1991R2568 — LT — 09.08.2012 — 024.001

Šis dokumentas yra skirtas tik informacijai, ir institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį

iš dalies keičiamas:

pataisytas:

▼B

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EEB) Nr. 2568/91

1991 m. liepos 11 d.

dėl maišyto alyvuogių aliejaus ir maišyto alyvuogių išspaudų aliejaus savybių ir dėl atitinkamų analizės metodų

▼M20

1 straipsnis

1.  Aliejai, kurių charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 1, 2 punktuose nustatytas charakteristikas, laikomi pirmojo spaudimo alyvuogių aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 1 punkto a ir b papunkčiuose.

2.  Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 3 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas pirmojo spaudimo klasikiniu alyvuogių aliejumi lampante, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 1 punkto c papunktyje.

3.  Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 4 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas rafinuotu alyvuogių aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 2 punkte.

4.  Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 5 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas alyvuogių aliejumi, sudarytu iš rafinuotų ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 3 punkte.

5.  Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 6 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas neapdorotu alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 4 punkte.

6.  Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 7 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas rafinuotu alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 5 punkte.

7.  Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 8 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 6 punkte.

▼B

2 straipsnis

1.  Aliejų savybės, nurodytos I priede, nustatomos taikant toliau pateiktus analizės metodus:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

4.   ►M20  Tikrinant 3 dalyje nustatyta tvarka, analizės, nurodytos II, III, IX, X ir XII prieduose, ir, jei daromos, bet kokios nacionaliniuose įstatymuose numatytos kontraanalizės atliekamos prieš pasibaigiant minimaliam bandinių galiojimo laikui. Jei bandiniai paimami daugiau nei prieš keturis mėnesius iki pasibaigiant minimaliam galiojimo laikui, jie turi būti analizuojami ne vėliau kaip ketvirtąjį mėnesį po bandinių paėmimo. Kitoms šiame reglamente numatytoms analizėms jokie laiko apribojimai netaikomi. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

2a straipsnis

Patikrinti, ar bandinys atitinka deklaruotą kategoriją, nacionalinės valdžios institucijos arba jų atstovai gali šiais būdais:

▼M19 —————

▼M5

►M19  3 ◄ straipsnis

Jei nustatoma, kad aliejaus organoleptinės savybės neatitinka jo aprašymo, suinteresuota valstybė narė, nespręsdama iš anksto apie bet kokias kitas bausmes, taiko administracines finansines baudas, atsižvelgdama į nustatyto pažeidimo sunkumą.

Įvertinant pažeidimą ypatingai turi būti kreipiamas dėmesys į savaime suprantamus įprastomis sąlygomis laikomo aliejaus savybių pakitimus.

Kiekvieno pusmečio pradžioje valstybės narės informuoja Komisiją apie nustatytų pažeidimų skaičių bei pobūdį ir apie per praėjusį pusmetį pritaikytas bausmes.

▼M5

4 straipsnis

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Jei valstybės narės jos teritorijoje kuriant degustatorių grupes susiduria su sunkumais, jos gali pasikviesti kitoje valstybėje narėje patvirtintą degustatorių grupę.

3.  Kiekviena valstybė narį pateikia degustatorių grupių, sukurtų profesinių arba tarpšakinių organizacijų pagal šio straipsnio 1 dalyje nustatytas sąlygas, sąrašą ir užtikrina, kad tų sąlygų būtų laikomasi.

▼M19 —————

▼B

6 straipsnis

1.  Aliejaus kiekis aliejaus išspaudose ir kitose alyvuogių aliejaus ekstrahavimo atliekose (KN kodai 2306 90 11 ir 2306 90 19) nustatomas, taikant XV priede nurodytą metodą.

2.  Straipsnio 1 dalyje minimas aliejaus kiekis skaičiuojamas aliejaus masės procentais sausos medžiagos masei.

▼M20

7 straipsnis

Taikomos Bendrijos nuostatos dėl nepageidaujamų medžiagų.

Tirpikliams, kurių sudėtyje yra halogenų, visų kategorijų alyvuogių aliejams nustatytos šios ribinės vertės:

▼B

8 straipsnis

1.  Valstybės narės praneša Komisijai apie priemones, kurių buvo imtasi reglamentui įgyvendinti.

2.  Valstybės narės kiekvieno pusmečio pradžioje siunčia Komisijai per praėjusį pusmetį atliktų tikrinimų analizės duomenų oficialią suvestinę.

Rezultatus nagrinėja Aliejaus ir riebalų vadybos komitetas, laikydamasis Reglamento Nr. 136/66/EEB 39 straipsnyje nustatytos tvarkos.

9 straipsnis

Šiuo dokumentu Reglamentas (EEB) Nr. 1058/77 yra panaikinamas.

10 straipsnis

1.  Šis reglamentas įsigalioja trečią dieną po jo paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.

Tačiau XII priede nurodytas metodas taikomas nuo ►M1  1992 m. lapkričio 1 d. ◄ , išskyrus atvejus, susijusius su intervencinės sistemos operacijomis.

▼M5

Tas metodas netaikomas pirmo spaudimo alyvuogių aliejui, paruoštam parduoti iki 1992 m. lapkričio 1 d.

▼B

2.  Šis reglamentas netaikomas alyvuogių aliejui ir alyvuogių išspaudų aliejui, įpakuotam iki šio reglamento įsigaliojimo ir parduotam iki 1992 m. spalio 31 d.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.

PRIEDAI

Turinys

▼M23

I PRIEDAS

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS SAVYBĖS

▼M20

Ia PRIEDAS

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ARBA ALYVŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS BANDINIŲ, PRISTATYTŲ NE DIDESNĖSE KAIP 100 LITRŲ PAKUOTĖSE, PAĖMIMAS

Šis bandinių paėmimo būdas taikomas alyvuogių aliejaus arba alyvų išspaudų aliejaus 125 000 litrų neviršijančioms siuntoms, pristatytoms ne didesnėse kaip 100 litrų pakuotėse.

Jei siunta viršija 125 000 litrų, ji turi būti padalinta į kelias 125 000 litrų arba mažesnes partijas. Jei siunta mažesnė nei 125 000 litrų, ji laikoma viena partija. Tiriama atskirai kiekviena partija.

Priklausomai nuo partijos dydžio, pagal 1 punkte pateiktą lentelę nustatomas reikalingų priminių bandinių skaičius.

Bandinio dydis pagal 2.1 punkte pateiktą lentelę nustatomas atsižvelgiant į pakuotės talpą.

Sąvokos „siunta“, „pirminis bandinys“ ir „laboratorijos bandinys“ apibrėžti standarte EN ISO 5555.

„Partija“ susideda iš daugelio prekės vienetų, kurie buvo pagaminti ir supakuoti tokiomis aplinkybėmis, kad kiekviename prekės vienete esantis aliejus pagal visas analitines charakteristikas gali būti laikomas homogenišku.

1.   REIKALINGŲ PIRMINIŲ BANDINIŲ SKAIČIUS

Pagal šią lentelę, priklausomai nuo partijos dydžio, nustatomas reikalingų priminių bandinių skaičius:

Pirminiams bandiniams paimti turi būti pasirenkamos šalia viena kitos esančios tos partijos pakuotės.

Iškilus abejonėms, valstybė narė padidina reikalingų priminių bandinių skaičių.

2.   PIRMINIŲ BANDINIŲ SUDĖTIS

3.   ANALIZĖS IR REZULTATAI

▼M20

Ib PRIEDAS

SCHEMA SPRENDIMAMS PRIIMTI, SIEKIANT NUSTATYTI, AR ALYVUOGIŲ ALIEJAUS BANDINYS ATITINKA DEKLARUOTĄ KATEGORIJĄ

Analizė siekiant nustatyti, ar alyvuogių aliejus arba alyvų išspaudų aliejus atitinka deklaruotą kategoriją, gali būti atlikta taip:

Taip pat, atsižvelgiant į Bendrijos nuostatas, turi būti atlikta papildoma analizė nepageidaujamoms medžiagoms nustatyti.

Schema sprendimams priimti taikoma visoms alyvuogių aliejaus ir alyvų išspaudų aliejaus kategorijoms. Ją sudaro nuo 1 iki 11 numeruotos lentelės, kurios taikomos atsižvelgiant į deklaruotą aliejaus kategoriją bendrojoje lentelėje nustatyta eilės tvarka.

Bendrosios lentelės ir lentelių nuo 1 iki 11 paaiškinimai:

1 priedėlis

Šio reglamento priedų ir schemos sprendimams priimti laukelių atitikmenų lentelė

2 priedėlis

1 lentelė

2 lentelė

3 lentelė

4 lentelė

7 lentelė

8 lentelė

11 lentelė

▼B

II PRIEDAS

▼M21

LAISVŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KIEKIO NUSTATYMAS, NAUDOJANT ŠALTĄJĮ METODĄ

▼B

1.   RŪGŠTINGUMO NUSTATYMAS

Laisvųjų riebiųjų rūgščių nustatymas alyvuogių aliejuose. Laisvųjų rūgščių kiekis išreiškiamas sutartu būdų skaičiuojamu rūgštingumu.

1.1.   Metodo esmė

Bandinys ištirpinamas tirpiklių mišinyje ir esančios laisvosios riebiųjų rūgštys titruojamos kalio hidroksido tirpalu etanolyje.

1.2.   Reagentai

Visi reagentai turi būti pripažintos analiziškai grynų reagentų kokybės, naudojamas distiliuotas arba atitinkamo grynumo vanduo.

1.3.   Aparatūra

Įprasta laboratorinė įranga, tarp kitų įrenginių:

1.4.   Darbo eiga

1.5.   Rūgštingumas: skaičiuojamas oleino rūgšties procentiniu kiekiu

Rūgštingumas masės procentais skaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

Rezultatas skaičiuojamas ►M6  dviejų apskaičiavimų ◄ aritmetinis vidurkis.

III PRIEDAS

PEROKSIDŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS

1.   TIKSLAS

Šiame standarte aprašytas aliejų ir riebalų peroksidų skaičiaus nustatymo metodas.

2.   TAIKYMOSRITIS

Šis standartas taikytinas gyvuliniams ir augaliniams aliejams ir riebalams.

3.   APIBRĖŽIMAS

Medžiagų, kurios aprašytomis bandymo sąlygomis oksiduoja kalio jodidą, kiekis, skaičiuojamas aktyvaus deguonies miliekvivalentais kilogramui bandinio, vadinamas peroksidų skaičiumi.

4.   METODOESMĖ

Acto rūgšties ir chloroformo mišinyje ištirpinta analizuojamo bandinio dalis veikiama kalio jodido tirpalu. Išsiskyręs jodas titruojamas etaloniniu natrio tiosulfato tirpalu.

5.   APARATŪRA

Visoje naudojamoje įrangoje neturi būti oksiduojančių arba redukuojančių medžiagų.

Pastaba. Šlifo sujungimai netepami.

6.   REAGENTAI

7.   BANDINYS

Reikia žiūrėti, kad bandinys būtų imamas ir laikomas neapšviestoje šaltoje vietoje, visiškai užpildytame stikliniame inde, hermetiškai užkimštame šlifo arba kamščiamedžio kamščiais.

8.   DARBO EIGA

Analizė turi būti atliekama išsklaidytoje dienos šviesoje arba esant dirbtiniam apšvietimui. Stiklinėje bertuvėlėje (5.1) arba, jos neturint, kolboje (5.2) 0,001 g tikslumu pasveriama bandinio masė, kuri pasirenkama iš lentelės duomenų, atsižvelgiant į numatomą peroksidų skaičių:

Kolba (5.2) atkemšama ir į ją įdedama stiklinė bertuvėlė su bandiniu. Įpilama 10 ml chloroformo (6.1). Bandinys greitai ištirpinamas maišant. Įpilama 15 ml ledinės acto rūgšties (6.2) ir paskui 1 ml kalio jodido tirpalo (6.3). Kolba greitai užkemšama, kratoma vieną minutę ir lygiai penkias minutes paliekama stovėti neapšviestoje vietoje, 15–25 °C temperatūroje.

Įpilama maždaug 75 ml distiliuoto vandens. Išsiskyręs jodas titruojamas natrio tiosulfato tirpalu (6.4) (0,002 mol/l, jei manoma, kad peroksidų skaičius yra mažesnis kaip 12, ir 0,01 mol/l, jei numatomos vertės yra didesnės kaip 12), stipriai kratant. Indikatoriumi naudojamas krakmolo tirpalas (6.5).

Tam pačiam analizuojamam bandiniui atliekami du nustatymai.

Tuo pačiu metu atliekamas tuščiasis bandymas. Jei tuščiojo bandymo rezultatas didesnis kaip 0,05 ml 0,01 mol/l natrio tiosulfato tirpalo (6.4), negryni reagentai pakeičiami.

9.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Peroksidų skaičius (PS), skaičiuojant aktyvaus deguonies miliekvivalentais kilogramui, nustatomas pagal formulę:

kurioje:

Rezultatas skaičiuojamas kaip dviejų nustatymų aritmetinis vidurkis.

▼M21

IV PRIEDAS

VAŠKŲ KIEKIO NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU KAPILIARINĖJE KOLONĖLĖJE

1.   TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomi vaškų kiekiai alyvuogių aliejuje. Vaškai identifikuojami pagal anglies atomų skaičių. Metodas taikomas atskirti spaudimo būdu gautą alyvuogių aliejų nuo alyvuogių aliejaus, gauto ekstrahavimo būdu (maišytas alyvuogių išspaudų aliejus).

2.   METODO ESMĖ

Į riebalus arba aliejų pridedama atitinkamo vidinio etalono ir chromatografiškai frakcionuojama kolonėlėje, užpildytoje hidratuotu silikageliu. Frakcija, kuri bandymo sąlygomis išplaunama pirmoji (jos poliškumas yra mažesnis kaip trigliceridų), tiesiogiai tiriama dujų chromatografijos metodu kapiliarinėje kolonėlėje.

3.   ĮRANGA

4.   REAGENTAI

5.   DARBO EIGA

5.1.   Chromatografinės kolonėlės paruošimas.

15 g silikagelio (4.1.) suspenduojama n-heksane (4.2.) ir supilama į kolonėlę (3.2.). Silikageliui leidžiama savaime nusėsti. Kad chromatografinis sluoksnis būtų homogeniškesnis, nusodinimas baigiamas, naudojant elektrinę purtyklę (3.5.). Priemaišos pašalinamos per silikagelį praleidžiant 30 ml n-heksano. Į 25 ml talpos Erlenmejerio kolbą (3.1) svarstyklėmis (3.8) tiksliai pasveriama 500 mg mėginio ir pridedamas reikiamas vidinio etalono (4.5) kiekis, atsižvelgiant į numatomą vaško kiekį mėginyje. Pvz.: analizuojant alyvuogių aliejų įdedama 0,1 mg laurileikozanato, analizuojant maišytą alyvuogių išspaudų aliejų – 0,25–0,5 mg. Paruoštas mėginys dviem 2 ml n-heksano (4.2.) porcijomis supilamas į chromatografijos kolonėlę.

Tirpikliui leidžiama ištekėti iki 1 mm lygio virš absorbento viršutinio paviršiaus, tuomet per silikagelį praleidžiama 70 ml n-heksano natūraliai tirpaluose esantiems n-alkanams pašalinti. Chromatografinis išplovimas pradedamas palaikant 15 lašų per 10 sekundžių srauto greitį, surenkama 180 ml n-heksano/etileterio mišinio, paruošto santykiu 99:1. Mėginio išplovimas turi būti atliekamas kambario, t. y. 22 ± 4 °C, temperatūroje.

Pastabos:

Gauta frakcija džiovinama sukamajame garintuve (3.6.), kol išgarinamas beveik visas tirpiklis. Paskutinieji 2 ml tirpiklio pašalinami silpna azoto srove; tuomet įpilama 2–4 ml n-heptano.

5.2.   Dujų chromatografinė analizė

5.2.1.   Paruošiamieji darbai

Kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo (3.3), kolonėlės pradžią sujungiant su tiesioginio įpurškimo įtaisu, galą – su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografijos įrenginys (dujų kilpų, detektoriaus, ir savirašio veikimas ir t. t.).

Jei kolonėlė naudojama pirmą kartą, patartina ją kondicionuoti. Per kolonėlę paleidžiama nestipri dujų srovė, tuomet įjungiamas dujų chromatografas. Palaipsniui kaitinama, kol temperatūra per apytiksliai 4 valandas pakyla iki 350 °C. Ši temperatūra palaikoma ne mažiau kaip 2 valandas, po to nustatomos įrenginio darbo sąlygos (sureguliuojamas dujų srauto greitis, uždegama liepsna, prijungiamas elektroninis savirašis (3.3.4.), nustatoma termostato kameros temperatūra, sureguliuojamas detektorius ir t. t.) ir esant bent du kartus didesniam jautriui nei tas, kuris reikalingas analizei atlikti, užrašomas signalas. Bazinė linija turi būti tiesi, be jokių smailių ir nukrypimų.

Neigiamas tiesinis nuokrypis rodo, kad nesandarūs kolonėlės sujungimai; teigiamas nuokrypis – kad kolonėlė nepakankamai kondicionuota.

5.2.2.   Darbo sąlygų parinkimas

Paprastai turi būti laikomasi tokių darbo sąlygų:

šios sąlygos gali būti keičiamos, atsižvelgiant į kolonėlės bei dujų chromatografo savybes, kad būtų pasiektas visų vaškų atskyrimas, pakankama smailių skiriamoji geba (žr. paveikslą). Vidinio etalono C32 sulaikymo trukmė turi būti 18 ± 3 minutės. Būdingiausios vaškų smailės aukštis turi sudaryti ne mažiau kaip 60 % visos skalės aukščio.

Smailių integravimo parametrai nustatomi taip, kad būtų gautas teisingas nagrinėjamų smailių plotų įvertinimas.

Pastaba.Kadangi galutinė temperatūra aukšta yra leidžiamas teigiamas nuokrypis, neviršijantis 10 % visos skalės aukščio.

5.3.   Analizė

10 μl mikrošvirkštu įsiurbiama 1μl mėginio tirpalo; stūmoklis traukiamas, kol adata ištuštėja. Adata įkišama į įpurškimo įtaisą ir po vienos-dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Maždaug po penkių sekundžių adata lėtai ištraukiama.

Užrašinėjama, kol vaškai visiškai išplaunami.

Bazinė linija turi visuomet atitikti nustatytas sąlygas.

5.4.   Smailių identifikavimas

Smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes, lyginant jas su žinomas sulaikymo trukmes turinčiais vaškų mišiniais, analizuotais tomis pačiomis sąlygomis.

Gryno alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma parodyta paveiksle.

5.5.   Kiekybinis vertinimas

Integratoriumi išmatuojami vidinio etalono ir C40–C46 alifatiniių esterių smailių plotai.

Kiekvieno vašką sudarančio esterio kiekis mg/kg riebalų, apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

6.   REZULTATŲ PATEIKIMAS

Pateikiami atskirų C40–C46 vaškų kiekiai ir šių kiekių suma, mg/kg riebalų (ppm).

Pastaba.Vaškų sudedamųjų dalių kiekiai nustatomi remiantis alyvuogių aliejaus chromatogramos esterių porinių anglies skaičiaus smailių C40–C46 pavyzdžiu, pateiktu paveiksle. Jei C46 esteris matomas du kartus, jam identifikuoti rekomenduojama analizuoti maišytą alyvuogių išspaudų aliejų, kuriame C46 lengvai nustatomas, nes šiame aliejuje jo yra daugiausia.

Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu.

Paveikslas

Alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma ( 5 )

Paaiškinimas:

Priedėlis

Dujų linijinio greičio nustatymas

Į dujų chromatografą, nustatytą normalioms darbo sąlygoms, įpurškiama 1–3 μl metano arba propano ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės iškilimo momento (tM).

Linijinis greitis, cm/s, gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis, centimetrais, tM yra išmatuotas laikas sekundėmis.

▼B

V PRIEDAS

STEROLIŲ SUDĖTIES IR KIEKIO NUSTATYMAS KAPILIARINĖS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1.   TIKSLAS

Šiame metode aprašytas atskirų sterolių ir jų bendro kiekio nustatymo riebalinėse medžiagose būdas.

2.   METODO ESMĖ

Riebalinė medžiaga, įdėjus β-cholestanolio kaip vidinio etalono, muilinama kalio hidroksido tirpalu etanolyje ir nemuilinama dalis ekstrahuojama dietileteriu.

Sterolių frakcija iš nemuilinamų medžiagų ekstrakto išskiriama chromatografiškai ant šarmu impregnuotų silikagelio plokštelių. Iš silikagelio regeneruoti steroliai paverčiami trimetilsilileteriais ir analizuojami kapiliarinės dujų chromatografijos metodu.

3.   APARATŪRA

4.   REAGENTAI

5.   DARBO EIGA

6.   REZULTATŲ PATEIKIMAS

PRIEDĖLIS

Dujų linijinio greičio nustatymas

Į normalioms darbo sąlygoms sureguliuotą dujų chromatografą įpurškiama 1–3 μl metano (arba propano) ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės išplovimo momento (tM).

Linijinis greitis, cm/s, gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis centimetrais, tM yra sekundėmis išmatuotas laikas.

1 brėžinys

Negryninto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma

2 brėžinys

Gryninto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma

VI PRIEDAS

ERITRODIOLIO IR UVAOLIO NUSTATYMAS

ĮVADAS

Eritrodiolis (paprastai suprantamas kaip du glikoliai, eritrodiolis ir uvaolis, kartu) yra kai kurių rūšių riebalinėms medžiagoms būdingos nemuilinamos frakcijos sudedamoji dalis. Jo ženkliai didesnių koncentracijų randama tirpikliais ekstrahuojamose aliejuose, nei kituose aliejuose, pvz., spaudimo būdu gautame alyvuogių aliejuje ir vynuogių kauliukų aliejuje, kuriuose jo taip pat yra. Taigi eritrodiolio buvimas gali rodyti, kad yra tirpikliais ekstrahuoto aliejaus.

1.   TIKSLAS

Šiame metode aprašytas eritrodiolio nustatymo riebalinėse medžiagose būdas.

2.   METODO ESMĖ

Riebalinė medžiaga muilinama kalio hidroksido tirpalu etanolyje. Nemuilinama dalis ekstrahuojama dietileteriu ir gryninama leidžiant per kolonėlę su aliuminio oksidu.

Nemuilinamos medžiagos chromatografuojamos plonasluoksnės chromatografijos metodu ant silikagelio plokštelių, kol atskiriamos sterolių ir eritrodiolio frakcijas atitinkančios juostos. Nuo plokštelės regeneruoti steroliai ir eritrodiolis paverčiami trimetilsilileteriais ir mišinys analizuojamas dujų chromatografijos metodu.

Rezultatas apskaičiuojamas eritrodiolio procentiniu kiekiu eritrodiolio ir sterolių mišinyje.

3.   APARATŪRA

4.   REAGENTAI

5.   DARBO EIGA

5.1.   Nemuilinamų medžiagų paruošimas

Kaip aprašyta V priedo 5.1.2 skirsnyje.

5.2.   Eritrodiolio ir sterolių frakcijos atskyrimas

5.3.   Trimetilsilileterių ruošimas

Kaip aprašyta V priedo 5.3 skirsnyje.

5.4.   Dujų chromatografinė analizė

Kaip aprašyta anksčiau minėto metodo aprašymo 5.4 skirsnyje. Analizuojant chromatografo darbo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima atlikti sterolių analizę ir atskirti jų TMSE (trimetilsilileterius) nuo eritrodiolio ir uvaolio.

Įšvirkštus bandinį, užrašymas tęsiamas, kol, išplovus sterolius, išplaunami eritrodiolis ir uvaolis. Tuomet identifikuojamos smailės (santykinės eritrodiolio ir uvaolio sulaikymo trukmės pagal β-sitosterolį yra atitinkamai apie 1,45 ir 1,55) ir nustatomas jų plotas, kaip tai daroma sterolių atveju.

6.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

kurioje:

Rezultatas pateikiamas vieno ženklo po kablelio tikslumu.

▼M21

VII PRIEDAS

2-GLICERIL MONOPALMITATO PROCENTINIO KIEKIO NUSTATYMAS

1.   TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Aprašyti analitinę procedūrą 2-oje triglicerido padėtyje esančios palmitino rūgšties procentinei daliai apskaičiuoti, nustatant 2-glicerilo monopalmitato kiekį.

Šis metodas taikomas aplinkos temperatūros (20 °C) skystiems augaliniams aliejams.

2.   METODO ESMĖ

Paruoštas aliejaus mėginys veikiamas kasos lipaze: dėl dalinės ir specifinės 1 bei 3 padėties triglicerido molekulės hidrolizės monogliceridai atsiranda 2-oje padėtyje. Procentinis 2-glicerilo monopalmitato kiekis monoglicerido frakcijoje nustatomas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu, prieš tai atlikus sililinimą.

3.   ĮRANGA IR MEDŽIAGOS

4.   REAGENTAI

5.   DARBO EIGA

5.1.   Mėginio paruošimas

5.2.   Hidrolizė kasos lipaze

5.3.   Sililinizuotų darinių ir dujų chromatografijos paruošimas

5.4.   Dujų chromatografija

Darbo sąlygos:

5.4.1.   Smailių identifikavimas

Monogliceridai identifikuojami pagal sulaikymo trukmes ir šias trukmes lyginant su standartinių monogliceridų mišinių sulaikymo trukmėmis, analizuojamomis tomis pačiomis sąlygomis.

5.4.2.   Kiekybinis vertinimas

Kiekvienos smailės plotas apskaičiuojamas elektroniniu integratoriumi.

6.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Procentinis glicerilo monopalmitato kiekis apskaičiuojamas pagal atitinkamos smailės ploto santykį su visų monogliceridų smailių plotu (žr. 2 paveikslą), taikant tokią formulę:

kurioje:

Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu.

7.   ANALIZĖS ATASKAITA

Analizės ataskaitoje pateikiama:

1    paveikslas

Sililinizavimo reakcijos produktų, gautų rafinuotą alyvuogių aliejų su 20 % esterifikuoto aliejaus (100 %) priedu, paveikus lipaze, chromatograma

Paaiškinimas: Acides gras libres – Laisvosios riebalų rūgštys; Huile d’olives raffinée + 20 % huile estérifiée – Rafinuotas alyvuogių aliejus + 20 % esterifikuoto aliejaus; 1–2 monopalmitoléine – 1–2 monopalmitoleinas; 1–2 monopalmitine – 1–2 monopalmitinas; 1–2 mono C18 insat. – 1–2 mono C18 neprisot; Squalene – Skvalenas.

2    paveikslas

Chromatograma:

A)

neesterifikuotas alyvuogių aliejus po poveikimo lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Paaiškinimas: 1 = Laisvosios riebalų rūgštys 2 = Monogliceridai 3 = Digliceridai 4 = Trigliceridai * = 2-monopalmitinas ** = Trigliceridas C54

Chromatograma:

B)

esterifikuotas aliejus po poveikio lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Paaiškinimas: 1 = Laisvosios riebalų rūgštys 2 = Monogliceridai 3 = Digliceridai 4 = Trigliceridai * = 2-monopalmitinas ** = Trigliceridas C54

8.   PASTABOS

Rinkoje prekiaujama naudoti paruošta pakankamo aktyvumo lipaze. Lipazę taip pat galima paruošti laboratorijoje:

0 °C temperatūroje atšaldoma 5 kg šviežios kiaulių kasos. Pašalinami aplinkui esantys kieti riebalai bei apie juos esantis jungiamasis audinys, sumalama, kad susidarytų pastos pavidalo skysta masė. Ši pasta keturias-šešias valandas kratoma su 2,5 l absoliučiojo acetono ir centrifuguojama. Likutis dar tris kartus ekstrahuojamas tuo pačiu acetono tūriu, paskui du kartus 1:1 (v/v) acetono ir dietileterio mišiniu ir du kartus dietileteriu.

Likutis 48 valandas džiovinamas vakuume, tam kad gauti milteliai būtų patvarūs. Tokie milteliai, apsaugant juos nuo drėgmės, gali būti laikomi ilgą laiką šaldytuve.

Alyvuogių aliejaus emulsija ruošiama taip:

Maišytuve 10 minučių plakamas mišinys, sudarytas iš 165 ml gumiarabiko tirpalo (100 g/l), 15 g smulkinto ledo ir 20 ml neutralizuoto alyvuogių aliejaus.

Į 50 ml talpos cheminę stiklinę įpilama 10 ml šios emulsijos, po to 0,3 ml natrio choliato tirpalo (0,2 g/ml) ir 20 ml distiliuoto vandens.

Cheminė stiklinė dedama į termostatą, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra; įstatomi pH matuoklio elektrodai ir sraigtinis maišiklis.

Biurete lašinamas natrio hidroksido tirpalas, kol pH pasiekia 8,3.

Į vandenį įpilama lipazės miltelių suspensijos (0,1 g/ml lipazės). Kai tik pH matuoklis parodo 8,3, paleidžiamas chronometras ir natrio hidroksido tirpalas lašinamas tokiu greičiu, kad pH visą laiką būtų 8,3. Kas minutę pasižymimas sunaudoto tirpalo tūris.

Matavimai pavaizduojami x/y koordinačių sistemoje, abscisėje nurodant laiką, o ordinatėje – sunaudoto 0,1 N natrio hidroksido tūrį (mililitrais), kuris sunaudotas pastoviam pH išlaikyti. Turi būti gaunamas linijinis grafikas.

Lipazės aktyvumas, matuojamas lipazės vienetais/mg, apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

Lipazės vienetas yra apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris išskiria 10 mikroekvivalentų rūgšties per minutę.

▼M20 —————

▼B

IX PRIEDAS

SPEKTROFOTOMETRINIS TYRIMAS ULTAVIOLETINĖJE SPEKTRO DALYJE

ĮŽANGA

Spektrofotometrinis tyrimas ultravioletinėje spektro dalyje gali suteikti informacijos apie riebalų kokybę, jų išsilaikymo būklę ir technologinių procesų metu įvykusius pasikeitimus.

Absorbcija metode nurodytų bangų ilgių srityje vyksta dėl konjuguotų dienų ir trienų sistemų buvimo. Ši absorbcija reiškiama savitosios ekstinkcijos E1 % 1 cm pavidalu (1 cm sluoksnio storio 1 % riebalų tirpalo tam tikrame tirpiklyje ekstinkcija), pagal susitarimą žymimos K raide (taip pat vadinamos „ekstinkcijos koeficientu“).

1.   TIKSLAS

Metode aprašyta riebalų tyrimo ultravioletinėje spektro dalyje atlikimo metodika.

2.   METODO ESMĖ

Analizuojami riebalai ištirpinami reikiamame tirpiklyje, paskui, esant nustatytam bangos ilgiui, matuojama šio tirpalo ekstinkcija, lyginant su grynu tirpikliu. Pagal spektrofotometrinius duomenis skaičiuojamos savitosios ekstinkcijos vertės.

3.   APARATŪRA

▼M6

▼B

4.   REAGENTAI

5.   DARBO EIGA

6.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

I PRIEDĖLIS

Aliuminio oksido ruošimas ir jo aktyvumo tikrinimas

A.1.1.   Aliuminio oksido ruošimas

Aliuminio oksidas, prieš tai krosnyje džiovintas tris valandas 380–400 °C temperatūroje, supilamas į hermetiškai uždaromą indą, įpilama distiliuoto vandens, santykiu 5 ml vandens 100 g aliuminio oksido, indas tuojau pat uždaromas, kelis kartus pakratomas ir prieš naudojant paliekamas stovėti mažiausiai 12 valandų.

A.1.2.   Aliuminio oksido aktyvumo tikrinimas

Paruošiama chromatografinė kolonėlė su 30 g aliuminio oksido. Pagal 5.4 punkte pateiktą aprašymą, per kolonėlę leidžiamas mišinys, sudarytas iš:

ne mažesnė kaip 4.

Jei, mišiniui praėjus per kolonėlę, jo savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui 268 nm, yra didesnė kaip 0,11, aliuminio oksidas tinkamas naudoti, jei ne – jame reikia sumažinti vandens kiekį.

II PRIEDĖLIS

Spektrofotometro kalibravimas

X A PRIEDAS

RIEBIŲJŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ ANALIZĖ DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1.   TIKSLAS

Šiame metode aprašyti bendri nurodymai, kaip taikyti dujų chromatografiją su užpildomomis arba kapiliarinėmis kolonėlėmis, nustatant pagal X B priede nurodytą metodą gautų riebiųjų rūgščių metilesterių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Metodas netinka polimerizuotoms riebiosioms rūgštims.

2.   REAGENTAI

2.1.   Dujos nešiklis

Inertinės dujos (azotas, helis, argonas, vandenilis ir t. t), visiškai išdžiovintos, turinčios mažiau kaip 10 mg/kg deguonies.

1 pastaba.

Vandenilis, kuris kaip dujos nešiklis naudojamas tik kapiliarinėse kolonėlėse, gali du kartus padidinti analizės greitį, tačiau yra pavojingas. Galima pirkti saugių įtaisų.

2.2.   Pagalbinės dujos

2.3.   Palyginamasis etalonas

Grynų riebiųjų rūgščių metilesterių mišinys arba žinomos sudėties riebalų, geriausiai tokių, kurie yra panašūs į analizuojamą riebalinę medžiagą, metilesteriai.

Reikia imtis atsargumo priemonių, kad būtų išvengta nesočiųjų riebiųjų rūgščių su dideliu dvigubų jungčių skaičiumi oksidacijos.

3.   APARATŪRA

Pateikiamuose nurodymuose kalbama apie įprastą įrangą, kuri naudojama dujų chromatografijoje, turinčią užpildomas ir (arba) kapiliarines kolonėles ir dujų jonizacinį detektorių. Tinka bet koks prietaisas, kuriuo gaunamas 4.1.2 punkte nurodytas efektyvumas ir atskiriamoji galia.

3.1.   Dujų chromatografas

Dujų chromatografą sudaro:

3.1.1.   Įpurškimo įtaisas

Įpurškimo įtaisas naudojamas:

2 pastaba.Kai nėra mažiau kaip 16 atomų turinčių riebiųjų rūgščių, galima naudoti išimamą adatinį inžektorių.

3.1.2.   Krosnis

Krosnis turi įkaitinti kolonėlę bent iki 260 °C ir pasirinktą temperatūrą užpildomose kolonėlėse palaikyti 1 °C tikslumu, kapiliarinėse kolonėlėse – 0,1 °C tikslumu. Pastarasis reikalavimas ypač svarbus, kai naudojamas lydyto kvarco vamzdis.

Visais atvejais rekomenduojamas programuotos temperatūros kaitinimo režimas, ypač kai analizuojamos rūgštys, turinčios mažiau kaip 16 anglies atomų.

3.1.3.   Užpildoma kolonėlė

3.1.4.   Kapiliarinė kolonėlė

3.2.   Švirkštas

Didžiausia švirkšto talpa turi būti 10 μl, sugraduotas 0,1 μl padalomis.

3.3.   Savirašis

Jei savirašio brėžiama kreivė bus naudojama analizuojamo mišinio sudėčiai apskaičiuoti, reikalingas elektroninis didelio tikslumo savirašis, suderinamas su naudojamu prietaisu. Savirašio savybės turi būti tokios:

3.4.   Integratorius

Greitai ir tiksliai apskaičiuoti galima elektroniniu integratoriumi. Jis turi reikiamo jautrumo linijinį atsaką, bei turi patenkinamai atlikti korekciją dėl pagrindo linijos dreifo.

4.   DARBO EIGA

4.1–4.3 punktuose aprašytuose veiksmuose naudojama įranga su liepsnos jonizaciniu detektoriumi.

Kaip alternatyva gali būti naudojamas dujų chromatografas su katarometru (veikiančiu šilumos laidumo pokyčio matavimo principu). Tuo atveju darbo sąlygos keičiasi, kaip tai aprašyta 6 punkte.

4.1.   Analizės sąlygos

4.1.2.

Teorinių lėkščių (efektyvumo) ir atskiriamosios galios nustatymas (žr. 1 brėžinį) Atliekama maždaug lygiais kiekiais paimtų metilstearato ir metiloleato mišinio analizė (pvz., kakao aliejaus metilesterių analizė). Kolonėlės temperatūra ir dujų nešiklio srauto greitis pasirenkami tokie, kad metilstearato smailė užrašoma praėjus maždaug 15 minučių po tirpiklio smailės užrašymo. Naudojamas pakankamas metilesterių kiekis, kad metilstrearato smailė būtų per tris ketvirčius visos skalės aukščio. Teorinių lėkščių skaičius n (efektyvumas) apskaičiuojamas pagal formulę: ir atskiriamoji galia, R, apskaičiuojama pagal formulę: kuriose: dr1 yra sulaikymo atstumas nuo chromatogramos pradžios iki metilstearato smailės viršūnės, milimetrais; ω1 ir ω2 yra atitinkamai metilstearato ir metiloleato smailių pločiai, išmatuoti tarp kreivių perlinkio liečiamųjų susikirtimo su pagrindo linija taškų, milimetrais; Δ yra atstumas tarp metilstearato ir metiloleato smailių viršūnių, milimetrais; ▼M2 ir atskiriamosios galios koeficientas lr, taikant formulę kurioje: a = nuo pagrindo linijos išmatuotos žemiausios smailės aukštis; b = žemiausio taško tarp dviejų gretimų smailių atstumas išmatuotas nuo pagrindo linijos. ▼B 1 brėžinys Chromatograma teoriniam lėkščių skaičiui (efektyvumui) ir atskiriamajai galiai nustatyti Reikia pasirinkti tokias darbo sąlygas, kurios leistų analizuojant metilstearatą turėti bent 2 000 teorinių lėkščių vienam kolonėlės ilgio metrui ir ne mažesnę kaip 1,25 atskiriamąja galią.

4.2.   Analizei imama bandinio dalis

Mikrošvirkštu (3.2) paimama 0,1–2 μl pagal X B priedą paruoštų metilesterių ir įšvirkščiama į kolonėlę.

Kai esteriai neištirpinti, ruošiamas jų maždaug 100 mg/ml koncentracijos tirpalas chromatografiškai gryname heptane, ir įšvirkščiama 0,1–1 ml šio tirpalo.

Jei analizuojamų komponentų yra tik pėdsakai, analizuojama bandinio dalis gali būti padidinta (iki 10 kartų).

4.3.   Analizė

Paprastai naudojamos 4.1.1 punkte apibrėžtos darbo sąlygos.

Tačiau kolonėlė gali dirbti žemesnėje temperatūroje, kai reikia analizuoti riebiąsias rūgštis su mažiau kaip 12 anglies atomų, arba aukštesnėje temperatūroje, kai analizuojamos riebiosios rūgštys su daugiau kaip 20 anglies atomų. Kartais abiem šiais atvejais galima naudoti temperatūros programavimą. Pavyzdžiui, jei bandinį sudaro mažiau nei 12 anglies atomų turinčių riebiųjų rūgščių metilesteriai, bandinys įšvirkščiamas 100 °C temperatūroje (arba 50–60 °C, jei yra sviesto rūgšties) ir iš karto temperatūra 4–8 oC/min. greičiu keliama iki optimalios. Kai kuriais atvejais abi metodikos gali būti naudojamos kartu.

Po programuojamo temperatūros pakėlimo, išplovimas tęsiamas pastovioje temperatūroje, kol išplaunami visi komponentai. Jei prietaisas neturi programuoto kaitinimo, jis naudojamas esant dviems fiksuotoms temperatūroms tarp 100 ir 195 °C.

Prireikus patikrinti, ar nėra paslėptų smailių, pvz., kartu esant konjuguotiems

C18:3 ir C20:0 arba C18:3 ir C18:2 junginiams, rekomenduojama analizę atlikti su dviem nejudančiomis fazėmis, turinčiomis skirtingą poliškumą.

4.4.   Etaloninės chromatogramos ir etaloninių grafikų ruošimas

Tomis pačiomis sąlygomis, kurios naudojamos bandiniui analizuoti, analizuojamas etaloninis mišinys (2.3), išmatuojamos mišinį sudarančių riebiųjų rūgščių sulaikymo trukmės arba sulaikymo atstumai. Kiekvienam nesotumo laipsniui pusiau logaritminiame popieriuje braižomas sulaikymo trukmės arba atstumo logaritmo priklausomybės nuo anglies atomų skaičiaus grafikas. Pastovios temperatūros sąlygomis linijinės grandinės rūgščių su tuo pačiu nesotumo laipsniu grafikai turi būti tiesės. Šios tiesės turi būti daugiau arba mažiau lygiagrečios.

Būtina išvengti sąlygų, kuriomis galėtų atsirasti „paslėptų smailių“, t. y. kai atskiriamoji galia yra nepakankama dviems komponentams atskirti.

5.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

5.1.   Kokybinė analizė

Iš grafikų, gautų pagal 4.4 punktą, identifikuojamos bandinio metilesterių smailės, prireikus taikant interpoliaciją.

5.2.   Kiekybinė analizė

5.2.1.   Sudėties nustatymas

Išskyrus ypatingus atvejus, naudojamas vidinio normalizavimo metodas, t. y. daroma prielaida, kad chromatogramoje yra visi bandinio komponentai, todėl bendras smailių plotas atstovauja 100 % visų išplautų komponentų.

Jei įranga turi integratorių, naudojami juo gauti skaičiai. Jei integratoriaus nėra, kiekvienos smailės plotas apskaičiuojamas, padauginant jos aukštį iš pusaukščio pločio, kur reikia atsižvelgiant į užrašymo metu naudotus skirtingus signalo silpninimo laipsnius.

5.2.2.   Apskaičiavimo metodas

▼M2

6.   ATSKIRAS ATVEJIS – TRANS-IZOMERŲ NUSTATYMAS

Galima nustatyti riebiųjų rūgščių, turinčių 10–24 anglies atomus, trans-izomerų kiekį, jų metilo esteriams atskirti naudojant dujų chromatografines kapiliarines kolonėles su tam tikru poliškumu.

▼M21

▼M2

6.4.

Įvairių metilesterių identifikavimas atliekamas pagal sulaikymo trukmes, kurios lyginamos su etaloninių mišinių sulaikymo trukmėmis (kaip pažymėta 2.3 punkte). Trans-riebiųjų rūgščių esteriai išplaunami anksčiau kaip jų atitinkami cis-izomerai. Chromatogramos pavyzdys pateiktas 2 brėžinyje. 2 brėžinys Riebiųjų rūgščių trans-izomerų dujų chromatograma, naudojant kapiliarinę kolonėlę

▼B

7.   ATSKIRAS ATVEJIS – KATAROMETRINIO DETEKTORIAUS (VEIKIANČIO ŠILUMOS LAIDUMO KITIMO PRINCIPU) NAUDOJIMAS

Riebiųjų rūgščių metilesterių kokybinei ir kiekybinei sudėčiai nustatyti taip pat gali būti naudojamas dujų chromatografas, naudojantis detektorių, veikiantį šilumos laidumo kitimo principu (katarometrą). Jei naudojamas katarometras, 3 ir 4 punkte nurodytos sąlygos turi būti pakeistos, kaip parodyta 3 lentelėje.

Kiekybinėje analizėje naudojami 5.2.2.2 punkte apibrėžti korekcijos koeficientai.

8.   ANALIZĖS ATASKAITA

Analizės ataskaitoje nurodomi metilesterių gamyboje ir dujų chromatografinėje analizėje naudoti metodai ir gauti rezultatai. Joje taip pat nurodomos visos darbo detalės, neapibrėžtos šiame tarptautiniame standarte, arba laikomos pasirinktinėmis, kartu nurodant bet kokių atsitikimų, galėjusių turėti įtakos rezultatams, aplinkybes.

Analizės ataskaitoje nurodoma išsami visiškam bandinio identifikavimui reikalinga informacija.

▼M19

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

XI PRIEDAS

LAKIŲJŲ HALOGENINTŲ TIRPIKLIŲ KIEKIO ALYVUOGIŲ ALIEJUJE NUSTATYMAS

1.   METODAS

Dujų chromatografinė analizė, naudojant lakiųjų medžiagų nustatymo tuščioje erdvėje virš produkto metodą.

2.   APARATŪRA

3.   REAGENTAI

Etalonas: halogeninti tirpikliai, pagal grynumą tinkami dujų chromatografinei analizei.

4.   DARBO EIGA

▼M22

XII PRIEDAS

TARPTAUTINĖS ALYVUOGIŲ ALIEJAUS TARYBOS PIRMOJO SPAUDIMO ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ORGANOLEPTINIO VERTINIMO METODAS

1.   DALYKAS IR TAIKYMO SRITIS

Šio metodo pagrindas – 2007 m. lapkričio 16 d. sprendimas Nr. DEC-21/95-V/2007 dėl Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos persvarstyto pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus organoleptinio vertinimo metodo. Šio metodo tikslas – nustatyti pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus organoleptinių savybių vertinimo tvarką kaip tai apibrėžta Reglamento (EB) Nr. 1234/2007 XVI priedo 1 punkte ir nustatyti metodą, naudotiną aliejaus rūšiai remiantis tomis savybėmis nustatyti. Metode taip pat pateikiamos su neprivalomu žymėjimu susijusios nuorodos.

Šį metodą galima taikyti tik pirmojo spaudimo alyvuogių aliejui ir jo rūšies ar žymėjimo nustatymui remiantis trūkumų stiprumu, „vaisių“ požymiu ir kitais teigiamais požymiais, apie kuriuos sprendžia atrinktų, apmokytų ir patikrintų degustuotojų grupė.

2.   BENDROSIOS NUOSTATOS

Dėl aliejaus bendrojo pagrindinio žodyno, degustavimo patalpos ir degustavimo stiklinės ir kitokių su šiuo metodu susijusių klausimų rekomenduojama remtis Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos nuostatomis, visų pirma – 2007 m. lapkričio 16 d. sprendimu Nr. DEC-21/95-V/2007 dėl pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus organoleptinio vertinimo metodo.

3.   SPECIALUSIS ŽODYNAS

3.1.   Teigiami požymiai

iš karto ir (arba) giliai nosyje užuodžiami (pajuntami) įvairūs aromatai (atsižvelgiant į alyvuogių rūšį), būdingi aliejui, pagamintam iš žalių arba sunokusių sveikų ir šviežių vaisių.

Vaisių požymis nurodomas kaip žalių vaisių, kai aromatas ir skonis primena iš žalių vaisių išspaustam aliejui būdingą aromatą ir skonį.

Vaisių požymis nurodomas kaip sunokusių vaisių, kai aromatas ir skonis primena iš sunokusių vaisių išspaustam aliejui būdingą aromatą ir skonį.

Kartus : liežuvio šaknyje esančiais svogūnėliais pajaučiamas paprastas skonis, būdingas aliejams, pagamintiems iš žalių arba iš pradedančių nokti alyvuogių.

Aštrus : visoje burnos ertmėje, ypač gerklėje, jaučiamas dilgsėjimas; charakteringa aliejui, pagamintam sezono pradžioje, paprastai iš dar neprinokusių alyvuogių.

3.2.   Neigiami požymiai

Sudvisęs : prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam iš kaupuose laikytų alyvuogių, kurių anaerobinis fermentavimo procesas gerokai paspartėjęs, arba prieskonis, atsiradęs dėl ilgalaikio aliejaus sąlyčio su anaerobinį fermentavimo procesą taip pat patyrusiomis statinių ir talpyklų dekantavimo nuosėdomis.

Atsiduodantis pelėsiais – drėgme : prieskonis, būdingas aliejams, pagamintiems iš alyvuogių, kuriose užsiveisė didelis grybelių ir mielių bakterijų kiekis drėgnas alyvuoges kelias dienas palaikius supiltas į kaupus.

Vyno – acto arba rūgštus – aitrus : būdingas kai kurių aliejų aromatas, primenantis vyną arba actą. Atsiranda daugiausia dėl aerobinio alyvuogių ar alyvuogių masės likučių blogai išplautuose dembliuose fermentacijos proceso, dėl kurio susidaro acto rūgštis, etilacetatas ir etanolis.

Metalo : prieskonis, primenantis metalą. Prieskonis, atsirandantis dėl ilgalaikio aliejaus sąlyčio su metaliniais paviršiais gniuždymo, maišymo, spaudimo arba laikymo metu.

Apkartęs : būdingas aliejams, paveiktiems stipraus oksidacijos proceso.

Pakaitintas arba pridegęs : prieskonis būdingas aliejams, kurie buvo per stipriai ir (arba) per ilgai kaitinami juos gaminant, ypač jei terminis masės maišymas buvo atliekamas netinkamomis sąlygomis.

Šieno – medienos : prieskonis, būdingas kai kuriems aliejams, pagamintiems iš sausų alyvuogių.

Sunkus : kai kurių senų aliejų burnoje sukeliamas tirštumo, klampumo pojūtis.

Tepalų : aliejaus skonis, primenantis dyzeliną, taukus ar mineralinę alyvą.

Augalinio vandens : aliejaus prieskonis, atsiradęs dėl ilgo sąlyčio su fermentacijos paveiktu augaliniu vandeniu.

Sūrymo : aliejaus, pagaminto iš alyvuogių, kurios buvo konservuojamos sūryme, prieskonis.

Esparto : prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam alyvuoges spaudžiant naujuose dembliuose iš esparto žolės. Prieskonis gali skirtis pagal tai, ar dembliai pagaminti iš žalios ar džiovintos žolės.

Žemių : prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam iš alyvuogių, surinktų kartu su žemėmis, arba purvinų ir nenuplautų alyvuogių.

Kirmėlių : aliejaus, pagaminto iš alyvuogių, kurias smarkiai pažeidė alyvmedžių musių (Bactrocera Oleae) lervos, prieskonis.

Agurkų : prieskonis, atsirandantis susidarius 2-6 nonadienaliui ir būdingas aliejui, per ilgai laikytam sandariai uždarytuose induose, ypač skardinėse.

Drėgnos medienos : prieskonis, būdingas aliejui, išspaustam iš šalnos pakąstų alyvuogių.

3.3.   Neprivaloma etikečių terminologija

Gavęs prašymą degustuotojų grupės vadovas gali patvirtinti, kad, priklausomai nuo požymių pojūčio ir stiprumo, įvertinti aliejai atitinka apibrėžtis ir intervalus atitinkančius šiuos posakius ir būdvardžius:

4.   DEGUSTUOTOJŲ GRUPĖ

Degustuotojų grupę sudaro degustuotojų grupės vadovas ir 8–12 degustuotojų.

Degustuotojų grupės vadovas turi būti aukštą kvalifikaciją įgijęs ekspertas, išmanantis įvairias aliejaus rūšis. Jis atsakingas už degustuotojų grupės darbo organizavimą ir veiklą, už bandinių ruošimą ir kodavimą bei jų pateikimą degustuotojui, taip pat už gautų duomenų surinkimą ir jų statistinį apdorojimą.

Jis taip pat parenka degustuotojus, prižiūri jų mokymąsi bei jų darbo kokybę, siekdamas užtikrinti, kad jų įgūdžiai būtų pakankamo lygio.

Degustuotojai, tikrinantys organoleptines aliejaus savybes, turi būti parinkti ir apmokyti remiantis jų gebėjimu atskirti panašius bandinius, vadovaujantis Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos kvalifikuotų pirmojo spaudimo aliejaus degustuotojų atrankos, mokymo ir stebėjimo vadovu.

Degustuotojų grupės turi įsipareigoti dalyvauti nacionaliniuose, Bendrijos ir tarptautiniuose organoleptinių charakteristikų įvertinimuose, organizuojamuose siekiant užtikrinti nuolatinį pojūčių kriterijų stebėjimą ir suderinimą. Be to, pagal šio reglamento 4 straipsnio 1 dalies nuostatas patvirtintos degustuotojų grupės visą informaciją apie degustuotojų grupės sudėtį ir jų, kaip patvirtintos grupės, atliktų įvertinimų skaičių privalo kasmet pateikti atitinkamai valstybei narei.

5.   ORGANOLEPTINIS VERTINIMAS IR RŪŠIES NUSTATYMAS

5.1.   Degustuotojo pildomas savybių įvertinimo lapas

Savybių įvertinimo lapas, kurį pildo degustuotojas, yra pateiktas šio metodo A priedėlyje.

Kiekvienas degustuotojų grupei priklausantis degustuotojas uosto, po to ragauja analizei skirtą aliejų. Po to savybių įvertinimo lape 10 cm skalėje jis pažymi pajustų neigiamų ir teigiamų požymių stiprumą ( 6 ). Pajutęs žalių vaisių ar sunokusių vaisių „vaisių“ požymio pobūdį, degustuotojas pažymi atitinkamą vertinimo lapo langelį.

Pajutus savybių įvertinimo lape nenurodytus neigiamus požymius, juos reikia pažymėti grafoje „Kita“, naudojant kuo tiksliau juos apibūdinantį nustatytą terminą ar terminus.

5.2.   Degustuotojų grupės vadovo atliekamas duomenų apdorojimas

Degustuotojų grupės vadovas surenka kiekvieno degustuotojo užpildytus savybių įvertinimo lapus; patikrina nurodytą požymių stiprumą; pastebėjęs ką nors neįprasto, paprašo degustuotojo peržiūrėti savo lapą ir, reikalui esant, pakartoti bandymą.

Degustuotojų grupės vadovas gali įvesti kiekvieno degustuotojo gautus duomenis į kompiuterinę programą, suderinamą su statistinio medianos apskaičiavimo metodu, pateiktu B priedėlyje. Bandinio duomenys įvedami naudojant matricą, sudarytą iš 9 jutimo požymių atitinkančių 9 stulpelių ir n eilučių, atitinkančių n degustuotojų.

Jei ne mažiau nei 50 % degustuotojų grupės narių grafoje „Kita“ pažymi neigiamą požymį, šio požymio mediana turi būti apskaičiuota ir atitinkamai nustatyta aliejaus rūšis.

Kad įvertintas aliejus atitinka 3.3.a punkto sąlygas, susijusias su terminais „žali vaisiai“ ir „sunokę vaisiai“, degustuotojų grupės vadovas gali patvirtinti tik tuo atveju, jei ne mažiau kaip 50 % degustuotojų pažymėjo pajutę „vaisių“ požymio žalių vaisių ar sunokusių vaisių pobūdį.

Jei atliekama analizė, kurios metu tikrinama atitiktis, atliekamas bandymas. Jei analizių rezultatai prieštaringi, degustuotojų grupės vadovas turi suorganizuoti pakartotinę analizę. Jei analizių rezultatai nenuoseklūs, įvertinimas turi būti atliekamas tris kartus. Tokiais atvejais požymių mediana skaičiuojama remiantis medianų vidurkiu. Visi tokių analizių pakartojimai turi būti atliekami atskirų seansų metu.

5.3.   Aliejaus rūšies nustatymas

Atsižvelgiant į trūkumų medianą ir „vaisių“ požymio medianą aliejus suskirstomas į toliau nurodytas kategorijas. Trūkumų mediana – tai didžiausia labiausiai pajusto neigiamo požymio mediana. Trūkumų mediana ir „vaisių“ požymio mediana išreiškiamos vienos dešimtosios tikslumu, o stabilaus nuokrypio koeficientas turi būti ne didesnis nei 20 %.

Aliejaus rūšis nustatoma lyginant trūkumų medianos ir „vaisių“ požymio medianos dydžius su toliau nustatytais etaloniniais intervalais. Kadangi šių intervalų ribos nustatytos atsižvelgiant į metodo klaidas, jos laikomos absoliučiomis. Programinė įranga atvaizduoja rūšį statistikos duomenų lentelėje ar diagramoje.

5.4.   Ypatingas atvejis

Jei teigiamo požymio (išskyrus „vaisių“ požymio) mediana viršija 5,0, degustuotojų grupės vadovas tai pažymi aliejaus analizės sertifikate.

A priedėlis

Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus savybių įvertinimo lapas

B priedėlis

MEDIANOS IR PASIKLIAUTINŲJŲ INTERVALŲ APSKAIČIAVIMO METODAS

Mediana

Mediana – tai realusis skaičius Xm, apibrėžiamas taip: tikimybė (P), kad sklaidos (X) dydžiai yra mažesni už tą skaičių (Xm), yra ne didesnė negu 0,5, o tikimybė (P), kad sklaidos (X) dydžiai nėra didesni už Xm, yra ne mažesnė negu 0,5. Pagal kitą apibrėžtį mediana yra 50-asis sklaidos dydžių, išdėstytų didėjančia tvarka, procentilis. Paprasčiau sakant mediana yra vidurinis tam tikra tvarka išrikiuotų nelyginių skaičių imties dydis, arba tam tikra tvarka išrikiuotų lyginių skaičių imties dviejų vidurinių skaičių vidurkis.

Stabilus standartinis nuokrypis

Norint apskaičiuoti stabilų standartinį nuokrypį Stuarto ir Kendallo metodu, reikia patikimai apskaičiuoti kintamumą, susijusį su medianos regresija. Asimptotinio standartinio nuokrypio formulė, t. y. nagrinėjamųjų duomenų kintamumo stabilus apskaičiavimas, kai N yra stebėjimų skaičius, o IQR – tarpkvartilinis nuotolis, kurį sudaro tiksliai 50 % visų bet kurios tikimybės sklaidos atvejų.

Tarpkvartilinis nuotolis gaunamas apskaičiavus nuokrypio tarp 75-ojo ir 25-ojo procentilių dydį.

IQR = 75-asis procentilis – 25-asis procentilis

Procentilis – tai skaičius Xpc, apibrėžiamas taip: tikimybė (P), kad sklaidos skaičiai yra mažesni už Xpc, yra mažesnė arba lygi nustatytajai šimtajai, o tikimybė (P), kad sklaidos skaičiai yra ne didesni už Xpc, yra didesnė arba lygi minėtajai šimtajai. Šimtoji – tai naudojama sklaidos trupmena. Medianą yra 50/100.

Kitaip tariant, procentilis – tai sklaidos skaičius, atitinkantis nustatytą plotą, pažymėtą pagal sklaidos arba tankio kreivę. Pavyzdžiui, 25-asis procentilis – tai sklaidos skaičius, atitinkantis plotą, lygų 0,25 arba 25/100.

Stabilios variacijos koeficientas, %

SVK % – tai bedimensis dydis, t. y. neturintis matmenų, rodantis procentinį skaičių imties kintamumo dydį. Dėl šios priežasties tai labai naudinga degustuotojų grupės narių patikimumui patikrinti.

95 % pasikliautinieji intervalai ties mediana

95 % (pirmos rūšies paklaidos dydis yra lygus 0,05 arba 5 %) pasikliautinieji intervalai nurodo galimą medianos dydžio kitimo intervalą, jei būtų įmanoma eksperimentą kartoti iki begalybės. Praktiškai šis intervalas nurodo analizės kintamumo intervalą, esant pasirinktoms darbo sąlygoms, jei analizę būtų galima kartoti keletą kartų. Intervalu galima įvertinti, kaip ir SVK % atveju, analizės patikimumą.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me – (c.S*)

kur c lygus 1,96, jei pasikliautinasis intervalas yra 0,95.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

XV PRIEDAS

1.   ALIEJAUS KIEKIO ALYVUOGIŲ ATLIEKOSE NUSTATYMAS

1.1.   Aparatūra

1.2.   Reagentas

Techniškai grynas n-heksanas, kurio 100 ml visiškai išgarinus turi likti ne didesnės kaip 0,002 g masės likutis.

2.   DARBO EIGA

2.1.   Analizuojamo bandinio ruošimas

Prireikus laboratorinį bandinį sumalti, kad visos dalelės sumažėtų iki sijojamo dydžio, naudojamas mechaninis malūnas, kuris prieš tai gerai išvalomas.

Maždaug dvidešimtoji bandinio dalis sunaudojama malūno valymui užbaigti, sumalta medžiaga išmetama, likusi dalis malama, surenkama, kruopščiai sumaišoma ir iš karto analizuojama.

2.2.   Analizuojamo bandinio dalis

Užbaigus malimo operaciją, 0,01 g tikslumu analizei pasveriama maždaug 10 g bandinio.

2.3.   Ekstrahavimo tūtos ruošimas

Analizuojama dalis sudedama į tūtą, kuri užkemšama vata. Jei naudojamas filtravimo popierius, analizuojama bandinio dalis suvyniojama į jį.

2.4.   Išankstinis džiovinimas

Jei alyvuogių atliekos yra labai drėgnos (t. y. drėgmės ir lakiųjų medžiagų kiekis didesnis kaip 10 %), jos iš anksto džiovinamos, užpildytą tūtą (arba filtravimo popierių) laikant reikiamą laiką džiovinimo spintoje, kaitinamoje ne daugiau kaip iki 80 °C, kad drėgmės ir lakiųjų medžiagų kiekis sumažėtų iki mažiau kaip 10 %.

2.5.   Apvaliadugnės kolbos ruošimas

Kolba su vienu arba dviem gabaliukais pemzos, prieš tai išdžiovinta džiovinimo spintoje 103 ± 2 °C temperatūroje ir ne trumpiau kaip valandą aušinta eksikatoriuje, pasveriama 1 mg tikslumu.

2.6.   Pradinis ekstrahavimas

Į ekstrahavimo aparatą įkišama tūta (arba filtro popierius) su analizuojama bandinio dalimi. Į kolbą įpilamas reikiamas kiekis heksano. Kolba prijungiama prie ekstrahavimo aparato ir viskas įstatoma į elektra šildomą vonią. Šildymas nustatomas taip, kad tekėjimo atgal greitis būtų ne mažesnis kaip trys lašai per sekundę (vidutinis, ne audringas virimas). Po keturių ekstrahavimo valandų paliekama ataušti. Tūta išimama iš ekstrahavimo aparato ir įsigėrusio tirpiklio didesnei daliai pašalinti pakišama po oro srove.

2.7.   Antrasis ekstrahavimas

Tūtos turinys iškratomas į mažą grūstuvę ir kiek galima smulkiau sumalamas. Sumaltas mišinys be nuostolių vėl supilamas į tūtą, kuri dedama atgal į ekstrahavimo aparatą.

Ekstrahuojama dar dvi valandas toje pačioje apvaliadugnėje kolboje su pradiniu ekstraktu.

Ekstrahavimo kolboje gautas tirpalas turi būti skaidrus. Jei taip nėra, tirpalas filtruojamas per filtravimo popierių, paskui kolba, kurioje jis buvo laikomas, bei filtravimui naudotas popierius kelis kartus plaunami heksanu. Filtratas ir plovimo tirpiklis supilami į antrą apvaliadugnę kolbą, kuri buvo išdžiovinta ir pasverta 1 mg tikslumu.

2.8.   Tirpiklio šalinimas ir ekstrakto svėrimas

Didesnė tirpiklio dalis pašalinama distiliuojant ant elektra šildomos vonios. Paskutiniai tirpiklio pėdsakai šalinami kolbą 20 minučių kaitinant džiovinimo spintoje 103 ± 2 °C temperatūroje. Tirpiklio šalinimas greitinamas pučiant orą, geriausia inertines dujas, arba džiovinant sumažintame slėgyje.

Kolba ne trumpiau kaip valandą paliekama eksikatoriuje ataušti ir pasveriama 1 mg tikslumu.

Kolba pašildoma dar kartą 10 minučių tomis pačiomis sąlygomis, ataušinama eksikatoriuje ir vėl pasveriama.

Skirtumas tarp dviejų svėrimų neturi viršyti 10 mg. Jei jis didesnis, šildoma dar po 10 minučių, paskui aušinama ir sveriama, kol skirtumas sumažėja iki 10 mg arba mažiau. Paskutinė kolbos masės vertė užrašoma.

Atliekama pakartotina paties bandinio analizė.

3.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

3.1.   Apskaičiavimo metodas ir formulė

3.2.   Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analitikui lygiagrečiai arba greitai paeiliui atliekant du nustatymus, skirtumas neturi viršyti 0,2 g heksaninio ekstrakto 100 gramų bandinio.

Jei ši sąlyga neįvykdoma, analizė pakartojama su kitomis dviem bandinio dalimis. Jei ir šiuo atveju skirtumas didesnis kaip 0,2 g, rezultatu imamas šių keturių nustatymų aritmetinis vidurkis.

XVI PRIEDAS

JODO SKAIČIAUS NUSTATYMAS

1.   TAIKYMO SRITIS

Šis tarptautinis standartas tiksliai apibrėžia metodą gyvulinių ir augalinių riebalų bei aliejų, toliau vadinamų riebalais, jodo skaičiui nustatyti.

2.   APIBRĖŽIMAS

Šiame tarptautiniame standarte vartojamas toks apibrėžimas:

3.   METODO ESMĖ

Analizuojama bandinio dalis ištirpinama tirpiklyje ir pridedama Wijs reagento. Po tam tikro laiko įpilama kalio jodido tirpalo bei vandens ir išsiskyręs jodas titruojamas natrio tiosulfato tirpalu.

4.   REAGENTAI

Visi reagentai turi būti pripažintos analiziškai grynų reagentų kokybės:

5.   APARATŪRA

Įprasta laboratorinė įranga ir konkrečiai tokia:

6.   ANALIZUOJAMO BANDINIO RUOŠIMAS

Homogenizuotas bandinys džiovinamas virš natrio sulfato ir filtruojamas.

7.   DARBO EIGA

8.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Jodo skaičius apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

Rezultatu imamas dviejų nustatymų aritmetinis vidurkis, jei įvykdytos pakartojamumo (9.2) sąlygos.

▼M11

XVII PRIEDAS

AUGALINIUOSE ALIEJUOSE ESANČIŲ STIGMASTADIENŲ NUSTATYMO METODAS

1.   TIKSLAS

Stigmastadienų nustatymas augaliniuose aliejuose, turinčiuose mažą šių angliavandenilių kiekį, ypač pirmojo spaudimo alyvuogių aliejuje ir alyvuogių išspaudų aliejuje.

2.   TAIKYMO SRITIS

Standartas gali būti taikomas visiems augaliniams aliejams, nors matavimai yra patikimi tik tuo atveju, kai šių angliavandenilių kiekis yra 0,01–4,0 mg/kg. Metodas ypač tinka nustatyti grynintų augalinių aliejų (maišyto alyvuogių, maišyto alyvuogių išspaudų, saulėgrąžų, palmių ir t. t.) buvimą pirmojo spaudimo alyvuogių aliejuje, kadangi gryninti aliejai turi stigmastadienų, o pirmojo presavimo aliejus jų neturi.

3.   METODO ESMĖ

Nemuilinamos medžiagos atskyrimas. Steroidinių angliavandenilių frakcijos išskyrimas, taikant kolonėlinę chromatografiją su silikageliu, ir analizė kapiliarinės dujų chromatografijos metodu.

4.   APARATŪRA

5.   REAGENTAI

Visi reagentai turi būti analiziškai gryni, jei nepasakyta kitaip. Turi būti naudojamas distiliuotas vanduo arba bent atitinkamo grynumo vanduo.

6.   DARBO EIGA

6.1.   Nemuilinamos medžiagos gavimas

6.2.   Steroidinių angliavandenilių frakcijos atskyrimas

6.3.   Dujų chromatografija

1 brėžinys

Dujų chromatogramos, gautos alyvuogių aliejaus bandiniams, analizuojamiems lydyto kvarco kapiliarinėje kolonėlėje (vidinis skersmuo 0,25 mm, ilgis 25 m), padengtoje 0,25 μm storio 5 % polifenilmetilsiloksano plėvele.

2 brėžinys

Dujų chromatograma, gauta DB-5 kolonėlėje analizuojamiems gryninto alyvuogių aliejaus bandiniams, kurioje matoma 3,5-stigmastadieno izomero smailė.

▼M13

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1: The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

Note 2:

Note 3: With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4: The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5: A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

moles P = area % PMW Pmoles S = area % SMW Smoles Po = area % PoMW Po	(1)
moles O = area % OMW Omoles L = area % LMW Lmoles Ln = area % LnMW Ln

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %