Komisijos direktyva 2000/45/EB

2000 m. liepos 6 d.

nustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruose esantiems A vitaminui, E vitaminui ir triptofanui nustatyti

(tekstas svarbus EEE)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 1970 m. liepos 20 d. Tarybos direktyvą 70/373/EEB dėl Bendrijos mėginių paėmimo ir analizės metodų, taikomų valstybinei pašarų kontrolei, įvedimo [1], su paskutiniais pakeitimais, padarytais Austrijos, Suomijos ir Švedijos stojimo aktu [2], ypač į jos 2 straipsnį,

kadangi:

(1) Direktyva 70/373/EEB nustato, kad oficiali pašarų kontrolė siekiant patikrinti, kaip laikomasi pašarų kokybės ir sudėties reikalavimų, nustatytų įstatymais ir kitais teisės aktais, turi būti vykdoma taikant Bendrijos bandinių ėmimo ir analizės metodus.

(2) 1970 m. lapkričio 23 d. Tarybos direktyva 70/524/EEB dėl pašarų priedų [3], su paskutiniais pakeitimais, padarytais 1999 m. lapkričio 17 d. Komisijos reglamentu (EB) Nr. 2439/1999 [4] nustato, kad ant etiketės turi būti nurodytas A ir E vitaminų kiekis, jei šios medžiagos yra dedamos į premiksus ir pašarus.

(3) 1979 balandžio 2 d. Tarybos direktyva 79/373/EEB dėl prekybos kombinuotaisiais pašarais [5] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos direktyva 2000/16/EB [6] ir 1993 m. rugsėjo 13 d. Tarybos direktyva 93/74/EEB dėl pašarų, skirtų konkretiems mitybos tikslams [7], su paskutiniais pakeitimais, padarytais Direktyva 96/25/EB [8], nustato, kad ant pašarų etikečių turi būti nurodytos amino rūgštys.

(4) Šioms medžiagoms nustatyti turi būti sukurti Bendrijos analizės metodai.

(5) Šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Pašarų nuolatinio komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:

1 straipsnis

Valstybės narės numato, kad oficialiai tikrinant pašarus ir premiksus, juose esančių A vitamino, E vitamino ir triptofano kiekiui nustatyti būtų taikomi analizės metodai, nustatyti šios direktyvos priede.

2 straipsnis

Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 2000 m. rugpjūčio 31 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.

Šias priemones jos taiko nuo 2000 m. rugsėjo 1 d.

Valstybės narės, tvirtindamos šias priemones, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės.

3 straipsnis

Ši direktyva įsigalioja dvidešimtą dieną po jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.

4 straipsnis

Ši direktyva skirta valstybėms narėms.

Priimta Briuselyje, 2000 m. liepos 6 d.

Komisijos vardu

David Byrne

Komisijos narys

[1] OL L 170, 1970 8 3, p. 2.

[2] OL C 241, 1994 8 29, p. 1.

[3] OL L 270, 1970 12 14, p. 1.

[4] OL L 297, 1999 11 18, p. 8.

[5] OL L 86, 1979 4 6, p. 30.

[6] OL L 105, 2000 5 3, p. 36.

[7] OL L 237, 1993 9 22, p. 23.

[8] OL L 125, 1996 5 23, p. 35.

--------------------------------------------------

PRIEDAS

A DALIS A VITAMINO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas A vitaminui (retinoliui) pašaruose ir premiksuose nustatyti. A vitaminą sudaro visų-trans-(padėčių)-retinolis ir jo cis-izomerai, kurie yra nustatomi šiuo metodu. A vitamino kiekis yra išreiškiamas tarptautiniais vienetais (IU) vienam kg. Vienas IU atitinka 0,300 μg visų-trans-(padėčių)-A vitamino ar 0,344 μg visų-trans-(padėčių)-A vitamino acetato arba 0,550 μg visų-trans-(padėčių)-A vitamino palmitato aktyvumą.

Nustatymo riba yra 2000 IU A vitamino/kg.

2. Metodo esmė

Mėginys hidrolizuojamas šarminiu kalio hidroksido tirpalu ir A vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, likutis ištirpinamas metanolyje ir prireikus skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. A vitamino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu naudojant fluorescencinį arba UV detektorių. Chromatografavimo parametrai pasirenkami taip, kad neatsiskirtų visų-trans-(padėčių)-A vitamino alkoholis ir jo cis-izomerai.

3. Reagentai

3.1. Etanolis, σ = 96 %

3.2. Petroleteris, virimo temperatūros diapazonas 40–60 °C

3.3. Metanolis

3.4. Kalio hidroksido tirpalas, β = 50 g/100 ml

3.5. Natrio askorbato tirpalas, β = 10 g/100 ml (žr. 7.7 pastabas)

3.6. Natrio sulfidas, Na2S × xH2O (x = 7-9)

3.6.1. Natrio sulfido tirpalas, c = 0,5 mol/l glicerolio, β = 120 g/l (kai x = 9) (žr. 7.8 pastabas)

3.7. Fenolftaleino tirpalas, β = 2 g/100 ml etanolio (3.1)

3.8. 2-propanolis

3.9. HPLC judančioji fazė: metanolio (3.3) ir vandens, pvz., 980 + 20 (V + V). Tikslų santykį lemia naudojamos kolonėlės charakteristikos

3.10. Azotas, be deguonies

3.11. Visos-trans-A vitamino acetatas, ypač grynas, sertifikuoto aktyvumo, pvz., 2,80 × 106 IU/g

3.11.1. Visos-trans-A vitamino acetato pradinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą supilkite 50 mg A vitamino acetato (3.11), pasverto 0,1 mg tikslumu. Ištirpinkite 2-propanolyje (3.8) ir tuo pačiu tirpikliu praskieskite iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra lygi 1400 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.1.

3.12. Visos-trans-A vitamino palmitatas, ypatingai grynas, sertifikuoto aktyvumo, pvz., 1,80 × 106 IU/g

3.12.1. Visos-trans-A vitamino palmitato pradinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą įpilkite 80 mg A vitamino palmitato (3.12). Ištirpinkite 2-propanolyje (3.8) ir tuo pačiu tirpikliu praskieskite iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra lygi 1400 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.2.

3.13. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr. 7.5 pastabas)

4. Aparatūra

4.1. Vakuuminis sukamasis garintuvas

4.2. Gintaro spalvos stiklo indai:

4.2.1. plokščiadugnės arba kūginės kolbos, 500 ml, su šlifo mova;

4.2.2. matavimo kolbos su šlifo kamščiais, siaurakaklės, 10, 25, 100 ir 500 ml;

4.2.3. kūginiai dalinamieji piltuvai, 1000 ml, su šlifo kamščiais;

4.2.4. kriaušės formos kolbos, 250 ml, su šlifo mova.

4.3. Allihn kondensatorius, apvalkalo ilgis 300 mm, su šlifo jungtimi, su dujų tiekimo vamzdžio adapteriu

4.4. Lankstytasis filtro popierius fazėms atskirti, skersmuo 185 mm (pvz., Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. HPLC įranga su įšvirkštimo sistema

4.5.1. Skysčių chromatografijos kolonėlė, 250 mm × 4 mm, C18, 5 ar 10 μm pakuotė ar lygiavertė kolonėlė (veikimo kriterijus: tik viena visų retinolio izomerų smailė HPLC sąlygomis)

4.5.2. Fluorescencinis arba reguliuojamo bangos ilgio UV detektorius

4.6. Spektrofotometras ir 10 mm kvarco kiuvetės

4.7. Vandens vonia ir magnetinė maišyklė

4.8. Ekstrahavimo aparatas (žr. 1 paveikslą), kurį sudaro:

4.8.1. 1 l talpos stiklinis cilindras su šlifo mova ir kamščiu;

4.8.2. šlifo įmova su atšaka ir reguliuojamo ilgio vamzdžiu, einančiu per centrą. Reguliuojamo ilgio vamzdžio apatinis galas turi būti U formos, viršutinis – siaurėjančio antgalio formos, kad cilindre esančio tirpalo viršutinis sluoksnis galėtų būti perpiltas į dalinamąjį piltuvą.

5. Darbo eiga

Pastaba

A vitaminas yra jautrus (UV) šviesai ir oksidavimui. Visi veiksmai turi būti daromi tamsoje (naudojami gintaro spalvos indai arba aliuminio folija apvynioti indai) ir nesant deguonies (šalinamas azoto srove). Ekstrahuojant oras virš skysčio turi būti pakeistas azotu (venkite perteklinio slėgio kartkartėmis ištraukdami kamštį).

5.1. Mėginio paruošimas

Sumalkite mėginį, kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis, ir venkite šilumos susidarymo. Malti reikia prieš pat svėrimą ir muilinimą, kad nebūtų A vitamino nuostolių.

5.2. Muilinimas

Pagal A vitamino kiekį 0,01 g tikslumu pasverkite 2–25 g mėginio ir supilkite jį į plokščiadugnę ar kūginę 500 ml tūrio kolbą (4.2.1). Maišydami iš eilės įpilkite 130 ml etanolio (3.1), maždaug 100 mg BHT (3.13), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.6). Prie kolbos prijunkite kondensatorių (4.3) ir kolbą įmerkite į vandens vonią su magnetine maišykle (4.7). Pašildykite iki virimo ir virkite penkias minutes su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuomet per kondensatorių (4.3) įpilkite 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir dar 25 min. virkite su grįžtamuoju kondensatoriumi, maišydami silpna azoto srove. Kondensatorių nuplaukite maždaug 20 ml vandens ir kolbos turinį ataušinkite iki kambario temperatūros.

5.3. Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalą dekantuodami kiekybiškai jį perpilkite į 1000 ml dalinamąjį piltuvą (4.2.3) ar į ekstrahavimo aparatą (4.8) iš viso plovimui naudodami 250 ml vandens. Muilinimo kolbą iš eilės plaukite 25 ml etanolio (3.1) bei 100 ml petroleterio (3.2) ir plovimo skysčius supilkite į dalinamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatą. Vandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 2:1. Stipriai purtykite dvi minutes ir dviems minutėms palikite nusistovėti.

5.3.1. Ekstrahavimas naudojant dalinamąjį piltuvą (4.2.3)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), petroleterio sluoksnį perpilkite į kitą dalinamąjį piltuvą (4.2.3). Ekstrahavimą kartokite du kartus su 100 ml petroleterio (3.2) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2).

Dalinamajame piltuve sujungtus ekstraktus švelniai sukdami piltuvą (kad nesusidarytų emulsija) du kartus plaukite 100 ml vandens, toliau purtydami piltuvą plaukite dar 100 ml vandens porcijomis tol, kol įpiltas fenolftaleino tirpalas (3.7) nenudažys vandeninio sluoksnio (paprastai pakanka plauti keturis kartus). Kad būtų pašalintas visas suspenduotas vanduo, išplautą ekstraktą per sausą lankstytąjį filtrą fazėms atskirti (4.4) filtruokite į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2). Dalinamąjį piltuvą ir filtrą praplaukite 50 ml petroleterio (3.2), praskieskite petroleteriu (3.2) iki žymės ir gerai sumaišykite.

5.3.2. Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo aparatą (4.8)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), stiklinio cilindro (4.8.1) kamštį pakeiskite šlifo įmova (4.8.2) ir reguliuojamo vamzdžio U formos apatinį galą nustatykite taip, kad jis būtų šiek tiek virš sluoksnių skiriamosios ribos. Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pūsdami suslėgtą azotą, viršutinį petroleterio sluoksnį perpilkite į 1000 ml dalinamąjį piltuvą (4.2.3). Į stiklinį cilindrą įpilkite 100 ml petroleterio (3.2), cilindrą užkimškite ir gerai supurtykite. Leiskite sluoksniams atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinį sluoksnį supilkite į dalinamąjį piltuvą. Pakartokite ekstrahavimą dar kartą su 100 ml petroleterio (3.2), vėliau du kartus su 50 ml petroleterio (3.2) ir petroleterio sluoksnius supilkite į dalinamąjį piltuvą.

Sujungtus petroleterio ekstraktus plaukite, kaip tai aprašyta 5.3.1, ir toliau darykite, kaip čia aprašyta.

5.4. Mėginio tirpalo paruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4) pipete paimkite alikvotinę petroleterio tirpalo dalį (5.3.1 ar 5.3.2). Sukamajame garintuve (4.1) esant sumažintam slėgiui išgarinkite tirpiklį beveik iki sauso likučio, kai vonios temperatūra ne didesnė kaip 40 °C. Įleisdami azotą (3.10), slėgį padidinkite iki atmosferinio, kolbą nuimkite nuo sukamojo garintuvo. Likusį tirpiklį pašalinkite azoto srove (3.10) ir likutį iš karto ištirpinkite žinomame tūryje (10 - 100 ml) metanolio (3.3) (A vitamino koncentracija turi būti 5 IU/ml–30 IU/ml diapazone).

5.5. Nustatymas HPLC metodu

A vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (4.5.1), koncentracija matuojama naudojant UV detektorių (325 nm) arba fluorescencinį detektorių (sužadinimas: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2).

Alikvotinę metanolinio tirpalo, gauto 5.4, dalį (pvz., 20 μl) įšvirkškite ir plaukite judančiąja faze (3.9). Apskaičiuokite kelių to paties mėginio įšvirkštų tirpalų vidutinius smailių aukščius (plotus) ir kelių įšvirkštų kalibravimo tirpalų (5.6.2) vidutinius smailių aukščius (plotus).

HPLC sąlygos

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.5.1): | 250 mm × 4 mm, C18, 5 ar 10 µm pakuotė, ar lygiavertė |

Judančioji fazė (3.9): | Metanolio (3.3) ir vandens mišinys, pvz., 980 + 20 (V + V) |

Srautas: | 1-2 ml/min. |

Detektorius (4.5.2): | UV detektorius (325 nm) arba fluorescencinis detektorius (sužadinimas: 325 nm/emisija: 475 nm) |

5.6. Kalibravimas

5.6.1. Darbinių etaloninių tirpalų ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (4.2.1) pipete paimkite 20 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3.11.1) arba 20 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3.12.1) ir hidrolizuokite, kaip aprašyta 5.2, bet be BHT. Vėliau ekstrahuokite petroleteriu (3.2) pagal 5.3 ir praskieskite petroleteriu (3.2) iki 500 ml. 100 ml šio ekstrakto sukamajame garintuve (žr. 5.4) išgarinkite beveik iki sauso likučio, likusį tirpiklį pašalinkite azoto srove (3.10) ir likutį ištirpinkite 10,0 ml metanolio (3.3). Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 560 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.3. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2,0 ml šio darbinio etaloninio tirpalo, praskieskite iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišykite. Šio praskiesto darbinio tirpalo vardinė koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml.

5.6.2. Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilkite 1,0, 2,0, 5,0 ir 10,0 ml darbinio etaloninio tirpalo, praskieskite iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišykite. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,8, 5,6, 14,0 ir 28,0 IU A vitamino viename ml.

Kelis kartus išvirkškite 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatykite vidutinius smailių aukščius (plotus). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) nubraižykite kalibravimo kreivę, atsižvelgdami į UV kontrolės rezultatus (5.6.3.3).

5.6.3. Etaloninių tirpalų UV etalonavimas

5.6.3.1. A vitamino acetato pradinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimkite 2,0 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3.11.1) ir 2-propanoliu (3.8) praskieskite iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimkite 3,0 ml šio praskiesto A vitamino acetato tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) praskieskite iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU vitamino viename A ml. Spektrofotometru (4.6) išmatuokite šio tirpalo UV spektrą pagal 2-propanolį (3.8) 300–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti 325 nm–327 nm diapazone.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.2. A vitamino palmitato pradinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimkite 2,0 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3.12.1) ir 2-propanoliu (3.8) praskieskite iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimkite 3,0 ml šio praskiesto A vitamino palmitato tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) praskieskite iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) išmatuokite šio tirpalo UV spektrą pagal 2-propanolį (3.8) 300–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti 325 nm–327 nm diapazone.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.3. A vitamino darbinis etaloninis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimkite 3,0 ml nepraskiesto A vitamino etaloninio darbinio tirpalo, paruošto pagal 5.6.1, ir 2-propanoliu (3.8) praskieskite iki žymės. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimkite 5,0 ml šio tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) praskieskite iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) išmatuokite šio tirpalo UV spektrą pagal 2-propanolį (3.8) 300–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti 325 nm–327 nm diapazone.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

+++++ TIFF +++++

6. Rezultatų apskaičiavimas

Naudodami mėginio tirpalo A vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą), pagal kalibravimo kreivę (5.6.2) nustatykite mėginio tirpalo koncentraciją IU/ml.

A vitamino kiekis mėginyje IU/kg apskaičiuojamas pagal šią formulę:

w =

500 . β . V

. 1000

V

. m

kur:

β = A vitamino koncentracija mėginio tirpale (5.4) IU/ml

V1 = mėginio tirpalo (5.4) tūris ml

V2 = alikvotinės tirpalo (5.4) dalies tūris ml

m = mėginio masė g

7. Pastabos

7.1. Jei mėginių A vitamino koncentracija yra maža, gali būti naudinga sujungti dviejų po muilinimo gautų įkrovų (pasvertas kiekis: 25 g) petroleterio ekstraktus į vieną mėginio tirpalą, skirtą nustatymui HPLC metodu.

7.2. Analizei paimtame mėginyje riebalų neturi būti daugiau kaip 2 g.

7.3. Jei fazės neatsiskiria, emulsijai suardyti įpilkite papildomai 10 ml etanolio (3.1).

7.4. Jei tai menkės kepenų aliejus ir kiti grynieji riebalai, muilinimo trukmė turi būti pailginta iki 45–60 min.

7.5. Vietoje BHT galima naudoti hidrochinoną.

7.6. Naudojant tiesioginių fazių kolonėlę įmanomas retinolio izomerų atskyrimas.

7.7. Vietoje natrio askorbato tirpalo galima naudoti maždaug 150 mg askorbo rūgšties.

7.8. Vietoje natrio sulfido tirpalo galima naudoti maždaug 50 mg EDTA.

8. Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai daromų to paties mėginio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis kaip 15 % didesniojo rezultato vertės.

9. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai [1]

L : laboratorijų skaičius,

n : atskirų verčių skaičius

sr : pakartojamumo standartinis nuokrypis

sR : atkuriamumo standartinis nuokrypis

r : pakartojamumas

R : atkuriamumas

CVr : pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR : atkuriamumo variacijos koeficientas, %

| Premiksai | Pašarai su premiksais | Mineralų koncentratas | Baltyminiai pašarai | Pašarai paršeliams |

L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |

n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |

Vidurkis [IU/kg] | 17,02 × 106 | 1,21 × 106 | 537100 | 151800 | 18070 |

sr [IU/kg] | 0,51 × 106 | 0,039 × 106 | 22080 | 12280 | 682 |

r [IU/kg] | 1,43 × 106 | 0,109 × 106 | 61824 | 34384 | 1910 |

CVr [%] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |

sR [IU/kg] | 1,36 × 106 | 0,069 × 106 | 46300 | 23060 | 3614 |

R [IU/kg] | 3,81 × 106 | 0,193 × 106 | 129640 | 64568 | 10119 |

CVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |

+++++ TIFF +++++

B DALIS E VITAMINO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas E vitaminui pašaruose ir premiksuose nustatyti. E vitamino kiekis išreiškiamas mg DL-α-tokoferolio acetato vienam kg pašaro. 1 mg DL-α-tokoferolio acetato atitinka 0,91 mg DL-α-tokoferolio (E vitamino).

Nustatymo riba yra 2 mg E vitamino/kg.

2. Metodo esmė

Mėginys hidrolizuojamas etanoliniu kalio hidroksido tirpalu ir E vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, likutis ištirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. E vitamino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu naudojant fluorescencinį arba UV detektorių.

3. Reagentai

3.1. Etanolis, σ = 96 %

3.2. Petroleteris, virimo temperatūros diapazonas 40 °C–60 °C

3.3. Metanolis

3.4. Kalio hidroksido tirpalas, β = 50 g/100 ml

3.5. Natrio askorbato tirpalas, β = 10 g/100 ml (žr. 7.7 pastabas)

3.6. Natrio sulfidas, Na2S × xH2O (x = 7-9)

3.6.1. Natrio sulfido tirpalas, c = 0,5 mol/l glicerolio, β = 120 g/l (kai x = 9) (žr. 7.8 pastabas).

3.7. Fenolftaleino tirpalas, β = 2 g/100 ml etanolio (3.1)

3.8. HPLC judančioji fazė: metanolio (3.3) ir vandens mišinys, pvz., 980 + 20 (V + V). Tikslų santykį sąlygoja naudojamos kolonėlės charakteristikos

3.9. Azotas, be deguonies

3.10. DL-α-tokoferolio acetatas, ypatingai grynas, sertifikuoto aktyvumo

3.10.1. DL-α-tokoferolio acetato pradinis tirpalas. 100 mg DL-α-tokoferolio acetato (3.10) pasverkite 0,1 mg tikslumu ir supilkite į 100 ml matavimo kolbą. Ištirpinkite etanolyje (3.1) ir tuo pačiu tirpikliu praskieskite iki žymės. 1 ml šio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio acetato. (apie UV kontrolę žr. 5.6.1.3; apie stabilizavimą žr. 7.4 pastabas).

3.11. DL-α-tokoferolis, ypatingai grynas, sertifikuoto aktyvumo

3.11.1. 100 mg DL-α-tokoferolio (3.10) pasverkite 0,1 mg tikslumu ir supilkite į 100 ml matavimo kolbą. Ištirpinkite etanolyje (3.1) ir tuo pačiu tirpikliu praskieskite iki žymės. 1 ml šio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio. (apie UV kontrolę žr. 5.6.2.3; apie stabilizavimą žr. 7.4 pastabas).

3.12. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr. 7.5 pastabas).

4. Aparatūra

4.1. Vakuuminis sukamasis garintuvas

4.2. Gintaro spalvos stiklo indai:

4.2.1. plokščiadugnės arba kūginės kolbos, 500 ml, su šlifo mova;

4.2.2. matavimo kolbos su šlifo kamščiais, siaurakaklės, 10, 25, 100 ir 500 ml;

4.2.3. kūginiai dalinamieji piltuvai, 1000 ml, su šlifo kamščiais;

4.2.4. kriaušės formos kolbos, 250 ml, su šlifo mova.

4.3. Allihn kondensatorius, apvalkalo ilgis 300 mm, su šlifo jungtimi, su dujų tiekimo vamzdžio adapteriu

4.4. Lankstytasis filtro popierius fazėms atskirti, skersmuo 185 mm (pvz., Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. HPLC įranga su įšvirkštimo sistema

4.5.1. Skysčių chromatografijos kolonėlė, 250 mm × 4 mm, C18, 5 ar 10 μm pakuotė ar lygiavertė kolonėlė

4.5.2. Fluorescencinis arba reguliuojamo bangos ilgio UV detektorius

4.6. Spektrofotometras ir 10 mm kvarco kiuvetės

4.7. Vandens vonia ir magnetinė maišyklė

4.8. Ekstrahavimo aparatas (žr. 1 paveikslą), kurį sudaro:

4.8.1. 1 l talpos stiklinis cilindras su šlifo mova ir kamščiu;

4.8.2. šlifo įmova su atšaka ir reguliuojamo ilgio vamzdžiu, einančiu per centrą. Reguliuojamo ilgio vamzdžio apatinis galas turi būti U formos, viršutinis – siaurėjančio antgalio formos, kad cilindre esančio tirpalo viršutinis sluoksnis galėtų būti perpiltas į dalinamąjį piltuvą.

5. Darbo eiga

Pastaba

E vitaminas yra jautrus (UV) šviesai ir oksidavimui. Visi veiksmai turi būti daromi tamsoje (naudojami gintaro spalvos indai arba aliuminio folija apvynioti indai) ir nesant deguonies (šalinamas azoto srove). Ekstrahuojant oras virš skysčio turi būti pakeistas azotu (venkite perteklinio slėgio kartkartėmis ištraukdami kamštį).

5.1. Mėginio paruošimas

Sumalkite mėginį, kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis, ir venkite šilumos susidarymo. Malti reikia prieš pat svėrimą ir muilinimą, kad nebūtų E vitamino nuostolių.

5.2. Muilinimas

Pagal E vitamino kiekį 0,01 g tikslumu pasverkite 2–25 g mėginio ir jį supilkite į plokščiadugnę ar kūginę 500 ml tūrio kolbą (4.2.1). Maišydami iš eilės įpilkite 130 ml etanolio (3.1), maždaug 100 mg BHT (3.12), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.6). Prie kolbos prijunkite kondensatorių (4.3) ir kolbą įmerkite į vandens vonią su magnetine maišykle (4.7). Pašildykite iki virimo ir virkite penkias minutes su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuomet per kondensatorių (4.3) įpilkite 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir dar 25 min. virkite su grįžtamuoju kondensatoriumi, maišydami silpna azoto srove. Kondensatorių nuplaukite maždaug 20 ml vandens ir kolbos turinį ataušinkite iki kambario temperatūros.

5.3. Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalą dekantuodami kiekybiškai perpilkite į 1000 ml dalinamąjį piltuvą (4.2.3) ar į ekstrahavimo aparatą (4.8) iš viso plovimui naudodami 250 ml vandens. Muilinimo kolbą iš eilės plaukite 25 ml etanolio (3.1) bei 100 ml petroleterio (3.2) ir plovimo skysčius supilkite į dalinamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatą. Vandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 2:1. Stipriai purtykite dvi minutes ir dviems minutėms palikite nusistovėti.

5.3.1. Ekstrahavimas naudojant dalinamąjį piltuvą (4.2.3)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), petroleterio sluoksnį perpilkite į kitą dalinamąjį piltuvą (4.2.3). Ekstrahavimą kartokite du kartus su 100 ml petroleterio (3.2) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2).

Dalinamajame piltuve sujungtus ekstraktus švelniai sukdami piltuvą (kad nesusidarytų emulsija) du kartus plaukite 100 ml vandens, toliau purtydami piltuvą plaukite dar 100 ml vandens porcijomis tol, kol įpiltas fenolftaleino tirpalas (3.7) nenudažys vandeninio sluoksnio (paprastai pakanka plauti keturis kartus). Kad būtų pašalintas visas suspenduotas vanduo, išplautą ekstraktą per sausą lankstytąjį filtrą fazėms atskirti (4.4) filtruokite į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2). Dalinamąjį piltuvą ir filtrą praplaukite 50 ml petroleterio (3.2), iki žymės praskieskite petroleteriu (3.2) ir gerai sumaišykite.

5.3.2. Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo aparatą (4.8)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), stiklinio cilindro (4.8.1) kamštį pakeiskite šlifo įmova (4.8.2) ir reguliuojamo vamzdžio U formos apatinį galą nustatykite taip, kad jis būtų šiek tiek virš sluoksnių skiriamosios ribos. Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pūsdami suslėgtą azotą, viršutinį petroleterio sluoksnį perpilkite į 1000 ml dalinamąjį piltuvą (4.2.3). Į stiklinį cilindrą įpilkite 100 ml petroleterio (3.2), cilindrą užkimškite ir gerai supurtykite. Leiskite sluoksniams atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinį sluoksnį supilkite į dalinamąjį piltuvą. Pakartokite ekstrahavimą dar kartą su 100 ml petroleterio (3.2), vėliau du kartus su 50 ml petroleterio (3.2) ir petroleterio sluoksnius supilkite į dalinamąjį piltuvą.

Sujungtus petroleterio ekstraktus plaukite, kaip tai aprašyta 5.3.1, ir toliau darykite, kaip čia aprašyta.

5.4. Mėginio tirpalo ruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4) pipete paimkite alikvotinę petroleterio tirpalo dalį (5.3.1 ar 5.3.2). Sukamajame garintuve (4.1) esant sumažintam slėgiui išgarinkite tirpiklį beveik iki sauso likučio, kai vonios temperatūra ne didesnė kaip 40 °C. Įleisdami azotą (3.9), slėgį padidinkite iki atmosferinio, kolbą nuimkite nuo sukamojo garintuvo. Likusį tirpiklį pašalinkite azoto srove (3.9) ir likutį iš karto ištirpinkite žinomame tūryje (10–100 ml) metanolio (3.3) (DL-α-tokoferolio koncentracija turi būti 5 μg/ml–30 μg/ml diapazone).

5.5. Nustatymas HPLC metodu

E vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (4.5.1), koncentracija matuojama naudojant fluorescencinį detektorių (sužadinimas: 295 nm, emisija: 330 nm) ar UV detektorių (292 nm) (4.5.2).

Alikvotinę metanolinio tirpalo, gauto 5.4, dalį (pvz., 20 μl) įšvirkškite ir plaukite judančiąja faze (3.8). Apskaičiuokite kelių to paties mėginio įšvirkštų tirpalų vidutinius smailių aukščius (plotus) ir kelių įšvirkštų kalibravimo tirpalų (5.6.2) vidutinius smailių aukščius (plotus).

HPLC sąlygos

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.5.1): | 250 mm × 4 mm, C18, 5 ar 10 µm pakuotė ar lygiavertė |

Judančioji fazė (3.8): | Metanolio (3.3) ir vandens mišinys, pvz., 980 + 20 (V + V) |

Srautas: | 1–2 ml/min. |

Detektorius (4.5.2): | Fluorescencinis detektorius (sužadinimas: 295 nm/emisija: 330 nm) arba UV detektorius (292 nm) |

5.6. Kalibravimas (DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio)

5.6.1. DL-α-tokoferolio acetato etalonas

5.6.1.1. Darbinio etaloninio tirpalo ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (4.2.1) pipete paimkite 25 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) ir hidrolizuokite, kaip aprašyta 5.2. Vėliau ekstrahuokite petroleteriu (3.2) pagal 5.3 ir praskieskite petroleteriu iki 500 ml. 25 ml šio ekstrakto sukamajame garintuve (žr. 5.4) išgarinkite beveik iki sauso likučio, likusį tirpiklį pašalinkite azoto srove (3.9) ir likutį ištirpinkite 25,0 ml metanolio (3.3). Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 45,5 μg DL-α-tokoferolio viename ml, tai atitinka 50 μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

5.6.1.2. Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilkite 1,0, 2,0, 4,0 ir 10,0 ml darbinio etaloninio tirpalo, iki žymės praskieskite metanoliu (3.3) ir sumaišykite. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,5, 5,0, 10,0 ir 25,0 μg/ml DL-α-tokoferolio acetato, t. y. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml ir 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolio.

Kelis kartus išvirkškite 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatykite vidutinius smailių aukščius (plotus). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) nubraižykite kalibravimo kreivę.

5.6.1.3 5.6.1.3. DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) UV etalonavimas

5,0 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) etanoliu praskieskite iki 25,0 ml ir spektrofotometru (4.6) išmatuokite pagal etanolį (3.1) šio tirpalo UV spektrą 250–320 nm diapazone.

Absorbcijos maksimumas turi atitikti 284 nm:

+++++ TIFF +++++

Esant šiam praskiedimui, ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 0,84–0,88.

5.6.2. DL-α-tokoferolio etalonas

5.6.2.1. Darbinio etaloninio tirpalo ruošimas

Į 50 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2,0 ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1), ištirpinkite metanolyje (3.3) ir metanoliu praskieskite iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 40 μg DL-α-tokoferolio viename ml, tai atitinka 44,0 μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

5.6.2.2. Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilkite 1,0, 2,0, 4,0 ir 10,0 ml darbinio etaloninio tirpalo, iki žymės praskieskite metanoliu (3.3) ir sumaišykite. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,0, 4,0, 8,0 ir 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolio, t. y. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml ir 22,0 μg/ml DL-α-tokoferolio acetato.

Kelis kartus išvirkškite 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatykite vidutinius smailių aukščius (plotus). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) nubraižykite kalibravimo kreivę.

5.6.2.3. DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1) UV etalonavimas

2,0 ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1) etanoliu praskieskite iki 25,0 ml ir spektrofotometru (4.6) išmatuokite pagal etanolį (3.1) šio tirpalo UV spektrą 250–320 nm diapazone.Absorbcijos maksimumas turi atitikti 292 nm:

+++++ TIFF +++++

Esant šiam praskiedimui, ekstinkcijos faktoriaus vertė turi būti 0,6.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Naudodami mėginio tirpalo E vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą), pagal kalibravimo kreivę (5.6.1.2 ar 5.6.2.2) nustatykite mėginio tirpalo koncentraciją μg/ml (apskaičiuotą α-tokoferolio acetatui).

E vitamino kiekis mėginyje w, mg/kg, nustatomas pagal šią formulę:

+++++ TIFF +++++

kurioje:

β = mėginio tirpalo (5.4) E vitamino koncentracija μg/ml

V1 = mėginio tirpalo (5.4) tūris ml

V2 = tirpalo (5.4) paimtos alikvotinės dalies tūris 5.4 ml

m = mėginio dalies masė g

7. Pastabos

7.1. Jei mėginių E vitamino koncentracija yra maža, gali būti naudinga sujungti dviejų po muilinimo gautų įkrovų (pasvertas kiekis: 25 g) petroleterio ekstraktus į vieną mėginio tirpalą, skirtą nustatymui HPLC metodu.

7.2. Analizei paimtame mėginyje neturi būti daugiau kaip 2 g riebalų.

7.3. Jei fazės neatsiskiria, emulsijai suardyti įpilkite papildomai 10 ml etanolio (3.1).

7.4. Po DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio tirpalų spektrofotometrinių matavimų pagal 5.6.1.3 ar 5.6.2.3 į tirpalą (3.10.1 ar 3.10.2) įdėkite maždaug 10 mg BHT (3.12) ir tirpalą laikykite šaldytuve (laikymo trukmė ne ilgesnė kaip keturios savaitės).

7.5. Vietoje BHT galima naudoti hidrochinoną.

7.6. Naudojant tiesioginių fazių kolonėlę įmanoma atskirti α-, β-, χ-ir δ-tokoferolius.

7.7. Vietoje natrio askorbato tirpalo galima naudoti maždaug 150 mg askorbo rūgšties.

7.8. Vietoje natrio sulfido tirpalo galima naudoti maždaug 50 mg EDTA.

8. Pakartojamumas

Dviejų to paties mėginio lygiagrečiai daromų matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis kaip 15 % didesniojo rezultato vertės.

9. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai [2]

L : laboratorijų skaičius

n : atskirų verčių skaičius

sr : pakartojamumo standartinis nuokrypis

sR : atkuriamumo standartinis nuokrypis

r : pakartojamumas

R : atkuriamumas

CVr : pakartojamumo variacijos koeficientas

CVR : atkuriamumo variacijos koeficientas

| Premiksas | Pašarai su premiksais | Mineralų koncentratas | Baltyminiai pašarai | Pašarai paršiukams |

L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |

n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |

Vidurkis [mg/kg] | 17 380 | 1 187 | 926 | 315 | 61,3 |

sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |

r [mg/kg] | 1 075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |

CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |

sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |

R [mg/kg] | 2 324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |

CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |

+++++ TIFF +++++

C DALIS TRIPTOFANO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas pašaruose esančio suminio ir laisvo triptofano nustatymui. Taikant šį metodą D- ir L- formos neatskiriamos.

2. Metodo esmė

Suminiam triptofanui nustatyti mėginys 20 val. hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksido tirpalu esant 110 °C. Po hidrolizės įpilama vidinio etalono.

Laisvajam triptofanui nustatyti mėginys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui.

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3. Reagentai

3.1. Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas ar tokios pat kokybės vanduo (laidumas < 10 μS/cm)

3.2. Etaloninė medžiaga: triptofanas (grynumas/kiekis 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido

3.3. Vidinio etalono medžiaga: α-metiltriptofanas (grynumas/kiekis 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido

3.4. Bario hidroksido oktahidratas (reikia žiūrėti, kad Ba(OH)2 × 8H2O visiškai nesiliestų su oru, kad būtų išvengta BaCO3 susidarymo, kuris galėtų trukdyti nustatymui) (žr. 9.3 pastabą)

3.5. Natrio hidroksidas

3.6. Ortofosforo rūgštis, w = 85 %

3.7. Druskos rūgštis, ρ20= 1,19 g/ml

3.8. Metanolis, grynas HPLC

3.9. Petroleteris, virimo temperatūros diapazonas 40–60 °C

3.10. Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l:

40,0 g NaOH (3.5) ištirpinkite vandenyje ir iki 1 l praskieskite vandeniu (3.1).

3.11. Druskos rūgštis, c = 6 mol/l:

paimkite 492 ml HCl (3.7) ir iki 1 l praskieskite vandeniu.

3.12. Druskos rūgštis, c = 1 mol/l:

paimkite 82 ml HCl (3.7) ir iki 1 l praskieskite vandeniu.

3.13. Druskos rūgštis, c = 0,1 mol/l:

paimkite 8,2 ml HCl (3.7) ir iki 1 l praskieskite vandeniu.

3.14. Ortofosforo rūgštis, c = 0,5 mol/l:

paimkite 34 ml ortofosforo rūgšties (3.6) ir iki 1 l praskieskite vandeniu (3.1).

3.15. Koncentruotas triptofano tirpalas (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

į 500 ml matavimo kolbą įdėkite 0,2553 g triptofano (3.2), ištirpinkite jį druskos rūgštyje (3.13) ir iki žymės praskieskite druskos rūgštimi (3.13). Laikykite –18 °C ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.16. Koncentruotas vidinio etalono tirpalas, c = 2,50 μmol/ml:

į 500 ml matavimo kolbą įdėkite 0,2728 g α-metiltriptofano (3.3), ištirpinkite jį druskos rūgštyje (3.13) ir iki žymės praskieskite druskos rūgštimi (3.13). Laikykite –18 °C ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.17. Triptofano kalibravimo etaloninis tirpalas ir vidinis etalonas:

paimkite 2,00 ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15) ir 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Praskieskite vandeniu (3.1) ir metanoliu (3.8) iki maždaug tokio pat tūrio, kaip paruošto hidrolizato tūris, ir maždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10–30 %).

Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

Ruošdami tirpalą saugokite jį nuo tiesioginių saulės spindulių.

3.18. Acto rūgštis

3.19. 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolis

3.20. Etanolaminas > 98 %

3.21. 1 g 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalas 100 ml metanolio (3.8)

3.22. HPLC judančioji fazė: 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Naudodami etanolaminą (3.20), nustatykite pH 5,00. Vandeniu (3.1) skieskite iki 1000 ml.

4. Aparatūra

4.1. HPLC įranga ir spektrofluorimetrinis detektorius

4.2. Skysčių chromatografijos kolonėlė, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm pakuotė arba lygiavertė

4.3. pH-metras

4.4. Kolba iš polipropileno, talpa 125 ml, su plačiu kaklu ir užsukamu dangčiu

4.5. Membraninis filtras, 0,45 μm

4.6. Autoklavas, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar

4.7. Mechaninė arba magnetinė maišyklė

4.8. Vortex purtyklė

5. Darbo eiga

5.1. Mėginių ruošimas

Mėginys sumalamas taip, kad galima būtų jį sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys mėginiai prieš malimą turi būti džiovinami ore esant ne didesnei kaip 50 °C temperatūrai arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys mėginiai prieš malimą turi būti ekstrahuojami petroleteriu (3.9).

5.2. Laisvojo triptofano nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasverkite atitinkamą kiekį (1–5 g) paruošto mėginio (5.1). Įpilkite 100,0 ml druskos rūgšties, c = 0,1 mol/l (3.13) ir 5,00 ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16). Purtykite arba maišykite 60 min, naudodami mechaninę purtyklę ar magnetinę maišyklę (4.7). Leiskite nuosėdoms nusėsti, tuomet pipete į cheminę stiklinę paimkite 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų. Įpilkite 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Natrio hidroksido tirpalu, c = 1,0 mol/l, (3.10) nustatykite pH 3,0. Įpilkite pakankamą kiekį metanolio (3.8), kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10 - 30 %. Supilkite į atitinkamo tūrio matavimo kolbutę ir praskieskite vandeniu iki chromatografavimui tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio, kaip kalibravimo etaloninio tirpalo tūris (3.17)).

Kelis ml tirpalo prieš įšvirkščiant į HPLC kolonėlę nufiltruokite per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Pradėkite chromatografavimą pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninį tirpalą ir ekstraktus saugokite nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti esant 5 °C.

5.3. Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (4.4) 0,2 mg tikslumu pasverkite 0,1–1 g paruošto mėginio (5.1). Pasvertojoje mėginio dalyje turi būti apie 10 mg azoto. Įpilkite 8,4 g bario hidroksido oktahidrato (3.4) ir 10 ml vandens. Sumaišykite vortex maišykle (4.8) ar magnetine maišykle (4.7). Teflonu padengtą magnetą palikite mišinyje. Indo sieneles nuplaukite 4 ml vandens. Kolbą uždenkite užsukamuoju dangčiu jo neužverždami. Kolbą įdėkite į autoklavą (4.6) su verdančiu vandeniu ir garais ir palaikykite 30–60 min. Uždarykite autoklavą ir 20 val. kaitinkite esant 110 (± 2) °C.

Prieš atidarydami autoklavą temperatūrą sumažinkite iki šiek tiek mažesnės kaip 100 °C. Siekiant išvengti Ba(OH)2 × 8H2O išsikristalizavimo, į šiltą mišinį įpilkite 30 ml kambario temperatūros vandens. Švelniai papurtykite ar maišykite. Įpilkite 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Indus 15 min. aušinkite ant vandens ir ledo vonios.

Po to įpilkite 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Indą laikydami ant aušinamosios vonios ir maišydami, turinį neutralizuokite HCl, c = 6 mol/l (3.11) ir nustatykite pH 3,0, naudodami HCl, c = 1 mol/l (3.12). Įpilkite pakankamą kiekį metanolio, kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilkite į atitinkamo tūrio matavimo kolbutę ir praskieskite vandeniu iki apibrėžto tūrio, tinkamo chromatografavimui (pvz., 100 ml). Įpylus metanolio neturi susidaryti nuosėdų.

Kelis ml tirpalo prieš įšvirkščiant į HPLC kolonėlę nufiltruokite per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Pradėkite chromatografavimą pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninį tirpalą ir hidrolizatus saugokite nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti esant 5 °C.

5.4. Nustatymas HPLC metodu

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai (taip pat žr. 9.1 ir 9.2 pastabas):

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2): | 125 mm × 4 mm, C18, 3 µm pakuotė arba lygiavertiška |

Kolonėlės temperatūra: | kambario temperatūra |

Judančioji fazė (3.22): | 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Naudodami etanolaminą (3.20), nustatykite pH 5,00. Praskieskite vandeniu (3.1) iki 1 000 ml |

Srautas: | 1 ml/min. |

Visas eliuavimo laikas: | apytikriai 34 min. |

Detektoriaus bangos ilgis: | sužadinimas: 280 nm, emisija: 356 nm |

Išvirkščiamas tūris: | 20 µl |

6. Rezultatų apskaičiavimas

+++++ TIFF +++++

A = vidinio standarto smailės plotas, kalibravimo etaloninis tirpalas (3.17)

B = triptofano, ekstrakte (5.2) ar hidrolizate (5.3), smailės plotas

C = koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), tūris ml (2 ml)

D = koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), koncentracija μmol/ml (= 2,50)

E = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į ekstraktą (5.2) (= 5,00 ml) arba į hidrolizatą (5.3) (= 2,00 ml), tūris

F = ekstrakto (5.2) arba hidrolizato (5.3) vidinio etalono smailės plotas

G = triptofano kalibravimo etaloninio tirpalo (3.17) smailės plotas

H = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į kalibravimo etaloninį tirpalą (3.17), tūris ml (= 2,00 ml)

W = mėginio masė g (su pataisa pradinei masei, jei mėginys buvo džiovintas ar nuriebalintas)

MW = triptofano molekulinė masė (= 204,23)

7. Pakartojamumas

Dviejų to paties mėginio lygiagrečiai daromų matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis kaip 10 % didesniojo rezultato vertės.

8. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (ketvirtasis tarplaboratorinis palyginimas), kurį darant ne daugiau kaip 12 laboratorijų analizavo tris mėginius. Buvo daromos lygiagrečios (5) kiekvieno mėginio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

L : laboratorijų skaičius,

n : atskirų verčių skaičius, paliekamų po išskirčių (identifikuotų pagal Cochran, Dixon išskirčių kriterijų) pašalinimo

sr : pakartojamumo standartinis nuokrypis

sR : atkuriamumo standartinis nuokrypis

r : pakartojamumas

R : atkuriamumas

CVr : pakartojamumo variacijos koeficientas %

CVR : atkuriamumo variacijos koeficientas %

| 1 mėginys Kiaulių pašaras | 2 mėginys Kiaulių pašaras su L-triptofanu | 3 mėginys Kiaulių pašaro koncentratas |

L | 12 | 12 | 12 |

n | 50 | 55 | 50 |

Vidurkis [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |

sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |

r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |

CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |

sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |

R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |

CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |

Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo parengtas kitas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (ketvirtasis tarplaboratorinis palyginimas), kurį darant ne daugiau kaip 13 laboratorijų analizavo du mėginius. Buvo daromos lygiagrečios (5) kiekvieno mėginio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

L : laboratorijų skaičius

n : atskirų verčių skaičius, paliekamų po išskirčių (identifikuotų pagal Cochran, Dixon išskirčių kriterijų) pašalinimo

sr : pakartojamumo standartinis nuokrypis

sR : atkuriamumo standartinis nuokrypis

r : pakartojamumas

R : atkuriamumas

CVr : pakartojamumo variacijos koeficientas %

CVR : atkuriamumo variacijos koeficientas %

| 4 mėginys Kviečių ir sojos mišinys | 5 mėginys Kviečių ir sojos mišinys (= 4 mėginys) su triptofanu (0,457 g/kg) |

L | 12 | 12 |

n | 55 | 60 |

Vidurkis [g/kg] | 0,391 | 0,931 |

sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |

r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |

CVr [%] | 1,34 | 1,34 |

sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |

R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |

CVR [%] | 4,71 | 5,11 |

Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas dar vienas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas, kurį darant ne daugiau kaip 7 laboratorijos analizavo keturis mėginius. Rezultatai pateikti toliau. Kiekvieno mėginio analizė buvo daroma penkis kartus.

L : laboratorijų skaičius

n : atskirų verčių skaičius, paliekamų po išskirčių (identifikuotų pagal Cochran, Dixon išskirčių kriterijų) pašalinimo

sr : pakartojamumo standartinis nuokrypis

sR : atkuriamumo standartinis nuokrypis

r : pakartojamumas

R : atkuriamumas

CVr : pakartojamumo variacijos koeficientas %

CVR : atkuriamumo variacijos koeficientas %

| 1 mėginys Kiaulių pašaro mišinys (CRM117) | 2 mėginys Žuvų miltai su mažu riebalų kiekiu, (CRM118) | 3 mėginys Sojos pupelių pašarai (CRM119) | 4 mėginys Nugriebto pieno milteliai (CRM120) |

L | 7 | 7 | 7 | 7 |

n | 25 | 30 | 30 | 30 |

Vidurkis [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |

sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |

r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |

CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |

sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |

R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |

CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |

9. Pastabos

9.1. Šios specialios chromatografavimo sąlygos gali pagerinti triptofano ir

α-metiltriptofano atskyrimą.

Skysčių chromatografijos kolonėlė: | 125 mm × 4 mm, C18, 5 µm pakuotė arba lygiavertė |

Kolonėlės temperatūra: | 32 °C |

Judančioji fazė: | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanolis, 95 + 5 (V + V) B: metanolis |

Gradiento programa: | 0 min. | 100 % A | 0 % B |

15 min. | 100 % A | 0 % B |

17 min. | 60 % A | 40 % B |

19 min. | 60 % A | 40 % B |

21 min. | 100 % A | 0 % B |

33 min. | 100 % A | 0 % B |

Srautas: | 1,2 ml/min. |

Visas eliuavimo laikas: | apytikriai 33 min. |

9.2. Chromatografavimas bus nevienodas, atsižvelgiant į HPLC tipą ir naudojamą kolonėlės pakavimo medžiagą. Pasirinkta sistema turi užtikrinti triptofano ir vidinio etalono smailių atsiskyrimą iki pat bazinės linijos. Be to, svarbu, kad irimo produktai būtų gerai atskirti nuo triptofano ir vidinio etalono. Siekiant patikrinti, ar bazinėje linijoje, kur turi būti vidinio etalono smailė, nėra priemaišų, turi būti analizuojami hidrolizatai be vidinio etalono. Svarbu, kad eliuavimo laikas būtų pakankamai ilgas visiems irimo produktams išplauti, antraip pavėlavusios eliuavimo smailės gali trukdyti paskesniems chromatografavimo bandymams.

Chromatografavimo sistemos atsakas darbinių koncentracijų diapazone turi būti tiesinis. Atsako tiesiškumas turi būti nustatomas naudojant vieną (normalią) vidinio etalono koncentraciją ir keičiant triptofano koncentraciją. Svarbu, kad triptofano ir vidinio etalono smailės būtų HPLC ir fluorescencinio detektoriaus sistemos tiesinėje dalyje. Jei triptofano ir (arba) vidinio etalono smailė (-s) yra per žema (-os) ar per aukšta (-os), analizė turi būti kartojama imant kito dydžio mėginį ir (arba) galutinį tūrį.

9.3. Bario hidroksidas

Sendamas bario hidroksidas tirpsta vis blogiau. Dėl šios priežasties tirpalas, naudojamas nustatymui HPLC metodu, darosi neskaidrus ir tai gali sumažinti gautus triptofano kiekio rezultatus.

[1] Vykdė Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) pašarų darbo grupė.

[2] Vykdė Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) pašarų darbo grupė.

--------------------------------------------------