che attua la direttiva 2006/88/CE del Consiglio per quanto riguarda le misure di lotta all'aumento della mortalità delle ostriche della specie Crassostrea gigas in relazione al rilevamento dell'Ostreid herpesvirus 1 μvar (OsHV-1 μvar)

vista la direttiva 2006/88/CE del Consiglio, del 24 ottobre 2006, relativa alle condizioni di polizia sanitaria applicabili alle specie animali d'acquacoltura e ai relativi prodotti, nonché alla prevenzione di talune malattie degli animali acquatici e alle misure di lotta contro tali malattie (1), in particolare l'articolo 41, paragrafo 3, e l'articolo 61, paragrafo 3,

Ai fini del presente regolamento, OsHV-1 μvar indica un genotipo del virus dell'herpes Ostreid -1 (OsHV-1), definito sulla base di dati di sequenza parziali dai quali risulta la cancellazione sistematica di 12 coppie di base nell'ORF 4 del genoma rispetto all'OsHV-1 (GenBank # AY509253).

1. Non appena si rileva un aumento della mortalità nelle ostriche della specie Crassostrea gigas, l'autorità competente deve:

2. Se i risultati dei test di cui al paragrafo 1, lettera b) indicano la presenza del virus OsHV-1 μvar, l'autorità competente istituisce una zona di contenimento. Tale zona va definita sulla base di un'analisi caso per caso, tenendo conto dei fattori che determinano i rischi di diffusione della malattia di cui all'allegato I, parte C.

3. Gli Stati membri informano la Commissione e gli altri Stati membri senza inutili ritardi dell'istituzione della prima zona di contenimento nel loro territorio nel 2010.

Prescrizioni relative all'immissione sul mercato delle ostriche Crassostrea gigas originarie di una zona di contenimento di cui all'articolo 2

1. Le ostriche Crassostrea gigas originarie di zone di contenimento istituite in conformità dell'articolo 2, paragrafo 2, non possono uscire da dette zone.

2. In deroga al paragrafo 1, le partite di ostriche Crassostrea gigas possono uscire dalle zone di contenimento nei casi seguenti:

3. Le partite di cui al paragrafo 2, lettera a) e lettera b) destinate a zone di allevamento o di stabulazione devono essere accompagnate da un certificato sanitario compilato secondo il modello di cui all'allegato II del presente regolamento e secondo le note esplicative di cui all'allegato V del regolamento (CE) n. 1251/2008.

L'autorità competente può revocare le misure di controllo relative alle zone di contenimento istituite in conformità dell'articolo 2, paragrafo 2, e le restrizioni all'immissione sul mercato di cui all'articolo 3 dopo aver svolto due ispezioni consecutive a 15 giorni di distanza l'una dall'altra, che dimostrino che l'aumento della mortalità è cessato.

Prescrizioni relative all'immissione sul mercato di ostriche Crassostrea gigas originarie di compartimenti in precedenza soggetti a misure di controllo dovute ad un aumento della mortalità delle ostriche Crassostrea gigas connesso alla presenza del virus OsHV-1 μvar

1. Le ostriche Crassostrea gigas immesse sul mercato e originarie di compartimenti che sono stati soggetti a misure di contenimento nel 2009 o nel 2010, dovute ad un aumento della mortalità delle stesse, connesso alla presenza del virus OsHV-1 μvar devono:

2. I programmi per il rilevamento tempestivo del virus OsHV-1 μvar di cui al paragrafo 1, lettera a), punto i), devono rispettare le seguenti prescrizioni:

3. Il paragrafo 1 si applica una settimana dopo la riunione del Comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali durante la quale è stato dichiarato il programma di cui al paragrafo 1, lettera a), punto i).

1. Gli Stati membri mettono a disposizione della Commissione e degli altri Stati membri:

2. Le informazioni di cui al paragrafo 1 vanno tenute aggiornate e disponibili pubblicandole sulla pagine d'informazione su Internet elaborate in conformità dell'articolo 10 della decisione 2009/177/CE.

Entro il 1o ottobre 2010 gli Stati membri presentano alla Commissione una relazione sui programmi dichiarati in conformità dell'articolo 5, paragrafo 2.

La relazione è redatta in conformità del modello di formulario figurante nell’allegato VI della decisione 2009/177/CE.

Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla sua pubblicazione sulla Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

ALLEGATO I

PARTE A

Campionamento

1. Campionamento in applicazione dell'articolo 2

I campioni di cui all'articolo 2 devono essere costituiti da almeno 12 esemplari di ostriche Crassostrea gigas. Vanno selezionati gli animali deboli, a conchiglia aperta o appena morti (non decomposti) e vanno prelevati dal compartimento in cui è stata osservata la mortalità.

2. Campionamento in applicazione dell’articolo 3, paragrafo 2, lettera b), dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera b) e dell’articolo 5, paragrafo 2

Il campionamento in applicazione dell'articolo 3, paragrafo 2, lettera b) consiste:

i)	per le larve, in cinque prelievi di almeno 50 mg di animali interi per partita, raccolti tra 4 e 8 giorni dopo la fecondazione, compresa la conchiglia;

ii)	per le ostriche giovani, di dimensioni inferiori a 6 mm, in 30 prelievi di 300 mg di animali interi per partita, compresa la conchiglia;

iii)	per le ostriche di dimensioni superiori a 6 mm, in 150 esemplari per partita.

Selezionando gli animali per il campione si devono rappresentare, in modo proporzionale, tutte le parti della partita. Il prelievo deve innanzitutto comprendere i soggetti deboli, a conchiglia aperta, o appena morti (non in stato di decomposizione);

il campionamento in applicazione dell'articolo 5, paragrafo 2 consiste in almeno 150 esemplari di Crassostrea gigas per punto di campionamento. Tutte le aziende o zone di allevamento di molluschi dello Stato membro o del compartimento oggetto del programma vanno sottoposte a campionamento.

Il campionamento in applicazione dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera b) consiste in almeno 150 esemplari di ostriche Crassostrea gigas per compartimento.

Per la selezione degli animali da includere nel campione va tenuto conto dei criteri seguenti:

—	il prelievo deve innanzitutto comprendere i soggetti deboli, a conchiglia aperta, o appena morti (non in stato di decomposizione); se non sono disponibili animali nelle suddette situazioni, la selezione deve comprendere molluschi sani di età inferiore a 12 mesi,

—	per i campionamenti da effettuare presso aziende che, per la produzione, ricorrono a più di una fonte idrica, vanno selezionati animali che rappresentino tutte le fonti idriche, in modo che tutte le parti dell'azienda siano rappresentate in modo proporzionale nel campione,

—

per i campioni prelevati in zone di allevamento dei molluschi, il campione deve comprendere animali prelevati da un numero sufficiente di punti di campionamento, almeno tre, affinché il campione rappresenti in modo proporzionale tutte le parti della zona di allevamento dei molluschi, compresi i banchi naturali eventualmente presenti; i principali fattori da tenere in considerazione per la selezione dei punti di campionamento sono: precedenti rilevamenti del virus OsHV-1 μvar nella zona, coefficiente di densità, flussi idrici, batimetria e prassi di gestione;

il campionamento di cui all'articolo 5, paragrafo 2 va effettuato nel periodo dell'anno in cui, secondo le informazioni, si registra la massima prevalenza del virus OsHV-1 μvar nello Stato membro o nel compartimento. Se tali informazioni non sono disponibili, il campionamento va effettuato immediatamente dopo il periodo in cui la temperatura dell'acqua supera i 16 °C oppure nel periodo dell'anno in cui la temperatura raggiunge solitamente i massimi livelli;

il campionamento di cui all'articolo 5, paragrafo 1, lettera b) va preferibilmente effettuato nel periodo dell'anno indicato al punto c). Se i campioni vengono prelevati in un altro periodo dell'anno, le ostriche ivi contenute devono essere conservate in condizioni equivalenti a quelle descritte al punto c) per un periodo adatto al rilevamento del virus OsHV-1 μvar, prima di essere sottoposte a test.

PARTE B

Metodi di diagnosi per il rilevamento del virus OsHV-1 μvar

1. Campo d'applicazione

La presente procedura illustra un metodo di diagnosi standard da impiegare per il rilevamento e l'identificazione del virus OsHV-1 μvar tramite PCR (reazione a catena della polimerasi). La PCR consente di distinguere tra OsHV-1 e OsHV-1 μvar.

Se opportuno, al fine di ottimizzare le condizioni di reazione e di adeguarle all'attrezzatura e alle condizioni presenti nel loro laboratorio, i laboratori possono apportare modifiche ai metodi descritti dal presente allegato, a condizione di poter dimostrare pari sensibilità e specificità.

2. Definizioni

Il virus OsHV-1 μvar è definito all'articolo 1 del presente regolamento.

3. Attrezzature e condizioni ambientali

Il test di diagnosi che si effettua per rilevare e identificare il virus OsHV-1 μvar attraverso la PCR necessita delle attrezzature e delle condizioni ambientali solitamente impiegate per le prove di PCR, ovvero:

—	una cappa chiusa, con sistema di produzione di raggi UV per l'eliminazione di eventuali contaminazioni durante la preparazione della miscela PCR,

—	due serie complete di pipette (2 μl; 20 μl; 200 μl e 1 000 μl), la prima per l'estrazione del DNA e la seconda per la preparazione della miscela PCR,

—	tre pipette diverse: una (2 μl) per distribuire i campioni nella miscela PCR, una (20 μl) per prelevare EB ed un'altra (20 μl) per inoculare i prodotti della PCR nei gel di agarosio,

—	puntali per pipette con filtro (2 μl; 20 μl; 200 μl e 1 000 μl) per l'estrazione del DNA, per la preparazione della miscela PCR e per la distribuzione dei campioni,

—	puntali per pipette (20 μl) per prelevare EB e inoculare i prodotti di amplificazione nel gel di agarosio,

—	un thermocycler per effettuare le amplificazioni,

—	un apparecchio per elettroforesi orizzontale per l'elettroforesi dei prodotti della PCR,

—	un tavolo UV per osservare i prodotti della PCR dopo l'elettroforesi su gel di agarosio,

—	un dispositivo atto ad ottenere immagini dei gel.

Il tecnico di laboratorio deve indossare camice e guanti durante tutte le varie fasi descritte qui di seguito. Il camice e i guanti vanno sostituiti, di preferenza, dopo ogni fase principale: estrazione del DNA, preparazione della miscela PCR, distribuzione dei campioni, amplificazione e carico nel gel.

Si raccomanda di eseguire le varie fasi in locali diversi. In particolare, l'amplificazione ed il carico nel gel/l'elettroforesi devono essere effettuati in un locale separato da quello in cui vengono effettuate l'estrazione del DNA, la preparazione della miscela PCR e la distribuzione del DNA.

4. Procedura

4.1. Preparazione del campione

Le ostriche vive o appena morte (non decomposte), che possono essere state congelate, vengono trattate per estrarre il DNA.

I campioni vengono trattati in modo diverso a seconda delle loro dimensioni:

a)	per le larve, i prelievi di 50 mg di animali interi (compresa la conchiglia) vengono frantumati e centrifugati a 1 000 g per un minuto, unitamente a 200 μl di acqua distillata;

b)	per le ostriche giovani di dimensioni inferiori a 6 mm, i prelievi di 300 mg di animali interi (compresa la conchiglia) vengono frantumati e centrifugati a 1 000 g per un minuto, unitamente a 1 200 μl di acqua distillata;

c)	per le ostriche giovani di dimensioni comprese tra 6 e 15 mm, tutti i tessuti molli di ogni animale vanno frantumati separatamente;

d)	per gli animali di dimensioni superiori a 15 mm, vanno isolati pezzi di branchie e mantello.

L'estrazione del DNA viene effettuata con il QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN), seguendo le istruzioni del protocollo per il test sui tessuti.

Le altre operazioni di preparazione del campione vanno svolte nel seguente ordine:

1.	Mettere 100 μl di surnatante [per i campioni di cui alle lettere a) e b)] oppure da 10 a 50 mg di tessuti [per i campioni di cui alle lettere c) e d)] in un tubo per microcentrifuga e aggiungere 180 μl di Buffer ATL.

Aggiungere 20 μl di Proteinase K, miscelare con il vortex e incubare a 56 °C finché il tessuto non è completamente lisato (una notte). Durante l'incubazione, miscelare occasionalmente con il vortex per disperdere il campione. Centrifugare brevemente il tubo per microcentrifuga da 1,5 ml per rimuovere le gocce dal tappo.

3.	Aggiungere al campione 200 μl di Buffer AL, miscelare con il vortex a pulsazione per 15 s ed incubare a 70 °C per 10 minuti. Centrifugare brevemente il tubo per microcentrifuga da 1,5 ml per rimuovere le gocce dal tappo.

4.	Aggiungere al campione 200 μl di etanolo (96-100 %) e miscelare con il vortex a pulsazione per 15 s. Centrifugare brevemente il tubo per microcentrifuga da 1,5 ml per rimuovere le gocce dal tappo.

Applicare con cautela la miscela ottenuta al termine della fase 4 alla colonnina QIAamp (in un tubo di raccolta da 2 ml) senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 10 000 rpm per un minuto. Mettere la colonnina QIAamp in un tubo di raccolta da 2 ml pulito (presente nel kit) e gettare il tubo contenente il filtrato.

6.	Aprire con cautela la colonnina QIAamp e aggiungere 500 μl di Buffer AW1 senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 10 000 rpm per un minuto. Mettere la colonnina QIAamp in un tubo di raccolta da 2 ml pulito (presente nel kit) e gettare il tubo contenente il filtrato.

7.	Aprire con cautela la colonnina QIAamp e aggiungere 500 μl di Buffer AW2 senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a massima velocità (14 000 rpm) per tre minuti.

8.	(Facoltativo) Mettere la colonnina QIAamp in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml (non presente nel kit) e gettare il tubo contenente il filtrato. Centrifugare a massima velocità (14 000 rpm) per un minuto.

Mettere la colonnina QIAamp in un tubo per microcentrifuga pulito da 1,5 ml (non presente nel kit) e gettare il tubo contenente il filtrato. Aprire con cautela la colonnina QIAamp e aggiungere 100 μl di acqua distillata. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 10 000 rpm per un minuto.

10.	Controllare la qualità e l'efficacia dell'estrazione (ad esempio misurando la OD (260 nm) sotto spettrofotometro o dopo l'elettroforesi nel gel di agarosio).

11.	Diluire i campioni in modo da avere una concentrazione finale di DNA pari a 50-100 ng/μl.

12.	Le soluzioni di DNA vanno conservate a 4 °C fino all'esecuzione delle analisi della PCR.

Per estrarre il DNA possono essere utilizzati anche altri kit commerciali, a condizione che forniscano risultati analoghi.

4.2. Reazione a catena della polimerasi (PCR)

4.2.1. Reagenti

—	10 X Buffer (fornito con la Taq DNA polimerasi)

—	MgCl2 (fornito con la DNA polimerasi) (25 mM)

—	Taq DNA Polimerasi (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl

—	dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM) da diluire 10 volte (a 2mM) prima dell'uso

—	d H2O (H2O distillata, priva di DNA e di RNA)

4.2.2. Primer

Vanno impiegati i primer (1) seguenti:

CF (10 μM)

4.2.3. Miscela PCR

La miscela PCR per ogni tubo:

	Volume per tubo	Concentrazione finale
Buffer (10 X)	5 μl	1X
MgCl2 (25 mM)	5 μl	2,5 mM
dNTP (2 mM)	5 μl	0,2 mM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
Taq polimerasi (5 U/μl)	0,5 μl	2,5 U
dH2O	31,5 μl

—	In ogni tubo per PCR vanno versati 49 μl di tale miscela PCR

—	In ogni tubo va aggiunto 1 μl di DNA estratto (50-100 ng/μl)

4.2.4. Controlli

Sono previsti due tipi di controllo:

—	i controlli negativi consistono in dH2O (1 μl per 49 μl di miscela PCR). Essi sono intesi ad individuare eventuali contaminazioni o ambienti di lavoro reattivi. Ogni 10 campioni o dopo ogni serie di campioni va inserito un controllo negativo,

—

i controlli positivi consistono in DNA plasmidico contenente la regione genomica bersaglio CF-CR dell'OsHV-1. Il loro obiettivo è verificare l'efficacia della reazione PCR. Va incluso un controllo positivo per ogni analisi PCR. I controlli positivi sono messi a disposizione dal Laboratorio comunitario di riferimento.

4.2.5. Amplificazione

I cicli di amplificazione vengono realizzati in un thermocycler.

—	Denaturazione iniziale: 2 minuti a 94 °C

—	Amplificazione: 35 cicli (1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 50 °C e 1 minuto a 72 °C)

—	Allungamento finale: 5 minuti a 72 °C

4.3. Elettroforesi

4.3.1. Reagenti

—

50 X TAE (si può acquistare pronto per l'uso):

—	Tris base (40 mM) 242 g

—	Acido acetico glaciale (40 mM) 57,1 ml

—	Na2EDTA-2H2O (1 mM) 18,61 g

—	d H2O per 1 litro

—	Aggiustare a pH 8

—	Gel di agarosio 2,5 % in 1X TAE Aggiungere bromuro d'etidio (0,5 μg/ml) dopo il raffreddamento del gel.

—

Colorante loading blue dye:

—	Blu di bromofenolo 0,25 %

—	Xilene cianolo FF 0,25 %

—	Saccarosio 40 %

—	Conservare a 4 °C

—	Utilizzare diluito 6 volte (2 μl di loading blue buffer per 10 μl di prodotti della PCR)

—	marcatore di peso molecolare: SmartLadder SF (Eurogentec): Marcatore di peso molecolare pronto per l'uso, comprendente 9 bande a spaziatura regolare, da 100 a 1 000 bp.

4.3.2. Preparazione del gel di agarosio

1.	Pesare 2,5 g di agarosio, aggiungere 100 ml di 1X TAE e riscaldare fino a far sciogliere la miscela.

2.	Dopo aver raffreddato la soluzione, aggiungere il bromuro d'etidio (5 μl per 100 ml di gel di agarosio) e versare la soluzione nell'apposito stampo dotato di pettini (per formare i pozzetti).

3.	Quando il gel è polimerizzato si tolgono i pettini e si inserisce il gel in un apparecchio per elettroforesi orizzontale contenente 1X TAE in quantità sufficiente da coprire il gel di agarosio.

4.	Nei pozzetti si dispongono 10 μl di prodotti della PCR mescolati a 2 μl di blue dye (6X).

5.	Un pozzetto è riservato al marcatore di peso molecolare (5 μl)

6.	Si applica corrente elettrica a 50-150 volt per un periodo compreso tra 30 minuti e un'ora, a seconda dello spessore e della dimensione del gel.

7.	Si osserva il gel sotto raggi UV.

4.4. Interpretazione

La presenza di OsHV-1 μVar in un campione è indicata dalla presenza di una banda della dimensione adeguata (157 bp anziché 173 bp per l'OsHV-1) su gel di agarosio al 2,5 % con tutti i controlli negativi negativi e tutti i controlli positivi positivi.

PARTE C

Definizione della zona di contenimento

Quando si definisce una zona di contenimento in applicazione dell'articolo 2, paragrafo 2, va tenuto conto dei fattori seguenti che determinano i rischi di diffusione della malattia:

a)	il numero, il tasso e la distribuzione di molluschi nell'azienda o nella zona di allevamento infette;

b)	la distanza e la densità di aziende o zone di allevamento limitrofe;

c)	la prossimità a stabilimenti di trasformazione, aziende o zone di allevamento di contatto;

d)	specie presenti nell'azienda o nella zona di allevamento;

e)	prassi di allevamento applicate nell'azienda o zona infetta e nelle aziende o zone di allevamento limitrofe; nonché

f)	condizioni idrodinamiche ed altri fattori significativi dal punto di vista delle epizoozie identificati.

(1) I primer o le relative descrizioni possono essere ottenuti dal Laboratorio comunitario di riferimento per le malattie dei molluschi (LGP-Ifremer, av. De Mus de Loup, 17390 La Tremblade, Francia).