DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 14 aprile 1993 che stabilisce i metodi da impiegare per la ricerca dei residui di sostanze ad azione ormonica e di sostanze ad azione tireostatica

(93/256/CEE)LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il Trattato che istituisce la Comunità economica europea,

vista la direttiva 85/358/CEE del Consiglio, del 16 luglio 1985, che integra la direttiva 81/602/CEE concernente il divieto di talune sostanze ad azione ormonica e delle sostanze ad azione tireostatica (1), modificata da ultimo dalla direttiva 88/146/CEE (2), in particolare l'articolo 5, paragrafo 2,

considerando che l'articolo 8, paragrafo 1 della direttiva 64/433/CEE del Consiglio, del 26 giugno 1964, relativa a problemi sanitari in materia di scambi intracomunitari di carni fresche (3), modificato da ultimo dalla direttiva 92/5/CEE (4), e l'articolo 11, paragrafo 4, secondo comma della direttiva 85/397/CEE del Consiglio, del 5 agosto 1985, concernente i problemi sanitari e di polizia sanitaria negli scambi intracomunitari di latte trattato termicamente (5), modificato da ultimo dalla direttiva 89/662/CEE (6), stabilisce che gli esami dei residui devono essere effettuati in base a metodi scientificamente riconosciuti e collaudati nella pratica, e in particolare in base a quelli definiti dalle direttive comunitarie o da altre norme internazionali;

considerando che la determinazione dei metodi di analisi dei campioni comprende la definizione delle procedure analitiche da seguire, le norme da osservare durante il prelievo di campioni ed i criteri da rispettare durante l'esecuzione delle analisi;

considerando che i procedimenti analitici adottati devono essere abbastanza sensibili per individuare la presenza di residui delle sostanze ad azione ormonica e delle sostanze ad azione tireostatica;

considerando che la campionatura è una parte essenziale del metodo d'analisi; che pertanto devono essere definite le norme per il prelievo dei campioni;

considerando che, ai fini della presente decisione, è necessario tener conto dei criteri elencati al punto 1 dell'allegato della direttiva 85/591/CEE del Consiglio, del 20 dicembre 1985, concernente l'istituzione di modalità di prelievo dei campioni e di metodi d'analisi comunitari per il controllo dei prodotti destinati all'alimentazione umana (7);

considerando che in conseguenza degli sviluppi delle conoscenze scientifiche e tecniche, e per motivi di chiarezza, è necessario abrogare la decisione 87/410/CEE della Commissione (8);

considerando che le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato veterinario permanente,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:

Articolo 1

I metodi d'analisi correnti autorizzati per la ricerca dei residui di sostanze aventi azione ormonica o tireostatica sono i seguenti:

- prova immunologica,

- cromatografia su strato sottile,

- cromatografia in fase liquida,

- cromatografia in fase gassosa,

- spettrometria di massa,

- spettrometria,

o qualsiasi altra procedura rispondente a criteri analoghi a quelli specificati nell'allegato.

Articolo 2

I campioni devono essere prelevati secondo le regole seguenti:

1) il campione deve essere rappresentativo e di dimensioni sufficienti per consentire un'analisi adeguata, la ripetizione dell'analisi e l'esecuzione di eventuali analisi di conferma;

2) i campioni devono essere contrassegnati in modo da renderne possibile l'identificazione in tutte le fasi dell'esame;

3) i metodi di campionatura, condizionamento, conservazione e trasporto dei campioni devono essere tali da mantenerne l'integrità e non pregiudicare i risultati dell'esame; deve essere inoltre vietato l'accesso non autorizzato ai campioni.

Articolo 3

I criteri applicabili ai metodi correnti per l'analisi dei residui di sostanze aventi azione ormonica o tireostatica sono fissati in allegato.

Articolo 4

La presente decisione sarà riesaminata anteriormente al 1o gennaio 1996 alla luce degli sviluppi delle conoscenze scientifiche e tecniche.

Articolo 5

La decisione 87/410/CEE della Commissione è abrogata.

Articolo 6

Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.

Fatto a Bruxelles, il 14 aprile 1993.

Per la Commissione

René STEICHEN

Membro della Commissione

(1) GU n. L 191 del 23. 7. 1985, pag. 46.

(2) GU n. L 70 del 16. 3. 1988, pag. 16.

(3) GU n. 121 del 29. 7. 1964, pag. 2012/64.

(4) GU n. L 57 del 2. 3. 1992, pag. 1.

(5) GU n. L 226 del 24. 8. 1985, pag. 13.

(6) GU n. L 395 del 30. 12. 1989, pag. 13.

(7) GU n. L 372 del 31. 12. 1985, pag. 50.

(8) GU n. L 223 dell'11. 8. 1987, pag. 18.

ALLEGATO

1. DEFINIZIONI E PRINCIPI GENERALI

1.1. Definizioni

1.1.1. Metodi di analisi correnti

Si tratta di metodi d'analisi che gli Stati membri usano nell'attuazione dei piani nazionali per il controllo dei residui negli animali da azienda e relativi derivati, in conformità con la direttiva 86/469/CEE del Consiglio (1). I metodi correnti devono essere stati convalidati da laboratori operativi e rispettare i criteri definiti nel presente allegato. Essi possono essere usati per motivi di screening e/o conferma:

- metodi usati per scopi di screening (metodi di screening): si tratta di metodi usati per rivelare la presenza di un analita o di una classe di analiti alla concentrazione che interessa. Questi metodi hanno un'elevata « produttività » e vengono usati per selezionare ampi quantitativi di campioni per potenziali positivi. Il loro scopo è quello di evitare risultati erroneamente negativi.

- Metodi usati per scopi di conferma (metodi di conferma): si tratta di metodi che forniscono informazioni complete o complementari che consentono l'identificazione dell'analita con certezza, alla concentrazione che interessa.

Questi metodi sono intesi a evitare risultati erroneamente positivi, nonché a ridurre il più possibile risultati erroneamente negativi.

1.1.2. Analita

Si tratta di un componente del campione, di cui occorre dimostrare e/o quantificare la presenza. Il termine « analita » comprende gli eventuali derivati che si formano dall'analita durante l'analisi.

La determinazione quantitativa di un analita deve essere espressa come:

- una quantità, espressa come quantità della massa (ad esempio mg, ng) oppure

- un contenuto, espresso come frazione della massa (ad esempio mg kg 1, ng kg 1), concentrazione della massa (ad esempio mg l 1) oppure concentrazione (ad esempio mol l 1).

1.1.3. Campioni

1.1.3.1. Campione di laboratorio

Si tratta di un campione preparato per essere sottoposto all'ispezione o all'analisi da parte di un laboratorio.

1.1.3.2. Campione per analisi

Si tratta di un campione preparato a partire dal campione di laboratorio e dal quale verranno prelevate delle porzioni da analizzare.

1.1.3.3. Porzione per analisi

Si tratta della quantità di materiale prelevata dal campione per analisi (oppure dal campione di laboratorio, se sono gli stessi) e sulla quale viene effettivamente effettuata la prova o l'osservazione.

1.1.4. Analita standard

Si tratta di una sostanza ben definita di contenuto dichiarato dell'analita al massimo grado di purezza ed usata nell'analisi come riferimento.

1.1.5. Materiale di riferimento

Si tratta di un materiale la cui o le cui proprietà sono state confermate con un metodo convalidato e che viene usato per calibrare un'apparecchiatura o per verificare un metodo di misura.

1.1.6. Prove in bianco

1.1.6.1. Determinazione del bianco campione

Si tratta dell'intero metodo d'analisi applicato ad una porzione per analisi prelevata da un campione non contenente l'analita.

1.1.6.2. Determinazione del bianco reattivi

Si tratta dell'intero metodo d'analisi applicato omettendo la porzione per analisi oppure usando un quantitativo equivalente di un adatto solvente invece della porzione in questione.

1.1.7. Specificità

La specificità è la capacità del metodo di distinguere l'analita da misurare rispetto alle altre sostanze. Questa caratteristica dipende soprattutto dalla metodica adottata, ma può variare a seconda della classe di composto o matrice.

I dati sulla specificità devono riferirsi almeno a tutte quelle sostanze che si pensa possano dare origine ad un segnale quando viene impiegata la metodica descritta, ad esempio omologhi, analoghi, metaboliti del residuo che interessa. Da tali dati deve essere possibile risalire quantitativamente al limite oltre il quale il metodo non consente più di distinguere, nelle condizioni sperimentali, tra l'analita e le altre sostanze da analizzare.

1.1.8. Accuratezza

Nella presente decisione essa indica l'accuratezza del valore medio delle misure. La definizione qui adottata è quella riportata al punto 2.83 della norma ISO 3534-1977 (accuratezza della media: lo scostamento tra il valore vero e il valore medio dei risultati di prova che si otterrebbero applicando il metodo sperimentale un gran numero di volte).

I limiti principali dell'accuratezza sono:

a) gli errori casuali;

b) gli errori sistematici.

Per un gran numero di esperimenti, l'accuratezza del valore medio si avvicina all'errore sistematico. Per valutare l'accuratezza di un metodo, occorre specificare il numero di esperimenti effettuati.

La misura dell'accuratezza richiesta è data dalla differenza tra il valore medio misurato per un materiale di riferimento ed il valore vero relativo a quest'ultimo espresso in percentuale del valore vero. Nel caso in cui non sia disponibile un materiale di riferimento, i parametri da misurare possono essere valutati analizzando il materiale che costituisce il campione cui sia stata addizionata la sostanza di riferimento (« fortificato »).

Qualora non fossero disponibili né metodi definitivi, assoluti, né materiali di riferimento certificati, il tenore di analita di un campione può essere valutato dai risultati ottenuti con un metodo che possiede un alto grado di specificità, accuratezza e precisione.

1.1.9. Precisione

Si tratta della concordanza tra i risultati di prove ottenuti applicando varie volte il procedimento sperimentale nelle condizioni fissate [ISO 3534-1977 (2), punto 2.84] e comprende la ripetibilità e la riproducibilità.

Ripetibilità:

Si tratta della concordanza tra i risultati di prove reciprocamente indipendenti ottenuti in condizioni di ripetibilità, ovvero con lo stesso metodo, su un identico materiale, nello stesso labortorio, dallo stesso operatore che usa la stessa apparecchiatura e in brevi intervalli di tempo.

Riproducibilità:

Si tratta della concordanza tra i risultati di prove reciprocamente indipendenti ottenute in condizioni di riproducibilità, cioè con lo stesso metodo, su un identico materiale, in diversi laboratori, con diversi operatori che usano diverse apparecchiature. Ai sensi dell'allegato della direttiva 85/591/CEE del Consiglio (3) i valori di precisione dei metodi d'analisi da adottare in conformità alle disposizioni di detta direttiva verranno determinati con una prova interlaboratorio effettuata, di preferenza, secondo la norma ISO 5725-1986 (4). A questo scopo, i termini di ripetibilità e di riproducibilità vengono definiti nella ISO 5725-1986. Per eseguire siffatte prove dovranno essere usati campioni aventi un contenuto di analita noto che si aggira entro i limiti massimi ammissibili di residuo.

Finché la riproducibilità di un metodo non sia stata stabilita mediante una prova interlaboratorio, per effettuare una prima selezione dei metodi presentati sulla base della documentazione disponibile è sufficiente che vengano prodotti i dati sulla ripetibilità.

Per misurare la ripetibilità e la riproducibilità si usa il coefficiente di variazione quale definito al punto 2.35 della norma ISO 3534-1977 (coefficiente di variazione: rapporto tra la deviazione standard e il valore assoluto della media aritmetica).

1.1.10. Limite di rivelazione

Il limite di rivelazione è la minima concentrazione misurata da cui si possa dedurre con ragionevole certezza statistica (almeno del 95 % per sostanze non autorizzate - cfr. punto 1.2.6.1) la presenza dell'analita. Esso può essere calcolato con diverse impostazioni:

a) un sistema consiste nell'effettuare determinazioni del bianco campione su almeno venti bianchi rappresentativi. Il limite di rivelazione viene calcolato come il contenuto apparente corrispondente alla media più tre volte la deviazione standard per le determinazioni del bianco.

Nota 1: Il quantitativo di porzione per analisi che viene usato di norma deve essere specificato.

Nota 2: Qualora si preveda che fattori quali la specie, il sesso, l'età, l'alimentazione o altri fattori ambientali possano influenzare le caratteristiche del metodo, occorre disporre di una serie di almeno 20 bianci per ogni singola popolazione omogenea cui il metodo viene applicato.

b) Come alternativa, nel caso di determinazioni spettrometriche nelle quali le determinazioni rappresentative sul bianco presentino soltanto il rumore di fondo, il limite di rivelazione viene calcolato come il tenore apparente corrispondente al triplo del rumore da picco a picco.

1.1.11. Limite di determinazione

Si tratta del più piccolo tenore di analita per il quale il metodo è stato convalidato con un determinato grado di accuratezza e precisione.

1.1.12. Sensibilità

La sensibilità misura il grado in cui un metodo rivela differenze nel tenore di un analita. Nella presente decisione la sensibilità è definita come la pendenza della curva di taratura in corrispondenza della concentrazione data.

1.1.13. Praticabilità

Si tratta di una caratteristica di un procedimento analitico che dipende dal campo d'applicazione del metodo e da parametri quali la potenzialità di lavoro ed i costi.

1.1.14. Applicabilità

L'applicabilità corrisponde all'elenco dei materiali che costituiscono il campione e/o analiti cui il metodo piò essere applicato sia direttamente che con lievi modifiche specificate.

1.1.15. Interpretazione dei risultati

1.1.15.1. Risultato positivo

La presenza dell'analita nel campione è provata, secondo il metodo d'analisi, quando vengono soddisfatti i criteri generali e i criteri fissati per il singolo metodo di rivelazione.

a) Per le sostanze con tolleranza zero, il risultato d'analisi è « positivo » se l'identità dell'analita nel campione viene provata senza incertezze.

b) Per le sostanze con un limite massimo di residui stabilito, il risultato dell'analisi è « positivo » se il contenuto dell'analita nel campione determinato sperimentalmente (dopo aver applicato eventuali correzioni ai fini del recupero) è superiore a quello del limite massimo di residui stabilito, che tiene conto della probabilità accettabile di ottenere risultati erroneamente positivi o erroneamente negativi.

1.1.15.2. Risultato negativo

Il risultato dell'analisi è considerato « negativo » secondo il metodo analitico se sono soddisfatti i criteri generali e quelli specifici per il determinato metodo di rivelazione nel caso di analisi di adeguati materiali di riferimento e di determinazione del bianco nonché

a) nel caso di sostanze con tolleranza zero, se l'identità dell'analita non è stata provata con certezza, oppure,

b) nel caso di sostanze con un limite massimo di residui stabilito, se il tenore di analita misurato nel campione è inferiore al livello specificato al punto 1.1.15.1 b) di cui sopra. Nota: Un risultato negativo non indica: nel caso a), che l'analita è assente dal campione; nel caso b), che il contenuto effettivo dell'analita è inferiore al limite massimo di residui.

1.1.16. Co-cromatografia

Si tratta di una procedura nella quale, prima di effettuare la cromatografia, la soluzione purificata da esaminare viene suddivisa in due parti e:

a) su una parte viene direttamente effettuata la cromatografia,

b) all'altra parte si addiziona della soluzione ottenuta. La quantità dell'analita standard addizionato deve essere circa uguale alla quantità dell'analita che si ritiene presente nella soluzione in esame.

1.1.17. Immunogramma

Nella presente decisione si definisce immunogramma un grafico della risposta immunochimica in funzione del tempo di ritenzione o del volume di eluizione ottenuto dalla separazione cromatografica con rivelazione immunochimica (in generale off-line) dei componenti dell'estratto del campione.

1.2. Requisiti generali

1.2.1. Criteri

In conformità con l'allegato della direttiva 85/591/CEE del Consiglio, all'esame dei metodi d'analisi si applicano i criteri seguenti.

1.2.2. Metodi di screening

Per i metodi di screening non è possibile fissare dei requisiti. L'aspetto più importante delle prestazioni di questi metodi è che l'incidenza dei risultati erroneamente negativi in corrispondenza della concentrazione che interessa deve essere minima.

1.2.2.1. La specificità deve essere definita.

1.2.2.2. Accuratezza e precisione:

La quantificazione può non essere necessaria. A seconda che l'uso di una sostanza venga vietato o autorizzato, un metodo di screening può essere qualitativo o quantitativo. Dei risultati erroneamente positivi sono accettabili, mentre dei risultati erroneamente negativi in corrispondenza della concentrazione che interessa dovrebbero essere minimi.

1.2.2.3. Limite di rivelazione:

Deve essere adeguato allo scopo prefisso. Per le sostanze per le quali sia stato stabilito un limite massimo di residui, il limite deve essere abbastanza basso da consentire l'individuazione dei residui a quel livello. Per le sostanze il cui uso in animali da azienda non è autorizzato (tolleranza zero), il limite di rivelazione deve essere il più basso possibile.

1.2.2.4. Praticabilità:

È opportuno che il metodo abbia un'elevata potenzialità di lavoro e che i costi siano limitati.

1.2.3. Metodi di conferma

1.2.3.1. Specificità:

Se possibile, i metodi di conferma devono fornire informazioni sicure sulla struttura chimica dell'analita. Se la stessa risposta viene data da più di un composto, ciò significa che il metodo non è in grado di distinguere tra l'uno e l'altro di essi.

I metodi basati soltanto sull'analisi cromatografica senza ricorrere alla rivelazione spettrometrica molecolare non sono idonei come metodi di conferma.

Se una data tecnica non è sufficientemente specifica, la specificità desiderata può essere ottenuta mediante procedimenti analitici consistenti in opportune combinazioni di purificazione, separazione cromatografica e rivelazione spettrometrica o immunochimica, ad esempio GC-MS, LC-MS, IAC/GC-MS, GC-IR, LC-IR, LC/IMG.

1.2.3.2. Accuratezza

Nel caso di analisi ripetute su un materiale di riferimento, i valori guida per la deviazione del contenuto medio sperimentalmente determinato (dopo aver apportato eventuali correzioni per il recupero) rispetto al valore vero possono variare come segue:

Nel caso di analisi ripetute di un materiale di riferimento in condizioni di riproducibilità, i valori tipici per il coefficiente di variazione (CV) interlaboratorio calcolato secondo l'equazione di Horwitz [(CV(%) = 2(5) 0,5 logC)], dove C è il contenuto espresso come potenza di 10, sono i seguenti:

linea di massima compreso tra la metà e i due terzi dei valori di cui sopra. 1.2.3.4. Limite di rivelazione:

Adeguato allo scopo (cfr. il punto 1.2.6.1).

1.2.3.5. Limite di determinazione:

Adeguato allo scopo (cfr. il punto 1.2.6.2).

1.2.3.6. Sensibilità:

Adeguato allo scopo

1.2.3.7. Praticabilità:

La velocità ed i costi sono di importanza inferiore rispetto ai metodi di screening.

Per i metodi di conferma, la maggior parte degli aspetti della praticabilità sono di minore importanza rispetto agli altri criteri definiti nella presente decisione. Di norma è sufficiente che i reattivi e le apparecchiature richieste siano disponibili.

1.2.4. Curva di taratura

Se il metodo prevede l'uso di curve di taratura, occorre conoscere:

- la formula matematica che descrive la curva di taratura,

- gli intervalli accettabili entro cui possono variare da un giorno all'altro i parametri della curva di taratura,

- l'intervallo di lavoro della curva di taratura.

Se possibile, per il controllo di qualità delle curve di taratura di metodi di conferma, dovranno essere usati opportuni standard interni e materiali di riferimento; dovrebbe essere precisata la varianza delle variabili valide almeno per l'intervallo di lavoro della curva di taratura.

1.2.5. Sensibilità all'interferenza

1.2.5.1. Per tutte le condizioni sperimentali che nella pratica potrebbero essere soggette a fluttuazione (ad esempio stabilità dei reattivi, composizione del campione, pH, temperatura) occorre indicare quali sono le variazioni che potrebbero condizionare i risultati analitici. Il metodo deve descrivere altresì mezzi per superare eventuali interferenze. Se necessario, devono essere descritti sistemi alternativi di rivelazione idonei alla conferma.

1.2.5.2. Qualora si applichi il metodo della co-cromatografia, si dovrebbe ottenere un solo picco, con un incremento dell'altezza (o dell'area) del picco equivalente alla quantità dell'analita aggiunto. Con la GC oppure con la LC, la larghezza del picco misurata a metà altezza dovrebbe rientrare nel limite del 90-110 % della larghezza originale e i tempi di ritenzione dovrebbero essere identici entro un margine del 5 %. Nei metodi basati sulla TLC, dovrebbe risultare ingrandita soltanto la macchia che si ritiene dovuta all'analita; non dovrebbe formarsi nessuna nuova macchia e l'aspetto visivo della stessa non dovrebbe cambiare.

1.2.5.3. È estremamente importante esaminare tutte le possibili interferenze dei componenti della matrice.

1.2.6. Rapporto tra livelli di residui consentiti e limiti analitici.

1.2.6.1. Per le sostanze delle quali non è autorizzato l'uso in animali da azienda (tolleranza zero), il limite di rivelazione del metodo analitico deve essere sufficientemente basso in modo che il livello di residui che si pensa di trovare dopo un uso illecito possa essere individuato con una probabilità di almeno il 95 %.

1.2.6.2. Per le sostanze con un limite massimo di residui stabilito, la somma del limite di determinazione del metodo con il triplo della deviazione standard prodotta dal metodo per un campione al limite massimo di residui non deve superare il limite massimo di residui stabilito.

1.2.6.3. Per le sostanze con un limite massimo di residui stabilito, il metodo deve essere convalidato a quel livello, nonché a metà e al doppio del livello stesso.

2. CRITERI PER L'IDENTIFICAZIONE E LA QUANTIFICAZIONE DEI RESIDUI

2.1. Requisiti generali

I laboratori che effettuano analisi per la conferma finale della presenza di residui costituiti da sostanze organiche a basso peso molecolare garantiscono che i criteri per l'interpretazione dei risultati vengano rispettati conformemente ai requisiti del presente capitolo. I criteri in questione sono intesi all'identificazione dell'analita e alla prevenzione di risultati erroneamente positivi. Ai fini di una conclusione positiva, i risultati analitici devono rispettare i criteri fissati per quel determinato metodo analitico.

2.2. Considerazioni generali per il metodo d'analisi completo

2.2.1. Preparazione del campione

Il campione deve essere ottenuto, manipolato e lavorato in modo da aumentare al massimo le possibilità di individuare l'analita, se è presente.

2.2.2. Sensibilità all'interferenza

Devono essere presentate le informazioni dettagliate di cui al punto 1.2.5 (sensibilità all'interferenza).

2.2.3. Criteri generali per l'intera procedura

2.2.3.1. La specificità (1.1.7) ed i limiti di rivelazione (1.1.10) nonché di determinazione (1.1.11) del metodo per quanto si riferisce all'analita nel materiale del campione in esame devono essere noti.

Nota: Questa informazione può essere ottenuta da dati sperimentali e/o da considerazioni teoriche.

2.2.3.2. Per un risultato positivo il comportamento fisico e chimico dell'analita durante l'analisi non deve essere distinguibile da quello del corrispondente analita standard nell'opportuno materiale del campione.

2.2.3.3. Il risultato positivo o negativo dell'analisi sarà valido soltanto nei limiti della specificità e della rivelazione nonché della determinazione della procedura relativa all'analita e al materiale del campione sotto esame.

2.2.3.4. L'intero procedimento dovrebbe essere effettuato simultaneamente, per ciscuna partita di campioni analizzati, sul materiale di riferimento oppure su quello « fortificato » contenente quantitativi noti di analita. Come alternativa si può aggiungere uno standard interno ai campioni.

2.2.4. Criteri per la preconcentrazione, purificazione e separazione fisica e/o chimica off-line

2.2.4.1. L'analita deve trovarsi nella frazione che è caratteristica del corrispondente analita standard nell'opportuno tipo di materiale, nelle stesse condizioni sperimentali.

2.2.4.2. I dati di ritenzione relativi agli standard, ai campioni di controllo e alle porzioni per analisi devono essere presentati assieme al risultato finale: positivo o negativo.

2.2.5. Criteri per le determinazioni quantitative

2.2.5.1. Il recupero deve essere misurato e specificato per tutte le determinazioni quantitative.

2.2.5.2. La variabilità intralaboratorio nel recupero deve essere la più bassa possibile.

2.2.5.3. Deve essere chiaramente indicato se i risultati finali siano o meno stati corretti per il recupero. In caso affermativo, deve essere descritto il metodo usato per effettuare la correzione.

2.3. Criteri relativi ai metodi d'analisi che possono essere usati a scopo di conferma solo in combinazione con altri metodi

2.3.1. Requisiti di qualità per la determinazione di un analita mediante IA

2.3.1.1. Occorre specificare l'intervallo di lavoro della curva di taratura, che in genere deve coprire un intervallo di concentrazione di almeno 10 unità.

2.3.1.2. Si richiedono almeno sei punti di taratura, adeguatamente distribuiti lungo la curva di taratura.

2.3.1.3. Determinati parametri del controllo di qualità devono essere conformi a quelli delle prove precedenti, ad esempio NSB e ai parametri della curva di taratura.

2.3.1.4. Ogni prova deve comprendere campioni di controllo. Valori della concentrazione: zero ed un valore preso nella prima metà dell'intervallo di lavoro, un valore centrale ed un valore preso nella seconda metà dell'intervallo di lavoro. I risultati ottenuti devono essere coerenti con quelli delle prove precedenti.

Tutti i dati originali relativi ai campioni di controllo e alla porzione per analisi devono essere presentati insieme al risultato finale: positivo o negativo.

2.3.2. Criteri di identificazione di un analita mediante GC oppure LC usando una rivelazione non specifica

2.3.2.1. L'analita deve eluire al tempo di ritenzione che è caratteristico del corrispondente analita standard nelle stesse condizioni sperimentali.

2.3.2.2. Il massimo del picco più vicino nel cromatogramma deve essere separato dal picco dell'analita designato da una distanza pari almeno alla larghezza al 10 % dell'altezza del massimo.

2.3.2.3. Per informazioni supplementari possono essere applicati i metodi di co-cromatografia e di cromatografia utilizzando almeno 2 colonne di polarità differente.

2.3.3. Criteri per la determinazione di un analita mediante TLC

2.3.3.1. I valori Rf dell'analita devono corrispondere a quelli caratteristici dell'analita standard. Questa condizione è soddisfatta quando i valori Rf dell'analita non si discostano di oltre il ± 3 % dai valori Rf dell'analita standard nelle stesse condizioni sperimentali.

2.3.3.2. Alla vista l'analita non deve risultare diverso dall'analita standard.

2.3.3.3. Il centro della macchia più vicina a quella dell'analita deve distare da quest'ultima di un valore pari ad almeno la metà della somma dei diametri delle macchie.

2.3.3.4. Per ulteriori informazioni, è possibile usare la co-cromatografia e/o la TLC bidimensionale.

2.4. Criteri relativi a metodi d'analisi che possono essere usati a scopo di conferma

2.4.1. Criteri per la determinazione di un analita mediante LC/IA oppure LC/IMG

2.4.1.1. Per la LC/IMG, il picco dell'analita nell'IMG deve essere costruito partendo da almeno cinque frazioni di LC.

2.4.1.2. Devono essere soddisfatti i criteri relativi ai punti 2.2.4.1 e 2.2.4.2.

2.4.1.3. Reattivi

Deve essere specificata la fonte e le caratteristiche dell'anticorpo e degli altri reattivi.

2.4.1.4. Curva di taratura

Dato che il metodo dipende dalle curve di taratura, deve essere fornita l'informazione rappresentata al punto 1.2.4 (curve di taratura).

Devono essere rispettati i requisiti di qualità specificati per la IA (2.3.1.1-2.3.1.4).

2.4.1.5. A scopo di conferma, se il metodo non viene usato in associazione con altri metodi, devono essere effettuate due separazioni LC diverse oppure due immunogrammi usando anticorpi a diversa specificità.

2.4.2. Criteri per la determinazione di un analita mediante LC-SP

2.4.2.1. Devono essere soddisfatti i criteri di cui ai punti 2.3.2.1 e 2.3.2.2.

2.4.2.2. I massimi di assorbimento nello spettro dell'analita devono essere alle stesse lunghezze d'onda di quelli dell'analita standard con un margine che dipende dalla risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione a serie di diodi tale margine è di solito di ± 2 nm.

2.4.2.3. Per le parti dei due spettri con un'assorbanza relativa & ge;10 % lo spettro dell'analita al di sopra dei 220 nm non deve apparire diverso da quello dell'analita standard. Questo criterio è soddisfatto quando si hanno gli stessi massimi e in nessuno dei punti osservati la differenza tra i due spettri risulta superiore al 10 % dell'assorbanza dell'analita standard.

2.4.2.4. Per scopi di conferma, se il metodo non viene usato in associazione con altri metodi, occorre ricorrere alla co-cromatografia allo stadio della LC. Per i requisiti da rispettare nel caso della co-cromatografia vedasi il punto 1.2.5.2.

2.4.3. Criteri per la determinazione di un'analita mediante TLC-SP

2.4.3.1. Il metodo deve rispettare i criteri specificati per la TLC (2.3.3.1-2.3.3.3).

2.4.3.2 I massimi di assorbimento nello spettro dell'analita devono essere alla stessa lunghezza d'onda di quelli dell'analita standard, con un margine che dipende dalla risoluzione del sistema di rivelazione.

2.4.3.3. Alla vista lo spettro dell'analita non deve risultare diverso dallo spettro dell'analita standard.

2.4.3.4. Per scopi di conferma, se il metodo non viene usato in associazione con altri metodi, occorre ricorrere alla co-cromatografia allo stadio della TLC. Per i requisiti da rispettare nel caso della co-cromatografia vedasi il punto 1.2.5.2.

2.4.4. Criteri per la determinazione di un'analita mediante GC-MS

2.4.4.1. Criteri relativi alla GC

2.4.4.1.1. Devono essere rispettati i criteri di cui ai punti 2.3.2.1 e 2.3.2.2.

2.4.4.1.2. Deve essere usato uno standard interno se è disponibile appositamente del materiale. Si deve trattare, di preferenza, di una forma dell'analita marcata con un isotopo stabile oppure, se ciò non è possibile, di un opportuno standard con un tempo di ritenzione vicino a quello dell'analita.

2.4.4.1.3. Il rapporto tra il tempo di ritenzione dell'analita in GC e quello dello standard interno, cioè il tempo di ritenzione relativo dell'analita, deve essere lo stesso di quello dell'analita standard nella matrice adeguata entro un margine di ± 0,5 %.

2.4.4.1.4. Come metodo di conferma, se non si usa uno standard interno, l'identificazione dell'analita deve essere eseguita mediante co-cromatografia.

2.4.4.2. Criteri relativi alla LRMS

2.4.4.2.1. Come metodo di screening, deve essere misurata almeno l'intensità dello ione diagnostico più abbondante.

2.4.4.2.2. Come metodo di conferma, devono essere misurate, se possibile, le intensità di almeno quattro ioni diagnostici. Se il composto non produce quattro ioni diagnostici con il metodo usato, l'identificazione dell'analita deve essere basata sui risultati di almeno due metodi indipendenti GC-LRMS con diversi derivati e/o tecniche di ionizzazione, in modo da ottenere ogni volta due o tre ioni diagnostici.

Lo ione molecolare deve essere di preferenza uno degli ioni diagnostici selezionati.

2.4.4.2.3. Le abbondanze relative di tutti gli ioni diagnostici misurati per l'analita devono corrispondere a quelle dell'analita standard, di preferenza entro un margine di ± 10 % (tecnica di EI) oppure ± 20 % (tecnica di CI).

2.4.5. Criteri per l'identificazione di un analita mediante IR

2.4.5.1. Definizione di picchi idonei

Si definiscono picchi idonei i massimi di assorbimento nello spettro infrarosso di un analita standard, che soddisfano alle seguenti condizioni.

2.4.5.1.1. Il massimo di assorbimento è nella regione compresa tra 1 800 e 500 cm 1.

2.4.5.2. L'intensità dell'assorbimento non è inferiore a:

a) una assorbanza molare specifica di 40 rispetto all'assorbanza zero e di 20 rispetto alla linea di base del picco oppure

b) una assorbanza relativa del 12,5 % dell'assorbanza del picco più intenso nella regione 1 800 - 500 cm 1 se sono entrambi misurati rispetto all'assorbanza zero e del 5 % dell'assorbanza del picco più intenso nella regione 1 800 - 500 cm 1 se sono entrambi misurati rispetto alla linea di base dei relativi picchi.

Nota: Anche se i picchi idonei di cui alla lettera a) possono essere preferibili da un punto di vista teorico, quelli di cui alla lettera b) sono in pratica di più facile determinazione.

2.4.5.2. Si determina il numero di picchi nello spettro infrarosso dell'analita le cui frequenze corrispondono a un picco idoneo nello spettro dell'analita standard con uno scostamento massimo di ± 1 cm 1.

2.4.5.3. Criteri IR

2.4.5.3.1. L'assorbimento deve essere presente in tutte le regioni dello spettro dell'analita corrispondenti ad un picco idoneo nello spettro di riferimento dell'analita standard.

2.4.5.3.2. Nello spettro infrarosso dell'analita standard è necessario un minimo di sei picchi idonei. Se vi sono meno di sei picchi idonei, lo spettro in questione non può essere usato come spettro di riferimento.

2.4.5.3.3. Il « punteggio » ovvero la percentuale di picchi idonei trovata nello spettro infrarosso dell'analita, deve essere di almeno 50.

2.4.5.3.4. Se non vi è una corrispondenza esatta per un picco idoneo, la relativa regione dello spettro dell'analita deve mostrare la presenza di un picco confrontabile.

2.4.5.3.5. Il procedimento è applicabile unicamente ai picchi di assorbimento nello spettro del campione aventi un'intensità almeno tre volte maggiore del rumore tra picco e picco.

2.5. Altri metodi d'analisi

A scopo di screening o di conferma possono essere usati metodi di analisi, oppure associazioni di metodi diversi da quelli considerati ai capitoli 2.3 e 2.4 (ad esempio LC - MS, MS - MS, GC - IR) a condizione che essi rispettino analoghi criteri tali da consentire una identificazione certa dell'analita in corrispondenza della concentrazione che interessa.

APPENDICE

Elenco delle abbreviazioni e dei simboli CI = ionizzazione chimica

EI = ionizzazione a impatto elettronico

g = grammo oppure grammi

GC = gascromatografia

IA = prova immunologica

IAC = cromatografia per immunoaffinità

IMG = immunogramma

IR = spettrometria all'infrarosso

Kg = chilogrammo (chilogrammi) (103 g)

l = litro oppure litri

LC = cromatografia liquida

LRMS = spettrometria di massa a bassa risoluzione

mg = milligrammo oppure milligrammi (10 3 g)

MS = spettrometria di massa

ng = nanogrammo (nanogrammi) (10 9 g)

NSB = legame non specifico

Rf = distanza percorsa rispetto al fronte del solvente

SP = spettrometria, ad esempio con rivelazione a serie di diodi

TLC = cromatografia su strato sottile

mg = microgrammo (microgrammi) (10 6 g)

/ = tecniche combinate off-line

- = tecniche combinate on-line

ad esempio LC/GC - MS = LC fuori linea seguito da GC con MS in linea.

(1) GU n. L 275 del 26. 9. 1986, pag. 36.

(2) International Organization for Standardization: Statistics - vocabulary and symbols.

(3) GU n. L 372 del 31. 12. 1985, pag. 50.

(4) International Organization for Standardization: Precision of test methods - determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.