1.3.2016   

LT

Europos Sąjungos oficialusis leidinys

L 54/1


KOMISIJOS REGLAMENTAS (ES) 2016/266

2015 m. gruodžio 7 d.

kuriuo, derinant prie technikos pažangos, iš dalies keičiamas Reglamentas (EB) Nr. 440/2008, nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH)

(Tekstas svarbus EEE)

EUROPOS KOMISIJA,

atsižvelgdama į Sutartį dėl Europos Sąjungos veikimo,

atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB ir 2000/21/EB (1), ypač į jo 13 straipsnio 2 dalį,

kadangi:

(1)

Komisijos reglamente (EB) Nr. 440/2008 (2) yra išdėstyti pagal Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 taikytini bandymų metodai, skirti cheminių medžiagų fizikinėms ir cheminėms savybėms, taip pat toksiškumui ir ekotoksiškumui nustatyti;

(2)

Reglamentą (EB) Nr. 440/2008 būtina atnaujinti – įtraukti EBPO neseniai patvirtintus naujus ir atnaujintus bandymų metodus, taip siekiant atsižvelgti į technikos pažangą ir užtikrinti, kad, laikantis Europos Parlamento ir Tarybos direktyvos 2010/63/ES (3) nuostatų, bandymų tikslais būtų naudojama mažiau gyvūnų. Dėl šio projekto konsultuotasi su suinteresuotaisiais subjektais;

(3)

pritaikymas apima dvidešimt bandymo metodų: vienas naujas metodas skirtas fizikinei ir cheminei savybei nustatyti, įtraukta vienuolika naujų metodų ir atnaujinti trys ekotoksiškumo vertinimo bandymų metodai, taip pat įtraukti penki nauji išlikimo ir elgsenos aplinkoje vertinimo metodai;

(4)

todėl Reglamentas (EB) Nr. 440/2008 turėtų būti atitinkamai iš dalies pakeistas;

(5)

šiame reglamente numatytos priemonės atitinka pagal Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 133 straipsnį įsteigto komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:

1 straipsnis

Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas pagal šio reglamento priedą.

2 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja trečią dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.

Priimta Briuselyje 2015 m. gruodžio 7 d.

Komisijos vardu

Pirmininkas

Jean-Claude JUNCKER


(1)  OL L 396, 2006 12 30, p. 1.

(2)  2008 m. gegužės 30 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 440/2008, nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (OL L 142, 2008 5 31, p. 1).

(3)  2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos (OL L 276, 2010 10 20, p. 33).


PRIEDAS

Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas taip:

1)

Priedo pradžioje prieš A dalį įrašoma pastaba:

„Pastaba.

Prieš bet kurį iš toliau pateikiamų bandymo metodų naudojant bandymams su cheminėmis medžiagomis, sudarytomis iš kelių sudedamųjų dalių (MCS), su nežinomos ar kintamos sudėties medžiagomis, sudedamaisiais reakcijų produktais ar biologinėmis medžiagomis (UVCB) arba su mišiniais, jei atitinkamo metodo aprašyme nenurodyta, ar metodas tinkamas bandymams su MCS, UVCB ar mišiniais atlikti, reikia apsvarstyti, ar metodas tinkamas numatytam reguliavimo tikslui.

Jei bandymo metodas naudojamas bandymams su MCS, UVCB ar mišiniu atlikti, reikėtų, kiek įmanoma, gauti pakankamai informacijos apie jų sudėtį, pvz., nustatant jo sudedamųjų dalių cheminį tapatumą, jų kiekius ir svarbias tų cheminių medžiagų savybes.“

2)

Įterpiamas A.24 skyrius:

A.24.   PASISKIRSTYMO (N-OKTANOLIO / VANDENS) KOEFICIENTAS. DIDELIO SLĖGIO SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (HPLC) METODAS

ĮVADAS

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 117 (2004).

1.

Pasiskirstymo koeficientas (P) apibrėžiamas kaip medžiagos, ištirpintos dvifazėje dviejų iš esmės nesimaišančių tirpiklių sistemoje, pusiausvyros koncentracijų tuose tirpikliuose santykis. Jeigu pasirinkti tirpikliai yra n-oktanolis ir vanduo, tai:

Formula

Kadangi pasiskirstymo koeficientas yra dviejų koncentracijos verčių dalmuo, jis yra nedimensinis dydis, paprastai išreiškiamas dešimtainiu logaritmu.

2.

Tiriant cheminių medžiagų išlikimą aplinkoje, Pow yra vienas svarbiausių tyrimo parametrų. Įrodyta, kad tarp nejonizuotos formos medžiagų Pow ir jų biologinio kaupimosi žuvyse esama labai svarbaus ryšio. Taip pat įrodyta, kad Pow parametrą pravartu žinoti prognozuojant medžiagų įgertį į dirvožemį bei dugnines nuosėdas ir nustatant kiekybinius medžiagų struktūros ir savybių ryšius, svarbius tiriant labai įvairų biologinį jų poveikį.

3.

Taikyti šį bandymo metodą iš pradžių pasiūlyta remiantis C. V. Eadsforth ir P. Moser straipsniu (1). Šio bandymo metodo kūrimą ir EBPO tarplaboratorinį lyginamąjį bandymą 1986 m. koordinavo Vokietijos Federacinės Respublikos aplinkos apsaugos agentūra Umweltbundesamt (2).

PRADINIAI SVARSTYMAI

4.

Intervale nuo – 2 iki 4 (kai kada iki 5 ar daugiau) esančios log Pow vertės (1) gali būti nustatomos atliekant bandymą pagal kratomos kolbos metodą (šio priedo A.8 skyrius, EBPO bandymo gairės Nr. 107). Taikant HPLC metodą log Pow intervalas yra nuo 0 iki 6 (1), (2), (3), (4), (5). Pagal pastarąjį metodą gali reikėti apskaičiuoti Pow įvertį, kad būtų galima parinkti tinkamas etalonines medžiagas ir patvirtinti bet kokias iš bandymo duomenų padarytas išvadas. Apskaičiavimo metodai trumpai aptarti šio bandymo metodo aprašymo priedėlyje. Didelio slėgio skysčių chromatografija (HPLC) atliekama izokratiniu būdu.

5.

Pow vertės priklauso nuo tokių aplinkos sąlygų kaip temperatūra, pH, joninė jėga ir t. t., todėl, siekiant teisingai aiškinti Pow duomenis, šios sąlygos turėtų būti nustatytos atliekant bandymą. Galbūt bus sukurtas kitas metodas jonizuojamoms medžiagoms (žr., pvz., EBPO gairių dėl pH matavimo metodo taikymo jonizuotoms medžiagoms projektą (6)), kurį būtų galima taikyti kaip alternatyvų metodą. Nors šių EBPO gairių projektu gali būti tinkama remtis nustatant tokių jonizuojamų medžiagų Pow, kai kuriais atvejais labiau tinka taikyti HPLC metodą, pasirinkus aplinkai būdingą pH lygį (žr. 9 skirsnį).

METODO PRINCIPAS

6.

Atvirkštinių fazių HPLC atliekama naudojant analizės kolonėles, įkrautas rinkoje parduodamomis kietosiomis fazėmis su ilgomis angliavandenių grandinėmis (pvz., C8, C18), chemiškai sujungtomis su silicio dioksidu.

7.

Į tokią kolonėlę įšvirkšta cheminė medžiaga, pernešama judančiosios fazės, kolonėlėje pasiskirsto tarp judančiosios tirpiklio fazės ir nuostoviosios angliavandenių fazės. Šiose fazėse medžiagos sulaikomos proporcingai jų pasiskirstymo angliavandenių terpėje ir vandenyje koeficientui: pirmiausia eliuuojamos hidrofilinės, paskiausia – lipofilinės medžiagos. Medžiagų sulaikymo trukmė apibūdinama sulaikymo gebos koeficientu k, kuris išreiškiamas formule

Formula

kurioje tR yra bandomosios medžiagos sulaikymo trukmė, o t0 – laukimo trukmė, t. y. kiek laiko vidutiniškai reikia tirpiklio molekulei prasiskverbti per kolonėlę. Kiekybinių analizės metodų taikyti nebūtina – tereikia nustatyti sulaikymo trukmę.

8.

Bandomosios medžiagos oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą galima apskaičiuoti bandymu nustatant jos sulaikymo gebos koeficientą k ir įrašant k į lygtį

Formula

kurioje

a ir b yra tiesinės regresijos koeficientai.

Šią lygtį galima sudaryti taikant tiesinę regresiją etaloninių medžiagų oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientų logaritmams tų etaloninių medžiagų sulaikymo gebos koeficientų logaritmų atžvilgiu.

9.

Taikant atvirkštinių fazių HPLC metodą galima gauti pasiskirstymo koeficientų log Pow įverčius intervale nuo 0 iki 6, tačiau išimtiniais atvejais log Pow gali siekti ir nuo 6 iki 10, todėl gali reikėti pakeisti judančiąją fazę (3). Šis metodas netinka stiprioms rūgštims ir bazėms, kompleksiniams metalų junginiams, su eliuentu reaguojančioms medžiagoms ar paviršinio aktyvumo medžiagoms. Nejonizuotos formos jonizuojamų medžiagų (laisvųjų rūgščių arba laisvųjų bazių) matavimus galima atlikti tik naudojant tinkamą buferinį tirpalą, kurio pH lygis nesiektų pKa (laisvosios rūgšties) arba viršytų pKa (laisvosios bazės). Taip pat galbūt bus sukurtas jonizuojamų medžiagų bandymo pH-metrinis metodas (6), kurį būtų galima taikyti kaip alternatyvų metodą (6). Jeigu log Pow vertė nustatoma siekiant klasifikuoti aplinkai gresiančius pavojus ar vertinti riziką aplinkai, bandymo pH intervalas turėtų būti toks pat, kaip gamtinėje aplinkoje, t. y. nuo 5,0 iki 9.

10.

Kartais gautų rezultatų aiškinimas gali būti sudėtingas dėl priemaišų, dėl kurių sunku grafike tinkamai priskirti smailes. Jeigu tiriant mišinį gauti rezultatai sudaro neišskaidytą juostą, ataskaitoje reikėtų nurodyti viršutinę ir žemutinę log Pow ribas ir kiekvienos log Pow smailės procentinį plotą. Homologinės grupės mišinių atveju taip pat reikėtų nurodyti svertinį log Pow vidurkį (7), apskaičiuotą pagal atskiras Pow vertes ir atitinkamų smailių ploto procentines vertes (8). Skaičiuojant reikėtų atsižvelgti į visas smailes, kurios užima 5 % arba daugiau bendro visų smailių ploto (9):

Formula

Svertinį log Pow vidurkį tinka naudoti tik tada, kai cheminės medžiagos arba mišiniai (pvz., talo alyvos) priklauso homologinei eilei, kaip antai alkanų grupei. Atliekant mišinių matavimus, patikimus rezultatus galima gauti naudojant analitinį detektorių, jei jis vienodai jautriai reaguoja į visas mišinio sudėtyje esančias medžiagas ir jei jas būtų galima tinkamai atskirti.

INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ

11.

Prieš taikant šį metodą reikėtų žinoti bandomosios medžiagos disociacijos konstantą, struktūrinę formulę ir tirpumą judančiojoje fazėje. Taip pat naudinga turėti informacijos apie jos hidrolizę.

KOKYBĖS KRITERIJAI

12.

Kad matavimai būtų patikimesni, reikiami nustatymai turi būti atliekami po du kartus.

Pakartojamumas. Kartojant matavimus vienodomis sąlygomis ir naudojant tas pačias etalonines medžiagas, gautos log Pow vertės turėtų sutapti ± 0,1 log vieneto tikslumu.

Atkuriamumas. Jeigu kartojant matavimus naudojamos kitos etaloninės medžiagos, galima gauti skirtingus rezultatus. Pasirinktų bandomųjų medžiagų log k ir log Pow santykio koreliacijos koeficientas R paprastai yra apie 0,9 ir atitinka oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą log Pow + 0,5 log vieneto tikslumu.

13.

Per tarplaboratorinį lyginamąjį bandymą nustatyta, kad taikant HPLC metodą galima gauti log Pow vertes, ± 0,5 vieneto besiskiriančias nuo pagal kratomos kolbos metodą gaunamų verčių (2). Daugiau palyginimų galima rasti literatūros šaltiniuose (4), (5), (10), (11), (12). Tiksliausi rezultatai gaunami iš koreliacijos grafikų, sudarytų naudojant struktūriškai susijusias etalonines medžiagas (13).

ETALONINĖS MEDŽIAGOS

14.

Siekiant susieti išmatuotą cheminės medžiagos sulaikymo gebos koeficientą k su jos Pow reikia nubrėžti bent 6 taškų kalibracinę kreivę (žr. 24 skirsnį). Tinkamas etalonines medžiagas parenka naudotojas. Bandomosios medžiagos log Pow turėtų patekti į etaloninių medžiagų log Pow verčių intervalą, t. y. bent vienos etaloninės medžiagos Pow turėtų būti didesnis, o kitos – mažesnis negu bandomosios medžiagos Pow. Ekstrapoliavimą reikėtų taikyti tik išimtiniais atvejais. Patartina naudoti bandomajai medžiagai struktūriškai artimas etalonines medžiagas. Etaloninių medžiagų log Pow vertės kalibravimui turėtų būti gautos iš patikimų bandymų duomenų, tačiau kai medžiagoms būdingos didelės (paprastai viršijančios 4) log Pow vertės, o patikimų bandymų duomenų nėra, galima naudoti apskaičiuotas vertes. Jeigu naudojamos ekstrapoliuotos vertės, reikėtų nurodyti ribinę vertę.

15.

Yra paskelbti daugelio cheminių medžiagų grupių log Pow verčių išsamūs sąrašai (14) (15). Jeigu nėra duomenų apie struktūriškai artimų medžiagų pasiskirstymo koeficientus, galima atlikti daugiau bendro pobūdžio kalibravimą naudojant kitas etalonines medžiagas. Rekomenduojamos etaloninės medžiagos ir jų Pow vertės išvardytos 1 lentelėje. Jonizuojamų medžiagų atveju joje nurodytos nejonizuotos formos vertės. Šių verčių patikimumas ir kokybė patikrinti per tarplaboratorinį lyginamąjį bandymą.

1 lentelė.

Rekomenduojamos etaloninės medžiagos

 

CAS Nr.

Etaloninė medžiaga

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanonas

(metiletilketonas)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetilpiridinas

0,5

 

3

62-53-3

Anilinas

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilidas

1,0

 

5

100-51-6

Benzilo alkoholis

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksifenolis

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoksiacto rūgštis

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenolis

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenolis

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benznitrilas

1,6

 

11

140-29-4

Fenilacetonitrilas

1,6

 

12

589-18-4

4-metilbenzilo alkoholis

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenonas

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenolis

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobenzenkarboninė rūgštis

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-chloranilinas

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenzenas

1,9

 

18

104-54-1

Cinamilo alkoholis

(stirolis)

1,9

 

19

65-85-0

Benzenkarboksirūgštis

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-krezolis

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Cinamono rūgštis

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anizolas

2,1

 

23

93-58-3

Metilbenzenkarboksilatas

2,1

 

24

71-43-2

Benzenas

2,1

 

25

99-04-7

3-metilbenzenkarboninė rūgštis

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-chlorfenolis

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trichloretilenas

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazinas

2,6

 

29

93-89-0

Etilbenzenkarboksilatas

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-dichlorbenznitrilas

2,6

 

31

535-80-8

3-chlorbenzenkarboninė rūgštis

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluenas

2,7

 

33

90-15-3

1-naftolis

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dichloranilinas

2,8

 

35

108-90-7

Chlorbenzenas

2,8

 

36

1746-13-0

Alilfenileteris

2,9

 

37

108-86-1

Brombenzenas

3,0

 

38

100-41-4

Etilbenzenas

3,2

 

39

119-61-9

Benzofenonas

3,2

 

40

92-69-3

4-fenilfenolis

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timolis

3,3

 

42

106-46-7

1,4-dichlorbenzenas

3,4

 

43

122-39-4

Difenilaminas

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalenas

3,6

 

45

93-99-2

Fenilo benzoatas

3,6

 

46

98-82-8

Izopropilbenzenas

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-trichlorfenolis

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenilas

4,0

 

49

120-51-4

Benzilbenzenkarboksilatas

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-(antr- butil)-fenolis

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-trichlorbenzenas

4,2

 

52

143-07-7

Dodekano rūgštis

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenileteris

4,2

 

54

85-01-8

Fenantrenas

4,5

 

55

104-51-8

n-butilbenzenas

4,6

 

56

103-29-7

Dibenzilas

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenilpiridinas

4,9

 

58

206-44-0

Fluorantenas

5,1

 

59

603-34-9

Trifenilaminas

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

METODO APRAŠYMAS

Pasiskirstymo koeficiento išankstinis įvertis

16.

Jei būtina nustatyti apytikrį bandomosios medžiagos pasiskirstymo koeficientą, geriausia tai daryti taikant apskaičiavimo metodą (žr. priedėlį) arba, kai tinka, naudojant bandomosios medžiagos tirpumo grynuose tirpikliuose santykį.

Aparatūra

17.

Bandymui atlikti reikalingas skystafazis chromatografas su mažai pulsuojančiu siurbliu ir tinkama aptikimo sistema. Daugelio įvairių grupių cheminėms medžiagoms tinka naudoti 210 nm bangų ilgio UV detektorių arba lūžio rodiklio (RI) detektorių. Nuostoviojoje fazėje esančios polinės grupės gali labai sutrikdyti HPLC kolonėlės veikimą, todėl polinių grupių procentas nuostoviosiose fazėse turėtų būti minimalus (16). Galima naudoti rinkoje parduodamas mikrodalelių atvirkštinių fazių įkrovas arba jau įkrautas kolonėles. Tarp įšvirkštimo sistemos ir analizės kolonėlės gali būti įdėta apsauginė kolonėlė.

Judančioji fazė

18.

Eliuentinis tirpiklis ruošiamas iš HPLC tinkamo metanolio ir distiliuoto arba dejonizuoto vandens ir prieš naudojant nudujinamas. Eliuavimas turėtų būti izokratinis. Metanolio ir vandens santykis turėtų būti toks, kad vandens būtų ne mažiau kaip 25 %. Medžiagoms, kurių log P = 6, eliuuoti per valandą, esant 1 ml/min. debitui, paprastai pakanka, kad metanolio ir vandens santykis mišinyje būtų 3:1 (tūriniais procentais). Kai medžiagos log P viršija 6, eliuavimo (taip pat ir etaloninių medžiagų) trukmę gali reikėti sutrumpinti sumažinant judančiosios fazės poliškumą arba sutrumpinant kolonėlę.

19.

Bandomoji ir etaloninės medžiagos turi būti tirpios judančiojoje fazėje ir pakankamos koncentracijos, kad jas būtų galima aptikti. Į metanolio ir vandens mišinį priedų galima dėti tik išimtiniais atvejais, nes jie keičia kolonėlės savybes. Tokiais atvejais būtina įsitikinti, kad naudojami priedai nekeičia bandomosios medžiagos ir etaloninių medžiagų sulaikymo trukmės. Jeigu metanolio ir vandens mišinys netinka, galima naudoti kito organinio tirpiklio ir vandens (pvz., etanolio ir vandens, acetonitrilo ir vandens arba izopropilo alkoholio (2-propanolio) ir vandens) mišinius.

20.

Eliuento pH vertė yra itin svarbi jonizuojamoms medžiagoms. Ji turėtų patekti į kolonėlei eksploatuoti tinkamų pH verčių intervalą (paprastai 2–8). Patartina naudoti buferinius tirpalus. Naudojant kai kuriuos organinės fazės ir buferinio tirpalo mišinius reikia saugotis, kad nesusidarytų druskų nuosėdų, ir nesugadinti kolonėlės. Paprastai nepatartina naudoti kvarcinių nuostoviųjų fazių HPLC matavimams tada, kai pH viršija 8, nes dėl naudojamos šarminės judančiosios fazės gali greitai pablogėti kolonėlės veikimas.

Tirpiniai

21.

Bandomosios ir etaloninės medžiagos turi būti pakankamai grynos, kad chromatogramose būtų galima priskirti smailes atitinkamoms medžiagoms. Bandymui arba kalibravimui naudojamos medžiagos, kai įmanoma, ištirpinamos judančiojoje fazėje. Jeigu bandomoji ir etaloninės medžiagos tirpinamos ne judančiojoje fazėje, o kitame tirpiklyje, judančiąją fazę reikėtų naudoti galutiniam atskiedimui prieš įšvirkščiant į kolonėlę.

Bandymo sąlygos

22.

Temperatūra atliekant matavimą neturėtų svyruoti daugiau kaip ± 1 °C.

Laukimo trukmės to nustatymas

23.

Laukimo trukmę t0 galima nustatyti naudojant tokias organines medžiagas, kurios nėra sulaikomos (pvz., tiokarbamidą arba formamidą). Laukimo trukmę tiksliau nustatyti galima pagal išmatuotą sulaikymo trukmę arba naudojant maždaug septynis homologinės eilės narius (pvz., n-alkilmetilketonus) (17). Sulaikymo trukmė tR (nC+ 1) grafike pavaizduojama kaip tR (nC) funkcija; nC yra anglies atomų skaičius. Gaunama tiesė tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A) t0; A šiuo atveju yra k(nC + 1)/k(nC) atitinkanti konstanta. Laukimo trukmė t0 nustatoma iš atkarpos (1 – A)t0 ir krypties koeficiento A.

Regresijos lygtis

24.

Tada sudaromas tinkamų etaloninių medžiagų, kurių log P vertės yra artimos numatomai bandomosios medžiagos log P vertei, log k ir log P santykio koreliacijos grafikas. Praktikoje vienu kartu įšvirkščiama 6–10 etaloninių medžiagų ir nustatoma jų sulaikymo trukmė (geriausia tai padaryti įrašančiuoju integratoriumi, sujungtu su aptikimo sistema). Atitinkami sulaikymo gebos koeficientų logaritmai log k grafike pavaizduojami kaip log P funkcija. Siekiant atsižvelgti į galimus kolonėlės veikimo pokyčius, regresijos lygtis sudaroma reguliariais laiko intervalais, ne rečiau kaip kartą per dieną.

BANDOMOSIOS MEDŽIAGOS POW NUSTATYMAS

25.

Įšvirkščiamas kuo mažesnis bandomosios medžiagos kiekis – tik tiek, kad ją būtų įmanoma aptikti. Jos sulaikymo trukmė nustatoma matuojant du kartus. Bandomosios medžiagos pasiskirstymo koeficientas gaunamas interpoliuojant apskaičiuotą sulaikymo gebos koeficientą kalibracinėje kreivėje. Kai pasiskirstymo koeficientai yra labai maži arba labai dideli, būtina atlikti ekstrapoliaciją. Tokiais atvejais ypač svarbu atkreipti dėmesį į regresijos tiesės pasikliovimo ribas. Jeigu ėminio sulaikymo trukmė nepatenka į nustatytą standartinių etaloninių medžiagų sulaikymo trukmės verčių intervalą, reikėtų nurodyti ribinę vertę.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Bandymo ataskaita

26.

Ataskaitoje turi būti nurodyta:

(jei nustatytas) preliminarus pasiskirstymo koeficiento įvertis, apskaičiuotos vertės ir pasirinktas metodas;

jei taikytas apskaičiavimo metodas – išsamus jo aprašymas, be kita ko, nurodant naudotą duomenų bazę ir pateikiant išsamią informaciją apie fragmentų pasirinkimą;

bandomoji medžiaga ir etaloninės medžiagos: jų grynumas, struktūrinė formulė ir CAS numeris;

naudotos įrangos ir darbo sąlygų aprašymas: analizės kolonėlė, apsauginė kolonėlė, judančioji fazė, aptikimo priemonės, temperatūros intervalas, pH;

eliuavimo profiliai (chromatogramos);

laukimo trukmė ir kaip ji nustatyta;

kalibravimui naudotų etaloninių medžiagų sulaikymo duomenys ir iš literatūros šaltinių gautos jų log Pow vertės;

pritaikytos regresijos tiesės (log k pagal log Pow) duomenys ir jos koreliacijos koeficientas, įskaitant pasikliautinuosius intervalus;

vidutiniai bandomosios medžiagos sulaikymo duomenys ir interpoliuota log Pow vertė;

mišinio atveju – eliuavimo profilio chromatograma su nurodytomis ribomis;

log Pow vertės pagal log Pow smailės procentinį plotą;

apskaičiavimas naudojant regresijos tiesę;

apskaičiuotas svertinis log Pow verčių vidurkis, jei jis buvo apskaičiuotas.

NUORODOS

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). „Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995“, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Priedėlis

POW apskaičiavimo metodai

ĮVADAS

1.

Šiame priedėlyje pateiktas trumpas įvadas, kaip apskaičiuoti Pow. Daugiau informacijos ieškokite literatūroje (1), (2).

2.

Apskaičiuotos Pow vertės naudojamos:

sprendžiant, kurį bandymo metodą taikyti: kai log Pow yra nuo – 2 iki 4, taikomas kratomos kolbos metodas, o kai log Pow yra nuo 0 iki 6 – HPLC metodas;

nustatant, kokiomis sąlygomis reikėtų atlikti HPLC (etalonines medžiagas, metanolio ir vandens santykį);

tikrinant bandymo metodais gautų verčių patikimumą;

kai bandymo metodai netaikytini, tinkamam įverčiui nustatyti.

Apskaičiavimo metodų esmė

3.

Šiame priedėlyje siūlomi apskaičiavimo metodai pagrįsti teoriniu molekulės dalijimu į atitinkamas mažesnes struktūras – fragmentus, kurių patikimi log Pow dydžiai yra žinomi; log Pow gaunamas sudedant tų fragmentų vertes ir intramolekulinių sąveikų pataisos dėmenis. Molekulių fragmentų konstantų ir pataisos dėmenų sąrašai paskelbti literatūroje (1), (2), (3), (4), (5), (6). Kai kurie iš jų reguliariai atnaujinami (3).

Apskaičiuotų verčių patikimumas

4.

Apskritai kuo sudėtingesnė medžiaga tiriama, tuo mažiau galima pasikliauti apskaičiavimo metodais. Nesudėtingų, mažos molekulinės masės, tik vieną ar dvi funkcines grupes turinčių molekulių atveju tarp įvairiais fragmentavimo metodais gautų rezultatų ir matavimais nustatytų verčių galima tikėtis 0,1–0,3 log Pow vieneto nuokrypio. Paklaidos dydis priklausys nuo taikomų fragmentų konstantų patikimumo, gebėjimo atpažinti intramolekulines sąveikas (pvz., vandenilio jungtis) ir tinkamo pataisos dėmenų naudojimo. Jonizuojamų medžiagų atveju būtina atsižvelgti į jonų krūvį ir jonizacijos laipsnį (10).

Fujita-Hansch π metodas

5.

Fujita et al. (7) nustatyta hidrofobinio pakaito darinio konstanta π apibrėžiama taip:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

Šioje formulėje PhX yra aromatinis darinys, o PhH – pradinė medžiaga,

pvz.:

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

Šis π metodas visų pirma taikomas aromatinėms medžiagoms. Daugelio pakaitų π vertės pateiktos literatūroje (4), (5).

Rekker metodas

6.

Pagal Rekker metodą (8) log Pow vertė apskaičiuojama taip:

Formula

Šioje formulėje ai yra tam tikro fragmento pasikartojimų molekulėje skaičius, o fi – to fragmento log Pow inkrementinis dydis. Sąveikos dėmenys gali būti išreiškiami kaip vienos atskiros konstantos Cm (vadinamosios „magiškosios konstantos“) sveikasis kartotinis. Fragmentų konstantos fi ir Cm nustatytos iš 1 054 eksperimentinių Pow verčių (825 medžiagų) sąrašo, atlikus daugianarę regresinę analizę (6), (8). Sąveikos dėmenys nustatomi pagal konkrečias taisykles (6), (8), (9).

Hansch-Leo metodas

7.

Pagal Hansch ir Leo metodą (4) log Pow vertė apskaičiuojama taip:

Formula

Šioje formulėje fi yra fragmento konstanta, Fj – pataisos dėmuo (faktorius), ai ir bj – atitinkamas kartojimosi dažnis. Atomų ir grupių fragmentinių verčių ir pataisos dėmenų Fj sąrašai sudaryti pagal bandymų ir klaidų metodą naudojant eksperimentines Pow vertes. Pataisos dėmenys suskirstyti į kelias klases (1), (4). Sukurta speciali programinė įranga padeda dirbant atsižvelgti į visas taisykles ir pataisos dėmenis (3).

MIŠRUSIS METODAS

8.

Sudėtingų molekulių log Pow galima kur kas tiksliau apskaičiuoti dalijant molekulę į didesnes struktūrines dalis, kurių patikimos log Pow vertės yra nurodytos lentelėse (3), (4) arba nustatytos matavimais. Tada tokių fragmentų (pvz., heterociklų, antrachinono, azobenzeno) vertes galima derinti su vertėmis, gautomis pagal Hansch π metodą, arba su Rekker ar Leo metodo fragmentų konstantomis.

Pastabos

i)

Apskaičiavimo metodai taikytini tik iš dalies arba visiškai jonizuotoms medžiagoms, atsižvelgiant į būtinus pataisos faktorius.

ii)

Jei galima tikėtis esant intramolekulinių vandenilinių jungčių, būtina pridėti atitinkamus pataisos dėmenis (maždaug nuo +0,6 iki +1,0 log Pow vieneto) (1). Tokių jungčių buvimą galima nustatyti naudojant erdvinius modelius arba spektroskopinius duomenis.

iii)

Jeigu yra kelios galimos tautomerinės formos, skaičiavimus reikėtų atlikti naudojant labiausiai tikėtiną formą.

iv)

Reikėtų atidžiai sekti fragmentų konstantų sąrašų keitimus.

NUORODOS APIE APSKAIČIAVIMO METODUS

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

3)

C.3 skyrius pakeičiamas taip:

C.3.   GĖLAVANDENIŲ DUMBLIŲ IR MELSVABAKTERIŲ AUGIMO SLOPINIMO BANDYMAS

ĮVADAS

1.

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 201 (2006 m., priedas pataisytas 2011 m.). Nustatyta, kad šį bandymo metodą reikėtų taikyti tam tikroms papildomoms rūšims ir atnaujinti, kad jis atitiktų cheminių medžiagų pavojingumo vertinimo ir klasifikacijos reikalavimus. Šis pakeitimas atliktas remiantis gausia sukaupta praktine patirtimi, cheminių medžiagų toksiškumo dumbliams tyrimų srities mokslo pažanga ir tuo, kad iš pradžių patvirtinus šį metodą, jis pradėtas plačiai taikyti reglamentavimo reikmėms.

2.

Vartojamos sąvokos apibrėžtos 1 priedėlyje.

BANDYMO PRINCIPAS

3.

Šio bandymo paskirtis – nustatyti cheminės medžiagos poveikį gėlavandenių mikrodumblių ir (arba) melsvabakterių augimui. Eksponentiškai augantys bandomieji organizmai atskiromis partijomis paruoštose kultūrose yra paprastai 72 valandas veikiami bandomosios cheminės medžiagos. Nors bandymo trukmė gana trumpa, per jį galima įvertinti poveikį kelioms organizmų kartoms.

4.

Sisteminis atsakas į poveikį yra dumblių kultūrų (bandymo vienetų) serijos, veikiamos įvairių koncentracijų bandomosios cheminės medžiagos, augimo sulėtėjimas. Šis atsakas vertinamas kaip bandomosios medžiagos koncentracijos funkcija tos medžiagos poveikio nepatyrusių kontrolinių kultūrų vidutinio augimo kartotiniuose bandiniuose atžvilgiu. Siekiant, kad visapusiškai pasireikštų sisteminis atsakas į toksinį poveikį (optimalusis jautris), organizmų kultūros turėtų pakankamai ilgą laiko tarpą nevaržomai eksponentiškai augti nestokodamos mitybinių medžiagų ir nuolatinio apšvietimo sąlygomis, po to išmatuojant savitojo augimo greičio sumažėjimą.

5.

Augimas ir augimo slopinimas kiekybiškai nustatomi matuojant dumblių biomasės pokyčius laike. Dumblių biomasė išreiškiama sausosios medžiagos mase tūrio vienetui, pvz., kiek miligramų dumblių yra viename bandymo tirpalo litre. Kadangi sausosios medžiagos masę matuoti sunku, vietoj jos naudojami pakaitiniai parametrai. Iš jų dažniausiai pasirenkamas ląstelių skaičius; kiti pakaitiniai parametrai yra ląstelių tūris, fluorescencija, optinis tankis ir t. t. Turėtų būti žinomas išmatuoto pakaitinio parametro perskaičiavimo į biomasę koeficientas.

6.

Bandymo vertinamoji baigtis yra augimo slopinimas, išreiškiamas kaip biomasės didėjimo bandomosios medžiagos veikimo laikotarpiu logaritminis dydis (vidutinis savitasis augimo greitis). Pagal vidutinius savituosius augimo greičius, išmatuotus naudojant bandymo tirpalų seriją, nustatoma konkretų procentinį augimo greičio sumažėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti bandomosios medžiagos koncentracija, kuri išreiškiama ErCx (pvz., ErC50).

7.

Taikant šį bandymo metodą naudojamas papildomas atsako kintamasis – išeiga, kurią gali reikėti nustatyti pagal kai kurių valstybių konkrečius norminius reikalavimus. Išeiga apibrėžiama kaip biomasės skirtumas, atsiradęs nuo bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio pradžios iki pabaigos. Pagal išeigą, nustatytą naudojant bandymo tirpalų seriją, apskaičiuojama konkretų procentinį išeigos sumažėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, kuri išreiškiama EyCx (pvz., EyC50).

8.

Taip pat galima statistiškai nustatyti mažiausią pastebėto poveikio koncentraciją (LOEC) ir nepastebėto poveikio koncentraciją (NOEC).

INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ

9.

Nustatant bandymo sąlygas gali būti naudinga žinoti šią informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą: jos struktūrinę formulę, grynumą, patvarumą veikiant šviesai, patvarumą bandymo sąlygomis, šviesos sugerties savybes, pKa ir virsmo tyrimų rezultatus, įskaitant biologinį skaidumą vandenyje.

10.

Reikėtų žinoti bandomosios medžiagos tirpumą vandenyje, oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą (Pow) ir garų slėgį; turėtų būti taikomas patvirtintas metodas tos medžiagos kiekiui bandymo tirpaluose nustatyti, žinant jos regeneravimo našumą ir aptikimo ribą.

BANDYMO TINKAMUMAS

11.

Tinkamas bandymas turėtų atitikti šiuos veiksmingumo kriterijus:

per 72 val. bandymo laikotarpį kontrolinių kultūrų biomasė turėtų eksponentiškai padidėti bent 16 kartų; tai atitinka savitąjį augimo greitį 0,92 para– 1. Bandymams dažniausiai naudojamų rūšių organizmai paprastai auga kur kas greičiau (žr. 2 priedėlį). Bandymas gali neatitikti šio kriterijaus, kai pasirinktos rūšies organizmai auga lėčiau negu 2 priedėlyje išvardytų rūšių organizmai. Tokiu atveju bandymo laikotarpį reikėtų pratęsti iki tol, kol kontrolinės kultūros padidės bent 16 kartų; augimas turi būti eksponentinis per visą bandymo laikotarpį. Jeigu reikiamas padidėjimo koeficientas – 16 kartų – pasiekiamas greičiau, bandymo laikotarpį galima sutrumpinti (minimali trukmė yra 48 val.), palaikant neribotą, eksponentinį augimą per visą bandymą;

kontrolinių kultūrų savitųjų augimo greičių atskirais laiko tarpais (0–1, 1–2 ir 2–3 paros per 72 val. trukmės bandymą) vidutinis variacijos koeficientas (žr. variacijos koeficiento apibrėžtį 1 priedėlyje) neturi viršyti 35 %. Kaip apskaičiuoti savitąjį augimo greitį atskirais laiko tarpais per bandymą, nurodyta 49 skirsnyje. Šis kriterijus taikomas vidutinei variacijos koeficientų, apskaičiuotų naudojant kontrolines kultūras kartotiniuose bandiniuose, vertei;

bandymams naudojant Pseudokirchneriella subcapitata ir Desmodesmus subspicatus, kartotinių bandinių kontrolinių kultūrų vidutinių savitųjų augimo greičių visu bandymo laikotarpiu variacijos koeficientas neturi viršyti 7 %; bandymui naudojant kitas, mažiau įprastas rūšis, ši vertė neturėtų viršyti 10 %.

ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA

12.

Bandymo procedūrai patikrinti galima atlikti bandymą su etalonine chemine medžiaga arba medžiagomis, pvz., 3,5-dichlorfenoliu, kuris naudotas per tarptautinį tarplaboratorinį bandymą (1). Atliekant bandymus su žaliadumbliais, kaip etaloninę cheminę medžiagą taip pat galima naudoti kalio dichromatą. Etaloninės cheminės medžiagos bandymus patartina atlikti bent dukart per metus.

BANDYMO TAIKOMUMAS

13.

Šį bandymo metodą lengviausia taikyti vandenyje tirpioms cheminėms medžiagoms, kurios bandymo sąlygomis paprastai lieka vandenyje. Bandymams naudojant lakias, lengvai įsigeriančias (adsorbuojamas), spalvingas, vandenyje mažai tirpias chemines medžiagas arba medžiagas, kurios gali paveikti mitybinių arba mineralinių medžiagų įsisavinimą iš bandymo terpės, gali reikėti atitinkamai pakeisti aprašytą bandymo procedūrą (pvz., bandymą atlikti uždaroje sistemoje, kondicionuoti bandymo indus). Rekomendacijų dėl kai kurių tinkamų pakeitimų pateikta literatūroje (2), (3), (4).

BANDYMO METODO APRAŠYMAS

Aparatūra

14.

Bandymo indai ir kita aparatūra, su kuria liečiasi bandymo tirpalai, turėtų būti pagaminti tik iš stiklo ar kitos chemiškai inertinės medžiagos. Bandymo reikmenys turėtų būti kruopščiai plaunami, taip užtikrinant, kad dumblių augimo ar bandymo tirpalų sudėties nepaveiktų jokie organiniai ar neorganiniai teršalai.

15.

Įprasti bandymo indai yra stiklinės kolbos – tokių matmenų, kad pakaktų bandomųjų organizmų kultūros tūriui išmatuoti per bandymą ir į jas patektų pakankama anglies dioksido masė iš aplinkos oro (žr. 30 skirsnį). Atminkite, kad skysčio tūris turi būti pakankamas analiziniams nustatymams (žr. 37 skirsnį).

16.

Be to, per bandymą gali reikėti kai kurių arba visų toliau išvardytų įrenginių.

Kultūros auginimo aparatūra. Rekomenduojama naudoti spintą arba kamerą, kurioje būtų galima ± 2 °C tikslumu palaikyti pasirinktą inkubacijos temperatūrą.

Apšvietimo matavimo prietaisai. Svarbu pažymėti, kad matuojamos vertės gali priklausyti nuo šviesos stiprio matavimo metodo ir ypač jutiklio (kolektoriaus) tipo. Matavimus patartina atlikti naudojant sferinį (4 π) jutiklį (reaguojantį į tiesioginę ir atspindėtą šviesą, krintančią visais kampais virš ir žemiau matavimo plokštumos) arba 2 π jutiklį (reaguojantį į šviesą, krintančią visais kampais virš matavimo plokštumos).

Aparatūra dumblių biomasei matuoti. Įprasčiausias dumblių biomasės pakaitinis parametras – ląstelių skaičius – gali būti nustatomas elektroniniu dalelių skaitikliu, mikroskopu su skaičiavimo kamera arba tėkmės citometru. Kiti pakaitiniai parametrai vietoj biomasės gali būti matuojami tėkmės citometru, fluorimetru, spektrofotometru arba kolorimetru. Pravartu nustatyti perskaičiavimo koeficientą, pagal kurį iš ląstelių skaičiaus nustatoma sausosios medžiagos masė. Siekiant atlikti naudingus matavimus spektrofotometru esant mažoms biomasės koncentracijoms, gali reikėti naudoti kiuvetes, kurių šviesos kelio ilgis būtų bent 4 cm.

Bandomieji organizmai

17.

Bandymui galima naudoti kelių rūšių nepritvirtintus mikrodumblius ir melsvabakteres. Pagal nustatytą šio bandymo metodo procedūrą tinka naudoti 2 priedėlyje išvardytas patvirtintas padermes.

18.

Jeigu naudojami kitų rūšių dumbliai, bandymo ataskaitoje turėtų būti nurodyta jų padermė ir arba (kilmė). Įsitikinkite, kad bandymui pasirinktų dumblių eksponentinį augimą pagrindinėmis bandymo sąlygomis bus galima užtikrinti per visą bandymo laikotarpį.

Auginimo terpė

19.

Rekomenduojama rinktis vieną iš dviejų auginimo terpių – EBPO siūlomą terpę arba JAV aplinkos apsaugos agentūros AAP (angl. algal assay procedure) terpę; šių terpių sudėtis parodyta 3 priedėlyje. Įsidėmėtina, kad skiriasi abiejų terpių pradinė pH vertė ir buferinė talpa (pH didėjimui reguliuoti). Todėl bandymų rezultatai gali skirtis dėl naudojamos terpės, ypač atliekant jonizuojamų cheminių medžiagų bandymus.

20.

Auginimo terpes tam tikrais atvejais gali reikėti modifikuoti, pvz., atliekant metalų ir kompleksonų (chelantų) bandymus arba bandymus esant skirtingoms pH vertėms. Modifikuotos terpės naudojimas turėtų būti išsamiai aprašytas ir pagrįstas (3), (4).

Pradinė biomasės koncentracija

21.

Visų bandomųjų kultūrų biomasės pradinis kiekis turi būti vienodas ir pakankamai mažas, kad būtų įmanomas eksponentinis augimas per visą inkubacinį periodą nerizikuojant, kad pritrūks mitybinių medžiagų. Pradinis biomasės kiekis (sausosios medžiagos masė) neturėtų viršyti 0,5 mg/l. Rekomenduojama pradinė ląstelių koncentracija:

Pseudokirchneriella subcapitata

5 × 103– 104 ląstelių/ml

Desmodesmus subspicatus

2–5 × 103 ląstelių/ml

Navicula pelliculosa

104 ląstelių/ml

Anabaena flos-aquae

104 ląstelių/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104– 105 ląstelių/ml

Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos

22.

Tikėtiną poveikį sukeliančių cheminės medžiagos koncentracijų intervalą galima nustatyti remiantis intervalo nustatymo bandymų rezultatais. Atliekant galutinį nustatomąjį bandymą reikėtų pasirinkti bent penkias koncentracijos vertes, išdėstytas geometrine progresija, kurios daugiklis neviršytų 3,2. Jeigu bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ir atsako kreivė yra gulsčia, gali būti pagrįsta rinktis didesnį daugiklį. Patartina, kad pasirinktų koncentracijos verčių eilutė apimtų intervalą, kuriam esant dumblių augimo greitis slopinamas 5–75 %.

Kartotiniai ir kontroliniai bandiniai

23.

Bandymo plane turėtų būti numatyta paruošti po tris kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotinius bandinius. Jeigu nereikia nustatyti NOEC, bandymo planą galima keisti – padidinti koncentracijų skaičių ir sumažinti kiekvienos koncentracijos kartotinių bandinių skaičių. Kontrolinių kartotinių bandinių turi būti ne mažiau kaip trys. Geriausia, kad jų būtų dukart daugiau negu kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotinių bandinių.

24.

Galima paruošti atskirą bandymo tirpalų rinkinį bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų analiziniams nustatymams (žr. 36 ir 38 skirsnius).

25.

Kai bandomajai cheminei medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis, į bandymo planą būtina įtraukti papildomus kontrolinius bandinius su tuo tirpikliu, kurio koncentracija būtų tokia pati, kaip ir bandomųjų kultūrų induose.

Sėjamos kultūros paruošimas

26.

Siekiant pripratinti bandymui naudojamus dumblius prie bandymo sąlygų ir užtikrinti, kad dumbliai į bandymo tirpalus būtų sėjami per jų eksponentinio augimo tarpsnį, sėjama kultūra bandymo terpėje paruošiama iki bandymo pradžios likus 2–4 dienoms. Dumblių biomasė turėtų būti tvarkoma taip, kad sėjamos kultūros augimas iki bandymo pradžios būtų iš esmės eksponentinis. Sėjama kultūra turėtų būti inkubuojama tokiomis pačiomis sąlygomis, kaip ir bandomosios kultūros. Sėjamos kultūros biomasės didėjimą reikėtų matuoti, siekiant įsitikinti, kad jos augimas atitinka normalų tai bandomajai padermei būdingą intervalą kultūros auginimo sąlygomis. Dumblių kultūrų auginimo procedūros pavyzdys pateiktas 4 priedėlyje. Siekiant išvengti vienalaikio ląstelių dalijimosi per bandymą, gali reikėti palaukti, kol sėjamos kultūros organizmai pasidaugins antrą kartą.

Bandymo tirpalų ruošimas

27.

Auginimo terpės ir pradinės bandymui naudojamų dumblių biomasės koncentracijos turi būti vienodos visuose bandymo tirpaluose. Pasirinktų koncentracijų bandymo tirpalai paprastai ruošiami sumaišant bandomosios cheminės medžiagos pradinį tirpalą su auginimo terpe ir sėjama kultūra. Pradiniai tirpalai paprastai ruošiami ištirpinant cheminę medžiagą bandymo terpėje.

28.

Galima naudoti tirpiklius, pvz., acetoną, tret-butilo alkoholį ir dimetilformamidą, kaip nešiklius vandenyje mažai tirpioms cheminėms medžiagoms įmaišyti į bandymo terpę (2), (3). Tirpiklio koncentracija neturėtų viršyti 100 μl/l. Tos pačios koncentracijos tirpiklio turėtų būti dedama į visų bandymo serijos kultūrų (įskaitant kontrolines kultūras) indus.

Inkubacija

29.

Bandymo indai užkemšami pralaidžiais orui kamščiais, sukratomi ir dedami į kultūros auginimo aparatą. Dumbliai per visą bandymą turi būti suspenduoti ir juos turi lengvai pasiekti anglies dioksidas, todėl indus reikėtų dažnai sukratyti arba pamaišyti. Bandomųjų kultūrų laikymo temperatūra turėtų būti 21–24 °C, reguliuojama ± 2 °C tikslumu. Jeigu naudojami 2 priedėlyje nenurodytų, pvz., tropinių rūšių organizmai, galbūt tiktų juos laikyti aukštesnėje temperatūroje, su sąlyga, kad nebūtų nukrypta nuo bandymo tinkamumo kriterijų. Bandymo kolbas patartina atsitiktine tvarka sudėti į inkubatorių ir kasdien sukeisti jas vietomis.

30.

Kontrolinių bandinių terpės pH per bandymą neturėtų padidėti daugiau kaip 1,5 vieneto. Atliekant bandymą su metalais ir cheminėmis medžiagomis, kurios iš dalies jonizuojasi, kai pH lygis yra artimas bandymo pH, gali reikėti riboti pH kitimą, kad būtų gauti atkuriami ir tikslūs bandymo rezultatai. Techniškai įmanoma pasiekti, kad pH vertė pakistų mažiau kaip 0,5 vieneto, užtikrinant tinkamą CO2 masės patekimo iš aplinkos oro į bandomąjį tirpalą spartą, pvz., dažniau pakratant indą. Taip pat galima mažinti CO2 suvartojimą, sumažinant pradinės biomasės kiekį ar bandymo trukmę.

31.

Paviršius, ant kurio inkubuojamos kultūros, turėtų būti nuolat ir vienodai apšviestas liuminescencinėmis, pvz., šaltai baltos arba dienos šviesos lempomis. Dumblių ir melsvabakterių padermėms šviesos reikia nevienodai. Šviesos stipris turėtų būti pritaikytas naudojamiems bandomiesiems organizmams. Rekomenduojamų rūšių žaliadumbliams tinkamas šviesos stipris bandymo tirpalų lygiu yra 60–120 μE · m– 2 s – 1, matuojant tinkamu jutikliu esant fotosintezei optimaliam 400–700 nm bangų ilgio intervalui. Kai kurios rūšys, ypač Anabaena flos-aquae, gerai auga esant ne tokiai stipriai šviesai; labai intensyvi šviesa gali joms pakenkti. Vidutinis šviesos stipris tokioms rūšims turėtų būti nuo 40 iki 60 μE · m– 2 · s – 1 (jeigu apšvietimo matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, 4 440–8 880 lx apšvietimas šaltai balta šviesa maždaug atitinka rekomenduojamą 60–120 μE · m– 2 · s – 1 šviesos stiprį). Šviesos stipris neturi kisti daugiau kaip ± 15 % vidutinio šviesos, kuria apšviečiama inkubavimo vieta, stiprio.

Bandymo trukmė

32.

Įprasta bandymo trukmė – 72 val., tačiau visus 11 skirsnyje nurodytus tinkamumo kriterijus atitinkantis bandymas gali trukti ir trumpesnį arba ilgesnį laiko tarpą.

Matavimai ir analiziniai nustatymai

33.

Dumblių biomasė kiekvienoje kolboje matuojama bent kartą per dieną per visą bandymo laikotarpį. Jeigu matavimai atliekami naudojant mažus biomasės kiekius, iš bandymo tirpalo ištrauktus pipete, po to biomasės papildyti nereikia.

34.

Biomasės matavimai atliekami rankiniu būdu suskaičiuojant ląsteles per mikroskopą arba naudojant elektroninį dalelių skaitiklį (nustatant ląstelių skaičių ir (arba) biologinį tūrį). Galima taikyti ir kitus metodus, pvz., srovinę citometriją, in vitro arba in vivo chlorofilo fluorescenciją (5), (6) arba optinio tankio matavimą, jei galima įrodyti pakankamą koreliaciją su biomase, atitinkančia bandymui naudojamos biomasės intervalą.

35.

Tirpalų pH turi būti išmatuotas pradedant ir baigiant bandymą.

36.

Jeigu yra analizės procedūra, tinkama bandomajai cheminei medžiagai pasirinktame koncentracijų intervale nustatyti, reikėtų išanalizuoti bandymo tirpalus, siekiant patikrinti pradines jų koncentracijas ir per visą bandymą palaikyti poveikiui reikalingas koncentracijas.

37.

Atliekant bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos analizę bandymo pradžioje ir pabaigoje, gali pakakti išanalizuoti tik vieną mažą ir vieną didelę bandymui pasirinktas koncentracijas ir numatomą EC50 vertę apytikriai atitinkančią koncentraciją, jeigu tikėtina, kad tos medžiagos efektyviosios koncentracijos per bandymą pakis mažiau kaip 20 % vardinių verčių. Jeigu manoma, jog koncentracijos pasikeis tiek, kad nebepateks į 80–120 % vardinės koncentracijos intervalą, patartina pradedant ir baigiant bandymą atlikti visų bandymui pasirinktų koncentracijų analizę. Kai bandomosios cheminės medžiagos yra lakios, nepatvarios arba lengvai įsigeriančios (adsorbuojamos), jų veikimo laikotarpiu rekomenduojama kas 24 val. imti papildomus pavyzdžius analizei, kad būtų galima tiksliau nustatyti, koks bandomosios medžiagos kiekis prarastas. Gali reikėti paruošti papildomų kartotinių bandinių su šiomis cheminėmis medžiagomis. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijas visais atvejais reikia nustatyti tik viename kartotiniame bandymui pasirinktos koncentracijos inde (arba analizuojant sujungtą kartotinio bandinio indų turinį).

38.

Bandymo terpės, specialiai ruošiamos efektyviosioms koncentracijoms per bandymą analizuoti, turėtų būti apdorojamos taip pat, kaip ir bandymui naudojamos terpės, t. y. į jas pasėjami dumbliai ir sudaromos tokios pačios inkubacijos sąlygos. Jeigu reikia išanalizuoti ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją, gali reikėti dumblius atskirti nuo terpės. Patartina juos atskirti centrifuguojant, nustačius mažą perkrovos jėgą – tik tiek, kiek reikia dumbliams nusodinti.

39.

Jeigu yra įrodymų, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją per visą bandymą pavyko išlaikyti nepakitusią daugiau kaip ± 20 % vardinės arba išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatus galima analizuoti remiantis vardinėmis arba išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Jeigu nuo vardinės arba išmatuotos pradinės koncentracijos nukrypta daugiau kaip ± 20 %, rezultatus reikėtų analizuoti remiantis efektyviųjų koncentracijų geometriniu vidurkiu arba modeliais, kuriais parodytas bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos mažėjimas (3), (7).

40.

Dumblių augimo slopinimo bandymo sistema yra dinamiškesnė nei daugelio kitų trumpalaikių toksiškumo vandens organizmams bandymų, todėl gali būti sunku nustatyti faktines efektyviąsias koncentracijas, ypač lengvai įsigeriančių (adsorbuojamų) cheminių medžiagų, bandomų mažomis koncentracijomis. Tokiais atvejais bandomosios cheminės medžiagos dingimas iš tirpalo, jai įsigeriant į augančios dumblių biomasės paviršių, nereiškia, kad jos nebėra bandymo sistemoje. Analizuojant bandymo rezultatą, reikėtų patikrinti, ar per bandymą sumažėjus bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai, kartu sumažėjo dumblių augimo slopinimas. Jeigu taip, galima apsvarstyti, kaip reikėtų parodyti bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos mažėjimą taikant tinkamą modelį (7), o jeigu ne, rezultatų analizę galbūt reikėtų pagrįsti pradinėmis (vardinėmis arba išmatuotomis) koncentracijos vertėmis.

Kiti stebėjimai

41.

Reikėtų per mikroskopą apžiūrėti sėjamą kultūrą, siekiant įsitikinti, kad ji yra normalios ir sveikos išvaizdos, ir pastebėti bet kokius neįprastus dumblių išvaizdos pakitimus (galėjusius atsirasti veikiant bandomajai cheminei medžiagai) bandymo pabaigoje.

Ribų nustatymo bandymas

42.

Tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jeigu išankstinis bandymas parodo, kad bandomoji cheminė medžiaga neturi toksinio poveikio, kol jos koncentracija nesiekia 100 mg/l arba tirpumo bandymo terpėje ribos (mažesnės iš šių verčių), galima atlikti ribų nustatymo bandymą, palyginant kontrolinės grupės ir vienos bandomosios (100 mg/l arba tirpumo ribinei vertei lygios koncentracijos) grupės atsaką į poveikį. Taip gautus rezultatus labai patartina patvirtinti atliekant efektyviosios koncentracijos analizę. Ribų nustatymo bandymas turi atitikti visas pirmiau aprašytas bandymo sąlygas ir tinkamumo kriterijus, tačiau kartotiniai bandiniai su bandomąja medžiaga turėtų būti ne mažiau kaip šeši. Kontrolinės ir bandomosios grupių atsako kintamuosius galima analizuoti taikant statistinį kriterijų vidurkiams palyginti, pvz., Stjudento t kriterijų. Jeigu abiejų grupių dispersijos yra nelygios, analizę reikėtų atlikti taikant nelygioms dispersijoms pritaikytą t kriterijų.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Augimo kreivių braižymas

43.

Bandymo induose esančią biomasę galima išreikšti matavimui naudojamų pakaitinių parametrų (pvz., ląstelių skaičiaus, fluorescencijos) vienetais.

44.

Rengiant augimo kreivių grafikus, į lenteles surašomos įvertintos bandomųjų ir kontrolinių kultūrų biomasės koncentracijos vertės, bandomosios medžiagos koncentracijos vertės ir matavimo laikas, skaičiuojamas bent valandos tikslumu. Šiame pirmajame etape galima naudoti tiek logaritminių, tiek linijinių parametrų skales, tačiau logaritmines skales naudoti būtina ir pagal jas paprastai geriau pavaizduojami organizmų augimo pokyčiai per bandymo laikotarpį. Įsidėmėtina, kad eksponentinis augimas logaritminėse koordinatėse vaizduojamas tiese, kurios nuolydis (krypties koeficientas) rodo savitąjį augimo greitį.

45.

Naudodami grafikus patikrinkite, ar kontrolinės kultūros per visą bandymą eksponentiškai augo numatytu greičiu. Kritiškai įvertinkite visus duomenų taškus ir apžiūrėkite grafikus, patikrinkite neapdorotus duomenis ir procedūras, ar nėra klaidų. Ypač atidžiai tikrinkite kiekvieną duomenų tašką, kuris atrodo pasislinkęs dėl sistemingosios paklaidos. Jeigu akivaizdžiai yra ir (arba) labai tikėtina, kad yra procedūros klaidų, atitinkamas duomenų taškas pažymimas kaip riktas ir neįtraukiamas vėliau atliekant statistinę analizę (jeigu dumblių koncentracijos vertė viename iš dviejų ar trijų kartotinių indų yra lygi nuliui, tai gali reikšti, kad tame inde nebuvo tinkamai pasėti dumbliai arba indas buvo nepakankamai išvalytas). Bandymo ataskaitoje aiškiai nurodykite, dėl kokių priežasčių tam tikri duomenų taškai atmesti kaip riktai; tik (retai pasitaikančios) procedūros klaidos, o ne preciziškumo trūkumas, yra pateisinama priežastis. Statistinės riktų nustatymo procedūros tik iš dalies padeda išspręsti šią problemą ir negali atstoti ekspertų vertinimo. Riktus (atitinkamai juos pažymėjus) geriausia palikti tarp kitų duomenų taškų, vėliau kokia nors forma pateikiamų kaip grafikų arba lentelių duomenys.

Atsako kintamieji

    vidutinis savitasis augimo greitis. Šis atsako kintamasis apskaičiuojamas pagal logaritminį biomasės didėjimą (per parą) bandymo laikotarpiu;

    išeiga atsako kintamasis, reiškiantis biomasės skirtumą, atsiradusį nuo bandymo pradžios iki pabaigos.

46.

Bandymo paskirtis – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį dumblių augimui. Pagal šį bandymo metodą apibūdinami du atsako kintamieji, nes įvairiose jurisdikcijose skiriasi prioritetai ir norminiai reikalavimai. Siekiant, kad bandymo rezultatai būtų priimtini visose jurisdikcijose, poveikį reikėtų vertinti taikant abu toliau aprašytus atsako kintamuosius a ir b:

a)

b)

47.

Pažymėtina, kad taikant šiuos du atsako kintamuosius apskaičiuotos toksiškumo vertės nėra lygintinos tarpusavyje ir jų skirtumą būtina pripažinti naudojant bandymo rezultatus. Turint omenyje atitinkamų metodų matematinį pagrindą, jeigu laikomasi bandymo pagal šį metodą sąlygų, pagal vidutinį savitąjį augimo greitį nustatytos ECx vertės (ErCx) paprastai yra didesnės negu išeiga pagrįsti rezultatai (EyCx). To nereikėtų suprasti kaip abiejų atsako kintamųjų jautrio skirtumo – tiesiog vertės skiriasi matematiškai. Vidutinio savitojo augimo greičio sąvoka apibrėžta remiantis bendrąja eksponentinio dumblių augimo nevaržomose kultūrose schema, kurią taikant toksiškumas vertinamas pagal poveikį augimo greičiui, nepriklausomai nuo kontrolinės kultūros absoliučiojo savitojo augimo greičio, koncentracijos ir atsako kreivės krypties koeficiento ar bandymo trukmės. Kitu atsako kintamuoju – išeiga – pagrįsti rezultatai, priešingai, yra priklausomi nuo visų šių kitų kintamųjų. EyCx vertė priklauso nuo kiekvienam bandymui naudojamos dumblių rūšies savitojo augimo greičio ir nuo didžiausio savitojo augimo greičio, kuris įvairių rūšių ir net atskirų dumblių padermių gali būti skirtingas. Šio atsako kintamojo nereikėtų naudoti lyginant kelių dumblių rūšių ar net atskirų padermių jautrį nuodingosioms medžiagoms. Nors toksiškumui vertinti moksliniu požiūriu labiau tinka vidutinis savitasis augimo greitis, pagal šį bandymo metodą numatyta naudoti ir išeiga pagrįstus toksiškumo įverčius, kurie yra privalomi pagal kai kuriose valstybėse galiojančių norminių teisės aktų reikalavimus.

Vidutinis augimo greitis

48.

Vidutinis savitasis augimo greitis tam tikru laikotarpiu apskaičiuojamas kaip kiekvieno atskiro kontrolinių ir bandomųjų grupių indo biomasės logaritminis padidėjimas pagal lygtį [1]:

Formula

[1],

kurioje:

μi-j

yra vidutinis savitasis augimo greitis per laiko tarpą i–j;

Xi

biomasė i laiku;

Xj

biomasė j laiku.

Apskaičiuojama kiekvienos bandomosios ir kontrolinės grupės augimo greičio vidutinė vertė ir dispersijos įverčiai.

49.

Vidutinis savitasis augimo greitis per visą bandymo trukmę (paprastai 0–3 paras) apskaičiuojamas kaip pradinę vertę naudojant pasėtos biomasės kiekio vardinę vertę, o ne išmatuotą pradinę vertę, nes toks skaičiavimas paprastai yra tikslesnis. Jeigu mažą pasėlio biomasės kiekį galima pakankamai tiksliai nustatyti biomasei matuoti skirta įranga (pvz., tėkmės citometru), galima naudoti išmatuotą pradinę biomasės koncentraciją. Taip pat įvertinkite augimo greitį atskirais laiko tarpais, apskaičiuojamą kaip kiekvienos bandymo dienos (0–1, 1–2 ir 2–3 parų) savitasis augimo greitis, ir ištirkite, ar kontrolinių bandinių augimo greitis tebėra tolygus (žr. tinkamumo kriterijus 11 skirsnyje). Jeigu savitasis augimo greitis pirmąją parą yra kur kas mažesnis negu bendras vidutinis savitasis augimo greitis, tai gali reikšti latentinį periodą. Nors kontrolinių kultūrų latentinį periodą galima sutrumpinti arba visiškai panaikinti tinkamai pasėjant iš anksto paruoštą kultūrą, jeigu latentinį periodą patiria bandomosios medžiagos veikiamos kultūros, tai gali reikšti, kad jos atsigauna po pradinio toksinio streso arba iš pradžių patirtas bandomosios cheminės medžiagos poveikis vėliau susilpnėja netekus dalies jos kiekio (be kita ko, dėl gerties į dumblių biomasės paviršių). Taigi, augimo greitis atskirais laiko tarpais gali būti nustatomas siekiant įvertinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį jos veikimo laikotarpiu. Jeigu tokie nustatyti augimo greičiai atskirais laiko tarpais reikšmingai skiriasi nuo vidutinio augimo greičio, tai rodo nuokrypį nuo tolygaus eksponentinio augimo ir reikia nuodugniai ištirti augimo kreives.

50.

Apskaičiuokite augimo greičio procentinį slopinimą kiekviename kartotiniame bandinyje su bandomąja medžiaga pagal lygtį [2]:

Formula

[2],

kurioje:

%Ir

vidutinio savitojo augimo greičio sumažėjimas procentais;

μC

kontrolinės grupės vidutinio savitojo augimo greičio (μ) vidutinė vertė;

μT

vidutinis savitasis augimo greitis kartotiniame bandinyje su bandomąja medžiaga.

51.

Kai ruošiant bandymo tirpalus naudojami tirpikliai, apskaičiuojant augimo slopinimo procentinį dydį reikėtų naudoti tirpiklio kontrolinius bandinius, o ne kontrolinius bandinius be tirpiklių.

Išeiga

52.

Išeiga apskaičiuojama kaip nuo bandymo pradžios iki pabaigos atsiradęs biomasės skirtumas kiekviename atskirame kontrolinių ir bandomųjų grupių inde. Apskaičiuokite kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos ir kontrolinės grupės išeigos vidutinę vertę kartu su dispersijos įverčiais. Kiekvieno bandomosios grupės kartotinio bandinio išeigos sumažėjimą procentais ( % Iy) galima apskaičiuoti pagal formulę

Formula

[3]

Šioje formulėje:

% Iy

išeigos sumažėjimas procentais;

YC

vidutinė kontrolinės grupės išeigos vertė;

YT

bandomosios grupės kartotinio bandinio išeigos vertė.

Koncentracijos ir atsako kreivės braižymas

53.

Nubraižykite augimo slopinimo procentinio lygio ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos logaritmo grafiką ir nuodugniai jį išnagrinėkite, nekreipdami dėmesio į tuos duomenų taškus, kurie per pirmąjį etapą buvo pažymėti kaip riktai. Iš akies arba kompiuterinio interpoliavimo būdu nubrėžkite per duomenų taškus tolydžią liniją, kad gautumėte pradinį koncentracijos ir atsako santykio vaizdą. Tada taikykite išsamesnį, geriausia kompiuterinį statistinį, metodą. Priklausomai nuo numatomos duomenų paskirties, kokybės (preciziškumo) bei kiekio ir turimų duomenų analizės priemonių, galima (kartais labai pagrįstai) nuspręsti baigti duomenų analizę šiame etape ir tiesiog iš akies nubrėžtoje kreivėje rasti pagrindinius EC50, EC10 ir (arba) EC20 dydžius (taip pat žr. tolesnį skirsnį, kuriame rašoma apie skatinamąjį poveikį). Statistinio metodo galima netaikyti dėl tokių pagrįstų priežasčių:

apdorojant tuos duomenis kompiuterizuotais metodais gauti rezultatai nebūtų patikimesni negu ekspertų vertinimo rezultatai. Tokiais atvejais naudojant kai kurias kompiuterines programas gali net nepavykti gauti patikimo sprendinio (iteracijos gali nekonverguoti ir t. t.);

turimomis kompiuterinėmis programomis neįmanoma tinkamai apdoroti atsako į augimo skatinimą duomenų (žr. toliau).

Statistinės procedūros

54.

Tikslas yra kiekybiškai nustatyti koncentracijos ir atsako santykį atliekant regresinę analizę. Galima taikyti svertinę tiesinę regresiją atlikus atsako duomenų tiesinamąjį transformavimą, pvz., į probito, logito arba Weibull vienetus (8), tačiau geriau atlikti procedūras netiesinės regresijos metodais, per kurias geriau apdorojami neišvengiami duomenų neatitikimai ir nukrypimai nuo glodžiųjų skirstinių. Artėjant prie nulinio arba visiško augimo slopinimo, tokie neatitikimai dėl transformavimo gali padidėti ir trukdyti analizei (8). Pažymėtina, kad standartiniai analizės metodai naudojant probito, logito arba Weibull transformuotus dydžius yra skirti dvireikšmiams (pvz., gaištamumo arba išgyvenimo) kintamiesiems, todėl norint naudoti juos augimo ar biomasės duomenims, būtina juos atitinkamai pritaikyti. Konkrečios ECx verčių nustatymo iš tolydžiųjų duomenų procedūros aprašytos literatūroje (9), (10), (11). Netiesinės regresijos analizės taikymas išsamiau aprašytas 5 priedėlyje.

55.

Analizuodami kiekvieną atsako kintamąjį, remdamiesi koncentracijos ir atsako santykiu, apskaičiuokite ECx verčių taškinius įverčius. Kai įmanoma, reikėtų nustatyti kiekvieno įverčio 95 % pasikliovimo ribas. Reikėtų pagal grafiką arba statistiškai įvertinti atsako duomenų atitiktį regresijos modeliui. Regresinė analizė turėtų būti atliekama naudojant atskirų kartotinių bandinių atsakus, o ne visos bandomosios grupės vidutines vertes. Tačiau jeigu netiesinę kreivę pritaikyti yra sunku arba neįmanoma dėl per didelės duomenų sklaidos, šią problemą galima apeiti atliekant nustatytų grupės vidutinių verčių regresiją – taip praktiškai sumažinama spėjamų riktų įtaka. Pasirinkus šį būdą, bandymo ataskaitoje reikėtų nurodyti, kad nukrypta nuo įprastos procedūros, nes pritaikant kreivę atskiriems kartotiniams bandiniams nebuvo gauta tinkamo rezultato.

56.

Be to, jeigu esami regresijos modeliai ir (arba) metodai netinka turimiems duomenims, EC50 įverčius ir pasikliovimo ribas taip pat galima gauti atliekant tiesinę interpoliaciją su saviranka (angl. bootstrapping) (13).

57.

Vertinant bandomosios cheminės medžiagos poveikio augimo greičiui LOEC, taigi ir NOEC, būtina palyginti bandomosios grupės vidutines vertes taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodus. Taip gautą kiekvienos koncentracijos grupės vidurkį reikia palyginti su kontrolinės grupės vidurkiu taikant tinkamą kartotinių palyginimų arba trendo kriterijaus metodą. Gali būti naudinga taikyti Dunnett arba Williams kriterijų (12), (14), (15), (16), (17). Būtina įvertinti, ar tinka ANOVA dispersijos vienalytiškumo prielaida. Šį vertinimą galima atlikti naudojant grafiką arba taikant formalųjį kriterijų (17). Tinka taikyti Levene arba Bartlett kriterijus. Jeigu netinka dispersijų vienalytiškumo prielaida, kartais galima tai pataisyti logaritmine duomenų transformacija. Jei dispersija yra itin nevienalytė ir to neįmanoma pataisyti transformuojant duomenis, reikėtų apsvarstyti galimybę atlikti analizę kitais metodais, pvz., taikant laipsninio mažinimo Jonkheere trend kriterijus. Papildomų rekomendacijų, kaip nustatyti NOEC, pateikta literatūroje (11).

58.

Atsižvelgiant į naujus mokslo pasiekimus, rekomenduojama atsisakyti NOEC sąvokos ir vietoj jos naudoti regresija pagrįstus ECx taškinius įverčius. Pagal šį dumblių bandymo metodą tinkama x vertė nenustatyta, tačiau atrodo, kad tinka į 10–20 % intervalą patenkanti vertė (kuri priklauso nuo pasirinkto atsako kintamojo). Ataskaitoje geriausia nurodyti abi (EC10 ir EC20) vertes.

Augimo skatinimas

59.

Esant nedidelėms bandomųjų medžiagų koncentracijoms, kartais pastebima, kad jos skatina bandomųjų organizmų augimą (tai vadinama neigiamu slopinimu). Šio reiškinio priežastis gali būti hormezė („toksinis skatinimas“) arba tai, kad kartu su bandomąja medžiaga į naudojamą minimalią terpę pridėta augimo skatinimo veiksnių. Pažymėtina, kad neorganinių mitybinių medžiagų patekimas į terpę neturėtų turėti jokio tiesioginio poveikio organizmams, nes bandymo terpėje per visą bandymo laiką turėtų būti palaikomas mitybinių medžiagų perteklius. Į mažų dozių sukeltą skatinamąjį poveikį paprastai galima nekreipti dėmesio apskaičiuojant EC50, jeigu jis nėra labai didelis. Tačiau jeigu toks poveikis yra itin didelis arba reikia apskaičiuoti ECx vertę, kai x yra mažas, gali reikėti specialių procedūrų. Kai įmanoma, organizmų atsaką į skatinamąjį poveikį reikėtų įtraukti atliekant duomenų analizę, o jeigu naudojant turimą kreivių pritaikymo programinę įrangą į nedidelį skatinamąjį poveikį atsižvelgti neįmanoma, galima taikyti tiesinę interpoliaciją su saviranka. Jeigu skatinamasis poveikis itin didelis, galbūt tiktų taikyti hormezės modelį (18).

Netoksinis augimo slopinimas

60.

Kai bandomosios medžiagos sugeria šviesą, organizmų augimas gali sulėtėti dėl tamsinimo sumažėjus gaunamam šviesos kiekiui. Tokių fizinių reiškinių poveikį reikėtų skirti nuo toksinio poveikio, atitinkamai pakeičiant bandymo sąlygas, ir ataskaitoje jį reikėtų aprašyti atskirai. Rekomendacijų pateikta literatūroje (2), (3).

BANDYMO ATASKAITA

61.

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta toliau nurodyta informacija.

 

Bandomoji cheminė medžiaga

Medžiagos fizikinė prigimtis ir atitinkamos fizikinės ir cheminės savybės, įskaitant tirpumo vandenyje ribą.

Cheminės medžiagos atpažinties duomenys (pvz., CAS numeris), įskaitant grynumą (priemaišas).

 

Bandomosios rūšys

Pasirinkta padermė, tiekėjas arba šaltinis ir kultūros auginimo sąlygos.

 

Bandymo sąlygos

Bandymo pradžios data ir trukmė.

Bandymo plano aprašymas: naudojami bandymo indai, kultūrų tūriai, biomasės tankis bandymo pradžioje.

Terpės sudėtis.

Bandymui pasirinktos koncentracijos ir kartotiniai bandiniai (pvz., kartotinių bandinių skaičius, bandymui pasirinktų koncentracijų skaičius ir taikyta geometrinė progresija).

Bandymo tirpalų ruošimo aprašymas, įskaitant tirpiklių naudojimą ir t. t.

Kultūros auginimo aparatūra.

Šviesos stipris ir apšvietimo kokybė (šaltinis, vienalytiškumas).

Temperatūra.

Bandomosios koncentracijos – vardinės bandymui pasirinktos koncentracijos ir bet kokie analizių, atliktų nustatant bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją bandymo induose, rezultatai. Reikėtų nurodyti bandomosios medžiagos regeneravimo našumą pagal pasirinktą metodą ir kiekybinio nustatymo ribą bandymo matricoje.

Bet kokie nukrypimai nuo šio bandymo metodo.

Biomasės nustatymo metodas ir matuojamo parametro bei sausosios medžiagos masės sąsajos įrodymas.

 

Rezultatai

Visų bandomosios grupės indų pH vertės bandymo pradžioje ir pabaigoje.

Kiekvienos kolbos biomasė kiekviename matavimo taške ir biomasės matavimo metodas.

Augimo kreivės (biomasės kaip laiko funkcijos grafikas).

Apskaičiuoti kiekvieno bandomosios grupės kartotinio bandinio atsako kintamieji, jų vidutinės vertės ir kartotinių bandinių variacijos koeficientas.

Koncentracijos ir poveikio santykio grafikas.

Toksiškumo įverčiai pagal atsako kintamuosius, pvz., EC50, EC10, EC20, ir atitinkami pasikliautinieji intervalai. LOEC ir NOEC vertės (jeigu apskaičiuotos) ir statistiniai metodai, pagal kuriuos jos nustatytos.

Jei taikytas ANOVA metodas – mažiausio aptinkamo poveikio dydis (pvz., mažiausias reikšminis skirtumas).

Bet koks bandomosiose grupėse nustatytas augimo skatinimas.

Bet kokie kiti pastebėti reiškiniai, pvz., dumblių sandaros (morfologiniai) pokyčiai.

Rezultatų aptarimas, be kita ko, paaiškinant bet kokių nukrypimų nuo šio bandymo metodo įtaką bandymo rezultatams.

NUORODOS

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1 priedėlis

Sąvokų apibrėžtys

Toliau pateiktos taikant šį bandymo metodą vartojamų sąvokų apibrėžtys.

Biomasė – gyvų organizmų populiacijos masė, išreiškiama tam tikrame tūrio vienete esančios sausosios medžiagos mase, pvz., kiek miligramų dumblių yra viename bandymo tirpalo litre (mg/l). Biomasės sąvoka paprastai suprantama kaip masė, tačiau per šį bandymą šis terminas vartojamas masei tūrio vienete apibūdinti. Be to, per šį bandymą vietoj biomasės paprastai matuojami pakaitiniai parametrai, kaip antai ląstelių skaičius, fluorescencija ir t. t., taigi biomasės sąvoka apima ir šiuos pakaitinius matavimo vienetus.

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

Variacijos koeficientas – nedimensinis tam tikro parametro kintamumo matas, apibrėžiamas kaip standartinio nuokrypio ir vidurkio santykis. Jį galima išreikšti ir procentine verte. Kartotinių kontrolinių kultūrų vidutinio savitojo augimo greičio vidutinis variacijos koeficientas turėtų būti apskaičiuojamas taip:

1.

pagal kasdienio (atskirų laiko tarpų) augimo greičius apskaičiuojamas atitinkamo kartotinio bandinio vidutinio savitojo augimo greičio variacijos koeficientas (procentais);

2.

apskaičiuojama visų taip, kaip nurodyta pirmojoje įtraukoje, apskaičiuotų verčių vidutinė vertė, pagal kurią gaunamas kartotinių kontrolinių kultūrų kasdienio (atskirų laiko tarpų) savitojo augimo greičio vidutinis variacijos koeficientas.

ECx – bandymo terpėje ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant bandomojo organizmo augimas per nustatytą bandomosios medžiagos veikimo laikotarpį (kuris, jeigu skiriasi nuo visos arba įprastos bandymo trukmės, turi būti tiksliai nurodytas) sumažėja x % (pvz., 50 %). Pagal augimo greitį arba išeigą nustatytai EC vertei vienareikšmiškai žymėti vartojami simboliai ErC (augimo greičio) ir EyC (išeigos).

Auginimo terpė – visiškai paruošta sintetinė kultūrai auginti skirta terpė, kurioje per bandymą auginami bandomosios cheminės medžiagos veikiami dumbliai. Bandomoji cheminė medžiaga paprastai ištirpinama auginimo terpėje.

Augimo greitis (vidutinis savitasis augimo greitis)– logaritminis biomasės didėjimas bandomosios medžiagos veikimo laikotarpiu.

Mažiausia pastebėto poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandymui pasirinkta koncentracija, kuriai esant pastebimas statistiškai reikšmingas cheminės medžiagos slopinamasis poveikis bandomųjų organizmų augimui (kai p < 0,05), palyginti su kontroliniais bandiniais, per nustatytą tos medžiagos veikimo laikotarpį; tačiau visų LOEC viršijančių bandymo koncentracijos verčių kenksmingas poveikis turi būti lygus LOEC poveikiui arba didesnis. Kai šios dvi sąlygos netenkinamos, būtina išsamiai paaiškinti, kaip pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė.

Nepastebėto poveikio koncentracija (NOEC) – bandymui pasirinkta koncentracija, kuri yra tik truputį mažesnė negu LOEC koncentracija.

Atsako kintamasis – toksiškumui vertinti naudojamas kintamasis, gautas pagal bet kurį iš matuojamų parametrų, kuriais apibūdinama biomasė taikant skirtingus apskaičiavimo metodus. Pagal šį bandymo metodą atsako kintamieji yra augimo greitis ir išeiga, nustatyti matuojant pačią biomasę arba kurį nors iš nurodytų pakaitinių parametrų.

Savitasis augimo greitis – atsako kintamasis, apibrėžiamas kaip stebimo parametro (pagal šį bandymo metodą – biomasės) natūraliųjų logaritmų skirtumo ir atitinkamo laikotarpio dalmuo.

Bandomoji cheminė medžiaga – naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.

Išeiga – matuojamo kintamojo verčių bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio pabaigoje ir pradžioje skirtumas, kuriuo išreiškiamas biomasės padidėjimas per bandymo laikotarpį.

2 priedėlis

Bandymui tinkamos padermės

Žaliadumbliai

 

Pseudokirchneriella subcapitata (anksčiau vadinti Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG.

 

Desmodesmus subspicatus (anksčiau vadinti Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG.

Titnagdumbliai

Navicula pelliculosa, UTEX 664.

Melsvabakterės

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A.

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1.

Padermių šaltiniai

Rekomenduojamas dumblių padermes galima gauti kaip vienarūšes kultūras iš šių rinkinių (išvardyti abėcėlės tvarka):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

USA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

UK

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

GERMANY

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA

Rekomenduojamų naudoti rūšių išvaizda ir savybės

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Išvaizda

Lenktos, susuktos pavienės ląstelės

Ovalo formos, daugiausia pavienės ląstelės

Lazdelės

Ovalo formos ląstelių grandinės

Lazdelės

Dydis (ilgis ir plotis), μm

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Ląstelės tūris (μm3/ląstelė)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Sausoji ląstelių masė (mg/ląstelė)

2–3 × 10– 8

3–4 × 10– 8

3–4 × 10– 8

1–2 × 10– 8

2–3 × 10– 9

Augimo greitis (4) (para– 1)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Konkrečios rekomendacijos dėl bandymams rekomenduojamų rūšių kultūrų auginimo ir priežiūros

Pseudokirchneriella subcapitata ir Desmodesmus subspicatus

Šiuos žaliadumblius apskritai lengva prižiūrėti įvairiose auginimo terpėse. Informaciją apie tinkamas terpes teikia atitinkamų kultūrų rinkinių tiekėjai. Ląstelės paprastai yra pavienės, jų tankį lengva išmatuoti elektroniniu dalelių skaitikliu arba mikroskopu.

Anabaena flos-aquae

Pradinei kultūrai laikyti tinka įvairios auginimo terpės. Itin svarbu užtikrinti, kad nesibaigtų atnaujinamos atskiromis partijomis ruošiamos kultūros eksponentinio augimo tarpsnis, nes atgaivinti pasibaigus šiam tarpsniui būtų sunku.

Anabaena flos-aquae sudaro viena prie kitos prikibusių ląstelių grandinių sankaupas, kurių dydis gali kisti priklausomai nuo kultūros auginimo sąlygų. Šias sankaupas gali reikėti suardyti, kai biomasei nustatyti atliekami skaičiavimai mikroskopu arba elektroniniu dalelių skaitikliu.

Siekiant suardyti ląstelių grandines ir taip sumažinti jų skaičiaus kintamumą, dalinius ėminius galima apdoroti ultragarsu. Ilgiau, negu reikia grandinėms sutrumpinti, ultragarsu apdorojamos ląstelės gali žūti. Kiekvieno apdorojimo ultragarsu intensyvumas ir trukmė turi būti vienodi.

Siekiant kompensuoti kintamumą, suskaičiuokite pakankamai daug hemocitometro laukų (bent 400 ląstelių). Tai padės patikimiau nustatyti tankį mikroskopu.

Bendrą Anabaena ląstelių tūrį galima nustatyti elektroniniu dalelių skaitikliu, ląstelių grandines suardžius atsargiai apdorojant ultragarsu. Kad ląstelės nesuirtų, apdorojimo ultragarsu jėga turi būti reguliuojama.

Siekiant užtikrinti, kad į bandymo indus sėjama dumblių suspensija būtų gerai sumaišyta ir vienalytė, naudojamas sūkurinis maišytuvas arba panašus tinkamas būdas.

Bandymo indus reikėtų pastatyti ant sukamosios arba slankiojamosios purtyklės stalo ir maišyti maždaug 150 sūkių per minutę greičiu. Arba galima suplakti indų turinį darant pertraukas – taip Anabaena būtų mažiau linkę sudaryti gniužulus. Jei susidaro gniužulų, būtina stengtis paimti reprezentatyvius ėminius biomasei matuoti. Norint suardyti dumblių gniužulus, prieš imant ėminius gali reikėti juos stipriai pakratyti.

Synechococcus leopoliensis

Pradinei kultūrai laikyti tinka įvairios auginimo terpės. Informaciją apie tinkamas terpes teikia atitinkamų kultūrų rinkinių tiekėjai.

Synechococcus leopoliensis yra pavienės lazdelės formos ląstelės, kurios yra labai mažos, todėl matuojant biomasę jas sunku suskaičiuoti mikroskopu. Pravartu naudoti elektroninius dalelių skaitiklius, pritaikytus mažesnėms, iki maždaug 1 μm dydžio dalelėms skaičiuoti. Taip pat tinka atlikti in vitro fluorimetrinius matavimus.

Navicula pelliculosa

Pradinei kultūrai laikyti tinka įvairios auginimo terpės. Informaciją apie tinkamas terpes teikia atitinkamų kultūrų rinkinių tiekėjai. Atminkite, kad terpės sudėtyje turi būti silikato.

Tam tikromis auginimo sąlygomis Navicula pelliculosa gali sudaryti sankaupas. Dėl lipidų susidarymo šių dumblių ląstelės kartais sudaro plėvelę terpės paviršiuje. Tokiomis sąlygomis imant dalinius ėminius biomasei nustatyti, būtina imtis specialių priemonių, kad ėminiai būtų reprezentatyvūs. Gali reikėti stipriai sukratyti dumblius, pvz., sūkuriniu maišytuvu.

3 priedėlis

Auginimo terpės

Galima naudoti vieną iš šių dviejų auginimo terpių:

EBPO terpė – originali EBPO TG 201 terpė, taip pat naudojama pagal standartą ISO 8692;

JAV aplinkos apsaugos agentūros AAP terpė, taip pat naudojama pagal ASTM.

Šioms terpėms ruošti turėtų būti naudojamos analiziškai grynos cheminės medžiagos ir dejonizuotas vanduo.

AAP (JAV aplinkos apsaugos agentūros) terpės ir EBPO TG 201 terpės sudėtis

Sudedamoji dalis

AAP terpė

EBPO terpė

 

mg/l

mmol

mg/l

mmol

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

EDTA ir geležies molinis santykis vos viršija vienetą; taip nesusidaro geležies nuosėdų ir kartu sunkiųjų metalų jonų chelodara yra minimali.

Bandymui naudojant titnagdumblius Navicula pelliculosa, siekiant gauti 1,4 mg Si/l koncentraciją, į abi terpes turi būti papildomai dedama Na2SiO3 · 9H20.

Terpės pH vertė gaunama nusistovėjus pusiausvyrai tarp terpės karbonatinės sistemos ir atmosferos oro dalinio CO2 slėgio. Apytikris santykis tarp pH vertės, esant 25 °C temperatūrai, ir molinės hidrokarbonato koncentracijos išreiškiamas formule

pHeq = 11,30 + log[HCO3].

Esant 15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (JAV aplinkos apsaugos agentūros siūlomoje terpėje), o esant 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (EBPO terpėje).

Bandymo terpių elementinė sudėtis

Elementas

AAP terpė

EBPO terpė

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

EBPO terpės ruošimas

Mitybinė medžiaga

Koncentracija pradiniame tirpale

1 pradinis tirpalas:

mitybiniai makroelementai

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

2 pradinis tirpalas:

geležis

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

3 pradinis tirpalas:

mikroelementai

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

4 pradinis tirpalas:

hidrokarbonatas

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Pradiniai tirpalai sterilizuojami membraninio filtravimo būdu (vidutinis akučių skersmuo 0,2 μm) arba apdorojant autoklave (120 °C temperatūroje, 15 min.). Tirpalai laikomi tamsoje, 4 °C temperatūroje.

Autoklave negalima apdoroti 2 ir 4 pradinių tirpalų, jie sterilizuojami membraninio filtravimo būdu.

Auginimo terpė paruošiama į vandenį įpilant atitinkamą 1–4 pradinių tirpalų kiekį.

 

Į 500 ml sterilizuoto vandens įpilama:

 

10 ml 1 pradinio tirpalo;

 

1 ml 2 pradinio tirpalo;

 

1 ml 3 pradinio tirpalo;

 

1 ml 4 pradinio tirpalo.

 

Atskiedžiama sterilizuotu vandeniu iki 1 000 ml tūrio.

Terpė pakankamai ilgai laikoma, kad tarp jos ir atmosferos oro nusistovėtų CO2 pusiausvyra, jei reikia, kelias valandas barbotuojant sterilų filtruotą orą.

JAV aplinkos apsaugos agentūros terpės ruošimas

1.

Po 1 ml kiekvieno iš 2.1–2.7 punktuose nurodytų pradinių tirpalų įpilama į maždaug 900 ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens ir atskiedžiama iki 1 litro tūrio.

2.

Mitybinių makroelementų pradiniai tirpalai ruošiami 500 ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens ištirpinant toliau nurodytus medžiagų kiekius. 2.1, 2.2, 2.3 ir 2.4 punktuose nurodytus reagentus galima sumaišyti viename pradiniame tirpale.

2.1

NaNO3

12,750 g

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g

2.4

Mitybinių mikroelementų pradiniai tirpalai (žr. 3)

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g

2.6

K2HPO4

0,522 g

2.7

NaHCO3

7,500 g

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

Žr. 1 pastabą.

1 pastaba. Tinka tik bandomosioms titnagdumblių rūšims. Galima dėti tiesiai į terpę (202,4 mg) arba kaip pradinį tirpalą, kad galutinė koncentracija terpėje būtų 20 mg/l Si.

3.

Mitybinių mikroelementų pradinis tirpalas ruošiamas 500 ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens ištirpinant:

3.1

H3BO3

92,760 mg

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg

3.3

ZnCl2

1,635 mg

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [dinatrio (etilendinitrilo) tetraacetatas]

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg Žr. 2 pastabą.

2 pastaba. Tinka dėti tik į titnagdumblių rūšių pradinių kultūrų terpes.

4.

Nustatoma 7,5 ± 0,1 pH vertė įdedant 0,1 N arba 1,0 N NaOH arba HCl.

5.

Terpės perfiltruojamos į sterilią talpą per 0,22 μm akučių membraninį filtrą, jeigu bus naudojamas dalelių skaitiklis, arba per 0,45 μm akučių filtrą, jeigu dalelių skaitiklis nebus naudojamas.

6.

Terpė iki naudojimo laikoma tamsoje, maždaug 4 °C temperatūroje.

4 priedėlis

Dumblių kultūrų auginimo procedūros pavyzdys

Bendrosios pastabos

Pagal šią procedūrą dumblių kultūros auginamos toksiškumo bandymams atlikti.

Tinkamais metodais užtikrinkite, kad dumblių kultūros nebūtų užkrėstos bakterijomis. Gali būti patartina naudoti sterilizuotas kultūras, tačiau turi būti gautos ir naudojamos vienarūšės dumblių kultūros.

Stengiantis išvengti užkrėtimo bakterijomis ir kitais dumbliais, visus veiksmus būtina atlikti steriliomis sąlygomis.

Naudojama įranga ir medžiagos

Žr. šio bandymo metodo aprašymą („Aparatūra“).

Dumblių kultūrų gavimo procedūros

Mitybinių medžiagų tirpalų (terpių) ruošimas

Paruošiami visų į terpę dedamų mitybinių medžiagų druskų koncentruoti pradiniai tirpalai, kurie laikomi tamsoje ir šaltai. Šie tirpalai sterilizuojami filtruojant arba apdorojant autoklave.

Terpė ruošiama į sterilų distiliuotą vandenį įpilant reikiamą pradinio tirpalo kiekį, imantis apsaugos nuo užkrėtimo priemonių. Ruošiant kietąją terpę įdedama 0,8 % agaro.

Pradinė kultūra

Pradinės kultūros yra mažos dumblių kultūros, kurios reguliariai perkeliamos į šviežią terpę ir naudojamos kaip pradinė bandymų medžiaga. Jeigu kultūros reguliariai nenaudojamos, jos perkeliamos ant gulsčiojo agaro mėgintuvėliuose. Šios kultūros bent kartą per du mėnesius perkeliamos į šviežią terpę.

Pradinės kultūros auginamos tinkamoje terpėje (apie 100 ml tūrio) kūginėse kolbose. 20 °C temperatūroje nuolatinio apšvietimo sąlygomis inkubuojamus dumblius reikia perkelti kas savaitę.

Į kolbą su šviežia terpe sterilia pipete perkeliamas toks „senos“ kultūros kiekis, kad pradinė koncentracija greitai augančių rūšių atveju būtų maždaug 100 kartų mažesnė nei senos kultūros.

Konkrečios rūšies dumblių augimo greitį galima nustatyti iš augimo kreivės. Žinant augimo greitį, galima įvertinti, koks turėtų būti į naują terpę perkeliamos kultūros tankis. Tai reikia padaryti anksčiau, negu atitinkama kultūra pasieks žūties tarpsnį.

Iš anksto paruošta kultūra

Iš anksto paruošta kultūra naudojama bandomųjų kultūrų pasėliui reikalingam dumblių kiekiui gauti. Iš anksto paruošta kultūra inkubuojama bandymo sąlygomis ir naudojama per eksponentinio augimo tarpsnį, paprastai maždaug po 2–4 parų inkubacinio periodo. Dumblių kultūrose esančios deformuotos arba neįprastos sandaros ląstelės turi būti pašalintos.

5 priedėlis

Duomenų analizė netiesinės regresijos būdu

Bendrosios pastabos

Per dumblių ir kitų mikroorganizmų augimo bandymus gaunamas atsakas – biomasės augimas – yra iš esmės tolydusis arba metrinis kintamasis – proceso greitis, jei naudojamas augimo greitis, ir jo integralas pagal laiką, kintamuoju pasirinkus biomasę. Abu dydžiai lyginami su atitinkamu bandomosios medžiagos neveikiamų kartotinių kontrolinių bandinių vidutiniu atsaku, kuris yra didžiausias atsakas nustatytomis sąlygomis (pagrindiniai lemiamą įtaką turintys veiksniai per dumblių bandymą yra šviesa ir temperatūra). Bandymo sistema yra paskirstytoji arba vienalytė ir biomasę galima vertinti kaip ištisinį parametrą neatsižvelgiant į atskiras ląsteles. Tokioje sistemoje būdingo atsako dispersijos pasiskirstymas (paprastai apibūdinamas logaritminiu normaliuoju arba normaliuoju paklaidų skirstiniu) siejamas tik su bandymo veiksniais. Tai yra priešinga tipiniams dvireikšmių kintamųjų bioanalizės atsakams, dėl kurių dažnai daroma prielaida, kad atskirų organizmų atsparumas (paprastai išreikštas binominiu skirstiniu) yra vyraujantis dispersijos komponentas. Šiuo atveju kontrolinės grupės atsakas yra nulinio arba foninio lygio.

Nesudėtingu atveju normalizuotas arba santykinis atsakas r tolygiai mažėja nuo 1 (nulinis slopinimas) iki 0 (100 % slopinimas). Įsidėmėtina, kad visi atsakai turi asocijuotąją paklaidą ir kad gali būti apskaičiuotas tariamas neigiamas slopinimas, kuris būtų tik atsitiktinės paklaidos rezultatas.

Regresinė analizė

Modeliai

Regresinės analizės tikslas – koncentracijos ir atsako kreivę kiekybiškai apibūdinti kaip matematinės regresijos funkciją Y = f (C) arba, dažniau, F (Z), kai Z = log C. Naudojant atvirkštinę funkciją C = f– 1 (Y) galima apskaičiuoti ECx vertes, įskaitant EC50, EC10 ir EC20, ir jų 95 % pasikliovimo ribas. Įrodyta, kad dumblių augimo slopinimo bandymais gautiems koncentracijos ir atsako santykiams apibūdinti tinka kelios paprastos matematinių funkcijų formulės. Tokios funkcijos yra, pvz., logistinė lygtis, nesimetrinė Weibull lygtis ir logaritminio normaliojo skirstinio funkcija. Visos jos yra sigmoidės, asimptotiškai artėjančios prie vieneto, kai C → 0, ir prie nulio, kai C → begalybė.

Neseniai pasiūlyta kaip alternatyvą asimptotiniams modeliams taikyti tolydžiosios slenksčio funkcijos modelius (pvz., Kooijman „populiacijos augimo slopinimo“ modelį, Kooijman et al., 1996). Pagal šį modelį daroma prielaida, kad poveikio nėra, kol koncentracija nesiekia tam tikros ribinės EC0+ vertės, įvertinamos ekstrapoliuojant atsako ir koncentracijos santykį iki sankirtos su koncentracijos verčių ašimi, naudojant paprastą tolydžiąją funkciją, nediferencijuojamą pradžios taške.

Įsidėmėtina, kad analizė gali būti atliekama paprasčiausiai naudojant minimalias liekanų kvadratų (pastovios dispersijos atveju) sumas arba svertinių kvadratų sumas, jeigu kompensuojamas dispersijos nevienalytiškumas.

Procedūra

Taikomą procedūrą galima glaustai apibūdinti taip: pasirinkta tinkama funkcinė lygtis Y = f(C) pritaikoma turimiems duomenims taikant netiesinę regresiją. Siekiant iš turimų duomenų gauti kuo daugiau informacijos, geriau naudoti atskirus kiekvienos kolbos matavimų duomenis, o ne vidutines kartotinių bandinių vertes. Kita vertus, esant didelei dispersijai, iš praktinės patirties yra žinoma, kad naudojant kartotinių bandinių vidurkius galima atlikti patikimesnį, mažiau duomenų sistemingųjų paklaidų veikiamą matematinį vertinimą negu tada, kai naudojamas kiekvienas atskiras paliktas duomenų taškas.

Grafike pavaizduojama pritaikyta kreivė kartu su matavimų duomenimis ir patikrinama, ar kreivė pritaikyta tinkamai. Šiuo tikslu gali būti itin naudinga atlikti liekanų analizę. Jeigu pasirinkta koncentracijos ir atsako pritaikymo funkcija tinka ne visai kreivei arba tik kuriai nors esminei jos daliai aprašyti, pvz., atsako „duobei“ esant mažoms koncentracijos vertėms, vietoj simetrinės pasirenkama kita pritaikoma kreivė, pvz., nesimetrinė Weibull funkcijos kreivė. Dėl neigiamo slopinimo gali kilti problemų, pvz., naudojant logaritminio normaliojo skirstinio funkciją; tokiu atveju irgi reikės rinktis kitą regresijos funkciją. Tokių neigiamų verčių nepatartina prilyginti nuliui ar priskirti joms mažą teigiamą vertę, nes taip būtų iškreiptas paklaidų pasiskirstymas. Norint įvertinti ECx, kai x yra mažas, vertes, galbūt tiktų pritaikyti kreivę atskirose jos dalyse, pvz., mažo slopinimo dalyje. Pagal pritaikytą lygtį apskaičiuojami („atvirkštinio įvertinimo“ būdu) C = f– 1(Y) būdingųjų taškų įverčiai ECx ir ataskaitoje pateikiamas bent EC50 įvertis bei vienas iš dviejų ECx, esant mažam x, įverčių. Iš bandymų praktikos žinoma, kad dėl dumblių bandymo preciziškumo paprastai galima pakankamai tiksliai įvertinti 10 % slopinimo lygį, jeigu yra pakankamai duomenų taškų, nebent, esant mažoms koncentracijoms, iškraipantysis veiksnys būtų augimo skatinimas. EC20 įverčio preciziškumas dažnai yra kur kas didesnis negu EC10, nes EC20 paprastai yra maždaug tiesiojoje vidurinės koncentracijos ir atsako kreivės dalyje. Kartais EC10 duomenis gali būti sunku aiškinti dėl skatinamojo poveikio augimui. Todėl, nors EC10 vertę paprastai galima pakankamai tiksliai nustatyti, rekomenduojama ataskaitoje visada nurodyti ir EC20.

Svertiniai koeficientai

Bandymų dispersija apskritai yra nepastovi ir į ją paprastai įeina proporcinis komponentas, taigi įprastai galima sėkmingai atlikti svertinę regresinę analizę. Tokiai analizei naudojami svertiniai koeficientai paprastai laikomi atvirkščiai proporcingais dispersijai:

Wi = 1/Var(ri)

Naudojant daugelį regresijos programų galima pasirinkti svertinę regresinę analizę, svertinius koeficientus pateikiant lentelėje. Patogu normalizuoti svertinius koeficientus dauginant juos iš n/Σ wi (n yra duomenų taškų skaičius), kad jų suma būtų lygi vienetui.

Atsakų normalizavimas

Normalizavimas pagal vidutinį kontrolinių bandinių atsaką kelia tam tikrų metodinių problemų ir gaunama gan sudėtingos struktūros dispersija. Kai augimo slopinimo procentinė vertė gaunama dalijant konkrečias atsako vertes iš kontrolinių bandinių atsako vidurkio, atsiranda papildoma paklaida dėl kontrolinių bandinių vidurkio paklaidos, todėl būtina atlikti regresijos svertinių koeficientų ir pasikliovimo ribų pataisą dėl kovariacijos su kontroliniais bandiniais (Draper ir Smith, 1981), nebent ši paklaida būtų labai maža. Įsidėmėtina, jog svarbu didelis kontrolinių bandinių vidutinio atsako įverčio preciziškumas, kad santykinio atsako suminė dispersija būtų kuo mažesnė. Ši dispersija atrodo taip:

(apatinis i indeksas reiškia i koncentracijos lygį, 0 indeksas – kontrolinius bandinius)

Yi = santykinis atsakas = ri/r0 = 1 – I = f(Ci),

kurio dispersija Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)),

ir kadangi (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 ir (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2,

esant normaliajam duomenų skirstiniui ir mi bei m0 kartotiniams bandiniams: Var(ri ) = σ2/mi

suminė santykinio atsako Yi dispersija yra

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Kontrolinių bandinių vidurkio paklaida yra atvirkščiai proporcinga kvadratinei šakniai iš suvidurkintų kontrolinių kartotinių bandinių skaičiaus; kartais galima pagrįstai įtraukti iš anksčiau sukauptus duomenis ir taip labai sumažinti paklaidą. Pagal alternatyvią procedūrą nereikia normalizuoti duomenų ir pritaikyti absoliučiųjų atsakų dydžių, įskaitant kontrolinių bandinių atsakų duomenis, tačiau reikia naudoti kontrolinių bandinių atsako vertę kaip papildomą parametrą, pritaikomą netiesinės regresijos būdu. Naudojant įprastą 2 parametrų regresijos lygtį, pagal šį metodą reikia pritaikyti 3 parametrus, todėl reikia daugiau duomenų taškų negu taikant netiesinę regresiją duomenims, kurie normalizuojami naudojant iš anksto nustatytą kontrolinių bandinių atsaką.

Atvirkštiniai pasikliautinieji intervalai

Netiesinės regresijos pasikliautinųjų intervalų apskaičiavimas atliekant atvirkštinį įvertinimą yra gana sudėtingas ir įprastuose statistikos kompiuterinių programų rinkiniuose jo nėra kaip tipinės pasirinkties. Apytikrius pasikliautinuosius intervalus galima gauti naudojant įprastas netiesinės regresijos programas ir atliekant parametrų keitimą (Bruce ir Versteeg, 1992), kurį sudaro matematinės lygties perrašymas pagal reikiamus taškų įverčius, pvz., EC10 ir EC50 kaip vertinamus parametrus (tarkime, kad yra funkcija I = f (α, β, koncentracija) ir naudojami apibrėžiamieji santykiai f (α, β, EC10) = 0,1 bei f (α, β, EC50) = 0,5 funkcijai f (α, β, koncentracija) pakeisti lygiaverte funkcija g (EC10, EC50, koncentracija).

Labiau tiesioginis apskaičiavimas (Andersen et al., 1998) atliekamas nekeičiant pradinės lygties ir taikant Taylor eilutės skleidinį apie ri ir r0 vidurkius.

Neseniai išpopuliarėjo savirankos (angl. bootstrap) metodai. Taikant tokius metodus empiriniam dispersijos skirstiniui vertinti naudojami matavimų duomenys ir, naudojant atsitiktinių skaičių generatorių, dažnai imami pakartotiniai ėminiai.

NUORODOS

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R..D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

4)

C.11 skyrius pakeičiamas taip:

C.11.   AKTYVIOJO DUMBLO KVĖPAVIMO SLOPINIMO BANDYMAS (ANGLIES IR AMONIO OKSIDACIJA)

ĮVADAS

1.

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 209 (2010). Jis skirtas cheminės medžiagos poveikiui aktyviojo dumblo mikroorganizmams (daugiausia bakterijoms) nustatyti matuojant jų kvėpavimo intensyvumą (anglies ir (arba) amonio oksidaciją) nustatytomis konkrečiomis sąlygomis, esant įvairioms bandomosios cheminės medžiagos koncentracijoms. Šis bandymo metodas pagrįstas ETAD (dažiklių gamybos pramonės ekologijos ir toksikologijos asociacijos) bandymais (1), (2), ankstesnėmis EBPO bandymo gairėmis Nr. 209 (3) ir pakeistu ISO 8192 standartu (4). Šio bandymo tikslas – taikant greitąjį atrankos metodą, vertinti cheminių medžiagų poveikį nuotekų valymo įrenginių biologinio (aerobinio) valymo etape naudojamo aktyviojo dumblo mikroorganizmams. Šio bandymo rezultatais taip pat galima remtis nustatant neslopinančias bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijas, tinkamas naudoti atliekant biologinio skaidumo tyrimus (pvz., šio priedo C.4 A–F, C.9, C.10, C12 ir C.29 skyriai, EBPO TG302C). Tokiu atveju šį bandymą galima atlikti kaip atrankos bandymą, panašų į intervalo arba ribų nustatymo bandymą (žr. 39 skirsnį), vertinant tik bendrąjį kvėpavimą. Tačiau šia informacija reikėtų atsargiai remtis atliekant lengvo biologinio skaidumo bandymus (šio priedo C.4 A–F ir C.29 skyriai), per kuriuos pasėlio koncentracija yra kur kas mažesnė nei pagal šį bandymo metodą. Iš tiesų, nors per šį kvėpavimo slopinimo bandymą gali būti nustatyta, kad jokio slopinimo nėra, tai dar nereiškia, kad būtų pripažintos neslopinančios sąlygos atliekant lengvo biologinio skaidumo bandymą pagal šio priedo C.4 A–F arba C.29 skyrių.

2.

Apskritai atrodo, jog nuo tada, kai pirmą kartą paskelbta apie kvėpavimo slopinimo bandymą, jis atliekamas sėkmingai, tačiau kartais pranešama apie gautus klaidingus rezultatus, pvz., (2), (4), (5). Kartais gaunamos dvifazės kvėpavimo pagal koncentraciją kreivės, iškraipyti dozės ir atsako santykio grafikai ar netikėtai mažos EC50 vertės (5). Ištyrus nustatyta, jog tokie rezultatai gaunami tada, kai bandymo aktyviajam dumblui yra būdinga stipri nitrifikacija ir bandomoji cheminė medžiaga amonio oksidaciją veikia labiau negu bendrąją heterotrofinę oksidaciją. Todėl tokių klaidingų rezultatų galima išvengti atliekant papildomus bandymus naudojant specialų nitrifikacijos inhibitorių. Išmatuojant deguonies sugerties greitį esant tokiam inhibitoriui, pvz., N-aliltiokarbamidui (ATU), ir be jo, galima atskirai apskaičiuoti bendros, heterotrofinės ir dėl nitrifikacijos vykstančios deguonies sugerties lygius (4), (7), (8). Taip galima nustatyti bandomosios cheminės medžiagos slopinamąjį poveikį abiem procesams ir tiek organinės (heterotrofinės) anglies oksidacijos, tiek amonio oksidacijos (nitrifikacijos) EC50 vertes apskaičiuoti įprastu būdu. Pažymėtina, jog kai kuriais retais atvejais N-aliltiokarbamido slopinamasis poveikis gali iš dalies arba visiškai išnykti dėl kompleksodaros su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis arba terpės priedais, pvz., Cu++ jonais (6). Cu++ jonai yra būtini Nitrosomonas, tačiau didesnėmis koncentracijomis toksiški.

3.

Užtikrinti nitrifikaciją atliekant aerobinį nuotekų valymą kaip būtiną azoto junginių šalinimo iš nuotekų, denitrifikuojant dujinius darinius, proceso etapą yra itin svarbus uždavinys, ypač Europos šalyse; ES neseniai nustatė žemesnes azoto koncentracijos išvalytose nuotekose, išleidžiamose į nuotekų priimtumą, ribines vertes (5).

4.

Daugeliu atvejų pakanka taikyti tokį metodą, pagal kurį būtų įvertintas poveikis organinės anglies oksidacijos procesams. Tačiau kai kuriais atvejais, siekiant išaiškinti gautus rezultatus ir suprasti šį poveikį, reikia ištirti poveikį vien nitrifikacijai arba atskirai ištirti poveikį nitrifikacijai ir poveikį organinei anglies oksidacijai.

BANDYMO METODO ESMĖ

5.

Sintetinėmis nuotekomis maitinamo aktyviojo dumblo ėminių kvėpavimo intensyvumas matuojamas uždaroje kameroje su deguonies elektrodu po 3 val. sąlyčio su bandomąja medžiaga. Atsižvelgiant į tikėtiną poveikio scenarijų, sąlytis galėtų trukti ir ilgiau. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra greitai suskaidoma, pvz., abiotiškai hidrolizės būdu, arba yra laki ir pastovios jos koncentracijos palaikyti neįmanoma, papildomai galima nustatyti trumpesnį, pvz., 30 min., poveikio laikotarpį. Poveikio dieną turėtų būti patikrintas kiekvienos partijos aktyviojo dumblo jautris naudojant tinkamą etaloninę cheminę medžiagą. Per šį bandymą paprastai nustatoma bandomosios cheminės medžiagos ECx (pvz., EC50) ir (arba) nepastebėto poveikio koncentracija (NOEC).

6.

Organinę anglį oksiduojančių mikroorganizmų deguonies suvartojimo slopinimas gali būti išreiškiamas atskirai nuo amonį oksiduojančių mikroorganizmų, išmatuojant deguonies suvartojimo spartą su N-aliltiokarbamidu ir be jo (tai specialus inhibitorius, stabdantis pirmosios pakopos nitrobakterijų amonio oksidavimą į nitritą). Šiuo atveju deguonies sugerties greičio procentinis slopinimas apskaičiuojamas palyginant deguonies sugerties greitį veikiant bandomajai cheminei medžiagai su atitinkamų kontrolinių bandinių be bandomosios cheminės medžiagos vidutiniu deguonies sugerties greičiu, tiek naudojant specialųjį inhibitorių N-aliltiokarbamidą, tiek be jo.

7.

Bet kokią deguonies sugertį per abiotinius procesus galima nustatyti išmatuojant sugerties greitį bandomosios cheminės medžiagos, sintetinių nuotekų terpės ir vandens mišiniuose be aktyviojo dumblo.

INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ

8.

Kad būtų įmanoma teisingai aiškinti bandymo rezultatus, reikėtų žinoti bandomosios cheminės medžiagos tapatybę (geriausia CAS numerį), pavadinimą (IUPAC), grynumą, tirpumą vandenyje, garų slėgį, lakumą ir įgerties (adsorbcijos) savybes. Lakiųjų cheminių medžiagų bandymų paprastai neįmanoma tinkamai atlikti be specialių atsargumo priemonių (žr. 21 skirsnį).

BANDYMO METODO TAIKOMUMAS

9.

Šį bandymo metodą galima taikyti vandenyje tirpioms, mažai tirpioms ir lakioms cheminėms medžiagoms. Tačiau gali būti ne visada įmanoma gauti riboto tirpumo cheminių medžiagų EC50 vertes, o atliekant lakiųjų cheminių medžiagų bandymus, patikimus rezultatus įmanoma gauti tik tada, kai didžioji bandomosios cheminės medžiagos dalis (pvz., > 80 %) lieka reakcijos mišinyje iki veikimo laikotarpio (-ių) pabaigos. Reikėtų pateikti papildomų patvirtinamųjų analitinių duomenų, siekiant patikslinti ECx koncentraciją tais atvejais, kai esama neaiškumų dėl bandomosios cheminės medžiagos stabilumo arba lakumo.

ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS

10.

Siekiant įsitikinti bandymo metodo ir bandymo sąlygų patikimumu, reikėtų reguliariai atlikti bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis, o poveikio dieną patikrinti kiekvienos mikroorganizmų pasėlio partijos aktyviojo dumblo jautrį. Kaip etaloninę slopinamąjį poveikį turinčią cheminę medžiagą rekomenduojama naudoti 3,5-dichlorfenolį (3,5-DCP) – tai žinomas kvėpavimo inhibitorius, naudojamas atliekant daugelį įvairaus pobūdžio slopinamojo ir (arba) toksinio poveikio bandymų (4). Matuojant bendrojo kvėpavimo slopinimą, kaip etaloninę cheminę medžiagą taip pat galima naudoti vario (II) sulfato pentahidratą (9). Kaip specialų etaloninį nitrifikacijos inhibitorių galima naudoti N-metilaniliną (4).

TINKAMUMO KRITERIJAI IR ATKURIAMUMAS

11.

Tuščių (be bandomosios ar etaloninės cheminės medžiagos) kontrolinių bandinių deguonies sugerties greitis turėtų būti ne mažiau kaip 20 mg deguonies vienam gramui aktyviojo dumblo (sausosios suspenduotų kietųjų medžiagų masės) per valandą. Jei greitis yra mažesnis, bandymą reikėtų pakartoti naudojant išplautą aktyvųjį dumblą arba iš kito šaltinio gautą dumblą. Kartotinių kontrolinių bandinių deguonies sugerties greičio variacijos koeficientas nustatomojo bandymo pabaigoje neturėtų būti didesnis kaip 30 %.

12.

2004 m. atlikus ISO organizuotą tarptautinį tarplaboratorinį bandymą (4), per kurį naudotas buitinių nuotekų aktyvusis dumblas, nustatytos 3,5-DCP EC50 vertės matuojant bendrąjį kvėpavimą buvo nuo 2 iki 25 mg/l, matuojant heterotrofinį kvėpavimą – nuo 5 iki 40 mg/l, matuojant nitrifikacinį kvėpavimą – nuo 0,1 iki 10 mg/l. Jeigu nustatyta 3,5-DCP EC50 vertė nepatenka į tikėtiną intervalą, bandymą reikėtų pakartoti naudojant iš kito šaltinio gautą aktyvųjį dumblą. Vario (II) sulfato pentahidrato EC50 vertė, matuojant bendrąjį kvėpavimą, turėtų būti 53–155 mg/l (9).

BANDYMO METODO APRAŠYMAS

Bandymo indai ir aparatūra

13.

Turėtų būti naudojama įprasta laboratorinė įranga ir šie reikmenys:

a)

bandymo indai – pvz., 1 000 ml tūrio cheminės stiklinės, kuriose laikoma 500 ml reakcijos mišinio (žr. 1 pav. – 5);

b)

ištirpusio deguonies koncentracijos matavimo kamera ir priedai; tinkamas deguonies elektrodas; uždara talpa ėminiui laikyti be viršerdvės, su savirašiu (pvz., 2 priedėlio 1 pav. – 7, 8, 9); vietoj jos galima naudoti biocheminiam deguonies suvartojimui (BDS) matuoti skirtą butelį su pritaikyta mova deguonies elektrodui prie butelio kaklelio pritvirtinti (žr. 3 priedėlio 2 pav.). Kad įstatant deguonies elektrodą nebūtų išstumta ir prarasta butelyje esančio skysčio, patartina visų pirma per movą įstatyti piltuvėlį ar stiklinį vamzdelį arba naudoti indus išlenktais kraštais. Abiem atvejais reikėtų naudoti magnetinį maišiklį arba kitą maišymo priemonę, pvz., savimaišį zondą;

c)

inertine medžiaga padengti magnetiniai maišikliai ir kartotuvai, skirti naudoti matavimo kameroje ir (arba) bandymo induose;

d)

aeratorius. Jeigu reikia, suslėgtas oras turėtų būti leidžiamas per tinkamą filtrą, iš jo pašalinant dulkes ir riebalus, ir per plovykles su vandeniu orui drėkinti. Indų turinys turėtų būti aeruojamas naudojant Pastero pipetes arba kitus cheminių medžiagų nesugeriančius aeratorius. Sukamoji purtyklė, kurios sukimosi greitis būtų 150–250 sūkių/min., gali būti naudojama, pvz., 2 000 ml talpos kolboms, siekiant tiekti dumblui reikalingą deguonį ir išspręsti problemas, kylančias, kai cheminės medžiagos pernelyg gausiai putoja, yra lakios ir todėl prarandamos arba sunkiai išsklaidomos barbotuojant. Bandymo sistema paprastai susideda iš nuolat aeruojamų ir tam tikra seka (pvz., 10–15 min. intervalais) paruoštų cheminių stiklinių, kurių turinys atitinkama eilės tvarka analizuojamas. Taip pat galima naudoti patvirtintus instrumentus mišiniams aeruoti ir kartu deguonies vartojimo greičiui matuoti juose;

e)

pH-metras;

f)

centrifuga – įprasta dumblui tinkama stalinė centrifuga, kurios sparta siekia 10 000 m/s2.

Cheminiai reagentai

14.

Per visą bandymą turėtų būti naudojami analiziškai gryni cheminiai reagentai.

Vanduo

15.

Turėtų būti naudojamas distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kuriame būtų mažiau nei 1 mg/l ištirpusios organinės anglies, nebent konkrečiai tiktų naudoti vandentiekio vandenį be chloro.

Sintetinių nuotekų mitybinė terpė

16.

Terpė ruošiama iš toliau nurodytų sudedamųjų dalių, kurių kiekiai turėtų būti tokie:

peptono

16 g

mėsos ekstrakto (arba panašaus augalinio ekstrakto)

11 g

karbamido

3 g

natrio chlorido (NaCl)

0,7 g

kalcio chlorido dihidrato (CaCl2, 2H2O)

0,4 g

magnio sulfato heptahidrato (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

bevandenio kalio monohidrofosfato (K2HPO4)

2,8 g

distiliuoto arba dejonizuoto vandens iki 1 litro tūrio.

 

17.

Šio tirpalo pH turėtų būti 7,5 ± 0,5. Jeigu paruošta terpė naudojama ne iš karto, ją reikėtų laikyti tamsoje 0–4 °C temperatūroje ne ilgiau kaip savaitę arba tokiomis sąlygomis, kad nepakistų jos sudėtis. Įsidėmėtina, jog šios sintetinių nuotekų terpės koncentracija yra 100 kartų didesnė negu terpės, aprašytos EBPO techninėje ataskaitoje „Proposed metod for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents“ (Siūlomas metodas paviršinio aktyvumo medžiagų, naudojamų sintetiniuose plovikliuose, biologiniam skaidumui nustatyti) (1976 m. birželio 11 d.), be to, į šią terpę dedama dikalio vandenilio fosfato.

18.

Kitu atveju, ruošiant terpę laikymui, galima atskirai sterilizuoti jos sudedamąsias dalis arba peptonas ir mėsos ekstraktas gali būti dedami prieš pat bandymą. Prieš naudojant terpę reikėtų gerai sumaišyti ir, jei reikia, jos pH vertę patikslinti iki 7,5 ± 0,5.

Bandomoji cheminė medžiaga

19.

Lengvai vandenyje tirpstančioms bandomosioms medžiagoms reikėtų paruošti tiek pradinio tirpalo, kad nebūtų viršyta jų tirpumo vandenyje riba (neturi susidaryti nuosėdų). Vandenyje mažai tirpios medžiagos, mišiniai, kurių įvairios sudedamosios dalys yra nevienodai tirpios vandenyje, ir lengvai įsigeriančios (adsorbuojamos) medžiagos turėtų būti dedamos tiesiai į bandymo indus ir juose pasveriamos. Tokiais atvejais galima naudoti pradinius tirpalus, jeigu ištirpusių bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijų analiziniai nustatymai atliekami bandymo induose (prieš įdedant aktyvųjį dumblą). Ištirpusių bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijų analizinis nustatymas taip pat turi būti atliekamas bandymo induose tuo atveju, jeigu ruošiamos vandenyje ištirpusios dalys (angl. water accommodated fractions, WAF). Nereikėtų naudoti organinių tirpiklių, dispergentų ar emulsiklių tirpumui padidinti. Pradinius tirpalus ir dar nesumaišytas suspensijas apdoroti ultragarsu, pvz., per naktį, galima tada, kai pakanka informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos stabilumą tokiomis sąlygomis.

20.

Bandomoji cheminė medžiaga gali neigiamai paveikti bandymo sistemos pH. Mišinių su bandomąja chemine medžiaga pH vertes reikėtų išmatuoti dar iki bandymo pradžios, per išankstinį bandymą, siekiant nustatyti, ar reikės patikslinti pH prieš pagrindinį bandymą ir dar kartą pagrindinio bandymo dieną. Bandomosios cheminės medžiagos vandeniniai tirpalai arba suspensijos, kai reikia, turėtų būti neutralizuojami prieš įdedant pasėlį. Tačiau kadangi neutralizuojant gali pakisti cheminės medžiagos savybės, priklausomai nuo tyrimo tikslų, galima papildomais bandymais įvertinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį dumblui netikslinant pH vertės.

21.

Lakiųjų cheminių medžiagų toksinis poveikis, ypač kai atliekant bandymą sistemoje barbotuojamas oras, gali būti nevienodai didelis dėl tokios medžiagos kiekio mažėjimo jos veikimo laikotarpiu. Atliekant šių medžiagų bandymus reikėtų imtis atsargumo priemonių – atskirai išanalizuoti kontrolinius mišinius su tokia medžiaga ir atitinkamai pakeisti aeravimo normą.

Etaloninė cheminė medžiaga

22.

Kaip etaloninę cheminę medžiagą naudojant 3,5-dichlorfenolį, reikėtų paruošti tirpalą iš 1,00 g 3,5-dichlorfenolio ir 1 000 ml vandens (15). Kad ši medžiaga greičiau ištirptų, reikėtų naudoti šiltą vandenį ir (arba) apdoroti tirpalą ultragarsu, o kai tirpalas atauš iki kambario temperatūros, papildyti jį iki reikiamo tūrio. Tačiau reikėtų užtikrinti, kad nepakistų etaloninės medžiagos struktūra. Tirpalo pH vertę reikėtų patikrinti ir, jei reikia, patikslinti naudojant NaOH arba H2SO4, kad pH būtų 7–8.

23.

Jeigu kaip etaloninė cheminė medžiaga naudojamas vario (II) sulfato pentahidratas, jo koncentracijos turi būti 58 mg/l, 100 mg/l ir 180 mg/l (besiskiriančios 1,8 karto). Ši medžiaga dedama tiesiai į bandymo indus ir juose pasveriama (kai bendras bandymo tirpalo tūris yra 500 ml, imama 29, 50 arba 90 mg medžiagos), tada ištirpinama 234 ml autoklave apdoroto vandentiekio vandens. Vario (II) sulfato pentahidratas yra lengvai tirpstanti medžiaga. Pradedant bandymą į tirpalą įdedama 16 ml sintetinių nuotekų ir 250 ml aktyviojo dumblo.

Specialus nitrifikacijos inhibitorius

24.

Reikėtų paruošti 2,32 g/l N-aliltiokarbamido (ATU) pradinį tirpalą. Įpylus 2,5 ml šio pradinio tirpalo į inkubuojamą 500 ml bendro tūrio mišinį, gaunama galutinė 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l) koncentracija, kurios, kaip žinoma, pakanka (4) nitrifikacijai visiškai (100 %) sustabdyti nitrifikuojančiame aktyviajame dumble, kuriame yra 1,5 g/l suspenduotų kietųjų medžiagų.

Abiotinė kontrolė

25.

Tam tikromis retomis sąlygomis, kai bandomoji cheminė medžiaga turi stipriai redukuojančių savybių, matuojant gali būti nustatyta nemaža abiotinė deguonies sugertis. Tokiais atvejais, siekiant skirti bandomosios cheminės medžiagos abiotinę deguonies sugertį nuo mikroorganizmų kvėpavimo, būtina abiotinė kontrolė. Abiotinius kontrolinius bandinius galima paruošti į bandymo mišinius nededant pasėlio. Abiotinius kontrolinius bandinius be pasėlio taip pat galima naudoti atliekant patvirtinamuosius analizinius matavimus, siekiant nustatyti per bandomosios medžiagos veikimo etapą pasiektą koncentracijos lygį, pvz., naudojant vandenyje mažai tirpių cheminių medžiagų pradinius tirpalus, kurių sudedamosios dalys nevienodai tirpios vandenyje. Konkrečiais atvejais gali reikėti paruošti abiotinį kontrolinį bandinį naudojant sterilizuotą (pvz., apdorojus autoklave arba pridėjus sterilizuojančių toksinių medžiagų) pasėlį. Kai kurios cheminės medžiagos gali išskirti arba sugerti deguonį tuo atveju, jeigu jų paviršiaus plotas yra pakankamai didelis tokiai reakcijai vykti, net jeigu tai reakcijai įprastai reikėtų kur kas aukštesnės temperatūros ar slėgio. Todėl daugiau dėmesio reikėtų skirti peroksi- grupės medžiagoms. Sterilizuotas pasėlis užima didelį paviršiaus plotą.

Pasėlis

26.

Aktyvusis dumblas bendroms reikmėms turėtų būti imamas iš tinkamai veikiančio nuotekų valymo įrenginio, į kurį patenka daugiausia buitinės nuotekos, aeracijos rezervuaro išleidimo angos arba arti jos. Atsižvelgiant į bandymo tikslą, gali būti naudojamas ir kitų tinkamų rūšių arba iš kitų šaltinių gautas, pvz., laboratorijoje išaugintas aktyvusis dumblas. Tinkama suspenduotų dumblo kietųjų medžiagų koncentracija yra 2–4 g/l. Tačiau iš kelių valymo įrenginių surinktas dumblas veikiausiai turėtų skirtingų savybių, skirtųsi jo jautris įvairiam poveikiui.

27.

Dumblą galima naudoti tokį, koks jis surinktas, tačiau reikėtų pašalinti stambias daleles paliekant dumblą trumpam (pvz., 5–15 min.) nusistovėti ir tada viršutinį smulkesnių kietųjų dalelių sluoksnį nupilant arba nukošiant (pvz., per 1 mm2 dydžio akučių sietą). Vietoj to dumblą galima sumaišyti iki vienalytės masės, įjungus maišytuvą maždaug 15 sekundžių ar ilgiau, tačiau reikia stengtis, kad nebūtų per didelių šlyties jėgų ir temperatūros pokyčių ilgai maišant maišytuvu.

28.

Dažnai reikia išplauti dumblą, pvz., jeigu jam būdingo kvėpavimo intensyvumas yra mažas. Pirmiausia reikėtų dumblą kurį laiką centrifuguoti, pvz., 10 min. apie 10 000 m/s2 greičiu, kad susidarytų skaidrus paviršinis skystis ir nuotekų kietųjų medžiagų gumulas. Susidariusį paviršinį skystį reikėtų pašalinti, tada dumblą dar kartą suspenduoti vandentiekio vandenyje be chloro, sukratyti ir pašalinti plovimo vandenį dar kartą centrifuguojant bei nupilant. Jeigu reikia, plovimo ir centrifugavimo procesas kartojamas. Žinant resuspenduoto dumblo tūrį, turėtų būti nustatyta jo sausosios medžiagos masė ir dumblo koncentracija padidinta pašalinant dalį skysčio arba dumblas dar labiau atskiestas vandentiekio vandeniu be chloro, kad būtų gauta reikiama dumblo kietųjų medžiagų koncentracija – 3 g/l. Aktyvusis dumblas turėtų būti nuolat aeruojamas (pvz., 2 l/min. sparta) esant bandymo temperatūrai, ir, jeigu įmanoma, naudojamas tą pačią dieną, kurią surinktas. Jei tai neįmanoma, dumblą reikėtų kasdien maitinti sintetinių nuotekų mitybine terpe (į 1 l aktyviojo dumblo dedama 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės) ir jį laikyti galima ne ilgiau kaip dar dvi dienas. Tada dumblas naudojamas bandymui ir, jeigu jo aktyvumas (vertinant pagal jam būdingo heterotrofinio ir nitrifikacinio kvėpavimo intensyvumą) reikšmingai nepakito, bandymo rezultatai pripažįstami tinkamais.

29.

Gali kilti sunkumų tuo atveju, jeigu inkubuojamas dumblas užputoja tiek, kad putos ir į jas patekusios kietosios dumblo dalelės išsiveržia iš aeracijos rezervuarų. Kai kada putojimą gali sukelti vien sintetinės nuotekos, tačiau putojimo taip pat reikėtų tikėtis tada, kai bandomoji cheminė medžiaga yra paviršinio aktyvumo medžiaga arba jos sudėtyje yra paviršinio aktyvumo medžiagų. Iš bandymo mišinių pašalinus dalį kietųjų dumblo medžiagų, dirbtinai sumažinamas dumblo kvėpavimo intensyvumas ir tai gali būti klaidingai palaikyta slopinamojo poveikio rezultatu. Be to, aeruojant paviršinio aktyvumo medžiagos tirpalą, ta medžiaga kaupiasi putų sluoksnyje, todėl efektyvioji jos koncentracija sumažėja pašalinus putas iš bandymo sistemos. Putojimą galima kontroliuoti paprastais mechaniniais būdais (pvz., kartais rankomis pamaišant stikline lazdele) arba įdedant silikoninės emulsijos priešpučio, kurio sudėtyje nėra paviršinio aktyvumo medžiagų, ir (arba) taikant kratomos kolbos aeravimo metodą. Jeigu putojimo problema kyla dėl naudojamų sintetinių nuotekų, reikėtų pakeisti nuotekų sudėtį pridedant priešpučio reagento, pvz., 50 μl/l. Jeigu putojimą sukelia pati bandomoji cheminė medžiaga, putojimui sustabdyti reikalingą priešpučio kiekį reikėtų nustatyti didžiausiai bandomosios medžiagos koncentracijai ir tada visus atskirus aeracijos rezervuarus (įskaitant tuos, kuriuose nesusidaro putų, pvz., tuščių kontrolinių ir etaloninių bandinių indus) apdoroti vienodai. Jeigu naudojami priešpučiai, neturėtų būti sąveikos tarp jų ir pasėlio ir (arba) bandomosios cheminės medžiagos.

BANDYMO PROCEDŪRA

30.

Galima nustatyti trijų skirtingų rūšių deguonies sugerties – bendrosios, tik heterotrofinės ir tik nitrifikacinės – slopinimą. Paprastai turėtų pakakti išmatuoti bendrąjį deguonies sugerties slopinimą. Poveikį heterotrofinei deguonies sugerčiai, vykstančiai dėl organinės anglies oksidacijos ir amonio oksidacijos, būtina nustatyti tada, kai konkrečiai reikia gauti šias dvi atskiras konkrečios cheminės medžiagos tyrimo vertinamąsias baigtis arba (nebūtinai) paaiškinti neįprastas dozės ir atsako santykio kreives, gautas išmatavus bendrosios deguonies sugerties slopinimą.

Bandymo sąlygos

31.

Bandymas turėtų būti atliekamas 20 ± 2 °C temperatūroje.

Bandymo mišiniai

32.

Bandymo mišiniai (FT 1 lentelėje) iš vandens, sintetinių nuotekų mitybinės terpės ir bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti ruošiami taip, kad būtų gautos įvairios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vardinės vertės (mišinio sudedamųjų dalių kiekių pavyzdį žr. 1 lentelėje). Jeigu reikia, pH patikslinamas iki 7,5 ± 0,5; mišinius reikėtų atskiesti vandeniu ir įdėti pasėlio tiek, kad galutinis mišinio tūris būtų vienodas visuose induose. Tada indai pradedami aeruoti.

Etaloninės medžiagos mišiniai

33.

Mišiniai (FR) su etalonine chemine medžiaga, pvz., 3,5-dichlorfenoliu, vietoj bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti ruošiami taip pat, kaip ir bandomieji mišiniai.

Tušti kontroliniai bandiniai

34.

Tuščius kontrolinius bandinius (FB) reikėtų paruošti bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje atliekant bandymus, kuriems bandymo indai ruošiami tam tikra seka nustatytais laiko intervalais. Kai naudojant bandymo įrangą deguonies suvartojimą galima matuoti vienu metu keliuose bandiniuose, bent po du tuščius kontrolinius bandinius reikėtų įtraukti į kiekvieną atskirą vienu metu analizuojamų bandinių grupę. Į tuščius kontrolinius bandinius dedama po vienodą aktyviojo dumblo ir sintetinės terpės kiekį, tačiau nededama bandomosios ar etaloninės cheminės medžiagos. Juos reikėtų atskiesti vandeniu iki bandomųjų ir etaloninių medžiagų mišinių tūrio.

Abiotinė kontrolė

35.

Kai būtina, pavyzdžiui, žinant arba įtariant, kad bandomoji cheminė medžiaga turi stipriai redukuojančių savybių, reikėtų paruošti FA mišinį abiotiniam deguonies suvartojimui matuoti. Bandomosios cheminės medžiagos ir sintetinių nuotekų mitybinės terpės kiekiai šiame mišinyje bei jo tūris turėtų būti tokie patys, kaip ir bandomųjų mišinių, tačiau į jį nededama aktyviojo dumblo.

Bendra darbo tvarka ir matavimai

36.

Bandomųjų ir etaloninių medžiagų mišiniai, taip pat tušti ir abiotiniai kontroliniai bandiniai inkubuojami bandymo temperatūroje, dirbtinės aeracijos (0,5–1 l/min.) sąlygomis, siekiant palaikyti ištirpusio deguonies koncentraciją, viršijančią 60–70 % soties vertę, ir kad dumblo gumulėliai visą laiką būtų suspenduoti. Taip pat, kad dumblo gumulėliai būtų suspenduoti, paruoštas kultūras būtina maišyti. Inkubacinis periodas prasideda nuo tada, kai aktyviojo dumblo pasėlis iš pradžių sumaišomas su kitomis galutinio mišinio sudedamosiomis dalimis. Po inkubacinio periodo, praėjus nustatytam bandomosios medžiagos veikimo laikui (paprastai 3 valandoms), paimami ėminiai ir ištirpusio deguonies koncentracijos sumažėjimas išmatuojamas specialioje kameroje (3 priedėlio 2 pav.) arba visiškai pripildytame BOD butelyje. Inkubacinio periodo pradžios eiga taip pat priklauso nuo turimos įrangos gebos matuoti deguonies vartojimo greitį. Pavyzdžiui, jeigu turimas tik vienas deguonies zondas, matavimai atliekami atskirai. Šiuo atveju reikėtų paruošti įvairius bandymui reikalingus sintetinių nuotekų mišinius, tačiau į juos nedėti pasėlio ir reikiamas dumblo porcijas atskirai įdėti į kiekvieną tos serijos bandymo indą. Kiekvieno indo inkubacija turėtų būti pradedama paeiliui patogiais laiko intervalais, pvz., kas 10–15 min. Kitu atveju matavimo sistemoje gali būti keli zondai, todėl galima vienu metu atlikti kelis matavimus; šiuo atveju pasėlį galima vienu metu įdėti į atitinkamų grupių indus.

37.

Visuose bandomųjų bei etaloninių medžiagų ir tuščiuose (tačiau ne abiotinės kontrolės) mišiniuose aktyviojo dumblo koncentracijos vardinė vertė yra 1,5 g suspenduotų kietųjų medžiagų viename mišinio litre. Deguonies suvartojimą reikėtų matuoti po 3 poveikio valandų. Kaip aprašyta 5 skirsnyje, kai tinka, reikėtų atlikti matavimus po papildomų 30 minučių poveikio.

Dumblo nitrifikacinė geba

38.

Siekiant nustatyti, ar dumblas yra nitrifikuojantis, ir jei taip – nitrifikacijos proceso greitį, reikėtų paruošti tokius mišinius (FB), kurie būtų kaip tušti kontroliniai ir papildomi „kontroliniai“ mišiniai (FN), tačiau į juos papildomai dedama 11,6 mg/l N-aliltiokarbamido. Šie mišiniai turėtų būti aeruojami ir 3 valandas inkubuojami 20 ± 2 °C temperatūroje, po to išmatuojamas deguonies sugerties greitis ir apskaičiuojamas deguonies sugerties dėl nitrifikacijos greitis.

Bandymų planai

Intervalo nustatymo bandymas

39.

Kai reikia, atliekamas išankstinis bandymas, per kurį įvertinamas deguonies vartojimo slopinimo nustatomajam bandymui tinkamų bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų intervalas. Kitu atveju per išankstinį bandymą gali būti nustatyta, kad bandomoji cheminė medžiaga deguonies vartojimo neslopina, todėl nustatomojo bandymo atlikti nereikia, tačiau šiuo atveju matavimai turėtų būti atlikti trijuose didžiausios bandomosios koncentracijos (paprastai 1 000 mg/l, tačiau didžiausia koncentracija priklauso nuo to, kokius duomenis reikia gauti) kartotiniuose bandiniuose.

1 lentelė.

Išankstiniam bandymui naudojamų mišinių pavyzdžiai

Reagentas

Pradinė koncentracija

Bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas

10 g/l

Sintetinės terpės pradinis tirpalas

Žr. 16 skirsnį

Aktyviojo dumblo pradinė suspensija

3 g/l suspenduotų kietųjų medžiagų

Mišinių sudedamosios dalys

Į bandomuosius indus dedami kiekiai (žr. a pastabą) (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas (ml)

(19–21 skirsniai)

0,5

5

50

0

50

Sintetinių nuotekų mitybinės terpės pradinis tirpalas (ml)

(16 skirsnis)

16

16

16

16

16

Aktyviojo dumblo suspensija (ml)

(26–29 skirsniai)

250

250

250

250

0

Vanduo

(15 skirsnis)

233,5

229

184

234

434

Bendras mišinių tūris (ml)

500

500

500

500

500

Mišinio sudedamųjų dalių koncentracijos

 

 

 

 

 

Bandomosios cheminės medžiagos suspensija (mg/l)

Aktyvusis dumblas

10

100

1 000

0

1 000

(suspenduotos kietosios medžiagos) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Atliekant bandymą reikėtų rinktis bent tris bandomosios cheminės medžiagos koncentracijas, pvz., 10 mg/l, 100 mg/l ir 1 000 mg/l, kartu naudojant tuščią kontrolinį bandinį ir, jei reikia, bent tris abiotinius kontrolinius bandinius su didžiausiomis bandomosios cheminės medžiagos koncentracijomis (žr. pavyzdį 1 lentelėje). Geriausia parinkti tokią mažiausią koncentraciją, kuri neturėtų jokio poveikio deguonies vartojimui. Kai tinka, reikėtų apskaičiuoti deguonies sugerties greitį ir nitrifikacijos greitį, o tada apskaičiuoti šių procesų slopinimo lygį procentais. Atsižvelgiant į bandymo tikslą, taip pat galima paprasčiausiai nustatyti ribinės koncentracijos, pvz., 1 000 mg/l, toksiškumą. Jeigu, esant tokiai koncentracijai, statistiškai reikšmingo toksinio poveikio nėra, tolesnių bandymų su didesnėmis ar mažesnėmis koncentracijomis atlikti nebūtina. Reikia pažymėti, kad vandenyje mažai tirpios medžiagos, mišiniai, kurių sudedamosios dalys yra nevienodai tirpios vandenyje, ir lengvai įsigeriančios (adsorbuojamos) medžiagos turėtų būti dedami tiesiai į bandymo indus ir juose pasveriami. Šiuo atveju nustatytą bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūrį reikėtų pakeisti skiedimui tinkamu vandeniu.

Nustatomasis bandymas

Bendrosios deguonies sugerties slopinimas

41.

Atliekant šį bandymą reikėtų naudoti per išankstinį bandymą nustatytą koncentracijos verčių intervalą. Siekiant gauti tiek NOEC, tiek ECx (pvz., EC50) vertes, daugeliu atvejų rekomenduojama naudoti šešis kontrolinius bandinius ir penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, nustatytas geometrinės progresijos seka, paruošiant penkis kartotinius bandinius. Abiotinės kontrolės kartoti nereikia, jeigu per išankstinį bandymą abiotinės deguonies sugerties nenustatyta; tačiau jeigu nustatyta reikšminga abiotinė deguonies sugertis, reikėtų paruošti kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos abiotinius kontrolinius bandinius Dumblo jautrį reikėtų patikrinti naudojant etaloninę cheminę medžiagą 3,5-dichlorfenolį. Reikėtų tikrinti kiekvienos bandymų serijos dumblo jautrį, nes yra žinoma, kad jis kinta. Visais atvejais po 3 valandų (ir, jei reikia, papildomų 30 minučių) iš bandymo indų paimami ėminiai ir deguonies sugerties greitis išmatuojamas kameroje su deguonies elektrodu. Pagal gautus duomenis apskaičiuojamas konkretus kontrolinių ir bandomųjų mišinių kvėpavimo intensyvumas, tada apskaičiuojamas procentinis slopinimo lygis pagal 7 lygtį (pateikta toliau).

Heterotrofinio kvėpavimo ir nitrifikacijos slopinimo skyrimas

42.

Naudojant specialų nitrifikacijos inhibitorių ATU galima tiesiogiai įvertinti bandomųjų cheminių medžiagų slopinamąjį poveikį heterotrofinei oksidacijai, o atimant deguonies sugerties greitį, veikiant ATU, iš bendrosios sugerties greičio (be ATU) galima apskaičiuoti poveikį nitrifikacijos greičiui. Reikėtų paruošti du reakcijos mišinių rinkinius pagal 41 skirsnyje aprašytus bandymo planus, skirtus ECx arba NOEC nustatyti, tačiau viename iš šių rinkinių reikėtų į kiekvieną mišinį papildomai įdėti ATU (galutinė šios medžiagos koncentracija turėtų būti 11,6 mg/l; įrodyta, kad ji visiškai nuslopina nitrifikaciją dumble, kurio suspenduotų kietųjų medžiagų koncentracija siekia iki 3 000 mg/l) (4). Deguonies sugerties greitis turėtų būti matuojamas po bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio; šios tiesioginės vertės parodo tik heterotrofinį kvėpavimą, o skirtumai tarp jų ir atitinkamo bendrojo kvėpavimo intensyvumo reiškia nitrifikaciją. Tada apskaičiuojami įvairūs slopinimo laipsniai.

Matavimai

43.

Po bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio (-ių) reikėtų iš pirmojo aeracijos rezervuaro paimtą ėminį perkelti į kamerą su deguonies elektrodu (2 priedėlio 1 pav.) ir iškart išmatuoti ištirpusio deguonies koncentraciją. Naudojant kelių elektrodų sistemą, matavimus galima atlikti vienu metu. Maišyti (naudojant dengtą magnetą) būtina ta pačia sparta, kaip ir kalibruojant elektrodą, taip užtikrinant, kad zondas kuo mažiau vėluodamas reaguotų į deguonies koncentracijų kaitą ir matavimo inde būtų atliekami reguliarūs bei atkuriami deguonies matavimai. Paprastai pakanka savimaišio zondo sistemos su keliais deguonies elektrodais. Kamerą tarp matavimų reikėtų išplauti vandeniu. Vietoj to ėminį galima įpilti į BDS butelį (3 priedėlio 2 pav.) su magnetiniu maišikliu. Tada reikėtų į kolbos kaklelį įstatyti deguonies zondą su adapteriu (mova) ir įjungti magnetinį maišiklį. Abiem atvejais ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti nuolat matuojama ir registruojama tam tikrą laiko tarpą, paprastai 5–10 minučių arba iki tol, kol deguonies koncentracija sumažės iki mažiau nei 2 mg/l. Tada, jeigu reikia atlikti matavimus po ilgesnių veikimo laikotarpių, reikėtų išimti elektrodą, mišinį grąžinti į aeracijos rezervuarą ir toliau aeruoti bei maišyti.

Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos patikrinimas

44.

Dėl tam tikrų priežasčių gali reikėti išmatuoti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją bandymo induose. Pažymėtina, kad jeigu naudojami pradiniai tirpalai, paruošti iš:

vandenyje mažai tirpių medžiagų,

mišinių, kurių sudedamosios dalys nevienodai tirpios vandenyje, arba

vandenyje labai tirpių medžiagų, kurių pradinio tirpalo koncentracija yra artima tirpumo vandenyje ribai,

tokiu atveju vandenyje ištirpusi dalis ir faktinė į bandymo indus perkeliamos bandomosios cheminės medžiagos koncentracija yra nežinomos. Siekiant apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį, reikia analitiškai įvertinti jos koncentracijas bandymo induose. Kad būtų paprasčiau, šį analitinį vertinimą reikėtų atlikti prieš dedant pasėlį. Kadangi į bandymo indus pateks tik ištirpusios bandomosios medžiagos dalys, išmatuotos jos koncentracijos gali būti labai mažos.

45.

Kad nereikėtų atlikti ilgai trunkančios ir brangiai kainuojančios analizės, patartina paprasčiausiai dėti bandomąją cheminę medžiagą tiesiai į bandymo indus ir juose pasverti, o tada šia iš pradžių pasvėrus nustatyta vardine koncentracija remtis atliekant vėlesnius skaičiavimus. Ištirpusių, neištirpusių ar įsigėrusių (adsorbuotų) bandomosios cheminės medžiagos dalių skirti nebūtina, nes visos šios dalys taip pat susidaro nuotekų valymo įrenginyje natūraliomis sąlygomis ir gali skirtis priklausomai nuo nuotekų sudėties. Šiuo bandymo metodu siekiama pagrįstai įvertinti neslopinančią bandomosios medžiagos koncentraciją, tačiau jis netinka, kai reikia išsamiai ištirti, kurios tos medžiagos dalys prisideda prie slopinamojo poveikio aktyviojo dumblo organizmams. Galiausiai pažymėtina, kad lengvai įsigeriančias (adsorbuojamas) medžiagas taip pat reikėtų pasverti tiesiai bandymo induose, kurie turėtų būti silanizuoti, kad dėl įgerties būtų prarasta kuo mažiau medžiagos.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Deguonies sugerties greičio apskaičiavimas

46.

Deguonies sugerties greitis turėtų būti apskaičiuojamas naudojant išmatuotų verčių vidurkį, pvz., pagal deguonies koncentracijos kaip laiko funkcijos grafiko tiesinę dalį, atliekant skaičiavimus tik 2,0–7,0 mg/l deguonies koncentracijų intervale, nes nuo didesnių arba mažesnių koncentracijų savaime gali priklausyti deguonies vartojimo greitis. Kartais neišvengiamai būtina rinktis už šias vertes mažesnių arba didesnių koncentracijų intervalus, pavyzdžiui, kai kvėpavimas yra stipriai slopinamas, todėl labai lėtas, arba kai tam tikras aktyvusis dumblas kvėpuoja labai intensyviai. Tai yra priimtina, jeigu deguonies sugerties grafike nubrėžtos papildomos atkarpos yra tiesės, kurių nuolydis nesikeičia ir už O2 2,0 arba 7,0 mg/l ribos. Bet kokių kreivių atsiradimas grafike reiškia, kad matavimo sistema stabilizuojasi arba kad deguonies sugerties greitis kinta ir jo nereikėtų naudoti apskaičiuojant kvėpavimo intensyvumą. Deguonies sugerties greitį reikėtų išreikšti miligramais vienam litrui per valandą (mg/l/val.) arba miligramais vienam dumblo sausosios medžiagos masės gramui per valandą (mg/g/val.). Deguonies suvartojimo greitis R (mg/l/val.) gali būti apskaičiuojamas arba interpoliuojamas iš nustatyto deguonies kiekio mažėjimo grafiko tiesinės dalies pagal 1 lygtį:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

kurioje:

Q1

yra deguonies koncentracija (mg/l) grafiko tiesinės dalies pasirinktos atkarpos pradžioje;

Q2

deguonies koncentracija (mg/l) grafiko tiesinės dalies pasirinktos atkarpos pabaigoje;

Δt

laiko intervalas (min.) tarp abiejų matavimų.

47.

Konkretus kvėpavimo intensyvumas (Rs) išreiškiamas kaip suvartoto deguonies kiekis vienam dumblo sausosios medžiagos masės gramui per valandą (mg/g/val.) pagal 2 lygtį:

Rs = R/SS

(2)

kurioje SS yra bandymo mišinyje suspenduotų kietųjų medžiagų koncentracija (g/l).

48.

Įvairūs R rodikliai, kuriuos galima taikyti kartu, yra:

S

savitasis deguonies vartojimo greitis

T

bendrojo kvėpavimo intensyvumas

N

nitrifikacinio kvėpavimo intensyvumas

H

heterotrofinio kvėpavimo intensyvumas

A

deguonies sugerties dėl abiotinių procesų greitis

B

iš tuščiųjų bandinių nustatytas (vidutinis) greitis

Nitrifikacinės deguonies sugerties greičio apskaičiavimas

49.

Bendrojo kvėpavimo (RT), nitrifikacinio kvėpavimo (RN) ir heterotrofinio kvėpavimo (RH) santykis gaunamas pagal 3 lygtį:

RN = RT – RH

(3)

kurioje:

RN

yra nitrifikacinės deguonies sugerties greitis (mg/l/val.);

RT

tuščiame kontroliniame bandinyje išmatuotas deguonies sugerties greitis (nenaudojant ATU; FB) (mg/l/val.);

RH

tuščiame kontroliniame bandinyje išmatuotas deguonies sugerties greitis naudojant ATU (FN) (mg/l/val.).

50.

Šis santykis tinka matuojant tuščiųjų bandinių vertes (RNB, RTB, RHB), abiotinius kontrolinius bandinius (RNA, RTA, RHA) ir bandinius su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis (RNS, RTS, RHS) (mg/g/val.). Savitasis kvėpavimo intensyvumas apskaičiuojamas pagal:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Jeigu per išankstinį bandymą RN yra nereikšmingas (pvz., < 5 % RT tuščiuose kontroliniuose bandiniuose), galima daryti prielaidą, kad heterotrofinė deguonies sugertis prilygsta bendrajai sugerčiai ir nitrifikacijos procesas nevyksta. Iš kito šaltinio paimtą aktyvųjį dumblą reikėtų naudoti tuo atveju, jeigu atliekant bandymus reikia atsižvelgti į poveikį heterotrofiniams ir nitrifikuojantiems mikroorganizmams. Jeigu yra įrodymų, kad deguonies sugerties greitis slopinamas esant įvairioms bandomosios cheminės medžiagos koncentracijoms, atliekamas nustatomasis bandymas.

Slopinimo procentinio lygio apskaičiavimas

52.

Bendrojo deguonies vartojimo slopinimo, esant kiekvienai bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai, procentinis lygis (IT) nustatomas pagal 7 lygtį:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Heterotrofinės deguonies sugerties slopinimo, esant kiekvienai bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai, procentinis lygis (IH) panašiai gaunamas pagal 8 lygtį:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Galiausiai deguonies sugerties dėl nitrifikacijos slopinimas (IN), esant kiekvienai koncentracijai, gaunamas pagal 9 lygtį:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Deguonies sugerties slopinimo procentinį lygį reikėtų pavaizduoti grafike kaip bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos logaritmo funkciją (slopinimo kreivė, žr. 4 priedėlio 3 pav.). Slopinimo kreivės brėžiamos po kiekvieno aeravimo periodo (3 val.) arba po papildomų 30 min. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant deguonies sugertis nuslopinama 50 % (EC50), turėtų būti apskaičiuojama arba interpoliuojama pagal grafiką. Jeigu yra tinkamų duomenų, galima apskaičiuoti arba interpoliuoti EC50 95 % pasikliovimo ribas, kreivės nuolydį ir atitinkamas vertes slopinimo pradžioje (pvz., EC10 arba EC20) ir slopinimo intervalo pabaigoje (pvz., EC80 arba EC90).

56.

Pažymėtina, kad dėl dažnai pastebimo rezultatų kintamumo daugeliu atvejų gali pakakti papildomai išdėstyti rezultatus didėjimo tvarka, pvz.:

EC50

< 1 mg/l

EC50

nuo 1 mg/l iki 10 mg/l

EC50

nuo 10 mg/l iki 100 mg/l

EC50

> 100 mg/l

Rezultatų aiškinimas

ECx

57.

ECx vertės, įskaitant susijusias atitinkamo parametro žemutinę ir viršutinę 95 % pasikliovimo ribas, apskaičiuojamos taikant tinkamus statistinius metodus (pvz., probito analizę, logistinę arba Weibull funkciją, sutrumpintą Spearman-Karber metodą arba paprastąją interpoliaciją (11)). ECx vertė gaunama į gautą lygtį įrašant vertę, atitinkančią x % kontrolinės grupės vidurkio. Apskaičiuojant EC50 ar bet kokią kitą ECx vertę turėtų būti atlikta bandomųjų grupių vidurkių (x) regresinė analizė.

NOEC įvertinimas

58.

Jeigu, siekiant nustatyti NOEC, reikia atlikti statistinę analizę, būtina turėti kiekvieno indo statistinius duomenis (kartotiniais bandiniais laikomi atskiri indai). Turėtų būti taikomi tinkami statistiniai metodai pagal EBPO „Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application“ (dokumentas, kuriame rašoma apie dabartinius ekotoksiškumo duomenų statistinės analizės metodus – jų taikymo gairės) (11). Apskritai bandomosios cheminės medžiagos neigiamas poveikis, palyginti su kontroline grupe, tiriamas atliekant vienpusį (trumpesnįjį) hipotezės tikrinimą, kai p ≤ 0,05.

Bandymo ataskaita

59.

Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.

 

Bandomoji cheminė medžiaga

Bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, grynumas.

Bandomosios cheminės medžiagos fizikinės ir cheminės savybės (pvz., log Kow, tirpumas vandenyje, garų slėgis, Henrio dėsnio konstanta (H) ir galima informacija apie bandomosios cheminės medžiagos išlikimą aplinkoje, pvz., įgertį į aktyvųjį dumblą).

 

Bandymo sistema

Aktyviojo dumblo šaltinis, atitinkamo nuotekų valymo įrenginio veikimo sąlygos ir į jį patenkančios nuotekos, aktyviojo dumblo koncentracija, išankstinis apdorojimas ir priežiūra.

 

Bandymo sąlygos

Bandymo temperatūra, pH lygis bandymo metu ir bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio (-ių) trukmė.

 

Rezultatai

Savitasis kontrolinių bandinių deguonies vartojimas (mg O2/(g dumblo × val.).

Visi matavimų duomenys, slopinimo kreivė (-ės) ir EC50 apskaičiavimo metodas.

EC50 ir, jeigu įmanoma, 95 % pasikliovimo ribos, galbūt EC20, EC80; galbūt NOEC ir taikyti statistiniai metodai, jeigu EC50 nustatyti neįmanoma.

Bendrojo ir, kai tinka, heterotrofinio kvėpavimo bei nitrifikacijos slopinimo nustatymo rezultatai.

Abiotinė deguonies sugertis kontroliniame fizikinių ir cheminių savybių tyrimo bandinyje (jeigu naudojamas).

Etaloninės cheminės medžiagos pavadinimas ir ją naudojant gauti rezultatai.

Bet kokie pastebėjimai ir nukrypimai nuo standartinės procedūros, galėję turėti įtakos bandymo rezultatui.

NUORODOS

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1 priedėlis

Sąvokų apibrėžtys

Toliau pateiktos taikant šį bandymo metodą vartojamų sąvokų apibrėžtys.

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

ECx (x % poveikį sukelianti poveikio koncentracija) – bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant bandomieji organizmai patiria x % poveikį per atitinkamą tos medžiagos veikimo laikotarpį, palyginti su kontroliniu bandiniu. Pavyzdžiui, EC50 yra koncentracija, kuri, kaip įvertinta, iki bandymo vertinamosios baigties per nustatytą bandomosios medžiagos veikimo laikotarpį paveikia 50 % atitinkamos populiacijos.

Nepastebėto poveikio koncentracija (NOEC) – bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant jokio poveikio nepastebima. Atliekant šį bandymą, NOEC atitinkanti koncentracija per nustatytą veikimo laikotarpį nepadaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05), palyginti su kontroline grupe.

Bandomoji cheminė medžiaga – naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.

2 priedėlis

1 pav.   Matavimo prietaiso pavyzdys

Image

Paaiškinimas

1

aktyvusis dumblas

2

sintetinė terpė

3

bandomoji cheminė medžiaga

4

oras

5

maišymo indas

6

magnetinis maišiklis

7

deguonies matavimo kamera

8

deguonies elektrodas

9

deguonies matuoklis

10

savirašis

3 priedėlis

2 pav.   Su BDS buteliu naudojamo matavimo prietaiso pavyzdys

Image

Paaiškinimas

1

bandymo indas

2

deguonies elektrodas

3

deguonies matuoklis

4 priedėlis

3 pav.   Slopinimo kreivių pavyzdys

Image

Paaiškinimas

X

3,5-dichlorfenolio koncentracija (mg/l)

Y

slopinimo lygis ( %)

Image

heterotrofinio kvėpavimo slopinimas naudojant nitrifikuojantį dumblą

Image

nitrifikacijos slopinimas naudojant nitrifikuojantį dumblą.

5)

C.26 skyrius pakeičiamas taip:

C.26    LEMNA RŪŠIŲ AUGALŲ AUGIMO SLOPINIMO BANDYMAS

ĮVADAS

1.

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 221 (2006). Jis skirtas cheminių medžiagų toksiškumui Lemna (plūdenų) genties gėlo vandens augalams vertinti. Jis pagrįstas esamais metodais (1), (2), (3), (4), (5), (6), tačiau į jį įtraukti tų metodų pakeitimai, atsižvelgiant į naujus mokslinius tyrimus ir konsultacijas keliais svarbiais klausimais. Šio bandymo metodo tinkamumas patvirtintas tarptautiniu tarplaboratoriniu bandymu (7).

2.

Pagal šį bandymo metodą atliekami toksiškumo bandymai naudojant Lemna gibba ir Lemna minor rūšių augalus; abi rūšys yra plačiai ištirtos ir joms taikomi minėti standartai. Lemna spp. klasifikacija yra sudėtinga dėl didelės fenotipų įvairovės. Nors Lemna atsakas į nuodingųjų medžiagų poveikį gali priklausyti nuo genetinio kintamumo, kol kas nepakanka duomenų apie šio kintamumo pobūdį, kad bandymams pagal šį metodą būtų galima rekomenduoti konkretų kloną. Pažymėtina, kad nors šie bandymai nėra atliekami steriliai, įvairiuose bandymo proceso etapuose imamasi priemonių užkrėtimui kitais organizmais, kiek įmanoma, sumažinti.

3.

Išsamiai aprašyta šio bandymo atlikimo atnaujinant bandymo tirpalą (pusiau stacionarusis ir pratekamojo srauto bandymas) ir jo neatnaujinant (stacionarusis bandymas) tvarka. Atsižvelgiant į bandymo tikslus ir norminius reikalavimus, rekomenduojama apsvarstyti galimybę taikyti pusiau stacionarųjį ir pratekamojo srauto metodus, jeigu, pvz., cheminės medžiagos greitai dingsta iš tirpalo dėl garavimo, fotocheminio skilimo, nuosėdų susidarymo ar biologinio skaidymo. Papildomų gairių pateikta literatūroje (8).

4.

Taikant šį metodą vartojamos sąvokos apibrėžtos 1 priedėlyje.

BANDYMO PRINCIPAS

5.

Eksponentiškai augančios Lemna genties augalų monokultūros septynias paras auginamos veikiant įvairių koncentracijų bandomajai cheminei medžiagai. Šio bandymo tikslas – kiekybiškai įvertinti cheminės medžiagos poveikį augalų vegetatyviniam augimui per tą laikotarpį remiantis pasirinktų matuojamų kintamųjų vertinimais. Pagrindinis matuojamas kintamasis yra augalų gniužulų skaičius. Kartu su juo matuojamas dar bent vienas kintamasis (bendras gniužulų plotas, sausos medžiagos masė arba šviežios medžiagos masė), nes kai kurios cheminės medžiagos gali paveikti kitus matuojamus kintamuosius kur kas labiau nei gniužulų skaičių. Siekiant kiekybiškai išreikšti cheminės medžiagos poveikį, augalų augimas bandymo tirpaluose palyginamas su kontrolinės grupės augimu ir nustatoma konkretų x % (pvz., 50 %) augimo slopinimą sukelianti tos cheminės medžiagos koncentracija, kuri išreiškiama ECx (pvz., EC50).

6.

Bandymo vertinamoji baigtis yra augalų augimo slopinimas, išreiškiamas kaip logaritminis matuojamo kintamojo didėjimas (vidutinis savitasis augimo greitis) bandomosios medžiagos veikimo laikotarpiu. Pagal vidutinius savituosius augimo greičius, išmatuotus naudojant bandymo tirpalų seriją, nustatoma konkretų augimo greičio sumažėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, kuri išreiškiama ErCx (pvz., ErC50).

7.

Taikant šį bandymo metodą naudojamas papildomas atsako kintamasis – išeiga, kurią gali reikėti nustatyti pagal kai kurių valstybių konkrečius norminius reikalavimus. Išeiga apibrėžiama kaip matuojamų kintamųjų skirtumas, atsiradęs nuo bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio pradžios iki pabaigos. Pagal išeigą, nustatytą naudojant bandymo tirpalų seriją, apskaičiuojama konkretų procentinį išeigos sumažėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, kuri išreiškiama EyCx (pvz., EyC50).

8.

Be to, galima statistiškai nustatyti mažiausią pastebėto poveikio koncentraciją (LOEC) ir nepastebėto poveikio koncentraciją (NOEC).

INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ

9.

Turėtų būti taikomas pakankamo jautrio analizės metodas cheminės medžiagos kiekiui bandymo terpėje nustatyti.

10.

Nustatant bandymo sąlygas gali būti naudinga žinoti šią informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą: jos struktūrinę formulę, grynumą, tirpumą vandenyje, stabilumą veikiant vandeniui ir šviesai, disociacijos konstantą, oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą, garų slėgį ir biologinį skaidumą. Tirpumo vandenyje ir garų slėgio duomenis galima panaudoti apskaičiuojant Henrio dėsnio konstantą, iš kurios būtų aišku, ar yra tikimybė per bandymo laikotarpį netekti didelio bandomosios cheminės medžiagos kiekio. Tai padėtų nustatyti, ar reikia imtis konkrečių priemonių tokiems nuostoliams mažinti. Jeigu turima informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tirpumą ir stabilumą kelia abejonių, patartina įvertinti šias savybes bandymo sąlygomis, t. y. bandymui naudojamoje auginimo terpėje, esant bandymo temperatūrai ir apšvietimo režimui.

11.

Jeigu itin svarbu kontroliuoti bandymo terpės pH lygį, pvz., atliekant metalų arba vandenyje nepatvarių cheminių medžiagų bandymus, į auginimo terpę rekomenduojama įpilti buferinio tirpalo (žr. 21 skirsnį). Daugiau gairių, kaip atlikti bandymus su cheminėmis medžiagomis, kurias tirti yra sunkiau dėl jų fizikinių ir cheminių savybių, pateikta literatūroje (8).

BANDYMO TINKAMUMAS

12.

Bandymas pripažįstamas tinkamu, jeigu augalų gniužulų skaičius kontroliniuose bandiniuose padvigubėja greičiau nei per 2,5 paros (60 val.), taigi per septynias paras padidėja maždaug septynis kartus, o vidutinis savitasis augimo greitis yra 0,275 para– 1. Šio bandymo metodo aprašyme nurodytų terpių ir bandymo sąlygomis šį kriterijų gali atitikti stacionarusis bandymas (5). Taip pat numatoma, kad šį kriterijų gali atitikti ir pusiau stacionariosiomis bei pratekamojo srauto sąlygomis atliekami bandymai. Kaip apskaičiuojama gniužulų dvigubėjimo trukmė, parodyta 49 skirsnyje.

ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA

13.

Bandymo procedūrai patikrinti galima atlikti bandymą su etalonine chemine medžiaga arba medžiagomis, pvz., 3,5-dichlorfenoliu, kuris naudotas per tarptautinį tarplaboratorinį bandymą (7). Etaloninės cheminės medžiagos bandymą patartina atlikti bent dukart per metus arba, jeigu rečiau, – tuo pačiu metu, kai nustatomas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas.

METODO APRAŠYMAS

Aparatūra

14.

Visa įranga, kuri liečiasi su bandymo terpėmis, turėtų būti pagaminta tik iš stiklo ar kitos chemiškai inertinės medžiagos. Augalų kultūroms auginti ir bandymams naudojami stikliniai indai turėtų būti išvalyti, kad juose neliktų cheminių medžiagų priemaišų, kurios galėtų būti išplautos į bandymo terpę, ir sterilūs. Bandymui turėtų būti naudojami pakankamai platūs indai, kad atskirų kolonijų gniužulai kontrolinės grupės induose iki bandymo pabaigos augtų nesudarydami sanklotos. Nesvarbu, ar augalų šaknys siekia bandymo indo dugną, ar ne, tačiau patartina naudoti ne mažiau kaip 20 mm gylio ir 100 ml tūrio indus. Galima rinktis bet kokius bandymo indus, kurie atitinka šiuos reikalavimus. Iš praktikos žinoma, kad tinka reikiamų matmenų cheminės stiklinės, kristalizatoriai arba stiklinės Petri lėkštelės. Bandymo indai turi būti uždengti, siekiant kuo labiau sumažinti garavimą ir apsaugoti nuo atsitiktinio užteršimo, tačiau juose turi pakankamai cirkuliuoti oras. Tinkami bandymo indai ir ypač jų dangčiai neturi mesti šešėlių ar keisti šviesos spektrinių savybių.

15.

Kultūrų auginimo ir bandymo indų nereikėtų laikyti kartu; geriausia naudoti atskiras klimatines auginimo kameras, inkubatorius arba patalpas. Apšvietimas ir temperatūra turi būti reguliuojami ir pastovūs (žr. 35–36 skirsnius).

Bandomieji organizmai

16.

Šiam bandymui naudojami Lemna gibba arba Lemna minor rūšies organizmai. Toksiškumo bandymams naudojamos plūdenų rūšys glaustai aprašytos 2 priedėlyje. Augalų medžiaga gali būti gauta iš kultūrų rinkinio, kitos laboratorijos arba iš lauko. Jei augalai surinkti lauke, jų kultūrą reikėtų bent aštuonias savaites iki naudojimo laikyti tokioje pačioje terpėje, kokia bus naudojama bandymui. Lauko vietose, iš kurių renkamos pradinės kultūros, neturi būti jokių pastebimų taršos šaltinių. Iš kitos laboratorijos arba kultūrų rinkinio gautas kultūras reikėtų tokia pačia tvarka laikyti mažiausiai tris savaites. Bandymo ataskaitoje reikėtų visuomet nurodyti bandymui naudotos augalų medžiagos šaltinį, rūšį ir kloną (jei žinomas).

17.

Turėtų būti naudojamos monokultūros be pastebimų užkrėtimo kitais organizmais, kaip antai dumbliais ir pirmuonimis, požymių. Sveiki L. minor rūšies augalai sudaro 2–5 gniužulų kolonijas, o sveikose L. gibba kolonijose gali būti iki 7 gniužulų.

18.

Bandymo rezultatas labai priklauso nuo bandymui naudojamų augalų kokybės ir vienodumo, todėl reikėtų kruopščiai atrinkti augalus. Turėtų būti naudojami jauni, sparčiai augantys augalai be matomų pažeidimų ar spalvos pakitimų (chlorozės). Aukštos kokybės kultūrų požymis – daug kolonijų, kuriose yra bent po du gniužulus. Vieno gniužulo kolonijų gausa yra aplinkos sukelto streso, pvz., mitybinių medžiagų trūkumo, požymis, todėl tokių kultūrų augalų medžiagos bandymams naudoti nereikėtų.

Auginimas

19.

Kad augalų kultūroms reikėtų mažiau priežiūros (pvz., jei kurį laiką neketinama atlikti bandymų su Lemna), jas galima laikyti prietemoje ir žemesnėje (4–10 °C) temperatūroje. Kultūrų auginimas išsamiai aprašytas 3 priedėlyje. Kai yra akivaizdžių užkrėtimo dumbliais ar kitais organizmais požymių, gali reikėti paimti dalinį Lemna gniužulų ėminį, atlikti paviršinį sterilizavimą ir perkelti jį į šviežią terpę (žr. 3 priedėlį). Tokiu atveju likusią užkrėstą kultūrą reikėtų pašalinti.

20.

Iki bandymo likus bent septynioms paroms, pakankamai kolonijų steriliu būdu perkeliama į šviežią sterilią terpę, kurioje kultūra 7–10 parų auginama bandymo sąlygomis.

Bandymo terpė

21.

Lemna minor ir Lemna gibba rekomenduojama naudoti skirtingas terpes, kaip aprašyta toliau. Reikėtų kruopščiai apsvarstyti pH reguliuoti skirto buferinio tirpalo (MOPS (4-morfolinpropansulfonrūgšties, CAS Nr. 1132-61-2) – L. minor terpėje, NaHCO3L. gibba terpėje) naudojimą bandymo terpėje, jeigu įtariama, kad jis gali reaguoti su bandomąja chemine medžiaga ir paveikti jos toksiškumo savybes. Be to, galima naudoti Steinbergo terpę (9), jei ji atitinka bandymo tinkamumo kriterijus.

22.

L. minor rūšies kultūrų auginimui ir bandymams rekomenduojama naudoti modifikuotą Lemna auginimo terpę pagal Švedijos standartą (SIS). Šios terpės sudėtis aprašyta 4 priedėlyje.

23.

L. gibba rūšies kultūrų auginimui ir bandymams rekomenduojama naudoti 20X-AAP auginimo terpę, kaip aprašyta 4 priedėlyje.

24.

4 priedėlyje aprašyta Steinbergo terpė taip pat tinka L. minor, tačiau ją galima naudoti ir L. gibba auginti, jei tai atitinka bandymo tinkamumo kriterijus.

Bandymo tirpalai

25.

Bandymo tirpalai paprastai ruošiami atskiedžiant pradinį tirpalą. Bandomosios cheminės medžiagos pradiniai tirpalai paprastai ruošiami ištirpinant cheminę medžiagą augalų auginimo terpėje.

26.

Didžiausia bandymui pasirinkta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija paprastai neturėtų viršyti tos cheminės medžiagos tirpumo vandenyje ribos bandymo sąlygomis, tačiau pažymėtina, kad Lemna spp. genties augalai plūduriuoja vandens paviršiuje ir gali būti veikiami cheminių medžiagų, besikaupiančių ties vandens ir oro riba (tai, pvz., vandenyje mažai tirpios, hidrofobinės arba paviršinio aktyvumo cheminės medžiagos). Tokiomis sąlygomis augalai patirtų ne tirpale esančių, o kitų medžiagų poveikį, ir bandymo koncentracijos, priklausomai nuo bandomosios cheminės medžiagos savybių, gali viršyti tos medžiagos tirpumo vandenyje lygį. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mažai tirpi vandenyje, gali reikėti paruošti koncentruotą jos pradinį tirpalą arba dispersinę terpę naudojant organinį tirpiklį arba dispergentą, kad būtų lengviau į bandymo terpę įdėti tikslius bandomosios cheminės medžiagos kiekius, ir siekiant palengvinti jos dispergavimą bei tirpimą. Kiek įmanoma, tokių medžiagų reikėtų vengti – bandomieji augalai neturėtų patirti fitotoksinio poveikio dėl naudojamų pagalbinių tirpiklių ar dispergentų. Įprastų tirpiklių, kurie nėra fitotoksiški, kol jų koncentracija neviršija 100 μl/l, pavyzdžiai yra acetonas ir dimetilformamidas. Jeigu naudojamas tirpiklis arba dispergentas, jo galutinė koncentracija turėtų būti nurodyta ataskaitoje ir kuo mažesnė (≤ 100 μl/l), be to, tirpiklio arba dispergento koncentracija turėtų būti vienoda visuose bandomosios ir kontrolinės grupių bandiniuose. Daugiau gairių, kaip naudoti dispergentus, pateikta literatūroje (8).

Bandomosios ir kontrolinės grupės

27.

Turint išankstinių žinių apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą Lemna, pvz., atlikus intervalo nustatymo bandymą, bus lengviau pasirinkti bandymui tinkamas jos koncentracijas. Nustatomajam toksiškumo bandymui paprastai reikėtų pasirinkti bent penkias bandomosios medžiagos koncentracijos vertes geometrinės progresijos seka. Patartina, kad gretimos bandymui pasirinktos koncentracijos vertės skirtųsi ne daugiau nei 3,2 karto, tačiau skirtumas gali būti ir didesnis, jei koncentracijos ir atsako kreivė yra gulsčia. Mažiau nei penkių koncentracijų naudojimą reikėtų pagrįsti. Reikėtų paruošti bent po tris kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotinius bandinius.

28.

Nustatant bandymo koncentracijos verčių intervalą (atliekant intervalo nustatymo ir (arba) toksiškumo nustatomąjį bandymą) reikėtų atsižvelgti į šiuos dalykus:

siekiant užtikrinti tinkamą pasikliautinąjį lygmenį, nustatoma ECx vertė turėtų patekti į bandymui pasirinktų koncentracijos verčių intervalą; pavyzdžiui, vertinant EC50, didžiausia bandymo koncentracijos vertė turėtų viršyti EC50 vertę. Jeigu EC50 vertė nepateks į bandymo koncentracijos verčių intervalą, atitinkami pasikliautinieji intervalai bus dideli ir gali būti neįmanoma tinkamai įvertinti statistinės taikomo modelio atitikties;

jeigu siekiama įvertinti LOEC (NOEC), mažiausia pasirinkta bandomosios medžiagos koncentracija turėtų būti pakankamai maža, kad jos veikiamų augalų augimas nebūtų pastebimai lėtesnis negu kontrolinės grupės augalų, o didžiausia bandymo koncentracija turėtų būti pakankamai didelė, kad jos veikiami augalai augtų kur kas lėčiau negu kontrolinės grupės augalai. Jei taip nėra, bandymą teks pakartoti nustačius kitokių koncentracijų intervalą (nebent didžiausia koncentracija atitiktų tirpumo vandenyje ribą arba būtų didžiausia privaloma ribinė koncentracija, pvz., 100 mg/l).

29.

Per kiekvieną bandymą turėtų būti naudojami kontroliniai bandiniai su ta pačia mitybine terpe, gniužulų bei kolonijų skaičius juose turi būti toks pats ir aplinkos sąlygos bei procedūros tokios pačios, kaip ir bandymo induose, į juos tik nededama bandomosios cheminės medžiagos. Jeigu naudojamas pagalbinis tirpiklis arba dispergentas, reikėtų paruošti papildomą kontrolinę grupę su tuo tirpikliu ar dispergentu, kurio koncentracija būtų tokia pati, kaip ir induose, į kuriuos dėta bandomosios cheminės medžiagos. Kontrolinės grupės kartotinių bandinių indų (ir, kai tinka, indų su tirpikliu) turėtų būti bent tiek pat, kiek ir kiekvienos bandymo koncentracijos indų; geriausia, kad jų būtų du kartus daugiau.

30.

Jeigu nereikia nustatyti NOEC, galima pakeisti bandymo planą, padidinant koncentracijos verčių skaičių ir sumažinant kiekvienos koncentracijos kartotinių bandinių skaičių, tačiau turi būti ne mažiau kaip trys kartotiniai kontroliniai bandiniai.

Poveikis

31.

Iš 2–4 matomų gniužulų sudarytos kolonijos paimamos iš sėjamos kultūros indo ir steriliomis sąlygomis atsitiktine tvarka paskirstomos bandymo induose. Kiekviename inde turėtų iš viso būti 9–12 gniužulų. Gniužulų ir kolonijų skaičius kiekviename bandymo inde turėtų būti vienodas. Iš šio metodo taikymo patirties ir tarplaboratorinio bandymo duomenų žinoma, kad trijų kartotinių kiekvienos bandomosios grupės bandinių, kurių kiekviename iš pradžių yra po 9–12 gniužulų, pakanka nustatyti augalų augimo bandomosiose grupėse skirtumams esant maždaug 4–7 % slopinimui, apskaičiuotam pagal augimo greitį (10–15 %, apskaičiuotas pagal išeigą) (7).

32.

Siekiant, kiek įmanoma, sumažinti bandymo indų padėties erdvėje, šviesos stiprio ar temperatūros skirtumų įtaką, reikia atsitiktine tvarka išdėstyti bandymo indus inkubatoriuje. Be to, stebėjimus reikia atlikti „blokinės schemos“ tvarka arba atsitiktine tvarka sukeičiant indus vietomis (arba dažniau juos perkeliant į kitą vietą).

33.

Jeigu atlikus išankstinį stabilumo bandymą nustatyta, kad pastovios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos per visą bandymo trukmę (7 paras) palaikyti neįmanoma (t. y. matuojamoji koncentracija nesiekia 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), rekomenduojama taikyti pusiau stacionariojo bandymo režimą. Šiuo atveju bandomosios ir kontrolinės grupių tirpalai, kuriuose laikomos augalų kolonijos, turėtų būti keičiami šviežiais bent dukart per bandymą (pvz., 3 ir 5 dienomis). Terpės keitimo dažnis priklauso nuo bandomosios cheminės medžiagos stabilumo; labai nestabilių arba lakių cheminių medžiagų tirpalus gali reikėti keisti dažniau, siekiant palaikyti beveik vienodas jų koncentracijas. Tam tikromis aplinkybėmis bandymą gali reikėti atlikti pagal pratekamojo srauto procedūrą (8), (10).

34.

Bandomosios medžiagos poveikio per augalų lapus (purškiant) scenarijus pagal šį bandymo metodą netaikomas; vietoj to žr. (11).

Inkubavimo sąlygos

35.

Turėtų būti užtikrintas nuolatinis apšvietimas šiltai arba šaltai balta liuminescencinių lempų šviesa, kurios stipris būtų 85–135 μE · m– 2s– 1 intervale, matuojant fotosintezei optimalaus spektro (400–700 nm) spinduliuotę tokiu pačiu atstumu nuo šviesos šaltinio, kokiu nuo jo yra Lemna gniužulai (atitikmuo liuksais yra 6 500–10 000 lx). Šviesos stipris virš bandymo vietos neturi kisti daugiau kaip ± 15 % pasirinkto šviesos stiprio intervalo. Išmatuota vertė priklausys nuo šviesos aptikimo ir matavimo metodo, ypač naudojamo jutiklio rūšies. Sferiniai jutikliai (reaguojantys į šviesą, krintančią visais kampais virš ir žemiau matavimo plokštumos) ir „kosinusiniai“ jutikliai (reaguojantys į šviesą, krintančią visais kampais virš matavimo plokštumos) yra tinkamesni nei vienakrypčiai jutikliai, ir jais bus gauti didesni rodmenys naudojant čia aprašyto tipo daugiataškį šviesos šaltinį.

36.

Temperatūra bandymo induose turėtų būti 24 ± 2 °C. Kontrolinių bandinių terpės pH per bandymą neturėtų padidėti daugiau kaip 1,5 vieneto, tačiau net jeigu nuokrypis būtų didesnis kaip 1,5 vieneto, bandymas vis vien būtų pripažintas tinkamu, jei tik būtų galima įrodyti atitiktį tinkamumo kriterijams. Reikia imtis papildomų atsargumo priemonių dėl pH kitimo konkrečiais atvejais, pvz., atliekant nestabilių cheminių medžiagų arba metalų bandymus. Papildomų gairių dėl to pateikta literatūroje (8).

Trukmė

37.

Bandymas baigiamas po 7 parų nuo augalų perkėlimo į bandymo indus.

Matavimai ir analiziniai nustatymai

38.

Pradedant bandymą nustatomas ir užrašomas gniužulų skaičius bandymo induose, stengiantis įskaityti atsikišusius, aiškiai matomus gniužulus. Įprastos ir neįprastos išvaizdos gniužulų skaičių būtina nustatyti bandymo pradžioje, bent kas 3 paras bandomosios medžiagos veikimo laikotarpiu (t. y. bent du kartus per 7 paras) ir baigiant bandymą. Reikėtų aprašyti augalų vystymosi, pvz., gniužulų dydžio arba išvaizdos, pokyčius, nurodyti nekrozės požymius, chlorozę arba gumbuotumą, kolonijų smulkėjimą arba plūdrumo netekimą, šaknų ilgį ir išvaizdą. Taip pat reikėtų nurodyti svarbias bandymo terpės savybes (pvz., jeigu bandymo inde yra neištirpusios medžiagos arba auga dumbliai).

39.

Per bandymą skaičiuojant gniužulus, taip pat vertinamas bandomosios cheminės medžiagos poveikis vienam (arba daugiau) iš šių matuojamų kintamųjų:

i)

bendram gniužulų plotui;

ii)

sausos medžiagos masei;

iii)

šviežios medžiagos masei.

40.

Bendras gniužulų plotas yra pranašesnis už kitus kintamuosius tuo, kad jį galima nustatyti kiekviename bandomosios ir kontrolinės grupių inde bandymo pradžioje, eigoje ir pabaigoje. Sausos arba šviežios medžiagos masė turėtų būti nustatoma bandymo pradžioje paimant sėjamos kultūros, naudojamos pradedant bandymą, pavyzdį ir bandymo pabaigoje paimant augalų medžiagos pavyzdžius iš kiekvieno bandomosios ir kontrolinės grupių indo. Jei gniužulų plotas nematuojamas, geriau matuoti ne šviežios, o sausos medžiagos masę.

41.

Bendrą gniužulų plotą, sausos medžiagos masę ir šviežios medžiagos masę galima nustatyti toliau aprašyta tvarka.

i)

Bendras gniužulų plotas. Visų kolonijų gniužulų bendras plotas gali būti nustatomas išanalizuojant jų vaizdą. Galima užfiksuoti bandymo indo ir jame esančių augalų siluetą vaizdo kamera (t. y. pastačius indą ant šviesdėžės) ir gautą vaizdą apdoroti skaitmeniniu būdu, o tada kalibruojant pagal plokščius žinomo ploto vaizdus galima nustatyti bendrą gniužulų plotą. Dėl indo krašto atsiradusius trukdžius reikėtų pašalinti. Pagal kitą metodą (kurį taikant reikia įdėti daugiau darbo) padaroma bandymo indų ir juose esančių augalų fotokopija, gautas kolonijų siluetas iškerpamas ir jų plotas nustatomas naudojant lapų ploto analizatorių arba milimetrinį popierių. Gali tikti ir kiti metodai (pvz., kolonijų silueto ploto ir vienetinio ploto popieriaus masės santykio nustatymas).

ii)

Sausos medžiagos masė. Visos kolonijos surenkamos iš kiekvieno bandymo indo ir nuplaunamos distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Pašalinus vandens perteklių sugeriamuoju popieriumi, kolonijos, įskaitant visus šaknų likučius, išdžiovinamos 60 °C temperatūroje iki pastovios masės. Sausos medžiagos masė turėtų būti nustatoma bent 0,1 mg tikslumu.

iii)

Šviežios medžiagos masė. Visos kolonijos surenkamos į iš anksto pasvertus polistireno (arba kitos inertinės medžiagos) mėgintuvėlius su išgaubtais dugnais, kuriuose yra mažų (1 mm skersmens) skylučių. Tada mėgintuvėliai 10 min. centrifuguojami 3 000 sūkių/min. greičiu, palaikant kambario temperatūrą. Mėgintuvėliai su nusausintomis kolonijomis pasveriami iš naujo ir šviežios medžiagos masė apskaičiuojama atimant tuščio mėgintuvėlio masę.

Matavimų ir analizinių nustatymų dažnis

42.

Pagal stacionariojo bandymo planą kiekvieno bandomosios grupės indo pH vertė turėtų būti išmatuota pradedant ir baigiant bandymą. Pagal pusiau stacionariojo bandymo planą reikėtų išmatuoti kiekvienos šviežio bandymo tirpalo partijos pH vertę kaskart prieš atnaujinant tirpalą ir panaudotų keičiamų tirpalų pH vertę.

43.

Šviesos stipris turėtų būti matuojamas tose auginimo kameros, inkubatoriaus arba patalpos vietose, kurios nuo šviesos šaltinio yra nutolusios tokiu pačiu atstumu, kaip ir Lemna gniužulai. Matavimai bandymo metu turėtų būti atliekami bent kartą. Reikėtų bent kartą per dieną užrašyti terpės temperatūrą pakaitiniame inde, kuris tokioms pačiomis sąlygomis laikomas auginimo kameroje, inkubatoriuje arba atitinkamoje patalpoje.

44.

Per bandymą tinkamais laiko intervalais nustatomos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos. Atliekant stacionariuosius bandymus, būtina nustatyti koncentracijas pradedant ir baigiant bandymą.

45.

Atliekant pusiau stacionariuosius bandymus, kai nesitikima, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija išliks vardinės koncentracijos ± 20 % intervalo ribose, būtina išanalizuoti visus naujai paruoštus bandymo tirpalus ir tuos pačius tirpalus kaskart, kai jie atnaujinami (žr. 33 skirsnį). Tačiau kai per bandymą išmatuota pradinė bandomosios cheminės medžiagos koncentracija nepatenka į vardinės koncentracijos ± 20 % intervalą, bet galima pakankamais įrodymais pagrįsti, kad pradinės koncentracijos yra pakartojamos ir pastovios (t. y. patenka į 80–120 % pradinės koncentracijos intervalą), galima atlikti tik didžiausios ir mažiausios bandymo koncentracijų cheminę analizę. Visais atvejais bandomosios cheminės medžiagos koncentracijas iki tirpalo atnaujinimo tereikia nustatyti viename kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotinio bandinio inde (arba analizuojant sujungiamas kartotinių indų turinys).

46.

Atliekant pratekamojo srauto bandymą tinka analizuoti ėminius tokia pačia tvarka, kaip ir per pirmiau aprašytus pusiau stacionarius bandymus, įskaitant analizę bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje, tačiau šiuo atveju nereikia atlikti panaudotų tirpalų matavimų. Per šio pobūdžio bandymus skiediklio ir bandomosios cheminės medžiagos arba bandomosios cheminės medžiagos pradinio tirpalo srautas turėtų būti tikrinamas kasdien.

47.

Jeigu įrodyta, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją per visą bandymą pavyko išlaikyti nepakitusią daugiau kaip ± 20 % vardinės arba išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatus galima analizuoti remiantis vardinėmis arba išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Tačiau jeigu nuo vardinės arba išmatuotos pradinės koncentracijos nukrypta daugiau kaip ± 20 %, rezultatus reikėtų analizuoti remiantis bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio geometrinio vidurkio koncentracija arba taikant modelius bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos mažėjimui apibūdinti (8).

Ribų nustatymo bandymas

48.

Tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jeigu išankstinis bandymas parodo, kad bandomoji cheminė medžiaga neturi toksinio poveikio, kol jos koncentracija nesiekia 100 mg/l arba tirpumo bandymo terpėje ribos (mažesnės iš šių verčių), galima atlikti ribų nustatymo bandymą, palyginant kontrolinės grupės ir vienos bandomosios (100 mg/l arba tirpumo ribinei vertei lygios koncentracijos) grupės atsaką į poveikį. Taip gautus rezultatus labai patartina patvirtinti atliekant efektyviosios koncentracijos analizę. Ribų nustatymo bandymas turi atitikti visas pirmiau aprašytas bandymo sąlygas ir tinkamumo kriterijus, tačiau kartotinių bandinių su bandomąja medžiaga turėtų būti dukart daugiau. Kontrolinės ir bandomosios grupių augalų augimą galima analizuoti taikant statistinį kriterijų vidurkiams palyginti, pvz., Stjudento t kriterijų.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Dvigubėjimo trukmė

49.

Siekiant nustatyti gniužulų skaičiaus dvigubėjimo trukmę (Td ) ir ar tyrimas atitinka šį tinkamumo kriterijų (12 skirsnis), gautiems kontrolinių indų duomenims taikoma ši formulė:

Td = ln 2/μ

kurioje μ yra vidutinis savitasis augimo greitis, nustatytas 54–55 skirsniuose aprašyta tvarka.

Atsako kintamieji

50.

Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį Lemna genties augalų vegetatyviniam augimui. Pagal šį bandymo metodą apibūdinami du atsako kintamieji, nes įvairiose jurisdikcijose skiriasi prioritetai ir norminiai reikalavimai. Siekiant, kad bandymo rezultatai būtų priimtini visose jurisdikcijose, poveikį reikėtų vertinti taikant abu toliau aprašytus atsako kintamuosius a ir b:

a)

vidutinis savitasis augimo greitis. Šis atsako kintamasis apskaičiuojamas pagal kontrolinių bandinių ir kiekvienos bandomosios grupės gniužulų skaičiaus logaritmų pokyčius ir, papildomai, kito matuojamo parametro (bendro gniužulų ploto, sausos medžiagos masės arba šviežios medžiagos masės) logaritmų pokyčius per laiko tarpą (išreiškiamą para). Jis kartais vadinamas santykiniu augimo greičiu (12);

b)

išeiga – šis atsako kintamasis apskaičiuojamas pagal kontrolinių bandinių ir kiekvienos bandomosios grupės gniužulų skaičiaus pokyčius ir, papildomai, kito matuojamo parametro (bendro gniužulų ploto, sausos medžiagos masės arba šviežios medžiagos masės) pokyčius iki bandymo pabaigos.

51.

Pažymėtina, kad taikant šiuos du atsako kintamuosius apskaičiuotos toksiškumo vertės nėra lygintinos tarpusavyje ir jų skirtumą būtina pripažinti naudojant bandymo rezultatus. Turint omenyje atitinkamų metodų matematinį pagrindą, jei laikomasi bandymo pagal šį metodą sąlygų, pagal vidutinį savitąjį augimo greitį nustatytos ECx vertės (ErCx) paprastai yra didesnės negu išeiga pagrįsti rezultatai (EyCx). To nereikėtų suprasti kaip abiejų atsako kintamųjų jautrio skirtumo – tiesiog vertės skiriasi matematiškai. Vidutinio savitojo augimo greičio sąvoka apibrėžiama remiantis bendrąja eksponentinio plūdenų augimo nevaržomose kultūrose schema, kurią taikant toksiškumas vertinamas pagal poveikį augimo greičiui, nepriklausomai nuo kontrolinės kultūros absoliučiojo savitojo augimo greičio, koncentracijos ir atsako kreivės krypties koeficiento ar bandymo trukmės. Kitu atsako kintamuoju – išeiga – pagrįsti rezultatai, priešingai, priklauso nuo visų šių kitų kintamųjų. EyCx vertė priklauso nuo kiekvienam bandymui naudojamos plūdenų rūšies savitojo augimo greičio ir nuo didžiausio savitojo augimo greičio, kuris įvairių rūšių ar net atskirų klonų gali būti skirtingas. Šio atsako kintamojo nereikėtų naudoti lyginant kelių plūdenų rūšių ar net atskirų klonų jautrį nuodingosioms medžiagoms. Nors toksiškumui vertinti moksliniu požiūriu labiau tinka vidutinis savitasis augimo greitis, pagal šį bandymo metodą numatyta naudoti ir išeiga pagrįstus toksiškumo įverčius, kurie yra privalomi pagal kai kuriose jurisdikcijose galiojančių norminių teisės aktų reikalavimus.

52.

Toksiškumo įverčiai turėtų būti nustatomi pagal gniužulų skaičių ir vieną papildomą matuojamą kintamąjį (bendrą gniužulų plotą, sausos medžiagos masę arba šviežios medžiagos masę), nes kai kurios cheminės medžiagos gali paveikti kitus matuojamus kintamuosius kur kas labiau nei gniužulų skaičių, o skaičiuojant tik gniužulus šis poveikis nebūtų nustatytas.

53.

Gniužulų skaičius ir visi kiti užrašyti matuojami kintamieji, t. y. bendras gniužulų plotas, sausos medžiagos masė arba šviežios medžiagos masė, surašomi į lenteles kartu su per kiekvieną matavimą nustatytomis bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertėmis. Vėliau analizuojant duomenis, pvz., siekiant nustatyti LOEC, NOEC arba ECx įvertį, reikėtų remtis atskirų kartotinių bandinių vertėmis, o ne apskaičiuotais kiekvienos bandomosios grupės vidurkiais.

Vidutinis savitasis augimo greitis

54.

Vidutinis savitasis augimo greitis tam tikru laikotarpiu kiekviename kontrolinės grupės ir bandomųjų grupių kartotiniame bandinyje apskaičiuojamas kaip augimo kintamųjų – gniužulų skaičiaus ir vieno kito matuojamo kintamojo (bendro gniužulų ploto, sausos medžiagos masės arba šviežios medžiagos masės) – logaritminis didėjimas pagal formulę

Formula

kurioje:

μi-j

vidutinis savitasis augimo greitis per laiko tarpą ij;

Ni

bandymo arba kontroliniame inde i laiku išmatuotas kintamasis;

Nj

bandymo arba kontroliniame inde j laiku išmatuotas kintamasis;

t

laiko tarpas nuo i iki j.

Apskaičiuojama kiekvienos bandomosios ir kontrolinės grupės augimo greičio vidutinė vertė ir dispersijos įverčiai.

55.

Reikėtų apskaičiuoti viso bandymo laikotarpio (pateiktoje formulėje i laikas yra bandymo pradžia, j laikas – bandymo pabaiga) vidutinį savitąjį augimo greitį. Apskaičiuokite kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos ir kontrolinės grupės vidutinio savitojo augimo greičio vidutinę vertę kartu su dispersijos įverčiais. Be to, reikėtų įvertinti augimo greitį atskirais laiko tarpais, siekiant įvertinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį jos veikimo laikotarpiu (pvz., nagrinėjant logaritmuotas augimo kreives). Jeigu tokie nustatyti augimo greičiai atskirais laiko tarpais reikšmingai skiriasi nuo vidutinio augimo greičio, tai rodo nuokrypį nuo tolygaus eksponentinio augimo ir reikia nuodugniai ištirti augimo kreives. Šiuo atveju taikytinas konservatyvus metodas būtų bandomųjų kultūrų savitojo augimo greičio didžiausio slopinimo laikotarpiu ir kontrolinių bandinių savitojo augimo greičio tuo pačiu laikotarpiu palyginimas.

56.

Tada galima apskaičiuoti kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos (bandomosios grupės) augimo greičio slopinimo lygį procentais (Ir) pagal formulę

Formula

kurioje:

% Ir

vidutinio savitojo augimo greičio slopinimo procentinis lygis;

μC

kontrolinės grupės vidutinė μ vertė;

μT

bandomosios grupės vidutinė μ vertė.

Išeiga

57.

Poveikis išeigai nustatomas pagal du matuojamus kintamuosius – gniužulų skaičių ir vieną kitą matuojamą kintamąjį (bendrą gniužulų plotą, sausos medžiagos masę arba šviežios medžiagos masę) – kiekviename bandymo inde pradedant ir baigiant bandymą. Matuojant sausos arba šviežios medžiagos masę, pradinė biomasė nustatoma paėmus gniužulų ėminį iš tos pačios paruoštos kultūros, kuri pasėta į bandymo indus, partijos (žr. 20 skirsnį). Apskaičiuokite kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos ir kontrolinės grupės išeigos vidutinę vertę kartu su dispersijos įverčiais. Kiekvienos bandomosios grupės išeigos vidutinį sumažėjimą procentais ( % Iy) galima apskaičiuoti pagal formulę

Formula

kurioje:

% Iy

išeigos sumažėjimas procentais;

bC

kontrolinės grupės galutinės ir pradinės biomasės skirtumas;

bT

bandomosios grupės galutinės ir pradinės biomasės skirtumas.

Koncentracijos ir atsako kreivių braižymas

58.

Reikėtų nubrėžti koncentracijos ir atsako kreives, susiejant pasirinkto atsako kintamojo slopinimo vidutinį lygį procentais (apskaičiuotą Ir, arba Iy, kaip parodyta 56 arba 57 skirsnyje) su bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos logaritmu.

ECx vertinimas

59.

ECx įverčiai (pvz., EC50) turėtų būti nustatomi tiek pagal vidutinį savitąjį augimo greitį (ErCx), tiek pagal išeigą (EyCx), nustatytus pagal gniužulų skaičių ir vieną papildomą matuojamą kintamąjį (bendrą gniužulų plotą, sausos medžiagos masę arba šviežios medžiagos masę. Tai daroma dėl tos priežasties, kad kai kurios bandomosios cheminės medžiagos nevienodai veikia gniužulų skaičių ir kitus matuojamus kintamuosius. Todėl reikiami toksiškumo parametrai yra pagal kiekvieną slopinimo lygį x apskaičiuojamos keturios ECx vertės: ErCx (gniužulų skaičius), ErCx (bendras gniužulų plotas, sausos medžiagos masė arba šviežios medžiagos masė), EyCx (gniužulų skaičius) ir EyCx (bendras gniužulų plotas, sausos medžiagos masė arba šviežios medžiagos masė).

Statistinės procedūros

60.

Tikslas yra nustatyti kiekybinį koncentracijos ir atsako santykį atliekant regresinę analizę. Galima taikyti svertinę tiesinę regresiją atlikus atsako duomenų tiesinamąjį transformavimą, pvz., į probito, logito arba Weibull vienetus (13), tačiau geriau atlikti procedūras netiesinės regresijos metodais, per kurias geriau apdorojami neišvengiami duomenų neatitikimai ir nukrypimai nuo glodžiųjų skirstinių. Artėjant prie nulinio arba visiško augimo slopinimo, tokie neatitikimai dėl transformavimo gali padidėti ir trukdyti analizei (13). Pažymėtina, kad standartiniai analizės metodai taikant probito, logito arba Weibull transformuotus dydžius yra skirti dvireikšmiams (pvz., mirtingumo arba išgyvenimo) kintamiesiems, todėl norint juos naudoti augimo greičio ar išeigos duomenims, būtina juos atitinkamai pritaikyti. Konkrečios ECx verčių nustatymo iš tolydžiųjų duomenų procedūros aprašytos literatūroje (14), (15), (16).

61.

Analizuodami kiekvieną atsako kintamąjį, remdamiesi koncentracijos ir atsako santykiu, apskaičiuokite ECx verčių taškinius įverčius. Kai įmanoma, reikėtų nustatyti kiekvieno įverčio 95 % pasikliovimo ribas. Reikėtų pagal grafiką arba statistiškai įvertinti atsako duomenų atitiktį regresijos modeliui. Regresinė analizė turėtų būti atliekama naudojant atskirų kartotinių bandinių atsakus, o ne visos bandomosios grupės vidutines vertes.

62.

Be to, jeigu esami regresijos modeliai ir (arba) metodai netinka turimiems duomenims, EC50 įverčius ir pasikliovimo ribas taip pat galima gauti atliekant tiesinę interpoliaciją su saviranka (angl. bootstrapping) (17).

63.

Siekiant įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, būtina palyginti bandomosios grupės vidutines vertes taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodus. Taip gautą kiekvienos koncentracijos grupės vidurkį reikia palyginti su kontrolinės grupės vidurkiu taikant tinkamą kartotinių palyginimų arba trendo kriterijaus metodą. Gali būti naudinga taikyti Dunnett arba Williams kriterijų (18), (19), (20), (21). Būtina įvertinti, ar tinka ANOVA dispersijos vienalytiškumo prielaida. Šį vertinimą galima atlikti naudojant grafiką arba taikant formalųjį kriterijų (22). Tinka taikyti Levene arba Bartlett kriterijus. Jeigu netinka dispersijų vienalytiškumo prielaida, kartais galima tai pataisyti logaritmine duomenų transformacija. Jei dispersija yra itin nevienalytė ir to neįmanoma pataisyti transformuojant duomenis, reikėtų apsvarstyti galimybę atlikti analizę kitais metodais, pvz., taikant žingsnio žemyn Jonkheere trendo kriterijus. Papildomų gairių, kaip nustatyti NOEC, pateikta literatūroje (16).

64.

Atsižvelgiant į naujus mokslo pasiekimus, rekomenduojama atsisakyti NOEC sąvokos ir vietoj jos naudoti regresija pagrįstus ECx taškinius įverčius. Pagal šį Lemna bandymo metodą tinkama x vertė nenustatyta, tačiau atrodo, kad tinka į 10–20 % intervalą patenkanti vertė (kuri priklauso nuo pasirinkto atsako kintamojo). Ataskaitoje geriausia nurodyti abi (EC10 ir EC20) vertes.

Ataskaitos rengimas

65.

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta toliau nurodyta informacija.

 

Bandomoji cheminė medžiaga

Medžiagos fizikinė prigimtis ir atitinkamos fizikinės ir cheminės savybės, įskaitant tirpumo vandenyje ribą.

Cheminės medžiagos atpažinties duomenys (pvz., CAS numeris), įskaitant grynumą (priemaišas).

 

Bandomosios rūšys

Mokslinis pavadinimas, klonas (jei žinomas) ir šaltinis.

 

Bandymo sąlygos

Pasirinkta bandymo procedūra (stacionarusis, pusiau stacionarusis ar pratekamojo srauto bandymas).

Bandymo pradžios data ir trukmė.

Bandymo terpė.

Bandymo plano aprašymas: naudoti bandymo indai ir dangčiai, tirpalų tūris, bandymo pradžioje kiekviename bandymo inde buvusių kolonijų ir gniužulų skaičius.

Bandymui pasirinktos koncentracijos vertės (vardinės ir, kai tinka, išmatuotos) ir kiekvienos koncentracijos kartotinių bandinių skaičius.

Pradinių ir bandymo tirpalų ruošimo metodai, įskaitant bet kokių tirpiklių ar dispergentų naudojimą.

Bandymo temperatūra.

Apšvietimo šaltinis, šviesos stipris ir vienalytiškumas.

Bandymo ir kontrolinės grupės terpių pH vertės.

Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės, analizės metodas ir atitinkami kokybės vertinimo duomenys (tinkamumo patvirtinimo tyrimai, analizės rezultatų standartiniai nuokrypiai arba pasikliovimo ribos).

Gniužulų skaičiaus ir kitų matuojamų kintamųjų, pvz., sausos medžiagos masės, šviežios medžiagos masės arba gniužulų ploto, nustatymo metodai.

Bet kokie nukrypimai nuo šio bandymo metodo.

 

Rezultatai

Neapdoroti duomenys: gniužulų skaičius ir kiti kiekviename bandymo bei kontroliniame inde matuoti kintamieji per kiekvieną stebėjimą ir atliktą analizę.

Kiekvieno matuojamo kintamojo vidurkis ir standartinis nuokrypis.

Kiekvieną bandomosios medžiagos koncentraciją atitinkančios augimo kreivės (matuojamą kintamąjį patartina logaritmuoti, žr. 55 skirsnį).

Kontrolinės grupės dvigubėjimo trukmė (augimo greitis) pagal gniužulų skaičių.

Apskaičiuoti kiekvieno bandomosios grupės kartotinio bandinio atsako kintamieji, jų vidutinės vertės ir kartotinių bandinių variacijos koeficientas.

Koncentracijos ir poveikio santykio grafikas.

Toksiškumo vertinamųjų baigčių įverčiai pagal atsako kintamuosius, pvz., EC50, EC10, EC20, ir atitinkami pasikliautinieji intervalai. LOEC ir (arba) NOEC vertės (jeigu apskaičiuotos) ir statistiniai metodai, pagal kuriuos jos nustatytos.

Jei taikytas ANOVA metodas – mažiausio aptinkamo poveikio dydis (pvz., mažiausias reikšminis skirtumas).

Bet koks bandomosiose grupėse nustatytas augimo skatinimas.

Visi pastebėti fitotoksiškumo požymiai ir bandymo tirpalų stebėjimų duomenys.

Rezultatų aptarimas, be kita ko, paaiškinant bet kokių nukrypimų nuo šio bandymo metodo įtaką bandymo rezultatams.

NUORODOS

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96-156. 8pp.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

(4)

SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 pp.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(9)

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

(13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

(16)

OECD. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1 priedėlis

Sąvokų apibrėžtys

Toliau pateiktos taikant šį bandymo metodą vartojamų sąvokų apibrėžtys ir santrumpos.

 

Biomasė – gyvų organizmų populiacijoje esančios sausosios medžiagos masė. Per šį bandymą vietoj biomasės paprastai matuojami pakaitiniai parametrai, kaip antai gniužulų skaičius arba gniužulų plotas, taigi biomasės sąvoka apima ir šiuos pakaitinius matavimo vienetus.

 

Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.

 

Chlorozė – augalo gniužulo audinio pageltimas.

 

Klonas – organizmas arba ląstelė, gauta iš vieno individo nelytinio dauginimosi būdu, todėl to iš paties klono išsivystę individai yra genetiškai tapatūs.

 

Kolonija – sujungtų motininių ir dukterinių gniužulų (paprastai 2–4) sankaupa, kartais vadinama augalu.

 

ECx – bandymo terpėje ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant Lemna augimas per nustatytą bandomosios medžiagos veikimo laikotarpį (kuris, jeigu skiriasi nuo visos arba įprastos bandymo trukmės, turi būti tiksliai nurodytas) sumažėja x % (pvz., 50 %). Pagal augimo greitį arba išeigą nustatytai EC vertei vienareikšmiškai žymėti vartojami simboliai „ErC“ (augimo greičio) ir „EyC“ (išeigos), kartu nurodant naudotą matuojamą kintamąjį, pvz., ErC (gniužulų skaičius).

 

Pratekamojo srauto bandymas – bandymas, kurį atliekant bandymo tirpalai nuolat keičiami.

 

Gniužulas – atskira (pavienė) plūdenos augalo „lapo formos“ struktūra. Tai mažiausiais gebantis daugintis vienetas, t. y. individas.

 

Gumbuotumas reiškia gumbuotų arba išsipūtusių gniužulų išvaizdą.

 

Augimas – matuojamo kintamojo, pvz., gniužulų skaičiaus, sausos medžiagos masės, šviežios medžiagos masės arba gniužulų ploto, didėjimas bandymo laikotarpiu.

 

Augimo greitis (vidutinis savitasis augimo greitis) – logaritminis biomasės didėjimas bandomosios medžiagos veikimo laikotarpiu.

 

Mažiausia pastebėto poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandymui pasirinkta koncentracija, kuriai esant pastebimas statistiškai reikšmingas cheminės medžiagos slopinamasis poveikis bandomųjų organizmų augimui (kai p < 0,05), palyginti su kontroliniais bandiniais, per nustatytą tos medžiagos veikimo laikotarpį; tačiau visų LOEC viršijančių bandymo koncentracijos verčių kenksmingas poveikis turi būti lygus LOEC poveikiui arba didesnis. Kai šios dvi sąlygos netenkinamos, būtina išsamiai paaiškinti, kaip pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė.

 

Matuojami kintamieji – visų rūšių kintamieji, matuojami bandymo vertinamajai baigčiai išreikšti naudojant vieną arba daugiau skirtingų atsako kintamųjų. Pagal šį metodą matuojami kintamieji yra gniužulų skaičius, gniužulų plotas, šviežios medžiagos masė ir sausos medžiagos masė.

 

Monokultūra – vienos rūšies augalų kultūra.

 

Nekrozė – žuvęs (t. y. pabalęs arba vandens prisisunkęs) gniužulo audinys.

 

Nepastebėto poveikio koncentracija (NOEC) – bandymui pasirinkta koncentracija, kuri yra tik truputį mažesnė negu LOEC koncentracija.

 

Fenotipas – pastebimos organizmo savybės, kurias lemia jo genų sąveika su aplinka.

 

Atsako kintamieji – toksiškumui vertinti naudojami kintamieji, gauti pagal bet kurį iš matuojamų kintamųjų, kuriais apibūdinama biomasė taikant skirtingus apskaičiavimo metodus. Pagal šį bandymo metodą iš matuojamų kintamųjų gaunami atsako kintamieji yra gniužulų skaičius, gniužulų plotas, šviežios medžiagos masė arba sausos medžiagos masė.

 

Pusiau stacionarusis (atnaujinamasis) bandymas – bandymas, kurį atliekant bandymo tirpalas kas kiek laiko reguliariai keičiamas.

 

Stacionarusis bandymas – bandymo metodas, pagal kurį bandymo tirpalas per bandymą neatnaujinamas.

 

Bandomoji cheminė medžiaga – naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.

 

Bandymo vertinamąja baigtimi vadinamas bendrasis parametras, kurio pokytį siekiama nustatyti per bandymą veikiant bandomajai cheminei medžiagai, palyginti su kontroline grupe. Bandymo vertinamoji baigtis pagal šį bandymo metodą yra bandomųjų augalų augimo slopinimas, kurį galima išreikšti įvairiais atsako kintamaisiais, nustatytais pagal vieną arba daugiau matuojamųjų kintamųjų.

 

Bandymo terpė – visiškai paruošta sintetinė auginimo terpė, kurioje per bandymą auginami bandomosios cheminės medžiagos veikiami augalai. Bandomoji cheminė medžiaga paprastai ištirpinama bandymo terpėje.

 

Išeiga – matuojamo kintamojo verčių bandomosios medžiagos veikimo laikotarpio pabaigoje ir pradžioje skirtumas, kuriuo išreiškiamas biomasės pokytis.

2 priedėlis

Lemna spp. apibūdinimas

Lemna spp., vandens augalas, įprastai vadinamas plūdena, priklauso Lemnaceae šeimai, kurioje yra kelios visame pasaulyje paplitusios rūšys, priskiriamos keturioms gentims. Skirtinga jų išvaizda ir sistematika išsamiai aprašytos literatūroje (1), (2). Rūšys Lemna gibba ir L. minor yra būdingos vidutinio klimato zonoms ir dažnai naudojamos toksiškumo bandymams. Abiejų rūšių augalai turi plūduriuojantį arba panirusį disko formos kamieną (gniužulą) ir iš kiekvieno gniužulo apatinės dalies vidurio auga labai plona šaknis. Lemna spp. žydi retai, augalai dauginasi vegetatyviniu būdu sudarydami naujus gniužulus (3). Jaunesni augalai yra šviesesni nei seni augalai, turi trumpesnes šaknis ir susideda iš dviejų arba trijų skirtingo dydžio gniužulų. Smulkūs, nesudėtingos sandaros, nelytiniu būdu besidauginantys ir trumpos generacijos Lemna augalai labai tinka laboratoriniams bandymams (4), (5).

Kadangi įvairių rūšių jautris gali skirtis, lyginti galima tik vienos rūšies augalų jautrį.

Toliau pateikti bandymams naudojamų Lemna rūšių pavyzdžiai (rūšys ir nuorodos):

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96-156. (p. 8).

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. (p. 10).

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. (p. 15; švedų k.).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). (p. 733–742).

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96-156. (p. 8).

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Lemna rūšių šaltiniai:

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Tel. +1-416-978-3641

Faks.+1-416-978-5878

El. paštas: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

United States

Tel. 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

SWEDEN

Tel. +46 8 674 7240

Faks. +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

Germany

El. paštas: lemna@uba.de

NUORODOS

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

3 priedėlis

Pradinės kultūros priežiūra

Pradines kultūras galima ilgesnį laiką laikyti žemesnėje (4–10 °C) temperatūroje, tokiu atveju jų nereikia rekultivuoti. Lemna auginimo terpė gali būti tokia pati, kokia naudojama bandymui, tačiau pradinėms kultūroms galima naudoti ir kitokias pakankamai mitybinių medžiagų turinčias terpes.

Tam tikras jaunų, šviesiai žalių augalų skaičius reguliariai steriliomis sąlygomis perkeliamas į naujai kultūrai skirtus indus su nauja terpe. Jeigu, kaip pasiūlyta, augalai laikomi vėsesnėmis sąlygomis, persėti galima rečiausiai kas tris mėnesius.

Kultūroms auginti turėtų būti naudojami chemiškai švarūs (rūgštimi išplauti) ir sterilūs stikliniai indai ir taikomi sterilaus tvarkymo metodai. Jei pradinė kultūra užkrečiama, pvz., dumbliais arba grybeliais, būtina imtis priemonių užkrato organizmams pašalinti. Jei tai dumbliai ar dauguma kitų užkrečiamųjų organizmų, galima atlikti paviršinį sterilizavimą: paimamas užkrėstos augalų medžiagos ėminys ir nupjaunamos šaknys, tada augalų medžiaga įdedama į indą su švariu vandeniu ir stipriai sukratoma, po to kurį laiką (nuo 30 sekundžių iki 5 min.) laikoma įmerkta į 0,5 % (tūrinių procentų) natrio hipochlorito tirpalą. Tada augalų medžiaga praskalaujama steriliu vandeniu, išskirstoma į kelias dalis ir įdedama į kultūrai auginti skirtus indus su šviežia auginimo terpe. Po tokio apdorojimo, ypač apdorojant ilgesnį laiką, daug gniužulų žūsta, tačiau tam tikra likusių augalų dalis paprastai nebeturi užkrato ir juos galima naudoti naujoms kultūroms sėti.

4 priedėlis

Terpės

L. minor ir L. gibba auginti rekomenduojamos skirtingos terpės. L. minor rekomenduojama naudoti modifikuotą terpę pagal Švedijos standartą (SIS), o L. gibba – 20X AAP terpę. Abiejų terpių sudėtis aprašyta toliau. Šioms terpėms ruošti turėtų būti naudojamos analiziškai grynos cheminės medžiagos ir dejonizuotas vanduo.

Lemna auginimo terpė pagal Švedijos standartą (SIS):

I–V pradiniai tirpalai sterilizuojami autoklave (120 °C, 15 min.) arba membraninio filtravimo būdu (akučių dydis turėtų būti maždaug 0,2 μm);

VI (ir, jei pasirinktas, VII) pradinis tirpalas sterilizuojamas tik membraninio filtravimo būdu; šių tirpalų autoklave apdoroti nereikėtų;

sterilūs pradiniai tirpalai turėtų būti laikomi vėsiai ir tamsoje. Nepanaudotus I–V pradinius tirpalus reikėtų pašalinti po šešių mėnesių, o VI (ir, jei pasirinktas, VII) tirpalo laikymo trukmė – vienas mėnuo.

Pradi-nio tirpalo Nr.

Cheminė medžiaga

Koncentracija pradiniame tirpale

(g/1)

Koncentracija paruoštoje terpėje

(mg/·l)

Paruošta terpė

 

 

 

 

Elemen-tas

Koncentracija

(mg/·l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

-

-

VII

MOPS (buferinis tirpalas)

490

490

-

-

Vienam SIS terpės litrui paruošti į 900 ml dejonizuoto vandens įpilama:

10 ml I pradinio tirpalo;

5 ml II pradinio tirpalo;

5 ml III pradinio tirpalo;

5 ml IV pradinio tirpalo;

1 ml V pradinio tirpalo;

5 ml VI pradinio tirpalo;

1 ml VII pradinio tirpalo (nebūtinai).

Pastaba. Papildomo VII pradinio tirpalo (MOPS buferinio tirpalo) gali reikėti atliekant kai kurių cheminių medžiagų bandymus (žr. 11 skirsnį).

Naudojant 0,1 mol/l ar 1 mol/l HCl arba NaOH, pH lygis patikslinamas iki 6,5 ± 0,1, ir atskiedžiama dejonizuotu vandeniu iki 1 litro tūrio.

20X AAP auginimo terpė

Pradiniams tirpalams ruošti naudojamas sterilus distiliuotas arba dejonizuotas vanduo.

Sterilūs pradiniai tirpalai turėtų būti laikomi vėsiai ir tamsoje. Tokiomis sąlygomis pradinius tirpalus galima laikyti bent 6–8 savaites.

20X-AAP terpei paruošiami penki pradiniai mitybinių medžiagų tirpalai (A1, A2, A3, B ir C) iš analiziškai grynų cheminių medžiagų. Ruošiant auginimo terpę, po 20 ml kiekvieno pradinio mitybinių medžiagų tirpalo įpilama į maždaug 850 ml dejonizuoto vandens. Naudojant 0,1 mol/l ar 1 mol/l HCl arba NaOH, pH lygis patikslinamas iki 7,5 ± 0,1, ir atskiedžiama dejonizuotu vandeniu iki 1 litro tūrio. Tada terpė perfiltruojama į sterilų indą per (maždaug) 0,2 μm dydžio akučių membraninį filtrą.

Bandymui skirtą auginimo terpę reikėtų paruošti prieš 1–2 paras iki naudojimo, kad nusistovėtų pH lygis. Prieš naudojant auginimo terpę, jos pH reikėtų patikrinti ir, jei reikia, patikslinti naudojant 0,1 mol/l ar 1 mol/l NaOH arba HCl, kaip aprašyta pirmiau.

Pradinio tirpalo Nr.

Cheminė medžiaga

Koncentracija pradiniame tirpale

(g/·l) (7)

Koncentracija paruoštoje terpėje

(mg/·l) (7)

Paruošta terpė

 

 

 

 

Elementas

Koncentracija

(mg/·l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2 · O

1,4

30

K; P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

Steinbergo (STEINBERG) terpė (pagal ISO 20079)

Koncentracijos ir pradiniai tirpalai

Modifikuota Steinbergo terpė pagal standartą ISO 20079 naudojama tik Lemna minor (nes pagal šį standartą ją galima naudoti tik Lemna minor), tačiau atlikti bandymai parodė, kad gerų rezultatų galima gauti ir su Lemna gibba.

Terpei ruošti turėtų būti naudojamos analiziškai grynos cheminės medžiagos ir dejonizuotas vanduo.

Mitybinė terpė ruošiama iš pradinių tirpalų arba iš 10 kartų didesnės koncentracijos terpės – tai didžiausia terpės koncentracija, kuriai esant dar nesusidaro nuosėdų.

1 lentelė.

Pastovios pH vertės STEINBERG terpė (modifikuota pagal Altenburger)

Sudedamoji dalis

Mitybinė terpė

Makroelementai

Molinė masė

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelementai

Molinė masė

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA dinatrio dihidratas

372,24

1 500,00

4,03


2 lentelė.

Pradiniai (makroelementų) tirpalai

1.

Makroelementai (50 kartų didesnės koncentracijos)

g/l

1 pradinis tirpalas:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

2 pradinis tirpalas:

MgSO4 · 7H2O

5,00

3 pradinis tirpalas:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


3 lentelė.

Pradiniai (mikroelementų) tirpalai

2.

Mikroelementai (1 000 kartų didesnės koncentracijos)

mg/l

4 pradinis tirpalas:

H3BO3

120,0

5 pradinis tirpalas:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

6 pradinis tirpalas:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

7 pradinis tirpalas:

MnCl2 · 4H2O

180,0

8 pradinis tirpalas:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA dinatrio dihidratas

1 500,00

2 ir 3 pradinius tirpalus ir, atskirai, 4–7 pradinius tirpalus galima supilti kartu (atsižvelgiant į reikiamas koncentracijas).

Kad pradinius tirpalus būtų galima laikyti ilgesnį laiką, apdorokite juos autoklave 20 min. 121 °C temperatūroje arba steriliai perfiltruokite (per 0,2 μm dydžio akučių filtrą). Ypač patartina steriliai filtruoti (per 0,2 μm akučių filtrą) 8 pradinį tirpalą.

Galutinės koncentracijos STEINBERG (modifikuotos) terpės ruošimas:

po 20 ml 1, 2 ir 3 pradinių tirpalų (žr. 2 lentelę) įpilama į maždaug 900 ml dejonizuoto vandens, kad nesusidarytų nuosėdų;

įpilama po 1,0 ml 4, 5, 6, 7 ir 8 pradinių tirpalų (žr. 3 lentelę);

pH turėtų būti 5,5 +/– 0,2 (reguliuojama įpilant minimalų NaOH tirpalo arba HCl kiekį);

atskiedžiama vandeniu iki 1 000 ml tūrio;

jei pradiniai tirpalai yra sterilizuoti ir paruošti naudojant tinkamą vandenį, papildomai sterilizuoti nebūtina. Jei sterilizuojama galutinė paruošta terpė, 8 pradinį tirpalą reikėtų įpilti po terpės apdorojimo autoklave (20 min., 121 °C temperatūroje).

10 kartų didesnės koncentracijos (modifikuotos) STEINBERG terpės, skirtos laikyti ilgesnį laiką, ruošimas:

po 20 ml 1, 2 ir 3 pradinių tirpalų (žr. 2 lentelę) įpilama į maždaug 30 ml vandens, kad nesusidarytų nuosėdų;

įpilama po 1,0 ml 4, 5, 6, 7 ir 8 pradinių tirpalų (žr. 3 lentelę). Atskiedžiama vandeniu iki 100 ml tūrio;

jei pradiniai tirpalai yra sterilizuoti ir paruošti naudojant tinkamą vandenį, papildomai sterilizuoti nebūtina. Jei sterilizuojama galutinė paruošta terpė, 8 pradinį tirpalą reikėtų įpilti po terpės apdorojimo autoklave (20 min., 121 °C temperatūroje).

Terpės (galutinės koncentracijos) pH vertė turėtų būti 5,5 ± 0,2.

(6)

Įtraukiami šie C.31–C.46 skyriai:

C.31.   BANDYMAS SU SAUSUMOS AUGALAIS. DAIGŲ PASIRODYMO IR DAIGŲ AUGIMO BANDYMAS

ĮVADAS

1.

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 208 (2006). Bandymų metodai reguliariai persvarstomi atsižvelgiant į mokslo pažangą ir į jų tinkamumą reglamentavimo reikmėms. Šis atnaujintas bandymo metodas skirtas galimam cheminių medžiagų poveikiui augalų daigų pasirodymui ir augimui vertinti. Pagal šį metodą neatsižvelgiama į lėtinį poveikį ar poveikį reprodukcijai (t. y. sėklų užmezgimui, žiedų formavimuisi, vaisių brendimui). Siekiant užtikrinti, kad būtų taikomi tinkami bandymo metodai, būtina atsižvelgti į bandomosios cheminės medžiagos poveikio sąlygas ir savybes (pvz., atliekant metalų ir metalų junginių bandymus, reikėtų atsižvelgti į pH ir susijusių priešjonių poveikį) (1). Pagal šį bandymo metodą netiriamas cheminių medžiagų garų poveikis augalams. Pagal jį atliekami bendrosios paskirties cheminių medžiagų, biocidų ir augalų apsaugos produktų (taip pat vadinamų pesticidais) bandymai. Šis metodas parengtas remiantis esamais metodais (2), (3), (4), (5), (6), (7), atsižvelgiant ir į kitus augalų bandymams svarbius šaltinius (8), (9), (10). Taikant šį metodą vartojamos sąvokos apibrėžtos 1 priedėlyje.

BANDYMO PRINCIPAS

2.

Atliekant šį bandymą vertinamas dirvožemyje (ar kitoje tinkamoje dirvožemio terpėje) esančios bandomosios cheminės medžiagos poveikis aukštesniųjų augalų daigų pasirodymui ir pradiniam augimui. Sėklos įterpiamos į bandomąja chemine medžiaga apdorotą dirvožemį ir poveikis paprastai vertinamas praėjus 14–21 dienai po 50 % kontrolinės grupės daigų pasirodymo. Vertinamoji baigtis – pasirodžiusių daigų išvaizdos vertinimas, sausos daigų medžiagos masės (arba šviežios daigų medžiagos masės) masės ir, kai kuriais atvejais, daigų aukščio nustatymas, taip pat pastebimo kenksmingo poveikio įvairioms augalo dalims vertinimas. Šių vertinimų ir stebėjimų duomenys palyginami su atitinkamais kontrolinės neapdorotos grupės augalų duomenimis.

3.

Priklausomai nuo numatomo poveikio būdo, bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į dirvožemį (arba galbūt į dirbtinio dirvožemio terpę) arba ja padengiamas dirvožemio paviršius (jei tai atitinka galimą tos cheminės medžiagos poveikio būdą). Į dirvožemį bandomoji medžiaga įterpiama bendrai apdorojant visą bandymui naudojamo dirvožemio kiekį, taip apdorotas dirvožemis paskirstomas į augalams auginti skirtus indus ir jame pasėjamos atitinkamos rūšies augalų sėklos. Kai bandomąja medžiaga reikia padengti dirvožemio paviršių, tai daroma jau pasėjus sėklas į indus su dirvožemiu. Po to bandymo vienetai (kontroliniai ir apdoroto dirvožemio bandiniai su pasėtomis sėklomis) laikomi sėklų dygimui ir augalų augimui palankiomis sąlygomis.

4.

Priklausomai nuo tyrimo tikslo, šis bandymas gali būti atliekamas siekiant nubrėžti bandomosios medžiagos dozės ir atsako kreivę arba, pasirinkus vieną koncentracijos vertę (normą), kaip ribų nustatymo bandymas. Jeigu vienos koncentracijos (normos) bandymo rezultatas viršija tam tikrą toksiškumo lygį (pvz., jeigu pastebimas didesnis negu x % poveikis), atliekamas intervalo nustatymo bandymas, siekiant nustatyti viršutinę ir žemutinę toksiškumo ribas, o tada – kelių koncentracijų (normų) bandymas siekiant nubrėžti dozės ir atsako kreivę. Siekiant nustatyti efektyviąją koncentraciją ECx arba efektyviąją naudojimo normą ERx (pvz., EC25, ER25, EC50, ER50) tiriamam didžiausio jautrio parametrui arba parametrams, atliekama tinkama statistinė analizė. Be to, atliekant šį bandymą galima apskaičiuoti nepastebėto poveikio koncentraciją (NOEC) ir mažiausią pastebėto poveikio koncentraciją (LOEC).

INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ

5.

Nustatant tikėtiną cheminės medžiagos poveikio būdą ir planuojant bandymą naudinga žinoti šią informaciją: cheminės medžiagos struktūrinę formulę, grynumą, tirpumą vandenyje, tirpumą organiniuose tirpikliuose, 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą, gerties į dirvožemį savybes, garų slėgį, cheminį stabilumą veikiant vandeniui bei šviesai ir biologinį skaidumą.

BANDYMO TINKAMUMAS

6.

Bandymas pripažįstamas tinkamu, jei kontrolinės grupės bandiniai atitinka šiuos veiksmingumo kriterijus:

daigų pasirodymas siekia bent 70 %;

daigai nėra patyrę pastebimo fitotoksinio poveikio (pvz., chlorozės, nekrozės, vytimo, lapų ir stiebų deformacijos) ir augalams yra būdingas tik tai konkrečiai rūšiai įprastas augimo ir sandaros (morfologinis) kintamumas;

per visą tyrimo trukmę išgyvena vidutiniškai bent 90 % pasirodžiusių kontrolinės grupės daigų;

konkrečios rūšies augalai laikomi vienodomis aplinkos sąlygomis ir jų auginimo terpių sudėtyje yra vienodi iš to paties šaltinio gautos dirvožemio terpės, atraminių medžiagų arba substrato kiekiai.

ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA

7.

Siekiant įsitikinti, kad laikui bėgant per daug nesikeičia bandymo eiga, konkrečių bandomųjų augalų atsakas į poveikį ir bandymo sąlygos, galima reguliariai atlikti bandymus su etalonine chemine medžiaga. Kita vertus, kai kuriose laboratorijose bandymo sistemos veikimui vertinti gali būti naudojami ankstesnių kontrolinių augalų biomasės ar augimo matavimų duomenys; tai galėtų būti ir tarplaboratorinės kokybės kontrolės priemonė.

METODO APRAŠYMAS

Natūralus dirvožemis arba dirbtinis substratas

8.

Augalai gali būti auginami induose, pripildytuose priesmėlio arba smėlingo priemolio, kurio sudėtyje turi būti iki 1,5 % organinės anglies (apie 3 % organinės medžiagos). Taip pat galima naudoti rinkoje parduodamą vazoniniams augalams skirtą dirvožemį arba sintetinį dirvožemio mišinį, kurio sudėtyje yra iki 1,5 % organinės anglies. Molingo dirvožemio naudoti nepatartina, jeigu yra žinoma, kad bandomajai cheminei medžiagai būdingas didelis junglumas su moliu. Iš lauko paimtą dirvožemį reikėtų išsijoti, kad jame liktų ne didesnės kaip 2 mm dalelės, taip jį suvienodinant ir pašalinant stambias daleles. Bandymo ataskaitoje reikėtų nurodyti galutinio paruošto dirvožemio rūšį ir struktūrą, organinės anglies kiekį ( %), pH ir druskų kiekį, nuo kurio priklauso elektroninis laidumas. Turėtų būti nurodyta dirvožemio kategorija pagal standartinę klasifikavimo schemą (11). Dirvožemį galima pasterizuoti arba iškaitinti, kad sumažėtų jame esančių patogeninių mikroorganizmų poveikis.

9.

Naudojant natūralų dirvožemį gali būti sudėtingiau aiškinti bandymo rezultatus ir jų kintamumas gali būti didesnis dėl dirvožemio fizikinių ar cheminių savybių ir mikroorganizmų populiacijų skirtumų, o šie kintamieji savo ruožtu gali pakeisti dirvožemio drėgmės imlumą, cheminių medžiagų surišimo gebą, aeraciją ir mitybinių medžiagų bei mikroelementų sudėtį. Kinta ne tik šie fiziniai parametrai, bet ir cheminės dirvožemio savybės, kaip antai pH ir oksidacijos-redukcijos potencialas, ir nuo to gali priklausyti bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinamumas (12), (13), (14).

10.

Dirbtiniai substratai paprastai nenaudojami augalų apsaugos produktų bandymams, tačiau galima juos naudoti bandant bendrosios paskirties chemines medžiagas arba siekiant kuo labiau sumažinti natūraliam dirvožemiui būdingą kintamumą ir padidinti bandymų rezultatų palyginamumą. Naudojami substratai turėtų būti sudaryti iš inertinių medžiagų, kurios kuo mažiau sąveikautų su bandomąja chemine medžiaga, jos nešikliu-tirpikliu arba abiem šiomis medžiagomis. Nustatyta, kad rūgštimi išplautas kvarcinis smėlis, mineralinė vata ir stikliniai (pvz., 0,35–0,85 mm skersmens) rutuliukai yra tinkamos inertinės medžiagos, beveik nesugeriančios bandomosios cheminės medžiagos (15), taip užtikrinant, kad kuo didesnis jos kiekis per šaknis pasiektų daigus. Vermikulitas, perlitas ar kitos medžiagos, kurioms būdinga didelė sugerties geba, yra netinkami substratai. Turėtų pakakti augalams augti reikalingų mitybinių medžiagų, kad augalai nepatirtų streso dėl mitybinių medžiagų trūkumo; kai įmanoma, šių medžiagų pakankamumą reikėtų įvertinti atliekant cheminę analizę arba apžiūrint kontrolinius augalus.

Bandomųjų rūšių atrankos kriterijai

11.

Siekiant tirti įvairius augalų atsakus į poveikį, reikėtų bandymui rinktis pakankamai įvairias rūšis, pvz., atsižvelgiant į jų taksonominę įvairovę augalų karalystėje, paplitimą, gausą, rūšiai būdingus gyvenimo ciklo ypatumus ir paplitimo gamtoje teritoriją (8), (10), (16), (17), (18), (19), (20). Renkantis iš bandymams galimų naudoti rūšių, reikėtų atsižvelgti į šiuos aspektus:

ar tos rūšies augalai subrandina vienodas sėklas, kurias lengva gauti iš patikimo standartinių sėklų šaltinio arba šaltinių ir kurios vienodai, patikimai ir tolygiai dygsta, o daigai tolygiai auga;

ar tie augalai yra tinkami laboratoriniams bandymams ir ar juos naudojant galima gauti patikimus ir atkuriamus rezultatus tiek toje pačioje bandymo vietoje, tiek įvairiose laboratorijose;

bandymui naudojamos rūšies jautris turėtų atitikti natūralioje aplinkoje augančių augalų reakcijas į atitinkamos cheminės medžiagos poveikį;

ar tos rūšys jau pirmiau kiek nors naudotos toksiškumo bandymams ir jas naudojant, pvz., herbicidų bioanalizei, sunkiųjų metalų tyrimams, druskingumo ar mineralinių medžiagų sukelto streso bandymams arba alelopatiniams tyrimams, nustatyta, kad jos yra jautrios labai įvairiems stresą sukeliantiems veiksniams;

ar joms tinka auginimo sąlygos pagal šį bandymo metodą;

ar jos atitinka bandymo tinkamumo kriterijus.

Kai kurios bandymams iki šiol daugiausia naudotos rūšys išvardytos 2 priedėlyje, o galimos naudoti nekultūrinių augalų rūšys – 3 priedėlyje.

12.

Kiek augalų rūšių reikia naudoti per bandymą, priklauso nuo galiojančių norminių reikalavimų, todėl šio bandymo metodo aprašyme tai nenurodyta.

Bandomosios cheminės medžiagos naudojimas

13.

Cheminę medžiagą reikėtų naudoti įterptą į tinkamą nešiklį (pvz., vandenį, acetoną, etanolį, polietilenglikolį, gumiarabiką, smėlį). Galima atlikti ir mišinių (apibrėžtos sudėties produktų arba preparatų), susidedančių iš veikliųjų medžiagų ir įvairių priedų, bandymus.

Įterpimas į dirvožemį arba dirbtinį substratą

14.

Vandenyje tirpias arba vandenyje suspenduojamas chemines medžiagas galima įmaišyti į vandenį ir gautą tirpalą sumaišyti su dirvožemiu naudojant tinkamą maišytuvą. Bandymą šiuo būdu gali būti tinkama atlikti tada, kai cheminės medžiagos poveikis patiriamas per dirvožemį arba dirvožemio porų vandenį ir reikia tirti jos įsisavinimą per augalų šaknis. Dedant bandomąją cheminę medžiagą į dirvožemį, neturėtų būti viršytas jo drėgmės imlumas. Į kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos indą įpilamo vandens tūris turėtų būti vienodas, tačiau vandens kiekį reikėtų riboti, kad dirvožemis nesukibtų į gumulėlius.

15.

Vandenyje mažai tirpias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti tinkamame lakiame tirpiklyje (pvz., acetone, etanolyje) ir sumaišyti su smėliu, tada tirpiklį iš smėlio galima pašalinti leidžiant oro srautą ir smėlį nepaliaujamai maišant. Taip apdorotas smėlis sumaišomas su bandymui naudojamu dirvožemiu. Paruošiamas antras kontrolinis bandinys, į kurį dedama tik smėlio ir tirpiklio. Į visų koncentracijų bandinius ir antrąjį kontrolinį bandinį dedama po vienodą smėlio, į kurį įmaišyta tirpiklio (kuris vėliau pašalintas), kiekį. Atliekant kietų, netirpių cheminių medžiagų bandymus, cheminė medžiaga sumaišoma su sausu dirvožemiu naudojant tinkamą maišytuvą, tada dirvožemis sudedamas į augalams auginti skirtus indus, į kuriuos iškart pasėjamos sėklos.

16.

Kai vietoj dirvožemio naudojamas dirbtinis substratas, vandenyje tirpias chemines medžiagas galima ištirpinti mitybinių medžiagų tirpale prieš pat pradedant bandymą. Vandenyje netirpias chemines medžiagas, kurias galima suspenduoti vandenyje naudojant tirpiklį-nešiklį, reikėtų kartu su nešikliu įmaišyti į mitybinių medžiagų tirpalą. Vandenyje netirpias chemines medžiagas, kurioms tinkamų netoksiškų vandenyje tirpių nešiklių nėra, reikėtų ištirpinti tinkamame lakiajame tirpiklyje. Gautas tirpalas sumaišomas su smėliu arba stikliniais rutuliukais, mišinys įdedamas į būgninį vakuuminį aparatą ir išgarinamas. Lieka chemine medžiaga tolygiai padengtos smėlio dalelės arba stikliniai rutuliukai. Tam tikrą pasvertą rutuliukų dalį reikėtų paveikti tuo pačiu organiniu tirpikliu, ekstrahuojant bandomąją cheminę medžiagą ir ją išanalizuojant; tai reikėtų padaryti prieš pripildant indus, kuriuose bus auginami augalai.

Dirvožemio paviršiaus apdorojimas bandomąja medžiaga

17.

Atliekant augalų apsaugos produktų bandymus, bandomoji cheminė medžiaga dažnai naudojama apipurškiant bandomuoju tirpalu dirvožemio paviršių. Visa bandymams naudojama įranga, įskaitant bandomosios cheminės medžiagos ruošimo ir dozavimo įrangą, turėtų būti tokio modelio ir gebos, kad, naudojant tą įrangą, bandymus būtų galima atlikti tiksliai ir prireikus pakartoti. Bandomąja medžiaga turėtų būti vienodai padengiamas visų bandinių dirvožemio paviršius. Reikėtų stengtis apsisaugoti nuo galimos cheminės medžiagos įgerties į naudojamą įrangą ar reakcijų su šia įranga (pvz., plastikiniais vamzdeliais ir lipofilinėmis medžiagomis arba plieninėmis dalimis ir elementais). Bandomoji cheminė medžiaga užpurškiama ant dirvožemio paviršiaus imituojant įprastą purškimą žemės ūkyje naudojamais purkštuvais. Paprastai užpurškiamas toks medžiagos kiekis, koks naudojamas pagal įprastą žemės ūkio praktiką; atitinkami (vandens ir kt.) kiekiai turėtų būti nurodyti ataskaitoje. Reikėtų rinktis tokį purkštuvo antgalį, kad būtų tolygiai padengiamas visas dirvožemio paviršius. Jeigu naudojami tirpikliai ir nešikliai, reikėtų paruošti antrą kontrolinių augalų, į kurių indus bus dedama tik tirpiklio arba nešiklio, grupę. To daryti nereikia, kai augalų apsaugos produktai bandomi kaip preparatai.

Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (normos) patikrinimas

18.

Bandymui pasirinktas cheminės medžiagos koncentracijas (naudojimo normas) būtina patikrinti atliekant tinkamą patvirtinamąją analizę. Visas tirpių cheminių medžiagų bandymo koncentracijas (normas) galima patvirtinti išanalizuojant bandymui naudojamą didžiausios koncentracijos bandomąjį tirpalą, jo vėlesnį skiedimą aprašant bandymo dokumentuose ir naudojant tinkamą kalibruotą įrangą (pvz., kalibruotus analizei skirtus stiklinius indus, kalibruotą purškimo įrangą). Atliekant netirpių cheminių medžiagų bandymus, gautą sudėtinę medžiagą būtina patikrinti pagal bandomosios cheminės medžiagos, dedamos į dirvožemį, masę. Jei būtina įrodyti dirvožemio vienalytiškumą, gali reikėti jį išanalizuoti.

PROCEDŪRA

Bandymo planas

19.

Į indus pasėjamos tos pačios rūšies augalų sėklos. Į vieną indą sėjamų sėklų kiekis priklauso nuo augalų rūšies, indo dydžio ir bandymo trukmės. Viename inde turėtų būti tiek augalų, kad jie per visą bandymo trukmę galėtų augti tinkamomis sąlygomis ir jiems nebūtų per ankšta. Augalai turėtų būti sėjami ne tankiau kaip maždaug 3–10 sėklų 100 cm2 plote (priklausomai nuo sėklų dydžio). Pavyzdžiui, 15 cm skersmens inde patartina auginti 1–2 kukurūzų, sojų, pomidorų, agurkų ar cukrinių runkelių daigus, tris rapsų ar žirnių daigus arba 5–10 svogūnų, kviečių ar kitų smulkiasėklių augalų daigų. Sėklų ir kartotinių indų (kartotiniais bandiniais laikomi indai, todėl atskiri tame pačiame inde augantys augalai nėra kartotiniai bandiniai) skaičius turėtų būti tinkamas statistinei analizei efektyviai atlikti (21). Pažymėtina, kad rezultatų kintamumas yra didesnis tada, kai į vieną (kartotinį) indą pasėjama mažiau, tačiau didesnių bandomosios rūšies augalų sėklų, negu tada, kai į indą galima pasėti daugiau smulkių sėklų. Šį kintamumą galima sumažinti į kiekvieną indą sėjant po vienodą augalų skaičių.

20.

Siekiant užtikrinti, kad per bandymą būtų stebimas tik bandomosios cheminės medžiagos sukeltas ar su ja susijęs poveikis, naudojamos kontrolinės grupės. Tinkama kontrolinė grupė turėtų būti visais atžvilgiais tapati bandomajai grupei, išskyrus tai, kad ji nepatiria bandomosios cheminės medžiagos poveikio. Visi per vieną bandymą naudojami augalai, įskaitant kontrolinius augalus, turėtų būti gauti iš to paties šaltinio. Kad būtų išvengta vertinimo klaidų, būtina atsitiktine tvarka paskirstyti bandymo ir kontrolinius indus.

21.

Reikėtų stengtis nenaudoti insekticidais ar fungicidais padengtų (t. y. beicuotų) sėklų, tačiau kai kurios reguliavimo institucijos leidžia naudoti tam tikrus nesisteminius kontaktinius fungicidus (pvz., kaptaną, tiramą) (22). Jeigu esama susirūpinimo dėl per sėklas platinamų patogeninių organizmų, galima trumpai pamirkyti sėklas silpname 5 % hipochlorito tirpale, tada kruopščiai perplauti tekančiu vandeniu ir išdžiovinti. Sėklų negalima papildomai apdoroti kitu augalų apsaugos produktu.

Bandymo sąlygos

22.

Bandymo sąlygos turėtų būti artimos normaliam bandomųjų rūšių ir veislių augalų augimui reikalingoms sąlygoms (tinkamų bandymo sąlygų pavyzdžių pateikta 4 priedėlyje). Sudygę augalai turėtų būti pagal gerąją daržininkystės praktiką prižiūrimi reguliuojamo klimato kamerose, fitotronuose arba šiltnamiuose. Naudojant specialias augalams auginti skirtas patalpas, jose paprastai turėtų būti kontroliuojama ir pakankamai dažnai (pvz., kartą per dieną) užrašoma temperatūra, drėgnis, anglies dioksido koncentracija, šviesos (stiprio, bangų ilgio, fotosintezei tinkamos apšvietos) ir apšvietimo trukmės duomenys, laistymo būdas ir t. t., siekiant užtikrinti, kad augalai gerai augtų, palyginti su kontroliniais tos rūšies augalais. Temperatūra šiltnamyje turėtų būti reguliuojama vėdinimo, šildymo ir (arba) vėsinimo sistemomis. Apskritai bandymus šiltnamyje rekomenduojama atlikti tokiomis sąlygomis:

22 ± 10 °C temperatūra;

70 ± 25 % drėgnis;

apšvietimo trukmė – ne mažiau kaip 16 šviesos valandų per parą;

350 ± 50 μ E/m2/s šviesos stipris. Jeigu šviesos stipris yra mažesnis nei 200 μE/m2/s, o bangų ilgis nesiekia 400–700 nm intervalo, gali reikėti papildomo apšvietimo, išskyrus tuos atvejus, kai naudojamoms rūšims reikia mažiau šviesos.

Aplinkos sąlygos turėtų būti stebimos ir užrašomos per visą tyrimo trukmę. Augalai turėtų būti auginami neakytuose plastikiniuose ar glazūruotuose induose, po kuriais padėti padėklai arba lėkštelės. Indus galima reguliariai perstatyti siekiant, kad augalai augtų vienodai (taip sumažinant kintamumą dėl auginimo patalpose esamų nevienodų bandymo sąlygų). Indai turi būti pakankamai dideli, kad augalai juose galėtų normaliai augti.

23.

Dirvožemio mitybines medžiagas galima papildyti, kai to reikia augalų gyvybingumui palaikyti. Ar reikia papildomų mitybinių medžiagų, ir kada jų dėti, galima sužinoti stebint kontrolinius augalus. Bandymo indus patartina drėkinti iš apačios (pvz., naudojant stiklo pluošto vamzdelius), tačiau iš pradžių galima laistyti iš viršaus, nes taip skatinamas sėklų dygimas ir, jeigu bandomąja medžiaga padengtas dirvožemio paviršius, palengvinama jos skverbtis į dirvožemį.

24.

Konkrečios auginimo sąlygos turėtų būti tinkamos bandomajai augalų rūšiai ir tiriamai cheminei medžiagai. Kontrolinių ir bandomųjų grupių augalai turi būti laikomi vienodomis aplinkos sąlygomis, tačiau reikėtų imtis tinkamų priemonių, kad (pvz., lakiosios) bandomosios cheminės medžiagos neprasiskverbtų iš vienos bandomosios grupės į kitą ir nepaveiktų kontrolinės grupės augalų.

Vienos koncentracijos (normos) bandymas

25.