PRIEDAS
FERMENTINIS METODAS KRAKMOLO KIEKIUI GYVŪNŲ PAŠARAMS NAUDOJAMUOSE PRODUKTUOSE NUSTATYTI TAIKANT AUKŠTO SLĖGIO SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJĄ (HPLC)
1. Taikymo sritis
Šis metodas aprašo fermentinį krakmolo kiekio gyvūnų pašaruose nustatymą. Krakmolo kiekis gaunamas iš kiekybinio gliukozės nustatymo duomenų, atlikus fermentinį esamo krakmolo skaidymą iki gliukozės. Laikoma, kad visa nustatyta gliukozė yra gauta iš mėginyje esančio krakmolo.
2. Apibrėžtys
Taikant šį metodą nustatomas krakmolo ir didelės molekulinės masės jo skilimo produktų, netirpių 40 % etanolyje, kiekis. Krakmolo kiekis išreiškiamas % (m/m).
3. Principas
Mėginiai homogenizuojami malant. Mėginys plaunamas 40 % etanoliu tirpiesiems cukrums ir tirpiesiems krakmolo skaidymo produktams pašalinti.
Į suspensiją dedama termostabilios alfa-amilazės. Šis fermentas skaido krakmolą 100 °C temperatūroje į trumpesnes grandines, nepriklausomai nuo to, ar krakmolas yra visiškai ištirpęs, ar neištirpęs. Dideli krakmolo gabalai skaidomi labai lėtai.
Todėl būtina, kad mėginiai būtų visiškai ištirpinti arba būtų mažų kietų dalelių suspensijos, pavidalo.
Tada dedama kito fermento – amilogliukozidazės, kuri 60 °C temperatūroje hidrolizuoja sutrumpėjusias gliukozės grandines iki gliukozės.
Skystį nuskaidrinus ir esamus baltymus, riebalus ir likučius pašalinus filtruojant, gaunamas skaidrus tirpalas, kurį galima tirti HPLC.
Esamų cukrų atskyrimas atliekamas HPLC.
4. Reagentai ir kitos medžiagos
Naudojami patvirtinto analizinio grynumo reagentai ir demineralizuotas vanduo.
4.1. Etanolio 40 % tūrio tirpalas vandenyje
4.2. Gliukozė, ne mažiau kaip 99 % grynumo
4.3. Amilogliukozidazės (1,4-α-D-gliukangliukohidrolazė) iš Aspergillus niger (fermentinis aktyvumas > 5 000 U/ml) tirpalas. Saugoma apie 4 °C temperatūroje
Kaip alternatyva gali būti naudojami ir amilogliukozidazės milteliai
4.4. Termostabili alfa-amilazė (1,4-alfa-D-gliukan-gliukanohidrolazė). Saugoma apie 4 °C temperatūroje
4.5. Cinko acetato dihidratas, a. g.
4.6. Kalio heksacianoferatas (II) (K4[Fe(CN)]6 · 3H2O), ypač grynas
4.7. Natrio acetatas bevandenis, a. g.
4.8. Ledinė acto rūgštis, 100 %
4.9. Natrio acetato buferinis tirpalas (0,2 mol/l)
Cheminėje stiklinėje pasveriama 16,4 g natrio acetato (4.7). Ištirpinama vandenyje ir supilama į 1 000 ml matavimo kolbą. Praskiedžiama iki žymos vandeniu ir acto rūgštimi pakoreguojamas pH iki 4,7 (naudojant pH-metrą (5.11)). Šį tirpalą galima naudoti ne ilgiau kaip 6 mėnesius, laikant 4 oC temperatūroje.
4.10. Amilogliukozidazės tirpalas (fermentinis aktyvumas > 250 U/ml)
Paruošiamas tirpalas iš 5 ml amilogliukozidazės tirpalo (4.3) arba 660 mg amilogliukozidazės miltelių, pripilant iki 100 ml galutinio tūrio natrio acetato buferinio tirpalo (4.9). Ruošiama prieš pat naudojimą.
4.11. Etaloninis tirpalas
Paruošiami vandeniniai gliukozės tirpalai, kurie paprastai naudojami atliekant HPLC tyrimą.
4.12. Nuskaidrinimo reagentas (Carrez I)
Cheminėje stiklinėje vandenyje ištirpinama 219,5 g cinko acetato (4.5). Supilama į 1 000 ml matavimo kolbą, įpilama 30 ml acto rūgšties (4.8). Gerai sumaišoma ir skiedžiama vandeniu iki žymos. Šį tirpalą galima naudoti ne ilgiau kaip 6 mėnesius, laikant kambario temperatūroje.
Galima naudoti kitus lygiaverčius Carrez tirpalui nuskaidrinimo reagentus.
4.13. Nuskaidrinimo reagentas (Carrez II)
Cheminėje stiklinėje vandenyje ištirpinama 106,0 g kalio heksacianoferato (II) (4.6). Supilama į 1 000 ml matavimo kolbą. Gerai sumaišoma ir skiedžiama vandeniu iki žymos. Šį tirpalą galima naudoti ne ilgiau kaip 6 mėnesius, laikant kambario temperatūroje.
Galima naudoti kitus lygiaverčius Carrez tirpalui nuskaidrinimo reagentus.
4.14. Mobili fazė
Paruošiama mobili fazė, kuri paprastai naudojama atliekant cukrų HPLC tyrimą. Naudojant aminopropilsilikagelio kolonėlę, mobilia faze dažniausiai naudojamas, pavyzdžiui, HPLC grynumo vandens ir acetonitrilo mišinys.
5. Įranga
5.1. Standartiniai laboratoriniai stikliniai indai
5.2. Centrifuga, ne mažesnė kaip 1 000 g (vertinama mėgintuvėlio centre)
5.3. Stikliniai 100 ml tūrio centrifugavimo mėgintuvėliai
5.4. Magnetinė maišyklė
5.5. Magnetiniai maišikliai
5.6. Gofruoti filtrai, pavyzdžiui, 185 mm
5.7. Filtrai švirkštams, 0,45 μm, tinkami vandeniniams tirpalams
5.8. Mėginių buteliukai, pritaikyti HPLC automatiniam mėginių įvedimo įrenginiui
5.9. 100 ml matavimo kolbos
5.10. Plastikiniai švirkštai, 5 ir 10 ml
5.11. pH-metras
5.12. Vandens vonia su termostatu, reguliuojama nuo 60 °C iki 100 °C
5.13. Kaitinamos magnetinės maišyklės
5.14. HPLC aparatas
5.14.1. Siurblys, nepulsuojantis
5.14.2. Automatinis mėginių įvedimo įrenginys
5.14.3. Kolonėlė ir prieškolonėlė, tinkamos cukrų tyrimui
5.14.4. Kolonėlės krosnis, temperatūros intervalas – nuo kambario iki 40 °C temperatūros
5.14.5. Detektorius, tinkamas cukrų tyrimui, pavyzdžiui, refrakcinio indekso detektorius
5.14.6. Duomenų apdorojimo sistema
6. Procedūra
6.1. Bendrosios nuostatos
Mėginiai tiriami po vieną kartą.
6.2. Kelių tipų produktų mėginio ruošimas
Produktas homogenizuojamas malant.
6.3. Mėginio tiriamoji dalis
Krakmolo kiekis įvertinamas pagal deklaruojamą ingredientų kiekį. Mėginio (pasverto 0,1 mg tikslumu) kiekis gali būti įvertintas pagal formulę:
6.4. Tuščiasis tyrimas
Tuščiojo tyrimo rezultatas gaunamas atliekant visą tyrimą (kaip aprašyta 6.5), bet be pridėto mėginio. Tuščiojo tyrimo rezultatas naudojamas krakmolo kiekiui apskaičiuoti (7.1).
6.5. Tyrimas
6.5.1. Mėginių paruošimas
Mėginys sumaišomas purtant arba kratant. Pasirinkta tiriamoji dalis (6.3) pasveriama centrifugavimo mėgintuvėlyje (5.3), į kurį įpilama 50 ml 40 % etanolio (4.1). Maišoma magnetine maišykle 20 min. kambario temperatūroje. Magnetinis maišiklis paliekamas mėgintuvėlyje ir centrifuguojama penkias minutes. Atsargiai nusiurbiama ir pašalinama skystoji fazė (pavyzdžiui, Pastero pipete). Ši ekstrahavimo procedūra kartojama du kartus, naudojant po 25 ml etanolio (4.1). Likutis suplaunamas į 100 ml matavimo kolbą (5.9), naudojant apie 70 ml vandens. Likutis ištirpinamas arba suspenduojamas, įpilama 100 mikrolitrų termostabilios alfa-amilazės (4.4) ir kaitinama 100 °C temperatūroje 1 val., pvz., vandens vonioje (5.12). Atvėsinama vandens vonioje iki 60 °C ir įpilama 5 ml amilogliukozidazės tirpalo (4.10). Kolba įstatoma 30 min. į 60 °C vandens vonią. Atvėsinama iki kambario temperatūros, mėginys nuskaidrinamas, įpilant 1 ml Carrez I (4.12) tirpalo, supurtant ir įpilant 1 ml Carrez II (4.13) tirpalo. Carrez I ir II galima įpilti prieš atvėsinant arba atvėsinus. Atskiedžiama vandeniu iki žymos, tirpalas sumaišomas ir filtruojamas per gofruotą filtrą (5.6). Mėginio ekstraktas surenkamas.
6.5.2. Mėginio ekstraktų apdorojimas
Ekstraktai filtruojami per filtrą (5.7) švirkštu (5.10), kuris prieš tai buvo praplautas ekstraktu. Filtratai surenkami į buteliukus (5.8).
Pastaba. Filtrą galima naudoti kelis kartus. Jis turėtų būti plaunamas kitu ekstraktu, kad būtų išvengta užteršimo pirmesniuoju.
6.6. Chromatografija
HPLC atliekama, kaip tai įprastai daroma tiriant cukrus. Kadangi mėginiai apdoroti etanolio ir vandens mišiniu, gliukozė yra pagrindinis cukrus, kuris turi būti nustatomas. Jei HPLC tyrimas rodo maltozės pėdsakus, tai gali reikšti nepilną krakmolo hidrolizę.
7. Rezultatų skaičiavimas ir pateikimas
7.1. HPLC rezultatų apskaičiavimas
Fermentinis amilogliukozidazės tirpalas (4.3) stabilizuojamas gliukoze. Be to, termostabilialfa-amilazė (4.4) stabilizuojama sacharoze, kuri iš dalies gali virsti gliukoze dėl amilogliukozidazės invertazės aktyvumo. Todėl turėtų būti įvedama išmatuotos gliukozės koncentracijos (%, m/V) pataisa, atsižvelgus į tuščiojo tyrimo metu gautą gliukozės koncentraciją (%, m/V). Tuomet gliukozės koncentracija (%, m/m), įvertinus pataisą, apskaičiuojama iš gliukozės koncentracijos (%, m/V), įvertinus pataisą, mėginio masės ir kalibravimo etaloniniais tirpalais (4.11) duomenų.
7.2. Krakmolo kiekio apskaičiavimas
Krakmolo kiekis (%, m/m) apskaičiuojamas iš gliukozės kiekio (%, m/m) įvertinus pataisą.
Krakmolo kiekis = 0,9 * gliukozės kiekis, įvertinus pataisą
8. Tikslumas
8.1. Tarplaboratorinis tyrimas
Tarplaboratorinio tyrimo duomenys metodo glaudumui nustatyti yra apibendrinti 8.4 punkte.
8.2. Pakartojamumas
Dviejų nepriklausomų atskirų tyrimų rezultatų, gautų taikant tą patį metodą tokiai pačiai tiriamajai medžiagai toje pat laboratorijoje to paties darbuotojo ta pačia įranga per trumpą laiko tarpą, absoliutusis skirtumas ne daugiau kaip 5 % atvejų gali būti didesnis už pakartojamumo ribą 1,1 % (m/m). Pakartojamumo riba gauta apibendrinus tarplaboratorinio tyrimo rezultatus (žr. 8.4 punktą).
8.3. Atkuriamumas
Dviejų atskirų tyrimų rezultatų, gautų taikant tą patį metodą tokiai pačiai tiriamajai medžiagai skirtingose laboratorijose skirtingų darbuotojų skirtinga įranga, absoliutusis skirtumas ne daugiau kaip 5 % atvejų gali būti didesnis už atkuriamumo ribą 3,7 % (m/m). Atkuriamumo riba gauta apibendrinus tarplaboratorinio tyrimo rezultatus (žr. 8.4 punktą).
8.4. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai
Tarplaboratorinis tyrimas buvo atliktas 2005 ir 2006 metais dalyvaujant Europos muitinių laboratorijoms. Šis tyrimas buvo atliekamas pagal ISO 5725 ir IUPAC protokolą (W. Horwitz, Pure and Applied Chemistry, vol 67, 1995, p. 331–343). Glaudumo duomenys pateikiami lentelėje.
Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo duomenys
|
|
Mėginys |
|||||||||||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
||||||||||||||||
|
Laboratorijų skaičius, atmetus riktus |
25 |
26 |
26 |
25 |
24 |
|||||||||||||||
|
Priimtų rezultatų skaičius |
50 |
52 |
52 |
50 |
48 |
|||||||||||||||
|
Krakmolo kiekio vidurkis (%, m/m) |
31,2 |
14,4 |
25,1 |
12,9 |
27,8 |
|||||||||||||||
|
Pakartojamumo standartinis nuokrypis sr (%, m/m) |
0,4 |
0,3 |
0,6 |
0,2 |
0,3 |
|||||||||||||||
|
Pakartojamumo riba r (%, m/m) |
1,1 |
0,8 |
1,7 |
0,7 |
0,9 |
|||||||||||||||
|
Atkuriamumo standartinis nuokrypis sR (%, m/m) |
1,7 |
0,8 |
1,7 |
0,9 |
1,3 |
|||||||||||||||
|
Atkuriamumo riba R (%, m/m) |
4,8 |
2,2 |
4,7 |
2,5 |
3,7 |
|||||||||||||||
|
Mėginiai
|
||||||||||||||||||||