1.

Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 105 (OECD bandymo gairės Nr. 105) (1995). Šis bandymo metodas yra atnaujinta 1981 m. patvirtinto originalaus bandymo metodo Nr. 105 redakcija. Dabartinė redakcija iš esmės nesiskiria nuo 1981 m. redakcijos. Daugiausia buvo keičiamas formatas. Atnaujinant remtasi ES bandymo metodu „Tirpumas vandenyje“ (1).

2.

Cheminės medžiagos tirpumą vandenyje gali stipriai paveikti joje esančios priemaišos. Šis bandymo metodas skirtas nustatyti iš esmės grynų cheminių medžiagų, kurios yra stabilios vandenyje ir nelakios, tirpumą vandenyje. Prieš nustatant tirpumą vandenyje, naudinga gauti išankstinės informacijos apie bandomąją cheminę medžiagą, pvz., informacijos apie jos struktūrinę formulę, garų slėgį, disociacijos konstantą ir hidrolizę kaip pH funkciją.

3.

Dėstant šį bandymo metodą aprašomi du metodai – kolonėlės eliuavimo metodas ir kolbos metodas, atitinkamai taikomi, kai tirpumas yra mažesnis kaip 10–2 g/l ir kai tirpumas yra didesnis kaip 10–2 g/l. Taip pat aprašomas paprastas išankstinis bandymas. Šiuo bandymu galima nustatyti apytikrį ėminio kiekį, naudotiną per galutinį bandymą, ir laiką, reikalingą sočiai užtikrinti.

4.

Cheminės medžiagos tirpumas vandenyje yra medžiagos soties masės koncentracija vandenyje esant tam tikrai temperatūrai.

5.

Tirpumas vandenyje išreiškiamas tirpinio mase tirpalo tūryje. SI sistemos vienetas – kg/m3, bet gali būti naudojama ir g/l.

6.

Tiriant bandomąją cheminę medžiagą, etaloninių cheminių medžiagų naudoti nereikia.

7.

Bandymą geriausia atlikti 20 ± 0,5 °C temperatūroje. Pasirinktoji temperatūra turėtų būti išlaikoma pastovi visose svarbiose įrangos dalyse.

8.

Į apytikriai 0,1 g ėminio (kietosios bandomosios cheminės medžiagos turi būti pulverizuotos), esančio stikliniu kaiščiu užkimštame 10 ml talpos matavimo cilindre, kambario temperatūroje nuosekliai pilami vis didesni vandens kiekiai. Kiekvieną kartą įpylus tam tikrą vandens kiekį, mišinys kratomas 10 minučių ir vizualiai tikrinama, ar nėra neištirpusių ėminio dalelių. Jeigu supylus 10 ml vandens ėminys arba jo dalys neištirpsta, bandymas tęsiamas 100 ml talpos matavimo cilindre. Toliau pateiktoje 1 lentelėje nurodytas apytikris tirpumas esant tokiam vandens tūriui, kuriame ėminys visiškai ištirpsta. Kai tirpumas mažas, bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti gali reikėti daug laiko; tam turėtų būti skiriamos ne mažiau kaip 24 valandos. Jeigu per 24 valandas bandomoji cheminė medžiaga vis tiek neištirpsta, turėtų būti skiriama daugiau laiko (bet ne daugiau kaip 96 val.), arba turėtų būti mėginama dar labiau skiesti, siekiant išsiaiškinti, ar turėtų būti taikomas kolonėlės eliuavimo arba kolbos metodas.

1   lentelė

9.

Šis metodas pagrįstas bandomosios cheminės medžiagos eliuavimu vandeniu iš mikrokolonėlės, į kurią įdėta inertinės pagalbinės medžiagos, pirmiau padengtos pertekliniu bandomosios medžiagos kiekiu (2). Tirpumas vandenyje nustatomas pagal eliuato masės koncentraciją, susidariusią pasiekus laiko funkcijos kreivės plokščiąją dalį.

10.

Vienas iš prietaisų – mikrokolonėlė (1 paveikslas), kurioje išlaikoma pastovi temperatūra. Ji prijungiama prie recirkuliacinio siurblio (2 paveikslas) arba išlyginamojo indo (3 paveikslas). Į mikrokolonėlę įdedama inertinės pagalbinės medžiagos, laikomos vietoje mažu stiklo vatos kamščiu, kuris kartu atlieka dalelių filtravimo funkciją. Kaip pagalbinės medžiagos gali būti naudojami stiklo rutuliukai, diatomitas arba kitos inertinės medžiagos.

11.

1 paveiksle parodyta mikrokolonėlė yra tinkama prijungti prie recirkuliacinio siurblio. Kolonėlės viršutinėje dalyje yra tiek erdvės, kad joje tilptų penki sluoksniai (pradedant bandymą jie išpilami) ir penki ėminiai (atliekant bandymą jie paimami analizei). Arba šį dydį galima sumažinti, jeigu atliekant bandymą į sistemą galima įpilti vandens, kuriuo būtų pakeisti pradiniai penki su priemaišomis pašalinami sluoksniai. Kolonėlė prijungiama prie recirkuliacinio siurblio iš inertinės medžiagos pagamintais vamzdeliais, kuriais galima užtikrinti apie 25 ml/h pralaidumą. Pvz., recirkuliacinis siurblys gali būti peristaltinis arba membraninis siurblys. Reikia imtis atsargumo priemonių, kad vamzdelis neužsiterštų ir (arba) kad nevyktų adsorbcija į vamzdelio medžiagą.

12.

3 paveiksle pateikta montavimo naudojant išlyginamąjį indą schema. Pagal šią montavimo schemą mikrokolonėlėje įrengiamas vienšakis čiaupas. Išlyginamasis indas prijungiamas naudojant matinio stiklo jungtį ir vamzdelius, pagamintus iš inertinės medžiagos. Srauto, tekančio iš išlyginamoji indo, greitis turėtų būti apie 25 ml/h.

1   paveikslas

Matmenys, mm

2   paveikslas

3   paveikslas

13.

Apie 600 mg pagalbinės medžiagos perpilama į 50 ml apvaliadugnę kolbą. Tinkamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis ištirpinamas lakiame analizinio reagento kokybės tirpiklyje, ir reikiamas šio tirpalo kiekis užpilamas ant pagalbinės medžiagos. Tirpiklis visiškai išgarinamas, pavyzdžiui, sukamajame garintuve, nes kitaip eliuavimo etapu dėl paviršinio skaidymosi pagalbinė medžiaga nebus įsotinta vandeniu. Įkrauta pagalbinė medžiaga dvi valandas mirkoma apytikriai 5 mililitruose vandens, po to suspensija supilama į mikrokolonėlę. Arba dedama sausa pagalbinė medžiaga gali būti supilama į vandens pripildytą mikrokolonėlę ir dvi valandas paliekama nusistovėti pusiausvyrai.

14.

Dėl pagalbinės medžiagos įkrovimo gali kilti sunkumų ir dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai, pvz., kai bandomoji cheminė medžiaga nusėda kaip alyva. Šios problemos turėtų būti išnagrinėtos ir apie jas turėtų būti pateikta išsami informacija ataskaitoje.

15.

Srautas pradedamas leisti per kolonėlę. Rekomenduojamas srauto greitis – apie 25 ml/val.; aprašytos kolonėlės atveju tai atitinka 10 sluoksnių per valandą. Ne mažiau kaip penki pirmieji sluoksniai išpilami, kad būtų pašalintos vandenyje tirpios priemaišos. Tada recirkuliacinis siurblys paliekamas veikti tol, kol nusistovi pusiausvyra, kuri laikoma pasiekta tada, kai penkių paeiliui paimtų ėminių koncentracijos atsitiktine tvarka skiriasi ne daugiau kaip ± 30 %. Šie ėminiai turėtų būti imami laiko intervalais, per kuriuos pasikeičia ne mažiau kaip dešimt eliuato sluoksnių. Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą, gali būti naudinga nubrėžti koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivę, rodančią, ar jau pasiekta pusiausvyra.

16.

Ištisinės sekos eliuato frakcijos turėtų būti surenkamos ir analizuojamos pasirinktu metodu. Intervalo vidurio eliuato frakcijos, kurių koncentracijos yra pastovios (± 30 %) ne mažiau kaip penkiose paeiliui paimtose frakcijose, yra naudojamos nustatyti tirpumą vandenyje.

17.

Tinkamiausias eliuatas – du kartus distiliuotas vanduo. Taip pat gali būti naudojamas dejonizuotas vanduo, kurio savitoji varža didesnė kaip 10 ΜΩ/cm, o bendras organinės anglies kiekis mažesnis kaip 0,01 %.

18.

Pagal abi procedūras atliekamas antrasis matavimas, taikant perpus mažesnį srauto greitį nei pirmąjį kartą. Jeigu abiejų matavimų rezultatai sutampa, bandymas yra patenkinamas. Jeigu esant mažesniam srauto greičiui nustatomas didesnis tirpumas, srauto greitis turi būti toliau mažinamas perpus tol, kol dviem vienas po kito einančiais matavimais bus gautas toks pat tirpumas.

19.

Taikant abi procedūras turėtų būti patikrinama, ar frakcijose nėra koloidinių medžiagų, tiriant, ar nepasireiškia Tindalio efektas. Jeigu tokių dalelių yra, bandymo rezultatai negalioja, ir bandymas turėtų būti pakartojamas, prieš tai pagerinus kolonėlės filtruojamąsias savybes.

20.

Turėtų būti išmatuojamas kiekvieno ėminio pH, geriausia – naudojant specialias indikacines juosteles.

21.

Bandomoji cheminė medžiaga (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos) ištirpinama vandenyje, kurio temperatūra šiek tiek aukštesnė už bandymo temperatūrą. Pasiekus sotį, mišinys ataušinamas ir laikomas bandymo temperatūroje. Matavimas gali būti atliekamas ir esant tiksliai bandymo temperatūrai, jeigu atitinkama ėminių imtimi užtikrinama, kad bus pasiekta soties pusiausvyra. Tada bandomosios cheminės medžiagos masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame turi nebūti neištirpusių dalelių, yra nustatoma atitinkamu analizės metodu (3).

22.

Reikalingos tokios medžiagos:

23.

Išankstiniu bandymu apskaičiuojamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis, reikalingas pageidaujamam vandens tūriui įsotinti. Apytikriai penkis kartus didesnis kiekis įdedamas į kiekvieną iš trijų stiklinių indų su stikliniais kaiščiais (pvz., centrifugos vamzdžius, kolbas). Į kiekvieną indą įpilamas vandens kiekis, parinktas atsižvelgiant į analizės metodą ir tirpumo intervalą. Indai tvirtai uždaromi ir kratomi 30 °C temperatūroje. Turėtų būti naudojamas kratytuvas arba maišytuvas, galintis dirbti pastovioje temperatūroje, pvz., gali būti taikomas magnetinis maišymas termostatu kontroliuojamoje vandens vonelėje. Po paros vienas indas išimamas ir 24 valandoms paliekamas bandymo temperatūroje, kad nusistovėtų pusiausvyra, retsykiais pakratant. Tada indo turinys centrifuguojamas bandymo temperatūroje ir atitinkamu analizės metodu nustatoma bandomosios cheminės medžiagos koncentracija skaidrioje vandeninėje fazėje. Su kitomis dviem kolbomis daroma taip pat, prieš tai atitinkamai per dvi ir tris paras užtikrinus pradinę pusiausvyrą 30 °C temperatūroje. Jeigu bent paskutiniuosiuose dviejuose induose išmatuota koncentracija nesiskiria daugiau kaip 15 %, bandymas yra patenkinamas. Jeigu 1, 2 ir 3 indų rezultatai krypsta į didesnes vertes, visas bandymas turėtų būti pakartojamas taikant ilgesnius pusiausvirinimo laikotarpius.

24.

Bandymas gali būti atliekamas ir be išankstinio laikymo 30 °C temperatūroje. Kad būtų galima apskaičiuoti soties pusiausvirinimo greitį, ėminiai imami tol, kol maišymo laikas nebeturi įtakos išmatuotai koncentracijai.

25.

Turėtų būti išmatuojamas kiekvieno ėminio pH, geriausia – naudojant specialias indikacines juosteles.

26.

Turėtų būti taikomas konkrečiai cheminei medžiagai pritaikytas metodas, kadangi nedideli priemaišų medžiagų kiekiai gali būti didelių matuojamo tirpumo paklaidų priežastis. Tokių metodų pavyzdžiai: dujų arba skysčių chromatografija, titravimo metodai, fotometriniai metodai, voltamperometriniai metodai.

27.

Per kiekvieną matavimą turėtų būti apskaičiuotos ne mažiau kaip penkių iš soties kreivės plokščiosios dalies paeiliui paimtų ėminių vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai. Vidutinės vertės, gautos per du bandymus taikant skirtingus srautus, turėtų skirtis ne daugiau kaip 30 %.

28.

Apskaičiuojamas kiekvienoje iš trijų kolbų gautų atskirų rezultatų, kurie turėtų skirtis ne daugiau kaip 15 %, vidurkis.

29.

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:

30.

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:

1.

1992 m. liepos 31 d. Komisijos direktyva 92/69/EEB, septynioliktąjį kartą su technikos pažangos derinanti Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo (OL L 383, 1992 12 29, p. 113).

2.

NF T 20–045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.

3.

NF T 20–046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method“.

1.

Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 123 (OECD bandymo gairės Nr. 123) (2006 m.). 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento (POW) vertės, kai log POW neviršija 8,2, tiksliai nustatytos taikant lėto maišymo metodą (1). Todėl Šis bandymo metodas yra tinkamas tiesiogiai nustatyti didelio hidrofobiškumo medžiagų POW.

2.

Kiti 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento (POW) nustatymo metodai yra kratomos kolbos metodas (2) ir POW nustatymas remiantis atvirkštinės fazės HPLC sulaikymo savybėmis (3). Kratomos kolbos metodui būdingi artefaktai, susidarantys labai mažiems oktanolio lašeliams pereinant į vandeninę fazę. Didėjant POW vertėms, dėl šių lašelių buvimo vandeninėje fazėje vis labiau pervertinama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija vandenyje. Todėl šis metodas taikytinas tik toms cheminėms medžiagoms, kurių POW vertė mažesnė nei 4. Antrasis metodas grindžiamas patikimais tiesiogiai nustatytų POW verčių duomenimis, naudojamais tiksliai nustatyti HPLC sulaikymo savybių ir išmatuotų POW verčių tarpusavio priklausomybę. Buvo paskelbtas OECD gairių, skirtų nustatyti jonizuojamųjų cheminių medžiagų 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientus, projektas (4), tačiau jis nebenaudotinas.

3.

Šis bandymo metodas parengtas Nyderlanduose. Čia aprašytų metodų tikslumas patvirtintas ir pagerintas per tarplaboratorinį patvirtinamąjį tyrimą, kuriame dalyvavo 15 laboratorijų (5).

4.

Nagrinėjant inertines organines chemines medžiagas, nustatyta labai stiprių priklausomybių tarp 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientų (POW) ir tų medžiagų bioakumuliacijos žuvyse. Be to, įrodyta, kad POW susijęs su toksiškumu žuvims, taip pat su cheminių medžiagų sugertimi į kietąsias medžiagas, pvz., dirvožemius ir nuosėdas. Išsami šių priklausomybių apžvalga pateikta literatūros šaltinyje (6).

5.

Nustatyta didelė 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento ir kitų cheminės medžiagos savybių, kurios yra svarbios aplinkos toksikologijai ir chemijai, tarpusavio priklausomybių įvairovė. Todėl 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas ilgainiui tapo pagrindiniu kriterijumi vertinant cheminių medžiagų keliamą pavojų aplinkai, taip pat prognozuojant cheminių medžiagų išliekamumą aplinkoje.

6.

Manoma, kad atliekant lėto maišymo bandymą sumažinamas labai mažų lašelių susidarymas iš 1-oktanolio lašelių vandeninėje fazėje. Todėl nepervertinama koncentracija vandenyje, susidaranti dėl bandomosios cheminės medžiagos molekulių, susijusių su šiais lašeliais. Dėl šios priežasties lėto maišymo metodas yra labai tinkamas nustatyti POW, susijusį su cheminėmis medžiagomis, kurių numatomos log POW vertės yra 5 arba didesnės ir kurioms taikant kratomos kolbos metodą (2) veikiausiai būtų gauti klaidingi rezultatai.

7.

Cheminės medžiagos pasiskirstymo tarp vandens ir lipofilinio tirpiklio (1-oktanolio) koeficientas rodo cheminės medžiagos pusiausvyros pasiskirstymą dviejose fazėse. Pasiskirstymo tarp vandens ir 1-oktanolio koeficientas (POW) apibrėžiamas kaip bandomosios cheminės medžiagos pusiausvyros koncentracijų 1-oktanolyje, įsotintame vandeniu (CO), ir vandenyje, įsotintame 1-oktanoliu (CW), santykis.

Koncentracijų santykis yra bematis. Dažniausiai jis nurodomas kaip logaritmas pagrindu 10 (log POW). POW priklauso nuo temperatūros, todėl pateikiant duomenis turėtų būti nurodyta matavimo temperatūra.

8.

Norint nustatyti pasiskirstymo koeficientą, pasiekiama vandens, 1-oktanolio ir bandomosios cheminės medžiagos tarpusavio pusiausvyra esant pastoviai temperatūrai. Tada nustatomos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos abiejose fazėse.

9.

Bandymų sunkumus, susijusius su labai mažų lašelių susidarymu atliekant kratomos kolbos bandymą, galima sumažinti atliekant čia siūlomą lėto maišymo bandymą. Atliekant lėto maišymo bandymą, 1-oktanolio ir bandomosios cheminės medžiagos pusiausvyra pasiekiama termostatu kontroliuojamame maišomame reaktoriuje. Perėjimas iš vienos fazės į kitą pagreitinamas maišant. Maišant sukuriamas nedidelis sūkuriavimas, kuriuo pagerinamas perėjimas iš 1-oktanolio į vandenį (ir atvirkščiai) be labai mažų lašelių susidarymo (1).

10.

Kadangi kitų cheminių medžiagų, be bandomosios, buvimas gali turėti įtakos bandomosios cheminės medžiagos aktyvumo koeficientui, bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti bandoma kaip gryna cheminė medžiaga. Per 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo bandymą turėtų būti naudojama pati gryniausia cheminė medžiaga, kokios tik galima įsigyti rinkoje.

11.

Šis metodas taikomas grynoms cheminėms medžiagoms, kurios nesiskaido ar nesijungia ir kurioms nebūdinga aktyvi sąveika. Jis gali būti taikomas nustatyti tokių cheminių medžiagų ir mišinių 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą. Jeigu metodas taikomas mišiniams, nustatytieji 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientai yra sąlyginiai ir priklauso nuo cheminės bandomojo mišinio sudėties ir nuo elektrolitų, kurie naudojami kaip vandeninė fazė, sudėties. Įtraukus papildomų etapų, šis metodas taip pat gali būti taikomas besiskaidantiems arba besijungiantiems junginiams (12 skirsnis).

12.

Dėl įvairios pusiausvyros vandenyje ir 1-oktanolyje, kurie naudojami per besiskaidančių cheminių medžiagų, pvz., organinių rūgščių ir fenolių, organinių bazių ir organometalinių cheminių medžiagų, pasiskirstymo procesą, 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas yra sąlyginė konstanta, labai priklausoma nuo elektrolitų sudėties (7) (8). Todėl nustatant 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą būtina bandymo metu kontroliuoti pH ir elektrolitų sudėtį ir tai nurodyti ataskaitoje. Vertinant šiuos pasiskirstymo koeficientus, būtina atsižvelgti į ekspertų nuomonę. Taikant disociacijos konstantos (-ų) vertę (-es), turi būti parinktos tinkamos pH vertės, kad pasiskirstymo koeficientas būtų nustatytas kiekvienai jonizacijos būklei. Atliekant bandymus su organometaliniais junginiais, turi būti naudojami nekompleksodariniai buferiai. Atsižvelgiant į turimas žinias apie vandens chemiją (kompleksodaros konstantas, disociacijos konstantas), Bandymo sąlygos turėtų būti parinktos taip, būtų galima įvertinti bandomosios cheminės medžiagos atmainavimą. Per visus bandymus naudojant foninį elektrolitą turėtų būti užtikrinta tokia pat joninė jėga.

13.

Atliekant bandymą gali kilti sunkumų, kai bandymas atliekamas su cheminėmis medžiagomis, kurios prastai tirpsta vandenyje arba kurių POW yra didelis, nes koncentracijos vandenyje tampa labai mažos ir sunku jas tiksliai nustatyti. Aprašant šį bandymo metodą patariama, kaip spręsti šią problemą.

14.

Cheminiai reagentai turėtų būti analizinio arba didesnio grynumo. Rekomenduojama naudoti žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas, kurių cheminė sudėtis yra žinoma ir kurių grynumas, pageidautina, ne mažesnis kaip 99 %, arba radioaktyviu izotopu žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas, kurių cheminė sudėtis ir radiocheminis grynumas yra žinomi. Jeigu naudojamos trumpo pusinio gyvavimo atsekamosios medžiagos, turėtų būti taikomos skilimo pataisos. Jeigu naudojamos radioaktyviu izotopu žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos, turėtų būti taikomas cheminei medžiagai pritaikytas analizės metodas, kuriuo būtų užtikrinama, jog išmatuotasis radioaktyvumas būtų tiesiogiai susijęs su bandomąja chemine medžiaga.

15.

Log POW įvertis gali būti gaunamas naudojant komercinę programinę įrangą, skirtą apskaičiuoti log POW, arba naudojant tirpumo abiejuose tirpikliuose santykį.

16.

Prieš atliekant lėto maišymo bandymą, skirtą nustatyti POW, reikėtų gauti tokią informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą:

17.

Reikalinga įprasta laboratorinė įranga, pirmiausia šie dalykai:

18.

Indai turėtų būti pagaminti iš inertinės medžiagos, kad adsorbcija į indo paviršių būtų labai maža.

19.

POW turėtų būti nustatomas naudojant patį gryniausią 1-oktanolį, kokio tik galima įsigyti rinkoje (ne mažesnio kaip 99 % grynumo). Rekomenduojama 1-oktanolį gryninti jį ekstrahuojant rūgštimi, baze ir vandeniu, o tada išdžiovinant. Be to, 1-oktanolis gali būti gryninamas distiliavimo būdu. Išgrynintas 1-oktanolis bus naudojamas paruošti etaloninius bandomųjų cheminių medžiagų tirpalus. Nustatant POW naudojamas vanduo turi būti distiliuotas stiklu arba kvarcu arba išgautas iš gryninimo sistemos, arba turi būti naudojamas HPLC kokybės vanduo. Distiliuotas vanduo turi būti filtruojamas per 0,22 μm filtrą; siekiant patikrinti, ar koncentruotuose ekstraktuose nėra priemaišų, kurios galėtų susimaišyti su bandomąja chemine medžiaga, taip pat turėtų būti įterpiami tuštieji ėminiai. Jeigu naudojamas stiklo pluošto filtras, jis turėtų būti išvalytas ne trumpiau kaip tris valandas kaitinant 400 °C temperatūroje.

20.

Prieš bandymą abu tirpikliai įsotinami vienas kitu pasiekiant jų pusiausvyrą pakankamai dideliame inde. Tai atliekama dvi paras lėtai maišant dviejų fazių sistemą.

21.

Parenkama tinkama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija ir ištirpinama 1-oktanolyje (įsotintame vandeniu). 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas turi būti nustatytas atskiestuose tirpaluose, įpiltuose į 1-oktanolį ir vandenį. Todėl bandomosios cheminės medžiagos koncentracija neturėtų viršyti 70 % jos tirpumo, susidarant ne didesnei kaip 0,1 M koncentracijai kiekvienoje fazėje (1). Per bandymą naudojami 1-oktanolio tirpalai turi būti be suspenduotos kietosios bandomosios cheminės medžiagos.

22.

Tinkamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis ištirpinamas 1-oktanolyje (įsotintame vandeniu). Jeigu POW įvertis didesnis kaip penki, būtina imtis atsargumo priemonių, kad per bandymą naudojamuose 1-oktanolio tirpaluose nebūtų suspenduotos kietosios bandomosios cheminės medžiagos. Šiuo tikslu su cheminėmis medžiagomis, kurių apskaičiuotoji log POW vertė didesnė kaip 5, atliekama tokia procedūra:

23.

Bandomajai cheminei medžiagai ištirti turėtų būti taikomas patvirtintas analizės metodas. Tyrinėtojai turi pateikti įrodymų, kad koncentracijos vandeniu įsotintoje 1-oktanolio ir 1-oktanoliu įsotintoje vandeninėje fazėje per bandymą viršija metodinę taikomų analizės procedūrų kiekybinio vertinimo ribą. Tais atvejais, kai būtina taikyti ekstrahavimo metodus, prieš bandymą turi būti nustatytas analizinis bandomosios cheminės medžiagos regeneravimas iš vandeninės fazės ir iš 1-oktanolio fazės. Analizinis signalas turi būti koreguojamas atsižvelgiant į tuščiuosius ėminius, ir turėtų būti imtasi atsargumo priemonių, kad analitės nebūtų perkeltos iš vieno ėminio į kitą.

24.

Atsižvelgiant į gana mažas hidrofobinių bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijas vandeninėje fazėje, prieš atliekant analizę veikiausiai reikės ekstrahuoti vandens fazę naudojant organinį tirpiklį ir paruošti parengtinę ekstrakto koncentraciją. Dėl tos pat priežasties būtina sumažinti atsitiktines tuščiąsias koncentracijas. Šiuo tikslu būtina naudoti didelio grynumo tirpiklius, pageidautina – likučių analizei naudojamus tirpiklius. Be to, naudojant iš anksto kruopščiai išvalytus (pvz., išplautus tirpikliais arba pakaitintus aukštoje temperatūroje) stiklinius indus, galima išvengti kryžminės taršos.

25.

Log POW įvertį galima gauti naudojant skaičiavimo programą arba remiantis ekspertų nuomone. Jeigu vertė didesnė už šešis, būtina atidžiai stebėti su tuščiaisiais ėminiais susijusias pataisas ir analičių perkėlimą. Atitinkamai, jeigu log POW vertė didesnė už šešis, regeneravimo pataisoms privaloma taikyti pakaitinį etaloną, kad būtų galima pasiekti didelius parengtinės koncentracijos koeficientus. Rinkoje galima įsigyti įvairios programinės įrangos, skirtos apskaičiuoti log POW  (1), pvz., „Clog P“ (16), „KOWWIN“ (17), „ProLogP“ (18) ir „ACD log P“ (19). Skaičiavimo principų aprašymai pateikti literatūros šaltiniuose (20–22).

26.

Kiekybinio įvertinimo ribos (KĮR), taikytinos tiriant bandomąją cheminę medžiagą 1-oktanolyje ir vandenyje, nustatomos taikant patvirtintus metodus. Metodinė kiekybinio įvertinimo riba gali būti apytikriai nustatyta kaip koncentracija vandenyje arba 1-oktanolyje, kuriai esant gaunamas signalo ir triukšmo santykis, lygus dešimčiai. Turėtų būti parinktas tinkamas ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metodas; be to, turėtų būti taikomas analizinis regeneravimas. Norint prieš analitinį tyrimą gauti reikiamo dydžio signalą, būtina parinkti tinkamą parengtinės koncentracijos koeficientą.

27.

Remiantis analizės metodo parametrais ir numatomomis koncentracijomis, nustatomas apytikris imties dydis, reikalingas norint tiksliai nustatyti mišinio koncentraciją. Neturėtų būti naudojami vandens ėminiai, kurie yra per maži, kad būtų galima gauti pakankamą analizinį signalą. Be to, neturėtų būti naudojami pernelyg dideli vandens ėminiai, nes gali likti per mažai vandens minimaliam reikiamų analizių skaičiui (n = 5). 1 priedėlyje nurodytas mažiausias ėminio tūris, kaip indo tūrio funkcija, bandomosios cheminės medžiagos AR ir bandomosios medžiagos tirpumas.

28.

Bandomųjų cheminių medžiagų kiekybinis įvertinimas atliekamas lyginant atitinkamo mišinio kalibravimo kreives. Koncentracija analizuojamuose ėminiuose turi būti sulyginama su etaloninėmis koncentracijomis.

29.

Jeigu bandomosios cheminės medžiagos log POW įvertis didesnis už šešis, prieš ekstrahavimą vandens ėminiui turi būti pritaikytas pakaitinis etalonas, kad būtų galima užregistruoti nuostolius, susidarančius vandens ėminių ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metu. Kad regeneravimo pataisa būtų tiksli, pakaitalų savybės turi būti labai panašios į bandomosios cheminės medžiagos savybes arba tokios pat. Pageidautina, kad šiuo tikslu būtų naudojami (stabilūs) izotopais žymėtieji dominančių cheminių medžiagų analogai (pvz., deuterizuotieji arba žymėtieji izotopu 13C). Jeigu žymėtųjų stabilių izotopų, pvz., 13C arba 2H, naudoti neįmanoma, remiantis patikimais literatūroje pateiktais duomenimis turėtų būti įrodyta, kad pakaitalo fizinės ir cheminės savybės labai panašios į bandomosios cheminės medžiagos savybes. Pagal skysčių ekstrahavimo skysčiais principą ekstrahuojant vandeninę fazę, gali susidaryti emulsijos. Jų susidarymą galima sumažinti įpilant druskos ir paliekant emulsiją nakčiai nusistovėti. Ataskaitoje turi būti nurodyti taikyti ėminių ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metodai.

30.

Iš 1-oktanolio fazės ekstrahuoti ėminiai prieš atliekant analizę prireikus gali būti atskiedžiami tinkamu tirpikliu. Be to, jeigu per cheminių medžiagų regeneravimo bandymus pastebimi dideli regeneravimo bandymų nuokrypiai (santykinis standartinis nuokrypis didesnis kaip 10 %), rekomenduojama regeneravimo pataisos tikslais naudoti pakaitinius etalonus.

31.

Ataskaitoje būtina išsamiai aprašyti analizės metodą. Turėtų būti nurodytas ekstrahavimo metodas, parengtinės koncentracijos ir skiedimo koeficientai, kalibravimo tvarka, kalibravimo intervalas, bandomosios cheminės medžiagos analizinis regeneravimas iš vandens, pakaitinių etalonų naudojimas regeneravimo pataisos tikslais, tuščiosios vertės, aptikimo ribos ir kiekybinio įvertinimo ribos.

32.

Parenkant vandens ir 1-oktanolio kiekius, reikėtų atsižvelgti į kiekybinio įvertinimo ribas 1-oktanolyje ir vandenyje, vandens ėminiams taikomus parengtinės koncentracijos koeficientus, imamus 1-oktanolio ir vandens kiekius ir į numatomas koncentracijas. Bandymo sumetimais 1-oktanolio kiekis lėto maišymo sistemoje turėtų būti parinktas taip, kad 1-oktanolio sluoksnis būtų gana storas (> 0,5 cm), jog 1-oktanolio fazės ėminius būtų galima imti nesuardant šio sluoksnio.

33.

Tipiniai fazių santykiai, taikomi tiriant mišinius, kurių log POW vertės yra 4,5 ir didesnės, yra 20–50 ml 1-oktanolio ir 950–980 ml vandens vieno litro talpos inde.

34.

Atliekant bandymą reaktorius kontroliuojamas termostatu siekiant sumažinti temperatūros kaitą iki mažiau kaip 1 °C. Tyrimas turėtų būti atliekamas 25 °C temperatūroje.

35.

Bandymų sistema turėtų būti apsaugota nuo dienos šviesos, bandymą atliekant tamsioje patalpoje arba reaktorių uždengiant aliuminio folija.

36.

Bandymas turėtų būti atliekamas nedulkėtoje (kiek įmanoma) aplinkoje.

37.

1-oktanolio ir vandens sistema maišoma, kol pasiekiama pusiausvyra. Per bandomąjį eksperimentą, atliekant lėto maišymo eksperimentą ir periodiškai imant vandens ir 1-oktanolio ėminius, įvertinamas pusiausvirinimo laikotarpis. Minimalus ėminių ėmimo laiko intervalas – penkios valandos.

38.

Kiekvienas POW turėtų būti nustatomas atliekant ne mažiau kaip tris atskirus lėto maišymo bandymus.

39.

Daroma prielaida, kad pusiausvyra pasiekiama tada, kai koncentracijų 1-oktanolyje ir vandenyje santykio priklausomybės nuo laiko kreivės nuolydis laikotarpiu, apimančiu keturis laiko momentus, įgyja beveik nulinę vertę, kai p reikšmė lygi 0,05. Trumpiausias pusiausvirinimo laikotarpis – viena para iki galimos ėminių ėmimo pradžios. Ėminių ėmimas iš cheminių medžiagų, kurių log POW įvertis mažesnis nei penki, apytikriai gali būti atliekamas antrąją ir trečiąją paromis. Kai tiriamos didesnio hidrofobiškumo medžiagos, pusiausvirinimo laikotarpis gali būti ilgesnis. Jeigu mišinio log POW vertė lygi 8,23 (dekachlorobifenilas), pusiausvyrai nusistovėti pakanka 144 valandų. Pusiausvyra įvertinama pakartotinai imant ėminius iš vieno indo.

40.

Pradedant bandymą reaktorius pripildomas 1-oktanoliu įsotinto vandens. Turėtų būti skiriama pakankamai laiko, kol bus pasiekta termostatu reguliuojama temperatūra.

41.

Pageidaujamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis (ištirpintas reikiamame vandeniu įsotinto 1-oktanolio kiekyje) atsargiai įdedamas į reaktorių. Tai labai svarbus bandymo etapas, nes būtina išvengti sūkurinio dviejų fazių maišymosi. Šiuo tikslu 1-oktanolio fazė gali būti lėtai lašinama pipete ant bandymų indo sienelės nedideliu atstumu nuo vandens paviršiaus. Tada ji nutekės stiklo sienele ir sudarys ploną sluoksnį virš vandeninės fazės. Visada reikėtų vengti tiesiogiai filtruoti 1-oktanolį į kolbą; 1-oktanolio lašeliams neturėtų būti leidžiama tiesiogiai kristi į vandenį.

42.

Pradėjus maišyti, maišymo greitis turėtų būti pamažu didinamas. Jeigu maišymo greičio negalima tinkamai sureguliuoti, turėtų būti apsvarstyta galimybė naudoti transformatorių. Maišymo greitis turėtų būti sureguliuotas taip, kad ties vandens ir 1-oktanolio sąlyčio vieta susidarytų 0,5–2,5 cm gylio sūkurys. Sūkurio gyliui viršijus 2,5 cm, maišymo greitis turėtų būti sumažintas; kitaip iš 1-oktanolio lašelių vandeninėje fazėje gali susidaryti labai maži lašeliai, o dėl to gali būti pervertinta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija vandenyje. Ne didesnį kaip 2,5 cm gylį atitinkantis maišymas rekomenduojamas atsižvelgiant į tarplaboratorinio patvirtinamojo tyrimo rezultatus (5). Tai greito pusiausvyros pasiekimo ir labai mažų 1-oktanolio lašelių susidarymo ribojimo kompromisas.

43.

Prieš imant ėminius maišytuvas turėtų būti išjungtas, ir reikėtų palaukti, kol skysčiai nustos judėti. Baigus imti ėminius, maišytuvas vėl iš lėto paleidžiamas, kaip aprašyta pirmiau, ir pamažu didinamas maišymo greitis.

44.

Vandeninės fazės ėminiai imami iš čiaupo, įrengto reaktoriaus apačioje. Visada atmeskite nenaudingą vandens kiekį, susikaupusį čiaupuose (2 priedėlyje parodytame inde – apie 5 ml). Čiaupuose susikaupęs vanduo nemaišomas, todėl nepasiekiama jo pusiausvyra su pagrindine mase. Užsirašykite vandens ėminių tūrį ir pasirūpinkite, kad nustatant masių balansą būtų atsižvelgta į bandomosios cheminės medžiagos kiekį atmestame vandenyje. Garavimo nuostoliai turėtų būti sumažinti leidžiant vandeniui inertiškai tekėti į skirstomąjį piltuvą, kad nebūtų drumsčiamas vandens ir 1-oktanolio sluoksnis.

45.

1-oktanolio ėminiai gaunami 100 mikrolitrų švirkštu, pagamintu tik iš stiklo ir metalo, paimant mažą (apie 100 μl) 1-oktanolio sluoksnio alikvotinę dalį. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nebūtų suardyta riba. Užregistruojamas paimto skysčio tūris. Pakanka paimti mažą alikvotinę tirpalo dalį, nes 1-oktanolio ėminys bus atskiestas.

46.

Turėtų būti vengiama nebūtinų ėminio perkėlimo veiksmų. Šiuo tikslu ėminio tūris turėtų būti nustatomas gravimetriniu būdu. Imant vandens ėminius tai galima užtikrinti vandens ėminį imant skirstomajame piltuve, kuriame jau yra reikiamas tirpiklio kiekis.

47.

Pagal šį bandymo metodą POW nustatomas vienodomis sąlygomis atliekant tris lėto maišymo bandymus (tris atskirus bandymus) su tiriamu mišiniu. Regresija, naudojama įrodyti pusiausvyros pasiekimą, turėtų būti grindžiama bent keturių CO/CW santykių nustatymo nuosekliais laiko momentais rezultatais. Tai suteikia galimybę apskaičiuoti dispersiją, kuria išreiškiamas per kiekvieną atskirą bandymą gautos vidutinės vertės neapibrėžtis.

48.

POW vertė gali būti apibūdinama duomenų, gautų per kiekvieną atskirą bandymą, dispersija. Ši informacija naudojama apskaičiuoti POW, kaip svertinį atskirų bandymų rezultatų vidurkį. Šiuo tikslu kaip svoris naudojamas atskirų bandymų rezultatų dispersijai atvirkštinis dydis. Todėl duomenys, kuriems būdingas didelis nuokrypis (išreikštas dispersija) ir atitinkamai mažesnis patikimumas, rezultatui turės mažiau įtakos nei duomenys, kuriems būdinga maža dispersija.

49.

Lygiai taip pat apskaičiuojamas svertinis standartinis nuokrypis. Juo apibūdinamas POW matavimų pakartojamumas. Maža svertinio standartinio nuokrypio vertė reiškia, kad toje pačioje laboratorijoje gautiems POW nustatymo rezultatams būdingas labai aukštas pakartojamumas. Toliau aprašytas formalus statistinis duomenų apdorojimas.

50.

Kiekvienam ėminių ėmimo laiko momentui apskaičiuojamas bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų 1-oktanolyje ir vandenyje santykio logaritmas (log (CO/Cw)). Cheminės pusiausvyros pasiekimas įrodomas nubrėžiant šio santykio, kaip laiko funkcijos, kreivę. Šios kreivės plokščioji dalis, pagrįsta ne mažiau kaip keturiais nuosekliais laiko momentais, rodo, kad buvo pasiekta pusiausvyra ir kad mišinys iš tikrųjų ištirpo 1-oktanolyje. Priešingu atveju bandymas turi būti tęsiamas tol, kol remiantis keturiais nuosekliais laiko momentais negaunama kreivės nuolydžio, kurio vertė beveik nesiskiria nuo nulio, kai p reikšmė lygi 0,05, t. y. reiškiantis, kad log Co/Cw vertė nepriklauso nuo laiko.

51.

Atskiro bandymo log POW vertė apskaičiuojama kaip svertinė vidutinė log Co/Cw vertė, pagrįsta log Co/Cw kreivės, kaip laiko funkcijos, dalimi, kurioje įrodytas pusiausvyros susidarymas. Svertinis vidurkis apskaičiuojamas duomenims taikant svorius, išreikštus dispersijai atvirkštiniu dydžiu, kad duomenų įtaka galutiniam rezultatui būtų atvirkščiai proporcinga duomenų neapibrėžčiai.

52.

Vidutinė atskirų bandymų log POW vertė apskaičiuojama kaip atskirų bandymų rezultatų, kuriems buvo pritaikyti jų atitinkamomis dispersijomis pagrįsti svoriai, vidurkis.

Skaičiuojama taip:

čia:

Atvirkštinis log POW,i dispersijai dydis yra wi ().

53.

Log POW vidurkio paklaida apskaičiuojama kaip log Co/Cw, nustatyto atskirų bandymų pusiausvirinimo etapu, pakartojamumas. Jis išreiškiamas kaip log POW,Av (σlog Pow,Av) svertinis standartinis nuokrypis, kuris savo ruožtu yra log POW,Av paklaidos matas. Svertinis standartinis nuokrypis gali būti skaičiuojamas remiantis svertine dispersija (varlog Pow,Av):

Simbolis n reiškia atskirų bandymų skaičių.

54.

Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.

1.

De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512.

2.

Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas.

3.

Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas.

4.

OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

5.

Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

6.

Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

7.

Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

8.

Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602.

9.

OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

10.

Šio priedo A.6 skyrius. Tirpumas vandenyje.

11.

Šio priedo C.7 skyrius. Skaidymas. Abiotinis skaidymas. Hidrolizė kaip pH funkcija.

12.

Šio priedo C.4 skyrius. II–VII dalys (A–F metodai). „Lengvo“ biologinio skaidomumo matavimas.

13.

Šio priedo A.4 skyrius. Garų slėgis.

14.

Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626.

15.

Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2–1 to 2–52.

16.

Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

17.

Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

18.

Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

19.

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

20.

Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.

21.

Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488.

22.

Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386–390.

1.

Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 403 (OECD bandymo gairės Nr. 403) (2009) (1). Pirmosios ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymų gairės |Nr. 403 (TG 403) priimtos 1981 m. Šis atnaujintas B.2 bandymo metodas (lygiavertis atnaujintoms TG 403) parengtas siekiant užtikrinti didesnį lankstumą, naudoti mažiau gyvūnų ir įgyvendinti reglamentavimo reikmes. Atnaujintasis bandymo metodas sudarytas iš dviejų rūšių tyrimų: įprasto LC50 protokolo ir protokolo „Koncentracija × laikas“ („K × l“). Pagrindinės šio bandymo metodo savybės yra galimybė nustatyti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę remiantis nemirtinomis ir mirtinomis pasekmėmis, siekiant nustatyti medianinę mirtiną koncentraciją (LC50), nemirtiną ribinę koncentraciją (pvz., LC01) ir kreivės nuolydį, taip pat galimą jautrumą pagal lytį. „K × l“ protokolas turėtų būti naudojamas tada, kai yra specialiųjų reglamentavimo arba mokslinių reikmių, dėl kurių būtina atlikti įvairios trukmės bandymus su gyvūnais, pvz., reagavimo į nepaprastąsias aplinkybes planavimo [pvz., ūmaus poveikio rekomendacinių lygių (ŪPRL) nustatymo, reagavimo į nepaprastąsias aplinkybes planavimo gairių (RNAPG) parengimo arba ūmaus poveikio ribinių lygių (ŪPRL) verčių nustatymo] arba žemėnaudos planavimo tikslais.

2.

Šio bandymo metodo tyrimų atlikimo ir aiškinimo gairės pateiktos rekomendaciniame dokumente dėl ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymo (RD Nr. 39) (2).

3.

Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir RD Nr. 39 (2).

4.

Šiuo bandymo metodu galima nustatyti bandomosios cheminės medžiagos savybes ir atlikti kokybinį rizikos vertinimą, taip pat įvertinti ir klasifikuoti bandomąsias chemines medžiagas pagal Reglamentą (EB) Nr. 1272/2008 (3). RD Nr. 39 (2) pateikiamos rekomendacijos, kaip pasirinkti tinkamą bandymo metodą, skirtą ūmaus poveikio tyrimams. Kai reikalinga informacija tik apie klasifikavimą ir ženklinimą, paprastai rekomenduojama remtis šio priedo B.52 skyriumi (4) [žr. RD Nr. 39 (2)]. Šis (B.2) bandymo metodas nėra specialiai skirtas specialiosios paskirties medžiagų, pvz., mažo tirpumo izomerinių arba pluoštinių medžiagų arba dirbtinių nanomedžiagų, bandymams.

5.

Prieš svarstydama galimybę atlikti bandymus pagal šį bandymo metodą, bandymų laboratorija, siekdama sumažinti bandymų su gyvūnais poreikį, turėtų peržiūrėti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, įskaitant esamus tyrimus (pvz., šio priedo B.52 skyrius (4)), kurių duomenys leistų neatlikti papildomų bandymų. Pasirinkti tinkamiausią gyvūnų rūšį, padermę, lytį, poveikio būdą ir tinkamas bandymų koncentracijas gali padėti informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomi panaudojimo būdai ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas [žr. RD Nr. 39 (2)].

6.

Turėtų būti kaip įmanoma vengiama atlikti ėsdinančių ir (arba) dirginančių bandomųjų cheminių medžiagų bandymus naudojant koncentracijas, kurios, tikėtina, sukeltų didelį skausmą ir (arba) kančią. Ėsdinimo ir (arba) dirginimo galimybė turėtų būti vertinama pasitelkiant ekspertų nuomonę ir remiantis tokiais įrodymais kaip patirtis su žmonėmis ir gyvūnais (pvz., remiantis kartotinių dozių tyrimais, atliktais naudojant neėsdinančias ir (arba) nedirginančias koncentracijas), turimi in vitro duomenys (pvz., remiantis šio priedo B.40 (5) ir B.40 bis (6) skyriais arba OECD TG 435 (OECD bandymo gairės Nr. 425) (7)), pH vertės, informacija apie panašias chemines medžiagas arba kiti tinkami duomenys, pvz., norint ištirti, ar galima neatlikti papildomų bandymų. Jeigu yra specialiųjų reglamentavimo reikmių (pvz., nepaprastųjų aplinkybių planavimo tikslais), taikant šį bandymo metodą gyvūnai gali būti veikiami šiomis medžiagomis, nes pagal šį bandymo metodą tyrimo vadovas arba vyriausiasis tyrėjas turi galimybę kontroliuoti tikslinių koncentracijų pasirinkimą. Tačiau tikslinės koncentracijos neturėtų sukelti stipraus dirginimo ir (arba) ėsdinimo, bet turėtų būti pakankamos, kad būtų galima pratęsti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivę į tokių lygių, kad būtų pasiektas reglamentavimo arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncentracijos turėtų būti parinktos atsižvelgiant į konkretų atvejį, ir turėtų būti pateiktas tokių koncentracijų pasirinkimo pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)].

7.

Šis atnaujintasis B.2 bandymo metodas skirtas gauti pakankamai informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos ūmų toksiškumą, kad ją būtų galima klasifikuoti ir pateikti gaištamumo duomenis (pvz., LC50, LC01 ir kreivės nuolydis), susijusius su viena arba abejomis lytimis ir reikalingus kiekybiniams rizikos vertinimams. Pagal šį bandymo metodą siūlomi du metodai. Pirmasis metodas yra įprastas protokolas, pagal kurį gyvūnų grupės veikiamos ribine koncentracija (ribinis bandymas) arba iš anksto nustatytą laiką, paprastai – keturias valandas, veikiamos įvairiomis pamažu didinamomis koncentracijomis. Atsižvelgiant į specialius reglamentavimo tikslus, gali būti taikomi ir kitokie poveikio laikotarpiai. Antrasis metodas yra („K × l“) protokolas, pagal kurį gyvūnų grupės veikiamos viena (ribine) koncentracija arba įvairiais laikotarpiais veikiamos skirtingomis koncentracijomis.

8.

Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymių, turėtų būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatą laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištančius arba sunkiai kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl pasekmių žmonėms (8).

9.

Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Tinkamiausia rūšis yra žiurkės; jeigu naudojama kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.

10.

Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Poveikio dieną gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaugę, 8–12 savaičių amžiaus, o masė pagal kiekvieną lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka ir paženklinami, kad būtų galima identifikuoti kiekvieną gyvūną. Ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo pradžios gyvūnai laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų. Prieš bandymus gyvūnai taip pat turėtų būti trumpai papratinami prie bandymų aparatūros, nes tai padės sumažinti įtampą, kylančią patekus į naują aplinką.

11.

Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, bet jis gali būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš dozės davimą ir davus dozę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grupėmis pagal lytį ir koncentraciją; narvelyje laikomų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad būtų galima aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną ir kad būtų patiriama kuo mažiau žalos dėl kanibalizmo ir grumtynių. Jeigu dozė gyvūnams duodama tik per nosį, gali reikėti juos pripratinti prie uždaromųjų vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyvūnams neturėtų kelti didelės fizinės, terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali turėti fiziologinių pasekmių, pvz., turėti poveikio kūno temperatūrai (hipertermija) ir (arba) per minutę įkvepiamam tūriui. Jeigu yra bendrųjų duomenų, rodančių, kad tokių pastebimų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždaromųjų vamzdelių nebūtinas. Gyvūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu turėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis nebūtų filtruojamas per kitų narvelyje esančių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, duodant neribotą geriamo vandens kiekį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką.

12.

Parenkant inhaliacinę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį ir bandymo tikslą. Pirmenybė teikiama dozės davimui tik per nosį (ši sąvoka apima sąvokas „tik per galvą“, „tik per nosį“ ir „tik per šnipą“). Pirmenybė dozės davimui tik per nosį paprastai teikiama tiriant skystųjų arba kietųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali būti sėkmingiau pasiekti taikant poveikio per visą kūną metodą, tačiau tai turi būti pagrįsta tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovumą naudojant poveikio per visą kūną kamerą, visa bandomųjų gyvūnų užimama erdvė turėtų neviršyti 5 % kameros tūrio. Poveikio tik per nosį ir poveikio per visą kūną metodų principai ir konkretūs šių metodų privalumai bei trūkumai aprašyti RD Nr. 39 (2).

13.

Poveikio tik per nosį trukmė atliekant bandymus su žiurkėmis gali būti bet kokia, tačiau ne ilgesnė kaip 6 valandos. Jeigu poveikis tik per nosį taikomas pelėms, poveikio trukmė paprastai neturėtų viršyti keturių valandų. Jeigu reikalingi ilgesnės trukmės tyrimai, būtinas pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)]. Gyvūnai, kurie veikiami aerozoliais poveikio per visą kūną kamerose, turėtų būti laikomi atskirai, kad kiti viename narvelyje laikomi gyvūnai laižydami nenurytų bandomosios cheminės medžiagos. Poveikio metu gyvūnas neturėtų būti šeriamas. Vandens gali būti duodama per visą laikotarpį, kuriuo gyvūnas veikiamas per visą kūną.

14.

Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga dujų, garų, aerozolių arba jų mišinių pavidalu. Per tyrimą naudotina fizinė būsena priklauso nuo fizinių ir cheminių bandomosios cheminės medžiagos savybių, pasirinktos koncentracijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiagą. Higroskopinės ir chemiškai reaguojančios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos sauso oro sąlygomis. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad būtų išvengta sprogių koncentracijų susidarymo.

15.

Dalelių rūšiavimas pagal dydį turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis būtų padarytas visoms svarbioms kvėpavimo takų sritims, rekomenduojama naudoti aerozolius, kurių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 1–4 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis (σg) – 1,5–3,0 (2) (9) (10). Nors turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad šio standarto būtų laikomasi, jeigu jo įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti pateikta ekspertų nuomonė. Pvz., metalų garai gali būti mažesni už šį standartą, o įelektrintos dalelės, pluoštai ir higroskopinės medžiagos (kurios padidėja drėgnoje kvėpavimo takų aplinkoje) gali viršyti šį standartą.

16.

Siekiant užtikrinti reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ir dalelių dydį atmosferoje, gali būti naudojamas nešiklis. Paprastai pirmenybė teikiama vandeniui. Siekiant užtikrinti reikiamą dalelių dydžio pasiskirstymą, iš dalelių sudaryta medžiaga gali būti apdorojama mechaniškai, tačiau turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad bandomoji medžiaga nebūtų suskaidyta arba nebūtų pakeistos jos savybės. Kai manoma, kad mechaniškai apdorojus bandomąją cheminę medžiagą pasikeitė jos cheminė sudėtis (pvz., dėl labai aukštų temperatūrų, susidariusių dėl trinties pernelyg stipriai malant), bandomosios cheminės medžiagos sudėtis turėtų būti patikrinta analizės būdu. Turėtų būti imamasi tinkamų atsargumo priemonių, kad bandomoji cheminė medžiaga nebūtų užteršta. Nebūtina tikrinti netrapių granulių pavidalo medžiagų, kurios specialiai paruoštos taip, kad jų nebūtų galima įkvėpti. Turėtų būti atliekamas trynimo bandymas, skirtas įrodyti, kad tvarkant granulių pavidalo medžiagą nesusidaro įkvepiamų dalelių. Jeigu atliekant trynimo bandymą susidaro įkvepiamų cheminių medžiagų, turėtų būti atliekamas toksiškumo įkvėpus bandymas.

17.

Vienalaikės neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupė nebūtina. Jeigu bandymo atmosferos sukūrimo tikslais naudojamas nešiklis nėra vanduo, nešiklio kontrolinė grupė turėtų būti naudojama tik tuo atveju, jeigu nėra istorinių toksiškumo įkvėpus duomenų. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo tyrimą nustatoma, kad medžiaga nėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, nėra toksiškas; taigi nešiklio kontrolė nebūtina.

18.

Kiekvieno poveikio metu turėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas ir ne rečiau kaip kartą per valandą registruojamas per kamerą tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo) stebėjimas yra vienas iš visų dinaminių parametrų matavimų, suteikiantis galimybę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius atmosferos kūrimo parametrus. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kad būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo dozės davimo tik per nosį kamerose, kai per poveikio sistemą tekantis oro srautas yra nepakankamas užtikrinti dinaminį bandomosios cheminės medžiagos atmosferos srautą. Yra nustatyti metodai, kurie gali būti taikomi norint įrodyti, kad pasirinktomis poveikio sąlygomis neįvyksta pakartotinio įkvėpimo (2) (11). Deguonies koncentracija turėtų būti ne mažesnė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šių standartų įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos.

19.

Kameroje turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Tiek dozę duodant tik per nosį, tiek veikiant visą kūną, santykinis drėgnis turėtų būti stebimas ir registruojamas ne mažiau kaip tris kartus, kai poveikio trukmė keturios valandos, ir kas valandą, kai poveikio trukmė mažesnė. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, tačiau jis gali būti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas dėl trukdžių, atsirandančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metodą.

20.

Jeigu įmanoma, turėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardinė koncentracija poveikio kameroje. Vardinė koncentracija yra sukurtos bandomosios cheminės medžiagos masės ir viso oro srauto, perleisto per kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardinė koncentracija nėra naudojama apibūdinti poveikį gyvūnui, tačiau, vardinę koncentraciją palyginus su faktine, nustatomas generavimo, kurį užtikrina bandymų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.

21.

Faktinė koncentracija yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija inhaliacinės kameros gyvūno kvėpavimo zonoje. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos ar cheminių reakcijų metodus ir tada atliekant analizinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrinė analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies miltelių aerozoliams arba mažo lakumo skystųjų dalelių aerozoliams ir turėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrimą atliktais bandomosios cheminės medžiagos savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudarytų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali būti nustatomos atliekant gravimetrinę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esančios medžiagos sudėtis panaši į pirminės medžiagos sudėtį. Jeigu tokios informacijos nėra, tyrimo metu gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotinę bandomosios cheminės medžiagos (geriausia, kad ji būtų ore) analizę. Jeigu aerozolinės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, turėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos fazės. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti nurodytos siekiamos, vardinės ir faktinės koncentracijos, tačiau atliekant statistinę analizę, skirtą apskaičiuoti mirtinas koncentracijos vertes, naudojamos tik faktinės koncentracijos.

22.

Jeigu įmanoma, turėtų būti naudojama viena bandomosios cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys turėtų būti laikomas tokiomis sąlygomis, kad būtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. Prieš pradedant tyrimą reikėtų apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos savybes, įskaitant jos grynumą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatumą, taip pat nustatytų teršalų ir priemaišų kiekius. Be kitų duomenų, tai galima pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopinę arba dujų chromatografijos analizę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo ėminio tapatumo nustatymas nėra bandymų laboratorijos pareiga, bandymų laboratorijai gali būti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateikėjo nurodytas savybes (pvz., spalvą, fizinę būseną ir t. t.).

23.

Poveikio atmosfera turėtų būti kaip įmanoma pastovesnė ir turėtų būti stebima nuolat ir (arba) su pertraukomis, atsižvelgiant į analizės metodą. Jeigu ėminiai imami su pertraukomis, per keturių valandų tyrimą kameros atmosferos ėminiai turėtų būti imami ne mažiau kaip du kartus. Jeigu tai neįmanoma dėl nedidelių oro srauto greičių arba mažų koncentracijų, gali būti imamas vienas ėminys per visą poveikio laikotarpį. Jeigu ėminiai pastebimai skiriasi, tiriant kitas koncentracijas per poveikio laikotarpį turėtų būti imami keturi ėminiai. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai neturėtų nukrypti nuo vidutinės koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skystųjų arba kietųjų dalelių aerozoliai. Turėtų būti apskaičiuotas ir užregistruotas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95). Į poveikio trukmę įtraukiamas laikas, per kurį susidaro bandomoji cheminė medžiaga, ir atsižvelgiama į laiką, kurio reikia, kad būtų pasiekta t95. T95 apskaičiavimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).

24.

Jeigu tiriami labai sudėtingi mišiniai, sudaryti iš dujų ir (arba) garų, ir aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios cheminės medžiagos, pučiamos iš specialiai varomų galutinio naudojimo produktų arba prietaisų), kiekvienos fazės veikimas inhaliacinėje kameroje gali būti skirtingas, todėl iš kiekvienos fazės (dujų ir (arba) garų ir aerozolio) turėtų būti parinkta bent viena indikacinė cheminė medžiaga (analitė); paprastai šiuo tikslu pasirenkama pagrindinė veiklioji mišinio cheminė medžiaga. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mišinys, turėtų būti nurodyta mišinio, o ne tik veikliosios cheminės medžiagos arba sudedamosios dalies (analitės) analizinė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).

25.

Aerozolių dalelių dydžio pasiskirstymas turėtų būti nustatomas bent kartą per kiekvieną keturių valandų trukmės poveikio laikotarpį naudojant pakopinį ėmiklį arba alternatyvų prietaisą, pvz., aerodinaminį dalelių rūšiuotuvą. Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu arba alternatyviu prietaisu gaunami lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrimą gali būti naudojamas alternatyvus prietaisas. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu turėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudyklė arba barboteris. Atlikus dalelių dydžio analizę nustatyta masės koncentracija turėtų neviršyti priimtinų filtruojamosios analizės būdu nustatytos masės koncentracijos ribų [žr. RD Nr. 39 (2)]. Jeigu lygiavertiškumą galima įrodyti pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti imamasi priemonių, kad būtų kuo mažiau negalutinių duomenų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti poveikį. Garuose esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu garų atmosferoje aptinkama dalelių, dėl kurių gali susidaryti mišrių fazių (žr. 15 skirsnį).

26.

Toliau aprašyti du tyrimų tipai: įprastas protokolas ir „K × l“ protokolas. Pagal abu protokolus gali būti atliekamas orientacinis tyrimas, pagrindinis tyrimas ir (arba) ribinis bandymas (tradicinis protokolas) arba bandymai taikant ribinę koncentraciją („K × l“ protokolas). Jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni, tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti šiuos tyrimus tik su jautresniąja lytimi. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Prieš pradedant turėtų būti atsižvelgta į visus turimus duomenis, kad būtų kuo labiau sumažintas gyvūnų naudojimo poreikis. Pvz., naudojant pagal šio priedo B.52 skyrių (4) gautus duomenis galima sumažinti orientacinio tyrimo poreikį ir įrodyti, ar kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni [žr. RD Nr. 39 (2)].

27.

Atliekant įprastą tyrimą, gyvūnų grupės nustatytą laikotarpį (paprastai – keturias valandas) veikiamos bandomąja chemine medžiaga dozės davimo tik per nosį arba dozės davimo per visą kūną kameroje. Gyvūnai veikiami ribine koncentracija (ribinis bandymas) arba nuosekliai veikiami ne mažiau kaip trimis skirtingomis koncentracijomis (pagrindinis tyrimas). Išskyrus atvejus, kai apie bandomąją cheminę medžiagą jau turima informacijos, pvz., gautos remiantis anksčiau atliktu B.52 tyrimu, prieš pagrindinį tyrimą gali būti atliekamas orientacinis tyrimas [žr. RD Nr. 39 (2)].

28.

Orientacinis tyrimas skirtas įvertinti bandomosios cheminės medžiagos stiprumą, nustatyti lyčių jautrumo skirtumus ir padėti pasirinkti poveikio koncentracijos lygius, taikytinus per pagrindinį tyrimą arba ribinį bandymą. Parenkant per orientacinį tyrimą taikytinus koncentracijos lygius, turėtų būti naudojama visa turima informacija, įskaitant turimus (Q)SAR duomenis ir duomenis apie panašias chemines medžiagas. Taikant kiekvieną skirtingą koncentraciją, dozė turėtų būti duodama ne daugiau kaip trims patinams ir trims patelėms (trijų kiekvienos lyties gyvūnų gali reikėti lyčių skirtumams nustatyti). Per orientacinį tyrimą gali būti taikoma tik viena koncentracija, tačiau prireikus bandymas gali būti atliktas ir taikant kitokias koncentracijas. Per orientacinį tyrimą neturėtų būti naudojama tiek gyvūnų ir taikoma tiek skirtingų koncentracijų, kiek per pagrindinį tyrimą. Vietoje orientacinio tyrimo gali būti remiamasi anksčiau atliktu B.52 tyrimu [žr. RD Nr. 39 (2)].

29.

Ribinis bandymas atliekamas tada, kai bandomoji cheminė medžiaga yra nežinoma arba kai manoma, kad ji iš esmės netoksiška, t. y. sukelianti toksinį poveikį tik taikant didesnę nei norminę ribinę koncentraciją. Atliekant ribinį bandymą, ribine bandomosios cheminės medžiagos koncentracija veikiama tik viena trijų patinų ir trijų patelių grupė. Informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą galima gauti remiantis žiniomis apie panašias bandytas chemines medžiagas, atsižvelgiant į toksikologinės reikšmės turinčių sudedamųjų dalių tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai remiantis ta informacija yra tikėtina, kad bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, turėtų būti atliekamas pagrindinis bandymas.

30.

Ribinės koncentracijos paprastai parenkamos atsižvelgiant į norminius reikalavimus. Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribinės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l (arba didžiausioji pasiekiama koncentracija) (3). Pasiekti kai kurių bandomųjų cheminių medžiagų, ypač garų ir aerozolių, ribines koncentracijas, gali būti techniškai sudėtinga. Atliekant aerozolių bandymus, pirmiausia turėtų būti siekiama užtikrinti įkvepiamą dalelių dydį (MMAS – 1–4 μm). Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atveju tai įmanoma pasiekti, kai koncentracija yra 2 mg/l. Atlikti aerozolių bandymus taikant didesnę kaip 2 mg/l koncentraciją turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (2)]. Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 gyvūnų gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti bandymų viršijant ribinę koncentraciją (3). Galimybė taikyti ribinę koncentraciją turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tikėtina, kad tokio bandymo rezultatai turės tiesioginės reikšmės žmonių sveikatos apsaugai (3); tokiu atveju tyrimo ataskaitoje pateikiamas pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandomąsias chemines medžiagas turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nesusidarytų sprogimui palankių sąlygų. Siekiant išvengti nebūtino gyvūnų naudojimo, prieš ribinį bandymą turėtų būti atliktas atskiras bandymas be gyvūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti ribiniam bandymui reikalingas kameros sąlygas.

31.

Jeigu taikant ribinę koncentraciją pastebimas gyvūnų gaišimas arba liguistumas, ribinio bandymo rezultatai gali būti naudojami kaip orientacinis tyrimas, kuriuo būtų remiamasi per tolesnius bandymus taikant kitokias koncentracijas (žr. apie pagrindinį tyrimą). Jeigu dėl bandomosios cheminės medžiagos fizinių arba cheminių savybių neįmanoma pasiekti ribinės koncentracijos, turėtų būti bandoma didžiausioji pasiekiama koncentracija. Jeigu esant didžiausiajai pasiekiamai koncentracijai pasireiškia mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandymų atlikti nereikia. Jeigu ribinės koncentracijos neįmanoma pasiekti, tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas paaiškinimas ir patvirtinamieji duomenys. Jeigu didžiausioji pasiekiama koncentracija nesukelia toksiškumo, gali reikėti sukurti skystojo aerozolio pavidalo bandomąją cheminę medžiagą.

32.

Pagrindinis tyrimas paprastai atliekamas naudojant po penkis patinus ir penkias pateles (arba penkis jautresniosios lyties, jeigu ji žinoma, gyvūnus) kiekvienam koncentracijos lygiui ir taikant bent tris koncentracijos lygius. Norint gauti patikimą statistinę analizę, turėtų būti taikomi pakankami koncentracijos lygiai. Laiko tarpas tarp dozių davimo grupėms nustatomas atsižvelgiant į toksiškumo požymių atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą. Kito koncentracijos lygio dozės davimas gyvūnams nukeliamas iki to laiko, kai bus pagrįstai įsitikinta, kad pirmiau bandytieji gyvūnai išgyveno. Tai tyrimo vadovui suteikia galimybę pakoreguoti tikslinę koncentraciją, taikytiną kitai grupei, kuriai duodama dozė. Atsižvelgiant į technologijų sudėtingumą, atliekant inhaliacinius tyrimus tai gali būti ne visada įgyvendinama, todėl poveikis gyvūnams taikant kitą koncentracijos lygį turėtų būti grindžiamas jau įgyta patirtimi ir mokslinu vertinimu. Bandant mišinius, turėtų būti remiamasi RD Nr. 39 (2).

33.

Vertinant toksiškumą įkvėpus, kaip alternatyva įprastam protokolui gali būti svarstoma galimybė atlikti nuoseklų „K × l“ protokolu pagrįstą tyrimą (12) (13) (14). Šiuo metodu suteikiama galimybė daryti poveikį gyvūnams taikant keletą koncentracijos lygių ir keletą laikotarpių. Visi bandymai atliekami tik dozės davimo tik per nosį kameroje (pagal šį protokolą netikslinga naudoti poveikio per visą kūną kameras). Šis protokolas pavaizduotas 1 priedėlyje pateiktoje struktūrinėje schemoje. Modeliuojamoji analizė parodė, kad gauti patikimas LC50 vertes galima ir pagal įprastą protokolą, ir pagal „K × l“ protokolą, tačiau „K × l“ protokolas paprastai tinkamesnis norint gauti patikimas LC01 ir LC10 vertes (15).

34.

Modeliuojamoji analizė parodė, kad dviejų gyvūnų naudojimas (kai naudojama po vieną skirtingų lyčių gyvūną arba kai naudojami du jautresniosios lyties gyvūnai) kiekvienam koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivės intervalui paprastai yra tinkamas, kai per pagrindinį tyrimą bandomos keturios koncentracijas ir taikomi penki poveikio laikotarpiai. Tam tikromis aplinkybėmis tyrimo vadovas gali pasirinkti kiekviename koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivės intervale naudoti po dvi kiekvienos lyties žiurkes (15). Kiekvienam koncentracijos ir laiko momento deriniui naudojant po du kiekvienos lyties gyvūnus gali būti sumažintas įverčių poslinkis ir nuokrypis, padidintas vertinimo sėkmės koeficientas ir pagerinta pasikliautinojo intervalo aprėptis. Tačiau, jeigu nepasiekiama pakankamai tikslios atitikties skaičiuojant naudotiniems duomenims (kai naudojama po vieną skirtingų lyčių gyvūną arba kai naudojami du jautresniosios lyties gyvūnai), gali pakakti ir penktosios poveikio koncentracijos. Daugiau patarimų dėl gyvūnų skaičiaus ir koncentracijų, taikytinų atliekant „K × l“ protokolu pagrįstą tyrimą, pateikta RD Nr. 39 (2).

35.

Orientacinis tyrimas yra skirtas įvertinti bandomosios cheminės medžiagos stiprumą ir padėti pasirinkti poveikio koncentracijos lygius, taikytinus per pagrindinį tyrimą. Siekiant parinkti tinkamą pradinę koncentraciją, taikytiną per pagrindinį tyrimą, ir sumažinti naudojamų gyvūnų skaičių, gali reikėti atlikti orientacinį tyrimą kiekvienai koncentracijai naudojant ne daugiau kaip po tris kiekvienos lyties gyvūnus [išsamesnės informacijos pateikta RD Nr. 39 (2) III priedėlyje]. Norint nustatyti lyčių skirtumus, gali reikėti naudoti po tris kiekvienos lyties gyvūnus. Šiems gyvūnams turėtų būti daromas vienkartinis poveikis, paprastai trunkantis 240 minučių. Galimybė sukurti tinkamas bandymo atmosferas turėtų būti įvertinta per išankstinius techninius bandymus, nenaudojant gyvūnų. Jeigu yra per B.52 (4) tyrimą gautų gaištamumo duomenų, orientacinis tyrimas paprastai nebūtinas. Parinkdamas pradinę B.2 tyrimo tikslinę koncentraciją, tyrimo vadovas turėtų atsižvelgti į gaištamumo pobūdį, nustatytą per B.52 tyrimus (4) pagal kiekvieną lytį ir visas bandytas koncentracijas [žr. RD Nr. 39 (2)].

36.

Pradinė koncentracija (I poveikio seansas) (I priedėlis) bus ribinė koncentracija arba koncentracija, tyrimo vadovo parinkta remiantis orientaciniu tyrimu. Šia koncentracija įvairiais laikotarpiais (pvz., 15, 30, 60, 120 arba 240 minučių) veikiamos gyvūnų grupės, sudarytos iš dviejų skirtingos lyties gyvūnų, t. y. bendras gyvūnų skaičius yra 10 (vadinamasis I poveikio seansas) (I priedėlis).

37.

Ribinės koncentracijos paprastai parenkamos atsižvelgiant į norminius reikalavimus. Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribinės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l (arba didžiausioji pasiekiama koncentracija) (3). Pasiekti kai kurių bandomųjų cheminių medžiagų, ypač garų ir aerozolių, ribines koncentracijas, gali būti techniškai sudėtinga. Atliekant aerozolių bandymus, turėtų būti siekiama užtikrinti įkvėpiamą dalelių dydį (MMAS – 1–4 μm), esant ribinei 2 mg/l koncentracijai. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atveju tai įmanoma pasiekti. Atlikti aerozolių bandymus taikant didesnę kaip 2 mg/l koncentraciją turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (2)]. Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 gyvūnų gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti bandymų viršijant ribinę koncentraciją (3). Galimybė atlikti bandymus viršijant ribinę koncentraciją turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tikėtina, kad tokio bandymo rezultatai turės tiesioginės reikšmės žmonių sveikatos apsaugai (3); tokiu atveju tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandomąsias chemines medžiagas turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nesusidarytų sprogimui palankių sąlygų. Siekiant išvengti nebūtino gyvūnų naudojimo, prieš bandymą taikant pradinę koncentraciją turėtų būti atliktas atskiras bandymas be gyvūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti šiai koncentracijai reikalingas kameros sąlygas.

38.

Jeigu taikant pradinę koncentraciją pastebimas gyvūnų gaišimas arba liguistumas, tos koncentracijos bandymo rezultatai gali būti panaudojami kaip pagrindas per tolesnius bandymus taikant kitokias koncentracijas (žr. apie pagrindinį tyrimą). Jeigu dėl bandomosios cheminės medžiagos fizinių arba cheminių savybių neįmanoma pasiekti ribinės koncentracijos, turėtų būti bandoma didžiausia pasiekiama koncentracija. Jeigu esant didžiausiai pasiekiamai koncentracijai pasireiškia mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandymų atlikti nereikia. Jeigu ribinės koncentracijos neįmanoma pasiekti, tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas paaiškinimas ir patvirtinamieji duomenys. Jeigu didžiausia pasiekiama koncentracija nesukelia toksiškumo, gali reikėti sukurti skystojo aerozolio pavidalo bandomąją cheminę medžiagą.

39.

Per pagrindinį tyrimą bandoma pradinė koncentracija (I poveikio seansas) (I priedėlis) bus ribinė koncentracija arba koncentracija, tyrimo vadovo parinkta remiantis orientaciniu tyrimu. Jeigu per I poveikio seansą arba po jo pastebimas gaištamumas, II poveikio seanso koncentracija ir poveikio laikotarpiai bus nustatomi remiantis mažiausiuoju poveikiu („K × l“ protokolas), dėl kurio nugaištama. Kiekvienas tolesnis seansas priklausys nuo ankstesniojo seanso (žr. 1 priedėlį).

40.

Norint nustatyti „K × l“ protokolu pagrįstą gaištamumo priklausomybę, daugeliui bandomųjų cheminių medžiagų pakanka rezultatų, gautų taikant pradinę koncentraciją ir per tris papildomus poveikio seansus naudojant smulkesnę laiko matricą (t. y. poveikio laikotarpių geometrinius intervalus, apibūdinamus vienas po kito einančių laikotarpių santykiu, kuris paprastai yra √2) (15), tačiau taip pat gali būti naudinga taikyti penktąją poveikio koncentraciją [žr. 1 priedėlį ir RD Nr. 39 (2)]. Matematinis pagal „K × l“ protokolą gautų rezultatų apdorojimas aprašytas 1 priedėlyje.

41.

Poveikio laikotarpiu turėtų būti dažnai atliekami klinikiniai gyvūnų stebėjimai. Baigus duoti dozę, dozės davimo dieną klinikiniai stebėjimai turėtų būti atliekami bent du kartus arba daugiau, atsižvelgiant į gyvūnų reakciją į gautą dozę, o vėliau – bent kartą per parą, iš viso stebint 14 dienų. Tikslios stebėjimų laikotarpio trukmės nenustatoma; ji turėtų būti parenkama atsižvelgiant į klinikinių požymių atsiradimo laiką ir gyvūnų atsigavimo laikotarpio trukmę. Svarbu atkreipti dėmesį į toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo laiką, ypač jeigu toksiškumo požymiai pasireiškia tik po kurio laiko. Visi stebėjimai sistemingai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvieną gyvūną. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus ir (arba) kuriems pasireiškia ilgalaikių sunkios kančios požymių, gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti humaniškai numarinami. Atliekant klinikinių toksiškumo požymių tyrimus, turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad prasta pradinė išvaizda ir trumpalaikiai kvėpavimo takų pakitimai, atsiradę dėl poveikio procedūros, nebūtų palaikyti bandomosios cheminės medžiagos sukelto toksiškumo požymiais, dėl kurių reikėtų pirmiau laiko numarinti gyvūnus. Turėtų būti atsižvelgta į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (RD Nr. 19) (7). Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas žūties laikas.

42.

Narveliuose turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pakitimai, taip pat kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pakitimai. Jeigu įmanoma, turėtų būti išskirti vietinis ir sisteminis poveikiai. Ypač reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Matuojant temperatūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinamųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperatūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu.

43.

Kiekvieno gyvūno masė turėtų būti vieną kartą užregistruojama pratinimo laikotarpiu, tada poveikio dieną dar nedavus dozės (nulinė diena) ir bent pirmąją, trečiąją ir septintąją dienomis (o vėliau – kas savaitę), taip pat žūties arba numarinimo metu, jeigu tai įvyksta po pirmosios dienos. Kūno masė yra labai svarbus toksiškumo gyvūnams rodiklis, todėl gyvūnai, kurių masė, palyginti su vertėmis, gautomis prieš tyrimą, nukrenta 20 % arba daugiau, turėtų būti atidžiai stebimi. Pasibaigus poveikio pasekmių stebėjimo laikotarpiui, išgyvenę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.

44.

Visiems bandomiesiems gyvūnams, įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyvūnų gerovės sumetimais, daromas bendrasis skrodimas. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaišęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autolizę. Skrodimai turėtų būti atliekamai kaip galima anksčiau, paprastai – per dieną arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai turėtų būti užregistruojami pagal kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kvėpavimo takų pakitimams.

45.

Norint padidinti tyrimo aiškinamąją reikšmę, gali būti atliekamos papildomos apžiūros, iš anksto numatytos pagal tyrimo planą, pvz., išgyvenusių žiurkių plaučių svėrimas ir (arba) dirginimo įrodymų gavimas atliekant kvėpavimo takų apžiūrą mikroskopu. Taip pat gali būti tiriami organai, turintys didelės 24 valandas arba ilgiau išgyvenusių gyvūnų patologijos požymių, arba organai, apie kuriuos žinoma arba dėl kurių manoma, kad jiems buvo pakenkta. Mikroskopu apžiūrėjus visus kvėpavimo takus, galima gauti naudingos informacijos apie bandomąsias chemines medžiagas, kurios reaguoja su vandeniu, pvz., rūgštis ir higroskopines bandomąsias chemines medžiagas.

46.

Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno masės duomenys ir skrodimo išvados. Klinikinių stebėjimų duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant naudotų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyvūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašymą, pasireiškimo laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas.

47.

Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):

1.

OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

2.

OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

3.

2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31, p. 1.

4.

Šio priedo B.52 skyrius. Ūmus toksiškumas įkvėpus. Ūmaus toksiškumo klasės (ŪTK) metodas.

5.

Šio priedo B.40 skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.

6.

Šio priedo B.40bis skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.

7.

OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

8.

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

9.

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.

10.

Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

11.

Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.

12.

Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.

13.

Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.

14.

Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.

15.

OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

16.

Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

1.

Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 407 (OECD bandymo gairės Nr. 407) (2008). Originalios bandymo gairės „Test Guideline“ 407 priimtos 1981 m. Siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrimą naudotais gyvūnais, pirmiausia informacijos apie neurotoksiškumą ir imunotoksiškumą, 1995 m. priimta atnaujinta versija.

2.

1998 m. OECD ėmėsi prioritetinės veiklos, skirtos atnaujinti esamas bandymų gaires ir parengti naujas bandymų gaires, pagal kurias būtų atrenkamos ir bandomos medžiagos, galinčios pakenkti endokrininei sistemai (8). Viena iš veiklos krypčių buvo esamų OECD gairių, susijusių su „28 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą graužikams tyrimu“ (TG 407), atnaujinimas įtraukiant parametrus, tinkamus nustatyti bandomųjų cheminių medžiagų poveikį endokrininei sistemai. Rengiant šią procedūrą įgyvendinta plati tarptautinė programa, skirta patikrinti papildomų parametrų reikšmę ir praktinį naudingumą, jų veiksmingumą cheminėms medžiagoms, turinčioms (anti)estrogeninio, (anti)androgeninio ir (anti)tiroidinio poveikio, atkuriamumo vienoje laboratorijoje ir įvairiose laboratorijose galimybes ir naujųjų parametrų nesuderinamumą su parametrais, kurie buvo privalomi prieš priimant TG 407. Pagal šią programą gauti gausūs duomenys buvo surinkti ir įvertinti išsamioje OECD ataskaitoje (9). Šis atnaujintasis B.7 metodas (lygiavertis TG 407) yra įgyvendinant šią tarptautinę bandymų programą įgytos patirties ir gautų rezultatų išdava. Šis bandymo metodas suteikia galimybę tam tikrus per endokrininę sistemą daromus poveikius susieti su kitais toksikologiniais poveikiais.

3.

Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo charakteristikas, kartotinės dozės toksiškumas per virškinamąjį traktą gali būti nustatomas po to, kai ūmaus toksiškumo bandymais gaunama pradinės informacijos. Šis bandymo metodas skirtas nustatyti poveikį, atsižvelgiant į labai didelę galimo toksinio poveikio objektų įvairovę. Taikant šį metodą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, kurie gali grėsti dėl gana trumpą laiką trunkančio kartotinio poveikio, įskaitant poveikį nervų, imuninei ir endokrininei sistemoms. Atsižvelgiant šias konkrečias pasekmes, taikant šį metodą turėtų būti nustatytos cheminės medžiagos, galinčios turėti neurotoksinio poveikio, dėl kurio gali reikėti atlikti nuodugnesnius šio aspekto tyrimus, ir cheminės medžiagos, kenksmingos skydliaukės fiziologijai. Be to, šiuo metodu galima gauti duomenų apie chemines medžiagas, kurios kenkia jaunų, bet suaugusių patinų ir (arba) patelių lytiniams organams, ir pastebėti poveikio imuninei sistemai požymių.

4.

Šio (B.7) bandymo metodo rezultatai turėtų būti naudojami pavojų nustatymo ir rizikos vertinimo tikslais. Rezultatai, gauti pagal endokrininei sistemai taikomus parametrus, turėtų būti vertinami atsižvelgiant į OECD konceptualią endokrininei sistemai kenksmingų cheminių medžiagų bandymų ir vertinimo sistemą (11). Šis metodas sudarytas iš pamatinio kartotinės dozės toksiškumo tyrimo, kuris gali būti taikomas cheminėms medžiagoms, dėl kurių nebūtina atlikti 90 dienų tyrimo (pvz., kai gamybos apimtis neviršija tam tikrų ribų), arba kaip išankstinis tyrimas prieš ilgalaikį tyrimą. Stebėjimų laikotarpio trukmė turėtų būti 28 dienos.

5.

Tarptautinė programa, įgyvendinta siekiant patvirtinti parametrus, kurie būtų tinkami nustatyti galimą bandomosios cheminės medžiagos poveikį endokrininei sistemai, parodė, kad pagal šį (B.7) bandymo metodą gaunamų duomenų kokybė labai priklauso nuo bandymų laboratorijos patirties. Tai pirmiausia taikytina histopatologiniam ciklinių patelės lytinių organų pakitimų tyrimui ir mažų, nuo hormonų priklausomų organų, kuriuos sudėtinga skrosti, masės nustatymui. Parengtos histopatologinių tyrimų gairės (19). Jos skelbiamos OECD viešojoje svetainėje, skirtoje bandymų gairėms. Jos skirtos padėti patologams atlikti tyrimus ir užtikrinti didesnį analizės tikslumą. Nustatyta, kad toksiškumą endokrininei sistemai rodo labai įvairūs parametrai; šie parametrai įtraukti į šį bandymo metodą. Parametrai, dėl kurių negauta pakankamai duomenų, kad būtų galima įrodyti jų naudingumą, arba dėl kurių per patvirtinimo programą gauta silpnų įrodymų, kad jie gali padėti nustatyti endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas, siūlomi naudoti kaip neprivalomos pasekmės (žr. 2 priedėlį).

6.

Remiantis per patvirtinimo procesą gautais duomenimis, būtina pabrėžti, kad šios analizės tikslumas nėra pakankamas, kad būtų galima nustatyti visas chemines medžiagas, kurių veikimo būdas yra (anti)androgeninis arba (anti)estrogeninis (9). Šis bandymo metodas netaikomas tam gyvenimo etapui, kuriuo endokrininė sistema yra pažeidžiamiausia. Visgi patvirtinimo proceso metu taikant šį bandymo metodą nustatyta cheminių medžiagų, kurios daugiau ar mažiau kenkia skydliaukės funkcijai, ir cheminių medžiagų, stipriai ir vidutiniškai stipriai veikiančių skydliaukę per estrogeninius arba androgeninius receptorius, tačiau dažniausiai nepavykdavo nustatyti endokrininę sistemą veikiančių cheminių medžiagų, kurios silpnai veikia estrogeninius arba androgeninius receptorius. Taigi jo negalima apibūdinti kaip atrankinės analizės, skirtos nustatyti poveikį endokrininei sistemai.

7.

Todėl, nesant su šiais veikimo būdais susijusio poveikio, negalima teigti, kad nesukeliama poveikio endokrininei sistemai. Nagrinėjant per endokrininę sistemą daromus poveikius, cheminės medžiagos savybių apibūdinimas neturėtų būti grindžiamas vien tik šio bandymo metodo taikymo rezultatais, bet jis turėtų būti naudojamas taikant įrodomosios duomenų galios metodą, apimantį visus turimus cheminės medžiagos duomenis, skirtus apibūdinti galimą poveikį endokrininei sistemai. Dėl šios priežasties reglamentavimo tikslais priimami sprendimai dėl poveikio endokrininei sistemai (cheminės medžiagos savybių apibūdinimas) turėtų būti grindžiami platesnio metodo taikymu, o ne tik šio bandymo metodo taikymo rezultatais.

8.

Pripažinta, kad visos gyvūnų naudojimu pagrįstos procedūros atitiks vietinius gyvūnų priežiūros reikalavimus; toliau išdėstyti priežiūros ir poveikio aprašymai yra minimalūs veiklos reikalavimai, kurie bus pakeičiami vietos teisės aktais, jeigu šie bus griežtesni. Daugiau rekomendacijų dėl humaniško elgesio su gyvūnais pateikia OECD (14).

9.

Vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

10.

Bandomoji cheminė medžiaga per burną 28 dienas kasdien skirtingomis dozėmis duodama kelioms bandomųjų gyvūnų grupėms – po vieno dydžio dozę vienai grupei. Kiekvieną dozės davimo laikotarpio dieną gyvūnai atidžiai stebimi toksiškumo požymiams nustatyti. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai. Atliekant 28 dienų tyrimą gaunama informacijos apie kartotinės oralinės dozės poveikį, iš kurio gali būti matoma, ar reikia atlikti tolesnius ilgalaikius tyrimus. Be to, taip gali būti gauta informacijos dėl koncentracijų parinkimo ilgalaikiams tyrimams. Remiantis šiuo bandymo metodu gautais duomenimis turėtų būti galima apibūdinti cheminės medžiagos toksiškumą, nustatyti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lygį (NNPL).

11.

Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, bet galima naudoti ir kitų rūšių graužikus. Jeigu pagal šį (B.7) bandymo metodą nustatyti parametrai tiriami naudojant kitų rūšių graužikus, turėtų būti pateiktas išsamus pagrindimas. Nors biologiniu požiūriu tikėtina, kad kitos rūšis į toksines medžiagas turėtų reaguoti panašiai kaip žiurkės, naudojant smulkesnes rūšis gali atsirasti didesnių nuokrypių, susijusių su techniniais mažesnių organų skrodimo sunkumais. Vienintelė pagal tarptautinę patvirtinimo programą, skirtą nustatyti endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas, naudota rūšis buvo žiurkės. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Dozė turėtų būti pradedama duoti kaip galima anksčiau, kai tik jauniklis atjunkomas, bet ne vėliau nei gyvūnams sueina devynios savaitės. Pradedant tyrimą gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti kuo mažesni ir nenukrypti nuo kiekvienos lyties kūno masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Jeigu prieš ilgesnio laikotarpio tyrimą atliekamas išankstinis kartotinės oralinės dozės tyrimas, pageidautina, kad per abu tyrimus naudojami gyvūnai būtų tos pačios padermės ir gauti iš to paties šaltinio.

12.

Visos procedūros turėtų atitikti vietinius laboratorinės gyvūnų priežiūros reikalavimus. Bandomųjų gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors santykinis oro drėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalpos plovimo metą), turėtų būti siekiama užtikrinti 50–60 % santykinį drėgnį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, užtikrinant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro parinkimui gali turėti įtakos poreikis tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą, kai ji duodama pagal šį metodą. Gyvūnai turėtų būti laikomi mažomis tos pačios lyties grupėmis; jeigu tai moksliškai pagrįsta, gyvūnai gali būti laikomi po vieną. Jeigu gyvūnai narveliuose laikomi grupelėmis, viename narvelyje turėti būti laikomi ne daugiau kaip penki gyvūnai.

13.

Turėtų būti nuolat analizuojama, ar pašaro sudėtyje nėra teršalų. Pašaro ėminys turėtų būti saugomas, kol bus parengta ataskaita.

14.

Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinės atrankos principu suskirstomi į kontrolines ir bandomąsias grupes. Narveliai turėtų būti išdėstyti taip, kad galimas narvelių išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų kuo mažesnis. Gyvūnai paženklinami, kad kiekvieną iš jų būtų galima identifikuoti, ir ne mažiau kaip penkias paras iki poveikio tyrimo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.

15.

Bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu arba duodama su pašarais arba geriamuoju vandeniu. Oralinis dozės davimo būdas priklauso nuo tyrimo tikslų ir fizinių, cheminių bei (arba) toksikokinetinių bandomosios cheminės medžiagos savybių.

16.

Prireikus bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos suspensija tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimybę naudoti aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalą arba suspensiją ir tik po to – galimybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu naudojamas nešiklis nėra vanduo, turi būti žinomos to nešiklio toksinės savybės. Turėtų būti nustatytas bandomosios cheminės medžiagos stabilumas nešiklyje.

17.

Kiekvieno dydžio dozė duodama ne mažiau kaip dešimčiai gyvūnų (penkiems patinams ir penkioms patelėms). Jeigu numatoma marinti gyvūnus nebaigus bandymo, pradinis gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti gyvūnų skaičiumi. Turėtų būti apsvarstyta galimybė į kontrolinę grupę ir didžiausiajai dozei skirtą grupę įtraukti po vieną papildomą pagalbinę dešimties gyvūnų grupę (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), kad bent 14 dienų po dozės davimo būtų galima stebėti toksinio poveikio grįžtamumą, tvarumą arba delsą.

18.

Paprastai turėtų būti naudojamos ne mažiau kaip trys bandomosios grupės ir viena kontrolinė grupė, tačiau jeigu įvertinus turimus duomenis nesitikima jokio 1 000 mg/kg kūno masės per parą dozės poveikio, galima atlikti ribinį bandymą. Jeigu nėra tinkamų duomenų, gali būti atliktas ribų nustatymo tyrimas (naudojant tos pačios padermės ir iš to paties šaltinio gautus gyvūnus), padėsiantis nustatyti naudotinas dozes. Kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti prižiūrimi lygiai taip pat kaip ir bandomieji gyvūnai, išskyrus tai, kad jiems neduodama bandomosios cheminės medžiagos. Jeigu duodant bandomąją cheminę medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią naudotą nešiklio kiekį.

19.

Dozių dydžiai turėtų būti parenkami atsižvelgiant į jau turimus bandomosios arba į ją panašių cheminių medžiagų toksiškumo ir (toksiko)kinetinius duomenis. Pasirinkta didžiausioji dozė turėtų sukelti toksinį poveikį, tačiau nenužudyti gyvūno ir nesukelti sunkių kančių. Kitos, mažesnės dozės turėtų būti parenkamos taip, kad būtų galima nustatyti galimas reakcijas į dozes ir nepastebimą neigiamą poveikį (NNPL), kai duodama mažiausioji dozė. Dažnai būtų geriausia, jeigu mažėjančia tvarka parenkami dozių dydžiai vienas nuo kito skirtųsi du–keturis kartus, ir dažnai patartina ketvirtajai papildomai tiriamajai grupei taikyti labai didelius dozių dydžių skirtumus (pvz., koeficientus, didesnius kaip 10).

20.

Jeigu pastebimas bendras toksinis poveikis (pvz., sumažėjusi kūno masė, poveikis kepenims, širdžiai, plaučiams arba inkstams ir t. t.) arba nustatoma kitų pakitimų, kurie gali būti ne toksinės reakcijos (pvz., sumažėjęs pašaro vartojimas, kepenų padidėjimas), pastebėtas poveikis imuninio, nervinio arba endokrininio pobūdžio pasekmėms turėtų būti vertinamas atsargiai.

21.

Jeigu vieno dydžio dozės, ne mažesnės kaip 1 000 mg/kg kūno masės per parą arba atitinkama procentinė dalis pašaruose ar geriamame vandenyje (nustatant pagal kūno masę), kai dozė duodama su pašarais ar geriamu vandeniu, bandymas, atliekamas taikant tokiam tyrimui nustatytas procedūras, nesukelia pastebimo toksinio poveikio ir jeigu toksinio poveikio nesitikima remiantis turimais duomenimis apie panašios struktūros chemines medžiagas, išsamus trijų dydžių dozių tyrimas nebūtinas. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia duoti didesnes dozes.

22.

Bandomosios cheminės medžiagos dozė 28 dienų laikotarpiu gyvūnams duodama kasdien, septynias dienas per savaitę. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu, ji turėtų būti duodama viena doze, naudojant skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausias vienkartinis duodamo skysčio kiekis priklauso nuo bandomojo gyvūno dydžio. Šis kiekis neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ėsdinančias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukelia sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turėtų būti kiek įmanoma sumažintas keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų vienodas.

23.

Jeigu cheminės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios cheminės medžiagos kiekiai netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Bandomąją cheminę medžiagą duodant su pašaru, galima taikyti vienodą koncentraciją pašare (ppm) ar vienodą dozės dydį pagal gyvūno kūno masę; turi būti nurodytas pasirinktas variantas. Jeigu cheminė medžiaga leidžiama zondu, dozė kasdien turėtų būti duodama panašiu metu ir prireikus koreguojama, kad būtų palaikomas pastovus dozės dydis atsižvelgiant į gyvūno kūno masę. Jeigu prieš ilgalaikį tyrimą atliekamas išankstinis kartotinės dozės tyrimas, per abu tyrimus gyvūnams turi būti duodami panašūs pašarai.

24.

Stebėjimų laikotarpio trukmė turėtų būti 28 dienos. Tolesniems stebėjimams numatytos pagalbinės grupės gyvūnai turėtų būti dar bent 14 dienų laikomi neduodant jokios dozės, kad būtų galima nustatyti toksinio poveikio delsą, tvarumą arba gyvūnų atsigavimą nuo poveikio.

25.

Bent kartą per parą turėtų būti atliekami bendrieji klinikiniai stebėjimai; geriausia, kad jie būtų atliekami tuo pačiu paros metu, atsižvelgiant į stipriausią numatomo poveikio pasireiškimą po dozės davimo. Turėtų būti registruojama gyvūnų sveikatos būklė. Bent du kartus per parą visi gyvūnai turėtų būti patikrinami, ar jie sveiki ir nenugaišę.

26.

Kartą prieš pirmojo poveikio pradžią (kad būtų galima palyginti atskirus gyvūnus) ir bent kartą per savaitę po dozės davimo turėtų būti atliekami išsamūs visų gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Šie stebėjimai atliekami perkėlus gyvūną iš jo narvo į tam skirtą įprastą vietą ir, pageidautina, turėtų būti atliekami tuo pačiu paros metu. Stebėjimai turėtų būti kruopščiai registruojami, pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibrėžtą vertinimo sistemą. Turėtų būti dedamos pastangos, kad bandymo sąlygų kaita būtų kuo mažesnė, ir pageidautina, kad šiuos stebėjimus atliktų stebėtojai, nežinantys apie dozės davimą. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, kailio, akių, gleivinės pakitimai, išskyrų atsiradimas ir autonominis aktyvumas (pvz., ašarojimas, plaukų pašiaušimas, vyzdžio dydis, neįprasti kvėpavimo pakitimai). Taip pat turėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimai, traukulių arba toninių judesių atsiradimas, stereotipinis (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., savęs luošinimas, vaikščiojimas atbulomis) (2).

27.

Ketvirtą poveikio savaitę turėtų būti tiriamos jutiminės reakcijos į įvairaus pobūdžio dirgiklius (pvz., klausos, regos ir proprioreceptorinius) (3) (4) (5), vertinamas spaudimo (jėgos) stiprumas (6) ir judėjimo aktyvumas (7). Išsamesnės informacijos apie procedūras, kurios galėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literatūros šaltiniuose. Vietoje nurodytųjų gali būti taikomos ir alternatyvios procedūros.

28.

Jeigu kartotinės dozės tyrimas atliekamas kaip išankstinis tyrimas prieš pusiau lėtinio poveikio (90 dienų) tyrimą, funkciniai stebėjimai ketvirtąją savaitę gali būti neatliekami. Tokiu atveju funkciniai stebėjimai turėtų būti įtraukiami į šį tolesnį tyrimą. Kita vertus, tokie funkciniai stebėjimai atliekant kartotinės dozės tyrimą suteikia didesnę galimybę geriau parinkti dozių dydžius tolesniam pusiau lėtinio poveikio tyrimui.

29.

Išimtiniais atvejais funkcinių stebėjimų galima neatlikti ir su tomis grupėmis, kurių toksiškumo požymiai tokio laipsnio, kad jie labai trukdytų atlikti funkcinius bandymus.

30.

Atliekant skrodimą, (neprivaloma tvarka) galėtų būti nustatomas visų patelių lytinis ciklas, imant makšties tepinėlius. Šie stebėjimai suteiktų informacijos apie lytinio ciklo etapą, buvusį gyvūno numarinimo metu, ir padėtų atlikti histologinius su estrogenais susijusių audinių tyrimus [žr. histopatologinių tyrimų gaires (19)].

31.

Bent kartą per savaitę visi gyvūnai turėtų būti pasveriami. Ne rečiau kaip kartą per savaitę turėtų būti matuojamas pašarų suvartojimas. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kartą per savaitę turėtų būti matuojamas ir vandens suvartojimas.

32.

Pasibaigus bandymo laikotarpiui turėtų būti atlikti tokie hematologiniai tyrimai: hematokrito, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio, retikolucitų, bendro leukocitų kiekio ir įvairių leukocitų kiekių, trombocitų kiekio ir kraujo krešėjimo laiko ir aktyvumo. Jeigu įtariama, kad bandomoji cheminė medžiaga arba jos numatomi metabolitai turi oksidacinių savybių, turėtų būti nustatyti ir kiti rodikliai, įskaitant methemoglogino koncentraciją ir Heinco kūnelius.

33.

Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu ir saugomi tinkamomis sąlygomis. Naktį prieš numarinimą gyvūnams turėtų būti neduodama pašaro (7).

34.

Siekiant ištirti pagrindinius toksinius poveikius audiniams, pirmiausia inkstams ir kepenims, turėtų būti atlikti visų gyvūnų kraujo ėminių, paimtų prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu, klinikiniai biocheminiai tyrimai (atmetus gaištančius arba nebaigus tyrimo numarintus gyvūnus). Kraujo plazmoje arba serume tiriama: natris, kalis, gliukozė, bendras cholesterolio kiekis, šlapalas, kreatininas, bendras baltymų ir albumino kiekis, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (pvz., alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, šarminė fosfatazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir glutamato dehidrogenazė), ir tulžies rūgštys. Tam tikromis aplinkybėmis naudingos informacijos gali suteikti papildomi fermentų (kepenų arba kitokios kilmės) ir bilirubino tyrimai.

35.

Paskutinę tyrimo savaitę (neprivaloma tvarka) gali būti atliekami šlapimo tyrimai, per nustatytą laiko tarpą surenkant tam tikrą šlapimo kiekį ir ištiriant šlapimo išvaizdą, kvapą, tūrį, osmosinį slėgį arba savitąjį svorį, pH, baltymus, gliukozę ir kraują (kraujo kūnelius).

36.

Be to, turėtų būti apsvarstyta galimybė atlikti plazmos arba serumo rodiklių, rodančių bendruosius audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomos bandomosios cheminės medžiagos savybės gali arba, įtariama, gali turėti neigiamo poveikio susijusioms metabolinėms savybėms, galima atlikti kalcio, fosforo, trigliceridų, specifinių hormonų ir cholinesterazės tyrimus. Šie tyrimai turi būti paskiriami tam tikrų kategorijų medžiagoms arba atsižvelgiant į konkretų atvejį.

37.

Nors atliekant tarptautinį su endokrinine sistema susijusių pasekmių vertinimą ir nepavyko įrodyti aiškios skydliaukės hormonų (T3, T4) ir tireotropinų (angl. TSH) tyrimų naudos, gali būti naudinga išsaugoti plazmos ir serumo ėminius, kad būtų galima įvertinti T3, T4 ir TSF (neprivaloma), kai atsiranda poveikio hipofizės-skydliaukės ašiai požymių. Saugotini ėminiai gali būti užšaldomi –20 °C temperatūroje. Hormonų tyrimų rezultatų nuokrypiams ir absoliutinėms koncentracijoms gali turėti įtakos šie veiksniai:

Galutinai nustatyti skydliaukę veikiančias chemines medžiagas patikimiau taikant histopatologinę analizę, o ne remiantis hormonų lygiais.

38.

Hormonų tyrimams specialiai skirti plazmos ėminiai turėtų būti imami panašiu paros metu. Rekomenduojama apsvarstyti galimybę atlikti T3, T4 ir TSH tyrimus remiantis skydliaukės histopatologiniais pakitimais. Taikant įvairią komercinę analizės įrangą, skaitinės vertės, gautos analizuojant hormonų koncentracijas, skiriasi. Todėl gali būti neįmanoma parengti poveikio vertinimo kriterijų, pagrįstų vienodais istoriniais duomenimis. Arba laboratorijos turėtų siekti, kad kontroliniai T3 ir T4 variacijos koeficientai būtų mažesni kaip 25, o TSH – mažesni kaip 35. Visos koncentracijos registruojamos ng/ml išraiška.

39.

Jeigu pamatiniai istoriniai duomenys yra netinkami, turėtų būti apsvarstyta galimybė nustatyti hematologinius ir klinikinius biocheminius kintamuosius prieš pradedant duoti dozes arba, pageidautina, naudojant gyvūnų grupę, neįtrauktą į bandomąsias grupes.

40.

Atliekamas išsamus visų bandomųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes ir jų turinį. Atlikus skrodimą, visų gyvūnų (išskyrus gaištančius ir (arba) numarintus nebaigus tyrimo) kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės, sėklidžių prielipai, prostata ir sėklinės pūslelės su koaguliatorių liaukomis (kaip kompleksas), užkrūčio liauka, blužnis, smegenys ir širdis turėtų būti nuvalyti, jeigu reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo greičiau pasverti, kol neišdžiuvo. Valant prostatos kompleksą, būtina imtis atsargumo priemonių, kad nebūtų pradurtos sėklinės pūslelės su skysčiais. Arba sėklinės pūslelės ir prostata gali būti valomos ir sveriamos atlikus fiksavimą.

41.

Be to, kaip galima greičiau skrodimo, kol neišdžiuvo, gali būti pasveriami ir kiti du audiniai: kiaušidžių pora (drėgnų organų masė) ir gimda su gimdos kakleliu (patarimų, kaip pašalinti ir svėrimui paruošti gimdos audinius, pateikta OECD TG 440 (OECD bandymų gairės Nr. 440) (18)).

42.

Atlikus fiksavimą, gali būti (bet neprivaloma) nustatyti skydliaukės masę. Valyti irgi būtina labai atsargiai ir tik atlikus fiksavimą, kad nebūtų pažeistas audinys. Pažeidus audinį gali būti gauti netikslūs histopatologinės analizės rezultatai.

43.

Atsižvelgiant į audinio tipą ir numatomą vėliau atlikti histopatologinį tyrimą, tinkamiausioje fiksavimo terpėje turėtų būti konservuoti šie audiniai (žr. 47 skirsnį): visi labai pakitę audiniai, smegenys (jų būdingiausios dalys – didžiosios smegenys, smegenėlės ir smegenų tiltas), nugaros smegenys, akis, skrandis, mažosios ir didžiosios žarnos (taip pat Peyerio plokštelės), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, užkrūčio liauka, skydliaukė, trachėja ir plaučiai (prileidžiant fiksatyvo ir tada panardinant), lytinės liaukos (sėklidės ir kiaušidės), kiti lytiniai organai (gimda, gimdos kaklelis, sėklidžių prielipai, prostata ir sėklinės pūslelės su koaguliatorių liaukomis), makštis, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai [be artimiausio drenažinio mazgo, remiantis geriausiąja laboratorine patirtimi paimamas dar vienas mazgas (15)], periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio), pageidautina, esantis arti raumens, skeleto raumuo ir kaulas su kaulų čiulpais (išpjova arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija). Rekomenduojama atlikti sėklidžių fiksavimą jas panardinant į Bouino arba modifikuotąjį Davidsono fiksatyvą (16) (17). Abu tunica albuginea galai turi būti atsargiai ir negiliai pradurti adata, kad būtų galima greitai prileisti fiksatyvo. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai.

44.

Vertingos informacijos apie poveikį endokrininei sistemai galima gauti ištiriant šiuos organus: lytines liaukas (kiaušides ir sėklides), kitus lytinius organus (gimdą su gimdos kakleliu, sėklidžių prielipus, sėklines pūsleles su koaguliatorių liaukomis, dorsolateralinę ir pilvinę prostatas), makštį, hipofizę, patinų pieno liaukas, skydliaukę ir antinksčius). Patinų pieno liaukų pakitimai nėra pakankamai išsamiai aprašyti, tačiau šis parametras gali būti labai svarbus estrogeninio poveikio turinčias chemines medžiagas. 43 skirsnyje nenurodytų organų ir (arba) audinių stebėjimai neprivalomi (žr. 2 priedėlį).

45.

Histopatologinių tyrimų gairėse (19) pateikta išsamios papildomos informacijos apie skrodimą, fiksavimą, pjaustymą ir endokrininių audinių histopatologiją.

46.

Įgyvendinant tarptautinę bandymų programą gauta šiek tiek įrodymų, kad sunkiai pastebimo poveikio endokrininei sistemai turinčios cheminės medžiagos, menkai veikiančios lytinių hormonų homeostazę, gali būti nustatomos atsižvelgiant į lytinio ciklo sinchronizavimo trikdymą įvairiuose audiniuose ir iš dalies – į atvirus histopatologinius patelių lytinių organų pakitimus. Nors galutinių įrodymų dėl tokio poveikio negauta, rekomenduojama aiškinant kiaušidžių (folikulų, apvalkalų ir kiaušidžių grūdėtųjų ląstelių), gimdos, gimdos kaklelio ir makšties histopatologinių tyrimų rezultatus atsižvelgti į galimo lytinio ciklo asinchroniškumą. Jeigu vertinamas ciklo etapas, nustatomas imant makšties tepinėlius, į jį taip pat galima atsižvelgti atliekant šį palyginimą.

47.

Turėtų būti atliktas išsamus histopatologinis visų kontrolinės grupės ir didžiausiąją dozę gavusios grupės gyvūnų konservuotų organų ir audinių tyrimas. Jeigu nustatoma, kad didžiausiąją dozę gavusioje grupėje atsirado su dozės davimu susijusių pakitimų, turėtų būti atlikti ir visų kitų dydžių dozes gavusių grupių gyvūnų histopatologiniai tyrimai.

48.

Ištiriami visi labai pakitę audiniai.

49.

Jei naudojama pagalbinė grupė, turėtų būti atliekamas histopatologinis audinių ir organų, dėl kurių, ištyrus dozę gavusias grupes, nustatyta, kad jiems buvo padarytas poveikis, tyrimas.

50.

Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant pradedant bandymą turėtų gyvūnų skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos žūties arba numarinimo dėl humaniškų priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičių, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo laiką, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su audinių pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį.

51.

Jeigu įmanoma, skaitiniai rezultatai turėtų būti įvertinti taikant tinkamą visuotinai pripažintą statistinį metodą. Lyginant poveikį pagal dozių intervalą turėtų būti vengiama taikyti įvairius t kriterijus. Statistiniai metodai turėtų būti parenkami planuojant tyrimą.

52.

Siekiant užtikrinti kokybės kontrolę, siūloma surinkti istorinius kontrolinius duomenis ir skaitiniams duomenims apskaičiuoti variacijos koeficientus, ypač parametrams, susijusiems su endokrininei sistemai kenksmingų medžiagų nustatymu. Šie duomenys gali būti naudojami palyginimo tikslais, kai vertinami faktiniai tyrimai.

53.

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

1.

OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.

2.

IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

3.

Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.

4.

Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.

5.

Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.

6.

Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.

7.

Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.

8.

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

9.

OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

10.

OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

11.

OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html

12.

OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

13.

OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

14.

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

15.

Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407.

16.

Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52–85.

17.

Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.

18.

OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.

19.

OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 412 (OECD bandymo gairės Nr. 412) (2009). Originalios poūmio toksiškumo įkvėpus bandymo gairės „Test Guideline“ 412 (TG 412) priimtos 1981 m. (1). Šis (B.8) bandymo metodas (lygiavertis atnaujintosioms TG 412) atnaujintas siekiant jį suderinti su mokslo pasiekimais ir patenkinti dabartines ir būsimas reglamentavimo reikmes.

2.

Šis metodas suteikia galimybę apibūdinti neigiamą poveikį, sukeltą 28 dienas kasdien per kvėpavimo takus duodant kartotinę bandomosios cheminės medžiagos dozę. Atlikus 28 dienų poūmio toksiškumo įkvėpus tyrimus gauti duomenys gali būti naudojami kokybiniams rizikos vertinimams [jeigu po to neatliekamas 90 dienų pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimas (šio priedo B.29 skyrius)]. Šie duomenys taip pat gali suteikti informacijos dėl koncentracijų parinkimo ilgesnio laikotarpio tyrimams, pvz., 90 dienų pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimui. Šis bandymo metodas nėra specialiai skirtas nanomedžiagų bandymams. Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 39 (2).

3.

Siekdama užtikrinti aukštesnę tyrimo kokybę ir kaip galima labiau sumažinti gyvūnų naudojimą, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų įvertinti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą. Pasirinkti tinkamas bandymų koncentracijas gali padėti informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo būdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas, taip pat duomenys, gauti atlikus ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymus. Jeigu yra tikėtinas arba jeigu atliekant tyrimą pastebimas neurotoksinis poveikis, tyrimo vadovas gali nuspręsti įtraukti atitinkamus vertinimus, pvz., funkcinių stebėjimų rinkinį (FSR) ir judėjimo aktyvumo vertinimą. Nors gali būti labai svarbu užtikrinti tinkamą su konkrečiais tyrimais susijusių dozių davimo laiką, ši papildoma veikla neturėtų trukdyti įgyvendinti pagrindinio tyrimo planą.

4.

Ėsdinančių arba dirginančių bandomųjų cheminių medžiagų tirpalai gali būti bandomi taikant koncentracijas, kurioms esant pasiekiamas reikiamas toksiškumo lygis [žr. RD Nr. 39 (2)]. Tačiau veikiant gyvūnus šiomis medžiagomis taikytinos tikslinės koncentracijos turėtų būti gana mažos, kad nesukeltų ženklaus skausmo ir kančių, bet pakankamos, kad būtų galima pratęsti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivę iki tokių lygių, kuriems esant būtų pasiektas reglamentavimo arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncentracijos turėtų būti parenkamos atsižvelgiant į konkretų atvejį ir, pageidautina, remiantis tinkamai suplanuotu ribų nustatymo tyrimu, suteikiančiu informacijos apie pavojingas pasekmes, dirginimo ribinę vertę ir poveikio pasireiškimo laiką (žr. 11–13 skirsnius). Turėtų būti pateiktas koncentracijos pasirinkimo pagrindimas.

5.

Gaištantys gyvūnai arba skausmą ar sunkias ilgalaikes kančias akivaizdžiai patiriantys gyvūnai turėtų būti humaniškai numarinami. Gaištantys gyvūnai laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištančius arba sunkiai kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (3).

6.

Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių graužikai. Tinkamiausia rūšis yra žiurkės. Jeigu naudojama kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.

7.

Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Atsitiktinės atrankos dieną gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaugę, 7–9 savaičių amžiaus. Kūno masė pagal kiekvieną lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti vidutinę tos lyties gyvūnų masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka, paženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.

8.

Kad būtų patogiau stebėti ir kad būtų išvengta painiavos, kiekvienas gyvūnas turėtų būti išskirtinai paženklintas, jeigu įmanoma, naudojant poodinius atsakiklius. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, bet jis gali būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis nėra vanduo. Prieš dozės davimą ir davus dozę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grupėmis pagal lytį ir koncentraciją; narvelyje laikomų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad būtų galima aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną ir kad būtų patiriama kuo mažiau žalos dėl kanibalizmo ir grumtynių. Jeigu dozė gyvūnams duodama tik per nosį, gali reikėti juos pripratinti prie uždaromųjų vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyvūnams neturėtų kelti didelės fizinės, terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali turėti fiziologinių pasekmių, pvz., turėti poveikio kūno temperatūrai (hipertermija) ir (arba) per minutę įkvepiamam tūriui. Jeigu yra bendrųjų duomenų, rodančių, kad tokių pastebimų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždaromųjų vamzdelių nebūtinas. Gyvūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu turėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis nebūtų filtruojamas per kitų narvelyje esančių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, duodant neribotą geriamo vandens kiekį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką.

9.

Parenkant inhaliacinę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį ir bandymo tikslą. Pirmenybė teikiama dozės davimui tik per nosį (ši sąvoka apima sąvokas „tik per galvą“, „tik per nosį“ ir „tik per šnipą“). Pirmenybė dozės davimui tik per nosį paprastai teikiama tiriant skystųjų arba kietųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali būti sėkmingiau pasiekti taikant poveikio per visą kūną metodą, tačiau tai turi būti pagrįsta tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovumą naudojant poveikio per visą kūną kamerą, visa bandomųjų gyvūnų užimama erdvė turėtų neviršyti 5 % kameros tūrio. Poveikio tik per nosį ir poveikio per visą kūną metodų principai ir konkretūs šių metodų privalumai bei trūkumai aprašyti RD Nr. 39 (2).

10.

Kitaip nei ūmaus poveikio tyrimams, 28 dienų poūmio toksiškumo įkvėpus tyrimams ribinių koncentracijų nenustatyta. Didžiausioji bandytina koncentracija turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į šiuos dalykus: 1) didžiausiąją pasiekiamą koncentraciją, 2) „blogiausiu atveju“ taikytiną poveikio žmonėms lygį, 3) poreikį užtikrinti tinkamą deguonies tiekimą ir (arba) 4) gyvūnų gerovės aspektus. Jeigu nėra duomenimis pagrįstų ribų, gali būti taikomos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 (13) nustatytos ūmaus poveikio ribos (t. y. neviršijant 5 mg/l koncentracijos, jeigu tai aerozoliai, 20 mg/l, jeigu tai garai, ir 20 000 ppm, jeigu tai dujos); žr. RD Nr. 39 (2). Jeigu atliekant dujų arba labai lakių bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., šaldymo medžiagų) bandymus būtina viršyti šias ribas, turi būti pateiktas pagrindimas. Ribinė koncentracija turėtų sukelti akivaizdų toksiškumą nesukeldama pernelyg didelio streso gyvūnams ir netrumpindama jų gyvenimo trukmės (3).

11.

Prieš pradedant pagrindinį tyrimą, gali reikėti atlikti ribų nustatymo tyrimą. Ribų nustatymo tyrimas yra išsamesnis už orientacinį tyrimą, nes jis susijęs ne tik su koncentracijų parinkimu. Per ribų nustatymo tyrimą gautos žinios gali padėti sėkmingai atlikti pagrindinį tyrimą. Pvz., ribų nustatymo tyrimas gali suteikti techninės informacijos apie analizės metodus, dalelių dydžius, toksinio poveikio mechanizmų nustatymą, klinikinės patologijos ir histopatologinių tyrimų duomenis ir apytikrius vertinimus, koks NNPL ir kokia didžiausioji leidžiama koncentracija (DLK) galėtų būti taikomi atliekant pagrindinį tyrimą. Tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti ribų nustatymo tyrimą, kad nustatytų kvėpavimo takų dirginimo ribinę vertę (pvz., atliekant histopatologinį kvėpavimo takų tyrimą, plaučių funkcijos tyrimus arba bronchoalveolinį plovimą), didžiausiąją koncentraciją, kuri būtų leidžiama kaip nesukelianti pernelyg didelio streso gyvūnams, ir parametrus, kuriais būtų geriausiai apibūdinamas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas.

12.

Ribų nustatymo tyrimas gali būti atliekamas taikant vieną arba daugiau koncentracijos lygių. Kiekvienas koncentracijos lygis turėtų būti bandomas naudojant ne daugiau kaip tris patinus ir tris pateles. Ribų nustatymo tyrimas turėtų trukti ne mažiau kaip penkias dienas, bet paprastai – ne ilgiau kaip 14 dienų. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas per pagrindinį tyrimą taikytinų koncentracijų parinkimo pagrindimas. Pagrindinio tyrimo tikslas – įrodyti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę remiantis numanoma sunkiausia pasekme. Tinkamiausia mažiausioji koncentracija – nepastebimo neigiamo poveikio lygio koncentracija, didžiausioji – akivaizdų toksiškumą sukelianti koncentracija, nesukelianti pernelyg didelio streso gyvūnams ir netrumpinanti jų gyvenimo trukmės (3).

13.

Parenkant per ribų nustatymo tyrimą taikytinus koncentracijos lygius, turėtų būti atsižvelgiama į visą turimą informaciją, įskaitant struktūros ir savybių ryšius ir duomenis apie panašias chemines medžiagas (žr. 3 skirsnį). Ribų nustatymo tyrimu gali būti patikrintos ir (arba) atmestos pasekmės, kurios laikomos sunkiausiomis mechaniniu požiūriu vertinamomis pasekmėmis, pvz., cholinesterazės inhibavimas organiniais fosforo junginiais, methemoglobino susidarymas veikiant eritrocitotoksinėms medžiagoms, skydliaukės hormonų (T3, T4) reakcija į tirotoksines medžiagas, poveikis baltymams, laktatdehidrogenazei arba neutrofilams atliekant bronchoalveolinį plovimą, siekiant pašalinti nekenksmingas prastai tirpstančias daleles arba plaučius dirginančius aerozolius.

14.

Pagrindinis poūmio toksiškumo tyrimas paprastai atliekamas taikant tris koncentracijos lygius ir prireikus taikant vienalaikę neigiamą kontrolę (naudojant orą) ir (arba) nešiklio kontrolę (žr. 17 skirsnį). Parenkant poveikio lygius turėtų būti pasitelkiami visi turimi duomenys, įskaitant sisteminio toksiškumo tyrimų rezultatus, metabolizmo ir kinetinių savybių duomenis (labai svarbu užtikrinti, kad nebūtų taikomos tokios didžiausiosios koncentracijos, kuriomis būtų įsotinti kinetiniai procesai). Kiekviena bandomoji grupė sudaroma iš ne mažiau kaip dešimties graužikų (penkių patinų ir penkių patelių), kurie keturių savaičių laikotarpiu (bendra tyrimo trukmė – 28 dienos) penkias dienas per savaitę šešias valandas per parą veikiami bandomąja chemine medžiaga. Gyvūnai gali būti veikiami ir septynias dienas per savaitę (pvz., tiriant įkvepiamus vaistus). Jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni konkrečiai bandomajai cheminei medžiagai, siekiant nustatyti kuo tikslesnę koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę, kaip aprašyta 15 skirsnyje, skirtingų lyčių gyvūnams gali būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu taikomas trumpesnis nei šešių valandų per parą poveikis arba jeigu būtina atlikti ilgalaikio (pvz., 22 valandų per parą) poveikio per visą kūną tyrimą, turėtų būti pateiktas atitinkamas pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)]. Poveikio metu gyvūnas neturėtų būti šeriamas, išskyrus atvejus, kai poveikio trukmė ilgesnė kaip šešios valandos. Vandens gali būti duodama per visą poveikio per visą kūną laikotarpį.

15.

Turėtų būti nurodyta, kokiam organui (-ams) skirtos pasirinktos tikslinės koncentracijos, ir taikant šias koncentracijas turėtų būti užtikrinta aiški koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybė:

16.

Siekiant nustatyti toksinio poveikio grįžtamumą, tvarumą arba delsą, reikiamos trukmės, bet ne ilgesniu kaip 14 dienų laikotarpiu po dozės davimo gali būti atliekamas pagalbinis (grįžtamumo) tyrimas. Pagalbinės (grįžtamumo tyrimų) grupės sudaromos iš penkių patinų ir penkių patelių, kurie per pagrindinį tyrimą veikiami kartu su bandomaisiais gyvūnais. Pagalbinės (grįžtamumo) grupės turėtų būti veikiamos didžiausiąja bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; prireikus turėtų būti taikoma vienalaikė kontrolė naudojant orą ir (arba) nešiklį (žr. 17 skirsnį).

17.

Su vienalaikės neigiamos kontrolės (naudojant orą) gyvūnais turėtų būti elgiamasi taip pat, kaip su bandomosios grupės gyvūnais, išskyrus tai, kad jie veikiami išvalytu oru, o ne bandomąja chemine medžiaga. Jeigu siekiant palengvinti bandymo atmosferos sukūrimą naudojamas vanduo arba kita cheminė medžiaga, atliekant tyrimą naudojama nešiklio kontrolės grupė, o ne neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupė. Jeigu įmanoma, kaip nešiklis turėtų būti naudojamas vanduo. Jeigu kaip nešiklis naudojamas vanduo, kontroliniai gyvūnai turėtų būti veikiami oru, kurio drėgnis turėtų būti toks pat, koks taikomas grupėms, kurioms duodama dozė. Tinkamas nešiklis turėtų būti parenkamas remiantis tinkamai atliktu išankstiniu tyrimu arba istoriniais duomenimis. Jeigu nešiklio toksiškumas nėra gerai žinomas, tyrimo vadovas gali nuspręsti taikyti ir neigiamą kontrolę (naudojant orą), ir nešiklio kontrolę, tačiau primygtinai rekomenduojama to nedaryti. Jeigu istoriniai duomenys rodo, kad nešiklis netoksiškas, neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupės naudoti nebūtina, turėtų būti taikoma tik nešiklio kontrolė. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios cheminės medžiagos išankstinį tyrimą nustatoma, kad medžiaga nėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, nėra toksiškas, todėl turėtų būti taikoma kontrolė naudojant šį nešiklį.

18.

Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga dujų, garų, aerozolių arba jų mišinių pavidalu. Per tyrimą naudotina fizinė būsena priklauso nuo fizinių ir cheminių bandomosios cheminės medžiagos savybių, pasirinktos koncentracijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiagą. Higroskopinės ir chemiškai reaguojančios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos sauso oro sąlygomis. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad būtų išvengta sprogių koncentracijų susidarymo. Iš dalelių sudaryta medžiaga gali būti apdorojama mechaniškai, siekiant sumažinti dalelių dydį. Daugiau patarimų pateikta RD Nr. 39 (2).

19.

Dalelių rūšiavimas pagal dydį turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis būtų padarytas visoms svarbioms kvėpavimo takų sritims, rekomenduojama naudoti aerozolius, kurių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 1–3 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis (σg) – 1,5–3,0 (4). Nors turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad šio standarto būtų laikomasi, jeigu jo įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti pateikta ekspertų nuomonė. Pvz., metalų garų dalelės gali būti mažesnės už šį standartą, o įelektrintų dalelių ir pluoštų – didesnės.

20.

Geriausia, kad bandomoji cheminė medžiaga būtų bandoma nenaudojant nešiklio. Jeigu būtina naudoti nešiklį norint pasiekti reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ir užtikrinti reikiamą dalelių dydį, pirmenybė turėtų būti teikiama vandeniui. Visuomet, kai bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama nešiklyje, turėtų būti įrodytas jos stabilumas.

21.

Kiekvieno poveikio metu turėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas ir ne rečiau kaip kartą per valandą registruojamas per poveikio kamerą tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo laiko atžvilgiu) stebėjimas realiuoju laiku yra vienas iš visų dinaminių parametrų matavimų, suteikiantis galimybę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius inhaliacinius parametrus. Jeigu koncentracija stebima tiesiogiai, oro srautų matavimo dažnumas gali būti sumažintas iki vieno matavimo kiekvieną dieną per kiekvieną poveikio seansą. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kad būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo dozės davimo tik per nosį kamerose. Deguonies koncentracija turėtų būti ne mažesnė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šio standarto įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos. Jeigu pirmąją poveikio dieną atlikti matavimai rodo, kad šių dujų lygiai yra tinkami, daugiau matavimų atlikti nebūtina.

22.

Kameroje turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Ir dozę duodant tik per nosį, ir per visą kūną, jeigu įmanoma, per kiekvieną poveikio seansą turėtų būti nuolat stebimas ir kas valandą registruojamas santykinis drėgnis gyvūnų kvėpavimo zonoje. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, tačiau jis gali būti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas dėl trukdžių, atsirandančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metodą.

23.

Jeigu įmanoma, turėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardinė koncentracija poveikio kameroje. Vardinė koncentracija yra sukurtos bandomosios cheminės medžiagos masės ir viso oro srauto, perleisto per inhaliacinių kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardinė koncentracija nėra naudojama apibūdinti poveikį gyvūnui, tačiau, vardinę koncentraciją palyginus su faktine, nustatomas generavimo, kurį užtikrina bandymų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.

24.

Faktinė koncentracija yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, nustatyta paėmus ėminį iš inhaliacinėje kameroje esančios gyvūno kvėpavimo zonos. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos arba cheminių reakcijų metodus ir tada atliekant analizinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrinė analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies miltelių aerozoliams arba mažo lakumo skystųjų dalelių aerozoliams ir turėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrimą atliktais bandomosios cheminės medžiagos savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudarytų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali būti nustatomos atliekant gravimetrinę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esančios medžiagos sudėtis panaši į pirminės medžiagos sudėtį. Jeigu tokios informacijos nėra, tyrimo metu gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotinę bandomosios cheminės medžiagos (geriausia, kad ji būtų ore) analizę. Jeigu aerozolinės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, turėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos fazės.

25.

Jeigu įmanoma, per visą tyrimą turėtų būti naudojama viena bandomosios cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys turėtų būti laikomas tokiomis sąlygomis, kad būtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. Prieš pradedant tyrimą reikėtų apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos savybes, įskaitant jos grynumą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatumą, taip pat nustatytų teršalų ir priemaišų kiekius. Be kitų duomenų, tai galima pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopinę arba dujų chromatografijos analizę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo ėminio tapatumo nustatymas nėra bandymų laboratorijos pareiga, bandymų laboratorijai gali būti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateikėjo nurodytas savybes (pvz., spalvą, fizinę būseną ir t. t.).

26.

Jeigu įmanoma, turėtų būti palaikoma pastovi poveikio atmosfera. Poveikio sąlygų pastovumui įrodyti gali būti naudojamas stebėjimo realiuoju laiku prietaisas, pvz., aerozoliams gali būti naudojamas aerozolių fotometras, garams – bendro angliavandenilių kiekio analizatorius. Faktinė kameroje susidariusi koncentracija turėtų būti matuojama kiekvieną poveikio dieną, ne mažiau kaip tris kartus pagal kiekvieną poveikio lygį. Jeigu tai neįmanoma dėl nedidelių oro srauto greičių arba mažų koncentracijų, gali būti imamas vienas ėminys per vieną poveikio laikotarpį. Būtų geriausia, kad tokiu atveju šis ėminys būtų imamas per visą poveikio laikotarpį. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai neturėtų nukrypti nuo vidutinės kameroje susidariusios koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skystųjų arba kietųjų dalelių aerozoliai. Turėtų būti apskaičiuotas ir ataskaitoje nurodytas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95). Poveikio laikotarpis apima bandomosios cheminės medžiagos sukūrimo trukmę. Į šį laikotarpį įtraukiamas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95) ir irimo laikas. t95 apskaičiavimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).

27.

Jeigu tiriami labai sudėtingi mišiniai, sudaryti iš dujų ir (arba) garų, ir aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios cheminės medžiagos, pučiamos iš specialiai varomų galutinio naudojimo produktų arba prietaisų), kiekvienos fazės veikimas inhaliacinėje kameroje gali būti skirtingas. Todėl iš kiekvienos fazės (dujų ir (arba) garų ir aerozolio) turėtų būti parinkta bent viena indikacinė cheminė medžiaga (analitė); paprastai šiuo tikslu pasirenkama pagrindinė veiklioji mišinio cheminė medžiaga. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mišinys, turėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik veikliosios sudedamosios dalies arba indikacinės cheminės medžiagos (analitės) analizinė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).

28.

Aerozolių dalelių dydžio pasiskirstymas turėtų būti nustatomas bent kartą per savaitę pagal kiekvieną koncentracijos lygį, naudojant pakopinį ėmiklį arba alternatyvų prietaisą, pvz., aerodinaminį dalelių rūšiuotuvą (ADR). Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu ir alternatyviu prietaisu gaunami lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrimą gali būti naudojamas alternatyvus prietaisas.

29.

Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu turėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudyklė arba barboteris. Atlikus dalelių dydžio analizę nustatyta masės koncentracija turėtų neviršyti priimtinų filtruojamosios analizės būdu nustatytos masės koncentracijos ribų [žr. RD Nr. 39 (2)]. Jeigu, taikant visas bandomas koncentracijas, lygiavertiškumą galima įrodyti pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti imamasi priemonių, kad būtų kuo mažiau negalutinių duomenų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti tyrimą.

30.

Garuose esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu garų atmosferoje aptinkama dalelių, dėl kurių gali susidaryti mišrių fazių.

31.

Prieš poveikio laikotarpį, poveikio laikotarpiu ir pasibaigus poveikio laikotarpiui, turėtų būti atliekami klinikiniai gyvūnų stebėjimai. Atsižvelgiant į gyvūnų reakciją poveikio laikotarpiu, stebėjimus gali reikėti atlikti dažniau. Jeigu gyvūnų stebėjimą apsunkina gyvūnų uždaromųjų vamzdelių naudojimas, prastas poveikio per visą kūną kamerų apšvietimas arba neskaidrios atmosferos, gyvūnai turėtų būti atidžiai apžiūrimi po dozės davimo. Stebėjimais prieš kitos dienos poveikį galima įvertinti toksinio poveikio grįžtamumą arba pasunkėjimą.

32.

Visi stebėjimai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvieną gyvūną. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas žūties laikas.

33.

Narveliuose turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės, kvėpavimo ir kraujotakos sistemų, centrinės nervų sistemos, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pakitimai. Ypač reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Matuojant temperatūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinamųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperatūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu. Į tyrimo protokolą gali būti įtraukti papildomi vertinimai, pvz., kinetikos, biomonitoringo, plaučių funkcijos, plaučių audinyje besikaupiančių mažo tirpumo medžiagų užsilaikymo ir elgsenos pokyčių.

34.

Kiekvieno gyvūno masė turėtų būti registruojama prieš pat pirmąjį poveikį (nulinę dieną), o vėliau – dukart per savaitę (pvz., pirmadieniais ir penktadieniais, siekiant įrodyti gyvūnų atsigavimą per savaitgalį, kai nedaroma poveikio, arba tokiais laiko intervalais, kad būtų galima įvertinti sisteminį toksiškumą) ir kai gyvūnas nugaišta arba yra numarinamas. Jeigu per pirmąsias dvi savaites nepasireiškia jokio poveikio, likusiu tyrimo laikotarpiu kūno masė gali būti matuojama kas savaitę. Pagalbiniai (grįžtamumo tyrimų) gyvūnai (jeigu naudojami) atsigavimo laikotarpiu turėtų būti ir toliau sveriami kas savaitę. Baigus tyrimą, visi gyvūnai turėtų būti pasverti netrukus po numarinimo, kad būtų galima tiksliai apskaičiuoti organų ir kūno masių santykius.

35.

Pašarų suvartojimas turėtų būti matuojamas kas savaitę. Gali būti matuojamas ir vandens suvartojimas.

36.

Klinikinės patologijos vertinimai turėtų būti taikomi visiems gyvūnams, įskaitant kontrolinius ir pagalbinius (grįžtamumo tyrimų) gyvūnus, kai jie numarinami. Turėtų būti užregistruotas laikotarpis nuo poveikio pabaigos iki kraujo paėmimo, ypač jeigu tiriama pasekmė sparčiai nyksta. Ėminių ėmimas baigus duoti dozę būtinas pagal tuos parametrus, kuriems būdingas trumpas plazmos pusinės eliminacijos laikas (pvz., COHb, CHE ir MetHb).

37.

1 lentelėje nurodyti klinikinės patologijos parametrai, kurie paprastai privalomi atliekant visus toksikologinius tyrimus. Nereikalaujama visada atlikti šlapimo analizę, tačiau ji gali būti atliekama, jeigu manoma, kad tai būtų naudinga atsižvelgiant į numatomą arba nustatytą toksiškumą. Kad būtų geriau apibūdintas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas, tyrimo vadovas gali nuspręsti įvertinti papildomus parametrus (pvz., cholinesterazė, lipidai, hormonai, rūgščių ir bazių balansas, methemoglobinas arba Heinco kūneliai, kreatino kinazė, mieloidų ir eritroidų santykis, troponinai, arterinio kraujo dujos, laktato dehidrogenazė, sorbitolio dehidrogenazė, glutamato dehidrogenazė ir gamaglutamiltranspeptidazė.

1   lentelė

Įprastiniai klinikinės patologijos parametrai

38.

Jeigu yra įrodymų, kad pagrindinė kaupimosi ir užsilaikymo vieta yra apatiniai kvėpavimo takai (t. y. alveolės), tada, norint kiekybiškai išanalizuoti prielaidomis pagrįsto dozės poveikio parametrus, daugiausia dėmesio skiriant alveolitui, plaučių uždegimui ir fosfolipidozei, būtų galima rinktis bronchoalveolinio plovimo (BAP) metodą. Šis metodas suteikia galimybę tinkamai ištirti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir per tam tikrą laiką įvykusius alveolių pažeidimų pokyčius. BAP skystis gali būti analizuojamas siekiant nustatyti įvairių leukocitų kiekius, bendrą baltymų kiekį ir laktato dehidrogenazę. Kiti parametrai, į kuriuos būtų galima atsižvelgti, yra parametrai, rodantys lizosomų pažeidimus, fosfolipidozę, fibrozę ir dirginamąjį arba alerginį uždegimą, galbūt įtraukiant uždegimą sukeliančių citokinų ir (arba) chemokinų tyrimą. BAP matavimais paprastai papildomi histopatologinių tyrimų rezultatai, tačiau BAP matavimai negali atstoti šių tyrimų rezultatų. Plaučių plovimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).

39.

Turėtų būti visiškai nuleidžiamas visų bandomųjų gyvūnų, įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyvūnų gerovės sumetimais, kraujas (jeigu įmanoma) ir atliekamas šių gyvūnų bendrasis skrodimas. Turėtų būti užregistruotas laikas nuo kiekvieno paskutinio dozės davimo kiekvienam gyvūnui iki to gyvūno numarinimo. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaišęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autolizę. Skrodimai turėtų būti atliekamai kaip galima anksčiau, paprastai – per dieną arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai turėtų būti užregistruojami pagal kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kvėpavimo takų pakitimams.

40.

2 lentelėje nurodyti organai ir audiniai, kurie turėtų būti užkonservuojami atliekant bendrąjį skrodimą, naudojant histopatologiniam tyrimui tinkamą fiksavimo terpę. Skliausteliuose ([…]) nurodyti organai ir audiniai, taip pat kai kurie kiti organai ir audiniai, dėl kurių konservavimo sprendžia tyrimo vadovas. Paryškintuoju šriftu nurodytieji organai turėtų būti nuvalyti ir pasverti kaip galima greičiau po atskyrimo, kol neišdžiuvo. Skydliaukė ir sėklidžių prielipai turėtų būti sveriami tik esant reikalui, nes valymo įrankiai gali pakenkti histopatologiniam tyrimui. Audiniai ir organai turėtų būti fiksuojami 10 % buferiniame formaline arba kitokiame tinkamame fiksatyve kaip galima greičiau po skrodimo, ne mažiau kaip 24–48 valandos iki valymo, atsižvelgiant į ketinamą naudoti fiksatyvą.

2   lentelė

Atliekant bendrąjį skrodimą konservuojami organai ir audiniai

Antinksčiai

Kaulų čiulpai (ir (arba) šviežiai paruošta punkcija)

Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)

[Akys (tinklainė, regos nervas) ir akių vokai]

Širdis

Inkstai

Gerklos (trys lygiai, į vieną lygį įtraukiant antgerklio pagrindą)

Kepenys

Plaučiai (visos vieno lygmens skiltys, įskaitant pagrindinius bronchus)

Limfmazgiai, imami iš plaučių vartų srities, ypač jeigu tiriamos mažo tirpumo kietųjų dalelių bandomosios cheminės medžiagos. Atliekant nuodugnesnius tyrimus, per kuriuos nagrinėjami imuniniai aspektai, gali būti imama daugiau mazgų, pvz., iš tarpuplaučio, kaklo, pažandžių ir (arba) ausų sričių.

Nosiaryklės audiniai (ne mažiau keturių lygių; į vieną lygį įtraukiant nosiaryklės latakus ir nosies limfinius audinius (NLA))

Stemplė

[Uoslės receptoriai]

Kiaušidės

Sėklinės pūslelės

Stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)

Blužnis

Skrandis

Sėklidės

Užkrūčio liauka

Skydliaukė

Trachėja (ne mažiau kaip du lygiai, iš kurių vienas – išilginis keteros pjūvis ir vienas – skersinis pjūvis

[Šlapimo pūslė]

Gimda

Visi labai pakitę audiniai

41.

Plaučiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami tinkamu fiksatyvu užtikrinant 20–30 cm vandens sluoksnio slėgį, kad būtų išsaugota plaučių struktūra (5). Išpjovos turėtų būti imamos iš visų vieno lygmens skilčių, įskaitant pagrindinius bronchus, bet, jeigu atliekamas plaučių plovimas, neišplautos skiltys turėtų būti išpjaunamos trimis lygmenimis (ne iš eilės).

42.

Tiriami ne mažiau kaip keturi nosiaryklės audinių lygiai; vienas iš jų turėtų apimti nosinę ryklės angą (5, 6, 7, 8, 9), kad būtų galima tinkamai ištirti ragėjantįjį, pereinamąjį (be blakstienėlių, kvėpuojamąjį), kvėpuojamąjį (su blakstienėlėmis, kvėpuojamąjį) ir uodžiamąjį epitelius bei limfodrenažinį audinį (NALT; 10, 11). Turėtų būti ištirti trys gerklų lygiai; vienas iš jų turėtų apimti antgerklio pagrindą. Turėtų būti ištirti ne mažiau kaip du trachėjos lygiai; vienas iš jų turėtų būti išilginis pagrindinių bronchų išsišakojimo keteros pjūvis ir vienas – skersinis pjūvis.

43.

Turėtų būti atliktas visų 2 lentelėje nurodytų organų ir audinių histopatologinis tyrimas, apimantis kontrolinę ir didžiausiosios koncentracijos grupes, taip pat visus gyvūnus, kurie tyrimo metu nugaišo arba buvo numarinti. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas kvėpavimo takams, tiksliniams organams ir labai pakitusiems audiniams. Visose grupėse turėtų būti tiriami didžiausiosios koncentracijos grupės gyvūnų organai ir audiniai, dėl kurių nustatyta pakitimų. Norėdamas įrodyti aiškią reakciją į tam tikrą koncentraciją, tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti papildomų grupių histopatologinius tyrimus. Jeigu naudojama pagalbinė (grįžtamumo tyrimų) grupė, atliekant histopatologinį tyrimą turėtų būti tiriami visi audiniai ir organai, kuriems padarytas poveikis dozę gavusiose grupėse. Jeigu didžiausiosios koncentracijos grupėje nebaigus bandymo nugaišta labai daug gyvūnų ar kyla kitokių problemų, mažinančių duomenų reikšmingumą, turėtų būti atliktas kito pagal dydį (mažesnio) koncentracijos lygio histopatologinis tyrimas. Reikėtų mėginti rasti sąsajų tarp bendrųjų stebėjimų ir mikroskopinės analizės rezultatų.

44.

Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno kūno masės, pašarų suvartojimo, klinikinės patologijos tyrimų, organų masės ir histopatologinių tyrimų duomenys. Klinikinių stebėjimų duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant naudotų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyvūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašymą, pasireiškimo laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas. Visi rezultatai – kiekybiniai ir papildomi – turėtų būti įvertinti taikant tinkamą statistinį metodą. Gali būti taikomas bet kuris visuotinai pripažintas statistinis metodas; statistiniai metodai turėtų būti parenkami planuojant tyrimą.

45.

Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):