02009R0152 — LT — 26.04.2017 — 005.001

Šis tekstas yra skirtas tik informacijai ir teisinės galios neturi. Europos Sąjungos institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį. Autentiškos atitinkamų teisės aktų, įskaitant jų preambules, versijos skelbiamos Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje ir pateikiamos svetainėje „EUR-Lex“. Oficialūs tekstai tiesiogiai prieinami naudojantis šiame dokumente pateikiamomis nuorodomis

iš dalies keičiamas:

▼B

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 152/2009

2009 m. sausio 27 d.

nustatantis oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos ėminių ėmimo ir analizės metodus

(Tekstas svarbus EEE)

▼M3

1 straipsnis

Ėminių ėmimas oficialiai pašarų kontrolei, visų pirma susijusiai su sudedamųjų dalių, įskaitant medžiagą, kurios sudėtyje yra genetiškai modifikuotų organizmų (toliau – GMO) arba kuri yra iš jų sudaryta arba iš jų pagaminta, pašarų priedų, kaip apibrėžta Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 1831/2003 ( 1 ), nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Europos Parlamento ir Tarybos direktyvoje 2002/32/EB ( 2 ), nustatymu, atliekamas laikantis I priede nurodytų metodų.

I priede nurodytas ėminių ėmimo metodas taikomas pašarų kontrolei, susijusiai su pesticidų likučių nustatymu, kaip apibrėžta 2005 m. vasario 23 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 396/2005 ( 3 ), ir atitikties kontrolei pagal Reglamentą (ES) Nr. 619/2011.

▼B

2 straipsnis

Ėminiai analizei ruošiami ir rezultatų išraiška pateikiama pagal II priede aprašytus metodus.

3 straipsnis

Oficialiai pašarų kontrolei skirta analizė atliekama, taikant metodus, aprašytus III priede (Analizės metodai, taikomi pašarinių medžiagų ir kombinuotųjų pašarų sudėčiai kontroliuoti), IV priede (Analizės metodai leidžiamų pašarų priedų koncentracijai kontroliuoti), V priede (Analizės metodai nepageidaujamoms medžiagoms pašaruose kontroliuoti) ir VI priede (Analizės metodai gyvūninės kilmės sudedamosioms dalims nustatyti atliekant oficialiąją pašarų kontrolę).

4 straipsnis

Paukščių kombinuotųjų pašarų energinė vertė apskaičiuojama pagal VII priedą.

5 straipsnis

VIII priede aprašyti analizės metodai, skirti daugiau neleidžiamų naudoti pašarų priedų neteisėtam buvimui kontroliuoti, taikomi patvirtinimo tikslais.

6 straipsnis

Direktyvos 71/250/EEB, 71/393/EEB, 72/199/EEB, 73/46/EEB, 76/371/EEB, 76/372/EEB, 78/633/EEB, 81/715/EEB, 84/425/EEB, 86/174/EEB, 93/70/EEB, 93/117/EB, 98/64/EB, 1999/27/EB, 1999/76/EB, 2000/45/EB, 2002/70/EB ir 2003/126/EB panaikinamos.

Nuorodos į panaikintas direktyvas laikomos nuorodomis į šį reglamentą ir aiškinamos pagal IX priede pateiktas atitikčių lenteles.

7 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja dvidešimtą dieną nuo jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

Jis taikomas nuo 2009 m. rugpjūčio 26 d.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.

▼M3

I PRIEDAS

ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI

1.   TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Ėminiai, skirti oficialiai pašarų kontrolei, imami pagal toliau aprašytus metodus. Taip gauti ėminiai laikomi reprezentatyviosiomis atrinktosiomis dalimis.

Reprezentatyviojo ėminių ėmimo tikslas yra gauti mažą dalį iš partijos tokiu būdu, kad nustatytos šiai daliai būdingos savybės rodytų visos partijos vidutines savybes. Partijos ėminiai sudaromi pakartotinai imant atskiruosius ėminius skirtingose partijos vietose. Atskirieji ėminiai sudedami ir sumaišomi, kad sudarytų jungtinį ėminį, iš kurio dalijant į visumos savybes rodančias dalis paruošiami reprezentatyvieji galutiniai ėminiai.

Jei atliekant regimąjį patikrinimą nustatoma, kad pašarų partijų, iš kurių turi būti paimti mėginiai, kokybė skiriasi nuo kitų tos pačios partijos pašarų, tokios partijos atskiriamos nuo likusių pašarų ir traktuojamos kaip atskira partijos dalies dalis. Jei pašarų neįmanoma padalyti į atskiras partijos dalis, pašarai laikomi viena partija. Tokiais atvejais šis faktas paminimas ėminių ėmimo ataskaitoje.

Jei nustatoma, kad pašarai, iš kurių ėminiai paimti laikantis šio reglamento nuostatų, neatitinka ES reikalavimų, yra tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalis, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

2.   APIBRĖŽTYS

3.   BENDROSIOS NUOSTATOS

4.   APARATAS

5.   KIEKYBINIAI REIKALAVIMAI DĖL ATSKIRŲJŲ ĖMINIŲ SKAIČIAUS

5.1.    Kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai kontroliuojant pašaruose vienodai pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

5.1.1.    Piltiniai kietieji pašarai

5.1.2.    Piltiniai skystieji pašarai

5.1.3.    Supakuoti pašarai

Pašarai (kietieji ir skystieji) gali būti supilti į maišelius, maišus, dėžes, statines ir kt., nurodytus lentelėje kaip pakavimo vienetai. Iš didelių vienetų (≥ 500 kg arba litrų) ėminiai turi būti imami laikantis piltiniams pašarams nustatytų nuostatų (žr. 5.1.1 ir 5.1.2 punktus).

5.1.4.    Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Mažiausiai vienas briketas arba laižalas, iš kurio imamas ėminys, 25 vienetų atrinktajai daliai, bet ne daugiau kaip keturi briketai arba laižalai.

Jei briketai arba laižalai sveria ne daugiau kaip po 1 kg, atskirasis ėminys yra vieno briketo arba vieno laižalo turinys.

5.1.5.    Stambieji pašarai/pašariniai augalai

5.2.    Kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai kontroliuojant pašaruose tikėtinai nevienodai pasiskirsčiusias sudedamąsias dalis ar medžiagas

Šie kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai taikytini tokiomis aplinkybėmis:

Jei kompetentinga kontrolės institucija pagrįstai įtaria, kad toks nevienodas pasiskirstymas taip pat galimas kryžminės taršos sudedamąja dalimi arba kombinuotųjų pašarų medžiaga atveju, gali būti taikomi lentelėje toliau nurodyti kiekybiniai reikalavimai.

5.3.    Labai didelėms partijoms taikomi kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai

Jei atrinktosios dalys yra didelės (> 500 tonų), imtinų atskirųjų ėminių skaičius = 40 atskirųjų ėminių + tonų skaičiaus kvadratinė šaknis, kai atliekama vienodai pašaruose pasiskirsčiusių medžiagų arba produktų kontrolė, arba 100 atskirųjų ėminių + tonų skaičiaus kvadratinė šaknis, kai atliekama greičiausiai nevienodai pasiskirsčiusių sudedamųjų dalių ar medžiagų kontrolė.

6.   KIEKYBINIAI JUNGTINIO ĖMINIO REIKALAVIMAI

7.   KIEKYBINIAI GALUTINIŲ ĖMINIŲ REIKALAVIMAI

Galutiniai ėminiai

Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio analizę. Analizuojamo galutinio ėminio kiekis turi būti ne mažesnis kaip:

8.   ĖMINIŲ ĖMIMO IŠ LABAI DIDELIŲ PARTIJŲ ARBA IŠ PARTIJŲ, KURIOS LAIKOMOS ARBA GABENAMOS TAIP, KAD ĖMINIŲ ĖMIMAS IŠ VISOS PARTIJOS NĖRA ĮMANOMAS, METODAS

8.1.    Bendrieji principai

Jei dėl partijos gabenimo arba laikymo būdo neįmanoma paimti atskirųjų ėminių iš visos partijos, tokių partijų ėminius reikėtų imti tuomet, kai partija juda srautu.

Didelių sandėlių, skirtų laikyti pašarus, atveju, juos eksploatuojančius subjektus reikėtų paskatinti sandėlyje sumontuoti įrangą, kad būtų galima (automatiškai) imti ėminius iš visos sandėlyje laikomos partijos.

Taikant ėminių ėmimo procedūrą, kaip nurodyta 8 skyriuje, pašarų ūkio subjektui arba jo atstovui pranešama apie ėminių ėmimo procedūrą. Jei pašarų ūkio subjektui arba jo atstovui kyla abejonių dėl šios ėmimo procedūros, pašarų ūkio subjektas arba jo atstovas leidžia kompetentingai institucijai imti ėminius iš visos partijos ir padengia su tuo susijusias išlaidas.

8.2.    Laivu gabenamos didelės partijos

8.2.1.    Dinaminis ėmimas iš didelių laivu gabenamų partijų

Ėminius iš didelių partijų laivuose geriausia imti tuo metu, kai produktas juda srautu (dinaminis ėmimas).

Ėminiai imami talpų vienetais, kuriuos galima fiziškai atskirti. Vis dėlto talpos viena po kitos iš dalies ištuštinamos, kad po perkėlimo į saugyklas nebeliktų pradinio fizinio atskyrimo. Todėl ėminiai gali būti imami juos fiziškai atskiriant pačioje pradžioje arba jau perkėlus pašarus į saugyklą.

Partijai iškrauti iš laivo gali prireikti kelių dienų. Paprastai ėminiai turi būti imami reguliariu intervalu visą partijos iškrovimo laiką. Vis dėlto, tai ne visada įmanoma ar tinkama, nes valstybinis inspektorius negali būti toje vietoje visą partijos iškrovimo laiką. Todėl ėminius leidžiama imti iš partijos dalies (atrinktosios dalies). Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį.

Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

Net jei oficialus ėminys imamas automatiškai, inspektoriui dalyvauti būtina. Vis dėlto, jei automatinis ėmimas atliekamas vadovaujantis iš anksto nustatytais parametrais, kurių negalima keisti imant ėminius, o atskirieji ėminiai surenkami į talpyklą, kuri užplombuojama apsaugant nuo bet kokių pažeidimų, tuomet inspektoriui būtina dalyvauti tik ėminių ėmimo pradžioje, kiekvieną kartą, kai reikia pakeisti ėminių talpyklą, ir ėminių ėmimo pabaigoje.

8.2.2.    Statinis ėmimas iš laivu gabenamų partijų

Jei ėminiai imami statiniu būdu, turi būti taikoma tokia pati procedūra, kokia numatyta iš viršaus pasiekiamoms laikymo patalpoms (silosinėms) (žr. 8.4.1).

Ėmimas turi būti atliekamas (iš viršaus) pasiekiamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.3.    Ėminių ėmimas iš didelių sandėliuose laikomų partijų

Ėminiai turi būti imami pasiekiamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.4.    Ėminių ėmimas iš laikymo patalpų (silosinių)

8.4.1.    Ėminių ėmimas iš silosinių, (lengvai) pasiekiamų iš viršaus

Ėminiai turi būti imami pasiekiamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.4.2.    Ėminių ėmimas iš silosinių, nepasiekiamų iš viršaus (uždaros silosinės)

8.4.2.1.    Didesnės nei 100 tonų silosinės, kurios yra nepasiekiamos iš viršaus (uždaros silosinės)

Tokiose silosinėse laikomų pašarų ėminių negalima imti statiniu būdu. Jei reikia imti ėminį iš silosinėje laikomų pašarų ir nėra galimybės partijos pajudinti, su silosinę eksploatuojančiu subjektu susitariama, kad jis inspektoriui praneš, kada silosinės turinys bus iškraunamas, kad būtų galima paimti ėminius pašarams judant srautu.

8.4.2.2.    Mažesnės kaip 100 tonų silosinės, kurios yra nepasiekiamos iš viršaus (uždaros silosinės)

Ėmimo procedūros metu į talpyklą paimamas 50–100 kg pašarų kiekis ir iš jo imami ėminiai. Jungtinio ėminio dydis priklauso nuo visos partijos dydžio, o atskirųjų ėminių skaičius yra susijęs su siloso, paimto į talpyklą ėminiams, kiekiu. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.5.    Piltinių pašarų dideliuose uždaruose konteineriuose ėminių ėmimas

Ėminius iš tokių partijų dažnai galima imti tik tuomet, kai partijos yra iškrautos. Tam tikrais atvejais konteinerių neįmanoma iškrauti importo ar kontrolės punkte, todėl ėminiai turėtų būti imami iškrovus konteinerius.

9.   ĖMINIŲ ĖMIMO, RUOŠIMO IR PAKAVIMO INSTRUKCIJOS

9.1.    Bendrosios aplinkybės

Ėminiai turi būti imami ir ruošiami nedelsiant, laikantis atsargumo priemonių, kurios yra būtinos siekiant užtikrinti, kad produktas nepakistų ir nebūtų užterštas. Įrankiai ėminiams imti ir konteinerių, kuriuose jie laikomi, paviršiai turi būti švarūs ir sausi.

9.2.    Atskirieji ėminiai

Atskirieji ėminiai turi būti imami atsitiktinai iš visos atrinktosios dalies ir jie turi būti maždaug vienodo dydžio.

Atskirojo ėminio dydis yra ne mažiau nei 100 g arba 25 g, jei tai yra stambieji pašarai arba pašariniai augalai, kurių yra mažas savitasis svoris.

Jei laikantis 8 punkte nurodytų ėmimo procedūros taisyklių būtina imti mažiau nei 40 atskirųjų ėminių, atskirųjų ėminių dydis nustatomas atsižvelgiant į nustatytą jungtinio ėminio dydį (žr. 6 punktą).

Ėminių ėmimo iš supakuotų pašarų mažų partijų atveju, kai, laikantis kiekybinių reikalavimų, būtina imti ribotą atskirųjų ėminių skaičių, atskirasis ėminys yra vieno pradinio vieneto, kurio turinys yra ne didesnis kaip 1 kg ar 1 litras, turinys.

Jei imami į mažus vienetus (pvz., < 250 g) supakuotų pašarų ėminiai, atskirojo ėminio dydis priklauso nuo vieneto dydžio.

9.2.1.    Piltiniai pašarai

Jei tinka, ėminius galima imti keičiant atrinktosios dalies vietą (kraunant arba iškraunant).

9.2.2.    Supakuoti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių vienetų ėminiams imti, kaip nurodyta 5 skyriuje, kiekvieno vieneto dalis paimama bertuve arba zondu. Prireikus ėminiai imami atskirai ištuštinus vienetus.

9.2.3.    Homogeniniai arba homogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių vienetų ėminiams imti, kaip nurodyta 5 skyriuje, jų turinys prireikus homogenizuojamas ir iš kiekvieno vieneto paimamas tam tikras kiekis.

Atskiruosius ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį.

9.2.4.    Nehomogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių vienetų ėminiams imti, kaip nurodyta 5 skyriuje, ėminiai imami iš skirtingų lygių.

Be to, ėminius galima imti išpilant turinį, tačiau pirmosios dalys turėtų būti išpiltos kaip netinkamos.

Abiem atvejais visas paimto ėminio tūris neturi būti mažesnis kaip 10 litrų.

9.2.5.    Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Atrinkus ėminiams imti reikalingą skaičių pašarų briketų arba laižalų, kaip nurodyta 5 skyriuje, galima imti kiekvieno briketo arba laižalo dalį. Jei įtariama, kad briketas arba laižalas yra nehomogeninis, kaip ėminį galima imti visą briketą arba laižalą.

Jei briketai arba laižalai sveria ne daugiau kaip po 1 kg, atskirasis ėminys yra vieno briketo arba vieno laižalo turinys.

9.3.    Jungtinių ėminių ruošimas

Atskirieji ėminiai sumaišomi, kad būtų gautas vienas jungtinis ėminys.

9.4.    Galutinių ėminių ruošimas

Bendrojo ėminio medžiaga kruopščiai sumaišoma ( 4 ).

9.5.    Ėminių pakavimas

Konteineriai arba pakuotės plombuojami ir ženklinami taip, kad jų nebūtų galima atidaryti, nepažeidus plombos. Visa etiketė turi būti po plomba.

9.6.    Ėminių siuntimas į laboratoriją

Ėminys nedelsiant siunčiamas į paskirtąją kontrolės laboratoriją kartu su analizę atliekančiam asmeniui būtina informacija.

10.   ĮRAŠAI APIE ĖMINIUS

Turi būti daromi įrašai apie visus ėminius, kad vienareikšmiškai būtų galima nustatyti kiekvieną atrinktąją dalį ir jos dydį.

Darant įrašą taip pat nurodomas bet koks nukrypimas nuo šiame reglamente nustatytos ėmimo procedūros.

Su padarytu įrašu gali susipažinti oficiali kontrolės laboratorija, įrašas taip pat pateikiamas pašarų ūkio subjektui ir (arba) pašarų ūkio subjektui paskirtai laboratorijai.

II PRIEDAS

BENDROSIOS NUOSTATOS DĖL PAŠARŲ ANALIZĖS METODŲ

A.   ĖMINIŲ RUOŠIMAS ANALIZEI

1.    Tikslas

Toliau aprašytos procedūros taikomos analizei ruošiant į kontrolės laboratorijas atsiųstus ėminius, paimtus pagal I priede pateiktas nuostatas.

Šie laboratoriniai ėminiai turi būti ruošiami taip, kad pagal analizės metodą sverti numatyto kiekio ėminiai būtų homogeniniai ir atitiktų galutinius ėminius.

2.    Taikytinos atsargumo priemonės

Ėminių ruošimo procedūra, kurios reikia laikytis, priklauso nuo taikomo analizės metodo ir nuo tikrintinų sudedamųjų dalių ir medžiagų. Todėl labai svarbu užtikrinti, kad ėminių ruošimo procedūra atitiktų taikomą analizės metodą ir tikrintinas sudedamąsias dalis ar medžiagas.

Visi būtini veiksmai turi būti atlikti taip, kad kiek įmanoma būtų išvengta ėminio užteršimo ir jo sudėties pokyčių.

Malama, maišoma ir sijojama nedelsiant, kad ėminį kuo mažiau veiktų oras ir šviesa. Nenaudojami malūnėliai ir smulkintuvai, kurie gali gerokai įkaitinti ėminį.

Šilumai ypač jautrių pašarų ėminius rekomenduojama malti rankiniu būdu. Be to, užtikrinama, kad pati aparatūra nebūtų užteršimo šaltiniu.

Jei ruošiant ėminį neįmanoma užtikrinti, kad gerokai nepakistų jo drėgmės kiekis, jis nustatomas prieš ėminio ruošimą ir jį paruošus pagal III priedo A dalyje nurodytą metodą.

3.    Procedūra

3.1.    Bendroji procedūra

Tiriamoji alikvotinė dalis paimama iš galutinio ėminio. Kūgio supylimo ir ketvirčiavimo metodas nerekomenduojamas, nes gali būti gautos alikvotinės dalys su didele dalijimo paklaida.

3.1.1.    Pašarai, kuriuos galima malti be paruošimo

3.1.2.    Pašarai, kurie prieš malant džiovinami

3.1.3.    Skystieji arba pusiau skysti pašarai

3.1.4.    Kiti pašarai

3.2.    Speciali procedūra atliekant regimąjį patikrinimą, tiriant mikroskopu arba tais atvejais, kai visas jungtinis ėminys yra homogenizuotas

4.    Ėminių laikymas

Ėminiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Vitaminų analizei skirti ėminiai arba šviesai ypač jautrūs ėminiai laikomi tokiomis sąlygomis, kad ėminio neigiamai nepaveiktų šviesa.

B.   NUOSTATOS DĖL ANALIZĖS METODAMS NAUDOJAMŲ REAGENTŲ IR APARATŪROS

C.   ANALIZĖS METODŲ TAIKYMAS IR REZULTATŲ IŠRAIŠKA

1.    Ekstrahavimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra ekstrahavimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta ekstrahavimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gautas ekstrahavimo veiksmingumas atitinka metodu nustatytos procedūros veiksmingumą.

2.    Gryninimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra gryninimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta gryninimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gauti analizės rezultatai atitinka rezultatus, gautus taikant metodu nustatytą procedūrą.

3.    Nustatymų skaičius

Jei analizuojant nepageidaujamas medžiagas, pirmojo nustatymo rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Du nustatymai, atsižvelgus į matavimo neapibrėžtį, yra naudojami atitikčiai patikrinti.

Jei atliekant nurodyto medžiagos arba sudedamosios dalies kiekio kontrolę, pirmojo nustatymo rezultatas patvirtina nurodytą kiekį, t. y. analizės rezultatas atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Du nustatymai, atsižvelgus į matavimo neapibrėžtį, yra naudojami atitikčiai patikrinti.

Kai kuriais atvejais priimtinas nuokrypis yra nustatytas teisės aktuose, kaip antai 2009 m. liepos 13 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 767/2009 dėl pašarų tiekimo rinkai ir naudojimo, iš dalies keičiančiame Reglamentą (EB) Nr. 1831/2003 ir panaikinančiame Direktyvas 79/373/EEB, 80/511/EEB, 82/471/EEB, 83/228/EEB, 93/74/EEB, 93/113/EEB, 96/25/EB bei Komisijos sprendimą 2004/217/EB ( 7 ).

4.    Taikyto analizės metodo pateikimas ataskaitoje

Analizės ataskaitoje nurodomas taikytas analizės metodas.

5.    Analizės rezultato pateikimas ataskaitoje

Analizės rezultatas turi būti išreikštas analizės metode nustatytu būdu; nurodant atitinkamą reikšminių skaitmenų skaičių ir prireikus darant pataisą dėl drėgmės kiekio galutiniame ėminyje prieš ruošimą.

6.    Matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant nepageidaujamų medžiagų analizę

Dėl nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Direktyvoje 2002/32/EB, laikoma, kad gyvūnų pašarams skirtas produktas neatitinka nustatyto didžiausio kiekio, jei manoma, kad su pašaru, kurio drėgmės kiekis yra 12 %, susijęs analizės rezultatas viršija didžiausią kiekį, įskaitant išplėstinę matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą. Atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija, atlikus išgavos dydžio pataisą ir atėmus išplėstinę matavimo neapibrėžtį. Ši procedūra taikoma tais atvejais, kai galima įvertinti analizės metodo matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą (tai, pvz., neįmanoma, kai atliekama mikroskopinė analizė).

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį):

Tačiau jei analizės rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė ir jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros, o analizės tikslas yra tik patikrinti atitiktį teisinėms nuostatoms, analizės rezultatą būtų galima pateikti ataskaitoje be išgavos dydžio pataisos ir išgavos dydžio bei matavimo neapibrėžties tais atvejais galima nenurodyti.

▼B

III PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI, TAIKOMI PAŠARINIŲ MEDŽIAGŲ IR KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ SUDĖČIAI KONTROLIUOTI

A.   DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų drėgmės kiekį. Jei pašarai turi lakiųjų medžiagų, pvz., organinių rūgščių, reikia turėti omenyje, kad nustatant drėgmės kiekį nustatomas didelis kiekis lakiųjų medžiagų.

Jis netaikomas analizuojant pieno produktus kaip pašarus, mineralines medžiagas ir mišinius, kuriuos iš esmės sudaro mineralinės medžiagos, gyvūninius ir augalinius riebalus bei aliejus arba aliejingąsias sėklas ir vaisius.

2.   Metodas

Ėminys džiovinamas nurodytomis sąlygomis, kurios priklauso nuo pašarų tipo. Masės sumažėjimas nustatomas sveriant. Tiriant kietuosius pašarus, kurių drėgmės kiekis didelis, būtina atlikti pradinį džiovinimą.

3.   Aparatūra

4.   Procedūra

4.1   Ėminių ruošimas

4.1.1    Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.1.2 ir 4.1.3

Paimama bent 50 g ėminio. Prireikus ėminys susmulkinamas arba sumalamas taip, kad būtų išvengta drėgmės kiekio pokyčio (žr. 6).

4.1.2    Javai ir kruopos

Paimama bent 50 g ėminio. Susmulkinama į daleles, kurių bent 50 % išbyra per 0,5  mm akučių sietą ir ant 1 mm skersmens apvalių akučių sieto lieka ne daugiau kaip 10 %.

4.1.3    Skysti ar pastų tipo pašarai, kuriuos daugiausia sudaro aliejai ir riebalai

Maždaug 25 g ėminio pasveriama 10 mg tikslumu, įdedamas reikiamas kiekis sauso smėlio, pasverto 10 mg tikslumu, ir maišoma tol, kol gaunamas vienalytis produktas.

4.2   Džiovinimas

4.2.1    Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.2.2 ir 4.2.3

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 1 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 103 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama keturias valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 103 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

Jei pašarus daugiausia sudaro aliejai ir riebalai, džiovinama spintoje dar 30 min 130 oC temperatūroje. Dviejų svėrimo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1  % drėgmės kiekio.

4.2.2    Javai, miltai, kruopos ir rupūs miltai

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5  mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 130 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama dvi valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 130 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5  mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į vakuuminę džiovinimo spintą (3.5), įkaitintą iki 80–85 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje.

Slėgis sumažinamas iki 100 mm Hg stulpelio ir tokiame slėgyje keturias valandas džiovinama karšto sauso oro srove arba džiovikliu (20 ėminių reikia apie 300 g). Pastaruoju atveju, pasiekus nurodytą slėgį, vakuuminis siurblys išjungiamas. Džiovinimo trukmė skaičiuojama nuo to momento, kai džiovinimo spintos temperatūra vėl pakyla iki 80–85 oC. Džiovinimo spintos slėgis atsargiai padidinamas iki atmosferos slėgio. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Džiovinama dar 30 min vakuuminėje džiovinimo spintoje 80–85 oC temperatūroje ir dar kartą pasveriama. Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1  % drėgmės kiekio.

4.3   Pradinis džiovinimas

4.3.1    Pašarai, išskyrus išvardytus 4.3.2

Kietieji labai drėgni pašarai, kuriuos sunku susmulkinti, turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5  cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu (prireikus presuotus arba į gabalus sulipusius pašarus galima kažkiek sutrupinti). Džiovinama džiovinimo spintoje 60–70 oC temperatūroje tol, kol drėgmės kiekis nesumažėja iki 8–12 %. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas valandą vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.1, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.1 arba 4.2.3, atsižvelgiant į pašarų tipą.

4.3.2    Javai

Javai, kurių drėgmės kiekis didesnis nei 17 % turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5  cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu. 5–7 min džiovinama džiovinimo spintoje 130 oC temperatūroje. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas dvi valandas vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.2, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.2.

5.   Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio masės procentais (X) apskaičiuojamas pagal šias formules:

5.1   Džiovinimas, kai netaikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

5.2   Džiovinimas, kai taikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

5.3   Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečių matavimų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 0,2  % drėgmės kiekio absoliučiosios vertės.

6.   Pastaba

Jei paaiškėja, kad ėminį būtina susmulkinti, ir pastebima, kad produkto drėgmės kiekis pakito, pašarų komponentų analizės rezultatus reikia perskaičiuoti pagal pradinės būklės ėminio drėgmės kiekį.

B.   GYVŪNINIŲ IR AUGALINIŲ RIEBALŲ BEI ALIEJŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvūninės ir augalinės kilmės riebaluose bei aliejuose.

2.   Metodas

Ėminys džiovinamas 103 oC temperatūroje iki pastoviosios masės (masės sumažėjimas tarp dviejų paeiliui atliekamų svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg). Nuodžiūvis nustatomas sveriant.

3.   Aparatūra

4.   Procedūra

Į sausą pasvertą indą (3.1), į kurį įdėtas termometras (3.2), 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuoto ėminio. Nuolat maišant termometru, kaitinama ant smėlio vonios arba kaitlentės (3.3) taip, kad maždaug per 7 min temperatūra pasiektų 90 oC.

Kaitinimas sumažinamas, stebint, kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai. Temperatūra turi būti ne aukštesnė kaip 105 oC. Maišoma toliau, braukiant per indo dugną tol, kol nebesusidaro burbuliukų.

Siekiant užtikrinti visišką drėgmės pašalinimą, dar keletą kartų kaitinama iki 103 oC ± 2 oC, kaskart tarp kaitinimų atvėsinant ėminį iki 93 oC. Tada paliekama eksikatoriuje (3.4) atvėsti iki kambario temperatūros ir pasveriama. Šis veiksmas kartojamas tol, kol ėminio svoris tarp iš eilės atliekamų kaitinimo veiksmų sumažėja ne daugiau kaip 2 mg.

5.   Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio procentine dalimi (X) apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

Mažesni nei 0,05  % rezultatai turi būti užrašomi kaip „mažiau nei 0,05  %“.

Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečiai atliktos drėgmės kiekio analizės rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,05  % absoliučiąja verte.

C.   ŽALIŲ BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių baltymų kiekį pašaruose pagal Kjeldalio metodu nustatomą azoto kiekį.

2.   Metodas

Ėminys skaidomas sieros rūgštimi esant katalizatoriui. Rūgštus tirpalas šarminamas natrio hidroksido tirpalu. Gautas amoniakas distiliuojamas ir surenkamas žinomame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius titruojamas natrio hidroksido standartiniu tirpalu.

Pagal kitą metodą išsiskyręs amoniakas distiliuojamas į tirpalą su boro rūgšties pertekliumi, tada titruojama vandenilio chlorido rūgšties arba sieros rūgšties tirpalu.

3.   Reagentai

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, į boro rūgšties tirpalus turi būti įdėta metilraudonojo ir bromkrezolio žaliojo indikatorių. Jei ruošiamas 1 litras boro rūgšties tirpalo, prieš skiedžiant iki žymės įpilama 7 ml metilraudonojo indikatoriaus tirpalo (3.16) ir 10 ml bromkrezolio žaliojo tirpalo (3.17).

Priklausomai nuo naudojamo vandens, skirtingų partijų boro rūgšties tirpalų pH vertė gali skirtis. Dažnai būtina koreguoti nedideliu šarmo tirpalo tūriu, kad būtų gautas teigiamas tuščiasis ėminys.

4.   Aparatūra

Aparatūra, tinkama skaidyti, distiliuoti ir titruoti pagal Kjeldalio procedūrą.

5.   Procedūra

5.1   Skaidymas

1 g ėminio pasveriama 0,001  g tikslumu ir ėminys supilamas į skaidymo aparato kolbą. Įdedama 15 g kalio sulfato (3.1) ir atitinkamas kiekis katalizatoriaus (3.2) (0,3 –0,4  g vario oksido arba 0,9 –1,2  g vario (II) sulfato pentahidrato), įpilama 25 ml sieros rūgšties (3.4, prireikus įmetamos kelios pemzos granulės (3.12) ir sumaišoma.

Kolba iš pradžių šildoma, kartkartėmis ją sukiojant, ant nestiprios ugnies tol, kol masė suanglėja ir nelieka putų; tada šildoma stipriau tol, kol tirpalas pradeda nuolat virti. Kaitinimas yra pakankamas, jei verdanti rūgštis kondensuojasi ant kolbos sienelių. Reikia žiūrėti, kad neperkaistų šoninės kolbos sienelės ir prie jų nepriliptų organinių medžiagų dalelių.

Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias, virinama dar dvi valandas, vėliau paliekama atvėsti.

5.2   Distiliavimas

Atsargiai įpilama pakankamai vandens, kad visiškai ištirptų sulfatai. Paliekama atvėsti ir įdedamos kelios cinko granulės (3.3). Tęsiama pagal 5.2.1 arba 5.2.2.

5.2.1    Distiliavimas į sieros rūgštį

Į distiliavimo aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (3.5) arba (3.7) tirpalo, atsižvelgiant į tai, kiek ėminyje galėtų būti azoto. Įlašinami keli lašai metilraudonojo indikatoriaus (3.8).

Skaidymo aparato kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus, kurio antgalis ne mažiau kaip per centimetrą įmerkiamas į surinkimo kolboje esantį skystį (žr. 8.3 pastabą). Neleidžiant amoniakui garuoti (žr. 8.1 pastabą), į kolbą lėtai įpilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Kolba kaitinama tol, kol amoniakas baigiamas distiliuoti.

5.2.2    Distiliavimas į boro rūgštį

Jei amoniakas distiliate titruojamas rankiniu būdu, taikoma toliau nurodyta procedūra. Jei distiliavimo įrenginys yra visiškai automatizuotas, įskaitant amoniako distiliate titravimą, laikomasi gamintojo instrukcijų dėl distiliavimo įrenginio naudojimo.

Surinkimo kolba su 25 ml–30 ml boro rūgšties tirpalo (3.18) statoma po kondensatoriaus išleidžiamuoju antgaliu taip, kad tiekimo vamzdis būtų žemiau boro rūgšties perteklių turinčio tirpalo paviršiaus. Distiliavimo įrenginys nustatomas dozuoti 50 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Distiliavimo įrenginys naudojamas pagal gamintojo instrukcijas ir amoniakas distiliuojamas įpilant natrio hidroksido tirpalo. Distiliatas surenkamas į boro rūgšties tirpalą. Distiliato kiekis (distiliavimo garais trukmė) priklauso nuo azoto kiekio ėminyje. Laikomasi gamintojo instrukcijų.

5.3   Titravimas

Tęsiama pagal 5.3.1 arba 5.3.2.

5.3.1    Sieros rūgštis

Atsižvelgiant į naudotos sieros rūgšties koncentraciją, sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamas natrio šarmo (3.10 arba 3.11) tirpalu tol, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas.

5.3.2    Boro rūgštis

Surinkimo kolbos turinys titruojamas iš biuretės vandenilio chlorido rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.19) arba sieros rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.6) ir užrašomas sunaudoto titranto tūris.

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, ekvivalentinis taškas pasiekiamas, pirmą kartą atsiradus tirpalo rožinei spalvai. Biuretės rodmuo įvertinamas 0,05  ml tikslumu. Apšviesta magnetinė maišyklė arba fotometrinis detektorius gali padėti lengviau pamatyti ekvivalentinį tašką.

Tai galima atlikti automatiškai, naudojant distiliavimo garais įrenginį su automatiniu titravimu.

Konkretus distiliatorius (titratorius) naudojamas pagal gamintojo instrukcijas.

5.4   Tuščiasis bandymas

Siekiant patvirtinti, kad reagentai neturi azoto, atliekamas tuščiasis bandymas (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), vietoj ėminio naudojant 1 g sacharozės (3.14).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojama pagal 6.1 arba 6.2.

6.1   Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.1

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

6.2   Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.2

6.2.1    Titravimas vandenilio chlorido rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

6.2.2    Titravimas sieros rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

7.   Metodo tikrinimas

7.1   Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų atliekant du lygiagrečius to paties ėminio matavimus, skirtumas neturi būti didesnis nei:

7.2   Tikslumas

Atliekama 1,5 –2,0  g acetanilido (3.13) analizė (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), įdėjus 1 g sacharozės (3.14). 1 g acetilanilido sunaudoja 14,80  ml sieros rūgšties (3.5). Išgavos dydis turi būti ne mažesnis nei 99 %.

8.   Pastabos

D.   KARBAMIDO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti karbamido kiekį pašaruose.

2.   Metodas

Ėminys suspenduojamas vandenyje kartu su skaidrinančiąja medžiaga. Suspensija filtruojama. Dedama 4-dimetilaminobenzaldehido (4-DMAB) ir karbamido kiekis filtrate nustatomas matuojant optinį tankį, esant bangos ilgiui 420 nm.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Ėminio analizė

1 mg tikslumu pasveriama 2 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintų anglių (3.4) supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens ir 5 ml Carrez I (3.2) tirpalo, maždaug 30 s maišoma ir įpilama 5 ml Carrez II (3.3) tirpalo. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas vartytuve. Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės, sumaišomas ir filtruojamas.

Į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais įpilama 5 ml skaidraus bespalvio filtrato, 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1) ir sumaišoma. Mėgintuvėliai statomi į vandens vonią 20 oC (+/- 4 oC) temperatūroje. Po penkiolikos minučių spektrofotometru matuojamas ėminio tirpalo optinis tankis, esant 420 nm bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu naudojamas tuščiam ėminiui ruošti naudojamų reagentų tirpalas.

5.2   Kalibravimo kreivė

Į 100 ml matavimo kolbas įpilama 1, 2, 4, 5 ir 10 ml karbamido tirpalo (3.5) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Paimama po 5 ml kiekvieno tirpalo, į kiekvieną iš jų įpilama 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1), sumaišoma ir, kaip nurodyta anksčiau, matuojamas jų optinis tankis, lyginant su kontroliniu tirpalu, turinčiu 5 ml 4-DMAB ir 5 ml vandens, neturinčio karbamido. Brėžiama kalibravimo kreivė.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal kalibravimo kreivę nustatomas karbamido kiekis ėminyje.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastabos

E.   LAKIŲJŲ AZOTO BAZIŲ NUSTATYMAS

I.   MIKRODIFUZIJOS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančių lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku.

2.   Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos mikrodifuzijos būdu, naudojant kalio karbonato tirpalą, surenkamos boro rūgšties tirpale ir titruojamos sieros rūgštimi.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Pipete įlašinama 1 ml boro rūgšties tirpalo (3.3) į Conway kiuvetės centrinę dalį ir 1 ml ėminio filtrato į kiuvetės išorinį žiedą. Iš dalies uždengiama tepalu suteptu dangčiu. Į išorinį žiedą greitai įlašinama 1 ml sočiojo kalio karbonato tirpalo (3.4) ir uždengiama taip, kad į kiuvetę nepatektų oro. Kiuvetė atsargiai sukiojama apie ašį horizontalioje plokštumoje taip, kad abu reagentai susimaišytų. Inkubuojama kambario temperatūroje bent keturias valandas arba 40 oC temperatūroje vieną valandą.

Lakiosios bazės boro rūgšties tirpale iš mikrobiuretės (4.3) titruojamos 0,01  mol/l sieros rūgštimi (3.5).

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,01  mol/l H2SO4 atitinka 0,34  mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

7.   Pastaba

Jei amoniako kiekis ėminyje didesnis nei 0,6  %, pradinis filtratas skiedžiamas.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II   DISTILIAVIMO METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku, žuvies miltuose, kuriuose beveik nėra karbamido. Jį galima taikyti tik mažesniam nei 0,25  % amoniako kiekiui.

2.   Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos virimo temperatūroje, pridedant magnio oksido, ir surenkamos tam tikrame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius atvirkščiai titruojamas natrio hidroksido tirpalu.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Paimamas skaidraus filtrato kiekis, atitinkantis numatomą lakiųjų azoto bazių kiekį (paprastai reikia 100 ml). Skiedžiama iki 200 ml, įdedama 2 g magnio oksido (3.2) ir įlašinami keli lašai priešpučio emulsijos (3.3). Tirpalas turi būti šarminis pagal lakmusą; priešingu atveju įdedama dar šiek tiek magnio oksido (3.2). Tęsiama pagal analizės metodo, taikomo žalių baltymų kiekiui nustatyti (šio priedo C dalis), 5.2 ir 5.3 punktus.

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,05  mol/l H2SO4 atitinka 1,7  mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 10 % amoniako santykinės vertės.

F.   AMINO RŪGŠČIŲ (IŠSKYRUS TRIPTOFANĄ) NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Naudojant aminorūgščių analizatorių, šiuo metodu galima nustatyti laisvųjų (sintetinių ir gamtinių) amino rūgščių ir suminį (peptidų ir laisvųjų) aminorūgščių kiekį pašaruose. Šis metodas tinka šioms aminorūgštims: cisteinui (cistinui), metioninui, lizinui, treoninui, alaninui, argininui, asparto ir glutamino rūgštims, glicinui, histidinui, izoleucinui, leucinui, fenilalaninui, prolinui, serinui, tirozinui ir valinui.

Šiuo metodu negalima atskirti aminorūgščių druskų ir negalima atskirti aminorūgščių D-ir L-formų. Metodas netinka triptofano arba hidroksigrupę turintiems aminorūgščių analogams nustatyti.

2.   Metodas

2.1   Laisvosios aminorūgštys

Laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Kartu ekstrahuojamos azoto turinčios makromolekulės nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant. Nustatoma filtruoto tirpalo pH vertė 2,20 . Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai vykdant reakciją su ninhidrinu, kai bangos ilgis 570 nm.

2.2   Suminis aminorūgščių kiekis

Pasirinkta procedūra priklauso nuo tiriamų aminorūgščių. Cisteinas (cistinas) ir metioninas prieš hidrolizę turi būti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono. Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų ėminių hidrolizatuose. Visos kitos 1 skirsnyje išvardytos aminorūgštys gali būti nustatomos arba oksiduotuose, arba neoksiduotuose ėminiuose.

Oksidacija atliekama peroksiskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 oC temperatūroje. Oksidacijos reagento perteklius skaidomas natrio disulfitu. Oksiduoti ar neoksiduoti ėminiai 23 valandas hidrolizuojami vandenilio chlorido rūgštimi (3.20). Nustatoma hidrolizatų pH vertė 2,20 . Aminorūgštys atskiriamos taikant jonų mainų chromatografiją ir nustatomos fotometriniu metodu vykdant reakciją su ninhidrinu, esant 570 nm (prolinui – 440 nm).

3.   Reagentai

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba atitinkamos kokybės (elektrinis laidis < 10 μS) vanduo.

300 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

40 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

889 g skruzdžių rūgšties (3.2) sumaišoma su 111 g vandens ir įdedama 4,73  g fenolio (3.3).

įdedama 1 g fenolio (3.3) į 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (3.6) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

Mažoje stiklinėje sumaišoma 0,5  ml vandenilio peroksido (3.1) ir 4,5  ml skruzdžių rūgšties bei fenolio tirpalo (3.19). Laikoma 1 val. 20–30 oC temperatūroje, kad susidarytų peroksiskruzdžių rūgštis, ir prieš supilant į ėminį šaldoma ledo ir vandens vonioje (15 min).

Įspėjimas. Vengiama patekimo ant odos ir dėvimi apsauginiai drabužiai.

maždaug 800 ml vandens ištirpinama 19,61  g natrio citrato (3.8), 5 ml tiodiglikolio (3.9), 1 g fenolio (3.3) ir 16,50  ml HCl (3.7). Nustatoma pH vertė 2,20 . Skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

c = 2,5  μmol/ml kiekvienos rūgšties tirpalas vandenilio chlorido rūgštyje.

Galima naudoti esančius prekyboje.

0,2115  g cistino rūgšties (3.16.2) ir 0,2265  g metionino sulfono (3.16.3) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 1 litro matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių. Šis tirpalas nenaudojamas, jei pradiniame etaloniniame tirpale (3.27.1) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono.

0,6560  g norleucino (3.13) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 250 ml matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 6 mėnesius.

Kiekybiškai supilama į 50 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) ir sumaišoma.

Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

Žr. dar 9.1 pastabą.

Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

4.   Aparatūra

Kolonėlės įkrova – sulfoninto polistireno dervos, galinčios atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių medžiagų. Srautas buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemose reguliuojamas siurbliais, srauto stabilumas – ±0,5  % kalibravimo tirpalo ir ėminio analizės metu.

Su kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima naudoti hidrolizės procedūras, kai hidrolizato natrio jonų koncentracija c = 0,8  mol/l ir jame yra visas po oksidacijos likęs skruzdžių rūgšties perteklius. Kitais analizatoriais negalima tinkamai atskirti tam tikras aminorūgštis, jei hidrolizate yra skruzdžių rūgšties perteklius ir (arba) didelė natrio jonų koncentracija. Tokiu atveju po hidrolizės ir prieš pH nustatymą, rūgšties tūris sumažinamas maždaug iki 5 ml ją garinant. Garinama vakuume ne aukštesnėje nei 40 oC temperatūroje.

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5  mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 oC temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.12).

5.2   Laisvųjų amino rūgščių nustatymas pašaruose ir premiksuose

Į kūginę kolbą 0,2  mg tikslumu pasveriamas atitinkamas paruošto ėminio (5.1) kiekis (1–5 g) ir įpilama 100,0  ml ekstrahavimo mišinio (3.21). Mišinys maišomas 60 min mechanine purtykle arba magnetine maišykle (4.8). Nuosėdoms leidžiama nusėsti ir 10,0  ml tirpalo virš nuosėdų paimama pipete į 100 ml stiklinę.

Maišant įpilama 5,0  ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (3.22) ir maišoma magnetine maišykle 5 min. Tirpalas virš nuosėdų filtruojamas arba centrifuguojamas visoms nuosėdoms pašalinti. 10,0  ml gauto tirpalo įpilama į 100 ml stiklinę, natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 , plaunant citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) supilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą ir citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) skiedžiama iki žymės.

Jei naudojamas vidinis etalonas, įpilama 1,00  ml vidinio etalono (3.27.3) kiekvienam 100 ml gauto tirpalo ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 punktą.

Jei ekstraktai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.3   Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas

5.3.1    Oksidavimas

0,1 –1 g paruošto ėminio (5.1) 0,2  mg tikslumu pasveriama:

Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg, o drėgmės ne daugiau nei 100 mg.

Kolba (butelis) dedama į ledo ir vandens vonią, atšaldoma iki 0 oC, įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (3.23) ir maišoma stikline mentele su lenktu galu. Kolba (butelis) kartu su viduje esančia mentele uždengiama orui nepralaidžia plėvele, ledo ir vandens vonia su taip uždarytu indu dedama į šaldytuvą, kuriame temperatūra 0 oC, ir laikoma jame 16 valandų. Po 16 valandų indas išimamas iš šaldytuvo ir oksidavimo reagento perteklius suskaidomas, pridedant 0,84  g natrio disulfito (3.4).

Tęsiama pagal 5.3.2.1.

5.3.2    Hidrolizė

5.3.2.1    Oksiduotų ėminių hidrolizė

Į oksiduotą ėminį, paruoštą pagal 5.3.1, įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (3.20), nuplaunant prie indo sienelių ir mentelės prilipusius ėminio likučius.

Atsižvelgiant į taikomą procedūrą, tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.2    Neoksiduotų ėminių hidrolizė

Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) ar į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) 0,2  mg tikslumu pasveriama 0,1 –1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg. Atsargiai įpilama hidrolizavimo mišinio (3.20) ir sumaišoma su ėminiu. Tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.3    Hidrolizė atvirame inde

Į kolbą su mišiniu (paruoštu pagal 5.3.2.1 ar 5.3.2.2) įdedami 3 stikliniai rutuliukai ir 23 valandas virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Hidrolizei pasibaigus, kondensatorius išplaunamas 5 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24). Kolba nuimama ir atšaldoma ledo vonioje.

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.2.4    Hidrolizė uždarame inde

Butelis su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 arba 5.3.2.2, dedamas į krosnį (4.3) 110 oC temperatūroje. Kad slėgis nedidėtų (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir būtų išvengta sprogimo, pirmąją hidrolizės valandą užsukamas kamštis dedamas ant indo viršaus. Kamštis neužsukamas. Po valandos kamštis užsukamas ir indas laikomas krosnyje 23 valandas. Hidrolizei pasibaigus, indas išimamas iš krosnies, kamštis atsargiai atsukamas ir butelis statomas į ledo ir vandens vonią. Paliekama atvėsti.

Atsižvelgiant į pH reguliavimo procedūrą (5.3.3), butelio turinys kiekybiškai supilamas į 250 ml stiklinę arba 250 ml apvaliadugnę kolbą, naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24).

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.3    pH reguliavimas

Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (4.9) jautrumą natriui, pH reguliavimas tęsiamas pagal 5.3.3.1 arba 5.3.3.2.

5.3.3.1    Chromatografinės analizės sistemos (4.9), kurioms reikia mažos natrio koncentracijos

Kai naudojami aminorūgščių analizatoriai, kuriems reikia mažos natrio jonų koncentracijos (kai turi būti sumažintas rūgšties tūris), patariama naudoti pradinį vidinio etalono tirpalą (3.27.3).

Šiuo atveju prieš garinimą į hidrolizatą įpilama 2,00  ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3).

Į hidrolizatus, gautus pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, įlašinami 2 lašai 1-oktanolio.

Sukamajame garintuve (4.7) garinant vakuume ir 40 oC temperatūroje, tūris sumažinamas iki 5–10 ml. Jei netyčia tūris sumažėja iki mažesnio nei 5 ml tūrio, hidrolizatas turi būti išpiltas ir analizė atliekama iš naujo.

Natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 ir toliau tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.3.2    Visiems kitiems aminorūgščių analizatoriams (4.9)

Hidrolizatai, gauti pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, iš dalies neutralizuojami atsargiai įpilant 17 ml natrio hidroksido tirpalo (3.17), tirpalą visą laiką maišant ir žiūrint, kad temperatūra būtų žemesnė nei 40 oC.

Kambario temperatūroje nustatoma pH vertė 2,20 , naudojant natrio hidroksido tirpalą (3.17) ir vėliau natrio hidroksido tirpalą (3.18). Tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.4    Ėminio tirpalas chromatografijai

Hidrolizatas, kurio pH vertė nustatyta (5.3.3.1 arba 5.3.3.2), kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24), ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Jei vidinis etalonas dar nebuvo naudotas, įpilama 2,00  ml vidinio etalono (3.27.3) ir iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu (3.24). Gerai sumaišoma.

Atliekama chromatografinė analizė (5.4).

Jei ėminių tirpalai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.4   Chromatografija

Prieš atliekant chromatografinę analizę ekstraktui (5.2) arba hidrolizatui (5.3.4) leidžiama pasiekti kambario temperatūrą. Mišinys kratomas ir filtruojamas per 0,22 μm membraninį filtrą (4.5). Aminorūgščių analizatoriumi (4.9) atliekama gauto skaidraus tirpalo jonų mainų chromatografija.

Įpurkšti galima rankiniu būdu arba automatiškai. Svarbu, kad matuojant etalonus ir ėminius į kolonėlę ± 0,5  % tikslumu būtų įpurškiamas vienodas tirpalo tūris, išskyrus atvejus, kai naudojamas vidinis etalonas, ir kad natrio bei aminorūgščių santykis etalone ir ėminio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis.

Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analizinės sistemos. Etalonas arba ėminys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (3.24), kad etalono smailės plotas sudarytų 30–200 % ėminio aminorūgšties smailės ploto.

Priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus ir dervos tipo, aminorūgščių chromatografija šiek tiek skirsis. Pasirinkta sistema turi atskirti vieną aminorūgštį nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių junginių. Atsakas į kolonėlėje analizuojamų aminorūgščių kiekio pokyčius turi būti tiesinis chromatografinės sistemos naudojimo intervale.

Atliekant chromatografinę analizę, taikomi toliau nurodyti įdubos ir viršūnės aukščių santykiai, kai analizuojamas (nustatomų aminorūgščių) ekvimolinis tirpalas. Šis ekvimolinis tirpalas turi turėti mažiausiai 30 % kiekvienos aminorūgšties, kurią galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizatoriaus sistema (4.9), įkrovos didžiausio kiekio.

Norint atskirti treoniną ir seriną, žemesnės iš dviejų persiklojančių aminorūgščių smailių įdubos ir viršūnės aukščių santykis chromatogramoje neturi būti didesnis nei 2:10 (jei nustatomas tik cisteinas (cistinas), metioninas, treoninas ir lizinas, nepakankamas gretimų smailių atsiskyrimas neigiamai veiktų nustatymui). Visoms kitoms aminorūgštims atskyrimas turi būti geresnis nei 1: 10.

Sistema turi užtikrinti, kad lizinas būtų atskirtas nuo „lizino darinių“ ir ornitino.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Matuojamas ėminio ir etalono kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir apskaičiuojamas kiekis (X) aminorūgšties gramais kg ėminio:

Jei naudojamas vidinis etalonas, dauginama iš:

Oksiduotų ėminių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis, bet apskaičiuojami kaip cistinas (C6H12N2O4S2, M = 240,30  g/mol), naudojant M = 120,15  g/mol (0,5 × 240,30 ).

Metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas oksiduoto ėminio hidrolizatuose, bet apskaičiuojamas kaip metioninas, naudojant metionino M = 149,21  g/mol.

Įdėtas laisvasis metioninas nustatomas po ekstrakcijos kaip metioninas, apskaičiavimui naudojant tą pačią molinę masę.

7.   Metodo įvertinimas

Metodas buvo patikrintas 1990 m. atliekant palyginimą tarptautiniu lygiu, naudojant keturis skirtingus pašarus (mišriuosius kiaulių pašarus, broilerių kombinuotuosius pašarus, baltymų koncentratą, premiksus). Vidurkio ir standartinio nuokrypio rezultatai, gauti atmetus riktus, pateikiami šio punkto lentelėse:

7.1   Pakartojamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo pakartojamumas, išreikštas kaip laboratorijos standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:

7.2   Atkuriamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo atkuriamumas, išreikštas kaip tarplaboratorinis standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:

8.   Pamatinių medžiagų naudojimas

Tinkamas šio metodo taikymas turi būti patikrintas atliekant kartotinius sertifikuotųjų pamatinių medžiagų matavimus, jei jos yra. Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotaisiais aminorūgščių kalibravimo tirpalais.

9.   Pastabos

Prietaiso tiesinio atsako intervalas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims.

Etaloninis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu, kad smailių plotai būtų intervalo viduryje.

G.   TRIPTOFANO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančio triptofano suminį kiekį ir laisvąjį triptofaną. Šiuo metodu D- ir L-formos neatskiriamos.

2.   Metodas

Suminiam triptofanui nustatyti ėminys 20 valandų hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksido tirpalu 110 oC temperatūroje. Po hidrolizės įpilama vidinio etalono.

Laisvajam triptofanui nustatyti ėminys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui.

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3.   Reagentai

40,0  g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

paimama 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

paimama 82 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

paimama 8,2  ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

paimama 34 ml ortofosforo rūgšties (3.6) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2553  g triptofano (3.2), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2728  g α-metiltriptofano (3.3), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

paimama 2,00  ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15) ir 2,00  ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Skiedžiama vandeniu (3.1) ir metanoliu (3.8) iki maždaug tokio pat tūrio ir maždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10–30 %) kaip galutinio hidrolizato tūris ir koncentracija.

Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

Ruošiamas tirpalas saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių.

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Ėminių ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5  mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 C temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.9).

5.2   Laisvojo triptofano nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas kiekis (1–5 g) paruošto ėminio (5.1). Įpilama 100,0  ml vandenilio chlorido rūgšties, c = 0,1  mol/l (3.13) ir 5,00  ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16). 60 min purtoma mechanine purtykle arba maišoma magnetine maišykle (4.7). Nuosėdoms leidžiama nusėsti, pipete paimama į cheminę stiklinę 10,0  ml tirpalo virš nuosėdų. Įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5  mol/l (3.14). Natrio hidroksido tirpalu, c = 1,0  mol/l, (3.10) nustatoma pH vertė 3,0 . Įpilamas pakankamas kiekis metanolio (3.8), kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio, kaip kalibravimo etaloninio tirpalo tūris (3.17)).

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45  μm membraninį filtrą (4.5). Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir ekstraktai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 C temperatūroje.

5.3   Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (4.4) 0,2  mg tikslumu pasveriama 0,1 –1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertojoje ėminio dalyje yra apie 10 mg azoto. Įpilama 8,4  g bario hidroksido oktahidrato (3.4) ir 10 ml vandens. Sumaišoma sūkurine maišykle (4.8) arba magnetine maišykle (4.7). Teflonu padengtas magnetas paliekamas mišinyje. Indo sienelės nuplaunamos 4 ml vandens. Kolba uždengiama užsukamuoju dangčiu jo neužveržiant. Kolba įdedama į autoklavą (4.6) su verdančiu vandeniu ir garais ir laikoma 30–60 min. Autoklavas uždaromas ir 20 valandų kaitinama 110 (± 2) C temperatūroje.

Prieš atidarant autoklavą temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemesnės nei 100 oC. Siekiant išvengti Ba(OH)2 × 8H2O išsikristalizavimo, į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens. Švelniai purtoma arba maišoma. Įpilama 2,00  ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Indai 15 min aušinami ant vandens arba ledo vonios.

Tada įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5  mol/l (3.14). Indą laikant ant aušinamosios vonios ir maišant, turinys neutralizuojama HCl, c = 6 mol/l (3.11), ir HCl, c = 1 mol/l (3.12) nustatoma pH vertė 3,0 . Įpilamas pakankamas kiekis metanolio, kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei reikiamo tūrio (pvz., 100 ml). Įpylus metanolio, nuosėdos nesusidaro.

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45  μm membraninį filtrą (4.5). Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir hidrolizatai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 oC temperatūroje.

5.4   HPLC nustatymas

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos; gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai (žr. dar 9.1 ir 9.2 pastabas):

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojamas triptofano kiekis (X) g 100 g ėminio.

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didesniojo rezultato vertės.

8.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (4-asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 12 laboratorijų analizavo tris ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo parengtas kitas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (3–asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 13 laboratorijų analizavo du ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:

Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas dar vienas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas, kurį atliekant ne daugiau kaip 7 laboratorijos analizavo keturis ėminius. Rezultatai pateikti toliau. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus.

9.   Pastabos

Izokratinis eliuavimas, po kurio kolonėlė plaunama taikant gradientinį eliuavimą:

Chromatografavimo sistemos atsakas darbinių koncentracijos verčių intervale yra tiesinis. Atsako tiesiškumas nustatomas naudojant vieną (normalią) vidinio etalono koncentraciją ir keičiant triptofano koncentraciją. Svarbu, kad triptofano ir vidinio etalono smailės būtų HPLC ir fluorescencinio detektoriaus sistemos tiesinėje dalyje. Jei triptofano ir (arba) vidinio etalono smailė (-s) yra per žemos ar per aukštos, analizė kartojama imant kito dydžio ėminį ir (arba) kitą galutinį tūrį.

Sendamas bario hidroksidas vis blogiau tirpsta. Dėl šios priežasties tirpalas, naudojamas nustatymui HPLC metodu, darosi neskaidrus ir dėl to gali būti gauti mažesni triptofano kiekio rezultatai.

H.   ŽALIŲ ALIEJŲ IR RIEBALŲ NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas žalių aliejų ir riebalų kiekiui pašaruose nustatyti. Metodas netaikomas aliejingosioms sėkloms ir aliejiniams vaisiams.

Atsižvelgiant į pašarų tipą bei sudėtį ir į analizės atlikimo priežastį taikoma viena iš dviejų aprašytų procedūrų.

1.1   A procedūra. Tiesiogiai ekstrahuojami žali aliejai ir riebalai

Šis metodas taikomas augalinės kilmės pašarams, išskyrus pašarus, įtrauktus į B procedūros taikymo sritį.

1.2   B procedūra. Suminis žalių aliejų ir riebalų kiekis

Šis metodas taikomas gyvūninės kilmės pašarams ir visiems kombinuotiesiems pašarams. Šis metodas turi būti taikomas visoms medžiagoms, iš kurių žali aliejai ir riebalai negali būti visiškai ekstrahuoti prieš tai neatlikus jų hidrolizės (pvz., grūdų glitimas, mielės, bulvių baltymai ir produktai, kurie apdorojami taikant procesus, pvz., išspaudimo, dribsnių gamybos ir kaitinimo procesus).

1.3   Rezultatų aiškinimas

Visais atvejais, kai rezultatas, gautas taikant B procedūrą, yra didesnis nei rezultatas gautas pagal A procedūrą, teisingu turi būti laikomas rezultatas, gautas taikant B procedūrą.

2.   Metodas

2.1   A procedūra

Ėminys ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, o likutis džiovinamas ir sveriamas.

2.2   B procedūra

Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi kaitinant. Mišinys atvėsinamas ir filtruojamas. Likutis plaunamas, džiovinamas ir ekstrahuojamas pagal A procedūrą.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   A procedūra (žr. 8.1 punktą)

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, supilama į ekstrahavimo tūtą (4.2) ir užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu.

Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1) ir ekstrahuojama šešias valandas petroleteriu (3.1). Petroleterio ekstraktas surenkamas į pasvertą sausą kolbą su pemzos gabaliukais ( 9 ).

Tirpiklis distiliuojamas. Likutis džiovinamas kolbą laikant džiovinimo spintoje (4.3) pusantros valandos. Kolba atvėsinama eksikatoriuje ir pasveriama. Džiovinama dar 30 min, siekiant patikrinti, ar nekinta riebalų ir aliejų masė (paeiliui sveriant du kartus, masės skirtumas turi būti mažesnis arba lygus 1 mg).

5.2   B procedūra

2,5  g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu (žr. 8.2 punktą), supilama į 400 ml stiklinę arba 300 ml kūginę kolbą, įpilama 100 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.3) ir įmetami keli pemzos gabaliukai. Stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu arba kūginė kolba sujungiama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Mišinys atsargiai užverdamas virš mažos liepsnos arba ant kaitlentės ir vieną valandą virinamas. Reikia žiūrėti, kad produktas nepriliptų prie indo sienelių.

Atvėsinama ir pridedama pakankamai pagalbinės filtravimo priemonės (3.4), kad būtų išvengta aliejaus ir riebalų nuostolių filtruojant. Filtruojama per sudrėkintą, dvigubą riebalų neturintį filtravimo popierių. Likutis plaunamas šaltu vandeniu tol, kol gaunamas neutralios reakcijos filtratas. Patikrinama, ar filtrate nėra riebalų. Jų buvimas filtrate rodo, kad prieš hidrolizę ėminys turi būti ekstrahuojamas petroleteriu pagal A procedūrą.

Dvigubas filtravimo popierius su likučiu dedamas ant laikrodžio stiklo ir 100 ± 3 oC temperatūroje džiovinamas pusantros valandos džiovinimo spintoje su oro cirkuliacija (4.3).

Dvigubas filtravimo popierius su sausu likučiu įdedamas į ekstrahavimo tūtą (4.2), kuri užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu. Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1) ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose.

6.   Rezultato išraiška

Likučio masė išreiškiama ėminio masės procentais.

7.   Pakartojamumas

To paties tyrėjo atliekamų dviejų lygiagrečių to paties ėminio analizės rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

8.   Pastabos

20 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir sumaišoma su 10 g ar didesniu kiekiu bevandenio natrio sulfato (3.2). Ekstrahuojama petroleteriu (3.1), kaip nurodyta 5.1. Gautas ekstraktas skiedžiamas iki 500 ml petroleteriu (3.1) ir tirpalas sumaišomas. 50 ml tirpalo supilama į prieš tai pasvertą nedidelę sausą kolbą su pemzos gabalėliais. Tirpiklis distiliuojamas, likutis džiovinamas ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto paskutinėje pastraipoje.

Pašalinamas tirpiklis iš tūtoje likusio ekstrahavimo likučio, likutis susmulkinamas ne didesnėmis nei 1 mm dydžio dalelėmis, sudedamas atgal į ekstrahavimo tūtą (natrio sulfato nededama) ir atliekamos 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose nurodytos procedūros.

Aliejų ir riebalų kiekis ėminio masės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę:

(10 m1 + m2) × 5

kurioje:

I.   ŽALIOS LĄSTELIENOS NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų neriebalines organines medžiagas, netirpias rūgštinėje ir šarminėje terpėje, kurios paprastai apibūdinamos kaip žalia ląsteliena.

2.   Metodas

Ėminys, iš kurio prireikus pašalinami riebalai, veikiamas tam tikros koncentracijos sieros rūgšties ir kalio hidroksido tirpalais virimo temperatūroje. Likutis atskiriamas filtruojant, plaunamas, džiovinamas, sveriamas ir sudeginamas 475–500 oC temperatūros intervale. Žalios ląstelienos kiekis tiriamajame ėminyje atitinka masės sumažėjimą po sudeginimo.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

1 mg tikslumu pasveriama 1 g paruošto ėminio, ėminys dedamas į tiglį (4.2) (žr. 8.1, 8.2 ir 8.3 pastabas) ir pridedama 1 g pagalbinės filtravimo priemonės.

Surenkamas kaitinimo įrenginys (4.1) ir filtravimo tiglis (4.2), tada prie tiglio prijungiamas cilindras (4.3). Į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančios sieros rūgšties (3.1) ir prireikus įlašinami keli lašai priešpučio (3.2).

Užvirinama per 5 ± 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min.

Atsukamas čiaupas į išleidimo vamzdį (4.1), sieros rūgštis filtruojama vakuumu per filtravimo tiglį ir likutis tris kartus paeiliui plaunamas 30 ml verdančio vandens, užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Išleidžiamasis čiaupas užsukamas, į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančio kalio hidroksido tirpalo (3.7) ir įlašinami keli lašai priešpučio (3.2). Užvirinama per 5 ± 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min. Filtruojama ir kartojama plovimo procedūra, taikyta sieros rūgščiai.

Po paskutinio plovimo ir džiovinimo tiglis su jame esančia medžiaga atjungiamas ir sujungiamas su šaltojo ekstrahavimo įrenginiu (4.6). Prijungiamas vakuumas ir likutis tiglyje tris kartus iš eilės plaunamas 25 ml acetono porcijomis (3.4) užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Tiglis džiovinamas džiovinimo spintoje iki pastoviosios masės 130 oC temperatūroje. Po kiekvieno džiovinimo tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir greitai pasveriamas. Tiglis dedamas į mufelinę krosnį ir ne mažiau nei 30 min iškaitinamas 475–500 oC temperatūroje iki pastoviosios masės.

Po kiekvieno iškaitinimo iš pradžių atvėsinama krosnyje, vėliau eksikatoriuje, ir pasveriama.

Atliekamas tuščiasis bandymas be ėminio. Masės sumažėjimas dėl iškaitinimo neturi būti didesnis nei 4 mg.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Žalios ląstelienos kiekis ėminio masės procentais gaunamas pagal lygtį:

kurioje:

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

8.   Pastabos

J.   CUKRAUS NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti redukuojančiųjų sacharidų kiekį ir suminį sacharidų kiekį, išreiškiamą gliukozės kiekiu arba, jei tinka, sacharozės kiekiu, dauginant rezultatą iš faktoriaus 0,95 . Metodas tinka kombinuotiesiems pašarams. Kitiems pašarams numatyti specialieji metodai. Jei būtina, laktozė nustatoma atskirai, ir į jos kiekį atsižvelgiama apskaičiuojant rezultatus.

2.   Metodas

Sacharidai ekstrahuojami praskiestu etanoliu; tirpalas skaidrinamas I ir II Carrez tirpalais. Etanolį pašalinus, sacharidų kiekis prieš ir po inversijos nustatomi Luff-Schoorl metodu.

3.   Reagentai

Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (3.8.2) supilamas į natrio karbonato tirpalą (3.8.3). Įpilamas vario sulfato tirpalas (3.8.1) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro. Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas.

Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu – 0,05  mol/l, Na2CO3 – 1 mol/l), žr. 5.4. paskutinę pastraipą. Tirpalo pH yra apie 9,4 .

4.   Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ekstrahavimas

2,5  g ėminio, pasverto 1 mg tikslumu, supilama į 250 ml matavimo kolbą. Įpilama 200 ml etanolio (3.1) ir vieną valandą maišoma maišikliu. Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.2) ir maišoma maždaug 30 s. Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.3) ir vėl maišoma 1 min. Etanoliu (3.1) skiedžiama iki žymės, sumaišoma ir filtruojama. Imama 200 ml filtrato ir garinama didesnei daliai etanolio pašalinti tol, kol tūris sumažėja maždaug du kartus. Likutis po išgarinimo naudojant šiltą vandenį kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą, tirpalas atvėsinamas, skiedžiamas iki žymės vandeniu, sumaišomas ir prireikus filtruojamas. Šis tirpalas naudojamas redukuojančiųjų sacharidų kiekiui nustatyti ir, po inversijos, suminiam sacharidų kiekiui nustatyti.

5.2   Redukuojančiųjų sacharidų nustatymas

Pipete paimama ne daugiau 25 ml tirpalo, turinčio mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų sacharidų, kurių kiekis išreiškiamas gliukozės kiekiu. Prireikus skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu. Rezultatas išreiškiamas gliukozės kiekiu ėminyje procentais.

5.3   Suminio invertuotų sacharidų kiekio nustatymas

Pipete paimama 50 ml tirpalo ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įlašinami keli lašai metiloranžinio tirpalo (3.4) ir atsargiai, nuolat maišant, pilama vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.5) tol, kol neišnyksta tirpalo raudona spalva. Įpilama 15 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.6), kolba nuleidžiama į stipriai verdančio vandens vonią, kurioje laikoma trisdešimt minučių. Tirpalas greitai atvėsinamas iki maždaug 20 oC temperatūros ir į jį įpilama 15 ml natrio hidroksido tirpalo (3.7). Skiedžiama vandeniu iki 100 ml ir sumaišoma. Paimama ne daugiau 25 ml šio tirpalo, turinčio mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų sacharidų, perskaičiuotų į gliukozės kiekį. Prireikus distiliuotu skiedžiama vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu. Rezultatas išreiškiamas gliukozės procentiniu kiekiu arba, jei tinka, sacharozės kiekiu, gautą rezultatą padauginus iš faktoriaus 0,95 .

5.4   Titravimas Luff-Schoorl metodu

Pipete įpilama 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.8) ir supilama į 300 ml Erlenmejerio kolbą; įpilama lygiai 25 ml skaidrinto sacharidų tirpalo. Įdedamos dvi pemzos (3.13) granulės, tirpalas šildomas ir maišomas, laikant kolbą rankoje virš vidutinės atviros liepsnos, kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes. Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle, po kuria dega liepsna. Liepsna reguliuojama taip, kad būtų šildomas tik Erlenmejerio kolbos dugnas. Prie kūginės kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Virinama lygiai dešimt minučių. Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip:

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (3.12) ir tuojau pat (atsargiai, nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.11). Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (3.9) tol, kol spalva tampa vos gelsva, įpilama krakmolo tirpalo (3.10) indikatoriaus ir baigiama titruoti.

Toks pats titravimas, tik nevirinant, atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.8) ir 25 ml vandens mišiniu, įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (3.12) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.11).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg, kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumą, išreiškiamą 0,1  mol/l natrio tiosulfato tirpalo ml. Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Specialiosios procedūros

Sumaišoma ir filtruojama. Etanolis pašalinamas, kaip aprašyta 5.1 punkte. Jei ėminyje nėra dekstrinizuoto krakmolo, skiedžiama iki žymės vandeniu.

8.   Pastabos

Abiem atvejais turimas sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu ir perskaičiuojamas į gliukozės kiekį miligramais. Viena iš verčių atimama iš kitos ir skirtumas išreiškiamas ėminio masės procentais.

Pavyzdys

Du kiekvienam nustatymui paimti tūriai atitinka 250 mg ėminį.

Pirmuoju atveju sunaudota 17 ml natrio tiosulfato 0,1  mol/l tirpalo ir tai atitinka 44,2  mg gliukozės; antruoju atveju sunaudota 11 ml ir tai atitinka 27,6  mg gliukozės.

Skirtumas yra 16,6  mg gliukozės.

Taigi redukuojančiųjų sacharidų (išskyrus laktozę) kiekis, perskaičiuotas į gliukozės kiekį, yra lygus:

K.   LAKTOZĖS NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti laktozės kiekį pašaruose, kai jos yra daugiau nei 0,5  %.

2.   Metodas

Cukrūs ištirpinami vandenyje. Tirpalas fermentuojamas, pridedant mielių Saccharomyces cerevisiae, kurios laktozės neliečia. Po skaidrinimo ir filtravimo laktozės kiekis filtrate nustatomas Luff-Schoorl metodu.

3.   Reagentai

Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (3.4.2) supilamas į natrio karbonato tirpalą (3.4.3). Įpilamas vario sulfato tirpalas (3.4.1) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro. Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas. Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu – 0,05  mol/l; Na2CO3 – 1 mol/l). Tirpalo pH yra apie 9,4 .

4.   Aparatūra

Vandens vonia su šilumine rele, nustatyta 38–40 oC.

5.   Procedūra

1 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25–30 ml vandens. Kolba 30 min laikoma verdančio vandens vonioje ir atvėsinama iki maždaug 35 oC temperatūros. Įpilama apie 5 ml mielių suspensijos (3.1) ir sumaišoma. Kolba laikoma dvi valandas vandens vonioje 38–40 oC temperatūroje. Atvėsinama iki maždaug 20 oC temperatūros.

Įpilama 2,5  ml Carrez I tirpalo (3.2) ir 30 s maišoma, tada įpilama 2,5  ml Carrez II tirpalo (3.3) ir vėl maišoma 30 s. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml, sumaišoma ir filtruojama. Ne daugiau nei 25 ml šio tirpalo, kuriame turėtų būti 40–80 mg laktozės, pipete paimama į 300 ml Erlenmejerio kolbą. Prireikus iki 25 ml skiedžiama vandeniu.

Tokiu pačiu būdu atliekamas tuščiasis bandymas su 5 ml mielių suspensijos (3.1). Laktozės kiekis Luff-Schoorl metodu nustatomas taip: įpilama lygiai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.4) ir įdedamos dvi pemzos (3.5) granulės. Tirpalas maišomas laikant kolbą rankoje ir tuo pat metu šildant virš vidutinės atviros liepsnos, kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes. Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle, po kuria dega liepsna. Liepsna reguliuojama taip, kad būtų šildomas tik kūginės kolbos dugnas. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Virinama lygiai dešimt minučių. Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip:

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (3.6) ir tuojau pat (atsargiai, nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.7). Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (3.8) tol, kol spalva tampa vos gelsva, įpilama krakmolo tirpalo (3.9) indikatoriaus ir baigiama titruoti.

Toks pats titravimas, tik nevirinant, atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.4) ir 25 ml vandens mišiniu, įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (3.6) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.7).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg, kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumą, išreiškiamą 0,1  mol/l natrio tiosulfato tirpalo ml.

Rezultatas pateikiamas kaip bevandenės laktozės kiekis, išreikštas ėminio masės procentais.

7.   Pastaba

Jei produktai turi daugiau nei 40 % fermentuojamo sacharido, naudojama daugiau nei 5 ml mielių suspensijos.

L.   KRAKMOLO NUSTATYMAS

POLIARIMETRINIS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti krakmolo ir didelės molekulinės masės krakmolo skilimo produktų kiekį pašaruose, siekiant patikrinti atitiktį nurodomai energinei vertei (VII priedo nuostatoms) ir Tarybos direktyvai 96/25/EB ( 10 ).

2.   Metodas

Metodas susideda iš dviejų nustatymų. Nustatant pirmuoju būdu, ėminys veikiamas praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Po tirpalo skaidrinimo ir filtravimo poliarimetriškai matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas.

Analizuojant antruoju būdu, ėminys ekstrahuojamas 40 % etanoliu. Filtratas rūgštinamas vandenilio chlorido rūgštimi, skaidrinamas, filtruojamas ir matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, kaip tai buvo daroma pirmuoju būdu.

Dviejų matavimų skirtumas, padaugintas iš žinomo faktoriaus, atitinka krakmolo kiekį ėminyje.

3.   Reagentai

Koncentracija turi būti patikrinta titruojant 0,1  mol/l natrio hidroksido tirpalu, įlašinus metilraudonojo 0,1  % (m/V) tirpalo 94 % (V/V) etanolyje. Reikia 30,94  ml 0,1  mol/l NaOH, norint neutralizuoti 10 ml.

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys susmulkinamas taip, kad jį visą būtų galima persijoti per sietą su 0,5  mm apvaliomis akutėmis.

5.2   Suminio poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P ir S) nustatymas (žr. 7.1 pastabą)

1 mg tikslumu pasveriama 2,5  g sumalto ėminio, kuris supilamas į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2), kratoma, kad ėminys tolygiai pasiskirstytų, ir dar įpilama 25 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2). Kolba panardinama į verdančio vandens vonią, pirmąsias tris minutes stipriai ir visą laiką kratoma, kad nesusidarytų aglomeratų. Vandens vonioje turi būti pakankamai daug, kad panardinus į ją matavimo kolbą, jis nenustotų viręs. Kratomos kolbos negalima išimti iš vonios. Lygiai po 15 min kolba išimama iš vonios, įpilama 30 ml šalto vandens ir iš karto atvėsinama iki 20 oC.

Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.3) ir kratoma 30 s. Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.4) ir vėl kratoma maždaug 30 s. Skiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma ir filtruojama. Jei filtratas nėra visiškai skaidrus (tai pasitaiko retai), nustatymas kartojamas naudojant daugiau Carrez I ir II tirpalų, pvz., 10 ml.

200 mm ilgio vamzdyje poliarimetru arba sacharimetru matuojama, kokiu kampu tirpalas suka poliarizuotos šviesos plokštumą.

5.3   Medžiagų, tirpstančių 40 % etanolyje, poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P′ ir S′) nustatymas

1 mg tikslumu pasveriama 5 g ėminio, ėminys supilamas į 100 ml matavimo kolbą ir įpilama apie 80 ml etanolio (3.5) (žr. 7.2 pastabą). Kolba laikoma vieną valandą kambario temperatūroje; per tą laiką šešis kartus kolba stipriai kratoma, kad ėminys gerai susimaišytų su etanoliu. Skiedžiama iki žymės etanoliu (3.5), sumaišoma ir filtruojama.

50 ml filtrato (atitinka 2,5  g ėminio) įpilama į 250 ml Erlenmejerio kolbą, įpilama 2,1  ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1) ir stipriai kratoma. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius, kolba panardinama į verdančio vandens vonią. Lygiai po 15 min Erlenmejerio kolba išimama iš vonios, jos turinys supilamas į 100 ml matavimo kolbą, plaunant Erlenmejerio kolbą trupučiu šalto vandens, ir atvėsinama iki 20 oC.

Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.3) ir II (3.4) tirpalus, skiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma, filtruojama ir matuojamas poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, kaip nurodyta 5.2 punkto 2–oje ir 3–oje pastraipoje.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Krakmolo kiekis (%) ėminyje apskaičiuojamas taip:

6.1   Matavimas poliarimetru

6.2   Matavimas sacharimetru

6.3   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių, tam pačiam ėminiui atliktų nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,4 absoliučiąja verte, kai krakmolo yra mažiau nei 40 %, ir 1 % santykine verte, kai krakmolo yra 40 % arba daugiau.

7.   Pastabos

M.   ŽALIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių pelenų kiekį pašaruose.

2.   Metodas

Ėminys sudeginamas 550 oC temperatūroje; likutis pasveriamas.

3.   Reagentai

Amonio nitrato tirpalas, 20 % (m/V)

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

Maždaug 5 g ėminio (2,5  g tuo atveju, kai analizuojami linkę išsipūsti produktai) pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į ėminiui sudeginti skirtą tiglį, kuris pats prieš tai buvo iškaitintas 550 oC temperatūroje, atvėsintas ir pasvertas. Tiglis statomas ant kaitlentės ir iš lėto kaitinamas tol, kol medžiaga suanglėja. Iškaitinama pagal 5.1 arba 5.2.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Likučio masė apskaičiuojama, atimant tiglio masę.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastabos

N.   VANDENILIO CHLORIDO RŪGŠTYJE NETIRPIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti neorganinių medžiagų, kurios netirpsta vandenilio chlorido rūgštyje, kiekį pašaruose. Atsižvelgiant į bandinio tipą, galima taikyti du metodus.

2.   Metodas

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   A metodas

Ėminys sudeginamas taip pat, kaip nustatant žalių pelenų kiekį. Galima panaudoti pelenus, gautus atliekant šią analizę.

Pelenai supilami į 250–400 ml cheminę stiklinę, naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1). Mišinys lėtai užvirinamas ir atsargiai virinamas penkiolika minučių. Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą ir likutis plaunamas šiltu vandeniu tol, kol plovimo vanduo nerodo rūgščios reakcijos. Filtras su likučiu džiovinamas ir pasvertame tiglyje sudeginamas ne žemesnėje nei 550 oC, bet ne aukštesnėje nei 700 oC temperatūroje. Tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir pasveriamas.

5.2   B metodas

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 250–400 ml cheminę stiklinę. Įpilama 25 ml vandens ir 25 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), sumaišoma ir palaukiama dujų skyrimosi pabaigos. Įpilama dar 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1). Palaukiama dar galimo dujų skyrimosi pabaigos, stiklinė statoma į verdančio vandens vonią ir laikoma joje trisdešimt minučių, prireikus ir ilgiau, kad visiškai būtų hidrolizuotas krakmolas, kurio galėjo būti ėminyje. Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą, likutis plaunamas 50 ml šilto vandens (žr. 7 pastabą). Filtras su likučiu dedamas į tiglį ėminiui sudeginti, džiovinamas ir sudeginamas ne žemesnėje nei 550 oC, bet ne aukštesnėje nei 700 oC temperatūroje. Pelenai supilami į 250–400 ml cheminę stiklinę, naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1); tęsiama, kaip nurodyta antroje 5.1 punkto pastraipoje.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Likučio masė apskaičiuojama, atimant tiglio masę. Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastaba

Jei ėminys sunkiai filtruojamas, analizė atliekama iš naujo, 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1) pakeičiant 50 ml 20 % trichloracto rūgšties (3.2) ir plaunant filtrą šiltu 1 % trichloracto rūgšties tirpalu (3.3).

O.   KARBONATŲ NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose karbonatų kiekį, kuris paprastai išreiškiamas kalcio karbonato kiekiu.

Tačiau tam tikrais atvejais (pvz., naudojant geležies karbonatą) būtina taikyti specialųjį metodą.

2.   Metodas

Karbonatai skaidomi vandenilio chlorido rūgštimi; išsiskyręs anglies dioksidas surenkamas į matavimo biuretę ir jo tūris palyginamas su tūriu, kuris tomis pačiomis sąlygomis susidaro iš žinomo kalcio karbonato kiekio.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

Scheibler-Dietrich aparatas (žr. piešinį) ar panašus aparatas.

5.   Procedūra

Atsižvelgiant į karbonatų kiekį ėminyje, sveriamas toks ėminio kiekis:

Ėminys supilamas į specialų aparato butelį (4), į kurį įstatytas iš nedūžtančios medžiagos pagamintas mažas mėgintuvėlis su 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), ir butelis prijungiamas prie aparato. Trišakis čiaupas (5) pasukamas taip, kad vamzdis (1) susijungtų su atmosfera. Kilnojamu vamzdžiu (2), kuris yra pripildytas nudažytos sieros rūgšties (3.3) ir prijungtas prie matavimo biuretės (1), skysčio lygis nustatomas ties nulio padala. Čiaupas (5) pasukamas taip, kad biuretė (1) ir vamzdis (3) būtų sujungti, ir patikrinama, ar skysčio lygis yra ties nulio padala.

Vandenilio chlorido rūgštis (3.1) palenkiant butelį (4) po truputį supilama ant ėminio. Slėgis išlyginamas nuleidžiant vamzdį (2). Butelis (4) kratomas tol, kol anglies dioksidas nustoja skirtis.

Grąžinamas pradinis slėgis, sulyginant skysčio lygį biuretėje (1) ir vamzdyje (2). Po kelių minučių, jei dujų tūris daugiau nekinta, rodmuo užrašomas.

Tomis pačiomis sąlygomis atliekamas kontrolinis bandymas su 0,5  g kalcio karbonato (3.2).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Karbonatų, išreikštų kalcio karbonatu, kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

7.   Pastabos

P.   SUMINIO FOSFORO KIEKIO NUSTATYMAS

FOTOMETRINIS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti suminio fosforo kiekį pašaruose. Jis labiausiai tinka analizuoti produktus, kuriuose nedaug fosforo. Kai kuriais atvejais (kai produkte daug fosforo) galima taikyti gravimetrinį metodą.

2.   Metodas

Ėminys mineralizuojamas sausuoju deginimu (organinių pašarų) arba skaidant rūgštyje (mineralinių junginių ir skystųjų pašarų) ir ir įdedamas į rūgšties tirpalą. Tirpalas veikiamas molibdovanadato reagentu. Taip susidariusio geltono tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru esant 430 nm bangos ilgiui.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio tipą, ruošiamas tirpalas, kaip nurodyta 5.1.1. arba 5.1.2.

5.1.1    Įprastinė procedūra

Pasveriama 1 g arba daugiau ėminio 1 mg tikslumu. Ėminys dedamas į Kjeldalio kolbą, įpilama 20 ml sieros rūgšties (3.5), kolba kratoma, kad medžiaga visiškai susimaišytų su rūgštimi ir nepriliptų ant kolbos sienelių, pakaitinama iki virimo ir virinama 10 min. Kolba paliekama šiek tiek atvėsti, įpilama 2 ml azoto rūgšties (3.4), nestipriai pakaitinama, šiek tiek atvėsinama, įpilamas dar nedidelis kiekis azoto rūgšties (3.4) ir vėl užvirinama. Procedūra kartojama tol, kol gaunamas bespalvis tirpalas. Atvėsinama, įpilama truputį vandens, skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą, Kjeldalio kolbą plaunant karštu vandeniu. Paliekama atvėsti, skiedžiama vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.2    Ėminiai, kuriuose yra organinių medžiagų ir nėra kalcio ir magnio dihidrofosfatų

Deginimo tiglyje pasveriama 1 mg tikslumu maždaug 2,5  g ėminio. Ėminys labai gerai sumaišomas su 1 g kalcio karbonato (3.1). Deginama krosnyje 550 oC temperatūroje tol, kol gaunami balti ar pilki pelenai (nedidelis anglių kiekis netrukdo). Pelenai supilami į 250 ml cheminę stiklinę. Įpilama 20 ml vandens ir vandenilio chlorido rūgšties (3.2) tol, kol nustoja skirtis burbuliukai. Įpilama dar 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.2). Stiklinė statoma ant smėlio vonios ir skystis garinamas iki sauso likučio netirpiam silicio dioksidui gauti. Likutis ištirpinamas 10 ml azoto rūgšties (3.3) ir tirpalas virinamas ant smėlio vonios arba kaitlentės 5 min, neišgarinant iki sauso likučio. Skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą, keletą kartų stiklinę plaunant karštu vandeniu. Kolba paliekama atvėsti, skiedžiama vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.2   Spalvos gavimas ir optinio tankio matavimas

Pagal 5.1.1 arba 5.1.2 gauto filtrato alikvotinė dalis skiedžiama taip, kad gauta fosforo koncentracija būtų ne didesnė nei 40 μg/ml. Į mėgintuvėlį (4.6) įpilama 10 ml šio tirpalo ir 10 ml molibdovanadato reagento (3.6). Sumaišoma ir tirpalas paliekamas stovėti bent 10 min 20 oC temperatūroje. Spektrofotometru matuojamas optinis tankis, esant 430 nm bangos ilgiui ir palyginamuoju tirpalu naudojant tirpalą, gautą įpilant 10 ml molibdovanadato reagento (3.6) į 10 ml vandens.

5.3   Kalibravimo kreivė

Iš etaloninio tirpalo (3.7) ruošiami tirpalai, kurių fosforo koncentracija 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml ir 40 μg/ml. Paimama po 10 ml kiekvieno iš šių tirpalų ir į juos įpilama po 10 ml molibdovanadato reagento (3.6). Tirpalai sumaišomi ir paliekami stovėti bent 10 min 20 oC temperatūroje. Matuojamas optinis tankis, kaip nurodyta 5.2. Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinatė – optinis tankis, abscisė – fosforo koncentracija. Koncentracijos verčių intervale nuo 0 μg/ml iki 40 μg/ml kreivės dalis yra tiesinė.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Fosforo kiekis tiriamajame ėminyje nustatomas pagal kalibravimo kreivę.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio bandymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

Q.   CHLORIDŲ CHLORO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandenyje tirpių chloridų chloro kiekį, paprastai išreiškiamą natrio chlorido kiekiu. Metodas tinka visiems pašarams.

2.   Metodas

Chloridai ištirpinami vandenyje. Jei produkte yra organinių medžiagų, jis skaidrinamas. Tirpalas šiek tiek parūgštinamas azoto rūgštimi ir chloridai nusodinami sidabro chlorido pavidalu, veikiant sidabro nitrato tirpalu. Sidabro perteklius yra titruojamas amonio tiocianatu pagal Volhardo metodą.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

5.   Procedūra

5.1   Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio pobūdį, tirpalas ruošiamas pagal 5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3 punktą.

Kartu atliekamas tuščiasis bandymas, nededant analizuojamo ėminio.

5.1.1    Organinių medžiagų neturintys ėminiai

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 10 g ėminio, kuriame chloro chloridų pavidalu būtų ne daugiau nei 3 g. 500 ml matavimo kolboje ėminys ištirpinamas 400 ml vandens, kurio temperatūra maždaug 20 oC. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas maišymo būgne, praskiedžiamas iki žymės, sumaišomas ir filtruojamas.

5.1.2    Organinių medžiagų turintys ėminiai, išskyrus 5.1.3 punkte išvardytus produktus

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 5 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintųjų anglių supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens, kurio temperatūra apie 20 oC, ir 5 ml Carrez I tirpalo (3.7), maišoma 30 s, įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.8). Maišymo būgne maišoma trisdešimt minučių, skiedžiama iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.3    Virti pašarai, linų sėmenų išspaudos ir miltai, produktai, kuriuose daug linų sėmenų miltų, ir kiti produktai, kuriuose daug glitėsių ar koloidinių medžiagų (pvz., dekstrinuotas krakmolas)

Tirpalas ruošiamas taip, kaip aprašyta 5.1.2 punkte, bet nefiltruojamas. Skystis nupilamas nuo nuosėdų (prireikus, centrifuguojamas), 100 ml skysčio įpilama į 200 ml matavimo kolbą. Skystis maišomas su acetonu (3.6), šiuo tirpikliu skiedžiamas iki žymės, tirpalas sumaišomas ir filtruojamas.

5.2   Titravimas

Pipete į Erlenmejerio kolbą paimama 25–100 ml (pagal numatomą chlorido kiekį) tirpalo, paruošto pagal 5.1.1, 5.1.2 ar 5.1.3 punktus. Paimtoje alikvotinėje tirpalo dalyje turi būti ne daugiau nei 150 mg chloro (Cl). Prireikus tirpalas skiedžiamas ne mažiau nei 50 ml vandens, įpilama 5 ml azoto rūgšties (3.4), 20 ml sočiojo amonio-geležies (III) sulfato tirpalo (3.3) ir du lašai amonio tiocianato tirpalo (3.1), lašinamo iš biuretės, pripildytos iki nulinės žymės. Iš biuretės įpilama tiek sidabro nitrato tirpalo (3.2), kad susidarytų 5 ml perteklius. Įpilama 5 ml dietileterio (3.5) ir stipriai purtoma, kad nuosėdos koaguliuotų. Sidabro nitrato perteklius titruojamas amonio tiocianato tirpalu (3.1) tol, kol atsiradusi raudonai ruda spalva neišnyksta per vieną minutę.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Chloro kiekis, išreikštas natrio chlorido kiekio % (X), apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

čia:

Jei tuščiasis bandymas rodo, kad 0,1  mol/l sidabro nitrato tirpalo buvo sunaudota, šis tūris atimamas iš tūrio (V1 – V2).

7.   Pastabos

IV PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI LEIDŽIAMŲ PAŠARŲ PRIEDŲ KONCENTRACIJAI KONTROLIUOTI

A.   A VITAMINO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas A vitaminui A (retinoliui) pašaruose ir premiksuose nustatyti. A vitaminą sudaro visų-trans-(padėčių)-retinolis ir jo cis-izomerai, kurie yra nustatomi šiuo metodu. A vitamino kiekis yra išreiškiamas tarptautiniais vienetais (IU) vienam kg. Vienas IU atitinka 0,300  μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A ar 0,344  μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A acetato arba 0,550  μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A palmitato aktyvumą.

Kiekybinio nustatymo riba – 2 000 IU A vitamino/kg.

2.   Metodas

Ėminys hidrolizuojamas šarminiu kalio hidroksido tirpalu ir A vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, likutis ištirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. A vitamino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu, naudojant ultravioletinį arba fluorescencinį detektorių. Chromatografavimo parametrai pasirenkami taip, kad neatsiskiria visų-trans-(padėčių)-vitamino A alkoholis ir jo cis-izomerai.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas, kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis, vengiant šilumos susidarymo. Turi būti malama prieš pat svėrimą ir muilinimą, kad nebūtų A vitamino nuostolių.

5.2   Muilinimas

Atsižvelgiant į A vitamino kiekį, 1 mg tikslumu pasveriama 2–25 g ėminio, ėminys supilamas į plokščiadugnę ar kūginę 500 ml tūrio kolbą (4.2.1). Maišant iš eilės įpilama 130 ml etanolio (3.1), maždaug 100 mg BHT (3.13), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.6). Prie kolbos prijungiamas kondensatorius (4.3) ir kolba įmerkiama į vandens vonią su magnetine maišykle (4.7). Šildoma iki virimo ir verdama 5 min su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuomet per kondensatorių (4.3) įpilama 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir dar 25 min. verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi, maišant silpna azoto srove. Kondensatorius plaunamas maždaug 20 ml vandens ir kolbos turinys aušinamas iki kambario temperatūros.

5.3   Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalas dekantuojant kiekybiškai supilamas į 1 000  ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3) ar į ekstrahavimo aparatą (4.8), iš viso plovimui sunaudojant 250 ml vandens. Muilinimo kolba iš eilės plaunama 25 ml etanolio (3.1) ir 100 ml petroleterio (3.2), plovimo skysčiai supilami į dalijamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatą. Vandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 2:1. Stipriai purtoma 2 min ir 2 min paliekama nusistovėti.

5.3.1    Ekstrahavimas naudojant dalijamąjį piltuvą (4.2.3)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), petroleterio sluoksnis supilamas į kitą dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2).

Dalijamajame piltuve sujungti ekstraktai du kartus plaunami 100 ml vandens, švelniai sukant piltuvą (kad nesusidarytų emulsija), purtant piltuvą ekstraktai toliau plaunami 100 ml vandens porcijomis tol, kol vandeninis sluoksnis lieka bespalvis, kai įpilama fenolftaleino tirpalo (3.7) (paprastai pakanka plauti keturis kartus). Išplautas ekstraktas filtruojamas per sausą gofruotąjį filtrą fazėms atskirti (4.4) į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2), kad būtų pašalintas visas suspenduotas vanduo. Dalijamasis piltuvas ir filtras plaunami 50 ml petroleterio (3.2), skiedžiama petroleteriu (3.2) iki žymės ir gerai sumaišoma.

5.3.2    Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo aparatą (4.8)

Sluoksniams atsiskyrus (žr. 7.3 pastabą), stiklinio cilindro (4.8.1) kamštis keičiamas šlifo įmova (4.8.2) ir reguliuojamo vamzdžio apatinis U formos galas nustatomas taip, kad jis būtų šiek tiek virš sluoksnių skiriamosios ribos. Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pučiant suslėgtąjį azotą, viršutinis petroleterio sluoksnis supilamas į 1 000  ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (3.2), cilindras užkemšamas ir gerai supurtomas. Sluoksniams leidžiama atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinis sluoksnis supilamas į dalijamąjį piltuvą. Ekstrahavimo procedūra kartojama dar kartą su 100 ml petroleterio (3.2), vėliau du kartus su 50 ml petroleterio (3.2) ir petroleterio sluoksniai supilami į dalijamąjį piltuvą.

Sujungti petroleterio ekstraktai plaunami, kaip aprašyta 5.3.1, ir tęsiama, kaip ten aprašyta.

5.4   Ėminio tirpalo ruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4) pipete paimama alikvotinė petroleterio tirpalo (5.3.1 ar 5.3.2) dalis. Sukamajame garintuve (4.1) esant sumažintam slėgiui tirpiklis išgarinamas beveik iki sauso likučio, kai vonios temperatūra ne aukštesnė nei 40 oC. Įleidžiant azoto (3.10), slėgis didinamas iki atmosferos slėgio, kolba nuimama nuo sukamojo garintuvo. Likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.10) ir likutis iš karto tirpinamas žinomame tūryje (10–100 ml) metanolio (3.3) (A vitamino koncentracija turi būti 5 IU/ml–30 IU/ml intervale).

5.5   Nustatymas HPLC metodu

A vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (4.5.1), koncentracija matuojama naudojant ultravioletinį detektorių (325 nm) arba fluorescencinį detektorių (sužadinimas: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2).

Alikvotinė metanolinio tirpalo, gauto pagal 5.4 dalį, dalis (pvz., 20 μl) įpurškiama ir plaunama judančiąja faze (3.9). Apskaičiuojamas kelių to paties ėminio įpurkštų tirpalų vidutinis smailių aukštis (plotas) ir kelių įpurkštų kalibravimo tirpalų (5.6.2) vidutiniai smailių aukščiai (plotai).

HPLC sąlygos

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

5.6   Kalibravimas

5.6.1    Darbinių etaloninių tirpalų ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (4.2.1) pipete paimama 20 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3.11.1) arba 20 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3.12.1) ir hidrolizuojama, kaip aprašyta 5.2, bet be BHT. Vėliau ekstrahuojama petroleteriu (3.2) pagal 5.3 dalį ir skiedžiama petroleteriu (3.2) iki 500 ml. 100 ml šio ekstrakto sukamajame garintuve (žr. 5.4) išgarinama beveik iki sauso likučio, likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.10) ir likutis ištirpinamas 10,0  ml metanolio (3.3). Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 560 IU A vitamino viename ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.3. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimama 2,0  ml šio darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šio praskiesto darbinio tirpalo vardinė koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml.

5.6.2    Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 1,0 , 2,0 , 5,0 ir 10,0  ml praskiesto darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,8 , 5,6 , 14,0 ir 28,0 IU A vitamino viename ml.

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė, atsižvelgiant į UV kontrolės rezultatus (5.6.3.3).

5.6.3    Etaloninių tirpalų UV etalonavimas

5.6.3.1    A vitamino acetato pradinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimama 2,0  ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3.11.1) ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 3,0  ml šio praskiesto A vitamino acetato tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (3.8) 300 nm–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

A vitamino IU/ml = E326 × 19,0

(

A vitamino acetato = 1 530 , esant 326 nm, 2-propanolyje)

5.6.3.2    A vitamino palmitato pradinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimama 2,0  ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3.12.1) ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 3,0  ml šio praskiesto A vitamino palmitato tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (3.8) 300 nm–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

A vitamino IU/ml = E326 × 19,0

(

A vitamino palmitato = 957, esant 326 nm, 2-propanolyje)

5.6.3.3    A vitamino darbinis etaloninis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2) pipete paimama 3,0  ml nepraskiesto A vitamino darbinio etaloninio tirpalo, paruošto pagal 5.6.1, ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 5,0  ml šio tirpalo ir 2-propanoliu (3.8) skiedžiama iki žymės. Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 6,72 IU A vitamino viename ml. Spektrofotometru (4.6) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (3.8) 300 nm–400 nm diapazone. Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm.

A vitamino kiekio apskaičiavimas:

A vitamino IU/ml = E325 ×18,3

(

A vitamino alkoholio = 1 821 esant 326 nm, 2-propanolyje)

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Naudojant ėminio tirpalo A vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą), pagal kalibravimo kreivę (5.6.2) nustatoma ėminio tirpalo koncentracija IU/ml.

A vitamino kiekis ėminyje IU/kg apskaičiuojamas pagal šią formulę:

[UI/kg]

kurioje:

7.   Pastabos

Norint patikrinti, ar šiai konkrečiai matricai (pieno pakaitalui) taikomu analizės metodu gaunami patikimi rezultatai, išgavos dydis patikrinamas, paėmus papildomą tiriamąją dalį. Jei išgavos dydis mažesnis nei 80 %, turi būti daroma analizės rezultato pataisa dėl išgavos dydžio.

8.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliekamų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 15 % didžiausiojo rezultato vertės.

9.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai ( 11 )

B.   E VITAMINO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas E vitaminui pašaruose ir premiksuose nustatyti. E vitamino kiekis išreiškiamas mg DL-α-tokoferolio acetato vienam kg pašaro. 1 mg DL-α-tokoferolio acetato atitinka 0,91  mg α-tokoferolio (E vitamino).

Kiekybinio nustatymo riba – 2 mg E vitamino/kg. Šią kiekybinio nustatymo ribą galima pasiekti tik naudojant fluorescencinį detektorių. Naudojant ultravioletinį detektorių, kiekybinio nustatymo riba – 10 mg/kg.

2.   Metodas

Ėminys hidrolizuojamas etanoliniu kalio hidroksido tirpalu ir E vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, likutis ištirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. E vitamino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu naudojant fluorescencinį arba ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas, kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis, vengiant šilumos susidarymo. Turi būti malama prieš pat svėrimą ir muilinimą, kad nebūtų E vitamino nuostolių.

5.2   Muilinimas

Atsižvelgiant į E vitamino kiekį, 0,01  g tikslumu pasveriama 2–25 g ėminio, ėminys supilamas į plokščiadugnę ar kūginę 500 ml tūrio kolbą (4.2.1). Maišant iš eilės įpilama 130 ml etanolio (3.1), maždaug 100 mg BHT (3.12), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.6). Prie kolbos prijungiamas kondensatorius (4.3) ir kolba įmerkiama į vandens vonią su magnetine maišykle (4.7). Šildoma iki virimo ir verdama 5 min su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuomet per kondensatorių (4.3) įpilama 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir dar 25 min. verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi, maišant silpna azoto srove. Kondensatorius plaunamas maždaug 20 ml vandens ir kolbos turinys aušinamas iki kambario temperatūros.

5.3   Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalas dekantuojant kiekybiškai supilamas į 1 000  ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3) ar į ekstrahavimo aparatą (4.8), iš viso plovimui sunaudojant 250 ml vandens. Muilinimo kolba iš eilės plaunama 25 ml etanolio (3.1) ir 100 ml petroleterio (3.2), plovimo skysčiai supilami į dalijamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatą. Vandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 2:1. Stipriai purtoma 2 min ir 2 min paliekama nusistovėti.

5.3.1    Ekstrahavimas naudojant dalijamąjį piltuvą (4.2.3)

Kai sluoksniai atsiskiria (žr. 7.3 pastabą), petroleterio sluoksnis supilamas į kitą dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2).

Dalijamajame piltuve sujungti ekstraktai du kartus plaunami 100 ml vandens, švelniai sukant piltuvą (kad nesusidarytų emulsija), purtant piltuvą ekstraktai toliau plaunami 100 ml vandens porcijomis tol, kol vandeninis sluoksnis lieka bespalvis, kai įpilama fenolftaleino tirpalo (3.7) (paprastai pakanka plauti keturis kartus). Išplautas ekstraktas filtruojamas per sausą gofruotąjį filtrą fazėms atskirti (4.4) į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2), kad būtų pašalintas visas suspenduotas vanduo. Dalijamasis piltuvas ir filtras plaunami 50 ml petroleterio (3.2), skiedžiama petroleteriu (3.2) iki žymės ir gerai sumaišoma.

5.3.2    Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo aparatą (4.8)

Sluoksniams atsiskyrus (žr. 7.3 pastabą), stiklinio cilindro (4.8.1) kamštis keičiamas šlifo įmova (4.8.2) ir reguliuojamo vamzdžio apatinis U formos galas nustatomas taip, kad jis būtų šiek tiek virš sluoksnių skiriamosios ribos. Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pučiant suslėgtąjį azotą, viršutinis petroleterio sluoksnis supilamas į 1 000  ml dalijamąjį piltuvą (4.2.3). Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (3.2), cilindras užkemšamas ir gerai supurtomas. Sluoksniams leidžiama atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinis sluoksnis supilamas į dalijamąjį piltuvą. Ekstrahavimo procedūra kartojama dar kartą su 100 ml petroleterio (3.2), vėliau du kartus su 50 ml petroleterio (3.2) ir petroleterio sluoksniai supilami į dalijamąjį piltuvą.

Sujungti petroleterio ekstraktai plaunami, kaip tai aprašyta 5.3.1, ir tęsiama, kaip ten aprašyta.

5.4   Ėminio tirpalo ruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4) pipete paimama alikvotinė petroleterio tirpalo (5.3.1 ar 5.3.2) dalis. Sukamajame garintuve (4.1) esant sumažintam slėgiui tirpiklis išgarinamas beveik iki sauso likučio, kai vonios temperatūra ne aukštesnė nei 40 oC. Įleidžiant azoto (3.9), slėgis didinamas iki atmosferos slėgio, kolba nuimama nuo sukamojo garintuvo. Likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.10) ir likutis iš karto tirpinamas žinomame tūryje (10–100 ml) metanolio (3.3) (DL-α-tokoferolio koncentracija turi būti 5 μg/ml–30 μg/ml intervale).

5.5   Nustatymas HPLC metodu

E vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (4.5.1), koncentracija matuojama naudojant fluorescencinį detektorių (sužadinimas: 295 nm, emisija: 330 nm) ar ultravioletinį detektorių (292 nm) (4.5.2).

Alikvotinė metanolinio tirpalo, gauto pagal 5.4 dalį, dalis (pvz., 20 μl) įpurškiama ir plaunama judančiąja faze (3.9). Apskaičiuojamas kelių to paties ėminio įpurkštų tirpalų vidutinis smailių aukštis (plotas) ir kelių įpurkštų kalibravimo tirpalų (5.6.2) vidutiniai smailių aukščiai (plotai).

HPLC sąlygos

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

5.6   Kalibravimas (DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio)

5.6.1    DL-α-tokoferolio acetato etalonas

5.6.1.1    Darbinio etaloninio tirpalo ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (4.2.1) pipete paimama 25 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) ir hidrolizuojama, kaip aprašyta 5.2. Vėliau ekstrahuojama petroleteriu (3.2), kaip aprašyta 5.3, ir skiedžiama petroleteriu iki 500 ml. 25 ml šio ekstrakto garinama sukamajame garintuve (žr. 5.4) beveik iki sauso likučio, likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (3.9) ir likutis ištirpinamas 25,0  ml metanolio (3.3). Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 45,5  μg DL-α-tokoferolio viename ml, tai atitinka 50 μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

5.6.1.2    Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 1,0 , 2,0 , 4,0 ir 10,0  ml darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,5 , 5,0 , 10,0 ir 25,0  μg/ml DL-α-tokoferolio acetato, t. y. 2,28 , 4,55 , 9,10  μg/ml ir 22,8  μg/ml DL-α-tokoferolio.

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė.

5.6.1.3    DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) UV etalonavimas

5,0  ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3.10.1) etanoliu skiedžiama iki 25,0  ml ir spektrofotometru (4.6) matuojamas pagal etanolį (3.1) šio tirpalo ultravioletinis spektras 250 nm–320 nm diapazone.

Absorbcijos maksimumas atitinka 284 nm:

= 43,6 esant 284 nm etanolyje

Esant šiam praskiedimui, gauta ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 0,84 –0,88 .

5.6.2.    DL-α-tokoferolio etalonas

5.6.2.1    Darbinio etaloninio tirpalo ruošimas

Į 50 ml matavimo kolbą pipete paimama 2,0  ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1), ištirpinama metanolyje (3.3) ir metanoliu skiedžiama iki žymės. Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 40 μg DL-α-tokoferolio viename ml, tai atitinka 44,0  μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml. Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

5.6.2.2    Kalibravimo tirpalų ruošimas ir kalibravimo kreivės gavimas

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 1,0 , 2,0 , 4,0 ir 10,0  ml darbinio etaloninio tirpalo, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.3) ir sumaišoma. Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 2,0 , 4,0 , 8,0 ir 20,0  μg/ml DL-α-tokoferolio, t. y. 2,20 , 4,40 , 8,79  μg/ml ir 22,0  μg/ml DL-α-tokoferolio acetato.

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai). Pagal vidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė.

5.6.2.3    DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1) UV etalonavimas

2,0  ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3.11.1) etanoliu skiedžiama iki 25,0  ml ir spektrofotometru (4.6) matuojamas pagal etanolį (3.1) šio tirpalo ultravioletinis spektras 250–320 nm diapazone. Absorbcijos maksimumas atitinka 292 nm:

= 75,8 esant 292 nm, etanolyje

Esant šiam praskiedimui, ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 0,6 .

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Naudojant ėminio tirpalo E vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą), pagal kalibravimo kreivę (5.6.1.2 ar 5.6.2.2) nustatoma ėminio tirpalo koncentracija μg/ml (apskaičiuota α-tokoferolio acetatui).

E vitamino kiekis ėminyje w, mg/kg, nustatomas pagal šią formulę:

[mg/kg]

kurioje:

7.   Pastabos

8.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliekamų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 15 % didžiausiojo rezultato vertės.

9.   Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai ( 12 )

C.   GELEŽIES, VARIO, MANGANO IR CINKO MIKROELEMENTŲ NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti geležies, vario, mangano ir cinko mikroelementų kiekį pašaruose. Kiekybinio nustatymo riba:

2.   Principas

Ėminys po organinės medžiagos (jei ji buvo) suskaidymo ištirpinamas druskos rūgštyje. Po atitinkamo praskiedimo geležis, varis, manganas ir cinkas nustatomi atominės absorbcijos spektrometrijos metodu.

3.   Reagentai

Įvadinės pastabos

Reagentams ir analizei skirtiems tirpalams ruošti reikia naudoti vandenį, kuriame nebūtų nustatomų katijonų, todėl vanduo gaunamas du kartus distiliuojant distiliatoriuje iš borosilikatinio ar kvarcinio stiklo arba du kartus apdorojant jonitine derva.

Reagentai turėtų būti bent analiziškai gryni. Nustatomų elementų nebuvimas turi būti tikrinamas atliekant tuščiąjį bandymą. Prireikus reagentai turi būti papildomai gryninami.

Vietoje žemiau aprašomų etaloninių tirpalų galima naudoti prekyboje esančius etaloninius tirpalus, jei tik jie turi garantiją ir prieš naudojimą buvo patikrinti.

4.   Aparatūra

5.   Procedūra ( 13 )

5.1   Ėminiai, turintys organinių medžiagų

5.1.1    Ėminio sudeginimas ir analizei skirto tirpalo ruošimas ( 14 )

Pelenai sudrėkinami vandeniu ir supilami į 250 ml tūrio cheminę stiklinę.Tiglio turinys išplaunamas į cheminę stiklinę, tam sunaudojant iš viso maždaug 5 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1), kuri pilama lėtai ir atsargiai (dėl CO2 susidarymo gali vykti audringa reakcija). Vandenilio chlorido rūgštis (3.1) į stiklinę lašinama maišant tirpalą tol, kol nustoja skirtis dujų burbuliukai. Išgarinama iki sauso likučio, retkarčiais maišant stikline lazdele.

Į likutį įpilama 15 ml 6 mol/l vandenilio chlorido rūgšties (3.2) ir apie 120 ml vandens. Maišoma stikline lazdele, kuri paliekama stiklinėje, stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu. Stiklinės turinys lėtai užverdamas ir virinamas tol, kol galima pamatyti, kad daugiau pelenų nebeištirpsta. Filtruojama per bepelenį filtravimo popierių ir filtratas supilamas į 250 ml matavimo kolbą. Stiklinė ir filtras plaunami 5 ml karšto vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2) ir du kartus verdančiu vandeniu. Matavimo kolbos turinys skiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija maždaug 0,5  mol/l).

Pastabos:

Bendram užteršimo pavojui sumažinti dirbama dulkių neturinčioje aplinkoje su labai švaria įranga ir rūpestingai išplautais stikliniais indais. Cinko nustatymas yra ypač jautrus įvairių rūšių teršalams, pvz., teršalams ant stiklinių indų, reagentuose, dulkėms ir pan.

5.1.2    Spektrofotometrinis nustatymas

5.1.2.1    Kalibravimo tirpalų ruošimas

Iš darbinių etaloninių tirpalų, nurodytų 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ir 3.10.1 punktuose, kiekvienam nustatomam elementui ruošiama keletas kalibravimo tirpalų, kurių kiekvieno HCl koncentracija yra apie 0,5  mol/l ir lantano chlorido koncentracija (geležies, mangano ir cinko atveju) atitinka 0,1  % (m/V) La koncentraciją.

Pasirenkama mikroelementų koncentracija turi atitikti naudojamo spektrofotometro jautrio ribas. Toliau kaip pavyzdys pateikiamose lentelėse rodoma kalibruoti naudojamų tirpalų sudėties tipiniai intervalai, tačiau, atsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro tipą ir jautrį, gali tekti pasirinkti kitas koncentracijos vertes.

5.1.2.2    Tirpalo ruošimas analizei

Variui nustatyti pagal 5.1.1 punktą paruoštą tirpalą paprastai galima naudoti tiesiogiai. Jei reikia, kad jo koncentracija būtų kalibruoti naudojamų tirpalų koncentracijos verčių intervale, alikvotinė dalis gali būti paimta pipete į 100 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės 0,5  mol/l vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (3.3).

Geležiai, manganui ir cinkui nustatyti pagal 5.1.1 punktą paruošto tirpalo alikvotinė dalis paimama pipete į 100 ml matavimo kolbą, įpilama 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.11) ir skiedžiama iki žymės 0,5  mol/l vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (3.3). (Be to, žr. 8 punkto pastabą).

5.1.2.3    Tuščiasis bandymas

Tuščiąjį bandymą turi sudaryti visos nurodytos procedūros pakopos, išskyrus tai, kad nededama ėminio medžiagos. Kaip tuščiasis ėminys neturi būti naudojamas „0“ koncentracijos kalibravimo tirpalas.

5.1.2.4    Atominės absorbcijos matavimas

Matuojama kalibravimo tirpalų ir analizuojamo tirpalo atominė absorbcija, naudojant oro-acetileno oksiduojančiąją liepsną, esant šiems bangų ilgiams:

Kiekvienas matavimas atliekamas keturis kartus.

5.2   Mineraliniai pašarai

Jei ėminyje nėra organinių medžiagų, sudeginimas prieš analizę nereikalingas. Daroma kaip aprašyta 5.1.1.1 punkte, pradedant nuo antrosios pastraipos. Galima praleisti išgarinimo su fluoro vandenilio rūgštimi pakopą.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Naudojant kalibravimo kreivę, apskaičiuojama mikroelementų koncentracija analizuojamame tirpale ir rezultatas išreiškiamas mikroelemento mg kiekiu vienam ėminio kilogramui (milijonosiomis dalimis).

7.   Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analizę atliekančiam asmeniui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu ėminiu, skirtumas ne didesnis nei:

8.   Pastaba

Dideli fosfatų kiekiai gali trukdyti nustatyti geležį, manganą ir cinką. Tokie trukdžiai turi būti pašalinti, įpilant lantano chlorido tirpalo (3.11). Tačiau, jei ėminyje masių santykis (Ca + mg)/P > 2, lantano chlorido tirpalo (3.11) į analizės tirpalą ir etaloninius tirpalus galima nepilti.

D.   HALOFUGINONO NUSTATYMAS

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-ono hidrobromidas

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Metodas taikomas halofuginonui nustatyti pašaruose. Kiekybinio nustatymo riba – 1 mg/kg.

2.   Metodas

Apdorotas karštu vandeniu halofuginonas ekstrahuojamas kaip laisvoji bazė į etilacetatą ir po to atskiriamas kaip vandenilio chloridas į vandeninį rūgšties tirpalą. Ekstraktas gryninamas, taikant jonų mainų chromatografiją. Halofuginono kiekis nustatomas atvirkštinės fazės efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC), naudojant ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

Į 500 ml matavimo kolbą 0,1  mg tikslumu pasveriama 50 mg halofuginono (3.6), ištirpinama amonio acetato buferiniame tirpale (3.18), iki žymės skiedžiama buferiniu tirpalu ir sumaišoma. Šis tirpalas lieka stabilus tris savaites 5 oC temperatūroje, jei laikomas tamsoje.

Į keletą 100 ml matavimo kolbų įpilama 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 ir 6,0  ml pradinio etaloninio tirpalo (3.6.1). Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.21) ir sumaišoma. Šių tirpalų halofuginono koncentracija yra 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 ir 6,0  μg/ml. Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą.

Vandenyje ištirpinama 50 g natrio karbonato (3.11), skiedžiama iki 1 litro ir dedama natrio chlorido (3.12) tiek, kad gaunamas sotus tirpalas.

10 ml HCI (3.7) skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

Vandenyje (3.14) ištirpinama 19,3  g amonio acetato (3.3), 30 ml acto rūgšties (3.5) ir skiedžiama iki 1 litro.

Reikiamas kiekis amberlito (3.2) plaunamas vandeniu tol, kol pašalinami visi chlorido jonai, kaip rodo bandymas su sidabro nitrato tirpalu (3.20), atliekamas su išpilama vandenine faze. Derva plaunama 50 ml metanolio (3.8), metanolis išpilamas ir derva laikoma ant jos užpylus švaraus metanolio.

0,17  g sidabro nitrato (3.9) ištirpinama 10 ml vandens.

500 ml acetonitrilo (3.1) maišoma su 300 ml amonio acetato buferiniu tirpalo (3.18) ir 1 200  ml vandens (3.14). Acto rūgštimi (3.5) nustatoma pH 4,3 . Tirpalas filtruojamas per 0,22  μm filtrą (4.8) ir degazuojamas (pvz., 10 min ultragarsu). Šis tirpalas stabilus vieną mėnesį, jei laikomas uždarame inde ir tamsoje.

4.   Aparatūra

5.   Procedūra

5.1   Bendrosios nuostatos

5.2   Ekstrahavimas

Į 200 ml centrifugos mėgintuvėlį 0,1  g tikslumu pasveriama 10 g paruošto ėminio, įdedama 0,5  g natrio askorbato (3.10), 0,5  g EDTA (3.13), 20 ml vandens ir sumaišoma. Mėgintuvėlis įdedamas 5 min į vandens vonią (80 oC). Atvėsinus iki kambario temperatūros, įpilama 20 ml natrio karbonato tirpalo (3.15) ir sumaišoma. Tuoj pat įpilama 100 ml etilacetato (3.4) ir 15 s stipriai purtoma ranka. Atkimštas mėgintuvėlis dedamas trims minutėms į ultragarso vonią (4.1). Centrifuguojama 2 min ir etilacetato fazė per stiklo pluošto filtrą (4.6) nupilama į 500 ml dalijamąjį piltuvą. Kartojamas ėminio ekstrahavimas dar su 100 ml etilacetato. Sujungti ekstraktai vieną minutę plaunami 50 ml natrio chloridu prisotintu natrio karbonato tirpalu (3.16), vandeninis sluoksnis išpilamas.

Organinis sluoksnis 1 min. ekstrahuojamas 50 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (3.17). Apatinis rūgšties sluoksnis išleidžiamas į 250 ml dalijamąjį piltuvą. Organinis sluoksnis dar kartą 1,5  min ekstrahuojamas kita 50 ml vandenilio chlorido rūgšties porcija ir gautas ekstraktas sujungiamas su pirmuoju ekstraktu. Abu sujungti rūgšties ekstraktai maždaug 10 s plaunami 10 ml etilacetatu (3.4), atliekant sukamuosius judesius.

Visas vandeninis sluoksnis kiekybiškai supilamas į 250 ml talpos apvaliadugnę kolbą, organinė fazė išpilama. Visas likęs etilacetatas pašalinamas iš rūgšties tirpalo garinant sukamajame garintuve (4.2). Vandens vonios temperatūra neturi būti aukštesnė nei 40 oC. Esant maždaug 25 milibar vakuumui, visas likęs etilacetatas turėtų būti pašalintas per 5 min, kai temperatūra 38 oC.

5.3   Gryninimas

5.3.1    Amberlito kolonėlės ruošimas

XAD-2 kolonėlė ruošiama kiekvienam ėminio ekstraktui. 10 g paruošto amberlito (3.19) supilama į stiklinę kolonėlę (4.5) su metanoliu (3.8). Ant dervos sluoksnio uždedamas nedidelis stiklo vatos kamštis. Metanolis išleidžiamas iš kolonėlės ir derva plaunama 100 ml vandens, paliekant jo tiek, kad skystis apsemtų dervos paviršių. Prieš naudojimą kolonėlė 10 min paliekama pusiausvyrai nusistovėti. Niekuomet neleidžiama skysčiui visiškai ištekėti iš kolonėlės.

5.3.2    Ėminio gryninimas

Visas ekstraktas (5.2) kiekybiškai supilamas ant paruoštos amberlito kolonėlės (5.3.1) viršaus ir plaunama, išpilant eliuatą. Eliuavimo srautas neturi būti didesnis nei 20 ml/min. Apvaliadugnė kolba plaunama 20 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.17) ir šiuo tirpalu plaunama dervos kolonėlė. Rūgšties tirpalo likutis išpučiamas oro srautu. Plovimo tirpalai išpilami. Į kolonėlę įpilama 100 ml metanolio (3.8) ir į 250 ml apvaliadugnę kolbą ir surenkama nuo 5 ml iki 10 ml eliuato. Likęs metanolis 10 min. laikomas pusiausvyrai su derva nusistovėti ir eliuavimas tęsiamas esant ne didesniam nei 20 ml/min srautui, surenkant eliuatą į tą pačią kolbą. Metanolis išgarinamas sukamajame garintuve (4.2). Vandens vonios temperatūra neturi būti aukštesnė nei 40 oC. Plaunant judančiąja faze (3.21), likutis kiekybiškai supilamas į 10 ml matavimo kolbą. Skiedžiama judančiąja faze iki žymės ir sumaišoma. Alikvotinė dalis filtruojama per membraninį filtrą (4.7). Šis tirpalas naudojamas HPLC nustatymui (5.4).

5.4   HPLC nustatymas

5.4.1    Parametrai

Rekomenduojamos šios sąlygos, gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai.

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4.1).

HPLC judančioji fazė (3.21).

Srautas: 1,5  ml/min.–2 ml/min.

Detektoriaus bangos ilgis: 243 nm.

Įpurškiamas tūris: 40 μl–100 μl.

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas, kelis kartus įpurškiant 3,0  μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.6.2) tol, kol nustoja keistis smailės aukštis (arba plotas) ir sulaikymo trukmė.

5.4.2    Kalibravimo kreivė

Kiekvienas kalibravimo tirpalas (3.6.2) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (arba plotai). Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinačių ašyje – kalibravimo tirpalų smailių aukščių (arba plotų) vidurkiai, o abscisių ašyje – atitinkama koncentracija μg/ml.

5.4.3    Ėminio tirpalas

Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (5.3.2), kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį, ir matuojamas halofuginono smailių vidutinis aukštis (plotas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Ėminio tirpalo koncentracija μg/ml nustatoma pagal ėminio tirpalo halofuginono smailių vidutinį aukštį (plotą) ir kalibravimo kreivę (5.4.2).

Halofuginono kiekis w (mg/kg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

7.   Rezultatų patvirtinimas

7.1   Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektorių, kuriuo lyginami ėminio ekstrakto ir 6,0  μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.6.2) spektrai.

7.1.1    Kochromatografija

Ėminio ekstrakto tirpalo koncentracija padidinama, įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3.6.2.) tūrį. Pridėto halofuginono kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą halofuginono kiekį.

Turi padidėti tik halofuginono smailės aukštis, įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą. Smailės plotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinį plotį ± 10 % tikslumu.

7.1.2    Aptikimas naudojant diodų matricą

Rezultatai vertinami pagal šiuos kriterijus:

Jei vienas iš šių kriterijų nevykdomas, analitės buvimas nepatvirtinamas.

7.2   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,5  mg/kg, kai halofuginono yra iki 3 mg/kg.

7.3   Išgavos dydis

Išgavos dydis, gautas tuščiajam ėminiui su analitės priedu, yra ne mažesnis nei 80 %.

8.   Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo atlikti tarplaboratoriniai tyrimai ( 15 ), kurių metu aštuonios laboratorijos analizavo tris ėminius.

E   ROBENIDINO NUSTATYMAS

1,3-bi[(4-chlorbenziliden)amino]guanidino hidrochloridas

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatoma robenidino koncentracija pašaruose. Kiekybinio nustatymo riba – 5 mg/kg.

2.   Metodas

Ėminys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu. Ekstraktas džiovinamas, alikvotinė ekstrakto dalis gryninama, naudojant kolonėlę su aliuminio oksidu. Robenidinas iš kolonėlės plaunamas metanoliu, koncentruojamas ir judančiąja faze skiedžiamas iki reikiamo tūrio. Robenidino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu naudojant ultravioletinį detektorių.

3.   Reagentai

4,0  ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 1,18  g/ml) įpilama į 500 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės metanoliu (3.1) ir sumaišoma. Tirpalas turi būti ruošiamas prieš naudojimą.

3A tipo, 8 – 12 mešų granulės (1,6 –2,5  mm granulės, kristalinis aliumosilikatas, akučių skersmuo 0,3  mm).

100 g aliuminio oksido supilama į tinkamą indą ir įpilama 2 ml vandens. Indas užkemšamas ir kratomas maždaug 20 min. Laikomas gerai uždarytame inde.

3,40  g kalio dihidrofosfato ištirpinama vandenyje (HPLC grynumo), skiedžiama 1 000  ml matavimo kolboje iki žymės ir sumaišoma.

3,55  g bevandenio natrio hidrofosfato (arba 4,45  g dihidrato, arba 8,95  g dodekahidrato) ištirpinama vandenyje (HPLC grynumo), skiedžiama 1 litro matavimo kolboje iki žymės ir sumaišoma.

Sumaišomi šie reagentai:

Filtruojama per 0,22 μm akytumo filtrą (4.6), tirpalas degazuojamas (pvz., 10 min veikiant ultragarsu).

Grynas robenidinas: 1,3 -bi[(4-chlorbenziliden)amino]guanidino hidrochloridas.

0,1  mg tikslumu pasveriama 30 mg robenidino etaloninės medžiagos (3.9). 100 ml matavimo kolboje ištirpinama parūgštintame metanolyje (3.2), tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsioje vietoje.

10 ml pradinio tirpalo (3.9.1) įpilama į 250 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.8) ir sumaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsioje vietoje.

Į keletą 50 ml matavimo kolbų įpilama 5,0 ; 10,0 ; 15,0 ; 20,0 ir 25,0  ml tarpinio etaloninio tirpalo (3.9.2). Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.8) ir sumaišoma. Šių tirpalų koncentracija atitinkamai yra 1,2 ; 2,4 ; 3,6 ; 4,8 ir 6,0  μg/ml. Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą.

4.   Aparatūra

Pagaminta iš geltono stiklo, yra su čiaupu ir maždaug 150 ml talpos, vidinis skersmuo 10–15 mm, ilgis 250 mm.

5.   Procedūra

5.1   Bendrosios nuostatos

5.2   Ekstrahavimas

0,01  g tikslumu pasveriama maždaug 15 g paruošto ėminio. Ėminys supilamas į 250 ml kūginę kolbą, į ją įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.2), kolba užkemšama ir vieną valandą kratoma ant purtyklės (4.2). Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtravimo popierių (4.5), visas filtratas surenkamas į 150 ml kūginę kolbą. Pridedama 7,5  g molekulinio sieto (3.4), kolba užkemšama ir kratoma penkias minutes. Iš karto filtruojama per stiklo pluošto filtravimo popierių. Toliau tirpalas gryninamas (5.3).

5.3   Gryninimas

5.3.1    Aliuminio oksido kolonėlės ruošimas

Į stiklinės kolonėlės (4.1) apačią įkišamas mažas stiklo vatos kamštis, kuris stikline lazdele sutankinamas. Pasveriama 11,0  g paruošto aliuminio oksido (3.5) ir supilama į kolonėlę. Siekiama, kad pilant sąlytis su oru būtų kiek įmanoma mažesnis. Švelniai tapšnojama per užpildomos kolonėlės apačią, kad aliuminio oksidas suslūgtų.

5.3.2    Ėminio gryninimas

Į kolonėlę pipete įpilama 5,0  ml pagal 5.2 punktą paruošto ėminio ekstrakto. Pipetės galiukas laikomas prie kolonėlės sienelės ir leidžiama tirpalui susigerti į aliuminio oksidą. Robenidinas iš kolonėlės išplaunamas 100 ml metanolio (3.1), esant 2–3 ml/min. srautui, eliuatas surenkamas į 250 ml apvaliadugnę kolbą. Metanolinis tirpalas išgarinamas iki sauso likučio sukamajame garintuve (4.3) esant sumažintam slėgiui, kai temperatūra 40 oC. Likutis ištirpinamas 3–4 ml judančiosios fazės (3.8) ir kiekybiškai supilamas į 10 ml matavimo kolbą. Apvaliadugnė kolba kelis kartus plaunama 1–2 ml judančiosios fazės ir šie plovimo tirpalai supilami į matavimo kolbą. Tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma. Alikvotinė tirpalo dalis filtruojama per 0,45  μm filtrą (4.7). Tirpalas naudojamas analizei HPLC metodu (5.4).

5.4   HPLC nustatymas

5.4.1    Parametrai

Rekomenduojamos šios sąlygos; galima taikyti kitas sąlygas, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai:

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4.1),

HPLC judančioji fazė (3.8),

Srautas: 1,5 –2 ml/min.,

Detektoriaus bangos ilgis: 317 nm,

Įpurškiamas tūris: 20–50 μl.

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas, kelis kartus įpurškiant 3,6  μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.9.3) tol, kol nustoja keistis smailių aukščio ir sulaikymo trukmės vertės.

5.4.2    Kalibravimo kreivė

Kiekvienas kalibravimo tirpalas (3.9.3) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (arba plotai). Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinačių ašyje – kalibravimo tirpalų smailių aukščių arba plotų vidurkiai, o abscisių ašyje – atitinkama koncentracija μg/ml.

5.4.3    Ėminio tirpalas

Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (5.3.2), kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį, ir matuojamas robenidino smailių vidutinis aukštis (plotas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Ėminio tirpalo koncentracija μg/ml nustatoma pagal ėminio tirpalo robenidino smailių vidutinį aukštį (plotą) ir kalibravimo kreivę (5.4.2).

Robenidino kiekis w (mg/kg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

7.   Rezultatų patvirtinimas

7.1   Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektorių, kuriuo lyginami ėminio ekstrakto ir 6,0  μg/ml koncentracijos kalibravimo tirpalo (3.9.3) spektrai.

7.1.1    Kochromatografija

Ėminio ekstrakto tirpalo koncentracija padidinama, įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3.9.3) tūrį. Pridėto robenidino kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą robenidino kiekį.

Padidinamas tik robenidino smailės aukštis, įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą. Smailės plotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinį plotį maždaug 10 % tikslumu.

7.1.2    Aptikimas naudojant diodų matricą

Rezultatai įvertinami pagal šiuos kriterijus:

Jei vienas iš šių kriterijų nevykdomas, analitės buvimas nepatvirtinamas.

7.2   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didžiausio rezultato, gauto didesniam nei 15 mg/kg robenidino kiekiui.

7.3   Išgavos dydis

Išgavos dydis, gautas tuščiajam ėminiui su analitės priedu, yra ne mažesnis nei 85 %.

8.   Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Bendrija surengė tarplaboratorinį tyrimą, kuriame 12–oje laboratorijų buvo analizuojami keturi paukščių ir triušių pašaro miltų arba granulių pavidalu ėminiai. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas du kartus. Rezultatai pateikiami lentelėje: