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Sottopartita: porzione di una partita di grandi dimensioni designata per essere sottoposta a campionamento secondo le modalità stabilite. Ogni sottopartita deve essere fisicamente separata e identificabile.

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Campione elementare: quantitativo di materiale prelevato in un solo punto della partita o della sottopartita.

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Campione globale: campione ottenuto riunendo tutti i campioni elementari prelevati dalla partita o dalla sottopartita.

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Campione di laboratorio: parte/quantità rappresentativa del campione globale destinata al laboratorio.

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Se la partita da cui viene prelevato il campione è costituita da pesci di piccole dimensioni (singoli pesci che pesano < 1 kg circa), il pesce intero viene prelevato come campione elementare per formare il campione globale. Se il campione globale che ne risulta pesa più di 3 kg, i campioni elementari possono essere costituiti dalla parte centrale, del peso di almeno 100 grammi, dei pesci che formano il campione globale. La parte intera cui viene applicato il livello massimo viene utilizzata per l’omogeneizzazione del campione.

La parte centrale del pesce è quella in cui si trova il centro di gravità. Nella maggior parte dei casi è situata in corrispondenza della pinna dorsale (qualora il pesce ne abbia una) o a metà strada fra l’apertura branchiale e l’ano.

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Se la partita da cui viene prelevato il campione è costituita da pesci di maggiori dimensioni (singoli pesci che pesano più di 1 kg circa), il campione elementare consiste nella parte centrale del pesce. Il peso di un campione elementare deve essere di almeno 100 grammi.

Nel caso di pesci di dimensioni intermedie (da 1 a 6 kg circa) il campione elementare è costituito da una porzione prelevata dalla spina dorsale al ventre, nella parte centrale del pesce.

Nel caso di pesci di dimensioni molto grandi (ad esempio > 6 kg circa), il campione elementare viene prelevato dal muscolo dorsolaterale destro (vista frontale) nella parte centrale del pesce. Qualora il prelievo di questa porzione dalla parte centrale del pesce comporti un considerevole danno economico, può essere sufficiente prelevare tre campioni elementari di almeno 350 grammi ciascuno, indipendentemente dalle dimensioni della partita, o in alternativa è possibile prelevare una parte equivalente del muscolo vicino alla coda e del muscolo vicino alla testa di un pesce per formare il campione elementare rappresentativo del livello di diossine nell’intero pesce.

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Si applicano le disposizioni di cui al punto 4.3 per la costituzione del campione.

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Qualora predomini una classe/categoria di dimensioni o peso (l’80 % circa o più della partita) il campione è prelevato dai pesci appartenenti alla classe/categoria predominante. Tale campione è considerato rappresentativo dell’intera partita.

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Qualora non predomini una particolare classe/categoria di dimensioni o peso, occorre assicurarsi che i pesci selezionati per il campione siano rappresentativi della partita. Il documento «Guidance document for the sampling of lots of fish containing whole fishes of different size and/or weight» (2) fornisce orientamenti specifici per questo tipo di situazioni.

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calcolando l’incertezza estesa, utilizzando un fattore di copertura di 2 corrispondente ad un livello di affidabilità del 95 % circa. Una partita o sottopartita non è conforme se il valore misurato meno U supera il livello consentito che è stato stabilito. Qualora le diossine e i PCB diossina-simili siano oggetto di determinazioni separate, per la somma di entrambi si utilizza la somma dell’incertezza estesa stimata dei risultati analitici ottenuti separatamente per le diossine e i PCB diossina-simili,

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stabilendo il limite della decisione (CCα) conformemente alle disposizioni della decisione 2002/657/CE della Commissione, del 12 agosto 2002, che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all’interpretazione dei risultati (5) (punto 3.1.2.5 dell’allegato — caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito). Una partita o sottopartita non è conforme se il valore misurato è pari o superiore al CCα.

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Occorre adottare misure per evitare qualsiasi contaminazione incrociata durante ogni fase del campionamento e dell’analisi.

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I campioni devono essere conservati e trasportati in appositi contenitori di vetro, alluminio, polipropilene o polietilene, dopo avere rimosso eventuali tracce di polvere di carta dal contenitore. Gli strumenti in vetro devono essere risciacquati con solventi certificati esenti da diossine o previamente sottoposti a un controllo volto a determinare la presenza di diossine.

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La conservazione e il trasporto devono svolgersi in modo da preservare l’integrità del campione alimentare.

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Se necessario, macinare finemente e mescolare bene ogni campione di laboratorio ricorrendo a un metodo che garantisca una completa omogeneizzazione (ad esempio, macinazione che consenta al materiale di passare attraverso un setaccio a maglie di 1 mm); prima della macinazione, i campioni devono essere asciugati, nel caso il livello di umidità sia troppo elevato.

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Occorre eseguire un’analisi in bianco, ovvero effettuare l’intera procedura analitica senza il campione.

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Il peso del campione utilizzato per l’estrazione deve essere tale da rispettare le prescrizioni relative alla sensibilità.

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Le procedure specifiche di preparazione del campione utilizzate per i prodotti in questione devono essere convalidate in base a orientamenti riconosciuti a livello internazionale.

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Nel caso dei pesci, è necessario eliminare la pelle dal momento che il livello massimo si applica al muscolo privo di pelle. Occorre tuttavia raschiare accuratamente e completamente tutti i resti di muscolo e di grasso attaccati alla parte interna della pelle e aggiungerli al campione da analizzare.

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I laboratori devono dimostrare la validità del metodo nell’intervallo di tolleranza del livello d’interesse, ad esempio, 0,5x, 1x e 2x il livello d’interesse, con un coefficiente di variazione accettabile per analisi ripetute. Per ulteriori informazioni sui criteri di accettazione, si veda il punto 5.

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Il limite di quantificazione per un metodo di conferma deve situarsi in un intervallo di circa un quinto del livello d’interesse.

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Si devono regolarmente effettuare controlli in bianco, esperimenti con campioni arricchiti o analisi dei campioni di controllo (di preferenza, se disponibile, materiale di riferimento certificato), quali misure interne di controllo della qualità.

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La competenza del laboratorio deve essere dimostrata dalla partecipazione regolare ed efficace a studi condotti in collaborazione con altri laboratori sulla determinazione di diossine e di PCB diossina-simili nelle corrispondenti matrici di prodotti alimentari/mangimi.

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Conformemente a quanto prescritto dal regolamento (CE) n. 882/2004, i laboratori devono essere accreditati da un organismo riconosciuto che opera in conformità della guida ISO 58 per garantire che applichino la garanzia della qualità relativamente ai metodi d’analisi. I laboratori devono essere accreditati in base alla norma EN ISO/IEC 17025.

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Elevata sensibilità e bassi limiti di rilevabilità. Per quanto concerne le PCDD e i PCDF, le quantità rilevabili devono essere dell’ordine del picogrammo TEQ (10-12 g) data l’estrema tossicità di alcuni di questi composti. È noto che i PCB si presentano in quantità più elevate rispetto alle PCDD e ai PCDF. Per quanto concerne la maggior parte dei congeneri di PCB, è sufficiente una sensibilità dell’ordine del nanogrammo (10-9 g). Tuttavia, per la determinazione dei congeneri più tossici dei PCB diossina-simili (in particolare i congeneri non orto sostituiti) si deve ottenere la stessa sensibilità che per le PCDD e i PCDF.

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Alta selettività (specificità). Occorre distinguere le PCDD, i PCDF e i PCB diossina-simili da una moltitudine di altri composti che, estratti simultaneamente dal campione e suscettibili d’interferire, sono presenti in concentrazioni molto superiori a quelle degli analiti da rilevare. Per quanto concerne i metodi di gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS), è necessario distinguere tra vari congeneri, in particolare tra quelli tossici (ad esempio, i diciassette PCDD e PCDF sostituiti alle posizioni 2,3,7,8 e i PCB diossina-simili) e altri congeneri. Mediante biotest è possibile determinare selettivamente i valori di TEQ quali somma di PCDD, PCDF e PCB diossina-simili.

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Estrema accuratezza (esattezza e precisione). La determinazione deve fornire una stima valida della concentrazione reale presente in un campione. È necessario porre estrema cura (accuratezza della misura: grado di concordanza tra il risultato di una misura e il valore reale o assegnato del misurando) per evitare che i risultati dell’analisi di un campione siano respinti a causa della scarsa affidabilità della stima dei TEQ. L’accuratezza è espressa come esattezza (differenza tra il valore medio misurato per un analita in un materiale certificato e il suo valore certificato, espressa in percentuale di tale valore) e precisione (deviazione standard relativa RSDR calcolata in base a risultati ottenuti in condizioni di ripetibilità).

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Per convalidare la procedura d’analisi, occorre aggiungere all’inizio dell’analisi, ad esempio prima dell’estrazione, standard interni di PCDD/F clorosostituiti alle posizioni 2,3,7,8 e marcati con 13C e standard interni di PCB diossina-simile marcati con 13C. Va aggiunto almeno un congenere per ciascun gruppo omologo di PCDD/F da tetra a octaclorati e almeno un congenere per ciascun gruppo omologo di PCB diossina-simile (in alternativa, è possibile aggiungere almeno un congenere per ciascuna funzione di registrazione di ioni selezionati tramite spettrografia di massa utilizzata per il controllo di PCDD/F e PCB diossina-simili). Si consiglia vivamente, soprattutto per i metodi di conferma, di utilizzare l’insieme dei diciassette standard interni di PCDD/F sostituiti alle posizioni 2,3,7,8 marcati con 13C, nonché la totalità dei dodici standard interni di PCB diossina-simile marcati con 13C.

Vanno inoltre determinati i fattori di risposta relativa per quei congeneri ai quali non è stato aggiunto alcun analogo marcato con 13C, utilizzando soluzioni di taratura adeguate.

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Per i prodotti alimentari d’origine vegetale e per i prodotti alimentari d’origine animale con un contenuto di grassi inferiore al 10 %, l’aggiunta di standard interni prima dell’estrazione è obbligatoria. Per i prodotti alimentari d’origine animale con un contenuto di grassi superiore al 10 %, gli standard interni possono essere aggiunti prima o dopo l’estrazione dei grassi. Occorre convalidare adeguatamente l’efficacia dell’estrazione, a seconda della fase in cui sono stati introdotti gli standard interni e del modo in cui i risultati sono riportati (sulla base del prodotto o dei grassi).

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Prima dell’analisi GC/MS, occorre aggiungere 1 o 2 standard di recupero (surrogato).

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È necessario effettuare il controllo del recupero. Per i metodi di conferma, i recuperi dei singoli standard interni devono essere compresi tra il 60 % e il 120 %. Recuperi inferiori o superiori per singoli congeneri, in particolare per alcune dibenzodiossine e alcuni dibenzofurani epta e octaclorati, sono accettabili, purché il loro contributo al valore TEQ non superi il 10 % del valore totale TEQ (tenendo conto della somma di PCDD/F e di PCB diossina-simili). Per quanto concerne i metodi di screening, i recuperi devono essere compresi tra il 30 % e il 140 %.

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È opportuno separare le diossine dai composti clorurati interferenti, quali i PCB non diossina-simili e gli eteri clorurati di difenile, ricorrendo ad adeguate tecniche cromatografiche (di preferenza tramite una colonna di florisil, d’allumina e/o di carbone).

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È sufficiente la separazione gascromatografica degli isomeri (< 25 % da picco a picco tra 1,2,3,4,7,8-HxCDF e 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

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La determinazione deve essere effettuata conformemente al metodo EPA 1613 revisione B: diossine e furani da tetra a octa-clorati per diluizione degli isotopi con HRGC/HRMS, o un altro metodo con criteri di rendimento equivalenti.

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La differenza tra il livello massimo e il livello minimo non deve essere superiore al 20 % per i prodotti alimentari con una contaminazione da diossina di circa 1 pg OMS/TEQ/g di base lipidica (tenendo conto della somma di PCDD/PCDF e di PCB diossina-simili). Per i prodotti alimentari a basso contenuto di grasso si applicano le stesse prescrizioni che per i livelli di contaminazione dell’ordine di circa 1 pg OMS/TEQ/g di prodotto. Per livelli di contaminazione inferiori, ad esempio 0,50 pg. OMS-TEQ/g di prodotto, la differenza tra il livello massimo e il livello minimo può essere dell’ordine del 25-40 %.

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in ogni serie di prove si devono includere un campione di riferimento e uno in bianco, estratti e analizzati allo stesso tempo e alle medesime condizioni. Il campione di riferimento deve presentare una risposta nettamente superiore a quella del campione in bianco,

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si devono includere campioni di riferimento supplementari con concentrazione pari a 0,5x e 2x il livello d’interesse, per dimostrare l’efficacia del test nell’intervallo considerato per il controllo del livello d’interesse,

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qualora si analizzino altre matrici, occorre dimostrare la validità dei campioni di riferimento, utilizzando di preferenza campioni il cui livello di TEQ, stabilito tramite HRGC/HRMS, sia simile a quello del campione di riferimento o un bianco arricchito per raggiungere questo livello,

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poiché nei biotest non si possono utilizzare standard interni, si devono effettuare test di ripetibilità per ottenere informazioni sullo deviazione standard nell’ambito di una serie di test. Il coefficiente di variazione deve essere inferiore al 30 %,

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per quanto concerne i biotest, occorre definire quali sono i composti-bersaglio, le potenziali interferenze e il valore massimo tollerato per il bianco.

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Lo screening può essere effettuato tramite metodi d’analisi GC/MS e biotest. Ai metodi GC/MS si applicano le prescrizioni stabilite al punto 6. Prescrizioni specifiche sono stabilite al punto 7.3 del presente allegato per i biotest cellulari e al punto 7.4 per i biotest realizzati con kit.

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Sono necessarie informazioni sul numero di risultati falsi positivi e falsi negativi di un’ampia serie di campioni al di sopra e al di sotto dei livelli massimi o dei livelli d’azione, raffrontati al contenuto di TEQ determinato tramite metodo analitico di conferma. La percentuale reale di falsi negativi deve essere inferiore all’1 %. Affinché il metodo di screening risulti vantaggioso, la percentuale di campioni falsi positivi deve essere sufficientemente bassa.

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I risultati positivi devono essere sempre convalidati tramite un metodo analitico di conferma (HRGC/HRMS). I campioni corrispondenti a una vasta gamma di TEQ devono inoltre essere confermati tramite HRGC/HRMS (circa 2-10 % dei campioni negativi). Si devono fornire dati sulle corrispondenze tra i risultati dei biotest e quelli della HRGC/HRMS.

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Quando si effettua un biotest, si deve utilizzare in ogni prova una serie di concentrazioni di riferimento di TCDD o una miscela di diossine/furani/PCB diossina-simili (curva di risposta con R2 > 0,95 per una dose completa). Tuttavia, ai fini dello screening, si può utilizzare nell’analisi dei campioni a bassa concentrazione una curva dettagliata nei livelli bassi.

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Per i risultati del biotest in un intervallo di tempo costante, è necessario usare una concentrazione di riferimento di TCDD (circa 3x il limite di quantificazione) su un modulo di controllo della qualità. In alternativa, si può utilizzare la risposta relativa di un campione di riferimento paragonata a una curva di taratura di TCDD, dato che la risposta delle cellule può dipendere da molteplici fattori.

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Occorre compilare e verificare i grafici del controllo della qualità (QC) per ogni tipo di materiale di riferimento allo scopo di garantire che il risultato sia conforme agli orientamenti indicati.

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L’induzione della diluizione utilizzata per il campione deve situarsi nella parte lineare della curva di risposta, in particolare per i calcoli quantitativi. I campioni situati al di sopra della parte lineare della curva di risposta devono essere diluiti e nuovamente analizzati. Occorre pertanto analizzare 3 o più diluizioni alla volta.

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La deviazione standard percentuale non deve essere superiore al 15 % quando si effettua una determinazione tripla per ogni diluizione del campione, né superiore al 30 % fra tre esperimenti indipendenti.

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È possibile scegliere come limite di rilevabilità un valore equivalente a 3x la deviazione standard della soluzione di solvente in bianco o della risposta di fondo. Un altro metodo consiste nell’applicare una risposta che sia superiore alla risposta di fondo (fattore di diluizione 5x il solvente in bianco) calcolata dalla curva di taratura del giorno. È possibile scegliere come limite di quantificazione un valore equivalente a 5x-6x la deviazione standard della soluzione di solvente in bianco o della risposta di fondo oppure applicare una risposta che sia superiore alla risposta di fondo (fattore d’induzione 10x il solvente in bianco) calcolata dalla curva di taratura del giorno.

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Occorre assicurarsi che i biotest effettuati con kit dimostrino una sensibilità ed un’affidabilità sufficienti per essere applicati ai prodotti alimentari.

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Occorre seguire le istruzioni del fabbricante relative alla preparazione dei campioni e alle analisi.

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Il kit non deve essere utilizzato oltre la data di scadenza indicata.

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Non si devono utilizzare materiali o componenti previsti per altri kit.

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I kit vanno conservati e utilizzati alle temperature di conservazione e di impiego indicate.

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Il limite di rilevazione per gli immunodosaggi è pari a 3x la deviazione standard, basandosi su 10 analisi ripetute del bianco, diviso per il valore della pendenza dell’equazione di regressione lineare.

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Occorre impiegare standard di riferimento per le prove di laboratorio al fine di garantire che la risposta allo standard rientri in un intervallo di valori accettabile.