Komisijas Lēmums

(2001. gada 22. februāris),

ar ko nosaka paraugu ņemšanas plānus un diagnostikas metodes dažu zivju slimību atklāšanai un apstiprināšanai un ar ko atceļ Lēmumu 92/532/EEK

(izziņots ar dokumenta numuru C(2001) 426)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

(2001/183/EK)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Padomes 1991. gada 28. janvāra Direktīvu 91/67/EEK par dzīvnieku veselības nosacījumiem, kas reglamentē akvakultūras dzīvnieku un produktu laišanu tirgū [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Direktīvu 98/45/EK [2], un jo īpaši tās 15. pantu,

tā kā:

(1) Paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes dažu zivju slimību atklāšanai un apstiprināšanai ir paredzētas Komisijas Lēmumā 92/532/EEK [3], kas grozīts ar Komisijas Lēmumu 96/240/EK [4].

(2) Kopš Lēmuma 92/532/EEK pieņemšanas ir ieviestas jaunas praktiskas un zinātniskas izstrādes un Direktīva 91/67/EEK ir grozīta. Tas prasa atjaunināt paraugu ņemšanas plānus un diagnostikas metodes.

(3) Šāda atjaunināšana attiecas uz vīrusu, kas izraisa vīrusu hemorāģisko septicēmiju (VHS) un infekciozo hematopoētisko nekrozi (IHN), pārbaudi un identifikāciju un uz izmaiņām saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK jaunākajiem grozījumiem.

(4) Ir notikusi apspriešanās ar Kopienas references laboratoriju zivju slimībām, kura izveidota ar Padomes Direktīvu 93/53/EEK.

(5) Tā kā paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes dažu zivju slimību atklāšanai un apstiprināšanai, ko ieviesa ar Lēmumu 92/532/EEK, skaidrības labad ir jāatceļ.

(6) Šajā lēmumā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pastāvīgās veterinārijas komitejas atzinumu,

IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU.

1. pants

Pielikumā ir noteikti paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes vīrusu hemorāģiskās septicēmijas (VHS) un infekciozās hematopoētiskās nekrozes (IHN) atklāšanai un apstiprināšanai.

2. pants

Šis lēmums atceļ Lēmumu 92/532/EEK.

3. pants

Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm.

Briselē, 2001. gada 22. februārī

Komisijas vārdā —

Komisijas loceklis

David Byrne

[1] OV L 46, 19.2.1991., 1. lpp.

[2] OV L 189, 3.7.1998., 12. lpp.

[3] OV L 337, 21.11.1992., 18. lpp.

[4] OV L 79, 29.3.1996., 19. lpp.

--------------------------------------------------

PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANAS PLĀNI UN DIAGNOSTIKAS METODES VĪRUSU HEMORĀĢISKĀS SEPTICĒMIJAS (VHS) UN INFEKCIOZĀS HEMATOPOĒTISKĀS NEKROZES (IHN) ATKLĀŠANAI UN APSTIPRINĀŠANAI

IEVADS

Šis pielikums:

a) nosaka vadlīnijas un prasību minimumu attiecībā uz paraugu ņemšanas plāniem un diagnostikas metodēm vīrusu hemorāģiskās septicēmijas (VHS) un infekciozās hematopoētiskās nekrozes (IHN) atklāšanai un apstiprināšanai;

b) apvieno Direktīvas 91/67/EEK B un C pielikuma noteikumus zonu statusa un neapstiprinātās zonās esošo audzētavu statusa apstiprināšanai un uzturēšanai;

c) paredz noteikumus pareizai VHS un IHN diagnosticēšanai un zonu statusa, kā arī neapstiprinātās zonās esošo audzētavu statusa oficiālai atzīšanai saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK 5. un 6. pantu;

d) ir adresēts gan iestādēm, kas atbildīgas par VHS un IHN kontroli, gan laboratorijas personālam, kas veic testus attiecībā uz šīm slimībām. Tādēļ tajā uzsvērtas paraugu ņemšanas procedūras, laboratorisko pārbaužu principi un pielietojums un to rezultātu vērtēšana, kā arī sīki izstrādātas laboratoriskas metodes. Tomēr vajadzības gadījumā laboratorijas var piemērot šajā pielikumā aprakstīto testu modifikācijas vai arī izmantot atšķirīgus testus ar noteikumu, ka var pierādīt līdzīgu jutīgumu un specifiskumu.

I daļa ietver paraugu ņemšanas plānus un diagnostikas metodes VHS un IHN uzraudzībai, lai zona vai audzētava neapstiprinātā zonā iegūtu un uzturētu apstiprinātu statusu.

II daļā aprakstītas diagnostikas procedūras VHS un IHN apstiprināšanai aizdomu gadījumā.

III daļā noteikti kritēriji un vadlīnijas oficiālai veselības pārbaudes programmai, kas dokumentē vēsturisku brīvību no VHS un/vai IHN.

IV daļā sniegti ieteikumi VHS un IHN vīrusa titrēšanas procedūrai, lai pārbaudītu šūnu kultūru uzņēmību pret infekciju.

V daļā ir uzskaitīti akronīmi un abreviatūras.

I DAĻA Paraugu ņemšanas plāni un diagnostikas metodes VHS un IHN uzraudzībai, lai zona vai audzētava neapstiprinātā zonā iegūtu un uzturētu apstiprinātu statusu

I. Pārbaudes un paraugu ņemšana

1. Vispārēji noteikumi par klīniskām veselības pārbaudēm, paraugu vākšanu un atlasi zonu vai neapstiprinātās zonās esošu audzētavu uzraudzībai, lai iegūtu vai uzturētu apstiprinātu statusu attiecībā uz VHS un/vai IHN

Klīniskas veselības pārbaudes un zivju audu un/vai dzimumdziedzeru šķidruma paraugu ņemšana zonās vai neapstiprinātās zonās esošās audzētavās, kas saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK A un B pielikumu jāveic, lai iegūtu vai uzturētu apstiprinātu statusu attiecībā uz VHS un/vai IHN, ir apkopota 1.A, 1.B un 1.C tabulā. Sīkāka informācija ir izklāstīta I.I.2. līdz I.I.4. daļā. Tabulas 1.A un 1.B nav piemērojamas jaunās audzētavās un audzētavās, kas atjauno savu darbību ar zivīm, ikriem vai gametām no apstiprinātas zonas vai neapstiprinātā zonā esošas apstiprinātas audzētavas, ar noteikumu, ka tās atbilst prasībām, kas noteiktas Direktīvas 91/67/EEK C pielikuma I.A.6. daļas a) apakšpunktā vai I.A.6. daļas b) apakšpunktā, vai II.A.3. daļas a) apakšpunktā, vai II.A.3. daļas b) apakšpunktā.

Klīniskās pārbaudes jāveic laikā no oktobra līdz jūnijam vai arī citā laikā, kad ūdens temperatūra ir zemāka par 14 °C. Ja audzētavās klīniskās pārbaudes veic divreiz gadā, starp pārbaudēm jābūt vismaz četru mēnešu intervālam. Lai atklātu beigtas, novājinātas vai anormālas uzvedības zivis, jāpārbauda visas ražošanas vienības (dīķi, cisternas, tīklu būri utt.). Īpaša uzmanība jāpievērš ūdens izplūdes zonai, kur novājinātajām zivīm ir tendence atrasties straumes dēļ.

Zivis paraugiem atlasāmas šādi:

- ja ūdenstilpnē ir varavīksnes forele, paraugu ņemšanai atlasāmas tikai minētās sugas zivis. Ja varavīksnes foreles nav, paraugus iegūst no visu citu sugu zivīm, ja vien šīs sugas ir uzņēmīgas pret VHSV un vai IHNV (kā uzskaitīts Direktīvas 91/67/EEK A pielikumā). Paraugā sugām jābūt proporcionāli pārstāvētām,

- ja zivju audzēšanai izmanto vairāk nekā vienu ūdens avotu, paraugu ņemšanā jāiekļauj zivis no visiem ūdens avotiem,

- ja sastopamas novājinātas, anormālas uzvedības vai nesen nobeigušās zivis (nesadalījušās), vispirms atlasa šādas zivis. Ja šādu zivju nav, jāatlasa normāla izskata, veselīgas zivis tā, lai paraugā būtu proporcionāli pārstāvētas visas audzētavas daļas, kā arī visas vecuma grupas.

2. Īpaši noteikumi, tostarp paraugu ņemšana, zonu vai neapstiprinātās zonās esošu audzētavu uzraudzībai, lai iegūtu vai uzturētu apstiprinātu statusu attiecībā uz VHS un/vai IHN

1. Zona vai audzētava neapstiprinātā zonā, kas atrodas oficiālu dienestu uzraudzībā, var iegūt apstiprinātu statusus attiecībā uz VHS un/vai IHN, ja tajā veic vai nu:

a) A modelis – divu gadu uzraudzības programmu

Pēc tam, kad vismaz divus gadu nav bijis nekādu VHS un/vai IHN klīnisku vai citu pazīmju, visās audzētavās šajā zonā vai jebkurā apstiprināmā audzētavā neapstiprinātā zonā divus gadus jāveic veselības pārbaudes divreiz gadā. Šo divu gadu kontroles perioda laikā, kas ir pirms apstiprināta statusa iegūšanas, klīnisku vai citu VHS un/vai IHN pazīmju nedrīkst būt un paraugi pārbaudei jāņem saskaņā ar 1.A tabulu. Turklāt paraugi jāatlasa, jāsagatavo un jāpārbauda, kā noteikts I.I līdz I.IV daļā, bet laboratoriskajos izmeklējumos attiecībā uz VHS un/vai IHN jāiegūst negatīvi rezultāti; vai

b) B modelis – divu gadu uzraudzības programma ar samazinātu parauga lielumu

Pēc oficiālas veselības pārbaudes programmas, kas dokumentē vēsturisku brīvību no VHS un/vai IHN vismaz divus gadus, visās zonas audzētavās vai jebkurā apstiprināmā neapstiprinātas zonas audzētavā divus gadus jāveic veselības pārbaudes divreiz gadā. Šo divu gadu kontroles perioda laikā, kas ir pirms apstiprināta statusa iegūšanas, klīnisku vai citu VHS un/vai IHN pazīmju nedrīkst būt un paraugi pārbaudei jāņem saskaņā ar 1.B tabulu. Turklāt paraugi jāatlasa, jāsagatavo un jāpārbauda, kā aprakstīts I.I līdz I.IV daļā, bet laboratoriskajos izmeklējumos attiecībā uz VHS un/vai IHN jāiegūst negatīvi rezultāti. Lai veselības pārbaudes programmu brīvības no VHS un/vai IHN dokumentēšanai varētu atzīt oficiāli dienesti, tai jāatbilst III daļā noteiktajiem kritērijiem un vadlīnijām.

2. Īpaši noteikumi jaunu audzētavu vai tādu audzētavu apstiprināšanai, kuras atjauno savu darbību ar zivīm, ikriem vai gametām no apstiprinātas zonas vai no apstiprinātas audzētavas neapstiprinātā zonā

Jaunas audzētavas vai tādas audzētavas, kuras atjauno savu darbību ar zivīm, ikriem vai gametām no apstiprinātas zonas vai no apstiprinātas audzētavas neapstiprinātā zonā, var iegūt statusu saskaņā ar prasībām, kas noteiktas Direktīvas 91/67/EEK C pielikuma I.A.6.a/b vai II.A.3.a/b daļā. Attiecīgi – paraugu ņemšanas noteikumus, kas izklāstīti A un B modelī iepriekš (I.I.2.1.a un I.I.2.I.b daļā), attiecībā uz šādām audzētavām nepiemēro.

3. Uzraudzības programma apstiprināta statusa uzturēšanai attiecībā uz VHS un/vai IHN

Lai uzturētu apstiprinātu statusu zonā vai neapstiprinātā zonā esošā audzētavā attiecībā uz VHS un/vai IHN, saskaņā ar 1.C tabulu jāveic pārbaudes un paraugu ņemšana pārbaudei. Paraugi jāatlasa, jāsagatavo un jāpārbauda, kā aprakstīts I.I līdz I.IV daļā, bet laboratoriskajiem izmeklējumiem attiecībā uz VHS un/vai IHN izraisītājiem jābūt negatīviem.

3. Zivju paraugu sagatavošana un nosūtīšana

Pirms nosūtīšanas vai pārvešanas uz laboratoriju pārbaudāmās orgānu daļas jāizņem no zivs ar steriliem secēšanas instrumentiem un jāievieto sterilās plastmasas tūbiņās, kurās ir transporta vide, piemēram, šūnu kultūras vide ar 10 % teļa serumu un antibiotikām. Ieteicama kombinācija no 200 iu penicilīna, 200 μg streptomicīna un 200 μg kanamicīna uz mililitru (ml), bet tikpat labi var lietot arī citas antibiotikas ar pierādītu efektivitāti. Pārbaudāmais audu materiāls ir žults, priekšējā niere un papildus – vai nu sirds, vai galvas smadzenes. Dažos gadījumos jāpārbauda dzimumdziedzeru šķidrums (1.A līdz C tabula).

Dzimumdziedzeru šķidrumu vai orgānu daļas, lielākais, no desmit zivīm (1.A līdz C tabula) jāsavāc vienā sterilā tūbiņā, kurā ir vismaz 4 ml transporta vides un kas veido vienu kopēju paraugu. Katra parauga audiem jāsver vismaz 0,5 gramus (g).

Tūbiņas jāievieto izolētos konteineros (piemēram kastēs ar polistirolu piepildītām sienām) kopā ar pietiekamu daudzumu ledus vai "saldēšanas bloku", lai nodrošinātu paraugu dzesināšanu ceļā uz laboratoriju. Jāizvairās no sasaldēšanas. Parauga temperatūra pārvadāšanas laikā nekad nedrīkst pārsniegt 10 °C un pārvadāšanas kastē, to saņemot, vēl ir jābūt ledum vai arī vienam vai vairākiem saldēšanas blokiem vēl jābūt daļēji vai pilnīgi sasalušiem.

Virusoloģiskā pārbaude jāsāk, cik drīz vien iespējams un ne vēlāk kā 48 stundas pēc paraugu paņemšanas. Izņēmuma gadījumos [1] virusoloģisko pārbaudi var sākt vēlākais 72 stundas pēc paraugu materiāla savākšanas, ja pārbaudāmo materiālu aizsargā transporta vide un ja temperatūras prasības pārvadāšanas laikā ir ievērotas (I.I.3. daļa, 3. punkts).

Uz laboratoriju var nosūtīt veselu zivi, ja pārvadāšanas laikā ir ievērotas temperatūras prasības. Veselu zivi var ietīt absorbējošā papīrā, tad tā jāieliek plastikāta maisā, kas atdzesēts, kā iepriekš minēts. Var nosūtīt arī dzīvu zivi.

Visa iepakošana un marķēšana jāveic saskaņā ar pašreizējiem valsts un starptautiskiem pārvadāšanas noteikumiem, pēc vajadzības.

4. Papildu diagnostikas materiāla vākšana

Atbilstoši tam, kāda ir vienošanās ar iesaistīto diagnostikas laboratoriju, var ņemt arī citus zivs audus un sagatavot tos papildu izmeklējumiem.

II. Paraugu sagatavošana virusoloģiskajai pārbaudei

1. Sasaldēšana izņēmuma gadījumos

Ja rodas praktiskas grūtības (piemēram, slikti laika apstākļi, nav darba dienas, laboratorijas problēmas utt.), kas neļauj veikt šūnu inokulēšanu 48 stundas pēc audu paraugu paņemšanas, ir pieļaujams audu paraugus sasaldēt šūnu kultūras vidē pie - 20 °C vai zemākas temperatūras un veikt virusoloģisko pārbaudi 14 dienu laikā. Tomēr audiem jābūt sasaldētiem un atkausētiem tikai vienu reizi pirms pārbaudes. Par katru audu paraugu sasaldēšanas gadījumu jāveic ieraksti, norādot sīkas ziņas par cēloni (piemēram, vētra, šūnu līniju bojāeja utt.).

2. Orgānu homogenizēšana

Laboratorijā audiem tūbiņās jāveic pilnīga homogenizēšana (vai nu ar stomaheru, blenderi vai miezeri un piestu ar sterilām smiltīm) un turpmāka suspendēšana sākotnējā transporta vidē.

Ja paraugu veido veselas zivis, kas ir mazākas par 4 cm, tās jāsasmalcina ar sterilām grieznēm vai skalpeli pēc ķermeņa daļas, kas ir aiz zarnu atveres, nodalīšanas. Ja paraugu veido veselas zivis, kuru garums ir no 4 līdz 6 cm, jāsavāc iekšas, ietverot nieri. Ja paraugu veido veselas zivis, kas ir garākas par 6 cm, audu paraugi jāņem, kā aprakstīts I.I.3. daļā. Audu paraugi jāsasmalcina ar sterilām grieznēm vai skalpeli un jāhomogenizē, kā aprakstīts iepriekš, un jāveic suspendēšana transporta vidē.

Galīgo attiecību starp audu materiālu un transporta vidi jāpielāgo laboratorijā kā 1:10.

3. Homogenizētā materiāla centrifugēšana

Homogenizēto materiālu centrifugē atdzesētā centrifūgā 2 °C līdz 5 °C temperatūrā ar 2000 līdz 4000 × g 15 minūtes, un centrifugātu savāc un apstrādāt vai nu četras stundas 15 °C temperatūrā, vai visu nakti 4 °C temperatūrā ar antibiotikām, piemēram, šajā posmā var noderēt 1 mg/ml gentamicīna.

Ja parauga nosūtīšanu veic transporta vidē (piemēram, iedarbojoties ar antibiotikām), centrifugāta apstrādi ar antibiotikām var izlaist.

Antibiotiskās apstrādes nolūks ir kontrolēt bakteriālo piesārņojumu paraugos, un tas atbrīvo no vajadzības veikt filtrēšanu caur membrānas filtriem.

Ja savākto centrifugātu uzglabā -80 °C temperatūrā 48 stundas pēc parauga ņemšanas, to var atkārtoti izmantot tikai vienreiz – virusoloģiskajai pārbaudei.

Ja rodas praktiskas grūtības (piemēram, inkubators nestrādā, problēmas ar šūnu kultūrām utt.), kas neļauj inokulēt šūnas 48 stundu laikā pēc audu paraugu paņemšanas, ir pieņemami centrifugātu sasaldēt -80 °C temperatūrā un veikt virusoloģisko pārbaudi 14 dienu laikā.

Pirms šūnu inokulēšanas centrifugātu vienādās daļās sajauc ar attiecīgi atšķaidītu imūnseruma un IPN vīrusa vietējo serotipu kopumu un inkubē ar to vismaz vienu stundu 15 °C temperatūrā vai, maksimāli, 18 stundas 4 °C temperatūrā. Imūnseruma titram jābūt vismaz 1/2000 50 % plāksnes neitralizācijas testā.

Visa inokulāta apstrādei ar IPN vīrusa imūnserumu (vīruss, kurš dažās Eiropas daļās sastopams 50 % zivju paraugu) ir mērķis novērst IPN vīrusa izraisīto CPE rašanos inokulētajās šūnu kultūrās. Tas samazinās virusoloģisko pārbaužu ilgumu, kā arī to gadījumu skaitu, kad CPE rašanos varētu uzskatīt par potenciālu norādi uz VHSV vai IHNV.

Ja paraugi ir no ražošanas vienībām, kuras uzskata par brīvām no IPN, inokulāta apstrādi ar IPN vīrusa imūnserumu var izlaist.

III. Virusoloģiskā pārbaude

1. Šūnu kultūras un vide

BF-2 vai RTG-2 un vai nu EPC, vai FHM šūnas audzē 20 % līdz 30 °C temperatūrā piemērotā vidē, piemēram, Eagle’s MEM (vai tās modifikācijās) ar 10 % liellopu embrija serumu un antibiotikām standarta koncentrācijā.

Ja šūnas kultivē noslēgtos stobriņos, ieteicams buferēt vidi ar bikarbonātu. Šūnu audzēšanai izmantojamo vidi vaļējās vienībās var buferēt ar Tris-HCl (23 mM) un nātrija bikarbonātu (6 mM). pH jābūt 7,6 ± 0,2.

Šūnu kultūrām, ko lieto inokulēšanai ar audu materiālu, jābūt jaunām (4 līdz 48 stundas vecām), un inokulēšanas laikā tām jābūt aktīvi augošām (nesaplūdušām).

2. Šūnu kultūru inokulēšana

Ar antibiotikām apstrādāto orgānu suspensiju inokulē šūnu kultūrām divos atšķaidījumos, piemēram, primārajā atšķaidījumā un 1:10 atšķaidījumā, kas rada galīgos audu materiāla atšķaidījumus šūnu kultūru vidē ar attiecību atbilstoši 1:100 un 1:1000 (lai novērstu homologu interferenci). Jāveic vismaz divu šūnu līniju inokulācija (skat. I.III.1. daļu). Attiecībai starp inokulāta lielumu un šūnu kultūras vides tilpumu jābūt apmēram 1:10.

Katram atšķaidījumam un katrai šūnu līnijai jāizmanto vismaz apmēram 2 cm2 šūnu platība, kas atbilst vienai iedobei 24 iedobju šūnu kultūras platē. Ieteicams izmantot šūnu kultūras plates, bet tikpat labi ir izmantojamas arī citas vienības ar līdzīgu vai lielāku augšanas platību.

3. Šūnu kultūru inkubēšana

Inokulētās šūnu kultūras inkubē 15 °C temperatūrā 7 līdz 10 dienas. Ja šūnu kultūras vides krāsa mainās no sarkanas uz dzeltenu, norādot vides paskābināšanos, veic pH koriģēšanu ar sterilu bikarbonāta šķīdumu vai līdzvērtīgām vielām, lai nodrošinātu šūnu uzņēmību pret vīrusa infekciju.

Vismaz reizi katros sešos mēnešos vai tad, ja ir aizdomas par šūnu uzņēmīgumu samazināšanos, veic titrēšanu ar saldētiem VHSV un IHNV krājumiem, lai pārbaudītu šūnu kultūru uzņēmību pret infekciju. Ieteicamā procedūra ir aprakstīta IV daļā.

4. Mikroskopija

Inokulētās šūnu kultūras regulāri jāpārbauda (vismaz trīs reizes nedēļā) 40 līdz 150 x palielinājumā, vai nav radies CPE. Ja novērojams nepārprotams CPE, nekavējoties jāsāk vīrusa identifikācijas procedūras saskaņā ar I.IV daļu.

5. Subkultivēšana

Ja pēc primārās inkubēšanas 7 līdz 10 dienu laikā nav radies CPE, veic subkultivēšanu svaigās šūnu kultūrās, lietojot primārajai kultūrai līdzīgu šūnu platību.

Vides (centrifugāta) alikvotās daļas no visām kultūrām/iedobēm, kas veido primāro kultūru, apvieno atbilstoši šūnu līnijai 7 līdz 10 dienas pēc inokulēšanas. Tad šos apvienotos paraugus inokulē homologām šūnu kultūrām neatšķaidītā veidā un atšķaidījumā 1:10 (kas dod galīgos centrifugāta atšķaidījumus attiecīgi – 1:10 un 1:100), kā aprakstīts I.III.2. daļā. Pārmaiņus 10 % primārās kultūras vides alikvotās daļas inokulē tieši iedobē ar svaigu šūnu kultūru (subkultivēšana no iedobes iedobē). Pirms inokulēšanas var veikt iepriekšēju inkubēšanu atšķaidījumiem ar IPN vīrusa imūnserumu attiecīgā atšķaidījuma pakāpē, kā aprakstīts I.II.3. daļā.

Tad inokulētās kultūras inkubē 7 līdz 10 dienas 15 °C temperatūrā ar novērošanu kā I.III.4. daļā.

Ja pirmajās trijās inkubēšanas dienās rodas toksisks CPE, subkultivēšanu var veikt šajā posmā, bet tad šūnas jāinkubē 7 dienas un atkal jāveic subkultivēšana ar turpmāku septiņu dienu inkubēšanu. Ja toksisks CPE rodas pēc trim dienām, šūnām var veikt vienu pasāžu un inkubēt, lai iegūtu kopā 14 dienas no pirmās inokulēšanas. Pēdējās septiņās inkubēšanas dienās nedrīkst būt nekādu toksicitātes pazīmju.

Ja neatkarīgi no apstrādes ar antibiotikām rodas bakteriāls piesārņojums, pirms subkultivēšanas jāveic centrifugēšana ar 2000 līdz 4000 x g 15 līdz 30 minūtes 2 līdz 5 °C temperatūrā un/vai centrifugāta filtrēšana ar 0,45 μm filtru (membrāna ar zemu olbaltumvielu saistīšanas spēju). Papildus tam subkultivēšanas procedūras ir tādas pašas kā toksiska CPE gadījumā.

IV. Vīrusa identificēšana

1. Vīrusa identificēšanas testi

Ja šūnu kultūrā novēro CPE klātbūtni, vidi (centrifugātu) savāc un pārbauda ar vienu vai vairākiem šādiem paņēmieniem: neitralizēšana, IF, ELISA. Ja šie testi neļauj vīrusu skaidri identificēt vienas nedēļas laikā, centrifugāts jānosūta uz valsts references laboratoriju vai uz ES references laboratoriju zivju slimībām nekavējošai identifikācijai.

2. Neitralizēšana

Centrifugējot (2000 līdz 4000 x g) vai filtrējot caur membrānas filtru (0,45 μm) ar zemu olbaltumvielu saistīšanas spēju, atdala šūnas no savāktā centrifugāta un atšķaida centrifugātu 1: 100 un 1: 10000 šūnu kultūras vidē.

Divu centrifugāta atšķaidījumu alikvotās daļas sajauc un inkubē 60 minūtes 15 °C temperatūrā ar vienādām šādu reaģentu daļām atsevišķi:

- serums, kas satur īpašu VHSV antivielu grupu atšķaidījumā 1:50 (V: V) [2];

- serums, kas saturs īpašu IHNV antivielu grupu atšķaidījumā 1:50 (V: V) [3];

- imūnserumu apkopojums pret IPNV vietējiem serotipiem atšķaidījumā 1:50 (V: V) [4];

- tikai vide (pozitīvā kontrole).

No katra vīrusa centrifugāta – seruma maisījuma inokulē vismaz divas šūnu kultūras ar 50 μl katru un tad inkubē 15 °C temperatūrā. Pārbauda CPE rašanos, kā aprakstīts I.III.4. daļā.

Daži VHSV celmi neitralizācijas testos nereaģē. Šādi izolāti identificējami ar IF vai ELISA.

Alternatīvi var izmantot citus neitralizācijas testus ar pierādītu efektivitāti.

3. IF

Katram identificējamajam vīrusa izolātam vismaz astoņus segstikliņus vai to ekvivalentu inokulē ar šūnām tādā blīvumā, kas pēc 24 stundu audzēšanas rada apmēram 60 % līdz 90 % saplūšanu. Šajā nolūkā ir ieteicamas EPC šūnas, jo tās stingri pielīp stikla virsmām, tomēr tikpat labi var izmantot citas šūnu līnijas – tādas kā BF-2, RTG-2 vai FHM.

Ja šūnas izgulsnējušās uz stikla virsmas (apmēram vienu stundu pēc inokulēšanas) vai ja kultūras ir inkubētas līdz 24 stundām, identificējamais vīruss ir inokulēts. Četras kultūras inokulē ar tilpumu attiecību 1:10 un četras kultūras ar attiecību 1:1000. Tad tās inkubē 15 °C temperatūrā 20 līdz 30 stundas.

Pēc inkubēšanas kultūras divreiz skalo ar Eagle’s MEM bez seruma, fiksējot 80 % ledus aukstā acetonā un tad iekrāso ar divslāņu IFAT. Pirmais reaģenta slānis sastāv no references kvalitātes poliklonu vai klona antivielām. Otrais reaģenta slānis ir ar fluorhromu konjugēts imunoglobulīna imūnserums, kas lietots pirmajā slānī. Katram no pārbaudītajiem imūnserumiem jāiekrāso vismaz viena lielāka un viena mazāka inokulētās kultūras deva. Testā jāiekļauj pienācīga negatīvā un pozitīvā kontrole. Ieteicami tādi fluorhromi kā FITC vai TRITC.

Paceļ iekrāsotās kultūras, lietojot glicerīna šķīdumu sālsūdenī. Pārbauda ar krītošu ultravioleto (UV) gaismu. Izmanto 10 x un 12 x okulārus un x 25 vai x 40 objektīva lupu ar skaitlisko apertūru > 0,7 un > 1,3 attiecīgi.

Iepriekš aprakstītā IF tehnika ir dota kā piemērs. Alternatīvi var lietot citas IF tehnikas (attiecībā uz šūnu kultūrām, fiksēšanu un references kvalitātes antivielām) ar pārbaudītu efektivitāti.

4. ELISA

Mikrotitrēšanas platēs iedobes pa nakti pārklāj ar ieteiktajiem atšķaidījumiem no attīrītām references kvalitātes antivielu imunoglobulīna frakcijām.

Pēc iedobju skalošanas ar PBS-Tween-20 buferšķīdumu identificējamo vīrusu pievieno iedobēm divkārtējos vai četrkārtējos atšķaidīšanas soļos un atstāj reaģēt ar antivielas slāni 60 minūtes 37 °C temperatūrā. Pēc skalošanas ar PBS-Tween-20 buferšķīdumu pievieno ar biotīnu iezīmētas antivielas ar specifiskumu atbilstoši pārklājošajām antivielām un ļauj reaģēt 60 minūtes 20 °C temperatūrā. Pēc vēl vienas skalošanas, kā aprakstīts iepriekš, pievieno ar HRP konjugētu streptavidīnu un ļauj reaģēt vienu stundu 20 °C temperatūrā. Pēc pēdējās skalošanas vizualizē saistīto fermentu, lietojot attiecīgus ELISA substrātus (OPD vai citus).

Iepriekš aprakstītā uz biotīnu – avidīnu bāzētā ELISA versija ir dota kā piemērs. Alternatīvi var izmantot citas ELISA versijas ar pierādītu efektivitāti.

1.A TABULA

Pārbaude un paraugu ņemšanas shēma zonām un audzētavām, kas atrodas neapstiprinātās zonās, divu gadu kontroles periodam, kas ir pirms apstiprināta statusa attiecībā uz VHS un/vai IHN iegūšanas

(saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK B un C pielikumu un šā pielikuma I daļā izklāstītajiem noteikumiem)

Maksimālais zivju skaits parauga kopā: 10

[5] [6] [7] [8]

| Klīnisko pārbaužu skaits gadā (divos gados) | Laboratorisko pārbaužu skaits gadā (divos gados) | [5]Laboratoriskā pārbaude vīrusa klātbūtnes noteikšanai |

Augošu zivju skaits (orgānu materiāli) | Vaislas zivju skaits (dzimumdziedzeru šķidrums) |

Kontinentālās zonas un audzētavas

(a)Audzētavas, kurās ir ikri | 2 | 2 | 120 (pirmajā pārbaudē) [6]; 150 (otrajā pārbaudē) | 30 (pirmajā pārbaudē) [7]; 0 (otrajā pārbaudē) |

(b)Audzētavas, kurās ir tikai ikri | 2 | 1 | 0 | 150 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) [7] |

(c)Audzētavas, kurās nav ikru | 2 | 2 | 150 (pirmajā un otrajā pārbaudē) | 0 |

Piekrastes zonas un audzētavas

(a)Audzētavas, kurās ir ikri | 2 | 2 | 120 (pirmajā pārbaudē); 150 (otrajā pārbaudē) | 30 (pirmajā pārbaudē) [7]; 0 (otrajā pārbaudē) |

(b)Lašu dzimtas zivju audzētavas, kurās nav ikru | 2 | 2 | 30 (pirmajā un otrajā pārbaudē) [8] | 0 |

(c)Audzētavas, kur neaudzē lašu dzimtas zivis un kur nav ikru | 2 | 2 | 150 (pirmajā un otrajā pārbaudē) | 0 |

1.B TABULA

Pārbaude un paraugu ņemšanas shēma divu gadu kontroles periodam, kas ir pirms apstiprināta statusa attiecībā uz VHS un/vai IHN iegūšanas zonās un audzētavās, kuras atrodas neapstiprinātās zonās, ar oficiāli atzītu, dokumentētu brīvības vēsturi no šīm slimībām

(saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK B un C pielikumu un šā pielikuma I un III daļā izklāstītajiem noteikumiem)

Maksimālais zivju skaits parauga kopā: 10

[9] [10] [11]

| Klīnisko pārbaužu skaits gadā (divos gados) | Laboratorisko pārbaužu skaits gadā (divos gados) | Laboratoriskā pārbaude vīrusa klātbūtnes noteikšanai |

Augošu zivju skaits (orgānu materiāli) | Vaislas zivju skaits (dzimumdziedzeru šķidrums) |

Kontinentālās zonas un audzētavas

(a)Audzētavas, kurās ir ikri | 2 | 2 | 0 (pirmajā pārbaudē) [5]; 30 (otrajā pārbaudē) | 30 (pirmajā pārbaudē) [6]; 0 (otrajā pārbaudē) |

(b)Audzētavas, kurās ir tikai ikri | 2 | 1 | 0 | 30 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) [6] |

(c)Audzētavas, kurās nav ikru | 2 | 2 | 30 (pirmajā un otrajā pārbaudē) | 0 |

Piekrastes zonas un audzētavas

(a)Audzētavas, kurās ir ikri | 2 | 2 | 0 (pirmajā pārbaudē) 30 (otrajā pārbaudē) | 30 (pirmajā pārbaudē) [6]; 0 (otrajā pārbaudē) |

(b)Lašu dzimtas zivju audzētavas, kurās nav ikru | 2 | 2 | 30 (pirmajā un otrajā pārbaudē) [7] | 0 |

(c)Audzētavas, kur neaudzē lašu dzimtas zivis un kur nav ikru | 2 | 2 | 30 (pirmajā un otrajā pārbaudē) | 0 |

1.C TABULA

Pārbaude un paraugu ņemšanas shēma zonām un audzētavām neapstiprinātās zonās, lai uzturētu apstiprinātu statusu attiecībā uz VHS un/vai IHN

(saskaņā ar Direktīvas 91/67/EEK B un C pielikumu un šā pielikuma I daļā izklāstītajiem noteikumiem)

Maksimālais zivju skaits parauga kopā: 10

[12] [13] [14]

| Klīnisko pārbaužu skaits gadā | [5]Zivju skaits parauga grupā laboratoriskai pārbaudei |

Augošu zivju skaits (orgānu materiāli) | Vaislas zivju skaits (dzimumdziedzeru šķidrums) |

Kontinentālās zonas un audzētavas

(a)Audzētavas, kurās ir ikri | 2 | 20 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) | 10 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) [6] |

(b)Audzētavas, kurās ir tikai ikri | 2 | 0 | 30 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) [6] |

(c)Audzētavas, kurās nav ikru | 2 | 30 | 0 |

Piekrastes zonas un audzētavas

(a)Audzētavas, kurās ir ikri | 2 | 20 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) | 10 (pirmajā vai otrajā pārbaudē) [6] |

(b)Audzētavas, kurās nav ikru | 1 | 30 [7] | 0 |

II DAĻA Diagnostikas procedūras VHS un IHN apstiprināšanai aizdomīgu uzliesmojumu gadījumā

VHS un IHN diagnosticēšanai izmanto vienu vai vairākas no šādām metodēm:

- A. konvenciāla vīrusa izolēšana ar turpmāku seroloģisku vīrusa identifikāciju,

- B. vīrusa izolēšana ar vienlaicīgu seroloģisku vīrusa identifikāciju,

- C. citas diagnostikas metodes (IFAT, ELISA).

Pirmā VHS un/vai IHN gadījuma apstiprināšana audzētavās, kas atrodas apstiprinātās zonās, nedrīkst balstīties tikai uz C metodi. Jāizmanto arī vai nu A, vai B metode.

Virusoloģiskajai pārbaudei paredzētajam audu materiālam dažos gadījumos var pievienot papildu materiālu bakterioloģiskai, parazitoloģiskai, histoloģiskai vai cita veida pārbaudei diferenciāldiagnozes nolūkā.

A. Konvenciāla vīrusa izolēšana ar turpmāku seroloģisku vīrusa identifikāciju

I.1. Paraugu izvēle

Pārbaudei jāatlasa vismaz 10 zivis ar tipiskām IHN vai VHS pazīmēm.

I.2. Zivju paraugu sagatavošana un nosūtīšana

Kā noteikts I.I.3. daļā.

I.3. Papildu diagnostikas materiāla vākšana

Kā noteikts I.I.4. daļā.

II. Paraugu sagatavošana virusoloģiskajai pārbaudei

Kā noteikts I.II daļā.

III. Virusoloģiskā pārbaude

Kā noteikts I.III daļā.

IV. Vīrusa identificēšana

Kā noteikts I.IV daļā.

B. Vīrusa izolēšana ar vienlaicīgu seroloģisku vīrusa identificēšanu

I.1. Paraugu izvēle

Kā noteikts II.A.I.1. daļā.

I.2. Zivju paraugu sagatavošana un nosūtīšana

Kā noteikts I.I.3. daļā.

I.3. Papildu diagnostikas materiāla vākšana

Kā noteikts I.I.4. daļā.

II.1. Orgānu homogenizēšana

Kā noteikts I.II.2. daļā.

II.2. Homogenāta centrifugēšana

Homogenātu centrifugē saldēšanas centrifūgā 2 °C līdz 5 °C temperatūrā ar 2000 līdz 4000 x g 15 minūtes, un centrifugātu savāc un apstrādā vai nu četras stundas 15°C temperatūrā ar antibiotikām, piemēram, 1 mg/ml gentamicīna, vai filtrē caur membrānas filtru (0,45 μm) ar zemu olbaltumvielu saistīšanas membrānu.

II.3. Centrifugāta apstrāde ar diagnostikas imūnserumu

Ar antibiotikām apstrādāto vai caur membrānu izfiltrēto orgānu suspensiju atšķaida 1:10 un 1:1000 šūnu kultūras vidē, alikvotās daļas sajauc un inkubē 60 minūtes 15 °C temperatūrā ar vienādām I.IV.2. daļā uzskaitīto reaģentu daļām.

III.1. Šūnu kultūras un vide

Kā noteikts I.III.1. daļā.

III.2. Šūnu kultūru inokulēšana

No katra vīrusa – seruma maisījuma (sagatavots, kā noteikts II.B.II.3. daļā) ar 50 μl katru inokulē vismaz divas kultūras uz šūnu līniju.

III.3. Šūnu kultūru inkubēšana

Kā noteikts I.III.I. daļā.

III.4. Mikroskopija

Inokulētās šūnu kultūras CPE noteikšanai 40 līdz 150 x palielinājumā pārbauda katru dienu. Ja CPE rašanos kavē viens no izmantotajiem imūnserumiem, attiecīgi var uzskatīt, ka vīruss ir identificēts.

Ja CPE rašanos nekavē neviens no imūnserumiem, jāveic vīrusa identificēšanas procedūras saskaņā ar I.IV daļu.

III.5. Subkultivēšana

Ja CPE nav radies pēc 7 līdz 10 dienām, jāveic inokulēto kultūru subkultivēšana ar centrifugātu un vidi (II.B.II.3) saskaņā ar I.III.5. daļu.

C. Citas diagnostikas metodes

Centrifugātu, kas sagatavots atbilstoši I.II.2. daļas aprakstam, var nosūtīt IFAT vai ELISA testu veikšanai atbilstoši I.IV.3. vai I.IV.4 daļai, attiecīgi. Šīs ātrās metodes ir jāpapildina ar virusoloģisko pārbaudi saskaņā ar A vai B metodi 48 stundu laikā pēc paraugu ņemšanas, ja:

a) ir iegūts negatīvs rezultāts; vai

b) no materiāliem, kas pārstāv pirmo IHN vai VHS gadījumu apstiprinātā zonā, iegūts pozitīvs rezultāts.

Audu materiālus pārbauda ar citām diagnostikas metodēm, piemēram, ar RT-PCR, IF ar sasaldētām imunohistoķīmijas sekcijām uz formalīnā fiksēta audu materiāla. Šīs metodes vienmēr jāpapildina ar nefiksēta audu materiāla inokulēšanu šūnu kultūrām.

III DAĻA Dokumentēta brīvības no VHS un/vai IHN vēsture zonās vai audzētavās no neapstiprinātām zonām

Vadlīnijas un kritēriji oficiālajai veselības pārbaudes programmai

1. Veselības pārbaudes programmu var sākt tikai tad, ja:

- pēc oficiāli atzītas VHSV un/vai IHNV izskaušanas programmas, kas ietver visu zivju aizvākšanu no audzētavas, tīrīšanu, dezinfekciju un atstāšanu bez zivīm pirms krājumu atjaunošanas ar zivīm no apstiprinātām audzētavām, vai

- no zivjaudzētavām, kurās nav VHSV vai IHNV infekcijas vēstures.

2. Veselības pārbaudes programmai jābalstās gan uz klīniskām pārbaudēm, gan uz laboratoriskiem izmeklējumiem.

3. Programmā jāiekļauj divas ikgadējas klīniskās veselības pārbaudes saskaņā ar I daļā dotajām vadlīnijām.

4. Vismaz vienā no pārbaudēm, kuras veic katru gadu, no katras audzētavas savāc 30 zivju audu un/vai dzimumdziedzeru šķidruma paraugus. Paraugu atlasi, sagatavošanu un laboratorisko pārbaudi veic saskaņā ar I, II un IV daļu.

5. Veselības pārbaudes programma notiek vismaz četrus gadus visās apstiprināmās zonas audzētavās vai apstiprināmā audzētavā (neapstiprinātā zonā).

6. Programmas oficiālai atzīšanai nedrīkst būt neviena VHS vai IHN gadījuma vai tā atklāšanas (nekādas klīniskas infekcijas vai vīrusu izolācijas).

IV DAĻA Titrēšanas procedūras, lai pārbaudītu šūnu kultūru uzņēmīgumu pret infekciju

Turpmāk dotas ieteicamās titrēšanas procedūras, kas minētas I.III.3 daļā.

Jāizmanto vismaz divi VHSV izolāti un viens IHNV izolāts. Izolātiem būtu jāpārstāv nozīmīgākā vīrusu grupa ES, piemēram VHSV – viens patogēnu izolāts no saldūdens varavīksnes foreles un viens jūras patogēnu izolāts no akmeņplekstes, bet attiecībā uz IHNV – viens varavīksnes foreles patogēnu celms no Eiropas. Būtu jāizmanto labi definēti izolāti no dalībvalstīm. References izolāti ir pieejami ES references laboratorijā zivju slimībām.

Vīrusa partijas nelielā šūnu kultūru pasāžu skaitā ir ieaudzētas šūnu kultūras mēģenēs uz BF-2 vai RTG-2 šūnām VHS vīrusam un uz EPC vai FHM šūnām IHN vīrusam. Jāizmanto šūnu kultūras vide ar vismaz 10 % serumu. Inokulēšanai lieto zemu MOI (< 1).

Pie kopēja CPE vīrusu ievāc, centrifugējot šūnu kultūru centrifugātu ar 2000 x g 15 minūtes, filtrē sterilizētu caur 0,45 μm membrānas filtru un sadala marķētās krioskopiskās mēģenēs. Vīrusu uzglabā - 80 °C temperatūrā.

Nedēļu pēc sasaldēšanas trīs replikāta stobriņus ar katru no vīrusiem atkausē zem auksta ūdens strūklas un titrē uz to attiecīgajām šūnu līnijām. Vismaz reizi sešos mēnešos vai tad, ja ir aizdomas, ka šūnu līnijas uzņēmīgums ir samazinājies, katra vīrusa izolātu atkausē un titrē.

Titrēšanas procedūrām jābūt sīki aprakstītām, un katrreiz jāievēro viena un tā pati procedūra.

Titrēšanā līdz atšķaidījuma beigu punktam iekļauj vismaz sešus replikātus katrā atšķaidīšanas solī. Titrus salīdzina ar iepriekš iegūtajiem titriem. Ja kāds no trīs vīrusa izolātu titriem krities par 2 log koeficientu vai vairāk, salīdzinot ar sākotnējo titru, šūnu kultūra ilgāk vairs nav izmantojama uzraudzības mērķiem.

Ja laboratorijā tur dažādas šūnu līnijas, katra līnija jāpārbauda atsevišķi.

Dokumentācija jāglabā vismaz 10 gadus.

V DAĻA Akronīmi un abreviatūras

BF-2 Bluegill fry -2 (šūnu līnija)

CPE Citopātisks efekts

CRL Kopienas references laboratorija zivju slimībām

ELISA Fermentu imunosorbences noteikšana

EPC Epithelioma papulosum cyprini (šūnu līnija)

FHM Fathead minnow (šūnu līnija)

FITC Fluoresceīna izotiocianāts

Hepes N-2-hidroksietilpiperazīna-N’-2-etānsulfoskābe

HRP Mārrutku peroksidāze

IF Imunofluorescence

IFAT Netiešs fluorescējošo antivielu tests

IHN(V) Infekciozā hematopoētiskā nekroze (vīruss)

IPN Infekciozā pankreātiskā nekroze (vīruss)

MEM Minimālā pamatvide

MOI Infekcijas daudzējādība (infekcijas vīrusa daļiņu skaita attiecība, kas pieskaitīta zināmam šūnu skaitam kultūrā)

OPD Ortofenilēndiamīns

PBS Fosfāta buferšķīdums

RTG-2 Varavīksnes foreles gonāda (šūnu līnija)

RT-PCR Reversās transkriptāzes polimerāzes ķēdes reakcija

Tris-HCl Tris-(hidroksimetil)aminometāns-HCl

TRITC Tetrametilrodamīna izotiocianāts

VHS(V) Vīrusu hemorāģiskā septicēmija (vīruss)

[1] Izņēmuma gadījumos, piemēram, ja zivis savāc ļoti nomaļās vietās, kur nav iespējama ikdienas makšķerēšana.

[2] Vai kā noteikusi references laboratorija attiecībā uz imūnseruma iespējamo citotoksicitāti.

[3] Vai kā noteikusi references laboratorija attiecībā uz imūnseruma iespējamo citotoksicitāti.

[4] Vai kā noteikusi references laboratorija attiecībā uz imūnseruma iespējamo citotoksicitāti.

[5] Līdzīgi var izmantot samazinātu parauga lielumu, kā uzskaitīts I.B tabulā, ja ir ievērotas prasības, kas aprakstītas II.1., I.I.2.1.b un III daļu tekstā.

[6] Klīniskās pārbaudes.

[7] Izņēmuma gadījumā, ja nav iespējams iegūt dzimumdziedzeru šķidrumu, to vietā paraugam var ņemt orgānus.

[8] Paraugi ir jāvāc ne ātrāk kā trīs nedēļas pēc zivs pārvešanas no saldūdens un sālsūdeni.

[9] Klīniskās pārbaudes.

[10] Izņēmuma gadījumā, ja nav iespējams iegūt dzimumdziedzeru šķidrumu, to vietā paraugam var ņemt orgānus.

[11] Paraugi ir jāvāc ne ātrāk kā trīs nedēļas pēc zivs pārvešanas no saldūdens un sālsūdeni.

[12] Tikai apstiprinātās zonās paraugi ņemami pēc rotācijas principa – katru gadu 50 % zivjaudzētavu. Apstiprinātās audzētavās, kas atrodas neapstiprinātās zonās, paraugi jāņem katru gadu.

[13] Izņēmuma gadījumā, ja nav iespējams iegūt dzimumdziedzeru šķidrumu, to vietā paraugam var ņemt orgānus.

[14] Paraugi ir jāvāc ne ātrāk kā trīs nedēļas pēc zivs pārvešanas no saldūdens un sālsūdeni.

--------------------------------------------------