REGOLAMENTO (CE) N. 1081/96 DELLA COMMISSIONE del 14 giugno 1996 che definisce un metodo di riferimento per rivelare la presenza di caseinato e di latte vaccini nei formaggi prodotti con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala o con miscele di tali latti e che abroga il regolamento (CEE) n. 690/92

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

visto il regolamento (CEE) n. 804/68 del Consiglio, del 27 giugno 1968, relativo all'organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari (1), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 2931/95 della Commissione (2), in particolare l'articolo 9, paragrafo 3, l'articolo 16, paragrafi 1 e 4, e l'articolo 17, paragrafo 14,

considerando che è possibile concedere un aiuto all'ammasso privato di formaggi a base di latte di pecora ai sensi del regolamento (CEE) n. 508/71 del Consiglio, dell'8 marzo 1971, che stabilisce le norme generali per la concessione di aiuti all'ammasso privato di formaggi a lunga stagionatura (3); che, a norma dell'articolo 17 del regolamento (CEE) n. 804/68 può essere stabilita una speciale restituzione per questi stessi prodotti; che è prevista l'importazione nella Comunità, in provenienza da taluni paesi terzi nel quadro di accordi preferenziali, di formaggi prodotti con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala oppure con miscele di detti latti;

considerando che, data l'esistenza delle succitate disposizioni riguardanti i formaggi fabbricati con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala o con miscele di detti latti, è necessario verificare mediante controlli adeguati che nei prodotti in questione non sia stato incorporato latte vaccino; che è opportuno definire un metodo di riferimento comunitario atto a rivelare la presenza di latte vaccino, fatta salva la possibilità di applicare metodi correnti purché conformi a certi criteri;

considerando che un metodo di riferimento applicabile per i formaggi prodotti con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala oppure con miscele di detti latti sostituisce il metodo di riferimento definito dal regolamento (CEE) n. 690/92 della Commissione (4), il quale può pertanto essere abrogato;

considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per il latte e i prodotti lattiero-caseari,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

Per verificare che il formaggio che deve essere stato prodotto esclusivamente con latte di pecora o con latte di capra o con latte di bufala oppure con miscele di detti latti non contenga caseina di latte vaccino deve essere applicato il metodo d'analisi di riferimento specificato nell'allegato.

Si considera che la caseina di latte vaccino è presente se il tenore apparente di caseina di latte vaccino nel campione da analizzare è pari o superiore a quello del campione di riferimento contenente l'1 % di latte vaccino descritto nell'allegato.

Articolo 2

I metodi correnti per individuare la presenza di caseina di latte vaccino nei formaggi di cui all'articolo 1 possono essere applicati alle seguenti condizioni:

- il limite di rivelazione non deve essere superiore allo 0,5 %;

- non si devono ottenere risultati falso-positivi; se ciò avviene il campione che produce un risultato positivo dovrà essere analizzato con il metodo di riferimento;

- la caseina di latte vaccino deve essere rivelabile con l'opportuna sensibilità anche dopo i lunghi periodi di maturazione consueti in commercio; il tipo dei formaggi di cui all'articolo 1 che non risulta conforme al presente requisito dovrà essere analizzato con il metodo di riferimento.

Articolo 3

Il regolamento (CEE) n. 690/92 è abrogato. I riferimenti al regolamento (CEE) n. 690/92 si intendono fatti al presente regolamento.

Articolo 4

Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo a quello della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Esso è applicabile dal 1° ottobre 1996.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, il 14 giugno 1996.

Per la Commissione

Franz FISCHLER

Membro della Commissione

(1) GU n. L 148 del 28. 6. 1968, pag. 13.

(2) GU n. L 307 del 20. 12. 1995, pag. 10.

(3) GU n. L 58 dell'11. 3. 1971, pag. 1.

(4) GU n. L 74 del 20. 3. 1992, pag. 23.

ALLEGATO

METODO DI RIFERIMENTO PER LA RIVELAZIONE DI CASEINATO E DI LATTE VACCINI IN FORMAGGI PRODOTTI CON LATTE DI PECORA, DI CAPRA O DI BUFALA O CON MISCELE DI LATTI DI PECORA, DI CAPRA E DI BUFALA

1. Oggetto

Rivelazione di latte vaccino e caseinato in formaggi di latte di pecora, di capra o di bufala o di miscele di latti di pecora, capra e bufala mediante focalizzazione isoelettrica delle ã-caseine dopo plasminolisi.

2. Campo di applicazione

Il metodo è idoneo per una rivelazione sensibile e specifica di latte vaccino crudo o trattato termicamente e di caseinato in formaggi freschi e stagionati di latte di pecora, di capra, o di bufala o di miscele di latti di pecora, capra e bufala. Il metodo non è adatto per la rivelazione dell'adulterazione di latte e formaggi mediante concentrati di proteine del siero di latte vaccino trattate termicamente.

3. Principio del metodo

3.1. Isolamento delle caseine dal formaggio e dagli standard di riferimento.

3.2. Solubilizzazione delle caseine isolate ed azione plasminica sulle stesse (EC.3.4.21.7).

3.3. Focalizzazione isoelettrica delle caseine trattate con plasmina in presenza di urea e colorazione delle proteine.

3.4. Valutazione dei profili di ã3- e ã2-caseina (prova della presenza di latte vaccino) per confronto del profilo del campione con quelli ottenuti sullo stesso gel da standard di riferimento contenenti lo 0 % e l'1 % di latte vaccino.

4. Reagenti

Salvo dove diversamente indicato, utilizzare solo reagenti chimici per analisi. L'acqua deve essere bidistillata o di purezza equivalente.

Nota: Le indicazioni che seguono valgono per gel di poliacrilammide preparati in laboratorio, contenenti urea, delle dimensioni di 265 × 125 × 0,25 mm. Nel caso vengano utilizzati gel di differenti dimensioni o differente tipo, può rendersi necessario modificare le condizioni di separazione.

Focalizzazione isoelettrica

4.1. Reagenti per la produzione di gel di poliacrilammide contenenti urea

4.1.1. Soluzione madre di gel

Sciogliere in acqua:

4,85 g di acrilammide

0,15 g N, N,N'-metilen-bis-acrilammide (BIS)

48,05 g di urea

15,00 g di glicerolo (87 % p/p)

e portare a 100 ml. Conservare in frigorifero in un flacone di vetro scuro.

Nota: È preferibile utilizzare una soluzione premiscelata di acrilammide/BIS, disponibile in commercio, invece dei pesi prestabiliti delle acrilammidi neurotossiche. Se una tale soluzione contiene il 30 % p/v di acrilammide e lo 0,8 % p/v di BIS, utilizzare per la formulazione un volume di 16,2 ml invece del peso prestabilito. La soluzione madre può venire conservata per un massimo di 10 giorni; se la sua conducibilità è superiore a 5 ìS, deionizzarla agitandola per 30 minuti con 2 g di Amberlite MB-3, poi filtrare attraverso una membrana da 0,45 ìm.

4.1.2. Soluzione di gel

Preparare una soluzione di gel miscelando additivi e anfoliti con la soluzione madre di gel (4.1.1):

9,0 ml di soluzione madre

24 mg de ß-alanina500 ìl di anfolita pH 3,5-9,5 (1)

250 ìl di anfolita pH 5-7 (2)

250 ìl di anfolita pH 6-8 (3).

Miscelare la soluzione di gel e degassarla per due o tre minuti in un bagno a ultrasuoni o sotto vuoto.

Nota: La soluzione di gel va preparata appena prima dell'uso (vedi 6.2).

4.1.3. Soluzioni dei catalizzatori

4.1.3.1. N,N,N'N'-tetrametiletilendiammina (TEMED).

4.1.3.2. Persolfato d'ammonio (PER) al 40 % p/v:

Sciogliere 800 mg di PER in acqua e portare a 2 ml.

Nota: Usare sempre soluzioni di PER appena preparate.

4.2. Fluido di contatto

Cherosene o paraffina liquida.

4.3. Soluzione anodica

Sciogliere 5,77 g di acido fosforico (85 % p/p) in acqua e portare a 100 ml.

4.4. Soluzione catodica

Sciogliere 2,00 g di idrossido di sodio in acqua e portare a 100 ml con acqua.

Preparazione del campione

4.5. Reagenti per l'isolamento delle proteine

4.5.1. Acido acetico diluito (25,0 ml di acido acetico glaciale portati a 100 ml con acqua).

4.5.2. Diclorometano

4.5.3. Acetone

4.6. Tampone per la solubilizzazione delle proteine

Sciogliere in acqua:

5,75 g di glicerolo (87 % p/p)

24,03 g di urea

250 mg di ditiotreitolo

e portare a 50 ml.

Nota: Conservare in frigorifero, per 1 settimana al massimo.

4.7. Reagenti per la scissione plasmidica delle caseine

4.7.1. Tampone di carbonato d'ammonio

Titolare una soluzione di idrogenocarbonato d'ammonio a 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml di acqua) contenente 0,05 mol/l di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 1,46 g/100 ml), con una soluzione di carbonato d'ammonio a 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml di acqua) contenente 0,05 mol/l EDTA a pH 8.

4.7.2. Plasmina bovina (E.C. 3.4.21.7), attività non minore di 5 U/ml.

4.7.3. Soluzione di acido å-amminocapronico per l'inibizione dell'enzima

Sciogliere 2,624 g di acido å-amminocapronico (acido 6-ammino-n-esanoico) in 100 ml di etanolo al 40 % (v/v).

4.8. Standard

4.8.1. Standard di riferimento certificati di una miscela di coagulo presamico a partire da latte scremato di pecora e capra contenenti lo 0 % e l'1 % di latte vaccino possono essere richiesti allo Institute for Reference Materials and Measurements, della Commissione, B-2440 Geel, Belgio.

4.8.2. Preparazione di standard di laboratorio provvisori di coagulo presamico di latte di bufala contenenti lo 0 % e l'1 % di latte vaccino.

Il latte scremato viene preparato mediante centrifugazione di latte crudo di bufala o di vacca, a 37 °C, a 2 500 g per 20 minuti. Dopo aver raffreddato rapidamente a 6-8 °C la provetta e il contenuto, lo strato superiore di grasso viene completamente rimosso. Per la preparazione dello standard all'1 %, aggiungere 5,00 ml di latte vaccino scremato a 495 ml di latte scremato di bufala in un becher da 1 litro, regolare il pH a 6,4 aggiungendo acido lattico diluito (10 % p/v). Regolare la temperatura su 35 °C e aggiungere 100 ìl di caglio di vitello (attività 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), agitare per 1 minuto e poi lasciare a riposo il becher coperto con un foglio di alluminio a 35 °C per 1 ora per permettere la formazione della cagliata. Dopo la formazione della cagliata, liofilizzare l'intero latte coagulato, senza preventiva omogeneizzazione né drenaggio del siero. Dopo la liofilizzazione, macinare finemente fino ad ottenere una polvere omogenea. Per la preparazione dello standard allo 0 %, eseguire la stessa procedura usando latte scremato di bufala puro. Conservare gli standard a - 20 °C.

Nota: È consigliabile controllare la purezza del latte di bufala mediante focalizzazione isoelettrica delle caseine trattate con plasmina prima della preparazione degli standard.

Reagenti per la colorazione delle proteine

4.9. Fissativo

Sciogliere 150 g di acido tricloroacetico in acqua e portare a 1 000 ml.

4.10. Soluzione decolorante

Portare 500 ml di metanolo e 200 ml di acido acetico glaciale a 2 000 ml con acqua distillata.

Nota: Preparare la soluzione decolorante ogni giorno; per la preparazione si possono utilizzare soluzioni madre di metanolo al 50 % (v/v) e acido acetico glaciale al 20 % (v/v), da miscelare in volumi uguali.

4.11. Soluzioni coloranti

4.11.1. Soluzione di colorante (soluzione madre 1)

Sciogliere 3,0 g di blu brillante Coomassie G 250 (C.I. 42655) in 1 000 ml di metanolo al 90 % (v/v) con un agitatore magnetico (circa 45 minuti), filtrare attraverso due filtri a pieghe, a velocità media.

4.11.2. Soluzione colorante (soluzione madre 2)

Sciogliere 5,0 g di solfato di rame pentaidrato in 1 000 ml di acido acetico al 20 % (v/v).

4.11.3. Soluzione colorante (soluzione di lavoro)

Miscelare 125 ml di ciascuna delle soluzioni madre (4.11.1, 4.11.2) appena prima della colorazione.

Nota: la soluzione colorante deve venire preparata il giorno stesso in cui viene usata.

5. Apparecchiatura

5.1. Lastre di vetro (265 × 125 × 4 mm); rullo di gomma (larghezza 15 cm); tavolo con piano regolabile

5.2. Foglio di supporto del gel (265 × 125 mm)

5.3. Foglio di copertura (280 × 125 mm). Applicare una striscia di nastro adesivo (280 × 6 × 0,25 mm) a ciascun bordo lungo (vedi figura 1).

5.4. Camera di elettrofocalizzazione con piastra di raffreddamento (per esempio 265 × 125 mm) e alimentazione elettrica adatta (≥ 2,5 kV) o dispositivo per elettroforesi automatica.

5.5. Criostato a circolazione, con regolazione termostatica su 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifuga regolabile su 3 000 g

5.7. Strisce elettrodiche (lunghezza ≥ 265 mm)

5.8.Flaconi contagocce per le soluzioni anodica e catodica

5.9. Applicatori per campioni (10 × 5 mm, viscosa o carta da filtro a scarso assorbimento di proteine)

5.10. Forbici, bisturi e pinzette in acciaio inossidabile

5.11. Vaschette di colorazione e decolorazione in acciaio inossidabile o vetro (per esempio vassoi portastrumenti da 280 × 150 mm)

5.12. Omogeneizzatore ad asta regolabile (diametro 10 mm), velocità 8 000-20 000 giri al minuto

5.13. Agitatore magnetico

5.14. Bagno a ultrasuoni

5.15. Saldatore per pellicola

5.16. Micropipette da 5-25 ìl

5.17. Concentratore sotto vuoto o liofilizzatore

5.18. Bagnomaria a controllo termostatico regolabile su 35 e 40 ± 1 °C con agitatore

5.19. Densitometro con lettura a ë = 634 nm

6. Procedimento

6.1. Preparazione del campione

6.1.1. Isolamento delle caseine

Pesare una quantità equivalente a 5 g di sostanza secca di formaggio o degli standard di riferimento in una provetta da centrifuga da 100 ml, aggiungere 60 ml di acqua distillata e omogeneizzare con un omogeneizzatore ad asta (8 000-10 000 giri/min). Regolare di pH 4,6 con acido acetico diluito (4.5.1) e centrifugare (5 min, 3 000 g). Decantare il grasso e il siero, omogeneizzare il residuo a 20 000 giri/min in 40 ml di acqua distillata portata a pH 4-5 con acido acetico diluito (4.5.1), aggiungere 20 ml di diclorometano (4.5.2), omogeneizzare di nuovo e centrifugare (5 min, 3 000 g). Recuperare con una spatola lo strato di caseina disposto tra la fase acquosa e la fase organica (vedi figura 2) e separare le due fasi per decantazione. Riomogeneizzare la caseina in 40 ml di acqua distillata (vedi sopra) e 20 ml di diclorometano (4.5.2) e centrifugare. Ripetere questo procedimento fino a quando le due fasi di estrazione diventano incolori (2 o 3 volte). Omogeneizzare il residuo proteico con 50 ml di acetone (4.5.3) e filtrare attraverso carta da filtro a pieghe di media velocità. Lavare il residuo sul filtro con due aliquote separate di acetone di 25 ml ciascuna e far essiccare all'aria o in corrente d'azoto, quindi polverizzare finemente nel mortaio.

Nota: Gli isolati di caseina secchi devono essere conservati a - 20 °C.

6.1.2. Scissione plasminica delle ß-caseine per intensificare le bande di ã-caseine

Disperdere 25 mg di caseine isolate (6.1.1) in 0,5 ml di tampone carbonato d'ammonio (4.7.1) e omogeneizzare per 20 minuti, per esempio utilizzando un trattamento ad ultrasuoni. Riscaldare a 40 °C e aggiungere 10 ìl di plasmina (4.7.2), miscelare e incubare per 1 ora a 40 °C agitando in continuazione. Per inibire l'enzima, aggiungere 20 ìl di soluzione di acido å-amminocapronico (4.7.3), poi aggiungere 200 mg di urea solida e 2 mg di ditiotreitolo.

Nota: Per ottenere una maggiore simmetria nelle bande di caseina focalizzate, è consigliabile liofilizzare la soluzione dopo avere aggiunto l'acido å-amminocapronico e disciolto poi i residui in 0,5 ml di tampone di solubilizzazione delle proteine (4.6).

6.2. Preparazione di gel di poliacrilammide contenenti urea

Con qualche goccia d'acqua e col rullo stendere il foglio di supporto del gel (5.2) su una lastra di vetro (5.1) rimuovendo l'acqua in eccesso con carta assorbente o con un panno. Con il rullo, stendere il foglio di copertura (5.3) con distanziatori (0,25 mm) su un'altra lastra di vetro nello stesso modo. Posare la lastra orizzontalmente su un piano a livello regolabile.

Aggiungere 10 ìl TEMED (4.1.3.1) alla soluzione di gel preparata e disaereata (4.1.2) agitare e aggiungere 10 ìl di soluzione di PER (4.1.3.2), miscelare accuratamente e versare immediatamente in modo regolare sul centro del foglio di copertura. Posizionare un bordo della lastra di supporto del gel (con il lato del foglio in basso) sulla lastra del foglio di copertura e abassarla lentamente in modo che tra i fogli si formi una pellicola di gel uniforme e senza bolle (figura 3). Abbassare completamente la lastra di supporto del gel con attenzione usando una spatola sottile e porre altre tre lastre di vetro su di essa come pesi. Dopo il completamento della polimerizzazione (circa in 60 minuti), rimuovere il gel polimerizzato sul foglio di supporto insieme con il foglio di copertura scostando le lastre di vetro. Pulire accuratamente il rovescio della lastra di supporto per rimuovere residui di gel e urea. Saldare il «sandwich di gel» in una pellicola tubolare e conservare in frigorifero (massimo 6 settimane).

Nota: Il foglio di copertura con i distanziatori può venire riutilizzato. Il gel di poliacrilammide può venire tagliato in porzioni più piccole, cosa raccomandata quando i campioni sono pochi o si utilizza un dispositivo automatico per elettroforesi (2 gel, dimensioni 4,5 × 5 cm).

6.3. Focalizzazione isoelettrica

Regolare il termostato di raffreddamento su 12 °C. Detergere il rovescio del foglio di supporto del gel con cherosene, poi far cadere qualche goccia di cherosene (4.2) sul centro del blocco di raffreddamento. Far ruotare su di esso il sandwich di gel con il lato del supporto verso il basso, facendo attenzione che non rimangono bolle. Detergere l'eccesso di cherosene e rimuovere il foglio di copertura. Bagnare le strisce elettrodiche con le soluzioni elettrodiche (4.3, 4.4), tagliarle nel senso della lunghezza del gel e posizionarle nei punti previsti (distanza tra gli elettrodi 9,5 cm).

Condizioni della focalizzazione isoelettrica

6.3.1. Dimensioni del gel: 265 × 125 × 0,25 mm

>SPAZIO PER TABELLA>

Nota: Se lo spessore o la larghezza del gel vengono modificati, i valori di corrente e potenza devono venire regolati di conseguenza (per esempio raddoppiare i valori della corrente elettrica e della potenza se si utilizza un gel da 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Esempio di un programma di tensione per un dispositivo per elettroforesi automatica (2 gel da 5,0 × 4,5 cm), elettrodi senza strisce applicate direttamente al gel

>SPAZIO PER TABELLA>

Posizionare l'applicatore del campione nella fase 2 a 0 Vh

Rimuovere l'applicatore del campione nella fase 2 a 30 Vh

6.4. Colorazione delle proteine

6.4.1. Fissaggio delle proteine

Rimuovere le strisce elettrodiche immediatamente dopo aver interrotto l'alimentazione elettrica e porre il gel immediatamente in una bacinella di colorazione/decolorazione con 200 ml di fissativo (4.9). Lasciare per 15 minuti agitando continuamente.

6.4.2. Lavaggio e colorazione della lastra di gel

Eliminare accuratamente il fissativo e lavare la lastra di gel due volte per 30 secondi, ogni volta con 100 ml di soluzione decolorante (4.10). Eliminare la soluzione decolorante e riempire la bacinella con 250 ml di soluzione colorante (4.11.3); lasciar colorare per 45 minuti agitando delicatamente.

6.4.3. Decolorazione della lastra di gel

Eliminare la soluzione colorante, lavare due volte la lastra di gel con 100 ml di soluzione decolorante (4.10) ogni volta; agitare con 200 ml di soluzione di decolorazione per 15 minuti e ripetere l'operazione almeno due o tre volte fino a quando il fondo è chiaro e incolore. Risciacquare poi la lastra di gel con acqua distillata (2 × 2 min.) e asciugare all'aria per 2 o 3 ore o con un asciugacapelli per 10-15 minuti.

Nota 1: Eseguire il fissaggio, il lavaggio, la colorazione e la decolorazione a 20 °C. Non usare temperature elevate.

Nota 2: Se si preferisce una colorazione più sensibile con argento (per esempio Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, codice n. 17-1150-01) i campioni di caseina trattata con plasmina devono essere diluiti a 5 mg/ml.

7. Valutazione

La valutazione viene eseguita confrontando i profili proteici del campione sconosciuto con quello dello standard di riferimento sullo stesso gel. La presenza di latte vaccino nei formaggi di latte di pecora, di capra o di bufala e di miscele di latti di pecora, capra e bufala, viene rivelata attraverso le ã3 e ã2-caseine, i cui punti isoelettrici sono compresi tra pH 6,5 e pH 7,5 (figure 4a, 4b e figura 5). Il limite di rivelazione è inferiore allo 0,5 %.

7.1. Stima visiva

Per una valutazione visiva della quantità di latte vaccino, è consigliabile regolare le concentrazioni dei campioni e degli standard in modo da ottenere lo stesso livello di intensità delle ã2- e ã3-caseine ovine, caprine e/o di bufala (vedi «ã2 E, G, B» e «ã3 E, G, B» nelle figure 4a, 4b e in figura 5). Dopo di ciò, la quantità di latte vaccino (minore, uguale o maggiore dell'1 %) nel campione in esame può venire valutata direttamente confrontando l'intensità delle ã3- e ã2-caseine vaccine (vedi «ã3 C» e «ã2 C» nelle figure 4a, 4b e in figura 5) con quella degli standard di riferimento allo 0 % e all'1 % (pecora, capra) o con gli standard provvisori di laboratorio (bufala).

7.2. Stima densitometrica

Se disponibile, ricorrere alla densitometria (5.19) per la determinazione del rapporto tra le aree dei picchi delle ã2- e ã3-caseine vaccine sulle ã2- e ã3-caseine ovine, caprine e/o di bufala (vedi figura 5). Confrontare questo valore con il rapporto dei picchi delle aree delle ã2- e ã3-caseine dello standard di riferimento all'1 % (pecora, capra) o dello standard provvisorio di laboratorio (bufala) analizzati sullo stesso gel.

Nota: Il metodo è soddisfacente nel caso di un chiaro segnale positivo per le ã2- e ã3-caseine vaccine nello standard di riferimento all'1 %, ma non nello standard di riferimento allo 0 %. In caso contrario, ottimizzare la procedura seguendo con estrema precisione i dettagli del metodo.

Un campione viene considerato positivo se entrambe le ã2- e ã3-caseine vaccine, o i corrispondenti rapporti di area dei picchi, sono uguali o maggiori del livello dello standard di riferimento all'1 %.

8. Bibliografia

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of ã-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pag. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 ìm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

>RIFERIMENTO A UN FILM>

Figura 1: Disegno schematico del foglio di copertura.

>RIFERIMENTO A UN FILM>

Figura 2: Strato di caseina sospeso tra la fase acquosa e la fase organica dopo centrifugazione.

>RIFERIMENTO A UN FILM>

Figura 3: Tecnica per la colata di gel di poliacrilammide ultrasottile

a = nastro distanziatore (0,25 mm); b = foglio di copertura (5.3); c, e = lastre di vetro (5.1); d = soluzione di gel (4.1.2); f = foglio di supporto del gel (5.2).

>RIFERIMENTO A UN FILM>

Figura 4a: Focalizzazione isoelettrica di caseine di formaggio di latte di pecora e capra contenente varie quantità di latte vaccino trattate con plasmina

% CM = percentuali di latte vaccino, C = vacca, E = pecora, G = capra

È mostrata la metà superiore del gel IEF.

>RIFERIMENTO A UN FILM>

Figura 4b: Focalizzazione isoelettrica di caseine, trattate con plasmina, di formaggio di miscele di latte di pecora, capra e bufala contenenti varie quantità di latte vaccino

% CM = percentuale di latte vaccino, 1+ = campione contenente l'1 % di latte vaccino con aggiunta di caseina vaccina pura al centro della traccia; C = vacca; E = pecora, G = capra, B = bufala

È mostrata la distanza totale di separazione del gel IEF.

>RIFERIMENTO A UN FILM>

Figura 5: Sovrapposizione dei densitogrammi di standard (STD) e di campioni di formaggio prodotto con miscele di latte di pecora e capra dopo focalizzazione isoelettrica

a,b = standard contenenti lo 0 e l'1 % di latte vaccino; c-g = campioni di formaggio contenenti lo 0, 1, 2, 3 e 7 % di latte vaccino. C = vacca; E = pecora, G = capra.

È stata analizzata la metà superiore del gel IEF a ë = 634 nm.

(1) Per ottenere la separazione richiesta delle ã-caseine, si sono dimostrati particolarmente validi i prodotti Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck).