10)
|
Įterpiami C.27, C.28, C.29 ir C.30 skyriai:
„C.27. TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOSĖDOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT NUOSĖDAS SU ĮTERPTA BANDOMĄJA CHEMINE MEDŽIAGA
ĮVADAS
2.
|
Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 218 (2004). Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaikį cheminių medžiagų poveikį nuosėdose gyvenančioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio Chironomus sp. lervoms. Šis bandymas grindžiamas turimais toksiškumo bandymo su Chironomus riparius ir Chironomus tentans protokolais, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaurės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparnių vabzdžių rūšis, pvz., Chironomus yoshimatsui (10) (11), kurios tinkamai pagrįstos dokumentais.
|
2.
|
Pasirinkus šiame bandymo metode naudojamą poveikio metodą į nuosėdas įterpiama bandomoji cheminė medžiaga. Atitinkamo poveikio scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Pasirinkus bandomosios cheminės medžiagos įterpimo į nuosėdas scenarijų turi būti modeliuojami nuosėdose paprastai susikaupiantys cheminių medžiagų lygiai. Į šią poveikio sistemą įtrauktas bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į nuosėdų—vandens bandymo sistemos nuosėdas.
|
3.
|
Cheminės medžiagos, kurias būtina ištirti siekiant nustatyti jų poveikį nuosėdose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilgą laikotarpį. Nuosėdose gyvenančius organizmus galima veikti keliais būdais. Kiekvieno poveikio būdo santykinė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo atitinkamos cheminės medžiagos fizinių ir cheminių savybių. Jei tai lengvai absorbuojamos cheminės medžiagos (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusios cheminės medžiagos, užteršto maisto nurijimas galėtų būti tinkamas poveikio būdas. Siekiant, kad stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų toksiškumas būtų vertinamas tinkamai, galima svarstyti galimybę, ar nereikėtų į nuosėdas įterpti maisto prieš taikant bandomąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus galimus poveikio būdus pagrindinis dėmesys taikant šį bandymo metodą skiriamas ilgalaikiui poveikiui. Bandymo trukmė naudojant C. Riparius ir C. Yoshimatsui yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama C. tentans. Jeigu konkrečiam tikslui, pvz., tiriant nestabilių cheminių medžiagų poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius galima paimti po dešimties parų laikotarpio.
|
4.
|
Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusių suaugusiųjų skaičius ir išsiritimo trukmė. Rekomenduojama, kad lervų išgyvenimo ir augimo rodikliai būtų matuojami tik po dešimties parų laikotarpio, jeigu būtini papildomi trumpalaikiai duomenys, ir šiuo atveju, jeigu reikia, naudojant papildomus pakartotinius ėminius.
|
5.
|
Rekomenduojama naudoti sintetines nuosėdas. Sintetinės nuosėdos keliais atžvilgiais yra tinkamesnės negu natūralios nuosėdos:
—
|
darant bandymą kintamumas yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro atkuriamą „standartinę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužterštą ir švarų nuosėdų šaltinį,
|
—
|
bandymus galima pradėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandomųjų nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju nebūtina iš anksto apdoroti nuosėdų, kad iš jų būtų pašalinta būdingoji fauna; naudojant sintetines nuosėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant įprastiems bandymams reikalingą nuosėdų kiekį,
|
—
|
naudojant sintetines nuosėdas galima lyginti toksiškumą ir atitinkamai klasifikuoti chemines medžiagas.
|
|
6.
|
Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
|
BANDYMO METODO ESMĖ
7.
|
Pirmos stadijos chironomidų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos bandomąja chemine medžiaga nuosėdų–vandens sistemose. Bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į nuosėdas ir pirmos stadijos lervos sudedamos į bandymo laboratorines stiklines, kuriose nuosėdų ir vandens koncentracijos yra stabilizuotos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomidų išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lervų išgyvenimą ir masę po 10 parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai būtina). Šie duomenys analizuojami taikant regresijos modelį siekiant įvertinti koncentraciją, kuri būtų x % sumažinusi lervų išsinėrimą, arba lervų išgyvenimą ar augimą (pvz., EC15, EC50 ir t. t.) arba hipotezę tikrinant statistiniais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedarančią koncentraciją ir (arba) mažiausią stebimo poveikio koncentraciją). Pastaruoju atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes būtina lyginti su kontrolinėmis vertėmis.
|
INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
8.
|
Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje, jos garų slėgis, išmatuotas ar apskaičiuotas nuosėdų susidarymas ir stabilumas vandenyje bei nuosėdose. Turėtų būti prieinamas analizės metodas kiekybiniam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui nustatyti paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose su žinomu ir praneštu tikslumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios cheminės medžiagos struktūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiagų, kurios dėl jų fizinių ir cheminių savybių sunkiai pritaikomos bandymams atlikti, gairės pateiktos (12).
|
ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
9.
|
Bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis galima atlikti periodiškai ir juos darant būtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo sąlygos būtų patikimos. Etaloninės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13).
|
BANDYMO VALIDUMAS
10.
|
Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios sąlygos:
—
|
bandymo pabaigoje lervų išsinėrimas kontroliniuose bandiniuose turi būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6),
|
—
|
C. riparius ir C. yoshimatsui iš kontrolinių indų suaugėliais turėtų tapti 12–23 dienomis po lervų įleidimo į indus; C. tentans, šis laikotarpis turi būti 20–65 dienos,
|
—
|
bandymo pabaigoje pH vertė ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vertė esant naudojamai temperatūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vertės ir paviršinio vandens pH vertė visuose bandymo induose turėtų atitikti 6–9 intervalą,
|
—
|
vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens temperatūrą galima reguliuoti naudojant izoterminę patalpą ir šiuo atveju patalpos temperatūra turėtų būti patvirtinama atitinkamu laiko intervalu.
|
|
BANDYMO METODO APRAŠYMAS
Bandymo indai
11.
|
Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, tačiau juos naudojant turėtų būti užtikrinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuosėdų storis. Nuosėdų paviršiaus plotas turėtų būti toks, kad vienai lervai tektų 2–3 cm2. Nuosėdų storio ir paviršinio vandens sluoksnio storio santykis turėtų būti 1:4. Bandymo indai ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, turėtų būti vien iš stiklo ar kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono).
|
Rūšių pasirinkimas
12.
|
Renkantis atliekant bandymą naudojamą rūšį pirmenybė teikiama Chironomus riparius. Taip pat leidžiama naudoti Chironomus tentans, tačiau juos sunkiau prižiūrėti ir jiems būtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be to, leidžiama naudoti Chironomus yohimatsui. Su Chironomus riparius susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 priedėlyje. Taip pat pateikiama informacija apie kitų rūšių, t. y. Chironomus tentans (4) ir Chironomus yoshimatsui (11), kultūrų auginimo sąlygas. Rūšies tapatybės nustatymas turi būti patvirtinamas prieš bandymą, tačiau patvirtinimas nėra būtinas prieš kiekvieną bandymą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos kultūros.
|
Nuosėdos
13.
|
Pirmenybė teikiama pasiruoštoms nuosėdoms (jos dar vadinamos pertvarkytomis, dirbtinėmis ar sintetinėmis nuosėdomis). Tačiau jeigu naudojamos natūralios nuosėdos, turėtų būti nurodomos jų charakteristikos (bent pH, organinės anglies kiekis, kitų parametrų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrinę sudėtį) ir nuosėdose neturi būti jokių teršalų bei kitų organizmų, kurie galėtų konkuruoti su chironomidais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš nuosėdas pradedant naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, natūralios nuosėdos kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Atliekant šį bandymą (1) (15) (16) rekomenduojama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuosėdas:
a)
|
4–5 % durpių (sausoji masė): pH vertė kiek įmanoma turi būti 5,5–6,0; privaloma naudoti smulkiai sumaltus (dalelių dydis ≤ 1 mm) durpių miltelius; jos turi būti džiovintos tik ore;
|
b)
|
20 % (sausoji masė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau negu 30 %);
|
c)
|
75–76 % (sausoji masė) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm);
|
d)
|
įpilama dejonizuoto vandens, kad galutinio mišinio drėgnumas būtų 30—50 %;
|
e)
|
įdedama chemijos požiūriu gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5; galutinio mišinio sudėtyje turėtų būti 2 % (± 0,5 %) organinės anglies ir jos kiekis koreguojamas atitinkamais durpių ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c.
|
|
14.
|
Turėtų būti žinomas durpių, kaolino molio ir smėlio gavimo šaltinis. Nuosėdų sudedamosios dalys turėtų būti patikrinamos, ar jose nėra cheminės taršos pėdsakų (pvz., sunkiųjų metalų, chlororganinių komponentų, fosfororganinių komponentų ir t. t.). Sintetinių nuosėdų pasiruošimo pavyzdys aprašytas 3 priedėlyje. Taip pat leidžiama maišyti sausąsias sudedamąsias dalis, jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens nėra atskiriamos nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima plūduriuoti kietosios durpių dalelės) ir kad durpės ar nuosėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus.
|
Vanduo
15.
|
Kaip bandymo vandenį leidžiama rinktis bet kokį vandenį, atitinkantį 2 ir 4 priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršinį ar gruntinį), regeneruotą vandenį (žr. 2 priedėlį) arba vandentiekio vandenį, iš kurio pašalintas chloras, leidžiama rinktis kaip kultūros auginimo vandenį ir bandymo vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymių išgyvena kultūros veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vertė pradedant bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l kaip CaCO3. Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrimą turėtų būti naudojamas to paties tipo vanduo. 4 priedėlyje išvardytų vandens kokybės charakteristikų vertės turėtų būti matuojamos ne rečiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos yra gerokai pakitusios.
|
Pradiniai tirpalai. Nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga
16.
|
Pasirinktos koncentracijos nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga paprastai pasiruošiamos bandomosios cheminės medžiagos tirpalo įpilant tiesiogiai į nuosėdas. Bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas ištirpinamas dejonizuotame vandenyje ir maišymo įtaisu, tiekimo maišikliu ar rankomis maišomas su sintetinėmis nuosėdomis. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga sunkiai tirpsta vandenyje, ją galima ištirpinti kuo mažesniame tinkamo organinio tirpiklio kiekyje (pvz., heksane, acetone arba chloroforme). Šis tirpalas maišomas su 10 g smulkaus kvarco smėlio vienam bandymo indui. Palaukiama, kol tirpiklis išgaruoja ir jis turi būti visiškai pašalinamas iš smėlio; tada bandymo laboratorinėje stiklinėje smėlis maišomas su reikiamu nuosėdų kiekiu. Norint bandomąją cheminę medžiagą soliubilizuoti, disperguoti ar emulguoti leidžiama naudoti tik lengvai garuojančias medžiagas. Atkreiptinas dėmesys, kad ruošiantis nuosėdas turi būti atsižvelgiama į bandomoje cheminėje medžiagoje ir smėlio mišinyje esantį smėlį (t. y. nuosėdos turėtų būti pasiruošiamos naudojant mažiau smėlio). Privaloma pasirūpinti, kad į nuosėdas įterpiama bandomoji cheminė medžiaga būtų kruopščiai ir tolygiai paskirstoma nuosėdose. Jeigu būtina, galima analizuoti ėminio dalį siekiant nustatyti vienalytiškumą.
|
BANDYMO PLANAS
17.
|
Sudarant bandymo planą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir jų paskirstymas, kiekvienos koncentracijos indų skaičius ir lervų skaičius inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo atlikimo aprašymas.
|
Regresinės analizės planas
18.
|
Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC15, EC50) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Apskritai tikslumo ir ypač validumo vertes, kurias naudojant galima įvertinti poveikio koncentracijas (ECx), įmanoma patikslinti, jeigu poveikio koncentracijos vertės atitinka bandomųjų koncentracijų intervalą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesnių negu mažiausioji teigiamoji koncentracija arba didesnių negu didžiausioji koncentracija verčių. Pradinis intervalo nustatymo bandymas praverčia renkantis naudotinų koncentracijų intervalą (žr. 27 pastraipą).
|
19.
|
Jeigu turi būti nustatomos poveikio koncentracijos (ECx), turėtų būti atliekami bent penki bandymai naudojant kiekvieną koncentracijos vertę ir trys kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakankamą bandomųjų koncentracijų skaičių, kad modelis būtų reikiamai įvertinamas. Koncentracijų koeficiento vertė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimtį leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu dozės ir reakcijos santykio kreivė turi nuolaidų statumą). Kartotinių ėminių skaičių atliekant kiekvieną apdorojimą galima mažinti, jeigu padidėja skirtingą atsaką sukeliančių bandomųjų koncentracijų skaičius. Didinant kartotinių ėminių skaičių arba mažinant bandomųjų koncentracijų intervalo ribas būtų taikomi siauresni bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, jeigu reikia įvertinti 10 parų lervų išgyvenimą ir augimą.
|
NOEC/LOEC įvertinimo planas
20.
|
Jeigu reikia įvertinti LOEC arba NOEC, turėtų būti naudojamos ne mažiau negu keturių kartotinių bandymų penkios bandomosios koncentracijos ir koncentracijų koeficiento vertė ne turėtų viršyti 2. Kartotinių bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiamą statistinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greitį paprastai naudojama dispersinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo normą galima naudoti Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal bandymus.
|
Ribinis bandymas
21.
|
Ribinį bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis ėminys), jeigu darant pradinį intervalo nustatymo bandymą nebuvo nustatyta jokių poveikių. Ribinio bandymo tikslas – atlikti bandymą naudojant ganėtinai didelę koncentraciją, kad sprendimą priimantys asmenys galėtų išskirti galimą toksinį bandomosios cheminės medžiagos poveikį ir kad būtų nustatyta ribinė koncentracijos vertė, kuri jokiu būdu neturi būti naudojama. Rekomenduojama 1 000 mg/kg (sausoji masė). Paprastai poveikiui bandomąja medžiaga ir kontroliniam ėminiui būtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai bandymai. Turi būti įrodoma pakankama statistinė galia aptikti 20 % skirtumą nuo kontrolinės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir masė), t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalytės dispersijos). Jeigu šių reikalavimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavertės dispersijos t-bandymą arba neparametrinį bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandymą. Nustatant išsiritimo normą atliktinas Fisher bandymas.
|
PROCEDŪRA
Poveikio sąlygos
Nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens sistemos pasiruošimas
22.
|
Bandomosios cheminės medžiagos įtepimo procedūra aprašyta bandymo metode C.8: Nustatant toksiškumą sliekams rekomenduojama taikyti bandomąją medžiagą (14). Nuosėdos su įterpta bandomąja medžiaga dedamos į indus ir užpilamos paviršiniu vandeniu, kad būtų užtikrintas nuosėdų ir vandens santykis 1:4 (žr. 11 ir 15 pastraipas). Nuosėdų sluoksnio storis turėtų būti 1,5—3 cm. Kad į vandens tūrį pilant bandymo vandenį nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirtų ir kietosios dalelės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuosėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuosėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus.
|
23.
|
Bandymo indai turėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokštėmis) Jeigu būtina, atliekant tyrimą leidžiama įpilti vandens, kad būtų užtikrinamas pradinis vandens tūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo, kad nesusidarytų druskos.
|
Stabilizavimas
24.
|
Pasiruošus nuosėdas su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir paviršiniu vandeniu rekomenduojama palaukti, kol bandomoji cheminė medžiaga iš hidratuotos fazės pereis į nuosėdas (3) (4) (6) (13). Šis procesas turėtų būti visų pirma atliekamas laikantis darant bandymą taikomų temperatūros ir aeracijos sąlygų. Nuosėdoms ir cheminei medžiagai būdinga tam tikra pusiausvyros nusistovėjimo trukmė bei ji gali aprėpti kelias valandas ar dienas ir retais atvejais ne daugiau negu kelias savaites (4–5 savaites). Šiuo atveju būtų pakankamai laiko biologiškai suskaidyti daugelį cheminių medžiagų ir pusiausvyra nenusistovėtų, tačiau rekomenduojama rinktis 48 val. pusiausvyros nusistovėjimo laikotarpį. Kito šio pusiausvyros nusistovėjimo laikotarpio pabaigoje turėtų būti matuojama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose, bent jau didžiausios koncentracijos ir mažiausios koncentracijos (žr. 38 pastraipą). Naudojantis šiais bandomosios cheminės medžiagos analiziniais nustatymais galima apskaičiuoti masės balansą ir išreikšti rezultatus atsižvelgiant į išmatuotas koncentracijas.
|
Bandomųjų organizmų pridėjimas
25.
|
Keturias ar penkias dienas prieš bandomųjų organizmų įdėjimą į bandymo indus, kiaušinėlių masė turėtų būti paimama iš sėjimo kultūrų ir sudedama į mažus indus auginimo terpėje. Leidžiama naudoti iš kamieninės kultūros gautą terpę arba šviežią pasiruoštą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į auginimo terpę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žaliųjų dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumaltų žuvų maisto gabalėlių suspensijos filtrato (žr. 2 priedėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po kelių dienų nuo kiaušinėlių padėjimo (Chironomus riparius 20 °C temperatūroje išsirita per 2–3 dienas, Chironomus tentans 23 °C temperatūroje išsirita per 1–4 dienas ir Chironomus yoshimatui 25 °C temperatūroje) ir lervos augdamos pereina keturias stadijas, iš kurių kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 dienų po išsiritimo). Mašalų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvutės apvalkalo plotį (6).
|
26.
|
Pirmos stadijos dvidešimt lervų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiekvienam bandymo indui, kuriame yra nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi būti nutraukiamas, kol lervos dedamos į bandymo indą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lervų įdėjimo (žr. 25 ir 32 pastraipas). Pagal taikomą bandymo planą (žr. 19 ir 20 pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lervų, jeigu nustatomas ES taškas, arba 80 lervų, jeigu apibrėžiama NOEC.
|
Bandomosios koncentracijos
27.
|
Intervalo nustatymo bandymas gali būti naudingas siekiant apibrėžti darant galutinį bandymą pasirinktinų koncentracijų intervalą. Šiuo tikslu naudojamos labai besiskiriančių bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojamų chironomidų vienodą paviršiaus tankumą, jie veikiami kiekviena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi.
|
28.
|
Atliekant galutinį bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultatą. Turėtų būti naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 pastraipose.
|
Kontroliniai ėminiai
29.
|
Kontrolinių ėminių indai be jokios bandomosios cheminės medžiagos, tačiau su nuosėdomis, turėtų būti naudojami atliekant bandymą su atitinkamu skaičiumi kartotinių ėminių (žr. 19–20 pastraipą). Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraipą), turėtų būti įdedamas tirpiklio kontrolinis ėminys.
|
Bandymo sistema
30.
|
Naudojamos statinės sistemos. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau statines ar dinamines sistemas su trūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokybės reikalavimai neatitinka taikomų bandomajam organizmui ar daro poveikį cheminei pusiausvyrai (pvz., ištirpusio deguonies lygiai pernelyg sumažėja, labai padidėja šalinimo produktų koncentracija arba iš nuosėdų ima sunktis mineralų skystis ir daro poveikį pH ir (arba) vandens kietumo vertėms). Tačiau paprastai pakanka kitų paviršinio vandens kokybės gerinimo metodų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina pirmenybė.
|
Pašaras
31.
|
Lervas būtina maitinti; pageidautina kiekvieną dieną ar bent tris kartus per savaitę. Per pirmąsias 10 parų jaunoms lervoms per dieną turėtų pakakti 0,25–0,5 mg (C. yoshimatui lervoms 0,35–0,5 mg) žuvų maisto (vandens suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, išsami informacija pateikta 2 priedėlyje). Senesnėms lervoms pašaro reikia šiek tiek daugiau: likusiai bandymo daliai kiekvieną dieną lervoms turėtų pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis turėtų būti mažinamas visų apdorojimų atvejais ir kontrolinėje grupėje, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad kontrolinės grupės gyvūnai gaišta. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi būti pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis cheminėmis medžiagomis (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusiomis cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir natūraliam augimui būtiną pašaro kiekį galima įterpti į sintetines nuosėdas prieš stabilizavimo laikotarpį. Šiuo tikslu turi būti naudojamas ne žuvų maistas, o augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji masė) smulkiai sumaltų lapų, pvz., didžiosios dilgėlės (Urtica dioeca), baltojo šilkmedžio (Morus alba), persinio dobilo (Trifolium repens), daržinio špinato (Spinacia oleracea) arba galima naudoti kitą augalinę medžiagą (Cerophyl arba alfa celiuliozę).
|
Inkubacijos sąlygos
32.
|
Rekomenduojama visų pirma 24 valandas po lervų įdėjimo nestipriai aeruoti bandymo indų paviršinį vandenį ir vėliau aeruojama per visą bandymo atlikimo trukmę (privaloma stebėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos vertė nėra mažesnė negu 60 % soties ore vertės (ASV)). Aeruojant naudojama stiklinė Pastero pipetė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuosėdų sluoksnio (t. y. vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis cheminėmis medžiagomis galima nuspręsti nuosėdų–vandens sistemos neaeruoti.
|
33.
|
Atliekant bandymą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperatūra. Atliekant bandymą su C. tentans ir C. yoshimatui atitinkamai rekomenduojama pasirinkti 25 °C (± 2 °C) temperatūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laikotarpis; šviesos intensyvumo vertės turėtų būti 500–1 000 liuksų.
|
Poveikio trukmė
34.
|
Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandomąją chemine medžiaga ir kontrolinių ėminių indus. Jeigu naudojami C. riparius ir C. yoshimatsui, poveikio trukmė yra 28 dienos, o kai pasirenkama C. tentans – 65 dienos. Jeigu mašalai atsiranda anksčiau, bandymą galima nutraukti ne anksčiau negu po penkių dienų atsiradus paskutiniam kontrolinės grupės suaugusiajam.
|
Stebėjimai
Lervų išsinėrimas
35.
|
Nustatoma vystymosi trukmė ir bendras visų iki galo išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
|
36.
|
Bandymo indai turėtų būti stebimi bent tris kartus per savaitę siekiant nustatyti bet kokią neįprastą veikseną (pvz., nuosėdų susidarymą, neįprastą plūduriavimą) palyginti su kontroliniai indais. Numatomo lervų išsinėrimo laikotarpiu būtina skaičiuoti kasdieną atsirandančius mašalus. Kiekvieną dieną registruojami visi atsiradę mašalai ir nurodoma jų lytis. Nustačius tapatybę mašalai pašalinami iš indų. Turėtų būti registruojamos visos prie užbaigiant bandymą padėtos kiaušinėlių masės ir po to pašalinamos, kad lervos pakartotinai nebūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas matomų lėliukų skaičius, kurios nėra išsiritusios. Išsineriančių lervų skaičiavimo gairės pateiktos 5 priedėlyje.
|
Augimas ir išgyvenimas
37.
|
Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 parų lervų išgyvenimą ir augimą, iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos būtų galima naudoti vėliau. Šių papildomų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu siekiant surinkti lervas. Nejudumas ar nepakankamas atsakas į mechaninius dirgiklius yra gaišimo kriterijai. Neatsigavusios lervos taip pat turėtų būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos galėjo būti žuvusios nuo mikrobų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusių lervų sausoji masė (be pelenų) ir apskaičiuojama vidutinė pavienė indo sausoji masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plotį.
|
Analiziniai matavimai
Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija
38.
|
Prieš pradedant bandymą (t. y. prieš įdedant lervas) bent iš kiekvieno apdorojimo indo imami biriųjų nuosėdų ėminiai ir į juos atsižvelgiant bei naudojant analizinį nustatymą įvertinama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija nuosėdose. Bandymo pradžioje ir pabaigoje rekomenduojama analizuoti bent paviršinio vandens, porų vandens ir nuosėdų ėminius (žr. 24 pastraipą) esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nustačius bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos elgseną ir (arba) pasiskirstymą vandens–nuosėdų sistemoje.
|
39.
|
Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dieną) ir jeigu analizei atlikti reikalingi dideli ėminiai, kuriuos paėmus bandymo sistemai būtų padarytas poveikis, analiziniai nustatymai turėtų būti atliekami naudojant iš panašiai apdorotų papildomų bandymo indų paimtus ėminius (įskaitant bandomųjų organizmų buvimą), tačiau biologiniam stebėjimui nenaudotų indų.
|
40.
|
Siekiant izoliuoti laisvąjį vandenį rekomenduojama naudoti 30 min. trukmės centrifugavimo procedūrą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Tačiau jeigu įrodoma, kad bandomosios cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravimą. Tam tikrais atvejais gali nebūti įmanoma analizuoti porų vandens koncentracijų, nes ėminys yra pernelyg mažas.
|
Fiziniai ir cheminiai parametrai
41.
|
Tinkamu būdu turėtų būti matuojama bandymo indų pH ir temperatūros vertės (žr. 10 pastraipą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje turėtų būti matuojama kontrolinių ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vertės esant didžiausiai koncentracijai.
|
DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
Rezultatų apdorojimas
42.
|
Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį mašalų patelių ir patinėlių vystymosi greičiui ir bendram jų skaičiui, arba, jeigu atliekamas 10 parų bandymas, poveikį lervų išgyvenimui ir jų masei. Jeigu neturima duomenų apie statistiniu požiūriu skirtingą lyčių jautrumą, atliekant statistinę analizę patinėlių ir patelių rezultatus galima sujungti. Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spręsti naudojant statistines priemones, pvz., atliekant χ2-r × 2 lentelės bandymą. Jeigu reikia, po 10 parų turi būti nustatomas lervų išgyvenimas ir vidutinė kiekvieno indo sausoji masė.
|
43.
|
Visų pirmiausiai remiantis bandymo pradžioje (žr. 38 pastraipą) išmatuotomis nuosėdų koncentracijomis apskaičiuojamos sausąja mase pagrįstos ir išreikštos poveikio koncentracijos.
|
44.
|
Indo statistinius duomenis, norint apskaičiuoti EC50 arba bet kokio kito ECx taškinį įvertį, leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. Apskaičiuojant kiekvieno ECx pasikliovimo intervalą turėtų būti atsižvelgiama į kiekvieno indo skirtingumą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas yra toks mažas ir kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiausiųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškumą. Tačiau ECx vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsaką transformavus į pradinę vertę.
|
45.
|
Jeigu taikant statistinę analizę siekiama apibrėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu tikrinama hipotezė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijusį skirtingumą, pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos ANOVA prielaidos gali būti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius bandymus (21).
|
Išsinėrimo santykis
46.
|
Išsinėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti atliekant Cochran-Armitage bandymą, taikomą mažėjimo tvarka, jeigu laikoma, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir šie duomenys atitinka minėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba Mantel-Haentzal bandymą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant tą pačią koncentraciją kartotinių ėminių kintamumas yra didesnis negu būtų galima nustatyti atsižvelgiant į binominį skirstinį (dažnai vadinamą „pertekline dispersija“), šiuo atveju turėtų būti pasirenkamas (21) pasiūlytas išsamus Cochran-Armitage arba Fisher bandymas.
Nustatoma inde išsiritusių mašalų suma ne ir dalinama iš įdėtų lervų skaičiaus na:
kur:
ER
|
=
|
išsinėrimo santykis
|
ne
|
=
|
iš indo išsinėrusių mašalų skaičius
|
na
|
=
|
į indą įdėtų lervų skaičius
|
|
47.
|
Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklinė dispersija, šiuo atveju galima rinktis kitą alternatyvą, t. y. išsinėrimo santykį laikyti nenutrūkstamuoju atsaku ir rinktis Williamso bandymą, jeigu daroma prielaida, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksiąs šiuos ER duomenis. Jeigu monotoniškumas nėra užtikrinamas, pirmenybė teiktina Duneto bandymui. Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibrėžiamas išsinėrusių mašalų ir neišsinėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į kartotinį ėminį (indą).
|
48.
|
Norint taikyti ANOVA metodų vertes, ER vertės pirmiausiai turėtų būti transformuojamos naudojant arksinuso kvadratinės šaknies transformaciją arba Tukey-Freeman transformaciją siekiant gauti apytikslį įprastą skirstinį ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arcsin-sqrt transformacija taikoma pasirenkant ER vertės kvadratinės šaknies arksinusą (sin–1).
|
49.
|
Išsinėrimo santykių ECx vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analizę (arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkamą komercinę programinę įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analizė nepavyksta (pvz., jeigu tėra mažiau negu du daliniai atsakai), naudojami kiti neparametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas.
|
Vystymosi greitis
50.
|
Vidutinė vystymosi trukmė yra vidutinis laikotarpis nuo lervų įdėjimo (nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentinės mašalų kohortos išsinėrimo. (Apskaičiuojant tikrąją vystymosi trukmę turėtų būti atsižvelgiama į lervų amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis vystymosi trukmės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka tą lervos vystymosi atkarpą, kuris vyksta per vieną dieną. Vystymosi greičiui, palyginti su šių nuosėdų toksiškumo tyrimų įvertinimu, teikiama pirmenybė, nes jo dispersija yra mažesnė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą pasiskirstymą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama veikiau rinktis patikimą parametrinį bandymą su vystymosi greičiu negu su vystymosi trukme. Vystymosi greičio kaip nenutrūkstamo atsako ECx vertes galima įvertinti naudojant regresijos analizę (pvz., (23), (24)).
|
51.
|
Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dieną pastebėtas mašalų skaičius išsinėrė per vidutinį laiko intervalą nuo x dienos iki x-1 dienos (l = tikrinimo intervalo trukmė (paprastai viena diena)). Vienam indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė (x) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
kur:
|
:
|
indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė
|
i
|
:
|
tikrinimo intervalo indeksas
|
m
|
:
|
didžiausias tikrinimo intervalų skaičius
|
|
:
|
per tikrinimo intervalą i išsinėrusių mašalų skaičius
|
ne
|
:
|
bendras eksperimento pabaigoje išsinėrusių mašalų skaičius (=
|
xi
|
:
|
per intervalą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis
|
kur:
dienai
|
:
|
tikrinimo diena (diena po poveikio)
|
li
|
:
|
tikrinimo intervalo i trukmė (dienos, paprastai 1 diena)
|
|
Bandymo ataskaita
52.
|
Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama bent ši informacija:
|
Bandomoji cheminė medžiaga:
—
|
fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės (tirpumas vandenyje, garų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuosėdose, jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.),
|
—
|
cheminės tapatybės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, struktūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskaitant grynumą ir analinės metodas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekybinį nustatymą.
|
|
|
Bandomosios rūšys:
—
|
naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo gavimo šaltinis ir veisimo sąlygos,
|
—
|
informacija apie kiaušinėlių masės ir lervų tvarkymą,
|
—
|
gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus.
|
|
|
Bandymo sąlygos:
—
|
naudotos nuosėdos, t. y. natūralios ar sintetinės nuosėdos,
|
—
|
jei naudojamos natūralios nuosėdos, nuosėdų ėminių ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrinė analizė (jeigu reikia),
|
—
|
sintetinių nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos (organinės anglies kiekis, pH, drėgmė ir t. t. bandymo pradžioje),
|
—
|
bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. t. bandymo pradžioje),
|
—
|
nuosėdų ir vandens sluoksnių storis,
|
—
|
paviršinio vandens ir porų vandens tūris; drėgnųjų nuosėdų masė su porų vandeniu ir be jo,
|
—
|
bandymo indai (medžiaga ir dydis),
|
—
|
bandomosios cheminės medžiagos įterpimo į nuosėdas metodas: naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kartotinių ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti,
|
—
|
nuosėdų—vandens sistemos, į kurią įterpta bandomosios cheminės medžiagos, stabilizavimo pusiausvyros fazė: trukmė ir sąlygos,
|
—
|
inkubacijos sąlygos: temperatūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija (dažnumas ir intensyvumas),
|
—
|
išsami informacija apie maistą, įskaitant jo tipą, paruošiamą, kiekį ir maitinimo tvarką.
|
|
|
Rezultatai:
—
|
nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios koncentracijos ir visų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją,
|
—
|
vandens kokybė bandymo induose, t. y. pH, temperatūra, ištirpęs deguonis, kietumas ir amoniako kiekis,
|
—
|
išgaruojančio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma,
|
—
|
iš kiekvieno indo per dieną išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius,
|
—
|
lervų, kurios inde neišsinėrė kaip mašalai, skaičius,
|
—
|
vidutinė pavienė lervų sausoji masė inde ir tam tikros stadijos lervų sausoji masė inde, jeigu reikia,
|
—
|
išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapatų bandymą ir bandomoji koncentracija (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
|
—
|
atliekant tapatų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir apdorojimo norma (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
|
—
|
toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susiję pasikliovimo intervalai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai,
|
—
|
rezultatų aptarimas, įskaitant bet kokį poveikį bandymo rezultatams, kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo.
|
|
|
LITERATŪRA
1.
|
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
|
2.
|
Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
|
3.
|
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
|
4.
|
ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
|
5.
|
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
|
6.
|
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
|
7.
|
US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
|
8.
|
US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
|
9.
|
Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
|
10.
|
Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
|
11.
|
Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
|
12.
|
OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
|
13.
|
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
|
14.
|
Šio priedo bandymo metodas C.8. Toksiškumas sliekams.
|
15.
|
Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
|
16.
|
Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
|
17.
|
Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.
|
18.
|
Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491.
|
19.
|
Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.
|
20.
|
Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.
|
21.
|
Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
|
22.
|
Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
|
23.
|
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
|
24.
|
Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
|
1 priedėlis
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
Šiame bandymo metode vartojamų terminų apibrėžtys:
|
Pasiruoštosios nuosėdos ar regeneruotos, dirbtinės arba sintetinės nuosėdos yra natūralių nuosėdų fizines sudedamąsias dalis atitinkančių medžiagų mišinys.
|
|
Paviršinis vanduo – bandymo inde ant nuosėdų užpiltas vanduo.
|
|
Laisvasis vanduo ar porų vanduo – ertmes tarp nuosėdų ir dirvožemio kietųjų dalelių užpildantis vanduo.
|
|
Nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga – nuosėdos, į kurias prileista bandomosios cheminės medžiagos.
|
|
Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
|
2 priedėlis
Rekomendacijos dėl Chironomus riparius auginimo
1.
|
Chironomus lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didelėse talpyklose. Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco smėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diatomitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos kelių mm storio). Po to užpilamas kelių centimetrų storio vandens sluoksnis. Jeigu reikia, įpilama papildomo vandens, kad būtų atkuriamas išgaravęs kiekis ir sustabdomas džiūvimas. Jeigu reikia, vandenį leidžiama pakeisti. Turėtų būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lervų auginimo indai turėtų būti laikomi tinkamuose narvuose, kad išsinėrę suaugusieji vabzdžiai nepajėgtų pasprukti. Narvas turėtų būti ganėtinai erdvus, kad galėtų spiestis išsinėrę suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm).
|
2.
|
Narvai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje arba pastovių aplinkos sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperatūroje; šviesiojo laikotarpio trukmė 16 val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuksų), 8 val. tamsos. Parengta ataskaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro drėgnumas yra mažesnis negu 60 % RH, gali sumažėti reprodukcija).
|
Skiedimo vanduo
3.
|
Leidžiama naudoti bet kokį tinkamą natūralų ar sintetinį vandenį. Paprastai naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtinės terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemonė, žr. toliau). Prieš naudojimą vanduo turi būti aeruojamas. Jeigu būtina, kultūrų auginimo vandenį leidžiama atnaujinti pilant panaudotą vandenį iš kultūrų auginimo indų ar jį leidžiant per sifoną; būtina stengtis nepažeisti lervų vamzdžių.
|
Lervų šėrimas
4.
|
Chironomus lervos turėtų būti šeriamos žuvų maisto dribsniais (Tetra Min®, Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuvų maisto rūšimi); vienam indui per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Pašarą galima pateikti sausą, sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensiją: 1,0 g maisto dribsnių įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dieną leidžiama įdėti į kiekvieną indą (prieš naudojant būtina pakratyti). Vyresnėms lervoms duodama daugiau pašaro.
|
5.
|
Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokybę. Jeigu auginimo terpė „susidrumsčia“, duodamo pašaro kiekis turėtų būti sumažinamas. Duodamo pašaro kiekiai turi būti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro kiekis, lervos persikelia į vandens storymę, o skiriant per daug pašaro suintensyvėja mikroorganizmų veikla ir sumažėja deguonies koncentracija. Abiem minėtomis sąlygomis sumažėja augimo greitis.
|
6.
|
Ruošiant naujus kultūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti žaliųjų dumblių (pvz., Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
|
Išsinėrusių suaugusiųjų mašalų šėrimas
7.
|
Kai kurie tyrinėtojai pasiūlė, kad išsinėrusius suaugusius mašalus būtų galima šerti naudojant prisotintame sacharozė tirpale išmirkytus vilnos tamponus.
|
Lervų išsinėrimas
8.
|
Suaugę mašalai ima rastis iš lervų auginimo indų po 13–15 dienų 20 ± 2 °C temperatūroje. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
|
Kiaušinėlių masė
9.
|
Kol suaugę mašalai būna veisimo narve, visi lervų auginimo indai turėtų būti tikrinami tris kartus per savaitę, ar juose nėra drebučių pavidalo kiaušinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušinėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašalinama. Kiaušinėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens ėminiu. Kiaušinėlių masė naudojama pradedant inde auginti naują kultūrą (pvz., 2–4 kiaušinėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo bandymus.
|
10.
|
Pirmos stadijos lervos turėtų išsiristi po 2–3 dienų.
|
Naujų kultūrų auginimo indų ruošimas
11.
|
Išauginus kultūras turėtų būti įmanoma kiekvieną savaitę ar rečiau paruošti naują lervų kultūros auginimo indą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reikalavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaugę mašalai. Taikant šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaugę mašalai.
|
Bandymo tirpalų „M4“ ir „M7“ ruošimas
12.
|
Elendtas (1990) aprašė „M4“ terpę. „M7“ terpė ruošiama kaip „M4“ terpė, išskyrus 1 lentelėje išvardytas chemines medžiagas, kurių koncentracijos „M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesnės. Leidinys apie „M7“ terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas neturėtų būti ruošiamas pagal Elendtą ir Bias (1990), jeigu norima gauti NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 ir K2HPO4 koncentracijas, nes pradinių tirpalų ruošimas nėra tapati veikla.
|
„M7“ terpės ruošimas
13.
|
Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš šių pradinių tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentelę). 50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentelėje nurodyti kiekvieno makroelementų pradinio tirpalo kiekiai praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens, kad taip būtų pasiruošta „M7“ terpė. Vitaminų pradinis tirpalas pasiruošiamas į dejonizuotą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitaminų pradinio tirpalo įmaišoma į galutinę „M7“ terpę prieš pat naudojimo pradžią. (Vitaminų pradinis tirpalas laikomas sušaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis.) Terpė aeruojama ir stabilizuojama.
|
LITERATŪRA
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
1 lentelė
„M4“ ir „M7“ terpei skirtų mikroelementų pradiniai tirpalai
Pradiniai tirpalai (I)
|
Kiekis (mg), praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
|
Ruošiant kombinuotą pradinį tirpalą (II): maišomi nurodyti pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens
|
Galutinės bandomųjų tirpalų koncentracijos (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(15)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 · 4 H2O (15)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (15)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (15)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 · 6 H2O (15)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (15)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 · 2 H2O (15)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 · 2 H2O (15)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 · 6 H2O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA · 2 H2O (15)
(16)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 · 7 H2O (15)
(16)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
2 lentelė
M4 ir M7 terpėms skirti makroelementų pradiniai tirpalai
|
Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
(mg)
|
Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas makroelementų pradinių tirpalų kiekis
(ml/l)
|
Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
(mg/l)
|
CaCl2 · 2 H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 · 7 H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 · 9 H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
3 lentelė
M4 ir M7 terpei skirtas vitaminų pradinis tirpalas. Visi trys vitaminų tirpalai maišomi siekiant paruošti vieną vitaminų pradinį tirpalą
|
Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
(mg)
|
Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas vitaminų pradinio tirpalo kiekis
(ml/l)
|
Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
(mg/l)
|
Tiamino hidrochloridas
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Ciankobalaminas (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotinas
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
LITERATŪRA
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
3 priedėlis
SINTETINIŲ NUOSĖDŲ RUOŠIMAS
Nuosėdų sudėtis
Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš šių sudedamųjų dalių:
Sudedamoji dalis
|
Charakteristikos
|
Nuosėdų sausosios
procentinė dalis)
|
Durpės
|
Naujosios Zelandijos kiminų durpės, jų pH kiek įmanoma atitinka 5,5–6,0, jokių augalų matomų liekanų, smulkiai sumaltos (kietųjų dalelių dydis ≤ 1 mm), džiovintos ore
|
4–5
|
Kvarcinis smėlis
|
Grūdelių dydis: > 50 % dalelių dydžio vertės intervalas turėtų būti 0–200 μm
|
75–76
|
Kaolito molis
|
Kaolinito kiekis ≥ 30 %
|
20
|
Organinė anglis
|
Pakoreguota pridedant durpių ir smėlio
|
2 (± 0,5)
|
Kalcio karbonatas
|
CaCO3, milteliai, cheminiu atžvilgiu grynas
|
0,05–0,1
|
Vanduo
|
Laidumas ≤ 10 μS/cm
|
30–50
|
Pasiruošimas
Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulkūs milteliai. Suspensija iš nustatyto durpių miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO3 koreguojama, kad šios suspensijos pH vertė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondicionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperatūroje siekiant stabilizuoti pH ir paruošti stabilią mikroorganizmų populiaciją. pH matuojama dar kartą ir jo vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpių suspensija maišoma su kitomis sudedamosiomis dalimis (smėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu siekiant gauti vienalytes nuosėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % sausosios masės. Dar kartą matuojama galutinio mišinio pH vertė ir, jeigu reikia, naudojant CaCO3 koreguojama, kol pH vertė ima atitikti 6,5–7,5 vertę. Imami nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti sausąją masę ir organinės anglies kiekį. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti chironomidų toksiškumo bandymui, sintetinės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui.
Sandėliavimas
Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedamąsias sausas dalis galima laikyti sausoje ir vėsioje vietoje kambario temperatūroje. Sintetinės (drėgnos) nuosėdos neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, kuriuo baigiamas ruošimo etapas.
LITERATŪRA
Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. SAFEty 39: 10–20.
4 priedėlis
Tinkamo skiedimo vandens cheminės charakteristikos
Cheminė medžiaga
|
Koncentracijos
|
Kietosios dalelės
|
< 20 mg/l
|
Bendroji organinė anglis
|
< 2 mg/l
|
Nejonizuotas amoniakas
|
< 1 mg/l
|
Kietumas (kaip CaCO3)
|
< 400 mg/l (17)
|
Liekamasis chloras
|
< 10 mg/l
|
Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis
|
< 50 ng/l
|
Suminis organinių chloro pesticidų ir polichlorintų bifenilų kiekis
|
< 50 ng/l
|
Suminis organinio chloro kiekis
|
< 25 ng/l
|
5 priedėlis
Chironomidų lervų išsiritimo stebėjimo gairės
Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudyklės. Gaudyklės reikalingos nuo 20 dienos iki bandymo pabaigos. Gaudyklės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau:
A: nailono ekranas
B: apversti plastiko gaubtai
C: bebriaunė laboratorinė poveikio stiklinė
D: vandens keitimo ekrano angos
E: vanduo
F: nuosėdos
C.28. TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOSĖDOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT VANDENĮ SU ĮTERPTA BANDOMĄJA CHEMINE MEDŽIAGA
ĮVADAS
1.
|
Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires Nr. 219 (2004). Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaikį cheminių medžiagų poveikį nuosėdose gyvenančioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio Chironomus sp. lervoms. Šis metodas iš esmės pagrįstas BBA gairėmis; šiuo atveju naudojama nuosėdų—vandens sistema su dirbtiniu dirvožemiu ir vandens storymės poveikio scenarijumi (1). Atliekant šį bandymą taip pat atsižvelgiama į turimus toksiškumo bandymo su Chironomus riparius ir Chironomus tentans protokolus, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaurės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparnių vabzdžių rūšis, pvz., Chironomus yoshimatsui (10) (11), kurios tinkamai pagrįstos dokumentais.
|
2.
|
Taikant šį bandymo metodą kaip poveikio scenarijus pasirenkamas bandomosios cheminės medžiagos įterpimas į vandenį. Atitinkamo poveikio scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Vandens poveikio scenarijumi, kai, be kita ko, į vandens storymę įterpiama bandomoji cheminė medžiaga, ketinama modeliuoti pesticidų sklidimą ir scenarijus apima pradines didžiausias koncentracijas porų vandenyje. Šis scenarijus taip pat taikytinas kitų poveikio tipų atvejais (įskaitant cheminių medžiagų išsiliejimą), išskyrus ilgiau negu bandymo laikotarpis trunkančius kaupimosi procesus.
|
3.
|
Cheminės medžiagos, kurias būtina ištirti siekiant nustatyti jų poveikį nuosėdose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilgą laikotarpį. Nuosėdose gyvenančius organizmus galima veikti keliais būdais. Kiekvieno poveikio būdo santykinė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo atitinkamos cheminės medžiagos fizinių ir cheminių savybių. Jei tai lengvai absorbuojamos cheminės medžiagos (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusios cheminės medžiagos, užteršto maisto nurijimas galėtų būti tinkamas poveikio būdas. Siekiant, kad stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų toksiškus būtų reikiamai vertinamas, galima svarstyti galimybę, ar nereikėtų į nuosėdas įterpti pašaro prieš taikant bandomąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus galimus poveikio būdus pagrindinis dėmesys taikant šį bandymo metodą skiriamas ilgalaikiam poveikiui. Bandymo trukmė naudojant C. Riparius ir C. Yoshimatsui yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama C. tentans. Jeigu konkrečiam tikslui, pvz., tiriant nestabilių cheminių medžiagų poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius galima paimti po dešimties parų laikotarpio.
|
4.
|
Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusių suaugusiųjų skaičius ir išsiritimo trukmė. Rekomenduojama, kad lervų išgyvenimo ir augimo rodikliai būtų matuojami tik po dešimties parų laikotarpio, jeigu būtini papildomi trumpalaikiai duomenys ir jeigu reikia naudoti papildomus pakartotinius ėminius.
|
5.
|
Rekomenduojama naudoti sintetines nuosėdas. Sintetinės nuosėdos keliais atžvilgiais yra tinkamesnės negu natūralios nuosėdos:
—
|
kintamumas darant bandymą yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro atkuriamą „standartinę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužterštą ir švarų nuosėdų šaltinį,
|
—
|
bandymus galima pradėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandomųjų nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju nebūtina iš anksto apdoroti nuosėdų, kad iš jų būtų pašalinta būdingoji fauna; naudojant sintetines nuosėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant įprastiems bandymams reikalingą nuosėdų kiekį,
|
—
|
naudojant sintetines nuosėdas galima lyginti toksiškumą ir atitinkamai klasifikuoti chemines medžiagas: toksiškumo bandymų, kuriems naudotos natūralios ir dirbtinės nuosėdos, duomenys buvo lyginami atsižvelgiant į kelias chemines medžiagas (2).
|
|
6.
|
Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
|
BANDYMO METODO ESMĖ
7.
|
Pirmos stadijos chironomidų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos bandomąja chemine medžiaga nuosėdų-vandens sistemose. Pradėjus bandymą viena pirmosios stadijos lerva įdedama į bandymo stiklinę, kurioje yra nuosėdų–vandens sistema ir į kurios vandenį vėliau įleidžiama bandomosios cheminės medžiagos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomidų išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lervų išgyvenimą ir masę po 10 parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai būtina). Šie duomenys analizuojami taikant regresijos modelį ir siekiant įvertinti koncentraciją, kuri būtų x % sumažinusi lervų išsinėrimą, arba lervų išgyvenimą ar augimą (pvz., EC15, EC50 ir t. t.) arba hipotezę tikrinant statistiniais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedarančią koncentraciją ir (arba) mažiausią stebimo poveikio koncentraciją). Pastaruoju atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes būtina lyginti su kontrolinėmis vertėmis.
|
INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
8.
|
Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje, jos garų slėgis, išmatuotas ar apskaičiuotas nuosėdų susidarymas ir stabilumas vandenyje bei nuosėdose. Turėtų būti prieinamas analizės metodas kiekybiniam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui nustatyti paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose su žinomu ir praneštu tikslumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios cheminės medžiagos struktūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiagų, su kurioms dėl jų fizinių ir cheminių savybių sunku daryti bandymą, gairės pateiktos (12).
|
ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
9.
|
Bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis galima atlikti periodiškai ir juos darant būtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo sąlygos būtų patikimos. Etaloninės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13).
|
BANDYMO VALIDUMAS
10.
|
Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios sąlygos:
—
|
lervų išsinėrimas kontroliniuose ėminiuose bandymo pabaigoje turi būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6),
|
—
|
C. riparius ir C. yoshimatsui iš kontrolinių indų suaugėliais turėtų tapti 12–23 dienomis po lervų įleidimo į indus; C. tentans, šis laikotarpis turi būti 20–65 dienos,
|
—
|
bandymo pabaigoje pH vertė ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vertė esant naudojamai temperatūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vertės ir paviršinio vandens pH vertė visuose bandymo induose turėtų atitikti 6–9 intervalą,
|
—
|
vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens temperatūrą galima reguliuoti naudojant izoterminę patalpą ir šiuo atveju patalpos temperatūra turėtų būti patvirtinama atitinkamais laiko intervalais.
|
|
BANDYMO METODO APRAŠYMAS
Bandymo indai
11.
|
Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, tačiau juos naudojant turėtų būti užtikrinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuosėdų storis. Nuosėdų paviršiaus plotas turėtų būti toks, kad vienai lervai tektų 2–3 cm2. Nuosėdų storio ir paviršinio vandens sluoksnio storio santykis turėtų būti 1:4. Bandymo indai ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, turėtų būti vien iš stiklo ar kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono).
|
Rūšių pasirinkimas
12.
|
Renkantis atliekant bandymą naudojamą rūšį pirmenybė teikiama Chironomus riparius. Taip pat leidžiama naudoti Chironomus tentans, tačiau juos sunkiau prižiūrėti ir jiems būtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be to, leidžiama naudoti Chironomus yohimatsui. Su Chironomus riparius susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 priedėlyje. Taip pat pateikiama informacija apie kitų rūšių, t. y. Chironomus tentans (4) ir Chironomus yoshimatsui (11), kultūrų auginimo sąlygos. Rūšies tapatybės nustatymas turi būti patvirtinamas prieš bandymą, tačiau patvirtinimas nėra būtinas prieš kiekvieną bandymą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos kultūros.
|
Nuosėdos
13.
|
Pirmenybė teikiama pasiruoštoms nuosėdoms (jos dar vadinamos pertvarkytomis, dirbtinėmis ar sintetinėmis nuosėdomis). Tačiau jeigu naudojamos natūralios nuosėdos, turėtų būti nurodomos jų charakteristikos (bent pH, organinės anglies kiekis, kitų parametrų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrinę sudėtį) ir nuosėdose neturi būti jokių teršalų ir kitų organizmų, kurie galėtų konkuruoti su chironomidais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, natūralios nuosėdos kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Atliekant šį bandymą (1) (15) (16) rekomenduojama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuosėdas:
a)
|
4–5 % durpių (sausoji masė): pH vertė kiek įmanoma turi būti 5,5–6,0; privaloma naudoti smulkiai sumaltus (dalelių dydis ≤ 1 mm) durpių miltelius; jos turi būti džiovintos tik ore;
|
b)
|
20 % (sausoji masė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 30 %);
|
c)
|
75–76 % (sausoji masė) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm);
|
d)
|
įpilama dejonizuoto vandens, kad galutiniame mišinyje drėgnumas sudarytų 30–50 %;
|
e)
|
įdedama chemijos požiūriu gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5;
|
f)
|
galutinio mišinio sudėtyje turėtų būti be 2 % (± 0,5 %) organinės anglies ir jos kiekis turi būti koreguojamas atitinkamais durpių ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c.
|
|
14.
|
Turėtų būti žinomas durpių, kaolino molio ir smėlio gavimo šaltinis. Nuosėdų sudedamosios dalys turėtų būti patikrinamos, ar jose nėra cheminės taršos pėdsakų (pvz., sunkiųjų metalų, chlororganinių komponentų, fosfororganinių komponentų ir t. t.). Sintetinių nuosėdų pasiruošimo pavyzdys aprašytas 3 priedėlyje. Taip pat leidžiama maišyti sausąsias sudedamąsias dalis, jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens nėra atskiriamos nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima plūduriuoti kietosios durpių dalelės) ir kad durpės ar nuosėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus.
|
Vanduo
15.
|
Kaip bandymo vandenį leidžiama rinktis bet kokį vandenį, atitinkantį 2 ir 4 priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršinį ar gruntinį), regeneruotą vandenį (žr. 2 priedėlį) arba vandentiekio vandenį, iš kurio pašalintas chloras, leidžiama rinktis kaip kultūros auginimo vandenį ir bandymo vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymių išgyvena kultūros veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vertė pradedant bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l kaip CaCO3. Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrimą turėtų būti naudojamas to paties tipo vanduo. 4 priedėlyje išvardytų vandens kokybės charakteristikų vertės turėtų būti matuojamos ne rečiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos yra gerokai pakitusios.
|
Pradiniai tirpalai. Vanduo su įterpta bandomąja chemine medžiaga
16.
|
Bandymo koncentracijos apskaičiuojamos remiantis vandens storymės koncentracijomis, t. y. paviršiniu nuosėdų vandeniu. Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai paprastai pasiruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradiniai tirpalai visų pirmiausiai turėtų būti ruošiami bandomąją cheminę medžiagą tirpinant bandymo terpėje. Norint pasiruošti tinkamos koncentracijos pradinio tirpalo tam tikrais atvejais gali tekti naudoti tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai – acetonas, etanolis, metanolis, metoksietanolis, etilenglikolio dimetileteris, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Naudotini dispergatoriai – „Cremophor RH40“, „Tween 80“, metilceliuliozė 0,01 % ir HCO-40. Soliubilizavimo priemonės koncentracija galutinėje bandymo terpėje turėtų būti kuo mažesnė (t. y. ≤ 0,1 ml/l) ir vienoda kiekvieną kartą veikiant bandomąja chemine medžiaga. Jeigu naudojama soliubilizavimo priemonė, ji neturi daryti jokio didesnio poveikio chironomidų lervų išgyvenimui arba akivaizdaus neigiamo poveikio šioms lervoms, kaip kad nustatoma darant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau turėtų būti imamasi visų priemonių, kad šios medžiagos nebūtų naudojamos.
|
BANDYMO PLANAS
17.
|
Sudarant bandymo planą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir jų paskirstymas, kiekvienos koncentracijos indų skaičius ir lervų skaičius inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo atlikimo aprašymas. Pirmenybė teikiama regresinei analizei, o ne hipotezės tikrinimo metodui.
|
Regresinės analizės planas
18.
|
Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC15, EC50) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Apskritai tikslumo ir ypač validumo vertes, kurias naudojant galima įvertinti poveikio koncentracijas (ECx), įmanoma patikslinti, jeigu poveikio koncentracijos vertės atitinka bandymo koncentracijų intervalą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesnių negu mažiausioji teigiamoji koncentracija arba didesnių negu didžiausioji koncentracija verčių. Pradinis intervalo nustatymo bandymas praverčia renkantis naudotinų koncentracijų intervalą (žr. 27 pastraipą).
|
19.
|
Jeigu turi būti nustatomos poveikio koncentracijos (ECx), turėtų būti atliekami bent penki bandymai naudojant kiekvieną koncentracijos vertę ir trys kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakankamą bandymo koncentracijų skaičių, kad būtų užtikrinamas reikiamas modelio įvertinimas. Koncentracijų koeficiento vertė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimtį leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu dozės ir reakcijos santykio kreivė turi nuolaidų statumą). Kartotinių ėminių skaičių atliekant kiekvieną apdorojimą galima mažinti, jeigu padidėja skirtingą atsaką sukeliančių bandymo koncentracijų skaičius. Didinant kartotinių ėminių skaičių arba mažinant bandymo koncentracijų intervalo ribas būtų taikomi siauresni bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, jeigu būtina įvertinti 10 parų lervų išlikimą ir augimą.
|
NOEC/LOEC įvertinimo planas
20.
|
Jeigu turi būti vertinama LOEC arba NOEC, turėtų būti naudojamos ne mažiau negu keturių kartotinių bandymų penkios bandomosios koncentracijos ir koncentracijų koeficiento vertė neturėtų viršyti 2. Kartotinių bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiamą statistinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greitį paprastai naudojama dispersinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo normą galima naudoti Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal bandymus.
|
Ribinis bandymas
21.
|
Ribinį bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis ėminys), jeigu darant pradinį intervalo nustatymo bandymą nebuvo nustatyta jokių poveikių. Atliekant ribinį bandymą siekiama nurodyti, kad toksinė bandomosios cheminės medžiagos vertė yra didesnė negu darant bandymą nustatyta ribinė koncentracija. Naudojant šį bandymo metodą negalima pateikti jokių pasiūlymų dėl rekomenduojamos koncentracijos; ši teisė suteikta pareigūnui. Paprastai būtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai bandymai poveikiui bandomąja medžiaga ir kontroliniai bandymai. Turėtų būti įrodoma pakankama statistinė galia aptikti 20 % skirtumą nuo kontrolinės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir masė), t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalytės dispersijos). Jeigu šių reikalavimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavertės dispersijos t-bandymą arba ne parametrinį bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandymą. Nustatant išsinėrimo normą atliktinas Fisher bandymas.
|
PROCEDŪRA
Poveikio sąlygos
Vandens–nuosėdų sistemos su įterpta bandomąja chemine medžiaga paruošimas
22.
|
Į bandymo indus įdedami atitinkami sintetinių nuosėdų kiekiai (žr. 13–14 dalis ir 3 priedėlį), kad būtų paruoštas ne plonesnis negu 1,5 cm sluoksnis. Vandens pilama tiek, kol nusistovi 6 cm vandens storymė (žr. 15 pastraipą). Nuosėdų sluoksnio ir vandens storymės santykis neturėtų viršyti 1:4 bei nuosėdų sluoksnio storis neturėtų būti didesnis negu 3 cm. Nuosėdų–vandens sistema prieš įdedant į ją bandomuosius gyvūnus turėtų būti švelniai aeruojama septynias dienas (žr. 14 pastraipą ir 3 priedėlį). Kad į vandens storymę pilant bandymo vandenį nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirtų ir kietosios dalelės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuosėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuosėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus.
|
23.
|
Bandymo indai turėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokštėmis) Jeigu būtina, atliekant tyrimą leidžiama įpilti vandens, kad būtų užtikrinamas pradinis vandens tūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo siekiant užkirsti kelią, kad nesusidarytų druskos.
|
Bandomųjų organizmų įdėjimas
24.
|
Keturias ar penkias dienas prieš bandomuosius organizmus įdedant į bandymo indus, kiaušinėlių masė turėtų būti paimama iš sėjimo kultūrų ir sudedama į mažus indus auginimo terpėje. Leidžiama naudoti iš kamieninės kultūros gautą terpę arba šviežią pasiruoštą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į auginimo terpę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žaliųjų dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumaltų žuvų maisto gabalėlių suspensijos filtrato (žr. 2 priedėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po kelių dienų nuo kiaušinėlių padėjimo (Chironomus riparius 20 °C temperatūroje išsirita per 2–3 dienas, Chironomus tentans 23 °C temperatūroje išsirita per 1–4 dienas ir Chironomus yoshimatui 25 °C temperatūroje) ir lervos augdamos pereina keturias stadijas, iš kurių kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 dienų po išsiritimo). Mašalų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvutės apvalkalo plotį (6).
|
25.
|
Pirmos stadijos dvidešimt lervų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiekvienam bandymo indui, kuriame yra nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi būti nutraukiamas, kol lervos dedamos į bandymo indą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lervų įdėjimo (žr. 24 ir 32 pastraipas). Pagal taikomą bandymo planą (žr. 19 ir 20 pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lervų, jeigu nustatomas ES taškas, arba 80 lervų, jeigu apibrėžiama NOEC.
|
26.
|
Po dvidešimt keturių valandų nuo lervų įdėjimo, į paviršinio vandens storymę įleidžiama bandomoji cheminė medžiaga ir vanduo vėl imamas šiek tiek aeruoti. Maži bandomosios cheminės medžiagos tirpalų kiekiai pipete įterpiami po vandens paviršiumi. Tada paviršinis vanduo turėtų būti išmaišomas (stengiamasi nesukelti nuosėdų).
|
Bandomosios koncentracijos
27.
|
Intervalo nustatymo bandymas gali būti naudingas siekiant apibrėžti darant galutinį bandymą pasirinktinų koncentracijų intervalą. Šiuo tikslu naudojamos labai besiskiriančių bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojamų chironomidų vienodą paviršiaus tankumą, jie veikiami kiekviena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi.
|
28.
|
Atliekant galutinį bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultatą. Turėtų būti naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 pastraipose.
|
Kontroliniai ėminiai
29.
|
Kontrolinių ėminių indai be jokios bandomosios cheminės medžiagos, tačiau su nuosėdomis, turėtų būti naudojami atliekant bandymą su atitinkamu skaičiumi kartotinių ėminių (žr. 19–20 pastraipą) Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraipą), turėtų būti įdedama tirpiklio kontrolinis ėminys.
|
Bandymo sistema
30.
|
Naudojama statinė sistema. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau statines ar dinamines sistemas su trūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokybės reikalavimai neatitinka taikomų bandomajam organizmui ar daro poveikį cheminei pusiausvyrai (pvz., ištirpusio deguonies lygiai pernelyg sumažėja, labai padidėja šalinimo produktų koncentracija arba iš nuosėdų ima sunktis mineralų skystis ir daro poveikį pH ir (arba) vandens kietumo vertėms. Tačiau paprastai pakanka kitų paviršinio vandens kokybės gerinimo metodų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina pirmenybė.
|
Pašaras
31.
|
Lervas būtina šert; pageidautina kiekvieną dieną ar bent tris kartus per savaitę. Per pirmąsias 10 parų jaunoms lervoms per dieną turėtų pakakti 0,25–0,5 mg (C. yoshimatui lervoms 0,35–0,5 mg) žuvų maisto (vandens suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, išsami informacija pateikta 2 priedėlyje). Senesnėms lervoms reikia šiek tiek daugiau pašaro: likusiai bandymo daliai kiekvieną dieną lervoms turėtų pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis turėtų būti mažinamas visų poveikių bandomąja chemine medžiaga atvejais ir kontroliuojamas, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad gaišta kontrolinės grupės gyvūnai. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi būti pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis cheminėmis medžiagomis (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusiomis cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir natūraliam augimui būtiną pašaro kiekį galima įterpti į sintetines nuosėdas prieš stabilizavimo laikotarpį. Šiuo tikslu turi būti naudojamas ne žuvų maistas, o augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji masė) smulkiai sumaltų lapų, pvz., didžiosios dilgėlės (Urtica dioeca), baltojo šilkmedžio (Morus alba), persinio dobilo (Trifolium repens), daržinio špinato (Spinacia oleracea) arba galima naudoti kitą augalinę medžiagą (Cerophyl arba alfa celiuliozę).
|
Inkubacijos sąlygos
32.
|
Rekomenduojama visų pirma 24 valandas po lervų įdėjimo nestipriai aeruoti bandymo indų paviršinį vandenį ir vėliau aeruojama per visą bandymo atlikimo trukmę (privaloma stebėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos vertė nėra mažesnė negu 60 % soties ore vertės (ASV)). Aeruojant naudojama stiklinė Pastero pipetė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuosėdų sluoksnio (t. y. vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis cheminėmis medžiagomis galima apsispręsti ir neaeruoti nuosėdų–vandens sistemos.
|
33.
|
Atliekant bandymą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperatūra. Atliekant bandymą su C. tentans ir C. yoshimatui atitinkamai rekomenduojama pasirinkti 23 °C(± 2 °C) temperatūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laikotarpis; šviesos intensyvumo vertės turėtų būti 500–1 000 liuksų.
|
Poveikio trukmė
34.
|
Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandomąją chemine medžiaga ir kontrolinių ėminių indus. Jeigu naudojami C. riparius ir C. yoshimatsui, poveikio trukmė yra 28 dienos, o kai pasirenkama C. tentans – 65 dienos. Jeigu mašalai atsiranda anksčiau, bandymą galima nutraukti ne anksčiau negu po penkių dienų atsiradus paskutiniam kontrolinės grupės suaugusiajam.
|
STEBĖJIMAI
Lervų išsinėrimas
35.
|
Nustatoma vystymosi trukmė ir bendras visų iki galo išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
|
36.
|
Bandymo indai turėtų būti stebimi bent tris kartus per savaitę siekiant nustatyti bet kokią neįprastą veikseną (pvz., nuosėdų susidarymą, neįprastą plūduriavimą) palyginti su kontroliniais indais. Numatomo lervų išsinėrimo laikotarpiu būtina skaičiuoti kasdieną atsirandančius mašalus. Kiekvieną dieną registruojami visi atsiradę mašalai ir nurodoma jų lytis. Nustačius tapatybę mašalai pašalinami iš indų. Turėtų būti registruojamos visos prieš užbaigiant bandymą padėtos kiaušinėlių masės ir po to pašalinamos, kad lervos pakartotinai nebūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas matomų lėliukų skaičius, kurios nėra išsiritusios. Išsineriančių lervų skaičiavimo gairės pateiktos 5 priedėlyje.
|
Augimas ir išgyvenimas
37.
|
Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 parų lervų išlikimą ir augimą, iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos būtų galima naudoti vėliau. Šių papildomų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu siekiant surinkti lervas. Gaišimo kriterijai yra nejudumas ar nepakankamas atsakas į mechaninius dirgiklius. Neatsigavusios lervos taip pat turėtų būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos galėjo būti žuvusios nuo mikrobų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusių lervų sausoji masė (be pelenų) ir apskaičiuojama vidutinė pavienio indo sausoji masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plotį.
|
Analiziniai matavimai
Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija
38.
|
Bandymo pradžioje (geriausiai būtų vieną valandą po bandomosios cheminės medžiagos įterpimo) ir jo pabaigoje rekomenduojama analizuoti bent paviršinio vandens, porų vandens ir nuosėdų ėminius esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nustačius bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos elgseną ir (arba) pasiskirstymą vandens–nuosėdų sistemoje. Bandymo pradžioje imant nuosėdų ėminius gali būti padarytas poveikis bandymo sistemai (pvz., pašalinamos bandomosios lervos); vadinasi, turėtų būti naudojami papildomi bandymo indai siekiant bandymo pradžioje ir jį atliekant, jeigu reikia, atlikti analizinius nustatymus (žr. 39 pastraipą). Nuosėdų matavimų gali nereikėti atlikti, jeigu bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų buvo aiškiai apibrėžtas atlikus vandens ir (arba) nuosėdų tyrimą palyginamomis sąlygomis (pvz., nuosėdų ir vandens santykis, poveikio tipas, organinės anglies kiekis nuosėdose).
|
39.
|
Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dieną) ir jeigu analizei atlikti reikalingi dideli ėminiai, kuriuos paėmus bandymo sistemai būtų padarytas poveikis, analiziniai nustatymai turėtų būti atliekami naudojant iš panašiai apdorotų papildomų bandymo indų paimtus ėminius (įskaitant bandomųjų organizmų buvimą), tačiau biologiniam stebėjimui nenaudotų indų.
|
40.
|
Siekiant izoliuoti laisvąjį vandenį rekomenduojama 30 min. taikyti centrifugavimą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Tačiau jeigu įrodoma, kad bandomosios cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravimą. Tam tikrais atvejais gali nebūti įmanoma analizuoti porų vandens koncentracijų, nes ėminys yra pernelyg mažas.
|
Fiziniai ir cheminiai parametrai
41.
|
Tinkamu būdu turėtų būti matuojama bandymo induose esančio bandymo vandens pH, ištirpusio deguonies ir temperatūros vertės (žr. 10 pastraipą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje turėtų būti matuojama kontrolinių ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vertės esant didžiausiai koncentracijai.
|
DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
Rezultatų apdorojimas
42.
|
Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį mašalų patelių ir patinėlių vystymosi greičiui ir bendram jų skaičiui, arba, jeigu atliekamas 10 parų bandymas, poveikį lervų išgyvenimui ir jų masei. Jeigu neturima duomenų apie statistiniu požiūriu skirtingą lyčių jautrumą, atliekant statistinę analizę patinėlių ir patelių rezultatus galima sujungti. Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spręsti naudojant statistines priemones, pvz., atliekant χ2-r × 2 lentelės bandymą. Jeigu reikia, po 10 parų turi būti nustatomas lervų išgyvenimas ir vidutinė kiekvieno indo sausoji masė.
|
43.
|
Paviršinio vandens koncentracijomis išreikštos poveikio koncentracijos visų pirmiausiai apskaičiuojamos remiantis bandymo pradžioje išmatuotomis koncentracijomis (žr. 38 pastraipą).
|
44.
|
Norint apskaičiuoti EC50 arba bet kokio kito ECx taškinį įvertį indo statistinius duomenis leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. Apskaičiuojant kiekvieno ECx pasikliovimo intervalą turėtų būti atsižvelgiama į kiekvieno indo skirtingumą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas yra toks mažas, kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiausiųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškumą. Tačiau ECx vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsaką transformavus į pradinę vertę.
|
45.
|
Jeigu taikant statistinę analizę siekiama apibrėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu tikrinama hipotezė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijusį skirtingumą, pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos ANOVA prielaidos gali būti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius bandymus (21).
|
Išsinėrimo santykis
46.
|
Išsinėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti atliekant Cochran-Armitage bandymą, taikomą mažėjimo tvarka, jeigu laikoma, kad dozės ir atsakos santykis būsiąs monotoniškas ir šie duomenys atitinka minėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba Mantel-Haentzal bandymą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant tą pačią koncentraciją kartotinių ėminių kintamumas yra didesnis negu būtų galima nustatyti atsižvelgiant į binominį skirstinį (dažnai vadinamą „pertekline dispersija“), šiuo atveju turėtų būti pasirenkamas (21) pasiūlytas išsamus Cochran-Armitage arba Fisher bandymas.
|
47.
|
Viename inde išsiritusių mašalų skaičius ne nustatomas ir dalinamas iš įdėtų lervų skaičiaus na:
kur:
ER
|
=
|
išsinėrimo santykis
|
ne
|
=
|
viename inde išsinėrusių mašalų skaičius
|
na
|
=
|
į indą įdėtų lervų skaičius
|
|
48.
|
Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklinė dispersija, šiuo atveju galima rinktis kitą alternatyvą, t. y. išsinėrimo santykį laikyti nenutrūkstamuoju atsaku ir rinktis Williamso bandymą, jeigu daroma prielaida, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksiąs šiuos ER duomenis. Jeigu monotoniškumas nėra užtikrinamas, pirmenybė teiktina Duneto bandymui. Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibrėžiamas išsinėrusių mašalų ir neišsinėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į kartotinį ėminį (indą).
|
49.
|
Norint taikyti ANOVA metodų vertes, ER vertės pirmiausiai turėtų būti transformuojamos naudojant arksinuso kvadratinės šaknies transformaciją arba Tukey-Freeman transformaciją siekiant gauti apytikslį įprastą skirstinį ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arksinuso kvadratinės šaknies transformacija taikoma pasirenkant ER vertės kvadratinės šaknies arksinusą (sin–1).
|
50.
|
Išsinėrimo santykių ECx vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analizę (arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkamą komercinę programinę įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analizė nepavyksta (pvz., jeigu tėra mažiau negu du daliniai atsakai), naudojami kiti ne parametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas.
|
Vystymosi greitis
51.
|
Vidutinė vystymosi trukmė yra vidutinis laikotarpis nuo lervų įdėjimo (nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentinės mašalų kohortos išsinėrimo. (Apskaičiuojant tikrąją vystymosi trukmę turėtų būti atsižvelgiama į lervų amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis vystymosi trukmės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka tą lervos vystymosi atkarpą, kuris vyksta per vieną dieną. Vystymosi greičiui, palyginti su šių nuosėdų toksiškumo tyrimų įvertinimu, teikiama pirmenybė, nes jo dispersija yra mažesnė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą pasiskirstymą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama veikiau rinktis patikimą parametrinį bandymą su vystymosi greičiu negu su vystymosi trukme. Vystymosi greičio kaip nenutrūkstamo atsako ECx vertes galima įvertinti naudojant regresijos analizę (pvz., (23), (24)).
|
52.
|
Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dieną pastebėtas mašalų skaičius išsinėrė per vidutinį laiko intervalą nuo x dienos iki x-1 dienos (l = tikrinimo intervalo trukmė (paprastai viena diena)). Vienam indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė (x) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
kur:
|
:
|
indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė
|
i
|
:
|
tikrinimo intervalo indeksas
|
m
|
:
|
didžiausias tikrinimo intervalų skaičius
|
|
:
|
per tikrinimo intervalą i išsinėrusių mašalų skaičius
|
ne
|
:
|
bendras eksperimento pabaigoje išsinėrusių mašalų skaičius (= )
|
xi
|
:
|
per intervalą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis
|
kur:
dienai
|
:
|
tikrinimo diena (diena po poveikio)
|
li
|
:
|
tikrinimo intervalo i trukmė (dienos, paprastai 1 diena)
|
|
Bandymo ataskaita
53.
|
Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama bent ši informacija:
|
Bandomoji cheminė medžiaga:
—
|
fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės (tirpumas vandenyje, garų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuosėdose, jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.),
|
—
|
cheminės tapatybės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, struktūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskaitant grynumą ir analinės metodas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekybinį nustatymą.
|
|
|
Bandomosios rūšys:
—
|
naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo gavimo šaltinis ir veisimo sąlygos,
|
—
|
informacija apie kiaušinėlių masės ir lervų tvarkymą,
|
—
|
gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus.
|
|
|
Bandymo sąlygos:
—
|
naudotos nuosėdos, t. y. natūralios ar sintetinės nuosėdos,
|
—
|
jei naudojamos natūralios nuosėdos, nuosėdų ėminių ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrinė analizė (jeigu reikia),
|
—
|
sintetinių nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos (organinės anglies kiekis, pH, drėgmė ir t. t. bandymo pradžioje),
|
—
|
bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. t. bandymo pradžioje),
|
—
|
nuosėdų ir vandens sluoksnių storis,
|
—
|
paviršinio vandens ir porų vandens tūris; drėgnųjų nuosėdų masė su porų vandeniu ir be jo,
|
—
|
bandymo indai (medžiaga ir dydis),
|
—
|
pradinių tirpalų ruošimo metodai ir bandomosios koncentracijos,
|
—
|
bandomosios cheminės medžiagos taikymas: naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kartotinių ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti,
|
—
|
inkubacijos sąlygos: temperatūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija (dažnumas ir intensyvumas),
|
—
|
išsami informacija apie pašarą, įskaitant jo tipą, paruošimą, kiekį ir maitinimo tvarką.
|
|
|
Rezultatai:
—
|
nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios koncentracijos ir visų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją,
|
—
|
vandens kokybė bandymo induose, t. y. pH, temperatūra, ištirpęs deguonis, kietumas ir amoniako kiekis,
|
—
|
išgaruojančio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma,
|
—
|
iš kiekvieno indo per dieną išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius,
|
—
|
lervų, kurios iš indo neišsinėrė kaip mašalai, skaičius,
|
—
|
vidutinė pavienė lervų sausoji masė inde ir tam tikros stadijos lervų sausoji masė inde, jeigu reikia,
|
—
|
išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapatų bandymą ir bandomoji koncentracija (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
|
—
|
atliekant tapatų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir apdorojimo norma (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
|
—
|
toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susiję pasikliovimo intervalai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai,
|
—
|
rezultatų aptarimas, įskaitant bet kokį poveikį bandymo rezultatams, kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo.
|
|
|
LITERATŪRA
1.
|
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
|
2.
|
Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
|
3.
|
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
|
4.
|
ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
|
5.
|
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
|
6.
|
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
|
7.
|
US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
|
8.
|
US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
|
9.
|
Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
|
10.
|
Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
|
11.
|
Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
|
12.
|
OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
|
13.
|
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
|
14.
|
Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams.
|
15.
|
Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
|
16.
|
Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
|
17.
|
Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.
|
18.
|
Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
|
19.
|
Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
|
20.
|
Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.
|
21.
|
Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585.
|
22.
|
Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
|
23.
|
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.
|
24.
|
Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
|
1 priedėlis
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
Šiame metode vartojamų terminų apibrėžtys:
|
Pasiruoštosios nuosėdos ar regeneruotos, dirbtinės arba sintetinės nuosėdos yra natūralių nuosėdų fizines sudedamąsias dalis atitinkančių medžiagų mišinys.
|
|
Paviršinis vanduo – bandymo inde ant nuosėdų užpiltas vanduo.
|
|
Laisvasis vanduo ar porų vanduo – ertmes tarp nuosėdų ir dirvožemio kietųjų dalelių užpildantis vanduo.
|
|
Vanduo su įterpta bandomąja chemine medžiaga – bandymo vanduo, į kurias prileista bandomosios cheminės medžiagos.
|
|
Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
|
2 priedėlis
Rekomendacijos dėl Chironomus riparius auginimo
1.
|
Chironomus lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didelėse talpyklose. Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco smėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diatomitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos kelių mm storio). Po to įpilamas kelių centimetrų storio vandens sluoksnis. Jeigu reikia, įpilama papildomo vandens, kad būtų atkuriamas išgaravęs kiekis ir užkertamas kelias džiuvimui. Jeigu reikia, vandenį leidžiama pakeisti. Turėtų būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lervų auginimo indai turėtų būti laikomi tinkamuose narvuose, kad išsinėrę suaugusieji vabzdžiai nepajėgtų pasprukti. Narvas turėtų būti ganėtinai erdvus, kad galėtų spiestis išsinėrę suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm).
|
2.
|
Narvai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje arba pastovių aplinkos sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperatūroje; šviesiojo laikotarpio trukmė 16 val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuksų), 8 val. tamsos. Parengta ataskaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro drėgnumas yra mažesnis negu 60 % RH, gali sumažėti reprodukcija).
|
Skiedimo vanduo
3.
|
Leidžiama naudoti bet kokį tinkamą natūralų ar sintetinį vandenį. Paprastai naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtinės terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemonė, žr. toliau). Prieš naudojant vanduo turi būti aeruojamas. Jeigu būtina, kultūrų auginimo vandenį leidžiama atnaujinti pilant panaudotą vandenį iš kultūrų auginimo indų ar jį leidžiant per sifoną; būtina stengtis nepažeisti lervų vamzdžių.
|
Lervų šėrimas
4.
|
Chironomus lervos turėtų būti šeriamos žuvų maisto dribsniais (Tetra Min®, Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuvų maisto rūšimi); vienam indui per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Maistą galima pateikti sausą, sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensiją: 1,0 g maisto dribsnių įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dieną leidžiama įdėti į kiekvieną indą (prieš naudojant būtina pakratyti). Vyresnėms lervoms būtina duoti daugiau pašaro.
|
5.
|
Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokybę. Jeigu auginimo terpė „susidrumsčia“, duodamo pašaro kiekis turėtų būti sumažinamas. Duodamo pašaro kiekiai turi būti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro kiekis, lervos persikelia į vandens storymę, o skiriant per daug pašaro suintensyvėja mikroorganizmų veikla ir sumažėja deguonies koncentracija. Abiejų tipų sąlygomis gali sumažėti augimo greitis.
|
6.
|
Ruošiant naujus kultūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti žaliųjų dumblių (pvz., Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
|
Išsinėrusių suaugusiųjų mašalų šėrimas
7.
|
Kai kurie tyrinėtojai pasiūlė, kad išsinėrusius suaugusius mašalus būtų galima šerti naudojant prisotintame sacharozė tirpale išmirkytus vilnos tamponus.
|
Lervų išsinėrimas
8.
|
Suaugę mašalai ima rastis iš lervų auginimo indų po 13–15 dienų 20 ± 2 °C temperatūroje. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
|
Kiaušinėlių masė
9.
|
Kol suaugę mašalai būna veisimo narve, visi lervų auginimo indai turėtų būti tikrinami tris kartus per savaitę, ar juose nėra drebučių pavidalo kiaušinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušinėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašalinta. Kiaušinėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens ėminiu. Kiaušinėlių masė naudojama pradedant inde auginti naują kultūrą (pvz., 2–4 kiaušinėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo bandymus.
|
10.
|
Pirmos stadijos lervos turėtų išsiristi po 2–3 dienų.
|
Naujų kultūrų auginimo indų ruošimas
11.
|
Išauginus kultūras turėtų būti įmanoma kiekvieną savaitę ar rečiau paruošti naują lervų kultūros auginimo indą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reikalavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaugę mašalai. Taikant šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaugę mašalai.
|
Bandymo tirpalų „M4“ ir „M7“ ruošimas
12.
|
Elendtas (1990) aprašė „M4“ terpę. „M7“ terpė ruošiama kaip „M4“ terpė, išskyrus 1 lentelėje išvardytas chemines medžiagas, kurių koncentracijos „M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesnės. Leidinys apie „M7“ terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas neturėtų būti ruošiamas pagal Elendtą ir Bias (1990), jeigu norima gauti NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 ir K2HPO4 koncentracijas, nes pradinių tirpalų ruošimas nėra tapati veikla.
|
Terpės „M7“ ruošimas
13.
|
Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš šių pradinių tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentelę). 50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentelėje nurodyti kiekvieno makroelementų pradinio tirpalo kiekiai skiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens, kad taip būtų pasiruošta „M7“ terpė. Vitaminų pradinis tirpalas pasiruošiamas į dejonizuotą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitaminų pradinio tirpalo įmaišoma į galutinę „M7“ terpę prieš pat naudojimo pradžią. (Vitaminų pradinis tirpalas laikomas sušaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis). Terpė aeruojama ir stabilizuojama.
1 lentelė
M4 ir M7 terpei skirtų mikroelementų pradiniai tirpalai
Pradiniai tirpalai (I)
|
Kiekis (mg), praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
|
Ruošiant kombinuotą pradinį tirpalą (II): maišomi nurodyti pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens
|
Galutinės bandomųjų tirpalų koncentracijos (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(18)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 • 4 H2O (18)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (18)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (18)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 • 6 H2O (18)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (18)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 • 2 H2O (18)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 • 2 H2O (18)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 • 6 H2O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA • 2 H2O (18)
(19)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 • 7 H2O (18)
(19)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
2 lentelė
M4 ir M7 terpėms skirti makroelementų pradiniai tirpalai
|
Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
(mg)
|
Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas makroelementų pradinių tirpalų kiekis
(ml/l)
|
Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
(mg/l)
|
CaCl2 • 2 H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 • 7 H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 • 9 H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
3 lentelė
M4 ir M7 terpei skirtas vitaminų pradinis tirpalas
Visi trys vitaminų tirpalai maišomi siekiant paruošti vieną vitaminų pradinį tirpalą.
|
Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
(mg)
|
Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas vitaminų pradinio tirpalo kiekis
(ml/l)
|
Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
(mg/l)
|
Tiamino hidrochloridas
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Ciankobalaminas (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotinas
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
|
LITERATŪRA
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
3 priedėlis
SINTETINIŲ NUOSĖDŲ RUOŠIMAS
Nuosėdų sudėtis
Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš šių sudedamųjų dalių:
Sudedamoji dalis
|
Charakteristikos
|
nuosėdų sausosios
procentinė dalis)
|
Durpės
|
Naujosios Zelandijos kiminų durpės, jų pH kiek įmanoma atitinka 5,5–6,0, jokių augalų matomų liekanų, smulkiai sumaltos (kietųjų dalelių dydis ≤ 1 mm), džiovintos ore
|
4–5
|
Kvarcinis smėlis
|
Grūdelių dydis: > 50 % dalelių dydžio vertės intervalas turėtų būti 0–200 μm
|
75–76
|
Kaolito molis
|
Kaolinito kiekis ≥ 30 %
|
20
|
Organinė anglis
|
Pakoreguota pridedant durpių ir smėlio
|
2 (±0,5)
|
Kalcio karbonatas
|
CaCO3, milteliai, cheminiu atžvilgiu grynas
|
0,05–0,1
|
Vanduo
|
Laidumas ≤ 10 μS/cm
|
30–50
|
Pasiruošimas
Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulkūs milteliai. Suspensija iš nustatyto durpių miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO3 koreguojama, kad šios suspensijos pH vertė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondicionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperatūroje siekiant stabilizuoti pH ir paruošti stabilią mikroorganizmų populiaciją. pH matuojama dar kartą ir jo vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpių suspensija maišoma su kitomis sudedamosiomis dalimis (smėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu siekiant gauti vienalytes nuosėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % sausosios masės. Dar kartą matuojama galutinio mišinio pH vertė ir, jeigu reikia, naudojant CaCO3 koreguojama, kol pH vertė ima atitikti 6,5–7,5 vertę. Imami nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti sausąją masę ir organinės anglies kiekį. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti chironomidų toksiškumo bandymui, sintetinės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui.
Sandėliavimas
Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedamąsias sausas dalis galima laikyti sausoje ir vėsioje vietoje kambario temperatūroje. Sintetinės (drėgnos) nuosėdos neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, kuriuo baigiamas ruošimo etapas.
LITERATŪRA
Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. SAFEty 39: 10–20.
4 priedėlis
Tinkamo skiedimo vandens cheminės charakteristikos
Cheminė medžiaga
|
Koncentracijos
|
Kietosios dalelės
|
< 20 mg/l
|
Bendroji organinė anglis
|
< 2 mg/l
|
Nejonizuotas amoniakas
|
< 1 mg/l
|
Kietumas (kaip CaCO3)
|
< 400 mg/l (20)
|
Liekamasis chloras
|
< 10 mg/l
|
Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis
|
< 50 ng/l
|
Suminis organinių chloro pesticidų ir polichlorintų bifenilų kiekis
|
< 50 ng/l
|
Suminis organinio chloro kiekis
|
< 25 ng/l
|
5 priedėlis
Chironomidų lervų išsiritimo stebėjimo gairės
Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudyklės. Gaudyklės reikalingos nuo 20 dienos iki bandymo pabaigos. Gaudyklės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau:
A
|
:
|
nailono ekranas
|
B
|
:
|
apversti plastiko gaubtai
|
C
|
:
|
bebriaunė laboratorinė poveikio stiklinė
|
D
|
:
|
vandens keitimo ekrano angos
|
E
|
:
|
vanduo
|
F
|
:
|
nuosėdos
|
C.29. LENGVAS BIOLOGINIS SKAIDUMAS. CO2 SANDARIUOSE INDUOSE (VIRŠUTINĖS ERDVĖS TYRIMAS)
ĮVADAS
1.
|
Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 310 (2006). Šis metodas yra atrankos metodas, kurį naudojant įvertinamas lengvas biologinis cheminių medžiagų skaidumas, ir pateikiama panaši informacija šešiems bandymo metodams, aprašytiems šio priedo C.4 skirsnyje A–F dalyse. Todėl cheminę medžiagą, kurios rezultatai pagal šį bandymo metodą yra teigiami, galima laikyti lengvai biologiškai skaidoma ir, vadinasi, sparčiai suyrančia aplinkoje.
|
2.
|
Bandant mažai tirpias chemines medžiagas ir gerai adsorbuojamas medžiagas, pirmiausiai būtų pasirenkamas gerai paruoštas anglies dioksido (CO2) metodas (1), pagrįstas Sturmo originaliu bandymu (2), kuriuo organinių cheminių medžiagų biologinis skaidumas vertinamas matuojant anglies dioksidą, kurį išskiria mikroorganizmai. Šis metodas taip pat pasirenkamas tiriant tirpiąsias (tačiau ne lakiąsias) chemines medžiagas, nes anglies dioksido išsiskyrimą daugelis specialistų laiko vieninteliu akivaizdžiu mikroorganizmų veiklos įrodymu. Ištirpusią organinę anglį galima šalinti taikant fizinius–cheminius procesus – adsorbciją, lakiųjų junginių šalinimą, nusodinimą, hidrolizę – bei naudojant mikroorganizmų veiklą ir daugelį ne biologinių reakcijų, kurioms vykstant naudojamas deguonis; retais atvejais CO2 iš organinių cheminių medžiagų išsiskiria vykstant abiotiniams procesams. Naudojant originalų ir modifikuotą Sturmo bandymą (1) (2) CO2 į absorbuojantį indą iš skystosios fazės pašalinamas naudojant borbatavimą (t. y. pučiant oro burbulus, kad CO2 būtų šalinamas per skystą terpę), o pasirinkus Larsono (3) (4) CO2 versiją CO2 iš reakcijos indo į absorberius perkeliamas per viršutinės erdvės orą, kuriame nėra CO2, ir, be to, nenutrūkstamai kratant bandymo indą. Reakcijos indas yra kratomas tik naudojant Larsono modifikaciją; maišymas nurodomas tik netirpiosioms cheminėms medžiagoms (žr. standartą ISO 9439 (5)) ir originalioje JAV versijoje (6); abiejuose nurodomas veikiau borbatavimas negu viršutinės erdvės pakeitimas. Kitame oficialiame JAV EPA metode (7), pagrįstame Gledhillo metodu (8), kratomas reakcijos indas užsandarinamas nuo atmosferos ir išsiskyręs CO2 surenkamas vidinėje šarminėje gaudyklėje tiesiogiai iš dujinės fazės, kaip įprastose Warburg/Barcroft respiratorinėse kolbose.
|
3.
|
Tačiau įrodyta, kad įprastą, modifikuotą Sturmo bandymą atliekant su tam tikromis cheminėmis medžiagomis (9), neorganinė anglis (IC) kaupiasi terpėje. Skaidant 20 mg C/l anilino nustatyta, kad IC koncentracija buvo gana didelė, t. y. 8 mg/l. Vadinasi, šarminėse gaudyklėse surenkamas CO2, iš tikrųjų neatitina viso to CO2 kiekio, kuris mikrobiologiškai išskiriamas tarpiniais laikotarpiais, kai vyksta skaidymas. Todėl reikalavimas, kad > 60 % teorinio didžiausio CO2 išsiskiriančio ThCO2) kiekio turi būti surenkama per „10 parų langą“ (10 parų iš karto po to, kai užtikrinamas 10 % biologinis skaidymas), jeigu bandomąją cheminę medžiagą ketinama laikyti lengvai biologiškai skaidoma, nebūtų taikomas tam tikroms cheminėms medžiagoms, kurios būtų klasifikuojamos atsižvelgiant į šalinamą ištirpusios organinės anglies (DOC) kiekį.
|
4.
|
Jeigu procentinė skaidymo dalis yra mažesnė negu tikėtasi, IC, ko gero, kaupiasi bandomajame tirpale. Vadinasi, skaidomumą galima nustatyti taikant kitus lengvo biologinio skaidumo bandymus.
|
5.
|
Kiti Sturmo metodikos trūkumai (nepatogi, reikia gaišti daug laiko, lengvai įmanoma padaryti eksperimentinę klaidą ir netaikoma lakiosioms cheminėms medžiagoms) jau anksčiau paskatino kurti sandariųjų indų metodiką, tačiau ne Gledhillo, o veikiau pratekančių dujų (10) (11). Boatman ir kt. (12) apžvelgė ankstesnius metodus ir priėmė uždarosios viršutinės erdvės sistemą, kurią taikant inkubacijos pabaigoje terpė parūgštinama ir CO2 išleidžiamas į viršutinę erdvę. CO2 kiekis matuotas naudojant dujų chromatografijos (GC)/IC analizę; ėminiai automatiškai imti iš viršutinės erdvės, tačiau nebuvo atsižvelgiama į skystosios fazės ištirpusią neorganinę anglį (DIC). Be to, buvo naudoti labai maži indai (20 ml), į kuriuos tilpdavo tik 10 ml terpės, todėl sunkiai sekdavosi, pvz., įterpti reikiamus labai mažus netirpių bandomųjų cheminių medžiagų kiekius, ir (arba) terpėje su sėjimo kultūra galėdavo būti nepakankamas bandomąsias chemines medžiagas galinčių suskaidyti mikroorganizmų kiekis arba galėdavo jų apskritai nebūti.
|
6.
|
Šie trūkumai pašalinti ėmus naudoti nepriklausomus Struijs ir Stoltenkamp (13) bei Birch ir Fletcher tyrimus; pastarieji tyrėjai visų pirmiausiai rėmėsi savo patirtimi naudojant aparatą, būtiną atliekant anaerobinį biologinio skaidymo bandymą (15). Taikant ankstesnį metodą (13) CO2 kiekis matuojamas viršutinėje erdvėje, kai užtikrinamas parūgštinimas ir pusiausvyra, o pasirinkus pastarąjį (14) matuojamas dujinės ir skystosios fazės DIC kiekis be apdorojimo; daugiau negu 90 % susiformavusio IC buvo skystosios fazės. Abu metodai pranašesni už Sturmo bandymą, nes pirmųjų atveju bandymo sistema yra mažesnė ir lengvai tvarkoma bei pritaikyti tirti lakiąsias chemines medžiagas ir nenumatyta galimybė atidėti susiformavusio CO2 kiekio matavimą.
|
7.
|
Abu metodai įtraukti į ISO Viršutinės erdvės CO2 standartą (16), kuris patikrintas atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymą (17), ir būtent šiuo standartu grindžiamas šis bandymo metodas. Šie du metodai taip pat įtraukti į JAV EPA metodą (18). Rekomenduojama taikyti du CO2 kiekio matavimo metodus, būtent CO2 viršutinėje erdvėje po rūgštinimo (13) ir IC skystojoje fazėje, kai pridedama perteklinio šarmo. Pastarąjį metodą pasiūlė Petersonas atliekant CONCAWE tarplaboratorinio lyginimo bandymą (19), kai šis viršutinės erdvės metodas buvo modifikuotas siekiant matuoti savitąjį biologinį skaidumą. Pakeitimai, padaryti šio priedo dėl lengvo biologinio skaidumo C.4 skyriuje 1992 m. (20) persvarstant metodus, įtraukti į šį bandymo metodą, kad sąlygos (terpė, trukmė ir t. t.) kitais atžvilgiais būtų tapačios persvarstyto Strumo bandymo (20) sąlygoms. Birch ir Fletcher (14) įrodė, kad atliekant šį viršutinės erdvės bandymą buvo gauti labai panašūs rezultatai kaip kad su tomis pačioms cheminėmis medžiagomis darant persvarstytų bandymo metodų OECD tarplaboratorinio lyginimo bandymą (21).
|
BANDYMO METODO ESMĖ
8.
|
Bandomoji cheminė medžiaga (paprastai 20 mg/l) – vienintelis anglies ir energijos šaltinis – inkubuojama į buferinę mineralinių druskų terpę, į kurią įsėjama įvairių mikroorganizmų populiacija. Bandymas atliekamas sandariose kolbose su viršutine oro erdve, kuri yra deguonies šaltinis aerobiniam biologiniam skaidymui. CO2 išsiskyrimas vykstant visiškam bandomosios cheminės medžiagos biologiniam skaidymui nustatomas matuojant IC kiekį, išsiskyrusį bandymo kolbose ir viršijantį tuščiojo bandinio kolbose, į kurias įdėta tik terpės su sėjimo kultūra, išsiskiriantį IC kiekį. Biologinio skaidymo apimtis išreiškiama kaip teorinio didžiausio IC išsiskyrimo (ThIC) procentinė dalis atsižvelgiant į iš pradžių įdėtą bandomosios cheminės medžiagos kiekį (kaip organinės anglies).
|
9.
|
Taip pat galima matuoti pašalinamą DOC kiekį ir (arba) bandomosios cheminės medžiagos pirminio biologinio skaidymo apimtį (20).
|
INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
10.
|
Bandomosios cheminės medžiagos organinės anglies kiekis (% w/w) turi būti žinomas arba atsižvelgiant į jos cheminę struktūrą, arba nustatomas matuojant, kad būtų galima apskaičiuoti procentinę skaidymo dalį. Jei tai lakiosios bandomosios cheminės medžiagos, išmatuota ar apskaičiuota Henrio dėsnio konstanta naudinga apibrėžiant tinkamą viršutinės erdvės skysčio tūrio santykį. Informacija apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą mikroorganizmams praverčia pasirenkant tinkamą tiriamąją koncentraciją ir aiškinant mažą biologinį skaidymą patvirtinančius rezultatus: rekomenduojama įtraukti slopinimo nustatymo bandymą, jeigu nėra žinoma, ar bandomoji cheminė medžiaga slopina mikroorganizmų veiklą (žr. 24 pastraipą).
|
METODO PRITAIKOMUMAS
11.
|
Šiuo bandymu tiriamos vandenyje tirpios ir netirpios bandomosios cheminės medžiagos, todėl turėtų būti užtikrinama reikiama bandomosios cheminės medžiagos dispersija. Pasirinkus viršutinėje erdvėje rekomenduojamą taikyti skysčio tūrio santykį 1:2, galima bandyti lakiąsias chemines medžiagas, kurių Henrio dėsnio konstanta yra 50 Pa.m3 mol–1, nes šių bandomųjų cheminių medžiagų proporcija viršutinėje erdvėje neviršys 1 % (13). Atliekant bandymus su lakesnėmis cheminėmis medžiagomis galima rinktis mažesnę viršutinę erdvę, tačiau šių medžiagų biologinis pasisavinamumas gali būti apribotas tuo atveju, jeigu jos mažai tirpsta vandenyje. Tačiau vartotojai turi užtikrinti, kad viršutinės erdvės santykis su skysčio tūriu ir bandomosios cheminės koncentracija būtų toks, jog užtektų deguonies visiško biologinio skaidymo procesui (pvz., nenaudoti didelės substrato koncentracijos ir mažo viršutinės erdvės tūrio). Gairės dėl šio klausimo pateiktos (13) (23).
|
ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
12.
|
Siekiant patikrinti bandymo procedūrą tuo pačiu metu turėtų būti daromas bandymas naudojant etaloninę cheminę medžiagą, kurios biologinis skaidomumas yra žinomas. Šiuo tikslu galima naudoti aniliną, natrio benzoatą ar etilenglikolį, jeigu tiriamos vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos, ir 1-oktanolį tiriant mažai tirpias bandomąsias chemines medžiagas (13). Šių cheminių medžiagų biologinio skaidomumo vertė per 14 dienų turi atitikti > 60 % teorinio didžiausio neorganinės anglies (IC) išsiskyrimo.
|
ATKURIAMUMAS
13.
|
Atliekant ISO metodo (17) tarplaboratorinio lyginimo bandymą nustatyti toliau pateikti rezultatai; jį atliekant taikytos rekomenduotos sąlygos, įskaitant 20 mg anglies bandomosios cheminės medžiagos litre.
Bandomoji cheminė medžiaga
|
Vidutinė biologinio skaidymo procentinė dalis
(28d)
|
Variacijos koeficientas
(%)
|
Laboratorijų skaičius
|
Anilinas
|
90
|
16
|
17
|
1-oktanolis
|
85
|
12
|
14
|
Kintamumo (atkartojamumo) vertė atliekant bandymą su anilinu buvo maža ir variacijos koeficientai atliekant beveik visus bandymus nebuvo didesni negu 5 %. Šiais dviem atvejais, kai atkartojamumas buvo mažas, didesnį kintamumą, ko gero, sukėlė didesnis išsiskiriantis IC kiekis tuščiojo bandinio kolbose. Atkartojamumo vertė buvo mažesnė darant bandymus su 1-oktanoliu, tačiau vis dėlto mažesnė negu 10 % iš atliktų 79 % bandymų. Didesnį kintamumą atliekant bandymus galėjo sukelti dozavimo paklaidos, nes į sandarias bandymo kolbas reikėdavę įterpti mažus 1-oktanolio kiekius (3–4 μl). Didesni variacijos koeficientai galėjo būti nustatomi todėl, kad buvo naudojama mažesnės koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga, visų pirma tuo atveju, kai koncentracijos buvo mažesnės negu 10 mg C/l. Šią priklausomybę iš dalies įmanoma panaikint sėjimo kultūroje sumažinant bendrosios neorganinės anglies (TIC) koncentraciją.
|
14.
|
ES atlikus tarplaboratorinio lyginimo bandymus (24) su penkiomis paviršinio aktyvumo medžiagomis (10 mg/C/l) nustatyti šie rezultatai:
Bandomoji cheminė medžiaga
|
Vidutinė procentinė biologinio skaidymo dalis
(28d)
|
Variacijos koeficientas
(%)
|
Laboratorijų skaičius
|
Tetrapropilenas
Benzensulfonatas
|
17
|
45
|
10
|
Diizooktilsulfo-sukcinatas
(anijoninė)
|
72
|
22
|
9
|
Heksadeciltrimetil (21)
amonio chloridas chloride
(katijoninė)
|
75
|
13
|
10
|
Izo-nonilfenolis-(etoksilatas)9
(nejoninis)
|
41
|
32
|
10
|
Kokamidopropil
dimetilhidroksi
sulfobetainas
(amfoterinė)
|
60
|
23
|
11
|
Nustatytais rezultatais įrodoma, kad apskritai kintamumas buvo didesnis mažesniosios gerai skaidomų paviršinių medžiagų dalies. Atliekant bandymus mažesnis negu 15 % kintamumas nustatytas daugiau negu 90 % atvejų, o didžiausia kintamumo vertė buvo 30–40 %.
PASTABA:
|
Daugelis paviršinių medžiagų nėra sudarytos iš vieno dydžio molekulių, nes jas sudaro izomerfai, homologai ir t. t., kurie suskyla po skirtingos charakteristikos vėlinimo laikotarpių ir veikiant skirtingoms kinetinėms greičio konstantoms, todėl randasi „neryškios“ sumažėjusios kreivės ir 60 % atitikties vertė gali nebūti užtikrinama per „10 parų langą“ net tuo atveju, kai kiekvieno pavienio dydžio molekulės sudarys > 60 % per 10 dienų, jeigu bandymas atliekamas su vieno dydžio molekulėmis. Šio reikalavimo laikymąsi taip pat įmanoma užtikrinti naudojant kitus sudėtingus mišinius.
|
|
METODO APRAŠYMAS
Aparatūra
15.
|
Įprasta laboratorinė įranga:
a)
|
stiklinės serumo kolbos, užkimštos butilkaučiuko kamščiais ir apspaudžiamaisiais aliuminio sandarikliais; rekomenduojamas „125 ml“ dydis; šiuo atveju bendras tūris būtų apie 160 ml (Vadinasi, turėtų būti žinoma, kad kiekvienos kolbos tūris yra 160 ± 1 ml); leidžiama naudoti mažesnę kolbą, jeigu rezultatai atitinka 66 ir 67 pastraipose aprašytas sąlygas;
|
b)
|
anglies analizatorius arba kitas įtaisas (pvz., dujų chromatografas) neorganinei angliai išmatuoti;
|
c)
|
didelio tikslumo švirkštai dujų ir skysčio ėminiams imti;
|
d)
|
rotacinis kratytuvas reguliuojamos temperatūros aplinkoje;
|
e)
|
oro be CO2 dujų tiekimas – šio oro tiekimą galima užtikrinti leidžiant orą per natrio kalkes arba naudojant 80 % N2/20 % 02 dujų mišinį (pasirinktinas) (žr. 28 pastraipą);
|
f)
|
membraninis filtravimo įtaisas (porų dydis 0,20–0,45 μm) (pasirenkamas);
|
g)
|
organinės anglies analizatorius (pasirenkamas).
|
|
Cheminiai reagentai
16.
|
Naudojami visais atžvilgiais analiziškai gryni cheminiai reagentai.
|
Vanduo
17.
|
Turėtų būti naudojamas distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kuriame yra ≤ 1 mg/l bendros organinės anglies. Šis kiekis sudaro ≤ 5 % pradinio organinės anglies kiekio, įterpto rekomenduojama bandomosios cheminės medžiagos doze.
|
Mineralinių druskų terpės pradiniai tirpalai
18.
|
Pradiniai tirpalai ir mineralinių druskų terpė yra tapatūs nurodytiesiems ISO standarte 14 593 (16) ir C.4 „lengvo biologinio skaidumo“ bandymuose (20). Didesnės koncentracijos amonio chloridą (2,0 g/l vietoj 0,5 g/l) turėtų būti privaloma naudoti tik labai išskirtiniais atvejais, pvz., kai bandomosios cheminės medžiagos koncentracija yra > 40 mg C/l. Pradiniai tirpalai turėtų būti laikomi šaldytuve ir šalinami po šešių mėnesiu arba anksčiau, jeigu aptinkama įrodymų, kad yra padidėjęs mikrobų augimas. Pasiruošiami šie pradiniai tirpalai:
a)
|
kalio dihidrofosfato (KH2PO4), 8,50 g
bevandenio kalio dihidrofosfato (K2HPO4) 21,75 g
dinatrio vandenilio fosfato dihidrato (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
amonio chlorido (NH4Cl) 0,50 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro. Šio tirpalo pH vertė turėtų būti 7,4 (± 0,2). Jeigu ši vertė neužtikrinama, pasiruošiamas naujas tirpalas.
|
b)
|
kalcio chlorido dihidrato (CaCl2.2H2O) 36,40 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
|
c)
|
magnio sulfato heptahidrato (MgSO4.7H2O) 22,50 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
|
d)
|
geležies (III) chlorido (FeCl3.6H20) 0,25 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro bei įlašinamas vienas lašas koncentruoto HCl.
|
|
Mineralinės terpės pasiruošimas
19.
|
10 ml a tirpalo maišoma su maždaug 800 ml vandens (17 pastraipa), tada įpilama po 1 ml b, c ir d tirpalų ir su vandeniu praskiedžiama iki 1 litro (17 pastraipa).
|
Kiti cheminiai reagentai
20.
|
Koncentruota ortofosforo rūgštis (H3PO4) (> 85 % masė tūrio vienetui).
|
Natrio hidroksido tirpalas 7M
21.
|
280 g natrio hidroksido (NaOH) ištirpinama 1 litre vandens (17 pastraipa). Nustatoma ištirpusios neorganinės anglies koncentracija šiame tirpale ir ši vertė taikoma apskaičiuojant bandymo rezultatą (žr. 55 ir 61 pastraipas), ypač atsižvelgiant į 66 pastraipos b punkto pagrįstumo kriterijų. Paruošiamas šviežias tirpalas, jeigu ištirpusios neorganinės anglies (DC) koncentracija yra per didelė.
|
Bandomoji cheminė medžiaga
22.
|
Iš ganėtinai vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos (17 pastraipa) ar iš bandomojoje terpėje tirpios bandomosios cheminės medžiagos (19 pastraipa) pasiruošiamas pradinis tirpalas, kurio koncentracija turi būti 100 kartų didesnė negu atliekant bandymą naudotina galutinė koncentracija; gali tekti koreguoti pradinio tirpalo pH vertę. Pradinis tirpalas turėtų būti įterpiamas į mineralinę terpę siekiant užtikrinti 2–40 mg C/l galutinę organinės anglies koncentraciją (tinkamiausia koncentracija būtų 20 mg/l). Jeigu naudojamos mažesnės koncentracijos negu nurodytosios, gali būti neužtikrinamas reikiamas tikslumas. Į kolbas galima įšvirkšti aukštaslėgiais švirkštais tirpių ir netirpių skystųjų cheminių medžiagų. Mažai tirpias ir netirpias bandomąsias chemines medžiagas gali tekti specialiai apdoroti (25). Galima rinktis:
a)
|
tiesioginį žinomos masės kiekio įdėjimą;
|
b)
|
dispergavimą ultragarsu prieš įdėjimą;
|
c)
|
privalomą dispergavimą emulsikliais siekiant nustatyti, ar jie sukelia kokį nors slopinamąjį ar skatinamąjį poveikį mikroorganizmų veiklai prieš pridėjimą;
|
d)
|
skystųjų bandomųjų cheminių medžiagų arba tirpalo adsorbciją į tinkamą lakųjį tirpiklį, į inertinę terpę ar inertinę medžiagą (pvz., stiklo pluošto filtrą) ir tolesnį tirpiklio garinimą, jeigu naudojamas, ir tiesioginį žinomo kiekio įdėjimą;
|
e)
|
bandomosios cheminės medžiagos tirpalo lakiame tirpiklyje žinomo kiekio įdėjimą į tuščią bandymo indą ir vėlesnį tirpiklio išgarinimą.
|
C, d ir e punktuose nurodytos medžiagos arba tirpikliai turi būti išbandyti siekiant nustatyti, ar jie sukelia kokį nors skatinamąjį arba slopinamąjį poveikį mikroorganizmų veiklai (žr. 42 pastraipos b punktą).
|
Etaloninė cheminės medžiaga
23.
|
Iš (tirpios) etaloninės cheminės medžiagos vandenyje pasiruošiamas pradinis tirpalas (17 pastraipa), kurio koncentracija būtų 100 kartų didesnė negu naudotina atliekant bandymą galutinė koncentracija (20 mg/l).
|
Slopinimo poveikio tikrinimas
24.
|
Jeigu taikomos lengvo biologinio skaidymo vertinimo sąlygos, šiuo atveju bandomosios cheminės medžiagos dažnai nėra kiek nors labiau suskaidomos. Viena iš galimų priežasčių – bandomoji cheminė medžiaga slopina sėjimo kultūrą būdama tokios koncentracijos, kokios ši medžiaga naudojama atliekant bandymą. Slopinimo poveikio tikrinimą galima įtraukti į bandymo planą siekiant palengvinti slopinimo nustatymą (nukreiptą atgal), nes šis slopinimas gali būti tikėtina priežastis arba skatinimo veiksnys. Antraip atlikus slopinimo poveikio tikrinimą galima atmesti minėtus trukdžius ir įrodyti, kad nulinis ar nedidelis skaidymas priskirtinas tik atsparumui mikroorganizmų poveikiui laikantis bandymo sąlygų. Siekiant gauti informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą (aerobiniams) mikroorganizmams bandomojoje terpėje pasiruošiamas tirpalas, į kurį įtraukiama bandomoji cheminė medžiaga ir etaloninė cheminė medžiaga (19 pastraipa), atitinkamai kiekvienos įdedama vienodos koncentracijos (žr. 22 ir 23 pastraipas).
|
Sėjimo kultūra
25.
|
Sėjimo kultūrą galima gauti iš įvairių šaltinių: veikliojo dumblo; nuotekų ištakio (neapdoroto chloru); paviršinių vandenų ir dirvožemių; ar iš pastarųjų mišinio (20). Naudojant etaloninę cheminę medžiagą turėtų būti nustatomas šaltinio biologinio skaidymo veiksmingumas. Kad ir koks būtų šaltinis, bandomąja chemine medžiaga anksčiau paveikti mikroorganizmai neturėtų būti naudojami, jeigu procedūra turi būti taikoma kaip lengvo biologinio skaidumo bandymas.
Įspėjimas.
|
Veikliajame dumble, nuotekose ir nuotekų ištakyje yra patogeninių organizmų, todėl turi būti dirbama laikantis atsargumo priemonių.
|
|
26.
|
Remiantis patirtimi optimalus sėjimo kultūros kiekis:
—
|
kurio pakanka reikiamai biologinio skaidymo veiklai užtikrinti,
|
—
|
kuris suskaido nustatytą procentinę etaloninės cheminės medžiagos dalį (žr. 66 pastraipą),
|
—
|
kurį naudojant išauga 102–105 koloniją sudarančių vienetų milimetre galutinio mišinio,
|
—
|
kurį naudojant galutiniame mišinyje paprastai užtikrinama 4 mg/l suspenduotų medžiagų koncentracija, jeigu pasirenkamas veiklusis dumblas; leidžiama naudoti ne didesnes negu 30 mg/l koncentracijas, tačiau tuščiojo bandinio kolbose (26) gali išsiskirti gerokai daugiau CO2,
|
—
|
kurio indėlis į pradinę organinės anglies, įterptos naudojant bandomąją cheminę medžiagą, koncentraciją yra mažesnis negu 10 %,
|
—
|
paprastai yra 1–10 ml sėjimo kultūros 1 litrui bandomojo tirpalo.
|
|
Veiklusis dumblas
27.
|
Veiklusis dumblas surenkamas šviežias iš nuotekų valymo įrenginio aeracijos rezervuaro ar laboratorinio įrenginio, kuriuo valomos visų pirma buitinės nuotekos. Jeigu reikia, stambiosios dalelės turėtų būti pašalinamos per sietą (pvz., naudojant sietą, kurio akutės dydis 1 mm2) ir dumblas turi būti laikomas aerobinėmis sąlygomis, kol jį bus imta naudoti.
|
28.
|
Antraip pašalinus visas stambiąsias daleles, dumblas nusodinamas ar centrifuguojamas (pvz., 1 100 × g, 10 minučių). Nupilamas nusistojęs skystis. Dumblą galima nuplauti į mineralinį tirpalą. Koncentruotas dumblas suspenduojamas mineralinėje terpėje, kad būtų gautos 3–5 g koncentracijos suspenduotos medžiagos. Po to jis aeruojamas atsižvelgiant į nustatytus reikalavimus.
|
29.
|
Dumblas turėtų būti imamas iš tinkamai veikiančio įprasto valymo įrenginio. Jeigu dumblas turi būti imamas iš didelio našumo valymo įrenginio arba jeigu manoma, kad dumble yra inhibitorių, šis dumblas turi būti plaunamas. Gerai sumaišytas, pakartotinai suspenduotas dumblas paliekamas nusistoti arba centrifuguojamas, nupilamas nuo jo skystis ir išplautas dumblas dar kartą suspenduojamas kitame mineralinės terpės tūryje. Šie veiksmai kartojami tol, kol galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko.
|
30.
|
Visiškai užbaigus pakartotinį suspendavimą arba iš neapdoroto dumblo prieš pradedant naudoti imamas ėminys, kad būtų nustatyta suspenduotų medžiagų sausoji masė.
|
31.
|
Pagal kitą būdą homogenizuojamas aktyvusis dumblas (3–5 g/l suspenduotų medžiagų.) Dumblas maišomas 2 min. vidutiniu greičiu mechaniniame maišiklyje. Sumaišytas dumblas paliekamas 30 min. arba ilgiau, jei to reikia, ir dekantuojamas skystis, kuris naudojamas kaip sėjimo kultūra, pagal normą 10 ml/l mineralinės terpės
|
32.
|
Iš tuščiojo bandinio kolbos išsiskiriantį CO2 kiekį galima dar labiau sumažinti, jeigu dumblas per naktį būtų aeruojamas CO2 neturinčiu oru. Atliekant šį bandymą (13) 4 mg/l veikliojo dumblio kietųjų medžiagų naudojama kaip sėjimo kultūros koncentracija.
|
Biologinio nuotekų valymo ištakis
33.
|
Antraip sėjimo kultūrą galima paimti iš biologinio nuotekų valymo įrenginio ištakio arba laboratorinio įrenginio, kuriam tiekiamos vien buitinės nuotekos. Ėminys laikomas aerobinėmis sąlygomis ir naudojamas paėmimo dieną arba, jeigu reikia, iš anksto kondicionuojamas. Ištakis turėtų būti filtruojamas per stambų filtrą siekiant pašalinti dideles kietąsias daleles ir tada išmatuojama pH vertė.
|
34.
|
Norint jame sumažinti IC kiekį, filtratas 1 val. borbatuojamas CO2 neturinčiu oru (15-e pastraipa), ir naudojant ortofosforo rūgštį (20 pastraipa) kartu išlaikoma pH vertė 6,5. Naudojant natrio hidroksidą atkuriama pradinė pH vertė ir po maždaug 1 val. trukmės nusodinimo iš sėjimo kultūros paimamas reikiamas kiekis nusistojusio skysčio. Taikant šią borbatavimo procedūrą sėjimo kultūroje sumažinamas IC kiekis. Pvz., jeigu didžiausias rekomenduotas filtruoto ir borbatuoto ištakio kiekis (100 ml) litrui buvo naudotas kaip sėjimo kultūra, IC kiekis tuščiojo bandinio kolbose atitiko 0,4–1,3 mg/l (14), t. y. atitiko bandomosios cheminės medžiagos 2–6,5 % C esant 20 mg C/l koncentracijai ir 4–13 % esant 10 mg C/l koncentracijai.
|
Paviršiniai vandenys
35.
|
Ėminys imamas iš atitinkamo paviršinio vandens. Jis turėtų būti laikomas aerobinėmis sąlygomis ir naudojamas paėmimo dieną. Jeigu reikia, ėminio koncentracija turėtų būti didinama filtruojant arba centrifuguojant. Kiekviename bandymo inde naudotinos sėjimo kultūros kiekis turėtų atitikti 26 pastraipoje nustatytus kriterijus.
|
Dirvožemiai
36.
|
Paimamas tinkamo dirvožemio ėminys; jis imamas iš ne didesnio negu 20 cm gylio nuo dirvožemio paviršiaus. Prieš imantis sietu, kurio akučių dydis 2 mm, sijoti dirvožemio ėminį iš jo turėtų būti išrenkami akmenys, augalų liekanos ir bestuburiai (jeigu ėminys yra pernelyg drėgnas, kad būtų galima jį sijoti nedelsiant, šiuo atveju ėminys iš dalies džiovinamas oru – tokį ėminį sijoti būtų lengviau). Ėminys turėtų būti laikomas aeravimo sąlygomis ir naudojamas paėmimo dieną (jeigu ėminys turi būti gabenamas nesandariai užrištame juodos spalvos polietileno maiše, ėminį galima laikyti ne ilgiau negu vieną mėnesį 2–4 °C temperatūroje).
|
Pradinis sėjimo kultūros kondicionavimas
37.
|
Sėjimo kultūrai leidžiama taikyti pradinį kondicionavimą, kad ji atitiktų bandymo sąlygas, tačiau ėminio neleidžiama iš naujo pritaikyti prie bandomosios cheminės medžiagos. Taikant pradinį kondicionavimą gali būtų sumažinamas CO2 išsiskyrimas iš tuščiojo bandinio kolbų. Pradinis kondicionavimas – tai 30 mg/l bandymo terpe atskiesto veikliojo dumblo aeravimas 5–7 dienas bandymo temperatūroje CO2 neturinčiu oru.
|
BANDYMO ATLIKIMO TVARKA
Kolbų skaičius
38.
|
Bandymui reikalingų kolbų skaičius (15-a pastraipa) priklauso nuo analizės atlikimo dažnumo ir bandymo trukmės.
|
39.
|
Rekomenduojama, kad po pakankamo laiko intervalų skaičiaus, pvz., tokio, kad būtų galima identifikuoti 10 parų langą, būtų atliekama trijų kolbų analizė. Bandymo pabaigoje taip pat analizuojamos ne mažiau negu penkios kolbos (15-a pastraipa) iš a, b ir c rinkinių (žr. 42 pastraipą) siekiant užtikrinti 95 % pasikliovimo intervalus, kad būtų apskaičiuota vidutinė biologinio skaidymo procentinė vertė.
|
Terpė su sėjimo kultūra
40.
|
Naudojamos sėjimo kultūros koncentracija turi būti 4 mg/l veikliojo dumblo sausosios masės. Nedelsiant prieš naudojimą pasiruošiamas pakankamas kiekis terpės su sėjimo kultūra, pvz., šiuo atveju 2 ml tinkamai apdoroto veikliojo dumblo (27–32 pastraipos) įdedama į 2 000 mg/l–1 litrą mineralinių druskų terpės (19 pastraipa). Jeigu turi būti naudojamas biologinio valymo įrenginio ištakis, ne daugiau negu 100 ml ištakio (33 pastraipa) įdedama į 900 ml mineralinių druskų terpės (19 pastraipa) ir terpe atskiedžiama iki 1 litro.
|
Kolbų paruošimas
41.
|
Alikvotinės terpės su sėjimo kultūra dalys paskleidžiamos kolbose, kad viršutinės erdvės ir skysčio santykis būtų 1:2 (pvz., įdedama į 107–160 ml talpos kolbas). Leidžiama pasirinkti kitus santykius, tačiau šiuo atveju atsižvelgtina į 11 pastraipoje išdėstytą įspėjimą. Naudojant bet kurio iš šių dviejų tipų sėjimo kultūrą turi būti siekiama užtikrinti, kad terpė su įmaišyta sėjimo kultūra būtų reikiamai išmaišyta, nes tik šitaip įmanoma garantuoti tolygų terpės pasiskirstymą bandymo kolbose.
|
42.
|
Kolbų rinkiniai (15a pastraipa) paruošiami taip, kad juose būtų:
a)
|
bandymo indai (žymimi FT) su bandomąja chemine medžiaga;
|
b)
|
tuščiojo bandinio kolbos (žymimos FB), kuriose yra tik bandomoji terpė ir sėjimo kultūra; taip pat turi būti pridedamos visos cheminės medžiagos, tirpikliai, priemonės ar stiklo pluošto filtrai, naudojami bandomąją cheminę medžiagą įterpiant į bandymo indus;
|
c)
|
procedūros tikrinimo indai (žymimi FC), kuriuose yra etaloninė cheminė medžiaga;
|
d)
|
jeigu reikia, tikrinant galimą slopinimo poveikį naudojami indai (žymimi FI) su bandomąja chemine medžiaga ir tokios pačios koncentracijos etalonine chemine medžiaga (24 pastraipa) kaip atitinkamai kolbose FT ir FC;
|
e)
|
tikrinant galimą abiotinį skaidymą naudojami indai (žymimi FS) kaip a + 50 mg/l HgCl2 arba sterilizuoti kitomis priemonėmis (pvz., naudojant autoklavą).
|
|
43.
|
Siekiant užtikrinti 10–20 mg C/l koncentraciją kaip vandeniniai pradiniai tirpalai (22, 23 ir 24 pastraipos) įterpiamos vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos ir etaloninės cheminės medžiagos.
|
44.
|
Netirpios bandomosios cheminės medžiagos ir netirpios etaloninės cheminės medžiagos atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį įvairiais būdais įdedamos į kolbas (žr. 22a-e pastraipas); šiuo atveju prieš įdedant terpę su sėjimo kultūra ar terpę įdėjus (šiuo atveju paisoma bandomosios cheminės medžiagos poveikio metodo). Jeigu naudojama viena iš 22a-e pastraipoje nurodytų procedūrų, šiuo atveju tuščiojo bandinio kolbos FB (42b pastraipa) turėtų būti tvarkomos panašiu būdu, tačiau išskyrus bandomąją cheminę medžiagą arba etaloninę cheminę medžiagą.
|
45.
|
Lakios bandomosios cheminės medžiagos į sandarias kolbas (47 pastraipa) turėtų būti įšvirkščiamos mažais švirkštais. Dozė apskaičiuojama atsižvelgiant į įšvirkštą tūrį ir bandomosios cheminės medžiagos tankį.
|
46.
|
Jeigu reikia, turėtų būti įpilama vandens, kad kiekviename inde būtų vienodas skysčio tūris. Privaloma užtikrinti, kad viršutinės erdvės ir skysčio santykis (paprastai 1:2) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracija būtų tokia, kad viršutinėje erdvėje būtų pakankamas visiškam biologiniams suskaidymui reikalingas deguonies kiekis.
|
47.
|
Tada visos kolbos sandarinamos, pvz., butilkaučiuko sandarikliais ir aliuminio gaubteliais. Šiame etape (45 pastraipa) turėtų būti įterpiamos lakios bandomosios cheminės medžiagos. Jeigu turi būti stebimas DOC koncentracijos bandomajame tirpale sumažėjimas ir laiko atskaitos pradžioje atliekama pradinės IC koncentracijos analizė (sterilūs kontroliniai bandiniai, 42e pastraipa) ar analizuojamos kitos tiriamosios medžiagos, iš bandymo indo paimamas atitinkamas ėminys. Po to bandymo indas ir jo turinys yra šalinamas.
|
48.
|
Užkimštos kolbos dedamos į rotacinį kratytuvą (15d pastraipa); kratymo dažnis turi būti toks, kad kolbų turinys būtų tinkamai maišomas ir suspenduojamas (pvz., 150–200 sūk./min.) ir inkubuojama tamsoje 20 °C temperatūroje (± 1 °C).
|
Ėminių ėmimas
49.
|
Ėminių ėmimo tvarka priklauso nuo vėlavimo fazės ir nuo bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo kinetinio greičio. Kolbos paaukojamos, kad ėminių ėmimo dieną būtų galima atlikti analizę; ėminiai imami bent kartą per savaitę ar dažniau (pvz., du kartus per savaitę), jeigu būtina nubrėžti visiško suskaidymo kreivę. Reikiamas lygiagrečiai paruoštų kolbų skaičius paimamas iš kratytuvo, t. y. FT, FB ir FC ir, jeigu naudojama, FI ir FS (žr. 42 pastraipą). Bandymas paprastai daromas 28 dienas. Jeigu atsižvelgiant į biologinį skaidymą daroma išvada, kad kreivės plokščioji dalis užtikrinama anksčiau negu per 28 dienas, bandymą galima užbaigti anksčiau negu per 28 dienas. Ėminiai imami iš penkių kolbų, paliktų atlikti analizę 28-ają bandymo dieną, ir rezultatai naudojami apskaičiuojant procentinės biologinio skaidymo dalies pasikliautinuosius rėžius ar variacijos koeficientus. Iš kolbų, kurios naudojamos nustatant slopinimo poveikį ar abiotinį skaidymą, ėminių nebūtina imti taip dažnai kaip iš kitų kolbų; pakanka juos imti 1 ir 28 dieną.
|
Neorganinės anglies (IC) analizė
50.
|
CO2 išsiskyrimas kolbose nustatomas inkubacijos laikotarpiu matuojant neorganinės anglies (IC) koncentracijos padidėjimą. Rekomenduojami atliekant bandymą išsiskyrusios IC anglies kiekio matavimo du metodai ir jie aprašyti toliau. Naudojant šiuos metodus gali būti nustatomi šiek tiek besiskiriantys rezultatai, todėl atliekant bandymą turėtų būti naudojamas tik vienas metodas.
|
51.
|
A Metodas rekomenduojamas tuo atveju, jeigu terpėje galėtų būti, pvz., stiklo filtro popieriaus ir (arba) netirpios bandomosios cheminės medžiagos likučių. Šią analizę galima atlikti naudojant dujų chromatografą, jeigu neturimas anglies analizatorius. Privaloma pasirūpinti, kad analizuojant viršutinės erdvės dujas kolbų temperatūros vertė atitiktų ar beveik atitiktų bandymo temperatūros vertę. B metodas gali būti patogesnis taikyti laboratorijose, kuriose IC kiekis matuojamas anglies analizatoriais. Svarbu, kad natrio hidroksido tirpalas (21 pastraipa), kurį naudojant CO2 verčiamas karbonatu, būtų šviežiai pasiruoštas arba jo kiekis žinomas, kad į jį būtų galima atsižvelgti apskaičiuojant bandymo rezultatus (66-b pastraipa).
|
A metodas: rūgštinimas iki pH < 3
52.
|
Prieš pradedant kiekvieną analizės dalį IC analizatorius kalibruojamas naudojant atitinkamą IC standartą (pvz., 1 % w/w CO2 mišinyje su N2 dujomis). Koncentruota ortofosforo rūgštis (20 pastraipa) įšvirkščiama per kiekvienos kolbos sandariklį; kolbos pasirenkamos siekiant sumažinti terpės pH vertę iki < 3 (pvz., įšvirkščiama 1 ml į 107 ml bandomosios terpės). Kolbos vėl sudedamos į kratytuvą. Kolbas vieną valandą pakračius kratytuvu esant bandymo temperatūrai, jos išimamos iš kratytuvo; alikvotinės dujų dalys (pvz., 1 ml) paimamos iš kiekvienos kolbos viršutinės erdvės ir įleidžiamos į IC analizatorių. Išmatuotos IC koncentracijos registruojamos kaip mg C/l.
|
53.
|
Šio metodo esmė – užbaigus rūgštinti, kai pH < 3 ir užtikrinus pusiausvyrą 20 °C, CO2 pasiskirstymo tarp skystosios ir dujinės fazės bandymo kolbose pusiausvyros konstantos vertė yra 1,0, jeigu matuojama kaip koncentracija. Šis dalykas bandymo sistemos atžvilgiu bent vieną kartą turėtų būti įrodomas taip:
Naudojant bevandenio natrio karbonato (Na2 CO3) tirpalą, pasiruoštą iš CO2 neturinčio vandens, koncentruota ortofosforo rūgštimi (20 pastraipa) rūgštinant vandenį, kol pH vertė pasidaro 6,5, borbatuojant CO2 neturinčiu oru ir naudojamu šarmu užtikrinus neutralų pH, pasiruošiamos kolbos su 5 ir 10 mg/l IC koncentracija. Užtikrinama, kad viršutinės erdvės tūrio santykis su skysčio tūriu būtų toks pats kaip atliekant bandymus (pvz., 1:2). Rūgštinama ir užtikrinama pusiausvyra kaip aprašyta 52 pastraipoje bei matuojama IC koncentracijos viršutinės erdvės ir skystosiose fazėse. Patikrinama, ar dvi koncentracijos atitinka tokias pačias paklaidas. Jeigu paklaidos nėra tapačios, operatorius turėtų persvarstyti procedūras. Šis IC pasiskirstymas tarp skystosios ir dujinės fazės neturi būti tikrinimas kiekvieną kartą atliekant bandymą; jį galima atlikti kartu su kalibravimu.
|
54.
|
Jeigu turi būti matuojamas pašalinamas DOC kiekis (tik vandenyje tirpių bandomųjų cheminių medžiagų), turėtų būti imami skystos fazės ėminiai iš atskirų kolbų (neparūgštintų), filtruojami membraniniu filtru ir įleidžiami į DOC analizatorių. Šias kolbas galima naudoti atliekant kitas analizes, jeigu reikia, siekiant nustatyti pirminį biologinį skaidumą.
|
B metodas: CO2 perskaičiavimas į karbonatą
55.
|
Prieš pradedant kiekvienos partijos analizes, IC analizatorius kalibruojamas naudojant atitinkamą standartą, pvz., 0–20 mg/l koncentracijos, išreikštos IC, natrio vandenilio karbonato (NaHCO3) tirpalą CO2 neturinčiame vandenyje (žr. 53 pastraipą). Natrio hidroksido tirpalo (7M, 21 pastraipa) (pvz., 1 ml į 107 ml terpės) įšvirkščiama per kiekvienos pasirinktos kolbos sandariklį ir kolbos kratomos 1 val. esant bandymo temperatūrai. Visose kolbose, panaudotose konkrečią dieną, tačiau nebūtinai kiekvieno ėminio ėmimo atveju per visą bandymą, naudojamas tas pats NaOH tirpalas. Jeigu visų ėminių ėmimo atvejais būtinos absoliučios tuščiosios IC vertės, kiekvieną kartą naudojant NaOH tirpalą privaloma nustatyti IC. Kolbos išimamos iš kratytuvo ir paliekamos nusistoti. Pakankamas kiekis (pvz., 50–1000 μl) skystosios fazės iš kiekvienos kolbos ištraukiama švirkštu. Ėminiai įleidžiami į IC analizatorių ir užrašomos IC koncentracijos. Turėtų būti užtikrinama, kad naudojamas analizatorius būtų tinkamai pritaikytas analizuoti pagal minėtą metodą paruoštus šarminius ėminius.
|
56.
|
Šio metodo esmė – įdėjus šarmo ir užbaigus kratymą, IC koncentracija viršutinėje erdvėje nėra reikšminga. Šį bandymo sistemos parametrą galima patikrinti naudojant IC standartus, pridedant šarmo ir užtikrinant pusiausvyrą bei IC koncentraciją matuojant viršutinėje erdvėje ir skystosios fazės (žr. 53 pastraipą). Koncentracijos vertė viršutinėje erdvėje turėtų būti beveik lygi nuliui. Šio patikrinimo dėl beveik visiškos CO2 absorbcijos nebūtina atlikti kiekvieną kartą darant bandymą.
|
57.
|
Jeigu turi būti matuojamas šalinamas DOC kiekis (tik vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos), skystosios fazės ėminiai turėtų būti imami iš atskirų kolbų (į kurias nebuvo dėta šarmo), filtruojami membraniniu filtru ir įleidžiami į DOC analizatorių. Šias kolbas galima naudoti atliekant kitas analizes, jeigu reikia, kad būtų išmatuotas pirminis biologinis skaidumas
|
DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
Rezultatų apskaičiavimas
58.
|
Darant prielaidą, kad bandomoji cheminė medžiaga 100 % skyla į CO2, teorinis didžiausias išsiskyręs neorganinės anglies (IC) kiekis, viršijantis išsiskiriantį tuščiuose kontroliniuose bandiniuose, yra lygus TOC, kuri įdedama į kiekvieną kolbą bandymo pradžioje, t. y.:
Bendroji neorganinės anglies (TIC) masė (mg) kiekvienoje kolboje yra:
|
1 lygtis
|
kur:
VL
|
=
|
skysčio kolboje tūris (litrais)
|
CL
|
=
|
IC koncentracija skystyje (kaip anglies mg/l)
|
VH
|
=
|
viršutinės erdvės tūris (litrais)
|
CH
|
=
|
IC koncentracija viršutinėje erdvėje (kaip anglies mg/l)
|
TIC apskaičiavimai taikant du analizės metodus, naudojamus išmatuoti IC, kai atliekamas šis bandymas, aprašyti toliau 60 ir 61 pastraipose. Procentinė biologinio skaidymo dalis (% D) kiekvienu atveju apskaičiuojama pagal šią lygtį:
|
2 lygtis
|
kur:
TICt
|
=
|
bendroji neorganinė anglis (TIC) mg bandymo kolboje t laiko momentu
|
TICb
|
=
|
vidutinė bendroji neorganinė anglis (TIC) mg tuščiojo bandinio kolbose t laiko momentu
|
TOC
|
=
|
į bandymo indą iš pradžių įdėta TOC (mg).
|
Procentinė biologinio skaidymo dalis % D apskaičiuojama bandymo (FT), etaloninės (FC) ir, jeigu įtraukta, slopinimo stebėjimo kontrolinės (FI) kolbų atsižvelgiant į atitinkamus TIC kiekius, išsiskyrusius iki kiekvieno ėminio ėmimo laiko.
|
59.
|
Jeigu bandymo laikotarpiu gerokai padidėja TIC kiekis steriliuose kontroliniuose bandiniuose (FS), šiuo atveju galima daryti išvadą, kad bandomoji cheminė medžiaga buvo abiotinėmis sąlygomis suskaidyta, ir šį procesą turi būti atsižvelgiama apskaičiuojant 2 lygties D vertę.
|
Rūgštinimas iki pH < 3
60.
|
Rūgštinimu užtikrinus pH < 3 ir pusiausvyrą, suvienodėja TIC koncentracija skystojoje ir dujinėje fazėse; IC koncentraciją būtina matuoti tik dujinėje fazėje. Vadinasi, naudojantis 1 lygtimi
, kur VB = serumo kolbos tūris. |
CO2 perskaičiavimas į karbonatą
61.
|
Pasirinkus šį metodą apskaičiavimai atliekami pagal 1 lygtį, tačiau mažo IC kiekio dujinėje fazėje nepaisoma, t. y
, ir
. |
Rezultatų išraiška
62.
|
Biologinio skaidymo kreivė gaunama procentinę biologinio skaidymo dalį D, kaip liniją brėžiant atsižvelgiant į inkubacijos trukmę, jeigu įmanoma, vėlavimo fazę, biologinio skaidymo fazę, 10 parų langą ir kreivės plokščiosios dalies fazę, t. y. fazę, kai nurodoma užtikrinama didžiausia skaidymo vertė ir biologinio skaidymo kreivė išsilygina. Jeigu panašių bandymo indų FT (< 20 % skirtumas) nustatomi palyginamieji rezultatai, brėžiama vidutinė kreivė (žr. 2 priedėlio 1 pav.); jeigu jie nenustatomi, brėžiama kiekvieno indo atskira kreivė. Kreivės plokščiosios dalies tarpsnio biologinio skaidymo procentinės dalies vidutinė vertė apibrėžiama arba įvertinama didžiausia vertė (pvz., kai kreivė leidžiasi kreivės plokščiosios dalies fazėje), tačiau svarbu įvertinti, ar pastaruoju atveju vertė nėra išskirtis. Šis didžiausias biologinio skaidymo lygis bandymo ataskaitoje pavadinamas „bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo laipsniu“. Jeigu bandymo indų skaičius buvo nepakankamas, kad būtų galima nurodyti kreivės plokščiąją dalies tarpsnį, apskaičiuojant vidutinę vertę naudojami paskutinę bandymo dieną išmatuoti duomenys. Ši paskutinė vertė, vidutinė penkių tapačių indų vertė, naudojama nurodant procentinės biologinio skaidymo dalies nustatymo glaudumą. Taip pat nurodoma 10 parų lango pabaigoje nustatyta vertė.
|
63.
|
Tuo pačiu būdu brėžiama etaloninės cheminės medžiagos kreivė FC, ir, jeigu įtraukta, abiotinio šalinimo patikrinimo Fs ir slopinimo kontrolės FI kreivės.
|
64.
|
Tuščiuose kontroliniuose bandiniuose (FB) esantys TIC kiekiai užrašomi; taip pat užrašomi Fs kolbose (abiotinių sąlygų tikrinimas) esantys kiekiai, jeigu šie indai buvo naudojami atliekant bandymą.
|
65.
|
Apskaičiuojama FI indų D vertė remiantis teorine IC išeiga, numatoma tik pagal etaloninio mišinio komponentą. Jeigu 28 dieną [[(DFC
(22) – DFI
(23))/DFC] × 100 > 25 %, galima daryti prielaidą, kad bandomoji cheminė medžiaga slopina sėjimo kultūrą, ir todėl šiuo poveikiu galima pagrįsti mažas DFT vertes, nustatytas taikant bandymo sąlygas. Šiuo atveju bandymą galima pakartoti naudojant mažesnę bandymo koncentraciją ir verčiau sumažinant DIC sėjimo kultūroje ir tuščiuose kontroliniuose bandiniuose susiformavusią bendrąją neorganinę anglį, nes naudojant mažesnę koncentraciją vis tiek sumažinamas metodo tikslumas. Antraip galima naudoti kitą sėjimo kultūrą. Jeigu bandymo kolboje Fs (abiotinėmis sąlygomis) nustatomas gerokas (> 10 %) TIC kiekio padidėjimas, šiuo atveju gali būti įvykę abiotinio skaidymo procesai.
|
Rezultatų validumas
66.
|
Bandymas laikomas validuotu, jeigu:
a)
|
vidutinė skaidymo procentinė dalis induose FC su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis yra > 60 % iki 14 inkubacijos dienos ir
|
b)
|
tuščiuose kontroliniuose bandiniuose FB esantis vidutinis TIC kiekis bandymo pabaigoje yra > 3 mg C/l.
|
Jeigu šios ribinės vertės nėra užtikrinamos, bandymas turėtų būti kartojamas naudojant iš kito šaltinio paimtą sėjimo kultūrą ir (arba) turėtų būti persvarstytos procedūros. Pvz., jeigu tuščiuosiuose bandiniuose susidaro didelis IC kiekis, turėtų būti taikoma 27–32 pastraipose nurodyta procedūra.
|
67.
|
Jeigu bandomosios cheminės medžiagos kiekis nesudaro 60 % ThIC ir jeigu įrodoma, kad ši medžiaga nėra inhibitorius (65 pastraipa), bandymas turėtų būti kartojamas pasirinkus didesnę sėjimo kultūros koncentraciją (ne daugiau negu 30 mg/l veikliojo dumblo ir 100 ml/l ištakio) arba sėjimo kultūrą iš kitų šaltinių, ypač tuo atveju, jeigu skaidymo vertė 20–60 %.
|
Rezultatų interpretavimas
68.
|
Biologinio skaidymo per 10 parų langą vertė > 60 % ThIC atliekant bandymą įrodo, kad aerobinėmis sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga yra lengvai biologiškai skaidoma.
|
69.
|
Jeigu 60 % ThIC vertė nėra užtikrinama, nustatoma terpės pH vertė kolbose, kurios nebuvo paveiktos rūgštimi arba šarmu; mažesnė negu 6,5 vertė galėtų būti laikoma įrodymu, kad vyko nitrifikacijos procesas. Šiuo atveju kartojamas bandymas su didesnės koncentracijos buferiniu tirpalu.
|
Bandymo ataskaita
70.
|
Paruošiama kiekvieno bandymo (FT) % D, etaloninės (FC) ir, jeigu įtraukta, kiekvienos ėminių ėmimo dienos slopinimo kontrolinės kolbos (FC) verčių lentelė. Jeigu gaunami lygiagrečiai paruoštų kolbų palyginamieji rezultatai, brėžiama vidutinės % D vertės kreivė atsižvelgiant į laiką. Registruojamas TIC kiekis tuščiojo bandinio kolbose (FB) ir DOC vertė steriliuose kontroliniuose bandiniuose (FS) ir (arba) kitos tiriamosios medžiagos bei procentinė jų šalinimo dalis.
|
71.
|
Nustatoma vidutinė kreivės plokščiosios dalies tarpsnio vertė % D arba naudojama didžiausia vertė, jeigu biologinio skaidymo kreivė leidžiasi kreivės plokščiosios dalies tarpsnyje, ir šis dalykas pranešamas kaip „bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo laipsnis“. Būtina užtikrinti, kad pastaruoju atveju didžiausia vertė nebūtų išskirtis.
|
72.
|
Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukta ši informacija:
|
Bandomoji cheminė medžiaga:
—
|
bendrasis pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė ir atitinkamos fizinės-cheminės savybės,
|
—
|
bandomosios cheminės medžiagos grynumas (priemaišos).
|
|
|
Bandymo sąlygos:
—
|
nuoroda į šį bandymo metodą,
|
—
|
naudotos bandymo sistemos aprašymas (pvz., indo tūris, viršutinės erdvės ir skysčio santykis, maišymo metodas ir t. t.),
|
—
|
bandomosios cheminės medžiagos ir etaloninės cheminės medžiagos taikymo bandymo sistemoje: naudotos bandomosios koncentracijos ir anglies kiekis, įdėtas į kiekvieną bandymo kolbą, bet koks tirpiklių naudojimas,
|
—
|
išsami informacija apie naudotą sėjimo kultūrą, bet koks išankstinis apdorojimas ir išankstinis kondicionavimas,
|
—
|
inkubacijos temperatūra,
|
—
|
IC analizės principo pagrindimas,
|
—
|
pagrindinės naudotų IC analizatorių charakteristikos (ir bet kokie kiti naudoti analizės metodai),
|
—
|
pakartotinių bandymų skaičius.
|
|
|
Rezultatai:
—
|
lentelėje pateikti neapdoroti duomenys ir apskaičiuotos biologinio skaidymo vertės,
|
—
|
bandomųjų ir etaloninių cheminių medžiagų skaidymo procentinės dalies grafikas atsižvelgiant į laiką, vėlavimo fazė, skaidymo fazė, 10 parų langas ir statumas,
|
—
|
procentinė šalinimo dalis kreivės plokščiosios dalies fazėje, bandymo pabaigoje ir po 10 parų lango,
|
—
|
bet kokio bandymo rezultatų atmetimo priežastys,
|
—
|
bet kokie kiti faktai, susiję su taikyta procedūra,
|
|
|
LITERATŪRA
1.
|
Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas. CO2 išsiskyrimo tyrimo metodas (Metodas C.4-C).
|
2.
|
Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159–167.
|
3.
|
Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.
|
4.
|
Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
|
5.
|
ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
|
6.
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
|
7.
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
|
8.
|
Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.
|
9.
|
Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
|
10.
|
Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.
|
11.
|
Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.
|
12.
|
Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
|
13.
|
Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. SAFEty 19: 204–211.
|
14.
|
Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507–524.
|
15.
|
Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550.
|
16.
|
ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
|
17.
|
Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813–1822.
|
18.
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
|
19.
|
Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219–3235.
|
20.
|
Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas.
|
21.
|
OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
|
22.
|
Šio priedo C.11 skyrius. Veikliojo dumblo respiracijos slopinimo bandymas.
|
23.
|
Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327.
|
24.
|
ES (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
|
25.
|
ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
|
1 priedėlis
SANTRUMPOS IR SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
IC– neorganinė anglis.
ThCO2– teorinis anglies dioksidas (mg) yra anglies dioksido kiekis, apskaičiuotas kaip išsiskiriantis iš žinomo ar išmatuoto anglies kiekio bandomojoje cheminėje medžiagoje, visiškai ją suskaidžius; taip pat išreikštas kaip mg anglies dioksido, išsiskyrusio iš bandomosios cheminės medžiagos mg.
DOC– ištirpusi organinė anglis – tirpale esanti organinė anglis arba perleidžiama per 0,45 mikrometro filtrą ar liekanti nusistojusiame skystyje anglis užbaigus 15 minučių centrifugavimą taikant maždaug 4 000 g vertę (apie 40 000 m sek-2).
DIC– ištirpusi neorganinė anglis.
ThIC– teorinė neorganinė anglis.
TIC– bendroji neorganinė anglis.
Lengvai biologiškai skaidoma– siekiant nustatyti visišką biologinį skaidymą atliekamų tam tikrų specialių atrankos bandymų reikalavimus atitinkančių cheminių medžiagų sutartinis klasifikavimas; atliekant šiuos bandymus laikomasi labai griežtų reikalavimų, todėl daroma prielaida, kad šios cheminės medžiagos turi būti greitai ir visiškai skaidomos vandens aplinkoje aerobinėmis sąlygomis.
10 parų langas– 10 parų iš karto po 10 % biologinio skaidymo užtikrinimo.
Būdingasis biologinis skaitomumas– cheminių medžiagų klasifikavimas remiantis neabejojamais biologinio skaidymo (pirminio ar visiško) įrodymais atliekant bet kokį biologinio skaidomumo bandymą.
Visiškas biologinis skaidymas– užtikrinamas skaidymo lygis, kai bandomąją cheminę medžiagą visiškai sunaudoja mikroorganizmai ir kai išskiriamas anglies dioksidas, vanduo, mineralinės druskos ir naujos mikrobiologinės ląstelinės sudedamosios dalys (biomasė).
Mineralizacija– visiškas organinio junginio skilimas į CO2 ir H2O aerobinėmis sąlygomis, ir į CH4, CO2 bei H2O anaerobinėmis sąlygomis.
Vėlavimo tarpsnis– trukmė nuo bandymo pradžios iki skaidančiųjų mikroorganizmų aklimatizavimo ir (arba) prisitaikymo ir bandomosios cheminės medžiagos arba organinės medžiagos biologinio skaidymo padidėjimo tiek, kad jį įmanoma nustatyti (pvz., 10 % didžiausio teorinio biologinio skaidymo ar mažesnio atsižvelgiant į matavimo metodikos tikslumą).
Skaidymo tarpsnis– trukmė nuo vėlavimo fazės pabaigos iki tos akimirkos, kai užtikrinamas 90 % aukščiausio skaidymo lygio.
Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis– kreivės plokščiosios dalies fazė – tokia fazė, kai užtikrinamas didžiausias skaidymas ir biologinio skaidymo kreivė išsitiesina.
Bandomoji cheminė medžiaga– bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
2 priedėlis
Biologinio skaidymo kreivės pavyzdys
1 paveikslas
CO2 esančio 1-oktanolio biologinis skaidymas viršutinėje erdvėje
Žodynėlis
biologinis skaidymas
skaidymo tarpsnis
aukščiausias biologinio skaidymo lygis
kreivės plokščiosios dalies fazė
10 parų langas
bandymo trukmė (dienomis)
C.30. BIOLOGINIS KAUPIMASIS DUGNO MAŽAŠERĖSE KIRMĖLĖSE
ĮVADAS
1.
|
Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 317 (2010). Iš bandymo metodų, susijusių su išliekamumu aplinkoje, atitinkamai 1996 m. ir 2008 m. buvo paskelbta – Biologinio kaupimosi koncentracijos didėjimas: bandymas su žuvimis pratekėjimo sąlygomis (šio priedo 49 pastraipa, C.13 skyrius) ir Biologinis kaupimasis nuosėdose gyvenančiose Oligochaetes (53). Vandens aplinkos biologinio kaupimosi duomenų ekstrapoliavimas sausumos organizmams, pvz., sliekams, sunkiai įvykdomas, jeigu apskritai įmanomas. Vertinant biologinį cheminių medžiagų kaupimąsi dirvožemyje šiuo metu naudojami bandomosios cheminės medžiagos lipofilinėmis savybėmis, pvz., (14) (37), pagrįsti skaičiavimo modeliai, pvz., ES Techninių gairių dokumente (19). Poreikis parengti su terpe susijusį specialų bandymo metodą jau yra patenkintas, pvz., (55). Šis metodas yra ypač svarbus įvertinant antrinį apsinuodijimą sausumos mitybos grandinėse (4). Keli nacionaliniai bandymų metodai yra skirti biologiniam kaupimuisi organizmuose, išskyrus žuvis, pvz. (2) ir (72). Biologinio kaupimosi sliekuose ((Eisenia fetida, Savigny) ir enchitrėjuose iš užterštų dirvožemių matavimo metodą parengė Amerikos bandymų ir medžiagų draugija (ASTM) (3). Tarptautiniu mastu priimtas biologinio kaupimosi dirvožemyje su bandomąja medžiaga įvertinimo metodas padėtų geriau įvertinti cheminių medžiagų keliamą riziką sausumos ekologinėms sistemoms, pvz., (25) (29).
|
2.
|
Dirvožemį vartojančius bestuburius veikia dirvožemyje esančios cheminės medžiagos. Be visų kitų gyvūnų, dugno mažašerės kirmėlės yra svarbios išlaikant dirvožemių struktūrą ir jų veiksmingumą (15) (20). Mažašerės kirmėlės gyvena dirvožemyje ir iš dalies dirvožemio paviršiuje (ypač miško paklotėje); biomasės atžvilgiu jos dažnai būna gausiausia rūšis (54). Permaišydami dirvožemio sudedamąsias dalis ir būdami kitų gyvūnų grobiu minėti gyvūnai gali daryti didelį poveikį chemines medžiagas pasisavinantiems kitiems gyvūnams, kaip antai, bestuburiams (pvz., plėšriosioms erkėms ir vabalams, pvz., (64)) arba stuburiniams (pvz., lapėms ir kirams). Kai kurios dugno mažašerių kirmėlių rūšys, dabartiniu metu naudojamos atliekant ekotoksikologinius bandymus, aprašytos 5 priedėlyje.
|
3.
|
ASTM Pavyzdinėse gairėse dėl dirvožemio toksiškumo arba biologinio kaupimosi laboratorinių bandymų atlikimo naudojant Lumbricid sliekus Eisenia fetida ir enchitrėjus Enchytraeus albidus (3) pateikta daug esminių ir naudingų nurodymų taikant esamą biologinio kaupimosi dirvožemyje bandymo metodą. Kiti dokumentai, į kuriuos daroma nuoroda šiame bandymo metode, yra šio priedo C.13 skyrius, Biologinio kaupimosi koncentracijos didėjimas: bandymas su žuvimis pratekėjimo sąlygomis (49) ir OECD TG 315: Biologinis kaupimasis nuosėdose gyvenančiuose Oligochates (53). Praktinė patirtis atliekant biologinio kaupimosi dirvožemyje tyrimus ir leidiniai, pvz., (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79), taip pat yra svarbūs šio bandymo metodo informacijos šaltiniai.
|
4.
|
Šis bandymo metodas daugiausiai taikomas tiriant stabilias, neutralias organines chemines medžiagas, kurias paprastai adsorbuoja dirvožemiai. Naudojant šį metodą galima tirti biologinį stabilių metaloorganinių medžiagų kaupimąsi dirvožemyje. Jį taip pat galima taikyti tiriant metalus ir kitus mikroelementus.
|
BŪTINOS SĄLYGOS
5.
|
Cheminės medžiagos biologinio kaupimosi dugno mažašerėse kirmėlėse bandymai buvo atlikti naudojant sunkiuosius metalus (žr., pvz., (63)) ir patvarias organines medžiagas (jų log Kow vertės 3,0–6,0 (40)). Šie bandymai taip pat taikomi:
—
|
cheminėms medžiagoms, kurių log Kow vertė didesnė negu 6,0 (ypač hidrofobinės cheminės medžiagos),
|
—
|
cheminėms medžiagoms, laikomoms organinėmis cheminėmis medžiagomis, kurioms būdinga savybė biologiškai kauptis gyvuose organizmuose, pvz., aktyviosios paviršiaus cheminės medžiagos arba didelės sugerties cheminės medžiagos,
|
—
|
cheminėms medžiagoms, kurioms savybė biologiškai kauptis būdinga atsižvelgiant į jų struktūros ypatybes, pvz., analoginės cheminės medžiagos, kurių žinomas biologinio kaupimosi potencialas, ir
|
|
6.
|
Prieš pradedant tyrimą turėtų būti žinoma informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, pvz., bendrasis pavadinimas, cheminis pavadinimas (geriausiai nurodyti IUPAC pavadinimą), struktūrinė formulė, CAS registracijos numeris, grynumas, atsargumo priemonės, privalomosios sandėliavimo sąlygos ir analizės metodai. Be to, turėtų būti žinoma ši informacija:
b)
|
oktanalio ir vandens pasiskirstymo koeficientas Kow;
|
c)
|
dirvožemio ir vandens pasiskirstymo koeficientas, išreikštas Koc;
|
e)
|
skaidomumas (pvz., dirvožemyje, vandenyje);
|
|
7.
|
Galima naudoti žymėtąsias ir nežymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas. Tačiau siekiant palengvinti analizę rekomenduojama naudoti žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas. Sprendimas priimamas atsižvelgiant į aptikimo ribas arba pradinės bandomosios cheminės medžiagos ir metabolitų matavimo reikalavimą. Jeigu naudojama žymėtoji bandomoji cheminė medžiaga ir matuojamas bendrasis radioaktyviųjų liekanų kiekis, svarbu užtikrinti, kad žymėtosios liekanos dirvožemyje ir bandomuosiuose organizmuose būtų apibūdinamos procentine pradinės cheminės medžiagos ir žymėtosios nepradinės cheminės medžiagos dalimi, pvz., stabilioje būsenoje paimtuose ėminiuose ar ėmimo tarpsnio pabaigoje siekiant sudaryti galimybę apskaičiuoti atitinkamos pradinės bandomosios cheminės medžiagos ir dirvožemio metabolitų (žr. 50 pastraipą) biologinio kaupimosi kriterijų. Šį aprašytąjį metodą gali tekti modifikuoti, pvz., pateikti pakankamą kiekį biomasės siekiant išmatuoti nežymėtosios organinės bandomosios cheminės medžiagos arba metalų kiekį. Matuojant bendrąjį radioaktyviųjų liekanų kiekį (skystiniu blyksimuoju skaitikliu, kai užbaigiama ekstrakcija, deginimas ar audinio soliubilizavimas) biologinio kaupimosi kriterijus (toliau – BAF) yra grindžiamas pradine bandomąja chemine medžiaga ir metabolitais. Apskaičiuojant BAF visų pirmiausiai turėtų būti atsižvelgiama į pradinės bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją organizmuose ir bendrąsias radioaktyviąsias liekanas. Vėliau biotos-sedimentų akumuliacijos faktorius (toliau – BSAF), perskaičiuotas į kirmėlių lipidų kiekį ir dirvožemio organinės anglies (OC) kiekį, turėtų būti apskaičiuotas naudojantis BAF, kad būtų užtikrintas skirtingų biologinio kaupimosi bandymų rezultatų palyginamumas.
|
8.
|
Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas bandomųjų rūšių gyvūnams, pvz., poveikio koncentracija (ECx) ar mirtinoji koncentracija (LCx) sugerties tarpsnio laikotarpiu (pvz., (19)). Visų pirmiausiai turėtų būti pasirenkama tokia bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kad šios medžiagos aštrios asimptotinės LC50 ji sudarytų apie 1 % ir būtų bent dešimt kartų didesnė negu jos aptikimo riba dirvožemyje naudojant analizės metodą. Jeigu turima, pirmenybė turėtų būti teikiama toksiškumo vertėms, nustatytoms atliktais ilgalaikės trukmės tyrimais apie subletalinius poveikius (51) (52). Jeigu šie duomenys neprieinami, naudinga informacija būtų gaunama atlikus ūmaus toksiškumo bandymą (žr. pvz., 23 pastraipą).
|
9.
|
Turėtų būti naudojamas žinomo tikslumo, glaudumo ir jautrumo analizės metodas kiekybiškai nustatyti cheminę medžiagą bandomuosiuose tirpaluose, dirvožemyje ir biologinėse medžiagose bei žinoma išsami informacija apie ėminio ruošimą ir sandėliavimą bei medžiagų saugos duomenų lapai. Taip pat turėtų būti žinomos bandomosios medžiagos aptikimo ribos dirvožemyje ir kirmėlės audinyje. Jeigu naudojama 14C pažymėta bandomoji cheminė medžiaga, turėtų būti žinomas savitasis radioaktyvumas (t. y. Bq mol-1) ir procentinė su priemaišomis susijusi radioaktyvumo dalis. Bandomosios cheminės medžiagos savitasis radioaktyvumas turėtų būti ganėtinai didelis siekiant palengvinti analizę ir pasirinktos bandomosios koncentracijos neturėtų sukelti toksiško poveikio.
|
10.
|
Bandymą leidžiama atlikti su dirbtiniu dirvožemiu arba su natūraliu dirvožemiu. Prieš pradedant bandymą turėtų būti žinoma informacija apie naudojamo natūralaus dirvožemio charakteristikas, pvz., dirvožemio kilmė arba jo sudedamosios dalys, pH, organinės anglies kiekis, granuliometrinė sudėtis (procentinė smėlio, nuosėdų ir molio dalis) ir vandens sulaikymo geba (3) (48).
|
BANDYMO METODO ESMĖ
11.
|
Bandomosios cheminės medžiagos biologinį kaupimąsi apibūdinantys parametrai – biologinio kaupimosi kriterijus (BAF), sugerties greičio konstanta (ks) ir šalinimo greičio konstanta (ke). Sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
|
12.
|
Bandymą sudaro dvi dalys: sugerties (poveikio) tarpsnis ir šalinimo tarpsnis (tarpsnis po poveikio). Sugerties tarpsnyje tapačios kirmėlių grupės suleidžiamos į dirvožemį, į kurį yra įterpta bandomoji cheminė medžiaga. Be bandomųjų gyvūnų, kontrolinių kirmėlių grupės laikomos tomis pačiomis sąlygomis, tačiau be bandomosios cheminės medžiagos. Išmatuojama bandomųjų organizmų sausoji masė ir lipidų kiekis. Šį matavimą galima atlikti naudojant kontrolinės grupės kirmėles. Analizės fono vertes (tuščiąsias vertes) galima gauti analizuojant kontrolinių kirmėlių ėminius ir dirvožemį. Šalinimo tarpsniui kirmėlės perkeliamos į dirvožemį be bandomosios cheminės medžiagos. Šalinimo tarpsnis visada būtinas, nebent bandomosios cheminės medžiagos įsisavinimas sugerties etape būtų gana nedidelis. Pasirinkus šalinimo tarpsnį gaunama informacija apie greitį, kuriuo bandomieji organizmai (pvz., 27)) šalina bandomąją cheminę medžiagą. Jeigu per sugerties tarpsnį stabili būsena nėra užtikrinama, nustatant kinetinius parametrus – biologinio kaupimosi kinetinį kriterijų BAFk, sugerties ir šalinimo greičio konstantą (-as) – visų pirmiausiai turėtų būti remiamasi vienalaikiu sugerties ir šalinimo tarpsnių rezultatų pritaikymu. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse ir jas veikiančios medžiagos koncentracija stebima per abu bandymo etapus.
|
13.
|
Sugerties tarpsniu atliekami matavimai; ėminiai imami ne daugiau negu 14 dienų (enchytraeids) arba 21 dieną (sliekų atveju), kol užtikrinama nuostovi būsena (11) (12) (67). Nuostovi būsena užtikrinama tuo atveju, kai kirmėlių koncentracija atsižvelgiant į laiką yra lygiagreti laiko ašiai ir atlikus paimtų ne trumpesniais negu dviejų dienų intervalais ėminių tris einančias viena po kitos koncentracijos analizes jų tarpusavio rezultatai skiriasi ne daugiau negu ± 20 % (remiamasi statistiniais palyginimais, pvz., dispersine analize, regresijos analize).
|
14.
|
Per šalinimo tarpsnį bandomieji organizmai perkeliami į indus su tuo pačiu substratu, tačiau be bandomosios cheminės medžiagos. Per šalinimo tarpsnį atliekami matavimai imant ėminius 14 dienų (enchytraeids) arba 21 dieną (sliekų atveju), jeigu po ankstesnio analizinio nustatymo neužregistruojama, kad bandomosios cheminės medžiagos likučių kiekis kirmėlėse sumažėjo 90 %. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse šalinimo tarpsnio pabaigoje registruojama kaip nepašalintieji likučiai. Biologinio kaupimosi kriterijus esant nuostoviajai būsenai (BAFss) visų pirmiausiai apskaičiuojamas ir kaip koncentracijos kirmėlėse (Ca) bei dirvožemyje (Cs) santykis akivaizdžiai nuostovioje būsenoje, ir kaip kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK), t. y. kaip sugerties iš dirvožemio greičio konstantos (ks) ir šalinimo greičio konstantos (ke) santykis (žr. 1 priedėlyje pateiktas sąvokų apibrėžtis); šiuo atveju daroma prielaida dėl pirmojo laipsnio kinetikos (apskaičiavimai nurodyti 2 priedėlyje). Jeigu yra akivaizdu, kad pirmojo laipsnio kinetika nėra taikoma, turėtų būti pasirenkami kiti modeliai.
|
15.
|
Naudojant kompiuterizuotas modelines lygtis (gairės pateiktos 2 priedėlyje) apskaičiuojama sugerties greičio konstanta, šalinimo greičio konstanta (ar konstantos, jeigu naudojami kiti modeliai), kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK) ir, jeigu įmanoma, kiekvieno iš šių parametrų pasikliautinieji rėžiai. Bet kokio modelio atitiktį galima nustatyti taikant koreliacijos koeficientą arba mišrios koreliacijos koeficientą (jeigu koeficientų vertė yra beveik lygi vienetui, šiuo atveju atitiktis yra pakankama) ar taikant chi kvadrato kriterijų. Be to, įvertintųjų parametrų standartinės paklaidos ar pasikliautinojo rėžio dydžiu galima remtis apsisprendžiant dėl modelio atitikties.
|
16.
|
Siekiant sumažinti lipofiliškų bandomųjų cheminių medžiagų rezultatų kintamumą biologinio kaupimosi kriterijai turėtų būti išreiškiami atsižvelgiant į lipidų kiekį ir organinės anglies kiekį (dirvožemio kg organinės anglies (OC) kg-1 kirmėlių lipidų kiekis). Šis metodas grindžiamas tuo, kad cheminių medžiagų tam tikrų klasių atžvilgiu galima nurodyti aiškų jų biologinio kaupimosi gebos ir lipofiliškumo sąryšį; šis santykis gerai pagrįstas tiriant žuvis (47). Nustatytas lipidų kiekio žuvyje ir šių cheminių medžiagų biologinio kaupimosi sąryšis. Panašus tarpusavio ryšys nustatytas bentosiniams organizmams, pvz., (30) (44). Panašiai šis tarpusavio ryšys įrodytas dugno mažašerėms kirmėlėms, pvz., (5) (6) (7) (14). Jeigu turimas pakankamas kiekis kirmėlės audinio, bandomųjų gyvūnų lipidų kiekį galima nustatyti naudojant tą pačią biologinę medžiagą, kuri buvo pasirinkta apibrėžiant bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją. Matuojant lipidų kiekį antraip galima naudoti kontroliniu gyvūnus.
|
BANDYMO VALIDUMAS
17.
|
Bandymas laikomas validuotu, jeigu laikomasi šių kriterijų:
—
|
bandymo pabaigoje bendrasis gaištamumas sugerties tarpsniu ir šalinimo tarpsniu neturėtų viršyti 10 % (sliekai) arba 20 % (enchytraeids) viso naudotų kirmėlių skaičiaus,
|
—
|
jei tai Eisenia fetida ir Eisenia andrei, sugerties tarpsnio ir šalinimo tarpsnio pabaigoje išmatuota vidutinė sumažėjusi masė neturėtų būti didesnė negu 20 %, palyginti su pradine šviežių gyvūnų mase (š. m.) kiekvieno tarpsnio pradžioje.
|
|
METODO APRAŠYMAS
Bandomųjų gyvūnų rūšys
18.
|
Atliekant biologinio kaupimosi bandymą rekomenduojama pasirinkti kelių rūšių dugno mažašeres kirmėles. Dažniausiai naudojamos Eisenia fetida arba Eisenia andrei (Lumbricidae), arba Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, ar Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)) rūšys aprašytos 5 priedėlyje.
|
Aparatūra
19.
|
Būtina pasirūpinti, kad nebūtų naudojamos medžiagos, įrangos bet kokios dalys, galinčios tirpdyti, adsorbuoti bandomąją cheminę medžiagą ar pašalinti kitas chemines medžiagas ir neigiamai paveikti bandomuosius gyvūnus. Atsižvelgiant į apkrovos dydį, t. y. bandomųjų dugno mažašerių kirmėlių skaičių, leidžiama naudoti iš cheminiu atžvilgiu inertiškos medžiagos pagamintus ir tinkamos talpos įprastus keturkampio arba cilindro formos indus. Su bandymo terpe besiliečianti bet kokia įranga gali būti iš nerūdijančio plieno, plastiko ar stiklo. Bandymo indai turėtų būti tinkamai uždengti, kad iš jų neištrūktų mažašerės kirmėlės, tačiau taip pat užtikrinamas reikiamas oro tiekimas. Naudojant chemines medžiagas, kurioms būdingas didelis sugerties koeficientas, pvz., sintetinius piretroidus, gali tekti rinktis silanizuotą stiklą. Susiklosčius aprašytosioms situacijoms įrangą tenka šalinti, kai ji baigiama naudoti (49). Privaloma pasirūpinti, kad atliekant bandymus naudotos žymėtosios priemonės ir lakiosios cheminės medžiagos nepatektų į aplinką. Gaudyklės (pvz., stiklinės dujų plovimo kolbos) turėtų būti naudojamos su tinkamais adsorbentais, galinčiais sulaikyti bet kokias iš bandymo indų garuojančias liekanas.
|
Dirvožemis
20.
|
Atliekant bandymą naudojamas tokios kokybės dirvožemis, kad būtų užtikrinamas bandomųjų organizmų išgyvenimas ir ypač dauginimasis aklimatizavimo laikotarpiu bei bandymo laikotarpiais ir kad šie gyvūnai neįgautų neįprastos išvaizdos ar nepradėtų keistai elgtis. Mažašerės kirmėlės turėtų įsirausti į dirvožemį.
|
21.
|
Atliekant bandymus kaip substratą rekomenduojama naudoti šio priedo (48) C.8 skyriuje aprašytą dirbtinį dirvožemį. Atliekant biologinio kaupimosi bandymus naudotino dirbtinio dirvožemio pasiruošimo ir dirbtino dirvožemio sandėliavimo rekomendacijos pateiktos 4 priedėlyje. Ore džiovintą dirbtinį dirvožemį, kol jis bus pradėtas naudoti, galima sandėliuoti kambario temperatūros sąlygomis.
|
22.
|
Tačiau iš neužterštų vietovių paimtus natūralius dirvožemius galima naudoti kaip bandymo ir (arba) kirmėlių auginimo dirvožemį. Natūralūs dirvožemiai turėtų būti apibūdinami bent savo kilme (paėmimo vieta), pH, organinės anglies kiekiu, granuliometrine sudėtimi (procentinė smėlio, nuosėdų ir molio dalis), vandens sulaikymo geba ir procentine vandens kiekio dalimi (3). Prieš pradedant naudoti, jeigu atliekama dirvožemio arba jo sudedamųjų dalių mikroteršalų analizė, šiuo atveju būtų gaunama naudingos informacijos. Jeigu naudojamas žemės ūkio paskirties žemės lauko dirvožemis, prieš imant ėminius (50) jis neturėtų būti buvęs apdorotas javų apsaugos produktais ar ne trumpiau negu vienerius metus netręštas gyvulių mėšlu ir ne trumpiau negu šešis mėnesius netręštas organinėmis trąšomis. Natūralių dirvožemių tvarkymo procedūros prieš imantis juos naudoti ekotoksikologiniams bandymams su mažašerėmis kirmėlėmis aprašyti (3). Natūralių dirvožemių laikymo trukmė laboratorijoje turėtų būti kiek įmanoma trumpesnė.
|
Bandomosios cheminės medžiagos taikymas
23.
|
Bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į dirvožemį. Turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes. Vandenyje tirpi bandomoji cheminė medžiaga prieš įmaišant ją į dirvožemį turėtų būti visiškai ištirpinama vandenyje. Įterpiant mažai vandenyje tirpią bandomąją cheminę medžiagą rekomenduojama taikyti tokią įterpimo procedūrą, kai viena ar daugiau (dirbtinio) dirvožemio sudedamųjų dalių dengiama bandomąja chemine medžiaga. Pvz., kvarcinį smėlį ar jo dalį galima mirkyti tinkamame organiniame tirpiklyje ištirpytos bandomosios cheminės medžiagos tirpale; vėliau šis tirpiklis yra iš lėto išgarinamas. Padengtą sudedamąją dalį vėliau galima įmaišyti į dirvožemį. Pagrindinis šios procedūros pranašumas – į dirvožemį nepakliūna tirpiklio. Jeigu naudojamas natūralus dirvožemis, bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į ore džiovintą dirvožemio dalį kaip aprašyta pirmiau (ruošiantis dirbtinį dirvožemį) arba bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į drėgną dirvožemį ir vėliau taikoma garinimo procedūra, jeigu buvo naudota stabilizavimo priemonė. Apskritai kiek įmanoma turėtų būti stengiamasi, kad drėgnas dirvožemis susiliestų su tirpikliu. Turėtų būti atsižvelgiama į šiuos dalykus (3):
—
|
jeigu naudojamas ne vanduo, o kitas tirpiklis, pastarasis turi būti tinkamas maišyti su vandeniu ir (arba) jį turi būti įmanoma pašalinti (pvz., išgarinti), kad dirvožemyje liktų tik bandomoji cheminė medžiaga,
|
—
|
jeigu naudojamas tirpiklio kontrolinis ėminys, neigiamo kontrolinio mėginio naudoti nebūtina. tirpiklio kontrolinio ėminio koncentracija turėtų būti didžiausia į dirvožemį įterpto tirpiklio koncentracija ir turėtų būti naudojamas tos pačios partijos tirpiklis, kuris buvo pasirinktas ruošiantis pradinį tirpalą; renkantis tinkamą soliubilizavimo priemonę pagrindiniai kriterijai turėtų būti tirpiklio toksiškumas ir lakumas bei bandomosios cheminės medžiagos tirpumas pasirinktame tirpiklyje.
|
|
24.
|
Pasirinkus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose mažai tirpias chemines medžiagas, 2,0–2,5 g smulkiai malto kvarcinio smėlio grūstuvėje ar piestoje galima sumaišyti vienam bandymo indui su tam tikru bandomosios cheminės medžiagos kiekiu, kad būtų pasiruošta reikiama bandomoji koncentracija. Šis kvarcinio smėlio ir bandomosios cheminės medžiagos mišinys įterpiamas į iš anksto sudrėkintą dirvožemį ir kruopščiai sumaišomas su reikiamu dejonizuoto vandens kiekiu siekiant užtikrinti būtiną drėgmės kiekį. Galutinis mišinys paskirstomas po bandymo indus. Procedūra kartojama pasirinkus kiekvieną bandomąją procedūrą ir taip pat pasiruošiami atitinkami kiekvieno bandymo indo kontroliniai bandiniai su 2,0–2,5 g smulkiai sumalto kvarcinio smėlio.
|
25.
|
Bandomąją cheminę medžiagą įterpus į dirvožemį turėtų būti nustatyta jos koncentracija. Bandomosios cheminės medžiagos tolydus pasiskirstymas dirvožemyje turi būti patikrintas prieš į dirvožemį įdedant bandomuosius gyvūnus. Į ataskaitą turėtų būti įtrauktas pasirinkto bandomosios cheminės medžiagos įterpimo metodo apibūdinimas ir nurodomos jo pasirinkimo priežastys.
|
26.
|
Dirvožemio ir porų vandens fazės pusiausvyrą geriausiai būtų užtikrinti prieš įdedant organizmus; rekomenduojama pasirinkti keturių dienų laikotarpį su 20 °C temperatūra. Daugelio mažai vandenyje tirpstančių organinių cheminių medžiagų laikotarpis, kol nusistovi tikroji pusiausvyra tarp adsorbuojamų ir ištirpusių frakcijų, gali trukti kelias dienas ar mėnesius. Atsižvelgiant į tyrimo tikslą, pvz., jeigu turi būti modeliuojamos aplinkos sąlygos, dirvožemį su įterpta bandomąja chemine medžiaga galima „brandinti“ ilgesnį laikotarpį, pvz., metalų šis laikotarpis gali trukti tris savaites 20 °C temperatūroje (22).
|
Bandomųjų organizmų auginimas
27.
|
Mažašerės kirmėlės visų pirmiausiai turėtų būti laikomos skaidrioje laboratorinėje kultūroje. Laboratorinės kultūros, skirtos Eisenia fetida, Eisenia andrei, ir Enchytraeid rūšims, metodų gairės pateiktos 5 priedėlyje (žr. taip pat (48) (51) (52)).
|
28.
|
Atliekant bandymus naudojamos mažašerės kirmėlės neturėtų sirgti jokiomis įmanomomis nustatyti ligomis, nebūtų kokiu nors atžvilgiu neįprastos ar apniktos parazitų.
|
BANDYMO ATLIKIMAS
29.
|
Bandomuosius organizmus sugerties tarpsnio laikotarpiu veikia bandomoji cheminė medžiaga. Sugerties tarpsnio trukmė turėtų būti 14 dienų (enchytraeids) arba 21 diena (sliekai), jeigu nėra įrodoma, kad nebuvo užtikrinta nuostovi būsena.
|
30.
|
Šalinimo tarpsniui mažašerės kirmėlės perkeliamos į dirvožemį be bandomosios cheminės medžiagos. Pirmasis ėminys turėtų būti imamas 4–24 val. po šalinimo tarpsnio pradžios. Ėminių ėmimo pavyzdžiai pasirinkus 21 dienos sugerties tarpsnį ir 21 dienos šalinimo tarpsnį yra pateikti 3 priedėlyje.
|
Bandomieji organizmai
31.
|
Daugelio rūšių dirvožemio enchitrėjų masė yra labai maža (pvz., 5–10 mg Enchytraeus albidus individo šlapioji masė ir dar mažesnė Enchytraeus crypticus ir Enchytraeus luxuriosus masė); norint išmatuoti masę ir atlikti cheminę analizę gali tekti sujungti tapačių bandymo indų mažašeres kirmėles (t. y. siekiant gauti vieną audinio analizės rezultatą turėtų būti naudojamos visos tapataus indo mažašerės kirmėlės). Į kiekvieną tapatų indą įleidžiama po 20 enchitrėjų individų ir turėtų būti naudojami bent trys tapatūs indai. Jeigu bandomosios cheminės medžiagos analizinio nustatymo riba yra didelė, gali tekti naudoti daugiau mažašerių kirmėlių. Jeigu pasirenkami tų rūšių gyvūnai, kurių individo masė yra didesnė (Eisenia fetida ir Eisenia andrei), galima naudoti vieną individą iš tapačių indų.
|
32.
|
Atliekant bandymą naudojami sliekai turėtų būti panašios masės (pvz., Eisenia fetida ir Eisenia andrei individų masė turėtų būti 250–600 mg). Enchitrėjų (pvz., Enchytraeus albidus) ilgis turėtų būti maždaug 1 cm. Visos mažašerės kirmėlės, naudojamos specialiam bandymui, turėtų būti gautos iš to paties šaltinio ir būti suaugę gyvūnai su kliteliumu (clitellum) (žr. 5 priedėlį). Gyvūno amžius ir masė gali daryti įtaką BAF vertėms (pvz., atsižvelgiant į skirtingą lipidų kiekį ir (arba) kiaušinėlių turėjimą), todėl šiuos parametrus privalomas tiksliai užrašyti ir į juos atsižvelgtina aiškinant rezultatus. Be to, kokonus galima padėti per sugerties tarpsnį, kuris taip pat darys poveikį BAF vertėms. Rekomenduojama, kad bandomųjų mažašerių kirmėlių ėminio dalis būtų pasveriama prieš bandymą siekiant įvertinti vidutinę sausąją ir šlapiąja masę.
|
33.
|
Turėtų būti pasirinkamas didelis dirvožemio ir mažašerių kirmėlių santykis siekiant užtikrinti, kad sugerties tarpsniu bandomosios cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje sumažėtų kuo mažiau. Rekomenduojama, kad bandymo inde, jeigu pasirinkta Eisenia fetida ir Eisenia andrei, vienai mažašerei kirmėlei tektų ne mažiau negu 50 g sausosios masės (s. m.), o enchitrėjams būtų skirta ne mažiau negu 10–20 g sausosios masės. Šiuose induose turėtų būti 2–3 cm dirvožemio sluoksnis (enchitrėjams) arba 4–5 cm sluoksnis sliekams.
|
34.
|
Atliekant bandymą naudojamos mažašerės kirmėlės išimamos iš auginimo kultūros (pvz., enchitrėjai išimami juvelyro žnyplelėmis). Suaugę gyvūnai perkeliami į bandymo dirvožemį be bandomosios cheminės medžiagos, kur jie aklimatizuojami ir šeriami (žr. 36 pastraipą). Jeigu bandymo sąlygos skiriasi nuo auginimo sąlygų, 24–72 val. aklimatizavimo tarpsnio turėtų pakakti, kad mažašerės kirmėlės prisitaikytų prie bandymo sąlygų. Po aklimatizavimo sliekai nuplaunami juos perkeliant į stiklinius indus (pvz., Petrio lėkšteles) su švariu vandeniu, tada pasveriami ir suleidžiami į bandymo dirvožemį. Prieš pasveriant mažašerės kirmėlės atsargiai prispaudžiamos prie lėkštelės krašto, kad nuo jų nutekėtų perteklinis vanduo, arba kruopščiai ir sausai nušluostomos šiek tiek suvilgyta popierine servetėle.
|
35.
|
Bandomųjų gyvūnų įsirausimas į dirvožemį turėtų būti stebimas ir aprašomas. Atliekant bandymus su sliekais, gyvūnai (kontroliniai ir poveikį patyrę gyvūnai) į dirvožemį įsirausia per kelias valandas; ši trukmė turėtų būti tikrinama ne vėliau negu po 24 valandų nuo sliekų suleidimo į bandymo indus. Jeigu sliekai neįsirausia į dirvožemį (pvz., daugiau negu 10 % per ilgesnį laikotarpį negu pusė sugerties tarpsnio), vadinasi, bandymo sąlygos nėra tinkamos ar bandomieji organizmai nėra sveiki. Šiuo atveju bandymas turėtų būti nutraukiamas ir kartojamas iš naujo. Enchitrėjai daugiausiai gyvena plyšiuose tarp dirvožemio porų ir dažnai su aplinkiniu substratu gali liestis tik jų apvalkalas; laikoma, kad poveikis besirausiantiems ir nesirausiantiems enchitrėjams yra vienodas ir su nesirausiančiais enchitrėjais nėra būtina pakartoti bandymą.
|
Šėrimas
36.
|
Šėrimas turėtų būti numatomas tuo atveju, jeigu pasirenkamas dirvožemis su mažu bendru organinės anglies kiekiu. Jeigu naudojamas dirbtinis dirvožemis, rekomenduojama savaitinė šėrimo norma (t. y. mažašerės kirmėlės turėtų būti šeriamos kartą per savaitę) yra 7 mg sauso mėšlo vienam dirvožemio sausosios masės gramui, kai šeriami sliekai, ir rekomenduojama savaitinė 2–2,5 mg maltų avižų dribsnių norma vienam dirvožemio sausosios masės gramui, kai šeriami enchitrėjai (11). Pirmoji pašaro dalis į dirvožemį turėtų būti įmaišoma iš karto prieš į jį įleidžiant bandomuosius organizmus. Tikslinga rinktis to paties tipo pašarą, kuris naudotas auginant (žr. 5 priedėlį).
|
Šviesa ir temperatūra
37.
|
Bandymai turėtų būti atliekami pasirinkus reguliuojamą 16/8 valandų šviesos ir tamsos ciklą bei bandymo indų vietoje užtikrinant 400–800 lx apšvietimą. Atliekant bandymą visą laiką turėtų būti naudojama 20 ± 2 °C temperatūra.
|
Bandomosios koncentracijos
38.
|
Naudojama pavienė koncentracija. Atvejai, kai būtina taikyti papildomą (-as) koncentraciją (-as), turėtų būti pagrindžiami. Jeigu bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas (ECx) beveik tapatus analizinei aptikimo ribai, rekomenduojama naudoti žymėtąją bandomąją cheminę medžiagą (didelio savitojo radioaktyvumo žymeklį). Jeigu naudojami metalai, koncentracijos audinyje ir dirvožemyje turėtų būti didesnės negu fono lygis.
|
Tapatūs indai
39.
|
Norint atlikti kinetinius matavimus (sugerties ir šalinimo tarpsnis), vienoje ėminių ėmimo vietoje turėtų būti ne mažiau negu trys tapatūs indai. Bendro pasiruoštų tapačių indų skaičiaus turėtų pakakti, kad būtų aprėpiama visa ėminių ėmimo trukmė per sugerties ir šalinimo tarpsnius.
|
40.
|
Biologiniams stebėjimams ir matavimams atlikti (pvz., sausosios ir šlapiosios masės santykis, lipidų kiekis) ir fono koncentracijoms mažašerėse kirmėlėse ir dirvožemyje analizuoti turėtų būti paruošta ne mažiau negu 12 tapačių indų neigiamai kontrolei (iš keturių indų ėminiai imami pradžioje, keturi – sugerties pabaigoje ir dar keturi – šalinimo pabaigoje), jeigu kaip tirpiklis naudojamas tik vanduo. Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudojama kokia nors soliubilizavimo priemonė, be paveiktų tapačių indų, turėtų būti paruošti tirpiklio kontroliniai ėminiai (ėminiai imami iš keturių tapačių indų sugerties tarpsnio pradžioje ir jo pabaigoje ir ėminiai imami iš keturių indų šalinimo tarpsnio pabaigoje) su visomis sudedamosiomis dalimis, išskyrus bandomąjį objektą. Šiuo atveju taip pat galima pateikti keturis papildomus neigiamos kontrolės (be tirpiklio) tapačius indus siekiant užtikrinti pasirenkamąjį ėminių ėmimą sugerties tarpsnio pabaigoje. Šiuos tapačius indus biologiniu atžvilgiu galima lyginti su tirpiklio kontroliniais ėminiais siekiant gauti informacijos apie galimą tirpiklio poveikį bandymo organizmams. Rekomenduojama paruošti pakankamą papildomų rezervinių tapačių indų skaičių (pvz., aštuonis) poveikiui ir kontroliniam (-iams) ėminiui (-iams).
|
Dirvožemio kokybės matavimo dažnumas
41.
|
Dirvožemio pH, dirvožemio drėgnumas ir temperatūra (nuolat) bandymo patalpoje turėtų būti matuojama sugerties ir šalinimo tarpsnių pradžioje ir pabaigoje. Dirvožemio drėgnumas vieną kartą per savaitę turėtų būti koreguojamas pasveriant bandymo indus ir tikrąsias mases palyginant su pradinėmis masėmis bandymo pradžioje. Sumažėjęs vandens kiekis turėtų būti kompensuojamas pripilant dejonizuoto vandens.
|
Mažašerių kirmėlių ir dirvožemio ėminių ėmimas bei analizė
42.
|
Sugerties ir šalinimo tarpsnių tvarkaraščio pavyzdys atliekant biologinio kaupimosi bandymus su mažašerėmis kirmėlėmis ir enchitrėjais pateiktas 3 priedėlyje.
|
43.
|
Dirvožemio ėminys imamas iš bandymo indų, kad pirmiau negu į juos įleidžiami sliekai, ir sugerties bei šalinimo tarpsniais būtų nustatyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija. Atliekant bandymą bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos nustatomos sliekuose ir dirvožemyje. Apskritai matuojamos bendrosios dirvožemio koncentracijos. Antraip galima matuoti koncentracijas porų vandenyje; šiuo atveju prieš pradedant tyrimą numatomas atitinkamas pagrindimas ir būtini metodai, kurie įtraukiami į ataskaitą.
|
44.
|
Sugerties ir šalinimo tarpsniais sliekų bei dirvožemio ėminiai imami ne mažiau negu šešis kartus. Jeigu įrodoma, kad bandomoji cheminė medžiaga yra stabili, imamų dirvožemio ėminių skaičių galima sumažinti. Rekomenduojama, kad sugerties tarpsnio pradžioje ir pabaigoje būtų analizuojami ne mažiau negu trys kartotiniai ėminiai. Jeigu sugerties tarpsnio pabaigoje išmatuota dirvožemio koncentracija nuo pradinės koncentracijos skiriasi daugiau negu 30 %, taip pat turėtų būti analizuojami kitomis dienomis paimti dirvožemio ėminiai.
|
45.
|
Iš nustatyto tapataus indo dirvožemio sliekai išimami kiekvienu ėminių ėmimo metu (pvz., tapataus indo dirvožemį paskleidus plokščiame padėkle ir lanksčiomis juvelyro žnyplelėmis išrinkus sliekus), neatidėliotinai nuplaunami vandeniu negilioje stiklinėje ar plieniniame padėkle. Pašalinamas perteklinis vanduo (žr. 34 pastraipą). Sliekai atsargiai sudedami į iš anksto pasvertą indą, nedelsiant pasveriami, įskaitant jų virškinimo trakto turinį.
|
46.
|
Tada sliekams (Eisenia sp.) turėtų būti leidžiama valytis savo virškinamąjį traktą visą naktį, pvz., ant drėgno filtravimo popieriaus, uždengtoje Pietrio lėkštutėje (žr. 34 pastraipą). Po virškinamojo trakto valymo turėtų būti nustatoma sliekų masė siekiant įvertinti galimą biomasės sumažėjimą atliekant bandymą (žr. validumo kriterijus 17 pastraipoje), Enchitrėjai sveriami ir jų audinio analizė atliekama be jų virškinamojo trakto valymo, nes šią valymo procedūrą sunku atlikti atsižvelgiant į mažą šių sliekų dydį. Nustačius galutinę masę sliekai turėtų būti nedelsiant nudobiami naudojant patį tinkamiausią metodą (pvz., skystuoju azotu ar sušaldomi –18 °C temperatūroje).
|
47.
|
Užterštą virškinamojo trakto turinį sliekai per šalinimo tarpsnį pakeičia švariu dirvožemiu. Vadinasi, matuojant iš karto prieš šalinimo tarpsnį paimto ėminio sliekus su nevalytu virškinamuoju traktu (šiuo atveju enchitrėjus) yra įtraukiamas užterštas virškinamojo trakto dirvožemis. Daroma prielaida, kad didesnioji dalis gėlavandenių mažašerių kirmėlių virškinamojo trakto turinio po 4–24 val. trukmės šalinimo tarpsnio pakeičiama švariomis nuosėdomis, pvz., (46). Panašios išvados buvo pateiktos dėl sliekų atlikus tyrimus apie žymėtojo kadmio ir cinko kaupimąsi (78). Atliekant bandymą su enchitrėjais šio šalinimo tarpsnio pirmojo ėminio koncentraciją galima laikyti audinio koncentracija pašalinus virškinamojo trakto turinį. Siekiant atsižvelgti į tiriamo objekto koncentracijos skiedimą, kuris neužterštu dirvožemiu atliekamas per sugerties tarpsnį, virškinamojo trakto turinio masę galima vertinti remiantis šlapiąja sliekų mase ir sliekų pelenų mase arba sliekų sausąja mase ir sliekų pelenų masės santykiais.
|
48.
|
Dirvožemio ir sliekų ėminiai visų pirma turėtų būti analizuojami iš karto po pašalinimo (t. y. per 1–2 dienas) siekiant užkirsti kelią skaidymuisi ar kitiems nuostoliams ir rekomenduojama apskaičiuoti apytikslį sugerties ir šalinimo greitį vykdant bandymą. Jeigu analizė atidedama, ėminiai turėtų būti laikomi reikiamomis sąlygomis, pvz., užšaldyti (≤ –18 °C).
|
49.
|
Turėtų būti patikrinama, ar cheminės analizės glaudumas ir atkuriamumas bei bandomosios cheminės medžiagos regeneracija iš dirvožemio ir sliekų ėminiai atitinka nustatytam metodui taikomus reikalavimus; ataskaitoje turėtų būti nurodomas šalinimo veiksmingumas, aptikimo riba (LOD) ir kiekybinio nustatymo riba (LOQ). Taip pat turėtų būti patikrinama, ar kontroliniuose induose nėra nustatomos tokios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kurios viršytų fono koncentraciją. Jeigu kontrolinės grupės sliekuose bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme Ca yra > 0, šis veiksnys įtraukiamas apskaičiuojant kinetinius parametrus (žr. 2 priedėlį). Atliekant bandymą visi ėminiai turėtų būti tvarkomi taip, kad tarša ir nuostoliai būtų kuo mažesni (pvz., dėl bandomosios cheminės medžiagos įgerties į ėminių ėmimo įtaisą).
|
50.
|
Dirbant su žymėtosiomis bandomosiomis cheminėmis medžiagomis, įmanoma analizuoti pradinę medžiagą ir metabolitus. Po to ėminiai turėtų būti „išvalomi“, kad pradinę bandomąją cheminę medžiagą atskirai būtų įmanoma įvertinti kiekybiškai. Jeigu pavieniai metabolitai analizuojamame (-uose) ėminyje (-iuose) viršija 10 % bendrojo radioaktyvumo, rekomenduojama nustatyti šių metabolitų tapatybę.
|
51.
|
Turėtų būti registruojamas ir įtraukiamas į ataskaitą bendrasis regeneravimas ir bandomosios cheminės medžiagos regeneravimas iš sliekų, dirvožemio ir, jeigu naudojamos, gaudyklių su adsorbentais, siekiant sulaikyti išgaravusią bandomąja medžiagą.
|
52.
|
Atliekant bandymus su enchitrėjais, kurie yra mažesni negu sliekai, iš atitinkamo bandymo indo paimtus pavienius individus leidžiama sujungti į visumą. Jeigu pasirinkus sujungimą tenka mažinti tapačių indų skaičių, šiuo atveju apribojimas statistinių procedūrų, kurias galima taikyti duomenims, skaičius. Jeigu būtina taikyti specialią statistinę procedūrą ir statistinę galią, atliekant bandymą šiuo atveju turėtų būti naudojamas atitinkamas tapačių bandymo indų skaičius, kad būtų užtikrinamas norimas sujungimas į visumą arba taikoma procedūra ir galia.
|
53.
|
Rekomenduojama, kad BAF būtų išreiškiamas kaip bendros sausosios masės funkcija, jeigu reikia (t. y. hidrofobiškų cheminių medžiagų), arba kaip lipidų kiekio funkcija. Turėtų būti taikomi tinkami lipidų kiekio nustatymo metodai (šiam tikslui turėtų būti pritaikomi keli esami metodai, pvz., (31) (58)). Šie metodai – chloroformo ir (arba) metanolio ekstrakcijos metodika. Tačiau siekiant išvengti chlorintų tirpiklių naudojimo reikėtų rinktis modifikuotą Bligh ir Dyer metodą (9) (aprašymas pateiktas (17)). Renkantis skirtingus metodus gali nepavykti nustatyti tapačių verčių, todėl svarbu pateikti išsamią informaciją apie naudotą metodą. Jeigu įmanoma, t. y. jeigu turimas pakankamas slieko audinio kiekis, lipidų analizę geriausia atlikti naudojant tą patį bandinį ar ekstraktą, kuris naudotas analizuojant bandomąją cheminę medžiagą, nes lipidai dažnai turi būti pašalinami iš ekstrakto prieš jį pradedant analizuoti chromatografu (49). Antraip kontrolinius gyvūnus galima naudoti matuojant lipidų kiekį, kuriuo vėliau galima remtis normalizuojant BAF vertes. Pasirinkus pastarąjį metodą sumažinama įrangos tarša bandomąja chemine medžiaga.
|
DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
Rezultatų apdorojimas
54.
|
Bandomosios cheminės medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje brėžiant šios cheminės medžiagos koncentraciją sliekuose ir jiems poveikį sugerties tarpsiu darančią koncentraciją atsižvelgiant į jos kitimą laike. Kai kreivė pasiekia kreivės plokščiąją dalį ar nuostoviąją būseną (žr. sąvokų apibrėžtis 1 priedėlyje), biologinio kaupimosi kriterijus nuostovioje būsenoje (BAFss) apskaičiuojamas taip:
Ca yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme
Ca yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje
|
55.
|
Jeigu nuostovioji būsena nėra užtikrinama, greičio konstantomis grindžiamas BAFK turėtų būti nustatomas vietoje BAFss kaip aprašyta toliau:
—
|
biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK) nustatomas kaip santykis ks/ke,
|
—
|
sugerties ir šalinimo greitis visų pirmiausiai apskaičiuojami vienu metu (žr. 2 priedėlio 11 lygtį),
|
—
|
šalinimo greičio konstanta (ke) paprastai apskaičiuojama atsižvelgiant į šalinimo kreivę (t. y. tiriamojo objekto koncentracijos sliekuose kreivę šalinimo tarpsniu); tada šalinimo greičio konstanta ks apskaičiuojama atsižvelgiant į ke ir Ca vertę, kuri gaunama remiantis sugerties kreive, žr. 2 priedėlį, kuriame aprašyti šie metodai; Tinkamiausias BAFK ir greičio konstantų ks ir ke nustatymo metodas – netiesinio parametro įvertinimo metodai naudojant kompiuterį. Jeigu šalinimas akivaizdžiai nėra pirmo laipsnio, šiuo atveju turėtų būti taikomi sudėtingesni modeliai
|
|
Bandymo ataskaita
56.
|
Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukiama ši informacija:
|
Bandomoji cheminė medžiaga:
—
|
bet kokia turima informacija apie bandomosios cheminės medžiagos ūmųjį ar ilgalaikį toksiškumą (pvz., ECx, LCx„ NOEC) dirvožemio sliekams,
|
—
|
grynumas, fizinis pobūdis, fizinės ir cheminės savybės, pvz., log Kow, tirpumas vandenyje,
|
—
|
cheminės tapatybės nustatymo duomenys, bandomojo objekto šaltinis, bet kokio naudoto tirpiklio tapatybė ir koncentracija,
|
—
|
jeigu naudojama žymėtoji bandomoji cheminė medžiaga, šiuo atveju nurodoma tiksli žymėtųjų atomų padėtis, savitasis radioaktyvumas ir radiocheminis grynumas.
|
|
|
Bandomųjų rūšių gyvūnai:
—
|
mokslinis pavadinimas, veislė, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, gyvūnų amžiaus intervalas ir t. t.
|
|
|
Bandymo sąlygos:
—
|
naudotos bandymo procedūros,
|
—
|
pasirinkto apšvietimo tipas ir charakteristikos bei apšvietimo laikotarpio (ių) trukmė,
|
—
|
bandymo planas (pvz., bandymo indų skaičius ir dydis, dirvožemio masė ir dirvožemio sluoksnio storis, tapačių indų skaičius, sliekų skaičius tapačiame inde, bandomųjų koncentracijų skaičius, sugerties ir šalinimo tarpsnių trukmė, ėminių ėmimo dažnumas),
|
—
|
bandymo indo medžiagos pasirinkimo pagrindimas,
|
—
|
tiriamojo objekto paruošimo metodas ir naudojimas bei konkretaus metodo pasirinkimo priežastys,
|
—
|
nominaliosios bandymo koncentracijos, išmatuotų verčių vidurkiai ir jų standartiniai nuokrypiai bandymo induose bei šių verčių nustatymo metodai,
|
—
|
dirbtinio dirvožemio sudedamųjų dalių šaltinis arba, jeigu naudojama, natūrali terpė, dirvožemio kilmė, bet kokio išankstinio apdorojimo aprašymas, kontrolinių bandinių rezultatai (išgyvenimas, biomasės didėjimas, veisimasis), dirvožemio charakteristikos (pH, bendros organinės anglies kiekis, granuliometrinė sudėtis (procentinė smėlio, nuosėdų ir molio dalis), vandens sulaikymo geba (WHCdidž.) procentinė vandens dalis bandymo pradžioje ir pabaigoje ir bet kokie kiti atlikti matavimai,
|
—
|
išsami informacija apie dirvožemio ir sliekų ėminių apdorojimą, įskaitant duomenis apie ruošimo, sandėliavimo, bandomosios medžiagos įterpimo procedūras, bandomojo objekto sliekuose ir dirvožemyje ekstrakcijos bei analizės procedūras (ir glaudumą) ir lipidų kiekį (jeigu matuojamas) bei bandomojo objekto regeneravimą.
|
|
|
Rezultatai:
—
|
sliekų iš kontrolinių indų ir sliekų iš kiekvieno bandymo indo gaištamumas bei bet koks pastebėtas neprastas elgesys (pvz., vengimas įsirausti į dirvą, dauginimosi nebuvimas su enchitrėjais atliekant biologinio kaupimosi bandymą),
|
—
|
dirvožemio ir bandomųjų organizmų sausosios masės santykis su šlapiąja mase (naudingas atliekant normalizavimą),
|
—
|
šlapioji kirmėlių masė kiekvieną kartą imant ėminius; šlapioji sliekų masė bandymo pradžioje ir kiekvieną kartą imant ėminius prieš virškinamojo trakto turinio pašalinimą ir jį pašalinus,
|
—
|
bandomųjų organizmų lipidų kiekis (jeigu nustatomas),
|
—
|
bandomosios cheminės medžiagos sugerties kirmėlėse ir jos šalinimo iš kirmėlių kinetiką ir trukmę iki nuostoviosios būsenos apibūdinančios kreivės,
|
—
|
visų ėminių ėmimo laiko Ca ir Cs (su standartiniu nuokrypiu ir intervalu, jeigu reikia) (Ca išreiškiama viso kūno sausosios ir šlapiosios masės kg–1, Cs išreiškiama dirvožemio sausosios ir šlapiosios masės kg–1). Jeigu būtinas nuosėdų akumuliacijos faktorius (BSAF) (pvz., siekiant lyginti su skirtingo lipidų kiekio gyvūnais atliktų dviejų ar daugiau bandymų rezultatus), Ca taip pat galima išreikšti organizmo lipidų kiekiu (g kg–1) ir Cs galima išreikšti kaip dirvožemio organinės anglies kiekį (g kg-1),
|
—
|
BAF (išreikštas kaip dirvožemio kg kirmėlių –1 kg), dirvožemiui poveikio greičio konstanta ks (išreikšta g dirvožemio kg–1 kirmėlių dienų–1) ir šalinimo greičio konstanta (išreikšta diena–1); BSAF (išreikštą kg dirvožemio OC kg–1 kirmėlių lipidų kiekio) galima pateikti papildomai,
|
—
|
jeigu buvo išmatuota: procentinė dalis dirvožemyje ir bandomuosiuose gyvūnuose aptiktos pradinės cheminės medžiagos, metabolitų ir susijusių liekanų (t. y. bandomosios cheminės medžiagos, kurios neįmanoma ekstrahuoti naudojant įprastus ekstrahavimo metodus, procentinė dalis),
|
—
|
naudoti duomenų statistinės analizės metodai.
|
|
|
Rezultatų įvertinimas:
—
|
rezultatų atitiktis 17 pastraipoje išvardytiems validumo kriterijams,
|
—
|
netikėti ar neįprasti rezultatai, pvz., nevisiškas bandomosios cheminės medžiagos pašalinimas iš bandomųjų gyvūnų.
|
|
|
LITERATŪRA
1.
|
Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
|
2.
|
ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688–00a.
|
3.
|
ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676–04: 26 pp.
|
4.
|
Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
|
5.
|
Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.
|
6.
|
Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. SAFEty 25: 154–165.
|
7.
|
Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. SAFEty 31: 185–191.
|
8.
|
Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.
|
9.
|
Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.
|
10.
|
Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.
|
11.
|
Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
|
12.
|
Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.
|
13.
|
Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13–20.
|
14.
|
Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.
|
15.
|
Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2–29.
|
16.
|
Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, pp. 555–576.
|
17.
|
De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, ES, Standards, Measurement and Testing Programme.
|
18.
|
Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
|
19.
|
2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantis Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantis Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantis Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB, OL L 396, 2006 12 30, p. 1.
|
20.
|
Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
|
21.
|
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
22.
|
Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Galima parsisiųsti šiuo adresu: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
|
23.
|
Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). SAFEty factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
|
24.
|
Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
|
25.
|
EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
|
26.
|
Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.
|
27.
|
Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501–1514.
|
28.
|
Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
|
29.
|
Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78–84.
|
30.
|
Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
|
31.
|
Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
|
32.
|
Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
|
33.
|
Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
|
34.
|
Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.
|
35.
|
ISO 11268–2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
|
36.
|
Jaenike J (1982). „Eisenia foetida“ is two biological species. Megadrilogica 4: 6–8.
|
37.
|
Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
|
38.
|
Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.
|
39.
|
Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
|
40.
|
Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.
|
41.
|
Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
|
42.
|
Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.
|
43.
|
Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
|
44.
|
Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.
|
45.
|
Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. SAFEty 36: 17–26.
|
46.
|
Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.
|
47.
|
Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
|
48.
|
Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams.
|
49.
|
Šio priedo C.13 skyrius. Biologinis kaupimasis: bandymas su žuvimis pratekėjimo sąlygomis.
|
50.
|
Šio priedo C.21 skyrius. Dirvožemio mikroorganizmai: azoto transformacijos bandymas.
|
51.
|
OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
52.
|
Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
53.
|
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
54.
|
Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.
|
55.
|
Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.
|
56.
|
Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
|
57.
|
Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
|
58.
|
Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.
|
59.
|
Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
|
60.
|
Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
|
61.
|
Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
|
62.
|
Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. SAFEty 27: 107–127.
|
63.
|
Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
|
64.
|
Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433.
|
65.
|
Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100.
|
66.
|
Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
|
67.
|
Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
|
68.
|
Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.
|
69.
|
Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67–81.
|
70.
|
Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171.
|
71.
|
UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
|
72.
|
US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
|
73.
|
Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285.
|
74.
|
Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
|
75.
|
Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033.
|
76.
|
Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.
|
77.
|
Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.
|
78.
|
Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
|
79.
|
Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
|
1 priedėlis
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
|
Biologinis kaupimasis – bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios cheminės medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje. Biologinį kaupimąsi sukelia biologinės koncentracijos ir su užterštu maistu ar grobiu susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos organizme didėjimo procesai (žr. toliau).
|
|
Biologinio kaupimosi koncentracijos didėjimas – su cheminės medžiagos pasisavinimu visų pirmiausiai iš aplinkinės terpės (t. y. per kūno paviršių ir praryjamą dirvožemį) susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios cheminės koncentracija aplinkinėje terpėje.
|
|
Su užterštu maistu ar grobiu susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos organizme didėjimas – su pasisavinimu iš užteršto maisto ar grobio susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos maiste ar grobyje. Dėl su užterštu maistu ar grobiu susijusio bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos organizme didėjimo bandomasis objektas gali būti perduodamas į maisto grandines ar jose kauptis.
|
|
Bandomosios cheminės medžiagos šalinimas – šios cheminės medžiagos išskyrimas iš bandomojo organizmo audinio veikliaisiais ar pasyviaisiais procesais, kurie vyksta neatsižvelgiant į bandomojo objekto buvimą ar jo nebuvimą aplinkinėje terpėje
|
|
Biologinio kaupimosi kriterijus (BAF) bet kuriuo sugerties tarpsnio metu atliekant šį biologinio kaupimosi bandymą – bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme ar jo paviršiuje ((Ca g·kg-1 kirmėlių sausosios masės), padalinta iš cheminės medžiagos koncentracijos aplinkinėje terpėje (Cs kaip g·kg-1 dirvožemio sausosios masės); BAF vienetas yra dirvožemio kg kirmėlių kg-1).
|
|
Nuostoviosios būsenos biologinio kaupimosi kriterijus (BAFss) yra nuostovosios būsenos BAF ir ilgą laiką bent kiek labiau nesikeičia, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje (Cs kaip g kg-1 dirvožemio sausosios masės) yra pastovus šiuo laikotarpiu.
|
|
Biologinio kaupimosi kriterijai, apskaičiuoti tiesiogiai naudojantis pasisavinimo iš dirvožemio greičio konstantos ir šalinimo greičio konstantos (ks ir ke, žr. toliau) santykiu, vadinami kinetiniu biologinio kaupimosi kriterijumi (BAFK).
|
|
Biotos-nuosėdų akumuliacijos kriterijus (BSAF) – pagal į lipidų kiekį normalizuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme ar jo paviršiuje, padalyta iš pagal organinę anglį normalizuotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos dirvožemyje esant nuostoviajai būsenai. Tada Ca yra išreikšta kaip g kg-1 organizmo lipidų kiekio ir Cs išreikšta kaip g kg-1 dirvožemio organinės anglies kiekio; BSAF matuojamas kg OC kg-1 lipidų vienetais.
|
|
Nuostovioji būsena yra apibrėžiama kaip sugerties ir šalinimo procesų pusiausvyra, nusistovinti vienu metu per sugerties tarpsnį. Nuostovioji būsena užtikrinama brėžiant BAF kreivę atsižvelgiant į laiką, kai kreivė būna lygiagreti laiko ašiai ir kai trijų viena pa kitos atliktų ėminių, kurie paimti ne trumpesniais negu dviejų dienų intervalais, BAF analizių rezultatai vieni nuo kitų skiriasi ne daugiau negu 20 % ir trims ėminių ėmimo laikotarpiams nebūdingi statistiškai reikšmingi skirtumai. Jeigu naudojamos lėčiau pasisavinamos bandomosios cheminės medžiagos, tinkamesnis būtų septynių dienų intervalas (49).
|
|
Organinės anglies ir vandens pasiskirstymo koeficientas (Koc) – cheminės medžiagos koncentracijos dirvožemio organinės anglies dalyje ar prie jos santykis su cheminės medžiagos koncentracija vandenyje esant pusiausvyrai.
|
|
Oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas (Kow) – n-oktanolio cheminis tirpumas vandenyje esant pusiausvyrai, taip pat kartais išreiškiamas kaip Pow. Kow (log Kow) logaritmas naudojamas apibūdinant vandens organizmų biologinio kaupimo cheminį potencialą.
|
|
Pasisavinimo arba sugerties tarpsnis yra laikotarpis, per kurį bandomuosius organizmus veikia bandomoji cheminė medžiaga.
|
|
Pasisavinimo iš dirvožemio greičio konstanta (k2) – skaitinė vertė, kuria apibrėžiamas bandomojo objekto koncentracijos didėjimas bandomajame organizme arba jo paviršiuje, kai šį didėjimą sukelia pasisavinimo iš dirvožemio tarpsnis. ks išreiškiamas kaip g dirvožemio kg-1 kirmėlių d-1.
|
|
Šalinimo tarpsnis – laikotarpis po bandomųjų organizmų iš užterštos terpės perkėlimo į terpę be bandomojo objekto; šiuo laikotarpiu tiriamas cheminės medžiagos šalinimas (ar grynasis jos kiekio mažėjimas) iš bandomųjų organizmų.
|
|
Šalinimo greičio konstanta (ke) – skaitinė vertė, kuria apibrėžiamas bandomojo objekto koncentracijos bandomajame organizme ar jo paviršiuje mažėjimo greitis po to, kai bandomieji organizmai iš terpės su bandomuoju objektu perkeliami į terpę be šios cheminės medžiagos; ke išreiškiamas d-1.
|
|
Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
|
2 priedėlis
Pasisavinimo ir šalinimo parametrų skaičiavimas
Svarbiausias biologinio kaupimosi bandymo rezultatas yra biologinio kaupimosi kriterijus BAF. Išmatuotą BAF galima apskaičiuoti koncentraciją bandomajame organizme Ca dalinant iš koncentracijos dirvožemyje Cs esant nuostoviajai būsenai. Jeigu nuostovioji būsena per sugerties tarpsnį nėra užtikrinama, BAFK apskaičiuojamas pagal greičio konstantas, o ne pagal BAFss. Tačiau pabrėžtina, ar BAF grindžiamas nuostoviosios būsenos koncentracijomis ar negrindžiamas.
Kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK), pasisavinimo iš dirvožemio greičio konstanta (ks) ir šalinimo greičio konstanta (ke) gaunama įprastu būdu, t. y. naudojant kompiuterinius netiesinio parametro apskaičiavimo metodus, pvz., taikant (68) aprašytus modelius. Jeigu duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir lygčių modelis
|
0 < t < tc
|
[1 lygtis]
|
arba
|
t > tc
|
[2 lygtis]
|
kur:
Ca
|
=
|
cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
|
ks
|
=
|
sugerties greičio konstanta audinyje [g dirvožemio kg-1 kirmėlių d-1]
|
Ca
|
=
|
cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
|
ke
|
=
|
šalinimo greičio konstanta [d-1]
|
tc
|
=
|
laikotarpis sugerties tarpsnio pabaigoje,
|
taikant šias kompiuterių programas apskaičiuojamos BAFK, ks ir ke vertės.
Jeigu nepaveiktų kirmėlių, pvz., nulinę dieną, fono koncentracija gerokai skiriasi nuo nulinės vertės (ši situacija gali susiklostyti, pvz., metalų atžvilgiu, ši fono koncentracija (Ca,0) turėtų būti įtraukta į šias lygtis, kurios įgauna šią formą:
|
0 < t < tc
|
[3 lygtis]
|
ir
|
t > tc
|
[4 lygtis]
|
Tais atvejais, jeigu sugerties tarpsniu nustatomas didelis bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos sumažėjimas dirvožemyje, galima rinktis šiuos modelius, pvz., (67) (79):
|
[5 lygtis]
|
kur:
Cs
|
=
|
cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
|
k0
|
=
|
skilimo greičio dirvožemyje konstanta [d-1]
|
C0
|
=
|
pradinė cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
|
|
0 < t < tc
|
[6 lygtis]
|
|
t > tc
|
[7 lygtis]
|
kur:
Ca
|
=
|
cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
|
ks
|
=
|
sugerties greičio konstanta audinyje [g dirvožemio kg-1 kirmėlių d-1]
|
k0
|
=
|
skilimo greičio dirvožemyje konstanta [d-1]
|
ke
|
=
|
šalinimo greičio konstanta [d-1]
|
tc
|
=
|
laikotarpis sugerties tarpsnio pabaigoje.
|
Jeigu nuostovioji būsena užtikrinama per sugerties tarpsnį (t. y. t = ∞), 1 lygtį
|
0 < t < tc
|
[1 lygtis]
|
galima suprastinti iki:
arba
|
[8 lygtis]
|
Tada ks/ke x Cs yra arti bandomojo objekto koncentracijos kirmėlės audinyje nuostoviosios būsenos sąlygomis (Ca,ss).
Biotos-nuosėdų akumuliacijos kriterijų (BSAF) galima apskaičiuoti taip:
|
[9 lygtis]
|
kur foc yra dirvožemio organinės anglies dalis ir flip yra kirmėlės lipidų dalis; abi vertės visų pirmiausiai nustatomos pagal iš bandymo paimtus ėminius bei remiantis atitinkamai sausąja arba šlapiąja mase.
Šalinimo kinetiką galima modeliuoti naudojantis šalinimo tarpsnio duomenimis ir taikant toliau nurodytą pavyzdinę lygtį ir kompiuterinį ne linijinio parametro apskaičiavimo metodą. Jeigu duomenų taškai brėžiami kaip laiko funkcija ir gaunama bandomojo objekto koncentracijos gyvūnuose tolygi ir proporcinga mažėjimo linija, galima naudoti vieno skyriaus modelį (9 lygtis) siekiant aprašyti šalinimo trukmę.
|
[10 lygtis]
|
Šalinimo procesai kartais būna dviejų tarpsnių ir patvirtina greitą Ca vertės mažėjimą pirmuosiuose tarpsniuose; tada bandomųjų objektų netekimas lėtėja vėlesniais šalinimo tarpsniais, pvz., (27) (68). Du tarpsnius galima paaiškinti darant prielaidą, kad organizme yra du skirtingi skyriai, iš kurių bandomasis objektas šalinamas skirtingu greičiu. Šiais atvejais turėtų būti studijuojama speciali literatūra, pvz., (38) (39) (40) (78).
Naudojant pirmiau nurodytas pavyzdines lygtis taip pat galima apskaičiuoti kinetinius parametrus (ks ir ke) ir šiuo tikslu visiems sugerties tarpsnio ir šalinimo tarpsnio duomenims tuo pačiu metu taikant pirmojo laipsnio kinetikos modelį. Nuorodos į metodo, kurį taikant šiuo jungtiniu būdu galima apskaičiuoti sugerties greičio ir šalinimo greičio konstantas, aprašymą pateiktos 41), 73) ir 70).
|
[11 lygtis]
|
Pastaba:
|
Kai sugerties ir šalinimo parametrai vienu metu apskaičiuojami remiantis jungtiniais sugerties ir šalinimo duomenimis, 11 lygtyje pateiktasis „m“ yra deskriptorius, kurį naudojant kompiuterio programa atitinkamo tarpsnio duomenų rinkiniams įmanoma priskirti papildomus lygties dėmenis ir teisingai atlikti įvertinimą ((m = 1 naudojamas sugerties tarpsniui; m = 2 naudojamas šalinimo tarpsniui).
|
Vis dėlto šias pavyzdines lygtis reikėtų naudoti apdairiai, ypač tuo atveju, kai atliekant bandymą kinta bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinamumas ar (biologinis) skaidymas (žr. pvz., 79)).
3 priedėlis
DIRVOŽEMIO BIOLOGINIO KAUPIMOSI BANDYMŲ TVARKARAŠČIO PAVYZDŽIAI
Bandymas su sliekais
a)
|
Sugerties tarpsnis su 8 ėminių ėmimo datomis, naudojamomis apskaičiuojant kinetiką
Diena
|
Veikla
|
– 6
|
Pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;
|
– 4
|
Bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į dirvožemio dalį; bet kokio tirpiklio garinimas; dirvožemio sudedamųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirstymas bandymo indams; pusiausvyros užtikrinimas bandymo sąlygomis 4 dienas (3 savaitės, jeigu į dirvožemį įterpiamas metalas);
|
nuo – 3 iki – 1
|
Bandomųjų organizmų išėmimas iš auginimo kultūros siekiant juos aklimatizuoti; dirvožemio sudedamųjų dalių pasiruošimas ir drėkinimas;
|
0
|
Dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio ėminių pašalinimas iš paveiktų indų ir tirpiklio kontrolinių ėminių, kad būtų nustatyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; maisto normos dėjimas; kirmėlių svėrimas ir atsitiktinis paskirstymas po bandymo indus; pakankamų kirmėlių ėminių dalies išlaikymas siekiant nustatyti analizines fono vertes, šlapiąją ir sausąją masę ir lipidų kiekį; visų bandymo indų svėrimas siekiant kontroliuoti dirvožemio drėgmės kiekį; oro tiekimo kontrolė, jeigu naudojama uždaroji bandymo sistema;
|
1
|
Oro tiekimo kontrolė, kirmėlių elgsenos ir temperatūros registravimas dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti bandomojo objekto koncentraciją;
|
2
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
3
|
Oro tiekimo, kirmėlių elgsenos ir temperatūros kontrolė;
|
4
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
5–6
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
7
|
Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
|
8–9
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
10
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
11–13
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
14
|
Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
|
15–16
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
17
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
18–20
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
21
|
Tas pats kaip 1 dieną; dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio drėgnumo kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; sugerties tarpsnio pabaiga; kirmėlių perkėlimas iš likusių paveiktų tapačių indų į indus su švariu dirvožemiu šalinimo tarpsniui (virškinamojo trakto turinys nėra šalinamas); dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolinių ėminių.
|
|
Veiklos iki poveikio (pusiausvyros nustatymo tarpsnis) turėtų būti planuojamos atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes.
|
|
3 dienoms numatyta veikla turėtų būti vykdoma kasdien (bent darbo dienomis).
|
|
b)
|
Šalinimo tarpsnis
Diena
|
Veikla
|
– 6
|
Dirvožemio sudedamųjų dalių pasiruošimas ir drėkinimas; pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;
|
– 4
|
Dirvožemio sudedamųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirstymas po bandymo indus; inkubacija bandymo sąlygomis 4 dienas;
|
0 (sugerties tarpsnio pabaiga)
|
Dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; svėrimas ir atsitiktinis kirmėlių paskirstymas po bandymo indus; maisto normos įdėjimas; kirmėlių iš likusių paveiktų tapačių indų perkėlimas į indus su švariu dirvožemiu; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas po 4–6 val. siekiant nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją;
|
1
|
Oro tiekimo kontrolė, kirmėlių elgsenos ir temperatūros registravimas; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją;
|
2
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
3
|
Oro tiekimo, kirmėlių elgsenos ir temperatūros kontrolė;
|
4
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
5–6
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
7
|
Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
|
8–9
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
10
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
11–13
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
14
|
Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
|
15–16
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
17
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
18–20
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
21
|
Tas pats kaip 1 dieną; dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio drėgnumo kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolinių ėminių.
|
|
Dirvožemis prieš šalinimo tarpsnį turėtų būti pasiruošiamas taip pat kaip prieš sugerties tarpsnį.
|
|
3 dienoms numatyta veikla turėtų būti vykdoma kasdien (bent darbo dienomis).
|
|
Bandymas su enchitrėjais
a)
|
Sugerties tarpsnis su 8 ėminių ėmimo datomis, naudojamomis apskaičiuojant kinetiką
Diena
|
Veikla
|
– 6
|
Pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;
|
– 4
|
Bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į dirvožemio dalį; bet kokio tirpiklio garinimas; dirvožemio sudedamųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirstymas bandymo indams; pusiausvyros užtikrinimas bandymo sąlygomis 4 dienas (3 savaitės, jeigu į dirvožemį įterpiamas metalas);
|
nuo – 3 iki – 1
|
Bandomųjų organizmų išėmimas iš auginimo kultūros siekiant juos aklimatizuoti; dirvožemio sudedamųjų dalių pasiruošimas ir drėkinimas;
|
0
|
Dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio ėminių pašalinimas iš paveiktų indų ir tirpiklio kontrolinių ėminių, kad būtų nustatyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; maisto normos dėjimas į dirvožemį; kirmėlių svėrimas ir atsitiktinis paskirstymas po bandymo indus; pakankamų kirmėlių ėminių dalies išlaikymas siekiant nustatyti analizines fono vertes, šlapiąją ir sausąją masę ir lipidų kiekį; visų bandymo indų svėrimas siekiant kontroliuoti dirvožemio drėgmės kiekį; oro tiekimo kontrolė, jeigu naudojama uždaroji bandymo sistema;
|
1
|
Oro tiekimo kontrolė, kirmėlių elgsenos ir temperatūros registravimas; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti bandomojo objekto koncentraciją;
|
2
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
3
|
Oro tiekimo, kirmėlių elgsenos ir temperatūros kontrolė;
|
4
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
5–6
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
7
|
Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas į dirvožemį; dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
|
9
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
10
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
11
|
Tas pats kaip 1 dieną;
|
12–13
|
Tas pats kaip 3 dieną;
|
14
|
Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos dėjimas į dirvožemį; dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio drėgnumo kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; sugerties tarpsnio pabaiga; kirmėlių perkėlimas iš likusių paveiktų tapačių indų į indus su švariu dirvožemiu šalinimo tarpsniui (virškinamojo trakto turinys nėra šalinamas); dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolinių ėminių.
|
|
Veiklos iki poveikio (pusiausvyros nustatymo tarpsnis) turėtų būti planuojamos atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes.
|
|
3 dienoms numatyta veikla turėtų būti vykdoma kasdien (bent darbo dienomis).
|
|
4 priedėlis
Dirbtinis dirvožemis. Ruošimo ir sandėliavimo rekomendacijos
Natūralūs dirvožemiai apskritus metus iš konkretaus šaltinio gali būti neprieinami ir vietiniai organizmai bei esami mikroteršalai gali daryti įtaką bandymui, todėl atliekant šį bandymą rekomenduojama naudoti šio priedo C.8 skyriuje Toksiškumas sliekams (48) nurodytą dirbtinį substratą, dirbtinį dirvožemį. Kelių rūšių bandomieji gyvūnai gali išgyventi, augti ir daugintis šiame dirvožemyje ir todėl užtikrinamas didžiausias bandymų ir kultūros auginimo sąlygų standartizavimas bei bandymo palyginamumas laboratorijoje ir tarplaboratorinis bandymo palyginamumas.
Sudedamosios dirvožemio dalys:
Durpės:
|
10 %
|
Kiminų durpės pagal OECD gaires 207 (48);
|
Kvarcinis smėlis:
|
70 %
|
Pramoninis kvarcinis smėlis (džiovintas ore); grūdelių dydis: daugiau negu 50 % kietųjų dalelių turėtų būti 50–200 μm, tačiau visos dalelės turėtų būti ≤ 2 mm;
|
Kaolinito molis:
|
20 %
|
Kaolinito kiekis ≥ 30 %;
|
Kalcio karbonatas:
|
≤ 1 %
|
CaCO3, milteliai, cheminių atžvilgiu gryni.
|
Dirbtinio dirvožemio organinės anglies kiekį leidžiama sumažinti, pvz., durpių kiekį mažinant iki 4–5 % sauso dirvožemio kiekio ir atitinkamai didinant smėlio kiekį. Taip sumažinus organinės anglies kiekį galima apriboti dirvožemio (organinės anglies) gebą sugerti bandomąją cheminę medžiagą ir todėl galėtų padidėti bandomosios cheminės medžiagos prieinamumas kirmėlėms. Įrodyta, kad Enchytraeus albidus ir Eisenia fetida gali atitikti dauginimuisi taikomus validumo kriterijus, jeigu bandant naudojami lauko dirvožemiai su mažesniu organinės anglies kiekiu, pvz., 2,7 % (33), 61), ir yra patvirtinta patirtimi, kad šį dalyką taip pat galima užtikrinti naudojant dirbtinį dirvožemį su 5 % durpių.
Paruošimas
Dirvožemio sausosios sudedamosios dalys kruopščiai išmaišomos (pvz., dideliame laboratorijos maišytuve). Jos sumaišomos maždaug prieš savaitę iki bandymo pradžios. Sumaišytos sausosios dirvožemio sudedamosios dalys turėtų būti drėkinamos dejonizuotu vandeniu bent prieš 48 val. iki bandomojo objekto įterpimo siekiant užtikrinti rūgštingumo pusiausvyrą ir (arba) jį stabilizuoti. Nustatant pH vertę naudojamas dirvožemio ir 1 M KCl tirpalas (santykis 1:5). Jeigu pH vertė neatitinka privalomojo intervalo (6,0 ± 0,5), į dirvožemį įterpiamas pakankamas kiekis CaCO3 arba pasiruošiama nauja dirvožemio partija.
Dirbtinio dirvožemio didžiausia vandens sulaikymo geba (WHC) nustatoma pagal standartą ISO 11268-2 (35). Bent dvi dienos iki bandymo pradžios sausas dirbtinis dirvožemis yra drėkinamas įpilant reikiamą kiekį dejonizuoto ar regeneruoto vandens siekiant užtikrinti maždaug pusę galutinio vandens kiekio. Galutinis vandens kiekis turėtų būti 40 %–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. Iš anksto sudrėkintas dirvožemis bandymo pradžioje išskirstomas į tiek dalių, kiek atliekant bandymą numatoma naudoti bandomųjų koncentracijų ir kontrolinių bandinių, bei naudojant bandomojo objekto tirpalą ir (arba) įpilant dejonizuoto arba regeneruoto vandens užtikrinama, kad drėgmės kiekio vertė būtų 40–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. Drėgmės kiekis nustatomas bandymo pradžioje ir pabaigoje (105 °C temperatūroje). Drėgmės kiekis turėtų kuo geriausiai atitikti tam tikros rūšies gyvūnų reikalavimus (drėgmės kiekį taip pat galima tikrinti taip: dirvožemį nestipriai suspaudus delne, tarp pirštų turi atsirasti vandens lašeliais).
Sandėliavimas
Drėgnosios dirbtinio dirvožemio sudedamosios dalys iki naudojimo pradžios turi būti laikomos kambario temperatūros sąlygomis. Pasiruoštą, iš anksto sudrėkintą dirvožemį galima lakyti vėsioje vietoje ne ilgiau negu tris dienas iki tiriamojo objekto įterpimo į dirvožemį; būtina pasirūpinti, kad išgaruotų kuo mažesnis vandens kiekis. Dirvožemis su įterptu bandomuoju objektu turėtų būti naudojamas nedelsiant, jeigu neturima informacijos, iš kurios būtų matyti, kad tam tikrą dirvožemį leidžiama laikyti nepadarant jokio poveikio bandomojo subjekto toksiškumui ir biologiniam įsisavinamumui. Po to dirvožemio su įterptu bandomuoju objektu ėminius galima sandėliuoti tam tikram bandomajam objektui rekomenduojamomis sąlygomis, kol bus atliekama analizė.
5 priedėlis
Atliekant biologinio kaupimosi iš dirvožemio bandymus rekomenduojamos naudoti dugno mažašerių kirmėlių rūšys
Sliekai
Rekomenduojama bandomoji rūšis yra Eisenia fetida (Savigny 1826), priklausanti Lumbricidae šeimai. Nuo 1972 m. ji skiriama į du porūšius (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). Pagal Jaenike (36) jos yra iš tikrųjų atskiros rūšys. Eisenia fetida yra lengvai atpažįstami pagal šviečias segmentus jungiančias juosteles, o Eisenia Andrei yra vienalyčiai, tamsiai raudonos spalvos. Jie, ko gero, yra kilę iš Juodosios jūros regiono ir šiandien išplitę po visą pasaulį, ypač žmogaus modifikuotose buveinėse, pvz., komposto krūvose. Abiejų rūšių sliekus galima naudoti atliekant ekotoksikologinius ir biologinio kaupimosi bandymus.
Eisenia fetida ir Eisenia andrei galima įsigyti rinkoje, pvz., kaip masalą žuvims. Palyginti su kitų rūšių sliekais, minėtieji gyvena trumpiau, subręsta maždaug per 2–3 mėnesius (kambario temperatūros sąlygomis). Jiems tinkamiausia temperatūra yra maždaug 20–24 °C. Jie mėgsta palyginti drėgnus substratus, kurių pH yra beveik neutralus ir kurių didelę dalį sudaro organinės medžiagos. Šių rūšių gyvūnai jau maždaug 25 metus plačiai naudojami atliekant standartinius ekotoksikologijos bandymus, todėl jų auginimas yra gerai reglamentuotas (48) (77).
Abiejų rūšių gyvūnus galima auginti įvairių tipų gyvūninėse atliekose. Standarte ISO (35) rekomenduojama iš arklių ar galvijų mėšlo ir durpių (50:50) paruošta auginimo terpė. Terpės pH vertė turėtų būti maždaug 6–7 (koreguojama naudojant kalcio karbonatą), mažas joninis laidumas (mažesnis negu 6 mS/cm arba mažesnis negu 0,5 % druskos koncentracijos) ir neturėtų būti pernelyg užteršta amoniaku arba gyvūnų šlapimu. Taip pat leidžiama naudoti rinkai pateikiamą sodininkystės dirvožemį be priedų arba dirbtinį dirvožemį pagal OECD (48) ar jų abiejų mišinį santykiu 50:50. Substratas turėtų būti drėgnas, tačiau ne pernelyg. Galima naudoti 10–50 litrų auginimo dėžes.
Siekiant gauti standartinio amžiaus ir masės sliekus geriausia juos išsiauginti iš kokonų. Todėl suaugę sliekai sudedami į auginimo dėžę su šviežiu substratu kokonams auginti. Remiantis sukaupta patirtimi galima tvirtinti, kad neblogas auginimo greitis užtikrinamas tuo atveju, kai maždaug 100 suaugusių sliekų laikomi 1 kg substrato (šlapioji masė) Po 28 dienų suaugę sliekai yra pašalinami. Iš kokonų išsiritę sliekai bandymams naudojami subrendę, t. y. ne anksčiau negu po 2 mėnesių, tačiau ne vėliau negu po 12 mėnesių.
Minėtų rūšių sliekus galima laikyti sveikais, jeigu jie rausiasi substrate, nemėgina iš jo išsirangyti ir be perstojo dauginasi. Jeigu sliekai šliaužia labai lėtai arba jiems susiformuoja geltonos spalvos užpakalinis galas (turima omenyje (Eisenia fetida), šiuo atveju galima manyti, kad substrato yra per daug. Šiuo atveju rekomenduojama naudoti šviežią substratą ir (arba) dėžėje sumažinti individų skaičių.
Papildomos parinktos nuorodos
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1–58.
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1–81.
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49–55.
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180–201.
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London, 31: 1–171.
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
Enchitrėjai
Rekomenduojamoji rūšis yra Enchytraeus albidus Henle 1837 (baltieji sliekai). Enchytraeus albidus yra viena iš didžiausių (ne didesnės negu 15 mm) Enchytraeidae šeimos mažašerės kirmėlės ir jos išplitusios visame pasaulyje, pvz., (8). Enchytraeus albidus gyvena jūrose, ežeruose ir sausumoje esančiose buveinėse; jos daugiausiai veisiasi pūvančiose organinėse medžiagose (jūros dumbliuose, komposte) ir retai jų pasitaiko pievose (42). Šios kirmėlės veisiasi skirtingoje ekologinėje aplinkoje ir pagal tam tikrus šių kirmėlių sandaros skirtumas galima daryti išvadą, kad gali būti skirtingų šios rūšies porūšių.
Enchytraeus albidus tiekiamos rinkai ir parduodamos kaip žuvų pašaras. Privaloma patikrinti, ar kultūra nėra užteršta kitomis, paprastai mažesnių rūšių gyvūnais (60). Jeigu nustatoma tarša, visos kirmėlės turėtų būti nuplaunamos vandeniu Petrio lėkštelėje. Tada naudojant stereomikroskopą išrankiojami suaugę Enchytraeus albidus individai, kurie būtų naudojami pradedant naują auginimą. Visos kitos kirmėlės pašalinamos. Jų gyvenimo ciklas yra trumpas, nes šios kirmėlės subręsta per 33 dienas (18 °C temperatūroje) ir per 74 dienas (12 °C temperatūroje). Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos tik tos kultūros, kurios laboratorijoje buvo laikytos ne trumpiau negu 5 savaites (viena karta) ir dėl kurių nekilo jokių sunkumų.
Kitos Enchytraeus rūšys taip pat yra tinkamos, visų pirma Enchytraeus luxuriosus. Šios rūšies gyvūnai dažniausiai gyvena dirvožemyje (jų naujas aprašymas pateiktas (65)). Jeigu naudojamos kitos Enchytraeus rūšys, jos turėtų būti aiškiai identifikuojamos ir nurodomos šios rūšies pasirinkimo priežastys.
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) yra rūšis, priklausanti tai pačiai grupei kaip Enchytraeus luxuriosus. Patikimai nenustatyta, kad ji būtų išplitusi laukuose, nes jos aprašymai susiję tik su sliekų auginimu ir komposto krūvomis (Römbke 2003). Todėl jai taikomi pirminiai ekologiniai reikalavimai nėra nustatyti. Tačiau pastaruoju metu atlikus įvairių sričių laboratorinius tyrimus nustatyta, kad šios rūšies kirmėlės prisitaiko prie gana didelių dirvožemio savybių parametrų paklaidų, pvz., pH ir tekstūros (Jänsch ir kt. 2005). Pastaraisiais metais šios rūšies individai dažnai naudoti atliekant ekotoksikologijos tyrimus, nes juos lengva auginti ir patogu naudoti, pvz., Kuperman ir kt. 2003). Tačiau šios kirmėlės yra mažos (3–12 mm; vidutinis dydis 7 mm (Westheide & Müller 1996) ir todėl jas būna sunkiau tvarkyti, jeigu lyginama su Enchytraeus albidus. Jeigu ši rūšis naudojama vietoj Enchytraeus albidus, galima rinktis mažesnį bandymo indą, tačiau šia pasirinktimi nėra privaloma naudotis. Be to, nereikėtų užmiršti, kad šios rūšies individai veisiasi labai greitai, t. y. nauja palikuonių karta išauga greičiau negu per 20 dienų 20 ± 2 °C temperatūros sąlygomis (Achazi ir kt. 1999) ir net greičiau, jeigu auginami aukštesnės temperatūros sąlygomis.
Enchytraeus albidus (taip pat kitų Enchytraeus rūšių) rūšies enchitrėjus galima auginti didelės plastiko dėžėse (pvz., 30 × 60 × 10 cm arba 20 × 12 × 8 cm, pritaikytose mažoms kirmėlėms auginti), pripildytose dirbtinio dirvožemio ir rinkai pateikiamo neužteršto sodo dirvožemio be priedų mišinio. Kompostavimo medžiagos nereikėtų rinktis, nes joje gali būti toksiškų cheminių medžiagų, pvz., sunkiųjų metalų. Prieš naudojant auginimo dirvožemį jo gyvūnija turėtų būti pašalinama, t. y. šiuo tikslu jis turėtų būti tris kartus sušaldomas. Taip pat leidžiama naudoti dirbtinį dirvožemį be priemaišų, tačiau šiuo atveju dauginimosi greitis būtų mažesnis, palyginti su tuo greičiu, kuris yra užtikrinamas pasirinkus mišrius substratus. Substrato pH vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Auginimo kultūra laikoma inkubatoriuje 15 ± 2 °C temperatūroje, be šviesos. Bet kokiu atveju turėtų būti vengiama aukštesnės negu 23 °C temperatūros. Dirbtinis ir (rba) natūralus dirvožemis turėtų būti drėgnas, tačiau ne šlapias. Dirvožemį šiek tiek suspaudus delne turėtų rastis tik nedideli vandens lašeliai. Bet kokiu atveju neturėtų būti sukuriamos bedeguonės sąlygos (pvz., jeigu naudojamas dangtis, jame turi būti pakankamai angų, kad būtų užtikrinama reikiama oro kaita). Auginimo dirvožemis turėtų būti aeruojamas, t. y. atsargiai maišomas kartą per savaitę.
Traiškytomis avižomis, kurios beriamos į dirvožemio paviršiaus ertmes ir užberiamos dirvožemiu, kirmėlės turėtų būti šeriamos bent kartą per savaitę be apribojimų. Jeigu ankstesnio šėrimo pašaras dar yra likę dėžėje, duodamo pašaro kiekis turėtų būti atitinkamai koreguojamas. Jeigu likusį pašarą apninka grybelis, pašarą būtina keisti kitu traiškytų avižų kiekiu. Siekiant skatinti dauginimąsi, traiškytas avižas kas dvi savaites galima papildyti rinkai pateikiamais vitaminais papildytais baltymų milteliais. Po trijų mėnesių gyvūnai perkeliami į šviežiai pasiruoštą auginimo ar veisimo substratą. Sandariuose induose laikytinas traiškytas avižas prieš naudojant reikėtų apdoroti autoklave ar pakaitinti, kad būtų išvengta miltų erkių (pvz., Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) ar plėšriųjų erkių (pvz., Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) sukeliamų infekcijų. Užbaigus dezinfekavimą pašaras turi būti sumalamas taip, kad jį būtų įmanoma lengvai paskleisti dirvožemio paviršiuje. Pašarą taip pat gali atstoti kepimo mielės ar žuvų maistas „TetraMin®“.
Apskritai auginimo sąlygos laikomos tinkamomis, jeigu kirmėlės nemėgina išsigauti iš substrato, greitai šliaužti dirvožemiu, kirmėlėse nematyti blizgaus išorinio paviršiaus su prilipusiomis dirvožemio dalelėmis, kirmėlės būna daugiau ar mažiau baltos spalvos ir jeigu galima pamatyti skirtingo amžiaus kirmėlių. Tiesą sakant, kirmėles galima laikyti sveikomis, jeigu jos nuolat dauginasi.
Papildomos parinktos nuorodos
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616.
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.
Westheide W and Graefe U (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.
“ |