02009R0152 — LV — 28.06.2022 — 008.001

---

Šis dokuments ir tikai informatīvs, un tam nav juridiska spēka. Eiropas Savienības iestādes neatbild par tā saturu. Attiecīgo tiesību aktu un to preambulu autentiskās versijas ir publicētas Eiropas Savienības “Oficiālajā Vēstnesī” un ir pieejamas datubāzē “Eur-Lex”. Šie oficiāli spēkā esošie dokumenti ir tieši pieejami, noklikšķinot uz šajā dokumentā iegultajām saitēm

►B	KOMISIJAS REGULA (EK) Nr. 152/2009 (2009. gada 27. janvāris), ar ko nosaka paraugu ņemšanas un analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei (Dokuments attiecas uz EEZ) (OV L 054, 26.2.2009., 1. lpp)

Grozīta ar:

		Oficiālais Vēstnesis
		Nr.	Lappuse	Datums
M1	KOMISIJAS REGULA (ES) Nr. 278/2012 (2012. gada 28. marts),	L 91	8	29.3.2012
►M2	KOMISIJAS REGULA (ES) Nr. 51/2013 (2013. gada 16. janvāris),	L 20	33	23.1.2013
►M3	KOMISIJAS REGULA (ES) Nr. 691/2013 (2013. gada 19. jūlijs),	L 197	1	20.7.2013
M4	KOMISIJAS REGULA (ES) Nr. 709/2014 (2014. gada 20. jūnijs),	L 188	1	27.6.2014
►M5	KOMISIJAS REGULA (ES) 2017/645 (2017. gada 5. aprīlis),	L 92	35	6.4.2017
►M6	KOMISIJAS REGULA (ES) 2017/771 (2017. gada 3. maijs),	L 115	22	4.5.2017
M7	KOMISIJAS ĪSTENOŠANAS REGULA (ES) 2020/1560 (2020. gada 26. oktobris),	L 357	17	27.10.2020
►M8	KOMISIJAS ĪSTENOŠANAS REGULA (ES) 2022/893 (2022. gada 7. jūnijs),	L 155	24	8.6.2022

---

▼B

KOMISIJAS REGULA (EK) Nr. 152/2009

(2009. gada 27. janvāris),

ar ko nosaka paraugu ņemšanas un analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei

(Dokuments attiecas uz EEZ)

▼M3

1. pants

Paraugu ņemšanu barības oficiālai kontrolei, īpaši saistībā ar sastāvdaļu noteikšanu, ieskaitot materiālu, kas satur ģenētiski modificētus organismus (ĢMO) vai sastāv no tādiem organismiem, vai ir no tiem ražots, barības piedevas, kas definētas Eiropas Parlamenta un Padomes Regulā (EK) Nr. 1831/2003 ( 1 ), nevēlamas vielas, kas definētas Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvā 2002/32/EK, ( 2 ) veic saskaņā ar I pielikumā aprakstītajām metodēm.

Paraugu ņemšanas metode, kas aprakstīta I pielikumā, ir piemērojama barības kontrolei saistībā ar pesticīdu atlieku noteikšanu, kas definēta Eiropas Parlamenta un Padomes Regulā (EK) Nr. 396/2005 ( 3 ), un pārbaudot atbilstību Regulai (ES) Nr. 619/2011.

▼B

2. pants

Paraugus analīzei sagatavo un rezultātus izsaka saskaņā ar metodēm, kas izklāstītas II pielikumā.

3. pants

Analīzes barības oficiālajai kontrolei veic, izmantojot metodes, kas izklāstītas III pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu barības līdzekļu un barības maisījumu sastāvu), IV pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu atļauto piedevu koncentrāciju barībā), V pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu nevēlamas vielas barībā) un VI pielikumā (Analīzes metodes, lai noteiktu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas barības oficiālajai kontrolei).

4. pants

Mājputnu barības maisījumu enerģētisko vērtību aprēķina saskaņā ar VII pielikumu.

5. pants

VIII pielikumā izklāstītās analīzes metodes, lai kontrolētu vairs neatļautu piedevu nelikumīgu atrašanos barībā, izmanto apstiprināšanas nolūkos.

6. pants

Direktīvu 71/250/EEK, 71/393/EEK, 72/199/EEK, 73/46/EEK, 76/371/EEK, 76/372/EEK, 78/633/EEK, 81/715/EEK, 84/425/EEK, 86/174/EEK, 93/70/EEK, 93/117/EK, 98/64/EK, 1999/27/EK, 1999/76/EK, 2000/45/EK, 2002/70/EK un 2003/126/EK atceļ.

Atsauces uz atceltajām direktīvām uzskata par atsaucēm uz šo regulu un lasa saskaņā ar atbilstības tabulām IX pielikumā.

7. pants

Šī regula stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

To piemēro no 2009. gada 26. augusta.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs.

▼M3

---

I PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANAS METODES

1.   MĒRĶIS UN DARBĪBAS JOMA

Paraugus, kas paredzēti barības oficiālai kontrolei, ņem saskaņā ar turpmāk aprakstītajām metodēm. Šādi iegūtus paraugus uzskata par reprezentatīviem tā apjoma sastāvam, no kura tie ņemti.

Reprezentatīvas paraugu ņemšanas mērķis ir iegūt mazu daļiņu no partijas tādā veidā, ka jebkura konkrēta šīs daļiņas raksturlieluma noteikšana atainotu visas partijas raksturlieluma vidējo vērtību. Paraugu no partijas iegūst, dažādās atsevišķās partijas vietās atkārtoti ņemot elementārparaugus. Šos elementārparaugus apvieno sajaucot un izveidojot kopparaugu, no kura, reprezentatīvi sadalot, sagatavo reprezentatīvus gala paraugus.

Ja, vizuāli pārbaudot, kādas pārbaudāmās barības daļas kvalitatīvi atšķiras no pārējās barības tajā pašā partijā, šādas daļas atdala no pārējās barības un apstrādā kā atsevišķu apakšpartiju. Ja barību nav iespējams sadalīt atsevišķās apakšpartijās, to pārbauda kā vienu partiju. Šādos gadījumos to norāda paraugu ņemšanas pierakstos.

Ja barība, no kuras paraugi ņemti saskaņā ar šīs regulas noteikumiem, ir atzīta par ES prasībām neatbilstošu un ir daļa no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

2.   DEFINĪCIJAS

—

Partija : norādīts barības daudzums, kam ir kopīgi raksturlielumi, piemēram, izcelsme, veids, iesaiņojuma tips, fasētājs, izplatītājs vai marķējums, un – attiecībā uz ražošanas procesu – ražošanas vienība vienā un tajā pašā rūpnīcā, kas izmanto nemainīgus ražošanas parametrus, vai vairākas šādas vienības, ja šī barība tiek ražota nepārtrauktā secībā un uzglabāta kopā.

—	Apjoms, no kura ņem paraugus : partija vai norādīta partijas vai apakšpartijas daļa.

—	Aizplombēts paraugs : paraugs, kas ir noslēgts tādā veidā, lai nepieļautu piekļuvi paraugam, nesalaužot vai nenoņemot plombu.

—	Elementārparaugs : daudzums, kas paņemts vienā punktā no apjoma, no kura ņem paraugu.

—	Kopparaugs : visu elementārparaugu kopums, kas ņemti no viena un tā paša apjoma.

—	Samazinātais paraugs : kopparauga daļa, kas no tā iegūta reprezentatīva samazinājuma procesā.

—	Gala paraugs : samazinātā parauga daļa vai homogenizētā kopparauga daļa.

—	Laboratorijas paraugs : paraugs, kas paredzēts laboratorijai (kāds saņemts laboratorijā) un kas var būt gala paraugs, samazinātais paraugs vai kopparaugs.

3.   VISPĀRĪGI NOTEIKUMI

4.   IEKĀRTAS

4.1.	Paraugu ņemšanas ierīcēm jābūt izgatavotām no materiāliem, kas nevar piesārņot paraugu ņemšanai izmantojamos produktus. Iekārtām, ko paredzēts izmantot vairākkārt, jābūt viegli tīrāmām, lai novērstu paraugu jebkādu savstarpēju piesārņošanu.

4.2.

Iekārtas, ko iesaka cietās barības paraugu ņemšanai. 4.2.1.    Manuāla paraugu ņemšana 4.2.1.1.   Plakandibena lāpstiņa ar vertikālām malām. 4.2.1.2. Šķēpveida paraugu ņemšanas ierīce ar garu šķēlumu vai nodalījumiem. Šķēpveida paraugu ņemšanas ierīces izmēriem jāatbilst tā apjoma raksturlielumiem, no kura ņem paraugu, (konteinera dziļumam, maisa izmēriem utt.) un barības daļiņu lielumam. Ja šķēpveida paraugu ņemšanas ierīcei ir vairākas atveres, lai nodrošinātu, ka paraugu paņem dažādās vietās šķēpa garumā, atverēm jābūt atdalītām ar starpsienām vai pakāpienveidā izvietotām atverēm. 4.2.2.    Mehāniska paraugu ņemšana Piemērotu mehānisku ierīci var izmantot, lai paņemtu paraugus no barības, kuru tajā brīdī pārvieto. Piemērota ierīce nozīmē to, ka, izmantojot to, paraugs tiek paņemts vismaz no visa plūsmas šķērsgriezuma. Paraugu ņemšanu no barības, kuru tajā brīdī pārvieto (lielā kustības ātrumā), var veikt ar automātiskām paraugu ņemšanas ierīcēm. 4.2.3.    Sadalītājs Ja tas ir iespējams un lietderīgi, reprezentatīvai samazināto paraugu sagatavošanai izmanto ierīci, kas paredzēta paraugu sadalīšanai apmēram vienādās daļās.

5.   KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS ATTIECĪBĀ UZ ELEMENTĀRPARAUGU SKAITU

5.1.    Kvantitatīvās prasības elementārparaugiem attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi sadalīti visā barībā

5.1.1.    Neiesaiņota cietā barība

5.1.2.    Neiesaiņota šķidrā barība

5.1.3.    Iesaiņota barība

Barība (cietā un šķidrā) var būt iesaiņota somās, maisos, burkās, mucās utt., kuras tabulā apzīmētas kā vienības. No lielām vienībām (≥ 500 kg vai litru) paraugi jāņem saskaņā ar neiesaiņotai barībai paredzētajiem noteikumiem (sk. 5.1.1. un 5.1.2. punktu).

5.1.4.    Barības bloki un minerālvielu briketes

Par paraugu jāņem vismaz viens bloks vai brikete no apjoma, no kura ņem paraugu un kas sastāv no 25 vienībām, lielākais daudzums ir četri bloki.

Attiecībā uz blokiem vai briketēm, kuru svars nepārsniedz 1 kg, elementārparaugs ir viena bloka vai briketes saturs.

5.1.5.    Rupja barība/lopbarība

5.2.    Kvantitatīvās prasības elementārparaugiem attiecībā uz tādu sastāvdaļu vai vielu kontroli, kuras varētu būt nevienmērīgi sadalītas barībā

Šīs kvantitatīvās prasības attiecībā uz elementārparaugiem izmantojamas šādās situācijās:

Ja kontroles iestādei ir nopietnas aizdomas, ka šāda nevienmērīga izplatība ir arī savstarpējas piesārņošanās gadījumā ar kādu sastāvdaļu vai vielu barības maisījumos, var piemērot kvantitatīvās prasības, kas paredzētas tabulā.

5.3.    Kvantitatīvās prasības attiecībā uz elementārparaugiem ļoti lielu partiju gadījumā

Attiecībā uz ļoti lieliem apjomiem, no kuriem ņem paraugus (apjomi > 500 tonnu), ņemamo elementārparaugu skaits = 40 elementārparaugu + √ tonnu skaita attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi izplatīti visā barībā, vai 100 elementārparaugu + √ tonnu skaita attiecībā uz tādu sastāvdaļu vai vielu kontroli, kas varētu būt nevienmērīgi izplatītas barības līdzekļos.

6.   KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS ATTIECĪBĀ UZ KOPPARAUGU

7.   KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS ATTIECĪBĀ UZ GALA PARAUGIEM

Gala paraugi

Jāveic vismaz viena gala parauga analīze. Daudzums analīzei paredzētajā gala paraugā nedrīkst būt mazāks par turpmāk norādīto.

8.   PARAUGU ŅEMŠANAS METODE ĻOTI LIELĀM PARTIJĀM VAI PARTIJĀM, KO GLABĀ VAI TRANSPORTĒ TĀDĀ VEIDĀ, KA PARAUGU ŅEMŠANA VISĀ PARTIJĀ NAV IESPĒJAMA

8.1.    Vispārīgi principi

Ja partijas transportēšanas vai glabāšanas veids neļauj paņemt elementārparaugus no visas partijas, paraugu ņemšana no šādām partijām pēc iespējas jāveic, kad partija ir kustībā.

Attiecībā uz lielām noliktavām, kas paredzētas barības glabāšanai, to operatori jāmudina uzstādīt noliktavā iekārtas, kas ļauj automātiski paņemt paraugus no visas glabātās barības.

Ja piemēro šeit 8. nodaļā paredzētās paraugu ņemšanas procedūras, barības nozares uzņēmēju vai tā pārstāvi informē par paraugu ņemšanas procedūru. Ja barības nozares uzņēmējs vai tā pārstāvis apšauba šo paraugu ņemšanas procedūru, tad barības nozares uzņēmējs par saviem līdzekļiem nodrošina iespēju kompetentajai iestādei paņemt paraugus no visas partijas.

8.2.    Lielas partijas, ko pārvadā ar kuģi

8.2.1.    Dinamiska paraugu ņemšana no lielām partijām, ko pārvadā ar kuģi

Paraugu ņemšanu no lielām partijām kuģos vēlams veikt, kamēr produkts ir kustībā (dinamiskā paraugu ņemšana).

Paraugu ņemšana jāveic no katra kausa (vienības, ko iespējams fiziski nodalīt). Kausus tomēr iztukšo daļēji citu pēc cita tā, ka pēc pārvietošanas uz glabāšanas telpām sākotnējais fiziskais dalījums vairs nepastāv. Paraugu ņemšanu tāpēc var veikt sākotnējās fiziskās nodalīšanas darbības laikā vai nodalīšanas laikā pēc pārvietošanas uz glabāšanas telpām.

Kuģa izkraušana var ilgt vairākas dienas. Parasti paraugu ņemšana jāveic regulāri visas izkraušanas laikā. Tomēr ne vienmēr ir iespējams vai ir piemēroti oficiālam inspektoram būt klāt paraugu ņemšanai visu izkraušanas darbību laiku. Tāpēc ir pieļaujams paraugu ņemšanu veikt no visas partijas daļas (no apjoma, no kura ņem paraugus). Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus.

Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

Pat ja oficiālos paraugus ņem automātiski, nepieciešama inspektora klātbūtne. Tomēr gadījumā, ja automātisko paraugu ņemšanu veic ar iepriekš iestatītiem parametriem, kurus paraugu ņemšanas laikā nevar mainīt, un elementārparaugus savāc aizzīmogotā tvertnē, novēršot jebkādu iespējamu krāpšanu, tad inspektora klātbūtne nepieciešama tikai paraugu ņemšanas sākumā, katru reizi, kad jāmaina paraugu tvertne, un paraugu ņemšanas beigās.

8.2.2.    Paraugu ņemšana no kuģī pārvadātām partijām ar statisko paraugu ņemšanu

Ja paraugu ņemšanu veic statiski, jāpiemēro tāda pati procedūra, kāda paredzēta glabāšanas telpām (tvertnēm), kurām var piekļūt no augšas (sk. 8.4.1. punktu).

Paraugu ņemšana jāveic partijas/kausa pieejamajā daļā (no augšas). Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.3.    Paraugu ņemšana no lielām partijām, ko glabā noliktavās

Paraugu ņemšana jāveic partijas pieejamajā daļā. Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.4.    Paraugu ņemšana no glabāšanas vietām (silosiem)

8.4.1.    Paraugu ņemšana no silosiem, kuriem var (viegli) piekļūt no augšas

Paraugu ņemšana jāveic partijas pieejamajā daļā. Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.4.2.    Paraugu ņemšana no silosiem, kuriem nevar piekļūt no augšas (slēgtiem silosiem)

8.4.2.1.    Silosi, kuriem nevar piekļūt no augšas (slēgti silosi) ar lielumu > 100 tonnu

No šādos silosos glabātas barības nav iespējams paņemt paraugus statiski. Tāpēc gadījumā, ja no barības šādā silosā jāņem paraugi un nav iespējas šo sūtījumu pārvietot, jāvienojas ar uzņēmēju, ka tam jāinformē inspektors par to, kad šis siloss tiks izkrauts, lai varētu veikt paraugu ņemšanu, kad barība būs kustībā.

8.4.2.2.    Silosi, kuriem nevar piekļūt no augšas (slēgti silosi) ar lielumu < 100 tonnu

Paraugu ņemšana nozīmē to, ka kādā tvertnē ieber 50 līdz 100 kg barības un ņem paraugus no šā daudzuma. Šāds kopparauga lielums atbilst visai partijai, un elementārparaugu skaits attiecas uz daudzumu silosā, no kura barība iebērta traukā paraugu ņemšanai. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.5.    Paraugu ņemšana no neiesaiņotas barības lielos, slēgtos traukos

No šādām partijām paraugus bieži vien var paņemt tikai tad, kad tās izkrauj. Noteiktos gadījumos nav iespējams tās izkraut ievešanas vai kontroles brīdī, tāpēc paraugu ņemšana jāveic tad, kad šādus konteinerus izkrauj.

9.   INSTRUKCIJAS PARAUGU ŅEMŠANAI, SAGATAVOŠANAI UN IESAIŅOŠANAI

9.1.    Vispārīga informācija

Paraugi jāņem un jāsagatavo bez liekas kavēšanās, ievērojot piesardzību, kas vajadzīga, lai nodrošinātu, ka produkts netiek nedz mainīts, nedz piesārņots. Instrumentiem, tāpat arī virsmām un paraugiem paredzētajiem traukiem jābūt tīriem un sausiem.

9.2.    Elementārparaugi

Elementārparaugi jāņem izlases veidā no visa apjoma, no kura ņem paraugu, un tiem jābūt aptuveni vienāda lieluma.

Elementārparauga lielums ir vismaz 100 gramu vai 25 grami rupjai barībai vai lopbarībai ar zemu īpatsvaru.

Gadījumā, ja saskaņā ar noteikumiem par paraugu ņemšanas procedūru, kas paredzēti 8. punktā, jāņem mazāk nekā 40 elementārparaugu, elementārparaugu lielumu nosaka atkarībā no kopparauga vajadzīgā lieluma (skatīt 6. punktu).

Gadījumā, ja ņem paraugus no mazām iesaiņotas barības partijām, kur saskaņā ar kvantitatīvajām prasībām jāņem ierobežots elementārparaugu skaits, elementārparaugs ir vienas oriģinālās vienības saturs, kuras saturs nepārsniedz 1 kg vai vienu litru.

Ņemot paraugus no iesaiņotas barības, ko veido mazas vienības (piemēram, < 250 g), elementārparauga lielums ir atkarīgs no vienības lieluma.

9.2.1.    Neiesaiņota barība

Attiecīgā gadījumā paraugu var ņemt laikā, kad apjomu, no kura jāņem paraugs, pārvieto (iekrauj vai izkrauj).

9.2.2.    Iesaiņota barība

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, ar šķēpveida ierīci vai lāpstiņu paņem daļu no katras vienības satura. Vajadzības gadījumā paraugus var ņemt pēc tam, kad katra vienība atsevišķi ir iztukšota.

9.2.3.    Homogēna vai homogenizējama šķidrā vai pusšķidrā barība

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, to saturu vajadzības gadījumā homogenizē un paņem noteiktu daudzumu no katras vienības.

Elementārparaugus var ņemt laikā, kad saturu ņem laukā no traukiem.

9.2.4.    Nehomogenizējama šķidrā vai pusšķidrā barība

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, paraugus paņem no dažādiem līmeņiem.

Paraugus var arī ņemt laikā, kad saturu ņem laukā no traukiem, bet pirmās frakcijas izmet.

Abos gadījumos kopējam paņemtajam tilpumam jābūt ne mazākam kā 10 litri.

9.2.5.    Barības bloki un minerālvielu briketes

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, paraugus ņem no katra bloka vai briketes. Ja pastāv aizdomas, ka bloks vai brikete nav homogēna, par paraugu var ņemt visu bloku vai briketi.

Attiecībā uz blokiem vai briketēm, kuru svars nepārsniedz 1 kg, elementārparaugs ir viena bloka vai briketes saturs.

9.3.    Kopparaugu sagatavošana

Elementārparaugus samaisa, lai izveidotu vienu kopparaugu.

9.4.    Gala paraugu sagatavošana

Materiālu katrā kopparaugā rūpīgi samaisa ( 4 ).

9.5.    Paraugu iesaiņošana

Traukus vai pakas aizplombē un uz tiem uzliek etiķetes tā, lai tos nevarētu atvērt, nesabojājot plombu. Visa etiķete jāiestrādā plombā.

9.6.    Paraugu nosūtīšana uz laboratoriju

Paraugu pēc iespējas drīzāk nosūta pilnvarotajai analīžu laboratorijai, līdzi nosūtot arī laborantam vajadzīgo informāciju.

10.   PARAUGU ŅEMŠANAS PIERAKSTI

Par katru paraugu jāveic pieraksti, kas ļauj nepārprotami identificēt katru apjomu, no kura paņemts paraugs, un tā lielumu.

Šajos pierakstos jānorāda arī jebkuras atkāpes no šajā regulā paredzētās paraugu ņemšanas procedūras.

Papildus šo pierakstu nodošanai oficiālajai kontroles laboratorijai, pierakstus nodod barības nozares uzņēmējam un/vai barības nozares uzņēmēja norādītajai laboratorijai.

---

II PIELIKUMS

VISPĀRĪGI NOTEIKUMI PAR BARĪBAS ANALĪZES METODĒM

A.   PARAUGU SAGATAVOŠANA ANALĪZEI

1.    Mērķis

Turpmāk aprakstītā procedūra attiecas uz tādu paraugu sagatavošanu analīzei, kuri nosūtīti uz kontroles laboratoriju pēc paraugu ņemšanas saskaņā ar I pielikumā paredzētajiem noteikumiem.

Laboratorijas paraugi jāsagatavo tā, lai analīzes metodēs noteiktie iesvara daudzumi būtu homogēni un gala paraugiem reprezentatīvi.

2.    Piesardzības pasākumi, kas jāievēro

Paraugu sagatavošanas procedūra, kas jāievēro, ir atkarīga no tā, kādas analīzes metodes tiks izmantotas un kādas sastāvdaļas vai vielas tiks kontrolētas. Tāpēc ir ārkārtīgi svarīgi nodrošināt, lai ievērotā paraugu sagatavošanas procedūra būtu atbilstoša izmantotajai analīzes metodei un nosakāmajām sastāvdaļām vai vielām.

Visas vajadzīgās darbības jāveic tā, lai pēc iespējas izvairītos no parauga piesārņošanas un novērstu izmaiņas tā sastāvā.

Lai pēc iespējas samazinātu gaisa un gaismas iedarbību uz paraugiem, to samalšanu, samaisīšanu un sijāšanu veic nekavējoties. Neizmanto dzirnavas un dzirnaviņas, kurās paraugs var jūtami sakarst.

Barību, kas ir īpaši jutīga pret karstumu, ieteicams samalt manuāli. Veic arī visu iespējamo, lai nodrošinātu, ka pašas ierīces nepiesārņo paraugu.

Ja paraugu nevar sagatavot, ievērojami nemainot mitruma saturu tajā, tad mitruma saturu nosaka pirms un pēc parauga sagatavošanas atbilstoši III pielikuma A daļā noteiktajai metodei.

3.    Procedūra

3.1.    Vispārīga procedūra

Apakšparaugus ņem no gala parauga. Dalīšana konusā un kvartēšana nav ieteicama, jo tad apakšparaugos var būt augsta šķelšanas kļūda.

3.1.1.    Barība, ko var samalt dabīgā stāvoklī

3.1.2.    Barība, ko var samalt pēc kaltēšanas

3.1.3.    Šķidrā vai pusšķidrā barība

3.1.4.    Cita barība

3.2.    Īpaša procedūra gadījumos, kad pārbaudi veic, vizuāli apskatot vai ar mikroskopu, vai gadījumos, kad viss kopparaugs ir homogenizēts

4.    Paraugu glabāšana

Paraugi jāuzglabā temperatūrā, kurā nemainās to sastāvs. Paraugus, kuros paredzēts analizēt vitamīnus vai vielas, kas ir īpaši jutīgas pret gaismu, uzglabā tādos apstākļos, lai paraugam nekaitētu gaisma.

B.   NOTEIKUMI ATTIECĪBĀ UZ REAĢENTIEM UN IERĪCĒM, KO IZMANTO ANALĪZES METODĒS

C.   ANALĪZES METOŽU PIEMĒROŠANA UN REZULTĀTU IZTEIKŠANA

1.    Ekstrahēšanas procedūra

Vairākas metodes nosaka specifisku ekstrahēšanas procedūru. Parasti var izmantot citu ekstrahēšanas procedūru, kas nav minēta konkrētajā metodē, ja ir pierādīts, ka izmantotajai ekstrahēšanas procedūrai ir tāda pati ekstrahēšanas efektivitāte kā metodē minētajai procedūrai.

2.    Attīrīšanas procedūra

Vairākas metodes nosaka specifisku attīrīšanas procedūru. Parasti var izmantot citu attīrīšanas procedūru, kas nav minēta konkrētajā metodē, ja ir pierādīts, ka izmantotā attīrīšanas procedūra dod tādus pašus analīžu rezultātus kā metodē minētā procedūra.

3.    Noteikšanu skaits

Nevēlamu vielu analīzes gadījumā, ja pirmajā noteikšanā rezultāts ir ievērojami (> 50 %) zemāks nekā kontrolējamā specifikācija, nav vajadzīgs veikt papildu noteikšanu, ja vien tiek piemērotas atbilstošas kvalitātes procedūras. Citos gadījumos nepieciešama otrreizēja analīze (otra noteikšana), lai izslēgtu iekšējas savstarpējas piesārņošanas iespēju vai paraugu nejaušu samainīšanu. Atbilstības pārbaudei izmanto divu noteikšanu vidējo vērtību, ņemot vērā mērījumu neprecizitāti.

Ja kontrolē vielas vai sastāvdaļas deklarēto saturu un pirmajā noteikšanā rezultāts apstiprina deklarēto saturu, t. i., analīzes rezultāts atbilst pieņemamajam deklarētā satura variāciju diapazonam, tad nav vajadzīgs veikt papildu noteikšanu, ja piemēro atbilstošas kvalitātes procedūras. Citos gadījumos nepieciešama otrreizēja analīze (otra noteikšana), lai izslēgtu iekšējas savstarpējas piesārņošanas iespēju vai paraugu nejaušu samainīšanu. Atbilstības pārbaudei izmanto divu noteikšanu vidējo vērtību, ņemot vērā mērījumu neprecizitāti.

Dažos gadījumos minētais pieņemamais variāciju diapazons ir noteikts tiesību aktos, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2009. gada 13. jūlija Regulā (EK) Nr. 767/2009 par barības laišanu tirgū un lietošanu un ar ko groza Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1831/2003 un atceļ Padomes Direktīvu 79/373/EEK, Komisijas Direktīvu 80/511/EEK, Padomes Direktīvas 82/471/EEK, 83/228/EEK, 93/74/EEK, 93/113/EK un 96/25/EK un Komisijas Lēmumu 2004/217/EK ( 7 ).

4.    Ziņošana par izmantoto analīzes metodi

Analīzes ziņojumā norāda izmantoto analīzes metodi.

5.    Ziņošana par analīžu rezultātiem

Analīžu rezultātu izsaka veidā, kas noteikts analīzes metodē, līdz attiecīgam būtisko skaitļu skaitam un vajadzības gadījumā koriģē līdz mitruma saturam, kas gala paraugam bija pirms sagatavošanas.

6.    Mērījumu neprecizitāte un atgūstamības procents nevēlamu vielu analīzes gadījumā

Attiecībā uz nevēlamām vielām Direktīvas 2002/32/EK nozīmē dzīvnieku barībai paredzētu produktu uzskata par neatbilstīgu šo vielu noteiktajam maksimāli pieļaujamam saturam, ja pēc analīžu rezultātiem, attiecinot uz barību ar mitruma saturu 12 %, secina, ka minēto vielu maksimāli pieļaujamais saturs ir pārsniegts, ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti un atgūstamības korekciju. Lai novērtētu analīzes rezultātā iegūtās vielas koncentrācijas daudzuma atbilstību, to koriģē atbilstoši atgūstamības rādītājam un samazina atbilstoši mērījumu paplašinātās neprecizitātes koeficientam. Šo procedūru piemēro tikai tad, ja saskaņā ar analīzes metodi ir iespējams aplēst mērījumu neprecizitāti un atgūstamības korekciju (piemēram, to nav iespējams izmantot mikroskopiskā analīzē).

Analīžu rezultātus paziņo šādi (ciktāl izmantotā analīzes metode ļauj aplēst mērījumu neprecizitāti un atgūstamības procentu):

Tomēr, ja analīzes rezultāts ir ievērojami (> 50 %) zemāks nekā kontrolējamā specifikācija un ja piemēro atbilstošas kvalitātes procedūras un analīzes nolūks ir tikai pārbaudīt atbilstību tiesību normām, tad analīžu rezultātu var paziņot bez atgūstamības korekcijas un minētajos gadījumos var neziņot par atgūstamības procentu un mērījumu neprecizitāti.

▼B

---

III PIELIKUMS

ANALĪZES METODES, LAI KONTROLĒTU BARĪBAS LĪDZEKĻU UN BARĪBAS MAISĪJUMU SASTĀVU

A.   MITRUMA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt mitruma saturu barībā. Ja barība satur gaistošas vielas, piemēram, organiskās skābes, tad jāievēro, ka kopā ar mitruma saturu nosaka arī ievērojamu daudzumu gaistošo vielu.

Tā neietver piena produktu kā barības līdzekļu analīzi, minerālvielu un galvenokārt no minerālvielām sastāvošu maisījumu analīzi, dzīvnieku un augu tauku un eļļu un eļļas augu sēklu un augļu analīzi.

2.   Princips

Paraugu žāvē norādītajos apstākļos, kas mainās atkarībā no barības īpašībām. Svara zudumu nosaka sverot. Ja analizē cietu barību, kurai ir augsts mitruma saturs, tad jāveic sākotnējā kaltēšana.

3.   Ierīces

4.   Procedūra

N.B.!

Šajā iedaļā aprakstītās darbības jāveic tūlīt pēc paraugu iesaiņojumu atvēršanas. Analīzes jāatkārto vismaz divas reizes.

4.1.   Sagatavošana

4.1.1.    Barība, izņemot to, kas minēta 4.1.2. un 4.1.3. punktā

Ņem vismaz 50 g parauga. Vajadzības gadījumā sasmalcina vai sadala tā, lai novērstu mitruma satura izmaiņas (skatīt 6. punktu).

4.1.2.    Labība un putraimi

Ņem vismaz 50 g parauga. Samaļ daļiņās, no kurām vismaz 50 % izsijājas caur sietu ar 0,5 mm acīm, un atlikums sietā ar 1 mm apaļu acojumu nepārsniedz 10 %.

4.1.3.    Barība šķidrā vai pastas veidā un barība, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem

Ņem aptuveni 25 g parauga, nosver ar precizitāti līdz 10 mg, pievieno atbilstīgu daudzumu bezūdens smilts, kas nosvērta ar precizitāti līdz 10 mg, un maisa, līdz iegūst homogēnu produktu.

4.2.   Kaltēšana

4.2.1.    Barība, izņemot to, kas minēta 4.2.2. un 4.2.3. punktā

Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 1 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 103 oC. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Atstāj kaltēties četras stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 103 oC. Konteineram atkal uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg.

Barību, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem, kaltē krāsnī vēl papildu 30 minūtes 130 oC temperatūrā. Abu svēršanas rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 0,1 % mitruma.

4.2.2.    Labība, milti, putraimi un rupja maluma milti

Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g sasmalcinātā parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 130 oC. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Atstāj kaltēties divas stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 130 oC. Konteineram atkal uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg.

Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek vakuuma krāsnī (3.5.), kas iepriekš sakarsēta 80 oC līdz 85 oC temperatūrā. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri.

Palielina spiedienu līdz 100 toriem un zem šāda spiediena kaltē četras stundas – vai nu karsta, sausa gaisa plūsmā, vai izmantojot vielu, kas uzsūc mitrumu (aptuveni 300 g uz 20 paraugiem). Pēdējā gadījumā pēc paredzētā spiediena sasniegšanas vakuumsūkni atvieno. Kaltēšanas laiku skaita no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 80 oC līdz 85 oC. Krāsnī uzmanīgi atjauno atmosfēras spiedienu. Krāsni atver, konteineram tūlīt uzliek vāku, izņem konteineru no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Vēl 30 minūtes kaltē vakuuma krāsnī 80 oC līdz 85 oC temperatūrā un vēlreiz nosver. Abu svēršanas rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 0,1 % mitruma.

4.3.   Sākotnējā kaltēšana

4.3.1.    Barība, izņemot to, kas minēta 4.3.2. punktā

Cietu barību ar augstu mitruma saturu, ko grūti sasmalcināt, sākotnēji kaltē šādi:

50 g nesasmalcināta parauga (ja vajadzīgs, tad saspiestu vai aglomerētu barību var nedaudz sadalīt) ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā konteinerā (piemēram, 20 ×12 cm alumīnija plāksnē ar 0,5 cm apmali). Atstāj kaltēties krāsnī 60 oC līdz 70 oC temperatūrā, līdz mitruma saturs ir samazinājies līdz 8–12 %. Izņem no krāsns, bez vāka atdzesē laboratorijā vienu stundu un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties sasmalcina, kā norādīts 4.1.1. punktā, un kaltē, kā norādīts 4.2.1. vai 4.2.3. punktā, atkarībā no barības īpašībām.

4.3.2.    Labība

Graudus, kuru mitruma saturs pārsniedz 17 %, sākotnēji kaltē šādi:

50 g nesamaltu graudu ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā konteinerā (piemēram, 20 ×12 cm alumīnija plāksnē ar 0,5 cm apmali). Piecas līdz septiņas minūtes atstāj kaltēties krāsnī 130 oC temperatūrā. Izņem no krāsns, bez vāka atdzesē laboratorijā divas stundas un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.2. punktā, un izkaltē, kā norādīts 4.2.2. punktā.

5.   Rezultātu aprēķināšana

Mitruma saturu (X), izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādas formulas:

5.1.   Kaltēšana bez sākotnējās kaltēšanas

kur:

m

=

testa parauga sākotnējais svars gramos,

m0

=

izkaltētā testa parauga svars gramos.

5.2.   Kaltēšana ar sākotnējo kaltēšanu

kur:

m

=

testa parauga sākotnējais svars gramos,

m1

=

testa parauga svars gramos pēc sākotnējās kaltēšanas,

m2

=

testa parauga svars gramos pēc sasmalcināšanas vai samalšanas,

m0

=

izkaltētā testa parauga svars gramos.

5.3.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nepārsniedz 0,2 % mitruma absolūtās vērtības.

6.   Novērojums

Ja sasmalcināšana ir vajadzīga un ja tās rezultātā mainās produkta mitruma saturs, tad barības sastāvdaļu analīzes rezultāti jākoriģē, pamatojoties uz parauga mitruma saturu tā sākotnējā stāvoklī.

B.   MITRUMA NOTEIKŠANA DZĪVNIEKU UN AUGU TAUKOS UN EĻĻĀS

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt ūdens un gaistošo vielu saturu dzīvnieku un augu taukos un eļļās.

2.   Princips

Paraugu žāvē līdz konstantam svaram (svara zudumam starp diviem secīgiem svērumiem jābūt mazākam par vai vienādam ar 1 mg) 103 oC temperatūrā. Svara zudumu nosaka sverot.

3.   Ierīces

4.   Procedūra

Sausā, nosvērtā traukā (3.1.), kurā ir termometrs (3.2.), ar precizitāti līdz tuvākajam mg iesver apmēram 20 g homogenizētā parauga. Pastāvīgi maisot ar termometru, smilšu vannā vai uz elektriskās plītiņas (3.3.) silda tā, lai apmēram septiņās minūtēs temperatūra paaugstinātos līdz 90 oC.

Karstumu samazina, sekojot tam, cik bieži no trauka dibena paceļas burbuļi. Temperatūra nedrīkst pārsniegt 105 oC. Turpina maisīt, skrāpējot gar trauka dibenu, līdz pārstāj veidoties burbuļi.

Lai pilnībā izdalītos viss mitrums, vairākas reizes temperatūru paaugstina līdz 103 oC ± 2 oC, starplaikos starp karsēšanām atdzesējot līdz 93 oC. Pēc tam eksikatorā (3.4.) ļauj atdzist līdz istabas temperatūrai un nosver. Minēto darbību atkārto tikmēr, kamēr svara zudums starp diviem secīgiem svērumiem vairs nepārsniedz 2 mg.

N.B.!

Ja parauga svars pēc atkārtotas karsēšanas palielinās, tas liecina par tauku oksidēšanos, un tādā gadījumā rezultātu aprēķina, ņemot vērā svērumu, kas izdarīts pirms tam, kad svars sāka palielināties.

5.   Rezultātu aprēķināšana

Mitruma saturu (X), izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

m

=

testa parauga svars gramos,

m1

=

trauka un tā satura kopējais svars gramos pirms karsēšanas,

m2

=

trauka un tā satura kopējais svars gramos pēc karsēšanas.

Ja rezultāts ir mazāks par 0,05 %, tad tas jāreģistrē kā “mazāks par 0,05 %”.

Atkārtojamība

Mitruma satura starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 0,05 % absolūtās vērtības.

C.   JĒLPROTEĪNA SATURA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Ar šo metodi var noteikt jēlproteīna daudzumu barībā, pamatojoties uz slāpekļa saturu, ko nosaka saskaņā ar Kjeldāla metodi.

2.   Princips

Paraugu šķeļ ar sērskābi katalizatora klātbūtnē. Skābes šķīdumu neitralizē un noregulē tā reakciju līdz bāziskai ar nātrija hidroksīda šķīdumu. Amonjaku destilē un uztver noteiktā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu titrē ar nātrija hidroksīda standartšķīdumu.

Alternatīvi – atbrīvoto amonjaku destilē borskābes šķīduma pārpalikumā, pēc tam titrē ar sālsskābes vai sērskābes šķīdumu.

3.   Reaģenti

Ja izmanto kolorimetrisko galarezultāta noteikšanu, tad metilsarkanais un bromkrezolzaļais indikators jāpievieno borskābes šķīdumiem. Ja sagatavo vienu litru borskābes šķīduma, tad pirms tilpuma korekcijas pievieno 7 ml metilsarkanā indikatora šķīduma (3.16.) un 10 ml bromkrezolzaļā šķīduma (3.17.).

Atkarībā no izmantotā ūdens borskābes šķīduma pH līmenis dažādās partijās var būt atšķirīgs. Bieži vien, lai iegūtu pozitīvu tukšo analīzi, šķīdums jākoriģē, pievienojot nelielu sārma daudzumu.

Piezīme.

Parasti var iegūt labus korekcijas rezultātus, ja vienam litram 10 g/l borskābes pievieno apmēram 3 ml līdz 4 ml NaOH (3.11.). Šķīdumu uzglabā istabas temperatūrā un uzglabāšanas laikā sargā no gaismas un no amonjaka tvaiku avotiem.

Piezīme.

Var izmantot citas volumetrisko šķīdumu koncentrācijas (3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. un 3.19.), ja aprēķinos veic attiecīgas korekcijas. Koncentrāciju vienmēr izsaka līdz četriem cipariem aiz komata.

4.   Ierīces

Ierīces, kas piemērotas šķelšanai, destilēšanai un titrēšanai saskaņā ar Kjeldāla metodi.

5.   Procedūra

5.1.   Šķelšana

No parauga ar precizitāti līdz 0,001 g ņem 1 g lielu iesvaru, ko pārnes šķelšanas aparāta kolbā. Pievieno 15 g kālija sulfāta (3.1.), atbilstošu daudzumu katalizatora (3.2.) (0,3 līdz 0,4 g vara (II) oksīda vai 0,9 līdz 1,2 g vara (II) sulfāta pentahidrāta), 25 ml sērskābes (3.4.) un, ja vajadzīgs, dažus pumeka gabaliņus (3.12.) un kolbas saturu samaisa.

Kolbu sākumā karsē uzmanīgi, ja vajadzīgs, laiku pa laikam maisot, līdz masa ir karbonizēta un vairs neputo; tad karsēšanu pastiprina, līdz šķidrums sāk pastāvīgi vārīties. Pietiek karsēt, kad vārošā skābe kondensējas uz kolbas sienām. Nedrīkst pieļaut kolbas pārkaršanu un organisko vielu daļiņu pielipšanu pie tās sienām.

Kad šķīdums kļūst dzidrs un gaiši zaļš, to turpina vārīt vēl divas stundas, tad ļauj atdzist.

5.2.   Destilēšana

Uzmanīgi pievieno vajadzīgo ūdens daudzumu, lai nodrošinātu, ka sulfāti pilnībā izšķīst. Ļauj atdzist, tad, ja vajadzīgs, pievieno dažas cinka granulas (3.3.). Tad rīkojas, kā noteikts 5.2.1. vai 5.2.2. punktā.

5.2.1.    Destilēšana sērskābē

Atkarībā no sagaidāmā slāpekļa satura destilācijas aparāta uztvērējkolbā precīzi iemēra 25 ml sērskābes (3.5. vai 3.7.). Pievieno dažus pilienus metilsarkanā indikatora (3.8.).

Šķelšanas kolbu pievieno destilācijas aparāta kondensatoram un kondensatora galu iemērc šķidrumā, kas ir uztvērējkolbā, vismaz 1 cm dziļi (skatīt 8.3. novērojumu). Nepieļaujot amonjaka zudumus (skatīt 8.1. novērojumu), šķelšanas kolbā lēnām ielej 100 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.9.). Kolbu karsē, līdz destilējas amonjaks.

5.2.2.    Destilēšana borskābē

Ja destilāta amonjaka saturu titrē manuāli, tad izmanto tālāk minēto procedūru. Ja destilēšanas vienība ir pilnībā automatizēta un ietver arī destilāta amonjaka satura titrēšanu, tad jāievēro ražotāja norādījumi attiecībā uz destilēšanas vienības darbināšanu.

Savācējkolbu, kurā ir 25 ml līdz 30 ml borskābes šķīduma (3.18.), novieto zem kondensatora izplūdes tā, lai padeves caurule atrastos zem borskābes šķīduma pārākuma virsmas. Destilācijas vienību koriģē, lai tā izdalītu 50 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.9.). Destilācijas vienību darbina saskaņā ar ražotāja norādījumiem un atbrīvoto amonjaku destilē, pievienojot nātrija hidroksīda šķīdumu. Destilātu uztver borskābē, kura uzņem šķīdumu. Destilāta apjoms (destilācijas ar tvaiku laiks) ir atkarīgs no slāpekļa daudzuma paraugā. Ievēro ražotāja norādījumus.

Piezīme.

Pusautomātiskajā destilēšanas vienībā nātrija hidroksīda pārpalikumu pievieno un tvaiku destilē automātiski.

5.3.   Titrēšana

Rīkojas, kā noteikts 5.3.1. vai 5.3.2. punktā.

5.3.1.    Sērskābe

Sērskābes pārpalikumu savācējkolbā titrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.10. vai 3.11.) atkarībā no izmantotās sērskābes koncentrācijas, līdz tiek sasniegts galapunkts.

5.3.2.    Borskābe

Savācējkolbas saturu titrē ar sālsskābes standarta volumetrisko šķīdumu (3.19.) vai ar sērskābes standarta volumetrisko šķīdumu (3.6.), izmantojot bireti, un nolasa izmantotā titranta daudzumu.

Ja piemēro kolorimetrisko galapunkta noteikšanu, tad galapunkts ir sasniegts, kad parādās pirmās sārtas krāsas zīmes. Provizoriski nosaka biretes rādījumu ar precizitāti līdz 0,05 ml. Izgaismots magnētiskā maisītāja trauks vai fotometrisks detektors var palīdzēt ieraudzīt galapunktu.

To var izdarīt automātiski, izmantojot tvaika destilētāju ar automātisko titrēšanu.

Jāievēro ražotāja norādījumi attiecībā uz konkrētā destilētāja vai destilētāja/titrētāja izmantošanu.

Piezīme.

Ja izmanto automātisko titrēšanas sistēmu, tad titrēšana sākas tūlīt pēc destilācijas sākšanas un kad ir izmantots 1 % borskābes šķīdums (3.18.). Ja izmanto pilnībā automatizētu destilācijas vienību, tad amonjaka automātisko titrēšanu var veikt arī, ja galapunktu nosaka, izmantojot potenciometrisko pH sistēmu. Tādā gadījumā izmanto automātisko titrētāju ar pH mērītāju. pH mērītājs ir attiecīgi kalibrēts pH 4 līdz pH 7 diapazonā, ievērojot parastās laboratorijas pH kalibrēšanas procedūras. Titrēšanas pH galapunktu sasniedz pie pH 4,6 , kas ir stāvākais punkts titrēšanas līknē (pārliekuma punkts).

5.4.   Tukšā analīze

Lai apstiprinātu, ka reaģenti nesatur slāpekli, veic tukšo analīzi (šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu), parauga vietā izmantojot 1 g saharozes (3.14.).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Aprēķinus veic atbilstoši 6.1. vai 6.2. punktam.

6.1.   Titrēšanas aprēķins atbilstoši 5.3.1. punktam

Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

Vo

=

NaOH tilpums (ml) (3.10. vai 3.11.), ko izmanto tukšajā analīzē,

V1

=

NaOH tilpums (ml) (3.10. vai 3.11.), ko izmanto parauga titrēšanā,

c

=

nātrija hidroksīda (3.10. vai 3.11.) koncentrācija (mol/l),

m

=

parauga svars (g).

6.2.   Titrēšanas aprēķins atbilstoši 5.3.2. punktam

6.2.1.    Titrēšana ar sālsskābi

Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

m

=

analizējamā parauga svars (g),

c

=

sālsskābes (3.19.) standarta volumetriskā šķīduma koncentrācija (mol/l),

V0

=

tukšajā analīzē izmantotās sālsskābes tilpums (ml),

V1

=

analizējamam paraugam izmantotās sālsskābes tilpums (ml).

6.2.2.    Titrēšana ar sērskābi

Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

m

=

analizējamā parauga svars (g),

c

=

sērskābes standarta volumetriskā šķīduma (3.6.) koncentrācija (mol/l),

V0

=

tukšajai analīzei izmantotās sērskābes (3.6.) tilpums (ml),

V1

=

analizējamam paraugam izmantotās sērskābes (3.6.) tilpums (ml).

7.   Metodes verifikācija

7.1.   Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

7.2.   Precizitāte

Analizē (veicot šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu) 1,5 līdz 2,0 g acetanilīda (3.13.) 1 g saharozes (3.14.) klātbūtnē; 1 g acetanilīda patērē 14,80 ml sērskābes (3.5.). Atgūstamībai jābūt vismaz 99 %.

8.   Novērojumi

D.   URĪNVIELAS NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt urīnvielas daudzumu barībā.

2.   Princips

Paraugu kopā ar dzidrināšanas aģentu iejauc ūdenī. Suspensiju filtrē. Urīnvielas saturu filtrātā nosaka pēc 4-dimetilaminobenzaldehīda (4-DMAB) pievienošanas, mērot optisko blīvumu pie 420 nm viļņu garuma.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Parauga analīze

Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg un kopā ar 1 g aktīvās ogles (3.4.) pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 400 ml ūdens un 5 ml Karesa I šķīduma (3.2.), maisa apmēram 30 sekundes un pievieno 5 ml Karesa II šķīduma (3.3.). Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā. Papildina ar ūdeni līdz tilpumam, sakrata un filtrē.

Noņem 5 ml caurspīdīgā, bezkrāsainā filtrāta, pārnes mēģenēs ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem, pievieno 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.) un samaisa. Mēģenes ievieto ūdens vannā 20 oC (+/– 4 oC) temperatūrā. Pēc piecpadsmit minūtēm ar spektrofotometru pie 420 nm mēra parauga šķīduma optisko blīvumu. Salīdzina ar reaģentu tukšās analīzes šķīdumu.

5.2.   Kalibrēšanas līkne

Ņem pa 1, 2, 4, 5 un 10 ml urīnvielas šķīduma (3.5.), pārnes 100 ml tilpuma mērkolbās un papildina ar ūdeni līdz tilpumam. Ņem 5 ml no katra šķīduma, pievieno pa 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.), homogenizē un iepriekš aprakstītajā veidā mēra optisko blīvumu pret kontrolšķīdumu, kas sastāv no 5 ml 4-DMAB un 5 ml ūdens, kurš nesatur urīnvielu. Konstruē kalibrēšanas līkni.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Urīnvielas daudzumu paraugā nosaka, izmantojot kalibrēšanas līkni.

Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.

7.   Novērojumi

E.   GAISTOŠO SLĀPEKĻA BĀŽU NOTEIKŠANA

I.   AR MIKRODIFŪZIJU

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj barībā noteikt gaistošo slāpekļa bāžu saturu, kas izteikts kā amonjaks.

2.   Princips

Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala mikrodifūzijas ceļā, izmantojot kālija karbonāta šķīdumu, savāc borskābes šķīdumā un titrē ar sērskābi.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Nosver 10 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 100 ml ūdens ielej 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.1.), papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru.

Izmantojot pipeti, Konveja trauka centrā iepilina 1 ml borskābes šķīduma (3.3.) un 1 ml parauga filtrāta – trauka ārējā lokā. Daļēji nosedz ar ietaukotu vāku. 1 ml piesātināta kālija karbonāta šķīduma (3.4.) ātri iepilina ārējā lokā un aizver vāku, hermētiski noslēdzot trauku. Trauku uzmanīgi griež, lai tas rotētu horizontālā plaknē un abi reaģenti sajauktos. Iztur vai nu vismaz četras stundas istabas temperatūrā, vai vienu stundu 40 oC.

Ja izmanto mikrobireti (4.3.), tad gaistošās bāzes borskābes šķīdumā titrē ar sērskābi (3.5.).

Veic tukšo analīzi, izmantojot to pašu procedūru, bet bez analizējamā parauga.

6.   Rezultātu aprēķināšana

1 ml H2SO40,01 mol/l atbilst 0,34 miligramiem amonjaka.

Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.

Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nepārsniedz:

7.   Novērojums

Ja amonjaka saturs paraugā pārsniedz 0,6 %, tad atšķaida sākotnējo filtrātu.

KONVEJA TRAUKS

Mērogs 1:1

II.   DESTILĒJOT

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj zivju miltos, kas praktiski nesatur urīnvielu, noteikt gaistošo slāpekļa bāžu saturu, izteiktu kā amonjaks. To piemēro tikai tad, ja amonjaka saturs ir mazāks par 0,25 %.

2.   Princips

Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala viršanas temperatūrā, pievienojot magnija oksīdu, savāc konkrētā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Ar precizitāti līdz 1 mg nosver 10 g parauga un kopā ar 100 ml ūdens ievieto 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.1.), papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru.

Ņem tādu tīra filtrāta daudzumu, kas ir piemērots gaistošo slāpekļa bāžu domājamajam saturam (parasti der 100 ml). Atšķaida līdz 200 ml un pievieno 2 g magnija oksīda (3.2.) un dažus pilienus pretputošanas emulsijas (3.3.). Šķīduma reakcijai, pārbaudot ar lakmusa papīru, jābūt sārmainai; pretējā gadījumā pievieno vēl magnija oksīdu (3.2.). Rīkojas, kā noteikts analīzes metodes jēlproteīna satura noteikšanai 5.2. un 5.3. punktā (šā pielikuma C daļa).

Veic tukšo analīzi, izmantojot to pašu procedūru, bet bez analizējamā parauga.

6.   Rezultātu aprēķināšana

1 ml H2SO40,05 mol/l atbilst 1,7 miligramiem amonjaka.

Rezultātu izsaka procentos no parauga.

Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nepārsniedz 10 % amonjaka relatīvās vērtības.

F.   AMINOSKĀBJU (IZŅEMOT TRIPTOFĀNU) NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt brīvās (sintētiskās un dabīgās) un kopējās (ar peptīdsaitēm saistītās un brīvās) aminoskābes barībā, izmantojot aminoskābju analizētāju. To izmanto, lai noteiktu šādas aminoskābes: cist(e)īns, metionīns, lizīns, treonīns, alanīns, arginīns, asparagīnskābe, glutamīnskābe, glicīns, histidīns, izoleicīns, leicīns, fenilalanīns, prolīns, serīns, tirozīns un valīns.

Pēc šīs metodes neatšķir aminoskābju sāļus un nediferencē D un L formas aminoskābes. To nevar izmantot, lai noteiktu triptofāna un aminoskābju hidroksianalogus.

2.   Princips

2.1.   Brīvās aminoskābes

Brīvās aminoskābes ekstrahē ar atšķaidītu sālsskābi. Līdzekstrahētās slāpekļa makromolekulas izgulsnē ar sulfosalicilskābi un atdala filtrējot. Filtrēto šķīdumu koriģē līdz pH 2,20 . Aminoskābes sadala ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un pēc reakcijas ar ninhidrīnu nosaka fotometriski pie 570 nm.

2.2.   Kopējās aminoskābes

Procedūru izvēlas atkarībā no nosakāmajām aminoskābēm. Pirms hidrolīzes cist(e)īns un metionīns jāoksidē attiecīgi līdz cisteīnskābei un metionīna sulfonam. Tirozīns jānosaka neoksidētu paraugu hidrolizātos. Visas pārējās 1. punktā minētās aminoskābes var noteikt oksidētā vai neoksidētā paraugā.

Oksidēšanu veic 0 oC temperatūrā ar peroksiskudrskābes/fenola maisījumu. Oksidēšanas reaģenta pārpalikumu sadala ar nātrija disulfītu. Oksidēto vai neoksidēto paraugu 23 stundas hidrolizē ar sālsskābi (3.20.). Hidrolizātu koriģē līdz pH 2,20 . Aminoskābes sadala ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un pēc reakcijas ar ninhidrīnu nosaka fotometriski pie 570 nm (440 nm prolīnam).

3.   Reaģenti

Jāizmanto ūdens bidestilāts vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens (vadītspēja < 10 μS).

Ūdenī atšķaida 300 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram.

Ūdenī atšķaida 40 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram.

Samaisa 889 g skudrskābes (3.2.) ar 111 g ūdens un pievieno 4,73 g fenola (3.3.).

Pievieno 1 g fenola (3.3.) uz 492 ml HCl (3.7.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

Izšķīdina 60 g 5-sulfosalicilskābes (3.6.) ūdenī un papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

Nelielā vārglāzē samaisa 0,5 ml ūdeņraža peroksīda (3.1.) ar 4,5 ml skudrskābes un fenola šķīduma (3.19.). Iztur 20–30 oC temperatūrā vienu stundu, lai izveidojas peroksiskudrskābe, tad atdzesē ledusvannā (15 min), pirms pievieno paraugam.

Uzmanību: izvairīties no saskares ar ādu un valkāt aizsargapģērbu!

Izšķīdina 19,61 g nātrija citrāta (3.8.), 5 ml tiodiglikola (3.9.), 1 g fenola (3.3.) un 16,50 ml HCl (3.7.) apmēram 800 mililitros ūdens. Koriģē pH līmeni līdz 2,20 . Papildina ar ūdeni līdz vienam litram.

c = 2,5 μmol/ml no katra sālsskābē.

Var iegūt komerciāli.

Izšķīdina 0,2115 g cisteīnskābes (3.16.2.) un 0,2265 g metionīna sulfona (3.16.3.) citrāta buferšķīdumā (3.24.) viena litra mērkolbā un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā 12 mēnešus. Minēto šķīdumu neizmanto, ja izejas standartšķīdums (3.27.1.) satur cisteīnskābi un metionīna sulfonu.

Izšķīdina 0,6560 g norleicīna (3.13.) citrāta buferšķīdumā (3.24.) mērkolbā un papildina līdz 250 ml ar citrāta buferšķīdumu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā sešus mēnešus.

Kvantitatīvi pārnes 50 ml mērkolbā un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu (3.24.), un samaisa.

Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā trīs mēnešus.

Skatīt arī 9.1. novērojumu.

Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā trīs mēnešus.

4.   Ierīces

Kolonnu piepilda ar sulfonētiem polistirola sveķiem, kas spēj atdalīt aminoskābes citu no citas un no pārējiem ninhidrīnpozitīviem materiāliem. Plūsmu bufera un ninhidrīna līnijā nodrošina sūkņi, kuru plūsmas stabilitāte ir ±0,5 % periodā, kas ietver gan standarta kalibrēšanas norisi, gan parauga analīzi.

Ar dažiem aminoskābju analizētājiem var izmantot hidrolīzes procedūras, kurās hidrolizātā nātrija koncentrācija ir c = 0,8 mol/l un hidrolizāts satur visu atlikušo skudrskābi no oksidācijas posma. Pārējās pietiekami labi neatdala dažas aminoskābes, ja hidrolizāts satur skudrskābes pārpalikumu un/vai augstu nātrija jonu koncentrāciju. Tādā gadījumā skābes tilpumu samazina, pēc hidrolīzes un pirms pH līmeņa korekcijas iztvaicējot apmēram līdz 5 ml. Iztvaicēšanu veic vakuumā augstākais 40 oC temperatūrā.

5.   Procedūra

5.1.   Parauga sagatavošana

Paraugu samaļ, lai tas izsijātos caur sietu ar 0,5 mm acojumu. Paraugi, kuros ir liels mitruma saturs, pirms malšanas vai nu jāizkaltē temperatūrā, kas nepārsniedz 50 oC, vai jāizžāvē ar izsaldēšanu. Paraugus, kuros ir liels tauku saturs, pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.12.).

5.2.   Brīvo aminoskābju noteikšana barībā un premiksos

Attiecīgu apjomu (1–5 g) sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver koniskā kolbā un pievieno 100,0 ml ekstrakcijas maisījuma (3.21.). Maisījumu 60 minūtes krata, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.8.). Ļauj nogulsnēm nogulsnēties un 10,0 ml šķīduma augšējā slāņa ar pipeti iepilina vārglāzē.

Pievieno 5,0 ml sulfosalicilskābes šķīduma (3.22.), vienlaikus maisot, un turpina maisīt ar magnētisko maisītāju piecas minūtes. Šķīduma augšējo slāni filtrē vai centrifugē, lai atdalītu visas nogulsnes. Ievieto 10,0 ml iegūtā šķīduma 100 ml vārglāzē un koriģē pH līmeni līdz 2,20 , izmantojot nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.), pārnes uz attiecīga tilpuma mērkolbu, izmantojot citrāta buferšķīdumu (3.24.), un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.).

Ja izmanto iekšējo standartu, tad pievieno 1,00 ml iekšējā standarta (3.27.3.) uz katriem 100 ml galīgā šķīduma un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.).

Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam.

Ja ekstraktus nepārbauda tajā pašā dienā, tad tie jāuzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC.

5.3.   Kopējo aminoskābju noteikšana

5.3.1.    Oksidācija

No 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver:

Nosvērtajā apjomā, no kura ņem paraugu, slāpekļa saturam jābūt apmēram 10 mg un mitruma saturam – ne vairāk par 100 mg.

Kolbu/pudeli ievieto ledusvannā un atdzesē līdz 0 oC, pievieno 5 ml oksidēšanas maisījuma (3.23.) un samaisa, izmantojot stikla lāpstiņu ar liektu galu. Kolbu/pudeli, kurā ir lāpstiņa, cieši noslēdz ar hermētisku plēvi, ievieto ledusvannu ar noslēgto trauku ledusskapī 0 oC temperatūrā un atstāj uz 16 stundām. Pēc 16 stundām izņem no ledusskapja un sadala oksidēšanas reaģenta pārpalikumu, pievienojot 0,84 g nātrija disulfīta (3.4.).

Rīkojas, kā noteikts 5.3.2.1. punktā.

5.3.2.    Hidrolīze

5.3.2.1.    Oksidēto paraugu hidrolīze

Oksidētajam paraugam, kas sagatavots atbilstoši 5.3.1. punktam, pievieno 25 ml hidrolīzes maisījuma (3.20.), raugoties, lai tiktu noskalotas visas parauga atliekas, kas pielipušas trauka malām un lāpstiņai.

Atkarībā no izmantotās hidrolīzes procedūras rīkojas, kā noteikts 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktā.

5.3.2.2.    Neoksidēto paraugu hidrolīze

100 ml vai 250 ml apaļkolbā (4.1.) vai 100 ml pudelē, kas aprīkota ar skrūvējamu vāciņu (4.2.), ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver no 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.). Slāpekļa saturam iesvērtajā analizējamā paraugā jābūt apmēram 10 mg. Uzmanīgi pievieno 25 ml hidrolīzes maisījuma (3.20.) un samaisa ar paraugu. Rīkojas, kā noteikts 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktā.

5.3.2.3.    Atvērtā hidrolīze

Maisījumam kolbā (kas sagatavots atbilstoši 5.3.2.1. vai 5.3.2.2. punktam) pievieno trīs stikla lodītes un vāra, maisījumam attecē nepārtraukti burbuļojot 23 stundas. Pēc hidrolīzes pabeigšanas kondensatoru noskalo ar 5 ml citrāta buferšķīduma (3.24.). Kolbu atvieno un atdzesē ledusvannā.

Rīkojas, kā noteikts 5.3.3. punktā.

5.3.2.4.   S lēgtā hidrolīze

Pudeli ar maisījumu, kas sagatavots saskaņā ar 5.3.2.1. vai 5.3.2.2. punktu, ievieto krāsnī (4.3.) 110 oC temperatūrā. Pirmajā stundā, lai novērstu spiediena uzkrāšanos (kas notiek gāzveida vielu veidošanās dēļ) un lai novērstu sprādzienu, uz trauka augšas uzliek skrūvējamu vāciņu. Trauku neaizver ar vāciņu. Pēc vienas stundas trauku aizver ar vāciņu un atstāj krāsnī (4.3.) 23 stundas. Pēc hidrolīzes pabeigšanas pudeli izņem no krāsns, uzmanīgi atver pudeles vāciņu un pudeli ieliek ledusvannā. Atstāj atdzist.

Atkarībā no procedūras, kādu izmanto pH līmeņa korekcijai (5.3.3.), kvantitatīvi pārnes pudeles saturu 250 ml vārglāzē vai 250 ml apaļkolbā, izmantojot citrāta buferšķīdumu (3.24.).

Rīkojas, kā noteikts 5.3.3. punktā.

5.3.3.    pH līmeņa korekcija

Lai koriģētu pH līmeni, atkarībā no aminoskābes analizētāja (4.9.) nātrija tolerances rīkojas atbilstoši 5.3.3.1. vai 5.3.3.2. punktam.

5.3.3.1.    Hromatogrāfijas sistēmām (4.9.), kurām nepieciešama zema nātrija koncentrācija

Ja izmanto aminoskābju analizētājus, kuriem nepieciešama zema nātrija koncentrācija (kad skābes tilpums jāsamazina), ieteicams izmantot iekšējo izejas standartšķīdumu (3.27.3.).

Tādā gadījumā hidrolizātam pirms iztvaicēšanas pievieno 2,00 ml iekšējā izejas standartšķīduma (3.27.3.).

Pievieno divus pilienus 1-oktanola (3.15.) hidrolizātam, kas iegūts saskaņā ar 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktu.

Izmantojot rotācijas iztvaicētāju (4.7.), vakuumā un 40 oC grādu temperatūrā samazina tilpumu līdz 5–10 ml. Ja tilpumu nejauši samazina līdz mazāk nekā 5 ml, tad hidrolizāts jāizmet un analīze jāsāk no jauna.

Ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.) koriģē pH līmeni līdz 2,20 un rīkojas, kā noteikts 5.3.4. punktā.

5.3.3.2.    Visiem pārējiem aminoskābju analizētājiem (4.9.)

Hidrolizātus, kas iegūti saskaņā ar 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktu, daļēji neitralizē un, uzmanīgi maisot, pievieno 17 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.17.), un nodrošina, lai temperatūra būtu zem 40 oC.

Koriģē pH līmeni līdz 2,20 istabas temperatūrā, izmantojot nātrija hidroksīda šķīdumu (3.17.) un visbeidzot – nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.). Pāriet pie 5.3.4. punkta.

5.3.4.    Parauga šķīdums hromatogrāfijai

Kvantitatīvi pārnes pH koriģēto hidrolizātu (5.3.3.1. vai 5.3.3.2.) ar citrāta buferšķīdumu (3.24.) 200 ml tilpuma mērkolbā un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.).

Ja iekšējais standarts nav jau izmantots, tad pievieno 2,00 ml iekšējā standarta (3.27.3.) un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu (3.24.). Rūpīgi samaisa.

Pāriet pie hromatogrāfijas posma (5.4.).

Ja parauga šķīdumus nepārbauda tajā pašā dienā, tad tie jāuzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC.

5.4.   Hromatogrāfija

Pirms hromatogrāfijas ekstraktu (5.2.) vai hidrolizātu (5.3.4.) sasilda līdz istabas temperatūrai. Maisījumu sakrata un piemērotu daudzumu izfiltrē caur 0,22 μm membrānfiltru (4.5.). Iegūto dzidro šķīdumu pakļauj jonu apmaiņas hromatogrāfijai, izmantojot aminoskābju analizētāju (4.9.).

Injekciju var veikt manuāli vai automātiski. Ir svarīgi, lai kolonnā standartu un paraugu analīzei tiktu pievienots vienāds šķīduma daudzums ± 0,5 %, izņemot gadījumus, kad izmanto iekšējo standartu, un lai nātrija/aminoskābes proporcijas standarta un parauga šķīdumos būtu pēc iespējas līdzīgākas.

Parasti kalibrēšanas posmu biežums ir atkarīgs no ninhidrīna reaģenta stabilitātes un analīžu sistēmas. Standartu vai paraugu atšķaida ar citrāta buferšķīdumu (3.24.), lai uzrādītu standarta maksimālo laukumu 30–200 % no parauga aminoskābes maksimālā laukuma.

Aminoskābju hromatogrāfija nedaudz atšķirsies atkarībā no izmantotā analizētāja tipa un sveķiem. Izvēlētajai sistēmai jāspēj atdalīt aminoskābes citu no citas un no ninhidrīnpozitīviem materiāliem. Darbības diapazonā hromatogrāfiskajai sistēmai jāsniedz lineāra atbilde uz pārmaiņām to aminoskābju daudzumos, ko pievieno kolonnā.

Kad analizē (nosakāmo aminoskābju) ekvimolāru šķīdumu, tad hromatogrāfijas posma laikā piemēro tālāk minētās attiecības, kas ir starp maksimālo augstumu un atstarpi starp signāliem. Tādam ekvimolāram šķīdumam jāsatur vismaz 30 % no katras aminoskābes maksimālās slodzes, ko var precīzi izmērīt, izmantojot aminoskābju analizētāja sistēmu (4.9.).

Lai atdalītu treonīnu un serīnu, attiecība starp maksimālo augstumu un atstarpi starp signāliem zemākajā no divām aminoskābēm, kuras pārklājas hromatogrammā, nedrīkst pārsniegt 2:10 (ja nosaka tikai cist(e)īnu, metionīnu, treonīnu un lizīnu, tad nepietiekama atdalīšana no blakusesošajiem maksimālajiem augstumiem negatīvi ietekmēs noteikšanu). Visām pārējām aminoskābēm atdalījumam jābūt precīzākam par 1:10.

Sistēmai jānodrošina, lai lizīns tiktu atdalīts no “lizīna artefaktiem” un ornitīna.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Parauga un standarta maksimumu laukumu mēra katrai atsevišķai aminoskābei un aprēķina daudzumu (X) gramos, cik aminoskābes ir kilogramā parauga.

Ja izmanto iekšējo standartu, pareizina ar:

A

=

maksimālais laukums, hidrolizāts vai ekstrakts,

B

=

maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums,

C

=

maksimālais laukums, iekšējais standarts hidrolizātā vai ekstraktā,

D

=

maksimālais laukums, iekšējais standarts, kalibrēšanas standartšķīdums,

M

=

nosakāmās aminoskābes molmasa,

c

=

standarta koncentrācija μmol/ml,

m

=

parauga svars (g) (koriģēts līdz sākotnējam svaram, ja kaltēts vai attaukots),

V

=

ml kopējā hidrolizāta (5.3.4.) vai ml ekstrakta aprēķinātā kopējā atšķaidījuma tilpuma (6.1.).

Cistīnu un cisteīnu nosaka kā cisteīnskābi oksidētā parauga hidrolizātos, bet aprēķina kā cistīnu (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), izmantojot M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionīnu nosaka kā metionīna sulfonu oksidētā parauga hidrolizātos, bet aprēķina kā metionīnu, izmantojot metionīna M 149,21 g/mol.

Pievienoto brīvo metionīnu nosaka pēc tam, kad tas ekstrahēts kā metionīns, aprēķinam izmanto to pašu M.

V

=

gala ekstrakta tilpums.

7.   Metodes novērtējums

Minēto metodi pārbaudīja starptautiskā līmenī 1990. gadā, salīdzinot rezultātus starp laboratorijām, izmantojot četras dažādas barības (barības maisījumu cūkām, barības maisījumu broileriem, proteīnu koncentrātu un premiksu). Vidējo un standarta noviržu rezultāti, kas iegūti pēc galējo punktu likvidēšanas, ir norādīti tabulās šajā punktā.

7.1.   Atkārtojamība

Iepriekš minētā savstarpējā salīdzinājuma atkārtojamība, kas izteikta kā “laboratorijas standartnovirze”, ir norādīta tālāk tabulā.

7.2   Atveidojamība

Starplaboratoriju standartnoviržu rezultāti, kas iegūti iepriekš minētajā savstarpējā salīdzinājumā, ir norādīti tālāk tabulā.

8.   Standartmateriālu izmantošana

Metodes pareizu piemērošanu verificē, atkārtoti mērot sertificētus standartmateriālus, kad tie ir pieejami. Ir ieteicama kalibrēšana ar sertificētu aminoskābes kalibrēšanas šķīdumu.

9.   Novērojumi

Aparāta lineārās reakcijas diapazons jāpārbauda attiecībā uz visām aminoskābēm.

Standartšķīdumu atšķaida ar citrāta buferšķīdumu, lai uzrādītu maksimālos laukumus diapazona vidū.

G.   TRIPTOFĀNA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt kopējo un brīvo triptofānu barībā. Tajā neizšķir D un L formu.

2.   Princips

Lai noteiktu kopējo triptofānu, paraugu hidrolizē sārmainos apstākļos ar piesātinātu bārija hidroksīda šķīdumu un 20 stundas karsē līdz 110 oC temperatūrai. Pēc hidrolīzes pievieno iekšējo standartu.

Lai noteiktu brīvo triptofānu, paraugu ekstrahē nedaudz skābā vidē iekšējā standarta klātbūtnē.

Triptofānu un iekšējo standartu hidrolizātā vai ekstraktā nosaka, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) ar fluorescences noteikšanu.

3.   Reaģenti

Ūdenī atšķaida 40,0 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.1.).

492 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

82 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

8,2 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

Paņem 34 ml ortofosforskābes (3.6.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.1.).

500 ml tilpuma mērkolbā izšķīdina 0,2553 g triptofāna (3.2.) sālsskābē (3.13.) un papildina līdz zīmei ar sālsskābi (3.13.). Uzglabā –18 oC temperatūrā ne ilgāk kā četras nedēļas.

500 ml tilpuma mērkolbā sālsskābē (3.13.) izšķīdina 0,2728 g α-metil-triptofāna (3.3.) un papildina līdz zīmei ar sālsskābi (3.13.). Uzglabā –18 oC temperatūrā ne ilgāk kā četras nedēļas.

Ņem 2,00 ml koncentrēta triptofāna (3.15.) šķīduma un 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16.). Atšķaida ar ūdeni (3.1.) un metanolu (3.8.) aptuveni līdz tādam pašam tilpumam un aptuveni tādai pašai metanola koncentrācijai (10–30 %) kā gatavajam hidrolizātam.

Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

Sagatavošanas laikā jāuzmana, lai nepiekļūst tieša saules gaisma.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Paraugu sagatavošana

Paraugu samaļ, lai tas izsijātos caur sietu ar 0,5 mm acojumu. Paraugi, kuros ir liels mitruma saturs, pirms malšanas vai nu jāizkaltē temperatūrā, kas nepārsniedz 50 oC, vai jāizžāvē ar izsaldēšanu. Paraugus, kuros ir liels tauku saturs, pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.9.).

5.2.   Brīvā triptofāna noteikšana (ekstrakts)

Attiecīgu apjomu (1–5 g) sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 1 mg iesver koniskā kolbā. Pievieno 100,0 ml sālsskābes (3.13.) un 5,00 ml koncentrēta iekšējā standartšķīduma (3.16.). Krata vai maisa 60 minūtes, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.7.). Ļauj nogulsnēm nogulsnēties un 10,0 ml šķīduma augšējā slāņa ar pipeti iepilina vārglāzē. Pievieno 5 ml ortofosforskābes (3.14.). Koriģē pH līmeni līdz 3, izmantojot nātrija hidroksīdu (3.10.). Pievieno pietiekami daudz metanola (3.8.), lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu no 10 līdz 30 %. Pārnes attiecīga tilpuma kolbā un atšķaida ar ūdeni līdz tilpumam, kas vajadzīgs hromatogrāfijai (aptuveni tikpat, cik ir kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.)).

Izfiltrē dažus ml šķīduma caur 0,45 μm membrānfiltru (4.5.), pirms šķīdumu iešpricē HPLC kolonnā. Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam.

Standartšķīdums un ekstrakti jāsargā no tiešas saules gaismas. Ja ekstraktus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tad tos var uzglabāt 5 oC temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas.

5.3.   Kopējā triptofāna (hidrolizāta) noteikšana

No 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver polipropilēna kolbā (4.4.). Slāpekļa saturs iesvērtajā analizējamā paraugā ir apmēram 10 mg. Pievieno 8,4 g bārija hidroksīda oktahidrāta (3.4.) un 10 ml ūdens. Samaisa virpuļmikserī (4.8.) vai ar magnētisko maisītāju (4.7.). Atstāj maisījumā ar teflonu pārklātu magnētu. Trauka sienas noskalo ar 4 ml ūdens. Uzliek skrūvējamu korķi un vaļīgi aiztaisa kolbu. Pārvieto uz autoklāvu (4.6.) ar vārošu ūdeni un tvaicē 30–60 minūtes. Aizver autoklāvu un tur karsē 110 (± 2) oC temperatūrā 20 stundas.

Pirms autoklāva atvēršanas temperatūru samazina, lai tā būtu nedaudz zem 100 oC. Lai novērstu Ba(OH)2 ·8 H2O kristalizāciju, siltajam maisījumam pievieno 30 ml istabas temperatūras ūdens. Viegli sakrata vai samaisa. Pievieno 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16.). Atdzesē traukus ūdenī/ledusvannā 15 minūtes.

Tad pievieno 5 ml ortofosforskābes (3.14.). Trauku tur dzesēšanas vannā un neitralizē ar HCl (3.11.), vienlaikus maisot, un pH līmeni koriģē līdz 3,0 , izmantojot HCl (3.12.). Pievieno pietiekami daudz metanola, lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu no 10 līdz 30 %. Pārnes atbilstoša tilpuma kolbā un atšķaida ar ūdeni līdz tilpumam, kas noteikts hromatogrāfijas vajadzībām (piemēram, 100 ml). Pievienojot metanolu, neveidojas nogulsnes.

Izfiltrē dažus ml šķīduma caur 0,45 μm membrānfiltru (4.5.), pirms šķīdumu iešpricē HPLC kolonnā. Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam.

Standartšķīdums un hidrolizāti jāsargā no tiešas saules gaismas. Ja hidrolizātus nav iespējams izanalizēt tajā pašā dienā, tad tos var uzglabāt 5 oC temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas.

5.4.    HPLC noteikšana

Orientējoši izokrātiskajai eluācijai piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus (skatīt arī 9.1. un 9.2. novērojumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Aprēķina triptofāna (X) daudzumu gramos uz 100 g parauga.

A

=

iekšējā standarta maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.),

B

=

triptofāna maksimālais laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.),

V1

=

koncentrētā triptofāna šķīduma (3.15.) tilpums mililitros (2 ml), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.),

c

=

koncentrētā triptofāna šķīduma (3.15.) koncentrācija μmol/ml (= 2,50 ), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.),

V2

=

koncentrētā iekšējā standartšķīduma (3.16.) tilpums mililitros, ko pievieno ekstrahēšanas laikā (5.2.) (= 5,00 ml) vai hidrolizātam (5.3.) (=2,00 ml),

C

=

iekšējā standarta maksimālais laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.),

D

=

triptofāna maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.),

V3

=

koncentrētā iekšējā standartšķīduma (3.16.) tilpums mililitros (= 2,00 ml), ko pievieno kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17.),

m

=

parauga svars gramos (koriģēts līdz sākotnējam svaram, ja kaltēts un/vai attaukots),

M

=

triptofāna molmasa (= 204,23 g/mol).

7.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 10 % attiecībā pret lielāko rezultātu.

8.   Koppētījuma rezultāti

Tika noorganizēts EK koppētījums (4. salīdzinājums starp laboratorijām), kurā līdz 12 laboratorijām analizēja trīs paraugus, lai sertificētu hidrolīzes metodi. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.

L

=

to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus,

n

=

atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu),

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

r

=

atkārtojamība,

R

=

atveidojamība,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients (%),

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%).

Tika noorganizēts cits EK koppētījums (3. salīdzinājums starp laboratorijām), kurā līdz 13 laboratorijām analizēja divus paraugus, lai sertificētu brīvā triptofāna ekstrahēšanas metodi. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.

L

=

to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus,

n

=

atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu),

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

r

=

atkārtojamība,

R

=

atveidojamība,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients (%),

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%).

Tika noorganizēts cits EK salīdzinājuma pētījums starp laboratorijām, kurā līdz septiņām laboratorijām analizēja četrus paraugus, lai sertificētu triptofānu hidrolīzei. Rezultāti ir norādīti tālāk. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes.

L

=

to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus,

n

=

atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu),

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

r

=

atkārtojamība,

R

=

atveidojamība,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients (%),

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%).

9.   Novērojumi

Izokrātiskā eluācija, pēc kuras notiek gradienta kolonnas tīrīšana:

Darbības diapazonā hromatogrāfijas sistēma uzrāda lineāru reakciju. Lineāro reakciju mēra nemainīgā (normālā) iekšējā standarta koncentrācijā un mainīgās triptofāna koncentrācijās. Gan triptofāna, gan iekšējā standarta maksimumiem jābūt HPLC/fluorescences sistēmas lineārajā intervālā. Ja triptofāna un/vai iekšējā standarta maksimums(-i) ir pārāk mazs(-i) vai liels(-i), analīzi atkārto ar citu parauga apjomu un/vai citu galīgo tilpumu.

Laika gaitā bārija hidroksīda šķīdība samazinās. Līdz ar to HPLC noteiktais šķīdums ir neskaidrs un var uzrādīt zemu triptofāna saturu.

H.   JĒLEĻĻU UN JĒLTAUKU NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Ar šo metodi nosaka jēleļļas un jēltaukus barībā. Tā neattiecas uz eļļas augu sēklu un augļu analīzi.

Abu turpmāk aprakstīto procedūru izmantošana ir atkarīga no barības īpašībām un sastāva, kā arī no iemesla, kādēļ tiek veikta analīze.

1.1.   A procedūra. Tieši ekstrahējamās jēleļļas un jēltauki

Šo metodi piemēro augu izcelsmes barības līdzekļiem, izņemot tos, kas iekļauti B procedūras darbības jomā.

1.2.   B procedūra. Jēleļļas un jēltauki kopā

Šo metodi piemēro dzīvnieku izcelsmes barības līdzekļiem un visiem barību maisījumiem. Tā jāizmanto visiem barības līdzekļiem, no kuriem bez iepriekšējas hidrolīzes nevar pilnībā ekstrahēt eļļas un taukus (piemēram, kviešu lipeklim, raugam, kartupeļu proteīniem un produktiem, kas pārstrādāti ar ekstrūzijas paņēmienu pārslojot vai karsējot).

1.3.   Rezultātu interpretēšana

Visos gadījumos, kad, izmantojot B procedūru, iegūst augstāku rezultātu, nekā izmantojot A procedūru, par patieso vērtību uzskata B procedūrā iegūto rezultātu.

2.   Princips

2.1.   A procedūra

Paraugu ekstrahē ar petrolēteri. Pēc šķīdinātāja atdestilēšanas atlikumu izžāvē un nosver.

2.2.   B procedūra

Paraugu apstrādā ar sālsskābi karsējot. Maisījumu atdzesē un filtrē. Atlikumu skalo, žāvē un veic noteikšanu saskaņā ar A procedūru.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   A procedūra (skatīt 8.1. punktu)

Ar precizitāti līdz 1 mg iesver 5 g parauga, pārnes to uz ekstrakcijas kapsulu (4.2.) un nosedz ar attaukotas kokvilnas vates tamponu.

Kapsulu ieliek ekstraktorā (4.1.) un ekstrahē sešas stundas ar petrolēteri (3.1.). Petrolētera ekstraktu savāc sausā, nosvērtā kolbā, kurā atrodas pumeka gabaliņi ( 9 ).

Atdestilē šķīdinātāju. Atlikumu izžāvē, turot kolbu pusotras stundas žāvēšanas skapī (4.3.). Atstāj atdzist eksikatorā un nosver. Atkārtoti žāvē 30 minūtes, lai nodrošinātu, ka eļļu un tauku svars nemainās (divos secīgi veiktos svērumos svara zudumam jābūt mazākam par vai vienādam ar 1 mg).

5.2.   B procedūra

Nosver 2,5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg (skatīt 8.2. punktu), ievieto 400 ml vārglāzē vai 300 ml koniskā kolbā un pievieno 100 ml sālsskābes (3.3.) un pumeka gabaliņus. Vārglāzi nosedz ar pulksteņstiklu vai koniskajai kolbai pievieno atteces kondensatoru. Maisījumu uzkarsē līdz viršanas temperatūrai un vienu stundu lēni vāra uz nelielas gāzes degļa liesmas vai elektriskās plītiņas. Neļauj produktam pielipt pie konteinera sienām.

Atdzesē un pievieno tādu filtrēšanas palīgmateriāla (3.4.) daudzumu, kas ir pietiekams, lai novērstu eļļas un tauku zudumus filtrēšanas laikā. Izfiltrē caur samitrinātu, attaukotu, dubultu filtrpapīru. Atlikumu mazgā aukstā ūdenī līdz filtrāta neitrālai reakcijai. Pārbauda, vai filtrātā nav eļļu vai tauku. To klātbūtne liecina, ka paraugs pirms hidrolīzes jāekstrahē ar petrolēteri, izmantojot A procedūru.

Dubulto filtrpapīru ar atlikumu novieto uz pulksteņstikla un žāvē pusotras stundas žāvēšanas skapī (4.3.) 100 ± 3 oC temperatūrā.

Dubulto filtrpapīru ar sauso atlikumu ievieto ekstrakcijas kapsulā (4.2.) un nosedz ar attaukotas kokvilnas vates tamponu. Kapsulu ievieto ekstraktorā (4.1.) un rīkojas, kā norādīts 5.1. punkta otrajā un trešajā daļā.

6.   Rezultāta izteikšana

Atlikuma svaru izsaka procentos no parauga.

7.   Atkārtojamība

Viena laboranta divās paralēlās noteikšanās no viena parauga iegūtu rezultātu starpība nepārsniedz:

8.   Novērojumi

Ar precizitāti līdz 1 mg nosver 20 g parauga un samaisa ar 10 g vai vairāk gramiem bezūdens nātrija sulfāta (3.2.). Ekstrahē ar petrolēteri (3.1.), kā norādīts 5.1. punktā. Iegūto ekstraktu papildina līdz 500 ml ar petrolēteri (3.1.) un samaisa. No šķīduma paņem 50 ml un ielej mazā, sausā, nosvērtā kolbā, kurā atrodas pumeka gabaliņi. Atdestilē šķīdinātāju, izžāvē un rīkojas, kā norādīts 5.1. punkta pēdējā daļā.

Izdala šķīdinātāju no kapsulā palikušajiem ekstrakcijas atlikumiem, ko sasmalcina līdz 1 mm un pēc tam ievieto atpakaļ ekstrakcijas kapsulā (nepievieno nātrija sulfātu), un rīkojas, kā norādīts 5.1. punkta otrajā un trešajā daļā.

Eļļu un tauku saturu aprēķina procentos no parauga, izmantojot šādu formulu:

(10m1 + m2) × 5

kur:

m1

=

atlikuma svars gramos pēc pirmās ekstrakcijas (ekstrakta alikvotā daļa),

m2

=

atlikuma svars gramos pēc otrās ekstrakcijas.

I.   JĒLŠĶIEDRAS NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt barībā tādas skābēs un sārmos nešķīstošas organiskās vielas, kas nesatur taukus un ko parasti sauc par jēlšķiedru.

2.   Princips

Paraugu, ko attiecīgā gadījumā attauko, secīgi apstrādā ar noteiktas koncentrācijas vārošiem sērskābes un kālija hidroksīda šķīdumiem. Atlikumu ar filtrāciju atdala uz keramiskā stikla filtra, nomazgā, izžāvē, nosver un pārpelno temperatūras diapazonā no 475 līdz 500 oC. Svara zudums pārpelnojot atbilst testa parauga jēlšķiedras saturam.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Ar precizitāti līdz 1 mg iesver 1 g sagatavotā parauga un ievieto to tīģelī (4.2.) (skatīt 8.1., 8.2. un 8.3. novērojumu), un pievieno 1 g filtrēšanas palīgmateriāla (3.3.).

Samontē karsēšanas vienību (4.1.) un filtrtīģeli (4.2.), tad tīģeli savieno ar cilindru (4.3.). Ielej 150 ml vārošas sērskābes (3.1.) samontētajā cilindrā un tīģelī un vajadzības gadījumā pievieno dažus pilienus pretputošanas vielas (3.2.).

5 ± 2 minūtēs šķidrumu uzvāra un ļauj enerģiski vārīties precīzi 30 minūtes.

Atver izplūdes caurules (4.1.) krānu un vakuumā filtrē sērskābi caur filtrtīģeli, un mazgā atlikumu ar trīs secīgām 30 ml vāroša ūdens devām, nodrošinot, lai atlikums uz filtra pēc katras mazgāšanas tiktu izžāvēts sauss.

Aizver izplūdes krānu un ielej 150 ml vāroša kālija hidroksīda šķīduma (3.7.) samontētajā cilindrā un tīģelī, pievienojot dažus pilienus pretputošanas vielas (3.2.). 5 ± 2 minūtēs šķidrumu uzvāra un ļauj enerģiski vārīties precīzi 30 minūtes. Filtrē un atkārto mazgāšanas procedūru, kas izmantota sērskābes posmam.

Pēc pēdējās mazgāšanas un žāvēšanas atvieno tīģeli un tā saturu un atkal savieno to ar auksto ekstrakcijas vienību (4.6.). Atlikumu tīģelī mazgā vakuumā ar trīs secīgām 25 ml acetona (3.4.) devām, nodrošinot, lai atlikums uz filtra pēc katras mazgāšanas tiktu izžāvēts sauss.

Tīģeli žāvē krāsnī 130 oC temperatūrā līdz konstantam svaram. Pēc katras žāvēšanas atdzesē eksikatorā un ātri nosver. Tīģeli ievieto mufeļkrāsnī un vismaz 30 minūtes 475–500 oC temperatūrā pārpelno līdz konstantam svaram (divu secīgu svērumu svara zuduma starpībai jābūt mazākai par vai vienādai ar 2 mg).

Pēc katras karsēšanas un pirms svēršanas vispirms atdzesē krāsnī un tad – eksikatorā.

Veic tukšo analīzi bez parauga. Svara zudums pārpelnošanas rezultātā nedrīkst pārsniegt 4 mg.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Jēlšķiedras saturu, izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

m

=

parauga svars gramos,

m0

=

svara zudums gramos pēc pārpelnošanas noteikšanas laikā,

m1

=

svara zudums gramos pēc pārpelnošanas tukšās analīzes laikā.

7.   Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

8.   Novērojumi

J.   CUKURU NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt reducējošo cukuru daudzumu un, izdarot inversiju, kopējo cukuru daudzumu, ko izsaka glikozē vai attiecīgā gadījumā saharozē, pārveidojot ar koeficientu 0,95 . To piemēro barības maisījumiem. Pārējās barības analīzēm ir paredzētas īpašas metodes. Vajadzības gadījumā laktozi mēra atsevišķi un ņem vērā rezultātu aprēķinos.

2.   Princips

Cukurus ekstrahē atšķaidītā etanolā; šķīdumu dzidrina ar Karesa I šķīdumu un Karesa II šķīdumu. Pēc etanola atdalīšanas ar Lufa-Šorla metodi nosaka cukuru daudzumu pirms un pēc inversijas.

3.   Reaģenti

Uzmanīgi maisot, citronskābes šķīdumu (3.8.2.) ielej nātrija karbonāta šķīdumā (3.8.3.). Pievieno vara sulfāta šķīdumu (3.8.1.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni. Pa nakti atstāj nogulsnēties un filtrē.

Pārbauda tādējādi iegūtā reaģenta koncentrāciju (Cu 0,05 mol/litrā; Na2 CO3 1 mol/litrā), skatīt 5.4. punkta pēdējo daļu. Šķīduma pH līmenis ir apmēram 9,4 .

4.   Ierīces

Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.

5.   Procedūra

5.1.   Parauga ekstrahēšana

2,5 g parauga ar precizitāti līdz mg iesver 250 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 200 ml etanola (3.1.) un maisa maisītājā vienu stundu. Pievieno 5 ml Karesa I šķīduma (3.2.) un maisa apmēram 30 sekundes. Pievieno 5 ml Karesa II šķīduma (3.3.) un maisa vēl vienu minūti. Papildina ar etanolu (3.1.) līdz vajadzīgajam tilpumam, homogenizē un filtrē. Lai likvidētu lielāko daļu etanola, atdala 200 ml filtrāta un tvaicē, līdz paliek apmēram puse tilpuma. Izmantojot siltu ūdeni, iztvaicēšanas atlikumu kvantitatīvi pārnes 200 ml tilpuma mērkolbā, atdzesē, uzpilda līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, homogenizē un vajadzības gadījumā filtrē. Šo šķīdumu izmantos, lai noteiktu reducējošo cukuru daudzumu un pēc inversijas veikšanas – kopējo cukuru daudzumu.

5.2.   Reducējošo cukuru noteikšana

Ar pipeti ņem ne vairāk kā 25 ml šķīduma, kurā, izsakot glikozē, ir ne vairāk kā 60 mg reducējošo cukuru. Vajadzības gadījumā papildina līdz 25 ml ar destilētu ūdeni un nosaka reducējošo cukuru saturu, izmantojot Lufa-Šorla metodi. Rezultātu izsaka kā glikozes procentuālo saturu paraugā.

5.3.   Kopējo cukuru noteikšana pēc inversijas

Ar pipeti ņem 50 ml šķīduma un pārnes 100 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno dažus pilienus metiloranžā šķīduma (3.4.), tad, nepārtraukti maisot, uzmanīgi pievieno sālsskābi (3.5.), līdz šķidrums kļūst izteikti sarkans. Pievieno 15 ml sālsskābes (3.6.), uz trīsdesmit minūtēm iegremdē kolbu vannā ar ūdeni, kas strauji vārās. Strauji atdzesē apmēram līdz 20 oC temperatūrai un pievieno 15 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.7.). Papildina ar ūdeni līdz 100 ml un homogenizē. Atdala daudzumu, kas nepārsniedz 25 ml un satur mazāk nekā 60 mg reducējošo cukuru, izteiktu kā glikoze. Vajadzības gadījumā papildina līdz 25 ml ar destilētu ūdeni un nosaka reducējošo cukuru saturu, izmantojot Lufa-Šorla metodi. Rezultātu izsaka glikozes vai attiecīgā gadījumā saharozes procentos, reizinot ar koeficientu 0,95 .

5.4.   Titrēšana, izmantojot Lufa-Šorla metodi

Ar pipeti ņem 25 ml Lufa-Šorla reaģenta (3.8.) un pārnes 300 ml Erlenmeijera kolbā; pievieno precīzi 25 ml dzidrinātā cukura šķīduma. Pievieno divus gabaliņus pumeka (3.13.), ar roku maisot, uz vidēja augstuma vaļējas liesmas šķīdumu apmēram divās minūtēs uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai. Erlenmeijera kolbu nekavējoties novieto uz metāla sieta, kas pārklāts ar azbestu un kam ir apmēram 6 cm liels caurums, zem kura iedegta liesma. Liesmu noregulē tā, lai Erlenmeijera kolba tiktu karsēta tikai no apakšas. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces kondensatoru. Vāra precīzi desmit minūtes. Tūlīt atdzesē aukstā ūdenī un apmēram pēc piecām minūtēm titrē šādi.

Pievieno 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.12.) un tūlīt pēc tam (uzmanīgi, jo iespējama ievērojama putu veidošanās) pievieno 25 ml sērskābes (3.11.). Titrē ar nātrija tiosulfāta šķīdumu (3.9.), līdz parādās blāvi dzeltens krāsojums, pievieno cietes indikatoru (3.10.) un pabeidz titrēšanu.

Bez vārīšanas tādā pašā veidā titrē 25 ml precīzi mērīta Lufa-Šorla reaģenta (3.8.) un 25 ml ūdens maisījumu, kam pievienoti 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.12.) un 25 ml sērskābes (3.11.).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Izmantojot tabulu, nosaka glikozes daudzumu miligramos, kas atbilst abu titrēšanas vērtību starpībai un ko izsaka mg nātrija tiosulfāta 0,1 mol/l. Rezultātu izsaka procentos no parauga.

7.   Īpašas procedūras

Homogenizē un filtrē. Atdala etanolu, kā aprakstīts 5.1. punktā. Ja nav dekstrinētas cietes, tad uzpilda līdz tilpumam ar destilētu ūdeni.

8.   Novērojumi

Abos gadījumos klātesošā cukura daudzumu nosaka, izmantojot Lufa-Šorla metodi, un aprēķina glikozes miligramos. Vienu vērtību atņem no otras un starpību izsaka procentos no parauga.

Piemērs

Abi katrā noteikšanā ņemtie šķīdumu tilpumi atbilst 250 mg paraugam.

Pirmajā gadījumā patērē 17 ml nātrija tiosulfāta šķīduma 0,1 mol/l, kas atbilst 44,2 mg glikozes; otrā gadījumā – 11 ml, kas atbilst 27,6 mg glikozes.

Starpība ir 16,6 mg glikozes.

Līdz ar to reducējošo cukuru saturs (izņemot laktozi), kas aprēķināts kā glikoze, ir šāds:

K.   LAKTOZES NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt laktozes daudzumu barībā, kas satur vairāk par 0,5 % laktozes.

2.   Princips

Cukurus izšķīdina ūdenī. Šķīdumu fermentē ar Saccharomyces cerevisiae raugu, kas laktozi atstāj neskartu. Pēc dzidrināšanas un filtrēšanas laktozes saturu filtrātā nosaka, izmantojot Lufa-Šorla metodi.

3.   Reaģenti

Uzmanīgi maisot, citronskābes šķīdumu (3.4.2.) ielej nātrija karbonāta šķīdumā (3.4.3.). Pievieno vara sulfāta šķīdumu (3.4.1.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni. Pa nakti atstāj nogulsnēties un filtrē. Pārbauda tādējādi iegūtā reaģenta koncentrāciju (Cu 0,05 mol/litrā; Na2 CO3 1 mol/litrā). Šķīduma pH līmenis ir apmēram 9,4 .

4.   Ierīces

Ūdens vanna ar termostatu, kas iestatīts uz 38–40 oC.

5.   Procedūra

Iesver 1 g parauga ar precizitāti līdz mg un ievieto šo parauga daļu 100 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 25–30 ml ūdens. Uz trīsdesmit minūtēm ievieto kolbu vāroša ūdens vannā, tad atdzesē līdz apmēram 35 oC. Pievieno 5 ml rauga suspensijas (3.1.) un homogenizē. Atstāj kolbu uz divām stundām ūdens vannā 38–40 oC temperatūrā. Atdzesē līdz apmēram 20 oC.

Pievieno 2,5 ml Karesa I šķīduma (3.2.) un maisa trīsdesmit sekundes, tad pievieno 2,5 ml Karesa II šķīduma (3.3.) un maisa vēl trīsdesmit sekundes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml, samaisa un filtrē. Ar pipeti atdala ne vairāk kā 25 ml filtrāta, kas, ja iespējams, satur 40–80 mg laktozes, un pārnes to 300 ml Erlenmeijera kolbā. Vajadzības gadījumā papildina līdz 25 ml ar ūdeni.

Tādā pašā veidā veic tukšo analīzi ar 5 ml rauga suspensijas (3.1.). Šādi nosaka laktozes saturu atbilstoši Lufa-Šorla metodei: pievieno precīzi 25 ml Lufa-Šorla reaģenta (3.4.) un divus pumeka gabaliņus (3.5.). Ar roku maisot, uz vidēja augstuma vaļējas liesmas šķīdumu apmēram divās minūtēs uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai. Erlenmeijera kolbu tūlīt novieto uz metāla sieta, kas pārklāts ar azbestu un kam ir apmēram 6 cm diametra caurums, zem kura iedegta liesma. Liesmu noregulē tā, lai Erlenmeijera kolba tiktu karsēta tikai no apakšas. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces kondensatoru. Vāra precīzi desmit minūtes. Tūlīt atdzesē aukstā ūdenī un pēc apmēram piecām minūtēm titrē šādi.

Pievieno 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.6.) un tūlīt pēc tam (uzmanīgi, jo iespējama ievērojama putu veidošanās) pievieno 25 ml sērskābes (3.7.). Titrē ar nātrija tiosulfāta šķīdumu (3.8.), līdz parādās blāvi dzeltens krāsojums, pievieno cietes indikatoru (3.9.) un pabeidz titrēšanu.

Bez vārīšanas tādā pašā veidā titrē 25 ml precīzi mērīta Lufa-Šorla reaģenta (3.4.) un 25 ml ūdens maisījumu, kam pievienoti 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.6.) un 25 ml sērskābes (3.7.).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Izmantojot pievienoto tabulu, nosaka laktozes daudzumu miligramos, kas atbilst abu titrēšanu rezultātu starpībai un ko izsaka ml nātrija tiosulfāta 0,1 mol/l.

Rezultātu izsaka bezūdens laktozē kā parauga procentuālo daļu.

7.   Novērojums

Produktiem, kuri satur vairāk nekā 40 % fermentējama cukura, izmanto vairāk nekā 5 ml rauga suspensijas (3.1.).

L.   CIETES NOTEIKŠANA

POLARIMETRISKĀ METODE

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt cietes un lielmolekulāra svara cietes sadalīšanās produktu daudzumus barībā, lai pārbaudītu atbilstību deklarētajai enerģētiskajai vērtībai (VII pielikuma noteikumi) un Padomes Direktīvai 96/25/EK ( 10 ).

2.   Princips

Šī metode ietver divas noteikšanas. Pirmajā paraugu apstrādā ar atšķaidītu sālsskābi. Pēc dzidrināšanas un filtrēšanas šķīduma optisko rotāciju mēra, izmantojot polarimetriju.

Otrajā paraugu ekstrahē ar 40 % etanolu. Pēc tam, kad filtrāts ir paskābināts ar sālsskābi, dzidrināts un filtrēts, optisko rotāciju mēra tāpat kā pirmajā noteikšanā.

No abu mērījumu starpības, reizinot ar zināmu koeficientu, iegūst parauga cietes saturu.

3.   Reaģenti

Koncentrācija jāpārbauda, titrējot ar 0,1 mol/l nātrija hidroksīda šķīdumu 0,1 % (w/v) metilsarkanā klātbūtnē 94 % (v/v) etanolā. Lai neitralizētu 10 ml, vajag 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Parauga sagatavošana

Paraugu sasmalcina, līdz tas ir pietiekami smalks, lai izsijātos caur sietu ar 0,5 mm apaļu acojumu.

5.2.   Kopējās optiskās rotācijas (P vai S) noteikšana (skatīt 7.1. novērojumu)

2,5 g sasmalcinātā parauga ar precizitāti līdz mg iesver 100 ml mērkolbā. Pievieno 25 ml sālsskābes (3.2.), krata, lai testa paraugs vienmērīgi sadalītos, un pievieno vēl 25 ml sālsskābes (3.2.). Iegremdē kolbu vāroša ūdens vannā, pirmās trīs minūtes enerģiski un nepārtraukti kratot, lai novērstu aglomerātu veidošanos. Ūdens daudzumam ūdens vannā jābūt pietiekamam, lai vanna turpinātu vārīties, kad tajā ieliek kolbu. Kolbu no vannas nedrīkst izņemt, kad tā tiek kratīta. Precīzi pēc 15 minūtēm kolbu izņem no vannas, pievieno 30 ml auksta ūdens un tūlīt atdzesē līdz 20 oC.

Pievieno 5 ml Karesa I šķīduma (3.3.) un krata apmēram 30 sekundes. Tad pievieno 5 ml Karesa II šķīduma (3.4.) un atkal krata apmēram 30 sekundes. Papildina ar ūdeni līdz tilpumam, samaisa un filtrē. Ja filtrāts nav pilnīgi dzidrs (kas notiek reti), tad atkārto noteikšanu, izmantojot lielāku daudzumu Karesa I un II šķīduma, piemēram, 10 ml.

Ar polarimetru vai saharimetru izmēra šķīduma optisko rotāciju 200 mm mēģenē.

5.3.   Optiskās rotācijas (P' vai S') noteikšana vielām, kuras šķīst 40 % etanolā

Ar precizitāti līdz mg iesver 5 g parauga, ievieto 100 ml mērkolbā un pievieno apmēram 80 ml etanola (3.5.) (skatīt 7.2. novērojumu). Atstāj kolbu vienu stundu istabas temperatūrā; šajā laikā sešas reizes kārtīgi sakrata tā, lai testa paraugs labi sajauktos ar etanolu. Papildina līdz tilpumam ar etanolu (3.5.), samaisa un filtrē.

Ar pipeti 50 ml filtrāta (kas atbilst 2,5 g parauga) iepilina 250 ml Erlenmeijera kolbā, pievieno 2,1 ml sālsskābes (3.1.) un kārtīgi sakrata. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces kondensatoru un kolbu iegremdē vāroša ūdens vannā. Tieši pēc 15 minūtēm izņem Erlenmeijera kolbu no vannas, saturu pārnes 100 ml mērkolbā, skalojot ar nelielu daudzumu auksta ūdens, un atdzesē līdz 20 oC.

Dzidrina, izmantojot Karesa I (3.3.) un II (3.4.) šķīdumu, papildina līdz tilpumam ar ūdeni, samaisa, filtrē un izmēra optisko rotāciju, kā norādīts 5.2. punkta otrajā un trešajā daļā.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Cietes saturu (%) aprēķina šādi.

6.1.   Mērīšana ar polarimetru

P

=

kopējā optiskā rotācija leņķa grādos,

P'

=

40 % (V/V) etanolā šķīstošu vielu optiskā rotācija leņķa grādos,

=

tīras cietes specifiskā optiskā rotācija. Vispārīgi pieņemtās ; skaitliskās vērtības šim koeficientam ir šādas: +185,9 o: rīsu ciete +185,7 o: kartupeļu ciete +184,6 o: kukurūzas ciete +182,7 o: kviešu ciete +181,5 o: miežu ciete +181,3 o: auzu ciete +184,0 o: pārējie cietes un cietes maisījumu eidi barībasmaisījumos

6.2.   Mērīšana ar saharimetru

S

=

kopējā optiskā rotācija saharimetra grādos,

S'

=

40 % (v/v) etanolā šķīstošu vielu optiskā rotācija saharimetra grādos,

N

=

saharozes svars (g) 100 mililitros ūdens, kas, izmērot ar 200 mm mēģeni, dod 100 saharimetra grādu optisko rotāciju 16,29 g Francijas saharimetriem, 26,00 g Vācijas saharimetriem, 20,00 g jauktajiem saharimetriem. = tīras cietes specifiskā optiskā rotācija (skatīt 6.1. punktu).

6.3.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 0,4 no absolūtā lieluma, ja cietes saturs ir mazāks par 40 %, un 1 % no relatīvā lieluma, ja cietes saturs ir vienāds ar vai lielāks par 40 %.

7.   Novērojumi

M.   JĒLPELNU NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt jēlpelnu saturu barībā.

2.   Princips

Paraugu pārpelno 550 oC temperatūrā; atlikumu nosver.

3.   Reaģenti

Amonija nitrāts, 20 % šķīdums (w/v).

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Ar precizitāti līdz mg iesver apmēram 5 g parauga (2,5 g produktiem, kam ir tendence uzbriest) un ievieto pārpelnošanai tīģelī, kas iepriekš uzkarsēts līdz 550 oC, atdzesēts un nosvērts. Novieto tīģeli uz elektriskās plītiņas un pakāpeniski karsē, līdz viela pārogļojas. Pārpelno atbilstoši 5.1. vai 5.2. punktam.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Aprēķina atlikuma masu, atņemot taras masu.

Rezultātu izsaka procentos no parauga.

7.   Novērojumi

N.   SĀLSSKĀBĒ NEŠĶĪSTOŠU PELNU NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt tādu minerālvielu daudzumu barībā, kuras nešķīst sālsskābē. Atkarībā no parauga īpašībām var izmantot divas metodes.

2.   Princips

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   A metode

Paraugu pārpelno, izmantojot metodi, kas aprakstīta jēlpelnu noteikšanai. Var izmantot arī pelnus, kas iegūti no minētās analīzes.

Pelnus ievieto 250–400 ml vārglāzē, izmantojot 75 ml sālsskābes (3.1.). Lēni uzvāra un piecpadsmit minūtes lēni vāra. Silto šķīdumu izfiltrē caur bezpelnu filtrpapīru un atlikumu mazgā ar siltu ūdeni, līdz skābes reakcija vairs nav redzama. Filtru ar atlikumu izžāvē un pārpelno nosvērtajā tīģelī temperatūrā, kas nav zemāka par 550 oC un nav augstāka par 700 oC. Atdzesē eksikatorā un nosver.

5.2.   B metode

5 g parauga ar precizitāti līdz mg iesver 250–400 ml vārglāzē. Secīgi pievieno 25 ml ūdens un 25 ml sālsskābes (3.1.), samaisa un gaida, līdz pārstāj izdalīties burbuļi. Pievieno vēl 50 ml sālsskābes (3.1.). Pagaida, līdz gāze pārstāj izdalīties, tad ievieto vārglāzi vāroša ūdens vannā un tur atstāj trīsdesmit minūtes vai ilgāk, ja vajadzīgs, lai rūpīgi hidrolizētu jebkuru tur iespējami klātesošu cieti. Siltu izfiltrē caur bezpelnu filtru un filtru izmazgā 50 ml silta ūdens (skatīt 7. novērojumu). Filtru ar atlikumu ievieto tīģelī pārpelnošanai, izžāvē un pārpelno temperatūrā, kas nav zemāka par 550 oC un nav augstāka par 700 oC. Pelnus ievieto 250–400 ml vārglāzē, izmantojot 75 ml sālsskābes (3.1.); turpina, kā aprakstīts 5.1. punkta otrajā daļā.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Aprēķina atlikuma masu, atņemot taras masu. Rezultātu izsaka procentos no parauga.

7.   Novērojums

Ja atlikums filtrējas slikti, tad analīzi sāk vēlreiz, 50 ml sālsskābes (3.1.) vietā ņemot 50 ml 20 % trihloretiķskābes (3.2.) un filtru mazgājot ar siltu 1 % trihloretiķskābes šķīdumu (3.3.).

O.   KARBONĀTU NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj lielākajā daļā barības noteikt karbonātu daudzumu, parasti izteiktu kā kalcija karbonāts.

Tomēr dažos gadījumos (piemēram, ar dzelzs karbonātu) jāizmanto īpaša metode.

2.   Princips

Karbonātus sadala ar sālsskābi; izdalījušos oglekļa dioksīdu uztver kalibrētā mēģenē un tā tilpumu salīdzina ar oglekļa dioksīda tilpumu, kas izdalās, tādos pašos apstākļos sadaloties zināmam daudzumam kalcija karbonāta.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

Šaiblera-Dītriha aparāts (skatīt diagrammu) vai tam līdzvērtīga iekārta.

5.   Procedūra

Atkarībā no karbonātu satura paraugā analīzei ņemtā parauga iesvara lielums ir šāds:

Parauga iesvaru pārnes aparāta speciālajā kolbā (4), kas aprīkota ar nelielu neplīstoša materiāla mēģeni, kurā ir 10 ml sālsskābes (3.1.), un kolbu pievieno aparātam. Pagriež trīsceļu krānu (5) tā, lai mēģene (1) būtu savienota ar atmosfēru. Izmantojot pārvietojamu mēģeni (2), kas piepildīta ar iekrāsotu sērskābes šķīdumu (3.3.) un pievienota kalibrētajai mēģenei (1), šķidruma līmeni iestata līdz nulles atzīmei. Pagriež krānu (5), savienojot mēģenes (1 un 3), un pārbauda, vai līmenis ir pret nulles atzīmi.

Kolbu (4) pagāžot uz sāna, parauga devai lēni pārlej sālsskābi (3.1.). Nolaižot zemāk mēģeni (2), izlīdzina spiedienu. Kolbu (4) krata, līdz pilnībā pārstāj izdalīties oglekļa dioksīds.

Atjauno spiedienu, izlīdzinot šķidruma līmeni mēģenēs (1 un 2). Pēc dažām minūtēm, kad gāzes tilpums kļuvis nemainīgs, veic nolasījumu.

Tādos pašos apstākļos analizē 0,5 g kalcija karbonāta (3.2.) kontrolparaugu.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Kalcija karbonātā izteiktu karbonātu saturu aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

X

=

% (w/w) kalcija karbonātā izteiktu karbonātu paraugā,

V

=

no parauga devas izdalītais CO2 tilpums ml,

V1

=

no 0,5 g CaCO3 izdalītais CO2 tilpums ml,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Novērojumi

P.   KOPĒJĀ FOSFORA DAUDZUMA NOTEIKŠANA

FOTOMETRISKĀ METODE

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt kopējo fosfora saturu barībā. Tā ir īpaši piemērota tādu produktu analīzei, kuros ir mazs fosfora daudzums. Dažos gadījumos (ja produktā ir daudz fosfora) var izmantot gravimetrijas metodi.

2.   Princips

Paraugu mineralizē, izmantojot vai nu sauso dedzināšanu (organiskās barības gadījumā), vai skābes šķelšanu (kombinēto minerālu un šķidrās barības gadījumā), un ievieto skābes šķīdumā. Šķīdumu apstrādā ar molibdovanadāta reaģentu. Tādējādi iegūtā dzeltenā šķīduma optisko blīvumu mēra spektrofotometrā pie 430 nm.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Šķīduma sagatavošana

Atkarībā no parauga īpašībām sagatavo šķīdumu, kā norādīts 5.1.1. vai 5.1.2. punktā.

5.1.1.    Parastā procedūra

Ar precizitāti līdz 1 mg nosver 1 g vai vairāk parauga. Testa paraugu ievieto Kjeldāla kolbā, pievieno 20 ml sērskābes (3.5.), sakrata, lai vielu pilnībā piesūcinātu ar skābi un neļautu tai pielipt pie kolbas sienām, uzkarsē un uztur viršanas temperatūru 10 minūtes. Nedaudz atdzesē, pievieno 2 ml slāpekļskābes (3.4.), lēnām uzkarsē, nedaudz atdzesē, pievieno vēl nedaudz slāpekļskābes (3.4.) un atjauno viršanas temperatūru. Procedūru atkārto, līdz iegūst bezkrāsainu šķīdumu. Atdzesē, pievieno mazliet ūdens, dekantē šķidrumu 500 ml mērkolbā, izskalojot Kjeldāla kolbu ar karstu ūdeni. Ļauj atdzist, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, homogenizē un filtrē.

5.1.2.    Paraugi, kuros ir organiskas vielas un nav kalcija un magnija dihidrogēnfosfātu

Apmēram 2,5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg iesver tīģelī pārpelnošanai. Maisa testa paraugu, līdz tas pilnībā sajaucies ar 1 g kalcija karbonāta (3.1.). Pārpelno krāsnī 550 oC temperatūrā, līdz iegūst baltus vai pelēkus pelnus (var būt arī nedaudz ogļu). Pelnus pārnes 250 ml vārglāzē. Pievieno 20 ml ūdens un sālsskābes (3.2.), līdz pārstāj veidoties burbuļi. Pievieno vēl 10 ml sālsskābes (3.2.). Vārglāzi novieto smilšu vannā un tvaicē, līdz tā ir sausa, lai kvarcu padarītu nešķīstošu. Atlikumu atkārtoti šķīdina 10 mililitros slāpekļskābes (3.3.) un piecas minūtes vāra smilšu vannā vai uz elektriskās plītiņas netvaicējot, līdz tas ir sauss. Šķidrumu dekantē 500 ml mērkolbā, vairākas reizes izskalojot vārglāzi ar karstu ūdeni. Ļauj atdzist, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, homogenizē un filtrē.

5.2.   Krāsojuma attīstība un optiskā blīvuma mērījums

Saskaņā ar 5.1.1. vai 5.1.2. punktu iegūtā filtrāta alikvoto daļu atšķaida, lai iegūtu fosfora koncentrāciju, kas nepārsniedz 40 μg/ml. 10 ml šā šķīduma ielej mēģenē (4.6.) un pievieno 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.). Homogenizē un atstāj 20 oC temperatūrā vismaz 10 minūtes. Spektrofotometrā pie 430 nm izmēra optisko blīvumu pret šķīdumu, ko iegūst, pievienojot 10 mililitrus molibdovanadāta reaģenta (3.6.) 10 mililitriem ūdens.

5.3.   Kalibrēšanas līkne

No standartšķīduma (3.7.) sagatavo šķīdumus, kas satur attiecīgi 5, 10, 20, 30 un 40 μg fosfora uz 1 ml. Ņem 10 ml no katra minētā šķīduma un pievieno 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.). Homogenizē un atstāj 20 oC temperatūrā vismaz 10 minūtes. Optisko blīvumu mēra tā, kā norādīts 5.2. punktā. Veido kalibrēšanas līkni, atzīmējot optiskos blīvumus un atbilstīgos fosfora daudzumus. Ja koncentrācija ir no 0 līdz 40 μg/ml, tad līkne būs lineāra.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Fosfora daudzumu testa paraugā nosaka, izmantojot kalibrēšanas līkni.

Rezultātu izsaka procentos no parauga.

Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nepārsniedz:

Q.   HLORĪDU HLORA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt hlora saturu ūdenī šķīstošos hlorīdos, ko parasti izsaka kā nātrija hlorīdu. To piemēro visai barībai.

2.   Princips

Hlorīdus izšķīdina ūdenī. Ja produkts satur organisku vielu, tad to dzidrina. Šķīdumu nedaudz paskābina ar slāpekļskābi un hlorīdus ar sudraba nitrāta šķīdumu izgulsnē sudraba hlorīda veidā. Sudraba nitrāta pārpalikumu attitrē ar amonija tiocianāta šķīdumu, izmantojot Volharda metodi.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.

5.   Procedūra

5.1.   Šķīduma sagatavošana

Atkarībā no parauga īpašībām sagatavo šķīdumu, kā norādīts 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3. punktā.

Vienlaikus veic tukšo analīzi, neizmantojot analizējamo paraugu.

5.1.1.    Paraugi, kuros nav organisku vielu

Ar precizitāti līdz mg iesver ne vairāk kā 10 g parauga, kurā ir ne vairāk par 3 g hlora hlorīdu veidā. Kopā ar 400 ml ūdens iepilda 500 ml tilpuma kolbā apmēram 20 oC temperatūrā. Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam, homogenizē un filtrē.

5.1.2.    Paraugi, kuros ir organiskas vielas, izņemot 5.1.3. punktā minētos produktus

Ar precizitāti līdz mg iesver apmēram 5 g parauga, ko kopā ar 1 g aktīvās ogles ievieto 500 ml tilpuma kolbā. Pievieno 400 ml apmēram 20 oC ūdens un 5 ml Karesa I šķīduma (3.7.), maisa 30 sekundes, tad pievieno 5 ml Karesa II šķīduma (3.8.). Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam, homogenizē un filtrē.

5.1.3.    Termiski apstrādāta barība, linu rauši un milti, produkti, kuros ir daudz linu miltu, un citi produkti, kuros ir daudz gļotvielu vai koloīdu vielu (piemēram, dekstrinēta ciete)

Sagatavo šķīdumu, kā aprakstīts 5.1.2. punktā, bet nefiltrē. Dekantē (vajadzības gadījumā centrifugē), atdala 100 ml no šķīduma augšējā slāņa un pārnes 200 ml mērkolbā. Samaisa ar acetonu (3.6.) un ar šo šķīdinātāju papildina līdz vajadzīgajam tilpumam, homogenizē un filtrē.

5.2.   Titrēšana

Ar pipeti Erlenmeijera kolbā pārnes 25 ml līdz 100 ml filtrāta (atkarībā no sagaidāmā hlorīdu satura), ko iegūst pēc apraksta 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3. punktā. Alikvotā daļa nedrīkst saturēt vairāk par 150 mg hlora (Cl). Vajadzības gadījumā atšķaida līdz vismaz 50 ml tilpumam ar ūdeni, pievieno 5 ml slāpekļskābes (3.4.), 20 ml piesātināta amonija dzelzs sulfāta šķīduma (3.3.) un divus pilienus amonija tiocianāta šķīduma (3.1.), ko ņem ar bireti, kas uzpildīta līdz nulles atzīmei. Ar bireti pārnes sudraba nitrāta šķīdumu (3.2.) tā, lai tas būtu 5 ml pārākumā. Pievieno 5 ml dietilētera (3.5.) un stipri sakrata, lai koagulētu nogulsnes. Sudraba nitrāta pārākumu titrē ar amonija tiocianāta šķīdumu (3.1.), līdz veidojas sarkanbrūns krāsojums, kas saglabājas vienu minūti.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Hlora daudzumu (X), izteiktu % no nātrija hlorīda, aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

V1

=

pievienotā 0,1 mol/l sudraba nitrāta šķīduma tilpums ml,

V2

=

titrēšanai izmantotais 0,1 mol/l amonija tiocianāta šķīduma tilpums ml,

m

=

parauga svars.

Ja tukšā analīze norāda, ka ir patērēts 0,1 mol/l sudraba nitrāta šķīdums, tad minēto lielumu atskaita no tilpuma (V1 - V2).

7.   Novērojumi

---

IV PIELIKUMS

ANALĪZES METODES, LAI KONTROLĒTU ATĻAUTO PIEDEVU DAUDZUMU BARĪBĀ

A.   A VITAMĪNA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt A vitamīna (retinola) daudzumu barībā un premiksos. Ar A vitamīnu saprot all-trans-retinilspirtu un tā cis-izomērus, ko nosaka ar šo metodi. A vitamīna saturu izsaka starptautiskajās vienībās (SV) uz kg. Viena SV atbilst 0,300 μg all-trans-A vitamīna spirta vai 0,344 μg all-trans-A vitamīna acetāta, vai 0,550 μg all-trans-A vitamīna palmitāta aktivitātei.

Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 2 000 SV A vitamīna/kg.

2.   Princips

Paraugu hidrolizē kālija hidroksīda šķīdumā etanolā, un A vitamīnu ekstrahē petrolēterī. Šķīdinātāju atdala iztvaicējot, atlikumu izšķīdina metanolā un vajadzības gadījumā atšķaida līdz nepieciešamajai koncentrācijai. A vitamīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (RP-HPLC), izmantojot UV vai fluorescences detektoru. Hromatogrāfijas parametrus izvēlas tā, lai all-trans-A vitamīna spirts neatdalītos no tā cis-izomēriem.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Piezīme.

A vitamīns ir jutīgs pret (UV) gaismu un oksidāciju. Visas darbības veic, izvairoties no gaismas klātbūtnes (izmantojot brūna stikla traukus vai stikla traukus, kas ir aizsargāti ar alumīnija foliju), kā arī no skābekļa klātbūtnes (noskalo ar slāpekli). Ekstrakcijas laikā gaisu virs šķidruma aizstāj ar slāpekli (periodiski atbrīvojot aizbāzni, lai izvairītos no pārmērīga spiediena).

5.1.   Parauga sagatavošana

Paraugu samaļ tā, lai tas izietu caur sietu ar 1 mm acojumu un lai malšanas laikā nerastos siltums. Paraugs jāsamaļ tieši pirms svēršanas un pārziepjošanas, lai novērstu A vitamīna zudumus.

5.2.   Pārziepjošana

Atkarībā no A vitamīna satura svara 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1.) ar precizitāti līdz 1 mg iesver 2 g līdz 25 g parauga. Svārstot pakāpeniski pievieno 130 ml etanola (3.1.), apmēram 100 mg BHT (3.13.), 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.5.) un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.6.). Kolbai pievieno kondensatoru (4.3.) un kolbu iegremdē ūdens vannā ar magnētisko maisītāju (4.7.). Uzvāra un ļauj notikt attecei piecas minūtes. Tad caur kondensatoru (4.3.) pievieno 25 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4.) un, maisot lēnā slāpekļa plūsmā, ļauj notikt attecei vēl 25 minūtes. Tad noskalo kondensatoru apmēram ar 20 ml ūdens un atdzesē kolbas saturu līdz istabas temperatūrai.

5.3.   Ekstrakcija

Pārziepjoto šķīdumu dekantējot kvantitatīvi pārnes uz 1 000 ml dalāmpiltuvi (4.2.3.) vai ekstrakcijas aparātu (4.8.), noskalojot kopumā ar 250 ml ūdens. Pārziepjošanas kolbu secīgi noskalo ar 25 ml etanola (3.1.) un 100 ml petrolētera (3.2.) un noskalojumus pārnes uz dalāmpiltuvi vai ekstrakcijas iekārtu. Ūdens un etanola attiecība kombinētajos šķīdumos ir apmēram 2:1. Kārtīgi sakrata divas minūtes un ļauj nogulsnēties divas minūtes.

5.3.1.    Ekstrakcija, izmantojot dalāmpiltuvi (4.2.3.)

Kad slāņi ir atdalījušies (skatīt 7.3. novērojumu), petrolētera slāni pārnes uz citu dalāmpiltuvi (4.2.3.). Tādu ekstrakciju divas reizes atkārto ar 100 ml petrolētera (3.2.) un divas reizes – ar 50 ml petrolētera (3.2.).

Kombinētos ekstraktus divas reizes mazgā dalāmpiltuvē ar 100 ml ūdens devām, viegli svārstot, lai neveidotos emulsijas, tad, atkārtoti kratot, ar jaunām 100 ml ūdens devām, līdz ūdens, pievienojot fenolftaleīna šķīdumu (3.7.), kļūst bezkrāsains (parasti pietiek ar četrām mazgāšanas reizēm). Lai atdalītu suspendētu ūdeni, mazgāto ekstraktu caur sausu kroku filtru fāzu atdalīšanai (4.4.) filtrē 500 ml mērkolbā (4.2.2.). Dalāmpiltuvi un filtru noskalo ar 50 ml petrolētera (3.2.), papildina līdz zīmei ar petrolēteri (3.2.) un rūpīgi samaisa.

5.3.2.    Ekstrakcija, izmantojot ekstrakcijas aparātu (4.8.)

Kad slāņi ir atdalījušies (skatīt 7.3. novērojumu), stikla cilindra aizbāzni (4.8.1.) nomaina ar pieslīpēta stikla ieliktni (4.8.2.) un regulējamās caurules U veida apakšējo galu novieto tā, lai tas atrastos tieši virs slāņu saskares līmeņa. Ievadot slāpekli caur sānu nozarojumu, pārnes augšējo petrolētera slāni uz 1 000 ml dalāmpiltuvi (4.2.3.). Stikla cilindrā ievieto 100 ml petrolētera (3.2.), noslēdz ar aizbāzni un kārtīgi sakrata. Ļauj slāņiem atdalīties un pārnes augšējo slāni uz dalāmpiltuvi kā iepriekš. Atkārto ekstrakciju ar papildu 100 ml petrolētera (3.2.), tad divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2.) devām un pārnes petrolētera slāņus uz dalāmpiltuvi.

Mazgā kombinētos petrolētera ekstraktus, kā aprakstīts 5.3.1. punktā, un turpina rīkoties saskaņā ar minēto punktu.

5.4.   Parauga šķīduma sagatavošana priekš HPLC

Alikvoto daļu petrolētera šķīduma (no 5.3.1. vai 5.3.2. punkta) ar pipeti pārnes 250 ml bumbierveida kolbā (4.2.4.). Rotācijas iztvaicētājā (4.1.) samazinātā spiedienā ūdens vannas temperatūrā, kas nepārsniedz 40 oC, iztvaicē šķīdinātāju, līdz tas ir gandrīz sauss. Atjauno atmosfēras spiedienu, pievienojot slāpekli (3.10.), un izņem kolbu no rotācijas iztvaicētāja. Atlikušo šķīdinātāju atdala ar slāpekļa (3.10.) plūsmu un tūlīt izšķīdina atlikumu noteiktā tilpumā (10–100 ml) metanola (3.3.) (A vitamīna koncentrācijai jābūt diapazonā no 5 SV/ml līdz 30 SV/ml).

5.5.   Noteikšana ar HPLC

A vitamīnu atdala C18 apgrieztās fāzes kolonnā (4.5.1.) un koncentrāciju izmēra, izmantojot UV detektoru (325 nm) vai fluorescences detektoru (ierosa 325 nm, emisija 475 nm) (4.5.2.).

Iešpricē alikvoto daļu (piemēram, 20 μl) šķīduma metilspirtā, kas iegūts 5.4. punktā, un eluē ar kustīgo fāzi (3.9.). Aprēķina vairāku viena parauga šķīduma injekciju vidējo maksimālo augstumu (platību) un vairāku kalibrēšanas šķīdumu (5.6.2.) injekciju vidējos maksimālos augstumus (platības).

HPLC nosacījumi

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

5.6.   Kalibrēšana

5.6.1.    Darba standartšķīdumu sagatavošana

20 ml A vitamīna acetāta izejas standartšķīduma (3.11.1.) vai 20 ml A vitamīna palmitāta izejas standartšķīduma (3.12.1.) ar pipeti pārnes 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1.) un hidrolizē, kā norādīts 5.2. punktā, taču nepievienojot BHT. Tad ekstrahē ar petrolēteri (3.2.) saskaņā ar 5.3. punktu un papildina līdz 500 ml ar petrolēteri (3.2.). Rotācijas iztvaicētājā iztvaicē 100 ml tāda ekstrakta (skatīt 5.4.), līdz tas ir gandrīz sauss, ar slāpekļa plūsmu (3.10.) atdala atlikušo šķīdinātāju un atkārtoti izšķīdina atlikumu 10,0 mililitros metanola (3.3.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 560 SV A vitamīna/ml. Precīzais saturs jānosaka atbilstoši 5.6.3.3. punktam. Darba standartšķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

2,0 ml tāda darba standartšķīduma ar pipeti pārnes 20 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.3.) un samaisa. Šā atšķaidītā darba standartšķīduma nominālā koncentrācija ir 56 SV A vitamīna/ml.

5.6.2.    Kalibrēšanas šķīdumu un kalibrēšanas grafika sagatavošana

1,0 , 2,0 , 5,0 un 10,0 ml atšķaidītā darba standartšķīduma ar pipeti pārnes 20 ml mērkolbās, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.3.) un samaisa. Minēto šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,8 , 5,6 , 14,0 un 28,0 SV A vitamīna/ml.

20 μl katra kalibrēšanas šķīduma iešpricē vairākas reizes un nosaka vidējos maksimālos augstumus (laukumus). Izmantojot vidējos maksimālos augstumus (laukumus), izveido kalibrēšanas grafiku, kas satur UV kontroles rezultātus (5.6.3.3.).

5.6.3.    Standartšķīdumu UV standartizācija

5.6.3.1.    A vitamīna acetāta izejas standartšķīdums

2,0 ml A vitamīna acetāta izejas standartšķīduma (3.11.1.) ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā (4.2.2.) un papildina līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 SV A vitamīna/ml. 3,0 ml šā atšķaidītā A vitamīna acetāta šķīduma ar pipeti pārnes 25 ml mērkolbā un papildina līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 SV A vitamīna/ml. Šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6.) salīdzina ar 2-propanola (3.8.) spektru intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Ekstinkcijas maksimumam jābūt robežās starp 325 nm un 327 nm.

A vitamīna satura aprēķināšana:

A vitamīna SV/ml = E326 × 19,0

(

A vitamīna acetātam = 1 530 pie 326 nm 2-propanolā)

5.6.3.2.    A vitamīna palmitāta izejas standartšķīdums

2,0 ml A vitamīna palmitāta izejas standartšķīduma (3.12.1.) ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā (4.2.2.) un papildina līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 SV A vitamīna/ml. 3,0 ml šā atšķaidītā A vitamīna palmitāta šķīduma ar pipeti pārnes 25 ml mērkolbā un papildina līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 SV A vitamīna/ml. Šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6.) salīdzina ar 2-propanola (3.8.) spektru intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Ekstinkcijas maksimumam jābūt robežās starp 325 nm un 327 nm.

A vitamīna satura aprēķināšana:

A vitamīna SV/ml = E326 × 19,0

(

A vitamīna palmitātam = 957 pie 326 nm 2-propanolā)

5.6.3.3.    A vitamīna darba standartšķīdums

3,0 ml neatšķaidīta A vitamīna darba standartšķīduma, kas sagatavots saskaņā ar 5.6.1. punktu, ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā (4.2.2.) un papildina līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8.). 5,0 ml šā šķīduma ar pipeti pārnes 25 ml mērkolbā un papildina līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 SV A vitamīna/ml. Šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6.) salīdzina ar 2-propanola (3.8.) spektru intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Ekstinkcijas maksimumam jābūt robežās starp 325 nm un 327 nm.

A vitamīna satura aprēķināšana:

A vitamīna SV/ml = E325 × 18,3

(

A vitamīna spirtam = 1 821 pie 325 nm 2-propanolā)

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā parauga šķīduma A vitamīna maksimumu vidējo augstumu (laukumu), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju SV/ml, izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.6.2.).

A vitamīna saturu w (SV/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[SV/kg]

kur:

c

=

A vitamīna koncentrācija SV/ml parauga šķīdumā (5.4.),

V1

=

parauga šķīduma (5.4.) tilpums mililitros,

V2

=

5.4. punktā paņemtās alikvotās daļas tilpums ml,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Novērojumi

Lai pārbaudītu, vai izmantotā analīzes metode rada ticamus rezultātus par konkrēto matrici (piena aizstājējbarību), papildu analizējamam paraugam veic atgūstamības testu. Ja atgūstamības proporcija ir zemāka par 80 %, tad analīžu rezultāti jākoriģē, ņemot vērā atgūstamību.

8.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 15 % attiecībā pret lielāko rezultātu.

9.   Koppētījuma rezultāti ( 11 )

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo vērtību skaits,

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

sR

=

atveidojamības standartnovirze,

r

=

atkārtojamība,

R

=

atveidojamība,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients.

B.   E VITAMĪNA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt E vitamīna daudzumu barībā un premiksos. E vitamīna saturu izsaka kā DL-α-tokoferola acetātu mg/kg. 1 mg DL-α-tokoferola acetāta atbilst 0,91 mg DL-α-tokoferola (E vitamīna).

Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 2 mg E vitamīna/kg. Minēto kvantitatīvās noteikšanas robežu var sasniegt tikai ar fluorescences detektoru. Ar UV detektoru kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 10 mg/kg.

2.   Princips

Paraugu hidrolizē kālija hidroksīda šķīdumā etanolā, un E vitamīnu ekstrahē petrolēterī. Šķīdinātāju atdala iztvaicējot, atlikumu izšķīdina metanolā un vajadzības gadījumā atšķaida līdz nepieciešamajai koncentrācijai. E vitamīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (RP-HPLC), izmantojot fluorescences vai UV detektoru.

3.   Reaģenti

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Piezīme.

E vitamīns ir jutīgs pret (UV) gaismu un oksidāciju. Visas darbības veic, izvairoties no gaismas klātbūtnes (izmantojot brūna stikla traukus vai stikla traukus, kas ir aizsargāti ar alumīnija foliju), kā arī no skābekļa klātbūtnes (noskalo ar slāpekli). Ekstrakcijas laikā gaisu virs šķidruma aizstāj ar slāpekli (periodiski atbrīvojot aizbāzni, lai izvairītos no pārmērīga spiediena).

5.1.   Parauga sagatavošana

Paraugu samaļ tā, lai tas izietu caur sietu ar 1 mm acojumu un lai malšanas laikā nerastos siltums. Paraugs jāsamaļ tieši pirms svēršanas un pārziepjošanas, lai novērstu E vitamīna zudumus.

5.2.   Pārziepjošana

Atkarībā no E vitamīna satura svara 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1.) ar precizitāti līdz 0,01 g iesver 2 g līdz 25 g parauga. Svārstot pakāpeniski pievieno 130 ml etanola (3.1.), apmēram 100 mg BHT (3.12.), 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.5.) un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.6.). Kolbai pievieno kondensatoru (4.3.) un kolbu iegremdē ūdens vannā ar magnētisko maisītāju (4.7.). Uzvāra un ļauj notikt attecei piecas minūtes. Tad caur kondensatoru (4.3.) pievieno 25 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4.) un maisot lēnā slāpekļa plūsmā ļauj notikt attecei vēl 25 minūtes. Tad noskalo kondensatoru apmēram ar 20 ml ūdens un atdzesē kolbas saturu līdz istabas temperatūrai.

5.3.   Ekstrakcija

Pārziepjoto šķīdumu dekantējot kvantitatīvi pārnes uz 1 000 ml dalāmpiltuvi (4.2.3.) vai ekstrakcijas aparātu (4.8.), noskalojot kopumā ar 250 ml ūdens. Pārziepjošanas kolbu secīgi noskalo ar 25 ml etanola (3.1.) un 100 ml petrolētera (3.2.) un noskalojumus pārnes uz dalāmpiltuvi vai ekstrakcijas iekārtu. Ūdens un etanola attiecība kombinētajos šķīdumos ir apmēram 2:1. Kārtīgi sakrata divas minūtes un ļauj nogulsnēties divas minūtes.

5.3.1.    Ekstrakcija, izmantojot dalāmpiltuvi (4.2.3.)

Kad slāņi ir atdalījušies (skatīt 7.3. novērojumu), petrolētera slāni pārnes uz citu dalāmpiltuvi (4.2.3.). Tādu ekstrakciju divas reizes atkārto ar 100 ml petrolētera (3.2.) un divas reizes – ar 50 ml petrolētera (3.2.).

Kombinētos ekstraktus divas reizes mazgā dalāmpiltuvē ar 100 ml ūdens devām, viegli svārstot, lai neveidotos emulsijas, tad, atkārtoti kratot, ar jaunām 100 ml ūdens devām, līdz ūdens, pievienojot fenolftaleīna šķīdumu (3.7.), kļūst bezkrāsains (parasti pietiek ar četrām mazgāšanas reizēm). Lai atdalītu suspendētu ūdeni, mazgāto ekstraktu caur sausu kroku filtru fāzu atdalīšanai (4.4.) filtrē 500 ml mērkolbā (4.2.2.). Dalāmpiltuvi un filtru noskalo ar 50 ml petrolētera (3.2.), papildina līdz zīmei ar petrolēteri (3.2.) un rūpīgi samaisa.

5.3.2.    Ekstrakcija, izmantojot ekstrakcijas aparātu (4.8.)

Kad slāņi ir atdalījušies (skatīt 7.3. novērojumu), stikla cilindra aizbāzni (4.8.1.) nomaina ar pieslīpēta stikla ieliktni (4.8.2.) un regulējamās caurules U veida apakšējo galu novieto tā, lai tas atrastos tieši virs slāņu saskares līmeņa. Ievadot slāpekli caur sānu nozarojumu, pārnes augšējo petrolētera slāni uz 1 000 ml dalāmpiltuvi (4.2.3.). Stikla cilindrā ievieto 100 ml petrolētera (3.2.), noslēdz ar aizbāzni un kārtīgi sakrata. Ļauj slāņiem atdalīties un pārnes augšējo slāni uz dalāmpiltuvi kā iepriekš. Atkārto ekstrakciju ar papildu 100 ml petrolētera (3.2.), tad divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2.) devām un pārnes petrolētera slāņus uz dalāmpiltuvi.

Mazgā kombinētos petrolētera ekstraktus, kā aprakstīts 5.3.1. punktā, un turpina rīkoties saskaņā ar minēto punktu.

5.4.   Parauga šķīduma sagatavošana priekš HPLC

Alikvoto daļu petrolētera šķīduma (no 5.3.1. vai 5.3.2. punkta) ar pipeti pārnes 250 ml bumbierveida kolbā (4.2.4.). Rotācijas iztvaicētājā (4.1.) samazinātā spiedienā ūdens vannas temperatūrā, kas nepārsniedz 40 oC, iztvaicē šķīdinātāju, līdz tas ir gandrīz sauss. Atjauno atmosfēras spiedienu, pievienojot slāpekli (3.9.), un izņem kolbu no rotācijas iztvaicētāja. Atlikušo šķīdinātāju atdala ar slāpekļa plūsmu (3.9.) un tūlīt izšķīdina atlikumu noteiktā tilpumā (10–100 ml) metanola (3.3.) (DL-α-tokoferola koncentrācijai jābūt diapazonā no 5 μg/ml līdz 30 μg/ml).

5.5.   Noteikšana ar HPLC

E vitamīnu atdala C18 apgrieztās fāzes kolonnā (4.5.1.) un koncentrāciju izmēra, izmantojot fluorescences detektoru (ierosa 295 nm, emisija 330 nm) vai UV detektoru (292 nm) (4.5.2.).

Iešpricē alikvoto daļu (piemēram, 20 μl) šķīduma metilspirtā, kas iegūts 5.4. punktā, un eluē ar kustīgo fāzi (3.8.). Aprēķina vairāku viena parauga šķīduma injekciju vidējos maksimālos augstumus (platības) un vairāku kalibrēšanas šķīdumu injekciju vidējos maksimālos augstumus (platības) (5.6.2.).

HPLC nosacījumi

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

5.6.   Kalibrēšana (DL-α-tokoferola acetāts vai DL-α-tokoferols)

5.6.1.    DL-α-tokoferola acetāta standarts

5.6.1.1.    Darba standartšķīduma sagatavošana

25 ml DL-α-tokoferola acetāta izejas standartšķīduma (3.10.1.) ar pipeti pārnes 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1.) un hidrolizē, kā aprakstīts 5.2. punktā. Tad ekstrahē ar petrolēteri (3.2.) saskaņā ar 5.3. punktu un papildina līdz 500 ml ar petrolēteri (3.2.). Rotācijas iztvaicētājā iztvaicē 25 ml šā ekstrakta (skatīt 5.4. punktu), līdz tas ir gandrīz sauss, ar slāpekļa plūsmu (3.9.) atdala atlikušo šķīdinātāju un atkārtoti izšķīdina atlikumu 25,0 mililitros metanola (3.3.). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 45,5 μg DL-α-tokoferola/ml, kas atbilst 50 μg DL-α-tokoferola acetāta/ml. Darba standartšķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

5.6.1.2.    Kalibrēšanas šķīdumu un kalibrēšanas grafika sagatavošana

1,0 , 2,0 , 4,0 un 10,0 ml darba standartšķīduma pārnes 20 ml mērkolbās, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.3.) un samaisa. Minēto šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,5 , 5,0 , 10,0 un 25,0 μg/ml DL-α-tokoferola acetāta, t. i., 2,28 , 4,55 , 9,10 μg/ml un 22,8 μg/ml DL-α-tokoferola.

20 μl katra kalibrēšanas šķīduma iešpricē vairākas reizes un nosaka vidējos maksimālos augstumus (laukumus). Izmantojot vidējos maksimālos augstumus (laukumus), veido kalibrēšanas grafiku.

5.6.1.3.    DL-α-tokoferola acetāta izejas standartšķīduma (3.10.1.) UV standartizācija

5,0 ml DL-α-tokoferola acetāta izejas standartšķīduma (3.10.1.) atšķaida ar etanolu līdz 25,0 ml un šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6.) salīdzina ar etanola (3.1.) spektru intervālā no 250 nm līdz 320 nm.

Absorbcijas maksimums ir 284 nm:

= 43,6 284 nm etanolā

Tādā atšķaidījumā jāiegūst ekstinkcijas vērtība no 0,84 līdz 0,88 .

5.6.2.    DL-α-tokoferola standarts

5.6.2.1.    Darba standartšķīduma sagatavošana

Ar pipeti pārnes 2 ml DL-α-tokoferola izejas standartšķīduma (3.11.1.) 50 ml mērkolbā, izšķīdina metanolā (3.3.) un papildina līdz zīmei ar metanolu. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 40 μg DL-α-tokoferola/ml, kas atbilst 44,0 μg DL-α-tokoferola acetāta/ml. Darba standartšķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

5.6.2.2.    Kalibrēšanas šķīdumu un kalibrēšanas grafika sagatavošana

1,0 , 2,0 , 4,0 un 10,0 ml darba standartšķīduma pārnes 20 ml mērkolbās, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.3.) un samaisa. Minēto šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,0 , 4,0 , 8,0 un 20,0 μg/ml DL-α-tokoferola, t. i., 2,20 , 4,40 , 8,79 μg/ml un 22,0 μg/ml DL-α-tokoferola acetāta.

20 μl katra kalibrēšanas šķīduma iešpricē vairākas reizes un nosaka vidējos maksimālos augstumus (laukumus). Izmantojot vidējos maksimālos augstumus (laukumus), veido kalibrēšanas grafiku.

5.6.2.3.    DL-α-tokoferola izejas standartšķīduma (3.11.1.) UV standartizācija

2,0 ml DL-α-tokoferola izejas standartšķīduma (3.11.1.) atšķaida ar etanolu līdz 25,0 ml un šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6.) salīdzina ar etanola spektru (3.1.) intervālā no 250 nm līdz 320 nm. Absorbcijas maksimums ir 292 nm:

= 75,8 292 nm etanolā

Tādā atšķaidījumā jāiegūst ekstinkcijas vērtība 0,6 .

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā parauga šķīduma E vitamīna maksimumu vidējo augstumu (laukumu), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml (aprēķinātu kā α-tokoferola acetātu), izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.6.1.2 vai 5.6.2.2.).

E vitamīna saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg]

kur:

c

=

E vitamīna koncentrācija (kā α-tokoferola acetāts) parauga šķīdumā (5.4.) μg/ml,

V1

=

parauga šķīduma (5.4.) tilpums mililitros,

V2

=

5.4. punktā paņemtās alikvotās daļas tilpums ml,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Novērojumi

8.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 15 % no lielākā rezultāta.

9.   Koppētījuma rezultāti ( 12 )

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo vērtību skaits,

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

sR

=

atveidojamības standartnovirze,

r

=

atkārtojamība,

R

=

atveidojamība,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients.

C.   MIKROELEMENTU – DZELZS, VARA, MANGĀNA UN CINKA – NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt barībā mikroelementus – dzelzi, varu, mangānu un cinku. Kvantitatīvās noteikšanas robežas ir šādas:

2.   Princips

Pēc organisko vielu noārdīšanās, ja tādas ir, paraugu izšķīdina sālsskābē. Dzelzi, varu, mangānu un cinku pēc attiecīgas atšķaidīšanas nosaka atomu absorbcijas spektrometrijā.

3.   Reaģenti

Ievadpiezīmes

Reaģentu un analītisko šķīdumu gatavošanā lieto dejonizētu ūdeni, ko iegūst, divreiz destilējot ūdeni borsilikātstikla destilācijas iekārtā vai kvarca destilācijas iekārtā vai divreiz apstrādājot ar jonu apmaiņas sveķiem.

Reaģentiem jābūt vismaz analītiski tīriem. Tas, ka nosakāmā elementa nav, jāpārbauda tukšajā eksperimentā. Vajadzības gadījumā reaģenti vēl jāattīra.

Turpmāk aprakstīto standartšķīdumu vietā var izmantot komerciālus standartšķīdumus, ja tiem ir garantija un tie pirms izmantošanas ir pārbaudīti.

4.   Ierīces

5.   Procedūra ( 13 )

5.1.   Paraugi, kas satur organisku vielu

5.1.1.    Pārpelnošana un šķīduma sagatavošana analīzei ( 14 )

Samitrina pelnus ar ūdeni un pārnes tos 250 ml tilpuma vārglāzē. Tīģeli izmazgā ar apmēram 5 ml sālsskābes (3.1.), ko lēni un uzmanīgi pievieno vārglāzes saturam (CO2 veidošanās var izraisīt spēcīgu reakciju). Sakratot pa pilienam pievieno sālsskābi (3.1.), līdz pārstāj veidoties burbuļi. Iztvaicē, līdz tas ir sauss, pa laikam apmaisot ar stikla stienīti.

Tad atlikumam pievieno 15 ml 6 mol/l sālsskābes (3.2.) un pēc tam apmēram 120 ml ūdens. Maisa ar stikla stienīti, ko atstāj vārglāzē, un nosedz vārglāzi ar pulksteņstiklu. Lēni uzvāra un uztur viršanas temperatūrā, līdz vairs neredz, ka pelni izšķīstu. Filtrē uz bezpelnu filtrpapīra un filtrātu savāc 250 ml tilpuma kolbā. Izmazgā vārglāzi un filtru ar 5 ml karstas 6 mol/l sālsskābes (3.2.) un divreiz ar vārošu ūdeni. Uzpilda tilpuma kolbu līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija apmēram 0,5 mol/l).

Piezīmes

5.1.2.    Spektrofotometriskā noteikšana

5.1.2.1.    Kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

Lai noteiktu katru elementu, no darba standartšķīdumiem, kas aprakstīti 3.7.1., 3.8.1., 3.9.1. un 3.10.1. punktā, pagatavo kalibrēšanas šķīdumus, kuru HCl koncentrācija ir 0,5 mol/l, un (dzelzij, mangānam un cinkam) lantāna hlorīda koncentrācija ir līdzvērtīga 0,1 % La (w/v).

Izvēlētajām mikroelementu koncentrācijām jāatrodas izmantotā spektrofotometra jutīguma intervālā. Tālāk tabulās ar piemēriem parādīts tipisku kalibrēšanas šķīdumu sastāvs; tomēr atkarībā no spektrofotometra jutības var būt jāizvēlas citas koncentrācijas.

Dzelzs

Varš

Mangāns

Cinks

5.1.2.2.    Šķīduma sagatavošana analīzei

Vara noteikšanai parasti var tieši izmantot šķīdumu, kas sagatavots saskaņā ar 5.1.1. punktu. Ja tā koncentrācija jānoregulē atbilstīgi kalibrēšanas šķīdumu intervālam, tad alikvoto daļu ar pipeti var iepilināt 100 ml tilpuma kolbā un papildināt līdz zīmei ar 0,5 mol/l sālsskābi (3.3.).

Dzelzs, mangāna un cinka noteikšanai saskaņā ar 5.1.1. punktu gatavotā šķīduma alikvoto daļu ar pipeti iepilina 100 ml tilpuma kolbā, pievieno 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.) un papildina līdz zīmei ar 0,5 mol/l sālsskābi (3.3.) (skatīt arī 8. punktu “Novērojums”).

5.1.2.3.    Tukšais eksperiments

Tukšajam eksperimentam jāietver visi iepriekš paredzētie procedūras posmi, izņemot to, ka nav parauga materiāla. Kalibrēšanas šķīdumu “0”nedrīkst lietot kā tukšo šķīdumu.

5.1.2.4.    Atomu absorbcijas mērīšana

Izmēra kalibrēšanas šķīdumu un analizējamā šķīduma atomu absorbciju, izmantojot oksidējošu gaisa-acetilēna liesmu šādos viļņu garumos:

Katru mērījumu veic četras reizes.

5.2.   Minerālbarība

Ja paraugā nav organisko vielu, tad iepriekšēja pārpelnošana nav vajadzīga. Rīkojas, kā aprakstīts 5.1.1.1. punktā, sākot no otrās daļas. Iztvaicēšanu ar fluorūdeņražskābi var neveikt.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Izmantojot kalibrēšanas līkni, aprēķina mikroelementu koncentrāciju analizējamajā šķīdumā un rezultātu izsaka mikroelementa miligramos uz parauga kilogramu (ppm).

7.   Atkārtojamība

Viena laboranta divās paralēlās noteikšanās no viena parauga iegūtu rezultātu starpība nepārsniedz:

8.   Novērojums

Ja barībā ir daudz fosfātu, tas var traucēt noteikt dzelzi, mangānu un cinku. Tādu traucējumu var koriģēt, pievienojot lantāna hlorīda šķīdumu (3.11.). Ja tomēr paraugā svara attiecība Ca + Mg/P ir > 2, tad lantāna hlorīda šķīdumu (3.11.) analizējamajam šķīdumam un kalibrēšanas šķīdumiem var nepievienot.

D.   HALOFUGINONA NOTEIKŠANA

DL-trans-7-brom-6-hlor-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-hinazolīn-4-(3H)-ona hidrogēnbromīds

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt halofuginona daudzumu barībā. Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 1 mg/kg.

2.   Princips

Pēc apstrādes ar karstu ūdeni halofuginonu kā brīvu bāzi ekstrahē etilacetātā un pēc tam atdala kā sālsskābes sāli skābes ūdens šķīdumā. Ekstraktu attīra, izmantojot jonu apmaiņas hromatogrāfiju. Halofuginona saturu nosaka apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

Ar 0,1 mg precizitāti 500 ml mērkolbā iesver 50 mg halofuginona (3.6.), izšķīdina amonija acetāta buferšķīdumā (3.18.), papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu un samaisa. Tumšā vietā 5 oC temperatūrā tādu šķīdumu var glabāt trīs nedēļas.

100 ml mērkolbās iepilda attiecīgi 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 un 6,0 ml izejas standartšķīduma (3.6.1.) Papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.21.) un samaisa. Minēto šķīdumu koncentrācija ir attiecīgi 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 un 6,0 μg/ml halofuginona. Minētie šķīdumi jāsagatavo svaigi pirms izmantošanas.

Ūdenī izšķīdina 50 g nātrija karbonāta (3.11.), atšķaida līdz vienam litram un pievieno nātrija hlorīdu (3.12. apmēram), līdz šķīdums ir piesātināts.

Ar ūdeni atšķaida 10 ml HCI (3.7.) līdz vienam litram.

Ūdenī (3.14.) izšķīdina 19,3 g amonija acetāta (3.3.) un 30 ml etiķskābes (3.5.) un atšķaida līdz vienam litram.

Attiecīgu daudzumu amberlīta (3.2.) mazgā ar ūdeni, līdz visi hlorīda joni ir atdalīti, par ko liecina nolietās ūdens fāzes sudraba nitrāta (3.20.) tests. Pēc tam sveķus mazgā ar 50 ml metanola (3.8.), metanolu nolej un sveķus glabā svaigā metanolā.

Izšķīdina 0,17 g sudraba nitrāta (3.9.) 10 mililitros ūdens.

500 ml acetonitrila (3.1.) samaisa ar 300 ml amonija acetāta buferšķīduma (3.18.) un 1 200 ml ūdens (3.14.). Izmantojot etiķskābi (3.5.), koriģē pH līmeni līdz 4,3 . Šķīdumu filtrē caur 0,22 μm filtru (4.8.) un atgāzo (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu). Slēgtā konteinerā tumsā tādu šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Piezīme.

Halofuginons kā brīvā bāze ir nestabils sārmainos un etilacetāta šķīdumos. To neatstāj etilacetātā ilgāk par 30 minūtēm.

5.1.   Vispārīgas norādes

Piezīme.

Šīs metodes nolūkos tukšais paraugs ir tāda paša veida kā analizējamais paraugs, un analīzē neuzrādās halofuginons.

5.2.   Ekstrakcija

Ar precizitāti līdz 0,1 g iesver 10 g sagatavotā parauga 200 ml centrifūgas mēģenē, pievieno 0,5 g nātrija askorbāta (3.10.), 0,5 g EDTA (3.13.) un 20 ml ūdens un samaisa. Mēģeni uz piecām minūtēm ieliek ūdens vannā (80 oC). Atdzesē līdz istabas temperatūrai, tad pievieno 20 ml nātrija karbonāta šķīduma (3.15.) un samaisa. Tūlīt pievieno 100 ml etilacetāta (3.4.) un ar roku kārtīgi sakrata 15 sekundes. Tad mēģeni uz trīs minūtēm ieliek ultraskaņas vannā (4.1.) un atbrīvo aizbāzni. Centrifugē divas minūtes un caur stikla šķiedras filtru (4.6.) etilacetāta fāzi dekantē 500 ml dalāmpiltuvē. Parauga ekstrakciju atkārto ar otru 100 ml etilacetāta devu. Apvienotos ekstraktus vienu minūti mazgā ar 50 ml nātrija karbonāta šķīduma, kas piesātināts ar nātrija hlorīdu (3.16.), un nolej ūdens slāni.

Organisko slāni ekstrahē vienu minūti ar 50 ml sālsskābes (3.17.). Apakšējo skābes slāni nolaiž 250 ml dalāmpiltuvē. Pusotru minūti ar vēl vienu 50 ml sālsskābes devu atkārtoti ekstrahē organisko slāni un to pievieno pirmajam ekstraktam. Apvienotos skābes ekstraktus mazgā ar 10 ml etilacetāta (3.4.), svārstot apmēram 10 sekundes.

Ūdens slāni kvantitatīvi pārnes 250 ml apaļkolbā un nolaiž organisko fāzi. Izmantojot rotācijas iztvaicētāju (4.2.), iztvaicē visu atlikušo etilacetātu no skābes šķīduma. Ūdens vannā temperatūra nedrīkst pārsniegt 40 oC. Apmēram 25 mbar vakuumā 38 oC viss etilacetāta atlikums atdalīsies apmēram piecās minūtēs.

5.3.   Attīrīšana

5.3.1.    Amberlīta kolonnas sagatavošana

Katram parauga ekstraktam sagatavo XAD-2 kolonnu. 10 g sagatavotā amberlīta (3.19.) pārnes uz stikla kolonnu (4.5.) ar metanolu (3.8.). Sveķu slāņa virspusē pieliek nelielu stikla vates tamponu. Notecina metanolu no kolonnas un sveķus mazgā ar 100 ml ūdens, plūsmu apturot, kad šķidrums sasniedz sveķu slāņa virsu. Desmit minūtes pirms izmantošanas ļauj kolonnai nostabilizēties. Kolonna nedrīkst iztecēt sausa.

5.3.2.    Parauga attīrīšana

Ekstraktu (5.2.) kvantitatīvi pārnes uz sagatavotās amberlīta kolonnas (5.3.1.) augšgalu un eluē, nolejot eluātu. Eluācijas ātrums nedrīkst pārsniegt 20 ml/min. Apaļkolbu izskalo ar 20 ml sālsskābes (3.17.) un ar saskalojumu mazgā sveķu kolonnu. Skābes šķīduma atlikumu izpūš ar gaisa strūklu. Nolej saskalojumus. Kolonnai pievieno 100 ml metanola (3.8.) un 5–10 ml ļauj eluēties, savāc eluātu 250 ml apaļkolbā. Atlikušo metanolu atstāj 10 minūtes, lai nostabilizējas ar sveķiem, un turpina eluāciju ar ātrumu, kas nepārsniedz 20 ml/min, eluātu savāc tajā pašā apaļkolbā. Ar rotācijas iztvaicētāju (4.2.) iztvaicē metanolu, ūdens vannā temperatūra nedrīkst pārsniegt 40 oC. Atlikumu kvantitatīvi pārnes 10 ml mērkolbā, izmantojot kustīgo fāzi (3.21.). Papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi un samaisa. Alikvotu izfiltrē caur membrānfiltru (4.7.). Šo šķīdumu pataupa HPLC noteikšanai (5.4.).

5.4.    HPLC noteikšana

5.4.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus:

šķidrumu hromatogrāfa kolonna (4.4.1.),

HPLC kustīgā fāze (3.21.),

plūsmas ātrums 1,5 –2 ml/min,

noteikšanas viļņa garums 243 nm,

injekcijas tilpums 40 līdz 100 μl.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.6.2.) ar koncentrāciju 3,0 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus (vai laukumus) un izdalīšanas laiku.

5.4.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.6.2.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas grafiku, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos maksimālos augstumus vai laukumus un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.4.3.    Parauga šķīdums

Iešpricē parauga ekstraktu (5.3.2.) vairākas reizes, izmantojot to pašu tilpumu, kāds bija kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka halofuginona maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml, ņemot vērā parauga šķīduma halofuginona maksimumu vidējo augstumu (laukumu), izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.4.2.).

Halofuginona saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

c

=

halofuginona koncentrācija parauga šķīdumā μg/ml,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.6.2.) spektru, kura koncentrācija ir 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.6.2.). Pievienotā halofuginona daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam halofuginona daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai halofuginona maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā maksimālā augstuma jābūt ± 10 % no sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

Rezultātu starpība starp divām paralēlām noteikšanām, kas veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 0,5 mg/kg, ja halofuginona saturs ir līdz 3 mg/kg.

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta tukšā parauga atgūstamība ir vismaz 80 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

Tika noorganizēts koppētījums ( 15 ), kurā astoņas laboratorijas analizēja trīs paraugus.

NN

=

nav noteikts,

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%),

Atg.

=

atgūstamība (%).

E.   ROBENIDĪNA NOTEIKŠANA

1,3-bis [(4-hlorbenzilidēn)amino]guanidīna – hidrogēnhlorīds

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt robenidīna daudzumu barībā. Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 5 mg/kg.

2.   Princips

Paraugu ekstrahē ar paskābinātu metanolu. Ekstraktu žāvē un alikvoto daļu attīra uz alumīnija oksīda kolonnas. Robenidīnu no kolonnas eluē ar metanolu, kas ir koncentrēts un papildināts līdz attiecīgam tilpumam ar kustīgo fāzi. Robenidīna saturu nosaka apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

4,0 ml sālsskābes (ρ20 = 1,18 g/ml) pārnes 500 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.1.) un samaisa. Minēto šķīdumu sagatavo svaigu pirms izmantošanas.

3.A tips, ar 8 līdz 12 acojuma graudiņiem (1,6 līdz 2,5 mm graudiņi, kristālisks alumosilikāts, poru diametrs 0,3 mm).

100 ml alumīnija oksīda pārnes piemērotā konteinerā un pievieno 2,0 ml ūdens. Noslēdz ar aizbāzni un krata apmēram 20 minūtes. Glabā cieši noslēgtā konteinerā.

Izšķīdina 3,40 g kālija dihidrogēnfosfāta HPLC tīrības pakāpes ūdenī 1 000 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei un samaisa.

Izšķīdina 3,55 g bezūdens (vai 4,45 g dihidrāta, vai 8,95 g dodekahidrāta) dinātrija hidrogēnfosfāta HPLC tīrības pakāpes ūdenī viena litra mērkolbā, papildina līdz zīmei un samaisa.

Samaisa kopā ar šādiem reaģentiem:

Šķīdumu filtrē caur 0,22 μm filtru (4.6.) un atgāzo (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu).

Tīrs robenidīns: 1,3-bis [(4-hlorbenzilidēn)amino]guanidīna-hidrogēnhlorīds.

Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver 30 mg robenidīna standartvielas (3.9.). Izšķīdina paskābinātā metanolā (3.2.) 100 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā un glabā tumšā vietā.

10,0 ml izejas standartšķīduma (3.9.1.) pārnes 250 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.8.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā un glabā tumšā vietā.

50 ml mērkolbās pārnes 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 un 25,0 ml starpposma standartšķīduma (3.9.2.). Papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.8.) un samaisa. Minētie šķīdumi atbilst attiecīgi 1,2 , 2,4 , 3,6 , 4,8 un 6,0 μg/ml robenidīna. Minētie šķīdumi jāsagatavo svaigi pirms izmantošanas.

4.   Ierīces

Izgatavota no brūnā stikla, aprīkota ar krānu un rezervuāru, kura tilpums ir apmēram 150 ml, iekšējais diametrs no 10 līdz 15 mm, garums 250 mm.

5.   Procedūra

Piezīme.

Robenidīns ir gaismjutīgs. Visās darbībās izmanto brūnā stikla traukus.

5.1.   Vispārīgas norādes

Piezīme.

Šīs metodes nolūkos tukšais paraugs ir tāda paša veida kā analizējamais paraugs, un analīzē neuzrādās robenidīns.

5.2.   Ekstrakcija

Ar precizitāti līdz 0,01 g iesver apmēram 15 g sagatavotā parauga. Pārnes 250 ml koniskā kolbā un pievieno 100,0 ml paskābināta metanola (3.2.), aiztaisa ar aizbāzni un krata vienu stundu kratītājā (4.2.). Izfiltrē šķīdumu caur stikla šķiedras filtrpapīru (4.5.) un visu filtrātu savāc 150 ml koniskā kolbā. Pievieno 7,5 g molekulārā sieta (3.4.), aiztaisa ar aizbāzni un krata piecas minūtes. Tūlīt izfiltrē caur stikla šķiedras filtrpapīru. Minēto šķīdumu saglabā attīrīšanas posmam (5.3.).

5.3.   Attīrīšana

5.3.1.    Alumīnija oksīda kolonnas sagatavošana

Nelielu stikla vates tamponu ieliek stikla kolonnas (4.1.) apakšējā galā un saspiež ar stikla spieķīti. Iesver 11,0 g sagatavotā alumīnija oksīda (3.5.) un pārnes kolonnā. Šajā posmā pēc iespējas samazina gaisa iedarbību. Viegli uzsit pa uzpildīto kolonnu tās apakšējā galā, lai alumīnija oksīds sablīvētos.

5.3.2.    Parauga attīrīšana

Ar pipeti pārnes kolonnā 5,0 ml parauga ekstrakta, kas sagatavots saskaņā ar (5.2.). Pipetes galu pieliek klāt kolonnas sienai un ļauj, lai šķīdums absorbējas uz alumīnija oksīda. Robenidīnu no kolonnas eluē ar 100 ml metanola (3.1.) ar plūsmas ātrumu no 2 līdz 3 ml/minūtē un savāc eluātu 250 ml apaļkolbā. Ar rotācijas iztvaicētāju (4.3.) iztvaicē metanola šķīdumu līdz sausam stāvoklim 40 oC temperatūrā pazeminātā spiedienā. Atlikumu no jauna izšķīdina 3 līdz 4 mililitros kustīgās fāzes (3.8.) un kvantitatīvi pārnes 10 ml mērkolbā. Kolbu izskalo ar vairākām 1 līdz 2 ml kustīgās fāzes devām un saskalojumus pārnes uz mērkolbu. Papildina līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju un samaisa. Alikvotu izfiltrē caur 0,45 μm membrānfiltru (4.7.). Šo šķīdumu pataupa HPLC noteikšanai (5.4.).

5.4.    HPLC noteikšana

5.4.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus:

šķidrumu hromatogrāfa kolonna (4.4.1.),

HPLC kustīgā fāze (3.8.),

plūsmas ātrums 1,5 līdz 2 ml/min,

detektora viļņa garums 317 nm,

injekcijas tilpums 20 līdz 50 μl.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.9.3.) ar koncentrāciju 3,6 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus un izdalīšanas laiku.

5.4.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.9.3.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos maksimālos augstumus vai laukumus un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.4.3.    Parauga šķīdums

Iešpricē parauga ekstraktu (5.3.2.) vairākas reizes, izmantojot to pašu tilpumu, kāds bija kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka robenidīna maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā parauga šķīduma robenidīna maksimumu vidējo augstumu (laukumu), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml, izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.4.2.).

Robenidīna saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

c

=

robenidīna koncentrācija parauga šķīdumā μg/ml,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.9.3.) spektru, kura koncentrācija ir 6 μg/ml.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.9.3.). Pievienotā robenidīna daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam robenidīna daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai robenidīna maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā maksimālā augstuma jābūt apmēram 10 % no sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 10 % no lielākā rezultāta attiecībā uz robenidīnu, kura saturs ir lielāks par 15 mg/kg.

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta tukšā parauga atgūstamība ir vismaz 85 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

EK līmenī tika noorganizēts koppētījums, kurā 12 laboratorijās analizēja četrus saberztas vai granulu formas mājputnu un trušu barības paraugus. Visus paraugus analizēja divas reizes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients (%),

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%).

F.   DIKLAZURILA NOTEIKŠANA

(+)-4-hlorfenil [2,6-dihlor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazīn-2-il)fenil] acetonitrils

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt diklazurila daudzumu barībā un premiksos. Noteikšanas robeža ir 0,1 mg/kg, kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 0,5 mg/kg.

2.   Princips

Pievieno iekšējo standartu, tad paraugu ekstrahē ar paskābinātu metanolu. Barības ekstrakta alikvotu attīra, izmantojot C18 cietās fāzes ekstrakcijas kolonnu. Diklazurilu no kolonnas eluē ar paskābināta metanola un ūdens maisījumu. Pēc iztvaicēšanas atlikumu izšķīdina DMF/ūdenī. Premiksiem ekstraktu iztvaicē un atlikumu izšķīdina DMF/ūdenī. Diklazurila saturu nosaka trīspakāpju gradienta apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

Ar precizitāti līdz 0,1 mg 50 ml mērkolbā iesver 25 mg diklazurila standartvielas (3.8.). Izšķīdina DMF (3.6.), papildina līdz zīmei ar DMF (3.6.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā vai izmanto kolbu no brūnā stikla, uzglabā ledusskapī. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

5,00 ml izejas standartšķīduma (3.8.1.) pārnes 50 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar DMF (3.6.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā vai izmanto kolbu no brūnā stikla, uzglabā ledusskapī. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

Ar precizitāti līdz 0,1 mg 50 ml mērkolbā iesver 25 mg iekšējās standartvielas (3.9.). Izšķīdina DMF (3.6.), papildina līdz zīmei ar DMF (3.6.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā vai izmanto kolbu no brūnā stikla, uzglabā ledusskapī. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

5,00 ml iekšējā izejas standartšķīduma (3.9.1.) pārnes 50 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar DMF (3.6.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā vai izmanto kolbu no brūnā stikla, uzglabā ledusskapī. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

(p = diklazurila nominālais saturs premiksā mg/kg)

Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver p/10 mg iekšējās standartvielas 100 ml mērkolbā, izšķīdina DMF (3.6.) ultraskaņas vannā (4.6.), papildina līdz zīmei ar DMF un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā vai izmanto kolbu no brūnā stikla, uzglabā ledusskapī. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

Ar pipeti pārnes 2,00 ml diklazurila standartšķīduma (3.8.2.) un 2,00 ml iekšējā standartšķīduma (3.9.2.) 50 ml mērkolbā. Pievieno 16 ml DMF (3.6.), papildina līdz zīmei ar ūdeni un samaisa. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

Ar pipeti iepilina 5,0 ml sālsskābes (3.7.) 1 000 mililitros metanola (3.5.) un samaisa.

Izšķīdina 5 g amonija acetāta (3.2.) un 3,4 g TBHS (3.3.) 1 000 mililitros ūdens (3.1.) un samaisa.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Vispārīgas norādes

5.1.1.    Tukšais eksperiments

Lai pārbaudītu, ka barībā nav diklazurila un traucējošu vielu, analizē tukšo paraugu. Tukšais paraugs pēc veida ir līdzīgs analizējamajam paraugam, un, pārbaudot to, neuzrādās diklazurils vai noteikšanu traucējošas vielas.

5.1.2.    Atgūstamības tests

Atgūstamības testu veic, analizējot tukšo barības paraugu, kas pastiprināts, pievienojot tik daudz diklazurila, cik ir paraugā. Lai paraugu pastiprinātu līdz 1 mg/kg, 50 g barības tukšajam paraugam pievieno 0,1 ml izejas standartšķīduma (3.8.1.), rūpīgi samaisa un atstāj uz 10 minūtēm, pirms ekstrakcijas (5.2.) vairākas reizes rūpīgi samaisot.

Ja nav analizējamajam paraugam līdzīga tukšā parauga (skatīt 5.1.1. punktu), tad atgūstamības testu var veikt, izmantojot standarta piedevu metodi. Tādā gadījumā analizējamo paraugu pastiprina ar diklazurila daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Tādu paraugu analizē kopā ar nepastiprināto paraugu un atgūstamību aprēķina pēc starpības.

5.2.   Ekstrakcija

5.2.1.    Barība

Ar precizitāti līdz 0,01 g iesver apmēram 50 g parauga. Pārnes 500 ml koniskā kolbā, pievieno 1,00 ml iekšējā standarta šķīduma (3.9.2.), 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.), kolbu noslēdz ar aizbāzni. Maisījumu krata kratītājā (4.1.) visu nakti. Ļauj nogulsnēties 10 minūtes. Pārnes šķīduma augšējā slāņa 20 ml alikvotu piemērotā stikla traukā un atšķaida ar 20 ml ūdens. Minēto šķīdumu pārnes uz ekstrakcijas kolonnu (3.11.) un izlaiž cauri, izmantojot vakuumu (4.5.). Kolonnu mazgā ar 25 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.) un ūdens maisījumu tilpuma attiecībās 65 + 35 (V + V). Savāktās frakcijas izlej un savienojumus eluē ar 25 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.) un ūdens maisījumu tilpuma attiecībās 80 + 20 (V + V). Šo frakciju iztvaicē sausu ar rotācijas iztvaicētāja (4.3.) palīdzību 60 oC temperatūrā. Atlikumu izšķīdina 1,0 ml DMF (3.6.), pievieno 1,5 ml ūdens (3.1.) un samaisa. Izfiltrē caur membrānfiltru (4.4.). Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.2.2.    Premiksi

Ar precizitāti līdz 0,001 g iesver apmēram 1 g parauga. Pārnes 500 ml koniskā kolbā, pievieno 1,00 ml iekšējā standarta šķīduma (3.9.3.), 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.) un kolbu noslēdz ar aizbāzni. Maisījumu krata kratītājā (4.1.) visu nakti. Ļauj nogulsnēties 10 minūtes. Šķīduma augšējā slāņa alikvotu daļu 10,000 /p ml (p = diklazurila nominālais saturs premiksā mg/kg) pārnes piemērota izmēra apaļkolbā. Iztvaicē to sausu, izmantojot rotācijas iztvaicētāju (4.3.), 60 oC temperatūrā. Atlikumu no jauna izšķīdina 10,0 ml DMF (3.6.), pievieno 15,0 ml ūdens (3.1.) un samaisa. Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.3.    HPLC noteikšana

5.3.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.10.) ar koncentrāciju 2 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus un izdalīšanas laiku.

5.3.2.    Kalibrēšanas šķīdumi

Vairākas reizes iešpricē pa 20 μl kalibrēšanas šķīduma (3.10.) un nosaka diklazurila un iekšējā standarta maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

5.3.3.    Parauga šķīdums

Vairākas reizes iešpricē pa 20 μl parauga šķīduma (5.2.1. vai 5.2.2.) un nosaka diklazurila un iekšējā standarta maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

6.1.   Barības

Diklazurila saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg]

kur:

hd, s

=

diklazurila maksimālais augstums (laukums) parauga šķīdumā (5.2.1.),

hi, s

=

iekšējā standarta maksimālais augstums (laukums) parauga šķīdumā (5.2.1.),

hd, c

=

diklazurila maksimālais augstums (laukums) kalibrēšanas šķīdumā (3.10.),

hi, c

=

iekšējā standarta maksimālais augstums (laukums) kalibrēšanas šķīdumā (3.10.),

cd, c

=

diklazurila koncentrācija kalibrēšanas šķīdumā, μg/ml (3.10.),

m

=

analizējamā parauga svars gramos,

V

=

parauga ekstrakta tilpums atbilstoši 5.2.1. punktam (t. i., 2,5 ml).

6.2.   Premiksi

Diklazurila saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg]

kur:

hd, c

=

diklazurila maksimālais augstums (laukums) kalibrēšanas šķīdumā (3.10.),

hi, c

=

iekšējā standarta maksimālais augstums (laukums) kalibrēšanas šķīdumā (3.10.),

hd, s

=

diklazurila maksimālais augstums (laukums) parauga šķīdumā (5.2.2.),

hi, s

=

iekšējā standarta maksimālais augstums (laukums) parauga šķīdumā (5.2.2.),

cd, c

=

diklazurila koncentrācija kalibrēšanas šķīdumā, μg/ml (3.10.),

m

=

analizējamā parauga svars gramos,

V

=

parauga ekstrakta tilpums atbilstoši 5.2.2. punktam (t. i., 25 ml),

P

=

diklazurila nominālais saturs mg/kg premiksā.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru (5.2.1. vai 5.2.2.) ar kalibrēšanas šķīduma (3.10.) spektru.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu (5.2.1. vai 5.2.2.) stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.10.). Pievienotā diklazurila daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam diklazurila daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai diklazurila maksimālo augstumu un iekšējā standarta maksimālo augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā augstuma jābūt ± 10 % robežās no nepastiprināta parauga ekstrakta diklazurila maksimuma vai iekšējā standarta maksimuma sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta (tukšā) parauga atgūstamība ir vismaz 80 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

Tika noorganizēts koppētījums, kurā 11 laboratorijas analizēja piecus paraugus. Divi analizējamie paraugi bija premiksi: viens ar organisku matricu (O 100), otrs ar neorganisku matricu (A 100). Abu paraugu teorētiskais diklazurila saturs ir 100 mg/kg. Trīs mājputniem domāto barības maisījumu paraugus ražoja trīs atšķirīgi ražotāji (NL) (L1/Z1/K1). Abu paraugu teorētiskais diklazurila saturs ir 1 mg/kg. Laboratorijām tika dots norādījums katru paraugu analizēt vienu vai divas reizes. (Sīkāku informāciju par šo laboratoriju koppētījumu skatīt Journal of AOAC International, Volume 77, Nr. 6, 1994. g., 1359.–1361. lpp.). Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo vērtību skaits,

Sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients,

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients.

9.   Novērojumi

Vispirms jāparāda, ka diklazurila signāla izmaiņas mērāmo koncentrāciju diapazonā ir lineāras.

G.   LAZALOCĪDNĀTRIJA NOTEIKŠANA

Poliētera monokarbonskābes nātrija sāls, kuru ražo Streptomyces lasaliensis

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt lazalocīdnātrija daudzumu barībā un premiksos. Noteikšanas robeža ir 5 mg/kg, kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 10 mg/kg.

2.   Princips

Lazalocīdnātriju no parauga ekstrahē ar paskābinātu metanolu un nosaka ar apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC), izmantojot apektrofluorimetra detektoru.

3.   Reaģenti

Atšķaida 23,5 ml ortofosforskābes (3.2.) līdz 100 ml tilpumam ar ūdeni.

Izšķīdina 1,36 g KH2PO4 (3.1.) 500 mililitros ūdens (3.11.), pievieno 3,5 ml ortofosforskābes (3.2.) un 10,0 ml 6-metil-2-heptilamīna (3.4.). Koriģē pH līdz 4,0 ar ortofosforskābes šķīdumu (3.3.) un atšķaida līdz 1 000 ml tilpumam ar ūdeni (3.11.).

5,0 ml sālsskābes (3.6.) pārnes 1 000 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.5.) un samaisa. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

Samaisa 5 ml fosfāta buferšķīduma (3.7.) ar 95 ml metanola (3.5.).

Ar 0,1 mg precizitāti 100 ml mērkolbā iesver 50 mg lazalocīdnātrija (3.10.), izšķīdina paskābinātā metanolā (3.8.), papildina līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju un samaisa. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

10,0 ml izejas standartšķīduma (3.10.1.) ar pipeti pārnes 100 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar paskābināto metanolu (3.8.) un samaisa. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas.

50 ml mērkolbās iepilda attiecīgi 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 un 10,0 ml starpposma standartšķīduma (3.10.2.) Papildina līdz zīmei ar paskābināto metanolu (3.8.) un samaisa. Minētie šķīdumi atbilst attiecīgi šādām lazalocīdnātrija koncentrācijām: 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 un 10,0 μg. Minētie šķīdumi jāsagatavo svaigi pirms izmantošanas.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Vispārīgas norādes

5.1.1.    Tukšais eksperiments

Lai veiktu atpazīšanas testu (5.1.2.), analizē tukšo barības paraugu, lai pārbaudītu, ka barībā nav ne lazalocīdnātrija, ne noteikšanu traucējošu vielu. Tukšais paraugs pēc veida ir līdzīgs analizējamajam paraugam, un, pārbaudot to, neuzrādās lazalocīdnātrijs vai noteikšanu traucējošas vielas.

5.1.2.    Atgūstamības tests

Atgūstamības testu veic, analizējot tukšo barības paraugu, kas pastiprināts, pievienojot tik daudz lazalocīdnātrija, cik ir paraugā. Lai paraugu pastiprinātu līdz līmenim 100 mg/kg, 10,0 ml izejas standartšķīduma (3.10.1.) pārnes 250 ml koniskā kolbā un šķīdumu iztvaicē līdz apmēram 0,5 ml. Pirms ekstrakcijas (5.2.) pievieno 50 g tukšā barības parauga, vairākas reizes kārtīgi samaisa un atstāj uz 10 minūtēm.

Ja nav analizējamajam paraugam līdzīga tukšā parauga (skatīt 5.1.1. punktu), tad atgūstamības testu var veikt, izmantojot standarta piedevu metodi. Tādā gadījumā analizējamo paraugu pastiprina ar lazalocīdnātrija daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Tādu paraugu analizē kopā ar nepastiprināto paraugu, un atgūstamību aprēķina pēc starpības.

5.2.   Ekstrakcija

5.2.1.    Barība

Ar precizitāti līdz 0,01 mg iesver 5–10 g parauga 250 ml koniskā kolbā ar aizbāzni. Ar pipeti pievieno 100,0 ml paskābināta metanola (3.8.). Vaļīgi aizkorķē korķi un pasvārsta, lai disperģējas. Kolbu uz 20 minūtēm ieliek ultraskaņas vannā (4.1.) apmēram 40 oC temperatūrā, tad izņem un atdzesē līdz istabas temperatūrai. Ļauj nostāties apmēram vienu stundu, kamēr suspendētā viela nogulsnējas, tad alikvotu devu izfiltrē caur 0,45 μm membrānfiltru (4.2.) piemērotā traukā. Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.2.2.    Premiksi

Ar precizitāti līdz 0,001 g iesver apmēram 2 g nesamalta premiksa 250 ml mērkolbā. Ar pipeti pievieno 100,0 ml paskābināta metanola (3.8.) un pasvārsta, lai disperģējas. Kolbu ar tās saturu uz 20 minūtēm ieliek ultraskaņas vannā (4.1.) apmēram 40 oC temperatūrā, tad izņem un atdzesē līdz istabas temperatūrai. Atšķaida līdz zīmei ar paskābināto metanolu (3.8.) un rūpīgi samaisa. Ļauj nostāties vienu stundu, kamēr suspendētā viela nogulsnējas, tad alikvotu devu izfiltrē caur 0,45 μm membrānfiltru (4.2.). Atšķaida atbilstošu tilpumu tīrā filtrāta ar paskābinātu metanolu (3.8.), izveidojot galīgā testa šķīdumu, kas satur apmēram 4 μg/ml lazalocīdnātrija. Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.3.    HPLC noteikšana

5.3.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.10.3.) ar koncentrāciju 4,0 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus (vai laukumus) un izdalīšanas laiku.

5.3.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.10.3.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot vidējos maksimālos augstumus (laukumus) un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.3.3.    Parauga šķīdums

Iešpricē parauga ekstraktu, kas iegūts saskaņā ar 5.2.1. vai 5.2.2. punktu, vairākas reizes, izmantojot to pašu tilpumu, kāds bija kalibrēšanas šķīdumam, un nosaka lazalocīdnātrija maksimumu vidējos augstumus (laukumus).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Lazalocīdnātrija šķīduma koncentrāciju (μg/ml) nosaka pēc parauga šķīduma (5.3.3.) vidējā maksimālā augstuma (laukuma), salīdzinot ar kalibrēšanas grafiku.

6.1.   Barība

Lazalocīdnātrija saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg]

kur:

c

=

lazalocīdnātrija koncentrācija parauga šķīdumā (5.2.1.) μg/ml,

V1

=

parauga ekstrakta tilpums ml atbilstoši 5.2.1. punktam (t. i., 100 ml),

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

6.2.   Premiksi

Lazalocīdnātrija saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg]

kur:

c

=

lazalocīdnātrija koncentrācija parauga šķīdumā (5.2.2.) μg/ml,

V2

=

parauga ekstrakta tilpums ml atbilstoši 5.2.2. punktam (t. i., 250 ml),

f

=

atšķaidījuma pakāpe atbilstoši 5.2.2. punktam,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Metodes, kuru pamatā ir spektrofluorimetrija, interference ietekmē mazāk nekā tās, kur izmanto UV staru detektoru. Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt ar paralēlu hromatogrāfisko analīzi.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu (5.2.1. vai 5.2.2.) stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.10.3.). Pievienotā lazalocīdnātrija daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam lazalocīdnātrija daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā. Tikai lazalocīdnātrija maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā pievienoto lazalocīdnātrija daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā augstuma jābūt ± 10 % robežās no nepastiprinātā parauga ekstrakta sākotnējā maksimuma.

7.2.   Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta (tukšā) barības parauga atgūstamība ir vismaz 80 %. Stiprinātu premiksu paraugu atgūstamība ir vismaz 90 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

Tika noorganizēts koppētījums ( *1 ), kurā 12 laboratorijas analizēja divus premiksus (1. un 2. paraugs) un piecus barības paraugus (3. līdz 7. paraugs). Visus paraugus analizēja divas reizes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo rezultātu skaits,

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

sR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients (%),

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%).

---

V PIELIKUMS

ANALĪZES METODES, LAI KONTROLĒTU NEVĒLAMAS VIELAS BARĪBĀ

A.   BRĪVĀ UN KOPĒJĀ GOSIPOLA NOTEIKŠANA

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt brīvā gosipola, kopējā gosipola un ķīmiski radniecīgu vielu daudzumu kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos, un barības maisījumos, kas satur šos barības līdzekļus, ja tajos ir vairāk par 20 mg/kg brīvā gosipola, kopējā gosipola un ķīmiski radniecīgu vielu.

2.   Princips

Gosipolu ekstrahē 3-amino-1-propanola klātbūtnē ar 2-propanola un heksāna maisījumu brīvā gosipola noteikšanai vai ar dimetilformamīdu kopējā gosipola noteikšanai. Gosipolu ar anilīnu pārvērš gosipoldianilīnā, kura optisko blīvumu mēra pie 440 nm.

3.   Reaģenti

Standarta gosipola A un B šķīdumu var uzglabāt 24 stundas, ja tiem nepiekļūst gaisma.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.    Testa paraugs

Izmantotā testa parauga daudzums ir atkarīgs no domājamā gosipola satura paraugā. Ieteicams strādāt ar mazu testa paraugu un relatīvi lielu filtrāta alikvoto daļu, lai ar iegūto gosipola daudzumu būtu iespējami precīzi fotometrijas mērījumi. Brīvā gosipola noteikšanai kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos testa paraugs nepārsniedz 1 g; barības maisījumam tas var būt līdz 5 g. Vairumā gadījumu piemērota ir 10 ml filtrāta alikvotā daļa; tā satur 50–100 μg gosipola. Kopējā gosipola noteikšanai testa paraugs ir no 0,5 g līdz 5 g tā, lai 2 ml filtrāta alikvotā daļa saturētu 40 līdz 200 μg gosipola.

Analīzi veic istabas temperatūrā – apmēram 20 oC.

5.2.    Brīvā gosipola noteikšana

Testa paraugu ievieto 250 ml kolbā ar pieslīpētu kaklu, kuras dibens ir klāts ar stikla drumslām. Ar pipeti pievieno 50 ml šķīdinātāja A (3.2.), aizkorķē kolbu un maisa maisītājā vienu stundu. Izfiltrē caur sausu filtru un savāc filtrātu mazā kolbā ar pieslīpētu kaklu. Filtrēšanas laikā piltuvi apklāj ar pulksteņstiklu.

Ar pipeti iepilina identiskas filtrāta alikvotās daļas, kas satur 50 līdz 100 μg gosipola, katrā no divām 25 ml mērkolbām (A un B). Vajadzības gadījumā papildina tilpumu līdz 10 ml ar A šķīdinātāju (3.2.). Tad papildina kolbas (A) saturu līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Tādu šķīdumu izmantos par salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra parauga šķīdumu.

Ar pipeti iepilina 10 ml A šķīdinātāja (3.2.) katrā no divām citām 25 ml mērkolbām (C un D). Papildina kolbas (C) saturu līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Tādu šķīdumu izmantos kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra tukšās analīzes šķīdumu.

Katrā no abām kolbām (D) un (B) pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Karsē 30 minūtes virs vārošas ūdens vannas, līdz šķīdums iekrāsojas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj uz vienu stundu.

Ar spektrofotometru pie 440 nm nosaka optisko blīvumu tukšās analīzes šķīdumam (D), salīdzinot ar salīdzināšanas šķīdumu (C), un optisko blīvumu parauga šķīdumam (B), salīdzinot ar salīdzināšanas šķīdumu (A), izmantojot 1 cm stikla šūnas.

Atņem tukšās analīzes šķīduma optisko blīvumu no parauga šķīduma optiskā blīvuma (= koriģētais optiskais blīvums). No šā lieluma aprēķina brīvā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā.

5.3.    Kopējā gosipola noteikšana

Testa paraugu, kas satur 1 mg līdz 5 mg gosipola, ievieto 50 ml mērkolbā un pievieno 10 ml B šķīdinātāja (3.3.). Vienlaikus sagatavo tukšo analīzi, ievietojot 10 ml B šķīdinātāja (3.3.) citā 50 ml mērkolbā. 30 minūtes abas kolbas karsē virs vāroša ūdens vannas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un papildina katras kolbas saturu līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Homogenizē un ļauj nogulsnēties 10–15 minūtes, tad izfiltrē un filtrātus savāc kolbās ar pieslīpētu kaklu.

Ar pipeti iepilina katrā no divām 25 ml mērkolbām 2 ml parauga filtrāta un ar pipeti iepilina katrā no divām citām 25 ml kolbām 2 ml tukšās analīzes filtrāta. Tad papildina katra komplekta vienas kolbas saturu līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Minētos šķīdumus izmantos par salīdzināšanas šķīdumiem.

Katrā no abām pārējām kolbām pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Karsē 30 minūtes virs vārošas ūdens vannas, līdz šķīdums iekrāsojas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj uz vienu stundu.

Nosaka optisko blīvumu, kā norādīts 5.2. punktā attiecībā uz brīvo gosipolu. No šā lieluma aprēķina kopējā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā.

6.   Rezultātu aprēķināšana

Rezultātus var aprēķināt vai nu no specifiskā optiskā blīvuma (6.1.), vai izmantojot kalibrēšanas līkni (6.2.).

6.1.    No specifiskā optiskā blīvuma

Specifiskie optiskie blīvumi aprakstītajos apstākļos būs šādi:

Brīvā vai kopējā gosipola saturu paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

E

=

koriģētais optiskais blīvums, kas noteikts, kā norādīts 5.2. punktā,

p

=

testa paraugs gramos,

a

=

filtrāta alikvotā daļa mililitros.

6.2.    Izmantojot kalibrēšanas līkni

6.2.1.    Brīvais gosipols

Sagatavo divus komplektus, katrā pa piecām 25 ml mērkolbām. Katrā kolbu komplektā ar pipeti iepilina standarta gosipola A šķīduma 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 un 10,0 ml alikvotus. Papildina tilpumus līdz 10 ml ar A šķīdinātāju (3.2.). Papildina katru komplektu ar 25 ml mērkolbu, kurā ir tikai 10 ml A šķīdinātāja (3.2.) (tukšā analīze).

Papildina pirmā komplekta kolbas (tostarp kolbu tukšajai analīzei) līdz 25 ml tilpumam ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.) (salīdzināšanas komplekts).

Katrai otrā komplekta kolbai (tostarp kolbu tukšajai analīzei) pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Karsē 30 minūtes virs vārošas ūdens vannas, līdz šķīdums iekrāsojas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna šķīdumu (3.1.), homogenizē un atstāj uz vienu stundu (standarta komplekts).

Kā norādīts 5.2. punktā, nosaka standartkomplekta šķīdumu optisko blīvumu, salīdzinot ar attiecīgajiem šķīdumiem salīdzināšanas komplektā. Veido kalibrēšanas līkni, atzīmējot optiskos blīvumus un atbilstīgos gosipola daudzumus (μg).

6.2.2.    Kopējais gosipols

Sagatavo sešas 50 ml mērkolbas. Pirmajā kolbā ievieto 10 ml B šķīdinātāja (3.3.) un pārējās – attiecīgi 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 un 10,0 ml standarta gosipola B šķīduma (3.6.). Katras kolbas saturu papildina līdz 10 ml ar B šķīdinātāju (3.3.). Karsē 30 minūtes virs vārošas ūdens vannas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna šķīdumu (3.1.) un homogenizē.

Ievieto 2,0 ml minēto šķīdumu katrā no sešām abu komplektu 25 ml mērkolbām. Papildina pirmā komplekta kolbu saturu līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.) (salīdzināšanas komplekts).

Katrai kolbai otrajā komplektā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Karsē 30 minūtes virs vārošas ūdens vannas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar 2-propanola-heksāna šķīdumu (3.1.), homogenizē un atstāj uz vienu stundu (standarta komplekts).

Kā norādīts 5.2. punktā, nosaka standartkomplekta šķīdumu optisko blīvumu, salīdzinot ar attiecīgajiem šķīdumiem salīdzināšanas komplektā. Veido kalibrēšanas līkni, atzīmējot optiskos blīvumus un atbilstīgos gosipola daudzumus (μg).

6.3.    Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

▼M6

B.   DIOKSĪNU (PCDD/PCDF) UN PCB DAUDZUMU NOTEIKŠANA

I NODAĻA

Paraugu ņemšanas un analīžu rezultātu interpretācijas metodes

1.    Darbības joma un definīcijas

Polihlordibenzo-p-dioksīnu (PCDD), polihlordibenzofurānu (PCDF), dioksīniem līdzīgu polihlorbifenilu (PCB) ( 16 ) un tādu PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, paraugus, kas paredzēti barības oficiālajai kontrolei, ņem saskaņā ar I pielikuma noteikumiem. Attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi sadalīti visā barībā, piemēro I pielikuma 5.1. punktā paredzētās kvantitatīvās prasības. Minētajā veidā iegūtos kopparaugus uzskata par raksturīgiem tām partijām vai apakšpartijām, no kurām tie ņemti. Atbilstību Direktīvā 2002/32/EK noteiktajiem maksimāli pieļaujamajiem daudzumiem konstatē, pamatojoties uz laboratorijas paraugos noteikto daudzumu.

Šajā B daļā piemēro definīcijas, kas noteiktas Komisijas Lēmuma 2002/657/EK ( 17 ) I pielikumā.

Papildus minētajām definīcijām šajā B daļā piemēro arī šādas definīcijas:

2.    Partijas vai apakšpartijas atbilstība maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai

2.1.    Attiecībā uz PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem

Partija vai apakšpartija atbilst maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, ja PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 un PCB 180 (turpmāk tekstā PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem) analītiskais rezultāts nepārsniedz maksimāli pieļaujamo koncentrāciju, kas noteikta Direktīvā 2002/32/EK, ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti ( 18 ). Partija vai apakšpartija neatbilst maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, kas noteikta Direktīvā 2002/32/EK, ja divu lielāko analītisko rezultātu vidējā vērtība ( 19 ), kas iegūta otrreizējā analīzē ( 20 ), ņemot vērā mērījuma paplašināto nenoteiktību, neapšaubāmi pārsniedz maksimālo pieļaujamo koncentrāciju.

Mērījumu paplašināto neprecizitāti aprēķina, izmantojot pārklāšanās koeficientu 2, kas nodrošina apmēram 95 % ticamības līmeni. Partija vai apakšpartija nav atbilstoša, ja no izmērīto vērtību vidējā lieluma atskaitot vidējā lieluma paplašināto neprecizitāti, iegūst starpību, kas pārsniedz noteikto maksimālo koncentrāciju.

Noteikumus, kas minēti šā punkta iepriekšminētajos apakšpunktos, piemēro analīzes rezultātam, kas iegūts parauga oficiālajā kontrolē. Ja analīze vajadzīga aizstāvības vai arbitrāžas nolūkos, piemēro valsts tiesību aktus.

2.2.    Attiecībā uz PCDD/F un dioksīniem līdzīgiem PCB

Partija vai apakšpartija atbilst maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, ja tādas atsevišķas analīzes rezultāts:

Veicot skrīningu, jānosaka robežvērtība, kas jāņem vērā testos pieņēmumu izteikšanai par parauga atbilstību attiecīgajai maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, kas noteikta attiecībā uz PCDD/PCDF vai PCDD/PCDF un dioksīniem līdzīgu PCB summu.

Partija vai apakšpartija neatbilst maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, kas noteikta Direktīvā 2002/32/EK, ja divu lielāko analītisko rezultātu ( 21 ) vidējā vērtība, kas iegūta otrreizējā analīzē ( 22 ) ar apstiprināšanas metodi un ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti, neapšaubāmi pārsniedz maksimālo pieļaujamo koncentrāciju, proti, atbilstības novērtēšanai izmanto analīzes rezultātā iegūtās vielas koncentrācijas daudzumu pēc tam, kad no tās atņemta mērījumu paplašinātā neprecizitāte.

Mērījumu paplašināto neprecizitāti aprēķina, izmantojot pārklāšanās koeficientu 2, kas nodrošina apmēram 95 % ticamības līmeni. Partija vai apakšpartija nav atbilstoša, ja, no izmērīto vērtību vidējā lieluma atskaitot vidējā lieluma paplašināto neprecizitāti, iegūst starpību, kas pārsniedz noteikto maksimālo koncentrāciju.

Atsevišķo PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB analīžu rezultātu aprēķinātā izvērstās neprecizitātes summa ir jāizmanto kā PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summa.

Noteikumus, kas minēti šā punkta iepriekšminētajos apakšpunktos, piemēro analīzes rezultātam, kas iegūts parauga oficiālajā kontrolē. Ja analīze vajadzīga aizstāvības vai arbitrāžas nolūkos, piemēro valsts tiesību aktus.

3.    Rezultāti, kas pārsniedz darbības robežlielumus, kā noteikts Direktīvas 2002/32/EK II pielikumā

Intervences līmeņi paredzēti izmantošanai paraugu atlasei gadījumos, kad ir jāidentificē piesārņojuma avots un jāveic pasākumi tā samazināšanai vai likvidēšanai. Skrīninga metodes nosaka šo paraugu atlasei piemērotas robežvērtības. Ja avota identificēšanai un piesārņojuma samazināšanai vai novēršanai jāveic plašas darbības, ir lietderīgi apstiprināt intervences līmeņa pārsniegšanu, veicot otrreizēju analīzi ar apstiprināšanas metodi un ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti ( 23 ).

II NODAĻA

Paraugu gatavošana un prasības attiecībā uz analīzes metodēm, ko izmanto dioksīnu (PCDD/PCDF) un dioksīniem līdzīgu PCB daudzumu oficiālai kontrolei barībā

1.    Piemērošanas joma

Šajā nodaļā noteiktās prasības piemēro, ja barību analizē, lai veiktu 2,3,7,8-aizvietoto PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB daudzumu oficiālu kontroli, un attiecībā uz paraugu gatavošanu un analītiskajām prasībām citiem regulatīviem mērķiem, tostarp kontroli, ko veic pārtikas apritē iesaistīts tirgus dalībnieks, lai nodrošinātu atbilstību Eiropas Parlamenta un Padomes Regulas (EK) Nr.183/2005 ( 24 ) noteikumiem.

PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB klātbūtnes uzraudzību barībā var veikt, izmantojot divus dažādus analītisko metožu veidus.

2.    Vispārīga informācija

Lai aprēķinātu toksicitātes ekvivalenta koncentrāciju (TEQ), katras vielas koncentrāciju konkrētajā paraugā reizina ar vielas attiecīgo toksiskās ekvivalences faktoru (TEF) (sk. 1. zemsvītras piezīmi I nodaļā), pēc tam šos reizinājumus summē, lai iegūtu dioksīniem līdzīgu savienojumu kopējo koncentrāciju, kas izteikta toksicitātes ekvivalentos (TEQ).

Šajā B daļā atsevišķas radniecīgās vielas kvantitatīvās noteikšanas pieņemtā specifiskā robeža ir zemākā analizējamās vielas koncentrācija, ko var izmērīt ar pietiekamu statistisku ticamību, kas atbilst identifikācijas kritērijiem, kuri aprakstīti starptautiski atzītos standartos, piemēram, standartā EN 16215:2012 (Dzīvnieku barība. Dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB noteikšana ar GC-HRMS metodi un PCB indikatoru noteikšana ar GC-HRMS metodi) un/vai EPA 1613. un 1668. metodes pārskatītajā redakcijā.

Atsevišķas radniecīgas vielas kvantitatīvās noteikšanas robežu var identificēt kā:

Bioanalīžu skrīninga metodes radniecīgās vielas līmenī nesniegs rezultātus, bet vienīgi norādi ( 25 ) par TEQ līmeni, kas izteikts BEQ, lai apstiprinātu faktu, ka ne visi parauga ekstraktā esošie savienojumi, kas testā rada signālu, var atbilst visām TEQ principa prasībām.

Skrīninga un apstiprināšanas metodes var piemērot tikai konkrētas matrices kontroles vajadzībām, ja metodes ir pietiekami jutīgas, lai ticami noteiktu daudzumu intervences līmenī vai maksimāli pieļaujamajā koncentrācijā.

3.    Kvalitātes nodrošināšanas prasības

3.1.	Jāveic pasākumi, lai nevienā no paraugu ņemšanas un analīzes procedūras posmiem nepieļautu paraugu savstarpēju piesārņošanos.

3.2.	Paraugi jāglabā un jātransportē stikla, alumīnija, polipropilēna vai polietilēna traukos, kas piemēroti glabāšanai un neietekmē PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB koncentrāciju paraugos. No parauga konteinera jāaizvāc papīra putekļu pēdas.

3.3.	Paraugi jāuzglabā un jātransportē tā, lai saglabātu barības parauga integritāti.

3.4.	Vajadzības gadījumā katru laboratorijas paraugu rūpīgi sasmalcina un samaisa, izmantojot apstrādi, kas nodrošina pilnīgu homogenizāciju (piemēram, samaļ tā, lai paraugs pilnībā izietu caur 1 mm sietu). Pārlieku mitri paraugi pirms sasmalcināšanas jāizžāvē.

3.5.	Jāveic reaģentu, stikla trauku un aprīkojuma kontrole, lai nepieļautu ar TEQ vai BEQ pamatoto rezultātu ietekmēšanu.

3.6.	Jāveic tukšā analīze, izpildot pilnībā visu analīzes procedūru bez analizējamā parauga.

3.7.

Attiecībā uz bioanalīžu metodēm jāpārbauda visi analīzē izmantotie stikla trauki un šķīdinātāji, vai tajos nav savienojumi, kas traucē noteicamo savienojumu konstatēšanu darba diapazonā. Stikla trauki jāskalo ar šķīdinātājiem vai jākarsē temperatūrā, kas piemērota tam, lai notīrītu PCDD/F, dioksīnam līdzīgu savienojumu un traucējošo savienojumu pēdas no to virsmas.

3.8.	Ekstrakcijai izmantojamā parauga daudzumam jābūt pietiekami lielam, lai tiktu ievērotas prasības attiecībā uz pietiekami zemu darba diapazonu, tostarp maksimāli pieļaujamo vai intervences līmeņa koncentrāciju.

3.9.	Īpašajām paraugu sagatavošanas procedūrām, ko izmanto attiecīgajiem produktiem, ir jābūt apstiprinātām saskaņā ar starptautiski pieņemtām vadlīnijām.

4.    Prasības laboratorijām

4.1.

Saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 882/2004 noteikumiem laboratorijas akreditē atzīta iestāde, kas darbojas saskaņā ar standartu ISO Guide 58, lai nodrošinātu to, ka laboratorijās piemēro analīžu kvalitātes nodrošināšanu. Laboratorijas akreditē, ievērojot standartu EN ISO/IEC 17025. Attiecīgā gadījumā piemēro principus, kas aprakstīti vadlīniju dokumentā Technical Guidelines for the estimation of measurement uncertainty and limits of quantification for PCDD/F and PCB analysis (Tehniskie norādījumi par mērījumu nenoteiktības skaitlisko noteikšanu un kvantitatīvās noteikšanas robežas PCDD/F un PCB analīzei) ( 26 ).

4.2.	Laboratoriju kompetence ir jāpierāda ar pastāvīgu un veiksmīgu piedalīšanos starplaboratoriju pētījumos, kuros nosaka PCDD/F un dioksīniem līdzīgus PCB attiecīgajās barības matricās un koncentrācijas diapazonos.

4.3.	Laboratorijas, kurās paraugu regulārai kontrolei izmanto skrīninga metodes, izveido ciešu sadarbību ar laboratorijām, kas izmanto apstiprināšanas metodi, gan attiecībā uz kvalitātes kontroli, gan iespējami inficētu paraugu analīzes rezultātu apstiprināšanu.

5.    Pamatprasības, kas jāievēro attiecībā uz dioksīnu (PCDD/F) un dioksīniem līdzīgu PCB analīzes procedūru

5.1.    Zems darba diapazons un kvantitatīvās noteikšanas robežas

PCDD/F nosakāmajiem daudzumiem jābūt augšējo femtogramu (10– 15 g) robežās, jo daži no tādiem savienojumiem ir ārkārtīgi toksiski. Attiecībā uz lielāko daļu PCB radniecīgo vielu kvantitatīvās noteikšanas robeža nanogramu (10– 9 g) robežās ir pietiekama. Lai izmērītu toksiskākas dioksīniem līdzīgu PCB radniecīgās vielas (jo īpaši neorto aizvietotās radniecīgās vielas), darba diapazona zemākais punkts atbilst zemākajam pikogramu (10– 12 g) līmenim. Attiecībā uz visām pārējām PCB radniecīgām vielām kvantitatīvās noteikšanas robeža nanogramu (10– 9 g) robežās ir pietiekama.

5.2.    Augsta selektivitāte (specifiskums)

5.2.1.

Jāatšķir PCDD/F un dioksīniem līdzīgi PCB no daudziem citiem vienlaikus ekstrahētiem savienojumiem un varbūtēji traucējošiem savienojumiem, kuru koncentrācija līdz vairākām kārtām pārsniedz nosakāmās vielas koncentrāciju. Attiecībā uz GC-MS metodēm ir jādiferencē tādas atšķirīgas radniecīgās vielas kā toksiskās vielas (piemēram, septiņpadsmit 2,3,7,8-aizvietotie PCDD/F un divpadsmit dioksīniem līdzīgi PCB) un citas radniecīgās vielas.

5.2.2.

Izmantojot bioanalīzes metodes, nosakāmos savienojumus jāspēj konstatēt kā PCDD/F un/vai dioksīniem līdzīgo PCB summu. Paraugu attīra, lai likvidētu savienojumus, kas rada šķietami neatbilstošus rezultātus, vai savienojumus, kas var mazināt signālu, radot šķietami atbilstošus rezultātus.

5.3.    Liela precizitāte (ticamība un precizitāte, biotesta acīmredzamā atgūstamība)

5.3.1.

Attiecībā uz GC-MS metodēm ir jānodrošina pareizs patiesās koncentrācijas novērtējums paraugā. Liela precizitāte ir vajadzīga, lai noteiktā TEQ līmeņa mazās ticamības dēļ nevarētu noraidīt parauga analīzes rezultātus. Precizitāti izsaka kā ticamību (starpība starp analizējamās vielas vidējo vērtību, kas izmērīta, analizējot sertificētu materiālu, un tās sertificēto vērtību, kas izteikta procentos) un precizitāti (RSD R relatīvā standartnovirze, ko aprēķina no rezultātiem, kuri iegūti saskaņā ar reproducējamības nosacījumiem).

5.3.2.

Attiecībā uz bioanalīžu metodēm ir jānosaka biotesta acīmredzamā atgūstamība. Biotesta acīmredzamā atgūstamība ir BEQ līmenis, kas aprēķināts no TCDD vai PCB 126 kalibrēšanas līknes, kas koriģēta atbilstīgi tukšajam paraugam, pēc tam dalot ar TEQ līmeni, kas noteiks, izmantojot apstiprināšanas metodi. Tā rezultātā jākoriģē tādi koeficienti kā PCDD/F un dioksīniem līdzīgu savienojumu zudums ekstrakcijas laikā un attīrīšanas posmos, vienlaikus ekstrahēti savienojumi, kas palielina vai samazina signālu (agonistiska un antagonistiska iedarbība), līknes atbilstības kvalitāte vai atšķirības starp TEF un relatīvās potences (REP) vērtībām. Biotesta acīmredzamā atgūstamība tiek aprēķināta no piemērotiem standartparaugiem ar dažādām reprezentatīvām radniecīgām vielām aptuveni interesējošā koncentrācijā.

5.4.    Validācija maksimāli pieļaujamās koncentrācijas diapazonā un vispārīgi kvalitātes kontroles pasākumi

5.4.1.

Validēšanas procedūras un regulārās analīzes gaitā laboratorijas pierāda metodes veiktspēju maksimāli pieļaujamās koncentrācijas diapazonā, piemēram, maksimāli pieļaujamā koncentrācijas x0,5, x1 un x2 ar atbilstošu variācijas koeficientu atkārtotai analīzei.

5.4.2.

Kvalitātes iekšējās kontroles nolūkos regulāri izdara tukšo paraugu analīzes un kontrolparaugu analīzes ar standartvielu piedevas analīzi vai kontrolparaugu analīzi (ja iespējams, ieteicams izmantot sertificētu standartmateriālu). Lai pārliecinātos, ka analīzes veiktspēja atbilst prasībām, izveido un pārbauda tukšo paraugu analīžu, kontrolparaugu analīžu ar standartvielu piedevas analīzi vai kontrolparaugu analīžu kvalitātes kontroles grafikus.

5.5.    Kvantitatīvās noteikšanas robeža

5.5.1.

Attiecībā uz bioanalīžu skrīninga metodēm kvantitatīvās noteikšanas robežas (LOQ) nav obligāti jānosaka, taču metodei ir jāpierāda, ka tā var diferencēt tukšā parauga vērtību un robežvērtību. Lai noteiktu BEQ līmeni, jānosaka ziņojamā līmeņa robeža to paraugu analizēšanai, kuros uzrādītais signāls ir zem šā līmeņa. Ir jāpierāda, ka ziņojamais līmenis atšķiras no procedūras tukšajiem paraugiem vismaz ar koeficientu trīs un tā signāls ir zemāks par darba diapazonu. Tādēļ tas jāaprēķina no paraugiem, kuros noteicamie savienojumi aptuveni atbilst vajadzīgajam obligātajam līmenim, un nevis no S/T attiecības vai tukšās analīzes.

5.5.2.

Kvantitatīvās noteikšanas robežai apstiprināšanas metodē ir jābūt aptuveni vienai piektdaļai no maksimāli pieļaujamās koncentrācijas.

5.6.    Analītiskie kritēriji

Lai iegūtu ticamus rezultātus, izmantojot apstiprināšanas vai skrīninga metodes, attiecīgi TEQ vai BEQ vērtībai maksimāli pieļaujamās koncentrācijas diapazonā ir jāatbilst turpmāk minētajiem kritērijiem atkarībā no tā, vai vērtība tiek noteikta kā TEQ vai BEQ kopējā summa (kā PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summa) vai PCDD/F un dioksīniem līdzīgiem PCB katram atsevišķi:

5.7.    Īpašas prasības skrīninga metodēm

5.7.1.

Skrīningā var izmantot gan GC-MS, gan bioanalīžu metodes. Attiecībā uz GC-MS metodēm jāievēro 6. punktā noteiktās prasības. Īpašas prasības attiecībā uz šūnu bioanalīžu metodēm tiek noteiktas 7. punktā.

5.7.2.

Laboratorijas, kas paraugu regulārai kontrolei izmanto skrīninga metodes, izveido ciešu sadarbību ar laboratorijām, kas izmanto apstiprināšanas metodi.

5.7.3.

Skrīninga metodes veiktspējas pārbaude ir vajadzīga regulāras analīzes laikā, veicot analīzes kvalitātes kontroli un metožu pastāvīgu validēšanu. Atbilstošu rezultātu kontrolei ir vajadzīga ilgstoša programma.

5.7.4.

Pārbaude uz šūnas signāla iespējamo slāpēšanu un citotoksicitāti Regulārā skrīninga gaitā 20 % no paraugu ekstraktiem veic mērījumus, pievienojot 2,3,7,8-TCDD, kas atbilst maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai vai intervences līmenim, un bez tā, lai pārbaudītu, vai parauga ekstraktā esošās traucējošās vielas iespējami neslāpē signālu. Parauga ar standartvielu piedevu izmērīto koncentrāciju salīdzina ar parauga ekstrakta, kam nav pievienota standartviela, koncentrācijas summu, pieskaitot standartvielu piedevu koncentrāciju. Ja šī izmērītā koncentrācija pārsniedz aprēķināto (summu) koncentrāciju vairāk nekā par 25 %, tas norāda uz iespējamo signāla slāpēšanu un attiecīgo paraugu iesniedz, lai veiktu GC-HRMS apstiprinošu analīzi. Rezultātus kontrolē, izmantojot kvalitātes kontroles grafikus.

5.7.5.

Atbilstošu paraugu kvalitātes kontrole Atkarībā no parauga matrices un laboratorijas pieredzes aptuveni no 2 līdz 10 % atbilstošo paraugu apstiprina ar GC/HRMS metodēm.

5.7.6.

Šķietami atbilstošo paraugu proporcijas noteikšana, izmantojot kvalitātes kontroles datus Ir jānosaka tādu šķietami atbilstošu rezultātu proporcija, kas iegūti, veicot skrīningu paraugiem, kuros ir pārsniegta maksimāli pieļaujamā koncentrācija vai intervences līmenis. Faktiski, šķietami atbilstošo rezultātu proporcijai jābūt mazākai par 5 %. Ja atbilstošo paraugu kvalitātes kontroles gaitā no vienas matrices/ matricu grupas var iegūt vismaz 20 apstiprinātus rezultātus, secinājumus par šķietami atbilstošo rezultātu proporciju iegūst no šīs datubāzes. Rezultātus no paraugiem, kas analizēti, izmantojot salīdzinošus testus, vai kas analizēti saistībā ar piesārņojuma gadījumiem un kuru koncentrācijas diapazons aptver, piemēram, divas reizes lielāku maksimāli pieļaujamo koncentrāciju, arī var iekļaut obligātajos 20 rezultātos, kuri jāvērtē attiecībā uz šķietamo atbilstību. Paraugos iekļauj visbiežāk izmantojamās radniecīgās vielas, kas iegūtas no dažādiem avotiem. Lai gan skrīninga testus būtu vēlams veikt, lai noteiktu paraugus, kuros pārsniegts intervences līmenis, kritērijs šķietami atbilstošo rezultātu proporcijas noteikšanai ir maksimāli pieļaujamā koncentrācija, ņemot vērā apstiprināšanas metodes mērījumu paplašināto neprecizitāti.

5.7.7.

Potenciāli neatbilstošiem paraugiem, kas iegūti, veicot skrīningu, vienmēr veic pilnīgu atkārtotu analīzi no sākotnējā parauga, izmantojot apstiprināšanas analīzes metodi. Šos paraugus var izmantot arī, lai novērtētu šķietami neatbilstošu rezultātu proporciju. Attiecībā uz skrīninga metodēm šķietami neatbilstošu rezultātu proporcija ir to rezultātu frakcija, kas atzīti par atbilstošiem ar apstiprināšanas analīzi, arī tad, ja iepriekšējā skrīningā iegūtais paraugs tika uzskatīts par iespējami neatbilstošu. Skrīninga metodes priekšrocību novērtējuma pamatā jābūt šķietami neatbilstošu paraugu un pārbaudīto paraugu kopējā skaita salīdzinājumam. Šai attiecībai jābūt pietiekami mazai, lai skrīninga metodi izmantotu lietderīgi.

5.7.8.

Bioanalīžu metodes saskaņā ar validēšanas nosacījumiem nodrošina atbilstošu norādi par TEQ līmeni, kas aprēķināts un izteikts kā BEQ. Arī to bioanalīzes metožu gadījumā, kas tiek piemērotas atkārtojamības apstākļos, laboratorijas RSD r parasti būtu mazāka par reproducējamības apstākļos iegūtu RSD R.

6.    Īpašas prasības, kas jāievēro attiecībā uz GC-MS metodēm, kuras izmanto skrīningam vai apstiprināšanai

6.1.    Pieļaujamā starpība starp PVO TEQ lielāko un mazāko analītisko rezultātu

Lai apstiprinātu, ka ir pārsniegta maksimālā pieļaujamā koncentrācija vai (vajadzības gadījumā) intervences līmeņi, starpība starp lielāko un mazāko analītisko rezultātu nedrīkst pārsniegt 20 %.

6.2.    Atgūstamības kontrole

6.2.1.

Lai analīzes procedūra būtu atzīstama par derīgu, sākot analīzi, piemēram, pirms ekstrakcijas, jāpievieno ar 13C iezīmēti 2,3,7,8-hloraizvietoti iekšējie PCDD/F standarti un ar 13C iezīmēti dioksīniem līdzīgu PCB iekšējie standarti. Katrai tetra- līdz oktahloratvasināto PCDD/F homologu grupai jāpievieno vismaz viena radniecīga viela, un vismaz viena radniecīga viela jāpievieno katrai dioksīniem līdzīgu PCB homologu grupai (alternatīvi jāpievieno vismaz viena radniecīga viela uz katru masspektrometrijai izraudzīto reģistrējamo jonu funkciju, ko izmanto PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB uzraudzībai). Attiecībā uz apstiprināšanas metodēm tiek izmantoti visi 17 ar 13C iezīmēti 2,3,7,8-aizvietoti PCDD/F iekšējie standarti un visi 12 ar 13C-iezīmēti dioksīniem līdzīgu PCB iekšējie standarti.

6.2.2.

Izmantojot attiecīgus kalibrēšanas šķīdumus, nosaka relatīvā signāla koeficientus tām radniecīgajām vielām, kurām nav pievienots ar 13C iezīmēts analogs.

6.2.3.

Pirms ekstrakcijas iekšējie standarti obligāti jāpievieno augu un dzīvnieku izcelsmes barībai, kurā ir mazāk nekā 10 % tauku. Dzīvnieku izcelsmes barības, kas satur vairāk par 10 % tauku, analizēšanai iekšējos standartus pievieno pirms vai pēc tauku ekstrakcijas. Atkarībā no tā, kurā analīzes posmā sāk izmantot iekšējos standartus, jāveic atbilstīga veiktspējas validācija.

6.2.4.

Pirms GC-MS analīzes jāpievieno 1 vai 2 atgūstamības (surogāta) standarts(-i).

6.2.5.

Nepieciešams veikt atgūstamības kontroli. Attiecībā uz apstiprināšanas metodēm atsevišķu iekšējo standartu atgūstamībai jābūt intervālā no 60 % līdz 120 %. Lielāka vai mazāka atsevišķu radniecīgo vielu, jo īpaši dažu hepta- un oktahloratvasināto dibenzo-p-dioksīnu un dibenzofurānu atgūstamība ir pieņemama ar nosacījumu, ka to daļa TEQ vērtībā nepārsniedz 10 % no kopējās TEQ vērtības (kuras pamatā ir PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summa). Ja piemēro GC-MS skrīninga metodes, atgūstamībai jābūt diapazonā no 30 % līdz 140 %.

6.3.    Traucējošu vielu likvidēšana

6.4.    Kalibrēšana ar standartlīkni

Kalibrēšanas līknes diapazons ietver maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai intervences līmeņa atbilstošo diapazonu.

6.5.    Īpaši kritēriji apstiprināšanas metodēm

7.    Īpašas prasības bioanalīzes metodēm

Bioanalīzes metodes ir metodes, kuru pamatā ir tādu bioloģisko principu izmantošana kā šūnu testi, receptoru testi vai imūntesti. Ar šo 7. punktu tiek noteiktas prasības attiecībā uz bioanalīzes metodēm kopumā.

Skrīninga metode faktiski paraugu klasificē kā atbilstošu vai iespējami neatbilstošu. Tādēļ aprēķinātais BEQ līmenis tiek salīdzināts ar robežvērtību (sk. 7.3. apakšpunktu). Paraugi, kuros nosakāmā koncentrācija ir zem robežvērtības, tiek uzskatīti par atbilstīgiem, savukārt paraugi, kuros nosakāmā koncentrācija ir vienāda ar robežvērtību vai virs tās, tiek uzskatīti par iespējami neatbilstīgiem, kas jāanalizē ar apstiprināšanas metodi. Praksē BEQ līmenis, kas atbilst divām trešdaļām no maksimāli pieļaujamās koncentrācijas, var tikt izmantots par robežvērtību, ja tiek nodrošināta šķietami atbilstoša attiecība, kas ir mazāka par 5 %, un pieņemama attiecība šķietami neatbilstīgiem rezultātiem. Attiecībā uz atsevišķām PCDD/F maksimāli pieļaujamām koncentrācijām un PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summu, veicot paraugu atbilstības pārbaudi bez frakcionēšanas, PCDD/F ir vajadzīgas atbilstošas biotesta robežvērtības. Attiecībā uz tādu paraugu pārbaudi, kuros ir pārsniegti intervences līmeņi, piemērota robežvērtība ir attiecīgā intervences līmeņa atbilstoša procentuālā daļa.

Ja paredzamā koncentrācija ir izteikta BEQ, paraugiem jābūt darba diapazonā un tiem jāpārsniedz ziņojamā līmeņa robeža (sk. 7.1.1. un 7.1.6. apakšpunktu).

7.1.    Testa signāla novērtējums

7.1.1.    Vispārīgas prasības

7.1.2.    Kalibrēšana

7.1.2.1.   Kalibrēšana ar standartlīkni

7.1.2.2.   Kalibrēšana ar standartparaugiem

Var izmantot arī tādu kalibrēšanas līkni, kas sagatavota no vismaz četriem standartparaugiem (sk. 7.2.4. apakšpunktu): vienu tukšu matricu kopā ar trīs standartparaugiem, kuru maksimālā pieļaujamā koncentrācija vai intervences līmenis ir 0,5x, 1x un 2x, tādējādi likvidējot nepieciešamību veikt ar tukšo paraugu un atgūstamību saistītas korekcijas, ja standartparaugu matricas īpašības atbilst nezināmajiem paraugiem. Šajā gadījumā testa signālu, kas atbilst divām trešdaļām no maksimāli pieļaujamās koncentrācijas (sk. 7.3. apakšpunktu), var aprēķināt tieši no šiem paraugiem un izmantot par robežvērtību. Tādu paraugu pārbaudei, kuros pārsniegti intervences līmeņi, par robežvērtību jāuzskata šo intervences līmeņu atbilstīga procentuālā daļa.

7.1.3.    PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB atsevišķa noteikšana

Ekstraktus var sašķelt frakcijās, kas satur PCDD/F un dioksīniem līdzīgus PCB, ļaujot noteikt PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB atsevišķus TEQ līmeņus (BEQ). PCB 126 standarta kalibrēšanas līkni vēlams izmantot, lai novērtētu dioksīniem līdzīgu PCB saturošas frakcijas rezultātus.

7.1.4.    Biotesta acīmredzamā atgūstamība

“Biotesta acīmredzamo atgūstamību” aprēķina no piemērotiem standartparaugiem ar reprezentatīvām radniecīgām vielām, kurās ir aptuveni maksimāli pieļaujamā koncentrācija vai intervences līmenis un kuras salīdzinājumā ar TEQ līmeni izteiktas kā BEQ līmeņa procentuālā daļa. Atkarībā no izmantotā testa veida un TEF ( 27 ) atšķirības starp TEF un REP koeficientiem, ko piemēro attiecībā uz dioksīniem līdzīgiem PCB, var radīt zemu acīmredzamo atgūstamību dioksīniem līdzīgajiem PCB salīdzinājumā ar PCDD/F. Tāpēc, ja PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB noteikšanu veic atsevišķi, biotesta acīmredzamā atgūstamība dioksīniem līdzīgiem PCB ir intervālā no 20 % līdz 60 %, PCDD/F – intervālā no 50 % līdz 130 % (diapazoni attiecas uzTCDD kalibrēšanas līkni). Tā kā dioksīniem līdzīgu PCB daļa PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summā var būt izteikta ar dažādām matricām un paraugiem, biotesta acīmredzamā atgūstamība attiecībā uz PCDD/ F un dioksīniem līdzīgu PCB summu atspoguļo šo sastāvu un atgūstamībai jābūt intervālā no 30 % līdz 130 %. Ja TEF vērtības Savienības tiesību aktos attiecībā uz PCDD/F un dioksīniem līdzīgiem PCB tiek būtiski pārskatītas, šie diapazoni ir jāpārskata.

7.1.5.    Atgūstamības kontrole attīrīšanai

Veicot attīrīšanu, savienojumu zudumu pārbauda validēšanas laikā. Tukšais paraugs, kam pievienots standarts ar dažādu radniecīgo vielu maisījumu, jāiesniedz attīrīšanai (vismaz n = 3), pārbaudot atgūstamību un atšķirību ar apstiprināšanas metodi. Atgūstamībai jābūt 60 % līdz 120 % intervālā, jo īpaši attiecībā uz radniecīgām vielām, kuru devums TEQ līmenim dažādos maisījumos pārsniedz 10 %.

7.1.6.    Ziņojamā līmeņa robeža

Ziņojot par BEQ līmeņiem, ziņojamā līmeņa robežu nosaka no attiecīgajiem matrices paraugiem, tostarp parastām radniecīgām vielām, un nevis no standartu kalibrēšanas līknes tās zemās precizitātes dēļ līknes zemākajā diapazonā. Jāņem vērā ekstrakcijas un attīrīšanas procedūras ietekme. Ziņojamā līmeņa robežu nosaka ar koeficientu ne mazāku par 3 virs procedūras tukšajiem paraugiem.

7.2.    Standartparaugu izmantošana

7.2.1.

Standartparaugi ietver parauga matrici, radniecīgās vielas un PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB, kuros ir aptuveni maksimāli pieļaujamā koncentrācija vai intervences līmenis, koncentrācijas diapazonus.

7.2.2.

Tukšā matrice un attiecīgos gadījumos procedūras tukšais paraugs un standartparaugs maksimāli pieļaujamajā koncentrācijā vai intervences līmenī ir jāiekļauj visās analīžu sērijās. Šos paraugus ekstrahē un analizē vienlaikus identiskos apstākļos. Standartparauga signālam ievērojami jāpārsniedz tukšā parauga signāls, lai nodrošinātu testa piemērotību. Šos paraugus var izmantot tukšajām korekcijām un atgūstamības korekcijām.

7.2.3.

Standartparaugi, kas izvēlēti atgūstamības korekcijai, ir reprezentatīvi attiecībā uz testa paraugiem, kas nozīmē, ka radniecīgās vielas nevar radīt pazeminātus koncentrācijas rezultātus.

7.2.4.

Papildu standartparaugus, kuros maksimāli pieļaujamā koncentrācija vai intervences līmenis ir, piemēram, 0,5 un 2 reizes lielāks par maksimāli pieļaujamo koncentrāciju, var iekļaut, lai pierādītu testa veiktspēju vajadzīgajā diapazonā maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai intervences līmeņa kontrolei. Lai testa paraugos aprēķinātu BEQ līmeņus, šos paraugus var kombinēt (sk. 7.1.2.2. apakšpunktu).

7.3.    Robežvērtību noteikšana

Jānosaka saistība starp bioanalīžu rezultātiem BEQ un apstiprināšanas metodes izmantojuma rezultātā iegūtajiem rezultātiem TEQ, piemēram, veicot ar matrici iezīmētas kalibrēšanas analīzes, kurās izmanto standartparaugus ar standartvielu piedevu, kas ir 0, 0,5, 1 un 2 reizes lielāka par maksimāli pieļaujamo koncentrāciju, atkārtojot sešas reizes katrā līmenī (n = 24). Korekcijas koeficientus (tukšais paraugs un atgūstamība) var aprēķināt no šīs saistības, taču tie jāpārbauda saskaņā ar 7.2.2. apakšpunktu.

Lai pieņemtu lēmumu par parauga atbilstību maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai intervences līmeņa kontroles kritērijiem, ir jānosaka robežvērtības, ja nepieciešams, nosakot maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai intervences līmeni attiecībā uz PCDD/F un dioksīniem līdzīgiem PCB katram atsevišķi, vai PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summai. Tos atspoguļo bioanalīžu rezultātu sadalīšanas zemākais beigu punkts (koriģēts atbilstīgi tukšajam paraugam un atgūstamībai), kas atbilst apstiprināšanas metodes izšķiršanas robežai, kuras pamatā ir 95 % ticamības līmenis, nosakot, ka šķietamās atbilstības attiecība ir mazāka par 5 % un RSD R ir mazāka par 25 %. Apstiprināšanas metodes izšķiršanas robeža ir maksimāli pieļaujamā koncentrācija, ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti.

Robežvērtību (BEQ) var aprēķināt atbilstīgi vienai no 7.3.1., 7.3.2. un 7.3.3. apakšpunktā noteiktajām pieejām (sk. 1. attēlu).

7.3.1.

Prognozējamā intervāla zemākās 95 % robežas izmantošana pie apstiprināšanas metodes izšķiršanas robežas: kur: BEQ DL BEQ atbilst apstiprināšanas metodes izšķiršanas robežai, kas ir maksimāli pieļaujamā koncentrācija, ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti; sy,x atlikusī standartnovirze; t α,f = m-2 pārbaudāmais koeficients (α = 5 %, f = vienpusēja brīvības pakāpe); m kalibrācijas punktu kopējais skaits (rādītājs j); n atkārtoto mērījumu skaits katrā līmenī; xi ar apstiprināšanas metodi noteiktā kalibrēšanas punkta “i” parauga koncentrācija (TEQ); visu kalibrēšanas paraugu koncentrāciju vidējā vērtība (TEQ); kvadrātu summas parametrs, i = kalibrācijas punkta i rādītājs.

7.3.2.

Aprēķināšana no bioanalīžu rezultātiem (koriģēti atbilstīgi tukšajam paraugam un atgūstamībai), kas iegūti no paraugu, kuri piesārņoti pie apstiprināšanas metodes izšķiršanas robežas, vairākkārtējām analīzēm (n ≥ 6), izsakot tos kā datu izplatīšanas zemāko beigu punktu attiecīgajā vidējā BEQ vērtībā: Robežvērtība = BEQ DL – 1,64 × SD R, kur: SDR biotesta rezultātu standartnovirze ar BEQ DL, kas izmērīta saskaņā ar starplaboratorijas reproducējamības nosacījumiem.

7.3.3.

Bioanalīžu rezultātu vidējās vērtības aprēķināšana (BEQ koriģēta atbilstīgi tukšajam paraugam un atgūstamībai), veicot tādu paraugu, kuru piesārņojums ir 2/3 no maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai intervences līmeņa, vairākkārtējas analīzes (n ≥ 6), kuras pamatā ir novērojums, ka šī koncentrācija aptuveni atbildīs 7.3.1. apakšpunktā vai 7.3.2. apakšpunktā noteiktajai robežvērtībai: Robežvērtību aprēķināšanas pamatā ir 95 % ticamības līmenis ar šķietami atbilstošo paraugu proporciju, kura nav lielāka par 5 %, un RSD R kas nav lielāka par 25 % un kas iegūta no: 1)  95 % prognozes intervāla zemākās robežas pie apstiprināšanas metodes izšķiršanas robežas; 2)  to paraugu, kas piesārņoti pie apstiprināšanas metodes izšķiršanas robežas, vairākkārtējas analīzes (n ≥ 6), kura izteikta kā datu izplatīšanas zemākais beigu punkts (grafikā attēlota zvanveidīgas līknes formā) atbilstošajā vidējā BEQ vērtībā. 1. attēls

7.3.4.

Robežvērtību ierobežojumi Ar BEQ pamatotās robežvērtības, kas aprēķinātas no validēšanas laikā iegūtajām RSD R, izmantojot nelielu skaitu paraugu ar atšķirīgām matricu / radniecīgo vielu īpašībām, var būt augstākas par maksimāli pieļaujamajām koncentrācijām vai intervences līmeņiem, kuru pamatā ir TEQ, to lielākas precizitātes dēļ, ko nevar iegūt regulārajā analīzē, ja ir jākontrolē nezināms iespējami radniecīgo vielu īpašību spektrs. Šādos gadījumos robežvērtības aprēķina no RSD R = 25 % vai ieteicams izmantot divas trešdaļas maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai intervences līmeņa.

7.4.    Veiktspējas rādītāji

7.4.1.

Tā kā attiecībā uz bioanalīžu metodēm nav iespējams izmantot iekšējos standartus, bioanalīžu metožu atkārtojamības testus veic, lai iegūtu informāciju par standartnovirzi testa sēriju ietvaros un to starplaikā. Atkārtojamībai jābūt mazākai par 20 %, un reproducējamībai laboratorijā jābūt mazākai par 25 %. To pamatā ir aprēķinātie līmeņi BEQ pēc tukšā parauga un atgūstamības korekcijas.

7.4.2.

Validēšanas procesa ietvaros jāuzrāda tests, lai atšķirtu tukšo paraugu no koncentrācijas pie robežvērtības, ļaujot veikt paraugu identificēšanu virs atbilstošās robežvērtības (sk. 7.1.2. apakšpunktu).

7.4.3.

Jādefinē nosakāmie savienojumi, iespējamie traucējumi un maksimāli pieļaujamā tukšā parauga koncentrācija.

7.4.4.

Parauga ekstrakta, ja to nosaka trijos atkārtojumos, procentuālā standartnovirze signālā vai koncentrācija, kas aprēķināta no signāla (iespējams tikai darba diapazonā), nedrīkst pārsniegt 15 %.

7.4.5.

Standartparauga(-u) nekoriģētos rezultātus, kas izteikti BEQ (tukšais paraugs un maksimāli pieļaujamā koncentrācija vai intervences līmenis), izmanto bioanalīžu metodes veiktspējas novērtēšanai konstantā periodā.

7.4.6.

Izveido un pārbauda procedūras tukšos paraugus un katra veida standartparauga kvalitātes kontroles grafikus, lai pārliecinātos, ka analīžu veiktspēja atbilst prasībām, jo īpaši attiecībā uz procedūras tukšajiem paraugiem un, konkrēti, vajadzīgo minimālo atšķirību darba diapazona zemākajā punktā un standartparaugiem attiecībā uz reproducējamību laboratorijā. Procedūras tukšie paraugi jākontrolē tā, lai paraugu atdalīšanas laikā nepieļautu šķietami atbilstošu rezultātu iegūšanu.

7.4.7.

Rezultātus, kas ar apstiprināšanas metodēm iegūti no iespējami inficētiem paraugiem, un 2 % līdz 10 % atbilstošu paraugu (ne mazāk kā 20 paraugi uz vienu matrici) apkopo un izmanto, lai novērtētu skrīninga metodes veiktspēju un BEQ un TEQ saistību. Šo datubāzi var izmantot to robežvērtību atkārtotam novērtējumam, kas piemērojamas regulārajiem paraugiem attiecībā uz validācijas matricām.

7.4.8.

Efektīvas metodes veiktspēju var arī pierādīt, piedaloties salīdzinošu testu veikšanā. Paraugu rezultātus, kuri analizēti, izmantojot salīdzinošus testus, un kuru koncentrācijas diapazons aptver, piemēram, divreiz lielāku maksimāli pieļaujamo koncentrāciju, var iekļaut šķietami atbilstošas attiecības novērtējumā, ja laboratorija var pierādīt tās veiktspējas efektivitāti. Paraugos iekļauj visbiežāk izmantojamās radniecīgās vielas, kas iegūtas no dažādiem avotiem.

7.4.9.

Piesārņošanas gadījumos robežvērtības var atkārtoti novērtēt, atspoguļojot šā konkrētā piesārņojuma īpašo matrici un radniecīgo vielu īpašības.

8.    Rezultātu ziņošana

8.1.    Apstiprināšanas metodes

8.1.1.

Analīžu rezultātos iekļauj atsevišķu PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB radniecīgo vielu koncentrācijas, ziņojot par mazāko, lielāko un vidējo analītisko rezultātu, lai rezultātu ziņojumā iekļautu pēc iespējas pilnīgāku informāciju un tādējādi dotu iespēju interpretēt rezultātus saskaņā konkrētām prasībām.

8.1.2.

Ziņojumā norāda PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB ekstrahēšanā izmantoto metodi.

8.1.3.

Ja atgūstamība nav 6.2.5. apakšpunktā norādītajās robežās, ja ir pārsniegta maksimāli pieļaujamā koncentrācija (šādā gadījumā – atgūstamība attiecībā uz vienu no divām otrreizējām analīzēm) un pārējos gadījumos pēc pieprasījuma ir jānorāda atsevišķu iekšējo standartu atgūstamība.

8.1.4.

Lemjot par parauga atbilstību, ir jāņem vērā mērījumu paplašinātā neprecizitāte, tāpēc ir jāsniedz arī šis parametrs. Līdz ar to analīžu rezultātus paziņo kā “x +/– U”, kur x ir analīzes rezultāts un U – mērījumu paplašinātā neprecizitāte, izmantojot pārklāšanās koeficientu 2, kas nodrošina aptuveni 95 % ticamības līmeni. Ja PCDD/F un dioksīniem līdzīgus PCB nosaka atsevišķi, tad atsevišķo PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB analīžu rezultātu aprēķinātā izvērstās neprecizitātes summa jāizmanto kā PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summa.

8.1.5.

Rezultāti jāizsaka tādās pašās vienībās un ar (vismaz) tādu pašu nozīmīgu rādītāju skaitu kā maksimāli pieļaujamā koncentrācija, kas noteikta Direktīvā 2002/32/EK.

8.2.    Bioanalīžu skrīninga metodes

8.2.1.

Skrīninga rezultāts jāizsaka kā “atbilstīgs” vai “iespējami neatbilstīgs”.

8.2.2.

Papildus tam var norādīt PCDD/F un/vai dioksīniem līdzīgu PCB rezultātu, kas izteikts BEQ (nevis TEQ).

8.2.3.

Paraugi, kuros signāls ir zem ziņojamā līmeņa robežas, jāizsaka kā paraugi “zem ziņojamā līmeņa robežas”. Paraugus, kuros signāls ir virs ziņojamā līmeņa robežas, paziņo kā tādus, kas “pārsniedz darba diapazonu”, un līmeni, kas atbilst darba diapazona augstākajam punktam, izsaka BEQ.

8.2.4.

Attiecībā uz visiem parauga matrices veidiem ziņojumā norāda novērtējuma pamatā esošo maksimāli pieļaujamo koncentrāciju vai intervences līmeni.

8.2.5.

Ziņojumā norāda izmantotā testa veidu, testa pamatprincipus un kalibrēšanas veidu.

8.2.6.

Ziņojumā norāda PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB ekstrahēšanā izmantoto metodi.

8.2.7.

Attiecībā uz paraugiem, par kuriem ir aizdomas, ka tie nav atbilstoši, ziņojumā jāiekļauj piezīme par veicamajiem pasākumiem. PCDD/F un PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summas koncentrācija šajos paraugos ar ievērojamu koncentrāciju ir jānosaka/jāapstiprina, izmantojot apstiprināšanas metodi.

8.2.8.

Neatbilstošus rezultātus paziņo tikai no apstiprināšanas analīzes.

8.3.    Skrīninga fizikāli ķīmiskās metodes

8.3.1.

Skrīninga rezultāts jāizsaka kā “atbilstīgs” vai “iespējami neatbilstīgs”.

8.3.2.

Attiecībā uz visiem parauga matrices veidiem ziņojumā norāda novērtējuma pamatā esošo maksimāli pieļaujamo koncentrāciju vai intervences līmeni.

8.3.3.

Turklāt var sniegt atsevišķu PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB radniecīgo vielu koncentrācijas, ziņojot par mazāko, lielāko un vidējo analītisko rezultātu. Rezultāti jāizsaka tādās pašās vienībās un ar (vismaz) tādu pašu nozīmīgu rādītāju skaitu kā maksimāli pieļaujamā koncentrācija, kas noteikta Direktīvā 2002/32/EK.

8.3.4.

Ja atgūstamība nav 6.2.5. apakšpunktā norādītajās robežās, ja ir pārsniegta maksimāli pieļaujamā koncentrācija (šādā gadījumā – atgūstamība attiecībā uz vienu no divām otrreizējām analīzēm) un pārējos gadījumos pēc pieprasījuma, ir jānorāda atsevišķu iekšējo standartu atgūstamība.

8.3.5.

Ziņojumā norāda izmantoto GC-MS metodi.

8.3.6.

Ziņojumā norāda PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB ekstrahēšanā izmantoto metodi.

8.3.7.

Attiecībā uz paraugiem, par kuriem ir aizdomas, ka tie nav atbilstoši, ziņojumā jāiekļauj piezīme par veicamajiem pasākumiem. PCDD/F un PCDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB summas koncentrācija šajos paraugos ar ievērojamu koncentrāciju ir jānosaka/jāapstiprina, izmantojot apstiprināšanas metodi.

8.3.8.

Par neatbilstošiem rezultātiem izlemj tikai pēc apstiprināšanas analīzes.

III NODAĻA

Paraugu gatavošana un prasības attiecībā uz analīzes metodēm, ko izmanto PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, daudzumu oficiālai kontrolei barībā

1.    Piemērošanas joma

Šajā nodaļā noteiktās prasības piemēro, ja barību analizē, lai veiktu PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, daudzumu oficiālu kontroli, un attiecībā uz paraugu gatavošanu un analītiskajām prasībām citiem regulatīviem mērķiem, tostarp kontroli, ko veic pārtikas apritē iesaistīts tirgus dalībnieks, lai nodrošinātu atbilstību Regulas (EK) Nr. 183/2005 noteikumiem.

2.    Piemērojamās noteikšanas metodes

Gāzu hromatogrāfija / elektronu satveres detektors (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS vai līdzvērtīgas metodes.

3.    Nosakāmās vielas identificēšana un apstiprināšana

3.1.	Relatīvais aiztures laiks attiecībā uz iekšējiem standartiem vai etalonstandartiem (pieņemamā novirze no + / – 0,25 %).

3.2.	PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, atdalīšana no traucējošajām vielām, izmantojot gāzu hromatogrāfiju, tostarp vienlaikus eluējot ar PCB, jo īpaši, ja paraugu koncentrācija atbilst atļautajai robežkoncentrācijai un ja ir jāapstiprina neatbilstība ( 28 ).

3.3.

Prasības GC-MS paņēmieniem Kontrolēt vismaz šādu skaitu molekulāro jonu vai raksturīgo jonu no molekulu klastera: a)  divus konkrētus jonus HRMS gadījumā; b)  trīs konkrētus jonus LRMS gadījumā; c)  divus īpašus prekursoru jonus, kuriem katram ir viens konkrēts atbilstošs pārejas produkta jons MS-MS gadījumā. Maksimāli pieļaujamā pielaide attiecībā uz atlasīto masas fragmentu kopīgo koncentrāciju. Atlasīto masas fragmentu kopīgās koncentrācijas relatīvā novirze no teorētiskās kopīgās koncentrācijas vai kalibrēšanas standarta attiecībā uz nosakāmo jonu (jākontrolē joni, kuros ir vislielākā kopīgā koncentrācija) un jona(-u) apzīmētāju: ± 15 %

3.4.	Prasības GC-ECD paņēmieniem Rezultātus, kas pārsniedz maksimāli pieļaujamo koncentrāciju, apstiprina ar divām GC kolonnām, kuru stacionārās fāzes ir ar atšķirīgu polaritāti.

4.    Metodes veiktspējas pierādīšana

Metodes veiktspēja tiek pierādīta maksimāli pieļaujamās koncentrācijas diapazonā (0,5 līdz 2 reizes maksimāli pieļaujamajā koncentrācijā) ar piemērotu atkārtotas analīzes variāciju koeficientu (sk. 9. punktu par starpposmu precizitātes prasībām).

5.    Kvantitatīvās noteikšanas robeža

PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, LOQ ( 29 ) summa nepārsniedz vienu trešdaļu no maksimālās pieļaujamās koncentrācijas ( 30 ).

6.    Kvalitātes kontrole

Regulāri jāveic tukšo paraugu kontrole, analīzes ar inficēto paraugu un kvalitātes kontrolparaugu, līdzdalība starplaboratoriju pētījumos par attiecīgajām matricēm.

7.    Atgūstamības kontrole

7.1.	Jāizmanto piemēroti iekšējie standarti ar fizikāli ķīmiskām īpašībām, kas līdzvērtīgas nosakāmās vielas īpašībām.

7.2.	Iekšējo standartu pievienošana Pievienošana produktiem (pirms ekstrakcijas un attīrīšanas procesa).

7.3.

Prasības metodēm, kurās izmanto visas sešas ar izotopiem marķētas PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, radniecīgās vielas: a)  rezultātus koriģē atbilstīgi iekšējo standartu atgūstamībai; b)  ar izotopu iezīmētu iekšējo standartu atgūstamībai jābūt intervālā no 60 % līdz 120 %; c)  zemāka vai augstāka atgūstamība atsevišķām radniecīgām vielām, kuru veidotā daļa PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, summā ir mazāka par 10 %, ir pieņemama.

7.4.

Prasības attiecībā uz metodēm, kurās neizmanto visus sešus ar izotopu iezīmētus iekšējos standartus vai citus iekšējos standartus: a)  iekšējā(-o) standarta(-u) atgūstamības kontroli veic attiecībā uz visiem paraugiem; b)  iekšējā(-o) standarta(-u) atgūstamībai jābūt intervālā no 60 % līdz 120 %; c)  rezultātus koriģē atbilstīgi iekšējo standartu atgūstamībai.

7.5.

Neiezīmētu radniecīgo vielu atgūstamība jāpārbauda, izmantojot paraugus ar standartvielu piedevu vai kvalitātes kontrolparaugus, kuros maksimāli pieļaujamā koncentrācija ir vajadzīgās koncentrācijas diapazonā. Šo radniecīgo vielu atgūstamība ir uzskatāma par pieņemamu, ja tā ir intervālā no 60 % līdz 120 %.

8.    Prasības laboratorijām

Saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 882/2004 noteikumiem laboratorijas akreditē atzīta iestāde, kas darbojas saskaņā ar standartu ISO Guide 58, lai nodrošinātu to, ka laboratorijās piemēro analīžu kvalitātes nodrošināšanu. Laboratorijas akreditē, ievērojot EN ISO/IEC 17025 standartu. Turklāt attiecīgā gadījumā piemēro principus, kas aprakstīti vadlīniju dokumentā Guidelines for the estimation of measurement uncertainty and limits of quantification for PCB analysis (Vadlīnijas par mērījumu neprecizitāti un kvantitatīvās noteikšanas robežām PCB analīzei) ( 31 ).

9.    Veiktspējas rādītāji: kritēriji PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, summas noteikšanai maksimāli pieļaujamajā koncentrācijā

10.    Rezultātu paziņošana

10.1.

Analīžu rezultātos jānorāda atsevišķu PCB, kas nav līdzīgi dioksīniem, koncentrācijas un tādu PCB radniecīgo vielu koncentrācija, norādot mazāko, lielāko un vidējo analītisko rezultātu, lai ziņojumā iekļautu maksimāli daudz informācijas par rezultātiem un tādējādi dotu iespēju tos interpretēt saskaņā ar īpašām prasībām.

10.2.

Ziņojumā norāda PCB ekstrahēšanā izmantoto metodi.

10.3.

Jānorāda atsevišķu iekšējo standartu atgūstamība, ja atgūstamība nav 7. punktā norādītajās robežās, ja ir pārsniegta maksimāli pieļaujamā koncentrācija un pārējos gadījumos pēc pieprasījuma.

10.4.

Tā kā, lemjot par parauga atbilstību, ir jāņem vērā mērījumu paplašinātā neprecizitāte, ir jāsniedz arī šis parametrs. Līdz ar to analīžu rezultātus paziņo kā “x +/– U”, kur x ir analīzes rezultāts un U – mērījumu paplašinātā neprecizitāte, izmantojot pārklāšanās koeficientu 2, kas nodrošina aptuveni 95 % ticamības līmeni.

10.5.

Rezultāti jāizsaka tādās pašās vienībās un ar (vismaz) tādu pašu nozīmīgu rādītāju skaitu kā maksimāli pieļaujamā koncentrācija, kas noteikta Direktīvā 2002/32/EK.

▼M2

---

VI PIELIKUMS

ANALĪZES METODES, LAI NOTEIKTU DZĪVNIEKU IZCELSMES SASTĀVDAĻAS BARĪBAS OFICIĀLAI KONTROLEI

▼M8

1.   MĒRĶIS UN DARBĪBAS JOMA

Lai barībā noteiktu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas, saskaņā ar pielikumā izklāstītajiem noteikumiem izmanto gaismas mikroskopiju vai polimerāzes ķēdes reakciju (PĶR).

Šīs divas metodes ļauj noteikt dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu klātbūtni premiksos, barības sastāvdaļās un barības maisījumos. Tomēr ar tām nevar aprēķināt minēto sastāvdaļu daudzumu premiksos, barības sastāvdaļās un barības maisījumos. Abām metodēm noteikšanas robeža ir mazāka par 0,1 % (masas).

PĶR metode ļauj noteikt premiksos, barības sastāvdaļās un barības maisījumos klātesošo dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu taksonomisko grupu.

Šīs metodes piemēro Eiropas Parlamenta un Padomes Regulas (EK) Nr. 999/2001 ( 32 ) 7. panta 1. punktā, minētās regulas IV pielikumā un Eiropas Parlamenta un Padomes Regulas (EK) Nr. 1069/2009 ( 33 ) 11. panta 1. punktā noteikto aizliegumu piemērošanas kontrolei.

Atkarībā no testējamās barības veida minētās metodes atsevišķi vai kopā var izmantot viena operatīvā protokola ietvaros atbilstīgi standarta darbības procedūrām (SOP), ko izveidojusi un savā tīmekļa vietnē ( 34 ) publicējusi ES references laboratorija attiecībā uz dzīvnieku proteīniem barībā (EURL-AP).

▼M2

2.   METODES

▼M8

2.1.    Gaismas mikroskopija

2.1.1.    Princips

Dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas, kuras var būt analīzei nosūtītajos premiksos, barības sastāvdaļās un barības maisījumos, identificē pēc raksturīgiem un ar mikroskopu nosakāmiem elementiem, piemēram, muskuļu šķiedrām un citām gaļas daļiņām, skrimšļiem, kauliem, ragiem, matiem, sariem, bezmugurkaulnieku kutikulas fragmentiem, kukaiņu trahejas struktūrām, asins produktiem, piena tauku lodītēm, laktozes kristāliem, spalvām, olu čaumalām, asakām un zvīņām.

Mikroskopiskās pārbaudes pēc paraugu sagatavošanas veic izgulsnējot.

Paraugu izgulsnēšanas posmu veic šādi:

2.1.2.    Reaģenti un aprīkojums

2.1.2.1.   Reaģenti

2.1.2.1.1.   Koncentrēšanas aģents

2.1.2.1.2.   Krāsošanas reaģents

2.1.2.1.3.   Ietvarvide

2.1.2.1.4.   Krāsojoša ietvarvide

2.1.2.1.5.   Skalošanas aģenti

2.1.2.1.6.   Balināšanas reaģents

2.1.2.2.   Aprīkojums

2.1.3.    Paraugu ņemšana un paraugu sagatavošana

2.1.3.1.   Atlase

Izmanto reprezentatīvu paraugu, kas ņemts saskaņā ar I pielikumu.

2.1.3.1.1.   Paraugu žāvēšana

Paraugus, kuru mitruma saturs ir > 14 %, pirms izmantošanas žāvē saskaņā ar III pielikumu.

2.1.3.1.2.   Paraugu priekšsijāšana

Lai savāktu informāciju par iespējamo vidiskas izcelsmes piesārņojumu barībā, granulētu barību un kodolus ieteicams priekšsijāt līdz 1 mm izmēram un tad iegūtās divas frakcijas, kuras jāuzskata par atsevišķiem paraugiem, sagatavot un analizēt atsevišķi, kā arī atsevišķi ziņot par tām.

2.1.3.2.   Veicamie piesardzības pasākumi

Lai laboratorijā novērstu savstarpēju piesārņošanu, visu vairākkārt izmantojamo aprīkojumu pirms izmantošanas rūpīgi notīra. Dalāmpiltuvi pirms tīrīšanas sadala pa daļām. Dalāmpiltuves daļas un stikla traukus no sākuma mazgā ar rokām un tad mazgāšanas ierīcē. Sietus tīra, izmantojot suku ar cietiem, sintētiskiem sariem. Ja sijāti taukaini līdzekļi, piemēram, zivju milti, sietu galīgo tīrīšanu ieteicams veikt ar acetonu un saspiestu gaisu.

2.1.3.3.   Tauku vai eļļas paraugu sagatavošana

Šo protokolu izmanto, sagatavojot tauku paraugus:

To pašu protokolu (izņemot pirmo un ceturto ievilkumu) piemēro, lai sagatavotu eļļas paraugus.

2.1.3.4.   Tādu paraugu sagatavošana, kas nav tauku vai eļļas paraugi

Visus posmus veic 250 ml konusveida dalāmpiltuvē, kā aprakstīts 2.1.2.2. punkta ceturtajā ievilkumā.

2.1.4.    Mikroskopiskā pārbaude

2.1.4.1.   Priekšmetstikliņa sagatavošana

Mikroskopa priekšmetstikliņus sagatavo no nogulsnēm un, atkarībā no laboranta izvēles, no flotāta vai izejvielas. Vajadzības gadījumā, lai noteiktu tikai sauszemes bezmugurkaulnieku izcelsmes sastāvdaļas, no iegūtā galīgā flotāta sagatavo arī priekšmetstikliņus, kā aprakstīts 2.1.3.4.4. punktā. Sagatavo divas iegūtās frakcijas (smalko un rupjo). Uz priekšmetstikliņiem uznestie frakciju paraugi raksturo visu frakciju.

Lai nodrošinātu pilnīgu pārbaudes protokola izpildi, kā noteikts 2.1.4.2. punktā, sagatavo pietiekamu skaitu priekšmetstikliņu.

Saskaņā ar SOP, ko izstrādājusi un savā tīmekļa vietnē publicējusi EURL-AP, mikroskopa priekšmetstikliņus pārklāj ar atbilstošu ietvarvidi. Priekšmetstikliņus pārklāj ar segstikliņiem.

2.1.4.2.   Novērojumu plūsmkarte dzīvnieku izcelsmes daļiņu noteikšanai barības maisījumos, barības sastāvdaļās un premiksos.

Sagatavotos mikroskopa priekšmetstikliņus novēro saskaņā ar 1. un 2. diagrammā norādītajām novērojumu plūsmkartēm.

Nogulšņu un, atkarībā no laboranta izvēles, flotātu vai izejvielu mikroskopiskos novērojumus veic, izmantojot optisko mikroskopu. Turklāt, lai noteiktu sauszemes bezmugurkaulnieku izcelsmes sastāvdaļas, novērojumus veic arī attiecībā uz galīgo flotātu, kas iegūts, kā aprakstīts 2.1.3.4.4. punktā, saskaņā ar 3. diagrammu. Attiecībā uz rupjajām frakcijām papildus optiskajam mikroskopam var izmantot stereomikroskopu. Katru priekšmetstikliņu pilnībā pārbauda dažādos palielinājumos. Precīzi skaidrojumi par to, kā izmantot plūsmkartes, ir sīki izklāstīti SOP, ko izstrādājusi un savā tīmekļa vietnē publicējusi EURL-AP.

Stingri ievēro katrā novērojumu plūsmkartes posmā noteikto minimālo novērojamo priekšmetstikliņu skaitu, izņemot gadījumus, kad frakcijas materiāla kopums ir nepietiekams noteiktā priekšmetstikliņu skaita nodrošināšanai, piemēram, ja nogulsnes neiegūst. Daļiņu skaita reģistrēšanai vienā noteikšanā izmanto ne vairāk kā 6 priekšmetstikliņus.

Ja uz flotāta vai izejvielas sagatavo papildu priekšmetstikliņus ar specifiskāku krāsojošu ietvarvidi, kā aprakstīts 2.1.2.1.4. punktā, lai sīkāk raksturotu struktūras (piemēram, spalvas, mati, muskuļi vai asins daļiņas), kas noteiktas uz priekšmetstikliņiem, kuri sagatavoti ar citām ietvarvidēm, kā aprakstīts 2.1.2.1.3. punktā, tad daļiņu skaitu aprēķina, pamatojoties uz vienā noteikšanā izmantoto priekšmetstikliņu skaitu, kas nepārsniedz 6, ieskaitot papildu priekšmetstikliņus ar specifiskāku ietvarvidi. Papildu priekšmetstikliņus, kuri sagatavoti no galīgā flotāta, kas iegūts, kā aprakstīts 2.1.3.4.4. punktā, lai noteiktu sauszemes bezmugurkaulnieku izcelsmes sastāvdaļas, neņem vērā citu daļiņu veidu (sauszemes mugurkaulnieku un zivju izcelsmes) noteikšanai.

Lai atvieglotu daļiņu veida un izcelsmes identificēšanu, laborants var izmantot tādus palīginstrumentus kā, piemēram, lēmumatbalsta sistēma, attēlu bibliotēkas un standartparaugi.

1. diagramma

Pirmās noteikšanas novērojumu plūsmkarte pēc vienkāršas izgulsnēšanas ar TCE dzīvnieku izcelsmes daļiņu, kas nav no sauszemes bezmugurkaulniekiem, noteikšanai barības maisījumos, barības sastāvdaļās un premiksos

2. diagramma

Otrās noteikšanas novērojumu plūsmkarte pēc vienkāršas izgulsnēšanas ar TCE dzīvnieku izcelsmes daļiņu, kas nav no sauszemes bezmugurkaulniekiem, noteikšanai barības maisījumos, barības sastāvdaļās un premiksos

3. diagramma

Novērojumu plūsmkarte pēc divkāršas izgulsnēšanas ar PE/TCE sauszemes bezmugurkaulnieku izcelsmes sastāvdaļu noteikšanai barības maisījumos, barības sastāvdaļās un premiksos

2.1.4.3.   Noteikšanu skaits

Noteikšanas veic dažādiem pakārtotiem paraugiem, kur katra parauga svars ir 50 g.

Ja pēc pirmās noteikšanas, kas veikta attiecīgi saskaņā ar 1. vai 3. diagrammā norādīto novērojumu plūsmkarti, dzīvnieku izcelsmes daļiņas nav noteiktas, papildu noteikšana nav jāveic, un analīzes rezultātu paziņo, lietojot 2.1.5.1. punktā izklāstīto formulējumu.

Ja pēc pirmās noteikšanas, kas veikta saskaņā ar 1. diagrammā norādīto novērojumu plūsmkarti, ir noteiktas viena vai vairākas konkrēta veida (t. i., sauszemes mugurkaulnieku vai zivju) dzīvnieku izcelsmes daļiņas un atklāto daļiņu veids atbilst parauga deklarētajam saturam, otrā noteikšana nav jāveic. Ja konkrēta veida dzīvnieku izcelsmes daļiņu skaits, kas noteikts pirmās noteikšanas laikā, ir lielāks par 5, analīzes rezultātu paziņo par katru dzīvnieku veidu, lietojot 2.1.5.3. punktā izklāstīto formulējumu. Pretējā gadījumā analīzes rezultātu paziņo par katru dzīvnieku veidu, lietojot 2.1.5.2. punktā izklāstīto formulējumu.

Ja pēc pirmās noteikšanas, kas veikta saskaņā ar 3. diagrammā norādīto novērojumu plūsmkarti, ir noteiktas vairāk nekā 5 sauszemes bezmugurkaulnieku izcelsmes daļiņas, otra noteikšana nav jāveic, un analīzes rezultātu paziņo, lietojot 2.1.5.3. punktā izklāstīto formulējumu šim veidam.

Visos citos gadījumos – arī tad, ja laboratorijai nav iesniegta satura deklarācija, – veic otru noteikšanu, izmantojot jaunu pakārtoto paraugu. Ja pēc otrās noteikšanas, kas veikta attiecīgi saskaņā ar 2. vai 3. diagrammā norādīto novērojumu plūsmkarti, šo divu noteikšanu laikā noteikto konkrēta veida dzīvnieku izcelsmes daļiņu summa ir lielāka par 10, analīzes rezultātu paziņo par katru dzīvnieku veidu, lietojot 2.1.5.3. punktā izklāstīto formulējumu. Pretējā gadījumā analīzes rezultātu paziņo par katru dzīvnieku veidu, lietojot 2.1.5.2. punktā izklāstīto formulējumu.

2.1.5.    Rezultātu izteikšana

Paziņojot rezultātus, laboratorija norāda, kāda veida materiāls ir analizēts (nogulsnes, flotāts, galīgais flotāts vai izejviela). Ziņojumā skaidri jānorāda, cik noteikšanas ir veiktas un vai nav veikta frakciju sijāšana pirms priekšmetstikliņu sagatavošanas saskaņā ar 2.1.3.4.3. punkta pirmā ievilkuma trešo daļu vai 2.1.3.4.4. punkta trešo ievilkumu.

Laboratorijas ziņojumā jābūt vismaz informācijai par sauszemes mugurkaulnieku vai zivju izcelsmes sastāvdaļu klātbūtni.

Par dažādajām situācijām paziņo kādā no tālāk minētajiem veidiem.

Ja ir veikta tikai viena noteikšana:

Ja ir veiktas divas noteikšanas:

Turklāt:

Ja ir veikta tikai viena noteikšana:

Ja ir veiktas divas noteikšanas:

Turklāt:

▼M2

2.2.    PĶR

2.2.1.    Princips

Dzīvnieku izcelsmes dezoksiribonukleīnskābes (DNS) fragmentus, kas var būt barības sastāvdaļās un barības maisījumos, nosaka ar PĶR, izmantojot gēnu amplifikācijas tehniku, kas vērsta uz sugām raksturīgām DNS sekvencēm.

Lai pielietotu PĶR metodi, no sākuma jāveic DNS ekstrakcija. Pēc tam iegūtajam DNS ekstraktam piemēro amplifikāciju, lai noteiktu dzīvnieku sugas, uz kurām vērsta analīze.

2.2.2.    Reaģenti un aprīkojums

2.2.2.1.   Reaģenti:

2.2.2.1.1.   Reaģenti DNS ekstrakcijai

Izmanto tikai tos reaģentus, ko apstiprinājusi un savā tīmekļa vietnē publicējusi EURL-AP.

2.2.2.1.2.   Reaģenti gēnu amplifikācijai

2.2.2.1.2.1.   Praimeri un zondes

Izmanto tikai EURL-AP apstiprinātus oligonukleotīdu sekvenču praimerus un zondes ( 35 ).

2.2.2.1.2.2.   Master Mix

Izmanto tikai tos Master Mix šķīdumus, kas nesatur reaģentus, kuri dzīvnieku izcelsmes DNS klātbūtnes ietekmē varētu radīt nepareizus rezultātus ( 36 ).

2.2.2.1.2.3.   Reaģenti piesārņojuma attīrīšanai

2.2.2.1.2.3.1.   Sālsskābes šķīdums (0,1 N)

2.2.2.1.2.3.2.   Balinātājs (nātrija hipohlorīta šķīdums ar 0,15 % aktīvā hlora)

2.2.2.1.2.3.3.   Nekodīgi reaģenti tādu dārgu iekārtu kā analītisko svaru (piemēram, MP Biomedicals ražotais DNA Erase TM) attīrīšanai no piesārņojuma

2.2.2.2.   Aprīkojums

2.2.2.2.1.   Analītiskie svari ar precizitāti līdz 0,001 g

2.2.2.2.2.   Smalcināšanas ierīce

2.2.2.2.3.   Termoprocesors reāllaika PĶR

2.2.2.2.4.   Mikrocentrifūgas mēģeņu centrifūga

2.2.2.2.5.   Mikropipešu komplekts 1 μl līdz 1 000 μl lieliem pilieniem

2.2.2.2.6.

Molekulārās bioloģijas standarta plastmasas izstrādājumi: mikrocentrifūgas mēģenes, mikropipešu plastmasas uzgaļi ar filtru, termoprocesoram piemērotas plates

2.2.2.2.7.

Saldētavas paraugu un reaģentu glabāšanai

2.2.3.    Paraugu ņemšana un paraugu sagatavošana

2.2.3.1.   Paraugu ņemšana

Izmanto reprezentatīvu paraugu, kas ņemts saskaņā ar I pielikumā izklāstītajiem noteikumiem.

2.2.3.2.   Paraugu sagatavošana

Laboratorijas paraugu sagatavošana līdz pat DNS ekstrakcijai atbilst II pielikumā norādītajām prasībām. Vismaz 50 g parauga ņem pakārtota parauga analīzei un tad samaļ.

Paraugu sagatavo atsevišķā telpā, ko neizmanto DNS ekstrakcijai un gēnu amplifikācijas reakcijām, kā aprakstīts ISO 24276.

Sagatavo divus paraugus, no kuriem katrs sver vismaz 100 mg.

2.2.4.    DNS ekstrakcija

DNS ekstrakciju veic katram paraugam, kas sagatavots, izmantojot SOP, ko izveidojusi un savā tīmekļa vietnē publicējusi EURL-AP.

Saskaņā ar ISO 24276 katrai ekstrakcijas partijai veic divas ekstrakcijas kontroles:

2.2.5.    Gēnu amplifikācija

Gēnu amplifikāciju veic, izmantojot katrai identificējamajai sugai apstiprinātās metodes. Minētās metodes ir noteiktas SOP, ko izveidojusi un savā tīmekļa vietnē publicējusi EURL-AP. Lai novērtētu inhibīciju, katru DNS ekstraktu analizē vismaz divos dažādos atšķaidījumos.

Saskaņā ar ISO 24276 katrai mērķa sugai veic divas amplifikācijas kontroles:

2.2.6.    Rezultātu interpretēšana un izteikšana

Ziņojot par rezultātiem, laboratorija norāda vismaz analizēto paraugu svaru, izmantoto ekstrakcijas metodi, noteikšanas reižu skaitu un metodes noteikšanas robežu.

Rezultātus neinterpretē un par tiem neziņo, ja DNS ekstrakcijas pozitīvā kontrole un mērķa DNS pozitīvās kontroles nesniedz pozitīvus rezultātus par analizēto mērķi, bet amplifikācijas reaģenta kontrole ir negatīva.

Ja divu paraugu rezultāti ir nekonsekventi, atkārto vismaz gēnu amplifikāciju. Ja laboratorijai ir aizdomas par to, ka nekonsekvences iemesls var būt DNS ekstrakti, pirms rezultātu interpretēšanas veic jaunu DNS ekstrakciju, kam seko gēnu amplifikācija.

Galīgos rezultātus izsaka, integrējot un interpretējot šo divu paraugu rezultātus saskaņā ar SOP, ko izstrādājusi un savā tīmekļa vietnē publicējusi EURL-AP.

2.2.6.1.   Negatīvs rezultāts

Par negatīvu rezultātu ziņo šādi:

iesniegtajā paraugā netika konstatēts X DNS (X ir dzīvnieku suga vai dzīvnieku sugas grupa, uz kuru vērsta analīze).

2.2.6.2.   Pozitīvs rezultāts

Par pozitīvu rezultātu ziņo šādi:

iesniegtajā paraugā netika konstatēts X DNS (X ir dzīvnieku suga vai dzīvnieku sugas grupa, uz kuru vērsta analīze).

▼B

---

VII PIELIKUMS

METODE MĀJPUTNU BARĪBAS ENERĢĒTISKĀS VĒRTĪBAS APRĒĶINĀŠANAI

1.   Metode enerģētiskās vērtības aprēķināšanai un izteikšanai

Mājputnu barības maisījumu enerģētiskā vērtība jāaprēķina, izmantojot tālāk izklāstīto formulu, pamatojoties uz noteiktu barības analītisko komponentu procentuālajām attiecībām. Šo vērtību izsaka megadžoulos (MJ) no vielmaiņas rezultātā pārveidotās enerģijas (ME), koriģējot to slāpeklim, uz vienu kilogramu barības maisījuma:

MJ/kg ME = 0,1551 × % kopproteīna + 0,3431 × % jēltauku + 0,1669 × % cietes + 0,1301 × % kopējo cukuru (kas izteikti kā saharoze).

2.   Deklarētajām vērtībām piemērojamās pielaides

Ja oficiālā pārbaudē atklāj neatbilstību (lielāku vai mazāku barības enerģētisko vērtību) starp pārbaudes rezultātu un deklarēto enerģētisko vērtību, tad minimālā pieļaujamā pielaide ir 0,4 MJ/kg ME.

3.   Rezultāta izteikšana

Pēc iepriekš minētās formulas piemērošanas iegūtais rezultāts jānorāda līdz vienam ciparam aiz komata.

4.   Paraugu ņemšanas un analīzes metodes

Barības maisījumu paraugu ņemšana un analītisko komponentu satura noteikšana, kas norādīta aprēķināšanas metodē, jāveic attiecīgi atbilstoši Kopienas paraugu ņemšanas metodēm un analīzes metodēm barības oficiālās kontroles veikšanai.

Jāpiemēro:

---

VIII PIELIKUMS

ANALĪZES METODES, LAI KONTROLĒTU VAIRS NEATĻAUTU PIEDEVU NELIKUMĪGU KLĀTBŪTNI BARĪBĀ

A.   METILBENZOKVĀTA NOTEIKŠANA

7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-hinolīns

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt metilbenzokvāta daudzumu barībā. Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 1 mg/kg.

2.   Princips

Metilbenzokvātu ekstrahē no parauga ar metānsulfoskābes šķīdumu metanolā. Ekstraktu attīra ar dihlormetānu, ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un tad atkal ar dihlormetānu. Metilbenzokvāta saturu nosaka apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

Metanola (3.2.) un ūdens (kas ekvivalents HPLC tīrības pakāpei) maisījums, piemēram, 75 +25 (v + v).

Šķīdumu filtrē caur 0,22 μm filtru (4.5.) un atgāzo (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu).

20,0 ml metānsulfoskābes atšķaida līdz 1 000 ml tilpumam ar metanolu (3.2.).

100 ml sālsskābes (ρ201,18 g/ml) atšķaida līdz 1 000 ml tilpumam ar ūdeni.

Sveķus pirms izmantošanas iepriekš apstrādā. 100 g sveķu apstrādā ar 500 ml sālsskābes šķīduma (3.5.) un, pastāvīgi maisot, karsē uz elektriskās plītiņas līdz viršanai. Ļauj atdzist un dekantē skābi. Vakuumā izfiltrē caur filtrpapīru. Sveķus divas reizes mazgā ar 500 ml ūdens devām un pēc tam ar 250 ml metanola (3.2.). Sveķus skalo vēl ar 250 ml metanola un ar caurplūstošu gaisu žāvē nogulsnes, kas paliek uz filtra. Nožāvētos sveķus glabā ar aizbāzni noslēgtā pudelē.

Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver 50 mg standartvielas (3.7.), izšķīdina metānsulfoskābes šķīdumā (3.4.) 100 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei un samaisa.

5,0 ml metilbenzokvāta izejas standartšķīduma (3.7.1.) pārnes 50 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar metanolu (3.2.) un samaisa.

Pārnes 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 un 5,0 ml metilbenzokvāta starpposma standartšķīduma (3.7.2.) 25 ml mērkolbu komplektos. Papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.3.) un samaisa. Minēto šķīdumu koncentrācija ir attiecīgi 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 un 10,0 μg/ml metilbenzokvāta. Minētie šķīdumi jāsagatavo svaigi pirms izmantošanas.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Vispārīgas norādes

Piezīme. Šīs metodes nolūkos tukšais barības paraugs ir tāda paša veida kā analizējamais paraugs, un analīzē nedrīkst uzrādīties metilbenzokvāts.

5.2.   Ekstrakcija

Ar precizitāti līdz 0,01 g iesver apmēram 20 g sagatavotā parauga un pārnes 250 ml koniskā kolbā. Pievieno 100,0 ml metānsulfoskābes šķīduma (3.4.) un 30 minūtes mehāniski krata (4.1.). Izfiltrē šķīdumu caur filtrpapīru un filtrātu glabā divu šķidro fāžu atdalīšanai (5.3.).

5.3.   Divu šķidro fāžu atdalīšana

Uz 500 ml dalāmpiltuvi, kurā ir 100 ml sālsskābes šķīduma (3.5.), pārnes 25,0 ml iegūtā filtrāta (5.2.). Pievieno 100 ml dihlormetāna (3.1.) un krata vienu minūti. Ļauj slāņiem atdalīties un nolaiž apakšējo (dihlormetāna) slāni 500 ml apaļkolbā. Ūdens fāzes ekstrakciju atkārto ar vēl divām 40 ml dihlormetāna devām un apvieno tās ar pirmo ekstraktu apaļkolbā. Ar rotācijas iztvaicētāju (4.2.) pazeminātā spiedienā 40 oC temperatūrā iztvaicē dihlormetāna ekstraktu līdz sausam stāvoklim. Izšķīdina atlikumu 20 līdz 25 mililitros metanola (3.2.), ar aizbāzni noslēdz kolbu un visu ekstraktu glabā jonu apmaiņas hromatogrāfijai (5.4.).

5.4.   Jonu apmaiņas hromatogrāfija

5.4.1.    Katjonu apmaiņas kolonnas sagatavošana

Stikla kolonnas (4.3.) apakšējā galā ieliek stikla vates tamponu. Sagatavo 5,0 g apstrādāto katjonu apmaiņas sveķu (3.6.) un 50 ml sālsskābes (3.5.) uzduļķojuma, ielej stikla kolonnā un ļauj nostāties. Nolaiž lieko skābi tā, lai skābes līmenis ir tikai nedaudz virs sveķu virsmas, un mazgā kolonnu ar ūdeni, līdz izplūde ir neitrāla pret lakmusu. 50 ml metanola (3.2.) pārnes uz kolonnu un ļauj notecēt līdz sveķu virsmai.

5.4.2.    Kolonnas hromatogrāfija

Ar pipeti uzmanīgi pārnes iegūto ekstraktu (5.3.) uz kolonnu. Izskalo apaļkolbu ar divām 5 līdz 10 ml devām metanola (3.2.) un saskalojumus pārnes uz kolonnu. Nodrošinot, ka plūsmas ātrums nepārsniedz 5 ml minūtē, ekstraktu nolaiž līdz sveķu virsmai un kolonnu izmazgā ar 50 ml metanola. Efluentu izlej. Ar 150 ml metānsulfoskābes šķīduma (3.4.) no kolonnas eluē metilbenzokvātu un kolonnas eluātu savāc 250 ml koniskā kolbā.

5.5.   Divu šķidro fāžu atdalīšana

Pārnes iegūto eluātu (5.4.2.) viena litra dalāmpiltuvē. Izskalo konisko kolbu ar 5 līdz 10 ml metanola (3.2.) un saskalojumus apvieno ar dalāmpiltuves saturu. Pievieno 300 ml sālsskābes šķīduma (3.5.) un 130 ml dihlormetāna (3.1.). Krata vienu minūti un ļauj fāzēm atdalīties. Nolaiž apakšējo (dihlormetāna) slāni 500 ml apaļkolbā. Ūdens fāzes ekstrakciju atkārto ar vēl divām 70 ml dihlormetāna devām un šos ekstraktus apvieno ar pirmo ekstraktu apaļkolbā.

Ar rotācijas iztvaicētāju (4.2.) pazeminātā spiedienā 40 oC temperatūrā iztvaicē dihlormetāna ekstraktu līdz sausam stāvoklim. Atlikumu izšķīdina kolbā, kur ir apmēram 5 ml metanola (3.2.), un šo šķīdumu kvantitatīvi pārnes uz 10 ml mērkolbu. Izskalo apaļkolbu ar vēl divām 1 līdz 2 ml devām metanola un saskalojumus pārnes uz mērkolbu. Papildina līdz zīmei ar metanolu un samaisa. Alikvotu devu izfiltrē caur membrānfiltru (4.6.). Šo šķīdumu pataupa HPLC noteikšanai (5.6.).

5.6.    HPLC noteikšana

5.6.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus:

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.) ar koncentrāciju 4 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus vai laukumus un izdalīšanas laiku.

5.6.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas grafiku, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos maksimālos augstumus vai laukumus un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.6.3.    Parauga šķīdums

Iešpricē parauga ekstraktu (5.5.) vairākas reizes, izmantojot to pašu tilpumu, kāds bija kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka metilbenzokvāta maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā parauga šķīduma metilbenzokvāta maksimumu vidējo augstumu (laukumu), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml, izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.6.2.).

Metilbenzokvāta saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

c

=

metilbenzokvāta koncentrācija parauga šķīdumā, g/ml,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.7.3.) spektru, kura koncentrācija ir 10 μg/ml.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu starpposma standartšķīduma (3.7.2.). Pievienotā metilbenzokvāta daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam metilbenzokvāta daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai metilbenzokvāta maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā maksimālā augstuma jābūt apmēram 10 % no sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 10 % no lielākā rezultāta, ja metilbenzokvāta saturs ir starp 4 un 20 mg/kg.

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta tukšā parauga atgūstamība ir vismaz 90 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

Desmit laboratorijas analizēja piecus paraugus. Visus paraugus analizēja divas reizes.

NN

=

nav noteikts,

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients (%),

sR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients (%),

B.   OLAHINDOKSA NOTEIKŠANA

2-[N-2'-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilhinoksalīn-N 1 ,N 4 -dioksīds

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt olahindoksa daudzumu barībā. Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 5 mg/kg.

2.   Princips

Paraugu ekstrahē ar ūdens un metanola maisījumu. Olahindoksa saturu nosaka apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

Ūdens (3.3.) un metanola (3.2.) maisījums, 900 + 100 (V + V).

Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver 50 mg olahindoksa (3.5.) 200 ml mērkolbā un pievieno apmēram 190 ml ūdens. Tad kolbu uz 20 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.1.). Pēc apstrādes ar ultraskaņu šķīdumu atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz zīmei ar ūdeni un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā un glabā ledusskapī. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs katru mēnesi.

10,0 ml izejas standartšķīduma (3.5.1.) pārnes 100 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.4.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā un glabā ledusskapī. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs katru dienu.

50 ml mērkolbās iepilda attiecīgi 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 un 20,0 ml starpposma standartšķīduma (3.5.2.) Papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.4.) un samaisa. Ietin kolbas alumīnija folijā. Minētie šķīdumi atbilst attiecīgi šādām olahindoksa koncentrācijām: 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 un 10,0 μg/ml.

Minētie šķīdumi jāsagatavo svaigi katru dienu.

4.   Ierīces

5.   Procedūra

Piezīme.

Olahindokss ir gaismjutīgs. Visas darbības veic izkliedētā gaismā vai lieto brūnā stikla traukus.

5.1.   Vispārīgas norādes

Piezīme.

Šīs metodes nolūkos tukšajais barības paraugs ir tāda paša veida kā analizējamais paraugs, un analīzē nedrīkst uzrādīties olahindokss.

5.2.   Ekstrakcija

Ar precizitāti līdz 0,01 g iesver apmēram 50 g parauga. Pārnes 1 000 ml koniskā kolbā, pievieno 100 ml metanola (3.1.) un kolbu uz piecām minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.1.). Pievieno 410 ml ūdens un atstāj ultraskaņas vannā vēl uz 15 minūtēm. Izņem kolbu no ultraskaņas vannas, 30 minūtes krata uz kratītāja (4.2.) un izfiltrē caur kroku filtru. 10,0 ml filtrāta pārnes 20 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar ūdeni un samaisa. Alikvotu izfiltrē caur membrānfiltru (4.4.) (skatīt 9. novērojumu). Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.3.    HPLC noteikšana

5.3.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.5.3.) ar koncentrāciju 2,5 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus un izdalīšanas laiku.

5.3.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.5.3.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas grafiku, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos maksimālos augstumus (laukumus) un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.3.3.    Parauga šķīdums

Iešpricē parauga ekstraktu (5.2.) vairākas reizes, izmantojot to pašu tilpumu, kāds bija kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka olahindoksa maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā olahindoksa maksimumu vidējo augstumu (laukumu) parauga šķīdumā, nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml, izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.3.2.).

Olahindoksa saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

c

=

olahindoksa koncentrācija parauga ekstraktā (5.2.), μg/ml,

m

=

analizējamā parauga svars g/ml (5.2.).

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta (5.2.) spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.5.3.) spektru, kura koncentrācija ir 5,0 μg/ml.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu (5.2.) stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.5.3.). Pievienotā olahindoksa daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam olahindoksa daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai olahindoksa maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā augstuma jābūt ± 10 % robežās no nepastiprināta parauga ekstrakta olahindoksa maksimuma sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas vienam paraugam, nedrīkst pārsniegt 15 % attiecībā pret lielāko rezultātu attiecībā uz olahindoksu, kura saturs ir no 10 līdz 200 mg/kg.

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta tukšā parauga atgūstamība ir vismaz 90 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

EK organizētajā koppētījumā līdz 13 laboratorijām analizēja četrus sivēnu barības paraugus, no kuriem viens bija tukšais paraugs. Analīžu rezultāti ir šādi.

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo vērtību skaits,

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

sR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients.

9.   Novērojums

Lai gan metode nav validēta tādas barības analīzēm, kas satur vairāk par 100 mg/kg olahindoksa, apmierinošus analīzes rezultātus iespējams iegūt, ņemot mazāku parauga svaru un/vai atšķaidot ekstraktu (5.2.) tā, lai koncentrācija būtu kalibrēšanas grafika ietvaros (5.3.2.).

C.   AMPROLIJA NOTEIKŠANA

1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidinil)metil]-2-metil-piridīna hlorīda hidrogēnhlorīds

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt amprolija daudzumu barībā un premiksos. Noteikšanas robeža ir 1 mg/kg, kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 5 mg/kg.

2.   Princips

Paraugu ekstrahē ar metanola un ūdens maisījumu. Pēc atšķaidīšanas ar kustīgo fāzi un membrānfiltrācijas amprolija saturu nosaka ar katjonu apmaiņas augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfijas metodi (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

Izšķīdina 13,80 g nātrija dihidrogēnfosfāta ūdenī (3.3.) 1 000 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar ūdeni (3.3.) un samaisa.

Izšķīdina 224,74 g nātrija perhlorāta monohidrāta ūdenī (3.3.) 1 000 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar ūdeni (3.3.) un samaisa.

Acetonitrila (3.2.), nātrija dihidrogēnfosfāta šķīduma (3.4.) un nātrija perhlorāta šķīduma (3.5.) maisījums 450 + 450 + 100 (v + v + v). Pirms lietošanas filtrē caur 0,22 μm membrānfiltru (4.3.) un šķīdumu atgāzo (piemēram, ultraskaņas vannā (4.4.) vismaz 15 minūtes).

Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver 50 mg amprolija (3.7.) 100 ml mērkolbā, izšķīdina 80 mililitros metanola (3.1.) un kolbu uz 10 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.4.). Pēc apstrādes ar ultraskaņu šķīdumu atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz zīmei ar ūdeni un samaisa. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

5,0 ml izejas standartšķīduma (3.7.1.) ar pipeti iepilina 50 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar ekstrakcijas šķīdinātāju (3.8.) un samaisa. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

Pārnes 0,5 , 1,0 un 2,0 ml starpposma standartšķīduma (3.7.2.) 50 ml mērkolbu komplektos. Papildina līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.6.) un samaisa. Tādi šķīdumi atbilst attiecīgi šādām koncentrācijām: 0,5 , 1,0 un 2,0 μg/ml amprolija. Minētie šķīdumi jāsagatavo svaigi pirms izmantošanas.

Metanola (3.1.) un ūdens maisījums 2+1 (v+v).

4.   Ierīces

5.   Procedūra

5.1.   Vispārīgas norādes

5.1.1.    Tukšais eksperiments

Lai veiktu atgūstamības testu (5.1.2.), analizē tukšo barības paraugu, lai pārbaudītu, ka barībā nav ne amprolija, ne noteikšanu traucējošu vielu. Tukšais paraugs pēc veida ir līdzīgs analizējamajam paraugam, un, pārbaudot to, nav jāuzrādās amprolijam vai noteikšanu traucējošām vielām.

5.1.2    Atgūstamības tests

Atgūstamības testu veic, analizējot tukšo barības paraugu, kas pastiprināts, pievienojot tik daudz amprolija, cik ir paraugā. Lai paraugu pastiprinātu līdz līmenim 100 mg/kg, 10,0 ml izejas standartšķīduma (3.7.1.) pārnes 250 ml koniskā kolbā un šķīdumu iztvaicē līdz apmēram 0,5 ml. Pirms ekstrakcijas (5.2.) pievieno 50 g tukšā barības parauga, vairākas reizes kārtīgi samaisa un atstāj uz 10 minūtēm.

Ja nav analizējamajam paraugam līdzīga tukšā parauga (skatīt 5.1.1. punktu), tad atgūstamības testu var veikt, izmantojot standarta piedevu metodi. Tādā gadījumā analizējamo paraugu pastiprina ar amprolija daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Tādu paraugu analizē kopā ar nepastiprināto paraugu un atgūstamību aprēķina pēc starpības.

5.2.   Ekstrakcija

5.2.1.    Premiksi (satur < 1 % amprolija) un barība

Atkarībā no amprolija satura ar precizitāti līdz 0,01 g iesver 5 līdz 40 g parauga, ko pārnes 500 ml koniskā kolbā, un pievieno 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.8.). Kolbu ievieto ultraskaņas vannā (4.4.) un atstāj uz 15 minūtēm. Kolbu izņem no ultraskaņas vannas un vienu stundu krata kratītājā vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.5.). Ekstrakta alikvotu atšķaida ar kustīgo fāzi (3.6.), līdz amprolija koncentrācija sasniedz 0,5 –2 μg/ml, un samaisa (skatīt 9.3. novērojumu). Šā atšķaidītā šķīduma 5 līdz 10 ml filtrē ar membrānfiltru (4.2.). Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.2.2.    Premiksi (satur ≥ 1 % amprolija)

Atkarībā no amprolija satura ar precizitāti līdz 0,001 g iesver 1 līdz 4 g premiksa, ko pārnes 500 ml koniskā kolbā, un pievieno 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.8.). Kolbu ievieto ultraskaņas vannā (4.4.) un atstāj uz 15 minūtēm. Kolbu izņem no ultraskaņas vannas un vienu stundu krata kratītājā vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.5.). Ekstrakta alikvotu atšķaida ar kustīgo fāzi (3.6.), līdz amprolija koncentrācija sasniedz 0,5 –2 μg/ml, un samaisa. Šā atšķaidītā šķīduma 5 līdz 10 ml filtrē ar membrānfiltru (4.2.). Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.3.).

5.3.    HPLC noteikšana

5.3.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.) ar koncentrāciju 1,0 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus un izdalīšanas laiku.

5.3.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošo vidējos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas grafiku, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos maksimālos augstumus (laukumus) un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.3.3.    Parauga šķīdums

Iešpricē parauga ekstraktu (5.2.) vairākas reizes, izmantojot to pašu tilpumu, kāds bija kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka amprolija maksimumu vidējo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā amprolija maksimumu vidējo augstumu (laukumu) parauga šķīdumā, nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml, izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.3.2.).

Amprolija saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg],

kur:

V

=

ekstrakcijas šķīdinātāja (3.8.) tilpums mililitros atbilstoši 5.2. punktam (t. i., 200 ml),

c

=

amprolija koncentrācija parauga ekstraktā (5.2.) μg/ml,

f

=

atšķaidījuma pakāpe atbilstoši 5.2. punktam,

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta (5.2.) spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.7.3.) spektru, kura koncentrācija ir 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu (5.2.) stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.7.3.). Pievienotā amprolija daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam amprolija daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai amprolija maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā augstuma jābūt ± 10 % robežās no nepastiprināta parauga ekstrakta amprolija maksimuma sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt:

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta (tukšā) parauga atgūstamība ir vismaz 90 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

Tika noorganizēts koppētījums, kurā analizēja trīs mājputnu barības paraugus (1. līdz 3. paraugs), vienu minerālbarības paraugu (4. paraugs) un vienu premiksu (5. paraugs). Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo vērtību skaits,

sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients,

sR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients.

9.   Novērojumi

D.   KARBADOKSA NOTEIKŠANA

Metil 3-(2-hinoksalinilmetilēn)karbazāta N 1 ,N 4 -dioksīds

1.   Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt karbadoksa daudzumu barībā, premiksos un preparātos. Noteikšanas robeža ir 1 mg/kg. Kvantitatīvās noteikšanas robeža ir 5 mg/kg.

2.   Princips

Paraugu līdzsvaro ar ūdeni un ekstrahē ar metanola un acetonitrila maisījumu. Analizējot barību, filtrēta ekstrakta alikvotu attīra alumīnija oksīda kolonnā. Analizējot premiksus un preparātus, filtrēta ekstrakta alikvotu līdz vajadzīgajai koncentrācijai atšķaida ar ūdeni, metanolu un acetonitrilu. Kabadoksa saturu nosaka apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC), izmantojot UV detektoru.

3.   Reaģenti

500 ml metanola (3.1.) samaisa ar 500 ml acetonitrila (3.2.).

Atšķaida 10 ml etiķskābes (3.3.) līdz 100 ml tilpumam ar ūdeni.

Izšķīdina 0,82 g nātrija acetāta (3.7.) 700 mililitros ūdens (3.8.) un koriģē pH līmeni līdz 6,0 ar etiķskābi (3.6.). Pārnes 1 000 ml mērkolbā, papildina līdz zīmei ar ūdeni (3.8.) un samaisa.

Samaisa 825 ml acetāta buferšķīduma (3.9.) ar 175 ml acetonitrila (3.2.).

Šķīdumu filtrē caur 0,22 μm filtru (4.5.) un atgāzo (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu).

Tīrs karbadokss: metil 3-(2-hinoksalinilmetilēn)karbazāta N1,N4-dioksīds, E 850.

ar precizitāti līdz 0,1 mg 250 ml mērkolbā iesver 25 mg karbadoksa standartvielas (3.11.). Izšķīdina metanola un acetonitrila maisījumā (3.5.), apstrādājot ar ultraskaņu (4.7.). Pēc apstrādes ar ultraskaņu šķīdumu atdzesē līdz istabas temperatūrai, papildina līdz zīmei ar metanola un acetonitrila maisījumu (3.5.) un samaisa. Ietin kolbu alumīnija folijā vai izmanto kolbu no brūnā stikla, uzglabā ledusskapī. Temperatūrā, kas ir ≤ 4 oC, šķīdumu var glabāt vienu mēnesi.

Pārnes 2,0 , 5,0 , 10,0 un 20,0 ml izejas standartšķīduma (3.11.1.) 100 ml mērkolbu komplektos. Pievieno 30 ml ūdens, papildina līdz zīmei ar metanola un acetonitrila maisījumu (3.5.) un samaisa. Ietin kolbas alumīnija folijā. Tādi šķīdumi atbilst attiecīgi 2,0 , 5,0 , 10,0 un 20,0 μg/ml karbadoksa.

Kalibrēšanas šķīdumi jāsagatavo svaigi pirms izmantošanas.

Piezīme.

Lai noteiktu karbadoksu, ja tā saturs barībā nepārsniedz 10 mg/kg, jāpagatavo kalibrēšanas šķīdumi, kuru koncentrācija ir mazāka par 2 μg/ml.

Samaisa 300 ml ūdens ar 700 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.).

4.   Ierīces

Piezīme.

Var izmantot arī stikla kolonnu ar krānu vai sašaurinātu apakšdaļu; tādā gadījumā kolonnas apakšējā daļā ievieto nelielu stikla vates tamponu, ko sablīvē ar stikla spieķīti.

5.   Procedūra

Piezīme.

Karbadokss ir gaismjutīgs. Visas darbības veic izkliedētā gaismā vai izmanto brūnā stikla traukus, vai izmanto alumīnija folijā ietītus stikla traukus.

5.1.   Vispārīgas norādes

5.1.1.    Tukšais eksperiments

Lai veiktu atgūstamības testu (5.1.2.), analizē tukšo barības paraugu, lai pārbaudītu, ka barībā nav ne karbadoksa, ne noteikšanu traucējošu vielu. Tukšais paraugs pēc veida ir līdzīgs analizējamajam paraugam, un, pārbaudot to, nav jāuzrādās karbadoksam vai noteikšanu traucējošām vielām.

5.1.2.    Atgūstamības tests

Atgūstamības testu veic, analizējot tukšo barības paraugu (5.1.1.), kas pastiprināts, pievienojot tik daudz karbadoksa, cik ir paraugā. Lai pastiprinātu paraugu līdz līmenim 50 mg/kg, 5,0 ml izejas standartšķīduma (3.11.1.) pārnes 200 ml koniskā kolbā. Slāpekļa plūsmā šķīdumu iztvaicē līdz apmēram 0,5 ml. Pirms ekstrakcijas (5.2.) pievieno 10 g tukšā barības parauga, samaisa un atstāj uz 10 minūtēm.

Ja nav analizējamajam paraugam līdzīga tukšā parauga (skatīt 5.1.1. punktu), tad atgūstamības testu var veikt, izmantojot standarta piedevu metodi. Tādā gadījumā analizējamo paraugu pastiprina ar karbadoksa daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Tādu paraugu analizē kopā ar nepastiprināto paraugu un atgūstamību aprēķina pēc starpības.

5.2.   Ekstrakcija

5.2.1.    Barība

Ar precizitāti līdz 0,01 g iesver 10 g parauga un pārnes 200 ml koniskā kolbā. Pievieno 15,0 ml ūdens, samaisa un līdzsvaro piecas minūtes. Pievieno 35,0 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.), noslēdz ar aizbāzni un 30 minūtes krata kratītājā vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.1.). Šķīdumu izfiltrē caur stikla šķiedras filtrpapīru (4.2.). Minēto šķīdumu saglabā attīrīšanas posmam (5.3.).

5.2.2.    Premiksi (0,1 –2,0 %)

Ar precizitāti līdz 0,001 g iesver 1 g nesamalta parauga un pārnes 200 ml koniskā kolbā. Pievieno 15,0 ml ūdens, samaisa un līdzsvaro piecas minūtes. Pievieno 35,0 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.), noslēdz ar aizbāzni un 30 minūtes krata kratītājā vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.1.). Šķīdumu izfiltrē caur stikla šķiedras filtrpapīru (4.2.).

Ar pipeti iepilina filtrāta alikvotu 50 ml mērkolbā. Pievieno 15,0 ml ūdens, papildina līdz zīmei ar metanola un acetonitrila maisījumu (3.5.) un samaisa. Karbadoksa koncentrācija galīgajā šķīdumā ir apmēram 10 μg/ml. Alikvotu izfiltrē caur 0,45 μm filtru (4.6.).

Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.4.).

5.2.3.    Preparāti (> 2 %)

Ar precizitāti līdz 0,001 g iesver 0,2 g nesamalta parauga un pārnes 250 ml koniskā kolbā. Pievieno 45,0 ml ūdens, samaisa un līdzsvaro piecas minūtes. Pievieno 105,0 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.), noslēdz ar aizbāzni un homogenizē. Paraugu 15 minūtes apstrādā ar ultraskaņu (4.7.), pēc tam 15 minūtes kratot vai maisot (4.1.). Šķīdumu izfiltrē caur stikla šķiedras filtrpapīru (4.2.).

Filtrāta alikvotu atšķaida ar ūdens, metanola un acetonitrila maisījumu (3.12.), līdz karbadoksa galīgā koncentrācija sasniedz 10–15 μg/ml (10 % preparātam atšķaidījuma pakāpe ir 10). Alikvotu izfiltrē caur 0,45 μm filtru (4.6.).

Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.4.).

5.3.   Attīrīšana

5.3.1.    Alumīnija oksīda kolonnas sagatavošana

Iesver 4 g alumīnija oksīda (3.4.) un pārnes to uz stikla kolonnu (4.3.).

5.3.2.    Parauga attīrīšana

15 ml filtrētā ekstrakta (5.2.1.) pārnes alumīnija oksīda kolonnā un pirmos 2 ml eluāta izlej. Savāc nākamos 5 ml un izfiltrē alikvotu caur 0,45 μm filtru (4.6.).

Pāriet pie HPLC noteikšanas (5.4.).

5.4.    HPLC noteikšana

5.4.1.    Parametri

Orientējoši piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešpricējot kalibrēšanas šķīdumu (3.11.2.) ar koncentrāciju 5,0 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus maksimālos augstumus (laukumus) un izdalīšanas laiku.

5.4.2.    Kalibrēšanas grafiks

Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.11.3.) iešpricē vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos maksimālos augstumus (laukumus). Izveido kalibrēšanas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos maksimālos augstumus vai laukumus un uz abscisu ass – atbilstīgās koncentrācijas μg/ml.

5.4.3.    Parauga šķīdums

Vairākas reizes iešpricē parauga ekstraktu ((5.3.2.) barībai, (5.2.2.) premiksiem un (5.2.3.) preparātiem) un nosaka karbadoksa maksimumu vidējo maksimālo augstumu (laukumu).

6.   Rezultātu aprēķināšana

Ņemot vērā karbadoksa maksimumu vidējo augstumu (laukumu) parauga šķīdumā, nosaka karbadoksa koncentrāciju parauga šķīdumā μg/ml, izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.4.2.).

6.1.   Barība

Karbadoksa saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg],

kur:

c

=

karbadoksa koncentrācija parauga ekstraktā (5.3.2.), μg/ml,

V1

=

ekstrakcijas tilpums ml (t. i., 50),

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

6.2.   Premiksi un preparāti

Karbadoksa saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

[mg/kg],

kur:

c

=

karbadoksa koncentrācija parauga ekstraktā (5.2.2. vai 5.2.3.), μg/ml,

V2

=

ekstrakcijas tilpums ml (t. i., 50 premiksiem; 150 preparātiem),

f

=

atšķaidījuma pakāpe atbilstoši 5.2.2. (premiksiem) vai 5.2.3. (preparātiem),

m

=

analizējamā parauga svars gramos.

7.   Rezultātu validācija

7.1.   Identitāte

Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai izmantojot diodes matricu detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.11.3.) spektru, kura koncentrācija ir 10,0 μg/ml.

7.1.1.    Paralēla hromatogrāfiska analīze

Parauga ekstraktu stiprina, pievienojot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.11.2.). Pievienotā karbadoksa daudzumam jābūt tādam pašam kā aplēstajam karbadoksa daudzumam, kas atrasts parauga ekstraktā.

Tikai karbadoksa maksimuma augstumu palielina, ņemot vērā gan pievienoto daudzumu, gan ekstrakta atšķaidījumu. Maksimālajam platumam pusē no tā maksimālā augstuma jābūt apmēram 10 % no sākotnējā platuma.

7.1.2.    Diodes matricu noteikšana

Rezultātus novērtē atbilstoši šādiem kritērijiem:

Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, tad nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.

7.2.   Atkārtojamība

Ja saturs ir 10 mg/kg un vairāk, tad starpībai starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nav jāpārsniedz 15 % no lielākā rezultāta.

7.3.   Atgūstamība

Stiprināta (tukšā) parauga atgūstamība ir vismaz 90 %.

8.   Koppētījuma rezultāti

Tika organizēts koppētījums, kurā astoņas laboratorijas analizēja sešas barības, četrus premiksus un trīs preparātus. Visus paraugus analizēja divas reizes. (Sīkāku informāciju par šo koppētījumu skatīt Journal of the AOAC, Volume 71, 1988. g., 484.–490. lpp.). Rezultāti (izņemot galējos punktus) ir šādi.

L

=

laboratoriju skaits,

n

=

atsevišķo vērtību skaits,

Sr

=

atkārtojamības standartnovirze,

CVr

=

atkārtojamības variācijas koeficients,

SR

=

atveidojamības standartnovirze,

CVR

=

atveidojamības variācijas koeficients.

---

IX PIELIKUMS

6. PANTĀ MINĒTĀS ATBILSTĪBAS TABULAS

1.   Direktīva 71/250/EEK

2.   Direktīva 71/393/EEK

3.   Direktīva 72/199/EEK

4.   Direktīva 73/46/EEK

5.   Direktīva 76/371/EEK

6.   Direktīva 76/372/EEK

7.   Direktīva 78/633/EEK

8.   Direktīva 81/715/EEK

9.   Direktīva 84/425/EEK

10.   Direktīva 86/174/EEK

11.   Direktīva 93/70/EEK

12.   Direktīva 93/117/EK

13.   Direktīva 98/64/EK

14.   Direktīva 1999/27/EK

15.   Direktīva 1999/76/EK

16.   Direktīva 2000/45/EK

17.   Direktīva 2002/70/EK

18.   Direktīva 2003/126/EK

---

( 1 ) OV L 268, 18.10.2003., 29. lpp.

( 2 ) OV L 140, 30.5.2002., 10. lpp.

( 3 ) OV L 70, 16.3.2005., 1. lpp.;

( 4 ) Visus gabalus sadala daļās (vajadzības gadījumā atdalot tos un pievienojot atpakaļ paraugam).

( 5 ) Izņemot rupjo barību vai lopbarību ar zemu īpatsvaru.

( 6 ) Izņemot rupjo barību vai lopbarību ar zemu īpatsvaru.

( 7 ) OV L 229, 1.9.2009., 1. lpp.

( 7 ) Labības, miltu, putraimu un rupja maluma miltu kaltēšanai krāsns termiskajai jaudai jābūt tādai, lai, kad tā iestatīta uz 131 oC, tā atgrieztos minētajā temperatūrā mazāk nekā 45 minūtēs pēc tam, kad tajā vienlaikus kaltēšanai ir salikts maksimāli iespējamais testa paraugu skaits. Ventilēšanai jābūt tādai, lai tad, kad krāsnī divas un četras stundas ir kaltēts maksimāli iespējamais kviešu paraugu daudzums, abi rezultāti atšķirtos mazāk nekā par 0,15 %.

( 7 ) Ja eļļai vai taukiem jāveic turpmākas kvalitātes kontroles, tad pumeka gabaliņus aizstāj ar stikla lodītēm.

( 7 ) OV L 125, 23.5.1996., 35. lpp.

( 7 ) Veica Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) Barības darba grupa.

( 7 ) Veica Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) Barības darba grupa.

( 7 ) Var izmantot citas šķelšanas metodes, ja ir pierādīts, ka tās uzrāda līdzīgus rezultātus (piemēram, šķelšana mikroviļņu spiedienā).

( 7 ) Rupjā lopbarība zaļmasā (svaiga vai kaltēta), kura var saturēt lielus daudzumus dārzeņu kvarca, kas var aizturēt mikroelementus un tāpēc ir jāatdala. Minēto barību paraugiem līdz ar to jāievēro šāda koriģēta procedūra. Veic 5.1.1.1. punktā minēto procedūru līdz filtrēšanai. Divreiz ar vārošu ūdeni nomazgā filtrpapīru, kas satur nešķīstošo atlikumu, un ievieto to kvarca vai platīna tīģelī. Iededzina mufeļkrāsni (4.1.) temperatūrā, kas ir zem 550 oC, līdz viss oglekļa materiāls ir pilnībā izzudis. Ļauj atdzist, pievieno dažus pilienus ūdens un tad 10–15 ml fluorūdeņražskābes (3.4.) un iztvaicē, līdz tas ir sauss, apmēram 150 oC temperatūrā. Ja atlikumā paliek kvarcs, tad to atkārtoti izšķīdina dažos mililitros fluorūdeņražskābes (3.4.) un iztvaicē, līdz tas ir sauss. Pievieno dažus pilienus sērskābes (3.5.) un karsē, līdz vairs nepaceļas balti dūmi. Pievieno 5 ml 6 mol/l sālsskābes (3.2.), tad apmēram 30 ml ūdens, karsē, šķīdumu filtrē un ievieto 250 ml tilpuma kolbā, un papildina līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija apmēram 0,5 mol/l). Pēc tam noteikšanu turpina no 5.1.2. punkta.

( 7 ) Analyst 108, 1983. g., 1252. līdz 1256. lpp.

( *1 ) Analyst, 1995. g., 120., 2175.–2180. lpp.

( 8 ) TEF (= toksiskās ekvivalences faktoru) tabula PCDD, PCDF un dioksīniem līdzīgiem PCB: PVO-TEF riska novērtējumam attiecībā uz cilvēku veselību, kura pamatā ir secinājumi, kas sagatavoti Pasaules Veselības organizācijas (PVO) Starptautiskās ķīmiskās drošības programmas (IPCS) ekspertu sanāksmē, kura notika 2005. gada jūnijā Ženēvā (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Lietotie saīsinājumi: “T” = tetra; “Pe” = penta; “Hx” = heksa; “Hp” = hepta; “O” = okta; “CDD” = hlordibenzdioksīns; “CDF” = hlordibenzfurāns; “CB” = hlorbifenils.

( 9 ) Komisijas 2002. gada 14. augusta Lēmums 2002/657/EK, ar ko īsteno Padomes Direktīvu 96/23/EK par analīzes metožu veiktspēju un rezultātu interpretēšanu (OV L 221, 17.8.2002., 8. lpp.).

( 10 ) Attiecīgā gadījumā piemēro principus, kas aprakstīti vadlīniju dokumentā Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry (Vadlīnijas par mērījumu neprecizitāti attiecībā uz laboratorijām, kas veic PCDD/F un PCB analīzi, izmantojot izotopu atšķaidīšanas masspektrometriju) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 11 ) Saistībā ar “lielākā analītiskā rezultāta” jēdzienu jāizmanto kvantitatīvās noteikšanas robeža, lai aprēķinātu katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas devumu. Saistībā ar “mazākā analītiskā rezultāta” jēdzienu jāizmanto nulle, lai aprēķinātu katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas devumu. Saistībā ar “vvidējā analītiskā rezultāta” jēdzienu jāizmanto puse no kvantitatīvās noteikšanas robežas, lai aprēķinātu katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas devumu.

( 12 ) Otrreizēja analīze: atsevišķa interesējošo analizējamo vielu analīze, izmantojot otru tā paša homogenizētā parauga alikvotu. Parasti piemērojamas II pielikuma C nodaļas 3. punktā noteiktās prasības attiecībā uz otrreizējo analīzi. Tomēr attiecībā uz metodēm, kurās attiecībā uz attiecīgajām analizējamajām vielām izmanto ar 13C iezīmētus iekšējos standartus, otrreizējā analīze ir vajadzīga tikai tad, ja rezultāts, ko iegūst pēc pirmās noteikšanas, ir neatbilstošs. Otrreizējā analīze ir nepieciešama, lai izslēgtu iekšējas savstarpējas piesārņošanās iespēju vai paraugu nejaušu samainīšanu. Ja analīzi veic piesārņošanas gadījuma laikā, tad apstiprinājumu ar otrreizēju analīzi var neveikt, ja vien analīzei atlasītie paraugi izsekojamā veidā ir saistīti ar šo piesārņojumu un ja konstatētā koncentrācija ievērojami pārsniedz maksimāli pieļaujamo koncentrāciju.

( 13 ) Saistībā ar “lielākā analītiskā rezultāta” jēdzienu jāizmanto kvantitatīvās noteikšanas robeža, lai aprēķinātu katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas devumu toksicitātes ekvivalentā (TEQ). Saistībā ar “mazākā analītiskā rezultāta” jēdzienu jāizmanto nulle, lai aprēķinātu katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas devumu TEQ. Saistībā ar “vidējā analītiskā rezultāta” jēdzienu jāizmanto puse no kvantitatīvās noteikšanas robežas, lai aprēķinātu katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas devumu TEQ.

( 14 ) Parasti piemērojamas II pielikuma C nodaļas 2. punktā noteiktās prasības attiecībā uz otrreizējo analīzi. Tomēr attiecībā uz metodēm, kurās attiecībā uz attiecīgajām analizējamajām vielām izmanto ar 13C iezīmētus iekšējos standartus, otrreizējā analīze ir vajadzīga tikai tad, ja rezultāts, ko iegūst pēc pirmās noteikšanas, ir neatbilstošs. Otrreizējā analīze ir nepieciešama, lai izslēgtu iekšējas savstarpējas piesārņošanās iespēju vai paraugu nejaušu samainīšanu. Ja analīzi veic piesārņošanas gadījuma laikā, tad apstiprinājumu ar otrreizēju analīzi var neveikt, ja vien analīzei atlasītie paraugi izsekojamā veidā ir saistīti ar šo piesārņojumu un ja konstatētā koncentrācija ievērojami pārsniedz maksimāli pieļaujamo koncentrāciju.

( 15 ) Skaidrojums un prasības attiecībā uz otrreizējo analīzi intervences līmeņa kontrolei ir identiski 2. zemsvītras piezīmē attiecībā uz maksimāli pieļaujamo koncentrāciju norādītajiem.

( 16 ) Eiropas Parlamenta un Padomes 2005. gada 12. janvāra Regula (EK) Nr. 183/2005, ar ko paredz barības higiēnas prasības (OV L 35, 8.2.2005., 1. lpp.).

( 17 ) Bioanalīžu metodes nav īpaši paredzētas tām radniecīgajām vielām, kas iekļautas TEF shēmā. Citi strukturāli radniecīgi AhR aktīvi savienojumi var būt parauga ekstraktā, kas ietekmē vispārējo signālu. Tādēļ TEQ līmeni paraugā nevar noteikt ar bioanalīžu rezultātiem un tos var vienīgi izmantot kā norādi.

( 18 ) Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry (Vadlīnijas par mērījumu nenoteiktību attiecībā uz laboratorijām, kas veic PCDD/F un PCB analīzi, izmantojot izotopu atšķaidīšanas masspektrometriju) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food (Vadlīnijas par mērījumu noteikšanas robežu (LOD) un kvantitatīvās noteikšanas robežu (LOQ) attiecībā uz piesārņotājiem pārtikā un barībā) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Spēkā esošo prasību pamatā ir TEF, kas publicēti M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223.–241. lpp. (2006).

( 20 ) Radniecīgās vielas, kuras bieži vienlaikus eluē ir, piemēram, PCB 28/31, PCB 52/69 un PCB 138/163/164. Attiecībā uz GC-MS metodēm jāapsver arī iespējamie traucējumi, ko rada izteikti hloratvasināto radniecīgo vielu fragmenti.

( 21 ) Attiecīgā gadījumā piemēro principus, kas aprakstīti Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food (Vadlīniju dokuments par LOD un LOQ novērtēšanu attiecībā uz piesārņotājiem pārtikā un barībā) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 22 ) Ļoti ieteicams, lai reaģenta tukšā parauga koncentrācijas daļa parauga piesārņojuma koncentrācijā būtu iespējami zemāka. Laboratorija ir atbildīga par tukšā parauga koncentrācijas vērtību maiņas kontroli, jo īpaši, ja tukšā parauga koncentrācijas vērtības tiek atskaitītas.

( 23 ) Spēkā esošo prasību pamatā ir TEF, kas publicēti M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223.–241. lpp. (2006).

( 24 ) Eiropas Parlamenta un Padomes Regula (EK) Nr. 999/2001 (2001. gada 22. maijs), ar ko paredz noteikumus dažu transmisīvo sūkļveida encefalopātiju profilaksei, kontrolei un apkarošanai (OV L 147, 31.5.2001., 1. lpp.).

( 25 ) Eiropas Parlamenta un Padomes Regula (EK) Nr. 1069/2009 (2009. gada 21. oktobris), ar ko nosaka veselības aizsardzības noteikumus attiecībā uz dzīvnieku izcelsmes blakusproduktiem un atvasinātajiem produktiem, kuri nav paredzēti cilvēku patēriņam, un ar ko atceļ Regulu (EK) Nr. 1774/2002 (Dzīvnieku izcelsmes blakusproduktu regula) (OV L 300, 14.11.2009., 1. lpp.).

( 26 ) https://www.eurl.craw.eu/legal-sources-and-sops/method-of-reference-and-sops/

( 27 ) Saraksts ar šiem praimeriem un zondēm katrai dzīvnieku sugai, uz kuru ir vērsta analīze, ir pieejams EURL-AP tīmekļa vietnē.

( 28 ) Funkcionālu Master Mix piemēri ir pieejami EURL-AP tīmekļa vietnē.