1.

Il coefficiente di ripartizione (P) è definito come il rapporto tra le concentrazioni all'equilibrio di una sostanza disciolta in un sistema a due fasi costituito da due solventi pressoché immiscibili. Nel caso del n-ottanolo e dell'acqua:

Il coefficiente di ripartizione è adimensionale poiché è il quoziente di due concentrazioni, e viene generalmente espresso sotto forma del suo logaritmo decimale.

2.

Pow è un parametro chiave negli studi sul destino ambientale delle sostanze chimiche. È stata dimostrata l'esistenza di una relazione altamente significativa tra il Pow delle sostanze in forma non ionizzata e il loro bioaccumulo nei pesci. È stato inoltre dimostrato che il Pow è un parametro utile nella previsione dell'assorbimento nel terreno e nei sedimenti, nonché per stabilire relazioni quantitative struttura-attività per un'ampia gamma di effetti biologici.

3.

La proposta originaria del presente metodo di prova si basava su un articolo di C.V. Eadsforth and P. Moser (1). Lo sviluppo del metodo di prova e l'esecuzione di una prova comparativa tra laboratori OCSE sono stati coordinati dall'Umweltbundesamt (Agenzia federale per l'ambiente) della Repubblica federale di Germania nel 1986 (2).

4.

I valori log Pow nell'intervallo da – 2 a 4 (talora fino a 5 e oltre) (1) possono essere determinati sperimentalmente utilizzando il metodo Shake-Flask (capitolo A.8 del presente allegato, linea guida dell'OCSE n. 107). Il metodo HPLC si applica per log Pow nell'intervallo da 0 a 6 (1)(2)(3)(4)(5). Questo metodo può richiedere una stima di Pow per l'assegnazione di sostanze di riferimento adeguate e l'avallo delle conclusioni tratte dai risultati della prova. I metodi di calcolo sono discussi brevemente nell'Appendice del presente metodo di prova. La modalità operativa del metodo HPLC è in isocratica.

5.

I valori di Pow dipendono dalle condizioni ambientali quali la temperatura, il pH, la forza ionica, ecc., queste dovrebbero essere definite nell'esperimento ai fini di una corretta interpretazione dei dati Pow. Per le sostanze ionizzabili potrebbe rendersi disponibile, ed essere utilizzato in alternativa, un altro metodo (ad esempio, il metodo pH-metrico per le sostanze ionizzate (6) descritto nel progetto di linea guida OCSE). Sebbene questo progetto di linea guida OCSE possa essere appropriato per determinare il Pow per tali sostanze ionizzabili, in alcuni casi è più opportuno utilizzare il metodo HPLC a un pH pertinente dal punto di vista ambientale (cfr. paragrafo 9).

6.

Il metodo HPLC a fase inversa è condotto su colonne analitiche impaccate con una fase solida disponibile in commercio contenente idrocarburi a catena lunga (ad esempio C8, C18) chimicamente legati su silice.

7.

Una sostanza chimica iniettata su una colonna di questo tipo si riparte tra la fase mobile del solvente e la fase stazionaria idrocarburica man mano che viene trasportata lungo la colonna dalla fase mobile. Le sostanze sono ritenute in proporzione al loro coefficiente di ripartizione idrocarburo-acqua con le sostanze idrofile eluite per prime e quelle lipofile per ultime. Il tempo di ritenzione è descritto dal fattore di capacità k dato dalla seguente espressione:

dove tR è il tempo di ritenzione della sostanza in esame e t0 è il tempo morto, ossia il tempo medio necessario perché una molecola di solvente passi attraverso la colonna. Non sono richiesti metodi analitici quantitativi ed è necessaria solo la determinazione dei tempi di ritenzione.

8.

Il coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua di una sostanza in esame può essere calcolato sperimentalmente determinando il suo fattore di capacità k e quindi inserendo k nella seguente equazione:

dove

L'equazione riportata sopra può essere ottenuta mediante la regressione lineare del logaritmo dei coefficienti di ripartizione ottanolo/acqua delle sostanze di riferimento rispetto al logaritmo dei fattori di capacità delle sostanze di riferimento.

9.

Il metodo HPLC a fase inversa consente di ottenere la stima dei coefficienti di ripartizione nell'intervallo del log Pow compreso tra 0 e 6, ma tale intervallo può essere esteso in casi eccezionali tra 6 e 10. Ciò può richiedere la modifica della fase mobile (3). Il metodo non è applicabile a basi e acidi forti, complessi metallici, sostanze che reagiscono con l'eluente o tensioattivi. È possibile effettuare misurazioni sulle sostanze ionizzabili nella loro forma non ionizzata (acido libero o base libera) unicamente utilizzando un tampone appropriato con un pH inferiore al pKa per un acido libero o superiore al pKa per una base libera. Il metodo pH-metrico per l'esecuzione di prove sulle sostanze ionizzabili (6) potrebbe diventare disponibile ed essere utilizzato come metodo alternativo (6). Se il valore di log Pow è determinato ai fini della classificazione dei pericoli per l'ambiente o della valutazione del rischio ambientale, la prova va eseguita nell'intervallo di pH pertinente per l'ambiente naturale, ossia con un pH compreso tra 5 e 9.

10.

In alcuni casi la presenza di impurità può complicare l'interpretazione dei risultati a causa delle incertezze nell'assegnazione dei picchi. Per le miscele che risultano in una banda non risolta, si devono indicare i limiti superiore e inferiore di log Pow e l'area percentuale di ciascun picco di log Pow. Per le miscele costituite da un gruppo di omologhi, è necessario indicare anche la media ponderata del log Pow (7), calcolata sulla base dei singoli valori Pow e i corrispondenti valori percentuali dell'area di picco (8). Tutti i picchi che contribuiscono a un'area del 5 % o più dell'area totale di picco devono essere presi in considerazione nel calcolo (9):

La media ponderata del log Pow è valida solo per le sostanze o le miscele (ad esempio, il tallolio) costituite da omologhi (ad esempio, serie di alcani). Le misurazioni delle miscele possono restituire risultati significativi, a condizione che il rivelatore analitico utilizzato abbia la stessa sensibilità verso tutte le sostanze della miscela e che esse possano essere adeguatamente risolte.

11.

La costante di dissociazione, la formula di struttura e la solubilità nella fase mobile devono essere note prima di utilizzare il metodo. Inoltre, sarebbe utile disporre delle informazioni sull'idrolisi.

12.

Per aumentare l'affidabilità della misurazione, le determinazioni devono essere eseguite in duplicato.

13.

La prova comparativa interlaboratorio ha mostrato che, con il metodo HPLC, i valori di log Pow possono essere ottenuti entro ± 0,5 unità dei valori ottenibili con il metodo Shake-Flask (2). In letteratura è possibile trovare altre comparazioni (4)(5)(10)(11)(12). I risultati più accurati si ottengono con grafici di correlazione basati su sostanze di riferimento aventi una struttura simile (13).

14.

Al fine di correlare il fattore di capacità misurato k di una sostanza con il relativo Pow, è necessario tracciare un grafico di taratura utilizzando almeno 6 punti (cfr. paragrafo 24). E' compito dell'utilizzatore selezionare le sostanze di riferimento appropriate. Le sostanze di riferimento normalmente devono avere valori di log Pow comprendenti il log Pow della sostanza in esame; per esempio, almeno una sostanza di riferimento deve avere un Pow superiore a quello della sostanza in esame e un'altra sostanza di riferimento deve avere un Pow inferiore a quello della sostanza in esame. L'estrapolazione va utilizzata unicamente in casi eccezionali. È preferibile che tali sostanze di riferimento siano strutturalmente simili alla sostanza in esame. I valori di log Pow delle sostanze di riferimento utilizzati per la taratura devono essere basati su dati sperimentali attendibili. Tuttavia, per le sostanze con un log Pow elevato (generalmente superiore a 4), è possibile utilizzare valori calcolati, a meno che non si disponga di dati sperimentali attendibili. Se si utilizzano valori estrapolati, è necessario specificare un valore limite.

15.

Sono disponibili lunghi elenchi di valori di log Pow per molti gruppi di sostanze chimiche (14)(15). Se non sono disponibili dati sui coefficienti di ripartizione di sostanze strutturalmente simili, si può usare una taratura più generale basata su altre sostanze di riferimento. Nella tabella 1 sono elencate le sostanze di riferimento consigliate e i rispettivi valori di Pow. Per le sostanze ionizzabili, i valori forniti si applicano alla forma non ionizzata. L'attendibilità e la qualità dei valori sono state verificate durante la prova comparativa interlaboratorio.

Tabella 1

Sostanze di riferimento raccomandate

16.

Se necessario, è possibile stimare il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame, preferibilmente ricorrendo a un metodo di calcolo (cfr. Appendice) o, se del caso, utilizzando il rapporto della solubilità della sostanza in esame nei solventi puri.

17.

È richiesto un cromatografo in fase liquida dotato di pompa a bassi impulsi e di un sistema di rivelazione adeguato. Un rivelatore UV, che utilizza una lunghezza d'onda di 210 nm, o un rivelatore RI sono applicabili ad un'ampia gamma di gruppi chimici. La presenza di gruppi polari nella fase stazionaria può compromettere gravemente le prestazioni della colonna HPLC. Pertanto, le fasi stazionarie devono contenere una percentuale minima di gruppi polari (16). Si possono usare riempimenti commerciali a fase inversa a microparticelle o colonne preimpaccate. Si può posizionare una colonna di protezione tra il sistema di iniezione e la colonna analitica.

18.

Per preparare il solvente di eluizione, che viene degassato prima dell'uso, si utilizzano il metanolo per HPLC e l'acqua distillata o deionizzata. Si consiglia di optare per l'eluizione isocratica. Si devono usare rapporti metanolo/acqua con un contenuto minimo di acqua del 25 %. Normalmente, una miscela metanolo/acqua 3:1 (v/v) è soddisfacente per eluire sostanze aventi un log P pari a 6 in un'ora ad una portata di 1 ml/min. Per le sostanze con un log P superiore a 6 può essere necessario abbreviare il tempo di eluizione (e quello delle sostanze di riferimento) diminuendo la polarità della fase mobile oppure la lunghezza della colonna.

19.

La sostanza in esame e le sostanze di riferimento devono essere solubili nella fase mobile, in concentrazione sufficiente a consentirne la rilevazione. Solo in casi eccezionali si possono usare degli additivi con la miscela metanolo-acqua perché modificano le proprietà della colonna. In questi casi è necessario accertarsi che i tempi di ritenzione delle sostanze in esame e delle sostanze di riferimento non siano influenzati. Se la miscela metanolo-acqua non è appropriata, si possono usare altre miscele solvente organico-acqua, per esempio etanolo-acqua, acetonitrile-acqua o alcole isopropilico (2-propanolo)-acqua.

20.

Il pH dell'eluente è un fattore critico per le sostanze ionizzabili. Esso deve rientrare nell'intervallo operativo di pH della colonna, che di solito è compreso tra 2 e 8. Si raccomanda di tamponare la soluzione. Occorre aver cura di evitare la precipitazione di sali e il deterioramento della colonna che si verificano con alcune miscele di fase organica/tampone. Le misurazioni mediante HPLC con fasi stazionarie a base di silice al di sopra di pH 8 non sono generalmente consigliabili perché l'uso di una fase mobile alcalina può provocare un rapido deterioramento delle prestazioni della colonna.

21.

Le sostanze in esame e di riferimento devono essere sufficientemente pure per poter assegnare i picchi nei cromatogrammi alle rispettive sostanze. Le sostanze da usare a scopo di prova o di taratura devono, se possibile, essere disciolte nella fase mobile. Se si utilizza un solvente diverso dalla fase mobile per sciogliere le sostanze in esame e di riferimento, è necessario utilizzare la fase mobile per la diluizione finale prima dell'iniezione.

22.

Durante la misura le variazioni della temperatura non devono essere superiori a ± 1 °C.

23.

Il tempo morto t0 può essere misurato utilizzando sostanze organiche non ritenute (ad esempio tiourea o formammide). Un tempo morto più preciso può essere ottenuto dai tempi di ritenzione misurati o da una successione di circa 7 elementi di una serie omologa (ad esempio, n-alchilmetilchetoni) (17). I tempi di ritenzione tR (nC+ 1) sono tracciati in funzione di tR (nC), dove nC è il numero di atomi di carbonio. Si ottiene una retta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, dove A, che rappresenta k(nC + 1)/k(nC), è costante. Il tempo morto t0 è ottenuto dall'intercetta (1 – A)t0 e dal coefficiente angolare A.

24.

La fase successiva consiste nel tracciare un log di correlazione k in funzione di un log P per le sostanze di riferimento appropriate con valori di log P simili al valore previsto per la sostanza in esame. In pratica, sono iniettate simultaneamente da 6 a 10 sostanze di riferimento. La determinazione dei tempi di ritenzione è effettuata preferibilmente con un registratore-integratore collegato al sistema di rivelazione. I logaritmi corrispondenti dei fattori di capacità, log k, sono tracciati come una funzione di log P. L'equazione di regressione viene eseguita a intervalli regolari, almeno una volta al giorno, in modo da tenere conto di eventuali variazioni delle prestazioni della colonna.

25.

La sostanza in esame è iniettata nelle più piccole quantità rilevabili. Il tempo di ritenzione viene determinato in duplicato. Il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame è ottenuto mediante interpolazione del fattore di capacità calcolato sul grafico di taratura. Per coefficienti di ripartizione molto bassi o molto elevati è necessario ricorrere all'estrapolazione. In particolare in questi casi bisogna prestare attenzione ai limiti di confidenza della retta di regressione. Se il tempo di ritenzione del campione è al di fuori dell'intervallo dei tempi di ritenzione ottenuti per gli standard, è necessario specificare un valore limite.

26.

La relazione deve includere i seguenti elementi:

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459-1475.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Aggiornamento della linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 107 — Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361-386.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pestic. Sci. 17, 311-325.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pestic. Sci. 12, 219-277.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73-83.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals — Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). “Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20-24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). A User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683-691.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatog. 247, 1-13.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatog. 7, 675-689.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. J. Biomed. Mater. Res. 15, 787-793.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479-488.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromatog. 3, 1669-1686.

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 201 (2006; rettifica dell'allegato nel 2011). La revisione del metodo, nata dall'esigenza di includere nuove specie e aggiornarlo affinché soddisfi i requisiti relativi alla valutazione dei pericoli e alla classificazione delle sostanze chimiche, è stata effettuata sulla base di un'ampia esperienza pratica, del progresso scientifico nel settore degli studi di tossicità sulle alghe e di una estesa prassi normativa messa in atto fin dall'adozione del metodo iniziale.

2.

L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.

3.

La presente prova è finalizzata a determinare gli effetti di una sostanza chimica sulla crescita di microalghe di acqua dolce e/o cianobatteri. Gli organismi sperimentali in fase di crescita esponenziale sono esposti alla sostanza chimica in esame in colture batch per un periodo che dura normalmente 72 ore. Nonostante la durata relativamente breve della prova è possibile valutare gli effetti su diverse generazioni.

4.

La risposta del sistema consiste nella riduzione della crescita in una serie di colture di alghe (unità di prova) esposte a varie concentrazioni della sostanza chimica in esame. La risposta è valutata come funzione della concentrazione di esposizione rispetto alla crescita media di colture di controllo identiche non esposte (repliche). Per ottenere l'espressione completa della risposta del sistema agli effetti tossici (sensibilità ottimale), le colture sono poste in condizioni idonee a una crescita esponenziale senza limitazioni, fornendo una quantità sufficiente di nutrienti e un'illuminazione continua per un periodo sufficiente a misurare la riduzione del tasso di crescita specifico.

5.

La crescita e l'inibizione della crescita sono quantificate attraverso misurazioni della biomassa delle alghe in funzione del tempo. La biomassa delle alghe è espressa in peso secco per volume, per esempio mg di alghe per litro di soluzione di prova. Dato tuttavia che è difficile misurare il peso secco, si ricorre a parametri alternativi, quali il conteggio delle cellule, che è quello più utilizzato, il volume cellulare, la fluorescenza, la densità ottica ecc. Il fattore di conversione del parametro alternativo misurato in biomassa deve essere noto.

6.

L'endpoint della prova è l'inibizione della crescita, espressa come l'aumento logaritmico della biomassa (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A partire dai tassi di crescita specifici medi registrati in una serie di soluzioni di prova si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del tasso di crescita (per esempio 50 %), espressa come ErCx (per esempio ErC50).

7.

Un'altra variabile di risposta considerata nel presente metodo è il rendimento, che può essere necessario utilizzare per soddisfare requisiti normativi specifici di alcuni paesi. È definito come la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e la biomassa all'inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del rendimento (per esempio 50 %), espressa come EyCx (per esempio EyC50).

8.

Si possono inoltre determinare mediante un calcolo statistico la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).

9.

Le informazioni sulla sostanza chimica in esame che possono essere utili per stabilire le condizioni sperimentali comprendono la formula strutturale, la purezza, la stabilità alla luce, la stabilità alle condizioni sperimentali, le proprietà di assorbimento della luce, la pKa e i risultati degli studi di trasformazione, inclusa la biodegradabilità nell'acqua.

10.

Occorre conoscere l'idrosolubilità, il coefficiente di partizione ottanolo/acqua (Pow) e la pressione di vapore della sostanza chimica in esame e disporre di un metodo convalidato per la quantificazione della sostanza chimica nelle soluzioni di prova, metodo di cui devono essere noti l'efficienza di recupero e il limite di rilevamento.

11.

Affinché la prova sia valida devono essere soddisfatti i criteri di esecuzione seguenti:

12.

La procedura sperimentale può essere verificata saggiando una o più sostanze chimiche di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (1). Anche il dicromato di potassio può essere utilizzato come sostanza chimica di riferimento per le alghe verdi. È preferibile effettuare una prova con una sostanza chimica di riferimento almeno due volte all'anno.

13.

Il presente metodo di prova si presta soprattutto per le sostanze chimiche idrosolubili le quali, alle condizioni sperimentali, con tutta probabilità permangono nell'acqua. Per saggiare sostanze chimiche volatili, fortemente adsorbenti, colorate, a bassa idrosolubilità oppure sostanze chimiche che possono influire sulla disponibilità dei nutrienti o dei minerali nel mezzo di prova, possono essere necessarie determinate modifiche della procedura descritta (per esempio sistema chiuso, condizionamento dei recipienti di prova). Nei riferimenti bibliografici (2)(3) e (4) si trovano orientamenti sulle eventuali modifiche da apportare.

14.

I recipienti e le altre apparecchiature destinate a entrare in contatto con le soluzioni di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Gli strumenti devono essere lavati accuratamente per assicurare che nessun contaminante organico o inorganico possa interferire con la crescita delle alghe o la composizione delle soluzioni di prova.

15.

I recipienti sono in genere beute in vetro di dimensioni tali da contenere i volumi di coltura necessari per le misurazioni da effettuare durante la prova e garantire una superficie di contatto sufficiente per il trasferimento massico di CO2 dall'atmosfera (cfr. paragrafo 30). Si noti che il volume di liquido deve essere tale da permettere le determinazioni analitiche (cfr. paragrafo 37).

16.

Sono inoltre necessarie alcune o tutte le seguenti apparecchiature:

17.

Possono essere utilizzate diverse specie di microalghe e di cianobatteri che non formano aggregati. I ceppi di cui all'appendice 2 sono risultati adatti alla procedura sperimentale del presente metodo di prova.

18.

Se si utilizzano altre specie, devono essere indicati il ceppo e/o la provenienza. È necessario confermare che la crescita esponenziale dell'alga selezionata per la prova può essere mantenuta per tutta la durata della prova nelle condizioni applicate.

19.

Si consigliano due mezzi di crescita alternativi: il mezzo dell'OCSE e il mezzo AAP. Le composizioni di entrambi i mezzi sono illustrate nell'appendice 3. Si fa presente che il valore iniziale del pH e la capacità tampone (regolazione dell'aumento del pH) di questi due mezzi sono diversi. I risultati delle prove possono pertanto variare in funzione del mezzo utilizzato, soprattutto nelle prove su sostanze chimiche ionizzanti.

20.

Può essere talvolta necessario modificare il mezzo di crescita, ad esempio se si saggiano metalli o agenti chelanti oppure se la prova è eseguita con diversi valori di pH. L'uso di un mezzo modificato deve essere descritto con precisione e giustificato (3)(4).

21.

La biomassa iniziale deve essere la stessa in tutte le colture e sufficientemente bassa da permettere una crescita esponenziale per tutto il periodo di incubazione senza il rischio di esaurimento dei nutrienti. La biomassa iniziale non deve superare 0,5 mg/l in peso secco. Si raccomandano le seguenti concentrazioni iniziali di cellule:

22.

L'intervallo di concentrazione entro il quale possono verificarsi degli effetti può essere determinato in base ai risultati di precedenti prove a diversi intervalli di concentrazione. Per la prova definitiva si devono scegliere almeno cinque concentrazioni in progressione geometrica, con un fattore di separazione non superiore a 3,2. Un fattore più elevato può essere giustificato per le sostanze chimiche in esame la cui curva concentrazione-risposta è nulla. Le serie di concentrazioni devono di preferenza coprire l'intervallo che causa un'inibizione del 5 % - 75 % del tasso di crescita delle alghe.

23.

Il disegno sperimentale deve comprendere tre repliche per ogni concentrazione di prova. Se non è necessario determinare la NOEC, il disegno sperimentale può essere modificato in modo da aumentare il numero delle concentrazioni e ridurre il numero delle repliche per concentrazione. Le repliche dei controlli devono essere almeno tre e, idealmente, il doppio delle repliche utilizzate per ogni concentrazione di prova.

24.

Una serie a parte di soluzioni di prova può essere preparata per le determinazioni analitiche delle concentrazioni della sostanza chimica in esame (cfr. paragrafi 36 e 38).

25.

Quando la sostanza chimica in esame è solubilizzata con un solvente il disegno sperimentale deve includere controlli supplementari contenenti il solvente alla stessa concentrazione utilizzata nelle colture di prova.

26.

Per adattare le alghe alle condizioni sperimentali e garantire che siano nella fase di crescita esponenziale quando sono utilizzate per inoculare le soluzioni di prova, 2-4 giorni prima dell'inizio della prova si prepara una coltura di inoculo nel mezzo di prova. La biomassa delle alghe deve essere adattata affinché la coltura di inoculo mantenga una crescita esponenziale fino al momento in cui ha inizio la prova. La coltura di inoculo è incubata alle stesse condizioni delle colture di prova. Occorre misurare l'aumento della biomassa nella coltura di inoculo per verificare che, nelle condizioni di coltura, la crescita segua un andamento normale per il ceppo in esame. L'appendice 4 presenta un esempio di metodo di coltura delle alghe. Per evitare divisioni sincrone delle cellule durante la prova può essere necessaria una seconda fase di propagazione della coltura di inoculo.

27.

Tutte le soluzioni di prova devono contenere le stesse concentrazioni del mezzo di crescita e la stessa biomassa iniziale delle alghe utilizzate per la prova. Le soluzioni delle concentrazioni prescelte sono di solito preparate mescolando una soluzione madre della sostanza chimica in esame con il mezzo di crescita e la coltura di inoculo. Di solito le soluzioni madri sono preparate sciogliendo la sostanza nel mezzo di prova.

28.

Solventi quali acetone, alcol t-butilico e dimetilformammide possono essere utilizzati come veicoli per aggiungere sostanze chimiche a bassa idrosolubilità nel mezzo di prova (2)(3). La concentrazione di solvente non deve superare 100 μl/l e deve essere identica in tutte le colture (comprese quelle dei controlli).

29.

I recipienti di prova, chiusi con coperchi permeabili all'aria, sono agitati e collocati nell'incubatore. Durante la prova è necessario mantenere le alghe in sospensione e agevolare il trasferimento di CO2. A tal fine i recipienti sono agitati oppure il loro contenuto è rimescolato in permanenza. Le colture vanno mantenute ad una temperatura compresa tra 21 e 24 °C, con variazione ammissibile di ± 2 °C. Per le specie diverse da quelle di cui all'appendice 2, come per esempio le specie tropicali, può essere necessario utilizzare temperature più elevate, a condizione che i criteri di validità siano rispettati. Si raccomanda di disporre le beute all'interno dell'incubatore in maniera casuale e di cambiarne ogni giorno la posizione.

30.

Il pH del mezzo dei controlli non deve aumentare di oltre 1,5 unità durante la prova. Per i metalli e le sostanze chimiche che in parte ionizzano a un pH prossimo a quello della prova può essere necessario limitare l'evoluzione del pH per ottenere risultati riproducibili e chiaramente definiti. Un'evoluzione del pH inferiore a 0,5 unità è tecnicamente fattibile e può essere ottenuta inducendo un tasso adeguato di trasferimento massico di CO2 dall'aria circostante alla soluzione di prova, per esempio aumentando l'intensità dell'agitazione. Un'altra possibilità consiste nel ridurre la domanda di CO2 diminuendo la biomassa iniziale o la durata della prova.

31.

La superficie su cui le colture sono incubate deve ricevere un'illuminazione fluorescente, continua ed uniforme, per esempio del tipo “bianca fredda” o “naturale”. I requisiti di illuminazione variano in funzione dei ceppi di alghe e cianobatteri utilizzati. L'intensità della luce deve essere adeguata all'organismo sperimentale utilizzato. Per le specie di alghe verdi raccomandate l'intensità della luce a livello delle soluzioni di prova deve essere scelta nell'intervallo 60-120 μE · m– 2 · s– 1, misurata nell'intervallo di lunghezza d'onda che consente la fotosintesi (400-700 nm) con un recettore adeguato. Alcune specie, in particolare l'Anabaena flos-aquae, crescono bene con un'intensità luminosa più bassa e possono essere danneggiate da intensità elevate. Per queste specie occorre utilizzare un'intensità luminosa media compresa tra 40 e 60 μE · m– 2 · s– 1 (per quanto riguarda gli strumenti di misurazione calibrati in lux, l'intensità luminosa raccomandata di 60-120 μE · m– 2 · s– 1 corrisponde a circa 4 440 — 8 880 lux per la luce bianca fredda). Sulla zona di incubazione l'intensità luminosa non deve discostarsi più di ±15 % dall'intensità luminosa media.

32.

La prova dura normalmente 72 ore, ma è possibile prolungarla o accorciarla a condizione che tutti i criteri di validità di cui al paragrafo 11 siano rispettati.

33.

La biomassa delle alghe in ogni recipiente è determinata almeno una volta al giorno durante il periodo di prova. Se le misurazioni sono effettuate su piccoli volumi prelevati dalla soluzione di prova con una pipetta, tali volumi non devono essere rimessi nella soluzione.

34.

La biomassa è misurata mediante conteggio manuale delle cellule al microscopio o con un contatore elettronico di particelle (conteggio delle cellule e/o biovolume). È possibile utilizzare tecniche alternative, come per esempio la citometria a flusso, la fluorescenza clorofilliana in vitro o in vivo (5)(6) o la densità ottica, a condizione di poter dimostrare che esiste una correlazione soddisfacente con la biomassa per la gamma dei valori della biomassa della prova.

35.

Il pH delle soluzioni è misurato all'inizio e alla fine della prova.

36.

Se si dispone di un metodo per analizzare la sostanza chimica in esame nell'intervallo di concentrazione utilizzato, occorre analizzare le soluzioni di prova per verificare le concentrazioni iniziali e il mantenimento delle concentrazioni di esposizione durante la prova.

37.

Se si presume che le concentrazioni di esposizione della sostanza chimica in esame non si discostino più del 20 % dai valori nominali durante la prova, può essere sufficiente analizzare all'inizio e alla fine della prova una concentrazione alta, una bassa e una intorno al valore EC50 previsto. Si raccomanda di analizzare tutte le concentrazioni all'inizio e alla fine della prova se si presume che non si situeranno nell'intervallo dell'80-120 % della concentrazione nominale. Per le sostanze chimiche in esame volatili, instabili o fortemente adsorbenti si raccomanda di prelevare campioni aggiuntivi da analizzare ogni 24 ore durante il periodo di esposizione per definire con maggiore precisione la perdita della sostanza chimica in esame. Per queste sostanze potrebbe essere necessario aumentare il numero delle repliche. In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza chimica in esame è da effettuarsi soltanto in uno dei recipienti replicati (o nel contenuto mescolato di tutti i recipienti replicati).

38.

I mezzi di prova appositamente preparati per l'analisi delle concentrazioni di esposizione durante la prova devono essere trattati come quelli utilizzati per le prove, devono cioè essere inoculati con alghe e incubati alle stesse condizioni. Se occorre analizzare la concentrazione della sostanza chimica in esame disciolta, può essere necessario separare le alghe dal mezzo. A tal fine è preferibile procedere per centrifugazione a bassa velocità, sufficiente per far sedimentare le alghe.

39.

Se è dimostrato che per tutta la durata della prova la concentrazione della sostanza chimica in esame non è variata più di ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata inizialmente, l'analisi dei risultati può essere basata sui valori nominali o su quelli misurati inizialmente. Se la variazione rispetto alla concentrazione nominale o a quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati deve basarsi sulla media geometrica della concentrazione durante l'esposizione o su modelli che descrivono la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (3)(7).

40.

La prova di inibizione della crescita delle alghe è un sistema sperimentale più dinamico di altre prove di tossicità acquatica a breve termine. Di conseguenza può essere difficile determinare le concentrazioni reali di esposizione, soprattutto per le sostanze adsorbenti esaminate a basse concentrazioni. In questi casi, la scomparsa della sostanza chimica in esame dalla soluzione per adsorbimento sulla biomassa delle alghe in crescita non significa che essa sia scomparsa dal sistema sperimentale. All'atto di analizzare il risultato della prova è opportuno verificare se la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame durante la prova è accompagnata dalla diminuzione dell'inibizione della crescita. Se così fosse si potrebbe considerare l'applicazione di un modello adeguato per descrivere la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (7). In caso contrario, può essere opportuno basare l'analisi dei risultati sulle concentrazioni iniziali (nominali o misurate).

41.

Si osserva al microscopio la coltura di inoculo per verificare che presenti un aspetto normale e sano e osservare eventuali anomalie delle alghe (che potrebbero essere causate dall'esposizione alla sostanza chimica in esame) alla fine della prova.

42.

In determinate circostanze, per esempio quando una prova preliminare indica che la sostanza chimica in esame non ha effetti tossici in concentrazioni fino a 100 mg/l o fino al suo limite di solubilità nel mezzo di prova (si scelga il valore più basso), può essere svolta una prova limite che consiste nel confrontare le risposte di un gruppo di controllo e di un gruppo trattato (a una concentrazione di 100 mg/l o pari al limite di solubilità). È vivamente raccomandato che l'assenza di tossicità sia corroborata da un'analisi della concentrazione di esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero delle repliche trattate, che devono essere almeno sei. Le variabili di risposta osservate nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato possono essere analizzate con una prova statistica che consenta di confrontare le medie, per esempio con un test t di Student. Se le varianze dei due gruppi sono ineguali, si esegue un test t adattato per varianze ineguali.

43.

La biomassa dei recipienti di prova può essere espressa nell'unità del parametro alternativo utilizzato per misurarla (per esempio, numero di cellule, fluorescenza).

44.

Per rappresentare graficamente le curve di crescita si riportano in tabelle la concentrazione stimata della biomassa delle colture di prova e dei controlli, le concentrazioni del materiale in esame e i tempi delle misurazioni, approssimati almeno all'ora. In questa prima fase si potrà utilizzare sia la scala lineare che quella logaritmica, ma quest'ultima è obbligatoria e in genere rappresenta meglio le variazioni del ritmo di crescita nell'arco della prova. Si osservi che la crescita esponenziale rappresentata in scala logaritmica risulta in una retta la cui pendenza indica il tasso di crescita specifico.

45.

Utilizzando i grafici, verificare se le colture dei controlli si sviluppano al tasso esponenziale previsto nel corso dell'intera prova. Studiare con attenzione tutti i punti e l'aspetto globale dei grafici, nonché verificare i dati grezzi e i procedimenti utilizzati, per rilevare eventuali errori. Verificare in particolare tutti i punti che sembrano discostarsi per un errore sistematico. Se l'individuazione degli errori del procedimento è palese e/o la probabilità di occorrenza di questi errori è elevata, il punto in causa deve essere evidenziato come valore anomalo e non deve essere incluso nella successiva analisi statistica (una concentrazione algale nulla in una delle due o tre repliche può indicare che l'inoculo non è avvenuto correttamente o che il recipiente non è stato pulito bene). Le ragioni che giustificano l'esclusione di un punto perché considerato valore anomalo devono essere esposte chiaramente nella relazione sulla prova. Sono accettate soltanto le ragioni dovute a (rari) errori metodologici e non a mera mancanza di precisione. I metodi statistici di identificazione dei valori anomali presentano un'utilità limitata per questo tipo di problema e non possono sostituire il giudizio di un esperto. È preferibile mantenere i valori anomali (segnalati come tali) tra i punti presentati su eventuali grafici o tabelle.

46.

La prova è intesa a determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla crescita delle alghe. Il presente metodo di prova descrive due variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione di entrambe le variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito:

47.

Si fa presente che i valori di tossicità calcolati utilizzando queste due variabili di risposta non sono comparabili, per cui occorre tenere conto di questa differenza al momento di utilizzare i risultati della prova. I valori dell'ECx basati sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (EyCx), se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non va considerata una differenza di sensibilità tra le due suddette variabili di risposta. Il concetto di tasso di crescita specifico medio si basa sull'andamento generale della crescita esponenziale delle alghe in colture non soggette a limitazioni; la tossicità è valutata in base agli effetti sul tasso di crescita senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico dei controlli, della pendenza della curva concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sulla variabile di rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. L'EyCx dipende dal tasso di crescita specifico della specie di alga utilizzata in ciascuna prova e dal tasso di crescita specifico massimo, che può variare da una specie di alga all'altra o persino da un ceppo all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche di specie o ceppi diversi di alga. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, stimare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, per i soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi il presente metodo di prova include anche la stima basata sul rendimento.

48.

Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è calcolato in funzione dell'aumento logaritmico della biomassa, utilizzando la seguente equazione per ciascuna replica dei gruppi di controllo e dei gruppi trattati [1]:

dove:

Per ciascun gruppo trattato e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita e le relative stime della varianza.

49.

Calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero periodo di prova (in genere dal giorno 0 al giorno 3), prendendo come valore di partenza il valore nominale della biomassa inoculata anziché il suo valore misurato, poiché di norma ciò permette di ottenere una maggiore precisione. Se lo strumento utilizzato per misurare la biomassa consente di determinare con sufficiente precisione una piccola biomassa di inoculo (per esempio un citometro a flusso), è possibile utilizzare il valore misurato della concentrazione iniziale della biomassa. Valutare anche il tasso di crescita in ogni sezione della prova, calcolato come il tasso di crescita specifico di ciascun giorno di prova (giorni 0-1, 1-2 e 2-3) e verificare se il tasso di crescita dei controlli rimane costante (cfr. i criteri di validità, paragrafo 11). Un tasso di crescita specifico del primo giorno sensibilmente inferiore al tasso di crescita specifico medio può indicare una fase di latenza. Sebbene sia possibile ridurre al minimo e praticamente eliminare la fase di latenza nelle colture di controllo mediante un'adeguata propagazione della precoltura, la presenza di una fase di latenza nelle colture trattate può essere indizio di una fase di recupero successiva ad uno choc tossico iniziale oppure di un'esposizione ridotta causata da una perdita della sostanza chimica in esame (anche per assorbimento sulla biomassa delle alghe) dopo l'esposizione iniziale. Il tasso di crescita sezione per sezione permette quindi di studiare i vari effetti della sostanza chimica in esame durante il periodo di esposizione. Una differenza significativa tra il tasso di crescita sezione per sezione e il tasso di crescita medio indica l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, il che richiede un attento esame delle curve di crescita.

50.

Si calcola la percentuale di inibizione del tasso di crescita per ciascuna replica del gruppo trattato utilizzando la seguente equazione [2]:

dove:

51.

Se le soluzioni di prova sono preparate utilizzando un solvente, per calcolare la percentuale di inibizione si devono utilizzare i controlli con solvente anziché i controlli senza solvente.

52.

Il rendimento è calcolato come differenza tra la biomassa alla fine della prova e la biomassa all'inizio della prova per ciascun recipiente del gruppo trattato e di controllo. Per ogni concentrazione di prova e di controllo si calcola un valore medio di rendimento e le relative stime della varianza. La percentuale di inibizione del rendimento (%Iy) può essere calcolata per ciascuna replica del gruppo trattato, secondo la seguente formula:

dove:

53.

Riportare su un grafico la percentuale di inibizione in funzione del logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame e osservare con attenzione i punti ottenuti, senza tenere conto dei punti eliminati perché considerati valori anomali durante la prima fase. Tracciare, manualmente o con programma informatico d'interpolazione, una curva approssimata tra i punti per ottenere una prima impressione del rapporto concentrazione-risposta e successivamente procedere con un metodo più esatto, di preferenza un metodo statistico computerizzato. In funzione dell'uso al quale i dati sono destinati, della qualità (precisione) e della quantità dei dati, nonché della disponibilità di strumenti di analisi dei dati, si potrà decidere (a giusto titolo in alcuni casi) di interrompere l'analisi dei dati in questa fase e considerare soltanto le cifre chiave, vale a dire i valori EC50 e EC10 (e/o EC20), della curva interpolata manualmente (cfr. anche la sezione sottostante sugli effetti stimolatori). Vi sono valide ragioni per non ricorrere ad un metodo statistico, tra le quali:

54.

L'obiettivo consiste nel descrivere in maniera quantitativa, mediante un'analisi della regressione, la relazione concentrazione-risposta. È possibile utilizzare una regressione lineare ponderata, preceduta da una trasformazione di linearizzazione dei valori che descrivono la risposta osservata — per esempio in unità probit, logit o Weibull (8), ma è preferibile applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle irregolarità inevitabili dei dati e degli scarti rispetto alle distribuzioni regolari. Vicine allo zero o all'inibizione totale, queste irregolarità possono essere amplificate dalla trasformazione e interferire con l'analisi (8). Si fa presente che i metodi analitici standard che utilizzano le trasformazioni probit, logit o Weibull si applicano a dati quantali (per esempio, mortalità o sopravvivenza) e devono quindi essere modificati per poter essere utilizzati con i dati relativi alla crescita o alla biomassa. Per le procedure specifiche che consentono di determinare i valori dell'ECx a partire da dati continui si vedano i riferimenti (9)(10) e (11). L'uso di un'analisi della regressione non lineare è descritto nel dettaglio nell'appendice 5.

55.

Per ciascuna variabile di risposta da analizzare, si utilizza il rapporto concentrazione-risposta per stimare i valori puntuali dell'ECx. Laddove possibile per ogni stima si determinano i limiti di confidenza a 95 %. La corrispondenza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione deve essere valutata graficamente o con metodi statistici. L'analisi della regressione deve essere effettuata basandosi sulle risposte rilevate in ogni replica e non sulle medie dei gruppi trattati. Tuttavia, se risulta difficile o impossibile costruire una curva interpolante perché i dati sono troppo dispersi, si può ricorrere ad una regressione sulle medie dei gruppi in modo da ridurre l'influenza dei valori che potrebbero essere anomali. Il ricorso a questa opzione, che si discosta dalla procedura normale, deve essere indicato nella relazione di prova e motivato dall'impossibilità di interpolare la curva dei valori delle singole repliche con risultati soddisfacenti.

56.

Le stime dell'EC50 e i limiti di confidenza possono essere ottenuti anche mediante interpolazione lineare con bootstrapping (13), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.

57.

Per stimare la LOEC, e dunque la NOEC, per quanto riguarda gli effetti della sostanza chimica in esame sul tasso di crescita, è necessario paragonare le medie dei gruppi trattati mediante un'analisi della varianza (ANOVA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli ricorrendo a un metodo adeguato di comparazione multipla o di analisi della tendenza. A questo proposito possono risultare utili i test di Dunnett o di William (12)(14)(15)(16)(17). È necessario valutare se l'ipotesi di omogeneità della varianza dell'ANOVA è fondata, valutazione che può essere effettuata graficamente oppure con una prova formale (17), ad esempio con i test di Levene o di Bartlett. in particolare tramite il test di Levene. Se l'ipotesi dell'omogeneità della varianza non si conferma, può essere talvolta utile correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. Se l'eterogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta con una trasformazione, si prenderanno in considerazione metodi di analisi della tendenza come, ad esempio, i test di tendenza regressivi di Jonckheere. Il riferimento bibliografico (11) fornisce ulteriori informazioni sulla determinazione della NOEC.

58.

Alcuni sviluppi scientifici recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare l'abbandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali della CEx basate sulla regressione. Per questa prova sulle alghe non è stato definito alcun valore appropriato di x. Tuttavia, un intervallo tra il 10 e il 20 % sembra appropriato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile riportare sia l'EC10 sia l'EC20.

59.

Si osserva talvolta una stimolazione della crescita (inibizione negativa) a basse concentrazioni. Questo fenomeno può derivare da ormesi (“stimolazione tossica”) o dall'introduzione di fattori di stimolazione della crescita, trasportati dal materiale in esame, nel mezzo utilizzato. Si fa presente che l'aggiunta di sostanze nutritive inorganiche non dovrebbe esercitare alcun effetto diretto dato che per tutta la prova il mezzo mantiene sostanze nutritive in eccesso. La stimolazione a basse concentrazioni può essere generalmente ignorata nei calcoli dell'EC50, a meno che sia estrema. Tuttavia, se tale stimolazione è estrema o quando il valore x nell'ECx da calcolare è basso, potrebbero essere necessarie procedure particolari. Si eviti, per quanto possibile, di eliminare semplicemente dall'analisi dei dati le risposte della stimolazione e, se il software di interpolazione della curva non è in grado di trattare gli effetti di tale stimolazione di lieve entità, si può fare ricorso a un'interpolazione lineare con bootstrapping. Se la stimolazione è estrema, è possibile considerare l'uso di un modello di ormesi (18).

60.

I materiali in esame che assorbono la luce possono causare una diminuzione del tasso di crescita per effetto della riduzione della quantità di luce disponibile. Occorre distinguere questi tipi di effetti fisici dagli effetti tossici modificando le condizioni sperimentali e riportandoli separatamente nella relazione. I riferimenti (2) e (3) forniscono orientamenti al riguardo.

61.

La relazione sulla prova deve includere le informazioni indicate di seguito.

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 209 (2010). Si tratta della descrizione di un metodo per la determinazione degli effetti di una sostanza chimica sui microrganismi dei fanghi attivi (in gran parte batteri), misurandone i tassi di respirazione (ossidazione del carbonio e/o dell'ammonio) in determinate condizioni in presenza di diverse concentrazioni della sostanza in esame. Il metodo di prova si basa sul test messo a punto dall'ETAD (The Ecological and Toxicological Association of Dyes and Organic Pigments Manufacturers) (1) e (2), sulla precedente linea guida dell'OCSE n. 209 (3) e sulla norma ISO 8192 rivista (4). Il metodo di prova ha lo scopo di fornire un procedimento rapido di screening per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui microrganismi dei fanghi attivi nella fase biologica (aerobica) dei trattamenti negli impianti di depurazione delle acque reflue. I risultati della prova possono anche servire da indicatore delle concentrazioni idonee e non inibitrici delle sostanze chimiche in esame da utilizzare nelle prove di biodegradabilità (ad esempio i capitoli C.4 A-F, C.9, C.10, C.12 e C.29 del presente allegato, la linea guida OCSE n. 302C). In tal caso, la prova può essere eseguita come prova di screening, simile a una prova di definizione dell'intervallo delle concentrazioni o a una prova limite (cfr. paragrafo 39), prendendo in considerazione unicamente la respirazione totale. Tuttavia, è opportuno tener conto con cautela di queste informazioni per le prove di pronta biodegradabilità (cfr. capitolo C.4, A-F, e capitolo C.29 del presente allegato), per le quali la concentrazione dell'inoculo è significativamente inferiore a quella utilizzata nel presente metodo di prova. Infatti, l'assenza di inibizione in questa prova di respirazione non garantisce automaticamente condizioni inibitorie nelle prove di pronta biodegradabilità dei capitoli C.4, A-F, o C.29 del presente allegato.

2.

Nel complesso, la prova di inibizione della respirazione sembra essere stata applicata con successo da quando è stata pubblicata per la prima volta, ma in alcuni casi sono stati segnalati risultati spuri, ad esempio (2) (4) (5). Quindi, le curve di respirazione in funzione della concentrazione a volte risultano bifasiche, i tracciati dose-risposta possono essere distorti e i valori EC50 sono risultati inaspettatamente bassi (5). Dalle indagini è emerso che tali risultati si ottengono in caso di prove su fanghi attivi notevolmente nitrificanti e se la sostanza chimica in esame ha un effetto maggiore sull'ossidazione dell'ammonio che sulla generale ossidazione eterotrofica. Pertanto, è possibile ovviare ai risultati spuri mediante ulteriori prove, utilizzando un apposito inibitore della nitrificazione. Misurando il tasso di consumo di ossigeno in presenza e in assenza di un inibitore (ad esempio N-alliltiourea, ATU), è possibile calcolare il tasso di consumo di ossigeno, rispettivamente, dell'ossidazione totale, dell'ossidazione eterotrofica e della nitrificazione (4) (7) (8). È dunque possibile determinare gli effetti inibitori della sostanza chimica in esame sui due processi ed è possibile calcolare con il metodo classico i valori EC50 sia per l'ossidazione del carbonio organico (eterotrofica) sia per l'ossidazione dell'ammonio (nitrificazione). Va osservato che in alcuni rari casi, l'effetto inibitorio della N-alliltiourea può essere parzialmente o completamente annullato se essa forma dei complessi con le sostanze chimiche in esame o con un additivo del mezzo, per esempio gli ioni Cu++(6). Gli ioni Cu++ sono essenziali per le Nitrosomonas, ma sono tossici in concentrazioni elevate.

3.

La necessità di ricorrere alla nitrificazione nel trattamento aerobico delle acque reflue, in quanto tappa necessaria nel processo di eliminazione dei composti azotati dalle acque reflue mediante denitrificazione e ottenimento di prodotti gassosi, è diventato particolarmente urgente nei paesi europei; l'UE ha attualmente abbassato i limiti massimi di concentrazione dell'azoto negli effluenti trattati riversati nelle acque riceventi (5).

4.

Nella maggior parte dei casi, è sufficiente ricorrere solo al metodo per valutare l'effetto sui processi di ossidazione del carbonio organico. Tuttavia, in alcuni casi è necessario esaminare l'effetto sulla sola nitrificazione, o, separatamente, sulla nitrificazione e sull'ossidazione del carbonio organico, per poter interpretare i risultati e comprendere gli effetti.

5.

I tassi di respirazione dei campioni di fanghi attivi alimentati con liquami artificiali sono misurati in una cella chiusa contenente un elettrodo a ossigeno, dopo un periodo di contatto di 3 ore. Per uno scenario d'esposizione realistico, potrebbero essere appropriati dei tempi di contatto più lunghi. Se la sostanza chimica in esame è rapidamente degradata, ad esempio tramite idrolisi abiotica, oppure presenta una volatilità che non permette di mantenerne adeguatamente la concentrazione, è possibile anche utilizzare un tempo di esposizione più corto, ad esempio 30 minuti. Il giorno stesso dell'esposizione occorre controllare la sensibilità di ciascun lotto di fanghi attivi, tramite una sostanza chimica di riferimento adeguata. La prova serve generalmente a determinare il valore ECx (per esempio EC50) della sostanza chimica in esame e/o la sua concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).

6.

È possibile determinare separatamente l'inibizione del consumo di ossigeno da parte dei microrganismi che ossidano il carbonio organico e dei microrganismi che ossidano l'ammonio, ricorrendo alla misura dei tassi di assorbimento di ossigeno in assenza e in presenza di N-alliltiourea, un inibitore specifico dell'ossidazione dell'ammonio in nitriti da parte dei batteri nitrificanti della prima fase. In questo caso la percentuale di inibizione del tasso di consumo di ossigeno è calcolata comparando il tasso di consumo di ossigeno in presenza della sostanza chimica in esame con il tasso medio di consumo di ossigeno dei controlli corrispondenti senza la sostanza chimica in esame, sia in presenza sia in assenza dell'inibitore specifico (N-alliltiourea).

7.

Il calcolo del tasso di consumo di ossigeno in miscele acquose contenenti la sostanza chimica in esame e liquame artificiale, senza i fanghi attivi, permette di determinare ogni consumo di ossigeno derivante da processi abiotici.

8.

È necessario disporre dell'identificazione chimica (di preferenza il numero CAS), del nome (di preferenza il nome IUPAC), delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, tensione di vapore, volatilità e adsorbimento della sostanza chimica in esame, in modo da permettere la corretta interpretazione dei risultati. Le sostanze chimiche volatili non possono normalmente essere sottoposte a prova in modo adeguato, se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. paragrafo 21).

9.

Il metodo di prova può essere applicato alle sostanze chimiche idrosolubili, scarsamente solubili e volatili. Tuttavia, non è sempre possibile ottenere i valori EC50 con sostanze chimiche limitatamente solubili; inoltre, è possibile ottenere risultati validi con sostanze chimiche volatili soltanto a condizione che la maggior parte (per esempio > 80 %) della sostanza chimica in esame rimanga nella miscela di reazione alla fine del o dei periodi di esposizione. In caso di incertezza sulla stabilità o volatilità della sostanza chimica in esame, è necessario fornire dati analitici supplementari che permettano di stabilire la concentrazione corrispondente di ECx.

10.

Le sostanze chimiche di riferimento devono essere testate periodicamente al fine di garantire che il metodo e le condizioni di prova siano affidabili, e per verificare la sensibilità di ciascun lotto di fanghi attivi utilizzati come inoculo batterico il giorno stesso dell'esposizione. La sostanza raccomandata come sostanza chimica inibitrice di riferimento è il 3,5-diclorofenolo (3,5-DCP), in quanto si tratta di un noto inibitore della respirazione e viene utilizzato in vari tipi di prove di inibizione/tossicità (4). Anche il solfato di rame (II) pentaidrato può essere utilizzato come sostanza chimica di riferimento per l'inibizione della respirazione totale (9). La N-metilanilina può essere utilizzata come inibitore di riferimento specifico della nitrificazione (4).

11.

Il tasso di consumo di ossigeno dei controlli in bianco (senza la sostanza chimica in esame o la sostanza chimica di riferimento) non deve essere inferiore a 20 mg di ossigeno per un grammo di fanghi attivi (peso secco dei solidi sospesi) all'ora. Se il tasso è inferiore, la prova deve essere ripetuta con fanghi attivi lavati o con fanghi provenienti da un'altra fonte. Il coefficiente di variazione del tasso di consumo di ossigeno nei controlli replicati non deve superare il 30 % alla fine della prova definitiva.

12.

Nel 2004, in una prova interlaboratorio internazionale organizzata dall'ISO (4) che utilizzava fanghi attivi provenienti da liquami domestici, il valore EC50 del 3,5-DCP è risultato essere compreso nell'intervallo tra 2 mg/l e 25 mg/l per la respirazione totale, tra 5 mg/l e 40 mg/l per la respirazione eterotrofica e tra 0,1 mg/l e 10 mg/l per la respirazione legata alla nitrificazione. Se il valore EC50 del 3,5-DCP non si situa nell'intervallo previsto, occorre ripetere la prova con fanghi attivi provenienti da un'altra fonte. Il valore EC50 del solfato di rame (II) pentaidrato deve essere compreso nell'intervallo 53-155 mg/l per la respirazione totale (9).

13.

Occorre utilizzare normali apparecchiature di laboratorio e quanto indicato di seguito:

14.

Occorre utilizzare sempre reagenti di grado analitico.

15.

Utilizzare acqua distillata o deionizzata, contenente meno di 1 mg/l di DOC, salvo quando viene prescritto l'uso di acqua di rubinetto non clorata.

16.

La composizione qualitativa e quantitativa del mezzo è la seguente:

17.

Questa soluzione deve avere un PH pari a 7,5 ± 0,5. Se non viene utilizzata subito, la soluzione preparata dovrà essere conservata al buio a temperature comprese tra 0 °C e 4 °C per una settimana al massimo, o in condizioni tali da non subire alterazioni nella composizione. Occorre osservare che questo liquame artificiale è 100 volte più concentrato di quello descritto nella relazione tecnica dell'OCSE “Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents”, dell'11 giugno 1976, con inoltre l'aggiunta di idrogenofosfato dipotassico.

18.

In alternativa, i componenti del mezzo di coltura possono essere sterilizzati individualmente prima dello stoccaggio, oppure il peptone e l'estratto di carne possono essere aggiunti poco prima di effettuare l'analisi. Prima dell'uso, il mezzo deve essere accuratamente mescolato ed il suo pH dovrà essere corretto se necessario fino a portarlo a 7,5 ± 0,5.

19.

Per le sostanze in esame facilmente solubili in acqua va preparata una soluzione madre, a una concentrazione che non ecceda il limite di solubilità in acqua (per evitare precipitazioni). Le sostanze scarsamente solubili in acqua, le miscele a base di componenti di varia solubilità e le sostanze adsorbenti vanno pesate direttamente nei recipienti di prova. In casi simili, il ricorso a soluzioni madre può costituire un'alternativa valida se, prima di aggiungere i fanghi attivi, viene svolta un'analisi delle concentrazioni delle sostanze chimiche in esame disciolte nei recipienti di prova. Se si ricorre al metodo Water Accommodated Fractions (WAF), è altresì necessario determinare analiticamente le concentrazioni delle sostanze chimiche in esame disciolte nei recipienti di prova. Occorre evitare di utilizzare solventi organici, emulsionanti/disperdenti per migliorare la solubilità. È possibile trattare con ultrasuoni le soluzioni madre e pre-agitare le sospensioni, ad esempio la notte precedente, se la stabilità della sostanza chimica in esame è sufficientemente attestata in tali condizioni.

20.

La sostanza chimica in esame potrebbe influenzare negativamente il pH nel sistema di prova. Prima di procedere alla prova occorre determinare il pH delle miscele con la sostanza chimica in esame attraverso una prova preliminare che stabilisca se vi sia la necessità di regolare il pH prima di svolgere la prova principale e poi, nuovamente, il giorno del suo svolgimento. Le soluzioni/sospensioni acquose della sostanza chimica in esame devono essere neutralizzate prima di aggiungere l'inoculo, se necessario. Tuttavia, poiché la neutralizzazione può modificare le proprietà chimiche della sostanza chimica, è consigliabile procedere a ulteriori prove, a seconda della finalità dello studio, per valutare l'effetto della sostanza in esame sui fanghi quando il pH non è regolato.

21.

Gli effetti tossici delle sostanze chimiche volatili, soprattutto nelle prove in cui l'aria è gorgogliata nel sistema, possono produrre livelli di effetti variabili derivanti da perdite di sostanza nel corso del periodo di esposizione. Occorre quindi procedere con cautela con tali sostanze, effettuando un'analisi specifica della miscela di controllo contenente la sostanza e modificando la modalità di aerazione.

22.

Se viene utilizzato il 3,5-diclorofenolo come sostanza chimica di riferimento, occorre preparare una soluzione di 1,00 g di 3,5-diclorofenolo in 1 000 ml di acqua (15). La dissoluzione è accelerata tramite un trattamento ad ultrasuoni e/o l'uso di acqua calda, che servono per portare a volume la soluzione dopo che si è raffreddata a temperatura ambiente. Tuttavia, occorre garantire che la struttura della sostanza chimica di riferimento non venga modificata. Il pH della soluzione va controllato e regolato a 7 — 8, se necessario, con l'aggiunta di NaOH oppure H2SO4.

23.

Se la sostanza chimica di riferimento è il solfato di rame (II) pentaidrato, vengono utilizzate concentrazioni a 58 mg/l, 100 mg/l e 180 mg/l (un fattore pari a 1,8). La sostanza viene pesata direttamente nei recipienti di prova (29 - 50 - 90 mg per 500 ml di volume totale). È poi disciolta in autoclave con 234 ml di acqua di rubinetto. Il solfato di rame (II) pentaidrato è facilmente solubile. A prova iniziata, vengono aggiunti 16 ml di liquame artificiale e 250 ml di fanghi attivi.

24.

Occorre preparare una soluzione madre di 2,32 g/l di N-alliltiourea (ATU). L'aggiunta di 2,5 ml di questa soluzione madre a una miscela di incubazione del volume finale di 500 ml produce una concentrazione finale di 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), che si sa essere sufficiente (4) a causare il 100 % di inibizione della nitrificazione in fanghi attivi nitrificanti contenenti 1,5 g/l di solidi sospesi.

25.

In rare circostanze, una sostanza chimica in esame con forti proprietà riducenti può comportare un consumo di ossigeno abiotico misurabile. Sono allora necessari controlli abiotici per distinguere tra il consumo abiotico di ossigeno dovuto alla sostanza chimica in esame e quello dovuto alla respirazione microbica. I controlli abiotici sono preparati omettendo l'inoculo dalle miscele sperimentali. Analogamente, è possibile includere controlli abiotici senza inoculo al momento di analizzare la concentrazione ottenuta nella fase di esposizione (ad esempio quando si usano soluzioni madre a base di sostanze chimiche scarsamente idrosolubili oppure miscele di componenti con diversi gradi di idrosolubilità). In casi specifici, può essere necessario preparare un controllo abiotico con inoculo sterilizzato (ad es. sterilizzando in autoclave o aggiungendo sostanze tossiche sterilizzanti). Alcune sostanze chimiche possono produrre o consumare ossigeno solo a condizione che la superficie dove avviene la reazione sia sufficientemente ampia, anche se normalmente necessitano di una temperatura o una pressione molto superiori affinché la reazione abbia luogo. A tale riguardo, bisogna prestare particolare attenzione alle sostanze perossidiche. Un inoculo sterilizzato fornisce una superficie sufficientemente ampia.

26.

I fanghi attivi per uso generale devono essere raccolti all'uscita, o in prossimità dell'uscita, del serbatoio di aerazione di un impianto ben gestito per il trattamento delle acque reflue, alimentato principalmente da liquami domestici. A seconda della finalità della prova, si possono eventualmente utilizzare altri tipi o fonti di fanghi attivi adattati, ad esempio fanghi ricostituiti in laboratorio, con una concentrazione di solidi in sospensione che si situi tra 2 g/l e 4 g/l. Tuttavia, i fanghi provenienti da diversi impianti di trattamento avranno probabilmente caratteristiche e sensibilità diverse.

27.

I fanghi possono essere utilizzati così come sono stati raccolti, ma occorre eliminare le particelle grossolane mediante sedimentazione per un breve periodo, da 5 a 15 minuti, e quindi far decantare o setacciare lo strato superficiale contenente le particelle solide più sottili (setaccio con maglie da 1 mm2). In alternativa, è possibile omogenizzare i fanghi con un miscelatore per circa 15 secondi o più a lungo, ma tenendo debito conto della forza trasversale e del cambiamento di temperatura causati da un periodo di miscelazione prolungato.

28.

È spesso necessario lavare i fanghi, ad esempio quando la velocità di respirazione endogena è bassa. In primo luogo, i fanghi vanno centrifugati per un determinato periodo (ad esempio 10 minuti a circa 10 000 m/s2) per produrre un surnatante chiaro e pellet di solidi delle acque reflue. Il surnatante va scartato e i fanghi risospesi in acqua di rubinetto non clorata, agitandoli; l'acqua di lavaggio va rimossa attraverso una nuova centrifugazione per poi scartarla nuovamente. Il lavaggio e la centrifugazione vanno ripetuti, se necessario. Occorre determinare il peso secco compreso in un determinato volume di fanghi (costituiti da solidi risospesi), che poi vengono concentrati eliminando la frazione liquida oppure, al contrario, vengono diluiti con acqua di rubinetto non clorata in modo da ottenere la concentrazione di solidi richiesta, vale a dire 3 g/l. I fanghi attivi devono essere aerati continuamente (ad es. 2 l/min) alla temperatura della prova e, se possibile, vanno utilizzati il giorno stesso della raccolta. Se non è possibile farlo, i fanghi vanno alimentati quotidianamente con liquame artificiale (50 ml di liquame artificiale per litro di fanghi attivi), per altri due giorni. I fanghi vengono poi utilizzati per la prova: i risultati sono ritenuti validi, a condizione che non venga rilevato alcun cambiamento significativo nella loro attività, rispetto ai tassi di respirazione eterotrofica endogena da un lato e di respirazione legata alla nitrificazione dall'altro.

29.

Nel periodo di incubazione possono insorgere difficoltà dovute all'apparizione di schiuma che, se deborda dai recipienti di aerazione, trasporta con sé particelle solide dei fanghi. In alcuni casi la schiuma è semplicemente prodotta dai liquami artificiali, ma occorre prevedere che si formi se la sostanza chimica in esame è, o contiene, un tensioattivo. La perdita di solidi dei fanghi dalle miscele di prova comporta dei tassi di respirazione artificialmente più bassi che potrebbero essere erroneamente interpretati come risultanti da un'inibizione. Inoltre, l'aerazione di una soluzione di tensioattivi fa concentrare queste sostanze nello strato di schiuma; la perdita di schiuma dal dispositivo di prova renderà più deboli le concentrazioni di esposizione. La schiuma può essere controllata attraverso semplici metodi meccanici (ad esempio tramite agitazione manuale occasionale, con una bacchetta di vetro) o con l'addizione di un agente antischiuma siliconico privo di tensioattivi, e/o aerando attraverso il metodo del dibattimento in pallone. Se il problema è legato alla presenza di liquami artificiali, la composizione di questi ultimi viene modificata dall'aggiunta di un agente antischiuma in proporzione di 50 μl/l, ad esempio. Se è invece la sostanza chimica di prova a causare la schiuma, la quantità necessaria a ridurre la schiuma va determinata per la concentrazione massima, e tutti i recipienti di aerazione sono in seguito trattati con la stessa quantità (compresi quelli che non contengono schiuma, come quelli dei controlli in bianco e i recipienti di riferimento). Qualora siano utilizzati agenti antischiuma, non deve verificarsi alcuna interazione con l'inoculo e/o la sostanza chimica in esame.

30.

È possibile determinare l'inibizione di tre diversi consumi di ossigeno (totale, eterotrofico e dovuto alla nitrificazione). Di norma, la misura dell'inibizione totale del consumo di ossigeno può considerarsi adeguata. Tuttavia, conviene determinare gli effetti sul consumo di ossigeno eterotrofico legati all'ossidazione del carbonio organico, da una parte, e all'ossidazione dell'ammonio dall'altra parte, quando alcune sostanze specifiche esigono la valutazione di questi due criteri supplementari oppure (se del caso) per spiegare le curve dose-risposta atipiche relative all'inibizione del consumo di ossigeno totale.

31.

La prova va svolta a una temperatura che si situa nell'intervallo 20±2 °C.

32.

Le miscele di prova (FT come nella tabella 1) contenenti acqua, liquame artificiale e la sostanza in esame vanno preparate in modo da ottenere diverse concentrazioni nominali della sostanza chimica in esame (cfr. tabella 1 per esempi dei volumi dei componenti). Il pH deve essere aggiustato a 7,5 ± 0,5, se necessario; le miscele sono diluite con acqua e va aggiunto l'inoculo, fino a ottenere gli stessi volumi finali nei recipienti, per poi dare inizio all'aerazione.

33.

Le miscele di riferimento (FR) sono preparate come le miscele di prova, ma con la sostanza chimica di riferimento, ad esempio 3,5-diclorofenolo, invece della sostanza in esame.

34.

I controlli in bianco (FB) vanno preparati all'inizio e alla fine del periodo di esposizione nelle prove che prevedono becher allestiti in modo sequenziale a intervalli regolari. Per i sistemi di prova con apparecchiature che consentono la misurasimultanea dei diversi consumi di ossigeno, occorre prevedere almeno due controlli in bianco per ogni lotto di analisi simultanee. I controlli in bianco contengono un uguale volume di fanghi attivi e mezzo artificiale ma non la sostanza chimica in esame né quella di riferimento. Essi devono essere diluiti con acqua per ottenere lo stesso volume della miscela contenente la sostanza in esame o quella di riferimento.

35.

Se necessario, ad esempio se si sospetta o si ha la certezza che una sostanza chimica abbia forti proprietà riducenti, occorre preparare una miscela FA per misurare il consumo abiotico di ossigeno. La miscela deve contenere la stessa quantità di sostanza chimica in esame e di liquame artificiale e avere lo stesso volume delle miscele sperimentali, ma senza fanghi attivi.

36.

Le miscele di prova e di riferimento insieme ai controlli in bianco e a quelli abiotici vengono incubati alla temperatura di prova in condizioni di aerazione forzata (da 0,5 a 1 l/min), in modo da mantenere la concentrazione dell'ossigeno disciolto sopra al 60 — 70 % di saturazione e assicurare che i fiocchi dei fanghi siano perennemente in sospensione. Occorre inoltre agitare le colture per mantenere i fiocchi di fanghi in sospensione. Si considera che l'incubazione abbia inizio al primo contatto dell'inoculo di fanghi attivi con gli altri componenti della miscela finale. Al termine dell'incubazione, cioè alla fine di un periodo di esposizione stabilito (in genere 3 ore), i campioni vengono ritirati per misurare la velocità di riduzione della concentrazione di ossigeno disciolto nella cella adibita all'uopo (fig. 2 dell'appendice 3) o in una bottiglia per BOD completamente piena. Le condizioni in cui si dà inizio all'incubazione dipendono anche dalla capacità di misurare i tassi di consumo di ossigeno da parte dell'apparecchiatura utilizzata. Per esempio, se l'apparecchiatura comprende un'unica sonda per l'ossigeno, le misurazioni vanno effettuate individualmente. In tal caso, le varie miscele necessarie per la prova del liquame artificiale saranno preparate senza l'inoculo, e una quantità adeguata di fanghi sarà aggiunta a ciascun recipiente della serie. Ogni incubazione sarà avviata a turno, ad intervalli convenientemente prestabiliti, ad esempio ogni 10 o 15 minuti. In alternativa, il sistema di misurazione può comprendere sonde multiple che facilitano misurazioni multiple e simultanee; in questo caso, è possibile aggiungere l'inoculo contemporaneamente in più gruppi appropriati di recipienti.

37.

La concentrazione di fanghi attivi in tutte le miscele di prova (di riferimento e in bianco, ma non nei controlli abiotici) è nominalmente pari a 1,5 g/l di solidi sospesi. Il consumo di ossigeno va misurato dopo 3 ore di esposizione. Nei casi in cui ciò sia necessario (descritti al paragrafo 5) occorre effettuare ulteriori misurazioni dopo 30 minuti supplementari.

38.

Per decidere se i fanghi abbiano potere nitrificante, e, in caso affermativo, quale ne sia il tasso, occorre preparare miscele (FB) come nel controllo in bianco e miscele di “controllo” supplementari (FN), che contengano però anche N-alliltiourea a 11,6 mg/l. Queste miscele vanno aerate e incubate a 20° ± 2 °C per 3 ore. In seguito, occorre misurare i tassi di consumo di ossigeno e calcolare il tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione.

39.

Se del caso, occorre allestire una prova preliminare per valutare l'intervallo di concentrazioni della sostanza chimica in esame necessarie in una prova definitiva di determinazione dell'inibizione del consumo di ossigeno. In alternativa, l'assenza di inibizione del consumo di ossigeno da parte della sostanza chimica in esame in una prova preliminare può dimostrare che non sia necessario procedere a una prova definitiva; tuttavia, occorre includere dei triplicati che presentano la concentrazione più alta tra quelle testate nella prova preliminare (generalmente 1 000 mg/L, ma questo valore dipende dai dati che è necessario ottenere).

Tabella 1

Esempi di miscele per una prova preliminare

40.

La prova deve essere eseguita con almeno tre concentrazioni della sostanza chimica in esame, per esempio, 10 mg/l, 100 mg/l e 1 000 mg/l, con un controllo in bianco e, se necessario, almeno tre controlli abiotici con le più alte concentrazioni della sostanza in esame (cfr. ad esempio la tabella 1). Idealmente, la concentrazione più bassa non dovrebbe avere alcun effetto sul consumo di ossigeno. Occorre calcolare i tassi di consumo di ossigeno e il tasso di nitrificazione, se rilevante; va poi calcolata l'inibizione percentuale. In funzione dello scopo della prova, è inoltre possibile determinare semplicemente la tossicità di una concentrazione limite, ad es. 1 000 mg/l. Se a questa concentrazione non si verifica alcun effetto tossico statisticamente significativo, non è necessario procedere ad ulteriori prove con concentrazioni più elevate o minori. Occorre notare che le sostanze scarsamente solubili in acqua, le miscele a base di componenti di varia solubilità e le sostanze adsorbenti vanno pesate direttamente nei recipienti di prova. In tal caso, il volume riservato alla soluzione madre della sostanza di prova va sostituito con acqua di diluizione.

41.

La prova va eseguita utilizzando una gamma di concentrazioni dedotta dalla prova preliminare. Per ottenere contemporaneamente un valore NOEC e un valore ECx (ad es. EC50), si raccomandano, nella maggior parte dei casi, sei concentrazioni di controllo e cinque concentrazioni di trattamento, in progressione geometrica, con cinque repliche. Il controllo abiotico non deve essere ripetuto se non si è registrato consumo di ossigeno nella prova preliminare; invece, in caso di consumo significativo, occorre includere controlli abiotici per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame. La sensibilità dei fanghi va verificata utilizzando la sostanza chimica di riferimento (3,5-diclorofenolo). La sensibilità dei fanghi va verificata per ciascuna serie di prove, in quanto è noto che essa tende a fluttuare. In tutti i casi i campioni vanno prelevati dai recipienti di prova dopo 3 ore (e, se necessario, anche dopo 3 ore e 30 minuti), per misurare il tasso di assorbimento di ossigeno nella cella dotata di elettrodo a ossigeno. In base ai dati raccolti, vengono calcolate le velocità di respirazione specifiche delle miscele di controllo e di prova; la percentuale di inibizione viene quindi calcolata a partire dall'equazione 7, indicata di seguito.

42.

L'uso di un inibitore specifico della nitrificazione (ATU) consente di verificare direttamente gli effetti inibitori della sostanza chimica in esame sull'ossidazione eterotrofica; è inoltre possibile calcolare gli effetti sul tasso di nitrificazione sottraendo dal tasso totale di consumo (senza ATU) il tasso di consumo di ossigeno in presenza di ATU. Occorre preparare due serie di miscele di reazione secondo i disegni sperimentali per la determinazione dei valori ECx o NOEC di cui al paragrafo 41; inoltre, occorre aggiungere l'inibitore ATU a ciascuna miscela di una delle due serie, per ottenere una concentrazione finale di 11,6 mg/l, in quanto è stato dimostrato che questa concentrazione impedisce completamente la nitrificazione in fanghi con concentrazioni di solidi sospesi fino a 3 000 mg/l (4). I tassi di consumo di ossigeno vanno misurati dopo il periodo di esposizione; questi valori diretti rappresentano unicamente la respirazione eterotrofica, e gli scostamenti tra questi risultati e i tassi di respirazione totale associati corrispondono alla nitrificazione. Vengono poi calcolati i vari gradi di inibizione.

43.

Alla fine del o dei periodi di esposizione, un campione viene trasferito dal primo recipiente di aerazione alla cella dotata di elettrodo a ossigeno (figura 1 dell'appendice 2), per procedere immediatamente alla misurazione della concentrazione dell'ossigeno disciolto. Se è disponibile un sistema a elettrodi multipli, le misurazioni possono essere effettuate simultaneamente. È fondamentale che l'agitazione (tramite ancoretta magnetica) avvenga alla stessa velocità applicata al momento di tarare l'elettrodo, in modo da garantire una risposta rapida della sonda alle variazioni nella concentrazione dell'ossigeno, e per assicurare la regolarità e la riproducibilità delle misurazioni dell'ossigeno nel recipiente di misurazione. Alcuni sistemi con elettrodi a ossigeno sono dotati di un agitatore generalmente adeguato. Tra una misurazione e l'altra la cella va sciacquata con acqua. In alternativa, si può utilizzare il campione per riempire una bottiglia per BOD (figura 2 dell'allegato 3) munita di un agitatore magnetico. Inserire una sonda dell'ossigeno con manicotto adattatore nel collo della bottiglia e avviare l'agitatore magnetico. In entrambi i casi la concentrazione di ossigeno disciolto deve essere misurata in continuo e registrata per un determinato periodo, solitamente 5 — 10 minuti, o finché la concentrazione di ossigeno scende al di sotto di 2 mg/l. Occorre poi rimuovere l'elettrodo, rimettere la miscela nel recipiente di aerazione e, se è necessario procedere a misurazioni dopo periodi di esposizione più estesi, continuare ad aerarla e agitarla.

44.

In alcuni casi, può essere necessario misurare la concentrazione della sostanza chimica nei contenitori di prova. Va osservato che se si utilizzano soluzioni madre di:

la frazione disciolta non sarà nota, come non lo sarà la concentrazione effettiva della sostanza in esame che viene trasferita nei recipienti di prova. Al fine di caratterizzare l'esposizione, è necessaria una stima analitica delle concentrazioni della sostanza chimica nei recipienti di prova. Per una maggior semplificazione, la stima analitica va svolta prima di aggiungere l'inoculo. Dal momento che soltanto le frazioni disciolte vengono trasferite nei recipienti di prova, le concentrazioni misurate possono essere molto basse.

45.

Al fine di evitare analisi onerose in termini di tempo e di costi, si raccomanda semplicemente di pesare la sostanza in esame direttamente nei recipienti di prova e, per i calcoli successivi, di fare riferimento alla concentrazione nominale iniziale corrispondente a tale massa. È inutile operare una distinzione tra frazione disciolta, non disciolta e adsorbita della sostanza chimica in esame, in quanto tutte queste frazioni appaiono in condizioni reali negli impianti di trattamento delle acque reflue, e possono variare a seconda della composizione di queste ultime. L'obiettivo del presente metodo di prova è di produrre una stima realistica della concentrazione non inibitrice: il metodo non è adatto a determinare in dettaglio quali frazioni contribuiscano all'inibizione degli organismi dei fanghi attivi. Infine, le sostanze adsorbenti vengono anch'esse pesate direttamente nei loro recipienti di prova che devono essere in vetro silanizzato per minimizzare le perdite per adsorbimento.

46.

I tassi di consumo di ossigeno sono calcolati a partire dalla media dei valori misurati, ad esempio utilizzando la parte lineare delle curve della concentrazione di ossigeno in funzione del tempo, limitando i calcoli alle concentrazioni di ossigeno tra 2,0 mg/l e 7,0 mg/l, poiché sia le basse che le elevate concentrazioni possono anch'esse influire sul tasso di consumo. Tuttavia, talvolta è inevitabile, nonché necessario, lavorare su valori che si situano al di fuori di questa forchetta, ad esempio quando la respirazione è fortemente inibita e, di conseguenza, molto lenta, oppure se particolari fanghi attivi respirano molto rapidamente. Ciò è accettabile, a condizione che le sezioni della curva del consumo di ossigeno siano lineari e il loro gradiente non cambi ai limiti dell'intervallo 2,0 mg/l o 7,0 mg/l di O2. Le sezioni curve del grafico indicano una stabilizzazione del sistema di misurazione o un'alterazione del tasso di consumo, e non vanno quindi utilizzate per il calcolo dei tassi di respirazione. Il tasso di consumo di ossigeno è espresso in milligrammi per litro e per ora (mg/lh) o in milligrammi per grammo di fanghi secchi per ora (mg/gh). Il tasso di consumo di ossigeno, R, in mg/lh, può essere dedotto o stimato a partire dalla sezione lineare della curva di quantità d'ossigeno decrescente, secondo l'equazione 1:

dove:

47.

Il tasso di respirazione specifica (Rs) è espresso come quantità di ossigeno consumata per grammo di sostanza secca di fanghi per ora (mg/gh), secondo l'equazione 2:

dove SS è la concentrazione di solidi sospesi nella miscela di prova (g/l).

48.

I diversi indici di R che possono essere combinati sono:

49.

La relazione tra la respirazione totale (RT), la respirazione legata alla nitrificazione (RN) e la respirazione eterotrofica (RH) è fornita dall'equazione 3:

dove:

50.

Questa relazione è valida per i valori dei controlli in bianco (RNB, RTB, RHB), i controlli abiotici (RNA, RTA, RHA) e le prove con le sostanze chimiche (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). I tassi di respirazione specifici sono calcolati a partire da:

51.

Se in una prova preliminare il valore RN non è significativo (ad es. < 5 % di RT nei controlli in bianco), si può presumere che il consumo di ossigeno eterotrofico sia pari al consumo totale e che non si verifichi alcuna nitrificazione. Se le prove devono tenere conto degli effetti sui microrganismi eterotrofici e nitrificanti, è necessaria una fonte alternativa di fanghi attivi. Viene svolta una prova definitiva qualora si verifichi una soppressione nel consumo di ossigeno con diverse concentrazioni della sostanza chimica di prova.

52.

La percentuale di inibizione del consumo totale di ossigeno, IT, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 7:

53.

Allo stesso modo, la percentuale di inibizione del consumo eterotrofico di ossigeno, IH, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 8:

54.

Infine, l'inibizione del consumo di ossigeno dovuta alla nitrificazione, IN, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 9:

55.

Occorre tracciare l'inibizione percentuale del consumo di ossigeno in base al logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame (curva di inibizione, cfr. figura 3 dell'appendice 4). Le curve di inibizione vengono tracciate per ciascuna fase di aerazione di 3 ore, eventualmente aggiungendo 30 minuti supplementari. La concentrazione della sostanza chimica in esame corrispondente a un'inibizione del 50 % del consumo di ossigeno (EC50) va calcolata o stimata a partire da questo grafico. Se sono disponibili dati adeguati, è possibile calcolare o stimare i limiti di confidenza al 95 % del valore di EC50, la pendenza della curva e i valori rilevanti che rappresentano l'inizio dell'inibizione (ad esempio, EC10 o EC20) e la fine dell'intervallo di inibizione (ad esempio, EC80 o EC90).

56.

Va sottolineato che, vista la variabilità che spesso caratterizza i risultati, in molti casi può essere sufficiente esprimerli in ordine di grandezza, per esempio:

57.

I valori ECx, inclusi i corrispondenti limiti di confidenza al 95 % superiori e inferiori per il parametro, sono calcolati utilizzando metodi statistici adeguati (ad esempio analisi probit, funzione logistica o funzione di Weibull, metodo di Spearman-Karber semplificato o interpolazione semplice (11)). Si ottiene un valore ECx inserendo il valore corrispondente all'x % della media del gruppo di controllo nell'equazione ottenuta. Per calcolare il valore EC50 o qualsiasi altro valore ECx, occorre sottoporre le medie per ciascun gruppo di trattamento (x) a un'analisi di regressione.

58.

Se si procede a un'analisi statistica per determinare la NOEC, è necessario essere in possesso di statistiche per ciascun recipiente (ogni singolo recipiente è considerato una replica distinta). Occorre far ricorso a metodi statistici appropriati, conformemente al documento di orientamento dell'OCSE intitolato Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). In generale, gli effetti avversi della sostanza chimica in esame rispetto al controllo sono analizzati procedendo a una verifica dell'ipotesi unilaterale (più debole) con p ≤ 0,05.

59.

La relazione sulla prova comprende le informazioni riportate di seguito.

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OCSE (1984), Fanghi attivi: saggio di inibizione della respirazione, linea guida dell'OCSE n. 209 (Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209), Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 221 (2006). È destinato a valutare la tossicità delle sostanze chimiche nei confronti delle piante acquatiche di acqua dolce del genere Lemna (lenticchia d'acqua). Si basa su metodi esistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6) ma include le modifiche apportate a questi metodi in modo da tenere conto sia degli ultimi progressi della ricerca sia delle consulenze di esperti su una serie di aspetti fondamentali. Il metodo qui proposto è stato convalidato da una prova interlaboratorio (ring test) internazionale (7).

2.

Il presente metodo illustra come condurre prove di tossicità su Lemna gibba e Lemna minor, due specie ampiamente studiate e che sono oggetto delle norme i cui riferimenti sono indicati in precedenza. La tassonomia di Lemna spp. è complessa a causa dell'esistenza di numerosi fenotipi. Benché la variabilità genetica di Lemna possa influire sulla risposta alle sostanze tossiche, i dati di cui disponiamo attualmente su questa fonte di variabilità sono insufficienti per raccomandare l'utilizzo di un clone specifico nel presente metodo di prova. Occorre rilevare che, sebbene la prova non sia effettuata con colture pure, sono adottate misure in varie fasi della procedura per mantenere al minimo la contaminazione da parte di altri organismi.

3.

Sono descritte dettagliatamente le procedure con rinnovo (procedura semistatica e a flusso continuo) e senza rinnovo (procedura statica) della soluzione di prova. In funzione degli obiettivi della prova e dei requisiti normativi si raccomanda di valutare l'uso di metodi semistatici e continui, per esempio per le sostanze che spariscono rapidamente dalla soluzione per volatilizzazione, fotodegradazione, precipitazione o biodegradazione. Ulteriori orientamenti sono contenuti nel riferimento bibliografico (8).

4.

L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.

5.

Si allestiscono monoculture di piante del genere Lemna a crescita esponenziale con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame per un periodo di sette giorni. L'obiettivo della prova è quantificare gli effetti della sostanza chimica sulla crescita vegetativa nel corso di questo periodo, sulla base della valutazione di determinate variabili di misura. Il numero di fronde è la principale variabile di misurazione. Viene misurata almeno un'altra variabile (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), in quanto alcune sostanze chimiche possono avere un effetto più pronunciato su variabili di misurazione diverse dal numero di fronde. Per quantificare gli effetti della sostanza chimica, si confronta la crescita nelle soluzioni di prova con quella che avviene nei controlli e si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione della crescita (per esempio 50 %), espressa come ECx (per esempio EC50).

6.

L'endpoint della prova è l'inibizione della crescita, espressa come l'aumento logaritmico della variabile di misurazione (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A partire dai tassi di crescita specifici medi registrati in una serie di soluzioni di prova, si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del tasso di crescita (per esempio 50 %), espressa come ErCx (ad esempio ErC50).

7.

Un'altra variabile di risposta utilizzata nel presente metodo di prova è il rendimento, che può essere necessario utilizzare per soddisfare requisiti normativi specifici di alcuni paesi. È definito come la differenza tra il valore delle variabili di misurazione al termine del periodo di esposizione e il valore delle variabili di misurazione all'inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova, si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del rendimento (per esempio 50 %), espressa come EyCx (ad esempio EyC50).

8.

Si possono inoltre determinare mediante un calcolo statistico la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).

9.

Occorre disporre di un metodo analitico con un'adeguata sensibilità per la quantificazione della sostanza chimica nel mezzo di prova.

10.

Le informazioni sulla sostanza chimica in esame che possono essere utili per stabilire le condizioni sperimentali comprendono la formula strutturale, la purezza, l'idrosolubilità, la stabilità in acqua e alla luce, la pKa, il Kow, la pressione di vapore e la biodegradabilità. L'idrosolubilità e la pressione di vapore possono essere utilizzate per calcolare la costante della legge di Henry, che indica se possono verificarsi perdite significative della sostanza chimica in esame nel corso della prova. Tale calcolo consente di sapere se occorre adottare misure specifiche per tenere sotto controllo le perdite. Quando le informazioni sulla solubilità e la stabilità della sostanza chimica in esame sono incerte, si consiglia di verificarle nelle condizioni sperimentali, ossia nel mezzo di crescita, alla temperatura e con l'illuminazione che si utilizzeranno nella prova.

11.

Quando la regolazione del pH del mezzo di prova è particolarmente importante, ossia quando si saggiano metalli o sostanze chimiche idroliticamente instabili, si raccomanda di aggiungere un tampone al mezzo di crescita (cfr. paragrafo 21). Al riferimento (8) sono forniti ulteriori orientamenti per saggiare sostanze chimiche le cui proprietà fisicochimiche rendono difficile la conduzione delle prove.

12.

Affinché la prova sia valida, il tempo di raddoppio del numero di fronde nei controlli deve essere inferiore a 2,5 giorni (60 ore), che corrisponde approssimativamente ad una moltiplicazione per sette in sette giorni e a un tasso di crescita specifico medio di 0,275 g–1. Utilizzando il mezzo e le condizioni sperimentali descritti nel presente metodo, questo criterio può essere soddisfatto mediante una procedura statica (5), partendo comunque dal principio che può essere soddisfatto anche con prove semistatiche o a flusso continuo. Il calcolo del tempo di raddoppio è illustrato nel paragrafo 49.

13.

La procedura sperimentale può essere verificata saggiando sostanze chimiche di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (7). Si consiglia di effettuare una prova con una sostanza chimica di riferimento almeno due volte l'anno o, qualora la prova sia realizzata con una frequenza inferiore, parallelamente alla determinazione della tossicità della sostanza chimica in esame.

14.

Tutte le apparecchiature che entrano in contatto con i mezzi di prova devono essere di vetro o di un altro materiale chimicamente inerte. Le apparecchiature di vetro utilizzate per le colture e le prove devono essere sterili e esenti da contaminanti chimici che potrebbero penetrare nel mezzo di prova. I recipienti devono essere sufficientemente ampi da consentire alle fronde delle varie colonie dei recipienti di controllo di crescere senza sovrapporsi fino alla fine della prova. Le radici possono toccare il fondo dei recipienti, ma si consiglia di utilizzare recipienti con una profondità minima di 20 mm e un volume minimo di 100 ml. La scelta dei recipienti non riveste particolare importanza a condizione che si rispettino i suddetti requisiti. Becher di vetro, cristallizzatori o piastre Petri di vetro di dimensioni adeguate si sono dimostrati recipienti adatti. I recipienti di prova devono essere coperti per minimizzare l'evaporazione e la contaminazione accidentale, pur consentendo il ricambio d'aria necessario. Sono indicati recipienti di prova, e in particolare i rispettivi coperchi, che non creano zone d'ombra o alterano le caratteristiche dello spettro luminoso.

15.

Le colture e i recipienti di prova non devono essere tenuti insieme; è quindi opportuno utilizzare camere di crescita ambientali, incubatori o stanze separati. L'illuminazione e la temperatura devono essere regolabili e mantenute ad un livello costante (cfr. paragrafi 35-36).

16.

L'organismo utilizzato per questa prova è Lemna gibba o Lemna minor. L'appendice 2 contiene una breve descrizione delle specie di lenticchia d'acqua che sono state utilizzate per le prove di tossicità. Il materiale vegetale può essere ottenuto da una collezione di colture, da un altro laboratorio o raccolto sul terreno. In quest'ultimo caso, le piante vanno tenute nel mezzo che sarà utilizzato per le prove per almeno otto settimane prima del loro impiego. Le colture di partenza sono prelevate solo da siti chiaramente esenti da fonti evidenti di inquinamento. Se le colture provengono da un altro laboratorio o da una collezione, devono essere tenute nelle stesse condizioni per almeno tre settimane. La fonte del materiale vegetale, nonché la specie e il clone (se noto) utilizzati per la prova devono sempre essere indicati.

17.

Occorre utilizzare delle monoculture, chiaramente esenti da contaminazioni da parte di altri organismi come alghe e protozoi. Le piante sane di L. minor formano colonie comprendenti da due a cinque fronde, mentre le colonie sane di L. gibba possono presentare fino a sette fronde.

18.

La qualità e l'uniformità delle piante utilizzate per la prova avranno un impatto significativo sui risultati della stessa e vanno pertanto selezionate con cura. Occorre utilizzare piante giovani, in rapida crescita, prive di lesioni visibili e di parti scolorite (clorosi). Le colture di buona qualità presentano molte colonie con almeno due fronde. Un elevato numero di fronde singole è indizio di stress ambientale, ad esempio per scarsità di nutrienti, per cui materiale vegetale proveniente da colture con queste caratteristiche non deve essere utilizzato per le prove.

19.

Per ridurre la frequenza delle operazioni di manutenzione (per esempio, se per un certo periodo non si prevedono prove su Lemna), le colture possono essere conservate ad un'illuminazione e una temperatura ridotte (4-10 °C). Informazioni dettagliate sulle tecniche di coltura sono riportate nell'appendice 3. In caso di segni evidenti di contaminazione da parte di alghe o altri organismi è opportuno sterilizzare superficialmente un sottocampione di fronde di Lemna e trasferirlo in un terreno nuovo (cfr. appendice 3). In tal caso la parte restante della coltura contaminata va eliminata.

20.

Almeno sette giorni prima della prova, un numero sufficiente di colonie è trasferito, in condizioni asettiche, in un mezzo sterile nuovo ed è coltivato per 7-10 giorni nelle condizioni previste per la prova.

21.

I vari mezzi raccomandati per Lemna minor e Lemna gibba sono descritti di seguito. L'aggiunta di un tampone di pH nel mezzo di prova (MOPS (acido 4-morfolinopropanosulfonico, n. CAS 1132-61-2) nel mezzo per L. minor e NaHCO3 nel mezzo per L. gibba) va ponderata con attenzione se si sospetta che possa interagire con la sostanza chimica in esame e condizionare l'espressione della sua tossicità. È possibile impiegare anche il mezzo di Steinberg (9), a condizione che siano rispettati i criteri di validità.

22.

Per le colture e le prove con L. minor si raccomanda l'uso di una versione modificata del mezzo di crescita della norma svedese (SIS). La composizione di questo mezzo è riportata nell'appendice 4.

23.

Per le colture e le prove con L. gibba si raccomanda l'uso del mezzo di crescita 20X — AAP, descritto nell'appendice 4.

24.

Per L. minor è adatto anche il mezzo di Steinberg, descritto nell'appendice 4, che può essere utilizzato anche per L. gibba a condizione che siano rispettati i criteri di validità.

25.

In genere le soluzioni di prova sono preparate mediante diluizione di una soluzione madre. Le soluzioni madre della sostanza chimica in esame sono solitamente preparate sciogliendo detta sostanza nel mezzo di crescita.

26.

La concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame non deve di norma superare il limite di solubilità della sostanza stessa in acqua, nelle condizioni di prova. Va rilevato, tuttavia, che le specie di Lemna galleggiano in superficie e rischiano di essere esposte a sostanze che si accumulano nell'interfaccia acqua-aria (per esempio sostanze a bassa idrosolubilità, idrofobe o tensioattivi). In tali circostanze l'esposizione risulterà da materiale diverso da quello presente nella soluzione, quindi le concentrazioni di prova potrebbero, in funzione delle caratteristiche della sostanza chimica in esame, essere superiori al limite di idrosolubilità. Per le sostanze chimiche a bassa idrosolubilità potrà essere necessario preparare una soluzione madre concentrata o disperdere la sostanza chimica utilizzando un solvente o un disperdente organico, al fine di agevolare l'aggiunta di quantità esatte della sostanza chimica in esame nel mezzo di prova e favorirne la dispersione e la dissoluzione. Occorre fare il possibile per evitare di utilizzare materiali di questo tipo. L'uso di solventi o disperdenti ausiliari non deve causare alcuna fitotossicità. Tra i solventi di uso comune che non provocano fitotossicità a concentrazioni fino a 100 μl/1 rientrano, ad esempio, l'acetone e il dimetilformammide. Se si utilizza un solvente o un disperdente, la sua concentrazione finale deve essere comunicata e tenuta al minimo (ossia ≤ 100 μl/1); deve inoltre essere identica in tutti i recipienti trattati e di controllo. Per ulteriori informazioni sull'uso dei disperdenti si veda il riferimento (8).

27.

Per determinare le concentrazioni sperimentali adeguate è utile conoscere già la tossicità della sostanza chimica in esame nei confronti di Lemna, per esempio sulla base di precedenti prove a diversi intervalli di concentrazione. Nella prova di tossicità definitiva di norma si devono scegliere almeno cinque concentrazioni in progressione geometrica. Di preferenza il fattore di separazione tra le concentrazioni non deve essere superiore a 3,2, ma si può utilizzare un valore più elevato se la curva concentrazione-risposta è piatta. L'uso di un numero di concentrazioni inferiore a cinque va giustificato. Occorre impiegare almeno tre repliche per ogni concentrazione di prova.

28.

Nel fissare l'intervallo delle concentrazioni di prova (per le prove di determinazione dell'intervallo e/o la prova di tossicità definitiva), occorre tenere presente quanto segue:

29.

Ogni prova deve prevedere controlli con mezzo nutriente, numero di fronde e colonie, condizioni ambientali e procedure (come i recipienti di prova) identici a quelli dei recipienti trattati, ma senza la sostanza chimica in esame. Qualora si utilizzi un solvente o un disperdente ausiliario, la prova deve includere un controllo supplementare con il solvente/disperdente alle stesse concentrazioni utilizzate nei recipienti contenenti la sostanza chimica in esame. Il numero dei recipienti di controllo identici, e degli eventuali recipienti con solvente, deve essere almeno pari al numero dei recipienti utilizzati per ciascuna concentrazione di prova, e idealmente il doppio di tale numero.

30.

Se la determinazione della NOEC non è necessaria, la prova può essere modificata in modo da aumentare il numero di concentrazioni e ridurre il numero di repliche per concentrazione. Tuttavia le repliche dei controlli devono essere almeno tre.

31.

Si prelevano colonie, composte da 2 a 4 fronde visibili, dalle colture dell'inoculo e si distribuiscono a caso nei recipienti di prova in condizioni asettiche. Ciascun recipiente di prova deve contenere complessivamente da 9 a 12 fronde. Il numero di fronde e di colonie deve essere uguale in ciascun recipiente. L'esperienza acquisita con questo metodo e i dati ottenuti con la prova interlaboratorio (ring-test) indicano che bastano tre repliche per trattamento (con 9 - 12 fronde iniziali per replica) per individuare differenze di crescita tra i trattamenti dell'ordine del 4 % - 7 % per l'inibizione calcolata in base al tasso di crescita e del 10 % - 15 % per l'inibizione calcolata in base al rendimento (7).

32.

La disposizione dei recipienti di prova nell'incubatore deve essere casuale per ridurre al minimo l'influenza delle differenze spaziali in termini di intensità luminosa o termica. È inoltre necessario cambiare la posizione dei recipienti, per blocchi o in modo casuale, dopo le osservazioni (o più spesso).

33.

Se una prova di stabilità preliminare indica che nel corso della prova (7 giorni) la concentrazione della sostanza chimica in esame non può essere mantenuta (ossia la concentrazione misurata diminuisce più dell'80 % della concentrazione misurata inizialmente), si raccomanda di impiegare una procedura sperimentale semistatica. In tal caso, occorre esporre le colonie a soluzioni di prova e di controllo nuove almeno due volte durante la prova (per esempio, il 3o e il 5o giorno). La frequenza dell'esposizione al mezzo fresco dipenderà dalla stabilità della sostanza chimica in esame; una frequenza più elevata può essere necessaria per mantenere concentrazioni pressoché costanti nel caso di sostanze chimiche ad elevata volatilità o instabilità. In alcune circostanze può essere necessario ricorrere a una procedura a flusso continuo (8)(10).

34.

L'esposizione mediante un'applicazione fogliare (polverizzazione) non è contemplata nel presente metodo di prova; per informazioni in proposito si veda il riferimento bibliografico (11).

35.

Occorre fornire un'illuminazione continua a fluorescenza bianca, calda o fredda, al fine di ottenere un'intensità luminosa compresa tra 85 e 135 μE · m– 2s– 1, misurata in una radiazione fotosinteticamente attiva (da 400 a 700 nm) in punti situati a una distanza dalla fonte luminosa identica a quella delle fronde di Lemna (intensità equivalente a 6 500-10 000 lux). Eventuali differenze rispetto all'intensità luminosa prescelta non devono superare, in tutta la zona in cui è condotta la prova, ± 15 %. Il metodo di rilevamento e misurazione della luce, in particolare il tipo di sensore, inciderà sul valore misurato. I sensori sferici (che rilevano la luce proveniente da tutti gli angoli situati sopra e sotto il piano di misurazione) e i sensori cosinusoidali (che rilevano la luce da tutti gli angoli situati sopra il piano di misurazione) sono preferibili ai sensori unidirezionali e indicheranno valori più elevati per una fonte luminosa multipla come quella qui descritta.

36.

La temperatura nei recipienti di prova deve essere mantenuta a 24 ± 2 °C. Il pH del mezzo di controllo non deve aumentare di oltre 1,5 unità nel corso della prova. Uno scarto superiore a 1,5 unità non invalida tuttavia la prova se il rispetto dei criteri di validità può essere dimostrato. In determinati casi occorre prestare particolare attenzione alle variazioni del pH, in particolare quando si saggiano sostanze chimiche instabili e metalli. Per ulteriori indicazioni al riguardo, si veda il riferimento bibliografico (8).

37.

La prova termina sette giorni dopo il trasferimento delle piante nei recipienti di prova.

38.

All'inizio della prova si conta e si registra il numero di fronde contenute nei recipienti di prova, avendo cura di contare tutte le fronde emergenti chiaramente visibili. Il numero di fronde che presentano un aspetto normale o anomalo deve essere determinato all'inizio della prova, almeno una volta ogni tre giorni nel periodo di esposizione (ossia almeno due volte nell'arco dei sette giorni) e alla fine della prova. Occorre registrare anche le modifiche riscontrate nello sviluppo delle piante per quanto riguarda, per esempio, la dimensione e l'aspetto delle fronde, i segni di necrosi, clorosi e gibbosità, la frammentazione delle colonie o la diminuzione della loro galleggiabilità, nonché la lunghezza e l'aspetto delle radici. È anche necessario registrare le caratteristiche salienti del mezzo di prova (per esempio la presenza di materiale in sospensione, lo sviluppo di alghe nei recipienti di prova).

39.

Durante le prova, oltre a determinare il numero di fronde, si misurano gli effetti della sostanza chimica in esame su una o più delle seguenti variabili:

40.

L'area totale delle fronde presenta il vantaggio di potere essere determinata per ciascun recipiente di prova e di controllo all'inizio, durante e al termine della prova. Il peso secco o fresco è determinato all'inizio della prova, utilizzando un campione della coltura di inoculo rappresentativo del materiale impiegato per avviare la prova, e alla fine della prova, con il materiale vegetale di ciascun recipiente di prova e di controllo. Se l'area delle fronde non è misurata, il peso secco è da preferirsi al peso fresco.

41.

L'area totale delle fronde, il peso secco e il peso fresco possono essere determinati nel modo seguente:

42.

Se si applica una procedura statica, il pH di ciascun recipiente trattato deve essere misurato all'inizio e alla fine della prova. Se la procedura è semistatica, il pH deve essere misurato in ciascun lotto di soluzione di prova “nuova” prima di ogni rinnovo, così come nelle soluzioni “usate” corrispondenti.

43.

L'intensità luminosa è misurata nella camera di crescita, nell'incubatore o nella stanza in punti situati a una distanza dalla fonte luminosa identica a quella delle fronde di Lemna. La misurazione deve essere effettuata almeno una volta nel corso della prova. La temperatura del mezzo è registrata almeno una volta al giorno in un recipiente appositamente allestito a questo scopo e conservato alle stesse condizioni degli altri nella camera di crescita, nell'incubatore o nella stanza.

44.

Durante la prova, le concentrazioni della sostanza chimica in esame sono determinate a congrui intervalli. Nelle prove statiche, le concentrazioni devono essere rilevate almeno all'inizio e alla fine della prova.

45.

Nelle prove semistatiche in cui si presume che la concentrazione della sostanza chimica in esame non si mantenga entro un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale è necessario analizzare tutte le soluzioni di prova appena vengono preparate e al momento del rinnovo (cfr. paragrafo 33). Tuttavia, per le prove in cui la concentrazione della sostanza chimica in esame misurata inizialmente non si situa in un intervallo di ± 20 % del valore nominale, ma in cui un numero sufficiente di indizi dimostra che le concentrazioni iniziali sono ripetibili e stabili (ossia nell'intervallo tra 80 % e 120 % della concentrazione iniziale), le determinazioni chimiche possono limitarsi solo alla concentrazione di prova più alta e a quella più bassa. In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza chimica in esame prima del rinnovo deve essere effettuata su una sola replica per ciascuna concentrazione di prova (o in un recipiente in cui è stato mescolato il contenuto di tutti i recipienti trattati in modo identico).

46.

Nel caso delle prove con procedura a flusso continuo si può applicare uno schema di campionamento identico a quello descritto per le prove semistatiche, con un'analisi all'inizio, a metà e al termine della prova, ma senza l'analisi delle soluzioni “usate”, che in questo caso non è necessaria. In questo tipo di prova deve essere controllato giornalmente la velocità di flusso del diluente e della sostanza chimica in esame oppure della soluzione madre della sostanza chimica in esame.

47.

Se è comprovato che la concentrazione della sostanza chimica in esame si è mantenuta nel corso dell'intera prova entro un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata all'inizio, l'analisi dei risultati può basarsi sui valori nominali o quelli misurati all'inizio. Se lo scarto rispetto alla concentrazione nominale o quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati dovrà basarsi sulla media geometrica della concentrazione durante l'esposizione o su modelli che descrivono la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (8).

48.

In determinate circostanze, per esempio quando una prova preliminare indica che la sostanza chimica in esame non ha effetti tossici in concentrazioni fino a 100 mg/l oppure fino al suo limite di solubilità nel mezzo di prova (si scelga il valore più basso), può essere svolta una prova limite che consiste nel confrontare le risposte di un gruppo di controllo e di un gruppo trattato (a una concentrazione di 100 mg/l o pari al limite di solubilità della sostanza chimica in esame nel mezzo di prova). È vivamente raccomandato che l'assenza di tossicità sia corroborata da un'analisi della concentrazione di esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero delle repliche trattate, che deve essere raddoppiato. La crescita nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato può essere analizzata mediante una prova statistica di confronto delle medie, per esempio un test t di Student.

49.

Per determinare il tempo di raddoppio (Td) del numero di fronde e verificare se lo studio rispetta questo criterio di validità (paragrafo 12), si applica la formula seguente ai dati risultanti dai controlli:

Td = ln 2/μ

in cui μ è il tasso di crescita specifico medio determinato secondo quanto indicato nei paragrafi 54-55.

50.

La finalità di questa prova è di determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla crescita vegetativa di Lemna. Il presente metodo di prova descrive due variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione di entrambe le variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito:

51.

Occorre rilevare che i valori della tossicità calcolati utilizzando queste due variabili di risposta non sono comparabili, per cui occorre tenere conto di questa differenza al momento di utilizzare i risultati della prova. I valori dell'ECx basati sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (EyCx), se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non va considerata una differenza di sensibilità tra le due suddette variabili di risposta. Il concetto di tasso di crescita specifico medio si basa sull'andamento generale della crescita esponenziale delle lenticchie d'acqua in colture non soggette a limitazioni; la tossicità è valutata in base agli effetti sul tasso di crescita, senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico dei controlli, della curva discendente concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sul rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. L'EyCx dipende dal tasso di crescita specifico della specie di lenticchia d'acqua utilizzata in ogni prova e dal tasso di crescita specifico massimo che può variare da una specie all'altra, se non addirittura da un clone all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche di specie diverse né di cloni diversi di lenticchie d'acqua. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, stimare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, per soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi il presente metodo di prova include anche la stima basata sul rendimento.

52.

La stima della tossicità deve basarsi sul numero di fronde e su un'altra variabile di misura (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), perché alcune sostanze chimiche possono avere un effetto più marcato su una variabile diversa dal numero di fronde. Questo effetto potrebbe passare inosservato se il calcolo si basa unicamente sul numero di fronde.

53.

In una tabella si registrano il numero di fronde e qualsiasi altra variabile di risposta misurata (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), insieme alle concentrazioni della sostanza chimica in esame rilevate in ogni misurazione. Le analisi successive, per esempio per stimare la LOEC, la NOEC o l'ECx devono basarsi sui valori di ciascuna replica e non sulle medie calcolate di ciascun gruppo trattato.

54.

Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è calcolato in funzione dell'aumento logaritmico delle variabili di crescita — numero di fronde e un'altra variabile di misura (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) — utilizzando la formula riportata qui di seguito per ciascuna replica dei gruppi di controllo e dei gruppi trattati:

dove:

Per ciascuno gruppo trattato e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita e le relative stime della varianza.

55.

Occorre calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero periodo di prova (i momenti “i” e “j” nella formula suindicata corrispondono rispettivamente all'inizio e alla fine della prova). Per ciascuna concentrazione dei gruppi trattati e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita specifico e le rispettive stime della varianza. Occorre inoltre valutare il tasso di crescita in ogni sezione della prova per verificare gli effetti della sostanza chimica in esame durante il periodo di esposizione (per esempio, analizzando le curve di crescita dopo trasformazione logaritmica). Una differenza importante tra il tasso di crescita sezione per sezione e il tasso di crescita medio sta ad indicare l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, il che richiede un attento esame delle curve di crescita. In tal caso, un approccio prudente consiste nel confrontare i tassi di crescita specifici delle colture trattate durante il periodo di inibizione massima con quelli dei controlli nello stesso periodo.

56.

La percentuale di inibizione del tasso di crescita (Ir) può essere successivamente calcolata per ciascuna concentrazione di prova (gruppo trattato) secondo la formula seguente:

dove:

57.

Gli effetti sul rendimento sono determinati in funzione di due variabili di misurazione: il numero di fronde e un'altra variabile (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), per ciascun recipiente di prova all'inizio e al termine della prova. Per quanto riguarda il peso secco o il peso fresco, la biomassa di partenza è determinata a partire da un campione di fronde prelevato dallo stesso lotto utilizzato per inoculare i recipienti di prova (cfr. paragrafo 20). Per ciascuna concentrazione di prova e di controllo occorre calcolare un valore medio di rendimento nonché le stime della varianza. Per ogni gruppo trattato la percentuale media di inibizione del rendimento (% Iy) può essere calcolata secondo la formula seguente:

dove:

58.

Occorre tracciare curve concentrazione-risposta che raffigurano la percentuale d'inibizione media della variabile di risposta (Ir oppure Iy calcolate come indicato nei paragrafi 56 o 57) e il logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame.