I PRIEDAS

ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI

1.   TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Ėminiai, skirti oficialiai pašarų kontrolei, imami pagal toliau aprašytus metodus. Taip gauti ėminiai laikomi reprezentatyviaisiais partijos ėminiais.

2.   ĖMINIUS IMANTYS PAREIGŪNAI

Ėminius ima pareigūnai, kuriuos tam įgalioja valstybės narės.

3.   APIBRĖŽTYS

Partija: produkto kiekis, sudarantis tyrimo vienetą ir pasižymintis savybėmis, kurios laikomos tolygiomis.

Atskirasis ėminys: kiekis, paimtas iš vienos partijos vietos.

Jungtinis ėminys: jungtinių ėminių, paimtų iš vienos ėminio partijos, visuma.

Sumažintasis ėminys: jungtinio ėminio dalis, atspindinti jo visumą, gauta jį redukuojant.

Galutinis ėminys: sumažintojo arba homogenizuoto jungtinio ėminio dalis.

4.   APARATAS

4.1	Ėminių ėmimo aparatas turi būti pagamintas iš medžiagų, negalinčių užteršti produktų, iš kurių imami ėminiai. Toks aparatas gali būti oficialiai patvirtintas valstybių narių.

4.2   Aparatas, rekomenduojamas kietųjų pašarų ėminiams imti

4.2.1   Ėminių ėmimas rankiniu būdu

4.2.1.1

Plokščiadugnė bertuvė vertikaliais kraštais.

4.2.1.2

Ėminių ėmimo zondas su ilgu plyšiu arba pertvaromis. Zondo matmenys turi atitikti ėminio tiriamosios dalies ypatybes (talpyklos gylį, maišo matmenis ir pan.) ir pašarų dalelių dydį.

4.2.2   Ėminių ėmimas mechaniniu būdu

Judančių pašarų ėminiams imti gali būti naudojamas patvirtintas mechaninis aparatas.

4.2.3   Dalytuvas

Aparatas, skirtas padalyti ėminį į maždaug vienodo dydžio dalis, gali būti naudojamas atskiriesiems ėminiams imti bei sumažintiesiems ir galutiniams ėminiams ruošti.

5.   KIEKYBINIAI REIKALAVIMAI

5.A.	Tikrinant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus
5.A.1.	Partija Partija turi būti tokia, kad iš jos būtų galima paimti kiekvienos jos sudedamosios dalies ėminį.
5.A.2.	Atskirieji ėminiai
5.A.2.1.	Piltiniai pašarai:	Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius:
5.A.2.1.1.	Partija ne didesnė kaip 2,5 metrinės tonos	septyni
5.A.2.1.2.	Partija didesnė kaip 2,5 metrinės tonos	kvadratinė šaknis iš 20 kartų partiją sudarančių metrinių tonų skaičiaus (1), bet ne daugiau kaip 40 atskirųjų ėminių
5.A.2.2.	Supakuoti pašarai:	Mažiausias pakuočių, iš kurių imami ėminiai, skaičius (2):
5.A.2.2.1.	Pakuotės, kurių masė didesnė kaip 1 kg:
5.A.2.2.1.1.	Partiją sudaro nuo vienos iki keturių pakuočių	visos pakuotės
5.A.2.2.1.2.	Partiją sudaro nuo penkių iki 16 pakuočių	keturios pakuotės
5.A.2.2.1.3.	Partiją sudaro daugiau kaip 16 pakuočių	kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių pakuočių skaičiaus (1), be ne daugiau kaip 20 pakuočių
5.A.2.2.2.	Pakuotės, kurių masė ne didesnė kaip 1 kg:	keturios
5.A.2.3.	Skystieji arba pusiau skysti pašarai:	Mažiausias talpyklų, iš kurių imami ėminiai, skaičius (2):
5.A.2.3.1.	Talpyklų tūris didesnis kaip 1 l:
5.A.2.3.1.1.	Partiją sudaro nuo vienos iki keturių talpyklų	visos talpyklos
5.A.2.3.1.2.	Partiją sudaro nuo penkių iki 16 talpyklų	keturios
5.A.2.3.1.3.	Partiją sudaro daugiau kaip 16 talpyklų	kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių talpyklų skaičiaus (1), be ne daugiau kaip 20 talpyklų
5.A.2.3.2.	Talpyklų tūris ne didesnis kaip 1 l	keturios
5.A.2.4.	Pašarų briketai ir mineralų laižalai	Mažiausias briketų arba laižalų, iš kurių imami ėminiai, skaičius (2): vienas pašarų briketas arba laižalas 25 vienetų partijai, bet ne daugiau kaip keturi briketai arba laižalai
5.A.3.	Jungtinis ėminys Reikia paruošti vieną jungtinį vienos tiriamosios ėminio dalies ėminį. Jungtinį ėminį sudarančių atskirųjų ėminių suminis kiekis turi būti ne mažesnis kaip:
5.A.3.1.	Piltiniai pašarai:	4 kg
5.A.3.2.	Supakuoti pašarai:
5.A.3.2.1.	pakuotės, kurių masė didesnė kaip 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2.	pakuotės, kurių masė ne didesnė kaip 1 kg	keturių pirminių pakuočių turinio masė
5.A.3.3.	Skystieji arba pusiau skysti pašarai:
5.A.3.3.1.	talpyklų tūris didesnis kaip 1 l:	keturi litrai
5.A.3.3.2.	talpyklų tūris ne didesnis kaip 1 l:	keturių pirminių talpyklų turinio tūris
5.A.3.4.	Pašarų briketai arba laižalai:
5.A.3.4.1.	kiekvieno masė didesnė kaip 1 kg	4 kg
5.A.3.4.2.	kiekvieno masė ne didesnė kaip 1 kg	keturių pirminių briketų arba laižalų masė
5.A.4.	Galutiniai ėminiai Prireikus iš jungtinio ėminio jį mažinant ruošiami galutiniai ėminiai. Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio analizę. Analizuojamo galutinio ėminio kiekis turi būti ne mažesnis kaip:
	Kietieji pašarai	500 g
	Skystieji arba pusiau skysti pašarai:	500 ml
5.B.	Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus, kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose, pvz., aflatoksinus, rugių skalsę, ricinžolę ir crotalaria  (3)
5.B.1.	Partija: žr. 5.A.1.
5.B.2.	Atskirieji ėminiai
5.B.2.1.	Piltiniai pašarai: žr. 5.A.2.1.
5.B.2.2.	Supakuoti pašarai:	Mažiausias pakuočių, iš kurių imami ėminiai, skaičius:
5.B.2.2.1.	partiją sudaro nuo vienos iki keturių pakuočių	visos pakuotės
5.B.2.2.2.	partiją sudaro nuo penkių iki 16 pakuočių	keturios
5.B.2.2.3.	partiją sudaro daugiau kaip 16 pakuočių	kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių pakuočių skaičiaus (1), be ne daugiau kaip 40 pakuočių
5.B.3.	Jungtiniai ėminiai Jungtinių ėminių skaičius skirsis atsižvelgiant į partijos dydį. Toliau nurodomas mažiausias iš vienos partijos paimtų jungtinių ėminių skaičius. Kiekvieną jungtinį ėminį sudarančių atskirųjų ėminių suminė masė turi būti ne mažesnė kaip 4 kg
5.B.3.1.	Piltiniai pašarai
	Partijos svoris metrinėmis tonomis:	Mažiausias partijos jungtinių ėminių skaičius:
	iki 1	1
	nuo daugiau kaip 1 iki 10	2
	nuo daugiau kaip 10 iki 40	3
	daugiau kaip 40	4
5.B.3.2.	Supakuoti pašarai
	Supakuotų pašarų partijos pakuočių skaičius	Mažiausias partijos jungtinių ėminių skaičius:
	nuo 1 iki 16	1
	nuo 17 iki 200	2
	nuo 201 iki 800	3
	daugiau kaip 800	4
5.B.4.	Galutiniai ėminiai Iš jungtinio ėminio jį mažinant gaunami galutiniai ėminiai. Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio vienam jungtiniam ėminiui analizę. Analizei paimto galutinio ėminio masė negali būti mažesnė kaip 500 g.

6.   ĖMINIŲ ĖMIMO, RUOŠIMO IR PAKAVIMO INSTRUKCIJOS

6.1   Bendrosios nuostatos

Ėminiai turi būti imami ir ruošiami kiek įmanoma greičiau, turint omenyje atsargumo priemones, kurios yra būtinos siekiant užtikrinti, kad produktas nepakistų ir nebūtų užterštas. Įrankiai ėminiams imti ir talpyklų, kuriose jie laikomi, paviršiai turi būti švarūs ir sausi.

6.2   Atskirieji ėminiai

6.2.A   Kontroliuojant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

Atskirieji ėminiai turi būti imami atsitiktinai iš visos partijos ir jie turi būti maždaug vienodo dydžio.

6.2.A.1   Piltiniai pašarai

Partija vizualiai dalijama į tam tikrą skaičių maždaug vienodų dalių. Atsitiktinai pasirenkamas dalių skaičius, atitinkantis pagal 5.A.2 punktą reikalaujamą atskirųjų ėminių skaičių, ir iš kiekvienos dalies paimama bent po vieną ėminį.

Jei tinka, ėminius galima imti keičiant partijos vietą (kraunant arba iškraunant).

6.2.A.2   Supakuoti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių pakuočių ėminiams imti, kaip nurodyta 5.A.2. punkte, dalis kiekvienos pakuotės turinio paimama bertuve arba zondu. Prireikus ėminiai imami, atskirai ištuštinus pakuotes. Prireikus atskirai kiekvieno jungtinio ėminio gabalai turi būti sutrupinti juos atskiriant nuo ėminio ir grąžinti atgal.

6.2.A.3   Homogeniniai arba homogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių talpyklų ėminiams imti, kaip nurodyta 5.A.2 punkte, jų turinys prireikus homogenizuojamas ir iš kiekvienos talpyklos paimamas tam tikras kiekis.

Atskiruosius ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį.

6.2.A.4   Nehomogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių talpyklų ėminiams imti, kaip nurodyta 5.A.2 punkte, ėminiai imami iš skirtingų lygių.

Be to, ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį, tačiau pirmosios frakcijos turėtų būti išpiltos lauk.

Abiem atvejais visas paimto ėminio tūris neturi būti mažesnis kaip 10 l.

6.2.A.5   Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Atrinkus ėminiams imti reikalingą kiekį pašarų briketų arba laižalų, kaip nurodyta 5.A.2.punkte, imama kiekvieno briketo arba laižalo dalis.

6.2.B.   Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus, kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose, pvz., aflatoksinus, rugių skalsę, ricinžolę ir crotalaria

Partija vizualiai dalijama į tam tikrą skaičių maždaug vienodų dalių, atitinkančių 5.B.3 punkte numatytą jungtinių ėminių skaičių. Jeigu šis skaičius didesnis už 1,5.B.2 punkte numatytas suminis atskirųjų ėminių skaičius paskirstomas maždaug vienodai skirtingoms dalims. Tada imami maždaug tokie vienodo dydžio ėminiai (4), kad suminis ėminių kiekis iš kiekvienos dalies būtų ne mažesnis kaip kiekvienam jungtiniam ėminiui gauti būtinas 4 kg kiekis. Iš skirtingų dalių paimti atskirieji ėminiai neturi būti sujungiami.

6.3   Jungtinių ėminių ruošimas

6.3.A.   Kontroliuojant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

Atskirieji ėminiai sumaišomi, kad būtų gautas vienas jungtinis ėminys.

6.3.B.   Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus, kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose, pvz., aflatoksinus, rugių skalsę, ricinžolę ir crotalaria

Atskirieji ėminiai iš kiekvienos partijos dalies sumaišomi ir gaunamas 5.B.3 punkte nurodytas jungtinių ėminių skaičius, imantis priemonių užrašyti kiekvieno jungtinio ėminio kilmę.

6.4   Galutinių ėminių ruošimas

Kiekvieno jungtinio ėminio medžiaga gerai sumaišoma, kad būtų gautas homogenizuotas ėminys (5) Prireikus jungtinis ėminys iš pradžių sumažinamas bent iki 2 kg arba dviejų litrų (sumažintasis ėminys) mechaniniu arba automatiniu dalytuvu arba taikant ketvirčiavimo metodą.

Tada ruošiami bent trys maždaug vienodo kiekio galutiniai ėminiai, atitinkantys 5.A.4 arba 5.B.4 punktų kiekybinius reikalavimus. Kiekvienas ėminys sudedamas į atitinkamą talpyklą. Imamasi visų reikalingų atsargumo priemonių, kad gabenant arba saugant negalėtų pasikeisti ėminio sudėtis, jis nebūtų užterštas arba sufalsifikuotas.

6.5   Galutinių ėminių pakavimas

Talpyklos arba pakuotės plombuojamos ir ženklinamos (visa etiketė turi būti po plomba) taip, kad jų nebūtų galima atidaryti, nepažeidus plombos.

7.   ĮRAŠAI APIE ĖMINIUS

Turi būti daromi įrašai apie visus ėminius, kad vienareikšmiškai būtų galima nustatyti kiekvieną partiją.

8.   ĖMINIŲ PASKIRTIES VIETA

Bent vienas kiekvieno jungtinio ėminio galutinis ėminys kuo skubiau siunčiamas į įgaliotąją kontrolės laboratoriją kartu su analizę atliekančiam asmeniui būtina informacija.

---

(1)  Jei gautas skaičius yra trupmena, ji turėtų būti suapvalinama iki sveiko skaičiaus.

(2)  Jei pakuotės arba talpyklos turinio masė ne didesnė kaip 1 kg arba tūris ne didesnis kaip 1 l ir pašarų briketų arba laižalų masė ne didesnė kaip 1 kg, atskirasis ėminys yra vienos pirminės pakuotės arba talpyklos, vieno briketo arba laižalo turinys.

(3)  Metodai, numatyti 5.A, taikomi aflatoksinams, rugių skalsei, ricinžolei ir crotalaria kontroliuoti visaverčiuose pašaruose ir pašarų papilduose.

(4)  Supakuotų pašarų, iš kurių imami ėminiai, pakuočių turinio dalis paimama zondu arba bertuve, prieš tai atskirai ištuštinus pakuotes, jei reikia.

(5)  Prireikus atskirai kiekvieno jungtinio ėminio visi gabalai turi būti sutrupinti juos atskiriant nuo ėminio ir grąžinti atgal.

II PRIEDAS

BENDROSIOS NUOSTATOS DĖL PAŠARŲ ANALIZĖS METODŲ

A.   ĖMINIŲ RUOŠIMAS ANALIZEI

1.   Tikslas

Toliau aprašytos procedūros taikomos analizei ruošiant į kontrolės laboratorijas atsiųstus galutinius ėminius, paimtus pagal I priede pateiktas nuostatas.

Šie ėminiai turi būti ruošiami taip, kad pagal analizės metodą sverti numatyto kiekio ėminiai būtų vienalyčiai ir atitiktų galutinius ėminius.

2.   Taikytinos atsargumo priemonės

Ėminių ruošimo procedūra, kurios reikia laikytis, priklauso nuo taikomo analizės metodo. Todėl labai svarbu užtikrinti, kad ėminių ruošimo procedūra atitiktų taikomą analizės metodą.

Visi būtinosios operacijos turi būti atliktos taip, kad kiek įmanoma būtų išvengta ėminio užteršimo ir jo sudėties pokyčių.

Malama, maišoma ir sijojama kiek įmanoma greičiau, kad ėminį kuo mažiau veiktų oras ir šviesa. Nenaudojami malūnėliai ir smulkintuvai, kurie gali gerokai įkaitinti ėminį.

Šilumai ypač jautrių pašarų ėminius rekomenduojama malti rankiniu būdu. Be to, užtikrinama, kad pati aparatūra nebūtų užteršimo mikroelementais šaltiniu.

Jei ėminio paruošti neįmanoma gerokai nepakintant jo drėgmės kiekiui, jis nustatomas prieš ėminio ruošimą ir jį paruošus pagal III priedo A dalyje pateiktą metodą.

3.   Procedūra

Ėminys dalijamas į analizei ir palyginimui skirtus atitinkamus poėminius, taikant reikiamus dalijimo būdus, pvz., pakaitinį perkasimą, stacionarųjį arba sukamąjį latakinį dalytuvą. Kūgio supylimo ir ketvirčiavimo metodas nerekomenduojamas, nes gali būti gauti poėminiai su didele dalijimo paklaida. Palyginamasis ėminys laikomas tinkamame švariame ir sausame, sandariai uždaromame inde, ir bent 100 g poėminiai ruošiami analizei kaip nurodyta toliau.

3.1   Pašarai, kuriuos galima malti be paruošimo

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, prireikus visas sumaltas ėminys sijojamas per sietą su kvadratinėmis 1 mm dydžio akutėmis (pagal ISO R565 rekomendaciją). Vengiama malti labai smulkiai.

Sijotas ėminys sumaišomas ir sudedamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą indą. Dar kartą sumaišoma prieš sveriant analizei reikiamą ėminio kiekį.

3.2   Pašarai, kurie prieš malant džiovinami

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, ėminys džiovinamas drėgmės kiekiui sumažinti iki 8–12 % taikant pradinio džiovinimo procedūrą, aprašytą III priedo A dalyje pateikto drėgmės nustatymo metodo 4.3 punkte. Tada tęsiama, kaip nurodyta 3.1 skirsnyje.

3.3   Skystieji arba pusiau skysti pašarai

Ėminys supilamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą indą. Dar kartą sumaišoma prieš sveriant analizei reikiamą ėminio kiekį.

3.4   Kiti pašarai

Ėminiai, kurių neįmanoma paruošti pagal kurią nors pirmiau pateiktą procedūrą, apdorojami taikant bet kurią kitą procedūrą, kuri užtikrintų, kad analizei pasverti ėminiai būtų vienalyčiai ir atitiktų galutinius ėminius.

4.   Ėminių laikymas

Ėminiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Vitaminų analizei skirti ėminiai arba šviesai ypač jautrūs ėminiai laikomi rudo stiklo induose.

B.   NUOSTATOS DĖL ANALIZĖS METODAMS NAUDOJAMŲ REAGENTŲ IR APARATŪROS

1.	Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. g.). Atliekant pėdsakų analizę, reagentų grynumas turi būti patikrintas atliekant tuščiąjį bandymą. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali tekti papildomai gryninti reagentus.

2.

Visoms tirpalų ruošimo, skiedimo, skalavimo arba plovimo operacijoms, apie kurias kalbama analizės metoduose, nenurodant naudojamo tirpiklio arba skiediklio tipo, turi būti naudojamas vanduo. Paprastai vanduo demineralizuojamas arba distiliuojamas. Konkrečiais atvejais, nurodytais analizės metode, jam turi būti taikomos specialios gryninimo procedūros.

3.	Atsižvelgiant į paprastai kontrolės laboratorijų turimą įrangą, analizės metoduose nurodomi tik specialios paskirties arba tam tikru būdu naudojami prietaisai ir aparatūra. Jie turi būti švarūs, ypač kai reikia nustatyti mažus cheminių medžiagų kiekius.

C.   ANALIZĖS METODŲ TAIKYMAS IR REZULTATŲ IŠRAIŠKA

1.   Ekstrahavimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra ekstrahavimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta ekstrahavimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gautas ekstrahavimo veiksmingumas atitinka metodu nustatytos procedūros veiksmingumą.

2.   Gryninimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra gryninimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta gryninimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gauti analizės rezultatai atitinka rezultatus, gautus taikant metodu nustatytą procedūrą.

3.   Taikyto analizės metodo pateikimas ataskaitoje

Paprastai kiekvienai pašaruose esančiai cheminei medžiagai nustatyti pateikiamas vienas analizės metodas. Jei pateikiami keli metodai, kontrolės laboratorijos taikomas konkretus metodas turi būti nurodytas analizės ataskaitoje.

4.   Nustatymų skaičius

Analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas turi būti tinkamo pakartojamumo vidutinė vertė, gauta atliekant mažiausiai du atskirų ėminio dalių nustatymus.

Tačiau, jei analizuojant nepageidaujamas medžiagas, pirmojo nustatymo rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros.

Jei atliekant nurodyto medžiagos arba sudedamosios dalies kiekio kontrolę, pirmojo nustatymo rezultatas patvirtina nurodytą kiekį, t. y. analizės rezultatas atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros.

Kai kuriais atvejais priimtinas kitimo intervalas yra apibrėžtas teisės aktuose, pvz., Tarybos direktyvoje 79/373/EEB (1).

5.   Analizės rezultato pateikimas ataskaitoje

Analizės rezultatas turi būti išreikštas analizės metode nustatytu būdu; nurodant atitinkamą reikšminių skaitmenų skaičių ir prireikus darant pataisą dėl drėgmės kiekio galutiniame ėminyje prieš ruošimą.

6.   Matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant nepageidaujamų medžiagų analizę

Dėl nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Direktyvoje 2002/32/EB, įskaitant dioksinus ir dioksinų tipo PCB, laikoma, kad gyvūnų pašarams skirtas produktas neatitinka nustatyto didžiausio kiekio, jei manoma, kad analizės rezultatas viršija didžiausią kiekį, įskaitant išplėstinę matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą. Atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija, atlikus išgavos dydžio pataisą ir ir atėmus išplėstinę matavimo neapibrėžtį. Ši procedūra taikoma tais atvejais, kai galima įvertinti analizės metodo matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą (tai, pvz., neįmanoma, kai atliekama mikroskopinė analizė).

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį):

a)	su pataisa dėl išgavos dydžio, nurodant išgavos dydį. Pataisa dėl išgavos dydžio nebūtina, jei jis yra 90–110 %;

b)	kaip „x +/- U“, čia x – analizės rezultatas, U – išplėstinė matavimo neapibrėžtis, taikant aprėpties faktorių 2, kuris užtikrina maždaug 95 % patikimumo lygį.

Tačiau jei analizės rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, ir su ta sąlyga, kad taikomos atitinkamos kokybės procedūros, o analizės tikslas yra tik patikrinti atitiktį teisinėms nuostatoms, analizės rezultatą būtų galima pateikti ataskaitoje be išgavos dydžio pataisos ir išgavos dydžio bei matavimo neapibrėžties tais atvejais galima nenurodyti.

---

(1)  OL L 86, 1979 4 6, p. 30.

III PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI, TAIKOMI PAŠARINIŲ MEDŽIAGŲ IR KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ SUDĖČIAI KONTROLIUOTI

A.   DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų drėgmės kiekį. Jei pašarai turi lakiųjų medžiagų, pvz., organinių rūgščių, reikia turėti omenyje, kad nustatant drėgmės kiekį nustatomas didelis kiekis lakiųjų medžiagų.

Jis netaikomas analizuojant pieno produktus kaip pašarus, mineralines medžiagas ir mišinius, kuriuos iš esmės sudaro mineralinės medžiagos, gyvūninius ir augalinius riebalus bei aliejus arba aliejingąsias sėklas ir vaisius.

2.   Metodas

Ėminys džiovinamas nurodytomis sąlygomis, kurios priklauso nuo pašarų tipo. Masės sumažėjimas nustatomas sveriant. Tiriant kietuosius pašarus, kurių drėgmės kiekis didelis, būtina atlikti pradinį džiovinimą.

3.   Aparatūra

3.1

Smulkintuvas, pagamintas iš drėgmės nesugeriančių medžiagų, kuris būtų lengvai valomas, kuriuo būtų galima greitai ir vienodai susmulkinti ėminį, per daug jam neįkaistant, ir kuris kiek įmanoma apsaugotų ėminį nuo sąlyčio su išorės oru ir atitiktų 4.1.1 ir 4.1.2 nustatytus reikalavimus (pvz., plaktukiniai ar vandeniu aušinami mikrosmulkintuvai, sudedamieji kūginiai malūnėliai, mažo apsisukimų dažnio arba krumpliaratiniai smulkintuvai).

3.2	Analizinės svarstyklės, tikslumas 1 mg.

3.3	Sausi korozijai atsparaus metalo arba stikliniai indai su sandariai uždengiamais dangčiais; darbinis paviršius ėminiui paskleisti maždaug 0,3 g/cm2 tankiu.

3.4	Elektrinė pastovios temperatūros džiovinimo spinta (± 2 oC), tinkamai ventiliuojama ir užtikrinanti greitą temperatūros reguliavimą (1).

3.5	Reguliuojama elektrinė vakuuminė džiovinimo spinta, turinti alyvos siurblį ir mechanizmą, kuriuo galima įleisti karšto sauso oro, arba naudojanti džioviklį (pvz., kalcio oksidą).

3.6	Eksikatorius su stora perforuota metalo arba porceliano plokšte ir veiksmingu džiovikliu.

4.   Procedūra

N.B	Šiame skirsnyje aprašyti veiksmai turi būti atliekami iškart po ėminių pakuočių atidarymo. Analizė turi būti atliekama bent du kartus.

4.1   Ėminių ruošimas

4.1.1   Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.1.2 ir 4.1.3

Paimama bent 50 g ėminio. Prireikus ėminys susmulkinamas arba sumalamas taip, kad būtų išvengta drėgmės kiekio pokyčio (žr. 6).

4.1.2   Javai ir kruopos

Paimama bent 50 g ėminio. Susmulkinama į daleles, kurių bent 50 % išbyra per 0,5 mm akučių sietą ir ant 1 mm skersmens apvalių akučių sieto lieka ne daugiau kaip 10 %.

4.1.3   Skysti ar pastų tipo pašarai, kuriuos daugiausia sudaro aliejai ir riebalai

Maždaug 25 g ėminio pasveriama 10 mg tikslumu, įdedamas reikiamas kiekis sauso smėlio, pasverto 10 mg tikslumu, ir maišoma tol, kol gaunamas vienalytis produktas.

4.2   Džiovinimas

4.2.1   Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.2.2 ir 4.2.3

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 1 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 103 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama keturias valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 103 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

Jei pašarus daugiausia sudaro aliejai ir riebalai, džiovinama spintoje dar 30 min 130 oC temperatūroje. Dviejų svėrimo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.2.2   Javai, miltai, kruopos ir rupūs miltai

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 130 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama dvi valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 130 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

4.2.3

Kombinuotieji pašarai, kurie turi daugiau nei 4 % sacharozės arba laktozės: pašarinės žaliavos, pvz., saldžiosios ceratonijos ankštys, hidrolizuotieji javų produktai, salyklas, džiovinti runkelių griežiniai, žuvų hidrolizatai ir cukraus žlaugtai; kombinuotieji pašarai, turintys daugiau nei 25 % mineralinių druskų, įskaitant kristalizacinį vandenį. Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į vakuuminę džiovinimo spintą (3.5), įkaitintą iki 80–85 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Slėgis sumažinamas iki 100 mm Hg stulpelio ir tokiame slėgyje keturias valandas džiovinama karšto sauso oro srove arba džiovikliu (20 ėminių reikia apie 300 g). Pastaruoju atveju, pasiekus nurodytą slėgį, vakuuminis siurblys išjungiamas. Džiovinimo trukmė skaičiuojama nuo to momento, kai džiovinimo spintos temperatūra vėl pakyla iki 80–85 oC. Džiovinimo spintos slėgis atsargiai padidinamas iki atmosferos slėgio. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Džiovinama dar 30 min vakuuminėje džiovinimo spintoje 80–85 oC temperatūroje ir dar kartą pasveriama. Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.3   Pradinis džiovinimas

4.3.1   Pašarai, išskyrus išvardytus 4.3.2

Kietieji labai drėgni pašarai, kuriuos sunku susmulkinti, turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu (prireikus presuotus arba į gabalus sulipusius pašarus galima kažkiek sutrupinti). Džiovinama džiovinimo spintoje 60–70 oC temperatūroje tol, kol drėgmės kiekis nesumažėja iki 8–12 %. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas valandą vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.1, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.1 arba 4.2.3, atsižvelgiant į pašarų tipą.

4.3.2   Javai

Javai, kurių drėgmės kiekis didesnis nei 17 % turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu. 5–7 min džiovinama džiovinimo spintoje 130 oC temperatūroje. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas dvi valandas vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.2, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.2.

5.   Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio masės procentais (X) apskaičiuojamas pagal šias formules:

5.1   Džiovinimas, kai netaikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m	=	tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais;
m0	=	išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.2   Džiovinimas, kai taikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m	=	tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais,
m1	=	tiriamojo ėminio svoris po pradinio džiovinimo gramais,
m2	=	tiriamojo ėminio svoris po smulkinimo arba malimo gramais,
m0	=	išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.3   Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečių matavimų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 0,2 % drėgmės kiekio absoliučiosios vertės.

6.   Pastaba

Jei paaiškėja, kad ėminį būtina susmulkinti, ir pastebima, kad produkto drėgmės kiekis pakito, pašarų komponentų analizės rezultatus reikia perskaičiuoti pagal pradinės būklės ėminio drėgmės kiekį.

B.   GYVŪNINIŲ IR AUGALINIŲ RIEBALŲ BEI ALIEJŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvūninės ir augalinės kilmės riebaluose bei aliejuose.

2.   Metodas

Ėminys džiovinamas 103 oC temperatūroje iki pastoviosios masės (masės sumažėjimas tarp dviejų paeiliui atliekamų svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg). Nuodžiūvis nustatomas sveriant.

3.   Aparatūra

3.1	Indas plokščiu dugnu iš korozijai atsparios medžiagos, skersmuo 8–9 cm, aukštis – 3 cm.

3.2	Maždaug 10 cm ilgio gyvsidabrio termometras, su padalomis nuo 80 oC iki bent 110 oC, su pastorintu burbuliuku ir plėtimosi vamzdžiu viršutiniame gale.

3.3	Smėlio vonia arba elektrinė kaitlentė.

3.4	Eksikatorius su veiksmingu džiovikliu.

3.5	Analizinės svarstyklės.

4.   Procedūra

Į sausą pasvertą indą (3.1), į kurį įdėtas termometras (3.2), 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuoto ėminio. Nuolat maišant termometru, kaitinama ant smėlio vonios arba kaitlentės (3.3) taip, kad maždaug per 7 min temperatūra pasiektų 90 oC.

Kaitinimas sumažinamas, stebint, kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai. Temperatūra turi būti ne aukštesnė kaip 105 oC. Maišoma toliau, braukiant per indo dugną tol, kol nebesusidaro burbuliukų.

Siekiant užtikrinti visišką drėgmės pašalinimą, dar keletą kartų kaitinama iki 103 oC ± 2 oC, kaskart tarp kaitinimų atvėsinant ėminį iki 93 oC. Tada paliekama eksikatoriuje (3.4) atvėsti iki kambario temperatūros ir pasveriama. Šis veiksmas kartojamas tol, kol ėminio svoris tarp iš eilės atliekamų kaitinimo veiksmų sumažėja ne daugiau kaip 2 mg.

N.B	Ėminio svorio padidėjimas po kartotinių kaitinimo veiksmų rodo, kad oksiduojasi riebalai, todėl šiuo atveju rezultatai skaičiuojami pagal svėrimo duomenis, gautus prieš tai, kai svoris pradėjo didėti.

5.   Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio procentine dalimi (X) apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m	=	tiriamojo ėminio svoris gramais;
m1	=	indo su turiniu svoris prieš kaitinimą gramais;
m2	=	indo du turiniu svoris po kaitinimo gramais.

Mažesni nei 0,05 % rezultatai turi būti užrašomi kaip „mažiau nei 0,05 %“.

Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečiai atliktos drėgmės kiekio analizės rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,05 % absoliučiąja verte.

C.   ŽALIŲ BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių baltymų kiekį pašaruose pagal Kjeldalio metodu nustatomą azoto kiekį.

2.   Metodas

Ėminys skaidomas sieros rūgštimi esant katalizatoriui. Rūgštus tirpalas šarminamas natrio hidroksido tirpalu. Gautas amoniakas distiliuojamas ir surenkamas žinomame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius titruojamas natrio hidroksido standartiniu tirpalu.

Pagal kitą metodą išsiskyręs amoniakas distiliuojamas į tirpalą su boro rūgšties pertekliumi, tada titruojama vandenilio chlorido rūgšties arba sieros rūgšties tirpalu.

3.   Reagentai

3.1	Kalio sulfatas

3.2	Katalizatorius: vario (II) oksidas CuO arba vario (II) sulfato pentahidratas CuSO4 5H2O

3.3	Cinko granulės

3.4	Sieros rūgštis, ρ 20 = 1,84 g/ml

3.5	Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6	Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7	Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8	Indikatorius metilraudonasis: 300 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio, σ = 95–96 % (V/V)

3.9	Natrio hidroksido tirpalas (galima naudoti techninį hidroksidą) β = 40 g/100 ml (m/V: 40 %)

3.10	Natrio hidroksidas, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11	Natrio hidroksidas, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12	Pemzos granulės, išplautos vandenilio chlorido rūgštyje ir iškaitintos

3.13	Acetanilidas (lyd. temp. = 114 oC, N kiekis = 10,36 %)

3.14	Sacharozė (neturinti azoto)

3.15	Boro rūgštis (H3BO3)

3.16	Indikatoriaus metilraudonojo tirpalas: 100 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

3.17	Bromkrezolio žaliojo tirpalas: 100 mg bromkrezolio žaliojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

3.18

Boro rūgšties tirpalas (10 g/l–40 g/l atsižvelgiant į naudojamą aparatūrą) Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, į boro rūgšties tirpalus turi būti įdėta metilraudonojo ir bromkrezolio žaliojo indikatorių. Jei ruošiamas 1 litras boro rūgšties tirpalo, prieš skiedžiant iki žymės įpilama 7 ml metilraudonojo indikatoriaus tirpalo (3.16) ir 10 ml bromkrezolio žaliojo tirpalo (3.17). Priklausomai nuo naudojamo vandens, skirtingų partijų boro rūgšties tirpalų pH vertė gali skirtis. Dažnai būtina koreguoti nedideliu šarmo tirpalo tūriu, kad būtų gautas teigiamas tuščiasis ėminys. Pastaba. Paprastai tinkamai korekcijai pakanka maždaug 3 ml–4 ml NaOH (3.11) 1 litrui 10 g/l boro rūgšties. Tirpalas laikomas kambario temperatūroje, apsaugotas nuo šviesos ir amoniako garų šaltinių.

3.19

Vandenilio chlorido rūgšties standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas c(HCl) = 0,10 mol/l Pastaba. Galima naudoti kitokios koncentracijos tūrinės titrimetrijos tirpalus (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ir 3.19), jei apskaičiuojant būtų daroma korekcija dėl koncentracijos. Koncentracijos vertės visuomet išreiškiamos keturiais skaičiais po kablelio.

4.   Aparatūra

Aparatūra, tinkama skaidyti, distiliuoti ir titruoti pagal Kjeldalio procedūrą.

5.   Procedūra

5.1   Skaidymas

1 g ėminio pasveriama 0,001 g tikslumu ir ėminys supilamas į skaidymo aparato kolbą. Įdedama 15 g kalio sulfato (3.1) ir atitinkamas kiekis katalizatoriaus (3.2) (0,3–0,4 g vario oksido arba 0,9–1,2 g vario (II) sulfato pentahidrato), įpilama 25 ml sieros rūgšties (3.4, prireikus įmetamos kelios pemzos granulės (3.12) ir sumaišoma.

Kolba iš pradžių šildoma, kartkartėmis ją sukiojant, ant nestiprios ugnies tol, kol masė suanglėja ir nelieka putų; tada šildoma stipriau tol, kol tirpalas pradeda nuolat virti. Kaitinimas yra pakankamas, jei verdanti rūgštis kondensuojasi ant kolbos sienelių. Reikia žiūrėti, kad neperkaistų šoninės kolbos sienelės ir prie jų nepriliptų organinių medžiagų dalelių.

Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias, virinama dar dvi valandas, vėliau paliekama atvėsti.

5.2   Distiliavimas

Atsargiai įpilama pakankamai vandens, kad visiškai ištirptų sulfatai. Paliekama atvėsti ir įdedamos kelios cinko granulės (3.3). Tęsiama pagal 5.2.1 arba 5.2.2.

5.2.1   Distiliavimas į sieros rūgštį

Į distiliavimo aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (3.5) arba (3.7) tirpalo, atsižvelgiant į tai, kiek ėminyje galėtų būti azoto. Įlašinami keli lašai metilraudonojo indikatoriaus (3.8).

Skaidymo aparato kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus, kurio antgalis ne mažiau kaip per centimetrą įmerkiamas į surinkimo kolboje esantį skystį (žr. 8.3 pastabą). Neleidžiant amoniakui garuoti (žr. 8.1 pastabą), į kolbą lėtai įpilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Kolba kaitinama tol, kol amoniakas baigiamas distiliuoti.

5.2.2   Distiliavimas į boro rūgštį

Jei amoniakas distiliate titruojamas rankiniu būdu, taikoma toliau nurodyta procedūra. Jei distiliavimo įrenginys yra visiškai automatizuotas, įskaitant amoniako distiliate titravimą, laikomasi gamintojo instrukcijų dėl distiliavimo įrenginio naudojimo.

Surinkimo kolba su 25 ml–30 ml boro rūgšties tirpalo (3.18) statoma po kondensatoriaus išleidžiamuoju antgaliu taip, kad tiekimo vamzdis būtų žemiau boro rūgšties perteklių turinčio tirpalo paviršiaus. Distiliavimo įrenginys nustatomas dozuoti 50 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Distiliavimo įrenginys naudojamas pagal gamintojo instrukcijas ir amoniakas distiliuojamas įpilant natrio hidroksido tirpalo. Distiliatas surenkamas į boro rūgšties tirpalą. Distiliato kiekis (distiliavimo garais trukmė) priklauso nuo azoto kiekio ėminyje. Laikomasi gamintojo instrukcijų.

Pastaba.

Pusiau automatizuotame distiliavimo įrenginyje natrio hidroksido pertekliaus įpylimas ir distiliavimas garais atliekamas automatiškai.

5.3   Titravimas

Tęsiama pagal 5.3.1 arba 5.3.2.

5.3.1   Sieros rūgštis

Atsižvelgiant į naudotos sieros rūgšties koncentraciją, sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamas natrio šarmo (3.10 arba 3.11) tirpalu tol, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas.

5.3.2   Boro rūgštis

Surinkimo kolbos turinys titruojamas iš biuretės vandenilio chlorido rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.19) arba sieros rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.6) ir užrašomas sunaudoto titranto tūris.

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, ekvivalentinis taškas pasiekiamas, pirmą kartą atsiradus tirpalo rožinei spalvai. Biuretės rodmuo įvertinamas 0,05 ml tikslumu. Apšviesta magnetinė maišyklė arba fotometrinis detektorius gali padėti lengviau pamatyti ekvivalentinį tašką.

Tai galima atlikti automatiškai, naudojant distiliavimo garais įrenginį su automatiniu titravimu.

Konkretus distiliatorius (titratorius) naudojamas pagal gamintojo instrukcijas.

Pastaba.

Naudojant automatizuotą titravimo sistemą, titruoti pradedama iškart, kai prasideda distiliavimas ir sunaudojama 1 % boro rūgšties tirpalo (3.18). Jei naudojamas visiškai automatizuotas distiliavimo įrenginys, amoniako automatinį titravimą galima atlikti naudojant potenciometrinę pH sistemą ekvivalentiniam taškui nustatyti. Šiuo atveju naudojamas automatinis titratorius su pH-metru. pH-metras tinkamai sukalibruotas pH 4–pH 7 intervale pagal įprastas laboratorines pH-metro kalibravimo procedūras. Titravimo ekvivalentinis taškas pagal pH atitinka pH vertę 4,6, šis taškas yra stačiausias titravimo kreivės taškas (perlinkio taškas).

5.4   Tuščiasis bandymas

Siekiant patvirtinti, kad reagentai neturi azoto, atliekamas tuščiasis bandymas (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), vietoj ėminio naudojant 1 g sacharozės (3.14).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojama pagal 6.1 arba 6.2.

6.1   Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.1

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

V0	=	NaOH (3.10 arba 3.11) tūris, sunaudotas tuščiajam bandymui, ml;
V1	=	NaOH (3.10 arba 3.11) tūris, sunaudotas ėminiui titruoti, ml;
c	=	natrio hidroksido (3.10 arba 3.11) koncentracija, mol/l;
m	=	ėminio svoris, g.

6.2   Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.2

6.2.1   Titravimas vandenilio chlorido rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m	=	tiriamosios dalies svoris, g;
c	=	vandenilio chlorido rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (3.19) koncentracija, mol/l;
V0	=	tuščiajam bandymui sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml;
V1	=	tiriamajai daliai sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml.

6.2.2   Titravimas sieros rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m	=	tiriamosios dalies svoris, g;
c	=	sieros rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (3.6) koncentracija, mol/l;
V0	=	tuščiajam bandymui sunaudotas sieros rūgšties (3.6) tūris, ml;
V1	=	tiriamajai daliai sunaudotas sieros rūgšties (3.6) tūris, ml.

7.   Metodo tikrinimas

7.1   Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų atliekant du lygiagrečius to paties ėminio matavimus, skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	0,2 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis mažesnis nei 20 %,

—	1,0 % didžiausios vertės, kai žalių baltymų kiekis 20–40 %,

—	0,4 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis didesnis nei 40 %.

7.2   Tikslumas

Atliekama 1,5–2,0 g acetanilido (3.13) analizė (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), įdėjus 1 g sacharozės (3.14). 1 g acetilanilido sunaudoja 14,80 ml sieros rūgšties (3.5). Išgavos dydis turi būti ne mažesnis nei 99 %.

8.   Pastabos

8.1

Aparatūra gali būti rankinio, pusiau automatinio arba automatinio tipo. Jei naudojama aparatūra, kai ėminį po skaidymo reikia supilti į distiliavimo įrenginį, turi būti supilama be nuostolių. Jei distiliavimo aparato kolba neturi lašinamojo piltuvo, natrio šarmo tirpalas įpilamas prieš pat kolbą prijungiant prie kondensatoriaus, skystį iš lėto pilant kolbos sienele.

8.2	Jei skaidymo produktas sukietėja, analizė pradedama iš naujo su didesniu nei pirmiau nurodyta sieros rūgšties tirpalo (3.4) kiekiu.

8.3	Produktams, kuriuose azoto kiekis nedidelis, į surinkimo kolbą įpilamo sieros rūgšties tirpalo (3.7) tūris prireikus gali būti sumažintas iki 10 arba 15 ml, skiedžiant vandeniu iki 25 ml.

8.4

Atliekant įprastą analizę, galima taikyti alternatyviuosius metodus žalių baltymų kiekiui nustatyti, bet šioje C dalyje aprašytas Kjeldalio metodas yra pamatinis metodas. Rezultatų gautų alternatyviaisiais metodais (pvz., DUMAS) lygiavertiškumas palyginti su pamatiniu metodu turi būti įrodytas kiekvienai matricai atskirai. Kadangi alternatyviuoju metodu gauti rezultatai ir pamatiniu metodu gauti rezultatai gali šiek tiek skirtis, netgi patikrinus lygiavertiškumą, analizės ataskaitoje būtina nurodyti žalių baltymų kiekiui nustatyti taikytą analizės metodą.

D.   KARBAMIDO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti karbamido kiekį pašaruose.

2.   Metodas

Ėminys suspenduojamas vandenyje kartu su skaidrinančiąja medžiaga. Suspensija filtruojama. Dedama 4-dimetilaminobenzaldehido (4-DMAB) ir karbamido kiekis filtrate nustatomas matuojant optinį tankį, esant bangos ilgiui 420 nm.

3.   Reagentai

3.1	4-dimetilaminobenzaldehido tirpalas: 1,6 g 4-DMAB ištirpinama 100 ml 96 % etanolio ir įpilama 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 1,19 g/ml). Šį reagentą galima laikyti ne ilgiau kaip dvi savaitės.

3.2	Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3	Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4	Aktyvintosios anglys, kurios nesugeria karbamido (turi būti patikrinta).

3.5	Karbamido 0,1 % (m/V) tirpalas.

4.   Aparatūra

4.1	Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

4.2	Mėgintuvėliai: 160 × 16 mm su šlifo kamščiais.

4.3	Spektrofotometras.

5.   Procedūra

5.1   Ėminio analizė

1 mg tikslumu pasveriama 2 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintų anglių (3.4) supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens ir 5 ml Carrez I (3.2) tirpalo, maždaug 30 s maišoma ir įpilama 5 ml Carrez II (3.3) tirpalo. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas vartytuve. Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės, sumaišomas ir filtruojamas.

Į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais įpilama 5 ml skaidraus bespalvio filtrato, 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1) ir sumaišoma. Mėgintuvėliai statomi į vandens vonią 20 oC (+/- 4 oC) temperatūroje. Po penkiolikos minučių spektrofotometru matuojamas ėminio tirpalo optinis tankis, esant 420 nm bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu naudojamas tuščiam ėminiui ruošti naudojamų reagentų tirpalas.

5.2   Kalibravimo kreivė

Į 100 ml matavimo kolbas įpilama 1, 2, 4, 5 ir 10 ml karbamido tirpalo (3.5) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Paimama po 5 ml kiekvieno tirpalo, į kiekvieną iš jų įpilama 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1), sumaišoma ir, kaip nurodyta anksčiau, matuojamas jų optinis tankis, lyginant su kontroliniu tirpalu, turinčiu 5 ml 4-DMAB ir 5 ml vandens, neturinčio karbamido. Brėžiama kalibravimo kreivė.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal kalibravimo kreivę nustatomas karbamido kiekis ėminyje.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastabos

7.1	Tais atvejais, kai karbamido kiekis yra didesnis nei 3 %, imama 1 g ėminio arba pradinis tirpalas skiedžiamas tiek, kad jo 500 ml būtų ne daugiau nei 50 mg karbamido.

7.2	Tuo atveju, kai karbamido yra mažai, ėminio kiekis padidinamas tiek, kad filtratas dar liktų skaidrus ir bespalvis.

7.3	Jei ėminyje yra nesudėtingų azoto junginių, pvz., aminorūgščių, optinis tankis matuojamas esant 435 nm bangos ilgiui.

E.   LAKIŲJŲ AZOTO BAZIŲ NUSTATYMAS

I.   MIKRODIFUZIJOS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančių lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku.

2.   Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos mikrodifuzijos būdu, naudojant kalio karbonato tirpalą, surenkamos boro rūgšties tirpale ir titruojamos sieros rūgštimi.

3.   Reagentai

3.1	Trichloracto rūgšties tirpalas, 20 % (m/V).

3.2	Indikatorius: 33 mg bromkrezolio žaliojo ir 65 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml 95–96 % (V/V) etanolio.

3.3

Boro rūgšties tirpalas: 1 l matavimo kolboje ištirpinama 10 g boro rūgšties, 200 ml 95–96 % (V/V) etanolio ir 700 ml vandens. Įpilama 10 ml indikatoriaus (3.2). Sumaišoma ir, jei reikia, gaunama šviesiai raudona tirpalo spalva, įpilant natrio hidroksido tirpalo. 1 ml šio tirpalo suriša ne daugiau nei 300 μg NH3.

3.4	Sotusis kalio karbonato tirpalas: 100 ml verdančio vandens ištirpinama 100 g kalio karbonato. Atvėsinama ir filtruojama.

3.5	Sieros rūgštis 0,01 mol/l.

4.   Aparatūra

4.1	Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

4.2	Stiklinės arba plastikinės Conway kiuvetės (žr. schemą).

4.3	Mikrobiuretės, graduotos 1/100 ml padalomis.

5.   Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Pipete įlašinama 1 ml boro rūgšties tirpalo (3.3) į Conway kiuvetės centrinę dalį ir 1 ml ėminio filtrato į kiuvetės išorinį žiedą. Iš dalies uždengiama tepalu suteptu dangčiu. Į išorinį žiedą greitai įlašinama 1 ml sočiojo kalio karbonato tirpalo (3.4) ir uždengiama taip, kad į kiuvetę nepatektų oro. Kiuvetė atsargiai sukiojama apie ašį horizontalioje plokštumoje taip, kad abu reagentai susimaišytų. Inkubuojama kambario temperatūroje bent keturias valandas arba 40 oC temperatūroje vieną valandą.

Lakiosios bazės boro rūgšties tirpale iš mikrobiuretės (4.3) titruojamos 0,01 mol/l sieros rūgštimi (3.5).

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,01 mol/l H2SO4 atitinka 0,34 mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

—	10 % santykinės vertės, kai amoniako kiekis mažesnis nei 1,0 %;

—	0,1 % absoliučiąja verte, kai amoniako kiekis 1,0 % arba didesnis.

7.   Pastaba

Jei amoniako kiekis ėminyje didesnis nei 0,6 %, pradinis filtratas skiedžiamas.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II   DISTILIAVIMO METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku, žuvies miltuose, kuriuose beveik nėra karbamido. Jį galima taikyti tik mažesniam nei 0,25 % amoniako kiekiui.

2.   Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos virimo temperatūroje, pridedant magnio oksido, ir surenkamos tam tikrame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius atvirkščiai titruojamas natrio hidroksido tirpalu.

3.   Reagentai

3.1	Trichloracto rūgšties tirpalas, 20 % (m/V).

3.2	Magnio oksidas.

3.3	Priešpučio emulsija (pvz., siloksanas).

3.4	Sieros rūgšties 0,05 mol/l tirpalas.

3.5	Natrio hidroksido 0,1 mol/l tirpalas.

3.6	Metilraudonojo tirpalas, 0,3 % tirpalas 95–96 % (V/V) etanolyje.

4.   Aparatūra

4.1	Maišiklis (vartytuvas), dažnis maždaug 35–40 sūk./min.

4.2	Distiliavimo aparatas, Kjeldalio tipo.

5.   Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Paimamas skaidraus filtrato kiekis, atitinkantis numatomą lakiųjų azoto bazių kiekį (paprastai reikia 100 ml). Skiedžiama iki 200 ml, įdedama 2 g magnio oksido (3.2) ir įlašinami keli lašai priešpučio emulsijos (3.3). Tirpalas turi būti šarminis pagal lakmusą; priešingu atveju įdedama dar šiek tiek magnio oksido (3.2). Tęsiama pagal analizės metodo, taikomo žalių baltymų kiekiui nustatyti (šio priedo C dalis), 5.2 ir 5.3 punktus.

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 atitinka 1,7 mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 10 % amoniako santykinės vertės.

F.   AMINO RŪGŠČIŲ (IŠSKYRUS TRIPTOFANĄ) NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Naudojant aminorūgščių analizatorių, šiuo metodu galima nustatyti laisvųjų (sintetinių ir gamtinių) amino rūgščių ir suminį (peptidų ir laisvųjų) aminorūgščių kiekį pašaruose. Šis metodas tinka šioms aminorūgštims: cisteinui (cistinui), metioninui, lizinui, treoninui, alaninui, argininui, asparto ir glutamino rūgštims, glicinui, histidinui, izoleucinui, leucinui, fenilalaninui, prolinui, serinui, tirozinui ir valinui.

Šiuo metodu negalima atskirti aminorūgščių druskų ir negalima atskirti aminorūgščių D-ir L-formų. Metodas netinka triptofano arba hidroksigrupę turintiems aminorūgščių analogams nustatyti.

2.   Metodas

2.1   Laisvosios aminorūgštys

Laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Kartu ekstrahuojamos azoto turinčios makromolekulės nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant. Nustatoma filtruoto tirpalo pH vertė 2,20. Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai vykdant reakciją su ninhidrinu, kai bangos ilgis 570 nm.

2.2   Suminis aminorūgščių kiekis

Pasirinkta procedūra priklauso nuo tiriamų aminorūgščių. Cisteinas (cistinas) ir metioninas prieš hidrolizę turi būti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono. Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų ėminių hidrolizatuose. Visos kitos 1 skirsnyje išvardytos aminorūgštys gali būti nustatomos arba oksiduotuose, arba neoksiduotuose ėminiuose.

Oksidacija atliekama peroksiskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 oC temperatūroje. Oksidacijos reagento perteklius skaidomas natrio disulfitu. Oksiduoti ar neoksiduoti ėminiai 23 valandas hidrolizuojami vandenilio chlorido rūgštimi (3.20). Nustatoma hidrolizatų pH vertė 2,20. Aminorūgštys atskiriamos taikant jonų mainų chromatografiją ir nustatomos fotometriniu metodu vykdant reakciją su ninhidrinu, esant 570 nm (prolinui – 440 nm).

3.   Reagentai

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba atitinkamos kokybės (elektrinis laidis < 10 μS) vanduo.

3.1	Vandenilio peroksidas, w (w/w) = 30 %.

3.2	Skruzdžių rūgštis, w (w/w) = 98–100 %.

3.3

Fenolis.

3.4	Natrio disulfitas.

3.5	Natrio hidroksidas.

3.6	5-sulfosalicilo rūgšties dihidratas.

3.7	Vandenilio chlorido rūgštis, tankis maždaug 1,18 g/ml.

3.8	trinatrio citrato dihidratas.

3.9	2,2'-tiodietanolis (tiodiglikolis).

3.10	Natrio chloridas.

3.11	Ninhidrinas.

3.12	Petroleteris, virimo temperatūros intervalas 40–60 oC.

3.13	Norleucinas arba kitas junginys, kurį galima naudoti kaip vidinį etaloną.

3.14	Azoto dujos (< 10 ppm deguonies).

3.15	1-oktanolis.

3.16	Aminorūgštys.

3.16.1

1 skirsnyje išvardytų medžiagų etalonai. Grynieji junginiai, neturintys kristalizacinio vandens. Džiovinami vakuume virš P2O5 arba H2SO4 likus savaitei iki naudojimo.

3.16.2

Cistino rūgštis.

3.16.3

Metionino sulfonas.

3.17	Natrio hidroksido tirpalas, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.18	Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.19	Skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalas: 889 g skruzdžių rūgšties (3.2) sumaišoma su 111 g vandens ir įdedama 4,73 g fenolio (3.3).

3.20	Hidrolizės mišinys, c = 6 mol/l HCl tirpalas, turintis 1 g/l fenolio: įdedama 1 g fenolio (3.3) į 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.21	Ekstrahavimo mišinys, c = 0,1 mol/l HCl tirpalas, turintis 2 % tiodiglikolio: paimama 8,2 ml HCl (3.7), skiedžiama maždaug 900 ml vandens, įpilama 20 ml tiodiglikolio (3.9) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro (tiesiogiai nemaišyti 3.7 ir 3.9).

3.22	5-sulfosalicilo rūgštis, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (3.6) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.23

Oksidavimo mišinys (peroksiskruzdžių rūgštis ir fenolis): Mažoje stiklinėje sumaišoma 0,5 ml vandenilio peroksido (3.1) ir 4,5 ml skruzdžių rūgšties bei fenolio tirpalo (3.19). Laikoma 1 val. 20–30 oC temperatūroje, kad susidarytų peroksiskruzdžių rūgštis, ir prieš supilant į ėminį šaldoma ledo ir vandens vonioje (15 min). Įspėjimas. Vengiama patekimo ant odos ir dėvimi apsauginiai drabužiai.

3.24	Citratinis buferinis tirpalas, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: maždaug 800 ml vandens ištirpinama 19,61 g natrio citrato (3.8), 5 ml tiodiglikolio (3.9), 1 g fenolio (3.3) ir 16,50 ml HCl (3.7). Nustatoma pH vertė 2,20. Skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.25	Plovimo buferiniai tirpalai, paruošti pagal naudojamo analizatoriaus (4.9) sąlygas.

3.26	Ninhidrino reagentas ruošiamas pagal analizatoriaus (4.9) sąlygas.

3.27	Aminorūgščių etaloniniai tirpalai. Šie tirpalai laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

3.27.1

Aminorūgščių pradiniai etaloniniai tirpalai (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml kiekvienos rūgšties tirpalas vandenilio chlorido rūgštyje. Galima naudoti esančius prekyboje.

3.27.2

Cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinis etaloninis tirpalas, c = 1,25 μmol/ml. 0,2115 g cistino rūgšties (3.16.2) ir 0,2265 g metionino sulfono (3.16.3) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 1 litro matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių. Šis tirpalas nenaudojamas, jei pradiniame etaloniniame tirpale (3.27.1) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono.

3.27.3

Pradinis vidinio etalono, pvz.: norleucino, tirpalas, c = 20 μmol/ml. 0,6560 g norleucino (3.13) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 250 ml matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 6 mėnesius.

3.27.4

Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, c = 5 nmol/50 μl cistino rūgšties ir metionino sulfono ir c = 10 nmol/50 μl kitų aminorūgščių. 2,2 g natrio chlorido (3.10) ištirpinama 30 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24) 100 ml stiklinėje. Įpilama 4,00 ml aminorūgščių pradinio etaloninio tirpalo (3.27.1), 4,00 ml cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinio etaloninio tirpalo (3.27.2) ir 0,50 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3), jei naudojamas. Natrio hidroksidu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20. Kiekybiškai supilama į 50 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) ir sumaišoma. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius. Žr. dar 9.1 pastabą.

3.27.5

Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, paruoštiems pagal 5.3.3.1 punktą, ir ekstraktams (5.2). Kalibravimo tirpalas ruošiamas pagal 3.27.4, bet nededama natrio chlorido. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

4.   Aparatūra

4.1	100 arba 250 ml apvaliadugnė kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi.

4.2	100 ml borosilikatinio stiklo butelis su užsukamu kamščiu ir guminiu ar tefloniniu tarpikliu (pvz.: Duran, Schott), tinkamas naudoti krosnyje.

4.3	Ventiliuojama krosnis su temperatūros reguliatoriumi, kurio tikslumas geresnis nei ± 2 oC.

4.4	pH-metras (trys skaičiai po kablelio).

4.5	Membraninis filtras (0,22 μm).

4.6	Centrifuga.

4.7	Sukamasis vakuuminis garintuvas.

4.8	Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.9

Aminorūgščių analizatorius arba HPLC įranga su jonų mainų kolonėle, reakcijos su ninhidrinu įtaisu, darinių gavimo įtaisu ir fotometriniu detektoriumi. Kolonėlės įkrova – sulfoninto polistireno dervos, galinčios atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių medžiagų. Srautas buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemose reguliuojamas siurbliais, srauto stabilumas – ±0,5 % kalibravimo tirpalo ir ėminio analizės metu. Su kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima naudoti hidrolizės procedūras, kai hidrolizato natrio jonų koncentracija c = 0,8 mol/l ir jame yra visas po oksidacijos likęs skruzdžių rūgšties perteklius. Kitais analizatoriais negalima tinkamai atskirti tam tikras aminorūgštis, jei hidrolizate yra skruzdžių rūgšties perteklius ir (arba) didelė natrio jonų koncentracija. Tokiu atveju po hidrolizės ir prieš pH nustatymą, rūgšties tūris sumažinamas maždaug iki 5 ml ją garinant. Garinama vakuume ne aukštesnėje nei 40 oC temperatūroje.

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 oC temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.12).

5.2   Laisvųjų amino rūgščių nustatymas pašaruose ir premiksuose

Į kūginę kolbą 0,2 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas paruošto ėminio (5.1) kiekis (1–5 g) ir įpilama 100,0 ml ekstrahavimo mišinio (3.21). Mišinys maišomas 60 min mechanine purtykle arba magnetine maišykle (4.8). Nuosėdoms leidžiama nusėsti ir 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų paimama pipete į 100 ml stiklinę.

Maišant įpilama 5,0 ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (3.22) ir maišoma magnetine maišykle 5 min. Tirpalas virš nuosėdų filtruojamas arba centrifuguojamas visoms nuosėdoms pašalinti. 10,0 ml gauto tirpalo įpilama į 100 ml stiklinę, natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20, plaunant citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) supilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą ir citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) skiedžiama iki žymės.

Jei naudojamas vidinis etalonas, įpilama 1,00 ml vidinio etalono (3.27.3) kiekvienam 100 ml gauto tirpalo ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 punktą.

Jei ekstraktai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.3   Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas

5.3.1   Oksidavimas

0,1–1 g paruošto ėminio (5.1) 0,2 mg tikslumu pasveriama:

—	į 100 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) hidrolizei atvirame inde (5.3.23), arba

—	į 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1), jei turi būti maža natrio koncentracija (5.3.3.1), arba,

—	į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) hidrolizei uždarytame inde (5.3.2.4).

Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg, o drėgmės ne daugiau nei 100 mg.

Kolba (butelis) dedama į ledo ir vandens vonią, atšaldoma iki 0 oC, įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (3.23) ir maišoma stikline mentele su lenktu galu. Kolba (butelis) kartu su viduje esančia mentele uždengiama orui nepralaidžia plėvele, ledo ir vandens vonia su taip uždarytu indu dedama į šaldytuvą, kuriame temperatūra 0 oC, ir laikoma jame 16 valandų. Po 16 valandų indas išimamas iš šaldytuvo ir oksidavimo reagento perteklius suskaidomas, pridedant 0,84 g natrio disulfito (3.4).

Tęsiama pagal 5.3.2.1.

5.3.2   Hidrolizė

5.3.2.1    Oksiduotų ėminių hidrolizė

Į oksiduotą ėminį, paruoštą pagal 5.3.1, įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (3.20), nuplaunant prie indo sienelių ir mentelės prilipusius ėminio likučius.

Atsižvelgiant į taikomą procedūrą, tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.2    Neoksiduotų ėminių hidrolizė

Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) ar į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1–1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg. Atsargiai įpilama hidrolizavimo mišinio (3.20) ir sumaišoma su ėminiu. Tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.3    Hidrolizė atvirame inde

Į kolbą su mišiniu (paruoštu pagal 5.3.2.1 ar 5.3.2.2) įdedami 3 stikliniai rutuliukai ir 23 valandas virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Hidrolizei pasibaigus, kondensatorius išplaunamas 5 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24). Kolba nuimama ir atšaldoma ledo vonioje.

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.2.4    Hidrolizė uždarame inde

Butelis su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 arba 5.3.2.2, dedamas į krosnį (4.3) 110 oC temperatūroje. Kad slėgis nedidėtų (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir būtų išvengta sprogimo, pirmąją hidrolizės valandą užsukamas kamštis dedamas ant indo viršaus. Kamštis neužsukamas. Po valandos kamštis užsukamas ir indas laikomas krosnyje 23 valandas. Hidrolizei pasibaigus, indas išimamas iš krosnies, kamštis atsargiai atsukamas ir butelis statomas į ledo ir vandens vonią. Paliekama atvėsti.

Atsižvelgiant į pH reguliavimo procedūrą (5.3.3), butelio turinys kiekybiškai supilamas į 250 ml stiklinę arba 250 ml apvaliadugnę kolbą, naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24).

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.3   pH reguliavimas

Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (4.9) jautrumą natriui, pH reguliavimas tęsiamas pagal 5.3.3.1 arba 5.3.3.2.

5.3.3.1    Chromatografinės analizės sistemos (4.9), kurioms reikia mažos natrio koncentracijos

Kai naudojami aminorūgščių analizatoriai, kuriems reikia mažos natrio jonų koncentracijos (kai turi būti sumažintas rūgšties tūris), patariama naudoti pradinį vidinio etalono tirpalą (3.27.3).

Šiuo atveju prieš garinimą į hidrolizatą įpilama 2,00 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3).

Į hidrolizatus, gautus pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, įlašinami 2 lašai 1-oktanolio.

Sukamajame garintuve (4.7) garinant vakuume ir 40 oC temperatūroje, tūris sumažinamas iki 5–10 ml. Jei netyčia tūris sumažėja iki mažesnio nei 5 ml tūrio, hidrolizatas turi būti išpiltas ir analizė atliekama iš naujo.

Natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 ir toliau tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.3.2    Visiems kitiems aminorūgščių analizatoriams (4.9)

Hidrolizatai, gauti pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, iš dalies neutralizuojami atsargiai įpilant 17 ml natrio hidroksido tirpalo (3.17), tirpalą visą laiką maišant ir žiūrint, kad temperatūra būtų žemesnė nei 40 oC.

Kambario temperatūroje nustatoma pH vertė 2,20, naudojant natrio hidroksido tirpalą (3.17) ir vėliau natrio hidroksido tirpalą (3.18). Tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.4   Ėminio tirpalas chromatografijai

Hidrolizatas, kurio pH vertė nustatyta (5.3.3.1 arba 5.3.3.2), kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24), ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Jei vidinis etalonas dar nebuvo naudotas, įpilama 2,00 ml vidinio etalono (3.27.3) ir iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu (3.24). Gerai sumaišoma.

Atliekama chromatografinė analizė (5.4).

Jei ėminių tirpalai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.4   Chromatografija

Prieš atliekant chromatografinę analizę ekstraktui (5.2) arba hidrolizatui (5.3.4) leidžiama pasiekti kambario temperatūrą. Mišinys kratomas ir filtruojamas per 0,22 μm membraninį filtrą (4.5). Aminorūgščių analizatoriumi (4.9) atliekama gauto skaidraus tirpalo jonų mainų chromatografija.

Įpurkšti galima rankiniu būdu arba automatiškai. Svarbu, kad matuojant etalonus ir ėminius į kolonėlę ±0,5 % tikslumu būtų įpurškiamas vienodas tirpalo tūris, išskyrus atvejus, kai naudojamas vidinis etalonas, ir kad natrio bei aminorūgščių santykis etalone ir ėminio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis.

Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analizinės sistemos. Etalonas arba ėminys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (3.24), kad etalono smailės plotas sudarytų 30–200 % ėminio aminorūgšties smailės ploto.

Priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus ir dervos tipo, aminorūgščių chromatografija šiek tiek skirsis. Pasirinkta sistema turi atskirti vieną aminorūgštį nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių junginių. Atsakas į kolonėlėje analizuojamų aminorūgščių kiekio pokyčius turi būti tiesinis chromatografinės sistemos naudojimo intervale.

Atliekant chromatografinę analizę, taikomi toliau nurodyti įdubos ir viršūnės aukščių santykiai, kai analizuojamas (nustatomų aminorūgščių) ekvimolinis tirpalas. Šis ekvimolinis tirpalas turi turėti mažiausiai 30 % kiekvienos aminorūgšties, kurią galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizatoriaus sistema (4.9), įkrovos didžiausio kiekio.

Norint atskirti treoniną ir seriną, žemesnės iš dviejų persiklojančių aminorūgščių smailių įdubos ir viršūnės aukščių santykis chromatogramoje neturi būti didesnis nei 2:10 (jei nustatomas tik cisteinas (cistinas), metioninas, treoninas ir lizinas, nepakankamas gretimų smailių atsiskyrimas neigiamai veiktų nustatymui). Visoms kitoms aminorūgštims atskyrimas turi būti geresnis nei 1: 10.

Sistema turi užtikrinti, kad lizinas būtų atskirtas nuo „lizino darinių“ ir ornitino.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Matuojamas ėminio ir etalono kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir apskaičiuojamas kiekis (X) aminorūgšties gramais kg ėminio:

Jei naudojamas vidinis etalonas, dauginama iš:

A	=	hidrolizato arba ekstrakto smailės plotas
B	=	kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas
C	=	vidinio etalono hidrolizate arba ekstrakte smailės plotas
D	=	vidinio etalono, kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas
M	=	nustatomos aminorūgšties molinė masė
c	=	etalono koncentracija μmol/ml
m	=	ėminio masė (g) (su pataisa pradinei masei, jei ėminys buvo džiovinamas ar iš jo šalinami riebalai)
V	=	visas hidrolizato tūris (5.3.4) arba apskaičiuotas visas praskiesto ekstrakto tūris (6.1) ml

Oksiduotų ėminių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis, bet apskaičiuojami kaip cistinas (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), naudojant M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30).

Metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas oksiduoto ėminio hidrolizatuose, bet apskaičiuojamas kaip metioninas, naudojant metionino M = 149,21 g/mol.

Įdėtas laisvasis metioninas nustatomas po ekstrakcijos kaip metioninas, apskaičiavimui naudojant tą pačią molinę masę.

6.1	Visas praskiesto ekstrakto tūris (F) laisvosioms aminorūgštims (5.2) nustatyti apskaičiuojamas taip: V = galutinio ekstrakto tūris

7.   Metodo įvertinimas

Metodas buvo patikrintas 1990 m. atliekant palyginimą tarptautiniu lygiu, naudojant keturis skirtingus pašarus (mišriuosius kiaulių pašarus, broilerių kombinuotuosius pašarus, baltymų koncentratą, premiksus). Vidurkio ir standartinio nuokrypio rezultatai, gauti atmetus riktus, pateikiami šio punkto lentelėse:

Vidurkiai g/kg

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrieji kiaulių pašarai	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Broilerių kombinuotieji pašarai	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Baltymų koncentratas	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premiksas	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.1   Pakartojamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo pakartojamumas, išreikštas kaip laboratorijos standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:

Laboratorijos standartinis nuokrypis (Sr) g/kg

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrieji kiaulių pašarai	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Broilerių kombinuotieji pašarai	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Baltymų koncentratas	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Premiksas	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

Laboratorijos standartinio nuokrypio (Sr) variacijos koeficientas (%)

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrieji kiaulių pašarai	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Broilerių kombinuotieji pašarai	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Baltymų koncentratas	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premiksas	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.2   Atkuriamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo atkuriamumas, išreikštas kaip tarplaboratorinis standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:

Tarplaboratorinis standartinis nuokrypis (SR) g/kg

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrieji kiaulių pašarai	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Broilerių kombinuotieji pašarai	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Baltymų koncentratas	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Premiksas	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

Tarplaboratorinis standartinio nuokrypio (SR) variacijos koeficientas (%)

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrieji kiaulių pašarai	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Broilerių kombinuotieji pašarai	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Baltymų koncentratas	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premiksas	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

8.   Pamatinių medžiagų naudojimas

Tinkamas šio metodo taikymas turi būti patikrintas atliekant kartotinius sertifikuotųjų pamatinių medžiagų matavimus, jei jos yra. Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotaisiais aminorūgščių kalibravimo tirpalais.

9.   Pastabos

9.1

Dėl aminorūgščių analizatorių skirtumų tikrinama pagal galutinę etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalų (žr. 5.27.4 ir 5.27.5) ir hidrolizatų (žr. 5.3.4) koncentraciją. Prietaiso tiesinio atsako intervalas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims. Etaloninis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu, kad smailių plotai būtų intervalo viduryje.

9.2	Jei hidrolizatams analizuoti naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos įranga, bandymų sąlygas reikia optimizuoti pagal gamintojo rekomendacijas.

9.3	Taikant metodą pašarams, kuriuose yra daugiau nei 1 % chloridų (koncentratai, mineraliniai pašarai, papildai), gali būti gauti sumažinti metionino rezultatai, todėl reikia numatyti specialų apdorojimą.

G.   TRIPTOFANO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančio triptofano suminį kiekį ir laisvąjį triptofaną. Šiuo metodu D- ir L-formos neatskiriamos.

2.   Metodas

Suminiam triptofanui nustatyti ėminys 20 valandų hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksido tirpalu 110 oC temperatūroje. Po hidrolizės įpilama vidinio etalono.

Laisvajam triptofanui nustatyti ėminys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui.

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1	Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba tokios pat kokybės vanduo (laidis < 10 μS/cm).

3.2	Etaloninė medžiaga: triptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.3	Vidinio etalono medžiaga: α-metiltriptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.4	Bario hidroksido oktahidratas (siekiant išvengti BaCO3 susidarymo, kuris galėtų trukdyti nustatymui, užtikrinama, kad Ba(OH)2 8H2O visiškai nesiliestų su oru) (žr. 9.3 pastabą).

3.5	Natrio hidroksidas.

3.6	Ortofosforo rūgštis, w = 85 %.

3.7	Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8	Metanolis, HPLC grynumo.

3.9	Petroleteris, virimo temperatūros intervalas – 40–60 oC.

3.10	Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

3.11	Vandenilio chlorido rūgštis, c = 6 mol/l: paimama 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.12	Vandenilio chlorido rūgštis, c = 1 mol/l: paimama 82 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.13	Vandenilio chlorido rūgštis, c= 0,1 mol/l: paimama 8,2 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.14	Orto fosforo rūgštis, c = 0,5 mol/l: paimama 34 ml ortofosforo rūgšties (3.6) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

3.15	Koncentruotas triptofano tirpalas (3.2), c = 2,50 μmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2553 g triptofano (3.2), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.16	Koncentruotas vidinio etalono tirpalas, c = 2,50 μmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2728 g α-metiltriptofano (3.3), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.17

Triptofano kalibravimo etaloninis tirpalas ir vidinis etalonas: paimama 2,00 ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15) ir 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Skiedžiama vandeniu (3.1) ir metanoliu (3.8) iki maždaug tokio pat tūrio ir maždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10–30 %) kaip galutinio hidrolizato tūris ir koncentracija. Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą. Ruošiamas tirpalas saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių.

3.18	Acto rūgštis

3.19	1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolis.

3.20	Etanolaminas, w (w/w) > 98 %.

3.21	1 g 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalas 100 ml metanolio (3.8).

3.22	HPLC judančioji fazė: 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20) nustatoma pH vertė 5,00. Vandeniu (3.1) skiedžiama iki 1 000 ml.

4.   Aparatūra

4.1	HPLC įranga ir fluorescencinis detektorius.

4.2	Skysčių chromatografijos kolonėlė, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė.

4.3	pH-metras.

4.4	Kolba iš polipropileno, talpa 125 ml, su plačiu kaklu ir užsukamu dangčiu.

4.5	Membraninis filtras, 0,45 μm.

4.6	Autoklavas, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7	Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.8	Sūkurinė maišyklė.

5.   Procedūra

5.1   Ėminių ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 C temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.9).

5.2   Laisvojo triptofano nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas kiekis (1–5 g) paruošto ėminio (5.1). Įpilama 100,0 ml vandenilio chlorido rūgšties, c = 0,1 mol/l (3.13) ir 5,00 ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16). 60 min purtoma mechanine purtykle arba maišoma magnetine maišykle (4.7). Nuosėdoms leidžiama nusėsti, pipete paimama į cheminę stiklinę 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų. Įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Natrio hidroksido tirpalu, c = 1,0 mol/l, (3.10) nustatoma pH vertė 3,0. Įpilamas pakankamas kiekis metanolio (3.8), kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio, kaip kalibravimo etaloninio tirpalo tūris (3.17)).

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir ekstraktai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 C temperatūroje.

5.3   Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (4.4) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1–1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertojoje ėminio dalyje yra apie 10 mg azoto. Įpilama 8,4 g bario hidroksido oktahidrato (3.4) ir 10 ml vandens. Sumaišoma sūkurine maišykle (4.8) arba magnetine maišykle (4.7). Teflonu padengtas magnetas paliekamas mišinyje. Indo sienelės nuplaunamos 4 ml vandens. Kolba uždengiama užsukamuoju dangčiu jo neužveržiant. Kolba įdedama į autoklavą (4.6) su verdančiu vandeniu ir garais ir laikoma 30–60 min. Autoklavas uždaromas ir 20 valandų kaitinama 110 (± 2) C temperatūroje.

Prieš atidarant autoklavą temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemesnės nei 100 oC. Siekiant išvengti Ba(OH)2 × 8H2O išsikristalizavimo, į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens. Švelniai purtoma arba maišoma. Įpilama 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Indai 15 min aušinami ant vandens arba ledo vonios.

Tada įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Indą laikant ant aušinamosios vonios ir maišant, turinys neutralizuojama HCl, c = 6 mol/l (3.11), ir HCl, c = 1 mol/l (3.12) nustatoma pH vertė 3,0. Įpilamas pakankamas kiekis metanolio, kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei reikiamo tūrio (pvz., 100 ml). Įpylus metanolio, nuosėdos nesusidaro.

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir hidrolizatai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 oC temperatūroje.

5.4   HPLC nustatymas

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos; gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai (žr. dar 9.1 ir 9.2 pastabas):

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2):	125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė
Kolonėlės temperatūra:	kambario temperatūra
Judančioji fazė (3.22):	3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20) nustatoma pH vertė 5,00. Skiedžiama iki 1 000 ml vandeniu (3.1)
Srautas:	1 ml/min
Visa eliuavimo trukmė:	maždaug 34 min
Detektoriaus bangos ilgis:	sužadinimas: 280 nm, emisija: 356 nm.
Įpurškiamas tūris	20 μl

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojamas triptofano kiekis (X) g 100 g ėminio.

A	=	vidinio etalono smailės plotas, kalibravimo etaloninis tirpalas (3.17)
B	=	triptofano ekstrakte (5.2) ar hidrolizate (5.3) smailės plotas
V1	=	koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), tūris ml (2 ml)
c	=	koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), koncentracija μmol/ml (= 2,50)
V2	=	koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į ekstraktą (5.2) (= 5,00 ml) arba į hidrolizatą (5.3) (= 2,00 ml), tūris
C	=	ekstrakto (5.2) arba hidrolizato (5.3) vidinio etalono smailės plotas
D	=	triptofano kalibravimo etaloninio tirpalo (3.17) smailės plotas
V3	=	koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į kalibravimo etaloninį tirpalą (3.17), tūris ml (= 2,00 ml)
m	=	ėminio masė g (su pataisa pradinei masei, jei jis buvo išdžiovintas arba iš jo buvo pašalinti riebalai)
M	=	triptofano molekulinė masė (= 204,23 g/mol)

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didesniojo rezultato vertės.

8.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (4-asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 12 laboratorijų analizavo tris ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

	1 ėminys Kiaulių pašaras	2 ėminys Kiaulių pašaras su L-triptofanu	3 ėminys Kiaulių pašaro koncentratas
L	12	12	12
n	50	55	50
Vidurkis [g/kg]	2,42	3,40	4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [ %]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [ %]	6,3	6,0	2,2

L	=	rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius
n	=	atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius
sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
SR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
r	=	pakartojamumas
R	=	atkuriamumas
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas, %
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas, %

Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo parengtas kitas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (3–asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 13 laboratorijų analizavo du ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

	4 ėminys Kviečių ir sojų mišinys	5 ėminys Kviečių ir sojų mišinys (4 ėminys) su triptofanu (0,457 g/kg)
L	12	12
n	55	60
Vidurkis [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [ %]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [ %]	4,71	5,11

L	=	rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius
n	=	atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius
sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
SR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
r	=	pakartojamumas
R	=	atkuriamumas
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas, %
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas, %

Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas dar vienas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas, kurį atliekant ne daugiau kaip 7 laboratorijos analizavo keturis ėminius. Rezultatai pateikti toliau. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus.

	1 ėminys Kiaulių pašaro mišinys (CRM 117)	2 ėminys Žuvų miltai su mažu riebalų kiekiu (CRM 118)	3 ėminys Sojų miltai (CRM 119)	4 ėminys Nugriebto pieno milteliai (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Vidurkis [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [ %]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [ %]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius
n	=	atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius
sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
SR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
r	=	pakartojamumas
R	=	atkuriamumas
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas, %
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas, %

9.   Pastabos

9.1

Šios specialios chromatografavimo sąlygos gali pagerinti triptofano ir α-metiltriptofano atskyrimą. Izokratinis eliuavimas, po kurio kolonėlė plaunama taikant gradientinį eliuavimą: Skysčių chromatografijos kolonėlė: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė Kolonėlės temperatūra: 32 oC Judančioji fazė: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanolis, 95 + 5 (V + V). B: Metanolis Gradiento programa: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Srautas: 1,2 ml/min. Visa eliuavimo trukmė: maždaug 33 min.

9.2

Chromatografinė analizė bus nevienoda atsižvelgiant į HPLC tipą ir naudojamą kolonėlės įkrovos medžiagą. Pasirinkta sistema turi užtikrinti triptofano ir vidinio etalono smailių atsiskyrimą iki pat bazinės linijos. Be to, svarbu, kad irimo produktai būtų gerai atskirti nuo triptofano ir vidinio etalono. Siekiant patikrinti, ar bazinėje linijoje, kur turi būti vidinio etalono smailė, nėra priemaišų, analizuojami hidrolizatai be vidinio etalono. Svarbu, kad eliuavimo trukmė būtų pakankamai ilga visiems irimo produktams išplauti, antraip pavėlavusios eliuavimo smailės gali trukdyti vėliau atliekamoms chromatografavimo procedūroms. Chromatografavimo sistemos atsakas darbinių koncentracijos verčių intervale yra tiesinis. Atsako tiesiškumas nustatomas naudojant vieną (normalią) vidinio etalono koncentraciją ir keičiant triptofano koncentraciją. Svarbu, kad triptofano ir vidinio etalono smailės būtų HPLC ir fluorescencinio detektoriaus sistemos tiesinėje dalyje. Jei triptofano ir (arba) vidinio etalono smailė (-s) yra per žemos ar per aukštos, analizė kartojama imant kito dydžio ėminį ir (arba) kitą galutinį tūrį.

9.3	Bario hidroksidas Sendamas bario hidroksidas vis blogiau tirpsta. Dėl šios priežasties tirpalas, naudojamas nustatymui HPLC metodu, darosi neskaidrus ir dėl to gali būti gauti mažesni triptofano kiekio rezultatai.

H.   ŽALIŲ ALIEJŲ IR RIEBALŲ NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas žalių aliejų ir riebalų kiekiui pašaruose nustatyti. Metodas netaikomas aliejingosioms sėkloms ir aliejiniams vaisiams.

Atsižvelgiant į pašarų tipą bei sudėtį ir į analizės atlikimo priežastį taikoma viena iš dviejų aprašytų procedūrų.

1.1   A procedūra. Tiesiogiai ekstrahuojami žali aliejai ir riebalai

Šis metodas taikomas augalinės kilmės pašarams, išskyrus pašarus, įtrauktus į B procedūros taikymo sritį.

1.2   B procedūra. Suminis žalių aliejų ir riebalų kiekis

Šis metodas taikomas gyvūninės kilmės pašarams ir visiems kombinuotiesiems pašarams. Šis metodas turi būti taikomas visoms medžiagoms, iš kurių žali aliejai ir riebalai negali būti visiškai ekstrahuoti prieš tai neatlikus jų hidrolizės (pvz., grūdų glitimas, mielės, bulvių baltymai ir produktai, kurie apdorojami taikant procesus, pvz., išspaudimo, dribsnių gamybos ir kaitinimo procesus).

1.3   Rezultatų aiškinimas

Visais atvejais, kai rezultatas, gautas taikant B procedūrą, yra didesnis nei rezultatas gautas pagal A procedūrą, teisingu turi būti laikomas rezultatas, gautas taikant B procedūrą.

2.   Metodas

2.1   A procedūra

Ėminys ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, o likutis džiovinamas ir sveriamas.

2.2   B procedūra

Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi kaitinant. Mišinys atvėsinamas ir filtruojamas. Likutis plaunamas, džiovinamas ir ekstrahuojamas pagal A procedūrą.

3.   Reagentai

3.1	Petroleteris: virimo temperatūros intervalas – 40–60 oC, bromo skaičius turi būti mažesnis kaip 1, likutis po išgarinimo mažesnis nei 2 mg/100 ml.

3.2	Natrio sulfatas, bevandenis.

3.3	Vandenilio chlorido rūgštis, c = 3 mol/l

3.4	Pagalbinė filtravimo priemonė, pvz., diatomitas, Hyflo-supercel.

4.   Aparatūra

4.1	Ekstrahavimo aparatas. Jei naudojamas sifonas (Soksleto aparatas), grąžinamo skysčio srautas yra toks, kad per valandą būtų 10 ciklų; jei sifonas nenaudojamas, grąžinamo skysčio srautas yra apie 10 ml/min.

4.2	Ekstrahavimo tūtos, kurios neturėtų petroleteryje tirpių medžiagų ir kurių akytumas atitiktų 4.1 punkto reikalavimus.

4.3	Džiovinimo spinta, vakuuminė spinta, nustatyta 75 ± 3 oC, arba spinta su oro cirkuliacija, nustatyta 100 ± 3 oC.

5.   Procedūra

5.1   A procedūra (žr. 8.1 punktą)

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, supilama į ekstrahavimo tūtą (4.2) ir užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu.

Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1) ir ekstrahuojama šešias valandas petroleteriu (3.1). Petroleterio ekstraktas surenkamas į pasvertą sausą kolbą su pemzos gabaliukais (2).

Tirpiklis distiliuojamas. Likutis džiovinamas kolbą laikant džiovinimo spintoje (4.3) pusantros valandos. Kolba atvėsinama eksikatoriuje ir pasveriama. Džiovinama dar 30 min, siekiant patikrinti, ar nekinta riebalų ir aliejų masė (paeiliui sveriant du kartus, masės skirtumas turi būti mažesnis arba lygus 1 mg).

5.2   B procedūra

2,5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu (žr. 8.2 punktą), supilama į 400 ml stiklinę arba 300 ml kūginę kolbą, įpilama 100 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.3) ir įmetami keli pemzos gabaliukai. Stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu arba kūginė kolba sujungiama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Mišinys atsargiai užverdamas virš mažos liepsnos arba ant kaitlentės ir vieną valandą virinamas. Reikia žiūrėti, kad produktas nepriliptų prie indo sienelių.

Atvėsinama ir pridedama pakankamai pagalbinės filtravimo priemonės (3.4), kad būtų išvengta aliejaus ir riebalų nuostolių filtruojant. Filtruojama per sudrėkintą, dvigubą riebalų neturintį filtravimo popierių. Likutis plaunamas šaltu vandeniu tol, kol gaunamas neutralios reakcijos filtratas. Patikrinama, ar filtrate nėra riebalų. Jų buvimas filtrate rodo, kad prieš hidrolizę ėminys turi būti ekstrahuojamas petroleteriu pagal A procedūrą.

Dvigubas filtravimo popierius su likučiu dedamas ant laikrodžio stiklo ir 100 ± 3 oC temperatūroje džiovinamas pusantros valandos džiovinimo spintoje su oro cirkuliacija (4.3).

Dvigubas filtravimo popierius su sausu likučiu įdedamas į ekstrahavimo tūtą (4.2), kuri užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu. Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1) ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose.

6.   Rezultato išraiška

Likučio masė išreiškiama ėminio masės procentais.

7.   Pakartojamumas

To paties tyrėjo atliekamų dviejų lygiagrečių to paties ėminio analizės rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

—	0,2 %, absoliučiąja verte, kai žalių aliejų ir riebalų kiekis yra mažesnis nei 5 %,

—	4,0 % didžiausio rezultato vertės, kai kiekis 5–10 %,

—	0,4 % absoliučiąja verte, kai kiekis didesnis nei 10 %.

8.   Pastabos

8.1

Jei produktus, turinčius didelį aliejų ir riebalų kiekį, sunku susmulkinti arba jie yra netinkami sumažintajam vienalyčiam tiriamajam ėminiui paimti, daroma taip. 20 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir sumaišoma su 10 g ar didesniu kiekiu bevandenio natrio sulfato (3.2). Ekstrahuojama petroleteriu (3.1), kaip nurodyta 5.1. Gautas ekstraktas skiedžiamas iki 500 ml petroleteriu (3.1) ir tirpalas sumaišomas. 50 ml tirpalo supilama į prieš tai pasvertą nedidelę sausą kolbą su pemzos gabalėliais. Tirpiklis distiliuojamas, likutis džiovinamas ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto paskutinėje pastraipoje. Pašalinamas tirpiklis iš tūtoje likusio ekstrahavimo likučio, likutis susmulkinamas ne didesnėmis nei 1 mm dydžio dalelėmis, sudedamas atgal į ekstrahavimo tūtą (natrio sulfato nededama) ir atliekamos 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose nurodytos procedūros. Aliejų ir riebalų kiekis ėminio masės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę: (10 m1 + m2) × 5 kurioje: m1 = likučio po pirmojo ekstrahavimo (alikvotinės ekstrakto dalies) svoris gramais, m2 = likučio po antrojo ekstrahavimo svoris gramais.

8.2	Jei produkte yra nedaug aliejų arba riebalų, tiriamojo ėminio masė gali būti padidinta iki 5 g.

8.3	Naminių gyvūnėlių ėdalą, turintį daug vandens, prieš hidrolizę ir ekstrahavimą gali tekti maišyti su bevandeniu natrio sulfatu, kaip tai daroma taikant B procedūrą.

8.4	Atliekant 5.2 punkte aprašytas procedūras, veiksmingiau būtų naudoti ne šaltą, bet karštą vandenį likučiui po filtravimo plauti.

8.5	Kai kurių pašarų atveju 1,5 val. džiovinimo trukmę gali tekti padidinti. Per ilgo džiovinimo vengiama, nes dėl to gali būti gauti mažesni rezultatai. Gali būti naudojama mikrobangų krosnį.

8.6	Pradinis ekstrahavimas pagal A procedūrą prieš hidrolizę ir pakartotinis ekstrahavimas pagal B procedūrą rekomenduojamas tuo atveju, jei žalių aliejų ir riebalų kiekis yra didesnis nei 15 %. Ekstrahavimo trukmė kažkiek priklauso nuo pašarų ir nuo juose esančių aliejų arba riebalų tipo.

I.   ŽALIOS LĄSTELIENOS NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų neriebalines organines medžiagas, netirpias rūgštinėje ir šarminėje terpėje, kurios paprastai apibūdinamos kaip žalia ląsteliena.

2.   Metodas

Ėminys, iš kurio prireikus pašalinami riebalai, veikiamas tam tikros koncentracijos sieros rūgšties ir kalio hidroksido tirpalais virimo temperatūroje. Likutis atskiriamas filtruojant, plaunamas, džiovinamas, sveriamas ir sudeginamas 475–500 oC temperatūros intervale. Žalios ląstelienos kiekis tiriamajame ėminyje atitinka masės sumažėjimą po sudeginimo.

3.   Reagentai

3.1	Sieros rūgštis, c = 0,13 mol/l.

3.2	Priešputis (pvz., n-oktanolis).

3.3	Pagalbinė filtravimo priemonė (Celite 545 arba lygiavertė), iškaitinta 500 oC temperatūroje keturias valandas (8.6).

3.4

Acetonas.

3.5	Petroleteris, kurio virimo temperatūros intervalas 40–60 oC.

3.6	Vandenilio chlorido rūgštis, c = 0,5 mol/l.

3.7	Kalio hidroksido tirpalas, c = 0,23 mol/l.

4.   Aparatūra

4.1	Kaitinimo įrenginys skaidymui sieros rūgštimi arba kalio hidroksido tirpalu, turintis filtravimo tiglio (4.2) laikiklį, išleidimo vamzdį su čiaupu skysčiui išleisti ir vakuuminį siurblį, gali būti suslėgtojo oro. Kiekvieną dieną prieš naudojimą blokas penkias minutes šildomas verdančiu vandeniu.

4.2	Stiklinis filtravimo tiglis su sukepinto stiklo filtro plokšte, kurios akučių dydis 40–90 μm. Prieš naudojant pirmą kartą, tiglis kelias minutes kaitinamas iki 500 oC ir atvėsinamas (8.6).

4.3	Ne mažesnės nei 270 ml talpos cilindras su grįžtamuoju kondensatoriumi, tinkamas virinimui.

4.4	Džiovinimo spinta su šilumine rele.

4.5	Mufelinė krosnis su šilumine rele.

4.6	Ekstrahavimo įrenginys, kurį sudaro filtravimo tiglio (4.2) laikiklio plokštė ir išleidimo vamzdis su čiaupu vakuumui prijungti ir skysčiui išleisti.

4.7	Jungiamieji žiedai kaitinimo įrenginiui (4.1), tigliui (4.2) ir cilindrui (4.3) sujungti ir šaltojo ekstrahavimo įrenginiui (4.6) bei tigliui prijungti.

5.   Procedūra

1 mg tikslumu pasveriama 1 g paruošto ėminio, ėminys dedamas į tiglį (4.2) (žr. 8.1, 8.2 ir 8.3 pastabas) ir pridedama 1 g pagalbinės filtravimo priemonės.

Surenkamas kaitinimo įrenginys (4.1) ir filtravimo tiglis (4.2), tada prie tiglio prijungiamas cilindras (4.3). Į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančios sieros rūgšties (3.1) ir prireikus įlašinami keli lašai priešpučio (3.2).

Užvirinama per 5 ± 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min.

Atsukamas čiaupas į išleidimo vamzdį (4.1), sieros rūgštis filtruojama vakuumu per filtravimo tiglį ir likutis tris kartus paeiliui plaunamas 30 ml verdančio vandens, užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Išleidžiamasis čiaupas užsukamas, į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančio kalio hidroksido tirpalo (3.7) ir įlašinami keli lašai priešpučio (3.2). Užvirinama per 5 ± 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min. Filtruojama ir kartojama plovimo procedūra, taikyta sieros rūgščiai.

Po paskutinio plovimo ir džiovinimo tiglis su jame esančia medžiaga atjungiamas ir sujungiamas su šaltojo ekstrahavimo įrenginiu (4.6). Prijungiamas vakuumas ir likutis tiglyje tris kartus iš eilės plaunamas 25 ml acetono porcijomis (3.4) užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Tiglis džiovinamas džiovinimo spintoje iki pastoviosios masės 130 oC temperatūroje. Po kiekvieno džiovinimo tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir greitai pasveriamas. Tiglis dedamas į mufelinę krosnį ir ne mažiau nei 30 min iškaitinamas 475–500 oC temperatūroje iki pastoviosios masės.

Po kiekvieno iškaitinimo iš pradžių atvėsinama krosnyje, vėliau eksikatoriuje, ir pasveriama.

Atliekamas tuščiasis bandymas be ėminio. Masės sumažėjimas dėl iškaitinimo neturi būti didesnis nei 4 mg.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Žalios ląstelienos kiekis ėminio masės procentais gaunamas pagal lygtį:

kurioje:

m	=	ėminio svoris g;
m0	=	ėminio svorio sumažėjimas po iškaitinimo, g;
m1	=	svorio sumažėjimas po iškaitinimo, atliekant tuščiąjį bandymą, g.

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	0,6 % absoliučiąja verte, kai žalios ląstelienos kiekis mažesnis nei 10 %;

—	6 % didžiausiojo rezultato vertės, kai žalios ląstelienos kiekis lygus ar didesnis nei 10 %.

8.   Pastabos

8.1

Jei pašarai turi daugiau nei 10 % žalių riebalų, prieš analizę jie turi būti pašalinti petroleteriu (3.5). Filtravimo tiglis (4.2) su jame esančia medžiaga prijungiamas prie šaltojo ekstrahavimo įrenginio (4.6) ir prijungus vakuumą likutis tris kartus plaunamas 30 ml petroleterio porcijomis (3.7), užtikrinant, kad likutis būtų sausas. Tiglis su jame esančia medžiaga prijungiamas prie kaitinimo įrenginio (4.1) ir analizė tęsiama, kaip aprašyta 5 punkte.

8.2

Jei pašarai turi riebalų, kurių tiesiogiai negalima ekstrahuoti petroleteriu (3.5), riebalai turi būti pašalinti, kaip nurodyta 8.1, ir dar kartą šalinami po virinimo su rūgštimi. Pavirinus su rūgštimi ir išplovus, tiglis su jame esančia medžiaga prijungiamas prie šalto ekstrahavimo indo (4.6) ir tris kartus plaunamas 30 ml acetono (3.6), tada tris kartus 30 ml petroleterio porcijomis. Filtruojama prijungus vakuumą iki sauso likučio ir analizė tęsiama, kaip aprašyta 5 punkte, pradedant nuo apdorojimo kalio hidroksido tirpalu.

8.3

Jei pašarai turi daugiau kaip 5 % karbonatų, išreikštų kalcio karbonatu, tiglis (4.2) su pasvertu ėminiu prijungiamas prie kaitinimo įrenginio (4.1). Ėminys tris kartus plaunamas 30 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.6). Kiekvieną kartą įpylus rūgšties ėminys paliekamas stovėti prieš filtravimą maždaug vieną minutę. Vieną kartą plaunama 30 ml vandens ir procedūra tęsiama, kaip aprašyta 5 punkte.

8.4	Jei aparatas naudojamas kaip stovas (prie to paties kaitinimo įrenginio prijungti keli tigliai), atliekant vieną bandymų seriją negalima vykdyti dviejų to paties ėminio atskirų nustatymų.

8.5	Jei po virinimo sunku filtruoti rūgštinius ir šarminius tirpalus, per kaitinimo įrenginio išleidimo vamzdį leidžiamas suslėgtasis oras ir filtravimas tęsiamas.

8.6	Siekiant pratęsti stiklinių filtravimo tiglių naudojimo trukmę, iškaitinimo temperatūra yra ne aukštesnė nei 500 oC. Reikia žiūrėti, kad kaitinant ir atvėsinant būtų išvengta staigių temperatūros svyravimų.

J.   CUKRAUS NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti redukuojančiųjų sacharidų kiekį ir suminį sacharidų kiekį, išreiškiamą gliukozės kiekiu arba, jei tinka, sacharozės kiekiu, dauginant rezultatą iš faktoriaus 0,95. Metodas tinka kombinuotiesiems pašarams. Kitiems pašarams numatyti specialieji metodai. Jei būtina, laktozė nustatoma atskirai, ir į jos kiekį atsižvelgiama apskaičiuojant rezultatus.

2.   Metodas

Sacharidai ekstrahuojami praskiestu etanoliu; tirpalas skaidrinamas I ir II Carrez tirpalais. Etanolį pašalinus, sacharidų kiekis prieš ir po inversijos nustatomi Luff-Schoorl metodu.

3.   Reagentai

3.1	Etanolio tirpalas 40 % (V/V), tankis: 0,948 g/ml 20 oC temperatūroje, neutralizuotas pagal fenolftaleiną.

3.2	Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3	Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4	Metiloranžinio 0,1 % (m/V) tirpalas.

3.5	Vandenilio chlorido rūgšties 4 mol/l tirpalas.

3.6	Vandenilio chlorido rūgšties 0,1 mol/l tirpalas.

3.7	Natrio hidroksido 0,1 mol/l tirpalas.

3.8

Luff-Schoorl reagentas: Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (3.8.2) supilamas į natrio karbonato tirpalą (3.8.3). Įpilamas vario sulfato tirpalas (3.8.1) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro. Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas. Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu – 0,05 mol/l, Na2CO3 – 1 mol/l), žr. 5.4. paskutinę pastraipą. Tirpalo pH yra apie 9,4.

3.8.1

Vario sulfato tirpalas: 25 g vario sulfato, CuSO4·5H2O, neturinčio geležies, ištirpinama 100 ml vandens.

3.8.2

Citrinų rūgšties tirpalas: 50 g citrinų rūgšties, C6H8O7 · H2O, ištirpinama 50 ml vandens.

3.8.3

Natrio karbonato tirpalas: 143,8 g bevandenio natrio karbonato, ištirpinama maždaug 300 ml šilto vandens. Paliekama atvėsti.

3.9	Natrio tiosulfato 0,1 mol/l tirpalas.

3.10	Krakmolo tirpalas: 5 g tirpaus krakmolo mišinys su 30 ml vandens supilamas į 1 litrą verdančio vandens. Virinama tris minutes, tirpalas atvėsinamas, prireikus į jį kaip konservanto įdedama 10 mg gyvsidabrio (II) jodido.

3.11	Sieros rūgšties 3 mol/l tirpalas.

3.12	Kalio jodido tirpalas, 30 % (m/V).

3.13	Pemzos granulės, virintos vandenilio chlorido rūgšties tirpale, išplautos ir išdžiovintos.

3.14	3-metilbutan-l-olis.

4.   Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ekstrahavimas

2,5 g ėminio, pasverto 1 mg tikslumu, supilama į 250 ml matavimo kolbą. Įpilama 200 ml etanolio (3.1) ir vieną valandą maišoma maišikliu. Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.2) ir maišoma maždaug 30 s. Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.3) ir vėl maišoma 1 min. Etanoliu (3.1) skiedžiama iki žymės, sumaišoma ir filtruojama. Imama 200 ml filtrato ir garinama didesnei daliai etanolio pašalinti tol, kol tūris sumažėja maždaug du kartus. Likutis po išgarinimo naudojant šiltą vandenį kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą, tirpalas atvėsinamas, skiedžiamas iki žymės vandeniu, sumaišomas ir prireikus filtruojamas. Šis tirpalas naudojamas redukuojančiųjų sacharidų kiekiui nustatyti ir, po inversijos, suminiam sacharidų kiekiui nustatyti.

5.2   Redukuojančiųjų sacharidų nustatymas

Pipete paimama ne daugiau 25 ml tirpalo, turinčio mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų sacharidų, kurių kiekis išreiškiamas gliukozės kiekiu. Prireikus skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu. Rezultatas išreiškiamas gliukozės kiekiu ėminyje procentais.

5.3   Suminio invertuotų sacharidų kiekio nustatymas

Pipete paimama 50 ml tirpalo ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įlašinami keli lašai metiloranžinio tirpalo (3.4) ir atsargiai, nuolat maišant, pilama vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.5) tol, kol neišnyksta tirpalo raudona spalva. Įpilama 15 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.6), kolba nuleidžiama į stipriai verdančio vandens vonią, kurioje laikoma trisdešimt minučių. Tirpalas greitai atvėsinamas iki maždaug 20 oC temperatūros ir į jį įpilama 15 ml natrio hidroksido tirpalo (3.7). Skiedžiama vandeniu iki 100 ml ir sumaišoma. Paimama ne daugiau 25 ml šio tirpalo, turinčio mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų sacharidų, perskaičiuotų į gliukozės kiekį. Prireikus distiliuotu skiedžiama vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu. Rezultatas išreiškiamas gliukozės procentiniu kiekiu arba, jei tinka, sacharozės kiekiu, gautą rezultatą padauginus iš faktoriaus 0,95.

5.4   Titravimas Luff-Schoorl metodu

Pipete įpilama 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.8) ir supilama į 300 ml Erlenmejerio kolbą; įpilama lygiai 25 ml skaidrinto sacharidų tirpalo. Įdedamos dvi pemzos (3.13) granulės, tirpalas šildomas ir maišomas, laikant kolbą rankoje virš vidutinės atviros liepsnos, kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes. Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle, po kuria dega liepsna. Liepsna reguliuojama taip, kad būtų šildomas tik Erlenmejerio kolbos dugnas. Prie kūginės kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Virinama lygiai dešimt minučių. Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip:

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (3.12) ir tuojau pat (atsargiai, nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.11). Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (3.9) tol, kol spalva tampa vos gelsva, įpilama krakmolo tirpalo (3.10) indikatoriaus ir baigiama titruoti.

Toks pats titravimas, tik nevirinant, atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.8) ir 25 ml vandens mišiniu, įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (3.12) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.11).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg, kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumą, išreiškiamą 0,1 mol/l natrio tiosulfato tirpalo ml. Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Specialiosios procedūros

7.1

Pašarų, turinčių daug melasos, ir kitų nelabai vienalyčių pašarų atveju pasveriama 20 g pašarų ir su 500 ml vandens jie supilami į 1 l matavimo kolbą. Maišikliu maišoma vieną valandą. Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.2) ir II (3.3) tirpalus, kaip aprašyta 5.1 punkte, tačiau naudojant keturiskart didesnius reagentų kiekius. Skiedžiama iki žymės 80 % (V/V) etanoliu. Sumaišoma ir filtruojama. Etanolis pašalinamas, kaip aprašyta 5.1 punkte. Jei ėminyje nėra dekstrinizuoto krakmolo, skiedžiama iki žymės vandeniu.

7.2

Melasos ir pašarinių žaliavų, kuriuose yra daug cukraus ir beveik nėra krakmolo (ceratonia siliqua vaisiai, džiovinti runkelių griežiniai ir pan.) atveju 5 g ėminio sudedama į 250 ml matavimo kolbą, įpilama 200 ml distiliuoto vandens ir valandą maišoma maišikliu, prireikus, ir ilgiau. Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.2) ir II (3.3) tirpalus, kaip aprašyta 5.1 punkte. Skiedžiama iki žymės šaltu vandeniu, sumaišoma ir filtruojama. Norint nustatyti suminį sacharidų, daroma, kaip aprašyta 5.3 punkte.

8.   Pastabos

8.1	Siekiant išvengti putojimo, prieš virinant su Luff-Schoorl reagentu įpilama (nepaisant tūrio) apie 1 ml 3-metilbutan-1-olio (3.14).

8.2	Suminio sacharidų po inversijos kiekio, perskaičiuoto į gliukozės kiekį, ir redukuojančiųjų sacharidų kiekio, perskaičiuoto į gliukozės kiekį, skirtumą padauginus iš 0,95 gaunamas sacharozės kiekis procentais.

8.3	Norint nustatyti redukuojančiųjų sacharidų, išskyrus laktozę, kiekį, galima taikyti du metodus.

8.3.1

Skaičiuojant apytiksliai, kitu analizės metodu nustatytas laktozės kiekis dauginamas iš 0,675 ir gautas rezultatas atimamas iš redukuojančiųjų sacharidų kiekio.

8.3.2

Redukuojančių sacharidų, išskyrus laktozę, kiekį skaičiuojant tiksliai, tas pats ėminys turi būti naudojamas dviem galutiniams nustatymams. Viena analizė atliekama su alikvotine dalimi tirpalo, gauto pagal 5.1 punktą, kita – su alikvotine dalimi tirpalo, gauto nustatant laktozę pagal šiam tikslui nustatytą metodą (atlikus kitų sacharidų fermentaciją ir skaidrinimą). Abiem atvejais turimas sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu ir perskaičiuojamas į gliukozės kiekį miligramais. Viena iš verčių atimama iš kitos ir skirtumas išreiškiamas ėminio masės procentais. Pavyzdys Du kiekvienam nustatymui paimti tūriai atitinka 250 mg ėminį. Pirmuoju atveju sunaudota 17 ml natrio tiosulfato 0,1 mol/l tirpalo ir tai atitinka 44,2 mg gliukozės; antruoju atveju sunaudota 11 ml ir tai atitinka 27,6 mg gliukozės. Skirtumas yra 16,6 mg gliukozės. Taigi redukuojančiųjų sacharidų (išskyrus laktozę) kiekis, perskaičiuotas į gliukozės kiekį, yra lygus:

Verčių lentelė, naudojant 25 ml Luff-Schoorl reagento

Na2S2O30,1 mol/l tūris ml, dviejų minučių trukmės šildymas, dešimties minučių trukmės virimas

Na2S2O3 0,1 mol/l	Gliukozė, fruktozė, invertuoti sacharidai C6H12O6		Laktozė C12H22O11		Maltozė C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	skirtumas	mg	skirtumas	mg	skirtumas	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   LAKTOZĖS NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti laktozės kiekį pašaruose, kai jos yra daugiau nei 0,5 %.

2.   Metodas

Cukrūs ištirpinami vandenyje. Tirpalas fermentuojamas, pridedant mielių Saccharomyces cerevisiae, kurios laktozės neliečia. Po skaidrinimo ir filtravimo laktozės kiekis filtrate nustatomas Luff-Schoorl metodu.

3.   Reagentai

3.1	Saccharomyces cerevisiae suspensija: 25 g šviežių mielių maišoma su 100 ml vandens. Šaldytuve suspensija galima laikyti ne ilgiau kaip savaitę.

3.2	Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3	Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4

Luff-Schoorl reagentas: Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (3.4.2) supilamas į natrio karbonato tirpalą (3.4.3). Įpilamas vario sulfato tirpalas (3.4.1) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro. Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas. Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu – 0,05 mol/l; Na2CO3 – 1 mol/l). Tirpalo pH yra apie 9,4.

3.4.1

Vario sulfato tirpalas: 25 g vario sulfato, CuSO4·5H2O, neturinčio geležies, ištirpinama 100 ml vandens.

3.4.2

Citrinų rūgšties tirpalas: 50 g citrinų rūgšties, C6H8O7 · H2O, ištirpinama 50 ml vandens.

3.4.3

Natrio karbonato tirpalas: 143,8 g bevandenio natrio karbonato, ištirpinama maždaug 300 ml šilto vandens. Paliekama atvėsti.

3.5	Pemzos granulės, virintos vandenilio chlorido rūgšties tirpale, išplautos ir išdžiovintos.

3.6	Kalio jodido tirpalas, 30 % (m/V).

3.7	Sieros rūgšties 3 mol/l tirpalas.

3.8	Natrio tiosulfato 0,1 mol/l tirpalas.

3.9	Krakmolo tirpalas: 5 g tirpaus krakmolo mišinys su 30 ml vandens supilamas į 1 litrą verdančio vandens. Virinama tris minutes, tirpalas atvėsinamas, prireikus į jį kaip konservanto įdedama 10 mg gyvsidabrio (II) jodido.

4.   Aparatūra

Vandens vonia su šilumine rele, nustatyta 38–40 oC.

5.   Procedūra

1 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25–30 ml vandens. Kolba 30 min laikoma verdančio vandens vonioje ir atvėsinama iki maždaug 35 oC temperatūros. Įpilama apie 5 ml mielių suspensijos (3.1) ir sumaišoma. Kolba laikoma dvi valandas vandens vonioje 38–40 oC temperatūroje. Atvėsinama iki maždaug 20 oC temperatūros.

Įpilama 2,5 ml Carrez I tirpalo (3.2) ir 30 s maišoma, tada įpilama 2,5 ml Carrez II tirpalo (3.3) ir vėl maišoma 30 s. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml, sumaišoma ir filtruojama. Ne daugiau nei 25 ml šio tirpalo, kuriame turėtų būti 40–80 mg laktozės, pipete paimama į 300 ml Erlenmejerio kolbą. Prireikus iki 25 ml skiedžiama vandeniu.

Tokiu pačiu būdu atliekamas tuščiasis bandymas su 5 ml mielių suspensijos (3.1). Laktozės kiekis Luff-Schoorl metodu nustatomas taip: įpilama lygiai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.4) ir įdedamos dvi pemzos (3.5) granulės. Tirpalas maišomas laikant kolbą rankoje ir tuo pat metu šildant virš vidutinės atviros liepsnos, kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes. Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle, po kuria dega liepsna. Liepsna reguliuojama taip, kad būtų šildomas tik kūginės kolbos dugnas. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Virinama lygiai dešimt minučių. Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip:

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (3.6) ir tuojau pat (atsargiai, nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.7). Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (3.8) tol, kol spalva tampa vos gelsva, įpilama krakmolo tirpalo (3.9) indikatoriaus ir baigiama titruoti.

Toks pats titravimas, tik nevirinant, atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.4) ir 25 ml vandens mišiniu, įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (3.6) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.7).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg, kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumą, išreiškiamą 0,1 mol/l natrio tiosulfato tirpalo ml.

Rezultatas pateikiamas kaip bevandenės laktozės kiekis, išreikštas ėminio masės procentais.

7.   Pastaba

Jei produktai turi daugiau nei 40 % fermentuojamo sacharido, naudojama daugiau nei 5 ml mielių suspensijos.

Verčių lentelė, naudojant 25 ml Luff-Schoorl reagento

Na2S2O30,1 mol/l tūris ml, dviejų minučių trukmės šildymas, dešimties minučių trukmės virimas

Na2S2O3 0,1 mol/l	Gliukozė, fruktozė, invertuoti sacharidai C6H12O6		Laktozė C12H22O11		Maltozė C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	skirtumas	mg	skirtumas	mg	skirtumas	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   KRAKMOLO NUSTATYMAS

POLIARIMETRINIS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti krakmolo ir didelės molekulinės masės krakmolo skilimo produktų kiekį pašaruose, siekiant patikrinti atitiktį nurodomai energinei vertei (VII priedo nuostatoms) ir Tarybos direktyvai 96/25/EB (3).

2.   Metodas

Metodas susideda iš dviejų nustatymų. Nustatant pirmuoju būdu, ėminys veikiamas praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Po tirpalo skaidrinimo ir filtravimo poliarimetriškai matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas.

Analizuojant antruoju būdu, ėminys ekstrahuojamas 40 % etanoliu. Filtratas rūgštinamas vandenilio chlorido rūgštimi, skaidrinamas, filtruojamas ir matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, kaip tai buvo daroma pirmuoju būdu.

Dviejų matavimų skirtumas, padaugintas iš žinomo faktoriaus, atitinka krakmolo kiekį ėminyje.

3.   Reagentai

3.1	Vandenilio chlorido rūgštis, 25 % (m/m) tirpalas, tankis 1,126 g/ml.

3.2	Vandenilio chlorido rūgštis, 1,13 % (m/V) tirpalas. Koncentracija turi būti patikrinta titruojant 0,1 mol/l natrio hidroksido tirpalu, įlašinus metilraudonojo 0,1 % (m/V) tirpalo 94 % (V/V) etanolyje. Reikia 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH, norint neutralizuoti 10 ml.

3.3	Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4	Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.5	Etanolis, 40 % (V/V) tirpalas, tankis 0,948 g/ml 20 oC temperatūroje.

4.   Aparatūra

4.1	250 ml Erlenmejerio kolba su tipine šlifo jungtimi ir grįžtamasis kondensatorius

4.2	Poliarimetras arba sacharimetras

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys susmulkinamas taip, kad jį visą būtų galima persijoti per sietą su 0,5 mm apvaliomis akutėmis.

5.2   Suminio poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P ir S) nustatymas (žr. 7.1 pastabą)

1 mg tikslumu pasveriama 2,5 g sumalto ėminio, kuris supilamas į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2), kratoma, kad ėminys tolygiai pasiskirstytų, ir dar įpilama 25 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2). Kolba panardinama į verdančio vandens vonią, pirmąsias tris minutes stipriai ir visą laiką kratoma, kad nesusidarytų aglomeratų. Vandens vonioje turi būti pakankamai daug, kad panardinus į ją matavimo kolbą, jis nenustotų viręs. Kratomos kolbos negalima išimti iš vonios. Lygiai po 15 min kolba išimama iš vonios, įpilama 30 ml šalto vandens ir iš karto atvėsinama iki 20 oC.

Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.3) ir kratoma 30 s. Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.4) ir vėl kratoma maždaug 30 s. Skiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma ir filtruojama. Jei filtratas nėra visiškai skaidrus (tai pasitaiko retai), nustatymas kartojamas naudojant daugiau Carrez I ir II tirpalų, pvz., 10 ml.

200 mm ilgio vamzdyje poliarimetru arba sacharimetru matuojama, kokiu kampu tirpalas suka poliarizuotos šviesos plokštumą.

5.3   Medžiagų, tirpstančių 40 % etanolyje, poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P′ ir S′) nustatymas

1 mg tikslumu pasveriama 5 g ėminio, ėminys supilamas į 100 ml matavimo kolbą ir įpilama apie 80 ml etanolio (3.5) (žr. 7.2 pastabą). Kolba laikoma vieną valandą kambario temperatūroje; per tą laiką šešis kartus kolba stipriai kratoma, kad ėminys gerai susimaišytų su etanoliu. Skiedžiama iki žymės etanoliu (3.5), sumaišoma ir filtruojama.

50 ml filtrato (atitinka 2,5 g ėminio) įpilama į 250 ml Erlenmejerio kolbą, įpilama 2,1 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1) ir stipriai kratoma. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius, kolba panardinama į verdančio vandens vonią. Lygiai po 15 min Erlenmejerio kolba išimama iš vonios, jos turinys supilamas į 100 ml matavimo kolbą, plaunant Erlenmejerio kolbą trupučiu šalto vandens, ir atvėsinama iki 20 oC.

Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.3) ir II (3.4) tirpalus, skiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma, filtruojama ir matuojamas poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, kaip nurodyta 5.2 punkto 2–oje ir 3–oje pastraipoje.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Krakmolo kiekis (%) ėminyje apskaičiuojamas taip:

6.1   Matavimas poliarimetru

P	=	suminis poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, laipsniais;
P'	=	40 % etanolyje tirpių medžiagų tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, laipsniais;
	=	savitasis gryno krakmolo tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas. Visuotinai priimtos skaitmeninės šio faktoriaus vertės yra šios: + 185,9o: ryžių krakmolo + 185,7o: bulvių krakmolo + 184,6o: kukurūzų krakmolo + 182,7o: kviečių krakmolo + 181,5o: miežių krakmolo + 181,3o: avižų krakmolo + 184,0o: kitų rūšių krakmolo, taip pat krakmolo mišinių kombinuotuose pašaruose

6.2   Matavimas sacharimetru

S	=	suminis poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, sacharimetro laipsniais;
S'	=	40 % (v/v) etanolyje tirpių medžiagų tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, sacharimetro laipsniais
N	=	sacharozės masė g/100 ml vandens, kai 200 mm ilgio vamzdyje poliarizuotos šviesos plokštuma pasukama 100o sacharimetro laipsnių 16,29 g prancūziškų sacharimetrų 26,00 g vokiškų sacharimetrų 20,00 g kitų sacharimetrų savitasis gryno krakmolo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas (žr. 6.1 punktą).

6.3   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių, tam pačiam ėminiui atliktų nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,4 absoliučiąja verte, kai krakmolo yra mažiau nei 40 %, ir 1 % santykine verte, kai krakmolo yra 40 % arba daugiau.

7.   Pastabos

7.1	Jei ėminyje yra daugiau nei 6 % karbonatų, skaičiuojamų kaip kalcio karbonatas, jie prieš suminio poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo matavimą turi būti suardomi įpilant lygiai tiek, kiek reikia praskiestos sieros rūgšties.

7.2

Jei produkte yra daug laktozės, pvz., pieno miltelių serume ar nugriebto pieno milteliuose, įpylus 80 ml etanolio (3.5), daroma taip: prie kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir kolba 30 min panardinama į vandens vonią 50 oC temperatūroje. Kolba paliekama atvėsti ir analizė tęsiama kaip nurodyta 5.3 punkte.

7.3

Yra žinoma, kad šios medžiagos, kai jų pašaruose yra didelis kiekis, sukelia trukdžius, nustatant krakmolo kiekį poliarimetriniu metodu, todėl gali būti gauti netikslūs rezultatai: — (cukrinių) runkelių produktai, pvz., (cukrinių) runkelių išspaudos, (cukrinių) runkelių melasa, (cukrinių) runkelių išspaudos su melasa, (cukrinių) runkelių žlaugtai, (runkelių) cukrus, — citrusų vaisių minkštimas, — linų sėmenys; linų sėmenų išspaudos; ekstrahuoti linų sėmenys, — rapso sėklos; rapso sėklų išspaudos; ekstrahuotos rapso sėklos; rapso sėklų lukštai, — saulėgrąžų sėklos; ekstrahuotos saulėgrąžų sėklos; ekstrahuotos iš dalies išlukštentos saulėgrąžų sėklos, — kopros išspaudos; ekstrahuota kopra, — bulvių masė, — dehidratuotos mielės, — produktai, turintys daug inulino (pvz., topinambų trupiniai ir miltai), — spirgučiai.

M.   ŽALIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių pelenų kiekį pašaruose.

2.   Metodas

Ėminys sudeginamas 550 oC temperatūroje; likutis pasveriamas.

3.   Reagentai

Amonio nitrato tirpalas, 20 % (m/V)

4.   Aparatūra

4.1

Kaitlentė

4.2	Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele

4.3	Kvarciniai, porcelianiniai arba platininiai tigliai ėminiui sudeginti, stačiakampiai (maždaug 60 × 40 × 25 mm) arba apvalieji (skersmuo: 60–75 mm, aukštis: 20–40 mm)

5.   Procedūra

Maždaug 5 g ėminio (2,5 g tuo atveju, kai analizuojami linkę išsipūsti produktai) pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į ėminiui sudeginti skirtą tiglį, kuris pats prieš tai buvo iškaitintas 550 oC temperatūroje, atvėsintas ir pasvertas. Tiglis statomas ant kaitlentės ir iš lėto kaitinamas tol, kol medžiaga suanglėja. Iškaitinama pagal 5.1 arba 5.2.

5.1	Tiglis dedamas į reguliuojamos temperatūros mufelinę krosnį, nustatytą 550 oC. Medžiaga laikoma toje temperatūroje, kol virsta baltais, šviesiai pilkais ar rausvais pelenais, kuriuose greičiausiai nebeliko anglingųjų dalelių. Tiglis dedamas į eksikatorių atvėsti ir iš karto sveriamas.

5.2

Tiglis dedamas į reguliuojamos temperatūros mufelinę krosnį, nustatytą 550 oC. Kaitinama 3 h. Tiglis dedamas į eksikatorių atvėsti ir iš karto sveriamas. Kaitinama dar 30 min, siekiant užtikrinti, kad pelenų masė nekinta (masės skirtumas tarp dviejų nuoseklių svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Likučio masė apskaičiuojama, atimant tiglio masę.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastabos

7.1

Medžiagų, kurias sunku paversti pelenais, pelenai iš pradžių turi būti kaitinami ne trumpiau kaip tris valandas, atvėsinami ir į juos įlašinami keli lašai 20 % amonio nitrato tirpalo arba vandens (lašinama atsargiai, kad pelenai neišsisklaidytų arba nesušoktų į gabalus). Išdžiovinus, toliau kaitinama krosnyje. Prireikus veiksmas kartojamas tol, kol medžiaga visiškai virsta pelenais.

7.2

Jei medžiagos atsparios apdorojimui, aprašytam 7.1 punkte, daroma taip: po trijų valandų kaitinimo, pelenai supilami į šiltą vandenį ir filtruojami per mažą bepelenį filtrą. Filtras su turiniu sudeginamas prieš tai naudotame tiglyje. Į atvėsintą tiglį supilamas filtratas, tirpalas išgarinamas iki sauso likučio, likutis iškaitinamas ir pasveriamas.

7.3	Analizuojant aliejus ir riebalus, tinkamo dydžio tiglyje tiksliai pasveriamas 25 g ėminys. Ėminys anglinamas padegant jį bepelenio filtravimo popieriaus juostele. Sudeginus likutis sudrėkinamas kiek įmanoma mažesniu kiekiu vandens. Likutis džiovinamas ir iškaitinamas, kaip aprašyta 5 skyriuje.

N.   VANDENILIO CHLORIDO RŪGŠTYJE NETIRPIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti neorganinių medžiagų, kurios netirpsta vandenilio chlorido rūgštyje, kiekį pašaruose. Atsižvelgiant į bandinio tipą, galima taikyti du metodus.

1.1	A metodas. Taikomas organiniams pašarams ir didesnei daliai kombinuotųjų pašarų;

1.2	B metodas. Taikomas neorganiniams junginiams ir mišiniams, taip pat kombinuotiesiems pašarams, kuriuose A metodu nustatytas vandenilio chlorido rūgštyje netirpių medžiagų kiekis yra didesnis nei 1 %.

2.   Metodas

2.1	A metodas. Ėminys paverčiamas pelenais, pelenai virinami vandenilio chlorido rūgštyje, neištirpusi dalis filtruojama ir sveriama.

2.2	B metodas. Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi. Tirpalas filtruojamas, likutis paverčiamas pelenais, kurie apdorojami pagal A metodą.

3.   Reagentai

3.1	Vandenilio chlorido rūgštis 3 mol/l

3.2	Trichloracto rūgštis, 20 % (m/V) tirpalas

3.3	Trichloracto rūgštis, 1 % (m/V) tirpalas

4.   Aparatūra

4.1

Kaitlentė

4.2	Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele

4.3	Kvarciniai, porcelianiniai arba platininiai tigliai ėminiui sudeginti, stačiakampiai (maždaug 60 × 40 × 25 mm) arba apvalieji (skersmuo: 60–75 mm, aukštis: 20–40 mm)

5.   Procedūra

5.1   A metodas

Ėminys sudeginamas taip pat, kaip nustatant žalių pelenų kiekį. Galima panaudoti pelenus, gautus atliekant šią analizę.

Pelenai supilami į 250–400 ml cheminę stiklinę, naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1). Mišinys lėtai užvirinamas ir atsargiai virinamas penkiolika minučių. Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą ir likutis plaunamas šiltu vandeniu tol, kol plovimo vanduo nerodo rūgščios reakcijos. Filtras su likučiu džiovinamas ir pasvertame tiglyje sudeginamas ne žemesnėje nei 550 oC, bet ne aukštesnėje nei 700 oC temperatūroje. Tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir pasveriamas.

5.2   B metodas

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 250–400 ml cheminę stiklinę. Įpilama 25 ml vandens ir 25 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), sumaišoma ir palaukiama dujų skyrimosi pabaigos. Įpilama dar 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1). Palaukiama dar galimo dujų skyrimosi pabaigos, stiklinė statoma į verdančio vandens vonią ir laikoma joje trisdešimt minučių, prireikus ir ilgiau, kad visiškai būtų hidrolizuotas krakmolas, kurio galėjo būti ėminyje. Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą, likutis plaunamas 50 ml šilto vandens (žr. 7 pastabą). Filtras su likučiu dedamas į tiglį ėminiui sudeginti, džiovinamas ir sudeginamas ne žemesnėje nei 550 oC, bet ne aukštesnėje nei 700 oC temperatūroje. Pelenai supilami į 250–400 ml cheminę stiklinę, naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1); tęsiama, kaip nurodyta antroje 5.1 punkto pastraipoje.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Likučio masė apskaičiuojama, atimant tiglio masę. Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastaba

Jei ėminys sunkiai filtruojamas, analizė atliekama iš naujo, 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1) pakeičiant 50 ml 20 % trichloracto rūgšties (3.2) ir plaunant filtrą šiltu 1 % trichloracto rūgšties tirpalu (3.3).

O.   KARBONATŲ NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose karbonatų kiekį, kuris paprastai išreiškiamas kalcio karbonato kiekiu.

Tačiau tam tikrais atvejais (pvz., naudojant geležies karbonatą) būtina taikyti specialųjį metodą.

2.   Metodas

Karbonatai skaidomi vandenilio chlorido rūgštimi; išsiskyręs anglies dioksidas surenkamas į matavimo biuretę ir jo tūris palyginamas su tūriu, kuris tomis pačiomis sąlygomis susidaro iš žinomo kalcio karbonato kiekio.

3.   Reagentai

3.1	Vandenilio chlorido rūgštis, tankis 1,10 g/ml

3.2	Kalcio karbonatas

3.3	Sieros rūgštis, maždaug 0,05 mol/l, nudažyta metilraudonuoju

4.   Aparatūra

Scheibler-Dietrich aparatas (žr. piešinį) ar panašus aparatas.

5.   Procedūra

Atsižvelgiant į karbonatų kiekį ėminyje, sveriamas toks ėminio kiekis:

—	0,5 g produktų, kuriuose karbonatai, išreikšti kalcio karbonato kiekiu, sudaro nuo 50 iki 100 %,

—	1 g produktų, kuriuose karbonatai, išreikšti kalcio karbonato kiekiu, sudaro nuo 40 iki 50 %,

—	2–3 g kitų produktų.

Ėminys supilamas į specialų aparato butelį (4), į kurį įstatytas iš nedūžtančios medžiagos pagamintas mažas mėgintuvėlis su 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), ir butelis prijungiamas prie aparato. Trišakis čiaupas (5) pasukamas taip, kad vamzdis (1) susijungtų su atmosfera. Kilnojamu vamzdžiu (2), kuris yra pripildytas nudažytos sieros rūgšties (3.3) ir prijungtas prie matavimo biuretės (1), skysčio lygis nustatomas ties nulio padala. Čiaupas (5) pasukamas taip, kad biuretė (1) ir vamzdis (3) būtų sujungti, ir patikrinama, ar skysčio lygis yra ties nulio padala.

Vandenilio chlorido rūgštis (3.1) palenkiant butelį (4) po truputį supilama ant ėminio. Slėgis išlyginamas nuleidžiant vamzdį (2). Butelis (4) kratomas tol, kol anglies dioksidas nustoja skirtis.

Grąžinamas pradinis slėgis, sulyginant skysčio lygį biuretėje (1) ir vamzdyje (2). Po kelių minučių, jei dujų tūris daugiau nekinta, rodmuo užrašomas.

Tomis pačiomis sąlygomis atliekamas kontrolinis bandymas su 0,5 g kalcio karbonato (3.2).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Karbonatų, išreikštų kalcio karbonatu, kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

X	=	karbonatų, išreikštų kalcio karbonatu, procentinis kiekis ėminyje (w/w)
V	=	CO2 tūris, kuris susidaro iš ėminio, ml;
V1	=	CO2 tūris, kuris susidaro iš 0,5 g CaCO3, ml;
m	=	ėminio tiriamosios dalies masė gramais.

7.   Pastabos

7.1	Jei ėminio masė didesnė nei 2 g, iš pradžių į butelį (4) įpilama 15 ml distiliuoto vandens ir prieš bandymo pradžią sumaišoma. Toks pats vandens tūris naudojamas atliekant kontrolinį bandymą.

7.2	Jei naudojamas aparatas turi kitokį tūrį, nei Scheibler-Dietrich aparato tūris, sveriamo ėminio masė ir kontrolinio ėminio masė bei rezultatų apskaičiavimas turi būti atitinkamai pakeisti.

P.   SUMINIO FOSFORO KIEKIO NUSTATYMAS

FOTOMETRINIS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti suminio fosforo kiekį pašaruose. Jis labiausiai tinka analizuoti produktus, kuriuose nedaug fosforo. Kai kuriais atvejais (kai produkte daug fosforo) galima taikyti gravimetrinį metodą.

2.   Metodas

Ėminys mineralizuojamas sausuoju deginimu (organinių pašarų) arba skaidant rūgštyje (mineralinių junginių ir skystųjų pašarų) ir ir įdedamas į rūgšties tirpalą. Tirpalas veikiamas molibdovanadato reagentu. Taip susidariusio geltono tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru esant 430 nm bangos ilgiui.

3.   Reagentai

3.1	Kalcio karbonatas

3.2	Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,10 g/ml (maždaug 6 mol/l)

3.3	Azoto rūgštis, ρ20 = 1,045 g/ml

3.4	Azoto rūgštis, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml

3.5	Sieros rūgštis, ρ20 = 1,84 g/ml

3.6	Molibdovanadato reagentas: 1 litro matavimo kolboje sumaišoma 200 ml amonio heptamolibdato tirpalo (3.6.1), 200 ml amonio monovanadato tirpalo (3.6.2) ir 134 ml azoto rūgšties (3.4). Skiedžiama vandeniu iki žymės.

3.6.1

Amonio heptamolibdato tirpalas: karštame vandenyje ištirpinama 100 g amonio heptamolibdato tetrahidrato (NH4)6Mo7O24·4H2O. Įpilama 10 ml amoniako (tankis 0,91 kg/l) ir skiedžiama vandeniu iki 1 l.

3.6.2

Amonio monovanadato tirpalas: 2,35 g amonio monovanadato, NH4VO3 ištirpinama 400 ml karšto vandens. Nuolat maišant lėtai įpilama 20 ml praskiestos azoto rūgšties (7 ml HNO3 (3.4) ir 13 ml H2O) ir skiedžiama vandeniu iki 1 l.

3.7	Etaloninis fosforo tirpalas 1 mg/ml: ištirpinkite 4,387 g kalio dihidrofosfato, KH2PO4 vandenyje. Skiedžiama vandeniu iki 1 l.

4.   Aparatūra

4.1	Kvarciniai, porcelianiniai arba platininiai tigliai ėminiui sudeginti.

4.2	Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele, nustatyta 550 oC temperatūrai.

4.3	250 ml Kjeldalio kolba.

4.4	Matavimo kolbos ir tikslios pipetės.

4.5	Spektrofotometras.

4.6	Maždaug 16 mm skersmens mėgintuvėliai su 14,5 mm skersmens kamščiais; talpa: 25–30 ml.

5.   Procedūra

5.1   Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio tipą, ruošiamas tirpalas, kaip nurodyta 5.1.1. arba 5.1.2.

5.1.1   Įprastinė procedūra

Pasveriama 1 g arba daugiau ėminio 1 mg tikslumu. Ėminys dedamas į Kjeldalio kolbą, įpilama 20 ml sieros rūgšties (3.5), kolba kratoma, kad medžiaga visiškai susimaišytų su rūgštimi ir nepriliptų ant kolbos sienelių, pakaitinama iki virimo ir virinama 10 min. Kolba paliekama šiek tiek atvėsti, įpilama 2 ml azoto rūgšties (3.4), nestipriai pakaitinama, šiek tiek atvėsinama, įpilamas dar nedidelis kiekis azoto rūgšties (3.4) ir vėl užvirinama. Procedūra kartojama tol, kol gaunamas bespalvis tirpalas. Atvėsinama, įpilama truputį vandens, skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą, Kjeldalio kolbą plaunant karštu vandeniu. Paliekama atvėsti, skiedžiama vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.2   Ėminiai, kuriuose yra organinių medžiagų ir nėra kalcio ir magnio dihidrofosfatų

Deginimo tiglyje pasveriama 1 mg tikslumu maždaug 2,5 g ėminio. Ėminys labai gerai sumaišomas su 1 g kalcio karbonato (3.1). Deginama krosnyje 550 oC temperatūroje tol, kol gaunami balti ar pilki pelenai (nedidelis anglių kiekis netrukdo). Pelenai supilami į 250 ml cheminę stiklinę. Įpilama 20 ml vandens ir vandenilio chlorido rūgšties (3.2) tol, kol nustoja skirtis burbuliukai. Įpilama dar 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.2). Stiklinė statoma ant smėlio vonios ir skystis garinamas iki sauso likučio netirpiam silicio dioksidui gauti. Likutis ištirpinamas 10 ml azoto rūgšties (3.3) ir tirpalas virinamas ant smėlio vonios arba kaitlentės 5 min, neišgarinant iki sauso likučio. Skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą, keletą kartų stiklinę plaunant karštu vandeniu. Kolba paliekama atvėsti, skiedžiama vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.2   Spalvos gavimas ir optinio tankio matavimas

Pagal 5.1.1 arba 5.1.2 gauto filtrato alikvotinė dalis skiedžiama taip, kad gauta fosforo koncentracija būtų ne didesnė nei 40 μg/ml. Į mėgintuvėlį (4.6) įpilama 10 ml šio tirpalo ir 10 ml molibdovanadato reagento (3.6). Sumaišoma ir tirpalas paliekamas stovėti bent 10 min 20 oC temperatūroje. Spektrofotometru matuojamas optinis tankis, esant 430 nm bangos ilgiui ir palyginamuoju tirpalu naudojant tirpalą, gautą įpilant 10 ml molibdovanadato reagento (3.6) į 10 ml vandens.

5.3   Kalibravimo kreivė

Iš etaloninio tirpalo (3.7) ruošiami tirpalai, kurių fosforo koncentracija 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml ir 40 μg/ml. Paimama po 10 ml kiekvieno iš šių tirpalų ir į juos įpilama po 10 ml molibdovanadato reagento (3.6). Tirpalai sumaišomi ir paliekami stovėti bent 10 min 20 oC temperatūroje. Matuojamas optinis tankis, kaip nurodyta 5.2. Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinatė – optinis tankis, abscisė – fosforo koncentracija. Koncentracijos verčių intervale nuo 0 μg/ml iki 40 μg/ml kreivės dalis yra tiesinė.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Fosforo kiekis tiriamajame ėminyje nustatomas pagal kalibravimo kreivę.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio bandymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

—	3 % didžiausiojo rezultato vertės, kai fosforo kiekis mažesnis nei 5 %,

—	0,15 % absoliučiąja verte, kai fosforo kiekis 5 % arba didesnis.

Q.   CHLORIDŲ CHLORO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandenyje tirpių chloridų chloro kiekį, paprastai išreiškiamą natrio chlorido kiekiu. Metodas tinka visiems pašarams.

2.   Metodas

Chloridai ištirpinami vandenyje. Jei produkte yra organinių medžiagų, jis skaidrinamas. Tirpalas šiek tiek parūgštinamas azoto rūgštimi ir chloridai nusodinami sidabro chlorido pavidalu, veikiant sidabro nitrato tirpalu. Sidabro perteklius yra titruojamas amonio tiocianatu pagal Volhardo metodą.

3.   Reagentai

3.1	Amonio tiocianato tirpalas, 0,1 mol/l.

3.2	Sidabro nitrato tirpalas, 0,1 mol/l.

3.3	Sotusis amonio-geležies (III) sulfato (NH4)Fe(SO4)2 tirpalas.

3.4	Azoto rūgštis, tankis: 1,38 g/ml.

3.5	Dietileteris.

3.6

Acetonas.

3.7	Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2 · 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.8	Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6· 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.9	Aktyvintosios anglys, neturinčios chloridų ir jų neabsorbuojančios.

4.   Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

5.   Procedūra

5.1   Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio pobūdį, tirpalas ruošiamas pagal 5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3 punktą.

Kartu atliekamas tuščiasis bandymas, nededant analizuojamo ėminio.

5.1.1   Organinių medžiagų neturintys ėminiai

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 10 g ėminio, kuriame chloro chloridų pavidalu būtų ne daugiau nei 3 g. 500 ml matavimo kolboje ėminys ištirpinamas 400 ml vandens, kurio temperatūra maždaug 20 oC. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas maišymo būgne, praskiedžiamas iki žymės, sumaišomas ir filtruojamas.

5.1.2   Organinių medžiagų turintys ėminiai, išskyrus 5.1.3 punkte išvardytus produktus

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 5 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintųjų anglių supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens, kurio temperatūra apie 20 oC, ir 5 ml Carrez I tirpalo (3.7), maišoma 30 s, įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.8). Maišymo būgne maišoma trisdešimt minučių, skiedžiama iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.3   Virti pašarai, linų sėmenų išspaudos ir miltai, produktai, kuriuose daug linų sėmenų miltų, ir kiti produktai, kuriuose daug glitėsių ar koloidinių medžiagų (pvz., dekstrinuotas krakmolas)

Tirpalas ruošiamas taip, kaip aprašyta 5.1.2 punkte, bet nefiltruojamas. Skystis nupilamas nuo nuosėdų (prireikus, centrifuguojamas), 100 ml skysčio įpilama į 200 ml matavimo kolbą. Skystis maišomas su acetonu (3.6), šiuo tirpikliu skiedžiamas iki žymės, tirpalas sumaišomas ir filtruojamas.

5.2   Titravimas

Pipete į Erlenmejerio kolbą paimama 25–100 ml (pagal numatomą chlorido kiekį) tirpalo, paruošto pagal 5.1.1, 5.1.2 ar 5.1.3 punktus. Paimtoje alikvotinėje tirpalo dalyje turi būti ne daugiau nei 150 mg chloro (Cl). Prireikus tirpalas skiedžiamas ne mažiau nei 50 ml vandens, įpilama 5 ml azoto rūgšties (3.4), 20 ml sočiojo amonio-geležies (III) sulfato tirpalo (3.3) ir du lašai amonio tiocianato tirpalo (3.1), lašinamo iš biuretės, pripildytos iki nulinės žymės. Iš biuretės įpilama tiek sidabro nitrato tirpalo (3.2), kad susidarytų 5 ml perteklius. Įpilama 5 ml dietileterio (3.5) ir stipriai purtoma, kad nuosėdos koaguliuotų. Sidabro nitrato perteklius titruojamas amonio tiocianato tirpalu (3.1) tol, kol atsiradusi raudonai ruda spalva neišnyksta per vieną minutę.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Chloro kiekis, išreikštas natrio chlorido kiekio % (X), apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

čia:

V1	=	įpilto 0,1 mol/l sidabro nitrato tirpalo tūris ml,
V2	=	analizei suvartoto 0,1 mol/l amonio tiocianato tirpalo tūris ml,
m	=	ėminio svoris.

Jei tuščiasis bandymas rodo, kad 0,1 mol/l sidabro nitrato tirpalo buvo sunaudota, šis tūris atimamas iš tūrio (V1 – V2).

7.   Pastabos

7.1	Titravimą taip pat galima atlikti potenciometriškai.

7.2	Tuo atveju, jei produktuose yra daug aliejų ir riebalų, iš pradžių dietileteriu ar petroleteriu pašalinami riebalai.

7.3	Analizuojant žuvų miltus, chloridus galima titruoti Mohro metodu.

---

(1)  Džiovinimo spintos grūdams, miltams, kruopoms ir miltams džiovinti šiluminė galia turi būti tokia, kad nustačius 131 oC temperatūrą, spinta, į kurią džiūti vienu metu sudedamas didžiausias galimas ėminių kiekis, vėl pasiektų tą temperatūrą per mažiau kaip 45 min. Ventiliacija turi būti tokia, kad rezultatų, gautų dvi valandas spintoje džiovinant tiek paprastų kviečių ėminių, kiek jų gali tilpti, ir rezultatų, gautų po 4 valandų džiovinimo, skirtumas būtų mažesnis kaip 0,15 %.

(2)  Jei vėliau atliekami aliejaus arba riebalų kokybės bandymai, pemzos gabaliukai pakeičiami stikliniais rutuliukais.

(3)  OL L 125, 1996 5 23, p. 35.

IV PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI LEIDŽIAMŲ PAŠARŲ PRIEDŲ KONCENTRACIJAI KONTROLIUOTI

A.   A VITAMINO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas A vitaminui A (retinoliui) pašaruose ir premiksuose nustatyti. A vitaminą sudaro visų-trans-(padėčių)-retinolis ir jo cis-izomerai, kurie yra nustatomi šiuo metodu. A vitamino kiekis yra išreiškiamas tarptautiniais vienetais (IU) vienam kg. Vienas IU atitinka 0,300 μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A ar 0,344 μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A acetato arba 0,550 μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A palmitato aktyvumą.

Kiekybinio nustatymo riba – 2 000 IU A vitamino/kg.

2.   Metodas

Ėminys hidrolizuojamas šarminiu kalio hidroksido tirpalu ir A vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, likutis ištirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. A vitamino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu, naudojant ultravioletinį arba fluorescencinį detektorių. Chromatografavimo parametrai pasirenkami taip, kad neatsiskiria visų-trans-(padėčių)-vitamino A alkoholis ir jo cis-izomerai.

3.   Reagentai

3.1	Etanolis, σ = 96 %.

3.2	Petroleteris, virimo temperatūros intervalas 40 oC–60 oC.

3.3	Metanolis.

3.4	Kalio hidroksido tirpalas, c = 50 g/100 ml.

3.5	Natrio askorbato tirpalas, c = 10 g/100 ml (žr. 7.7 pastabas).

3.6	Natrio sulfidas, Na2S· xH2O (x = 7–9).

3.6.1

Natrio sulfido tirpalas glicerolyje, c = 0,5 mol/l, ß = 120 g/l (kai x = 9) (žr. 7.8 pastabas).

3.7	Fenolftaleino tirpalas etanolyje (3.1), c = 2 g/100 ml.

3.8	2-propanolis.

3.9	HPLC judančioji fazė: metanolio (3,3) ir vandens mišinys, pvz., 980 + 20 (V + V). Tikslus santykis nustatomas pagal naudojamos kolonėlės charakteristikas.

3.10	Azotas, be deguonies.

3.11	Visos-trans-vitamino A acetatas, ypač grynas, sertifikuoto aktyvumo, pvz., 2,80 × 106 IU/g

3.11.1

Visos-trans-vitamino A acetato pradinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg A vitamino acetato (3.11). Ištirpinama 2-propanolyje (3.8) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra lygi 1 400 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis turi būti nustatytas pagal 5.6.3.1.

3.12	Visos-trans-vitamino A palmitatas, ypač grynas, sertifikuoto aktyvumo, pvz., 1,80 × 10 6 IU/g

3.12.1

Visos-trans-vitamino A palmitato pradinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 80 mg A vitamino palmitato (3.12). Ištirpinama 2-propanolyje (3.8) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra lygi 1 400 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis turi būti nustatytas pagal 5.6.3.2.

3.13	2,6-di-tret-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr. 7.5 pastabas)

4.   Aparatūra

4.1	Vakuuminis sukamasis garintuvas

4.2	Rudo stiklo indai

4.2.1

plokščiadugnės arba kūginės kolbos, 500 ml, su šlifo mova;

4.2.2

matavimo kolbos su šlifo kamščiais, siaurakaklės, 10, 25, 100 ir 500 ml;

4.2.3

kūginiai dalijamieji piltuvai, 1 000 ml, su šlifo kamščiais;

4.2.4

kriaušės formos kolbos, 250 ml, su šlifo mova.

4.3	Allihn kondensatorius, apvalkalo ilgis 300 mm, su šlifo jungtimi, su dujų tiekimo vamzdžio adapteriu

4.4	Gofruotasis filtravimo popierius fazėms atskirti, skersmuo 185 mm (pvz., Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5	HPLC įranga su įpurškimo sistema

4.5.1

Skysčių chromatografijos kolonėlė, 250 mm × 4 mm, C18, 5 ar 10 μm įkrova, ar lygiavertė kolonėlė (veikimo kriterijus: tik viena visų retinolio izomerų smailė HPLC sąlygomis)

4.5.2

Reguliuojamo bangos ilgio fluorescencinis arba ultravioletinis detektorius

4.6	Spektrofotometras ir 10 mm kvarco kiuvetės

4.7	Vandens vonia ir magnetinė maišyklė

4.8	Ekstrahavimo aparatas (žr. 1 paveikslą), kurį sudaro:

4.8.1

1 l talpos stiklinis cilindras su šlifo mova ir kamščiu;

4.8.2

šlifo įmova su atšaka ir reguliuojamo ilgio vamzdžiu, einančiu per centrą. Reguliuojamo ilgio vamzdžio apatinis galas yra U formos, viršutinis – siaurėjančio antgalio formos, kad cilindre esančio tirpalo viršutinis sluoksnis galėtų būti supiltas į dalijamąjį piltuvą.

5.   Procedūra

Pastaba.

A vitaminas yra jautrus ultravioletinei spinduliuotei ir oksidavimui. Visi veiksmai atliekami tamsoje (naudojami rudo stiklo indai arba aliuminio folija apvynioti indai) ir nesant deguonies (šalinamas azoto srove). Ekstrahuojant oras virš skysčio pakeičiamas azotu (vengiant per didelio slėgio kartkartėmis reikia ištraukti kamštį).

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas, kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis, vengiant šilumos susidarymo. Turi būti malama prieš pat svėrimą ir muilinimą, kad nebūtų A vitamino nuostolių.

5.2   Muilinimas

Atsižvelgiant į A vitamino kiekį, 1 mg tikslumu pasveriama 2–25 g ėminio, ėminys supilamas į plokščiadugnę ar kūginę 500 ml tūrio kolbą (4.2.1). Maišant iš eilės įpilama 130 ml etanolio (3.1), maždaug 100 mg BHT (3.13), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.6). Prie kolbos prijungiamas kondensatorius (4.3) ir kolba įmerkiama į vandens vonią su magnetine maišykle (4.7). Šildoma iki virimo ir verdama 5 min su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuomet per kondensatorių (4.3) įpilama 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir dar 25 min. verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi, maišant silpna azoto srove. Kondensatorius plaunamas maždaug 20 ml vandens ir kolbos turinys aušinamas iki kambario temperatūros.

5.3   Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalas dekantuojant kiekybiškai supilamas į 1 000 ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3) ar į ekstrahavimo aparatą (4.8), iš viso plovimui sunaudojant 250 ml vandens. Muilinimo kolba iš eilės plaunama 25 ml etanolio (3.1) ir 100 ml petroleterio (3.2), plovimo skysčiai supilami į dalijamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatą. Vandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 2:1. Stipriai purtoma 2 min ir 2 min paliekama nusistovėti.

5.3.1   Ekstrahavimas naudojant dalijamąjį piltuvą (4.2.3)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), petroleterio sluoksnis supilamas į kitą dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2).

Dalijamajame piltuve sujungti ekstraktai du kartus plaunami 100 ml vandens, švelniai sukant piltuvą (kad nesusidarytų emulsija), purtant piltuvą ekstraktai toliau plaunami 100 ml vandens porcijomis tol, kol vandeninis sluoksnis lieka bespalvis, kai įpilama fenolftaleino tirpalo (3.7) (paprastai pakanka plauti keturis kartus). Išplautas ekstraktas filtruojamas per sausą gofruotąjį filtrą fazėms atskirti (4.4) į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2), kad būtų pašalintas visas suspenduotas vanduo. Dalijamasis piltuvas ir filtras plaunami 50 ml petroleterio (3.2), skiedžiama petroleteriu (3.2) iki žymės ir gerai sumaišoma.

5.3.2   Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo aparatą (4.8)

Sluoksniams atsiskyrus (žr. 7.3 pastabą), stiklinio cilindro (4.8.1) kamštis keičiamas šlifo įmova (4.8.2) ir reguliuojamo vamzdžio apatinis U formos galas nustatomas taip, kad jis būtų šiek tiek virš sluoksnių skiriamosios ribos. Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pučiant suslėgtąjį azotą, viršutinis petroleterio sluoksnis supilamas į 1 000 ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (3.2), cilindras užkemšamas ir gerai supurtomas. Sluoksniams leidžiama atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinis sluoksnis supilamas į dalijamąjį piltuvą. Ekstrahavimo procedūra kartojama dar kartą su 100 ml petroleterio (3.2), vėliau du kartus su 50 ml petroleterio (3.2) ir petroleterio sluoksniai supilami į dalijamąjį piltuvą.

Sujungti petroleterio ekstraktai plaunami, kaip aprašyta 5.3.1, ir tęsiama, kaip ten aprašyta.

5.4   Ėminio tirpalo ruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4) pipete paimama alikvotinė petroleterio tirpalo (5.3.1 ar 5.3.2) dalis. Sukamajame garintuve (4.1) esant sumažintam slėgiui tirpiklis išgarinamas beveik iki sauso likučio, kai vonios temperatūra ne aukštesnė nei 40 oC. Įleidžiant azoto (3.10), slėgis didinamas iki atmosferos slėgio, kolba nuimama nuo sukamojo garintuvo. Likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.10) ir likutis iš karto tirpinamas žinomame tūryje (10–100 ml) metanolio (3.3) (A vitamino koncentracija turi būti 5 IU/ml–30 IU/ml intervale).

5.5   Nustatymas HPLC metodu

A vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (4.5.1), koncentracija matuojama naudojant ultravioletinį detektorių (325 nm) arba fluorescencinį detektorių (sužadinimas: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2).

Alikvotinė metanolinio tirpalo, gauto pagal 5.4 dalį, dalis (pvz., 20 μl) įpurškiama ir plaunama judančiąja faze (3.9). Apskaičiuojamas kelių to paties ėminio įpurkštų tirpalų vidutinis smailių aukštis (plotas) ir kelių įpurkštų kalibravimo tirpalų (5.6.2) vidutiniai smailių aukščiai (plotai).

HPLC sąlygos

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, 5 arba 10 μm įkrova, arba lygiavertė
Judančioji fazė (3.9):	metanolio (3.3) ir vandens mišinys, pvz., 980 + 20 (V + V).
Srautas:	1–2 ml/min
Detektorius (4.5.2):	ultravioletinis (325 nm) arba fluorescencinis detektorius (sužadinimas: 325 nm, emisija: 475 nm)

5.6   Kalibravimas

5.6.1   Darbinių etaloninių tirpalų ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (4.2.1) pipete paimama 20 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3.11.1) arba 20 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3.12.1) ir hidrolizuojama, kaip aprašyta 5.2, bet be BHT. Vėliau ekstrahuojama petroleteriu (3.2) pagal 5.3 dalį ir skiedžiama petroleteriu (3.2) iki 500 ml. 100 ml šio ekstrakto sukamajame garintuve (žr. 5.4) išgarinama beveik iki sauso likučio, likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.10) ir likutis ištirpinamas 10,0 ml metanolio (3.3). Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 560 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.3. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimama 2,0 ml šio darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šio praskiesto darbinio tirpalo vardinė koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml.

5.6.2   Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 1,0, 2,0, 5,0 ir 10,0 ml praskiesto darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,8, 5,6, 14,0 ir 28,0 IU A vitamino viename ml.

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė, atsižvelgiant į UV kontrolės rezultatus (5.6.3.3).

5.6.3   Etaloninių tirpalų UV etalonavimas

5.6.3.1   A vitamino acetato pradinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimama 2,0 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3.11.1) ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 3,0 ml šio praskiesto A vitamino acetato tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (3.8) 300 nm–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

A vitamino IU/ml = E326 × 19,0

( A vitamino acetato = 1 530, esant 326 nm, 2-propanolyje)

5.6.3.2   A vitamino palmitato pradinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimama 2,0 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3.12.1) ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 3,0 ml šio praskiesto A vitamino palmitato tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (3.8) 300 nm–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

A vitamino IU/ml = E326 × 19,0

( A vitamino palmitato = 957, esant 326 nm, 2-propanolyje)

5.6.3.3   A vitamino darbinis etaloninis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimama 3,0 ml nepraskiesto A vitamino darbinio etaloninio tirpalo, paruošto pagal 5.6.1, ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 5,0 ml šio tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (3.8) 300 nm–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

A vitamino IU/ml = E325 ×18,3

( A vitamino alkoholio = 1 821 esant 326 nm, 2-propanolyje)

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Naudojant ėminio tirpalo A vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą), pagal kalibravimo kreivę (5.6.2) nustatoma ėminio tirpalo koncentracija IU/ml.

A vitamino kiekis ėminyje IU/kg apskaičiuojamas pagal šią formulę:

[UI/kg]

kurioje:

c	=	A vitamino koncentracija ėminio tirpale (5.4) IU/ml
V1	=	ėminio tirpalo (5.4) tūris ml
V2	=	alikvotinės tirpalo (5.4) dalies tūris ml
m	=	tiriamosios dalies svoris g

7.   Pastabos

7.1	Jei ėminių A vitamino koncentracija yra maža, gali būti naudinga sujungti dviejų po muilinimo gautų įkrovų (pasvertas kiekis: 25 g) petroleterio ekstraktus į vieną ėminio tirpalą, skirtą nustatymui HPLC metodu.

7.2	Analizei paimtame ėminyje riebalų ne daugiau nei 2 g.

7.3	Jei fazės neatsiskiria, emulsijai suardyti įpilama maždaug 10 ml etanolio (3.1).

7.4	Jei tai menkės kepenų aliejus ir kiti grynieji riebalai, muilinimo trukmė prailginama iki 45 min–60 min.

7.5	Vietoje BHT galima naudoti hidrochinoną.

7.6	Naudojant tiesioginių fazių kolonėlę įmanomas retinolio izomerų atskyrimas. Bet šiuo atveju atliekant apskaičiavimus visų cis- ir trans-izomerų smailių aukščiai (plotai) turi būti sudėti.

7.7	Vietoje natrio askorbato tirpalo galima naudoti maždaug 150 mg askorbo rūgšties.

7.8	Vietoje natrio sulfido tirpalo galima naudoti maždaug 50 mg EDTA.

7.9

Analizuojant A vitaminą pieno pakaitaluose, ypač reikia kreipti dėmesį į: — muilinimą (5.2): dėl ėminyje esančio riebalų kiekio gali tekti naudoti didesnį kalio hidroksido tirpalo (3.4) tūrį, — ekstrahavimą (5.3): dėl emulsijų buvimo gali tekti keisti vandens ir etanolio santykį 2:1. Norint patikrinti, ar šiai konkrečiai matricai (pieno pakaitalui) taikomu analizės metodu gaunami patikimi rezultatai, išgavos dydis patikrinamas, paėmus papildomą tiriamąją dalį. Jei išgavos dydis mažesnis nei 80 %, turi būti daroma analizės rezultato pataisa dėl išgavos dydžio.

8.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliekamų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 15 % didžiausiojo rezultato vertės.

9.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai  (1)

	Premiksai	Pašarai su premiksais	Mineralų koncentratas	Baltyminiai pašarai	Paršelių pašarai
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
vidurkis [IU/kg]	17,02 × 106	1,21 × 106	537 100	151 800	18 070
sr [IU/kg]	0,51 × 106	0,039 × 106	22 080	12 280	682
r [IU/kg]	1,43 × 106	0,109 × 106	61 824	34 384	1 910
CVr [ %]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
sR [IU/kg]	1,36 × 106	0,069 × 106	46 300	23 060	3 614
R [IU/kg]	3,81 × 106	0,193 × 10 6	129 640	64 568	10 119
CVR [ %]	8,0	6,2	8,6	15	20

L	=	laboratorijų skaičius
n	=	atskirų verčių skaičius
sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
sR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
r	=	pakartojamumas
R	=	atkuriamumas
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas

B.   E VITAMINO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas E vitaminui pašaruose ir premiksuose nustatyti. E vitamino kiekis išreiškiamas mg DL-α-tokoferolio acetato vienam kg pašaro. 1 mg DL-α-tokoferolio acetato atitinka 0,91 mg α-tokoferolio (E vitamino).

Kiekybinio nustatymo riba – 2 mg E vitamino/kg. Šią kiekybinio nustatymo ribą galima pasiekti tik naudojant fluorescencinį detektorių. Naudojant ultravioletinį detektorių, kiekybinio nustatymo riba – 10 mg/kg.

2.   Metodas

Ėminys hidrolizuojamas etanoliniu kalio hidroksido tirpalu ir E vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, likutis ištirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. E vitamino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu naudojant fluorescencinį arba ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1	Etanolis, σ = 96 %

3.2	Petroleteris, virimo temperatūros intervalas 40 oC–60 oC

3.3

Metanolis

3.4	Kalio hidroksido tirpalas, c = 50 g/100 ml

3.5	Natrio askorbato tirpalas, c = 10 g/100 ml (žr. 7.7 pastabas)

3.6	Natrio sulfidas, Na2S· x H2O (x = 7–9)

3.6.1

Natrio sulfido tirpalas glicerolyje, c = 0,5 mol/l, β = 120 g/l (kai x = 9) (žr. 7.8 pastabas)

3.7	Fenolftaleino tirpalas etanolyje (3.1), c = 2 g/100 ml

3.8	HPLC judančioji fazė: metanolio (3.3) ir vandens mišinys, pvz., 980 + 20 (V + V). Tikslus santykis nustatomas pagal naudojamos kolonėlės charakteristikas

3.9	Azotas, be deguonies

3.10	DL-α-tokoferolio acetatas, ypač grynas, sertifikuoto aktyvumo

3.10.1

DL-α-tokoferolio acetato pradinis tirpalas. 100 mg DL-α-tokoferolio acetato (3.10) pasveriama 0,1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Ištirpinama etanolyje (3.1) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. 1 ml šio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio acetato (apie UV kontrolę žr. 5.6.1.3; apie stabilizavimą žr. 7.4 pastabas).

3.11	DL-α-tokoferolis, ypač grynas, sertifikuoto aktyvumo

3.11.1

DL-α-tokoferolio pradinis tirpalas. 100 mg DL-α-tokoferolio (3.11) pasveriama 0,1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Ištirpinama etanolyje (3.1) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. 1 ml šio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio (apie UV kontrolę žr. 5.6.2.3; apie stabilizavimą žr. 7.4 pastabas).

3.12	2,6-di-tert-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr. 7.5 pastabas)

4.   Aparatūra

4.1	Sukamasis garintuvas

4.2	Rudo stiklo indai

4.2.1

plokščiadugnės arba kūginės kolbos, 500 ml, su šlifo mova

4.2.2

matavimo kolbos su šlifo kamščiais, siaurakaklės, 10, 25, 100 ir 500 ml

4.2.3

kūginiai dalijamieji piltuvai, 1 000 ml, su šlifo kamščiais

4.2.4

kriaušės formos kolbos, 250 ml, su šlifo mova

4.3	Allihn kondensatorius, apvalkalo ilgis 300 mm, su šlifo jungtimi, su dujų tiekimo vamzdžio adapteriu

4.4	Gofruotasis filtravimo popierius fazėms atskirti, skersmuo 185 mm (pvz., Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5	HPLC įranga su įpurškimo sistema

4.5.1

Skysčių chromatografijos kolonėlė, 250 mm × 4 mm, C18, 5 ar 10 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė

4.5.2

Reguliuojamo bangos ilgio fluorescencinis arba ultravioletinis detektorius

4.6	Spektrofotometras ir 10 mm kvarco kiuvetės

4.7	Vandens vonia ir magnetinė maišyklė

4.8	Ekstrahavimo aparatas (žr. 1 paveikslą), kurį sudaro:

4.8.1

1 l talpos stiklinis cilindras su šlifo mova ir kamščiu

4.8.2

šlifo įmova su atšaka ir reguliuojamo ilgio vamzdžiu, einančiu per centrą. Reguliuojamo ilgio vamzdžio apatinis galas yra U formos, viršutinis – siaurėjančio antgalio formos, kad cilindre esančio tirpalo viršutinis sluoksnis galėtų būti supiltas į dalijamąjį piltuvą.

5.   Procedūra

Pastaba

E vitaminas yra jautrus ultravioletinei spinduliuotei ir oksidavimui. Visi veiksmai atliekami tamsoje (naudojami rudo stiklo indai arba aliuminio folija apvynioti indai) ir nesant deguonies (šalinamas azoto srove). Ekstrahuojant oras virš skysčio pakeičiamas azotu (vengiant per didelio slėgio kartkartėmis reikia ištraukti kamštį).

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas, kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis, vengiant šilumos susidarymo. Turi būti malama prieš pat svėrimą ir muilinimą, kad nebūtų E vitamino nuostolių.

5.2   Muilinimas

Atsižvelgiant į E vitamino kiekį, 0,01 g tikslumu pasveriama 2–25 g ėminio, ėminys supilamas į plokščiadugnę ar kūginę 500 ml tūrio kolbą (4.2.1). Maišant iš eilės įpilama 130 ml etanolio (3.1), maždaug 100 mg BHT (3.12), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.6). Prie kolbos prijungiamas kondensatorius (4.3) ir kolba įmerkiama į vandens vonią su magnetine maišykle (4.7). Šildoma iki virimo ir verdama 5 min su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuomet per kondensatorių (4.3) įpilama 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir dar 25 min. verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi, maišant silpna azoto srove. Kondensatorius plaunamas maždaug 20 ml vandens ir kolbos turinys aušinamas iki kambario temperatūros.

5.3   Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalas dekantuojant kiekybiškai supilamas į 1 000 ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3) ar į ekstrahavimo aparatą (4.8), iš viso plovimui sunaudojant 250 ml vandens. Muilinimo kolba iš eilės plaunama 25 ml etanolio (3.1) ir 100 ml petroleterio (3.2), plovimo skysčiai supilami į dalijamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatą. Vandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 2:1. Stipriai purtoma 2 min ir 2 min paliekama nusistovėti.

5.3.1   Ekstrahavimas naudojant dalijamąjį piltuvą (4.2.3)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), petroleterio sluoksnis supilamas į kitą dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2).

Dalijamajame piltuve sujungti ekstraktai du kartus plaunami 100 ml vandens, švelniai sukant piltuvą (kad nesusidarytų emulsija), purtant piltuvą ekstraktai toliau plaunami 100 ml vandens porcijomis tol, kol vandeninis sluoksnis lieka bespalvis, kai įpilama fenolftaleino tirpalo (3.7) (paprastai pakanka plauti keturis kartus). Išplautas ekstraktas filtruojamas per sausą gofruotąjį filtrą fazėms atskirti (4.4) į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2), kad būtų pašalintas visas suspenduotas vanduo. Dalijamasis piltuvas ir filtras plaunami 50 ml petroleterio (3.2), skiedžiama petroleteriu (3.2) iki žymės ir gerai sumaišoma.

5.3.2   Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo aparatą (4.8)

Sluoksniams atsiskyrus (žr. 7.3 pastabą), stiklinio cilindro (4.8.1) kamštis keičiamas šlifo įmova (4.8.2) ir reguliuojamo vamzdžio apatinis U formos galas nustatomas taip, kad jis būtų šiek tiek virš sluoksnių skiriamosios ribos. Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pučiant suslėgtąjį azotą, viršutinis petroleterio sluoksnis supilamas į 1 000 ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (3.2), cilindras užkemšamas ir gerai supurtomas. Sluoksniams leidžiama atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinis sluoksnis supilamas į dalijamąjį piltuvą. Ekstrahavimo procedūra kartojama dar kartą su 100 ml petroleterio (3.2), vėliau du kartus su 50 ml petroleterio (3.2) ir petroleterio sluoksniai supilami į dalijamąjį piltuvą.

Sujungti petroleterio ekstraktai plaunami, kaip tai aprašyta 5.3.1, ir tęsiama, kaip ten aprašyta.

5.4   Ėminio tirpalo ruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4) pipete paimama alikvotinė petroleterio tirpalo (5.3.1 ar 5.3.2) dalis. Sukamajame garintuve (4.1) esant sumažintam slėgiui tirpiklis išgarinamas beveik iki sauso likučio, kai vonios temperatūra ne aukštesnė nei 40 oC. Įleidžiant azoto (3.9), slėgis didinamas iki atmosferos slėgio, kolba nuimama nuo sukamojo garintuvo. Likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.10) ir likutis iš karto tirpinamas žinomame tūryje (10–100 ml) metanolio (3.3) (DL-α-tokoferolio koncentracija turi būti 5 μg/ml–30 μg/ml intervale).

5.5   Nustatymas HPLC metodu

E vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (4.5.1), koncentracija matuojama naudojant fluorescencinį detektorių (sužadinimas: 295 nm, emisija: 330 nm) ar ultravioletinį detektorių (292 nm) (4.5.2).

Alikvotinė metanolinio tirpalo, gauto pagal 5.4 dalį, dalis (pvz., 20 μl) įpurškiama ir plaunama judančiąja faze (3.9). Apskaičiuojamas kelių to paties ėminio įpurkštų tirpalų vidutinis smailių aukštis (plotas) ir kelių įpurkštų kalibravimo tirpalų (5.6.2) vidutiniai smailių aukščiai (plotai).

HPLC sąlygos

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, 5 arba 10 μm įkrova, arba lygiavertė
Judančioji fazė (3.8):	metanolio (3.3) ir vandens mišinys pvz., 980 + 20 (V + V).
Srautas:	1–2 ml/min.
Detektorius (4.5.2):	fluorescencinis detektorius (sužadinimas: 295 nm, emisija 330 nm) arba ultravioletinis detektorius (292 nm)

5.6   Kalibravimas (DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio)

5.6.1   DL-α-tokoferolio acetato etalonas

5.6.1.1   Darbinio etaloninio tirpalo ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (4.2.1) pipete paimama 25 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) ir hidrolizuojama, kaip aprašyta 5.2. Vėliau ekstrahuojama petroleteriu (3.2), kaip aprašyta 5.3, ir skiedžiama petroleteriu iki 500 ml. 25 ml šio ekstrakto garinama sukamajame garintuve (žr. 5.4) beveik iki sauso likučio, likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.9) ir likutis ištirpinamas 25,0 ml metanolio (3.3). Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 45,5 μg DL-α-tokoferolio viename ml, tai atitinka 50 μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

5.6.1.2   Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 1,0, 2,0, 4,0 ir 10,0 ml darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,5, 5,0, 10,0 ir 25,0 μg/ml DL-α-tokoferolio acetato, t. y. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml ir 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolio.

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė.

5.6.1.3   DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) UV etalonavimas

5,0 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) etanoliu skiedžiama iki 25,0 ml ir spektrofotometru (4.6) matuojamas pagal etanolį (3.1) šio tirpalo ultravioletinis spektras 250 nm–320 nm diapazone.

Absorbcijos maksimumas atitinka 284 nm:

= 43,6 esant 284 nm etanolyje

Esant šiam praskiedimui, gauta ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 0,84–0,88.

5.6.2.   DL-α-tokoferolio etalonas

5.6.2.1   Darbinio etaloninio tirpalo ruošimas

Į 50 ml matavimo kolbą pipete paimama 2,0 ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1), ištirpinama metanolyje (3.3) ir metanoliu skiedžiama iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 40 μg DL-α-tokoferolio viename ml, tai atitinka 44,0 μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

5.6.2.2   Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 1,0, 2,0, 4,0 ir 10,0 ml darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,0, 4,0, 8,0 ir 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolio, t. y. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml ir 22,0 μg/ml DL-α-tokoferolio acetato.

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė.

5.6.2.3   DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1) UV etalonavimas

2,0 ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1) etanoliu skiedžiama iki 25,0 ml ir spektrofotometru (4.6) matuojamas pagal etanolį (3.1) šio tirpalo ultravioletinis spektras 250–320 nm diapazone. Absorbcijos maksimumas atitinka 292 nm:

= 75,8 esant 292 nm, etanolyje

Esant šiam praskiedimui, ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 0,6.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Naudojant ėminio tirpalo E vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą), pagal kalibravimo kreivę (5.6.1.2 ar 5.6.2.2) nustatoma ėminio tirpalo koncentracija μg/ml (apskaičiuota α-tokoferolio acetatui).

E vitamino kiekis ėminyje w, mg/kg, nustatomas pagal šią formulę:

[mg/kg]

kurioje:

c	=	ėminio tirpalo (5.4) E vitamino (kaip α-tokoferolio acetato) koncentracija μg/ml
V1	=	ėminio tirpalo (5.4) tūris ml
V2	=	tirpalo (5.4) paimtos alikvotinės dalies tūris ml
m	=	tiriamosios dalies svoris g

7.   Pastabos

7.1	Jei ėminių E vitamino koncentracija yra maža, gali būti naudinga sujungti dviejų po muilinimo gautų įkrovų (pasvertas kiekis: 25 g) petroleterio ekstraktus į vieną ėminio tirpalą, skirtą nustatymui HPLC metodu.

7.2	Analizei paimtame ėminyje riebalų ne daugiau nei 2 g.

7.3	Jei fazės neatsiskiria, emulsijai suardyti įpilama maždaug 10 ml etanolio (3.1).

7.4	Po DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio tirpalų spektrofotometrinių matavimų atitinkamai pagal 5.6.1.3 ar 5.6.2.3, į tirpalą (3.10.1 ar 3.10.2) įdedama maždaug 10 mg BHT (3.12) ir tirpalas laikomas šaldytuve (laikymo trukmė ne ilgesnė kaip keturios savaitės).

7.5	Vietoje BHT galima naudoti hidrochinoną.

7.6	Naudojant tiesioginių fazių kolonėlę, įmanoma atskirti α-, β-, γ- ir δ-tokoferolius.

7.7	Vietoje natrio askorbato tirpalo galima naudoti maždaug 150 mg askorbo rūgšties.

7.8	Vietoje natrio sulfido tirpalo galima naudoti maždaug 50 mg EDTA.

7.9

E vitamino acetatas labai greitai hidrolizuojasi šarminėje terpėje, taigi yra labai jautrus oksidavimui, ypač jei yra metalų pėdsakų, pvz., geležies arba vario. Dėl šios priežasties nustatant E vitaminą premiksuose, kai jo koncentracija didesnė nei 5 000 mg/kg, gali vykti jo skilimas. Todėl patvirtinimui reikia rekomenduoti HPLC metodą ir E vitamino preparato skaidymą fermentais, netaikant šarminio muilinimo stadijos.

8.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliekamų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 15 % didžiausiojo rezultato vertės.

9.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai  (2)

	Premiksas	Pašarai su premiksais	Mineralų koncentratas	Baltyminiai pašarai	Paršelių pašarai
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
vidurkis [mg/kg]	17 380	1 187	926	315	61,3
sr [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr [ %]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
sR [mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR [ %]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	=	laboratorijų skaičius
n	=	atskirų verčių skaičius
sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
sR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
r	=	pakartojamumas
R	=	atkuriamumas
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas

C.   GELEŽIES, VARIO, MANGANO IR CINKO MIKROELEMENTŲ NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti geležies, vario, mangano ir cinko mikroelementų kiekį pašaruose. Kiekybinio nustatymo riba:

—	geležies (Fe): 20 mg/kg

—	vario (Cu): 10 mg/kg

—	mangano (Mn): 20 mg/kg

—	cinko (Zn): 20 mg/kg

2.   Principas

Ėminys po organinės medžiagos (jei ji buvo) suskaidymo ištirpinamas druskos rūgštyje. Po atitinkamo praskiedimo geležis, varis, manganas ir cinkas nustatomi atominės absorbcijos spektrometrijos metodu.

3.   Reagentai

Įvadinės pastabos

Reagentams ir analizei skirtiems tirpalams ruošti reikia naudoti vandenį, kuriame nebūtų nustatomų katijonų, todėl vanduo gaunamas du kartus distiliuojant distiliatoriuje iš borosilikatinio ar kvarcinio stiklo arba du kartus apdorojant jonitine derva.

Reagentai turėtų būti bent analiziškai gryni. Nustatomų elementų nebuvimas turi būti tikrinamas atliekant tuščiąjį bandymą. Prireikus reagentai turi būti papildomai gryninami.

Vietoje žemiau aprašomų etaloninių tirpalų galima naudoti prekyboje esančius etaloninius tirpalus, jei tik jie turi garantiją ir prieš naudojimą buvo patikrinti.

3.1	Vandenilio chlorido rūgštis (d:1,19 g/ml).

3.2	Vandenilio chlorido rūgštis (6 mol/l).

3.3	Vandenilio chlorido rūgštis (0,5 mol/l).

3.4	Vandenilio fluorido rūgšties 38–40 % (V/V) tirpalas, kuriame geležies (Fe) būtų mažiau nei 1 mg/l, o likučio po išgarinimo masė (sulfato pavidalu) mažesnė nei 10 mg/l.

3.5	Sieros rūgštis (d: 1,84 g/ml).

3.6	Vandenilio peroksidas (maždaug 100 tūrių deguonies (30 % masės)).

3.7	Etaloninis geležies tirpalas (1 000 μg Fe/ml), ruošiamas, kaip nurodyta toliau, arba naudojamas lygiavertis prekyboje esantis tirpalas: 1 g geležies vielos ištirpinama 200 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2), įpilama 16 ml vandenilio peroksido (3.6) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.7.1

Darbinis etaloninis geležies tirpalas (100 μg Fe/ml) ruošiamas etaloninį tirpalą (3.7) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9.

3.8

Etaloninis vario tirpalas (1 000 μg Cu/ml) ruošiamas, kaip nurodyta toliau, arba naudojamas lygiavertis prekyboje esantis tirpalas: — 1 g vario miltelių užpilama 25 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2), įpilama 5 ml vandenilio peroksido (3.6) ir gautas tirpalas skiedžiamas vandeniu iki 1 litro.

3.8.1

Darbinis etaloninis vario tirpalas (10 μg Cu/ml) ruošiamas etaloninį tirpalą (3.8) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9 ir taip gautą tirpalą dar kartą skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9.

3.9	Etaloninis mangano tirpalas (1 000 μg Mn/ml) ruošiamas, kaip nurodyta toliau, arba naudojamas lygiavertis prekyboje esantis tirpalas: — 1 g mangano miltelių tirpinama 25 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.9.1

Darbinis etaloninis mangano tirpalas (10 μg Mn/ml) ruošiamas etaloninį tirpalą (3.9) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9 ir taip gautą tirpalą dar kartą skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9.

3.10	Etaloninis cinko tirpalas (1 000 μg Zn/ml) ruošiamas, kaip nurodyta toliau, arba naudojamas lygiavertis prekyboje esantis tirpalas: — 1 g cinko strypelio arba lapelių (a. g.) tirpinama 25 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.10.1

Darbinis etaloninis cinko tirpalas (10 μg Zn/ml) ruošiamas etaloninį tirpalą (3.10) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9 ir taip gautą tirpalą dar kartą skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9.

3.11	Lantano chlorido tirpalas: 12 g lantano oksido ištirpinama 150 ml vandens, įpilama 100 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

4.   Aparatūra

4.1	Mufelinė krosnis su temperatūros reguliatoriumi ir pageidautina su rašytuvu.

4.2	Stikliniai indai turi būti iš atsparaus borosilikatinio stiklo, rekomenduojama naudoti aparatūrą, kuri būtų skirta tik mikroelementams nustatyti.

4.3	Spektrofotometras atominei absorbcinei analizei atlikti, atitinkantis metodo jautrio ir glaudumo reikalavimus reikiamame koncentracijos intervale.

5.   Procedūra  (3)

5.1   Ėminiai, turintys organinių medžiagų

5.1.1   Ėminio sudeginimas ir analizei skirto tirpalo ruošimas  (4)

5.1.1.1.

5–10 g ėminio, pasverto 0,2 mg tikslumu, įdedama į platininį arba kvarcinį tiglį (4.3) (žr. (b) pastabą), džiovinama 105 oC temperatūroje džiovinimo spintoje, tada tiglis dedamas į šaltą mufelinę krosnį (4.1). Krosnis uždaroma (žr. (c) pastabą) ir per maždaug 90 min temperatūra laipsniškai pakeliama iki 450–475 oC. Tokioje temperatūroje tiglis laikomas 4–16 h (pvz., per naktį), kad būtų pašalintos visos organinės medžiagos, krosnis atidaroma ir paliekama ataušti (žr. d) pastabą). Pelenai sudrėkinami vandeniu ir supilami į 250 ml tūrio cheminę stiklinę.Tiglio turinys išplaunamas į cheminę stiklinę, tam sunaudojant iš viso maždaug 5 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), kuri pilama lėtai ir atsargiai (dėl CO2 susidarymo gali vykti audringa reakcija). Vandenilio chlorido rūgštis (3.1) į stiklinę lašinama maišant tirpalą tol, kol nustoja skirtis dujų burbuliukai. Išgarinama iki sauso likučio, retkarčiais maišant stikline lazdele. Į likutį įpilama 15 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2) ir apie 120 ml vandens. Maišoma stikline lazdele, kuri paliekama stiklinėje, stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu. Stiklinės turinys lėtai užverdamas ir virinamas tol, kol galima pamatyti, kad daugiau pelenų nebeištirpsta. Filtruojama per bepelenį filtravimo popierių ir filtratas supilamas į 250 ml matavimo kolbą. Stiklinė ir filtras plaunami 5 ml karšto vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2) ir du kartus verdančiu vandeniu. Matavimo kolbos turinys skiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija maždaug 0,5 mol/l).

5.1.1.2.

Jei likutis ant filtro yra juodas (anglis), filtras vėl dedamas į krosnį ir sudeginamas 450–475 oC temperatūroje. Šis sudeginimas, kuris trunka tik kelias valandas (tris–penkias valandas), yra baigtas, kai pelenai tampa balti arba beveik balti. Likutis tirpinamas maždaug 2 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), garinamas iki sauso likučio ir įpilama 5 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2). Pakaitinama, tirpalas filtruojamas į matavimo kolbą ir skiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija yra apie 0,5 mol/l). Pastabos: a) Atliekant pėdsakų analizę, svarbu visą laiką turėti omenyje užteršimo, ypač cinku, variu ir geležimi, pavojų. Dėl šios priežasties įrangoje, kuri naudojama ėminiams ruošti, šių elementų turi nebūti. Bendram užteršimo pavojui sumažinti dirbama dulkių neturinčioje aplinkoje su labai švaria įranga ir rūpestingai išplautais stikliniais indais. Cinko nustatymas yra ypač jautrus įvairių rūšių teršalams, pvz., teršalams ant stiklinių indų, reagentuose, dulkėms ir pan. b) Sudeginamo ėminio masė apskaičiuojama pagal apytikrį mikroelementų kiekį pašaruose, atsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro jautrį. Tam tikriems pašarams, kuriuose mikroelementų mažai, gali prireikti 10–20 g masės ėminio ir gauti iš jo tik 100 ml tūrio galutinį tirpalą. c) Turi būti deginama uždarytoje krosnyje, nepučiant oro arba deguonies. d) Pirometro rodoma temperatūra neturi būti aukštesnė nei 475 oC.

5.1.2   Spektrofotometrinis nustatymas

5.1.2.1   Kalibravimo tirpalų ruošimas

Iš darbinių etaloninių tirpalų, nurodytų 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ir 3.10.1 punktuose, kiekvienam nustatomam elementui ruošiama keletas kalibravimo tirpalų, kurių kiekvieno HCl koncentracija yra apie 0,5 mol/l ir lantano chlorido koncentracija (geležies, mangano ir cinko atveju) atitinka 0,1 % (m/V) La koncentraciją.

Pasirenkama mikroelementų koncentracija turi atitikti naudojamo spektrofotometro jautrio ribas. Toliau kaip pavyzdys pateikiamose lentelėse rodoma kalibruoti naudojamų tirpalų sudėties tipiniai intervalai, tačiau, atsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro tipą ir jautrį, gali tekti pasirinkti kitas koncentracijos vertes.

Geležis

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml darbinio etaloninio tirpalo (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir skiedžiama vandeniu iki 100 ml

Varis

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml darbinio etaloninio tirpalo (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Manganas

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml darbinio etaloninio tirpalo (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir skiedžiama vandeniu iki 100 ml

Cinkas

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml darbinio etaloninio tirpalo (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir skiedžiama vandeniu iki 100 ml

5.1.2.2    Tirpalo ruošimas analizei

Variui nustatyti pagal 5.1.1 punktą paruoštą tirpalą paprastai galima naudoti tiesiogiai. Jei reikia, kad jo koncentracija būtų kalibruoti naudojamų tirpalų koncentracijos verčių intervale, alikvotinė dalis gali būti paimta pipete į 100 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės 0,5 mol/l vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (3.3).

Geležiai, manganui ir cinkui nustatyti pagal 5.1.1 punktą paruošto tirpalo alikvotinė dalis paimama pipete į 100 ml matavimo kolbą, įpilama 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir skiedžiama iki žymės 0,5 mol/l vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (3.3). (Be to, žr. 8 punkto pastabą).

5.1.2.3    Tuščiasis bandymas

Tuščiąjį bandymą turi sudaryti visos nurodytos procedūros pakopos, išskyrus tai, kad nededama ėminio medžiagos. Kaip tuščiasis ėminys neturi būti naudojamas „0“ koncentracijos kalibravimo tirpalas.

5.1.2.4    Atominės absorbcijos matavimas

Matuojama kalibravimo tirpalų ir analizuojamo tirpalo atominė absorbcija, naudojant oro-acetileno oksiduojančiąją liepsną, esant šiems bangų ilgiams:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Kiekvienas matavimas atliekamas keturis kartus.

5.2   Mineraliniai pašarai

Jei ėminyje nėra organinių medžiagų, sudeginimas prieš analizę nereikalingas. Daroma kaip aprašyta 5.1.1.1 punkte, pradedant nuo antrosios pastraipos. Galima praleisti išgarinimo su fluoro vandenilio rūgštimi pakopą.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Naudojant kalibravimo kreivę, apskaičiuojama mikroelementų koncentracija analizuojamame tirpale ir rezultatas išreiškiamas mikroelemento mg kiekiu vienam ėminio kilogramui (milijonosiomis dalimis).

7.   Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analizę atliekančiam asmeniui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu ėminiu, skirtumas ne didesnis nei:

—	5 mg/kg, absoliučiąja verte, kai nustatomo mikroelemento kiekis ne didesnis nei 50 mg/kg,

—	10 % didžiausio rezultato, kai nustatomo mikroelemento kiekis yra 50–100 mg/kg,

—	10 mg/kg, absoliučiąja verte, kai nustatomo mikroelemento kiekis yra 100–200 mg/kg,

—	5 % didžiausio rezultato, kai nustatomo mikroelemento kiekis yra didesnis nei 200 mg/kg.

8.   Pastaba

Dideli fosfatų kiekiai gali trukdyti nustatyti geležį, manganą ir cinką. Tokie trukdžiai turi būti pašalinti, įpilant lantano chlorido tirpalo (3.11). Tačiau, jei ėminyje masių santykis (Ca + mg)/P > 2, lantano chlorido tirpalo (3.11) į analizės tirpalą ir etaloninius tirpalus galima nepilti.

D.   HALOFUGINONO NUSTATYMAS

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-ono hidrobromidas

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas halofuginonui nustatyti pašaruose. Kiekybinio nustatymo riba – 1 mg/kg.

2.   Metodas

Apdorotas karštu vandeniu halofuginonas ekstrahuojamas kaip laisvoji bazė į etilacetatą ir po to atskiriamas kaip vandenilio chloridas į vandeninį rūgšties tirpalą. Ekstraktas gryninamas, taikant jonų mainų chromatografiją. Halofuginono kiekis nustatomas atvirkštinės fazės efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC), naudojant ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1	Acetonitrilas, HPLC grynumo.

3.2	Amberlito XAD-2 derva.

3.3	Amonio acetatas.

3.4	Etilacetatas.

3.5	Acto rūgštis, ledinė.

3.6	Halofuginono etaloninė medžiaga (DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-ono hidrobromidas, E 764).

3.6.1

Halofuginono pradinis etaloninis tirpalas, 100 μg/ml Į 500 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg halofuginono (3.6), ištirpinama amonio acetato buferiniame tirpale (3.18), iki žymės skiedžiama buferiniu tirpalu ir sumaišoma. Šis tirpalas lieka stabilus tris savaites 5 oC temperatūroje, jei laikomas tamsoje.

3.6.2

Kalibravimo tirpalai Į keletą 100 ml matavimo kolbų įpilama 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ir 6,0 ml pradinio etaloninio tirpalo (3.6.1). Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.21) ir sumaišoma. Šių tirpalų halofuginono koncentracija yra 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ir 6,0 μg/ml. Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą.

3.7	Vandenilio chlorido rūgštis (ρ20 maždaug 1,16 g/ml).

3.8	Metanolis.

3.9	Sidabro nitratas.

3.10	Natrio askorbatas.

3.11	Natrio karbonatas.

3.12	Natrio chloridas.

3.13	EDTA (etilendiamintetraacto rūgšties dinatrio druska).

3.14	Vanduo, HPLC grynumo.

3.15	Natrio karbonato tirpalas, c = 10 g/100 ml.

3.16	Natrio karbonato tirpalas sočiajame natrio chlorido tirpale, c = 5 g/100 ml. Vandenyje ištirpinama 50 g natrio karbonato (3.11), skiedžiama iki 1 litro ir dedama natrio chlorido (3.12) tiek, kad gaunamas sotus tirpalas.

3.17	Vandenilio chlorido rūgštis, maždaug 0,1 mol/l. 10 ml HCI (3.7) skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.18	Amonio acetato buferinis tirpalas, maždaug 0,25 mol/l. Vandenyje (3.14) ištirpinama 19,3 g amonio acetato (3.3), 30 ml acto rūgšties (3.5) ir skiedžiama iki 1 litro.

3.19

Amberlito XAD-2 dervos ruošimas. Reikiamas kiekis amberlito (3.2) plaunamas vandeniu tol, kol pašalinami visi chlorido jonai, kaip rodo bandymas su sidabro nitrato tirpalu (3.20), atliekamas su išpilama vandenine faze. Derva plaunama 50 ml metanolio (3.8), metanolis išpilamas ir derva laikoma ant jos užpylus švaraus metanolio.

3.20	Sidabro nitrato tirpalas, maždaug 0,1 mol/l. 0,17 g sidabro nitrato (3.9) ištirpinama 10 ml vandens.

3.21

HPLC judančioji fazė. 500 ml acetonitrilo (3.1) maišoma su 300 ml amonio acetato buferiniu tirpalo (3.18) ir 1 200 ml vandens (3.14). Acto rūgštimi (3.5) nustatoma pH 4,3. Tirpalas filtruojamas per 0,22 μm filtrą (4.8) ir degazuojamas (pvz., 10 min ultragarsu). Šis tirpalas stabilus vieną mėnesį, jei laikomas uždarame inde ir tamsoje.

4.   Aparatūra

4.1	Ultragarso vonia.

4.2	Sukamasis garintuvas.

4.3	Centrifuga.

4.4	HPLC įranga su kintamo bangos ilgio ultravioletiniu detektoriumi arba diodų matricos detektoriumi.

4.4.1

Skysčių chromatografijos kolonėlė, 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė.

4.5	Stiklinė kolonėlė (300 mm × 10 mm) su sukepinto stiklo filtru ir čiaupu.

4.6	Stiklo pluošto filtrai, skersmuo 150 mm.

4.7	Membraniniai filtrai, 0,45 μm.

4.8	Membraniniai filtrai, 0,22 μm.

5.   Procedūra

Pastaba.

Halofuginonas kaip laisvoji bazė yra nepatvarus šarminiuose ir etilacetato tirpaluose, todėl etilacetate laikomas ne ilgiau nei 30 min.

5.1   Bendrosios nuostatos

5.1.1.

Siekiant patikrinti, ar nėra halofuginono arba trukdančiųjų medžiagų, atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė.

5.1.2.

Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį, į jį pridedant halofuginono, kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyje, nustatomas išgavos dydis. 3 mg/kg koncentracijai gauti į 10 g pašaro tuščiojo ėminio reikia įpilti 300 μl pradinio etaloninio tirpalo (3.6.1), sumaišyti ir prieš ekstrahavimą (5.2) palaukti 10 min. Pastaba Šiame metode pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptikta halofuginono.

5.2   Ekstrahavimas

Į 200 ml centrifugos mėgintuvėlį 0,1 g tikslumu pasveriama 10 g paruošto ėminio, įdedama 0,5 g natrio askorbato (3.10), 0,5 g EDTA (3.13), 20 ml vandens ir sumaišoma. Mėgintuvėlis įdedamas 5 min į vandens vonią (80 oC). Atvėsinus iki kambario temperatūros, įpilama 20 ml natrio karbonato tirpalo (3.15) ir sumaišoma. Tuoj pat įpilama 100 ml etilacetato (3.4) ir 15 s stipriai purtoma ranka. Atkimštas mėgintuvėlis dedamas trims minutėms į ultragarso vonią (4.1). Centrifuguojama 2 min ir etilacetato fazė per stiklo pluošto filtrą (4.6) nupilama į 500 ml dalijamąjį piltuvą. Kartojamas ėminio ekstrahavimas dar su 100 ml etilacetato. Sujungti ekstraktai vieną minutę plaunami 50 ml natrio chloridu prisotintu natrio karbonato tirpalu (3.16), vandeninis sluoksnis išpilamas.

Organinis sluoksnis 1 min. ekstrahuojamas 50 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (3.17). Apatinis rūgšties sluoksnis išleidžiamas į 250 ml dalijamąjį piltuvą. Organinis sluoksnis dar kartą 1,5 min ekstrahuojamas kita 50 ml vandenilio chlorido rūgšties porcija ir gautas ekstraktas sujungiamas su pirmuoju ekstraktu. Abu sujungti rūgšties ekstraktai maždaug 10 s plaunami 10 ml etilacetatu (3.4), atliekant sukamuosius judesius.

Visas vandeninis sluoksnis kiekybiškai supilamas į 250 ml talpos apvaliadugnę kolbą, organinė fazė išpilama. Visas likęs etilacetatas pašalinamas iš rūgšties tirpalo garinant sukamajame garintuve (4.2). Vandens vonios temperatūra neturi būti aukštesnė nei 40 oC. Esant maždaug 25 milibar vakuumui, visas likęs etilacetatas turėtų būti pašalintas per 5 min, kai temperatūra 38 oC.

5.3   Gryninimas

5.3.1   Amberlito kolonėlės ruošimas

XAD-2 kolonėlė ruošiama kiekvienam ėminio ekstraktui. 10 g paruošto amberlito (3.19) supilama į stiklinę kolonėlę (4.5) su metanoliu (3.8). Ant dervos sluoksnio uždedamas nedidelis stiklo vatos kamštis. Metanolis išleidžiamas iš kolonėlės ir derva plaunama 100 ml vandens, paliekant jo tiek, kad skystis apsemtų dervos paviršių. Prieš naudojimą kolonėlė 10 min paliekama pusiausvyrai nusistovėti. Niekuomet neleidžiama skysčiui visiškai ištekėti iš kolonėlės.

5.3.2   Ėminio gryninimas

Visas ekstraktas (5.2) kiekybiškai supilamas ant paruoštos amberlito kolonėlės (5.3.1) viršaus ir plaunama, išpilant eliuatą. Eliuavimo srautas neturi būti didesnis nei 20 ml/min. Apvaliadugnė kolba plaunama 20 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.17) ir šiuo tirpalu plaunama dervos kolonėlė. Rūgšties tirpalo likutis išpučiamas oro srautu. Plovimo tirpalai išpilami. Į kolonėlę įpilama 100 ml metanolio (3.8) ir į 250 ml apvaliadugnę kolbą ir surenkama nuo 5 ml iki 10 ml eliuato. Likęs metanolis 10 min. laikomas pusiausvyrai su derva nusistovėti ir eliuavimas tęsiamas esant ne didesniam nei 20 ml/min srautui, surenkant eliuatą į tą pačią kolbą. Metanolis išgarinamas sukamajame garintuve (4.2). Vandens vonios temperatūra neturi būti aukštesnė nei 40 oC. Plaunant judančiąja faze (3.21), likutis kiekybiškai supilamas į 10 ml matavimo kolbą. Skiedžiama judančiąja faze iki žymės ir sumaišoma. Alikvotinė dalis filtruojama per membraninį filtrą (4.7). Šis tirpalas naudojamas HPLC nustatymui (5.4).

5.4   HPLC nustatymas

5.4.1   Parametrai

Rekomenduojamos šios sąlygos, gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4.1).

HPLC judančioji fazė (3.21).

Srautas: 1,5 ml/min.–2 ml/min.

Detektoriaus bangos ilgis: 243 nm.

Įpurškiamas tūris: 40 μl–100 μl.

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas, kelis kartus įpurškiant 3,0 μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.6.2) tol, kol nustoja keistis smailės aukštis (arba plotas) ir sulaikymo trukmė.

5.4.2   Kalibravimo kreivė

Kiekvienas kalibravimo tirpalas (3.6.2) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (arba plotai). Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinačių ašyje – kalibravimo tirpalų smailių aukščių (arba plotų) vidurkiai, o abscisių ašyje – atitinkama koncentracija μg/ml.

5.4.3   Ėminio tirpalas

Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (5.3.2), kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį, ir matuojamas halofuginono smailių vidutinis aukštis (plotas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Ėminio tirpalo koncentracija μg/ml nustatoma pagal ėminio tirpalo halofuginono smailių vidutinį aukštį (plotą) ir kalibravimo kreivę (5.4.2).

Halofuginono kiekis w (mg/kg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

c	=	halofuginono koncentracija ėminio tirpale μg/ml,
m	=	tiriamosios dalies svoris gramais.

7.   Rezultatų patvirtinimas

7.1   Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektorių, kuriuo lyginami ėminio ekstrakto ir 6,0 μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.6.2) spektrai.

7.1.1   Kochromatografija

Ėminio ekstrakto tirpalo koncentracija padidinama, įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3.6.2.) tūrį. Pridėto halofuginono kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą halofuginono kiekį.

Turi padidėti tik halofuginono smailės aukštis, įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą. Smailės plotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinį plotį ± 10 % tikslumu.

7.1.2   Aptikimas naudojant diodų matricą

Rezultatai vertinami pagal šiuos kriterijus:

a)	ėminio ir etalono spektrų didžiausios absorbcijos bangos ilgis, užrašomas kaip chromatogramos smailės viršūnės bangos ilgis, turi būti vienodas paklaidos ribose, kurias lemia aptikimo sistemos skiriamoji geba. Diodų matricos detektoriaus tipinė vertė būtų ± 2 nm;

b)

nuo 225 nm iki 300 nm ėminio ir etalono spektras, užrašytas apie chromatogramos smailės viršūnę, šioms spektro dalims turi nesiskirti 10–100 % santykinio optinio tankio intervale. Šis kriterijus vykdomas, kai yra tie patys maksimumai ir jokiame matavimo taške dviejų spektrų skirtumas nėra didesnis nei 15 % etalono analitės optinio tankio vertės;

c)

nuo 225 nm iki 300 nm ėminio ekstraktui gautos smailės kylančios, viršūnės ir nusileidžiančios dalių spektrai šioms spektro dalims turi nesiskirti vienas nuo kito 10–100 % santykinio optinio tankio intervale. Šis kriterijus vykdomas, kai yra tie patys maksimumai ir visuose stebimuose taškuose spektrų skirtumas yra ne didesnis nei 15 % smailės viršūnę atitinkančio optinio tankio vertės.

Jei vienas iš šių kriterijų nevykdomas, analitės buvimas nepatvirtinamas.

7.2   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,5 mg/kg, kai halofuginono yra iki 3 mg/kg.

7.3   Išgavos dydis

Išgavos dydis, gautas tuščiajam ėminiui su analitės priedu, yra ne mažesnis nei 80 %.

8.   Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo atlikti tarplaboratoriniai tyrimai (5), kurių metu aštuonios laboratorijos analizavo tris ėminius.

Rezultatai

	A ėminys (tuščiasis) Kaip gautas	B ėminys (miltai)		C ėminys (granulės)
		Kaip gautas	Po dviejų mėnesių	Kaip gautas	Po dviejų mėnesių
Vidurkis [mg/kg]	ND	2,80	2,42	2,89	2,45
SR [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR [ %]	—	16	18	14	17
Rec. [ %]		86	74	88	75

ND	=	neaptikta
SR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas ( %)
Rec	=	išgavos dydis ( %)

E   ROBENIDINO NUSTATYMAS

1,3-bi[(4-chlorbenziliden)amino]guanidino hidrochloridas

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatoma robenidino koncentracija pašaruose. Kiekybinio nustatymo riba – 5 mg/kg.

2.   Metodas

Ėminys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu. Ekstraktas džiovinamas, alikvotinė ekstrakto dalis gryninama, naudojant kolonėlę su aliuminio oksidu. Robenidinas iš kolonėlės plaunamas metanoliu, koncentruojamas ir judančiąja faze skiedžiamas iki reikiamo tūrio. Robenidino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu naudojant ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1

Metanolis

3.2	Parūgštintas metanolis 4,0 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 1,18 g/ml) įpilama į 500 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.1) ir sumaišoma. Tirpalas turi būti ruošiamas prieš naudojimą.

3.3	Acetonitrilas, HPLC grynumo

3.4	Molekulinis sietas 3A tipo, 8 – 12 mešų granulės (1,6–2,5 mm granulės, kristalinis aliumosilikatas, akučių skersmuo 0,3 mm).

3.5	Aliuminio oksidas, I laipsnio rūgštinio aktyvumo, skirtas chromatografijai kolonėlėje 100 g aliuminio oksido supilama į tinkamą indą ir įpilama 2 ml vandens. Indas užkemšamas ir kratomas maždaug 20 min. Laikomas gerai uždarytame inde.

3.6	Kalio dihidrofosfato tirpalas, c = 0,025 mol/l 3,40 g kalio dihidrofosfato ištirpinama vandenyje (HPLC grynumo), skiedžiama 1 000 ml matavimo kolboje iki žymės ir sumaišoma.

3.7	Natrio hidrofosfato tirpalas, c = 0,025 mol/l 3,55 g bevandenio natrio hidrofosfato (arba 4,45 g dihidrato, arba 8,95 g dodekahidrato) ištirpinama vandenyje (HPLC grynumo), skiedžiama 1 litro matavimo kolboje iki žymės ir sumaišoma.

3.8	HPLC judančioji fazė Sumaišomi šie reagentai:   650 ml acetonitrilo (3.3),   250 ml vandens (HPLC grynumo),   50 ml kalio dihidrofosfato tirpalo (3.6),   50 ml natrio hidrofosfato tirpalo (3.7). Filtruojama per 0,22 μm akytumo filtrą (4.6), tirpalas degazuojamas (pvz., 10 min veikiant ultragarsu).

3.9	Etaloninė medžiaga Grynas robenidinas: 1,3-bi[(4-chlorbenziliden)amino]guanidino hidrochloridas.

3.9.1

Robenidino pradinis etaloninis tirpalas: 300 μg/ml 0,1 mg tikslumu pasveriama 30 mg robenidino etaloninės medžiagos (3.9). 100 ml matavimo kolboje ištirpinama parūgštintame metanolyje (3.2), tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsioje vietoje.

3.9.2

Robenidino tarpinis etaloninis tirpalas: 12 μg/ml 10 ml pradinio tirpalo (3.9.1) įpilama į 250 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.8) ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsioje vietoje.

3.9.3

Kalibravimo tirpalai Į keletą 50 ml matavimo kolbų įpilama 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 ir 25,0 ml tarpinio etaloninio tirpalo (3.9.2). Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.8) ir sumaišoma. Šių tirpalų koncentracija atitinkamai yra 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 ir 6,0 μg/ml. Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą.

3.10	Vanduo, HPLC grynumo

4.   Aparatūra

4.1	Stiklinė kolonėlė Pagaminta iš geltono stiklo, yra su čiaupu ir maždaug 150 ml talpos, vidinis skersmuo 10–15 mm, ilgis 250 mm.

4.2	Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė

4.3	Sukamasis garintuvas

4.4	HPLC įranga su kintamo bangos ilgio ultravioletiniu detektoriumi arba diodinės matricos detektoriumi, veikiančiu 250–400 nm bangų ilgio intervale

4.4.1

Skysčių chromatografijos kolonėlė: 300 mm × 4 mm, C18 10 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė

4.5	Stiklo pluošto filtravimo popierius (Whatman GF/A arba lygiavertis)

4.6	Membraniniai filtrai, 0,22 μm

4.7	Membraniniai filtrai, 0,45 μm

5.   Procedūra

Pastaba.

Robenidinas yra jautrus šviesai. Atliekant visus veiksmus naudojami rudo stiklo indai.

5.1   Bendrosios nuostatos

5.1.1

Siekiant patikrinti, ar nėra robenidino arba trukdančiųjų medžiagų, atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė.

5.1.2

Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį, į jį pridedant robenidino, kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyje, nustatomas išgavos dydis. 60 mg/kg koncentracijai gauti, į 250 ml kūginę kolbą įpilama 3,0 ml pradinio etaloninio tirpalo (3.9.1). Azoto srovėje tirpalas garinamas iki maždaug 0,5 ml. Įdedama 15 g pašaro tuščiojo ėminio, sumaišoma ir prieš ekstrahavimą (5.2) palaukiama 10 min. Pastaba. Taikant šį metodą pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptinkama robenidino.

5.2   Ekstrahavimas

0,01 g tikslumu pasveriama maždaug 15 g paruošto ėminio. Ėminys supilamas į 250 ml kūginę kolbą, į ją įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.2), kolba užkemšama ir vieną valandą kratoma ant purtyklės (4.2). Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtravimo popierių (4.5), visas filtratas surenkamas į 150 ml kūginę kolbą. Pridedama 7,5 g molekulinio sieto (3.4), kolba užkemšama ir kratoma penkias minutes. Iš karto filtruojama per stiklo pluošto filtravimo popierių. Toliau tirpalas gryninamas (5.3).

5.3   Gryninimas

5.3.1   Aliuminio oksido kolonėlės ruošimas

Į stiklinės kolonėlės (4.1) apačią įkišamas mažas stiklo vatos kamštis, kuris stikline lazdele sutankinamas. Pasveriama 11,0 g paruošto aliuminio oksido (3.5) ir supilama į kolonėlę. Siekiama, kad pilant sąlytis su oru būtų kiek įmanoma mažesnis. Švelniai tapšnojama per užpildomos kolonėlės apačią, kad aliuminio oksidas suslūgtų.

5.3.2   Ėminio gryninimas

Į kolonėlę pipete įpilama 5,0 ml pagal 5.2 punktą paruošto ėminio ekstrakto. Pipetės galiukas laikomas prie kolonėlės sienelės ir leidžiama tirpalui susigerti į aliuminio oksidą. Robenidinas iš kolonėlės išplaunamas 100 ml metanolio (3.1), esant 2–3 ml/min. srautui, eliuatas surenkamas į 250 ml apvaliadugnę kolbą. Metanolinis tirpalas išgarinamas iki sauso likučio sukamajame garintuve (4.3) esant sumažintam slėgiui, kai temperatūra 40 oC. Likutis ištirpinamas 3–4 ml judančiosios fazės (3.8) ir kiekybiškai supilamas į 10 ml matavimo kolbą. Apvaliadugnė kolba kelis kartus plaunama 1–2 ml judančiosios fazės ir šie plovimo tirpalai supilami į matavimo kolbą. Tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma. Alikvotinė tirpalo dalis filtruojama per 0,45 μm filtrą (4.7). Tirpalas naudojamas analizei HPLC metodu (5.4).

5.4   HPLC nustatymas

5.4.1   Parametrai

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai:

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4.1),

HPLC judančioji fazė (3.8),

Srautas: 1,5–2 ml/min.,

Detektoriaus bangos ilgis: 317 nm,

Įpurškiamas tūris: 20–50 μl.

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas, kelis kartus įpurškiant 3,6 μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.9.3) tol, kol nustoja keistis smailių aukščio ir sulaikymo trukmės vertės.

5.4.2   Kalibravimo kreivė

Kiekvienas kalibravimo tirpalas (3.9.3) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (arba plotai). Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinačių ašyje – kalibravimo tirpalų smailių aukščių arba plotų vidurkiai, o abscisių ašyje – atitinkama koncentracija μg/ml.

5.4.3   Ėminio tirpalas

Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (5.3.2), kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį, ir matuojamas robenidino smailių vidutinis aukštis (plotas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Ėminio tirpalo koncentracija μg/ml nustatoma pagal ėminio tirpalo robenidino smailių vidutinį aukštį (plotą) ir kalibravimo kreivę (5.4.2).

Robenidino kiekis w (mg/kg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

c	=	robenidino koncentracija ėminio tirpale μg/ml,
m	=	tiriamosios dalies svoris gramais.

7.   Rezultatų patvirtinimas

7.1   Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektorių, kuriuo lyginami ėminio ekstrakto ir 6,0 μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.9.3) spektrai.

7.1.1   Kochromatografija

Ėminio ekstrakto tirpalo koncentracija padidinama, įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3.9.3) tūrį. Pridėto robenidino kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą robenidino kiekį.

Padidinamas tik robenidino smailės aukštis, įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą. Smailės plotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinį plotį maždaug 10 % tikslumu.

7.1.2   Aptikimas naudojant diodų matricą

Rezultatai įvertinami pagal šiuos kriterijus:

a)	ėminio ir etalono spektrų didžiausios absorbcijos bangos ilgis, užrašomas kaip chromatogramos smailės viršūnės bangos ilgis, turi būti vienodas paklaidos ribose, kurias lemia aptikimo sistemos skiriamoji geba. Diodų matricos detektoriaus tipinė vertė paprastai yra maždaug 2 nm;

b)

nuo 250 nm iki 400 nm ėminio ir etalono spektras, užrašytas apie chromatogramos smailės viršūnę, šioms spektro dalims turi nesiskirti 10–100 % santykinio optinio tankio intervale. Šis kriterijus vykdomas, kai yra tie patys maksimumai ir jokiame matavimo taške dviejų spektrų skirtumas nėra didesnis nei 15 % etalono analitės optinio tankio vertės;

c)

nuo 250 nm iki 400 nm ėminio ekstraktui gautos smailės kylančios, viršūnės ir nusileidžiančios dalių spektrai šioms spektro dalims turi nesiskirti vienas nuo kito 10–100 % santykinio optinio tankio intervale. Šis kriterijus vykdomas, kai yra tie patys maksimumai ir visuose stebimuose taškuose spektrų skirtumas yra ne didesnis nei 15 % smailės viršūnę atitinkančio optinio tankio vertės.

Jei vienas iš šių kriterijų nevykdomas, analitės buvimas nepatvirtinamas.

7.2   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didžiausio rezultato, gauto didesniam nei 15 mg/kg robenidino kiekiui.

7.3   Išgavos dydis

Išgavos dydis, gautas tuščiajam ėminiui su analitės priedu, yra ne mažesnis nei 85 %.

8.   Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Bendrija surengė tarplaboratorinį tyrimą, kuriame 12–oje laboratorijų buvo analizuojami keturi paukščių ir triušių pašaro miltų arba granulių pavidalu ėminiai. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas du kartus. Rezultatai pateikiami lentelėje:

	Paukščiai		Triušiai
	Miltai	Granulės	Miltai	Granulės
Vidurkis [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
sr [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr [ %]	5,4	4,5	3,3	4,1
SR [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR [ %]	16,1	12,0	10,6	9,7
Išgavos dydis [ %]	90,0	93,3	87,2	80,2

sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas, %
SR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas, %

F.   DIKLAZURILO NUSTATYMAS

(+)-4-chlorphenil[2,6-dichlor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il) fenil]acetonitrilas

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas diklazurilui pašaruose ir premiksuose nustatyti. Aptikimo riba – 0,1 mg/kg, ribinė nustatymo vertė – 0,5 mg/kg.

2.   Metodas

Pridėjus vidinio etalono, ėminys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu. Jei tai pašarai, ekstrakto alikvotinė dalis gryninama C18 kietosios fazės ekstrahavimo tūta. Iš tūtos diklazurilas išplaunamas parūgštinto metanolio ir vandens mišiniu. Eliuatą išgarinus, likutis ištirpinamas DMF ir vandens mišinyje. Jei tai premiksai, ekstraktas išgarinamas ir likutis ištirpinamas DMF ir vandens mišinyje. Diklazurilo kiekis nustatomas atvirkštinių fazių trigubo gradiento efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (HPLC), naudojant ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1	Vanduo, HPLC grynumo

3.2	Amonio acetatas

3.3	Tetrabutilamonio hidrosulfatas (TBHS)

3.4	Acetonitrilas, HPLC grynumo

3.5	Metanolis, HPLC grynumo

3.6	N, N-dimetilformamidas (DMF)

3.7	Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8	Etaloninė medžiaga: garantuoto grynumo diklazurilas II-24: (+)-4-chlorfenil[2,6-dichlor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il) fenil]acetonitrilas, E 771

3.8.1

Diklazurilo pradinis etaloninis tirpalas, 500 μg/ml Į 50 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 25 mg diklazurilo etaloninės cheminės medžiagos (3.8). Ištirpinama DMF (3.6), skiedžiama DMF (3.6) iki žymės ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija, arba naudojama rudo stiklo kolba, ir padedama į šaldytuvą. Esant ≤ 4 oC temperatūrai, tirpalas stabilus vieną mėnesį.

3.8.2

Diklazurilo etaloninis tirpalas, 50 μg/ml Į 50 ml matavimo kolbą įpilama 5,00 ml pradinio etaloninio tirpalo (3.8.1.), skiedžiama iki žymės DMF (3.6) ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija, arba naudojama rudo stiklo kolba, ir padedama į šaldytuvą. Esant ≤ 4 oC temperatūrai, tirpalas stabilus vieną mėnesį.

3.9	Vidinio etalono medžiaga: 2,6-dichlor-α-(4-chlorfenil)-4-(4,5-dihidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2(3H)-il)-α-metilbenzenacetonitrilas

3.9.1

Vidinio etalono pradinis tirpalas, 500 μg/ml Į 50 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 25 mg vidinio etalono (3.9). Ištirpinama DMF (3.6), skiedžiama DMF (3.6) iki žymės ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija, arba naudojama rudo stiklo kolba, ir padedama į šaldytuvą. Esant ≤ 4 oC temperatūrai, tirpalas stabilus vieną mėnesį.

3.9.2

Vidinio etalono tirpalas, 50 μg/ml Į 50 ml matavimo kolbą įpilama 5,00 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.9.1), skiedžiama iki žymės DMF (3.6) ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija, arba naudojama rudo stiklo kolba, ir dedama į šaldytuvą. Esant ≤ 4 oC temperatūrai, tirpalas stabilus vieną mėnesį.

3.9.3

Premiksų vidinio etalono tirpalas, p/1 000 mg/ml (p – diklazurilo vardinė koncentracija premikse, mg/kg) Į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama p/10 mg vidinio etalono, ultragarso vonioje (4.6) jis ištirpinamas DMF (3.6), skiedžiama iki žymės DMF ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija, arba naudojama rudo stiklo kolba, ir padedama į šaldytuvą. Esant ≤ 4 oC temperatūrai, tirpalas stabilus vieną mėnesį.

3.10	Kalibravimo tirpalas, 2 μg/ml Į 50 ml matavimo kolbą pipete įpilama 2,00 ml diklazurilo etaloninio tirpalo (3.8.2) ir 2,00 ml vidinio etalono tirpalo (3.9.2). Įpilama 16 ml DMF (3.6), skiedžiama vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą.

3.11	C18 kietosios fazės ekstrahavimo tūta, pvz., Bond Elut, dydis: 1 cm3, sorbento svoris: 100 mg

3.12	Ekstrahavimo tirpiklis: parūgštintas metanolis. Į 1 000 ml metanolio (3.5) pipete įpilama 5,0 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.7) ir sumaišoma.

3.13	HPLC judančioji fazė

3.13.1

Eliuentas A: amonio acetato ir tetrabutilamonio hidrosulfato mišinio tirpalas. 5 g amonio acetato (3.2) ir 3,4 g TBHS (3.3) ištirpinama 1 000 ml vandens (3.1) ir sumaišoma.

3.13.2

Eliuentas B: acetonitrilas (3.4).

3.13.3

Eliuentas C: metanolis (3.5).

4.   Aparatūra

4.1	Mechaninė purtyklė

4.2	Įranga trigubo gradiento HPLC

4.2.1

Skysčių chromatografijos kolonėlė, Hypersil ODS, 3 μm dalelių įkrova, 100 mm × 4,6 mm, arba lygiavertė

4.2.2

Reguliuojamo bangos ilgio ultravioletinis detektorius arba diodų matricos detektorius

4.3	Sukamasis garintuvas

4.4	Membraninis filtras, 0,45 μm

4.5	Vakuumavimo sistema

4.6	Ultragarso vonia

5.   Procedūra

5.1   Bendrosios nuostatos

5.1.1   Pašaro tuščiasis ėminys

Analizuojamas pašaro tuščiasis ėminys, siekiant patikrinti, ar jame nėra diklazurilo ir trukdančių cheminių medžiagų. Taikant šį metodą pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptinkama diklazurilo arba trukdančių medžiagų.

5.1.2   Išgavos dydžio nustatymo bandymas

Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį, į jį pridedant diklazurilo, kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyje, nustatomas išgavos dydis. Norint pridėti 1 mg/kg, į 50 g pašaro tuščiojo ėminio įpilama 0,1 ml pradinio etaloninio tirpalo (3.8.1), gerai sumaišoma, paliekama 10 min ir prieš atliekant kitą pakopą (5.2) kelis kartus sumaišoma.

Jei nėra pašaro tuščiojo ėminio, kuris būtų panašus į ėminio pašarą (žr. 5.1.1), išgavos dydį galima nustatyti, taikant etalono pridėjimo metodą. Šiuo atveju į analizuojamą ėminį pridedamas diklazurilo kiekis, maždaug atitinkantis diklazurilo kiekį ėminyje. Šis ėminys analizuojamas kartu su ėminiu be pridėto diklazurilo ir išgavos dydis gali būti apskaičiuotas iš skirtumo.

5.2   Ekstrahavimas

5.2.1   Pašarai

Maždaug 50 g ėminio pasveriama 0,01 g tikslumu. Ėminys supilamas į 500 ml kūginę kolbą, įpilama 1,00 ml vidinio etalono tirpalo (3.9.2), 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12) ir kolba užkemšama. Mišinys kratomas ant purtyklės (4.1) per naktį. Paliekamas 10 min nusistovėti. Į tinkamą stiklinį indą paimama tirpalo virš nuosėdų alikvotinė 20 ml dalis ir skiedžiama 20 ml vandens. Šis tirpalas supilamas į ekstrahavimo tūtą (3.11) ir siurbiamas, prijungus vakuumą (4.5). Tūta plaunama 25 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12) ir vandens mišinio, 65 + 35 (V + V). Surinktos frakcijos išpilamos ir junginiai išplaunami 25 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12) ir vandens mišinio, 80 + 20 (V + V). Ši frakcija garinama beveik iki sauso likučio sukamajame garintuve (4.3) esant 60 oC. Likutis ištirpinamas 1,0 ml DMF (3.6), įpilama 1,5 ml vandens (3.1) ir sumaišoma. Filtruojama per membraninį filtrą (4.4). Toliau analizuojama HPLC metodu (5.3).

5.2.2   Premiksai

Maždaug 1 g ėminio pasveriama 0,001 g tikslumu. Ėminys supilamas į 500 ml kūginę kolbą, įpilama 1,00 ml vidinio etalono tirpalo (3.9.3), 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12) ir kolba užkemšama. Mišinys kratomas ant purtyklės (4.1) per naktį. Paliekamas 10 min nusistovėti. Į tinkamo tūrio apvaliadugnę kolbą paimama alikvotinė tirpalo virš nuosėdų dalis 10 000/p ml (p – vardinė diklazurilo koncentracija premikse, mg/kg). Garinama 60 oC temperatūroje beveik iki sauso likučio sukamajame garintuve (4.3), esant sumažintam slėgiui. Likutis ištirpinamas 10,0 ml DMF (3.6), įpilama 15,0 ml vandens (3.1) ir sumaišoma. Toliau analizuojama HPLC metodu (5.3).

5.3   HPLC nustatymas

5.3.1   Parametrai

Rekomenduojamos šios sąlygos, gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2.1.):	100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm įkrova, arba lygiavertė
Judančioji fazė:	Eliuentas A (3.13.1):	vandeninis amonio acetato ir tetrabutilamonio hidrosulfato mišinio tirpalas
	Eliuentas B (3.13.2):	acetonitrilas
	Eliuentas C (3.13.3):	metanolis
Eliuavimo būdas:	— tiesinis gradientas — pradinės sąlygos: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — po 10 min gradientinis eliuavimas 30 min, kol: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). 10 min plovimas eliuentu B.
Srautas:	1,5–2 ml/min
Įpurškiamas tūris:	20 μl
Detektoriaus bangos ilgis:	280 nm

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas, kelis kartus įpurškiant 2,0 μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.10) tol, kol nustoja keistis smailės aukščio ir sulaikymo trukmės vertės.

5.3.2   Kalibravimo tirpalas

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kalibravimo tirpalo (3.10) ir nustatomas diklazurilo bei vidinio etalono smailių vidutinis smailės aukštis (plotas).

5.3.3   Ėminio tirpalas

Kelis kartus įpurškiama 20 μl ėminio tirpalo (5.2.1 arba 5.2.2) ir nustatomas diklazurilo bei vidinio etalono smailių vidutinis smailės aukštis (plotas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

6.1   Pašarai

Diklazurilo kiekis w (mg/kg) ėminyje nustatomas pagal šią formulę:

[mg/kg]

kurioje:

hd, s	=	ėminio tirpalo (5.2.1) diklazurilo smailės aukštis (plotas);
hi, s	=	ėminio tirpalo (5.2.1) vidinio etalono smailės aukštis (plotas);
hd, c	=	kalibravimo tirpalo (3.10) diklazurilo smailės aukštis (plotas);
hi, c	=	kalibravimo tirpalo (3.10) vidinio etalono smailės aukštis (plotas);
cd, c	=	diklazurilo koncentracija kalibravimo tirpale (3.10) μg/ml;
m	=	tiriamosios dalies svoris g.
V	=	ėminio ekstrakto tūris pagal 5.2.1 (t. y. 2,5 ml).

6.2   Premiksai

Diklazurilo kiekis w (mg/kg) ėminyje nustatomas pagal šią formulę:

[mg/kg]

kurioje:

hd, c	=	kalibravimo tirpalo (3.10) diklazurilo smailės aukštis (plotas);
hi, c	=	kalibravimo tirpalo (3.10) vidinio etalono smailės aukštis (plotas);
hd, s	=	ėminio tirpalo (5.2.2) diklazurilo smailės aukštis (plotas);
hi, s	=	ėminio tirpalo (5.2.2) vidinio etalono smailės aukštis (plotas);
cd, c	=	diklazurilo koncentracija kalibravimo tirpale (3.10) μg/ml;
m	=	tiriamosios dalies svoris g;
V	=	ėminio ekstrakto tūris pagal 5.2.2 (t. y. 2,5 ml);
p	=	vardinė diklazurilo koncentracija premikse mg/kg.

7.   Rezultatų patvirtinimas

7.1   Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektorių, kuriuo lyginami ėminio ekstrakto (5.2.1 arba 5.2.2) ir kalibravimo tirpalo (3.10) spektrai.

7.1.1   Kochromatografija

Ėminio ekstrakto (5.2.1 arba 5.2.2) koncentracija padidinama, įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3.10) tūrį. Pridėto diklazurilo kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą diklazurilo kiekį.

Padidinamas tik diklazurilo ir vidinio etalono smailių aukštis, įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą. Diklazurilo arba vidinio etalono smailių plotis jų pusaukštyje turi atitikti nepadidintos koncentracijos ėminio ekstrakto smailių plotį ± 10 % tikslumu.

7.1.2   Aptikimas naudojant diodų matricą

Rezultatai įvertinami pagal šiuos kriterijus:

a)	ėminio ir etalono spektrų didžiausios absorbcijos bangos ilgis, užrašomas kaip chromatogramos smailės viršūnės bangos ilgis, turi būti vienodas paklaidos ribose, kurias lemia aptikimo sistemos skiriamoji geba. Diodų matricos detektoriaus tipinė vertė būtų ± 2 nm;

b)

nuo 230 nm iki 320 nm ėminio ir etalono spektras, užrašytas apie chromatogramos smailės viršūnę, šioms spektro dalims turi nesiskirti 10–100 % santykinio optinio tankio intervale. Šis kriterijus vykdomas, kai yra tie patys maksimumai ir jokiame matavimo taške dviejų spektrų skirtumas nėra didesnis nei 15 % etalono analitės optinio tankio vertės;

c)

nuo 230 nm iki 320 nm ėminio ekstraktui gautos smailės kylančios, viršūnės ir nusileidžiančios dalių spektrai šioms spektro dalims turi nesiskirti vienas nuo kito 10–100 % santykinio optinio tankio intervale. Šis kriterijus vykdomas, kai yra tie patys maksimumai ir visuose stebimuose taškuose spektrų skirtumas yra ne didesnis nei 15 % smailės viršūnę atitinkančio optinio tankio vertės.

Jei vienas iš šių kriterijų nevykdomas, analitės buvimas nepatvirtinamas.

7.2   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	30 % didesnės vertės, jei diklazurilo kiekis 0,5 mg/kg – 2,5 mg/kg;

—	0,75 mg/kg, jei diklazurilo kiekis 2,5 mg/kg – 5 mg/kg;

—	15 % didesnės vertės, jei diklazurilo kiekis didesnis nei 5 mg/kg.

7.3   Išgavos dydis

Išgavos dydis, gautas (tuščiajam ėminiui) su analitės priedu, yra ne mažesnis nei 80 %.

8.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Buvo parengtas tarplaboratorinis tyrimas, kurį atliekant 11 laboratorijų tyrė penkių tipų ėminius. Šiuos ėminius sudarė du premiksai, vienas sumaišytas su organine matrica (O 100), kitas su neorganine matrica (A 100). Teorinė diklazurilo koncentracija – 100 mg/kg. Trijų tipų naminių paukščių pašarų mišinius pagamino trys skirtingi gamintojai (NL) (L1/Z1/K1). Teorinė diklazurilo koncentracija – 1 mg/kg. Laboratorijoms buvo nurodyta kiekvieną ėminį analizuoti vieną arba du kartus. (Išsamesnė informacija apie šį tarplaboratorinį tyrimą yra pateikta Journal of AOAC International, Volume 77, Nr. 6, 1994, p. 1 359–1 361). Rezultatai pateikti šioje lentelėje.

	1 ėminys A 100	2 ėminys O 100	3 ėminys L1	4 ėminys Z1	5 ėminys K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Vidurkis	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
Sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr ( %)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR ( %)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Vardinis kiekis mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	laboratorijų skaičius
n	=	atskirų verčių skaičius
Sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas
SR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas

9.   Pastabos

Turi būti iš anksto parodyta, kad diklazurilo atsakas matuojamų koncentracijos verčių intervale yra tiesinis.

G.   NATRIO LASALOCIDO NUSTATYMAS

Polieterio monokarboksirūgšties natrio druska, gauta iš Streptomyces lasaliensis

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti lasalocido natrio druskos koncentraciją pašaruose ir premiksuose. Aptikimo riba – 5 mg/kg, kiekybinio nustatymo riba – 10 mg/kg.

2.   Metodas

Natrio lasalocido druska ekstrahuojama iš ėminio parūgštintu metanoliu ir jos kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1	Kalio dihidrofosfatas (KH2PO4)

3.2	Ortofosforo rūgštis, w (w/w) = 85 %

3.3	Ortofosforo rūgšties tirpalas, c = 20 % 23,5 ml ortofosforo rūgšties (3.2) skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4	6-metil-2-heptilaminas (1,5-dimetilheksilaminas), w (w/w) = 99 %

3.5	Metanolis, HPLC grynumo

3.6	Vandenilio chlorido rūgštis, tankis = 1,19 g/ml

3.7	Fosfatinis buferinis tirpalas, c = 0,01 mol/l 500 ml vandens (3.11) ištirpinama 1,36 g KH2PO4 (3.1), įpilama 3,5 ml ortofosforo rūgšties (3.2) ir 10,0 ml 6-metil-2-heptilamino (3.4). Ortofosforo rūgštimi (3.3) nustatoma tirpalo pH 4,0, vandeniu (3.11) skiedžiama iki 1 000 ml.

3.8	Parūgštintas metanolis Į 1 000 ml matavimo kolbą įpilama 5,0 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.6), iki žymos skiedžiama metanoliu (3.5) ir sumaišoma. Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą.

3.9	HPLC judančioji fazė, fosfatinio buferinio tirpalo ir metanolio mišinys 5 + 95 (V + V) 5 ml fosfatinio buferinio tirpalo (3.7) sumaišoma su 95 ml metanolio (3.5).

3.10	Garantuoto grynumo natrio lasalocido etaloninė medžiaga, C34H53O8Na (polieterio monokarboksirūgšties natrio druska, gauta iš Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1

Natrio lasalocido pradinis etaloninis tirpalas, 500 μg/ml, 500 μg/ml Į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg natrio lasalocido (3.10), ištirpinama parūgštintame metanolyje (3.8), iki žymos skiedžiama tuo pačiu tirpikliu ir sumaišoma. Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą.

3.10.2

Natrio lasalocido tarpinis etaloninis tirpalas, 50 μg/ml Į 100 ml matavimo kolbą pipete paimama 10 ml natrio lasalocido pradinio etaloninio tirpalo (3.10.1), iki žymos skiedžiama parūgštintu metanoliu (3.8) ir sumaišoma. Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą.

3.10.3

Kalibravimo tirpalai Į keletą 50 ml matavimo kolbų įpilama 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ir 10,0 ml tarpinio etaloninio tirpalo (3.10.2), iki žymos skiedžiama parūgštintu metanoliu (3.8) ir sumaišoma. Natrio lasalocido koncentracija šiuose tirpaluose yra 1,0 μg/ml, 2,0 μg/ml, 4,0 μg/ml, 5,0 μg/ml ir 10,0 μg/ml. Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą.

3.11	Vanduo HPLC grynumo

4.   Aparatūra

4.1	Ultragarso vonia (arba purtoma vandens vonia) su temperatūros reguliavimu

4.2	Membraniniai filtrai, 0,45 μm

4.3	HPLC įranga su įpurškimo sistema, kuria būtų galima įpurkšti 20 μl tūrį

4.3.1

Atvirkštinių fazių skysčių chromatografijos kolonėlė 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė

4.3.2

Reguliuojamo sužadinimo ir emisijos bangų ilgio fluorescencinis detektorius

5.   Procedūra

5.1   Bendrosios nuostatos

5.1.1   Pašaro tuščiasis ėminys

Norint nustatyti išgavos dydį (5.1.2), analizuojamas pašaro tuščiasis ėminys, siekiant patikrinti, ar jame nėra natrio lasalocido ir trukdančių cheminių medžiagų. Taikant šį metodą pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptinkama natrio lasalocido arba trukdančių medžiagų.

5.1.2   Išgavos dydžio nustatymo bandymas

Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį, į jį pridedant natrio lasalocido, kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyje, nustatomas išgavos dydis. Norint gauti 100 mg/kg koncentraciją, į 250 ml kūginę kolbą įpilama 10,0 ml pradinio etaloninio tirpalo (3.10.1) ir tirpalas išgarinamas iki maždaug 0,5 ml. Įdedama 50 g pašaro tuščiojo ėminio, gerai sumaišoma ir paliekama 10 min. Prieš ekstrahavimą (5.2) dar keletą kartų maišoma.

Jei nėra pašaro tuščiojo ėminio, kuris būtų panašus į ėminio pašarą (žr. 5.1.1), išgavos dydį galima nustatyti, taikant etalono pridėjimo metodą. Šiuo atveju į analizuojamą ėminį pridedamas natrio lasalocido kiekis, maždaug atitinkantis natrio lasalocido kiekį ėminyje. Šis ėminys analizuojamas kartu su ėminiu be pridėto natrio lasalocido ir išgavos dydis gali būti apskaičiuotas iš skirtumo.

5.2   Ekstrahavimas

5.2.1   Pašarai

Į užkemšamą 250 ml kūginę kolbą 0,01 g tikslumu pasveriama 5–10 g ėminio. Įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.8). Kolba užkemšama ir sukama, kad ėminys galėtų susimaišyti. Kolba 20 min dedama į ultragarso vonią (4.1), kurioje yra maždaug 40 oC temperatūra, tada išimama ir atvėsinama iki kambario temperatūros. Kolba paliekama maždaug 1 h, kad nusėstų suspenduotos medžiagos. Alikvotinė ekstrakto dalis filtruojama į tinkamą indą per 0,45 μm membraninį filtrą (4.2). Toliau atliekamas nustatymas HPLC metodu (5.3).

5.2.2   Premiksai

Į 250 ml matavimo kolbą 0,001 g tikslumu pasveriama apie 2 g nemalto premikso. Įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.8). Kolba sukama, kad ėminys galėtų susimaišyti. Kolba 20 min dedama į ultragarso vonią (4.1), kurioje yra maždaug 40 oC temperatūra, tada išimama ir atvėsinama iki kambario temperatūros. Iki žymos skiedžiama parūgštintu metanoliu (3.8) ir gerai sumaišoma. Kolba paliekama maždaug 1 h, kad nusėstų suspenduotos medžiagos, tada alikvotinė ekstrakto dalis filtruojama per 0,45 μm membraninį filtrą (4.2). Tinkamas skaidraus filtrato tūris skiedžiamas parūgštintu metanoliu (3.8), kad natrio lasalocido koncentracija galutiniame bandymo tirpale būtų apie 4 μg/ml. Toliau atliekamas nustatymas HPLC metodu (5.3).

5.3   HPLC nustatymas

5.3.1   Parametrai

Rekomenduojamos šios sąlygos, gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai:

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.3.1):	125 mm × 4 mm, atvirkštinių fazių, C18, 5 μm įkrova, arba lygiavertė
Judančioji fazė (3.9):	Fosfatinio buferinio tirpalo (3.7) ir metanolio (3.5) mišinys, 5 + 95 (V + V)
Srautas:	1,2 ml/min
Detektoriaus bangų ilgiai:
sužadinimo:	310 nm
emisijos:	419 nm
Įpurškiamas tūris:	20 μl

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas, kelis kartus įpurškiant 4,0 μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.10.3) tol, kol nustoja keistis smailės aukščio (arba ploto) ir sulaikymo trukmės vertės.

5.3.2   Kalibravimo kreivė

Kiekvienas kalibravimo tirpalas (3.10.3) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (arba plotai). Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinačių ašyje – kalibravimo tirpalų smailių aukščių (arba plotų) vidurkiai, o abscisių ašyje – atitinkama koncentracija μg/ml.

5.3.3   Ėminio tirpalas

Kelis kartus įpurškiama ėminio ekstrakto tirpalo, gauto 5.2.1 arba 5.2.2, kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalų tūrį, ir nustatomas natrio lasalocido smailių vidutiniai smailės aukščiai (plotai).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Natrio lasalocido koncentracija (μg/ml) nustatoma pagal įpurkšto ėminio tirpalo (5.3.3) smailių vidutinį aukštį (plotą) ir kalibravimo kreivę.

6.1   Pašarai

Natrio lasalocido kiekis w (mg/kg) ėminyje nustatomas pagal šią formulę:

[mg/kg]

kurioje:

c	=	natrio lasalocido koncentracija ėminio tirpale (5.2.1) μg/ml;
V1	=	ėminio ekstrakto pagal 5.2.1 tūris ml (t. y. 100);
m	=	tiriamosios dalies svoris g.

6.2   Premiksai

Natrio lasalocido kiekis w (mg/kg) ėminyje nustatomas pagal šią formulę:

[mg/kg]

kurioje:

c	=	natrio lasalocido koncentracija ėminio tirpale (5.2.2) μg/ml
V2	=	ėminio ekstrakto pagal 5.2.2 tūris ml (t. y. 250);
f	=	praskiedimo faktorius pagal 5.2.2;
m	=	tiriamosios dalies svoris g.

7.   Rezultatų patvirtinimas

7.1   Tapatumas

Spektrofluorimetrija pagrįsti metodai mažiau jautrūs trukdžiams palyginti su metodais, kuriuose naudojamas ultravioletinis detektorius. Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos metodu.

7.1.1   Kochromatografija

Į ėminio ekstraktą (5.2.1 ar 5.2.2) koncentracija padidinama, įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3.10.3) tūrį. Pridėto natrio lasalocido kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą natrio lasalocido kiekį. Padidinamas tik natrio lasalocido smailių aukštis, atsižvelgiant į pridėtą natrio lasalocido kiekį ir ekstrakto praskiedimą. Smailės plotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinio ėminio ekstrakto smailių plotį ± 10 % tikslumu.

7.2   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	15 % didesnės vertės, jei natrio lasalocido kiekis 30 mg/kg–100 mg/kg,

—	15 mg/kg, jei natrio lasalocido kiekis 100 mg/kg–200 mg/kg,

—	7,5 % didesnės vertės, jei natrio lasalocido kiekis didesnis nei 200 mg/kg.

7.3   Išgavos dydis

Išgavos dydis, gautas (tuščiajam ėminiui) su analitės priedu, turėtų būti ne mažesnis kaip 80 %. Išgavos dydis, gautas premiksams su analitės priedu, yra ne mažesnis nei 90 %.

8.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Buvo parengtas tarplaboratorinis tyrimas (6) 1), kurio metu 12 laboratorijų analizavo du premiksus (1 ir 2 ėminiai) ir penkis pašarus (3–7 ėminiai). Kiekvienas ėminys analizuotas du kartus. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

	1 ėminys Premiksas viščiukams	2 ėminys Premiksas kalakutams	3 ėminys Granuliuotas lesalas kalakutams	4 ėminys Trupininis lesalas viščiukams	5 ėminys Lesalas kalakutams	6 ėminys Lesalas paukščiams A	7 ėminys Lesalas paukščiams B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Vidurkis [mg/kg]	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
sr [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr [ %]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
sR [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR [ %]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Vardinis kiekis [mg/kg]	5 000 (7)	16 000 (7)	80 (7)	105 (7)	120 (7)	50 (8)	35 (8)

L	=	laboratorijų skaičius
n	=	atskirų rezultatų skaičius
sr	=	pakartojamumo standartinis nuokrypis
sR	=	atkuriamumo standartinis nuokrypis
CVr	=	pakartojamumo variacijos koeficientas, %
CVR	=	atkuriamumo variacijos koeficientas, %

---

(1)  Atliko Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA) pašarų darbo grupė (VDLUFA).

(2)  Atliko Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA) pašarų darbo grupė (VDLUFA).

(3)  Galima taikyti kitus skaidymo būdus, jei būtų įrodyta, kad gaunami panašūs rezultatai (pvz., skaidymas autoklave aukšto dažnio spinduliuote).

(4)  Žaliuose pašaruose (šviežiuose arba džiovintuose) gali būti didelis kiekis augalinio silicio dioksido, kuriame gali būti mikroelementų, todėl jis turi būti pašalintas. Todėl šių pašarų ėminiams turi būti taikoma ši pakeista procedūra. Veiksmas 5.1.1.1 atliekamas iki filtravimo. Filtravimo popierius su netirpiu likučiu du kartus plaunamas verdančiu vandeniu ir dedamas į kvarcinį arba platininį tiglį. Filtras deginamas mufelinėje krosnyje (4.1) žemesnėje kaip 550 oC temperatūroje tol, kol visiškai išnyksta anglinė medžiaga. Paliekama ataušti, įlašinami keli lašai vandens, 10–15 ml vandenilio fluorido rūgšties (3.4) ir garinama iki sauso likučio maždaug 150 oC temperatūroje. Jei likutyje dar lieka kažkiek silicio dioksido, likutis pakartotinai tirpinamas keliuose mililitruose vandenilio fluorido rūgšties (3.4) ir išgarinamas iki sauso likučio. Įlašinami penki lašai sieros rūgšties (3.5) ir kaitinama tol, kol nustoja skirtis balti dūmai. Įpylus 5 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2) ir apie 30 ml vandens, tirpalas pašildomas, filtruojamas į 250 ml matavimo kolbą ir skiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija apie 0,5 mol/l). Toliau nustatymas tęsiamas nuo 5.1.2 punkto.

(5)  The Analyst, 108, 1983, p. 1 252–1 256.

(6)  Analyst, 1995, 120, 2 175–2 180.

(7)  Gamintojo nurodytas kiekis

(8)  Laboratorijoje paruošti pašarai