējamās vielas ietekmi, augšanu testa šķīdumos salīdzina ar augšanu kontrolšķīdumos un atrod koncentrāciju, kas izraisa noteiktu augšanas inhibēšanos par x % (piemēram, 50 %), ko izsaka kā ECx (piemēram, EC50).

6.

Testa beigupunkts ir augšanas inhibīcija, ko izsaka kā mērāmā parametra (vidējā specifiskā augšanas ātruma) logaritmisko pieaugumu ekspozīcijas periodā. No specifiskā augšanas ātruma vidējām vērtībām, kas reģistrētas testa šķīdumu rindā, nosaka koncentrāciju, kas nodrošina noteikta augšanas ātruma inhibēšanos par x % (piemēram, 50 %), un to izsaka kā ErCx (piemēram, ErC50).

7.

Šajā testēšanas metodē izmantotais papildu atkarīgais mainīgais ir ražība, kas var būt nepieciešams, lai dažās valstīs izpildītu īpašas regulējuma prasības. Tas ir definēts kā mērāmais parametrs ekspozīcijas perioda beigās, no kura atņemts attiecīgs ekspozīcijas perioda sākumā izmērīts parametrs. No ražības skaitliskajām vērtībām, ko iegūst testa šķīdumu rindā, atrod koncentrāciju, kas izraisa noteiktu ražības samazināšanos par x % (piemēram, par 50 %), ko izsaka kā EyCx (piemēram, EyC50).

8.

Papildus statistiski var noteikt zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC) un nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC).

INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶĪMISKO VIELU

9.

Jābūt pieejamai pietiekami jutīgai analīzes metodei vielas kvantitatīvai noteikšanai testēšanas barotnē.

10.

Nosakot testēšanas apstākļus, var noderēt informācija par testējamo ķīmisko vielu – struktūrformula, tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, stabilitāte ūdenī un gaismā, pKa, Kow, tvaika spiediens un bioloģiskās noārdīšanās spēja. Šķīdību ūdenī un tvaika spiedienu var izmantot, lai aprēķinātu Henrija likuma konstanti un novērtētu, vai testa periodā iespējami būtiski testējamās ķīmiskās vielas zudumi. Tā iespējams gūt priekšstatu par to, vai jāveic īpaši pasākumi šādu zudumu kontrolei. Ja informācija par testējamās ķīmiskās vielas šķīdību un stabilitāti ir neskaidra, ieteicams to novērtēt testa apstākļos, t. i., ar barotni, temperatūru, apgaismojuma režīmu, ko izmantos testa laikā.

11.

Ja īpaši svarīga ir testēšanas barotnes pH kontrole, piemēram, ja testējamie metāli vai ķīmiskās vielas ir hidrolītiski nestabilas, barotnei ieteicams pievienot buferšķīdumu (sk. 21. punktu). Papildu norādījumi par testiem ar tādām vielām, kas grūti testējamas to fizikālķīmisko īpašību dēļ, ir sniegti (8).

TESTA DERĪGUMS

12.

Lai testēšanas rezultātus atzītu par derīgiem, plātnīšu skaita divkāršošanās laikam kontrolē jābūt mazākam par 2,5 dienām (60 h), kas atbilst aptuveni septiņkārtīgam pieaugumam septiņās dienās un vidējam specifiskajam augšanas ātrumam 0,275 d-1. Izmantojot šajā testēšanas metodē aprakstītās barotnes un testa apstākļus, šo kritēriju var sasniegt statiskā testa režīmā (5). Tāpat sagaidāms, ka šo kritēriju var sasniegt, izmantojot testā pusstatisko metodi un caurplūdes metodi. Divkāršošanās laika aprēķināšana norādīta 49. punktā.

ĶĪMISKĀ STANDARTVIELA

13.

Ķīmiskā(-s) standartviela(-s), piemēram, 3,5-dihlorfenols, kas izmantots starptautiskā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā (7), var testēt, lai pārbaudītu testa procedūru. Ķīmisko standartvielu ieteicams testēt vismaz divas reizes gadā vai, ja testēšana tiek veikta retāk, vienlaikus ar testējamās ķīmiskās vielas toksicitātes noteikšanu.

TESTĒŠANAS METODES APRAKSTS

Aprīkojums

14.

Visām iekārtām, kas ir saskarē ar testa vidi, jābūt izgatavotām no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla. Stikla trauki, kas paredzēti kultivēšanai un testēšanai, jāattīra no ķīmiskiem kontaminantiem, kas varētu iekļūt testēšanas barotnē, un tiem jābūt steriliem. Testa traukiem jābūt pietiekami lieliem, lai dažādu koloniju plātnītes kontroles traukos varētu brīvi augt, testa beigās nepārklājoties cita ar citu. Nav būtiski, vai saknes pieskaras testa trauka dibenam, tomēr visiem testa traukiem ieteicamais minimālais dziļums ir 20 mm un minimālais tilpums 100 ml. Testa trauku izvēlei nav citas būtiskas nozīmes, ja vien tiek izpildītas minētās prasības. Par piemērotām atzītas arī atbilstoša izmēra stikla vārglāzes, kristalizatori vai Petri plates no stikla. Testa traukiem jābūt apsegtiem, lai pēc iespējas samazinātu iztvaikošanu un nejaušas kontaminācijas iespēju, vienlaikus nodrošinot nepieciešamo gaisa apmaiņu. Piemēroti ir tādi testa trauki un jo īpaši to vāki, kas nenoēno augus un nerada gaismas spektra izmaiņas.

15.

Kultūras un testa traukus nedrīkst izvietot vienkopus. Šī prasība vislabāk izpildāma, izmantojot atsevišķas audzēšanas kameras, inkubatorus vai telpas. Apgaismojums un temperatūra jākontrolē un jāuztur nemainīgā līmenī (sk. 35.–36. punktu).

Testa organismi

16.

Šajā testā izmantojamie organismi ir kuprainais ūdenszieds (Lemna gibba) vai mazais ūdenszieds (Lemna minor). Toksiskuma noteikšanai izmantojamo ūdensziedu sugu īss apraksts dots 2. papildinājumā. Augu materiāls jāsaņem no kultūru kolekcijas, no citas laboratorijas vai jāievāc lauka apstākļos. Lauka apstākļos ievākti augi vismaz astoņas nedēļas pirms izmantošanas jāuztur kultūrā tieši tādā barotnē, kādu izmanto testēšanai. Ja augus vāc laukā, vietām, kur ievāc kultūras sākummateriālu, jābūt bez redzamiem kontaminācijas avotiem. Ja augu materiāls saņemts no citas laboratorijas vai no kultūru kolekcijas, tas jāuztur līdzīgi vismaz trīs nedēļas. Visos gadījumos jānorāda testā izmantojamā augu materiāla izcelsmes avots, suga un klons (ja zināms).

17.

Jāizmanto monokultūras, kas redzami nav kontaminētas ar citiem organismiem, piemēram, aļģēm un vienšūņiem. Veselīgi mazā ūdenszieda (L. minor) augi sastāv no kolonijām, ko veido divas līdz piecas plātnītes, bet veselīgā kuprainā ūdenszieda (L. gibba) kolonijā var būt pat septiņas plātnītes.

18.

Testā izmantojamo augu kvalitāte un vienveidīgums būtiski ietekmē testa rezultātus, tāpēc tie jāizraugās rūpīgi. Jāizmanto jauni, ātri augoši augi bez redzamiem bojājumiem vai krāsas izmaiņām (hlorozes). Labas kvalitātes kultūras pazīme ir daudz koloniju, kas sastāv no vismaz divām plātnītēm. Liels atsevišķu plātnīšu skaits liecina par vidisko stresu, piemēram, barības vielu nepietiekamību, un testēšanai augus no šādām augu kultūrām izmantot nedrīkst.

Audzēšana

19.

Lai manipulācijas kultūras uzturēšanai varētu veikt retāk (piemēram, ja ūdensziedu testi tuvākajā laikā nav plānoti), kultūras glabā samazināta apgaismojuma apstākļos pazeminātā temperatūrā (4–10 °C). Sīkāka informācija par kultivēšanu ir dota 3. papildinājumā. Ja novērojamas aļģu vai citu organismu kontaminācijas pazīmes, jāņem ūdensziedu plātnīšu apakšparaugs, jāveic tā virsmas sterilizācija un pēc tam tas jāpārnes svaigā barotnē (sk. 3. papildinājumu). Šādā gadījumā atlikusī kontaminētā kultūra jālikvidē.

20.

Vismaz septiņas dienas pirms testēšanas sākuma pietiekamu daudzumu koloniju aseptiski pārvieto uz svaigu, sterilu barotni un 7–10 dienas kultivē testa apstākļos.

Testēšanas barotne

21.

Turpmāk minētas vairākas barotnes, kas ieteicamas mazā ūdenszieda (Lemna minor) un kuprainā ūdenszieda (Lemna gibba) kultivēšanai. Rūpīgi jāapsver pH buferšķīduma pievienošana testēšanas barotnēm (MOPS 4-morfolīnpropānsulfonskābe; CAS Nr. 1132-61-2 mazā ūdenszieda barotnei un NaHCO3 kuprainā ūdenszieda barotnei), ja iespējams, ka tas varētu reaģēt ar testējamo ķīmisko vielu un ietekmēt tās toksiskuma izpausmi. Var izmantot arī Steinberga (Steinberg) barotni (9), ja tā atbilst derīguma kritērijiem.

22.

Arī modificēta Zviedrijas standartos (SIS) minētā ūdensziedu barotne ieteicama mazā ūdenszieda kultivēšanai un testēšanai. Šīs barotnes sastāvs dots 4. papildinājumā.

23.

Barotne 20X – AAP, kas aprakstīta 4. papildinājumā, ieteicama kuprainā ūdenszieda kultivēšanai un testēšanai.

24.

Arī Steinberga barotne, kas aprakstīta 4. papildinājumā, ir piemērota mazā ūdenszieda kultivēšanai, un ja tā atbilst derīguma kritērijiem, izmantojama arī kuprainā ūdenszieda kultivēšanai.

Testa šķīdumi

25.

Testa šķīdumus parasti gatavo, atšķaidot izejšķīdumu. Testējamās ķīmiskās vielas izejšķīdumu parasti gatavo, izšķīdinot ķīmisko vielu barotnē.

26.

Lielākā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija parasti nav augstāka par vielas šķīdību ūdenī testa apstākļos. Jānorāda, ka ūdensziedi (Lemna) peld barotnes virspusē un uz tiem var iedarboties vielas, kas uzkrājas ūdens un gaisa saskares zonā (piemēram, ūdenī slikti šķīstošas vai hidrofobas vielas vai virsmaktīvās vielas). Tādos apstākļos ekspozīciju var radīt viela, kuras nav šķīdumā, un atkarībā no testējamās vielas īpašībām testa koncentrācijas var pārsniegt tās šķīdību ūdenī. No slikti šķīstošām testējamām ķīmiskajām vielām var būt jāsagatavo koncentrēti ķīmiskās vielas izejšķīdumi vai dispersijas, izmantojot organiskos šķīdinātājus vai disperģētājvielas, lai atvieglotu vielas disperģēšanu un izšķīdināšanu, dodot iespējas paaugstināt testējamās vielas dozēšanas precizitāti testēšanas barotnē. Tomēr jādara viss iespējamais, lai izvairītos no šādu materiālu lietošanas. Šīs palīgvielas – šķīdinātāji vai disperģētājvielas – nedrīkst būt fitotoksiskas. Piemēram, daži parasti izmantotie šķīdinātāji, kas nav fitotoksiski koncentrācijā virs 100 μl/l, ir acetons un dimetilformamīds. Ja lieto šķīdinātājus vai disperģētājvielas, jānorāda šo vielu gala koncentrācija un tā jāuztur minimālā līmenī (≤ 100 μl/l), un visos variantos – testējamās vielas un kontrolgrupas traukos – šķīdinātājam vai disperģētājvielai jābūt vienādā koncentrācijā. Papildu norādījumi par disperģētājvielu lietošanu ir doti (8).

Testa grupas un kontrolgrupas

27.

Piemērotu testēšanas koncentrāciju izvēlei ieteicams izmantot priekšzināšanas par testējamās ķīmiskās vielas toksiskumu ūdensziediem (Lemna), piemēram, diapazona noteikšanas testa datus. Galīgajā toksiskuma testā parasti jābūt vismaz piecām testējamām koncentrācijām, kas sakārtotas ģeometriskā progresijā. Vēlams, lai starp testa koncentrāciju kvocients nepārsniegtu 3,2, bet lielāku vērtību var izmantot tad, ja koncentrācijas–atbildreakcijas līkne ir lēzena. Ja testē mazāk nekā piecas koncentrācijas, tas ir jāpamato. Katram testējamās koncentrācijas variantam jābūt vismaz trijos replikātos.

28.

Nosakot testējamo koncentrāciju diapazonu (diapazona noteikšanai un/vai galīgajam toksiskuma testam), jāņem vērā šādi apsvērumi.

ECx noteikšanā testa koncentrācijām jāietver ECx vērtība, lai nodrošinātu pietiekamu ticamības līmeni. Piemēram, nosakot EC50, augstākajai testētajai koncentrācijai jābūt lielākai par EC50 vērtību. Ja EC50 vērtība atrodas ārpus testa koncentrāciju diapazona, attiecīgie ticamības intervāli būs lieli un nebūs iespējama modeļa statistiskā derīguma korekta novērtēšana.

Ja mērķis ir noteikt LOEC/NOEC, zemākajai testa koncentrācijai jābūt pietiekami mazai, tā, lai augšana nebūtu ievērojami lēnāka kā kontrolgrupā. Turklāt augstākajai testa koncentrācijai jābūt pietiekami lielai, tā, lai augšana būtu ievērojami lēnāka nekā kontrolgrupā. Ja tā nav, testēšana jāatkārto, izmantojot citādu koncentrāciju diapazonu (ja vien lielākā koncentrācija nav tuvu šķīdības robežai vai maksimāli pieļaujamajai robežkoncentrācijai, piemēram, 100 mg/l).

29.

Katrā testā iekļaujama kontrolgrupa, kurā ir tāda pati barotne, vienāds plātnīšu un koloniju skaits, vidiskie apstākļi, manipulācijas kā testa traukos, bet bez testējamās ķīmiskās vielas. Ja par palīgvielu lieto šķīdinātāju vai disperģētājvielu, kontrolgrupai papildus jāpievieno tas pats šķīdinātājs/disperģētājviela tieši tādā koncentrācijā kā traukos ar testējamo ķīmisko vielu. Kontrolreplikātu skaitam (arī traukiem ar šķīdinātāju, ja to lieto) jābūt vismaz tādam pašam kā katras testējamās koncentrācijas trauku skaitam, bet ideālā gadījumā divreiz lielākam par to.

30.

Ja nav nepieciešams noteikt NOEC, testēšanas plānu var mainīt, palielinot testējamo koncentrāciju skaitu un samazinot katras koncentrācijas replikātu skaitu. Taču kontrolgrupā jābūt vismaz trīs replikātiem.

Ekspozīcija

31.

Kolonijas, kas sastāv no divām līdz četrām saredzamām plātnītēm, no inokulācijas kultūras aseptiskos apstākļos pārvieto uz testa traukiem, sadalot pēc nejaušās izvēles principa. Katrā testa traukā jāatrodas pavisam 9–12 plātnītēm. Plātnīšu un koloniju skaitam visos testa traukos jābūt vienādam. Šīs metodes izmantošanas pieredze un starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas dati liecina, ka trīs replikāti katrai koncentrācijai, katram replikātam sākotnēji saturot 9–12 plātnītes, ir pietiekami, lai starp koncentrācijām konstatētu aptuveni 4–7 % augšanas atšķirības inhibēšanās dēļ, rēķinot pēc augšanas ātruma (10–15 %, rēķinot pēc ražības) (7).

32.

Testa trauki inkubatorā jāizvieto pēc nejaušības principa, lai pēc iespējas samazinātu telpiskās atšķirības gaismas intensitātes vai temperatūras ziņā. Nepieciešams blokveida sadalījums vai trauku pārvietošana pēc nejaušības principa, izdarot novērojumus (vai arī trauku pārvietošana biežāk).

33.

Ja orientējošajā testā konstatē, ka testa periodā (7 dienas) testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju nav iespējams uzturēt (t. i., izmērītā koncentrācija nokrītas zem 80 % no sākotnējās koncentrācijas), ieteicams izmantot pusstatisko metodi. Šādā gadījumā kolonijas jāpārvieto svaigi sagatavotā testēšanas barotnē un kontrolšķīdumos vismaz divas reizes testa laikā (t. i., trešajā un piektajā dienā). Tas, cik bieži eksponē svaigai barotnei, atkarīgs no testējamās ķīmiskās vielas stabilitātes; lai ļoti nestabilām un gaistošām vielām uzturētu pēc iespējas nemainīgu koncentrāciju, tas var būt jādara biežāk. Dažkārt var būt jāizmanto caurplūdes pieeja (8)(10).

34.

Ekspozīcijas modeļi, kas paredz testējamo vielu izsmidzināt uz auga lapām, šajā testēšanas metodē nav aprakstīti, bet ir atrodami (11).

Inkubācijas apstākļi

35.

Jāizmanto pastāvīgas silti vai vēsi baltas fluorescentas gaismas avots, kas nodrošina apgaismojuma intensitāti diapazonā 85–135 μE · m– 2s– 1, mērot fotosintēzes aktivitātei atbilstošā spektra daļā (400–700 nm) tādā pašā attālumā no gaismas avota, kādā atrodas ūdensziedu (Lemna) plātnītes (ekvivalents 6 500–10 000 luksiem). Jebkuras novirzes no izraudzītās apgaismojuma intensitātes testa zonā nedrīkst pārsniegt ± 15 % Gaismas detektēšanas un mērīšanas metodes, jo īpaši sensora veids, ietekmē izmērītās vērtības. Par labākiem atzīstami sfēriskie sensori (reaģē uz gaismu visos leņķos virs mērījumu plaknes un zem tās) un “kosinusa” sensori (reaģē uz gaismu visos leņķos virs mērījumu plaknes) salīdzinājumā ar vienvirziena sensoriem, un ar tiem var iegūt augstākus nolasījumus no šeit aprakstītā veida daudzpunktu gaismas avota.

36.

Temperatūrai testa traukos jābūt 24 ± 2 °C. Kontrolgrupas barotnē testēšanas laikā pH nedrīkst palielināties par vairāk kā 1,5 vienībām. Tomēr testēšanas rezultāti nav uzskatāmi par nederīgiem tādu noviržu dēļ, kas pārsniedz 1,5 vienības, ja tie atbilst citiem derīguma kritērijiem. Papildu uzmanība īpašos gadījumos jāvelta pH novirzēm – ja jātestē nestabilas vielas vai metāli. Sīkākus norādījumus sk. (8).

Ilgums

37.

Testu beidz septiņas dienas pēc augu pārvietošanas uz testa traukiem.

Mērījumi un analītiskā noteikšana

38.

Testēšanas sākumā jāizskaita un jāreģistrē plātnīšu skaits testa traukos, pārliecinoties, ka tiek uzskaitītas uz āru izvirzītas, skaidri saskatāmas plātnītes. Plātnīšu skaits jānosaka testa sākumā, tad vismaz vienu reizi trīs dienās ekspozīcijas periodā (t. i., vismaz divas reizes septiņu dienu periodā) un testa beigās, uzskaitot gan normālās, gan anomālās plātnītes. Jāievēro augu attīstības izmaiņas, piemēram, plātnīšu lielums, ārējais izskats, nekrozes pazīmes, hloroze, kumpainība, koloniju sadalīšanās, peldspējas zudums, kā arī saknīšu garums un izskats. Jānovēro arī būtiskas testēšanas barotnes iezīmes (piemēram, neizšķīdušas vielas, aļģu augšana testa traukā).

39.

Papildus plātnīšu skaita noteikšanai testēšanas laikā jānovērtē arī testējamās ķīmiskās vielas ietekme uz vienu (vai vairākiem) šādiem mērāmajiem parametriem:

i)

kopējais plātnīšu laukums;

ii)

sausssvars;

iii)

svaigsvars.

40.

Kopējā plātnīšu laukuma noteikšanai ir tāda priekšrocība, ka to var noteikt katram testējamā varianta un kontrolgrupas traukam testa sākumā, norises gaitā un testa beigās. Saussvars un svaigsvars jānosaka testa sākumā paraugā, kas ir reprezentatīvs laboratorijas kultūrai, kuru lietos par inokulātu testa sākšanai, kā arī testa beigās augu materiālā no katra testējamā varianta un kontrolgrupas trauka. Ja plātnīšu laukums netiek mērīts, vēlams noteikt saussvaru, nevis svaigsvaru.

41.

Kopējo plātnīšu laukumu, saussvaru un svaigsvaru varu var noteikt šādi:

i)

kopējā plātnīšu platība: kopējo visu koloniju platību var noteikt ar attēlu analīzi. Testa trauka un augu siluetus var fiksēt ar videokameru (t. i., novietojot trauku uz gaismas kameras) un iegūto attēlu digitalizēt. Ja kalibrēšanu veic ar plakanas formas modeļiem ar zināmu laukumu, var noteikt kopējo plātnīšu platību testa traukā. Jāraugās, lai nebūtu traucējumu, ko rada testa trauka malas. Alternatīva, bet darbietilpīgāka metode ir fotografēt testa traukus un augus, izgriezt iegūto koloniju siluetu un izmērīt to laukumu, izmantojot lapu virsmas platības analizatoru vai milimetrpapīru. Piemērotas ir arī citas metodes (piemēram, izmantojot papīru, var noteikt papīra masas attiecību starp koloniju silueta laukumu un laukuma vienību);

ii)

saussvars: no katra testa trauka ievāc visas kolonijas un skalo ar destilētu vai dejonizētu ūdeni. Tās nosusina, lai atbrīvotos no liekā ūdens, un 60 °C temperatūrā žāvē līdz nemainīgai masai. Jāņem arī saknīšu fragmenti. Sausna jānosaka vismaz ar 0,1 mg precizitāti;

iii)

svaigsvars: visas kolonijas pārvieto iepriekš nosvērtās polistirola (vai cita inerta materiāla) mēģenēs ar noapaļotu apakšdaļu, kurā ir sīkas (1 mm) atveres. Mēģenes 10 minūtes istabas temperatūrā centrifugē ar ātrumu 3 000 rpm. Mēģenes ar notecinātajām kolonijām atkal nosver un aprēķina svaigsvaru, atņemot tukšas mēģenes masu.

Mērījumu un analītiskās noteikšanas biežums

42.

Izmantojot statisko testēšanas plānu, pH jāmēra katrā apstrādes traukā testa sākumā un beigās. Pusstatiskā testēšanas plāna gadījumā pH jāmēra katrā “svaigā” testa šķīduma partijā pirms katras šķīduma nomaiņas, kā arī attiecīgajās “izlietoto” šķīdumu porcijās.

43.

Gaismas intensitāte jāmēra audzēšanas kamerā, inkubatorā vai telpā tādā pašā attālumā no gaismas avota, kādā atrodas ūdensziedu (Lemna) plātnītes. Mērījumi jāveic vismaz vienreiz testēšanas laikā. Barotnes temperatūras mērīšanu aizvietotājtraukā, kas novietots identiskos apstākļos audzēšanas kamerā, inkubatorā vai telpā, mēra vismaz vienreiz dienā.

44.

Testa laikā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas nosaka regulāros intervālos. Statiskajos testos minimālā prasība ir noteikt koncentrāciju testēšanas sākumā un beigās.

45.

Pusstatiskajos testos, kad nav gaidāms, ka testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija saglabāsies ± 20 % robežās no nominālās koncentrācijas, jāanalizē visi no jauna pagatavotie testa šķīdumi, kā arī tie paši šķīdumi pirms katras ievadīšanas testa traukos (sk. 33. punktu). Tomēr tādos testos, kur testējamās ķīmiskās vielas izmērītā sākotnējā koncentrācija nav ± 20 % no nominālās koncentrācijas, bet pietiekami pierādījumi liecina, ka sākotnējā koncentrācija ir atkārtojama un stabila (t. i., 80–120 % no sākotnējās koncentrācijas), ķīmiskās analīzes var veikt tikai pie pašām lielākajām un mazākajām testējamajām koncentrācijām. Visos gadījumos testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju noteikšana veicama pirms svaiga šķīduma pievienošanas vienā replikāta traukā katrai testa koncentrācijai (vai to trauku saturā, kas apvienoti replikātā).

46.

Ja izmanto caurplūdes metodi, paraugus ņem līdzīgā režīmā, kā aprakstīts pusstatiskās metodes gadījumā, tostarp ņem analīzes testēšanas sākumā, vidusposmā un beigās; veikt mērījumus “izlietotajos” šķīdumos nav lietderīgi. Šāda veida testā šķīdinātāja un testējamās ķīmiskās vielas vai testējamās ķīmiskās vielas izejšķīduma plūsmas ātrums jāpārbauda katru dienu.

47.

Ja ir pierādījumi, ka testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija ir apmierinoši uzturēta ± 20 % robežās no nominālās vai testa laikā izmērītās sākotnējās koncentrācijas, tad rezultātu analīzes pamatā var būt nominālās vai izmērītās sākotnējās vērtības. Ja novirze no nominālās vai izmērītās sākotnējās koncentrācijas nav ± 20 % diapazonā, rezultātu analīzes pamatā jābūt koncentrāciju ģeometriskai vidējai vērtībai ekspozīcijas laikā vai modeļiem, kas raksturo testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas samazināšanos (8).

Robežtests

48.

Noteiktos apstākļos, piemēram, kad orientējošais tests norāda, ka testējamajai ķīmiskajai vielai nav toksiskas ietekmes koncentrācijās līdz 100 mg/l vai līdz šķīdības robežai testēšanas barotnē (atkarībā no tā, kura ir zemāka), var veikt robežtestu, kurā salīdzina kontrolgrupas un vienas apstrādes grupas (100 mg/l vai koncentrācija, kas vienāda ar šķīdības robežu) atbildreakcijas. Noteikti ieteicams to apstiprināt, analizējot ekspozīcijas koncentrācijas. Uz robežtestu attiecas visi iepriekš aprakstītie testēšanas nosacījumi un derīguma kritēriji, izņemot to, ka apstrādes replikātu skaits jādubulto. Augšanu kontrolgrupā un apstrādes grupā var analizēt, izmantojot statistisku testu vidējo vērtību salīdzināšanai, piemēram, Stjūdenta t-testu.

DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA

Divkāršošanās laiks

49.

Lai noteiktu ūdensziedu plātnīšu skaita divkāršošanās laiku (Td) un pētījuma atbilstību šim derīguma kritērijam (12. punkts), aprēķiniem ar kontrolgrupas traukos iegūtiem datiem izmanto šādu formulu:

Td = ln 2/μ

kur μ ir vidējais specifiskais augšanas ātrums, ko nosaka, kā aprakstīts 54.–55. punktā.

Atkarīgie mainīgie

50.

Testēšanas mērķis ir noteikt testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz ūdensziedu (Lemna) veģetatīvo augšanu. Šī testa metode ietver divus atkarīgos mainīgos, jo dažādās jurisdikcijās ir priekšroku dod atšķirīgiem parametriem un atšķiras regulējuma vajadzības. Lai testēšanas rezultāti būtu pieņemami visās jurisdikcijās, rezultāti ir jāizvērtē, izmantojot abus turpmāk aprakstītos atkarīgos mainīgos a) un b).

a)

Vidējais specifiskais augšanas ātrums: šo atkarīgo mainīgo aprēķina, pamatojoties uz plātnīšu skaita logaritmu izmaiņām un pamatojoties uz vēl cita mērāmā parametra (kopējās plātnīšu platības, saussvara vai svaigsvara) logaritmu izmaiņām laikā (izteiktām dienās) kontrolgrupās un katrā apstrādes grupā. To dažreiz sauc par relatīvo augšanas ātrumu (12).

b)

Ražība: šo atkarīgo mainīgo aprēķina, pamatojoties uz plātnīšu skaita izmaiņām un uz vēl kāda cita mērāma parametra (kopējās plātnīšu zonas platības, saussvara vai svaigā svara) izmaiņām kontrolgrupās un katrā apstrādes grupā periodā līdz testēšanas beigām.

51.

Jānorāda, ka toksiskuma vērtības, kas aprēķinātas, izmantojot šos abus atkarīgos mainīgos, nav savstarpēji salīdzināmas, un šī atšķirība jāapzinās, izmantojot testa rezultātus. Tā kā katras pieejas matemātiskais pamats ir atšķirīgs, tad, ja būs ievēroti šīs testa metodes testa nosacījumi, ECx vērtības, kuru pamatā ir vidējais specifiskais augšanas ātrums (ErCx), kopumā būs augstākas nekā rezultāti, kuru pamatā ir ražība (EyCx). To nedrīkst interpretēt kā šo abu iegūto parametru jutības atšķirību; šīs vērtības vienkārši ir matemātiski atšķirīgas. Vidējā specifiskā augšanas ātruma koncepcijas pamatā ir ūdensziedu vispārējais eksponenciālās augšanas modelis kultūrās, kuru augšanu neierobežo; toksiskumu tajās aplēš pēc ietekmes uz augšanas ātrumu neatkarīgi no kontrolgrupas absolūtā specifiskā augšanas ātruma līmeņa, koncentrācijas–atbildreakcijas līknes virziena koeficienta vai testa ilguma. Savukārt rezultāti, kuru pamatā esošais atkarīgais mainīgais ir ražība, ir atkarīgi no visiem citiem minētajiem mainīgajiem. EyCx ir atkarīgs no katrā testā iekļauto ūdensziedu sugu vidējā specifiskā augšanas ātruma un no maksimālā specifiskā augšanas ātruma, kas var būt atšķirīgs ne tikai katrai sugai, bet arī dažādiem kloniem. Šo atkarīgo mainīgo nevajadzētu izmantot, lai salīdzinātu dažādu ūdesnziedu sugu vai pat atšķirīgu klonu jutību pret toksikantiem. Kaut arī zinātnē priekšroku dod toksiskuma noteikšanai pēc vidējā specifiskā augšanas ātruma, lai apmierinātu dažu valstu pašreizējās regulatīvās prasības, šajā testēšanas metodē ir ietverta arī toksiskuma noteikšana pēc ražības.

52.

Toksiskuma noteikšanā jāpamatojas uz plātnīšu skaitu un vēl vismaz vienu citu mērāmo parametru (plātnīšu zonas kopējā platība, saussvars vai svaigais svars), jo dažas vielas var ietekmēt citus mērāmos lielumus vairāk nekā plātnīšu skaitu. Šo ietekmi nevar noteikt, aprēķinot tikai plātnīšu skaitu.

53.

Plātnīšu skaits, kā arī jebkurš cits iegūtais mērāmais parametrs, t. i., plātnīšu zonas kopējā platība, saussvars vai svaigsvars, jāapkopo tabulā kopā ar testējamās vielas koncentrācijam katrā mērījumā. Turpmākā datu analīzē, piemēram, lai noteiktu LOEC, NOEC vai ECx, jāpamatojas uz katrā atsevišķā replikāta vērtībām, nevis katras apstrādes grupas aprēķināto vidējo vērtību.

Vidējais specifiskais augšanas ātrums

54.

Vidējo specifisko augšanas ātrumu noteiktā laika posmā aprēķina kā plātnīšu skaita un vēl cita mērāmā lieluma (kopējās plātnīšu zonas, saussvara vai svaigsvara) logaritmisko pieaugumu katram replikātam kontrolgrupās un apstrādes grupās, izmantojot formulu:

Formula

kur:

:

μi-j

:

ir vidējais specifiskais augšanas ātrums laika periodā no i līdz j;

:

Ni

:

mērāmais lielums testa traukā vai kontroltraukā laika punktā i;

:

Nj

:

mērāmais lielums testa traukā vai kontroltraukā laika punktā j;

:

t

:

laika posms no i līdz j.

Katrā apstrādes grupā un kontrolgrupā aprēķina vidējo augšanas ātrumu un aplēš tā dispersiju.

55.

Vidējais specifiskais augšanas ātrums jāaprēķina visam testa periodam (laika punkts “i” ir testa sākums, un laika punkts “j” ir testa beigas). Katrai testa koncentrācijai un kontrolgrupai aprēķina vidējā specifiskā augšanas ātruma vidējo vērtību un aplēš dispersiju. Papildus jānosaka augšanas ātrums pa posmiem, lai novērtētu testējamās ķīmiskās vielas ietekmi parādīšanos ekspozīcijas laikā (piemēram, pārbaudot logaritmiski transformētās augšanas līknes). Vidējā augšanas ātruma būtiskas atšķirības no individuālo posmu augšanas ātruma liecina par novirzi no konstantas eksponenciālas augšanas un to, ka rūpīgi jāanalizē augšanas līknes. Šajā gadījumā konservatīva pieeja būtu salīdzināt apstrādāto kultūru specifisko augšanas ātrumu maksimālās inhibēšanās periodā ar kontrolgrupu specifisko augšanas ātrumu tajā pašā laika periodā.

56.

Procentuālo augšanas ātruma inhibēšanos (Ir) katrai testējamajai koncentrācijai (apstrādes grupai) aprēķina pēc šādas formulas:

Formula

kur:

:

%Ir

:

vidējā specifiskā augšanas ātruma inhibēšanās procentos;

:

μC

:

vidējā μ vērtība kontrolgrupā

:

μT

:

vidējā μ vērtība apstrādes grupā

Ražība

57.

Ietekmi uz ražību nosaka, pamatojoties uz diviem mērāmajiem parametriem – plātnīšu skaitu un vēl kādu citu mērāmo lielumu (kopējo plātnīšu zonas platību, saussvaru vai svaigsvaru) katrā testa traukā testēšanas sākumā un beigās. Sākotnējās biomasas saussvaru vai svaigsvaru nosaka, ņemot plātnīšu paraugus no tās pašas partijas, ko izmanto testa trauku inokulēšanai (sk. 20. punktu). Katrai apstrādes grupai un kontrolgrupai aprēķina ražības vidējo vērtību un aplēš dispersiju. Vidējo ražības inhibīcijas procentuālo vērtību ( % Iy) katrai apstrādes grupai var aprēķināt šādi:

Formula

kur:

% Iy

ražības samazināšanās procentuālā vērtība;

bC

kontrolgrupas biomasa testa beigās, no kuras atņemta biomasa testa sākumā;

bT

apstrādes grupas biomasa testa beigās, no kuras atņemta biomasa testa sākumā.

Koncentrācijas–atbildreakcijas līkņu konstruēšana

58.

Koncentrācijas–atbildreakcijas līknes konstruē, atkarīgā mainīgā vidējo inhibīciju procentos (Ir vai Iy, ko aprēķina, kā noteikts 56. vai 57. punktā) grafiski attēlojot testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas logaritmu.

ECx noteikšana

59.

ECx (piemēram, EC50) aprēķina pēc vidējā specifiskā augšanas ātruma (ErCx) un ražības (EyCx), kurus savukārt nosaka pēc plātnīšu skaita un vēl viena mērāmā lieluma (kopējās plātnīšu platības, saussvara vai svaigsvara). Tā ir tāpēc, ka ir testējamās ķīmiskās vielas, kas plātnīšu skaitu ietekmē citādi nekā citus mērāmos parametrus. Vēlamie toksiskuma rādītāji tāpēc ir četras dažādas ECx vērtības katram inhibēšanās līmenim x: ErCx (plātnīšu skaits); ErCx (kopējā plātnīšu platība, saussvars vai svaigsvars); EyCx (plātnīšu skaits); un EyCx (kopējā plātnīšu platība, saussvars vai svaigsvars).

Statistiskās metodes

60.

Mērķis ir regresijas analīzē iegūt kādu kvantitatīvu koncentrācijas–atbildreakcijas sakarību. Kad atbildreakcijas dati linearizējoši transformēti probita, logita vai Veibula vienībās (13), iespējams izmantot svērtu lineāro regresiju, tomēr priekšroku mēdz dot nelineārām regresijas procedūrām, jo tajās vieglāk tikt galā ar neizbēgamajām datu anomālijām un novirzēm no gludiem sadalījumiem. Ja inhibēšanās vai nu tuvojas nullei, vai ir pilnīga, transformācija var šādas anomālijas samilzināt, jūtami sagrozot analīzes rezultātus (13). Būtu jāatceras, ka analīzes standartmetodes, kurās izmanto probita, logita vai Veibula transformācijas, ir domātas darbam ar binārajiem datiem (piem., izdzīvošanas/neizdzīvošanas datiem) un, lai tās būtu izmantojamas darbam ar augšanas ātruma vai ražības datiem, tās jāmodificē. Īpašas metodes ECx vērtību noteikšanai no bezpārtraukumu datiem ir izklāstītas (14), (15) un (16) avotā.

61.

Lai aplēstu ECx punktveida vērtības, katram analizējamajam atkarīgajam mainīgajam jāizmanto koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība. Ja iespējams, katrai aplēstajai vērtībai jānosaka 95 % ticamības robeža. Iegūto datu atbilstība regresijas modelim jānovērtē grafiski vai statistiski. Regresijas analīze jāveic, izmantojot katrā atsevišķā replikātā iegūtās atbildreakcijas vērtības, nevis apstrādes variantu grupu vidējās vērtības.

62.

EC50 aplēses un ticamības robežas var noteikt, arī izmantojot lineāro interpolāciju ar “bootstrapping” metodi (17), ja pieejamie regresijas modeļi/metodes nav piemērotas datiem.

63.

LOEC un tādējādi NOEC aplēšanai ir nepieciešams salīdzināt apstrādes replikātu vidējās vērtības, izmantojot dispersijas analīzes (ANOVA) metodes. Katras koncentrācijas vidējā vērtība jāsalīdzina ar kontrolgrupas vidējo vērtību, izmantojot atbilstošu multiplās salīdzināšanas vai trenda testa metodi. Iespējams, būs noderīgs Daneta [Dunnett] vai Viljamsa [Williams] tests (18)(19)(20)(21). Jānovērtē, vai ir spēkā pieņēmums par dispersijas homogenitāti, kas ir ANOVA pamatā. Šo novērtējumu var veikt grafiski vai izmantojot formālu testu (22). Piemērots ir Levena [Levene] vai Bārtleta [Bartlett] tests. Dispersijas homogenitātes pieņēmuma neatbilstību dažkārt var koriģēt, izmantojot datu logaritmisko transformāciju. Ja dispersijas heterogenitāte ir pārlieku liela un to nevar koriģēt ar transformāciju, jāveic analīze ar tādām metodēm kā descendents Džonkhīra [Jonckheere] trenda tests. Papildu norādījumus par NOEC noteikšanu sk. (16).

64.

Jaunākie sasniegumi zinātnē ir bijuši par pamatu ieteikumam atteikties no NOEC jēdziena un aizstāt to ar ECx punktveida vērtību aplēsanu ar regresiju. Šim ūdensziedu testam nav noteikta piemērota x vērtība. Piemērots šķiet diapazons no 10 līdz 20 % (atkarībā no izraudzītā atkarīgā mainīgā), un ieteicams pārskatā iekļaut gan EC10, gan EC20.

Pārskatu sagatavošana

65.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj turpmāk norādītā informācija.

 

Testējamā ķīmiskā viela:

fizikālās īpašības un fizikālķīmiskās īpašības, tostarp ūdensšķīdības robežas;

ķīmiskās vielas identifikācijas dati (piemēram, CAS numurs), tostarp tīrības pakāpe (piemaisījumi).

 

Testa suga:

zinātniskais nosaukums, klons (ja zināms) un izcelsmes avots.

 

Testa apstākļi:

izmantotā testēšanas procedūra (statiskā, pusstatiskā vai caurplūdes metode);

testa sākuma un beigu datums un tā ilgums;

testēšanas barotne;

eksperimentālā plāna apraksts: testa trauki un vāki, šķīdumu tilpums, plātnīšu un koloniju skaits katrā testa traukā testa sākumā;

izraudzītās testējamās koncentrācijas (nominālās un izmērītās, pēc vajadzības) un katra koncentrācijas varianta replikātu skaits;

izejšķīdumu un testa šķīdumu pagatavošanas metodes, tostarp šķīdinātāju vai disperģētājvielu izmantošana;

temperatūra testēšanas laikā;

gaismas avots, gaismas intensitāte un homogenitāte;

pH vērtības testējamiem un kontrolgrupas šķīdumiem;

testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija un analīzes metode ar attiecīgiem kvalitātes novērtēšanas datiem (analīžu validācijas pētījumi, standartnovirzes vai ticamības robežas);

metodes plātnīšu skaita un citu mērāmo parametru, piemēram, saussvara, svaigsvara vai plātnīšu kopējās platības noteikšanai;

visas atkāpes no šīs testa metodes.

 

Rezultāti:

neapstrādātie dati: plātnīšu skaits un citi mērāmie parametri katrā testējamā un kontrolgrupas traukā katrā novērošanas vai analīzes reizē,

katra mērāmā lieluma vidējās vērtības un standartnovirzes;

augšanas līknes katrai koncentrācijai (ieteicams – ar logaritmiski pārveidotu mērāmo parametru, sk. 55. punktu);

divkāršošanās laiks / augšanas ātrums kontrolgrupā, kas aprēķināts pēc plātnīšu skaita;

aprēķinātie atbildreakcijas rādītāji katram apstrādes replikātam, to vidējās vērtības un replikātu variācijas koeficienti;

koncentrācijas un ietekmes savstarpējās sakarības grafisks attēlojums;

atkarīgo mainīgo, piemēram, EC50, EC10, EC20 toksicitātes aplēstie beigupunkti un ar tiem saistītie ticamības intervāli. LOEC un/vai NOEC; ja tās ir aprēķinātas, un to noteikšanai izmantotās statistiskās metodes;

ja ir izmantota ANOVA, detektējamais ietekmes apmērs (piemēram, mazākā nozīmīgā atšķirība);

apstrādes variantos konstatētā augšanas stimulēšana;

fitotoksiskuma vizuālas pazīmes, kā arī testa šķīdumu novērojumi;

rezultātu apspriešana, arī ietekme uz testēšanas rezultātiem, kuru rada atkāpes no šīs testēšanas metodes.

LITERATŪRA

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90–337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

(4)

SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 pp.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency).

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(9)

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3–77 108. September 1977.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

(13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

(16)

OECD. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1. papildinājums

DEFINĪCIJAS

Šajā testa metodē izmantotas turpmāk norādītās definīcijas un saīsinājumi.

 

Biomasa ir populācijas dzīvās vielas saussvars. Šajā testā parasti tiek mērīti arī biomasas aizstājējparametri, piemēram, plātnīšu skaits vai platība, un termina “biomasa” lietojums attiecas arī uz šiem aizstājējparametriem.

 

Ķīmiskā viela ir viela vai to maisījums.

 

Hloroze ir ūdensziedu plātnīšu dzeltēšana.

 

Klons ir organisms vai šūna, kas cēlusies no atsevišķa īpatņa bezdzimumvairošanās ceļā. Tāpēc indivīdi, kas cēlušies no viena un tā paša klona, ir ģenētiski identiski.

 

Kolonija ir savstarpēji saistītu ūdensziedu mātesplātnīšu un meitasplātnīšu (parasti 2–4) kopums. Dažkārt to dēvē par augu.

 

ECx ir testēšanas barotnē izšķīdinātas testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kuras rezultāts ir ūdensziedu (Lemna) augšanas samazinājums par x % (piemēram, 50 %) noteiktā ekspozīcijas periodā (skaidri jānorāda, ja tas atšķiras no pilna vai normāla testa ilguma). Lai nepārprotami norādītu EC vērtību, kas iegūta no augšanas ātruma vai ražības, izmanto simbolu “ErC” augšanas ātrumam, bet “EyC” – ražībai, kam seko mērāmais mainīgais parametrs, piemēram, ErC (plātnīšu skaits).

 

Caurplūde ir tests, kurā testa šķīdumi pastāvīgi tiek nomainīti.

 

Plātnīte ir ūdenszieda atsevišķa daļa, kas pēc ārējā izskata ir lapveidīga. Tā ir ūdenszieda mazākā vienība, kas spējīga vairoties, respektīvi, īpatnis.

 

Kumpainība ir īpašība, kas piemīt ūdenszieda plātnītēm, kuras izskatās kumpainas vai uzpūtušās.

 

Augšana ir mērāmā parametra vērtības palielināšanās, piemēram, ūdensziedu plātnīšu skaita, saussvara, mitrā svara vai plātnīšu platības palielināšanās testa periodā.

 

Augšanas ātrums (vidējais specifiskais augšanas ātrums) ir biomasas logaritmisks pieaugums eksponēšanas laikā.

 

Zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC) ir zemākā testētā koncentrācija, pie kuras novērotajai ķīmiskajai vielai noteiktā ekspozīcijas laikposmā novēro statistiski nozīmīgu samazinošu ietekmi uz augšanu (pie p < 0,05), salīdzinot ar kontrolgrupu. Tomēr visām testa koncentrācijām, kas pārsniedz LOEC, jāuzrāda kaitīga ietekme, kura ir vienāda ar vai lielāka par to, kas novērojama pie LOEC. Ja ir neiespējami nodrošināt šos abus nosacījumus, jāsniedz izsmeļošs izskaidrojums, kā izraudzīta LOEC (un tādējādi NOEC).

 

Mērāmie parametri jeb mainīgie ir jebkuri parametri, kas tiek mērīti, lai izteiktu testēšanas beigupunktu ar vienu vai vairākiem atšķirīgiem atkarīgajiem mainīgajiem. Šajā metodē mērāmie parametri ir ūdensziedu plātnīšu skaits, plātnīšu platība, svaigsvars un saussvars.

 

Monokultūra ir vienas sugas augu kultūra.

 

Nekroze ir nedzīvi (t. i., balti vai ūdenī izmirkuši) plātnīšu audi.

 

Nenovērojamās ietekmes koncentrācija (NOEC) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas ir tieši zem LOEC koncentrācijas.

 

Fenotips ir organisma novērojamo pazīmju kopums, ko nosaka tā gēnu un vides savstarpējā mijiedarbība.

 

Atkarīgais mainīgais ir mainīgais, ar ko aplēš toksicitāti un ko, izmantojot dažādas aprēķina metodes, iegūst no jebkuriem izmērītajiem parametriem, kuri raksturo biomasu. Šai testa metodei atkarīgie mainīgie ir augšanas ātrums un ražība, kurus iegūst no tādiem mērāmajiem parametriem kā plātnīšu skaits, plātnīšu platība, svaigsvars vai saussvars.

 

Pusstatiskais tests ir tests, kurā testa šķīdumu testa gaitā periodiski maina ar noteiktu regularitāti.

 

Statiskais tests ir testa metode, kurā šķīdumu testa gaitā nemaina.

 

Testējamā ķīmiskā viela ir jebkura viela vai to maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

 

Testa beigupunkts ir galvenais faktors, kas mainās testējamās ķīmiskās vielas ietekmē salīdzinājumā ar kontrolgrupu un ko uzzināt ir testēšanas mērķis. Šajā metodē testa beigupunkts ir augšanas inhibēšanās, ko var izteikt ar dažādiem atkarīgajiem mainīgajiem, kuru pamatā ir viens vai vairāki mērāmie parametri.

 

Testēšanas barotne ir pilnīga sintētiska kultūras barotne, kurā aug testa augi, kad tie tiek eksponēti testējamai ķīmiskajai vielai. Testējamo ķīmisko vielu parasti izšķīdina testēšanas barotnē.

 

Ražība ir mērījuma mainīgā vērtība ekspozīcijas perioda beigās, no kuras atņemta mērījuma mainīgā vērtība ekspozīcijas perioda sākumā, lai izteiktu biomasas pieaugumu testēšanas laikā.

2. papildinājums

Ūdensziedu (Lemna spp.) apraksts

Ūdensaugi, kurus parasti dēvē par ūdensziediem (Lemna), pieder pie ūdensziedu (Lemnaceae) dzimtas, kas ietver četras ģintis ar daudzām pasaulē plaši izplatītām sugām. Šo augu ārējais izskats un taksonomija ir izsmeļoši aprakstīta (1) (2). Kuprainais ūdenszieds (Lemna gibba) un mazais ūdenszieds (L. minor) ir tipiskas mērenā klimata joslu sugas, un tās bieži izmanto toksiskuma pārbaudēs. Abām sugām raksturīgas ūdenī brīvi peldošas vai iegrimušas diskveida plātnītes ar sīku pavedienveida saknīti katras plātnītes apakšpuses vidusdaļā. Ūdensziedu (Lemna) sugām ziedi veidojas reti; šie augi vairojas, veģetatīvi radot jaunas plātnītes (3). Salīdzinājumā ar vecākiem eksemplāriem jaunie augi ir bālāki, ar īsākām saknēm un sastāv no divām vai trim dažādu lielumu plātnītēm. Ūdensziediem raksturīgs mazs izmērs, vienkārša uzbūve, bezdzimumvairošanās un īss paaudžu maiņas laiks, tāpēc šie augi ir ļoti piemēroti laboratorijas testiem (4)(5).

Tā kā jutības starpsugu variācijas ir ļoti varbūtīgas, derīgs ir vienīgi jutības salīdzinājums vienas sugas robežās.

Testēšanai izmantoto ūdensziedu sugu piemēri: sugu norādes

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (zviedru valodā).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 733–742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Lemna sugu avoti

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Kanāda, M5S 3 B2

Tālr: +1-416-978-3641

Fakss: +1-416-978-5878

e-pasts: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

ASV

Tālr.: 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOKHOLMA

ZVIEDRIJA

Tālr: +46 8 674 7240

Fakss: +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlīne

Vācija

E-pasts: lemna@uba.de

LITERATŪRA

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82–991150–0–0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

3. papildinājums

Izejkultūras uzturēšana

Izejkultūras pazeminātā temperatūrā (4–10 °C) var uzturēt, ilgāku laiku neatjaunojot. Ūdensziedu (Lemna) kultivēšanai var izmantot to pašu barotni, ko lieto testēšanai, bet izejkultūrai var lietot citu ar barības vielām bagātu barotni.

Periodiski vairākus jaunus, gaiši zaļas krāsas augus aseptiski pārnes uz kultivēšanas traukiem ar svaigu barotni. Uzglabājot kultūru šeit ieteiktajā pazeminātas temperatūras režīmā, pārnešanas intervāls var būt līdz trim mēnešiem.

Jālieto ķīmiski tīri (ar skābi mazgāti) un sterili stikla kultivēšanas trauki, un manipulācijas jāveic aseptiski. Ja izejkultūra ir kontaminēta, piemēram, ar aļģēm vai sēnēm, jāveic pasākumi kontaminējošo organismu likvidēšanai. Aļģes un vairākus citus kontaminējošos organismus iespējams likvidēt, sterilizējot virsmu. Ņem kontaminētā augu materiāla paraugu un nogriež saknītes. Materiālu enerģiski krata tīrā ūdenī, pēc tam iegremdē 0,5 % (tilpumu attiecība (v/v)) nātrija hipohlorīta šķīdumā uz laiku no 30 sekundēm līdz 5 minūtēm. Augu materiālu pēc tam skalo ar sterilu ūdeni un vairākās partijās pārvieto kultivēšanas traukos ar svaigu barotni. Daudzas plātnītes šīs apstrādes rezultātā iet bojā, jo īpaši, ja ekspozīcijas periods ir ilgāks, bet izdzīvojušie eksemplāri parasti ir attīrīti no kontaminācijas. Tos var izmantot jaunu kultūru inokulēšanai.

4. papildinājums

Barotnes

Mazā ūdenszieda (L. minor) un kuprainā ūdenszieda (L. gibba) kultivēšanai ieteicamas dažādas barotnes. Mazā ūdenszieda kultivēšanai ieteicama modificēta Zviedrijas standartos (SIS) minētā barotne, bet kuprainā ūdenszieda kultivēšanai ieteicama 20X AAP barotne. Abu barotņu sastāvs norādīts tālāk. Sagatavojot šīs barotnes, jāizmanto reaģenta vai analītiskās tīrības pakāpes vielas un dejonizēts ūdens.

Zviedrijas standarta (Swedish Standard, SIS) ūdensziedu (Lemna) barotne

Izejšķīdumus I–V sterilizē autoklāvā (120 °C, 15 minūtes) vai ar membrānfiltrāciju (poru izmērs aptuveni 0,2 μm).

Izejšķīdumu VI (un pēc izvēles VII) sterilizē tikai ar membrānfiltrāciju; tos nedrīkst sterilizēt autoklāvā.

Sterilie izejšķīdumi jāglabā tumšā, vēsā vietā. Izejšķīdumi I–V derīgi sešus mēnešus, bet izejšķīdumam VI (vai pēc izvēles VII) derīguma termiņš ir viens mēnesis.

Izejšķīdums Nr.

Viela

Koncentrācija izejšķīdumā

(g/l)

Koncentrācija gatavajā barotnē

(mg/ߦl)

Gatavā barotne

 

 

 

 

Elements

Koncentrācija

(mg/ߦl)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 . 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 . 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 . 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 . 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (buferšķīdums)

490

490

Lai pagatavotu vienu litru SIS barotnes, 900 ml dejonizēta ūdens pievieno izejšķīdumus:

10 ml izejšķīduma I;

5 ml izejšķīduma II;

5 ml izejšķīduma III;

5 ml izejšķīduma IV;

1 ml izejšķīduma V;

5 ml izejšķīduma VI;

1 ml izejšķīduma VII (pēc vajadzības).

Ievērībai: papildu izejšķīdums VII (MOPS buferšķīdums) var būt vajadzīgs dažām testējamajām ķīmiskajām vielām (sk. 11. punktu).

Koriģē pH 6,5 ± 0,2 ar 0,1 M vai 1 M HCl vai NaOH šķīdumu, tilpumu uzpilda līdz vienam litram ar dejonizētu ūdeni.

20X AAP barotne

Izejšķīdumus gatavo sterilā destilētā vai dejonizētā ūdenī.

Sterilie izejšķīdumi jāglabā tumšā vēsā vietā. Šādos apstākļos glabājot, izejšķīdumu derīguma termiņš ir vismaz 6–8 nedēļas.

20X – AAP barotnei gatavo piecus barības vielu izejšķīdumus (A1, A2, A3, B un C), izmantojot ķīmiski tīras vielas. Barotni pagatavo, aptuveni 850 ml dejonizēta ūdens pievienojot 20 ml katra barības vielu izejšķīduma. Koriģē pH 7,5 ± 0,1 ar 0,1 M vai 1 M HCl vai NaOH šķīdumu, tilpumu uzpilda līdz vienam litram ar dejonizētu ūdeni. Barotni filtrē caur 0,2 μm (aptuveni) membrānfiltru sterilā traukā.

Lai stabilizētos, testēšanai izmantojamās barotnes pH, to pagatavo 1–2 dienas pirms lietošanas. Barotnes pH pirms lietošanas jāpārbauda un, ja nepieciešams, noregulē ar 0,1 M vai 1 M HCl vai NaOH šķīdumu, kā minēts iepriekš.

Izejšķīdums Nr.

Viela

Koncentrācija izejšķīdumā

(g/l) (7)

Koncentrācija gatavajā barotnē

(mg/ߦl) (7)

Gatavā barotne

 

 

 

 

Elements

Koncentrācija

(mg/ߦl) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 . 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 . 3H2.O

1,4

30

K;P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA.2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

Steinberga barotne (ISO 20079)

Koncentrācijas un izejšķīdumi

Modificēto Steinberga barotni saskaņā ar ISO 20079 izmanto tikai mazā ūdenszieda kultivēšanai (tā kā pēc šīs metodes atļauta vienīgi mazā ūdenszieda izmantošana), taču testos gūtā pieredze liecina, ka labi rezultāti sasniedzami arī ar kupraino ūdensziedu.

Gatavojot šo barotni, jāizmanto ķīmiski tīras vai analītiski tīras vielas un dejonizēts ūdens.

Barotni gatavo no izejšķīdumiem vai no desmitkārtīgas koncentrācijas barotnes; tā ir barotnes maksimālā koncentrācija, kas iespējama bez vielu izgulsnēšanās.

1 tabula

Steinberga barotne ar stabilizētu pH (modificēta saskaņā ar Altenburger)

Komponents

Barotne

Makroelementi

molekulmasa

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelementi

molekulmasa

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA dinātrija dihidrāts

372,24

1 500,00

4,03


2. tabula.

Izejšķīdumi (makroelementi)

1.

Makroelementi (×50 koncentrēti)

g/l

1. izejšķīdums:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

2. izejšķīdums:

MgSO4 · 7H2O

5,00

3. izejšķīdums:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


3. tabula.

Izejšķīdumi (mikroelementi)

2.

Mikroelementi (1 000 koncentrēti)

mg/l

4. izejšķīdums:

H3BO3

120,0

5. izejšķīdums:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

6. izejšķīdums:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

7. izejšķīdums:

MnCl2 · 4H2O

180,0

8. izejšķīdums:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA dinātrija dihidrāts

1 500,00

Vienā šķīdumā var apvienot 2. un 3. izejšķīdumu un atsevišķi 4. līdz 7. (ņemot vērā nepieciešamās koncentrācijas).

Ilgākai glabāšanai izejšķīdumus 20 min. sterilizē autoklāvā 121 °C temperatūrā, vai –alternatīvi – izmanto sterilo filtrēšanu (0,2 μm). Ir ļoti ieteicams 8. izejšķīdumu sterilizēt ar filtrēšanu (0,2 μm).

Modificētās Steinberga barotnes pagatavošana galīgajā koncentrācijā

Aptuveni 900 ml dejonizēta ūdens pievieno pa 20 ml 1., 2. un 3. izejšķīduma (sk. 2. tabulu), lai nenotiktu izgulsnēšanās.

Pievieno pa 1,0 ml 4., 5., 6., 7. un 8. izejšķīduma (sk. 3. tabulu).

pH jābūt 5,5 ± 0,2 (to koriģē, pievienojot pēc iespējas mazāku tilpumu NaOH šķīduma vai HCl).

Uzpilda ar ūdeni līdz 1 000 ml.

Ja izejšķīdumus sterilizē un tiek lietots piemērots ūdens, gatavā barotne nav jāsterilizē. Ja barotni sterilizē tās galīgajā koncentrācijā, 8. izejšķīdums jāpievieno pēc autoklavēšanas (121 °C, 20 min).

Koncentrētas (×10) modificētās Steinberga barotnes pagatavošana pagaidu glabāšanai

Aptuveni 30 mililitriem ūdens pievieno pa 20 ml 1., 2. un 3. izejšķīduma (sk. 2. tabulu), lai nenotiktu izgulsnēšanās.

Pievieno pa 1,0 ml 4., 5., 6. 7. un 8. izejšķīduma (sk. 3. tabulu). Uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml.

Ja izejšķīdumus sterilizē un tiek lietots piemērots ūdens, gatavā barotne nav jāsterilizē. Ja barotni sterilizē tās galīgajā koncentrācijā, 8. izejšķīdums jāpievieno pēc autoklavēšanas (121 °C, 20 min.).

Barotnes pH (galīgajā koncentrācijā) jābūt 5,5 ± 0,2.

(6)

pievieno turpmāk norādīto C.31 līdz C.46 nodaļu:

C.31.   SAUSZEMES AUGU TESTS: DĪGSTU UZDĪGŠANAS UN DĪGSTU AUGŠANAS TESTS

IEVADS

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 208 (2006. gads). Testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā zinātnes attīstību un piemērojamību izmantošanai regulējumā. Šī atjauninātā testa metode ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmisko vielu iespējamo ietekmi uz dīgstu uzdīgšanu un augšanu. Tā neattiecas uz hronisku ietekmi vai ietekmi uz vairošanos (t. i., sēklu un ziedu veidošanos, augļu nobriešanu). Lai nodrošinātu, ka tiek izmantotas atbilstošas testēšanas metodes (piemēram, testējot metālus/metāla savienojumus, jāņem vērā pH un saistīto pretēji lādēto jonu ietekme), jāņem vērā ekspozīcijas apstākļi un testējamās ķīmiskās vielas īpašības (1). Šī testa metode neattiecas uz augiem, kas pakļauti ķīmisko vielu izgarojumiem. Testa metode ir piemērojama vispārēju ķīmisko vielu, biocīdu un kultūraugu aizsardzības līdzekļu (ko dēvē arī par augu aizsardzības līdzekļiem vai pesticīdiem) testēšanai. Tā ir izstrādāta, pamatojoties uz esošām metodēm (2)(3)(4)(5)(6)(7). Tika ņemtas vērā arī citas atsauces, kas attiecas uz augu testēšanu (8)(9)(10). Izmantotās definīcijas ir dotas 1. papildinājumā.

TESTA PRINCIPS

2.

Testā izvērtē ietekmi uz augstāko augu dīgstu uzdīgšanu un agrīnu augšanu pēc ekspozīcijas testējamai ķīmiskajai vielai augsnē (vai citā piemērotā augsnes matricā). Sēklas novieto saskarē ar augsni, kas apstrādāta ar testējamo ķīmisko vielu, un ietekmi parasti novērtē 14 līdz 21 dienu pēc tam, kad kontrolgrupā uzdīgst 50 % dīgstu. Izmērāmais mērķis ir vizuāls dīgstu uzdīgšanas novērtējums, asnu saussvars (alternatīvi – asnu svaigsvars) un atsevišķos gadījumos asnu garuma novērtējums, kā arī redzamas kaitīgas ietekmes uz dažādām auga daļām novērtējums. Šos mērījumus un novērojumus salīdzina ar neapstrādātu kontrolgrupas augu rezultātiem.

3.

Atkarībā no prognozējamā ekspozīcijas ceļa testējamā ķīmiskā viela ir jāiestrādā augsnē (vai, iespējams, mākslīgā augsnes matricā) vai ar to jāapstrādā augsnes virskārta, kas pienācīgi atspoguļo iespējamo ķīmiskās vielas ekspozīcijas ceļu. Iestrādi augsnē veic, apstrādājot tādu augsni, kas ņemta ārpus rizosfēras. Pēc augsnes apstrādes to pārvieto uz podiņiem, tad attiecīgo augu sugu sēklas iesētj augsnē. Virsmas apstrādi veic jau podiņos ievietotai augsnei, kurā sēklas jau ir iesētas. Testa vienības (kontrolgrupas un apstrādātas augsnes ar sēklām) pēc tam novieto atbilstošos apstākļos, lai veicinātu dīgšanu/augšanu.

4.

Atkarībā no pētījuma mērķa testu var veikt, lai noteiktu devas un atbildreakcijas līkni vai kā robežtestu vienai koncentrācijai/rādītājam. Ja vienas koncentrācijas/rādītāja testa rezultāti pārsniedz noteiktu toksiskuma līmeni (piemēram, novēro ietekmi, kas lielāka par x %), veic diapazona noteikšanas testu, lai noteiktu augšējo un apakšējo toksicitātes robežu, pēc tam veicot vairākus koncentrācijas/ rādītāja testus, lai izveidotu devas un atbildreakcijas līkni. Jāizmanto piemērota statistiskā analīze, lai noskaidrotu iedarbīgo koncentrāciju ECx vai iedarbīgo apstrādes rādītāju ERx (piemēram, EC25, ER25, EC50, ER50) attiecībā uz visjutīgāko interesējošo parametru vai parametriem. Tāpat arī šajā testā var aprēķināt nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC) un zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC).

INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶĪMISKO VIELU

5.

Turpmāk minētā informācija ir noderīga ķīmiskās vielas paredzamā ekspozīcijas ceļa identifikācijai un testa izstrādāšanai: struktūrformula, tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, šķīdība organiskos šķīdinātājos, 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficients, augsnes sorbcijas spēja, tvaika spiediens, ķīmiskā stabilitāte ūdenī un gaismā un bioloģiskās noārdīšanās spēja.

TESTA DERĪGUMS

6.

Lai testu varētu uzskatīt par derīgu, kontrolgrupām jāatbilst šādiem testa kritērijiem:

dīgstu uzdīgšana ir vismaz 70 %;

dīgstiem nav redzama fitotoksiska ietekme (piemēram, hloroze, nekroze, vīte, lapu un stublāja deformācijas), un augi uzrāda tikai konkrētās sugas augšanas un morfoloģijas parastās variācijas;

pētījuma laikā vidējais izdīgušo kontrolgrupas dīgstu izdzīvošanas rādītājs ir vismaz 90 %;

konkrētās sugas vidiskie apstākļi ir identiski, un barotne satur vienādu daudzumu augsnes matricas, augšanas veicināšanas barotnes vai tā paša avota substrāta.

ĶĪMISKĀ STANDARTVIELA

7.

Ķīmisko standartvielu var regulāri testēt, lai pārliecinātos, ka testa veiktspēja un konkrēto testa augu atbildreakcija, kā arī testa apstākļi laika gaitā nav būtiski mainījušies. Alternatīvi kontrolgrupās veiktus vēsturiskos biomasas vai augšanas mērījumus var izmantot, lai novērtētu testa sistēmas veiktspēju konkrētā laboratorijā, un tos var izmantot par laboratorijas iekšējās kvalitātes kontroles pasākumiem.

TESTĒŠANAS METODES APRAKSTS

Dabiska augsne – mākslīgs substrāts

8.

Augus var audzēt podos, izmantojot smilšainu smilšmālu, smilšmālainu smilti vai smilšainu, mālainu smilšmālu, kas satur līdz 1,5 procentiem organiskā oglekļa (aptuveni 3 procenti organisko vielu). Var izmantot arī komerciālo stādu augsni vai sintētisko augsnes maisījumu, kas satur līdz 1,5 procentus organiskā oglekļa. Mālainas augsnes nevajadzētu lietot, ja ir zināms, ka testējamajai ķīmiskajai viela ir augsta māltiece. Lauka augsne jāizsijā līdz 2 mm daļiņu lielumam, lai to homogenizētu un atdalītu rupjās daļiņas. Pārskatā jāiekļauj informācija par gatavās augsnes veidu un tekstūru, organiskā oglekļa %, pH līmeni un sāls saturu, kā arī elektrovadītspēju. Augsne ir jāklasificē atbilstoši standarta klasifikācijas shēmai (11). Augsni var pasterizēt vai karsēt, lai samazinātu augsnes patogēnu ietekmi.

9.

Dabiska augsne var sarežģīt rezultātu interpretēšanu un mainīgo fizikālķīmisko īpašību un mikroorganismu populāciju dēļ palielināt mainīgumu. Šie mainīgie savukārt ietekmē mitrumnoturspēju, ķīmisko vielu saistīšanas spēju, aerāciju un barības vielu un mikroelementu saturu. Papildus šo fizisko faktoru atšķirībām būs arī ķīmisko īpašību atšķirības, piemēram, atšķirīgs pH līmenis un redokspotenciāls, kas var ietekmēt testējamās ķīmiskās vielas bioloģisko pieejamību (12)(13)(14).

10.

Mākslīgos substrātus parasti neizmanto augu aizsardzības līdzekļu testēšanai, taču tie var būt noderīgi vispārēju ķīmisku vielu testēšanai vai gadījumos, kad ir nepieciešams samazināt dabisko augšņu mainīgumu un palielināt testa rezultātu salīdzināmību. Izmantojamajiem substrātiem ir jāsastāv no inertiem materiāliem, lai mazinātu mijiedarbību ar testējamo ķīmisko vielu, ar šķīdinātāja nesēju vai abiem. Skābē mazgātas kvarca smiltis, minerālvate un stikla pērlītes (piemēram, 0,35–0,85 mm diametrā) ir atzītas par piemērotu inertu materiālu, kas minimāli absorbē testējamo ķīmisko vielu (15), nodrošinot, ka ķīmiskā viela būs maksimāli pieejama dīgstiem caur saknēm. Nepiemēroti substrāti ir vermikulīts, perlīts vai citi materiāli ar augstu absorbcijas spēju. Jānodrošina uzturvielas augu augšanai, lai nodrošinātu, ka augi netiek pakļauti stresam barības vielu trūkuma dēļ, un, ja iespējams, tas ir jānovērtē, veicot ķīmiskās analīzes vai vizuāli novērtējot kontrolgrupas augus.

Kritēriji testa sugu atlasei

11.

Sugu atlasei jābūt saprātīgi plašai, piemēram, attiecībā uz to taksonomisko daudzveidību augu valstī, to izplatību, pieejamību, konkrētai sugai raksturīgo dzīves ciklu un dabisko areālu, lai iegūtu plašu atbildreakciju klāstu (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Izvēloties iespējamās testa sugas, jāņem vērā turpmāk norādītie rādītāji:

suga ir vienādas sēklas, kas ir viegli pieejamas no uzticamā standarta sēklu avotā vai avotiem un kam raksturīga konsekventa, uzticama un vienmērīga dīgšana, kā arī vienāda dīgstu augšana;

augs ir piemērots testēšanai laboratorijā, un ar to var iegūt ticamus un reproducējamus rezultātus vienā un vairākās testēšanas iekārtās;

testēšanā iekļautās sugas augu jutīgumam jāsaskan ar to augu atbildreakcijām, kas atrodami vidē un eksponēti ķīmiskajai vielai;

tie jau iepriekš zināmā mērā izmantoti toksicitātes testos, un to izmantošana, piemēram, herbicīdu biotestos, smago metālu skrīningā, sāļuma vai minerālvielu stresa testos vai allelopātijas pētījumos norāda uz to jutīgumu pret daudziem dažādiem faktoriem;

tie ir piemēroti šajā testa metodē izmantotajiem augšanas apstākļiem;

tie atbilst testa derīguma kritērijiem.

Dažas no vēsturiski testos visvairāk izmantotajām sugām ir uzskaitītas 2. pielikumā, un potenciālās sugas, kas nav kultūraugi, ir 3. papildinājumā.

12.

Testā iekļauto sugu skaits ir atkarīgs no attiecīgajām normatīvajām prasībām, tāpēc tas šajā testa metodē nav norādīts.

Testējamās ķīmiskās vielas ievadīšana

13.

Ķīmiskā viela ir jāpievieno piemērotam nesējam (piemēram, ūdenim, acetonam, etilspirtam, polietilēnglikolam, akāciju sveķiem (gumiarābikam), smiltij). Var testēt arī maisījumus (preparātus vai preparātu maisījumus), kas satur aktīvās vielas un dažādas palīgvielas.

Iestrāde augsnē/mākslīgā substrātā

14.

Ķīmiskās vielas, kas ir ūdenī šķīstošas vai suspendētas ūdenī, var pievienot ūdenim, un pēc tam šķīdumu sajauc ar augsni, izmantojot atbilstošas maisīšanas ierīces. Šī veida testēšana var būt lietderīga, ja ekspozīcija ķīmiskajai vielai notiek caur augsni vai augsnes porūdeni un ja pastāv bažas par uzņemšanu ar saknēm. Pievienojot testējamo ķīmisko vielu, nedrīkst pārsniegt augsnes ūdensnoturspēju. Pievienotā ūdens tilpumam ir jābūt vienādam visās testa koncentrācijās, bet tas jāierobežo, lai novērstu augsnes salipšanu.

15.

Ķīmiskās vielas ar vāju šķīdību ūdenī izšķīdina piemērotā gaistošā šķīdinātājā (piemēram, acetons, etanols) un sajauc ar smiltīm. Šķīdinātāju pēc tam no smiltīm var atdalīt, izmantojot gaisa plūsmu, vienlaikus nepārtraukti maisot smiltis. Apstrādātās smiltis sajauc ar eksperimentālo augsni. Izveido otro kontrolparaugu, kurā pievieno tikai smiltis un šķīdinātāju. Visiem testa apstrādes paraugiem un otrajam kontrolparaugam pievieno vienādu daudzumu smilšu, kas sajauktas ar šķīdinātāju, kurš pēc tam atdalīts. Cietu, nešķīstošu testējamo ķīmisko vielu gadījumā sauso augsni un ķīmisko vielu sajauc piemērotā maisīšanas ierīcē. Pēc tam augsni ieliek podos un nekavējoties iesēj sēklas.

16.

Ja augsnes vietā izmanto mākslīgo substrātu, ķīmiskās vielas, kas šķīst ūdenī, var izšķīdināt barības vielu šķīdumā tieši pirms testa sākuma. Ķīmiskās vielas, kas nešķīst ūdenī, bet kuras var suspendēt ūdenī, izmantojot šķīdinātāja nesējvielu, būtu jāpievieno barības vielu šķīdumam kopā ar nesējvielu. Ūdenī nešķīstošas ķīmiskās vielas, kurām nav pieejama netoksiska ūdenī šķīstoša nesējviela, jāizšķīdina piemērotā gaistošā šķīdinātājā. Šķīdumu sajauc ar smiltīm vai stikla pērlītēm, kas novietotas rotācijas vakuumierīcē, un iztvaicē, atstājot uz smiltīm vai lodītēm viendabīgu ķīmiskās vielas pārklājumu. Nosvērta pērlīšu daļa jāekstrahē ar to pašu organisko šķīdinātāju un ķīmiski jātestē, pirms tiek piepildīti stādīšanas konteineri.

Virsas apstrāde

17.

Attiecībā uz kultūraugu aizsardzības līdzekļiem apstrādei ar testējamo ķīmisko vielu bieži izmanto augsnes virsas apsmidzināšanu ar testa šķīdumu. Visām iekārtām, ko izmanto testu veikšanai, tostarp iekārtām, ko izmanto testējamās ķīmiskas vielas sagatavošanai un administrēšanai, jābūt tā konstruētām un ar tādu jaudu, lai testus ar šo ierīci varētu veikt pareizi un tie nodrošinātu reproducējamu pārklājumu. Visa augsnes virsa jānoklāj vienmērīgi. Būtu jāizvairās no situācijas, kad ķīmiskā vielu tiek adsorbēta vai reaģē ar aprīkojumu (piemēram, plastmasas caurulēm un lipofilajām ķīmiskajām vielām vai tērauda daļām un elementiem). Testējamo ķīmisko vielu izsmidzina uz augsnes virsas, imitējot tipisku uzklāšanu ar izsmidzinātāju. Kopumā izsmidzināšanas apjomam jābūt atbilstošiem parastā lauksaimniecības praksē izmantotajam un apjoms (ūdens daudzums utt.) ir jāietver pārskatā. Jāizvēlas tāds sprauslu veids, kas nodrošina vienmērīgu augsnes virsas noklāšanu. Ja tiek izmantoti šķīdinātāji un nesējvielas, jāizveido otra kontrolaugu kopa, kas saņem tikai šķīdinātāju/nesējvielu. Tas nav jādara, ja augu aizsardzības līdzekļus testē kā preparātus.

Testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas/rādītāja verifikācija

18.

Apstrādes koncentrācijas/rādītāji jāapstiprina, veicot attiecīgu analītisko verifikāciju. Šķīstošām vielām visas testa koncentrācijas/rādītājus var verificēt un apstiprināt, analizējot augstāko testā izmantoto šķīduma koncentrāciju, dokumentējot turpmāko atšķaidīšanu un izmantojot kalibrētas vielas uzklāšanas iekārtas (piemēram, kalibrēti analītiskie stikla trauki, smidzinātāja iekārtas kalibrēšana). Nešķīstošām ķīmiskajām vielām sastāvdaļu materiāla verifikācija jānodrošina ar augsnei pievienotās testējamās ķīmiskās vielas nosvēršanu. Ja nepieciešams uzrādīt homogenitāti, var būt nepieciešams veikt augsnes analīzes.

PROCEDŪRA

Testēšanas plāns

19.

Vienas sugas sēklas tiek iesētas podos. Podos iesēto augu sēklu skaits ir atkarīgs no augu sugas, poda izmēra un testa ilguma. Jānodrošina tāds augu skaits podā, lai būtu atbilstoši augšanas apstākļi un podi testa veikšanas laikā nebūtu pārblīvēti. Maksimālais augu blīvums ir aptuveni 3–10 sēklas uz 100 cm2, atkarībā no sēklu izmēra. Piemēram, ieteicams viens vai divi kukurūzas, sojas pupiņu, tomātu, gurķu vai cukurbiešu augi 15 cm traukā, trīs rapša vai zirņu augi 15 cm traukā un 5 līdz 10 sīpolu, kviešu, vai citu sīku sēklu 15 cm traukā. Sēklu skaitam un replikātu podu (replikāts saskaņā ar definīciju ir pods, tāpēc augi vienā podā neveido replikātu) skaitam jābūt pietiekamam optimālai statistiskai analīzei (21). Jāievēro, ka mainīgums būs lielāks tām testa sugām, kurām izmanto mazāku skaitu lielu sēklu vienā podā (replikātā), salīdzinot ar testa sugām, kurām katrā podā iespējams izmantot lielāku skaitu sīku sēklu. Stādot vienādu skaitu sēklu katrā podā, šo mainību var samazināt līdz minimumam.

20.

Kontrolgrupas izmanto, lai nodrošinātu, ka novērotā ietekme ir saistīta tikai ar ekspozīciju testējamai ķīmiskajai vielai vai attiecināma uz to. Atbilstošajai kontrolgrupai ir visos aspektos jābūt identiskai testa grupai, izņemot to, ka tā netiek eksponēta testējamai ķīmiskajai vielai. Attiecīgajā testā visiem testa augiem, tostarp kontrolgrupai, vajadzētu būt no viena avota. Lai novērstu neobjektivitāti, testa un kontrolgrupas podi jāizraugās pēc nejaušības principa.

21.

Būtu jāizvairās izmantot sēklas, kas pārklātas ar insekticīdu vai fungicīdu (t. i., “apstrādātas” sēklas). Tomēr dažas regulējošās iestādes atļauj noteiktu ārpussistēmas saskares fungicīdu (piemēram, kaptāna, tirama) lietošanu (22). Ja ir bažas par patogēniem sēklās, sēklas uz neilgu laiku var iemērkt vājā 5 % hipohlorīta šķīdumā, pēc tam kārtīgi noskalot tekošā ūdenī un izžāvēt. Nav atļauta nekāda korektīva apstrāde ar citu augu aizsardzības līdzekli.

Testa apstākļi

22.

Testa apstākļi būtu jātuvina tiem apstākļiem, kas nepieciešami normālai testa sugu un varietāšu augšanai (4. papildinājumā ir norādīti testa apstākļu piemēri). Arī dīgstošie augi jātur atbilstoši labai dārzkopības praksei kontrolētas vides kamerās, augšanas kamerās vai siltumnīcās. Izmantojot augšanas iekārtas, šāda prakse parasti ietver kontroli un šādu datu pietiekami biežu (piemēram, ik dienas) reģistrāciju: temperatūra, mitrums, oglekļa dioksīda koncentrācija, gaisma (intensitāte, viļņu garums, fotosintēzes aktivitātei atbilstošā spektra daļa) un gaismas periodu, laistīšanas līdzekļi utt., lai nodrošinātu labu augšanu, ko novērtē ar izraudzītās sugas kontrolaugiem. Siltumnīcā temperatūru kontrolē, izmantojot ventilēšanas, apkures un/vai dzesēšanas sistēmas. Turpmāk norādīti apstākļi, kas ieteicami testēšanai siltumnīcās:

temperatūra: 22 °C ± 10 °C;

mitrums: 70 % ± 25 %;

fotoperiods: gaisma vismaz 16 stundas;

gaismas intensitāte: 350 ± 50 μE/m2/s. Ja gaismas intensitāte nokrītas zem 200 μE/m2/s, viļņu garuma 400–700 nm, var būt nepieciešama papildu apgaismošana, izņemot noteiktām sugām, kuru prasības pēc gaismas ir zemākas.

Pētījuma laikā jāmonitorē un pārskatā jāiekļauj informācija par vides apstākļiem. Augi audzējami neporainos plastmasas vai glazētos podos ar paplāti vai paliktni zem tiem. Laiku pa laikam podi ir jāpārvieto, lai līdz minimumam samazinātu mainību augu augšanā (audzēšanas iekārtu testēšanas apstākļu atšķirību dēļ). Podiem ir jābūt pietiekami lieliem, lai nodrošinātu normālu augšanu.

23.

Augsnes barības vielas var papildināt, cik nepieciešams, lai uzturētu labu dzīvotspēju. Par papildu barības vielu nepieciešamību un padeves laiku var spriest, novērojot kontrolaugus. Testa konteineros ieteicama laistīšana no apakšas (piemēram, izmantojot stikla šķiedras daktis). Tomēr sākotnēji var izmantot laistīšanu no augšas, lai stimulētu sēklu dīgšanu; paraugos, kur veikta augsnes virsas apstrāde, tas atvieglos ķīmiskās vielas virzību augsnē.

24.

Konkrētajiem augšanas apstākļiem ir jābūt piemērotiem testa sugām un testējamajām ķīmiskajām vielām. Kontrolaugi un apstrādātie augi ir jāglabā vienādos vides apstākļos, tomēr būtu jāveic piemēroti pasākumi, lai novērstu šķērsekspozīciju (piemēram, gaistošām ķīmiskajām vielām) starp dažādiem apstrādes testējamās ķīmiskās vielas paraugiem un kontrolgrupām.

Vienas koncentrācijas/rādītāja testēšana

25.

Lai noteiktu ķīmiskās vielas koncentrāciju/rādītāju, ar kuru veikt vienas koncentrācijas/rādītāja (provocēšanas/robežas) testu, ir jāņem vērā vairāki faktori. Vispārējām ķīmiskām vielām tie ietver arī vielas fizikālķīmiskās īpašības. Attiecībā uz augu aizsardzības līdzekļiem jāņem vērā testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās īpašības un izmantošanas modelis, testējamās ķīmiskās vielas maksimālā koncentrācija vai lietojuma deva, lietošanas reižu skaits vienā sezonā un/vai noturība. Lai noteiktu, vai vispārējai ķīmiskai vielai piemīt fitotoksiskas īpašības, to var būt lietderīgi pārbaudīt testā maksimālajā līmenī – 1 000 mg/kg sausas augsnes.

Diapazona noteikšanas tests

26.

Ja nepieciešams, diapazona noteikšanas testu var veikt, lai gūtu norādījumus par koncentrācijām/rādītājiem, kas jātestē galīgajā devas un atbildreakcijas pētījumā. Diapazona noteikšanas testā testa koncentrācijām/rādītājiem jābūt ar plašiem intervāliem (piemēram, 0,1, 1,0, 10, 100 un 1 000 mg/kg sausas augsnes). Augu aizsardzības līdzekļu koncentrācijas/rādītāji varētu būt balstīti uz ieteicamo vai maksimālo koncentrāciju vai lietošanas rādītāju, piemēram, 1/100, 1/10, 1/1 no ieteicamās/maksimālās koncentrācijas vai lietošanas rādītāja.

Vairāku koncentrāciju/daudzumu testēšana

27.

Vairāku koncentrāciju/rādītāju testa mērķis ir noteikt devas un atbildreakcijas sakarību un noteikt ECx vai ERx vērtību uzdīgšanai, biomasai un/vai redzamajai ietekmei, salīdzinot ar kontrolgrupām, kuras nav eksponētas vielai, saskaņā ar pārvaldes iestāžu prasībām.

28.

Koncentrāciju vai rādītāju skaitam un intervāliem būtu jābūt pietiekamiem, lai varētu iegūt uzticamu devas un atbildreakcijas sakarību un regresijas vienādojumu, kā arī aplēst ECx vai ERx vērtības. Izraudzītajām koncentrācijām/rādītājiem būtu jāietver nosakāmās ECx vai ERx vērtības. Piemēram, ja ir nepieciešama EC50 vērtība, būtu vēlams veikt testēšanu pie rādītājiem, kas rada 20 līdz 80 % ietekmi. Lai to sasniegtu, ieteicamais testa koncentrāciju/rādītāju skaits ir vismaz pieci ģeometriskā progresijā un neapstrādātā kontrole intervālos ar kvocientu, kas nepārsniedz trīs. Katrā apstrādes grupā un kontrolgrupā ir jābūt vismaz četriem replikātiem un kopā vismaz 20 sēklām. Tādiem augiem, kam ir zema dīgtspēja vai mainīgi augšanas paradumi, var būt nepieciešams izmantot vairāk replikātu, lai uzlabotu testa statistisko jaudu. Ja tiek izmantots lielāks skaits testa koncentrāciju/rādītāju, replikātu skaitu var samazināt. Ja ir jānosaka NOEC, var būt nepieciešams izveidot vairāk replikātu, lai panāktu vēlamo statistisko jaudu (23).

Novērojumi

29.

Novērošanas periodā, proti, 14 līdz 21 dienu pēc tam, kad ir izdīguši 50 % no kontrolgrupas augiem (arī šķīdinātāja kontrolgrupas augiem, ja tāda ir), augus novēro bieži (vismaz reizi nedēļā, bet, ja iespējams, ik dienas) attiecībā uz to uzdīgšanu un redzamo fitotoksiskumu un mirstību. Testa beigās reģistrē izdzīvojušo augu uzdīgšanas un biomasas procentuālos mērījumus, kā arī redzamo kaitīgo ietekmi uz dažādām auga daļām. Tas ietver uzdīgušo dīgstu izskata anomālijas, kavētu augšanu, hlorozi, krāsas zaudēšanu, mirstību un ietekmi uz augu attīstību. Galīgo biomasu var izmērīt, izmantojot izdzīvojušo augu galīgo vidējo sauso dzinumu svaru, ievācot dzinumus pie augsnes virskārtas un tos žāvējot līdz nemainīgam svaram 60 °C temperatūrā. Galīgo biomasu var mērīt, arī izmantojot svaigu dzinumu svaru. Ja to prasa pārvaldes iestādes, beigupunkts var būt arī dzinumu garums. Būtu jāizmanto vienota vizuālo bojājumu uzskaites sistēma, lai novērtētu toksicitātes atbildreakcijas. Piemēri kvalitatīvā un kvantitatīvā vizuālā novērtējuma veikšanai ir doti atsaucēs (23)(24).

DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA

Statistiskā analīze

Vienas koncentrācijas/rādītāja tests

30.

Dati par katru augu sugu ir jāanalizē, izmantojot piemērotu statistisko metodi (21). Jāreģistrē testa koncentrācijas/rādītāja ietekmes līmenis vai arī attiecīgās ietekmes nesasniegšana pie testa koncentrācijas/rādītāja (piemēram, < x % ietekme, novērota pie y koncentrācijas vai rādītāja)

Vairāku koncentrāciju/rādītāju tests

31.

Devas un atbildreakcijas sakarību nosaka regresijas vienādojuma izteiksmē. Var izmantot dažādus modeļus, piemēram, ECx vai ERx noteikšanai (piemēram, EC25, ER25, EC50, ER50) un tā uzdīgšanas ticamības robežām var būt piemēroti binārie dati, logita, probita, Veibula, Spīrmena–Kerbera saīsinātā metode. Dīgstu augšanu (svars un garums) kā nepārtrauktus ECx vai ERx beigupunktus un to ticamības robežas var aprēķināt, izmantojot atbilstošu regresijas analīzi (piemēram, Brūsa–Ferštēga (Bruce-Versteeg) nelineārās regresijas analīzi (25)). Kad vien iespējams, visjutīgākajām sugām R2 ir jābūt 0,7 vai augstākam un izmantotajām testa koncentrācijām/rādītājiem jāietver 20 % līdz 80 % ietekmes. Ja jānosaka NOEC, būtu jādod priekšroka jaudīgu statistisko testu izmantošanai un tie būtu jāizvēlas, balstoties uz datu sadalījumu (21)(26).

Testēšanas pārskats

32.

Testēšanas pārskatā jāparāda pētījumu rezultāti, kā arī sīks testa apstākļu apraksts, detalizēta rezultātu apspriešana, datu analīze un analīzes rezultātā izdarītie secinājumi. Jāsniedz arī pārskats tabulas veidā un rezultātu kopsavilkums. Pārskatā iekļauj turpmāk norādītos elementus.

 

Testējamā ķīmiskā viela:

ķīmiskās vielas identifikācijas dati, attiecīgās testējamās ķīmiskās vielas īpašības (piemēram, log Pow, šķīdība ūdenī, tvaika spiediens un informācija par vielas apriti vidē un mijiedarbību ar to, kā arī uzvedība, ja informācija ir pieejama);

informācija par testa šķīduma pagatavošanu un testa koncentrāciju verifikāciju, kā norādīts 18. punktā.

 

Testa suga:

informācija par testa organismu: suga/varietāte, augu dzimtas, zinātniskie un vispārpieņemtie nosaukumi, pēc iespējas sīkāka informācija par sēklu avotu un vēsturi (t. i., piegādātāja nosaukums, dīgtspēja procentos, sēklu lieluma klase, grupas vai partijas numurs, sēklu ievākšanas gads vai augšanas sezona, dīgtspējas novērtējuma datums), dzīvotspēja utt.;

testēto viendīgļlapju un divdīgļlapju sugu skaits;

sugu izraudzīšanās pamatojums;

sēklu uzglabāšanas, apstrādes un uzturēšanas apraksts.

 

Testa apstākļi:

testēšanas iekārta (piemēram, augšanas kamera, fitotrons vai siltumnīca);

testēšanas sistēmas apraksts (piemēram, podu izmēri, podu materiāli un augsnes daudzums);

augsnes apraksts (augsnes tekstūra vai tips: augsnes daļiņu sadalījums un klasifikācija, fizikālķīmiskās īpašības, tostarp organisko vielu %, organiskā oglekļa % un pH);

augsnes/substrāta (piemēram, augsnes, mākslīgās augsnes, smiltšu un citu) sagatavošana pirms testa;

barotnes apraksts, ja tādu izmanto;

testējamās ķīmiskās vielas lietojums: lietošanas metodes apraksts, aprīkojuma apraksts, ekspozīcijas rādītāji un apjomi, tostarp ķīmiskā verifikācija, kalibrēšanas metodes apraksts un lietošanas laika vides apstākļu apraksts;

augšanas apstākļi: gaismas intensitāte (piemēram, PAR, fotosintēzes aktivitātei atbilstošā spektra daļa), fotoperiods, maksimālā/minimālā temperatūra, laistīšanas grafiks un metode, mēslošana;

sēklu skaits podā, augu skaits uz devu, replikātu (podu) skaits uz ekspozīcijas rādītāju;

kontrolparaugu veids un skaits (negatīvi un/vai pozitīvi kontrolparaugi, arī šķīdinātāja kontrolparaugs, ja tādu izmanto);

testa ilgums.

 

Rezultāti:

tabula par katra replikāta, testa koncentrācijas/rādītāja un sugas beigupunktiem;

uzdīgušo dīgstu skaits un procentuālais salīdzinājums ar kontrolparaugiem;

biomasas mērījumi (dzinumu saussvars vai svaigsvars) procentos no kontrolparaugiem;

augu dzinumu garums procentos no kontrolparaugiem, ja to mēra;

testējamās ķīmiskās vielas iedarbībā radušos redzamo bojājumu procentuālā vērtība un kvalitatīvs un kvantitatīvs redzamo bojājumu apraksts (hloroze, nektroze, vīte, lapu un stublāju deformācija, kā arī nenovērota ietekme), salīdzinot ar kontrolgrupas augiem;

izmantotās vērtējuma skalas apraksts, ar kuru novērtē redzamos bojājumus, ja tiek sniegts vizuāls vērtējums;

viena rādītāja pētījumiem pārskatā jāiekļauj bojājumi procentos;

ECx vai ERx (piemēram, EC50, ER50, EC25, ER25) vērtības un ar tām saistītās ticamības robežas. Ja ir veikta regresijas analīze, norāda regresijas vienādojuma standartkļūdu un individuālo parametru novērtējuma standartkļūdu (piemēram, virziena koeficients, krustpunkts);

NOEC (un LOEC) vērtība, ja tā aprēķināta;

statistisko procedūru un izmantoto pieņēmumu apraksts;

šo datu un testētās sugas devas un atbildreakcijas sakarības grafisks attēlojums.

Ziņo par atkāpēm no testa procedūrām, kas aprakstītas šajā testa metodē, un jebkuriem neraksturīgiem notikumiem testa laikā.

LITERATŪRA

(1)

Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193.

(2)

International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.

(3)

International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants.

(4)

American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.

(5)

U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1.

(6)

US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:

850.4000: Background – Non-target Plant Testing;

850.4025: Target Area Phytotoxicity;

850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);

850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;

850.4225: Seedling Emergence, Tier II;

850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.

(7)

AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.

(8)

Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada.

(9)

Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48.

(10)

Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada.

(11)

Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Ind. 26:305 (1962).

(12)

Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206.

(13)

Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575.

(14)

Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250.

(15)

U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC.

(16)

McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174

(17)

Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369.

(18)

Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271.

(19)

Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271.

(20)

Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541.

(21)

OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(22)

Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63.

(23)

Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389.

(24)

Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23.

(25)

Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492.

(26)

Šā pielikuma C33. nodaļa “Slieku vairošanās tests (Eisenia fetida/Eisenia andrei)”.

1. papildinājums

Definīcijas

 

Aktīvā sastāvdaļa (AS) (vai aktīvā viela (AV)) ir viela, ar ko paredzēts nodrošināt īpašu bioloģisko ietekmi (piemēram, insektu kontroli, augu slimību kontroli, nezāļu kontroli apstrādes zonā); to dēvē arī par tehniskās tīrības pakāpes aktīvo sastāvdaļu, aktīvo vielu.

 

Ķīmiskā viela ir viela vai to maisījums.

 

Kultūraugu aizsardzības līdzekļi (CPP) vai augu aizsardzības produkti (PPP) , vai pesticīdi ir tādas vielas ar noteiktu bioloģisko aktivitāti, ko ar nolūku lieto kultūraugu aizsargāšanai pret kaitēkļiem (piemēram, sēnīšu slimībām, kukaiņiem un konkurējošiem augiem).

 

ECx. X % ietekmes koncentrācija vai ERx. x % ietekmes rādītājs ir koncentrācija vai rādītājs, kas mērītajā testa beigupunktā rada nelabvēlīgas x % izmaiņas salīdzinājumā ar kontrolgrupu (piemēram, par 25 % vai 50 % samazina dīgstu uzdīgšanu, dzinumu svaru, galīgo augu skaitu vai palielina vizuālos bojājumus, kas attiecīgi atbilstu EC25/ER25 vai EC50/ER50).

 

Uzdīgšana ir koleoptila vai dīgļlapas parādīšanās virs augsnes virsas.

 

Preparāts ir komerciāls produkts, kas satur aktīvo vielu (aktīvo sastāvdaļu), pazīstams arī kā galapreparāts (8) vai tipisks galapatēriņa produkts (TEP).

 

Zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC) ir zemākā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, pie kuras novērota ietekme. Šajā testā koncentrācijai, kas atbilst LOEC, attiecīgajā ekspozīcijas periodā, salīdzinot ar kontrolgrupu, ir statistiski nozīmīga ietekme (p < 0,05) un tā ir augstāka par NOEC vērtību.

 

Nemērķa augi ir augi, kas neatrodas mērķaugu zonā. Attiecībā uz kultūraugu aizsardzības līdzekļiem tas parasti attiecas uz augiem ārpus apstrādes zonas.

 

Nenovērojamās ietekmes koncentrācija (NOEC) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, pie kuras nav novērota nekāda ietekme. Šajā testā koncentrācijai, kas atbilst NOEC, attiecīgajā ekspozīcijas periodā, salīdzinot ar kontrolgrupu, nav statistiski nozīmīgas ietekmes (p < 0,05).

 

Fitotoksiskums: kaitīgās novirzes (saskaņā ar mērījumiem un vizuālo novērtējumu) no normāla augu izskata un augšanas konkrētas ķīmiskās vielas ietekmē.

 

Replikāts ir eksperimenta vienība, kas reprezentē kontrolgrupu un/vai apstrādes grupu. Šajos pētījumos audzēšanas pods pēc definīcijas ir replikāts.

 

Vizuāls novērtējums: vizuālo bojājumu novērtējums, kura pamatā ir auga stāves, augtspēja, anomāliju, hlorozes, nekrozes un vispārējā izskata novērojumi, ko salīdzina ar kontrolgrupu.

 

Testējamā ķīmiskā viela ir jebkura viela vai to maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.

2. papildinājums

To augu sugu saraksts, kas vēsturiski izmantoti testēšanā

Dzimta

Suga

Vispārpieņemtie nosaukumi

DIVDĪGĻLAPJI (DICOTYLEDONAE)

Čemurziežu

Daucus carota

Savvaļas burkāns

Kurvjziežu

Helianthus annuus

Vasaras saulgrieze

Kurvjziežu

Lactuca sativa

Dārza salāti

Krustziežu

Sinapis alba

Baltā sinepe

Krustziežu

Brassica campestris var. chinensis

Ķīnas kāposts

Krustziežu

Brassica napus

Rapsis

Krustziežu

Brassica oleracea var. capitata

Galviņkāposts

Krustziežu

Brassica rapa

Ripsis

Krustziežu

Lepidium sativum

Dārza cietķērsa

Krustziežu

Raphanus sativus

Rutks (redīss)

Balandu

Beta vulgaris

Biete

Ķirbju

Cucumis sativus

Lauka gurķis

Tauriņziežu

Glycine max (G. soja)

Soja

Tauriņziežu

Phaseolus aureus

Zeltainā pupiņa

Tauriņziežu

Phaseolus vulgaris

Parastā pupiņa

Tauriņziežu

Pisum sativum

Sējas zirnis

Tauriņziežu

Trigonella foenum-graecum

Grieķu trigonella

Tauriņziežu

Lotus corniculatus

Ragainais vanagnadziņš

Tauriņziežu

Trifolium pratense

Pļavas āboliņš

Tauriņziežu

Vicia sativa

Sējas vīķis

Linu

Linum usitatissimum

Sējas lins

Sūreņu

Fagopyrum esculentum

Sējas griķis

Nakteņu

Solanum lycopersicon

Parastais tomāts

VIENDĪGĻLAPJI (MONOCOTYLEDONAE)

Liliju

Allium cepa

Dārza sīpols

Graudzāļu

Avena sativa

Sējas auza

Graudzāļu

Hordeum vulgare

Parastais miezis

Graudzāļu

Lolium perenne

Daudzgadīgā airene

Graudzāļu

Oryza sativa

Sējas rīss

Graudzāļu

Secale cereale

Sējas rudzi

Graudzāļu

Sorghum bicolor

Parastais sorgo

Graudzāļu

Triticum aestivum

Parastais kviesis

Graudzāļu

Zea mays

Parastā kukurūza

3. papildinājums

Potenciālais saraksts sugām, kas nav kultūraugi

ESAO potenciālās sugas augu toksicitātes testiem

Piezīme: turpmākajā tabulā ir sniegta informācija par 52 sugām, kas nav kultūraugi (katram ierakstam iekavās ir sniegtas atsauces). Uzdīgšanas rādītāji ir aizgūti no publicētās literatūras, un tie ir paredzēti tikai kā vispārēja norāde. Individuālā pieredze var atšķirties atkarībā no sēklu izcelsmes un citiem faktoriem.

DZIMTA, sugas botāniskais nosaukums

(vispārpieņemtais nosaukums latviešu valodā)

Dzīves ilgums (9) un dzīvotne

Sēklas svars

(mg)

Dīgšanas vai augšanas fotoperiods (10)

Augšanas dziļums

(mm) (11)

Dīgšanas ilgums

(dienas) (12)

Īpaša apstrāde (13)

Toksicitātes tests (14)

Sēklu piegādātāji (15)

Citas atsauces (16)

APIACEAE

Torilis japónica

(Japānas sārtburkšķis)

А, В traucējumu skartas platības, dzīvžogi, ganības (16, 19)

1,7–1,9 (14, 19)

L = D (14)

0

(1, 19)

5 (50 %) (19)

aukstā stratifikācija (7, 14, 18, 19), var būt nepieciešama nobriešana (19), dīgšanu inhibē tumsa (1, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5)

PĒC (5)

 

 

ASTERACEAE

Bellis perennis

(ilgziedu mārpuķīte)

Ρ

pļavas, aramlauki, velēnas platības (16, 19)

0,09–0,17 (4, 19)

L = D (14)

0

(4)

3 (50 %) (19)

11 (100 %) (18)

apstarošana neietekmē dīgšanu (18, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14)

PĒC (4)

A, D, F

7

Centaurea cyanus

(zilā rudzupuķe)

A