DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 19 novembre 1992 che stabilisce i piani di campionamento ed i metodi diagnostici per individuare e confermare alcune malattie dei pesci (92/532/CEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,

vista la direttiva 91/67/CEE del Consiglio, del 28 gennaio 1991, che stabilisce le norme di polizia sanitaria per la commercializzazione di animali e prodotti di acquacoltura (1), in particolare l'articolo 15,

considerando che, ai sensi dell'articolo 15 della direttiva 91/67/CEE, occorre predisporre i piani di campionamento ed i metodi diagnostici da applicare per l'individuazione e la conferma delle malattie degli animali d'acquacoltura;

considerando che il comitato scientifico veterinario, istituito con decisione 81/651/CEE della Commissione (2), è stato consultato;

considerando che le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato permanente veterinario,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:

Articolo 1

I piani di campionamento ed i metodi diagnostici per individuare e confermare la necrosi ematopoietica infettiva (IHN) e la setticemia emorragica virale (VHS) figurano in allegato.

Articolo 2

Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione. Fatto a Bruxelles, il 19 novembre 1992. Per la Commissione

Ray MAC SHARRY

Membro della Commissione

(1) GU n. L 46 del 19. 2. 1991, pag. 1. (2) GU n. L 233 del 19. 8. 1981, pag. 32.

ALLEGATO

PARTE PRIMA

METODI DI CAMPIONAMENTO E DI ACCERTAMENTO DELLA VHS E CONTROLLI RELATIVI ALLA IHN I. Campionamento 1. Intervalli di campionamento

Le aziende sono sottoposte a controllo sanitario almeno due volte all'anno, nel periodo che va da ottobre a giugno o comunque quando la temperatura dell'acqua è inferiore a 14°. L'intervallo tra un'ispezione e l'altra deve essere almeno di quattro mesi. In tutte le unità di produzione (stagni, vasche, acquari, gabbie, ecc.) va rilevata la presenza di pesci morti, deboli o dal comportamento anomalo. In particolare, vanno controllate (se possibile) le zone in prossimità delle griglie di scarico dell'acqua, dove i soggetti deboli tendono ad accumularsi spinti dalla corrente.

2. Selezione e raccolta dei campioni

In base ai controlli di cui alla tabella 1 A, vengono prelevati da 30 a 150 campioni di pesce e/o di fluido ovarico. Se la trota iridea è presente nell'azienda, l'intero campione deve provenire da questa specie; altrimenti, i prelievi vanno effettuati su tutte le altre specie allevate, ritenute soggette alla VHS e/o alla IHN in base all'elenco contenuto nell'allegato A della direttiva 91/67/CEE del Consiglio che stabilisce le norme di polizia sanitaria per la commercializzazione di animali e prodotti dell'acquacoltura. Le specie presenti nell'allevamento devono essere rappresentate in uguale misura nel campione. Nel primo quadriennio di controllo anteriore al conseguimento dello status di zona riconosciuta immune, il numero di unità da prelevare è 150, onde accertare con un margine di sicurezza del 95 % la presenza di portatori di virus con una prevalenza di portatori del 2 %. Negli anni successivi (mantenimento dello status di zona riconosciuta), la dimensione del campione potrà essere ridotta a 30 esemplari, per accertare con un margine di sicurezza del 95 % la presenza di virus con una prevalenza del 10 % (tabella 1 B).

Nelle aziende che si sottopongono regolarmente a controlli sanitari sulla base di un programma ufficiale e che risultano pertanto immuni da VHS e IHN, la dimensione del campione può essere di 30 esemplari anche durante il quadriennio iniziale.

Se un'azienda utilizza diversi tipi di acque per l'allevamento, i campioni (di 30 o 150 unità) possono provenire dalle diverse zone. Il prelievo deve innanzitutto comprendere i soggetti deboli, di morte recente (non in stato di decomposizione) o che presentano un comportamento anomalo. Qualora non sussistano le patologie suddette, il campione va scelto tra gli esemplari di aspetto normale e sano, deve provenire dalle varie zone dell'allevamento e rappresentare tutte le varie annate.

3. Preparazione ed invio dei campioni

Prima dell'invio o del trasferimento dei campioni al laboratorio, si asportano dai pesci, con forbici o forcipi sterili, pezzi degli organi da esaminare, che vengono posti in provette di plastica contenenti un mezzo di trasporto, ossia un mezzo di coltura cellulare costituito per il 10 % da siero di vitello e antibiotici. Si può raccomandare un'associazione di 200 UI di penicillina, 200 mg di streptomicina e 200 mg di canamicina per ml, ma si possono utilizzare anche altri antibiotici di provata efficacia. Gli organi da esaminare sono la milza, il rene anteriore e l'encefalo; in alcuni casi, si dovranno prelevare campioni di fluido ovarico (tabelle 1 A e 1 B).

Si possono raccogliere in una provetta parti di organo provenienti da un numero di pesci compreso tra 5 e 10 (tabelle 1 A e 1 B), che costituiscono un campione collettivo. In ogni campione il tessuto dovrebbe pesare almeno 1 g, in modo che la diluizione finale sia di 1: 10.

Le provette sono poste in contenitori isolati (ad esempio scatole di polistirene con pareti spesse) muniti di ghiaccio a sufficienza o di blocchi gelati, affinché i campioni siano raffreddati ad una temperatura compresa tra 0 e 5 °C durante il trasporto al laboratorio. Si deve evitare il congelamento dei campioni.

L'esame virologico deve iniziare quanto prima, e comunque non più tardi di 48 ore dalla raccolta dei campioni. Se i pesci da esaminare sono lunghi meno di 6 cm, si possono inviare al laboratorio i pesci interi in sacchetti di plastica raffreddati come sopra indicato.

4. Raccolta di ulteriore materiale diagnostico

A seconda degli accordi presi con il laboratorio diagnostico incaricato, possono essere raccolti e preparati anche altri tessuti dei pesci in vista di ulteriori esami.

II. Preparazione dei campioni per l'esame virologico

1. Omogeneizzazione di organi

In laboratorio, il contenuto delle provette viene interamente omogeneizzato (con stomacher, miscelatore o mortaio e pestello). L'omogeneizzato viene quindi messo in sospensione nel mezzo di trasporto originale. Se il campione è costituito da un pesce intero, ossia un pesce di lunghezza inferiore a 6 cm, esso viene tritato con forbici sterili previo asporto della parte del corpo situata dopo l'apertura anale, omogeneizzato come sopra indicato e messo in sospensione a 1: 10 in un mezzo di trasporto.

2. Centrifugazione dell'omogeneizzato

L'omogeneizzato viene immesso in una centrifuga refrigerata a 2-5 °C a 2 000-4 000 x g per 15 minuti e il supernatante viene raccolto a scopo di esame.

Se il campione è stato inviato in un mezzo di trasporto (ossia con esposizione ad antibiotici), il supernatante non deve essere nuovamente trattato con antibiotici.

Se il campione è stato inviato come pesce intero, l'omogeneizzato ottenuto dalla centrifugazione deve essere esposto ad antibiotici, nel mezzo di trasporto utilizzato per la risospensione, per 4 ore a temperatura ambiente oppure per una notte a 4 °C.

Il trattamento con antibiotici serve a controllare la contaminazione batterica nei campioni e a rendere superfluo il filtraggio attraverso membrane.

Subito dopo la centrifugazione si mescola un volume del supernatante con parti uguali di antisiero bivalente adeguatamente diluito del virus dell'IPN (ceppi di riferimento Sp e Ab) e il tutto viene incubato da un minimo di un'ora a 15 °C ad un massimo di 18 ore a 4 °C. Il titolo dell'antisiero deve essere almeno di 1: 2 000 in una prova di neutralizzazione delle placche al 50 %.

Il trattamento di tutti gli inoculi con antisiero del virus dell'IPN (che in alcune parti d'Europa si manifesta nel 50 % dei campioni di pesce) serve a impedire che si sviluppino nelle colture cellulari inoculate effetti citopatogeni (CPE) provocati dal virus dell'IPN. Si riduce in tal modo la durata degli esami virologici, nonché il numero di casi in cui la comparsa di CPE dovrebbe essere considerata potenzialmente indicativa di VHS o IHN.

Se i campioni provengono da unità di produzione ufficialmente considerate immuni da IPN, si può fare a meno di trattare gli inoculi con il relativo antisiero.

III. Esame virologico

1. Colture cellulari e mezzi

Cellule BF-2 e, a scelta, cellule EPC o FHM sono coltivate a 20 - 25 °C nel MEM di Eagle (o in sue modifiche) con aggiunta del 10 % di siero bovino fetale e di antibiotici in concentrazioni standard.

Se le cellule sono coltivate in fiale chiuse, il mezzo è tamponato con bicarbonato. Il mezzo utilizzato per la coltura di cellule in unità aperte deve essere tamponato con Tris-HCI (23 mM) e bicarbonato di sodio (6 mM) ad un pH il più vicino possibile a 7,6, valore ottimale per la moltiplicazione del virus.

Le colture cellulari da impiegare per l'inoculazione con materiale tissulare devono essere giovani (da 4 a 48 ore di vita) e devono svilupparsi rapidamente (non concrescenti) quando vengono inoculate.

2. Inoculazione delle colture cellulari

La sospensione di organi trattata con antibiotici è inoculata in colture cellulari a due diluizioni, cioè una diluzione primaria e successivamente una diluzione di 1: 100 per prevenire interferenze omologhe. Debbono essere inoculate almeno due linee cellulari (vedi punto III.1). Il rapporto tra la grandezza dell'inoculo e il volume del mezzo di coltura cellulare dovrebbe approssimarsi a 1: 10.

Per ogni diluizione ed ogni linea cellulare si utilizza una superficie cellulare minima di circa 2 cm2, corrispondente ad un pozzetto su una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Si raccomanda l'uso di piastre di colture cellulari, ma sono ammesse anche unità aventi una superficie di sviluppo analoga o più grande.

3. Incubazione delle colture cellulari

Le colture cellulari inoculate sono incubate per 7 giorni alla temperatura di 15 °C. Se il colore del mezzo di coltura cellulare vira dal rosso al giallo e indica quindi una acidificazione del mezzo, occorre regolare il pH con una soluzione di bicarbonato sterile o sostanze equivalenti, in modo da garantire la sensibilità della cellula all'infezione virale.

Una volta ogni sei mesi si procede alla titolazione delle scorte congelate dei virus della VHS e della IHN per controllare la sensibilità delle colture cellulari all'infezione.

4. Microscopia

Le colture cellulari inoculate vengono controllate ogni giorno per individuare la comparsa di CPE mediante ingrandimento di circa 40 volte. Qualora si constati chiaramente la presenza di CPE, si inizia immediatamente la procedura di identificazione del virus secondo quanto disposto al capitolo IV.

Nello stesso tempo si prendono le misure opportune per sospendere il riconoscimento dell'unità di produzione da cui proviene il campione di virus positivo, nonché delle unità di produzione situate a valle della medesima.

La sospensione del riconoscimento è mantenuta fintanto che non venga evidenziato con prove di laboratorio che il virus in questione non è un virus della VHS o della IHN. Il virus deve essere identificato entro quattro settimane al massimo, compreso il tempo necessario per l'esame nei laboratori di riferimento.

5. Subcoltivazione

Se dopo sette giorni di incubazione non si sono sviluppati CPE, si effettua una subcoltivazione di cellule colturali fresche, utilizzando una superficie cellulare simile a quella della coltura principale.

Dopo un ciclo di congelamento-scongelamento delle colture vengono messe assieme, in base alla linea cellulare, alcune aliquote del mezzo di tutti i pozzetti/colture che costituiscono la coltura principale, 0,5 ml del mezzo vengono mescolati con aliquote uguali di antisiero dell'IPN, secondo quanto descritto al punto II.3, e la miscela viene incubata a 15 °C per 60 minuti. Si inocula quindi la miscela in colture cellulari analoghe a diluizioni di 1: 1 e 1: 100, secondo quanto descritto al punto III.2. L'inoculazione può essere preceduta da una preincubazione di tutte le diluizioni con antisiero bivalente del virus IPN ad una diluizione appropriata.

Le colture inoculate vengono poi incubate per sette giorni alla temperatura di 15 °C, effettuando le osservazioni di cui al punto III.4.

IV. Identificazione del virus

1. Neutralizzazione

Se in una coltura cellulare sono stati individuati CPE, il mezzo viene raccolto e si rimuovono le cellule tramite centrifugazione a bassa velocità o filtraggio su membrana (0,45 mm). Il mezzo viene poi diluito a 1: 100 e 1: 10 000 in un mezzo di coltura cellulare.

Alcune aliquote delle diluizioni sono mescolate e inoculate per 60 minuti a 15 °C separatamente con aliquote uguali dei seguenti reattivi:

Anticorpo gruppo specifico del VHSV (Virus Egtved) 1: 50 * Anticorpo gruppo specifico del virus della necrosi ematopoietica infettiva (IHNV) 1: 50 * Antisiero bivalente specifico del virus della necrosi pancreatica infettiva (IPNV) (ceppi di riferimento Sp e Ab) 1: 50 * Mezzo 1: 1

* o in base alle istruzioni del laboratorio di riferimento circa la possibile citotossicità degli antisieri.

I reattivi utilizzati devono essere della qualità di riferimento per quanto attiene al titolo e alla specificità.

Almeno due colture cellulari di ogni miscela siero-virus sono inoculate con 50 ml ciascuna e quindi incubate a 15 °C. Lo sviluppo di CPE viene controllato secondo quanto descritto al punto III.4.

Se la prova non consente un'identificazione sicura del virus entro una settimana, si prende uno dei seguenti provvedimenti:

a) il virus viene trasferito in un laboratorio di riferimento nazionale per i virus del pesce, allo scopo di esservi immediatamente identificato;

b) si applicano l'IFAT (punto IV.2), l'ELISA (punto IV.3) o altri metodi di identificazione del virus con reattivi della qualità di riferimento.

2. Immunofluorescenza (IFAT)

Per ogni isolato di virus da identificare, 8 vetrini o equivalenti sono seminati con cellule EPC ad una densità che favorisca una concrescenza del 60-90 % dopo 24 ore di coltivazione. Vengono scelte a tale scopo cellule EPC a causa della loro forte aderenza alle superfici vetrose.

Quando le cellule si sedimentano sulla superficie del vetro (circa un'ora dopo la semina) o quando le colture sono state incubate fino a 24 ore, il virus da identificare viene inoculato. Quattro colture vengono inoculate ad un rapporto di 1: 10 (volume/volume) e quattro colture ad un rapporto di 1: 100.

Dopo 20-30 ore dall'inoculazione, le colture sono sciacquate due volte nel MEM di Eagle senza siero, fissate nell'acetone e quindi tinte per mezzo di un IFAT a due strati. Il primo strato di reattivi è formato da un antisiero approvato (vedi punto IV.1). Il secondo strato di reattivi è un antisiero coniugato FITC dell'immunoglobulina utilizzata nel primo strato. Per ciascuno degli antisieri saggiati si devono tingere almeno una coltura inoculata a dose elevata e una coltura inoculata a dose bassa. La prova deve comportare regolari controlli negativi e positivi.

Le colture tinte vengono montate con una soluzione fisiologica addizionata di glicerolo. L'esame al microscopio va fatto con luce UV incidente, utilizzando oculari da 10 o da 12 ed obiettivi da 25 o da 40 con rispettive aperture >0,7 e >1,3. Le diluizioni del primo antisiero e dell'antisiero coniugato FITC dell'immunoglobulina antispecie dipendono dalla strumentazione microscopica scelta o disponibile.

Alcuni ceppi di virus Egtved reagiscono fortemente con l'antisiero del ceppo di riferimento F 1 nell'IFAT, sebbene non reagiscano nelle prove di neutralizzazione.

3. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

I pozzetti nelle piastre di microtitolazione (ad esempio: immunopiastre Nunc-Maxisorp, Nunc, Danimarca) sono coperti per una notte con diluizioni raccomandate di frazioni di immunoglobulina purificata a proteina A degli antisieri, menzionate al punto IV.1.

Dopo aver sciacquato i pozzetti con il tampone PBS-Tween-20, si aggiunge ai pozzetti il virus da identificare con diluizioni effettuate 2 o 4 volte e lo si lascia reagire con l'anticorpo di copertura per 60 minuti a 37 °C. Dopo il risciacquo con il tampone PBS-Tween-20, si aggiungono anticorpi biotinilati di una specificità corrispondente a quella degli anticorpi di copertura e li si lascia reagire per 60 minuti a 20 °C. Dopo un altro risciacquo effettuato come sopra, si aggiunge streptavidina coniugata HRP e la si lascia reagire per un'ora a 20 °C. Dopo un ultimo risciacquo l'enzima legato viene visualizzato per mezzo di un adeguato substrato ELISA (OPD, TMB o altri).

Il metodo ELISA a base di biotina-avidina sopra descritto è stato presentato a titolo d'esempio, ma si possono utilizzare anche altre versioni di ELISA, che siano di sicura efficacia.

Tabella 1 A

Conseguimento dello status

Numero dei controlli sanitari su base annuale Numero dei campioni di organi da esaminare Numero dei campioni di fluido ovarico da esaminare Zone continentali: a) Allevamenti con riproduttori 2 120 (1o periodo)

150 (2o periodo) 30 (1o periodo)

0 b) Allevamenti di soli riproduttori 2 0 150 (1o o 2o periodo) c) Allevamenti senza riproduttori 2 150 (1o e 2o periodo) 0 Zone costiere: a) Allevamenti senza riproduttori 2 30 (1o e 2o periodo) 0 b) Allevamenti con riproduttori 2 120 (1o periodo)

150 (2o periodo) 30 (1o periodo)

0

Numero massimo di esemplari per ogni campione collettivo: 5

Tabella 1 B

Conservazione dello status

Numero dei controlli sanitari su base annuale Numero dei campioni di organi da esaminare Numero dei campioni di fluido ovarico da esaminare Zone continentali: a) Allevamenti con riproduttori 2 15 (1o o 2o periodo) 15 (1o o 2o periodo) b) Allevamenti di soli riproduttori 2 0 30 (1o o 2o periodo) c) Allevamenti senza riproduttori 2 30 (1o o 2o periodo) 0 Zone costiere: a) Allevamenti senza riproduttori 1 30 (1) (1o o 2o periodo) 0 b) Allevamenti con riproduttori 2 0 30 (1o o 2o periodo)

Numero massimo di esemplari per ogni campione collettivo: 10

(1) I campioni vanno raccolti in un periodo compreso tra 2 e 6 mesi dopo il trasferimento dei pesci dall'acqua dolce a quella salata.

SECONDA PARTE

METODI DIAGNOSTICI PER L'ACCERTAMENTO DELLA IHN E DELLA VHS NEI CASI SOSPETTI DI INFEZIONE

La necrosi ematopoietica infettiva (IHN) e la setticemia emorragica virale (VHS) possono essere diagnosticate con una delle seguenti tecniche:

A. Isolamento convenzionale del virus e sua successiva identificazione sierologica.

B. Isolamento del virus e sua simultanea identificazione sierologica.

C. Tecniche diagnostiche rapide (IFAT, ELISA).

Una prima diagnosi della IHN o della VHS nelle aziende delle zone riconosciute non si può basare solamente sul metodo C: deve essere usato anche il metodo A o il metodo B.

I tessuti da utilizzare per l'esame virologico debbono, in alcuni casi, essere accompagnati da altro materiale per esami batteriologici, parassitologici, istologici o di altro tipo, necessari per effettuare una diagnosi differenziale. Questo materiale deve essere raccolto in base alle procedure stabilite dall'OIE. A. Isolamento convenzionale del virus e sua successiva identificazione sierologica

A.I.1. Selezione dei campioni Per l'esame vengono scelti almeno 10 pesci che presentino sintomi clinici di IHN o VHS. A.I.2. Preparazione ed invio dei campioni Prima dell'invio o del trasferimento dei campioni al laboratorio, si asportano dai pesci, con forbici o forcipi sterili, pezzi degli organi da esaminare, che vengono posti in provette di plastica contenenti un mezzo di trasporto, ossia un mezzo di coltura cellulare costituito per il 10 % da siero di vitello e antibiotici. Si può raccomandare un'associazione di 200 UI di penicillina, 200 mg di streptomicina e 200 mg di canamicina per ml, ma si possono utilizzare anche altri antibiotici di provata efficacia. Gli organi da esaminare sono la milza, il rene anteriore e l'encefalo. Si possono raccogliere in una provetta parti di organo, provenienti da un numero di pesci compreso tra 5 e 10 che costituiscono un campione collettivo. In ogni campione il tessuto dovrebbe pesare almeno 1 g, in modo che la diluizione finale sia all'incirca di 1: 10. Le provette sono poste in contenitori isolati (ad esempio scatole di polistirene con pareti spesse) muniti di ghiaccio a sufficienza o di blocchi gelati, affinché i campioni siano raffreddati ad una temperatura compresa tra 0 e 5 °C durante il trasporto al laboratorio. Si deve evitare il congelamento dei campioni. L'esame virologico deve iniziare prima possibile, e comunque non più tardi di 48 ore dalla raccolta dei campioni. Se i pesci da esaminare sono lunghi meno di 6 cm, si possono inviare al laboratorio i pesci interi in sacchetti di plastica raffreddati come sopra indicato. A.I.3. Raccolta di ulteriore materiale diagnostico A seconda degli accordi presi con il laboratorio diagnostico incaricato, possono essere raccolti e preparati altri tessuti dei pesci in vista di ulteriori esami. A.II.1. Omogeneizzazione di organi In laboratorio, il contenuto delle provette viene interamente omogeneizzato (con stomacher, miscelatore o mortaio e pestello). L'omogeneizzato viene quindi messo in sospensione nel mezzo di trasporto originale. Se il campione è costituito da un pesce intero, ossia un pesce di lunghezza inferiore a 6 cm, esso viene tritato con forbici sterili previo asporto della parte del corpo situata dopo l'apertura anale, omogeneizzato come sopra indicato e messo in sospensione a 1: 10 in un mezzo di trasporto. A.II.2. Centrifugazione dell'omogeneizzato L'omogeneizzato viene immesso in una centrifuga refrigerata a 2-5 °C a 2 000-4 000 × g per 15 minuti e il supernatante viene raccolto a scopo di esame. Se il campione è stato inviato in un mezzo di trasporto (ossia con esposizione ad antibiotici), il supernatante non deve essere nuovamente trattato con antibiotici. Se il campione è stato inviato come pesce intero, l'omogeneizzato ottenuto dalla centrifugazione deve essere esposto ad antibiotici, nel mezzo di trasporto utilizzato per la risospensione, per 4 ore a temperatura ambiente oppure per una notte a 4 °C. Il trattamento con antibiotici serve a controllare la contaminazione batterica nei campioni e a rendere superfluo il filtraggio attraverso membrane. Subito dopo la centrifugazione si mescola un volume del supernatante con parti uguali di antisiero bivalente adeguatamente diluito, del virus dell'IPN (ceppi di riferimento Sp e Ab) e il tutto viene incubato da un minimo di un'ora a 15 °C ad un massimo di 18 ore a 4 °C. Il titolo dell'antisiero deve essere almeno di 1: 2 000 in una prova di neutralizzazione delle placche al 50 %. Il trattamento di tutti gli inoculi con antisiero del virus dell'IPN (che in alcune parti d'Europa si manifesta nel 50 % dei campioni di pesce) serve a impedire che si sviluppino nelle colture cellulari inoculate effetti citopatogeni (CPE) provocati dal virus dell'IPN. Si riduce in tal modo la durata degli esami virologici, nonché il numero di casi in cui la comparsa di CPE dovrebbe essere considerata potenzialmente indicativa di VHS o IHN. Se i campioni provengono da unità di produzione ufficialmente considerate immuni da IPN, si può fare a meno di trattare gli inoculi con il relativo antisiero. A.III.1. Colture cellulari e mezzi Cellule BF-2 e, a scelta, cellule EPC o FHM sono coltivate a 20-25 °C nel MEM di Eagle (o in sue modifiche) con aggiunta del 10 % di siero bovino fetale e di antibiotici in concentrazioni standard. Se le cellule sono coltivate in fiale chiuse, il mezzo è tamponato con bicarbonato. Il mezzo utilizzato per la coltura di cellule in unità aperte deve essere tamponato con Tris-HCI (23 mM) e bicarbonato (6 mM) ad un pH il più vicino possibile a 7,6, valore ottimale per la moltiplicazione del virus. Le colture cellulari da impiegare per l'inoculazione con materiale tissulare devono essere giovani (da 4 a 48 ore di vita) e devono svilupparsi rapidamente (non concrescenti) quando vengono inoculate. A.III.2. Inoculazione delle colture cellulari La sospensione di organi trattata con antibiotici è inoculata in colture cellulari a due diluizioni, cioè una diluzione primaria e, successivamente, una diluzione di 1: 100 della stessa per prevenire interferenze omologhe. Debbono essere inoculate almeno due linee cellulari (vedi A.III.1). Il rapporto tra la grandezza dell'inoculo e il volume del mezzo di coltura cellulare dovrebbe approssimarsi a 1: 10. Per ogni diluizione ed ogni linea cellulare si utilizza una superficie cellulare minima di circa 2 cm2, corrispondente ad un pozzetto su una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Si raccomanda l'uso di piastre di colture cellulari, ma sono ammesse anche unità aventi una superficie di sviluppo analoga o più grande.

A.III.3. Incubazione delle colture cellulari Le colture cellulari inoculate sono incubate per 7 giorni alla temperatura di 15 °C. Se il colore del mezzo di coltura cellulare vira dal rosso al giallo e indica quindi una acidificazione del mezzo, occorre regolare il pH con una soluzione di bicarbonato sterile e sostanze equivalenti, in modo da garantire la sensibilità della cellula all'infezione virale. Una volta ogni sei mesi si procede alla titolazione delle scorte congelate dei virus della VHS e della IHN per controllare la sensibilità delle colture cellulari all'infezione. A.III.4. Microscopia Le colture cellulari inoculate vengono controllate ogni giorno per individuare la comparsa di CPE mediante ingrandimento di circa 40 volte. Qualora si constati chiaramente la presenza di CPE, si inizia immediatamente la procedura di identificazione del virus secondo quanto disposto al punto A.IV. Nello stesso tempo si prendono le misure opportune per sospendere il riconoscimento dell'unità di produzione da cui proviene il campione di virus positivo, nonché delle unità di produzione situate a valle della medesima. La sospensione del riconoscimento è mantenuta fintanto che non venga evidenziato con prove di laboratorio che il virus in questione non è un virus della VHS o della IHN. Il virus deve essere identificato entro 4 settimane al massimo, compreso il tempo necessario per l'esame nei laboratori di riferimento. A.III.5. Subcoltivazione Se dopo 7 giorni di incubazione non si sono sviluppati CPE, si effettua una subcoltivazione di cellule colturali fresche, utilizzando una superficie cellulare simile a quella della coltura principale. Dopo un ciclo di congelamento-scongelamento delle colture vengono messe assieme, secondo la linea cellulare, alcune aliquote del mezzo di tutti i pozzetti/colture che costituiscono la coltura principale, 0,5 ml del mezzo vengono mescolati con aliquote uguali di antisiero dell'IPN, secondo quanto descritto al punto A.II.2, e la miscela viene incubata a 15 °C per 60 minuti. Si inocula quindi la miscela nelle colture cellulari a diluizioni di 1: 1 e 1: 100, secondo quanto descritto al punto A.III.2. L'inoculazione può essere preceduta da una preincubazione di tutte le diluizioni con antisiero bivalente del virus IPN ad una diluizione appropriata. Le colture inoculate vengono poi incubate per sette giorni alla temperatura di 15 °C, effettuando le osservazioni di cui al punto A.III.4. A.IV.1. Neutralizzazione Se in una coltura cellulare sono stati individuati CPE, il mezzo viene raccolto e si rimuovono le cellule tramite centrifugazione a bassa velocità o filtraggio su membrana (0,45 mm). Il mezzo viene poi diluito a 1: 100 e 1: 10 000 in un mezzo di coltura cellulare. Alcune aliquote delle diluizioni sono mescolate e inoculate per 60 minuti a 15 °C separatamente con aliquote uguali dei seguenti reattivi: Anticorpo gruppo specifico del VHSV (Virus Egtved) 1: 50 * Anticorpo gruppo specifico del virus della necrosi ematopoietica infettiva (IHNV) 1: 50 * Antisiero bivalente specifico del virus della necrosi pancreatica infettiva (IPNV) (ceppi di riferimento Sp e Ab) 1: 50 * Mezzo 1: 1 * o in base alle istruzioni del laboratorio di riferimento circa la possibile citotossicità degli antisieri. I reattivi utilizzati devono essere della qualità di riferimento per quanto attiene al titolo e alla specificità. Almeno due colture cellulari di ogni miscela siero-virus sono inoculate con 50 ml ciascuna e quindi incubate a 15 °C. Lo sviluppo di CPE viene controllato secondo quanto descritto al punto A.III.4. Se la prova non consente un'identificazione sicura del virus entro una settimana, si prende uno dei seguenti provvedimenti: a) il virus viene trasferito in un laboratorio di riferimento nazionale per i virus del pesce, allo scopo di esservi immediatamente identificato; b) si applicano l'IFAT (punto A.IV.2), l'ELISA (punto A.IV.3) o altri metodi di identificazione del virus con reattivi della qualità di riferimento. A.IV.2. Immunofluorescenza (IFAT) Per ogni isolato di virus da identificare, 8 vetrini o equivalenti sono seminati con cellule EPC ad una densità che favorisca una concrescenza del 60-90 % dopo 24 ore di coltivazione. Vengono scelte a tale scopo cellule EPC a causa della loro forte aderenza alle superfici vetrose. Quando le cellule si sedimentano sulla superficie del vetro (circa un'ora dopo la semina) o quando le colture sono state incubate fino a 24 ore, si inocula il virus da identificare. Quattro colture vengono inoculate secondo un rapporto in volume di 1: 10 e le altre quattro secondo un rapporto di 1: 100. Dopo 20-30 ore dall'inoculazione, le colture sono sciacquate due volte nel MEM di Eagle senza siero, fissate nell'acetone e quindi tinte per mezzo di un IFAT a due strati. Il primo strato di reattivi è formato da un antisiero approvato (vedi punto IV.1). Il secondo strato di reattivi è un antisiero coniugato FITC dell'immunoglobulina utilizzata nel primo strato. Per ciascuno degli antisieri saggiati si devono tingere almeno una coltura inoculata a dose elevata e una coltura inoculata a dose bassa. La prova deve comportare regolari controlli negativi e positivi. Le colture tinte vengono montate con una soluzione fisiologica addizionata di glicerolo. L'esame al microscopio va fatto con luce UV incidente, utilizzando oculari da 10 o da 12 ed obiettivi da 25 o da 40 con rispettive aperture >0,7 e >1,3. Le diluizioni del primo antisiero e dell'antisiero coniugato FITC dell'immunoglobulina antispecie dipendono dalla strumentazione microscopica scelta o disponibile. Alcuni ceppi di virus Egtved reagiscono fortemente con l'antisiero del ceppo di riferimento F 1 nell'IFAT, sebbene non reagiscano nelle prove di neutralizzazione. A.IV.3. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) I pozzetti nelle piastre di microtitolazione (ad es. immunopiastre Nunc-Maxisorp, Nunc, Danimarca) sono coperti per una notte con diluizioni raccomandate di frazioni di immunoglobulina purificata a proteina A degli antisieri, menzionate al punto A.IV.1. Dopo aver sciacquato i pozzetti con il tampone PBS-Tween-20, si aggiunge ai pozzetti il virus da identificare con diluizioni effettuate 2 o 4 volte e lo si lascia reagire con l'anticorpo di copertura per 60 minuti a 37 °C. Dopo il risciacquo con il tampone PBS-Tween-20, si aggiungono anticorpi biotinilati di una specificità corrispondente a quella degli anticorpi di copertura e li si lascia reagire per 60 minuti a 20 °C. Dopo un altro risciacquo effettuato come sopra, si aggiunge streptavidina coniugata HRP e la si lascia reagire per un'ora a 20 °C. Dopo un ultimo risciacquo l'enzima legato viene visualizzato per mezzo di un adeguato substrato ELISA (OPD, TMB o altri). Il metodo ELISA a base di biotina-avidina sopra descritto è stato presentato a titolo di esempio, ma si possono utilizzare anche altre versioni di ELISA, che siano di sicura efficacia.

B. Isolamento del virus e sua simultanea identificazione sierologica

B.I.1-2. Raccolta dei campioni Vedi punto A.I.1. B.I.3. Preparazione e invio dei campioni Vedi punto A.I.2. B.II.1. Omogeneizzazione di organi Vedi punto A.II.1. B.II.2. Centrifugazione dell'omogeneizzato Vedi punto A.II.2. B.II.3. Trattamento del supernatante con antisieri diagnostici La sospensione di organi trattata con antibiotici e anti-IPN viene diluita a 1: 10 e 1: 10 000 in mezzo di coltura cellulare e delle aliquote vengono miscelate e incubate per 60 minuti a 15 °C con parti uguali dei reagenti elencati al punto A.IV.1. B.III.1. Colture cellulari e mezzi Vedi punto A.III.1. B.III.2. Inoculazione delle colture cellulari Per ogni miscela siero-virus (preparata conformemente al punto B.II.3) almeno due colture cellulari per ogni linea cellulare vengono inoculate ciascuna con 50 ml. B.III.3. Incubazione delle colture cellulari Vedi punto A.III.3. B.III.4. Microscopia Le colture cellulari inoculate vengono controllate ogni giorno per individuare la comparsa di CPE mediante ingrandimento di circa 40 volte. Se la comparsa di CPE viene ostacolata da uno degli antisieri utilizzati, si può considerare identificato il virus. Se nessuno degli antisieri è efficace, debbono essere intraprese le procedure di identificazione del virus descritte al punto A.IV. B.III.5. Subcoltivazione Se dopo sette giorni non si sono sviluppati CPE, deve essere effettuata una subcoltivazione a partire da colture inoculate con supernatante più mezzo (B.II.3).

C. Tecniche diagnostiche rapide (IFAT, ELISA) Il supernatante preparato come indicato al punto A.II.2 è sottoposto alla tecnica IFAT o alla tecnica ELISA, descritte rispettivamente ai punti A.IV.2 e A.IV.3. Queste tecniche rapide vanno integrate con un'indagine virologica conforme ad A o B entro le 48 ore successive alla raccolta dei campioni, qualora:

a) si ottenga una reazione negativa;

b) si ottenga una reazione positiva che rappresenti il primo caso di IHN o VHS nelle zone riconosciute.