(1)

Nella parte A è aggiunto il seguente capitolo:

«A.25   COSTANTI DI DISSOCIAZIONE IN ACQUA (METODO DELLA TITOLAZIONE — METODO SPETTROFOTOMETRICO — METODO CONDUTTIMETRICO)

INTRODUZIONE

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE n. 112 (1981)

Presupposti

Informazioni generali

Condizioni particolari

Documenti di riferimento

Il presente metodo di prova si basa sui metodi indicati nei riferimenti citati nella sezione “Bibliografia” e nel documento Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification dell'EPA, del 18 agosto 1978.

INTRODUZIONE, OGGETTO, PORTATA, PERTINENZA, APPLICAZIONE E LIMITI DI PROVA

La dissociazione di una sostanza in acqua è importante per valutare il suo impatto sull'ambiente. Essa determina la forma della sostanza che, a sua volta, ne determina il comportamento e il trasporto. Può incidere sull'adsorbimento della sostanza chimica nel suolo e nei sedimenti e sull'assorbimento all'interno di cellule biologiche.

Definizioni e unità di misura

La dissociazione è la divisione reversibile in due o più specie chimiche che possono essere ionizzate. Il processo è comunemente indicato dall'equilibrio:

RX ⇌ R ++ X –

e la costante di equilibrio della concentrazione è:

Ad esempio, nel caso specifico in cui R è l'idrogeno (la sostanza è un acido), la costante è:

oppure

Sostanze di riferimento

Non è necessario utilizzare le seguenti sostanze di riferimento ogni volta che si esamina una nuova sostanza. Esse sono fornite soprattutto affinché la calibrazione del metodo possa essere effettuata periodicamente e che i risultati possano essere confrontati con i risultati ottenuti con altri metodi.

Sarebbe utile disporre di una sostanza con diversi pK, come indicato nella sezione “Principio del metodo”. Una siffatta sostanza potrebbe essere:

Principio del metodo

Il processo chimico descritto dipende generalmente solo in misura ridotta dalla temperatura nell'intervallo delle temperature registrate nell'ambiente. La determinazione della costante di dissociazione implica la misurazione delle concentrazioni delle forme dissociate e non dissociate della sostanza chimica in esame. Conoscendo la stechiometria della reazione di dissociazione indicata nella sezione “Definizioni e unità”, si può determinare la costante corrispondente. Nel caso specifico descritto nel presente metodo di prova, la sostanza si comporta come un acido o una base, ed il metodo più facile consiste nel determinare le relative concentrazioni nelle forme ionizzata e non ionizzata della sostanza e il pH della soluzione. Il rapporto tra queste condizioni è dato dall'equazione per pKa nella sezione “Definizione e unità”. Alcune sostanze presentano più di una costante di dissociazione e possono essere sviluppate formule analoghe. Alcuni dei metodi qui descritti si applicano anche alla dissociazione non-acido/base.

Criteri di qualità

Riproducibilità

La costante di dissociazione va replicata (un minimo di tre determinazioni); i valori devono essere compresi in un intervallo di ± 0,1 unità logaritmiche.

DESCRIZIONE DEL METODO

Vi sono due differenti approcci per la determinazione del pKa. Uno comporta la titolazione di una quantità nota della sostanza con un acido o una base standard, a seconda dei casi; l'altro consiste nel determinare la concentrazione relativa delle forme ionizzata e non ionizzata e la sua dipendenza dal pH.

Preparazioni

I metodi basati su questi principi possono essere classificati come metodo della titolazione, metodo spettrofotometrico e metodo conduttimetrico.

Soluzioni campione

Per il metodo della titolazione e quello conduttimetrico, dissolvere la sostanza chimica in esame in acqua distillata. Per il metodo spettrofotometrico e altri metodi sono utilizzate le soluzioni tampone. La concentrazione della sostanza di prova non deve superare il valore minore tra 0,01 M e la metà della concentrazione di saturazione; per la preparazione delle soluzioni utilizzare la sostanza nella forma più pura disponibile. Se è scarsamente solubile, la sostanza può essere disciolta in una piccola quantità di solvente miscibile con l'acqua prima di essere aggiunta alle concentrazioni sopra indicate.

Le soluzioni devono essere sottoposte a controllo per verificare la presenza di emulsioni utilizzando un fascio Tyndall, soprattutto se è stato utilizzato un co-solvente per migliorare la solubilità. Quando si utilizzano soluzioni tampone, la loro concentrazione non deve superare 0,05 M.

Condizioni sperimentali

Temperatura

La temperatura deve essere controllata almeno a ± 1 °C. La determinazione deve essere effettuata, preferibilmente, a 20 °C.

Se si ritiene che i risultati varino in modo significativo in funzione della temperatura, ripetere la determinazione ad almeno altre due temperature. In tal caso, gli intervalli di temperatura devono essere di 10°C, con un controllo di ± 0,1 °C circa.

Analisi

Il metodo sarà determinato dalla natura della sostanza chimica in esame. Esso deve essere sufficientemente sensibile da consentire la determinazione delle diverse specie a ciascuna delle concentrazioni della soluzione campione.

Esecuzione della prova

Metodo della titolazione

La soluzione campione è determinata per titolazione con una soluzione acida o basica standard, secondo il caso. Misurare il pH dopo ogni aggiunta di titolante. Vanno effettuate almeno 10 aggiunte incrementali prima del punto di equivalenza. Se l'equilibrio è raggiunto abbastanza rapidamente, si può utilizzare un potenziometro registratore. Per questo metodo è necessario conoscere con precisione la quantità totale della sostanza e la sua concentrazione. Vanno prese le precauzioni necessarie per escludere la presenza di CO2. I dettagli della procedura, le misure precauzionali da adottare e il metodo di calcolo sono riportati nelle prove standardizzate, ad esempio nei riferimenti (1), (2), (3) e (4)

Metodo spettrofotometrico

Trovare una lunghezza d'onda in cui le forme ionizzate e non ionizzate della sostanza presentano coefficienti di estinzione significativamente diversi. Lo spettro di assorbimento UV/Vis è ottenuto da soluzioni di concentrazione costante, in condizioni di pH in cui la sostanza è praticamente non ionizzata, completamente ionizzata e a diversi pH intermedi. Ciò può essere ottenuto mediante aggiunta di acido (o di base) concentrato a un volume relativamente significativo di una soluzione della sostanza in un tampone a più componenti, inizialmente a pH elevato (basso) (rif. 5), o aggiungendo volumi uguali della soluzione madre della sostanza stessa, ad esempio in acqua o metanolo, a volumi costanti di varie soluzioni tampone che coprono l'intervallo voluto di pH. A partire dai valori di pH e di assorbanza alla lunghezza d'onda scelta si calcola un numero sufficiente di valori pKa utilizzando i dati ottenuti per almeno 5 pH diversi ai quali il tasso di ionizzazione della sostanza è compreso tra il 10 e il 90 %. Ulteriori dati sperimentali e metodo di calcolo sono riportati nel riferimento (1).

Metodo conduttimetrico

Utilizzando una cella, la cui costante è nota e ridotta, misurare la conducibilità di circa 0,1 M di soluzione della sostanza in acqua. Sono inoltre misurate le conducibilità di alcune diluizioni, accuratamente preparate, di tale sostanza. La concentrazione è dimezzata ogni volta, e la serie deve comprendere almeno un ordine di grandezza di concentrazione. La conducibilità limite a una diluizione infinita è ottenuta eseguendo una sperimentazione simile con il sale di Na e estrapolando. Si può quindi calcolare il grado di dissociazione a partire dalla conducibilità di ciascuna soluzione utilizzando l'equazione di Onsager; successivamente, applicando la legge di diluizione di Ostwald, la costante di dissociazione può essere calcolata con la seguente formula: K = α2C/(1 – α), dove C è la concentrazione in moli per litro e α è la frazione dissociata. Vanno prese le precauzioni necessarie per escludere la presenza di CO2. Ulteriori dati sperimentali e metodo di calcolo sono indicati nei testi di riferimento e nei riferimenti (1), (6) e (7).

DATI E RELAZIONE

Calcolo dei risultati

Metodo per titolazione

Il pKa è calcolato per 10 punti misurati sulla curva di titolazione. Si calcola la media e la deviazione standard di tali valori pKa. Vanno inclusi un grafico del pH in funzione del volume di base o acido standard e una presentazione sotto forma di tabella.

Metodi spettrofotometrici

L'assorbanza e il pH sono registrati per ciascuno spettro. Partendo dai punti corrispondenti ai dati relativi agli spettri intermedi si calcolano almeno cinque valori pKa, nonché la media e la deviazione standard dei risultati.

Metodo conduttimetrico

La conducibilità equivalente Λ è calcolata per ciascuna concentrazione dell'acido e per ciascuna concentrazione di una miscela di 1 equivalente di acido più 0,98 equivalente di idrossido di sodio privo di carbonato. L'acido è eccedente per evitare un eccesso di OH– dovuto all'idrolisi. Si rappresenta graficamente 1/Λ in funzione di √C e si può trovare il valore Λo del sale mediante estrapolazione a concentrazione zero.

Il valore λo dell'acido può essere calcolato utilizzando i valori forniti dalla letteratura per H+ and Na+. Il pKa può essere ricavato dalle formule α = Λi /Λo e Ka = α2C/(1 – α) per ciascuna concentrazione. Si possono ottenere valori migliori per Ka procedendo a correzione per la mobilità e l'attività. Calcolare le medie e le deviazioni standard dei valori pKa.

Relazione sula prova

Tutti i dati grezzi e i valori calcolati per il pKa devono essere presentati assieme al metodo di calcolo (preferibilmente sotto forma di tabella, come suggerito nel rif. 1) così come i parametri statistici sopra descritti. Per i metodi per titolazione, indicare informazioni dettagliate sui metodi di standardizzazione dei titolanti.

Per i metodi spettrofotometrici, presentare tutti gli spettri. Per il metodo conduttimetrico riportare i dettagli della determinazione della costante di cella. Vanno indicati la tecnica utilizzata, i metodi di analisi e la natura di eventuali tamponi utilizzati.

La o le temperature sperimentali devono essere indicate.

BIBLIOGRAFIA

(2)

Nella parte B, il capitolo B.5 è sostituito dal seguente:

«B.5   IRRITAZIONE/CORROSIONE OCULARE ACUTA

INTRODUZIONE

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 405 (2012). Le linee guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche sono rivedute periodicamente affinché riflettano le migliori conoscenze scientifiche disponibili. Nelle precedenti revisioni di questa linea guida si è prestata particolare attenzione, mediante la valutazione di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame, ai miglioramenti che si possono apportare per evitare prove non necessarie sugli animali da laboratorio e tenere conto in modo più adeguato del benessere degli animali. La linea guida n. 405 (adottata nel 1981 e aggiornata nel 1987, 2002 e 2012) raccomanda, prima di eseguire il saggio in vivo descritto per l'irritazione/corrosione oculare acuta, di effettuare un'analisi basata sul “peso dell'evidenza” (weight-of-the-evidence) (1) dei dati pertinenti esistenti. Qualora i dati disponibili fossero insufficienti, si raccomanda di ottenerli mediante l'applicazione di sperimentazioni sequenziali (2)(3). La strategia sperimentale raccomandata comprende l'esecuzione di prove in vitro validate ed accettate ed è descritta nell'allegato del presente metodo. Ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006 concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (2), una strategia sperimentale integrata è inclusa anche nella rispettiva linea guida ECHA (21). La sperimentazione sugli animali dovrebbe essere effettuata solo se ritenuta necessaria, dopo aver preso in considerazione i metodi alternativi disponibili e aver utilizzato quelli ritenuti appropriati. Al momento della stesura del presente metodo di prova aggiornato, esistono ancora casi in cui il ricorso a questo metodo di prova rimane indispensabile o obbligatorio nell'ambito di alcuni quadri regolamentari.

L'aggiornamento più recente si è concentrato principalmente sull'uso di analgesici e anestetici senza modificare il concetto di base e la struttura della linea guida. L'ICCVAM (3) e un gruppo internazionale di esperti scientifici indipendenti hanno esaminato l'utilità e i limiti di un ricorso sistematico ad anestetici per uso topico, ad analgesici sistemici e a endpoint umanitari durante la prova di sicurezza in vivo dell'irritazione oculare (12). Da questo esame è emerso che l'impiego di anestetici per uso topico e di analgesici sistemici permette di evitare agli animali la maggior parte, se non la totalità, del dolore e dello stress senza modificare il risultato della prova, e raccomanda che tali sostanze siano utilizzate in modo sistematico. Questo metodo tiene conto delle conclusioni di tale revisione. È pertanto opportuno che gli anestetici per uso topico, gli analgesici sistemici e gli endpoint umanitari siano utilizzati sistematicamente nell'ambito della sperimentazione in vivo dell'irritazione/corrosione oculare acuta. Qualsiasi eccezione deve essere giustificata. Le modifiche di cui al presente metodo contribuiranno in misura significativa a ridurre o evitare il dolore e lo stress degli animali nella maggior parte delle sperimentazioni che richiedono ancora una prova di sicurezza oculare in vivo.

Una gestione preventiva ed equilibrata del dolore comprende: i) un pretrattamento di routine con un anestetico a uso topico (ad es. proparacaina o tetracaina) e un analgesico sistemico (ad es. buprenorfina), ii) un programma di trattamento post-esposizione di routine con un analgesico sistemico (ad es. buprenorfina e melossicam), iii) un programma di osservazione, monitoraggio e la registrazione dei segni clinici di dolore o di stress negli animali, e iv) un programma di osservazione e monitoraggio e la registrazione della natura, della gravità e della progressione di tutte le lesioni oculari. Ulteriori dettagli sono forniti nelle procedure aggiornate descritte di seguito. Dopo l'esposizione alla sostanza chimica in esame, non dovrà essere somministrato alcun anestetico o analgesico per uso topico supplementare, in modo da evitare qualsiasi interferenza con la prova. Gli analgesici con proprietà antinfiammatorie (come il melossicam) non saranno oggetto di applicazione topica e le dosi utilizzate sistematicamente non devono interferire con gli effetti oculari.

Le definizioni sono riportate nell'Appendice del presente metodo di prova.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

Nell'interesse dell'accuratezza scientifica e del benessere degli animali, non bisogna considerare il ricorso a prove in vivo finché non siano stati valutati, sulla base del peso dell'evidenza, tutti i dati disponibili pertinenti sulla potenziale corrosività/irritazione oculare della sostanza chimica. Tali dati comprendono le evidenze scientifiche derivanti da studi esistenti su soggetti umani e/o animali da laboratorio, le evidenze di corrosività/irritazione di una o più sostanze strutturalmente correlate o di miscele di tali sostanze, dati dimostranti l'elevata acidità o alcalinità della sostanza chimica (4) (5), nonché i risultati di prove in vitro o ex vivo validate ed accettate sulla corrosione e l'irritazione cutanea e oculare (6) (13) (14) (15) (16) (17). Gli studi possono essere stati condotti prima di un'analisi basata sul peso delle evidenze, o in conseguenza di essa.

Per alcune sostanze chimiche, un'analisi di questo tipo può indicare la necessità di studi in vivo del potenziale di corrosione/irritazione oculare. In tutti questi casi, prima di considerare il ricorso a prove oculari in vivo, va preferibilmente condotto uno studio sugli effetti della corrosione cutanea in vivo e/o in vitro della sostanza chimica, e valutato in base alla strategia di sperimentazione sequenziale nel metodo di prova B.4 (7) o alla strategia sperimentale integrata descritta nella linea guida ECHA (21).

La strategia di sperimentazione sequenziale, che prevede l'esecuzione di prove della corrosione/irritazione oculare in vitro o ex vivo validate, è riportata nell'Allegato al presente metodo di prova e, per le finalità del REACH, nella linea guida ECHA. Si raccomanda di seguire questa strategia prima di passare alla sperimentazione in vivo. Per le nuove sostanze chimiche, si raccomanda di adottare un approccio sperimentale graduale, per sviluppare dati scientificamente validi sulla corrosività/irritazione della sostanza chimica. Se per le sostanze chimiche esistenti i dati sulla corrosione/irritazione oculare e cutanea sono insufficienti, si può usare tale strategia per recuperare i dati mancanti. È necessario giustificare l'uso di una strategia o procedura sperimentale differente, nonché l'eventuale decisione di non usare un approccio sperimentale «per gradi.»

PRINCIPIO DELLA PROVA IN VIVO

Successivamente al pretrattamento con un analgesico sistemico e della somministrazione di un'adeguata anestesia topica, la sostanza chimica in esame è applicata in un'unica dose su uno degli occhi dell'animale sperimentale; l'occhio non trattato serve da controllo. Il grado di irritazione/corrosione è valutato dando un punteggio alle lesioni di congiuntiva, cornea e iride, a specifici intervalli di tempo. Per fornire una valutazione completa degli effetti sono descritti anche altri effetti sull'occhio ed effetti negativi sistemici. La durata dello studio deve essere sufficiente per valutare la reversibilità o irreversibilità degli effetti.

Gli animali che presentano segni di grave stress e/o dolore, in qualsiasi fase della prova, o lesioni compatibili con gli endpoint umanitari descritti nel presente metodo di prova (cfr. paragrafo 26) vanno soppressi con metodi non cruenti e la sostanza chimica va valutata di conseguenza. I criteri da seguire nel decidere la soppressione non cruenta di animali moribondi o che soffrono gravemente formano oggetto di un documento orientativo dell'OCSE (8).

PREPARAZIONE DELLA PROVA IN VIVO

Selezione delle specie

L'animale da laboratorio di elezione è il coniglio albino, del quale vanno utilizzati giovani adulti sani. Giustificare l'eventuale uso di altri ceppi o specie.

Preparazione degli animali

Entro 24 ore dall'inizio della prova è necessario esaminare entrambi gli occhi di ciascun animale sperimentale provvisoriamente selezionato per la prova. Non vanno utilizzati animali che presentino irritazione oculare, difetti degli occhi o preesistenti lesioni corneali.

Condizioni di stabulazione e alimentazione.

Gli animali vanno posti in gabbie singole. La temperatura del locale sperimentale deve essere di 20°C (± 3°C) per i conigli. L'umidità relativa dovrebbe raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 % (tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti), ma occorre puntare a un valore del 50-60 %. L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d'oscurità. Va evitata un'eccessiva intensità luminosa. Per l'alimentazione, attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile.

PROCEDURA

Utilizzo di anestetici topici e analgesici sistemici

Le seguenti procedure sono raccomandate per ridurre o evitare dolore e stress nelle prove di sicurezza sugli occhi. Si può ricorrere a procedure alternative più efficaci o efficienti per ridurre o evitare il dolore e lo stress degli animali.

Applicazione della sostanza chimica in esame

Instillare la sostanza chimica in esame nel sacco congiuntivale di un occhio di ciascun animale, dopo aver allontanato delicatamente la palpebra inferiore dal bulbo. Le palpebre vanno poi tenute unite con delicatezza per circa un secondo, per evitare la fuoriuscita del materiale. L'altro occhio, che non viene trattato, serve da controllo.

Irrigazione

Gli occhi degli animali sperimentali non vanno lavati per almeno 24 ore dopo l'instillazione della sostanza chimica in esame, tranne nel caso di sostanze solide (cfr. paragrafo 18) e nel caso di effetti corrosivi o irritanti immediati. Dopo 24 ore è possibile effettuare un lavaggio, se lo si considera necessario.

Non si raccomanda l'uso di un gruppo satellite di animali per studiare l'influenza del lavaggio oculare, a meno che ciò non risulti scientificamente giustificato. Qualora sia necessario un gruppo satellite, vanno usati due conigli. Le condizioni del lavaggio vanno documentate accuratamente: ad esempio, momento del lavaggio, composizione e temperatura della soluzione di lavaggio, durata, volume e velocità di applicazione.

Livelli di dose

(1)   Saggio di liquidi

Per testare le sostanze liquide si impiega una dose di 0,1 ml. Non usare spray per instillare la sostanza chimica direttamente nell'occhio; lo spray liquido va spruzzato e raccolto in un contenitore prima di instillarne 0,1 ml nell'occhio.

(2)   Saggio di solidi

Per testare le sostanze solide, paste e sostanze particellari, la quantità impiegata deve avere un volume di 0,1 ml o un peso non superiore a 100 mg. La sostanza chimica in esame va ridotta in polvere fine. Prima della misurazione del volume, il materiale solido va delicatamente compattato, ad esempio picchiettando sul contenitore per la misurazione. Se la sostanza chimica in esame solida non è stata rimossa dall'occhio dell'animale da meccanismi fisiologici, alla prima osservazione che avviene un'ora dopo il trattamento si può sciacquare l'occhio con soluzione salina o acqua distillata.

(3)   Saggio di aerosol

Si raccomanda di raccogliere tutti gli spray e gli aerosol prima dell'instillazione nell'occhio. L'unica eccezione riguarda le sostanze chimiche in contenitori pressurizzati per aerosol, che non possono essere raccolte a causa della vaporizzazione. In questi casi l'occhio va tenuto aperto e la sostanza chimica va somministrata nell'occhio con un unico spruzzo di circa un secondo, da una distanza di 10 cm, direttamente nella parte frontale dell'occhio. La distanza può variare a seconda della pressione dello spray e del suo contenuto. Occorre evitare di danneggiare l'occhio con la pressione dello spray. In alcuni casi può essere necessario valutare il potenziale di danno «meccanico» all'occhio dovuto alla forza dello spray.

È possibile ottenere una stima della dose di un aerosol simulando la prova come segue: spruzzare la sostanza chimica attraverso un'apertura delle dimensioni dell'occhio di un coniglio posta esattamente di fronte ad un foglio di carta. L'aumento di peso della carta viene usato quindi per approssimare la quantità spruzzata nell'occhio. Per le sostanze chimiche volatili, la dose può essere stimata pesando un contenitore ricevente prima e dopo la rimozione della sostanza chimica in esame.

Prova iniziale (prova di irritazione/corrosione oculare in vivo usando un solo animale)

Si raccomanda caldamente di eseguire inizialmente la prova in vivo usando un solo animale (si veda l'Allegato del presente metodo: Strategia di sperimentazione sequenziale per l'irritazione e la corrosione oculare). Le osservazioni devono consentire di determinare la gravità e la reversibilità delle lesioni prima di eseguire una prova di conferma su un secondo animale.

Se con la procedura descritta, i risultati di tale prova indicano che la sostanza chimica è corrosiva o gravemente irritante per l'occhio, non eseguire altre prove di irritazione oculare.

Prova di conferma (prova di irritazione oculare in vivo con animali supplementari)

Se nella prova iniziale non si osservano effetti corrosivi o fortemente irritanti, confermare la reazione irritante o negativa su un massimo di altri due animali. Se nella prova iniziale è stato osservato un effetto irritante si raccomanda di eseguire il saggio di conferma in maniera sequenziale su un solo animale per volta, anziché esporre contemporaneamente i due animali. Se il secondo animale rivela effetti corrosivi o gravemente irritanti, interrompere la prova. Se i risultati delle prove sul secondo animale sono sufficienti per determinare la categoria di pericolo della sostanza chimica, è necessario interrompere la sperimentazione.

Periodo di osservazione

La durata del periodo di osservazione deve essere sufficiente a valutare completamente l'entità e la reversibilità degli effetti osservati. Occorre tuttavia interrompere l'esperimento in qualsiasi momento se l'animale mostra segni di dolore o stress gravi (8). Per determinare la reversibilità degli effetti, gli animali vanno osservati di norma per 21 giorni successivamente alla somministrazione della sostanza chimica in esame. In caso di reversibilità prima dei 21 giorni, interrompere subito l'esperimento.

Osservazioni cliniche e classificazione delle reazioni oculari

Gli occhi sono sottoposti ad un esame approfondito per individuare eventuali lesioni oculari un'ora dopo l'applicazione della sostanza chimica in esame, e tale procedura va ripetuta almeno una volta al giorno. Nei primi tre giorni successivi gli animali vanno esaminati più volte al giorno per assicurare che si possa decidere di porre fine alla prova in tempo utile, se necessario. Gli animali sono sottoposti a esami di routine durante tutta la prova alla ricerca di segni clinici di dolore e/o di stress (ad esempio eccessivo scalpitare con le zampe, sfregamento ripetuto dell'occhio, eccessivo sbattere delle palpebre o eccessiva lacrimazione) (9) (10) (11), almeno due volte al giorno con un intervallo minimo di sei, o più frequentemente se necessario. Tali esami sono necessari per i) valutare correttamente i segni di dolore e stress degli animali al fine di dimostrare la necessità di aumentare il dosaggio di analgesici e ii) «valutare» gli animali per riconoscere segni conclamati di endpoint umanitari, in modo da decidere con cognizione di causa la soppressione incruenta degli animali e garantire che tali decisioni siano adottate in tempo utile. Per agevolare l'individuazione e la misurazione delle lesioni oculari e determinare se i criteri stabiliti ai fini della soppressione incruenta sono stati raggiunti, va utilizzata di routine una colorazione con fluoresceina nonché un microscopio con lampada a fessura se ritenuto opportuno (ad esempio per valutare la gravità della lesione in caso di ulcerazione della cornea). Fotografie digitali delle lesioni riscontrate possono essere raccolte come riferimento e per documentare in modo permanente l'estensione della lesione oculare. Gli animali devono essere sottoposti a sperimentazione per il tempo minimo necessario per ottenere informazioni definitive. Gli animali che presentano dolore o stress intensi vanno soppressi al più presto con metodi non cruenti e la sostanza chimica va valutata di conseguenza.

Sopprimere con metodi non cruenti gli animali che, dopo l'instillazione, presentano le seguenti lesioni oculari (si veda la tabella 1 per una descrizione dei gradi di lesione): perforazione corneale o ulcerazione corneale di rilievo, compreso stafiloma; sangue nella camera anteriore dell'occhio; opacità corneale di grado 4; assenza di riflesso pupillare alla luce (risposta dell'iride di grado 2) che persista per 72 ore; ulcerazione della membrana congiuntivale; necrosi della congiuntiva o della membrana nittitante; distacco epidermico. Tali lesioni sono infatti generalmente irreversibili. È inoltre opportuno considerare le seguenti lesioni oculari come endpoint umanitari, la cui insorgenza giustifica di porre termine alla prova prima che sia trascorso il periodo di osservazione di 21 giorni previsto. Si ritiene che tali lesioni prefigurino altre reazioni a una sostanza corrosiva o gravemente irritante e altre lesioni che probabilmente non saranno pienamente scomparse entro il periodo di osservazione di 21 giorni: lesioni profonde — come ad esempio un'ulcerazione della cornea oltre gli strati superficiali dello stroma), distruzione del lembo > 50 % (comprovato dallo scoloramento del tessuto congiuntivale) e un'infezione oculare acuta (secrezione purulenta). Una combinazione di: vascolarizzazione della superficie corneale (cioè, panno corneale) associata a una superficie macchiata di fluoresceina che non diminuisce nel tempo, sulla base di esami giornalieri; e/o all'assenza di ricrescita epiteliale 5 giorni dopo l'applicazione della sostanza chimica in esame, può anche costituire un insieme di criteri pertinenti per giustificare la decisione di porre termine alla prova anticipatamente. Tuttavia, ciascuno di questi risultati preso isolatamente non è sufficiente a motivare la conclusione anticipata della sperimentazione. Qualora siano osservati effetti oculari gravi, occorre consultare un veterinario curante o specializzato in animali da laboratorio, o a personale debitamente formato a individuare le lesioni cliniche, per condurre un esame clinico che consenta di stabilire se la combinazione di tali reazioni implica una conclusione anticipata della sperimentazione. Si determinano i gradi della reazione oculare (congiuntiva, cornea e iride) a 1, 24, 48 e 72 ore dopo l'applicazione della sostanza chimica in esame e se ne registrano i risultati (tabella 1). Gli animali che non sviluppano lesioni oculari possono essere soppressi non prima di 3 giorni dopo l'instillazione. Gli animali con lesioni oculari non gravi vanno tenuti sotto osservazione fino alla scomparsa delle lesioni, oppure per 21 giorni, momento in cui lo studio si conclude. Occorre effettuare le osservazioni e le registrazioni con intervalli minimi di 1 ora, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 7 giorni, 14 giorni e 21 giorni, con l'obiettivo di determinare lo stato delle lesioni e la loro reversibilità o irreversibilità. Talvolta è necessario eseguire le osservazioni con frequenza maggiore per stabilire se l'animale sperimentale debba essere sottoposto a morte non cruenta per considerazioni etiche o eliminata dalla prova a motivo di risultati negativi.

Per ogni esame si deve registrare il livello di lesione oculare (vedi tabella 1). Annotare anche qualsiasi altra lesione dell'occhio (ad es. panno corneale, macchie, alterazioni della camera anteriore) e qualsiasi effetto sistemico negativo.

L'esame delle reazioni può essere facilitato usando una lente binoculare, una lampada manuale a fessura, un biomicroscopio o altro dispositivo idoneo. Dopo aver registrato le osservazioni a 24 ore, è possibile esaminare ulteriormente gli occhi con l'ausilio di fluoresceina.

La classificazione delle reazioni oculari è necessariamente soggettiva. Per favorirne l'armonizzazione e per assistere i laboratori e le persone che eseguono e interpretano le osservazioni, è necessario istruire adeguatamente il personale responsabile sul sistema di punteggio utilizzato.

DATI E RELAZIONE

Valutazione dei risultati

Valutare i punteggi dell'irritazione oculare insieme alla natura e alla gravità delle lesioni, nonché alla loro reversibilità o irreversibilità. I punteggi individuali non rappresentano uno standard assoluto per le proprietà irritanti di una sostanza chimica, in quanto si valutano anche altri effetti della sostanza chimica in esame. I punteggi individuali vanno invece considerati come valori di riferimento e hanno significato solo se corredati di una descrizione e una valutazione complete di tutte le osservazioni.

Relazione sulla prova

La relazione sulla prova comprende le informazioni seguenti.

Interpretazione dei risultati

L'estrapolazione dei risultati degli studi sull'irritazione oculare negli animali da laboratorio agli esseri umani ha un valore solo limitato. In molti casi, il coniglio albino è più sensibile dell'uomo alle sostanze irritanti o corrosive per l'occhio.

È necessario interpretare con attenzione i dati per escludere l'irritazione dovuta a infezione secondaria.

BIBLIOGRAFIA

Tabella 1

Classificazione delle lesioni oculari

ALLEGATO DEL METODO DI PROVA B.5  (4)

STRATEGIA DI PROVE IN SEQUENZA PER L'IRRITAZIONE E LA CORROSIONE OCULARI

Considerazioni generali

Nell'interesse dell'accuratezza scientifica e del benessere degli animali, è importante evitare l'uso non necessario di animali e ridurre al minimo le prove atte a provocare reazioni gravi. Valutare tutte le informazioni relative alla potenziale irritazione/corrosività oculare di una sostanza chimica prima di prendere in considerazione le prove in vivo. È possibile che esistano già prove sufficienti per classificare il potenziale di irritazione o corrosione oculare di una sostanza chimica in esame senza bisogno di effettuare prove su animali da laboratorio. L'analisi basata sul peso delle evidenze e l'uso di una strategia di sperimentazione sequenziale ridurranno al minimo la necessità di eseguire prove in vivo, soprattutto se è probabile che la sostanza chimica provochi reazioni gravi.

Si raccomanda di svolgere un'analisi basata sul peso delle evidenze per valutare le informazioni esistenti sul potenziale di irritazione e corrosione oculare delle sostanze chimiche e determinare la necessità di altri studi, diversi da quelli in vivo sugli occhi, per meglio caratterizzare tale potenziale. Qualora tali studi fossero necessari, si raccomanda di applicare la strategia di sperimentazione sequenziale per ottenere i dati sperimentali pertinenti. Per le sostanze per le quali non è disponibile una documentazione sperimentale, usare la strategia di sperimentazione sequenziale per ottenere i dati necessari al fine di valutarne la corrosività/irritazione oculari. La strategia sperimentale iniziale descritta nel presente Allegato è stata sviluppata nel corso di un workshop dell'OCSE (1) e successivamente confermata ed ampliata nello Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances (Sistema di classificazione armonizzato integrato dei rischi per la salute umana e gli effetti ambientali delle sostanze chimiche), approvata alla 28a riunione congiunta del comitato sulle sostanze chimiche e dal gruppo di lavoro sulle sostanze chimiche nel novembre 1998 (2) e aggiornata da un gruppo di esperti dell'OCSE nel 2011.

Sebbene non sia parte integrante del metodo di prova B.5, questa strategia sperimentale esprime tuttavia l'approccio raccomandato per la determinazione delle proprietà di irritazione/corrosione oculari. Tale approccio rappresenta non solo una “migliore pratica” ma anche un punto di riferimento etico per l'esecuzione di prove in vivo sull'irritazione/corrosione oculari. Il metodo di prova fornisce indicazioni sull'esecuzione della prova in vivo e riassume i fattori da valutare prima di prendere in considerazione il ricorso a tale prova. La strategia di sperimentazione sequenziale fornisce un metodo di analisi basata sul peso delle evidenze per la valutazione dei dati esistenti sulle proprietà di irritazione/corrosione oculare delle sostanze chimiche e un approccio graduale per lo sviluppo di dati pertinenti sulle sostanze chimiche che necessitano ulteriori studi o che non sono mai state oggetto di studio. La strategia prevede dapprima l'esecuzione di prove validate ed accettate in vitro o ex vivo e successivamente di studi in base al metodo di prova B.4 in circostanze specifiche (3) (4).

Descrizione della strategia sperimentale «per gradi»

Prima di effettuare le prove nell'ambito della strategia di sperimentazione sequenziale (Figura), valutare tutte le informazioni disponibili, per determinare l'effettiva necessità di eseguire prove oculari in vivo. Sebbene sia possibile trarre significative informazioni dalla valutazione di singoli parametri (ad es. pH estremo), è necessario valutare la totalità delle informazioni esistenti. Nel prendere una decisione basata sul peso delle evidenze, valutare tutti i dati pertinenti sugli effetti della sostanza chimica in questione e dei suoi analoghi strutturali; siffatta decisione deve essere giustificata. Si dovrebbe attribuire innanzitutto importanza ai dati esistenti sulla sperimentazione della sostanza chimica su persone e animali, e successivamente ai risultati di prove in vitro o ex vivo. Ove possibile, evitare gli studi in vivo delle sostanze chimiche corrosive. I fattori considerati nella strategia sperimentale sono:

STRATEGIA SPERIMENTALE E VALUTAZIONE DELL'IRRITAZIONE/CORROSIONE OCULARE

BIBLIOGRAFIA

(3)

Nella parte B, il capitolo B.10 è sostituito dal seguente:

«B.10   Prova in vitro di aberrazione cromosomica nei mammiferi

INTRODUZIONE

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 473 (2016) e fa parte di una serie di metodi di prova sulla tossicologia genetica. È stato elaborato un documento OCSE contenente informazioni succinte sulle prove di tossicologia genetica e un compendio delle modifiche recentemente apportate alla rispettiva linea guida (1).

La prova in vitro di aberrazione cromosomica è destinata ad identificare le sostanze chimiche che causano aberrazioni cromosomiche strutturali in una coltura di cellule di mammifero (2) (3) (4). Le aberrazioni strutturali possono essere di due tipi: cromosomiche o cromatidiche. Nei test di aberrazione cromosomica in vitro può verificarsi poliploidia (compresa l'endoriduplicazione). Se è vero che gli aneugeni possono provocare poliploidia, quest'ultima di per sé non indica un potenziale aneugenico e può semplicemente rivelare una perturbazione del ciclo cellulare o citotossicità (5). Questa prova non è destinata a misurare l'aneuploidia. Per il rilevamento dell'aneuploidia si raccomanda un test del micronucleo in vitro (6).

Nella prova in vitro di aberrazione cromosomica si possono usare colture di linee cellulari stabilizzate o colture cellulari primarie di origine umana o di roditori. Le cellule devono essere scelte in funzione della capacità di crescita in coltura, della stabilità del cariotipo (compreso il numero dei cromosomi) e della frequenza delle aberrazioni cromosomiche spontanee (7). Attualmente i dati disponibili non consentono di elaborare raccomandazioni solide ma rivelano l'importanza di considerare, al momento di valutare i rischi chimici: lo stato della p53, la stabilità genetica (del cariotipo), la capacità di riparazione del DNA e l'origine (da roditori piuttosto che umane) delle cellule scelte per la sperimentazione. Gli utilizzatori del presente metodo di prova sono pertanto incoraggiati a valutare l'influenza di queste ed altre caratteristiche cellulari sul comportamento di una linea cellulare nel rilevare l'induzione di aberrazioni cromosomiche, in funzione dell'evoluzione delle conoscenze in questo campo.

Le definizioni utilizzate figurano nell'appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI

Le prove in vitro richiedono in generale l'uso di una fonte esogena di attivazione metabolica, a meno che le cellule non siano metabolicamente compatibili con le sostanze chimiche in esame. Il sistema esogeno di attivazione metabolica non simula perfettamente le condizioni in vivo. Occorre adoperarsi per evitare condizioni che potrebbero portare a falsi risultati positivi, vale a dire danni cromosomici non causati da un'interazione diretta tra le sostanze chimiche in esame e i cromosomi; tali condizioni comprendono le variazioni di pH o di osmolalità (8) (9) (10), l'interazione con gli ingredienti del mezzo (11) (12) o livelli eccessivi di citotossicità (13) (14) (15) (16).

La prova è utilizzata per individuare aberrazioni cromosomiche che possono derivare da eventi clastogenici. L'analisi dell'induzione di aberrazioni cromosomiche deve avvenire utilizzando cellule in metafase. È quindi essenziale che le cellule raggiungano la mitosi sia nelle colture trattate sia in quelle non trattate. Possono essere necessari adattamenti specifici di questo metodo di prova, non descritti in questa sede, per i nanomateriali di sintesi.

Prima dell'uso del metodo di prova su una miscela, per la generazione di dati per un determinato scopo normativo, occorre esaminare se, e in caso affermativo perché, può fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie in presenza di un obbligo normativo di prova sulla miscela.

PRINCIPIO DELLA PROVA

Le colture di cellule umane o di altro mammifero sono esposte alla sostanza chimica in esame con e senza una fonte esogena di attivazione metabolica, a meno di utilizzare cellule con un'adeguata capacità metabolizzante (cfr. il paragrafo 13). Dopo l'inizio dell'esposizione alla sostanza chimica in esame, le colture cellulari sono trattate, a intervalli opportunamente predefiniti, con un inibitore della metafase (per esempio Colcemid o colchicina), raccolte e sottoposte a un processo di colorazione; le cellule in metafase sono esaminate al microscopio per determinare la presenza di aberrazioni di tipo cromatidico e cromosomiche.

DESCRIZIONE DEL METODO

Preparazioni

Cellule

Si possono utilizzare varie linee cellulari (ad esempio cellule di ovario di criceto cinese (CHO), di polmone di criceto cinese V79, di polmone di criceto cinese (CHL)/IU, TK 6) o colture cellulari primarie, fra cui linfociti del sangue periferico umano o di altri mammiferi (7). La scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata. Nel caso di impiego di cellule primarie, per motivi attinenti al benessere degli animali occorre prendere in considerazione l'uso di cellule di origine umana ove possibile, prelevate in conformità dei principi e delle norme etiche pertinenti. I linfociti del sangue periferico umano devono essere ottenuti da soggetti giovani (circa 18-35 anni di età), non fumatori, non affetti da malattie note e non esposti recentemente ad agenti genotossici (ad esempio sostanze chimiche o radiazioni ionizzanti) a livelli tali da aumentare l'incidenza di base di aberrazioni cromosomiche. In tal modo si garantisce che l'incidenza di base di aberrazioni cromosomiche rimanga lieve e omogenea. L'incidenza di base di aberrazioni cromosomiche aumenta con l'età e questa tendenza è più marcata nelle donne che negli uomini (17) (18). Se si raccolgono cellule da più donatori, il numero dei donatori dev'essere indicato. È necessario dimostrare che le cellule si sono divise fra l'inizio del trattamento con la sostanza chimica in esame e il prelievo. Le colture cellulari vengono mantenute in una fase di crescita esponenziale (linee cellulari) o stimolate a dividersi (colture primarie di linfociti), per esporre le cellule in diversi stadi del ciclo cellulare, essendo potenzialmente ignota la sensibilità dei diversi stadi delle cellule alle sostanze chimiche in esame. In generale, le cellule primarie che per dividersi devono essere stimolate con agenti mitogenici non sono più sincronizzate durante l'esposizione alla sostanza chimica in esame (ad esempio linfociti umani dopo 48 ore dalla stimolazione mitogenica). L'uso di cellule sincronizzate durante il trattamento non è raccomandato, ma può essere ammissibile se giustificato.

Mezzo e condizioni di coltura

Le colture vanno mantenute in mezzi di coltura e condizioni di incubazione (recipienti di coltura, atmosfera umidificata al 5 % di CO2 se del caso, temperatura di incubazione di 37 °C) adeguati. Occorre controllare periodicamente la stabilità del numero modale dei cromosomi e l'assenza di contaminazione da micoplasma nelle linee cellulari (7) (19); non si devono usare cellule contaminate o che presentano modifiche del numero modale dei cromosomi. Occorre stabilire la durata normale del ciclo cellulare delle linee cellulari o delle colture primarie utilizzate nel laboratorio di prova, che deve essere coerente con le caratteristiche cellulari pubblicate (20).

Preparazione delle colture

Linee cellulari: le cellule provenienti da colture primarie vengono inoculate in un terreno di coltura ad una densità tale da consentire alle cellule in sospensione o in monostrati di continuare a crescere in maniera esponenziale fino al momento del prelievo (occorre, ad esempio, evitare che le cellule in crescita in monostrati raggiungano la confluenza).

Linfociti: sangue intero trattato con un anticoagulante (ad esempio eparina) o linfociti isolati sono posti in un terreno di coltura (ad esempio per 48 ore nel caso di linfociti umani) contenente un mitogeno [ad esempio fitoemoagglutinina (PHA) nel caso di linfociti umani] per ridurre la divisione cellulare prima dell'esposizione alla sostanza chimica in esame.

Attivazione metabolica

Se si utilizzano cellule prive di un'adeguata capacità di attivazione metabolica endogena si deve ricorrere a sistemi di attivazione metabolica esogeni. Il sistema più comunemente usato, raccomandato in tutti i casi salvo alternativa motivata, è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattore (S9), prelevata dal fegato di roditori (solitamente ratti) trattati con induttori enzimatici come Aroclor 1254 (21) (22) (23) o con una combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (24) (25) (26) (27) (28) (29). Quest'ultima combinazione è conforme alla convenzione di Stoccolma sugli inquinanti organici persistenti (30) e ha dimostrato di essere tanto efficace quanto l'Aroclor 1254 nell'indurre ossidasi a funzione mista (24) (25) (26) (28). Solitamente la frazione S9 viene usata a concentrazioni comprese tra 1 % e 2 % (v/v), ma può essere aumentata al 10 % (v/v) nel terreno di coltura finale. Occorre evitare, durante il trattamento, l'impiego di prodotti che riducono il coefficiente mitotico, soprattutto prodotti di complessazione del calcio (31). La scelta del tipo e della concentrazione del sistema di attivazione metabolica esogeno o dell'induttore metabolico utilizzato può essere influenzata dalla classe delle sostanze chimiche in esame.

Preparazione della sostanza chimica in esame

Le sostanze chimiche in esame solide devono essere preparate in adeguati solventi e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule (cfr. il paragrafo 23). Le sostanze chimiche in esame liquide possono essere aggiunte direttamente alla coltura o diluite prima del trattamento della coltura stessa. Le sostanze chimiche in esame gassose o volatili devono essere sottoposte alla prova modificando adeguatamente i protocolli standard (trattamento in recipienti di coltura ermetici) (33) (34). Occorre preparare la sostanza chimica in esame subito prima del trattamento, salvo se i dati sulla stabilità dimostrano che la conservazione è un'alternativa accettabile.

Condizioni sperimentali

Solventi

La scelta del solvente deve favorire l'ottimizzazione della solubilità delle sostanze chimiche in esame, senza nuocere alla conduzione del saggio (ad esempio influenzando la crescita cellulare), compromettere l'integrità della sostanza chimica in esame, reagire con recipienti di coltura o pregiudicare il sistema di attivazione metabolica. Si raccomanda di prendere in considerazione in primo luogo, se possibile, l'uso di un solvente (o mezzo di coltura) acquoso. Solventi di uso consolidato sono, ad esempio, l'acqua o il dimetilsolfossido. In generale è opportuno che i solventi organici non superino l'1 % (v/v) e quelli acquosi (soluzione fisiologica o acqua) il 10 % (v/v) nel terreno di coltura finale. Qualora si utilizzino solventi di uso non consolidato (ad esempio etanolo o acetone), il loro uso dovrebbe essere suffragato da dati che ne comprovino la compatibilità con le sostanze chimiche in esame e con il sistema di prova e l'assenza di tossicità genetica alla concentrazione usata. In assenza di tali dati, è importante includere controlli non trattati (cfr. l'appendice 1) per dimostrare che il solvente scelto non induce effetti nocivi o clastogenici.

Misurazione della proliferazione cellulare e della citotossicità e scelta delle concentrazioni di trattamento

Nel determinare la concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame, occorre evitare le concentrazioni che hanno la capacità di produrre falsi risultati positivi, come quelle che causano eccessiva citotossicità (cfr. il paragrafo 22), precipitazione nel terreno di coltura (cfr. il paragrafo 23) o variazioni marcate del pH o osmolalità (cfr. il paragrafo 5). Se la sostanza chimica in esame provoca una variazione marcata del pH del mezzo al momento dell'aggiunta, il pH può essere adeguato tamponando il terreno di coltura finale in modo da evitare falsi risultati positivi e mantenere adeguate condizioni di coltura.

Occorre misurare la proliferazione cellulare per garantire che un numero sufficiente di cellule trattate abbia raggiunto la mitosi durante la prova e che i trattamenti siano condotti ad adeguati livelli di citotossicità (cfr. i paragrafi 18 e 22). La citotossicità deve essere determinata con e senza attivazione metabolica nel test principale, sulla base di un indicatore adeguato della morte e della crescita cellulare. Mentre la valutazione della citotossicità in un saggio iniziale può essere utile per definire meglio le concentrazioni da utilizzare per il test principale, l'effettuazione di un saggio iniziale non è obbligatoria. Se viene eseguito, non deve sostituire la misurazione della citotossicità nel test principale.

Il raddoppiamento relativo della popolazione (RPD) o l'aumento relativo delle conte cellulari (RICC) sono metodi adeguati per la valutazione della citotossicità nella prova citogenetica (13) (15) (35) (36) (55) (cfr. l'appendice 2 per le formule). In caso di trattamento a lungo termine e fasi di campionamento dopo l'inizio del trattamento superiori a 1,5 volte la durata normale del ciclo cellulare (ossia oltre 3 cicli cellulari in totale), l'RPD potrebbe sottostimare la citotossicità (37). In tali circostanze l'RICC potrebbe essere una misura migliore, ma una stima utile si potrebbe ottenere anche valutando la citotossicità mediante l'RPD dopo 1,5 cicli cellulari normali.

Per i linfociti in colture primarie, il coefficiente mitotico (MI) è una misura degli effetti citotossici/citostatici, ma è anche influenzato dal tempo trascorso fra il trattamento e la misurazione, dal mitogeno usato e dalla possibile interruzione del ciclo cellulare. Tuttavia, il coefficiente mitotico è accettabile perché altre misurazioni della citotossicità potrebbero essere onerose e di difficile esecuzione e potrebbero non risultare adeguate alla popolazione interessata di linfociti in crescita in risposta alla stimolazione con PHA.

Mentre RICC e RPD per le linee cellulari e MI per la coltura primaria di linfociti sono i parametri raccomandati di citotossicità, altri indicatori (ad esempio l'integrità delle cellule, l'apoptosi, la necrosi, il ciclo cellulare) potrebbero fornire utili informazioni aggiuntive.

Occorre valutare almeno tre concentrazioni di prova (non compreso il solvente e i controlli positivi) che soddisfano i criteri di accettabilità (adeguata citotossicità, numero di cellule, ecc.). A prescindere dal tipo di cellula (linee cellulari o colture primarie di linfociti), ciascuna coltura realizzata singolarmente o in più repliche può essere utilizzata per ciascuna concentrazione di prova. È consigliato l'uso di colture in duplicato, ma colture singole sono accettabili a condizione di analizzare lo stesso numero totale di cellule sia nel caso di coltura singola sia nel caso di colture in duplicato. L'uso di colture singole è particolarmente indicato quando si valutano più di 3 concentrazioni (cfr. il paragrafo 31). I risultati ottenuti con colture replicate indipendenti con una determinata concentrazione possono essere aggregati per l'analisi dei dati (38). Per le sostanze chimiche di prova che dimostrino tossicità assente o debole, sono solitamente indicati intervalli di concentrazione di un fattore da 2 a 3. In caso di citotossicità, le concentrazioni selezionate per la prova devono coprire una gamma comprendente quella che ha prodotto la citotossicità di cui al paragrafo 22 e concentrazioni alle quali la citotossicità è debole o assente. Molte sostanze chimiche in esame presentano curve di concentrazione-risposta accentuate e al fine di ottenere dati a bassa o debole citotossicità o di studiare la relazione dose-risposta nel dettaglio, sarà necessario ricorrere a concentrazioni separate fra loro da intervalli minori e/o a più di tre concentrazioni (colture singole o replicate), in particolare nelle situazioni in cui è necessario ripetere l'esperimento (cfr. il paragrafo 47).

Se la concentrazione massima è basata sulla citotossicità, la concentrazione più elevata deve puntare a raggiungere il 55 ± 5 % di citotossicità sulla base dei parametri di citotossicità raccomandati (ossia la riduzione di RICC e RPD per le linee cellulari e la riduzione di MI per le colture primarie di linfociti al 45 ± 5 % nel controllo negativo parallelo). Occorre interpretare con cautela risultati positivi ottenuti nel solo segmento superiore di tale intervallo di citotossicità al 55 ± 5 % (13).

Per le sostanze chimiche scarsamente solubili non citotossiche a concentrazioni inferiori alla concentrazione minima insolubile, la più elevata concentrazione analizzata dovrebbe produrre torbidità o la formazione di un precipitato visibile a occhio nudo o con l'aiuto di un microscopio invertito, alla fine del trattamento con la sostanza chimica di prova. Anche se la citotossicità si verifica a concentrazioni superiori a quella minima insolubile, è indicato effettuare la prova a una sola concentrazione che produce torbidità o un precipitato visibile, perché il precipitato può falsare gli effetti. Alla concentrazione che produce un precipitato, occorre adoperarsi per garantire che il precipitato non interferisca nello svolgimento della prova (ad esempio mediante colorazioni o abrasioni). Può essere utile determinare la solubilità nel terreno di coltura prima del test.

Se non si osserva nessun precipitato o nessuna citotossicità limitante, la concentrazione massima di prova dovrebbe essere pari al valore più basso fra 10 mM, 2 mg/ml o 2 μl/ml (39) (40) (41). Se la sostanza chimica in esame non ha una composizione definita — quale ad esempio una sostanza di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici (UVCB) (42) o estratti dall'ambiente, ecc. — la concentrazione massima potrebbe dover essere più elevata (ad esempio 5 mg/ml), in mancanza di sufficiente citotossicità, per aumentare la concentrazione di ciascuna componente. Va tuttavia rilevato che tali requisiti possono essere diversi per i prodotti farmaceutici per uso umano (43).

Controlli

Occorre anche effettuare controlli negativi paralleli (cfr. il paragrafo 15), con il solo solvente sul terreno di coltura, trattato allo stesso modo delle colture di trattamento, per ogni fase di raccolta.

Controlli positivi paralleli sono necessari per dimostrare la capacità del laboratorio di individuare clastogeni alle condizioni del protocollo di prova utilizzato e l'efficacia del sistema di attivazione metabolica esogeno, se del caso. Esempi di controlli positivi sono indicati nella tabella 1 in appresso. Si possono utilizzare sostanze chimiche alternative di controllo, se giustificate. Poiché test in vitro su cellule di mammiferi per tossicità genetica sono sufficientemente standardizzati, l'uso dei controlli positivi può limitarsi a un clastogeno che richiede attivazione metabolica. A condizione che si svolga contemporaneamente alla prova senza attivazione con la stessa durata di trattamento, quest'unico risultato di controllo positivo dimostrerà sia l'attività del sistema di attivazione metabolica sia la capacità di risposta del sistema di prova. Tuttavia, il trattamento a lungo termine (senza S9) richiede l'effettuazione di un proprio controllo positivo, in quanto la durata del trattamento differisce da quella della prova con attivazione metabolica. Ciascun controllo positivo deve essere utilizzato a una o più concentrazioni da cui ci si attende un aumento riproducibile e rilevabile rispetto ai valori di fondo, per dimostrare la sensibilità del sistema di prova (ossia effetti chiari che tuttavia non rivelino immediatamente allo sperimentatore l'identità dei vetrini codificati), e la risposta non deve essere compromessa da una citotossicità superiore ai limiti specificati nel metodo di prova.

Tabella 1.

Sostanze chimiche di riferimento raccomandate per la valutazione della competenza dei laboratori e per la selezione dei controlli positivi.

SVOLGIMENTO DEL METODO

Trattamento con la sostanza chimica in esame

Le cellule in proliferazione sono trattate con la sostanza chimica in esame in presenza e in assenza di un sistema di attivazione metabolica.

Raccolta delle colture

Ai fini di una valutazione rigorosa, necessaria per concludere un esito negativo, occorre rispettare tutte e tre le seguenti condizioni sperimentali utilizzando un trattamento di breve durata con e senza attivazione metabolica e un trattamento di lunga durata senza attivazione metabolica (cfr. i paragrafi 43, 44 e 45):

Nel caso in cui una qualsiasi delle suddette condizioni sperimentali porti ad un risultato positivo, può non essere necessario esaminare gli altri regimi di trattamento.

Preparazione dei cromosomi

Le colture cellulari sono trattate con Colcemid o colchicina, di norma per un periodo variabile da una a tre ore prima della raccolta. Ogni coltura cellulare viene raccolta e trattata separatamente per la preparazione dei cromosomi. La preparazione dei cromosomi comprende il trattamento ipotonico delle cellule, il fissaggio e la colorazione. Nei monostrati possono essere presenti cellule mitotiche (identificabili perché di forma tonda e in fase di distacco dalla superficie) al termine del trattamento di 3-6 ore. Poiché tali cellule mitotiche si staccano facilmente, potrebbero andare perdute al momento della rimozione del terreno di coltura contenente la sostanza chimica in esame. Se si rileva un aumento sostanziale del numero di cellule mitotiche rispetto ai controlli, tale da indicare il probabile arresto mitotico, occorre allora prelevare le cellule mediante centrifugazione e aggiungerle nuovamente alle colture per evitare di perdere cellule in mitosi, e quindi a rischio di aberrazione cromosomica, al momento della raccolta.

Analisi

Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima dell'esame al microscopio per l'aberrazione cromosomica. Poiché le procedure di fissaggio provocano spesso la perdita di cromosomi in una parte delle cellule in metafase, le cellule classificate devono contenere un numero di centromeri pari al numero modale ± 2.

Occorre classificare almeno 300 metafasi ben spaziate per ogni concentrazione e per ogni controllo, per rilevare un risultato chiaramente negativo per la sostanza chimica in esame (cfr. il paragrafo 45). Se si usano colture replicate, le 300 cellule devono essere divise equamente tra le repliche. Se si usano colture singole per ogni concentrazione (cfr. il paragrafo 21), occorre classificare almeno 300 metafasi ben spaziate in ogni coltura singola. L'analisi di 300 cellule comporta il vantaggio di aumentare la potenza statistica della prova; inoltre valori pari a zero saranno rari (stimati dell'ordine del 5 %) (44). È possibile ridurre il numero di metafasi classificate se si osserva un numero elevato di cellule con aberrazioni cromosomiche e la sostanza chimica in esame è considerata chiaramente positiva.

Le cellule che presentano una o più aberrazioni cromosomiche strutturali con e senza gap devono essere classificate. Le rotture e i gap sono definiti nell'appendice 1 conformemente a (45) (46). Occorre registrare separatamente le aberrazioni cromatidiche e quelle cromosomiche e classificarle in sottotipi (rotture, scambi). Le procedure in uso presso il laboratorio devono assicurare che l'analisi delle aberrazioni cromosomiche sia effettuata da analisti ben preparati e sottoposta valutazione inter pares, se del caso.

Sebbene la prova sia destinata a rivelare aberrazioni cromosomiche strutturali, è importante registrare le frequenze di eventuali casi di poliploidia e di endoriduplicazione (cfr. il paragrafo 2).

Competenza del laboratorio

Al fine di verificare sufficiente esperienza con la prova prima del suo impiego corrente, il laboratorio deve avere eseguito una serie di esperimenti con sostanze chimiche positive di riferimento che agiscono attraverso meccanismi diversi e vari controlli negativi (con diversi solventi/veicoli). Tali risposte dei controlli, positive e negative, devono essere coerenti con la letteratura scientifica. Ciò non si applica ai laboratori che hanno già maturato un'esperienza, vale a dire che dispongono di una banca di dati storici quale definita al paragrafo 37.

Occorre analizzare una selezione di sostanze chimiche di controllo a esito positivo (cfr. la tabella 1 al paragrafo 26) con trattamenti brevi e lunghi in assenza di attivazione metabolica e anche con trattamento breve in presenza di attivazione metabolica, al fine di dimostrare la capacità di individuare sostanze chimiche con proprietà clastogeniche e determinare l'efficacia del sistema di attivazione metabolica. Occorre scegliere una serie di concentrazioni delle sostanze chimiche selezionate per fornire aumenti riproducibili e correlati alla concentrazione rispetto ai valori di fondo, dimostrando così la sensibilità e la gamma dinamica del sistema di prova.

Dati storici di controllo

Il laboratorio deve stabilire:

All'acquisizione dei primi dati di distribuzione dei controlli negativi storici, è necessario che i controlli negativi paralleli siano coerenti con i dati di controllo pubblicati, se esistenti. Con l'aumento dei dati sperimentali aggiunti alla distribuzione dei controlli, i controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % di tale distribuzione (44) (47). La banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio deve inizialmente essere costituita con un minimo di 10 esperimenti ma preferibilmente con almeno 20 esperimenti svolti in condizioni sperimentali analoghe. I laboratori devono utilizzare metodi di controllo della qualità, quali diagrammi di controllo (ad esempio carte C o carte X medio (48)), per rilevare la variabilità dei loro dati di controllo positivi e negativi e dimostrare che la metodologia è “sotto controllo” nel laboratorio (44). Ulteriori raccomandazioni su come sviluppare e utilizzare i dati storici (cioè i criteri per l'inclusione e l'esclusione di dati nelle serie storiche e i criteri di accettabilità per un determinato esperimento) sono reperibili nella letteratura scientifica (47).

Eventuali modifiche apportate al protocollo sperimentale devono essere considerate in base alla loro coerenza con le esistenti banche dati di controlli storici del laboratorio. L'esistenza di incongruenze significative deve portare alla creazione di una nuova banca dati di controlli storici.

I dati sui controlli negativi devono comprendere l'incidenza di cellule con aberrazioni cromosomiche da coltura singola o dalla somma di colture replicate, come descritto nel paragrafo 21. I controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % della distribuzione della banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio (44) (47). Qualora i dati dei controlli negativi paralleli non rientrino nei limiti del controllo al 95 %, possono essere accettabili per l'inserimento nella distribuzione dei controlli storici purché non siano valori erratici estremi e sia provato che il sistema di prova è “sotto controllo” (cfr. il paragrafo 37) e che non si sono verificati errori tecnici o umani.

DATI E RELAZIONE

Presentazione dei risultati

Occorre valutare la percentuale di cellule con una o più aberrazioni cromosomiche strutturali. Occorre elencare separatamente le aberrazioni cromosomiche e quelle cromatidiche e classificarle in sottotipi (rotture, scambi) con l'indicazione del numero e della frequenza per le colture sperimentali e di controllo. I gap devono essere registrati e indicati separatamente nella relazione, ma non inclusi nella frequenza totale delle aberrazioni. Le percentuali di poliploidia e/o di cellule endoriduplicate sono segnalate se verificate.

Occorre riportare anche le misurazioni di citotossicità condotte in parallelo per tutte le colture trattate di controllo negativo e positivo nei principali test di aberrazione.

Occorre fornire dati sulle singole colture. Tutti i dati devono essere riassunti in tabelle.

Criteri di accettabilità

L'accettazione di una prova è basata sui seguenti criteri:

Analisi e interpretazione dei risultati

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è considerata chiaramente positiva se, in una qualsiasi delle condizioni sperimentali esaminate (cfr. il paragrafo 28):

Se tutti i criteri sono soddisfatti, la sostanza chimica in esame è ritenuta in grado di indurre aberrazioni cromosomiche in cellule di mammifero coltivate nel sistema di prova. Raccomandazioni dei metodi statistici più appropriati sono reperibili nella letteratura scientifica (49) (50) (51).

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è considerata chiaramente negativa se, in tutte le condizioni sperimentali esaminate (cfr. il paragrafo 28):

La sostanza chimica in esame è quindi ritenuta non in grado di indurre aberrazioni cromosomiche in cellule di mammifero coltivate nel sistema di prova.

Non è necessario verificare una risposta palesemente positiva o negativa.

In caso di risposta non chiaramente positiva o negativa come sopra descritto o per contribuire a stabilire la pertinenza biologica di un risultato, i dati devono essere valutati da esperti e/o mediante ulteriori indagini. Potrebbe essere utile analizzare nuove cellule (se appropriato) o ripetere un esperimento modificandone eventualmente le condizioni (ad esempio, intervallazione delle concentrazioni, altre condizioni di attivazione metabolica (ossia concentrazione S9 od origine S9)).

In rari casi, anche dopo ulteriori indagini, i dati non consentono di arrivare a una conclusione positiva o negativa e pertanto la risposta della sostanza chimica in esame è considerata ambigua.

Un aumento del numero di cellule poliploidi può significare che le sostanze chimiche in esame sono in grado di inibire processi mitotici e di indurre aberrazioni numeriche nei cromosomi (52). Un aumento del numero di cellule con cromosomi endoriduplicati può indicare che le sostanze chimiche in esame sono in grado di inibire la progressione del ciclo cellulare (53) (54) (cfr. il paragrafo 2). Pertanto, l'incidenza delle cellule poliploidi e quella delle cellule con cromosomi endoriduplicati devono essere registrate separatamente.

Relazione sulla prova

La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti.

BIBLIOGRAFIA

(4)

Nella parte B, il capitolo B.11 è sostituito dal seguente:

«B.11   Prova di aberrazione cromosomica del midollo osseo nei mammiferi

INTRODUZIONE

Il presente metodo di prova è equivalente alle linee guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 475 (2016), e fa parte di una serie di metodi di prova di tossicologia genetica. È stato elaborato un documento OCSE contenente informazioni succinte sulle prove di tossicologia genetica e un compendio delle modifiche recentemente apportate alla rispettiva linea guida (1).

La prova in vivo di aberrazione cromosomica del midollo osseo nei mammiferi è particolarmente rilevante per valutare la genotossicità. Difatti, benché possano variare a seconda delle specie, i fattori del metabolismo in vivo, gli aspetti farmacocinetici e i processi di riparazione del DNA sono attivi e contribuiscono alle reazioni. La prova in vivo è inoltre utile per studiare più approfonditamente la genotossicità rilevata tramite un sistema in vitro.

La prova in vivo di aberrazione cromosomica del midollo osseo nei mammiferi è utilizzato per individuare aberrazioni cromosomiche strutturali indotte dalle sostanze chimiche in esame nelle cellule del midollo osseo di animali, di solito roditori (2) (3) (4) (5). Tali aberrazioni strutturali possono essere di due tipi: cromosomiche o cromatidiche. La maggior parte delle aberrazioni indotte da sostanze chimiche genotossiche è di tipo cromatidico, ma si verificano anche aberrazioni di tipo cromosomico. I danni cromosomici e i fenomeni ad esse connessi sono la causa di molte malattie genetiche umane e vi sono prove concrete del fatto che, quando causano alterazioni degli oncogeni e dei geni soppressori dei tumori, queste lesioni ed i fenomeni ad esse connessi sono implicati nella comparsa delle neoplasie umane e di quelle sperimentalmente indotte negli animali da laboratorio. Nelle prove di aberrazione cromosomica in vivo possono verificarsi casi di poliploidia (inclusa l'endoriduplicazione). Un aumento della poliploidia non è tuttavia, di per sé, un segno di potenziale aneugenico, e può semplicemente indicare una perturbazione del ciclo delle cellule o citotossicità. Questo test non è destinato a misurare l'aneuploidia, per il cui rilevamento sono raccomandati i test in vivo sui micronuclei negli eritrociti di mammifero (capitolo B.12 del presente allegato) o i test del micronucleo in vitro con cellule di mammifero (capitolo B.49 del presente allegato).

Le definizioni della terminologia usata figurano nell'Appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

Per tale saggio si usano di norma roditori, ma in certi casi si può ricorrere anche ad altre specie se ciò è giustificato sul piano scientifico. Il midollo osseo è il tessuto bersaglio, in quanto è altamente vascolarizzato e contiene una popolazione di cellule a ciclo rapido, che possono essere agevolmente isolate e trattate. L'utilizzazione di specie diverse dai ratti e dai topi deve essere scientificamente giustificata nella relazione. Se si ricorre a specie diverse dai roditori, viene raccomandato di integrare la misurazione delle aberrazioni cromosomiche del midollo osseo in un'altra prova di tossicità pertinente.

Se è comprovato che la sostanza o le sostanze chimiche in esame, o i loro metaboliti, non raggiungono il tessuto bersaglio, può non essere opportuno utilizzare questa prova.

Prima dell'uso del metodo di prova su una miscela, per la generazione di dati per un determinato scopo normativo, occorre esaminare se, e in caso affermativo perché, può fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie in presenza di un obbligo normativo di prova sulla miscela.

PRINCIPIO DELLA PROVA

Gli animali sono esposti alla sostanza chimica in esame attraverso un'adeguata via d'esposizione, e al momento opportuno, dopo il trattamento, sono soppressi in modo incruento. Prima della soppressione incruenta, gli animali sono trattati con un inibitore della metafase (ad es. colchicina o colcemid). Le preparazioni cromosomiche approntate dalle cellule di midollo osseo sono poi sottoposte a un processo di colorazione, e le cellule in metafase sono analizzate per individuare aberrazioni cromosomiche.

VERIFICA DELLA COMPETENZA DEL LABORATORIO

Prove di competenza

Per accertare che il laboratorio possieda un'esperienza sufficiente nella conduzione del saggio prima di utilizzarlo nelle prove di routine, il laboratorio deve dimostrare la capacità di riprodurre i risultati attesi dai dati pubblicati (ad es. (6)) riguardanti le frequenze delle aberrazioni cromosomiche, con un minimo di due sostanze per i controlli positivi (incluse le risposte deboli indotte da dosi basse di sostanze per i controlli positivi), come quelle elencate nella tabella 1, e con controlli sui mezzi disperdenti/solventi compatibili (cfr. il paragrafo 22). Le dosi utilizzate nel corso di tali sperimentazioni devono produrre aumenti riproducibili e collegati alle dosi somministrate, e devono dimostrare la sensibilità e l'intervallo dinamico del sistema di analisi sul tessuto in questione (il midollo osseo). Il metodo di conteggio deve essere quello che sarà usato dal laboratorio. Questo requisito non si applica ai laboratori con esperienza, che dispongono cioè di una base di dati storica quale definita ai paragrafi 10-14.

Dati di controllo storici

Nell'ambito delle prove di competenza il laboratorio deve stabilire:

All'acquisizione dei primi dati di distribuzione dei controlli negativi storici, è necessario che i controlli negativi paralleli siano coerenti con i dati di controllo pubblicati, se esistenti. Con l'aumento dei dati sperimentali aggiunti alla distribuzione dei controlli storici, i controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % di tale distribuzione. La banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio deve essere solida sotto il profilo statistico per garantire la capacità del laboratorio di valutare la distribuzione dei suoi dati di controllo negativi. La letteratura suggerisce che possa essere necessario un minimo di 10 esperimenti, ma che sarebbe preferibile contarne almeno 20, svolti in analoghe condizioni sperimentali. I laboratori devono utilizzare metodi di controllo della qualità, quali diagrammi di controllo (ad esempio carte C o carte X medio (7)), per rivelare la variabilità dei loro dati e dimostrare che la metodologia è “sotto controllo” nel laboratorio. Ulteriori raccomandazioni su come sviluppare e utilizzare i dati storici (cioè i criteri per l'inclusione e l'esclusione di dati nelle serie storiche e i criteri di accettabilità per un determinato esperimento) sono reperibili nella letteratura scientifica (8).

Se nell'ambito delle prove di competenza (descritte al paragrafo 9) il laboratorio non porta a termine un numero sufficiente di esperimenti per stabilire una distribuzione dei controlli negativi statisticamente solida (cfr. il paragrafo 11), si può accettare che la distribuzione sia definita durante i primi test di routine. Questo approccio deve seguire le raccomandazioni formulate nella letteratura (8), e i risultati dei controlli negativi ottenuti in questi esperimenti devono essere coerenti con i dati di controllo negativi pubblicati.

Eventuali modifiche apportate al protocollo sperimentale devono essere considerate in base alle loro ripercussioni sulla coerenza fra i nuovi dati e le esistenti banche dati di controlli storici del laboratorio. Solo le incongruenze significative dovrebbero portare alla creazione di una nuova banca dati di controlli storici, se il parere di un esperto stabilisce che vi è una differenza rispetto alla distribuzione precedente (cfr. il paragrafo 11). Durante la costituzione di questa nuova banca dati, il laboratorio non ha necessariamente bisogno di una banca dati completa di controlli negativi per permettere lo svolgimento di una prova, a condizione che esso possa dimostrare che i valori dei controlli negativi paralleli rimangano coerenti con la precedente banca dati o con i dati corrispondenti pubblicati.

I dati sui controlli negativi devono riguardare l'incidenza delle aberrazioni cromosomiche strutturali (senza “gap”) in ogni animale. I controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % della distribuzione della banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio. Qualora i dati dei controlli negativi paralleli non rientrino nei limiti del controllo al 95 % possono essere accettabili per l'inserimento nella distribuzione dei controlli storici purché non siano outlier estremi e sia provato che il sistema di prova è “sotto controllo” (cfr. il paragrafo 11) e che non si sono verificati errori tecnici o umani.

DESCRIZIONE DEL METODO

Preparazioni

Selezione delle specie animali

Di preferenza sono utilizzati individui adulti, giovani e in buona salute, provenienti da ceppi di animali da laboratorio. Sono comunemente usati i ratti, ma possono essere idonei anche i topi. Si può ricorrere a qualsiasi altra specie idonea di mammiferi, se ciò viene giustificato scientificamente nella relazione.

Condizioni di stabulazione e alimentazione degli animali

Per i roditori, la temperatura dello stabulario deve essere mantenuta a 22 °C (± 3 °C). Idealmente l'umidità relativa deve essere del 50-60 %. Deve comunque essere come minino del 40 % e non deve preferibilmente superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti. L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d'oscurità. Per l'alimentazione, attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un'adeguata miscela della sostanza in esame, se somministrata per questa via. Se non ci si aspetta alcun comportamento aggressivo, i roditori vanno alloggiati in piccoli gruppi (non più di cinque in ogni gabbia) dello stesso sesso e gruppo di trattamento, preferibilmente in gabbie a fondo pieno con adeguato arricchimento ambientale. Gli animali possono essere alloggiati individualmente solo se ciò è giustificato sotto il profilo scientifico.

Preparazione degli animali

Sono generalmente utilizzati animali adulti, giovani e sani (i roditori hanno idealmente un'età di 6-10 settimane all'inizio del trattamento, ma sono accettati anche animali di età un pÓ più avanzata), che vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. I singoli animali sono identificati univocamente applicando un metodo incruento e il meno possibile invasivo (cioè inanellamento, etichettatura, applicazione di un microchip o identificazione biometrica, evitando il taglio delle orecchie o la falangectomia) e devono essere acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Deve essere evitata ogni contaminazione incrociata fra il controllo positivo e la sostanza chimica in esame. All'inizio dello studio la variazione di peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio per ciascun sesso.

Preparazione delle dosi

Le sostanze solide in esame vanno sciolte o poste in sospensione in appropriati solventi o mezzi disperdenti o mescolate alla dieta o all'acqua da bere prima di essere somministrate agli animali. Le sostanze liquide possono essere somministrate direttamente o diluite prima del trattamento. In caso di esposizione per via inalatoria, le sostanze possono essere somministrate sotto forma di gas, vapore o aerosol solido o liquido, in funzione delle loro proprietà fisico-chimiche. Vanno usati preparati freschi della sostanza, a meno che i dati sulla stabilità dimostrino che la conservazione è accettabile e definiscano le adeguate condizioni di conservazione.

Solvente/mezzo disperdente

Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici ai livelli di dose usati e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Fra gli esempi di solventi/mezzi disperdenti compatibili e comunemente usati si possono menzionare l'acqua, la soluzione fisiologica, la soluzione di metilcellulosa, la soluzione di carbossimetilcellulosa sodica, l'olio di oliva e l'olio di mais. In mancanza di dati di controllo storici o pubblicati che dimostrino che un solvente/mezzo disperdente atipico prescelto non induce aberrazioni strutturali o altri effetti nocivi, va effettuato uno studio iniziale per stabilire l'accettabilità del controllo del solvente/mezzo disperdente.

Controlli

Controlli positivi

Ogni prova deve generalmente includere un gruppo di animali trattati con una sostanza usata per i controlli positivi. Questa condizione può essere eliminata quando il laboratorio di prova ha dimostrato la sua competenza nello svolgimento della prova e ha stabilito l'intervallo dei controlli positivi storici. Quando manca un gruppo di controllo positivo parallelo, in ogni esperimento devono essere inclusi controlli del conteggio (vetrini fissati e non colorati). Questo può avvenire includendo nello studio campioni di riferimento idonei ottenuti e conservati in occasione di un esperimento separato di controllo positivo svolto periodicamente (ad es. ogni 6-18 mesi) nel laboratorio in cui è condotta la prova; ad esempio, durante la verifica della competenze e successivamente, se necessario, su base periodica.

Le sostanze chimiche per i controlli positivi devono portare, in modo affidabile, a un aumento individuabile della frequenza delle cellule con aberrazioni cromosomiche strutturali al di là del livello spontaneo. Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente all'analista l'identità dei campioni codificati. È ammissibile che le sostanze per i controlli positivi siano somministrate per una via diversa da quella della sostanza chimica in esame, usando un programma di trattamento diverso, e che il campionamento avvenga in un unico momento. È anche ammissibile, se appropriato, l'uso per i controlli positivi di sostanze di una classe chimica correlata. Nella tabella 1 figurano esempi di sostanze chimiche per i controlli positivi.

Tabella 1.

Esempi di sostanze chimiche per i controlli positivi

Controlli negativi

In ogni momento del campionamento devono essere inclusi animali del gruppo di controllo negativo, che sono gestiti nello stesso modo dei gruppi di trattamento, ma a cui non viene somministrata la sostanza chimica in esame. Se per la somministrazione della sostanza in esame si usa un solvente/mezzo disperdente, anche il gruppo di controllo deve riceverlo. Tuttavia, se dai dati dei controlli negativi storici risulta una variabilità intraspecifica e una frequenza delle cellule con aberrazioni strutturali coerente ad ogni momento del campionamento per il laboratorio di prova, può essere sufficiente un solo campionamento per il controllo negativo. In tal caso, esso deve avvenire al momento del primo campionamento effettuato nell'ambito dello studio.

PROCEDURA

Numero e sesso degli animali

In generale, la risposta dei micronuclei è simile nei maschi e nelle femmine degli animali (9), ed è da prevedere che ciò valga anche per le aberrazioni cromosomiche strutturali; la maggior parte degli studi potrebbe pertanto venire effettuata sull'uno o sull'altro sesso. L'esistenza di dati che dimostrano differenze rilevanti fra i maschi e le femmine (ad es. differenze riguardanti la tossicità sistemica, il metabolismo, la biodisponibilità, la tossicità del midollo osseo, ecc., incluso ad es. un range-finding test) incoraggerebbero l'uso di entrambi i sessi. Nella fattispecie potrebbe essere appropriato effettuare uno studio su entrambi i sessi, ad es. come parte di uno studio di tossicità a dose ripetuta. Nel caso si effettuino prove su entrambi i sessi potrebbe essere adeguato ricorrere al metodo fattoriale. Nell'appendice 2 figurano precisazioni sulle modalità di analisi dei dati in base a tale metodo.

All'inizio dello studio, la dimensione stabilita del gruppo deve consentire di disporre, in ogni gruppo, di almeno 5 animali analizzabili dello stesso sesso, o di ogni sesso se sono usati entrambi. Se l'esposizione umana a sostanze chimiche è specifica per un sesso, ad esempio nel caso di alcuni prodotti farmaceutici, il test deve essere eseguito su animali di tale sesso. A titolo di orientamento sul numero massimo di animali tipicamente necessario, uno studio sul midollo osseo con due momenti di campionamento, con tre gruppi di trattamento e un gruppo di controllo negativo parallelo, più un gruppo di controllo positivo (ogni gruppo composto da cinque animali dello stesso sesso), richiederebbe 45 animali.

Livelli di dose

Se viene effettuato uno studio preliminare di range-finding poiché non sono già disponibili dati appropriati per orientare la scelta delle dosi, tale studio deve essere svolto nello stesso laboratorio, usando specie, ceppi, sesso e un regime di trattamento identici a quelli che saranno utilizzati nello studio principale (10). Lo studio preliminare serve a individuare la dose massima tollerata (MTD), definita come la dose più alta che sarà tollerata per la durata della prova senza che appaia una tossicità che limita lo studio (inducendo ad esempio un calo del peso corporeo o citotossicità del sistema emopoietico, ma che non provoca morte o segni di dolore, sofferenza o stress che rendano necessaria una soppressione incruenta (11)).

La dose massima può essere definita anche come la dose che produce qualche segno di tossicità nel midollo osseo.

Le sostanze chimiche che comportano saturazione delle caratteristiche tossicocinetiche o che inducono processi di detossificazione che possono portare a una diminuzione dell'esposizione dopo un trattamento a lungo termine possono essere considerate eccezioni rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso.

Per ottenere informazioni sulla relazione dose-risposta, uno studio completo deve includere un gruppo di controllo negativo e almeno tre livelli di dose, generalmente separati da un fattore 2, ma non più di 4. Se la sostanza chimica in esame non provoca alcuna tossicità nell'ambito di un test di range-finding o secondo quanto emerge dai dati esistenti, la dose massima per una singola somministrazione deve essere di 2 000 mg/kg di peso corporeo. Se la sostanza chimica in esame provoca invece tossicità, la MTD deve corrispondere alla dose più elevata somministrata, e i livelli di dose utilizzati devono essere compresi in un intervallo che va dalla tossicità massima a una tossicità modica o assente. Quando una tossicità del tessuto bersaglio (midollo osseo) è osservata a tutti i livelli di dose di prova, è consigliabile un ulteriore studio con dosi non tossiche. Gli studi volti a descrivere più pienamente le informazioni quantitative sulla relazione dose-risposta possono richiedere gruppi di trattamento supplementari. Per certi tipi di sostanze chimiche in esame (ad es. medicinali per uso umano) per le quali valgono specifici requisiti, i limiti possono variare.

Prova limite

Se gli esperimenti per determinare gli intervalli di dose o i dati disponibili relativi ai ceppi di animali affini indicano che un trattamento uguale o superiore alla dose limite (sotto descritta) non produce effetti tossici osservabili (comprese nessuna depressione della funzione del midollo osseo o altre manifestazioni di citotossicità del tessuto bersaglio), e se non si prevede genotossicità sulla base degli studi di genotossicità in vitro o dei dati relativi alle sostanze chimiche strutturalmente affini, uno studio completo con tre livelli di dose può non essere considerato necessario, purché sia stato dimostrato che la sostanza o le sostanze chimiche in esame raggiungono il tessuto bersaglio (midollo osseo). In tali casi può essere sufficiente un solo livello di dose, corrispondente alla dose limite. Per un periodo di somministrazione di >14 giorni, la dose limite è 1 000 mg/kg di peso corporeo al giorno. Per periodi di somministrazione di 14 giorni o meno, la dose limite è 2 000 mg/kg/ di peso corporeo al giorno.

Somministrazione delle dosi

Nella concezione di un saggio va considerata la via d'esposizione umana prevista. Pertanto possono essere scelti, se giustificati, vie di somministrazione quali l'alimentazione, l'acqua potabile, la via sottocutanea locale, la via endovenosa, la via orale (sonda gastrica), inalatoria, intratracheale, o l'impianto. In ogni caso, deve essere scelta la via che garantisce un'adeguata esposizione del o dei tessuti bersaglio. L'iniezione intraperitoneale non è generalmente raccomandata in quanto non si tratta di una via di esposizione umana prevista, e va utilizzata solo con una specifica giustificazione scientifica. Se la sostanza chimica in esame è miscelata nell'alimentazione o nell'acqua occorre fare attenzione, specialmente nei casi di dosaggio singolo, che il lasso di tempo fra l'assunzione del cibo e dell'acqua e il campionamento sia sufficiente per consentire l'individuazione degli effetti (cfr. i paragrafi 33-34). Il volume massimo di liquido somministrabile in un'unica volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'animale da laboratorio. Esso non deve generalmente essere superiore a 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere somministrate in quantità pari a massimo 2 ml/100 g di peso corporeo. L'uso di volumi maggiori deve essere giustificato. Salvo nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l'aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da garantire la somministrazione di un volume costante in relazione al peso corporeo per tutti i livelli di dose.

Programma di trattamento

Le sostanze chimiche in esame sono di norma somministrate in un'unica presa, ma possono essere somministrate anche in prese frazionate (due prese nello stesso giorno, a distanza di qualche ora al massimo) per agevolare la somministrazione di un grosso volume. In queste situazioni, o in caso di somministrazione della sostanza chimica in esame per inalazione, il momento del campionamento deve essere programmato in base al momento di somministrazione dell'ultima dose o della fine dell'esposizione.

Vi sono pochi dati disponibili sull'idoneità di un protocollo a dosi ripetute per questa prova. Tuttavia, qualora sia auspicabile integrare la prova in questione con un test di tossicità a dosi ripetute, occorre fare attenzione a evitare la perdita delle cellule mitotiche che presentano danni cromosomici, fenomeno che può verificarsi con le dosi tossiche. Una tale integrazione è accettabile quando la dose massima è superiore o pari alla dose limite (cfr. il paragrafo 29), e la dose limite è somministrata a un gruppo di trattamento per tutta la durata del trattamento. Il test del micronucleo (metodo di prova B.12) va considerato come il test in vivo prescritto per le aberrazioni cromosomiche quando è auspicata un'integrazione con altri studi.

I campioni di midollo osseo devono essere prelevati in due momenti diversi dopo i singoli trattamenti. Per i roditori, il primo intervallo di campionamento deve corrispondere al tempo necessario per completare una volta e mezza la durata del ciclo cellulare normale (che è generalmente di 12-18 ore dopo il periodo del trattamento). Poiché il tempo necessario affinché la sostanza o le sostanze chimiche in esame siano assorbite e metabolizzate e producano effetti sulla cinetica del ciclo cellulare può influire sul momento ottimale per l'individuazione delle aberrazioni cromosomiche, si raccomanda di prelevare un altro campione 24 ore dopo. Al momento del primo campionamento, tutti i gruppi di trattamento devono essere trattati e i campioni per l'analisi prelevati, mentre al momento del o dei campionamenti successivi deve essere somministrata solo la dose massima. Se il protocollo di trattamento è più lungo di un giorno in base a una giustificazione scientifica, si deve procedere ad un unico campionamento una volta trascorso un periodo equivalente fino a circa una volta e mezza la durata normale del ciclo cellulare dopo l'ultima somministrazione.

Dopo il trattamento e prima della raccolta dei campioni, agli animali viene iniettata per via intraperitoneale un'adeguata dose di un agente inibitore della metafase (ad es. colcemid o colchicina), e i campioni sono prelevati successivamente a un intervallo appropriato. Per i topi questo intervallo è di circa 3-5 ore prima della raccolta, e per i ratti è di 2-5 ore. Le cellule sono prelevate dal midollo osseo, sono ingrandite, fissate e colorate, e analizzate ai fini dell'individuazione di aberrazioni cromosomiche (12).

Osservazioni

Gli animali da laboratorio devono essere oggetto di osservazioni cliniche generali e i segni clinici devono essere registrati almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa o alle stesse ore e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Almeno due volte al giorno, durante il periodo di somministrazione, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità. Tutti gli animali devono essere pesati all'inizio dello studio, almeno una volta alla settimana nel corso degli studi a dosi ripetute, e al momento della soppressione incruenta. Negli studi la cui durata è di almeno una settimana, la misurazione del consumo di cibo va eseguita almeno con cadenza settimanale. Se la sostanza in esame viene somministrata con l'acqua, il consumo di acqua va misurato ad ogni cambio dell'acqua e almeno una volta alla settimana. Gli animali che manifestano segni di eccessiva, ma non letale, tossicità vanno soppressi in modo incruento prima della fine del periodo di saggio (11).

Esposizione del tessuto bersaglio

Ove ciò sia giustificato e non esistano altri dati sull'esposizione (cfr. il paragrafo 44), al o ai momenti idonei va prelevato un campione di sangue per esaminare i livelli delle sostanze chimiche in esame nel plasma, allo scopo di dimostrare l'avvenuta esposizione del midollo osseo.

Midollo osseo e preparazioni cromosomiche

Immediatamente dopo la soppressione incruenta, dai femori e dalle tibie degli animali vengono prelevate le cellule del midollo osseo, che vengono esposte a una soluzione ipotonica e fissate. Le cellule in metafase vengono poi poste sui vetrini e colorate secondo metodi prestabiliti (cfr. (3) (12)).

Analisi

Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima dell'analisi, e devono essere randomizzati in modo che l'analista non conosca le condizioni del trattamento.

Come misura della citotossicità deve essere determinato il coefficiente mitotico in almeno 1 000 cellule per animale, in tutti gli animali trattati (compresi i controlli positivi), e nei controlli negativi non trattati o con somministrazione della sostanza chimica in esame in solvente/mezzo disperdente.

Per individuare le aberrazioni cromosomiche strutturali, inclusi ed esclusi i gap, devono essere analizzate almeno 200 metafasi per ogni animale (6). Tuttavia, se la banca dati dei controlli negativi storici indica che la frequenza di fondo media delle aberrazioni cromosomiche strutturali nel laboratorio di prova è <1 %, occorre prendere in considerazione l'opportunità di esaminare cellule supplementari. Le aberrazioni di tipo cromatidico e cromosomico devono essere registrate separatamente e classificate in sottotipi (rotture, scambi). Le procedure in uso nel laboratorio devono garantire che l'analisi delle aberrazioni cromosomiche sia effettuata da analisti qualificati e, se appropriato, che sia oggetto di una revisione inter pares. Poiché le procedure di preparazione dei vetrini causano spesso la rottura di una parte delle cellule in metafase, con perdita di cromosomi, le cellule conteggiate devono quindi contenere un numero di centromeri non inferiore a 2n±2, dove n è il numero aploide di cromosomi per quella specie.

DATI E RELAZIONE

Trattamento dei risultati

I dati relativi a ciascun animale vanno presentati sotto forma di tabella. Per ogni animale devono essere indicati l'indice mitotico, il numero di cellule in metafase conteggiate, il numero di aberrazioni per ogni cellula in metafase e la percentuale di cellule con aberrazioni cromosomiche strutturali. Devono essere elencati i diversi tipi di aberrazioni cromosomiche strutturali, con il relativo numero e la frequenza per i gruppi trattati e i gruppi di controllo. I gap, così come le cellule poliploidi e le cellule con cromosomi endoriduplicati sono registrati separatamente. La frequenza dei gap viene indicata nella relazione, ma non viene generalmente inclusa nell'analisi della frequenza totale delle aberrazioni strutturali. Se non c'è un'evidente differenza di risposta tra i sessi, i dati possono essere combinati nell'analisi statistica. Nella relazione devono anche figurare i dati riguardanti la tossicità animale e i segni clinici.

Criteri di accettabilità

L'accettabilità delle prove si basa sui seguenti criteri:

Valutazione e interpretazione dei risultati

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente positiva se:

Se in un particolare momento del campionamento viene esaminata solo la dose massima, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente positiva se vi è un aumento statisticamente significativo rispetto al controllo negativo parallelo, e i risultati sono al di fuori della distribuzione dei dati di controllo negativi storici (ad es. limiti del controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson). Raccomandazioni relative agli appropriati metodi statistici figurano nella letteratura (13). Quando si effettua un'analisi della relazione dose-risposta, devono essere analizzati almeno tre gruppi di trattamento. Nei test statistici l'unità sperimentale deve essere l'animale. L'ottenimento di risultati positivi nella prova di aberrazione cromosomica indica che la sostanza chimica in esame induce aberrazioni cromosomiche strutturali nel midollo osseo della specie esaminata.

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente negativa se in tutte le condizioni sperimentali esaminate:

Raccomandazioni relative ai metodi statistici più appropriati figurano nella letteratura (13). L'esposizione del midollo osseo alla sostanza chimica in esame può essere dimostrata, ad esempio, da un calo dell'indice mitotico, o dalla misurazione del livello delle sostanze in esame nel plasma o nel sangue In caso di somministrazione per via endovenosa, la prova dell'esposizione non è necessaria. In alternativa, l'esposizione del midollo osseo può essere dimostrata ricorrendo ai dati ADME, ottenuti nell'ambito di uno studio indipendente usando la stessa via di somministrazione e le stesse specie. L'ottenimento di risultati negativi indica che, nelle condizioni di prova, la sostanza chimica in esame non induce aberrazioni cromosomiche strutturali nel midollo osseo delle specie esaminate.

Non è necessario verificare una risposta chiaramente positiva o chiaramente negativa.

Nei casi in cui la risposta non sia chiaramente negativa né chiaramente positiva, per poter stabilire la rilevanza biologica di un risultato (ad es. un aumento debole o marginale), i dati devono venire sottoposti al giudizio di esperti e/o a indagini più approfondite sugli esperimenti portati a termine. In alcuni casi può essere utile analizzare più cellule o ripetere l'esperienza in condizioni sperimentali modificate.

In rari casi, anche dopo ulteriori indagini, i dati non permetteranno di concludere se la sostanza chimica in esame produce risultati positivi o negativi, e lo studio dovrà pertanto essere dichiarato ambiguo.

La frequenza delle metafasi poliploidi e delle metafasi con endoriduplicazione, rispetto al numero totale delle metafasi, va registrata separatamente. Un aumento del numero di cellule poliploidi/endoriduplicate può indicare che la sostanza chimica in esame è in grado di inibire il processo mitotico o il ciclo cellulare (cfr. il paragrafo 3).

Relazione sulla prova

La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti:

Sintesi

BIBLIOGRAFIA

(5)

Nella parte B, il capitolo B.12 è sostituito dal seguente:

«B.12   Prova sui micronuclei negli eritrociti di mammifero

INTRODUZIONE

Il presente metodo di prova è equivalente alle linee guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 474 (2016), e fa parte di una serie di metodi di prova di tossicologia genetica. È stato elaborato un documento OCSE contenente informazioni succinte sulle prove di tossicologia genetica e un compendio delle modifiche recentemente apportate alla rispettiva linea guida (1).

La prova in vivo sui micronuclei dei mammiferi è particolarmente rilevante per valutare la genotossicità. Difatti, benché possano variare a seconda delle specie, i fattori del metabolismo in vivo, gli aspetti farmacocinetici e i processi di riparazione del DNA sono attivi e contribuiscono alle reazioni. La prova in vivo è inoltre utile per studiare più approfonditamente la genotossicità rilevata tramite un sistema in vitro.

La prova in vivo sui micronuclei dei mammiferi è utilizzato per individuare i danni indotti dalla sostanza chimica in esame sui cromosomi o sull'apparato mitotico degli eritoblasti. Esso valuta la formazione di micronuclei in eritrociti provenienti dal midollo osseo o dalle cellule del sangue periferico di animali, di norma roditori.

Lo scopo della prova sui micronuclei è individuare le sostanze chimiche che provocano danni citogenetici, che si manifestano nella formazione di micronuclei contenenti frammenti residui di cromosomi o cromosomi interi.

Quando da un eritroblasto del midollo osseo si sviluppa un eritrocita immaturo (designato a volte anche come eritrocita policromatico o reticolocito), il nucleo principale viene espulso; i micronuclei formatisi possono rimanere nel citoplasma. In queste cellule la visualizzazione o il rilevamento dei micronuclei sono facilitati poiché manca il nucleo principale. L'aumento della frequenza di eritrociti immaturi contenenti micronuclei negli animali trattati è un'indicazione di aberrazioni cromosomiche strutturali o numeriche indotte.

Gli eritrociti contenenti micronuclei di nuova formazione sono individuati e quantificati mediante colorazione, seguita o da un conteggio visivo al microscopio, o da un'analisi automatizzata. Il conteggio di un numero sufficiente di eritrociti immaturi nel sangue periferico o nel midollo osseo degli animali adulti è grandemente facilitato dall'uso di una piattaforma di calcolo automatizzata. Tali piattaforme sono alternative accettabili alla valutazione manuale (2). Studi comparativi hanno mostrato che tali metodi, usando standard di calibrazione adeguati, possono consentire riproducibilità inter- e intra-laboratorio e sensibilità migliore di quella consentita dal conteggio manuale al microscopio (3) (4). I sistemi automatizzati che possono misurare la frequenza degli eritrociti contenenti micronuclei includono (ma non sono limitati a questi): citometri a flusso (5), piattaforme di analisi delle immagini (6) (7), e citometri a scansione laser (8).

Benché generalmente non rientri nella prova, i frammenti di cromosomi possono essere distinti dai cromosomi interi in base a una serie di criteri. Questi includono la presenza o l'assenza del cinetocore, o del centromero, entrambi caratteristici dei cromosomi intatti. L'assenza del cinetocore, o del centromero, indica che il micronucleo contiene solo frammenti di cromosomi, mentre la presenza è indicativa di una perdita cromosomica.

Le definizioni della terminologia usata figurano nell'Appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

In questo saggio il tessuto bersaglio delle lesioni genetiche è il midollo osseo di roditori adulti giovani. In questo tessuto sono difatti prodotti gli eritrociti. La misurazione dei micronuclei negli eritrociti immaturi del sangue periferico può essere effettuata in altre specie di mammiferi per i quali è stata dimostrata una sensibilità sufficiente per l'individuazione di sostanze chimiche che provocano aberrazioni cromosomiche strutturali o numeriche in queste cellule (tramite induzione di micronuclei negli eritrociti immaturi), e a condizione che ciò sia giustificato sul piano scientifico. L'endpoint è la frequenza degli eritrociti immaturi micronucleati. La frequenza degli eritrociti maturi contenenti micronuclei nel sangue periferico può anch'essa essere utilizzata come endpoint nelle specie che non presentano una forte selezione splenica contro le cellule contenenti micronuclei e quando gli animali sono trattati continuativamente per un periodo superiore alla durata di vita di un eritrocita nella specie utilizzata (ad es., nel topo, 4 settimane o più).

Se è comprovato che la sostanza o le sostanze chimiche in esame, o i loro metaboliti, non raggiungono il tessuto bersaglio, può non essere opportuno utilizzare questa prova.

Prima dell'uso del metodo di prova su una miscela, per la generazione di dati per un determinato scopo normativo, occorre esaminare se, e in caso affermativo perché, può fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie in presenza di un obbligo normativo di prova sulla miscela.

PRINCIPIO DELLA PROVA

Gli animali sono esposti alla sostanza chimica in esame attraverso un'adeguata via d'esposizione. Se si utilizza il midollo osseo, al momento / ai momenti opportuni, dopo il trattamento, gli animali sono soppressi in modo incruento. Il midollo osseo viene estratto, e si procede alle preparazioni e alle colorazioni (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Quando si utilizza il sangue periferico, il sangue viene raccolto al momento / ai momenti opportuni dopo il trattamento e si procede alle preparazioni e alle colorazioni (12) (16) (17) (18). In caso di somministrazione acuta del trattamento, è importante effettuare il prelievo del midollo osseo o del sangue in un momento in cui l'induzione di eritrociti immaturi micronucleati dovuta al trattamento possa essere individuata. In caso di prelievo di sangue periferico, perché tali elementi appaiano nella circolazione sanguigna deve essere trascorso un lasso di tempo sufficiente. Le preparazioni sono analizzate ai fini dell'individuazione dei micronuclei, tramite visualizzazione con microscopio, analisi delle immagini, citometri a flusso, oppure citometria a scansione laser.

VERIFICA DELLA COMPETENZA DEL LABORATORIO

Prove di competenza

Per accertare che il laboratorio possieda un'esperienza sufficiente nella conduzione del saggio prima di utilizzarlo nelle prove di routine, il laboratorio deve dimostrare la capacità di riprodurre i risultati attesi dai dati pubblicati (17) (19) (20) (21) (22) riguardanti le frequenze dei micronuclei, con un minimo di due sostanze per i controlli positivi (incluse le risposte deboli indotte da dosi basse di sostanze per i controlli positivi), come quelle elencate nella tabella 1, e con controlli su mezzi disperdenti/solventi compatibili (cfr. il paragrafo 26). Le dosi utilizzate nel corso di tali sperimentazioni devono produrre aumenti riproducibili e collegati alle dosi somministrate, e devono dimostrare la sensibilità e l'intervallo dinamico del sistema di analisi sul tessuto in questione (il midollo osseo o il sangue periferico). Il metodo di conteggio deve essere quello che sarà usato dal laboratorio. Questo requisito non si applica ai laboratori con esperienza, che dispongono cioè di una base di dati storica quale definita ai paragrafi 14-18.

Dati di controllo storici

Nell'ambito delle prove di competenza il laboratorio deve stabilire:

All'acquisizione dei primi dati di distribuzione dei controlli negativi storici, è necessario che i controlli negativi paralleli siano coerenti con i dati di controllo pubblicati, se esistenti. Con l'aumento dei dati sperimentali aggiunti alla distribuzione dei controlli storici, i controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % di tale distribuzione. La banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio deve essere solida sotto il profilo statistico per garantire la capacità del laboratorio di valutare la distribuzione dei suoi dati di controllo negativi. La letteratura suggerisce che possa essere necessario un minimo di 10 esperimenti, ma che sarebbe preferibile contarne almeno 20, svolti in analoghe condizioni sperimentali. I laboratori devono utilizzare metodi di controllo della qualità, quali diagrammi di controllo (ad esempio carte C o carte X medio (23)), per rivelare la variabilità dei loro dati e dimostrare che la metodologia è “sotto controllo” nel laboratorio. Ulteriori raccomandazioni su come sviluppare e utilizzare i dati storici (cioè i criteri per l'inclusione e l'esclusione di dati nelle serie storiche e i criteri di accettabilità per un determinato esperimento) sono reperibili nella letteratura scientifica (24).

Se nell'ambito delle prove di competenza (descritte al paragrafo 13) il laboratorio non porta a termine un numero sufficiente di esperimenti per stabilire una distribuzione dei controlli negativi statisticamente solida (cfr. il paragrafo 15), si può accettare che la distribuzione sia definita durante i primi test di routine. Questo approccio deve seguire le raccomandazioni formulate nella letteratura (24), e i risultati dei controlli negativi ottenuti in questi esperimenti devono essere coerenti con i dati di controllo negativi pubblicati.

Eventuali modifiche apportate al protocollo sperimentale devono essere considerate in base alle loro ripercussioni sulla coerenza fra i nuovi dati e le esistenti banche dati di controlli storici del laboratorio. Solo le incongruenze significative dovrebbero portare alla creazione di una nuova banca dati di controlli storici, se il parere di un esperto stabilisce che vi è una differenza rispetto alla distribuzione precedente (cfr. il paragrafo 15). Durante la costituzione di questa nuova banca dati, il laboratorio non ha necessariamente bisogno di una banca dati completa di controlli negativi per permettere lo svolgimento di una prova, a condizione che esso possa dimostrare che i valori dei controlli negativi paralleli rimangano coerenti con la precedente banca dati o con i dati corrispondenti pubblicati.

I dati sui controlli negativi devono riguardare l'incidenza degli eritrociti immaturi micronucleati in ogni animale. I controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % della distribuzione della banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio. Qualora i dati dei controlli negativi paralleli non rientrino nei limiti del controllo al 95 % possono essere accettabili per l'inserimento nella distribuzione dei controlli storici purché non siano outlier estremi e sia provato che il sistema di prova è “sotto controllo” (cfr. il paragrafo 15) e che non si sono verificati errori tecnici o umani.

DESCRIZIONE DEL METODO

Preparazione

Selezione delle specie animali

Di preferenza sono utilizzati individui adulti, giovani e in buona salute, provenienti da ceppi di animali da laboratorio. Si può ricorrere a topi, ratti, o ad altre specie idonee di mammiferi. Quando si utilizza il sangue periferico, occorre accertare che la rimozione splenica delle cellule micronucleate dalla circolazione non comprometta l'individuazione dei micronuclei indotti nelle specie selezionate. Questo è stato chiaramente dimostrato per il sangue periferico del topo e del ratto (2). L'utilizzazione di specie diverse dai ratti e dai topi deve essere scientificamente giustificata nella relazione. Se si ricorre a specie diverse dai roditori, viene raccomandato di integrare la misurazione dei micronuclei indotti dalle aberrazioni cromosomiche del midollo osseo in un'altra prova di tossicità pertinente.

Condizioni di stabulazione e alimentazione degli animali

Per i roditori, la temperatura dello stabulario deve essere mantenuta a 22 °C (± 3 °C). Idealmente l'umidità relativa deve essere del 50-60 %. Deve comunque essere come minino del 40 % e non deve preferibilmente superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti. L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d'oscurità. Per l'alimentazione, attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un'adeguata miscela della sostanza in esame, se somministrata per questa via. Se non ci si aspetta alcun comportamento aggressivo i roditori vanno alloggiati in piccoli gruppi (non più di cinque in ogni gabbia) dello stesso sesso e gruppo di trattamento, preferibilmente in gabbie a fondo pieno con adeguato arricchimento ambientale. Gli animali possono essere alloggiati individualmente solo se ciò è giustificato sotto il profilo scientifico.

Preparazione degli animali

Sono generalmente utilizzati animali adulti, giovani e sani (i roditori hanno idealmente un'età di 6-10 settimane all'inizio del trattamento, ma sono accettati anche animali di età un pÓ più avanzata), che vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. I singoli animali sono identificati univocamente applicando un metodo incruento e il meno possibile invasivo (cioè inanellamento, etichettatura, applicazione di un microchip o identificazione biometrica, evitando il taglio delle orecchie o la falangectomia) e devono essere acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Deve essere evitata ogni contaminazione incrociata fra il controllo positivo e la sostanza chimica in esame. All'inizio dello studio la variazione di peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio per ciascun sesso.

Preparazione delle dosi

Le sostanze solide in esame vanno sciolte o poste in sospensione in appropriati solventi o mezzi disperdenti o mescolate alla dieta o all'acqua da bere prima di essere somministrate agli animali. Le sostanze liquide possono essere somministrate direttamente o diluite prima del trattamento. In caso di esposizione per via inalatoria, le sostanze possono essere somministrate sotto forma di gas, vapore o aerosol solido o liquido, in funzione delle loro proprietà fisico-chimiche. Vanno usati preparati freschi della sostanza, a meno che i dati sulla stabilità dimostrino che la conservazione è accettabile e definiscano le adeguate condizioni di conservazione.

Condizioni sperimentali

Solvente/mezzo disperdente

Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici ai livelli di dose usati e non deve poter reagire chimicamente con la sostanza in esame. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Fra gli esempi di solventi/mezzi disperdenti compatibili e comunemente usati si possono menzionare l'acqua, la soluzione fisiologica, la soluzione di metilcellulosa, la soluzione di carbossimetilcellulosa sodica, l'olio di oliva e l'olio di mais. In mancanza di dati di controllo storici o pubblicati che dimostrino che un solvente/mezzo disperdente atipico prescelto non induce micronuclei o altri effetti nocivi, va effettuato uno studio iniziale per stabilire l'accettabilità del controllo del solvente/mezzo disperdente.

Controlli

Controlli positivi

Ogni prova deve generalmente includere un gruppo di animali trattati con una sostanza usata per i controlli positivi. Questa condizione può essere eliminata quando il laboratorio di prova ha dimostrato la sua competenza nello svolgimento della prova e ha stabilito l'intervallo dei controlli positivi storici. Quando manca un gruppo di controllo positivo parallelo, in ogni esperimento devono essere inclusi controlli del conteggio (vetrini fissati e non colorati o campioni di sospensione cellulare, se appropriato ai fini del metodo di conteggio). Questo può avvenire includendo nello studio campioni di riferimento idonei ottenuti e conservati in occasione di un esperimento separato di controllo positivo svolto periodicamente (ad es. ogni 6-18 mesi); ad esempio, durante la verifica della competenze e successivamente, se necessario, su base periodica.

Le sostanze chimiche per i controlli positivi devono portare, in modo affidabile, a un aumento individuabile della frequenza dei micronuclei al di là del livello spontaneo. Quando si ricorre al conteggio manuale al microscopio, le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente all'analista l'identità dei campioni codificati. È ammissibile che le sostanze per i controlli positivi siano somministrate per una via diversa da quella della sostanza chimica in esame, usando un programma di trattamento diverso, e che il campionamento avvenga in un unico momento. È anche ammissibile, se appropriato, l'uso per i controlli positivi di sostanze di una classe chimica correlata. Nella tabella 1 figurano esempi di sostanze chimiche per i controlli positivi.

Tabella 1.

Esempi di sostanze chimiche per i controlli positivi.

Sostanze chimiche e CASRN

Metansolfonato di etile [CASRN 62-50-0]

Metansolfonato di metile [CASRN 66-27-3]

Etilnitrosourea [CASRN 759-73-9]

Mitomicina C [CASRN 50-07-7]

Ciclofosfamide (monoidrato) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietilenmelammina [CASRN 51-18-3]

Colchicina [CASRN 64-86-8] o vinblastina [CASRN 865-21-4] — come aneugeni

Controlli negativi

In ogni fase del campionamento devono essere inclusi animali del gruppo di controllo negativo, che sono gestiti nello stesso modo dei gruppi di trattamento, ma a cui non viene somministrata la sostanza chimica in esame. Se per la somministrazione della sostanza in esame si usa un solvente / mezzo disperdente, anche il gruppo di controllo deve riceverlo. Tuttavia, se da dati dei controlli negativi storici risulta una variabilità intraspecifica e una frequenza delle cellule con micronuclei coerente ad ogni fase del campionamento per il laboratorio di prova, può essere sufficiente un solo campionamento per il controllo negativo. In tal caso, esso deve avvenire al momento del primo campionamento effettuato nell'ambito dello studio.

Se viene usato sangue periferico, un campione prelevato prima del trattamento può essere accettato al posto del controllo negativo parallelo per gli studi di breve durata, qualora i dati ottenuti siano coerenti con la banca dei dati di controllo storici del laboratorio di prova. Per i ratti è stato dimostrato che il campionamento pre-trattamento di piccoli volumi (ad es. < 100 μl/al giorno) ha un impatto minimo sulla frequenza di fondo dei micronuclei (25).

PROCEDURA

Numero e sesso degli animali

In generale, la risposta dei micronuclei è simile nei maschi e nelle femmine degli animali, e, pertanto, la maggior parte degli studi potrebbe pertanto venire effettuata sull'uno o sull'altro sesso (26). L'esistenza di dati che dimostrano differenze rilevanti fra i maschi e le femmine (ad es. differenze riguardanti la tossicità sistemica, il metabolismo, la biodisponibilità, la tossicità del midollo osseo, ecc., incluso ad es. in un range-finding test) incoraggerebbero l'uso di entrambi i sessi. Nella fattispecie potrebbe essere appropriato effettuare uno studio su entrambi i sessi, ad es. come parte di uno studio di tossicità a dose ripetuta. Nel caso si effettuino prove su entrambi i sessi potrebbe essere adeguato ricorrere al metodo fattoriale. Nell'Appendice 2 figurano precisazioni sulle modalità di analisi dei dati in base a tale metodo.

All'inizio dello studio, la dimensione stabilita del gruppo deve consentire di disporre, in ogni gruppo, di almeno 5 animali analizzabili dello stesso sesso, o di ogni sesso se sono usati entrambi. Se l'esposizione umana a sostanze chimiche è specifica per un sesso, ad esempio nel caso di alcuni prodotti farmaceutici, il test deve essere eseguito su animali di tale sesso. A titolo di orientamento sul numero massimo di animali tipicamente necessario, uno studio sul midollo osseo effettuato conformemente ai parametri stabiliti al paragrafo 37, con tre gruppi di trattamento e controlli negativi e positivi paralleli (ogni gruppo composto da cinque animali dello stesso sesso), richiederebbe fra i 25 e i 35 animali.

Livelli di dose

Se viene effettuato uno studio preliminare di range-finding poiché non sono già disponibili dati appropriati per orientare la scelta delle dosi, tale studio deve essere svolto nello stesso laboratorio, usando specie, ceppi, sesso e un regime di trattamento identici a quelli che saranno utilizzati nello studio principale (27). Lo studio preliminare serve a individuare la dose massima tollerata (MTD), definita come la dose più alta che sarà tollerata per la durata della prova senza che appaia una tossicità che limita lo studio (inducendo ad esempio un calo del peso corporeo o citotossicità del sistema emopoietico, ma senza provocare morte o segni di dolore, sofferenza o stress che rendano necessaria una soppressione incruenta (28)).

La dose massima può essere definita anche come la dose che produce tossicità nel midollo osseo (ad es. una diminuzione della proporzione di eritrociti immaturi rispetto al numero totale di eritrociti nel midollo osseo o nel sangue periferico di più del 50 %, ma senza che questa proporzione si riduca a meno del 20 % del valore di controllo). Tuttavia, dall'analisi delle cellule con reazione positiva al CD71 nella circolazione sanguigna periferica (con citometria a flusso), emerge che questa frazione di eritrociti immaturi molto giovani risponde alle sostanze tossiche più rapidamente della più ampia schiera di eritrociti immaturi positivi all'RNA. Pertanto, può apparire una tossicità apparente maggiore in caso di sperimentazioni che prevedono un'esposizione acuta seguita dall'esame della frazione di eritrociti immaturi positivi al CD71 rispetto alle metodologie che individuano gli eritrociti immaturi sulla base del contenuto di RNA. Per questa ragione, quando l'esperimento prevede cinque o meno giorni di trattamento, il livello di dose più elevato, e tossico, della sostanza chimica in esame può essere definito come la dose che provoca una riduzione statisticamente significativa della proporzione degli eritrociti immaturi positivi al CD71 rispetto al numero totale di eritrociti, senza che questa proporzione scenda al di sotto del 5 % del valore di controllo (29).

Le sostanze chimiche che comportano saturazione delle caratteristiche tossicocinetiche o che inducono processi di detossificazione che possono portare a una diminuzione dell'esposizione dopo una somministrazione a lungo termine possono essere considerate eccezioni rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso.

Per ottenere informazioni sulla relazione dose-risposta, uno studio completo deve includere un gruppo di controllo negativo e almeno tre livelli di dose, generalmente separati da un fattore 2, ma non più di 4. Se la sostanza chimica in esame non provoca alcuna tossicità nell'ambito di un test di range-finding o secondo quanto emerge dai dati esistenti, la dose massima per periodo di somministrazione di 14 giorni o più deve essere di 1 000 mg/kg di peso corporeo al giorno o, per periodi di somministrazione di meno di 14 giorni, di 2 000 mg/kg di peso corporeo al giorno. Se la sostanza chimica in esame provoca invece tossicità, la MTD deve corrispondere alla dose più elevata somministrata, e i livelli di dose utilizzati devono essere compresi in un intervallo che va dalla tossicità massima a una tossicità modica o assente. Quando una tossicità del tessuto bersaglio (midollo osseo) è osservata a tutti i livelli di dose di prova, è consigliabile un ulteriore studio con dosi non tossiche. Gli studi volti a descrivere più pienamente le informazioni quantitative sulla relazione dose-risposta possono richiedere gruppi di trattamento supplementari. Per certi tipi di sostanze chimiche in esame (ad es. medicinali per uso umano) per le quali valgono specifici requisiti, i limiti possono variare.

Prova limite

Se gli esperimenti per determinare gli intervalli di dose o i dati disponibili relativi ai ceppi di animali affini indicano che un trattamento uguale o superiore alla dose limite (sotto descritta) non produce effetti tossici osservabili (comprese nessuna depressione della funzione del midollo osseo o altre manifestazioni di citotossicità del tessuto bersaglio), e se non si prevede genotossicità sulla base degli studi di genotossicità in vitro o dei dati relativi alle sostanze chimiche strutturalmente affini, uno studio completo con tre livelli di dose può non essere considerato necessario, purché sia stato dimostrato che la sostanza o le sostanze chimiche in esame raggiungono il tessuto bersaglio (midollo osseo). In tali casi può essere sufficiente un solo livello di dose, corrispondente alla dose limite. Quando la somministrazione avviene per 14 giorni o più, la dose limite è 1 000 mg/kg di peso corporeo al giorno. Per periodi di somministrazione di meno di 14 giorni, la dose limite è 2 000 mg/kg/ di peso corporeo al giorno.

Somministrazione delle dosi

Nella concezione di un saggio va considerata la via d'esposizione umana prevista. Pertanto possono essere scelti, se giustificati, vie di somministrazione quali l'alimentazione, l'acqua potabile, la via sottocutanea locale, la via endovenosa, la via orale (sonda gastrica), inalatoria, intratracheale, o l'impianto. In ogni caso, deve essere scelta la via che garantisce un'adeguata esposizione del o dei tessuti bersaglio. L'iniezione intraperitoneale non è generalmente raccomandata in quanto non si tratta di una via di esposizione umana prevista, e va utilizzata solo con una specifica giustificazione scientifica. Se la sostanza chimica in esame è miscelata nell'alimentazione o nell'acqua occorre fare attenzione, specialmente nei casi di dosaggio singolo, che il lasso di tempo fra l'assunzione del cibo e dell'acqua e il campionamento sia sufficiente per consentire l'individuazione degli effetti (cfr. il paragrafo 37). Il volume massimo di liquido somministrabile in un'unica volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'animale da laboratorio. Esso non deve generalmente essere superiore a 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere somministrate in quantità pari a massimo 2 ml/100 g di peso corporeo. L'uso di volumi maggiori deve essere giustificato. Salvo nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l'aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da garantire la somministrazione di un volume costante in relazione al peso corporeo per tutti i livelli di dose.

Programma di trattamento

Sono di preferenza effettuati 2 o più trattamenti, somministrati a intervalli di 24 ore, specialmente quando la prova viene integrata in altri studi di tossicità. Alternativamente, possono essere somministrati trattamenti singoli, se ciò è giustificato sul piano scientifico (ad es. qualora sia noto che le sostanze chimiche in esame bloccano il ciclo cellulare). Le sostanze chimiche in esame possono anche essere somministrate in prese frazionate, cioè due prese nello stesso giorno a distanza di qualche ora al massimo, per agevolare la somministrazione di un grosso volume. In queste situazioni, o in caso di somministrazione della sostanza chimica in esame per inalazione, il momento del campionamento deve essere programmato in base al momento di somministrazione dell'ultima dose o della fine dell'esposizione.

La prova può essere realizzata su topi o su ratti in uno dei tre seguenti modi:

Qualora ciò sia pertinente e scientificamente giustificato, e per facilitare l'integrazione con altri test di tossicità, possono essere utilizzati altri regimi di dosaggio o di campionamento.

Osservazioni

Gli animali da laboratorio devono essere oggetto di osservazioni cliniche generali e i segni clinici devono essere registrati almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa o alle stesse ore e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Almeno due volte al giorno, durante il periodo di somministrazione, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità. Tutti gli animali devono essere pesati all'inizio della prova, almeno una volta alla settimana nel corso degli studi a dosi ripetute, e al momento della soppressione incruenta. Nelle prove la cui durata è di almeno una settimana, la misurazione del consumo di cibo va eseguita almeno con cadenza settimanale. Se la sostanza in esame viene somministrata con l'acqua, il consumo di acqua va misurato ad ogni cambio dell'acqua e almeno una volta alla settimana. Gli animali che manifestano segni di eccessiva, ma non letale, tossicità vanno soppressi in modo incruento prima della fine del periodo di saggio (28). In certe circostanze può essere controllata la temperatura corporea degli animali, poiché un'iper- o ipotermia indotta dal trattamento può falsare i risultati (32) (33) (34).

Esposizione del tessuto bersaglio

Ove ciò sia giustificato e non esistano altri dati sull'esposizione (cfr. il paragrafo 48), al o ai momenti idonei va prelevato un campione di sangue per esaminare i livelli delle sostanze chimiche in esame nel plasma, allo scopo di dimostrare l'avvenuta esposizione del midollo osseo).

Preparazione del midollo osseo / del sangue

Le cellule del midollo osseo vengono di solito prelevate dal femore o dalla tibia degli animali immediatamente dopo la soppressione incruenta. Generalmente le cellule sono prelevate, preparate e colorate secondo metodi prestabiliti. Conformemente alle norme pertinenti sul benessere degli animali possono essere ottenute piccole quantità di sangue periferico usando un metodo che permetta la sopravvivenza della cavia (come il prelievo dalla vena caudale o da altro vaso sanguigno adeguato), oppure tramite puntura cardiaca o prelievo da un vaso sanguigno principale dopo la soppressione incruenta. Sia per gli eritrociti ottenuti dal midollo osseo che per quelli ottenuti dal sangue periferico, a seconda del metodo di analisi, le cellule possono venire immediatamente sottoposte a un processo di colorazione sopravitale (16) (17) (18), vengono preparati strisci che sono poi colorati per l'analisi al microscopio, o fissati e opportunamente colorati per l'analisi citometrica a flusso. L'uso di un colorante specifico per il DNA [ad esempio, arancio di acridina (35) o Hoechst 33258 più pironina-Y (36)] può eliminare alcuni degli artefatti dovuti all'uso di un colorante non specifico per il DNA. Ciò non esclude l'uso di coloranti convenzionali (per esempio Giemsa per l'analisi microscopica). Si possono usare anche altri sistemi [per esempio colonne di cellulosa per la rimozione delle cellule nucleate (37) (38)], se ne è dimostrata la compatibilità con la preparazione dei campioni in laboratorio.

Qualora questi metodi siano applicabili, per individuare la natura dei micronuclei (cromosoma/frammento cromosomico) possono essere usati anticorpi anticinetocore (39), FISH con sonde di DNA pancentromerico (40), o marcatura in situ mediante primer specifici per DNA pancentromerico, unitamente a un'adeguata colorazione del DNA (41), per stabilire se il meccanismo di induzione di micronuclei è dovuto a un'attività clastogenica e/o aneugenica. Possono infine essere usati altri metodi per distinguere i clastogeni dagli aneugeni, purché sia stata dimostrata la loro efficacia.

Analisi (manuale e automatizzata)

Tutti i vetrini o i campioni per l'analisi, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima di ogni tipo di analisi, e devono essere randomizzati in modo che l'analista manuale non conosca le condizioni del trattamento; questa codificazione non è necessaria quando si usano sistemi di conteggio automatizzato che non si basano sull'esame visivo e non possono essere influenzati dall'operatore. Per ogni animale, la percentuale di eritrociti immaturi rispetto agli eritrociti totali (immaturi + maturi) è determinata contando un totale di almeno 500 eritrociti per il midollo osseo e 2 000 eritrociti per il sangue periferico (42). Per determinare l'incidenza degli eritrociti immaturi micronucleati devono essere esaminati almeno 4 000 eritrociti immaturi per animale (43). Se la banca dati dei controlli negativi storici indica che la frequenza di fondo media degli eritrociti immaturi micronucleati nel laboratorio di prova è <0,1 %, occorre prendere in considerazione l'opportunità di esaminare cellule supplementari. Quando si analizzano i campioni, la percentuale di eritrociti immaturi rispetto al numero totale di eritrociti negli animali trattati non deve essere inferiore al 20 % della proporzione verificata nel gruppo di controllo mezzo disperdente/solvente con l'analisi microscopica, e non deve essere inferiore al 5 % circa della proporzione verificata nel gruppo di controllo mezzo disperdente/solvente con l'analisi citometrica e il conteggio degli eritrociti immaturi positivi al CD71+ (cfr. il paragrafo 31) (29). Ad esempio, per un saggio su midollo osseo con esame al microscopio, se la percentuale di controllo degli eritrociti immaturi nel midollo osseo è del 50 %, il limite superiore di tossicità equivarrebbe al 10 % di eritrociti immaturi.

Poiché la milza del ratto blocca e distrugge gli eritrociti micronucleati, per mantenere un'alta sensibilità delle analisi per l'esame del sangue periferico del ratto è preferibile limitare l'analisi degli eritrociti immaturi micronucleati alla frazione più giovane. Quando si utilizzano metodi di analisi automatizzata, questi eritrociti più immaturi possono essere individuati in base al loro contenuto elevato di RNA, o all'alto livello di recettori della transferrina (CD71+) espressi sulla loro superficie (31). Tuttavia, il raffronto diretto di vari metodi di colorazione ha mostrato che possono essere ottenuti risultati soddisfacenti con varie metodologie, compresa la colorazione classica con arancio di acridina (3) (4).

DATI E RELAZIONE

Trattamento dei risultati

I dati relativi a ciascun animale vanno presentati sotto forma di tabella. Il numero degli eritrociti immaturi e degli eritrociti immaturi con micronuclei, nonché la percentuale degli eritrociti immaturi sul totale degli eritrociti, devono essere elencati separatamente per ciascun animale. Quando i topi sono trattati per 4 settimane o più, devono essere anche forniti, se raccolti, i dati sul numero e la percentuale degli eritrociti maturi micronucleati. Nella relazione devono anche figurare i dati riguardanti la tossicità animale e i segni clinici.

Criteri di accettabilità

L'accettabilità delle prove si basa sui seguenti criteri:

Valutazione e interpretazione dei risultati

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente positiva se:

Se in un particolare momento del campionamento viene esaminata solo la dose massima, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente positiva se vi è un aumento statisticamente significativo rispetto al controllo negativo parallelo, e i risultati sono al di fuori della distribuzione dei dati di controllo negativi storici (ad es. limiti del controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson). Raccomandazioni relative agli appropriati metodi statistici figurano nella letteratura (44) (45) (46) (47). Quando si effettua un'analisi della relazione dose-risposta, devono essere analizzati almeno tre gruppi di trattamento trattati. Nei test statistici l'unità sperimentale deve essere l'animale. L'ottenimento di risultati positivi nel test del micronucleo indica che la sostanza chimica in esame induce la formazione di micronuclei, che sono il risultato di danni cromosomici o danni all'apparato mitotico degli eritroblasti nelle specie in esame. Nel caso in cui sia stata effettuata una prova per individuare i centromeri nei micronuclei, una sostanza chimica in esame che produca micronuclei contenenti centromeri (DNA centromerico o cinetocore, indicativi di un'intera perdita cromosomica) è da considerarsi aneugenica.

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente negativa se in tutte le condizioni sperimentali esaminate:

Raccomandazioni relative ai metodi statistici più appropriati figurano nella letteratura (44) (45) (46) (47). L'esposizione del midollo osseo alla sostanza chimica in esame può essere dimostrata, ad esempio, da un calo del rapporto fra eritrociti immaturi e maturi, o dalla misurazione del livello delle sostanze in esame nel plasma o nel sangue In caso di somministrazione per via endovenosa, la prova dell'esposizione non è necessaria. In alternativa, l'esposizione del midollo osseo può essere dimostrata ricorrendo ai dati ADME, ottenuti nell'ambito di uno studio indipendente usando la stessa via di somministrazione e le stesse specie. L'ottenimento di risultati negativi indica che, nelle condizioni di prova, la sostanza chimica in esame non induce la formazione di micronuclei negli eritrociti immaturi delle specie utilizzate.

Non è necessario verificare una risposta chiaramente positiva o chiaramente negativa.

Nei casi in cui la risposta non sia chiaramente negativa né chiaramente positiva, per poter stabilire la rilevanza biologica di un risultato (ad es. un aumento debole o marginale), i dati devono venire sottoposti al giudizio di esperti e/o a indagini più approfondite sugli esperimenti portati a termine. In alcuni casi può essere utile analizzare più cellule o ripetere l'esperienza in condizioni sperimentali modificate.

In rari casi, anche dopo ulteriori indagini, i dati non permetteranno di concludere se la sostanza chimica in esame produce risultati positivi o negativi, e lo studio dovrà pertanto essere dichiarato ambiguo.

Relazione sulla prova

La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti:

BIBLIOGRAFIA

6)

Nella parte B, il capitolo B.15. è soppresso.

7)

Nella parte B, il capitolo B.16. è soppresso.

8)

Nella parte B, il capitolo B.18. è soppresso.

9)

Nella parte B, il capitolo B.19. è soppresso.

10)

Nella parte B, il capitolo B.20. è soppresso.

11)

Nella parte B, il capitolo B.24. è soppresso.

12)

Nella parte B, il capitolo B.47. è sostituito dal seguente:

«B.47   Metodo di prova dell'opacità e della permeabilità della cornea nei bovini per l'identificazione di i) sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari e ii) sostanze chimiche che non richiedono classificazione per irritazione oculare o gravi lesioni oculari

INTRODUZIONE

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 437 (2013). Il metodo di prova dell'opacità e della permeabilità della cornea nei bovini (Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) è un metodo di prova valutato dal Comitato di coordinamento interagenzia per la convalida dei metodi alternativi (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM), in collaborazione con il Centro europeo per la convalida di metodi alternativi (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) e del corrispondente organismo del Giappone (Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) nel 2006 e nel 2010 (1) (2). Nella prima valutazione il metodo di prova BCOP è stato valutato per la sua utilità nell'identificare sostanze chimiche (sostanze e miscele) che inducono gravi lesioni oculari (1). Nella seconda valutazione il metodo di prova BCOP è stato valutato per la sua utilità nell'identificare sostanze chimiche (sostanze e miscele) non classificate che inducono irritazione oculare o gravi lesioni oculari (2). La banca dati di validazione del metodo BCOP conteneva complessivamente 113 sostanze e 100 miscele (2) (3). Tali valutazioni e i relativi esami inter pares hanno permesso di concludere che il metodo di prova può identificare correttamente le sostanze chimiche (sostanze e miscele) che inducono gravi lesioni oculari (categoria 1) nonché quelle che non richiedono classificazione per irritazione oculare o gravi lesioni oculari, secondo la definizione del Sistema generale armonizzato di classificazione e di etichettatura dei prodotti chimici delle Nazioni Unite (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals — UN GHS) (4) e del regolamento (CE) n. 1272/2008 relativo alla classificazione, all'etichettatura e all'imballaggio delle sostanze e delle miscele (CLP) (7) e la validità scientifica del metodo di prova è stata riconosciuta per entrambe le finalità. Per gravi lesioni oculari s'intendono lesioni dei tessuti oculari o un grave deterioramento della vista conseguente all'applicazione di una sostanza chimica in esame sulla superficie anteriore dell'occhio, non totalmente reversibili entro 21 giorni dall'applicazione. Le sostanze chimiche in esame che inducono gravi lesioni oculari sono classificate nella categoria UN GHS 1. Le sostanze chimiche non classificate in termini di irritazione oculare o gravi lesioni oculari sono definite come quelle sostanze che non soddisfano quanto prescritto per la classificazione nella categoria UN GHS 1 o 2 (2A o 2B), ovvero sono definite “senza categoria” da tale sistema. Il presente metodo di prova include l'uso raccomandato e le limitazioni del metodo di prova BCOP sulla base delle valutazioni ottenute. Le principali differenze fra la versione originale del 2009 e quella aggiornata nel 2013 della linea guida dell'OCSE riguardano fra l'altro: l'uso del metodo di prova BCOP per identificare le sostanze chimiche che non richiedono classificazione secondo il sistema GHS delle Nazioni Unite (paragrafi 2 e 7); chiarimenti circa l'applicabilità del metodo di prova BCOP per la prova di alcoli, chetoni e sostanze solide (paragrafi 6 e 7) e delle sostanze e delle miscele (paragrafo 8); chiarimenti sulle modalità di prova delle sostanze tensioattive e delle miscele contenenti tensioattivi (paragrafo 28); aggiornamenti e chiarimenti relativi ai controlli positivi (paragrafi 39 e 40); un aggiornamento dei criteri decisionali relativi al metodo di prova BCOP (paragrafo 47); un aggiornamento dei criteri di accettazione dello studio (paragrafo 48); un aggiornamento degli elementi della relazione sulla prova (paragrafo 49); un aggiornamento delle definizioni contenute nell'appendice 1; l'aggiunta dell'appendice 2 relativa alla capacità predittiva del metodo di prova BCOP secondo diversi sistemi di classificazione; un aggiornamento dell'appendice 3 relativa all'elenco delle sostanze chimiche per la verifica della prestazione; e un aggiornamento dell'appendice 4 relativa al supporto corneale per il metodo di prova BCOP (paragrafo 1) e all'opacimetro (paragrafi 2 e 3).

Attualmente è generalmente riconosciuto che nel prossimo futuro nessuna singola prova di irritazione oculare in vitro sarà in grado di sostituire il test di Draize in vivo per prevedere tutta la gamma di irritazione per diverse classi chimiche. Tuttavia combinazioni strategiche di diversi metodi alternativi nell'ambito di una strategia di prova (sequenziale) possono sostituire il test oculare di Draize (5). L'approccio top-down (5) è usato quando, in base alle informazioni esistenti, si prevede che una sostanza chimica abbia un elevato potenziale di irritazione, mentre l'approccio bottom-up (5) è usato quando, in base alle informazioni esistenti, si prevede che una sostanza chimica non causi un'irritazione oculare sufficiente da richiedere una classificazione. Il metodo di prova BCOP è un metodo di prova in vitro che può essere usato in alcune circostanze e con limitazioni specifiche per la classificazione dei rischi oculari e l'etichettatura delle sostanze chimiche. Anche se da solo non è considerato un valido sostituto del test in vivo sugli occhi dei conigli, il metodo di prova BCOP è raccomandato come fase iniziale nell'ambito di una strategia sperimentale, quale l'approccio top-down proposto da Scott et al. (5) per identificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari, ossia le sostanze chimiche da classificare nella categoria UN GHS 1, senza effettuare ulteriori prove (4). Il metodo di prova BCOP è altresì raccomandato per identificare le sostanze chimiche che non richiedono una classificazione per irritazione oculare o per gravi lesioni oculari, secondo la definizione del sistema GHS delle Nazioni Unite (“senza categoria” nel sistema UN GHS) (4) nell'ambito di una strategia di prova quale l'approccio bottom-up (5). Tuttavia, la classificazione definitiva di una sostanza chimica cui non si attribuisce la possibilità di causare gravi lesioni oculari o non classificata per irritazione oculare/gravi lesioni oculari con il metodo di prova BCOP richiederebbe prove supplementari (in vitro e/o in vivo).

Scopo di questo metodo di prova è descrivere le procedure impiegate per valutare il potenziale di pericolo per gli occhi di una sostanza chimica in esame sulla base della capacità di tale sostanza di indurre opacità e aumentare la permeabilità di una cornea isolata di bovino. Gli effetti tossici sulla cornea sono misurati attraverso: i) diminuzione della trasmissione della luce (opacità), e ii) aumento del passaggio del colorante a base di fluorosceina sodica (permeabilità). Le valutazioni di opacità e permeabilità della cornea successivamente all'esposizione a una sostanza chimica in esame vengono combinate per ottenere un punteggio di irritazione in vitro (In Vitro Irritancy Score — IVIS), utilizzato per classificare il livello di irritazione provocato dalla sostanza chimica in esame.

Le definizioni di questi parametri figurano nell'appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI

Questo metodo di prova è basato sul protocollo del metodo di prova ICCVAM BCOP (6) (7), in origine elaborato dalle informazioni ottenute dal protocollo dell'Institute for in vitro Sciences (IIVS) e dal protocollo INVITTOX 124 (8). Quest'ultimo rappresenta il protocollo usato nello studio di prevalidazione condotto negli anni 1997-1998 e finanziato dalla Comunità europea. Entrambi i protocolli erano basati sul metodo di prova BCOP inizialmente trattato da Gautheron et al. (9).

Il metodo di prova BCOP può essere usato per identificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari, secondo la definizione UN GHS, ossia le sostanze chimiche da classificare nella categoria UN GHS 1 (4). Se usato a tali fini, il metodo di prova BCOP presenta un'accuratezza complessiva del 79 % (150/191), una percentuale di falsi positivi del 25 % (32/126) e una percentuale di falsi negativi del 14 % (9/65), rispetto ai dati ottenuti con il test in vivo sugli occhi dei conigli classificati secondo il sistema di classificazione UN GHS (3) (cfr. appendice 2, tabella 1). Se le sostanze chimiche in esame nell'ambito di alcune classi chimiche (per es. alcoli, chetoni) o fisiche (per es. solidi) sono escluse dalla banca dati, il metodo di prova BCOP presenta un'accuratezza complessiva dell'85 % (111/131), una percentuale di falsi positivi del 20 % (16/81) e una percentuale di falsi negativi dell'8 % (4/50) secondo il sistema di classificazione UN GHS (3). Le lacune potenziali del metodo di prova BCOP quando è usato per identificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari (categoria UN GHS 1) sono basate sulle elevate percentuali di falsi positivi per gli alcoli e i chetoni nonché sulle elevate percentuali di falsi negativi per i solidi osservate nella banca dati di validazione (1)(2)(3). Tuttavia, poiché non tutti gli alcoli e i chetoni sono sovrastimati dal metodo di prova BCOP e alcuni sono stimati correttamente nella categoria UN GHS 1, questi due gruppi funzionali organici non sono considerati esterni all'ambito d'applicazione del metodo di prova. Spetta all'utilizzatore di questo metodo di prova decidere se un'eventuale sovrastima di un alcol o di un chetone possa essere accettata o se sia necessario effettuare prove supplementari con un metodo basato sul peso dell'evidenza. Per quanto attiene alle percentuali di falsi negativi per i solidi, è opportuno osservare che i solidi possono generare condizioni di esposizione variabili ed estreme nel test di Draize in vivo, il che può falsare il reale potenziale di irritazione (10). Va altresì osservato che nessuno dei falsi negativi identificati nella banca dati di validazione ICCVAM (2) (3), nell'ambito dell'identificazione delle sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari (categoria UN GHS 1), ha prodotto un risultato IVIS ≤ 3, ossia il criterio usato per identificare una sostanza chimica in esame come “senza categoria” nel sistema UN GHS. Inoltre, i falsi positivi BCOP in questo contesto non sono fondamentali poiché tutte le sostanze chimiche in esame che producono un risultato 3 ≤ IVIS ≤ 55 sarebbero successivamente sottoposte a prova con altri metodi in vitro adeguatamente validati o, in ultima ratio sui conigli, a seconda dei requisiti regolamentari, mediante una strategia di saggi sequenziali con un metodo basato sul peso dell'evidenza. Considerato che alcuni solidi chimici sono stimati correttamente con il metodo di prova BCOP come appartenenti alla categoria UN GHS 1, nemmeno tale stato fisico è ritenuto esterno all'ambito di applicazione del metodo di prova. Gli sperimentatori potrebbero prendere in considerazione il ricorso a tale metodo per tutti i tipi di sostanze chimiche, laddove un risultato IVIS > 55 dovrebbe essere accettato come indicativo di una risposta che induce gravi lesioni oculari tale da essere classificata nella categoria UN GHS 1, senza ulteriori prove. Come già precisato, i risultati positivi ottenuti con alcoli o chetoni andrebbero tuttavia interpretati con cautela, considerato il rischio di sovrastima.

Il metodo di prova BCOP può inoltre essere usato per identificare le sostanze chimiche che non richiedono una classificazione per irritazione oculare o per gravi lesioni oculari nell'ambito del sistema di classificazione UN GHS (4). Se usato a tali fini, il metodo di prova BCOP presenta un'accuratezza complessiva del 69 % (135/196), una percentuale di falsi positivi del 69 % (61/89) e una percentuale di falsi negativi dello 0 % (0/107), rispetto ai dati ottenuti con il test in vivo sugli occhi dei conigli classificati secondo il sistema di classificazione UN GHS (3) (cfr. appendice 2, tabella 2). La percentuale di falsi positivi ottenuta è notevolmente elevata (le sostanze chimiche “senza categoria” nel sistema UN GHS in vivo che producono un risultato IVIS > 3, cfr. paragrafo 47), ma in questo contesto non è fondamentale poiché tutte le sostanze chimiche in esame che producono un risultato 3 ≤ IVIS ≤ 55 sarebbero successivamente sottoposte a prova con altri metodi in vitro adeguatamente validati o, in ultima ratio sui conigli, a seconda dei requisiti regolamentari, mediante una strategia di saggi sequenziali con un metodo basato sul peso dell'evidenza. Il metodo di prova BCOP non mostra lacune specifiche per quanto riguarda le prove di alcoli, chetoni e solidi se il fine è identificare le sostanze chimiche che non richiedono classificazione per l'irritazione oculare o gravi lesioni oculari (“senza categoria” nel sistema UN GHS)(3). Gli sperimentatori potrebbero prendere in considerazione il ricorso a tale metodo di prova per tutti i tipi di sostanze chimiche, laddove un risultato negativo (IVIS ≤ 3) dovrebbe essere accettato come indicativo del fatto che non è necessaria alcuna classificazione (“senza categoria” nel sistema UN GHS). Poiché il metodo di prova BCOP può solo identificare correttamente il 31 % delle sostanze chimiche che non richiedono classificazione per irritazione oculare o gravi lesioni oculari, questo metodo di prova non dovrebbe costituire la prima scelta per avviare un approccio bottom-up (5), se sono disponibili altri metodi in vitro validati e accettati aventi un'analoga elevata sensibilità ma una maggiore specificità.

La banca dati di validazione del metodo BCOP conteneva complessivamente 113 sostanze e 100 miscele (2) (3). Il metodo di prova BCOP è pertanto ritenuto applicabile per le prove sia delle sostanze che delle miscele.

Il metodo di prova BCOP non è raccomandato per identificare le sostanze chimiche in esame da classificarsi come irritanti per gli occhi (categoria UN GHS 2 o 2A) o le sostanze chimiche in esame da classificarsi come moderatamente irritanti per gli occhi (categoria UN GHS 2B) a causa dell'elevato numero di sostanze chimiche appartenenti alla categoria UN GHS 1 sottoclassificate nelle categorie 2, 2A o 2B e di sostanze chimiche “senza categoria” nel sistema UN GHS sovraclassificate nelle categorie 2, 2A o 2B (2) (3). A tal fine possono essere necessarie ulteriori prove con un altro metodo adeguato.

Tutte le procedure che prevedono l'impiego di occhi e cornee di bovini devono osservare le regolamentazioni e le procedure in vigore nella struttura che effettua l'analisi relativamente alla gestione dei materiali di derivazione animale che comprendono, tra l'altro, i tessuti e i liquidi tessutali. È consigliabile adottare le comuni norme di cautela osservate nei laboratori (11).

Sebbene il metodo di prova BCOP non prenda in considerazione le lesioni della congiuntiva e dell'iride, esso riguarda gli effetti sulla cornea, che sono i principali fattori di classificazione in vivo nel sistema UN GHS. Il metodo di prova BCOP di per sé non consente di valutare la reversibilità delle lesioni corneali. Studi condotti sugli occhi dei conigli suggeriscono di esaminare la profondità iniziale di una lesione corneale per identificare alcuni tipi di effetti irreversibili (12). Tuttavia è necessario un approfondimento scientifico per comprendere in quale modo possano verificarsi effetti irreversibili non collegati all'elevato livello iniziale della lesione. Infine, il metodo di prova BCOP non consente di valutare il potenziale di tossicità sistemica associato all'esposizione attraverso l'occhio.

Infine, il metodo di prova BCOP sarà aggiornato con cadenza regolare, mano a mano che si disporrà di ulteriori dati e informazioni. A titolo di esempio, l'istopatologia presenta un'utilità potenziale nei casi in cui è necessaria una caratterizzazione più completa della lesione corneale. Come delineato nel documento orientativo dell'OCSE “OECD Guidance Document n. 160” (13), gli utilizzatori sono invitati a conservare le cornee e a preparare campioni istopatologici che possono servire a elaborare una banca dati e criteri decisionali in grado di migliorare ulteriormente l'accuratezza di questo metodo di prova.

Ai laboratori che ricorrono a questo tipo di metodo di prova per la prima volta si consiglia di utilizzare le sostanze chimiche di riferimento indicate nell'appendice 3. Un laboratorio può utilizzare tali sostanze chimiche per dimostrare le proprie competenze tecniche nell'esecuzione del metodo di prova BCOP prima di presentare i dati del metodo di prova BCOP a scopi regolamentari per la classificazione dei rischi.

PRINCIPIO DEL METODO

Il metodo di prova BCOP è un modello organotipico che mantiene a breve termine in vitro la normale funzionalità fisiologica e biochimica della cornea dei bovini. Questo metodo di prova è utilizzato per la valutazione dei danni prodotti dalla sostanza chimica in esame sulla base di misurazioni quantitative dei cambiamenti di opacità e permeabilità, effettuate rispettivamente con un opacimetro e uno spettrofotometro. Entrambe le misurazioni vengono impiegate per il calcolo del punteggio IVIS, utilizzato per assegnare una categoria di classificazione di pericolo di irritazione in vitro per la previsione del potenziale di irritazione oculare in vivo di una sostanza chimica in esame (cfr. criteri decisionali al paragrafo 48).

Il metodo di prova BCOP impiega cornee isolate da occhi di bovini appena macellati. L'opacità corneale si misura con la quantità di luce trasmessa attraverso la cornea. La permeabilità si misura con la quantità di colorante a base di fluoresceina sodica che attraversa l'intero spessore della cornea ed è rilevata nel mezzo della camera posteriore. Le sostanze chimiche in esame vengono applicate alla superficie epiteliale della cornea e mediante aggiunta nella camera anteriore del supporto corneale. L'appendice 4 riporta una descrizione e un diagramma del supporto corneale utilizzato per il metodo di prova BCOP. I supporti corneali possono essere acquistati sul mercato da diversi fornitori o possono essere costruiti.

Origine ed età degli occhi dei bovini e selezione delle specie animali

I bovini inviati ai macelli vengono di norma abbattuti per il consumo umano o altri usi commerciali. Le cornee utilizzate per il metodo di prova BCOP provengono esclusivamente da animali sani ritenuti idonei a essere immessi nella catena alimentare umana. Poiché i capi di bestiame sono di peso diverso a seconda della razza, dell'età e del sesso, non vi sono raccomandazioni relative al peso dell'animale al momento della macellazione.

L'impiego di animali di età diversa può comportare variazioni nelle dimensioni della cornea. Le cornee di diametro orizzontale > 30,5 mm e spessore corneale centrale (central corneal thickness — CCT) ≥ 1 100 μm si ottengono di norma da bovini di età superiore a otto anni, mentre le cornee che presentano un diametro orizzontale < 28,5 mm e un valore di CCT < 900 μm derivano solitamente da capi di bestiame di età inferiore a cinque anni (14). Per questo motivo non si utilizzano di norma occhi di bovini di età superiore a 60 mesi. Gli occhi dei bovini di età inferiore a 12 mesi di norma non sono impiegati, in quanto sono ancora in fase di sviluppo e i valori relativi allo spessore e al diametro della cornea sono notevolmente inferiori rispetto ai corrispondenti parametri rilevati nei bovini adulti. L'impiego di cornee di animali giovani (ovvero di età compresa fra 6 e 12 mesi) è tuttavia ammesso in quanto comporta alcuni vantaggi, quali la maggiore disponibilità, la limitata fascia di età e la riduzione dei rischi legati alla potenziale esposizione del lavoratore all'encefalopatia spongiforme bovina (15). Sarebbe utile valutare ulteriormente gli effetti delle dimensioni o dello spessore corneali sulla capacità di reazione a sostanze chimiche corrosive e irritanti, pertanto si raccomanda agli utilizzatori di indicare la stima dell'età e/o del peso degli animali da cui provengono le cornee utilizzate in uno studio.

Prelievo e trasporto degli occhi in laboratorio

Gli occhi sono prelevati dai dipendenti del mattatoio. Per minimizzare i danni meccanici e di altro tipo agli occhi, questi dovrebbero essere enucleati non appena possibile dopo la morte e raffreddati immediatamente dopo l'enucleazione e durante il trasporto. Durante il risciacquo della testa dell'animale è necessario che i dipendenti del mattatoio non facciano uso di detergenti al fine di evitare l'esposizione degli occhi a sostanze chimiche potenzialmente irritanti.

Gli occhi vanno immersi completamente nella soluzione salina bilanciata di Hank raffreddata (Hank's Balanced Salt Solution, HBBS) in un contenitore di dimensioni adeguate e trasportati in laboratorio in modo da ridurre al minimo il relativo deterioramento e/o la contaminazione batterica. Gli occhi sono prelevati durante il processo di macellazione e potrebbero pertanto essere esposti al sangue o ad altri materiali biologici, compresi batteri e microorganismi di altra natura. Per questo motivo è importante assicurare che il rischio di contaminazione sia ridotto al minimo (per es. tenendo il contenitore degli occhi in ghiaccio durante la raccolta e il trasporto e aggiungendo antibiotici alla soluzione HBSS utilizzata per conservare gli occhi durante il trasporto [per es. penicillina a 100 IU/ml e streptomicina a 100 μg/ml]).

È consigliabile ridurre al minimo l'intervallo temporale che intercorre fra il prelievo degli occhi e l'utilizzo delle cornee per il metodo di prova BCOP (idealmente, gli occhi andrebbero raccolti e utilizzati nell'arco della stessa giornata) e accertare che tale intervallo non pregiudichi i risultati del saggio. I risultati in questione si basano sui criteri di selezione degli occhi e sulle reazioni dei controlli positivi e negativi. Si suggerisce di utilizzare per il saggio occhi dello stesso gruppo di prelievo, ottenuti nella medesima giornata.

Criteri di selezione egli occhi usati nel metodo di prova BCOP

Giunti in laboratorio, gli occhi sono sottoposti a un attento esame volto a evidenziare la presenza di eventuali difetti, quali per es. aumento dell'opacità, graffi e neovascolarizzazione. Possono essere utilizzate solamente cornee provenienti da occhi privi di tali difetti.

La qualità di ciascuna cornea è valutata anche durante le fasi successive del saggio. Vanno scartate le cornee che, dopo un periodo iniziale di un'ora per ristabilire l'equilibrio, presentano un valore di opacità superiore a sette unità o equivalente per l'opacimetro e per i supporti corneali (NOTA: l'opacimetro va tarato su valori di opacità standard impiegati per definire le unità di opacità, cfr. appendice 4).

Ciascun gruppo di trattamento (sostanza chimica in esame, controlli negativi e positivi paralleli) consiste di un minimo di tre occhi. Tre cornee dovrebbero essere utilizzate per le cornee di controllo negativo nel metodo di prova BCOP. Poiché tutte le cornee sono tagliate dal bulbo intero e montate nelle camere corneali, vi è il rischio che maneggiando tali dispositivi vengano alterati i valori di opacità e permeabilità (compresi i controlli negativi). Inoltre, i valori di opacità e permeabilità delle cornee di controllo negativo sono utilizzati per correggere i valori di opacità e permeabilità corneali relativi alla sostanza chimica in esame e al controllo positivo nei calcoli IVIS.

PROCEDURA

Preparazione degli occhi

Le cornee prive di difetti sono dissezionate lasciando un bordo di 2-3 mm di sclera per permettere di maneggiarle più agevolmente in seguito e facendo attenzione a non danneggiare l'epitelio e l'endotelio corneale. Le cornee così separate sono montate in appositi supporti corneali composti da una sezione anteriore e una posteriore, che si interfacciano rispettivamente con i lati epiteliale ed endoteliale della cornea. Entrambe le camere sono riempite fino all'orlo con mezzo minimo essenziale di Eagle (EMEM) preriscaldato privo di fenolo rosso, riempiendo per prima la camera posteriore e facendo attenzione a evitare la formazione di bolle. L'apparecchio è poi equilibrato a 32 (± 1) °C per almeno un'ora per consentire alle cornee di equilibrarsi con il mezzo e raggiungere per quanto possibile la normale attività metabolica (la temperatura approssimativa della superficie corneale in vivo è di 32 °C).

Dopo il periodo di equilibratura si aggiunge il mezzo EMEM fresco preriscaldato privo di fenolo rosso in entrambe le camere e si rilevano i valori base di opacità per ciascuna cornea. Sono scartate le cornee che presentano lesioni macroscopiche dei tessuti (per es. graffi, pigmentazione, neovascolarizzazione) o un'opacità superiore a sette unità di opacità o equivalente per l'opacimetro. Almeno tre cornee sono selezionate come cornee di controllo negativo (o del solvente). Le cornee restanti sono poi allocate al gruppo di trattamento e al gruppo dei controlli positivi.

La capacità termica dell'acqua è più elevata di quella dell'aria, di conseguenza l'acqua offre condizioni di temperatura più stabili per l'incubazione. Si suggerisce pertanto di utilizzare un bagno ad acqua per mantenere il supporto corneale e il relativo contenuto a una temperatura pari a 32 (± 1) °C. Si possono comunque utilizzare anche incubatori ad aria, a condizione che si adottino le necessarie cautele per il mantenimento di condizioni di temperatura stabili (per es. preriscaldando i supporti e il mezzo in essi contenuto).

Applicazione della sostanza chimica in esame

Si seguono due diversi protocolli di trattamento, uno per i liquidi e i tensioattivi (solidi o liquidi) e uno per i solidi non tensioattivi.

I liquidi sono analizzati non diluiti. Le sostanze semisolide, le creme e le cere sono di norma analizzate come liquidi. La prova sui tensioattivi non diluiti è eseguita a una concentrazione del 10 % p/v in una soluzione composta da cloruro di sodio allo 0,9 %, acqua distillata o altro solvente che abbia dimostrato di non avere ripercussioni negative sul sistema di prova. L'impiego di diluizioni diverse deve essere opportunamente motivato. Le miscele contenenti tensioattivi possono essere sottoposte a prova non diluite o diluite in opportuna concentrazione secondo il pertinente scenario di esposizione in vivo. Le concentrazioni di prova devono essere opportunamente motivate. Le cornee sono esposte ai liquidi e ai tensioattivi per 10 minuti. La scelta di altri tempi di esposizione va accompagnata da adeguate motivazioni scientifiche. Cfr. appendice 1 per una definizione di tensioattivo e di miscela contenente tensioattivi.

I solidi non tensioattivi sono di norma analizzati sotto forma di soluzioni o sospensioni a una concentrazione del 20 % p/v, in una soluzione composta da cloruro di sodio allo 0,9 %, acqua distillata o altro solvente, che abbia dimostrato di non avere ripercussioni negative sul sistema di prova. In determinate circostanze e con opportune giustificazioni scientifiche i solidi possono anche essere analizzati non diluiti e applicati direttamente sulla superficie della cornea utilizzando il metodo della camera aperta (cfr. paragrafo 32). Le cornee sono esposte ai solidi per quattro ore, mentre in caso di applicazione di liquidi e tensioattivi è possibile scegliere tempi di esposizione alternativi a condizione che vengano fornite opportune motivazioni scientifiche.

A seconda della natura fisica e delle caratteristiche chimiche della sostanza chimica in esame (per es. solidi, liquidi, liquidi viscosi o liquidi non viscosi) possono essere adottati diversi metodi di trattamento. La criticità sta nel garantire che la sostanza chimica in esame copra adeguatamente la superficie epiteliale e che venga correttamente rimossa durante il risciacquo. Il metodo della camera chiusa è di norma impiegato per sostanze chimiche in esame liquide da non viscose a leggermente viscose, mentre il metodo della camera aperta si utilizza di regola per sostanze chimiche in esame liquide da semiviscose a viscose e per solidi non diluiti.

Il metodo della camera chiusa prevede l'introduzione nella camera anteriore di una sostanza chimica in esame in quantità sufficiente (750 μl) a coprire il lato epiteliale della cornea attraverso i fori di dosaggio posti sulla superficie superiore della camera. I fori sono successivamente sigillati con tappi durante l'esposizione. È importante assicurare che ciascuna cornea sia esposta alla sostanza chimica in esame per l'intervallo di tempo necessario.

Nel metodo della camera aperta, prima di eseguire il trattamento, occorre rimuovere dalla camera anteriore l'anello di chiusura della finestra e la finestra in vetro. La sostanza di controllo o in esame (750 μl o una quantità della sostanza chimica in esame sufficiente a coprire interamente la cornea) è applicata direttamente alla superficie epiteliale della cornea con una micropipetta. Se è difficile usare la pipetta per una sostanza chimica in esame, questa può essere caricata a pressione in una pipetta a spostamento positivo per agevolare il dosaggio. Il puntale di una pipetta a spostamento positivo è inserito nel puntale di erogazione della siringa al fine di caricare sotto pressione il materiale nel puntale di spostamento. Contemporaneamente, lo stantuffo della siringa è premuto man mano che il pistone della pipetta è tirato verso l'alto. Se si formano bolle d'aria nel puntale della pipetta, occorre rimuovere (espellere) la sostanza chimica e ripetere il processo finché il puntale non sarà riempito senza che si creino bolle d'aria. È possibile all'occorrenza utilizzare una normale siringa (senza ago), poiché tale metodo consente la misurazione di un volume preciso di sostanza chimica in esame e facilita l'applicazione della sostanza alla superficie epiteliale della cornea. Dopo il dosaggio, la finestra è riposizionata sulla camera anteriore per ricreare un sistema chiuso.

Incubazione post-esposizione

Dopo il periodo di esposizione la sostanza chimica in esame, la sostanza chimica usata per il controllo negativo o la sostanza chimica per il controllo positivo è rimossa dalla camera anteriore e si lava l'epitelio almeno tre volte (o comunque fino a che non restino ulteriori tracce visibili della sostanza in esame) con EMEM (contenente rosso fenolo). Si utilizza per il risciacquo il mezzo contenente rosso fenolo, in quanto è possibile monitorare l'eventuale cambiamento di colore del rosso fenolo per determinare l'efficacia del risciacquo di sostanze chimiche acide o alcaline. Le cornee sono lavate più di tre volte nel caso in cui il rosso fenolo continui a scolorirsi, divenendo giallo o porpora, o se vi siano ancora tracce visibili della sostanza chimica in esame. Non appena la sostanza chimica in esame è stata completamente eliminata, le cornee sono sottoposte a un ultimo risciacquo con EMEM (senza rosso fenolo). Si impiega l'EMEM (senza rosso fenolo) per il risciacquo finale per assicurare che il rosso fenolo sia stato completamente rimosso dalla camera anteriore prima della misurazione dell'opacità. Si riempie la camera anteriore nuovamente con EMEM fresco senza rosso fenolo.

Per i liquidi o i tensioattivi, dopo il risciacquo le cornee restano in incubazione per ulteriori due ore a una temperatura di 32 (± 1) °C. Un periodo più lungo di post-esposizione può rivelarsi utile in determinate circostanze e va valutato caso per caso. Le cornee trattate con i solidi sono risciacquate accuratamente al termine delle quattro ore di esposizione, ma non richiedono un ulteriore periodo di incubazione.

Al termine del periodo di post-incubazione per i liquidi e i tensioattivi e delle quattro ore di esposizione per i solidi non tensioattivi si registrano i valori di opacità e permeabilità di ciascuna cornea. Inoltre, ogni cornea è sottoposta a esame visivo e si registrano altre osservazioni utili (per es. desquamazione dei tessuti, presenza di residui della sostanza chimica in esame, opacità non uniforme). Queste osservazioni potrebbero essere importanti in quanto possono determinare eventuali variazioni dei dati registrati con l'opacimetro.

Sostanze chimiche usate come controlli

Ogni prova deve includere controlli positivi o negativi (solvente o mezzo disperdente) paralleli.

Nelle prove con sostanze liquide al 100 % il metodo di prova BCOP comprende un controllo negativo parallelo (per es. soluzione di cloruro di sodio allo 0,9 % o acqua distillata) al fine di rilevare eventuali cambiamenti non specifici nel sistema sperimentale e offrire una base di riferimento per i risultati del saggio. La presenza del controllo garantisce inoltre che non si verifichino reazioni irritanti a causa delle condizioni del saggio.

Nelle prove con liquidi diluiti, tensioattivi o solidi, il metodo di prova BCOP comprende un gruppo di controllo (solvente o mezzo disperdente) parallelo al fine di rilevare eventuali cambiamenti non specifici nel sistema sperimentale e offrire una base di riferimento per i risultati del saggio. Può essere utilizzato solo un solvente/mezzo disperdente che abbia dimostrato di non influire negativamente sul sistema sperimentale.

Una sostanza chimica nota per indurre una risposta positiva è inclusa come controllo positivo parallelo in ogni esperimento per verificare l'integrità del sistema di prova e del suo corretto svolgimento. Tuttavia il grado dell'irritazione non deve essere eccessivo, per garantire la possibilità di valutare la variabilità della reazione dei controlli positivi nel tempo.

L'etanolo al 100 % o la dimetilformammide al 100 % sono esempi di controlli positivi di sostanze chimiche in esame liquide. Un esempio di controllo positivo per le sostanze chimiche in esame solide è l'imidazolo al 20 % p/v in una soluzione composta da cloruro di sodio allo 0,9 %.

Le sostanze chimiche di riferimento sono utili per valutare il potenziale di irritazione oculare di sostanze chimiche sconosciute appartenenti a determinate classi di sostanze chimiche o prodotti o per la valutazione del potenziale di irritazione relativo di una sostanza irritante per occhi nell'ambito di una serie specifica di reazioni irritanti.

Risultati misurati

L'opacità è determinata dalla quantità di luce trasmessa attraverso la cornea. L'opacità corneale è misurata quantitativamente per mezzo di un opacimetro, che consente di ottenere valori di opacità misurati su una scala continua.

La permeabilità è determinata dalla quantità di colorante a base di fluoresceina sodica che penetra negli strati cellulari della cornea (ovvero, l'epitelio sulla superficie esterna della cornea attraverso l'endotelio sulla superficie corneale interna). Si aggiunge 1 ml di soluzione di fluoresceina sodica (rispettivamente 4 o 5 mg/ml nella prova con sostanze liquide e tensioattivi o solidi non tensioattivi) alla camera anteriore del supporto corneale. Tale soluzione è a contatto con l'epitelio della cornea, mentre la camera posteriore, che è a contatto con il lato endoteliale della cornea, è riempita con EMEM fresco. Il supporto è poi messo in incubazione in posizione orizzontale per 90 (± 5) min a 32 (± 1) °C. La quantità di fluoresceina sodica che giunge alla camera posteriore è misurata attraverso la spettrofotometria UV/VIS. I dati spettrofotometrici rilevati a 490 nm sono registrati come valori di densità ottica (OD490) o assorbanza e misurati su una scala continua. I valori di permeabilità della fluoresceina sono determinati utilizzando valori OD490 a partire da uno spettrofotometro a luce visibile impostato su una lunghezza di percorso standard di 1 cm.

In alternativa è possibile usare un lettore di piastre da microtitolazione a 96 pozzetti, purché: i) sia possibile stabilire l'intervallo lineare del lettore per determinare i valori della fluoresceina OD490e ii), si usi il volume corretto di campioni di fluoresceina nella piastra a 96 pozzetti per risultare in valori OD490 equivalenti alla lunghezza standard del percorso di 1 cm (che potrebbe richiedere un pozzetto completamente riempito, di norma 360 μl).

DATI E RELAZIONE

Valutazione dei dati

Appena saranno stati corretti i valori di opacità e permeabilità media (OD490) con i valori dell'opacità di fondo e i valori di permeabilità OD490dei controlli negativi, i valori medi di opacità e permeabilità OD490 relativi a ciascun gruppo di trattamento saranno utilizzati nella seguente formula empirica per il calcolo del punteggio di irritazione in vitro (IVIS) per ciascun gruppo di trattamento:

IVIS = valore medio di opacità + (15 × valore medio di permeabilità OD490)

Sina et al. (16) precisano che questa formula è stata derivata durante studi interni e interlaboratorio. I dati generati per una serie di 36 composti nell'ambito di uno studio che ha coinvolto più laboratori sono stati oggetto di un'analisi multivariata per la determinazione dell'equazione più appropriata per la correlazione fra dati in vivo e in vitro. Gli scienziati di due diverse imprese hanno eseguito questa analisi e hanno derivato equazioni quasi identiche.

I valori di opacità e permeabilità dovrebbero essere valutati separatamente per determinare se una sostanza chimica in esame ha indotto corrosività o irritazione grave solo per uno dei due risultati (cfr. criteri decisionali).

Criteri decisionali

I valori limite IVIS per identificare le sostanze chimiche in esame come in grado di indurre gravi lesioni oculari (categoria UN GHS 1) e le sostanze chimiche in esame che non richiedono classificazione per l'irritazione oculare o per gravi lesioni oculari (“senza categoria” nel sistema UN GHS) sono elencati in appresso:

Criteri di accettazione dello studio

Una prova è considerata accettabile se il punteggio IVIS risultante dal controllo positivo rientra fra due deviazioni standard dalla media storica, che va aggiornata con cadenza almeno trimestrale o comunque ogni volta si effettui una prova accettabile in laboratori nei quali le prove sono svolte con scarsa frequenza (ovvero, meno di una volta al mese). Le reazioni dei controlli negativi o dei solventi/mezzi disperdenti dovrebbero corrispondere a valori di opacità e permeabilità inferiori ai limiti superiori stabiliti per i valori storici di opacità e permeabilità di cornee di bovini trattati con i relativi controlli negativi o solventi/mezzi disperdenti. Un singolo ciclo di prove costituito da almeno tre cornee dovrebbe essere sufficiente per una sostanza chimica in esame, se la classificazione che ne risulta è univoca. Tuttavia, nei casi in cui sussiste un margine di incertezza nel primo ciclo di prove, è opportuno prendere in considerazione un secondo ciclo di prove (non obbligatorio) nonché un terzo qualora emergessero risultati IVIS discordanti fra i primi due cicli di prova. In questo contesto, un risultato nel primo ciclo di prova è ritenuto incerto se le stime relative alle? tre cornee si sono rivelate divergenti, come:

Relazione sulla prova

La relazione sulla prova include le seguenti informazioni, se pertinenti alla conduzione dello studio:

BIBLIOGRAFIA

Appendice 4

SUPPORTO CORNEALE PER IL METODO DI PROVA BCOP

I supporti corneali impiegati per il test BCOP sono fatti di materiale inerte (per es. polipropilene). I supporti constano di due metà (una camera anteriore e una posteriore) e presentano due camere cilindriche interne simili. Ciascuna camera è progettata per contenere un volume di circa 5 ml e sfocia in una finestra di vetro, attraverso la quale sono registrate le misurazioni dell'opacità. Ciascuna camera interna ha un diametro di 1,7 cm ed è profonda 2,2 cm (11). Una guarnizione ad anello posta sulla camera posteriore serve a prevenire fuoriuscite. Le cornee sono posizionate dal lato dell'endotelio in basso sulla guarnizione ad anello delle camere posteriori, mentre le camere anteriori sono poste dal lato dell'epitelio delle cornee. Le camere sono mantenute in posizione da tre viti in acciaio inossidabile poste sui bordi esterni della camera. L'estremità di ciascuna camera presenta una finestra in vetro che può essere rimossa per facilitare l'accesso alla cornea. Una guarnizione ad anello è posizionata anche fra la finestra in vetro e la camera per prevenire fuoriuscite. Due aperture nella parte superiore di ciascuna camera consentono di introdurre ed estrarre il mezzo e le sostanze chimiche di prova. Le aperture sono chiuse con tappi di gomma durante le fasi di trattamento e incubazione. La trasmissione della luce attraverso i supporti corneali può modificarsi mano a mano che gli effetti dell'usura o dell'accumulo di specifici residui di materiale sui fori della camera interna o sulla finestra di vetro possono incidere sulla diffusione luminosa o sulla riflettanza. La conseguenza potrebbe constare in aumenti o diminuzioni della trasmissione luminosa di base (e quindi delle letture dell'opacità di base) attraverso i supporti corneali e può essere evidente se intervengono variazioni importanti delle misurazioni dell'opacità corneale iniziale previste nelle camere individuali (ossia i valori iniziali dell'opacità corneale in singoli specifici supporti corneali possono differire di norma di oltre 2 o 3 unità di opacità dai valori di base previsti). Ciascun laboratorio dovrebbe prendere in considerazione l'istituzione di un programma per valutare le modifiche della trasmissione luminosa attraverso i supporti corneali, secondo la natura dei tipi di sostanze chimiche sottoposte a prova e la frequenza di utilizzo delle camere. Per stabilire i valori di base, i supporti corneali possono essere ispezionati prima dell'uso consueto mediante misurazione dei valori di base dell'opacità (o della trasmissione luminosa) delle camere riempite con il mezzo completo, senza cornee. I supporti corneali sono quindi ispezionati con cadenza regolare per accertare le variazioni della trasmissione luminosa durante i periodi di uso. Ciascun laboratorio può stabilire la frequenza di controllo dei supporti corneali, in base ai tipi di chimica sottoposta a prova, alla frequenza d'uso e alle osservazioni delle variazioni dei valori di base dell'opacità corneale. Se si rilevano variazioni importanti della trasmissione luminosa attraverso i supporti corneali, è opportuno prendere in considerazione idonee procedure di pulizia e/o lucidatura della superficie interna dei supporti corneali o la loro sostituzione.

Supporto corneale: diagramma esploso.

(13)

nella parte B, il capitolo B.48 è sostituito dal seguente:

«B.48   Metodo di prova sull'occhio isolato dei polli (Isolated Chicken Eye — ICE) per l'identificazione di i) sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari e ii) sostanze chimiche che non richiedono classificazione per irritazione oculare o gravi lesioni oculari

INTRODUZIONE

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 438 (2013). Il metodo di prova sull'occhio isolato dei polli (Isolated Chicken Eye — ICE) è un metodo di prova valutato dal Comitato di coordinamento interagenzia per la convalida dei metodi alternativi (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM), insieme con il Centro europeo per la convalida di metodi alternativi (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) e del corrispondente organismo del Giappone (Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) nel 2006 e nel 2010 (1) (2) (3). Nella prima valutazione la validità del metodo di prova ICE è stata riconosciuta come test di screening per identificare le sostanze chimiche (e le miscele) che inducono gravi lesioni oculari (categoria 1) secondo la definizione del Sistema generale armonizzato di classificazione e di etichettatura dei prodotti chimici delle Nazioni Unite (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals — UN GHS) (1) (2) (4) e del regolamento (CE) n. 1272/2008 relativo alla classificazione, all'etichettatura e all'imballaggio delle sostanze e delle miscele (CLP) (12). Nella seconda valutazione il metodo di prova ICE è stato valutato per il suo uso come test di screening per identificare sostanze chimiche non classificate che inducono irritazione oculare o gravi lesioni oculari secondo la definizione del sistema UN GHS (3) (4). I risultati dello studio di validazione e il panel di esame inter pares ha ribadito le raccomandazioni originarie di utilizzare il metodo di prova ICE per classificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari (categoria UN GHS 1) poiché la banca dati disponibile è rimasta invariata dalla validazione originaria dell'ICCVAM. In questa fase non sono state suggerite ulteriori raccomandazioni per un'espansione dell'ambito d'applicazione del metodo di prova ICE al fine di includere altre categorie. È stata condotta una valutazione ulteriore dell'insieme di dati in vitro e in vivo usati nello studio di validazione al fine di valutare l'utilità del metodo di prova ICE per identificare le sostanze chimiche che non richiedono classificazione per irritazione oculare o gravi lesioni oculari (5). Questo esercizio ha permesso di concludere che il metodo di prova può inoltre essere usato per identificare le sostanze chimiche che non richiedono una classificazione per l'irritazione oculare o per gravi lesioni oculari secondo il sistema UN GHS (4) (5). Questo metodo di prova include gli usi raccomandati e le limitazioni del metodo di prova ICE sulla base di tali valutazioni. Le principali differenze fra la versione originale del 2009 e la versione aggiornata del 2013 della linea guida dell'OCSE comprende fra l'altro l'uso del metodo di prova ICE per identificare le sostanze chimiche che non richiedono classificazione per irritazione oculare o gravi lesioni oculari secondo il sistema di classificazione UN GHS, un aggiornamento degli elementi della relazione, un aggiornamento dell'appendice 1 sulle definizioni nonché un aggiornamento dell'appendice 2 sulle sostanze chimiche di riferimento.

Attualmente è generalmente riconosciuto che nel prossimo futuro nessuna singola prova di irritazione oculare in vitro sarà in grado di sostituire il test di Draize in vivo per prevedere tutta la gamma di irritazione per diverse classi chimiche. Tuttavia combinazioni strategiche di diversi metodi alternativi nell'ambito di una strategia di prova (sequenziale) possono sostituire il test oculare di Draize (6). L'approccio top-down (7) è usato quando, in base alle informazioni esistenti, si stima che una sostanza chimica abbia un elevato potenziale di irritazione, mentre l'approccio bottom-up (7) è usato quando, in base alle informazioni esistenti, si stima che una sostanza chimica non causi un'irritazione oculare sufficiente da richiedere una classificazione. Il metodo di prova ICE è un metodo di prova in vitro che può essere usato in alcune circostanze e con limitazioni specifiche, come descritto ai paragrafi da 8 a 10, per la classificazione dei rischi oculari e l'etichettatura delle sostanze chimiche. Anche se da solo non è considerato un valido sostituto del test in vivo sugli occhi dei conigli, il metodo di prova ICE è raccomandato come fase iniziale nell'ambito di una strategia di prova, quale l'approccio top-down proposto da Scott et al. (7) per identificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari, ossia le sostanze chimiche da classificare nella categoria UN GHS 1, senza effettuare ulteriori prove (4). Il metodo di prova ICE è altresì raccomandato per identificare le sostanze chimiche che non richiedono una classificazione per l'irritazione oculare o per gravi lesioni oculari, secondo la definizione del sistema GHS delle Nazioni Unite (“senza categoria”) (4) e può quindi essere usato come fase iniziale nell'ambito di una strategia di prova quale l'approccio bottom-up (7). Tuttavia, la classificazione definitiva di una sostanza chimica cui non si attribuisce la possibilità di causare gravi lesioni oculari o non classificata per irritazione oculare/gravi lesioni oculari con il metodo di prova BCOP richiederebbe prove supplementari (in vitro e/o in vivo). Si dovrebbero inoltre consultare le autorità di regolamentazione preposte prima di utilizzare il metodo di prova ICE in un approccio bottom-up nell'ambito di sistemi di classificazione diversi dal sistema UN GHS.

Scopo di questo metodo di prova è descrivere le procedure impiegate per valutare il potenziale di rischio oculare di una sostanza chimica in esame sulla base della capacità di tale sostanza di causare tossicità in un occhio enucleato di pollo. Gli effetti tossici sulla cornea sono misurati attraverso i) una valutazione qualitativa dell'opacità, ii) una valutazione qualitativa dei danni all'epitelio in base all'applicazione di fluoresceina all'occhio (ritenzione della fluoresceina), iii) una misurazione quantitativa dell'aumento dello spessore (rigonfiamento), e iv) una stima qualitativa di eventuali danni morfologici macroscopici alla superficie. L'opacità, il rigonfiamento e le stime dei danni della cornea in seguito all'esposizione a una sostanza chimica in esame sono valutati individualmente e poi cumulativamente per formulare un sistema di classificazione di irritazione oculare (Eye Irritancy Classification).

Le definizioni figurano nell'appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI

Il presente metodo di prova ICE si basa sul protocollo suggerito nel documento orientativo n. 160 dell'OCSE (8), elaborato in seguito allo studio internazionale di validazione dell'ICCVAM (1) (3) (9) con il contributo dell'ECVAM e del JaCVAM nonché del dipartimento di tossicologia e farmacologia applicata per la qualità della vita (TNO, Paesi Bassi). Il protocollo si basa su informazioni ottenute da protocolli già pubblicati, nonché dal protocollo attualmente impiegato dal TNO (10) (11) (12) (13) (14).

Nella validazione del metodo in questione è stato sottoposto a prova un'ampia gamma di sostanze chimiche e la banca dati empirica dello studio di validazione comprende 152 sostanze chimiche, fra cui 72 sostanze e 80 miscele (5). Questo metodo di prova è applicabile ai solidi, ai liquidi, alle emulsioni e ai gel. I liquidi possono essere acquosi o non acquosi; i solidi possono essere solubili o insolubili in acqua. I gas e gli aerosol non sono ancora stati valutati nell'ambito di uno studio di validazione.

Il metodo di prova ICE può essere usato per classificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari, ossia le sostanze chimiche da classificare nella categoria UN GHS 1 (4). Quando è usato a questo fine, le limitazioni identificate per il metodo di prova ICE sono basate su un tasso elevato di falsi positivi per gli alcoli e un elevato tasso di falsi negativi per i solidi e i tensioattivi (1) (3) (9). La percentuale di falsi negativi ottenuta (categoria UN GHS 1) in questo contesto non costituisce un aspetto critico poiché tutte le sostanze chimiche in esame che producono un risultato negativo sono successivamente sottoposte a prova con altri metodi in vitro adeguatamente validati o, in ultima ratio sui conigli, a seconda dei requisiti regolamentari, mediante una strategia di saggi sequenziali con un metodo basato sul peso dell'evidenza. È opportuno osservare che i solidi possono generare condizioni di esposizione variabili ed estreme nel test di Draize in vivo, che potrebbe falsare il reale potenziale di irritazione (15). Gli sperimentatori potrebbero prendere in considerazione il ricorso a tale metodo per tutti i tipi di sostanze chimiche, laddove un risultato positivo dovrebbe essere accettato come indicativo di una risposta che induce gravi lesioni oculari, per es. classificazione nella categoria UN GHS 1, senza ulteriori prove. I risultati positivi ottenuti con gli alcol andrebbero tuttavia interpretati con cautela, considerato il rischio di effettuare previsioni non corrette.

Se usato per identificare le sostanze chimiche che inducono gravi lesioni oculari (categoria UN GHS 1), il metodo di prova ICE presenta un'accuratezza dell'86 % (120/140), una percentuale di falsi positivi del 6 % (7/113) e una percentuale di falsi negativi del 48 % (13/27), rispetto ai dati ottenuti con il test in vivo sugli occhi dei conigli classificati secondo il sistema di classificazione UN GHS (4) (5).

Il metodo di prova ICE può inoltre essere usato per identificare le sostanze chimiche che non richiedono una classificazione per irritazione oculare o per gravi lesioni oculari nell'ambito del sistema di classificazione UN GHS (4). Si dovrebbero consultare le autorità di regolamentazione preposte prima di utilizzare il metodo di prova ICE in un approccio bottom-up nell'ambito di sistemi di classificazione diversi. Questo metodo di prova può essere usato per tutti i tipi di sostanze chimiche in cui è accettabile un risultato negativo per non classificare una sostanza chimica per irritazione oculare o gravi lesioni oculari. Tuttavia, sulla base di un unico risultato proveniente dalla banca dati di validazione le pitture antivegetative contenenti solventi organici possono essere sottostimate (5).

Se usato per identificare le sostanze chimiche che non richiedono classificazione per irritazione oculare e gravi lesioni oculari, il metodo di prova ICE presenta un'accuratezza dell'82 % (125/152), una percentuale di falsi positivi del 33 % (26/79) e una percentuale di falsi negativi dell'1 % (1/73), rispetto ai dati ottenuti con il test in vivo sugli occhi dei conigli classificati secondo il sistema di classificazione UN GHS (4) (5). Se le sostanze chimiche in esame nell'ambito di alcune classi chimiche (per es. pitture antivegetative contenenti solventi organici) sono escluse dalla banca dati, il metodo di prova ICE presenta un'accuratezza complessiva dell'83 % (123/149), una percentuale di falsi positivi del 33 % (26/78) e una percentuale di falsi negativi dello 0 % (0/71) secondo il sistema di classificazione UN GHS (5).

Il metodo di prova ICE non è raccomandato per identificare le sostanze chimiche in esame da classificarsi come irritanti per gli occhi (categoria UN GHS 2 o 2A) o le sostanze chimiche in esame da classificarsi come moderatamente irritanti per gli occhi (categoria UN GHS 2B) a causa dell'elevato numero di sostanze chimiche appartenenti alla categoria UN GHS 1 sottoclassificate nelle categorie 2, 2A o 2B e le sostanze chimiche “senza categoria” secondo il sistema UN GHS sovraclassificate nelle categorie 2, 2A o 2B. A tal fine possono essere necessarie ulteriori prove con un altro metodo adeguato.

Tutte le procedure che prevedono l'impiego di occhi di polli dovrebbero osservare le regole e le procedure in vigore nella struttura che effettua l'analisi relativamente alla gestione di materiali di derivazione umana o animale che comprendono, tra l'altro, i tessuti e i liquidi tessutali. È consigliabile adottare le comuni norme di cautela osservate nei laboratori (16).

Sebbene il metodo di prova ICE non prenda in considerazione le lesioni della congiuntiva e dell'iride valutati secondo il metodo di prova per l'irritazione oculare sui conigli, esso riguarda gli effetti sulla cornea, che sono i principali fattori di classificazione in vivo secondo la classificazione UN GHS. Inoltre, benché il metodo di prova ICE non consente di per sé di valutare la reversibilità delle lesioni corneali, studi condotti sugli occhi dei conigli suggeriscono di esaminare la profondità iniziale di una lesione corneale per identificare alcuni tipi di effetti irreversibili (17). In particolare è necessario un approfondimento scientifico per comprendere in quale modo possano verificarsi effetti irreversibili non collegati all'elevato livello iniziale della lesione. Infine, il metodo di prova ICE non consente di valutare il potenziale di tossicità sistemica associato all'esposizione attraverso l'occhio.

Infine, questo metodo di prova sarà aggiornato con cadenza regolare, mano a mano che si disporrà di ulteriori dati e informazioni. A titolo di esempio, l'istopatologia presenta un'utilità potenziale nei casi in cui è necessaria una caratterizzazione più completa della lesione corneale. Gli utilizzatori sono invitati a conservare le cornee e a preparare campioni istopatologici che possono servire a elaborare una banca dati e criteri decisionali in grado di migliorare ulteriormente l'accuratezza di questo metodo di prova. L'OCSE ha elaborato un documento orientativo sull'uso dei metodi di prova in vitro per la tossicità oculare, che comprende procedure dettagliate sulla raccolta di campioni istopatologici e informazioni in merito alla trasmissione di campioni e/o di dati istopatologici (8).

Ai laboratori che ricorrono a questo tipo di metodo di prova per la prima volta si consiglia di utilizzare le sostanze chimiche di riferimento per la verifica della competenza tecnica indicate nell'appendice 2. Un laboratorio può utilizzare tali sostanze chimiche per dimostrare le proprie competenze tecniche nell'esecuzione del metodo di prova ICE prima di presentare i dati relativi al metodo di prova ICE a scopi regolamentari per la classificazione dei rischi.

PRINCIPIO DELLA PROVA

Il metodo di prova ICE è un modello organotipico per il mantenimento di occhi di pollo a breve termine in vitro. Questo metodo di prova consente di valutare i danni prodotti dalla sostanza chimica in esame in base al rigonfiamento corneale, all'opacità e alla ritenzione di fluoresceina. Mentre gli ultimi due parametri richiedono una valutazione qualitativa, l'analisi del rigonfiamento corneale è di tipo quantitativo. Ciascuna misurazione è convertita in un punteggio quantitativo usato per calcolare un indice di irritazione generale oppure è categorizzata qualitativamente al fine di assegnare un pericolo oculare in vitro, alla categoria UN GHS 1 o senza categoria UN GHS. Questi risultati possono essere quindi usati per stimare in vivo il potenziale di gravi lesioni oculari o dell'assenza di classificazione relativamente alla classificazione di pericolo oculare di una sostanza chimica (cfr. criteri decisionali). Con il metodo di prova ICE non è tuttavia possibile attribuire una classificazione delle sostanze non ritenute causare gravi lesioni oculari o non classificate (cfr. paragrafo 11).

Origine ed età degli occhi dei polli

Storicamente, per questo tipo di saggio sono utilizzati occhi prelevati da polli abbattuti nei mattatoi per il consumo alimentare umano, ovviando in questo modo alla necessità di utilizzare animali da laboratorio. Sono impiegati solamente occhi di animali sani ritenuti idonei a essere immessi nella catena alimentare umana.

Sebbene non sia stato condotto alcuno studio con controlli per identificare l'età ottimale del pollo, l'età e il peso degli animali storicamente impiegati per questo metodo di prova corrispondono a quelli dei pollastri tradizionalmente abbattuti nei macelli per pollame (ovvero, pollastri di circa 7 settimane e 1,5 – 2,5 kg di peso).

Prelievo e trasporto degli occhi in laboratorio

Si suggerisce di rimuovere le teste subito dopo aver stordito i polli, di norma con scossa elettrica, e aver praticato loro un'incisione sul collo per consentire il sanguinamento. È preferibile che l'allevamento da cui provengono i polli sia situato nelle vicinanze del laboratorio, per consentire di trasferire le teste dal macello in tempi sufficientemente rapidi e ridurre così al minimo il deterioramento e/o la contaminazione batterica. L'intervallo temporale fra la raccolta delle teste di pollo e la collocazione degli occhi nella camera di superfusione in seguito all'enucleazione dovrebbe essere minimizzato (di norma, entro due ore) per garantire il rispetto dei criteri di accettazione del saggio. Si suggerisce di utilizzare per il saggio occhi dello stesso gruppo di prelievo, ottenuti nella medesima giornata.

Gli occhi sono dissezionati in laboratorio, pertanto il trasporto delle teste intatte dal macello deve avvenire a temperatura ambiente (solitamente 18°-25°) in scatole di plastica umidificate con panni inumiditi di soluzione salina isotonica.

Criteri di selezione e numero di occhi usati nel metodo di prova ICE

Sono scartati gli occhi che presentano consistenti macchie di fluoresceina (> 0,5) o un punteggio di opacità corneale elevato (> 0,5) dopo l'enucleazione.

Ciascun gruppo di trattamento e di controllo positivo parallelo comprende almeno tre occhi. Il gruppo di controllo negativo o del solvente (se si utilizza un solvente diverso dalla soluzione salina) comprende almeno un occhio.

Nel caso dei materiali solidi che producono un risultato UN GHS, si raccomanda un secondo ciclo di tre occhi per confermare o smentire il risultato negativo.

PROCEDURA

Preparazione degli occhi

Le palpebre sono asportate con cautela, facendo attenzione a non danneggiare la cornea. L'integrità della cornea è subito valutata con una goccia di fluoresceina sodica al 2 % (p/v) applicata alla superficie della cornea per alcuni secondi e poi risciacquata con soluzione salina isotonica. Gli occhi trattati con la fluoresceina sono poi esaminati al microscopio con lampada a fessura per assicurare che la cornea non presenti danni (per es. ritenzione di fluoresceina e valori di opacità corneale ≤ 0,5).

Se non è danneggiato, l'occhio è ulteriormente dissezionato dal cranio facendo attenzione a non danneggiare la cornea. Il bulbo oculare è estratto dall'orbita servendosi di pinze chirurgiche per tenere saldamente ferma la membrana nittitante e i muscoli oculari sono tagliati con forbici chirurgiche curve smusse. È importante non applicare una pressione eccessiva (per es. artefatti da compressione) per evitare di danneggiare la cornea.

Nel rimuovere l'occhio dall'orbita, dovrebbe restare attaccata una porzione visibile di nervo ottico. Rimosso dall'orbita, l'occhio è posto su un tappetino assorbente e sono recisi la membrana nittitante e il restante tessuto connettivo.

L'occhio enucleato è montato in un morsetto in acciaio inossidabile con la cornea in posizione verticale. Il morsetto è poi trasferito all'interno di una camera dell'apparecchio di superfusione (18). I morsetti dovrebbero essere posizionati nell'apparecchio di superfusione in modo che tutta la cornea sia esposta alla perfusione di soluzione salina isotonica (3-4 gocce al minuto o 0,1-0,15 ml/min). Le camere dell'apparecchio di superfusione devono essere a temperatura controllata di 32 (± 1,5) °C. L'appendice 3 presenta un diagramma esemplificativo di apparecchio di superfusione e dei morsetti oculari, che sono disponibili sul mercato o possono essere costruiti. L'apparecchio può essere modificato a seconda delle esigenze dei singoli laboratori (per es. per alloggiare un numero diverso di occhi).

Dopo l'inserimento nell'apparecchio di superfusione, gli occhi sono nuovamente esaminati con un microscopio con lampada a fessura per accertarsi che non siano stati danneggiati durante la procedura di dissezione. È opportuno misurare anche lo spessore corneale, questa volta all'apice della cornea, utilizzando lo strumento di misurazione della profondità del microscopio con lampada a fessura. Occhi con i), un punteggio di ritenzione della fluoresceina > 0,5; ii) opacità corneale > 0,5; o iii) qualsiasi altro segno di lesione, dovrebbero essere sostituiti. Fra gli occhi che non sono stati scartati per nessuno dei criteri suddetti, devono essere scartati gli occhi con una deviazione dello spessore corneale di oltre il 10 % dal valore medio di tutti gli occhi. È opportuno che gli sperimentatori siano consapevoli del fatto che i microscopi con lampade a fessura possono produrre misurazioni dello spessore corneale diverse a seconda delle diverse larghezze su cui è impostata la fessura. La larghezza della fessura dovrebbe essere impostata a 0,095 mm.

Dopo essere stati esaminati e selezionati, gli occhi sono incubati per un periodo di tempo compreso fra 45 e 60 minuti circa per l'equilibratura con il sistema prima del dosaggio. Successivamente al periodo di equilibratura è registrato il valore di riferimento per lo spessore e l'opacità della cornea, che funge da base per le altre misurazioni (per es. tempo = 0). Il valore di fluoresceina determinato al momento della dissezione è usato come misurazione di base per questo risultato.

Applicazione della sostanza chimica in esame

Subito dopo le misurazioni del valore di riferimento (zero) si estrae l'occhio (nel suo supporto) dall'apparecchio di superfusione, lo si dispone in posizione orizzontale e si applica alla cornea la sostanza chimica in esame.

Le sostanze chimiche in esame liquide sono di norma analizzate non diluite, ma possono essere diluite se lo si ritiene necessario (per es. se previsto dallo studio). Il solvente più frequentemente utilizzato per le sostanze chimiche in esame diluite è la soluzione salina fisiologica. In determinate condizioni controllate possono tuttavia essere utilizzati anche solventi alternativi diversi dalla soluzione salina fisiologica, ma la loro idoneità deve essere comunque dimostrata.

Le sostanze chimiche in esame liquide sono applicate alla cornea in modo che l'intera superficie sia uniformemente coperta con tale sostanza; il volume standard è pari a 0,03 ml.

Se possibile, è opportuno triturare le sostanze chimiche in esame solide il più finemente possibile in un mortaio con un pestello o un analogo strumento di macinatura. La polvere è applicata alla cornea in modo che la superficie sia uniformemente coperta con tale sostanza; il quantitativo standard è pari a 0,03 g.

La sostanza chimica in esame (liquida o solida) è applicata per 10 secondi e successivamente risciacquata dall'occhio con circa 20 ml di soluzione salina isotonica a temperatura ambiente. L'occhio (nel suo supporto) è in seguito posizionato nuovamente nell'apparecchio di superfusione nella posizione verticale originaria. Se necessario, è possibile risciacquare ulteriormente dopo l'applicazione di 10 secondi e a scadenze temporali successive (per es. se sono presenti residui di sostanza chimica in esame sulla cornea). Di norma il quantitativo di soluzione salina usato in aggiunta per il risciacquo non è rilevante, tuttavia l'osservazione dell'adesione della sostanza chimica alla cornea è importante.

Sostanze chimiche di controllo

Ogni saggio dovrà comprendere controlli negativi o con solventi/mezzi disperdenti e controlli positivi paralleli.

Le prove con i liquidi al 100 % o i solidi prevedono l'impiego di una soluzione salina fisiologica come controllo negativo parallelo nel metodo di prova ICE per rilevare cambiamenti non specifici del sistema di prova e assicurare che le condizioni sperimentali non causino una reazione irritante non desiderata.

Le prove con i liquidi diluiti comprendono un gruppo di controllo con solventi/mezzi disperdenti per rilevare cambiamenti non specifici del sistema di prova e assicurare che le condizioni sperimentali non causino una reazione irritante non desiderata. Come indicato al paragrafo 31, può essere utilizzato solo un solvente/mezzo disperdente per il quale si sia dimostrato che non ha ripercussioni negative sul sistema di prova.

Ciascuna prova comprende un controllo positivo parallelo (noto irritante per occhi) per verificare la possibilità di indurre una reazione adeguata. Poiché il presente metodo di prova utilizza il saggio ICE per l'identificazione di sostanze corrosive o gravemente irritanti, il controllo positivo ideale dovrebbe essere una sostanza chimica di riferimento che consenta di indurre una reazione grave durante questo metodo di prova. Tuttavia la portata dell'irritazione non dovrebbe essere eccessiva per garantire la possibilità di valutare la variabilità della reazione dei controlli positivi nel tempo. Dovrebbero essere generati dati in vitro sufficienti per il controllo positivo in modo da poter calcolare una serie statisticamente accettabile di dati per il controllo positivo. Se non sono disponibili dati storici idonei relativi al metodo di prova ICE per un determinato controllo positivo, è opportuno condurre degli studi per ottenere questo tipo di informazioni.

L'acido acetico al 10 % o il cloruro di benzalconio al 5 % sono esempi di controlli positivi di sostanze chimiche in esame liquide, mentre esempi di controlli positivi per le sostanze di prova solide comprendono l'idrossido di sodio o l'imidazolo.

Le sostanze chimiche di riferimento sono utili per valutare il potenziale di irritazione oculare di sostanze chimiche sconosciute appartenenti a determinate classi di sostanze o prodotti chimici o per valutare il potenziale di irritazione relativo di una sostanza irritante per gli occhi nell'ambito di una serie specifica di reazioni irritanti.

Endpoint misurati

La valutazione delle cornee trattate avviene prima del trattamento e dopo 30, 75, 120, 180 e 240 minuti (con una tolleranza di ± 5 minuti) dal risciacquo successivo al trattamento. Queste scadenze temporali consentono di svolgere un numero idoneo di misurazioni nel corso del periodo complessivo di quattro ore previsto dal trattamento e lasciano al tempo stesso un periodo sufficiente fra una misurazione e l'altra per le necessarie osservazioni da effettuarsi su tutti gli occhi.

Gli endpoint valutati sulla cornea comprendono fenomeni quali opacità e rigonfiamento corneali, ritenzione di fluoresceina ed effetti morfologici (per es. pitting o allentamento dell'epitelio). Tutti gli endpoint sono rilevati a ciascuna delle scadenze temporali sopra menzionate, ad eccezione della ritenzione della fluoresceina che è determinata solo prima del trattamento e 30 minuti dopo l'esposizione alla sostanza chimica in esame.

È consigliabile servirsi di fotografie per documentare l'opacità corneale, la ritenzione della fluoresceina, gli effetti morfologici e l'istopatologia, se effettuata.

Dopo l'esame finale condotto al termine delle quattro ore, si suggerisce agli sperimentatori di conservare gli occhi in un apposito fissativo (per es. formalina tamponata neutra) per un possibile esame istopatologico (cfr. paragrafo 14 e riferimento 8 per i dettagli).

Il rigonfiamento corneale si determina grazie a misurazioni dello spessore della cornea, condotte con un pachimetro ottico montato su un microscopio con lampada a fessura. Il valore relativo è espresso in percentuale ed è calcolato sulla base delle misurazioni dello spessore della cornea secondo la seguente formula:

La percentuale media di rigonfiamento corneale per tutti gli occhi sottoposti al saggio è calcolata a tutte le scadenze temporali di osservazione. In base al punteggio medio più elevato di rigonfiamento corneale, osservato a ciascuna scadenza, è poi assegnato un punteggio complessivo di categoria per ciascuna sostanza chimica in esame (cfr. paragrafo 51).

L'opacità corneale è valutata usando l'area della cornea maggiormente opacizzata per stabilire un punteggio secondo la tabella 1. La percentuale media di opacità corneale per tutti gli occhi sottoposti al saggio è calcolata a tutte le scadenze temporali di osservazione. In base al punteggio medio più elevato di opacità corneale, osservato a ciascuna scadenza, è poi assegnato un punteggio complessivo di categoria per ciascuna sostanza chimica in esame (cfr. paragrafo 51).

Tabella 1

Punteggi di opacità corneale

Il valore di ritenzione della fluoresceina è valutato solo a 30 minuti, come indicato alla tabella 2. Il valore di ritenzione della fluoresceina medio per tutti gli occhi esaminato è calcolato a 30 minuti dal trattamento e vale come punteggio di categoria assegnato a ciascuna sostanza chimica in esame (cfr. paragrafo 51).

Tabella 2

Punteggi di ritenzione della fluoresceina

Gli effetti morfologici comprendono il “pitting” delle cellule epiteliali corneali, l'“allentamento” dell'epitelio, l'“irruvidimento” della superficie corneale e l'“incollamento” della sostanza chimica in esame alla cornea. Questi risultati possono variare in termini di gravità e presentarsi contemporaneamente. La classificazione dei risultati suddetti è soggettiva e dipende dall'interpretazione del ricercatore.

DATI E RELAZIONE

Valutazione dei dati

I risultati delle misurazioni relative a opacità e rigonfiamento corneali e ritenzione di fluoresceina dovrebbero essere valutati separatamente per creare una classe ICE per ciascun endpoint. Le classi ICE relative a ciascun endpoint sono poi associate per generare una classificazione di irritazione per ciascuna sostanza chimica in esame.

Criteri decisionali

Dopo aver valutato ciascun endpoint, è possibile assegnare le classi ICE sulla base di una serie predefinita. L'interpretazione del rigonfiamento corneale (tabella 3), dell'opacità (tabella 4) e della ritenzione della fluoresceina (tabella 5), utilizzando quattro classi ICE, avviene in base alle seguenti scale di classificazione: è importante osservare che i punteggi di rigonfiamento corneale di cui nella tabella 3 sono applicabili solo se lo spessore è misurato con microscopio con lampada a fessura (per es. del tipo Haag-Streit BP900) con dispositivo di misurazione della profondità n. 1 e larghezza della fessura impostata a 9, pari a 0,095 mm. È opportuno richiamare l'attenzione degli sperimentatori sul fatto che i microscopi con lampade a fessura possono produrre misurazioni dello spessore della cornea diverse a seconda delle diverse larghezze su cui è impostata la fessura.

Tabella 3

Criteri di classificazione ICE per il rigonfiamento corneale

Tabella 4

Criteri di classificazione ICE per l'opacità

Tabella 5

Criteri di classificazione ICE per la ritenzione media di fluoresceina

La classificazione in vitro di una sostanza chimica è valutata mediante lettura della classificazione UN GHS corrispondente alla combinazione di categorie risultanti per il rigonfiamento corneale, l'opacità e la ritenzione della fluoresceina secondo la tabella 6.

Tabella 6

Classificazioni in vitro generali.

Criteri di accettazione dello studio

Una prova è ritenuta accettabile se i controlli negativi o con solventi/mezzi disperdenti e i controlli positivi paralleli sono identificati rispettivamente come “senza categoria e di categoria UN GHS 1”.

Relazione di prova

La relazione di prova dovrebbe includere le seguenti informazioni, se pertinenti alla conduzione dello studio: