Komisijas Astotā Direktīva

(1978. gada 15. jūnijs),

ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei

(78/633/EEK)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Padomes 1970. gada 20. jūlija Direktīvu 70/373/EEK par paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metožu ieviešanu barības oficiālajai kontrolei [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Pievienošanās aktu, un jo īpaši tās 2. pantu,

tā kā minētajā direktīvā ir prasīts veikt barības oficiālo kontroli, izmantojot paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metodes, lai pārbaudītu atbilstību prasībām, kas normatīvo un administratīvo aktu noteikumos paredzētas attiecībā uz barības kvalitāti un sastāvu;

tā kā ar Komisijas 1971. gada 15. jūnija Direktīvu 71/250/EEK [2], 1971. gada 18. novembra Direktīvu 71/393/EEK [3], 1972. gada 27. aprīļa Direktīvu 72/199/EEK [4], 1972. gada 5. decembra Direktīvu 73/46/EEK [5], 1974. gada 25. marta Direktīvu 74/203/EEK [6], 1974. gada 20. decembra Direktīvu 75/84/EEK [7] un 1976. gada 1. marta Direktīvu 76/372/EEK [8] jau ir noteiktas vairākas Kopienas analīžu metodes; tā kā, ņemot vērā panākumus, kas gūti kopš tā laika, ir ieteicams pieņemt astoto metožu kopumu;

tā kā šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Barības pastāvīgās komitejas sniegto atzinumu,

IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU.

1. pants

1. Dalībvalstis prasa, lai barības oficiālās kontroles analīzes attiecībā uz cinka bacitracīna, flavofosfolipola, dzelzs, vara, mangāna un cinka saturu veic saskaņā ar šīs direktīvas pielikumā aprakstītajām metodēm.

2. Vispārīgos noteikumus, kas izklāstīti Pirmās Direktīvas 71/250/EEK pielikuma 1. daļā "Ievads", izņemot to daļu, kas attiecas uz analizējamā parauga sagatavošanu, piemēro šīs direktīvas pielikumā aprakstītajām metodēm.

2. pants

Dalībvalstīs 1979. gada 1. janvārī stājas spēkā normatīvie un administratīvie akti, kas vajadzīgi, lai panāktu atbilstību šai direktīvai. Dalībvalstis par to tūlīt informē Komisiju.

3. pants

Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm.

Briselē, 1978. gada 15. jūnijā

Komisijas vārdā —

priekšsēdētāja vietnieks

Finn Gundelach

[1] OV L 170, 3.8.1970., 2. lpp.

[2] OV L 155, 12.7.1971., 13. lpp.

[3] OV L 279, 20.12.1971., 7. lpp.

[4] OV L 123, 29.5.1972., 6. lpp.

[5] OV L 83, 30.3.1973., 21. lpp.

[6] OV L 108, 22.4.1974., 7. lpp.

[7] OV L 32, 5.2.1975., 26. lpp.

[8] OV L 102, 15.4.1976., 8. lpp.

--------------------------------------------------

PIELIKUMS

1. CINKA BACITRACĪNA NOTEIKŠANA PĒC DIFŪZIJAS AGARA BAROTNĒ

1. MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA.

Metode paredzēta cinka bacitracīna noteikšanai barībā, koncentrātos un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 5 mg/kg (5 ppm) [1]. Metode nav izmantojama traucējošu vielu, īpaši liela daudzuma vara un askorbīnskābes klātbūtnē.

2. PRINCIPS.

Paraugu pH 2 apstākļos ekstrahē ar metanola/ūdens/sālsskābes maisījumu. Ekstraktu noregulē līdz pH 6,5, vajadzības gadījumā koncentrē un atšķaida. Tā antibiotisko aktivitāti novērtē, nosakot cinka bacitracīna difūziju agara barotnē, kas uzsēta ar Micrococcus luteus (sin. M. flavus). Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavējuma zonu veidošanās. Pieņem, ka minēto zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam izmantoto antibiotiku koncentrāciju intervālā.

3. MIKROORGANISMS: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240.

3.1 Izejas kultūras uzturēšana.

Slīpagara barotnē uzsēj Micrococcus luteus (4.1.). Inkubē 24 stundas no 30 līdz 37 °C temperatūrā, glabā ledusskapī apmēram 4 °C temperatūrā un reizi divās nedēļās atkārtoti uzsēj uz slīpagara.

3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana [2].

Ar 2 – 3 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) novāc pieaugumu no nesen sagatavota slīpagara (3.1.). Iegūto suspensiju lieto, lai uzsētu 250 ml barotni (4.1.) Rū kolbā, un inkubē no 18 līdz 20 stundām 30 – 37 °C temperatūrā. Pieaugumu novāc ar 25 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) un samaisa. Suspensiju atšķaida ar nātrija hlorīda šķīdumu attiecībā 1/10 (4.3.). Suspensijas gaismas caurlaidībai jābūt apmēram 75 %, mērot 650 nm līmenī 1 cm kivetē pret nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.).

4. BAROTNES UN REAĢENTI.

4.1. Barotne [3].

Gaļas peptons | 6,0 g |

Triptons | 4,0 g |

Rauga ekstrakts | 3,0 g |

Gaļas ekstrakts | 1,5 g |

Glikoze | 1,0 g |

Agars | 15,0 g |

Ūdens | 1000 ml |

pH 6,5 – 6,6 (pēc sterilizācijas) | |

4.2. Eksperimenta vide [4].

Triptons | 10,0 g |

Rauga ekstrakts | 3,0 g |

Gaļas ekstrakts | 1,5 g |

Glikoze | 1,0 g |

Agars | 20,0 g |

Tween 80 | 1 ml |

Ūdens | 1000 ml |

pH 6,5 (pēc sterilizācijas) | |

4.3. Nātrija hlorīda 0,8 % (m/V) šķīdums: 8 g analītiski tīra nātrija hlorīda izšķīdina ūdenī un atšķaida līdz 1000 ml; sterilizē.

4.4. Metanola/tīra ūdens/analītiski tīras sālsskābes maisījums (d: 1,18 – 1,19): 80/17,5/2,5 (V/V/V).

4.5. Fosfāta buferšķīdums, pH 6,5.

Analītiski tīrs dikālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 (22,15 g).

Analītiski tīrs kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 (27,85 g).

Ūdens līdz 1000 ml.

4.6. Analītiski tīra sālsskābe (d: 1,18 – 1,19).

4.7. Analītiski tīra sālsskābe (0,1 N).

4.8. Nātrija hidroksīds, 1 N šķīdums (analītiski tīrs).

4.9. Bromkrezolsarkanā 0,04 % (m/V) šķīdums: izšķīdina 0,1 g bromkrezolsarkanā 18,5 ml nātrija hidroksīda 0,01 N šķīdumā. Papildina ar ūdeni līdz 250 ml un samaisa.

4.10. Standartviela: cinka bacitracīns ar zināmu aktivitāti (SV).

5. STANDARTŠĶĪDUMI.

Iesver tādu standarta cinka bacitracīna (4.10.) daudzumu, kas atbilst 1050 SV (atbilstīgi norādītajai aktivitātei). Pievieno 5 ml 0,1 N sālsskābes (4.7.) un atstāj uz 15 minūtēm. Pievieno 30 ml ūdens, ar fosfāta buferšķīdumu, kura pH ir 6,5 (4.5.) (apmēram 4 ml), noregulē pH līdz 4,5, ar ūdeni uzpilda līdz 50 ml tilpumam un labi samaisa (1 ml = 21 SV).

No šā šķīduma, pakāpeniski atšķaidot ar fosfāta buferšķīdumu, kura pH ir 6,5, (4.5.) pagatavo šādus šķīdumus:

S8 | 0,42 | SV/ml |

S4 | 0,21 | SV/ml |

S2 | 0,105 | SV/ml |

S1 | 0,0525 | SV/ml |

6. EKSTRAKTA GATAVOŠANA.

6.1. Ekstrakcija.

6.1.1. Koncentrāti, premiksi un minerālbarība.

Iesver 2,0 līdz 5,0 g parauga, pievieno 30 ml maisījuma (4.4.) un īsu brīdi krata. Pārbauda, vai pH ir apmēram 2. Krata 10 minūtes, pievieno 30 ml fosfāta buferšķīduma ar pH 6,5 (4.5.) un krata 15 minūtes. Atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.) tā, lai cinka bacitracīna paredzamais saturs būtu 0,42 SV/ml (= U8).

6.1.2. Olbaltumvielu koncentrāti.

Iesver 10,0 g parauga, pievieno 50 ml maisījuma (4.4.) un īsu brīdi krata. Pārbauda, vai pH ir apmēram 2. Krata 10 minūtes, pievieno 50 ml fosfāta buferšķīduma ar pH 6,5 (4.5.) un krata 15 minūtes. Atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.) tā, lai cinka bacitracīna paredzamais saturs būtu 0,42 SV/ml (= U8).

6.1.3. Citu veidu barība.

Iesver 10,0 g parauga (20,0 g, ja cinka bacitracīna paredzamais saturs ir 5 mg/kg), pievieno 25 ml maisījuma (4.4.) un apmēram 10 minūtes homogenizē. Pievieno 25 ml fosfāta buferšķīduma, kura pH ir 6,5 (4.5.), krata 15 minūtes un centrifugē. Ņem 20 ml koncentrāta, ar 1 N nātrija hidroksīda šķīduma (4.8.) noregulē pH līdz 6,5, par indikatoru lietojot bromkrezolsarkanā šķīdumu (4.9.). Ar rotācijas ietvaicētāju temperatūrā, kas nepārsniedz 35 °C, ietvaicē apmēram 4 ml. Atlikumu atšķaida ar ūdeni tā, lai cinka bacitracīna paredzamais saturs būtu 0,42 SV/ml (= U8).

6.2. Eksperimenta šķīdumi.

No šķīduma U8 pagatavo šķīdumu U4 (paredzamais saturs: 0,21 SV/ml), U2 (paredzamais saturs: 0,105 SV/ml) un U1 (paredzamais saturs: 0,0525 SV/ml), tos secīgi atšķaidot (1 + 1) ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.).

7. EKSPERIMENTA NORISE.

7.1. Eksperimenta vides uzsēšana.

Eksperimenta vidi (4.2.) uzsēj ar baktēriju suspensiju (3.2.) apmēram 50 °C temperatūrā. Priekšmēģinājumos ar eksperimenta vidi (4.2.) uz platēm nosaka baktēriju suspensijas daudzumu, kas nodrošina lielāko un skaidrāko kavējuma zonu veidošanos dažādo cinka bacitracīna koncentrāciju gadījumos.

7.2. Plašu sagatavošana.

Difūziju agarā veic uz platēm ar visu četru koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2, S1) un visu četru koncentrāciju eksperimenta šķīdumiem (U8, U4, U2, U1). Uz visām platēm noteikti jābūt visu četru koncentrāciju ekstraktam un standartšķīdumam. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas iedobes ar 10 – 13 mm diametru, atstājot starp to centriem vismaz 30 mm. Testu var veikt uz plates, kas izveidota no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis, kura diametrs ir 200 mm.

Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.2.), kas saskaņā ar 7.1. punktu uzsēta tā, lai iegūtu apmēram 2 mm biezu slāni (50 ml uz plati ar 200 mm diametru). Atstāj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobumus un tajos precīzi nomērītā daudzumā iepilda eksperimenta šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml uz iedobi atkarībā no diametra).

Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 kavējuma zonas.

7.3. Inkubācija.

Plates inkubē 16 līdz 18 stundas 28 līdz 30 °C temperatūrā.

8. NOVĒRTĒŠANA.

Ar 0,1 mm precizitāti izmēra kavējuma zonu diametru. Uz puslogaritmiskā papīra atzīmē punktus, kas atbilst kavējuma zonu vidējam diametram atkarībā no koncentrācijas. Novelk standartšķīdumam un ekstraktam atbilstīgās līnijas, piemēram, kā aprakstīts tālāk tekstā.

"Atbilstošāko" punktu standarta zemākajam līmenim (SL) nosaka pēc formulas:

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

"Atbilstošāko" punktu standarta augstākajam līmenim (SH) nosaka pēc formulas:

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Līdzīgi aprēķina "atbilstošākos" punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), iepriekšminētajās formulās S1, S2, S4 un S8 attiecīgi aizstājot ar U1, U2, U4 un U8.

Uz tā paša puslogaritmiskā papīra atzīmē SL un SH lielumus, un tos savieno, iegūstot standartšķīduma "atbilstošāko" līniju. Līdzīgi atzīmē UL un UH, ko savieno, iegūstot ekstrakta "atbilstošāko" līniju.

Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām vajadzētu būt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH-SL) un (UH-UL) neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.

Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, bet SL, SH, UL un UH "atbilstošākās" līnijas aprēķināt pēc alternatīvām formulām:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo "atbilstošāko" līniju paralelitāte būtu jāpārbauda, kā minēts iepriekš. Nobeiguma ziņojumā būtu jānorāda, ka rezultāts aprēķināti pēc trim līmeņiem.

Ja līnijas uzskata par paralēlām, relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) aprēķina pēc vienas no šīm formulām.

Četru līmeņu gadījumā:

log A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Trīs līmeņu gadījumā:

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

vai

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Faktiskā aktivitāte = pieņemtā aktivitāte × relatīvā aktivitāte.

Ja līnijas nevar uzskatīt par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) aprēķina pēc c) formulas. Tomēr iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jāatzīmē nobeiguma ziņojumā.

9. ATKĀRTOJAMĪBA.

No viena parauga viena analītiķa izdarītās divās noteikšanās iegūto rezultātu starpībai nevajadzētu pārsniegt:

20 % no lielākā rezultāta, ja cinka bacitracīna saturs ir no 5 līdz 25 mg/kg;

5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja cinka bacitracīna saturs ir lielāks par 25 un mazāks par 50 mg/kg;

10 % no lielākā rezultāta, ja cinka bacitracīna saturs pārsniedz 50 mg/kg.

2. FLAVOFOSFOLIPOLA NOTEIKŠANA PĒC DIFŪZIJAS AGARA BAROTNĒ

1. MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA.

Metode paredzēta flavofosfolipola noteikšanai barībā, koncentrātos un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 1 mg/kg (1 ppm).

2. PRINCIPS.

Paraugu ekstrahē ar atšķaidītu metanolu, karsējot ar atteces dzesinātāju. Pēc centrifugēšanas ekstraktu attīra, vajadzības gadījumā apstrādājot ar jonu apmaiņas sveķiem, un atšķaida. Tā antibiotisko aktivitāti nosaka, novērtējot flavofosfolipola difūziju agara barotnē, kas uzsēta ar Staphylococcus aureus. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavējuma zonu veidošanās. Pieņem, ka minēto zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam izmantoto antibiotiku koncentrāciju intervālā.

3. MIKROORGANISMS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P.

3.1. Izejas kultūras uzturēšana.

Staphylococcus aureus uzsēj slīpagara barotnē (4.1.). Inkubē 24 stundas 37 °C temperatūrā, glabā ledusskapī apmēram 4 °C temperatūrā un reizi mēnesī atkārtoti uzsēj uz slīpagara.

3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana [5].

Atliek divas mēģenes ar izejas kultūru (3.1.) un reizi nedēļā atkārtoti uzsēj. Inkubē 24 stundas 37 °C temperatūrā un glabā ledusskapī apmēram 4 °C temperatūrā.

24 stundas pirms eksperimenta ar pieaugumu uzsēj divas līdz četras mēģenes, kurās ir slīpagara barotne (4.1.). Inkubē 16 – 18 stundas 37 °C temperaturā. Pieaugumu suspendē nātrija hlorīda šķīdumā (4.3.). Suspensijas gaismas caurlaidībai 578 nm līmenī, mērot 1 cm kivetē pret nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.), jābūt apmēram 40 %.

4. BAROTNES UN REAĢENTI.

4.1. Barotne [6].

Gaļas peptons | 6,0 g |

Triptons | 4,0 g |

Rauga ekstrakts | 3,0 g |

Gaļas ekstrakts | 1,5 g |

Glikoze | 1,0 g |

Agars | 15,0 g |

Ūdens | 1000 ml |

pH 6,5 (pēc sterilizācijas) | |

4.2. Eksperimenta vide.

4.2.1. Pamatslānis [7].

Gaļas peptons | 6,0 g |

Rauga ekstrakts | 3,0 g |

Gaļas ekstrakts | 1,5 g |

Agars | 10,0 g |

Ūdens | 1000 ml |

pH 6,5 (pēc sterilizācijas) | |

4.2.2. Uzsējuma slānis.

Kā 4.1. punktā, tikai pievienojot 2,0 g silīcija pretputu emulsiju [8].

4.3. Nātrija hlorīda šķīdums, 0,4 % (m/V): izšķīdina 4 g analītiski tīra nātrija hlorīda ūdenī un atšķaida līdz 1000 ml; sterilizē.

4.4. Ķīmiski tīrs metanols.

4.5. Metanols, 50 %( V/V): atšķaida 500 ml metanola (4.4.) ar 500 ml ūdens.

4.6. Metanols 80 % (V/V): atšķaida 800 ml metanola (4.4.) ar 200 ml ūdens.

4.7. Tris(hidroksimetil)aminometāns (analītiski tīrs).

4.8. Kālija hlorīda metanola šķīdums, 1,5 % (m/V): izšķīdina 1,5 g analītiski tīra kālija hlorīda 20 ml ūdens, uzpilda līdz 100 ml ar metanolu (4.4.).

4.9. Katjonu apmaiņas sveķi: Dowex 50 W×8, 20 – 50 graudiņi, Na formas (kat. Serva Nr. 41600) vai līdzvērtīgi.

4.10. Anjonu apmaiņas sveķi: Dowex 1×2, 50 – 100 graudiņu, Cl formas (kat. Serva Nr. 41010) vai līdzvērtīgi. Pirms lietošanas 12 – 14 stundas tur 80 % metanolā (4.6.).

4.11. Stikla vate.

4.12. pH indikatora papīrītis (pH 6,6 – 8,1).

4.13. Askorbīnskābe.

4.14. Standartviela: flavofosfolipols ar zināmu aktivitāti.

5. IEKĀRTA.

5.1. 150 – 200 mm gara hromatogrāfijas stikla kolonna ar 9 mm iekšējo diametru, kuras apakšgala sašaurinātajā daļā ir krāns un augšgalā slīpēta stikla savienojums šķirpiltuves (5.2.) pievienošanai.

5.2. Pilināmā piltuve (250 ml) ar krānu un slīpēta stikla savienojumu.

5.3. 250 ml koniskā kolba ar slīpēta stikla savienojumu.

5.4. Atteces kondensators ar slīpēta stikla savienojumu.

6. STANDARTŠĶĪDUMI.

Precīzi nosvērtu standartvielas (4.14.) daudzumu izšķīdina 50 % metanolā (4.5.) un atšķaida, lai iegūtu rezerves šķīdumu, kas satur 100 μg flavofosfolipola uz mililitru. Noslēgtās kolbās 4 °C temperatūrā šis šķīdums saglabā stabilitāti līdz diviem mēnešiem.

No šā rezerves šķīduma, secīgi atšķaidot ar 50 % metanolu (4.5.), gatavo šādus šķīdumus:

S8 | 0,2 | μg/ml |

S4 | 0,1 | μg/ml |

S2 | 0,05 | μg/ml |

S1 | 0,025 | μg/ml |

7. EKSTRAKTA GATAVOŠANA.

7.1. Ekstrakcija.

7.1.1. Koncentrāti, premiksi un minerālbarība.

Iesver 2,0 līdz 5,0 g parauga un pievieno apmēram 150 mg askorbīnskābes (4.13.). Homogenizē ar 150 ml 50 % metanola (4.5.) koniskā kolbā (5.3.) un ar apmēram 400 mg tris(hidroksimetil)aminometāna (4.7.) noregulē pH līdz 8,1 – 8,2. Ar indikatora papīrīti (4.12.) pārbauda pH. Atstāj uz 15 minūtēm, tad ar tris(hidroksimetil)aminometānu (4.7.) atkārtoti noregulē pH līdz 8,1 – 8,2 un, nepārtraukti maisot, 10 minūtes vāra, lietojot atteces dzesinātāju (5.4.). Ļauj atdzist, centrifugē maisījumu un dekantē ekstraktu.

7.1.2. Citu veidu barība.

Iesver 5,0 – 30,0 g parauga, kas satur vismaz 30 μg flavofosfolipola. Homogenizē ar 150 ml 50 % metanola (4.5.) koniskā kolbā (5.3.) un ar apmēram 400 mg tris(hidroksimetil)aminometāna (4.7.) noregulē pH līdz 8,1 – 8,2. Ar indikatora papīrīti (4.12.) pārbauda pH. Atstāj uz 15 minūtēm, tad ar tris(hidroksimetil)aminometānu (4.7.) atkārtoti noregulē pH līdz 8,1 – 8,2 un, nepārtraukti maisot, 10 minūtes vāra, lietojot atteces dzesinātāju (5.4.). Ļauj atdzist, centrifugē maisījumu un dekantē ekstraktu.

7.2. Attīrīšana (šo stadiju var izlaist koncentrātu, premiksu un minerālbarības analīzē).

Sajauc 110 ml ekstrakta ar 11 g katjonu apmaiņas sveķu (4.9.), vāra vienu minūti, lietojot atteces dzesinātāju (5.4.) un nepārtraukti maisot. Katjonu apmaiņas sveķus atdala centrifugējot vai filtrējot. Sajauc 100 ml ekstrakta ar 150 ml metanola (4.4.), un šķīdumu 12 – 15 stundas glabā 4 °C temperatūrā. Kamēr šķīdums nav sasilis, nofiltrē izgulsnēto vielu.

Stikla caurules (5.1.) apakšgalā ieliek stikla vates tamponu (4.11.), caurulē ielej 5 ml anjonu apmaiņas sveķu (4.10.) un izmazgā kolonnu ar 100 ml 80 % metanola (4.6.). Lietojot piltuvi (5.2.), uz kolonnu pārnes vismaz 100 ml filtrāta, kura paredzamais flavofosfolipola saturs ir 16 μg (200 ml uz 30 g barības parauga 1 ppm). Ja vajadzīgs, pirms pārnešanas uz kolonnu filtrātu atšķaida ar 80 % metanolu (4.6.), lai iegūtu paredzamo flavofosfolipola saturu 16 μg/100 ml. Tecēšanas ātrumu noregulē apmēram līdz 2 ml/minūtē. Efluentu izmet. Tad kolonnu izmazgā ar 50 ml 80 % metanola (4.6.) un efluentu izmet.

Flavofosfolipolu eluē ar kālija hlorīda metanola šķīdumu (4.8.), tecēšanas ātrumu uzturot apmēram 2 ml/minūtē. Savāc mērkolbā 50 ml eluāta, pievieno 30 ml ūdens un samaisa. Šā šķīduma flavofosfolipola saturam vajadzētu būt 0,2 μg/ml (= U8).

7.3. Eksperimenta šķīdumi.

Ja vajadzīgs, t.i., ja ir izlaista attīrīšanas stadija, saskaņā ar 7.1.1. punktu iegūto ekstraktu atšķaida ar 50 % metanolu (4.5.), lai iegūtu paredzamo flavofosfolipola saturu 0,2 μg/ml (= U8).

No šķīduma U8, to secīgi atšķaidot (1 + 1) ar 50 % metanolu (4.5.), pagatavo šķīdumu U4 ar paredzamo saturu 0,1 μg/ml, U2 ar paredzamo saturu 0,05 μg/ml un U1 ar paredzamo saturu 0,025 μg/ml.

8. EKSPERIMENTA NORISE.

8.1. Eksperimenta vides uzsēšana.

Eksperimenta vidi (4.2.2.) uzsēj ar baktēriju suspensiju (3.2.) apmēram 50 °C temperatūrā. Priekšmēģinājumos uz platēm ar eksperimenta vidi (4.2.2.) nosaka, kāds baktēriju suspensijas daudzums vajadzīgs, lai radītu lielākās un skaidrākās kavējuma zonas, kas atbilst dažādajām flavofosfolipola koncentrācijām (apmēram 30 ml/l).

8.2. Plašu gatavošana.

Difūziju agarā izdara uz platēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2, S1) un visu četru koncentrāciju eksperimenta šķīdumiem (U8, U4, U2, U1). Šo četru dažādo koncentrāciju ekstrakta šķīdumiem un standartšķīdumiem noteikti jābūt uz katras plates. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas iedobes ar 10 – 13 mm diametru, starp iedobju centriem atstājot vismaz 30 mm. Testu var veikt uz plates, kas sastāv no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis, kura diametrs ir 200 mm.

Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.2.1.), lai izveidojas apmēram 1,5 mm biezs slānis (45 ml uz plati ar 200 mm diametru). Ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, tad pārklāj ar tādu daudzumu barotnes (4.2.2.), kas uzsēta saskaņā ar 8.1. punktu, lai izveidojas 1 mm biezs slānis (30 ml uz plati ar 200 mm diametru). Vēlreiz ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobes, un tajās precīzi nomērītā daudzumā iepilda eksperimenta šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml iedobē atkarībā no diametra).

Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 kavējuma zonas.

8.3. Inkubēšana.

Plates inkubē 16 līdz 18 stundas 28 – 30 °C temperatūrā.

9. NOVĒRTĒŠANA.

Ar 0,1 mm precizitāti izmēra kavējuma zonu diametru. Katrai koncentrācijai atbilstīgos vidējos mērījumus reģistrē uz puslogaritmiskā papīra, parādot koncentrāciju logaritmu attiecībā pret kavējuma zonu diametriem. Novelk standartšķīdumam un ekstraktam atbilstīgās līnijas, piemēram, kā aprakstīts zemāk.

"Atbilstošāko" punktu standarta zemākajam līmenim (SL) nosaka pēc formulas:

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Līdzīgi aprēķina "atbilstošākos" punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), iepriekšminētajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8.

Tajā pašā grafikā atzīmē SL un SH lielumus, un tos savieno, iegūstot standartšķīdumam "atbilstošāko" līniju. Līdzīgi atzīmē UH un UL, ko savieno, iegūstot ekstraktam "atbilstošāko" līniju.

Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām vajadzētu būt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH-SL) un (UH-UL) neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.

Konstatējot, ka līnijas nav paralēlas, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, un SL, SH, UL un UH "atbilstošākās" līnijas aprēķināt pēc alternatīvām formulām:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo "atbilstošāko" līniju paralelitāte būtu jāpārbauda, kā minēts iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, tas jāatzīmē nobeiguma ziņojumā.

Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no šīm formulām.

Četru līmeņu gadījumā:

log A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Trīs līmeņu gadījumā:

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

vai

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Faktiskā aktivitāte = pieņemtā aktivitāte × relatīvā aktivitāte.

Ja līnijas nevar uzskatīt par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) aprēķina pēc c) formulas. Tomēr iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jāatzīmē nobeiguma ziņojumā.

10. ATKĀRTOJAMĪBA.

No viena parauga viena analītiķa divās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirībai nevajadzētu pārsniegt:

0,5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja flavofosfolipola saturs ir no 1 līdz 2 mg/kg;

25 % no lielākā rezultāta, ja flavofosfolipola saturs ir lielāks par 2 un mazāks par 10 mg/kg;

20 % no lielākā rezultāta, ja flavofosfolipola saturs ir lielāks par 10 un mazāks par 25 mg/kg;

5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja flavofosfolipola saturs ir lielāks par 25 un mazāks par 50 mg/kg;

10 % no lielākā rezultāta, ja flavofosfolipola saturs pārsniedz 50 mg/kg.

3. MIKROELEMENTU – DZELZS, VARA, MANGĀNA UN CINKA NOTEIKŠANA

1. MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA.

Ar šo metodi barībā var noteikt mikroelementus – dzelzi, varu, mangānu un cinku. Zemākā noteikšanas robeža ir:

20 mg/kg dzelzs (Fe);

10 mg/kg vara (Cu);

20 mg/kg mangāna (Mn);

20 mg/kg cinka (Zn).

2. PRINCIPS.

Pēc organisko vielu noārdīšanās, ja tādas ir, paraugu izšķīdina sālsskābē. Elementus – dzelzi, varu, mangānu un cinku – pēc attiecīgas atšķaidīšanas nosaka atomu absorbcijas spektrometrijā.

3. REAĢENTI.

Ievada komentāri

Reaģentu un analītisko šķīdumu gatavošanā lieto dejonizētu ūdeni, ko iegūst, divreiz destilējot ūdeni borsilikātstikla destilācijas iekārtā vai kvarca destilācijas iekārtā vai divreiz apstrādājot ar jonu apmaiņas sveķiem.

Reaģentiem jābūt vismaz analītiski tīriem (a.p.). Tas, ka nosakāmā elementa nav, jāpārbauda tukšā eksperimentā. Vajadzības gadījumā reģentu attīrīšana jāturpina.

Šeit turpmāk aprakstītos standartšķīdumus var aizstāt ar gataviem standartšķīdumiem, ja tiem ir garantija un tie pirms lietošanas ir pārbaudīti.

3.1. Analītiski tīra sālsskābe (d: 1,19).

3.2. Analītiski tīra sālsskābe (6 N).

3.3. Analītiski tīra sālsskābe (0,5 N).

3.4. Fluorūdeņražskābe (38 – 40 % (V/V)), kuras dzelzs saturs nav mazāks par 1 mg Fe/litrā un kuras atlikums pēc ietvaicēšanas ir mazāks par 10 mg (sulfāta)/litrā.

3.5. Analītiski tīra sērskābe (d: 1,84).

3.6. Analītiski tīrs ūdeņraža peroksīds (apmēram 100 skābekļa tilpumi (30 % pēc svara)).

3.7. Dzelzs standartšķīdums (1000 μg Fe/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīras dzelzs stieplītes 200 ml 6 N sālsskābes (3.2.), pievieno 16 ml ūdeņraža peroksīda (3.6.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni.

3.7.1. Dzelzs darba standartšķīdums (100 μg Fe/ml), ko gatavo, atšķaidot standartšķīdumu (3.7.) 1 + 9 ar ūdeni.

3.8. Vara standartšķīdums (1000 μg Cu/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīra pulverveida vara 25 ml 6 N sālsskābes (3.2.), pievieno 5 ml ūdeņraža peroksīda (3.6.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni.

3.8.1. Vara darba standartšķīdums (10 μg Cu/ml), ko gatavo, atšķaidot standartšķīdumu (3.8.) 1 + 9 ar ūdeni un iegūto šķīdumu atšķaidot 1 + 9 ar ūdeni.

3.9. Mangāna standartšķīdums (1000 μg Mn/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīra pulverveida mangāna 25 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni.

3.9.1. Mangāna darba standartšķīdums (10 μg Mn/ml), ko gatavo, atšķaidot standartšķīdumu (3.9.) 1 + 9 ar ūdeni un iegūto šķīdumu atšķaidot 1 + 9 ar ūdeni.

3.10. Cinka standartšķīdums (1000 μg Zn/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīra cinka lentītes vai plāksnītes 25 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni.

3.10.1. Cinka darba standartšķīdums (10 μg Zn/ml), ko gatavo, atšķaidot standartšķīdumu (3.10.) 1 + 9 ar ūdeni un iegūto šķīdumu atšķaidot 1 + 9 ar ūdeni.

3.11. Lantāna hlorīda šķīdums, ko gatavo šādi: izšķīdina 12 g lantāna oksīda 150 ml ūdens, pievieno 100 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni.

4. IEKĀRTA.

4.1. Mufeļkrāsns ar termoregulatoru un pašrakstītāju.

4.2. Jālieto izturīgi borsilikātstikla trauki un ieteicams lietot iekārtu, kas paredzēta tikai mikroelementu noteikšanai.

4.3. Platīna tīģelis un (pēc izvēles) kvarca tīģelis.

4.4. Atomu absorbcijas spektrofotometrs, kas atbilst tām metodes prasībām, kuras attiecas uz jutību un precizitāti vajadzīgajā intervālā.

5. PROCEDŪRA.

5.1. Paraugi, kas satur organiskas vielas.

5.1.1. Pārpelnošana un šķīduma gatavošana analīzei [9]:

i) paraugu, kura svars ir 5 – 10 g un kas nosvērts ar 0,2 mg precizitāti, liek kvarca vai platīna tīģelī (4.3.) (skat. b) piezīmi), žāvē žāvēšanas skapī 105 °C temperatūrā un liek tīģeli aukstajā mufeļkrāsnī (4.1.). Krāsni aizver (skat. c) piezīmi) un apmēram 90 minūtēs pakāpeniski paaugstina temperatūru līdz 450 – 475 °C. Šo temperatūru uztur 4 – 16 stundas, piemēram, atstājot pa nakti, lai atdalītu oglekli saturošas vielas, tad atver krāsni un ļauj atdzist (skat. d) piezīmi).

Tīģeli izmazgā ar apmēram 5 ml sālsskābes (3.1.), pēdējo lēni un uzmanīgi pievieno vārglāzes saturam (CO2 var izraisīt spēcīgu reakciju). Pa pilienam pievieno sālsskābi (3.1.), kratot, līdz burbuļu veidošanās pilnīgi izbeidzas. Ietvaicē līdz sausam stāvoklim, palaikam maisot ar stikla nūjiņu.

Atlikumam pievieno 15 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un pēc tam apmēram 120 ml ūdens. Samaisa ar stikla nūjiņu, kas jāatstāj vārglāzē, un pārsedz vārglāzi ar pulksteņstikliņu. Uz mazas uguns uzvāra un uztur viršanas punktā, līdz vairs neredz, ka šķīstu pelni. Izfiltrē uz bezpelnu filtrpapīra un savāc filtrātu 250 ml mērkolbā. Izmazgā vārglāzi un filtru ar 5 ml karstas 6 N sālsskābes (3.2.) un divreiz ar verdošu ūdeni. Uzpilda mērkolbu līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija ir apmēram 0,5 N);

ii) ja atlikums filtrā izskatās melns (ogleklis), to liek atpakaļ krāsnī un pārpelno vēlreiz 450 – 475 °C temperatūrā. Šī pārpelnošana, kurai ir vajadzīgas tikai dažas (apmēram trīs līdz piecas) stundas, ir pabeigta, kad pelni izskatās balti vai gandrīz balti. Izšķīdina atlikumu ar apmēram 2 ml sālsskābes (3.1.), ietvaicē līdz sausam stāvoklim un pievieno 5 ml 6 N sālsskābes (3.2.). Karsē, iefiltrē šķīdumu mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija ir apmēram 0,5 N).

Piezīmes:

a) mikroelementu noteikšanā ir svarīgi ņemt vērā analīzes piesārņošanās risku, īpaši ar cinku, varu un dzelzi. Tāpēc paraugu gatavošanas iekārtai jābūt brīvai no šiem metāliem.

Lai mazinātu vispārējo piesārņošanās risku, strādā bezputekļu atmosfērā ar ļoti tīrām iekārtām un kārtīgi izmazgātiem traukiem. Cinka noteikšana ir īpaši jutīga pret dažādu veidu piesārņojumiem ar traukiem, reaģentiem, putekļiem u.tml.;

b) pārpelnojamā parauga svaru aprēķina pēc aptuvenā mikroelementa satura barībā attiecībā pret lietojamā spektrofotometra jutību. Ja barības mikroelementu saturs ir zems, var būt jāsāk ar 10 – 20 g paraugu un beigu šķīdums jāuzpilda tikai līdz 100 ml;

c) pārpelnošana jāveic slēgtā krāsnī bez gaisa vai skābekļa pieplūdes;

d) pirometra rādītā temperatūra nedrīkst pārsniegt 475 °C.

5.1.2. Spektrofotometriskā noteikšana.

5.1.2.1. Kalibrēšanas šķīdumu gatavošana.

Katra elementa noteikšanai no darba standartšķīdumiem, kas aprakstīti 3.7.1., 3.8.1., 3.9.1. un 3.10.1. punktā, gatavo kalibrēšanas šķīdumus, kuru HCl koncentrācija ir 0,5 N, un (dzelzij, mangānam un cinkam) lantāna hlorīda koncentrācija ir līdzvērtīga 0,1 % La (m/V). Mikroelementu koncentrācijām jābūt spektrofotometra jutības intervālā. Tabulās ar piemēriem parādīts tipisku kalibrēšanas šķīdumu sastāvs; tomēr atkarībā no spektrofotometra jutības var būt jāizvēlas citas koncentrācijas.

Dzelzs

μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

ml darba standartšķīduma (3.7.1.) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.), un uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |

Varš

μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

ml darba standartšķīduma (3.8.1.) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |

Uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |

Mangāns

μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

ml darba standartšķīduma (3.9.1.) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.) un uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |

Cinks

μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |

ml darba standartšķīduma (3.10.1.) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.) un uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |

5.1.2.2. Šķīduma gatavošana analīzei.

Vara noteikšanai saskaņā ar 5.1.1. punktu gatavoto šķīdumu parasti var lietot tieši. Ja tā koncentrācija jānoregulē atbilstīgi kalibrēšanas šķīdumiem, alikvotu daļu var iepilināt 100 ml mērkolbā un uzpildīt līdz zīmei ar 0,5 N sālsskābi (3.3.).

Dzelzs, mangāna un cinka noteikšanai saskaņā ar 5.1.1. punktu gatavotā šķīduma alikvotu daļu iepilina 100 ml mērkolbā, pievieno 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.) un uzpilda līdz zīmei ar 0,5 N sālsskābi (3.3.) (skatīt arī 8. punktu "Piezīme").

5.1.2.3. Tukšais eksperiments.

Tukšais eksperiments ietver visas iepriekš aprakstītās procedūras stadijas, izņemot to, ka parauga materiāls ir izlaists.

Kalibrēšanas šķīdumu "0" nedrīkst lietot par tukšo šķīdumu.

5.1.2.4. Atomu absorbcijas mērīšana.

Izmēra kalibrēšanas šķīdumu un analizējamā šķīduma atomu absorbciju, lietojot oksidējošu gaisa – acetilēna liesmu šādos viļņu garumos:

Fe 248,3 nm

Cu 324,8 nm

Mn 279,5 nm

Zn 213,8 nm

Katru mērījumu izdara četras reizes.

5.2. Minerālbarība.

Ja paraugā nav organisku vielu, iepriekšēja pārpelnošana nav vajadzīga. Rīkojas, kā aprakstīts 5.1.1.i) punktā, sākot ar otro daļu. Ietvaicēšanu ar fluorūdeņražskābi var izlaist.

6. REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA.

Pēc kalibrācijas līknes aprēķina mikroelementu koncentrāciju analizējamā šķīdumā, un rezultātu izsaka mikroelementa miligramos uz parauga kilogramu (ppm).

7. ATKĀRTOJAMĪBA.

No viena parauga viena analītiķa paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirībai nevajadzētu pārsniegt:

- 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja attiecīgā mikroelementa saturs ir līdz 50 mg/kg;

- 10 % no lielākā rezultāta, ja attiecīgā mikroelementa saturs ir no 50 līdz 100 mg/kg;

- 10 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja attiecīgā mikroelementa saturs ir no 100 līdz 200 mg/kg;

- 5 % no lielākā rezultāta, ja attiecīgā mikroelementa saturs pārsniedz 200 mg/kg.

8. PIEZĪME.

·2

lantāna hlorīda šķīdumu (3.11.) var nepievienot analizējamam šķīdumam un kalibrēšanas šķīdumiem.

[1] 1 mg barības kvalitātes cinka bacitracīna ir līdzvērtīgs 42 starptautiskajām vienībām (SV).

[2] Var izmantot citas metodes, ja ir konstatēts, ka ar tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas.

[3] Var izmantot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus.

[4] Var izmantot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus.

[5] Var izmantot citas metodes, ja ir konstatēts, ka ar tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas.

[6] Var izmantot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus, piemēram, oksoīdu antibiotiku barotni 1 (CM 327) ar oksoīdā agara Nr. 3 (L 13) piedevu.

[7] Var izmantot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus, piemēram, oksoīdu antibiotiku barotni 2 (CM 335) ar oksoīdā agara Nr. 3 (L 13) piedevu.

[8] Piemēram, SE 2 no Wacker Chemie GmbH, Minhene.

[9] Svaiga vai žāvēta rupjā barība zaļmasā satur lielus daudzumus silīcija, kas var saglabāt mikroelementus un kas jāatdala. Tāpēc, gatavojot minētās barības paraugus, jāievēro šāda modificēta procedūra.Veic 5.1.1.i) punktā paredzēto darbību līdz filtrēšanai. Filtrpapīru, kas satur nešķīstošo atlikumu, divreiz izmazgā ar verdošu ūdeni un liek platīna tīģelī (4.3.). Dedzina mufeļkrāsnī (4.1.) temperatūrā, kas ir zemāka par 550 °C, līdz visas oglekli saturošās vielas ir pilnīgi izzudušas. Ļauj atdzist, pievieno dažus pilienus ūdens, pēc tam 10 – 15 ml fluorūdeņražskābes (3.4.) un apmēram 150 °C temperatūrā ietvaicē līdz sausam stāvoklim. Ja atlikumā saglabājas silīcijs, to no jauna izšķīdina dažos mililitros fluorūdeņražskābes (3.4.) un ietvaicē līdz sausam stāvoklim. Pievieno piecus pilienus sērskābes (3.5.) un karsē, līdz vairs neizdalās balti dūmi. Pievieno 5 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un apmēram 30 ml ūdens, karsē, šķīdumu iefiltrē 250 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija ir apmēram 0,5 N). Pēc tam turpina noteikšanu atbilstoši 5.1.3. punktam.

--------------------------------------------------