Oficiālais Vēstnesis L 156 , 25/06/2003 Lpp. 0061 - 0073
Komisijas Lēmums (2003. gada 13. jūnijs) par zonēšanas un valsts uzraudzības kritērijiem, rodoties aizdomām par saslimšanu ar lašu infekciozo anēmiju (ISA) vai gūstot tam apstiprinājumu (izziņots ar dokumenta numuru C(2003) 1831) (Dokuments attiecas uz EEZ) (2003/466/EK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1991. gada 28. janvāra Direktīvu 91/67/EEK par dzīvnieku veselības nosacījumiem, kas regulē akvakultūras dzīvnieku un produktu laišanu tirgū [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EK) Nr. 806/2003 [2], un jo īpaši tās 15. pantu, ņemot vērā Padomes 1993. gada 24. jūnija Direktīvu 93/53/EK, ar ko ievieš obligātos pasākumus dažu zivju slimību kontrolei Kopienā [3], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Komisijas Direktīvu 2001/288/EK [4], un jo īpaši tās 5. panta 2. punktu un 6. pantu, tā kā: (1) Direktīva 93/53/EEK paredz, ka paraugu ņemšanu un laboratorisko testēšanu, lai noteiktu slimības, kas minētas Direktīvas 91/67/EEK A pielikuma I un II sarakstā, veic izmantojot metodes, kuras izraudzītas saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK 15. pantu. (2) Paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes II sarakstā iekļauto zivju slimību – hemorāģiskās vīrussepticēmijas (HVS) un infekciozās hematopoētiskās nekrozes (INH) – noteikšanai un apstiprināšanai ir izklāstīti Komisijas Lēmumā 2001/183/EK [5]. (3) Saskaņā ar Direktīvas 93/53/EEK 5. panta 2. punktu un 6. pantu valsts uzraudzībai pakļauj visas saimniecības, kas atrodas vienā ūdens sateces baseinā vai piekrastes zonā ar saimniecību, kurā konstatētas vai ir apstiprinājušās aizdomas par inficēšanos ar lašu infekciozās anēmijas (ISA) vīrusu. Ir jāizstrādā zonēšanas un valsts uzraudzības kritēriji. (4) Lai izstrādātu paraugu ņemšanas plānus un diagnostikas metodes ISA noteikšanai un apstiprināšanai, kā arī zonēšanas un valsts uzraudzības kritērijus, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu, ir notikušas apspriedes ar zivju veselības un laboratorijas ekspertiem. Bez tam ir jāņem vērā ISA diagnostikas pamatprincipi, kas izklāstīti Starptautiskā epizootiju biroja (SEB) Ūdensdzīvnieku slimību diagnostikas rokasgrāmatas jaunākajā izdevumā. (5) Ir jāparedz pietiekams laiks šo jauno prasību īstenošanai. (6) Šajā lēmumā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pastāvīgās pārtikas aprites un dzīvnieku veselības komitejas atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU. 1. pants Šā lēmuma pielikumā ir izklāstīti paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes lašu infekciozās anēmijas (ISA) noteikšanai un apstiprināšanai, kā arī zonēšanas un valsts uzraudzības kritēriji, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu. 2. pants Šo lēmumu piemēro no 2003. gada 23. oktobra. 3. pants Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm. Briselē, 2003. gada 13. jūnijā Komisijas vārdā — Komisijas loceklis David Byrne [1] OV L 46, 19.2.1991., 1. lpp. [2] OV L 122, 16.5.2003., 1. lpp. [3] OV L 175, 19.7.1993., 23. lpp. [4] OV L 99, 10.4.2001., 11. lpp. [5] OV L 67, 9.3.2001., 65. lpp. -------------------------------------------------- PIELIKUMS Paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes lašu infekciozās anēmijas (ISA) noteikšanai un apstiprināšanai un zonēšanas un valsts uzraudzības kritēriji, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu IEVADS UN DEFINĪCIJAS Šajā pielikumā: a) ir paredzētas pamatnostādnes un obligātās prasības attiecībā uz paraugu ņemšanas plāniem un diagnostikas metodēm ISA noteikšanai un apstiprināšanai; b) ir ietverti Direktīvā 91/67/EEK un Direktīvā 93/53/EEK izklāstītie noteikumi un definīcijas; c) iekļauti noteikumi, kas nodrošina pienācīgu ISA diagnostiku, kontroli un uzraudzību, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu; d) sniegtā informācija ir adresēta gan iestādēm, kas atbild par ISA kontroli, gan laboratorijas personālam, kas veic šīs slimības noteikšanu. Šeit galvenokārt ir aplūkotas paraugu ņemšanas procedūras, laboratorisko testu principi un pielietojums, rezultātu novērtēšana, kā arī sīki izstrādātās laboratorijas metodes. Vajadzības gadījumā laboratorijas tomēr drīkst piemērot šajā pielikumā aprakstītos testu paveidus vai izmantot atšķirīgus testus, ja vien tie nodrošina tādu pašu vai pat lielāku jutīgumu un specifiskumu. Turklāt šeit ir noteikti kritēriji iedalīšanai zonās un valsts uzraudzības ieviešanai, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu. Šajā pielikumā ir spēkā šeit norādītās papildu definīcijas. "Ūdens sateces baseins" aptver visu sateces baseinu no ūdensceļu iztekas līdz grīvlīcim vai tikai daļu sateces baseina no ūdensceļa iztekas līdz dabīgam vai mākslīgam šķērslim, kas neļauj zivīm migrēt lejpus tā. "Piekrastes zona" aizņem daļu krasta, jūras vai grīvlīča un tai ir precīza ģeogrāfiskā robeža, kas aptver homogēnu hidrodinamisko sistēmu vai vairākas šādas sistēmas. Šā pielikuma I daļā ir izklāstīti ISA diagnostikas un apstiprināšanas vispārējie principi un kritēriji, kā arī zonēšanas un valsts uzraudzības kritēriji, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu. Šā pielikuma II daļā ir norādīts, kā jāveic pārbaudes un paraugu ņemšana, lai noteiktu saslimšanu ar ISA. Šā pielikuma III daļā ir aplūkotas izmantojamās virusoloģiskās izmeklēšanas metodes. Šā pielikuma IV daļā ir izklāstīta paraugu pārbaudes procedūra ISA noteikšanai ar RT-PCR palīdzību. Šā pielikuma V daļā ir aprakstīta nieru nospiedumu pārbaudes kārtība, izmantojot netiešo fluorescējošo antivielu testu (IFAT) ISA noteikšanai. Šā pielikuma VI daļa ir veltīta histoloģijas metodēm. Šā pielikuma VII daļā ir apkopoti izmantotie akronīmi un saīsinājumi. I. Kritēriji ISA diagnostikai, iedalīšanai zonās, dažiem kontroles pasākumiem un valsts uzraudzībai I.1. ISA diagnostikas vispārīgie principi Pielikuma I.2. daļā ir izklāstītas pazīmes, kas kalpo par pamatu aizdomām, ka zivis ir inficējušās ar ISAV. Dalībvalstis gādā par to, lai saimniecībā, rodoties aizdomām par zivju inficēšanos ar ISAV, iespējami ātri tiktu veikta oficiāla izmeklēšana ar mērķi apstiprināt vai noliegt slimības iespējamību, veicot pārbaudes un klīniskos izmeklējumus, paraugu ņemšanu un atlasi, kā arī laboratoriskās pārbaudes, kā tas noteikts pielikuma III līdz VI daļā. Lai gūtu oficiālu apstiprinājumu saslimšanai ar ISA, ir jābūt izpildītam vismaz vienam no trim kritēriju kopumiem, kas norādīti pielikuma I.3. daļā. I.2. Aizdomas par saslimšanu ar ISA I.2.1. Aizdomas par saslimšanu ar ISA rodas tad, ja ir izpildīts vismaz viens no šeit minētajiem kritērijiem: a) pēcnāves izmeklēšanas rezultāti norāda uz ISA neatkarīgi no slimības klīniskajām pazīmēm. Pēcnāves izmeklēšanas rezultāti un slimības klīniskās pazīmes atbilst pazīmēm, kas norādītas SEB Ūdensdzīvnieku slimību diagnostikas rokasgrāmatas jaunākajā izdevumā; b) ISAV izdalīšana un identificēšana šūnu kultūrā, kas iegūta no viena parauga, izmantojot jebkuru zivi no saimniecības, kā tas norādīts III daļā; c) pārliecinoši ISAV klātbūtnes pierādījumi, kas gūti divos neatkarīgos laboratoriskajos testos, piemēram, izmantojot RT-PCR (IV daļa) un IFAT (V daļa); d) dzīvu zivju nogādāšana saimniecībā, kurā zivju pārvietošanas brīdī bija pamatotas aizdomas par saslimšanu ar ISA; e) ja izmeklēšanā atklājas citas būtiskas epidemioloģiskās saiknes ar saimniecībām, ko tur aizdomās saistībā ar ISA vai ir saņemts apstiprinājums tam. I.2.2. Aizdomas par saslimšanu ar ISA var atmest, ja turpmākā izmeklēšana, kas paredz sešu mēnešu laikā veikt vismaz vienu klīnisko pārbaudi katru mēnesi, vairs neatklāj jaunus pierādījumus par saslimšanu ar ISA. I.3. ISA apstiprināšana Uzskata, ka saslimšana ar ISA ir apstiprinājusies, ja ir izpildīti a) vai b), vai c) apakšpunktā norādītie kritēriji: a) klīniskās pazīmes un pēcnāves izmeklēšanas rezultāti atbilst ISA pazīmēm SEB Ūdensdzīvnieku slimību rokasgrāmatas jaunākajā izdevumā, tostarp novēro beigtas, novājinātas zivis vai zivis ar neraksturīgu uzvedību, anēmijas pazīmes, citus pēcnāves simptomus un patoloģiskas izmaiņas, kā arī izdodas atklāt ISAV ar vienas vai vairāku šeit norādīto metožu palīdzību: i) ISAV izdalīšana un identificēšana šūnu kultūrā, kas iegūta vismaz no viena parauga, izmantojot jebkuru zivi no saimniecības, kā tas norādīts III daļā; ii) ISAV noteikšana ar RT-PCR palīdzību, izmantojot IV daļā aprakstītās metodes; iii) ISAV noteikšana audos vai audu preparātos, izmantojot specifiskās antivielas pret ISAV (piem., nieru nospiedumu IFAT, kā tas norādīts V daļā); b) ISAV izdalīšana un identificēšana divos paraugos, kas atsevišķos gadījumos iegūti no vienas vai vairākām zivīm pārbaudāmajā saimniecībā, izmantojot III daļā aplūkoto metodi; c) ISAV izdalīšana un identificēšana vismaz vienā paraugā, kas iegūts saimniecībā no jebkuras zivs, izmantojot III daļā aprakstīto metodi, ko apstiprina arī ISAV klātbūtne audu preparātos, kas iegūti saimniecībā no jebkuras zivs, izmantojot RT-PCR (IV daļa) vai IFAT (V daļa). I.4. Kritēriji, pēc kuriem nosaka un atceļ kontroles un valsts uzraudzības zonas, ja rodas vai apstiprinās aizdomas par saslimšanu ar ISA I.4.1. Lai realizētu uz riska izpēti balstītu valsts uzraudzības programmu, dalībvalstis izveido attiecīgas kontroles un uzraudzības zonas saimniecības apkaimē, ja pēc oficiāla atzinuma tur pastāv aizdomas par saslimšanu ar ISA vai ir gūts apstiprinājums tam. I.4.2. Izveidojamās zonas nosaka, katrā atsevišķā gadījumā analizējot slimības tālākās izplatības risku. Atkarībā no epizootioloģiskā stāvokļa, ūdens sateces baseinam vai skartajai piekrastes zonai: - piešķir kontroles zonas statusu vai, - ja ūdens sateces baseins un piekrastes zona aizņem plašāku teritoriju, to sadala kontroles zonā un uzraudzības zonā, ar nosacījumu, ka tas netraucē ierobežot ISA izplatīšanos. Bez tam vajadzības gadījumā var izveidot papildu uzraudzības zonas ārpus ūdens sateces baseina un piekrastes zonas. I.4.3. Izveidojot iepriekš minētās zonas, galvenokārt ņem vērā riska faktorus, kuru ietekmē slimība var skart saimniecībās audzētas zivis un savvaļas zivis, piemēram, zivju nāves gadījumu skaitu, mirstības koeficientu un tā sadalījumu saimniecībā, kur pastāv aizdomas par ISAV infekciju vai ir saņemts apstiprinājums tam; zivju mirstības cēloņus skartajā saimniecībā; attālumu līdz tuvējām saimniecībām un zivju daudzumu tajās; saskarē esošās saimniecības; saimniecībās pārstāvētās sugas; skartās saimniecības un tuvējo saimniecību apsaimniekošanas veidu; hidrodinamiskos rādītājus un citus epidemioloģiski svarīgus faktorus, kas noteikti epizootiskajā pārbaudē, kura veikta saskaņā ar Direktīvas 93/53/EEK 5. panta 2. punktu un 8. pantu. I.4.4. Iedalīšanu zonās veic saskaņā ar šeit norādītajiem obligātajiem kritērijiem. I.4.4.1. Tuvējā apkārtnē ap saimniecību, kurā pastāv aizdomas par ISAV infekciju vai ir gūts apstiprinājums tam, dalībvalsts nosaka šādu "kontroles zonu": - piekrastes zonās tā aizņem teritoriju, ko aptver aplis, kura rādiuss ir vismaz vienas plūdmaiņu joslas platumā vai vismaz 5 km ap saimniecību, kurā konstatēta ISAV infekcija, vai ir vienāda ar teritoriju, kas noteikta, pamatojoties uz attiecīgajiem hidrodinamiskajiem vai epidemioloģiskajiem datiem, vai - sauszemes apvidos tā aizņem visu ūdens sateces baseinu saimniecībā, kurā konstatēta ISAV infekcija; ja ūdens sateces baseins aizņem lielu platību, dalībvalsts var noteikt, ka šī zona aizņem tikai daļu no ūdens sateces baseina teritorijas, ar nosacījumu, ka tas netraucē ierobežot ISA izplatīšanos. I.4.4.2. "Pagaidu kontroles zonu" izveido tad, ja pastāv aizdomas par saslimšanu ar ISA, pamatojoties uz tiem pašiem kritērijiem, kas izklāstīti attiecībā uz kontroles zonu. I.4.4.3. Vajadzības gadījumā apgabalos, kur, kā uzskata, pietiks ar ne tik stingru uzraudzību, dalībvalsts ap kontroles zonu izveido "uzraudzības zonu", kas: - piekrastes zonās aizņem teritoriju ap pārklājošos plūdmaiņu zonu kontroles zonu, teritoriju ap kontroles zonu un ietilpst aplī ar 10 km rādiusu ap kontroles zonas centru vai līdzvērtīgu teritoriju, ko nosaka pamatojoties uz attiecīgiem hidrodinamiskajiem vai epidemioloģiskajiem datiem, vai - vajadzības gadījumā, sauszemes apgabalos aizņem plašāku teritoriju ap kontroles zonu. I.5. Karantīnas ilgums un noteiktā zonējuma atcelšana I.5.1. Dalībvalsts kompetentā iestāde gādā par to, lai visām kontroles zonas saimniecībām būtu noteikts pienācīgs karantīnas laiks pēc visu zivju izņemšanas un pēc dezinfekcijas, ja tā ir jāveic. Karantīnas laiks saimniecībās, kurās konstatēta inficēšanās ar ISA, ilgst vismaz sešus mēnešus. Karantīnas ilgumu pārējās kontroles zonas saimniecībās kompetentā iestāde nosaka, veicot riska novērtējumu katrā atsevišķā gadījumā. Pēc zivju izņemšanas no visām kontroles zonas saimniecībām vienlaicīgi ievieš vismaz sešu nedēļu karantīnu. Bez tam kompetentā iestāde var pieņemt lēmumu ieviest karantīnu saimniecībās, kas atrodas izveidotajās uzraudzības zonās. I.5.2. Izveidotās kontroles zonas drīkst atcelt un tajās drīkst atjaunot zivju krājumus tikai pēc tam, kad visās zonu saimniecībās būs izņemtas zivis un, ja vajag, veikta dezinfekcija, kā arī ievērota karantīna saskaņā ar I.5.1. punktu. Kontroles zonas zivju krājumu atjaunošanas laikā kļūst par uzraudzības zonām saskaņā ar 1.4.4.3. punktu. I.5.3. Izveidotās pagaidu kontroles zonas nedrīkst atcelt, kamēr nav noraidītas aizdomas par saslimšanu ar ISA saskaņā ar I.2.2. daļu. Ja apstiprinās saslimšana ar ISA saskaņā ar I.3. daļu, pagaidu kontroles zona kļūst par kontroles zonu. I.5.4. Izveidotās uzraudzības zonas nedrīkst atcelt, kamēr nav pagājuši divi gadi pēc kontroles zonas atcelšanas. I.6. Valsts uzraudzība, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu I.6.1. Sakarā ar Direktīvas 93/53/EEK 5. panta 2. punktu un 6. pantu un lai noskaidrotu slimības izplatību un attīstību saimniecībā, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA vai gūstot tam apstiprinājumu, kompetentā iestāde vai kvalificēti veterinārie dienesti zivju veselības jautājumos, apspriežoties ar kompetento iestādi un tās uzraudzībā, obligāti realizē valsts uzraudzības programmu visās saimniecībās, kas atrodas izveidotajās zonās, balstoties uz riska novērtējumu. I.6.2. Realizējot šādu valsts uzraudzības programmu, kompetentajai iestādei, vajadzības gadījumā veicot pārbaudes uz vietas, jāapseko visas saimniecības izveidotajās zonās un jāiegūst oficiāli dati par saimniecībās turēto zivju sugām, kategorijām un skaitu, arī mirstības rādītāji. I.6.3. Saimniecības, kas atrodas izveidotajās kontroles zonās un kas audzē Atlantijas lašus (Salmo salar) vai citas sugas, kuras minētas SEB Ūdensdzīvnieku veselības kodeksa jaunākajā izdevumā, jo tās ir uzņēmīgas pret ISA vai ir tās iespējamie pārnēsātāji, pēc pirmās oficiālās apsekošanas ik pēc 14 dienām paziņo kompetentajai iestādei zivju mirstības datus. Ziņojot par mirstības pieaugumu, norāda attiecīgo dienu un būri. Kompetentā iestāde pārbauda katru gadījumu, kad saimniecībā ievērojami pieaug mirstība. Ja aizdomas apstiprinās, visas saimniecības, kas atrodas noteiktajā kontroles zonā, katru nedēļu ziņo kompetentajai iestādei par mirstību, sniedzot datus par katru dienu un būri. Saimniecības, kas atrodas uzraudzības zonās, ik pēc 14 dienām ziņo kompetentajai iestādei par mirstību. Noteiktajās zonās turklāt visu gadu veic regulāras pārbaudes, kuru biežums ir norādīts 1. tabulā. Bet ja klimatisko apstākļu dēļ šādas pārbaudes nav iespējams veikt visu gadu, dalībvalstis var noteikt citu pārbaužu periodiskumu ārkārtas rīcības plānā. 1. tabula Valsts uzraudzības programma Saimniecības atrašanās vieta | Minimālais pārbaužu skaits gadā | Minimālais pārbaužu skaits gadā pēc kontroles zonas atcelšanas | Kontroles zona | 12 | | Uzraudzības zona | 6 | 6 | Pagaidu kontroles zona | 6 | | Uzraudzības programmu realizē līdz zonu atcelšanas brīdim. I.6.4. Pārbaudes, kā arī paraugu atlasi, iegūšanu, sagatavošanu un nosūtīšanu veic, kā tas norādīts II.1. līdz II.4. daļā. Paraugus pārbauda saskaņā ar III līdz VI daļu. II. Pārbaudes un paraugu ņemšana II.1. Pārbaudes, paraugu atlase un iegūšana saimniecībā, rodoties aizdomām par saslimšanu ar ISA II.1.1. Veicot regulāras pārbaudes I.6. daļā izklāstītās valsts uzraudzības programmas gaitā, kā arī saimniecībās, kur pastāv aizdomas par saslimšanu ar ISA, visos saimniecības objektos (būros, tvertnēs vai dīķos) reģistrē beigtas un novājinātas zivis, kā arī zivis, kuru uzvedība atšķiras no normas. Ja iespējams, nesen mirušas (nesadalījušās) un novājinātas zivis vai zivis, kuru uzvedība atšķiras no normas, apskata un reģistrē ISA klīniskās pazīmes vai veic to pēcnāves izmeklēšanu, kā tas noteikts SEB Ūdensdzīvnieku diagnostikas rokasgrāmatā. II.1.2. Ja novēro ISA klīniskās pazīmes, vai inspektoram vai veterinārārstam ir citi iemesli uzskatīt, ka zivis var būt inficējušās, ņem paraugus vismaz no 10 zivīm. Ja iespējams, atlasa nesen mirušas un novājinātas zivis, kā arī zivis, kuru uzvedība atšķiras no normas. Ja slimības skarto zivju skaits ir nepietiekams, tad paraugu kopumu papildina ar veselīgām zivīm no būriem, tvertnēm vai dīķiem, kuros ir reģistrēta visaugstākā zivju mirstība vai lielākais klīnisko pazīmju skaits. II.1.3. Ja konstatē nesen mirušas un novājinātas zivis vai zivis, kuru uzvedība atšķiras no normas, bet klīniskās pazīmes un pēcnāves izmeklēšanas rezultāti neliecina par ISA, nav obligāti jāveic paraugu ņemšana, lai gan tā var būt nepieciešama diferenciāldiagnozei un to var veikt pēc inspektora vai veterinārārsta ieskatiem. II.1.4. Ja pastāv aizdomas, ka savvaļās zivis slimo ar ISA, dalībvalstis gādā par to, lai tiktu paņemti un pārbaudīti attiecīgie paraugi, izmantojot piemērotas klīniskās un laboratoriskās metodes, kas paredzētas II līdz VI daļā, tādējādi noraidot vai apstiprinot saslimšanu ar ISA, kā arī novērtējot, cik lielus draudus šī slimība rada saimniecībā audzētām zivīm. II.2. Zivju paraugu sagatavošana II.2.1. Paraugus histoloģiskai izmeklēšanai ņem tikai no nesen nonāvētām zivīm, kam novēro klīniskās pazīmes vai kuru pēcnāves izmeklēšanas rezultāti liecina par slimību. Ņem visu ārējo vai iekšējo bojājumu paraugus un atsevišķām zivīm ar skalpeļa palīdzību obligāti izņem aknas, pagaidnieres, sirdi un liesu un ievieto tos 8 – 10 tilp. % fizioloģiskajā formalīna buferšķīdumā. Lai audi pietiekami labi saglabātos, fiksatora un audu attiecībai jābūt vismaz 20:1. II.2.2. No visām paraugu ņemšanai paredzētām zivīm ņem audus virusoloģiskai izmeklēšanai. Rezultātu apstiprināšanai paraugus ņem divos eksemplāros. Ar sterila instrumenta palīdzību zivīm ņem aknu, galvasnieres, sirds un liesas gabaliņus un ievieto tos plastmasas mēģenēs, kurās iepildīts pārvadāšanas šķīdums (9 ml), proti, šūnu kultūras barotne, kas satur antibiotikas. Šim nolūkam der 12,5 μg/ml-1 fungizona, 200 IU/ml-1 polimiksīna B un 200 μg/ml-1 kanamicīna maisījums, bet var izmantot arī citus maisījumus, kuru efektivitāte jau ir atzīta. Audus, kas iegūti no vairākām (ne vairāk kā piecām) zivīm, var glabāt vienā mēģenē, kurā iepildīts pārvadāšanas šķīdums, un tie veido vienu paraugu. Viena parauga audu svars ir 1,0 ± 0,5 g. II.2.3. Nieru nospiedumus IFAT vajadzībām iegūst tikai no nesen nonāvētām zivīm, t.i., divu stundu laikā pēc nāves. Zivs pagaidnieres gabaliņu izņem ar steriliem instrumentiem. Audu gabaliņu nosusina ar filtrpapīru, lai noņemtu liekās asinis, un tad to vairākkārt piespiež pie priekšmetstikliņa, kas pārklāts ar poli-L-lizīnu. Atsevišķiem nospiedumiem ir jābūt vienam otram blakus, nepārklājoties, lai iegūtu vienu nepārtrauktu šūnu kārtu. Asins un audu šķidrums nav izmantojami šajā testā. Nieru paraugu nevajadzētu atstāt ilgu laiku uz filtrpapīra, jo tas var izraisīt asins recēšanu un uz priekšmetstikliņa nogulsnēsies pārāk daudz seruma olbaltumvielu. Iegūtos nospiedumus žāvē gaisā un tad uzglabā vēsumā un sausumā, ja tos nav paredzēts uzreiz fiksēt. Nospiedumus fiksē 72 stundu laikā pēc paraugu ņemšanas. Nospiedumus pēc žāvēšanas gaisā var arī sasaldēt un glabāt ne ilgāk kā vienu mēnesi -20 °C temperatūrā un tad veikt fiksāciju. II.2.4. Zivis ar anēmijas pazīmēm var arī apdullināt un tūlīt pēc tām ņemt heparinizētas asins paraugus hematoloģiskai izmeklēšanai, piemēram, hematokrīta noteikšanai. II.2.5. Audus RT-PCR analīzei ņem no visām paraugu ņemšanai paredzētām zivīm. Galvasnieres un pagaidnieres gabaliņu izņem ar sterilu instrumentu un ievieto tos mikrocentrifūgas mēģenē, kurā iepildīts pietiekami efektīvs šķīdums RNS konservēšanai (1 ml). Audus, kas iegūti no vairākām (ne vairāk kā piecām) zivīm, var glabāt vienā mēģenē, kurā iepildīts konservantu šķīdums, un tie veido vienu paraugu. Viena parauga audu svars ir aptuveni 0,5 g. Ja zivis ir pārāk mazas, lai iegūtu vajadzīgu parauga svaru, var paņemt nieru, sirds, liesas, aknu vai vārtnieka aklās zarnas gabaliņus, ievērojot šo secību, lai kopējais svars būtu 0,5 g. II.3. Zivju paraugu nosūtīšana II.3.1. Asins paraugus un mēģenes ar zivju audiem virusoloģiskai izmeklēšanai vai RT-PCR analīzei ievieto izotermiskos konteineros (piemēram, kastēs ar polistirolu piepildītām sienām) kopā ar pietiekamu daudzumu ledus vai "saldētājbloku", lai nodrošinātu paraugu dzesināšanu ceļā uz laboratoriju. Paraugus nedrīkst sasaldēt, bet pārvadāšanas kastē, to saņemot, vēl jābūt ledum vai arī vienam vai vairākiem "saldētājblokiem" vēl jābūt daļēji vai pilnīgi sasalušiem. Ārkārtējos apstākļos paraugus RT-PCR analīzei un paraugus virusoloģiskai izmeklēšanai drīkst ātri sasaldēt un pārvest uz laboratoriju – 20 °C vai zemākā temperatūrā. II.3.2. Priekšmetstikliņus IFAT veikšanai pārvadā priekšmetstikliņu ietverē ar mitrumuzsūcēju pietiekamā daudzumā, lai nospiedumpreparāti būtu sausi un vēsi. II.3.3. Ja zivju audus histoloģiskai izmeklēšanai pārvadā kopā ar fiksatoru, tos ievieto hermētiski noslēgtās mēģenēs triecienizturīgos konteineros, piemēram, kastēs ar polistirolu piepildītām sienām. II.3.4. Ja paraugi netiek sasaldēti, virusoloģiskā pārbaude jāsāk, cik drīz vien iespējams un ne vēlāk kā 72 stundas pēc paraugu ņemšanas. Paraugu paralēlās analīzes veikšanai pēc nogādāšanas laboratorijā glabā – 20 °C vai zemākā temperatūrā. II.3.5. Uz laboratoriju var nosūtīt veselu zivi, ja pārvadāšanas laikā ievēro II.3.1. daļā noteikto temperatūras režīmu. Veselu zivi ietin filtrpapīrā un pārvadā plastikāta maisiņā, vēsumā, kā tas noteikts iepriekš. II.3.6. Var pārvadāt arī dzīvas zivis valsts iestādes uzraudzībā. II.3.7. RNS ekstrakciju RNAlater konservēto audu RT-PCR analīzei paraugos, kas glabājas dažādā temperatūrā, veic noteiktā laikā. Ievēro šādus laika ierobežojumus: —37 °C | dienas laikā | —25 °C | nedēļas laikā | —4 °C | mēneša laikā | —20 °C | bez ierobežojumiem | II.3.8. Iepakošana un marķēšana jāveic saskaņā ar attiecīgiem spēkā esošajiem valsts un starptautiskiem pārvadāšanas noteikumiem. II.4. Papildu diagnostikas materiāla iegūšana Pēc vienošanās ar diagnostikas laboratoriju var ņemt arī citus zivju audus un sagatavot tos papildu izmeklējumiem. III. Virusoloģiskā pārbaude III.1. Paraugu sagatavošana III.1.1. Ja praktisku iemeslu dēļ šūnas nav iespējams izmantot 72 stundu laikā pēc audu paraugu iegūšanas, ir pieļaujama audu sasaldēšana – 80 °C temperatūrā līdz 28 dienām. Audus pirms pārbaudes drīkst sasaldēt un atkausēt tikai vienu reizi. III.1.2. Katru paraugu (apvienotos audus pārvadāšanas šķīdumā) pilnīgi homogenizē, izmantojot stomaheru, maisītāju vai miezeri ar piestu, 15 minūtes centrifugē (2000 līdz 4000 x g) 0 – 6 °C temperatūrā, un centrifugātu pēc filtrācijas (0,45 μm) inkubē ar vienādu tilpumu pienācīgi atšķaidītu apvienoto imūnserumu pret IPNV vietējiem serotipiem. Imūnseruma titram 50 % plātnīšu neitralizācijas testā jābūt vismaz 1:2000. Maisījumu inkubē vienu stundu 15 °C temperatūrā. Šādi iegūst inokulātu. Visus inokulātus apstrādā ar imūnserumu pret IPN vīrusu (dažviet Eiropā šis vīruss ir sastopams 50 % zivju paraugu) ar mērķi novērst IPN vīrusa citopātisko efektu (CPE) inokulētajās šūnu kultūrās. Tas ļauj samazināt virusoloģisko pārbaužu ilgumu, kā arī to gadījumu skaitu, kad CPE varētu uzskatīt par potenciālu norādi uz ISAV klātbūtni. Ja paraugi ir iegūti no ražotnēm, kuras uzskata par IPN neskartām, inokulātu apstrādi ar IPN vīrusa imūnserumu var neveikt. III.2. Šūnu kultūru inokulēšana III.2.1. SHK-1 (80. vai agrāks pārsējums) vai TO šūnas audzē mikroplanšetēs ar 12 vai 24 nodalījumiem, izmantojot L-15 barotnē, kas satur 5 % liellopu embrionālā seruma, 2 tilp. % 200 mM L-glutamīna un 0,08 tilp. % 50 mM 2-merkaptoetanola. Var izmantot arī citas šūnu līnijas, kas ir pietiekami efektīvas un jutīgas, lai veiktu ISAV izdalīšanu, ņemot vērā celma mainīgumu un to, ka dažādu celmu vairošanās spēja atšķiras atkarībā no šūnu līnijas. Orgānu suspensiju pēc apstrādes ar imūnserumu ievada jaunu, aktīvi augošu šūnu kultūrās tā, lai galīgais audu materiāla atšķaidījums barotnē būtu 1:1000. No katras orgāna suspensijas ņem 40 μl inokulātu un ievada to vienā nodalījumā ar 2 ml barotnes. Lai novērstu savstarpējas kontaminācijas risku, ir ieteicams izmantot atsevišķas mikroplanšetes ar 12 vai 24 nodalījumiem paraugiem no dažādām zivju audzētavām. III.2.2. Vienu mikroplanšeti atstāj bez inokulāta, un tā kalpo kā negatīvā kontrole. Atsevišķā mikroplanšetē inokulē ISAV standartizolātu, kā tas norādīts tālāk, un tā kalpo kā pozitīvā kontrole. Pirmajā nodalījumā ievada 100 μl ISAV pamatpreparāta (minimālais titrs 107TCID/50 ml) un rūpīgi to sajauc. Noteiktu materiāla tilpumu pārnes no pirmā nodalījuma otrajā, lai iegūtu 1:10 atšķaidījumu, un rūpīgi to sajauc. Šo procedūru atkārto, lai iegūtu sešus desmitkārtīgus atšķaidījumus. ISAV pamatpreparātu glabā – 80 °C temperatūrā vismaz divus gadus, bet pēc atkausēšanas tas ir jāizlieto trīs dienu laikā. Piezīme – ir jāpievērš uzmanība tam, lai nepieļautu pozitīvās kontroles materiāla nokļūšanu izmēģinājuma mikroplanšetēs. Lai izslēgtu šādu varbūtību, pozitīvās kontroles paraugus apstrādā atsevišķi no izmēģinājuma mikroplanšetēm. III.2.3. Paraugus inkubē 14 ± 2 °C temperatūrā ne ilgāk kā 15 dienas. III.3. Mikroskopija Šūnu kultūras divas reizes – 5. līdz 7. dienā un 12. līdz 14. dienā pēc inokulēšanas – pārbauda mikroskopā attiecībā uz CPE. Ja kādā no apvienotajiem paraugiem novēro CPE, tūlīt uzsāk vīrusa identificēšanu (III.6. daļa). Ja līdz 14. dienai CPE netiek novērots, veic hemadsorbcijas testu (III.4. daļa). III.4. Hemadsorbcija ISAV replikācija šūnu kultūrās ne katrreiz rada CPE. Tādēļ katrā mikroplanšetes nodalījumā veic tālāk aprakstīto hemadsorbcijas testu vai arī katru nodalījumu pārbauda, izmantojot III.6.1. punktā aplūkoto IF analīzi. III.4.1. Barotni no visiem nodalījumiem, tas attiecas arī uz pozitīvo un negatīvo kontroli, pārnes marķētās sterilās mēģenēs. Katrā nodalījumā ievieto 500 μl 0,2 tilp. % trušu vai zirgu eritrocītu suspensijas pēc skalošanas vai 0,05 tilp. % varavīksnes foreļu vai Atlantijas lašu eritrocītu suspensijas pēc skalošanas un 45 minūtes inkubē istabas temperatūrā. Pēc tam eritrocītu suspensiju izlej un katru nodalījumu divas reizes izskalo ar L-15 barotni. Katru nodalījumu pārbauda mikroskopā. III.4.2. Eritrocītu sakopojumi uz SHK-1 vai TO šūnu virsmas liecina par varbūtēju inficēšanos ar ortomiksovīrusu. Ja hemadsorbcijas tests ir pozitīvs, tūlīt veic vīrusa identificēšanu (III.6. daļa). III.5. Šūnu kultūras pārsēšana III.5.1. Šūnas pārsēj laikā starp 13. un 15. dienu. 125 μl kultūras šķidruma iepilda mikroplanšetes 12 nodalījumos ar nesen pārsētām aktīvi augošām SHK-1 šūnām un inkubē 14 ± 2 °C temperatūrā ne ilgāk kā 18 dienas. Šūnu kultūras divas reizes – 5. līdz 7. dienā un 14. līdz 18. dienā pēc inokulēšanas – pārbauda mikroskopā attiecībā uz CPE. Ja kāds no apvienotajiem paraugiem uzrāda CPE, tūlīt uzsāk vīrusa identificēšanu (III.6. daļa). Ja līdz 14. līdz 18. dienai CPE netiek novērots, veic hemadsorbcijas testu (III.4. daļa). III.5.2. Ja inkubācijas pirmajās septiņās dienās novēro citotoksicitāti, šūnas pārsēj šajā laikposmā un inkubē 14 līdz 18 dienas, tad šūnas atkal pārsēj un inkubē vēl 14 līdz 18 dienas. Ja citotoksicitāti novēro pēc septiņām dienām, šūnas pārsēj vienu reizi un inkubē pavisam 28 līdz 36 dienas, skaitot no pirmās pārsēšanas. III.5.3. Ja sākotnējā kultūra ir inficējusies ar baktērijām, izmēģinājumu atkārto, izmantojot audu homogenātu, kas glabāts – 80 °C temperatūrā. Audu homogenātu pirms inokulēšanas centrifugē 30 minūtes (4000 x g) 0 – 6 °C temperatūrā un centrifugātu filtrē (0,22 μm). Ja bakteriālo infekciju novēro šūnu pārsēšanas laikā, centrifugātu filtrē (0,22 μm), pievieno tikko pārsētām šūnām un inkubē vēl 14 līdz 18 dienas. III.6. Vīrusa identificēšanas metodes Ja CPE novēro ikvienā stadijā vai hemadsorbcijas tests ir pozitīvs, veic vīrusa identificēšanu. ISAV identificēšanai var izvēlēties šādas metodes – IF (III.6.1. punkts) un RT-PCR (IV daļa). Ja pieļauj inficēšanos ar citiem vīrusiem, ir ieteicams papildus veikt vīrusu identificēšanu. Ja nedēļas laikā šīs pārbaudes neļauj skaidri identificēt vīrusu, centrifugāts ir jānosūta tūlītējai identifikācijai uz valsts references laboratoriju vai uz ES references laboratoriju zivju slimībām. III.6.1. IF III.6.1.1. SHK-1 (80. vai agrāks pārsējums) vai TO šūnas audzē mikroplanšetēs ar 24 vai 96 nodalījumiem, izmantojot L-15 barotni, kas satur 5 % liellopu embrionālā seruma, 2 tilp. % 200 mM L-glutamīna un 0,08 tilp. % 50 mM 2-merkaptoetanola, un izmanto tad, kad vairāk nekā 50 % šūnu veido vienlaidu slāni. Var izmantot arī citas šūnu līnijas vai barotni, kuru iedarbīgums jau ir pierādīts. Kultūras šķidrumu (225 μl), kas, iespējams, ir inficēts ar vīrusu, iepilda divos mikroplanšetes nodalījumos, samaisa un 225 μl šķidruma pārnes uz vēl diviem nodalījumiem, lai iegūtu 1:5 atšķaidījumu. Vēl divi nodalījumi, kuros nav ievadīts inokulāts, kalpo kā kontrole. Paraugiem no katras zivjaudzētavas, kā arī vīrusa kontrolei izmanto atsevišķu mikroplanšeti. Vīrusa kontrolei izmanto ISAV standartizolātu. III.6.1.2. Mikroplanšetes inkubē 14 ± 2 °C temperatūrā un pārbauda mikroskopā ne ilgāk kā 7 dienas. Ja CPE novēro jau agrīnā stadijā, kā arī tad, ja 7 dienu laikā CPE netiek novērots, nākamā stadija ir fiksācija. Katru mikroplanšetes nodalījumu izskalo ar fosfātu buferšķīdumu un 20 minūtes veic fiksāciju ar 80 % acetonu istabas temperatūrā. Mikroplanšetes žāvē gaisā un uzreiz nokrāso vai pirms krāsošanas ne ilgāk kā 24 stundas uzglabā 0 – 6 °C temperatūrā. III.6.1.3. Paralēlos nodalījumus apstrādā ar monoklonālo antivielu 3H6F8 pret ISAV vai citu pietiekami iedarbīgu un specifisku monoklonālu antivielu, atšķaidot to ar fosfātu buferšķīdumu un inkubējot 30 minūtes 37 ± 4 °C temperatūrā. Tad mikroplanšetes atbrīvo no monoklonālās antivielas un trīs reizes skalo ar 0,05 % Tween 20 fosfatu buferšķīdumā. FITC konjugātu ar antivielu pret peļu IgG atšķaida fosfātu buferšķīdumā, iepilda katrā nodalījumā un inkubē 30 minūtes 37 ± 4 °C temperatūrā. Piezīme – dažādu partiju monoklonālo antivielu un FITC konjugāta atšķaidījumus optimizē katrā laboratorijā. Tad mikroplanšetes atbrīvo no antivielas un trīs reizes skalo ar 0,05 % Tween 20 fosfatu buferšķīdumā. III.6.1.4. Mikroplanšetes pārbauda inversijas mikroskopā, kas pielāgots fluorescences mikroskopijai un aprīkots ar filtru FITC ierosai. Uzskata, ka pārbaudes rezultāts ir pozitīvs, ja novēro fluorescējošas šūnas. Pārbaude ir derīga tikai tad, ja pozitīvā kontrole uzrāda pozitīvus rezultātus, bet negatīvā kontrole – negatīvus rezultātus. IV. Paraugu RT-PCR analīze IV.1. Šajā daļā ir aplūkotas metodes, kas vajadzīgas ISAV genoma 8. fragmenta daļas PCR paplašināšanai, ko var veikt izmantojot zivju audus vai ISAV kultūru IV.1.1. RNS ekstrakcija a) Katru paraugu atbrīvo no RNAlater. Katrā mēģenē iepilda 1 ml destilētu ūdeni, kas apstrādāts ar DEPC, un mēģenes 5 minūtes centrifugē 0 – 6 °C temperatūrā ar ātrumu 13000 apgriezienu minūtē. b) Centrifugātu nolej un katram paraugam, kā arī kontroles materiālam (400 μl destilēta ūdens vai nieru homogenāta, kas iegūts no zivīm, kuras nav inficētas ar norādīto patogēnu) pievieno 800 μl TRIzol (Invitrogen) vai citu atzītu un tikpat iedarbīgu vai vēl iedarbīgāku reaģentu. Vajadzības gadījumā audus var sasmalcināt, tos vairākkārt iesūcot pipetē. Mēģenes uz piecām minūtēm atstāj istabas temperatūrā. Katrā mēģenē iepilda 160 μl hloroforma un tad mēģenes spēcīgi krata piecas minūtes, kam seko centrifugācija 0 – 6 °C temperatūrā ar ātrumu 13000 apgriezienu minūtē (15 min.). c) Virsējo ūdens slāni pārlej marķētā 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenē ar 500 μl izopropanola, un mēģenes atstāj uz 10 minūtēm istabas temperatūrā, kam seko centrifugācija 0 – 6 °C temperatūrā ar ātrumu 6500 apgriezienu minūtē (15 min.). d) Centrifugātu izlej un RNS nogulsnējumam pievieno 1 ml 75 % etilspirta. Pēc tam mēģenes piecas minūtes centrifugē 0 līdz 6 °C temperatūrā ar ātrumu 6500 apgriezienu minūtē. e) Centrifugātu izlej un apmēram trīs minūtes ļauj izgarot atlikušajam etilspirtam no vaļējām mēģenēm. Nogulsnējumam pievieno 15 μl destilēta ūdens, kas apstrādāts ar DEPC, lai atkal iegūtu suspensiju, vajadzības gadījumā to īslaicīgi samaisot. f) RNS koncentrāciju un paraugu tīrības pakāpi nosaka ar spektrofotometra palīdzību. Optiskā blīvuma mērījumus veic 260 un 280 nm viļņu garumā. g) RNS, kas jāizmanto uzreiz (tajā pašā dienā), var īslaicīgi uzglabāt 0 – 6 °C temperatūrā. RNS, kas nav izmantota uzreiz, uzglabā – 80 °C temperatūrā. IV.1.2. RT a) 2 μg RNS atšķaida destilētā ūdenī, kas apstrādāts ar DEPC, izmantojot 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenes. Ja RNS koncentrācija paraugā ir pārāk niecīga, lai iegūtu 2 μg izmantošanai RT reakcijā, ņem maksimāli iespējamo RNS daudzumu. Atšķaidīto RNS 10 minūtes inkubē 55 – 60 °C temperatūrā. b) Mēģenes ar RNS atdzesē uz ledus un pievieno RT reaģentus, lai kopējā 20 μg tilpumā iegūtu galīgo 1 x buferšķīduma koncentrāciju 1 mM dNTP, 100 ng jauktā sastāva heksamēru, 20 U RNāzes inhibitora un 200 U MMLV-RT. c) Mēģenes vienu stundu uzglabā 37 °C temperatūrā. d) cDNS, kamēr to neizmanto, uzglabā 0 – 6 °C temperatūrā, tā ir jāizmanto PCR analīzei, cik ātri vien iespējams. IV.1.3. PCR a) PCR maisījumam (45 μl) pievieno 5 μl cDNS, lai iegūtu 1x buferšķīduma koncentrāciju 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM no katra dNTP, 25 pmol no katra praimera un 1 U Taq polimerāzes. Izmanto šādus praimerus – ISA+ (5’-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3’) (turpvērstais praimers) un ISA- (5’-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3’) (atpakaļvērstais praimers). Ekstrakcijas, RT un PCR stadijā ir jāparedz arī negatīvā kontrole. b) Mēģenes uz piecām minūtēm ievieto termoprogrammētājā, kas iestatīts uz 94 °C, kam seko 35 cikli 94 °C temperatūrā vienas minūtes garumā, vienas minūtes cikls 55 °C temperatūrā un 72 °C temperatūrā un visbeidzot 5 minūtes 72 °C temperatūrā. c) PCR rezultātus novērtē pēc elektroforēzes, izmantojot 2 % agarozes gelu, kas iekrāsots ar etīdija bromīdu, un paraugu izmēru marķējumu, kā arī RT un PCR negatīvo kontroli. Ja iegūst vienu PCR produktu (155 bp), uzskata, ka tas liecina par ISAV RNS klātbūtni. Ja paraugi satur vēl vienu produktu (310 bp), arī uzskata, ka tie satur ISAV RNS. Paraugi, no kuriem iegūst vairākus PCR produktus, tostarp vismaz vienu, kas ir aptuveni 155 bp garš, iespējams, satur ISAV RNS. Tos var izpētīt tālāk, izmantojot DNS zondes vai nosakot nukleotīdu secību. IV.1.4. No audu kultūras izolētā ISAV apstiprināšana ar PCR palīdzību Ja, veicot audu paraugu virusoloģisko pārbaudi SHK-1 šūnās, novēro pilnu CPE, 400 μl centrifugāta pārnes no mikroplanšetes nodalījuma 1,5 ml mēģenē. RNS ekstrahē no parauga, kā tas norādīts III.1. daļā, un veic RT-PCR analīzi. Ja izmanto kultūras, kurās nav novērots pilns CPE, centrifugātu izlej un šūnas noņem no mikroplanšetes nodalījuma vai flakona virsmas un ievieto sterilā 1,5 ml mēģenē, lai veiktu RNS ekstrakciju un RT-PCR analīzi. IV.1.5. PCR produktu papildu noteikšana ar DNS zondi a) PCR produkta (155 bp) specifiskumu var noteikt ar nukleotīdu zondi, kas hibridizējas ar PCR produkta fragmentu, kurš sakrīt ar praimeriem. Veic PCR produktu elektroforēzi 1 % agarozes gelā, izmantojot paralēli novietoto izmēru marķējumu un RT un PCR negatīvo kontroli. b) Izmantojot Southern blot metodi, DNS pārnes uz membrānu un iezīmēto oligonukleotīdu (5’-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3’) pēc pirmshibridizācijas stadijas inkubē kopā ar membrānu. c) Nesaistītās un nespecifiski saistītās zondes noskalo no membrānas un padara redzamas saistītās zondes. d) Zondes, kas saistās ar 155 bp fragmentu (un 310 bp, ja tāds ir), liecina par PCR specifiskumu un norāda uz to, ka paraugs satur ISAV RNS. IV.1.6. Nukleotīdu sekvences noteikšana PCR produktos PCR specifiskumu var pārbaudīt, nosakot nukleotīdu secību 155 bp PCR produktā. a) Tīru PCR produktu izdala no agarozes gela vai šķīduma. b) Fragmenta sekvencēšanai izmanto tos pašus praimerus, kas izmantoti PCR analīzē, vai vektorpraimerus, ja pirms sekvencēšanas tie klonēti vektorā. c) Nukleotīdu secību salīdzina ar ISAV 8. fragmenta secību, kas ir pieejama EMBL nukleotīdu sekvenču datu bāzē (piekļuves kods Y10404, AJ012285, AJ242016). d) Ja atrod sekvenci, kas atbilst ISAV 8. fragmenta sekvencei, tas norāda uz to, ka paraugs satur ISAV RNS. V. Nieru nospiedumu pārbaude ar IFAT palīdzību V.1. Nieru nospiedumu pārbaudei ar IFAT palīdzību ir noteikta šāda kārtība V.2. Nospiedumu sagatavošana un krāsošana V.2.1. Priekšmetstikliņus trīs minūtes fiksē acetonā vai metanola/acetona maisījumā (1:1) un žāvē gaisā. Katru priekšmetstikliņu pirms krāsošanas apskata un atzīmē tajā vajadzīgās vietas, apvelkot tās ar ImmEdgeTM zīmuli vai kādā citā veidā, un ļauj tiem nožūt gaisā. Tad priekšmetstikliņus iegremdē bloķējošā šķīdumā (6 % vājpiens fosfātu buferšķīdumā, kas satur 0,2 % Tween 20) un inkubē 30 minūtes istabas temperatūrā, tos viegli kustinot. Katru priekšmetstikliņu notecina un ieliek horizontāli priekšmetstikliņu kastītē ar samitrinātu salvešpapīru, lai nodrošinātu mitrumu. V.2.2. Katru audu nospiedumu pārklāj ar monoklonālās antivielas 3H6F8 šķīdumu, kas iegūta pret ISAV (var izmantot arī citu atzītu antivielu, kas ir tikpat specifiska un iedarbīga), priekšmetstikliņu kastīti aizver un atstāj uz 60 minūtēm istabas temperatūrā, ik pa laikam to viegli kustinot. Antivielu parasti atšķaida 1 % vājpienā (1:10 līdz 1:100), katrai partijai nosakot vajadzīgo atšķaidījumu. Priekšmetstikliņus trīs reizes pa divām minūtēm skalo fosfātu buferšķīdumā, kas satur 0,1 % Tween 20. Katru audu nospiedumu pārklāj ar šķīdumu, kas satur kazu pretpeļu [imūn]konjugātu ar FITC, kurš atšķaidīts 1 % vājpienā (1:1000), un 60 minūtes inkubē mitrā atmosfērā istabas temperatūrā. Priekšmetstikliņus trīs reizes pa divām minūtēm skalo fosfātu buferšķīdumā, kas satur 0,1 % Tween 20. Katru priekšmetstikliņu uz 10 minūtēm pārklāj ar CitifluorTM šķīdumu (500 ul CitifluorTM maisījumā ar 1,5 ml 0,1 tilp. % Tween 20 fosfātu buferšķīdumā) vai citu ietvarvidi. Priekšmetstikliņus trīs reizes skalo fosfātu buferšķīdumā, kas satur 0,1 % Tween 20. Ja ir jāneitralizē krāsviela, katru nospiedumu var pārklāt ar propīdija jodīdu (0,01 mg/ml) fosfātu buferšķīdumā, kas satur 0,1 % Tween 20, un tad trīs minūtes inkubēt istabas temperatūrā. Priekšmetstikliņus trīs reizes pa divām minūtēm skalo fosfātu buferšķīdumā, kas satur 0,1 % Tween 20. Priekšmetstikliņus notecina un pārklāj ar CitifluorTM vai citu piemērotu ietvarvidi. Priekšmetstikliņus pirms mikroskopiskās izmeklēšanas uzglabā tumsā, 4 °C temperatūrā. V.3. Fluorescentās mikroskopijas izmantošana Katru priekšmetstikliņu apskata fluorescences mikroskopā, kas aprīkots ar attiecīgu filtru FITC ierosai, pēc kuras tas izstaro sev raksturīgo zaļu fluorescenci. Visus laukumus, kas apvilkti ar ImmEdgeTM zīmuli, apskata zem 10 un 20 objektīva, bet aizdomīgas vietas (kur parādās zaļa fluorescence) pēc tam apskata zem 40 objektīva fāzes kontrasta/fluorescences gaismā, lai pārliecinātos, ka fluorescentā krāsviela iezīmē tieši šūnas. Reģistrē aizdomīgo vietu koordinātas uz priekšmetgaldiņa, lai vēlāk vēl viens pārbaudītājs varētu apstiprināt novērotās fluorescences specifiskumu. Pēc tam kad pirmais pārbaudītājs ir apskatījis priekšmetstikliņus, pozitīvos un aizdomīgos preparātus pārbauda vēl viens cilvēks un apstiprina iegūtos rezultātus. V.4. Kontrole V.4.1. Katrā priekšmetstikliņu partijā pēc krāsošanas IFAT veikšanai ir jāparedz trīs dažādas kontroles: - nieru nospiedumi, kas iegūti no neinficētiem Atlantijas lašiem (negatīvā kontrole), - neinficēta SHK-1 šūnu kultūra vai cita pret slimību uzņēmīga šūnu kultūra (negatīvā kontrole), - ar ISAV inficēta SHK-1 šūnu kultūra vai cita pret slimību uzņēmīga šūnu kultūra (pozitīvā kontrole). V.4.2. Ja pastāv iespēja, kā vēl vienu pozitīvo kontroli ir ieteicams izmantot nieru nospiedumus, kas iegūti no ISAV inficētiem Atlantijas lašiem. V.4.3. Ja kādā no negatīvajām kontrolēm iegūst pozitīvus rezultātus, uzskata, ka visi rezultāti, kas iegūti pārbaudot šīs partijas priekšmetstikliņus, ir nederīgi. Ja, pārbaudot visus vienas partijas priekšmetstikliņus, arī pozitīvās kontroles, iegūst negatīvus rezultātus, uzskata, ka visi iegūtie rezultāti ir nederīgi. Ja iepriekš minēto iemeslu dēļ priekšmetstikliņu partija ir atzīta par nederīgu, priekšmetstikliņus iznīcina un izmēģinājumu veic no jauna, izmantojot divus paralēlos nospiedumus. V.5. Citu audu pārbaude Šo metodi var pielietot arī citiem audiem, piemēram, aknām, liesai un sirdij, ja uz priekšmetstikliņu izdodas pārnest pietiekami daudz endotēlija šūnu, leikocītu vai limfocītu. Visiem audiem izmanto vienādu krāsošanas paņēmienu, lai gan dažus audus nebūtu vēlams krāsot ar propīdija jodīdu, bet šūnu tipu noteikšanai audu nospiedumā drīzāk izmanto fāzes kontrasta gaismu. VI. HISTOLOĢIJA No parafīnā iekļautiem paraugiem iegūst 5 μm biezus griezumus un krāso ar hematoksilīnu un eozīnu. Histoloģiskās izmaiņas saistībā ar ISA ir aplūkotas SEB Ūdensdzīvnieku slimību diagnostikas rokasgrāmatā, tās jaunākajā izdevumā. VII. Akronīmi un saīsinājumi cDNS | komplementārā dezoksiribonukleīnskābe | CPE | citopātisks efekts | DEPC | dietilpirokarbonāts | dNTP | dezoksinukleotīdtripolifosfāts | FITC | fluoresceīnizotiocianāts | IF | imunofluorescence | IFAT | netiešais fluorescējošo antivielu tests | ΟΙΕ | Office international des epizootics (Starptautiskais epizootiju birojs (SEB)) | IPN(V) | infekciozā pankreātiskā nekroze (vīruss) | ISA(V) | lašu infekciozā anēmija (vīruss) | PBS | fosfātu fizioloģiskais buferšķīdums | RNS | ribonukleīnskābe | RT-(PCR) | Reversās transkriptāzes (polimerāzes ķēdes reakcija) | SHK-1 | laša galvasnieru šūnas | TCID50 | šūnu kultūras 50 % inficējošā deva | --------------------------------------------------