PRIEDAS

TURINYS

1.	TANKIS IR SAVITASIS TANKIS ESANT 20 °C TEMPERATŪRAI (OIV - AS2 - 01- MASVOL) – I tipo metodas

2	CUKRAUS KONCENTRACIJOS VYNUOGIŲ MISOJE, KONCENTRUOTOJE VYNUOGIŲ MISOJE IR REKTIFIKUOTOJE KONCENTRUOTOJE VYNUOGIŲ MISOJE NUSTATYMAS REFRAKTOMETRINIU METODU (OIV - AS2 - 02- SUCREF) – I tipo metodas

3.	SUMINIS SAUSOJO EKSTRAKTO KIEKIS (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Suminis sausųjų medžiagų kiekis – I tipo metodas

4.	VANDENS KIEKIO VYNE IZOTOPINIO SANTYKIO 18O/16O NUSTATYMAS (OIV-AS-2-09-MOUO18) – II tipo metodas

5	41.FOLIN-CIOCALTEU RODIKLIS (OIV-AS-2-10-INDFOL) – IV tipo metodas

6	GLIUKOZĖ IR FRUKTOZĖ (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – II tipo metodas

7	CUKRŲ DOZAVIMAS PAGAL HPLC (SACHAROZĖ) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – II tipo metodas

8	VYNUOGIŲ MISŲ, KONCENTRUOTŲ VYNUOGIŲ MISŲ, REKTIFIKUOTŲ KONCENTRUOTŲ VYNUOGIŲ MISŲ IR VYNŲ SODRINIMO NUSTATYMAS TAIKANT DEUTERIO MAGNETINIO BRANDUOLIŲ REZONANSO METODĄ (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – I tipo metodas

9	ALKOHOLIO STIPRUMAS PAGAL TŪRĮ (OIV-AS-312-01-TALVOL) – I tipo metodas

10	IZOTOPŲ 13C/12C KIEKIO VYNO ETANOLYJE IR ETANOLYJE, GAUTŲ FERMENTUOJANT MISĄ, KONCENTRUOTĄ MISĄ ARBA REKTIFIKUOTĄ KONCENTRUOTĄ MISĄ, NUSTATYMAS IZOZTOPŲ MASĖS SPEKTROMETRIJOS BŪDU (OIV-AS-312-06-ETHANO) – II tipo metodas

11	SUMINIS RŪGŠTINGUMAS (OIV - AS-313-01-ACITOT) – I tipo metodas

12	LAKIOSIOS RŪGŠTYS (OIV - AS-313-02-ACIVOL) – I tipo metodas

13	CITRINŲ RŪGŠTIS (OIV -AS-313-09-ACIENZ) – II tipo metodas

14	SORBO RŪGŠTIS (OIV - AS-313-14-ACISOR) – IV tipo metodas

15	pH (OIV - AS-313-15-PH) – I tipo metodas

16	L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties vienalaikis kiekio nustatymas pagal HPLC ir naudojant UV detektorių (OIV-AS-313-22-ACASCO) – II tipo metodas

17	Anglies dvideginis (OIV - AS-314-01-DIOCAR) – II tipo metodas

18	ANGLIES DIOKSIDO NUSTATYMAS VYNE, NAUDOJANT MANOMETRINĮ METODĄ (OIV – AS314-04-CO2MAN) – II tipo metodas

19	PUSIAU PUTOJANČIŲ IR PUTOJANČIŲ VYNŲ SPAUDIMO PERTEKLINIO SLĖGIO MATAVIMAS (OIV - AS-314-02-SURPRES) – I tipo metodas

20	LIZOCIMO NUSATYMAS VYNE, NAUDOJANT HPLC (OIV-AS-315-14) – IV TIPO METODAS

21	SULFATAI (OIV- AS-321-05-SULFAT) – II tipo metodas

22	GELEŽIS (OIV - AS-322-05-FER) – IV tipo metodas

23	VARIS (OIV – AS 322-06) – IV tipo metodas

24	SIEROS DIOKSIDAS (OIV - AS-323-04-DIOSU) – II tipo metodas

1   TANKIS IR SAVITASIS TANKIS ESANT 20 °C TEMPERATŪRAI (OIV-AS2-01-MASVOL) – I TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽIMAI

Tankis yra vyno ar misos tūrio vieneto masė esant 20 °C temperatūrai. Jis yra reiškiamas gramais mililitre ir žymimas simboliu ρ20 °C.

Savitasis tankis, esant 20 °C temperatūrai (arba 20 °C/20 °C santykinis tankis), yra tam tikro vyno ar misos tūrio masės ir to paties tūrio vandens masės esant 20 °C temperatūrai santykis, išreiškiamas dešimtainiu skaičiumi. Jis žymimas simboliu

2.   METODŲ ESMĖ

Bandinio tankis ir savitasis tankis, esant 20 °C temperatūrai, yra matuojami:

arba piknometru : etaloninis metodas,

arba densimetru, naudojant hidrostatines svarstykles arba elektroniniu densimetru.

Pastaba:

Norint gauti labai tikslius tankio matavimus, pataisa dėl sieros dioksido kiekio turi būti daroma pagal formulę:

ρ20 °C	=	ρ′20 °C – 0,0006 × S
ρ20 °C	=	pataisytasis tankis
ρ′20 °C	=	išmatuotasis tankis
S	=	suminis sieros dioksido kiekis (g/l).

3.   PIRMINIS BANDINIO APDOROJIMAS

Jei vyne ar misoje yra nemažas anglies dioksido kiekis, tai didesnę jo dalį pašalinkite maišydami 250 ml vyno 1 litro kolboje arba filtruodami esant sumažintam slėgiui per 2 g medvilninę vatą, kuri dedama į ilginamąjį vamzdį.

4.   ETALONINIS METODAS

4.1.   Aparatūra

Įprasta laboratorinė įranga:

4.1.1.   Apie 100 ml tūrio pirekso stiklo piknometras (1) su nuimamu termometru, turinčiu šlifo movą ir sugraduotu dešimtosiomis laipsnio dalimis nuo 10 °C iki 30 °C. Termometras turi būti etalonuotas(1 pav.).

Piknometras turi 25 mm ilgio ir 1 mm (ne daugiau) vidinio skersmens šoninį vamzdelį, kuris baigiasi kūgine šlifo mova. Ant šio šoninio vamzdelio gali būti uždėtas vadinamasis „indo kamštis“, kurį sudaro jungiamasis vamzdelis su šlifo įmova, užsibaigiantis išplatėjusia dalimi. Šis kamštis naudojamas kaip plėtimosi kamera.

Abi prietaiso šlifo jungtys turi būti daromos labai kruopščiai.

4.1.2.   Taros butelis, kurį sudaro to paties išorinio tūrio (bent 1 ml tikslumu) indas kaip ir piknometras bei kurio masė yra lygi piknometro masei, pripildytas 1,0 l savitojo tankio skysčiu (2,0 % m/V natrio chlorido tirpalas).

Termiškai izoliuotas konteineris, tiksliai atitinkantis piknometro matmenis.

4.1.3.   Dviejų lėkščių svarstyklės, kurių skalė yra ne mažesnė kaip 300 g, o jautris 0,1 mg,

arba

vienos lėkštės svarstyklės, kurių skalė yra ne mažesnė kaip 200 g, o jautris 0,1 mg.

4.2.   Piknometro kalibravimas

Kalibruojant piknometrą, nustatomi tokie dydžiai:

—	tuščio piknometro masė,

—	piknometro tūris, esant 20 °C temperatūrai,

—	vandens pripildyto piknometro masė, esant 20 °C temperatūrai.

4.2.1.   Metodas, kai naudojamos dviejų lėkščių svarstyklės

Ant kairės svarstyklių lėkštės padėkite taros indą, o ant dešinės lėkštės – švarų ir sausą piknometrą su įdėtu „indo kamščiu“. Dėkite svarsčius ant lėkštės su piknometru ir užrašykite masės rodmenį, kai svarstyklių lėkštės išsilygina: tai bus p rodmuo gramais.

Į piknometrą atsargiai įpilkite kambario temperatūros distiliuoto vandens ir įdėkite termometrą. Kruopščiai nusausinkite piknometrą ir įstatykite jį į termiškai izoliuotą konteinerį. Maišykite jo turinį, vartydami konteinerį tol, kol temperatūros rodmuo bus pastovus. Kruopščiai nustatykite lygį pagal šoninio vamzdelio viršutinį kraštą. Sausai nušluostykite šoninį vamzdelį ir užkimškite jį indo kamščiu. Užrašykite tikslų temperatūros t °C rodmenį, galbūt padarydami pataisą dėl skalės netikslumo. Pasverkite pripildytą piknometrą, dedami svarsčius tol, kol svarstyklės išsilygins, ir užrašykite masės p′rodmenį gramais.

Skaičiavimai

Tuščio piknometro masės nustatymas: tuščio piknometro masė= p + m, m= piknometre esančio oro masė, m= 0,0012 (p – p′).

Tūris, esant 20 °C temperatūrai: V20 °C= (p + m – p′) × Ft Ft= faktorius, paimtas iš I lentelės, esant temperatūrai t °C. V20 °C turi būti gautas ± 0, 001 ml tikslumu.

Vandens masė, esant 20 °C temperatūrai: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= yra vandens tankis, esant 20 °C temperatūrai.

4.2.2.   Metodas, kai naudojamos vienos lėkštės svarstyklės

Nustatoma:

—	švaraus sauso piknometro masė (P)

—	t °C temperatūros vandeniu pripildyto piknometro masę: pagal 4.2.1 skirsnyje aprašytą metodiką ji bus P1,

—	taros masę – T0.

Skaičiavimai

Tuščio piknometro masės nustatymas:

tuščio piknometro masė= P – m, P - m m= piknometre esančio oro masė, m= 0,0012 (P1 – P);

Tūris, esant 20 °C temperatūrai: V20 °C= [P1 – (P – m)] · Ft Ft= rodiklis, paimtas iš I lentelės, esant temperatūrai t °C.

Tūris, esant 20 °C temperatūrai, turi būti gautas ± 0, 001 ml tikslumu.

Vandens masė, esant 20 °C temperatūrai: M20 °C= V20 °C · 0,998203 0,998203= yra vandens tankis, esant 20 °C temperatūrai.

4.3.   Nustatymo metodas

4.3.1.   Metodas, kai naudojamos dviejų lėkščių svarstyklės

Pagal 4.2.1 skirsnyje pateiktą aprašymą pasverkite paruoštu tiriamuoju bandiniu užpildytą piknometrą (3 skirsnis).

p″ bus masė gramais, kai svarstyklės išsilygina, esant temperatūrai t °C.

Piknometre esančio skysčio masė = p + m – p″

Tariamasis tankis esant t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/(V20 °C)

Paskaičiuokite tankį, esant 20 °C temperatūrai, naudodami vieną iš toliau pateiktų pataisų lentelių ir atsižvelgdami į matuojamo skysčio rūšį: sausasis vynas (II lentelė), natūrali ar koncentruota misa (III lentelė), saldusis vynas (IV lentelė).

Savitasis vyno tankis 20 °C/20 °C yra skaičiuojamas, dalijant jo tankį, esant 20 °C temperatūrai, iš 0,998203.

4.3.2.   Metodas, kai naudojamos vienos lėkštės svarstyklės

Pasverkite tarą. Jos masė bus T1.

Apskaičiuokite dT = T1 – T0.

Tuščio piknometro masė matuojant = P – m + dT.

Pagal 4.2.1 skirsnyje pateiktą aprašymą pasverkite paruoštu tiriamuoju bandiniu užpildytą piknometrą (3 skirsnis). Jo masė esant t °C bus P2 .

Piknometre esančio skysčio masė, esant t °C = P2 – (P – m + dT).

Tariamasis tankis esant t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT))/(V20 °C)

Apskaičiuokite bandomojo skysčio (sausojo vyno, natūralios ar koncentruotos misos, saldžiojo vyno) tankį esant 20 °C, kaip nurodyta 4.3.1 skirsnyje.

Savitasis tankis 20 °C/20 °C yra skaičiuojamas dalinant tankį, esant 20 °C temperatūrai, iš 0,998203.

4.3.3.   Tankio matavimų pakartojamumas:

sausieji ir pusiau saldūs vynai: r = 0,00010

saldieji vynai: r = 0,00018

4.3.4.   Tankio matavimo verčių atkuriamumas:

sausieji ir pusiau saldūs vynai: R = 0,00037

saldieji vynai: R = 0,00045

I   LENTELĖ

F rodikliai

iš kurių reikia padauginti pirekso stiklo piknometre esančio vandens masę esant t °C, norint apskaičiuoti piknometro tūrį, atitinkantį 20 °C temperatūrą

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 01 metodo II priedo I lentele ]

II   LENTELĖ

Nealkoholinių sausųjų vynų tankių, išmatuotų pirekso stiklo piknometru esant t C, temperatūros pataisos c norint gauti rezultatą, atitinkantį 20 °C temperatūrą

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 01 metodo II priedo II lentele ]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000)

– jei t °C yra mažesnė kaip 20 °C + jei t °C yra didesnė kaip 20 °C

III   LENTELĖ

Natūralių ir koncentruotų misų tankių, išmatuotų pirekso stiklo piknometru esant t C, temperatūros pataisos c, norint gauti rezultatą, atitinkantį 20 °C temperatūrą

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 01 metodo II priedo III lentele ]

ρ20 = ρ t ± (c)/(1 000)

– jei t °C yra mažesnė kaip 20 °C + jei t °C yra didesnė kaip 20 °C

IV   LENTELĖ

Vynų, kurių stiprumas yra 13 % tūrio ir daugiau bei kurie turi liktinio cukraus, tankių, išmatuotų pirekso stiklo piknometru esant t °C, temperatūros pataisos c, norint gauti rezultatą, atitinkantį 20 °C temperatūrą

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 01 metodo II priedo IV lentele ]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000)

– jei t °C yra mažesnė kaip 20 °C + jei t °C yra didesnė kaip 20 °C

2   CUKRAUS KONCENTRACIJOS VYNUOGIŲ MISOJE, KONCENTRUOTOJE VYNUOGIŲ MISOJE IR REKTIFIKUOTOJE KONCENTRUOTOJE VYNUOGIŲ MISOJE NUSTATYMAS REFRAKTOMETRINIU METODU (OIV - AS2 - 02- SUCREF) – I TIPO METODAS

1.   METODO ESMĖ

Lūžio rodiklis esant 20 °C temperatūrai išreikštas arba absoliučia verte, arba sacharozės masės procentais, yra pateiktas atitinkamoje lentelėje, kurią naudojant galima apskaičiuoti cukraus koncentraciją gramais litre ar gramais kilograme vynuogių misoje, koncentruotoje vynuogių misoje bei rektifikuotoje koncentruotoje vynuogių misoje.

2.   APARATŪRA

2.1.   Abbe refraktometras

Naudojamas refraktometras turi turėti skalę, rodančią:

—	arba sacharozės masės procentinę dalį 0,1 % tikslumu,

—	arba lūžio rodiklį su keturiais skaičiais po kablelio.

Refraktometras turi turėti termometrą, kurio skalė yra bent nuo + 15 °C iki + 25 °C, bei įtaisą vandeniui cirkuliuoti, kad būtų galima atlikti matavimus esant 20 °C temperatūrai (± 5 °C).

Taip pat turi būti griežtai laikomasi darbo su šiuo prietaisu taisyklių, ypač nurodymų dėl kalibravimo ir šviesos šaltinio.

3.   BANDINIO PARUOŠIMAS

3.1   Misa ir koncentruota misa

Jei reikia, perkoškite misą per sausą keturgubą marlę ir, išpylę pirmuosius filtrato lašus, atlikite filtruoto produkto matavimus.

3.2   Rektifikuota koncentruota misa Atsižvelgdami į koncentraciją, naudokite arba pačią rektifikuotą koncentruotą misą, arba tirpalą.

Tirpalas gaminamas skiedžiant 200 g rektifikuotos koncentruotos misos vandeniu iki 500 g tirpalo. Sverti būtina tiksliai.

4.   DARBO EIGA

Bandinį pašildykite iki 20 °C temperatūros. Padėkite nedidelį mėginio kiekį ant apatinės refraktometro prizmės taip, kad šis mėginys tolygiai padengtų stiklo paviršių (kadangi prizmės yra stipriai prispaudžiamos viena prie kitos). Matavimus atlikite pagal naudojimo instrukciją, pateiktą prie naudojamo prietaiso.

Nustatykite sacharozės masės procentą 0,1 % tikslumu arba lūžio rodiklį keturių skaičių po kablelio tikslumu.

Su tuo pačiu pavyzdžiu atlikite ne mažiau kaip du matavimus. Pasižymėkite temperatūrą t °C.

5.   SKAIČIAVIMAI

5.1.   Temperatūros pataisa

5.1.1.   Jei prietaisas sugraduotas sacharozės masės procentais, temperatūros pataisai naudokite I lentelę.

5.1.2.   Jei prietaisas sugraduotas lūžio rodiklio vertėmis, II lentelėje suraskite rodiklį, atitinkantį temperatūrą t °C, ir gausite atitinkamą sacharozės masės procentinę dalį (1 stulpelis), esant temperatūrai t °C. Daroma šios vertės pataisa dėl temperatūros ir naudojant I lentelę išreiškiama kaip koncentracija, esant 20 °C temperatūrai.

5.2.   Cukraus koncentracija misoje ir koncentruotoje misoje

II lentelėje raskite sacharozės masės procentinę dalį esant 20 °C temperatūrai bei toje pačioje eilutėje rasite cukraus koncentraciją gramais litre ir gramais kilograme. Cukraus koncentracija išreiškiama invertuotuoju cukrumi su vienu skaičiumi po kablelio.

5.3.   Cukraus koncentracija rektifikuotoje koncentruotoje misoje

III lentelėje raskite sacharozės masės procentinę dalį esant 20 °C temperatūrai bei toje pačioje eilutėje rasite cukraus koncentraciją gramais litre ir gramais kilograme. Cukraus koncentracija išreiškiama invertuotuoju cukrumi su vienu skaičiumi po kablelio.

Jei matavimus atlikote naudodami praskiestą rektifikuotą koncentruotą misą, padauginkite gautą rezultatą iš praskiedimo koeficiento.

5.4   Misos, koncentruotos misos ir rektifikuotos koncentruotos misos lūžio rodiklis

II lentelėje raskite sacharozės masės procentinę dalį esant 20 °C temperatūrai. Toje pačioje eilutėje rasite lūžio rodiklį esant 20 °C temperatūrai.

Pastaba. Potencinė alkoholio koncentracija tūrio proc., koncentruota vynuogių misa bei rektifikuota koncentruota vynuogių misa gali būti nustatytos, naudojantis 2000 m. liepos 25 d. Komisijos reglamento Nr. 1623/2000 (ESOL L194, 2000 m. liepos 31 d.) I priede pateikiama atitikmenų lentele.

I   LENTELĖ

Pataisa, kuri turi būti daroma, kai sacharozės masės procentinė dalis buvo nustatyta esant kitai nei 20 °C temperatūrai

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 02 metodo priedo I lentele ]

II   LENTELĖ

Lentelė, kurioje pateikiama cukraus koncentracija misose bei koncentruotose misose, išreikšta gramais litre ir gramais kilograme, kuri buvo nustatyta refraktometru, sugraduotu sacharozės masės procentais arba lūžio rodiklio vertėmis, kai temperatūra yra 20 °C. Taip pat yra pateiktas tankis esant 20 °C temperatūrai

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 02 metodo priedo II lentele ]

III   LENTELĖ

Lentelė, kurioje pateikiama cukraus koncentracija rektifikuotoje koncentruotoje misoje, išreikšta gramais litre ir gramais kilograme, kuri buvo nustatyta refraktometru, sugraduotu sacharozės masės procentais arba lūžio rodiklio vertėmis, kai temperatūra yra 20 °C. Taip pat yra pateiktas tankis esant 20 °C temperatūrai

[Remtis OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinyje aprašyto AS2 – 02 metodo priedo III lentele ]

3   SUMINIS SAUSOJO EKSTRAKTO KIEKIS (OIV-AS-2-03-EXTSEC) SUMINIS SAUSŲJŲ MEDŽIAGŲ KIEKIS – I TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽTIS

Suminį sausojo ekstrakto ar sausųjų medžiagų kiekį sudaro visos medžiagos, kurios apibrėžtomis fizinėmis sąlygomis yra nelakios. Šios fizinės sąlygos turi būti tokios, kad ekstraktą sudarančios medžiagos bandymo metu pakistų kiek įmanoma mažiau.

Becukris ekstraktas – tai skirtumas tarp suminio sausojo ekstrakto kiekio ir suminio cukrų kiekio.

Sumažintas ekstraktas – tai suminio sausojo ekstrakto kiekio ir suminio cukrų kiekio, viršijančio 1 g/l, kalio sulfato, viršijančio 1 g/l, manito ar kitų cheminių medžiagų, kurios galėjo būti įdėtos į vyną, kiekio skirtumas.

Liekamasis ekstraktas – tai becukris ekstraktas atėmus fiksuotą rūgštingumą, išreikštą vyno rūgšties kiekiu.

Ekstrakto kiekis yra reiškiamas gramais litre ir turi būti nustatomas maždaug 0,5 g tikslumu.

2.   METODO ESMĖ

[Šio analizės metodo aprašymą atnaujina OIV tarnybos. Jis bus paskelbtas kitame Komisijos pranešime, kai tik OIV atnaujintas tekstas bus paskelbtas OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinio 2010 metų leidime. Kol tas aprašymas nepaskelbtas kaip orientacija galima remtis Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 priedo 4 skyriumi.

4.   VANDENS KIEKIO VYNE IZOTOPINIO SANTYKIO 18O/16O NUSTATYMAS (OIV-AS-2-09-MOUO18) – II TIPO METODAS

(p.m.)

[Šio analizės metodo aprašymą atnaujina OIV tarnybos. Jis bus paskelbtas kitame Komisijos pranešime, kai tik OIV atnaujintas tekstas bus paskelbtas OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinio 2010 metų leidime. Kol tas aprašymas nepaskelbtas kaip orientacija galima remtis Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 priedo 43 skyriumi.

5   FOLIN-CIOCALTEU RODIKLIS (OIV-AS-2-10-INDFOL) – IV TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽTIS

Folin-Ciocalteu rodiklis – tai rezultatas, gautas naudojant žemiau aprašytą metodą.

2.   METODAS

Visus fenolio junginius vyne oksiduoja Folin-Ciocalteu reagentas. Šį reagentą sudaro volframo rūgšties (H3PW12O40) ir molibdeno rūgšties (H3PMo12O40) mišinys, kuris po fenolių oksidacijos redukuojamas į mėlynos spalvos volframo (W8O23) ir molibdeno (Mo8O23) oksidų mišinį.

Gauta mėlyna spalva atitinka didžiausią absorbciją esant bangos ilgiui 750 nm, proporcingą suminiam esančių fenolio junginių kiekiui.

3.   REAGENTAI

Jie turi būti analizinio grynumo. Naudojamas distiliuotas vanduo arba panašus į jį.

3.1.   Folin-Ciocalteu reagentas

Šį reagentą galima nusipirkti jau paruoštą naudoti. Taip pat jį galima pasigaminti: 700 ml distiliuoto vandens ištirpinkite 100 g natrio volframato (Na2WO42H2O) ir 25 g natrio molibdato (Na2MoO42H2O). Įpilkite 50 ml 85 % fosforo rūgšties (ρ20 = 1,71 g/ml) ir 100 ml koncentruotos druskos rūgšties (ρ20 = 1,19 g/ml). Užvirkite ir pavirinkite 10 valandų kolboje su grįžtamuoju šaldytuvu. Tada įdėkite 150 g ličio sulfato (Li2SO4H2O), įlašinkite keletą lašų bromo ir dar kartą pavirinkite 15 minučių. Leiskite atvėsti ir praskieskite distiliuotu vandeniu iki vieno litro.

3.2.   Bevandenio natrio karbonato (Na2CO3) 20 % (m/V) tirpalas.

4.   APARATŪRA

Įprasta laboratorinė įranga:

4.1.   100 ml matavimo kolbos.

4.2.   Spektrofotometras, su kuriuo galima atlikti matavimus esant bangos ilgiui 750 nm.

5.   DARBO EIGA

5.1.   Raudonasis vynas

Į 100 ml matavimo kolbą (4.1 skirsnis) būtinai paeiliui supilkite toliau išvardytus skysčius:

1 ml vyno, kuris buvo praskiestas santykiu 1 : 5;

50 ml distiliuoto vandens;

5 ml Folin-Ciocalteu reagento (3.1);

20 ml natrio karbonato tirpalo (3.2).

Praskieskite distiliuotu vandeniu iki 100 ml.

Suplakite, kad tirpalas susimaišytų. Palaukite 30 minučių, kol reakcija baigsis. Nustatykite optinį tankį 1 cm storio kiuvetėje esant bangos ilgiui 750 nm. Palyginamuoju tirpalu naudokite distiliuotą vandenį.

Jei gauta optinio tankio vertė nėra apytiksliai 0,3, būtina atitinkamai praskiesti.

5.2.   Baltasis vynas

Atlikite tą pačią analizę su 1 ml neskiesto vyno.

5.3.   Rektifikuota koncentruota misa

5.3.1.   Bandinio paruošimas

Naudokite tirpalą, kuriame cukraus koncentracija yra 25 % (m/m) (25° pagal Brikso skalę) bei kuris buvo paruoštas pagal skyriaus „pH“ 4.1.2 skirsnyje aprašytą metodiką.

5.3.2.   Matavimas

Atlikite tuos pačius veiksmus, kaip ir raudonajam vynui (5.1 skirsnis), naudodami 5 ml bandinį, paruoštą pagal 5.3.1 skirsnį. Išmatuokite optinį tankį, tik palyginimui naudokite paruoštą 5 ml 25 % (m/m) invertuotojo cukraus tirpalą.

6.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

6.1.   Skaičiavimo metodas

Rezultatas išreiškiamas rodikliu, gautu dauginant optinio tankio vertę iš 100, jei tai raudonasis vynas, praskiestas santykiu 1 : 5 (arba atitinkamu koeficientu, jei praskiedimo santykis kitoks), arba iš 20, jei tai baltasis vynas. Jei tai rektifikuota koncentruota misa, dauginama iš 16.

6.2.   Pakartojamumas

Dviejų tyrimų, kurie atliekami tuo pat metu ar labai greitai vienas po kito to paties analitiko, rezultatų skirtumas turi būti ne didesnis kaip 1.

Geras rezultatų pakartojamumas bus naudojant ypatingai švarią įrangą (matavimo kolbas ir spektrofotometro kiuvetes).

6   GLIUKOZĖ IR FRUKTOZĖ (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – II TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽTIS

Gliukozė ir fruktozė gali būti atskirai nustatomos fermentiniu metodu, kurio vienintelis tikslas yra apskaičiuoti gliukozės ir fruktozės santykį.

2.   METODAS

Gliukozė ir fruktozė yra fosforilinamos su adenozintrifosfatu (ATP) fermentuojant su heksokinaze (HK) kaip katalizatoriumi ir gaunamas gliukozo-6-fosfatas (G6P) ir fruktozo-6-fosfatas (F6P):

gliukozė + ATP←→G6P + ADP

fruktozė + ATP←→F6P + ADP

Gliukozo-6-fosfatas iš pradžių oksiduojamas su nikotinamidadenindinukleotido fosfatu (NADP) iki gliukonato-6-fosfato, dalyvaujant fermentui - gliukozo-6-fosfatdehidrogenazei (G6PGH). Gautas redukuoto nikotinamidadenindinukleotido fosfato kiekis atitinka gliukozo-6-fosfato kiekį ir pačios gliukozės kiekį.

G6P + NADP+←→ gluconate 6-phosphate + NADPH + H+

Redukuotas nikotinamidadenindinukleotido fosfatas nustatomas pagal jo absorbciją esant 340 nm.

Pasibaigus šiai reakcijai fruktozo-6-fosfatas paverčiamas į gliukozo-6-fosfatą veikiant fosfogliukozės izomerazei (PGI):

F6P←→G6P

Gliukozo-6-fosfatas vėl reaguoja su nikotinamidadenindinukleotido fosfatu, sudarydamas gliukonato-6-fosfatą ir redukuotą nikotinamidadenindinukleotido fosfatą, kuris vėliau yra nustatomas.

3.   APARATŪRA

—

Spektrofotometras, leidžiantis atlikti matavimus esant bangos ilgiui 340 nm, - tai bangos ilgis, kuriame NADPH absorbcija yra didžiausia. Kadangi bus atliekamas absoliučių verčių nustatymas (t. y. kalibravimo kreivės nenaudojamos, tačiau etalonuojama naudojant NADPH ekstinkcijos koeficientą), tai reikia patikrinti prietaiso bangų ilgių skales bei optinio tankio vertes. Jei tokio prietaiso nėra, galima naudoti spektrofotometrą su diskretinio spektro šaltiniu, kuris leistų atlikti matavimus esant bangos ilgiui 334 nm ar 365 nm.

—	1 cm storio stiklo kiuvetės ar vienkartinės kiuvetės.

—	0,02 ml, 0,05 ml, 0,1 ml ir 0,2 ml.

4.   REAGENTAI

4.1.   1 tirpalas: buferis (0,3 M trietanolamino ; pH = 7,6; 4×10-3M Mg2+): ištirpinkite 11,2 g trietanolamino hidrochlorido (C2H5)3N HCl)) ir 0,2 g (Mg SO4 7 H2O) 150 ml bidistiliato, įpilkite apie 4 ml 5 M natrio hidroksido (NaOH) tirpalo, kad pH būtų 7,6, ir praskieskite iki 200 ml.

Tokį buferinį tirpalą galima laikyti keturias savaites esant + 4 °C temperatūrai.

4.2.   2 tirpalas: nikotinamidadenindinukleotido fosfato tirpalas (apie 11,5 × 10–3-M): ištirpinkite 50 mg natrio nikotinamidadenindinukleotido fosfato 5 ml bidistiliato.

Šį tirpalą galima laikyti keturias savaites esant +4 °C temperatūrai.

4.3.   3 tirpalas: adenozin-5'-trifosfato tirpalas (apie 81 × 10–3M): ištirpinkite 250 mg natrio adenozin-5'—trifosfato ir 250 mg natrio rūgščiojo karbonato (NaHCO3) 5 ml bidistiliato.

Šį tirpalą galima laikyti keturias savaites esant +4 °C temperatūrai.

4.4.   4 tirpalas: heksokinazės ir gliukozo-6-fosfatdehidrogenazės tirpalas: sumaišykite 0,5 ml heksokinazės (2 mg baltymo/ml ar 280 vnt./ml) su 0,5 ml gliukozo-6-fosfatdehidrogenazė (1 mg baltymo/ml).

Šį tirpalą galima laikyti metus + 4 °C temperatūroje.

4.5.   5 tirpalas: fosfogliukozės izomerazė (2 mg baltymo/ml ar 700 vnt./ml). Suspensija naudojama neskiesta.

Šį tirpalą galima laikyti metus esant + 4 °C temperatūrai.

Pastaba:

Yra prekiaujama visų reagentų nurodytais kiekiais.

5.   DARBO EIGA

5.1.   Bandinio paruošimas

Pagal apskaičiuotą gliukozės + fruktozės kiekį litre bandinį praskieskite tokiu santykiu:

Matavimas, kai bangos ilgis 340 nm ir 334 nm	Matavimas, kai bangos ilgis 365 nm	Praskiedimas vandeniu	Praskiedimo faktorius F
Iki 0,4 g/l	Iki 0,8 g/l	—	—
Iki 4,0 g/l	Iki 8,0 g/l	1 + 9	10
Iki 10,0 g/l	Iki 20,0 g/l	1 + 24	25
Iki 20,0 g/l	Iki 40,0 g/l	1 + 49	50
Iki 40,0 g/l	Iki 80,0 g/l	1 + 99	100
Virš 40,0 g/l	Virš 80,0 g/l	1 + 999	1 000

5.2.   Titravimas

Su spektrofotometru esant bangos ilgiui 340 nm atlikite matavimus, naudodami orą (šviesos kelyje nėra kiuvetės) arba vandenį kaip palyginamąjį tirpalą.

Temperatūra turi būti 20–25 °C.

Į dvi 1 cm storio kiuvetes įpilkite tokių medžiagų: Kiuvetė su palyginamuoju tirpalu

	Palyginamasis tirpalas	Titravimas
1 tirpalas (4.1) (temperatūra 20 °C): 2,50 ml	2,50 ml	2,50 ml
2 tirpalas (4.2):	0,10 ml	0,10 ml
3 tirpalas (4,3):	0,10 ml	0,10 ml
Bandinys, kuris bus matuojamas		0,20 ml
Bidistiliatas	0,20 ml

Sumaišykite ir po maždaug trijų minučių užrašykite tirpalų optinį tankį (A1). Įvykdykite reakciją įpildami:

4 tirpalas (4,4):

0,02 ml

0,02 ml

Sumaišykite. Palaukti 15 minučių, užrašykite optinio tankio rodmenį ir po dar dviejų minučių patikrinkite, ar reakcija baigėsi (A2).

Tuoj pat įpilkite:

5 tirpalas (4,5):

0,02 ml

0,02 ml

Sumaišykite, po 10 minučių užrašykite rodmenis, o po dar dviejų minučių patikrinkite, ar reakcija baigėsi (A3).

Apskaičiuokite skirtumus tarp optinio tankio verčių:

A2 – A1 atitinka gliukozę,

A3 – A2 atitinka fruktozę

palyginamojoje ir bandinio kiuvetėse.

Apskaičiuokite skirtumus tarp optinio tankio rodmenų palyginamojoje kiuvetėje (ΔAR) ir bandinio kiuvetėje (ΔAS)

gliukozė: ΔAG = ΔAS – ΔAR

fruktozė: ΔAF = ΔAS – ΔAR

Pastaba:

įvairių bandinių partijų fermentų aktyvumui pasibaigti reikalingas laikas gali skirtis. Anksčiau nurodytas laikas yra tik orientacinis; Rekomenduojama, kad jis būtų nustatinėjamas kiekvienai partijai atskirai.

5.3.   Rezultatų užrašymas

5.3.1.   Skaičiavimo metodas

Bendroji formulė koncentracijoms skaičiuoti yra:

C= ((V × PM)/(ε × d × v × 1 000)) × ΔA (g/l)

V= bandomojo tirpalo tūris (ml);

v= bandinio tūris (ml);

PM= nustatomosios medžiagos molekulinė masė;

d= kiuvetės storis (cm);

ε= NADPH absorbcijos koeficientas esant bangos ilgiui 340 nm = 6,3 mmole.–1 × l × cm–1)

V= 2,92 ml gliukozei nustatyti

V= 2,94 ml fruktozei nustatyti;

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Taigi:

gliukozė: C(g/l) = 0,417 × ΔAG

fruktozė: C(g/l) = 0,420 × ΔAF

Jeigu bandinys buvo skiedžiamas jį ruošiant, padauginkite gautą rezultatą iš praskiedimo koeficiento F.

Pastaba:

Jei matavimai buvo atlikti esant bangos ilgiui 334 nm arba 365 nm, tuomet gaunami tokie rezultatai:

—	matavimas esant bangos ilgiui 334 nm: ε = 6,2 (mmole–1 × l × cm–1) gliukozė: C(g/l) = 0,425 × ΔAG fruktozė: (Cg/l) = 0,428 × ΔAF

—	matavimas esant bangos ilgiui 365 nm: ε = 3,4 (mmole–1 × l × cm–1) gliukozė: C(g/l) = 0,773 × ΔAG fruktozė: C(g/l) = 0,778 × ΔAF

5.3.2.   Pakartojamumas (r)

r= 0,056 ×i

5.3.3.   Atkuriamumas (R)

R= 0,12 + 0,076 ×i

xi= gliukozės arba fruktozės koncentracija g/l.

7   CUKRŲ DOZAVIMAS PAGAL HPLC (SACHAROZĖ) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – II TIPO METODAS

(p.m.)

[Šio analizės metodo aprašymą atnaujina OIV tarnybos. Jis bus paskelbtas kitame Komisijos pranešime, kai tik OIV atnaujintas tekstas bus paskelbtas OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinio 2010 metų leidime. Kol tas aprašymas nepaskelbtas, kaip orientacija galima remtis Komisijos reglamento (EEB)Nr. 2676/90 priedo 6 skyriaus 3 dalimi.

8   VYNUOGIŲ MISŲ, KONCENTRUOTŲ VYNUOGIŲ MISŲ, REKTIFIKUOTŲ KONCENTRUOTŲ VYNUOGIŲ MISŲ IR VYNŲ SODRINIMO NUSTATYMAS TAIKANT DEUTERIO MAGNETINIO BRANDUOLIŲ REZONANSO METODĄ (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – I TIPO METODAS

(p.m.)

[Šio analizės metodo aprašymą iš naujo svarsto OIV tarnybos. Jis bus paskelbtas Komisijos pranešime, kai tik OIV visuotinis susirinkimas patvirtins galutinį tekstą. Kol tas aprašymas nepaskelbtas, kaip orientacija galima remtis Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 priedo 8 skyriumi.

9   ALKOHOLIO STIPRUMAS PAGAL TŪRĮ (OIV-AS-312-01-TALVOL) – I TIPO METODAS

(p.m.)

[Šių analizės metodų aprašymą atnaujina OIV tarnybos. Jie bus paskelbti kitame Komisijos pranešime, kai tik OIV atnaujintas tekstas bus paskelbtas OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinio 2010 metų leidime. Kol tas aprašymas nepaskelbtas, kaip orientacija galima remtis Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 priedo 3 skyriumi.

10   IZOTOPŲ 13C/12C KIEKIO VYNO ETANOLYJE IR ETANOLYJE, GAUTŲ FERMENTUOJANT MISĄ, KONCENTRUOTĄ MISĄ ARBA REKTIFIKUOTĄ KONCENTRUOTĄ MISĄ, NUSTATYMAS IZOZTOPŲ MASĖS SPEKTROMETRIJOS BŪDU (OIV-AS-312-06-ETHANO) – II TIPO METODAS

1.   TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas izotopų 13C/12C kiekis vyno etanolyje ir etanolyje, gautų fermentuojant iš vynuogių gautus produktus (misą, koncentruotą misą, rektifikuotą koncentruotą misą).

2.   NORMATYVINĖS NUORODOS

ISO:	5725:1994 „Matavimo metodų ir rezultatų tikslumas (teisingumas ir tikslumas): Pagrindinis metodas standartinio matavimo metodo pakartojamumui ir palyginamumui nustatyti“.
V-PDB:	Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).
OIV metodas AS-311-O5-ENRRMN	„Vynuogių misos, koncentruotos vynuogių misos, rektifikuotos koncentruotos vynuogių misos ir vyno sodrinimo radimas panaudojant deuterio magnetinio branduolių rezonanso metodą (SNIF-NMR).“

3.   SĄVOKOS

13C/12C	:	anglies izotopų 13 (13C) ir 12 (12C) santykis pateiktame bandinyje.
δ13C	:	anglies izotopų 13 (13C) kiekis, išreikštas tūkstantosiomis dalimis (‰).
SNIF-NMR	:	natūralus izomero frakcionavimas, tiriant jį magnetinio branduolių rezonanso metodu.
V-PDB	:	Vienna-Pee-Dee Belemnite. PDB yra pagrindinis rodiklis matuojant natūralius anglies 13 izotopo, gauto iš Pee-Dee formavimo belemnito Pietų Karolinoje (JAV), kalcio karbonato kiekio pokyčius. Jo izotopų santykis 13C/12C arba RPDB lygus RPDB = 0,0112372. PDB atsargos seniai išnaudotos, tačiau jis tebėra pagrindinis rodiklis, parodantis anglies 13 izotopo kiekio natūralius pokyčius, ir yra naudojamas kalibruojant etaloninę medžiagą, saugomą Tarptautinėje atominės energijos agentūroje (TATENA) Vienoje (Austrija). Gamtoje aptinkamo anglies 13 izotopo kiekis paprastai išreiškiamas jo santykiu su V-PDB.
m/z	:	masės ir krūvio santykis.

4.   METODAS

Fotosintezės metu anglies dioksido asimiliavimas vyksta dviem metabolizmo būdais, t. y. C3 metabolizmas (Kalvino ciklas) ir C4 metabolizmas (Hatch ir Slack). Šie fotosintezės mechanizmai yra skirtingų izotopų frakcionavimo rūšių. C4 augalų produktai, pavyzdžiui, cukrus ir dėl fermentavimo susidaręs alkoholis, turi didesnį anglies 13 kiekį nei panašūs C3 augalų fotosintezės produktai. Dauguma augalų, įskaitant vynuogienojus ir cukrinius runkelius, priklauso C3 grupei. Cukranendrės ir kukurūzai priklauso C4 grupei. Matuojant anglies 13 kiekį galima aptikti ir įvertinti C4 augalų cukrų (cukranendrių ir kukurūzų izogliukozė), kurio buvo pridėta į vynuogių produktus (vynuogių misą, vyną ir t. t.). Duomenys apie anglies 13 kiekį kartu su duomenimis, gautais iš SNIF-NMR, leidžia nustatyti pridėtų cukraus mišinių ir iš jų susidariusio alkoholio gauto iš C3 ir C4 augalų.

Anglies 13 kiekį galima nustatyti pagal anglies dioksido, susidariusio visiškai sudeginus bandinį, kiekį. Pagrindinių izotopomerų, kurių masė 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 ir 12C17O16O ) ir 46 (12C16O18O) ir kurie sudaryti iš įvairiausių 18O, 17O, 16O, 13C ir 12C kombinacijų, gausą galima nustatyti trimis skirtingais masės izotopų spektrometro kolektoriais matuojant jonų sroves. Į izotopomerus 13C17O16O ir 12C17O2 galima nekreipti dėmesio, jei jų kiekis yra nedidelis. m/z = 45 jonų srovė patikslinama pagal 12C17O16O, kuris apskaičiuojamas remiantis m/z = 46 srovės intensyvumu ir atsižvelgiant į 18O ir 17O perteklių (Kreigo korekcija). Lyginant su etalonu, kalibruotu pagal tarptautinį V-PDB etaloną, galima apskaičiuoti anglies 13 kiekį pagal δ13C santykinę skalę.

5.   REAGENTAI

Nuo konkrečioje laboratorijoje naudojamų prietaisų (6 skirsnis) priklauso, kokie reagentai ir reikmenys bus naudojami. Paprastai naudojamos sistemos, sudarytos remiantis elementų analizatorių principu. Šios sistemos gali būti turėti techniką, kuri sudaro sąlygas įstatyti bandinius, įdėtus į sandarias metalines kapsules, arba per pertvarą įšvirkšti skystus bandinius švirkštu.

Priklausomai nuo naudojamų prietaisų rūšies, gali būti naudojamos šios pamatinės medžiagos, reagentai ir reikmenys:

—	pamatinės medžiagos,

—	gaunamos iš TATENA: Pavadinimas Įranga δ13C lyginant su V-PDB (9) — IAEA-CH-6 Sacharozė –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 Polietilenas –31,8 ‰ — NBS22 Aliejus –29,7 ‰ — USGS24 Grafitas –16,1 ‰

—	gaunamos iš IRMM Geelyje (Belgija) (Pamatinių medžiagų ir matų institutas): Pavadinimas Įranga δ13C lyginant su V-PDB (9) — CRM/BCR 656 Vyno alkoholis –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 Gliukozė –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 Vandeninis alkoholio tirpalas (12 % koncentracijos) –26,72 ‰

—	standartinis darbinis bandinys su žinomu 13C/12C kiekiu, kalibruotas pagal tarptautines pamatines medžiagas,

—

toliau pateikiamas medžiagų, skirtų nuolatinio srauto sistemoms, sąrašas: — tyrimui skirtas helis (CAS 07440-59-7), — tyrimui skirtas deguonis (CAS 07782-44-7), — tyrimui skirtas anglies dioksidas, naudojamas kaip antrinės etaloninės dujos anglies 13 kiekiui nustatyti (CAS 00124-38-9), — oksidacijos reagentas, skirtas naudoti degimo sistemoje, pavyzdžiui, vario (II) oksidas, naudojamas pagrindiniam tyrimui (CAS 1317-38-0), — desikantas, skirtas pašalinti vandeniui, susidariusiam degimo metu, pavyzdžiui, anhidronas, naudojamas elementų analizei (magnio perchloratas) (CAS 10034-81-8). (Tai nebūtina prietaisams, kuriuose įrengta vandens šalinimo sistema, turinti šaldytuvą-gaudyklę arba selektyvaus pralaidumo kapiliarus).

6.   PRIETAISAI IR ĮRANGA

6.1.   Izotopų kiekio masės spektrometras (IKMS)

Izotopų kiekio masės spektrometru (IKMS) galima 0,05 ‰ tikslumu arba tiksliau nustatyti santykinį 13C kiekį gamtinės kilmės CO2 dujose (9 skirsnis). Vidinis tikslumas - tai dviejų to paties CO2 bandinio matavimų rezultatų skirtumas. Masės spektrometras, naudojamas izotopų kiekiui nustatyti, paprastai turi trigubą kolektorių, kad vienu metu būtų galima matuoti m/z = 44, 45 ir 46 intensyvumą. Izotopų kiekio masės spektrometras turi turėti arba dvigubą įvedimo sistemą, kad būtų galima tirti nežinomą bandinį ir etaloninį bandinį, arba turėti integruotą deginimo sistemą, kurioje bandinys kiekybiškai sudeginamas ir, prieš atliekant išmatavimą masės spektrometru, nuo kitų degimo produktų atskiriamas anglies dioksidas.

6.2.   Deginimo įranga

Tai – deginimo įranga, kurioje visą etanolio kiekį galima sudeginti iki anglies dioksido, kartu atskiriant visus kitus degimo produktus, įskaitant ir vandenį, be jokio izotopų frakcionavimo. Ši įranga gali būti nuolatinio srauto sistema, integruota į masės spektrometrą (6.2.1 skirsnis), arba atskira deginimo sistema (6.2.2 skirsnis). Įranga turi leisti gauti bent nurodytą 11 punkte tikslumą.

6.2.1.   Nuolatinio srauto sistemos

Jos sudarytos arba iš elementų analizatoriaus, arba iš dujų chromatografo su prijungta deginimo sistema.

Sistemoms, turinčioms techniką, kuri sudaro sąlygas įstatyti bandinius, įdėtus į sandarias metalines kapsules, naudojama ši laboratorijos įranga:

—	kalibruotas mikrošvirkštas arba mikropipetė su atitinkamu piltuvėliu,

—	1 μg tikslumo arba tikslesnės svarstyklės,

—	replės, skirtos kapsulei paruošti,

—	alavinės kapsulės, skirtos skystiems bandiniams,

—	alavinės kapsulės, skirtos kietiems bandiniams.

pastaba:

norint sumažinti etanolio bandinių išgaravimo riziką, į kapsules galima dėti absorbento (pavyzdžiui, chromosorb W 45–60 mesh), iš anksto nustačius, kad jame nėra didelio kiekio anglies, kuri galėtų daryti įtaką tyrimų rezultatui.

Sistemoms, turinčioms elementų analizatorių su skysčio įpurškikliu arba chromatografą su deginimo sistema, naudojama ši laboratorijos įranga:

—	švirkštas skysčiams,

—	kolba, turinti sandarinimo sistemą ir nepaslankią pertvarėlę.

Minėtuose sąrašuose išvardinti laboratorijos įrangos pavyzdžiai kali būti pakeista kita tos pačios paskirties įranga, priklausomai nuo to, kokios rūšies deginimo sistema ir masės spektrometras naudojami atitinkamoje laboratorijoje.

6.2.2.   Atskira paruošimo sistema

Šiuo atveju tiek anglies dioksido bandiniai, susidarę sudeginus tyrimams skirtus bandinius, tiek etaloninis bandinys kaupiami stiklinėse kolbose, kurios tyrimams prijungiamos prie dvigubos spektrometro įvedimo sistemos. Galima naudoti įvairius literatūroje aprašytus deginimo prietaisus:

—	uždarą degimo sistemą su cirkuliuojančiu deguonimi,

—	elementų analizatorių su helio ir deguonies srautu,

—	sandarią stiklinę kolbą su oksidantu vario (II) oksidu.

7.   BANDINIŲ PARUOŠIMAS TYRIMAMS

Prieš pradedant izotopų tyrimą, iš vyno turi būti ekstrahuotas etanolis. Tam vynas yra distiliuojamas 3.1 punkte aprašytu metodu SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

Vynuogių misos, koncentruotos vynuogių misos ir rektifikuotos koncentruotos vynuogių misos atveju pirmiausiai reikia fermentuoti cukrų į alkoholį 3.2 punkte aprašytu metodu SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8.   DARBO EIGA

Visus paruošiamuosius darbus reikia atlikti neprarandant etanolio jam nugaruojant, nes tai galėtų pakeisti izotopinę bandinio sudėtį.

Toliau pateiktas etanolio bandinio deginimo eigos aprašymas skirtas komercinėms automatinėms deginimo sistemoms. Visus kitus metodus, užtikrinančius etanolio bandinio virsmą anglies dioksidu neprarandant etanolio jam nugaruojant, taip pat galima naudoti anglies dioksidui, skirtam izotopų tyrimui, paruošti.

Tyrimo eiga, naudojant elementų analizatorių:

a)

bandinių kapsulių paruošimas: — naudoti švarias kapsules, reples ir darbinį padėklą, — reikiamo dydžio kapsulę imti replėmis, — mikropipete įpilti į kapsulę reikiamą kiekį skysčio, — pastaba: norint gauti 2 mg anglies, reikia 3,84 mg absoliučiojo etanolio arba 4,17 mg 92 % m/m alkoholio koncentracijos distiliato. Tinkamas distiliato kiekis apskaičiuojamas tokiu pat būdu, remiantis reikalingu tyrimui anglies kiekiu, atsižvelgiant į masės spektrometro jautrumą, — replėmis uždaryti kapsulę, — kiekviena kapsulė turi būti visiškai sandari. Jei taip nėra, ji turi būti atmesta ir paruošta nauja kapsulė; — kiekvienam bandiniui paruošti dvi kapsules, — kapsules padėti atitinkamoje elementų analizatoriaus automatinio bandinių keitiklio vietoje. Kiekvieną kapsulę tinkamai pažymėti serijos numeriu, — kapsules su darbiniu standartu visuomet dėti bandinių serijos pradžioje ir gale, — į bandinių serijas reguliariai įterpti kontrolinius bandinius;

b)

elementų analizatoriaus ir masės spektrometro patikrinimas ir nustatymas: — nustatyti elementų analizatoriaus krosnies temperatūrą ir helio bei deguonies srautą, kad bandinys būtų optimaliai sudegintas, — patikrinti elementų analizatoriaus ir masės spektrometro sistemų sandarumą (pavyzdžiui, išmatuojant m/z = 28 jonų srovę, kuri atitinka N2), — nustatyti masės spektrometrą jonų srovėms m/z = 44, 45 ir 46 matuoti, — prieš pradedant tirti bandinius, patikrinti sistemą naudojant žinomą kontrolinį bandinį;

c)

priemonių serijų nustatymas Bandiniai, sudėti ant elementų analizatoriaus (arba chromatografo) automatinio bandinių keitiklio, tiriami iš eilės. Anglies dioksidas, gautas sudeginus kiekvieną bandinį, patenka į masės spektrometrą, kuriame išmatuojamos jonų srovės. Su prietaisais sujungtas kompiuteris užrašo jonų srovių stiprumą ir apskaičiuoja kiekvieno bandinio δ vertę (9 skirsnis).

9.   APSKAIČIAVIMAS

Šio metodo tikslas – nustatyti 13C/12C izotopų kiekį etanolyje, gautame iš vyno arba vynuogių produktų po fermentavimo. 13C/12C izotopų kiekį galima išreikšti jo nuokrypiu nuo darbinio etalono. Tokiu atveju anglies 13 (δ13 C) izotopinis nuokrypis apskaičiuojamas delta skalėje tūkstantosiomis dalimis (δ/1 000), palyginant bandinio tyrimų rezultatus su darbiniu standartu, kalibruotu pagal pirminį tarptautinį etaloną (V-PDB). δ 13C vertės darbinio standarto atžvilgiu išreiškiamos taip:

δ13Cech/ref ‰ = 1 000 × (Rech-Rref)/Rref

kai Rech ir Rref yra atitinkamai 13C/12C izotopų kiekiai bandinyje ir anglies diokside naudojamame kaip etaloninės dujos.

δ 13C vertės, atsižvelgiant į V-PDB, išreiškiamos taip:

δ13Cech/V-PDB ‰ = δ13Cech/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cech/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

kai δ13Cref/V-PDB yra anksčiau nustatytasis darbinio standarto izotopinis nuokrypis nuo V-PDB.

Tyrimų metu dėl skirtingų tyrimų sąlygų gali atsirasti nedidelių nukrypimų. Šiuo atveju bandinio δ 13C vertės turi būti pakoreguotos atsižvelgiant į skirtumą tarp išmatuotos standartinio darbinio bandinio δ13C vertės ir jo tikrosios vertės, prieš tai kalibruotos pagal V-PDB lyginant su viena iš tarptautinių pamatinių medžiagų. Skirtumą tarp dviejų standartinio darbinio bandinio matavimų rezultatų, o tuo pačiu ir bandinių tyrimo rezultatų korekciją, galima laikyti tiesiogine priklausomybe. Bandinių serijos tyrimas turi būti pradėtas ir užbaigtas standartinio darbinio bandinio tyrimu. Tada, remiantis tiesiogine priklausomybe, gali būti apskaičiuotas kiekvieno bandinio tyrimo rezultatų korekcijos koeficientas.

10.   KOKYBĖS UŽTIKRINIMAS IR KONTROLĖ

Patikrinti, ar darbinio etalono 13C vertė nesiskiria nuo leistinos daugiau nei 0,5 ‰. Kitu atveju reikia patikrinti ir, jei būtina, suderinti spektrometro įrangos nustatymus.

Kiekvieno bandinio atveju, patikrinti, ar skirtumas tarp dviejų iš eilės tirtų to paties bandinio kapsulių tyrimo rezultatų neviršija 0,3 ‰. Galutinis pateikto bandinio tyrimo rezultatas yra abiejų bandinio kapsulių rezultatų vidurkis. Jei nuokrypis viršija 0,3 ‰, tyrimas turi būti pakartotas.

Patikrinti, ar apskaičiavimai yra tikslūs, galima remiantis m/z = 44 jonų srovės stiprumu, kuris yra proporcingas į elementų analizatorių įpurkštos anglies kiekiui. Standartinėmis sąlygomis tiriamų bandinių jonų srovės stiprumas turėtų būti beveik pastovus. Žymus nuokrypis gali būti dalies etanolio nugaravimo (pavyzdžiui, nesandari kapsulė) arba elementų analizatoriaus ar masės spektrometro nestabilumo pasekmė.

11.   METODO TAIKYMO CHARAKTERISTIKOS (tikslumas)

Pirmaisiais tarplaboratoriniais tyrimais (11.1 skirsnis) buvo tirti alkoholio turintys distiliatai, gauti iš vyno, cukranendrių ir runkelių, o taip pat įvairūs šių trijų rūšių skirtingos kilmės alkoholių mišiniai. Kadangi šis tyrimas neapima paties distiliavimo proceso, buvo atsižvelgta ir į papildomą informaciją, gautą iš kitų tarplaboratorinių vyno tyrimų (11.2 skirsnis), ir ypač iš izotopų matavimų tinkamumo tyrimų (11.3 skirsnis). Rezultatai rodo, kad įvairios distiliavimo sistemos, ir ypač naudojant SNIF-NMR atlikti matavimai, esant normalioms sąlygoms, δ13C kiekį alkoholyje nustato be žymių nukrypimų. Bendrųjų tyrimų metu (11.1 skirsnis) gauti tikslumo distiliatų parametrai yra beveik identiški vyno tikslumo parametrams.

11.1.   Bendrieji distiliatų tyrimai

Tarplaboratorinių tyrimų metai:	1996
Laboratorijų skaičius	20
Mėginių skaičius:	6 bandiniai, lyginami dvigubai koduotu tyrimu
Tyrimo objektas:	δ 13C iš etanolio

Bandinių kodas	Alkoholis, gautas iš vyno	Alkoholis, gautas iš runkelių	Alkoholis, gautas iš cukranendrių
A & G	80 %	10 %	10 %
B & C	90 %	10 %	0 %
D & F	0 %	100 %	0 %
E & I	90 %	0 %	10 %
H & K	100 %	0 %	0 %
J & L	0 %	0 %	100 %

Ėminiai	A/G	B/C	D/F	E/I	H/K	J/L
Laboratorijų skaičius, atmetus klaidingus rezultatus	19	18	17	19	19	19
Priimtų rezultatų skaičius	38	36	34	38	38	38
Vidutinė vertė (δ13C) ‰	–25,32	–26,75	–27,79	–25,26	–26,63	–12,54
Sr2	0,0064	0,0077	0,0031	0,0127	0,0069	0,0041
Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) ‰	0,08	0,09	0,06	0,11	0,08	0,06
Pakartojamumo riba r (2,8 × Sr) ‰	0,22	0,25	0,16	0,32	0,23	0,18
SR 2	0,0389	0,0309	0,0382	0,0459	0,0316	0,0584
Pakartojamumo standartinis nuokrypis (SSR) ‰	0,20	0,18	0,20	0,21	0,18	0,24
Pakartojamumo riba R (2,8 × SR) ‰	0,55	0,49	0,55	0,60	0,50	0,68

11.2.   Tarplaboratoriniai dviejų vyno rūšių ir vienos alkoholio rūšies tyrimai

Tarplaboratorinių tyrimų metai:	1996
Laboratorijų skaičius	14 vynų distiliavimui, iš jų 7 tuo pat metu ir δ13C vyno etanolyje kiekio nustatymui 8 δ13C kiekio nustatymui alkoholio bandiniuose
Mėginių skaičius:	3 (9,3 % koncentracijos baltasis vynas, 9,6 % koncentracijos raudonasis vynas ir 93 % m/m alkoholis)
Tyrimo objektas:	δ13C iš etanolio

Ėminiai	Raudonasis vynas	Baltasis vynas	Alkoholis
Laboratorijų skaičius	7	7	8
Priimtų rezultatų skaičius	7	7	8
Vidutinė vertė (δ13C) ‰	–26,20	–26,20	–25,08
Pakartojamumo pasiskirstymas SR 22	0,0525	0,0740	0,0962
Pakartojamumo standartinis nuokrypis (SR) ‰	0,23	0,27	0,31
Pakartojamumo riba R (2,8 × SR) ‰	0,64	0,76	0,87

Tyrimuose dalyvavusios laboratorijos naudojo skirtingas distiliavimo sistemas. Bet kurioje laboratorijoje atliktų izotopų δ13C tyrimų visuose distiliatuose rezultatai nėra klaidinantys ar žymiai nukrypę nuo vidutinių verčių. Rezultatų pasiskirstymą (S2 = 0,0059) galima palyginti su bendrųjų distiliatų tyrimų pakartojamumo pasiskirstymu Sr2 (11.1 skirsnis).

11.3.   Izotopų matavimų tinkamumo tyrimų rezultatai

Nuo 1994 metų gruodžio mėnesio reguliariai atliekami tarptautiniai izotopų vynuose ir alkoholiuose (96 % koncentracijos distiliatai) matavimų tinkamumo tyrimai. Pagal šių tyrimų rezultatus tyrimuose dalyvaujančios laboratorijos gali patikrinti jų tyrimų kokybę. Statistinė duomenų analizė sudaro sąlygas įvertinti matavimų nukrypimus, atsirandančius tomis pačiomis sąlygomis, ir tuo pačiu nustatyti pasiskirstymo ir palyginamumo ribas. Toliau pateiktoje lentelėje apibendrinti δ13C vyno ir distiliato etanolyje nustatymo rezultatai:

Data	Vynas				Distiliatai
	N	SR	SR 2	R	N	SR	SR 2	R
1994 metų gruodžio mėn.	6	0,210	0,044	0,59	6	0,151	0,023	0,42
1995 metų birželio mėn.	8	0,133	0,018	0,37	8	0,147	0,021	0,41
1995 metų gruodžio mėn.	7	0,075	0,006	0,21	8	0,115	0,013	0,32
1996 metų kovo mėn.	9	0,249	0,062	0,70	11	0,278	0,077	0,78
1996 metų birželio mėn.	8	0,127	0,016	0,36	8	0,189	0,036	0,53
1996 metų rugsėjo mėn.	10	0,147	0,022	0,41	11	0,224	0,050	0,63
1996 metų gruodžio mėn.	10	0,330	0,109	0,92	9	0,057	0,003	0,16
1997 metų kovo mėn.	10	0,069	0,005	0,19	8	0,059	0,003	0,16
1997 metų birželio mėn.	11	0,280	0,079	0,78	11	0,175	0,031	0,49
1997 metų rugsėjo mėn.	12	0,237	0,056	0,66	11	0,203	0,041	0,57
1997 metų gruodžio mėn.	11	0,127	0,016	0,36	12	0,156	0,024	0,44
1998 metų kovo mėn.	12	0,285	0,081	0,80	13	0,245	0,060	0,69
1998 metų birželio mėn.	12	0,182	0,033	0,51	12	0,263	0,069	0,74
1998 metų rugsėjo mėn.	11	0,264	0,070	0,74	12	0,327	0,107	0,91
Svertinis vidurkis		0,215	0,046	0,60		0,209	0,044	0,59
N : tyrimuose dalyvaujančių laboratorijų skaičius.

11.4.   Pakartojamumo ir palyginamumo ribos

Pirmiau pateiktose lentelėse pateikti skirtingų tarplaboratorinių tyrimų duomenys leidžia nustatyti šio metodo, įskaitant distiliavimo stadiją, pakartojamumo ir palyginamumo ribas:

pakartojamumo riba r: 0,24

palyginamumo riba R: 0,6.

11   SUMINIS RŪGŠTINGUMAS (OIV-AS-313-01-ACITOT) – I TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽTIS

Suminis vyno rūgštingumas yra jo titruojamų rūgštingumų suma, kai jis titruojamas iki pH 7, naudojant etaloninį šarminį tirpalą.

Anglies dioksidas nėra įtraukiamas į suminį rūgštingumą.

2.   METODO ESMĖ

Potenciometrinis titravimas ar titravimas naudojant bromtimolio mėlynąjį kaip indikatorių ir palyginimas su ekvivalentinio taško spalvos standartu.

3.   REAGENTAI

3.1.   Buferinis tirpalas pH 7,0:

kalio dihidrofosfatas (KH2PO4): 107,3 g

1 M natrio hidroksido (NaOH) tirpalas: 500 ml

vandens iki: 1 000 ml.

taip pat galima naudoti parduodamus buferinius tirpalus.

3.2.   0,1 M natrio hidroksido (NaOH) tirpalas

3.3.   4 g/l bromtimolio mėlynojo indikatoriaus tirpalas:

bromtimolio mėlynasis (C27H28Br2O5S) …	4 g
neutralus etilo alkoholis, 96 % tūrio …	200 ml
Ištirpinkite ir įpilkite:
vandens, iš kurio pašalintas CO2 …	200 ml
M natrio hidroksido tirpalas
kol susidaro mėlynai žalia spalva (pH 7)…	7,5 ml
vandens iki…	1 000 ml

4.   APARATŪRA

4.1.   Vakuuminis vandens siurblys.

4.2.   500 ml vakuuminė kolba.

4.3.   Potenciometras su pH skale ir elektrodais. Stiklinis elektrodas turi būti laikomas distiliuotame vandenyje. Kalomelio/sotaus kalio chlorido elektrodas turi būti laikomas sočiame kalio chlorido tirpale. Dažniausiai naudojamas sujungtasis elektrodas – jis turi būti laikomas distiliuotame vandenyje.

4.4.   Matavimo cilindrai: 50 ml (vynui), 100 ml (rektifikuotai koncentruotai misai).

5.   DARBO EIGA

5.1.   Bandinio paruošimas

5.1.1.   Vynai

Anglies dioksido pašalinimas. Į vakuuminę kolbą įpilkite apie 50 ml vyno: su vandens siurbliu išsiurbkite iš kolbos orą, kad susidarytų vakuumas. Vyną kolboje reikia nuolat plakti.

5.1.2.   Rektifikuota koncentruota misa

Įpilkite 200 g tiksliai pasvertos rektifikuotos koncentruotos misos. Iki 500 ml žymės praskieskite vandeniu. Sumaišykite.

5.2.   Potenciometrinis titravimas

5.2.1.   Prietaiso, matuojančio pH, kalibravimas

Pagal gamintojo instrukcijas pH-metras yra kalibruojamas naudoti esant 20 °C temperatūrai su pH 7,00 buferiniu tirpalu, kurio temperatūra yra 20 °C.

5.2.2.   Nustatymo metodas

Į matavimo cilindrą (4.4 skirsnis ) įpilkite tam tikrą bandinio, kuris paruošiamas pagal 5.1 skirsnyje aprašytą metodiką, kiekį: jei tai vynas, – 10 ml, jei rektifikuota koncentruota misa, – 50 ml. Tada įpilkite apie 10 ml distiliuoto vandens bei iš biuretės toliau lašinkite 0,1 M natrio hidroksido tirpalą (3.2 skirsnis), kol pH pasiekia 7 esant 20 °C temperatūrai. Šarmo tirpalas pilamas pamažu, nuolat maišant. Laikykime, kad n ml yra įpiltas 0,1 M NaOH kiekis.

5.3.   Titravimas su indikatoriumi (bromtimolio mėlynasis)

5.3.1.   Išankstinis bandymas: ekvivalentinio taško spalvos nustatymas.

Į matavimo cilindrą (4.4 skirsnis) įpilkite 25 ml virinto distiliuoto vandens, 1 ml bromtimolio mėlynojo tirpalo (3.3 skirsnis) ir pagal 5.1 skirsnį paruošto tirpalo: 10 ml – jei tai yra vynas, arba 50 ml – jei tai rektifikuota koncentruota misa. Pilkite 0,1 M natrio hidroksido tirpalo (3.2), kol spalva tampa mėlynai žalia. Tada įpilkite 5 ml pH 7 buferinio tirpalo (3.1).

5.3.2.   Titravimas

Į matavimo cilindrą (4.4 skirsnis) įpilkite 30 ml virinto distiliuoto vandens, 1 ml bromtimolio mėlynojo tirpalo (3.3 skirsnis) ir pagal 5.1 skirsnį paruošto bandinio: 10 ml – jei tai yra vynas, arba 50 ml – jei tai rektifikuota koncentruota misa. Įpilkite 0,1 M natrio hidroksido tirpalo (3.2 skirsnis), kol bus gauta tokia pat spalva, kaip ir atlikus išankstinį bandymą (5.3.1 skirsnis). Laikykime, kad n ml yra įpiltas 0,1 M natrio hidroksido kiekis.

6.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

6.1.   Skaičiavimo metodas

6.1.1.   Vynai

Suminis rūgštingumas, išreikštas miliekvivalentais litre, yra apskaičiuojamas pagal formulę:

A = 10 n.

Jis užrašomas su vienu skaičiumi po kablelio.

Suminis rūgštingumas, išreikštas vyno rūgšties gramais litre, yra apskaičiuojamas pagal formulę:

A′ = 0,075 × A

Jis užrašomas su vienu skaičiumi po kablelio.

6.1.2.   Rektifikuota koncentruota misa

—	Suminis rūgštingumas, išreikštas miliekvivalentais suminio cukrų kiekio kilogramui, apskaičiuojamas pagal formulę: A = 5 × n

—	Suminis rūgštingumas, išreikštas miliekvivalentais suminio cukrų kiekio kilogramui, yra apskaičiuojamas pagal formulę: — A = (500 n)/P — P = procentinė suminio cukrų kiekio koncentracija (m/m).

Jis užrašomas su vienu skaičiumi po kablelio.

6.2.   Pakartojamumas (r), kai atliekamas titravimas su indikatoriumi(5.3)

r	=	0,9 miliekvivalento/litre;
r	=	0,07 g vyno rūgšties/litre.

Taikoma baltiesiems, rausviesiems ir raudoniesiems vynams.

6.3.   Atkuriamumas (R), kai atliekamas titravimas su indikatoriumi (5.3):

Baltiesiems ir rausviesiems vynams: R = 3,6 miliekvivalento/litre; R = 0,3 g vyno rūgšties/litre.

Raudoniesiems vynams: R = 5,1 miliekvivalento/litre; R = 0,4 g vyno rūgšties/litre.

12   LAKIOSIOS RŪGŠTYS (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – I TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽTIS

Lakiąsias rūgštis sudaro visos vyne esančios acto rūgšties homologinės eilės rūgštys, laisvos arba kaip druskos.

2.   METODO ESMĖ

Lakiųjų rūgščių pašalinimas iš vyno, distiliuojant su vandens garais ir distiliato titravimas.

Pirmiausia iš vyno pašalinamas anglies dioksidas.

Laisvo ir surišto sieros dioksido, kuris buvo išdistiliuotas tokiomis sąlygomis, rūgštingumas turi būti atimtas iš distiliato rūgštingumo.

Taip pat turi būti atimtas ir bet kurios sorbo rūgšties, kuri galėjo būti įmaišyta į vyną, rūgštingumas.

Pastaba:

Taip pat distiliate yra dalis salicilo rūgšties, kadangi kai kurios šalys naudoja ją vynams stabilizuoti prieš analizę. Tai turi būti nustatyta ir atimta iš rūgštingumo vertės. Nustatymo metodas yra pateiktas šio skyriaus 7 skirsnyje.

3.   REAGENTAI

3.1.   Kristalinė vyno rūgštis (C4H6O6).

3.2.   0,1 M natrio hidroksido tirpalas (NaOH).

3.3.   1 % fenolftaleino tirpalas 96 % tūrio neutraliame alkoholyje.

3.4.   Druskos rūgštis (ρ20 = 1,18– ,19 g/ml), skiesta santykiu 1: 4 (v/v).

3.5.   0,005 M jodo (I2) tirpalas

3.6.   Kristalinis kalio jodidas (KJ).

3.7.   5 g/l krakmolo tirpalas.

Sumaišykite 5 g krakmolo su maždaug 500 ml vandens. Užvirkite nuolat maišydami ir pavirinkite apie 10 minučių. Įpilkite 200 g natrio chlorido. Kai tirpalas atvėsta, praskieskite, kad susidarytų 1 litras.

3.8.   Sotus natrio borato (Na2B4O7, 10 H2O) tirpalas, t. y. apie 55 g/l, esant 20 °C temperatūrai.

4.   APARATŪRA

4.1.   Distiliavimo garais aparatą sudaro:

1)	Garų generatorius: garuose neturi būti anglies dioksido.

2)	Kolba su garų vamzdeliu.

3)	Distiliavimo kolonėlė.

4)	Kondensatorius.

Ši aparatūra turi būti tris kartus išbandyta tokiu būdu:

a)	į kolbą įpilkite 20 ml virinto vandens. paimkite 250 ml distiliato ir į jį įpilkite 0,1 ml 0,1 M natrio hidroksido tirpalo (3.2 skirsnis) bei įlašinkite du lašus fenolftaleino tirpalo (3.3 skirsnis). Rožinė spalva turi neišnykti mažiausiai 10 sekundžių (t. y. garai be anglies dioksido);

b)	į kolbą įpilkite 20 ml 0,1 M acto rūgšties tirpalo. Surinkite 250 ml distiliato. Titruokite 0,1 M natrio hidroksido tirpalu (3.2 skirsnis): mažiausias naudojamo tirpalo kiekis turi būti 19,9 ml (t.y. mažiausiai 99,5 % acto rūgšties buvo nudistiliuota su vandens garais);

c)	į kolbą įpilkite 20 ml 1 M pieno rūgšties tirpalo. Paimkite 250 ml distiliato ir titruokite rūgštį su 0,1 M natrio hidroksido tirpalu (3.2 skirsnis).

Įpiltas natrio hidroksido kiekis turi būti mažesnis arba lygus 1,0 ml (t. y. nudistiliuota ne daugiau kaip 0,5 % pieno rūgšties).

Bet koks aparatas ar metodas, su kuriais buvo atlikti šie bandymai ir gauti patenkinami rezultatai, atitinka reikalavimus, keliamus oficialiems tarptautiniams aparatams ar metodams.

4.2.   Vandens siurblys.

4.3.   Vakuuminė kolba.

5.   DARBO EIGA

5.1.   Mėginio paruošimas anglies dioksido pašalinimas.

Į vakuuminę kolbą įpilkite apie 50 ml vyno: su vandens siurbliu iš kolbos išsiurbkite orą, kad susidarytų vakuumas. Vakuumas kolboje turi būti vieną dvi minutes. Vyną kolboje reikia nuolat plakti.

5.2.   Distiliavimas su vandens garais

Į kolbą įpilkite 20 ml vyno, iš kurio buvo pašalintas anglies dioksidas, kaip aprašyta 5.1 skirsnyje. Įdėkite apie 0,5 g vyno rūgšties (3.1 skirsnis). Paimkite ne mažiau kaip 250 ml distiliato.

5.3.   Titravimas

Titruokite 0,1 M natrio hidroksido tirpalu (3.2 skirsnis) ir įlašinkite du lašus fenolftaleino (3.3 skirsnis), kuris bus indikatoriumi.

Įlašinkite keturis lašus druskos rūgšties (3.4 skirsnis), skiestos 1: 4 santykiu, įpilkite 2 ml krakmolo tirpalo (3.3) ir įmeskite keletą kalio jodido kristalų (3.6 skirsnis). Nutitruokite laisvą sieros dioksidą 0,005 M jodo tirpalu (3.5 skirsnis). Laikykite, kad n′ ml yra sunaudotas kiekis.

Įpilkite sotaus natrio borato tirpalo (3.8 skirsnis), kol vėl atsiras rožinė spalva. Titruokite surištą sieros dioksidą 0,005 M jodo tirpalu (3.5 skirsnis). Laikykite, kad n″ ml yra sunaudotas kiekis.

6.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

6.1.   Skaičiavimo metodas

Lakusis rūgštingumas, išreikštas miliekvivalentais litre su vienu skaičiumi po kablelio, yra skaičiuojamas taip:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″).

Lakusis rūgštingumas, išreikštas acto rūgšties gramais litre su dviem skaičiais po kablelio, yra skaičiuojamas pagal formulę:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″).

6.2.   Pakartojamumas (r)

r	=	0,7 miliekvivalento/litre;
r	=	0,04 g acto rūgšties/litre.

6.3.   Atkuriamumas (R)

R	=	1,3 miliekvivalento/litre;
R	=	0,08 g acto rūgšties/litre.

6.4.   Vynas, kuriame yra sorbo rūgšties

Kadangi 96 % sorbo rūgšties yra nudistiliuojama su vandens garais į 250 ml distiliato, jos rūgštingumas turi būti atimamas iš lakiojo rūgštingumo, kai žinoma, kad 100 mg sorbo rūgšties atitinka 0,86 miliekvivalentus rūgštingumo arba 0,053 g acto rūgšties, ir kai žinoma sorbo rūgšties koncentracija mg/l, kuri nustatoma kitais metodais.

7.   Į DISTILIATĄ PATEKUSIOS SALICILO RŪGŠTIES NUSTATYMAS, ŽINANT LAKŲJĮ RŪGŠTINGUMĄ

7.1.   Principas

Nustačius lakiąsias rūgštis ir padarius pataisas dėl sieros dioksido bei parūgštinus distiliatą, salicilo rūgšties buvimą parodo violetinės spalvos atsiradimas įdėjus geležies (III) druskos.

Salicilo rūgštis, esanti distiliate, turinčiame lakiųjų rūgščių, nustatoma antrame tokio paties kiekio distiliate, kuriam buvo nustatinėjamas lakusis rūgštingumas. Šiame distiliate salicilo rūgštis nustatoma lyginamuoju kolorimetriniu metodu. Jos kiekis yra atimamas iš lakiųjų rūgščių distiliato rūgštingumo.

7.2.   Reagentai

7.2.1.   Druskos rūgštis (HCl) (ρ20 = 1,18 – 1,19 g/ml).

7.2.2.   Natrio tiosulfatas (Na2 S2 O35 H2O), 0,1 M tirpalas.

7.2.3.   10 % (m/V) geležies (III) amonio sulfatas (Fe2 (SO4)3 (NH4)2 SO4 × 24 H2O).

7.2.4.   0,01 M natrio salicilatas. Tirpalas, kuriame yra 1,60 g/l natrio salicilato (Na C7 H5 O3).

7.3.   Darbo eiga

7.3.1.   Salicilo rūgšties nustatymas lakiųjų rūgščių distiliate

Nustatę lakųjį rūgštingumą ir pakoregavę laisvo ir surišto sieros dioksido kiekį, iš karto į kūginę kolbą įpilkite 0,5 ml druskos rūgšties (7.2.1 skirsnis), 3 ml 0,1 M natrio tiosulfato tirpalo (7.2.2 skirsnis) ir 1 ml geležies (III) amonio sulfato tirpalo (7.2.3 skirsnis).

Jei yra salicilo rūgšties, atsiranda violetinė spalva.

7.3.2.   Salicilo rūgšties nustatymas

Ant pirmiau minėtos kolbos pasižymėkite distiliato tūrį. Tada iš kolbos išpilkite distiliatą ir ją praskalaukite.

Paimkite naują 20 ml vyno bandinį ir išdistiliuokite su vandens garais. Gautą distiliatą surinkite į tą pačią kūginę kolbą iki pažymėtos padalos. Įpilkite 0,3 ml grynos druskos rūgšties (7.2.1 skirsnis) ir 1 ml geležies (III) amonio sulfato tirpalo (7.2.3 skirsnis). Kūginėje kolboje esantis turinys nusidažo violetine spalva.

Į kūginę kolbą, kuri yra visiškai vienoda kaip ir kolba, turinti pažymėtą padalą, įpilkite tiek pat distiliuoto vandens, kiek yra distiliato. Įpilkite 0,3 ml grynos druskos rūgšties (7.2.1 skirsnis) ir 1 ml geležies (III) amonio sulfato tirpalo (7.2.3 skirsnis). Iš biuretės įlašinkite 0,01 M natrio salicilato tirpalo (7.2.4 skirsnis), kol atsiradusi violetinė spalva tampa tokia pati kaip ir kūginėje kolboje su vyno distiliatu.

Laikykite, kad n″ ml yra įpilto iš biuretės tirpalo kiekis.

7.4.   Pataisa dėl lakiųjų rūgščių

Atimkite kiekį 0,1 × n″ ml iš 0,1 M natrio hidroksido tirpalo kiekio n ml, kuris naudojamas distiliato rūgštingumui titruoti, kai nustatinėjamas lakusis rūgštingumas.

13   CITRINŲ RŪGŠTIS (OIV -AS-313-09-ACIENZ) – II TIPO METODAS

1.   METODO ESMĖ

Katalizinama citratliaze (CL) citrinų rūgštis skyla į oksalacetatą ir acetatą:

Citratas ←→ oksalacetatas + acetatas

Vykstant malato dehidrogenazei (MDH) ir laktato dehidrogenazei (LDH), oksalacetatas ir jo dekarboksilinimo produktas — piruvatas redukuojami į L-malatą ir L-laktatą, naudojant redukuotą nikotinamidadenindinukleotidą (NADH):

Oksalacetatas + NADH + H+ ←→ L-malatas + NAD+

Piruvatas + NADH + H+ ←→ L-laktatas+ NAD+

NADH kiekis, kuris šiose reakcijose oksiduojasi į NAD+, yra proporcingas esamam citrato kiekiui. NADH oksidacija yra matuojama, kai sumažėjimu absorbcija, o bangos ilgis yra 340 nm.

2.   REAGENTAI

2.1.   Buferinis tirpalas pH 7,8

(0,51 M glicilglicinas; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10– 3M):

Ištirpinkite 7,13 g glicilglicino maždaug 70 ml bidistiliato.

Nustatykite pH 7,8, naudodami maždaug 13 ml 5 M natrio hidroksido, įpilkite 10 ml cinko chlorido (ZnCl2) tirpalo, 80 mg į 100 ml ir praskieskite bidistiliatu, kad susidarytų 100 ml.

Šis tirpalas tinka naudoti mažiausiai keturias savaites, esant 4 °C temperatūrai.

2.2.   Redukuoto nikotinamidadenindinukleotido (NADH) tirpalas apie 6.10- 3 M: Ištirpinkite 30 mg NADH ir 60 mg NaHCO3 6 ml bidistiliato.

2.3.   Malato dehidrogenazės/laktato dehidrogenazės tirpalas (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml):

Sumaišykite 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml) ir 0,4 ml amonio sulfato tirpalo (3,2 M ir 0,5 l LDH (5 mg/ml). Ši suspensija patvari mažiausiai metus, jei laikoma esant 4 °C temperatūrai.

2.4.   Citratliazė (CL, 5 mg baltymo/ml): Ištirpinkite 168 mg liofilizato 1 ml ledinio vandens. Šis tirpalas patvarus mažiausiai savaitę, laikant 4 °C temperatūroje, o užšaldytas – mažiausiai keturias savaites.

Rekomenduojama prieš bandymus patikrinti fermentų aktyvumą.

2.5.   Polivinilpolipirolidonas (PVPP).

Pastaba: visus reagentus galima nusipirkti.

3.   APARATŪRA

3.1.   Spektrofotometras, kuriuo matuojama, kai bangos ilgis yra 340 nm, nes tuomet NADH absorbcija yra maksimali.

Jei tokio nėra, galima naudoti spektrofotometrą su diskretinio spektro šaltiniu, kuris leidžia atlikti matavimus, kai bangos ilgis yra 334 nm ar 365 nm. Kadangi yra atliekami absoliučios absorbcijos matavimai (t. y. nenaudojamos kalibravimo kreivės, tačiau etalonavimas yra atliekamas pagal NADH ekstinkcijos koeficientą), reikia patikrinti bangų ilgių skalę ir prietaiso absorbcijos spektrą.

3.2.   1 cm storio stiklo kiuvetės ar vienkartinės kiuvetės.

3.3.   Mikropipetės, skirtos įpilti nuo 0,02 ml iki 2 ml.

4.   BANDINIO PARUOŠIMAS

Citratas yra paprastai nustatomas tiesiogiai vyne, todėl nebūtina preliminariai panaikinti pigmentacijos (spalvos) ir nereikia skiesti, tačiau tik tuomet, kai citrinų rūgšties kiekis yra mažesnis negu 400 mg/l. Jei taip nėra, praskieskite vyną tiek, kad citrato koncentracija būtų nuo 20 mg/l iki 400 mg/l (t. y. 5-80 μg citrato analizuojamame bandinyje).

Analizuojant raudonuosius vynus, kuriuose yra daug fenolio junginių, rekomenduojama vyną pirmiausia apdoroti su PVPP.

Ištirpinkite apie 0,2 g PVPP vandenyje ir palikite 15 minučių. Po to filtruokite su rievėtu filtru.

Į 50 ml kūginę kolbą įpilkite 10 ml vyno, su mentele sudėkite nuo filtro drėgną PVPP. Plakite dvi tris minutes. Filtruokite.

5.   DARBO EIGA

Su spektrofotometru, nustatytu 340 nm bangos ilgiui, ir naudodami 1 cm kiuvetes išmatuokite absorbciją. Kaip nulinį absorbcijos etaloną naudokite orą (be kiuvetės šviesos kelyje). Į 1 cm kiuvetes supilkite:

	Palyginamasis tirpalas	Titravimas
Tirpalas Nr. 2,1	1,00 ml	1,00 ml
Tirpalas Nr. 2,2	0,10 ml	0,10 ml
Bandinys	—	0,20 ml
Bidistiliatas	2,00 ml	1,80 ml
Tirpalas 2,3	0,02 ml	0,02 ml

Sumaišykite. maždaug po penkių minučių, nustatykite tirpalų optinį tankį kiuvetėje su palyginamuoju ir su bandinio tirpalu (A1).

Papildoma:

Tirpalas Nr. 2,4

0,02 ml

0,02 ml

Sumaišykite. Palaukite, kol pasibaigia reakcija (apie penkias minutes) ir užsirašykite tirpalų palyginamojoje ir bandinio kiuvetėje optinio tankio vertes (A2).

Apskaičiuokite palyginamosios ir bandinio kiuvečių optinio tankio verčių skirtumą(A1–A2).

Galiausiai apskaičiuokite skirtumą tarp gautų rezultatų:

ΔA = ΔAD – ΔAT

Pastaba: įvairių bandinių partijų fermentų aktyvumui pasibaigti reikalingas laikas gali skirtis. Anksčiau nurodytas laikas yra tik orientacinis; Rekomenduojama, kad jis būtų nustatinėjamas kiekvienai partijai atskirai.

6.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

Citrinų rūgšties koncentracija nurodoma miligramais litre, suapvalinant iki sveikojo skaičiaus.

6.1.   Skaičiavimo metodas

Bendra formulė koncentracijai mg/l apskaičiuoti yra tokia:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

V	=	kontrolinio tirpalo kiekis ml (šiuo atveju 3,14 ml);
v	=	bandinio kiekis ml (šiuo atveju 0,2 ml);
PM	=	medžiagos, kuri bus nustatyta, molekulinė masė (šiuo atveju bevandenės citrinų rūgšties masė yra M = 192,1)
d	=	kiuvetės storis cm (šiuo atveju 1 cm);
ε	=	NADH absorbcijos koeficientas: 340 nm,
ε	=	6,3 mmole– 1 × l × cm– 1.

Taigi:

C = 479 × ΔA

Jeigu bandinys ruošiant buvo praskiestas, rezultatas padauginamas iš praskiedimo faktoriaus.

Pastaba: Matavimas, kai bangos ilgis 334 nm: C = 488 × ΔA (ε = 6,2 mmole– 1 × l × cm- 1)

Matavimas, kai bangos ilgis 365 nm: C = 887 × ΔA (ε = 3,4 mmole- 1 × l × cm– 1)

6.2.   Pakartojamumas (r)

Citrinų rūgšties koncentracija mažesnė negu 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Citrinų rūgšties koncentracija didesnė negu 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3.   Atkuriamumas (R)

Citrinų rūgšties koncentracija mažesnė negu 400 mg/l: Citrinų rūgšties koncentracija, didesnė negu R = 39 mg/l.

Citrinų rūgšties koncentracija didesnė negu 400 mg/l: Citrinų rūgšties koncentracija, didesnė negu R = 65 mg/l.

14   SORBO RŪGŠTIS (OIV-AS-313-14-ACISOR) – IV TIPO METODAS

1.   METODŲ ESMĖ

1.1.   Nustatymas naudojant ultravioletinės absorbcijos spektrofotometriją

Sorbo rūgštis (trans, trans, 2,4-heksadieno rūgštis), ekstrahuota distiliuojant vandens garais, yra nustatoma vyno distiliate, naudojant ultravioletinės absorbcijos spektrofotometriją. Medžiagos, kurios trukdo nustatyti ultravioletinėje srityje, yra pašalinamos, sausai išgarinant vyną, esant silpnam šarmui, kalcio hidroksidui. Įrodant mažesnio už 20 mg/l kiekio buvimą, naudojama plonasluoksnė chromatografija.(jautris: 1 mg/l)

1.2.   Nustatymas naudojant dujų chromatografiją

Sorbo rūgštis, ekstrahuojama etileteriu, yra nustatoma dujų chromatografija, naudojant vidinį etaloną.

1.3.   Rūgšties pėdsakų nustatymas naudojant plonasluoksnę chromatografiją

Sorbo rūgštis, ekstrahuojama etileteriu, yra išskiriama naudojant plonasluoksnę chromatografiją, o jos koncentracija įvertinama pusiau kiekybiškai.

2.   NUSTATYMAS NAUDOJANT ULTRAVIOLETINĖS ABSORBCIJOS SPEKTROFOTOMETRIJĄ

2.1.   Reagentai

2.1.1.   Kristalinė vyno rūgštis (C4H6O6).

2.1.2.   Kalcio hidroksido Ca(OH)2 tirpalas, apytiksliai 0,02M.

2.1.3.   Etaloninis sorbo rūgšties tirpalas (20 mg/l).

Ištirpinkite 20 mg sorbo rūgšties (C6H8O2), maždaug 2 ml 0,1 M natrio hidroksido tirpalo. Supilkite tirpalą į 1 000 ml matavimo kolbą ir iki žymės praskieskite vandeniu. Taip pat vandenyje galima ištirpinti 26,8 mg kalio sorbato (C6H7KO2), ir praskiesti vandeniu, kad susidarytų 1 000 ml tirpalo.

2.2.   Aparatūra

2.2.1.   Distiliavimo garais aparatas (žr. skyrių „Lakiosios rūgštys“).

2.2.2.   Verdančio vandens vonia.

2.2.3.   Spektrofotometras, kuris leidžia išmatuoti absorbciją esant bangos ilgiui 256 nm, naudojant 1 cm storio kvarco kiuvetę.

2.3.   Darbo eiga

2.3.1.   Distiliavimas

Į distiliavimo garais aparato kolbą įpilkite 10 ml vyno ir įdėkite 1-2 g vyno rūgšties (2.1.1). Surinkite 250 ml distiliato.

2.3.2.   Kalibravimo kreivės braižymas

Praskieskite etaloninį tirpalą (2.1.3 skirsnis) tokiu santykiu, kad gautumėte keturis etaloninius tirpalus, kuriuose būtų atitinkamai 0,5 mg, 1,0 mg, 2,5 mg ir 5 mg sorbo rūgšties litre. Spektrofotometru esant bangos ilgiui 256 nm, išmatuokite jų optinio tankio vertes, palyginimui naudodami distiliuotą vandenį. Optinio tankio priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesinė. Gautas grafikas yra tiesė.

2.3.3.   Titravimas

Įpilkite 5 ml distiliato į garinimo lėkštę, kurios skersmuo yra 55 mm, ir 1 ml kalcio hidroksido tirpalo (2.1.2 skirsnis). Garinkite ant vandens vonios, kol liks sausos liekanos.

Ištirpinkite nuosėdas keliuose mililitruose distiliuoto vandens, supilkite visą tirpalą į 20 ml matavimo kolbą ir iki žymės praskieskite vandeniu, kuriuo plovėte lėkštę su nuosėdomis. Spektrofotometru išmatuokite absorbciją, kai bangos ilgis – 256 nm, kaip palyginamąjį tirpalą naudodami tirpalą, gautą praskiedus 1 ml kalcio hidroksido tirpalo (2.1.2 skirsnis) 20 ml vandens.

Raskite išmatuotą optinio tankio vertę kalibravimo kreivėje ir nustatykite sorbo rūgšties koncentraciją C tirpale.

Pastaba: Taikant šį metodą, galima neatsižvelgti į nuostolius dėl garinimo. Matuojamas apdoroto distiliato, kuris skiedžiamas distiliuotu vandeniu santykiu ¼, optinis tankis

2.4.   Rezultatų užrašymas

2.4.1.   Skaičiavimo metodas

Sorbo rūgšties koncentracija vyne (mg/l) yra apskaičiuojama pagal formulę:

100 × C

kurioje C sorbo rūgšties koncentracija (mg/l) tirpale, kuris buvo analizuotas taikant spektrofotometrijos metodą.

3.   NUSTATYMAS NAUDOJANT DUJŲ CHROMATOGRAFIJĄ

3.1.   Reagentai

3.1.1.   Etileteris (C2H5)2O, distiliuotas prieš pat naudojimą.

3.1.2.   Vidinio etalono tirpalas: undekano rūgšties (C11H22O2), 1 g/l koncentracijos tirpalas 95 % etilo alkoholyje.

3.1.3.   Vandeninis sieros rūgšties (H2SO4) tirpalas (ρ20 = 1,84 g/ml), skiestas santykiu 1: 3 (V/V).

3.2.   Aparatūra

3.2.1.   Dujų chromatografas su liepsnos jonizacijos detektoriumi ir nerūdijančio plieno kolonėlė (4 m × ⅓ colio), kuri iš anksto buvo apdorota su dimetildichlorsilanu ir užpildyta nejudamąja faze, kurią sudaro 2,2'–oksidietanolio sukcinato (5 %) ir fosforo rūgšties (1 %) mišinys (DEGS – H3PO4) arba 2,2'-oksidietanolio adipato (7 %) ir fosforo rūgšties (1 %) mišinys (DEGA – H3PO4) skiepytas Gaschrom Q, 80-100 mešų.

Kolonėlės apdorojimas su DMDCS: perleiskite per kolonėlę tirpalą, kuriame yra 2–3 g toluene ištirpinto DMDCS. Po to tuoj pat išplaukite kolonėlę su metanoliu, vėliau su azotu ir galiausiai išplaukite su heksanu ir vėl azotu. Dabar kolonėlė yra paruošta užpildyti.

Darbo sąlygos:

Krosnies temperatūra: 175 °C.

Inžektoriaus ir detektoriaus temperatūra: 230 °C.

Nešiklis: azotas (tekėjimo greitis – 200 ml/min).

3.2.2.   10 μl talpos mikrošvirkštas, sugraduotas kas 0,1 μl.

Pastaba: galima naudoti kitas kolonėlių rūšis, kurios užtikrina gerą atskyrimą, ypač kapiliarines kolonėles (pvz. FFAP).

Aprašytas darbo metodas yra pateikiamas kaip pavyzdys.

3.3.   Darbo eiga

3.3.1.   Analizuojamo bandinio paruošimas

Į stiklinį mėgintuvėlį su šlifo kamščiu, kurio talpa yra apytiksliai 40 ml, įpilkite 20 ml vyno, 2 ml vidinio etalono tirpalo (3.1.2 skirsnis) bei 1 ml praskiestos sieros rūgšties (3.1.3 skirsnis).

Tirpalą maišykite kartais apversdami mėgintuvėlį, po to į tirpalą įpilkite dar 10 ml etileterio (3.1.1 skirsnis). Ekstrahuokite sorbo rūgštį į organinį sluoksnį, plakdami mėgintuvėlio turinį penkias minutes. Leiskite nusistovėti.

3.3.2.   Etaloninio tirpalo paruošimas

Paimkite vyną, kurio eterinio ekstrakto chromatogramoje nėra sorbo rūgšties eliuavimo smailės. Įpilkite į tokį vyną sorbo rūgšties, kurios koncentracija yra 100 mg/l. Apdorokite 20 ml taip paruošto bandinio pagal 3.3.1 skirsnyje aprašytą metodiką.

3.3.3.   Chromatografija

Į chromatografą su mikrošvirkštu paeiliui įšvirkškite 2 μl eterinio ekstrakto, kuris buvo gautas pagal 3.3.2 skirsnį ir 2 μl eterinio ekstrakto, kuris buvo gautas pagal 3.3.1 skirsnį.

Užrašykite atitinkamas chromatogramas: patikrinkite sorbo rūgšties ir vidinio etalono sulaikymo trukmių atitikimą. Išmatuokite kiekvienos užrašytos smailės aukštį (arba išmatuokite plotą).

3.4.   Rezultatų užrašymas

3.4.1.   Skaičiavimo metodas

Sorbo rūgšties koncentracija (mg/l) analizuojamame vyne yra apskaičiuojama pagal formulę:

100 × (h/H) × (l/i)

H= sorbo rūgšties smailės aukštis etaloniniame tirpale;

h= sorbo rūgšties smailės aukštis analizuojamame tirpale;

l= vidinio etalono smailės aukštis etaloniniame tirpale;

i= vidinio etalono smailės aukštis analizuojamame tirpale.

Pastaba: Sorbo rūgšties koncentraciją galima nustatyti matuojant atitinkamos smailės plotą.

15   PH (OIV-AS-313-15-PH) – I TIPO METODAS

1.   METODAS

Išmatuojamas potencialų skirtumas tarp dviejų bandomajame skystyje įmerktų elektrodų. Vieno šių elektrodų potencialas yra skysčio pH funkcija, o kito potencialas yra fiksuotas ir žinomas. Jis yra palyginamasis elektrodas.

2.   APARATŪRA

2.1.   pH matavimo prietaisas, kurio skalė sugraduota pH vienetais, leidžia pamatuoti mažiausiai ± 0, 05 pH vieneto tikslumu.

2.2.   Elektrodai:

2.2.1.   Stiklinis elektrodas, laikomas distiliuotame vandenyje.

2.2.2.   Sotus kalomelio palyginamasis elektrodas, laikomas sočiame kalio chlorido tirpale.

2.2.3.   Arba kombinuotas elektrodas, laikomas distiliuotame vandenyje.

3.   REAGENTAI

3.1.   Buferiniai tirpalai

3.1.1.   Sotus kalio hidrotartrato tirpalas. Jame ne mažiau kaip 5,7 g kalio hidrotartrato litre (C4H5KO6), kai temperatūra 20 °C. Šį tirpalą galima laikyti iki dviejų mėnesių, į 200 ml įdedant 0,1 g timolio.

pH	3,57, kai temperatūra 20 °C 3,56, kai temperatūra 25 °C 3,55, kai temperatūra 30 °C

3.1.2.   Kalio hidroftalato 0,05 M tirpalas. Jame ne mažiau kaip 5,7 g kalio hidrotartrato litre (C4H5KO6), kai temperatūra 20 °C. (Didžiausia laikymo trukmė – du mėnesiai.)

pH	3,999, kai temperatūra 15 °C 4,003, kai temperatūra 20 °C 4,008, kai temperatūra 25 °C 4,015, kai temperatūra 30 °C

3.1.3.   Tirpalas, kuriame yra:

kalio dihidrofosfato KH2 PO4 …	3,402 g
kalio hidrofosfato K2 H PO4 …	4,354 g
vandens iki …	1 l

(Didžiausia laikymo trukmė – du mėnesiai)

pH	6,90, kai temperatūra 15 °C 6,88, kai temperatūra 20 °C 6,86, kai temperatūra 25 °C 6,85, kai temperatūra 30 °C

Pastaba: taip pat galima naudoti parduodamus buferinius tirpalus.

4.   DARBO EIGA

4.1   Analizuojamo bandinio paruošimas

4.1.1.   Misos ir vyno atveju:

naudokite misą ar vyną be jokių papildomų procedūrų.

4.1.2.   Rektifikuotos koncentruotos misos atveju:

praskieskite rektifikuotą koncentruotą misą vandeniu, kad suminė cukrų koncentracija būtų apie 25 ± 0, 5 % (m/m) (25° pagal Brikso skalę).

Jei P – suminė cukrų koncentracija (m/m) procentais rektifikuotoje koncentruotoje misoje, pasverkite 2 500/P

ir praskieskite vandeniu, kad būtų 100 g tirpalo. Naudojamo vandens laidumas turi būti 2 mikrosimensai/cm.

4.2   Nulio nustatymas

Prieš pradedant matavimus reikia nustatyti aparato nulinį tašką. Jis nustatomas pagal aparato instrukcijas.

4.3.   Prietaiso, matuojančio pH, kalibravimas

pH matavimo prietaisas kalibruojamas esant 20 °C temperatūrai ir naudojant buferinius 20 °C temperatūros tirpalus, kurių pH 6,88 ir 3,57.

Skalės kalibravimui patikrinti, esant 20 °C temperatūrai, naudokite buferinį tirpalą, kurio pH 4,00.

4.4.   Matavimas

Į analizuojamą tirpalą, kurio temperatūra turi būti 20-25 °C ir kiek galima arčiau 20 °C, įmerkite elektrodą. pH vertė skaitoma tiesiogiai skalėje.

To paties bandinio pH matuokite mažiausiai du kartus.

Galutinis rezultatas – matavimo rezultatų aritmetinis vidurkis.

5.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

Misos, vyno ar 25 % (m/m) (25o pagal Brikso skalę) rektifikuotos koncentruotos misos tirpalo pH užrašoma su dviem skaičiais po kablelio.

16   L-ASKORBO RŪGŠTIES IR D-IZOASKORBO RŪGŠTIES VIENALAIKIS KIEKIO NUSTATYMAS PAGAL HPLC IR NAUDOJANT UV DETEKTORIŲ (OIV-AS-313-22-ACASCO) – II TIPO METODAS

1.   ĮVADAS

Askorbo rūgštis yra antioksidantas, natūraliai esantis daugelyje maisto produktų. Įprastinis askorbo rūgšties kiekis vynuogėse sumažėja ruošiant misą ir gaminant vyną. Laikantis tam tikrų ribų jos galima įdėti į misą ir vyną.

Aprašytasis metodas patvirtintas, tarplaboratoriniais tyrimais, atlikus vyno, į kurį įpilta atitinkamai nuo 30 mg/l iki 150 mg/l L-askorbo rūgšties ir nuo 10 mg/l iki 100 mg/l D-izoaskorbo rūgšties, bandinių analizes.

2.   TAIKYMAS:

Šis metodas tinkamas L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties (eritorbo rūgšties) vienalaikiam kiekio vyne nustatymui, naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją ir UV detektorių kai kiekis yra nuo 3 iki 150 mg/l.

Jei koncentracija didesnė kaip 150 mg/l, bandinį būtina skiesti.

3.   METODAS

Bandiniai tiesiogiai įterpiami į sistemą HLPC, prieš tai perfiltravus per membraninį filtrą. Tiriamosios medžiagos atskiriamos kolonėlėje, taikant atvirkštinių fazių chromatografiją, ir apdorojamos UV detektoriumi, kai bangos ilgis 266 nm. L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties kiekio rezultatas apskaičiuojamas pagal išorinį etaloną.

Pastaba: Kolonėlės ir veikimo sąlygos nurodyti tik kaip orientaciniai. Ir naudojant kitas kolonėlių rūšis gali būti užtikrintas geras atskyrimas.

4.   REAGENTAI IR PRODUKTAI

4.1   Reagentai

4.1.1   n-oktilaminas, grynumas ≥ 99,0 %

4.1.2   Natrio acetatas x 3 H2O, grynumas ≥ 99,0 %

4.1.3   Gryna acto rūgštis, 100 %

4.1.4   Fosforo rūgštis, apie 25 %

4.1.5   Oksalo rūgštis, grynumas ≥ 99,0 %

4.1.6   Oksidazės askorbatas

4.1.7   L-askorbo rūgštis, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8   D-izoaskorbo rūgštis, grynumas ≥ 99,0 %

4.1.9   Bidistiliatas

4.1.10   Metanolis, apie 99,8 %

4.2   Judančiosios fazės parengimas

4.2.1   Judančiojoje fazėje naudojami tirpalai

Judančiajai fazei paruošti tokius tirpalus:

4.2.1.1   Ištirpinkite12,93 g n-oktilamino 100 ml metanolio.

4.2.1.2   68,05 g natrio acetato x 3 H2O praskieskite 500 ml bidistiliato.

4.2.1.3   12,01 g grynos acto rūgšties praskieskite 200 ml bidistiliato

4.2.1.4   Buferinis tirpalas (pH 5,4): 430 ml natrio acetato tirpalo(4.2.1.2) ir 70 ml acto rūgšties tirpalo (4.2.1.3)

4.2.2   Judančiosios fazės parengimas:

Įpilkite 5 ml n-oktilamino tirpalo (4.2.1.1) į apie 400 ml bidistiliato laboratorinėje stiklinėje. Pasiekite, kad tirpalo pH būtų nuo 5,4 iki 5,6, įlašindami 25 % stiprumo fosforo rūgšties (4.1.4). Įpilti 50 ml buferinio tirpalo (4.2.1.4) ir mišinį perpilti į 1 000 ml matavimo kolbą, po to papildomai įpilti bidistiliato. Prieš pradedant naudoti judančiosios fazės tirpalą reikia perfiltruoti membrana (iš regeneruotosios 0,2 μm celiuliozės) ir, jei įmanoma, pašalinti dujas heliu (apie 10 min), atsižvelgiant į naudojamos sistemos HLPC poreikius.

4.3   Etaloninio tirpalo paruošimas

Pastaba:

Visi etaloniniai tirpalai ( pradinis tirpalas 4.3.1 skirsnis ir darbiniai tirpalai 4.3.2 skirsnis) turi būti ruošiami kas dieną ir, pageidautina, kad prieš įpurškimą būtų laikomi šaldytuve.

4.3.1   Pradinio tirpalo paruošimas (1 mg/ml)

Paruošti vandeninį 2 % oksalo rūgšties tirpalą ir panaudojant azoto burbuliukus pašalinti ištirpusį deguonį.

Pasvėrus tiksliai 100 mg L-askorbo rūgšties ir 100 mg D-izoaskorbo rūgšties 100 ml matavimo kolboje ir įpilti pripildyti vandeninio 2 % oksalo rūgšties tirpalo.

4.3.2   Darbinių tirpalų paruošimas

Ruošiant darbinį tirpalą, praskiesti pagrindinį tirpalą (4.3.1 vandeniniu 2 % oksalo rūgšties tirpalu iki pageidaujamos koncentracijos. Rekomenduojama koncentracija – nuo 10 mg/l iki 120 mg/l. Pavyzdžiui 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl 1 200 μl praskiedus 10 ml atitinkamai gaunama 10, 20, 40, 80 et 120 mg/l.

5.   APARATŪRA

Įprastiniai ir toliau nurodyti laboratoriniai įrenginiai:

5.1   HLPC siurblys

5.2   20 μl kilpinis inžektorius

5.3   UV detektorius

6.   PAVYZDŽIŲ ATRANKA

Vyno bandiniai filtruojami membrana, kurios skylučių diametras prieš įpurškimą – 0,2 μm.

Jei koncentracija didesnė kaip 150 mg/l, bandinį būtina skiesti.

7.   DARBO EIGA

7.1   Sistemos HLPC naudojimo sąlygos

Į chromatografinį aparatą įpurkšti 20 μl membrana perfiltruoto bandinio.

Prieškolonėlė	:	Pavyzdžiui Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm)
Stulpelis	:	Pavyzdžiui Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm)
Įpurškiamas kiekis	:	20 μl
Judrioji fazė	:	Žr.4.2.2, izokratinis
Srautas	:	1 ml/min
UV detektorius	:	266 nm
Plovimo ciklas	:	ne mažiau kaip 30 ml bidistiliato, po to – 30 ml metanolio ir 30 ml acetonitrilo.

7.2   Identifikavimas/Patvirtinimas

Smailės nustatomos lyginant etalonų ir bandinių sulaikymo laiką. Naudojant pavyzdyje aprašytą chromatografinę sistemą, sulaikymo trukmė yra atitinkamai 7,7 min L-askorbo rūgšties atveju ir 8,3 min D-izoaskorbo rūgšties atveju (žr. paveikslėlį, chromatograma A).

Kad teigiami rezultatai būtų patvirtinti, bandinius reikia apdoroti įdedant vieną mentelę oksidazės askorbato ir pamatuoti iš naujo (žr.1 paveikslėlį, chromatograma B).

Kadangi oksidazės askorbatas sukelia L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties suirimą, Sulaikymo trukmėje neturėtų likti jokių L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties požymių. Jei nustatoma trukdančių smailių, jų paviršių reikia įtraukti apskaičiuojant tiriamųjų medžiagų koncentraciją.

Pastaba: Oksidazės askorbatu apdorotus bandinius rekomenduojama analizuoti prieš tai juos nuskalavus, kad nuo kolonėlės būtų pašalinti oksidazės askorbato likučiai, nes kitaip L-askorbo rūgštis ir D-izoaskorbo rūgštis dėl oksidazės askorbato likučių gali konvertuotis atliekant matavimus HPLC ir dėl to rezultatai būtų iškraipyti.

8.   SKAIČIAVIMAI

Paruošti kalibracinę kreivę, naudojant darbinius tirpalus(4.3.2). Pagal išorinio etalono metodą L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties kiekis nustatomas išmatuojant smailių plotus ir juos palyginant su tokios pačios koncentracijos kalibracine kreive.

Rezultatų užrašymas

L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties rezultatai atitinkamai nurodomi mg/l, su vienu skaičiumi po kablelio (pavyzdžiui, 51,3 mg/l).

Kai koncentracija didesnė už 150 mg/l, atsižvelgti į praskiedimą.

9.   TIKSLUMAS

Metodas išbandytas 1994 metais per tarplaboratorinį bandymą, kurį atliko Visuomenės higienos federalinis biuras( Bundesgesundheitsamt, Vokietija), ir kuriame dalyvavo 27 laboratorijos. Tarplaboratorinis bandymo programa vykdyta, laikantis Vokietijos maisto produktų įstatymo 35 straipsnio, jai pritarė OIV, kol nebus pradėtas naudoti naujas protokolas (OENO 6/2000).

Buvo ištirti keturi skirtingi vynų bandiniai – du baltojo ir du raudonojo vyno – kiekvieną bandinį tiriant penkis kartus. Kadangi paruošti bandinių su pakankamu tiriamųjų medžiagų stabilumu (nes jų irimo greičiai skirtingi) nebuvo įmanoma, nuspęsta dalyviams išsiųsti nustatyto dydžio grynas etalonines medžiagas ir vyno bandinius. Laboratorijoms nurodyta etalonus kiekybiškai perkelti į vyno bandinius ir iš karto atlikti analizę. Atlikta nuo 30 iki 150 mg/l analizė L-askorbo rūgšties atveju ir nuo 10 iki 100 mg/l analizė D-izoaskorbo rūgšties atveju. Išsamūs tyrimo rezultatai pateikti OIV paskelbtame PRIEDE. Vertinimas atliktas pagal DIN/ISO 5725 (1988 m. versija).

Pakartojamumo standartinis nuokrypis (sr) ‰ atkuriamumas (sR) atitiko L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties koncentraciją. Tikrojo tikslumo parametras gali būti apskaičiuotas pagal tokias lygtis:

L-askorbo rūgštis sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: L-askorbo rūgšties koncentracija (mg/l)

D-izoaskorbo rūgštis sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: D-izoaskorbo rūgšties koncentracija (mg/l)

Pavyzdys

50 mg/l D-izoaskorbo rūgšties sr = 1,0 mg/L

sR = 5,2 mg/L

10.   KITI ANALIZĖS DUOMENYS

10.1   Nustatymo riba

Šio metodo nustatymo riba yra 3 mg/l L-askorbo rūgšties ir D-izoaskorbo rūgšties atveju.

10.2   Tikslumas

Vidutinis regeneravimas, apskaičiuotas su keturiais bandiniais, vykdant tarplaboratorinius bandymus (žr. OIV rinkinio PRIEDĄ) buvo:

—	D-izoaskorbo rūgšties – 100,6 %

—	D-izoaskorbo rūgšties – 103,3 %

17   ANGLIES DVIDEGINIS (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – II TIPO METODAS

1.   METODO ESMĖ

1.1.   Ramūs vynai (CO2slėgis ≤ 0,5 × 105 Pa)  (2)

Paimtas vyno bandinys atvėsinamas iki maždaug 0 °C ir sumaišomas su pakankamu kiekiu natrio hidroksido, kad pH vertė būtų 10-11. Toliau titruojama rūgšties tirpalu, dalyvaujant karboanhidrazei. Anglies dioksido kiekis apskaičiuojamas pagal rūgšties kiekį, kuris reikalingas pH 8,6 vertei (hidrokarbonato jonas) pakeisti į 4,0 (anglies rūgštis). Siekiant nustatyti, kokį natrio hidroksido tirpalo kiekį sunaudoja vyno rūgštys, tokiomis pačiomis sąlygomis atliekamas dekarbonizuoto vyno tuščiasis titravimas.

1.2.   Putojantys ir pusiau putojantys vynai

Analizuojamo vyno bandinys atvėsinamas beveik iki užšalimo temperatūros. Iš butelio nupilamas tam tikras vyno kiekis, kuris bus naudojamas tuščiajam bandymui po dekarbonizacijos. Butelyje likęs vynas pašarminamas, kad visas anglies dioksidas virstų Na2CO3. Toliau titruojama rūgšties tirpalu, dalyvaujant karboanhidrazei. Anglies dioksido kiekis apskaičiuojamas pagal rūgšties kiekį, kuris reikalingas pH 8,6 vertei (hidrokarbonato jonas) pakeisti į 4,0 (anglies rūgštis). Siekiant nustatyti, kokį natrio hidroksido tirpalo kiekį sunaudoja vyno rūgštys, tokiomis pačiomis sąlygomis atliekamas dekarbonizuoto vyno tuščiasis titravimas.

2.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS

2.1.   Ramūs vynai (CO2 slėgis ≤ 0,5 × 105 Pa)

2.1.1.   Aparatūra

2.1.1.1.   Magnetinė maišyklė.

2.1.1.2.   pH matavimo prietaisas.

2.1.2.   Reagentai

2.1.2.1.   0,1 M natrio hidroksido tirpalas (NaOH).

2.1.2.2.   0,05 M sieros rūgšties tirpalas (H2SO4).

2.1.2.3.   Karboanhidrazės (1 g/l) tirpalas.

2.1.3.   Darbo eiga

Atvėsinkite vyno bandinį iki maždaug 0 °C kartu su 10 ml bandinių pipete.

Į 100 ml laboratorinę stiklinę įpilkite 25 ml natrio hidroksido tirpalo (2.1.2.1 skirsnis) ir įlašinkite du lašus vandeninio karboanhidrazės tirpalo (2.1.2.3 skirsnis). Su atvėsinta iki 0 °C pipete įpilkite 10 ml vyno.

Padėkite stiklinę ant magnetinės maišyklės, įstatykite pH elektrodą ir vidutiniškai maišykite.

Kai skysčio temperatūra pasiekia kambario temperatūrą, lėtai titruokite tirpalą sieros rūgšties tirpalu (2.1.2.2 skirsnis), kol pH tampa 8.6.

Toliau titruokite tirpalą sieros rūgšties tirpalu (2.1.2.2 skirsnis), kol pH tampa 4,0. Laikykime, kad n ml yra kiekis, sunaudotas mažinant pH nuo 8,6 iki 4,0.

Iš maždaug 50 ml vyno bandinio pašalinkite CO2. Tai atliekama taip: tris minutes vakuume maišykite vyną esantį kolboje, kuri šildoma vandens vonioje iki 25 °C temperatūros.

Atlikite tokią pačią procedūrą su 10 ml dekarbonizuoto vyno. Laikykime n′ ml yra sunaudotas kiekis.

2.1.4.   Rezultatų užrašymas

1 ml 0,05 sieros rūgšties M tirpalo atitinka 4,4 mg CO2.

CO2 kiekis (g/l) vyne yra apskaičiuojamas pagal formulę:

0,44 (n – n′)

Rezultatas užrašomas su dviem skaičiais po kablelio.

Pastaba: jei vynuose CO2 yra mažai (CO2< 1 g/l), nebūtina dėti karboanhidrazės, kuri katalizuoja CO2 hidrataciją.

2.2.   Putojantys ir pusiau putojantys vynai

2.2.1.   Aparatūra

2.2.1.1.   Magnetinė maišyklė.

2.2.1.2.   pH matavimo prietaisas.

2.2.2.   Reagentai

2.2.2.1.   50 % (m/m) natrio hidroksidas (NaOH).

2.2.2.2.   0,05 M sieros rūgšties tirpalas (H2SO4).

2.2.2.3.   Karboanhidrazės (1 g/l) tirpalas.

2.2.3.   Darbo eiga

Pažymėkite vyno lygį butelyje ir tada aušinkite, kol vynas pradeda užšalti.

Leiskite buteliui truputį sušilti. Vyną suplakite, kad ištirptų ledo kristalai.

Greitai ištraukite kamštį ir į matavimo cilindrą pripilkite 45-50 ml vyno tuščiajam titravimui. Tikslus nupilto vyno kiekis v ml yra nustatomas pagal žymę ant cilindro, kai vynas sušyla iki kambario temperatūros.

Nupylę bandinį tuščiajam titravimui, tuoj pat į 750 ml butelį įpilkite 20 ml natrio hidroksido tirpalo (2.2.2.1 skirsnis).

Palaukite, kol vynas sušils iki kambario temperatūros.

Į 100 ml laboratorinę stiklinę įpilkite 30 ml virinto distiliuoto vandens ir įlašinkite du lašus karboanhidrazės tirpalo (2.2.2.3 skirsnis). Įpilkite 10 ml pašarminto vyno.

Padėkite stiklinę ant magnetinės maišyklės, į stiklinę įstatykite elektrodą bei įmeskite magnetinį strypelį ir maišykite vidutiniu greičiu.

Lėtai titruokite tirpalą sieros rūgšties tirpalu (2.2.2.2 skirsnis), kol pH tampa 8,6.

Toliau lėtai titruokite tirpalą su sieros rūgšties tirpalu (2.2.2.2 skirsnis), kol pH tampa 4,0. Laikykime, kad n ml yra kiekis, sunaudotas mažinant pH nuo 8,6 iki 4,0.

Iš v ml vyno, palikto tuščiajam titravimui, pašalinkite CO2 Tai daroma taip: tris minutes vakuume maišykite vyną esantį kolboje, kuri šildoma iki 25 °C temperatūros vandens vonioje. Nupilkite 10 ml dekarbonizuoto vyno, į jį įpilkite 30 ml virinto distiliuoto vandens bei įlašinkite du tris lašus natrio hidroksido tirpalo (2.2.2.1 skirsnis), kad pH būtų 10-11. Toliau vadovaukitės pirmiau aprašyta procedūra. Laikykime, n' yra įpiltas 0,05 M sieros rūgšties kiekis.

2.2.4.   Rezultatų užrašymas

1 ml 0,05 M sieros rūgšties atitinka 4,4 mg CO2.

Išpilkite iš butelio pašarmintą vyną ir 1 ml tikslumu nustatykite pradinį vyno tūrį: iki žymės pripilto vandens tūris bus V ml.

CO2 kiekis (g/l) vyne apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

0,44 (n – n′) × ((V – v + 20)/(V – v))

Rezultatas užrašomas su dviem skaičiais po kablelio.

2.3.   Teorinio perteklinio slėgio skaičiavimas

Viršslėgis, esant 20 °C temperatūrai (Paph20) išreiškiamas paskaliais ir apskaičiuojamas pagal formulę:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

kurioje:

Q	:	CO2 kiekis (g/l) vyne
A	:	vyno alkoholio stiprumas, esant 20 °C temperatūrai
S	:	cukraus kiekis (g/l) vyne;
P atm	:	atmosferos slėgis, išreikštas paskaliais

18   ANGLIES DIOKSIDO NUSTATYMAS VYNE, NAUDOJANT MANOMETRINĮ METODĄ (OIV-AS314-04-CO2MAN) – II TIPO METODAS

(p.m.)

[Šio analizės metodo aprašymą atnaujina OIV tarnybos. Jis bus paskelbtas kitame Komisijos pranešime, kai tik OIV atnaujintas tekstas bus paskelbtas OIV Tarptautinių vyno ir misos analizės metodų rinkinio 2010 metų leidime.]

19   PUSIAU PUTOJANČIŲ IR PUTOJANČIŲ VYNŲ SPAUDIMO PERTEKLINIO SLĖGIO MATAVIMAS (OIV-AS-314-02-SURPRES) – I TIPO METODAS

1.   METODAS

Kai temperatūra stabilizuojasi ir butelio turinys suplakamas, perteklinis slėgis matuojamas afrometru (spaudimo matuoklis). Jis išreiškiamas paskaliais (Pa) (I tipo metodas). Metodas taip pat taikomas gazuotiems pusiau putojantiems vynams ir gazuotiems putojantiems vynams.

2.   APARATŪRA

Prietaisas, kuriuo matuojamas perteklinis slėgis pusiau putojančio ir putojančio vyno buteliuose, vadinamas afrometru. Jis gali būti įvairių formų, atsižvelgiant į tai, kaip užkimštas butelis (metalinis viršus, užsukamas kamštis, kamštis iš kamščiamedžio ar plastikinis kamštis).

2.1.   Buteliai su metaliniu viršumi ar užsukamu kamščiu

Prietaisą sudaro trys dalys (1 paveikslas):

—

Viršutinė dalis (adatos laikiklis su sriegiu) sudaryta iš manometro, rankinio veržiančiojo žiedo, į viduriniąją dalį įsriegiamo Archimedo sraigto ir kamštį perduriančios adatos. Adatoje yra šoninė anga, per kurią spaudimas perduodamas į manometrą. Tarpine užtikrinamas hermetiškumas tarp butelio kamščio ir prietaiso.

—	Vidurinioji dalis (veržlė) padeda centruoti viršutinę dalį. Ji įsukama į apatinę dalį ir tvirtai laiko prietaisą ant butelio.

—	Apatinė dalis (spaustuvas) turi galinį kakliuką, kuris palenda po butelio žiedu ir laiko visą prietaisą. Žiedai yra pritaikyti kiekvienam butelio tipui.

2.2.   Buteliai su kamščiu

Prietaisą sudaro dvi dalys (2 paveikslas):

—	Viršutinė dalis yra tokia pati, kaip prieš tai aprašyto prietaiso, tačiau adata - ilgesnė. Ji sudaryta iš ilgo tuščiavidurio vamzdelio, kurio gale yra antgalis kamščiui perdurti. Šis antgalis – nuimamas. Pradūrus kamštį, antgalis įkrenta į vyną.

—	Apatinė dalis sudaryta iš veržlės ir prie kamščio priglundančio pagrindo. Pagrinde yra keturi suspaudimo varžtai, laikantys prietaisą ant kamščio.

Pastabos apie ant šių dviejų tipų prietaisų tvirtinamus manometrus:

—	jie gali būti mechaniniai su Burdono vamzdeliu, arba skaitmeniniai su pjezo elektriniu davikliu. Pirmuoju atveju Burdono vamzdelis turi būti nerūdijančio plieno.

—	manometrai sugraduoti paskaliais (santrumpa Pa). matuojant pusiau putojančių vynų slėgį, praktiškiau kaip vienetą naudoti 105 Pa ar kilopaskalį (kPa).

—

šie manometrai yra įvairių klasių. Manometro klasė priklauso nuo parodymų tikslumo, atsižvelgiant į maksimalų parodymą, išreikštą procentais (pvz., 1 000 kPa manometro I klasė reiškia, kad maksimalus 1 000 kPa slėgis išmatuojamas ±10 kPa tikslumu). Tiksliems matavimams rekomenduojamas I klasės prietaisai.

3.   DARBO EIGA

Matavimai atliekami su tais buteliais, kurių temperatūra buvo stabilizuojama mažiausiai 24 valandas. Kai praduriamas kamštis, butelio turinį reikia gerai suplakti, kol slėgis nesikeičia, ir tik tada matuoti.

3.1.   Buteliai metaliniu viršumi ar užsukamais kamščiais

Užkišti spaustuvo galinį kakliuką po butelio žiedu. Sukti veržlę tol, kol prietaisas bus prispaustas prie butelio. Įsukti viršutinę dalį į veržlę. Siekiant išvengti pernelyg didelio dujų nutekėjimo, kamštį reikia pradurti kuo greičiau ir prispausti prie jo tarpinę. Tada butelio turinį reikia gerai suplakti, kol slėgis nebesikeičia, ir tik tada matuoti.

3.2.   Buteliai su kamščiais

Užmauti antgalį ant adatos galo, tada uždėti prietaisą ant kamščio. Priveržti keturis varžtus. Sukti viršutinę dalį (adata perduria kamštį). Antgalis turi įkristi į butelį, kad slėgis būtų perduotas į manometrą. Suplakus butelį ir palaukus, kol slėgis nebesikeičia, užrašyti manometro parodymus. Išmatavus slėgį, išimti antgalį.

4.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

Perteklinis slėgis, esant 20 °C temperatūrai (Paph20) išreiškiamas paskaliais (Pa) arba kilopaskaliais (kPa). Rezultatas užrašomas pagal manometro tikslumą (pvz., 6,3 × 105 Pa arba 630 kPa, tačiau ne 6,33 × 105 Pa ar 633 kPa, jei tai I klasės manometras, kurio maksimalus rodmuo 1 000 kPa).

Jei matavimo metu temperatūra yra kita, nei 20 °C, matavimus reikia koreguoti: išmatuotas slėgis dauginamas iš atitinkamo koeficiento (žr. 1 lentelę).

1 Lentelė

Perteklinio slėgio Paph20 putojančiame ir pusiau putojančiame vyne santykis, esant 20 °C temperatūrai, su slėgio pertekliumi Papht temperatūroje

°C
0	1,85
1	1,80
2	1,74
3	1,68
4	1,64
5	1,59
6	1,54
7	1,50
8	1,45
9	1,40
10	1,36
11	1,32
12	1,28
13	1,24
14	1,20
15	1,16
16	1,13
17	1,09
18	1,06
19	1,03
20	1,00
21	0,97
22	0,95
23	0,93
24	0,91
25	0,88

5.   REZULTATŲ KONTROLĖ

Tiesioginio fizinių parametrų nustatymo metodas (I tipo kriterijaus metodas)

Afrometrų tikrinimas

Afrometrus būtina reguliariai tikrinti (mažiausiai kartą per metus).

Tikrinama su kalibravimo stendu. Jį naudojant, galima palyginti testuojamo ir kartu prijungto etaloninio aukštesnės klasės manometro, nustatyto pagal nacionalinius etalonus, parodymus. Tikrinant stebimi abiejų prietaisų parodymai iš pradžių slėgį didinant, po to mažinant. Jei parodymai skiriasi, reguliavimo varžtu galima pakoreguoti tikrinamojo manometro parodymus.

Tokį kalibravimo stendą turi visos laboratorijos ir pripažintos institucijos; jį taip pat galima įsigyti iš manometrų gamintojų.

20   LIZOCIMO NUSATYMAS VYNE, NAUDOJANT HPLC (OIV-AS-315-14) – IV TIPO METODAS

1.   ĮVADAS

Lizocimui labiau tinka naudoti analitinį metodą, nesiremiantį enzimų veikla.

2.   TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu galima nustatyti baltuosiuose ir raudonuosiuose vynuose esantį lizocimo kiekį (mg baltymo/l), neatsižvelgiant į matricos enzimų veiklą (kuri gali būti iškreipta dėl dalinio denatūravimo arba dėl kompleksodaros ir bendro nusėdimo).

3.   APIBRĖŽTIS

Naudojantis didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) galima taikyti analitinį metodą, pagrįstą nejudamojosios fazės ir bandomosios medžiagos sterinio, poliarinio ir absorbcinio tipo sąveika, nesusijusia su realia baltymo enzimų veikla.

4.   PRINCIPAS

Analizė atliekama naudojantis didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC), kartu panaudojant spektrofotometrinį detektorių ir spektrofluorimetrinį detektorių. Vyno bandinyje esančios nežinomos medžiagos apskaičiuojamos pagal hromatografinės smailės paviršiaus plotą, remiantis išorinės kalibracijos metodu.

5.   REAGENTAI

5.1.   Tirpikliai ir tirpalai

Acetonitrilas (CH3CN) HPLC analizei

Gryna trifluoracto rūgštis (TFA)

Dejonizuotas vanduo HPLC analizei

Etaloninis tirpalas: Vyno rūgštis 1 g/l, etilo alkoholis 10 % V/V, kurio pH 3,2 su neutraliu kalio partratu.

5.2.   Eliuentai

A	:	CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 %
B	:	CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3.   Etaloninių tirpalų paruošimas

Nuo 1 iki 250 mg/l etaloninio lizocimo, ištirpinto matricos tirpale, nuolat kratant ne trumpiau kaip 12 valandų.

6.   ĮRANGA

6.1.   HPLC aparatas su įsiurbimo sistema, skirtu atlikti gradientų eliuavimą.

6.2.   Kolonėlės termostato vieta

6.3.   Spektrofotometrinis detektorius kartu su spektrofluorimetriniu detektoriumi

6.4.   Įpurškimo kilpa, 20 μL

6.5.   Atvirkštinių fazių polimero kolonėlė su fenilo funkcinėmis grupėmis (skylučių diametras= 1 000 Å, nedalyvavimo riba = 1 000 000 Da), pavyzdžiui, Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID.

6.6.   Prieškolonėlė iš tokios pat medžiagos kaip kolona, pavyzdžiui Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm ID.

7.   MĖGINIO PARUOŠIMAS

Vyno bandiniai parūgštinami druskos rūgštimi HCl (10 M), skiesta santykiu 1: 10 ir filtruota poliamidiniu filtru, kurio skylučių diametras 0,22 μm, likus 5 minutėms iki papildymo. Chromatografinė analizė atliekama iš karto po filtravimo.

8.   DARBO SĄLYGOS

8.1.   Eliuento srautas: 1 ml/min

8.2.   Kolonėlės temperatūra: 30 °C

8.3.   Spektrofotometrinis detektorius: 280 nm

8.4.   Spektrofluorimetrinis detektorius: λ ex = 276 nm ; λ em = 345 nm ; Gain = 10

8.5.   Eliuavimo gradientų programa

Laikas (min)	A tirpalas %	B tirpalas %	gradientas
0	100	0
			izokratinis
3	100	0
			linijinis
10	65	35
			izokratinis
15	65	35
			linijinis
27	40,5	59,5
			linijinis
29	0	100
			izokratinis
34	0	100
			linijinis
36	100	0
			izokratinis
40	100	0

8.6.   Vidutinė lizocimo sulaikymo trukmė 25,50 minutės

9.   SKAIČIAVIMO METODAS

Etaloniniai tirpalai, kuriuose lizocimo koncentracija yra 1, 5, 10, 50, 100, 200, 250 mg/l, analizuojama tris kartus. Kiekvienos chromatogramos smailių plotas, atitinkantis lizocimą, perkialiamas į diagramą, atsižvelgiant į atitinkamą koncentraciją, kad būtų gauti tiesinės regresijos tiesių nuolydžiai, išreikšti formule Y = ax+b. Koreliacijos koeficientas r2 turi būti > 0,999.

10.   METODŲ SAVYBĖS

Siekiant nustatyti, ar metodas tinkamas suformuluotam tikslui pasiekti, buvo atlikta patvirtinimo studija, atsižvelgiant į linijiniškumą, nustatymo ribas, kiekio nustatymą ir metodo tikslumą. Pastarasis rodiklis nustatytas apibrėžiant metodo tikslumą ir patikimumą.

	Linijiškumo amplitudė (mg/l)	Nuolydžio tiesė	Koreliacijos koeficientas (r2)	LD (mg/l)	LQ (mg/l)	Pakartojamumas ( n=5) RSD%			Atkuriamumas ( n=5) RSD%
						Std1	V.R.2	V.B.3	Std1
UV	5-250	3 786	0,9993	1,86	6,20	4,67	5,54	0,62	1,93
FLD	1-250	52 037	0,9990	0,18	0,59	2,61	2,37	0,68	2,30

1 lentelė. Su metodų savybėmis susiję duomenys Std1 etaloninis tirpalas ; V.R.2 raudonasis vynas; V.B.3 baltasis vynas

10.1.   Metodų linijiniškumas

Nustatyta, kad taikant tiesinės regresijos nuolydžių analizę gauti rezultatai yra linijiniai 1 lentelėje nurodytiems plotams.

10.2.   Nustatymo ir kiekio riba

Nustatymo riba (LD) ir kiekio riba (LQ) apskaičiuotos kaip atitinkantis atitinkamai 3 ir 10 kartų chromatografinį fono signalą realios matricos darbo sąlygomis (1 lentelė).

10.3.   Metodo tikslumas

Parametrai, į kuriuos atsižvelgiama, yra pakartojamumas ir atkuriamumas. 1 lentelėje pateikiami tų parametrų duomenys (išreikšti %, kaip skirtingomis koncentracijomis pakartotų priemonių etaloninis nuokrypis), nustatyti etaloniniuose baltajam ir raudonajam vynui naudotuose tirpaluose.

10.4.   Metodo patikimumas

Procentinė regeneravimo dalis apskaičiuota pagal etaloninius tirpalus, kuriuose yra 5 ir 50 mg/l lizocimo, prie kurios pridėtas nurodytas lizocimo kiekis, kaip nurodyta toliau pateikiamoje lentelėje.

	[C] pirminis vardinis (mg/l)	Pridėjimas (mg/l)	[C] teorinis (mg/l)	[C] rastas (mg/l)	Etaloninis nuokrypis	Medžiagų regeneravimas %
UV 280 nm	50	13,1	63,1	62,3	3,86	99
FD	50	13,1	63,1	64,5	5,36	102
UV 280 nm	5	14,4	19,4	17,9	1,49	92,1
FD	5	14,4	19,4	19,0	1,61	97,7

21   SULFATAI (OIV – AS314-04-CO2MAN) – II TIPO METODAS

1.   METODŲ ESMĖ

1.1.   Etaloninis metodas

Bario sulfato nusodinimas ir svėrimas. Bario fosfatas, iškritęs tokiomis pačiomis sąlygomis, yra pašalinamas, plaunant susidariusias nuosėdas druskos rūgštimi.

Tuo atveju, jei misoje ar vyne yra didelis sieros dioksido kiekis, rekomenduojama pašalinti sulfitus, virinant bandinį hermetiškame inde.

1.2.   Greitas nustatymo metodas

Vynai yra klasifikuojami į kelias kategorijas, naudojant vadinamąjį ribų metodą, kurio esmė - bario sulfato nusodinimas titruojant bario jonais.

2.   ETALONINIS METODAS

2.1.   Reagentai

2.1.1.   2 M druskos rūgšties tirpalas.

2.1.2.   Bario chlorido tirpalas, 200 g BaCl2 2H2O.

2.2.   Darbo eiga

2.2.1.   Bendra darbo eiga

Įpilkite 40 ml analizuojamo bandinio į 50 ml centrifugos mėgintuvėlį. Taip pat įpilkite 2 ml 2 M druskos rūgšties ir 2 ml bario chlorido tirpalo, kurio koncentracija yra 200 g/l. Maišykite maišymo lazdele. Nuplaukite lazdelę su nedideliu kiekiu distiliuoto vandens ir mėgintuvėlį palikite pastovėti penkias minutes. Tada centrifuguokite penkias minutes, po to centrifugatą atsargiai nupilkite.

Bario sulfato nuosėdos plaunamos taip: įpilkite 10 ml 2 M druskos rūgšties, nuosėdas suspenduokite ir centrifuguokite penkias minutes. Tada centrifugatą atsargiai nupilkite. Pakartokite plovimo procedūrą du kartus tokiomis pačiomis sąlygomis, kiekvieną kartą panaudodami po 15 ml distiliuoto vandens.

Su distiliuotu vandeniu visas nuosėdas kiekybiškai nuplaukite į pasvertą platinos tiglį ir ant verdančio vandens vonios išgarinkite, kad liktų sausos nuosėdos. Išdžiovintos nuosėdos keletą kartų trumpai iškaitinamos, kol pasidaro baltos. Atvėsinkite jas eksikatoriuje ir pasverkite.

Laikykime, kad m yra gauto bario sulfato masė miligramais.

2.2.2.   Konkrečiai: sulfituota misa ir vynas, kuriuose yra didelis sieros dioksido kiekis.

Pirmiausia pašalinkite sieros dioksidą.

Į 500 ml kūginę kolbą, kurioje yra lašinamasis piltuvas ir išleidimo atšaka, įpilkite 25 ml vandens ir 1 ml grynos druskos rūgšties (ρ 20 = 1,15 to 1,18 g/ml). Tirpalą užvirinkite, kad iš jo išeitų oras, ir iš lašinamojo piltuvo įpilkite 100 ml vyno. Toliau virinkite, kol skysčio kiekis kolboje sumažės iki maždaug 75 ml, ir atvėsinę visą skystį supilkite į 100 ml matavimo kolbą. Įpilkite iki žymės vandens. Nustatykite sulfatus 40 ml bandinyje pagal 2.2.1 skirsnyje aprašytą metodiką.

2.3.   Rezultatų užrašymas

2.3.1.   Skaičiavimai

Sulfato kiekis kalio sulfato K2SO4 litre, išreikštas miligramais, yra:

18,67 × m

Sulfato kiekis misose ar vyne yra išreiškiamas sveiku skaičiumi miligramų kalio sulfato litre.

2.3.2.   Pakartojamumas

Iki 1 000 mg/l: r = 27 mg/l;

maždaug 1 500 mg/l: r = 41 mg/l;

2.3.3.   Atkuriamumas

Iki 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

maždaug 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22   GELEŽIS (OIV-AS-322-05-FER) – IV TIPO METODAS

1.   METODŲ ESMĖ

ETALONINIS METODAS

Atitinkamai praskiedus vyną ir pašalinus alkoholį, geležis yra nustatoma tiesiogiai, naudojant atominės absorbcijos analizę.

TRADICINIS METODAS

Po suardymo 30 % vandenilio peroksido tirpale suminė geležis, dabar jau trivalentė (Fe(III)), redukuojama į dvivalentę geležį (Fe(II)) ir nustatoma pagal spalvą, atsirandančią dėl o-fenantrolino pridėjimo.

2.   ETALONINIS METODAS

2.1.   Reagentai

2.1.1.   Koncentruotas etaloninis geležies tirpalas, kuriame yra 1 g/l Fe (III).

Naudokite etaloninį prekybinį tirpalą, kuriame yra 1 g/l fluorido. Šį tirpalą galima paruošti taip: distiliuotame vandenyje, kuris truputį parūgštinamas 1 M druskos rūgštimi, ištirpinkite 8,6341 g geležies amonio sulfato (FeNH4(SO4)2, 12H2O) ir praskieskite distiliuotu vandeniu iki 1 litro.

2.1.2.   Skiesti skirtas etaloninis geležies tirpalas, kuriame yra 100 mg/l geležies.

2.2.   Aparatūra

2.2.1.   Sukamasis garintuvas su termostatuojama vandens vonia.

2.2.2.   Atominės absorbcijos spektrofotometras su oro ir acetileno degikliu.

2.2.3.   Geležies lempa su tuščiaviduriu katodu.

2.3.   Darbo eiga

2.3.1.   Bandinio paruošimas

Su sukamuoju garintuvu (50-60 °C) iš vyno pašalinkite alkoholį ir sumažinkite bandinio tūrį per pusę. Tada pripilkite distiliuoto vandens, kad vėl būtų pradinis bandinio tūris.

Jei reikia, prieš analizę bandinį praskieskite.

2.3.2.   Kalibravimas

Į rinkinio 100 ml matavimo kolbas įpilkite atitinkamai 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml ir 5 ml tirpalo, kuriame yra 100 mg/l geležies (2.1.2 skirsnis), ir iki 100 ml praskieskite distiliuotu vandeniu. Taip paruoštuose tirpaluose yra atitinkamai 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l ir 5 mg/l geležies.

Šiuos tirpalus laikykite polietileno buteliuose.

2.3.3.   Titravimas

Nustatomas 248,3 nm bangos ilgis. Su distiliuotu vandeniu nustatykite optinio tankio nulį. Įpurkškite skiestą bandinį tiesiogiai į spektrofotometro degiklį, o po to penkis etaloninius tirpalus, kaip nurodyta 2.3.2 skirsnyje. Užrašykite optinio tankio vertes. Matuokite po du kartus.

2.4.   Rezultatų užrašymas

2.4.1.   Skaičiavimo metodas

Nubraižykite grafiką, kaip kinta optinio tankio vertės pagal geležies koncentraciją etaloniniuose tirpaluose. Šiame grafike raskite nustatytą vidutinę praskiesto vyno bandinio optinio tankio vertę ir apskaičiuokite geležies koncentraciją C.

Geležies koncentracija (mg/l), užrašoma ir apskaičiuojama pagal formulę suapvalinus iki vieno skaičiaus po kablelio:

C × F

F= praskiedimo faktorius.

23   VARIS (OIV – AS 322-06) – IV TIPO METODAS

1.   METODO ESMĖ

Naudojama atominės absorbcijos analizė.

2.   APARATŪRA

2.1.   Platinos lėkštelė.

2.2.   Atominės absorbcijos spektrofotometras.

2.3.   Vario lempa su tuščiaviduriu katodu.

2.4.   Dujų tiekimas: oras ir acetilenas arba azoto (I) oksidas/acetilenas.

3.   REAGENTAI

3.1.   Metalinis varis.

3.2.   65 % koncentruota azoto rūgštis (HNO3, ρ20 = 1,38 g/ml.

3.3.   Praskiesta azoto rūgštis santykiu 1: 2 (V/V).

3.4.   Tirpalas, kuriame yra 1 g/l vario.

Naudokite parduodamą etaloninį vario tirpalą. Šį tirpalą galima paruošti taip: pasverkite 1 000 g metalinio vario ir viską atsargiai supilkite į 1 000 ml matavimo kolbą. Įpilkite pakankamą kiekį praskiestos 1: 2 (V/V) azoto rūgšties (3.3), kad ištirptų metalas, po to 10 ml koncentruotos azoto rūgšties (3.2) ir iki žymės pripilkite bidistiliato.

3.5.   Tirpalas, kuriame yra 100 mg/l vario.

Į 100 ml matavimo kolbą įpilkite 10 ml tirpalo, kuris buvo paruoštas pagal 3.4 skirsnį, ir iki žymės įpilkite bidistiliato.

4.   DARBO EIGA

4.1.   Bandinio paruošimas ir vario nustatymas

Paimkite 20 ml bandinio, įpilkite jį į 100 ml matavimo kolbą ir iki žymės praskieskite distiliuotu vandeniu. Jei reikia, skiedinį pakoreguokite.

Pagal atominės absorbcijos spektrofotometrą nustatykite praskiesto bandinio absorbcija, kai bangos ilgis 324,8 nm, prtieš tai su distiliuotu vandeniu nustačius optinio tankio nulį. Jei reikia, tirpalą praskieskite bidistiliatu.

4.2.   Kalibravimo kreivės braižymas

Į 100 ml matavimo kolbas pipete įpilkite 0,5 ml, 1 ml ir 2 ml tirpalo (3.5 skirsnis) (100 mg/l vario) ir iki žymės įpilkite bidistiliato. Taip paruoštame tirpale yra atitinkamai 0,5 mg/l, 1 mg/l ir 2 mg/l vario. Panaudodami šių tirpalų optinio tankio vertes, nustatytas kaip aprašyta 4.1 skirsnyje, nubraižykite kalibravimo kreivę.

5.   REZULTATŲ UŽRAŠYMAS

Remdamiesi šiuo grafiku apskaičiuokite koncentraciją C mg/l.

Jei F – praskiedimo faktorius, vario koncentracija (mg/l) apskaičiuojama pagal formulę F × C.

Jis užrašomas su dviem skaičiais po kablelio.

Pastabos:

a)	pagal naudojamo prietaiso jautrumą ir vario koncentraciją bandinyje pasirinkite atitinkamus tirpalus kalibravimo kreivei brėžti bei juos atitinkamai skieskite;

b)

jei numanote, kad analizuojamame bandinyje vario koncentracija labai nedidelė, darykite taip: į platinos lėkštelę įpilkite 100ml bandinio ir garinkite ant verdančio vandens vonios, kol bandinys taps panašus į sirupą. Įlašinkite 2,5 ml koncentruotos azoto rūgšties (3.2 skirsnis), kad lėkštelės dugnas būtų visiškai padengtas. Likutį atsargiai iškaitinkite ant elektrinės plytelės arba ant nedidelės ugnies; tada lėkštelę įdėkite į mufelinę krosnį, kurios temperatūra 500 ± 25 °C, ir palikite maždaug valandai. Atvėsinę sudrėkinkite pelenus 1 ml koncentruotos azoto rūgšties (3.2 skirsnis), grūsdami tuo pat metu stikliniu grūstuvėliu. Mišinį išgarinkite ir vėl iškaitinkite pagal pirmiau aprašytą procedūrą. Įdėkite lėkštelę 15 minučių į mufelinę krosnį. Pakartokite veiksmą su azoto rūgštimi mažiausiai tris kartus. Praskieskite lėkštelėje esančius pelenus 1 ml koncentruotos azoto rūgšties (3.2 skirsnis) ir 2 ml bidistiliato. Viską supilkite į 10 ml kolbą, tris kartus išplaukite lėkštelę su 2 ml bidistiliato ir galiausiai kolbos turinį praskieskite bidistiliatu iki žymės. Atlikite titravimą, kaip nurodyta 4.1 skirsnyje, naudodami 10 ml tirpalo; nustatydami rezultatą, atsižvelkite į koncentracijos veiksnį.

24   SIEROS DIOKSIDAS (OIV-AS-323-04-DIOSU) – II TIPO METODAS

1.   APIBRĖŽIMAI

Laisvas sieros dioksidas yra sieros dioksidas, esantis misoje ar vyne kaip H2SO3, HSO3 Pusiausvyra tarp šių dalelių yra pH ir temperatūros funkcija:

H2SO3 ←→ H+ + HSO3–

H2SO3 yra molekulinis sieros dioksidas.

Suminis sieros dioksidas yra suminis visų sieros dioksido formų, laisvų ar susijungusių su kitomis vyno sudedamosiomis dalimis, kiekis vyne.

2.   LAISVAS IR VISAS SIEROS DIOKSIDAS

2.1.   Metodų esmė

2.1.1.   Etaloninis metodas

2.1.1.1.   Vynai

Sieros dioksido nešiklis – oras ar azotas. Jis jungiamas ir oksiduojamas barbotuojant per praskiestą ir neutralų vandenilio peroksido tirpalą. Susidariusi sieros rūgštis nustatoma titruojant etaloniniu natrio hidroksido tirpalu. Laisvas sieros dioksidas yra pašalinamas iš vyno, barbotuojant žemoje temperatūroje (10 °C).

Visas sieros dioksidas yra pašalinamas iš vyno, barbotuojant aukštoje temperatūroje (apytiksliai 100 °C).

2.1.1.2.   Rektifikuota koncentruota misa

Visas sieros dioksidas pašalinamas iš anksčiau praskiestos rektifikuotos koncentruotos misos, barbotuojant aukštoje temperatūroje (apytiksliai 100 °C).

2.1.2.   Greitasis nustatymo metodas (vynams ir misoms)

Laisvas sieros dioksidas nustatomas tiesioginiu jodometriniu metodu.

Toliau po hidrolizės šarmais jodometriškai nustatomas sujungtas sieros dioksidas. Sudėjus su laisvu sieros dioksidu, gaunamas suminio sieros dioksido kiekis.

2.2.   Etaloninis metodas

2.2.1.   Aparatūra

2.2.1.1.   Naudojamas aparatas turi būti toks, koks pavaizduotas piešinyje, ypač kondensatorius.

Dujų tiekimo vamzdelis į barboterį B baigiasi nedideliu 1 cm skersmens rutuliu su 20-čia 0,2 mm skylučių, išdėstytų išilgai didžiausio horizontalaus apskritimo. Taip pat toks vamzdelis gali baigtis akyto stiklo plokšte, kurioje susidaro daug labai mažų burbuliukų, ir todėl yra geras sąlytis tarp skysčio ir dujų.

Dujų tekėjimo greitis per aparatą turi būti maždaug 40 litrų per valandą. Dešinėje piešinio pusėje pavaizduotas butelis skirtas apriboti slėgio sumažėjimą, kurį sukelia vandens siurblys, iki 20-30 cm vandens stulpelio. Siekiant palaikyti reikiamą vakuumą, tarp barboterio ir butelio turi būti debitmatis su pusiau kapiliariniu vamzdeliu.

2.2.1.2.   Mikrobiuretė.

2.2.2.   Reagentai

2.2.2.1.   85 % fosforo rūgštis (H3PO4), (ρ20 = 1,71 g/ml.

2.2.2.2.   Vandenilio peroksido (H2O2) tirpalas, 9,1 g/litre (trys tūriai).

2.2.2.3.   Indikatorius:

metilo raudonasis …	100 mg
metileno mėlynasis …	50 mg
alkoholis, 50 % tūrio …	100 ml

2.2.2.4.   Natrio hidroksido (NaOH) tirpalas, 0,01M.

2.2.3.   Laisvo sieros dioksido nustatymas

2.2.3.1.   Darbo eiga

Dvi dienas prieš analizę vynas turi būti laikomas pilname ir sandariai uždarytame butelyje 20 °C temperatūroje.

—	Į barboterį B įpilkite 2-3 ml vandenilio peroksido tirpalo (2.2.2.2 skirsnis), įlašinkite du lašus indikatoriaus ir neutralizuokite vandenilio peroksido tirpalą su 0,01 M natrio hidroksido tirpalu (2.2.2.4 skirsnis). Prijunkite barboterį prie aparato.

—	Į barbotavimo aparato kolbą A įpilkite 50 ml bandinio ir 1 ml fosforo rūgšties (2.2.2.1 skirsnis). Prijunkite kolbą prie aparato.

—	15 minučių per skystį leiskite orą (arba azotą). Pašalinamas laisvas sieros dioksidas oksiduojamas į sieros rūgštį. Išimkite iš aparato barboterį ir titruokite gautą rūgštį su 0,01 M natrio hidroksido tirpalu (2.2.2.4 skirsnis). n ml – sunaudotas kiekis.

2.2.3.2.   Rezultatų užrašymas

Išsiskyręs sieros dioksidas išreiškiamas sveiku skaičiumi mg/l.

2.2.3.2.1.   Skaičiavimo metodas

Laisvo sieros dioksido kiekis mg/l: 6,4 n.

2.2.4.   Suminio sieros dioksido kiekio nustatymas

2.2.4.1   Darbo eiga

2.2.4.1.1.   Jei tai rektifikuota koncentruota misa, naudokite tirpalą, gaunamą skiedžiant bandinį iki 40 % (m/V), kaip nurodyta skyriaus „Suminis rūgštingumas“ 5.1.2 skirsnyje. Į barbotavimo aparato A kolbą, kurios talpa 250 ml, įpilkite 50 ml gauto tirpalo ir 5 ml fosforo rūgšties (2.2.2.1 skirsnis). Prijunkite kolbą prie aparato.

2.2.4.1.2.   Vynai

Jei apskaičiuota suminė SO2 koncentracija bandinyje yra mažesnė arba lygi 50 mg/l, Į barbotavimo aparato kolbą A įpilkite 50 ml bandinio ir 1 ml fosforo rūgšties (2.2.2.1 skirsnis). Prijunkite kolbą prie aparato.

Jei apskaičiuota suminė SO2 koncentracija bandinyje yra didesnė arba lygi 50 mg/l, Į 100 ml barbotavimo aparato kolbą A įpilkite 20 ml bandinio ir 5 ml fosforo rūgšties (2.2.2.1 skirsnis). Prijunkite kolbą prie aparato.

Į barboterį B įpilkite 2-3 ml vandenilio peroksido tirpalo (2.2.2.2 skirsnis), jį neutralizuokite tokiu pat būdu, kaip buvo aprašyta ankščiau, o A kolboje esantį vyną užvirinkite ant nedidelės 4-5 cm aukščio liepsnos, kuri turi tiesiogiai liesti kolbos dugną. Nedėkite kolbos ant metalinės plokštės. Ji dedama ant skridinio su maždaug 30 mm skersmens anga. Tai padeda apsaugoti ekstrahuotas iš vyno ir nusėdusias ant kolbos sienelių medžiagas nuo perkaitinimo.

Toliau tirpalą virkite ir per jį leiskite oro (ar azoto) srovę. Per 15 minučių pašalinamas ir oksiduojamas visas sieros dioksidas. Susidariusios sieros rūgšties kiekį nustatykite titruodami 0,01 M natrio hidroksido tirpalu (2.2.2.4 skirsnis).

n ml – sunaudotas kiekis.

2.2.4.2.   Rezultatų užrašymas

Rektifikuota koncentruota misa: suminio sieros dioksido kiekis užrašomas miligramais suminio cukrų kiekio kilograme.

2.2.4.2.1.   Skaičiavimo metodas

—	Vynai Suminis sieros dioksido kiekis mg/l: — bandiniai su nedideliu sieros dioksido kiekiu (50 ml bandinys): 6,4 × n — kiti bandiniai (20 ml bandinys): 16 × n

—	Rektifikuota koncentruota misa Suminis sieros dioksido kiekis miligramais suminio cukrų kiekio kilogramui (50 ml paruoštas bandinys ( 2.2.4.1.1 skirsnis): (1600 × n)/P P = procentinė suminio cukrų kiekio koncentracija (m/m) procentais.

2.2.3.4.2.   Pakartojamumas (r)

50 ml bandinys mažesnis už 50 mg/l: r 1 mg/l.

20 ml bandinys didesnis už 50 mg/l: r 6 mg/l.

2.2.3.4.3.   Atkuriamumas (R)

50 ml bandinys mažesnis už 50 mg/l: R 9 mg/l.

50 ml bandinys didesnis už 20 mg/l: R 15 mg/l.

---

(1)  Galima naudoti bet kokį piknometrą, kuris turi lygiavertes savybes.

(2)  105 pascal (Pa) = 1 bar.