Komisijas Direktīva 2004/73/EK

(2004. gada 29. aprīlis),

ar ko divdesmit devīto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par to normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu, kas attiecas uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakojumu un marķēšanu

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Padomes 1967. gada 27. jūnija Direktīvu 67/548/EEK par to normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu, kas attiecas uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķējumu [1], un jo īpaši tās 28. pantu,

tā kā:

(1) Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā ietverts bīstamo vielu saraksts, kurā ir informācija par katras tajā iekļautās vielas klasifikāciju un marķēšanu. Norādītais saraksts ir jāatjaunina, lai iekļautu papildu paziņotās jaunas vielas un papildu esošās vielas, kā arī pielāgotu esošos ierakstus tehnikas attīstībai, piemēram, noteiktu dažu vielu koncentrācijas robežas vidē. Attiecīgi ieraksti par dažām vielām ir arī jāsvītro un daži ieraksti jāsadala, jo klasifikācija vairs neattiecas uz visām minēto ierakstu vielām. Vielu, kas satur 1,3-butadiēnu, marķējums ir jāmaina, lai norādītu, ka viela šajā direktīvā būs klasificēta kā mutagēns.

(2) Direktīvas 67/548/EEK V pielikumā izklāstītas vielu un preparātu fizikāli ķīmisko īpašību, toksiskuma un ekotoksiskuma noteikšanas metodes. Ir lietderīgi grozīt minēto pielikumu, lai līdz minimumam samazinātu dzīvnieku skaitu, ko izmanto eksperimentāliem nolūkiem saskaņā ar Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīvu 86/609/EEK par dalībvalstu normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz eksperimentāliem un citiem zinātniskiem nolūkiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību [2]. Attiecīgi ir jāpārskata subhroniskās orālās toksicitātes metodes B.1., B.4., B.5., B.31. un B.35. nodaļā. Turklāt, lai darītu pieejamu pilnveidotu subhroniskās orālās toksicitātes metodi, V pielikumam ir jāpievieno B.42. nodaļa. Visbeidzot, lai varētu noteikt īpašības, ko vēl pietiekami neietver V pielikumā iekļautās metodes, ir jāpievieno A.21. nodaļa par fizikāli ķīmiskajām īpašībām, B.43. nodaļa par subhronisko orālo toksicitāti un C.21. līdz C.24. nodaļa par toksicitāti uz vidi.

(3) Šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi Komiteja, kas izveidota, lai tehniskas attīstībai pielāgotu direktīvas par tehnisku šķēršļu novēršanu tirdzniecībā ar bīstamajām vielām un preparātiem,

IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU.

1. pants

Direktīvu 67/548/EEK groza šādi.

1. Direktīvas I pielikumu groza šādi:

a) priekšvārda K piezīmi aizstāj ar 1.A pielikumā izklāstīto tekstu;

b) ierakstus, kas atbilst šīs direktīvas 1.B pielikumā izklāstītajiem, aizstāj ar minētajā pielikumā izklāstīto tekstu;

c) šīs direktīvas 1.C pielikumā izklāstītos ierakstus iestarpina saskaņā ar Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā izklāstītajiem ierakstiem;

d) ierakstus ar indeksa numuriem 604–050–00–X, 607–050–00–8, 607–171–00–6 un 613–130–00–3 svītro;

e) ierakstu ar indeksa numuru 048–002–00–0 aizstāj ar ierakstiem, kam indeksa numuri ir 048–002–00–0 un 048–011–00–X, kā norādīts šīs direktīvas 1.D pielikumā;

f) ierakstu ar indeksa numuru 609–006–00–3 aizstāj ar ierakstiem, kam indeksa numuri ir 609–006–00–3 un 609–065–00–5, kā norādīts šīs direktīvas 1.D pielikumā;

g) ierakstu ar indeksa numuru 612–039–00–6 aizstāj ar ierakstiem, kam indeksa numuri ir 612–039–00–6 un 612–207–00–9, kā norādīts 1.D pielikumā.

2. Šādi groza V pielikumu:

a) šīs direktīvas 2.A pielikumā izklāstīto tekstu pievieno kā A.21. nodaļu;

b) B.1. bis nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.B pielikumā izklāstīto tekstu;

c) B.1. tris nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.C pielikumā izklāstīto tekstu;

d) B.4. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.D pielikumā izklāstīto tekstu;

e) B.5. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.E pielikumā izklāstīto tekstu;

f) B.31. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.F pielikumā izklāstīto tekstu;

g) B.35. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.G pielikumā izklāstīto tekstu;

h) šīs direktīvas 2.H pielikumā izklāstīto tekstu pievieno kā B.42. un B.43. nodaļu;

i) šīs direktīvas 21. pielikumā izklāstīto tekstu pievieno kā C.21. līdz C.24. nodaļu.

2. pants

1. Dalībvalstīs stājas spēkā normatīvi un administratīvi akti, kas vajadzīgi, lai vēlākais līdz 2005. gada 31. oktobrim nodrošinātu atbilstību šai direktīvai. Dalībvalstis tūlīt dara zināmus Komisijai minēto aktu tekstus, kā arī minēto aktu un šīs direktīvas atbilstības tabulu. Kad dalībvalstis pieņem minētos tiesību aktus, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno to oficiālai publikācijai. Dalībvalstis nosaka, kā izdarāmas šādas atsauces.

2. Dalībvalstis dara zināmus Komisijai galvenos valsts tiesību aktu noteikumus, ko tās pieņēmušas jomā, uz kuru attiecas šī direktīva.

3. pants

Šī direktīva stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

4. pants

Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm.

Briselē, 2004. gada 29. aprīlī

Komisijas vārdā —

Komisijas locekle

Margot Wallström

[1] OV L 196, 16.8.1967., 1. lpp. Direktīvā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EK) Nr. 807/2003 (OV L 122, 16.5.2003., 36. lpp.).

[2] OV L 358, 18.12.1986., 1. lpp. Direktīvā jaunākie grozījumi izdarīti ar Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvu 2003/65/EK (OV L 230, 16.9.2003., 32. lpp.).

--------------------------------------------------

1.A PIELIKUMS

"K piezīme.

Viela nav jāklasificē kā kancerogēna vai mutagēna, ja var pierādīt, ka tajā ir mazāk par 0,1 masas % 1,3-butadiēna (Einecs Nr. 203–450–8). Ja viela nav klasificēta kā kancerogēna vai mutagēna, būtu jālieto vismaz nekaitīguma frāzes (2–)9–16. Šī piezīme attiecas uz dažām I pielikumā norādītām kompleksām vielām, kas iegūtas no naftas"

.

--------------------------------------------------

2.A PIELIKUMS

A21. OKSIDĒJOŠĀS ĪPAŠĪBAS (ŠĶIDRUMI)

1. METODE

1.1. IEVADS

Šī testa metode paredzēta, lai noteiktu šķidruma spēju palielināt degošu vielu degšanas ātrumu vai degšanas intensitāti, vai arī spēju veidot pašaizdegošos maisījumu ar degošu vielu, tos rūpīgi sajaucot. Metodes pamatā ir ANO oksidējošu šķidrumu tests (1), un tā ir šim testam līdzvērtīga. Tomēr tāpēc, ka šī metode A.21. galvenokārt paredzēta, lai ievērotu Direktīvā 67/548 noteiktās prasības, ir nepieciešams salīdzinājums tikai ar vienu standartvielu. Testēšana un salīdzinājums ar papildus standartvielām var būt vajadzīgi gadījumos, kad testu rezultātus izmanto citiem nolūkiem [1].

Šis tests nav jāveic gadījumos, kad vielas struktūrformula nepārprotami liecina, ka viela nevar stāties eksotermiskās reakcijās ar viegli uzliesmojošiem materiāliem.

Pirms noteikt šo rādītāju, ir lietderīgi iegūt sākotnēju informāciju par testējamās vielas iespējamo sprādzienbīstamību.

Šī metode nav izmantojama cietvielām, gāzēm, sprādzienbīstamām vai viegli uzliesmojošām vielām un organiskajiem peroksīdiem.

Testēšanu pēc šīs metodes nav jāveic, ja jau ir pieejami attiecīgās vielas testēšanas rezultāti pēc ANO oksidējošu šķidrumu testa.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS

Vidējais spiediena paaugstināšanās laiks ir vidējais laiks, kādā testējamais maisījums izraisa spiediena paaugstināšanos no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena.

1.3. STANDARTVIELA

Par standartvielu izmanto (analītiski tīru) 65 % (masas %) slāpekļskābes ūdens šķīdumu [2].

Ja eksperimentators paredz, ka testēšanas rezultātus iespējams izmantos arī citiem nolūkiem, [3] var būt lietderīgi papildus testēt arī citas standartvielas [4].

1.4. TESTA METODES PRINCIPS

Testējamo šķidrumu masas attiecībā 1:1 sajauc ar celulozes šķiedru un ievieto spiedtvertnē. Ja maisījuma sajaukšanas vai ievietošanas laikā notiek pašaizdegšanās, testēšanu neturpina.

Ja nenotiek pašaizdegšanās, testēšanu veic pilnībā. Maisījumu spiedientvertnē karsē, un nosaka vidējo laiku, kādā spiediens paaugstinās no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. To salīdzina ar vidējo spiediena paaugstināšanās laiku, kāds ir standartvielas(–u) un celulozes maisījumam attiecībā 1:1.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI

Piecu izmēģinājumu rezultāti ar vienu vielu nedrīkst atšķirties vairāk par 30 % no to vidējās aritmētiskās vērtības. Izbrāķē rezultātus, kas no vidējās aritmētiskās vērtības atšķiras vairāk par 30 %, testēšanu atkārto pēc maisījuma sajaukšanas un ievietošanas procedūras pilnveidošanas.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.1. Sagatavošana

1.6.1.1. Viegli uzliesmojoša viela

Par viegli uzliesmojošu materiālu izmanto sausas celulozes šķiedras ar šķiedru garumu no 50 līdz 250 μm un vidējo diametru 25 μm [5]. Celulozi līdz nemainīgai masai 4 stundas žāvē līdz 25 mm biezā slānī 105 °C temperatūrā, pēc tam atdzesē un līdz lietošanai glabā eksikatorā virs žāvētāja. Sausas celulozes mitruma saturs nedrīkst pārsniegt 0,5 % no bezūdens masas [6], [7]. Lai to panāktu, žāvēšanas laiks, ja vajadzīgs, ir jāpagarina. Visai testēšanai jāizmanto celuloze no vienas un tās pašas partijas.

1.6.1.2. Iekārta

1.6.1.2.1. Spiedtvertne

Nepieciešama spiedtvertne. Tvertne sastāv no 89 mm gara tērauda spiedtvertnes ar ārējo diametru 60 mm (sk. 1. att.). Cilindra pretējās pusēs izslīpētas divas plakanas virsmas (samazinot šķērsgriezumu līdz 50 mm), ko izmanto fiksēšanai, ieskrūvējot ventilācijas atveres ventili un aizdedzināšanas ventili. Tvertnes abos galos ir izveidots 19 mm dziļš urbums 20 mm diametrā ar iekšējo Lielbritānijas standarta 1 "cauruļvītni vai tai līdzvērtīgu metriskās sistēmas vītni. Spiediena novada īscauruli ieskrūvē spiedtvertnes liektajā virsmā 90o leņķī pret izslīpētajām plakanajām virsmām 35 mm attālumā no viena gala. Šim nolūkam līdz 12 mm dziļumam izveido urbumu un iegriež ½" Lielbritānijas standarta cauruļvītni (vai tai līdzvērtīgu metriskās sistēmas vītni), kas atbilst īscaurules vītnei. Ja vajadzīgs, hermētiskuma nodrošināšanai izmanto inerta materiāla blīvi. Īscaurules garums ārpus spiedtvertnes korpusa ir 55 mm, un tās urbuma diametrs ir 6 mm. Īscaurules galā ir urbums ar vītni, kurā ieskrūvē diafragmas tipa spiediena devēju. Var izmantot visas spiediena mērīšanas ierīces, kuru darbību neietekmē karstas gāzes vai sadalīšanās produkti, un kuru reakcijas laiks uz spiediena paaugstināšanos no 690 līdz 2070 kPa nepārsniedz 5 m/s.

No īscaurules attālāko spiedtvertnes galu noslēdz ar aizdedzināšanas ventili, kas sastāv no diviem elektrodiem, no kuriem viens izolēts no ierīces aizbāžņa, bet otrs ar to savienots. Spiedtvertnes otru galu noslēdz ar pārraujamu disku (pārraušanas spiediens apmēram 2200 kPa), ko nostiprina ar uzgriezni, kurā ir 20 mm diametra urbums. Ja vajadzīgs, aizdedzināšanas ventiļa hermētiskuma nodrošināšanai izmanto inerta materiāla blīvi. Lietošanas laikā ierīci pareizā stāvoklī notur statīvā (2. att.). Tas parasti sastāv no mazleģēta tērauda pamatloksnes (235 mm x 184 mm x 6 mm) un 180 mm gara doba kvadrātveida šķērsgriezuma (70 mm x 70 mm x 4 mm) profila.

No kvadrātveida šķērsgriezuma profila pretējās pusēs vienā galā izveidots izgriezums tā, ka izveidojas konstrukcija ar divām plakanām gludām kājām ar 86 mm garu neskartu daļu. Šīs plakanās daļas nogriež 60o leņķī pret horizontāli un piemetina pamatplatei. Pamatnes augšējā daļā vienā pusē izgriež 22 mm platu 46 mm dziļu spraugu tā, lai statīvā ievietojot spiedtvertnes mezglu ar aizdedzināšanas ventili uz leju, spraugā atrastos īscaurule. Apakšējai iekšējai virsmai piemetina 30 mm platu un 6 mm biezu tērauda gabaliņu, kas kalpo par starpliku. Spiedtvertni cieši fiksē ar divām pretējā virsmā ieskrūvētām 7 mm spārnskrūvēm. No apakšas spiedtvertni balsta divas 12 mm platas 6 mm biezas tērauda lentas, kas piemetinātas sānu gabaliem un pieguļ pamatnei.

1.6.1.2.2. Aizdedzināšanas sistēma

Aizdedzināšanas sistēma sastāv no 25 cm garas 0,6 mm diametra nihroma stieples ar pretestību 3,85 omi/m. Stiepli uz 5 mm diametra stieņa savij spirālē un piestiprina aizdedzināšanas ventiļa elektrodiem. Spirāli savij kādā no 3. att. parādītajiem veidiem. Aizdedzināšanas spirāles apakšai jābūt vismaz 20 mm attālumā no tvertnes dibena. Ja elektrodi nav regulējami, aizdedzināšanas stieples gali starp spirāli un tvertnes apakšu jāizolē ar keramikas apvalku. Stiepli sakarsē no pastāvīga barošanas avota, kas nodrošina vismaz 10 A stipru strāvu.

1.6.2. Testa norise [8]

Iekārtu ar uzmontētu spiediena devēju un aizdedzināšanas sistēmu, neuzstādot pārraujamo disku, nostiprina statīvā ar aizdedzināšanas ventili uz leju. Stikla vārglāzē ar stikla spieķīti sajauc 2,5 g testējamā šķidruma ar 2,5 g sausas celulozes [9]. Drošības labad sajaukšana jāveic, lietotājam atrodoties aiz aizsargekrāna. Ja maisījums aizdegas tā sajaukšanas vai iepildīšanas laikā, testēšana nav jāturpina. Maisījumu nelielās daļās sablīvējot pārnes spiedtvertnē un raugās, lai maisījums tiktu sablīvēts ap aizdedzināšanas spirāli un ir ar to labā kontaktā. Svarīgi, lai sablīvēšanas laikā spirāle netiktu deformēta, jo tādēļ var iegūt kļūdainus rezultātus [10]. Ievieto pārraujamo disku un to nostiprina, cieši ieskrūvējot uzgriezni. Uzpildīto tvertni ar pārraujamo disku uz augšu ievieto statīvā velkmes skapī vai dedzināšanas kamerā. Aizdedzināšanas ventiļa ārējos izvadus pieslēdz elektrībai un padod 10 A stipru strāvu. Laiks no maisījuma sajaukšanas līdz elektriskās strāvas ieslēgšanai nedrīkst pārsniegt 10 minūtes.

Spiediena devēja signālu reģistrē, izmantojot piemērotu reģistrācijas sistēmu, kas nodrošina gan radītā spiediena izmaiņu novērtēšanu, gan pastāvīgu reģistrēšanu (piemēram, pārejas procesu reģistrētājs, kas apvienots ar diagrammas reģistrētāju). Maisījumu karsē, līdz saplīst pārraujamais disks, vai vismaz 60 sekundes. Ja pārraujamais disks nesaplīst, pirms iekārtu izjaukt, maisījumam ļauj atdzist, veicot piesardzības pasākumus, kas saistīti ar iespējamo spiediena paaugstināšanos iekārtā. Testējamās vielas un standartvielas(–u) izmēģinājumus atkārto piecas reizes. Atzīmē laiku, kādā paaugstinās spiediens no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku.

Dažkārt vielas var izraisīt spiediena paaugstināšanos (pārlieku augstu vai pārāk zemu), ar to oksidējošajām īpašībām nesaistītu ķīmisko reakciju dēļ. Šādos gadījumos, lai noskaidrotu reakcijas raksturu, testēšana var būt jāatkārto, celulozes vietā izmantojot inertas vielas, piemēram, diatomītu (kizelguru).

2. REZULTĀTI

Spiediena paaugstināšanās laiks testējamās vielas un standartvielas(–u) izmēģinājumos.

Spiediena paaugstināšanās laiks izmēģinājumos ar inertu vielu, ja tie tiek veikti.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku testējamajai vielai un standartvielai(–ām).

Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku izmēģinājumos ar inertu vielu (ja tiek veikti).

Daži rezultātu piemēri norādīti 1. tabulā.

1. tabula

Rezultātu piemēri [14]

Viela [13] | Vidējais spiediena paaugstināšanās laiks 1:1 maisījumam ar celulozi (m/s) |

Amonija dihromāts, piesātināts ūdens šķīdums | 20800 |

Kalcija nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | 6700 |

Dzelzs nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | 4133 |

Litija perhlorāts, piesātināts ūdens šķīdums | 1686 |

Magnija perhlorāts, piesātināts ūdens šķīdums | 777 |

Niķeļa nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | 6250 |

Slāpekļskābe, 65 % | 4767 [11] |

Perhlorskābe, 50 % | 121 [11] |

Perhlorskābe, 55 % | 59 |

Kālija nitrāts, 30 % ūdens šķīdums | 26690 |

Sudraba nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | – [12] |

Nātrija hlorāts, 40 % ūdens šķīdums | 2555 [11] |

Nātrija nitrāts, 45 % ūdens šķīdums | 4133 |

Inerta viela | |

Ūdens – celuloze | – [12] |

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija:

- testējamās vielas identifikācija, sastāvs, tīrība u.c.;

- testējamās vielas koncentrācija;

- izmantotās celulozes žāvēšanas procedūra;

- izmantotās celulozes ūdens saturs;

- mērījumu rezultāti;

- testēšanas rezultāti ar inertu vielu, ja tā veikta;

- aprēķinātais vidējais spiediena paaugstināšanās laiks;

- atkāpes no minētās metodes un to iemesli;

- papildu informācija vai piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA [15]

Testēšanas rezultātus novērtē, ņemot vērā:

a) vai notiek testējamās vielas un celulozes maisījuma pašaizdegšanās; un

b) vidējā spiediena paaugstināšanās laika no 690 kPa līdz 2070 kPa salīdzinājumu ar standartvielai(–ām) noteikto.

Šķidrums uzskatāms par oksidētāju, ja:

a) notiek vielas maisījuma ar celulozi masas attiecībā 1:1 pašaizdegšanās; vai

b) vielas, kuru maisījumiem ar celulozi masas attiecībā 1:1 testējot vidējais spiediena paaugstināšanās laiks ir vienāds vai mazāks nekā 65 masas % no slāpekļskābes ūdens šķīduma un celulozes (1:1 pēc masas) maisījumam noteiktā.

Lai neiegūtu šķietami pozitīvus rezultātus, rezultātu interpretācijai ņem vērā arī rezultātus, kas iegūti, vielu testējot maisījumā ar inertu vielu.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. AN publikācijas Nr.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999. gads, 342. epp. Tests O.2: Šķdrumu oksidēšanas tests.

+++++ TIFF +++++

Spiedtvertne

A spiedtvertnes korpuss

B plīstoša pārraujamā diska fiksācijas ventilis

C aizdedzināšanas ventilis

D mīksta svina paplāksne

E pārraujamais disks

F īscaurule

G spiediena devēja stiprinājums

H paplāksne

J izolētais elektrods

K iezemētais elektrods

L izolācija

M tērauda konuss

N paplāksni deformējošā rieva

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

A aizdedzināšanas spirāle

B izolācija

C elektrodi

D aizdedzināšanas ventilis

Piezīme.

Var izmantot jebkuru no abām konfigurācijām.

[1] Piemēram, ANO transporta noteikumu programmā.

[2] Skābe pirms testēšanas jātitrē, lai apstiprinātu tās koncentrāciju.

[3] Piemēram, ANO transporta noteikumu programmā.

[4] Piemēram, 1. norādē izmantoti 50 masas % perhlorskābes un 40 masas % nātrija hlorāta šķīdumi.

[5] Piemēram, Vatmaņa celulozes pulveris kolonnu hromatogrāfijai CF 11, kataloga nr. 4021 050.

[6] Apstiprina, piemēram, titrējot pēc Fišera metodes.

[7] Šādu ūdens saturu var panākt arī, piemēram, 24 h karsējot 105 °C temperatūrā vakuumā.

[8] Oksidētāju maisījumi ar celulozi jāuzskata par potenciāli sprādzienbīstamiem, un ar tiem jāstrādā, ievērojot attiecīgus piesardzības pasākumus.

[9] Praktiski to var izdarīt, sagatavojot testējamā šķidruma 1:1 maisījumu ar celulozi lielākā daudzumā, nekā izmēģinājumiem vajadzīgs, un pārnesot 5 ± 0,1 g spiedtvertnē. Katram izmēģinājumam jāsagatavo jauns maisījums.

[10] Jo īpaši nedrīkst saskarties spirāles blakus vijumi.

[11] Starplaboratoriju salīdzinošajā izmēģinājumā noteiktā vidējā vērtība

[12] Maksimālais spiediens of 2070 kPa nav sasniegts

[13] Piesātinātie šķīdumi jāpagatavo 20 °C

[14] Klasifikācijai pēc ANO transporta shēmas sk. 1. norādi

[15] Izmantojot vairākas standartvielas, par rezultātu interpretāciju saskaņā ar ANO transporta noteikumiem sk. 1. norādē.

--------------------------------------------------

2.B PIELIKUMS

B.1. bis AKŪTAIS PERORĀLAIS TOKSISKUMS – FIKSĒTĀS DEVAS METODE

1. METODE

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 420. (2001) vadlīnijā noteiktajai metodei.

1.1. IEVADS

Akūtā toksiskuma novērtēšanas tradicionālajās metodēs par beigu punktu izmanto dzīvnieku nobeigšanos. Jaunu pieeju akūtā toksiskuma noteikšanai, kuras pamatā ir vairāku fiksētu devu ievadīšana, 1984. gadā ieteica Britu Toksikoloģijas biedrība (1). Saskaņā ar šo pieeju izvairās par beigu punktu izmantot dzīvnieku nobeigšanos, tās vietā novērojot vairāku fiksētu devu toksiskuma pazīmes. Pēc Apvienotajā Karalistē (2) un starptautiski (3) in vivo veiktajiem validācijas pētījumiem šī procedūra 1992. gadā tika pieņemta par testa metodi. Tādejādi, izmantojot matemātiskos modeļus, fiksēto devu procedūras statistiskie raksturlielumi vēlāk tika novērtēti vairākos pētījumos (4), (5), (6). Modelēšanas pētījumi un in vivo pētījumi uzskatāmi parādījuši, ka procedūra ir reproducējama, tai jāizmanto mazāk dzīvnieku, izraisa mazāk ciešanu nekā tradicionālās metodes un nodrošina iespējas novērtēt vielas līdzvērtīgā veidā kā ar citām akūtā toksiskuma testa metodēm.

Norādījumi par katrā konkrētā gadījumā piemērotāko testa metodi atrodami pamatnostādnēs par akūtā perorālā toksiskuma testēšanu Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). Šajās pamatnostādnēs ir arī papildu informācija par testa metodes B.1. bis veikšanu un pēc tās iegūto rezultātu interpretāciju.

Saskaņā ar metodes principu galvenajos pētījumos izmanto tikai mēreni toksiskas devas, un jāizvairās lietot tādas devas, kurām varētu būt letāla iedarbība. Tāpat nav jāievada devas, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ. Bojā ejoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīmredzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas briesmu sajūtas, ir humāni jānonāvē, un interpretējot testa rezultātus, tie jāņem vērā tieši tāpat kā testos nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt bojā ejošus dzīvniekus vai dzīvniekus, kuriem ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos norādīti citās pamatnostādnēs (8).

Metode sniedz informāciju par bīstamajām īpašībām un dod iespējas novērtēt un klasificēt vielas ar akūti toksisku iedarbību saskaņā ar Vispārējo saskaņoto ķīmisko vielu klasifikācijas sistēmu (VSS) (9).

Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra; fizikāli ķīmiskās īpašības; citu in vitro vai in vivo veikto testu rezultāti; toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām; vielas paredzamo izmantošanas veidu(–iem). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka testi tiek veikti cilvēku veselības aizsardzībai piemērotā veidā un tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva.

1.2. DEFINĪCIJAS

Akūts perorāls toksiskums – attiecas uz to kaitīgo iedarbību, kāda ir 24 stundu laikā pēc vienas vai vairāku vielas devu ievadīšanas caur muti.

Aizkavēta nāve – ir tad, ja dzīvnieks 48 stundu laikā nav nobeidzies vai neizbēgami nav gājis bojā, bet krīt vēlāk 14 dienu novērošanas perioda laikā.

Deva – ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka testējamās vielas svara veidā uz testa dzīvnieka svara vienību (piemēram, mg/kg).

Izteikts toksiskums – ir vispārīgs termins, ar ko raksturo acīmredzamas toksiskas iedarbības pazīmes pēc testējamo vielu ievadīšanas (piemēram, sk. 3. norādi), un nākamās lielākās devas iedarbībā var sagaidīt izmēģinājuma dzīvnieku lielākās daļas nobeigšanos, izraisot stipras sāpes vai smagas un ilgstošas ciešanas (kritēriji noteikti Humane Endpoints Guidance Document (8)).

VSS – Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu un maisījumu klasifikācijas sistēma. Kopīgs ESAO (cilvēku veselības un vides aizsardzība), ANO Bīstamo kravu pārvadājumu ekspertu komitejas (fizikāli ķīmiskās īpašības) un ILO – Starptautiskās darba organizācijas (kaitīguma paziņošana) pasākums, ko koordinē Ķīmisko vielu drošas apsaimniekošanas starporganizāciju programma (IOMC).

Neizbēgama nāve – ir, ja miršana vai nāves iestāšanās sagaidāma pirms nākamā plānotā novērojumu laika. Pazīmes, kas liecina par šā stāvokļa iestāšanos grauzējiem var būt konvulsijas, gulēšana uz sāniem vai augšpēdus un drebēšana. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (8)).

LD50 (vidējā letālā deva) – ir statistiski noteikta vielas deva, kas, ievadot perorāli, var izraisīt 50 % dzīvnieku nobeigšanos. LD50 vērtību izsaka kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieka svara vienību (mg/kg).

Robeždeva – attiecas uz devas augšējo ierobežojumu testā (2000 vai 5000 mg/kg).

Mirstošs – atrašanās stāvoklī, kad mirst vai nav iespēju izdzīvot, arī saņemot ārstēšanu. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (8)).

Prognozējama nāve – klīniskās pazīmes, kas liecina par nāves iestāšanos pēc zināma laika, nesagaidot eksperimenta plānotās beigas, piemēram – nespēja sasniegt ūdeni vai barību. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (8)).

1.3. TESTA METODES PRINCIPS

Viena dzimuma dzīvnieku grupām dod pakāpeniski palielinātas fiksētas devas 5, 50, 300 un 2000 mg/kg (izņēmuma gadījumos var izmantot papildu fiksētu devu 5000 mg/kg, sk. 1.6.2. punktā) Sākotnējās devas līmeni izraugās pēc devu diapazona pētījumiem kā devu, kas var izraisīt toksiskas iedarbības pazīmes, bet kas nav stipri toksiska un neizraisa nobeigšanos. Klīniskās pazīmes un stāvokļi, kas saistīti ar sāpēm, ciešanām un neizbēgamu nāvi, sīki aprakstīti ESAO pamatnostādnēS (8). Atkarībā no toksiskuma pazīmēm vai mirstības papildu dzīvnieku grupām var ievadīt par to augstākas vai zemākas fiksētas devas. Šo procedūru turpina, līdz fiksētā deva izraisa izteiktas toksiskuma pazīmes, tiek konstatēts ne vairāk kā viens nobeigšanās gadījums, augstākajai devai netiek konstatētas toksiskas iedarbības pazīmes vai notiek nobeigšanās zemākās devas iedarbībā.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, kaut arī var izmanot citas grauzēju sugas. Parasti izmanto sievišķā dzimuma īpatņus (7). Tas tāpēc, ka parasto LD50 testu literatūras pārskati liecina, ka abu dzimumu jutība daudz neatšķiras, taču gadījumos, kad tā ir atšķirīga, sievišķā dzimuma īpatņi ir nedaudz jutīgākI (10). Tomēr, ja dati par struktūras ziņā līdzvērtīgu vielu toksikoloģiskajām un toksikokinētiskajām īpašībām liecina, ka uz testējamās vielas iedarbību tēviņi varētu būt jutīgāki, testi jāveic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem. Ja testus veic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem, tas ir jāpamato.

Jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Visiem testa dzīvniekiem testēšanas sākumā jābūt 8 līdz 12 nedēļas veciem un to svaram jābūt ± 20 % no testiem iepriekš izmantoto dzīvnieku vidējā svara.

1.4.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C) temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Dzīvniekus būros var turēt grupās atbilstoši devai, bet to skaits vienā būrī nedrīkst apgrūtināt katra dzīvnieka novērošanu.

1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana

Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas izlases veidā, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz 5 dienas pirms devu ievadīšanas sākuma, lai aklimatizētu laboratorijas apstākļiem.

1.4.4. Devu sagatavošana

Parasti testējamās vielas jāievada visām pārbaudāmajām devām vienādā tilpumā, mainot ievadāmā preparāta koncentrāciju. Taču, ja jātestē gala produkts, kas ir šķidrums vai maisījums, vielas bīstamības novērtēšanai tā var būt jāizmanto neatšķaidītā testējamās vielas veidā, t.i., ar nemainīgu koncentrāciju, un tā ir arī dažu reglamentējošo iestāžu prasība. Jebkurā gadījumā nedrīkst pārsniegt ievadāmās devas maksimālo tilpumu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Grauzējiem šis tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumu gadījumā var ievadīt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara. Ņemot vērā ievadāmā preparāta sastāvu, vienmēr kad iespējams, ieteicams izmantot šķīdumu/suspensiju/emulsiju ūdenī, ja nē, tad šķīdumu/suspensiju/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā), un tikai pēc tam šķīdumu citos nesējos. Ja par nesēju neizmanto ūdeni, jānoskaidro tā toksikoloģiskās īpašības. Ja nav datu par preparāta pietiekamu stabilitāti visā tā lietošanas laikā, devas jāsagatavo neilgi pirms ievadīšanas.

1.5. PROCEDŪRA

1.5.1. Devu ievadīšana

Testējamo vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Ja kādu apstākļu dēļ ievadīt vienā devā nav iespējams, to var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas.

Pirms ievadīšanas dzīvniekus nedrīkst barot (piemēram, žurkas pārstāj barot iepriekšējā dienā, dodot tikai dzert ūdeni; peles nebaro 3 – 4 stundas iepriekš, dodot dzert tikai ūdeni). Pirms ievada testējamo vielu pēc nebarošanas perioda, dzīvnieki ir jānosver. Pēc testējamās vielas ievadīšanas žurkas var nebarot vēl 3 – 4 stundas, bet peles – 1 – 2 stundas. Ja devu ievada pa daļām ilgākā laika posmā, var būt nepieciešams dzīvniekiem dot barību un ūdeni atkarībā no šā laika posma ilguma.

1.5.2. Devu diapazona pētījums

Devu diapazona pētījuma mērķis ir noteikt galvenajā pētījumā izmantojamo sākotnējo devu. Testējamo vielu atsevišķiem dzīvniekiem ievada pēc 1. pielikumā noteiktajām diagrammām. Devu diapazona pētījumu beidz, kad var pieņemt lēmumu par galvenajā pētījumā izmantojamo sākotnējo devu (vai kad pie mazākās fiksētās devas tiek konstatēta dzīvnieku nobeigšanās).

Devu diapazona pētījumam attiecībā uz sākotnējo devu izraugās no fiksēto līmeņu devām 5, 50, 300 un 2000 mg/kg to devu, kurai paredzams izteikts toksiskums, par ko iespējams ir pierādījumi par tās pašas vielas vai struktūras ziņā līdzvērtīgu vielu in vitro un in vivo testu rezultātiem. Ja šādas informācijas nav, par sākotnējo devu izmanto 300 mg/kg.

Katram dzīvniekam vielas ievadīšanas starplaikam jābūt vismaz 24 stundām. Visi dzīvnieki jānovēro vismaz 14 dienas.

Augšējo devu 5000 mg/kg var izmantot tikai izņēmuma gadījumos, kad tā ir pamatota ar īpašām reglamentējošām prasībām (sk. 3. pielikumu). Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem nav ieteicams testēt dzīvniekus ar VSS 5. kategorijas devām (2000 – 5000 mg/kg), un tās jātestē tikai tādos gadījumos, kad ir lielas iespējas, ka šādu testu rezultāti ir ļoti nepieciešami cilvēku vai dzīvnieku veselības vai vides aizsardzībai.

Gadījumos, kad devu diapazona pētījumā nobeidzas dzīvnieks, kuram pārbaudīta mazākās fiksētās devas (5 mg/kg) iedarbība, parasti pētījumu izbeidz un attiecīgo vielu klasificē VSS 1. kategorijā (kā norādīts 1. pielikumā). Tomēr, ja ir nepieciešams precīzāks klasifikācijas apstiprinājums, papildus var veikt šādu fakultatīvu procedūru. Devu 5 mg/kg ievada vēl otram dzīvniekam. Ja arī šis otrs dzīvnieks nobeidzas, VSS 1. kategorija tiek apstiprināta, un pētījumi nekavējoties jāizbeidz. Ja šis otrais dzīvnieks nenobeidzas, devu 5 mg/kg ievada vēl ne vairāk kā trijiem dzīvniekiem. Tā kā ir augsts mirstības risks, ievērojot labturības apsvērumus, šiem dzīvniekiem devu ievada noteiktā secībā. Starplaikam, pēc kāda vielu ievada nākamajam dzīvniekam, ir jābūt pietiekami ilgam, lai varētu konstatēt, ka iepriekšējais dzīvnieks varētu izdzīvot. Ja tiek konstatēts otrs bojāejas gadījums, devu ievadīšanas noteikto secību nekavējoties pārtrauc un deva nevienam dzīvniekam vairāk nav ievadāma. Pēc otrā bojāejas gadījuma (neatkarīgi no dzīvnieku skaita, ar kuriem izdarīti testi testēšanas izbeigšanas laikā) tiek noteikts A rezultāts (2 vai vairāki bojāejas gadījumi), un tiek ievērots 2. pielikumā noteiktais klasifikācijas noteikums par 5 mg/kg fiksēto devu (1. kategorija, ja ir 2 vai vairāki bojāejas gadījumi vai 2. kategorija, ja tiek konstatēts ne vairāk kā viens bojāejas gadījums). Turklāt 4. pielikumā ir norādījumi par klasifikāciju ES sistēmā līdz laikam, kamēr tiek ieviesta jaunā VSS sistēma.

1.5.3. Galvenais pētījums

1.5.3.1. Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

Lēmumi, kas jāpieņem pēc testiem ar sākotnējo devu, ir norādīti diagrammās 2. pielikumā. Jāpieņem kāds no trijiem lēmumiem – testēšanu pārtraukt un piešķirt atbilstošu bīstamības klasi, veikt testus ar augstāko fiksēto devu, vai arī ar zemāko fiksēto devu. Tomēr, pamatojoties uz apsvērumiem, kas saistīti ar dzīvnieku aizsardzību, nav jātestē devu līmenis, kas devu diapazona pētījumā ir izraisījis dzīvnieku nobeigšanos (sk. 2. pielikumu). Līdzšinējā pieredze liecina, ka ticamākais sākotnējās devas testu rezultāts ir tāds, ka vielu iespējams klasificēt bez jebkādiem papildu testiem.

Katra līmeņa devu testēšanai parasti izmanto pavisam piecus viena dzimuma dzīvniekus. Šo piecu dzīvnieku grupu izvēlas, izmantojot vienu dzīvnieku no devu diapazona pētījuma, kam ievadīta izraudzītā līmeņa deva un papildus vēl četriem dzīvniekiem (izņemot gadījumus, kad galvenajā pētījumā izmantotais devu līmenis nav bijis iekļauts devu diapazona pētījumā, taču parasti tā nav).

Vielas ievadīšanas reižu starplaiku katram devu līmenim nosaka atkarībā no toksiskuma pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas nākamās devas ievadīšana ir jāatliek līdz laikam, kamēr rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu. Ja vajadzīgs, lai novērotu aizkavētu toksisko iedarbību, ieteicams ievērot 3 līdz 4 dienu starplaiku katrai devu līmeņa ievadīšanai. Starplaiku var koriģēt pēc vajadzības, piemēram, gadījumos, kad atbildes reakcija uz vielas iedarbību nav pārliecinoša.

Ja tiek pieņemts lēmums izmantot augstāko fiksēto devu 5000 mg/kg, jāievēro 3. pielikumā noteiktā procedūra (sk. arī 1.6.2. punktu).

1.5.3.2. Pieļaujamības tests

Pieļaujamības testu galvenokārt izmanto gadījumos, kad eksperimenta veicēja rīcībā ir informācija, kas liecina, ka vielai iespējams nav toksiskas iedarbības, t.i., tā ir toksiska tikai devās, kas ierobežotas ar reglamentējošām pieļaujamības devām. Informāciju par testējamās vielas toksiskumu var iegūt pēc testu datiem ar līdzīgiem maisījumiem vai produktiem, ņemot vērā identitāti un to komponentu īpatsvaru, kuru toksiskums ir zināms. Šādās situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī sagaidāms, ka testējamā viela varētu būt toksiska, ir jāveic galvenais tests.

Izmantojot parasto procedūru, devu diapazona pētījuma sākotnējo devu 2000 mg/kg (vai izņēmuma gadījumā 5000 mg/kg) ievada papildus četriem dzīvniekiem, ko izmanto pieļaujamības testam saskaņā ar šiem norādījumiem.

1.6. NOVĒROJUMI

Pēc ievadīšanas pirmo 30 minūšu laikā dzīvniekus individuāli novēro vismaz vienreiz, pirmo 24 stundu laikā periodiski, īpašu uzmanību veltot pirmajām 4 stundām un pēc tam reizi dienā, pavisam 14 dienas, izņemot gadījumus, kad tie gājuši bojā vai pētījumi jāizbeidz, dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ tos humāni nonāvējot. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas jānosaka pēc toksiskuma reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ novērojumu ilgumu var pagarināt, ja ir vajadzīgs. Laiki, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, ir svarīgi, īpaši ja tām ir tendence aizkavēties (11). Visus novērojumus regulāri reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālus reģistrus.

Ja dzīvnieki turpina uzrādīt toksiskas iedarbības pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Humane Endpoints Guidance Document (8). Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānonāvē. Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti nobeigušies, iespējami precīzi jāreģistrē nāves iestāšanās laiks.

1.6.1. Ķermeņa svars

Visi dzīvnieki jānosver neilgi pirms testējamās vielas ievadīšanas, un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāreģistrē. Testu beigās izdzīvojušos dzīvniekus nosver, tad humāni nonāvē.

1.6.2. Patoloģija

Visus testa dzīvniekus (arī tos, kas testa laikā nobeigušies vai ar kuriem dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ pētījumi izbeigti), ir jāizdara pilna autopsija. Visas makroskopiskās patoloģiskās izmaiņas jāreģistrē par katru dzīvnieku. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās makroskopiskās patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko izmeklēšanu dzīvniekiem, kas pēc sākotnējās devas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju.

2. DATI

Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, norādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksiskuma pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksiskās iedarbības veidu un to atgriezeniskuma aprakstu un gaitu, kā arī autopsijā iegūtos novērojumus.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija.

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības, tīrība, un attiecīgos gadījumos arī fizikāli ķīmiskās īpašības (tostarp izomerizācija);

- identifikācijas dati, tostarp CAS numuru.

Nesējs (ja vajadzīgs):

- nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.

Testa dzīvnieki:

- izmantotā suga/līnija;

- dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms;

- dzīvnieku skaits, vecums un dzimums (tostarp, ja vajadzīgs, vīrišķā dzimuma īpatņu izmantošanu sievišķā dzimuma īpatņu vietā);

- izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u.c.;

Testu apstākļi:

- sīkas ziņas par testējamās vielas preparātu, tostarp dati par ievadītā materiāla fizikālo formu;

- sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu, iekļaujot dozēšanas tilpumus un dozēšanas laikus;

- sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens avotu);

- sākotnējās devas izvēles pamatojums.

Rezultāti:

- datu tabula par atbildes reakcijām un devu līmeņiem (t.i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksiskuma pazīmes, tostarp nobeigšanās gadījumus, iedarbības veidu, smagumu un ilgumu);

- datu tabula par ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām;

- katra dzīvnieka svars ievadīšanas dienā un pēc tam ar nedēļas starplaikiem, kā arī nobeigšanās vai nonāvēšanas laikā;

- nobeigšanās datums un laiks, ja tā notikusi pirms paredzētās nonāvēšanas;

- toksiskuma pazīmju parādīšanās gaita katram dzīvniekam, un vai tās ir bijušas atgriezeniskas;

- katra dzīvnieka autopsijas konstatācijas un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas.

Rezultātu apspriešana un interpretācija.

Secinājumi.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed–dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed–dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed–dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315–323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN–documents–521–14–no–24–no–0,FF.html].

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up–and–Down, Conventional LD50, and Fixed–Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

--------------------------------------------------

2.C PIELIKUMS

"B1.tris . AKŪTS PERORĀLS TOKSISKUMS – AKŪTA TOKISKUMA KLASES METODE

1. METODE

Šī testa metode ir līdzvērtīga ESAO 423. (2001) vadlīnijā noteiktajai metodei.

1.1. IEVADS

Šajā testā norādītā akūtā toksiskuma klases noteikšanas metode (1) ir posmveida procedūra, kuras katrā posmā izmanto 3 viena dzimuma dzīvniekus. Atkarībā no dzīvnieku mirstības un/vai mirstošo dzīvnieku skaita testējamās vielas akūtā toksiskuma noteikšanai vidēji var būt vajadzīgi 2 – 4 posmi. Šī procedūra ir reproducējama, tajā izmanto ļoti nelielu skaitu dzīvnieku, un pēc tās iespējams vielas klasificēt līdzvērtīgi kā pēc citām akūtā toksiskuma noteikšanas metodēm. Akūtā toksiskuma klases noteikšanas metodes pamatā ir biometriski novērtējumi (2), (3), (4), (5) ar fiksētām devām, kas ir atbilstoši atdalītas tā, lai vielu varētu novērtēt gan klasifikācijas vajadzībām, gan bīstamības noteikšanai. Kopš tās pieņemšanas 1996. gadā metode plaši in vivo validēta gan valstu līmenī (6), gan starptautiski (7) salīdzinājumā ar datiem, kas iegūti no literatūras.

Norādījumi par katrā konkrētā gadījumā piemērotāko testa metodi atrodami pamatnostādnēs par akūtā perorālā toksiskuma testēšanu Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Šajās pamatnostādnēs ir arī papildu informācija par testēšanas metodes B.1. tris veikšanu un pēc tās iegūto rezultātu interpretāciju.

Testējamās vielas devās, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ, nav jāievada. Bojā ejoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīmredzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas briesmu sajūtas, ir humāni jānonāvē, un interpretējot testēšanas rezultātus, tie jāņem vērā tieši tāpat kā testos nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt bojā ejošus dzīvniekus vai dzīvniekus, kuriem ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos doti citās atsevišķās pamatnostādnēs (9).

Metodē izmanto iepriekš noteiktas fiksētas devas, un pēc tās iegūtie rezultāti dod iespējas vielas ar akūti toksisku iedarbību novērtēt un klasificēt saskaņā ar Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācija (10).

Šī metode principā nav paredzēta precīzai LD50 aprēķināšanai, bet ļauj noteikt iedarbības diapazonu, kurā ir sagaidāms letāls iznākums, jo šā testa galvenais beigu punkts ir kādas testa dzīvnieku daļas nobeigšanās. Pēc šīs metodes LD50 vērtību var noteikt tikai tādos gadījumos, kad vismaz divas devas izraisa nobeigšanos, kas ir augstāka nekā 0 % un zemāka nekā 100 %. Izmantojot iepriekš noteiktas devas, kas nav atkarīgas no konkrētās testējamās vielas, tās klasifikāciju tieši saistot ar dažādos stāvokļos novēroto dzīvnieku skaitu, uzlabo dažādās laboratorijās iegūto rezultātu atbilstību un atkārtojamību.

Pirms sākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra; fizikāli ķīmiskās īpašības; citu in vitro vai in vivo veikto toksiskuma testu rezultāti; toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā līdzīgām vielām; vielas paredzamais izmantošanas veids(–i). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka testi tiek veikti cilvēku veselības aizsardzībai piemērotā veidā un tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva.

1.2. DEFINĪCIJAS

Akūts perorāls toksiskums – ir kaitīgā iedarbība, kāda ir 24 stundu laikā pēc vienas vai vairāku vielas devu ievadīšanas caur muti.

Aizkavēta nāve – ir tad, ja dzīvnieks 48 stundu laikā nav nobeidzies vai neizbēgami nav gājis bojā, bet nobeidzas vēlāk 14 dienu novērošanas perioda laikā.

Deva – ir ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka testējamās vielas svara veidā uz testa dzīvnieka svara vienību (piemēram, mg/kg).

VSS – Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu un maisījumu klasifikācijas sistēma. Kopīgs ESAO (veselības un vides aizsardzība), ANO Bīstamo kravu pārvadājumu ekspertu komitejas (fizikāli ķīmiskās īpašības) un ILO – Starptautiskās darba organizācijas (kaitīguma paziņošana) pasākums, ko koordinē Ķīmisko vielu drošas apsaimniekošanas starporganizāciju programma (IOMC).

Neizbēgama nāve – ir tad, ja miršana vai nāves iestāšanās sagaidāma pirms nākamā plānotā novērojumu laika. Pazīmes, kas liecina par šā stāvokļa iestāšanos grauzējiem var būt konvulsijas, gulēšana uz sāniem vai augšpēdus un drebēšana. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (9)).

LD50 (vidējā letālā deva) – ir statistiski noteikta vielas deva, kas, ievadot perorāli, var izraisīt 50 % dzīvnieku nobeigšanos. LD50 vērtību izsaka kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieku svara vienību (mg/kg).

Robeždeva – attiecas uz devas augšējo ierobežojumu testā (2000 vai 5000 mg/kg).

Mirstošs – atrašanās stāvoklī, kad mirst, vai nav iespēju izdzīvot arī saņemot ārstēšanu. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (9)).

Prognozējama nāve – ir klīniskās pazīmes, kas liecina par nāves iestāšanos pēc zināma laika, nesagaidot eksperimenta plānotās beigas, piemēram, nespēja sasniegt ūdeni vai barību. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (9)).

1.3. METODES PRINCIPS

Metodes princips ir tāds, ka pamatojoties uz posmveida procedūru, kuras katrā posmā izmanto minimālu skaitu dzīvnieku, tiek iegūta klasifikācijai pietiekama informācija par testējamās vielas akūto toksiskumu. Vielu izmēģinājuma dzīvnieku grupai ievada perorāli vienā no noteiktajām devām. Vielu testē, izmantojot posmveida procedūru, katrā posmā izmanto trīs viena (parasti sievišķā) dzimuma dzīvniekus. Ar vielu saistīta testa dzīvnieku bojāeja vai tās neesamība nosaka nākamo posmu, t.i.:

- turpmāka testēšana nav vajadzīga,

- to pašu devu ievada vēl trijiem dzīvniekiem,

- vēl trijiem dzīvniekiem ievada nākamo augstāko vai zemāko devu.

Testa procedūra sīkāk aprakstīta I pielikumā. Metode dod iespējas testējamo vielu novērtēt, to klasificējot kādā no toksiskuma klasēm, kas noteiktas pēc fiksētām LD50 robežvērtībām.

1.4. METODES APRAKSTS

1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, lai gan var izmanot arī citas grauzēju sugas. Parasti izmanto sieviešu dzimuma īpatņus (9). Tas tāpēc, ka parasto LD50 testu literatūras apskati liecina, ka abu dzimumu jutība daudz neatšķiras, taču gadījumos, kad tā ir atšķirīga, sieviešu dzimuma īpatņi parasti ir nedaudz jutīgāki (11). Tomēr, ja dati par struktūras ziņā līdzīgu vielu toksikoloģiskajām un toksikokinētiskajām īpašībām liecina, ka uz testējamās vielas iedarbību tēviņi varētu būt jutīgāki, tests jāveic ar vīriešu dzimuma īpatņiem. Ja testu veic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem, tas ir jāpamato.

Ir jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Visiem testa dzīvniekiem testēšanas sākumā jābūt 8 līdz 12 nedēļas veciem un to ķermeņa svaram jābūt ± 20 % no testiem iepriekš izmantoto dzīvnieku vidējā svara.

1.4.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C) temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Dzīvniekus būros var turēt grupās atbilstoši devai, bet to skaits vienā būrī nedrīkst apgrūtināt katra dzīvnieka novērošanu.

1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana

Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas izlases veidā, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz 5 dienas pirms izmēģinājuma sākuma, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.

1.4.4. Devu sagatavošana

Parasti testējamās vielas jāievada visām pārbaudāmajām devām vienādā tilpumā, mainot ievadāmā preparāta koncentrāciju. Taču, ja jātestē gala produkts, kas ir šķidrums vai maisījums, vielas bīstamības novērtēšanai tā var būt jāizmanto neatšķaidītā veidā, t.i., ar nemainīgu koncentrāciju, un tā ir arī dažu reglamentējošo iestāžu prasība. Jebkurā gadījumā nedrīkst pārsniegt ievadāmo devas maksimālo tilpumu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Žurkām tas parasti nedrīkst pārsniegt 1ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumus var ievadīt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara. Ņemot vērā ievadāmā preparāta sastāvu, vienmēr, kad iespējams, ieteicams izmantot šķīdumu/suspensiju/emulsiju ūdenī, ja nē, tad šķīdumu/suspensiju/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā), un tikai pēc tam šķīdumu citos nesējos. Ja nesējs nav ūdens, jānoskaidro tā toksiskās īpašības. Ja nav datu par preparāta pietiekamu stabilitāti visā tā lietošanas laikā, devas jāsagatavo neilgi pirms ievadīšanas.

1.5. PROCEDŪRA

1.5.1. Devu ievadīšana

Testējamo vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Ja kādu apstākļu dēļ ievadīt vienā devā nav iespējams, to var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas.

Dzīvniekus pirms devu ievadīšanas nebaro (piemēram, žurkas pārtrauc barot iepriekšējā dienā, dodot tikai dzert, bet peles – 3 – 4 stundas pirms devu ievadīšanas). Pirms ievadīt testējamo vielu pēc nebarošanas perioda, dzīvnieki ir jānosver. Pēc testējamās vielas ievadīšanas žurkas var nebarot vēl 3 – 4 stundas, bet peles – 1 – 2 stundas. Ja vielas devu ievada pa daļām kādā laika posmā, atkarībā no tā ilguma var gadīties, ka dzīvnieki ir jānodrošina ar barību un ūdeni.

1.5.2. Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

Katrā posmā izmato trīs dzīvniekus. Devas līmeni, ko izmanto par sākotnējo devu, izvēlas kā vienu no četriem noteiktiem līmeņiem, t.i., 5, 50, 300 un 2000 mg/kg ķermeņa svara. Sākotnējam devas līmenim jābūt tādam, kas ar lielu varbūtību varētu izraisīt vismaz dažu devu saņēmušo dzīvnieku bojāeju. Diagrammās 1. pielikumā norādīta procedūra, kas jāievēro atkarībā no sākotnējās devas. Papildus 4. pielikumā ir norādījumi par klasifikāciju ES sistēmā līdz laikam, kamēr tiek ieviesta jaunā VSS sistēma.

Ja pieejamā informācija liek domāt, ka pie lielākā sākotnējās devas līmeņa (2000 mg/kg ķermeņa svara) mirstība ir mazticama, tad ir jāizdara pieļaujamības tests. Ja par testējamo vielu nav informācijas, dzīvnieku labturības dēļ ir ieteicams izmantot sākotnējo devu 300 mg/kg ķermeņa svara.

Laika intervālu starp vielas atkārtotu ievadīšanu izmēģinājumu dzīvnieku grupām nosaka atkarībā no toksiskuma pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas nākamās devas ievadīšana ir jāatliek līdz laikam, kamēr rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu.

Augšējo devu 5000 mg/kg ķermeņa svara var izmantot tikai izņēmuma gadījumos, kad tā ir pamatota ar īpašām reglamentējošām prasībām (sk. 2. pielikumu). Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem nav ieteicams ar dzīvniekiem izmēģināt VSS 5. kategorijas devas (2000 – 5000 mg/kg), un tās jātestē tikai tādos gadījumos, ja ir lielas iespējas, ka šādu testu rezultāti ir ļoti nepieciešami cilvēku vai dzīvnieku veselības vai vides aizsardzībai.

1.5.3. Pieļaujamības tests

Pieļaujamības testu galvenokārt izmanto gadījumos, kad eksperimenta veicēja rīcībā ir informācija, kas liecina, ka vielai varētu nebūt toksiskas iedarbības, t.i., tā ir toksiska tikai devās, kas ierobežotas ar reglamentējošiem dokumentiem. Informāciju par testējamā materiāla toksiskumu var iegūt pēc testu datiem ar līdzīgiem maisījumiem vai produktiem, ņemot vērā identitāti un to sastāvdaļu procentuālo īpatsvaru, kuru toksiskums ir zināms. Šādās situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī paredzams, ka testējamā viela varētu būt toksiska, ir jāveic galvenais tests.

Pieļaujamības testu pie viena devas līmeņa 2000 mg/kg ķermeņa svara var izdarīt ar sešiem dzīvniekiem (katrā posmā pa trijiem). Izņēmuma gadījumos pieļaujamības testu var veikt ar devu 5000 mg/kg ķermeņa svara, izmantojot trīs dzīvniekus (sk. 2. pielikumu). Ja tiek konstatēta ar vielas ievadīšanu saistīta bojāeja, var būt nepieciešams veikt nākamās zemākās devas testus.

1.6. NOVĒROJUMI

Pēc ievadīšanas pirmo 30 minūšu laikā dzīvniekus individuāli novēro vismaz vienreiz, pirmo 24 stundu laikā periodiski, īpašu uzmanību veltot pirmajām 4 stundām, un pēc tam reizi dienā, pavisam 14 dienas, izņemot gadījumus, kad dzīvnieki gājuši bojā vai pētījumi jāizbeidz, dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ tos humāni nonāvējot. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas ir jānosaka pēc toksiskās iedarbības reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ ilgumu var pagarināt, ja uzskata par vajadzīgu. Laiki, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, ir svarīgi, īpaši ja tām ir tendence aizkavēties (12). Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālu reģistrēšanu.

Ja dzīvniekiem turpinās toksiskās iedarbības pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Humane Endpoints Guidance Document (9). Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānonāvē. Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti miruši, iespējami precīzi ir jāreģistrē nobeigšanās laiks.

1.6.1. Ķermeņa svars

Visi dzīvnieki jānosver neilgi pirms testējamās vielas ievadīšanas, un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāreģistrē. Testa beigās pirms humānas nonāvēšanas izdzīvojušos dzīvniekus nosver.

1.6.2. Patoloģija

Visus testa dzīvniekus (arī tos, kas testa laikā nobeigušies vai ar kuriem dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ pētījumi izbeigti), ir jāveic pilna autopsija. Visas patoloģiskās izmaiņas reģistrē par katru dzīvnieku. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās visas patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko izmeklēšanu dzīvniekiem, kas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju.

2. DATI

Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, norādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksiskuma pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksiskās iedarbības veidu un tā atgriezeniskuma aprakstu un gaitu, kā arī autopsijā iegūtie novērojumi.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. Pārskats par testu

Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija:

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības, tīrība, un attiecīgos gadījumos arī fizikāli ķīmiskās īpašības (ieskaitot izomerizāciju);

- identifikācijas dati, tostarp CAS numuru.

Nesējs (ja vajadzīgs):

- nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens;

Testa dzīvnieki:

- izmantotā suga/līnija;

- dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms;

- dzīvnieku skaits, vecums un dzimums (ietverot, ja vajadzīgs, vīrišķā dzimuma īpatņu izmantošanu sievišķā dzimuma īpatņu vietā);

- izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u.c.

Testa apstākļi:

- informācija par testējamās vielas preparātu, ietverot datus par ievadītā materiāla fizikālo formu;

- sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu, iekļaujot ievadāmos tilpumus un ievadīšanas laikus;

- sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens avotu);

- sākotnējās devas izvēles pamatojums.

Rezultāti:

- katra dzīvnieka atbildes reakciju datu tabula un devas līmenis (t.i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksiskuma pazīmes, tostarp nobeigšanās gadījumus, iedarbības veidu, smagumu un ilgumu);

- datu tabula par ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām;

- katra dzīvnieka svars ievadīšanas dienā un pēc tam ar nedēļas starplaikiem, kā arī nobeigšanās vai nonāvēšanas laikā;

- nobeigšanās datums un laiks, ja tā notikusi pirms paredzētās nonāvēšanas;

- toksiskuma pazīmju parādīšanās gaita katram dzīvniekam, un vai tās ir bijušas atgriezeniskas;

- katra dzīvnieka autopsijā konstatētais un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas.

Rezultātu apspriešana un interpretācija.

Secinājumi.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Roll R., Hofer–Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute–Toxic–Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610.

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute–Toxic–Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134.

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute–Toxic–Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.

7 Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute–Toxic–Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.

8 OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

9 OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) displaygeneral/ 0,3380,EN–documents–521–14–no–24–no–0,FF.html]

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http:// webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN–documents–521–14–no–24–no–0,FF.html]

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up–and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16 Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."

--------------------------------------------------

2.D PIELIKUMS

Β.4. AKŪTS TOKSISKUMS – KAIRINĀJUMS/KODĪGA IEDARBĪBA UZ ĀDU

1. METODE

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 404. (2002) vadlīnijā noteiktai metodei.

1.1. IEVADS

Izstrādājot šo pilnveidoto metodi, īpaša vērība tika veltīta tās iespējamajiem uzlabojumiem, kas attiecas uz dzīvnieku labturību un visas esošās informācijas izvērtēšanu par testējamo vielu, lai neveiktu nevajadzīgus testus ar laboratorijas dzīvniekiem. Šajā metodē ietilpst arī ieteikums pirms vielas aprakstīto kodīgo/kairinošo īpašību pārbaudes in vivo testos par esošajiem atbilstīgajiem datiem veikt zinātnisko datu nozīmīguma analīzi. Ja esošie dati ir nepietiekami, tos var iegūt secīgā testēšanān (1). Testēšanas stratēģijā ietilpst validētu un vispārpieņemtu in vitro testu veikšana, un tā pievienota pielikumam, kurā aprakstīta šī metode. Bez tam attiecīgā gadījumā ieteicams sākotnējā testa in vivo trīs daļas veikt nevis vienlaicīgi, bet secīgi.

Gan zinātniskās precizitātes dēļ, gan ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, in vivo testus neveic, kamēr zinātnisko datu nozīmīguma analīzē nav izvērtēti visi pieejamie dati par vielas kodīgo/kairinošo iedarbību uz ādu. Šādi dati ir – ar cilvēkiem un/vai laboratorijas dzīvniekiem veiktajos pētījumos iegūtie zinātniskie dati, liecības par vienas vai vairāku struktūras ziņā līdzīgu vielu vai vielu maisījumu kodīgajām/kairinošajām īpašībām, dati, kas liecina, ka attiecīgajai vielai ir stipru skābju vai bāzu īpašības (2), (3), kā arī validētos un vispārpieņemtos in vitro vai ex vivo testos iegūti rezultāti (4), (5), (5.a). Šāda analīze samazina nepieciešamību veikt in vivo testus, nosakot kodīgās/kairinošās īpašības tādām vielām, par kurām citos pētījumos jau ir iegūts pietiekami daudz zinātnisku datu par šiem diviem galamērķiem.

Ieteicamā secīgā testēšanas stratēģija, pie kuras pieder validētu un vispārpieņemtu in vitro vai ex vivo izmēģinājumu veikšana kodīgo/kairinošo īpašību noteikšanai, ir pievienota šīs metodes pielikumā. Šo stratēģiju izstrādājusi un vienprātīgi ieteikusi ESAO darba grupa (6), un tā pieņemta par ieteicamo testēšanas stratēģiju Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācijas sistēma (VSS) (7). Šo stratēģiju ieteicams ievērot pirms in vivo testiem. Lai iegūtu zinātniski pamatotus datus par konkrētās vielas kodīgajām īpašībām/kairinošo iedarbību, testus ar jaunām vielām ieteicams veikt secīgos posmos. Attiecībā uz esošajām vielām, par kurām nav pietiekamu datu, kas raksturo to kodīgās/kairinošās īpašības, jāizmanto nepieciešamā stratēģija, kas vajadzīga, lai iegūtu trūkstošos datus. Ir jābūt pamatojumam par atšķirīgu testēšanas stratēģiju vai procedūru izmantošanu vai arī par lēmumu – neveikt testu secīgos posmos.

Ja kodīgās vai kairinošās īpašības nav iespējams noteikt zinātnisko datu nozīmīguma analīzē, ievērojot secīgās testēšanas stratēģiju, jāveic atbilstoši in vivo testi (sk. pielikumā).

1.2. DEFINĪCIJAS

Ādas kairinājums – ādas atgriezenisks bojājums, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas līdz 4 stundas ilgā ekspozīcijas laikā.

Kodīga iedarbība uz ādu (ādas saēšana) – ir ādas neatgriezenisku bojājumu radīšana;, t.i., nekrozes novērošana caur epidermu un zemādā, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas līdz 4 stundas ilgā ekspozīcijas laikā. Kodīgajai iedarbībai parasti raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērojumu perioda beigās atkrāsošanās ādas izbalēšanas dēļ, rodas zonas, kurās izkritis apmatojums un veidojas rētas. Lai novērtētu neskaidrus bojājumus, jāveic histopataloģiski izmeklējumi.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS

Uz izmēģinājumu dzīvnieku ādas aplicē vienu devu testējamās vielas. Par kontroli izmanto tā paša izmēģinājumu dzīvnieka ādas neskartās daļas. Nosaka kairinājuma/kodīgās iedarbības pakāpi, ko atzīmē pēc noteiktiem intervāliem un iedarbības pilnīgai novērtēšanai apraksta sīkāk. Pētījumi jāveic tik ilgi, lai varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu.

Visos testa posmos dzīvnieki, kuriem ilgstoši novēro stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, ir humāni jānonāvē, un atbilstoši jānovērtē testējamās vielas iedarbība. Kritēriji, pēc kuriem pieņemami lēmumi par to dzīvnieku humānu nonāvēšanu, kas iet bojā vai kuriem ir stipras ciešanas, atrodami literatūras sarakstā (8).

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.1. Sagatavošana testiem in vivo

1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Piemērotākais dzīvnieks laboratorijas izmēģinājumiem ir albīnais trusis, tiem izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Jābūt atbilstošam pamatojumam, ja izmanto citu sugu dzīvniekus.

1.4.1.2. Dzīvnieku sagatavošana

Apmēram 24 stundas pirms testa uzsākšanas dzīvniekiem muguras daļā no ķermeņa nocērp apmatojumu. Jāraugās, lai netiktu noberzta āda, un jāizmanto tikai tie dzīvnieki, kam ir vesela un nebojāta āda.

Dažām trušu līnijām ir bieži spalvu kušķi, kas zināmos gadalaikos kļūst biezāki. Šādas vietas, kur apmatojums uz ķermeņa ir ļoti blīvs, testēšanai izmantot nevar.

1.4.1.3. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Dzīvnieki jātur atsevišķi. Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, trušiem nepieciešama 20 °C (± 3 °C) temperatūra. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim.

1.4.2. Testa procedūra

1.4.2.1. Testējamās vielas aplicēšana

Testējamo vielu uztriepj uz nelielas ādas virsmas platības (apmēram 6 cm2) un šo vietu pārklāj ar marles gabaliņu, ko piestiprina ar nekairinošu plāksteri. Gadījumos, kad tieša aplicēšana nav iespējama (piemēram, šķidrumiem vai daļai pastu), testējamo vielu vispirms pārnes uz marles tamponu, ar kuru pēc tam apstrādā ādu. Marlei jābūt ne pārāk ciešā saskarē ar ādu, ko panāk, iedarbības laikā izmantojot piemērotu puspieguļošu pārsēju. Ja testējamā viela pārnesta uz marles tampona, tas ādai jāpiestiprina tā, lai vielai ar ādu būtu laba saskare un tā visā laukumā būtu sadalīta vienmērīgi. Jāpanāk, lai dzīvnieki nevarētu aiztikt marli, tādējādi izslēdzot iespēju, ka pārbaudāmā viela nonāk barības vadā vai elpošanas ceļos.

Testējamās vielas, kas ir šķidrumi, parasti neatšķaida. Testējot cietvielas (kuras, ja uzskata par vajadzīgu, var saberzt pulverī), testējamā viela jāsamitrina ar ļoti nelielu daudzumu ūdens (vai vajadzības gadījumā citā piemērotā nesējā), kas ir pietiekams labas saskares nodrošināšanai ar ādu. Ja izmanto nevis ūdeni, bet citus nesējus, nesēja kairinošajai iedarbībai uz ādu, ja tāda ir, jābūt iespējami minimālai.

Iedarbības perioda beigās, kas parasti ir 4 stundas, testējamās vielas atliekas no ādas noņem, ja iespējams, izmantojot ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, kas neietekmē izveidojušos atbildes reakciju uz vielu un nerada epidermas bojājumus.

1.4.2.2. Devas līmenis

Uz pārbaužu vietas aplicē 0,5 ml šķidruma vai 0,5 g cietvielas vai pastas.

1.4.2.3. Sākotnējs tests (In vivo ādas kairinājuma/kodīgās iedarbības tests, izmantojot vienu dzīvnieku)

Testi in vivo noteikti jāsāk ar vienu dzīvnieku, īpaši gadījumos, kad testējamā viela varētu būt kodīga. Tas atbilst secīgas testēšanas stratēģijai (sk. 1. pielikumu).

Ja, spriežot pēc zinātnisko datu nozīmīguma analīzes, viela ir kodīga, ar dzīvniekiem nav nepieciešams veikt papildu testus. Ar lielāko daļu vielu, kas varētu būt kodīgas, parasti papildu testi in vivo nav vajadzīgi. Tomēr tādos gadījumos, kad nepietiekamu zinātnisku datu dēļ tiek uzskatīts, ka ir jāiegūst papildu dati, ar dzīvniekiem veic ierobežota apjoma testus pēc turpmāk aprakstītās pieejas. Vienam dzīvniekam secīgi aplicē trīs marles tamponus ar testējamo vielu. Pirmo marles tamponu noņem pēc trim minūtēm. Ja netiek novērota nopietna ādas reakcija, uzliek otru marles tamponu, ko noņem pēc stundas. Ja novērojumi šajā testa posmā liecina, ka ir humāni iedarbības laiku pagarināt līdz 4 stundām, uzliek trešo tamponu, ko noņem pēc četrām stundām, un novērtē atbildes reakciju.

Ja kodīgā iedarbība tiek novērota pēc jebkuras no trijām secīgi veiktajām testējamās vielas iedarbībām, testus nekavējoties pārtrauc. Ja kodīgā iedarbība netiek konstatēta pēc pēdējā marles tampona noņemšanas, dzīvnieku novēro 14 dienas, ja kodīgā iedarbība neattīstās jau līdz šā termiņa beigām.

Gadījumos, kad testējamā viela nevarētu būt kodīga, bet tai iespējama kairinoša iedarbība, vienam dzīvniekam uz četrām stundām aplicē vienu marles tamponu.

1.4.2.4. Apstiprinājuma tests (In vivo ādas kairinājuma tests, izmantojot papildu dzīvniekus)

Ja sākotnējā testā kodīgums nav novērots, kairinošā iedarbība vai tās neesamība jāapstiprina izmēģinājumos ar diviem papildu dzīvniekiem, katram aplicējot vienu tamponu, kuru tur četras stundas. Ja kairinošā iedarbība novērota sākotnējā testā, apstiprinājuma testu var veikt secīgi, vai arī abus dzīvniekus vienlaicīgi pakļaujot vielas iedarbībai. Izņēmuma gadījumā, kad sākotnējs tests netiek veikts, diviem vai trijiem dzīvniekiem aplicē vienu tamponu, ko noņem pēc četrām stundām. Izmantojot divus dzīvniekus, un to abu reakcijas uz vielas iedarbību ir vienādas, turpmāka testēšana nav nepieciešama. Ja tā nav, jāveic testi ar vēl vienu dzīvnieku. Neskaidru reakciju novērtēšanai var būt nepieciešami vairāki papildu dzīvnieki.

1.4.2.5. Novērošanas periods

Novērojumi jāveic pietiekami ilgi, lai pilnībā varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču izmēģinājumi vienmēr jāpārtrauc uzreiz tad, ja dzīvniekiem parādās pastāvīgas smagu sāpju vai ciešanu pazīmes. Lai novērtētu iedarbības atgriezeniskumu, pēc tamponu noņemšanas dzīvnieki jānovēro līdz 14 dienām. Izmēģinājumus attiecīgi beidz drīzāk, ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 14 dienu perioda beigām.

1.4.2.6. Klīniskie novērojumi un ādas reakciju klasificēšana

Visiem dzīvniekiem jāpārbauda eritēmas un tūskas veidošanās pazīmes un iedarbība 60 minūtes pēc marles tampona noņemšanas, un turpmāk pēc 24, 48 un 72 stundām. Sākotnējā testā ar vienu dzīvnieku tūlīt pēc marles tampona noņemšanas apskata arī testēšanas vietu. Ādas reakcijas novērtē un reģistrē pēc turpmāk dotās klasifikācijas tabulas. Ja ir ādas bojājums, ko pēc 72 stundām nevar identificēt par kairinājumu vai kodīgas iedarbības rezultātu, iedarbības atgriezeniskuma noteikšanai novērojumi var būt jāturpina līdz 14. dienai. Papildus kairinājuma novērojumiem pilnībā jāraksturo un jāreģistrē arī visu veidu lokāla toksiska iedarbība, piemēram, ādas attaukošana un visu veidu sistēmiski kaitīga iedarbība (piemēram, ietekme uz toksiskuma klīniskajām pazīmēm un ķermeņa svara izmaiņām). Neskaidru reakciju noskaidrošanai var būt vajadzīgi histopatoloģiskie izmeklējumi.

Ādas reakciju klasifikācija ir neizbēgami subjektīva. Lai veicinātu ādas reakciju klasifikācijas saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītam par izmantojamo klasifikācijas sistēmu (sk. turpmāko tabulu). Var būt lietderīgi izmantot ilustrētus norādījumus par ādas kairinājuma un citu bojājumu klasifikāciju (9).

2. DATI

2.1. REZULTĀTU NOFORMĒŠANA

Pētījumu rezultāti jāapkopo tabulas veidā testēšanas galīgajā pārskatā, kurā jāiekļauj visi 3.1. nodaļā uzskaitītie jautājumi.

2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA

Ādas kairinājums punktos jānovērtē saistībā ar bojājumu raksturu un smagumu, to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētie punkti nav uzskatāmi par vielas kairinošo īpašību absolūtu standartu, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla citu veidu iedarbība. Gluži otrādi, atsevišķie punkti uzskatāmi par standartvērtībām, kuras jānovērtē saistībā ar visiem citiem pētījumā veiktajiem novērojumiem.

Kairinošās iedarbības novērtējumā jāņem vērā ādas bojājumu atgriezeniskums. Ja līdz 14 dienu novērošanas perioda beigām saglabājas tādas reakcijas kā apmatojuma zaudējums (ierobežotā platībā), hiperkeratoze – ādas pārragošanās, hiperplāzija un plaisāšana, testējamā viela jāuzskata par kairinošu.

3. PĀRSKATS

3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Pamatojums testu veikšanai in vivo – iepriekš veiktajos testos iegūto zinātnisko datu nozīmīguma analīze, tostarp secīgajā testēšanas stratēģijā iegūto rezultātu analīze:

- atbilstošu iepriekš veiktajos testos iegūto datu apraksts;

- visos testēšanas stratēģijas posmos iegūtie dati;

- in vitro veikto testu apraksts, tostarp sīkas ziņas par izmantotajām procedūrām, rezultātiem, kas iegūti ar testējamajām vielām un standartvielām;

- in vivo pētījumam nepieciešamā zinātnisko datu nozīmīguma analīze.

Testējamā viela:

- identifikācijas dati, (piemēram, CAS numurs, avots, tīrība, zināmie piemaisījumi, partijas numurs);

- fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, pH, gaistamība, šķīdība, stabilitāte);

- attiecībā uz maisījumiem to sastāvs un atsevišķo komponentu relatīvais īpatsvars.

Nesējs:

- identifikācija, koncentrācija (ja vajadzīgs), izmantotais tilpums;

- nesēja izvēles pamatojums.

Testu dzīvnieki:

- izmantotā suga/līnija, izvēles pamatojums gadījumos, kad neizmanto albīnos trušus;

- katra dzimuma dzīvnieku skaits;

- katra dzīvnieka svars testa sākumā un beigās;

- vecums izmēģinājumu sākumā;

- dzīvnieku izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c.

Testa apstākļi:

- tampona pielikšanas vietas sagatavošanas paņēmiens;

- sīkas ziņas par tamponam izmantotajiem materiāliem un tampona uzlikšanas paņēmienu;

- sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu, aplicēšanu un noņemšanu.

Rezultāti:

- kairinošās/kodīgās iedarbības punktu tabulas veidā apkopoti dati par katru dzīvnieku visos novērojumu laikos;

- visu novēroto bojājumu apraksts;

- apraksts stāstījuma veidā par novēroto kairinošo iedarbību vai kodīgumu un histopatoloģiskajos izmeklējumos iegūtajiem datiem;

- papildu ādas kairinājumam vai kodīgajai iedarbībai citas nevēlamas vietējas (piemēram, ādas attaukošanas) vai sistēmiska rakstura iedarbības apraksts.

Rezultātu izvērtējums.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.

(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA _26, 709–720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, lpp. 483–524.

(5.a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9) EPA (1990). Adas of Dermal Lesions, (20T–2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Available from OECD Secretariat upon request].

I TABULA: ĀDAS REAKCIJAS KLASIFICĒŠANA

Eritēmas un kreveļu veidošanās

Eritēmas nav … | 0 |

Ļoti viegla eritēma (tikko pamanāma) … | 1 |

Labi izteikta eritrēma … | 2 |

Mērena līdz smaga eritēma … | 3 |

Smaga eritrēma (liellopa gaļas sarkanums) ar kreveļu veidošanos, kas nedod eritrēmas klasifikācijas iespējas … | 4 |

Maksimāli iespējamie – 4 |

Tūskas veidošanās

Tūskas nav … | 0 |

Pavisam neliela tūska (tikko pamanāma) … | 1 |

Neliela tūska (skarto vietu var viegli noteikt pēc izteikta pietūkuma … | 2 |

Mērena tūska (pietūkums apmēram 1 mm augstumā) … | 3 |

Smaga tūska (pietūkums vairāk nekā 1 mm un ir plašāks nekā iedarbības vieta) … | 4 |

Maksimāli iespējamie – 4 |

Neskaidru reakciju noskaidrošanai var būt vajadzīgi histopatoloģiskie izmeklējumi.

--------------------------------------------------

2.E PIELIKUMS

Β.5. AKŪTS TOKSISKUMS – KAIRINĀJUMS/KODĪGA IEDARBĪBA UZ ACĪM

1. METODE

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 405. (2002)vadlīnijā noteiktajai metodei.

1.1. IEVADS

Izstrādājot šo pilnveidoto metodi, īpaša vērība tika veltīta tās iespējamajiem uzlabojumiem, izvērtējot visu esošo informāciju par testējamo vielu, lai nav jāveic nevajadzīgus testus ar laboratorijas dzīvniekiem, un tādējādi ievērotu dzīvnieku labturības prasības. Šajā metodē ietilpst arī ieteikums par zinātnisko datu nozīmīguma analīzes (1) veikšanu saistībā ar esošajiem atbilstošajiem datiem pirms aprakstīto vielas kodīgo/kairinošo īpašību pārbaudes in vivo testos. Ja esošie dati ir nav pietiekami, tos var iegūt secīgā testēšanā (2), (3). Testēšanas stratēģijā ietilpst validētu un vispārpieņemtu in vitro testu veikšana, un tā pievienota pielikumam, kurā ir noteikta testa metode. Bez tam, pirms veikt in vivo testus kodīgās iedarbības testēšanai uz acīm, šādas iedarbības prognozēšanai ieteicams veikt in vivo testus kairinošās kodīgās iedarbības noteikšanai uz ādu.

Gan zinātniskās precizitātes dēļ, gan ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, in vivo testi nav jāveic, kamēr zinātnisko datu nozīmīguma analīzē nav izvērtēti visi pieejamie atbilstošie dati par vielas iespējamo kodīgo/kairinošo iedarbību uz acīm. Tie ir – ar cilvēkiem un/vai laboratorijas dzīvniekiem veiktajos pētījumos iegūtie dati, liecības par vienas vai vairāku struktūras ziņā saistītu vielu vai vielu maisījumu kodīgajām/kairinošajām īpašībām, dati, kas liecina, ka attiecīgajai vielai ir stipru skābju vai bāzu īpašības (4), (5), kā arī validētos un vispārpieņemtos in vitro vai ex vivo testos iegūti rezultāti par kodīgo un kairinošo iedarbību uz ādu (6), (6.a). Pētījumus var veikt pirms zinātnisko datu nozīmīguma analīzes vai pēc tās.

Par dažām vielām šāda analīze var norādīt uz vajadzību veikt in vivo pētījumus par to kodīgumu/kairinošajām īpašībām, iedarbojoties uz acīm. Visos šādos gadījumos pirms pieņemt lēmumu veikt iedarbības testus uz acīm in vivo, ieteicams vispirms veikt pētījumus in vivo attiecīgās vielas iedarbībai saskarē ar ādu, un tos izvērtēt saskaņā ar testa metodi B.4 (7) Izmantojot zinātnisko datu nozīmības analīzi un secīgas testēšanas stratēģiju, samazinās vajadzība veikt in vivo testus to vielu kodīgās/kairinošās iedarbības noskaidrošanai uz acīm, par kurām citos pētījumos iegūtas pietiekami zinātniskie dati. Ja kodīgo vai kairinošo iedarbību uz acīm nevar noteikt, drīkst veikt izmēģinājumus in vivo kodīgās/kairinošās iedarbības noteikšanai uz acīm, izmantojot secīgas testēšanas stratēģiju pat pēc tam, kad jau ir veikti izmēģinājumi in vivo tās kodīgās un kairinošās iedarbības noteikšanai uz ādu.

Ieteicamā secīgā testēšanas stratēģija, pie kuras pieder validētu un vispārpieņemtu in vitro vai ex vivo testu veikšana kodīgo/kairinošo īpašību noteikšanai, ir pievienota pielikumā, kurā ir šī testa metode. Šo stratēģiju izstrādājusi un vienprātīgi ieteikusi ESAO darba grupa (8), un tā pieņemta par ieteicamo stratēģiju Vispārīgā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācijas sistēmā (VSS) (9). Šo stratēģiju ieteicams ievērot pirms in vivo testiem. Lai iegūtu zinātniski pamatotus datus par konkrētās vielas kodīgajām īpašībām/kairinošo iedarbību, testus ar jaunām vielām ieteicams veikt secīgos posmos. Jāizmanto nepieciešamā stratēģija trūkstošo datu iegūšanai par esošajām vielām, par kurām nav pietiekamu datu, kas raksturo to kodīgās/kairinošās īpašības. Jābūt pamatojumam par lēmumu, kas attiecas uz atšķirīgu testēšanas stratēģiju vai procedūru izmantošanu, vai arī par lēmumu neveikt testu secīgos posmos.

1.2. DEFINĪCIJAS

Acu kairinājums – izmaiņas acī, kas rodas pēc testējamās vielas aplikācijas uz acs ābola priekšējās virsmas un ir pilnīgi atgriezeniskas 21 dienas laikā pēc aplikācijas.

Kodīga iedarbība uz acīm – acs ābola audu bojājums vai nopietni fiziski redzes bojājumi, kas rodas pēc testējamās vielas aplikācijas uz acs ābola priekšējās virsmas un nav pilnīgi atgriezeniski 21 dienas laikā pēc aplikācijas.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS

Uz izmēģinājuma dzīvnieka vienas acs ābola aplicē vienu devu testējamās vielas; otru aci izmanto kontroles nolūkos. Kairinājumu/kodīgo iedarbību uz aci novērtē pēc konjunktīvas, radzenes un varavīksnenes bojājumu pakāpes noteiktos laika intervālos. Lai iedarbību novērtētu pilnīgi, apraksta arī citu veidu iedarbību uz aci, kā ar kaitīgu sistēmisku iedarbību. Pētījumi jāveic tik ilgi, lai varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu.

Visos testu posmos dzīvnieki, kuriem ilgstoši novēro stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, ir humāni jānonāvē, un atbilstoši jānovērtē testējamās vielas iedarbība. Kritēriji, pēc kuriem pieņemami lēmumi par to dzīvnieku humānu nonāvēšanu, kas iet bojā vai kuriem ir stipras ciešanas, atrodami literatūras sarakstā (10).

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.1. Sagatavošana testiem in vivo

1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Piemērotākais dzīvnieks laboratorijas izmēģinājumiem ir albīnais trusis, tiem izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Jābūt atbilstošam pamatojumam, ja izmanto citu sugu vai līniju dzīvniekus.

1.4.1.2. Dzīvnieku sagatavošana

Katram iepriekš atlasītam testa dzīvniekam 24 stundas pirms testa pārbauda abas acis. Dzīvnieki ar acu iekaisumu, okulārajiem defektiem vai radzenes bojājumiem nav izmantojami.

1.4.1.3. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Dzīvnieki jātur atsevišķi. Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, trušiem nepieciešama 20 °C (± 3 °C) temperatūra. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim.

1.4.2. Testa metode

1.4.2.1. Testējamās vielas aplicēšana

Testējamo vielu katram dzīvniekam ievada acs konjunktīvas maisiņā, pirms tam viegli pavelkot apakšējo plakstiņu nost no acs ābola. Pēc tam plakstiņus apmēram vienu sekundi viegli tur kopā, lai viela neizplūstu. Otrā acs paliek neapstrādāta un to izmanto kontroles nolūkos.

1.4.2.2. Skalošana

Testa dzīvniekiem acis nedrīkst skalot vismaz 24 stundas pēc testējamās vielas ievadīšanas, izņemot gadījumus, kad ievada cietvielas (sk. 1.4.2.3.2.), kā arī tad, kad novērojama tūlītēja kairinoša vai kodīga iedarbība. Vajadzības gadījumā pēc 24 stundām acis var izskalot.

Izņemot gadījumus, kad tas ir zinātniski pamatoti, nav ieteicams veikt pētījumus ar otru dzīvnieku grupu, lai noskaidrotu skalošanas ietekmi. Ja ir vajadzīga otra dzīvnieku grupa, tai jāizmanto divi truši. Precīzi jādokumentē skalošanas apstākļi, piemēram, skalošanas laiks; skalojamā šķīduma sastāvs un temperatūra; tās ilgums, apjoms un ātrums.

1.4.2.3. Devas līmenis

1.4.2.3.1. Šķidrumu testēšana

Šķidrumu testēšanai izmanto 0,1 ml devu. Vielas ievadīšanai tieši acī nedrīkst izmantot smidzinātājus. Pirms iepilināt acī 0,1 ml šķidra aerosola, tas vispirms jāizsmidzina un jāsavāc tvertnē.

1.4.2.3.2. Cietvielu testēšana

Testējot cietvielas, pastas un vielas daļiņu veidā, izmantojamajam daudzumam jābūt 0,1 ml tilpumam vai ne vairāk kā 100 mg. Testējamais materiāls jāsaberž smalkā pulverī. Cietu vielu tilpums jāmēra pēc to vieglas sablīvēšanas, piemēram, mērtvertnē sakratot. Ja testējamā cietviela nav izvadīta no testa dzīvnieka acs ar fizioloģiskiem mehānismiem līdz pirmajam novērojumu termiņam 1 stundu pēc ievadīšanas, aci var izskalot ar sālsūdeni vai destilētu ūdeni.

1.4.2.3.3. Aerosolu testēšana

Ieteicams pirms iepilināšanas acī visus ar sūkni vai propellentu izsmidzināmos aerosolus vispirms izsmidzināt un savākt tvertnē. Vienīgais izņēmums ir vielas aerosola balonā, kuras nav iespējams savākt tvertnē iztvaikošanas dēļ. Šādos gadījumos acs jātur atvērta, un testējamā viela jāievada acī, to izsmidzinot apmēram vienu sekundi no 10 cm attāluma tieši uz acs ābola. Attālumu var mainīt atkarībā no spiediena aerosola balonā un tā satura. Jāraugās, lai neradītu acs bojājumu no aerosola balona spiediena. Atsevišķos gadījumos var būt vajadzīgs novērtēt acs iespējamos "mehāniskos" bojājumus no aerosola balona spiediena spēka.

Ar aerosola balonu ievadīto devu var noteikt, testu imitējot šādi – vielu izsmidzina uz nosvērta papīra gabala, uz kura novietots ekrāns ar truša acs lieluma atveri. Papīra masas palielinājumu izmanto acī iesmidzinātās devas aptuvenai noteikšanai. Gaistošām vielām devu var noteikt, uztvērēja tvertni nosverot pirms un pēc testējamās vielas izņemšanas.

1.4.2.4. Sākotnējs tests (In vivo acu kairinājuma/kodīgās iedarbības tests, izmantojot vienu dzīvnieku)

Kā skaidri noteikts secīgās testēšanas stratēģijā (sk. 1. pielikumu), in vivo testi jāsāk, izmantojot vienu dzīvnieku.

Ja pēc iepriekš aprakstītās procedūras iegūtie testa rezultāti liecina, ka vielai ir kodīga vai stipri kairinoša iedarbība uz acīm, turpmāko acs kairinājuma testēšanu neveic.

1.4.2.5. Vietējā anestēzija

Pēc vajadzības katrā atsevišķā gadījumā var lietot vietējo anestēziju. Ja zinātnisko datu nozīmīguma analīze liecina, ka vielas iedarbība var radīt sāpes, vai arī sākotnējā testā noskaidrojas, ka rodas sāpju reakcija, pirms testējamās vielas iepilināšanas var lietot vietējo anestēziju. Rūpīgi jāizraugās vietējās anestēzijas veids, koncentrācija un deva tā, lai nodrošinātu, ka no tās lietošanas nerodas reakcijas atšķirības uz testējamās vielas iedarbību. Tāda pati anestēzija jādod acij, ko izmanto kontroles nolūkos.

1.4.2.6. Apstiprinājuma tests (In vivo ādas kairinājuma tests, izmantojot papildu dzīvniekus)

Ja kodīga iedarbība nav novērota sākotnējā testā, kairinošā iedarbība vai tās neesamība jāapstiprina testos ar vienu vai diviem papildu dzīvniekiem. Ja sākotnējā testā novērota stipri kairinoša iedarbība, kas norāda uz iespējamu stipru (neatgriezenisku) iedarbību apstiprināšanas testā, apstiprinošo testu ieteicams veikt secīgi, vienā reizē izmantojot vienu dzīvnieku, nevis pakļaut vielas iedarbībai abus papildu dzīvniekus vienlaicīgi. Ja otrajam dzīvniekam konstatē kodīgu vai stipri kairinošu iedarbību, tests nav jāturpina. Papildu dzīvnieki var būt vajadzīgi vājas vai mēreni kairinošas iedarbības apstiprināšanai.

1.4.2.7. Novērošanas periods

Novērojumi jāveic pietiekami ilgi, lai varētu pilnīgi novērtēt novērotās iedarbības lielumu, atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču izmēģinājumi vienmēr uzreiz jāpārtrauc tad, ja dzīvniekiem parādās pastāvīgas smagu sāpju vai ciešanu pazīmes (9). Lai noteiktu iedarbības atgriezeniskumu, dzīvnieki parasti jānovēro 21 dienu pēc testējamās vielas ievadīšanas. Izmēģinājumus attiecīgi beidz drīzāk, ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 21 dienas perioda beigām.

1.4.2.7.1. Klīniskie novērojumi un acs reakciju klasificēšana

Acis jāpārbauda 1, 24, 48 un 72 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas. Dzīvnieki testā nav jātur ilgāk par galīgas informācijas iegūšanai vajadzīgo laiku. Dzīvniekus ar ilgstošām smagu sāpju vai ciešanu pazīmēm nekavējoties humāni nonāvē un attiecīgi novērtē testējamo vielu. Humāni nonāvē dzīvniekus, kuriem pēc vielas iepilināšanas rodas šādi acs bojājumi – radzenes perforācija vai radzenes ievērojama čūla, tostarp stafiloma; asinis acs ābola priekšējā kamerā; 4. pakāpes radzenes aptumšošanās, kas saglabājas 48 stundas; nav refleksa uz gaismu (2. pakāpes varavīksnenes reakcija) ilgāk nekā 72 stundas; konjunktīvas plēves čūla; konjunktīvas vai mirkšķināšanas membrānas nekroze; vai noslīdēšana. Tā rīkojas tāpēc, ka šādi bojājumi parasti ir neatgriezeniski.

Dzīvniekus, kuriem neveidojas acs bojājumi, var nonāvēt ne ātrāk kā 3 dienas pēc vielas iepilināšanas.

Dzīvniekus ar viegliem līdz mēreniem bojājumiem jānovēro, līdz bojājumi beidzas, vai 21 dienu, kad pētījumus izbeidz. Novērojumi jāveic pēc 7, 14 un 21 dienas, lai novērtētu bojājumu stāvokli un to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu.

Acs (konjunktīvas, radzenes, varavīksnenes) reakcijas pakāpes reģistrē visos novērojumos (I tabula). Reģistrē arī visus citus acs bojājumus (piemēram, radzenes apduļķošanos, krāsošanos) un kaitīgu sistēmisku iedarbību.

Novēroto reakciju novērošanai var izmantot binokulāro lupu, pārnēsājamu spraugas lampu, bioloģisko mikroskopu vai citas piemērotas ierīces. Kad reģistrēti novērojumi pēc 24 stundām, turpmākām acu pārbaudēm var izmantot fluoresceīnu.

Acs reakciju klasifikācija ir neizbēgami subjektīva. Lai veicinātu acu reakciju klasifikācijas saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, kā arī novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītiem par izmantojamo klasifikācijas sistēmu.

2. DATI

2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA

Acu kairinājums jānovērtē saistībā ar bojājumu raksturu un smagumu, to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētie punkti nav uzskatāmi par vielas kairinošo īpašību absolūtu standartu, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla citu veidu iedarbība. Tāpēc atsevišķie punkti jāuzskata par standartvērtībām, un tiem ir nozīme tikai tad, ja tiek pamatoti ar pilnīgiem aprakstiem un visu novērojumu izvērtējumu.

3. PĀRSKATS

3.1. TESTA PĀRSKATS

Testēšanas pārskatā jābūt šādai informācijai.

Testa veikšanas in vivo pamatojums – iepriekš veikto testu rezultātu zinātnisko datu nozīmīguma analīze, tostarp pēc secīgās testēšanas stratēģijas iegūtos rezultātus;

- atbilstošu iepriekš veiktajos testos iegūto datu apraksts;

- visos testēšanas stratēģijas posmos iegūtie dati;

- in vitro veikto testu apraksts, tostarp sīkas ziņas par izmantotajām procedūrām, rezultātiem, kas iegūti ar testējamajām un standartvielām;

- veikto in vivo ādas kairinājuma/kodīgās iedarbības pētījumu apraksti, tostarp iegūtie rezultāti;

- in vivo pētījumam nepieciešamā zinātnisko datu nozīmīguma analīze.

Testējamā viela:

- identifikācijas dati (piemēram, CAS numurs, avots, tīrība, zināmie piemaisījumi, partijas numurs);

- fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, pH, gaistamība, šķīdība, stabilitāte, reaģētspēja ar ūdeni);

- maisījumiem – sastāvs un atsevišķo komponentu relatīvais īpatsvars;

- ja izmantota vietējā anestēzija, tās identifikācija, tīrība, veids, deva un iespējamā mijiedarbība ar testējamo vielu.

Nesējs:

- identifikācija, koncentrācija (ja vajadzīgs), izmantotais tilpums;

- nesēja izvēles pamatojums.

Testa dzīvnieki:

- izmantotā suga/līnija, izvēles pamatojums gadījumos, kad neizmanto albīnos trušus;

- katra dzīvnieka vecums pētījuma sākumā;

- katra dzimuma dzīvnieku skaits testa un kontroles grupās (ja vajadzīgs);

- katra dzīvnieka svars testa sākumā un beigās;

- izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c.

Rezultāti:

- visos novērojumu termiņos kairinājuma novērtēšanai izmantoto metožu apraksts (piemēram, pārnēsājamā spraugas lampa, bioloģiskais mikroskops, fluoresceīns);

- tabulā apkopoti kairinošās/kodīgās iedarbības dati par katru dzīvnieku visos novērošanas termiņos līdz testa pārtraukšanai ar to;

- novērotās kairinošās vai kodīgās iedarbības pakāpes un rakstura apraksts;

- citu novēroto acs bojājumu apraksts (piemēram, vaskularizācija, radzenes saduļķošanās, saaugumu, rētaudu veidošanās, krāsojums);

- ar aci nesaistīta kaitīga vietēja vai sistēmiska iedarbība un histopatoloģisko izmeklējumu rezultāti, ja tie veikti.

Rezultātu apspriešana.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA

Ar dzīvniekiem iegūti acu kairinājuma pētījumu rezultātu ekstrapolācijas iespējas uz cilvēkiem ir derīgas tikai līdz zināmai pakāpei. Daudzos gadījumos albīnie truši pret acīm kodīgām vai kairinošām vielām ir jutīgāki nekā cilvēki.

Interpretējot rezultātus, jāraugās, lai tiktu izslēgts kairinājums, ko rada sekundāra infekcija.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.

(2) De Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol.35., 159–164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, lpp. 483–524.

(6.a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.

(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

I TABULA: ACS BOJĀJUMU KLASIFIKĀCIJA

Radzene

Duļķošanās – blīvuma pakāpe (nolasījumi jāveic visblīvākajā zonā) [1] |

Nav novērota čūlu veidošanās vai duļķošanās … | 0 |

Izkaisītas vai difūzas duļķošanās zonas (izņemot normāla spīduma vieglu blāvumu); labi redzamas varavīksnenes daļas … | 1 |

Labi izšķirama caurspīdīgā daļa; varavīksnenes daļas redzamas nedaudz neskaidri … | 2 |

Perlamutra zona; varavīksnenes daļas redzamas; acs zīlītes izmērs tikko redzams … | 3 |

Radzene necaurredzama; cauri duļķojumam varavīksnene nav samanāma … | 4 |

Maksimāli iespējamie – 4 |

Varavīksnene

Norma … | 0 |

Krokas redzami padziļinātas, hiperēmija, pietūkums, mērena radzenes hiperēmija; vai asinsizplūdums; varavīksnene reaģē uz gaismu (par reakciju uzskata arī vāju vai lēnu reakciju) … | 1 |

Asiņošana, vispārējs bojājums, vai nav reakcijas uz gaismu … | 2 |

Maksimāli iespējamie – 2 |

Konjunktīva

Apsārtums (attiecas uz plakstiņu un acs ābola konjunktīvu; izņemot radzeni un varavīksneni) |

Norma … | 0 |

Daži asinsvadi izteikti hiperēmiski (piepildīti) … | 1 |

Difūza, tumšsarkana krāsa; atsevišķie asinsvadi grūti izšķirami … | 2 |

Difūza tumši sarkana liellopu gaļas krāsa … | 3 |

Maksimāli iespējamie – 3 |

Hemoze

Pietūkums (attiecas uz plakstiņiem un/vai mirkšķināšanas membrānām) |

Norma … | 0 |

Neliels pietūkums virs normas … | 1 |

Acīmredzams pietūkums ar plakstiņu daļēju izgriešanos … | 2 |

Pietūkums, plakstiņi gandrīz pusaizvērti … | 3 |

Pietūkums, plakstiņi vairāk nekā pusaizvērti … | 4 |

Maksimāli iespējamie – 4 |

[1] JĀNORĀDA RADZENES DUĻĶOŠANĀS PLATĪBA

--------------------------------------------------

2.F PIELIKUMS

B.31. PRENATĀLĀS ONTOĢENĒZES TOKSICITĀTES PĒTĪJUMS

1. METODE

Šī metode ir ESAO 414. (2001) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Šī ontoģenēzes toksicitātes testa metode ir paredzēta, lai sniegtu vispārīgo informāciju par pirmsdzemdību iedarbības ietekmi uz grūsnu testa dzīvnieku un uz attīstošos organismu in utero; tā var iekļaut vērtējumu par iedarbību uz māti, kā arī par augļa nāvi, strukturālajām anomālijām vai augšanas izmaiņām. Funkcionāli bojājumi, kaut arī tie ir svarīga attīstības daļa, nav šīs testa metodes sastāvdaļa. Tos var testēt atsevišķā pētījumā vai kā papildinājumu šim pētījumam, izmantojot attīstības neirotoksicitātes testa metodi. Informācija par funkcionālu bojājumu un citu postnatālo iedarbību testa metodi attiecīgi skatīt Divu paaudžu reproduktīvās toksicitātes un attīstības neirotoksicitātes pētījumu testa metodē.

Šai testa metodei atsevišķos gadījumos var būt vajadzīga īpaša pielāgošana, pamatojoties uz konkrētām zināšanām, piem., par testējamās vielas fizikāli ķīmiskajām vai toksikoloģiskajām īpašībām. Tāda pielāgošana ir pieņemama, ja pārliecinoši zinātniski dati liecina, ka pielāgojumi testu padarīs informatīvāku. Tādā gadījumā pētījuma pārskatā minētie zinātniskie dati ir rūpīgi jādokumentē.

1.2. DEFINĪCIJAS

Ontoģenēzes toksikoloģija – pētījums par tādām blakusparādībām uz attīstošos organismu, kuras var izraisīt iedarbība pirms apaugļošanas, prenatālās attīstības laikā vai postnatāli līdz seksuālās nobriešanas laikam. Galvenās ontoģenēzes toksicitātes izpausmes iekļauj – 1) organisma nāvi, 2) strukturālas anomālijas, 3) izmainītu augšanu un 4) funkcionālus bojājumus. Ontoģenēzes toksikoloģiju agrāk bieži minēja kā teratoloģiju.

Kaitīga iedarbība – jebkura ar vielas ievadīšanu saistīta tāda izmaiņa pret bāzes līniju, kas samazina organisma spēju izdzīvot, vairoties vai pielāgoties videi. Kas attiecas uz ontoģenēzes toksikoloģiju plašākajā nozīmē, tā iekļauj visas iedarbības, kas traucē normālu apaugļošanas produkta attīstību gan pirms dzimšanas, gan pēc tās.

Izmainīta augšana – pēcnācēja orgāna vai ķermeņa svara vai lieluma izmaiņas.

Izmaiņas (anomālijas) – attīstības strukturālas izmaiņas, kas iekļauj malformācijas un novirzes (28).

Malformācija/ievērojama anomālija – strukturāla izmaiņa, ko uzskata par dzīvniekam kaitīgu (var būt arī letāla) un kas parasti ir reti sastopama.

Novirze/neliela anomālija – strukturāla izmaiņa, ko uzskata par tādu, kam nav kaitīga iedarbība uz dzīvnieku; var būt pārejoša un kontroles populācijā var būt relatīvi bieži sastopama.

Apaugļošanas produkts – apaugļotas olšūnas atvasinājumu summa jebkurā attīstības pakāpē no apaugļošanas līdz dzimšanai, iekļaujot augļapvalkus, kā arī embriju vai augli.

Implantācija (nidācija) – blastocistas piestiprināšanās dzemdes epitēliālajam izklājumam, iekļaujot tās iziešanu caur dzemdes epitēliju un implantāciju endometrijā.

Embrijs – organisma agrīnais vai attīstības posms, jo īpaši olšūnas apaugļošanās produkts, kas attīstās, pēc tam, kad parādījusies garenvirziena ass, un līdz laikam, kad izveidojušās visas galvenās struktūras.

Embriotoksicitāte – kaitīga embrija normālajai struktūrai, attīstībai, augšanai un/vai dzīvotspējai.

Auglis – nedzimis pēcnācējs pēcembrija laika posmā.

Fetotoksicitāte – kaitīga augļa normālajai struktūrai, attīstībai, augšanai un/vai dzīvotspējai.

Aborts – priekšlaicīga apaugļošanās produktu – embrija vai dzīvotnespējīga augļa izgrūšana no dzemdes.

Resorbcija – apaugļošanas produkts, kas implantēts dzemdē, pēc tam miris un tiek resorbēts vai ir resorbēts.

Agrīna resorbcija – implantācijas pierādījumi bez identificējama embrija/augļa.

Vēla resorbcija – miris embrijs vai auglis ar ārējām deģeneratīvām izmaiņām.

NOAEL – saīsinājums no "nenovēro nelabvēlīgu ietekmes līmeni" (NOAEL) (līmenis, pie kura nav novērojama nevēlama ietekme), un tas ir lielākais devas vai iedarbības līmenis, pie kura nav novērojami ar vielas ievadīšanu saistīti nevēlami rezultāti.

1.3. STANDARTVIELA

Nav.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS

Parasti testējamo vielu ievada grūsniem dzīvniekiem vismaz pēc implantācijas līdz vienai dienai pirms plānotās nogalināšanas, kurai jābūt iespējami tuvu parastajai dzemdību dienai, neriskējot zaudēt datus priekšlaicīgu dzemdību dēļ. Testa metode nav paredzēta, lai apskatītu tikai organoģenēzes posmu (piem., no 5. līdz 15. dienai grauzējiem un no 6. līdz 18. dienai trušiem), bet attiecīgā gadījumā arī iedarbību no preimplantācijas visā grūsnības periodā līdz dienai pirms ķeizargrieziena. Īsi pirms ķeizargrieziena mātītes nogalina, apskata dzemdes saturu un augļus novērtē attiecībā uz ārēji redzamam anomālijām un mīksto audu un skeleta izmaiņām.

1.5. TESTA METODES APRAKSTS

1.5.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Ir ieteicams testēšanu izdarīt ar visatbilstošākajām sugām un tādām laboratorijas sugām un līnijām, ko parasti izmanto ontoģenēzes toksicitātes prenatālā testēšanā. Piemērotākā grauzēju suga ir žurka un piemērotākā suga, kas nav grauzēji, ir trusis. Ja izmanto citas sugas, jāsniedz pamatojums.

1.5.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Eksperimentālo dzīvnieku telpā temperatūrai jābūt 22 °C (± 3 o) žurkām un 18 °C (± 3 o) trušiem. Lai gan, izņemot telpas tīrīšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams, lai tas nepārsniegtu 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Attiecībā uz barošanu var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi.

Pārošanas procedūras jāveic attiecīgajam nolūkam piemērotos būros. Priekšroka dodama sapāroto dzīvnieku atsevišķai turēšanai, pieņemama ir arī turēšana nelielās grupās.

1.5.3. Dzīvnieku sagatavošana

Jāizmanto veseli dzīvnieki, kas ir aklimatizēti laboratorijas apstākļos vismaz 5 dienas un ar kuriem iepriekš nav veiktas izmēģinājumu procedūras. Testa dzīvniekiem norāda sugu, līniju, dzimumu, svaru un/vai vecumu. Visiem dzīvniekiem vai testa grupām, cik vien tas praktiski iespējams, jābūt vienāda svara un vecuma. Pie katra devas līmeņa jāizmanto jauni negrūsni pieauguši sievišķā dzimuma dzīvnieki. Sievišķā dzimuma dzīvnieki jāpāro ar tās pašas sugas un līnijas vīrišķa dzimuma dzīvniekiem un ir jāizvairās no brāļu un māsu pārošanas. Žurkām grūsnības 0 diena ir diena, kad novērots vagīnas embols un/vai sperma; trušiem grūsnības 0 diena ir diena, kad noticis coitus vai mākslīgā apsēklošana, ja lieto minēto metodi. Sapārotie sievišķā dzimuma dzīvnieki pēc nejaušas izvēles jāiedala kontroles un vielas došanas grupā. Būri jāizvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Katram dzīvniekam piešķir unikālu identifikācijas numuru. Pārotie sievišķā dzimuma dzīvnieki pēc nejaušās izvēles jāiedala kontroles un vielas došanas grupā, un, ja sievišķā dzimuma dzīvnieki ir pāroti partijās, dzīvnieki ir vienmērīgi jāsadala katras partijas grupās. Līdzīgi vienmērīgās grupās ir jāsadala sievišķā dzimuma dzīvnieki, ko apsēklojis viens un tas pats vīrišķā dzimuma dzīvnieks.

1.6. PROCEDŪRA

1.6.1. Dzīvnieku skaits un dzimums

Katrā testa un kontroles grupā jābūt pietiekamam sievišķā dzimuma dzīvnieku skaitam, lai autopsijā būtu aptuveni 20 sievišķā dzimuma dzīvnieki ar implantācijas vietām. Grupas ar mazāk nekā 16 dzīvniekiem ar implantācijas vietām var būt neatbilstošas. Māšu mirstība obligāti nepadara pētījumu nederīgu ar nosacījumu, ka tā nepārsniedz aptuveni 10 %.

1.6.2. Devu sagatavošana

Ja dozēšanas atvieglošanai izmanto nesēju vai citu piedevu, jāņem vērā šādas īpašības – iedarbība uz testējamās vielas uzsūkšanos, sadalījumu, metabolismu un aizturi vai izdalīšanos; iedarbība uz testējamās vielas ķīmiskajām īpašībām, kas var mainīt tās toksiskās īpašības; iedarbība uz barības un ūdens patēriņu vai dzīvnieku barojuma stāvokli. Nesējs nedrīkst būt toksisks ontoģenēzē vai ietekmēt reproduktīvo funkciju.

1.6.3. Dozēšana

Parasti testējamo vielu ievada katru dienu no implantācijas (piem., 5. dienā pēc pārošanas) līdz dienai, kas ir dienu pirms plānotā ķeizargrieziena. Ja pieejamie iepriekšējie pētījumi nenorāda uz augstu pirmsimplantācijas zudumu iespēju, vielas ievadīšanu var paildzināt, iekļaujot visu grūsnības periodu no pārošanas līdz dienai pirms plānotās nogalināšanas. Ir labi zināms, ka grūsnības laikā nepiemērota apiešanās vai stress var izraisīt prenatālus zudumus. Lai pasargātos no prenatāliem zudumiem, ko izraisa ar vielas ievadīšanu nesaistīti faktori, ir jāizvairās no nevajadzīgas rīkošanās ar grūsniem dzīvniekiem, kā arī no ārējo faktoru radīta stresa, piemēram, trokšņa.

Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas un jāpielieto vienlaicīga grupu kontrole. Veseli dzīvnieki pēc nejaušās izvēles jāiedala kontroles un vielas ievadīšanas grupā. Devu līmeņi jāizvieto tā, lai veidotos toksisko iedarbību gradācija. Ja testējamās vielas fizikālās/ķīmiskās īpašības vai bioloģiskās īpašības nav ierobežotas, lielākā deva jāizvēlas, lai izraisītu nelielu ontoģenēzes toksicitāti un/vai māšu toksicitāti (klīniskās pazīmes vai ķermeņa svara samazinājums), bet ne nāvi vai smagas ciešanas. Vismaz vienam vidēji lielās devas līmenim jāizraisa minimālā novērojamā toksiskā iedarbība. Vielas mazākā deva nedrīkst izraisīt mātes toksicitātes vai ontoģenēzes toksicitātes pazīmes. Devu līmeņi lejupejošā secībā jāizvēlas tā, lai parādītu visas ar dozēšanu saistītās atbildes reakcijas un nenovērotas nelabvēlīgas ietekmes līmeni (NOAEL). Lejupejošo devu līmeņu uzdošanai bieži optimāli ir divkārši līdz četrkārši starplaiki, un ceturtās testa grupas pievienošana bieži ir ieteicamāka par ļoti plašu (piem., vairāk par 10 reizēm) starplaiku izmantošanu starp dozēšanām. Kaut arī mērķis ir mātes NOAEL noteikšana, var būt pieņemami arī pētījumi, kas šādu līmeni nenosaka (1).

Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā esošos toksicitātes datus, kā arī papildu informāciju par testējamo vielu un ar to saistīto materiālu metabolismu un toksikokinētiku. Tāda informācija arī palīdzēs parādīt dozēšanas režīma atbilstību.

Jāizmanto vienlaicīgas kontroles grupa. Šai grupai jābūt placebo saņēmējai kontroles grupai vai nesēja kontroles grupai, ja testējamās vielas došanā izmanto nesēju. Visām grupām jādod tas pats testējamās vielas vai nesēja tilpums. Ar kontroles grupas(–u) dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupas dzīvniekiem. Nesēja kontroles grupai nesējs jāsaņem lielākajā izmantotajā daudzumā (kā zemākajā vielas saņemšanas grupā).

1.6.4. Pieļaujamības tests

Ja testā pie viena devas līmeņa, kas ir vismaz 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā, ievadot perorāli un izmantojot šim pētījumam aprakstītās procedūras, nav izraisīta novērojama toksicitāte ne grūsnajiem dzīvniekiem, ne to pēcnācējiem un ja iedarbība nav sagaidāma, pamatojoties uz esošajiem datiem (piem., no struktūras ziņā un/vai metaboliski radniecīgiem savienojumiem), tad pilnu pētījumu ar trīs devu līmeņu izmantošanu nevar uzskatīt par vajadzīgu. Paredzamā iedarbība uz cilvēku var norādīt uz to, ka pieļaujamības testā jāizmanto lielāks perorālās devas līmenis. Citiem ievadīšanas veidiem, tādiem kā ieelpošana un pielietošana uz ādas, vielas fizikāli ķīmiskās īpašības bieži var norādīt un ierobežot maksimālo sasniedzamo iedarbības līmeni (piemēram, pielietošana uz ādas nedrīkstētu izraisīt smagu lokālu toksicitāti).

1.6.5. Devu ievadīšana

Testējamo vielu vai nesēju parasti ievada perorāli vai caur zondi. Ja izmanto citu ievadīšanas veidu, testa izpildītājam jāsniedz tā izvēles pamatojums un izskaidrojums, un var būt vajadzīgi attiecīgi grozījumi (2), (3), (4). Testējamo vielu katru dienu ievada aptuveni vienā laikā.

Atsevišķo dzīvnieku devām parasti jābūt pamatotām uz atsevišķo ķermeņa svaru jaunāko noteikšanu. Tomēr jābūt piesardzīgiem, pielāgojot devu grūsnības pēdējās trešdaļas laikā. Lai novērstu pārliecīgu mātes toksicitāti, devas izvēlei jāizmanto esošie dati. Tomēr, ja vielu saņēmušajām mātītēm ir novērojama pārliecīga toksicitāte, tādi dzīvnieki ir humāni jānogalina. Ja vairāki grūsni dzīvnieki uzrāda pārliecīgas toksicitātes pazīmes, ir jāapsver attiecīgās devas grupas likvidēšana. Ja testējamo vielu dzīvniekiem ievada ar mākslīgo barošanu, tas jāizdara vienā devā, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml/100 g ķermeņa svara, izņemot ūdens šķīdumus, ko var ievadīt 2 ml/100 g uz ķermeņa svaru. Ja par nesēju izmanto kukurūzas eļļu, tilpums nedrīkst pārsniegt 0,4 ml/100 g ķermeņa svara. Testa tilpuma izmaiņas ir jāsamazina līdz minimumam, pielāgojot koncentrāciju, lai nodrošinātu nemainīgu tilpumu pie visiem devu līmeņiem.

1.6.6. Mātīšu novērošana

Klīniskie novērojumi jāizdara un tie jāreģistrē vismaz reizi dienā, vēlams katru dienu vienā(–os) laikā(–os) un ņemot vērā sagaidāmo iedarbību maksimuma laika posmu pēc dozēšanas. Dzīvnieku stāvoklis jāreģistrē, iekļaujot mirstību, mirstošos dzīvniekus, nepārejošas izturēšanās izmaiņas un visas atklātās toksicitātes pazīmes.

1.6.7. Ķermeņa svars un barības patēriņš

Dzīvnieki jānosver grūsnības 0 dienā vai vēlākais 3. grūtniecības dienā, ja sapārotos dzīvniekus ir piegādājis audzētājs no ārpuses, pirmajā dozēšanas dienā, vismaz reizi 3 dienās dozēšanas laika posmā un paredzētās nogalināšanas dienā.

Barības patēriņš ir jāreģistrē ik pēc trim dienām, un tam jāsakrīt ar ķermeņa svara noteikšanas dienām.

1.6.8. Pēcnāves pārbaude

Sievišķā dzimuma dzīvnieki jānogalina vienu dienu pirms sagaidāmās dzemdību dienas. Sievišķā dzimuma dzīvnieki, kuriem novēro aborta vai priekšlaicīgu dzemdību pazīmes, jānogalina un jāizdara to rūpīga makroskopiskā pārbaude.

Tūlīt pēc nogalināšanas vai nāves pētījuma laikā mātīte makroskopiski jāpārbauda attiecībā uz strukturālām anomālijām vai patoloģiskām izmaiņām. Mātīšu vērtēšana ķeizargrieziena laikā un turpmākās augļu analīzes jāveic, vēlams, bez zināšanām par vielas saņemšanas grupu, lai līdz minimumam samazinātu neobjektivitāti.

1.6.9. Dzemdes satura apskate

Tūlīt pēc nogalināšanas vai iespējami drīz pēc nāves dzemdes ir jāizņem un jāpārliecinās par dzīvnieku grūsnības statusu. Dzemdes, kas šķiet negravīdas, ir jāpārbauda turpmāk (piem., izmantojot amonija sulfīda iekrāsošanos grauzējiem un Salevska iekrāsošanos vai piemērotu alternatīvu metodi trušiem), lai apstiprinātu negrūsnības statusu (5).

Gravīdas dzemdes, iekļaujot dzemdes kaklu, ir jānosver. Gravīdas dzemdes svars nav jāiegūst no dzīvniekiem, kas pētījuma laikā atrasti nobeigušies.

Grūsniem dzīvniekiem jānosaka corpora lutea skaits.

Dzemdes saturs ir jāpārbauda, lai noteiktu nobeigušos embriju vai augļu skaitu un dzīvotspējīgo augļu skaitu. Lai noteiktu apaugļošanas produkta relatīvo nobeigšanās laiku, ir jāapraksta resorbcijas pakāpe (sk. 1.2. punktu).

1.6.10. Augļu pārbaude

Jānosaka katra augļa dzimums un ķermeņa svars.

Katrs auglis jāpārbauda attiecībā uz ārējām izmaiņām (6).

Augļi jāapskata attiecībā uz skeleta un mīksto audu izmaiņām (piem., novirzēm un malformācijām jeb anomālijām) (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24). Augļu izmaiņu iedalīšana kategorijās ir vēlama, bet nav nepieciešama. Ja iedalīšanu kategorijās veic, ir skaidri jānorāda katras kategorijas noteikšanas kritēriji. Īpaša uzmanība jāvelta reproduktīvajam traktam, kas ir jāpārbauda attiecībā uz izmainītas attīstības pazīmēm.

Attiecībā uz grauzējiem aptuveni puse no katra metiena ir jāpreparē un jāpārbauda attiecībā uz skeleta izmaiņām. Atlikusī puse jāpreparē un jāpārbauda attiecībā uz mīksto audu izmaiņām, izmantojot pieņemtas vai piemērotas sēriju sekcijas metodes vai uzmanīgu makroskopiskās secēšanas paņēmienu.

Dzīvniekiem, kas nav grauzēji, piem., trušiem, visi augļi ir jāpārbauda attiecībā gan uz mīksto audu, gan skeleta izmaiņām. Šo augļu ķermeņus vērtē, attiecībā uz mīksto audu izmaiņām izdarot rūpīgu sekciju, kas var iekļaut procedūras tālākai sirds iekšējās struktūras novērtēšanai (25). Pusei no tā apskatītajiem augļiem ir jānoņem galvas un jāapstrādā mīksto audu izmaiņu novērtēšanai (iekļaujot acis, smadzenes, deguna ejas un mēli), izmantojot standarta sēriju secēšanas metodes (26) vai tikpat jutīgu metodi. Minēto augļu ķermeņi un atlikušie neskartie augļi ir jāapstrādā un jāpārbauda attiecībā uz skeleta izmaiņām, izmantojot tās pašas metodes, kas aprakstītas saistībā ar grauzējiem.

2. DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Datus reģistrē atsevišķi mātītēm, kā arī to pēcnācējiem un apvieno tabulas veidā, katrai testa grupai un katrai paaudzei parādot dzīvnieku skaitu testa sākumā, testa laikā atrasto nobeigušos vai humānu iemeslu dēļ nogalināto dzīvnieku skaitu, katras nobeigšanās vai humānās nogalināšanas laiku, grūsno sievišķā dzimuma dzīvnieku skaitu, toksicitātes pazīmes uzrādījušo dzīvnieku skaitu, novēroto toksicitātes pazīmju aprakstu, iekļaujot toksisko iedarbību parādīšanās brīdi, ilgumu un smagumu, embriju/augļu novērojumu veidu un visus attiecīgos datus par metienu.

Skaitliskie rezultāti ir jānovērtē ar piemērotu statistikas metodi, izmantojot metienu kā datu analīzes vienību. Jāizmanto vispāratzīta statistikas metode; statistikas metodes ir jāizvēlas kā daļa no pētījuma projekta un jāpamato. Jāreģistrē arī dati par dzīvniekiem, kas nav izdzīvojuši līdz paredzētajai nogalināšanai. Attiecīgā gadījumā minētos datus var iekļaut grupas vidējos lielumos. No tādiem dzīvniekiem iegūto datu relevance un, tātad, to iekļaušana vai neiekļaušana grupas vidējā(–os) lielumā(–os) ir jāpamato un jāizspriež katrā atsevišķā gadījumā.

2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA

Prenatālās ontoģenēzes toksicitātes dati ir jānovērtē novērotās iedarbības izteiksmē. Vērtējumā ir šāda informācija:

- mātes un embriju/augļu testa rezultāti, iekļaujot sakarības novērtējumu vai tās trūkumu starp testējamās vielas iedarbību uz dzīvniekiem un visu konstatāciju biežumu un smagumu;

- augļu ārējo, mīksto audu un skeleta izmaiņu iedalīšanai kategorijās izmantotie kritēriji, ja iedalīšana kategorijās ir veikta;

- attiecīgā gadījumā vēsturiskie kontroles dati, lai veicinātu pētījuma rezultātu interpretāciju;

- visā procentuālā daudzuma vai koeficientu aprēķināšanā izmantotie skaitļi;

- attiecīgā gadījumā pētījuma rezultātu atbilstoša statistiskā analīze, kurā jāiekļauj pietiekama informācija par analīzes metodi, tā lai neatkarīgs recenzents/statistiķis varētu atkārtoti novērtēt un rekonstruēt analīzi.

Katrā pētījumā, kas rāda, ka toksiskās iedarbības nav, ir jāapsver turpmākie pētījumi, lai noteiktu testējamās vielas uzsūkšanos un bioloģisko pieejamību.

2.3. REZULTĀTU INTERPRETĒŠANA

Prenatālā ontoģenēzes toksicitāte sniedz informāciju par vielas atkārtotas iedarbības ietekmi grūsnības laikā uz mātītēm un uz to pēcnācēju intrauterīno attīstību. Pētījuma rezultāti ir jāinterpretē kopā ar subhronisko, reprodukcijas, toksikokinētisko un citu pētījumu datiem. Tā kā tiek uzsvērta vispārējā toksicitāte mātes toksicitātes un ontoģenēzes toksicitātes beigu punktu izteiksmē, pētījuma rezultāti zināmā mērā ļauj atšķirt iedarbību uz attīstību, kas sastopama, nepastāvot vispārējai toksicitātei, un iedarbību uz attīstību, ko izraisa tikai līmeņi, kas ir toksiski arī mātesdzīvniekam (27).

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija.

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikāli ķīmiskās īpašības;

- identifikācija, iekļaujot CAS numuru, ja tas ir zināms/noteikts;

- tīrība.

Nesējs (attiecīgā gadījumā):

- nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.

Testa dzīvnieki:

- izmantotā suga un līnija;

- dzīvnieku skaits un vecums;

- izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c.;

- atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā.

Testa apstākļi:

- devu līmeņa izvēles pamatojums;

- sīkas ziņas par testējamās vielas preparāta/barības sagatavošanu, iegūto koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti;

- sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu;

- testējamās vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā vai dzeramajā ūdenī pārrēķins faktiskajā dienas devā (mg/kg ķermeņa svara dienā) attiecīgā gadījumā;

- vides apstākļi;

- sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti.

Rezultāti

Dati par mātes toksisko atbildes reakciju uz devu iekļaujot, bet neaprobežojoties ar:

- dzīvnieku skaitu testa sākumā, izdzīvojušo dzīvnieku skaitu, grūsno dzīvnieku skaitu, abortu skaitu, priekšlaicīgu dzemdību skaitu;

- nāves iestāšanās dienu testa laikā vai norādi, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši;

- dati par dzīvniekiem, kas nav izdzīvojuši līdz plānotajai nogalināšanai, ir jāreģistrē, bet nav jāiekļauj starpgrupu statistiskajos salīdzinājumos;

- katra anomāla klīniskā simptoma novērošanas diena un tālākā attīstība;

- ķermeņa svars, ķermeņa svara izmaiņas un gravīdās dzemdes svars, neobligāti iekļaujot ķermeņa svara izmaiņas, kas koriģētas uz gravīdās dzemdes svaru;

- barības patēriņš un ūdens patēriņš, ja tas ir mērīts;

- autopsijas konstatācijas, iekļaujot dzemdes svaru;

- ir jāreģistrē iedarbības uz māti un attīstību NOAEL vērtības.

Attīstības beigu punkti attiecībā uz devu, metieniem ar implantāciju, iekļaujot:

- corpora lutea skaitu;

- implantāciju skaitu, dzīvo un mirušo augļu un resorbciju skaitu un procentuālo daudzumu;

- pre– un postimplantācijas zudumu skaitu un procentuālo daudzumu.

Attīstības beigu punkti attiecībā uz devu metieniem ar dzīviem augļiem, iekļaujot:

- dzīvu pēcnācēju skaitu un procentuālo daudzumu;

- dzimumu attiecību;

- augļu ķermeņa svaru, vēlams pēc dzimumiem un dzimumiem kopā;

- ārējas, mīksto audu un skeleta malformācijas un citas attiecīgās izmaiņas;

- attiecīgā gadījumā kritērijus iedalīšanai kategorijās;

- augļu un metienu kopējo skaitu un procentuālo daudzumu ar ārējām, mīksto audu un skeleta izmaiņās, kā arī individuālu anomāliju un citu attiecīgu izmaiņu veidus un biežumu.

Rezultātu apspriešana.

Secinājumi.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399–410.

(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386–398.

(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1–8.

(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart Ε–Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.

(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn–Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologic 247:367.

(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.

(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171–173.

(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32;381–391.

(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229–242.

(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.

(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291–306.

(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313–320.

(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;398–408.

(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309–316.

(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague–Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169–181.

(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, lpp. 163–173.

(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411–445.

(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH–Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61–63.

(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313–355.

(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181–188.

(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.

(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, lpp. 251–277.

(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.

(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233–239.

(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37–38.

(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, lpp. 126–144.

(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798–63826.

(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249–292.

--------------------------------------------------

2.G PIELIKUMS

B.35. DIVU PAAUDŽU REPRODUKTĪVĀS TOKSICITĀTES PĒTĪJUMS

1. METODE

Šī metode ir ESAO 416. (2001) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Šī divu paaudžu reprodukcijas testēšanas metode ir paredzēta vispārējās informācijas sniegšanai par testējamās vielas iedarbību uz vīrišķā un sievišķās reproduktīvās sistēmas integritāti un darbību, iekļaujot gonādu funkciju, estrālo ciklu, pārošanās uzvedību, apaugļošanos, grūsnību, dzemdības, laktāciju un zīdīšanas pārtraukšanu, un pēcnācēju augšanu un attīstību. Pētījums var arī sniegt informāciju par testējamās vielas iedarbību uz jaundzimušo saslimstību un mirstību un provizoriskus datus par prenatālo un postnatālo ontoģenēzes toksicitāti un būt par metodisku līdzekli turpmākajos testos. Papildu F.1 paaudzes augšanas un attīstības pētīšanai šī testa metode ir arī paredzēta vīrišķās un sievišķās reproduktīvās sistēmas integritātes un darbības, kā arī F.2 paaudzes augšanas un attīstības novērtēšanai. Papildu informāciju par ontoģenēzes toksicitāti un funkcionāliem trūkumiem vai arī papildu pētījumu segmentus var iekļaut šajā protokolā, attiecīgi ievērojot ontoģenēzes toksicitātes un/vai ontoģenēzes neirotoksicitātes metodes, vai arī minētos beigu punktus var pētīt atsevišķos pētījumos, izmantojot piemērotas testu metodes.

1.2. TESTA METODES PRINCIPS

Testējamo vielu pakāpeniskās devās saņem vairākas grupas vīrišķā un sievišķā dzimuma dzīvnieku. P paaudzes vīrišķā dzimuma dzīvniekiem devas jāsaņem augšanas posmā un vismaz viena pilna spermatoģenēzes cikla laikā (kas pelēm ilgst apmēram 56 dienas un žurkām – 70 dienas), lai noskaidrotu pārbaudāmās vielas kaitīgo iedarbību uz spermatoģenēzi. Iedarbību uz spermu nosaka ar vairākiem spermas rādītājiem (piem., spermas morfoloģiju un kustīgumu) un audu preparātā un sīki izstrādātā histopatoloģijā. Ja ir pieejami spermatoģenēzes dati no pietiekami ilga, piem., 90 dienu, iepriekšējā atkārtotās devas pētījuma, tad P paaudzes vīrišķā dzimuma dzīvnieki nav jāiekļauj vērtējumā. Tomēr ir ieteicams saglabāt P paaudzes spermas paraugus vai digitālos ierakstus, lai varētu novērtēt turpmāk. Lai varētu konstatēt kaitīgo iedarbību uz estrālā cikla normalitāti, P paaudzes sievišķā dzimuma dzīvniekiem testējamās vielas devas jāsaņem augšanas laikā un vairāku estrālo ciklu laikā. Testējamo vielu ievada vecāku (P) dzīvniekiem pārošanās laikā, radušās grūsnības laikā un līdz F.1 pēcnācēju zīdīšanas pārtraukšanai. F.1 pēcnācēji pēc zīdīšanas pārtraukšanas turpina saņemt testējamo vielu visu laiku, kamēr tie aug, pārojas un rada F.2 pēcnācējus, līdz F.2 pēcnācēju zīdīšanas pārtraukšanai.

Klīniskos novērojumus un patoloģiskās apskates visiem dzīvniekiem veic attiecībā uz toksiskuma pazīmēm ar īpašu uzsvaru uz iedarbību saistībā ar vīrišķās un sievišķās reproduktīvās sistēmas integritāti un darbību un uz pēcnācēju augšanu un attīstību.

1.3. TESTA METODES APRAKSTS

1.3.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Žurka ir vēlamākā testa suga. Ja izmanto citas sugas, ir jāsniedz pamatojums un ir nepieciešami attiecīgi pārlabojumi. Nav jāizmanto līnijas ar mazu auglību vai attīstības defektu labi zināmu lielu sastopamību. Izmēģinājuma sākumā dzīvnieku svara atšķirībām jābūt minimālām, un tās nedrīkst pārsniegt 20 % no vidējās svara, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi.

1.3.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Eksperimenta dzīvnieku telpas temperatūrai jābūt 22 °C (± 3o). Kaut arī relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un tam nav vēlams pārsniegt 70 %, izņemot telpas tīrīšanas laiku, mērķim jābūt 50 – 60 %. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Attiecībā uz barošanu var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Barības izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testējamās vielas piejaukšanu, ja vielu ievada ar šo metodi.

Dzīvniekus būros var turēt atsevišķi vai nelielās viena dzimuma dzīvnieku grupās. Pārošanas procedūras jāveic attiecīgajam nolūkam piemērotos būros. Pārotās mātītes pēc kopulācijas fakta būros tur atsevišķi dzemdību vai maternitātes būros. Pārotās žurkas var turēt arī mazās grupās un nošķirt vienu vai vairākas dienas pirms dzemdībām. Tuvojoties dzemdībām, pārotajiem dzīvniekiem nodrošina piemērotu un noteiktu migas veidošanas materiālu.

1.3.3. Dzīvnieku sagatavošana

Jāizmanto veseli, jauni dzīvnieki, kas ir aklimatizēti laboratorijas apstākļos vismaz 5 dienas un ar kuriem iepriekš nav veiktas izmēģinājuma procedūras. Testa dzīvniekiem norāda sugu, līniju, izcelsmi, dzimumu, svaru un/vai vecumu. Ir jābūt zināmai brāļu un māsu radniecībai starp dzīvniekiem, tā lai izvairītos no brāļu un māsu pārošanas. Dzīvnieki pēc nejaušās izvēles ir jāiedala kontroles un vielas saņemšanas grupās (ieteicama stratifikācija pēc ķermeņa svara). Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Katram dzīvniekam piešķir unikālu identifikācijas numuru. Ar P paaudzi tas ir jāizdara pirms dozēšanas sākuma. Ar F.1 paaudzes dzīvniekiem, kas atlasīti pārošanai, tas ir jāizdara pēc zīdīšanas pārtraukšanas. Reģistrācija, kas norāda izcelsmes metienu, ir jāizdara par visiem atlasītajiem F.1 dzīvniekiem. Turklāt ir ieteicams iespējami drīz pēc dzimšanas mazuļus individuāli identificēt, ja apsver mazuļu individuālu svēršanu vai funkcionālos testus.

Dozēšanas sākumā vecāku (P) dzīvnieki ir aptuveni 5 līdz 9 nedēļas veci. Visu testa grupu dzīvnieki, cik tas praktiski iespējams, ir viena svara un vecuma.

1.4. PROCEDŪRA

1.4.1. Dzīvnieku skaits un dzimums

Katrā testa un kontroles grupā jābūt pietiekamam skaitam dzīvnieku, lai, vēlams, dzemdībās vai īsi pirms dzemdībām būtu vismaz 20 grūsni sievišķā dzimuma dzīvnieki. Ar vielām, kas izraisa nevēlamas ar vielas došanu saistītas iedarbības (piem., sterilitāti, pārlieku lielu toksicitāti pie lielas devas), tas var būt nav iespējams. Mērķis ir nodrošināt pietiekamā daudzumā grūsnas mātītes, lai varētu statistiski novērtēt vielas spēju iedarboties uz auglību, grūsnību un mātišķo dzīvnieku uzvedību, kā arī F.1 pēcnācēju zīšanu, augšanu un attīstību no apaugļošanās brīža līdz dzimumgatavībai un to pēcnācēju (F.2) attīstību līdz zīdīšanas pārtraukšanai. Tādēļ nespēja iegūt grūsnu dzīvnieku pietiekamu skaitu (t.i., 20) obligāti nepadara pētījumu nederīgu, un tas jāvērtē katrā gadījumā atsevišķi.

1.4.2. Devu sagatavošana

Ir ieteicams testējamo vielu ievadīt perorāli (ar barību, dzeramo ūdeni vai mākslīgi barojot), ja vien cits ievadīšanas veids (piem., caur ādu vai ieelpojot) nav uzskatāms par lietderīgāku.

Vajadzības gadījumā testējamo vielu izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Ir ieteicams, ja vien iespējams, vispirms apsvērt ūdens šķīduma/suspensijas izmantošanu, pēc tam apsvērt eļļas (piem., kukurūzas eļļas) šķīdumu/emulsiju un pēc tam iespējamu šķīdināšanu citos nesējos. Ir jābūt zināmām nesēju, kas nav ūdens, toksiskajām īpašībām. Ir jānosaka testējamās vielas stabilitāte nesējā.

1.4.3. Dozēšana

Izmanto vismaz trīs devu līmeņus un vienlaicīgu kontroli. Ja testējamās vielas fizikāli ķīmiskās īpašības vai bioloģiskā iedarbība neierobežo, lielākās devas līmenis jāizvēlas ar nolūku izraisīt toksicitāti, bet ne nāvi vai smagas ciešanas. Negaidītas mirstības gadījumā vēl ir pieņemami pētījumi ar vecāku (P) dzīvnieku mirstību mazāku par aptuveni 10 procentiem. Lejupejoša devu līmeņu secība ir jāizraugās, lai parādītu ar dozēšanu saistīto iedarbību un nenovērojamas nelabvēlīgas ietekmes līmeni (NOAEL). Lejupejošo devu līmeņu noteikšanai bieži optimāli ir divkārši līdz četrkārši starplaiki, un ceturtās testa grupas pievienošana bieži ir vēlamāka nekā ļoti plašu starplaiku (piem., vairāk nekā 10 reizes) izmantošana starp dozēšanām. Barības pētījumos devu starplaikam jābūt ne lielākam par trīskāršu. Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā esošos toksicitātes datus, jo īpaši atkārtotās devas pētījumu rezultātus. Jāņem vērā arī pieejamā informācija par testa savienojuma vai saistīto materiālu metabolismu un kinētiku. Turklāt minētā informācija arī palīdzēs parādīt dozēšanas režīma piemērotību.

Kontroles grupa ir vielu nesaņēmusi grupa vai nesēja kontroles grupa, ja testējamās vielas ievadīšanā izmanto nesēju. Ar kontroles dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar pārējiem dzīvniekiem, tie tikai nesaņem testējamo vielu. Ja izmanto nesēju, kontroles grupa saņem lielāko izmantojamo nesēja tilpumu. Ja testējamo vielu ievada barībā un tā izraisa samazinātu barības uzņemšanu vai izmantošanu, tad var uzskatīt par vajadzīgu izmantot identiski barotu kontroles grupu. Vienlaicīgas identiski barotas kontroles grupas vietā var izmantot alternatīvus datus no kontrolētiem pētījumiem, kas paredzēti samazināta barības patēriņa iedarbībai uz reproduktīvajiem rādītājiem.

Jāņem vērā šādas nesēja un citu piedevu īpašības – iedarbība uz testējamās vielas uzsūkšanos, sadalījumu, metabolismu vai aizturi; iedarbība uz testējamās vielas ķīmiskajām īpašībām, kas var mainīt tās toksiskās īpašības; iedarbība uz dzīvnieku barības un ūdens patēriņu vai uz to barojuma statusu.

1.4.4. Pieļaujamības tests

Ja orālajā testā pie viena devas līmeņa, kas ir vismaz 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā, vai, ievadot ar barību vai dzeramo ūdeni, līdzvērtīgs procentuālais daudzums barībā vai dzeramajā ūdenī, izmantojot šajā pētījumā aprakstītās procedūras, nerodas novērojamas toksiskās iedarbības vecākiem vai to pēcnācējiem un ja toksicitāte nav sagaidāma, pamatojoties uz datiem par struktūras ziņā un/vai metaboliski radniecīgiem savienojumiem, tad pilnu pētījumu, izmantojot vairākus devu līmeņus var neuzskatīt par vajadzīgu. Pieļaujamības testu piemēro, izņemot gadījumu, ja iedarbība uz cilvēku rāda, ka jāizmanto augstāks orālās devas līmenis. Citiem ievadīšanas veidiem, tādiem kā inhalācija vai pielietošana uz ādas, fizikālās īpašības, tādas kā šķīdība, bieži var norādīt un ierobežot maksimālo sasniedzamo iedarbības līmeni.

1.4.5. Devu ievadīšana

Dzīvniekiem testējamo viela jādod 7 dienas nedēļā. Vēlamākais ir perorālais ievadīšanas veids (barība, dzeramais ūdens vai mākslīgā barošana). Ja izmanto citu ievadīšanas veidu, jāsniedz pamatojums un var būt vajadzīgas attiecīgas izmaiņas. Visiem dzīvniekiem attiecīgā eksperimenta periodā devu dod ar vienu un to pašu metodi. Ja testējamo vielu ievada ar mākslīgo barošanu, tas jādara, izmantojot kuņģa zondi. Vienā reizē ievadītā šķidruma tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml/100 g ķermeņa svara (0,4 ml/100 g ir maksimums kukurūzas eļļai), izņemot ūdens šķīdumus, kad var izmantot 2 ml/100 g ķermeņa svara. Izņemot kairinošas vai kodīgas vielas, kam parasti ir saasinājuma iedarbība augstākās koncentrācijās, testa tilpuma izmaiņas ir jāsamazina līdz minimumam, pielāgojot koncentrāciju, lai nodrošinātu nemainīgu tilpumu visos devu līmeņos. Mākslīgās barošanas pētījumos mazuļi parasti testējamo vielu saņem tikai netieši ar pienu, līdz tiešā dozēšana sākas, izbeidzot zīdīšanu. Barības vai dzeramā ūdens pētījumos mazuļi papildus saņem testējamo vielu tieši, kad tie sāk paši ēst laktācijas perioda pēdējās nedēļas laikā.

Vielām, ko ievada ar barību vai dzeramo ūdeni, ir svarīgi nodrošināt, lai iesaistītie testējamās vielas daudzumi netraucētu normālo barības vai ūdens līdzsvaru. Ievadot testējamo vielu barībā var izmantot nemainīgu barības koncentrāciju (milj. daļas) vai nemainīgu devas līmeni attiecībā uz ķermeņa svaru;izmantotā alternatīva ir jānorāda. Ievadot vielu ar mākslīgo barošanu, deva jādod katru dienu tajā pašā laikā un jāpielāgo vismaz reizi nedēļā, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā uz dzīvnieka ķermeņa svaru. Pielāgojot mākslīgās barošanas devu, kas pamatojas uz ķermeņa svaru, ir jāņem vērā informācija par sadalījumu placentā.

1.4.6. Eksperimenta grafiki

Ikdienas dozēšana vecāku (P) tēviņiem un mātītēm sākas, kad tie ir 5 līdz 9 dienas veci. Ikdienas dozēšana F1 tēviņiem un mātītēm sākas, izbeidzot zīdīšanu; jāievēro, ka testējamo vielu ievadot ar barību vai dzeramo ūdeni, testējamās vielas tieša iedarbība uz F.1 mazuļiem var notikt jau laktācijas periodā. Dozēšanu abiem dzimumiem (P un F.1) turpina vismaz 10 nedēļas pirms pārošanās perioda. Dozēšanu abiem dzimumiem turpina 2 nedēļas pārošanās perioda laikā. Ja tēviņi vairs nav vajadzīgi reproduktīvo iedarbību vērtēšanai, tie humāni jānogalina un jāizpēta. Vecāku (P) mātītēm dozēšana jāturpina grūsnības laikā un līdz F.1 pēcnācēju zīdīšanas pārtraukšanai. Jāapsver izmaiņas dozēšanas grafikā, pamatojoties uz pieejamo informāciju par testējamo vielu, iekļaujot esošos toksicitātes datus, metabolisma indukciju vai bioloģisko uzkrāšanos. Katra dzīvnieka deva parasti pamatojas uz jaunāko individuālā ķermeņa svara noteikšanu. Tomēr jābūt piesardzīgam, pielāgojot devu grūsnības pēdējā trešdaļā.

Devu došana P un F.1 tēviņiem un mātītēm turpinās līdz eksperimenta izbeigšanai. Visi pieaugušie P un F.1 tēviņi un mātītes humāni jānogalina, ja tie vairs nav vajadzīgi reproduktīvo iedarbību vērtēšanai. Pārošanai neizraudzītie F.1 pēcnācēji un visi F.2 pēcnācēji humāni jānogalina pēc zīdīšanas izbeigšanas.

1.4.7. Pārošanas procedūra

1.4.7.1. Vecāku (P) pārošana

Katrai pārošanai katru mātīti novieto ar viena un tā paša devas līmeņa tēviņu (1:1 pārošana), līdz notiek kopulācija vai ir pagājušas 2 nedēļas. Katru dienu mātītes apskata attiecībā uz spermas vai vagīnas embolu klātbūtni. Grūsnības 0 diena ir diena, kad konstatē vagīnas embolu vai spermu. Ja pārošanās ir neveiksmīga, var apsvērt mātīšu atkārtotu pārošanu ar tās pašas grupas pārbaudītiem tēviņiem. Pāri skaidri jānorāda datos. Jāizvairās no brāļu un māsu pārošanas.

1.4.7.2. F.1 pārošana

Lai radītu F.2 paaudzi, no F.1 pēcnācējiem pārošanai jāizvēlas, pārtraucot zīdīšanu, vismaz viens tēviņš un viena mātīte no katra metiena, lai pārotu ar citiem tā paša devas līmeņa, bet cita metiena mazuļiem. Ja metiena dzīvnieku nozīmīgas ķermeņa svara vai izskata atšķirības nav novērojamas, mazuļu izvēlei no katra metiena jābūt pēc nejaušās izvēles. Ja ir novērojamas atšķirības, jāizvēlas katra metiena labākie pārstāvji. Pragmatiski to vislabāk ir izdarīt, pamatojoties uz ķermeņa svaru, bet var būt lietderīgāk pamatoties uz izskatu. F.1 pēcnācēji nav jāpāro, līdz tie sasnieguši pilnīgu seksuālo briedumu.

Pāri bez pēcnācējiem ir jānovērtē, lai noteiktu neauglības cēloni. Tas var iekļaut tādas procedūras kā papildu pārošanu ar citu pārbaudītu tēviņu vai mātīti, reproduktīvo orgānu mikroskopisko izmeklēšanu, kā arī estrālā cikla vai spermatoģenēzes pārbaudi.

1.4.7.3. Otrā pārošana

Dažos gadījumos, tādos kā ar vielas došanu saistītas metiena lieluma izmaiņas vai neskaidrs efekts pirmajā pārošanā, ir ieteicams P vai F.1 pieaugušos dzīvniekus pārot vēlreiz, lai radītu otro metienu. Ir ieteicams mātītes vai tēviņus, kas nav radījuši metienu, atkārtoti pārot ar pretējā dzimuma pārbaudītiem vaislas dzīvniekiem. Ja otrā metiena radīšanu uzskata par nepieciešamu jebkurā paaudzē, dzīvnieki ir atkārtoti jāpāro vienu nedēļu pēc pēdējā metiena zīdīšanas pārtraukšanas.

1.4.7.4. Metiena lielums

Dzīvniekiem ļauj normāli dzemdēt un savus pēcnācējus audzināt līdz zīdīšanas pārtraukšanai. Metiena lielumu standartizēšana nav obligāta. Ja veic standartizāciju, izmantotā metode ir sīki jāapraksta.

1.5. NOVĒROJUMI

1.5.1. Klīniskie novērojumi

Vispārējie klīniskie novērojumi jāveic katru dienu un dozēšanas ar mākslīgo barošanu gadījumā novērojumu grafikā jāņem vērā iedarbību paredzamais maksimuma periods pēc dozēšanas. Jāreģistrē uzvedības izmaiņas, grūtu vai ilgu dzemdību pazīmes un visas toksicitātes pazīmes. Katra dzīvnieka papildu sīkāka apskate ir jāveic vismaz reizi nedēļā un to ērti var izdarīt, kad dzīvnieku sver. Divreiz dienā un nedēļas nogalē attiecīgi vienreiz dienā visi dzīvnieki jānovēro attiecībā uz saslimstību un mirstību.

1.5.2. Vecāku dzīvnieku ķermeņa svars un barības/ūdens patēriņš

Vecāku dzīvniekus (P un F.1) nosver pirmajā dozēšanas dienā un pēc tam reizi nedēļā. Vecāku sieviešu dzimuma dzīvniekus (P un F.1) nosver vismaz grūsnības 0,7., 14. un 20. vai 21. dienā un laktācijas laikā tajās pašās dienās, kad sver metienu, un dzīvnieku nogalināšanas dienā. Novērojumu rezultātus reģistrē atsevišķi par katru pieaugušo dzīvnieku. Pirmspārošanas un grūsnības periodā barības patēriņu mēra vismaz reizi nedēļā. Ja testējamo vielu ievada ar ūdeni, ūdens patēriņu mēra vismaz reizi nedēļā.

1.5.3. Meklēšanās cikls

Meklēšanās cikla ilgumu un normālību P un F.1 mātītēm novērtē pēc vaginālajām iztriepēm pirms pārošanas un pēc izvēles pārošanās laikā, līdz ir atrastas pārošanās pazīmes. Iegūstot vagīnas/dzemdes kakla šūnas, jāpievērš vērība, lai izvairītos no gļotādas bojāšanas un sekojošas pseidogrūsnības ierosināšanas (1).

1.5.4. Spermas rādītāji

Visu P un F1 tēviņu sēklinieku un sēklinieku piedēkļu svaru reģistrē nogalinot, un no katra orgāna vienu atstāj histopatoloģiskai izmeklēšanai (sk. 1.5.7., 1.5.8.1. punktu). Katras P un F.1 grupas tēviņu apakšgrupai, kurā ir vismaz desmit katras grupas tēviņu, atlikušie sēklinieki un sēklinieku piedēkļi ir attiecīgi jāizmanto pret homogenizāciju rezistento spermatīdu un cauda epididymal spermas rezervju skaitīšanai. Tai pašai tēviņu apakšgrupai sperma no cauda epididymides vai vas deferens jāsavāc spermas kustīguma un spermas morfoloģijas novērtēšanai. Ja ir novērota ar vielas došanu saistīta iedarbība vai ja ir citu pētījumu pierādījumi par iespējamo iedarbību uz spermatoģenēzi, spermas vērtēšana jāveic visiem tēviņiem katrā devas grupā; pretējā gadījumā skaitīšanu var ierobežot ar kontroles grupas un lielās devas P un F1 tēviņiem.

Pret homogenizāciju rezistentās sēklinieku spermatīdas un cauda epididymal sperma ir jāskaita (2,3). Cauda spermas rezerves var atvasināt no spermas koncentrācijas un tilpuma suspensijā, ko izmanto kvalitatīvo vērtējumu izdarīšanai, un no sekojošā atlikušo cauda audu malšanā un/vai homogenizācijā reģenerētās spermas skaita. Skaitīšanu izdara izraudzītajai visu devu grupu tēviņu apakšgrupai tūlīt pēc dzīvnieku nogalināšanas, ja vien netiek veikti video vai digitālie ieraksti vai paraugi nav sasaldējami un analizējami turpmāk. Tādos gadījumos kontroles grupu un lielākās devas grupu var analizēt pirmo. Ja nav novērojamas ar vielas došanu saistītas iedarbības (piem., iedarbība uz spermas skaitu, kustīgumu vai morfoloģiju), pārējo devu grupas nav jāanalizē. Ja lielākās devas grupā ir novērojamas ar vielas došanu saistītas iedarbības, ir jāvērtē arī mazāko devu grupas.

Epididimālās (vai ductus deferens) spermas kustīgums ir jānovērtē vai jāieraksta video tūlīt pēc nogalināšanas. Sperma jāreģenerē, samazinot bojājumus līdz minimumam, un jāatšķaida kustīguma analīzei, izmantojot pieņemamas metodes (4). Pieaugoši kustīgās spermas procentuālais daudzums jānosaka subjektīvi vai objektīvi. Ja veic kustīguma analīzi, izmantojot datoru (5), (6), (7), (8), (9), (10), pieaugošā kustīguma atvasināšana pamatojas uz lietotāja noteiktiem vidējā attāluma ātruma sliekšņiem un taisnumu vai lineāru koeficientu. Ja paraugus uzņem video (11) vai attēlus citādi reģistrē autopsijas laikā, var veikt vienīgi kontroles grupas un lielākās devas P un F.1 tēviņu analīzi, ja nav novērojamas ar vielas došanu saistītas iedarbības, pretējā gadījumā ir jāvērtē arī mazāko devu grupas. Ja nav videoattēla vai digitālā attēla, visi paraugi visās grupās ir jāanalizē autopsijā.

Jāizdara epididimālās (vai vas deferens) spermas morfoloģiskā vērtēšana. Sperma (vismaz 200 uz paraugu) ir jāapskata kā fiksēti mitri preparāti (12) un jāklasificē kā normāla vai nenormāla. Spermas morfoloģisko nenormālību piemēri iekļauj saplūšanu, izolētas galviņas un kroplīgas galviņas un/vai astes. Vērtēšana jāveic visu devu grupu izraudzītai tēviņu apakšgrupai tieši pēc nogalināšanas vai, pamatojoties uz video un digitālajiem ierakstiem, vēlāk. Iztriepes, kad tās ir fiksētas, arī var izskatīt vēlāk. Tādos gadījumos kontroles grupu un lielākās devas grupu var analizēt pirmo. Ja nav novērojamas ar vielas došanu saistītas iedarbības (piem., iedarbība uz spermas morfoloģiju), pārējo devu grupas nav jāanalizē. Ja lielākās devas grupā ir novērojamas ar vielas došanu saistītas iedarbības, ir jāvērtē arī mazāko devu grupas.

Ja kāds no iepriekš minētajiem spermas vērtēšanas rādītājiem jau ir apskatīts kā vismaz 90 dienu sistēmiskās toksicitātes pētījuma daļa, tie nav obligāti jāatkārto divu paaudžu pētījumā. Tomēr ir ieteicams saglabāt P paaudzes spermas paraugus vai digitālos ierakstus, lai vajadzības gadījumā veiktu turpmāku vērtēšanu.

1.5.5. Pēcnācēji

Katrs metiens ir jāapskata iespējami drīz pēc dzemdībām (0 laktācijas diena), lai konstatētu mazuļu skaitu un dzimumu, nedzīvi dzimušos, dzīvi dzimušos un makroskopisku anomāliju pastāvēšanu. Mazuļi, kas atrasti miruši 0 dienā, ja nav izmērcēti, vēlams, jāapskata attiecībā uz iespējamiem defektiem un nāves cēloni un jāsaglabā. Dzīvie mazuļi ir jāsaskaita un atsevišķi jānosver pēc dzimšanas (laktācijas 0 diena) vai 1. dienā un kārtējās svēršanas dienās pēc tam, piem., 4., 7., 14. un 21. laktācijas dienā. Mātītei un pēcnācējiem reģistrē visas novērotās fiziskās kroplības un uzvedības traucējumus.

Pēcnācēju fiziskā attīstība jāreģistrē galvenokārt pēc ķermeņa svara pieauguma. Citi fiziskie rādītāji (piem., ausu un acu atvēršanās, zobu parādīšanās, apmatojuma augšana) var dot papildu informāciju, bet minētos datus būtu vēlams vērtēt seksuālās nobriešanas kontekstā (piem., vecums un ķermeņa svars pie vagīnas atvēršanās vai balano–preputiālās atdalīšanās) (13). Ir ieteicami F.1 pēcnācēju funkcionālie izmeklējumi (piem., kustību aktivitāte, sensorā funkcija, refleksu ontoģenēze) pirms un/vai pēc zīdīšanas pārtraukšanas, jo īpaši tie, kas saistās ar seksuālo nobriešanu, ja tādi izmeklējumi nav iekļauti atsevišķos pētījumos. Vecums, kad notiek vagīnas atvēršanās un preputiālā atdalīšanās, ir jānosaka no mātes nošķirtajiem F.1 pēcnācējiem, kas izraudzīti pārošanai. Pēcdzemdību 0 dienā F.2 mazuļiem ir jāmēra anogenitālais atstatums, ja mainījusies F.1 dzimumu attiecība vai seksuālās nobriešanas laika iestāšanās.

Funkcionālos novērojumus var neizdarīt grupās, kas citādi uzrāda skaidras kaitīgo iedarbību pazīmes (piem., ievērojamu svara pieauguma samazināšanos utt.). Ja funkcionālos izmeklējumus izdara, tos nav jāizdara ar mazuļiem, kas izraudzīti pārošanai.

1.5.6. Makroskopiskā autopsija

Nogalināšanas vai nāves laikā pētījumā visus vecāku dzīvniekus (P un F.1), visus mazuļus ar ārējām anomālijām vai klīniskām pazīmēm, kā arī vienu mazuli/dzimumu/metienu pēc nejaušās izvēles no F.1 un F.2 paaudzes apskata makroskopiski attiecībā uz strukturālām anomālijām vai patoloģiskām izmaiņām. Īpaša uzmanība jāpievērš reproduktīvās sistēmas orgāniem. Mazuļi, kas ir humāni nogalināti mirstošā stāvoklī, un mirušie mazuļi, ja nav izmērcēti, ir jāapskata attiecībā uz iespējamiem defektiem un/vai nāves cēloni un jāsaglabā.

Visu pirmoreiz dzemdējušo mātīšu dzemdes ir jāapskata veidā, kas netraucē histopatoloģisko vērtēšanu, attiecībā uz implantācijas vietu klātbūtni un skaitu.

1.5.7. Orgānu svars

Nogalināšanas laikā visiem P un F.1 vecāku dzīvniekiem jānosaka ķermeņa svars un jānosver šādi orgāni (pāru orgāni jānosver atsevišķi):

- dzemde, olnīcas;

- sēklinieki, epididymides (kopā un cauda);

- prostata;

- sēklas pūslīši ar koagulācijas dziedzeriem un to šķidrumiem un prostatu (kā viena vienība);

- smadzenes, aknas, nieres, liesa, hipofīze, vairogdziedzeris un virsnieru dziedzeris un zināmie mērķa orgāni.

Ķermeņa svars pēc nogalināšanas jānosaka F.1 un F.2 mazuļiem, kas ir izraudzīti autopsijai. Jāsver šādi orgāni no viena nejauši izvēlēta mazuļa/dzimuma/metiena (sk. 1.5.6. punktu) – smadzenes, liesa un timuss.

Makroskopiskās autopsijas un orgānu svara rezultāti jānovērtē kontekstā ar citu atkārtotās devas pētījumu rezultātiem, ja tādi ir pieejami.

1.5.8. Histopatoloģija

1.5.8.1. Vecāku dzīvnieki

Šādi vecāku dzīvnieku (P un F.1) orgāni un audi vai to reprezentatīvi paraugi ir fiksējami un glabājami piemērotā vidē histopatoloģiskai apskatei:

- vagīna, dzemde ar kakliņu un olnīcām (glabājama piemērotā fiksatīvā);

- viens sēklinieks (glabājams Buina vai salīdzināmā fiksatīvā), viens epididymis, sēklas pūslīši, prostata un koagulācijas dziedzeris;

- iepriekš identificēts(–i) mērķa orgāns(–i) no visiem pārošanai izraudzītiem P un F.1 dzīvniekiem.

Iepriekš uzskaitīto saglabāto orgānu un audu pilna histopatoloģiskā analīze jāizdara visiem lielākās devas un kontroles grupas P un F.1 dzīvniekiem, kas izraudzīti pārošanai. P dzīvnieku olnīcu apskate nav obligāta. Orgāni, kuros parādās ar vielas došanu saistītas izmaiņas, ir jāapskata arī mazās un vidējās devas grupās, lai palīdzētu NOAEL noskaidrošanā. Turklāt histopatoloģiskā novērtēšanu veic mazas un vidējas devas dzīvniekiem, kuriem ir domājama samazināta auglība, piem., tādiem, kas nav pārojušies, apaugļojušies, radījuši pēcnācējus vai dzemdējuši veselus pēcnācējus, vai kuriem ir ietekmēts meklēšanās cikls vai spermas skaits, kustīgums vai morfoloģija. Jāapskata visi makroskopiskie bojājumi, tādi kā atrofija vai audzēji.

Lai identificētu ar vielas došanu saistītas iedarbības, tādas kā saglabātas spermatīdas, trūkstoši dīgļa šūnu slāņi vai tipi, daudzkodolu gigantiskās šūnas vai spermatogēno šūnu nekrotizēšanās lūmenā, ir jāveic sīka sēklinieku histopatoloģiskā apskate (piem., izmantojot Buina fiksatīvu, iegremdēšanu parafīnā un 4 – 5 μm biezus šķērsvirziena griezumus) (14). Neskarta epididymis apskatē jāiekļauj caput, corpus, un cauda, apskati var izdarīt, novērtējot garengriezumu. Epididymis jānovērtē attiecībā uz leikocītu infiltrāciju, pārsvarā esošo šūnu tipu izmaiņām, šūnu tipiem ar novirzēm no normas un spermas fagocitozi. Tēviņu reproduktīvo orgānu izmeklēšanai var izmantot perjodskābes Šifa reakciju un iekrāsošanu ar hematoksilīnu.

Pēclaktācijas olnīcām jāsatur aizmetņu un augošas olšūnas, kā arī lieli laktācijas corpora lutea. Histopatoloģiskajai apskatei jākonstatē aizmetņu olšūnu populācijas kvalitatīva sarukšana. Aizmetņu olšūnu kvantitatīvu novērtēšanu veic F.1 mātītēm; dzīvnieku skaitam, olnīcu griezumu izvēlei un autopsijas parauga lielumam jābūt statistiski atbilstošam izmantojamai vērtēšanas procedūrai. Apskatē jāiekļauj aizmetņu olšūnu skaitīšana, tās var apvienot ar mazām augošām olšūnām vielu saņēmušo un kontroles grupas olšūnu salīdzināšanai (15), (16), (17), (18), (19).

1.5.8.2. No mātes atšķirtie mazuļi

Makroskopiski nenormālus audus un mērķa orgānus no visiem mazuļiem ar ārējām anomālijām vai klīniskajām pazīmēm, kā arī no viena pēc nejaušās izvēles izraudzīta mazuļa/dzimuma/metiena no F.1 un F.2 paaudzes, kas nav bijis izraudzīts pārošanai, fiksē un glabā piemērotā vidē histopatoloģiskai apskatei. Saglabāto audu pilna histopatoloģiskā raksturošana jāizdara ar īpašu uzsvaru uz reproduktīvās sistēmas orgāniem.

2. IEGŪTIE DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Par katru testa grupu un katru paaudzi datus reģistrē atsevišķi un apkopotus tabulas veidā – parādot dzīvnieku skaitu testa sākumā, dzīvnieku skaitu, kas atrasti miruši testa laikā vai nogalināti humānu apsvērumu dēļ, katras nāves vai humānās nogalināšanas laiku, auglīgo dzīvnieku skaitu, grūsno mātīšu skaitu, dzīvnieku skaitu, kam ir toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju aprakstu, iekļaujot toksisko iedarbību sākuma laiku, ilgumu un stiprumu, vecāku un pēcnācēju novērojumu veidu, histopatoloģisko izmaiņu veidu un visus attiecīgos metienu datus.

Skaitliskie rezultāti jānovērtē ar piemērotu vispārpieņemtu statistikas metodi, statistikas metodes jāizvēlas kā daļa no pētījuma projekta un ir jāpamato. Datu analīzei var būt noderīgi devas–atbildes reakcijas statistiskie modeļi. Pārskatā jāiekļauj pietiekami daudz informācijas par izmantoto analīzes metodi un datorprogrammu, tā lai neatkarīgs pārbaudītājs/statistiķis varētu no jauna novērtēt un atjaunot analīzi.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA

Šā divu paaudžu reproduktīvās toksicitātes pētījuma konstatācijas jānovērtē novēroto iedarbību izteiksmē, iekļaujot autopsiju un mikroskopiskos izmeklējumus. Vērtējumā iekļauj testējamās vielas devas saistība ar anomāliju – iekļaujot makroskopiskos bojājumus, identificētos mērķa orgānus, ietekmēto auglību, klīniskās anomālijas, ietekmēto reproduktīvo un metiena rezultātu, ķermeņa svara izmaiņas, iedarbību uz mirstību un citas toksiskās iedarbības – to klātbūtni vai to neparādīšanos, biežumu un smagumu. Novērtējot testa rezultātus, jāņem vērā testējamās vielas fizikāli ķīmiskās īpašības un toksikokinētiskie dati, ja tie pieejami.

Pareizi veiktam reproduktīvās toksicitātes testam jādod apmierinošs nenovērojamas kaitīgas iedarbības līmeņa novērtējums un izpratne par kaitīgām iedarbībām uz vairošanos, dzemdībām, laktāciju, postnatālo attīstību, iekļaujot augšanu un seksuālo attīstību.

2.3. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA

Divu paaudžu reproduktīvās toksicitātes pētījums sniedz informāciju par vielas atkārtotas iedarbības ietekmi visās reproduktīvā cikla fāzēs. Jo īpaši pētījums sniedz informāciju par reproduktīvajiem rādītājiem un par pēcnācēju attīstību, augšanu, briedumu un izdzīvošanu. Pētījuma rezultāti jāinterpretē saistībā ar subhronisko, prenatālās attīstības, toksikokinētisko un citu pieejamo pētījumu rezultātiem. Šā pētījuma rezultātus var izmantot, novērtējot ķīmiskās vielas turpmāku pētījumu vajadzību. Rezultātu ekstrapolācija uz cilvēka pētījumu ir derīga ierobežotā veidā. Tie vislabāk izmantojami, lai sniegtu informāciju par nelabvēlīgas ietekmes līmeņiem un pieļaujamo iedarbību uz cilvēku (20), (21), (22), (23).

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA3.1.

PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija.

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikāli ķīmiskās īpašības;

- identifikācijas dati;

- tīrība.

Nesējs (attiecīgā gadījumā):

- nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.

Testa dzīvnieki:

- izmantotā suga/līnija;

- dzīvnieku skaits, vecums un dzimums;

- izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, materiāls migas ierīkošanai utt.;

- dzīvnieku individuālais svars testa sākumā.

Testa apstākļi:

- devu līmeņa izvēles pamatojums;

- sīki dati par testējamās vielas preparāta/barības pagatavošanu, sasniegtās koncentrācijas;

- preparāta stabilitāte un viendabīgums;

- sīki dati par testējamās vielas ievadīšanu;

- attiecīgā gadījumā testējamās vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā/dzeramajā ūdenī pārvēršana sasniegtajā devā (mg/kg ķermeņa svara dienā);

- sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti.

Rezultāti:

- barības patēriņš un, ja pieejams, ūdens patēriņš, barības efektivitāte (ķermeņa svara palielinājums uz patērētās barības gramu) un testējamā materiāla patēriņš P un F.1 dzīvniekiem, izņemot kopā turēšanas periodu un vismaz laktācijas pēdējo trešdaļu;

- uzsūkšanās dati (ja pieejami);

- pārošanai izraudzīto P un F.1 dzīvnieku ķermeņa svara dati;

- metiena un mazuļu svara dati;

- ķermeņa svars nogalinot, un vecāku dzīvnieku absolūtā un relatīvā svara dati;

- klīnisko pazīmju veids, smagums un ilgums (atgriezeniskas vai neatgriezeniskas);

- nāves laiks pētījuma laikā vai arī dzīvnieki izdzīvojuši līdz nogalināšanai;

- toksiskās atbildes reakcijas dati pēc dzimuma un devas, iekļaujot pārošanās, auglības, grūsnības, dzimšanas, dzīvotspējas un laktācijas indeksus; pārskatā jānorāda skaitļi, kas izmantoti minēto indeksu aprēķināšanā;

- toksiskās vai citas iedarbības uz reproduktīvo funkciju, pēcnācējiem, postnatālo augšanu utt;

- autopsijas konstatācijas;

- visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādāts apraksts;

- P un F.1 mātīšu skaits, kurām ir normāls cikls un cikla ilgums;

- kopējais cauda epididymal spermas skaits, pieaugoši kustīgās spermas procentuālais daudzums, morfoloģiski normālās spermas procentuālais daudzums un spermas ar katru identificētu nenormālību procentuālais daudzums;

- laiks līdz pārošanai, iekļaujot dienu skaitu līdz pārošanai;

- grūsnības ilgums;

- implantāciju un corpora lutea skaits, metiena lielums;

- dzīvi dzimušo skaits un pēcimplantācijas zudumi;

- mazuļu skaits ar makroskopiski redzamām anomālijām, ja ir noteikts nīkuļu skaits, kuri jāreģistrē;

- dati par mazuļu fiziskām atšķirības iezīmēm un citi postnatālās attīstības dati; novērtētas fiziskās atšķirības iezīmes ir jāpamato;

- funkcionālo novērojumu dati attiecīgi par mazuļiem un pieaugušajiem;

- attiecīgā gadījumā statistiskās apstrādes rezultāti.

Rezultātu apspriešana.

Secinājumi, iekļaujot NOAEL vērtības ietekmes uz māti un pēcnācējiem.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons; In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.

(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose–Response Analysis of Methoxychlor–Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92–108.

(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103–107.

(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39 44

(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237– 244.

(6) Chapin, R.E. et al., (1992). Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267–273

(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409–421.

(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449–458.

(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer–Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton–Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, lpp. 319–333.

(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401–415.

(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330–337.

(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491–505.

(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.

(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.

(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, lpp. 421–426.

(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.

(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379–383.

(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.

(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull′s Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.

(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.

(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke–Sam (eds.), Raven Press, New York.

(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.

--------------------------------------------------

2.H PIELIKUMS

B.42. ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA – LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA

1. METODE

Šī testa metode ir ESAO 429. (2002) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Lokālo limfmezglu noteikšana (LLNA) ir pietiekami validēta un akceptēta, lai pamatotu tās pieņemšanu par jaunu metodi (1), (2), (3). Šī ir otrā metode ādas sensibilizācijas ar ķīmiskām vielām potenciāla novērtēšanai. Citā metodē (B.6.) izmanto jūrascūciņu testus, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (4).

LLNA sniedz alternatīvu metodi, lai identificētu ādu sensibilizējošās ķīmiskās vielas un apstiprinātu, ka ķīmiskajām vielām nepiemīt nozīmīgs ādas sensibilizācijas izraisīšanas potenciāls. Tas obligāti nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA būtu jālieto jūrascūciņu testa vietā, bet gan, ka noteikšana ir līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajiem un negatīvajiem rezultātiem vairs nav vajadzīga turpmāka apstiprināšana.

LLNA nodrošina dažas priekšrocības attiecībā uz zinātnes attīstību un dzīvnieku labturību. Tā pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Ir publicēti sīki dati par LLNA validāciju un pārskats par saistītajiem darbiem (5), (6), (7), (8). Turklāt jānorāda uz to, ka viegli/vidēji sensibilizatori, kas ir ieteikti kā piemērotas pozitīvās kontroles vielas jūrascūciņu testa metodēm, ir piemēroti arī lietošanai ar LLNA (6), (8), (9).

LLNA ir in vivo metode un tātad neatmet dzīvnieku izmantošanu kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tai tomēr ir spēja samazināt šim mērķim vajadzīgo dzīvnieku skaitu. Turklāt LLNA piedāvā būtiski uzlabot veidu, kā kontakta sensibilizācijas testēšanā izmantot dzīvniekus. LLNA pamatojas uz to imunoloģisko gadījumu izskatīšanu, ko ķīmiskās vielas stimulē sensibilizācijas indukcijas fāzē. Atšķirībā no testiem ar jūrascūciņām LLNA nav jānoskaidro provocētās – inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Turklāt LLNA nav jāizmanto palīgviela, kā tas ir jūrascūciņu maksimizācijas testā. Tādā veidā LLNA samazina dzīvnieku ciešanas. Neraugoties uz LLNA priekšrocībām salīdzinājumā ar tradicionālajiem jūrascūciņu testiem, ir jāatzīst, ka ir daži ierobežojumi, kas var radīt nepieciešamību izmantot tradicionālos jūrascūciņu testus (piem., maldīgi negatīvi LLNA rezultāti ar dažiem metāliem, maldīgi pozitīvi rezultāti ar dažiem ādas kairinātājiem) (10).

Skat. arī ievada B daļu.

1.2. TESTA METODES PRINCIPS

LLNA pamatprincips ir, ka sensibilizatori inducē limfocītu primāro savairošanos limfmezglā, kurš drenē ķīmiskās vielas pielietošanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla pielietotajai devai (un alergēna iedarbīgumam) un nodrošina vienkāršus paņēmienus, kas vajadzīgi, lai iegūtu sensitivitātes objektīvu, kvantitatīvu mērījumu. LLNA novērtē šo savairošanos kā reakcijas uz devu sakarību, kurā savairošanos testa grupās salīdzina ar savairošanos nesēju saņēmušajās grupās. Savairošanās attiecību, ko apzīmē kā stimulācijas indeksu, nosaka vielu saņēmušajās grupās pret nesēju saņēmušo kontroles grupu, un tai jābūt vienādai vismaz ar trīs, pirms testējamo vielu var turpmāk vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru. Šeit aprakstītās metodes pamatojas uz radioaktīvās iezīmēšanas izmantošanu šūnu savairošanās izmērīšanai. Tomēr savairošanās vērtēšanai var izmantot citus beigu punktus ar nosacījumu, ka ir pamatojums un attiecīgs zinātnisks atbalsts, iekļaujot pilnīgu norādi un metodoloģijas aprakstu.

1.3. TESTA METODES APRAKSTS

1.3.1. Sagatavošanās

1.3.1.1. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Dzīvnieki jātur atsevišķi. Eksperimenta dzīvnieku telpas temperatūrai jābūt 22 °C (± 3 °C). Kaut arī relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, vēlams, nav jāpārsniedz 70 %, izņemot telpu tīrīšanas laiku, mērķim jābūt 50 – 60 %. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi.

1.3.1.2. Dzīvnieku sagatavošana

Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušās izvēles, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz 5 dienas pirms testa sākuma, lai aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi.

1.3.2. Testa apstākļi

1.3.2.1. Eksperimenta dzīvnieki

Šim testam izvēlētā suga ir peles. Izmanto jaunas, pieaugušas CBA/Ca vai CBA/J līnijas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8 – 12 nedēļu veciem, dzīvnieku svara atšķirībām jābūt minimālām, un tās nedrīkst pārsniegt 20 % vidējā svara. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam.

1.3.2.2. Ticamības pārbaude

Lai norādītu uz attiecīgo noteikšanas veiktspēju un laboratorijas kompetenci un veiksmīgi izdarītu noteikšanu, izmanto pozitīvo kontroli. Pozitīvajai kontrolei jādod pozitīva LLNA atbildes reakcija pie iedarbības līmeņa, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) > 3, salīdzinot ar negatīvo kontroles grupu. Pozitīvās kontroles deva jāizvēlas tā, lai indukcija būtu skaidri izteikta, bet ne pārlieku stipra. Ieteicamās vielas ir heksilkanēļskābes aldehīds (CAS Nr. 101–86–0, EINECS Nr. 202–983–3) un merkaptobenzotiazols (CAS Nr. 149–30–4, EINECS Nr. 205–736–8). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas kontroles vielas, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem. Kaut arī parasti katrā noteikšanā var būt vajadzīga pozitīva kontroles grupa, var būt gadījumi, kad testa laboratorijām ir pieejami iepriekšējie pozitīvās kontroles dati, lai norādītu uz apmierinošas atbildes reakcijas atbilstību sešu mēnešu vai ilgākā laika posmā. Tādos gadījumos var būt lietderīga retāka testēšana ar pozitīvu kontroli laikposmos, kas nepārsniedz 6 mēnešus. Kaut arī pozitīvās kontroles viela ir jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piem., acetons, olīveļļa),var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs). Tādā gadījumā ir jāpārbauda pozitīvās kontroles iespējamā iedarbība ar šo nekonvencionālo nesēju.

1.3.2.3. Dzīvnieku skaits, devu līmeņi un nesēja izvēle

Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus plus negatīva kontroles grupa, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un pēc vajadzības pozitīva kontroles grupa. Gadījumos, kad jāsavāc atsevišķo dzīvnieku dati, izmanto vismaz piecus dzīvniekus uz devas grupu. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz norādē (1) sniegtajiem ieteikumiem. Devas izraugās no koncentrāciju rindas 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % utt. Izvēloties trīs secīgas koncentrācijas, jāņem vērā esošie akūtās toksicitātes un ādas kairinājuma dati, ja tie ir pieejami, tā lai augstākajai koncentrācijai būtu maksimālā iedarbība, tomēr izvairoties no sistēmiskas toksicitātes un pārmērīga vietēja ādas kairinājuma (2), (11).

Nesējs jāizraugās, pamatojoties uz iespējami lielākām testa koncentrācijām un šķīdību, veidojot testējamās vielas pielietošanai piemērotu šķīdumu/suspensiju. Priekšrokas secībā ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (2), (10), bet var izmantot citus, ja ir sniegti pietiekami zinātniskie motīvi. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kurā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek. Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni.

1.3.3. Testa procedūra

1.3.3.1. Eksperimenta grafiks

Eksperimenta grafiks ir šāds.

1.diena

Individuāli identificē un reģistrē katra dzīvnieka svaru. Katras auss aizmugures virsmai uzliek 25 μl attiecigās testējamās vielas atšķaidījuma, ar vienu nesēju vai, pielietojot pozitīvo kontroli (attiecīgā gadījumā).

2.un 3. diena

Atkārto 1. dienā izdarīto uzlikšanas procedūru.

4.un 5. diena

Apstrāde nenotiek.

6.diena

Reģistrē katra dzīvnieka svaru. Visām testa un kontroles pelēm astes vēnā injicē 250 μl fosfāta bufera fizioloģiskā šķīduma (PBS), kas satur 20 μCi (7,4e + 8 Bq) 3H–metiltimidīna. Alternatīvi visām pelēm astes vēnā injicē 250 μl PBS, kas satur 2 μCi (7,4e + 7 Bq) 125I–joddeoksiuridīna un 10–5 Μ fluordeoksiuridīna.

Pēc piecām stundām visus dzīvniekus nogalina. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus un katrai eksperimenta grupai kopā ievieto PBS (apvienotās apstrādes grupas pieeja); alternatīvi atsevišķo dzīvnieku limfmezglu pārus var izgriezt un ievietot PBS katram dzīvniekam (individuālo dzīvnieku pieeja). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu sk. I pielikuma literatūras saraksts (10) .

1.3.3.2. Šūnu suspensiju sagatavošana

Limfmezglu šūnu (LNC) atsevišķu šūnu suspensiju no apvienotās apstrādes grupas vai arī no atsevišķiem dzīvniekiem pagatavo, saudzīgi mehāniski sadalot caur nerūsējošā tērauda sietu ar 200 μm acu izmēru. Limfmezglu šūnas divreiz mazgā ar PBS pārākumu un izgulsnē ar 5 % trihloretiķskābi (TCA) 4 °C temperatūrā 18 stundu laikā 2. Plāksnītes vai nu vēlreiz suspendē 1 ml TCA un pārnes scintilācijas stobriņos, kas satur 10 ml 3H skaitīšanas scintilācijas šķidruma, vai tieši pārnes gamma skaitīšanas caurulītēs 125I skaitīšanai.

1.3.3.3. Šūnu savairošanās noteikšana (inkorporētā radioaktivitāte)

3H–metiltimidīna inkorporēšanos mēra ar β–scintilāciju skaitīšanu kā sadalīšanās skaitu minūtē (dpm). 125I–joddeoksiuridīna inkorporēšanos mēra ar 125I skaitīšanu un arī izsaka kā dpm. Atkarībā no izmantotās pieejas inkorporēšanos izsaka kā dpm/apstrādes grupa (apvienotā pieeja) vai dpm/dzīvnieks (individuālā pieeja).

1.3.3.4. Novērojumi

1.3.3.4.1. Klīniskie novērojumi

Dzīvnieki reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu pielietošanas vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālu reģistrēšanu.

1.3.3.4.2. Ķermeņa svars

Kā norādīts 1.3.3.1. punktā, atsevišķo dzīvnieku ķermeņa svars ir jānosaka testa sākumā un dzīvniekus plānoti nokaujot.

1.3.4. Rezultātu aprēķins

Rezultātus izsaka kā stimulācijas indeksu (SI). Izmantojot apvienoto pieeju, SI iegūst, dalot katras apstrādes grupas apvienoto radioaktīvo inkorporāciju ar apvienotās nesēja kontroles grupas inkorporāciju; tas uzrāda vidējo SI. Izmantojot individuālo pieeju, SI atvasina, dalot dpm/dzīvnieks katrā testējamās vielas grupā un pozitīvās kontroles grupā ar vidējo dpm/dzīvnieks šķīdinātāja/nesēja kontroles grupā. Vidējais SI ar nesēju apstrādātai kontroles grupai tad ir 1.

Izmantojot SI aprēķināšanai individuālo pieeju, var veikt datu statistisko analīzi. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kādēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Ar atbilstošu datu interpretēšanas metodi novērtē visus apstrādāto dzīvnieku un nesēja kontroles dzīvnieku individuālos datus un no tiem atvasina vislabāk atbilstošo atbildes reakciju uz devu līkni, ņemot vērā ticamības robežas (8), (12), (13). Tomēr pētniekam jābūt modram attiecībā uz iespējamām atsevišķu grupas dzīvnieku "ārpusē esošām" atbildes reakcijām, kādēļ jāizmanto alternatīvs atbildes reakcijas mērs (piem., centrālais, nevis vidējais) vai ārpusē esošā likvidēšana.

Lēmumu pieņemšanas process attiecībā uz pozitīvu atbildes reakciju iekļauj stimulācijas indeksu ≥ 3 kopā ar devas–atbildes reakcijas apsvērumiem un attiecīgā gadījumā statistisko nozīmīgumu (3), (6), (8), (12), (14).

Noskaidrojot iegūtos rezultātus, jāņem vērā testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp, vai tai ir strukturālas sakarības ar zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu un redzamās atbildes reakcijas uz devu veids. Šie un citi apsvērumi turpmāk iztirzāti sīkāk (7).

2. IEGŪTIE DATI

Dati ir jāapkopo tabulā, parādot vidējās un individuālās dpm vērtības un stimulēšanas indeksus katrai devas grupai (iekļaujot nesēja kontroles grupu).

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jābūt iekļautai šādai informācijai.

Testējamā viela:

- identifikācijas dati (piem., CAS numurs, ja tas pieejams; avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs);

- fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piem., gaistamība, stabilitāte, šķīdība);

- maisījuma gadījumā sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums.

Nesējs:

- identifikācijas dati [tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums]

- nesēja izvēles pamatojums.

Testa dzīvnieki:

- izmantotā peļu līnija;

- dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms;

- izcelsme, turēšanas apstākļi, barība utt;

- dzīvnieku skaits, vecums un dzimums.

Testa apstākļi:

- sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu;

- devu izvēles pamatojums, iekļaujot rezultātus diapazona izvēles pētījumam, ja tas veikts; izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās vielas kopējais daudzums;

- sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi).

Ticamības pārbaude:

- pēdējās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par izmantoto vielu, koncentrāciju un nesēju;

- vienlaicīgi un/vai agrāki pozitīvās un negatīvās testēšanas laboratorijas kontroles dati.

Rezultāti:

- dzīvnieku individuālais svars dozēšanas sākumā un, veicot plānoto nogalināšanu;

- vidējās (apvienotā pieeja) un individuālās (individuālā pieeja) dpm vērtības, kā arī vērtību diapazons abām pieejām un katras devas grupas stimulācijas rādītāji (iekļaujot nesēja kontroles grupu);

- attiecīgā gadījumā statistiskā analīze;

- toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam.

Rezultātu apspriešana:

- īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un attiecīgā gadījumā statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165–169.

(2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13–31.

(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563–79.

(4) Testa metode B6.

(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999–1002.

(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay– A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985–997.

(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327–33.

(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49–59.

(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281–4.

(10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99–4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).

(11) Testa metode B4.

(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, PA. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63–67.

(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EK3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261–266.

(14) Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344–48.

B.43. ŽURKU NEIROTOKSICITĀTES PĒTĪJUMS

1. METODE

Šī metode ir līdzvērtīga ESAO 424. (1997) vadlīnijā noteiktajai metodei.

Šī testa metode ir paredzēta, lai iegūtu informāciju, kas nepieciešama ķīmisko vielu potenciālās neirotoksicitātes apstiprināšanai vai turpmākai raksturošanai pieaugušos dzīvniekos. To var apvienot ar esošajām atkārtotas devas toksicitātes pētījumu testu metodēm vai veikt kā atsevišķu pētījumu. Ir ieteicams iepazīties ar ESAO Pamatnostādnēm par neirotoksicitātes testēšanas stratēģijām un metodēm (OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods) (1), kas palīdzēs veikt pētījumus, kuru pamatā ir šī testa metode. Tas ir īpaši svarīgi, apsverot pārlabojumus novērošanā un testa procedūrās, kas ieteiktas šīs metodes parastajai izmantošanai. Pamatnostādnes ir sagatavotas, lai atvieglotu citu testa procedūru izvēli izmantošanai konkrētos apstākļos. Attīstības neirotoksicitātes novērtēšana nav šīs metodes temats.

1.1. IEVADS

Pārbaudot un novērtējot ķīmisko vielu toksiskās īpašības, ir svarīgi ņemt vērā neirotoksiskās iedarbības potenciālu. Jau atkārtotās devas sistēmiskās toksicitātes testa metode iekļauj novērojumus potenciālās neirotoksicitātes skrīninga veikšanai. Šo testa metodi var izmantot pētījuma veikšanai, lai iegūtu vairāk informācijas par atkārtotās devas sistēmiskās toksicitātes pētījumos novēroto neirotoksisko iedarbību vai to apstiprinātu. Tomēr apsvērumi par dažu klašu ķīmisko vielu potenciālo neirotoksicitāti var vedināt uz domām, ka tās var atbilstošāk novērtēt, izmantojot šo metodi, bez potenciālās neirotoksicitātes iepriekšējām norādēm no atkārtotās devas sistēmiskās toksicitātes pētījumiem. Piemēram, šādos apsvērumos jāiekļauj:

neiroloģisko pazīmju vai neiropatoloģisko bojājumu novērojumus toksicitātes pētījumos, kas nav atkārtotās devas sistēmiskās toksicitātes pētījumi, vai

struktūras radniecību vai citu informāciju, kas tās saista ar zināmām neirotoksiskām vielām.

Turklāt var būt citi gadījumi, kad ir lietderīgi izmantot šo testa metodi; sīkākus datus sk. (1).

Šī metode ir izveidota tā, lai to varētu pielāgot konkrētu vajadzību apmierināšanai, lai apstiprinātu ķīmiskās vielas konkrētu histopatoloģisko un izturēšanās neirotoksicitāti, kā arī sniegtu neirotoksisko atbildes reakciju raksturojumu un kvantitatīvu novērtējumu.

Agrāk neirotoksicitāti pielīdzināja neiropātijai, kas iekļauj neiropatoloģiskos bojājumus vai neiroloģiskas disfunkcijas – krampji, paralīze vai drebēšana. Lai gan neiropātija ir svarīga neirotoksicitātes izpausme, tagad ir skaidrs, ka ir daudzas citas nervu sistēmas toksicitātes pazīmes (piem., kustību koordinācijas zudums, jutības deficīts, mācīšanās un atmiņas disfunkcijas), kas var neatspoguļoties neiropātijas vai citu veidu pētījumos.

Šī neirotoksicitātes testa metode ir izstrādāta, lai konstatētu lielākās neiroizturēšanās un neiropatoloģiskās iedarbības pieaugušiem grauzējiem. Kaut arī izturēšanās, pat nepastāvot morfoloģiskām izmaiņām, var atspoguļot blakusparādības uz organismu, ne visas izturēšanās izmaiņas ir specifiskas nervu sistēmai. Tādēļ novērotās izmaiņas ir jānovērtē saistībā ar korelatīviem histopatoloģijas, hematoloģijas vai bioķīmijas datiem, kā arī ar citu veidu sistēmiskās toksicitātes datiem. Testēšana, kas šajā metodē vajadzīga, lai nodrošinātu neirotoksisko atbildes reakciju raksturojumu un kvantitatīvo izvērtējumu, iekļauj īpašas histopatoloģiskas un izturēšanās procedūras, ko turpmāk var papildināt ar elektrofizioloģiskiem vai bioķīmiskiem pētījumiem (1), (2), (3), (4).

Neirotoksiskās vielas nervu sistēmā var iedarboties uz vairākiem mērķiem un atbilstoši dažādiem mehānismiem. Tā kā neviena atsevišķa testu kopa nevar rūpīgi novērtēt visu vielu neirotoksisko potenciālu, var būt nepieciešams izmantot citus in vitro un in vivo testus, kas specifiski novērotajam vai sagaidāmajam neirotoksicitātes veidam.

Šo testa metodi var izmantot arī saistībā ar norādījumu kopu, kas izklāstīta ESAO Pamatnostādnēs par neirotoksicitātes testēšanas stratēģijām un metodēm (1), lai plānotu pētījumus, kas paredzēti, lai turpmāk raksturotu vai palielinātu atbildes reakcijas uz devu kvantitatīvās novērtēšanas jutību labākai nenovērotas nelabvēlīgas ietekmes līmeņa noteikšanai vai ķīmiskās vielas zināmās vai paredzamās bīstamības pamatošanai. Piemēram, var plānot pētījumus neirotoksisko mehānismu identificēšanai un novērtēšanai vai datu papildināšanai, kas jau pieejami no neiroizturēšanās un neiropatoloģisko pamatnovērojumu procedūru izmantošanas. Tādos pētījumos nav jākopē dati, kas iegūti, izmantojot šajā metodē ieteiktās standartprocedūras, ja tādi dati jau ir pieejami un netiek uzskatīti par nepieciešamiem pētījuma rezultātu interpretācijai.

Šis neirotoksicitātes pētījums, izmantots atsevišķi vai apvienojumā, nodrošina informāciju, kas var:

identificēt, vai testējamā ķīmiskā viela ir neatgriezeniski vai atgriezeniski iedarbojusies uz nervu sistēmu;

dot ieguldījumu ar ķīmiskās vielas iedarbību saistīto nervu sistēmas izmaiņu raksturošanā un pamatā esošā mehānisma izpratnē;

noteikt atbildes reakcijas sakarību ar devu un laiku, lai novērtētu nenovērotās nelavvēlīgas ietekmes līmeni (ko var izmantot ķīmiskās vielas drošības kritēriju noteikšanai).

Šajā testa metodē izmanto perorālo testējamās vielas ievadīšanu. Var būt piemērotāki citi ievadīšanas veidi (piem., caur ādu vai ieelpojot), un var būt vajadzīga ieteikto procedūru pārveidošana. Apsvērumi par ievadīšanas veida izvēli ir atkarīgi no iedarbības veida uz cilvēku un pieejamās toksikoloģiskās vai kinētiskās informācijas.

1.2. DEFINĪCIJAS

Kaitīgā iedarbība – tādas ar vielas ievadīšanu saistītas izmaiņas attiecībā pret bāzes līniju, kuras samazina organisma spēju izdzīvot, vairoties vai pielāgoties videi.

Deva – ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka kā svaru (g/mg) vai kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieka svara vienību (piem., mg/kg), vai kā nemainīgu koncentrāciju barībā (milj. daļas).

Dozēšana – vispārīgs termins, kas iekļauj devu, tās biežumu un ievadīšanas ilgumu.

Neirotoksicitāte – nervu sistēmas struktūras vai funkciju nevēlamas izmaiņas, ko rada ķīmiska, bioloģiska vai fizikāla aģenta iedarbība.

Neirotoksiska viela – ķīmisks, bioloģisks vai fizikāls aģents, kuram ir neirotoksicitātes izraisīšanas spēja.

NOAEL ir saīsinājums no ″no observed adverse effect level″ (nenovērojamas nelabvēlīgas ietekmes līmenis), un tas ir lielākais devas līmenis, pie kura nav novērojami ar vielas ievadīšanu saistīti nevēlami rezultāti.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS

Testējamo vielu ievada orāli devu diapazonā vairākām laboratorijas grauzēju grupām. Parasti ir vajadzīgas atkārtotās devas, un dozēšanas režīms var būt 28 dienas, subhronisks (90 dienas) vai hronisks (1 gads vai ilgāk). Šajā testa metodē izklāstītās procedūras var izmantot arī akūtās neirotoksicitātes pētījumā. Dzīvniekus testē, lai varētu konstatēt vai raksturot izturēšanos un/vai neiroloģiskās anomālijas. Katrā novērošanas laika posmā vērtē izturēšanās veidus, ko varētu ietekmēt neirotoksiskās vielas. Testa beigās katra dzimuma dzīvnieku apakškopai no katras grupas izdara perfūziju in situ, kā arī sagatavo un apskata galvas un muguras smadzeņu un perifēro nervu griezumus.

Ja pētījumu veic kā atsevišķu pētījumu neirotoksicitātes skrīninga izdarīšanai vai neirotoksisko iedarbību raksturošanai, katras grupas dzīvniekus, ko neizmanto perfūzijai un vēlākai histopatoloģijai (sk. 1. tabulu), var izmantot specifiskām neiroizturēšanās, neiropatoloģiskām, neiroķīmiskām vai elektrofizioloģiskām procedūrām, kuras var papildināt datus, kas iegūti no šai metodei vajadzīgajiem standarta izmeklējumiem (1). Minētās papildu procedūras var būt īpaši noderīgas, ja empīriskie novērojumi vai sagaidāmās iedarbības norāda uz ķīmiskās vielas neirotoksicitātes konkrētu veidu vai mērķi. Alternatīvi, atlikušos dzīvniekus var izmantot tādiem novērtējumiem, kas vajadzīgi atkārtotās devas toksicitātes testu metodēm pētījumos ar grauzējiem.

Ja šīs testa metodes procedūras apvieno ar citu testu metožu procedūrām, ir vajadzīgs pietiekams dzīvnieku skaits, lai izpildītu novērojumu prasības abiem pētījumiem.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle

Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, kaut arī, sniedzot pamatojumu, var izmantot citas grauzēju sugas. Ir jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Dozēšana parasti jāuzsāk iespējami drīz pēc atšķiršanas no mātes, vēlams, ne vēlāk kā sešu nedēļu veciem dzīvniekiem un katrā ziņā pirms dzīvnieki ir deviņas nedēļas veci. Tomēr, ja šo pētījumu apvieno ar citiem pētījumiem, šai vecuma prasībai var būt vajadzīga pielāgošana. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām, un tās nedrīkstētu pārsniegt ± 20 % no katra dzimuma dzīvnieku vidējā svara. Ja atkārtotās devas īslaicīgu pētījumu izdara kā ilgtermiņa pētījuma iepriekšēju pētījumu, ir ieteicams abos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus.

1.4.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi

Eksperimenta dzīvnieku telpas temperatūrai jābūt 22 °C (± 3 °C). Kaut arī relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, vēlams, nav jāpārsniedz 70 %, izņemot telpu tīrīšanas laiku, mērķim jābūt 50 – 60 %. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Skaļš, neregulārs troksnis iespējami jāsamazina. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Barības izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testējamās vielas piejaukšanu, ja vielu ievada ar šo metodi. Dzīvniekus var turēt atsevišķi vai būros nelielās tā paša dzimuma dzīvnieku grupās.

1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana

Veselus, jaunus dzīvniekus pēc nejaušās izvēles principa sadala kontroles un vielas saņemšanas grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Dzīvniekiem piešķir unikālu identifikāciju, un līdz izmēģinājumu sākumam vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.

1.4.4. Ievadīšanas veids un devu sagatavošana

Šajā testa metodē izmanto perorālo testējamās vielas ievadīšanu. Perorālā ievadīšana var notikt ar mākslīgo barošanu, barībā, dzeramajā ūdenī vai ar kapsulām. Var izmantot citus ievadīšanas veidus (piem., caur ādu vai ieelpojot), bet var būt vajadzīga ieteikto procedūru pārveidošana. Apsvērumi par ievadīšanas veida izvēli ir atkarīgi no iedarbības rakstura uz cilvēku un pieejamās toksikoloģiskās vai kinētiskās informācijas. Ievadīšanas veida izvēles motīvi, kā arī izrietošie šīs testa metodes procedūru pārlabojumi ir jānorāda.

Vajadzības gadījumā testējamo vielu izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Ir ieteicams vispirms apsvērt ūdens šķīduma/suspensijas lietošanu, pēc tam apsvērt eļļas (piem., kukurūzas eļļas) šķīduma/suspensijas lietošanu un pēc tam iespējamu šķīdumu/suspensiju citā nesējā. Nesēja toksiskajām īpašībām jābūt zināmām. Turklāt jāņem vērā šādas nesēja īpašības – nesēja iedarbība uz testējamās vielas uzsūkšanos, sadalījumu, metabolismu vai aizturi, kas var mainīt testējamās vielas toksiskās īpašības, un barības un ūdens patēriņa iedarbību uz dzīvnieku barojuma stāvokli.

1.5. PROCEDŪRAS

1.5.1. Dzīvnieku skaits un dzimums

Ja pētījumu veic kā atsevišķu pētījumu, sīki izstrādātu klīnisko un funkcionālo novērojumu izvērtēšanai katrā devas un kontroles grupā ir jāizmanto vismaz 20 dzīvnieki (10 tēviņi un 10 mātītes). Vismaz pieciem tēviņiem un piecām mātītēm, kas izraudzīti no minētajiem 10 tēviņiem un 10 mātītēm, ir jāizdara perfūzija in situ, un tie jāizmanto sīki izstrādātai neirohistopatoloģijai pētījuma beigās. Ja konkrētā devas grupā attiecībā uz neirotoksiskajām iedarbībām tiek novērots tikai ierobežots dzīvnieku skaits, jāapsver šo dzīvnieku iekļaušana perfūzijas izdarīšanai izraudzītajos dzīvniekos. Ja pētījumu veic apvienojumā ar atkārtotās devas toksicitātes pētījumu, ir jāizmanto pietiekams dzīvnieku skaits, lai atbilstu abu pētījumu mērķiem. Minimālais dzīvnieku skaits grupā dažādiem pētījumu apvienojumiem ir norādīts 1. tabulā. Ja plāno starpposmu nogalināšanas vai atveseļošanās grupas, lai novērotu toksiskās iedarbības atgriezeniskumu, noturīgumu vai aizkavētu parādīšanos pēc vielas saņemšanas, vai ja ir apsvērtas papildu novērošanas, tad dzīvnieku skaits ir jāpalielina, lai nodrošinātu, ka ir pieejams novērojumiem un histopatoloģijai vajadzīgais dzīvnieku skaits.

1.5.2. Vielas saņemšanas un kontroles grupa

Parasti jāizmanto vismaz trīs devu grupas un kontroles grupa, bet, ja no citu datu izvērtēšanas nav sagaidāma iedarbība pie atkārtotās devas 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā, tad var izdarīt pieļaujamības testu. Ja piemēroti dati nav pieejami, var izdarīt diapazona atrašanas pētījumu, kas palīdzētu noteikt izmantojamās devas. Ar kontroles dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem, tie tikai nesaņem testējamo vielu. Ja testējamo vielu ievada kopā ar nesēju, kontroles dzīvnieki saņem maksimālo izmantojamo nesēja daudzumu.

1.5.3. Ticamības pārbaude

Pētījuma veicējai laboratorijai ir jāuzrāda dati, kas parāda tās spēju veikt pētījumu un izmantojamo procedūru jutību. Tādiem datiem jāsniedz pierādījumi par spēju dažādos novērošanai ieteiktos beigu punktos attiecīgi konstatēt un kvantitatīvi noteikt izmaiņas, tādas kā veģetatīvās pazīmes, sensoro reaktivitāti, ekstremitāšu satvēriena stiprumu un kustību aktivitāti. Informācija par ķīmiskajām vielām, kas izraisa dažādu veidu neirotoksiskās atbildes reakcijas un ir izmantojamas kā pozitīvās kontroles vielas, ir atrodama 2. – 9. norādē. Var izmantot iepriekšējos datus, ja eksperimenta procedūru būtiskie aspekti paliek tie paši. Ir ieteicams regulāri atjaunināt vēsturiskos datus. Ja pētījuma veicēja laboratorija ir mainījusi kādu testa vai procedūru nozīmīgu sastāvdaļu, ir jāiegūst jauni dati, kas parāda procedūru saglabātu jutību.

1.5.4. Devu izvēle

Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā iepriekš novērotos toksicitātes un kinētikas datus, kas ir pieejami par testējamo vielu vai ar to saistītiem materiāliem. Augstākais devas līmenis ir jāizvēlas ar mērķi izraisīt neirotoksiskas iedarbības vai skaidras sistēmiskas toksiskas iedarbības. Pēc tam jāizvēlas devu līmeņi lejupejošā secībā, lai parādītu visas ar devām saistītās atbildes reakcijas un lai zemākajā devas līmenī nenovēro nelabvēlīgas ietekmes līmeni (NOAEL). Principā devu līmeņi ir jāizvēlas tā, lai primārā toksiskā iedarbība uz nervu sistēmu būtu atšķirama no iedarbības, kas saistīta ar sistēmisko toksicitāti. Bieži optimāli ir divi līdz trīs starplaiki, un ceturtās testa grupas pievienošana bieži ir vēlamāka par ļoti lielu starplaiku (piem., ar koeficientu, lielāku par 10) izmantošanu starp dozēšanām. Ja ir pamatots iedarbības uz cilvēku vērtējums, arī tas jāņem vērā.

1.5.5. Pieļaujamības tests

Ja novērojamu neirotoksisku iedarbību neizraisa tests ar devas līmeni vismaz 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā, izmantojot aprakstītās procedūras, un ja toksicitāte nav sagaidāma, pamatojoties uz datiem par struktūras ziņā saistītām vielām, tad pētījumu ar trim devu līmeņiem var uzskatīt par nevajadzīgu. Paredzamā iedarbība uz cilvēku var norādīt, ka pieļaujamības testā jālieto lielāka perorālā deva. Citiem ievadīšanas veidiem, tādiem kā ieelpošana vai ievadīšana caur ādu, maksimālo sasniedzamo iedarbības līmeni bieži var diktēt testējamās vielas fizikāli ķīmiskās īpašības. Perorāla akūtā pētījuma veikšanai pieļaujamības testa devai jābūt vismaz 2000 mg/kg.

1.5.6. Devu ievadīšana

Dzīvniekiem testējamo vielu dozē katru dienu septiņas dienas nedēļā vismaz 28 dienu laika posmā; piecu dienu dozēšanas režīms vai īsāks iedarbības laika posms ir jāpamato. Ja testējamo vielu dzīvniekiem ievada ar mākslīgo barošanu, tas jāizdara vienā devā, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa svara. Tomēr ūdens šķīdumu gadījumā var apsvērt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara izmantošanu. Izņemot kairinošas vai kodīgas vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, testiem lietotā tilpuma mainības iedarbība ir jāsamazina līdz minimumam, koriģējot koncentrāciju tā, lai pie visām devām tilpums būtu vienāds.

Vielām, ko ievada ar barību vai dzeramo ūdeni, ir svarīgi nodrošināt, lai iesaistītie testējamās vielas daudzumi netraucētu normālu barības vai ūdens līdzsvaru. Ja testējamo vielu ievada ar barību, var izmantot nemainīgu koncentrāciju barībā (milj. daļas) vai nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru; jebkura atkāpe no šīs shēmas ir jāpamato. Ja vielu ievada, mākslīgi barojot, deva katru dienu jāievada vienā laikā un pēc vajadzības jākoriģē, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Ja atkārtotās devas pētījumu izmanto kā ilgtermiņa pētījuma iepriekšēju pētījumu, abos pētījumos jāizmanto līdzīga veida barība. Akūtos pētījumos, ja nav iespējams uzreiz ievadīt visu devu, to sadala un ievada pa daļām laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas.

1.6. NOVĒROŠANA

1.6.1. Novērošanas un testu biežums

Atkārtotās devas pētījumos novērošanas laika posmam jāietver dozēšanas laika posms. Akūtajos pētījumos ir jāievēro 14 dienu laika posms pēc vielas ievadīšanas. Bez vielas iedarbības turēto satelītgrupu dzīvnieku novērošanā arī jāiekļauj šis laika posms pēc vielas ievadīšanas.

Novērojumi jāizdara pietiekami bieži, lai iespējami palielinātu izturēšanās un/vai neiroloģisko anomāliju konstatēšanas iespēju. Novērojumi, vēlams, jāveic katru dienu vienos un tajos pašos laikos, ņemot vērā sagaidāmo iedarbību maksimuma periodu pēc dozēšanas. Klīnisko novērojumu un funkcionālo testu biežums ir apkopots 2. tabulā. Ja iepriekšējos pētījumos iegūtie kinētiskie vai citi dati norāda uz vajadzību pēc novērojumiem, testiem vai pēcnovērojumu periodiem izmantot atšķirīgus laika punktus, ir jāpieņem alternatīvs grafiks, lai iegūtu maksimālo informāciju. Ir jāsniedz grafika izmaiņu motīvi.

1.6.1.1. Vispārējā veselības stāvokļa novērojumi un mirstība/saslimstība

Visi dzīvnieki ir rūpīgi jānovēro vismaz vienreiz dienā attiecībā uz to veselības stāvokli, kā arī vismaz divreiz dienā attiecībā uz saslimstību un mirstību.

1.6.1.2. Sīki izstrādāti klīniskie novērojumi

Sīki izstrādāti klīniskie novērojumi jāveic attiecībā uz visiem šim nolūkam izraudzītajiem dzīvniekiem (sk. 1. tabulu) vienreiz pirms pirmās iedarbības (lai varētu izdarīt individuāla pētījuma objekta stāvokļu salīdzinājumus) un pēc tam dažādos starplaikos atkarībā no pētījuma ilguma (sk. 2. tabulu). Atveseļošanās perioda beigās jāveic sīki izstrādāti atveseļošanās satelītgrupas klīniskie novērojumi. Sīki klīniskie novērojumi jāveic ārpus turēšanas būra standartnožogojumā. Tie rūpīgi jāreģistrē, izmantojot punktu sistēmas, kas iekļauj katra novērojumu mērījuma kritērijus vai punktu skalas. Testēšanas laboratorijai skaidri jānosaka kritēriji vai skalas. Ir jācenšas nodrošināt, lai izmaiņas testa apstākļos būtu minimālas (nebūtu sistemātiski saistītas ar vielas ievadīšanu) un lai novērošanu izdarītu apmācīti novērotāji, kas nav informēti par vielas ievadīšanu.

Novērojumus ieteicams izdarīt strukturētā veidā, katram dzīvniekam katrā novērošanas laikā sistemātiski pielietojot skaidri noteiktus kritērijus (iekļaujot "parastā diapazona" definīciju). "Parastais diapazons" ir atbilstoši jādokumentē. Visas novērotās pazīmes ir jāreģistrē. Kad vien tas īstenojams, ir jāreģistrē arī novēroto pazīmju lielums. Klīniskajos novērojumos jāiekļauj izmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādās, sekrēcijas un izdalījumi un veģetatīvā aktivitāte (piem., asarošana, piloerekcija, acs zīlītes lielums, neparasts elpošanas raksturs un/vai elpošana caur muti, neparastas urinācijas vai defekācijas pazīmes un izmainītas krāsas urīns), bet nav jāaprobežojas ar tiem.

Jāatzīmē arī neparastas atbildes reakcijas attiecībā uz ķermeņa stāvokli, aktivitātes līmeni (piem., samazināta vai pastiprināta standartiežogojuma pētīšana) un kustību koordināciju. Jāreģistrē izmaiņas gaitā (piem., gāzelēšanās, ataksija), stājā (piem., sakumpusi mugura) un reaģēšanā uz manipulācijām, novietošanu vai citiem vides stimuliem, kā arī klonisko vai tonisko kustību esamība, krampji vai drebēšana, stereotipi (piem., pārmērīga kopšanās, neparastas galvas kustības, atkārtota griešanās) vai dīvaina izturēšanās (piem., košana vai pārmērīga laizīšana, pašsakropļošanās, staigāšana atpakaļvirzienā, skaņu izdošana) vai agresija.

1.6.1.3. Funkcionālie testi

Tāpat kā sīki klīniskie novērojumi arī funkcionālie testi ir jāizdara vienreiz pirms iedarbības un bieži pēc tās visiem dzīvniekiem, kas šim nolūkam izraudzīti (sk. 1. tabulu). Funkcionālās testēšanas biežums arī ir atkarīgs no pētījuma ilguma (sk. 2. tabulu). Papildus novērošanas periodiem, kas norādīti 2. tabulā, funkcionālie atveseļošanās satelītgrupu novērojumi arī jāveic iespējami tuvu nogalināšanas laikam. Funkcionālajiem testiem jāiekļauj sensorā reaktivitāte uz dažādu modalitāšu stimuliem (piem., dzirdes, redzes un proprioceptīvajiem stimuliem (5), (6), (7)), ekstremitāšu tvērējstipruma vērtējums (8) un kustību aktivitātes vērtējums 9. Kustību aktivitāte jāmēra ar automatizētu ierīci, kas var konstatēt aktivitātes palielinājumus un samazinājumus. Ja izmanto citu noteiktu sistēmu, tai jābūt kvantitatīvai un ir jāparāda tās jutība un ticamība. Katra ierīce ir jātestē, lai nodrošinātu tās ticamību laika gaitā un atbilstību starp ierīcēm. Sīkāki dati par procedūrām, kuras var izmantot, ir sniegti attiecīgajā literatūras sarakstā. Ja nav datu (piem., struktūras–aktivitātes dati, epidemioloģiskie dati, citi toksikoloģiskie pētījumi), kas norādītu uz potenciālām neirotoksiskām iedarbībām, ir jāapsver specializētāku sensorās un kustību funkcijas vai mācīšanās un atmiņas testu iekļaušana, lai iespējamās iedarbības izpētītu sīkāk. Vairāk informācijas par specializētiem testiem un to izmantošanu ir sniegts literatūras sarakstā (1).

Izņēmuma gadījumā dzīvniekiem, kas uzrāda toksicitātes pazīmes tādā mērā, kas būtiski traucē funkcionālo testu, attiecīgo testu var neizdarīt. Dzīvnieku izslēgšana no funkcionālā testa ir jāpamato.

1.6.2. Ķermeņa svars un barības/ūdens patēriņš

Līdz 90 dienu ilgos pētījumos dzīvnieki jāsver vismaz reizi nedēļā, un vismaz reizi nedēļā ir jāmēra barības patēriņš (ja testējamo vielu ievada ar ūdeni, jāmēra ūdens patēriņš). Ilgtermiņa pētījumos visi dzīvnieki pirmo 13 nedēļu laikā ir jāsver vismaz reizi nedēļā un pēc tam vismaz vienreiz katrās četrās nedēļās. Izmēģinājuma pirmo 13 nedēļu laikā barības patēriņš (ūdens patēriņš, ja testējamo vielu ievada ar dzeramo ūdeni) jāmēra vismaz katru nedēļu un pēc tam apmēram ik pēc trim mēnešiem, ja vien veselības stāvokļa vai ķermeņa svara izmaiņu dēļ nav jārīkojas citādi.

1.6.3. Oftalmoloģija

Pētījumos, kas ilgāki par 28 dienām, pirms testējamās vielas ievadīšanas un pētījuma beigās jāveic, ja ne visu dzīvnieku, tad vismaz to, kas saņēmuši lielāko devu, un kontroles dzīvnieku oftalmoloģiskā izmeklēšana, izmantojot oftalmoskopu vai piemērotu līdzvērtīgu aparātu. Ja konstatē izmaiņas acīs vai ja klīnisko pazīmju dēļ ir vajadzīgs, jāizmeklē visi dzīvnieki. Ilgtermiņa pētījumos arī oftalmoloģiskā izmeklēšana jāveic ar 13 nedēļu starplaikiem. Oftalmoloģiskā izmeklēšana nav jāizdara, ja attiecīgie dati jau ir pieejami no citiem līdzīga ilguma un līdzīgu devu līmeņu pētījumiem.

1.6.4. Hematoloģija un klīniskā bioķīmija

Ja neirotoksicitātes pētījumu veic apvienojumā ar atkārtotās devas sistēmiskās toksicitātes pētījumu, hematoloģiskie izmeklējumi un klīniskās bioķīmijas noteikšanas ir jāizdara, kā norādīts sistēmiskās toksicitātes pētījuma attiecīgajā metodē. Paraugu vākšana ir jāizdara tā, lai iespējami samazinātu potenciālo iedarbību uz neiroizturēšanos.

1.6.5. Histopatoloģija

Neiropatoloģiskā apskate ir jāplāno, lai papildinātu un paplašinātu pētījuma in vivo fāzes laikā izdarītos novērojumus. Audi no vismaz 5 dzīvniekiem uz dzimumu katrā grupā (sk. 1. tabulu un nākamo daļu) ir jāfiksē in situ, izmantojot vispāratzītas perfūzijas un fiksācijas metodes (sk. literatūras saraksts (3) 5. nodaļu un literatūras saraksts (4) 50. nodaļu). Jāreģistrē novērotās makroskopiskās izmaiņas. Ja pētījumu veic kā atsevišķu skrīninga pētījumu attiecībā uz neirotoksicitāti vai lai raksturotu neirotoksiskās iedarbības, atlikušos dzīvniekus var izmantot specifiskiem neiroizturēšanās (10), (11), neiropatoloģiskām (10), (11), (12), (13), neiroķīmiskām (10), (11), (14), (15) vai elektrofizioloģiskām 10, 11, 16, 17 procedūrām, kas var papildināt šeit aprakstītās procedūras un izmeklējumus, vai arī palielināt histopatoloģiski apskatīto dzīvnieku skaitu. Papildu procedūras ir īpaši noderīgas, ja empīriskie novērojumi vai sagaidāmās iedarbības norāda uz ķīmiskās vielas neirotoksicitātes konkrētu veidu vai mērķi (2), (3). Alternatīvi atlikušos dzīvniekus var izmantot arī parastai patoloģijas novērtēšanai, kā aprakstīts atkārtotās devas pētījumu metodē.

Vispārējas iekrāsošanas procedūra, piemēram, ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E), ir jāizdara visiem audu paraugiem, kas aplieti ar parafīnu, un jāizdara apskate mikroskopā. Ja ir novērotas perifērās neiropātijas pazīmes vai par tām ir aizdomas, ir jāizdara ar plastmasu pārklātu perifēro nervu paraugu izmeklēšana. Klīniskās pazīmes var rosināt izmeklēt arī citas vietas vai izmantot īpašas iekrāsošanas procedūras. Norādījumus par izmeklējamām papildu vietām var atrast (3), (4). Lai parādītu konkrētus patoloģisko izmaiņu veidus, var būt noderīgi arī atbilstoši īpaši iekrāsojumi (18).

Histoloģiski jāizmeklē reprezentatīvas centrālās un perifērās nervu sistēmas daļas (sk. literatūras sarakstu (3) 5. nodaļu un literatūras sarakstu (4) 50. nodaļu). Izmeklējamo vietu skaitā parasti jāiekļauj – priekšējās smadzenes, lielo smadzeņu centrs, iekļaujot griezumu caur hipokampu, vidējās smadzenes, smadzenītes, tilts, garenās smadzenes, acs ar acs nervu un tīkleni, muguras smadzenes kakla un muguras paresninājumos, dorsālās saknītes gangliji, dorsālās un vēdera saknes šķiedras, proksimālais sēžas nervs, proksimālais tibiālais nervs (pie ceļa) un tibiālā nerva apakšstilba muskuļa zari. Muguras smadzeņu un perifēro nervu griezumiem jāiekļauj šķērsgriezums un garengriezums. Jāpievērš uzmanība nervu sistēmas asinsvadu tīklam. Jāapskata arī skeleta muskuļa, jo īpaši apakšstilba muskuļa paraugs. Īpaša uzmanība jāpievērš vietām ar šūnu un šķiedru struktūru un īpašībām centrālajā nervu sistēmā un perifērajā nervu sistēmā, kas ir zināmas kā īpaši iedarbīgas uz neirotoksiskām vielām.

Norādījumi par neiropatoloģiskām izmaiņām, ko parasti rada toksisko vielu iedarbība, ir atrodami literatūras sarakstā (3), (4). Ir ieteicama audu paraugu pakāpeniska apskate, kurā griezumus no lielākās devas grupas vispirms salīdzina ar kontroles grupas griezumiem. Ja paraugos no šīm grupām neiropatoloģiskas izmaiņas nav novērojamas, turpmāka analīze nav vajadzīga. Ja lielākās devas grupā novērotas neiropatoloģiskas izmaiņas, potenciāli ietekmēto audu paraugi no vidējās un mazākās devas grupām ir jākodē un secīgi jāizmeklē.

Ja kvalitatīvajā izmeklēšanā ir atrasti neiropatoloģisku izmaiņu pierādījumi, jāveic otra izmeklēšana visos nervu sistēmas apvidos, kuros parādījušās izmaiņas. Griezumus no katra potenciāli cietušā apvidus visās devu grupās ir jākodē un jāizmeklē pēc nejaušās izvēles, nezinot kodu. Katra bojājuma biežums un smagums ir jāreģistrē. Pēc tam, kad visi apvidi no visām devu grupām ir novērtēti, kodu var atklāt un izdarīt statistisko analīzi, lai novērtētu devas sakarību ar atbildes reakciju. Jāapraksta katra bojājuma dažādās smaguma pakāpes.

Neiropatoloģiskie rezultāti jānovērtē izturēšanās novērojumu un mērījumu, kā arī citu datu no iepriekšējiem un vienlaicīgiem sistēmiskās toksicitātes pētījumiem kontekstā.

2. IEGŪTIE DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Jānorāda dati par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati jāapkopo tabulas veidā, katrai testa vai kontroles grupai parādot dzīvnieku skaitu testa sākumā, dzīvnieku skaitu, kas testa laikā ir nobeigušies vai humānu apsvērumu dēļ nogalināti, un katras nobeigšanās vai humānas nogalināšanas laiku, dzīvnieku skaitu, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju aprakstu, iekļaujot toksisko iedarbību sākuma laiku, ilgumu un smagumu, dzīvnieku skaitu, kam novēroti audu bojājumi, iekļaujot bojājumu veidus un smagumu.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA

Pētījuma rezultāti jāvērtē neiroizturēšanās un neiropatoloģisko iedarbību (arī neiroķīmisko vai elektrofizoloģisko iedarbību, ja ir iekļauti papildu izmeklējumi), kā arī citu novēroto kaitīgo iedarbību biežuma, smaguma un korelāciju izteiksmē. Ja iespējams, skaitliskie rezultāti jānovērtē ar piemērotu un vispārpieņemtu statistikas metodi. Statistikas metodes jāizvēlas, plānojot pētījumu.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jābūt iekļautai šādai informācijai.

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības (iekļaujot izomērismu, tīrību un fizikāli ķīmiskās īpašības);

- identifikācijas dati.

Nesējs (attiecīgā gadījumā):

- nesēja izvēles pamatojums.

Testa dzīvnieki:

- izmantotā suga/līnija;

- dzīvnieku skaits, vecums un dzimums;

- izcelsme, turēšanas apstākļi, aklimatizācija, barība, utt.;

- atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā.

Testa apstākļi:

- sīkas ziņas par testējamās vielas preparāta/barības sagatavošanu, iegūto koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti;

- ievadīto devu specifikācija, iekļaujot sīkas ziņas par ievadītā materiāla nesēju, tilpumu un fizikālo formu;

- sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu;

- izraudzīto devu līmeņu pamatojums;

- iedarbības veida un ilguma pamatojums;

- testējamās vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā vai dzeramajā ūdenī pārrēķins faktiskajā dienas devā (mg/kg ķermeņa svara dienā) attiecīgā gadījumā;

- sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti.

Novērojumu un testa procedūras:

- sīki dati par katras grupas dzīvnieku iedalīšanu perfūzijas apakšgrupās;

- sīki dati par vērtēšanas sistēmām, iekļaujot katra mērījuma kritērijus un vērtēšanas skalas sīki izstrādātos klīniskajos novērojumos;

- sīki funkcionālo testu dati par sensoro reaktivitāti uz dažādu modalitāšu stimuliem, (piem., dzirdes, redzes un proprioceptīvajiem stimuliem); par ekstremitāšu tvēriena stipruma novērtējumu; par kustību aktivitātes vērtējumu (iekļaujot sīkus aktivitātes konstatēšanas automātisko ierīču datus); citas izmantotās procedūras;

- sīki oftalmoloģisko izmeklējumu dati un attiecīgā gadījumā hematoloģiskie izmeklējumi un klīniskās bioķīmijas testi ar attiecīgām bāzes līnijas vērtībām;

- sīki dati par konkrētām neiroizturēšanās, neiropatoloģijas, neiroķīmiskām vai elektrofizioloģiskām procedūrām.

Rezultāti:

- ķermeņa svars/ķermeņa svara izmaiņas, iekļaujot ķermeņa svaru pie nogalināšanas;

- barības patēriņš un attiecīgā gadījumā ūdens patēriņš;

- dati par toksisko atbildes reakciju pa dzimumiem un devu līmeņiem, iekļaujot toksicitātes pazīmes vai mirstību;

- sīki izstrādātu klīnisko novērojumu (atgriezenisku vai neatgriezenisku) raksturs, smagums un ilgums (parādīšanās laiks un turpmākā gaita);

- visu funkcionālo testu rezultātu sīks apraksts;

- autopsijas rezultāti;

- visu neiroizturēšanās, neiropatoloģijas un neiroķīmisko vai elektrofizioloģisko rezultātu sīks apraksts, ja tie pieejami;

- uzsūkšanās un metabolisma dati, ja tie ir pieejami;

- rezultātu statistiskā apstrāde attiecīgā gadījumā.

Rezultātu izvērtējums:

- informācija par atbildes reakciju uz devu;

- citu toksisko iedarbību sakarība ar secinājumu par testējamās ķīmiskās vielas neirotoksisko potenciālu;

- nenovērojamas nelabvēlīgas ietekmes līmenis.

Secinājumi:

- vēlams ir konkrēts paziņojums par testējamās ķīmiskās vielas vispārējo neirotoksicitāti.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.

(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.

(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.

(4) Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.

(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999–1003.

(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.

(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267–283.

(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore– and Hind– limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233–236.

(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.

(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.

(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.

(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.

(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2–Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343–352.

(14) O′Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445–452.

(15) O′Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368–378.

(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, lpp. 299–335.

(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, lpp. 726–742.

(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

1. tabula

Minimālais grupā vajadzīgais dzīvnieku skaits, ja neirotoksicitātes pētījumu veic atsevišķi vai apvienojumā ar citiem pētījumiem

| NEIROTOKSICITĀTES PĒTĪJUMU VEIC KĀ – |

atsevišķu pētījumu | apvienotu pētījumu ar 28 dienu pētījumu | apvienotu pētījumu ar 90 dienu pētījumu | apvienotu pētījumu ar hroniskās toksicitātes pētījumu |

Kopējais dzīvnieku skaits grupā | 10 sievišķā un 10 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 10 sievišķā un 10 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 15 sievišķā un 15 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 25 sievišķā un 25 vīrišķā dzimuma dzīvnieki |

Dzīvnieku skaits, kas izraudzīts funkcionālajai testēšanai, iekļaujot sīki izstrādātus klīniskos novērojumus | 10 sievišķā un 10 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 10 sievišķā un 10 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 10 sievišķā un 10 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 10 sievišķā un 10 vīrišķā dzimuma dzīvnieki |

Dzīvnieku skaits, kas izraudzīts perfūzijai in situ un neirohistopatoloģijai | 5 sievišķā un 5 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 5 sievišķā un 5 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 5 sievišķā un 5 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 5 sievišķā un 5 vīrišķā dzimuma dzīvnieki |

Dzīvnieku skaits, kas izraudzīts atkārtotās devas/subhroniskās/hroniskās toksicitātes novērojumiem, hematoloģijai, klīniskajai bioķīmijai, histopatoloģijai utt., kā norādīts attiecīgajās Norādījumos | | 5 sievišķā un 5 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | 10 sievišķā [1] un 10 vīrišķā [1] dzimuma dzīvnieki | 20 sievišķā [1] un 20 vīrišķā [1] dzimuma dzīvnieki |

Papildu novērojumi attiecīgā gadījumā | 5 sievišķā un 5 vīrišķā dzimuma dzīvnieki | | | |

2. tabula

Klīnisko novērojumu un funkcionālo testu biežums

Novērojumu veids | | Pētījuma ilgums |

Akūts | 28 dienas | 90 dienas | Hronisks |

Visiem dzīvniekiem | Vispārējais veselības stāvoklis | katru dienu | katru dienu | katru dienu | katru dienu |

Mirstība/saslimstība | Divreiz dienā | Divreiz dienā | Divreiz dienā | Divreiz dienā |

Dzīvniekiem, kas izraudzīti funkcionālajiem novērojumiem | Sīki izstrādāti klīniskie novērojumi | pirms pirmās iedarbības8 stundu laikā pēc dozēšanas aplēstajā maksimālā efekta laikā7. un 14. dienā pēc dozēšanas | pirms pirmās iedarbībaspēc tam reizi nedēļā | pirms pirmās iedarbībasvienreiz iedarbības pirmās vai otrās nedēļas laikāpēc tam reizi mēnesī | pirms pirmās iedarbībasvienreiz iedarbības pirmā mēneša laikāpēc tam reizi trijos mēnešos |

Funkcionalitātes testi | pirms pirmās iedarbības8 stundu laikā pēc dozēšanas aplēstajā maksimālā efekta laikā7. un 14. dienā pēc dozēšanas | pirms pirmās iedarbībasvielas saņemšanas ceturtās nedēļas laikā iespējami tuvu iedarbības laika posma beigām | pirms pirmās iedarbībasvienreiz iedarbības pirmās vai otrās nedēļas laikāpēc tam reizi mēnesī | pirms pirmās iedarbībasvienreiz iedarbības pirmā mēneša laikāpēc tam reizi trijos mēnešos |

--------------------------------------------------

2I. PIELIKUMS

C.21. AUGSNES MIKROORGANISMI – SLĀPEKĻA TRANSFORMĀCIJAS TESTS

1. METODE

Šī testa metode ir ESAO 216. (2000) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Šī testa metode apraksta laboratorijas metodi, kas izveidota ķīmisko vielu ilgtermiņa iedarbību izpētei uz augsnes mikroorganismu slāpekļa transformācijas aktivitāti pēc vienreizējas iedarbības. Tests galvenokārt pamatojas uz Eiropas un Vidusjūras Augu aizsardzības organizācijas ieteikumiem (1). Tomēr ir ņemtas vērā arī citi norādījumi, iekļaujot Vācijas Federatīvās bioloģijas iestādes (2), ASV Vides aizsardzības aģentūras (3), Vides toksikoloģijas un ķīmijas savienības (4) un Starptautiskās standartizācijas organizācijas (5) norādījumus. ESAO seminārā par augsnes/nogulumu atlasi, kas 1995. gadā notika Beldžiratē, Itālijā (6), vienojās par šajā testā izmantojamo augšņu skaitu un tipu. Ieteikumi par augsnes paraugu vākšanu, apstrādi un glabāšanu pamatojas uz ISO Pamatnostādnēm (7) un Beldžirates semināra ieteikumiem. Pārbaudot un vērtējot testējamo vielu toksiskās īpašības, var būt jānosaka ietekmes uz augsnes mikrobu aktivitāti, piem., ja vajadzīgi dati par kultūraugu aizsardzības līdzekļu iespējamām blakusiedarbībām uz augsnes mikrofloru vai ja ir sagaidāma ķīmisko vielu, kas nav kultūraugu aizsardzības līdzekļi, iedarbība uz augsnes mikroorganismiem. Slāpekļa transformācijas testu izdara, lai noteiktu šādu ķīmisku vielu iedarbību uz augsnes mikrofloru. Ja agroķīmiskās vielas (piem., kultūraugu aizsardzības līdzekļus, mēslošanas līdzekļus, mežsaimniecības ķīmiskās vielas) pārbauda, tiek veikti slāpekļa transformācijas un oglekļa transformācijas testi. Ja pārbauda ķīmiskās vielas, kas nav agroķīmiskās vielas, pietiek ar slāpekļa transformācijas testu. Tomēr, ja EK50 vērtības šādu ķīmisko vielu slāpekļa transformācijas testā ir diapazonā, kas atrasts tirdzniecībā pieejamiem nitrifikācijas inhibitoriem (piem., nitrapirīnam), var izdarīt oglekļa transformācijas testu, lai iegūtu papildu informāciju.

Augsnes sastāv no dzīviem un nedzīviem komponentiem, kas ir sarežģītos un neviendabīgos maisījumos. Mikroorganismiem ir svarīga loma organisko vielu noārdīšanā un transformācijā auglīgās augsnēs, kurās daudzas sugas dod ieguldījumu dažādos augsnes auglības aspektos. Jebkura ilgtermiņa iejaukšanās minētajos bioķīmiskajos procesos var potenciāli iejaukties barības vielu apritē, un tas var mainīt augsnes auglību. Oglekļa un slāpekļa transformācija notiek visās auglīgās augsnēs. Kaut arī par šiem procesiem atbildīgās mikrobu kopas atšķiras starp augsnēm, transformācijas ceļi būtībā ir vieni un tie paši.

Šī aprakstītā testēšanas metode ir izveidota, lai noskaidrotu vielas ilgtermiņa kaitīgo iedarbību uz slāpekļa transformācijas procesu aerobās virsmas augsnēs. Testa metode ļauj noteikt arī vielu iedarbību uz augsnes mikrofloras veikto oglekļa transformāciju. Nitrātu veidošanās notiek pēc oglekļa–slāpekļa saišu noārdīšanas. Tātad, ja apstrādātajās un kontroles augsnēs ir konstatēti vienādi nitrātu veidošanās ātrumi, ir liela varbūtība, ka galvenie oglekļa noārdīšanās ceļi ir neskarti un funkcionāli. Testam izraudzītajam substrātam (lucernas miltu pulverim) ir labvēlīga oglekļa attiecība pret slāpekli (parasti starp 12/1 un 16/1). Tādēļ testa laikā ir samazināts oglekļa trūkums un, ja ķīmiskā viela sabojā mikrobu kopas, tās var atveseļoties 100 dienu laikā.

Testi, no kuriem ir izstrādāta šī testa metode, sākotnēji bija paredzēti vielām, kurām var noteikt augsnē nokļūstošo daudzumu. Tā tas, piemēram, ir ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem, kuru lietojuma deva praksē ir zināma. Agroķīmiskajām vielām ir pietiekami testēt divas devas, kas saistītas ar sagaidāmo vai paredzamo lietojuma devu. Agroķīmiskās vielas var testēt kā aktīvās sastāvdaļas (a.s.) vai kā preparātus. Tomēr tests nav ierobežots ar agroķīmiskajām vielām. Mainot augsnē lietojamās testējamās vielas daudzumu un datu novērtēšanas veidu, testu var izmantot arī ķīmiskajām vielām, kurām nav zināms sagaidāmais augsnē nokļūstošais daudzums. Tā var noteikt koncentrāciju rindas iedarbību uz slāpekļa transformāciju vielām, kas nav agroķīmiskās vielas. Šo testu datus izmanto devas–atbildes reakcijas līknes sagatavošanai un EKx vērtību aprēķināšanai, kur x ir definēts kā iedarbības %.

1.2. DEFINĪCIJAS

Slāpekļa transformācija – mikroorganismu veikta slāpekli saturošu organisko vielu galīgā noārdīšana amonificēšanas un nitrificēšanas procesos līdz attiecīgajam neorganiskajam galaproduktam – nitrātam.

EKX (efektīvā koncentrācija) – testējamās vielas koncentrācija augsnē, kas izraisa slāpekļa transformācijas par nitrātu kavēšanu par x procentiem.

EK50 (vidējā efektīvā koncentrācija) – testējamās vielas koncentrācija augsnē, kas izraisa slāpekļa transformācijas par nitrātu kavēšanu par 50 procentiem (50 %).

1.3. STANDARTVIELAS

Nav.

1.4. TESTA METODES BŪTĪBA

Izsijātu augsni uzlabo ar augu miltu pulveri un vai nu apstrādā ar testējamo vielu, vai atstāj neapstrādātu (kontrole). Ja testē agroķīmiskas vielas, ir ieteicamas vismaz divas testa koncentrācijas, un tās jāizvēlas saistībā ar praksē sagaidāmo augstāko koncentrāciju. Pēc 0, 7, 14 un 28 inkubācijas dienām apstrādātās un kontroles augsnes paraugus ekstrahē ar piemērotu šķīdinātāju un ekstraktos nosaka nitrāta daudzumus. Nitrātu veidošanās ātrumu apstrādātajos paraugos salīdzina ar ātrumu kontroles paraugā, un aprēķina apstrādāto paraugu procentuālās novirzes no kontroles parauga. Visus testus izdara vismaz 28 dienas. Ja 28. dienā apstrādātā un neapstrādātā parauga atšķirība ir vienāda vai lielāka par 25 %, mērījumus turpina ne vairāk kā līdz 100 dienām. Ja testē vielas, kas nav agroķīmiskās vielas, testējamās vielas koncentrāciju rindu pievieno augsnes paraugiem, un apstrādātajos paraugos un kontroles paraugā izveidojušos nitrāta daudzumus mēra pēc 28 inkubācijas dienām. Testu ar daudzkāršotām koncentrācijām rezultātus analizē, izmantojot regresijas modeli, un aprēķina EKx vērtības (t.i., EK50, EK25 un/vai EK10). Sk. definīcijas.

1.5. TESTA VALIDĀCIJA

Testa ar agroķīmiskām vielām rezultātu izvērtēšana pamatojas uz relatīvi mazām atšķirībām (t.i., vidējo vērtību ± 25 %) starp nitrāta koncentrācijām kontroles un apstrādātas augsnes paraugos, tādēļ lielas kontroles mēģinājumu izmaiņas var izraisīt nepareizus rezultātus. Tādēļ izmaiņām starp kontroles paraugu atkārtojumiem jābūt mazākām par ± 15 %.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.1. Aparatūra

Izmanto ķīmiski inerta materiāla testa tvertnes. To tilpumam jāatbilst augšņu inkubācijai izmantojamām procedūrām, t.i., inkubācijai kopā vai atsevišķu augsnes paraugu virknē (sk. 1.7.1.2. punktu). Jārūpējas, lai testa laikā iespējami samazinātu ūdens zudumu un nodrošinātu gāzu apmaiņu (piem., testa tvertnes var pārklāt ar perforētu polietilēna plēvi). Testējot gaistošas vielas, ir jāizmanto graduētas un gāzu necaurlaidīgas tvertnes. Tām jābūt tik lielām, lai ar augsnes paraugu būtu pildīta aptuveni viena ceturtdaļa tilpuma.

Izmanto standarta laboratorijas aprīkojumu, kurā iekļauts:

- kratīšanas ierīce – mehāniskais kratītājs vai līdzvērtīgs aprīkojums;

- centrifūga (3000 g) vai filtrēšanas ierīce (kurā izmanto nitrātus nesaturošu filtrpapīru);

- atbilstošas jutības un atkārtojamības instruments nitrāta analīzei.

1.6.2. Augšņu izraudzīšanās un skaits

Izmanto vienu augsni. Ieteicamie augsnes rādītāji ir šādi:

- smilšu saturs – ne mazāks kā 50 % un ne lielāks kā 75 %;

- pH līmenis – 5,5 – 7,5;

- organiskā oglekļa saturs – 0,5 – 1,5 %;

- mikrobu biomasa ir jāizmēra (8), (9), un tās oglekļa saturam jābūt vismaz 1 % no kopējā augsnes organiskā oglekļa.

Vairumā gadījumu augsne ar šādiem rādītājiem pārstāv sliktākā gadījuma situāciju, jo testējamās ķīmiskās vielas adsorbcija ir minimāla un tās pieejamība mikroflorai ir maksimāla. Tādēļ testi ar citām augsnēm parasti nav vajadzīgi. Tomēr dažos apstākļos, piem., ja testējamās vielas sagaidāmā galvenā izmantošana ir īpašās augsnēs, tādās kā skābas meža augsnes, vai elektrostatiski uzlādētām ķīmiskām vielām, var būt vajadzīga papildu augsnes izmantošana.

1.6.3. Augsnes paraugu vākšana un glabāšana

1.6.3.1. Vākšana

Ir jābūt pieejamiem sīkiem datiem par tās vietas vēsturi, no kuras savākta testējamā augsne. Dati iekļauj precīzu atrašanās vietu, zemsedzi, datus par apstrādi ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem, bioloģisko materiālu piedevām vai nejaušiem piesārņojumiem. Augsnes savākšanai izraudzītajai vietai jābūt ilgstoši izmantojamai. Piemērotas ir ganības, lauki ar viengadīgām graudaugu kultūrām (izņemot kukurūzu) vai blīvi apsēts zaļmēslojums. Izraudzītā paraugu ņemšanas vieta nedrīkst būt apstrādāta ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem vismaz vienu gadu pirms paraugu ņemšanas. Arī organiskie mēslošanas līdzekļi nedrīkst būt pielietoti vismaz sešus mēnešus. Minerālmēslu izmantošana ir pieņemama tikai saskaņā ar kultūraugu prasībām, un augsnes paraugus nedrīkst ņemt vismaz trīs mēnešu laikā pēc mēslošanas līdzekļa pielietošanas. Ir jāizvairās izmantot augsni, kas apstrādāta ar mēslošanas līdzekļiem ar zināmu biocīdu iedarbību (piem., kalcija ciānamīds).

Jāizvairās ņemt paraugus tieši pēc ilgiem sausuma vai pārplūšanas laika posmiem (ilgākiem par 30 dienām). Aramzemju paraugi jāņem no 0 līdz 20 cm dziļuma. Pļavu (ganību) vai citām augsnēs, kur aršana nenotiek ilgākos laika posmos (vismaz vienu augšanas periodu), maksimālais paraugu ņemšanas dziļums var būt nedaudz lielāks par 20 cm (piem., līdz 25 cm).

Augsnes paraugi ir pārvedami, izmantojot tvertnes un temperatūras apstākļos, kas garantē, ka augsnes sākotnējās īpašības nav ievērojami mainījušās.

1.6.3.2. Glabāšana

Vēlams izmantot augsnes, kas ir svaigi savāktas no lauka. Ja nevar izvairīties no glabāšanas laboratorijā, augsnes var glabāt tumsā 4 ± 2 °C temperatūrā ilgākais trīs mēnešus. Augšņu glabāšanas laikā jānodrošina aerobi apstākļi. Ja augsnes vāc vietās, kur tās ir sasalušas vismaz trīs mēnešus gadā, var apsvērt sešus mēnešus ilgu glabāšanu mīnus 18 °C līdz mīnus 22 °C temperatūrā. Pirms katra eksperimenta izmēra glabāto augšņu mikrobu biomasu, un oglekļa saturam biomasā jābūt vismaz 1 % no kopējā augsnes oglekļa satura (sk. 1.6.2. punktu).

1.6.4. Rīkošanās ar augsni un tās sagatavošana testam

1.6.4.1. Priekšinkubācija

Ja augsne ir glabāta (sk. 1.6.3.2. punktu), ir ieteicama 2 līdz 28 dienu ilga priekšinkubācija. Priekšinkubācijas laikā augsnes temperatūrai un mitruma saturam jābūt līdzvērtīgam testā izmantotajai temperatūrai un mitruma saturam (sk. 1.6.4.2. un 1.7.1.3. punktu).

1.6.4.2. Fizikāli ķīmiskās īpašības

Augsni ar rokām attīra no lieliem priekšmetiem (piem., akmeņiem, augu daļām utt.) un pēc tam mitru sijā, pārmērīgi neizžāvējot, līdz daļiņu lielumam mazākam vai vienādam ar 2 mm. Augsnes mitruma saturs ir jākoriģē ar destilētu vai dejonizētu ūdeni līdz vērtībai no 40 % līdz 60 % no maksimālās ūdens saturēšanas spējas.

1.6.4.3. Uzlabošana ar organisku substrātu

Augsne ir jāuzlabo ar piemērotu organisku substrātu, piem., lucernas zāles zaļajiem miltiem (galvenā sastāvdaļa – Medicago sativa) ar C/N attiecību no 12/1 līdz 16/1. Ieteicamā lucernas attiecība pret augsni ir 5 g lucernas uz kilogramu augsnes (sausais svars).

1.6.5. Testējamās vielas sagatavošana pielietošanai augsnē

Testējamo vielu parasti pielieto, izmantojot nesēju. Nesējs var būt ūdens (ūdenī šķīstošām vielām) vai inerta cieta viela, tāda kā smalkas kvarca smiltis (daļiņu lielums 0,1 – 0,5 mm).Lietot šķidrus nesējus, izņemot ūdeni (piem., organiskos šķīdinātājus, tādus kā acetons, hloroforms), ir jāizvairās, jo tie var kaitēt mikroflorai. Ja par nesēju izmanto smiltis, tās var pārklāt ar testējamo vielu, kas izšķīdināta vai suspendēta piemērotā šķīdinātājā. Tādos gadījumos pirms sajaukšanas ar augsni šķīdinātājs jāaizvada iztvaicējot. Optimālam testējamās vielas sadalījumam augsnē ir ieteicama attiecība 10 g smilšu uz kilogramu augsnes (sauss svars). Kontroles paraugus apstrādā tikai ar tādu pašu daudzumu ūdens un/vai kvarca smilšu.

Testējot gaistošas ķīmiskās vielas, apstrādes laikā ir iespējami jāizvairās no zudumiem un jācenšas nodrošināt viendabīgu sadalījumu augsnē (piem., testējamā viela ir jāinjicē augsnē vairākās vietās).

1.6.6. Testa koncentrācijas

Ja testē agroķīmiskas vielas, ir jāizmanto vismaz divas koncentrācijas. Mazākajai koncentrācijai jāatspoguļo vismaz maksimālais daudzums, kas prakses apstākļos, sagaidāms, nokļūs augsnē, bet lielākajai koncentrācijai jābūt mazākās koncentrācijas daudzkārtnim. Augsnei pievienojamās testējamās vielas koncentrācijas aprēķina, pieņemot, ka viela ir vienmērīgi iekļauta 5 cm dziļumā un augsnes bēruma blīvums ir 1,5. Agroķīmiskām vielām, ko pielieto tieši augsnē, vai ķīmiskām vielām, kuru augsnē nokļuvušo daudzumu var paredzēt, ieteicamās koncentrācijas ir maksimālā paredzamā koncentrācija vidē (PEC) un par to piecreiz lielāka koncentrācija. Vielas, ko paredzēts pielietot augsnēm vairākas reizes vienā sezonā, ir jātestē koncentrācijās, kas atvasinātas, reizinot PEC ar maksimālo sagaidāmo pielietošanas reižu skaitu. Lielākā testētā koncentrācija tomēr nedrīkst pārsniegt desmitkāršotu maksimālo viena lietojuma devu. Ja testē vielas, kas nav agroķīmiskas vielas, izmanto vismaz piecu koncentrāciju ģeometrisko rindu. Testētajām koncentrācijām ir jāiekļauj EKx vērtības noteikšanai vajadzīgo koncentrāciju diapazons.

1.7. TESTA IZPILDE

1.7.1. Iedarbības apstākļi

1.7.1.1. Apstrāde un kontrole

Ja testē agroķīmiskas vielas, augsni sadala trijās vienāda svara daļās. Divas daļas sajauc ar nesēju, kas satur vielu, un trešo sajauc ar nesēju bez vielas (kontrole). Ir ieteicami vismaz trīs atkārtojumi gan apstrādātai, gan neapstrādātai augsnei. Ja testē vielas, kas nav agroķīmiskas vielas, augsni sadala sešās vienāda svara daļās. Piecus no paraugiem sajauc ar nesēju, kas satur testējamo vielu, un sesto paraugu sajauc ar nesēju bez vielas. Ir ieteicami trīs atkārtojumi gan apstrādei, gan kontrolei. Jārūpējas, lai nodrošinātu viendabīgu testējamās vielas sadalījumu apstrādātajos augsnes paraugos. Jaukšanas laikā jāizvairās augsni sablīvēt vai savelt.

1.7.1.2. Augsnes paraugu inkubācija

Augsnes paraugu inkubāciju var izdarīt divos veidos – inkubēt katras apstrādātās un neapstrādātās augsnes kopējos paraugus vai katras apstrādātās un neapstrādātās augsnes atsevišķu un vienāda lieluma apakšparaugu rindas. Tomēr, ja testē gaistošas vielas, tests jāizdara tikai ar atsevišķu paraugu rindām. Ja augsnes inkubē kopējā paraugā, sagatavo lielus katras apstrādātās un neapstrādātās augsnes daudzumus un ņem analizējamos paraugus, kā testa laikā vajadzīgs. Katrai apstrādei un kontrolei sākotnēji sagatavojamais daudzums ir atkarīgs no apakšparaugu lieluma, analīzē izmantoto atkārtojumu skaita un sagaidāmā paraugu ņemšanas reižu maksimālā skaita. Kopējā paraugā inkubētās augsnes pirms apakšparaugu ņemšanas ir rūpīgi jāsajauc. Ja augsnes inkubē kā atsevišķu augsnes paraugu rindu, katru apstrādāto un neapstrādāto kopējo augsnes paraugu sadala vajadzīgajā skaitā apakšparaugu, un tos izmanto pēc vajadzības. Eksperimentos, kuros sagaidāmas vairāk par divām paraugu ņemšanas reizēm, ir jāsagatavo pietiekami daudz apakšparaugu, ņemot vērā visus atkārtojumus un visas paraugu ņemšanas reizes. Vismaz trīs testa augsnes atkārtojumu paraugi ir jāinkubē aerobos apstākļos (sk. 1.7.1.1. punktu). Lai izvairītos no anaerobu apstākļu izveidošanās, visos testos jāizmanto piemērotas tvertnes ar pietiekamu telpu virs ūdens. Ja testē gaistošas vielas, tests jāizdara tikai ar atsevišķu paraugu rindām.

1.7.1.3. Testa apstākļi un ilgums

Testu izdara tumsā, istabas temperatūrā 20 ± 2 °C. Augsnes paraugu mitruma saturs testa laikā jāsaglabā no 40 % līdz 60 % no augsnes maksimālās ūdens saturēšanas spējas (sk. 1.6.4.2. punktu) ± 5 % diapazonā. Pēc vajadzības var pievienot destilētu, dejonizētu ūdeni.

Minimālais testa ilgums ir 28 dienas. Ja testē agroķīmiskas vielas, salīdzina nitrātu veidošanās ātrumu apstrādātajos un kontroles paraugos. Ja tie 28. dienā atšķiras vairāk nekā par 25 %, testu turpina, līdz atšķirība ir vienāda ar 25 % vai mazāka par to vai maksimāli 100 dienas, atkarībā no tā, kurš no šiem lielumiem ir mazāks. Vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, testu beidz pēc 28 dienām. Divdesmit astotajā dienā nosaka nitrātu daudzumu apstrādātajā un kontroles augsnes paraugā un aprēķina EKX vērtības.

1.7.2. Augsnes paraugu ņemšana un analīze

1.7.2.1. Augsnes paraugu ņemšanas grafiks

Ja testē agroķīmiskas vielas, augsnes paraugus analizē attiecībā uz nitrātiem 0., 7., 14. un 28. dienā. Ja vajadzīgs paildzināts tests, turpmākos mērījumus veic 14 dienu starplaikos pēc 28. dienas.

Ja testu veic vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, izmanto vismaz piecas testa koncentrācijas un augsnes paraugus analizē attiecībā uz nitrātiem iedarbības perioda sākumā (0 dienā) un beigās (28. dienā). Ja uzskata par vajadzīgu, var pievienot starpmērījumu, piem., 7. dienā. Datus, kas iegūti 28. dienā, izmanto EKX vērtības noteikšanai. Ja vēlas, 0 dienas kontroles parauga datus var izmantot, lai reģistrētu nitrātu sākotnējo saturu augsnē.

1.7.2.2. Augsnes paraugu analīze

Katrā apstrādātajā un kontroles atkārtojumā izveidojušos nitrātu daudzumu nosaka katrā paraugu ņemšanas reizē. Nitrātu ekstrahē no augsnes, kratot paraugus ar piemērotu ekstrakcijas šķīdinātāju, piem., 0,1 M nātrija hlorīda šķīdumu. Ir ieteicama attiecība 5 ml KCl šķīduma uz gramu augsnes sausā svara ekvivalenta. Lai optimizētu ekstrakciju, tvertnes, kurās ir augsne un ekstrakcijas šķīdums, nedrīkst būt pilnākas par pusi. Maisījumus krata pie 150 apgr./min. 60 minūtes. Maisījumus centrifugē vai filtrē, un šķidro fāzi analizē attiecībā uz nitrātu. Daļiņas nesaturošus šķidros ekstraktus var pirms analīzes glabāt mīnus 20 ± 5 °C temperatūrā līdz sešiem mēnešiem.

2. IEGŪTIE DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Ja testus izdara ar agroķīmiskām vielām, katrā augsnes parauga atkārtojumā radies nitrāta daudzums jāreģistrē, un visu atkārtojumu vidējās vērtības jāsniedz tabulas veidā. Slāpekļa transformācijas ātrumi ir jānovērtē ar piemērotām un vispārpieņemtām statistikas metodēm (piem., F–tests, 5 % nozīmības līmenis). Nitrāta daudzumus izsaka mg nitrāta/kg augsnes sausā svara dienā. Nitrāta veidošanās ātrumu katrā apstrādē salīdzina ar nitrāta veidošanās ātrumu kontrolē un aprēķina procentuālo novirzi no kontroles.

Ja testus izdara ar vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, nosaka katrā atkārtojumā radušos nitrāta daudzumu un EKX vērtības novērtēšanai sagatavo devas–atbildes reakcijas līkni. Nitrāta daudzumus (t.i., mg nitrāta/kg augsnes sausā svara dienā), kas atrasti apstrādātajos paraugos pēc 28 dienām, salīdzina ar kontroles paraugā atrasto. No šiem datiem izrēķina kavēšanas vērtību procentos katrai testa koncentrācijai. Attiecīgos procentus atliek pret koncentrāciju un pēc tam izmanto statistikas procedūrās, lai aprēķinātu EKx vērtības. Izmantojot standarta procedūras (10), (11), (12), nosaka arī aprēķinātās EKx ticamības robežas (p = 0,95).

Testējamās vielas, kurās ir daudz slāpekļa, var dot ieguldījumu nitrāta daudzumā, kas radies testa laikā. Ja minētās vielas testē lielā koncentrācijā (piem., ķīmiskās vielas, kuras paredzēts pielietot atkārtoti), testā ir jāiekļauj attiecīga kontrole (t.i., augsne plus testējamā viela, bet bez augu miltiem). Minētās kontroles dati jāņem vērā EKx aprēķinos.

2.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA

Ja vērtē testu rezultātus ar agroķīmiskām vielām un ja starpība nitrātu veidošanās ātrumā starp mazāko apstrādi (t.i., maksimālo paredzēto koncentrāciju) un kontroli ir vienāda ar 25 % vai mazāka par to jebkurā paraugu ņemšanas laikā pēc 28. dienas, ražojumu novērtēt kā tādu, kam nav ilgtermiņa iedarbības uz slāpekļa transformāciju augsnēs. Ja vērtē testu rezultātus ar vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, izmanto EK50, EK25 un/vai EK10 vērtības.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija.

Pilnīga izmantotās augsnes identifikācija, kurā ietverta:

- vietas ģeogrāfiskā norāde (platums, garums);

- informācija par vietas vēsturi (t.i., augsega, apstrāde ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem, apstrāde ar mēslošanas līdzekļiem, nejaušs piesārņojums utt.);

- izmantošanas veids (piem., lauksaimniecības zeme, mežs utt.);

- paraugu ņemšanas dziļums (cm);

- smilšu/sanesu/māla saturs (% no sausa svara);

- pH (ūdenī);

- organiskā oglekļa saturs (% no sausa svara);

- slāpekļa saturs (% no sausa svara);

- sākotnējā nitrāta koncentrācija (mg nitrāta/kg sausa svara);

- katjonu apmaiņas spēja (mmol/kg);

- mikrobu biomasa procentos no kopējā organiskā oglekļa;

- norāde par katra rādītāja noteikšanā izmantotajām metodēm;

- visa informācija par augsnes paraugu vākšanu un glabāšanu;

- sīki dati par augsnes priekšinkubāciju, ja tā bijusi.

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikāli ķīmiskās īpašības;

- ķīmiskās identifikācijas dati, attiecīgā gadījumā iekļaujot struktūrformulu, tīrību (t.i., kultūraugu aizsardzības līdzekļiem aktīvās sastāvdaļas procentuālo daudzumu), slāpekļa saturu.

Substrāts:

- substrāta izcelsme;

- sastāvs (t.i., lucernas milti, lucernas zāles zaļie milti);

- oglekļa, slāpekļa saturs (% no sausa svara);

- sieta acu lielums (mm).

Testa apstākļi:

- sīki dati par augsnes uzlabošanu ar organisko substrātu;

- izmantotās testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju skaits un attiecīgā gadījumā izraudzīto koncentrāciju pamatojums;

- sīki dati par testējamās vielas pielietošanu augsnē;

- inkubēšanas temperatūra;

- augsnes mitruma saturs testa sākumā un testa laikā;

- izmantotā augsnes inkubēšanas metode (t.i., kopējā parauga vai atsevišķu apakšparaugu rindas);

- atkārtojumu skaits;

- paraugu ņemšanas reizes;

- nitrāta ekstrahēšanai no augsnes izmantotā metode.

Rezultāti:

- nitrāta analizēšanai izmantotā analītiskā procedūra un iekārta;

- dati, kas ierakstīti tabulā, iekļaujot nitrāta mērījumu atsevišķās un vidējās vērtības;

- atšķirības starp atkārtojumiem apstrādātajos un kontroles paraugos;

- attiecīgā gadījumā aprēķinos izdarīto korekciju skaidrojums;

- nitrātu veidošanās ātrumu procentuālās atšķirības katrā paraugu ņemšanas reizē vai attiecīgā gadījumā EK50 vērtība ar 95 procentu ticamības robežu, pārējās EKx (t.i., EK25 vai EK10) ar ticamības starplaikiem un devas–atbildes reakcijas līknes grafiku;

- rezultātu statistiskā apstrāde;

- visa informācija un novērojumi, kas noderīgi rezultātu interpretācijai.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) EPPO (1994). Decision–Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.

(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).

(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC–Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC–Europe, Bruxelles.

(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Sou Quality – Biological Methods.

(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18–20 Janvier 1995.

(7) ISO 10381–6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(8) ISO 14240–1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate–induced respiration method.

(9) ISO 14240–2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation–extraction method.

(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose–effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.

(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New–York.

(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

C22. AUGSNES MIKROORGANISMI – OGLEKĻA TRANSFORMĀCIJAS TESTS

1. METODE

Šī metode ir ESAO 217. (2000) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Šī testa metode apraksta laboratorijas metodi, kas paredzēta, lai izpētītu kultūraugu aizsardzības līdzekļu un, iespējams, citu ķīmisko vielu potenciālo iedarbību uz augsnes mikroorganismu oglekļa transformācijas aktivitāti pēc vienas iedarbības reizes. Tests galvenokārt pamatojas uz Eiropas un Vidusjūras Augu aizsardzības organizācijas ieteikumiem (1). Tomēr ir ņemtas vērā arī citas pamatnostādnes, iekļaujot Vācijas Federatīvās bioloģijas iestādes (2), ASV Vides aizsardzības aģentūras (3) un Starptautiskās standartizācijas organizācijas (4) pamatnostādnes. ESAO seminārā par augsnes/nosēdumu atlasi, kas 1995. gadā notika Beldžiratē, Itālijā (5), vienojās par šajā testā izmantojamo augšņu skaitu un tipu. Ieteikumi par augsnes paraugu vākšanu, apstrādi un glabāšanu pamatojas uz ISO Pamatnostādņu dokumentu (6) un Beldžirates semināra ieteikumiem.

Pārbaudot un vērtējot testējamo vielu toksiskās īpašības, var būt jānosaka iedarbības uz augsnes mikrobu aktivitāti, piem., ja vajadzīgi dati par augu aizsardzības līdzekļu iespējamām blakusiedarbībām uz augsnes mikrofloru vai ja ir sagaidāma ķīmisko vielu, kas nav augu aizsardzības līdzekļi, iedarbība uz augsnes mikroorganismiem. Oglekļa transformācijas testu izdara, lai noteiktu tādu ķīmisku vielu iedarbību uz augsnes mikrofloru. Ja pārbauda agroķīmiskās vielas (piem., kultūraugu aizsardzības līdzekļus, mēslošanas līdzekļus, mežsaimniecības ķīmiskās vielas), tiek veikti oglekļa transformācijas un slāpekļa transformācijas testi. Ja pārbauda ķīmiskās vielas, kas nav agroķīmiskās vielas, pietiek ar slāpekļa transformācijas testu. Tomēr, ja EK50 vērtības šādu ķīmisko vielu slāpekļa transformācijas testā ir diapazonā, kas atrasts tirdzniecībā pieejamiem nitrifikācijas inhibitoriem (piem., nitrapirīnam), var izdarīt oglekļa transformācijas testu, lai iegūtu papildu informāciju.

Augsnes sastāv no dzīviem un nedzīviem komponentiem, kas pastāv sarežģītos un neviendabīgos maisījumos. Mikroorganismiem ir svarīga loma organisko vielu noārdīšanā un transformācijā auglīgās augsnēs, kurās daudzas sugas dod ieguldījumu dažādos augsnes auglības aspektos. Jebkura ilgtermiņa iejaukšanās minētajos bioķīmiskajos procesos var potenciāli iejaukties barības vielu apritē, un tas var mainīt augsnes auglību. Oglekļa un slāpekļa transformācija notiek visās auglīgās augsnēs. Kaut arī par šiem procesiem atbildīgās mikrobu kopas atšķiras starp augsnēm, transformācijas ceļi būtībā ir vieni un tie paši.

Šī testa metode ir izveidota, lai noskaidrotu vielas ilgtermiņa kaitīgo iedarbību uz oglekļa transformācijas procesu aerobās virsmas augsnēs. Tests ir jutīgs pret to mikrobu kopu lieluma un aktivitātes izmaiņām, kuras ir atbildīgas par oglekļa transformāciju, jo minētās kopas testā tiek pakļautas ķīmiskai spriedzei un oglekļa trūkumam. Izmanto smilšainu augsni ar mazu organisko vielu saturu. Attiecīgo augsni apstrādā ar testējamo vielu un inkubē apstākļos, kuros var notikt ātrs mikrobiāls metabolisms. Minētajos apstākļos viegli pieejama oglekļa avoti augsnē drīz izsīkst. Tas izraisa oglekļa trūkumu, kas nonāvē mikrobu šūnas un izraisa miera stāvokli un/vai sporu veidošanos. Ja tests ir ilgāks par 28 dienām, minēto reakciju summu var izmērīt (neapstrādātā augsnē) kontrolē kā metaboliski aktīvo mikrobu biomasas pieaugošu zudumu (7). Ja testa apstākļos ķīmiska viela iedarbojas uz biomasu augsnē, kurā ir oglekļa spriedze, biomasa var neatgriezties līdz tam pašam līmenim kā kontrole. Šā iemesla dēļ traucējumi, ko testējamā viela izraisījusi jebkurā testa laikā, bieži paliek līdz testa beigām.

Testi, no kuriem ir izveidota šī testa metode, sākotnēji bija izveidoti vielām, kurām var paredzēt augsnē nokļūstošo daudzumu. Tā tas, piemēram, ir ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem, kuru lietojuma deva praksē ir zināma. Agroķīmiskajām vielām ir pietiekami testēt divas devas, kas saistītas ar sagaidāmo vai paredzamo lietojuma devu. Agroķīmiskās vielas var testēt kā aktīvās sastāvdaļas (a.s.) vai kā preparātus. Tomēr tests nav ierobežots ar ķīmiskajām vielām, kuru koncentrācija vidē ir paredzama. Mainot augsnē lietojamās testējamās vielas daudzumu un datu novērtēšanas veidu, testu var izmantot arī ķīmiskajām vielām, kurām nav zināms sagaidāmais augsnē nokļuvušais daudzums. Tā nosaka koncentrāciju rindas iedarbību uz oglekļa transformāciju vielām, kas nav agroķīmiskās vielas. Šo testu datus izmanto devas–atbildes reakcijas līknes sagatavošanai un EKx vērtību aprēķināšanai, kur x ir noteikts kā iedarbības %.

1.2. DEFINĪCIJAS

Oglekļa transformācija – mikroorganismu veikta organisko vielu noārdīšana, veidojoties neorganiskam galaproduktam – oglekļa dioksīdam.

EKX (efektīvā koncentrācija) – testējamās vielas koncentrācija augsnē, kas izraisa oglekļa transformācijas par oglekļa dioksīdu x procentu kavēšanu.

EK50 (vidējā efektīvā koncentrācija) – testējamās vielas koncentrācija augsnē, kas izraisa oglekļa transformācijas par oglekļa dioksīdu 50 procentu kavēšanu.

1.3. STANDARTVIELAS

Nav.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS

Izsijātu augsni apstrādā ar testējamo vielu vai atstāj neapstrādātu (kontrole). Ja testē agroķīmiskas vielas, ir ieteicamas vismaz divas testa koncentrācijas, un tās jāizvēlas saistībā ar praksē sagaidāmo augstāko koncentrāciju. Pēc 0, 7, 14 un 28 inkubācijas dienām apstrādātās un kontroles augsnes paraugus sajauc ar glikozi un 12 secīgu stundu laikā mēra glikozes inducētos elpošanas ātrumus. Elpošanas ātrumus izsaka kā izdalīto oglekļa dioksīdu (mg oglekļa dioksīda/kg sausas augsnes/h) vai patērēto skābekli (mg skābekļa/kg augsnes/h). Vidējo elpošanas ātrumu apstrādātas augsnes paraugos salīdzina ar vidējo elpošanas ātrumu kontrolei un aprēķina apstrādātā parauga procentuālo atšķirību no kontroles. Visus testus turpina vismaz 28 dienas. Ja 28. dienā apstrādātā un neapstrādātā parauga atšķirība ir vienāda ar 25 % vai lielāka par to, mērījumus turpina 14 dienu starplaikos ne vairāk kā līdz 100 dienām. Ja testē vielas, kas nav agroķīmiskās vielas, testējamās vielas koncentrāciju rindu pievieno augsnes paraugiem, un glikozes inducētos elpošanas ātrumus (t.i., vidējos radušos oglekļa dioksīda vai patērētā skābekļa daudzumus mēra pēc 28 dienām. Testu ar koncentrāciju rindu rezultātus analizē, izmantojot regresijas modeli, un aprēķina EKx vērtības (t.i., EK50, EK25 un/vai EK10). Sk. definīcijas.

1.5. TESTA DERĪGUMS

Testa ar agroķīmiskām vielām rezultātu izvērtēšana pamatojas uz relatīvi mazām atšķirībām (t.i., vidējo vērtību ± 25 %) starp izdalīto oglekļa dioksīdu vai patērēto skābekli kontroles un apstrādātas augsnes paraugos, tādēļ lielas izmaiņas kontrolē var izraisīt nepareizus rezultātus. Tādēļ izmaiņām starp kontroles paraugu atkārtojumiem jābūt mazākām par ± 15 %.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.1. Aparatūra

Izmanto ķīmiski inerta materiāla testa tvertnes. To tilpumam jāatbilst augšņu inkubācijā izmantojamām procedūrām, t.i., inkubācijai kopā vai atsevišķu augsnes paraugu virknē (sk. 1.7.1.2. punktu). Jārūpējas, lai testa laikā iespējami samazinātu ūdens zudumu un nodrošinātu gāzu apmaiņu (piem., testa tvertnes var pārklāt ar perforētu polietilēna plēvi). Testējot gaistošas vielas, ir jāizmanto graduētas un gāzu necaurlaidīgas tvertnes. Tām jābūt tik lielām, lai ar augsnes paraugu būtu pildīta aptuveni viena ceturtdaļa tilpuma.

Glikozes inducētas elpošanas noteikšanai ir vajadzīgas inkubācijas sistēmas un oglekļa dioksīda veidošanās vai skābekļa patēriņa mērīšanas instrumenti. Šādu sistēmu un instrumentu piemēri ir atrodami literatūras sarakstā (8), (9), (10), (11).

1.6.2. Augšņu izvēle un skaits

Izmanto vienu augsni. Ieteicamie augsnes rādītāji ir šādi:

- smilšu saturs – ne mazāks kā 50 % un ne lielāks kā 75 %;

- pH līmenis – 5,5 – 7,5;

- organiskā oglekļa saturs – 0,5 – 1,5 %;

- mikrobu biomasa ir jāizmēra (12, 13), un tās oglekļa saturam jābūt vismaz 1 % no kopējā augsnes organiskā oglekļa.

Vairumā gadījumu augsne ar šādiem rādītājiem pārstāv sliktākā gadījuma situāciju, jo testējamās ķīmiskās vielas adsorbcija ir minimāla un tās pieejamība mikroflorai ir maksimāla. Tādēļ testi ar citām augsnēm parasti nav vajadzīgi. Tomēr dažos apstākļos, piem., ja testējamās vielas sagaidāmā galvenā izmantošana ir īpašās augsnēs, tādās kā skābas meža augsnes, vai ja ķīmiskās vielas ir elektrostatiski uzlādētas, var būt vajadzīga papildu augsnes izmantošana.

1.6.3. Augsnes paraugu savākšana un glabāšana

1.6.3.1. Savākšana

Ir jābūt pieejamai sīkai informācijai par tās vietas vēsturi, no kuras savākta testa augsne. Dati iekļauj precīzu atrašanās vietu, zemsedzi, datus par apstrādi ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem, bioloģisko materiālu piedevām vai nejaušiem piesārņojumiem. Augsnes savākšanai izraudzītajai vietai jābūt ilgstoši izmantojamai. Piemērotas ir ganības, lauki ar viengadīgām graudaugu kultūrām (izņemot kukurūzu) vai blīvi apsēts zaļmēslojums. Izraudzītā paraugu ņemšanas vieta nedrīkst būt apstrādāta ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem vismaz vienu gadu pirms paraugu ņemšanas. Arī organiskie mēslošanas līdzekļi nedrīkst būt pielietoti vismaz sešus mēnešus. Minerālmēslu izmantošana ir pieņemama tikai saskaņā ar kultūraugu prasībām, un augsnes paraugus nedrīkst ņemt vismaz trīs mēnešu laikā pēc mēslošanas līdzekļa pielietošanas. Ir jāizvairās izmantot augsni, kas apstrādāta ar mēslošanas līdzekļiem ar zināmu biocīdu iedarbību (piem., kalcija ciānamīds).

Jāizvairās ņemt paraugus tieši pēc ilgiem sausuma vai pārplūšanas laika posmiem (ilgākiem par 30 dienām). Aramzemju paraugi jāņem no 0 līdz 20 cm dziļuma. Pļavu (ganību) vai citām augsnēs, kur aršana nenotiek ilgākos laika posmos (vismaz vienu augšanas periodu), maksimālais paraugu ņemšanas dziļums var būt nedaudz lielāks par 20 cm (piem., līdz 25 cm). Augsnes paraugi jāpārvadā, izmantojot tvertnes un temperatūras apstākļos, kas garantē, ka augsnes sākotnējās īpašības nav ievērojami mainījušās.

1.6.3.2. Glabāšana

Vēlams izmantot augsnes, kas ir svaigi savāktas no lauka. Ja nevar izvairīties no glabāšanas laboratorijā, augsnes var glabāt tumsā 4 ± 2 °C temperatūrā ilgākais trīs mēnešus. Augšņu glabāšanas laikā jānodrošina aerobi apstākļi. Ja augsnes vāc vietās, kur tās ir sasalušas vismaz trīs mēnešus gadā, var apsvērt sešus mēnešus ilgu glabāšanu mīnus 18 °C temperatūrā. Pirms katra eksperimenta izmērī glabāto augšņu mikrobu biomasu, un oglekļa saturam biomasā jābūt vismaz 1 % no kopējā augsnes oglekļa satura (sk. 1.6.2. punktu).

1.6.4. Augsnes apstrāde un tās sagatavošana testam

1.6.4.1. Priekšinkubācija

Ja augsne ir glabāta (sk. 1.6.4.2. un 1.7.1.3. punktu), ir ieteicama 2 līdz 28 dienu ilga priekšinkubācija. Priekšinkubācijas laikā augsnes temperatūrai un mitruma saturam jābūt līdzīgam testā izmantotajai temperatūrai un mitruma saturam (sk. 1.6.4.2. un 1.7.1.3. punktu).

1.6.4.2. Fizikāli ķīmiskās īpašības

Augsni ar rokām attīra no lieliem priekšmetiem (piem., akmeņiem, augu daļām utt.) un pēc tam mitru sijā, pārmērīgi neizžāvējot, līdz daļiņu lielumam mazākam vai vienādam ar 2 mm. Augsnes mitruma saturs ir jākoriģē ar destilētu vai dejonizētu ūdeni līdz vērtībai no 40 % līdz 60 % no maksimālās ūdens saturēšanas spējas.

1.6.5. Testējamās vielas sagatavošana pielietošanai augsnē

Testējamo vielu parasti pielieto, izmantojot nesēju. Nesējs var būt ūdens (ūdenī šķīstošām vielām) vai inerta cieta viela, tāda kā smalkas kvarca smiltis (daļiņu lielums 0,1 – 0,5 mm). Lietot šķidrus nesējus, izņemot ūdeni (piem., organiskos šķīdinātājus, tādus kā acetons, hloroforms), ir jāizvairās, jo tie var kaitēt mikroflorai. Ja par nesēju izmanto smiltis, tās var pārklāt ar testējamo vielu, kas izšķīdināta vai suspendēta piemērotā šķīdinātājā. Tādos gadījumos pirms sajaukšanas ar augsni šķīdinātājs jāaizvada iztvaicējot. Optimālam testējamās vielas sadalījumam augsnē ir ieteicama attiecība 10 g smilšu uz kilogramu augsnes (sauss svars). Kontroles paraugus apstrādā tikai ar tādu pašu daudzumu ūdens un/vai kvarca smilšu.

Testējot gaistošas ķīmiskās vielas, apstrādes laikā ir iespējami jāizvairās no zudumiem un jācenšas nodrošināt viendabīgu sadalījumu augsnē (piem., testējamā viela ir jāinjicē augsnē vairākās vietās).

1.6.6. Testa koncentrācijas

Ja testē kultūraugu aizsardzības produktus vai citas ķīmiskās vielas ar paredzamām koncentrācijām vidē, ir jāizmanto vismaz divas koncentrācijas. Mazākajai koncentrācijai jāatspoguļo vismaz maksimālais daudzums, kas praktiskos apstākļos, sagaidāms, nokļūs augsnē, bet lielākajai koncentrācijai jābūt mazākās koncentrācijas daudzkārtnim. Augsnei pievienotās testējamās vielas koncentrācijas aprēķina, pieņemot, ka viela ir vienmērīgi iestrādāta 5 cm dziļumā un augsnes bēruma blīvums ir 1,5. Agroķīmiskām vielām, ko pielieto tieši augsnē, vai ķīmiskām vielām, kuru augsnē nokļuvušo daudzumu var paredzēt, ieteicamās koncentrācijas ir paredzamā koncentrācija vidē (PEC) un par to piecreiz lielāka koncentrācija. Vielas, ko paredzēts pielietot augsnēm vairākas reizes vienā sezonā, ir jātestē koncentrācijās, kas atvasinātas, reizinot PEC ar maksimālo sagaidāmo pielietošanas reižu skaitu. Lielākā testētā koncentrācija tomēr nedrīkst pārsniegt desmitkāršotu maksimālo viena lietojuma devu.

Ja testē vielas, kas nav agroķīmiskas vielas, izmanto vismaz piecu koncentrāciju ģeometrisko rindu. Testētajām koncentrācijām ir jāiekļauj EKx vērtības noteikšanai vajadzīgo koncentrāciju diapazons.

1.7. TESTA NORISE

1.7.1 Iedarbības apstākļi

1.7.1.1. Apstrāde un kontrole

Ja testē agroķīmiskas vielas, augsni sadala trijās vienāda svara daļās. Divas daļas sajauc ar nesēju, kas satur vielu, un trešo sajauc ar nesēju bez vielas (kontrole). Ir ieteicami vismaz trīs atkārtojumi gan apstrādātai, gan neapstrādātai augsnei. Ja testē vielas, kas nav agroķīmiskas vielas, augsni sadala sešās vienāda svara daļās. Piecus no paraugiem sajauc ar nesēju, kas satur testējamo vielu, un sesto paraugu sajauc ar nesēju bez vielas. Ir ieteicami trīs atkārtojumi gan apstrādei, gan kontrolei. Jārūpējas, lai nodrošinātu vienmērīgu testējamās vielas sadalījumu apstrādātajos augsnes paraugos. Jaukšanas laikā jāizvairās augsni sablīvēt vai savelt.

1.7.1.2. Augsnes paraugu inkubācija

Augsnes paraugu inkubāciju var izdarīt divos veidos – katras apstrādātās un neapstrādātās augsnes kopējiem paraugiem vai katras apstrādātās un neapstrādātās augsnes atsevišķu un vienāda lieluma apakšparaugu rindām. Tomēr, ja testē gaistošas vielas, tests jāizdara tikai ar atsevišķu paraugu rindām. Ja augsnes inkubē kopējā paraugā, sagatavo lielus katras apstrādātās un neapstrādātās augsnes daudzumus un ņem analizējamos paraugus, kā testa laikā vajadzīgs. Katrai apstrādei un kontrolei sākotnēji sagatavojamais daudzums ir atkarīgs no apakšparaugu lieluma, analīzē izmantoto atkārtojumu skaita un sagaidāmā paraugu ņemšanas reižu maksimālā skaita. Kopējā paraugā inkubētās augsnes pirms apakšparaugu ņemšanas ir rūpīgi jāsajauc. Ja augsnes inkubē kā atsevišķu augsnes paraugu rindu, katru apstrādāto un neapstrādāto kopējo augsnes paraugu sadala vajadzīgajā skaitā apakšparaugu un tos izmanto pēc vajadzības. Eksperimentos, kuros sagaidāmas vairāk par divām paraugu ņemšanas reizēm, ir jāsagatavo pietiekami daudz apakšparaugu, ņemot vērā visus atkārtojumus un visas paraugu ņemšanas reizes. Vismaz trīs testa augsnes atkārtojumu paraugi ir jāinkubē aerobos apstākļos (sk. 1.7.1.1. punktu). Lai izvairītos no anaerobu apstākļu izveidošanās, visos testos jāizmanto piemērotas tvertnes ar pietiekamu tukšo telpu. Ja testē gaistošas vielas, tests jāizdara tikai ar atsevišķu paraugu rindām.

1.7.1.3. Testa apstākļi un ilgums

Testu izdara tumsā, istabas temperatūrā 20 ± 2 °C. Augsnes paraugu mitruma saturs testa laikā jāsaglabā no 40 % līdz 60 % no augsnes maksimālās ūdens saturēšanas spējas (sk. 1.6.4.2. punktu) ± 5 % diapazonā. Pēc vajadzības var pievienot destilētu, dejonizētu ūdeni.

Minimālais testa ilgums ir 28 dienas. Ja testē agroķīmiskas vielas, salīdzina izdalītā oglekļa dioksīda vai patērētā skābekļa daudzumus apstrādātajos un kontroles paraugos. Ja tie 28. dienā atšķiras vairāk nekā par 25 %, testu turpina, līdz atšķirība ir vienāda ar 25 % vai mazāka par to vai maksimāli 100 dienas, atkarībā no tā, kurš no šiem lielumiem ir mazāks. Vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, testu beidz pēc 28 dienām. Divdesmit astotajā dienā nosaka izdalītā oglekļa dioksīda vai patērētā skābekļa daudzumu apstrādātajā un kontroles augsnes paraugā un aprēķina EKX vērtības.

1.7.2. Augsnes paraugu ņemšana un analīze

1.7.2.1. Augsnes paraugu ņemšanas grafiks

Ja testē agroķīmiskas vielas, augsnes paraugus analizē attiecībā uz glikozes inducētas elpošanas ātrumiem 0, 7., 14. un 28. dienā. Ja vajadzīgs paildzināts tests, turpmākos mērījumus veic 14 dienu starplaikos pēc 28. dienas.

Ja testu veic vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, izmanto vismaz piecas testa koncentrācijas un augsnes paraugus analizē attiecībā uz glikozes inducētas elpošanas ātrumiem iedarbības perioda sākumā (0 dienā) un beigās (28. dienā). Ja uzskata par vajadzīgu, var pievienot starpmērījumu, piem., 7. dienā. Datus, kas iegūti 28. dienā, izmanto EKx vērtības noteikšanai. Ja vēlas, 0 dienas kontroles parauga datus var izmantot, lai noteiktu metaboliski aktīvu mikrobu biomasas sākotnējo saturu augsnē (12).

1.7.2.2. Glikozes inducētas elpošanas ātrumu mērīšana

Katrā apstrādātajā un kontroles atkārtojumā glikozes inducētas elpošanas ātrumu nosaka katrā paraugu ņemšanas reizē. Augsnes paraugus sajauc ar pietiekamu daudzumu glikozes, lai izraisītu maksimālo elpošanas atbildes reakciju. Glikozes daudzumu, kas vajadzīgs maksimālās elpošanas atbildes reakcijas izraisīšanai no konkrētās augsnes, var noteikt priekštestā, izmantojot glikozes koncentrāciju rindu (14). Tomēr smilšainām augsnēm ar 0,5 – 1,5 % organiskā oglekļa parasti pietiek 2000 mg līdz 2000 mg glikozes uz kg augsnes sausā svara. Glikozi var samalt pulverī ar tīrām kvarca smiltīm (10 g smilšu/kg augsnes sausā svara) un vienmērīgi sajaukt ar augsni.

Ar glikozi uzlabotus augsnes paraugus 20 ± 2 °C temperatūrā inkubē aparātā, kas piemērots elpošanas ātrumu mērīšanai nepārtraukti, katru stundu vai katras divas stundas (sk. 1.6.1. punktu). Izdalīto oglekļa dioksīdu vai patērēto skābekli mēra 12 secīgas stundas, un mērījumi jāuzsāk iespējami drīz, t.i., 1 līdz 2 stundas pēc glikozes pievienošanas. Mēra kopējo izdalītā oglekļa dioksīda vai patērētā skābekļa daudzumu 12 stundu laikā un nosaka vidējos elpošanas ātrumus.

2. IEGŪTIE DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Ja testus izdara ar agroķīmiskām vielām, katrā augsnes parauga atkārtojumā izdalītā oglekļa dioksīda vai patērētā skābekļa daudzums jāreģistrē, un visu atkārtojumu vidējās vērtības jāsniedz tabulas veidā. Rezultāti ir jānovērtē ar piemērotām un vispārpieņemtām statistikas metodēm (piem., F–testu, 5 % nozīmības līmeni). Glikozes inducētās elpošanas ātrumus izsaka mg oglekļa dioksīda/kg augsnes sausā svara/h. Vidējo oglekļa dioksīda izdalīšanās vai skābekļa patēriņa ātrumu katrā apstrādē salīdzina ar oglekļa dioksīda izdalīšanās vai skābekļa patēriņa ātrumu kontrolē un aprēķina procentuālo novirzi no kontroles.

Ja testus izdara ar vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, nosaka katrā atkārtojumā izdalīto oglekļa dioksīda vai patērēto skābekļa daudzumu un EKx vērtības novērtēšanai sagatavo devas–atbildes reakcijas līkni. Glikozes inducētās elpošanas ātrumus (t.i., mg oglekļa dioksīda/kg sausā svara augsnes/h vai mg skābekļa/kg sausā svara augsnes/h), kas konstatēti apstrādātajiem paraugiem pēc 28 dienām, salīdzina ar kontrolē konstatētajiem. No šiem datiem izrēķina kavēšanas vērtību procentos katrai testa koncentrācijai. Attiecīgos procentus atliek pret koncentrāciju un izmanto statistikas procedūras, lai aprēķinātu EKx vērtības. Izmantojot standarta procedūras (15), (16), (17), nosaka arī aprēķinātās EKx ticamības robežas (p = 0.95).

2.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA

Ja vērtē testu rezultātus ar agroķīmiskām vielām un ja starpība elpošanas ātrumā starp mazāko apstrādi (t.i., maksimālo paredzēto koncentrāciju) un kontroli ir vienāda ar 25 % vai mazāka par to jebkurā paraugu ņemšanas laikā pēc 28. dienas, var novērtēt, ka ražojumam nav ilgtermiņa ietekmes uz oglekļa transformāciju augsnēs. Ja vērtē testu rezultātus ar vielām, kas nav agroķīmiskas vielas, izmanto EK50, EK25 un/vai EK10 vērtības.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jābūt iekļautai šādai informācijai.

Pilnīga izmantotās augsnes identifikācija, kurā iekļauta:

- vietas ģeogrāfiskā norāde (garums, platums);

- informācija par vietas vēsturi (t.i., augsega, apstrāde ar kultūraugu aizsardzības līdzekļiem, apstrāde ar mēslošanas līdzekļiem, nejaušs piesārņojums utt.);

- izmantošanas veids (piem., lauksaimniecības zeme, mežs utt.);

- paraugu ņemšanas dziļums (cm);

- smilšu/sanesu/māla saturs (% no sausa svara);

- pH (ūdenī);

- organiskā oglekļa saturs (% no sausa svara);

- slāpekļa saturs (% no sausa svara);

- katjonu apmaiņas spēja (mmol/kg);

- sākotnējā mikrobu biomasa procentos no kopējā organiskā oglekļa;

- norāde par katra rādītāja noteikšanā izmantotajām metodēm;

- visa informācija par augsnes paraugu vākšanu un glabāšanu;

- sīki dati par augsnes priekšinkubāciju, ja tā bijusi.

Testējamā viela:

- fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikāli ķīmiskās īpašības;

- ķīmiskās identifikācijas dati, attiecīgā gadījumā iekļaujot struktūras formulu, tīrību (t.i., kultūraugu aizsardzības līdzekļiem aktīvās sastāvdaļas procentuālo daudzumu), slāpekļa saturu.

Testa apstākļi:

- sīki dati par augsnes uzlabošanu ar organisko substrātu;

- izmantotās testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju skaits un attiecīgā gadījumā izraudzīto koncentrāciju pamatojums;

- sīki dati par testējamās vielas pielietošanu augsnē;

- inkubācijas temperatūra;

- augsnes mitruma saturs testa sākumā un testa laikā;

- izmantotā augsnes inkubācijas metode (t.i., kopējam paraugam vai atsevišķu apakšparaugu rindai);

- atkārtojumu skaits;

- paraugu ņemšanas reizes.

Rezultāti:

- elpošanas ātruma mērīšanai izmantotā metode un iekārta;

- tabulas veidā apkopoti dati, iekļaujot oglekļa dioksīda vai skābekļa daudzumu atsevišķās un vidējās vērtības;

- atšķirības starp atkārtojumiem apstrādātajos un kontroles paraugos;

- attiecīgā gadījumā aprēķinos izdarīto korekciju skaidrojums;

- glikozes inducētās elpošanas ātrumu procentuālās atšķirības katrā paraugu ņemšanas reizē vai attiecīgā gadījumā EK50 vērtība ar 95 procentu ticamības robežu, pārējās EKx (t.i., EK25 vai EK10) ar ticamības starplaikiem un devas–atbildes reakcijas līknes grafika;

- rezultātu statistiskā apstrāde, ja iespējams;

- visa informācija un novērojumi, kas noderīgi rezultātu interpretācijai.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) EPPO (1994). Decision–Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.

(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).

(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC–Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC–Europe, Brussels.

(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.

(6) ISO 10381–6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora". Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45–60.

(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph Nr. 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831– 871.

(9) ISO 11266–1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.

(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(11) Heinemeye,r Ο., Insam, Η., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77–81.

(12) ISO 14240–1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate–induced respiration method.

(13) ISO 14240–2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation–extraction method.

(14) Malkomes, H.–P. (1986). EinfluE von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit–Atmung im Boden Gegenuber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short–Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113–120.

(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose–effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.

(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New–York.

(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

C.23. AEROBĀ UN ANAEROBĀ TRANSFORMĀCIJA AUGSNĒ

1. METODE

Šī testa metode ir ESAO 307. (2002) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Šī testa metode pamatojas uz esošajām pamatnostādnēm (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9). Šajā testa metodē aprakstītā metode ir paredzēta ķīmisko vielu aerobās un anaerobās transformācijas augsnē novērtēšanai. Eksperimentus veic, lai noteiktu – i) testējamās vielas transformācijas ātrumu un ii) transformācijas produktu, kas var iedarboties uz augiem un augsnes organismiem, īpašības un veidošanās un samazināšanās ātrumu. Tādi pētījumi ir vajadzīgi par ķīmiskajām vielām, ko tieši pielieto augsnē vai kas varētu nokļūt augsnes vidē. Tādus laboratorijas pētījumu rezultātus var arī izmantot, lai izveidotu paraugu ņemšanas un analīzes protokolus ar pētījumiem saistītās jomās.

Lai novērtētu transformācijas ceļus, parasti pietiek ar aerobiem un anaerobiem pētījumiem ar vienu augsnes tipu (8), (10), (11). Transformācijas ātrumi ir jānosaka vismaz trīs papildu augsnēs (8), (10).

ESAO seminārā par augsnes un nosēdumu atlasi, kas 1995. gadā notika Beldžiratē, Itālijā (10), vienojās jo īpaši par šajā testā izmantojamo augšņu skaitu un tipu. Testēto augšņu tipiem jābūt reprezentatīviem attiecībā uz vides apstākļiem, kuros notiek izmantošana vai izlaišana. Piemēram, ķīmiskās vielas, ko var izlaist subtropiskajā vai tropiskajā klimatā, ir jātestē ar Ferrasols vai Nitosols (FAO sistēma). Seminārs arī sniedza ieteikumus attiecībā uz augsnes paraugu vākšanu, apstrādi un glabāšanu, pamatojoties uz ISO pamatnostādnēm (15). Šajā metodē ir apsvērta arī rīsa augšņu izmantošana.

1.2. DEFINĪCIJAS

Testējamā viela – jebkura viela, gan izejas savienojums, gan attiecīgie transformācijas produkti.

Transformācijas produkti – visas vielas, kas rodas testējamās vielas biotiskās vai abiotiskās transformācijas reakcijās, iekļaujot CO2 un produktus, kas ir saistītās nogulsnēs.

Saistītās nogulsnes – "saistītās nogulsnes" ir vielas augsnē, augos vai dzīvniekos, kuras ir noturīgas matricā izejas savienojuma vai tā metabolītu/transformācijas produktu veidā pēc ekstrakcijas. Ekstrakcijas metode nedrīkst būtiski mainīt pašus savienojumus vai matricas struktūru. Saistības veidu var noskaidrot daļēji ar matricu mainošām ekstrakcijas metodēm un sarežģītām analīzes metodēm. Līdz šim, piemēram, šādā veidā ir identificētas kovalentās, jonu un sorbcijas saites, kā arī ieslēgumi. Parasti saistīto nogulšņu veidošanās ievērojami samazina bioloģisko pieejamību un bioloģiski pieejamo daudzumu (12) [Starptautiskā teorētiskās un lietišķās ķīmijas savienība – modificēts 1984. gadā (13).

Aerobā transformācija – reakcijas, kas notiek molekulārā skābekļa klātbūtnē (14).

Anaerobā transformācija – reakcijas, kas notiek, izslēdzot molekulārā skābekļa klātbūtni.

Augsne – ir mazu organismu (galvenokārt mikroorganismu) apdzīvots neorganisku un organisku ķīmisko sastāvdaļu maisījums, pēdējās minētās satur savienojumus ar lielu oglekļa un slāpekļa saturu un lielu molekulsvaru. Ar augsni var rīkoties divos stāvokļos:

a) neskartu, kā tā laika gaitā ir izveidojusies raksturīgos dažādu augšņu tipu slāņos;

b) skartu, kā tā parasti ir atrodama aramzemē vai kā tas notiek, ja rokot vāc paraugus un izmanto šajā testa metodē (14).

Mineralizācija – pilnīga organisko savienojumu noārdīšana līdz CO2 un H2O aerobos apstākļos un līdz CH4, CO2 un H2O anaerobos apstākļos. Šīs testa metodes kontekstā, ja izmanto ar 14C marķētu savienojumu, mineralizācija nozīmē intensīvu noārdīšanos, kuras laikā marķētā oglekļa atomi oksidējas, izdalot attiecīgu daudzumu 14CO2 (14).

Pussabrukšanas periods – t0,5 ir laiks, kas vajadzīgs, lai transformētu 50 % testējamās vielas, ja transformāciju var aprakstīt pirmās kārtas kinētika; tas nav atkarīgs no koncentrācijas.

DT50 (izzušanas laiks 50) – laiks, kurā testējamās vielas koncentrācija samazinās par 50 %; tas ir atšķirīgs no pussabrukšanas perioda t0.5, ja transformācija nenotiek saskaņā ar pirmās kārtas kinētiku.

DT75 (izzušanas laiks 75) – laiks, kurā testējamās vielas koncentrācija samazinās par 75 %.

DT90 (izzušanas laiks 90) – laiks, kurā testējamās vielas koncentrācija samazinās par 90 %.

1.3. STANDARTVIELAS

Standartvielas jāizmanto transformācijas produktu raksturošanai un/vai identifikācijai ar spektroskopijas un hromatogrāfijas metodēm.

1.4. TESTA PIEMĒROJAMĪBA

Metode ir derīga visām ķīmiskajām vielām (nemarķētām vai radioaktīvi marķētām), kurām ir pieejama pietiekami precīza un jutīga analīzes metode. Tā ir derīga nedaudz gaistošiem, negaistošiem, ūdenī šķīstošiem vai ūdenī nešķīstošiem savienojumiem. Tests nav jāpielieto ķīmiskajām vielām, kas ir ļoti gaistošas no augsnes (piem., fumigantiem, organiskajiem šķīdinātājiem) un tādēļ šā testa eksperimenta apstākļos nav saglabājamas augsnē.

1.5. INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO VIELU

Transformācijas ātruma mērīšanai var izmantot nemarķētas vai marķētas vielas. Marķēts materiāls ir vajadzīgs, lai pētītu transformācijas ceļu un noteiktu masas bilanci. Ir ieteicama marķēšana ar 14C, bet noderīga var būt arī citu izotopu, tādu kā 13C, 15N, 3H, 32P izmantošana. Cik iespējams, marķējums jānovieto molekulas stabilākajā(–ās) daļā(–ās) [1]. Testējamās vielas tīrībai jābūt vismaz 95 %.

Pirms aerobās un anaerobās transformācijas augsnē testa izdarīšanas vajadzīga šāda informācija par testējamo vielu:

a) šķīdība ūdenī (A.6. metode);

b) šķīdība organiskajos šķīdinātājos;

c) tvaika spiediens (A.4. metode) un Henrija likuma konstante;

d) sadalījuma koeficients sistēmā n–oktanols/ūdens (A.8. metode);

e) ķīmiskā stabilitāte tumsā (hidrolīze) (C.7. metode);

f) pKa, ja molekula protonējas vai deprotonējas [ESAO 112. vadlīnija] (16).

Citā noderīgā informācijā var iekļaut datus par testējamās vielas toksicitāti attiecībā uz augsnes mikroorganismiem [C.21. un C.22. testa metode] (16).

Jābūt pieejamām analīzes metodēm (iekļaujot ekstrakciju un attīrīšanas metodes) testējamās vielas un tās transformācijas produktu kvantitatīvai noteikšanai un identifikācijai.

1.6. TESTA METODES PRINCIPS

Augsnes paraugus apstrādā ar testējamo vielu un inkubē tumsā biometra veida kolbās vai caurplūdes sistēmās kontrolētos laboratorijas apstākļos (nemainīgā temperatūrā un augsnes mitrumā). Piemērotos starplaikos augsnes paraugus ekstrahē un analizē attiecībā uz izejas savienojumu un transformācijas produktiem. Analīzei savāc arī gaistošos produktus, izmantojot piemērotas absorbcijas ierīces. Izmantojot ar 14C marķētu materiālu, var izmērīt dažādus testējamās vielas mineralizācijas ātrumus, uztverot radušos 14CO2, un noteikt masas bilanci, iekļaujot augsnes saistītās nogulsnes.

1.7. KVALITĀTES KRITĒRIJI

1.7.1. Atgūstamība

Vismaz divu paralēlu augsnes paraugu ekstrahēšana un analīze tieši pēc testējamās vielas pievienošanas dod pirmo norādi par analīzes metodes atkārtojamību un pielietojamās procedūras vienādību testējamai vielai. Atgūstamību eksperimentu vēlākiem posmiem iegūst no attiecīgajām masas bilancēm. Atgūstamībai jābūt diapazonā no 90 % līdz 110 % marķētām ķīmiskām vielām (8) un no 70 % līdz 110 % nemarķētām ķīmiskām vielām (3).

1.7.2. Analīzes metodes atkārtojamība un jutība

Analīzes metodes atkārtojamību (izņemot sākotnējās ekstrahēšanas efektivitāti), kvantitatīvi nosakot testējamās vielas un transformācijas produktu, var pārbaudīt, veicot divas paralēlas analīzes vienam un tam pašam augsnes ekstraktam, kas ir pietiekami inkubēts, lai veidotos transformācijas produkts.

Analītiskās metodes kvalitatīvās noteikšanas robežai (KNR) attiecībā uz testējamo vielu un transformācijas produktiem jābūt vismaz 0,01 mg μkg–1 augsnes (kā testējamai vielai) vai 1 % no pielietotās devas, atkarībā no tā, kurš lielums ir mazāks. Ir jānorāda arī kvantitatīvās noteikšanas robeža (LOQ).

1.7.3. Transformācijas datu precizitāte

Testējamās vielas koncentrācijas kā laika funkcijas regresijas analīze sniedz attiecīgu informāciju par transformācijas līknes ticamību un ļauj aprēķināt pussabrukšanas perioda ticamības robežas (pseido pirmās kārtas kinētikas gadījumā) vai DT50 vērtības un attiecīgā gadījumā DT75 un DT90 vērtības.

1.8. TESTA METODES APRAKSTS

1.8.1. Aprīkojums un ķīmiskie reaģenti

Inkubācijas sistēmas sastāv no statiskām noslēgtām sistēmām vai piemērotām caurplūdes sistēmām (7), (17). Piemērotu caurplūdes augsnes inkubācijas aparātu un biometra tipa kolbu piemēri ir attiecīgi parādīti 1. un 2. attēlā. Abu veidu inkubācijas sistēmām ir priekšrocības un ierobežojumi (7), (17).

Ir vajadzīgs laboratorijas standartaprīkojums un jo īpaši šāds aprīkojums:

- analīzes iekārtas, tādas kā GŠH, HPLC, TLC aprīkojums, iekļaujot attiecīgās atklāšanas sistēmas radioaktīvi marķētu un nemarķētu vielu analīzei vai apgrieztajai izotopu atšķaidīšanas metodei;

- aparāti identifikācijas nolūkiem (piem., MS, GC–MS, HPLC–MS, KMR, utt.);

- šķidruma scintilāciju skaitītājs;

- oksidēšanas iekārta radioaktīvā materiāla sadedzināšanai;

- centrifūga;

- ekstrahēšanas aparāts (piemēram, centrifūgas mēģenes aukstajai ekstrahēšanai un Soksleta aparāts nepārtrauktai ekstrahēšanai ar atteci);

- aprīkojums šķīdumu un ekstraktu koncentrēšanai (piem., rotācijas iztvaicētājs);

- ūdens vanna;

- mehāniskais maisītājs (piem., mīcītājs, rotācijas maisītājs).

Izmantojamie ķīmiskie reaģenti, piemēram, ir:

- NaOH, analītiski tīrs, 2 mol dm–3, vai cita piemērota bāze (piem., KOH, etanolamīns);

- H2SO4, analītiski tīrs, 0,05 mol dm–3;

- etilēnglikols, analītiski tīrs;

- cieti absorbcijas materiāli, tādi kā natronkaļķi un poliuretāna aizbāžņi;

- organiskie šķīdinātāji, analītiski tīri, tādi kā acetons, metanols utt.;

- scintilācijas šķidrums.

1.8.2. Testējamās vielas pielietošana

Testējamo vielu pielietošanai un sadalīšanai augsnē var izšķīdināt ūdenī (dejonizētā vai destilētā) vai vajadzības gadījumā niecīgos daudzumos acetonā vai citos organiskajos šķīdinātājos (6), kuros testējamā viela ir pietiekami šķīstoša un stabila. Tomēr izraudzītā šķīdinātāja daudzums nedrīkst ievērojami ietekmēt augsnes mikrobu aktivitāti (sk. 1.5. un 1.9.2. – 1.9.3. punktu). Ir jāizvairās lietot šķīdinātājus, kas kavē mikrobu aktivitāti, piemēram, hloroformu, dihlormetānu un citus halogenētus šķīdinātājus.

Testējamo vielu var arī pievienot kā cietu vielu, piem., sajauktu ar kvarca smiltīm (6) vai testa augsnes, kas ir izžāvēta gaisā, sausa un sterilizēta, nelielā apakšparaugā. Ja testējamo vielu pievieno, izmantojot šķīdinātāju, ir jāļauj šķīdinātājam iztvaikot, pirms apakšparaugu ar piejaukumu pievieno oriģinālajam nesterilajam augsnes paraugam.

Parastajām ķīmiskajām vielām, kuru galvenais iekļūšanas veids augsnē ir caur notekūdeņu dūņām/pielietošanu lauksaimniecībā, testējamā viela ir vispirms jāpievieno dūņām, ko pēc tam ievada augsnes paraugā (sk. 1.9.2. un 1.9.3. punktu).

Izmantot preparātus parasti nav ieteicams. Tomēr, piemēram, slikti šķīstošām testējamām vielām preparātu izmantošana var būt piemērota alternatīva.

1.8.3. Augsnes

1.8.3.1. Augšņu atlase

Lai noteiktu transformācijas ceļu, var lietot reprezentatīvu augsni; ieteicams ir smilšains smilšmāls vai sanešu smilšmāls, vai smilšmāls, vai smilšmālaina smilts [saskaņā ar FAO un USDA klasifikāciju (18)] ar pH 5,5 – 8,0, organiskā oglekļa saturu 0,5 – 2,5 % un mikrobu biomasu vismaz 1 % no kopējā organiskā oglekļa (10).

Transformācijas ātruma pētījumos jāizmanto vismaz trīs papildu augsnes, kas pārstāv attiecīgo augšņu diapazonu. Augsnēm jāatšķiras pēc oglekļa satura, pH, mālu satura un mikrobu biomasas (10).

Visas augsnes jāraksturo vismaz attiecībā uz struktūru (% smilšu, % sanešu, % mālu) [saskaņā ar FAO un USDA klasifikāciju (18)], pH, katjonu apmaiņas spēju, organisko oglekli, bēruma blīvumu, ūdens aiztures īpašībām [2] un mikrobu biomasu (tikai aerobiem pētījumiem). Rezultātu interpretēšanā var būt noderīga papildu informācija par augsnes īpašībām. Augsnes īpašību noteikšanai var izmantot literatūras sarakstā (19), (20), (21), (22), (23) ieteiktās metodes. Mikrobu masa ir jānosaka, izmantojot substrāta inducētās elpošanas (SIR) metodi (25), (26) vai alternatīvas metodes (20).

1.8.3.2. Augšņu vākšana, apstrāde un glabāšana

Ir jābūt pieejamai sīkai informācijai par tās vietas vēsturi, no kuras savākta testa augsne. Dati iekļauj precīzu atrašanās vietu, zemsedzi, datus par apstrādi ar ķīmiskām vielām, apstrādi ar organiskajiem un neorganiskajiem mēslošanas līdzekļiem, bioloģisko materiālu piedevām vai citiem piesārņojumiem. Ja augsnes iepriekšējos četros gados ir apstrādātas ar testējamo vielu vai tās struktūras analogiem, tās nav jāizmanto transformācijas pētījumos (10), (15).

Augsnei jābūt tikko savāktai no lauka (no A horizonta vai no augsnes augšējā 20 cm biezā slāņa) ar augsnes ūdens saturu, kas atvieglo sijāšanu. Augsnēm, kas nav rīsa lauku augsnes, no paraugu ņemšanas jāizvairās ilgu (> 30 dienu) sausuma, sasaluma vai pārplūšanas periodu laikā vai tūlīt pēc tiem (14). Paraugi ir jāpārved tādā veidā, kas iespējami samazina augsnes ūdens satura izmaiņas, un, cik iespējams, jātur tumsā, brīvi piekļūstot gaisam. Šajā nolūkā parasti ir piemērots vaļīgi aizsiets polietilēna maiss.

Augsne jāapstrādā iespējami drīz pēc paraugu ņemšanas. Veģetācija, lielāka augsnes fauna un akmeņi ir jāizņem, pirms augsni izsijā caur 2 mm sietu, kas atdala mazus akmeņus, faunu un augu atliekas. Jāizvairās no augsnes intensīvas žāvēšanas un drupināšanas pirms sijāšanas (15).

Ja ziemā paraugu ņemšana laukā ir apgrūtināta (augsne sasalusi vai pārklāta ar sniega slāni), to var ņemt no augsnes krājuma, ko glabā siltumnīcā zem zemsedzes (piem. zāles vai zāles un āboliņa maisījumiem). Pētījumiem ar tikko no lauka savāktu augsni noteikti ir priekšroka, bet ja savāktā un apstrādātā augsne ir jāglabā pirms pētījuma sākšanas, glabāšanas apstākļiem jābūt atbilstošiem un tikai uz ierobežotu laiku (4 ± 2 °C temperatūrā maksimāli uz trim mēnešiem), lai saglabātos mikrobu aktivitāte [3]. Sīki izstrādātas instrukcijas par biotransformācijas eksperimentos izmantojamo augšņu vākšanu, apstrādi un glabāšanu ir atrodamas literatūras sarakstā (8), (10), (15), (26), (27).

Pirms apstrādāto augsni izmanto šajā testā, tai izdara priekšinkubāciju, lai izdiedzētu un atdalītu sēklas un lai atjaunotu mikrobu metabolisma līdzsvaru pēc izmaiņām no paraugu ņemšanas vai glabāšanas apstākļiem uz inkubācijas apstākļiem. Parasti ir piemērots 2 līdz 28 dienu priekšinkubācijas periods aptuvenos faktiskā testa temperatūras un mitruma apstākļos. Glabāšanas un priekšinkubācijas laikam kopā nav jāpārsniedz trīs mēneši.

1.9. TESTA NORISE

1.9.1. Testa apstākļi

1.9.1.1. Testa temperatūra

Visā testa laikā augsnes ir jāinkubē tumsā, nemainīgā temperatūrā, kas ir reprezentatīva klimata apstākļiem, kuros notiks vielas izmantošana vai izlaišana. Ieteicama 20 ± 2 °C temperatūra visām testējamām vielām, kas var nokļūt augsnē mērenā klimatā. Temperatūra ir jāpārrauga.

Attiecībā uz ķīmiskām vielām, ko pielieto vai izlaiž aukstākā klimatā (piem., ziemeļu valstīs, rudens/ziemas periodos), ir jāinkubē papildu augsnes paraugi, bet zemākā temperatūrā (piem., 10 ± 2 °C).

1.9.1.2. Mitruma saturs

Transformācijas testiem aerobos apstākļos augsnes mitruma saturs [4] jākoriģē un jāuztur pie pF no 2,0 līdz 2,5 (3). Augsnes mitruma saturu izsaka kā ūdens masu uz sausas augsnes masu, un tas ir regulāri jākontrolē (piem., 2 nedēļu starplaikos), sverot inkubācijas kolbas un kompensējot ūdens zudumus ar ūdens (vēlams, sterili filtrēta krāna ūdens) pievienošanu. Jārūpējas, lai novērstu vai iespējami samazinātu testējamās vielas un/vai transformācijas produktu zudumus iztvaikošanas un/vai fotonoārdīšanās (ja tā notiek) veidā mitruma papildināšanas laikā.

Transformācijas testiem anaerobos un rīsa lauku apstākļos augsne ir piesātināta ar ūdeni appludinot.

1.9.1.3. Aerobas inkubācijas apstākļi

Caurplūdes sistēmās aerobos apstākļus uztur, ar pārtraukumiem appludinot vai nepārtraukti vēdinot ar mitrinātu gaisu. Biometra kolbās gaisa apmaiņu uztur ar difūziju.

1.9.1.4. Sterili aerobi apstākļi

Lai iegūtu informāciju par testējamās vielas abiotiskās transformācijas nozīmīgumu, augsnes paraugus var sterilizēt (sterilizācijas metodes sk. 16. un 29. norādē), apstrādāt ar sterilu testējamo vielu (piem., pievienot šķīdumu caur sterilu filtru) un aerēt ar mitrinātu sterilu gaisu, kā aprakstīts 1.9.1.3. punktā. Rīsa lauku augsne un ūdens jāsterilizē un inkubācija jāizdara, kā aprakstīts 1.9.1.6. punktā.

1.9.1.5. Anaerobas inkubācijas apstākļi

Lai izveidotu un uzturētu anaerobus apstākļus, ar testējamo vielu apstrādātu un 30 dienas vai vienu pussabrukšanas periodu, vai DT50 (atkarībā no tā, kurš ir īsāks) aerobos apstākļos inkubētu augsni pēc tam pārklāj ar ūdeni (1 – 3 cm biezu ūdens slāni) un inkubācijas sistēmu appludina ar inertu gāzi (piem., slāpekli vai argonu) [5]. Testa sistēmā jāvar izdarīt mērījumus, tādus kā pH, skābekļa koncentrācija un redokspotenciāls, un jāiekļauj gaistošo produktu uztveršanas ierīces. Biometra veida sistēmai jābūt noslēgtai, lai izvairītos no gaisa iekļūšanas difundējot.

1.9.1.6. Rīsa lauka inkubācijas apstākļi

Lai pētītu transformāciju rīsu lauku augsnēs, augsni appludina ar apmēram 1 – 5 cm biezu ūdens slāni un testējamo vielu pielieto ūdens fāzei (9). Ieteicamais augsnes dziļums ir vismaz 5 cm. Sistēmu vēdina ar gaisu tāpat kā aerobos apstākļos. Jāpārrauga un jāreģistrē ūdens slāņa pH, skābekļa koncentrācija un redokspotenciāls. Pirms transformācijas pētījumu uzsākšanas ir nepieciešams vismaz divas nedēļas ilgs pirmsinkubācijas laika posms (sk. 1.8.3.2. punktu).

1.9.1.7. Testa ilgums

Ātruma un noārdīšanās ceļa pētījumiem parasti nav jāpārsniedz 120 dienas [6] (3), (6), (8), jo pēc tam mākslīgā laboratorijas sistēmā, kas izolēta no dabiskās papildināšanās, ir sagaidāma augsnes mikrobu aktivitātes samazināšanās. Ja ir jāraksturo testējamās vielas samazinājums un galveno transformācijas produktu veidošanās un samazinājums, pētījumu var turpināt ilgākā laika posmā (piem., 6 vai 12 mēnešus) (8). Ilgāki inkubācijas periodi ir jāpamato pārskatā par testu un tiem jābūt kopā ar biomasas mērījumiem minēto periodu laikā un to beigās.

1.9.2. Testa norise

Aptuveni 50 līdz 200 g augsnes (pamatojoties uz sausu svaru) ievieto katrā inkubācijas kolbā (sk. 3. pielikuma 1. un 2. attēlu) un augsni apstrādā ar testējamo vielu, izmantojot vienu no 1.8.2. punktā aprakstītajām metodēm. Ja testējamās vielas pielietošanai izmanto organiskos šķīdinātājus, tie ir jāaizvada no augsnes iztvaicējot. Pēc tam augsni rūpīgi sajauc ar lāpstiņu un/vai kratot kolbu. Ja pētījumu veic rīsa lauka apstākļos, augsne un ūdens pēc testējamās vielas pielietošanas ir rūpīgi jāsajauc. Apstrādātās augsnes mazi alikvoti (piem. 1 g) ir jāanalizē attiecībā uz testējamo vielu, lai pārbaudītu tās vienmērīgu sadalījumu. Alternatīvu metodi sk. turpmāk.

Apstrādes devai jāatbilst lietošanas pamācībās ieteiktajai augstākajai kultūraugu aizsardzības līdzekļa devai un jābūt vienmērīgi iestrādātai atbilstoši dziļumam laukā (piem., augsnes augšējā 10 cm biezā slānī [7]. Piemēram, ķīmiskajām vielām, ko bez iestrādāšanas pielieto uz lapām vai augsnes, atbilstošais dziļums izskaitļošanai, cik daudz ķīmiskās vielas ir jāpievieno katrā kolbā, ir 2,5 cm. Augsnē iestrādātām ķīmiskajām vielām atbilstošais dziļums ir lietošanas pamācībās norādītais iestrādāšanas dziļums. Vispārējām ķīmiskajām vielām lietojuma deva jāaplēš, pamatojoties uz visatbilstošāko ievadīšanas veidu; piemēram, ja galvenais ievadīšanas veids augsnē ir caur notekūdeņu dūņām, ķīmiskā viela ir jādozē dūņās koncentrācijā, kas atspoguļo sagaidāmo koncentrāciju dūņās, un augsnei pievienoto dūņu daudzumam jāatspoguļo parastā dūņu slodze uz lauksaimniecības augsnēm. Ja attiecīgā koncentrācija nav pietiekami liela galveno transformācijas produktu identificēšanai, var būt noderīgi inkubēt atsevišķus augsnes paraugus, kas satur lielākas devas, bet ir jāizvairās no pārlieku lielām devām, kas ietekmē augsnes mikrobu funkcijas (sk. 1.5. un 1.8.2. punktu).

Alternatīvi, ar testējamo vielu var apstrādāt lielāku augsnes partiju (t.i., 1 līdz 2 kg), kas rūpīgi sajaukta piemērotā maisītājā un pēc tam mazās 50 līdz 200 g daļās pārnesta inkubācijas kolbās (piemēram, izmantojot parauga dalītājus). Apstrādātās augsnes partijas mazi alikvoti (piem. 1 g) ir jāanalizē attiecībā uz testējamo vielu, lai pārbaudītu tās vienmērīgu sadalījumu. Tādai procedūrai ir priekšroka, jo tā ļauj vienmērīgāk sadalīt testējamo vielu augsnē.

Neapstrādātās augsnes paraugus arī inkubē tādos pašos apstākļos (aerobos) kā paraugus, kas apstrādāti ar testējamo vielu. Minētos paraugus izmanto biomasas mērījumiem pētījuma laikā un tā beigās.

Ja augsnē pielieto organiskajā(–os) šķīdinātājā(–os) izšķīdinātu testējamo vielu, augsnes paraugus, kas apstrādāti ar to pašu šķīdinātāja(–u) daudzumu, inkubē tādos pašos apstākļos (aerobos) kā ar testējamo vielu apstrādātos paraugus. Minētos paraugus izmanto biomasas mērījumiem sākumā, pētījuma laikā un beigās, lai pārbaudītu šķīdinātāja(–u) iedarbību uz mikrobu biomasu.

Kolbas, kas satur apstrādāto augsni, vai nu pievieno 1. attēlā parādītajai caurplūdes sistēmai, vai arī noslēdz ar 2. attēlā parādīto absorbcijas kolonnu (sk. 3. pielikumu).

1.9.3. Paraugu ņemšana un mērīšana

Dublikātu inkubācijas kolbas atbilstošos starplaikos izņem un augsnes paraugus ekstrahē ar piemērotiem dažādas polaritātes šķīdinātājiem un analizē attiecībā uz testējamo vielu un/vai transformācijas produktiem. Labi izplānots pētījums iekļauj pietiekami daudz kolbu, tā lai katrā paraugu ņemšanas reizē izmantotu divas kolbas. Arī absorbcijas šķīdumus vai cietos absorbcijas materiālus izņem dažādos starplaikos (7 dienu starplaikos pirmā mēneša laikā un pēc viena mēneša 17 dienu starplaikos) katra augsnes parauga inkubācijas laikā un beigās un analizē attiecībā uz gaistošajiem produktiem. Bez augsnes parauga, ko ņem tieši pēc pielietošanas (0 dienas paraugs), jāiekļauj vismaz 5 papildu paraugu ņemšanas punkti. Starplaiki jāizvēlas tā, lai varētu izveidot testējamās vielas samazināšanās modeli un transformācijas produktu veidošanās un samazināšanās modeli (piem., 0, 1, 3, 7 dienas; 2, 3 nedēļas; 1, 2, 3 mēneši utt.)

Izmantojot ar 14C marķētu testējamo vielu, neekstrahējamo radioaktivitāti kvantitatīvi nosaka sadedzinot un katram paraugu ņemšanas starplaikam aprēķina masas bilanci.

Anaerobās un rīsa lauka inkubācijas gadījumā augsnes un ūdens fāzes analizē kopā attiecībā uz testējamo vielu un transformācijas produktiem vai arī pirms ekstrakcijas un analīzes atdala filtrējot vai centrifugējot.

1.9.4. Neobligātie testi

Aerobi, nesterili pētījumi papildu temperatūrās un pie papildu augsnes mitrumiem var būt noderīgi, lai noteiktu temperatūras un augsnes mitruma ietekmi uz testējamās vielas transformācijas ātrumiem un/vai tās transformācijas produktiem augsnē.

Var mēģināt papildus raksturot neekstrahējamo radioaktivitāti, izmantojot, piemēram, superkritiskā šķidruma ekstrakciju.

2. IEGŪTIE DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Testējamās vielas daudzumi, transformācijas produkti, gaistošās vielas (tikai %) un neekstrahējamās vielas jāsniedz kā pielietotās sākuma koncentrācijas % un attiecīgā gadījumā kā mg.kg–1 augsnes (pamatojoties uz augsnes sauso svaru) katrā paraugu ņemšanas starplaikā. Masas bilance jāsniedz kā pielietotās sākotnējās koncentrācijas procentuālais daudzums katrā paraugu ņemšanas starplaikā. Testējamās vielas koncentrāciju grafiskais attēlojums attiecībā pret laiku ļauj novērtēt tās transformācijas pussabrukšanas periodu vai DT50. Galvenie transformācijas produkti ir jāidentificē un to koncentrācijas arī jāatliek pret laiku, lai parādītu to veidošanās un samazināšanās ātrumus. Galvenais transformācijas produkts ir jebkurš produkts, kas pārstāv ≥10 % no pielietotās devas jebkurā pētījuma laika brīdī.

Uztvertie gaistošie produkti sniedz norādi uz testējamās vielas un tās transformācijas produktu gaistamības potenciālu no augsnes.

Precīzākas pussabrukšanas perioda vai DT50 vērtības un attiecīgā gadījumā DT75 un DT90 vērtības ir jāiegūst, pielietojot atbilstošus kinētiskā modeļa aprēķinus. Pussabrukšanas perioda un DT50 vērtības jāreģistrē kopā ar izmantotā modeļa aprakstu, kinētikas kārtu un noteikšanas koeficientu (r2). Priekšroka ir pirmās kārtas kinētikai, ja vien r2 < 0,7. Attiecīgā gadījumā aprēķini jāpielieto arī galvenajiem transformācijas produktiem. Piemērotu modeļu piemēri ir aprakstīti literatūras sarakstā (31) līdz (35).

Dažādās temperatūrās izdarītos ātruma pētījumos transformācijas ātrumi eksperimenta temperatūru diapazonā ir jāapraksta kā temperatūras funkcija, izmantojot Arrēniusa sakarību formā:

k =

vai

ln k =

B

T,

kur ln A un B ir regresijas konstantes attiecīgi no koordinātu ass nogriežņa un slīpuma leņķa vislabāk atbilstošajai taisnei, kas izveidota, atliekot ln k pret 1/T, k ir ātruma konstante temperatūrā T un T ir temperatūra Kelvina grādos. Jāpievērš uzmanība ierobežotajam temperatūras diapazonam, kurā Arreniusa sakarība ir derīga, ja transformāciju ietekmē mikrobu darbība.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA

Kaut arī pētījumu veic mākslīgā laboratorijas sistēmā, rezultāti ļauj novērtēt testējamās vielas transformācijas ātrumu un arī transformācijas produktu veidošanās un samazināšanās ātrumu lauka apstākļos (36), (37).

Testējamās vielas transformācijas ceļu pētījums sniedz informāciju par veidu, kā pielietotās vielas struktūra augsnē mainās ķīmiskās un mikrobu reakcijās.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā par testu jāiekļauj.

Testējamā viela:

- vispārpieņemtais nosaukums, ķīmiskais nosaukums, CAS numurs, struktūrformula (norādot marķētā(–o) atoma(–u) stāvokli, ja izmanto radioaktīvi marķētu materiālu) un attiecīgās fizikāli ķīmiskās īpašības (sk. 1.5. punktu);

- testējamās vielas tīrība (piemaisījumi);

- marķēto ķīmisko vielu radioķīmiskā tīrība un īpatnējā aktivitāte (attiecīgā gadījumā).

Standartvielas:

- transformācijas produktu raksturošanai un/vai identifikācijai izmantoto standartvielu ķīmiskais nosaukums un struktūra.

Testa augsnes:

- sīki dati par vākšanas vietu;

- augsnes paraugu ņemšanas datums un procedūra;

- augšņu īpašības, piemēram, pH, organiskā oglekļa saturs, struktūra (% smilšu, % sanešu, % mālu) katjonu apmaiņas spēja, bēruma blīvums, ūdens aiztures raksturojums un mikrobu biomasa;

- augsnes glabāšanas ilgums un glabāšanas apstākļi (ja augsne glabāta)

Testa apstākļi:

- pētījuma norises datumi;

- pielietotās testējamās vielas daudzums;

- testējamās vielas pielietošanas metode un izmantotie šķīdinātāji;

- sākotnēji apstrādātās augsnes svars un katrā analīzes starplaikā ņemto paraugu svars;

- izmantotās inkubācijas sistēmas apraksts;

- gaisa plūsmas ātrumi (tikai caurplūdes sistēmām);

- eksperimentālā veidojuma temperatūra;

- augsnes mitruma saturs inkubācijas laikā;

- mikrobu biomasa aerobā pētījuma sākumā, tā laikā un beigās;

- pH, skābekļa koncentrācija un redokspotenciāls anaerobā un rīsa lauka pētījuma sākumā, tā laikā un beigās;

- ekstrahēšanas metode(–es);

- testējamās vielas un galveno transformācijas produktu kvantitatīvās noteikšanas un identifikācijas metodes augsnē un absorbcijas materiālos;

- atkārtojumu skaits un kontroles mēģinājumu skaits.

Rezultāti:

- mikrobu aktivitātes noteikšanas rezultāts;

- izmantoto analīzes metožu atkārtojamība un jutība;

- atgūstamība (% vērtības derīgam pētījumam ir sniegtas 1.7.1. punktā);

- tabulas ar rezultātiem, kas izteikti kā pielietotās sākuma devas % un attiecīgā gadījumā kā mg.kg–1 augsnes (pamatojoties uz sausu svaru);

- masas bilance pētījuma laikā un beigās;

- neekstrahējamās (saistītās) radioaktivitātes vai atlieku raksturojums augsnē;

- izdalītās CO2 un citu gaistošo savienojumu kvantitatīvā noteikšana;

- testējamās vielas un attiecīgā gadījumā galveno transformācijas produktu koncentrācijas grafika attiecība pret laiku;

- testējamās vielas un attiecīgā gadījumā galveno transformācijas produktu pussabrukšanas periods vai DT50, DT75 un DT90, iekļaujot ticamības robežas;

- abiotiskās noārdīšanās ātruma novērtējums sterilos apstākļos;

- testējamās vielas un attiecīgā gadījumā galveno transformācijas produktu transformācijas kinētikas novērtējums;

- ierosinātie transformācijas ceļi attiecīgā gadījumā;

- rezultātu apspriešana un interpretācija;

- izejas dati (t.i., paraugu hromatogrammas, paraugu transformācijas ātrumu aprēķini un transformācijas produktu identifikācijai izmantotie līdzekļi).

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) US– Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.

(3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EK of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEK concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex HI, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.

(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G:–{}– Behaviour of the product and its metabolites in sou, water and air.

(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4–1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.

(6) ISO/DIS 11266–1 (1994). Soil Quality –Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.

(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.

(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).

(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.

(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123–157.

(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).

(13) T.R. Roberts: Non–extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984).

(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

(15) ISO 10381–6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(16) Annex V to Dir. 67/548/EEK.

(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.

(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.

(22) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG–Verlag, Frankfurt, Main.

(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.

(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215–221.

(25) ISO 14240–1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate–induced respiration method. Part 2: fumigation–extraction method.

(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45–60.

(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio–transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105–120.

(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59–63 (SETAC–Europe).

(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl–Svensson K., Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68–69 (SETAC–Europe).

(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197–200.

(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Fesdegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.

(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181–199.

(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135–172.

(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, 188–204.

(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47–60.

(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non–linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032–1041.

(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83–122.

1 PIELIKUMS

ŪDENS SPRAIGUMS, LAUKA IETILPĪBA (FC) UN ŪDENSIETILPĪBA (WHC) [1]

Ūdens staba augstums [cm] | pF [2] | bar [3] | Komentāri |

107 | 7 | 104 | Sausa augsne |

1,6·104 | 4,2 | 16 | Vīšanas punkts |

104 | 4 | 10 |

103 | 3 | 1 |

6·102 | 2,8 | 0,6 |

3,3·102 | 2,5 | 0,33 [4] | Lauka ietilpības diapazons [5] WHC (tuvinājums) Ūdens piesātināta augsne |

102 | 2 | 0,1 |

60 | 1,8 | 0,06 |

33 | 1,5 | 0,033 |

10 | 1 | 0,01 |

1 | 0 | 0,001 |

Ūdens spraigumu mēra ūdens staba centimetros vai bāros. Uzsūkšanas spraiguma lielā diapazona dēļ to izsaka vienkārši kā pF vērtību, kas ir līdzvērtīga ūdens staba centimetru logaritmam.

Lauka ietilpību nosaka kā ūdens daudzumu, ko dabiska augsne var saglabāt pretī smaguma spēkam 2 dienas pēc ilga lietus perioda vai pēc pietiekamas apūdeņošanas. To nosaka neskartā augsnē in situ laukā. Mērīšana tādēļ nav pielietojama skartiem laboratorijas augsnes paraugiem. Lauka ietilpības (FC) vērtības, kas noteiktas skartās augsnēs, var uzrādīt lielas sistemātiskas atkāpes.

Ūdensietilpību (WHC) nosaka laboratorijā neskartai un skartai augsnei, piesātinot ar ūdeni augsnes kolonnu ar kapilāro pārnesi. Tā ir īpaši noderīga skartām augsnēm, un tā var būt līdz 30 % lielāka par lauka ietilpību.

2. PIELIKUMS

AUGSNES MITRUMA SATURS (g ūdens un 100 g sausas augsnes) DAŽĀDIEM AUGŠŅU TIPIEM NO DAŽĀDĀM VALSTĪM

Augsnes tips | Valsts | Mitruma saturs |

| | WHC [1] | pF = 1,8 | pF = 2,5 |

Smilts | Vācija | 28,7 | 8,8 | 3,9 |

Smilšmālaina smilts | Vācija | 50,4 | 17,9 | 12,1 |

Smilšmālaina smilts | Šveice | 44,0 | 35,3 | 9,2 |

Sanešu smilšmāls | Šveice | 72,8 | 56,6 | 28,4 |

Mālains smilšmāls | Brazīlija | 69,7 | 38,4 | 27,3 |

Mālains smilšmāls | Japāna | 74,4 | 57,8 | 31,4 |

Smilšains smilšmāls | Japāna | 82,4 | 59,2 | 36,0 |

Sanešu smilšmāls | ASV | 47,2 | 33,2 | 18,8 |

Smilšains smilšmāls | ASV | 40,4 | 25,2 | 13,3 |

3. PIELIKUMS

1 – | adatas ventilis; |

2 – | gāzu skalotne, kurā ir ūdens; |

3 – | ultramembrāna (tikai sterilos apstākļos), poru lielums 0,2 μm; |

4 – | augsnes metabolisma pudele (ar stāvošu ūdeni tikai anaerobos un rīsa lauka apstākļos); |

5 – | uztvērējs ar etilēnglikolu gaistošiem organiskiem savienojumiem; |

6 – | uztvērējs ar sērskābi sārmainiem gaistošiem savienojumiem; |

7, 8 | uztvērējs ar nātrija hidroksīdu CO2 un citiem skābiem gaistošiem savienojumiem; |

9 – | plūsmas mērītājs. |

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

(1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123–157.

(2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.

(3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.

C.24. AEROBĀ UN ANAEROBĀ TRANSFORMĀCIJA ŪDENS NOSĒDUMU SISTĒMĀS

1. METODE

Šī testa metode ir ESAO 308. (2002) vadlīnijā noteiktās metodes kopija.

1.1. IEVADS

Ķīmiskās vielas var iekļūt seklos vai dziļos virsmas ūdeņos ar tādiem ievadīšanas veidiem kā tiešā pielietošana, aerosolu pārvietošanās, noplūde, nosusināšana, atkritumu apglabāšana, rūpniecības, mājsaimniecības vai lauksaimniecības notekūdeņi un izgulsnēšanās no atmosfēras. Šī testa metode apraksta laboratorijas metodi organisko ķīmisko vielu aerobās un anaerobās transformācijas novērtēšanai ūdens nosēdumu sistēmās. Tā pamatojas uz esošajām pamatnostādnēm (1), (2), (3), (4), (5), (6). ESAO seminārā par augsnes un nosēdumu atlasi, kas 1995. gadā notika Beldžiratē, Itālijā (7), vienojās jo īpaši par šajā testā izmantojamo augšņu skaitu un tipu. Seminārs arī sniedza ieteikumus attiecībā uz nosēdumu paraugu vākšanu, apstrādi un glabāšanu, pamatojoties uz ISO pamatnostādnēm (8). Tādi pētījumi ir vajadzīgi par ķīmiskajām vielām, ko tieši pielieto ūdenī vai kas varētu nokļūt ūdens vidē iepriekš aprakstītajā veidā.

Dabīgo ūdens nosēdumu sistēmas augšējā ūdens fāzē bieži ir aerobas. Nosēdumu virsmas slānis var būt aerobs vai anaerobs, bet dziļākie nosēdumi parasti ir anaerobi. Lai ietvertu visas minētās iespējas, šajā dokumentā ir aprakstīti gan aerobi, gan anaerobi testi. Aerobais tests simulē aerobu ūdens kolonnu virs aeroba nosēdumu slāņa, zem kura ir anaerobs gradients. Anaerobs tests simulē pilnīgi anaerobu ūdens–nosēdumu sistēmu. Ja apstākļi rāda, ka ir ievērojami jāatkāpjas no šiem ieteikumiem, piemēram, izmantojot neskartas nosēdumu serdes vai nosēdumus, uz ko varētu būt iedarbojusies testējamā viela, attiecīgajam nolūkam ir pieejamas citas metodes (9).

1.2. DEFINĪCIJAS

Visos gadījumos jālieto Starptautiskās mērvienību sistēmas (SI) vienības.

Testējamā viela – jebkura viela, vai nu izejas savienojums, vai arī attiecīgie transformācijas produkti.

Transformācijas produkti – visas vielas, kas rodas testējamās vielas biotiskās vai abiotiskās transformācijas reakcijās, iekļaujot CO2 un saistītās nogulsnes.

Saistītās nogulsnes – "saistītās nogulsnes" ir vielas augsnē, augos vai dzīvniekos, kuras ir noturīgas matricā izejas savienojuma vai tā metabolītu veidā pēc ekstrakcijas. Ekstrakcijas metode nedrīkst būtiski mainīt pašus savienojumus vai matricas struktūru. Saistības veidu var noskaidrot daļēji ar matricu mainošām ekstrakcijas metodēm un sarežģītām analīzes metodēm. Līdz šim, piemēram, šādā veidā ir identificētas kovalentās, jonu un sorbcijas saites, kā arī ieslēgumi. Parasti saistīto nogulšņu veidošanās ievērojami samazina bioloģisko pieejamību un bioloģiski pieejamo daudzumu (10) [Starptautiskā teorētiskās un lietišķās ķīmijas savienība – modificēts 1984. gadā (11)].

Aerobā transformācija – (oksidējošā) – reakcijas, kas notiek molekulārā skābekļa klātbūtnē (12).

Anaerobā transformācija – (reducējošā) – reakcijas, kas notiek, izslēdzot molekulārā skābekļa klātbūtni (12).

Dabīgie ūdeņi – virsmas ūdeņi, iegūti no dīķiem, upēm, strautiem utt.

Nosēdumi – neorganisku un organisku ķīmisko sastāvdaļu maisījums, pēdējās minētās satur savienojumus ar lielu oglekļa un slāpekļa saturu un lielu molekulsvaru. Tos izgulsnē dabīgie ūdeņi, un tie veido saskari ar attiecīgo ūdeni.

Mineralizācija – pilnīga organisko savienojumu noārdīšanās līdz CO2 un H2O aerobos apstākļos un līdz CH4, CO2 un H2O anaerobos apstākļos. Šīs testa metodes kontekstā, ja izmanto radioaktīvi marķētu savienojumu, mineralizācija nozīmē intensīvu molekulas noārdīšanos, kuras laikā marķētā oglekļa atomi kvantitatīvi oksidējas vai reducējas, izdalot attiecīgu daudzumu 14CO2 vai 14CH4.

Pussabrukšanas periods, t0,5 – laiks, kas vajadzīgs, lai transformētu 50 % testējamās vielas, ja transformāciju var aprakstīt pirmās kārtas kinētika; tas nav atkarīgs no sākotnējās koncentrācijas.

DT50 (izzušanas laiks 50) – laiks, kurā testējamās vielas sākotnējā koncentrācija samazinās par 50 %.

DT75 (izzušanas laiks 75) – laiks, kurā testējamās vielas sākotnējā koncentrācija samazinās par 75 %.

DT90 (izzušanas laiks 90) – laiks, kurā testējamās vielas sākotnējā koncentrācija samazinās par 90 %.

1.3. STANDARTVIELAS

Standartvielas jāizmanto transformācijas produktu identifikācijai un kvantitatīvai noteikšanai ar spektroskopijas un hromatogrāfijas metodēm.

1.4. INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO VIELU

Transformācijas ātruma mērīšanai var izmantot nemarķētas vai ar izotopiem marķētas vielas, kaut arī priekšroka ir marķētam materiālam. Marķēts materiāls ir vajadzīgs, lai pētītu transformācijas ceļu un noteiktu masas bilanci. Ir ieteicama marķēšana ar 14C, bet noderīga var būt arī citu izotopu, tādu kā 13C, 15N, 3H, 32P izmantošana. Cik iespējams, marķējums jānovieto molekulas stabilākajā(–ās) daļā(–ās) [8]. Testējamās vielas ķīmiskajai un/vai radioķīmiskajai tīrībai jābūt vismaz 95 %.

Pirms testa izdarīšanas ir vajadzīga šāda informācija par testējamo vielu:

a) šķīdība ūdenī (A.6. metode);

b) šķīdība organiskajos šķīdinātājos;

c) tvaika spiediens (A.4. metode) un Henrija likuma konstante;

d) sadalījuma koeficients sistēmā n–oktanols/ūdens (A.8. metode);

(e) adsorbcijas koeficients (attiecīgā gadījumā Kd, Kf vai Koc) (C.18. metode);

f) hidrolīze (C.7. metode);

g) disociācijas konstante (pKa) [ESAO 112. vadlīnija] (13);

h) testējamās vielas ķīmiskā struktūra un attiecīgā gadījumā marķētā(–o) izotopa(–u) vieta(–as).

Piezīme.

Ir jāreģistrē temperatūra, kādā minētie mērījumi izdarīti.

Cita noderīga informācija var iekļaut datus par testējamās vielas toksicitāti mikroorganismiem, datus par vieglu un/vai potenciālu bioloģisko noārdīšanos un aerobu un anaerobu transformāciju augsnē.

Jābūt pieejamām analīzes metodēm (iekļaujot ekstrakciju un attīrīšanas metodes) testējamās vielas un tās transformācijas produktu kvantitatīvai noteikšanai un identifikācijai ūdenī un nosēdumos (sk. 1.7.2. punktu).

1.5. TESTA METODES PRINCIPS

Šajā testā aprakstītā metode izmanto aerobu un anaerobu ūdens nosēdumu sistēmu (sk. 1. pielikumu), kas ļauj:

i) mērīt testējamās vielas transformācijas ātrumu ūdens–nosēdumu sistēmā;

ii) mērīt testējamās vielas transformācijas ātrumu nosēdumos;

iii) mērīt testējamās vielas un/vai tās transformācijas produktu mineralizācijas ātrumu (ja izmanto ar 14C marķētu testējamo vielu);

iv) identificēt un kvantitatīvi noteikt transformācijas produktus ūdens un nosēdumu fāzē, iekļaujot masas bilanci (ja izmanto ar 14C marķētu testējamo vielu);

v) mērīt testējamās vielas un tās transformācijas produktu sadalījumu starp abām fāzēm inkubācijas perioda laikā tumsā (lai izvairītos, piemēram, no aļģu ziedēšanas) nemainīgā temperatūrā. Ja dati atļauj, nosaka pussabrukšanas periodus, DT50, DT75 un DT90 vērtības, bet tās nedrīkst ekstrapolēt tālu aiz eksperimenta laika posma (sk. 1.2. punktu).

Vismaz divi nosēdumi un ar tiem saistītie ūdeņi ir vajadzīgi attiecīgi aerobajam un anaerobajam pētījumam 7. Tomēr var būt gadījumi, kad jāizmanto vairāk par diviem ūdens nosēdumiem, piemēram, ķīmiskai vielai, kas var būt klāt saldūdens un/vai jūras vidē.

1.6. TESTA DERĪGUMS

Metode parasti ir derīga ķīmiskajām vielām (nemarķētām vai radioaktīvi marķētām), kurām ir pieejama pietiekami precīza un jutīga analīzes metode. Tā ir derīga nedaudz gaistošiem, negaistošiem, ūdenī šķīstošiem vai ūdenī slikti šķīstošiem savienojumiem. Tests nav jāpielieto ķīmiskajām vielām, kas ir ļoti gaistošas attiecībā uz ūdeni (piem., fumigantiem, organiskajiem šķīdinātājiem) un tādēļ šā testa eksperimenta apstākļos nav saglabājamas ūdenī un/vai nosēdumos.

Metode līdz šim ir pielietota ķīmisko vielu transformācijas pētījumiem saldūdeņos un nosēdumos, bet principā to var pielietot arī grīvas/jūras sistēmām. Tā nav piemērota, lai simulētu apstākļus tekošā ūdenī (piem., upēs) vai atklātā jūrā.

1.7. KVALITĀTES KRITĒRIJI

1.7.1. Atgūstamība

Vismaz ūdens un nosēdumu paraugu dublikātu ekstrahēšana un analīze tieši pēc testējamās vielas pievienošanas dod pirmo norādi par analīzes metodes atkārtojamību un pielietojamās procedūras vienādību testējamai vielai. Atgūstamību eksperimentu vēlākiem posmiem iegūst no attiecīgajām masas bilancēm (ja izmanto marķētu materiālu). Atgūstamībai jābūt diapazonā no 90 % līdz 110 % marķētām ķīmiskām vielām6 un no 70 % līdz 110 % nemarķētām ķīmiskām vielām.

1.7.2. Analīzes metodes atkārtojamība un jutība

Analīzes metodes atkārtojamību (izņemot sākotnējās ekstrahēšanas efektivitāti) testējamās vielas un transformācijas produktu kvantitatīvā noteikšanā var pārbaudīt ar transformācijas produktu veidošanai pietiekami ilgi inkubēta viena un tā paša ūdens vai nosēdumu parauga ekstrakta dublikātu analīzēm.

Analītiskās metodes kvalitatīvās noteikšanas robežai (KNR) attiecībā uz testējamo vielu un transformācijas produktiem jābūt vismaz 0,01 mg.kg–1 ūdenī vai nosēdumos (kā testējamai vielai) vai 1 % no testa sistēmai pielietotās devas, atkarībā no tā, kurš lielums ir mazāks. Ir jānorāda arī kvantitatīvās noteikšanas robeža (LOQ).

1.7.3. Transformācijas datu precizitāte

Testējamās vielas koncentrācijas kā laika funkcijas regresijas analīze sniedz attiecīgu informāciju par transformācijas līknes precizitāti un ļauj aprēķināt pussabrukšanas perioda ticamības robežas (pseido pirmās kārtas kinētikas gadījumā) vai DT50 vērtības un attiecīgā gadījumā DT75 un DT90 vērtības.

1.8. METODES APRAKSTS

1.8.1. Testa sistēma un aparatūra

Pētījums jāizdara stikla tvertnēs (piem., pudelēs, centrifūgas stobriņos), ja vien iepriekšējā informācija (tāda kā sadalījuma koeficients sistēmā n–oktanols–ūdens, sorbcijas dati utt.) nenorāda, ka testējamā viela var pielipt stiklam, tādā gadījumā var apsvērt alternatīva materiāla (tāda kā teflons) izmantošana. Ja ir zināms, ka testējamā viela pielīp stiklam, var būt iespējams šo problēmu samazināt, izmantojot vienu no šādām metodēm:

- noteikt uz stikla sorbēto testējamās vielas un transformācijas produktu masu;

- nodrošināt visu stikla priekšmetu mazgāšanu ar šķīdinātāju testa beigās;

- izmantot preparātus (sk. arī 1.9.2. punktu);

- testējamās vielas pievienošanai sistēmā izmantot palielinātu daudzumu palīgšķīdinātāja; ja izmanto palīgšķīdinātāju, tam jābūt tādam, kas neizraisa testējamās vielas solvolīzi.

Parasto testa aparātu piemēri, t.i., gāzes plūsmas un biometra tipa sistēmas, attiecīgi ir parādīti 2. un 3. pielikumā (14). Citas noderīgas inkubācijas sistēmas ir aprakstītas 15. norādē. Eksperimentālā aparāta konstrukcijai ir jāļauj apmainīties gaisam vai slāpeklim un uztvert gaistošos produktus. Aparāta izmēriem jābūt tādiem, lai tie atbilstu testa prasībām (sk. 1.9.1. punktu). Vēdināšanu var nodrošināt, lēni burbuļojot vai laižot pāri ūdens virsmai gaisu vai slāpekli. Pēdējā minētā gadījumā, lai būtu labākas skābekļa vai slāpekļa sadalījums, var ieteikt no augšas lēni maisīt ūdeni. Nav jāizmanto CO2 nesaturošs gaiss, jo tas var izraisīt ūdens pH palielinājumu. Katrā gadījumā nosēdumu traucēšana ir nevēlama, un no tās iespējami jāizvairās. Nedaudz gaistošas ķīmiskās vielas ir jātestē biometra tipa sistēmā, lēni maisot ūdens virsmu. Var izmantot arī noslēgtas tvertnes, kuru brīvajā telpā ir atmosfēras gaiss vai slāpeklis un iekšējie stobriņi gaistošo produktu uztveršanai (16). Aerobā testā ir regulāri jāapmaina brīvās telpas gāze, lai kompensētu biomasas patērēto skābekli.

Piemēroti uztvērēji gaistošo transformācijas produktu savākšanai iekļauj 1 mol.dm–3 kālija hidroksīda vai nātrija hidroksīda šķīdumus oglekļa dioksīdam [9] un etilēnglikolu, etanolamīnu vai 2 % parafīnu ksilolā organiskajiem savienojumiem, bet ar to nav ierobežoti. Anaerobos apstākļos radušās gaistošās vielas, tādas kā metāns, var savākt, piemēram, ar molekulārajiem sietiem. Tādas vielas var sadedzināt, piemēram, līdz CO2, laižot gāzi 900 °C temperatūrā caur kvarca cauruli, kas pildīta ar CuO, un uztverot radušos CO2 absorberā ar sārmu (17).

Testējamās vielas un transformācijas produktu ķīmiskajai analīzei ir vajadzīgas laboratorijas iekārtas (piem., gāzu–šķidruma hromatogrāfija (GŠH), augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC), plānslāņa hromatogrāfija (TLC), masspektrosmetrija (MS), šķidruma hromatogrāfija–masspektrometrija (LC–MS), kodolmagnētiskā rezonanse (KMR) utt.), attiecīgā gadījumā iekļaujot atklāšanas sistēmas radioaktīvi marķētām vai nemarķētām ķīmiskām vielām. Ja izmanto radioaktīvi marķētu materiālu, vajadzīgs ir arī šķidruma scintilāciju skaitītājs un sadegšanas oksidēšanas iekārta (nosēdumu paraugu sadedzināšanai pirms radioaktivitātes analīzes).

Attiecīgā gadījumā ir vajadzīgs cits standarta laboratorijas aprīkojums fizikāli ķīmiskajām un bioloģiskajām noteikšanām (sk. 1.8.2.2. punkta 1. tabulu), stikla priekšmeti, ķīmiskās vielas un reaģenti.

1.8.2. Ūdens nosēdumu atlase un skaits

Paraugu ņemšanas vietas izraugās saskaņā ar testa nolūku konkrētajā situācijā. Izraugoties paraugu ņemšanas vietas, jāņem vērā iespējamie agrākie lauksaimniecības, rūpniecības un mājsaimniecības ieguldījumi ieplūdes vietā un augstāk pa straumi. Nosēdumi nav jāizmanto, ja tie ar testējamo vielu vai tās struktūras analogiem ir bijuši piesārņoti iepriekšējo 4 gadu laikā.

1.8.2.1. Nosēdumu atlase

Aerobiem pētījumiem parasti izmanto divus nosēdumus (7). Abiem atlasītajiem nosēdumiem jāatšķiras attiecībā uz organiskā oglekļa saturu un struktūru. Vienam no nosēdumiem jābūt ar lielu organiskā oglekļa saturu (2,5 – 7,5 %) un smalku struktūru, otram jābūt ar mazu organiskā oglekļa saturu (0,5 – 2,5 %) un rupju struktūru. Organiskā oglekļa saturu atšķirībai parasti jābūt vismaz 2 %. "Smalka struktūra" ir noteikta kā [mālu + sanesu] [10] saturs > 50 % un "rupja struktūra" ir noteikta kā [mālu + sanesu] saturs < 50 %. Abu nosēdumu [mālu + sanesu] satura atšķirībai parasti jābūt vismaz 20 %. Ja ķīmiskā viela var nokļūt arī jūras ūdenī, vismaz vienai ūdens–nosēdumu sistēmai jābūt jūras izcelsmes.

Stingri anaerobā pētījumā divi nosēdumi (iekļaujot ar tiem saistītos ūdeņus) ir jāņem no virsmas ūdeņu anaerobajām zonām (7). Ar nosēdumu un ūdens fāzēm jārīkojas un tās jāpārved uzmanīgi, izslēdzot skābekļa piekļuvi.

Nosēdumu atlasē var būt svarīgi citi rādītāji, un tie jāapsver katrā atsevišķā gadījumā. Piemēram, nosēdumu pH diapazons ir svarīgs, testējot ķīmiskās vielas, kuru transformācija un/vai sorbcija var būt atkarīga no pH. Sorbcijas atkarība no pH var atspoguļoties testējamās vielas pKa.

1.8.2.2. Ūdens–nosēdumu paraugu raksturošana

Galvenie rādītāji, kas jāmēra un jāreģistrē (norādot izmantoto metodi) par ūdeni un nosēdumiem, un testa posms, kurā attiecīgie rādītāji ir jānosaka, ir apkopoti turpmākajā tabulā. Informācijai – attiecīgo rādītāju noteikšanas metodes ir iekļautas literatūras sarakstā 18, 19, 20, 21.

Turklāt katrā atsevišķā gadījumā var būt jāmēra un jāreģistrē citi rādītāji (piem., saldūdenim – daļiņas, sārmainība, cietība, vadītspēja, NO3/PO4 (attiecība un individuālās vērtības); nosēdumiem – katjonu apmaiņas spēja, ūdensietilpība, karbonāts, kopējais slāpeklis un fosfors; jūras sistēmām – sāļums). Arī nitrāta, sulfāta, bioloģiski pieejamās dzelzs un, iespējams, citu elektronakceptoru analīze nosēdumos un ūdenī var būt noderīga, novērtējot redoksapstākļus, jo īpaši saistībā ar anaerobo transformāciju.

Rādītāju mērīšana ūdens–nosēdumu paraugu raksturošanai (7), (22), (23)

Rādītājs | Testa procedūras posms |

paraugu ņemšana laukā | pēcapstrāde | aklimatizācijas sākums | testa sākums | testa laikā | testa beigas |

Ūdens

Izcelsme/avots | X | | | | | |

Temperatūra | X | | | | | |

pH | X | | X | X | X | X |

Kopējais organiskais ogleklis (TOC) | | | X | X | | X |

O2 koncentrācija [11] | X | | X | X | X | X |

Redokspotenciāls [11] | | | X | X | X | X |

Nosēdumi

Izcelsme/avots | X | | | | | |

Slāņa dziļums | X | | | | | |

pH | | X | X | X | X | X |

Daļiņu lieluma sadalījums | | X | | | | |

Kopējais organiskais ogleklis (TOC) | | X | X | X | | X |

Mikrobu biomasa [12] | | X | | X | | X |

Redokspotenciāls [11] | Novērojumi (krāsa/smarža) | | X | X | X | X |

1.8.3. Savākšana, apstrāde un glabāšana

1.8.3.1. Savākšana

Nosēdumu savākšanā jāizmanto ISO pamatnostādņu projekts par nosēdumu paraugu vākšanu (8). Nosēdumu paraugi jāņem no visa augšējā 5 līdz 10 cm bieza nosēdumu slāņa. Saistītais ūdens jāvāc no tās pašas vietas un tajā pašā laikā kā nosēdumi. Anaerobam pētījumam nosēdumi un saistītais ūdens jāņem un jāpārved, izslēdzot skābekļa piekļuvi (28) (sk. 1.8.2.1. punktu). Dažas paraugu ņemšanas ierīces ir aprakstītas literatūras sarakstā (8), (23).

1.8.3.2. Apstrāde

Nosēdumus filtrējot atdala no ūdens, un nosēdumus mitrus sijā caur 2 mm sietu, izmantojot no tās pašas vietas ņemtā ūdens pārākumu, ko pēc tam izlej. Pēc tam nosēdumu un ūdens zināmus daudzumus sajauc vēlamajā attiecībā (sk. 1.9.1. punktu) inkubācijas kolbās un sagatavo aklimatizācijas periodam (sk. 1.8.4. punktu). Anaerobā pētījumā visi apstrādes posmi jāveic, izslēdzot skābekļa piekļuvi (29), (30), (31), (32), (33).

1.8.3.3. Glabāšana

Ir ļoti ieteicami izmantot svaigi ņemtus nosēdumu un ūdens paraugus, bet, ja glabāt ir nepieciešami, nosēdumi un ūdens ir jāizlaiž caur sietu, kā aprakstīts iepriekš, un jāglabā kopā piesātināti ar ūdeni (6 – 10 cm biezs ūdens slānis) tumsā, 4 ± 2 °C [13] temperatūrā maksimāli 4 nedēļas (7), (8), (23). Aerobos pētījumos izmantojamie paraugi jāglabā ar brīvu gaisa piekļuvi (piem., vaļējās tvertnēs), bet anaerobos pētījumos izmantojamie paraugi jāglabā, izslēdzot gaisa piekļuvi. Pārvadāšanas un glabāšanas laikā nosēdumi un ūdens nedrīkst sasalt un izžūt.

1.8.4. Nosēdumu/ūdens paraugu sagatavošana testam

Pirms testējamās vielas pievienošanas jābūt aklimatizācijas periodam, kad katrs nosēdumu/ūdens paraugs ir ievietots inkubācijas tvertnē, ko izmantos galvenajā testā, un aklimatizācija jāveic tieši tādos pašos apstākļos kā testa inkubēšana (sk. 1.9.1. punktu). Aklimatizācijas periods ir laiks, kas vajadzīgs sistēmas pieņemamas stabilitātes sasniegšanai, ko atspoguļo pH, skābekļa koncentrācija ūdenī, nosēdumu un ūdens redokspotenciāls un fāzu makroskopiskā atdalīšanās. Parasti aklimatizācijas periodam jāilgst no vienas līdz divām nedēļām, un tas nedrīkst pārsniegt četras nedēļas. Minētā perioda laikā veikto noteikšanu rezultāti ir jāreģistrē.

1.9. TESTA NORISE

1.9.1. Testa apstākļi

Tests jāizdara inkubēšanas aparātā (sk. 1.8.1. punktu) ar ūdens–nosēdumu tilpuma attiecību no 3:1 līdz 4:1 un ar 2,5 cm (± 0,5 cm) biezu nosēdumu slāni. Minimālais ieteicamais nosēdumu daudzums uz inkubēšanas tvertnes ir 50 g (pamatojoties uz sausu svaru).

Tests jāizdara tumsā nemainīgā temperatūrā no 10 līdz 30 °C diapazonā. Piemērota temperatūra ir (20 ± 2) °C. Attiecīgā gadījumā var apsvērt papildu zemāku temperatūru (piem., 10 °C) katrā atsevišķā gadījumā atkarībā no informācijas, kas jāiegūst testā. Inkubēšanas temperatūra ir jāuzrauga un jāreģistrē.

1.9.2. Testējamās vielas apstrāde un pielietošana

Izmanto vienu ķīmiskās vielas testa koncentrāciju [14]. Kultūraugu aizsardzības ķīmiskajām vielām, ko tieši pielieto ūdens struktūrās, maksimālā deva, kas ir uz etiķetes, jāuzskata par maksimālo lietojuma devu, ko aprēķina, pamatojoties uz ūdens virsmas laukumu testa tvertnē. Visos citos gadījumos izmantojamā koncentrācija jāpamato uz prognozēm no emisijām vidē. Jāpievērš vērība, lai nodrošinātu, ka tiek pielietota atbilstoša testējamās vielas koncentrācija transformācijas ceļu un transformācijas produktu veidošanās un samazināšanās raksturošanai. Var būt nepieciešams pielietot lielākas devas (piem., 10 reižu) situācijās, kad testējamās vielas koncentrācijas ir tuvas noteikšanas robežai pētījuma sākumā un/vai kad galvenos transformācijas produktus nevar viegli noteikt, kaut arī to daļa ir 10 % no testējamās vielas lietojuma devas. Tomēr, ja izmanto lielākas testa koncentrācijas, tām nedrīkst būt ievērojama kaitīga iedarbība uz ūdens–nosēdumu sistēmas mikrobu aktivitāti. Lai sasniegtu nemainīgu testējamās vielas koncentrāciju dažādu izmēru tvertnēs, var apsvērt, vai nav lietderīgi pielietojamā materiāla daudzumu koriģēt, pamatojoties uz ūdens staba dziļumu tvertnē attiecībā pret ūdens dziļumu laukā (ko pieņem par 100 cm, bet var izmantot citu dziļumu). Aprēķina piemēru sk. 4. pielikumā.

Ideālā gadījumā testējamā viela jāpielieto kā ūdens šķīdums testa sistēmas ūdens fāzē. Ja no tā nevar izvairīties, testējamās vielas pielietošanai un izplatīšanai ir atļauts lietot mazus daudzumus ar ūdeni sajaucamu šķīdinātāju (tādu kā acetons, etanols), bet tie nedrīkst pārsniegt 1 % tilp./tilp. un tiem nedrīkst būt kaitīga iedarbība uz testa sistēmas mikrobu aktivitāti. Jārīkojas uzmanīgi, veidojot testējamās vielas ūdens šķīdumu – var būt piemēroti izmantot šķīduma veidošanas kolonnas un iepriekšēju maisīšanu, lai nodrošinātu pilnīgu viendabīgumu. Pēc ūdens šķīduma pievienošanas testa sistēmai ir ieteicams uzmanīgi maisīt ūdens fāzi, iespējami maz skarot nosēdumus.

Preparātu izmantošana parasti nav ieteicama, jo preparāta sastāvdaļas var ietekmēt testējamās vielas un/vai transformācijas produktu sadalījumu starp ūdens un nosēdumu fāzēm. Tomēr slikti šķīstošām testējamām vielām preparātu izmantošana var būt piemērota alternatīva.

Inkubācijas tvertņu skaits ir atkarīgs no paraugu ņemšanas reižu skaita (sk. 1.9.3. punktu). Ir jāiekļauj pietiekams testa sistēmu skaits, lai katrā paraugu ņemšanas reizē varētu iztērēt divas sistēmas. Izmantojot katras ūdens nosēdumu sistēmas kontroles vienības, tās nav jāapstrādā ar testējamo vielu. Kontroles vienības var izmantot, lai noteiktu nosēdumu mikrobu biomasu un ūdens un nosēdumu kopējo organisko oglekli pētījuma beigās. Divas no kontroles vienībām (t.i., vienu kontroles vienību katram ūdens nosēdumam) var izmantot, lai pārraudzītu vajadzīgos rādītājus nosēdumos un ūdenī aklimatizācijas periodā (sk. tabulu 1.8.2.2. punktā). Divas papildu kontroles vienības ir jāiekļauj, ja testējamo vielu pielieto, izmantojot šķīdinātāju, lai izmērītu kaitīgo iedarbību uz testa sistēmas mikrobu aktivitāti.

1.9.3. Testa ilgums un paraugu ņemšana

Eksperimenta ilgumam parasti nav jāpārsniedz 100 dienas (6), un tam jāturpinās, līdz ir noskaidrots noārdīšanās ceļš un sadalījuma modelis sistēmā ūdens–nosēdumi vai kad 90 % testējamās vielas ir izkliedēti transformējoties un/vai gaistot. Paraugu ņemšanas reizēm jābūt vismaz sešām (iekļaujot nulles reizi) ar neobligātu priekšpētījumu (sk. 1.9.4. punktu), ko izmanto piemērota paraugu ņemšanas režīma un testa ilguma izveidošanai, ja vien pietiekami dati par testējamo vielu nav pieejami no iepriekšējiem pētījumiem. Hidrofobām testējamām vielām pētījuma sākumposmā var būt vajadzīgas papildu paraugu ņemšanas reizes, lai noteiktu sadalījuma attiecību starp ūdens un nosēdumu fāzēm.

Piemērotās paraugu ņemšanas reizēs analīzei izņem visu inkubācijas tvertņu (ar atkārtojuma tvertni). Nosēdumus un virs tiem esošo ūdeni analizē atsevišķi [15]. Virsmas ūdens ir uzmanīgi jāatdala, iespējami maz skarot nosēdumus. Testējamās vielas un transformācijas produktu ekstrakcija un raksturošana jāizdara, ievērojot atbilstošās analīzes procedūras. Jārūpējas, lai noņemtu materiālu, kas varētu būt adsorbējies uz inkubācijas tvertnes vai uz savienotājiem cauruļvadiem, kurus izmanto gaistošo vielu uztveršanai.

1.9.4. Neobligāts iepriekšējais tests

Ja ilgumu un paraugu ņemšanas režīmu nevar novērtēt no citiem attiecīgajiem pētījumiem ar testējamo vielu, var uzskatīt par atbilstošu neobligātu iepriekšējo testu, kas jāizdara tādos pašos testa apstākļos kā galīgajam pētījumam paredzētie. Īsi jāreģistrē attiecīgie iepriekšējā testa eksperimenta apstākļi un rezultāti, ja veic iepriekšējo testu.

1.9.5. Mērījumi un analīze

Katrā paraugu ņemšanas reizē ir jāmēra un jāreģistrē testējamās vielas un transformācijas produktu koncentrācija (kā pielietotā koncentrācija un kā procentuālais daudzums). Parasti ir jāidentificē transformācijas produkti, kas konstatēti pie ≥ 10 % no pielietotās radioaktivitātes kopējā ūdens–nosēdumu sistēmā jebkurā paraugu ņemšanas reizē, ja nav pienācīgi pamatots citādi. Jāapsver arī to transformācijas produktu identificēšana, kuru koncentrācija pētījuma laikā nepārtraukti palielinās, pat ja to koncentrācijas nepārsniedz iepriekš norādītās robežas, jo tas var norādīt uz noturību. Pēdējā minētā jāapsver katrā atsevišķā gadījumā, pārskatā sniedzot pamatojumu.

Katrā paraugu ņemšanas reizē ir jāreģistrē gāzu/gaistošo vielu (CO2 un citu, t.i., gaistošo organisko savienojumu) uztveršanas sistēmu rezultāti Jāreģistrē mineralizācijas ātrumi. Katrā paraugu ņemšanas reizē jāreģistrē neekstrahējamās (saistītās) nogulsnes nosēdumos.

2. IEGŪTIE DATI

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE

Katrā paraugu ņemšanas reizē jāaprēķina kopējā masas bilance vai pievienotās radioaktivitātes atgūstamība (sk. 1.7.1. punktu). Rezultāti jāreģistrē kā pievienotās radioaktivitātes procenti. Katrā paraugu ņemšanas reizē jāreģistrē radioaktivitātes sadalījums starp ūdeni un nosēdumiem kā koncentrācija un procentuālais daudzums.

Jāaprēķina testējamās vielas pussabrukšanas periods, DT50 un attiecīgā gadījumā DT75 un DT90 ar to ticamības robežām (sk. 1.7.3. punktu). Informāciju par testējamās vielas izkliedēšanās ātrumu ūdenī un nosēdumos var iegūt, izmantojot attiecīgus vērtēšanas rīkus. Tie var būt diapazonā no pseido pirmās kārtas kinētikas pielietošanas, empīriskas līknes pielāgošanas metodes, kas izmanto grafiskus vai skaitliskus risinājumus, līdz sarežģītākiem pieņēmumiem, kas izmanto, piemēram, viena vai vairāku nodalījumu modeļus. Sīkākus datus var iegūt attiecīgajā literatūras sarakstā (35), (36), (37).

Visām pieejām ir stiprās un vājās puses un ievērojamas atšķirības sarežģītībā. Pieņēmums par pirmās kārtas kinētiku var būt noārdīšanās un sadalījuma procesu pārāk liels vienkāršojums, bet, ja iespējams, sniedz terminu (ātruma konstanti vai pussabrukšanas periodu), kas ir viegli saprotams un vērtīgs simulācijas modelēšanā un paredzamo vides koncentrāciju aprēķinos. Empīriskās pieejas vai lineārās transformācijas var sniegt labāku līkņu atbilstību datiem un tādēļ dot iespēju labāk novērtēt pussabrukšanas periodus, DT50 un attiecīgā gadījumā DT75 un DT90 vērtības. Atvasināto konstanšu lietojums tomēr ir ierobežots. Ar nodalījumu modeļiem var iegūt riska novērtēšanai vairākas noderīgas konstantes, kas apraksta noārdīšanās ātrumu dažādos nodalījumos un ķīmiskās vielas sadalījumu. Tie arī jāizmanto galveno transformācijas produktu rašanās un noārdīšanās ātruma konstanšu noteikšanai. Visos gadījumos izraudzītā metode ir jāpamato, un eksperimentatoram grafiski un/vai statistiski jāparāda, cik labi tā piemērota.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU

Pārskatā jāiekļauj šāda informācija.

Testējamā viela:

- vispārpieņemtais nosaukums, ķīmiskais nosaukums, CAS numurs, struktūrformula (norādot marķējuma(–u) vietu, ja izmanto radioaktīvi marķētu materiālu) un attiecīgās fizikāli ķīmiskās īpašības;

- testējamās vielas tīrība (piemaisījumi);

- marķēto ķīmisko vielu radioķīmiskā tīrība un īpatnējā aktivitāte (attiecīgā gadījumā).

Standartvielas:

- transformācijas produktu raksturošanai un/vai identifikācijai izmantoto standartvielu ķīmiskais nosaukums un struktūra.

Testa nosēdumi un ūdeņi:

- ūdens nosēdumu paraugu ņemšanas vietas(–u) atrašanās un apraksts, iekļaujot, ja iespējams, piesārņošanas vēsturi;

- visa informācija par ūdens–nosēdumu sistēmas vākšanu, glabāšanu (ja tā notikusi) un aklimatizāciju;

- ūdens–nosēdumu paraugu raksturojums, kā uzskaitīts 1.8.2.2. punkta tabulā.

Testa apstākļi:

- izmantotā testa sistēma (piem., caurplūdes, biometra, ventilācijas veids, kratīšanas metode, ūdens tilpums, nosēdumu masa, ūdens slāņa un nosēdumu slāņa biezums, testa tvertņu izmēri utt.);

- testējamās vielas pielietošana testa sistēmā – izmantotā testa koncentrācija, atkārtojumu un kontroles mēģinājumu skaits, testējamās vielas pielietošanas veids (piem., šķīdinātāja izmantošana, ja to izmanto) utt;

- inkubēšanas temperatūra;

- paraugu ņemšanas reizes;

- ekstrakcijas metodes un to efektivitāte, kā arī analīzes metodes un noteikšanas robežas;

- transformācijas produktu raksturošanas/identifikācijas metodes;

- novirzes no testa protokola vai testa apstākļiem pētījuma laikā.

Rezultāti:

- reprezentatīvu analīžu izejas dati skaitļos (visi izejas dati jāglabā labas laboratorijas prakses arhīvā);

- izmantoto analīzes metožu atkārtojamība un jutība;

- atgūstamība (% vērtības derīgam pētījumam ir sniegtas 1.7.1. punktā);

- tabulas ar rezultātiem, kas izteikti kā pielietotās devas % un kā mg.kg–1 ūdenī, nosēdumos un visā sistēmā (tikai %) testējamai vielai un attiecīgā gadījumā transformācijas produktiem un neekstrahējamai radioaktivitātei;

- masas bilance pētījuma laikā un beigās;

- transformācijas grafiskais attēlojums ūdens un nosēdumu frakcijās un visā sistēmā (iekļaujot mineralizāciju);

- mineralizācijas ātrumi;

- testējamās vielas un attiecīgā gadījumā galveno transformācijas produktu pussabrukšanas periods, DT50 un attiecīgā gadījumā DT75 un DT90 vērtības ūdenī, nosēdumos un visā sistēmā, iekļaujot ticamības robežas;

- testējamās vielas un attiecīgā gadījumā galveno transformācijas produktu transformācijas kinētikas novērtējums;

- ierosinātie transformācijas ceļi attiecīgā gadījumā;

- rezultātu apspriešana.

4. LITERATŪRAS SARAKSTS

(1) BBA–Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5–1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.

(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.

(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United–Kingdom.

(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada, lpp.35–37.

(5) US–EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162–3, Anaerobic aquatic metabolism.

(6) SETAC–Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC–Europe, Brussels.

(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.

(8) ISO/DIS 5667–12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.

(9) US–EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712–C–98–080.

(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley–VCH (1998).

(11) T.R. Roberts: Non–extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984).

(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994–2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B–4, 149–158.

(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85–114. J. Wiley & Sons.

(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non–ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631–637.

(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C–labelled model surfactants. Water Research 21, 661–667.

(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.

(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.

(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.

(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038–1039.

(22) SETAC–Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop "A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests", 3–4 July 1991.

(23) SETAC–Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8–10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.

(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858–2868.

(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329–338.

(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively–metabolising microbial populations under in–situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197–203.

(27) ISO–14240–2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation–extraction method.

(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13–21.

(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850–857.

(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber,]., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527–1550.

(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499–1509.

(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C–radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597–3603.

(33) US–EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712–C–98–090.

(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961–968.

(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187–203.

(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60.

(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, lpp. 1349–1354.

[1] Piemēram, ja testējamās vielas molekulā ir viens gredzens, ir nepieciešams marķējums gredzenā; ja testējamās vielas molekulā ir divi vai vairāki gredzeni, var būt vajadzīgi atsevišķi pētījumi, lai novērtētu, kas notiek ar katru marķēto gredzenu, un lai iegūtu piemērotu informāciju par transformācijas produktu veidošanos.

[2] Augsnes ūdens aiztures īpašības var izmērīt kā lauka ietilpību, kā ūdensietilpību vai kā ūdens uzsūkšanas spraigumu (pF). Paskaidrojumus sk. 1. pielikumā. Pārskatā par testu ir jānorāda, vai augšņu ūdens aiztures īpašības un beramais blīvums ir noteikts neskartos lauka paraugos vai skartos (apstrādātos) paraugos.

[3] Jaunākie pētījumu rezultāti norāda uz to, ka mēreno zonu augsnes arī var glabāt – 20 °C temperatūrā ilgāk par trim mēnešiem (28), (29), ievērojami nezūdot mikrobu aktivitātei.

[4] Augsne nedrīkst būt pārāk mitra vai pārāk sausa, lai saglabātu atbilstošu augsnes mikrofloras aerāciju un barošanu. Optimālai mikrobu augšanai ieteicamais mitruma saturs ir diapazonā 40 – 60 % no ūdensietilpības (WHC) un 0,1 – 0,33 bar 6. Pēdējais minētais diapazons ir ekvivalents pF diapazonam 2,0 – 2,5. Dažādu augšņu tipu parastais mitruma saturs ir norādīts 2. pielikumā.

[5] Aerobi apstākļi ir dominējoši virsmas augsnēs un pat zemvirsmas augsnēs, kā parādīts ES sponsorētā pētījumu projektā [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internal. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Anaerobi apstākļi var būt sastopami tikai nejauši augšņu appludināšanas laikā pēc stipra lietus vai ja rīsa lauku apstākļi ir izveidoti rīsa laukos.

[6] Aerobus pētījumus var beigt ilgu laiku pirms 120 dienām ar nosacījumu, ka tajā laikā ir skaidri sasniegta galīgā transformācija un galīgā mineralizācija. Testa pabeigšana ir iespējama pēc 120 dienām vai kad vismaz 90 % testējamās vielas ir transformējusies, bet tikai ja ir izveidojies vismaz 5 % CO2.

[7] Sākotnējo koncentrāciju, pamatojoties uz platību, aprēķina, izmantojot šādu vienādojumu:Caugsnesmg/kgsoil = Akg/ha·106mg/kg1m·104m2/ha·dkgaugsnes/m3Caugsne = sakotneja koncentracija augsne [mg·kg-1]A = piemerojamais limenis [kg·ha-1]; 1 = lauka augsnes slana biezums [m]; d = sausnes daudzums augsne [kg·m-3].Parasti 1 kg·ha-1 limena piemerosanas rezultata augsnes koncentracija ir 1 mg·kg-1 10 cm slani (pienemot, ka blivums ir 1 g·cm-3).

[1] Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

[2] pF = log no ūdens staba cm.

[3] 1 bar = 10s Pa.

[4] Atbilst aptuvenam ūdens saturam 10 % smiltī, 35 % mālsmiltī un 45 % mālā.

[5] lauka ietilpība nav nemainīga, bet atkarībā no augsnes tipa mainās pF no 1,5 līdz 2,5.

[1] Ūdensietilpība

[8] Piemēram, ja testējamās vielas molekulā ir viens gredzens, ir nepieciešams marķējums gredzenā; ja testējamās vielas molekulā ir divi vai vairāki gredzeni, var būt vajadzīgi atsevišķi pētījumi, lai novērtētu, kas notiek ar katru marķēto gredzenu, un lai iegūtu piemērotu informāciju par transformācijas produktu veidošanos.

[9] Tā kā sārmainie absorbcijas šķīdumi absorbē arī oglekļa dioksīdu no ventilācijas gaisa un oglekļa dioksīdu, kas veidojas aerobos eksperimentos elpošanā, šķīdumi ir regulāri jāmaina, lai izvairītos no to piesātināšanās un tādējādi no absorbcijas spējas zuduma.

[10] [Māli + sanesas] ir nosēdumu minerālu frakcija ar daļiņu lielumu < 50 μm.

[11] Jaunāko pētījumu rezultāti ir parādījuši, ka skābekļa koncentrāciju ūdenī mērījumiem un ūdens redokspotenciālu mērījumiem nav mehāniska vai iepriekš paredzama vērtība, ciktāl tas attiecas uz mikrobu populāciju augšanu un attīstību virsmas ūdeņos (24), (25). Bioķīmiskā skābekļa patēriņa (BSP, paraugus ņemot laukā, testa sākumā un beigās) un mikro/makro barības vielu Ca, Mg un Mn (testa sākumā un beigās) noteikšana un kopējā N un P mērīšana nosēdumos (paraugus ņemot laukā un testa beigās) var būt labāki rīki aerobās biotransformācijas ātrumu un ceļu interpretācijai un novērtēšanai.

[12] Mikrobu elpošanas ātruma metode (26), fumigācijas metode (27) vai dzīvotspējīgo mikroorganismu (piem., baktēriju, aktinomicešu, sēnīšu un koloniju kopā) skaita novērtējums aerobiem pētījumiem; metānoģenēzes ātrums anaerobiem pētījumiem.

[13] Jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka glabāšana 4 °C temperatūrā var izraisīt nosēdumu organiskā oglekļa satura samazinājumu, kas, iespējams, var izraisīt mikrobu aktivitātes samazinājumu (34).

[14] Tests ar otru koncentrāciju var būt noderīgs attiecībā uz ķīmiskajām vielām, kas sasniedz ūdens virsmu dažādos veidos, kādēļ rodas ievērojami atšķirīgas koncentrācijas, ciktāl mazāko koncentrāciju var analizēt ar pietiekamu precizitāti.

[15] Ja viegli var notikt anaerobās transformācijas produktu ātra reoksidācija, anaerobi apstākļi ir jāsaglabā paraugu ņemšanas un analīzes laikā.

--------------------------------------------------