Komisijos Direktyva 2000/32/EB

2000 m. gegužės 19 d.

dvidešimt šeštą kartą derinanti su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo [1]

(tekstas svarbus EEE)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo [2] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 1999/33/EB [3], ypač į jos 28 straipsnį,

kadangi:

(1) Direktyvos 67/458/EEB I priede yra pateiktas pavojingų medžiagų sąrašas, taip pat informacija apie kiekvienos medžiagos klasifikavimo ir ženklinimo tvarką. Turimos mokslo ir technikos žinios parodė, kad nurodytame priede pateiktą pavojingų medžiagų sąrašą reikėtų suderinti su turimomis žiniomis. Reikia pataisyti direktyvos tekstus, pateiktus tam tikromis kalbomis konkrečiuose pratarmės skirsniuose ir I priedo A lentelėje.

(2) Direktyvos 67/488/EEB III priede yra pateiktas su pavojingomis medžiagomis ir preparatais susijusios specialios rizikos pobūdį nurodančių frazių sąrašas. Direktyvos 67/548/EEB IV priede yra pateiktas frazių, duodančių su pavojingomis medžiagomis ir preparatais susijusius patarimus dėl saugos priemonių, sąrašas. Direktyvos 67/458/EEB VI priede yra pateiktas pavojingų medžiagų ir preparatų klasifikavimo bei ženklinimo vadovas. Reikia pataisyti direktyvos tekstus, pateiktus tam tikromis kalbomis konkrečiuose III, IV ir VI priedų skirsniuose.

(3) Direktyvos 67/458/EEB V priede nustatyti medžiagų ir preparatų fizikinių cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiškumo nustatymo metodai. Šį priedą būtina suderinti su technikos pažanga.

(4) Direktyvos 67/548/EEB IX priede pateikiamos nuostatos dėl sutvirtinimų, kurių negalėtų išardyti vaikas. Šios nuostatos turi būti pakoreguotos bei atnaujintos. Būtina išplėsti sutvirtinimų, kurių negalėtų išardyti vaikas, taikymo sritį.

(5) Šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Direktyvų dėl techninių kliūčių panaikinimo pavojingų medžiagų ir preparatų prekybos srityje derinimo su technikos pažanga komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:

1 straipsnis

Direktyva 67/548/EEB iš dalies keičiama taip:

1. I priedas iš dalies keičiamas taip:

a) šios direktyvos 1A priedo Q pastaba pakeičia atitinkamą pratarmėje esančią pastabą;

b) šios direktyvos 1B priede esančios eilutės pakeičia atitinkamas A lentelės eilutes;

c) šios direktyvos 1C priede esantys įrašai pakeičia atitinkamus įrašus;

d) įterpiami šios direktyvos 1D priede esantys įrašai.

2. Šios direktyvos 2 priede nurodyta rizikos frazė pakeičia atitinkamą frazę III priede.

3. IV priedas iš dalies keičiamas taip:

a) saugos frazė šios direktyvos 3A priede pakeičia atitinkamas frazes IV priede;

b) bendros saugos frazės šios direktyvos 3B priede pakeičia atitinkamas frazes IV priede.

4. V priedo B dalis iš dalies keičiama taip:

a) šios direktyvos 4A priedo tekstas pakeičia B.10 skyrių;

b) šios direktyvos 4B priedo tekstas pakeičia B.11 skyrių;

c) šios direktyvos 4C priedo tekstas pakeičia B.12 skyrių;

d) šos direktyvos 4D priedo tekstas pakeičia B.13 ir B.14 skyrius;

e) šios direktyvos 4E priedo tekstas pakeičia B.17 skyrių;

f) šios direktyvos 4F priedo tekstas pakeičia B.23 skyrių. Atitinkamai pakeičiama B.23 skyriaus antraštė paaiškinime;

g) prie šios direktyvos pridedamas 4G priedo tekstas.

5. Išbraukiama V priedo C dalies bendrosios įžangos ketvirtoji įtrauka.

6. Šios direktyvos 5 priedo tekstai pakeičia atitinkamus VI priedo tekstus.

7. IX priedas iš dalies keičiamas taip, kaip nurodyta šios direktyvos 6 priede.

2 straipsnis

V alstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 2001 m. birželio 1 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.

Valstybės narės, priimdamos šias nuostatas, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės.

2. Valstybės narės pateikia Komisijai šios direktyvos taikymo srityje priimtų nacionalinės teisės aktų pagrindinių nuostatų tekstus bei šios direktyvos ir priimtų nacionalinių nuostatų koreliacijos lentelę.

3 straipsnis

Ši direktyva įsigalioja trečią dieną po jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.

4 straipsnis

Ši direktyva skirta valstybėms narėms.

Priimta Briuselyje, 2000 m. gegužės 19 d.

Komisijos vardu

Margot Wallström

Komisijos narė

[1] Priimta po 27 derinimo.

[2] OL 196, 1967 8 16, p. 1.

[3] OL L 199, 1999 7 30, p. 57.

--------------------------------------------------

1 A PRIEDAS

1 PRIEDO PRATARMĖ

Pastabų apie medžiagų identifikavimą, klasifikavimą ir ženklinimą etiketėmis paaiškinimas

Danų kalba:

Q pastaba:

- en kortvarig biopersistensprøve ved inhalation har vist, at fibre, der er længere end 20 µm, har en vægtet halveringstid på mindre end 10 dage

- en kortvarig biopersistensprøve ved intratrakeal instillation har vist, at fibre, der er længere end 20 µm, har en vægtet halveringstid på mindre end 40 dage

- en egnet intra-peritoneal prøve ikke har vist kræftfremkaldende virkning, eller

- en egnet langvarig inhalationsprøve ikke har vist relevante sygdomsfremkaldende virkninger eller neoplastiske forandringer.

Švedų kalba:

Q pastaba:

- ett korttidstest för att bestämma den biologiska beständigheten vid inhalation har visat att fibrer längre än 20 µm har en viktad halveringstid på mindre än 10 dagar

- ett korttidstest för att bestämma den biologiska beständigheten vid intratrakeal instillation har visat att fibrer längre än 20 µm har en viktad halveringstid på mindre än 40 dagar

- ett lämpligt intraperitonealt test har inte givit belägg för förhöjd cancerogenitet

- frånvaro av relevant patogenitet eller neoplastiska förändringar i ett lämpligt långtids inhalationstest.

(Netaikoma tekstui ispanų kalba)

(Netaikoma tekstui vokiečių kalba)

(Netaikoma tekstui graikų kalba)

(Netaikoma tekstui anglų kalba)

(Netaikoma tekstui prancūzų kalba)

(Netaikoma tekstui italų kalba)

(Netaikoma tekstui olandų kalba)

(Netaikoma tekstui portugalų kalba)

(Netaikoma tekstui suomių kalba)

--------------------------------------------------

1B PRIEDAS

"A LENTELĖ

Z | Szimbólum | ES | DA | DE | EL | EN | FI | FR | IT | NL | PT | SV |

18 | Ar | Argón | Argon | Argon | Αργό | Argon | Argon | Argon | Argon | Argon | Árgon | Argon |

64 | Gd | Gadolinio | Gadolinium | Gadolinium | Γαδολίνιο | Gadolinium | Gadolinium | Gadolinium | Gadolinio | Gadolinium | Gadolínio | Gadolinium" |

--------------------------------------------------

1C PRIEDAS

Indekso Nr. | Cheminis pavadinimas | Pastabos apie medžiagas | EB Nr. | CAS Nr. | Klasifikavimas | Ženklinimas etiketėmis | Koncentracijos ribos | Pastabos apie preparatus |

006-011-00-7 | karbarilas (ISO) 1-naftilmetilkarbamatas | | 200-555-0 | 63-25-2 | Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50 | Xn; N R: 22-40-50 S: (2-)22-24-36/37-46-61 | | |

006-013-00-8 | natrio metamas(ISO) natrio metilditiokarbamatas | | 205-293-0 | 137-42-8 | Xn; R22 R31 C; R34 R43 N; R50-53 | C; N R: 22-31-34-43-50/53 S: (1/2-)26-36/37 /39-45-60-61 | | |

006-015-00-9 | diuronas (ISO) 3-(3,4-dichlorfenil)1,1-dimetilkarbamidas | | 206-354-4 | 330-54-1 | Kanc. Cat. 3; R40 Mut. Kat. 3; R40 Xn; R22-48/22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-48/22-50/53 S: (2-)13-22-23-37-46-60-61 | | |

006-016-00-4 | propoksuras (ISO) 2-izopropoksifenil N-metilkarbamatas 2-izopropoksifenilmetilkarbamatas | | 204-043-8 | 114-26-1 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

006-017-00-X | aldikarbas (ISO) 2-metil-2-(metiltio)propanal-O-(N-metilkarbamoil)ksimas | | 204-123-2 | 116-06-3 | T+; R26/28 T; R24 N; R50-53 | T+; N R: 24-26/28-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

006-018-00-5 | aminokarbas (ISO) 4-dimetilaminotolilmetilkarbamatas | | 217-990-7 | 2032-59-9 | T; R24/25 N; R50-53 | T; N R: 24/25-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

006-019-00-0 | dialatas (ISO) S-(2,3-dichlor alil)-N,N-diizopropil tiokarbamatas | | 218-961-1 | 2303-16-4 | Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)25-36/37-60-61 | | |

006-020-00-6 | barbanas (ISO) | | 202-930-4 | 2303-16-4 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-36/37-60-61 | | |

006-023-00-2 | merkaptodimeturas (ISO) metiokarbas 3,5-dimetil-4-metil-tiofenil-N-metilkarbamatas | | 217-991-2 | 2032-65-7 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-37-45-60-61 | | |

006-024-00-8 | natrio proksanas (ISO) natrio O-izopropilditiokarbamatas | | 205-443-5 | 140-93-2 | Xn; R22 Xi; R38 N; R51-53 | Xn; N R: 22-38-51 S: (2-)13-61 | | |

006-026-00-9 | karbofuranas (ISO) 2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il-N-metilkarbamatas | | 216-353-0 | 1563-66-2 | T+; R26/28 N; R50-53 | T+; N R: 26/28-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

006-028-00-X | dinobutonas (ISO) 2-(1-metilpropil)-4,6-dinitrofenil izopropilkarbonatas | | 213-546-1 | 973-21-7 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

006-029-00-5 | dioksakarbas (ISO) 2-(1,3-dioksolan-2-il)-fenil-N-metilkarbamatas | | 230-253-4 | 6988-21-2 | T; R25 N; R51-53 | T; N R: 25-51/53 S: (1/2-)37-45-61 | | |

006-033-00-7 | metoksuronas (ISO) 3-(3-chlor-4-metoksifenil)-1,1-dimetilkarbamidas | | 243-433-2 | 19937-59-8 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

006-034-00-2 | pebulatas (ISO) N-butil-N-etil-S-propiltiokarbamatas | | 214-215-4 | 1114-71-2 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)23-61 | | |

006-035-00-8 | pirimikarbas (ISO) 5,6-dimetil-2-dimetil-aminopirimidin-4-il-N,N-dimetilkarbamatas | | 245-430-1 | 23103-98-2 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-37-45-60-61 | | |

006-037-00-9 | promekarbas (ISO) 3-izopropil-5 metilfenil-N-metilkarbamatas | | 220-113-0 | 2631-37-0 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)24-37-45-60-61 | | |

006-038-00-4 | sulfalatas (ISO) 2-chloralil-N,N-dimetilditiokarbamatas | E | 202-388-9 | 95-06-7 | Carc. Cat. 2; R45 Xn; R22 N; R50-53 | T; N R: 45-22-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

006-039-00-X | trialatas (ISO) S-2,3,3-trichloralildiizopropil tiokarbamatas | | 218-962-7 | 2303-17-5 | Xn; R22-48/22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-48/22-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

006-042-00-6 | monuronas (ISO) 3-(4-chlorfenil)-1,1-dimetilkarbamidas | | 205-766-1 | 150-68-5 | Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-043-00-1 | monuronas-TCA 3-(4-chlorfenil)-1,1-dimetiluroniumo trichloracetatas | | — | 140-41-0 | Xi; R36/38 Carc. Cat. 3; R40 N; R50-53 | Xn; N R: 36/38-40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-045-00-2 | metomilas (ISO) 1-(metiltio)etilidenamino-N-metilkarbamatas | | 240-815-0 | 16752-77-5 | T+; R28 N; R50-53 | T+; N R: 28-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

006-046-00-8 | bendiokarbas (ISO) 2,2-dimetil-1,3 benzodioksol-4-il-N-metilkarbamatas | | 245-216-8 | 22781-23-3 | T; R23/25 Xn; R21 N; R50-53 | T; N R:21-23/25-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

006-047-00-3 | bufenkarbas (ISO) 3-(1-metilbutil)fenil-N-metilkarbamato ir 3-(1-etilpropil)fenil-N-metilkarbamato mišinys | | — | 8065-36-9 | T; R24/25 N; R50-53 | T; N R: 24/25-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

006-048-00-9 | etiofenkarbas (ISO) 2-(etiltiometil)fenil-N-metilkarbamatas | | 249-981-9 | 29973-13-5 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

006-050-00-X | fenuronas-TCA 1,1-dimetil-3-feniluroniumo trichloracetatas | | — | 4482-55-7 | Xi; R38 N; R50-53 | Xn; N R: 38-50/53 S: (2-)60-61 | | |

006-053-00-6 | izoprokarbas (ISO) 2-izopropilfenil-N-metilkarbamatas | | 220-114-6 | 2631-40-5 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

006-054-00-1 | meksakarbatas (ISO) 3,5-dimetil-4-dimetilaminofenil-N-metil-karbamatas | | 206-249-3 | 315-18-4 | T+; R28 Xn; R21 N; R50-53 | T+; N R: 21-28-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

006-057-00-8 | nitrapirinas (ISO) 2-chlor-6-trichlormetilpiridinas | | 217-682-2 | 1929-82-4 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)24-61 | | |

006-060-00-4 | oksikarboksinas (ISO) 2,3-dihidro-6-metil-5-(N-fenilkarbamoil)-1,4-oksotiino 4,4-dioksidas | | 226-066-2 | 5259-88-1 | Xn; R: 22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)61 | | |

006-069-00-3 | metiltiofanatas (ISO) 1,2-di-(3-metoksikarbonil-2-tioureido) benzenas | | 245-740-7 | 23564-05-8 | Muta. Kat. 3; R40 N; R50-53 | Xn; N R: 40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-070-00-9 | furmeciklosas N-cikloheksil-N-metoksi-2,5-dimetil-3-furamidas | | 262-302-0 | 60568-05-0 | Carc. Cat. 3; R40 N; R50-53 | Xn;N R: 40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-088-00-7 | benfurokarbas (ISO) etil N-[2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzfuran-7-iloksilkarbonil(metil)aminotio]-n-izopropil-β-alaninatas | | — | 82560-54-1 | T; R23/25 N; R50-53 | T; N R: 23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

007-012-00-5 | N,N-dimetilhidrazinas 1,1-dimetilhidrazinas | E | 200-316-0 | 57-14-7 | F; R11 Carc. Cat. 2; R45 T; R23/25 C; R34 N; R51-53 | F; T; N R: 45-11-23/25-34-51/53 S: 53-45-61 | | |

007-013-00-0 | N,N-dimetilhidrazinas 1,2-dimetilhidrazinas | E | — | 540-73-8 | Carc. Cat. 2; R45 T; R23/24/25 N; R51-53 | T; N R: 45-23/24/25-51/53 S: 53-45-61 | C≥25 %;T; R45-23/24 /25 3 %≤C<25 %; T; R45-20/21/22 0,01 %≤C<3 %; T; R45 | |

009-003-00-1 | vandenilio fluorido rūgštis…% | B | 231-634-8 | 7664-39-3 | T+;R26/27/28 C; R35 | T+; C R: 26/27/28-35 S: (1/2-)7/9-26-36/37-45 | C≥7 %; T+;C; R26/27/28-35 1 %≤C<7 %;T; R23/24/25-34 0,1 %≤C<1 %;Xn; R20/21/22-36/37/38 | |

015-039-00-9 | metilazinofosas (ISO) O,O-dimetil-4-oksobenzotriazin-3-ilmetil fosforoditioatas | | 201-676-1 | 86-50-0 | T+; R26/28 T; R24 R43 N; R50-53 | T+; N R: 24-26/28-43-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

015-048-00-8 | fentionas (ISO) O,O-dimetil-O-(4-metiltio-m-tolil) fosforotioatas | | 200-231-9 | 55-38-9 | Muta. Cat. 3; R40 T; R23-48/25 Xn; R21/22 N; R50-53 | T; N R: 21/22-23-40-48/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

015-056-00-1 | etilazinofosas (ISO) O,O-dietil4-oksobenzotriazin-3-ilmetil fosforoditioatas | | 220-147-6 | 2642-71-9 | T+; R28 T; R24 N; R50-53 | T+; N R: 24-28-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

015-140-00-8 | triazofosas (ISO) O,O-dietil-O-1-fenil-1H,2,4-triazol-3-ilmetilfosforotioatas | | 245-986-5 | 24017-47-8 | T; R23/25 Xn; R21 N; R50-53 | T; N R: 21-23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

016-013-00-X | sieros dichloridas | | 234-129-0 | 10545-99-0 | R14 C; R34 N; R50 | C; N R: 14-34-50 S: (1/2)26-36/37/39-45-61 | C≥10 %; C;R34 5 %≤C<10 %; Xi; R36/37/38 | |

016-014-00-5 | sieros tetrachloridas | | — | 13451-08-6 | R14 C; R34 N; R50 | C; N R:14-34-50 S: (1/2-)26-36/37-39-45-61 | C≥10 %; C; R34 5 %≤C<10 %; Xi; R36/37/38 | |

016-023-00-4 | dimetilsulfatas | E | 201-058-1 | 77-78-1 | Carc. Cat. 2; R45 Muta. Cat. 3; R40 T+; R26 T; R25 C; R34 R43 | T+; R: 45-25-26-34-43 S: 53-45 | C≥25 %; T+;R45-25-26-34-43 10 %≤C<10 %;T+; R45-22-26-36/37/38-43 5 %≤C<7 %; T; R45-22-23-36/37/38-43 3 %≤C<5 %; T; R45-22-23-43 1 %≤C<3 %; T; R45-23-4 0,1 %≤C<1 %; T; R45-20 0,01 %≤C<0,1 %; T; R45 | |

016-024-00-X | Dimeksano (ISO) bis(metoksitiokarbonil)disulfidas | | 215-993-8 | 1468-37-7 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

016-071-00-6 | trinatrio 3-amino-6,13-dichlor-10-((3-((4-chlor-6-(2-sulfofenilamino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)propil)amino)-4,11-trifenoksi dioksazindisulfonatas | | 410-130-3 | 136248-03-8 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-24-37 | | |

022-001-00-5 | titano tetrachloridas | | 231-441-9 | 7550-45-0 | R14 C; R34 | C R: 14-34 S: (1/2-)7/8-26-36/37/39-45 | C ≥10 %; C;R34 5 %≤C< 10 %;Xi; R36/37/38 | |

030-004-00-8 | dimetilcinkas [1] dietilcinkas [2] | | 208-884-1 [1] 209-161-3 [2] | 544-97-8 [1] 557-20-0 [2] | R14 F; R17 C; R34 N; R50-53 | F; C; N R:14-17-34-50 /53 S: (1/2-)16-43-45 -60-61 | | |

050-002-00-0 | ciheksatinas (ISO) hidroksitricikloheksilstananas tri(cikloheksil)alavo hidroksidas | | 236-049-1 | 13121-70-5 | Xn; R20/21/22 N; R50-53 | Xn; N R: 20/21/22-50/53 S: (2-)13-60-61 | | |

050-012-00-5 | tetracikloheksilstananas [1] chlortricikloheksilstananas [2] butiltricikloheksilstananas [3] | | 215-910-5 [1] 221-437-5 [2] 230-358-5 [3] | 1449-55-4 [1] 3091-32-5 [2] 7067-44-9 [3] | Xn; R20/21/22 N; R50-53 | Xn; N R: 20/21/22-50/53 S: (2-)26-28-60-61 | C≥1 %; Xn; R20/21/22 | 1 |

050-017-00-2 | fenbutanino oksidas (ISO) bis(tris(2-metil-2-fenilpropil)alavo oksidas | | 236-407-7 | 13356-08-6 | T+; R26 Xi; R36/38 N; R50/53 | T; N R: 26-36/38-50 /53 S: (1/2-)28-36 /37-45-60-61 | | |

082-009-00-X | geltonasis švino sulfochromatas C.I; Geltonasis pigmentas 34 [ši medžiaga identifikuojama pagal spalvos indeksą, remiantis spalvinio indekso registracijos numeriu, C.I. 77 603. | | 215-693-7 | 1344-37-2 | Carc. Cat. 3; R40 Repr. Cat. 1; R61 Mut. Cat. 3; R62 R33 N; R50-53 | T; N R: 61-33-40-50/53-62 S: 53-45-60-61 | | 1 |

082-010-00-5 | raudonasis švino chromato-molibdato sulfatas C.I.; Raudonasis pigmentas 104 [ši medžiaga identifikuojama pagal spalvos indeksą, remiantis spalvinio indekso registracijos numeriu, C.I. 77 605. | | 235-759-9 | 12656-85-8 | Carc. Cat. 3; R40 Muta. Cat. 1; R61 Repr. Cat. 3; R62 R33 N; R50-53 | T; N R: 61-33-40-50 /53-62 S: 53-45-60-61 | | 1 |

601-024-00-X | kumenas [1] propilbenzenas [2] | | 202-704-5 [1] 203-132-9 [2] | 98-82-8 [1] 103-65-1 [2] | R10 Xn; R65 Xi; R37 N; R51-53 | Xn; N R: 10-37-51/53-65 S: (2-)24-37-61-62 | | 4 |

601-032-00-3 | benz[a]pirenas benz[def]chrizenas | | 200-028-5 | 50-32-8 | Carc. Cat. 2; R45 Mut. Cat. 2; R46 Repr. Cat. 2; R60-61 N; R50-53 | T; N R: 45-46-60-61-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

601-034-00-4 | benz[e]acefenantrilenas | | 205-911-9 | 205-99-2 | Carc. Cat. 2; R45 N; R50-53 | T; N R: 45-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

602-035-00-2 | 1,4-dichlorbenzenas p-dichlorbenzenas | | 203-400-5 | 106-46-7 | Xn; R36 N; R50-53 | Xi; N R: 36-50/53 S: (2-)24/25-46-60-61 | | |

602-054-00-6 | 3-jodpropenas alilo jodidas | | 209-130-4 | 556-56-9 | R10 C; R34 | C R: 10-34 S: (1/2-)7-26-45 | | |

602-076-00-9 | but-2-in-1,4-diolis 2-butin-1,4-diolis | | 203-788-6 | 110-65-6 | T; R23/25 Xn; R21-48/22 C; R34 | T R: 21-23/25-34-48/22 S: (1/2-)26-36/37/39-45 | C≥50 %; T; R21-23/25-34 -48/22 25 %≤C<50 %; T; R21-23/25-36/38-48/22 10 %≤C<25 %;Xn; R20/22-48/22 3 %≤C<10 %; Xn; R20/22 | |

603-07 6-00-0 | ekso-1-metil-4-(1-metiletil)-7-oksabiciklo[2.2.1]heptan-2-olis | | 402-470-6 | 87172-89-2 | O; R8 Xn; R22 Xi; R36 | O; Xn; R: 8-22-36 S: (2-)26 | | |

603-093-00-1 | ekso-(+/-)-1-metil-4-1-metiletil)-2[(metil fenil)metoksi]-7-oksabiciklo [2.2.1]heptanas | | 402-410-9 | 87818-31-3 | Xn; R20 Xi; R51-53 | Xn; N R: 20-51/53 S: (2-)23-61 | | |

603-097-00-3 | 1,1′1′′-nitrilotripopan-2-olis triizopropanolaminas | | 204-528-4 | 122-20-3 | Xi; R36 R52-53 | Xi R: 36-52/53 S: (2-)26-61 | | |

603-117-00-0 | propan-2-olis izopropilo alkoholis izopropanolis | | 200-661-7 | 67-63-0 | F; R11 Xi; R36 R67 | F; Xi; R: 11-36-67 S: (2-)7-16-24 /25-26 | | 6 |

604-020-00-6 | bifenil-2-olis 2-hidroksibifenilas 2-fenilfenolis (ISO) | | 201-993-5 | 90-43-7 | Xi; R36/37/38 N; R50 | Xn; N R: 36/37/38-50 S: (2-)22-61 | | |

604-021-00-1 | 2-fenilfenolio natrio druska natrio 2-bifenilatas | | 205-055-6 | 132-27-4 | Xn; R22 Xi; R37/38-41 N; R50 | Xn; N R: 37/38-41-50 S: (2-)22-26-61 | | |

604-024-00-8 | 4,4′-izobutiletilidendifenolis(alt.); 2,2-bis (4′-hidroksifenil)-4-metilpentanas | | 401-720-1 | 6807-17-6 | Repr. Cat. 2; R60 Xi; R36 N; R50-53 | T; N R: 60-36-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

604-041-00-0 | acifluorfenas [1] natrio-acifluorfenas [2] 5-[2-chlor-4-(trifluormetil)fenoksi]-2-nitrobenzenkarboksirūgštis [1] natrio5-[2-chlor-4-(trifluor metil)fenoksi] -2- nitrobenzenkarboksilatas [2] | | 256-634-5 [1] 263-560-7 [2] | 50594-66-6 [1] 62476-59-9 [2] | Xn; R22 Xi; R38-41 N; R50-53 | Xn; N R: 22-38-41-50 /53 S: (2-)24-39-60-61 | | |

604-043-00-1 | monobenzonas 4-hidroksifenilbenzilo eteris hidroksichinono monobenzileteris | | 203-083-3 | 103-16-2 | Xi; R36 R43 | Xi R: 36-43 S: (2-)24/25-26-37 | | |

604-044-00-7 | mekvinolas 4-metoksifenolis hidroksichinono monometileteris | | 205-769-8 | 150-76-5 | Xn; R22 Xi; R36 R43 | Xn R: 22-36-43 S: (2-)24/25-26-37/39-43 | | |

605-016-00-7 | glioksalis…% etandialis…% | B | 203-474-9 | 107-22-2 | Mut. Cat. 3 R40 Xn; R20 Xi; R36/38 R43 | Xn R: 20-36/38-40-43 S: (2-)36/37 | C≥10 %; Xn; R20-36/38-40-43 1 %≤C<10 %; Xn; R40-43 | |

606-016-00-X | pindonas (ISO) 2-pivalolindan-1,3-dionas | | 201-462-8 | 83-26-1 | T; R25-48/25 N; R50-53 | T; N R: 25-48/25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

606-018-00-0 | dichlonas (ISO) 2,3-dichlor-1,4-naftochinonas | | 204-210-5 | 117-80-6 | Xn; R22 Xi; R36/38 N; R50-53 | Xn; N R: 22-36/38-50/53 S: (2-)26-60-61 | | |

606-019-00-6 | chlordekonas (ISO) perchlorpentaciklo[5,3,0,02,6,03,9,04,8] deka-5-nonas dekachlorpentaciklo[5,3,0,02,6,03,9,05,8] deka-4-nonas | | 205-601-3 | 143-50-0 | Carc. Cat. 3; R40 T; R24/25 N; R50-53 | T; N R: 24/25-40-50/53 S: (1/2-)22-36 /37-45-60-61 | | |

606-034-00-8 | metribuzinas (ISO) 4-amino-6-tret-butil-metiltio-1,2,4-triazin-5(4H)onas 4-amino-4,5-dihidro-6-(1,1-dimetiletil)-3-metiltio-1,2,4-triazin-5-onas | | 244-209-7 | 21087-64-9 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

606-035-00-3 | chloridazonas (ISO) 5-amino-4-chlor-2-fenilpiridazin-3-(2H)-ono pirazonas | | 216-920-2 | 1698-60-8 | R43 N; R50-53 | Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

606-036-00-9 | kvinometionatas chinometionatas (ISO) 6-metil-1,3-ditiolo(4,5-b)chinoksalin-2-onas | | 219-455-3 | 2439-01-2 | Repr. Cat. 3; R62 Xn; R20/21/22-48/22 Xi; R36 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 20/21/22-36-43-48/22-50/53-62 S: (2-)24-37-60-61 | | |

606-037-00-4 | triadimefonas (ISO) 1-(4-chlorfenoksi)-3,3-dimetil-1-(1,2,4-triazol-1-il)butanonas | | 256-103-8 | 43121-43-3 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)61 | | |

606-044-00-2 | 2,4,6-trimetilbenzofenonas | | 403-150-9 | 954-16-5 | Xn; R22 Xi; R36 N; R50-53 | Xn; N R: 22-36-50/53 S: (2-)26-60-61 | | |

607-043-00-X | dikamba (ISO) 2,5-dichlor-6-metoksibenzenkarboksi rūgštis 3,6-dichlor-2-metoksibenzenkarboksi rūgštis | | 217-635-6 | 1918-00-9 | Xn; R22 Xi; R41 R52-53 | Xn; N R: 22-41-52/53 S: (2-)26-61 | | |

607-057-00-6 | kumachloras (ISO) 3-[1-(4-chlorfenil)-3-oksobutil)-4-hidroksikumarinas | | 201-378-1 | 81-82-3 | Xn; R48/22 R52-53 | Xn R: 48/22-52/53 S: (2-) 3 7-61 | | |

607-058-00-1 | kumafurilas (ISO) fumarin (RS)-3-(1-(2-furil)-3-oksobutil)-4-hidroksikumarinas 4-hidroksi-3-[3-okso-1-(2-furil)butil] kumarinas | | 204-195-5 | 117-52-2 | T; R2 5-48/25 R52-53 | T R: 25-48/25-52/53 S: (1/2-)37-45-61 | | |

607-079-00-6 | kelevanas (ISO) etil-5-(perchlor-5-hidroksipentaciklo (5,3,0,02'6,03'9,04'8)dekan-5-il)-4-oksopentanoatas etil-5-(1,2,3,5,6,7,8,9,10,10-dekachlor-4-hidroksipentaciklo(5,2,l,02'6,03'9,05'8)dec-4-il)-4-oksovaleratas | | — | 4234-79-1 | T; R24 Xn; R22 N; R51-53 | T;N R: 22-24-51/53 S: (1/2-)36/37-45-61 | | |

607-097-00-4 | benzen-1,2,4-trikarboksirūgšties 1,2-anhidridas trimelito rūgšties anhidridas | | 209-008-0 | 552-30-7 | Xi; R37-41 R42/43 | Xn R: 37-41-42/43 S: (2-)22-26-36/37/39 | | |

607-143-00-3 | valerijonų rūgštis | | 203-677-2 | 109-52-4 | C; R34 R52-53 | C R: 34-52/53 S: (1/2-)26-36-45-61 | | |

607-152-00-2 | 2,3,6-TBA (ISO) 2,3,6-trichlorbenzenkarboksirūgštis | | 200-026-4 | 50-31-7 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)61 | | |

607-153-00-8 | benazolinas (ISO) 4-chlor-2,3-dihidro-2-okso-1,3-benztiazol-3-ilacto rūgštis | | 223-297-0 | 3813-05-6 | Xi; R36/38 R52-53 | Xi R: 36/38-52/53 S: (2-)22-61 | | |

607-156-00-4 | chlorfensonas (ISO) 4-chlorfenil-4-chlorbenzensulfonatas | | 201-270-4 | 80-33-1 | Xn; R22 Xi; R38 N; R50-53 | Xn; N R: 22-38-50/53 S: (2-)37-60-61 | | |

607-158-00-5 | schloracto rūgšties natrio druska natrio chloracetatas | | 223-498-3 | 3926-62-3 | T;R25 Xi; R38 N; R50 | T; N R: 25-38-50 S: (1/2-)22-37-45-61 | | |

607-159-00-0 | chlorbenzilatas (ISO) etil 2,2-di(4-chlorfenil)-2-hidroksiacetatas etil-4,4'-dichlorbenzilatas | | 208-110-2 | 510-15-6 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-) 60-61 | | |

607-176-00-3 | MišinyS: α-3-(3-(2H-benztriazol-2-il)-5-tret-butil-4-hidroksifenil)propionil-(ω-hidroksipoli(oksietileno);α-3-(3-(2H-benztriazol-2-il)-5-tret-butil-4-hidroksifenil)propionil-(ω-3-(3-(2H-benzotriazol-2-il)-5-tret-butil-4-hidroksifenil)propioniloksipoli(oksietileno) | | 400-830-7 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-) 3 6/3 7-61 | | |

607-188-00-9 | rūgštusis natrio N-karboksilatoetil-N-oktadec-9-enilmaleinamatas | | 402-970-4 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-) 24/3 7-61 | | |

607-209-00-1 | MišinyS: O,O-di(1-metiletil)tritio-bis-tioformiato; O,O-di(1-metiletil)tetratio-bis-tioformiato;O,O-di(1-metiletil) pentatio-bis-tioformiato | | 403-030-6 | — | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-) 3 6/3 7-60-61 | | |

607-213-00-3 | etil-3,3-bis[(1,1-dimetilpropil)peroksi] butiratas | | 403-320-2 | 67567-23-1 | E; R2 O; R7 R10 N; R51-53 | E; N R: 2-7-10-51/53 S: (2-)3/7-14-33-36/37/39-61 | | |

607-217-00-5 | 2-etoksietil-2-[4-(2,6-dihidro-2,6-diokso-7-fenil-1,5-dioksaindacen-3-il)fenoksi]acetatas | | 403-960-2 | — | R43 R53 | Xi R: 43-53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-243-00-7 | natrio 3,6-dichlor-o-anizatas [1] 3,6-dichlor-o-anyžių rūgšties junginys su 2,2'-iminodietanoliu (1:1) [2] 3,6-dichlor-o-anyžių rūgšties junginys su 2-aminoetanoliu (1:1) [3] | | 217-846-3 [1] 246-590-5 [2] 258-527-9 [3] | 1982-69-0 [1] 25059-78-3 [2] 53404-28-7 [3] | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-248-00-4 | natrio naptalamas natrio N-naft-1-ilftalamatas | | 205-073-4 | 132-67-2 | Xn; R22 | Xn R: 22 S: (2) | | |

607-249-00-X | (1-metil-1,2-etandiil)bis[oksi(metil-2,1-etandiil)diakrilatas tripropilenglikoldiakrilatas TPGDA | | 256-032-2 | 42978-66-5 | Xi; R36/37/38 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 36/37/38-43-51/53 S: (2-)24-37-61 | C >10 %:Xi; R36/37/38-43 l % < C <10 %:Xi; R43 | |

607-252-00-6 | λ-cihalotrinas (ISO) (S)-α-ciano-3-fenoksibenzil(Z)-(lR)-cis-3-(2-chlor-3,3,3-trifluorpropenil)-2,2-dimetilciklopropankarboksilato ir (R)-α-ciano-3-fenoksibenzil (Z)-(lS)-cis-3-(2-chlor-3,3,3-trifluorpropenil)-2,2-dimetilciklopropankaboksilato mišinys 1: 1 | | 415-130-7 | 91465-08-6 | T+; R26 T; R25 Xn; R21 N; R50-53 | T+;N R: 21-25-26-50/53 S: (1/2-)28-36/37/39-38-45-60-61 | | |

607-255-00-2 | fluroksipiras (ISO) 4-amino-3,5-dichlor-6-fluor-2-piridil oksiacto rūgštis | | — | 69377-81-7 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

608-003-00-4 | akrilonitrilas | D E | 203-466-5 | 107-13-1 | F; R11 Carc. Cat. 2; R45 T; R23/24/25 Xi; R37/38-41 R43 N; R51-53 | F; T; N R: 45-11-23-/24/25-37/38-41-43-51/53 S: 9-16-53-45-61 | C>20 %: T; R45-23/24/25-37/38-41-43 10 %< C< 20 %:T;R45-23/24/25-41-43 5 %< C< 10 %:T; R45-23/24/25-36-43 1 %< C<5 %:T; R45-23/24/25-43 0,2 %< C< l %:T; R45-20/21/22 0,1 %< C< 0,2 %: T; R45 | |

608-016-00-5 | 1,4-dician-2,3,5,6-tetrachlorbenzenas | | 401-550-8 | 1897-41-2 | R43 N; R50-53 | Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

609-030-00-4 | dinoterbas (ISO) 2-tret-butil-4,6-dinitrofenolis | E | 215-813-8 | 1420-07-1 | Repr. Cat. 2; R61 T+; R28 T;R24 R44 N; R50-53 | T+; N R: 61-24-28-44-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

609-040-00-9 | nitrofenas (ISO) 2,4-dichlorfenil 4-nitrofenileteris | E | 217-406-0 | 1836-75-5 | Carc. Cat. 2; R45 Repr. Cat. 2; R61 Xn; R22 N; R50-53 | T; N R: 45-61-22-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

609-044-00-0 | teknazenas (ISO) 1,2,4,5-tetrachlor-3 -nitrobenzenas | | 204-178-2 | 117-18-0 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn;N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

611-008-00-4 | 4-aminoazobenzenas 4-fenilazoanilinas | | 200-453-6 | 60-09-3 | Carc. Cat. 2; R45 N; R50-53 | T; N R: 45-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

611-013-00-1 | triličio 1-hidroksi-7-(3-sulfonatoanilino)-2(3-metil-4-(2-metoksi-4-(3-sulfonatofenilazo)fenilazo)naftalen-3-sulfonatas | | 403-650-7 | 117409-78-6 | E; R2 N; R51-53 | E; N R: 2-51/53 S: (2-)35-61 | | |

611-031-00-X | 4,4′-(4-imino cikloheksa-2,5-dienilidenmetilen)dianilino hidrochloridas C.I.šarminis raudonasis 9 | | 209-321-2 | 569-61-9 | Carc. Cat. 2; R45 | T R: 45 S: 53-45 | | |

612-035-00-4 | 2-metoksianilinas o-anizidinas | E | 201-963-1 | 90-04-0 | Carc. Cat. 2; R45 Muta. Cat. 3; R40 T; R23/24/25 | T R: 45-23/24/25 S: 53-45 | | |

612-042-00-2 | benzidinas 1,1′-bifenil-4,4′–diaminas 4,4′-diaminobifenilas bifenil-4,4′-ilendiaminas | E | 202-199-1 | 92-87-5 | Carc. Cat. 1; R45 Xn; R22 N; R50-53 | T; N R: 45-22-50/53 S: 53-45-60-61 | C≥25 %;T; R4 5 -22 0,01 %≤C<25 %; T; R45 | |

612-051-00-1 | 4,4′-diaminodifenilmetanas 4,4′-metilendianilinas | E | 202-974-4 | 101-77-9 | Carc. Cat. 2; R45 Muta. Cat. 3; R40 T; R39/23/2 4/25Xn; R48/20/21/22 R43 N; R51-53 | T; N R: 45-39/23/24/25-43-48/20/21/22-51/53 S: 53-45-61 | | |

612-081-00-5 | 4,4′-bi-o-toluidino druskos 3,3′-dimetilbenzidino druskos o-tolidino drus kos | A E | 210-322-5 265-294-7 277-985-0 | 612-82-8 64969-36-4 74753-18-7 | Carc. Cat. 2; R45 Xn; R22 N; R51-53 | T; N R: 45-22-51/53 S: 53-45-61 | | |

612-099-00-3 | 4-metil-m-fenilendiaminas 2,4-toluendiaminas | E | 202-453-1 | 95-80-7 | Carc. Cat. 2; R45 T; R25 Xn; R21 Xi; R36 R43 N; R51-53 | T; N R: 45-21-25-36-43-51/53 S: 53-45-61 | | |

612-105-00-4 | 2-piperazin-1-iletilaminas | | 205-411-0 | 140-31-8 | Xn, R21/22 C; R34 R43 R52-53 | C R: 21/22-34-43-52/53 S: (1/2-)26-36 /37/39-45-61 | | |

612-111-00-7 | 2-metil-m-fenilendiaminas 2,6-toluendiaminas | | 212-513-9 | 823-40-5 | Mut. Cat. 3; R40 Xn; R21/22 R43 N; 51-53 | Xn; N R: 21/22-34-43-52/53 S: (1/2-)26-36 /37/39-45-61 | | |

612-125-00-3 | 2-metil-p-fenilendiaminas 2,5-toluendiaminas | | 202-442-1 | 95-70-5 | T' R25 Xn; R20/21 R43 N; R51-53 | T; N R: 20/21-25-4 3-52/53 S: (1/2-)24-37 -45-61 | | |

612-144-00-7 | flumetralinas (ISO) N-(2-chlor-6-fluorbenzil)-N-etil-α,α,α-trifluor-2,6-dinitro-p-toluidinas | | — | 62924-70-3 | Xi; R36/38 R43 N; R50-53 | Xi; N R: 36/38-43-52/53 S: (2-)36/37-6 0-61 | | |

612-151-00-5 | diaminotoluenas | E | 246-910-3 | 25376-45-8 | Carc. Cat. 2; R45 T; R25 Xn; R20/21 Xi; R36 R43 N; R51-53 | T; N R: 45-20/21-25-36-43-51/53 S: (1/2-)26-36 /37/39-45-61 | | |

613-018-00-4 | morfamkvatas (ISO) 1,1′-bis(3,5-dimetilmorfolinkarbonilmetil)-4,4′-bipiridiliumo jonas | | — | 7411-47-4 | Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52-53 | Xn R: 22-36/37/38 -52/53 S: (2-)22-36-61 | | |

613-031-00-5 | simklozenas trichlorizocianuro rūgštis trichlor-1,3,5-triazintrionas | | 201-782-6 | 87-90-1 | O; R8 Xn; R22 R31 Xi; R36/37 N; R50-53 | O; Xn; N R: 8-22-31-36 /37-50/53 S: (1/2-)8-26-41-60-61 | | |

613-038-00-3 | 6-fenil-1,3,5-tiazin-2,4-diildiaminas 6-fenil-1,3,5-triazin-2,4-diaminobenz guanaminas | | 202-095-6 | 91-76-9 | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)61 | | |

613-042-00-5 | imazalilas (ISO) 1-[2-(aliloksi)-2-(2,4-dichlorfenil)etil)-1H-imidazolas | | 252-615-0 | 3554-4 4-0 | Xn; R20/22 N; R41 N; R50-53 | Xn; N R: 20/22-41-5 0 /53 S: (2-)26-39-6 0-61 | | |

613-043-00-0 | imazalilsulfatas (ISO) 1-[2-(aliloksil)etil-2-(2,4-di chlorfenil)]-1H-imidazolo rūgštusis sulfatas [1] (±)-1-[2-(aliloksi)etil-2-(2,4-dichlorfenil)]-1 H-imidazolo rūgštusis sulfatas [2] | | 261-351-5 [1] 281-291-3 [2] | 58594-7 2-2 [1] 83918-5 7-4 [2] | Xn; R20/23 Xi; R41 N; R50-53 | Xn; N R: 20/22-41-5 0/53 S: (2-)26-39-6 0-61 | | |

613-066-00-6 | terbumetonas (ISO) 2-tret-butilamino-4-etilamino-6-metoksi-1,3,5-triazinas | | 251-637-8 | 33693-04-8 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

613-091-00-2 | morfamkvato dichloridas [1] morfamkvato sulfatas [2] | | 225-062-8 [1] | 4636-83-3 [1] 29873-36-7 [2] | Xn; R22 Xi; R36/37/38 N; R52-53 | Xn R: 22-36/37/3 8-52/53 S: (2-)22-36-6 1 | | |

613-098-00-0 | N-(n-oktil)-2-pirolidinonas | | 403-700-8 | 2687-94-7 | C; R34 N; R51-53 | C; N R: 34-51/53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-61 | | |

613-130-00-3 | heksakonazolis (ISO) (RS)-2-(2,4-di chlorfenil)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)heksan-2-olis | | — | 79983-71-4 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-6 1 | | |

613-131-00-9 | pirokvilonas (ISO) 1,2,5,6-tetrahidropirol[3,2,1-ij)chinolin-4-onas | | — | 57369-32-1 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)61 | | |

613-134-00-5 | miklobutanilas (ISO) 2-(4-chlorfenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ilmetil)heksannitrilas | | — | 88671-89-0 | Repr. Cat. 3; R63 Xn; R22 Xi; R36 N; R51-53 | Xn; N R: 22-36-51 /53-63 S: (2-)36/37-46-61 | | |

613-137-00-1 | metabenztiazuronas (ISO) 1-(1,3-benzo tiazol-2-il)1,3-di metilkarbamidas | | 242-505-0 | 18691-97-9 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

613-139-00-2 | metilmetsulfuronas metil-2-(4-metoksi-6-metil-1,3,5-triazin-2-ilkarbamoilsulfamoil)benzenkarboksilatas | | — | 74223-64-6 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

614-001-00-4 | nikotinas (ISO) 3-(N-metil-2-pirodinil)piridinas | | 200-193-63 | 54-11-5 | Xn; R27 T; R25 N; R51-53 | T+; N R: 25-27-51 /53 S: (1/2-)36/37-45-61 | | |

614-006-00-1 | brucinas 2,3-dimetoksistrichninas | | 200-614-7 | 357-57-3 | T+; R26/28 R52-53 | T+ R: 26/28-52/53 S: (1/2-)13-45-61 | | |

614-007-00-7 | brucino sulfatas [1] brucino nitratas [2] 2,3-dimetoksistrichnidin-10-ono mono[(R)-1-metilheptil-1,2-benzendikarboksilatas] [3] 2,3-dimetoksistrichnidin-10-ono ir (S)mono[(R)-1-metilheptil-1,2-benzendikarboksilato junginys (1:1) [4] | | 225-432-9 [1] 227-317-9 [2] 269-39-5 [3] 269-710-8 [4] | 4845-99 -2 [1] 5786-97 -0 [2] 68239-26-9 [3] 68310-42-9 [4] | T+; R26/28 R52-53 | T+ R: 26/28-52/53 S: (1/2-)13-45-61 | | |

615-006-00-4 | 2-metil-m-fenilendiizocianatas [1] 4-metil-m-fenilendiizocianatas [2] m-tolidendiizocianatas [3] toluen-2,6-diizocianatas [1] toluen-2,4-diizocianatas [2] toluen-diizocianatas [3] | C | 202-039-0 [1] 209-544-5 [2] 247-722-4 [3] | 91-08-7 [1] 584-84-9 [2] 26471-62-5 [3] | Carc. Cat. 3; R40 T+; R26 Xi; R36/37/38 R42/43 R52-53 | T+ R: 26-36/37/3 8-40-42/43-5 2/53 S: (1/2-)23-36 /37-45-61 | C≥20 %; T+, R26-36/37/38-40-42/43 7 %≤C<20 %: T+; R26-40-42/43 1 %≤C<7 %; T; R23-40-42/43 0,1 %≤C<1 %; Xn; R20-42 | 2 |

616-010-00-9 | natrio tozilchloramidas | | 204-854-7 | 127-65-1 | Xn; R22 R31 C; R34 R42 | C R: 22-31-34-42 S: (1/2-)7-22-26-36/37/39-45 | | |

616-034-00-X | pirakarbolidas (ISO) 3,4-dihidro-6-metil-2H-piran-5-karboksanilidas | | 246-419-4 | 24691-76-7 | R52-53 | R:52/53 S: 61 | | |

616-035-00-5 | ksimoksanilas 2-cian-n-[(etilaminokarbonil]-2-(metoksiiminoacetamidas | | 261-043-0 | 57966-95-7 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-52/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

617-004-00-9 | 1,2,3,4-tetrahidro-1-naftilhidroperoksidas | | 212-230-0 | 771-29-9 | O; R7 Xn; R22 C; R34 N; R50-53 | O; C; N R: 7-22-34-50 /53 S: (1/2-)3/7-14 -26-36/37/39-45-60-61 | C≥25 %; C; R22-34 0 %≤C<25 %; C; R34 5 %≤C<10 %;Xi; R36/37/38 | |

617-006-00-X | bis(α,-dimetilbenzil)peroksidas | | 201-279-3 | 80-43-3 | O; R7 Xi; R36/38 N; R51-53 | O; Xi; N R: 7-36/38-51 /53 S: (2-)3/7-14-36/37/39-61 | | |

617-008-00-0 | dibenzoilperoksidas benzoilperoksidas | | 202-327-6 | 94-36-0 | E; R2 Xi; R36 R43 | E; Xi; R:2-36-43 S: (2-)3/7-14-3 6/37/39 | | |

650-007-00-3 | chlordimeformas (ISO) N2-(4-chlor-o-tolil)-N1,N1-dimetilformamidinas | | 228-200-5 | 6164-98-3 | Carc. Cat. 3; R40 Xn; R21/22 N; R50-53 | Xn; N R: 21/22-40-50/53 S: (2-)22-36/37-60-61 | | |

650-008-00-9 | drazoksolonas (ISO) 4-(2-chlorfenilhidrazon)-3-metil-5-izoksazolonas | | 227-197-8 | 5707-69-7 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-24-36/37-45-60-61 | | |

650-009-00-4 | chlordimeformo hidrochloridas N′-(4-chlor-o-tolil)-N,N-dimetilformamidino monohidrochloridas N2-(4-chlor-o-tolil)-N1,N1-dietilformami dino hidrochloridas | | 243-269-1 | 19750-95-9 | Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)22-36/37-60-61 | | |

650-033-00-5 | esfenvaleratas (ISO) (S)-α-ciano-3-fenoksibenzil-(S)-2-(4-chlorfenil)-3-metilbutiratas | | — | 66230-04-4 | T; R23/25 R43 N; R50-53 | T; N R: 23/25-43-50 /53 S: (1/2-)24-36 /37/39-45-60-61 | | |

650-041-00-9 | triasulfuronas (ISO) 1-[2-(2-chloretoksi)fenilsulfonil]-3-(4-metoksi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il)karbamidas | | — | 82097-50-5 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

--------------------------------------------------

1D PRIEDAS

Indekso Nr. | Cheminis pavadinimas | Past. Apie mdž. | EB Nr. | CAS Nr. | Klasifika cija | Ženklinimas etiketėmis | Konc. ribos | Past. Apie prep. |

006-090-00-8 | 2-(3-jodoprop-2-in-1-iloksi)etilfenilkarbamatas | | 408-010-0 | 88558-41-2 | Xn; R20 Xi; R41 R52-53 | Xn R: 20-41-52/53 S: (2-)22-26-39-61 | | |

014-016-00-0 | 1,3-diheksi-5-en -1-il-1,1,3,3-tet rametildisiloksano ir 1,3-diheksi -n-en-1-il-1,1,3,3-tetrametildisi loksano mišinys | | 406-490-6 | — | N; R51-53 | N R: 51/ 53 S: 61 | | |

015-164-00-9 | kalcio-P,P′-(1-hidroksietilenbisvandeniliofosfanato)dihidratas | | 400-48 0-5 | 36669-85-9 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

015-165-00-4 | tiobis(4,1-fenil en)-S,S,S′,S′-tet rafenildisulfoniumbisheksafluorfosfato ir (4-fenil tiofenil)sulfoniumheksafluorfosfato mišinys | | 404-98 6-7 | — | Xi; R41 N; R50-53 | Xi; N R: 41-50/53 S: (2-)15-26-39-60-61 | | |

015-166-00-X | 3,9-bis(2,6-di-tert-butil-4-me tilfenoksi-)-2,4, 8,10-tetraoksa-3,9-difosfapiro [5,5]undekanas | | 410-290-4 | 80693-00-1 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

015-167-00-5 | 3-(hidroksife nil fosfinyl)propanoinė rūgštis | | 411-200-6 | 14657-64-8 | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

601-050-00-1 | benzenas, C10-13 alkilo dariniai | | 267-05 1-0 | 67774-74-7 | N; R50 | N; R: 50 S: 61 | | |

601-051-00-7 | 4-fenilbut-1-e nas | | 405-980-7 | 768-56-9 | Xi; R38 R51-53 | Xi; N R: 38-51/53 S: (2-)37-61 | | |

602-083-00-4 | difenilo eteris, pentabromo da rinys, pentabro m difenilo eteris | | 251-08 4-2 | 32534-81-9 | Xn; R48/21/22 R64 N; R50-53 | Xn; N R: 48/21/22-50 /53-64 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

602-084-00-X | 1,1-dichloro-1-fluoretanas | | 404-080-1 | 1717-00-6 | N: R52-53-59 | N R: 52/53-59 S: 59-61 | | |

603-128-00-0 | 2-(fenilmetok si)naftalenas | | 405-490-3 | 613-62-7 | R53 | R: 53 S; 61 | | |

603-129-00-6 | 1-tert-butoksi propan-2-olis | | 406-180-0 | 57018-52-7 | R10 Xi; R41 | Xi R: 10-41 S: (2-)26-39 | | |

603-130-00-1 | α-((dimetil) bife nil)-ω-hidroksi poli(oksietileno) izomerų mišinys | | 406-325-8 | — | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)39-61 | | |

603-131-00-7 | 1-dezoksi-1-[metil-(1-okso dodecil)amino]-D-glucitolio ir 1 -dezosi-1-[metil -(1-metil(1-okso tetradecil)amino]-D-glucitolio, sumaišytų santy kiu 3:1, mišinys | | 407-290-1 | — | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

603-132-00-2 | 2-hidroksimetil-9-metil6-(1-me tiletil)-1,4-diok sapiro[4,5]dekanas | | 408-200-3 | 63187-91-7 | Xi; R38-41 R52-53 | Xi R: 38-41-52 /53 S: (2-)26-37/ 39-61 | | |

603-133-00-8 | 3-[(4-amino-2-chloro-3-nitro fenil)amino]-pro pan-1,2-diolio ir 3,3′-(2-chloro-5 -nitro-1,4-fenil endiimino)bis (propan-1,2-dio lio mišinys | | 408-240-1 | — | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)22-36-61 | | |

603-134-00-3 | Pakeistų dodecil ir ar tetradecil, difenilo eterių mišinys. Ši me džiaga susidaro Friedel-Crafts re akcijos metu. Iš produkto, susida riusio reakcijos metu, pašalina mas katalizato rius. Difenilo e teris pakeičia mas C1-C10 al kilo grupėmis. Alkilo grupės surišamos pasi rinktinai tarp C1 ir C6. Linijinės al kilo grupės C12 ir C14 naudoja mos vienodu san tykiu. | | 410-450-3 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

603-135-00-9 | bis[[2,2′,2-nit ro tris[etanolato ]]-1-N,O]bis[2-(2-metoksietok si]-titanas | | 410-500-4 | — | Xi; R41 N; R51-53 | Xi; N R: 41-51/53 S: (2-)26-39-61 | | |

603-136-00-4 | 3-((4-bis((2-hid roksietil) amino )-2-nitrofenil)a mino)-1-propa nolis | | 410-910-3 | 104226-19-9 | R43 R52-53 | Xi R: 43-52/53 S: (2-)24-37-61 | | |

603-137-00-X | 1-dezoksi-1-[me til-(1-oksohek sadecil[amino]-D-glucitolio ir 1 -dezoksi-1-metil -(1-oksooktade cil)amino]-D-glucitolio miši nys | | 411-130-6 | — | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

603-138-00-5 | 3-(2,2-dimetil-3-hidroksipro pyl)toluenas): 2,2-dimetil-3-(3-metilfenil)propanolis | | 403-140-4 | 103694-68-4 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

604-050-00-X | 4-chloro-o-kre zolis 4-chloro-2-me tilfenolis | | 216-38 1-3 | 1570-64-5 | T; R23 C; R35 N; R50 | T; C; N R: 21-35-50 S: (1/2-)26-36 /37/39-45-61 | C≥25 %; T; C; R 23-35 10 %≤ C<25 %: C; R20-35 5 %≤ C<10 %: C; R20-34 3 %≤ C<5 %; Xn; R20-36 /37/38 1 %≤ C<3 %; Xi; R36/37/38 | |

604-051-00-5 | 3,5-bis((3,5-di tert-butil-4-hi droksi)benzil)-2,4,6-trimetilfeno lis | | 401-11 0-5 | 87113-78-8 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

604-052-00-0 | 2,2′-metilenbis (6-(2H-benzo tri azol-2-il)-4-(1,1,3,3-tetrametilbu tilfenolis | | 403-80 0-1 | 103597-45-1 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

604-053-00-6 | 2-metil-4-(1,1-dimetiletil)-6-(1 -metil-pentade cil)-fenolis | | 410-760-9 | 157661-93-3 | Xi; R38 R43 N; R50-53 | Xi; N R: 38-43-50/ 53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

604-054-00-1 | 2-metoksi-4-(tet rahidro-4-metil en-2H-piran-2-il)-fenolio ir 4-(3,6-dihidro-4-metil-2H-piran-2-il)-2-metoksi fenolio mišinys | | 412-020-0 | — | R43 R 52-53 | Xi R: 43-52/53 S: (2-)24-37-61 | | |

604-055-00-7 | 2,2′-((3,5′,5,5′-tetrametil-(1,1′-bifenil)-4,4′-diil)-bis(oksimetil en))-bis-oksira nas | | 413-90 0-7 | 85954-11-6 | Muta. kat. 3; R40 | Xn R: 40 S: (2-)22-36-37 | | |

605-027-00-7 | 3a,4,5,6,7,7a-heksahidro-4,7-metano-1H-inde no-6-karboksal dehido ir 3a,4,5, 6,7,7a-heksahid ro-4,7,-metano-1H-indeno-5-kar boksaldehido mi šinys | | 410-480-7 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

606-051-00-0 | 4-pentilciklo heksanonas | | 406-670-4 | 61203-83-6 | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

606-052-00-6 | 4-(N,N-dibutil amino)-2-hidrok si-2′-karboksil benzofenonas | | 410-410-5 | 54574-82-2 | R 52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-272-00-5 | fluoroksilpir-me ptilas (ISO) [1] fluroksilpiro-bu tometilas (ISO) [2] metilheptil, O-(( 4-amino-3,5-di chloro-6-fluoro-2-pridoksiaceta tas [1] 2-butoksi-1-me tiletil,O-(4-ami no-3,5-dichloro-6-fluoro-2-piri diloksi)acetatas [2] | | 279-752-9 [1] — | 81406-37-3 [1] 1544886-27-8 [2] | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

607-273-00-0 | amonium-7(2,6-dimetil-8-(2,2-di metilbutiriloksi)-1,2,6,7,8,8a-he ksahidro-1-naftil )-3,5-dihidroksi heptanoatas | | 404-520-2 | — | R 52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-274-00-6 | 2-(N-benzil-N-metilamino)etil-3-amino-2-buten oatas | | 405-35 0-1 | 54527-73-0 | R43 N; R 51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-275-00-1 | natrio benzoilok sibenzen-4-sulfo natas | | 405-450-5 | 66531-87-1 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

607-276-00-7 | bis[(1-metilimi dazol)-(2-etil-he ksanoat)] cinko kompleksas | | 405-635-0 | — | Xi; R 38-41 N; R 50-53 | Xi; N R: 38-41-50/ 53 S: (2-)26-37/ 39-60-61 | | |

607-277-00-2 | 2-(heksiltio)etil amino hidrochlo rido ir natrio pro pionato mišinys | | 405-720-2 | — | Xn; R 22 Xi; R 41 R43 N; R 51-53 | Xn; N R: 22-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-278-00-8 | natrio fenetilna ftalensulfonato ir natrio naftile tilbenzensulfona to izomerų mi šinys | | 405-760-0 | — | Xi; R 41 R43 R 52-53 | Xi R: 41-43-52/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-279-00-3 | n-oktadecil ami nodietilbis(hidrogenmaleato) ir n-oktadecilami nodietilvandeni lio maleato hid rogenftalato mi šinys | | 405-960-8 | — | R 43 N; R 51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-280-00-9 | natrio 4-chloro-1-hidroksibutan-1-sulfonatas | | 406-19 0-5 | 54322-2 0-2 | Xn; R 22 Xi; R 36 R43 | Xn R: 22-36-43 S: (2-)22-26-36/37 | | |

607-281-00-4 | šakotų ir liniji nių C7-C9 alkil 3-[3-(2H-benzo triazol-2-il)-5(1,1-dimetiletil)-4-hidroksifenil] propionatų mi šinys | | 407-000-3 | 127519-17-9 | N; R 51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

607-282-00-X | 2-acetoksimetil-4-benziloksibu til-1-il acetatas | | 407-140-5 | 131266-10-9 | R52-53 | R: 52-53 S: 61 | | |

607-283-00-5 | E-etil-4-okso-4-fenilkrotonatas | | 408-04 0-4 | 15121-89-8 | Xn; R21/22 Xi; R38-41 R43 N; R50-53 | Xn; N R:21/22-38-41-43-50/53 S: (2-)26-36/ 37/39-60-61 | | |

607-284-00-0 | natrio 3,3′-(1,4-fenilen- bis(karbonilimino-3,1-pro panedilimino)) bis (10-amino-6, 13-dichlo- ro) -4,11-trifenodioksa- zindisulfonato) ir ličio 3,3′-(1,4-fenilenbis-(10-amino-6,13-dichlo- ro)-4,11-trifenodioksa zindisulfonato mišinys paruoštas, sumaišius šias medžiagas santykiu 9:1 | | 410-04 0-4 | 136213-76-8 | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

607-285-00-6 | 7-(((3-aminofe nil)sulfonilamino)-naftalen-1,3-disulfoninės rūgšties, natrio 7-(((3-aminofe nil)sulfonil)amino)-naftalen-1,3-disulfonato ir kalio 7-(((3-aminofenil)sulfonil)amino)-nafta len-1,3-disulfo nato mišinys | | 410-06 5-0 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-24-37 | | |

607-286-00-1 | natrio ir kalio 7-[[[3-[[4-((2-hid roksi-naftil)azo) fenil]azo]fenil]sulfonil]amino]-naftalen-1,3-di sulfonatų miši nys | | 410-07 0-8 | 141880-36-6 | R43 R52-53 | Xi R: 43-52/53 S: (2-)22-24-37-61 | | |

607-287-00-7 | O′-metil O-(1-metil-2-metakril oloksoetil)-1,2, 3,6-tetrahidro ftalatas | | 410-140-8 | — | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-288-00-2 | tetranatrio (c-(3-(1(e-dichloro-5-cianopirimidin-f-il(metil)amino )propil)-1,6-dihi dro-2-dihidrok si-4-metil-6-ok so-3-piridilazo)-4-sulfonatofenil sulfamoil)ftalocianin-a,b,c,d-tri sulfonato(6-)) ni kelatas(II), kai a yra 1 arba 2, arba 3, arba 4, b yra 8 arba 9, arba 10, arba 11, c yra arba 15, arba 16, arba 17, arba 18, d yra arba 22, arba 23, arba 24, arba 25 ir e bei f yra 2 ir 4 arba atitinka mai 4 ir 2 | | 410-160-7 | 148732-74-5 | Xi; R36 R43 R52-53 | Xi R: 36-43-52/ 53 S: (2-)22-26-36/37-61 | | |

607-288-00-8 | 3-(3-(4-(2,4-bis (1,1-dimetilpro pil)fenoksi)butilaminokarbonil-4-hidroksi-1-naf talenil)tio)propanoinė rūgštis | | 410-370-9 | 105488-33-3 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607-290-00-3 | amonio 1-C14-C18-alkiloksika rbonil-2-(3-alil oksi-2-hidroksi propoksikarbonil)etan-1-sulfona to ir amonio 2-C14-C18-alkil oksikarbonil-1-(3-aliloksi-2-hid roksipropoksikarbonil)etan-1-sul fonato mišinys ( mišinio kompo nentų santykis nėra žinomas) | | 410-540-2 | — | Xi; R38 R43 N; R50-53 | Xi; N R: 38-43-50/ 53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

607-291-00-9 | dodecil-ω-(C5/ C6-cikloalkil)al kilkarboksilatas | | 410-63 0-1 | 104051-92-5 | R53 | R:53 S: 61 | | |

607-292-00-4 | [1-(metoksime til)-2-(C12-alko ksi)-etoksi]acto rūgšties ir[1-(me toksimetil)-2-(C 14-alkoksi)-etok si] acto rūgšties mišinys | | 410-640-6 | — | Xi; R38-41 N; R50-53 | Xi; N R: 38-41-50/ 53 S: (2-)26-37/ 39 -60-61 | | |

607-293-00-X | N-aminoetilpipe razonium mono-2,4,6-trimetilno nildifenil eterio disulfonato ir N-aminoetilpiperazonium di-2,4,6-trimetilnonildi fenil eterio disulfonato mišinys | | 410-650-0 | — | Xi; R41 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 41-43-51/ 53 S: (2-)26-36/ 37/39-61 | | |

607-294-00-5 | natrio 2-benzoil oksi-1-hidroksi etansulfonatas | | 410-680-4 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

607-295-00-0 | tetranatrio fosfo natoetano-1,2-di karboksilato ir heksanatrio fos fonatoetano-1,2-tetrakarboksilato mišinys | | 410-800-5 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/ 53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-296-00-6 | pentaeritriolinių tetraesterių/ hep tanoinės bei 2-etilheksanoinės rūgšties mišinys | | 410-830-9 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607-297-00-1 | (E-E)-3,3′-(1,4-feniletilendimetilidene)bis(2-ok sobornano-10-sulfoninė rūgš tis) | | 410-96 0-6 | 92761-26-7 | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

607-298-00-7 | 2-(trimetilamo nio)etoksikar boksibenzen-4-sulfonatas | | 411-010-3 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)26-36/37 | | |

607-299-00-2 | metil 3-(acetiltio )-2-metil-propa noatas | | 411-04 0-7 | 97101-46-7 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/ 53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

607-300-00-6 | trinatrio [2-(5-chloro-2,6-di fluoropirimidin-4-ilamino)-5-(b-sulfamoil-c,d-sulfonatoftalocianin-a-il-K4, N 29,N30,N31, N32-sulfonil amino)benzoato(5-)]vario drus ka(II), kai a =1, 2,3,4; b =8,9,10, 11; c =15,16,17, 18; d =22,23,24, 25 | | 411-430-7 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-24-37 | | |

607-301-00-1 | dodekanoinės rūgšties ir jos poli(1-7) laktato esterių mišinys | | 411-860-5 | — | Xi; R38-41 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 38-41-43-51/ 53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-302-00-7 | tetradekanoinės rūgšties ir jos poli(1-7) laktato esterių mišinys | | 411-910-6 | — | Xi; R38-41 R43 R52-53 | Xi; N R: 38-41-43-51/ 53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-303-00-2 | 1-ciklopropil-6,7-difluoro-1,4-dihidro-4-okso kvinolin-3-kar boksilinė rūgštis | | 413-760-7 | 93107-30-3 | Repr. kat 3; R62 N; R51-53 | Xn R: 62-52/ 53 S: (2-)22-36/ 37-61 | | |

608-023-00-3 | 4-(4-chlorfenil)-2-fenil-2-[(1H-1,2,4-triazol-1-il)metil)]butanenitrilas | | 406-140-2 | 114369-43-6 | N; R50-53 | N R: 50/ 53 S: 60-61 | | |

608-024-00-9 | 2-(4-(n-butil-N-fenetilamino)fenil)etilen-1,1,2-trikarbonitrilas | | 407-650-8 | 97460-76-9 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

608-025-00-4 | 2-nitro-4,5-bis(benziloksi)fenilacetonitrilas | | 410-97 0-0 | 117568-27-1 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

609-053-00-X | hidrazin-tri-nit rometanas | | 414-850-9 | — | E; R3 O; R8 Karc.kat. 2; R45 T; R23/25 R43 | E; T R: 45-3-8-23/25-43 S: 53-45 | | |

610-010-00-2 | 2-bromo-1-(2-fu ril)2-nitroetile nas | | 406-110-9 | 35950-52-8 | Xn; R22-48 /22 C; R34 R43 N; R50-53 | C; N R: 22-34-43-48/22-50/ 53 S: (1/2-)22-26-36/37/39-45-60-61 | | |

611-043-00-5 | trinatrio N(1′)-N(2′):N(1″)-N (2″)-η-6-[2-ami no-4-(arba6)-hid roksi-(arba4-ami no-2-hidroksi) fenilazo]-6″-(1-karbaniloil-2-2-hidroksiprop-1-enilazo)-5′,5″-disulfamoil-3, 3″-disulfanato bis(naftalen-2, 1′-azobenzen-1, 2′-diolato-O(1), O(2′)) chroma to, trinatrio N (1′)-N(2):N(1″) -N(2″)-η-6,6″-bis(-(1-karbani loil-2-2-hidrok siprop-1-enil azo)-5′,5″-di sulfamoil-3,3″-disulfanatobis(naftalen-2,1′-azo benzen-1,2′-dio lato-O(1), O(2′) )-chromato ir trinatrio B(1′)-N(2);N(1″)-N (2″)-η-6,6″-bis [2-amino-4-(ar ba 6)-hidroksi-(arba 4-amino-2-hidroksi)fenil azo]5′,5′dsulfa moil-3,3″-disu fa nato bis(naftalen-2, 1′-azobenzen-1,2′diolato-O (1),O(2′))-chro mato mišinys, paruoštas, sumai šius medžiagas santykiu 2:1:1. | | 402-85 0-1 | | Xi; R41 52-53 | Xi R: 41-52/ 53 S: (2-)26-39-61 | | |

611-044-00-0 | tert-alkil(C12-C14) amonium bis[1-[(2-hidrok si-5-nitrofenil) azo]-2-nafteleno lato(2)] chroma to(1-), tert-alkil (C12-C14) amo nium bis[1-[(2-hidroksi-4-nitro fenil)azo]-2-naf telenolato (2)] chromato(1-), tert-alkil(C12-C 14)amonium bis [1-[[5(1,1-dime tilpropil)2-hid roksi-3-nitro fe nil]azo]-2-naf ta lenolato(2)]chromato(1-), tert-al kil(C12-C14) amonium bis[1-[(2-hidroksi-5-nitrofenil)azo]-2 -naftelenolato (2 )]-[1-[(2-hidrok si-5-nitrofenil) azo]-2-naftalen olato(2)]]-chro mato(1-), tert-al kil(C12-C14) amonium bis[1-[[(5-(1,1-dimetilpropil)-2--hidroksi-3-nitro fenil)azo]-2-naf talenolato(2)][1 -[(2-hidroksi-5-nitrofenilazo]-2-naftalenolato(2-)]]chromato(1-), tert-alkil(C12-C 14)amonium bis ((1-(4(arba5)- nitro-2-oksido fenilazo)-2-naf tolato)(1-(3-nit ro-2-oksido-5-pentilfenilazo)-2-naftolato))c hromato(1-) mišinys | | 403-720-7 | 117527-94-3 | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

611-045-00-6 | 2-[4-[N-(4-ace toksibutil)-N-e til]amino-2-me tilfenilazo]-3-acetil-5-nitrotio fenas | | 404-830-8 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611-046-00-1 | 4,4′-diamino-2-metilazobenze nas | | 407-590-2 | 43151-99-1 | T; R25 Xn; R48/22 R43 N; R50-53 | T; N R: 25-43-48/ 22-50/53 S: (1/2-)22-28 -36/37-45-60-61 | | |

611-047-00-7 | 2-[[4-[N-etil-N-(2-acetoetil) ami no)fenil]azo]-5,6-dichlorben zotiazolo ir 2-[[4-[N-etil-N-(2-acetoetil)amino)fenil]azo]-6,7-di chlorbenzitiazolo mišinys, pa ruoštas,sumaiš ius medžiagas santykiu 1:1 | | 407-890-3 | 111381-11-4 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611-048-00-2 | 2-[[4-[bis(2-acetoetil)amino)fenil]azo]-5,6-di chlorbenzotiazolo ir 2-[[4-[bis (2-acetoetil) amino]fenil]azo]-6,7-dichlorbenzotiazolo mišinys paruoštas, sumaišius medžiagas santykiu 1:1. | | 407-900-6 | 111381-11-5 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611-049-00-8 | 7-[4-(3-dietilaminopro- pilamino)-6-(3-dietil- amoniopropilamino)-1,3,5-triazin-2-ilami- no]-4-hidroksi-3-(4-fenilazofenilazo)-naf- talen-2-sulfonato, acto rūgšties ir pieno rūgš- ties mišinys paruoštas, sumaišius medžiagas san tykiu 2:1:1 | | 408-000-6 | 118658-98-3 | Xn; R48/22 R43 R52-53 | Xn R: 43-48/22-52/53 S: (2-)22-36/ 37-61 | | |

611-051-00-9 | 2-(4-(N-etil-(2-hidroksi))etil)amino-2-2-metil) fenil)azo-6-me toksi-3-metilben zotiazolium chlo ridas | | 411-110-7 | 136213-74-6 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60/61 | | |

611-052-0-4 | vandeninis mo nonatrio [5-[[2, 4-dihidroksi-5-[(2-hidroksi-3,5-dinitrofenil) azo]fenil]azo]-2-naftalensulfo natas], geležies kompleksas | | 400-720-99 | — | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

612-156-00-2 | triheksadecilamoniumchlorido ir diheksadecil dimetilamoniumchlorido mišinys | | 405-620-9 | — | Xi; R41 N; R50-53 | Xi; N R: 41-50/53 S: (2-)26-39-60-61 | | |

612-157-00-8 | (Z)benzo[b]tien-2-iletanono oksi mo hidrochlori das | | 410-780-8 | — | Xn; R22-48/22 Xi; R41 R43 N; R51-53 | Xn; N R: 22-41-43-48/22-51/53 S: (2-)22-26-36/37/39-61 | | |

612-158-00-3 | bis(5-dodecil-2-hidro ksi benzaldoksimat) va rio (I I ) C12 šakotos C12 alkilinės grupės ir 4-do decilsalicilaldok simo mišinys | | 4140-820-4 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

612-159-00-9 | trimetilheksamino reakcijos pro duktai: 2,2,4-tri metil-1,6-heksa ndimino ir 2,4,4 -trimetil-1,6-hek sandiamino ir (epoksido8) m ono [(C 10-C16- alkiloksi)meto ksi) oksirano jun giniai) ir p-toluen-sulfoninė rūgštis | | 410-880-1 | — | Xn; R22 C; R34 N; R50-53 | C; N R: 22-34-50/ 53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-60-61 | | |

613-149-00-7 | 2-tert-butil-5(4-tert-butilbenzo tio)-4-chlororopi ridazin-3(2H)-o nas | | 405-700-3 | 96489-71-3 | T; R23/25 N; R50/53 | T; N R: 23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

613-150-00-2 | 2,2′-[3,3′-(pipe razin-1.4-diil)di propil)bisbis(1H-benzimidazo [2,1b]benzol[m,n][3,8]fenantrolin-1,6-trionas | | 406-295-6 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

613-151-00-8 | 1-(3-mesiloksi-5-tritil- oksimetil-2-D-trejofu- ril)timinas | | 406-360-9 | 104218-44-2 | R53 | R: 53 S; 61 | | |

613-152-00-3 | fenil N-(4,6-dimetoksi- piridin-2-il)karbamatas | | 406-60 0-2 | 89392-03-0 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

613-153-00-9 | 2,3,5-trichloropiridinas | | 407-27 0-2 | 16063-70-0 | R52-53 | R:52/53 S: 61 | | |

613-154-00-4 | 2-amino-4-chloro-6-metoksipi ridinas | | 410-050-9 | 5734-64-5 | Xn; R22 | Xn R: 22 S: (2-)22 | | |

613-155-00-X | 5-chloro-2,3-difluoro- piridinas | | 410-090-7 | 89402-43-7 | R10 Xn; R22 R50-53 | Xn R: 10-22-52/ 53 S: (2-)23-36-61 | | |

613-156-00-5 | 2-butil-4-chloro-5-formilimidazolas | | 410-260-0 | 83857-96-9 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

613-157-00-0 | 2,4-diamino-5-metoksi- metilpiridinas | | 410-33 0-0 | 54236-98-5 | Xn; R22-48/ 22 Xi; R36 | Xn R: 22-36-48/ 22 S: (2-)22-26-36 | | |

613-158-00-6 | 2,3-dichloro-5-trifluor- metilpiridinas | | 410-34 0-5 | 69045-84-7 | Xn; R20/22 Xi; R41 R43 N; R51-53 | Xn; N R: 20/22-41-43-51/53 S: (2-)24-36-37-/39-61 | | |

613-159-00-1 | 4-[2-[4-(1,1-dimetil- etil)fenil)-e toksi]kvi- nazoli nas | | 410-58 0-0 | 120928-09-8 | T; R25 Xn; R20 N; R50-53 | T; N R: 20-25-50/ 53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

613-160-00-7 | (1S)-2-metil-2,5-diazo- biciklo [2.2.1]heptano dihidrobromidas | | 411-00 0-9 | 125224-62-6 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

615-022-00-1 | metil-3-izociana tosul fonil-2-tio fenokarbo ksilatas | | 410-55 0-7 | 79277-18-2 | E; R2 R14 Xn; R48/22 R42/43 | E; Xn R: 2-14-42/43-48/22 S: (2-)22-30-35-36/37 | | |

615-023-00-7 | 2-(izocianatosul fonilmetil)benzoinės rūgšties me tilo esteris′ (alt.): metil2-(izocian atosulfonilmetil)benzoatas | | 410-900-9 | 83056-32-0 | R10 R14 Mut. kat. 3; R40 Xn; R20-48/ 22 Xi; R41 R42 | Xn R: 10-14-20-40-41-42-48/22 S: (2-)23-26-36/37/39 | | |

616-044-00-4 | N-(3,5-dichloro-4-etil-2-hidroksi fenil)-2-(3- pen tadecilfenoksi)-butanamidas | | 402-510-2 | — | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

616-045-00-X | 2′-(4)chloro-3-ciano-5-formil-2-tienilazo)-5′-dietilamino-2-metoksiacetanilidas | | 405-19 0-2 | 122371-93-1 | R43 R53 | Xi; R: 43-53 S: (2-)22-24-37-61 | | |

616-046-00-5 | N-(2-(6-chloro-7-metilpirazolo (1,5-b)-1,2,4-triazol-4-il)pro pil)-2-(2,4-di-tert-pentilfenok si)oktanamidas | | 406-390-2 | — | N: R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

616-047-00-0 | 2,2′,2″,2″-(etil endinitrotetrakis-N,N-di(C16) al kilacteamido ir 2,2′,2″,2″-(etil endinitrotetrakis-N,N-di(C18) al kilacteamido mišinys | | 406-640-0 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

616-048-00-6 | 3′-trifluormetil izobutiranilidas | | 406-74 0-4 | 1939-27-1 | Xn; R48/22 N; R51-53 | Xn; N R: 48/22-51/53 S:(2-)22-36-61 | | |

616-049-00-1 | 2-(2,4-bis(1,1-dimetiletil)fenoksi)-N-(3,5-di chloro-4-etil-2-hidroksifenil)-heksanamidas | | 408-150-2 | 99141-89-6 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

616-050-00-7 | N-[2,5-dichloro-4-(1,1,2,3,3,3-heksafluorpropoksi)-fenil-amino karbonil]-2,6-di fluorbenzamidas | | 410-69 0-9 | 103055-07-8 | R43 N; R50-53 | Xi; N R: 43-50/53 S:(2-)24-37-60 -61 | | |

616-051-00-2 | 2,4-bis(N′-(4-metilfenil)-ureido)-tolueno ir 2,6-bis(N′-(4-metilfenil)-ureido)-tolueno | | 411-070-0 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

617-015-00-9 | bis(4-metilben zoil)peroksidas | | 407-95 0-9 | 895-85-2 | E; R2 O; R7 N; R50-53 | E; N R: 2-7-50/53 S: (2-)7-14-36 /37/39-47-60-61 | | |

650-032-00-X | ciprokonazolas (ISO) (2RS,3RS; 2RS, 3SR)-2-(4-chlo rofenil)-3-ciklopropil-1-(1H-1, 2, 4-triazol-1-il) butan-2-olis | | — | 94361-06-5 | Repr. kat 3; R63 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R:22-50/53-63 S:(2-)36/37-60-61 | | |

--------------------------------------------------

2 PRIEDAS

Žr. komisijos direktyvą 2001/59/EB, OL L 225, 2001 8 21, P. 1.

--------------------------------------------------

3A PRIEDAS

Žr. Komisijos direktyvą 2001/59/EB, OL L 225, 2001 8 21, p. 1.

--------------------------------------------------

3B PRIEDAS

Žr. Komisijos direktyvą 2001/59/EB, OL L 225, 2001 8 21, p. 1.

--------------------------------------------------

4A PRIEDAS

"B.10. MUTAGENIŠKUMAS - ŽINDUOLIU CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMAS IN VITRO

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 473 Žinduolių chromosomų aberacijos tyrimą in vitro (1997).

1.1. ĮVADAS

Chromosomų aberacijų tyrimo tikslas - identifikuoti agentus, sukeliančius žinduolių ląstelių, kultivuojamų in vitro, chromosomų aberacijas 1, 2, 3. Struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų - chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Tačiau šio metodo tikslas nėra išmatuoti chromosomų skaičiaus pokyčius, ir paprastai tam jis nėra taikomas. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių.

Tiriant chromosomų aberacijas in vitro galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų, ląstelių kamienų arba pirminių ląstelių kultūras. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą augti kultūroje, kariotipų stabilumą, chromosomų skaičių, chromosomų įvairovę ir spontaninį chromosomų aberacijų dažnį.

Atliekant tyrimus in vitro reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinės aktyvacijos sistema negali visiškai pakeisti žinduolių in vivo sąlygų. Reikia stengtis išvengti tokių sąlygų, kurioms esant būtų gaunami teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo ir galintys atsirasti pakeitus pH, osmosinį slėgį arba ypač padidėjus citotoksiškumui 4, 5.

Šis tyrimas atliekamas, kai ieškoma galimų žinduolių mutagenų ar karcinogenų. Daugelis cheminių junginių, naudojant šį tyrimą, duodančių teigiamus rezultatus, yra žinduolių karcinogenai; tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio tyrimo ir karcinogeniškumo. Ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; yra neginčijamų įrodymų kad šio tyrimo metu negalima nustatyti tam tikrų karcinogenų, nes pasirodo, jog jie veikia kitaip, ne tiesiogiai suardo DNR.

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS

Chromatidinė aberacija : struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas.

Chromotidinė aberacija : struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.

Endoreduplikacija : procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S (sintezės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S (sintezės) periodas. Šitaip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių.

Plyšys : achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.

Mitozinis indeksas : itozės metafazėje esančių ląstelių santykis, padalintas iš viso ląstelių populiacijos skaičiaus, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.

Chromosomų skaičiaus aberacija : ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu panaudotoms ląstelėms.

Poliploidiškumas : haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis.

Struktūrinė aberacija : chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.

1.3. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja chemine medžiaga esant metabolinei aktyvacijai arba jos nesant. Ląstelių kultūras paveikus tiriamąja medžiaga, tam tikrais laiko tarpais jos yra veikiamos ląstelių dalijimąsi metafazėje stabdančia medžiaga (pavyzdžiui Kolcemidu© arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu,kad būtų nustatomos chromosomų aberacijos.

1.4. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4.1. Preparatai

1.4.1.1. Ląstelės

Galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas, kamienus arba pirmines ląstelių, tarp jų ir žmonių ląstelių kultūras (pvz, kiniško žiurkėno fibroblastus, žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus).

1.4.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygos

Kultūros turėtų būti kultivuojamos reikiamoje terpėje, esant reikiamoms inkubacijos sąlygoms (kultivavimui skirtuose induose, esant reikiamai CO2 koncentracijai, temperatūrai ir drėgmei). Pastoviai tikrinama, ar gerai žinomų ląstelių linijos ir kamienai išlaiko pastovų modalinį chromosomų skaičių, ar jos neužsikrėtusios mikoplazmomis, o jei yra užkrėstos, tai toliau nebenaudojamos. Turi būti žinoma ląstelių ciklo trukmė bei taikomos kultivavimo sąlygos.

1.4.1.3. Kultūrų paruošimas

Gerai žinomos ląstelių linijos ir kamienai: ląstelės yra padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos kultūrinėje terpėje tokiu tankumu, kad prieš ląsteles surenkant, kultūros nesusilietų,, po to jos inkubuojamos 37 °C temperatūroje.

Limfocitai: į kultūrinę terpę, turinčią mitogeno (pvz., fitohemagliutinino), įnešamas sveikų tiriamųjų kraujo, paveikto antikoaguliantu (pvz., heparinu), mėginys arba iš to kraujo išskirti limfocitai ir inkubuojama 37 °C temperatūroje.

1.4.1.4. Metabolinė aktyvacija

Ląstelės turėtų būti paveikiamos tiriamąja chemine medžiaga tiek esant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai, tiek ir nesant. Plačiausiai naudojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 6, 7, 8, 9 ar fenobarbitono ir β-naftoflavono mišiniu 10, 11, 12, postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi.

Post-mitochondrinė frakcija paprastai naudojama tokių koncentracijų, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia 1-10 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema gali priklausyti nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti daugiau nei vieną post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją.

Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti, taikant tokias naujoves kaip genetinės inžinerijos pagalba gautas ląstelių linijas, gaminančias specifinius, aktyvacijoje dalyvaujančius fermentus. Tyrime naudojamų ląstelių linijų pasirinkimas turėtų būti moksliškai pagrįstas (pvz, pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).

1.4.1.5. Tiriama cheminė medžiaga/preparatas

Kietosios tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga, ir praskiestos. Prieš tyrimą į tiriamąją sistemą gali būti tiesiogiai įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios tiriamosios medžiagos. Turėtų būti naudojami naujai paruošti tiriamosios medžiagos preparatai, jeigu šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.1. Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys

Neturėtų būti manoma, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai reaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir turėtų būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.

1.4.2.2. Veikimo koncentracijos

Parenkant pačią didžiausią koncentraciją, vadovaujamasi tokiais kriterijais, kaip citotoksiškumu, tirpumu tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiais.

Citotoksiškumas turėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais ląstelių vientisumo ir augimo rodikliais, tokiais kaip ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis, gyvų ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas. Pirminio ekperimento metu būtų naudinga nustatyti toksiškumą ir tirpumą.

Turėtųi būti naudojamos bent trys koncentracijos. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; tai reikš, kad koncentracijos turės būti atskirtos tiktai faktoriumi, esančiu tarp 2 ir √10. Ląstelių surinkimo metu didžiausia koncentracija turėtų parodyti, kad gerokai sumažėjo ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis ir ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas (visi sumažėjo daugiau nei 50 %). Mitozinis indeksas yra tik netiesioginis citotoksinių/citostatinių efektų įvertinimo matas ir priklauso nuo laiko praėjusio po tiriamosios medžiagos poveikio. Tačiau mitozinis indeksas tinka ląstelių, auginamų suspensijoje, kultūroms, kuriose kiti toksiškumo tyrimai gali būti sudėtingi ir nepraktiški. Duomenys apie ląstelių ciklo kinetinius parametrus, tokius kaip vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, gali būti panaudoti kaip pagalbinė informacija. Tačiau vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, laikomas bendru vidurkiu, ne visada parodo, kad egzistuoja sulėtinto vystymosi subpopuliacijos, ir netgi menkas ląstelių susiformavimo laiko pailgėjimas gali būti susijęs su kur kas ilgesne optimalaus aberacijų skaičiaus atsiradimo trukme.

Kai medžiagos yra pakankamai necitotoksinės, tai didžiausia tiriamoji koncentracija turėtų būti 5 μl/ml, 5,5 mg/ml arba 0,01 M, priklausomai nuo to, kuri iš visų išvardintų koncentracijų yra pati mažiausia.

Kai medžiagos yra gana netirpios ir nėra toksiškos, o jų koncentracijos yra mažesnės už tas, kurioms esant medžiagos netirpsta, tai baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, didžiausios naudojamos dozės koncentracija turėtų viršyti tirpumo ribą paruoštoje, kultivavimui skirtoje terpėje. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, kai toksiškumas pasireiškia tik tada, kai medžiagos koncentracija yra truputį didesnė už pačią mažiausią koncentraciją, kuriai esant medžiaga visiškai netirpsta, rekomenduojama patikrinti daugiau nei vieną koncentraciją, kurioje susiformuoja matomas precipitatas. Derėtų įvertinti tirpumą prieš veikimą tiriamąja chemine medžiaga, ir po jo, kadangi veikiant tiriamąja medžiaga, tirpumas gali pakisti dėl ląstelių ir S9 serumo, esančių tiriamojoje sistemoje. Netirpumą galima nustatyti plika akimi. Precipitato susidarymas neturėtų trukdyti įvertinti duomenis.

1.4.2.3. Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai

Atliekant kiekvieną eksperimentą, esant metabolinei aktyvacijai, arba jos nesant, tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpikliai, tirpinntysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Kai naudojamasi metaboline aktyvacija, tai kartu su teigiamu kontroliniu mėginiu turi būti naudojama aktyvuojanti cheminė medžiaga tam, kad būtų sukuriamas atsakas į mutageną.

Teigiamuose kontroliniuose mėginiuose turi būti tokios žinomo elastogeno koncentracijos, kurioms esant, bei veikiant tiriamąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai, o tai parodo tiriamosios sistemos jautrumą.

Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atskleistų užkoduotas skaidres. Žemiau pateikiami teigiamuose kontroliniuose mėginiuose esančių cheminių medžiagų pavyzdžiai:

Metabolinės aktyvacijos sąlygos | Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

Egzogeninė metabolinė aktyvacija nevyksta | metilmetansulfonatas | 66–27–3 | 200–625–0 |

etilmetansulfonatas | 62–50–0 | 200–536–7 |

etilnitrošlapalas | 759–73–9 | 212–072–2 |

mitomicinas C | 50–07–7 | 200–008–6 |

4-nitrokvinolino–N- oksidas | 56–57–5 | 200–281–1 |

Egzogeninė metabolinė aktyvacija vyksta | benzopirenas | 50–32–8 | 200–028–5 |

ciklofosfamidas | 50–18–0 | 200–015–4 |

ciklofosfamido-monohidratas | 6055–19–2 | |

Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines chemines medžiagas. Kai įmanoma, tai reikia apsvarstomas teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimas.

Auginant kiekvieną ląstelių rinkinį, reikia naudoti neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus iš terpėje esančio pavienio tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir kurie paveikiami šia terpe lygiai taip pat kaip ir ląstelių kultūros.Taipogi reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesioį tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.

1.4.3. Tyrimo atlikimo metodika

1.4.3.1. Veikimas tiriamąja chemine medžiaga

Proliferuojančios ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant. Limfocitai veikiami tiriamąja medžiaga, praėjus maždaug 48 valandoms po stimuliacijos mitogenu.

1.4.3.2. Paprastai naudojamos kiekvienos koncentracijos pakartotinės kultūros, ypač rekomenduojama tai daryti, kai kultivuojamos neigiamos kontrolinės kultūros, terpėje esant vien tik tirpiklio. Jeigu remiantis anksčiau atliktų eksperimentų aprašymais galima parodyti, kad tarp kartotinio pasėjimo kultūrų egzistuoja minimalūs skirtumai 13, 14, tada pavienes kultūras bus galima tirti, terpėje esant skirtingoms tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijoms.

Dujinės ir lakiosios medžiagos tiriamos atitinkamais metodais, tokiais kaip kultivavimas užsandarintuose induose 15, 16.

1.4.3.3. Kultūrų surinkimo laikas

Atliekant pirmąjį eksperimentą, ląstelės, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant tiriamąja chemine medžiaga veikiamos 3-6 valandas ir yra surenkamos praėjus maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios 12. Jeigu eksperimentas atliekamas pagal šį protokolą, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant ir gaunami neigiami rezultatai, tai reikia atlikti papildomą poveikio tiriamąja medžiaga eksperimentą, nesant metabolinės aktyvacijos sistemos ir ląstelės surenkamos, praėjus laiko tarpui, maždaug lygiam 1,5 ląstelinio ciklo trukmės. Kai kurios cheminės medžiagos yra lengviau nustatomos, jei tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau, o mėginiai paimami tada, kai praeina daugiau nei 1,5 ląstelinio ciklo. Neigiami duomenys, gauti tuo metu, kai buvo naudojama metabolinė aktyvacija, turi būti patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, kad nereikia patvirtinti neigiamų rezultatų, tai privalo būti pagrįsta.

1.4.3.4. Chromosomų paruošimas

Paprastai likus 1-3 valandoms iki surinkimo ląstelių kultūros yra paveikiamos Kolcemidu© arba kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama tam, kad chromosomos būtų paruoštos. Ruošiant chromosomas, ląstelės paveikiamos hipotoniniu šoku, fiksuojamos ir dažomos.

1.4.3.5. Analizė

Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, yra atskirai koduojamos. Kadangi fiksavimo metu metafazėje esančios ląstelės dažnai suyra bei prarandamos chromosomos, tai suskaičiuotos ląstelės turės centromeras, kurių skaičius bus lygus visų tipų ląstelių modaliniam skaičiui ≠2. Jei tiriant kartotinio pasėjimo kultūras, galima naudotis ta pačia kontrole, tai nustatytas centromerų skaičius bus lygus 200 gerai matomų metafazių. Centromerų skaičius gali sumažėti, kai stebima daug aberacijų.

Nors šio tyrimo tikslas yra nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, svarbu poliploidiją bei endoduplikaciją registruoti tada, kai tai yra matoma.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Ląstelė yra eksperimentinis vienetas, todėl nustatomas ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas, išreiškiamas procentais. Reikia išvardinti chromosomų struktūrinių aberacijų skirtingus tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį tiriamose ir kontrolinėse ląstelių kultūrose. Atskirai registruojami chromosomų plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama nustatant absoliutų aberacijos dažnį.

Reikia taip pat registruoti tarpusavyje sutampančias priemones, kurios naudojamos citotoksiškumui vertinti visose paveiktose ir neigiamose kontrolinėse kultūrose, kai yra atliekami pagrindiniai eksperimentai, kurių metu nustatomos aberacijos.

Reikėtų pateikti ir pavienius duomenis. Be to visus duomenis reikėtų pateikti apibendrintai, lentelių forma.

Nėra reikalaujama, kad būtų patvirtintas aiškus teigiamas atsakas. Abejotini rezultatai patvirtinami, Atliekant toliau tyrimą, o pirmiausia pakeičiant eksperimento sąlygas, įsitikinama tuo, kad anksčiau gauti rezultatai yra abejotini. 1.4.3.3 skyriuje buvo aptarta būtinybė patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai. Vėlesnių eksperimentų metu reikia apsvarstyti tiriamų parametrų pakeitimus, tam, kad ištirtų sąlygų spektras būtų praplėstas. Koncentracijų intervalo išretinimas bei metabolinės aktyvacijos sąlygos priklauso tiriamiesiems parametrams, kuriuos galima keisti.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus 3, 13. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas.

Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali parodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą 17, 18.

Jei tiriant medžiagą, buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardintų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutageniška.

Nors atliekant daugelį eksperimentų, bus gauti aiškūs teigiami ir neigiami rezultatai, tačiau retais atvejais, remiantis gautų duomenų visuma, nebus galima padaryti konkrečios išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Net ir daug kartų pakartojus eksperimentą, rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs.

Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, gauti teigiami rezultatai, gauti atlikus tyrimą, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse.

3. ATASKAITA

TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys,

- tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Ląstelės:

- ląstelių tipas ir šaltinis,

- panaudoto ląstelių tipo kariotipo ypatybės ir tinkamumas,

- ar ląstelės neužsikrėtusios mikoplazmomis, jei tai įmanoma nustatyti,

- informacija apie ląstelinio ciklo trukmę,

- kraujo donorų, iš kurių buvo gauti viso kraujo mėginiai ar iš kurių kraujo buvo išskirti limfocitai, lytis bei panaudotas mitogenas,

- ląstelių persėjimų skaičius, jei tai įmanoma nustatyti,

- ląstelių kultivavimo metodai, jei tai galima nustatyti,

- modalinis chromosomų skaičius.

Tyrimo sąlygos:

- metafazę sustabdančios cheminės medžiagos prigimtis, koncentracija bei laiko tarpas, per kurį ši medžiaga veikė ląsteles,

- pagrindinė priežastis, dėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos ir ląstelių kultūrų kultivavimo skaičius nurodant, jei įmanoma, citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas,

- terpės sudėtis ir CO2 koncentracija, jei tai įmanoma nurodyti,

- tiriamosios medžiagos koncentracija,

- tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įneštos tiriamosios medžiagos tūris,

- inkubacijos temperatūra,

- inkubacijos laikas,

- veikimo tiriamąja medžiaga trukmė,

- ląstelių tankis pasėjimo metu, jei tai įmanoma nurodyti,

- metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant tinkamumo kriterijus,

- teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai,

- skaidrių paruošimo būdai,

- aberacijų vertinimo kriterijai,

- ištirtų metafazių skaičius,

- toksiškumo įvertinimo būdai,

- kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama, ar tyrimų metu gauti rezultatai teigiami, neigiami bei abejotini.

Rezultatai:

- toksiškumo požymiai, pvz., ląstelių kultūrų kolonijų susiliejimo laipsnis, ląstelinio ciklo duomenys, ląstelių skaičius, mitozinis indeksas,

- precipitacijos požymiai,

- duomenys apie terpės, kurioje buvo atliekamas veikimas, pH ir osmosinį slėgį, jei tai buvo nustatyta,

- aberacijų, įskaitant plyšius, apibūdinimas,

- ląstelių, esančių tiriamąja medžiaga veiktose bei kontrolinėse kolonijose ir turinčių chromosomų aberacijas, skaičius bei chromosomų aberacijų tipas,

- ploidiškumo pokyčiai, jei pastebimi,

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma,

- statistinės analizės, jei tokios buvo atliktos,

- vienu metu gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimų duomenys,

- duomenys, gauti anksčiau atliktų tyrimų metu išanalizavus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis prietaisas) ir teigiamus kontrolinius mėginius, kartu nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. NUORODOS

1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1–29.

2) Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427–432.

3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cellS: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (supl.10), p. 1–175.

4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, p. 147–204.

5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, p. 297–305.

6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, p. 347–364.

7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, p. 173–215.

8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, p. 83–90.

9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, p. 277–290.

10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, p. 175–177.

11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85–88.

12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, p. 241–261.

13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141–154.

14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, p. 139–149.

15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, p. 91–103.

16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801.

17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, p. 403–413.

18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, p. 1362–1364."

--------------------------------------------------

4B PRIEDAS

"B.11. MUTAGENIŠKUMAS - ŽINDUOLIŲ KAULŲ ČIULPŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS IN VIVO

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 475, Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijos tyrimą (1997).

1.1. ĮVADAS

Žinduolių chromosomų aberacijų tyrimas in vitro naudojamas nustatyti struktūrinėms chromosomų aberacijoms, kurias tiriamoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai griaužikų, kaulų čiulpų ląstelėse 1, 2, 3, 4. Chromosomų struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų - chromosominės arba chromatidinės. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių.

Šiam tyrimui paprastai naudojamas griaužikų stuburo skliautas. Pagrindinis tiriamasis audinys yra kaulų čiulpai, kadangi jie yra išvagoti daugybės kraujagyslių, o be to, kaulų čiulpuose yra daug greitai besidauginančių ląstelių, kurios yra lengvai išskiriamos ir apdorojamos. Šio tyrimo metu nėra tiriami kitų rūšių žinduoliai bei jų audiniai.

Šis chromosomų aberacijos tyrimas ypač svarbus, kai įvertinama mutagenų daroma žala, nes šio tyrimo metu galima ištirti metabolizmo, farmakokinetikos ir DNR pažaidų reparacinių procesų veiksnius in vivo, nors jie gali varijuoti tarp skirtingų žinduolių rūšių ir skirtingų audinių. Tyrimas in vivo naudingas ir tuo, kad vėliau galima ištirti mutageninius efektus, nustatytus in vitro.

Jeigu įrodoma, kad tiriamoji cheminė medžiaga arba reaktyvus metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui.

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. APIBRĖŽIMAI

Chromatidinė aberacija : struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas.

Chromotidinė aberacija : struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.

Endoreduplikacija : procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S (sintezės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S (sintezės) periodas. Šitaip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių.

Plyšys : achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.

Mitozinis indeksas : mitozės metafazėje esančių ląstelių santykis, padalintas iš viso ląstelių populiacijos skaičiaus, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.

Chromosomų skaičiaus aberacija : ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu panaudotoms ląstelėms.

Poliploidiškumas : haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis.

Struktūrinė aberacija : chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.

1.3. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga pagal atitinkamą poveikio chemine medžiaga procedūrą ir atitinkamais laiko tarpais, praėjusiais po veikimo yra numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami agentu, sustabdančiu ląstelių dalijimąsi metafazėje (pvz., kolchicinu arba Kolcemidu©). Po to iš kaulų čiulpų ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos, ir metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.

1.4. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4.1. Preparatai

1.4.1.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Paprastai naudojamos žiurkės, pelės ir kiniški žiurkėnai, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia panaudoti dažniausiai vartojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Turimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neperžengti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinio svorio.

1.4.1.2. Laikymo ir maitinimo sąlygos

Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50-60 %.

1.4.1.3. Gyvūnų paruošimas

Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus veikiami medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie laboratorinių sąlygų.

1.4.1.4. Dozių paruošimas

Kietosios tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga, ir praskiestos. Prieš tyrimą į tiriamąją sistemą gali būti tiesiogiai įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios tiriamosios medžiagos. Turėtų būti naudojami naujai paruošti tiriamosios medžiagos preparatai, jeigu šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.1. Tirpiklis/tirpinantysis įrengimas

Neturėtų būti manoma, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai reaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir turėtų būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.

1.4.2.2. Kontroliniai mėginiai

Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai yra veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).

Teigiamuose kontroliniuose mėginiuose, paveiktuose tokia pačia tiriamosios cheminės medžiagos doze in vivo, turi būti aptinkamos struktūrinės aberacijos, kurioms esant, bei veikiant tiriamąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai, o tai parodo tiriamosios sistemos jautrumą. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atskleistų užkoduotas skaidres.

Priimtina, kad teigiami kontroliniai mėginiai būtų suleisti gyvūnams tokiu būdu, kuris skiriasi nuo tiriamosios cheminės medžiagos suleidimo būdo bei būtų tik vienąkart dozuojami. Jeigu yra įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių cheminių medžiagų klase, panaudojimą. Toliau pateikiami teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai:

Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

etil metansulfonatas | 62–50–0 | 200–536–7 |

etil nitrošlapalas | 759–73–9 | 212–072–2 |

mitomicinas C | 50–07–7 | 200–008–6 |

ciklofosfamidas | 50–18–0 | 200–015–4 |

ciklofosfamido monohidratas | 6055–19–2 | |

trietilenmelaminas | 51–18–3 | 200–083–5 |

Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien tik tirpinančiuoju įrenginiu arba kiti mėginiai paveikti tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos, yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taipogi reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesioį tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.

1.5. BANDYMO ATLIKIMO METODIKA

1.5.1.1. Gyvūnų skaičius ir lytis

Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, kai buvo panaudota ta pati gyvūnų rūšis ir tas pats poveikio tiriama medžiaga būdas, duomenis, kurie rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pvz., jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia ištirti atitinkamos lyties gyvūną.

1.5.2. Veikimo tvarkaraštis

Pirmiausia tik vieną kartą veikiama tiriamosiomis cheminėmis medžiagomis. Tiriamosiomis cheminėmis medžiagomis galima veikti, taikant vadinamąją išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną du kartus paveikiama tiriamąja medžiaga ir padarius ne daugiau kaip keleto valandų pertrauką tam, kad būtų paveikta pakankamai dideliu tiriamosios medžiagos tūriu. Kitų dozių davimo tvarka turi būti moksliškai pagrindžiama.

Veikiant tiriamąja medžiaga vienos dienos bėgyje, prieš tai reikia dukart atskirai paimti mėginius. Tiriant griaužikus, pirmasis mėginys paimamas, praėjus maždaug 1,5 ląstelinio ciklo (šis normaliai trunka 12-18 valandų) po veikimo. Kadangi tiriamosios medžiagos įsiskverbimas bei metabolizmas o taipogi jos įtaka ląsteliniam ciklui gali paveikti optimalų laiką, per kurį nustatomos chromosomų aberacijos, tai rekomenduojama, kad antrasis mėginys būtų paimamas būtų atliekamas praėjus 24 valandoms po veikimo. Jei dozės duodamos daugiau nei vieną dieną, tai mėginys paimamas, praėjus po veikimo laiko tarpui, lygiam maždaug normalaus 1,5 ląstelinio ciklo trukmės.

Prieš numarinant, atitinkama dozė metafazę sustabdančio agento (pvz., Kolcemido© ar kolchicino) suleidžiama gyvūnams į pilvo plėvę Po atitinkamo intervalo iš gyvūnų paimami mėginiai. Pelėms tas intervalas yra maždaug 3–5 valandos, kiniškiems žiurkėnams - 4–5 valandos. Iš kaulų čiulpų išskiriamos ląstelės ir analizuojamos, siekiant nustatyti chromosomų aberacijas.

1.5.3. Dozės dydis

Jeigu tyrimas atliekamas, siekiant surasti intervalą, nes nėra apie tai duomenų, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu5. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami trys doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, yra suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna mažos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, mitozinis indeksas sumažėja daugiau nei 50 %).

1.5.4. Ribų paieškos tyrimas

Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam dozės lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2000 mg/kg kūno masės ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant tris dozinius lygmenis. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir tiriamąja medžiaga veikiant iki 14 dienų, ribinė dozė turi siekti 2000 mg/kg kūno masės, tuo atveju kai tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dienų -1000 mg/kg kūno masės. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad atliekant ribų paieškos tyrimą reikalingas aukštesnis dozinis lygmuo.

1.5.5. Dozių davimas

Tiriamoji medžiaga paprastai yra duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įterpti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnių koncentracijų, sukelia žalingus reiškinius, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems dozės lygiams, tūris būtų pastovus.

1.5.6. Chromosomų paruošimas

Kai tik gyvūnai numarinami, iš jų iškart išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant tepinėlių ir nudažomos.

1.5.7. Analizė

Mitozinis indeksas nustatomas įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1000 ląstelių, gautų iš 1 gyvūno ir tai atliekama, ištiriant visus tiriamąja medžiaga veiktus (įskaitant teigiamus kontrolinius) ir neveiktus (neigiamus kontrolinius) gyvūnus.

Išanalizuojama mažiausiai 100 ląstelių, gautų iš 1 gyvūno. Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visos skaidrės (įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių mėginių skaidres) turi būti užkoduojamos nepriklausomai viena nuo kitos tam, kad jas būtų galima ištirti mikroskopu. Kadangi ruošiant skaidres, dažnai suardoma metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti tokį centromerų skaičių, kuris būtų lygus 2n ± 2.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno ląstelių, chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičius bei ląstelių, turinčių chromosomas su struktūrinėmis aberacijomis, skaičių, išreiškiamą procentais. Reikia išvardinti skirtingus chromosomų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų tiriamąja chemine medžiaga, grupėse. Atskirai registruojami plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama, nustatant absoliutų aberacijos dažnį. Jeigu tarp atskirų lyčių nenustatoma jokių skirtumų pagal atsaką, tai abiejų lyčių tyrimo duomenys apjungiami tam, kad būtų galima atlikti statistinę analizę.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus6. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimento sąlygas.

Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali parodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą7, 8.

Jei tiriant medžiagą, buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardintų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutageniška.

Nors atliekant daugelį eksperimentų, bus gauti aiškūs teigiami ir neigiami rezultatai, tačiau retais atvejais, remiantis gautų duomenų visuma, nebus galima padaryti konkrečios išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Net ir daug kartų pakartojus eksperimentą, rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs.

Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, gauti teigiami rezultatai, gauti atlikus tyrimą, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse.

Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pvz., sisteminio toksiškumo atveju).

3. ATASKAITA

TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Tiriamieji gyvūnai:

- panaudota rūšis ar kamienas,

- gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

- šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,

- kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio intervalas, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.

Tyrimo sąlygoS:

- teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,

- ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,

- pagrindinė priežastis, nulėmusios arti ribos esančio lygio pasirinkimą,

- tiriamosios medžiagos paruošimo apibūdinimas,

- tiriamosios medžiagos davimo apibūdinimas,

- priežastys, nulėmusios davimo būdo pasirinkimą,

- metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai buvo padaryta,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,

- duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,

- detalus veikimo tiriamąja medžiaga atlikimo ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,

- metodai toksiškumui įvertinti,

- metafazę sustabdančios medžiagos prigimtis, jos koncentracija bei veikimo ja trukmė,

- skaidrių paruošimo būdai,

- aberacijų įvertinimo kriterijai,

- ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyvūno bei išanalizuotos, skaičius,

- teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.

Rezultatai:

- toksiškumo požymiai,

- mitozinis indeksas,

- kiekvieno gyvūno ląstelėse esančių aberacijų tipas ir skaičius,

- absoliutus aberacijų vieno grupės gyvūnų ląstelėse skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,

- ląstelėse esančių aberacijų skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,

- ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie stebimi,

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,

- statistinės analizės, jei tokios buvo atliktos,

- vienu metu gauti neigiami kontroliniai duomenys,

- anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,

- vienu metu gauti teigiami kontroliniai duomenys.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. IŠNAŠOS

1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Aproach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275–306.

2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic AssayS: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, p. 157–165.

3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.

4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, p. 305–312.

5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, p. 313–319.

6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, p. 184–232

7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, p. 403–413.

8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, p. 1362–1364."

--------------------------------------------------

4C PRIEDAS

"B.12. MUTAGENIŠKUMAS - ŽINDUOLIŲ ERITROCITŲ MAŽŲJŲ BRANDUOLIŲ TYRIMAS IN VIVO

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 474, žinduolių eritrocitų mažųjų branduolių tyrimą (1997).

1.1. ĮVADAS

Žinduolių mažųjų branduolių tyrimas in vivo naudojamas, kad analizuojant gyvūnų, paprastai griaužikų, kaulų čiulpų eritrocitus bei periferinio kraujo ląsteles būtų galima nustatyti tiriamosios cheminės medžiagos pažeidimus, padarytus eritroblastų chromosomose arba mitoziniame aparate.

Mažųjų branduolių tyrimo tikslas - identifikuoti chemines medžiagas, kurios sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgyja pirminę struktūrą ("išnyksta").

Kai kaulų čiulpų eritroblastas vystydamasis metu virsta polichromatiniu eritrocitu, pagrindinis (didysis) branduolys yra suspaudžiamas ir bet kuris susiformavęs mažasis branduolys gali likti už citoplazmos, neturinčios branduolio, ribų. Šiose ląstelėse galima pamatyti mažuosius branduolius, nes ląstelė yra praradusi savo pagrindinį branduolį. Jei gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja chemine medžiaga, padaugėja polichromatinių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, tai šitai rodo,kad chromosomos buvo pažeistos.

Atliekant šį tyrimą paprastai naudojami griaužikų kaulų čiulpai, nes būtent šiame audinyje susiformuoja polichromatiniai eritrocitai. Periferinio kraujo polichromatinių (nesubrendusių, turinčių mažuosius branduolius) eritrocitų tyrimą galima atlikti su bet kuria rūšimi, kurios blužnis nesugebėjo pašalinti eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, arba kuri buvo pakankamai jautri nustatytiems agentams, sukeliantiems chromosomų aberacijas, atžvilgiu. Mažuosius branduolius galima atskirti, pagal daugelį kriterijų. Vienas jų yra kinetochorų arba centromerinės DNR, esančios arba nesančios mažuosiuse branduoliuse, nustatymas. Tyrimo, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga kelias ar daugiau savaičių, pagrindinis tikslas taipogi gali būti periferiniame kraujyje esančių subrendusių (normochromatinių) eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičiaus, palyginimas su subrendusių eritrocitų skaičiumi.

Šis žinduolių mažųjų branduolių tyrimas in vivo yra ypač svarbus, įvertinant mutagenų daromą žalą, pagal kurią galima spręsti apie metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų reparaciją in vivo nulemiančius veiksnius, nors jie gali skirtis pagal gyvūnų rūšį, audinį ir genetinį lygmenį. Tyrimas in vivo taip pat naudingas toliau tiriant mutageninius efektus, nustatytus in vitro.

Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga ar reaktyvus metabolitas neįsiskverbė į audinį, į kurį buvo nukreiptas, tai atliekant šį tyrimą, jis nebenaudojamas.

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS

Centromera (kinetochoras) : chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.

Mažieji branduoliai : branduoliai, kurie yra atskirti nuo didžiojo ląstelės branduolio, tačiau jie yra papildomi branduoliai, susidarantys tada, kai mitozės telofazės metu chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgauna pirminę struktūrą ("išnyksta").

Normochromatinis eritrocitas : subrendęs, neturintis ribosomų eritrocitas, kuris skiriasi nuo nesubrendusio polichromatinio eritrocito pagal taip, kaip dažais, ribosomų dažosi specifiškais dažais.

Polichromatinis eritrocitas : nesubrendęs, tarpinėje vystymosi stadijoje esantis eritrocitas, kuris vis dar tebeturi ribosomas ir gali būti atskirtas nuo subrendusio normochromatinio eritrocito pagal kaip ribosomų atžvilgiu dažosi specifiniais dažais.

1.3. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami tiriamąja medžiaga pasirinktu būdu. Jeigu naudojami kaulų čiulpai, tai,praėjus tam tikriems laiko tarpams po veikimo tiriamąja medžiaga, gyvūnai numarinami, iš jų išimami kaulų čiulpai, paruošiami ir nudažomi jų preparatai (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Kai naudojamas periferinis kraujas, tai po veikimo tiriamąja medžiaga praėjus atitinkamiems laiko tarpams, paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi (4, 8, 9, 10). Tiriant periferinį kraują, kaip galima mažiau laiko turi praeiti tarp paskutinio veikimo ir ląstelių surinkimo. Preparatai analizuojami, siekiant identifikuoti mažuosius branduolius.

1.4. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4.1. Preparatai

1.4.1.1. Gyvūno rūšies pasirinkimas

Kai naudojami kaulų čiulpai, rekomenduojama pasirinkti peles ar žiurkes, nors galima pasirinkti ir bet kokias kitas žinduolių rūšis. Kai naudojamas periferinis kraujas, rekomenduojama pasirinkti peles. Tačiau galima naudoti bet kokias kitas žinduolių rūšis, jeigu parodoma, kad tos rūšies žinduolio blužnis nesugeba pašalinti eritrocitus, turinčius mažuosius branduolius arba tos rūšies žinduolis pakankamai jautrus žinomiems agentams, struktūrines chromosomų aberacijas arba chromosomų skaičiaus viename chromosomų rinkinyje pakitimus. Rekomenduojama panaudoti įprastinius jaunų ir sveikų gyvūnų laboratorinius kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neperžengti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno vidutinio svorio.

1.4.1.2. Laikymo ir maitinimo sąlygos

Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50-60 %.

1.4.1.3. Gyvūnų paruošimas

Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus veikiami chemine medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai per 5 dienas.

1.4.1.4. Dozių paruošimas

Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.1. Tirpiklis/tirpinantysis įrengimas

Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą.

1.4.2.2. Kontroliniai mėginiai

Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti tarpusavyje sutampantys teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).

Teigiamuose mėginiuose in vivo sąlygomis turi susidaryti mažieji branduoliai, esant tokiam veikimui, kuris kaip tikimasi, užgoš pašalinį foną. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iš kart atskleistų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiamas kontrolinis mėginys būtų duodamas kitu būdu nei tiriamoji cheminė medžiaga ir mėginiai būtų tik vienąkart paimami. Be to, jei įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, priklausančių konkrečiai cheminių medžiagų klasei, panaudojimą. Žemiau pateikiami teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai:

Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

etil metansulfonatas | 62–50–0 | 200–536–7 |

N-etil-N- nitrošlapalas | 759–73–9 | 212–072–2 |

mitomicinas C | 50–07–7 | 200–008–6 |

ciklofosfamidas | 50–18–0 | 200–015–4 |

ciklofosfamido monohidratas | 6055–19–2 | |

trietilenmelaminas | 51–18–3 | 200–083–5 |

Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien tik tirpinamuoju įrenginiu arba kiti mėginiai paveikti tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės turi būti kiekvienąkart paimami, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, turinčių mažuosius branduolius, yra priimtini. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą tai pirmojo paėmimo laikas yra pats priimtiniausias. Be to reikia papildomai panaudoti tiriamąja medžiaga nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų bei išspausdintus duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokių žalingų ar mutageninių efektų.

Jei naudojamas periferinis kraujas, tai mėginys, naudojamas prieš veikimą tiriamąja medžiaga, gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė, tačiau tik trumpai trunkančių periferinio kraujo tyrimų metu (pavyzdžiui, 1-3 kartus veikiant tiriamąja medžiaga), kai gaunami duomenys atitinka pageidaujamą anksčiau naudotos kontrolės intervalą.

1.5. TYRIMO ATLIKIMO METODIKA

1.5.1. Gyvūnų skaičius ir lytis

Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti mažiausiai 5 vienos lyties gyvūnai. Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, panaudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį veikimo tiriamąja medžiaga būdą, duomenis, kurie rodo, toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis veikiamas, priklauso nuo lyties, kaip antai jautrumo kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms atveju, tai reikia ištirti atitinkamą gyvūnų rūšį.

1.5.2. Veikimo tvarkaraštis

Nerekomenduojama laikytis veikimo tiriamąja chemine medžiaga atlikimo standartinio tvarkaraščio (t. y. 1, 2 ar daugiau veikimų atliekami kas 24 valandos). Geriau naudoti mėginius, kurių dozės davimo trukmė yra prailginta iki tol, kol šio tyrimo metu buvo nustatytas teigiamas efektas arba atliekant neigiamą kontrolinį tyrimą tol, kol buvo nustatytas toksiškumas arba buvo panaudota ribota dozė buvo duodama iki mėginio paėmimo. Tiriamosios cheminės medžiagos gali būti duodamos ir esant išskaidytai jų doze, t. y. per 1 dieną atliekami 2 poveikiai tiriamąja medžiaga ir abi procedūras skiria ne ilgesnis kaip kelių valandų laikotarpis tam, kad būtų duotas didelis medžiagos tūris.

Tyrimas gali būti atliekamas 2 būdaiS:

a) gyvūnai vienąkart veikiami tiriamąja chemine medžiaga. Kaulų čiulpų mėginiai paimami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip praėjus 24 valandoms po veikimo tiriamąja medžiaga, bet ne vėliau kaip praėjus 48 valandoms po veikimo ir be to mėginiai paimami atitinkamu laiko momentu. Jeigu mėginiai imami anksčiau nei praėjus 24 valandoms po veikimo, tai turi būti nurodomos priežastys, paskatinusios imtis tokių veiksmų. Periferinio kraujo mėginiai imami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip praėjus 36 valandoms po veikimo, atitinkamais laiko, praėjusio nuo to, kai buvo paimtas pirmasis mėginys, intervalais, bet ne ilgesniu kaip 72 valandų laikotarpiu. Kai paėmus vieną mėginį, nustatomas teigiamas atsakas, tai papildomas mėginio paėmimas nėra būtinas;

b) jei per dieną atliekami du ir daugiau veikimų (pavyzdžiui, atliekami du ir daugiau veikimų kas 24 valandos), tai mėginiai paimami vienąkart, praėjus 18-24 valandoms po paskutinio kaulų čiulpų paveikimo tiriamąja medžiaga vienąkart, praėjus 36-48 valandoms po paskutinio periferinio kraujo ląstelių paveikimo tiriamąja medžiaga (12).

Mėginiai gali būti papildomai paimami ir kitu laiko metu, jeigu tai manoma esą svarbu.

1.5.3. Dozės dydis

Jeigu atliekamas tyrimas, siekiant surasti intervalą, nes nėra duomenų apie tai, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu5. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami 3 doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, tokie, kurie pasirodo, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna žemos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (nesubrendusių eritrocitų skaičius, lyginant su absoliučiu visų eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje, skaičiumi, sumažėja).

1.5.4. Ribų paieškos tyrimas

Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant 3 dozinius lygmenis. Atliekant ilgiau užtrunkančius tyrimus ir tiriamąja medžiaga veikiant iki 14 dienų, ribinė dozė turi siekti 2000 mg/kūno/kg, tuo atveju kai tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dienų - 1000 mg/kūno/kg. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.

1.5.5. Dozių davimas

Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.

1.5.6. Kaulų čiulpų/kraujo paruošimas

Kaulų čiulpų ląstelės paprastai gaunamos iš numarintų gyvūnų šlaunikaulių ir blauzdikaulių. Bendru atveju iš šlaunikaulių ir blauzdikaulių išskiriamos ląstelės ir, panaudojant gerai žinomus metodus, paruošiami jų preparatai, kurie po to nudažomi. Periferinis kraujas imamas iš uodeginės venos ar kito atitinkamo kraujo indo. Iš kraujo išskirtos ląstelės arba iškart dažomos supravitaliniais dažais8, 9, 10, arba paruošiami tepinėliai, kurie vėliau yra nudažomi. DNR atžvilgiu naudojami specifiniai dažai, tokie kaip akridino oranžinis14 arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y15, gali pašalinti kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda, naudojant DNR atžvilgiu nespecifinius dažus. Tačiau šis privalumas neatmeta galimybės naudoti ir įprastinius dažus (pavyzdžiui, Giemsa dažą). Galima naudoti ir papildomas sistemas, tokias kaip celiulioze užpildytas chromatografines kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti 16, kadangi buvo parodyta, kad naudojant šias sistemas, mažuosius branduolius galima tinkamai išskirti laboratorinėmis sąlygomis.

1.5.7. Analizė

Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis, suskaičiuojant mažiausiai 200 eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir 1000 eritrocitų, esančių periferiniame kraujyje17. Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, užkoduojamos nepriklausomai vienos nuo kitų. Tam, kad identifikuoti nesubrendusius, mažuosius branduolius turinčius eritrocitus, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Papildoma informacija gali būti gaunama, kai skaičiuojami subrendę eritrocitai, turintys mažuosius branduolius. Kai skaidrės analizuojamos, tai nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis turi būti ne mažesnis kaip 20 % kontrolinė vertės. Tuo atveju, kai gyvūnai buvo veikiami tiriamąja medžiaga mėnesį ir ilgiau, tai reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno tam, kad galima būtų identifikuoti ląsteles, turinčias mažuosius branduolius. Vietoj rankinio įvertinimo galima naudoti automatizuotas analizės sistemas (vaizdo analizės ir ląstelių suspensijos srauto tėkmės citometrinės analizės sistemas), jeigu jos atitinkamai yra patvirtintos ir pagrįstos.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi būti nustatytas kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų ir nesubrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičius bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis. Jeigu gyvūnai pastoviai veikiami tiriamąja medžiaga mėnesį ar ilgiau, tai turi būti pateikti duomenys apie subrendusius eritrocitus, jei tokie duomenys buvo renkami. Jeigu įmanoma, tai kiekvieno gyvūno atveju pateikiamas nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis bei eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičius, išreikštas procentais Jeigu nenustatoma jokių atsako skirtumų tarp atskirų lyčių, tai abiejų lyčių tyrimo duomenys sujungiami tam, kad būtų galima atlikti statistinę analizę.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterijų, tokiais kaip nuo dozės priklausomas ląstelių, turinčių mažuosius branduolius skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių, turinčių mažuosius branduolius ir priklausančių pavienės dozės grupei pagal vienkartinį mėginio paėmimo laiką, skaičiaus padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo metu gautus rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais 18, 19. Statistinis reikšmingumas turėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar atsakas teigiamas, ar ne. Abejotini rezultatai turėtų būti išaiškinti, toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimentines sąlygas.

Jei tiriant medžiagą gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardytų kriterijų, ši tiriamoji medžiaga laikoma nemutageniška.

Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus.

Tiriant mažuosius branduolius in vitro, gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia mažųjų branduolių, kuriuos sąlygoja tiriamosios rūšies gyvūnų eritroblastų chromosomų ar mitozinio aparato pažeidimai, pasireiškimą. Neigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga nesukelia mažųjų branduolių atsiradimo tiriamos rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritroblastuose.

Reikia aptarti tą galimybę, kai tiriamoji medžiaga arba jos metabolitai specifiniu būdu pasieks bendrąją cirkuliaciją ar tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).

3. ATASKAITA

TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Tiriamieji gyvūnai:

- panaudota rūšis ar kamienas,

- gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

- šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,

- kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.

Tyrimo sąlygoS:

- teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,

- ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, rezultatai,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi arti ribos esančio lygio pasirinkimą,

- duomenys apie tiriamosios medžiagos paruošimą,

- duomenys apie tiriamosios medžiagos davimą,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą,

- metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai buvo padaryta,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,

- duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,

- detalus veikimo tiriamąja medžiaga atlikimo ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,

- skaidrių paruošimo metodai,

- metodai toksiškumui įvertinti,

- nesubrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičiavimo kriterijai,

- iš vieno gyvūno išskirtų bei išanalizuotų ląstelių skaičius,

- teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.

Rezultatai:

- toksiškumo požymiai,

- nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis,

- kiekvieno gyvūno nesubrendusių, turinčių mažuosius branduolius, eritrocitų skaičius,

- kiekvienos grupės nesubrendusių, mažuosius branduolius turinčių eritrocitų skaičiaus vidurkis ir standartinis nukrypimas,

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,

- statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,

- vienu metu naudojamų neigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys,

- vienu metu naudojamų teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. IŠNAŠOS

1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187–190.

2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9–15.

3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, p. 61–118.

4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S.Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29–80.

5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating ErythrocyteS: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, p. 555–558.

6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, p. 103–112.

7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Apl. Toxicol. 14, p. 513–522.

8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, p. 245–249

(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, p. 83–98.

10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, p. 53–159.

11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, p. 293–304.

12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, p. 313–319.

13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, p. 313–319.

14) Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Aplication of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, p. 241–247.

15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, p. 269–275.

16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, p. 91–104.

17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, p. 97–99.

18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.

19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J.R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232."

--------------------------------------------------

4D PRIEDAS

"B13/14. MUTAGENIŠKUMAS - GRĮŽTAMŲJŲ MUTACIJŲ BAKTERIJOSE TYRIMAS

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 471, grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą (1997).

1.1. ĮVADAS

Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, naudojami aminorūgščių reikalaujantys Salmonella typhimurium ir Escherichia coli kamienai tam, kad būtų galima nustatyti taškines mutacijas, tokias kaip vienos ar kelių DNR bazių porų pakaitos, intarpai ar delecijos 1, 2, 3. Šio grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo principas yra tai, kad jo metu nustatomos mutacijos, kurios pakeičia tiriamuosiuose kamienuose esančias mutacijas taip, kad atstato bakterijų funkcinį sugebėjimą sintetinti pagrindinę amino rūgštį. Bakterijos-revertantai aptinkamos pagal savo sugebėjimą augti terpėje, kurioje nėra amino rūgšties, reikalingos jų tėviniam tiriamajam kamienui.

Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra taškinės mutacijos bei su jomis susiję įvykiai ir egzistuoja pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl taškinių mutacijų. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas yra nebrangus ir greitai bei pakankamai lengvai atliekamas. Dauguma tiriamųjų kamienų pasižymi keletu ypatybių, pagal kurias juos galima lengvai nustatyti, analizuojant mutacijas, DNR sekose, esančiose grįžtamųjų mutacijų vyksmo vietose bei sukuriančiose atsaką į signalą, padidintą ląstelių pralaidumą didelės molekulinės masės molekulėms ir DNR pažaidų atstatymo sistemų sunaikinimą arba pažaidoms atsparių DNR atstatymo procesų suintensyvėjimą. Tiriant kamienų specifiškumą, gaunama vertingos informacijos apie genotoksiškų agentų sukeltų mutacijų tipus. Tiriant chemines medžiagas,tarp jų ir lakius junginius, pasižyminčius skirtingomis fizikinėmis bei cheminėmis savybėmis, buvo sukaupta didelė duomenų apie įvairiausias struktūras bazė, kuri vartojama, vykdant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimus bei naudojantis visuotinai pripažintais metodais.

Taipogi žr. Bendrojo įvado B dalį

1.2. SĄVOKOS

Tiriant grįžtamąsias mutacijas arba Salmonella typhimurium arba Escherichia coli kamienuose, nustatoma kamieno, kuriam reikalinga aminorūgštis (atitinkamai histidinas ar triptofanas), mutacija, dėl kurios atsiranda kamienas, kuriam nereikalinga aminorūgštis, tiekiama egzogeniniu būdu.

Mutagenai, sukeliantys bazių porų pakaitas - agentai, sukeliantys DNR bazių porų pakaitas. Atliekant reversijos tyrimą, nustatoma, kad pakaita gali vykti pradinės mutacijos ar kitoje bakterijos genomo vietoje.

Mutagenai, sukeliantys skaitymo rėmelio pasislinkimą - agentai, sukeliantys vienos ar kelių DNR bazių porų intarpus ar delecijas, o dėl to pasislenka RNR molekulėje esantis skaitymo rėmelis.

1.3. PRADINIAI SVARSTYMAI

Atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą, naudojamos prokariotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduolių ląstelių pagal tokius faktorius, kaip medžiagų transportas į ląstelę, metabolizmas, chromosomų struktūra bei DNR pažaidų atstatymo procesai. Paprastai atliekant tyrimus in vitro, reikia naudoti metabolinės aktyvacijos egzogeninį šaltinį. Metabolinės aktyvacijos sistemos in vitro negali absoliučiai imituoti žinduolių metabolinės aktyvacijos sąlygų in vivo. Taigi atliekant tyrimą, negaunama tiesioginės informacijos apie žinduolių cheminių medžiagų mutageniškumą ir karcinogeniškumą.

Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas paprastai naudojamas pirmiausia atrankai pagal genotoksiškumą, o konkrečiai, pagal sugebėjimą sukelti taškines mutacijas. Gausi duomenų bazė parodė, kad daugelio cheminių medžiagų genotoksiškumas buvo nustatytas tiek grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo tiek ir kitų tyrimų metu. Tačiau šio tyrimo metu negalima nustatyti keleto mutagenų ir šito priežastis yra dėl grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo pagrindinio tikslo savitumo, metabolinės aktyvacijos skirtumų bei mutagenų paplitimo gamtoje skirtumų. Kita vertus, atsižvelgus į faktorius, padidinančius grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo jautrumą, galima pervertinti mutageninį medžiagų aktyvumą.

Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas netinka konkrečių cheminių medžiagų klasėms, pavyzdžiui junginiams, pasižymintiems pernelyg dideliu baktericidiniu aktyvumu (konkretūs antibiotikai) ir tiems junginiams, kurie, kaip manoma, blokuoja žinduolių ląstelių DNR replikacijos sistemą (keletas topoizomerazių inhibitorių ir nukleozidų analogų). Tokiais atvejais labiau tinka tirti žinduolių mutacijas.

Nors vykdant šį tyrimą nustatoma, kad daugelis junginių karcinogeniški žinduolių atveju, tačiau šio tarpusavio ryšio nereikia suabsoliutinti. Tai priklauso nuo cheminių medžiagų klasės ir atliekant šį tyrimą neįmanoma nustatyti tam tikrų karcinogenų, kadangi jų veikimo mechanizmas nesiremia genotoksiškumu arba jie veikia visai kitaip nei bakterinėse ląstelėse.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Bakterinės ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemos. Pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą šios suspensijos padengiamos agaru ir užliejamos ant minimalios terpės. Pagal išankstinės inkubacijos metodą suspensija iš pradžių inkubuojama su medžiaga, kuria bus veikiamos bakterinės ląstelės, o vėliau padengiama agaru ir po to užpilama ant minimalios terpės. Panaudojant abu metodus ir praėjus 2–3 inkubacijos dienoms, skaičiuojamos revertantų kolonijos ir lyginamos su spontaninių revertantų kolonijomis, auginamomis kontrolinėse lėkštelėse, tirpiklyje, skaičiumi.

Atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą, dažniausiai naudojama keletas procedūrų, tokių kaip inkorporacijos į lėkštelę 1, 2, 3, 4, išankstinės inkubacijos 2, 3, 5, 6, 7, 8, fliuktuacijos 9, 10 ir suspendavimo metodai. Taipogi buvo aprašytos dujinių ir lakiųjų medžiagų tyrimo modifikacijos 12.

Tyrimo metodo aprašyme pateiktos bandymo atlikimo metodikos pirmiausia siejasi su inkorporacijos į lėkštelę ir išankstinės inkubacijos metodais. Šios dvi bandymo atlikimo metodikos tinka, atliekant eksperimentus, kai naudojama arba nenaudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Kai kurios medžiagos priklauso tokioms cheminių medžiagų klasėms, kaip alifatiniai aminai, turintys trumpąją grandinę, dvivalenčiai metalai, turintys NO grupę, alkaloidai, turintys pirolizidiną, alilo grupę turintys junginiai bei azoto junginiai. Taipogi pripažįstama, kad naudojant tokias standartines tyrimo metodikas, kaip inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos metodus, ne visada galima nustatyti tam tikroms klasėms priklausančius mutagenus. Šie mutagenai yra laikomi "ypatingais atvejais" ir ypač rekomenduojama, kad jų nustatymui būtų panaudojamos ir kitos, alternatyvios bandymo atlikimo metodikos. Šiuos "ypatingus atvejus" galima identifikuoti, kartu pateikiant ir jų nustatymo metodikaS: azodažai, diazo grupę turintys junginiai 3, 5, 6, 13, dujos bei lakiosios medžiagos 12, 14, 15, 16 ir glikozidai 17, 18. Nukrypimas nuo standartinės bandymo atlikimo metodikos turi būti moksliškai pagrįstas.

1.5. TYRIMO METODO APRAŠYMAS

1.5.1. Preparatai

1.5.1.1. Bakterijos

Grynos bakterijų kultūros auginamos tol, kol pasiekia vėlyvąją eksponentinę ir ankstyvąją plato augimo fazę (apie 109 ląstelių/ml). Kultūros, pasiekusios vėlyvąją plato augimo fazę, neturi būti naudojamos. Svarbu yra tai, kad bakterijų kultūrose, kurios naudojamos eksperimentams, būtų didelis gyvų bakterijų ląstelių titras. Titras nustatomas arba pagal anksčiau gautas augimo kreives arba kiekvieno bandymo metu nustatant gyvų ląstelių skaičių pagal jų augimą lėkštelėje.

Rekomenduojama inkubacijos temperatūra yra 37 °C.

Turi būti naudojami mažiausiai 5 bakterijų kamienai. Jų tarpe turi būti 4 Salmonella typhimurium kamienai (TA 1535, TA 1537 arba TA 97a arba TA 97; TA 98 ir TA 100), kurie, kaip buvo įrodyta daugelyje laboratorijų yra patikimi ir atkuria atsaką. Šių 4 Salmonella typhimurium kamienų pirminės reversijos vietoje lokalizuota GC bazių pora ir yra žinoma, kad panaudojant šiuos kamienus, negalima identifikuoti kryžmiškai rišančių mutagenų ir hidrazinų. Šios medžiagos nustatomos, panaudojant Escherichia coli WP2 ir Salmonella typhimurium TA 102 kamienus 19, kurių pirminėje reversijos vietoje lokalizuota AT bazių pora. Taigi rekomenduojamas sekantis kamienų derinyS:

- S. typhimurium TA 1535, ir

- S. typhimurium TA 1537 arba TA 97 arba TA 97a ir

- S. typhimurium TA 98, ir

- S. typhimurium TA 100 ir

- E .coli WP 2 uvr A arba WP 2 uvr A (pkM 101) arba S. typhimurium TA 102.

Tam, kad kryžmiškai surišantys mutagenai būtų nustatyti, reikia papildomai panaudoti S. typhimurium TA 102 arba E.coli WP 2 ar WP 2 (pKM 101) kamienus, sugebančius taisyti DNR pažaidas.

Reikia naudoti gerai žinomas pagrindinės kultūros paruošimo, žymės patvirtinimo bei saugojimo metodikas. Reikia parodyti, kad aminorūgštis yra būtina kiekvieno preparato, paruošto iš užšaldytos pradinės kultūros, augimui (histidinas - S. typhimurium kamienams, o triptofanas - E. coli kamienams). Kitos fenotipinės charakteristikos, o būtent plazmidžių, turinčių R-faktorių, egzistavimas arba neegzistavimas, jei tai yra reikalinga (kamienų TA 98, TA 100 it TA 97a arba TA 97, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM 101) atsparumas ampicilinui bei kamieno TA 102 atsparumas ampicilinui ir tetraciklinui), būdingos mutacijos (S. typhimurium rfa mutacija, apsprendžianti jautrumą violetinei šviesai, E. coli uvr A mutacija arba S.typhimurium uvr B mutacija, nulemianti jautrumą ultravioletinei šviesai) 2, 3. Kamienai turi spontaniškai sukurti revertantų kolonijas, kurių skaičius turi atitikti dažnumo ribas, numatomas, remiantis anksčiau gautais laboratorijoje duomenimis ir pirmiausia turi atitikti literatūroje nurodytas ribas.

1.5.1.2 Terpė

Naudojamas atitinkamas minimalus agaras (pavyzdžiui, turintis minimalios Vogel-Bonner terpės E ir gliukozės) ir ant viršaus užliejamas agaras, turintis histidino ir biotino arba triptofano tam, kad vyktų keleto ląstelių dalijimasis 1, 2, 9.

1.5.1.3. Metabolinė aktyvacija

Bakterijos turi būti veikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant tiek ir nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Plačiausiai vartojama sistema yra iš griaužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 1, 2 ar fenobarbitono ir β-naftoflavono mišiniu 18, 20 21, post-mitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas S9 mišinyje siekia nuo 5 iki 30 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Tiriant azodažus ir diazo grupę turinčius junginius, labiau tikslinga naudoti redukcinę metabolinę aktyvacijos sistemą 6, 13.

1.5.1.4. Tiriamoji medžiaga/preparatas

Kietosios tiriamosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinančiuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, tai prieš paveikiant jomis bakterijas, jos praskiedžiamos. Skystosios tiriamosios medžiagos įnešamos tiesiogiai į tyrimo sistemas ir/ar praskiedžiamos prieš veikiant jomis bakterijas. Kiekvieno bandymo metu turi būti paruošiami švieži preparatai, nekreipiant dėmesio į stabilumo tyrimo duomenis, rodančius, kad tiriamosios medžiagos atitinka saugojimui keliamus reikalavimus.

Neturi kilti abejonių dėl to, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga ir be to tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys turi būti suderintas su bakterijų išgyvenimu bei S9 aktyvumu22. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturi būti vandens.

1.5.2. Tyrimo sąlygos

1.5.2.1. Tiriamieji kamienai (žr. 1.5.1.1.)

1.5.2.2. Veikimo koncentracija

Kriterijai, į kuriuos reikia atsižvelgti, nustatant didžiausią tiriamosios medžiagos koncentracija, yra medžiagos citotoksiškumas ir tirpumas galutiniame veikimo mišinyje.

Būtų naudinga nustatyti toksiškumą bei netirpumą preliminarinio eksperimento metu. Citotoksiškumas gali būti nustatomas pagal revertantų skaičiaus sumažėjimą, šalutinės terpės praskaidrėjimą ar sunykimą arba pagal kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, išgyvenimo laipsnį. Medžiagos citotoksiškumas gali kisti dėl metabolinės aktyvacijos sistemų egzistavimo. Netirpumas gali būti įvertinamas plika akimi stebint precipitato susidarymą galutiniame reakciniame mišinyje, esant šiuo metu atliekamo eksperimento sąlygoms.

Maksimali rekomenduojama tiriamų tirpių medžiagų, nepasižyminčių citotoksiškumu, koncentracija yra 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje. Jei medžiagos, nepasižyminčios citotoksiškumu, netirpsta, jų koncentracijoms esant 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, tai esant vienai ar daugiau tirtų koncentracijų, tos medžiagos visai netirpsta galutiniame reakciniame mišinyje, skirtame, paveikti bakterijas. Tiriamosios medžiagos, kurios yra citotoksiškos, kai jų koncentracijos yra mažesnės nei 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, turi būti tiriamos tol, kol nustatoma koncentracija, kuriai esant, medžiagos pasižymi citotoksiniu aktyvumu. Precipitato susidarymas neturi trukdyti įvertinti duomenis.

Reikia panaudoti mažiausiai 5 išanalizuojamas tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurių vertes pradinio eksperimento metu skirtų intervalai, lygūs pusei log (√10). Mažesni skiriamieji intervalai tinka tada, kai tiriama atsako priklausomybė nuo koncentracijos. Koncentracija, mažesnė už 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, pasirenkama tuo atveju, jei tiriamųjų medžiagų mutageniškumas yra gana neaiškus.

1.5.2.3. Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai

Atliekant kiekvieną eksperimentą, kartu su metaboline aktyvacija arba be jos būtina vienu metu naudoti neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius mėginius, specifiškus bakterijų kamienui.

Kai bandymų metu naudojama metabolinės aktyvacijos sistema, tai teigiama kontrolinė etaloninė medžiaga pasirenkama pagal naudojamą bakterinio kamieno tipą.

Žemiau pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, naudojamų, esant metabolinei aktyvacijai, pavyzdžiai:

Medžiaga | CAS Nr | Einecs Nr |

9,10-dimetilantracenas | 781–43–1 | 212–308–4 |

7,12-dimetilbenzaantracenas | 57–97–6 | 200–359–5 |

benzpirenas | 50–32–8 | 200–028–5 |

2-aminoantracenas | 613–13–8 | 210–330–9 |

ciklofosfamidas | 50–18–0 | 200–015–4 |

ciklofosfamido monohidratas | 6055–19–2 | |

Žemiau pateikiama tinkama teigiama kontrolinė medžiaga, kai naudojamas redukcinės metabolinės aktyvacijos metodaS:

Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

Kongo raudonasis | 573–58–0 | 209–358–4 |

2-aminoantracenas neturi būti naudojamas kaip vienintelis S9 mišinio veikimo efektyvumo indikatorius. Jei 2-aminoantracenas yra naudojamas, tai kiekviena S9 mišinio partija išanalizuojama, panaudojant mutageną, kuriam yra reikalinga metabolinė aktyvacija mikrosominių fermentų pagalba, pavyzdžiui, benzpireną ar dimetilbenzaantraceną.

Toliau pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, specifiškų bakterijų kamienui, naudojamų, nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos, pavyzdžiai:

Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. | Kamienas |

Natrio azidas | 26628–22–8 | 247–852–1 | TA 1535 ir TA 100 |

2-nitrofluorenas | 607–57–8 | 210–138–5 | TA 98 |

9-aminoakridinas | 90–45–9 | 201–995–6 | TA 1537, TA 97 ir TA 97a |

ICD 191 | 17070–45–0 | 241–129–4 | TA 1537, TA 97 ir TA 97a |

kumeno hidroksiperoksidas | 80–15–9 | 201–254–7 | TA 102 |

mitomicinas C | 50–07–7 | 200–008–6 | WP 2 uvrA ir TA 102 |

N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidinas | 70–25–7 | 200–730–1 | WP 2, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM101) |

4-nitrokvinolino-1-oksidas | 56–57–5 | 200–281--1 | WP 2, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM101) |

Furilfuramidas (AF2) | 3688–53–7 | | kamienai, turintys plazmides |

Kitas atitinkamas etalonines medžiagas irgi galima naudoti kaip teigiamus kontrolinius mėginius. Jei įmanoma, tai apsvarstomas konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimas.

Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius tiriamosios medžiagos bei veiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji mėginiai. Be to reikia naudoti ir tiriamąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.

1.5.3. Bandymo atlikimo metodika

Atliekant bandymą pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą 1, 2, 3, 4, 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml šviežiai išaugintos bakterijų kultūros (turinčios apie 108 gyvų ląstelių) ir 0,5 ml sterilaus buferio. Įprastiniu atveju atliekant bandymą, kai naudojama metabolinė aktyvacija, 0,5 ml metabolinės aktyvacijos mišinio, turinčio pakankamą post-mitochondrinės frakcijos kiekį (intervalo 5-30 % v/v ribose, metabolinės aktyvacijos mišinyje), sumaišoma su 2 ml padengiančiojo agaro, bakterijomis ir tiriamąja medžiaga/tiriamuoju tirpalu. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys suplakamas ir užpilamas ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Prieš inkubaciją padengiančiajam agarui leidžiama sukietėti.

Atliekant bandymą pagal išankstinės inkubacijos metodą 2, 3, 5, 6, tiriamoji medžiaga/tiriamasis tirpalas iš anksto inkubuojamas su tiriamuoju bakteriniu kamienu (turinčiu apie 108 gyvų ląstelių) ir steriliu buferiu arba metabolinės aktyvacijos sistema (0,5 ml) ir įprastiniu atveju inkubuojamas 20 ar daugiau minučių 30-37 °C temperatūroje prieš sumaišant su padengiančiuoju agaru ir užpilant ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Įprastiniu atveju 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml tiriamosios medžiagos/tiriamojo tirpalo, 0,1 ml bakterijų ir 0,5 ml S9 mišinio ar sterilaus buferio. Atliekant išankstinę inkubaciją, mėgintuvėliai purtomi ant kratytuvo, kad jų turinys prisisotintų oro.

Tam, kad tiriant kiekvieną dozę, būtų gaunamas patenkinamas variacijos koeficientas, atliekamas bakterijų išsėjimas į 3 lėkšteles. Jeigu atliekamas išsėjimas tik į 2 lėkšteles, tai jis moksliškai pagrindžiamas. Atsitiktinis lėkštelės praradimas nereiškia, kad bandymas nepavyko.

Dujinės bei lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, jas laikant užsandarintuose induose 12, 14, 15, 16.

1.5.4. Inkubacija

Atliekant konkretų bandymą, visos lėkštelės turi būti inkubuojamos 48-72 valandas 37 °C temperatūroje. Po inkubacijos nustatomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje skaičius.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Pateikiant rezultatus, nurodomas revertantų kolonijų, esančių 1 lėkštelėje, skaičius. Taipogi reikia nurodyti revertantų kolonijų, esančių tiek teigiamose, tiek ir neigiamose (tirpiklio kontrolinis mėginys ir tiriamąja medžiaga neveiktas kontrolinis mėginys) kontrolinėse lėkštelėse, skaičių. Pateikiant duomenis apie tiriamąją medžiagą ir teigiamuss bei neigiamus (tirpiklio kontrolinis mėginys ir (ar) tiriamąja medžiaga neveiktas kontrolinis mėginys) kontrolinius mėginius, nurodomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje, skaičius, jo vidurkis bei standartinis nukrypimas.

Nėra reikalaujama, kad būtų patvirtinta, jog buvo gautas aiškus teigiamas rezultatas. Abejotini rezultatai išaiškinami, tęsiant tyrimus, modifikuojant eksperimento sąlygas. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atskiru atveju. Tais atvejais, kai manoma, jog nebūtina patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, šitai turi būti pagrįsta. Tęsiant eksperimentus apsvarstoma, ar reikia modifikuoti tiriamus parametrus tam, kad būtų išplėstas įvertinamų sąlygų intervalas. Tiriamieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti, yra ribos, skiriančios koncentracijas, bandymo atlikimo metodai (inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos) bei metabolinės aktyvacijos sąlygos.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Egzistuoja keletas teigiamo rezultato įvertinimo kriterijų, tokių kaip su koncentracija susijęs mažiausiai vieno kamieno revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje,skaičiaus padidėjimas virš tiriamos ribos, kai naudojama arba nenaudojama metabolinės aktyvacijos sistema ir/ar jį atkartojant, kai naudojama viena ar daugiau koncentracijų 23. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais 24. Tačiau statistikos svarba neturėtų tapti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu teigiamą atsaką.

Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška.

Nors daugumos eksperimentų metu gaunami aiškiai teigiami arba neigiami rezultatai, tačiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie tiriamos medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs, nepriklausomai nuo to, kiek kartų eksperimentas buvo pakartotas.

Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, gauti rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia taškines mutacijas (bazių pakaitas arba skaitymo rėmelio pasislinkimą) arba Salmonella typhimurium ir (arba) Escherichia coli genome. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia mutacijų tiriamose bakterijų rūšyse.

3. ATASKAITA

ATASKAITA APIE TYRIMĄ

Ataskaitoje apie tyrimą turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Kamienai:

- panaudoti kamienai,

- ląstelių, esančių vienoje kultūroje, skaičius,

- kamieno charakteristikos.

Tyrimo sąlygoS:

- tiriamosios medžiagos kiekis vienoje lėkštelėje (mg/lėkštelė arba μl/lėkštelė), nurodant pagrindinę priežastį dėl kurios tiriant vieną koncentraciją, buvo pasirinkta konkreti dozė bei lėkštelių skaičius,

- panaudota terpė,

- metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant ir sistemos tinkamumo kriterijus,

- poveikio tiriamąja medžiaga atlikimo metodiką.

Rezultatai:

- toksiškumo požymiai,

- precipitacijos požymiai,

- kolonijų vienoje lėkštelėje skaičius

- revertantų kolonijų vienoje lėkštelėje skaičiaus vidurkis bei standartinis nukrypimas,

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei jį įmanoma nurodyti,

- bet kokios statistinės analizės,

- vienu metu naudojamų neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus,

- anksčiau gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. IŠNAŠOS

1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, p. 347–364.

2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, p. 173–215.

3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, p. 217–233.

4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, p. 69–240.

5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, p. 91–96.

6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, p. 273–285.

7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity TestS: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, p. 13–61.

8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, p. 167–177.

9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, p. 33–42.

10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141–161.

11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, p. 453–465.

12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, p. 335–344.

13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, p. 33–47.

14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2–141.

15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249–258.

16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, p. 421–441.

17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, p. 3780–3782.

18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961–4965.

19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, p. 285–291.

20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85–88.

21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, p. 175–177.

22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, p. 343–350.

23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, p. 83–91.

24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, p. 28–65."

--------------------------------------------------

4E PRIEDAS

"B.17. MUTAGENIŠKUMAS - ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ GENŲ MUTACIJŲ TYRIMAS IN VITRO

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 476, žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimą in vitro (1997).

1.1. ĮVADAS

Žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimas in vitro gali būti naudojamas siekiant aptikti cheminių medžiagų sukeltas mutacijas. Tinkamoms ląstelių linijoms priklauso pelių limfomos ląstelių linija L5178Y, kiniškojo žiurkėno ląstelių linijos CHO, CHO-ASS2 bei V79 ir žmogaus limfoblastų linija TK 1. Naudojant šias linijas, dažniausiai įvertinamos timidinkinazę (TK) bei hipoksantinguaninfosforiboziltransferazę (HFRT) koduojančių genų bei ksantinguaninfosforiboziltransferazę (KFRT) koduojančio transgeno mutacijos. Atliekant TK, KFRT bei HFRT koduojančių genų mutacijų tyrimus, nustatomi ir skirtingi genetinių įvykių spektrai. Dėl to, kad TK ir KFRT koduojantys genai yra lokalizuoti autosominėse chromosomose, galima nustatyti genetinius įvykius (pavyzdžiui, didelių genų segmentų delecijas), kurie nėra nustatomi HFRT koduojančio geno, esančio X chromosomose, lokuse 2, 3, 4, 5, 6.

Atliekant žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimą in vitro, galima naudoti gerai žinomas ląstelių linijas ar kamienus. Tyrimo metu naudojamos ląstelės atrenkamos pagal sugebėjimą augti kultūroje bei stabilumą spontaniškai vykstančių mutacijų atžvilgiu.

Bendru atveju, kai tyrimai atliekami in vitro, reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinė aktyvacijos sistema negali absoliučiai atitikti žinduolių sąlygų in vivo. Reikia stengtis vengti tokių sąlygų, kurioms esant bus gaunami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo. Teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo, gali būti gaunami dėl pH ir osmosinio slėgio pokyčių bei didelio citotoksiškumo laipsnio 7.

Šis tyrimas naudojamas atrinkti galimus žinduolių mutagenus bei karcinogenus. Daugelis junginių, kurie šio tyrimo metu pasirodo esą teigiami, yra žinduolių karcinogenai, tačiau nėra aiškaus tarpusavio ryšio tarp šio tyrimo ir karcinogeniškumo. Tarpusavio ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės ir vis daugėja įrodymų, kad šio tyrimo metu negalima nustatyti kai kurių karcinogenų, galbūt dėl to, kad jie nepasižymi genotoksiškumu arba bakterinėse ląstelėse veikia visiškai kitaip 6.

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. APIBRĖŽIMAI

Tiesioginės mutacijoS : geno tėvinio tipo mutantinės formos mutacija, dėl kurios šio geno koduojamas baltymas praranda fermentinį aktyvumą arba šis pakinta.

Bazių porų pakaitas sukeliantys mutagenai : medžiagos, sukeliančios vienos ar kelių bazių porų, esančių DNR molekulėje, pakaitas.

Skaitymo rėmelio pasislinkimą sukeliantys mutagenai : medžiagos, sukeliančios vienos ar daugelio bazių porų intarpus ar iškritas.

Fenotipinės ekspresijos laikaS : laiko periodas, per kurį nepakitusio geno produktai pašalinami iš naujai mutavusių ląstelių.

Mutavimo dažniS : mutantinių ir gyvų ląstelių skaičiaus santykis.

Absoliutus santykinis augimaS : per konkretų laiko tarpą ląstelių, lyginant su kontroline populiacija, padidėjęs skaičius, įvertinamas kaip suspensijos augimas, lyginant su neigiamos kontrolinės ląstelių grupės kloninio augimo efektyvumu, o pastarasis lyginamas su neigiamu kontroliniu mėginiu.

Santykinis suspensijos augimaS : fenotipinės ekspresijos periodu padidėjęs ląstelių, lyginant su neigiamu kontroliniu mėginiu, skaičius.

GyvybingumaS : ląstelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai, pasibaigus ekspresijai, jos pasėjamos į terpę, esant sąlygoms, naudojamoms atrankai.

IšgyvenimaS : ląstelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, jos pasėjamos į terpę; bendru atveju išgyvenimas lyginamas su kontrolinės ląstelių populiacijos išgyvenimu.

1.3. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Ląstelės, nesugebančios sintetinti timidinkinazės (TK) dėl mutacijos TK+/-/TK-/-, yra atsparios pirimidino analogo - trifluortimidino (TFT) - sukeliamiems citotoksiniams efektams. Ląstelės, sugebančios sintetinti TK, yra jautrios TFT, kuris blokuoja ląstelės metabolizmą bei sustabdo tolimesnį jos dalijimąsi. Taigi mutantinės ląstelės sugeba proliferuoti, esant terpėje TFT, kai tuo tarpu normalios ląstelės, sintetinančios TK, šito padaryti negali. Ląstelės nesugebančios sintetinti HFRT ir KFRT yra panašiai atrenkamos pagal atsparumą 6-tioguaninui (TG) arba 8-azaguaninui (AG). Jeigu žinduolių genų mutacijos yra tiriamos, panaudojant agentą, kuris yra naudojamas ląstelių atrankai ir yra bazių analogas arba cheminis junginys, tai reikia ypač atkreipti dėmesį į tiriamosios cheminės medžiagos savybes. Pavyzdžiui, reikia tirti bet kokį įtarimą keliantį tiriamosios medžiagos toksiškumą mutantinių ir normalių ląstelių atžvilgiu. Taigi atrankos sistemos arba atrankos agento parinkimas turi būti patvirtinamas tada, kai tiriamos cheminės medžiagos, savo struktūra panašios į agentą8.

Ląstelės, esančios suspensijoje arba vienasluoksnėje kultūroje, veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos ir prieš pradedant tyrimą šiek tiek pakultivuojamos tam, kad būtų nustatytas citotoksiškumas bei vyktų fenotipo ekspresija 9, 10, 11, 12, 13. Įprastiniu atveju citotoksiškumas nustatomas pagal santykinį kloninio augimo efektyvumą ar absoliutų santykinį kultūros augimą, matuojamą tada, kai baigiasi ląstelių veikimas tiriamąja medžiaga. Kultūros, paveiktos tiriamąja medžiaga, palaikomos terpėje tam tikrą laiką, būdingą kiekvienam lokusui bei ląstelių tipui tam, kad vyktų beveik optimali atsiradusių mutacijų fenotipo ekspresija. Mutavimo dažnis nustatomas, pasėjant žinomą ląstelių skaičių į terpę, turinčią atrankai naudojamo agento tam, kad, siekiant įvertinti kloninio augimo efektyvumą, būtų identifikuotos mutantinės ląstelės, esančios terpėje, neturinčioje atrankai naudojamo agento. Pasibaigus inkubacijai, suskaičiuojamos kolonijos. Mutavimo dažnis nustatomas, suskaičiavus kolonijas, kuriose įvyko mutacijos ir kurios buvo auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje atrankai naudojamo agento.

1.4. TYRIMO METODO APRAŠYMAS

1.4.1. Preparatai

1.4.1.1. Ląstelės

Šio tyrimo metu galima naudoti įvairius ląstelių tipus, įskaitant L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 klonus arba TK6 ląsteles. Tyrimo metu naudojami ląstelių tipai turi būti jautrūs cheminiams mutagenams, jų kloninio augimo efektyvumas turi būti pakankamai didelis bei jose vykstančių spontaninių mutacijų dažnis turi būti pakankamai stabilus. Ląstelės turi būti patikrintos, ar neužkrėstos mikoplazmomis, nes priešingu atveju, atliekant šį tyrimą, jos nėra naudojamos.

Tyrimas parengiamas taip, kad jis būtų atliekamas, esant kuo didesniam nustatymo jautrumui bei visapusiškumui. Naudojamų ląstelių bei jų kultūrų skaičius ir tiriamosios medžiagos koncentracijos turi atspindėti šiuos apibrėžtus parametrus 14. Minimalus, gyvų ląstelių, išlikusių po veikimo tiriamąja medžiaga bei naudojamų kiekviename tyrimo etape, skaičius turi būti pagrįstas spontaninių mutacijų dažniu. Rekomenduojama panaudoti mažiausiai 10 6 ląstelių. Turi būti sudaryta galimybė susipažinti su anksčiau gautais duomenimis apie ląstelinę sistemą, rodančiais, kad tyrimas atliekamas nuosekliai.

1.4.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygos

Reikia naudoti atitinkamą terpę, skirtą kultivavimui bei laikytis atitinkamų inkubavimo sąlygų (kultivavimo indai, temperatūra, CO2 koncentracija ir drėgmė). Terpė turi būti parinkta atsižvelgiant į šio tyrimo metu naudojamas atrankos sistemas bei ląstelių tipą. Ypač svarbu tai, kad pasirinktos kultivavimo sąlygos užtikrintų optimalų ląstelių augimą ekspresijos metu bei normalių ir mutantinių ląstelių sugebėjimą suformuoti kolonijas.

1.4.1.3. Kultūrų paruošimas

Ląstelės padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos į terpę, skirtą kultivavimui ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje. Prieš pradedant šį tyrimą, kultūros turi būti išgryninamos, kad būtų atsikratyta jau anksčiau esančių mutantinių ląstelių.

1.4.1.4. Metabolinė aktyvacija

Ląstelės inkubuojamos su tiriamąja chemine medžiaga, tiek esant, tiek ir nesant atitinkamos metabolinės aktyvacijos sistemos. Plačiausiai vartojama sistema yra post-mitochondrinė frakcija, išskirta iš griaužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 15, 16, 17, 18 ar fenobarbitono ir β-naftoflavono mišiniu 19, 20 bei praturtinta kofaktoriumi.

Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia nuo 1-10 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją.

Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti tuo tikslu padaryta daug pasiekimų, įskaitant ir genetinės inžinerijos pagalba gautos ląstelių linijas, kurios gamina specifinius fermentus, dalyvaujančius aktyvacijoje. Tyrime naudojamos ląstelių linijos pasirenkamos moksliškai pagrįstai (pavyzdžiui pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).

1.4.1.5. Tiriama cheminė medžiaga/preparatas

Kietosios tiriamosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jeigu reikia, tai prieš tai, kai šia medžiaga bus paveiktos ląstelės, jos yra praskiedžiamos. Prieš paveikiant ląsteles skystosiomis tiriamosiomis medžiagomis arba po veikimo, šios medžiagos gali būti tiesiogiai įnešamos į tiriamąsias sistemas ir praskiedžiamos. Tiriamosios medžiagos preparatai gaminami prieš kiekvieną tyrimą, neatsižvelgiant į tai, kad šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys tenkina saugojimo sąlygas.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.1. Tirpiklis/tirpinantysis įrengimas

Nesitikima, kad tirpiklis/tirpinantysis įrengimas chemiškai nereaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir atitiks ląstelių išgyvenimą bei S9 aktyvumą. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturi būti vandens. Vandenį galima pašalinti, papildomai naudojant molekulinį filtrą.

1.4.2.2. Veikimo koncentracijos

Kai parenkama pati didžiausia koncentracija, tai vadovaujamasi tokiais kriterijais kaip citotoksiškumas, tirpumas tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiai.

Citotoksiškumas turi būti nustatomas pagrindinio eksperimento, naudojant arba nenaudojant metabolinės aktyvacijos sistemos, metu, remiantis atitinkamais rodikliais, rodančiais, kad ląstelės yra vientisos ir kad jos auga - santykiniu kloninio augimo efektyvumu arba absoliučiu santykiniu augimu. Būtų naudinga citotoksiškumą bei tirpumą nustatyti išankstinio eksperimento metu.

Turi būti naudojamos bent 4 ištiriamos koncentracijos. Jei citotoksiškumas pasireiškia, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; šitai paprastai reikš, kad koncentracijos turės būti atskirtos tiktai faktoriumi, esančiu tarp 2 ir √10. Jei didžiausia koncentracija yra pagrįsta citotoksiškumu, tai esant jai, santykinis išgyvenimas arba santykinis absoliutus augimas turi sudaryti apie 10-20 % (bet ne mažiau kaip 10 %). Santykinai necitotoksiškų medžiagų atveju maksimali tiriamoji koncentracija turi būti 5 mg/ml, 5 μl/ml arba 1,01 M, bet kuriai esant mažiausiai.

Santykinai netirpios medžiagos turi būti tiriamos kultivavimo sąlygomis, jų tirpumui siekiant ribą arba esant už jos. Netirpumas turi būti nustatomas galutinėje terpėje, kuria paveikiamos ląstelės. Prieš pradedant ir baigiant veikimą tiriamąja medžiaga, būtų naudinga nustatyti tirpumą, kadangi veikimo metu tirpumas gali pakisti dėl tiriamojoje sistemoje esančių ląstelių, S9 mišinio, serumo ir pan. Netirpumą galima įvertinti plika akimi. Precipitatas neturi trukdytu rezultatų vertinimui.

1.4.2.3. Kontroliniai mėginiai

Atliekant kiekvieną eksperimentą, vienu metu reikia naudoti teigiamus ir neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontrolinius mėginius, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos. Kai naudojama metabolinė aktyvacija, tai teigiamas kontrolinis mėginys turi būti cheminė medžiaga, kuria reikia aktyvuoti tam, kad ši sukeltų mutageninį atsaką.

Teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai:

Metabolinės aktyvacijos sąlygos | Lokusas | Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

Egzogeninės metabolinės aktyvacijos nėra | HFRT | Etilmetansulfonatas | 62–50–0 | 200–536–7 |

Etilnitrozošlapalas | 759–73–9 | 212–072–2 |

TK (mažos ir didelės kolonijos) | Metilmetansulfonatas | 66–27–3 | 200–625–0 |

KFRT | Etilmetansulfonatas | 62–50–0 | 200–536–7 |

Etilnitrozošlapalas | 759–73–9 | 212–072–2 |

Egzogeninė metabolinė aktyvacijos sistema yra | HFRT | 3-Metilcholantrenas | 56–49–5 | 200–276–4 |

N-nitrozodietilaminas | 62–75–9 | 200–549–8 |

7,12- Dimetilbenzantracenas | 57–97–6 | 200–359–5 |

TK (mažos ir didelės kolonijos) | Ciklofosfamidas | 50–18–0 | 200–015–4 |

Ciklofosfamidmonohidratas | 6055–19–2 | |

Benzpirenas | 50–32–8 | 200–028–5 |

3-Metilcholantrenas | 56–49–5 | 200–276–5 |

KFRT | N-nitrozodimetilaminas (esant dideliems S9 mišinio kiekiams) | 62–75–9 | 200–549–8 |

Benzpirenas | 50–32–8 | 200–028–5 |

Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines etalonines medžiagas, pavyzdžiui, jei laboratorijoje buvo anksčiau gauti duomenys apie 5-bromo-2'-dezoksiuridiną (CAS Nr. 59–14–3; Einecs Nr. 200–415–9), tai galima naudoti šią etaloninę medžiagą. Kai yra įmanoma, tai reikia apsvarstyti konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimą.

Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius tiriamosios medžiagos bei paveiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji mėginiai. Be to reikia naudoti ir tiriamąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.

1.4.3. Bandymo atlikimo metodika

1.4.3.1. Veikimas tiriamąja medžiaga

Proliferuojančios ląstelės paveikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant tiek ir nesant metabolinės aktyvacijos. Poveikis turi trukti atitinkamą laiką (efektyvus poveikis paprastai užtrunka 3-6 valandas). Poveikio trukmė gali būti prailginama vienu ar keliais ląstelės ciklais.

Tiriant kiekvieną koncentraciją, gali būti atliekami kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, 1 ar 2 pakartojimai. Kai atliekamas kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, vienetinis pakartojimas, tai koncentracijų skaičius padidinamas, kad užtikrinti, jog susidarys pakankamas analizuojamų kultūrų skaičius (turi būti naudojamos mažiausiai 8 tiriamosios koncentracijos). Reikia mažiausiai dukart panaudoti neigiamas (tirpikliu paveiktas) kontrolines kultūras.

Dujinės ir lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, panaudojant užsandarintus indus 21, 22.

1.4.3.2. Išgyvenimo, gyvybingumo bei mutavimo dažnio nustatymas

Baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, ląstelės perplaunamos ir pakultivuojamos, siekiant nustatyti jų išgyvenimą bei užtikrinti mutantinio fenotipo ekspresiją. Pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, iškart nustatomas citotoksiškumas, įvertinant santykinį kloninio augimo efektyvumą (išgyvenimą) arba absoliutų santykinį augimą.

Kiekvienas lokusas turi apibrėžtą mažiausią laiko tarpą, per kurį turi įvykti beveik optimali naujai atsiradusio mutantinio fenotipų ekspresija (HFRT ir KFRT fenotipas turi mažiausiai ekspresuotis 6-8 dienas, o TK fenotipas - mažiausiai 2 dienas). Ląstelės auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje agento, kurio pagalba mutantai atrenkami pagal kloninio augimo efektyvumą bei nustatomas jų skaičius. Gyvybingumas pradedamas nustatinėti (tam, kad būtų galima apskaičiuoti mutavimo dažnį) baigiantis ekspresijai, kai kamienai pasėjami į lėkštelę su terpe, kuri nėra skirta atrankai (nes neturi atrankai naudojamo agento).

Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga yra teigiama, tai mažiausiai vienąkart nustatomas tiriamųjų kultūrų (esant pačiai didžiausiai teigiamai koncentracijai) bei teigiamų ir neigiamų kontrolinių kultūrų dydis. Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad tiriamoji yra neigiama, tai nustatomas teigiamų bei neigiamų kontrolinių kolonijų skaičius. Atliekant TK6TK+/- tyrimą, taipogi galima įvertinti kolonijų dydį.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Pateikiant duomenis, turi būti nurodytas kontrolinių bei paveiktų tiriamąja medžiaga kultūrų nustatytas citotoksiškumas, gyvybingumas, kolonijų skaičius bei mutavimo dažnis. Jei atliekant L5178Y TK+/- tyrimą buvo gautas teigiamas atsakas, tai kolonijos vertinamos, panaudojant kriterijus, skirtus mažiausiai 1 tiriamosios medžiagos koncentracijai, kuria buvo veikiamos mažos ir didelės kolonijos bei teigiamos ir neigiamos kontrolinės kolonijos. Didelėse bei mažose kolonijose esančių mutantų molekulinė ir citogenetinė prigimtis buvo detaliai ištirta 23, 24. Atliekant TK+/- tyrimą, kolonijos buvo vertinamos, panaudojant normalaus augimo (didelės kolonijos) ir sulėtinto augimo (mažos kolonijos) kriterijus 25. Mutantinės ląstelės, kuriose įvyko dideli genetiniai pažeidimai, pasižymi ilgesniu nei paprastai dalijimosi periodu ir todėl jos suformuoja mažas kolonijas. Šis sutrikimas įprastiniu atveju gali pasireikšti arba kaip atskiro geno praradimas arba kariotipiškai įvertinamomis chromosomų aberacijomis. Cheminės medžiagos, sukeliančios gigantinių chromosomų aberacijas, skatina mažas kolonijas sudarančių mutantų susiformavimą 26. Mažiau pažeistos mutantinės ląstelės auga panašiai kaip ir tėvinės ląstelės bei sudaro dideles kolonijas.

Reikia pateikti išgyvenimo (santykinio kloninio augimo efektyvumo) ar absoliutaus santykinio augimo duomenis. Mutavimo dažnis turi būti išreiškiamas kaip mutantinių ir išgyvenusių ląstelių skaičiaus santykis.

Kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai. Be to visi duomenys turi būti pateikiami apibendrintai, lentelių forma.

Nėra būtina patvirtinti, kad buvo gautas teigiamas atsakas. Abejotini rezultatai išaiškinami tęsiant tyrimus, kurių metu pirmiausia pakeičiamos eksperimentinės sąlygos. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, jog nėra reikalo patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, tai reikia pateikti pateisinančias aplinkybes. Vėliau atliekant eksperimentus, reikia apsvarstyti tiriamų parametrų pakeitimus tam, kad, analizuojant abejotinus bei neigiamus rezultatus, būtų išplėstas įvertinamų sąlygų spektras. Koncentracijas skiriančiosios ribos bei metabolinės aktyvacijos sąlygos yra tiriamieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Egzistuoja keli teigiamo rezultato įvertinimo kriterijai, tokie kaip nuo koncentracijos priklausantis arba atkartojamas mutavimo dažnio padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais. Tačiau statistikos svarba neturėtų tapti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu teigiamą atsaką.

Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška.

Nors daugumos eksperimentų metu gaunami aiškiai teigiami arba neigiami rezultatai, tačiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie tiriamos medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs, nepriklausomai nuo to, kiek kartų eksperimentas buvo pakartotas.

Teigiami rezultatai, gauti, tiriant žinduolių ląstelių genų mutacijas, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia genų mutacijas panaudotose žinduolių ląstelėse. Nuo koncentracijos priklausantis teigiamas atsakas yra svarbiausias. Neigiami rezultatai rodo, kad, esant tyrimo sąlygoms tiriamoji medžiaga nesukelia genų mutacijų panaudotose žinduolių ląstelėse.

3. ATASKAITA

ATASKAITA APIE TYRIMĄ

Ataskaitoje apie tyrimą turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

LąstelėS:

- ląstelių tipas ir šaltinis,

- ląstelių kultūrų skaičius,

- ląstelių persėjimų skaičius (jei jį galima nurodyti),

- ląstelių kultūros palaikymo metodai (jei juos galima nurodyti),

- ar neužsikrėtusios mikoplazmomis.

Tyrimo sąlygoS:

- pagrindinė priežastis, nulėmusi koncentracijų bei kultūrų skaičiaus pasirinkimą, įskaitant citotoksiškumo nustatymo duomenis bei tirpumo apribojimus (jei juos įmanoma nurodyti),

- terpės sudėtis ir CO2 koncentracija,

- tiriamosios medžiagos sudėtis,

- tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įdėtos medžiagos tūris,

- inkubacijos temperatūra,

- inkubacijos trukmė,

- veikimo tiriamąja medžiaga trukmė,

- ląstelių tankis veikimo metu,

- metabolinės aktyvacijos sistemos tipas bei sudėtis,

- teigiami bei neigiami kontroliniai mėginiai, įskaitant jų tinkamumo kriterijus,

- ekspresijos trukmė (įskaitant pasėtų ląstelių skaičių, subkultivavimo bei mitybai skirtų medžiagų įnešimo tvarkaraščiai, jei juos įmanoma pateikti),

- atrankos agentai,

- kriterijai, kuriais vadovaujamasi, sprendžiant, ar tyrimų metu gauti rezultatai yra teigiami,neigiami ar abejotini,

- gyvų bei mutantinių ląstelių skaičiaus nustatymo metodai,

- kolonijų dydis ir tipas (įskaitant "mažų" bei "didelių" kolonijų vertinimo kriterijus, kaip yra numatyta).

Rezultatai:

- toksiškumo požymiai,

- precipitacijos požymiai,

- duomenys apie pH bei osmosinį slėgį, veikiant tiriamąja medžiaga (jei tai buvo tiriama),

- kolonijų dydis, jei buvo vertinamos bent neigiamos arba teigiamos kontrolės,

- laboratorijos kompetentingumas L5178Y TK+/- sistemos pagalba nustatyti mutantus, sudarančius mažas kolonijas (jei tai būtina nurodyti),

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys (jei įmanoma nurodyti),

- statistinės analizės (jei bet kokios buvo atliktos),

- duomenys apie vienu metu naudojamus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius mėginius,

- anksčiau gauti duomenys apie neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius mėginius, kartu nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,

- mutavimo dažnis.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. IŠNAŠOS

1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindal, K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

2) Chu, E.H.Y. and Malling H.V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, p. 1306–1312.

3) Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, p. 467–485.

4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, p. 394–403.

5) Aaron, C.S., and Stankowski, Jr. L.F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT AssayS: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, p. 121–128.

6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), MammalianCell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, p. 235–239.

7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, p. 147–204.

8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, p. 225–251.

9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical AgentS: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, p. 17–36.

10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, p. 135–141

11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid CellS: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, p. 9–17.

12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate - and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate - and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, p. 133–147.

13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, p. 239–268.

14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, p. 66–101.

15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, p. 365–373.

16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, p. 347–364.

17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- - Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, p. 61–108.

18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, p. 173–215.

19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, p. 175–177.

20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85–88.

21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, p. 91–103.

22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801.

23) Aplegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51–55.

24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- - Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, p. 161–174.

25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, p. 89–102.

26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, p. 609–614."

--------------------------------------------------

4F PRIEDAS

"B.23. ŽINDUOLIŲ SPERMATOGONIJŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 483 Žinduolių spermatogonijų chromosomų aberacijos tyrimą (1997).

1.1. ĮVADAS

Žinduolių spermatogonijų chromosomų aberacijos tyrimo in vivo tikslas - identifikuoti medžiagas, sukeliančias žinduolių spermatogonijų chromosomų struktūrines aberacijas 1, 2, 3, 4, 5. Struktūrinės aberacijos gali būti 2 tipų: chromosominės ir chromatidinės. Dauguma mutagenų sukelia chromosomines mutacijas, tačiau pasitaiko ir chromatidinių aberacijų. Šis metodas nėra skirtas chromosomų skaičiaus rinkinyje pokyčiams įvertinti ir šiam tikslui minėtasis metodas paprastai nėra naudojamas. Chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai sukelia daug genetinių ligų žmonių tarpe.

Šio tyrimo metu nustatomi spermatogeninių gemalinių ląstelių chromosomų pokyčiai, kuriais remiantis prognozuojama apie paveldimų mutacijų atsiradimą gemalinėse ląstelėse.

Atliekant šį tyrimą bendru atveju, panaudojami griaužikai. Šio citogenetinio tyrimo metu in vivo nustatomos chromosominio tipo aberacijos, atsirandančios spermatogonijų mitozinėse chromosomose. Kitos ląstelės nėra naudojamos šiam tyrimui atlikti.

Tam, kad spermatogonijose būtų identifikuotos chromatidinės aberacijos, tiriama ląstelių pirmoji mitozė, vykstanti iškart po to, kai ląstelės buvo paveiktos tiriamąja medžiaga tam, kad, ląstelėms dalijantis, šie pakitimai nebūtų prarandami. Papildomą informaciją apie tiriamąja medžiaga paveiktas spermatogonijų kamienines ląsteles galima gauti, analizuojant mejozines chromosomas bei ieškant chromosominių aberacijų ląstelių, esančių I diakinezės metafazės stadijoje, kai šios, paveiktos tiriamąja medžiaga, tampa spermatocitais, chromosomose.

Šio tyrimo, atliekamo in vivo sąlygomis, metu siekiama nustatyti, ar somatinių ląstelių mutacijas sukeliantys mutagenai, gali jas sukelti ir gemalinėse ląstelėse. Be to, spermatogonijų tyrimas yra svarbus, įvertinant mutagenų padarytą žalą, pagal kurią sprendžiama apie faktorių, reguliuojančių metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų atstatymo procesus, reikšmę.

Sėklidėse yra daug skirtingoms generacijoms priklausančių spermatogonijų, kurios tarpusavyje skiriasi pagal jautrumą cheminių medžiagų poveikiui. Todėl identifikuotos aberacijos parodo spermatogonijų populiacijų, kurių pagrindinę dalį sudaro daug diferencijuotų spermatogonijų, paveiktų tiriamąja medžiaga, bendrąjį atsaką. Priklausomai nuo jų lokalizacijos sėklidėse, skirtingų generacijų spermatogonijos gali arba patekti arba nepatekti į bendrąją cirkuliaciją, nes egzistuoja fizinis ir fiziologinis (Sertoli ląstelių bei kraujo ir sėklidžių) barjerai.

Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga arba reaktyvusis metabolitas nepasiekia audinio, į kurį buvo nukreiptas, tai šio tyrimo metu jis daugiau nebenaudojamas.

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS

Chromatidinė aberacija : chromosomos struktūros pakeitimas, sukuriant trūkį seserinėse chromatidėse ar tarp jų ir neleidžiant joms pakartotinai susijungti.

Chromosominė aberacija : chromosomos struktūros pakeitimas, sukuriant arba trūkį, arba trūkį ir susijungimą toje pačioje vietoje abiejose seserinėse chromatidėse.

PlyšyS : achromatinė spraga, kurios plotis mažesnis už vienos chromatidės plotį ir chromatidė mažiausią skaičių klaidingai suporuotų bazių.

Chromosomų skaičiaus aberacija : normalaus chromosomų, esančių ląstelėse, skaičiaus pokytis.

PoliploidiškumaS : haploidinio chromosomų skaičiaus (skirtingai nei haploidinio skaičiaus - 3n, 4n …) - didėjimas.

Struktūrinė aberacija : chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, mikroskopu analizuojant ląsteles, esančias dalijimosi ciklo metafazėje ir kuris atrodo kaip fragmentų, esančių tarp grandinių bei jų viduje, delecijos.

1.3. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga pagal atitinkamą veikimo chemine medžiaga metodiką ir atitinkamais laiko momentais po veikimo, numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami agentu, sustabdančiu ląstelių dalijimąsi metafazėje (pavyzdžiui, kolchicinu arba Kolcemidu©).Iš gemalinių ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos ir metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.

1.4. TYRIMO METODO APRAŠYMAS

1.4.1. Paruošimas

1.4.1.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Paprastai naudojami kiniško žiurkėno ir pelių patinėliai. Tačiau gali būti naudojami ir kitų atitinkamų žinduolių rūšių patinai. Reikia naudoti visuotinai naudojamus jaunų sveikų subrendusių gyvūnų kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacija turi būti minimali ir neviršyti ± 20 % vidutinio svorio.

1.4.1.2. Laikymo ir maitinimo sąlygos

Taikomos Pagrindinio Įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50-60 %.

1.4.1.3. Gyvūnų paruošimas

Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus paveikti chemine medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Prieš pradedant tyrimą, gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai per 5 dienas.

1.4.1.4. Dozių paruošimas

Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.1. Tirpiklis/tirpinantysis įrengimas

Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą.

1.4.2.2. Kontroliniai mėginiai

Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti vienu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).

Spermatogoninių ląstelių, paveiktų tokia pačia tiriamosios cheminės medžiagos doze in vivo, teigiamuose kontroliniuose mėginiuose turi būti nustatomos struktūrinės aberacijos, kurios, kaip tikimasi, užgoš lengvai nustatomą pašalinį foną.

Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iškart dešifruotų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiami kontroliniai mėginiai būtų duodami gyvūnams kitaip nei tiriamoji medžiaga bei būtų tik vieną kartą paimami. Jeigu yra įmanoma, tai galima pasvarstyti apie konkrečiai klasei priklausančių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimą. Žemiau pateikiami tokie teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai:

Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

ciklofosfamidas | 50–18–0 | 200–015–4 |

ciklofosfamido monohidratas | 6055–19–2 | |

cikloheksilaminas | 108–91–8 | 203–629–0 |

mitomicinas C | 50–07–7 | 200–008–6 |

monomerinis akrilamidas | 79–06–1 | 201–173–7 |

trietilenmelaminas | 51–18–3 | 200–083–5 |

Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba tirpikliu ar tik tirpinamuoju įrenginiu, arba paveikti taip pat kaip ir tiriamosios grupės, turi būti kiekvieną kartą paimami, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos yra priimtini. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra pats priimtiniausias. Be to reikia papildomai panaudoti tiriamąja medžiaga neveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų bei išspausdintus duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokių žalingų ar mutageninių efektų.

1.5. BANDYMO ATLIKIMO METODIKA

1.5.1. Gyvūnų skaičius

Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse turi būti mažiausiai 5 tiriami patinėliai.

1.5.2. Veikimo tvarkaraštis

Pirmiausia tik vienąkart arba dukart veikiama tiriamosiomis medžiagomis (pavienis veikimas arba 2 veikimai). Tiriamosiomis medžiagomis galima veikti, taikant taip vadinamą išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną atliekami du veikimai tiriamąja medžiaga ir jų atlikimo laikas skiriasi ne daugiau kaip keletu valandų tam, kad būtų suteiktas pakankamai didelis tiriamosios medžiagos tūris. Kitų dozių davimo tvarka turi būti moksliškai pagrindžiama.

Kai gyvūnų grupei duodama didžiausia koncentracija, tai, pasibaigus veikimui, mėginiai paimami 2 kartus. Kadangi tiriamoji medžiaga gali turėti įtakos ląstelės ciklo kinetikai, tai, pasibaigus veikimui, mėginiai paimami labai anksti bei labai vėlai 24–48 valandų laikotarpiu. Kai tiriamos kitos (ne didžiausios) dozės, tai pasibaigus veikimui, mėginiai paimami 24 valandų (arba 1,5 ląstelės ciklo trukmės) laikotarpiu, nebent yra žinomas kitas mėginių paėmimo laikas, kuris yra tinkamesnis, tiriant efektus 6.

Be to mėginius galima paimti ir kitu metu. Pavyzdžiui, tiriant chemines medžiagas, sukeliančias chromosomų pertraukimus arba galinčias turėti įtakos nuo S nepriklausantiems efektams, mėginius galima paimti ir kitu tinkamu metu1.

Pakartotinio veikimo tvarkaraščio tinkamumas turi būti nustatomas kiekvienu atveju. Pagal pakartotinio veikimo tvarkaraštį, gyvūnai numarinami 24 valandų laikotarpiu (1,5 ląstelės ciklo trukmės) po paskutinio veikimo. Jeigu reikia, tai mėginiai yra papildomai paimami atitinkamu metu.

Prieš numarinimą, gyvūnams į pilvo plėvę suleidžiama atitinkama dozė metafazę sustabdančio agento (pavyzdžiui, Kolcemido© ar kolchicino). Po atitinkamo intervalo iš gyvūnų paimami mėginiai, pelių atveju tai atliekama po 3-5 valandų, kiniškų žiurkėnų atveju tai atliekama po 4-5 valandų.

1.5.3. Dozės dydis

Jeigu atliekamas intervalo, apie kurį nėra duomenų, paieškos tyrimas, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu 7. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami 3 doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, tokie, kurie pasirodo, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina.

Medžiagos pasižyminčios specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna mažos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, spermatogonijose pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, I ir II mejozinės metafazės metu spermatogonijų mitozių santykis sumažėja; šis sumažėjimas neviršija 50 %).

1.5.4. Ribų paieškos tyrimas

Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant 3 dozinius lygmenis. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.

1.5.5. Dozių davimas

Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.

1.5.6. Chromosomų paruošimas

Iškart po numarinimo, iš gyvūnų išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant skaidrių ir nudažomos.

1.5.7. Analizė

Išanalizuojama mažiausiai 100 vieno gyvūno ląstelių (mažiausiai 500 vienos grupės metafazių). Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visi tepinėliai (įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius) turi būti užkoduojami nepriklausomai vienas nuo kito tam, kad būtų galima juos ištirti mikroskopu. Kadangi dažnai ruošiant skaidres, suardoma metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti tokį centromerų skaičių, kuris būtų lygus 2 n ± 2.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi būti nustatytas kiekvieno gyvūno ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas ir chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičius. Turi būti išvardinti skirtingi chromosomų struktūrinių aberacijų tipai, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų tiriamąja chemine medžiaga, grupėse. Atskirai registruojama bei pranešama apie plyšių pasireiškimą, tačiau bendru atveju jie neįskaitomi, kai nustatomas absoliutinis aberacijų pasireiškimo dažnis.

Jei stebima tiek mitozė,tiek ir mejozė, tai turi būti nustatytas spermatogonijų mitozių I ir II mejozinės metafazės metu santykis, naudojamas kaip citotoksiškumo matas paimant bendrą mėginį (turintį 100 vieno gyvūno ląstelių) iš visų tirtų bei neigiamų kontrolinių gyvūnų tam, kad būtų nustatytas galimas citotoksinis efektas. Jeigu stebima tik mitozė, tai kiekvieno gyvūno atveju, imant mažiausiai 1000 ląstelių, nustatomas jų mitozinis indeksas.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterijų, tokiais kaip nuo dozės priklausomas ląstelių su chromosominėmis aberacijomis skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių, turinčių aberacijas ir priklausančių pavienės dozės grupei pagal vienkartinį mėginio paėmimo laiką, skaičiaus padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo metu gautus rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais8. Statistinis reikšmingumas turėtų būti vienintelis faktorius, apsprendžiantis teigiamą atsaką. Abejotini rezultatai turėtų būti išaiškinti, toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimentines sąlygas.

Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardintų kriterijų, ši tiriamoji medžiaga laikoma nemutageniška.

Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus.

Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse.

Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).

3. ATASKAITA

TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Tiriamieji gyvūnai:

- panaudota rūšis ar kamienas,

- gyvūnų skaičius ir amžius,

- šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,

- kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.

Tyrimo sąlygoS:

- ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas,duomenys,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi dozės dydžio pasirinkimą,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą,

- tiriamosios medžiagos paruošimo apibūdinimas,

- tiriamosios medžiagos davimo būdo apibūdinimas,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi numarinimo laiko pasirinkimą,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,

- duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,

- veikimo tiriamąja medžiaga ir mėginio paėmimo tvarkaraščio detalus aprašymas,

- metodai toksiškumui įvertinti,

- metafazę sustabdančios medžiagos prigimtis, jos koncentracija bei veikimo ja trukmė,

- skaidrių paruošimo metodai,

- aberacijų įvertinimo kriterijai,

- ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyvūno bei išanalizuotos, skaičius,

- teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.

Rezultatai:

- toksiškumo požymiai,

- mitozinis indeksas,

- I ir II mejozinėse metafazėse esančių ląstelių spermatogoninių mitozių santykis,

- kiekvieno gyvūno ląstelių chromosomų aberacijų tipas ir skaičius,

- absoliutus aberacijų vienoje grupėje skaičius,

- vienos grupės ląstelių, turinčių aberacijas, skaičius,

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,

- statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos

- duomenys apie vienu metu naudotas neigiamas kontroles,

- anksčiau gauti duomenys apie neigiamus kontrolinius mėginius, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus,

- duomenys apie vienu metu naudotus teigiamus kontrolinius mėginius,

- ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie stebimi,

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. IŠNAŠOS

1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Aplied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, p. 477–484.

2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Aproach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275–306.

3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, p. 289–294.

4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.

5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, p. 207–209.

6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, p. 313–318.

7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, p. 313–319.

8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232."

--------------------------------------------------

4G PRIEDAS

"B.39. NENUMATYTOS DNR SINTEZĖS (NDS) TYRIMAS ŽINDUOLIŲ KEPENŲ LĄSTELĖSE IN VIVO

1. METODAS

Šis metodas pakartoja OECD TG 486 Nenumatytos DNR sintezės (NDS) tyrimą žinduolių kepenų ląstelėse in vivo (1997).

1.1. ĮVADAS

Nenumatytos DNR sintezės (NDS) tyrimo žinduolių kepenų ląstelėse in vivo tikslas - identifikuoti medžiagas, kurios vykdo DNR pažaidų reparaciją žinduolių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kepenų ląstelėse 1, 2, 3, 4.

Šio tyrimo metu galima ištirti kepenyse esančių cheminių medžiagų sukeliamus genotoksinius efektus. Galutinis nustatytas dydis parodo, kad iš pradžių kepenų ląstelėse atsiranda DNR pažaidos, o vėliau vyksta DNR pažaidų reparacija. Apskritai, absorbuotų junginių metabolizmo pagrindinė vieta yra kepenys. Todėl kepenys yra tinkamas DNR pažaidų tyrimo in vivo objektas.

Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga nepasiekia audinio, į kurį buvo nukreipta, tai ji laikoma netinkama šiam tyrimui.

Nenumatytos DNR sintezės (NDS) produktai analizuojami, įvertinant žymėtų nukleozidų transportą į ląsteles, kuriose nevyksta numatyta DNR sintezė (paprastai vykstanti ląstelės ciklo S fazės metu). Plačiausiai naudojamas metodas, skirtas šiam įvertinimui, yra tričiu (3H) žymėto timidino autoradiografija. Atliekant nenumatytos DNR sintezės (NDS) tyrimus in vitro, daugiausiai naudojamos žiurkių kepenys. Galima naudoti ir kitus audinius, tačiau jie nėra šio tyrimo objektas.

Nenumatytos DNR sintezės (NDS) nustatymas priklauso nuo pažaidos vietoje iškirptų DNR bazių, pakeistų kitomis, skaičiaus. Todėl nenumatytos DNR sintezės tyrimas ypač vertingas tada, kai siekiama identifikuoti "ilgų fragmentų pažaidų" (fragmentų ilgis siekia nuo 20 iki 30 bazių), sukeltų, paveikus tiriamąja medžiaga, reparacijas. Tuo tarpu "trumpų fragmentų pažaidos" nustatomos, esant žymiai mažesniam jautrumui. Be to, mutageniniai įvykiai pasireiškia dėl nevykstančios pažaidų reparacijos, klaidingai vykstančios reparacijos ar klaidingos DNR replikacijos. Nenumatytos DNR sintezės aktyvumas neparodo pažaidų reparacijos efektyvumo. Visai įmanoma, kad mutagenas sąveikauja su DNR, tačiau pažaidos reparacija iškirpos atstatymo būdu nevyksta. Nenumatytos DNR sintezės tyrimo metu negaunant specifinės informacijos apie mutageninį aktyvumą, šį trūkumą kompensuoja didelis matavimo jautrumas, nes tiriamas visas genomas.

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS

Ląstelės, kuriose vyksta reparacija : atliekant šį tyrimą laboratorijoje, patvirtinama, kad branduolinio tinklo granulių (BTG) išraiška didesnė negu nustatytoji vertė.

Branduolinio tinklo granulės (BTG) : kiekybinis nenumatytos DNR sintezės aktyvumo ląstelėse, atliekant nenumatytos DNR sintezės tyrimą autoradiografijos metodu, įvertinimo matas, išreiškiamas iš branduolinio tinklo granulių (BG) skaičiaus atimant vidutinį citoplazminių granulių, esančių nukleoplazminiuose ploteliuose, skaičių (CG): BTG = BG - CG. BGT nustatomas kiekvienoje ląstelėje ir tada apskaičiuojama kultūroje ar paraleliose kultūrose esančių ląstelių BTG bendra vertė.

Nenumatyta DNR sintezė (NDS) : DNR reparacinė sintezė, vykstanti po cheminėmis medžiagomis ar fiziniais agentais sukeltos DNR pažaidos apimto regiono iškirpimo bei pašalinimo.

1.3. TYRIMO METODO PRINCIPAS

Tiriant nenumatytą DNR sintezę (NDS) žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, parodoma, kad reparacinė DNR sintezė vyksta po to, kai cheminėmis medžiagomis ar fiziniais agentais sukeltos DNR pažaidos apimtas regionas iškerpamas ir pašalinamas. Šis tyrimas bendru atveju yra pagrįstas 3H žymėto timidino įterpimu į kepenų ląstelių, kurios sudaro labai nedidelę ląstelių, esančių ląstelinio ciklo S fazėje, dalį, DNR. 3H žymėto timidino transportas į ląstelę vertinamas autoradiografijos metodu, kadangi šis metodas nėra toks jautrus ląstelių, esančių S fazėje, atžvilgiu, kaip scintiliacijos skystyje nustatymo metodas.

1.4. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4.1. Preparatai

1.4.1.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Dažniausiai yra naudojamos žiurkės, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia panaudoti dažniausiai vartojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinio svorio.

1.4.1.2. Laikymo ir maitinimo sąlygos

Taikomos Pagrindinio Įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50-60 %.

1.4.1.3. Gyvūnų paruošimas

Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Prieš pradedant tyrimą, gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai 5 dienas.

1.4.1.4. Dozių paruošimas

Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.1. Tirpiklis/tirpinantysis įrengimas

Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą.

1.4.2.2. Kontroliniai mėginiai

Atliekant kiekvieną nepriklausomą eksperimento dalį, vienu metu turi būti naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) kontroliniai mėginiai.. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).

Teigiami kontroliniai mėginiai turi būti žinomos medžiagos, sukeliančios nenumatytą DNR sintezę, kai jos duodamos tokia doze, kuri, kaip tikimasi, užgoš lengvai nustatomą pašalinį foną. Kai vartojamos vidutinį atsaką sukeliančios dozės, tai reikia naudoti teigiamus kontrolinius mėginius, kuriems yra būtina metabolinė aktyvacija 4. Dozės turi būti taip parenkamo,s kad gaunami efektai būtų aiškūs, bet tyrėjas negalėtų iškart dešifruoti užkoduotų skaidrių. Teigiamoms kontrolinėms medžiagoms priklauso:

Mėginių paėmimo laikas | Medžiaga | CAS Nr. | Einecs Nr. |

Ankstyvasis mėginių paėmimas (2–4 valandos) | N-nitrozodimetilaminas | 62–75–9 | 200–249–8 |

Vėlyvasis mėginių paėmimas (12–16 valandų) | N-2-fluorenilacetamidas (2-AAF) | 53–96–3 | 200–188–6 |

Kitos atitinkamos teigiamos kontrolinės medžiagos irgi gali būti naudojamos. Priimtina, kad teigiama kontrolinė medžiaga duodama kitu būdu nei tiriamoji medžiaga.

1.5. BANDYMO ATLIKIMO METODIKA

1.5.1. Gyvūnų skaičius ir lytis

Atsižvelgiant į tiriamojo atsako natūraliąją biologinę variaciją, reikia panaudoti tinkamą gyvūnų skaičių. Kiekvienoje grupėje turi būti mažiausiai 3 tiriamieji gyvūnai. Jei sukaupiama anksčiau atliktų bandymų duomenų bazė, tai vienu metu naudojamose teigiamose ir neigiamose kontrolinėse grupėse turi būti po 1 ar 2 gyvūnus.

Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, panaudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio tiriamąja medžiaga būdą, duomenis, kurie rodo, toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties, pirmiausia patinus, gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis veikiamas, priklauso nuo lyties, kaip antai jautrumo kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms atveju, tai reikia ištirti atitinkamą gyvūnų rūšį.

1.5.2. Veikimo tvarkaraštis

Bendru atveju tiriamosios medžiagos duodamos tik vieną kartą.

1.5.3. Dozės dydžiai

Paprastai naudojami 2 dozės dydžiai. Didžiausia doze laikoma dozė, kuri sukelia toksiškumo požymius taip, kad didesniosios dozės, duodamos tokiu pačiu būdu, bus mirtinos. Apskritai, žemesnioji dozė turi sudaryti nuo 25 % iki 50 % didesniosios dozės.

Medžiagos, pasižyminčios specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna žemos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Jeigu nėra tinkamų duomenų ir tuo tikslu atliekama intervalo paieška, tai ji atliekama toje pačioje laboratorijoje, panaudojant tos pačios rūšies.kamieno, lyties gyvūnus bei tą patį veikimo būdą kaip ir pagrindinio tyrimo metu.

Didžiausia dozė gali taipogi būti apibrėžiama kaip dozė, kurią davus, kepenyse pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, piknotiniai branduoliai).

1.5.4. Ribų paieškos tyrimas

Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant 3 dozinius lygmenis. Prognozuojamas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.

1.5.5. Dozių davimas

Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Tačiau įvedimas į pilvo ertmę nerekomenduojamas, nes tiriamoji medžiaga gali tiesiogiai paveikti kepenis per cirkuliacinę sistemą. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.

1.5.6. Kepenų ląstelių paruošimas

Kepenų ląstelės yra paruošiamos, paimant jas iš gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, po dozės davimo praėjus 12–16 valandų. Apskritai, anksčiau atliekamas papildomas mėginio paėmimas (įprastiniu atveju - po veikimo praėjus 2–4 valandoms) yra būtinas, nebent 12–16 valandų laikotarpiu buvo gautas aiškus teigiamas atsakas. Tačiau mėginius paimti galima ir kitu metu, kuris pagrindžiamas, remiantis toksikokinetinių tyrimų duomenimis.

Perleidžiant kolagenazę per kepenis in situ ir sudarant sąlygas naujai disocijavusioms kepenų ląstelėms pačioms prisitvirtinti prie tinkamo paviršiaus, gaunamos žinduolių kepenų ląstelių trumpalaikės kultūros Neigiamų kontrolinių gyvūnų kepenų ląstelių gyvybingumas mažiausiai turi siekti 50 %.

1.5.7. Nenumatytos DNR sintezės (NDS) nustatymas

Šviežiai išskirtos žinduolių kepenų ląstelės paprastai inkubuojamos terpėje, turinčioje 3H žymėto timidino atitinkamam laikui (pavyzdžiui, nuo 3 iki 8 valandų). Baigiantis inkubacijai, terpė turi būti atskiriama nuo ląstelių, kurios vėliau gali būti inkubuojamos terpėje, turinčioje nežymėto timidino perteklių tam, kad sumažėtų neįsijungusio timidino radioaktyvumas (vadinamasis "šaltasis persekiojimas"). Po inkubacijos ląstelės sudrėkinamos, fiksuojamos bei džiovinamos. Jei inkubacija užtrunka ilgiau, tai nežymėto timidino perteklius terpėje nėra būtinas. Skaidrės pamerkiamos į autoradiografinę emulsiją, eksponuojamos tamsoje (jas šaldant 1–2 savaites), išryškinamos, dažomos ir skaičiuojamos sidabro granulės, susidariusios ekspozicijos metu. Iš kiekvieno gyvūno paimtų mėginių paruošiama nuo 2 iki 3 skaidrių.

1.5.8. Analizė

Ląstelės, esančios paruoštose skaidrėse, turi pasižymėti normaliomis morfologinėmis ypatybėmis tam, kad būtų galima įvertinti svarbią neplanuotą DNR sintezę. Preparatai tiriami mikroskopu, ieškant akivaizdžių toksiškumo požymių (pavyzdžiui, piknotinių branduolių arba sumažėjusio įvestos žymės radioaktyvumo).

Prieš skaičiuojant granules, skaidrės užkoduojamos. Normaliai kiekvieno gyvūno atveju 2 skaidrėse įvertinama 100 ląstelių. Jei kiekvieno gyvūno atveju įvertinama mažiau nei 100 ląstelių, tai šitai pagrindžiama. Granulės neskaičiuojamos branduoliuose, jei ląstelės yra S fazėje, tačiau reikia nurodyti ląstelių, esančių S fazėje, skaičių.

3H žymėto timidino įjungimas į morfologiškai normalių ląstelių branduolius bei citoplazmą, įvertinamas pagal sidabro granulių sankaupas, turi būti tiriamas atitinkamais metodais.

2. DUOMENYS

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Turi būti pateikiami duomenys apie kiekvieną skaidrę bei tirtą gyvūną. Be to visi duomenys pateikiami apibendrintai, lentelių forma. Branduolinio tinklo granulių (BTG) skaičius nustatomas kiekvienoje ląstelėje, kiekvieno gyvūno ląstelėse bei kiekvienos dozės ar laiko intervalo atveju, iš branduolio granulių (BG) skaičiaus atimant citoplazminių granulių (CG) skaičių. Jei skaičiuojamos ląstelės, kuriose vyksta "reparacija", tai kriterijai, taikomi šioms ląstelėms apibūdinti, turi būti pagrindžiami bei remtis anksčiau gautais neigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenimis.rezultatai, pateikiami skaičiais, gali būti vertinami statistiniais metodais. Jei atliekami statistiniai tyrimai, tai prieš pradedant bandymą, jie turi būti pasirinkti bei pagrindžiami.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS

Teigiamų/neigiamų atsakų kriterijų pavyzdžiai:

teigiami | (i) | BTG vertės yra aukščiau nustatyto slenkstinio lygio, kuris pagrindžiamas, remiantis anksčiau laboratorijoje gautais duomenimis; |

arba | (ii) | BTG vertės yra žymiai didesnės už kontrolinio mėginio, naudojamo tuo tuo pačiu metu, vertę; |

neigiami | (i) | BTG vertės atitinka arba yra mažesnės už anksčiau naudoto kontrolinio mėginio slenkstinį lygį; |

arba | (ii) | BTG vertės yra nežymiai didesnės už kontrolinio mėginio, naudojamo tuo pačiu metu, vertę. |

Reikia aptarti duomenų biologinę vertę: atsižvelgiama į tokius parametrus, kaip variacija tarp atskirų gyvūnų, dozės ir atsako tarpusavio ryšys bei citotoksiškumas. Tačiau statistinė svarba neturėtų būti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu, ar atsakas teigiamas ar ne.

Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus.

Teigiami rezultatai, gauti, tiriant neplanuotą DNR sintezę (NDS) žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia DNR pažaidas žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, o pažaidų reparacija vyksta neplanuotos DNR sintezės (NDS) metu in vitro. Neigiamas rezultatas rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia DNR pažaidų, nustatomų šio tyrimo metu.

Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).

3. ATASKAITA

TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginyS:

- priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Tiriamieji gyvūnai:

- panaudota rūšis ar kamienas,

- gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

- šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,

- kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.

Tyrimo sąlygoS:

- teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,

- intervalo paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas,duomenys,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi dozės dydžio pasirinkimą,

- duomenys apie tiriamosios medžiagos paruošimą,

- duomenys apie tiriamosios medžiagos davimą,

- pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą,

- metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai įmanoma nurodyti,

- tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,

- duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,

- detalus veikimo tiriamąja medžiaga ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,

- metodai toksiškumui įvertinti,

- kepenų ląstelių paruošimo ir kultivavimo metodai,

- panaudotas autoradiografinis metodas,

- paruoštų skaidrių ir įvertintų ląstelių skaičius,

- įvertinimo kriterijai,

- teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.

Rezultatai:

- branduolinių, citoplazminių bei branduolinio tinklo granulių, esančių kiekvienos skaidrės, gyvūno ar gyvūnų grupės ląstelėse, skaičiaus vidurkiai,

- dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,

- statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,

- toksiškumo požymiai,

- duomenys apie tuo pačiu metu naudotus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius mėginius,

- anksčiau gauti duomenys apie neigiamus kontrolinius mėginius, nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,

- "ląstelių, kuriose vyksta reparacija", skaičius, jeigu jis buvo nustatytas,

- ląstelių, esančių S fazėje skaičius, jeigu jis buvo nustatytas,

- ląstelių gyvybingumas.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. IŠNAŠOS

1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In Vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, p. 1–18.

2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 189, p. 123–133.

3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds), Suplementary Mutagenicity TestS: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 52–77.

4) Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutation Res., 312, p. 263–285.

5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, p. 21–27.

6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, p. 553–562."

--------------------------------------------------

5 PRIEDAS

Žr. komisijos direktyvą 2001/59/EB, OL L 225, 2001 8 21, P. 1.

--------------------------------------------------

6 PRIEDAS

"

IX PRIEDAS

A DALIS

Nuostatos dėl uždarų, kurių vaikai negali atidaryti

Papildant šios direktyvos 22 straipsnio 1 dalies e punkto nuostatas, bet kokios talpos pakuotės su kvėpavimui pavojingomis medžiagomis (Xn; R65), kurios yra suklasifikuotos ir pažymėtos pagal 6 priedo 3 dalies 2 punkto 3 pastraipą, išskyrus medžiagas, kurios pateikiamos į rinką aerozolių pavidalu arba pakuotėje su užsandarintu purkštuvu, turi būti uždarytos taip, kad vaikai negalėtų jų atidaryti.

1. Vėl sandariai uždaromos pakuotės

Vėl sandariai uždaromose pakuotėse naudojami uždarai, kurių vaikai negali atidaryti, atitinka TSO standartą 8317 (1989 m. liepos 1 d. redakcija) dėl "Pakuotės, kurių vaikai negali atidaryti - Vėl sandariai uždaromoms pakuotėms taikomi reikalavimai ir tyrimo metodai", kurį priėmė Tarptautinė Standartų Organizacija (TSO).

2. Sandariai nebeuždaromos pakuotės

Sandariai nebeuždaromose pakuotėse naudojami uždarai, kurių vaikai negali atidaryti, atitinka ESK standartą EN 662 (1997 m. kovo mėnesio redakcija) dėl "Pakuotės - Pakuotės, kurių vaikai negali atidaryti - Sandariai nebeuždaromoms ne farmacinių produktų pakuotėms taikomi reikalavimai ir jų tyrimo metodai", priimtą Europos Standartizacijos Komitete (ESK).

3. Pastabos

1. Tiktai Europos standartų seriją EN 45000 atitinkančios laboratorijos gali patvirtinti apie atitikimą aukščiau minimų standartų atžvilgiu.

2. Specifiniai atvejai

Jeigu atrodo, jog pakuotė yra pakankamai apsaugota nuo vaikų, nes jie negali jos atidaryti be jokio įrankio, tai pakuotės nereikia tirti.

Visais kitais atvejais, kai yra pagrindo abejoti, jog pakuotė nepakankamai apsaugota nuo vaikų tai tada nacionalinės valdžios institucijos gali paprašyti asmens, atsakingo už produkto pateikimą į rinką, kad šis įteiktų iš laboratorijos gautą bei 3.1. minimą sertifikatą, kuriame nurodyta:

- pakuotės tipas, kuriam esant, nereikia atlikti tyrimus, siekiant įsitikinti ar jis atitinka aukščiau minimus TSO bei ESK standartus,

arba

- pakuotė buvo ištirta ir nustatyta, kad ji atitinka aukščiau minimus reikalavimus.

B DALIS

Nuostatos dėl perspėjančiųjų sensorinių įrenginių

Perspėjančiųjų sensorinių įrenginių techninės charakteristikos atitinka EN TSO standartą 11683 (1997 m. redakcija) dėl "Supakavimas - Perspėjimai apie pavojų, gaunami sensoriniu būdu - Reikalavimai".

"

--------------------------------------------------