AŠTUNTOJI KOMISIJOS DIREKTYVA,

1978 m. birželio 15 d.

nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus

(78/633/EEB)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 1970 m. liepos 20 d. Tarybos direktyvą Nr. 70/373/EEB dėl Bendrijos mėginių paėmimo ir analizės metodų, taikomų oficialiai pašarų kontrolei, įvedimo([1]) su paskutiniais pakeitimais, padarytais Prisijungimo aktu, ir ypač į jos 2 straipsnį,

kadangi ta direktyva reikalauja, kad oficialiai pašarų kontrolei būtų taikomi Bendrijos mėginių paėmimo ir analizės metodai, siekiant patikrinti, kaip laikomasi įstatymais ir kitais teisės aktais patvirtintų reikalavimų dėl pašarų kokybės ir sudėties;

kadangi 1971 m. birželio 15 d. Komisijos direktyva Nr. 71/250/EEB([2]), 1971 m. lapkričio 18 d. Komisijos direktyva Nr. 71/393/EEB([3]), 1972 m. balandžio 27 d. Komisijos direktyva Nr. 72/199/EEB([4]), 1972 m. gruodžio 5 d. Komisijos direktyva Nr. 73/46/EEB([5]), 1974 m. kovo 25 d. Komisijos direktyva Nr. 74/203/EEB([6]), 1974 m. gruodžio 20 d. Komisijos direktyva Nr. 75/84/EEB([7]) ir 1976 m. kovo 1 d. Komisijos direktyva Nr. 76/372/EEB([8]) jau nustatė keletą analizės metodų, taikomų Bendrijoje; atsižvelgiant į nuo to laiko padarytą pažangą, tikslinga priimti aštuntą metodų rinkinį;

kadangi šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Pašarų nuolatinio komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:

1 straipsnis

1. Valstybės narės reikalauja, kad, oficialiai tikrinant pašarus cinko bacitracino, flavofosfolipolio, geležies, vario, mangano ir cinko kiekiams nustatyti būtų taikomi šios direktyvos priede aprašyti analizės metodai.

2. Šios direktyvos priede aprašytiems metodams taikomos bendrosios nuostatos, išdėstytos Pirmosios direktyvos Nr. 71/250/EEB priedo 1 dalyje "Įžanga", išskyrus dalį, nagrinėjančią analizei skirto mėginio paruošimą.

2 straipsnis

Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie įsigalioję 1979 m. sausio 1 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.

3 straipsnis

Ši direktyva skirta valstybėms narėms.

Priimta Briuselyje, 1978 m. birželio 15 d.

Tarybos vardu

Finn GUNDELACH

Pirmininko pavaduotojas

PRIEDAS

1. CINKO BACITRACINO NUSTATYMAS, MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARO TERPĖJE

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas cinko bacitracino kiekis pašaruose, koncentratuose ir premiksuose. Radimo riba 5 mg/kg (5 milijonosios dalys) (*) [9]. Metodas netinka, kai yra trukdančių medžiagų, ypač kai yra daug vario ir askorbo rūgšties.

2. METODO ESMĖ

Mėginys ekstrahuojamas metanolio, vandens ir druskos rūgšties mišiniu, esant pH 2. Ekstrakto pH padidinamas iki 6,5, tirpalas koncentruojamas (jei reikia) ir praskiedžiamas. Jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant cinko bacitracino difuziją agaro terpėje, kurioje pasėtas Micrococcus luteus. Difuzija matoma pagal mikroorganizmo inhibavimo zonų susidarymą. Laikoma, kad šių zonų skersmuo naudojamų koncentracijų intervale yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.

3. MIKROORGANIZMAS: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240

3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas

Gulsčiajame mitybinės terpės agare (4.1) pasėjamas Micrococcus luteus. Inkubuojama 24 valandas 30-37 °C temperatūroje, laikoma šaldytuve maždaug 4 °C temperatūroje ir kas dvi savaites persėjama į gulsčiąjį agarą.

3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas (a) [10]

Bakterijos iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) surenkamos naudojant 2-3 ml natrio chlorido tirpalo (4.3). Ši suspensija sėjama Roux kolboje esančioje mitybinėje terpėje (4.1), ir 30-37 °C temperatūroje inkubuojama 18-20 valandų. Gauta kultūra surenkama į 25 ml natrio chlorido tirpalo (4.3) ir sumaišoma. Suspensija dešimt kartų skiedžiama natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas pagal natrio chlorido tirpalą (4.3) 1 cm storio kiuvetėje turi būti apie 75 %, esant bangos ilgiui 650 nm.

4. MITYBINĖS TERPĖS IR REAGENTAI

4.1. Mitybinė terpė (b) [11]

Mėsos peptonas 6,0 g

Tripsino peptonas 4,0 g

Mielių ekstraktas 3,0 g

Mėsos ekstraktas 1,5 g

Gliukozė 1,0 g

Agaras 15,0 g

Vanduo 1 000 ml

pH 6,5-6,6 (po sterilizavimo).

4.2. Bandymo terpėb

Tripsino peptonas 10 g

Mielių ekstraktas 3,0 g

Mėsos ekstraktas 1,5 g

Gliukozė 1,0 g

Agaras 20,0 g

Tween 80 1 ml

Vanduo 1 000 ml

pH 6,5 (po sterilizavimo).

4.3. Natrio chlorido 0,8 % (m/v) tirpalas: 8 g natrio chlorido a. g. ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 000 ml; sterilizuojama.

4.4. Gryno metanolio, vandens ir druskos rūgšties a. g. ( = 1,18-1,19 g/ml) mišinys, tūrių santykis: 80/17,5/2,5.

4.5. Fosfatinis buferis, pH 6,5:

Kalio-vandenilio fosfatas K2HPO4 a. g. (22,15 g),

Kalio-divandenilio fosfatas KH2PO4 a. g. (27,85 g),

Vandens iki 1 000 ml.

4.6. Druskos rūgštis a. g. ( = 1,18-1,19 g/ml).

4.7. Druskos rūgšties a. g. 0,1 N tirpalas.

4.8. Natrio hidroksido a. g. 1 N tirpalas.

4.9. Bromkrezolio violetinis 0,04 % (m/v) tirpalas: 0,1 g bromkrezolio violetinio ištirpinama 18,5 ml 0,01 N natrio hidroksido tirpalo. Vandeniu praskiedžiama iki 250 ml ir sumaišoma.

4.10. Standartinė medžiaga: žinomo aktyvumo (T. V.) cinko bacitracinas.

5. STANDARTINIAI TIRPALAI

Pasveriamas cinko bacitracino (4.10) kiekis, atitinkantis 1 050 T. V. (pagal nurodytą aktyvumą). Įpilama 5 ml 0,1 N druskos rūgšties (4.7) ir paliekama stovėti 15 minučių. Įpilama 30 ml vandens, fosfatiniu buferiu pH 6,5 (4.5) nustatoma pH vertė 4,5 (apie 4 ml), skiedžiama iki 50 ml vandeniu ir gerai sumaišoma (1 ml = 21 T. V.).

Nuosekliai šį pradinį tirpalą skiedžiant buferiniu tirpalu, kurio pH 6,5 (4.5), paruošiami tokių koncentracijų tirpalai:

S8 0,42 T.V./ml

S4 0,21 T.V./ml

S2 0,105 T.V./ml

S1 0,0525 T.V./ml

6. EKSTRAKTO RUOŠIMAS

6.1. Ekstrahavimas

6.1.1. Koncentratai, premiksai ir mineraliniai pašarų priedai

Pasveriama 2,0-5,0 g mėginio, įpilama 30 ml mišinio (4.4) ir trumpai kratoma. Patikrinama pH vertė, kuri turi būti apie 2. Kratoma 10 minučių, įpilama 30 ml fosfatinio buferio, kurio pH vertė 6,5 (4.5), ir kratoma 15 minučių. Praskiedžiama fosfatiniu buferiu (4.5), kad būtų gauta numatoma cinko bacitracino koncentracija 0,42 T.V./ml (= U8).

6.1.2. Baltymingi koncentratai

Pasveriama 10,0 g mėginio, įpilama 50 ml mišinio (4.4) ir trumpai kratoma. Patikrinama pH vertė, kuri turi būti apie 2. Kratoma 10 minučių, įpilama 50 ml fosfatinio buferio, kurio pH vertė 6,5 (4.5), ir kratoma 15 minučių. Praskiedžiama fosfatiniu buferiu (4.5), kad būtų gauta numatoma cinko bacitracino koncentracija 0,42 T.V./ml (= U8).

6.1.3. Kiti pašarai

Pasveriama 10,0 g mėginio (20,0 g, jei manoma, kad cinko bacitracino koncentracija yra 5 mg/kg), įpilama 25 ml mišinio (4.4) ir apie 10 minučių maišoma. Įpilama 25 ml fosfatinio buferio, kurio pH vertė 6,5 (4.5), kratoma 15 minučių ir centrifuguojama. Paimama 20 ml centrifugato, 1 N natrio hidroksido tirpalu (4.8) nustatoma pH vertė 6,5, kaip indikatorių naudojant bromkrezolio violetinio tirpalą (4.9). Sukamajame garintuve tirpalas ne aukštesnėje kaip 35 °C temperatūroje nugarinamas maždaug iki 4 ml. Likutis praskiedžiamas vandeniu, kad būtų gauta numatoma cinko bacitracino koncentracija 0,42 T.V./ml (= U8).

6.2. Bandymo tirpalai

Iš tirpalo U8, nuosekliai praskiedžiant (1: 1) fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5),) ruošiami tirpalai U4 (numatomas kiekis 0,21 T.V./ml), U2 (numatomas kiekis 0,105 T.V./ml) ir U1 (numatomas kiekis: 0,0525 T.V./ml).

7. BANDYMO PROCEDŪRA

7.1. Sėjimas į bandymo mitybinę terpę

Bandymo terpėje (4.2) maždaug 50 °C temperatūroje pasėjama bakterijų suspensija (3.2). Išankstiniais bandymais lėkštelėse su bandymo terpe (4.2) nustatomas bakterijų suspensijos kiekis, kurio, esant įvairioms cinko bacitracino koncentracijoms, reikia didžiausioms ir aiškiausiai matomoms inhibavimo zonoms susidaryti.

7.2. Lėkštelių paruošimas

Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturias standartinio tirpalo koncentracijas (S8, S4, S2 ir S1) ir keturias tiriamojo tirpalo koncentracijas (U8, U4, U2 ir U1). Kiekvienoje lėkštelėje būtinai turi būti visų keturių koncentracijų standartiniai ir ekstrakto tirpalai. Šiam tikslui pasirenkamos gana didelės lėkštelės, kad agare būtų galima padaryti bent aštuonias 10-13 mm skersmens skyles, tarp kurių centrų būtų ne mažesnis kaip 30 mm atstumas. Bandymas gali būti atliekamas ant stiklo plokštelių su uždėtu aplygintu aliuminio ar plastiko žiedu, kurio skersmuo 200 mm, aukštis 20 mm.

Į lėkšteles įpilamas toks pagal 7.1 punktą apsėtos terpės (4.2) kiekis, kad susidarytų 2 mm storio sluoksnis (50 ml 200 mm skersmens lėkštelėje). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, gręžiamos skylės, į kurias įpilami tiksliai išmatuoti analizuojamo ir standartinio tirpalo tūriai (0,10-0,15 ml į kiekvieną skylę, atsižvelgiant į skersmenį).

Kiekvienos koncentracijos tirpalas panaudojamas bent keturis kartus, todėl kiekvieno nustatymo metu įvertinamos 32 inhibavimo zonos.

7.3. Inkubavimas

Lėkštelės inkubuojamos 16-18 valandų 28-30 °C temperatūroje.

8. ĮVERTINIMAS

Inhibavimo zonų skersmuo išmatuojamas 0,1 mm tikslumu. Matavimų vidurkio vertės kiekvienai koncentracijai pažymimos pusiau logaritminiame popieriuje, kuriame ihhibavimo zonų skersmuo vaizduojamas kaip koncentracijos logaritmo funkcija. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą geriausiai atitinkančios tiesės, pvz., kaip parodyta toliau.

Taikant formulę, nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):

[pic]

Taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH) nustatomas pagal formulę:

[pic]

Tokiu pat būdu apskaičiuojami taškai geriausiai atitinkantys mažiausią UL ir didžiausią UH koncentraciją ekstrakte, pakeičiant, anksčiau pateiktoje formulėje S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.

Apskaičiuotos SL ir SH vertės pažymimos tame pačiame grafike ir sujungiamos, taip gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiu būdu pažymėjus ir sujungus UL ir UH vertes, gaunama geriausiai ekstraktą atitinkanti tiesė.

Jei nėra jokių trukdžių, tiesės turi būti lygiagrečios. Praktiniame darbe tiesės gali būti laikomos lygiagrečiomis, jei (SH-SL) ir (UH-UL) vertės nuo jų vidutinės vertės nesiskiria daugiau kaip 10 %.

Jei nustatoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, gali būti atmetamos U1 ir S1 arba U8 ir S8 vertės ir SL, SH, UL ir UH vertės apskaičiuojamos pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:

[pic]

[pic]

Panašiai skaičiuojamos UL ir UH vertės. Kaip ir anksčiau, turi būti patikrinama, ar alternatyvios geriausio atitikimo tiesės yra lygiagrečios. Jei rezultatas buvo apskaičiuojamas pagal tris vertes, tai turi būti nurodyta galutinėje ataskaitoje.

Kai laikoma, kad tiesės lygiagrečios, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš šių formulių:

keturioms vertėms:

[pic],

trims vertėms:

[pic]

arba

[pic]

Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas.

Kai laikoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, bandymas pakartojamas. Jei lygiagretumo vis tiek nepasiekiama, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal formulę (c). Tačiau gautas rezultatas turi būti laikomas tik apytikriu, ir tai turi būti pažymėta galutinėje ataskaitoje.

9. PAKARTOJAMUMAS

Skirtumas tarp dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analitikui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu mėginiu, neturi viršyti:

20 % didžiausios vertės, kai cinko bacitracino kiekis 5-25 mg/kg;

5 mg/kg, absoliučia verte, kai cinko bacitracino kiekis 25-50 mg/kg;

10 % didžiausios vertės, kai cinko bacitracino yra daugiau kaip 50 mg/kg.

2. FLAVOFOSFOLIPOLIO NUSTATYMAS, MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARO TERPĖJE

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas flavofosfolipolio kiekis pašaruose, koncentratuose ir premiksuose. Radimo riba - 1 mg/kg (1 milijonoji dalis).

2. METODO ESMĖ

Mėginys ekstrahuojamas praskiestu metanoliu, šildant su grįžtamuoju kondensatoriumi. Po centrifugavimo ekstraktas, jei reikia, gryninamas, apdorojant jonitinėmis dervomis ir praskiedžiamas. Jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant flavofosfolipolio difuziją agaro terpėje, kurioje pasėtas Staphylococcus aureus. Difuzija matoma pagal mikroorganizmo inhibavimo zonų susidarymą. Laikoma, kad šių zonų skersmuo naudojamų koncentracijų intervale yra tiesiai proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.

3. MIKROORGANIZMAS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas

Mėgintuvėliuose su gulsčiuoju mitybinės terpės agaru (4.1) pasėjamas Staphylococcus aureus. Inkubuojama 24 valandas 37 °C temperatūroje, laikoma šaldytuve maždaug 4 °C temperatūroje ir kiekvieną mėnesį persėjama į gulsčiąjį agarą.

3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas[12]

Atskirai paimami du mėgintuvėliai su pradine kultūra (3.1) ir persėjami kas savaitę. Inkubuojami 24 valandoms 37 °C temperatūroje ir laikomi šaldytuve maždaug 4 °C temperatūroje.

24 valandas prieš bandymą šia kultūra apsėjami du - keturi mėgintuvėliai su mitybine terpe (4.1). Inkubuojama 16-18 valandų 37 °C temperatūroje. Bakterijų suspensija surenkama natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas pagal natrio chlorido tirpalą (4.3) matuojant 1 cm storio kiuvetėje turi būti apie 40 %, esant bangos ilgiui 578 nm.

4 . MITYBINĖS TERPĖS IR REAGENTAI

4.1. Mitybinė terpė[13]

Mėsos peptonas 6,0 g

Tripsino peptonas 4,0 g

Mielių ekstraktas 3,0 g

Mėsos ekstraktas 1,5 g

Gliukozė 1,0 g

Agaras 15,0 g

Vanduo 1 000 ml

pH 6,5 (po sterilizavimo).

4.2. Bandymo terpė

4.2.1. Pagrindo sluoksnio terpė[14]

Mėsos peptonas 6,0 g

Mielių ekstraktas 3,0 g

Mėsos ekstraktas 1,5 g

Agaras 10,0 g

Vanduo 1 000 ml

pH 6,5 (po sterilizavimo).

4.2.2. Apsėjamo sluoksnio terpė

Kaip nurodyta 4.1 punkte, papildomai pridedama 2,0 g silikoninės emulsijos priešpučio[15].

4.3. Natrio chlorido 0,4 % (m/v) tirpalas: 4 g natrio chlorido a. g. ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1000 ml; sterilizuojama.

4.4. Grynas metanolis.

4.5. Metanolio 50 % (v/v) tirpalas: 500 ml metanolio (4.4) praskiedžiama 500 ml vandens.

4.6. Metanolio 80 % (v/v) tirpalas: 800 ml metanolio (4.4) praskiedžiama 200 ml vandens.

4.7. Tris(hidroksimetil)aminometanas a. g.

4.8. Kalio chlorido 1,5 % (m/v) tirpalas metanolyje: 1,5 g kalio chlorido a. g. ištirpinama 20 ml vandens ir metanoliu (4.4) praskiedžiama iki 100 ml.

4.9. Katijonitinė derva: Dowex 50 W × 8, 20-50 mešų, Na+ forma (kat. Serva Nr. 41600) arba panaši.

4.10. Anijonitinė derva: Dowex 1 × 2, 50-100 mešų, Cl- forma (kat. Serva Nr. 41010) arba panaši. Prieš naudojant 12-14 valandų laikoma 80 % metanolio tirpale (4.6).

4.11. Stiklo vata.

4.12. pH indikatorinis popierius (pH 6,6-8,1).

4.13. Askorbo rūgštis.

4.14. Standartinė medžiaga: žinomo aktyvumo flavofosfolipolis.

5. ĮRANGA

5.1. Stiklo vamzdis chromatografijai, kurio vidinis skersmuo 9 mm, ilgis 150-200 mm. Vamzdis siaurėjančiame apatiniame gale turi čiaupą, viršutinėje dalyje šlifo įmovą (pagal lašinamojo piltuvo (5.2) movą).

5.2. 250 ml tūrio lašinamasis piltuvas su čiaupu ir šlifo mova.

5.3. 250 ml konusinė kolba su šlifo įmova.

5.4. Grįžtamasis kondensatorius su šlifo mova.

6. STANDARTINIAI TIRPALAI

Tiksliai pasvertas standartinės medžiagos (4.14) kiekis ištirpinamas 50 % metanolyje (4.5) ir praskiedžiamas tiek, kad būtų gautas pradinis tirpalas, turintis 100 g/ml flavofosfolipolio. Tirpalas, laikomas 4 °C temperatūroje užkimštose kolbose, patvarus iki 2 mėnesių.

Nuosekliai šį pradinį tirpalą praskiedžiant 50 % metanolio tirpalu (4.5), paruošiami tokių koncentracijų tirpalai:

S8 0,2 g/ml

S4 0,1 g/ml

S2 0,05 g/ml

S1 0,025 g/ml

7. EKSTRAKTO RUOŠIMAS

7.1. Ekstrahavimas

7.1.1. Koncentratai, premiksai ir mineraliniai pašarų priedai

Pasveriama 2,0-5,0 g mėginio, įdedama apie 150 mg askorbo rūgšties (4.13). Konusinėje kolboje (5.3) mėginys sumaišomas su 150 ml 50 % metanolio tirpalo (4.5) ir, pridėjus maždaug 400 mg tris(hidroksimetil)aminometano (4.7), nustatoma pH vertė 8,1-8,2. Nustatyta pH vertė tikrinama indikatoriniu popieriumi (4.12). Palaukiama 15 minučių, toliau su tris(hidroksimetil)aminometanu (4.7) vėl nustatoma pH vertė 8,1-8,2 ir, nuolat maišant, virinama 10 minučių su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4). Tirpalas ataušinamas, mišinys centrifuguojamas ir ekstraktas nupilamas.

7.1.2. Kiti pašarai

Pasveriama 5,0-30,0 g mėginio, kuriame yra ne mažiau kaip 30 g flavofosfolipolio. Konusinėje kolboje (5.3) mėginys sumaišomas su 150 ml 50 % metanolio tirpalo (4.5) ir, pridėjus maždaug 400 mg tris(hidroksimetil)aminometano (4.7), nustatoma pH vertė 8,1-8,2. Nustatyta pH vertė tikrinama indikatoriniu popieriumi (4.12). Palaukiama 15 minučių, toliau su tris(hidroksimetil)aminometanu (4.7) vėl nustatoma pH vertė 8,1-8,2 ir, nuolat maišant, virinama 10 minučių su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4). Tirpalas ataušinamas, mišinys centrifuguojamas ir ekstraktas nupilamas.

7.2. Gryninimas (šios pakopos galima netaikyti koncentratams, premiksams ir mineraliniams priedams)

110 ml ekstrakto sumaišoma su 11 g katijonitinės dervos (4.9), vieną minutę virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4), mišinį visą laiką maišant. Katijonitinė derva atskiriama centrifuguojant arba filtruojant. 100 ml ekstrakto sumaišoma su 150 ml metanolio (4.4) ir tirpalas 4 °C temperatūroje laikomas 12-15 valandų. Susidariusi dribsnių pavidalo masė nufiltruojama kol šalta.

Apatinis stiklinio vamzdžio (5.1) galas užkemšamas stiklo vatos kamščiu (4.11), į vamzdį įpilama 5 ml anijonitinės dervos (4.10) ir kolonėlė plaunama 100 ml 80 % metanolio tirpalu (4.6). Naudojant piltuvą (5.2) į kolonėlę supilama ne mažiau kaip 100 ml filtrato, kuriame turėtų būti 16 g flavofosfolipolio (200 ml, jei imamas 30 g pašaro mėginys, kuriame yra 1 milijonoji dalis antibiotiko). Jei reikia, prieš supilant į kolonėlę filtratas praskiedžiamas 80 % metanolio tirpalu (4.6), kad flavofosfolipolio koncentracija būtų 16 g/100 ml. Nustatomas maždaug 2 ml per minutę debitas. Ištekėjęs tirpalas išpilamas. Toliau kolonėlė plaunama 50 ml 80 % metanolio tirpalu (4.6), ištekėjęs tirpalas išpilamas.

Flavofosfolipolis išplaunamas kalio chlorido tirpalu metanolyje (4.8), debitas išlaikomas maždaug 2 ml per minutę. 50 ml eliuato surenkama į matavimo kolbą, įpilama 30 ml vandens ir sumaišoma. Šiame tirpale flavofosfolipolio koncentracija turi būti 0,2 g/ml (= U8).

7.3. Bandymo tirpalai

Kai būtina (t. y., jei buvo praleista gryninimo pakopa), pagal 7.1.1 punktą gautas eksraktas praskiedžiamas 50 % metanoliu (4.5), kad būtų gauta numatoma 0,2 g/ml flavofosfolipolio koncentracija (= U8).

Iš tirpalo U8, nuosekliai praskiedžiant (1:1) 50 % metanolio tirpalu (4.5), ruošiami tirpalai U4 (numatomas kiekis 0,1 g/ml), U2 (numatomas kiekis 0,05 g/ml) ir U1 (numatomas kiekis 0,025 g/ml).

8. BANDYMO PROCEDŪRA

8.1. Sėjimas bandymo į mitybinę terpę

Bandymo terpėje (4.2.2) maždaug 50 °C temperatūroje sėjama bakterijų suspensija (3.2). Išankstiniais bandymais lėkštelėse su bandymo terpe (4.2.2) nustatomas bakterijų suspensijos kiekis, kurio, esant įvairioms flavofosfolipolio koncentracijoms, reikia didžiausioms ir aiškiausiai matomoms inhibavimo zonoms susidaryti (apie 30 ml/litre).

8.1. Lėkštelių paruošimas

Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus(U8, U4, U2 ir U1). Kiekvienoje lėkštelėje būtinai turi būti visų keturių koncentracijų standartiniai ir ekstrakto tirpalai. Šiam tikslui pasirenkamos gana didelės lėkštelės, kad agare būtų galima padaryti bent aštuonias 10-13 mm skersmens skyles, tarp kurių centrų būtų ne mažesnis kaip 30 mm atstumas. Bandymas gali būti atliekamas ant stiklo plokštelės su uždėtu aplygintu aliuminio ar plastiko žiedu, kurio skersmuo 200 mm ir aukštis 20 mm.

Į lėkšteles įpilamas toks terpės (4.2.1) kiekis, kad susidarytų 1,5 mm storio sluoksnis (45 ml 200 mm skersmens lėkštelėje). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje ir tuomet ant viršaus užpilama tiek pagal 8.1 punktą apsėtos terpės (4.2.2), kad susidarytų 1 mm storio sluoksnis (30 ml 200 mm skersmens lėkštelėje). Vėl paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, gręžiamos skylės, į kurias įpilami tiksliai išmatuoti tiriamo ir etaloninio tirpalo tūriai (0,10-0,15 ml į kiekvieną skylę atsižvelgiant į skersmenį).

Kiekvienos koncentracijos tirpalas panaudojamas bent keturis kartus, todėl kiekvieno nustatymo metu įvertinamos 32 inhibavimo zonos.

8.3. Inkubavimas

Lėkštelės inkubuojamos 16-18 valandų 28-30 °C temperatūroje.

9. ĮVERTINIMAS

Inhibavimo zonų skersmuo išmatuojamas 0,1 mm tikslumu. Matavimų vidurkio vertė kiekvienai koncentracijai pažymima pusiau logaritminiame popieriuje, kuriame inhibavimo zonų skersmuo vaizduojamas kaip koncentracijos logaritmo funkcija. Standartiniam tirpalui ir ekstraktui brėžiamos geriausiai atitinkančios tiesės, pvz., kaip parodyta toliau.

Taikant formulę nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):

[pic]

Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH), taikant formulę:

[pic]

Panašiai skaičiuojami taškai geriausiai atitinkantys mažiausią (UL) ir didžiausią (UH) koncentraciją ekstrakte, pakeičiant nurodytose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.

Apskaičiuotos SL ir SH vertės pažymimos tame pačiame grafike ir sujungiamos - taip gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiu būdu pažymimos ir sujungiamos UL ir UH vertės, gaunant geriausiai ekstraktą atitinkančią tiesę.

Jei nėra jokių trukdžių, tiesės turi būti lygiagrečios. Praktiniame darbe tiesės gali būti laikomos lygiagrečiomis, jei (SH-SL) ir (UH-UL) vertės nuo jų vidutinės vertės nesiskiria daugiau kaip 10 %.

Jei nustatoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, gali būti atmetamos U1 ir S1 arba U8 ir S8 vertės, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:

[pic]

[pic]

Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH vertės. Kaip ir anksčiau turi būti patikrinama, ar alternatyvios geriausio atitikimo tiesės yra lygiagrečios. Jei rezultatas buvo apskaičiuojamas pagal tris lygius, tai turi būti pažymėta galutinėje ataskaitoje.

Kai laikoma, kad tiesės lygiagrečios, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš šių formulių:

keturiems lygiams:

trims lygiams:

[pic]

arba:

[pic].

Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas.

Kai laikoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, nustatymas pakartojamas. Jei lygiagretumo vis tiek nepasiekiama, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal formulę (c). Tačiau gautas rezultatas turi būti laikomas tik apytikriu, ir tai turi būti nurodyta galutinėje ataskaitoje.

10. PAKARTOJAMUMAS

Skirtumas tarp dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analitikui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu bandiniu, neturi viršyti:

- 0,5 mg/kg absoliučiu dydžiu, kai flavofosfolipolio kiekis 1-2 mg/kg,

- 25 % didžiausios vertės, kai flavofosfolipolio kiekis 2-10 mg/kg,

- 20 % didžiausios vertės, kai flavofosfolipolio kiekis 10-25 mg/kg,

- 5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai flavofosfolipolio kiekis 25-50 mg/kg,

- 10 % didžiausios vertės, kai flavofosfolipolio kiekis didesnis kaip 50 mg/kg.

3. GELEŽIES, VARIO, MANGANO IR CINKO MIKROELEMENTŲ NUSTATYMAS

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas geležies, vario, mangano ir cinko mikroelementų kiekis pašaruose. Apatinė nustatymo riba:

geležies (Fe): 20 mg/kg,

vario (Cu): 10 mg/kg,

mangano (Mn): 20 mg/kg,

cinko (Zn): 20 mg/kg.

2. METODO ESMĖ

Mėginys po organinės medžiagos (jei ji buvo) sudeginimo ištirpinamas druskos rūgštyje. Po atitinkamo praskiedimo geležis, varis, manganas ir cinkas nustatomi atominės absorbcijos analizės metodu.

3. REAGENTAI

Įvadinės pastabos

Reagentams ir analizei skirtiems tirpalams ruošti reikia naudoti vandenį, kuriame nebūtų nustatomų katijonų, todėl vanduo du kartus distiliuojamas distiliatoriuje iš borosilikatinio ar kvarcinio stiklo arba du kartus apdorojamas jonitine derva.

Reagentai turėtų būti bent analiziškai gryni (a. g.). Nustatomų elementų nebuvimas turi būti tikrinamas tuščiuoju bandymu. Prireikus reagentai turi būti papildomai gryninami.

Vietoje žemiau aprašomų standartinių tirpalų galima naudoti prekyboje esančius standartinius tirpalus, jei tik jie turi garantiją ir buvo prieš naudojimą patikrinti.

3.1. Druskos rūgštis a. g. ( = 1,19 g/ml).

3.2. Druskos rūgštis a. g. (6 N).

3.3. Druskos rūgštis a. g. (0,5 N).

3.4. Vandenilio fluoridas 38-40 % (v/v) tirpalas, kuriame geležies būtų mažiau kaip 1 mg litre, o likučio po išgarinimo masė (sulfato pavidalu) mažesnė kaip 10 mg litre.

3.5 Sieros rūgštis a. g. ( = 1,84 g/ml).

3.6. Vandenilio peroksidas a. g. (išskiriantis maždaug 100 tūrių deguonies (30 % masės)).

3.7. Standartinis geležies tirpalas (1 000 g Fe/ml) ruošiamas tokiu būdu: 1 g geležies vielos (a. g.) ištirpinama 200 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2), įpilama 16 ml vandenilio peroksido (3.6) ir gautas tirpalas vandeniu praskiedžiamas iki 1 litro.

3.7.1. Darbinis standartinis geležies tirpalas (100 g Fe/ml) ruošiamas standartinį tirpalą (3.7) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9.

3.8. Standartinis vario tirpalas (1 000 g Cu/ml) ruošiamas tokiu būdu: 1 g vario miltelių (a. g.) užpilama 25 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2), įpilama 5 ml vandenilio peroksido (3.6) ir gautas tirpalas vandeniu praskiedžiamas iki 1 litro.

3.8.1. Darbinis standartinis vario tirpalas (10 g Cu/ml) ruošiamas standartinį tirpalą (3.8) skiedžiant vandeniu santykiu 1:9. Taip gautas tirpalas dar kartą praskiedžiamas vandeniu santykiu 1: 9.

3.9. Standartinis mangano tirpalas (1 000 g Mn/ml) ruošiamas tokiu būdu: 1 g mangano miltelių (a. g.) ištirpinama 25 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2) ir gautas tirpalas vandeniu praskiedžiamas iki 1 litro.

3.9.1. Darbinis standartinis mangano tirpalas (10 g Mn/ml) ruošiamas standartinį tirpalą (3.9) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9. Taip gautas tirpalas dar kartą praskiedžiamas vandeniu santykiu 1: 9.

3.10. Standartinis cinko tirpalas (1 000 g Zn/ml) ruošiamas tokiu būdu: 1 g cinko strypelio arba lapelių (a. g.) ištirpinama 25 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2) ir gautas tirpalas vandeniu praskiedžiamas iki 1 litro.

3.10.1. Darbinis standartinis cinko tirpalas (10 g Zn/ml) ruošiamas standartinį tirpalą (3.10) skiedžiant vandeniu santykiu 1: 9. Taip gautas tirpalas dar kartą praskiedžiamas vandeniu santykiu 1: 9.

3.11. Lantano chlorido tirpalas ruošiamas tokiu būdu: 12 g lantano oksido ištirpinama 150 ml vandens, įpilama 100 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2) ir praskiedžiama vandeniu iki 1 litro.

4. ĮRANGA

4.1. Mufelinė krosnis su termorele ir registratoriumi.

4.2. Stikliniai indai turi būti pagaminti iš atsparaus borosilikatinio stiklo, rekomenduojami naudoti tik mikroelementams nustatyti.

4.3. Platininis tiglis ir (pasirinktinai) kvarcinis tiglis.

4.4. Spektrofotometras atominei absorbcinei analizei atlikti, atitinkantis metodo reikalavimus, keliamus prietaiso jautrumui ir tikslumui nustatomų koncentracijų intervale.

5. DARBO PROCEDŪRA

5.1. Organinės medžiagos mėginiai

5.1.1. Mėginio sudeginimas ir analizei skirto tirpalo ruošimas (*) [16]

i) 5-10 g mėginio, pasverto 0,2 mg tikslumu, įdedama į platininį arba kvarcinį tiglį (4.3) (žr. (b) pastabą), džiovinama 105 °C temperatūroje džiovinimo spintoje, po to tiglis dedamas į šaltą mufelinę krosnį (4.1). Krosnis uždaroma (žr. (c) pastabą) ir temperatūra joje per maždaug 90 minučių laipsniškai pakeliama iki 450-475 °C. Tokioje temperatūroje tiglis laikomas 4-16 valandų (pvz., per naktį), kad sudegtų visos organinės medžiagos, po to krosnis atidaroma ir leidžiama jai ataušti (žr. (d) pastabą).

Tiglio turinys išplaunamas į cheminę stiklinę, tam sunaudojant maždaug 5 ml druskos rūgšties (3.1), kuri pilama lėtai ir atsargiai (dėl CO2 skyrimosi gali vykti audringa reakcija). Druskos rūgštis (3.1) į stiklinę lašinama maišant tirpalą tol, kol nustoja skirtis dujų burbuliukai. Išgarinama iki sauso likučio, kartais pamaišant stikline lazdele.

Toliau į likutį įpilama 15 ml 6 N druskos rūgšties (3.2) ir apie 120 ml vandens. Maišoma stikline lazdele, kuri turi būti palikta cheminėje stiklinėje, stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu. Stiklinės turinys lėtai užverdamas ir virinamas tol, kol matosi, kad daugiau pelenų nebeištirpsta. Filtruojama per bepelenį filtrą ir filtratas supilamas į 250 ml matavimo kolbą. Cheminė stiklinė ir filtras plaunami 5 ml karšto 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2) ir du kartus verdančiu vandeniu. Matavimo kolbos turinys praskiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija maždaug 0,5 N).

ii) Jei likutis ant filtro yra juodas (anglis), filtras vėl dedamas į krosnį ir sudeginamas 450-475 °C temperatūroje. Šis sudeginimas, kuris atliekamas tik kelias valandas (tris - penkias valandas), užbaigiamas, kai pelenai tampa balti arba beveik balti. Likutis tirpinamas maždaug 2 ml druskos rūgšties (3.1), garinamas iki sauso likučio ir įpilama 5 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2). Pakaitinama, tirpalas filtruojamas į matavimo kolbą ir praskiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija yra apie 0,5 N).

Pastabos:

a) nustatant mikroelementus, svarbu visą laiką turėti omenyje užteršimo, ypač cinku, variu ir geležimi, pavojų. Dėl šios priežasties įrangoje, kuri naudojama mėginiams ruošti, šių elementų turi nebūti.

Bendram užteršimo pavojui sumažinti dirbama dulkių neturinčioje aplinkoje su ypatingai švaria įranga ir rūpestingai išplautais stikliniais indais. Įvairių rūšių užteršimai, pvz., nuo stiklinių indų, reagentų, dulkių ir t. t., ypač veikia cinko nustatymą;

b) sudeginamo mėginio masė apskaičiuojama pagal apytikrį mikroelementų kiekį pašaruose, atsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro jautrumą. Kai kuriems pašarams, kuriuose mikroelementų mažai, gali prireikti 10-20 g masės mėginio ir gaminti iš jo tik 100 ml tūrio galutinį tirpalą;

c) sudeginimas turi būti atliekamas uždarytoje krosnyje, nepučiant oro arba deguonies;

d) pirometro rodoma temperatūra turi neviršyti 475 °C.

5.1.2. Spektrofotometrinis nustatymas

5.1.2.1. Kalibracinių tirpalų ruošimas

Kiekvienam nustatomam elementui iš darbinių standartinių tirpalų, nurodytų 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ir 3.10.1 punktuose, ruošiama eilė kalibracinių tirpalų, kurių kiekvieno HCl koncentracija yra apie 0,5 N, o lantano chlorido koncentracija (geležies, mangano ir cinko atveju) atitinka 0,1 % (m/v) La koncentraciją. Pasirenkamos mikroelementų koncentracijos turi būti naudojamo spektrofotometro jautrumo ribose. Toliau kaip pavyzdys pateikiamose lentelėse rodoma kalibruoti naudojamų tirpalų sudėčių tipiški intervalai, tačiau, atsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro tipą ir jautrumą, gali prireikti pasirinkti kitas koncentracijas.

Geležis

g Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5

ml darbinio standartinio tirpalo (3.7.1) (1 ml = 100 g Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5

+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7

+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir vandeniu praskiedžiama iki 100 ml.

Varis

g Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

ml darbinio standartinio tirpalo (3.8.1) (1 ml = 10 g Cu) 0 1 2 4 6 8 10

+ ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8

Vandeniu praskiedžiama iki 100 ml.

Manganas

g Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

ml darbinio standartinio tirpalo (3.9.1) (1 ml = 10 g Mn) 0 1 2 4 6 8 10

+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7

+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir vandeniu praskiedžiama iki 100 ml.

Cinkas

g Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8

ml darbinio standartinio tirpalo (3.10.1) (1 ml = 10 g Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8

+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7

+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir vandeniu praskiedžiama iki 100 ml.

5.1.2.2. Tirpalo paruošimas analizei

Variui nustatyti pagal 5.1.1 punktą paruoštas tirpalas paprastai gali būti naudojamas tiesiogiai. Jei reikia, kad jo koncentracija būtų kalibruoti naudojamų tirpalų koncentracijų intervale, alikvotinė tirpalo dalis pipete paimama į 100 ml matavimo kolbą ir praskiedžiama iki žymės 0,5 N druskos rūgšties tirpalu (3.3).

Geležiai, manganui ir cinkui nustatyti pagal 5.1.1 punktą paruošto tirpalo alikvotinė dalis pipete paimama į 100 ml matavimo kolbą, įpilama 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir praskiedžiama iki žymės 0,5 N druskos rūgšties tirpalu (3.3). Taip pat žr. 8 punktą "Pastaba").

5.1.2.3. Tuščiasis bandymas

Tuščiąjį bandymą turi sudaryti visos nurodytos metodikos pakopos, išskyrus tai, kad nededama mėginio.

Matavimas, atliktas su kalibraciniu tirpalu "0", negali būti vertinamas kaip tuščiasis bandymas.

5.1.2.4. Atominės absorbcijos matavimas

Matuojama kalibracinių ir analizuojamo tirpalo atominė absorbcija, naudojant oro-acetileno oksiduojančiąją liepsną, esant tokiems bangų ilgiams:

Fe: 248,3 nm,

Cu: 324,8 nm,

Mn: 279,5 nm,

Zn: 213,8 nm.

Kiekvienas matavimas atliekamas keturis kartus.

5.2. Mineraliniai pašarai

Jei mėginyje nėra organinių medžiagų, sudeginimas prieš analizę nereikalingas. Daroma kaip aprašyta 5.1.1 (i) punkte, pradedant nuo antrosios pastraipos. Galima praleisti išgarinimo su fluoro vandenilio rūgštimi pakopą.

6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Naudojant kalibracinę kreivę, apskaičiuojam mikroelementų koncentracija analizuojamame tirpale ir rezultatas išreiškiamas mikroelemento mg kiekiu vienam mėginio kilogramui (milijonosiomis dalimis).

7. PAKARTOJAMUMAS

Skirtumas tarp dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analitikui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu bandiniu, neturi viršyti:

- 5 mg/kg, absoliučia verte, kai nustatomo mikroelemento kiekis ne didesnis kaip 50 mg/kg,

- 10 % didžiausios vertės, kai nustatomo mikroelemento kiekis yra 50-100 mg/kg,

- 10 mg/kg, absoliučia verte, kai nustatomo mikroelemento kiekis yra 100-200 mg/kg,

- 5 % didžiausios vertės, kai nustatomo mikroelemento kiekis yra didesnis kaip 200 mg/kg.

8. PASTABA

Dideli fosfatų kiekiai gali trukdyti nustatyti geležį, manganą ir cinką. Toks trukdis gali būti pašalintas, įpilant lantano chlorido tirpalo (3.11). Tačiau, jeigu masių santykis (Ca + Mg)/P = 2, lantano chlorido tirpalo (3.11) į tiriamus ir etaloninius tirpalus galima nepilti.

_______

[1] OL L 170, 1970 8 3, p. 2.

[2] OL L 15 5, 1971 7 12, p. 13.

[3] OL L 279, 1971 12 20, p. 7.

[4] OL L 123, 1972 5 29, p. 6.

[5] OL L 83, 1973 3 30, p. 21.

[6] OL L 108, 1974 4 22, p. 7.

[7] OL L 32, 1975 2 5, p. 26.

[8] OL L 102, 1976 4 15, p. 8.

[9] (*) 1 mg pašarinio cinko bacitracino atitinka 42 tarptautinius vienetus (T.V.).

[10] (a) Gali būti taikomi kiti metodai, jei nustatyta, kad jais gaunamos panašios sporų suspensijos.

[11] (b) Gali būti naudojama bet kuri prekyboje esanti mitybinė terpė, su kuria gaunami tokie patys rezultatai.

[12] Gali būti taikomi kiti metodai, jei nustatoma, kad gaunamos panašios bakterijų suspensijos.

[13] Gali būti naudojama bet kuri prekyboje esanti panašios sudėties mitybinė terpė, su kuria būtų gaunami tokie patys rezultatai, pvz., oksoidinė antibiotiko terpė 1 (CM 327), pridedant oksoidinio agaro Nr. 3 (L 13).

[14] Gali būti naudojama bet kuri prekyboje esanti panašios sudėties mitybinė terpė, su kuria būtų gaunami tokie patys rezultatai, pvz., oksoidinė antibiotiko terpė 2 (CM 335), pridedant oksoidinio agaro Nr. 3 (L 13).

[15] Pvz., SE 2, gaunamas iš Wacker Chemie GmbH, Miunchene.

[16] (*) Žaliuose pašaruose (šviežiuose arba džiovintuose) galima rasti daug augalinio silicio dioksido, kuriame gali būti mikroelementų, todėl jis turi būti pašalintas. Taigi tokios rūšies bandiniams turi būti taikoma tokia pakeista metodika.

Veiksmai pagal 5.1.1 punktą atliekami iki filtravimo. Filtro popierius su netirpiu likučiu du kartus plaunamas verdančiu vandeniu ir dedamas į platininį tiglį (4.3). Filtras sudeginamas mufelinėje krosnyje (4.1) žemesnėje kaip 550 oC temperatūroje, kol visiškai išnyksta anglinė medžiaga. Paliekama ataušti, įlašinami keli lašai vandens, po to 10-15 ml vandeninio vandenilio fluorido rūgšties tirpalo (3.4) ir maždaug 150 oC temperatūroje garinama iki sauso likučio. Jei likutyje dar lieka kažkiek silicio dioksido, likutis pakartotinai tirpinamas keliuose mililitruose vandenilio fluorido rūgšties (3.4) ir išgarinamas iki sauso likučio. Įlašinami penki lašai sieros rūgšties (3.5) ir kaitinama, kol nustoja skirtis balti dūmai. Įpylus 5 ml 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2) ir apie 30 ml vandens, tirpalas pašildomas, filtruojamas į 250 ml matavimo kolbą ir praskiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija apie 0,5 N). Toliau tęsiama nuo 5.13 punkto.

[pic] ,