28.4.2017   

LT

Europos Sąjungos oficialusis leidinys

L 112/1


KOMISIJOS REGLAMENTAS (ES) 2017/735

2017 m. vasario 14 d.

kuriuo, derinant prie technikos pažangos, iš dalies keičiamas Reglamento (EB) Nr. 440/2008, nustatančio bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), priedas

(Tekstas svarbus EEE)

EUROPOS KOMISIJA,

atsižvelgdama į Sutartį dėl Europos Sąjungos veikimo,

atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB, (1) ypač į jo 13 straipsnio 2 dalį,

kadangi:

(1)

Komisijos reglamente (EB) Nr. 440/2008 (2) pateikti bandymų metodai, skirti cheminių medžiagų fizikinėms ir cheminėms savybėms, toksiškumui ir ekotoksiškumui nustatyti ir taikytini pagal Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006;

(2)

Reglamentą (EB) Nr. 440/2008 būtina atnaujinti, kad į jį būtų įtraukti Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) neseniai patvirtinti nauji ir atnaujinti bandymų metodai, siekiant atsižvelgti į techninę pažangą ir sumažinti bandymams naudojamų gyvūnų skaičių pagal Europos Parlamento ir Tarybos direktyvą 2010/63/ES (3). Dėl šio projekto konsultuotasi su suinteresuotaisiais subjektais;

(3)

šį pritaikymą prie techninės pažangos sudaro dvidešimt bandymų metodų: vienas naujas fizikinių ir cheminių savybių nustatymo metodas, penki nauji ir vienas atnaujintas ekotoksiškumo vertinimo bandymo metodas, du atnaujinti išlikimo ir elgesio aplinkoje bandymo metodai bei keturi nauji ir septyni atnaujinti poveikio žmonių sveikatai nustatymo metodai;

(4)

EBPO reguliariai peržiūri savo bandymų gaires, siekdama nustatyti tas, kurios jau moksliškai atgyveno. Atliekant šį derinimą su technikos pažanga, pašalinami šeši bandymo metodai, kurių atitinkamos EBPO bandymų gairės yra panaikintos;

(5)

todėl Reglamentą (EB) Nr. 440/2008 reikėtų atitinkamai iš dalies pakeisti;

(6)

šiame reglamente numatytos priemonės atitinka pagal Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 133 straipsnį įsteigto komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:

1 straipsnis

Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas pagal šio reglamento priedą.

2 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja dvidešimtą dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.

Priimta Briuselyje 2017 m. vasario 14 d.

Komisijos vardu

Pirmininkas

Jean-Claude JUNCKER


(1)  OL L 396, 2006 12 30, p. 1.

(2)  2008 m. gegužės 30 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 440/2008, nustatantis bandymo metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (OL L 142, 2008 5 31, p. 1).

(3)  2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos (OL L 276, 2010 10 20, p. 33).


PRIEDAS

Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas taip:

1)

A dalis papildoma šiuo skyriumi:

„A.25   DISOCIACIJOS VANDENYJE KONSTANTOS (TITRAVIMO METODAS. SPEKTROFOTOMETRINIS METODAS. KONDUKTOMETRINIS METODAS)

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 112 (1981 m.).

Būtinos sąlygos

Tinkamas analizės metodas

Tirpumas vandenyje

Nurodomoji informacija

Struktūrinė formulė

Elektrinis laidis taikant konduktometrinį metodą

Tikslinamieji pareiškimai

Visus bandymo metodus galima atlikti naudojant grynas ar techninio grynumo medžiagas. Reikėtų atsižvelgti į galimą priemaišų poveikį rezultatams.

Titravimo metodas netinka mažai tirpioms medžiagoms (žr. toliau Bandymo tirpalai).

Spektrofotometrinis metodas tinka tik toms medžiagoms, kurių disocijuotos ir nedisocijuotos formų UV/VIS absorbcijos spektrai žymiai skiriasi. Šis metodas taip pat gali tikti mažai tirpioms medžiagoms ir vykstant ne rūgštinei / bazinei disociacijai, pvz., susidarant kompleksams.

Jei galioja Onzagerio lygtis, galima taikyti konduktometrinį metodą, netgi esant gana mažai koncentracijai ir netgi nesant rūgštinės / bazinės pusiausvyros.

Tipiniai dokumentai

Šis bandymo metodas pagrįstas metodais, pateiktais skirsnyje Literatūra išvardytose nuorodose ir EPA priešgamybinio pranešimo preliminariniame vadovo projekte, 1978 m. rugpjūčio 18 d.

METODAS. BANDYMO ĮVADAS, TIKSLAS, TAIKYMO SRITIS, SVARBA, TAIKYMAS IR RIBOS

Cheminės medžiagos disociacija vandenyje yra svarbi vertinant jos poveikį aplinkai. Ji daro įtaką medžiagos formai, kuri savo ruožtu lemia jos elgseną ir transportavimą. Ji gali veikti cheminės medžiagos adsorbciją dirvožemyje ir nuosėdose bei jos absorbciją į biologines ląsteles.

Apibrėžtys ir vienetai

Disociacija yra grįžtamasis skilimas į dvi ar daugiau cheminių dalelių, kurios gali būti joninės. Procesas paprastai žymimas taip:

RXR ++ X

reakciją apibūdinanti koncentracijos pusiausvyros konstanta yra:

Formula

pavyzdžiui, konkrečiu atveju, kai R yra vandenilis (medžiaga yra rūgštis), konstanta yra

Formula

arba

Formula

Etaloninės medžiagos

Šias etalonines medžiagas nebūtina naudoti kiekvienu atveju, kai tiriama nauja cheminė medžiaga. Jos pirmiausia pateiktos tam, kad retkarčiais būtų galima atlikti metodo kalibravimą ir būtų galimybė palyginti rezultatus, jei taikomas kitas metodas.

 

pKa  (1)

Temp. °C

p-nitrofenolis

7,15

25 (1)

Benzenkarboksirūgštis

4,12

20

p-chloranilinas

3,93

20

Būtų naudinga turėti kelias pK vertes turinčią cheminę medžiagą, kaip toliau nurodyta skirsnyje Bandymo metodo principas. Tokia medžiaga galėtų būti:

Citrinų rūgštis

pKa (8)

Temperatūra °C

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

Bandymo metodo principas

Aprašytas cheminis procesas paprastai tik šiek tiek priklauso nuo temperatūros aplinkai būdingame temperatūros intervale. Reikia išmatuoti cheminės medžiagos disocijavusios ir nedisocijavusios formų koncentraciją, kad būtų galima nustatyti disociacijos konstantą. Žinant Apibrėžčių ir vienetų skyriuje nurodytos disociacijos reakcijos stechiometriją, galima nustatyti atitinkamą konstantą. Šiame bandymo metode aprašytu konkrečiu atveju cheminė medžiaga elgiasi kaip rūgštis ar bazė, todėl patogiausias nustatymo būdas – jonizuotos ir nejonizuotos formų santykinės koncentracijos ir tirpalo pH nustatymas. Santykis tarp šių pKa lygties narių pateiktas pirmiau Apibrėžčių ir vienetų skirsnyje. Kai kurios cheminės medžiagos turi daugiau kaip vieną disociacijos konstantą ir galima sukurti panašias lygtis. Kai kurie iš čia aprašytų metodų taip pat tinka vykstant nerūgštinei / bazinei disociacijai.

Kokybės kriterijai

Pakartojamumas

Reikėtų atlikti kartotinį disociacijos konstantos nustatymą (ne mažiau kaip tris kartus) ± 0,1 log vienetų tikslumu.

BANDYMO PROCEDŪRŲ APRAŠYMAS

Yra du pagrindiniai pKa. nustatymo būdai. Taikant vieną, žinomas cheminės medžiagos kiekis titruojamas etaloniniu rūgšties arba bazės tirpalu; pagal kitą nustatoma jonizuotos ir nejonizuotos formų santykinė koncentracija ir jų priklausomybė nuo pH.

Parengiamieji darbai

Šiais principais pagrįsti metodai gali būti klasifikuojami kaip titravimo, spektrofotometrinės ir konduktometrinės procedūros.

Bandymo tirpalai

Taikant titravimo ir konduktometrinį metodą, cheminė medžiaga turėtų būti ištirpinta distiliuotame vandenyje. Taikant spektrofotometrinį ir kitus metodus, naudojami buferiniai tirpalai. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija neturėtų būti didesnė nei 0,01 mol/l arba viena antroji soties koncentracijos, jei ši mažesnė, o tirpalams ruošti turėtų būti naudojama gryniausia turima medžiagos forma. Jei medžiagos tirpumas vidutinis, ją galima ištirpinti mažame tūryje su vandeniu maišaus tirpiklio prieš padidinant iki pirmiau nurodytų koncentracijos verčių.

Tirpalus reikėtų tikrinti dėl emulsijos susidarymo naudojant Tindalio šviesos pluoštą, ypač jei buvo naudojamas kitas tirpiklis tirpumui padidinti. Jei naudojami buferiniai tirpalai, jų koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 0,05 mol/l.

Bandymo sąlygos

Temperatūra

Temperatūra turėtų būti kontroliuojama bent ± 1°C tikslumu. Nustatymą pageidautina atlikti 20 °C temperatūroje.

Jei yra įtarimų dėl reikšmingos priklausomybės nuo temperatūros, nustatymą reikėtų atlikti esant mažiausiai dar dviem temperatūros vertėms. Šiuo atveju temperatūros intervalai turėtų būti 10 °C, o temperatūra kontroliuojama ± 0,1 °C tikslumu.

Analizės

Dėl metodo bus sprendžiama atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos tipą. Jis turi būti pakankamai jautrus, kad būtų galima nustatyti skirtingas daleles esant kiekvienai bandymo tirpalo koncentracijai.

Bandymo eiga

Titravimo metodas

Bandymo tirpalas matuojamas titruojant reikiamu etaloniniu bazės ar rūgšties tirpalu ir matuojant pH po kiekvieno titranto pridėjimo. Iki ekvivalentinio taško titrantą reikėtų įpilti ne mažiau kaip per 10 kartų. Jei pusiausvyra pasiekiama pakankamai greitai, galima naudoti savirašį potenciometrą. Taikant šį metodą nebūtina tiksliai žinoti suminį medžiagos kiekį ir jos koncentraciją. Turi būti imtasi priemonių anglies dioksidui pašalinti. Daugiau informacijos apie procedūrą, atsargumo priemones ir skaičiavimą pateikta tipinių bandymų aprašymuose, pvz., (1), (2), (3), (4) nuorodos.

Spektrofotometrinis metodas

Nustatomas bangos ilgis, kuriam esant cheminės medžiagos jonizuotos ir nejonizuotos formų ekstinkcijos koeficientai žymiai skiriasi. Gaunamas pastovios koncentracijos tirpalų UV/VIS absorbcijos spektras, esant pH vertei, kai medžiaga yra iš esmės nejonizuota ir visiškai jonizuota bei kelioms tarpinėms pH vertėms. Tai galima atlikti nedidelius koncentruotos rūgšties (bazės) kiekius dedant į palyginti didelį cheminės medžiagos daugiakomponenčio buferinio tirpalo tūrį, iš pradžių esant didelei (mažai) pH vertei (nuor. 5), arba pridedant vienodus cheminės medžiagos pradinio tirpalo, pvz., vandenyje, metanolyje, tūrius į pastovius tūrius įvairių buferinių tirpalų, apimančių reikiamą pH intervalą. Pagal pH ir optinio tankio vertes, esant pasirinktam bangos ilgiui, apskaičiuojamas pakankamas pKa verčių skaičius, naudojant duomenis, gautus bent penkioms pH vertėms, kai cheminė medžiaga yra ne mažiau kaip 10 procentų ir mažiau kaip 90 procentų jonizuota. Papildomi bandymų duomenys ir skaičiavimo metodas pateikti (1) nuorodoje.

Konduktometrinis metodas

Naudojant žinomos mažos konstantos celę, matuojamas maždaug 0,1 mol/l cheminės medžiagos tirpalo laidžiui matuoti skirtame vandenyje laidis. Taip pat matuojamos kelių šio tirpalo tiksliai praskiestų tirpalų laidžio vertės. Kiekvieną kartą koncentracija mažinama pusiau, o tirpalų serija turi aprėpti bent vieną koncentracijos dydžių eilę. Ribinis laidis esant begaliniam praskiedimui nustatomas atliekant panašų bandymą su Na druska ir ekstrapoliuojant. Taikant Onzagerio lygtį, pagal kiekvieno tirpalo laidį galima apskaičiuoti disociacijos laipsnį, taigi taikant Ostvaldo praskiedimo dėsnį galima apskaičiuoti disociacijos konstantą kaip K = α2C/(1 – α), kai C yra koncentracija moliais litre, o α – disociacijos laipsnis. Turi būti imtasi priemonių CO2 pašalinti. Daugiau informacijos apie bandymo duomenis ir skaičiavimą pateikta tipinių bandymų aprašymuose ir (1), (6) bei (7) nuorodose.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų apdorojimas

Titravimo metodas

pKa apskaičiuojamas 10 matavimo taškų titravimo kreivėje. Apskaičiuojamas tokių pKa verčių vidurkis ir standartinis nuokrypis. Reikėtų įtraukti pH priklausomybės nuo etaloninio bazės ar rūgšties tirpalo tūrio grafiką ir duomenis lentelių pavidalu.

Spektrofotometriniai metodai

Į lenteles įrašomos kiekvienam spektrui gautos optinio tankio ir pH vertės. Pagal tarpinius spektrinių duomenų taškus apskaičiuojamos ne mažiau kaip penkios pKa vertės, taip pat apskaičiuojamas šių rezultatų vidurkis ir standartinis nuokrypis.

Konduktometrinis metodas

Ekvivalentinis laidis Λ apskaičiuojamas kiekvienai rūgšties koncentracijai ir kiekvienai mišinio, sudaryto iš vieno ekvivalento rūgšties ir 0,98 ekvivalento karbonato neturinčio natrio hidroksido, koncentracijai. Rūgšties perteklius imamas tam, kad nebūtų OH pertekliaus dėl hidrolizės. Gaunamas 1/Λ kaip √C funkcijos grafikas, o druskos Λo gali būti nustatytas atliekant ekstrapoliavimą į nulinę koncentraciją.

Rūgšties Λo gali būti apskaičiuotas, naudojant literatūroje pateiktas H+ ir Na+ vertes. Kiekvienos koncentracijos pKa gali būti apskaičiuota pagal α = Λio ir Ka = α2C/(1 – α). Tikslesnės Ka vertės gali būti gautos darant judrumo ir aktyvumo pataisas. Reikėtų apskaičiuoti pKa verčių vidurkį ir standartinius nuokrypius.

Bandymo ataskaita

Reikėtų pateikti visus neapdorotus duomenis, apskaičiuotas pKa vertes kartu su skaičiavimo metodu (pageidautina lentelės pavidalu, koks siūlomas nuor. 1), taip pat pirmiau aprašytus statistinius parametrus. Jei taikomi titravimo metodai, reikėtų pateikti titrantų standartizavimo duomenis.

Jei taikomas spektrofotometrinis metodas, reikėtų pateikti visus spektrus. Jei taikomas konduktometrinis metodas, ataskaitoje reikėtų pateikti celės konstantos nustatymo duomenis. Reikėtų pateikti informaciją apie naudojamą įrangą, analizės metodus ir visų naudotų buferinių tirpalų tipą.

Reikėtų pateikti bandymo temperatūros vertę (-es).

LITERATŪRA

(1)

Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.

(2)

Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).

(3)

ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(4)

Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

(5)

Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).

(6)

ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(7)

Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (žr. pirmiau).

(8)

Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“

2)

B dalies B.5 skyrius pakeičiamas taip:

„B.5   ŪMUS AKIŲ DIRGINIMAS IR (ARBA) ĖSDINIMAS

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 405 (2012). EBPO cheminėms medžiagoms bandyti skirtos bandymų gairės periodiškai peržiūrimos, siekiant, kad jose būtų atsižvelgta į geriausius turimus mokslinius duomenis. Anksčiau peržiūrint šias gaires, ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimus pagerinimo būdus, įvertinant visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kad būtų išvengta nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais ir taip būtų sprendžiamos jų gerovės problemos. Į TG 405 (priimtas 1981 m. ir atnaujintas 1987, 2002 ir 2012 m.) įtraukta rekomendacija, kad prieš atliekant aprašytą ūmaus akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymą, reikėtų atlikti esamų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę (1). Jei duomenų nepakanka, rekomenduojama jų gauti atliekant nuosekliuosius bandymus (2)(3). Bandymų strategiją, pateiktą kaip šio bandymų metodo priedėlis, sudaro patvirtinti ir priimti in vitro bandymai. Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (2) taikymo tikslu kompleksinių bandymų strategija taip pat įtraukta į atitinkamą ECHA rekomendaciją (21). Bandymus su gyvūnais reikėtų atlikti tik tais atvejais, kai nustatoma, kad jie yra būtini, išnagrinėjus turimus alternatyvius metodus, ir taikyti tik tuos metodus, kurie nustatyti kaip tinkami. Tuo metu, kai buvo rengiamas šio atnaujinto bandymo metodo projektas, pagal kai kurias reglamentavimo sistemas vis dar buvo būtina arba reikalaujama taikyti šį metodą.

Vėliausiame atnaujinime daugiausia dėmesio skiriama analgetikų ir anestetikų naudojimui, nedarant įtakos pagrindinei bandymų gairių koncepcijai ir struktūrai. ICCVAM (3) ir tarptautinė mokslinė nepriklausomų ekspertų grupė peržiūrėjo vietinių anestetikų ir sisteminių analgetikų įprastinio naudojimo naudą bei apribojimus ir humaniško poveikio vertinamąsias baigtis, atliekant in vivo akių dirginimo saugos bandymus (12). Peržiūros išvada yra ta, kad, naudojant vietinius anestetikus ir sisteminius analgetikus, dažniausiai arba visiškai būtų galima išvengti skausmo ir kančių, nedarant įtakos bandymo rezultatui, ir rekomenduojama, kad šios medžiagos būtų visuomet naudojamos. Šiame bandymo metode atsižvelgta į šią peržiūrą. Atliekant ūmaus akių dirginimo ir ėsdinimo in vivo bandymus, įprastai reikėtų naudoti vietinius anestetikus, sisteminius analgetikus ir humaniško poveikio vertinamąsias baigtis. Jų naudojimo išimtys turėtų būti pagrįstos. Šiame metodo aprašyme nurodyti patobulinimai iš esmės sumažins gyvūnų skausmą ir kančias arba jų bus išvengta atliekant daugelį bandymų, kai vis dar yra būtinas in vivo akių saugos bandymas.

Subalansuotą prevencinį skausmo valdymą turėtų sudaryti (i) įprastinis išankstinis apdorojimas vietiniu anestetiku (pvz., proparakainu ar tetrakainu) ir sisteminiu analgetiku (pvz., buprenorfinu), (ii) įprastinio paskesnio nuskausminimo sisteminiais analgetikais (pvz., buprenorfinu ir meloksikamu) planas, (iii) planinis gyvūnų stebėjimas, monitoringas ir registravimas dėl klinikinių skausmo ir (arba) kančių požymių ir (iv) planinis visų akių pažeidimo tipų, rimtumo ir eigos stebėjimas, monitoringas ir registravimas. Papildoma informacija pateikta toliau aprašytose atnaujintose procedūrose. Po veikimo bandomąja chemine medžiaga nereikėtų naudoti papildomų vietinių anestetikų ar analgetikų, kad būtų išvengta tyrimo trukdžių. Analgetikų su priešuždegiminiu veikimu (pvz., meloksikamo) nereikėtų naudoti kaip vietinių analgetikų, o sisteminio naudojimo dozės neturėtų trukdyti akių poveikiui.

Apibrėžtys aprašytos bandymo metodo priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI

Siekiant užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą cheminės medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudaro turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys cheminės medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (4)(5), be to, patvirtintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ir dirginimo bandymų rezultatai (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tyrimai gali būti daromi prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas.

Tokia tam tikrų cheminių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia atlikti cheminės medžiagos akių ėsdinimo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš svarstant in vivo akių bandymo atlikimą, pageidautina prieš tai atlikti cheminės medžiagos in vitro ir (arba) odos ėsdinimo in vivo padarinių tyrimą ir ją įvertinti taikant B.4 bandymų metodo (7) nuosekliųjų bandymų strategiją arba kompleksinių bandymų strategiją, aprašytą ECHA rekomendacijoje (21).

Nuosekliųjų bandymų strategija, kurią sudaro patvirtintų in vitro ar ex vivo akių ėsdinimo ar dirginimo bandymų atlikimas, yra įtraukta į šį bandymo metodą kaip priedėlis ir, dėl REACH, į ECHA rekomendaciją (21). Prieš pradedant in vivo bandymus, rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos. Naujoms cheminėms medžiagoms rekomenduojamas nuosekliųjų bandymų metodas, siekiant gauti moksliškai pagrįstus cheminės medžiagos ėsdinimo ar dirginimo duomenis. Esamoms cheminėms medžiagoms, apie kurių odos ir akių ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija gali būti taikoma trūkstamiems duomenims gauti. Kitokios bandymo strategijos arba procedūros taikymas arba sprendimas netaikyti nuosekliųjų bandymų metodo turėtų būti pagrįstas.

IN VIVO BANDYMO METODO PRINCIPAS

Po parengtinio apdorojimo sisteminiu analgetiku ir suleidus atitinkamo vietinio anestetiko, viena iš bandymo gyvūno akių veikiama vienkartine bandomosios cheminės medžiagos doze, neapdorota akis naudojama kaip kontrolinė. Akių dirginimo ir (arba) ėsdinimo geba nustatoma tam tikrais laiko tarpais balais įvertinant junginės, ragenos ir rainelės pažeidimus. Be to, siekiant išsamiai įvertinti poveikį, aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakankama, kad būtų galima įvertinti, ar poveikis yra grįžtamas ar negrįžtamas.

Gyvūnai, kuriems bet kurioje bandymo stadijoje pasireiškia stiprus skausmas, kančios arba pažeidimai, atitinkantys šiame bandymų metode aprašytas humaniško poveikio vertinamąsias baigtis (žr. 26 pastraipą), turi būti humaniškai numarinami, o cheminė medžiaga atitinkamai įvertinta. Sprendimo dėl gaištančių ir stipriai kenčiančių gyvūnų humaniško numarinimo priėmimo kriterijai yra nagrinėjami EBPO rekomendaciniame dokumente (8).

IN VIVO BANDYMO METODO PARENGIAMIEJI DARBAI

Rūšių parinkimas

Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni suaugę triušiai. Kitų rūšių ar veislių naudojimas turi būti pagrįstas.

Gyvūnų paruošimas

Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys turėtų būti patikrintos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturėtų būti naudojami.

Laikymo ir šėrimo sąlygos

Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turėtų būti 20 °C (± 3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų siekti, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Reikėtų vengti per didelio šviesos stiprio. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.

BANDYMO PROCEDŪRA

Vietinių anestetikų ir sisteminių analgetikų naudojimas

Rekomenduojamos šios procedūros, kad atliekant saugos akims bandymo procedūras būtų išvengta skausmo ir kančių arba jos būtų kiek įmanoma mažesnės. Jas galima pakeisti alternatyviomis procedūromis, jei būtų nustatyta, kad jos vienodai arba labiau padeda išvengti skausmo ir kančių.

Šešiasdešimt minučių iki veikimo chemine medžiaga (TCA) pradžios daroma buprenorfino 0,01 mg/kg poodinė injekcija, kad būtų užtikrintas gydomasis sisteminio nuskausminimo lygis. Neturima duomenų arba nėra tikėtina, kad sisteminio poveikio buprenorfinas ir kiti panašūs opiatiniai analgetikai pakeistų akių atsakus (12).

Prieš penkias minutes iki TCA į kiekvieną akį įlašinama vienas arba du lašai vietinio akių anestetiko (pvz., 0,5 % proparakaino hidrochlorido arba 0,5 % tetrakaino hidrochlorido). Siekiant išvengti galimų tyrimo trikdžių, rekomenduojamas vietinis anestetikas, kuris neturi konservantų. Kiekvieno gyvūno akis, kuri nėra apdorojama chemine medžiaga, bet apdorojama vietiniu anestetiku, naudojama kontrolei. Jei numanoma, kad cheminė medžiaga gali sukelti stiprų skausmą ir kančias, jos nereikėtų bandyti in vivo. Tačiau, jei yra abejonių arba bandymas yra būtinas, reikėtų svarstyti klausimą dėl papildomo vietinio anestetiko naudojimo 5 min intervalais prieš TCA. Naudotojai turėtų suvokti, kad daugkartinis vietinio anestetiko naudojimas galėtų šiek tiek padidinti chemiškai sukeltų pažeidimų rimtumą ir (arba) jų išnykimo trukmę.

Praėjus aštuonioms valandoms po TCA, daroma buprenorfino 0,01 mg/kg ir meloksikamo 0,5 mg/kg poodinė injekcija, kad būtų užtikrintas nuolatinis gydomasis sisteminio nuskausminimo lygis. Nors nėra duomenų, kurie rodytų meloksikamo priešuždegiminį poveikį akims, kai jis suleidžiamas po oda vieną kartą per dieną, meloksikamo nereikėtų naudoti anksčiau nei 8 h po TCA, kad būtų išvengta visų galimų tyrimo trukdžių (12).

Po pirmojo nuskausminimo, daromo praėjus 8 h po TCA, kas 12 h po oda reikėtų leisti 0,01 mg/kg buprenorfino ir kartu su juo kas 24 h – 0,5 mg/kg meloksikamo, kol išnyksta akių pažeidimai ir nelieka klinikinių skausmo bei kančių požymių. Galima svarstyti ilgesnės veikimo trukmės preparatų naudojimą, kurie sumažintų analgetikų dozavimo dažnumą.

Reikėtų atlikti „pagalbinį“ nuskausminimą nedelsiant po TCA, jei prevencinio nuskausminimo analgetikais ir vietinės anestezijos nepakanka. Jei tyrimo metu matyti, kad gyvūnas patiria skausmą ir kančias, vietoj poodinės 0,01 mg/kg injekcijos kas 12 h reikėtų nedelsiant po oda suleisti 0,03 mg/kg buprenorfino „pagalbinę“ dozę ir, jei būtina, tai kartoti kas 8 h. Poodinę meloksikamo 0,5 mg/kg injekciją reikėtų atlikti kas 24 h kartu su „pagalbine“ buprenorfino doze, bet ne anksčiau kaip bent praėjus 8 h po TCA.

Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas

Bandomoji cheminė medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad medžiaga neištekėtų. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei.

Drėkinimas

Įdėjus bandomosios cheminės medžiagos, bandymo gyvūno akių nereikėtų plauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 18 pastraipą) ir jei iš karto pasireiškia ėsdinimo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti.

Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus atvejus, kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du triušius. Plovimo sąlygos turėtų būti išsamiai dokumentuotos, pvz., plovimo laikas; plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra; plovimo trukmė, tirpalo tūris ir srautas.

Dozės dydis

(1)   Skysčių bandymas

Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio cheminei medžiagai tiesiai į akį įlašinti. Prieš įlašinant 0,1 ml į akį, skystasis purškiklis išpurškiamas į indą ir surenkamas.

(2)   Kietųjų medžiagų bandymas

Bandant kietąsias, pastos ir dalelių pavidalo chemines medžiagas, naudojamos medžiagos tūris turėtų būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūrį reikėtų matuoti ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji cheminė medžiaga nepasišalino iš bandymo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.

(3)   Aerozolių bandymas

Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis taikoma slėginiuose aerozolių purkštuvuose esančioms cheminėms medžiagoms, kurių negalima surinkti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis laikoma atverta ir bandomoji cheminė medžiaga maždaug vieną sekundę purškiama tiesiai į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali skirtis, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga tikimybę.

Aerozolio dozės įvertį būtų galima gauti modeliuojant bandymą taip: cheminė medžiaga purškiama ant sveriamojo popieriaus pro triušio akies dydžio angą, esančia tiesiai prieš popierių. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų cheminių medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su chemine medžiaga prieš įpurškimą ir po jo.

Pradinis bandymas (akies dirginimo ar ėsdinimo bandymas in vivo su vienu gyvūnu)

Griežtai rekomenduojama atlikti in vivo bandymą iš pradžių su vienu gyvūnu (žr. šio bandymo priedėlį Nuosekliųjų bandymų strategija akių dirginimui ir ėsdinimui nustatyti). Stebėjimai turėtų padėti nustatyti rimtumą ir grįžtamumą prieš atliekant patvirtinamąjį bandymą su antruoju gyvūnu.

Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją procedūrą cheminė medžiaga yra akis ėsdinanti arba stipriai jas dirginanti, kitų akies dirginimo bandymų nereikėtų atlikti.

Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais)

Jei atliekant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis nestebimas, dirginamąjį poveikį arba neigiamą atsaką reikėtų patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus. Jei atliekant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis stebimas, patvirtinamąjį bandymą rekomenduojama atlikti nuosekliuoju būdu su vienu gyvūnu, o ne veikiant abu papildomus gyvūnus vienu metu. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ėsdinamasis arba stiprus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas. Jei antrajam gyvūnui gautų rezultatų pakanka klasifikavimui nustatyti, kiti papildomi bandymai neatliekami.

Stebėjimo periodas

Stebėjimo laikotarpio trukmės turėtų pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymą reikėtų baigti bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia stipraus skausmo arba kančios požymiai (8). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios cheminės medžiagos davimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei 21 parą, bandymas nutraukiamas tuo momentu.

Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais

Reikėtų išsamiai įvertinti, ar akys pažeistos ar ne, praėjus vienai valandai po TCA, vėliau įvertinant ne rečiau kaip kasdien. Pirmąsias 3 paras gyvūnus reikėtų įvertinti kelis kartus per dieną, siekiant užtikrinti, kad sprendimai dėl nutraukimo būtų priimti laiku. Bandymo gyvūnai turėtų būti įprastiniu būdu įvertinami visą tyrimo trukmę skausmo ir (arba) kančių klinikiniams požymiams (pvz., kartotinio akies lietimo letena arba trynimo, per dažno mirkčiojimo, per didelio ašarojimo) (9) (10) (11) nustatyti ne rečiau kaip du kartus per dieną, esant ne mažesniam kaip 6 h intervalui tarp stebėjimų, arba dažniau, jei būtina. Tai yra būtina siekiant (i) tinkamai įvertinti gyvūnus dėl skausmo ir kančių požymių buvimo, kad būtų priimti pagrįsti sprendimai, ar reikia padidinti analgetikų dozes, ir (ii) įvertinti gyvūnus dėl nustatytų humaniško poveikio vertinamųjų baigčių buvimo, kad būtų galima priimti pagrįstus sprendimus, ar reikia humaniškai numarinti gyvūnus, ir užtikrinti, kad tokie sprendimai būtų priimti laiku. Paprastai reikėtų dažyti fluoresceinu ir naudoti biologinį mikroskopą su plyšine lempa, jei manoma, kad to reikia (pvz., žaizdos gyliui įvertinti, esant ragenos išopėjimui) kaip priemonės akių pažaidai aptikti bei išmatuoti ir įvertinti, ar pasiekti humaniško numarinimo vertinamųjų baigčių kriterijai. Galima kaupti stebimų pažeidimų skaitmenines nuotraukas, kurios būtų naudojamos palyginimui ir kaip nuolatinis akių pažaidų laipsnio registravimas. Gyvūnai turėtų būti bandomi ne ilgiau nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia stiprus skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai numarinti, o cheminė medžiaga atitinkamai įvertinta.

Turėtų būti humaniškai numarinami gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai (žr. 1 lentelę dėl pažeidimo balų aprašymo): ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės atsakas) ilgiau kaip 72h; junginės membranos opos; junginės arba mirksimosios membranos nekrozė, arba nekrozinio audinio lupimasis. Numarinti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami. Be to, rekomenduojama toliau nurodytus akių pažeidimus naudoti kaip humaniško poveikio vertinamąsias baigtis tyrimui užbaigti anksčiau nei 21 paros stebėjimo laikotarpiu. Sunkių dirginimo ar ėsdinimo sužeidimų ir sužeidimų, kurie, kaip manoma, nebūtų visiškai grįžtami baigiantis 21 paros stebėjimo periodui, numatomaisiais pažeidimais laikomi šie: didelis žaizdos gylis (pvz., ragenos opa išplinta giliau nei paviršiniai ragenos medžiagos sluoksniai), ragenos krašto suirimas > 50 % (rodo junginės audinio blukimas), ir stipri akių infekcija (pūlių išsiskyrimas). Ragenos paviršiaus vaskuliarizacijos (t. y. panuso), nudažyto fluoresceinu ploto nemažėjimo per kasdieniniam vertinimui nustatytą trukmę ir (arba) reepitelizacijos nebuvimo, praėjus 5 paroms nuo cheminės medžiagos įterpimo, derinys taip pat galėtų būti laikomas potencialiai naudingu kriterijumi priimant klinikinį sprendimą dėl pirmalaikio tyrimo nutraukimo. Tačiau vien tik šių duomenų nepakanka pirmalaikiam tyrimo nutraukimui pagrįsti. Nustačius stiprų poveikį akims, reikėtų pasikonsultuoti su gydančiuoju arba kvalifikuotu laboratorijos veterinaru arba su klinikinius pažeidimus nustatyti apmokytu personalu, kad būtų galima nustatyti, ar šių poveikių derinys pateisina pirmalaikį tyrimo nutraukimą. Turėtų būti gauti akių (junginės, ragenos ir rainelės) pažeidimai balais ir užrašyti praėjus 1, 24, 48 ir 72 h po bandomosios cheminės medžiagos uždėjimo (1 lentelė). Jei gyvūnų akių pažeidimų neatsiranda, bandymas gali būti baigtas ne anksčiau kaip 3 paros po įlašinimo. Gyvūnus su nedideliais pažeidimais reikėtų stebėti tol, kol tie pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, kai tyrimas baigiamas. Stebėjimai turi būti atliekami ir registruojami ne rečiau kaip po 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 parų, 14 parų ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų būseną ir jų grįžtamumą ar negrįžtamumą. Prireikus stebima dažniau, kad būtų galima nustatyti, ar bandymų gyvūną reikėtų numarinti iš humaniškų paskatų ar pašalinti iš tyrimo dėl neigiamų rezultatų.

Akių pažeidimų vertinimo balai (1 lentelė) turėtų būti užrašomi kiekvieno tikrinimo metu. Taip pat reikėtų pranešti apie visus kitus akių pažeidimus (pvz., panusą, dėmių atsiradimą, priekinės kameros pokyčius) arba neigiamą sisteminį poveikį.

Reakcijos tikrinimą galima palengvinti naudojant binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti toliau tiriamos naudojant fluoresceiną.

Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai išmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų įvertinimas

Akių dirginimo balus reikėtų įvertinti atsižvelgiant į pažeidimų tipą ir rimtumą bei į poveikio grįžtamumą arba negrįžtamumą. Atskiri balai nėra cheminės medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios cheminės medžiagos poveikis. Į šiuos atskirai gautus balus reikėtų žiūrėti kaip į palyginamąsias vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

 

in vivo bandymų pagrindimas: jau turimų bandymų duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:

ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas;

duomenys, gauti kiekviename bandymų strategijos etape;

atliktų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie procedūras, rezultatus, gautus tiriant bandomąsias ar etalonines chemines medžiagas;

atlikto in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo tyrimo aprašymas, įskaitant gautus rezultatus;

duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui atlikti.

 

Bandomoji cheminė medžiaga:

identifikavimo duomenys (pvz., cheminis pavadinimas ir CAS numeris, jei yra, grynumas, žinomos priemaišos, kilmė, partijos numeris);

fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas, reagavimas su vandeniu),

jei tai mišinys, reikėtų nurodyti komponentus, įskaitant sudedamųjų medžiagų identifikavimo duomenis (pvz., cheminį pavadinimą ir CAS numerį, jei yra), ir jų koncentraciją;

naudojama dozė.

 

Nešiklis:

identifikavimo duomenys, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris;

nešiklio pasirinkimo pagrindimas.

 

Bandymo gyvūnai:

naudota rūšis ar veislė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrindimas;

kiekvieno gyvūno amžius tyrimo pradžioje;

kiekvienos lyties gyvūnų skaičius bandymo ir kontrolinėje (jei reikia) grupėje;

atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje;

gyvūnų kilmė, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.

 

Anestetikai ir analgetikai:

dozės ir laikas, kuriuo buvo duodami vietiniai anestetikai ir sisteminiai analgetikai;

jei naudojamas vietinis anestetikas, jo identifikavimo duomenys, grynumas, tipas ir galima sąveika su bandomąja chemine medžiaga.

 

Rezultatai:

metodo, taikyto dirginimui kiekvienu stebėjimo momentu įvertinti balais (pvz., rankinė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, fluoresceinas), aprašymas;

kiekvieno gyvūno dirginimo ar ėsdinimo atsako duomenų, gautų kiekvienu stebėjimo momentu iki gyvūno pašalinimo iš bandymo, lentelės;

stebimo dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas;

visų kitų akies pažeidimų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, panuso susidarymas, sąaugų, dėmių atsiradimas);

vietinių ir sisteminių su akimis nesusijusių neigiamų padarinių aprašymas, skausmo ir kančių klinikinių požymių įrašai, skaitmeninės nuotraukos ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

 

Rezultatų aptarimas.

Rezultatų aiškinimas

Su laboratoriniais gyvūnais atliktų akių dirginimo tyrimų rezultatų ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru mastu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ėsdinančioms medžiagoms nei žmonės.

Aiškinant rezultatus turi būti stengiamasi neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo.

LITERATŪRA

(1)

Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410 – 429.

(2)

de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159 – 164.

(3)

Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4)

Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.

(5)

Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.

(6)

Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 – 524.

(7)

Šio priedo B.4 skyrius, Ūmus toksiškumas. Odos dirginimas ar ėsdinimas.

(8)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9)

Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.

(10)

National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(11)

National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(12)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

(13)

Šio priedo B.40 skyrius, Odos suardymas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.

(14)

Šio priedo B.40bis skyrius, Odos suardymas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.

(15)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(16)

Šio priedo B.47 skyrius Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą.

(17)

Šio priedo B.48 skyrius Atskirtų viščiukų akių bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo.

(18)

U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.

(19)

UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.

(20)

2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006. (OL L 353, 2008 12 31, p. 1).

(21)

ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

1 lentelė

Akių pažeidimo vertinimo balais skalė

Ragena

Balas

Drumstumas: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) (*1)

 

Opėjimo arba drumstumo nėra

0

Taškinės arba pasklidosios drumstumo sritys (kitokios nei nedidelis normalaus blizgesio išblukimas); rainelės elementai aiškiai matomi

1

Lengvai įžiūrima pusskaidrė sritis; rainelės elementai šiek tiek neryškūs

2

Perlamutrinė sritis; rainelės elementai nematomi; vyzdžio dydis vos įžiūrimas

3

Ragena matinė, dėl drumstumo rainelės nesimato

4

Didžiausias įmanomas balas: 4

 

Rainelė

 

Normali

0

Labai pagilėjusios raukšlės, kongestija, pabrinkimas, vidutiniška junginės apie rageną hiperemija; arba paburkimas; rainelė vis dar reaguoja į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu)

1

Kraujavimas, stiprus suirimas arba nėra reakcijos į šviesą

2

Didžiausias įmanomas balas: 2

 

Junginė

 

Raudonumas (taikoma voko ir obuolio junginei, išskyrus rageną ir rainelę)

 

Normalus

0

Kai kurie kraujo indai hiperemiški (paburkę)

1

Pasklidasis, tamsiai raudonos spalvos; atskiri indai sunkiai įžiūrimi

2

Pasklidasis, jautienos raudonumo spalvos

3

Didžiausias įmanomas balas: 3

 

Chemozė

 

Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacinėms membranoms)

 

Normali

0

Šiek tiek didesnis nei normalus pabrinkimas

1

Akivaizdus pabrinkimas, vokai iš dalies išvirtę

2

Pabrinkimas, pusiau užmerkti vokai

3

Pabrinkimas, daugiau nei pusiau užmerkti vokai

4

Didžiausias įmanomas balas: 4

 

Priedėlis

APIBRĖŽTYS

Rūgšties ar šarmo atsarga jei preparatai rūgštiniai, natrio hidroksido/100 g preparato kiekis (g), kurio reikia nurodytai pH vertei gauti. Jei preparatai šarminiai, natrio hidroksido kiekis (g), ekvivalentiškas sieros rūgšties/100 g preparato kiekiui (g), kurio reikia nurodytai pH vertei gauti (Young et al. 1988).

Cheminė medžiaga medžiaga arba mišinys.

Nedirginančios cheminės medžiagos medžiagos, kurios neklasifikuojamos kaip JAV aplinkos apsaugos agentūros (AAA) I, II ar III kategorijos; GHS 1, 2, 2A ar 2B kategorijos arba ES 1 ar 2 kategorijos akis dirginančios medžiagos (17) (18) (19).

Akis ėsdinančios cheminės medžiagos a) cheminės medžiagos, kurios sukelia negrįžtamąjį akies audinio pažeidimą; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip GHS 1 kategorijos, ar AAA I kategorijos akis dirginančios medžiagos arba ES 1 kategorijos (17) (18) (19).

Akis dirginančios cheminės medžiagos a) cheminės medžiagos, kurios sukelia grįžtamuosius akies pokyčius; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip AAA II ar III kategorijos; GHS 2, 2A ar 2B kategorijos arba ES 2 kategorijos akis dirginančios medžiagos (17) (18) (19).

Akis stipriai dirginančios medžiagos – a) cheminės medžiagos, sukeliančios akies audinių pažeidimą, kuris neišnyksta per 21 parą nuo įterpimo, arba sukeliančios smarkų fizinį regėjimo pablogėjimą; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip GHS 1 kategorijos, AAA I kategorijos arba ES 1 kategorijos akis dirginančios medžiagos (17) (18) (19).

Bandomoji cheminė medžiaga taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

Nuosekliųjų bandymų metodas pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomajai cheminei medžiagai dirginamąją gebą galima priskirti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.

Įrodomosios vertės analizė (procesas): Sukauptos informacijos privalumų ir trūkumų naudojimas, kad būtų galima pagrįsti išvadą, kuri, atsižvelgiant į pavienius duomenis, gali nebūti akivaizdi.

B.5 BANDYMŲ METODO PRIEDĖLIS  (4)

NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA AKIŲ DIRGINIMUI IR ĖSDINIMUI NUSTATYTI

Bendrieji aspektai

Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali sukelti stiprius atsakus. Visa informacija apie cheminę medžiagą dėl jos galimo ėsdinamojo ar dirginamojo poveikio odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant dėl in vivo bandymų. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios cheminės medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam odos poveikiui klasifikuoti, su laboratoriniais gyvūnais bandymų atlikti nereikia. Taigi, taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją, iki minimumo sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad cheminė medžiaga gali sukelti stiprias reakcijas.

Turimai informacijai apie cheminių medžiagų dirginamąjį ir ėsdinamąjį poveikį akims įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo akių tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Jei nėra medžiagų bandymo duomenų jų ėsdinamajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priedėlyje aprašyta pradinių bandymų strategija sukurta EBPO praktiniame seminare (1). Vėliau ji buvo patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema, 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (2) ir 2011 m. atnaujinta EBPO ekspertų grupės.

Nors ši bandymų strategija nėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, ji yra rekomenduojamas akių dirginimo ar ėsdinimo savybių nustatymo būdas. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Nuosekliųjų bandymų strategijoje siūlomas duomenų įrodomosios vertės analizės būdas, kuris leistų įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų cheminių medžiagų akių dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad būtų galima nuosekliai gauti reikiamų duomenų apie chemines medžiagas, kurias reikia papildomai ištirti arba kurios nebuvo tirtos. Taikant strategiją iš pradžių atliekami patvirtinti ir priimti in vitro ar ex vivo bandymai ir tada TM B.4 tyrimai specifinėmis aplinkybėmis (3) (4).

Nuosekliųjų bandymų strategijos aprašymas

Siekiant nustatyti in vivo akių bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), reikėtų įvertinti visą turimą informaciją. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant atskirus parametrus (pvz., ribines pH vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Priimant įrodomosios vertės analizės sprendimą, turėtų būti įvertinti visi atitinkami duomenys apie konkrečios cheminės medžiagos ir jos struktūrinių analogų poveikį, ir turėtų būti pateiktas sprendimo priėmimo pagrindimas. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į turimus duomenis apie cheminę medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų rezultatus. Ėsdinančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandymų strategijos veiksniai.

 

Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenų, gautų taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, įvertinimas (1 pakopa).

Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) bandymų su gyvūnais atliekant akių tyrimus duomenys, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, nes jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu akims. Toliau reikėtų įvertinti turimus odos ėsdinimo ar dirginimo duomenis, gautus atliekant tyrimus su žmonėmis ir (arba) gyvūnais, ir (arba) in vitro tyrimų duomenis, gautus taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus. Cheminės medžiagos, kurios yra žinomos kaip ėsdinančios arba stipriai dirginančios akis, neturėtų būti lašinamos į gyvūnų akis, be to, nereikėtų lašinti medžiagų, kurios ėsdina arba stipriai dirgina odą; tokios cheminės medžiagos taip pat turėtų būti laikomos ėsdinančiomis ir (arba) dirginančiomis akis. Cheminės medžiagos, apie kurias iš ankstesnių akių tyrimų turima pakankamai duomenų, kad jos nėra ėsdinančios arba dirginančios, irgi neturėtų būti bandomos atliekant in vivo akių tyrimus.

 

Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa).

Reikėtų atsižvelgti į giminingą struktūrą turinčių cheminių medžiagų bandymo rezultatus, jei tokių yra. Kai tiriant žmones ir (arba) gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka norint įrodyti jų gebą ėsdinti ar dirginti akis, galima daryti prielaidą, kad bandomosios cheminės medžiagos atsakas bus toks pats. Tokiais atvejais cheminės medžiagos galbūt nebūtina bandyti. Neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad cheminė medžiaga nėra ėsdinanti ar dirginanti pagal nuosekliųjų bandymų strategiją. Gebą ėsdinti ir dirginti odą bei akis reikėtų nustatyti taikant patvirtintus ir priimtus SAR metodus.

 

Fizikinės cheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa).

Cheminės medžiagos, kurių pH vertės yra ribinės, pvz., ≤ 2,0 ar ≥ 11,5, gali turėti stiprų vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kurią cheminė medžiaga identifikuojama kaip akis ėsdinanti ar dirginanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (buferinę talpą) (5)(6)(7). Jei buferinė talpa leidžia manyti, kad cheminė medžiaga gali nebūti akis ėsdinanti (t. y. ribinės pH vertės cheminės medžiagos su maža rūgšties ar šarmo atsarga), reikėtų atlikti papildomus bandymus šiai prielaidai pagrįsti, pageidautina, taikant patvirtintą ir priimtą in vitro ar ex vivo bandymą (žr. 10 pastraipą).

 

Kitos turimos informacijos nagrinėjimas (4 pakopa).

Šioje stadijoje įvertinama visa turima informacija apie sisteminį toksiškumą per odą. Taip pat reikėtų atsižvelgti į ūmų bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą per odą. Jei įrodyta, kad bandomoji cheminė medžiaga yra stipriai toksiška per odą, galbūt nebūtina bandyti jos poveikio akims. Nors nebūtinai turi būti ryšys tarp ūmaus toksiškumo per odą ir akių dirginimo ar ėsdinimo, galima daryti prielaidą, kad cheminei medžiagai esant stipriai toksiškai per odą, ji taip pat bus stipriai toksiška jos įlašinus į akis. Į tokius duomenis taip pat reikėtų atsižvelgti tarp 2 ir 3 pakopų.

 

Odos ėsdinimo chemine medžiaga vertinimas, jei to taip pat reikia reglamentavimo tikslais (5 pakopa).

Odos ėsdinimo ir stipraus dirginimo potencialą iš pradžių reikėtų įvertinti taikant B.4 metodą (4) ir pridedamą priedėlį (8), įskaitant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus odos ėsdinimo in vitro bandymo metodus (9) (10) (11). Jei įrodoma, kad cheminė medžiaga yra odą ėsdinanti ar stipriai dirginanti, ją taip pat galima laikyti akis ėsdinančia arba stipriai dirginančia medžiaga. Todėl tolesnių bandymų neprireiktų. Jei cheminė medžiaga nėra ėsdinanti arba stipriai dirginanti odą, reikėtų atlikti in vitro ar ex vivo akių bandymą.

 

In vitro ar ex vivo bandymų rezultatai (6 pakopa).

Jei atliekant patvirtintą ir tarptautiniu mastu priimtą in vitro ar ex vivo bandymą (12)(13), specialiai skirtą akių ėsdinimui ar dirginimui įvertinti, buvo įrodytos cheminių medžiagų ėsdinamosios arba stipriai dirginančios savybės, jų nereikia bandyti su gyvūnais. Galima daryti prielaidą, kad tokios cheminės medžiagos turės panašų stiprų poveikį in vivo. Jei patvirtintų ir priimtų in vitro ar ex vivo bandymų nėra, 5 ir 6 pakopas reikėtų praleisti ir iš karto pereiti prie 7 pakopos.

 

Bandymas su triušiais in vivo (7 ir 8 pakopos).

In vivo akių bandymą reikėtų pradėti atliekant pradinį bandymą su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad cheminė medžiaga yra stipriai dirginanti ar ėsdinanti akis, toliau bandyti nereikėtų. Jei atliekant šį bandymą ėsdinamasis ar stiprus dirginamasis poveikis nestebimas, atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant du papildomus gyvūnus. Atsižvelgiant į patvirtinamojo bandymo rezultatus, gali prireikti papildomų bandymų (žr. B.5 bandymų metodą).

AKIŲ DIRGINIMO AR ĖSDINIMO BANDYMO IR ĮVERTINIMO STRATEGIJA

 

Veiksmas

Rezultatas

Išvada

1

Yra duomenys, gauti tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, kurie rodo poveikį akims

Sunkus akių pažeidimas

Apikalinė vertinamoji baigtis; laikyti ėsdinančia akis. Bandyti nereikia.

Dirgina akis

Apikalinė vertinamoji baigtis; laikyti dirginančia akis. Bandyti nereikia.

Akių neėsdina ir nedirgina

Apikalinė vertinamoji baigtis; laikoma, kad akių neėsdina ir nedirgina. Bandyti nereikia.

Yra duomenys, gauti tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, kurie rodo ėsdinantį poveikį odai

Ėsdina odą

Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.

Yra duomenys, gauti tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, kurie rodo stiprų dirginantį poveikį odai

Stipriai dirgina odą

Daroma prielaida, kad dirgina akis. Bandyti nereikia.

 

 

Informacijos nėra arba turima informacija neįtikinanti

 

 

 

 

2

Įvertinami SAR dėl akių ėsdinimo ar dirginimo

Prognozuojamas stiprus akių pažeidimas

Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.

Numanomas akių dirginimas

Daroma prielaida, kad dirgina akis. Bandyti nereikia.

Atsižvelgiama į SAR dėl odos ėsdinimo

Numanomas odos ėsdinimas

Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.

 

 

Neįmanoma pateikti prognozių arba jos neįtikinančios ar neigiamos

 

 

 

 

3

Matuojama pH vertė (jei tinka, buferinė talpa)

pH ≤ 2 ar ≥ 11,5 (ir didelė buferinė talpa, jei tinka)

Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.

 

 

2 < pH < 11,5 arba pH ≤ 2,0 ar ≥ 11,5 turint mažą buferinę talpą ar jos neturint, jei tinka

 

 

 

 

4

Atsižvelgiama į turimus sisteminio toksiškumo, veikiant per odą, duomenis

Labai toksiška, esant koncentracijai, kuri būtų bandant akyje.

Cheminė medžiaga būtų per daug toksiška, kad būtų galima bandyti. Bandyti nereikia.

 

 

Tokios informacijos nėra arba cheminė medžiaga nėra labai toksiška

 

 

 

 

5

Bandant įvertinama odos ėsdinimo geba pagal šio priedo B.4 skyriaus bandymų strategiją, jei to taip pat reikia reglamentavimo tikslais

Ėsdina arba stipriai dirgina

Daroma prielaida, kad dirgina akis. Daugiau bandyti nereikia

 

 

Cheminė medžiaga odos neėsdina arba stipriai nedirgina

 

 

 

 

6

Atliekamas (-i) patvirtintas (-i) ir priimtas (-i) in vitro ar ex vivo akių bandymas (-ai)

Ėsdina ar stipriai dirgina

Daroma prielaida, kad ėsdina arba stipriai dirgina akis, jei atliekamą bandymą galima taikyti ėsdinančioms ar stipriai dirginančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti, o cheminė medžiaga patenka į bandymo taikymo sritį. Daugiau bandyti nereikia

Dirgina

Daroma prielaida, kad dirgina akis, jei atliekamą (-us) bandymą (-us) galima taikyti ėsdinančioms, stipriai dirginančioms ir dirginančioms medžiagoms tinkamai identifikuoti, o cheminė medžiaga patenka į bandymo (-ų) taikymo sritį. Daugiau bandyti nereikia

Nedirgina

Daroma prielaida, kad nedirgina akių, jei atliekamą (-us) bandymą (-us) galima taikyti nedirginančioms cheminėms medžiagoms tinkamai identifikuoti, tinkamai atskirti nuo akis dirginančių, stipriai dirginančių ar ėsdinančių cheminių medžiagų, o cheminė medžiaga patenka į bandymo taikymo sritį. Daugiau bandyti nereikia

 

 

Patvirtinto (-ų) ir priimto (-ų) in vitro ar ex vivo akių bandymo (-ų) negalima taikyti išvadai padaryti

 

 

 

 

7

Atliekamas pradinis in vivo triušio akių bandymas, naudojant vieną gyvūną

Sunkus akių pažeidimas

Laikoma, kad ėsdina akis. Daugiau bandyti nereikia

 

 

Nėra stipraus pažeidimo arba jokio atsako

 

 

 

 

8

Atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant vieną arba du papildomus gyvūnus

Ėsdina ar dirgina

Laikoma, kad ėsdina ar dirgina akis. Daugiau bandyti nereikia.

Neėsdina ar nedirgina

Laikoma, kad akių neėsdina ir nedirgina. Daugiau bandyti nereikia

LITERATŪRA

(1)

OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)

Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.

(4)

Šio priedo B.4 skyrius Ūmus toksiškumas. Odos dirginimas ar ėsdinimas.

(5)

Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.

(6)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 – 524.

(7)

Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.

(8)

Šio priedo B.4 skyriaus priedėlis. Nuosekliųjų bandymų strategija odos dirginimui ir ėsdinimui nustatyti.

(9)

Šio priedo B.40 skyrius. Odos suardymas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.

(10)

Šio priedo B.40bis skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.

(11)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(12)

Šio priedo B.47 skyrius. Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą.

(13)

OECD (2009b), Šio priedo B.48 skyrius. Atskirtų viščiukų akių bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo.“

3)

B dalies B.10 skyrius pakeičiamas taip:

„B.10   Žinduolių chromosomų aberacijų in vitro bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 473 (2016). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

Chromosomų aberacijų tyrimo in vitro tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijas (2) (3) (4). Struktūrinės aberacijos gali būti 2 tipų: chromosominės ar chromatidinės. Atliekant chromosomų aberacijų tyrimus in vitro galėtų atsirasti poliploidija (įskaitant endoreduplikaciją). Nors aneugeninės cheminės medžiagos gali sukelti poliploidiją, pati poliploidija nerodo aneugeninio potencialo ir gali tiesiog rodyti ląstelių ciklo sutrikimą arba citotoksiškumą (5). Šis bandymas nenumatytas aneuploidijai matuoti. Aneuploidijai aptikti būtų galima rekomenduoti in vitro mikrobranduolių bandymą (6).

Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų arba žmogaus ar graužikų kilmės pirminių ląstelių kultūras. Naudojamas ląsteles reikėtų pasirinkti pagal jų gebėjimą augti kultūroje, kariotipo stabilumą (įskaitant chromosomų skaičių) ir chromosomų aberacijų spontaninį dažnumą. Atsižvelgiant į šiuo metu turimus duomenis, neįmanoma pateikti patikimų rekomendacijų, bet svarbu patarti, kad, įvertinant cheminius pavojus, reikėtų atsižvelgti į bandymams pasirinktų ląstelių p53 būseną, genetinį (kariotipo) stabilumą, DNR atkūrimo gebą ir kilmę (graužikų, palyginti su žmogaus). Todėl šio bandymo metodo naudotojai raginami atsižvelgti į šių ir kitų ląstelių charakteristikų įtaką ląstelių linijos savybėms aptinkant chromosomų aberacijų atsiradimą, nes šios srities žinių visą laiką daugėja.

Vartojamų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

Bandymus atliekant in vitro paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį, išskyrus atvejus, kai ląstelės yra metaboliškai pajėgios bandomųjų cheminių medžiagų atžvilgiu. Egzogeninė metabolinio aktyvinimo sistema nevisiškai atkartoja in vivo sąlygas. Reikėtų stengtis išvengti sąlygų, kurioms esant būtų gauti dirbtinai teigiami rezultatai, t. y. chromosomos būtų pažeistos ne dėl tiesioginės sąveikos tarp bandomųjų cheminių medžiagų ir chromosomų; tokias sąlygas sudaro pH ar osmolialumo pokyčiai (8) (9) (10), sąveika su terpės komponentais (11) (12) ar per didelis citotoksiškumo lygis (13) (14) (15) (16).

Šis bandymas naudojamas aptikti chromosomų aberacijas, kurios gali atsirasti dėl klastogeninio poveikio reiškinių. Chromosomų aberacijos atsiradimo analizė turėtų būti atliekama naudojant metafazės ląsteles. Todėl svarbu, kad įvyktų apdorotos ir neapdorotos kultūrų ląstelių mitozė. Pramoninėms nanomedžiagoms gali prireikti tam tikro šio bandymų metodo pakeitimų, kurie šiame bandymų metode neaprašyti.

Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMO PRINCIPAS

Žmogaus arba kitų žinduolių kilmės ląstelių kultūros veikiamos bandomąja chemine medžiaga naudojant egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį ar jo nenaudojant, jei naudojamos reikiamą metabolinę gebą turinčios ląstelės (žr. 13 pastraipą). Tam tikrais iš anksto nustatytais tarpais nuo ląstelių kultūrų veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžios ląstelės apdorojamos metafazę stabdančia chemine medžiaga (pvz., kolcemidu arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazės ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromatidinės ir chromosominės aberacijos.

METODO APRAŠYMAS

Parengiamieji darbai

Ląstelės

Galima naudoti įvairias ląstelių linijas (pvz., kiniškojo žiurkėno kiaušidžių (CHO), kiniškojo žiurkėno plaučių V79, kiniškojo žiurkėno plaučių (CHL)/IU, TK6 ląsteles) arba pirmines ląstelių kultūras, įskaitant žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus (7). Naudojamų ląstelių linijų pasirinkimą reikėtų moksliškai pagrįsti. Naudojant pirmines ląsteles, dėl gyvūnų gerovės priežasčių reikėtų atsižvelgti į galimybę naudoti, jei įmanoma, žmogiškos kilmės pirmines ląsteles, ir ėminius imti atsižvelgiant į žmonių etikos principus ir taisykles. Žmogaus periferinio kraujo limfocitus reikėtų gauti iš jaunų (maždaug 18–35 metų amžiaus), nerūkančių žmonių, kurie nesirgtų ar kurie nebūtų neseniai paveikti genotoksiniais agentais (pvz., cheminėmis medžiagomis, jonizuojančiąja spinduliuote) tokiu mastu, kad tai padidintų chromosomų aberacijų foninį dažnumą. Tai užtikrintų, kad chromosomų aberacijų foninis dažnumas būtų mažas ir pastovus. Chromosomų aberacijų dažnumo atskaitos vertė didėja senstant ir ši tendencija labiau pasireiškia moterims nei vyrams (17) (18). Jei naudojamos ląstelės paimamos daugiau kaip iš vieno donoro, turėtų būti nurodytas donorų skaičius. Būtina įrodyti, kad ląstelės dalijosi nuo ląstelių ėminio apdorojimo bandomąja chemine medžiaga pradžios. Ląstelių kultūros laikomos eksponentinio ląstelių augimo fazėje (ląstelių linijos) arba stimuliuojamos dalytis (pirminės limfocitų kultūros), kad ląstelės būtų veikiamos skirtingose ląstelės ciklo stadijose, nes ląstelių stadijų jautris bandomosioms cheminėms medžiagoms gali būti nežinomas. Pirminės ląstelės, kurias reikia stimuliuoti mitogeniniais agentais, kad jos pradėtų dalytis, paprastai daugiau nesinchronizuojamos jas veikiant bandomąja chemine medžiaga (pvz., žmogaus limfocitai po 48 h mitogeninio stimuliavimo). Naudoti sinchronizuotas ląsteles apdorojimo metu nerekomenduojama, bet gali būti priimtina, jei būtų pagrįsta.

Terpės ir kultūros sąlygos

Prižiūrimoms kultūroms reikėtų naudoti reikiamą kultūros terpę ir inkubavimo sąlygas (kultūros indus, drėkinamąją 5 % CO2 atmosferą, jei tinka, inkubavimo temperatūrą – 37 °C). Ląstelių linijos turėtų būti reguliariai tikrinamos, ar nesikeičia modalinis chromosomų skaičius ir nėra mikoplazmos užkrato (7) (19), o užkrėstos arba pakitusio modalinio chromosomų skaičiaus ląstelės neturėtų būti naudojamos. Turėtų būti nustatyta bandymo laboratorijoje naudojamų ląstelių linijų ar pirminių kultūrų normalaus ląstelių ciklo trukmė ir ji turėtų atitikti paskelbtas ląstelių charakteristikas (20).

Kultūrų paruošimas

Ląstelių linijos: ląstelės yra dauginamos iš kamieninių kultūrų, sėjamos kultūros terpėje tokiu tankiu, kad ląstelių suspensijos ar monosluoksniai visą laiką iki pat surinkimo momento augtų eksponentiškai (pvz., reikėtų vengti monosluoksniuose augančių ląstelių susiliejimo).

Limfocitai: viso kraujo ėminys, apdorotas antikoaguliantu (pvz., heparinu), ar iš to kraujo atskirti limfocitai auginami (pvz., žmogaus limfocitai – 48 h) esant mitogeno (pvz., žmogaus limfocitams – fitohemagliutinino (PHA)), kad ląstelės pradėtų dalytis prieš jas paveikiant bandomąja chemine medžiaga.

Metabolinis aktyvinimas

Kai naudojamos nepakankamos endogeninės metabolinės gebos ląstelės, reikėtų naudoti egzogenines metabolizavimo sistemas. Jei nebūtų pagrįsta kita sistema, dažniausiai kaip numatytoji rekomenduojama sistema yra kofaktoriumi papildyta pomitochondrinė frakcija (S9), ruošiama iš graužikų (paprastai žiurkių) kepenų, apdorotų fermentų aktyvumą skatinančiais agentais, pvz,. Aroclor 1254 (21) (22) (23) ar fenobarbitalio ir β-naftoflavono derinys (24) (25) (26) (27) (28) (29). Pastarasis derinys neprieštarauja Stokholmo konvencijai dėl patvariųjų organinių teršalų (30) ir pasirodė esąs toks pat veiksmingas kaip Aroclor 1254 mišrių funkcijų oksidazėms skatinti (24) (25) (26) (28). S9 frakcija paprastai naudojama nuo 1 % iki 2 % (tūrio) koncentracijos, bet galutinio bandymo terpėje gali būti padidinta iki 10 % (tūrio). Apdorojant reikėtų vengti naudoti produktus, kurie mažina mitozinį indeksą, ypač su kalciu kompleksus sudarančius produktus (31). Naudojamos egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos ar metabolizmo skatinimo priemonės tipo ir koncentracijos pasirinkimui įtakos gali turėti bandomų cheminių medžiagų klasė.

Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas

Prieš apdorojant ląsteles, kietąsias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ir, jei reikia, praskiesti (žr. 23 pastraipą). Skystąsias chemines medžiagas galima dėti tiesiogiai į bandymo sistemą ir (arba) praskiesti prieš apdorojant bandymo sistemą. Dujos ar lakiosios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos atitinkamai pakeitus standartinius protokolus, pvz., apdorojimas sandariuose kultūros induose (32) (33) (34). Bandomųjų cheminių medžiagų preparatus reikėtų ruošti prieš pat apdorojimą, išskyrus atvejus, kai stabilumo duomenys rodo galimybę laikyti.

Bandymo sąlygos

Tirpikliai

Tirpiklį reikėtų pasirinkti taip, kad būtų optimizuotas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas, bet nebūtų daroma neigiama įtaka tyrimo eigai, pvz., kistų ląstelių augimas, būtų paveiktas bandomosios cheminės medžiagos vientisumas, vyktų reakcija su kultūros indais, būtų pakenkta metabolinio aktyvinimo sistemai. Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti vandeninį tirpiklį (ar kultūros terpę). Gerai ištirti tirpikliai yra, pvz., vanduo ar dimetilsulfoksidas. Paprastai organinio tirpiklio koncentracija galutinio apdorojimo terpėje neturėtų būti didesnė kaip 1 % (tūrio), o vandeninių tirpiklių (natrio chlorido tirpalo ar vandens) – 10 % (tūrio). Jei naudojami tinkamai neištirti tirpikliai (pvz., etanolis ar acetonas), jų naudojimas turėtų būti pagrįstas duomenimis, rodančiais, kad tirpiklis yra suderinamas su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis bei bandymo sistema ir kad naudojama koncentracija nesukelia genetinio toksiškumo. Jei tokių patvirtinančių duomenų nebūtų, svarbu įtraukti neapdorotus kontrolinius ėminius (žr. 1 priedėlį), kurie įrodytų, kad pasirinktas tirpiklis nesukelia žalingo arba klastogeninio poveikio.

Ląstelių proliferacijos bei citotoksiškumo matavimas ir apdorojimo koncentracijos verčių parinkimas

Nustatant didžiausią bandymui naudojamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją reikėtų vengti koncentracijos, galinčios sukelti dirbtinį teigiamą atsaką, pvz., kuri sukeltų per didelį citotoksiškumą (žr. 22 pastraipą), nuosėdų kultūros terpėje (žr. 23 pastraipą) ar žymius pH arba osmolialumo pokyčius (žr. 5 pastraipą). Jei bandomosios cheminės medžiagos pridėjimo metu žymiai pakinta terpės pH vertė, ją būtų galima reguliuoti buferuojant galutinio apdorojimo terpę, kad būtų išvengta dirbtinių teigiamų rezultatų ir būtų užtikrintos tinkamos kultūros sąlygos.

Ląstelių proliferacija matuojama siekiant įsitikinti, ar bandymo metu pakankamas apdorotų ląstelių skaičius pasiekė mitozę ir ar apdorojama esant reikiamam citotoksiškumo lygiui (žr. 18 ir 22 pastraipas). Citotoksiškumą reikėtų nustatyti pagrindinio bandymo metu pagal atitinkamus ląstelių žūties ir augimo rodiklius, esant ir nesant metaboliniam aktyvinimui. Nors citotoksiškumo įvertinimas atliekant pradinį bandymą gali būti naudingas pagrindinio bandymo koncentracijos vertėms geriau apibrėžti, pradinis bandymas nėra privalomas. Jei jis būtų atliekamas, jis neturėtų pakeisti citotoksiškumo matavimo atliekant pagrindinį bandymą.

Santykinis populiacijos padvigubėjimas (RPD) ar santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC) yra tinkami metodai citotoksiškumui įvertinti atliekant citogenetinius bandymus (13) (15) (35) (36) (55) (formules žr. 2priedėlyje). Jei apdorojimas yra ilgalaikis, o ėminių ėmimo laikas nuo apdorojimo pradžios yra daugiau kaip 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (t. y. iš viso yra daugiau kaip 3 kartus ilgesnis nei ląstelių ciklo trukmė), citotoksiškumo įvertis taikant RPD galėtų būti per mažas (37). Šiomis aplinkybėmis geresnis matas galėtų būti RICC arba naudingas įvertis galėtų būti ir RPD, citotoksiškumą įvertinant praėjus laikui, kuris būtų 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Jei kaip pirminė kultūra naudojami limfocitai, kurių citotoksinio ar citostatinio poveikio matas yra mitozinis indeksas (MI), jam įtaką daro matavimo laikas po apdorojimo, naudojamas mitogenas ir galimas ląstelių ciklo nutrūkimas. Tačiau MI yra priimtinas, nes kiti citotoksiškumo matavimai gali būti sudėtingi ir praktiškai neįmanomi bei gali netikti stimuliuojant PHA augančiai limfocitų tikslinei populiacijai.

Nors rekomenduojami ląstelių linijų citotoksiškumo parametrai yra RICC ir RPD, o pirminės limfocitų kultūros – MI, kiti rodikliai (pvz., ląstelių vientisumas, apoptozė, nekrozė, ląstelių ciklas) galėtų suteikti naudingos papildomos informacijos.

Reikėtų įvertinti ne mažiau kaip tris bandymo koncentracijos vertes (neįskaitant tirpiklio ir teigiamų kontrolinių ėminių), kurios atitinka priimtinumo kriterijus (reikiamas citotoksiškumas, ląstelių skaičius ir kt.). Neatsižvelgiant į ląstelių tipą (ląstelių linijos ar pirminės limfocitų kultūros), galima naudoti kiekvienos bandymo koncentracijos kartotines ar pavienes apdorotas kultūras. Nors patariama naudoti kartotines kultūras, pavienės kultūros taip pat priimtinos, jei vertinamas vienodas suminis pavienės ar kartotinės kultūros ląstelių skaičius. Naudoti pavienę kultūrą ypač tinka, kai vertinamos daugiau kaip 3 koncentracijos vertės (žr. 31 pastraipą). Nepriklausomoms kartotinėms kultūroms gauti tam tikros koncentracijos rezultatai gali būti sutelkti bendrai duomenų analizei (38). Jei bandomoji cheminė medžiaga rodo mažą citotoksiškumą arba jo visai nėra, paprastai tiktų maždaug nuo 2 iki 3 kartų besiskiriančios koncentracijos intervalai. Jei citotoksiškumas nustatomas, pasirinktos koncentracijos vertės turėtų aprėpti intervalą nuo koncentracijos, kuriai esant citotoksiškumas pasireiškia, kaip aprašyta 22 pastraipoje, įtraukiant koncentracijos vertes, kurioms esant gaunamas vidutinis citotoksiškumas ar jo visai nėra. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijos atsako kreivės kyla staigiai, todėl norint gauti mažo arba vidutinio citotoksiškumo duomenis arba išsamiai ištirti dozės ir atsako santykį, būtina naudoti arčiau išdėstytas ir (arba) daugiau kaip tris koncentracijos vertes (pavienių ar kartotinių kultūrų), ypač tomis aplinkybėmis, kai reikia atlikti kartotinį bandymą (žr. 47 pastraipą).

Jei maksimali koncentracija pagrįsta citotoksiškumu, didžiausiai koncentracijai reikėtų pasiekti 55 ± 5 % citotoksiškumą, taikant rekomenduotus citotoksiškumo parametrus (t. y. ląstelių linijų RICC bei RPD sumažėjimą ir pirminių limfocitų kultūrų MI sumažėjimą iki 45 ± 5 % vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio). Reikėtų atsargiai aiškinti teigiamus rezultatus, kurie būtų gauti tik viršutiniam šio 55 ± 5 % citotoksiškumo intervalo galui (13).

Jei mažai tirpios bandomosios cheminės medžiagos nėra citotoksiškos, kai koncentracija yra mažesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, paveikimo bandomąja chemine medžiaga pabaigoje, esant didžiausiai analizuojamai koncentracijai, turėtų atsirasti drumstumas arba nuosėdos, matomos plika akimi arba per inversinį mikroskopą. Netgi jei citotoksiškumas pasireiškia, kai koncentracija yra didesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, patartina bandyti tik esant vienai drumstumą ar matomas nuosėdas sukeliančiai koncentracijai, nes nuosėdos gali daryti dirbtinį poveikį. Esant koncentracijai, kurioje susidaro nuosėdos, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad nuosėdos netrukdytų atlikti bandymą (pvz., dažymą ar įvertinimą). Gali padėti tirpumo nustatymas kultūros terpėje prieš atliekant bandymą.

Jei nuosėdų ar ribinio citotoksiškumo nestebima, didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti 10 mmol/l, 2 mg/ml ar 2 μl/ml, pasirenkant mažiausią (39) (40) (41). Jei bandomoji cheminė medžiaga yra neapibrėžtos sudėties, pvz., nežinomos ar kintamos sudėties medžiaga, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinė medžiaga (UVCB) (42), iš aplinkos ekstrahuojamas ėminys ir kt., nesant pakankamam citotoksiškumui, gali prireikti didesnės didžiausios koncentracijos (pvz., 5 mg/ml), kad būtų didesnė kiekvieno iš komponentų koncentracija. Reikėtų pažymėti, kad žmonėms skirtiems vaistiniams preparatams šie reikalavimai gali būti skirtingi (43).

Kontroliniai ėminiai

Kiekvieną kartą surenkant kultūrą, reikėtų įtraukti vienalaikius neigiamus kontrolinius ėminius (žr. 15 pastraipą), sudarytus vien tik iš tirpiklio apdorojimo terpėje ir apdorotus taip pat, kaip apdorojamos kultūros.

Vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai yra būtini siekiant įrodyti laboratorijos gebėjimą naudojamo bandymų protokolo sąlygomis identifikuoti klastogenus ir egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą, jei tinka. Teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai pateikiami toliau 1 lentelėje. Galima naudoti alternatyvias teigiamas kontrolines chemines medžiagas, jei tai būtų pagrįsta. Kadangi žinduolių ląstelių genetinio toksiškumo in vitro bandymai yra pakankamai standartizuoti, teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas gali apsiriboti klastogenais, kuriems būtinas metabolinis aktyvinimas. Jei jis atliekamas vienu metu su neaktyvinto ėminio bandymu naudojant vienodą apdorojimo trukmę, šis vienas teigiamos kontrolės atsakas įrodys metabolinio aktyvinimo sistemos aktyvumą ir bandymo sistemos jautrį. Tačiau ilgalaikiam apdorojimui (be S9) reikėtų turėti savo teigiamą kontrolinį ėminį, nes apdorojimo trukmė skirsis nuo metabolinį aktyvinimą naudojančio bandymo trukmės. Kiekvienas teigiamas kontrolinis ėminys turėtų būti naudojamas vienos arba kelių koncentracijos verčių, kurioms esant būtų galima tikėtis gauti atkuriamą ir aptinkamą didesnį nei fonas atsaką, kad būtų galima įrodyti bandymo sistemos jautrį (t. y. poveikis yra aiškus, bet tyrėjui ne iš karto atskleidžiama užkoduotų objektinių stiklelių tapatybė), ir atsako neturėtų sutrikdyti citotoksiškumas, kuris viršytų bandymo metodui nustatytas ribas.

1 lentelė.

Etaloninės cheminės medžiagos, rekomenduojamos laboratorijos kvalifikacijai vertinti ir teigiamiems kontroliniams ėminiams pasirinkti.

Kategorija

Cheminė medžiaga

CAS Nr.

1.   

Klastogenai, aktyvūs be metabolinio aktyvinimo

 

Metilmetansulfonatas

66-27-3

 

Mitomicinas C

50-07-7

 

4-nitrochinolin-N-oksidas

56-57-5

 

Citozino arabinozidas

147-94-4

2.   

Klastogenai, kuriems reikia metabolinio aktyvinimo

 

Benz(a)pirenas

50-32-8

 

Ciklofosfamidas

50-18-0

PROCEDŪRA

Paveikimas bandomąja chemine medžiaga

Proliferuojančios ląstelės veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metabolinio aktyvinimo sistemai arba jos nesant.

Kultūrų surinkimo laikas

Siekiant atlikti išsamų įvertinimą, kurio prireiktų neigiamam rezultatui patvirtinti, visos šios trys Bandymo sąlygos turėtų būti įgyvendintos, taikant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ir be jo bei ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo (žr. 43, 44 ir 45 pastraipas):

ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga be metabolinio aktyvinimo 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (18),

ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metaboliniam aktyvinimui 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (18),

ląstelės turėtų būti nepertraukiamai veikiamos be metabolinio aktyvinimo ir surenkamos praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė. Tam tikras chemines medžiagas (pvz., nukleozidų analogus) galima aptikti lengviau, jei apdorojimo ar surinkimo laikas yra daugiau kaip 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (24).

Jei esant kuriai nors vienai iš pirmiau nurodytų bandymo sąlygų gaunamas teigiamas atsakas, gali būti nebūtina tirti kurią nors kitą apdorojimo schemą.

Chromosomų paruošimas

Paprastai likus 1–3 h iki surinkimo ląstelių kultūros yra veikiamos kolcemidu ar kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama chromosomoms paruošti. Ruošiant chromosomas ląstelės apdorojamos hipotoniniu tirpalu, fiksuojamos ir dažomos. 3–6 h trukmės apdorojimo pabaigoje monosluoksniuose gali būti mitozinių ląstelių (atpažįstamų iš apvalios formos ir atsiskyrimo nuo paviršiaus). Kadangi šios mitozinės ląstelės lengvai atsiskiria, jos gali būti prarastos šalinant terpę su bandomąja chemine medžiaga. Jei yra įrodymų dėl esminio mitozinių ląstelių skaičiaus padidėjimo palyginti su kontroliniais ėminiais, rodančio galimą ląstelių sulaikymą mitozės etape, ląsteles reikėtų surinkti centrifugavimu ir grąžinti į kultūras, kad surinkimo metu nebūtų prarastos mitozės etapo ląstelės, kurioms kyla chromosomų aberacijos rizika.

Analizė

Prieš atliekant chromosomų aberacijų mikroskopinę analizę, visi objektiniai stikleliai turėtų būti nepriklausomai užkoduoti, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių stiklelius. Kadangi fiksavimo metu dalis metafazės ląstelių praranda chromosomas, todėl suskaičiuotos ląstelės turės tam tikrą skaičių centromerų, lygų modaliniam skaičiui ± 2.

Ne mažiau kaip 300 gerai matomų metafazių turėtų būti suskaičiuotos kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui, norint padaryti išvadą, kad bandomoji cheminė medžiaga yra aiškiai neigiama (žr. 45 pastraipą). 300 ląstelių turėtų būti vienodai paskirstytos tarp kartotinių ėminių, jei naudojami kartotiniai kultūrų ėminiai. Kai vienai koncentracijai naudojama pavienė kultūra (žr. 21 pastraipą), šioje pavienėje kultūroje turėtų būti suskaičiuota ne mažiau kaip 300 gerai matomų metafazių. 300 ląstelių skaičiaus pranašumas – padidėja bandymo statistinė galia, be to, retai būtų stebimos nulinės vertės (manoma, kad jos sudarytų tik 5 %) (44). Skaičiuojamų metafazių skaičių galima sumažinti, kai stebimas didelis ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius ir bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama.

Reikėtų skaičiuoti ląsteles su chromosomų struktūrine (-ėmis) aberacija (-omis), įskaitant plyšius ir jų neįskaitant. Trūkiai ir plyšiai apibrėžti 1 priedėlyje pagal (45) (46). Chromatidinė ir chromosominė aberacijos turėtų būti registruojamos atskirai ir klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus). Laboratorijoje taikomos procedūros turėtų užtikrinti, kad chromosomų aberacijų analizę atlieka tinkamai apmokyti skaičiuotojai ir, jei reikia, ją peržiūrėtų ekspertai.

Nors tyrimo tikslas yra nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, svarbu registruoti poliploidijos bei endoduplikacijos dažnumą, kai šie įvykiai yra matomi (žr. 2 pastraipą).

Laboratorijos kvalifikacija

Siekdama įgyti pakankamos bandymo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams tyrimams, laboratorija turėtų būti atlikusi etaloninių teigiamų cheminių medžiagų bandymų seriją, joms veikiant pagal skirtingus mechanizmus ir su įvairiais neigiamais kontroliniais ėminiais (naudojant įvairius tirpiklius ir nešiklius). Šių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių atsakas turėtų atitikti literatūros duomenis. Tai netaikoma patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 37 pastraipoje.

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų rinkinį (žr. 26 pastraipos 1 lentelę) reikėtų tirti atliekant trumpalaikį ir ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo, taip pat trumpalaikį apdorojimą esant metaboliniam aktyvinimui, kad būtų galima įrodyti kvalifikaciją aptikti klastogenines chemines medžiagas ir nustatyti metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą. Pasirinktų cheminių medžiagų koncentracijos verčių intervalas turėtų būti pasirinktas taip, kad, siekiant įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, būtų gautas atkuriamas ir su koncentracija susijęs padidėjimas palyginti su fonu.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Laboratorija turėtų nustatyti:

istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,

istorinių neigiamų kontrolinių ėminių (neapdorotų, tirpiklio) intervalą ir pasiskirstymą.

Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas (44) (47). Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę iš pradžių turėtų sudaryti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei tokių palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (48)), kad galėtų nustatyti savo teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje (44). Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (47).

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų suderinamumą su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Esant didesnėms neatitiktims, turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti pavienės kultūros ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius arba kartotinių kultūrų skaičių suma, kaip aprašyta 21 pastraipoje. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas (44) (47). Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 37 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų pateikimas

Turėtų būti gautas ląstelių, turinčių struktūrines chromosomų aberacijas, įvertis procentais. Bandymo ir kontrolinių ėminių kultūrų chromatidinė ir chromosominė aberacijos, klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus), turėtų būti registruojamos atskirai, nurodant jų skaičių ir dažnumą. Plyšiai registruojami ir pateikiami ataskaitoje atskirai, bet neįtraukiami į suminį aberacijų buvimo dažnumą. Ataskaitoje pateikiama poliploidinių ir (arba) endoreduplikuotų ląstelių, kai matomos, procentinė dalis.

Turėtų būti registruojami vienalaikiai visų apdorotų, neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių citotoksiškumo duomenys, gauti atliekant pagrindinį (-ius) aberacijos bandymą (-us).

Turėtų būti pateikti atskiri kiekvienos kultūros duomenys. Be to, visi duomenys turi būti suvesti į lenteles.

Priimtinumo kriterijai

Bandymo priimtinumas pagrįstas šiais kriterijais:

vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę, kaip aprašyta 39 pastraipoje;

vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai (žr. 26 pastraipą) turėtų sukelti atsakus, kurie yra suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;

turėtų atitikti ląstelių proliferacijos tirpiklio kontroliniame ėminyje kriterijus (17 ir 18 pastraipos);

bandoma esant visoms trims Bandymo sąlygoms, nebent vienai iš jų gaunami teigiami rezultatai (žr. 28 pastraipą);

analizuojamas pakankamas ląstelių ir koncentracijos verčių skaičius (31 ir 21 pastraipa).

didžiausios koncentracijos pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 22, 23 ir 24 pastraipose.

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei, esant kuriai nors ištirtai bandymo sąlygai (žr. 28 pastraipą):

a)

bent vienai bandymo koncentracijai gaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,

b)

padidėjimas yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,

c)

kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 39 pastraipą).

Atitinkant visus šiuos kriterijus, laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti šios bandymų sistemos žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijas. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (49) (50) (51).

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis (žr. 28 pastraipą):

a)

jokiai bandymo koncentracijai negaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,

b)

nėra su koncentracija susijusio padidėjimo, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,

c)

visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 39 pastraipą).

Tada laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga negali sukelti šios bandymų sistemos žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijų.

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.

Jei atsakas nėra aiškiai neigiamas ar aiškiai teigiamas, kaip apibūdinta pirmiau, arba, siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą, duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus tyrimus. Galėtų būti naudingas papildomų ląstelių skaičiavimas (jei tinka) arba kartotinis bandymas galbūt modifikuotomis bandymo sąlygomis (pvz., tarpai tarp koncentracijos verčių, kitos metabolinio aktyvinimo sąlygos (t. y. S9 koncentracija ar S9 kilmė)).

Retais atvejais, kai netgi atlikus papildomus tyrimus, gautų duomenų rinkinio nepakaks padaryti išvadą, ar rezultatai yra teigiami ar neigiami, bus priimtas sprendimas, kad cheminės medžiagos atsakas yra dviprasmis.

Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji cheminė medžiaga gali slopinti mitozinius procesus ir sukelti kiekybines chromosomų aberacijas (52). Ląstelių su endoreduplikuotomis chromosomomis skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomosios cheminės medžiagos gali slopinti ląstelių ciklo eigą (53) (54) (žr. 2 pastraipą). Todėl poliploidinių ląstelių ir ląstelių su endoreduplikuotomis chromosomomis dažnumas turėtų būti registruojamas atskirai.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

 

Bandomoji cheminė medžiaga:

šaltinis, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;

pačios bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas;

bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ir stabilumas, jei yra žinomas;

pH, osmolialumo ir nuosėdų matavimas kultūros terpėje, į kurią bandomoji cheminė medžiaga buvo pridėta, jei reikia.

 

Vienkomponentė medžiaga:

fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;

cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų identifikavimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.

 

Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:

kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes.

 

Tirpiklis:

tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,

taip pat reikėtų nurodyti tirpiklio galutinėje kultūros terpėje procentinę dalį.

 

Ląstelės

ląstelių tipas ir šaltinis,

naudojamo tipo ląstelių kariotipo ypatybės ir tinkamumas,

ar nėra mikoplazmos, jei naudojamos ląstelių linijos;

informacija apie ląstelių ciklo trukmę, dvigubėjimo trukmę ar proliferacijos indeksą, jei naudojamos ląstelių linijos;

kraujo donorų lytis, amžius ir visa tinkama informacija apie donorą, visas kraujas ar atskirti limfocitai, naudotas mitogenas;

ląstelių sėjimų skaičius, jei žinomas, kai naudojamos ląstelių linijos;

ląstelių kultūros priežiūros metodai, jei naudojamos ląstelių linijos;

modalinis chromosomų skaičius, jei naudojamos ląstelių linijos.

 

Bandymo sąlygos:

metafazę stabdančios cheminės medžiagos pavadinimas, koncentracija ir ląstelių veikimo trukmė;

bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, išreikšta kaip galutinė koncentracija kultūros terpėje (pvz., μg ar mg/ml ar mmol/l kultūros terpės).

koncentracijos verčių ir kultūrų skaičiaus pasirinkimo pagrindimas, įskaitant, pvz., citotoksiškumo duomenis ir tirpumo apribojimus;

terpių sudėtis, CO2 koncentracija, jei tinka, drėgmės lygis;

tirpiklio ir bandomosios cheminės medžiagos, pridėtos į kultūros terpę, koncentracija (ir (arba) tūris);

inkubavimo temperatūra;

inkubavimo trukmė;

apdorojimo trukmė;

surinkimo laikas po apdorojimo,

ląstelių tankis sėjimo metu, jei tinka,

metabolinio aktyvinimo sistemos tipas ir sudėtis (S9 šaltinis, S9 mišinio paruošimo metodas, S9 mišinio ir S9 galutinėje kultūros terpėje koncentracija ar tūris, S9 kokybės kontrolės ėminiai);

teigiamos ir neigiamos kontrolinės cheminės medžiagos, galutinės koncentracijos vertės esant kiekvienai apdorojimo sąlygai;

objektinių stiklelių ruošimo metodai ir taikytas dažymo būdas;

tyrimų priimtinumo kriterijai;

aberacijų įvertinimo kriterijai,

ištirtų metafazių skaičius,

citotoksiškumo matavimo metodai,

visa papildoma informacija, susijusi su citotoksiškumu ir taikomu metodu;

tyrimo vertinimo kaip teigiamo, neigiamo ar dviprasmio kriterijai,

pH, osmolialumo ir nusėdimo nustatymo metodai.

 

Rezultatai:

kiekvienos kultūros apdototų ląstelių skaičius ir surinktų ląstelių skaičius, kai naudojamos ląstelių linijos;

citotoksišumo matavimai, pvz., RPD, RICC, MI, kiti stebėjimai, jei yra;

informacija apie ląstelių ciklo trukmę, dvigubėjimo trukmę arba proliferacijos indeksą, jei naudojamos ląstelių linijos;

nusėdimo požymiai ir nustatymo laikas;

aberacijų, įskaitant plyšius, apibūdinimas,

įvertintų ląstelių skaičius, ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius ir chromosomų aberacijų tipas, pateikiamas atskirai kiekvienai apdorotai ir kontrolinei kultūrai, įtraukiant ir neįtraukiant plyšių;

ploidiškumo pokyčiai (atskirai nurodomos poliploidinės ląstelės ir ląstelės su endoreduplikuotomis chromosomomis), jei matomi;

koncentracijos ir atsako priklausomybė, jei įmanoma,

vienalaikio neigiamo (tirpiklio) ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys (koncentracijos vertės ir tirpikliai);

istorinių neigiamų (tirpiklio) ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai bei skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat duomenų skaičius;

statistinės analizės duomenys, p vertės, jei yra.

 

Rezultatų aptarimas.

 

Išvados.

LITERATŪRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29

(3)

Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“ in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.

(4)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(5)

Muehlbauer, P.A. et al. (2008), Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.

(6)

Šio priedo B.49 skyrius. In Vitro žinduolių ląstelės mikrobranduolio bandymas.

(7)

ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.

(8)

Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, pp. 147-204.

(9)

Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.

(10)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.

(11)

Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.

(12)

Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.

(13)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.

(14)

Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.

(15)

Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.

(16)

Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.

(17)

Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.

(18)

Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.

(19)

Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.

(20)

Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.

(21)

Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.

(22)

Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.

(23)

Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.

(24)

Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.

(25)

Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.

(26)

Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.

(27)

Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(28)

Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.

(29)

Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.

(30)

UNEP (2001), Stokholmo konvencija dėl patvariųjų organinių teršalų, Jungtinių Tautų aplinkos programa (UNEP). Pateikiama adresu http://www.pops.int/.

(31)

Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.

(32)

Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.

(33)

Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.

(34)

Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.

(35)

Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.

(36)

Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.

(37)

Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.

(38)

Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(39)

OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Available upon request.

(40)

Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.

(41)

Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.

(42)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(43)

USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Disponible à l'adresse: https://federalregister.gov/a/2012-13774.

(44)

OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS)“, Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(45)

ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.

(46)

Scott, D. et al. (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro“, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.

(47)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(48)

Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.

(49)

Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.

(50)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(51)

Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(52)

Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.

(53)

Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.

(54)

Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364

(55)

Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.

1 priedėlis

APIBRĖŽTYS

Aneuploidija – vienos arba daugiau kaip vienos chromosomų, bet ne viso (-ų) jų rinkinio (-ų) (poliploidija) nukrypimas nuo normalaus diploidinio (arba haploidinio) chromosomų skaičiaus.

Apoptozė – užprogramuota ląstelių žūtis, kuriai būdinga serija etapų, per kuriuos ląstelės suyra į membrana apsuptas daleles, kurios vėliau pašalinamos fagocitoze arba numetimo būdu.

Ląstelių proliferacija – ląstelių skaičiaus didėjimas dėl mitozinio jų dalijimosi.

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

Chromatidžių trūkis – atskiros chromatidės nevientisumas, kai yra aiškus vienos iš chromatidžių nesutapimas.

Chromatidinis plyšys – nedažoma (achromatinė) vienos chromatidės sritis, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.

Chromatidinė aberacija – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip vienos iš chromatidžių trūkis arba kaip chromatidžių trūkis ir susijungimas.

Chromosominė aberacija – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip abiejų chromatidžių trūkis arba kaip trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.

Klastogenas – сheminė medžiaga, kuris sukelia ląstelių arba eukariotinių organizmų populiacijų struktūrines chromosomų aberacijas.

Koncentracijos vertės – bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kultūros terpėje galutinės vertės.

Citotoksiškumas – jei šio bandymo metodo tyrimams naudojamos ląstelių linijos, citotoksiškumas nustatomas kaip apdorotų ląstelių santykinio populiacijos padvigubėjimo (RPD) sumažėjimas ar santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC) palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 17 pastraipą ir 2 priedėlį). Jei šio bandymo metodo tyrimams naudojamos pirminės limfocitų kultūros, citotoksiškumas nustatomas kaip apdorotų ląstelių mitozinio indekso (MI) sumažėjimas palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 18 pastraipą ir 2 priedėlį).

Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 … chromatidžių.

Genotoksinis – bendrasis terminas, kuriuo išreiškiamas visų tipų DNR arba chromosomų pažeidimas, įskaitant trūkius, delecijas, aduktus, nukleotidų modifikacijas ir ryšius, pergrupavimus, genų mutacijas, chromosomų aberacijas ir aneuploidiją. Ne visų tipų genotoksiniai poveikiai sukelia mutacijas ar pastovų chromosomų pažeidimą.

Mitozinis indeksas (MI) – metafazės ląstelių skaičiaus ir ląstelių populiacijos stebimų ląstelių suminio skaičiaus dalmuo, kuris rodo tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.

Mitozė – ląstelės branduolio dalijimasis, paprastai į profazę, prometafazę, metafazę, anafazę ir telofazę.

Mutageninis – sukeliantis paveldimą DNR bazinės poros sekos (-ų) pokytį genuose arba chromosomų struktūroje (chromosomų aberacijas).

Kiekybinė aberacija – chromosomų skaičiaus pokytis palyginti su naudojamų ląstelių būdingu normaliu chromosomų skaičiumi.

Poliploidija – kiekybinės chromosomų aberacijos ląstelėse arba organizmuose, apimančios visą (-us) chromosomų rinkinį (-us), skirtingai nei atskirą (-as) chromosomą (-as) (aneuploidija).

p53 būsena – p53 baltymo dalyvavimas reguliuojant ląstelių ciklą, apoptozę ir DNR atkūrimą. Ląstelės, kurioms trūksta funkcinio p53 baltymo ir negali sustabdyti ląstelių ciklo arba pašalinti pažeistų ląstelių per apoptozę arba kitais mechanizmais (pvz., DNR atkūrimo skatinimą), susijusiais su p53 funkcijomis atsakant į DNR pažaidą, teoriškai turėtų būti labiau linkusios genų mutacijai ar chromosomų aberacijoms.

Santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (angl. RICC)– ląstelių skaičiaus padidėjimas chemine medžiaga veikiamose kultūrose, palyginti su padidėjimu neapdorotose kultūrose, santykį išreiškiant procentine dalimi.

Santykinis populiacijos padvigubėjimas (angl. RPD)– populiacijos padvigubėjimų skaičiaus padidėjimas chemine medžiaga veikiamose kultūrose, palyginti su neapdorotomis kultūromis, santykį išreiškiant procentine dalimi.

S9 kepenų frakcija – skystis virš kepenų homogenato, gautas po centrifugavimo esant 9 000 g, t. y. žalių kepenų ekstraktas.

S9 mišinys – S9 kepenų frakcijos ir fermentų metaboliniam aktyvumui būtinų kofaktorių mišinys.

Tirpiklio kontrolinis ėminys – bendras terminas, apibūdinantis kontrolines kultūras, į kurias dedama vien tik tirpiklio, naudoto bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti.

Struktūrinė aberacija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti dalijimosi ciklo metafazės ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.

Bandomoji cheminė medžiaga – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

Neapdorotieji kontroliniai ėminiai – kultūros, kurios neapdorojamos (t. y. nededama bandomosios cheminės medžiagos ar tirpiklio), bet yra tiriamos vienu metu su kultūromis, į kurias dedama bandomoji cheminė medžiaga.

2 priedėlis

CITOTOKSIŠKUMO VERTINIMO FORMULĖS

Mitozinis indeksas (MI):

Formula

Rekomenduojama naudoti santykinį ląstelių skaičiaus padidėjimą (RICC) ar santykinį populiacijos padvigubėjimą (RPD), nes abiem atvejais atsižvelgiama į padalytų ląstelių populiacijos dalį.

Formula

Formula

čia:

Populiacijos padvigubėjimas = [log (ląstelių skaičius po apdorojimo ÷ pradinis ląstelių skaičius)] ÷ log 2

Pvz., 53 % RICC ar RPD rodo 47 % citotoksiškumą ar citostazę, o 55 % citotoksiškumas ar citostazė matuojant MI reiškia, kad faktinis MI yra 45 % kontrolinio ėminio.

Visais atvejais reikėtų išmatuoti ląstelių skaičių prieš apdorojimą ir apdorojamose bei neigiamų kontrolinių ėminių kultūrose jis turėtų būti vienodas.

Nors praeityje kaip citotoksiškumo parametras buvo naudojamas RCC (t. y. apdorotų kultūrų ląstelių skaičius/ kontrolinių kultūrų ląstelių skaičius), jis daugiau nerekomenduojamas, nes gali būti gautas per mažas citotoksiškumo įvertis.

Neigiamų kontrolinių kultūrų populiacijos padvigubėjimas turėtų būti suderinamas su reikalavimu imti ląstelių ėminius nuo apdorojimo praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, o mitozinis indeksas turėtų būti gana didelis, kad būtų gautas pakankamas mitozės etapo ląstelių skaičius ir būtų galima patikimai apskaičiuoti 50 % sumažėjimą.

4)

B dalies B.11 skyrius pakeičiamas taip:

„B.11   Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 475 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų bandymas in vivo ypač tinka genotoksiškumui vertinti, nes, nors skirtingų gyvūnų rūšių chromosomos gali skirtis, in vivo metabolizmo veiksniai, farmakokinetika ir DNR atkūrimo procesai yra aktyvūs ir prisideda prie atsakų. Tyrimas in vivo taip pat naudingas toliau tiriant in vitro sistemoje nustatytą genotoksiškumą.

Žinduolių chromosomų aberacijų tyrimas in vivo naudojamas nustatant struktūrines chromosomų aberacijas, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai graužikų, kaulų čiulpų ląstelėse (2) (3) (4) (5). Struktūrinės chromosomų aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma genotoksinių cheminių medžiagų sukeltų aberacijų yra chromatidinės, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Chromosomų pažeidimas ir su juo susiję reiškiniai yra daugumos genetiškai paveldimų žmonių ligų priežastis ir yra esminių įrodymų, kad, kai šie pažeidimai ir susiję reiškiniai sukelia onkogenų bei navikų supresorinių genų pokyčius, jie prisideda prie žmonių ir bandymų sistemų vėžio atsiradimo. Atliekant chromosomų aberacijų tyrimus in vivo galėtų atsirasti poliploidija (įskaitant endoreduplikaciją). Tačiau pati padidėjusi poliploidija nerodo aneugeninio potencialo ir ji tiesiog gali rodyti ląstelių ciklo sutrikimą ar citotoksiškumą. Šis bandymas nenumatytas aneuploidijai matuoti. Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymas in vivo (šio priedo B.12 skyrius) arba žinduolių ląstelių mikrobranduolių bandymas in vitro (šio priedo B.49 skyrius) būtų in vivo ir in vitro bandymai, rekomenduojami aneuploidijai aptikti.

Vartojamų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI

Šiam bandymui atlikti paprastai naudojami graužikai, bet kai kuriais atvejais gali tikti kitos rūšys, jei jų naudojimas būtų moksliškai pagrįstas. Šio bandymo tikslinis audinys yra kaulų čiulpai, kadangi jis yra gausiai vaskuliarizuotas audinys ir turi sparčiai besidauginančių ląstelių, kurias galima atskirti ir apdoroti, populiaciją. Kitų nei žiurkės ar pelės rūšių naudojimas turėtų būti moksliškai pagrįstas ataskaitoje. Jei naudojamos kitos nei graužikai rūšys, rekomenduojama kaulų čiulpų chromosomų aberacijos matavimą įtraukti į kitą tinkamą toksiškumo bandymą.

Jei yra duomenų, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) ar jos arba jų metabolitas (-ai) nepasieks tikslinio audinio, jis gali būti netinkamas naudoti šiame bandyme.

Prieš šiuo bandymų metodu bandant mišinį, siekiant gauti duomenų numatomo reglamentavimo tikslais, reikėtų apsvarstyti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus, ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMŲ METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga tinkamu veikimo būdu ir reikiamu momentu po paveikimo humaniškai numarinami. Prieš numarinant gyvūnai paveikiami agentu, stabdančiu metafazę (pvz., kolchicinu ar kolcemidu). Tada iš kaulų čiulpų ląstelių ruošiami chromosomų preparatai, jie dažomi, ir metafazės ląstelės tiriamos mikroskopu chromosomų aberacijoms nustatyti.

LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS

Kvalifikacijos tyrimai

Siekdama įgyti pakankamos tyrimo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams bandymams, laboratorija turėtų įrodyti gebėjimą atkurti paskelbtų duomenų (pvz., (6)) tikėtinus chromosomų aberacijų dažnumo rezultatus, naudodama ne mažiau kaip dvi teigiamas kontrolines chemines medžiagas (įskaitant mažos dozės teigiamų kontrolinių ėminių sukeltus silpnus atsakus), pvz., išvardytas 1 lentelėje, ir suderinamų tirpiklių ir (arba) nešiklių kontrolinius ėminius (žr. 22 pastraipą). Atliekant šiuos bandymus, reikėtų naudoti dozes, kurioms esant tiriamajame audinyje (kaulų čiulpuose) gaunami atkuriami ir su doze susiję padidėjimai, ir įrodyti bandymų sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, pasitelkiant laboratorijoje taikomą vertinimo metodą. Šis reikalavimas netaikomas patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. toms, kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 10–14 pastraipose.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Atlikdama kvalifikacijos tyrimus, laboratorija turėtų nustatyti:

istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,

istorinių neigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą.

Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Istorinių kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas. Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė turėtų būti statistiškai patikima, kad būtų užtikrintas laboratorijos gebėjimas vertinti savo neigiamų kontrolinių ėminių duomenų pasiskirstymą. Literatūroje daroma prielaida, kad gali prireikti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (7)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (8).

Jei, atliekant 9 skirsnyje aprašytus kvalifikacijos tyrimus, laboratorijai nepakanka bandymų skaičiaus statistiškai patikimam neigiamų kontrolių ėminių skirstiniui gauti (žr. 11 pastraipą), priimtina skirstinį papildyti atliekant pirmuosius įprastinius bandymus. Taikant šį būdą, reikėtų laikytis literatūroje nurodytų rekomendacijų (8), o atliekant šiuos bandymus gauti neigiamų kontrolinių ėminių rezultatai turėtų būti suderinami su paskelbtais neigiamų kontrolinių ėminių duomenimis.

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų poveikį gaunamiems duomenims, kurie turi likti suderinami su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Tik esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė, jei, atsižvelgiant į ekspertų nuomonę, nustatoma, kad ji skiriasi nuo ankstesnio skirstinio (žr. 11 pastraipą). Atkūrimo metu atliekamam bandymui gali neprireikti visos neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės, jei laboratorija gali įrodyti, kad vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių vertės ir toliau yra suderinamos su ankstesne duomenų baze arba su atitinkamais paskelbtais duomenimis.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti kiekvieno gyvūno struktūrinės chromosomų aberacijos dažnumas (išskyrus plyšius). Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas. Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei jie nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema yra „valdoma“ (žr. 11 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

METODO APRAŠYMAS

Parengiamieji darbai

Gyvūnų rūšies parinkimas

Reikėtų tirti dažniausiai naudojamas sveikų jaunų suaugusių gyvūnų laboratorines veisles. Paprastai naudojamos žiurkės, nors taip pat gali tikti pelės. Galima naudoti kitas tinkamas žinduolių rūšis, jei ataskaitoje tai būtų moksliškai pagrįsta.

Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos

Temperatūra graužikų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 40 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Jei nesitikima agresyvaus elgesio, graužikus reikėtų laikyti nedidelėmis vienos lyties vienodai apdorojamomis grupėmis (ne daugiau kaip po penkis viename narvelyje), pageidautina narveliuose su kietomis grindimis ir esant atitinkamai pagerintai aplinkai. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai.

Gyvūnų paruošimas

Paprastai naudojami sveiki, jauni suaugę gyvūnai (geriausias graužikų amžius apdorojimo pradžioje yra 6–10 savaičių, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus), kurie atsitiktinai paskirstomi į kontrolines ir apdorojamas grupes. Kiekvienas gyvūnas humanišku minimaliai invaziniu būdu paženklinamas unikaliu ženklu (pvz., žieduojant, kabinant etiketę, naudojant mikrolustą ar biometrinį identifikavimą, bet ne ausų ar pėdų spaustukus) ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Reikėtų vengti teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos kryžminės taršos. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti minimalus ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties vidutinės gyvūno masės.

Dozių ruošimas

Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas prieš dozuojant gyvūnams reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybes, galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu. Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir yra apibrėžtos tinkamos laikymo sąlygos.

Tirpiklis ir (arba) nešiklis

Neturėtų būti tirpiklio ar nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamiems dozių dydžiams, ir neturėtų kilti įtarimų, kad galėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti tik pateikus suderinamumą rodančius etaloninius duomenis. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Dažniausiai naudojamų suderinamų tirpiklių ar nešiklių pavyzdžiai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, metilceliuliozės tirpalas, karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalas, alyvuogių ir kukurūzų aliejus. Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas netipinis tirpiklis ar nešiklis nesukelia struktūrinių aberacijų ar kitokio žalingo poveikio, reikėtų atlikti pradinį tyrimą tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.

Kontroliniai ėminiai

Teigiami kontroliniai ėminiai

Paprastai į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti grupę gyvūnų, apdorotų teigiama kontroline chemine medžiaga. To galima atsisakyti, jei bandymų laboratorija įrodė kvalifikaciją atlikti bandymą ir nustatė istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą. Jei vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupė neįtraukiama, į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti vertinimo kontrolinius ėminius (fiksuotus ir nedažytus objektinius stiklelius). Juos galima gauti į tyrimo vertinimą įtraukiant atitinkamus etaloninius ėminius, kurie būtų gauti bandymų laboratorijoje periodiškai (pvz., kas 6–18 mėnesių) atliekant atskirą teigiamo kontrolinio ėminio bandymą, pvz., kvalifikacijos tyrimo metu ir reguliariai vėliau, jei būtina, ir tuos ėminius laikyti.

Teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos turėtų patikimai sukelti ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis aiškų dažnumo padidėjimą, palyginti su savaiminiu lygiu. Reikėtų pasirinkti tokias teigiamų kontrolinių ėminių dozes, kad poveikis būtų ryškus, bet skaičiuotojui ne iškarto atsiskleistų užkoduotų ėminių tapatybė. Teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą galima duoti kitu nei bandomoji cheminė medžiaga būdu, taikant skirtingą apdorojimo planą ir ėminius imant tik vienu laiko momentu. Be to, jei tinka, galima atsižvelgti į tos pačios cheminės klasės teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų naudojimą. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai

Cheminė medžiaga

CAS Nr.

Etilmetansulfonatas

62-50-0

Metilmetansulfonatas

66-27-3

Etilnitrozokarbamidas

759-73-9

Mitomicinas C

50-07-7

Ciklofosfamidas (monohidratas)

50-18-0 (6055-19-2)

Trietilenmelaminas

51-18-3

Neigiami kontroliniai ėminiai

Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus reikėtų įtraukti kiekvieną kartą imant ėminį ir su jais elgtis kaip su apdorojama grupe, išskyrus tai, kad gyvūnai nepaveikiami bandomąja chemine medžiaga. Jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas tirpiklis ar nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti šio tirpiklio ar nešiklio. Tačiau jei kiekvienam ėminių ėmimo laikui bandymų laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys rodo pastovų kintamumą tarp gyvūnų ir ląstelių su struktūrinėmis aberacijomis dažnumą, gali pakakti paimti tik vieną neigiamą kontrolinį ėminį. Jei imamas tik vienas neigiamas kontrolinis ėminys, jis turėtų būti imamas pirmą kartą imant atliekamo tyrimo ėminį.

PROCEDŪRA

Gyvūnų skaičius ir lytis

Apskritai, vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų mikrobranduolių atsakas yra panašus (9) ir tikėtina, kad taip atsitiks tiriant struktūrines chromosomų aberacijas, todėl daugumą tyrimų būtų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais. Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo, toksiškumo kaulų čiulpams ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.

Reikėtų nustatyti grupių dydį tyrimo pradžioje, turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant kaulų čiulpų tyrimą, kai trijų dozių grupių ir vienos vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio grupės ėminiai imami du kartus, ir dar yra teigiamo kontrolinio ėminio grupė (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų 45 gyvūnai.

Dozių dydžiai

Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą (10). Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip didžiausia dozė, kuri būtų toleruojama nesant tyrimą ribojančio toksiškumo požymių, susijusių su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., sukeliant kūno masės sumažėjimą arba hematopoetinės sistemos citotoksiškumą, bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių gyvūną reikėtų humaniškai numarinti (11)).

Didžiausią dozę taip pat būtų galima apibrėžti kaip dozę, kuri būtų tam tikras toksiškumo kaulų čiulpams rodiklis.

Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio veikimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti poveikį, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.

Siekiant gauti informacijos apie dozės ir atsako priklausomybę, į išsamų tyrimą reikėtų įtraukti neigiamo kontrolinio ėminio grupę ir ne mažiau kaip tris dozes, kurių dydžio skirtumo faktorius būtų 2, bet ne didesnis kaip 4. Jei cheminė medžiaga nerodo toksiškumo atliekant intervalo nustatymo tyrimą arba atsižvelgiant į turimus duomenis, didžiausia vienkartinio davimo dozė turėtų būti 2 000 mg/kg kūno masės. Tačiau jei bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, didžiausia duodama dozė turėtų būti MTD, o naudojami dozių dydžiai turėtų aprėpti intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui (kaulų čiulpams) stebimas visiems bandomiems dozės dydžiams, patartina toliau tirti netoksines dozes. Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau apibūdinti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją, gali prireikti papildomų dozių grupių. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reikalavimai, šios ribos gali skirtis.

Ribinis bandymas

Jei dozės intervalo nustatymo bandymai arba esami susijusių gyvūnų veislių duomenys rodo, kad apdorojimo režimu bent ribinė dozė (aprašyta toliau) nesukelia jokio toksinio poveikio (įskaitant tai, kad nėra kaulų čiulpų proliferacijos slopinimo ar kitų citotoksiškumo tiksliniam audiniui požymių) ir, jei atsižvelgiant in vitro genotoksiškumo tyrimus arba į giminingos struktūros cheminėms medžiagoms gautus duomenis, genotoksiškumo nereikėtų tikėtis, visas bandymas naudojant trijų dydžių dozes gali būti nebūtinas, jei būtų įrodyta, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pasiekia tikslinį audinį (kaulų čiulpus). Tokiais atvejais gali pakakti vienos ribinio dydžio dozės. Jei davimo laikotarpis > 14 parų, ribinė dozė yra 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis – 14 parų arba trumpesnis, ribinė dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą.

Dozių davimas

Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus veikimo būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveikio žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik jei būtų specialiai moksliškai pagrįstas. Jei bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į pašarą ar į geriamąjį vandenį, ypač vienkartinio dozavimo atveju reikėtų imtis priemonių, kad laiko tarpas nuo maisto bei vandens vartojimo iki ėminių ėmimo būtų pakankamas poveikiui aptikti (žr. 33–34 pastraipas). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti ne daugiau kaip po 2 ml/100 g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą reikėtų pagrįsti. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukeltų sunkesnį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kuo mažesnis reguliuojant koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų dydžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.

Apdorojimo planas

Paprastai bandomosios cheminės medžiagos duodamos per vieną kartą, bet, siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, dozę galima padalyti (t. y. per vieną dieną apdoroti du arba daugiau kartų, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui). Šiomis aplinkybėmis arba tais atvejais, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama ją įkvepiant, ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo arba veikimo pabaigos laiką.

Turima mažai duomenų apie kartotinės dozės protokolo tinkamumą šiam bandymui. Tačiau jei šį bandymą norima sujungti su kartotinės dozės toksiškumo bandymu, reikėtų imtis priemonių išvengti mitozinių ląstelių su pažeistomis chromosomomis nuostolių, kurių gali būti esant toksinėms dozėms. Toks sujungimas yra priimtinas, kai didžiausia dozė yra lygi ribinei dozei arba didesnė (žr. 29 pastraipą) ir dozės grupei duodama ribinė dozė visą apdorojimo laikotarpio trukmę. Į mikrobranduolių bandymą (B.12 bandymų metodas) galima žiūrėti kaip į geriausią chromosomų aberacijų bandymą in vivo, kai siekiama jungti su kitais tyrimais.

Kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti imami atskirai du kartus po vienkartinio apdorojimo. Graužikų pirmasis ėminių ėmimo intervalas turėtų būti laikas, kuris yra būtinas, kad galėtų baigtis laikotarpis, 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (pastaroji paprastai yra 12–18 h po apdorojimo laikotarpio). Kadangi bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) sugertis ir metabolizmas, taip pat medžiagos (-ų) įtaka ląstelių ciklo kinetikai gali paveikti optimalų chromosomų aberacijos aptikimo laiką, rekomenduojama antrąjį ėminį paimti praėjus 24 h nuo pirmojo ėminio paėmimo. Imant ėminį pirmą kartą, visos dozių grupės turėtų būti apdorotos ir ėminiai paimti analizei, tačiau, imant ėminį kitą (-us) kartą (-us), duoti reikia tik didžiausią dozę. Jei moksliškai yra pagrįstos daugiau kaip vienos paros dozės davimo schemos, paprastai ėminius reikėtų imti vieną kartą, po galutinio apdorojimo praėjus laikui, maždaug 1,5 ilgesniam nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Po apdorojimo ir prieš ėminių surinkimą gyvūnams suleidžiama injekcija į pilvo ertmę su metafazę stabdančios medžiagos (pvz., kolchicino ar kolcemido) reikiama doze, ir ėminiai surenkami po reikiamo laiko tarpo. Pelėms šis laiko tarpas prieš surinkimą yra maždaug 3–5 h, žiurkėms – 2–5 h. Ląstelės surenkamos iš kaulų čiulpų, brinkinamos, fiksuojamos, dažomos ir analizuojamos chromosomų aberacijoms nustatyti (12).

Stebėjimai

Reikėtų atlikti bendruosius bandymo gyvūnų klinikinius stebėjimus ir bent kartą per dieną registruoti klinikinius požymius, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Mažiausiai du kartus per dieną dozavimo laikotarpiu visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius. Visi gyvūnai turėtų būti sveriami tyrimo pradžioje, bent kartą per savaitę kartotinės dozės tyrimų metu ir numarinant. Jei tyrimai atliekami ne trumpiau kaip vieną savaitę, bent kartą per savaitę reikėtų matuoti pašaro suvartojimą. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti dar nesibaigus bandymo laikotarpiui (11).

Tikslinio audinio veikimas

Reikiamu laiku vieną ar kelis kartus reikėtų paimti kraujo ėminį bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijai plazmoje nustatyti, siekiant įsitikinti, ar kaulų čiulpai buvo paveikti, jei reikalaujama ir jei nėra kitų poveikio duomenų (žr. 44 pastraipą).

Kaulų čiulpų ir chromosomų preparatai

Iš karto po humaniško numarinimo gaunamos kaulų čiulpų ląstelės iš gyvūnų šlaunikaulių ar blauzdikaulių, veikiamos hipotoniniu tirpalu ir fiksuojamos. Metafazės ląstelės paskleidžiamos ant objektinių stiklelių ir dažomos nustatytais būdais (žr. (3) (12)).

Analizė

Visi objektiniai stikleliai, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių, prieš analizę turėtų būti atskirai koduojami ir randomizuojami, kad skaičiuotojas nežinotų apdorojimo sąlygų.

Reikėtų nustatyti mitozinį indeksą kaip citotoksiškumo matą, įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1 000 ląstelių vienam gyvūnui, jį nustatant visiems apdorotiems gyvūnams (įskaitant teigiamus kontrolinius ėminius), neapdorotiems gyvūnams arba tirpiklio ar nešiklio neigiamų kontrolinių ėminių gyvūnams.

Reikėtų ištirti ne mažiau kaip 200 metafazės kiekvieno gyvūno ląstelių, kad būtų nustatytos struktūrinės chromosomų aberacijos, įtraukiant ir neįtraukiant plyšių (6). Tačiau jei istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė rodo, kad bandymo laboratorijos vidutinis foninis struktūrinių chromosomų aberacijų dažnumas yra < 1 %, reikėtų atsižvelgti į galimybę skaičiuoti papildomas ląsteles. Chromatidinė ir chromosominė aberacijos turėtų būti registruojamos atskirai ir klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus). Laboratorijoje taikomos procedūros turėtų užtikrinti, kad chromosomų aberacijų analizę atlieka tinkamai apmokyti skaičiuotojai ir, jei reikia, ją peržiūrėtų ekspertai. Atsižvelgiant į tai, kad objektinių stiklelių ruošimo procedūrų dažnas rezultatas dėl gautų chromosomų nuostolių pakeičia metafazės ląstelių dalį, skaičiuojamų ląstelių centromerų skaičius turėtų būti ne mažesnis kaip 2n ± 2, kai n yra tos rūšies haploidinis chromosomų skaičius.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų apdorojimas

Kiekvieno gyvūno bandymų rezultatai turėtų būti pateikiami lentelėse. Reikėtų įvertinti kiekvieno gyvūno mitozinį indeksą, suskaičiuotų metafazės ląstelių skaičių, aberacijų vienai metafazės ląstelei skaičių ir ląstelių su strūktūrine (-ėmis) chromosomų aberacija (-omis) procentinę dalį. Turėtų būti išvardyti apdorotų ir kontrolinių grupių gyvūnų skirtingi struktūrinių chromosomų aberacijų tipai, nurodant jų skaičių bei dažnumą. Plyšiai, taip pat poliploidinės ląstelės ir ląstelės su endoreduplikuotomis chromosomomis yra registruojamos atskirai. Plyšių dažnumas pateikiamas ataskaitoje, bet paprastai neįtraukiamas į suminio struktūrinių aberacijų dažnumo analizę. Jei nėra atsako skirtumo dėl lyties įrodymų, atliekant statistinę analizę duomenis galima apjungti. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo gyvūnams ir klinikinių požymių duomenis.

Priimtinumo kriterijai

Apie bandymo priimtinumą sprendžiama pagal šiuos kriterijus:

a)

vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių kontrolinių duomenų bazę (žr. 11–14 pastraipas);

b)

vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai arba skaičiavimo kontroliniai ėminiai turėtų sukelti atsakus, kurie būtų suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 20–21 pastraipą);

c)

atlikta reikiamo dozių ir ląstelių skaičiaus analizė;

d)

didžiausios dozės pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 25–28 pastraipose.

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:

a)

bent viena iš apdorotų grupių rodo statistiškai reikšmingą ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis (išskyrus plyšius) dažnumo padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;

b)

padidėjimas bent vienam ėminio ėmimo laikui yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų ir

c)

kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų).

Jei tam tikru ėminio ėmimo laiku tiriama tik didžiausia dozė, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei yra statistiškai reikšmingas padidėjimas, palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, o rezultatai yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų). Rekomendacijų dėl tinkamų statistinių metodų galima rasti literatūroje (13). Atliekant dozės ir atsako priklausomybės analizę, reikėtų analizuoti ne mažiau kaip tris dozę gavusias grupes. Taikant statistinius kriterijus, bandymo vienetu turėtų būti gyvūnas. Teigiami chromosomų aberacijų bandymo rezultatai rodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukelia bandomųjų rūšių kaulų čiulpų struktūrines chromosomų aberacijas.

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis:

a)

nei viena apdorota grupė nerodo statistiškai reikšmingo ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis (išskyrus plyšius) dažnumo padidėjimo palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;

b)

nėra su doze susijusio padidėjimo bet kuriuo ėminių ėmimo laiku, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,

c)

visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų) ir

d)

kaulų čiulpai buvo veikiami bandomąja (-osiomis) chemine (-ėmis) medžiaga (-omis).

Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (13). Kaulų čiulpų veikimo bandomąja chemine medžiaga įrodymu gali būti mitozinio indekso sumažėjimas arba bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentracijos verčių plazmoje ar kraujyje matavimas. Jei cheminė medžiaga leidžiama į veną, įrodyti poveikio nebūtina. Siekiant įrodyti, kad kaulų čiulpai buvo paveikti, taip pat galima naudoti ADME (absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, šalinimo) duomenis, gautus atliekant nepriklausomą tyrimą, kuriame būtų naudojamas tas pats davimo būdas ir ta pati rūšis. Neigiami rezultatai rodo, kad tyrimo sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų bandytos gyvūnų rūšies kaulų čiulpuose.

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar aiškų neigiamą atsaką.

Tais atvejais, kai atsakas nėra aiškiai neigiamas ar teigiamas, ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą (pvz., mažas ar tarpinis padidėjimas), duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) papildomai tiriant esamus atliktus bandymus. Kai kuriais atvejais galėtų būti naudinga analizuoti didesnį ląstelių skaičių arba pakartoti bandymą šiek tiek pakeistomis bandymo sąlygomis.

Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, nepakaks duomenų padaryti išvadą, ar gauti bandomosios cheminės medžiagos rezultatai yra teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad tyrimas yra dviprasmis.

Poliploidinių ir endoreduplikuotų metafazės ląstelių dažnumas turėtų būti registruojamas atskirai. Poliploidinių ar endoreduplikuotų ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji cheminė medžiaga gali slopinti mitozinius procesus ar ląstelių ciklo eigą (žr. 3 pastraipą).

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

Santrauka

 

Bandomoji cheminė medžiaga:

kilmė, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;

bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas.

 

Vienkomponentė cheminė medžiaga:

fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;

cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.

 

Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:

kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.

 

Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas

nešiklio pasirinkimo pagrindimas;

bandomosios cheminės medžiagos tirpumas ir stabilumas tirpiklyje ar nešiklyje, jei yra žinomas;

preparatų su pašarais, geriamuoju vandeniu arba inhaliacinių preparatų ruošimas;

preparatų analizinis nustatymas (pvz., stabilumo, vienalytiškumo, nominalių koncentracijos verčių), kai atliekamas.

 

Bandymo gyvūnai:

rūšis ir (arba) veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

kilmė, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.,

gyvūnų unikalaus identifikavimo būdas;

kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje, atliekant trumpalaikius tyrimus; kiekvieno gyvūno masė bandymo eigoje ir pašaro suvartojimas, atliekant ilgesnius nei savaitės trukmės bandymus. Reikėtų įtraukti kiekvienos grupės kūno masės intervalą, vidurkį ir standartinį nuokrypį.

 

Bandymo sąlygos:

teigiami ir neigiami (nešiklio ir (arba) tirpiklio) kontroliniai ėminiai,

intervalo nustatymo tyrimo, jei atliekamas, duomenys;

dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas;

išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą;

išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą,

davimo būdo ir trukmės pagrindimas;

tikrinimo, ar bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pateko į kraujotakos sistemą ar kaulų čiulpus, metodai;

faktinė dozė (mg/kg kūno masės per parą), apskaičiuota pagal bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją pašaruose ir (arba) geriamajame vandenyje (ppm) ir suvartojimą, jei tinka;

išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.

numarinimo metodas;

nuskausminimo metodas (jei taikomas);

išsamus apdorojimo ir ėminių ėmimo tvarkaraščių aprašymas, pasirinkimo pagrindimas;

objektinių stiklelių paruošimo metodai;

toksiškumo matavimo metodai,

metafazės tarpsnyje stabdančios cheminės medžiagos pavadinimas, jos koncentracija, dozė ir davimo laikas prieš ėminių ėmimą;

ėminių izoliavimo ir konservavimo procedūros;

aberacijų įvertinimo kriterijai,

analizuotų metafazės ląstelių skaičius vienam gyvūnui ir mitoziniam indeksui nustatyti analizuotų ląstelių skaičius;

tyrimo priimtinumo kriterijai;

kriterijai, pagal kuriuos tyrimas laikomas teigiamu, neigiamu ar nedavusiu rezultato.

 

Rezultatai:

gyvūnų būklė prieš bandymą ir visą bandymo laikotarpį, įskaitant toksiškumo požymius;

mitozinis indeksas, nurodytas atskirai kiekvienam gyvūnui;

aberacijų tipas bei skaičius ir ląstelių su aberacijomis skaičius, pateiktas atskirai kiekvienam gyvūnui;

kiekvienos grupės suminis aberacijų skaičius, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai;

kiekvienos grupės ląstelių su aberacijomis skaičius, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai;

ploidiškumo pokyčiai, jei matomi, įskaitant poliploidinių ląstelių ir (arba) endoreduplikuotų ląstelių dažnumus;

dozės ir atsako priklausomybė, jei įmanoma nustatyti;

statistinės analizės duomenys ir taikytas metodas.

kaulų čiulpų poveikio patvirtinimo duomenys;

vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys, nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;

istorinių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai, standartiniai nuokrypiai ir skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat apimamas laikotarpis ir stebėjimų skaičius;

atitikti teigiamo ar neigiamo atsako kriterijai.

 

Rezultatų aptarimas.

 

Išvada.

 

Nuorodos.

LITERATŪRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals“, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.

(3)

Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.

(4)

Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.

(5)

Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.

(6)

Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.

(7)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(8)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(9)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.

(10)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.

(11)

OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No19, OECD Publishing, Paris.

(12)

Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.

(13)

Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

1 priedėlis

APIBRĖŽTYS

Aneuploidija – vienos arba daugiau kaip vienos chromosomų, bet ne viso (-ų) jų rinkinio (-ų) (žr. poliploploidija) nukrypimas nuo normalaus diploidinio (arba haploidinio) chromosomų skaičiaus.

Centromera – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

Chromatidinė aberacija – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip vienos iš chromatidžių trūkis arba kaip chromatidžių trūkis ir susijungimas.

Chromosominė aberacija – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip abiejų chromatidžių trūkis arba kaip trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.

Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ... chromatidžių.

Plyšys – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis, spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.

Mitozinis indeksas – santykis tarp metafazėje esančių ląstelių skaičiaus ir visų populiacijos ląstelių skaičiaus, kuris yra tos ląstelių populiacijos proliferacijos būsenos matas.

Chromosomų skaičiaus aberacija – naudojamų gyvūnų chromosomų skaičiaus pokytis palyginti su normaliu jų skaičiumi (aneuploidija).

Poliploidija – chromosomų skaičiaus aberacija ląstelėse arba organizmuose, apimanti viso chromosomų rinkinio skaičiaus pokytį, bet ne chromosomų rinkinio dalies skaičiaus pokytį (žr. aneuploidija).

Struktūrinė chromosomų aberacija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti dalijimosi ciklo metafazės ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.

Bandomoji cheminė medžiaga – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

2 priedėlis

FAKTORINĖS ANALIZĖS SCHEMA LYČIŲ SKIRTUMAMS NUSTATYTI ATLIEKANT CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMĄ IN VIVO

Faktorinės analizės schema ir jos taikymas

Pagal šią schemą kiekvienai koncentracijos vertei bandomi ne mažiau kaip 5 patinai ir 5 patelės. Iš viso pagal schemą naudojama ne mažiau kaip 40 gyvūnų (20 patinų ir 20 patelių ir dar atitinkami teigiami kontroliniai ėminiai).

Schema, kuri yra viena iš paprastesnių faktorinės analizės schemų, atitinka dvifaktorinės dispersinės analizės schemą, kurios pagrindiniai veiksniai yra lytis ir koncentracijos vertė. Duomenis galima analizuoti naudojant daug standartinių statistinės programinės įrangos rinkinių, pvz., SPSS, SAS, STATA, Genstat taip pat naudojant programavimo kalbą R.

Atliekant analizę, duomenų rinkinio kintamumas perdalijamas į kintamumą tarp lyčių, tarp koncentracijos verčių ir į kintamumą, susijusį su sąveika tarp lyčių ir koncentracijos verčių. Kiekvienas iš narių tikrinamas tos pačios lyties kartotinių gyvūnų kintamumo grupių viduje įverčio atžvilgiu, esant vienodai koncentracijai. Išsami informacija apie bazinę metodiką pateikta daugelyje standartinių statistinių vadovėlių (žr. nuorodas) ir su statistiniais rinkiniais pateikiamose pagalbinėse priemonėse.

Analizė tęsiama tikrinant ANOVA lentelės x lyties ir koncentracijos sąveikos narį (5). Nesant reikšmingo sąveikos nario, lytims ar koncentracijos vertėms gautos jungtinės vertės duoda patikimus statistinius kriterijus tarp koncentracijos verčių, pagrįstus grupės jungtiniu ANOVA kintamumo nariu.

Atliekant analizę toliau, kintamumo tarp koncentracijos verčių įvertis dalijamas į kontrastus, taip gaunamas atsakų pagal koncentracijos vertes tiesinių ir kvadratinių kontrastų kriterijus. Kai yra reikšminga x lyties ir koncentracijos sąveika, šį narį taip pat galima padalyti į tiesinius x lyties ir kvadratinius x lyties sąveikos kontrastus. Šie nariai pateikia kriterijus, ar abiejų lyčių atsakas į koncentraciją yra lygiagretus, ar abiejų lyčių atsakas yra skirtuminis.

Grupės jungtinio kintamumo įvertis gali būti naudojamas skirtumų tarp vidurkių poriniams kriterijams gauti. Galima lyginti abiejų lyčių vidurkius ir skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius, pvz., palyginimui su neigiamų kontrolinių ėminių vidurkiais. Jei sąveika yra reikšminga, galima lyginti vienos lyties skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius ir vienos koncentracijos lytims gautus vidurkius.

Nuorodos

Yra daug statistikos vadovėlių, kuriuose aptariama faktorinės analizės schemų, nuo paprasčiausios dvifaktorinės analizės iki bandymų planavimo metodikoje naudojamų sudėtingesnių formų, teorija, projektavimas, metodika, analizė ir aiškinimas. Toliau pateikiamas sąrašas nėra išsamus. Kai kuriose knygose pateikiami palyginamųjų schemų pavyzdžiai su skaičiavimais, kartais su kompiuterine programa analizei atlikti naudojant įvairius programinės įrangos rinkinius.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

5)

B dalies B.12 skyrius pakeičiamas taip:

„B.12   Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 474 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

Žinduolių mikrobranduolių bandymas in vivo ypač tinka genotoksiškumui vertinti, nes, nors skirtingų gyvūnų rūšių mikrobranduoliai gali skirtis, metabolizmo in vivo veiksniai, farmakokinetika ir DNR atkūrimo procesai yra aktyvūs ir prisideda prie atsakų. Tyrimas in vivo taip pat yra naudingas toliau tiriant genotoksiškumą, aptiktą in vitro sistema.

Žinduolių mikrobranduolių bandymas in vivo yra naudojamas aptikti pažaidoms, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia chromosomoms ar eritroblastų mitoziniam aparatui. Atliekant bandymą įvertinamas mikrobranduolių susidarymas eritrocituose, imant gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų arba periferinio kraujo ląstelių ėminius.

Mikrobranduolių bandymo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, turintys atsilikusių chromosomų fragmentų ar ištisas chromosomas.

Kai kaulų čiulpų eritroblastas virsta nesubrendusiu eritrocitu (kartais vadinamu polichrominiu eritrocitu ar retikulocitu), pagrindinis branduolys yra išstumiamas; susiformavęs mikrobranduolys gali likti citoplazmoje. Matyti ar aptikti mikrobranduolius šiose ląstelėse nėra sunku, nes jos neturi pagrindinio branduolio. Nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimas apdorotuose gyvūnuose rodo sukeltas struktūrines arba kiekybines chromosomų aberacijas.

Naujai susidarę eritrocitai su mikrobranduoliais nustatomi ir kiekybiškai įvertinami juos dažant ir vizualiai skaičiuojant pro mikroskopą arba atliekant automatizuotą analizę. Nepakankamai subrendusių eritrocitų suaugusių gyvūnų periferiniame kraujyje ar kaulų čiulpuose suskaičiavimą labai palengvina automatizuota kompiuterinė skaičiavimo sistema. Tokios sistemos yra priimtinos vertinimo rankiniu būdu alternatyvos (2). Palyginamieji tyrimai parodė, kad, naudojant atitinkamus kalibravimo etalonus, tokiais metodais galima gauti geresnį laboratorinį ir tarplaboratorinį atkuriamumą ir jautrį, palyginti su skaičiavimu rankiniu būdu (3) (4). Automatizuotos sistemos, kurios gali matuoti eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą, yra tėkmės citometrai (5), vaizdo analizės sistemos (6) (7) ir lazeriniai skenuojantys citometrai (8), tačiau gali būti ir kitų sistemų.

Nors paprastai tai neatliekama kaip bandymo dalis, chromosomų fragmentus galima atskirti nuo ištisų chromosomų pagal kelis kriterijus. Tai yra kinetochorų ar centromerinių DNR buvimo ar nebuvimo nustatymas, nes abu dalykai yra nepažeistų chromosomų charakteristika. Kai kinetochorų ar centromerinių DNR nėra, tai rodo, kad mikrobranduoliai turi tik chromosomų fragmentus, o kai jų yra – chromosomų praradimą.

Taikomų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI

Jaunų suaugusių graužikų kaulų čiulpai yra šio bandymo genetinių pažeidimų tikslinis audinys, nes eritrocitai gaminami šiame audinyje. Galima vertinti kitų rūšių žinduolių mikrobranduolius periferinio kraujo nesubrendusiuose eritrocituose, jei įrodyta (mikrobranduolių indukcijos nesubrendusiuose eritrocituose būdu), kad jie pakankamai jautrūs, kad būtų galima išsiaiškinti, ar cheminės medžiagos sukelia struktūrines chromosomų ar jų skaičiaus aberacijas tose ląstelėse, ir jei pateiktas mokslinis pagrindimas. Nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumas yra pagrindinė vertinamoji baigtis. Rūšims be stiprios ląstelių su mikrobranduoliais atrankos blužnyje ir gyvūnus nuolat apdorojant laikotarpiu, kurio trukmė yra didesnė nei naudojamos gyvūnų rūšies eritrocitų gyvavimo trukmė (pvz., pelių – 4 savaitės arba ilgiau) kaip vertinamoji baigtis taip pat gali būti naudojamas periferinio kraujo subrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, dažnumas.

Jei yra duomenų, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) ar jos arba jų metabolitas (-ai) nepasieks tikslinio audinio, šis metodas gali būti netinkamas.

Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti duomenys numatomo reglamentavimo tikslu, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMŲ METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga reikiamu būdu. Jei naudojami kaulų čiulpai, gyvūnai humaniškai numarinami reikiamu (-ais) momentu (-ais) po apdorojimo, kaulų čiulpai išimami ir ruošiami bei dažomi jų preparatai (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Kai naudojamas periferinis kraujas, jis imamas reikiamu (-ais) momentu (-ais) po apdorojimo ir ruošiami bei dažomi jo preparatai (12) (16) (17) (18). Jei apdorojama ūmiu būdu, svarbu pasirinkti tokį kaulų čiulpų ar kraujo surinkimo laiką, kuriuo būtų galima aptikti su apdorojimu susijusią nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais indukciją. Imant periferinio kraujo ėminius taip pat turi praeiti pakankamai laiko, kad šie reiškiniai pasireikštų cirkuliuojančiame kraujyje. Preparatai analizuojami mikrobranduolių buvimui nustatyti vizualiai pro mikroskopą, naudojant vaizdo analizę, tėkmės citometriją ar lazerinę skenuojančią citometriją.

LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS

Kvalifikacijos tyrimai

Siekdama įgyti pakankamos tyrimo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams bandymams, laboratorija turėtų įrodyti gebėjimą atkurti paskelbtų duomenų (17) (19) (20) (21) (22) tikėtinus mikrobranduolių dažnumo rezultatus, naudodama ne mažiau kaip dvi teigiamas kontrolines chemines medžiagas (įskaitant mažos dozės teigiamų kontrolinių ėminių sukeltus silpnus atsakus), pvz., išvardytas 1 lentelėje, ir suderinamų tirpiklių ir (arba) nešiklių kontrolinius ėminius (žr. 26 pastraipą). Atliekant šiuos bandymus, reikėtų naudoti dozes, kurioms esant tiriamajame audinyje (kaulų čiulpuose ar periferiniame kraujyje) gaunami atkuriami ir su doze susiję padidėjimai, bei įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, pasitelkiant laboratorijoje taikomą vertinimo metodą. Šis reikalavimas netaikomas patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 14–18 pastraipose.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Atlikdama kvalifikacijos tyrimus, laboratorija turėtų nustatyti:

istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,

istorinių neigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą.

Pirmą kartą gaunant istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymo duomenis, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Istorinių kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas. Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė turėtų būti statistiškai patikima, kad būtų užtikrinta laboratorijos gebėjimas vertinti savo neigiamų kontrolinių ėminių duomenų pasiskirstymą. Literatūroje daroma prielaida, kad gali prireikti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (23)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (24).

Jei atliekant 13 skirsnyje aprašytus kvalifikacijos tyrimus laboratorijai nepakanka bandymų skaičiaus statistiškai patikimam neigiamų kontrolių ėminių skirstiniui gauti (žr. 15 pastraipą), priimtina skirstinį papildyti atliekant pirmuosius įprastinius bandymus. Taikant šį būdą, reikėtų laikytis literatūroje nurodytų rekomendacijų (24), o atliekant šiuos bandymus gauti neigiamų kontrolinių ėminių rezultatai turėtų būti suderinami su paskelbtais neigiamų kontrolinių ėminių duomenimis.

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų poveikį gaunamiems duomenims, kurie turi likti suderinami su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Tik esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė, jei atsižvelgiant į ekspertų nuomonę nustatoma, kad ji skiriasi nuo ankstesnio skirstinio (žr. 15 pastraipą). Atkūrimo metu atliekamam bandymui gali neprireikti visos neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės, jei laboratorija gali įrodyti, kad vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių vertės ir toliau yra suderinamos su ankstesne duomenų baze arba su atitinkamais paskelbtais duomenimis.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti kiekvieno gyvūno nesubrendusių, mažųjų branduolių turinčių eritrocitų dažnumas. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas. Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 15 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

METODO APRAŠYMAS

Parengiamieji darbai

Gyvūnų rūšies parinkimas

Reikėtų tirti dažniausiai naudojamas sveikų jaunų suaugusių gyvūnų laboratorines veisles. Galima naudoti peles, žiurkes ar kitas tinkamas žinduolių rūšis. Kai naudojamas periferinis kraujas, turi būti nustatyta, ar indukuotų mikrobranduolių aptikimas netrikdomas, pasirinktos rūšies gyvūno blužniai iš apytakos šalinant ląsteles su mikrobranduoliais. Tai buvo aiškiai įrodyta pelių ir žiurkių periferiniam kraujui (2). Kitų nei žiurkės ar pelės rūšių naudojimas turėtų būti moksliškai pagrįstas ataskaitoje. Jei naudojamos kitos nei graužikai rūšys, rekomenduojama indukuotų mikrobranduolių matavimą įtraukti į kitą tinkamą toksiškumo bandymą.

Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos

Temperatūra graužikų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 40 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Jei nesitikima agresyvaus elgesio, graužikus reikėtų laikyti nedidelėmis vienos lyties vienodai apdorotomis grupėmis (ne daugiau kaip po penkis viename narvelyje), pageidautina narveliuose su kietomis grindimis ir esant atitinkamai pagerintai aplinkai. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai.

Gyvūnų paruošimas

Paprastai naudojami sveiki jauni suaugę gyvūnai (geriausias graužikų amžius apdorojimo pradžioje yra 6–10 savaičių, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus), kurie atsitiktinai paskirstomi į kontrolines ir apdorotas grupes. Atskiri gyvūnai unikaliai paženklinami humanišku minimaliai invaziniu būdu (pvz., žieduojant, kabinant etiketę, naudojant mikrolustą ar biometrinį identifikavimą, bet ne ausų ar pėdų spaustukus) ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Reikėtų vengti teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos kryžminės taršos. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti kuo mažesnis ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno masės.

Dozių ruošimas

Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas, prieš dozuojant gyvūnams, reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybės. Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir šiuo atveju apibrėžiamos tinkamos laikymo sąlygos.

Bandymo sąlygos

Tirpiklis ir (arba) nešiklis

Neturėtų būti tirpiklio ar nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamiems dozių dydžiams, ir negalėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti, pateikus suderinamumą rodančius nuorodų duomenis. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Dažniausiai naudojamų suderinamų tirpiklių ar nešiklių pavyzdžiai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, metilceliuliozės tirpalas, karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalas, alyvuogių ir kukurūzų aliejus. Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas netipinis tirpiklis ar nešiklis nesukelia mikrobranduolių atsiradimo ir kitokio žalingo poveikio, reikėtų atlikti pradinį tyrimą tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.

Kontroliniai ėminiai

Teigiami kontroliniai ėminiai

Paprastai į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti grupę gyvūnų, apdorotų teigiama kontroline chemine medžiaga. To galima atsisakyti, jei bandymų laboratorija įrodė turinti kvalifikaciją atlikti bandymą ir nustatė istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą. Jei vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupė neįtraukiama, į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti vertinimo kontrolinius ėminius (fiksuotus ir nedažytus objektinius stiklelius arba ląstelių suspensijos ėminius, atsižvelgiant į vertinimo metodą). Juos galima gauti į tyrimo vertinimą įtraukiant atitinkamus etaloninius ėminius, kurie būtų gauti periodiškai (pvz., kas 6–18 mėnesių) atliekant atskirą teigiamo kontrolinio ėminio bandymą, pvz., kvalifikacijos tyrimo metu ir reguliariai vėliau, jei būtina, ir tuos ėminius laikyti.

Teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos turėtų patikimai sukelti aiškų mikrobranduolių dažnumo padidėjimą palyginti su savaiminiu lygiu. Kai skaičiuojama rankiniu būdu žiūrint pro mikroskopą, reikėtų pasirinkti tokias teigiamų kontrolinių ėminių dozes, kad poveikis būtų ryškus, bet skaičiuotojui ne iškarto atsiskleistų užkoduotų ėminių tapatybė. Teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą galima duoti kitu nei bandomoji cheminė medžiaga būdu, taikant skirtingą apdorojimo planą ir ėminius imant tik vienu laiko momentu. Be to, jei tinka, galima atsižvelgti į tos pačios cheminės klasės teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų naudojimą. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė.

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai

Cheminės medžiagos ir CAS Nr.

Etilmetansulfonatas [CAS Nr. 62-50-0]

Metilmetansulfonatas [CAS Nr. 66-27-3]

Etilnitrozokarbamidas [CAS Nr. 759-73-9]

Mitomicinas C [CAS Nr. 50-07-7]

Ciklofosfamidas (monohidratas) [CAS Nr. 50-18-0 (CAS Nr. 6055-19-2)]

Trietilenmelaminas [CAS Nr. 51-18-3]

Kolchicinas [CAS Nr. 64-86-8] ar vinblastinas [CAS Nr. 865-21-4] – kaip aneugenai

Neigiami kontroliniai ėminiai

Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus reikėtų įtraukti kiekvieną kartą imant ėminį ir su jais elgtis kaip su apdorota grupe, išskyrus tai, kad gyvūnai nepaveikiami bandomąja chemine medžiaga. Jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas tirpiklis ar nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti šio tirpiklio ar nešiklio. Tačiau jei kiekvienam ėminių ėmimo laikui bandymų laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys rodo pastovų kintamumą tarp gyvūnų ir ląstelių su mikrobranduoliais dažnumą, gali pakakti paimti tik vieną neigiamą kontrolinį ėminį. Jei imamas tik vienas neigiamas kontrolinis ėminys, jis turėtų būti imamas pirmą kartą imant atliekamo tyrimo ėminį.

Jei naudojamas periferinis kraujas, vietoj vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio atliekant trumpalaikius tyrimus galima naudoti parengtinio apdorojimo ėminį, kai gauti duomenys yra suderinami su bandymų laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų baze. Naudojant žiurkes buvo įrodyta, kad mažo tūrio parengtinio ėminio ėmimas (pvz., mažesnio kaip 100 μl/parai) turi minimalų poveikį mikrobranduolių foniniam dažnumui (25).

PROCEDŪRA

Gyvūnų skaičius ir lytis

Apskritai, vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų mikrobranduolių atsakas yra panašus, todėl daugumą tyrimų būtų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais (26). Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo, toksiškumo kaulų čiulpams ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.

Reikėtų nustatyti grupių dydį tyrimo pradžioje, turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant kaulų čiulpų tyrimą pagal 37 pastraipoje nustatytus parametrus, kai yra trys dozių grupės ir vienalaikio neigiamo ir teigiamo kontrolinių ėminių grupės (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų nuo 25 iki 35 gyvūnų.

Dozės dydžiai

Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą (27). Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip didžiausia dozė, kuri būtų toleruojama nesant tyrimą ribojančio toksiškumo požymių, susijusių su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., sukeliant kūno masės sumažėjimą arba hematopoetinės sistemos citotoksiškumą, bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių reikėtų humaniškai numarinti (28)).

Didžiausią dozę taip pat būtų galima apibrėžti kaip dozę, kuri sukeltų toksiškumą kaulų čiulpams (pvz., kaulų čiulpų arba periferinio kraujo nesubrendusių eritrocitų dalies sumažėjimas suminio eritrocitų skaičiaus atžvilgiu daugiau kaip 50 %, bet iki ne mažiau kaip 20 % kontrolinės vertės). Tačiau analizuojant periferinės kraujotakos CD71 teigiamas ląsteles (t. y. tėkmės citometrijos metodu), ši labai jauna nesubrendusių eritrocitų frakcija gali reaguoti į toksinius veiksnius labiau nei didesnė RNR teigiama nesubrendusių eritrocitų grupė. Todėl didesnis akivaizdus toksiškumas gali būti matomas naudojant ūmaus paveikimo schemas, kai tiriama CD71 teigiamų nesubrendusių eritrocitų frakcija, palyginti su schemomis, pagal kurias nustatomi nesubrendę eritrocitai pagal RNR kiekį. Todėl, kai bandant apdorojama penkias paras arba mažiau, didžiausia toksiškumą sukeliančių cheminių medžiagų dozė gali būti apibrėžta kaip dozė, kuri sukelia statistiškai reikšmingą CD71 teigiamų nesubrendusių eritrocitų sumažėjimą suminio eritrocitų skaičiaus atžvilgiu, bet ne mažesnį kaip 5 % kontrolinės vertės (29).

Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio davimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti veikimą, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.

Siekiant gauti informacijos apie dozės ir atsako priklausomybę, į išsamų tyrimą reikėtų įtraukti neigiamo kontrolinio ėminio grupę ir ne mažiau kaip tris dozes, kurių dydžio skirtumo faktorius būtų 2, bet ne didesnis kaip 4. Jei cheminė medžiaga nėra toksiška atliekant intervalo nustatymo tyrimą arba atsižvelgiant į turimus duomenis, 14 parų ar ilgesnio laikotarpio didžiausia davimo dozė turėtų būti 1 000 mg/kg kūno masės per parą arba 2 000 mg/kg kūno masės per parą, jei laikotarpis trumpesnis kaip 14 parų. Tačiau, jei bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, didžiausia duodama dozė turėtų būti MTD, o naudojami dozių dydžiai turėtų aprėpti intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui (kaulų čiulpams) stebimas naudojant visus bandomus dozės dydžius, patartina toliau tirti netoksines dozes. Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau apibūdinti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją, gali prireikti papildomų dozių grupių. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reikalavimai, šios ribos gali skirtis.

Ribinis bandymas

Jei dozės intervalo nustatymo bandymai arba esami susijusių gyvūnų veislių duomenys rodo, kad apdorojimo režimu bent ribinė dozė (aprašyta toliau) nesukelia jokio toksinio poveikio (įskaitant tai, kad nėra kaulų čiulpų proliferacijos slopinimo ar kitų citotoksiškumo tiksliniam audiniui požymių) ir, jei atsižvelgiant į in vitro genotoksiškumo tyrimus arba į giminingos struktūros cheminėms medžiagoms gautus duomenis, genotoksiškumo nereikėtų tikėtis, visas bandymas naudojant trijų dydžių dozes gali būti nebūtinas, jei būtų įrodyta, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pasiekia tikslinį audinį (kaulų čiulpus). Tokiais atvejais gali pakakti vienos ribinio dydžio dozės. Jei davimo laikotarpis – 14 parų arba ilgesnis, ribinė dozė yra 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis yra trumpesnis kaip 14 parų, ribinė dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą.

Dozių davimas

Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus poveikio būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveiko žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik, jei būtų specialiai moksliškai pagrįstas. Jei bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į pašarą ar į geriamąjį vandenį, ypač vienkartinio dozavimo atveju, reikėtų imtis priemonių, kad laiko tarpas nuo maisto bei vandens vartojimo iki ėminių ėmimo būtų pakankamas poveikiui aptikti (žr. 37 pastraipą). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti ne daugiau kaip po 2 ml/100 g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą reikėtų pagrįsti. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukeltų sunkinantį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kuo mažesnis reguliuojant koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų didžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.

Apdorojimo planas

Pageidautina apdoroti 2 kartus arba daugiau, duodant kas 24 h, ypač kai šis bandymas įtraukiamas į kitus toksiškumo tyrimus. Arba galima apdoroti duodant vieną kartą, jei tai būtų moksliškai pagrįsta (pvz., žinoma, kad bandomosios cheminės medžiagos stabdo ląstelių ciklą). Bandomąsias chemines medžiagas galima duoti kaip padalytą dozę (t. y. siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, per vieną dieną apdorojama du kartus arba daugiau, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui). Šiomis aplinkybėmis arba tais atvejais, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama ją įkvepiant, ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo arba veikimo pabaigos laiką.

Bandymą su pelėmis arba žiurkėmis galima atlikti vienu iš trijų būdų:

a.

Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga vieną kartą. Kaulų čiulpų ėminiai imami ne mažiau kaip du kartus (iš nepriklausomų gyvūnų grupių), pirmą kartą imant ne anksčiau kaip 24 h po apdorojimo, bet ne vėliau kaip 48 h po apdorojimo, esant atitinkamam (-iems) laiko tarpui (-ams) tarp ėminių, nebent būtų žinoma, kad bandomosios cheminės medžiagos pusėjimo trukmė yra labai didelė. Jei ėminiai imami anksčiau nei praėjus 24 h po apdorojimo, tai reikėtų pagrįsti. Periferinio kraujo ėminiai imami ne mažiau kaip du kartus (iš tos pačios gyvūnų grupės), pirmą kartą imant ne anksčiau kaip 36 h po apdorojimo, bet ne vėliau kaip 72 h po apdorojimo, esant atitinkamam (-iems) laiko tarpui (-ams) po pirmojo ėminio paėmimo. Imant ėminį pirmą kartą visos dozių grupės turėtų būti apdorotos ir ėminiai paimti analizei, tačiau, imant ėminį kitą (-us) kartą (-us), reikia duoti tik didžiausią dozę. Kai kurį nors kartą imant ėminį aptinkamas teigiamas atsakas, papildomų ėminių imti nereikia, nebent reikia gauti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją. Aprašyti ėminių surinkimo laikai yra mikrobranduolių atsiradimo ir išnykimo šiuose 2 audinių dalyse kinetikos rezultatas.

b.

Jei apdorojama du kartus kas parą (pvz., apdorojama du kartus kas 24 h), kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti surenkami vieną kartą, nuo galutinio apdorojimo praėjus nuo 18 iki 24 h, periferinio kraujo ėminiai surenkami vieną kartą, nuo galutinio apdorojimo praėjus nuo 36 iki 48 h (30). Aprašyti ėminių surinkimo laikai yra mikrobranduolių atsiradimo ir išnykimo šiuose 2 audinių dalyse kinetikos rezultatas.

c.

Jei kas parą apdorojama tris ir daugiau kartų (pvz., apdorojama tris kartus arba daugiau maždaug kas 24 h), kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti surenkami nuo paskutinio apdorojimo praėjus ne daugiau kaip 24 h, periferinio kraujo ėminiai turėtų būti surenkami nuo paskutinio apdorojimo praėjus ne daugiau kaip 40 h (31). Ši apdorojimo pasirinktis leidžia suderinti kometų bandymą (pvz., imant ėminius 2–6 h po paskutinio apdorojimo) su mikrobranduolių bandymu ir sujungti mikrobranduolių bandymą su kartotinės dozės toksiškumo tyrimais. Sukaupti duomenys parodė, kad mikrobranduolių indukciją galima stebėti šiuo ilgesniu laikotarpiu, kai dozė duodama 3 ir daugiau kartų (15).

Galima naudoti kitas dozavimo ar ėminių ėmimo schemas, siekiant palengvinti sujungimą su kitais toksiškumo bandymais, jei jos būtų tinkamos ir moksliškai pagrįstos.

Stebėjimai

Reikėtų atlikti bendruosius bandymo gyvūnų klinikinius stebėjimus ir bent kartą per dieną registruoti klinikinius požymius, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Mažiausiai du kartus per dieną, siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius, dozavimo laikotarpiu visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti. Visi gyvūnai turėtų būti sveriami tyrimo pradžioje, bent kartą per savaitę kartotinės dozės tyrimų metu ir numarinant. Jei tyrimai atliekami ne trumpiau kaip vieną savaitę, bent kartą per savaitę reikėtų matuoti pašaro suvartojimą. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti iki bandymo laikotarpio pabaigos (28). Tam tikromis aplinkybėmis būtų galima kontroliuoti gyvūnų kūno temperatūrą, nes apdorojimo sukelta hipertermija ir hipotermija prisidėjo gaunant klaidingus rezultatus (32) (33) (34).

Tikslinio audinio veikimas

Reikiamu laiku vieną ar kelis kartus reikėtų paimti kraujo ėminį bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijai plazmoje nustatyti, siekiant įsitikinti, ar kaulų čiulpai buvo paveikti, jei reikalaujama ir jei nėra kitų poveikio duomenų (žr. 48 pastraipą).

Kaulų čiulpų ar kraujo paruošimas

Kaulų čiulpų ląstelės gaunamos iš gyvūnų šlaunikaulių ar blauzdikaulių iš karto po humaniško numarinimo. Paprastai ląstelės yra išskiriamos, paruošiamos ir dažomos nustatytais būdais. Maži periferinio kraujo tūriai gali būti gauti pagal atitinkamus gyvūnų gerovės reikalavimus, taikant metodą, kuris užtikrintų bandymų gyvūno išgyvenamumą, pvz., imant kraują iš uodeginės venos ar kito tinkamo kraujo indo, atliekant širdies punkciją ar imant ėminį iš didelio kraujo indo gyvūną numarinus. Atsižvelgiant į analizės metodą, kaulų čiulpų ar iš periferinio kraujo gautų eritrocitų ląstelės gali būti nedelsiant supravitaliai dažomos (16) (17) (18), daromi tepinėliai ir tada dažomi mikroskopijai arba fiksuojami ir tinkamai dažomi tėkmės citometrinei analizei atlikti. Naudojant DNR specifinius dažus, pvz., akridino oranžinį (35) ar Hoechst 33258 ir pironiną Y (36), galima pašalinti kai kuriuos artefaktus, susijusius su DNR atžvilgiu nespecifinių dažų naudojimu. Šis privalumas netrukdo naudoti įprastinių dažų (pvz., Giemsa dažus mikroskopinei analizei atlikti). Taip pat galima naudoti papildomas sistemas (pvz., celiulioze užpildytas kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti (37) (38)), jei būtų įrodyta, kad šios sistemos yra suderinamos su ėminių paruošimu laboratorijoje.

Jei taikomi šie metodai, mikrobranduolių tipui identifikuoti (chromosomų ar chromosomų fragmentų), kad būtų galima nustatyti, ar mikrobranduolių indukcijos mechanizmas susijęs su klastogeniniu ir (arba) aneugeniniu aktyvumu, gali būti naudojami antikinetochoro antikūnai (39), FISH analizė ir pancentromeriniai DNR zondai (40) arba in situ ženklinimas pancentromerų specifiniais užpildais kartu su atitinkamu DNR priešpriešiniu dažymu (41). Gali būti taikomi kiti metodai klastogenams ir aneugenams atskirti, jei jie pasirodytų efektyvūs.

Analizė (rankiniu būdu ir automatizuota)

Prieš atliekant bet kurio tipo analizę visi objektiniai stikleliai ar ėminiai, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius ėminius, turėtų būti nepriklausomai užkoduoti ir randomizuoti, kad skaičiuotojas rankiniu būdu nežinotų apdorojimo sąlygų; toks kodavimas nebūtinas, kai naudojamos automatizuotos skaičiavimo sistemos, kurios nepriklauso nuo vizualios apžiūros ir negali būti paveiktos veiklos vykdytojo šališkumo. Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų kiekis kaip visų eritrocitų (subrendusių ir nesubrendusių) skaičiaus dalis, suskaičiuojant ne mažiau kaip 500 kaulų čiulpų eritrocitų ir 2 000 periferinio kraujo eritrocitų (42). Reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 4 000 nesubrendusių eritrocitų vienam gyvūnui, kad būtų galima nustatyti nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą (43). Jei istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė rodo, kad bandymo laboratorijos vidutinis foninis nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumas yra < 0,1 %, reikėtų atsižvelgti į galimybę skaičiuoti papildomas ląsteles. Analizuojant ėminius, apdorotų gyvūnų nesubrendusių eritrocitų dalis visų eritrocitų atžvilgiu neturėtų būti mažesnė kaip 20 % nešiklio ar tirpiklio kontrolinių ėminių dalies, kai skaičiuojama mikroskopu, ir ne mažesnė kaip maždaug 5 % nešiklio ar tirpiklio kontrolinių ėminių dalies, kai CD71+ nesubrendę eritrocitai skaičiuojami citometriniais metodais (žr. 31 pastraipą) (29). Pvz., jei atliekant kaulų čiulpų tyrimą mikroskopu, kontrolinio ėminio kaulų čiulpų nesubrendusių eritrocitų dalis yra 50 %, viršutinė toksiškumo riba būtų 10 % nesubrendusių eritrocitų.

Kadangi žiurkių blužnis atskiria ir suardo eritrocitus su mikrobranduoliais, siekiant užtikrinti didelį tyrimo jautrį, kai analizuojamas žiurkių periferinis kraujas, atliekant nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais analizę pageidautina apsiriboti jauniausia frakcija. Kai taikomi automatizuotos analizės metodai, šiuos labiausiai nesubrendusius eritrocitus galima nustatyti pagal jų didelį RNR kiekį arba jų paviršiuje ekspresuotų transferino receptorių (CD71+) didelį lygį (31). Tačiau tiesioginis daugelio dažymo būdų palyginimas parodė, kad priimtinus rezultatus galima gauti taikant įvairius būdus, įskaitant įprastinį dažymą akridino oranžiniu (3) (4).

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų apdorojimas

Kiekvienam gyvūnui gauti rezultatai turėtų būti pateikiami lentelėse. Turėtų būti atskirai įrašytas kiekvieno tirto gyvūno suskaičiuotų nesubrendusių eritrocitų skaičius, nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičius bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis. Kai pelės apdorojamos nuolat 4 savaites ar ilgiau, taip pat reikėtų pateikti subrendusių eritrocitų skaičiaus ir subrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dalies duomenis, jei renkami. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo gyvūnams ir klinikinių požymių duomenis.

Priimtinumo kriterijai

Apie bandymo priimtinumą sprendžiama pagal šiuos kriterijus:

a.

vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių kontrolinių duomenų bazę (žr. 15-18 pastraipas);

b.

vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai arba skaičiavimo kontroliniai ėminiai turėtų sukelti atsakus, kurie būtų suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 24–25 pastraipas);

c.

atlikta reikiamo dozių ir ląstelių skaičiaus analizė;

d.

didžiausios dozės pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 30–33 pastraipose.

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:

a.

bent viena iš apdorotų grupių rodo statistiškai reikšmingą nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;

b.

šis padidėjimas bent vienam ėminio ėmimo laikui yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų, ir

c.

kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų).

Jei tam tikru ėminio ėmimo laiku tiriama tik didžiausia dozė, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei yra statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, o rezultatai yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų). Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (44) (45) (46) (47). Atliekant dozės ir atsako priklausomybės analizę, reikėtų analizuoti ne mažiau kaip tris dozę gavusias grupes. Statistiniai kriterijai turėtų naudoti gyvūną kaip bandymo vienetą. Atliekant mikrobranduolių bandymą gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukelia mažųjų branduolių atsiradimą dėl bandymo rūšies gyvūnų chromosomų ar eritroblastų mitozinio aparato pažeidimų. Jei bandymas atliekamas centromeroms mikrobranduoliuose aptikti, bandomoji cheminė medžiaga, kuri gamina centromeras turinčius mikrobranduolius (centromeros DNR ar kinetochoras, kurie rodo ištisos chromosomos praradimą), akivaizdžiai yra aneugenas.

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis:

a.

nei viena apdorota grupė nerodo statistiškai reikšmingo nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimo palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;

b.

nėra su doze susijusio padidėjimo bet kuriuo ėminių ėmimo laiku, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,

c.

visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų) ir

d.

kaulų čiulpai paveikti bandomąja (-osioms) chemine (-ėms) medžiaga (-oms).

Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (44) (45) (46) (47). Kaulų čiulpų paveikimo bandomąja chemine medžiaga įrodymu gali būti nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykio sumažėjimas arba bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių plazmoje ar kraujyje matavimas. Jei cheminė medžiaga leidžiama į veną, poveikio įrodyti nebūtina. Siekiant įrodyti, kad kaulų čiulpai buvo paveikti, taip pat galima naudoti ADME (absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, šalinimo) duomenis, gautus atliekant nepriklausomą tyrimą, kuriame būtų naudojamas tas pats davimo būdas ir ta pati rūšis. Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga nesukelia mažųjų branduolių atsiradimo bandymo rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritrocituose.

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.

Tais atvejais, kai atsakas nėra aiškiai neigiamas ar teigiamas, ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą (pvz., mažas ar fono padidėjimas), duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus baigtų bandymų tyrimus. Kai kuriais atvejais galėtų būti naudinga analizuoti didesnį ląstelių skaičių arba pakartoti bandymą, naudojant modifikuotas bandymo sąlygas.

Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, duomenų nepakaks padaryti išvadą, ar bandomajai cheminei medžiagai gauti rezultatai yra teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad tyrimas yra dviprasmis.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

 

Santrauka

 

Bandomoji cheminė medžiaga:

kilmė, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;

bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas.

 

Vienkomponentė medžiaga:

fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;

cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.

 

Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:

kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.

 

Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas

nešiklio pasirinkimo pagrindimas;

bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ar nešiklyje ir stabilumas, jei yra žinomas;

preparatų su pašarais, geriamuoju vandeniu arba inhaliacinių preparatų ruošimas;

preparatų analizinis nustatymas (pvz., stabilumo, vienalytiškumo, nominalių koncentracijos verčių), kai atliekamas.

 

Bandymo gyvūnai:

rūšis ir (arba) veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

kilmė, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.,

gyvūnų unikalaus identifikavimo būdas;

kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje, atliekant trumpalaikius tyrimus; kiekvieno gyvūno masė bandymo eigoje ir pašaro suvartojimas, atliekant ilgesnius nei savaitės trukmės bandymus. Reikėtų įtraukti kiekvienos grupės kūno masės intervalą, vidurkį ir standartinį nuokrypį.

 

Bandymo sąlygos:

teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių (tirpiklio ir (arba) nešiklio) duomenys;

intervalo nustatymo tyrimo, jei atliekamas, duomenys;

dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas;

išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą;

išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą,

davimo būdo ir trukmės pagrindimas;

tikrinimo, ar bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pateko į kraujotakos sistemą ar tikslinį audinį, metodai;

faktinė dozė (mg/kg kūno masės per parą), apskaičiuota pagal bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją pašaruose ir (arba) geriamajame vandenyje (ppm) ir suvartojimą, jei tinka;

išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.

numarinimo metodas;

nuskausminimo metodas (jei taikomas);

išsamus apdorojimo ir ėminių ėmimo tvarkaraščio aprašymas, pasirinkimo pagrindimas;

objektinių stiklelių paruošimo metodai;

ėminių izoliavimo ir konservavimo procedūros;

toksiškumo matavimo metodai,

nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičiavimo kriterijai,

analizuotų ląstelių skaičius vienam gyvūnui, nustatant nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykį;

tyrimo priimtinumo kriterijai;

metodai, pvz., antikinetochoro antikūnų ar centromerų specifinių DNR zondų naudojimas, kurie apibūdintų, ar mikrobranduolys turi ištisą chromosomą ar jos fragmentą, jei taikomi.

 

Rezultatai:

gyvūnų būklė prieš bandymą ir visą bandymo laikotarpį, įskaitant toksiškumo požymius;

nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis,

kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičius,

nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais grupės vidurkis ± standartinis nuokrypis;

dozės ir atsako priklausomybė, jei įmanoma nustatyti;

statistinės analizės duomenys ir taikyti metodai.

vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys, nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;

istorinių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai, standartiniai nuokrypiai ir skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat aprėptas laikotarpis ir duomenų taškų skaičius;

kaulų čiulpų poveikio patvirtinimo duomenys;

apibūdinimo duomenys, kurie rodo, ar mikrobranduolys turi ištisą chromosomą ar jos fragmentą, jei tinka;

atitikti teigiamo ar neigiamo atsako kriterijai.

 

Rezultatų aptarimas.

 

Išvada.

 

Nuorodos.

LITERATŪRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.

(3)

MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.

(4)

Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.

(5)

Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.

(6)

Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.

(7)

Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.

(8)

Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.

(9)

Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.

(10)

Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.

(11)

Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.

(12)

Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.

(13)

MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.

(14)

MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.

(15)

MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.

(16)

Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.

(17)

CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.

(18)

CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.

(19)

Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.

(20)

Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.

(21)

Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.

(22)

Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.

(23)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(24)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(25)

Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.

(26)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.

(27)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.

(28)

OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.

(29)

LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.

(30)

Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/– 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.

(31)

Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.

(32)

Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.

(33)

Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.

(34)

Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.

(35)

Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.

(36)

MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.

(37)

Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.

(38)

Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.

(39)

Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.

(40)

Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.

(41)

Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.

(42)

Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.

(43)

OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(44)

Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.

(45)

Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

(46)

Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.

(47)

Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.

1 priedėlis

APIBRĖŽTYS

Centromera – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

Eritroblastas – ankstyvoji eritrocitų vystymosi stadija, prieš pat nesubrendusių eritrocitų stadiją, kai ląstelė dar turi branduolį.

Kinetochoras – ant eukariotinių lastelių centromeros susidaranti baltyminė struktūra, kuri mitozės ir mejozės metu sujungia chromosomą su mitozinės verpstės mikrovamzdelių polimerais ir dalijantis ląstelėms veikia kaip dukterinių chromatidžių atstūmimo vieną nuo kitos priemonė.

Mikrobranduoliai – nuo ląstelių pagrindinių branduolių atskirti papildomi maži branduoliai, susidarę mitozės (mejozės) telofazėje, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos lėtai juda link ląstelės polių.

Normochrominis ar subrendęs eritrocitas – visiškai subrendęs eritrocitas, pametęs po enukleacijos likusias RNR ir (arba) kitus trumpalaikius ląstelių žymeklius, kurie jiems būdingu būdu išnyksta po enukleacijos, vykstančios po galutinio eritroblasto dalijimosi.

Polichrominis ar nesubrendęs eritrocitas – naujai susidaręs tarpinėje vystymosi stadijoje esantis eritrocitas, kuris nusidažo klasikinių kraujo dažų, pvz., Wright Giemsa, mėlynuoju ir raudonuoju komponentais dėl liekamųjų RNR buvimo naujai susidariusioje ląstelėje. Tokios naujai susidariusios ląstelės yra maždaug tas pats kaip retikulocitai, kurios vizualizuojamos naudojant vitalinį dažą, sukeliantį liekamųjų ląstelių RNR sulipimą į būdingą tinklą. Šiuo metu dažnai taikomi kiti naujai susidariusių raudonųjų kraujo ląstelių identifikavimo metodai, įskaitant RNR monochrominį dažymą fluorescenciniais dažais arba trumpalaikių paviršinių žymeklių, pvz., CD71, ženklinimą fluorescuojančiais antikūnais. Polichrominiai eritrocitai, retikulocitai ir CD71 teigiami eritrocitai yra nesubrendę eritrocitai, nors kiekvienas iš jų kažkiek skiriasi amžiaus pasiskirstymu.

Retikulocitas – naujai susidaręs eritrocitas, dažytas vitaliniu dažu, kuris sukelia liekamųjų ląstelių RNR sulipimą į būdingą tinklą. Retikulocitų ir polichrominių eritrocitų ląstelių amžiaus pasiskirstymas yra panašus.

Bandomoji cheminė medžiaga – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

2 priedėlis

FAKTORINĖS ANALIZĖS CHEMA LYČIŲ SKIRTUMAMS NUSTATYTI ATLIEKANT MIKROBRANDUOLIŲ TYRIMĄ IN VIVO

Faktorinės analizės schema ir jos taikymas

Pagal šią schemą kiekvienai koncentracijos vertei bandomi ne mažiau kaip 5 patinai ir 5 patelės, iš viso pagal schemą naudojant ne mažiau kaip 40 gyvūnų (20 patinų ir 20 patelių ir dar atitinkami teigiami kontroliniai ėminiai).

Schema, kuri yra viena iš paprastesnių faktorinės analizės schemų, atitinka dvifaktorinės dispersinės analizės schemą, kurios pagrindiniai veiksniai yra lytis ir koncentracijos vertė. Duomenis galima analizuoti naudojant daug standartinių statistinės programinės įrangos rinkinių, pvz., SPSS, SAS, STATA, Genstat taip pat naudojant programavimo kalbą R.

Atliekant analizę, duomenų rinkinio kintamumas perdalijamas į kintamumą tarp lyčių, tarp koncentracijos verčių ir į kintamumą, susijusį su sąveika tarp lyčių ir koncentracijos verčių. Kiekvienas iš narių tikrinamas tos pačios lyties kartotinių gyvūnų kintamumo grupių viduje įverčio atžvilgiu, esant vienodai koncentracijai. Išsami informacija apie bazinę metodiką pateikta daugelyje standartinių statistinių vadovėlių (žr. nuorodas) ir su statistiniai rinkiniais pateikiamose pagalbinėse priemonėse.

Analizė tęsiama tikrinant ANOVA lentelės x lyties ir koncentracijos sąveikos narį (6). Nesant reikšmingo sąveikos nario, lytims ar koncentracijos vertėms gautos jungtinės vertės duoda patikimus statistinius kriterijus tarp koncentracijos verčių, pagrįstus grupės jungtiniu ANOVA kintamumo nariu.

Atliekant analizę toliau, kintamumo tarp koncentracijos verčių įvertis dalijamas į kontrastus, taip gaunamas atsakų pagal koncentracijos vertes tiesinių ir kvadratinių kontrastų kriterijus. Kai yra reikšminga x lyties ir koncentracijos sąveika, šį narį taip pat galima padalyti į tiesinius x lyties ir kvadratinius x lyties sąveikos kontrastus. Šie nariai pateikia kriterijus, ar abiejų lyčių atsakas į koncentraciją yra lygiagretus, ar abiejų lyčių atsakas yra skirtuminis.

Grupės jungtinio kintamumo įvertis gali būti naudojamas skirtumų tarp vidurkių poriniams kriterijams gauti. Galima lyginti abiejų lyčių vidurkius ir skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius, pvz., palyginimui su neigiamų kontrolinių ėminių vidurkiais. Jei sąveika yra reikšminga, galima lyginti vienos lyties skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius ir vienos koncentracijos lytims gautus vidurkius.

Nuorodos

Yra daug statistikos vadovėlių, kuriuose aptariama faktorinės analizės schemų teorija, projektavimas, metodika, analizė ir aiškinimas, kurios varijuoja nuo paprasčiausios dvifaktorinės analizės iki „bandymų planavimo“ metodikoje naudojamų sudėtingesnių formų. Toliau pateikiamas sąrašas nėra išsamus. Kai kuriose knygose pateikiami palyginamųjų schemų pavyzdžiai su skaičiavimais, kartais su kompiuterine programa analizei atlikti naudojant įvairius programinės įrangos rinkinius.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

6)

B dalies B.15 skyrius išbraukiamas.

7)

B dalies B.16 skyrius išbraukiamas.

8)

B dalies B.18 skyrius išbraukiamas.

9)

B dalies B.19 skyrius išbraukiamas.

10)

B dalies B.20 skyrius išbraukiamas.

11)

B dalies B.24 skyrius išbraukiamas.

12)

B dalies B.47 skyrius pakeičiamas taip:

„B.47   Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą

ĮVADAS

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 437 (2013). Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo (angl. Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) bandymo metodą 2006 m. ir 2010 m. įvertino Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetas (angl. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) kartu su Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) ir Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) (1)(2). Atliekant pirmąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar BCOP bandymo metodas tinka nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (1). Atliekant antrąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar BCOP bandymų metodas tinka nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios neklasifikuojamos kaip dirginančios akis ar sukeliančios smarkų akių pažeidimą (2). BCOP tinkamumo patvirtinimo duomenų bazę iš viso sudarė 113 medžiagų ir 100 mišinių (2)(3). Atsižvelgiant į šiuos įvertinimus ir jų ekspertizę buvo padaryta išvada, kad taikant bandymų metodą galima tinkamai identifikuoti chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), sukeliančias smarkų akių pažeidimą (1 kategorijos), taip pat medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (4) ir Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (7), todėl jis buvo patvirtintas kaip moksliškai tinkamas abiem tikslams. Smarkus akių pažeidimas – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai praeina per 21 dieną nuo uždėjimo. Bandomosios cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą, pagal JT GHS klasifikuojamos kaip 1 kategorijos medžiagos. Cheminės medžiagos, neklasifikuojamos kaip dirginančios akis ar sukeliančios smarkų akių pažeidimą, apibrėžiamos kaip medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 ar 2 kategorijos (2A ar 2B) klasifikavimo reikalavimų, t. y. jos nurodomos kaip JT GHS be kategorijos. Į šį bandymų metodą įtrauktas BCOP bandymų metodo rekomenduojamas taikymas ir apribojimai, pagrįsti jo įvertinimo darbais. Pagrindiniai skirtumai tarp EBPO bandymų gairių originalios 2009 m. versijos ir atnaujintos 2013 m. versijos yra susiję su šiais dalykais (tačiau ne tik): BCOP metodo taikymas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti pagal JT GHS (2 ir 7 pastraipos); pateikti paaiškinimai dėl BCOP bandymo metodo taikomumo bandant alkoholius, ketonus ir kietąsias medžiagas (6 ir 7 pastraipos) bei medžiagas ir mišinius (8 pastraipa); paaiškinta, kaip reikėtų bandyti paviršinio aktyvumo medžiagas ir jų turinčius mišinius (28 pastraipa); atnaujintas ir paaiškintas teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas (39 ir 40 pastraipos); atnaujinti BCOP bandymų metodo sprendimo priėmimo kriterijai (47 pastraipa); atnaujinti tyrimo priimtinumo kriterijai (48 pastraipa); atnaujinti bandymo ataskaitos elementai (49 pastraipa); atnaujintos 1 priedėlio apibrėžtys; papildytas 2 priedėlis dėl BCOP bandymų metodo tinkamumo prognozėms daryti pagal skirtingas klasifikavimo sistemas; atnaujintas 3 priedėlio kvalifikacijai tikrinti naudojamų cheminių medžiagų sąrašas ir atnaujintas 4 priedėlis dėl BCOP ragenos laikiklio (1 pastraipa) ir drumstumo matuoklio (2 ir 3 pastraipos).

Šiuo metu visuotinai pripažįstama, kad artimiausioje ateityje joks vienas in vitro akių dirginimo bandymas negalės pakeisti Draize akių bandymo in vivo siekiant prognozuoti skirtingų cheminių klasių visą dirginimo gebos intervalą. Tačiau kelių alternatyvių bandymų metodų strateginiai deriniai taikant (nuosekliųjų) bandymų strategiją galėtų pakeisti Draize akių bandymą (5). Žemynkryptis metodas (5) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida apie didelę cheminės medžiagos dirginamojo poveikio gebą, o aukštynkryptis metodas (5) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida, kad cheminė medžiaga nepakankamai dirgina akis, kad ją reikėtų klasifikuoti. BCOP bandymų metodas – bandymų metodas in vitro, kuris su tam tikrais apribojimais ir tam tikromis aplinkybėmis gali būti taikomas klasifikuoti ir ženklinti cheminėms medžiagoms, keliančioms pavojų akims. Nors kaip atskiras metodas BCOP metodas nelaikomas tinkamu pakeisti triušių akių bandymą in vivo, jis rekomenduojamas kaip pirmas bandymų strategijos etapas, pvz., žemynkryptis metodas, pasiūlytas Scott et al. (5), be papildomų bandymų nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). BCOP bandymų metodas taip pat rekomenduojamas, kai reikia identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta JT GHS (JT GHS be kategorijos) (4), taikant bandymų strategiją, pvz., aukštynkryptį metodą (5). Tačiau cheminė medžiaga, kuri pagal BCOP bandymų metodą nelaikoma galinčia sukelti smarkų akių pažeidimą arba neklasifikuojama dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, turėtų būti bandoma papildomai (in vitro ir (arba) in vivo) galutinei klasifikavimo kategorijai nustatyti.

Šio bandymo metodo tikslas – aprašyti procedūras, taikomas įvertinant bandomosios cheminės medžiagos keliamo pavojaus akims galimybę, matuojant jos gebą sukelti atskirai paimtos galvijo ragenos drumstumą ir padidėjusį pralaidumą. Toksinis poveikis ragenai vertinamas pagal: (i) sumažėjusį šviesos pralaidumą (drumstumą) ir ii) padidėjusią fluoresceino natrio druskos dažiklio skverbtį (pralaidumą). Bandomąja chemine medžiaga paveiktos ragenos drumstumo ir pralaidumo vertinimo rezultatai bendrinami, kad būtų gautas in vitro dirginimo balas (angl. In Vitro Irritancy Score, IVIS), kuris naudojamas bandomosios cheminės medžiagos dirginimo gebos lygiui klasifikuoti.

Apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

Šis bandymų metodas pagrįstas ICCVAM BCOP bandymo metodo protokolu (6)(7), kuris iš pradžių buvo sukurtas pagal informaciją, gautą iš In vitro bandymų metodų instituto (angl. Institute for In Vitro Sciences, IIVS) protokolo ir iš INVITTOX protokolo Nr. 124 (8). Pastarasis atitinka protokolą (10), kuris buvo naudojamas 1997–1998 m. atliekant Europos bendrijos finansuotą preliminaraus patvirtinimo tyrimą. Abu šie protokolai buvo pagrįsti BCOP bandymų metodu, kurį pirmasis paskelbė Gautheron et al. (9).

BCOP bandymų metodas gali būti taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta JT GHS, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia priskirti JT GHS 1 kategorijai (4). Kai taikomas šiuo tikslu, BCOP bandymų metodo visuminis tikslumas – 79 % (150/191), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 25 % (32/126), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 14 % (9/65), palyginti su triušio akies bandymo metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (3) (žr. 2 priedėlio 1 lentelę). Kai tam tikrų cheminių (t. y. alkoholių, ketonų) ar fizikinių (t. y. kietųjų medžiagų) klasių bandomosios cheminės medžiagos pašalinamos iš duomenų bazės, BCOP bandymo metodo bendras tikslumas pagal JT GHS klasifikavimo sistemą siekia 85 % (111/131), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 20 % (16/81), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 8 % (4/50) (3). Galimi BCOP bandymo metodo trūkumai, kai jis taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorijos), susiję su didele klaidingai teigiamų rezultatų dalimi bandant alkoholius bei ketonus ir didele klaidingai neigiamų rezultatų dalimi bandant kietąsias medžiagas, kaip nurodyta tinkamumo patvirtinimo duomenų bazėje (1)(2)(3). Tačiau kadangi taikant BCOP bandymų metodą neteisingai įvertinami ne visi alkoholiai ar ketonai, o kai kurie tiksliai nustatomi kaip JT GHS 1 kategorijos, šios dvi organinės funkcinės grupės nelaikomos nepatenkančiomis į bandymo metodo taikymo sritį. Šio bandymo metodo naudotojas turi nuspręsti, ar galimas alkoholio arba ketono pervertinimas yra priimtinas ar reikia atlikti papildomus bandymus taikant įrodomosios duomenų galios metodą. Kalbant apie klaidingai neigiamų rezultatų dalį, reikėtų pažymėti, kad atliekant kietųjų medžiagų Draize akių dirginimo bandymą in vivo, gali susidaryti kintamos ir ribinės veikimo sąlygos, todėl gali būti gautos netinkamos jų tikrosios dirginamosios gebos prognozės (10). Taip pat reikėtų pažymėti, kad, identifikuojant chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorijos), nė vienai ICCVAM tinkamumo įvertinimo duomenų bazėje (2)(3) nurodytai klaidingai neigiamai cheminei medžiagai nebuvo gauta IVIS ≤ 3 vertė, kuri naudojama kaip kriterijus cheminę medžiagą identifikuojant kaip JT GHS be kategorijos. Be to, BCOP klaidingai neigiamas rezultatas šiame kontekste esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunama 3 < IVIS ≤ 55 vertė, vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba, blogiausiu atveju, atliekant bandymą su triušiais pagal įrodomosios duomenų galios metodą taikant nuosekliųjų bandymų strategiją. Kadangi taikant BCOP bandymų metodą kai kurios kietosios medžiagos yra tiksliai nustatomos kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagos, ši agregatinė būsena taip pat nelaikoma nepatenkančia į bandymo metodo taikymo sritį. Tyrėjai galėtų spręsti, ar taikyti šį bandymų metodą visų tipų cheminėms medžiagoms, o IVIS > 55 turėtų būti priimta kaip smarkų akių pažeidimą sukeliančio atsako rodiklis ir cheminę medžiagą reikėtų klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos be papildomų bandymų. Tačiau, kaip buvo nurodyta pirmiau, alkoholiams ar ketonams gautus teigiamus rezultatus dėl galimo pervertinimo reikėtų aiškinti atsargiai.

BCOP bandymo metodą taip pat galima taikyti nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Kai taikomas šiuo tikslu, BCOP bandymų metodo bendras tikslumas – 69 % (135/196), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 69 % (61/89), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 0 % (0/107) palyginti su triušio akies bandymo metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (3) (žr. 2 priedėlio 2 lentelę). Gauta klaidingai teigiamų rezultatų dalis (in vivo JT GHS be kategorijos cheminės medžiagos, kurių IVIS > 3, žr. 47 pastraipą) yra labai didelė, bet šiame kontekste ji esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunama 3 < IVIS ≤ 55 vertė, vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba, blogiausiu atveju, atliekant bandymą su triušiais, pagal įrodomosios duomenų galios metodą taikant nuosekliųjų bandymų strategiją. BCOP bandymų metodas neturi specifinių trūkumų bandant alkoholius, ketonus ir kietąsias medžiagas, kai tikslas yra identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą (JT GHS be kategorijos) (3). Tyrėjai galėtų pamąstyti apie šio bandymo metodo taikymą visų tipų cheminėms medžiagoms, o neigiamas rezultatas (IVIS ≤ 3) turėtų būti laikomas kaip rodiklis, kad nereikia klasifikuoti (JT GHS be kategorijos). Kadangi BCOP bandymų metodu galima tiksliai identifikuoti tik 31 % cheminių medžiagų, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą, šis bandymų metodas neturėtų būti pirmoji pasirinktis pradedant taikyti aukštynkryptį metodą (5), jei yra kitų patvirtintų ir priimtų panašaus didelio jautrumo ir dar didesnio specifiškumo in vitro metodų.

BCOP tinkamumo patvirtinimo duomenų bazę iš viso sudarė 113 medžiagų ir 100 mišinių (2)(3). Todėl BCOP bandymų metodas laikomas tinkamu bandyti medžiagas ir mišinius.

BCOP bandymų metodas nerekomenduojamas, kai reikia identifikuoti bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis dirginančias (JT GHS 2 kategorija ar 2A kategorija), arba bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis nestipriai dirginančias (JT GHS 2B kategorija), dėl gana didelio skaičiaus JT GHS 1 kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai, ir JT GHS be kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai (2)(3). Šiuo tikslu gali prireikti papildomų bandymų taikant kitą tinkamą metodą.

Visos procedūros su galvijų akimis ir galvijų ragenomis turėtų būti atliekamos pagal bandymų laboratorijos taisykles ir procedūras, taikytinas gyvūninės kilmės medžiagoms, įskaitant audinius ir audinių skysčius, bet neapsiribojant tik jais. Rekomenduojama laikytis bendrųjų laboratorijose taikytinų atsargumo priemonių (11).

Nors taikant šį BCOP bandymų metodą neatsižvelgiama į akies junginės ir rainelės pažeidimus, tiriamas poveikis ragenai, kuris yra pagrindinis rodiklis, klasifikuojant in vivo pagal JT GHS klasifikavimą. Taikant BCOP bandymų metodą, ragenos pažeidimų grįžtamumas negali būti tiesiogiai įvertintas. Atsižvelgiant į triušio akies tyrimus, buvo pasiūlyta ragenos žaizdos pradinį gylį naudoti kaip galimą būdą kai kuriems negrįžtamo poveikio tipams nustatyti (12). Tačiau reikia turėti papildomų mokslinių duomenų, kad būtų galima suprasti, kaip atsiranda negrįžtamas poveikis, kuris nėra susijęs su dideliu pradinio pažeidimo lygiu. Galiausiai, taikant BCOP bandymų metodą, negalima įvertinti su poveikiu akims susijusio sisteminio toksiškumo galimybės.

Šis bandymų metodas bus periodiškai atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys. Pvz., histopatologija gali būti naudinga, kai reikia išsamiau apibūdinti ragenos pažeidimus. Kaip aprašyta EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 160 (13), naudotojai skatinami konservuoti ragenas ir ruošti histopatologinius bandinius, kuriuos galima naudoti kuriant duomenų bazę ir sprendimo priėmimo kriterijus, galinčius pagerinti šio bandymų metodo tikslumą.

Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymo metodą, turėtų naudoti 3 priedėlyje nurodytas kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas. Laboratorija gali naudoti šias chemines medžiagas, norėdama įrodyti savo techninę kompetenciją taikyti BCOP bandymų metodą, prieš pateikdama BCOP bandymo duomenis teisės aktuose numatytais pavojų klasifikavimo tikslais.

BANDYMO PRINCIPAS

BCOP bandymo metodas yra tipinis konkretaus organo tyrimo modelis, pagal kurį galima išsaugoti normalų trumpalaikį fiziologinį ir biocheminį galvijų ragenos funkcionavimą in vitro. Pagal šį bandymo metodą bandomosios cheminės medžiagos sukeltas pažeidimas nustatomas kiekybiškai įvertinant ragenos drumstumo ir pralaidumo pokyčius drumstumo matuokliu ir regimosios šviesos spektrofotometru. Abu matavimai naudojami siekiant apskaičiuoti IVIS, kuri naudojama in vitro dirginimo pavojaus klasifikavimo kategorijai nustatyti, kad būtų galima prognozuoti bandomosios cheminės medžiagos gebą dirginti akis in vivo (žr. 48 pastraipą Sprendimo priėmimo kriterijai).

Pagal BCOP bandymo metodą naudojamos atskirtos ragenos, paimtos iš ką tik paskerstų galvijų akių. Ragenos drumstumas kiekybiškai įvertinamas matuojant ragenos praleidžiamos šviesos kiekį. Ragenos pralaidumas kiekybiškai įvertinamas kaip per visą ragenos storį prasiskverbusio fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekis, nustatytas užpakalinės kameros terpėje. Bandomosios cheminės medžiagos uždedamos ant ragenos epitelio paviršiaus jų įdedant į ragenos laikiklio priekinę kamerą. 4 priedėlyje pateiktas ragenos laikiklio, naudojamo taikant BCOP bandymo metodą, aprašymas ir schema. Ragenų laikiklių galima įsigyti iš įvairių šaltinių arba pasidaryti.

Galvijų akių šaltinis bei amžius ir gyvūnų rūšies pasirinkimas

Į skerdyklas atvežti galvijai paprastai skerdžiami žmonių maistui arba kitais komerciniais tikslais. BCOP bandymo metodui skirtų ragenų šaltinis gali būti tik sveiki gyvūnai, kurie laikomi tinkamais naudoti žmonių maisto grandinėje. Kadangi galvijų masės intervalas gana didelis ir priklauso nuo veislės, amžiaus bei lyties, nėra nustatyta rekomenduojama skerdžiamo gyvūno masė.

Ragenų matmenys gali skirtis dėl gyvūnų amžiaus skirtumo. Ragenos, kurių horizontalus skersmuo > 30,5 mm ir ragenos storio per vidurį vertės ≥ 1 100 μm, paprastai gaunamos iš senesnių kaip aštuonerių metų galvijų, o ragenos, kurių horizontalus skersmuo < 28,5 mm ir ragenos storis per vidurį < 900 μm, paprastai gaunamos iš jaunesnių kaip penkerių metų galvijų (14). Dėl šios priežasties senesnių kaip 60 mėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos. Jaunesnių kaip 12 mėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos, nes jos vis dar vystosi, o jų ragenos storis ir skersmuo yra gerokai mažesni nei suaugusių galvijų. Tačiau jaunų gyvūnų (t. y. 6–12 mėnesių) ragenas naudoti leidžiama, nes jų naudojimas turi tam tikrų pranašumų, pvz., jų lengviau gauti, amžiaus intervalas yra nedidelis ir yra mažiau pavojų, susijusių su galimu galvijų spongiforminės encefalopatijos poveikiu darbuotojams (15). Kadangi būtų naudinga papildomai įvertinti ragenos matmenų arba storio įtaką atsako į ėsdinančias ir dirginančias chemines medžiagas jautriui, naudotojai prašomi pateikti duomenis apie gyvūnų, iš kurių gautos per tyrimą naudotos ragenos, apytikrį amžių ir (arba) masę.

Akių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją

Akis surenka skerdyklų darbuotojai. Siekiant, kad mechaninis ir kitoks akių pažeidimas būtų kuo mažesnis, jas iš paskersto gyvulio reikėtų išimti kiek įmanoma greičiau, nedelsiant atšaldyti ir atšaldytas vežti. Skerdyklų darbuotojai neturėtų naudoti valiklių gyvulio galvai nuplauti, kad į akis nepatektų galinčių dirginti cheminių medžiagų.

Akis reikėtų visiškai panardinti į atvėsintą Hankso subalansuotą druskos tirpalą (angl. Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS), supiltą į tinkamo dydžio talpyklą, ir į laboratoriją jos turėtų būti vežamos taip, kad būtų kuo mažiau pažeistos ir (arba) užkrėstos bakterijomis. Kadangi akys imamos skerdžiant, jos gali būti išteptos krauju ir kitomis biologinėmis medžiagomis, įskaitant bakterijas ir kitus mikroorganizmus. Todėl svarbu užtikrinti kuo mažesnį užkrėtimo pavojų (pvz., surenkant ir vežant indą su akimis laikyti ant drėgno ledo ir į joms vežti naudojamą HBSS tirpalą įdėti antibiotikų, pvz., 100 IU/ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino).

Laiko tarpas nuo akių surinkimo iki ragenų panaudojimo taikant BCOP bandymų metodą turėtų būti kuo trumpesnis (paprastai jos surenkamos ir naudojamos tą pačią dieną) ir reikėtų įrodyti, kad dėl to neigiamos įtakos tyrimo rezultatams nepadaryta. Šie rezultatai yra pagrįsti akių atrankos kriterijais ir teigiamų bei neigiamų kontrolinių ėminių atsaku. Visos tyrimui naudojamos akys turėtų būti iš tos pačios tam tikrą dieną surinktų akių grupės.

Taikant BCOP bandymo metodą naudojamų akių atrankos kriterijai

Į laboratoriją atvežtos akys atidžiai apžiūrimos, ar jos neturi defektų, įskaitant padidėjusį drumstumą, įbrėžimus ir neovaskuliarizaciją. Turėtų būti naudojamos tik tokių defektų neturinčių akių ragenos.

Be to, kiekvienos ragenos kokybė įvertinama vėlesniais tyrimo etapais. Ragenos, kurių drumstumas po pradinio vienos valandos trukmės pusiausvirinimo laikotarpio yra didesnis kaip septyni drumstumo vienetai arba lygiavertis, naudojant kitą drumstumo matuoklį ir ragenos laikiklį, atmetamos (PASTABA. Drumstumo matuoklis turėtų būti kalibruotas pagal drumstumo etalonus, naudojamus drumstumo vienetams nustatyti, žr. 4 priedėlį).

Kiekvieną apdorojimo grupę (bandomosios cheminės medžiagos, vienalaikių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių) sudaro ne mažiau kaip trys akys. Taikant BCOP bandymų metodą, neigiamam kontroliniam ėminiui reikėtų naudoti tris ragenas. Kadangi visos ragenos yra išpjaunamos iš viso akies obuolio ir įdedamos į ragenų kameras, dėl tvarkymo veiksmų gali būti ragenų drumstumo ir pralaidumo verčių artefaktų (įskaitant neigiamą kontrolinį ėminį). Be to, drumstumo ir pralaidumo vertės, gautos neigiamų kontrolinių ėminių ragenoms, yra naudojamos bandomąja chemine medžiaga apdorotų ir teigiamų kontrolinių ėminių ragenų drumstumo ir pralaidumo vertėms koreguoti, atliekant IVIS skaičiavimus.

PROCEDŪRA

Akių paruošimas

Stengiantis nepažeisti ragenos epitelio ir endotelio, defektų neturinčios ragenos išpjaunamos kartu su 2–3 mm pločio odenos žiedu, kuris paliekamas tam, kad vėliau būtų patogiau tvarkyti rageną. Atskirtos ragenos įdedamos į specialios konstrukcijos ragenų laikiklius, sudarytus iš priekinės ir užpakalinės kamerų, kurios liečiasi su ragenos epitelio ir endotelio pusėmis. Abi kameros iki viršaus pripildomos pašildyta Eagle'o minimalia pagrindine terpe (angl. Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) be fenolio raudonojo (pirmiau užpakalinė kamera) taip, kad nesusidarytų burbulų. Tada ne trumpiau kaip vieną valandą įtaisas pusiausvirinamas 32 ± 1 °C temperatūroje, kad susilygintų ragenų bei terpės temperatūra ir būtų gautas kiek įmanoma normalus metabolinis aktyvumas (apytikrė ragenos paviršiaus temperatūra in vivo yra 32 °C).

Pasibaigus pusiausvirinimo laikotarpiui, abi kameros pripildomos naujos pašildytos EMEM be fenolio raudonojo, ir registruojami kiekvienos ragenos pradinio drumstumo rodmenys. Visos ragenos, turinčios makroskopinių audinio pažeidimų (pvz., įbrėžimų, pigmentinių dėmių, neovaskuliarizacijos požymių) arba kurių drumstumas yra didesnis kaip septyni drumstumo vienetai arba lygiavertis, naudojant kitą drumstumo matuoklį ir ragenos laikiklį, atmetamos. Ne mažiau kaip trys ragenos pasirenkamos kaip neigiamo (arba tirpiklio) kontrolinio ėminio ragenos. Likusios ragenos padalijamos į paveikimo bandomąja chemine medžiaga grupę ir teigiamo kontrolinio ėminio grupę.

Kadangi vandens šiluminė talpa didesnė už oro, vanduo užtikrina stabilesnes inkubavimo temperatūros sąlygas. Todėl ragenos laikiklį ir jo turinį rekomenduojama laikyti vandens vonioje, kurioje būtų palaikoma 32 ± 1 °C temperatūra. Tačiau gali būti naudojami ir oro inkubatoriai, jei būtų imtasi priemonių temperatūros stabilumui užtikrinti (pvz., iš anksto pašildant laikiklius ir terpę).

Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas

Taikomi du skirtingi apdorojimo protokolai: vienas – skysčiams ir paviršinio aktyvumo medžiagoms (kietosioms medžiagoms arba skysčiams), kitas – kietosioms ne paviršinio aktyvumo medžiagoms.

Skysčiai bandomi neskiesti. Pusiau kietosios medžiagos, tepalai ir vaškai paprastai bandomi kaip skysčiai. Grynos paviršinio aktyvumo medžiagos bandomos naudojant 10 % m/V koncentracijos tirpalą 0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, kuris, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. Reikėtų tinkamai pagrįsti kitas praskiestų tirpalų koncentracijos vertes. Paviršinio aktyvumo medžiagų turinčius mišinius galima bandyti neskiestus arba praskiestus iki reikiamos koncentracijos, atsižvelgiant į atitinkamą veikimo scenarijų in vivo. Bandyme naudojamą koncentraciją reikėtų tinkamai pagrįsti. Ragenos veikiamos skysčiais ir paviršinio aktyvumo medžiagomis 10 min. Jei taikoma kitokia veikimo trukmė, ją reikėtų tinkamu būdu moksliškai pagrįsti. Žr. 1 priedėlį, kuriame pateiktos paviršinio aktyvumo medžiagų ir paviršinio aktyvumo medžiagų turinčio mišinio apibrėžtys.

Ne paviršinio aktyvumo kietosios medžiagos paprastai bandomos kaip 20 % m/V koncentracijos tirpalai ar suspensijos 0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, kuris, kaip įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. Tam tikromis aplinkybėmis ir pateikus reikiamą mokslinį pagrindimą, kietąsias medžiagas taip pat būtų galima bandyti grynas, jas tiesiogiai uždedant ant ragenos paviršiaus taikant atvirosios kameros metodą (žr. 32 skirsnį). Ragenos veikiamos kietosiomis medžiagomis keturias valandas, tačiau skysčiams ir paviršinio aktyvumo medžiagoms gali būti taikoma kitokia veikimo trukmė, pateikus reikiamą mokslinį pagrindimą.

Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizikinę būseną ir chemines savybes (pvz., kietoji medžiaga, skystis, klampus arba neklampus skystis), galima taikyti įvairius apdorojimo būdus. Pagrindinis veiksnys – užtikrinti, kad bandomoji cheminė medžiaga tinkamai padengtų epitelio paviršių ir būtų gerai pašalinta atliekant plovimo veiksmus. Neklampios ir nedidelės klampos bandomosios cheminės medžiagos paprastai bandomos uždarosios kameros metodu, o pusiau klampios ir klampios skystosios bandomosios cheminės medžiagos bei grynos kietosios medžiagos – atvirosios kameros metodu.

Taikant uždarosios kameros metodą, bandomosios cheminės medžiagos kiekis, kurio pakanka ragenos epitelio paviršiui padengti (750 μl), įterpiamas į priekinę kamerą per jos viršutiniame paviršiuje esančią dozavimo angą, veikimo metu užkemšama kamščiu. Svarbu užtikrinti, kad reikiamą laiko tarpą kiekvieną rageną veiktų bandomoji cheminė medžiaga.

Taikant atvirosios kameros metodą, prieš apdorojimą iš priekinės kameros išimamas lango fiksavimo žiedas ir stiklinis langas. Kontrolinė arba bandomoji cheminė medžiaga (750 μl arba toks bandomosios cheminės medžiagos kiekis, kurio pakaktų visai ragenai padengti) tiesiogiai užlašinama ant ragenos epitelio paviršiaus mikropipete. Jei bandomąją cheminę medžiagą sunku įlašinti pipete, dozavimui palengvinti bandomoji cheminė medžiaga gali būti įšvirkšta į stūmoklinę pipetę. Stūmoklinės pipetės antgalis įstatomas į švirkšto dozavimo galą taip, kad medžiagą būti galima įšvirkšti į stūmoklinės pipetės galą. Švirkšto stūmoklis stumiamas, tuo pat metu pipetės stūmoklis traukiamas į viršų. Jei antgalyje atsiranda oro burbuliukų, bandomoji cheminė medžiaga pašalinama (išstumiama), ir procedūra kartojama tol, kol antgalis užpildomas be oro burbuliukų. Prireikus gali būti naudojamas paprastas švirkštas (be adatos), kadangi jį naudojant galima tiksliai išmatuoti bandomosios cheminės medžiagos kiekį ir lengviau padengti ragenos epitelio paviršių. Baigus dozuoti, stiklinis langas įdedamas atgal į priekinę kamerą, taip vėl atkuriant uždarąją sistemą.

Inkubavimas po paveikimo

Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomoji cheminė medžiaga, neigiama kontrolinė medžiaga arba teigiama kontrolinė cheminė medžiaga pašalinama iš priekinės kameros, epitelis plaunamas ne mažiau kaip tris kartus (arba kol nelieka matomų bandomosios cheminės medžiagos žymių) naudojant EMEM (kurios sudėtyje yra fenolio raudonojo). Plovimui naudojama terpė su fenolio raudonuoju, nes galima stebėti fenolio raudonojo spalvos kitimą, kad būtų galima nustatyti rūgštinių ar šarminių bandomųjų cheminių medžiagų nuplovimo efektyvumą. Jei fenolio raudonasis vis dar keičia spalvą (į geltoną ar į raudonai violetinę) arba jei bandomoji cheminė medžiaga vis dar yra matoma, ragenos plaunamos daugiau kaip tris kartus. Iš terpės pašalinus bandomąją cheminę medžiagą, ragenos paskutinį kartą plaunamos EMEM (be fenolio raudonojo). Paskutinį kartą plaunama EMEM (be fenolio raudonojo) tam, kad prieš drumstumo matavimą fenolio raudonasis būtų visiškai pašalintas iš priekinės kameros. Tada priekinė kamera iš naujo pripildoma nauja EMEM be fenolio raudonojo.

Jei bandomi skysčiai arba paviršinio aktyvumo medžiagos, nuplautos ragenos dar dvi valandas laikomos 32 ± 1 °C temperatūroje. Tam tikromis aplinkybėmis gali būti naudinga ilgesnė laikymo po paveikimo trukmė ir dėl jos būtų galima spręsti kiekvienu konkrečiu atveju. Pasibaigus keturių valandų veikimo laikotarpiui, kietosiomis medžiagomis apdorotos ragenos kruopščiai nuplaunamos, bet papildomai inkubuoti jų nereikia.

Pasibaigus skysčių ir paviršinio aktyvumo medžiagų inkubaciniam laikotarpiui po veikimo ir keturių valandų trukmės ne paviršinio aktyvumo kietųjų medžiagų veikimo laikotarpiui, matuojamas kiekvienos ragenos drumstumas ir pralaidumas. Be to, kiekviena ragena apžiūrima ir registruojamos susijusios pastabos (pvz., audinio lupimasis, bandomosios cheminės medžiagos likučiai, nevienodo drumstumo vaizdai). Šios pastabos galėtų būti svarbios, nes jos gali paaiškinti drumstumo matuoklio rodmenų svyravimus.

Kontrolinės cheminės medžiagos

Atliekant kiekvieną bandymą, naudojami vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai arba tirpiklis ar nešiklis ir teigiami kontroliniai ėminiai.

Kai pagal BCOP bandymo metodą bandoma 100 % grynumo skystoji cheminė medžiaga, naudojamas vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys (pvz., 0,9 % natrio chlorido tirpalas arba distiliuotas vanduo), kad bandymo sistemoje būtų galima aptikti netipinius pokyčius ir gauti bandymo vertinamųjų baigčių atskaitos vertę. Taip pat užtikrinama, kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako.

Kai bandomas atskiestas skystis, paviršinio aktyvumo arba kietoji cheminė medžiaga, taikant BCOP bandymo metodą, įtraukiama vienalaikių tirpiklio ar nešiklio kontrolinių ėminių grupė, kad būtų galima aptikti nebūdingus bandymo sistemos pokyčius ir gauti bandymo vertinamųjų baigčių atskaitos vertę. Galima naudoti tik tokį tirpiklį ar nešiklį, kurie, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamos įtakos bandymo sistemai.

Cheminė medžiaga, kuri žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką, yra įtraukiama į kiekvieną bandymą kaip vienalaikis teigiamas kontrolinis ėminys, kad būtų patikrintas bandymo sistemos vientisumas ir jos tinkamas veikimas. Tačiau siekiant užtikrinti galimybę užtikrinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, atsakas į dirginimą neturėtų būti per stiprus.

Skystųjų bandomųjų cheminių medžiagų teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai yra 100 % etanolis ar 100 % dimetilformamidas. Kietųjų bandomųjų cheminių medžiagų teigiamo kontrolinio ėminio pavyzdys yra 20 % m/V imidazolo tirpalas 0,9 % natrio chlorido tirpale.

Palyginamosios cheminės medžiagos yra naudingos, kai reikia įvertinti tam tikros cheminių medžiagų ar produktų klasės nežinomų cheminių medžiagų gebą dirginti akis arba akis dirginančios medžiagos santykinę dirginamąją gebą tam tikrame atsako į dirginimą intervale.

Matuojamos vertinamosios baigtys

Drumstumas nustatomas pagal ragenos praleidžiamą šviesos kiekį. Ragenos drumstumas kiekybiškai matuojamas drumstumo matuokliu, kuriuo gaunamos drumstumo vertės tolydžioje skalėje.

Pralaidumas nustatomas pagal fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekį, prasiskverbusį per visus ragenos ląstelių sluoksnius (t. y. nuo išorinio ragenos paviršiaus epitelio per vidinio ragenos paviršiaus endotelį). Į priekinę ragenos laikiklio kamerą, kuri liečiasi su ragenos epitelio paviršiumi, įpilamas 1 ml fluoresceino natrio druskos tirpalo (4 arba 5 mg/ml, kai bandomos skystosios, paviršinio aktyvumo medžiagos arba ne paviršinio aktyvumo medžiagos), o į užpakalinę kamerą, kuri liečiasi su ragenos endotelio paviršiumi, pripilama naujos EMEM. Laikiklis laikomas 90 ± 5 min horizontalioje padėtyje 32 ± 1 °C temperatūroje. UV/VIS spektrofotometrijos metodu matuojamas į užpakalinę kamerą patekusios fluoresceino natrio druskos kiekis. Spektrofotometrinio matavimo duomenys registruojami kaip optinio tankio esant 490 nm bangos ilgiui (OD490) arba sugerties vertės, išmatuotos tolydžioje skalėje. Fluoresceino pralaidumo vertės nustatomos naudojant OD490 vertes, išmatuotas regimosios šviesos spektrofotometru, taikant standartinį 1 cm storio sluoksnį.

Taip pat galima naudoti 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės skaitytuvą, jei: i) gali būti nustatytas plokštelės skaitytuvo, naudojamo fluoresceino OD490 vertėms nustatyti, tiesinis intervalas ir ii) į 96 duobučių plokštelės duobutes įpilamas reikiamas tūris, kad būtų gautos OD490 vertės, atitinkančios standartinį 1 cm storio sluoksnį (gali prireikti visiškai pripildyti duobutę (įprastas kiekis – 360 μl)).

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Duomenų įvertinimas

Drumstumo ir vidutinio pralaidumo (OD490) vertes pakoregavus pagal foninio drumstumo ir neigiamo kontrolinio ėminio pralaidumo OD490 vertes, kiekvienos paveiktos bandomąja chemine mežiaga grupės vidutinės drumstumo ir pralaidumo OD490 vertes reikėtų įrašyti į empiriniu būdu gautą formulę, skirtą kiekvienos apdorotų ėminių grupės in vitro dirginimo skaitinei vertei (IVIS) apskaičiuoti:

IVIS = vidutinė drumstumo vertė + (15 × vidutinė pralaidumo OD490 vertė).

Sina et al. (16) paskelbė, kad ši formulė buvo gauta atliekant laboratorinius ir tarplaboratorinius tyrimus. Buvo atlikta duomenų, gautų atlikus 36 junginių serijos tarplaboratorinį tyrimą, daugiafaktorinė analizė, kad būtų gauta geriausiai in vivo ir in vitro duomenis atitinkanti lygtis. Šią analizę atliko dviejų atskirų bendrovių mokslininkai, kurie gavo beveik vienodas lygtis.

Drumstumo ir pralaidumo vertės taip pat turėtų būti įvertintos atskirai, siekiant nustatyti, ar bandomoji cheminė medžiaga sukėlė ėsdinimą arba stiprų dirginimą tik pagal vieną iš dviejų vertinamųjų baigčių (žr. Sprendimo priėmimo kriterijai).

Sprendimo priėmimo kriterijai

IVIS ribinės vertės, pagal kurias bandomosios cheminės medžiagos identifikuojamos kaip sukeliančios smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorija) ir bandomosios cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo (JT GHS be kategorijos), pateiktos toliau:

IVIS

JT GHS

≤ 3

Be kategorijos

> 3; ≤ 55

Prognozės pateikti negalima

> 55

1 kategorija

Tyrimo priimtinumo kriterijai

Bandymas laikomas priimtinu, jei teigiamam kontroliniam ėminiui gaunama IVIS, kuri patenka į dabartinio istorinio vidurkio dviejų standartinių nuokrypių intervalą, vidurkį atnaujinant ne rečiau kaip kartą per tris mėnesius arba kiekvieną kartą laboratorijose atliekant priimtiną bandymą, kai bandymai atliekami nedažnai (t. y. rečiau kaip kartą per mėnesį). Vertinant atsaką į neigiamą kontrolinę medžiagą arba tirpiklį ar nešiklį, gautos drumstumo ir pralaidumo vertės neturėtų viršyti foninio drumstumo ir pralaidumo verčių viršutinių ribų, nustatytų galvijų ragenoms, apdorotoms atitinkama neigiama kontroline medžiaga arba tirpikliu ar nešikliu. Jei klasifikavimas nedviprasmis, bandomajai cheminei medžiagai turėtų pakakti vieno bandymo, bandant ne mažiau kaip tris ragenas. Tačiau jei atliekant pirmąjį bandymą gaunami tarpiniai rezultatai, reikėtų spręsti klausimą dėl antrojo bandymo (bet jo nebūtinai reikia), taip pat, esant prieštaringiems pirmų dviejų bandymų IVIS vidutiniams rezultatams, – dėl trečiojo bandymo. Šiuo atveju pirmojo bandymo rezultatas laikomas tarpine verte, jei bandymų su 3 ragenomis gautos prognozės nesutapo taip, kad:

2 iš 3 ragenų gautos prieštaringos prognozės pagal visų trijų ragenų vidurkį AR,

1 iš 3 ragenų gauta prieštaringa prognozė pagal visų trijų ragenų vidurkį IR prieštaringas rezultatas buvo > 10 IVIS vienetų nuo ribinės vertės 55;

jei kartotinis bandymas patvirtina pradinio bandymo prognozę (pagrįstą vidutine IVIS verte), galutinį sprendimą galima priimti be papildomo bandymo; Jei, atlikus kartotinį bandymą, gaunama pirmajam bandymui prieštaraujanti prognozė (pagrįsta vidutine IVIS verte), turėtų būti atliekamas trečiasis ir galutinis bandymas nuspręsti dėl dviprasmių prognozių ir klasifikuoti bandomąją cheminę medžiagą. Gali būti leidžiama neatlikti tolesnių klasifikavimo ir ženklinimo bandymų, jei kuris nors bandymų rezultatas duoda JT GHS 1 kategorijos prognozę.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija, jei ji yra svarbi atliekant tyrimą:

 

Bandomosios ir kontrolinės cheminės medžiagos

cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. Chemical Abstracts Service, CAS) naudojamas struktūrinis pavadinimas ir kiti pavadinimai, jei jie žinomi; CAS registro numeris (RN), jei žinomas;

bandomosios ir (arba) kontrolinės cheminės medžiagos grynumas ir sudėtis (masės procentinėmis dalimis), jei tokia informacija yra;

tyrimui atlikti reikiamos fizikinės ir cheminės savybės, pvz., fizikinis būvis, lakumas, pH, stabilumas, cheminė klasė, tirpumas vandenyje;

bandomųjų ir (arba) kontrolinių cheminių medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas),

stabilumas, jei jis žinomas.

 

Informacija apie rėmėją ir bandymų laboratoriją

rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandymų laboratorija ir tyrimo vadovas.

 

Bandymų metodo sąlygos

naudojamas drumstumo matuoklis (pvz., modelis ir specifikacijos) ir prietaiso nuostačiai;

drumstumo ir pralaidumo matavimo prietaisų (pvz., drumstumo matuoklio ir spektrofotometro) kalibravimo informacija, kad būtų užtikrintas matavimų tiesiškumas;

naudotų ragenos laikiklių tipas (pvz., modelis ir specifikacijos);

kitos naudojamos įrangos aprašymas;

procedūra, taikyta bandymų metodo vientisumui (t. y. tikslumui ir patikimumui) užtikrinti laikui bėgant (pvz., kvalifikaciniam bandymui skirtų cheminių medžiagų periodinis tikrinimas).

 

Bandymo priimtinumo kriterijai

Priimtini vienalaikių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių intervalai, pagrįsti istoriniais duomenimis;

priimtini vienalaikių palyginamųjų cheminių medžiagų kontrolinių ėminių intervalai, pagrįsti istoriniais duomenimis, jei taikoma.

 

Akių surinkimas ir paruošimas

akių šaltinio identifikavimo duomenys (t. y. įmonė, iš kurios jos buvo paimtos);

ragenos skersmuo, kaip šaltinio gyvūno amžiaus ir tinkamumo bandymui matas;

akių laikymo ir transportavimo sąlygos (pvz., akių paėmimo data ir laikas, laiko tarpas iki bandymo pradžios, kelionėje naudojama terpė ir temperatūra, naudoti antibiotikai);

galvijų ragenų paruošimas ir įdėjimas, įskaitant pastabas dėl jų kokybės, ragenų laikiklių temperatūra ir bandymams skirtų ragenų atrankos kriterijai.

 

Bandymo procedūra

kartotinių ėminių skaičius

naudotų neigiamų ir teigiamų kontrolinių medžiagų identifikavimo duomenys (taip pat tirpiklio ir palyginamųjų kontrolinių cheminių medžiagų, jei tinka);

bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertė (-ės), naudojamas įterpimo būdas, veikimo trukmė ir inkubavimo po paveikimo trukmė;

įvertinimo ir taikytų sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas;

taikytų tyrimo priimtinumo kriterijų aprašymas;

visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas;

taikytų sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas.

 

Rezultatai

Atskirų ėminių duomenų lentelė (pvz., drumstumo ir OD490 vertės, bandomosios cheminės medžiagos, teigiamų, neigiamų bei lyginamųjų cheminių medžiagų (jei naudojamos) ėminių apskaičiuotos IVIS vertės, pateiktos lentelės pavidalu, įskaitant kartotinių bandymų duomenis, jei tinka, kiekvieno bandymo vidurkiai ± standartinis nuokrypis);

kitų pastebėtų reiškinių aprašymas.

gautas in vitro JT GHS klasifikavimas, jei tinka.

 

Rezultatų aptarimas

 

Išvada

LITERATŪRA

(1)

ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].

(2)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm].

(3)

OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.

(4)

UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html].

(5)

Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.

(6)

ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].

(7)

ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm].

(8)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(9)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(10)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.

(11)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(12)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(13)

OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.

(17)

Šio priedo B.5 skyrius. Ūmus akių dirginimas ar ėsdinimas.

(18)

ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].

(19)

OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).

Available at: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

1 priedėlis

APIBRĖŽTYS

Tikslumas – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti.

Palyginamoji cheminė medžiaga – cheminė medžiaga, naudojama kaip etalonas lyginant su bandomąja chemine medžiaga. Palyginamoji cheminė medžiaga turėtų turėti šias savybes: i) pastovų (-ius) ir patikimą (-us) šaltinį (-ius); ii) struktūrinį ir funkcinį panašumą su bandomųjų cheminių medžiagų klase; iii) žinomas fizikines ir (arba) chemines charakteristikas; iv) žinomą poveikį patvirtinančius duomenis ir v) žinomą veikimo gebą reikiamo atsako intervale.

Aukštynkryptis metodas – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad jos nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo, kurio pradžioje cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti (duodančios neigiamą rezultatą), atskiriamos nuo nuo kitų cheminių medžiagų (duodančių teigiamą rezultatą).

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

Ragena – permatoma priekinė akies obuolio dalis, dengianti rainelę bei vyzdį ir praleidžianti šviesą į vidų.

Ragenos drumstumas – ragenos, paveiktos bandomąja chemine medžiaga, neskaidrumo laipsnio matas. Padidėjęs ragenos drumstumas rodo ragenos pažeidimą. Drumstumą galima įvertinti subjektyviai, kaip tai daroma atliekant Draize triušio akies bandymą, arba objektyviai, naudojant prietaisą, pvz., drumstumo matuoklį.

Ragenos pralaidumas – kiekybinis ragenos epitelio pažeidimo matas, gautas nustatant fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekį, kuris prasiskverbia per visus ragenos ląstelių sluoksnius.

Akių dirginimas – akių pokyčių sukėlimas, uždėjus bandomosios cheminės medžiagos ant priekinio akies paviršiaus, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą nuo uždėjimo. Atitinka klasifikaciją Grįžtamasis poveikis akims ir JT GHS 2 kategorija (4).

Klaidingai neigiamų rezultatų dalis – visų teigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip neigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.

Klaidingai teigiamų rezultatų dalis – visų neigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.

Pavojus – būdingoji medžiagos savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia ta medžiaga.

In vitro dirginimo skaitinė vertė (IVIS) – vertė, apskaičiuojama pagal empiriniu būdu gautą formulę, naudojamą taikant BCOP bandymų metodą, kai kiekvienos apdorotos grupės vidutinės drumstumo ir vidutinio pralaidumo vertės bendrinamos į vieną kiekvienos apdorotos grupės in vitro skaitinę vertę. IVIS = vidutinė drumstumo vertė + (15 × vidutinė pralaidumo vertė).

Negrįžtamasis poveikis akims – žr. Smarkus akių pažeidimas.

Mišinys – dviejų arba daugiau medžiagų mišinys arba tirpalas, kuriame jos nereaguoja (4)

Neigiamas kontrolinis ėminys – neapdorotas kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus. Šis ėminys tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga paveiktais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti, ar vyksta tirpiklio sąveika su bandymo sistema.

Neklasifikuojamos – cheminės medžiagos, kurios neklasifikuojamos dėl akių dirginimo (JT GHS 2, 2A ar 2B kategorija) ar dėl smarkaus akių pažeidimo (JT GHS 1 kategorija). Atitinka klasifikaciją JT GHS be kategorijos.

Drumstumo matuoklis – prietaisas, naudojamas ragenos drumstumui matuoti, kiekybiškai įvertinant šviesos praleidimą per rageną. Paprastai šis prietaisas yra sudarytas iš dviejų skyrių, iš kurių kiekvienas turi savo šviesos šaltinį ir fotoelementą. Vienas skyrius skirtas apdorotai ragenai, kitas – prietaisui kalibruoti ir nuliui nustatyti. Halogeninės lempos šviesa perduodama per valdymo skyrių (tuščią kamerą be langų ar skysčio) į fotoelementą ir lyginama su šviesa, į fotoelementą perduota per bandymo skyrių, kuriame yra kamera su ragena. Fotoelementų praleistos šviesos skirtumas palyginamas ir skaitmeniniame ekrane rodoma skaitinė drumstumo vertė.

Teigiamas kontrolinis ėminys – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir paveiktas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.

Grįžtamasis poveikis akims – žr. Akių dirginimas.

Patikimumas – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymo metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matas. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje.

Smarkus akių pažeidimas – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai praeina per 21 dieną nuo uždėjimo. Atitinka klasifikaciją Negrįžtamasis poveikis akims ir su JT GHS 1 kategorija (4).

Tirpiklio ar nešiklio kontrolinis ėminys – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis neapdorotas ėminys, kuris tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti atskaitos vertę ėminiams, paveiktiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje ar nešiklyje. Kai bandomas kartu su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, šis ėminys taip pat parodo, ar vyksta tirpiklio arba nešiklio sąveika su bandymo sistema.

Medžiaga – gamtoje randami arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, įskaitant visus priedus, kurių reikia produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą taikomo proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties (4).

Paviršinio aktyvumo medžiaga – dar vadinama paviršinio aktyvumo agentu, tai yra medžiaga, pvz., ploviklis, kuri gali sumažinti skysčio paviršiaus įtemptį, kad jis galėtų putoti ar prasiskverbti į kietąsias medžiagas; be to, ji žinoma kaip drėkiklis.

Paviršinio aktyvumo medžiagų turintis mišinys – šio bandymų metodo kontekste tai yra mišinys, turintis vieną arba daugiau paviršinio aktyvumo medžiagų, kurių galutinė koncentracija > 5 %.

Žemynkryptis metodas – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad ji sukelia smarkų akių pažeidimą, pagal kurį cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (duodančios teigiamą rezultatą), atskiriamos nuo kitų cheminių medžiagų (duodančių neigiamą rezultatą).

Bandomoji cheminė medžiaga – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

Nuosekliųjų bandymų strategija – pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomosios cheminės medžiagos dirginamąją gebą galima nustatyti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.

Jungtinių Tautų visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (JT GHS) – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie cheminių medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (4).

JT GHS 1 kategorija – žr. Smarkus akių pažeidimas.

JT GHS 2 kategorija – žr. Akių dirginimas.

JT GHS be kategorijos – cheminės medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 arba 2 (2A ar 2B) kategorijos klasifikavimo reikalavimų. Atitinka Neklasifikuojamos.

Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas – bandymų metodas, kurio patvirtinimo tyrimai atlikti, kad būtų nustatytas jo tinkamumas tam tikram tikslui pasiekti (įskaitant tikslumą) ir patikimumas. Svarbu pažymėti, kad patvirtinto tinkamumo bandymo metodo tikslumo ir patikimumo charakteristikos gali būti nepakankamos, kad jį būtų galima laikyti priimtinu siūlomam tikslui pasiekti.

Įrodomoji duomenų galia – įvairių informacijos dalių privalumų ir trūkumų nagrinėjimo procesas priimant ir patvirtinant sprendimą dėl cheminės medžiagos pavojingumo.

2 priedėlis

BCOP BANDYMŲ METODO PROGNOZAVIMO GEBA

1 lentelė

BCOP prognozavimo geba nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus (JT GHS ar ES CLP 1 kategorijos palyginti su ne 1 kategorijos (2 kategorijos ir be kategorijos); JAV AAA I kategorijos palyginti su ne I kategorijos (II kategorijos + III kategorijos + IV kategorijos)

Klasifikavimo sistema

Skaičius

Tikslumas

Jautris

Klaidingai neigiami

Specifiškumas

Klaidingai teigiami

%

Skaičius

%

Skaičius

%

Skaičius

%

Skaičius

%

Skaičius

JT GHS

ES CLP

191

78,53

150/191

86,15

56/65

13,85

9/65

74,60

94/126

25,40

32/126

JAV AAA

190

78,95

150/190

85,71

54/63

14,29

9/63

75,59

96/127

24,41

31/127


2 lentelė

BCOP prognozavimo geba nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo (nedirginančias) (JT GHS/ES CLP be kategorijos palyginti su ne be kategorijos (1 kategorijos + 2 kategorijos); JAV AAA IV kategorijos palyginti su ne IV kategorijos (I kategorijos + II kategorijos + III kategorijos))

Klasifikavimo sistema

Skaičius

Tikslumas

Jautris

Klaidingai neigiami

Specifiškumas

Klaidingai teigiami

%

Skaičius

%

Skaičius

%

Skaičius

%

Skaičius

%

Skaičius

JT GHS

ES CLP

196

68,88

135/196

100

107/107

0

0/107

31,46

28/89

68,54

61/89

JAV AAA

190

82,11

156/190

93,15

136/146

6,85

10/146

45,45

20/44

54,55

24/44

3 priedėlis

KVALIFIKACIJAI TIKRINTI SKIRTOS CHEMINĖS MEDŽIAGOS TAIKANT BCOP BANDYMŲ METODĄ

Prieš pradėdamos įprastiniu būdu taikyti šį bandymų metodą, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, tinkamai klasifikuodamos 1 lentelėje rekomenduojamų 13 cheminių medžiagų keliamą pavojų akims. Šios cheminės medžiagos buvo parinktos taip, kad atitiktų pavojų akims atsakų intervalą (t. y. 1, 2A, 2B kategorijas arba be kategorijos), atsižvelgiant į in vivo triušio akių bandymo (TG 405) (17) rezultatus ir į JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Kiti atrankos kriterijai buvo cheminių medžiagų komercinis prieinamumas ir tai, ar galima gauti aukštos kokybės in vivo etaloninius duomenis bei aukštos kokybės in vitro BCOP bandymų metodo duomenis. Etaloniniai duomenys pateikti supaprastintame suvestiniame dokumente (3) ir BCOP bandymų metodo ICCVAM istorinės apžvalgos dokumente (2)(18).

1 lentelė

Cheminės medžiagos, rekomenduojamos techninei kvalifikacijai tikrinti taikant BCOP bandymų metodą

Cheminė medžiaga

CAS Nr.

Cheminė klasė (8)

Agregatinė būsena

In Vivo klasifikavimas (9)

BCOP klasifikavimas

Benzalkonio chloridas (5 %)

8001-54-5

Onio junginys

Skystis

1 kategorija

1 kategorija

Chlorheksidinas

55-56-1

Aminas, amidinas

Kietoji medžiaga

1 kategorija

1 kategorija

Dibenzoil-L-vyno rūgštis

2743-38-6

Karboksirūgštis, esteris

Kietoji medžiaga

1 kategorija

1 kategorija

Imidazolas

288-32-4

Heterociklinis junginys

Kietoji medžiaga

1 kategorija

1 kategorija

Trichloracto rūgštis (30 %)

76-03-9

Karboksirūgštys.

Skystis

1 kategorija

1 kategorija

2,6-dichlorbenzoilchloridas

4659-45-4

Acilhalogenidas

Skystis

2A kategorija

Negalima padaryti tikslios ir (arba) patikimos prognozės

Etil-2-metilacetoacetatas

609-14-3

Ketonas, esteris

Skystis

2 B kategorija

Negalima padaryti tikslios ir (arba) patikimos prognozės

Amonio nitratas

6484-52-2

Neorganinė druska

Kietoji medžiaga

2 kategorija (10)

Negalima padaryti tikslios ir (arba) patikimos prognozės

EDTA dikalio druska

25102-12-9

Aminas, karboksirūgštis (druska)

Kietoji medžiaga

Neklasifikuojama

Neklasifikuojama

Tween 20

9005-64-5

Esteris, polieteris

Skystis

Neklasifikuojama

Neklasifikuojama

2-merkaptopirimidinas

1450-85-7

Acilhalogenidas

Kietoji medžiaga

Neklasifikuojama

Neklasifikuojama

Fenilbutazonas

50-33-9

Heterociklinis junginys

Kietoji medžiaga

Neklasifikuojama

Neklasifikuojama

Polioksietileno (23) laurileteris (BRIJ-35) (10 %)

9002-92-0

Alkoholis

Skystis

Neklasifikuojama

Neklasifikuojama

Santrumpos: CAS NR. – Cheminių medžiagų pavadinimų santrumpų tarnybos registracijos numeris.

4 priedėlis

BCOP BANDYMUI NAUDOJAMAS RAGENOS LAIKIKLIS

BCOP ragenų laikikliai gaminami iš inertinės medžiagos (pvz., polipropileno). Laikikliai yra sudaryti iš dviejų dalių (priekinės ir užpakalinės kamerų) ir turi dvi panašias cilindro pavidalo vidines kameras. Kiekvienos kameros projektinė talpa yra maždaug 5 ml, jų galuose yra stikliniai langai, per kuriuos registruojamos drumstumo matavimų vertės. Kiekviena vidinė kamera yra 1,7 cm skersmens ir 2,2 cm gylio (11). Į užpakalinę kamerą yra įdėtas žiedinis tarpiklis, kad būtų išvengta nuotėkio. Ragenos endotelio puse dedamos ant užpakalinių kamerų žiedinio tarpiklio, o priekinės kameros dedamos ant ragenų epitelio. Kameros tvirtinamos trimis nerūdijančiojo plieno varžtais, esančiais išoriniuose kameros kraštuose. Kiekvienos kameros gale yra stiklinis langas, kurį galima išimti, kad būtų patogiau pasiekti rageną. Žiedinis tarpiklis taip pat yra įdėtas tarp stiklinio lango ir kameros, kad būtų išvengta nuotėkio. Kiekvienos kameros viršuje yra dvi angos, per kurias įpilama bei pašalinama terpė ir bandomosios cheminės medžiagos. Apdorojimo ir inkubavimo laikotarpiais jos uždaromos guminiais kamšteliais. Šviesos praleidimas per ragenos laikiklius gali kisti, nes susidėvėjimo reiškiniai arba tam tikrų cheminių medžiagų likučių kaupimasis ant vidinių kamerų angų arba ant stiklinių langų gali turėti įtakos šviesos sklaidai arba atspindžio gebai. Dėl to galėtų padidėti ar sumažėti šviesos praleidimo per ragenos laikiklius atskaitos vertės (drumstumo rodmenų atskaitos vertės pasikeistų priešingai), ir galėtų atrodyti kaip žymūs atskirų kamerų pradinio drumstumo matavimų tikėtinos atskaitos vertės pokyčiai (t. y. tam tikrų atskirų ragenų laikiklių pradinės ragenų drumstumo vertės gali įprastai skirtis daugiau kaip 2 ar 3 drumstumo vienetais, palyginti su numatomomis atskaitos vertėmis). Kiekviena laboratorija turėtų atsižvelgti į galimybę sukurti programą, kurią taikant būtų įvertinti šviesos praleidimo per ragenų laikiklius pokyčiai, atsižvelgiant į bandomųjų cheminių medžiagų tipą ir kamerų naudojimo dažnumą. Siekiant gauti atskaitos vertes, ragenų laikiklius galima patikrinti prieš įprastinį naudojimą, išmatuojant drumstumo (ar šviesos praleidimo) atskaitos vertes, į kameras be ragenų įpylus visos sudėties terpės. Tada būtų galima periodiškai tikrinti ragenų laikiklių šviesos praleidimo pokyčius naudojimo laikotarpiu. Kiekviena laboratorija, atsižvelgdama į tai, kokios cheminės medžiagos bandomos, į naudojimo dažnumą ir pastebėtus ragenų drumstumo atskaitos verčių pokyčius, galėtų nustatyti ragenų laikiklių tikrinimo dažnumą. Jei būtų pastebėti žymūs šviesos praleidimo per ragenų laikiklius pokyčiai, reikėtų spręsti ragenų laikiklių vidinių paviršių tinkamų valymo ir (arba) poliravimo procedūrų ar laikiklių pakeitimo klausimą.

Ragenos laikiklio surinkimo schema.

Image

5 priedėlis

DRUMSTUMO MATUOKLIS

Drumstumo matuoklis yra šviesos praleidimo matavimo prietaisas. Pvz., jei BCOP bandymo metodo tinkamumui patvirtinti naudojama OP-KIT įranga iš Electro Design (Riomas, Prancūzija), halogeninės lempos šviesa perduodama per valdymo skyrių (tuščią kamerą be langų ar skysčio) į fotoelementą ir lyginama su šviesa, į fotoelementą perduodama per bandymo skyrių, kuriame yra kamera su ragena. Fotoelementų praleistos šviesos skirtumas palyginamas ir skaitmeniniame ekrane rodoma skaitinė drumstumo vertė. Drumstumo vienetai yra nustatyti. Galima naudoti kitokios konstrukcijos drumstumo matuoklius (pvz., kuriems nereikia atlikti lygiagrečių valdymo ir bandymo skyrių matavimų), jei būtų įrodyta, kad jais gaunami rezultatai yra panašūs į gautus patvirtinta įranga.

Drumstumo matuokliu gautas atsakas turėtų būti tiesinis tam tikrame drumstumo rodmenų intervale, kuris aprėptų ribas, atitinkančias įvairius klasifikavimo būdus, aprašytus pagal prognozavimo modelį (t. y. iki ribos, susijusios su ėsdinimu ir (arba) stipriu dirginimu). Siekiant užtikrinti tiesinius ir tikslius rodmenis iki 75–80 drumstumo vienetų, drumstumo matuoklį būtina kalibruoti naudojant įvairius kalibravimo etalonus. Kalibravimo etalonai dedami į kalibravimo kamerą (ragenos kamerą, skirtą kalibravimo etalonams laikyti) ir registruojami drumstumo matuoklio rodmenys. Kalibravimo kamera suprojektuota kalibravimo etalonams laikyti tarp šviesos šaltinio ir fotoelemento maždaug tokiu atstumu, kokiu įdedamos ragenos matuojant jų drumstumą. Etaloninės vertės ir pradinis nuostatis priklauso nuo naudojamos įrangos tipo. Drumstumo matavimų tiesiškumą turėtų užtikrinti reikiamos (prietaisui nustatytos) procedūros. Pvz., jei naudojama OP-KIT įranga iš Electro Design (Riomas, Prancūzija), drumstumo matuoklis iš pradžių kalibruojamas drumstumo vienetų nulinei vertei gauti, naudojant kalibravimo kamerą be kalibravimo etalono. Tada vienas po kito į kalibravimo kamerą dedami trys kalibravimo etalonai ir matuojamas drumstumas. Naudojant 1, 2 ir 3 kalibravimo etalonus, reikėtų gauti jų nuostačių vertes atitinkančius drumstumo rodmenis – 75, 150 ir 225 drumstumo vienetų ± 5 %.

13)

B dalies B.48 skyrius pakeičiamas taip:

„B.48   Atskirtų viščiukų akių bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 438 (2013). Atskirtų viščiukų akių (ICE) bandymo metodą 2006 ir 2010 m. įvertino Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetas (angl. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) kartu su Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) ir Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) (1) (2) (3). Atliekant pirmąjį įvertinimą, ICE buvo patvirtintas kaip moksliškai pagrįstas bandymų metodas, tinkamas kaip atrankos bandymas nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios sukelia smarkius akių pažeidimus (1 kategorijos), kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (4) ir Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (12). Atliekant antrąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar ICE bandymų metodas tinka kaip atrankos bandymas nustatant chemines medžiagas, kurios pagal JT GHS neklasifikuojamos dėl akių dirginimo ar smarkių akių pažeidimų (3) (4). Remiantis tinkamumo patvirtinimo tyrimo rezultatais ir ekspertų grupės rekomendacijomis, palikta galioti pirminė rekomendacija, kad ICE galima naudoti klasifikuojant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkius akių pažeidimus (JT GHS 1 kategorijos), nes turima duomenų bazė nepasikeitė nuo pradinio ICCVAM tinkamumo patvirtinimo. Tame etape nebuvo pasiūlyta jokių papildomų rekomendacijų dėl ICE taikymo srities išplėtimo, kad būtų įtrauktos kitos kategorijos. Buvo iš naujo įvertintas in vitro ir in vivo duomenų rinkinys, naudotas atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą, siekiant visų pirma įvertinti ICE naudingumą nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo (5). Atlikus pakartotinį įvertinimą, buvo prieita prie išvados, kad ICE bandymų metodas taip pat gali būti taikomas, kai reikia nustatyti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo pagal JT GHS (4) (5). Atsižvelgiant į šiuos įvertinimus, į šį bandymų metodą įtrauktos rekomenduojamos ICE bandymų metodo taikymo sritys ir apribojimai. Pagrindiniai skirtumai tarp EBPO bandymų gairių originalios 2009 m. versijos ir atnaujintos 2013 m. versijos yra, be kita ko, susiję su šiais dalykais: ICE metodo taikymas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti pagal JT GHS klasifikavimo sistemą, atnaujinti bandymo ataskaitos elementai, atnaujintos 1 priedėlio apibrėžtys ir atnaujintas 2 priedėlio kvalifikacijai tikrinti naudojamų cheminių medžiagų sąrašas.

Šiuo metu visuotinai pripažįstama, kad artimiausioje ateityje joks atskiras in vitro akių dirginimo bandymas negalės pakeisti Draize akių bandymo in vivo, kad būtų galima prognozuoti skirtingų cheminių klasių visą dirginimo intervalą. Tačiau kelių alternatyvių bandymų metodų strateginiai deriniai taikant (nuosekliųjų) bandymų strategiją galėtų pakeisti Draize akių bandymą (6). Žemynkryptis metodas (7) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida apie didelę cheminės medžiagos dirginamojo poveikio gebą, o aukštynkryptis metodas (7) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida, kad cheminė medžiaga nepakankamai dirgina akis, kad ją reikėtų klasifikuoti. ICE bandymų metodas – bandymų metodas in vitro, kuris tam tikromis aplinkybėmis ir su tam tikrais apribojimais, kaip aprašyta 8–10 pastraipose, gali būti taikomas akims keliamam pavojui klasifikuoti ir cheminėms medžiagoms ženklinti. Nors kaip atskiras metodas ICE metodas nelaikomas tinkamu pakeisti triušių akių bandymą in vivo, jis rekomenduojamas kaip pirmas bandymų strategijos etapas, pvz., žemynkryptis metodas, pasiūlytas Scott et al. (7), be papildomų bandymų nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). ICE bandymų metodas taip pat rekomenduojamas, kai reikia identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, kaip apibrėžta JT GHS (JT GHS be kategorijos) (4), ir todėl gali būti taikomas kaip pradinis aukštynkrypčio metodo bandymo strategijos etapas (7). Tačiau cheminė medžiaga, kuri pagal ICE bandymų metodą nelaikoma galinčia sukelti smarkų akių pažeidimą arba neklasifikuojama dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, turėtų būti bandoma papildomai (in vitro ir (arba) in vivo) galutinei kategorijai nustatyti. Be to, prieš pradedant taikyti ICE kaip aukštinkryptį metodą pagal kitas nei JT GHS klasifikavimo schemas, reikėtų pasitarti su atitinkamomis priežiūros institucijomis.

Šio bandymo metodo tikslas – aprašyti procedūras, taikomas įvertinant bandomosios cheminės medžiagos keliamo pavojaus akims galimybę, matuojant jos gebą sukelti toksiškumą iš kūno paimtai viščiuko akiai. Toksinis poveikis ragenai matuojamas šiais būdais: i) kokybiškai vertinamas drumstumas, ii) kokybiškai vertinami epitelio pažeidimai ant akies uždėjus fluoresceino (fluoresceino sulaikymas), iii) kiekybiškai matuojamas storio padidėjimas (pabrinkimas) ir iv) kokybiškai įvertinami makroskopiniai morfologiniai paviršiaus pažeidimai. Ragenos drumstumas, pabrinkimas ir pažeidimai, paveikus bandomąja chemine medžiaga, vertinami atskirai ir kartu, kad būtų nustatyta akies dirginimo kategorija.

Apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

Šis bandymo metodas pagrįstas EBPO rekomendaciniame dokumente 160 pasiūlytu protokolu (8), kuris buvo parengtas ICCVAM atlikus tarptautinį tinkamumo patvirtinimo tyrimą (1) (3) (9), padedant Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centrui, Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centrui ir TNO Gyvenimo kokybės – Toksikologijos ir taikomosios farmakologijos departamentui (Nyderlandai). Protokolas pagrįstas informacija, gauta iš paskelbtų protokolų ir iš TNO dabar taikomo protokolo (10) (11) (12) (13) (14).

Atliekant šio bandymų metodo tinkamumo patvirtinimą, buvo išbandyta didelė cheminių medžiagų grupė, o tinkamumo patvirtinimo tyrimo empirinę duomenų bazę sudarė 152 cheminės medžiagos, įskaitant 72 medžiagas ir 80 mišinių (5). Bandymų metodas tinka kietosioms medžiagoms, skysčiams, emulsijoms ir geliams. Skysčiai gali būti vandeniniai arba nevandeniniai; kietosios medžiagos gali būti tirpios arba netirpios vandenyje. Atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą, dujos ir aerozoliai nebuvo vertinami (24).

ICE bandymų metodas gali būti taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkius akių pažeidimus, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). Kai ICE metodas taikomas šiuo tikslu, nustatyti jo apribojimai – didelė alkoholiams gautų teigiamų rezultatų dalis ir didelė kietosioms medžiagoms bei paviršinio aktyvumo medžiagoms gautų klaidingai neigiamų rezultatų dalis (1) (3) (9). Tačiau klaidingai neigiamų rezultatų dalis šiame kontekste (JT GHS 1 kategorijos identifikuota kaip ne JT GHS 1 kategorijos) esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunamas neigiamas rezultatas, vėliau bandomos atliekant tinkamai patvirtintą (-us) bandymą (-us) in vitro arba, blogiausiu atveju, bandymą su triušiais pagal nuosekliųjų bandymų strategiją, taikant įrodomosios duomenų galios metodą. Reikėtų pažymėti, kad atliekant kietųjų medžiagų Draize akių dirginimo bandymą in vivo gali būti kintamos ir ribinės veikimo sąlygos, dėl kurių gali būti gautos netinkamos jų tikrosios dirginamosios gebos prognozės (15). Tyrėjai galėtų spręsti, ar taikyti šį bandymų metodą visų tipų cheminėms medžiagoms, kai teigiamas rezultatas turėtų būti priimtas kaip smarkų akių pažeidimą sukeliančio atsako rodiklis ir cheminę medžiagą reikėtų klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos be papildomų bandymų. Tačiau teigiamus rezultatus, gautus bandant alkoholius, reikėtų aiškinti atsargiai, vengiant nepagrįstų prognozių.

Kai ICE bandymų metodas taikomas siekiant nustatyti chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus (JT GHS 1 kategorijos), jo visuminis tikslumas – 86 % (120/140), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 6 % (7/113), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 48 % (13/27), palyginti su triušio akių bandymų metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4) (5).

ICE bandymų metodą taip pat galima taikyti nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Prieš pradedant taikyti ICE kaip aukštinkryptį metodą pagal kitas klasifikavimo schemas, reikėtų pasitarti su atitinkamomis reguliavimo institucijomis. Šį bandymų metodą galima taikyti visų tipų cheminėms medžiagoms, kurioms gautą neigiamą rezultatą būtų galima priimti kaip įrodymą, kad cheminės medžiagos nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ir smarkaus akių pažeidimo. Tačiau, atsižvelgiant į vieną rezultatą iš tinkamumo įvertinimo duomenų bazės, organinių tirpiklių turintiems nuo apnašų apsaugantiems dažams galėtų būti gautas klaidingai neigiamas rezultatas (5).

Kai ICE bandymų metodas taikomas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ir smarkaus akių pažeidimo, jo visuminis tikslumas – 82 % (125/152), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 33 % (26/79), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 1 % (1/73), palyginti su triušio akių bandymų metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS (4) (5). Kai tam tikrų klasių bandomosios cheminės medžiagos (t. y. organinių tirpiklių turintys nuo apnašų apsaugantys dažai) pašalinamos iš duomenų bazės, ICE bandymų metodo tikslumas taikant JT GHS klasifikavimo sistemą yra 83 % (123/149), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 33 % (26/78), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 0 % (0/71) (4) (5).

ICE bandymų metodas nerekomenduojamas, kai reikia nustatyti bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis dirginančias (t. y. JT GHS 2 kategorijos ar 2A kategorijos), arba bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis nestipriai dirginančias (JT GHS 2B kategorijos), dėl gana didelio skaičiaus JT GHS 1 kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai, ir JT GHS be kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai. Šiuo tikslu gali prireikti papildomų bandymų taikant kitą tinkamą metodą.

Visos procedūros su viščiukų akimis turėtų būti atliekamos pagal bandymų laboratorijos taikytinas žmogaus arba gyvūninės kilmės medžiagų, įskaitant audinius ir audinių skysčius, bet neapsiribojant tik jais, tvarkymo taisykles ir procedūras. Rekomenduojama laikytis bendrųjų laboratorijose taikytinų atsargumo priemonių (16).

Nors ICE bandymų metode neatsižvelgiama į akies junginės ir rainelės pažeidimus, kurie yra įvertinami taikant triušio akių dirginimo bandymų metodą, tiriamas poveikis ragenai, kuris yra pagrindinis rodiklis, klasifikuojant in vivo pagal JT GHS klasifikavimą. Be to, nors pagal ICE bandymų metodą ragenos pažeidimų grįžtamumas negali būti įvertintas tiesiogiai, atsižvelgiant į triušio akių tyrimus, buvo pasiūlyta naudoti ragenos žaizdos pradinį gylį, kaip galimą būdą kai kuriems negrįžtamo poveikio tipams nustatyti (17). Visų pirma reikia turėti papildomų mokslinių duomenų, kad būtų galima suprasti, kaip atsiranda negrįžtamas poveikis, nesusijęs su dideliu pradinio pažeidimo lygiu. Galiausiai taikant ICE bandymų metodą negalima įvertinti su poveikiu akims susijusio sisteminio toksiškumo galimybės.

Šis bandymų metodas bus periodiškai atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys. Pvz., gali būti naudinga histopatologija, kai reikia išsamiau apibūdinti ragenos pažeidimus. Siekiant įvertinti šią galimybę, naudotojai skatinami konservuoti ragenas ir ruošti histopatologinius bandinius, kuriuos galima naudoti kuriant duomenų bazę ir sprendimo priėmimo kriterijus, galinčius pagerinti šio bandymų metodo tikslumą. EBPO parengė toksiškumo akims bandymų in vitro metodų rekomendacinį dokumentą, kurį sudaro išsamiai aprašytos histopatologinių bandinių ėmimo procedūros ir informacija apie tai, kur pateikti bandinius ir (arba) histopatologinius duomenis (8).

Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymo metodą, turėtų naudoti kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas, nurodytas 2 priedėlyje. Laboratorija gali naudoti šias chemines medžiagas, norėdama įrodyti savo techninę kompetenciją taikyti ICE bandymo metodą, prieš pateikdama ICE bandymų duomenis teisės aktuose numatytais pavojų klasifikavimo tikslais.

BANDYMO PRINCIPAS

ICE bandymo metodas yra organotipinių audinių tyrimo modelis, pagal kurį galima išsaugoti trumpalaikį viščiuko akies funkcionavimą in vitro. Pagal šį bandymų metodą bandomosios cheminės medžiagos padarytas pažeidimas nustatomas įvertinant ragenos pabrinkimą, drumstumą ir fluoresceino sulaikymą. Pastarieji du parametrai vertinami kokybiškai, o ragenos pabrinkimo analizė yra kiekybinis įvertinimas. Kiekvienas matavimas perskaičiuojamas į kiekybinį balą, naudojamą visuminiam dirginimo indeksui apskaičiuoti, arba priskiriama kokybinė kategorija, kuri naudojama pavojui akims in vitro klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos arba kaip JT GHS be kategorijos. Bet kuris iš šių rezultatų po to gali būti naudojamas bandomosios cheminės medžiagos sukeliamam smarkiam akių pažeidimui in vivo prognozuoti arba nustatyti, kad bendomosios cheminės medžiagos pavojaus akims klasifikuoti nereikia (žr. Sprendimo priėmimo kriterijai). Tačiau ICE bandymų metodu neįmanoma suklasifikuoti cheminių medžiagų, kurios nenustatytos kaip sukeliančios smarkius akių pažeidimus arba kurios neklasifikuojamos (žr.11 pastraipą).

Viščiukų akių šaltinis ir amžius

Paprastai šiam tyrimui naudojamos žmonėms skirtų vartoti viščiukų akys, paimtos skerdykloje, kurioje viščiukai skerdžiami, kad nereikėtų naudoti laboratorinių gyvūnų. Naudojamos tik sveikų gyvūnų, kurie laikomi tinkamais patekti į žmonių maisto grandinę, akys.

Nors kontrolinis tyrimas tinkamiausiam viščiukų amžiui įvertinti nebuvo atliktas, anksčiau taikant šį bandymų metodą buvo naudojami viščiukai, kurių amžius ir masė atitinka paukščių skerdykloje pavasarį skerdžiamų mėsinių viščiukų amžių ir masę (t. y. maždaug 7 savaičių amžiaus, 1,5–2,5 kg masės).

Akių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją

Galvos turėtų būti nupjautos iš karto po to, kai viščiukai numarinami, paprastai elektros šoku, ir įpjaunamas kaklas, kad nubėgtų kraujas. Reikėtų rasti netoli laboratorijos esantį vietinį viščiukų šaltinį, kad galvas būtų galima nuvežti iš skerdyklos į laboratoriją pakankamai greitai ir būtų kuo mažesnė jų pažeidimo ir (arba) užteršimo bakterijomis tikimybė. Laikotarpis nuo viščiukų galvų surinkimo iki išpjautų akių pernešimo į perfuzijos aparato kamerą turėtų būti kuo mažesnis (paprastai trumpesnis kaip dvi valandos), kad būtų užtikrinta atitiktis tyrimo priimtinumo kriterijams. Visos bandymui atlikti naudojamos akys turėtų būti iš tos pačios tam tikrą dieną surinktos akių grupės.

Kadangi akys išpjaunamos laboratorijoje, iš skerdyklos vežamos galvos su akimis laikomos plastikinėse dėžėse aplinkos temperatūroje (paprastai nuo 18 °C iki 25 °C) ir drėkinamos servetėlėmis, įmirkytomis izotoniniu druskos tirpalu.

ICE bandymui skirtų akių atrankos kriterijai ir skaičius

Išimtos akys atmetamos, jei jų dažymo fluoresceinu atskaitos vertės (t. y. > 0,5) arba ragenos drumstumo atskaitos vertės (t. y. > 0,5) yra didelės.

Kiekvieną apdorotų ėminių ir vienalaikių kontrolinių ėminių grupę sudaro ne mažiau kaip trys akys. Neigiamo kontrolinio ėminio arba tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio (jei naudojamas kitas nei druskos tirpalas tirpiklis) grupę sudaro bent viena akis.

Jei kietosioms medžiagoms gaunamas GHS be kategorijos rezultatas, rekomenduojama atlikti antrąjį bandymą su trimis akimis, kad būtų patvirtintas arba paneigtas neigiamas rezultatas.

PROCEDŪRA

Akių paruošimas

Atsargiai, nepažeidžiant ragenos, išpjaunami akių vokai. Ragenos vientisumas greitai įvertinamas ant ragenos paviršiaus kelioms sekundėms užlašinus 2 % (m/V) fluoresceino natrio druskos tirpalo lašą ir jį nuplovus izotoniniu druskos tirpalu. Fluoresceinu apdorotos akys apžiūrimos per mikroskopą su plyšine lempa, siekiant įsitikinti, ar ragena yra nepažeista (t. y. ar fluoresceino sulaikymo ir ragenos drumstumo vertės yra ≤ 0,5).

Jei ragena nepažeista, akis išpjaunama iš kaukolės, nepažeidžiant ragenos. Akies obuolys ištraukiamas iš akiduobės tvirtai suimant mirksimąją membraną chirurginėmis žnyplėmis, tada lenktomis, bukais galais žirklėmis nupjaunami akies raumenys. Svarbu nepažeisti ragenos (t. y. nepalikti spaudimo žymių) per daug ją spaudžiant.

Akį išėmus iš akiduobės, matoma regos nervo dalis turėtų būti palikta. Iš akiduobės išimta akis padedama ant sugeriamojo padėklo, tada nupjaunama mirksimoji membrana ir kiti jungiamieji audiniai.

Išimta akis tvirtinama nerūdijančiojo plieno laikiklyje taip, kad ragenos padėtis būtų vertikali. Laikiklis perkeliamas į perfuzijos aparato kamerą (18). Laikiklius perfuzijos aparate reikėtų įtaisyti taip, kad izotoninis druskos tirpalas lašėtų ant visos ragenos (3–4 lašai per minutę ar 0,1–0,15 ml/min). Kontroliuojama perfuzijos aparato kamerų temperatūra turėtų būti 32 ± 1,5 °C. 3 priedėlyje pateikta perfuzijos aparato ir akių laikiklių, kuriuos galima nusipirkti arba pasigaminti, schema. Aparato konstrukciją galima keisti, atsižvelgiant į kiekvienos laboratorijos poreikius (pvz., norint įdėti kitokį akių skaičių).

Įdėjus akis į perfuzijos aparatą, jos dar kartą apžiūrimos per mikroskopą su plyšine lempa, siekiant įsitikinti, ar jos nebuvo pažeistos per išpjovimo procedūrą. Kartu taip pat turėtų būti išmatuotas ragenos storis jos viršūnėje, naudojant gylio matavimo prietaisą, įrengtą mikroskope su plyšine lempa. Akis, kurių i) fluoresceino sulaikymo vertė > 0,5, ii) ragenos drumstumas > 0,5 arba iii) yra papildomų pažeidimo požymių, reikėtų pakeisti. Jei akys nebuvo atmestos pagal kurį nors iš šių kriterijų, reikėtų atmesti atskiras akis, kurių ragenos storio nuokrypis nuo visų akių vidurkio didesnis kaip 10 %. Naudotojai turėtų žinoti, kad matuojant mikroskopu su plyšine lempa gautas ragenų storis gali skirtis, pasirinkus nevienodus plyšio pločio nuostačius. Reikėtų nustatyti 0,095 mm pločio plyšį.

Apžiūrėjus akis ir patvirtinus jų tinkamumą, jos maždaug 45–60 min inkubuojamos, kad prieš dozavimą būtų pasiekta pusiausvyra su bandymo sistema. Pasibaigus pusiausvirinimo laikotarpiui, registruojamos ragenos nulinės storio ir drumstumo vertės, kurios būtų naudojamos kaip atskaitos vertės (t. y. laikas = 0). Išpjovimo metu gauta fluoresceino skaitinė vertė naudojama kaip šios vertinamosios baigties atskaitos vertė.

Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas

Iš karto po nulinio laiko atskaitos verčių matavimo, akis (su laikikliu) išimama iš perfuzijos aparato, padedama horizontaliai ir ant ragenos uždedama bandomosios cheminės medžiagos.

Skystos bandomosios cheminės medžiagos paprastai bandomos grynos, tačiau prireikus (pvz., jei tai yra tyrimo schemos dalis) jas galima atskiesti. Tinkamiausias bandomųjų cheminių medžiagų tirpiklis yra fiziologinis tirpalas. Kontroliuojamomis sąlygomis galima naudoti kitus tirpiklius, tačiau būtina įrodyti tirpiklių, kurie nėra fiziologinis tirpalas, tinkamumą.

Skystos bandomosios cheminės medžiagos užlašinamos ant ragenos taip, kad visas ragenos paviršius būtų tolygiai padengtas bandomąja chemine medžiaga, kurios tipinis tūris – 0,03 ml.

Jei įmanoma, kietąsias bandomąsias chemines medžiagas reikėtų kuo smulkiau sumalti grūstuve arba panašia malimo priemone. Milteliai ant ragenos beriami taip, kad jos paviršius būtų tolygiai padengtas bandomąja chemine medžiaga, kurios tipinis kiekis – 0,03 g.

Bandomoji cheminė medžiaga (skysta arba kieta) laikoma uždėta 10 sekundžių ir nuplaunama nuo akies aplinkos temperatūros izotoniniu druskos tirpalu (maždaug 20 ml). Tada akis (su laikikliu) vėl įdedama į perfuzijos aparatą, į pradinę vertikaliąją padėtį. Prireikus po 10 sekundžių laikymo ir vėlesniais laiko momentais (pvz., ant ragenos radus bandomosios cheminės medžiagos likučių) galima plauti papildomai. Apskritai papildomam plovimui naudojamas druskos tirpalo tūris neturi didelės reikšmės, bet svarbu pastebėti, ar ant ragenos yra prilipusios cheminės medžiagos.

Kontrolinės cheminės medžiagos

Atliekant kiekvieną bandymą turėtų būti įtraukti vienalaikiai neigiami arba tirpiklio ar nešiklio kontroliniai ėminiai ir teigiami kontroliniai ėminiai.

Kai pagal ICE bandymo metodą bandomi gryni skysčiai arba kietosios medžiagos, kaip vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys naudojamas fiziologinis tirpalas, kad būtų galima aptikti netipinius bandymo sistemos pokyčius ir kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako.

Kai taikant bandymo metodą bandomi atskiesti skysčiai, įtraukiama vienalaikė tirpiklio ar nešiklio kontrolinė grupė, kad būtų galima aptikti netipinius bandymo sistemos pokyčius ir kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako. Kaip nurodyta 31 skirsnyje, galima naudoti tik tokį tirpiklį ar nešiklį, kuris, kaip įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai.

Siekiant patikrinti, ar sukeliamas reikiamas atsakas, atliekant kiekvieną bandymą kaip teigiama kontrolinė medžiaga įtraukiama žinoma akis dirginanti medžiaga. Kadangi pagal šį bandymo metodą ICE bandymas atliekamas ėsdinančioms arba smarkiai dirginančioms medžiagoms nustatyti, šio bandymų metodo teigiama kontrolinė medžiaga turėtų būti etaloninė cheminė medžiaga, kuri sukelia stiprų atsaką. Tačiau, siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus. Turėtų būti gauta pakankamai in vitro duomenų apie teigiamą kontrolinę medžiagą, kad būtų galima apskaičiuoti statistiškai apibrėžtą priimtiną teigiamos kontrolinės medžiagos intervalą. Jei tinkamų istorinių ICE bandymo metodo duomenų apie tam tikrą teigiamą kontrolinę medžiagą nėra, gali tekti atlikti tyrimus šiai informacijai gauti.

Tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai bandant skystas chemines medžiagas yra 10 % acto rūgštis arba 5 % benzalkonio chloridas, o bandant kietąsias chemines medžiagas – natrio hidroksidas arba imidazolas.

Palyginamosios cheminės medžiagos yra naudingos, kai reikia įvertinti tam tikros cheminių medžiagų ar produktų klasės nežinomų cheminių medžiagų gebą dirginti akis arba akis dirginančios medžiagos santykinę dirginamąją gebą tam tikrame atsako į dirginimą intervale.

Matuojamos vertinamosios baigtys

Apdorotos ragenos įvertinamos prieš apdorojimą ir 30, 75, 120, 180 bei 240 min (± 5 min) po apdorotų ragenų nuplovimo. Matuojant tokiais laiko momentais užtikrinamas tinkamas matavimų skaičius keturių valandų apdorojimo laikotarpiu, tarp matavimų paliekant pakankamai laiko reikiamai visų akių apžiūrai.

Nustatytos vertinamosios baigtys – ragenos drumstumas, pabrinkimas, fluoresceino sulaikymas ir morfologiniai padariniai (pvz., epitelio išopėjimas arba atsiskyrimas). Visos vertinamosios baigtys, išskyrus fluoresceino sulaikymą (kuris nustatomas tik prieš apdorojimą ir praėjus 30 min nuo paveikimo bandomąja chemine medžiaga), vertinamos kiekvienu pirmiau nurodytu laiko momentu.

Patariama padaryti nuotraukas, kad būtų gauti ragenos drumstumo, fluoresceino sulaikymo, morfologinių padarinių ir histopatologinių tyrimų, jei atliekami, dokumentai.

Baigus keturių valandų tyrimą, naudotojams siūloma konservuoti akis tinkamame fiksavimo tirpale (pvz., neutraliame buferuotame formalino tirpale), kad būtų galima atlikti histopatologinį tyrimą (išsamesnės informacijos pateikta 14 pastraipoje ir (8) nuorodoje).

Ragenų pabrinkimas nustatomas ragenos storį matuojant optiniu pachimetru, įrengtu mikroskope su plyšine lempa. Jis išreiškiamas procentais ir taikant ragenos storio matavimo duomenis apskaičiuojamas pagal šią formulę:

Formula

Apskaičiuojamas visų bandytų akių vidutinis ragenos pabrinkimas procentais kiekvienu stebėjimo laiko momentu. Pagal didžiausią vidutinį ragenos pabrinkimo balą, nustatytą kuriuo nors laiko momentu, kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai priskiriamas visuminis kategorijos balas (žr. 51 pastraipą).

Ragenos drumstumas įvertinamas tame ragenos plote, kuris labiausiai nepraleidžia šviesos, kad būtų gautas drumstumo balas, pateiktas 1 lentelėje. Apskaičiuojama visų bandytų akių vidutinė ragenos drumstumo vertė kiekvienu stebėjimo laiko momentu. Pagal didžiausią vidutinį ragenos drumstumo balą, nustatytą kuriuo nors laiko momentu, kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai priskiriamas bendras kategorijos balas (žr. 51 pastraipą).

1 lentelė

Ragenos drumstumo balai

Balas

Stebėjimo rezultatas

0

Jokio drumstumo

0,5

Labai nežymus drumstumas

1

Taškinės arba pasklidosios drumstumo sritys; rainelės elementai aiškiai matomi

2

Lengvai įžiūrima pusskaidrė sritis; rainelės elementai šiek tiek neryškūs

3

Didelis ragenos drumstumas, atskirų rainelės elementų nesimato; vyzdžio dydis vos įžiūrimas

4

Visiškas ragenos drumstumas; vyzdys nematomas

Fluoresceino sulaikymas įvertinamas tik 30 min atitinkančiu stebėjimo momentu, kaip pateikta 2 lentelėje. Visų bandytų akių vidutinė fluoresceino sulaikymo vertė apskaičiuojama tik 30 min atitinkančiam stebėjimo momentui ir ji naudojama kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos visuminiam kategorijos balui gauti (žr. 51 pastraipą).

2 lentelė

Fluoresceino sulaikymo balai

Balas

Stebėjimo rezultatas

0

Jokio fluoresceino sulaikymo

0,5

Labai nedaug pavienių dažytų ląstelių

1

Pavienės dažytos ląstelės, išsklaidytos per visą apdorotą ragenos plotą

2

Dažytų pavienių ląstelių tankūs židiniai arba susilieję plotai

3

Dideli susilieję fluoresceiną sulaikančios ragenos plotai

Morfologiniai padariniai aprėpia ragenos epitelio ląstelių opėjimą, epitelio atsiskyrimą, ragenos paviršiaus šiurkštėjimą ir bandomosios cheminės medžiagos sulipimą su ragena. Šių požymių stiprumas gali būti įvairus ir jie gali pasireikšti kartu. Šių požymių klasifikavimas yra subjektyvus, priklauso nuo tyrėjo aiškinimų.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Duomenų įvertinimas

Ragenos drumstumo, pabrinkimo ir fluoresceino sulaikymas turėtų būti įvertinti atskirai, kad būtų gauta kiekvienos vertinamosios baigties ICE klasė. Tada kiekvienos vertinamosios baigties ICE klasės apibendrinamos, kad būtų gautas kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos akių dirginimo klasifikavimas.

Sprendimo priėmimo kriterijai

Nustačius kiekvieną vertinamąją baigtį, ICE klasės gali būti priskirtos atsižvelgiant į iš anksto nustatytą intervalą. Ragenos pabrinkimo (3 lentelė), drumstumo (4 lentelė) ir fluoresceino sulaikymo (5 lentelė) rezultatų aiškinimas, taikant keturias ICE klases, atliekamas pagal toliau pateiktas skales. Svarbu atkreipti dėmesį į tai, kad 3 lentelėje pateikti ragenos pabrinkimo balai taikomi tik tada, jei storis matuojamas mikroskopu su plyšine lempa (pvz., Haag-Streit BP900), gylio matavimo įtaisu Nr.1 ir plyšio pločio nuostačiu 9Formula, kuris yra lygus 0,095 mm. Naudotojai turėtų žinoti, kad matuojant mikroskopu su plyšine lempa ragenos storio matmenys gali skirtis, jei skirtingas plyšio pločio nuostatis.

3 lentelė

ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į ragenos pabrinkimą

Vidutinis ragenos pabrinkimas (%) (*2)

ICE klasė

nuo 0 iki 5

I

nuo > 5 iki 12

II

nuo > 12 iki 18 (> 75 min nuo apdorojimo)

II

nuo > 12 iki 18 (≤ 75 min nuo apdorojimo)

III

nuo > 18 iki 26

III

nuo > 26 iki 32 (> 75 min nuo apdorojimo)

III

nuo > 26 iki 32 (≤ 75 min nuo apdorojimo)

IV

> 32

IV


4 lentelė

ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į drumstumą

Maksimalus vidutinis drumstumo balas (*3)

ICE klasė

0,0–0,5

I

0,6–1,5

II

1,6–2,5

III

2,6–4,0

IV


.5 lentelė

ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į vidutinį fluoresceino sulaikymą

Vidutinis fluoresceino sulaikymo balas, praėjus 30 min nuo apdorojimo (*4)

ICE klasė

0,0–0,5

I

0,6–1,5

II

1,6–2,5

III

2,6–3,0

IV

Bandomosios cheminės medžiagos in vitro klasifikavimas vertinamas gaunant GHS klasifikavimą, kuris atitinka gautų ragenų pabrinkimo, ragenų drumstumo ir fluoresceino sulaikymo kategorijų derinį, kaip aprašyta 6 lentelėje.

6 lentelė

Visuminis in vitro klasifikavimas

JT GHS klasifikavimas

Trijų vertinamųjų baigčių deriniai

Be kategorijos

3 × I

2 × I, 1 × II

Prognozės pateikti negalima

Kiti deriniai

1 kategorija

3 × IV

2 × IV, 1 × III

2 × IV, 1 × II (*5)

2 × IV, 1 × I (*5)

Ragenos drumstumas ≥ 3 po 30 min (ne mažiau kaip dviejų akių)

Ragenos drumstumas = 4 kuriuo nors laiko momentu (ne mažiau kaip dviejų akių)

Didelis epitelio atsiskyrimas (bent vienos akies)

Tyrimo priimtinumo kriterijai

Bandymas laikomas priimtinu, jei vienalaikiai neigiami arba nešiklio ar tirpiklio kontroliniai ėminiai ir vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai nustatomi kaip GHS neklasifikuojami ar GHS 1 kategorijos ėminiai.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija, jei ji yra svarbi atliekant tyrimą:

 

Bandomoji cheminė medžiaga ir kontrolinės cheminės medžiagos

cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. Chemical Abstracts Service, CAS) naudojamas struktūrinis pavadinimas ir kiti pavadinimai, jei jie žinomi;

CAS registro numeris (RN), jei žinomas;

bandomosios ir (arba) kontrolinės cheminės medžiagos grynumas ir sudėtis (masės procentinėmis dalimis), jei tokia informacija yra;

tyrimui atlikti reikiamos fizikinės ir cheminės savybės, pvz., agregatinė būsena, lakumas, pH, stabilumas, cheminių junginių klasė, tirpumas vandenyje;

bandomųjų ir (arba) kontrolinių cheminių medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas),

stabilumas, jei jis žinomas.

 

Informacija apie rėmėją ir bandymų laboratoriją

rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandymų laboratorija ir tyrimo vadovas;

akių šaltinio identifikavimo duomenys (t. y. įmonė, iš kurios jos buvo paimtos);

 

Bandymų metodo sąlygos

naudotos bandymo sistemos aprašymas;

naudotas mikroskopas su plyšine lempa (pvz., modelis) ir naudoto prietaiso padaryti nuostačiai;

istorinių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių rezultatų nuorodos ir, jei tinka, istoriniai duomenys, kurie parodo priimtinus vienalaikių palyginamųjų medžiagų kontrolinių ėminių intervalus;

procedūra, taikyta bandymų metodo vientisumui (t. y. tikslumui ir patikimumui) užtikrinti laikui bėgant (pvz., kvalifikaciniam bandymui skirtų cheminių medžiagų periodinis tikrinimas).

 

Akių surinkimas ir paruošimas

gyvūno donoro amžius ir masė ir, jei yra, kitos gyvūnų, kurių akys buvo imamos, specifinės charakteristikos (pvz., lytis, veislė);

akių laikymo ir transportavimo sąlygos (pvz., akių paėmimo data ir laikas, laiko tarpas nuo viščiukų galvų surinkimo iki išpjautų akių įdėjimo į perfuzijos kamerą);

akių paruošimas ir įdėjimas, įskaitant pastabas dėl jų kokybės, akių kamerų temperatūra ir bandymams skirtų akių atrankos kriterijai.

 

Bandymų procedūra

kartotinių ėminių skaičius

naudotų neigiamų ir teigiamų kontrolinių medžiagų identifikavimo duomenys (taip pat tirpiklio ir palyginamųjų kontrolinių cheminių medžiagų, jei tinka);

bandomosios cheminės medžiagos dozė, naudotas uždėjimo laikas ir veikimo trukmė;

stebėjimo laiko momentai (pieš apdorojimą ir po jo);

įvertinimo ir taikytų sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas;

taikytų tyrimo priimtinumo kriterijų aprašymas;

visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas.

 

Rezultatai

kiekvienu stebėjimo momentu gautų kiekvienos atskiros akies ragenos pabrinkimo, drumstumo ir fluoresceino sulaikymo balų lentelė, įskaitant visų bandytų akių vidutinį balą kiekvienu stebėjimo momentu;

stebėti (bet kuriuo laiko momentu) didžiausi vidutiniai ragenos pabrinkimo, drumstumo ir fluoresceino sulaikymo balai ir susijusi ICE klasė.

visų kitų pastebėtų reiškinių aprašymas;

gautas in vitro GHS klasifikavimas, jei tinka;

akies nuotraukos, jei reikia.

 

Rezultatų aptarimas

 

Išvada

LITERATŪRA

(1)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(2)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available: [http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(3)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm]

(4)

United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html]

(5)

Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.

(6)

Šio priedo B.5 skyrius. Ūmus akių dirginimas arba ėsdinimas.

(7)

Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.

(8)

OECD (2011) Guidance Document on „The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants“. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.

(9)

ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Available: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78-81.

(16)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(17)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(18)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

1 priedėlis

APIBRĖŽTYS

Tikslumas – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti.

Palyginamoji cheminė medžiaga – cheminė medžiaga, naudojama kaip etalonas lyginant su bandomąja chemine medžiaga. Palyginamoji cheminė medžiaga turėtų turėti šias savybes: i) pastovų (-ius) ir patikimą (-us) šaltinį (-ius); ii) struktūrinį ir funkcinį panašumą su bandomųjų cheminių medžiagų klase; iii) žinomas fizikines ir (arba) chemines charakteristikas; iv) žinomą poveikį patvirtinančius duomenis ir v) žinomą veikimo gebą reikiamo atsako intervale.

Aukštynkryptis metodas – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad jos nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo, kai cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti (duoda neigiamą rezultatą), nustatomos atskiriant jas nuo kitų cheminių medžiagų (duoda teigiamą rezultatą).

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

Ragena – permatoma priekinė akies obuolio dalis, dengianti rainelę bei vyzdį ir praleidžianti šviesą į vidų.

Ragenos drumstumas – ragenos, paveiktos bandomąja chemine medžiaga, neskaidrumo laipsnio matas. Padidėjęs ragenos drumstumas rodo ragenos pažeidimą.

Ragenos pabrinkimas – objektyvus atliekant ICE bandymą nustatomas ragenos išsipūtimo lygio, baigus veikti bandomąja chemine medžiaga, matas. Išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamas pagal ragenos storio atskaitos vertę (nustatytą prieš veikiant doze) ir ragenos storį, užregistruotą vienodais laiko tarpais, baigus veikti bandomąja chemine medžiaga atliekant ICE bandymą. Ragenos pabrinkimo lygis rodo ragenos pažeidimą.

Akių dirginimas – akių pokyčių sukėlimas, uždėjus bandomosios cheminės medžiagos ant priekinio akies paviršiaus, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą nuo uždėjimo. Sukeičiama su Grįžtamasis poveikis akims ir su JT GHS 2 kategorija (4).

Klaidingai neigiamų rezultatų dalis – visų teigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai nustatytos kaip neigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.

Klaidingai teigiamų rezultatų dalis – visų neigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.

Fluoresceino sulaikymas – per ICE bandymą subjektyviai nustatomas fluoresceino natrio druskos kiekis, išlikęs ragenos epitelio ląstelėse, rageną baigus veikti bandomąja chemine medžiaga. Fluoresceino sulaikymo laipsnis rodo ragenos epitelio pažeidimą.

Pavojus – būdingoji agento savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia tas agentas.

Negrįžtamasis poveikis akims – žr. smarkus akių pažeidimas ir JT GHS 1 kategorija.

Mišinys – dviejų arba daugiau medžiagų mišinys arba tirpalas, kuriuose jos nereaguoja (4)

Neigiamas kontrolinis ėminys – neapdorotas kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus. Šis ėminys tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti, ar vyksta tirpiklio sąveika su bandymo sistema.

Neklasifikuojamos – cheminės medžiagos, kurios neklasifikuojamos dėl akių dirginimo (JT GHS 2 kategorija) ar dėl smarkaus akių pažeidimo (JT GHS 1 kategorija). Sukeičiama su JT GHS be kategorijos.

Teigiamas kontrolinis ėminys – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir paveiktas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.

Patikimumas – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymų metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matai. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje.

Grįžtamasis poveikis akims – žr. akių dirginimas ir JT GHS 2 kategorija.

Smarkus akių pažeidimas – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai išnyksta praėjus 21 parai nuo uždėjimo. Sukeičiama su Nerįžtamasis poveikis akims ir su JT GHS 1 kategorija (4).

Mikroskopas su plyšine lempa – prietaisas, naudojamas tiesiogiai ištirti akį, jos vaizdą padidinant binokuliniu mikroskopu ir sukuriant tiesioginį stereoskopinį vaizdą. Taikant ICE bandymo metodą, šis prietaisas naudojamas viščiukų akių priekinėms struktūroms apžiūrėti ir ragenos storiui objektyviai išmatuoti pritaisytu gylio matavimo prietaisu.

Tirpiklio ar nešiklio kontrolinis ėminys – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis neapdorotas ėminys, kuris tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti atskaitos vertę ėminiams, paveiktiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje ar nešiklyje. Kai bandomas kartu su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, šis ėminys taip pat parodo, ar vyksta tirpiklio arba nešiklio sąveika su bandymo sistema.

Medžiaga – natūralios būsenos arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, įskaitant visus priedus, kurie reikalingi produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą jo gamybos proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties;

Paviršinio aktyvumo medžiaga – dar vadinama paviršinio aktyvumo agentu, tai yra medžiaga, pvz., ploviklis, kuri gali sumažinti skysčio paviršiaus įtemptį, kad skystis galėtų putoti ar prasiskverbti į kietąsias medžiagas; be to, ji žinoma drėkiklio pavadinimu.

Žemynkryptis metodas – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad ji sukelia smarkų akių pažeidimą, kai cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (duoda teigiamą rezultatą), nustatomos atskiriant jas nuo kitų cheminių medžiagų (duoda neigiamą rezultatą).

Bandomoji cheminė medžiaga – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

Nuosekliųjų bandymų strategija – pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomosios cheminės medžiagos dirginamąją gebą galima nustatyti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol būtų galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.

Jungtinių Tautų visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (JT GHS) – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (4).

JT GHS 1 kategorija – žr. Smarkus akių pažeidimas ir (arba) Negrįžtamasis poveikis akims.

JT GHS 2 kategorija – žr. Akių dirginimas ir (arba) Grįžtamasis poveikis akims.

JT GHS be kategorijos – cheminės medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 arba 2 (2A ar 2B) kategorijos klasifikavimo reikalavimų. Sukeičiama su Neklasifikuojamos.

Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas – bandymų metodas, kurio patvirtinimo tyrimai atlikti, kad būtų nustatytas jo tinkamumas tam tikram tikslui pasiekti (įskaitant tikslumą) ir patikimumas. Svarbu pažymėti, kad patvirtinto tinkamumo bandymo metodo tikslumo ir patikimumo charakteristikos gali būti nepakankamos, kad jį būtų galima laikyti priimtinu siūlomam tikslui pasiekti.

Įrodomoji duomenų galia – įvairių informacijos dalių privalumų ir trūkumų nagrinėjimo procesas priimant ir patvirtinant sprendimą dėl cheminės medžiagos pavojingumo.

2 priedėlis

CHEMINĖS MEDŽIAGOS, SKIRTOS KVALIFIKACIJAI TIKRINTI TAIKANT ICE BANDYMŲ METODĄ

Prieš pradėdamos įprastiniu būdu atlikti bandymus, susijusius su šiuo bandymo metodu, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, tinkamai klasifikuodamos 1 lentelėje rekomenduojamų 13 cheminių medžiagų keliamą pavojų akims. Šios cheminės medžiagos buvo parinktos taip, kad atitiktų pavojų akims atsakų intervalą, atsižvelgiant į in vivo triušio akių bandymo (TG 405) rezultatus ir į JT GHS klasifikavimo sistemą (t. y. JT GHS 1, 2A, 2B kategorijas ar į GHS be kategorijos) (4)(6). Kiti atrankos kriterijai buvo galimybė pirkti chemines medžiagas ir tai, ar galima gauti aukštos kokybės in vivo etaloninius duomenis bei aukštos kokybės in vitro ICE bandymų metodo duomenis. Etaloniniai duomenys pateikti supaprastintame suvestiniame dokumente (5) ir ICE bandymų metodo ICCVAM istorinės apžvalgos dokumente (9).

1 lentelė

Cheminės medžiagos, rekomenduojamos techninei kvalifikacijai tikrinti taikant ICE bandymų metodą

Cheminė medžiaga

CAS Nr.

Cheminė klasė (13)

Agregatinė būsena

In vivo klasifikavimas (14)

In vitro klasifikavimas (15)

Benzalkonio chloridas (5 %)

8001-54-5

Onio junginys

Skystis

1 kategorija

1 kategorija

Chlorheksidinas

55-56-1

Aminas, amidinas

Kietoji medžiaga

1 kategorija

1 kategorija

Dibenzoil-L-vyno rūgštis

2743-38-6

Karboksirūgštis, esteris

Kietoji medžiaga

1 kategorija

1 kategorija

Imidazolas

288-32-4

Heterociklinis junginys

Kietoji medžiaga

1 kategorija

1 kategorija

Trichloracto rūgštis (30 %)

76-03-9

Karboksirūgštis

Skystis

1 kategorija

1 kategorija

2,6-dichlorbenzoil chloridas

4659-45-4

Acilhalogenidas

Skystis

2A kategorija

Neįmanoma pateikti prognozių (16)

Amonio nitratas

6484-52-2

Neorganinė druska

Kietoji medžiaga

2A kategorija (17)

Neįmanoma pateikti prognozių (16)

Etil-2-metilaceto acetatas

609-14-3

Ketonas, esteris

Skystis

2 B kategorija

Neįmanoma pateikti prognozių (16)

Dimetil sulfoksidas

67-68-5

Organinis sieros junginys

Skystis

Jokios kategorijos

Jokios kategorijos

Glicerolis

56-81-5

Alkoholis

Skystis

Be kategorijos

Be kategorijos (tarpinė vertė)

Metilciklo pentanas

96-37-7

Angliavandenilis (ciklinis)

Skystis

Be kategorijos

Be kategorijos

n-heksanas

110-54-3

Angliavandenilis (alifatinis)

Skystis

Be kategorijos

Be kategorijos

Triacetinas

102-76-1

Lipidas

Skystis

Neklasifikuojamos

Be kategorijos

Santrumpos: CAS Nr. – Cheminių medžiagų pavadinimų santrumpų tarnybos registracijos numeris.

3 priedėlis

ICE PERFUZIJOS APARATO IR AKIŲ LAIKIKLIŲ SCHEMOS

(Perfuzijos aparato ir akies laikiklio išsamesnis bendrasis aprašymas pateiktas Burton et al. (18))

Image

Detalės Nr.

Aprašymas

Detalės Nr.

Aprašymas

1

Šilto vandens išleidžiamoji anga

9

Kamera

2

Slankiojamosios durys

10

Akies laikiklis

3

Perfuzijos aparatas

11

Viščiuko akis

4

Optinis matavimo prietaisas

12

Fiziologinio tirpalo išleidžiamoji anga

5

Šilto vandens įleidžiamoji anga

13

Fiksavimo varžtas

6

Fiziologinis tirpalas

14

Reguliuojamos padėties viršutinė svirtis

7

Šiltas vanduo

15

Nejudamoji apatinė svirtis

8

Fiziologinio tirpalo įleidžiamoji anga

 

14)

B dalies B.49 skyrius pakeičiamas taip:

„B.49    In vitro žinduolių ląstelių mikrobranduolių bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 487 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

In vitro mikrobranduolių (MNvit) tyrimas yra genotoksiškumo bandymas, skirtas tarpfazinių ląstelių citoplazmos mikrobranduoliams (angl. micronuclei, MN) aptikti. Mikrobranduoliai gali susidaryti iš chromosomų acentrinių fragmentų (t. y. neturinčių centromeros) arba iš visų chromosomų, kurios ląstelių dalijimosi anafazės stadijoje negali migruoti link polių. Todėl MNvit bandymas yra in vitro metodas, kuris užtikrina patikimą pagrindą tiriant in vitro chromosomų pažeidimo gebą, nes galima aptikti aneugenus ir klastogenus (2) (3) ląstelėse, kurioms įvyko ląstelių dalijimasis veikiant chemine medžiaga arba pasibaigus veikimui (daugiau informacijos pateikta 13 pastraipoje). Mikrobranduoliai rodo pažeidimą, kuris buvo perduotas dukterinėms ląstelėms, o metafazės ląstelėse užfiksuotos chromosomų aberacijos gali būti neperduotos. Bet kuriuo atveju pokyčiai gali būti nesuderinami su ląstelės išgyvenamumu.

Pagal šį bandymo metodą galima naudoti protokolus su aktino polimerizacijos inhibitoriumi citochalazinu B (citoB) arba be jo. Pridėjus citoB prieš mitozę gaunamos dvibranduolės ląstelės, todėl yra galimybė atpažinti ir analizuoti mikrobranduolius tik tose ląstelėse, kuriose įvyko viena mitozė (4) (5). Pagal šį bandymo metodą taip pat galima naudoti protokolus be citokinezės blokavimo, jei yra įrodymų, kad analizuojamoje ląstelių populiacijoje įvyko mitozė.

Be MNvit tyrimo taikymo nustatant chemines medžiagas, kurios indukuoja mikrobranduolius, imunocheminio kinetochorų ženklinimo arba hibridizacijos su centromeriniais ar telomeriniais zondais (fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH)) naudojimas taip pat gali suteikti papildomos informacijos apie chromosomų pažeidimo ir mikrobranduolių susidarymo mechanizmus (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Šias ženklinimo ir hibridizacijos procedūras galima taikyti, kai yra padidėjęs mikrobranduolių susidarymas ir tyrėjas nori nustatyti, ar tą padidėjimą sukėlė klastogeniniai ir (arba) aneugeniniai reiškiniai.

Kadangi tarpfazinių ląstelių mikrobranduoliai gali būti įvertinti palyginti objektyviai, laboratorijos personalui tereikia nustatyti ląstelių su dviem branduoliais skaičių, kai naudojamas citoB, ir ląstelių su mikrobranduoliais dažnumą visais atvejais. Todėl objektinių stiklelių tyrimas yra palyginti spartus ir analizė gali būti automatizuota. Dėl to įmanoma įvertinti ne šimtus, o tūkstančius vieno apdorojimo ląstelių, todėl kriterijaus galia padidėja. Galiausiai, kadangi mikrobranduoliai gali susidaryti iš atsiliekančių chromosomų, yra galimybė aptikti aneuploidiją sukeliančias medžiagas, kurias sunku tirti įprastais chromosomų aberacijos bandymais, pvz., šio priedo B.10 (18). Tačiau taikant šiame bandymo metode aptašytą MNvit bandymą, negalima atskirti cheminių medžiagų, sukeliančių chromosomų skaičiaus pokyčius ir (arba) ploidiją, nuo klastogeniškumą sukeliančių medžiagų, jei netaikomi specialieji metodai, pvz., 4 pastraipoje nurodytas FISH metodas.

MNvit tyrimas yra patikimas ir gali būti atliekamas su įvairių tipų ląstelėmis, esant citoB arba jo nesant. Yra daug duomenų, kurie patvirtina MNvit bandymo tinkamumą, naudojant įvairių tipų ląsteles (ląstelių linijų kultūras ar pirminių ląstelių kultūras) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Pirmiausia tai yra tarptautiniai tinkamumo patvirtinimo tyrimai, kuriuos koordinavo Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23), ir tarptautinio genotoksiškumo bandymų seminaro ataskaitos (5) (17). Turimi duomenys buvo pakartotinai įvertinti atliekant retrospektyvųjį tinkamumo patvirtinimo tyrimą įrodomosios vertės analizės metodu, kurį atliko Europos Komisijos Europos alternatyvių metodų tinkamumo patvirtinimo centras (ECVAM), o ECVAM mokslinis patariamasis komitetas (ESAC) patvirtino tyrimo metodą kaip moksliškai patikimą (37) (38) (39).

Atliekant žinduolių ląstelių MNvit bandymą, galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų arba žmogaus ar graužikų kilmės pirminių ląstelių kultūras. Kadangi foninis mikrobranduolių dažnumas turės poveikį bandymo jautriui, rekomenduojama naudoti ląstelių tipus, kurių mikrobranduolių susidarymo foninis dažnumas yra mažas ir stabilus. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą gerai augti kultūroje, kariotipų stabilumą (įskaitant chromosomų skaičių) ir spontaninį mikrobranduolų dažnumą. Atsižvelgiant į šiuo metu turimus duomenis, neįmanoma pateikti tvirtų rekomendacijų, bet svarbu nurodyti, kad, įvertinant cheminius pavojus, reikėtų atsižvelgti į bandymams pasirinktų ląstelių p53 būseną, genetinį (kariotipo) stabilumą, DNR atkūrimo gebą ir kilmę (graužikų palyginti su žmogaus). Todėl šio bandymo metodo naudotojai raginami atsižvelgti į šių ir kitų ląstelių charakteristikų įtaką ląstelių linijos savybėms aptinkant mikrobranduolių indukciją, nes šios srities žinių visą laiką daugėja.

Vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

Bandymus atliekant in vitro paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį, išskyrus atvejus, kai ląstelės yra metaboliškai pajėgios bandomųjų cheminių medžiagų atžvilgiu. Egzogeninė metabolinio aktyvinimo sistema nevisiškai atkartoja in vivo sąlygas. Reikėtų imtis priemonių, kad būtų išvengta sąlygų, kurioms esant būtų gauti dirbtinai teigiami rezultatai, nerodantys bandomųjų cheminių medžiagų genotoksiškumo. Tokios sąlygos gali atsirasti dėl tokių veiksnių kaip pH pH (41) (42) (43) ar osmolialumo pokyčiai, sąveika su ląstelių kultūros terpe (44) (45) ar per didelis citotoksiškumas (žr. 29 pastraipą).

Mikrobranduolių indukcijai analizuoti svarbiausia, kad apdorotose ir neapdorotose kultūrose būtų įvykusi mitozė. Informatyviausias mikrobranduolių vertinimo etapas vyksta ląstelėse, kuriose veikiant bandomąja chemine medžiaga arba po to įvyko viena mitozė. Pramoninėms nanomedžiagoms gali prireikti tam tikro šio bandymų metodo pakeitimų, kurie šiame bandymų metode neaprašyti.

Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMO PRINCIPAS

Žmogaus ar kitų žinduolių kilmės ląstelių kultūros veikiamos bandomąja chemine medžiaga naudojant egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį arba jo nenaudojant, jei naudojamos reikiamą metabolinę gebą turinčios ląstelės (žr. 19 pastraipą).

Ląstelės auginamos pakankamą laikotarpį veikimo bandomąja chemine medžiaga metu arba po jo, kad įvyktų chromosomų pažeidimas arba kiti ląstelių ciklo ar ląstelių dalijimosi reiškiniai, dėl kurių interfazinėse ląstelėse imtų formuotis mikrobranduoliai. Aneuploidijai indukuoti bandomoji cheminė medžiaga paprastai turėtų būti mitozės metu. Surinktos ir nudažytos interfazinės ląstelės analizuojamos ieškant mikrobranduolių. Geriausiai būtų skaičiuoti mikrobranduolius tik tose ląstelėse, kuriose mitozė pasibaigia veikimo bandomąja chemine medžiaga metu arba jam pasibaigus, jei toks taikomas. Citokinezės blokatoriumi apdorotose kultūrose tai lengvai pasiekiama skaičiuojant tik dvibranduoles ląsteles. Jei nėra citokinezės blokatoriaus, svarbu įrodyti, kad analizuojamų ląstelių dalijimasis galimai įvyko atsižvelgiant į ląstelių populiacijos didėjimą veikimo bandomąja chemine medžiaga metu arba po jo. Pagal visus protokolus svarbu įrodyti, kad ląstelių proliferacija įvyko kontrolinėje ir apdorotoje kultūrose, o bandomosios cheminės medžiagos sukelto citotoksiškumo arba citostazės laipsnį reikėtų įvertinti visose kultūrose, kuriose skaičiuojami mikrobranduoliai.

METODO APRAŠYMAS

Ląstelės

Galima naudoti pirminių žmogaus arba kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitų kultūras (7) (20) (46) (47) ir įvairias graužikų ląstelių linijas, pvz., CHO, V79, CHL/IU ir L5178Y ląsteles, arba žmogaus ląstelių linijas, pvz., TK6, (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (žr. 6 pastraipą). Atliekant mikrobranduolių bandymus, buvo naudotos kitos ląstelių linijos, pvz., HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2 ląstelės (52) (53), A549 ir pirminės Sirijos žiurkėno embrioninės ląstelės (54), bet jų tinkamumas šiuo metu nėra plačiai patvirtintas. Todėl šių ląstelių linijų ir tipų naudojimą reikėtų pagrįsti, atsižvelgiant į jų įrodytas bandymo charakteristikas, kaip aprašyta Priimtinumo kriterijų skyriuje. Buvo paskelbta, kad CitoB gali daryti įtaką L5178Y ląstelių augimui, todėl jis nerekomenduojamas naudoti su šia ląstelių linija (23). Naudojant pirmines ląsteles, dėl gyvūnų gerovės priežasčių reikėtų atsižvelgti į galimybę naudoti, jei įmanoma, žmogiškos kilmės pirmines ląsteles, ir ėminius imti atsižvelgiant į žmonių etikos principus ir reglamentus.

Žmogaus periferinio kraujo limfocitus reikėtų gauti iš jaunų (maždaug 18–35 metų amžiaus), nerūkančių žmonių, kurie nesirgtų ar nebūtų neseniai paveikti genotoksiniais agentais (pvz., cheminėmis medžiagomis, jonizuojančiąja spinduliuote), esant tokiems jų lygiams, kurie padidintų ląstelių su mikrobranduoliais foninį dažnumą. Tai užtikrintų, kad ląstelių su mikrobranduoliais foninis dažnumas būtų mažas ir pastovus. Ląstelių su mikrobranduoliais dažnumo atskaitos vertė didėja senstant ir ši tendencija labiau pasireiškia moterims nei vyrams (55). Jei naudojamos ląstelės paimamos daugiau kaip iš vieno donoro, turėtų būti nurodytas donorų skaičius. Būtina įrodyti, kad ląstelės dalijosi nuo ląstelių ėminio veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžios. Ląstelių kultūros laikomos eksponentinio augimo fazėje (ląstelių linijos) arba stimuliuojamos dalytis (pirminės limfocitų kultūros), kad ląstelės būtų veikiamos skirtingose ląstelės ciklo stadijose, nes ląstelių stadijų jautris bandomosioms cheminėms medžiagoms gali būti nežinomas. Pirminės ląstelės, kurias reikia stimuliuoti mitogeniniais agentais, kad jos pradėtų dalytis, paprastai daugiau nesinchronizuojamos jas veikiant bandomąja chemine medžiaga (pvz., žmogaus limfocitai po 48 h mitogeninio stimuliavimo). Naudoti sinchronizuotas ląsteles veikimo bandomąja chemine medžiaga metu nerekomenduojama, bet gali būti priimtina, jei būtų pagrįsta.

Terpės ir kultūros sąlygos

Prižiūrimoms kultūroms reikėtų naudoti reikiamą kultūros terpę ir inkubavimo sąlygas (kultūros indus, drėkinamąją 5 % CO2 atmosferą, jei tinka, temperatūrą – 37 °C). Ląstelių linijos turėtų būti reguliariai tikrinamos, ar nesikeičia modalinis chromosomų skaičius ir nėra mikoplazmos užkrato, o užkrėstos arba pakitusio modalinio chromosomų skaičiaus ląstelės neturėtų būti naudojamos. Turėtų būti nustatyta bandymo laboratorijoje naudojamų ląstelių linijų ar pirminių kultūrų normalaus ląstelių ciklo trukmė ir ji turėtų atitikti paskelbtas ląstelių charakteristikas.

Kultūrų paruošimas

Ląstelių linijos: ląstelės yra dauginamos iš kamieninių kultūrų, sėjamos kultūros terpėje tokiu tankiu, kad ląstelės suspensijose ar monosluoksniuose visą laiką iki pat surinkimo laiko augtų eksponentiškai (pvz., reikėtų vengti monosluoksniuose augančių ląstelių susiliejimo).

Limfocitai: viso kraujo ėminys, apdorotas antikoaguliantu (pvz., heparinu), ar iš to kraujo atskirti limfocitai auginami (pvz., žmogaus limfocitai – 48 h) esant mitogeno (pvz., žmogaus limfocitams – fitohemagliutinino (PHA)), kad ląstelės pradėtų dalytis prieš jas paveikiant bandomąja chemine medžiaga ir citoB.

Metabolinis aktyvinimas

Kai naudojamos nepakankamos endogeninės metabolinės gebos ląstelės, reikėtų naudoti egzogenines metabolinimo sistemas. Jei nebūtų pagrįsta kita sistema, dažniausiai kaip numatytoji rekomenduojama sistema yra kofaktoriumi papildyta pomitochondrinė frakcija (S9), ruošiama iš graužikų (paprastai žiurkių) kepenų, paveiktų fermentų aktyvumą skatinančiais agentais, pvz,. Aroclor 1254 (56) (57) ar fenobarbitalio ir b-naftoflavono deriniu (58) (59) (60). Pastarasis derinys neprieštarauja Stokholmo konvencijai dėl patvariųjų organinių teršalų (61) ir pasirodė esąs toks pat veiksmingas kaip Aroclor 1254 mišrių funkcijų oksidazėms skatinti (58) (59) (60) (28). S9 frakcija paprastai naudojama nuo 1 % iki 2 % (tūrio) koncentracijos, bet galutinio bandymo terpėje gali būti padidinta iki 10 % (tūrio). Paveikiant bandomąja chemine medžiaga reikėtų vengti naudoti produktus, kurie mažina mitozinį indeksą, ypač su kalciu kompleksus sudarančius produktus (62). Naudojamos egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos ar metabolizmo skatinimo priemonės tipo ir koncentracijos pasirinkimui įtakos gali turėti naudojamų cheminių medžiagų klasė.

Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas

Prieš apdorojant ląsteles, kietąsias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ir, jei reikia, praskiesti. Skystąsias chemines medžiagas galima dėti tiesiogiai į bandymo sistemą ir (arba) praskiesti prieš apdorojant bandymo sistemą. Dujos ar lakiosios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos atitinkamai pakeitus standartinius protokolus, pvz., apdorojimas sandariuose kultūros induose (63) (64) (65). Bandomųjų cheminių medžiagų preparatus reikėtų ruošti prieš pat apdorojimą, išskyrus atvejus, kai stabilumo duomenys rodo, kad juos galima laikyti.

Bandymo sąlygos

Tirpikliai

Tirpiklį reikėtų pasirinkti taip, kad būtų optimizuotas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas, bet nebūtų daroma neigiama įtaka tyrimo eigai, pvz., kistų ląstelių augimas, būtų paveiktas bandomosios cheminės medžiagos vientisumas, vyktų reakcija su kultūros indais, būtų pakenkta metabolinio aktyvinimo sistemai. Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti vandeninį tirpiklį (ar kultūros terpę). Gerai ištirti tirpikliai yra vanduo ar dimetilsulfoksidas (DMSO). Paprastai organinių tirpiklių kiekis neturėtų būti didesnis kaip 1 % (tūrio). Jei citoB tirpinamas DMSO, cheminei medžiagai ir citoB tirpinti naudojamas organinio tirpiklio suminis kiekis neturėtų būti didesnis kaip 1 % (tūrio); priešingu atveju reikėtų naudoti neapdorotus kontrolinius ėminius, kad būtų galima įsitikinti, ar organinio tirpiklio procentinis kiekis nedaro neigiamo poveikio. Vandeninių tirpiklių (natrio chlorido tirpalo ar vandens) koncentracija galutinėje apdorojimo terpėje neturėtų būti didesnė kaip 10 % (tūrio). Jei naudojami tinkamai neištirti tirpikliai (pvz., etanolis ar acetonas), jų naudojimas turėtų būti pagrįstas duomenimis, kurie rodytų tirpiklio suderinamumą su bandomąja chemine medžiaga bei bandymo sistema ir genetinio toksiškumo nebuvimą, esant naudojamai koncentracijai. Jei tokių patvirtinančių duomenų nėra, svarbu įtraukti neapdorotus kontrolinius ėminius (žr. 1 priedėlį), taip pat tirpiklio kontrolinius ėminius, siekiant įrodyti, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir nesukelia žalingo poveikio chromosomoms (pvz., aneuploidijos ar klastogeniškumo).

CitoB kaip citokinezės blokatoriaus naudojimas

Vienas iš svarbiausių aspektų atliekant MNvit bandymą – užtikrinti, kad skaičiuojamų ląstelių mitozė būtų baigta apdorojimo metu ar po jo. Todėl mikrobranduolių skaičiavimas turėtų apsiriboti ląstelėmis, kuriose mitozė įvyko apdorojimo metu ar po jo. CitoB yra medžiaga, kuri plačiausiai naudojama citokinezei blokuoti, nes slopina aktino susijungimą ir taip neleidžia dukterinėms ląstelėms atsiskirti po mitozės, dėl ko ima formuotis dvibranduolės ląstelės (6) (66) (67). Kai naudojamas citoB, kartu galima matuoti bandomosios cheminės medžiagos įtaką ląstelių proliferacijos kinetikai. CitoB reikėtų naudoti kaip citokinezės blokatorių, kai naudojami žmogaus limfocitai, nes ląstelių ciklo trukmė tarp donorų skirsis ir ne visi limfocitai reaguos į stimuliavimą PHA. CitoB nėra privalomas kitų tipų ląstelėms, jei būtų galima nustatyti, kad jos pasidalijo, kaip aprašyta 27 pastraipoje. Be to, citoB paprastai nenaudojamas, kai ėminių mikrobranduoliai įvertinami taikant tėkmės citometrinius metodus.

Laboratorija turėtų nustatyti reikiamą citoB koncentraciją kiekvieno tipo ląstelėms, kad būtų gautas optimalus dvibranduolių ląstelių dažnumas tirpiklio kontrolinėse kultūrose ir būtų įrodyta, kad gaunama skaičiavimui tinkama dvibranduolių ląstelių išeiga. Tinkama citoB koncentracija paprastai yra 3–6 μg/ml.

Ląstelių proliferacijos bei citotoksiškumo matavimas ir apdorojimo koncentracijos verčių parinkimas

Nustatant didžiausią bandymui naudojamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją reikėtų vengti koncentracijos, galinčios sukelti dirbtinį teigiamą atsaką, pvz., kuri sukeltų per didelį citotoksiškumą (žr. 29 pastraipą), nuosėdų kultūros terpėje (žr. 30 pastraipą) ar žymius pH arba osmolialumo pokyčius (žr. 9 pastraipą). Jei bandomosios cheminės medžiagos pridėjimo metu žymiai pakinta terpės pH vertė, ją būtų galima reguliuoti buferuojant galutinio apdorojimo terpę, kad būtų išvengta dirbtinių teigiamų rezultatų ir būtų užtikrintos tinkamos kultūros sąlygos.

Ląstelių proliferacija matuojama siekiant įsitikinti, ar bandymo metu pakankamas paveiktų ląstelių skaičius pasiekė mitozę ir ar apdorojama esant reikiamam citotoksiškumo lygiui (žr. 29 pastraipą). Citotoksiškumą reikėtų nustatyti pagrindinio bandymo metu pagal atitinkamus ląstelių žūties ir augimo rodiklius, esant ir nesant metaboliniam aktyvinimui (žr. 26 ir 27 pastraipas). Nors citotoksiškumo įvertinimas atliekant pradinį parengiamąjį bandymą gali būti naudingas pagrindinio bandymo koncentracijos vertėms geriau apibrėžti, pradinis bandymas nėra privalomas. Jei jis būtų atliekamas, jis neturėtų pakeisti citotoksiškumo matavimo atliekant pagrindinį bandymą.

Ląstelių apdorojimas citoB ir santykinio vienbranduolių, dvibranduolių ir daugiabranduolių ląstelių dažnumo kultūroje matavimas yra tikslus metodas kiekybiškai įvertinant poveikį ląstelių proliferacijai ir apdorojimo citotoksinį ar citostatinį aktyvumą (6) ir juo užtikrinama, kad per mikroskopą būtų skaičiuojamos tik apdorojimo metu ar po jo pasidalijusios ląstelės. Apdorojimo citotoksiniam ar citostatiniam aktyvumui įvertinti, lyginant apdorotų ir kontrolinių kultūrų vertes, rekomenduojamas citokinezės blokavimo proliferacijos indeksas (angl. cytokinesis-block proliferation index, CBPI)(6) (27) (68) arba replikacijos indeksas (angl. Replication Index, RI), imant ne mažiau kaip 500 ląstelių vienai kultūrai (dėl formulių žr. 2priedėlį). Kitų citotoksiškumo rodiklių (pvz., ląstelių vientisumo, apoptozės, nekrozės, metafazės ląstelių skaičiaus, ląstelės ciklo) vertinimas galėtų suteikti naudingos informacijos, bet jų nereikėtų naudoti vietoj CBPI ar RI.

Atliekant tyrimus be citoB, būtina įrodyti, kad kultūros ląstelės dalijosi taip, kad didžioji skaičiuojamų ląstelių dalis pasidalijo veikimo bandomąja cheminė medžiaga metu arba po jo. Apdorojimo citotoksiniam ar citostatiniam aktyvumui įvertinti rekomenduojamas santykinio populiacijos padvigubėjimo (RPD) ar santykinio ląstelių skaičiaus padidėjimo (RICC) matavimas (17) (68) (69) (70) (71) (dėl formulių žr. 2priedėlį). Jei atliekamas ilgalaikis apdorojimas (t. y. 1,5–2,0 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, o surenkama praėjus laikui, dar 1,5–2,0 karto ilgesniam nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, iš viso gaunant ėminių ėmimo trukmę 3–4 kartus ilgesnę nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, kaip aprašyta 38 ir 39 pastraipose), taikant RPD gali būti gautas per mažas citotoksiškumo įvertis (71). Šiomis aplinkybėmis geresnis matas galėtų būti RICC arba naudingas įvertis galėtų būti ir RPD, citotoksiškumą įvertinant praėjus laikui, kuris būtų 1,5–2 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė. Kitų citotoksiškumo ar citostazės rodiklių (pvz., ląstelių vientisumo, apoptozės, nekrozės, metafazės ląstelių skaičiaus, proliferacijos indekso (PI), ląstelės ciklo, nukleoplazmos tiltelių ar branduolų užuomazgų) vertinimas galėtų suteikti naudingos informacijos, bet jų nereikėtų naudoti vietoj RPD ar RICC.

Reikėtų įvertinti ne mažiau kaip tris bandymo koncentracijos vertes (neįskaitant tirpiklio ir teigiamus kontrolinius ėminius), kurios atitinka priimtinumo kriterijus (reikiamas citotoksiškumas, ląstelių skaičius ir kt.). Neatsižvelgiant į ląstelių tipą (ląstelių linijos ar pirminės limfocitų kultūros), galima naudoti kiekvienos bandymo koncentracijos kartotines ar pavienes apdorotas kultūras. Nors patariama naudoti kartotines kultūras, pavienės kultūros taip pat priimtinos, jei vertinamas vienodas suminis pavienės ar kartotinės kultūros ląstelių skaičius. Naudoti pavienę kultūrą ypač tinka, kai vertinamos daugiau kaip 3 koncentracijos vertės (žr. 44–45 pastraipas). Nepriklausomoms kartotinėms kultūroms gauti tam tikros koncentracijos rezultatai gali būti subendrinti duomenų analizei (38). Jei bandomoji cheminė medžiaga rodo mažą citotoksiškumą arba jo visai nėra, paprastai tiktų maždaug nuo 2 iki 3 kartų besiskiriančios koncentracijos intervalai. Jei citotoksiškumas nustatomas, pasirinktos koncentracijos vertės turėtų aprėpti intervalą nuo koncentracijos, kuriai citotoksiškumas pasireiškia, kaip aprašyta 29 pastraipoje, įtraukiant koncentracijos vertes, kurioms gaunamas vidutinis citotoksiškumas ar jo visai nėra. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijos atsako kreivės kyla staigiai, todėl norint gauti mažo arba vidutinio citotoksiškumo duomenis arba išsamiai ištirti dozės ir atsako santykį, būtina naudoti arčiau išdėstytas ir (arba) daugiau kaip tris koncentracijos vertes (pavienių ar kartotinių kultūrų), ypač tomis aplinkybėmis, kai reikia atlikti kartotinį bandymą (žr. 60 pastraipą).

Jei maksimali koncentracija pagrįsta citotoksiškumu, didžiausiai koncentracijai reikėtų pasiekti 55 ± 5 % citotoksiškumą, taikant rekomenduotus citotoksiškumo parametrus (t. y. ląstelių linijų RICC bei RPD sumažėjimą, kai citoB nenaudojamas, ir CBPI ar RI sumažėjimą iki 45 ± 5 % vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio, kai citoB yra naudojamas) (72). Reikėtų atsargiai aiškinti teigiamus rezultatus, kurie būtų gauti tik viršutiniam šio 55 ± 5 % citotoksiškumo intervalo galui (71).

Jei mažai tirpios bandomosios cheminės medžiagos nėra citotoksiškos, kai koncentracija yra mažesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, veikimo bandomąja chemine medžiaga pabaigoje, esant didžiausiai analizuojamai koncentracijai, turėtų atsirasti drumstumas arba nuosėdos, matomos plika akimi arba per inversinį mikroskopą. Netgi jei citotoksiškumas pasireiškia, kai koncentracija yra didesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, patartina bandyti tik esant vienai drumstumą ar matomas nuosėdas sukeliančiai koncentracijai, nes nuosėdos gali daryti dirbtinį poveikį. Esant koncentracijai, kurioje susidaro nuosėdos, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad nuosėdos netrukdytų atlikti bandymą (pvz., dažymą ar įvertinimą). Gali padėti tirpumo nustatymas kultūros terpėje prieš atliekant bandymą.

Jei nuosėdų ar ribinio citotoksiškumo nestebima, didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti 10 mmol/l, 2 mg/ml ar 2 μl/ml, pasirenkant mažiausią (73) (74) (75). Jei bandomoji cheminė medžiaga yra neapibrėžtos sudėties, pvz., nežinomos ar kintamos sudėties medžiaga, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos (UVCB) (76), iš aplinkos ekstrahuojamas ėminys ir kt., nesant pakankamam citotoksiškumui, gali prireikti didesnės didžiausios koncentracijos (pvz., 5 mg/ml), kad būtų didesnė kiekvieno iš komponentų koncentracija. Reikėtų pažymėti, kad žmonėms skirtiems vaistiniams preparatams šie reikalavimai gali skirtis (93).

Kontroliniai ėminiai

Kiekvieną kartą surenkant kultūrą, reikėtų įtraukti vienalaikius neigiamus kontrolinius ėminius (žr. 21 pastraipą), sudarytus vien tik iš tirpiklio apdorojimo terpėje ir apdorotus taip pat, kaip apdorojamos kultūros.

Vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai yra būtini siekiant įrodyti laboratorijos gebėjimą naudojamo bandymų protokolo sąlygomis identifikuoti klastogenus bei aneugenus ir egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą (jei taikoma). Teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai pateikiami toliau 1 lentelėje. Galima naudoti alternatyvias teigiamas kontrolines chemines medžiagas, jei tai būtų pagrįsta.

Šiuo metu nežinoma jokių aneugenų, kurių genotoksiniam aktyvumui būtinas metabolinis aktyvinimas (17). Kadangi genetinio toksiškumo žinduolių ląstelėms bandymai in vitro yra pakankamai standartizuoti, esant trumplaikiam apdorojimui, atliekamam vienu metu su metaboliniu aktyvinimu ar be jo, naudojant vienodą apdorojimo trukmę, teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas gali apsiriboti klastogenu, kuriam būtinas metabolinis aktyvinimas. Šiuo atveju vieno klastogeninio teigiamo kontrolinio ėminio atsakas įrodys metabolinio aktyvinimo sistemos aktyvumą ir bandymo sistemos jautrį. Tačiau ilgalaikiam apdorojimui (be S9) reikėtų turėti savo teigiamą kontrolinį ėminį, nes apdorojimo trukmė skirsis nuo metabolinį aktyvinimą naudojančio bandymo trukmės. Jei atliekant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ar be jo, kaip vienas teigiamas kontrolinis ėminys pasirenkamas klastogenas, tai atliekant ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo reikėtų pasirinkti aneugeną. Reikėtų naudoti teigiamus kontrolinius ėminius su klastogenu ir aneugenu, jei ląstelės yra metaboliškai pajėgios ir joms nereikia S9.

Kiekvienas teigiamas kontrolinis ėminys turėtų būti naudojamas vienos arba kelių koncentracijos verčių, kurioms esant būtų galima tikėtis gauti atkuriamą ir aptinkamą didesnį nei fonas atsaką, kad būtų galima įrodyti bandymo sistemos jautrį (t. y. poveikis yra aiškus, bet tyrėjui ne iš karto atskleidžiama užkoduotų objektinių stiklelių tapatybė), ir atsako neturėtų sutrikdyti citotoksiškumas, kuris viršytų šiam bandymo metodui nustatytas ribas.

1 lentelė

Etaloninės cheminės medžiagos, rekomenduojamos laboratorijos kvalifikacijai vertinti ir teigiamiems kontroliniams ėminiams pasirinkti

Kategorija

Cheminė medžiaga

CAS Nr.

1.   Klastogenai, aktyvūs be metabolinio aktyvinimo

 

Metilmetansulfonatas

66-27-3

 

Mitomicinas C

50-07-7

 

4-nitrochinolin-N-oksidas

56-57-5

 

Citozino arabinozidas

147-94-4

2.   Klastogenai, kuriems reikia metabolinio aktyvinimo

 

Benz(a)pirenas

50-32-8

 

Ciklofosfamidas

50-18-0

3.   Aneugenai

 

Kolchicinas

64-86-8

 

Vinblastinas

143-67-9

PROCEDŪRA

Apdorojimo planas

Siekiant padidinti tikimybę aptikti aneugeną ar klastogeną, veikiantį tam tikroje ląstelės ciklo stadijoje, svarbu, kad bandomąja chemine medžiaga būtų apdorotas pakankamas skaičius ląstelių, reprezentuojančių visas įvairias ląstelių ciklo stadijas. Kiekvienas apdorojimas turėtų prasidėti ir baigtis ląstelėms augant eksponentiškai ir ląstelės turėtų augti iki ėminio ėmimo pradžios. Todėl ląstelių linijų ir pirminių ląstelių kultūrų apdorojimo planas gali kažkiek skirtis nuo taikomo limfocitams, kurių ląstelių ciklui pradėti būtinas mitogeninis stimuliavimas (17). Jei tai limfocitai, veiksmingiausias metodas yra pradėti veikti bandomąja chemine medžiaga praėjus 44–48 h nuo stimuliavimo PHA, kai ląstelės toliau dalysis nesinchroniškai (6).

Paskelbti duomenys (19) rodo, kad dauguma aneugenų ir klastogenų bus aptikti per trumpą 3–6 h apdorojimo laikotarpį esant ir nesant S9, vėliau bandomoji cheminė medžiaga pašalinama ir ėminiai imami nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (7).

Tačiau siekiant atlikti išsamų įvertinimą, kurio prireiktų neigiamam rezultatui patvirtinti, visos šios trys Bandymo sąlygos turėtų būti įgyvendintos, taikant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ir be jo bei ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo (žr. 56, 57 ir 58 pastraipas):

ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga be metabolinio aktyvinimo 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (19),

ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metaboliniam aktyvinimui 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (19),

ląstelės turėtų būti nuolat veikiamos be metabolinio aktyvinimo tol, kol bus surenkamos praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Jei esant kuriai nors vienai iš pirmiau nurodytų bandymo sąlygų gaunamas teigiamas atsakas, gali būti nebūtina tirti kurią nors kitą apdorojimo schemą.

Jei žinoma ar yra įtarimų, kad bandomoji cheminė medžiaga daro įtaką ląstelių ciklo trukmei (pvz., kai bandomi nukleozidų analogai), ypač p53 kompetentinėms ląstelėms (35) (36) (77), papildomas ėminių ėmimo arba regeneravimo laikas galėtų būti dar 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (t. y. laikas nuo trumpalaikio ir ilgalaikio apdorojimo pradžios iš viso būtų 3,0–4,0 kartus ilgesnis nei ląstelių ciklo trukmė). Šios pasirinktys skirtos situacijoms, kai gali kilti susirūpinimas dėl galimos bandomosios cheminės medžiagos ir citoB sąveikos. Jei taikoma ilgesnė ėminių ėmimo trukmė (t. y. laikas iš viso būtų 3,0–4,0 kartus ilgesnis nei kultūros ląstelių ciklo trukmė), reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad vis dar vyktų aktyvus ląstelių dalijimasis. Pvz., limfocitų eksponentinis augimas gali pradėti mažėti praėjus 96 h nuo stimuliavimo ir vienasluoksnės ląstelių kultūros gali susilieti.

Siūlomi ląstelių apdorojimo planai pateikti 2 lentelėje. Šie bendrieji apdorojimo planai gali būti keičiami (ir turėtų būti pagrįsti), atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ar reaktyvumą ar tam tikras naudojamų ląstelių augimo charakteristikas.

2 lentelė

MNvit tyrimo ląstelių apdorojimo ir surinkimo trukmė

Limfocitai, pagrindinės ląstelės ir ląstelių linijos, apdorotos citoB

Trumpalaikis apdorojimas esant S9

Apdorojama 3–6 h esant S9;

pašalinama S9 ir apdorojimo terpė;

įpilama naujos terpės ir citoB;

surenkama nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Trumpalaikis apdorojimas nesant S9

Apdorojama 3–6 h;

pašalinama apdorojimo terpė;

įpilama naujos terpės ir citoB;

surenkama nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Ilgalaikis apdorojimas nesant S9

Apdorojama 1,5 – 2 kartus ilgiau nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, esant citoB;

surenkama pasibaigus apdorojimo laikotarpiui.

Ląstelių linijos, apdorotos nenaudojant citoB

(Apdorojama pagal pirmiau pateiktus apdorojimo planus, išskyrus tai, kad nededama citoB)

Vienasluoksnių kultūrų 3–6 h trukmės apdorojimo pabaigoje gali būti mitozinių ląstelių (atpažįstamų iš apvalios formos ir atsiskyrimo nuo paviršiaus). Kadangi šios mitozinės ląstelės lengvai atsiskiria, jos gali būti prarastos šalinant terpę su bandomąja chemine medžiaga. Jei yra įrodymų dėl esminio mitozinių ląstelių skaičiaus padidėjimo palyginti su kontroliniais ėminiais, rodančio galimą ląstelių susilaikymą mitozės metu, jas reikėtų surinkti centrifugavimu ir surinkimo metu grąžinti į kultūrą, kad nebūtų prarastos mitozės ląstelės, kurioms kyla mikrobranduolių susidarymo ar chromosomų aberacijos rizika.

Ląstelių surinkimas ir preparatų ant objektinių stiklelių paruošimas

Kiekviena kultūra turėtų būti surenkama ir apdorojama atskirai. Ruošiamos ląstelės gali būti apdorojamos hipotoniniu tirpalu, tačiau šis veiksmas nebūtinas, jei ląsteles galima tinkamai paskleisti kitu būdu. Objektinius stiklelius galima paruošti įvairiais būdais, jei skaičiavimui gaunami aukštos kokybės ląstelių preparatai. Ląstelės su nepaliesta ląstelių membrana ir citoplazma turėtų būti išsaugotos, kad būtų galima aptikti mikrobranduolius ir citokinezės blokavimo metodu patikimai nustatyti dvibranduoles ląsteles.

Preparatai ant objektinio stiklelio gali būti dažomi įvairiais metodais, pvz., Giemsa arba DNR specifiniais dažikliais. Naudojant tinkamus fluorescencinius dažus (pvz., akridino oranžinį (78) ar Hoechst 33258 ir pironiną Y (79)), galima pašalinti kai kuriuos artefaktus, susijusius su DNR nespecifinių dažų naudojimu. Mikrobranduolių turiniui nustatyti gali būti naudojami antikinetochoro antikūnai FISH analizė ir pancentromeriniai DNR zondai arba in situ ženklinimas pancentromerų specifiniais užpildais kartu su atitinkamu DNR priešpriešiniu dažymu (nusidažo sveika chromosoma, bet ne acentriniai chromosomų fragmentai), jei domina informacija apie mikrobranduolių susidarymo mechanizmą (16) (17). Gali būti taikomi kiti metodai klastogenams ir aneugenams atskirti, jei jie pasirodytų efektyvūs ir būtų patvirtintas jų tinkamumas. Pvz., tam tikrų ląstelių linijų hipodiploidinių ląstelių branduolių kaip hipodiploidinių reiškinių matavimas taikant, pvz., vaizdo analizės, lazerinės skenuojančios citometrijos ar tėkmės citometrijos metodus, taip pat galėtų suteikti naudingos informacijos (80) (81) (82). Morfologiniai branduolių stebėjimai taip pat galėtų rodyti galimą aneuploidiją. Be to, metafazės chromosomų aberacijų bandymas, pageidautina to paties ląstelių tipo ir taikant palyginamojo jautrio protokolą, taip pat galėtų būti patogus būdas nustatyti, ar mikrobranduoliai susidaro dėl chromosomų trūkimo (žinant, kad chromosomų praradimas nebūtų aptiktas atliekant chromosomų aberacijų bandymą).

Analizė

Prieš atliekant mikrobranduolių dažnumo mikroskopinę analizę, visi objektiniai stikleliai turėtų būti nepriklausomai užkoduoti, įskaitant tirpiklio, neapdorotų ėminių (jei naudojami) ir teigiamų kontrolinių ėminių stiklelius. Reikėtų taikyti atitinkamus metodus, kad būtų galima kontroliuoti sistemingąsias paklaidas ar poslinkį, kai naudojamos automatizuotos skaičiavimo sistemos, pvz., tėkmės citometrijos, lazerinės skenuojančios citometrijos ar vaizdo analizės sistemos. Neatsižvelgiant į mikrobranduoliams skaičiuoti naudojamą automatizuotą sistemą, tuo pačiu metu reikėtų įvertinti CBPI, RI, RPD ar RICC.

CitoB apdorotose kultūrose mikrobranduolių dažnumą reikėtų analizuoti bent 2 000 dvibranduolių ląstelių kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui (83), vienodai padalytų tarp kartotinių ėminių, jei jie naudojami Jei dozei naudojama po vieną kultūrą (žr. 28 pastraipą), reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 2 000 dvibranduolių šios pavienės kultūros ląstelių (83). Jei vienai (kartotinių kultūrų) kultūrai būtų suskaičiuota gerokai mažiau kaip po 1 000 dvibranduolių ląstelių arba mažiau kaip 2 000 ląstelių (pavienei kultūrai), o reikšmingo mikrobranduolių skaičiaus padidėjimo nebūtų aptikta, bandymą reikėtų pakartoti naudojant daugiau ląstelių arba mažiau citotoksinę koncentraciją, jei tai būtų tinkamiau. Reikia imtis atsargumo priemonių, kad nebūtų skaičiuojamos netaisyklingos formos arba labai nevienodo dydžio branduolių dvibranduolės ląstelės. Be to, dvibranduolių ląstelių nereikia painioti su blogai pasklidusiomis daugiabranduolėmis ląstelėmis. Ląstelės, kuriose yra daugiau kaip du pagrindiniai branduoliai, neturi būti analizuojamos dėl mikrobranduolių, nes šių ląstelių mikrobranduolių dažnumo atskaitos vertė gali būti didesnė (84). Skaičiuoti vienbranduoles ląsteles galima, jei yra įrodyta, kad bandomoji cheminė medžiaga veikia citoB aktyvumą. Tokiais atvejais galėtų būti naudingas kartotinis bandymas be citoB. Be dvibranduolių ląstelių skaičiaus naudingos informacijos galėtų suteikti vienbranduolių ląstelių skaičius (85) (86), bet jis nėra privalomas.

CitoB neapdorotų ląstelių linijų mikrobranduolių dažnumą reikėtų analizuoti bent 2 000 ląstelių kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui (83), vienodai padalytų tarp kartotinių ėminių, jei jie naudojami. Jei koncentracijai naudojama po vieną kultūrą (žr. 28 pastraipą), reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 2 000 šios pavienės kultūros ląstelių (83). Jei kiekvienos koncentracijos vienai (kartotinių kultūrų) kultūrai būtų suskaičiuota gerokai mažiau kaip po 1 000 ląstelių arba mažiau kaip 2 000 ląstelių (pavienei kultūrai), o reikšmingo mikrobranduolių skaičiaus padidėjimo nebūtų aptikta, bandymą reikėtų pakartoti naudojant daugiau ląstelių arba mažiau citotoksinę koncentraciją, jei tai būtų tinkamiau.

Kai naudojamas citoB, reikėtų nustatyti CBPI arba RI ląstelių proliferacijai įvertinti (žr. 2 priedėlį), naudojant ne mažiau kaip 500 ląstelių vienai kultūrai. Jei apdorojama nesant citoB, svarbu pateikti įrodymą, kad kultūros ląstelės dalijosi, kaip aptarta 24–28 skirsniuose.

Laboratorijos kvalifikacija

Siekdama įgyti pakankamos bandymo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams tyrimams, laboratorija turėtų būti atlikusi etaloninių teigiamų cheminių medžiagų bandymų seriją, joms veikiant pagal skirtingus mechanizmus (bent vieną su metaboliniu aktyvinimu, vieną – be jo ir vieną, kuri veiktų pagal aneugeninį mechanizmą, medžiagas pasirenkant iš 1 lentelės sąrašo) su įvairiais neigiamais kontroliniais ėminiais (įskaitant neapdorotas kultūras ir įvairius tirpiklius ar nešiklį). Šių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių atsakas turėtų atitikti literatūros duomenis. Tai netaikoma patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 49–52 pastraipose.

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų rinkinį (žr. 1 lentelę) reikėtų tirti atliekant trumpalaikį ir ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo, taip pat trumpalaikį apdorojimą esant metaboliniam aktyvinimui, kad būtų galima įrodyti kvalifikaciją aptikti klastogenines ir aneugenines chemines medžiagas, nustatyti metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą ir įrodyti skaičiavimo procedūrų (vizualios mikroskopinės analizės, tėkmės citometrijos, lazerinės skenuojančios citometrijos ar vaizdo analizės) tinkamumą. Pasirinktų cheminių medžiagų koncentracijos verčių intervalas turėtų būti pasirinktas taip, kad, siekiant įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, būtų gautas atkuriamas ir su koncentracija susijęs padidėjimas palyginti su fonu.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Laboratorija turėtų nustatyti:

istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,

istorinių neigiamų kontrolinių ėminių (neapdorotų, tirpiklio) intervalą ir pasiskirstymą.

Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas (87) (88). Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę iš pradžių turėtų sudaryti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei tokių palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (88)), kad galėtų nustatyti savo teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje (83). Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (87).

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į duomenų suderinamumą su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti pavienės kultūros ląstelių mikrobranduolių dažnumo skaičius arba kartotinių kultūrų skaičių suma, kaip aprašyta 28 pastraipoje. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas (87) (88). Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 50 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų pateikimas

Jei taikomas citokinezės blokavimo metodas, vertinant mikrobranduolių indukciją naudojamas tik dvibranduolių ląstelių su mikrobranduoliais (nepriklausomai nuo mikrobranduolių skaičiaus ląstelėje) dažnumas. Naudingos informacijos galėtų suteikti ląstelių su vienu, dviem ar keliais mikrobranduoliais skaičiai ir jų pateikimas atskirai ataskaitoje, bet tai neprivaloma.

Turėtų būti nustatyti visų apdorotų, neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių citotoksiškumo ir (arba) citostazės vienalaikių matavimų duomenys (16). Visų apdorotų ir kontrolinių kultūrų CBPI arba RI turi būti apskaičiuoti kaip ląstelių ciklo delsos matavimų duomenys, kai taikomas citokinezės blokavimo metodas. Jei apdorojama be citoB, reikėtų taikyti RPD arba RICC ar PI (žr. 2 priedėlį).

Turėtų būti pateikti atskiri kiekvienos kultūros duomenys. Be to, visi duomenys turi būti suvesti į lenteles.

Priimtinumo kriterijai

Bandymo priimtinumas pagrįstas šiais kriterijais:

laikoma, kad vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys gali būti įtrauktas į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę, kaip aprašyta 50 pastraipoje;

vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai (žr. 50 pastraipą) turėtų sukelti atsakus, kurie yra suderinami su rastais laboratorijos istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;

turėtų atitikti ląstelių proliferacijos tirpiklio kontroliniame ėminyje kriterijus (25–27 pastraipos);

bandoma esant visoms Bandymo sąlygoms, nebent vienai iš jų gaunami teigiami rezultatai (žr. 36–40 pastraipas);

analizuojamas pakankamas ląstelių ir koncentracijos verčių skaičius (28 ir 44–46 pastraipos).

didžiausios koncentracijos pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 24–31 pastraipose.

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Kai įvykdyti visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei esant kuriai nors ištirtai bandymo sąlygai (žr. 36–39 pastraipas):

bent vienai bandymo koncentracijai gaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu (89);

padidėjimas yra susijęs su doze esant bent vienai iš bandymo sąlygų, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų (žr. 28 pastraipą);

kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 52 pastraipą).

Kai įvykdyti visi šie kriterijai, laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti šios bandymų sistemos chromosomų trūkius ir (arba) skaičiaus padidėjimą ar sumažėjimą. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų taip pat galima rasti literatūroje (90) (91) (92).

Kai įvykdyti visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis (žr. 36–39 pastraipas):

jokiai bandymo koncentracijai negaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,

nėra su koncentracija susijusio padidėjimo, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,

visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 52 pastraipą).

Laikoma, kad ši bandomoji cheminė medžiaga negali sukelti šios bandymų sistemos chromosomų trūkių ir (arba) skaičiaus padidėjimo ar sumažėjimo. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų taip pat galima rasti literatūroje (90) (91) (92).

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.

Jei atsakas nėra aiškiai neigiamas ar aiškiai teigiamas, kaip apibūdinta pirmiau, ir (arba) siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą, duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus tyrimus. Galėtų būti naudingas papildomų ląstelių skaičiavimas (jei tinka) arba kartotinis bandymas galbūt modifikuotomis bandymo sąlygomis (pvz., tarpai tarp koncentracijos verčių, kitos metabolinio aktyvinimo sąlygos (t. y. S9 koncentracija ar S9 kilmė)).

Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, gautų duomenų rinkinio nepakaks padaryti išvadą, ar rezultatai teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad atsakas yra dviprasmis.

Bandomosios cheminės medžiagos, kurios atliekant MNvit bandymą indukuoja mikrobranduolius, tai gali daryti todėl, kad sukelia chromosomų trūkimą, netekimą arba abiejų veiksnių derinį. Siekiant nustatyti, ar mikrobranduolių indukcijos mechanizmas yra klastogeninio ir (arba) aneugeninio aktyvumo rezultatas, gali būti atliekama papildoma analizė naudojant antikinetochoro antikūnus, centromeroms skirtus in situ zondus ar taikant kitus metodus.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

 

Bandomoji cheminė medžiaga:

šaltinis, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;

pačios bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas;

bandomųjų cheminių medžiagų reaktyvumas tirpiklio ar nešiklio arba ląstelių kultūros terpės atžvilgiu.

bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ir stabilumas, jei žinomas;

pH, osmolialumo ir nuosėdų matavimas kultūros terpėje, į kurią bandomoji cheminė medžiaga buvo pridėta, jei reikia.

 

Vienkomponentė medžiaga:

fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;

cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt.

 

Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:

kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.

 

Tirpiklis:

tirpiklio pasirinkimo pagrindimas;

tirpiklio galutinėje kultūros terpėje procentinė dalis.

 

Ląstelės:

naudojamų ląstelių tipas ir šaltinis,

naudojamo ląstelių tipo tinkamumas;

ar nėra mikoplazmos, jei naudojamos ląstelių linijos;

informacija apie ląstelių ciklo trukmę ar proliferacijos indeksą, jei naudojamos ląstelių linijos;

jei naudojami limfocitai, kraujo donorų lytis, amžius ir visa tinkama informacija apie donorą, visas kraujas ar atskirti limfocitai, naudotas mitogenas;

normalaus ląstelių ciklo (neigiamo kontrolinio ėminio) trukmė;

ląstelių sėjimų skaičius, jei žinomas, kai naudojamos ląstelių linijos;

ląstelių kultūros priežiūros metodai, jei naudojamos ląstelių linijos;

modalinis chromosomų skaičius, jei naudojamos ląstelių linijos.

 

Bandymo sąlygos

citokinezės blokavimo medžiagos (pvz., citoB) identifikavimo duomenys, jei naudojama, jos koncentracija ir ląstelių veikimo trukmė;

bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, išreikšta kaip galutinė koncentracija kultūros terpėje (pvz., μg ar mg/ml ar mmol/l kultūros terpės);

koncentracijos verčių ir kultūrų skaičiaus parinkimo pagrindimas, įskaitant citotoksiškumo duomenis ir tirpumo apribojimus;

terpių sudėtis, CO2 koncentracija, jei tinka, drėgmės lygis;

tirpiklio ir bandomosios cheminės medžiagos, pridėtos į kultūros terpę, koncentracija (ir (arba) tūris);

inkubavimo temperatūra ir trukmė,