02009R0152 — IT — 28.06.2022 — 008.001

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Modificato da:

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REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE

del 27 gennaio 2009

che fissa i metodi di campionamento e d'analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

(Testo rilevante ai fini del SEE)

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Articolo 1

Il campionamento per il controllo ufficiale degli alimenti per animali, in particolare per quanto concerne la determinazione dei costituenti, compresi i materiali che contengono, o sono costituiti da o sono prodotti a partire da, organismi geneticamente modificati (OGM), gli additivi per mangimi come definiti dal regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio ( 1 ), le sostanze indesiderabili quali definite dalla direttiva 2002/32/CE del Parlamento europeo e del Consiglio ( 2 ), è effettuato conformemente ai metodi di cui all’allegato I.

Il metodo di campionamento di cui all’allegato I è applicabile per il controllo dei mangimi per quanto concerne la determinazione dei residui di antiparassitari quali definiti dal regolamento (CE) n. 396/2005 del Parlamento europeo e del Consiglio ( 3 ), e il controllo della conformità al regolamento (UE) n. 619/2011.

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Articolo 2

La preparazione dei campioni per l'analisi e l'espressione dei risultati sono conformi ai metodi indicati nell'allegato II.

Articolo 3

Le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali sono effettuate secondo i metodi indicati nell'allegato III (Metodi di analisi per il controllo della composizione delle materie prime per alimenti per animali e degli alimenti composti), nell'allegato IV (Metodi di analisi per il controllo del contenuto di additivi autorizzati negli alimenti per animali), nell'allegato V (Metodi di analisi per il controllo della presenza di sostanze indesiderabili negli alimenti per animali) e nell'allegato VI (Metodi di analisi per la determinazione dei costituenti di origine animale nell'ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali).

Articolo 4

Il valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame è calcolato conformemente al metodo descritto nell'allegato VII.

Articolo 5

I metodi di analisi per il controllo della presenza illecita di additivi il cui uso non è più autorizzato negli alimenti per animali di cui all'allegato VIII sono applicati a fini di conferma.

Articolo 6

Le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE sono abrogate.

I riferimenti alle direttive abrogate s'intendono fatti al presente regolamento e vanno letti secondo le tavole di concordanza che figurano nell'allegato IX.

Articolo 7

Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Esso si applica a decorrere dal 26 agosto 2009.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

▼M3

ALLEGATO I

METODI DI CAMPIONAMENTO

1.   FINALITÀ E CAMPO DI APPLICAZIONE

I campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali sono prelevati secondo le modalità sottoindicate. Tali campioni sono da considerarsi rappresentativi delle partite campionate.

Lo scopo del campionamento rappresentativo è di prelevare una piccola frazione di un lotto in modo che la determinazione di una caratteristica specifica di tale frazione rappresenti il valore medio della caratteristica del lotto. Il campionamento avviene mediante prelievo ripetuto di campioni elementari in diversi punti del lotto. Tali campioni elementari sono mescolati per formare un campione globale, dal quale sono ricavati a loro volta dei campioni finali rappresentativi per divisione rappresentativa.

Se, ad un controllo visivo, partite del mangime da sottoporre a campionamento mostrano una differenza di qualità dal resto del mangime dello stesso lotto, tali partite vengono separate dal resto del mangime e trattate come un sottolotto distinto. Qualora non fosse possibile suddividerlo in sottolotti, il mangime viene sottoposto a campionamento come lotto unico. In tali casi, ne è fatta menzione nel verbale di campionamento.

Se un mangime facente parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione viene sottoposto a campionamento conformemente alle disposizioni del presente regolamento e risulta non soddisfare i requisiti UE, si presume che tutto il mangime di tale lotto non soddisfi i requisiti UE, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti alcuna prova che confermi che anche il resto del lotto non soddisfa i requisiti UE.

2.   DEFINIZIONI

3.   DISPOSIZIONI GENERALI

4.   STRUMENTI

5.   REQUISITI QUANTITATIVI PER QUANTO RIGUARDA IL NUMERO DI CAMPIONI ELEMENTARI

5.1.    Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo delle sostanze o dei prodotti distribuiti in modo uniforme negli alimenti per animali

5.1.1.    Alimenti solidi alla rinfusa

5.1.2.    Alimenti liquidi alla rinfusa

5.1.3.    Alimenti in confezioni

Gli alimenti (solidi e liquidi) possono essere confezionati in sacchetti, sacchi, barattoli, fusti ecc., ai quali si fa riferimento nella tabella come «unità». Le unità grandi (≥ 500 kg o litri) si campionano in base alle disposizioni prescritte per gli alimenti alla rinfusa (cfr. punti 5.1.1 e 5.1.2)

5.1.4.    Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali

Almeno un formellato o una mattonella da campionare per partita di 25 unità, per un massimo di quattro formellati o mattonelle.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

5.1.5.    Foraggi grossolani/foraggio

5.2.    Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti negli alimenti per animali in maniera non uniforme

Questi requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari si applicano nei casi seguenti:

Nel caso che l’autorità di controllo sospetti fortemente che una tale distribuzione non uniforme si presenti anche in caso di contaminazione crociata da un componente o da una sostanza in un alimento per animali composto, si possono applicare i requisiti quantitativi indicati nella tabella che segue.

5.3.    Requisiti quantitativi relativi ai campioni elementari nel caso di lotti molto grandi

Nel caso di grandi partite campionate (> 500 tonnellate): numero di campioni elementari da prelevare = 40 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di sostanze o prodotti ripartiti in modo uniforme nell’alimento, oppure 100 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme nelle materie prime per alimenti per animali.

6.   REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI IL CAMPIONE GLOBALE

7.   REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI I CAMPIONI FINALI

Campioni finali

È richiesta l’analisi di almeno un campione finale. L’entità del campione finale destinato all’analisi deve essere non inferiore ai seguenti quantitativi:

8.   METODO DI CAMPIONAMENTO PER LOTTI MOLTO GRANDI IMMAGAZZINATI O TRASPORTATI CON MODALITÀ CHE NON PERMETTONO IL PRELIEVO DI CAMPIONI DA TUTTO IL LOTTO.

8.1.    Principi generali

Se le modalità di trasporto o di immagazzinamento di un lotto non consentono il prelievo di campioni elementari dall’intero lotto, è preferibile effettuare il campionamento quando il lotto è in movimento.

Nel caso dei grandi depositi per immagazzinare alimenti per animali, gli operatori vanno incoraggiati ad installare nel deposito attrezzature che consentano di effettuare il campionamento (automatico) su tutto il lotto immagazzinato.

In caso di applicazione delle procedure di campionamento previste dal presente capitolo 8, l’operatore del settore dei mangimi o un suo rappresentante viene informato sulla procedura di campionamento. Se contesta la procedura, l’operatore o il suo rappresentante deve consentire all’autorità competente di effettuare prelievi per il campionamento in tutto il lotto a proprie spese.

8.2.    Lotti grandi trasportati per nave

8.2.1.    Campionamento dinamico di lotti grandi trasportati per nave

È preferibile effettuare il campionamento di lotti grandi nelle navi quando il prodotto è in movimento (campionamento dinamico).

Il campionamento si effettua stiva per stiva (intendendo come stiva uno spazio separabile fisicamente). Le stive vengono comunque parzialmente svuotate l’una dopo l’altra, così che l’iniziale separazione fisica non sussiste più dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio. Il campionamento può pertanto essere effettuato in funzione della separazione fisica iniziale o della separazione dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio.

Le operazioni di scarico di una nave possono durare diversi giorni. Di norma, il campionamento deve essere effettuato ad intervalli regolari durante l’intera fase di scarico. La presenza di un ispettore ufficiale per il campionamento durante l’intera operazione di scarico non è tuttavia sempre possibile o opportuna. Pertanto, il campionamento può riguardare soltanto una parte (partita campionata) del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata.

In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

La presenza di un ispettore è necessaria anche quando il campione ufficiale è prelevato automaticamente. Tuttavia, nel caso in cui il campionamento sia effettuato in modo automatico con parametri prefissati non modificabili nel corso dello stesso e i campioni elementari siano posti in un recipiente sigillato, così da prevenire possibili frodi, la presenza di un ispettore è richiesta solo all’inizio del campionamento, ogni volta che il recipiente dei campioni deve essere cambiato e alla fine del campionamento.

8.2.2.    Campionamento statico di lotti trasportati per nave

Se il campionamento è eseguito in modo statico, si applica la stessa procedura prevista per le strutture di stoccaggio (sili) accessibili dall’alto (cfr. punto 8.4.1).

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile (dall’alto) del lotto/della stiva. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.3.    Campionamento di lotti grandi immagazzinati in depositi

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.4.    Campionamento di strutture di stoccaggio (sili)

8.4.1.    Campionamento di sili (facilmente) accessibili dall’alto

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.4.2.    Campionamento di sili non accessibili dall’alto (chiusi)

8.4.2.1.    Sili non accessibili dall’alto (chiusi) di dimensioni > 100 tonnellate

Il mangime immagazzinato in siffatti sili non è campionabile in modo statico. Pertanto, qualora si debba campionare il mangime che si trova all’interno del silo e non vi sia possibilità di spostare la partita, occorre accordarsi con l’operatore affinché questi informi l’ispettore su quando sarà svuotato il silo, di modo che il campionamento possa essere eseguito con il mangime in movimento.

8.4.2.2.    Sili non accessibili dall’alto (chiusi) di dimensioni < 100 tonnellate

La procedura di campionamento prevede che si inserisca in un recipiente un quantitativo compreso fra 50 e 100 kg e che si prelevi da esso il campione. Le dimensioni del campione globale corrispondono alla totalità del lotto e il numero dei campioni elementari alla quantità tratta dal silo e immessa nel recipiente per il campionamento. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.5.    Campionamento di alimenti alla rinfusa in grandi contenitori chiusi

Spesso tali lotti sono campionabili solo dopo essere stati scaricati. In certi casi non è possibile scaricare presso il punto di importazione o di controllo, per cui il campionamento va eseguito al momento dello scarico dei contenitori.

9.   ISTRUZIONI RELATIVE AI PRELIEVI, ALLA FORMAZIONE E ALL’IMBALLAGGIO DEI CAMPIONI

9.1.    Aspetti generali

Prelevare e formare i campioni senza inutili ritardi, prendendo le precauzioni necessarie per evitare qualsiasi alterazione o contaminazione del prodotto. Le superfici, i recipienti e gli strumenti impiegati devono essere puliti e asciutti.

9.2.    Campioni elementari

I campioni elementari vanno prelevati a caso dall’insieme della partita da campionare e devono risultare d’entità approssimativamente uguale.

Il campione elementare è pari ad almeno 100 grammi o a 25 grammi in caso di foraggio grossolano o foraggio a basso peso specifico.

Qualora siano da prelevare meno di 40 campioni elementari, conformemente alle norme procedurali per il campionamento fissate al punto 8, le dimensioni di tali campioni sono determinate in funzione delle dimensioni prescritte per il campione globale da ottenere (cfr. punto 6).

In caso di campionamento di piccoli lotti di mangime confezionato da cui, in base ai requisiti quantitativi, sia da prelevare un numero limitato di campioni elementari, il campione elementare è dato dal contenuto di un’unità originaria di peso non superiore a 1 kg o di volume non superiore a un litro.

Per i campionamenti di mangime confezionato composto da piccole unità (ad esempio < 250 g), le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell’unità.

9.2.1.    Alimenti alla rinfusa

Eventualmente si può procedere al campionamento al momento della messa in movimento della partita da campionare (carico o scarico).

9.2.2.    Alimenti in confezioni

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare con una sonda o con una pala una parte del contenuto di ciascuna di tali unità. All’occorrenza svuotare separatamente le unità.

9.2.3.    Alimenti liquidi o semiliquidi omogenei o omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare una parte del contenuto di ciascuna unità, se necessario dopo omogeneizzazione.

I campioni elementari possono eventualmente essere prelevati al momento del travaso del prodotto.

9.2.4.    Alimenti liquidi o semiliquidi non omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare i campioni a diversi livelli.

I campioni possono essere prelevati anche al momento del travaso del prodotto, dopo eliminazione delle prime frazioni.

In entrambi i casi, il volume totale dei prelievi non deve essere inferiore a 10 litri.

9.2.5.    Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali

Dopo aver selezionato il numero prescritto di formellati o mattonelle da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare una parte da ciascun formellato o da ciascuna mattonella. Se si ha il sospetto che un formellato o una mattonella non sia omogeneo/a, può essere prelevato come campione l’intero formellato o l’intera mattonella.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

9.3.    Formazione dei campioni globali

Riunire i campioni elementari per costituire un unico campione globale.

9.4.    Formazione dei campioni finali

Il materiale del campione globale va mescolato con cura ( 4 )

9.5.    Imballaggio dei campioni

Sigillare ed etichettare i recipienti o le confezioni in modo che non possano essere aperti senza violare il sigillo. L’etichetta completa deve essere incorporata nel sigillo.

9.6.    Invio dei campioni al laboratorio

Il campione deve essere inviato senza indugio al laboratorio di analisi designato. Con esso vanno inviate anche le informazioni necessarie all’analista.

10.   VERBALI DEL CAMPIONAMENTO

Per ogni campione va redatto un verbale che permetta di identificare in modo univoco la partita campionata e le sue dimensioni.

Il verbale deve anche recare nota di ogni eventuale scostamento rispetto alla procedura di campionamento prevista dal presente regolamento.

Oltre che al laboratorio di controllo ufficiale, il verbale va messo a disposizione dell’operatore del settore dei mangimi e/o del laboratorio designato dall’operatore del settore dei mangimi.

ALLEGATO II

DISPOSIZIONI GENERALI RELATIVE AI METODI DI ANALISI DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI

A.   PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LE ANALISI

1.    Finalità

Le modalità qui di seguito descritte riguardano la preparazione per l’analisi dei campioni, trasmessi ai laboratori di controllo dopo essere stati prelevati conformemente alle diposizioni di cui all’allegato I.

La preparazione dei campioni di laboratorio deve assicurare che le quantità pesate previste dai metodi di analisi siano omogenee e rappresentative dei campioni finali.

2.    Precauzioni necessarie

Le modalità di preparazione dei campioni sono scelte in funzione dei metodi di analisi impiegati e dei costituenti o delle sostanze da controllare. È pertanto di fondamentale importanza assicurare che le modalità prescelte siano adeguate al metodo di analisi applicato e ai costituenti o alle sostanze da controllare.

Effettuare tutte le operazioni in modo da evitare, nei limiti del possibile, di contaminare il campione o di modificarne le composizione.

Effettuare le macinazioni, le miscelazioni e le setacciature senza ritardi, esponendo il meno possibile il campione all’aria e alla luce. Evitare l’impiego di mulini o attrezzature per la macinazione suscettibili di riscaldare eccessivamente il campione.

Per gli alimenti particolarmente sensibili al calore si raccomanda la macinazione manuale. Assicurarsi altresì che l’apparecchiatura in se stessa non costituisca una fonte di contaminazione.

Se il campione non può essere preparato senza causare una variazione sensibile del contenuto di umidità, quest’ultimo va determinato prima e dopo la preparazione, secondo il metodo previsto nell’allegato III, parte A.

3.    Procedura

3.1.    Procedura generale

Il quantitativo da saggiare è prelevato dal campione finale. Il metodo del cono e della quartatura è sconsigliato, in quanto può dar luogo a quantitativi da saggiare con un elevato errore di ripartizione.

3.1.1.    Alimenti che possono essere macinati direttamente

3.1.2.    Alimenti che possono essere macinati dopo essiccazione

3.1.3.    Alimenti liquidi o semiliquidi

3.1.4.    Altri alimenti

3.2.    Procedura specifica in caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio o nei casi in cui sia omogeneizzato l’intero campione globale

4.    Conservazione e immagazzinamento dei campioni

Conservare i campioni a una temperatura tale da non alterare la loro composizione. Nel caso dei campioni destinati all’analisi di vitamine o di sostanze particolarmente sensibili alla luce, conservarli in modo tale che non vengano alterati dalla luce.

B.   DISPOSIZIONI CONCERNENTI I REATTIVI E L’APPARECCHIATURA DA UTILIZZARE NEI METODI DI ANALISI

C.   APPLICAZIONE DEI METODI DI ANALISI ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI

1.    Procedura di estrazione

Diversi metodi determinano una procedura di estrazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di estrazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato un’efficienza di estrazione, per la matrice analizzata, equivalente a quella della procedura indicata nel metodo.

2.    Procedura di purificazione

Diversi metodi determinano una procedura di purificazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di purificazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato di produrre risultati, per la matrice analizzata, equivalenti a quelli prodotti dalla procedura indicata nel metodo.

3.    Numero di determinazioni

Qualora si analizzino sostanze indesiderabili, se il risultato della prima determinazione risulta significativamente inferiore (> 50 %) al valore della specifica oggetto di controllo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una seconda analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni, che tiene conto dell’incertezza di misura, è utilizzata per verificare la conformità.

Se, nel controllare il contenuto dichiarato di una sostanza o di un dato ingrediente, il risultato della prima determinazione conferma il contenuto dichiarato (ossia, lo scarto tra il risultato dell’analisi e il contenuto dichiarato rientra in un margine di variazione accettabile), non è necessario ripetere la determinazione, purché siano rispettate le opportune procedure di qualità. In altri casi, è necessaria una seconda analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni, che tiene conto dell’incertezza di misura, è utilizzata per verificare la conformità.

In alcuni casi il margine di variazione accettabile è definito da norme quali il regolamento (CE) n. 767/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 13 luglio 2009, sull’immissione sul mercato e sull’uso dei mangimi, che modifica il regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio e che abroga le direttive 79/373/CEE del Consiglio, 80/511/CEE della Commissione, 82/471/CEE del Consiglio, 83/228/CEE del Consiglio, 93/74/CEE del Consiglio, 93/113/CE del Consiglio e 96/25/CE del Consiglio e la decisione 2004/217/CE della Commissione ( 7 ).

4.    Comunicazione del metodo di analisi applicato

Il rapporto di prova deve indicare il metodo di analisi applicato.

5.    Comunicazione dei risultati dell’analisi

Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite nel metodo di analisi con un numero appropriato di cifre significative e, ove necessario, corretto in funzione del contenuto di umidità del campione finale prima della sua preparazione.

6.    Incertezza di misura e tasso di recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili

Per quanto riguarda le sostanze indesiderabili ai sensi della direttiva 2002/32/CE, un prodotto destinato all’alimentazione animale è considerato non conforme al livello massimo fissato quando il risultato d’analisi, relativo a un alimento con tenore di umidità del 12 %, è giudicato superiore al livello massimo, tenuto conto dell’incertezza di misura estesa e della correzione per il recupero. Al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall’analisi, corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l’incertezza di misura estesa. Tale procedura è applicabile unicamente nei casi in cui il metodo d’analisi consenta la stima dell’incertezza di misura e la correzione per il fattore di recupero (non è possibile, ad esempio, in caso di analisi microscopica).

Il risultato dell’analisi è riportato come segue (quando il metodo d’analisi consente di valutare l’incertezza di misura e il tasso di recupero):

Tuttavia, qualora il risultato dell’analisi risulti molto inferiore (> 50 %) al valore della specifica oggetto di controllo, e a condizione che si rispettino le procedure appropriate in materia di qualità e l’analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, il risultato dell’analisi può essere presentato senza correzioni per il recupero e, in questo caso, il tasso di recupero e l’incertezza della misura possono essere omessi.

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ALLEGATO III

METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA COMPOSIZIONE DELLE MATERIE PRIME PER ALIMENTI PER ANIMALI E DEGLI ALIMENTI COMPOSTI

A.   DETERMINAZIONE DELL'UMIDITÀ

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità degli alimenti per animali. Nel caso degli alimenti contenenti sostanze volatili, ad esempio acidi organici, va osservato che oltre al contenuto di umidità si rileva anche un'importante presenza di materie volatili.

Il metodo non riguarda l'analisi dei prodotti lattieri in quanto materie prime per alimenti per animali, delle sostanze minerali e miscele essenzialmente composte di sostanze minerali, l'analisi dei grassi e oli vegetali, né quella dei semi e frutti oleaginosi.

2.   Principio

Il campione è sottoposto a essiccazione in condizioni ben definite, varianti in funzione della natura dell'alimento. La perdita di peso è determinata per pesata. È necessario procedere a una preessiccazione quando si tratta di alimenti solidi aventi un elevato contenuto di umidità.

3.   Apparecchiatura

4.   Procedimento

4.1.   Preparazione

4.1.1.    Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.1.2 e 4.1.3

Prelevare almeno 50 g di campione. Se necessario macinare o dividere in particelle di grandezza appropriata in modo da evitare ogni variazione del contenuto di umidità (cfr. punto 6).

4.1.2.    Cereali e semole

Prelevare almeno 50 g di campione. Macinare in particelle di cui almeno la metà passi per un setaccio a maglie di 0,5 mm e non lasci più del 10 % di residuo su un setaccio a maglie rotonde di 1 mm di diametro.

4.1.3.    Alimenti liquidi o pastosi, alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse

Prelevare almeno 25 g di campione, pesati con l'approssimazione di 10 mg, e aggiungere una quantità appropriata di sabbia anidra, pesare con l'approssimazione di 10 mg e mescolare sino a ottenere un prodotto omogeneo.

4.2.   Essiccazione

4.2.1.    Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.2.2 e 4.2.3

Tarare, con la precisione di 1 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 103 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per quattro ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 103 oC. Rimettere il coperchio sul recipiente, estrarre quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg.

Nel caso di alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse, lasciare essiccare per altri 30 minuti nella stufa a 130 oC. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.

4.2.2.    Cereali, farine, semole e semolini

Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g circa di prodotto macinato e ripartirlo uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 130 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per due ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 130 oC. Rimettere il coperchio sul recipiente, estrarre quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg.

Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, privo del coperchio, nella stufa a vuoto (3.5) preriscaldata a una temperatura di 80-85 oC. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile.

Portare la pressione a 100 Torr e lasciare essiccare a questa pressione per quattro ore in corrente d'aria secca e calda, o mediante un disidratante (300 g circa per 20 campioni). In quest'ultimo caso interrompere la connessione con la pompa a vuoto quando è raggiunta la pressione prescritta. Misurare la durata dell'essiccazione a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 80-85 oC. Riportare poi con precauzione la stufa alla pressione atmosferica. Aprire la stufa, coprire immediatamente il recipiente con il coperchio, estrarlo dalla stufa, lasciarlo raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg. Essiccare per altri 30 minuti nella stufa a vuoto, alla temperatura di 80-85 oC, e pesare di nuovo. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.

4.3.   Preessiccazione

4.3.1.    Alimenti per animali diversi da quelli menzionati al punto 4.3.2

Gli alimenti solidi, il cui contenuto di umidità è elevato e rende difficile la macinazione, devono essere preessiccati nel modo indicato di seguito.

Pesare, con l'approssimazione di 10 mg, 50 g di prodotto non macinato (un grossolano spezzettamento può essere effettuato, se necessario, nel caso di alimenti compressi o agglomerati) in un recipiente appropriato (ad esempio, una piastra di alluminio di 20 × 12 cm con bordo di 0,5 cm). Lasciar essiccare in una stufa alla temperatura di 60-70 oC, sino a che il contenuto di umidità sia portato a un valore compreso tra l'8 e il 12 %. Togliere dalla stufa, lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per un'ora e pesare con l'approssimazione di 10 mg. Macinare subito dopo come indicato al punto 4.1.1 ed effettuare l'essiccazione come indicato ai punti 4.2.1 o 4.2.3 secondo la natura dell'alimento.

4.3.2.    Cereali

I cereali in granella aventi una percentuale di umidità superiore al 17 % debbono essere preessiccati nel modo indicato di seguito.

Pesare, con l'approssimazione di 10 mg, 50 g di cereali in granella non moliti in un recipiente appropriato (ad esempio una piastra di alluminio di 20 × 12 cm con bordo di 0,5 cm). Lasciare essiccare in una stufa per 5-7 minuti alla temperatura di 130 oC. Togliere dalla stufa, lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per due ore e pesare con l'approssimazione di 10 mg. Molire subito dopo come indicato al punto 4.1.2 ed effettuare l'essiccazione come indicato al punto 4.2.2.

5.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di umidità (X), espresso in percentuale del campione, è dato dalle seguenti formule:

5.1.   Essiccazione senza preessiccazione

dove

5.2.   Essiccazione con preessiccazione

dove

5.3.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera lo 0,2 % di umidità (valore assoluto).

6.   Osservazione

Qualora sia necessario procedere alla macinazione e questa comporti una variazione nel contenuto di umidità del prodotto, i risultati dell'analisi dei componenti dell'alimento devono essere corretti in funzione del contenuto di umidità del campione iniziale.

B.   DETERMINAZIONE DELL'UMIDITA NEI GRASSI E NEGLI OLI ANIMALI E VEGETALI

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità (acqua ed altre materie volatili) dei grassi e degli oli animali e vegetali.

2.   Principio

Il campione viene sottoposto ad essiccazione a 103 oC fino a cessazione della diminuzione di massa (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere inferiore o pari a 1 mg). La perdita di peso è determinata per pesata.

3.   Apparecchiatura

4.   Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 20 g circa del campione omogeneizzato nel recipiente (3.1), essiccato e tarato, contenente il termometro (3.2). Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante (3.3), agitando continuamente con il termometro, in modo da far salire la temperatura a 90 oC in circa 7 minuti.

Ridurre l'intensità del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le bolle risalgono dal fondo del recipiente. La temperatura non deve superare i 105 oC. Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando non si formano più bolle.

Per assicurare l'eliminazione completa dell'umidità, riscaldare più volte a 103 ± 2 oC, raffreddando a 93 oC tra i riscaldamenti successivi. Lasciare quindi raffreddare nell'essiccatore (3.4) sino a temperatura ambiente e pesare. Ripetere l'operazione fino a quando la perdita di peso tra due pesate consecutive non supera i 2 mg.

5.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di umidità, espresso in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula:

dove

I risultati inferiori allo 0,05 % debbono recare la dicitura «meno di 0,05 %».

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele, effettuate sullo stesso campione, non deve oltrepassare lo 0,05 % in valore assoluto.

C.   DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI PROTEINE GREGGE

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto in proteine gregge degli alimenti per animali a partire dal contenuto di azoto, dosato secondo il metodo di Kjeldahl.

2.   Principio

Il campione viene mineralizzato in acido solforico in presenza di un catalizzatore. La soluzione acida è alcalinizzata con una soluzione d'idrossido di sodio. L'ammoniaca viene isolata per distillazione e raccolta in una quantità determinata di acido solforico, il cui eccesso è titolato con una soluzione standard d'idrossido di sodio.

In alternativa, l'ammoniaca liberatasi viene distillata in un eccesso di soluzione di acido borico e successivamente titolata con una soluzione di acido cloridrico o acido solforico.

3.   Reattivi

Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale vanno aggiunti alle soluzioni di acido borico gli indicatori rosso di metile e bromocresolo. Nella preparazione di 1 litro di soluzione di acido borico, prima di portare a volume, aggiungere 7 ml di soluzione d'indicatore rosso metile (3.16) e 10 ml di soluzione di verde di bromocresolo (3.17).

A seconda dell'acqua utilizzata, il pH della soluzione di acido borico può variare da una partita all'altra. Per ottenere una prova in bianco positiva è spesso necessario un trattamento con una piccola quantità di alcali.

4.   Apparecchiatura

Apparecchi per mineralizzazione, distillazione e titolazione secondo il metodo di Kjeldahl.

5.   Procedimento

5.1.   Mineralizzazione

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo nel pallone dell'apparecchio di mineralizzazione. Aggiungere 15 g di solfato di potassio (3.1), una quantità appropriata di catalizzatore (3.2) [da 0,3 g a 0,4 g di ossido rameico, oppure da 0,9 g a 1,2 g di solfato di rame (II) pentaidrato], 25 ml di acido solforico (3.4) e, se necessario, frammenti di pietra pomice (3.12). Mescolare.

Riscaldare il pallone prima moderatamente, agitando di tanto in tanto, se necessario, fino a carbonizzazione della massa e a scomparsa della schiuma; quindi scaldare più intensamente sino a ebollizione regolare del liquido. Il riscaldamento è adeguato se l'acido bollendo si condensa sulle pareti del pallone. Evitare che le pareti si surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano.

Quando la soluzione diventa limpida e di colore verde pallido prolungare l'ebollizione ancora per due ore. Lasciare quindi raffreddare.

5.2.   Distillazione

Aggiungere con precauzione un quantitativo d'acqua sufficiente a sciogliere completamente i solfati. Lasciar raffreddare. Aggiungere quindi, se necessario, qualche granulo di zinco (3.3). Procedere secondo il punto 5.2.1 o 5.2.2.

5.2.1.    Distillazione in acido solforico

Introdurre nel matraccio collettore dell'apparecchio di distillazione 25 ml misurati esattamente di acido solforico (3.5 o 3.7, a seconda del presunto contenuto di azoto) e qualche goccia di indicatore al rosso di metile (3.8).

Collegare il pallone di mineralizzazione al refrigerante dell'apparecchio di distillazione e immergere l'estremità di quest'ultimo per almeno 1 cm nel liquido del matraccio collettore (cfr. osservazione al punto 8.3). Versare lentamente nel pallone 100 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.9) senza provocare una perdita di ammoniaca (cfr. osservazione al punto 8.1). Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell'ammoniaca.

5.2.2.    Distillazione in acido borico

Quando la titolazione del contenuto di ammoniaca del distillato è realizzata manualmente, si applica il metodo indicato di seguito. Quando l'unità di distillazione è interamente automatizzata, anche per quanto riguarda la titolazione del tenore di ammoniaca del distillato, seguire le istruzioni d'uso di tale unità fornite dal fabbricante.

Collocare un matraccio collettore contenente 25-30 ml della soluzione di acido borico (3.18) alla bocca d'uscita del refrigerante in modo che il tubo di evacuazione si trovi al di sotto della superficie dell'eccesso di soluzione di acido borico. Regolare l'unità di distillazione per ottenere 50 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.9). Far funzionare l'unità di distillazione conformemente alle istruzioni fornite dal fabbricante ed eliminare l'ammoniaca liberatasi per distillazione aggiungendo la soluzione di idrossido di sodio. Raccogliere il distillato nella soluzione di acido borico. La quantità di distillato (tempo di distillazione in corrente di vapore) dipende dal tenore di azoto nel campione. Seguire le indicazioni fornite dal fabbricante.

5.3.   Titolazione

Procedere conformemente al punto 5.3.1 o 5.3.2.

5.3.1.    Acido solforico

Titolare l'eccesso di acido solforico nel matraccio collettore per mezzo di una soluzione d'idrossido di sodio (3.10 o 3.11) secondo la concentrazione dell'acido solforico usato, sino a raggiungere il punto finale.

5.3.2.    Acido borico

Titolare il contenuto del matraccio collettore con la soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (3.19) o con la soluzione volumetrica standard di acido solforico (3.6) per mezzo di una buretta e leggere la quantità di soluzione titolata utilizzata.

Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale, si raggiunge il punto finale all'apparire della prima traccia di colore rosa nel contenuto. Valutare il contenuto della buretta con l'approssimazione di 0,05 ml. La visualizzazione del punto finale può essere facilitata per mezzo di un rivelatore fotometrico.

È possibile farlo automaticamente per mezzo di un'unità di distillazione in corrente di vapore a titolazione automatica.

Seguire le istruzioni del fabbricante relative al funzionamento dell'unità di distillazione o del distillatore titolatore, a seconda dei casi.

5.4.   Prova in bianco

Per confermare che i reattivi sono esenti da azoto, effettuare una prova in bianco (mineralizzazione, distillazione e titolazione) sostituendo il campione con 1 g di saccarosio (3.14).

6.   Calcolo dei risultati

I calcoli sono effettuati conformemente ai punti 6.1 o 6.2.

6.1.   Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.1

Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

dove

6.2.   Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.2

6.2.1.    Titolazione con acido cloridrico

Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

dove

6.2.2.    Titolazione con acido solforico

Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

dove

7.   Verifica del metodo

7.1.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:

7.2.   Precisione

Eseguire l'analisi (mineralizzazione, distillazione e titolazione) su 1,5 -2,0 g di acetanilide (3.13) in presenza di 1 g di saccarosio (3.14); 1 g di acetanilide consuma 14,80 ml di acido solforico (3.5). Il recupero deve essere almeno del 99 %.

8.   Osservazioni

D.   DETERMINAZIONE DELL'UREA

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di urea negli alimenti per animali.

2.   Principio

Il campione è messo in sospensione nell'acqua in presenza di un chiarificante. La sospensione è filtrata. Il contenuto di urea del filtrato è determinato, dopo aggiunta di 4-dimetilamminobenzaldeide (4-DMAB), misurando la densità ottica alla lunghezza d'onda di 420 nm.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Analisi del campione

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2 g del campione ed introdurli con 1 g di carbone attivo (3.4) in un matraccio tarato da 500 ml. Aggiungere 400 ml di acqua e 5 ml di soluzione di Carrez I (3.2), agitare per circa 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II (3.3). Mescolare per mezz'ora mediante l'agitatore rotativo a capovolgimento. Portare a volume con acqua, agitare e filtrare.

Prelevare 5 ml di filtrati limpidi ed incolori, introdurli nei tubi da prova con tappo smerigliato, aggiungere 5 ml di soluzione di 4-DMAB (3.1) e mescolare. Porre i tubi in bagnomaria a 20 oC (+/- 4 oC). Dopo 15 minuti, misurare la densità ottica della soluzione del campione con lo spettrofotometro a 420 nm rispetto alla soluzione della prova in bianco dei reattivi.

5.2.   Curva di taratura

Prelevare volumi di 1, 2, 4, 5 e 10 ml della soluzione di urea (3.5), introdurli in matracci tarati da 100 ml e portare a volume con acqua. Prelevare 5 ml di ciascuna soluzione aggiungendo ogni volta 5 ml di soluzione di 4-DMAB (3.1), mescolare e misurare la densità ottica, come indicato dianzi, rispetto ad una soluzione testimone contenente 5 ml di 4-DMAB e 5 ml d'acqua, esente da urea. Tracciare la curva di taratura.

6.   Calcolo dei risultati

Determinare la quantità d'urea, nella parte di campione sottoposta all'analisi, servendosi della curva di taratura.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

7.   Osservazioni

E.   DETERMINAZIONE DELLE BASI AZOTATE VOLATILI

I.   PER MICRODIFFUSIONE

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili, espresse in ammoniaca, degli alimenti per gli animali.

2.   Principio

Il campione viene estratto con acqua, la soluzione viene chiarificata e filtrata. Le basi azotate volatili sono spostate per mezzo di una soluzione di carbonato di potassio per microdiffusione, raccolte in una soluzione di acido borico e titolate con acido solforico.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 10 g di sostanza e porli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d'acqua. Mescolare o agitare il pallone, nell'agitatore rotativo, per 30 minuti. Aggiungere 50 ml della soluzione d'acido tricloroacetico (3.1), portare a volume con acqua, agitare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe.

Prelevare con una pipetta 1 ml della soluzione di acido borico (3.3) nell'incavo centrale della cella Conway e, nella corona della cella, 1 ml del filtrato ottenuto dal campione. Coprire parzialmente con il coperchio ingrassato. Lasciar scolare rapidamente nella corona periferica 1 ml della soluzione satura di carbonato di potassio (3.4) e chiudere ermeticamente il coperchio. Agitare con precauzione la cella facendola rotare su un piano orizzontale in modo da assicurare la miscelazione dei due reattivi. Mantenere l'apparecchio per almeno quattro ore alla temperatura ambiente o per un'ora a 40 oC.

Titolare le basi volatili nella soluzione d'acido borico con la soluzione di acido solforico (3.5) per mezzo di una microburetta (4.3).

Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento, in assenza del campione da analizzare.

6.   Calcolo dei risultati

1 ml di H2SO40,01 mol/l corrisponde a 0,34 mg di ammoniaca.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera:

7.   Osservazione

Se il contenuto di ammoniaca del campione è superiore allo 0,6 %, diluire il filtrato iniziale.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   PER DISTILLAZIONE

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili, espresse in ammoniaca, delle farine di pesce non contenenti, praticamente, urea. Il metodo è applicabile unicamente a contenuti di ammoniaca inferiori a 0,25 %.

2.   Principio

Il campione viene estratto con acqua, la soluzione è chiarificata e filtrata. Le basi azotate volatili sono portate/spostate all'ebollizione per aggiunta di ossido di magnesio e raccolte in una quantità determinata d'acido solforico il cui eccesso viene titolato di ritorno con una soluzione d'idrossido di sodio.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 10 g di sostanza e introdurli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d'acqua. Mescolare o agitare il pallone, nell'agitatore rotativo, per 30 minuti. Aggiungere 50 ml della soluzione d'acido tricloroacetico (3.1), portare a volume con acqua, agitare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe.

Prelevare una quantità di filtrato limpido in funzione del presunto contenuto di basi azotate volatili (100 ml sono generalmente sufficienti). Diluire a 200 ml e aggiungere 2 g di ossido di magnesio (3.2) e qualche goccia di emulsione antischiuma (3.3). La soluzione deve risultare alcalina alla cartina tornasole, altrimenti aumentare la quantità di ossido di magnesio (3.2). Procedere conformemente ai punti 5.2 e 5.3 del metodo di analisi per la determinazione del contenuto di proteine gregge (parte C del presente allegato).

Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento, in assenza del campione da analizzare.

6.   Calcolo dei risultati

1 ml di H2SO40,05 mol/l corrisponde a 1,7 mg di ammoniaca.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera, in valore relativo, il 10 % di ammoniaca.

F.   DETERMINAZIONE DEGLI AMMINOACIDI (TRIPTOFANO ESCLUSO)

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo serve per determinare gli amminoacidi liberi (sia di sintesi che naturali) e totali (legati a peptidi e liberi) negli alimenti per animali mediante un analizzatore di amminoacidi. Il metodo è applicabile ai seguenti amminoacidi: cist(e)ina, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, acido aspartico, acido glutammico, glicina, istidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

Il metodo non distingue gli amminoacidi dai loro sali e non può distinguere la forma D degli amminoacidi dalla forma L; esso non è adatto per la determinazione del triptofano né degli analoghi idrossilati degli amminoacidi.

2.   Principio

2.1.   Amminoacidi liberi

Gli amminoacidi liberi sono estratti con acido cloridrico diluito. Le macromolecole azotate coestratte vengono fatte precipitare con acido solfosalicilico e vengono rimosse per filtrazione. La soluzione filtrata viene portata a pH 2,20 . Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm.

2.2.   Amminoacidi totali

La scelta della procedura dipende dagli amminoacidi oggetto dell'analisi. Cist(e)ina e metionina devono essere ossidate ad acido cisteico e al metionina sulfone prima dell'idrolisi. La tirosina deve essere determinata in idrolizzati di campioni non ossidati. Tutti gli altri amminoacidi elencati al punto 1 possono essere determinati sia nel campione ossidato sia in quello non ossidato.

L'ossidazione viene eseguita a 0 oC con una miscela di acido performico e di fenolo. L'eccesso del reagente di ossidazione viene decomposto con metabisolfito di sodio. Il campione ossidato o non ossidato è idrolizzato con acido cloridrico (3.20) per 23 ore. L'idrolizzato è regolato a pH 2,20 . Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm (440 nm per la prolina).

3.   Reattivi

Usare acqua bidistillata o di qualità equivalente (conduttività < 10 μS).

sciogliere 300 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro.

sciogliere 40 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro.

miscelare 889 g di acido formico (3.2) con 111 g d'acqua e aggiungere 4,73 g di fenolo (3.3).

aggiungere 1 g di fenolo (3.3) a 492 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua.

sciogliere 60 g di acido 5-solfosalicilico (3.6) in acqua e portare a 1 litro con acqua.

miscelare 0,5 ml di perossido di idrogeno (3.1) con 4,5 ml di soluzione di acido formico e fenolo (3.19) in un piccolo becher. Tenere in incubazione a 20-30 oC per un'ora per ottenere acido performico; lasciare raffreddare su un bagno di acqua gelata (15 min) prima di aggiungere il campione.

Attenzione: evitare il contatto con la pelle e indossare indumenti di protezione.

sciogliere 19,61 g di citrato di sodio (3.8), 5 ml di tiodiglicole (3.9), 1 g di fenolo (3.3) e 16,50 ml di HCl (3.7) in cira 800 ml d'acqua. Portare il pH a 2,20 . Portare a 1 litro con acqua.

c = 2,5 μmol/ml di ciascuno in acido cloridrico.

Reperibile in commercio.

Sciogliere 0,2115 g di acido cisteico (3.16.2) e 0,2265 g di metionina sulfone (3.16.3) in tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato da 1 litro e portare a volume con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 12 mesi. Questa soluzione non viene utilizzata se la soluzione madre standard (3.27.1) contiene acido cisteico e metionina sulfone.

Sciogliere 0,6560 g di norleucina (3.13) in tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato e portare a 250 ml con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 6 mesi.

Trasferire quantitativamente in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con tampone citrato (3.24) e miscelare.

Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 3 mesi.

Cfr. anche le osservazioni al punto 9.1.

Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 3 mesi.

4.   Apparecchiatura

La colonna deve essere riempita di resine polistireniche sulfonate in grado di separare gli amminoacidi uno dall'altro e da altri prodotti reattivi alla ninidrina. Il flusso del tampone e del reattivo di ninidrina è garantito da pompe il cui grado di stabilità di portata è ±0,5 % nell'intervallo tra l'analisi della soluzione di taratura e l'analisi del campione.

Con alcuni analizzatori di amminoacidi si possono utilizzare metodi di idrolisi in cui l'idrolizzato presenta una concentrazione di sodio di c = 0,8 mol/l e contiene tutto l'acido formico residuo dalla fase di ossidazione. Altri apparecchi non consentono una separazione soddisfacente di certi amminoacidi se l'idrolizzato contiene troppo acido formico e/o presenta elevate concentrazioni di ioni sodio. In questo caso il volume dell'acido è ridotto a circa 5 ml mediante evaporazione dopo l'idrolisi e prima della regolazione del pH. L'evaporazione è eseguita sotto vuoto a temperatura non superiore a 40 oC.

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione del campione

Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all'aria ad una temperatura non superiore a 50 oC o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (3.12) prima di essere triturati.

5.2.   Determinazione degli amminoacidi liberi negli alimenti per animali e nelle premiscele

Pesare con l'approssimazione di 0,2 mg una quantità appropriata (1-5 g) del campione preparato (5.1) in una beuta e aggiungere 100,0 ml di miscela di estrazione (3.2.1). Agitare la miscela per 60 minuti con un agitatore o meccanico o miscelatore magnetico (4.8). Lasciar depositare il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher da 100 ml.

Aggiungere 5,0 ml di soluzione di acido solfosalicilico (3.22) sempre agitando e continuare ad agitare con agitatore magnetico per 5 minuti. Filtrare o centrifugare il surnatante per rimuovere eventuali precipitati. Introdurre 10,0 ml della soluzione risultante in un becher da 100 ml e portare il pH a 2,20 con una soluzione di idrossido di sodio (3.18), trasferire in un matraccio tarato di volume appropriato utilizzando tampone citrato (3.24) e portare a volume con la soluzione tampone (3.24).

Se si usa uno standard interno, aggiungere 1,00 ml di standard interno (3.27.3) ogni 100 ml di soluzione finale e portare a volume con la soluzione tampone (3.24).

Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Se gli estratti non vengono cromatografati lo stesso giorno, conservarli a temperatura inferiore a 5 oC.

5.3.   Determinazione degli amminoacidi totali

5.3.1.    Ossidazione

Pesare, con l'approssimazione di 0,2 mg, da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1) in:

La porzione di campione pesata deve avere un contenuto d'azoto di circa 10 mg e un contenuto di umidità non superiore a 100 mg.

Introdurre il pallone o il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio e raffreddare a 0 oC; aggiungere 5 ml di miscela di ossidazione (3.23) e miscelare con una spatola di vetro con un estremità ricurva. Sigillare il pallone o flacone contenente la spatola con una pellicola impermeabile all'aria, introdurre il bagno di acqua e ghiaccio contenente il contenitore sigillato in un frigorifero a 0 oC e lasciarvelo per 16 ore. Dopo 16 ore togliere dal frigorifero e decomporre l'eccesso di reagente di ossidazione mediante l'aggiunta di 0,84 g di bisolfito di sodio (3.4).

Procedere come indicato al punto 5.3.2.1.

5.3.2.    Idrolisi

5.3.2.1.    Idrolisi dei campioni ossidati

Aggiungere al campione ossidato, preparato conformemente al punto 5.3.1, 25 ml di miscela di idrolisi (3.20) avendo cura di risciacquare eventuali residui di campione che aderiscono alle pareti del recipiente e alla spatola.

Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, a seconda del metodo di idrolisi utilizzato.

5.3.2.2.    Idrolisi dei campioni non ossidati

Pesare in un pallone a fondo arrotondato da 100 ml o 250 ml (4.1) o in un flacone da 100 ml con tappo a vite (4.2) (con l'approssimazione di 0,2 mg) una quantità da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1). La porzione di campione pesata deve avere un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere con cautela 25 ml di miscela di idrolisi (3.20) e miscelare con il campione. Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Idrolisi, sistema aperto

Aggiungere 3 biglie di vetro alla miscela (preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2) contenuta nel pallone e far bollire a ricadere per 23 ore a ebollizione continua. Al completamento dell'idrolisi, risciacquare il refrigerante con 5 ml di tampone citrato (3.24). Togliere il pallone e farlo raffreddare in un bagno di ghiaccio.

Procedere come indicato al punto 5.3.3.

5.3.2.4.    Idrolisi, sistema chiuso

Introdurre il flacone contenente la miscela, preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2, in un forno (4.3) a 110 oC. Durante la prima ora, allo scopo di evitare un accumulo di pressione in conseguenza dello sviluppo di sostanze gassose e di evitare un'esplosione, porre il tappo a vite sopra al recipiente senza chiuderlo. Dopo un'ora, chiudere il recipiente con il tappo e lasciarlo nel forno (4.3) per 23 ore. Al completamento dell'idrolisi, togliere il flacone dal forno, aprire con cautela il tappo del flacone e introdurre il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio. Lasciar raffreddare.

Secondo la procedura usata per la regolazione del pH (5.3.3), trasferire quantitativamente il contenuto del flacone in un becher da 250 ml o in un pallone a fondo tondo da 250 ml utilizzando tampone citrato (3.24).

Procedere come indicato al punto 5.3.3.

5.3.3.    Regolazione del pH

Procedere, conformemente al punto 5.3.3.1 o 5.3.3.2, alla regolazione del pH, in funzione della tolleranza al sodio dell'analizzatore di amminoacidi (4.9).

5.3.3.1.    Per sistemi cromatografici (4.9) che richiedono una bassa concentrazione di sodio.

Quando si impiegano analizzatori di amminoacidi che richiedono una bassa concentrazione di sodio (quando il volume dell'acido deve essere ridotto), è consigliabile utilizzare una soluzione madre standard interna (3.27.3).

In questo caso aggiungere 2,00 ml della soluzione standard interna (3.27.3) all'idrolizzato prima dell'evaporazione.

Aggiungere 2 gocce di 1-ottanolo (3.15) all'idrolizzato ottenuto conformemente alla procedura di cui al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

Utilizzando un evaporatore rotante (4.7), ridurre il volume a 5-10 ml sotto vuoto a 40 oC. Se il volume viene ridotto accidentalmente a meno di 5 ml, scartare l'idrolizzato e ricominciare l'analisi.

Portare il pH a 2,20 con soluzione di idrossido di sodio (3.18) e procedere conformemente al punto 5.3.4.

5.3.3.2.    Per tutti gli altri analizzatori di amminoacidi (4.9)

Neutralizzare parzialmente gli idrolizzati ottenuti conformemente al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, aggiungendovi con cautela, sempre agitando, 17 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.17), facendo attenzione che la temperatura rimanga al di sotto di 40 oC.

Portare il pH a 2,20 a temperatura ambiente utilizzando la soluzione di idrossido di sodio di cui al punto 3.17 e, infine, una soluzione di idrossido di sodio conforme al punto 3.18. Procedere conformemente al punto 5.3.4.

5.3.4.    Soluzione del campione per cromatografia

Trasferire quantitativamente l'idrolizzato portato a pH 2,20 (5.3.3.1 o 5.3.3.2) con tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato da 200 ml e portare a volume con tampone (3.24).

Se non è stato ancora utilizzato uno standard interno, aggiungerne 2,00 ml (3.27.3) e portare a volume con tampone citrato (3.24). Miscelare accuratamente.

Procedere alla fase della cromatografia (5.4).

Se le soluzioni del campione non vengono cromatografate nello stesso giorno, conservarle a temperatura inferiore a 5 oC.

5.4.   Cromatografia

Prima della cromatografia, portare l'estratto (5.2) o l'idrolizzato (5.3.4) a temperature ambiente. Agitare la miscela e filtrarne una quantità appropriata attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm (4.5). La soluzione limpida risultante viene sottoposta a cromatografia a scambio ionico utilizzando un analizzatore di amminoacidi (4.9).

L'iniezione può venire eseguita manualmente o automaticamente. È importante iniettare sempre la stessa quantità (± 0,5 %) di soluzione nella colonna per l'analisi degli standard e dei campioni, salvo quando si usa uno standard interno; inoltre i rapporti sodio/amminoacidi nello standard e nelle soluzioni del campione devono essere il più possibile simili.

La frequenza delle iniezioni della soluzione di taratura dipende dalla stabilità del reattivo ninidrina e del sistema analitico. La soluzione standard o del campione è diluita con tampone citrato (3.24) in misura tale che l'area del picco della soluzione standard sia compresa Fra il 30 % e il 200 % dell'area del picco dell'amminoacido nel campione.

La cromatografia degli amminoacidi varierà leggermente secondo il tipo di analizzatore impiegato e la resina usata. Il sistema scelto deve essere in grado di separare gli amminoacidi uno dall'altro e dalle sostanze reattive alla ninidrina. Nel corso dell'operazione, il sistema cromatografico deve dare una risposta lineare alle variazioni delle quantità di amminoacidi introdotti in colonna.

Durante la fase di cromatografia, quando si analizza una soluzione equimolare (degli amminoacidi sottoposti a determinazione), si applicano i rapporti di altezza valle/picco citati più avanti. La soluzione equimolare deve contenere almeno il 30 % del carico massimo di ciascun amminoacido che può essere determinato con precisione tramite il sistema di analisi degli amminoacidi (4.9).

Per la separazione treonina-serina, il rapporto di altezza valle/picco del più basso dei due amminoacidi che si sovrappongono sul cromatogramma non deve superare 2/10 [se la determinazione viene effettuata solo su cist(e)ina, metionina, treonina e lisina, una insufficiente separazione di picchi adiacenti influirà sfavorevolmente sulla determinazione]. Per tutti gli altri amminoacidi la separazione deve essere maggiore di 1/10.

Il sistema deve poter separare la lisina da «artefatti di lisina» e dall'ornitina.

6.   Calcolo dei risultati

Determinare le aree del picco del campione e della soluzione standard per ogni singolo amminoacido e calcolare la quantità (X) in g di amminoacido per kg di campione secondo la seguente formula:

Se si usa uno standard interno moltiplicare per:

La cistina e la cisteina sono determinate entrambe sotto forma di acido cisteico negli idrolizzati di campione ossidato, ma calcolate come cistina (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) utilizzando un peso molecolare di 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

La metionina è determinata come metionina sulfone negli idrolizzati del campione ossidato, ma calcolata come metionina utilizzando il peso molecolare della metionina (149,21 g/mol).

La metionina libera aggiunta viene determinata dopo estrazione sotto forma di metionina; per il calcolo si usa lo stesso valore M.

7.   Valutazione del metodo

Il metodo è stato testato nel 1990, nel corso di un confronto internazionale tra laboratori sulla base di quattro diversi alimenti per animali (alimento composto per suini, alimento composto per polli da ingrasso, concentrato proteico, premiscela). Le medie e le deviazioni standard ottenute dopo l'eliminazione dei risultati anomali figurano nelle seguenti tabelle:

7.1.   Ripetibilità

La ripetibilità (espressa come «deviazione standard entro il laboratorio») del confronto tra laboratori è presentata nelle seguenti tabelle:

7.2.   Riproducibilità

I risultati relativi alla deviazione standard tra laboratori ottenuti dal confronto tra laboratori figurano nelle seguenti tabelle:

8.   Utilizzo di materiali di riferimento

La corretta applicazione del metodo può essere verificata ripetendo le misurazioni dei materiali di riferimento certificati, se disponibili. Si raccomanda di effettuare la taratura con una soluzione di taratura certificata di amminoacidi.

9.   Osservazioni

Per tutti gli amminoacidi va verificato il range della risposta lineare dell'apparecchiatura.

La soluzione standard è diluita con tampone citrato per ottenere aree dei picchi al centro del range.

G.   DETERMINAZIONE DEL TRIPTOFANO

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo serve per la determinazione del triptofano totale e libero negli alimenti per animali. Esso non distingue la forma D dalla forma L.

2.   Principio

Per la determinazione del triptofano totale, il campione è idrolizzato in ambiente alcalino con una soluzione satura di idrossido di bario e riscaldato a 110 oC per 20 ore. A idrolisi avvenuta, viene aggiunto lo standard interno.

Per la determinazione del triptofano libero, il campione è estratto in ambiente moderatamente acido in presenza dello standard interno.

Il triptofano e lo standard interno nell'idrolizzato e nell'estratto sono determinati per HPLC per mezzo di un rivelatore a fluorescenza.

3.   Reattivi

sciogliere 40,0 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro con acqua (3.1).

prelevare 492 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua.

prelevare 82 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua.

prelevare 8,2 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua.

prelevare 34 ml di acido ortofosforico (3.6) e portare a 1 litro con acqua (3.1).

in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0,2553 g di triptofano (3.2) in acido cloridrico (3.13) e portare a volume con acido cloridrico (3.13). Conservare a - 18 oC al massimo per quattro settimane.

in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0,2728 g di α-metil-triptofano (3.3) in acido cloridrico (3.13) e portare a volume con acido cloridrico (3.13). Conservare a - 18 oC al massimo per quattro settimane.

prelevare 2,00 ml di soluzione concentrata di triptofano (3.15) e 2,00 ml di soluzione concentrata di standard interno (α-metil-triptofano) (3.16). Diluire con acqua (3.1) e metanolo (3.8) a circa lo stesso volume e a circa la stessa concentrazione di metanolo (10-30 %) dell'idrolizzato finito.

Questa soluzione deve essere preparata al momento, prima dell'uso.

Proteggere dalla luce solare diretta durante la preparazione.

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione dei campioni

Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all'aria a una temperatura non superiore a 50 oC o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (3.9) prima di essere triturati.

5.2.   Determinazione del triptofano libero (estratto)

In una beuta pesare (con l'approssimazione di 1 mg) una quantità adeguata (1-5 g) del campione preparato (5.1); aggiungere 100,0 ml di acido cloridrico (3.13) e 5,00 ml di soluzione concentrata di standard interno (3.16). Agitare o miscelare per 60 minuti con un agitatore meccanico o magnetico (4.7). Lasciare che si depositi il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher. Aggiungere 5 ml di acido orto-fosforico (3.14). Portare il pH al valore 3 utilizzando idrossido di sodio (3.10). Aggiungere sufficiente metanolo (3.8) per ottenere una concentrazione compresa tra il 10 e il 30 % di metanolo nel volume finale. Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia [approssimativamente lo stesso volume della soluzione madre di taratura (3.17)].

Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0,45 μm (4.5) prima dell'iniezione nella colonna HPLC. Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Proteggere la soluzione madre e gli estratti dalla luce solare diretta. Se non è possibile analizzare gli estratti nello stesso giorno, questi devono essere conservati a 5 oC al massimo per 3 giorni.

5.3.   Determinazione del triptofano totale (idrolizzato).

Pesare (con l'approssimazione di 0,2 mg) da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1) nel matraccio di polipropilene (4.4). La porzione di campione pesata ha un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere 8,4 g di idrossido di bario (ottaidrato) (3.4) e 10 ml di acqua. Miscelare con un miscelatore Vortex (4.8) o con agitatore magnetico (4.7). Lasciare il magnete rivestito di teflon nella miscela. Sciacquare le pareti del recipiente con 4 ml di acqua. Porre il coperchio a vite e chiudere il matraccio senza stringere. Trasferire in una autoclave (4.6) con acqua bollente e vapore per 30-60 minuti. Chiudere l'autoclave e metterla in funzione a 110 (± 2) oC per 20 ore.

Prima di aprire l'autoclave, ridurre la temperatura poco al di sotto di 100 oC. Per evitare la cristallizzazione del Ba(OH)2 8H2O, aggiungere alla miscela calda 30 ml di acqua a temperatura ambiente. Scuotere o agitare non violentemente. Aggiungere 2,00 ml di soluzione concentrata di standard interno (α-metil-triptofano) (3.16). Lasciare raffreddare i recipienti in un bagno di acqua e ghiaccio per 15 minuti.

Aggiungere quindi 5 ml di acido orto-fosforico (3.14). Tenere il recipiente nel bagno di refrigerazione e neutralizzare con HCl (3.11) sempre agitando; regolare quindi il pH a 3,0 utilizzando HCl (3.12). Aggiungere una quantità sufficiente di metanolo per ottenere una concentrazione compresa tra 10 e 30 % di metanolo nel volume finale. Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia (ad esempio, 100 ml). L'aggiunta di metanolo non provoca precipitazione.

Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0,45 μm (4.5) prima dell'iniezione nella colonna HPLC. Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Proteggere la soluzione madre e gli idrolizzati dalla luce solare diretta. Se non è possibile analizzare gli idrolizzati il giorno stesso, questi devono essere conservati a 5 oC al massimo per 3 giorni.

5.4.   Determinazione HPLC

Le seguenti condizioni di eluizione isocratica sono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti (cfr. anche osservazioni 9.1 e 9.2):

6.   Calcolo dei risultati

Calcolare la quantità di triptofano (X), espressa in g, per 100 g di campione secondo la seguente formula:

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni, effettuate in parallelo sullo stesso campione, non deve superare il 10 % del valore ottenuto più elevato.

8.   Risultati di uno studio collaborativo

È stato organizzato uno studio collaborativo a livello comunitario (quarta intercomparazione) nel corso del quale dodici laboratori hanno analizzato tre campioni al fine di convalidare il metodo di idrolisi. Ogni campione è stato analizzato cinque volte. I risultati sono stati i seguenti:

È stato organizzato un altro studio collaborativo a livello comunitario (terza intercomparazione), in cui tredici laboratori hanno analizzato due campioni al fine di convalidare il metodo di estrazione del triptofano libero. Ogni campione è stato analizzato cinque volte. I risultati sono stati i seguenti:

È stato effettuato un altro studio di intercomparazione comunitario in cui sono stati analizzati quattro campioni da 7 laboratori ai fini della certificazione del triptofano per idrolisi. Ogni campione è stato analizzato cinque volte. I risultati sono stati i seguenti:

9.   Osservazioni

Eluizione isocratica seguita da pulitura della colonna a gradiente:

Nell'intervallo operativo, il sistema cromatografico dà una risposta lineare. Tale risposta è misurata a una concentrazione costante (concentrazione normale) dello standard interno e a concentrazioni variabili di triptofano. È importante che le altezze dei picchi del triptofano e dello standard interno si situino nell'intervallo lineare del sistema HPLC/fluorescenza. Se il picco o i picchi del triptofano e/o dello standard interno sono troppo bassi o troppo alti, l'analisi viene ripetuta con altre dimensioni del campione e/o un volume finale modificato.

Con il tempo, l'idrossido di bario si scioglie con maggiore difficoltà. Ciò causa una soluzione torbida per la determinazione HPLC, che può produrre bassi valori per il triptofano.

H.   DETERMINAZIONE DEGLI OLI E GRASSI GREGGI

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di oli e grassi greggi negli alimenti per gli animali, ma non riguarda l'analisi dei semi e frutti oleaginosi.

L'applicazione dei due procedimenti sotto descritti dipende dalla natura e dalla composizione dell'alimento, nonché dalla ragione per cui si esegue l'analisi.

1.1.   Procedimento A — Oli e grassi greggi estraibili direttamente

Il metodo è applicabile alle materie prime per alimenti per animali di origine vegetale, fatta eccezione per quelle alle quali si applica il procedimento B.

1.2.   Procedimento B — Oli e grassi greggi totali

Il metodo è applicabile alle materie prime per alimenti per animali di origine animale e a tutti gli alimenti composti. Esso deve essere usato per tutte le materie prime dai quali gli oli e i grassi non possono essere completamente estratti senza idrolisi preliminare, ad esempio i glutini, i lieviti, le proteine di patata e i prodotti che sono stati sottoposti a procedimenti quali l'estrusione, la fioccatura ed il riscaldamento.

1.3.   Interpretazione dei risultati

Se il valore ottenuto con il procedimento B è più elevato di quello ottenuto con il procedimento A, si considera valore reale il risultato ottenuto con il procedimento B.

2.   Principio

2.1.   Procedimento A

Il campione è estratto con etere di petrolio. Il solvente è eliminato per distillazione e il residuo è essiccato e pesato.

2.2.   Procedimento B

Il campione è trattato a caldo con acido cloridrico. La miscela è raffreddata e filtrata. Dopo essere stato lavato ed essiccato, il residuo è sottoposto all'analisi secondo il procedimento A.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Procedimento A (cfr. punto 8.1)

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g del campione; introdurli in un ditale da estrazione (4.2) e coprire con un tampone di cotone sgrassato.

Porre il ditale in un estrattore (4.1) ed estrarre per 6 ore con etere di petrolio (3.1). Raccogliere l'estratto in un pallone asciutto e tarato, contenente frammenti di pietra pomice ( 9 ).

Eliminare il solvente per distillazione. Essiccare il residuo introducendo il pallone in una stufa per essiccazione (4.3), lasciandovelo per un'ora e mezza. Lasciar raffreddare in essiccatore e pesare. Essiccare una seconda volta per 30 minuti, onde assicurarsi che il peso della sostanza oleosa o grassa rimanga costante (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 1 mg).

5.2.   Procedimento B

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2,5 g del campione (cfr. punto 8.2); introdurli in un becher da 400 ml o in una beuta da 300 ml e aggiungere 100 ml di acido cloridrico (3.3) e qualche granulo di pietra pomice. Ricoprire il becher con un vetro da orologio o applicare sulla beuta un refrigerante a ricadere. Portare la miscela a lenta ebollizione su piccola fiamma o su piastra riscaldante e lasciarvela per un'ora. Evitare che la sostanza aderisca alle pareti del recipiente.

Raffreddare e aggiungere una quantità sufficiente di un coadiuvante di filtrazione (3.4) per evitare qualsiasi perdita di sostanza grassa durante la filtrazione stessa. Filtrare su un doppio filtro di carta bagnato, esente da materie grasse. Lavare il residuo con acqua fredda fino a reazione neutra del filtrato. Verificare che il filtrato non contenga sostanza grasse. La presenza di queste nel filtrato indica che, prima dell'idrolisi, deve essere effettuata un'estrazione del campione con etere di petrolio, secondo il procedimento A.

Porre il doppio filtro con il residuo su un vetro da orologio ed essiccare per un'ora e mezza nella stufa a pressione atmosferica (4.3) a 100 ± 3 oC.

Introdurre il doppio filtro contenente il residuo secco in un ditale da estrazione (4.2) e coprire con un tampone di cotone sgrassato. Porre il ditale in un estrattore (4.1) e operare come indicato al punto 5.1, secondo e terzo capoverso.

6.   Espressione del risultato

Esprimere il risultato della pesata del residuo in percentuale del campione.

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione dallo stesso analista non supera:

8.   Osservazioni

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 20 g di campione e mescolarli con 10 g o più di solfato di sodio anidro (3.2). Procedere all'estrazione con etere di petrolio (3.1) come indicato al punto 5.1. Portare l'estratto ottenuto al volume di 500 ml con etere di petrolio (3.1) e mescolare. Introdurre 50 ml della soluzione in un palloncino asciutto, contenente qualche granulo di pietra pomice, e tarato. Eliminare il solvente per distillazione, essiccare e proseguire come indicato al punto 5.1, ultimo capoverso.

Eliminare il solvente dal residuo d'estrazione che si trova nel ditale, macinare il residuo alla finezza di 1 mm, porlo nuovamente nel ditale (non aggiungere solfato di sodio) e proseguire come indicato al punto 5.1, secondo e terzo capoverso.

Il contenuto di materie oleose e grasse gregge, espresso in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula:

(10m1 + m2) × 5

dove

I.   DETERMINAZIONE DELLA CELLULOSA GREZZA

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare negli alimenti per animali le materie organiche esenti da grasso, insolubili in ambiente acido e in ambiente alcalino, convenzionalmente designate con il nome di cellulosa grezza.

2.   Principio

Il campione, eventualmente sgrassato, è trattato successivamente con soluzioni bollenti di acido solforico e di idrossido di potassio di determinate concentrazioni. Il residuo è separato per filtrazione su vetro sinterizzato, lavato, essiccato, pesato e incenerito a 475-500 oC. La perdita di peso conseguente all'incenerimento corrisponde alla cellulosa grezza della quantità di prodotto sottoposta all'analisi.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione preparato e introdurlo nel crogiolo (4.2) (cfr. osservazioni ai punti 8.1, 8.2 e 8.3) e aggiungere 1 g di coadiuvante di filtrazione (3.3).

Assemblare l'unità riscaldante (4.1) e il crogiolo filtrante (4.2), quindi applicare il cilindro (4.3) al crogiolo. Versare 150 ml di acido solforico bollente (3.1) nel cilindro e crogiolo assemblati e, se necessario, aggiungere qualche goccia di agente antischiuma (3.2).

Portare il liquido all'ebollizione in 5 ± 2 minuti e lasciar bollire vivacemente per esattamente 30 minuti.

Posizionare la valvola verso il tubo di scarico (4.1) e, sotto vuoto, filtrare l'acido solforico attraverso il crogiolo filtrante e sciacquare il residuo tre volte con 30 ml di acqua bollente ciascuna, controllando che il residuo sia filtrato a secco dopo ogni risciacquo.

Richiudere la valvola di svuotamento e versare 150 ml di soluzione di idrossido di potassio bollente (3.7) nel cilindro e nel crogiolo assemblati e aggiungere qualche goccia di antischiuma (3.2). Portare il liquido all'ebollizione entro 5 ± 2 minuti e lasciar bollire vivacemente per esattamente 30 minuti. Filtrare e ripetere la procedura di risciacquo applicata all'acido solforico.

Dopo il risciacquo finale e l'essiccazione, staccare il crogiolo e il suo contenuto e ricollegarlo all'unità di estrazione a freddo (4.6). Applicare il tubo vuoto e risciacquare il residuo nel crogiolo tre volte con porzioni di 25 ml di acetone ciascuna (3.4) assicurandosi che il residuo sia filtrato a secco dopo ogni lavaggio.

Essiccare il crogiolo nel forno a 130 oC fino a cessazione della diminuzione di massa. Dopo ogni essiccazione lasciar raffreddare nell'essiccatore e pesare rapidamente. Introdurre quindi il crogiolo nel forno a muffola e incenerire fino a peso costante (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 2 mg) ad una temperature compresa tra 450 e 500 oC per almeno 30 minuti.

Dopo ciascun riscaldamento, lasciar raffreddare in un primo momento nel forno, poi nell'essiccatore e pesare.

Procedere ad una prova in bianco in assenza del campione. La perdita di peso conseguente all'incenerimento non deve essere superiore a 4 mg.

6.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di cellulosa grezza, in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula:

dove

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:

8.   Osservazioni

J.   DETERMINAZIONE DEGLI ZUCCHERI

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto in zuccheri riduttori ed in zuccheri totali dopo inversione, espressi in glucosio e, se del caso, in saccarosio, per conversione mediante fattore 0,95 . Il metodo è applicabile agli alimenti composti. Particolari modalità sono previste per altri alimenti. All'occorrenza si doserà separatamente il lattosio e se ne terrà conto nel calcolo dei risultati.

2.   Principio

Gli zuccheri presenti sono sciolti nell'etanolo diluito; la soluzione è chiarificata con reattivi di Carrez I e II. Dopo l'eliminazione dell'etanolo, le determinazioni sono effettuate, prima e dopo l'inversione, secondo il metodo di Luff-Schoorl.

3.   Reattivi

aggiungere, agitando prudentemente, la soluzione d'acido citrico (3.8.2) alla soluzione di carbonato di sodio (3.8.3). Aggiungere quindi la soluzione di solfato di rame (3.8.1) e portare al volume di 1 litro con acqua. Lasciar riposare una notte e filtrare.

Controllare la concentrazione del reattivo così ottenuto (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), cfr. punto 5.4, ultimo capoverso. Il pH della soluzione è circa 9,4 .

4.   Apparecchiatura

Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto.

5.   Procedimento

5.1.   Estrazione del campione

Introdurre 2,5 g di sostanza, pesata con l'approssimazione di 1 mg, in un pallone tarato da 250 ml. Aggiungere 200 ml di etanolo (3.1) e far girare il pallone per un’ora nell'apparecchio rotativo. Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I (3.2) e agitare per circa 30 secondi. Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II (3.3) e agitare nuovamente per un minuto. Portare a volume con etanolo (3.1), omogeneizzare e filtrare. Prelevare 200 ml del filtrato ed evaporare circa la metà del volume allo scopo di eliminare la maggior parte di etanolo. Trasferire quantitativamente il residuo d'evaporazione mediante acqua calda in un pallone tarato da 200 ml, raffreddare, portare a volume con acqua, omogeneizzare e filtrare, se necessario. Questa soluzione sarà utilizzata per la determinazione degli zuccheri riduttori e, dopo inversione, per la determinazione degli zuccheri totali.

5.2.   Determinazione degli zuccheri riduttori

Con una pipetta prelevare un volume di soluzione non superiore a 25 ml e contenente meno di 60 mg di zuccheri riduttori, espressi in glucosio. Se necessario, portare a 25 ml con acqua distillata e determinare il contenuto in zuccheri riduttori secondo il metodo di Luff-Schoorl. Il risultato è espresso in percentuale di glucosio presente nel campione.

5.3.   Determinazione degli zuccheri totali dopo inversione

Con una pipetta prelevare 50 ml della soluzione e introdurli in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere qualche goccia di soluzione di metilarancio (3.4), poi, con molta attenzione, e sempre agitando, aggiungere acido cloridrico (3.5) fino a ottenere un viraggio nettamente al rosso. Aggiungere 15 ml di acido cloridrico (3.6), immergere il pallone per 30 minuti in bagnomaria a forte ebollizione e lasciarvelo per 30 minuti. Raffreddare rapidamente alla temperatura di circa 20 oC e aggiungere 15 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.7). Portare al volume di 100 ml con acqua ed omogeneizzare. Prelevare un volume non superiore a 25 ml e contenente meno di 60 mg di zuccheri riduttori, espressi in glucosio. Se necessario, portare a 25 ml con acqua distillata e determinare il contenuto in zuccheri riduttori secondo il metodo di Luff-Schoorl. Esprimere il risultato in percentuale di glucosio, o se del caso, di saccarosio moltiplicando per il fattore 0,95 .

5.4.   Titolazione secondo il metodo di Luff-Schoorl

Con una pipetta prelevare 25 ml del reattivo di Luff-Schoorl (3.8) e introdurlo in un erlenmeyer da 300 ml; aggiungere 25 ml esatti della soluzione zuccherina chiarificata. Dopo aver aggiunto due granuli di pietra pomice (3.13) riscaldare, agitando a mano, su fiamma libera di altezza media e portare il liquido a ebollizione in circa 2 minuti. Collocare immediatamente l'erlenmeyer su una tela metallica, provvista di uno schermo d'amianto munito di un foro del diametro di circa 6 cm, sulla quale è stata preventivamente accesa una fiamma. Questa è regolata in modo tale che venga riscaldato soltanto il fondo dell'erlenmeyer. Adattare sull'erlenmeyer un refrigerante a riflusso. A decorrere da questo momento far bollire per 10 minuti esatti. Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa 5 minuti titolare nel seguente modo:

Aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (3.12) e, subito dopo, con molta attenzione (a causa del rischio di formazione di abbondante schiuma), 25 ml di acido solforico (3.11). Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio (3.9) sino all'apparire di una colorazione giallo opaco, aggiungere l'indicatore all'amido (3.10) e terminare la titolazione.

Effettuare la stessa titolazione su di una miscela, esattamente misurata, di 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl (3.8) e 25 ml d'acqua, dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (3.12) e 25 ml di acido solforico (3.11) senza portare a ebollizione.

6.   Calcolo dei risultati

Stabilire, a mezzo della tabella, la quantità (in mg) di glucosio corrispondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni, espresse in mg di tiosolfato di sodio 0,1 mol/l. Esprimere il risultato in percentuale del campione.

7.   Procedimenti speciali

Omogeneizzare e filtrare. Eliminare l'etanolo come descritto al punto 5.1. In assenza di amido destrinizzato, portare a volume con acqua distillata.

8.   Osservazioni

In entrambi i casi, la quantità di zucchero presente è determinata secondo il metodo di Luff-Schoorl e calcolata in mg di glucosio. Uno dei valori è detratto dall'altro e la differenza è espressa in percentuale del campione.

Esempio

Le due quantità prelevate corrispondono, per ciascuna analisi, a un campione di 250 mg.

Nel primo caso si consumano 17 ml di una soluzione di tiosolfato di sodio di 0,1 mol/l, corrispondenti a 44,2 mg di glucosio, nel secondo 11 ml, corrispondenti a 27,6 mg di glucosio.

La differenza è di 16,6 mg di glucosio.

Il contenuto in zuccheri riduttori (eccettuato il lattosio), calcolato in glucosio, è pertanto di:

K.   DETERMINAZIONE DEL LATTOSIO

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di lattosio negli alimenti per animali che ne contengono più dello 0,5 %.

2.   Principio

Gli zuccheri sono disciolti nell'acqua. La soluzione è sottoposta a fermentazione col lievito Saccharomyces cerevisiae che lascia intatto il lattosio. Dopo chiarificazione e filtrazione il contenuto in lattosio del filtrato è determinato con il metodo di Luff-Schoorl.

3.   Reattivi

versare, agitando sempre lentamente, la soluzione di acido citrico (3.4.2) nella soluzione di carbonato di sodio (3.4.3). Aggiungere la soluzione di solfato di rame (3.4.1) e portare al volume di 1 litro con acqua. Lasciar riposare una notte e filtrare. Controllare la concentrazione del reattivo così ottenuto (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Il pH della soluzione è circa 9,4 .

4.   Apparecchiatura

Bagnomaria con termostato regolato a 38-40 oC.

5.   Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere 25-30 ml d'acqua. Porre il pallone per 30 minuti in un bagnomaria bollente e lasciarlo poi raffreddare a circa 35 oC. Aggiungere 5 ml di sospensione di lievito (3.1) e mescolare. Lasciar riposare il pallone per 2 ore in un bagnomaria, a una temperatura di 38-40 oC. Raffreddare quindi sino a circa 20 oC.

Aggiungere 2,5 ml di soluzione di Carrez I (3.2) e agitare per 30 secondi; aggiungere poi 2,5 ml di soluzione di Carrez II (3.3) e agitare nuovamente per 30 secondi. Portare a 100 ml con acqua, mescolare e filtrare. Prelevare con la pipetta un quantitativo di filtrato non eccedente i 25 ml e contenente preferibilmente da 40 a 80 mg di lattosio; porlo quindi in un erlenmeyer da 300 ml. Se necessario portare a 25 ml con acqua.

Procedere nello stesso modo a una prova in bianco con 5 ml di sospensione di lievito (3.1). Determinare il contenuto di lattosio secondo il metodo Luff-Schoorl come segue: aggiungere 25 ml esatti del reattivo di Luff-Schoorl (3.4) e due granuli di pietra pomice (3.5). Riscaldare agitando a mano su una fiamma libera di media altezza e portare il liquido all'ebollizione in circa 2 minuti. Trasferire immediatamente l'erlenmeyer su una tela metallica, provvista di uno schermo d'amianto munito di un foro del diametro di circa 6 cm, sulla quale è stata preventivamente accesa una fiamma. Questa è regolata in modo tale che venga riscaldato soltanto il fondo dell'erlenmeyer. Adattare sull'erlenmeyer un refrigerante a riflusso. A decorrere da questo momento far bollire per 10 minuti esatti. Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa 5 minuti titolare nel seguente modo:

aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (3.6) e, subito dopo, con molta attenzione (a causa del rischio di formazione di abbondante schiuma), 25 ml di acido solforico (3.7). Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio (3.8) sino all'apparire di una colorazione giallo opaco, aggiungere l'indicatore all'amido (3.10) e terminare la titolazione.

Effettuare la stessa titolazione su di una miscela, esattamente misurata, di 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl (3.4) e 25 ml d'acqua, dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (3.6) e 25 ml di acido solforico (3.7) senza portare a ebollizione.

6.   Calcolo dei risultati

Stabilire, a mezzo della tabella allegata, la quantità di lattosio in mg corrispondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni, espressi in ml di tiosolfato di sodio 0,1 mol/l.

Esprimere il risultato in percentuale del lattosio anidro del campione.

7.   Osservazione

Per i prodotti contenenti più del 40 % di zuccheri fermentescibili, utilizzare più di 5 ml di sospensione di lievito (3.1).

L.   DETERMINAZIONE DELL'AMIDO

METODO POLARIMETRICO

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto in amido e in prodotti di degradazione dell'amido ad alto peso molecolare negli alimenti per animali, al fine di controllarne la conformità al valore energetico dichiarato (disposizioni di cui all'allegato VII) e alla direttiva 96/25/CE del Consiglio ( 10 ).

2.   Principio

Il metodo prevede una duplice determinazione. Nella prima, il campione è trattato con acido cloridrico diluito. Dopo chiarificazione e filtrazione si misura per polarimetria il potere rotatorio della soluzione.

Nella seconda, il campione viene estratto con etanolo al 40 %. Dopo acidificazione del filtrato con acido cloridrico, chiarificazione e filtrazione, si misura il potere rotatorio come nella prima determinazione.

La differenza tra le due misure, moltiplicata per un fattore noto, dà il contenuto in amido del campione.

3.   Reattivi

La concentrazione deve essere verificata per titolazione mediante una soluzione di idrossido di sodio 0,1 mol/l in presenza di rosso di metile allo 0,1 % (p/v) in etanolo al 94 % (v/v). Per la neutralizzazione di 10 ml, sono necessari 30,94 ml di NaOH 0,1 mol/l.

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione del campione

Macinare il campione in modo che passi tutto attraverso un setaccio a maglie rotonde di 0,5 mm di diametro.

5.2.   Determinazione del potere rotatorio totale (P o S) (cfr. osservazione 7.1)

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2,5 g del campione macinato e introdurli in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere 25 ml di acido cloridrico (3.2), agitare per ottenere una buona ripartizione della sostanza e aggiungere altri 25 ml di acido cloridrico (3.2). Immergere il pallone in bagnomaria bollente, agitando energicamente e regolarmente per i primi tre minuti allo scopo di evitare la formazione di grumi. La quantità d'acqua del bagnomaria deve essere sufficiente per mantenere l'ebollizione quando vi è immerso il pallone. Quest'ultimo non può essere tolto dal bagnomaria durante l'agitazione. Dopo 15 minuti esatti togliere il pallone dal bagnomaria, aggiungere 30 ml d'acqua fredda e raffreddare immediatamente sino a 20 °C.

Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I (3.3) ed agitare per circa 30 secondi. Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II (3.4) e agitare nuovamente per circa 30 secondi. Portare a volume con acqua, mescolare e filtrare. Se il filtrato non è perfettamente limpido (caso poco frequente), ripetere l'analisi usando una maggiore quantità di soluzione di Carrez I e II, ad esempio 10 ml.

Misurare quindi il potere rotatorio della soluzione, in un tubo da 200 mm, con un polarimetro od un saccarimetro.

5.3.   Determinazione del potere rotatorio (P' o S') delle sostanze solubili in etanolo al 40 %

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g del campione, introdurli in un pallone tarato da 100 ml e aggiungere circa 80 ml di etanolo (3.5) (cfr. osservazione 7.2). Lasciar riposare il pallone per un'ora a temperatura ambiente; durante questo intervallo agitarlo energicamente sei volte in modo che la sostanza sia ben mescolata con l'etanolo. Portare quindi a volume con etanolo (3.5), mescolare e filtrare.

Pipettare 50 ml del filtrato (corrispondenti a 2,5 g del campione) in una beuta da 250 ml, aggiungere 2,1 ml di acido cloridrico (3.1) e agitare energicamente. Applicare un refrigerante a ricadere sulla beuta e immergerla in bagnomaria bollente. Dopo 15 minuti esatti ritirare la beuta dal bagno, travasarne il contenuto in un pallone tarato da 100 ml, sciacquando con un po' di acqua fredda, e raffreddare sino a 20 oC.

Chiarificare quindi con le soluzioni di Carrez I (3.3) e II (3.4), portare a volume con acqua, mescolare, filtrare e misurare il potere rotatorio come indicato al punto 5.2, secondo e terzo capoverso.

6.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di amido (in %) è calcolato come segue:

6.1.   Misurazioni effettuate con il polarimetro

6.2.   Misurazioni effettuate con il saccarimetro

6.3.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare lo 0,4 in valore assoluto, per i contenuti di amido inferiori al 40 %, e l'1 % in valore relativo, per i contenuti di amido uguali o superiori al 40 %.

7.   Osservazioni

M.   DETERMINAZIONE DELLE CENERI GREZZE

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il tenore di ceneri grezze negli alimenti per gli animali.

2.   Principio

Il campione è incenerito alla temperatura di 550 oC; il residuo viene pesato.

3.   Reattivi

Nitrato d'ammonio, soluzione al 20 % (p/v).

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g circa (o 2,5 g per i prodotti aventi tendenza a rigonfiare) del campione in un crogiolo per incenerimento preventivamente riscaldato a 550 °C, raffreddato e tarato. Porre il crogiolo sopra la piastra riscaldante e scaldare progressivamente fino a carbonizzazione della sostanza. Incenerire conformemente ai punti 5.1 o 5.2.

6.   Calcolo dei risultati

Calcolare il peso del residuo deducendone la tara.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

7.   Osservazioni

N.   DETERMINAZIONE DELLE CENERI INSOLUBILI IN ACIDO CLORIDRICO

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di sostanze minerali insolubili nell'acido cloridrico presenti negli alimenti per gli animali. Si può procedere in due modi in funzione della natura del campione.

2.   Principio

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Metodo A

Incenerire la sostanza da analizzare secondo il procedimento previsto per la determinazione delle ceneri grezze. Possono essere utilizzate anche le ceneri ottenute in tale determinazione.

Trasferire le ceneri in un becher da 250-400 ml con 75 ml d'acido cloridrico (3.1). Portare lentamente a ebollizione e lasciare bollire adagio per 15 minuti. Filtrare la soluzione calda su filtro di carta senza ceneri e lavare il residuo con acqua calda sino a scomparsa della reazione acida. Essiccare il filtro contenente il residuo e incenerire in un crogiolo tarato a temperatura non inferiore a 550 oC e non superiore a 700 oC. Raffreddare in un essiccatore e pesare.

5.2.   Metodo B

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g di campione e introdurli in un becher da 250 a 400 ml. Aggiungere successivamente 25 ml d'acqua e 25 ml d'acido cloridrico (3.1), agitare sino a cessazione dell'effervescenza. Aggiungere altri 50 ml d'acido cloridrico (3.1). Attendere la fine di nuova effervescenza e porre il becher in un bagno di acqua bollente e tenervelo per la durata di 30 minuti o più, se necessario, al fine di idrolizzare completamente l'amido eventualmente presente. Filtrare a caldo su un filtro senza ceneri e lavare il filtro mediante 50 ml di acqua calda (cfr. osservazione 7). Porre il filtro contenente il residuo in un crogiolo da incenerimento, essiccare e incenerire a temperatura non inferiore a 550 oC e non superiore a 700 oC. Trasferire infine le ceneri in un becher della capacità di 250-400 ml mediante 75 ml di acido cloridrico (3.1) e continuare come descritto al punto 5.1, secondo capoverso.

6.   Calcolo dei risultati

Calcolare il peso del residuo deducendone la tara. Esprimere il risultato in percentuale del campione.

7.   Osservazione

Se la filtrazione si rivela difficile, ricominciare la determinazione, sostituendo i 50 ml di acido cloridrico (3.1) con 50 ml di acido tricloroacetico al 20 % (3.2) lavando il filtro mediante una soluzione calda di acido tricloroacetico all'1 % (3.3).

O.   DETERMINAZIONE DEI CARBONATI

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente la determinazione dei carbonati, convenzionalmente espressi in carbonato di calcio, nella maggior parte degli alimenti per animali.

Tuttavia, in alcuni casi (ad esempio con il carbonato di ferro) bisogna impiegare un metodo particolare.

2.   Principio

I carbonati sono decomposti in acido cloridrico; l'anidride carbonica liberata è raccolta in un tubo tarato e il suo volume è comparato a quello sprigionato, nelle medesime condizioni, da una quantità nota di carbonato di calcio.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

Apparecchio di Scheibler-Dietrich (cfr. schema) o apparecchio equivalente.

5.   Procedimento

Secondo il contenuto di carbonati del campione, pesare una quantità di prodotto come indicato di seguito:

Introdurre la quantità di sostanza da analizzare nello speciale recipiente (4) dell'apparecchio, provvisto di un piccolo tubo in materiale infrangibile, contenente 10 ml di acido cloridrico (3.1), e collegare il recipiente all'apparecchio. Girare il rubinetto a tre vie (5), in modo che il tubo (1) comunichi con l'esterno. Per mezzo del tubo mobile (2), che è riempito di acido solforico colorato (3.3) ed è collegato al tubo tarato (1), portare il livello del liquido alla gradazione zero. Girare il rubinetto (5) in modo da far comunicare i tubi (1) e (3) e verificare se il livello è a zero.

Versare lentamente l'acido cloridrico (3.1) sulla sostanza inclinando il recipiente (4). Pareggiare la pressione abbassando il tubo (2). Agitare il recipiente (4) fino a cessazione completa dell'emissione di anidride carbonica.

Ristabilire la pressione riportando il liquido allo stesso livello nei tubi (1) e (2). Eseguire la lettura dopo qualche minuto quando il volume gassoso è divenuto costante.

Effettuare nelle stesse condizioni una prova comparativa su 0,5 g di carbonato di calcio (3.2).

6.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di carbonati, espressi in carbonato di calcio, è dato dalla seguente formula:

dove

7.   Osservazioni

P.   DETERMINAZIONE DEL FOSFORO TOTALE

METODO FOTOMETRICO

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente la determinazione del contenuto di fosforo totale negli alimenti per gli animali. Esso è particolarmente indicato per l'analisi dei prodotti poveri di fosforo. In certi casi (prodotti ricchi di fosforo) può essere applicato un metodo gravimetrico.

2.   Principio

Il campione viene mineralizzato, per via secca (per gli alimenti organici) o per via umida (per i composti minerali e gli alimenti liquidi) e trasferito in soluzione acida. La soluzione viene trattata con il reattivo vanado-molibdico. La densità ottica della soluzione gialla così formatasi, viene misurata allo spettrofotometro a 430 nm.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione della soluzione

Secondo la natura del campione preparare una soluzione come indicato al punto 5.1.1 o 5.1.2.

5.1.1.    Procedura abituale

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g o più del campione. Introdurre la quantità da analizzare in un matraccio di Kjeldahl, aggiungere 20 ml di acido solforico (3.5), agitare per imbibire d'acido tutta la sostanza e per evitare che essa aderisca alle pareti del pallone; riscaldarla e farla bollire per 10 minuti. Lasciar raffreddare leggermente, aggiungere 2 ml di acido nitrico (3.4), riscaldare lentamente, lasciare ancora raffreddare leggermente, aggiungere dell'altro acido nitrico (3.4) e portare il tutto nuovamente a ebollizione. Ripetere le operazioni fino a ottenere una soluzione incolore. Far raffreddare, aggiungere un po' d'acqua, travasare il liquido in un pallone tarato da 500 ml lavando il pallone con acqua calda. Lasciar raffreddare, portare a volume con acqua, mescolare e filtrare.

5.1.2.    Campioni contenenti sostanze organiche ed esenti da diidrogenofosfati di calcio e magnesio

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2,5 g circa di campione e introdurli in un crogiolo da incenerimento. Miscelare il campione da analizzare sino ad amalgamarlo con 1 g di carbonato di calcio (3.1). Incenerire nel forno a 550 oC fino a ottenere ceneri bianche o grigie (una piccola quantità di carbone non disturba). Trasferire le ceneri in un becher da 250 ml. Aggiungere 20 ml d'acqua e acido cloridrico (3.2) sino a cessazione dell'effervescenza. Aggiungere altri 10 ml di acido cloridrico (3.2). Porre il becher su un bagno di sabbia e evaporare a secco per insolubilizzare la silice. Riprendere il residuo con 10 ml di acido nitrico (3.3) e far bollire per 5 minuti sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante senza arrivare a secco. Travasare il liquido in un pallone tarato da 500 ml lavando il becher, a più riprese, con acqua calda. Lasciar raffreddare, portare a volume con acqua, mescolare e filtrare.

5.2.   Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica

Diluire una parte del filtrato ottenuto conformemente a quanto indicato al punto 5.1.1 o 5.1.2 in modo da ottenere una concentrazione di fosforo in quantità non superiore a 40 μg/ml. Introdurre in un tubo da saggio (4.6) 10 ml di questa soluzione ed aggiungervi 10 ml del reattivo vanado-molibdico (3.6). Mescolare e lasciar riposare almeno 10 minuti alla temperatura di 20 oC. Misurare la densità ottica allo spettrofotometro a 430 nm per comparazione con una soluzione ottenuta per aggiunta di 10 ml di reattivo vanado-molibdico (3.6) a 10 ml di acqua.

5.3.   Curva di taratura

Preparare, a partire dalla soluzione tipo (3.7), soluzioni contenenti rispettivamente 5, 10, 20, 30 e 40 μg di fosforo per ml. Prelevare 10 ml da ciascuna soluzione e aggiungervi 10 ml di reattivo vanado-molibdico. Mescolare e lasciar riposare almeno 10 minuti alla temperatura di 20 oC. Misurarne la densità ottica come indicato al punto 5.2. Tracciare la curva di taratura portando in ordinata i valori di densità ottica ed in ascissa le quantità corrispondenti di fosforo. Per concentrazioni comprese tra 0 e 40 μg/ml, la curva sarà lineare.

6.   Calcolo dei risultati

Determinare la quantità di fosforo nella sostanza sottoposta all'analisi riferendosi alla curva di taratura.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera:

Q.   DETERMINAZIONE DEL CLORO DEI CLORURI

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il cloro dei cloruri solubili in acqua, convenzionalmente espresso in cloruro di sodio. Esso è applicabile a tutti gli alimenti per gli animali.

2.   Principio

I cloruri sono disciolti in acqua. Se il prodotto contiene sostanze organiche, si procede ad una chiarificazione. La soluzione è leggermente acidificata con acido nitrico e i cloruri sono precipitati sotto forma di cloruro d'argento a mezzo di una soluzione di nitrato d'argento. L'eccesso di nitrato d'argento è titolato mediante una soluzione di tiocianato di ammonio, secondo il metodo Volhard.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto.

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione della soluzione

Secondo la natura del campione preparare una soluzione come indicato ai punti 5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3.

Effettuare in parallelo una prova in bianco, senza il campione da analizzare.

5.1.1.    Campioni esenti da sostanze organiche

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, un campione di peso non superiore a 10 g e contenente al massimo 3 g di cloro sotto forma di cloruri. Introdurlo in un matraccio tarato da 500 ml con 400 ml di acqua a 20 oC circa. Agitare per 30 minuti con l'agitatore rotativo, portare a volume, mescolare e filtrare.

5.1.2.    Campioni contenenti materie organiche, a eccezione dei prodotti indicati al punto 5.1.3

Pesare con l'approssimazione di 1 mg un quantitativo di campione di circa 5 g e introdurlo con un grammo di carbone attivo in un matraccio tarato da 500 ml. Aggiungere 400 ml di acqua a circa 20 oC e 5 ml di soluzione di Carrez I (3.7), agitare per 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II (3.8). Miscelare per 30 minuti nell'agitatore rotativo, portare a volume, mescolare e filtrare.

5.1.3.    Alimenti cotti, panelli e farina di lino, prodotti ricchi di farina di lino e altri prodotti ricchi di mucillaggini o di sostanze colloidali (ad esempio amido destrinizzato)

Preparare la soluzione come indicato al punto 5.1.2 ma senza filtrare. Dopo decantazione (se necessario centrifugare) prelevare 100 ml del liquido surnatante e introdurli in un pallone tarato da 200 ml. Mescolare con acetone (3.6) e portare a volume con tale solvente, miscelare e filtrare.

5.2.   Titolazione

Porre in un erlenmeyer, con la pipetta, da 25 a 100 ml del filtrato (a seconda del contenuto presunto di cloro) ottenuto secondo quanto indicato ai punti 5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3. L'aliquota non deve contenere più di 150 mg di cloro (Cl). Diluire, se necessario, con acqua fino a ottenere una soluzione di 50 ml, aggiungere 5 ml di acido nitrico (3.4), 20 ml di soluzione satura di bis(solfato) di ammonio e ferro (3.3) e 2 gocce di soluzione di tiocianato di ammonio (3.1) proveniente dalla buretta riempita a questo scopo fino al tratto zero. Far gocciolare in seguito da una buretta la soluzione di nitrato d'argento (3.2) fino ad averne un eccesso di 5 ml. Aggiungere 5 ml di etere dietilico (3.5) e agitare energicamente per far coagulare il precipitato. Titolare l'eccesso di nitrato d'argento con la soluzione di tiocianato di ammonio (3.1) fino a quando il viraggio al rosso-bruno persiste per 1 minuto.

6.   Calcolo dei risultati

La quantità di cloro (X), espressa in cloruro di sodio, è data dalla formula seguente:

dove

Qualora la prova in bianco indichi un consumo di soluzione di nitrato d'argento di 0,1 mol/l detrarre questo valore dal volume (V1 - V2).

7.   Osservazioni

ALLEGATO IV

METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DEL CONTENUTO DI ADDITIVI AUTORIZZATI NEGLI ALIMENTI PER ANIMALI

A.   DETERMINAZIONE DELLA VITAMINA A

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di vitamina A (retinolo) negli alimenti per animali e nelle premiscele. La vitamina A comprende l'alcole retinilico tutto trans e i suoi isomeri cis che vengono determinati con tale metodo. Il contenuto di vitamina A è espresso in unità internazionali (UI) per kg. Una UI corrisponde all'attività di 0,300 μg di alcole di vitamina A tutto trans oppure 0,344 μg di acetato di vitamina A tutto trans oppure 0,550 μg di palmitato di vitamina A tutto trans.

Il limite di quantificazione è di 2 000 UI di vitamina A/kg.

2.   Principio

Il campione viene idrolizzato con una soluzione etanolica di idrossido di potassio e la vitamina A viene estratta in etere di petrolio. Il solvente è rimosso per evaporazione e il residuo sciolto in metanolo e, se necessario, diluito alla concentrazione richiesta. Il contenuto di vitamina A è determinato per cromatografia liquida ad alta prestazione a fase inversa (RP-HPLC) utilizzando un rivelatore UV o a fluorescenza. I parametri cromatografici sono scelti in modo che non vi sia separazione tra l'alcole di vitamina A tutto trans e i suoi isomeri cis.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione del campione

Frantumare il campione affinché passi attraverso un vaglio da 1 mm, evitando la produzione di calore. La frantumazione deve essere effettuata immediatamente prima della pesatura e della saponificazione, altrimenti si possono verificare perdite di vitamina A.

5.2.   Saponificazione

A seconda del contenuto di vitamina A, pesare, con l'approssimazione di 1 mg, da 2 a 25 g di campione in un matraccio da 500 ml a fondo piatto o conico (4.2.1). Aggiungere, rimestando ogni volta, 130 ml di etanolo (3.1), circa 100 mg di BHT (3.13), 2 ml di soluzione di ascorbato di sodio (3.5) e 2 ml di soluzione di solfuro di sodio (3.6). Adattare un refrigerante (4.3) al matraccio e immergere quest'ultimo in un bagno d'acqua con agitatore magnetico (4.7). Portare a ebollizione e lasciar rifluire per 5 minuti. Aggiungere quindi 25 ml di soluzione di idrossido di potassio (3.4) attraverso il refrigerante (4.3) e lasciar rifluire per altri 25 minuti, sempre agitando sotto una debole corrente di azoto. Risciacquare il refrigerante con circa 20 ml di acqua e lasciare raffreddare il contenuto del matraccio a temperatura ambiente.

5.3.   Estrazione

Trasferire quantitativamente per decantazione la soluzione di saponificazione risciacquando con un volume totale di 250 ml di acqua in un imbuto separatore da 1 000 ml (4.2.3) o nel dispositivo di estrazione (4.8). Risciacquare successivamente il matraccio di saponificazione con 25 ml di etanolo (3.1) e 100 ml di etere di petrolio (3.2) e trasferire il liquido di lavaggio nell'imbuto separatore o nel dispositivo di estrazione. Il rapporto di acqua ed etanolo nelle soluzioni combinate deve essere di circa 2:1. Agitare energicamente per 2 minuti e lasciare riposare per 2 minuti.

5.3.1.    Estrazione con imbuto separatore (4.2.3)

Quando gli strati sono separati (cfr. osservazione al punto 7.3) trasferire lo strato di etere di petrolio in un altro separatore (4.2.3). Ripetere questa estrazione due volte con 100 ml di etere di petrolio (3.2), poi ancora due volte con 50 ml di etere di petrolio (3.2).

Lavare due volte gli estratti combinati nell'imbuto separatore rimestando delicatamente (per evitare la formazione di emulsioni) con volumi di 100 ml di acqua e quindi agitando ripetutamente con altri volumi di 100 ml di acqua, finché l'acqua risulti incolore con l'aggiunta di soluzione di fenolftaleina (3.7) (in genere sono sufficienti quattro successivi lavaggi). Filtrare l'estratto lavato attraverso un filtro asciutto per separazione di fase (4.4) per rimuovere eventuale acqua residua e trasferire in un matraccio tarato da 500 ml (4.2.2). Risciacquare l'imbuto separatore ed il filtro con 50 ml di etere di petrolio (3.2), portare a volume con etere di petrolio (3.2) e mescolare bene.

5.3.2.    Estrazione con apparecchiatura per estrazione (4.8)

Quando gli strati si sono separati (cfr. osservazione al punto 7.3) sostituire il tappo del cilindro di vetro (4.8.1) con l'insert di vetro smerigliato (4.8.2) e disporre l'estremità inferiore a U del tubo regolabile in modo che risulti appena al di sopra del livello dell'interfaccia. Esercitando una pressione con getto d'azoto nel braccio laterale, trasferire lo strato superiore di etere di petrolio in un imbuto separatore da 1 000 ml (4.2.3). Aggiungere 100 ml di etere di petrolio (3.2) nel cilindro di vetro, tappare e scuotere bene. Lasciare che gli strati si separino e trasferire lo strato superiore nell'imbuto separatore come prima. Ripetere la procedura di estrazione con altri 100 ml di etere di petrolio (3.2), e altre due volte con frazioni di 50 ml di etere di petrolio (3.2); aggiungere gli strati di etere di petrolio nell'imbuto separatore.

Lavare gli estratti di etere di petrolio combinati come descritto al punto 5.3.1 e procedere come ivi indicato.

5.4.   Preparazione della soluzione del campione per HPLC

Pipettare un'aliquota della soluzione di etere di petrolio (risultante dalla procedura di cui ai punti 5.3.1 o 5.3.2) in un matraccio a pera da 250 ml (4.2.4). Far evaporare il solvente quasi interamente nell'evaporatore rotante (4.1), a pressione ridotta, a una temperatura del bagno non superiore a 40 oC. Ripristinare la pressione atmosferica facendovi fluire azoto (3.10) e togliere il matraccio dall'evaporatore. Togliere il solvente rimanente con un flusso di azoto (3.10) e disciogliere immediatamente il residuo in un volume noto (10-100 ml) di metanolo (3.3) (la concentrazione di vitamina A deve essere dell'ordine di 5 UI/ml-30 UI/ml).

5.5.   Determinazione HPLC

La vitamina A è separata su una colonna C18 a fase inversa (4.5.1) e la concentrazione è misurata mediante rivelatore UV (325 nm) o a fluorescenza (eccitazione: 325 nm, emissione: 475 nm) (4.5.2).

Iniettare un'aliquota (ad esempio 20 μl) della soluzione di metanolo ottenuta conformemente al punto 5.4 ed eluire con la fase mobile (3.9). Calcolare l'altezza (area) media dei picchi di diverse iniezioni della stessa soluzione del campione e le altezze medie (aree) dei picchi di diverse iniezioni di soluzioni di taratura (5.6.2).

Condizioni HPLC

Le seguenti condizioni sono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse purché si ottengano risultati equivalenti.

5.6.   Taratura

5.6.1.    Preparazione delle soluzioni madre di lavoro

Pipettare 20 ml della soluzione madre di acetato di vitamina A (3.11.1) o 20 ml della soluzione madre di palmitato di vitamina A (3.12.1) in un matraccio a fondo piatto o in una beuta da 500 ml (4.2.1) e idrolizzare come indicato al punto 5.2, ma senza aggiunta di BHT. Successivamente, estrarre con etere di petrolio (3.2) secondo le indicazioni di cui al punto 5.3 e portare a 500 ml con etere di petrolio (3.2). Fare evaporare 100 ml di questo estratto nell'evaporatore rotante (cfr. punto 5.4) sin quasi all'essiccazione, togliere il solvente residuo con una corrente di azoto (3.10) e ridisciogliere il residuo in 10,0 ml di metanolo (3.3). La concentrazione nominale di questa soluzione è 560 UI di vitamina A/ml. Il contenuto esatto deve essere determinato conformemente al punto 5.6.3.3. La soluzione madre di lavoro deve essere preparata al momento, poco prima dell'uso.

Pipettare 2,0 ml di questa soluzione madre di lavoro in un matraccio tarato da 20 ml, portare a volume con metanolo (3.3) e mescolare. La concentrazione nominale di questa soluzione madre di lavoro diluita è 56 UI di vitamina A/ml.

5.6.2.    Preparazione delle soluzioni di taratura e della curva di taratura

In una serie di matracci tarati da 20 ml trasferire 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml e 10,0 ml di soluzione madre di lavoro diluita; portare a volume con metanolo (3.3) e mescolare. Le concentrazioni nominali di queste soluzioni sono 2,8 , 5,6 , 14,0 e 28,0 UI di vitamina A/ml.

Iniettare più volte 20 μl di ogni soluzione di taratura e determinare le altezze medie dei picchi (aree). Sulla base delle altezze medie (aree) dei picchi tracciare una curva di taratura tenendo presente i risultati del controllo UV (5.6.3.3).

5.6.3.    Standardizzazione UV delle soluzioni madre

5.6.3.1.    Soluzione madre di acetato di vitamina A

Pipettare 2,0 ml della soluzione madre di acetato di vitamina A (3.11.1) in un matraccio tarato da 50 ml (4.2.2) e portare a volume con 2-propanolo (3.8). La concentrazione nominale di questa soluzione è di 56 UI di vitamina A/ml. Pipettare 3,0 ml di questa soluzione di acetato di vitamina A diluita in un matraccio tarato da 25 ml e portare a volume con 2-propanolo (3.8). La concentrazione nominale di questa soluzione è di 6,72 UI di vitamina A/ml. Misurare lo spettro UV di questa soluzione su 2-propanolo (3.8) nello spettrofotometro (4.6) tra 300 nm e 400 nm. Il massimo di estinzione deve situarsi tra 325 nm e 327 nm.

Calcolo del contenuto di vitamina A:

UI di vitamina A/ml = E326 × 19,0

(

per l'acetato di vitamina A = 1 530 a 326 nm in 2-propanolo)

5.6.3.2.    Soluzione madre di palmitato di vitamina A

Pipettare 2,0 ml della soluzione madre di palmitato di vitamina A (3.12.1) in un matraccio tarato da 50 ml (4.2.2) e portare a volume con 2-propanolo (3.8). La concentrazione nominale di questa soluzione è di 56 UI di vitamina A/ml. Pipettare 3,0 ml di questa soluzione di palmitato di vitamina A diluita in un matraccio tarato da 25 ml e portare a volume con 2-propanolo (3.8). La concentrazione nominale di questa soluzione è di 6,72 UI di vitamina A/ml. Misurare lo spettro UV di questa soluzione su 2-propanolo (3.8) nello spettrofotometro (4.6) tra 300 nm e 400 nm. Il massimo di estinzione deve situarsi tra 325 nm e 327 nm.

Calcolo del contenuto di vitamina A:

UI di vitamina A/ml = E326 × 19,0

(

per il palmitato di vitamina A = 957 a 326 nm in 2-propanolo)

5.6.3.3.    Soluzione standard di lavoro di vitamina A

Pipettare 3,0 ml della soluzione standard di lavoro di vitamina A non diluita, preparata secondo quanto indicato al punto 5.6.1, in un matraccio tarato da 50 ml (4.2.2) e portare a volume con 2-propanolo (3.8). Pipettare 5,0 ml di questa soluzione in un matraccio tarato da 25 ml e portare a volume con 2-propanolo (3.8). La concentrazione nominale di questa soluzione è di 6,72 UI di vitamina A/ml. Misurare lo spettro UV di questa soluzione su 2-propanolo (3.8) nello spettrofotometro (4.6) tra 300 nm e 400 nm. Il massimo di estinzione deve situarsi tra 325 nm e 327 nm.

Calcolo del contenuto di vitamina A:

UI di vitamina A/ml = E325 × 18,3

(

per l'alcole di vitamina A = 1 821 a 325 nm in 2-propanolo)

6.   Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in UI/ml in base all'altezza (area) media dei picchi della vitamina A, per riferimento alla curva di taratura (5.6.2).

Il contenuto w di vitamina A (in UI/kg) del campione è dato dalla seguente formula:

[UI/kg]

dove

7.   Osservazioni

Per verificare se il metodo di analisi applicato consente di ottenere risultati affidabili relativi a questa matrice specifica (alimenti d'allattamento), è effettuata una prova di recupero su un campione supplementare. Se il tasso di recupero è inferiore all'80 %, il risultato dell'analisi va corretto per il fattore di recupero.

8.   Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 % del risultato più elevato.

9.   Risultati di uno studio effettuato in cooperazione tra vari laboratori ( 11 )

B.   DETERMINAZIONE DELLA VITAMINA E

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di vitamina E negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il contenuto di vitamina E è espresso in mg di acetato di DL-α-tocoferolo per kg. 1 mg di acetato di DL-α-tocoferolo corrisponde a 0,91 mg di DL-α-tocoferolo (vitamina E).

Il limite di quantificazione è di 2 mg di vitamina E/kg. Tale limite è ottenibile unicamente mediante rivelatore a fluorescenza. Utilizzando un rivelatore UV il limite di quantificazione è di 10 mg/kg.

2.   Principio

Il campione è idrolizzato con una soluzione etanolica di idrossido di potassio e la vitamina E è estratta in etere di petrolio. Il solvente viene rimosso per evaporazione e il residuo è disciolto in metanolo e, se necessario, diluito alla concentrazione richiesta. Il contenuto di vitamina E viene determinato per cromatografia liquida ad alta prestazione a fase inversa (RP-HPLC) utilizzando un rivelatore UV o a fluorescenza.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Preparazione del campione

Frantumare il campione affinché passi attraverso un vaglio da 1 mm, evitando la produzione di calore. La frantumazione deve essere effettuata immediatamente prima della pesatura e della saponificazione, altrimenti si possono verificare perdite di vitamina E.

5.2.   Saponificazione

A seconda del contenuto di vitamina E, pesare, con l'approssimazione di 0,01 g, da 2 g a 25 g di campione in un matraccio da 500 ml a fondo piatto o conico (4.2.1). Aggiungere successivamente, sempre rimestando, 130 ml di etanolo (3.1), circa 100 mg di BHT (3.13), 2 ml di soluzione di ascorbato di sodio (3.5) e 2 ml di soluzione di solfuro di sodio (3.6). Adattare un refrigerante (4.3) al matraccio e immergere quest'ultimo in un bagno d'acqua con agitatore magnetico (4.7). Portare a ebollizione e lasciare rifluire per 5 minuti. Aggiungere 25 ml di soluzione di idrossido di potassio (3.4) attraverso il refrigerante (4.3) e lasciare rifluire per altri 25 minuti, sempre agitando sotto una debole corrente di azoto. Risciacquare il refrigerante con circa 20 ml di acqua e lasciare raffreddare il contenuto del matraccio a temperatura ambiente.

5.3.   Estrazione

Trasferire quantitativamente per decantazione la soluzione di saponificazione risciacquando con un volume totale di 250 ml di acqua in un imbuto separatore da 1 000 ml (4.2.3) o nel dispositivo di estrazione (4.8). Risciacquare successivamente il matraccio di saponificazione con 25 ml di etanolo (3.1) e 100 ml di etere di petrolio (3.2) e trasferire il liquido di lavaggio nell'imbuto separatore o nel dispositivo di estrazione. Il rapporto di acqua ed etanolo nelle soluzioni combinate deve essere di circa 2:1. Agitare energicamente per 2 minuti e lasciare riposare per 2 minuti.

5.3.1.    Estrazione con imbuto separatore (4.2.3)

Quando gli strati sono separati (cfr. osservazione al punto 7.3) trasferire lo strato di etere di petrolio in un altro separatore (4.2.3). Ripetere questa estrazione due volte con 100 ml di etere di petrolio (3.2), poi ancora due volte con 50 ml di etere di petrolio (3.2).

Lavare due volte gli estratti combinati nell'imbuto separatore rimestando delicatamente (per evitare la formazione di emulsioni) con volumi di 100 ml di acqua e quindi agitando ripetutamente con altri volumi di 100 ml di acqua finché l'acqua risulti incolore con l'aggiunta di soluzione di fenolftaleina (3.7) (in genere sono sufficienti quattro successivi lavaggi). Filtrare l'estratto lavato attraverso un filtro asciutto per separazione di fase (4.4) per rimuovere eventuale acqua residua e trasferire in un matraccio tarato da 500 ml (4.2.2). Risciacquare l'imbuto separatore e il filtro con 50 ml di etere di petrolio (3.2), portare a volume con etere di petrolio (3.2) e mescolare bene.

5.3.2.    Estrazione con apparecchiatura per estrazione (4.8)

Quando gli strati si sono separati (cfr. osservazione al punto 7.3) sostituire il tappo del cilindro di vetro (4.8.1) con l'insert di vetro smerigliato (4.8.2) e disporre la terminazione inferiore a U del tubo adattabile in modo che risulti appena al di sopra del livello dell'interfaccia. Esercitando una pressione con getto d'azoto nel braccio laterale, trasferire lo strato superiore di etere di petrolio in un imbuto separatore da 1 000 ml (4.2.3). Aggiungere 100 ml di etere di petrolio (3.2) nel cilindro di vetro, tappare e scuotere bene. Lasciare che gli strati si separino e trasferire lo strato superiore nell'imbuto separatore come prima. Ripetere la procedura di estrazione con altri 100 ml di etere di petrolio (3.2), poi ancora due volte con 50 ml di etere di petrolio (3.2); aggiungere gli strati di etere di petrolio nell'imbuto separatore.

Lavare gli estratti di etere di petrolio combinati come descritto al punto 5.3.1 e procedere come ivi indicato.

5.4.   Preparazione della soluzione del campione per HPLC

Pipettare un'aliquota della soluzione di etere di petrolio (risultante dalla procedura di cui ai punti 5.3.1 o 5.3.2) in un matraccio a pera da 250 ml (4.2.4). Far evaporare il solvente sin quasi all'essiccazione nell'evaporatore rotante (4.1), a pressione ridotta, ad una temperatura del bagno non superiore a 40 oC. Ripristinare la pressione atmosferica facendovi fluire azoto (3.9) e togliere il matraccio dall'evaporatore. Togliere il solvente rimanente con un flusso di azoto (3.9) e disciogliere il residuo immediatamente in un volume noto (10-100 ml) di metanolo (3.3) (la concentrazione di DL-α-tocoferolo deve essere dell'ordine di 5 μg/ml a 30 μg/ml).

5.5.   Determinazione HPLC

La vitamina E viene separata su una colonna C18 a fase inversa (4.5.1) e la concentrazione è misurata mediante rivelatore a fluorescenza (eccitazione: 295 nm, emissione: 330 nm) (4.5.2) o un rivelatore UV (292 nm) (4.5.2).

Iniettare un'aliquota (ad esempio 20 μl) della soluzione di metanolo ottenuta conformemente al punto 5.4 ed eluire con la fase mobile (3.8). Calcolare le altezze medie (aree) dei picchi di diverse iniezioni della stessa soluzione del campione e le altezze medie dei picchi (aree) di diverse iniezioni delle soluzioni di taratura (5.6.2).

Condizioni HPLC

Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse purché si ottengano risultati equivalenti.

5.6.   Taratura (acetato di DL-α-tocoferolo o DL-α-tocoferolo)

5.6.1.    Standard di acetato di DL-α-tocoferolo

5.6.1.1.    Preparazione della soluzione standard di lavoro

Pipettare 25 ml della soluzione madre di acetato di DL-α-tocoferolo (3.10.1) in un matraccio a fondo piatto o in una beuta da 500 ml (4.2.1) e idrolizzare come indicato al punto 5.2. Successivamente, estrarre con etere di petrolio (3.2) secondo quanto indicato al punto 5.3 e portare a 500 ml con etere di petrolio. Far evaporare 25 ml di questo estratto nell'evaporatore (cfr. punto 5.4) sin quasi all'essiccazione, togliere il solvente residuo con una corrente di azoto (3.9) e ridisciogliere il residuo in 25,0 ml di metanolo (3.3). La concentrazione nominale di questa soluzione è di 45,5 μg di DL-α-tocoferolo/ml, equivalente a 50 μg di acetato di DL-α-tocoferolo/ml. La soluzione standard di lavoro deve essere preparata al momento, poco prima dell'uso.

5.6.1.2.    Preparazione delle soluzioni di taratura e della curva di taratura

In una serie di matracci tarati da 20 ml trasferire 1,0 , 2,0 , 4,0 e 10,0 ml della soluzione standard di lavoro, portare a volume con metanolo (3.3) e miscelare. Le concentrazioni nominali di queste soluzioni sono 2,5 , 5,0 , 10,0 e 25,0 μg/ml di acetato di DL-α-tocoferolo e cioè 2,28 , 4,55 , 9,10 e 22,8 μg/ml di DL-α-tocoferolo.

Iniettare più volte 20 μl di ogni soluzione di taratura e determinare le altezze medie (aree) dei picchi. Sulla base delle altezze medie (aree) dei picchi tracciare una curva di taratura.

5.6.1.3.    Standardizzazione UV della soluzione madre di acetato di DL-α-tocoferolo (3.10.1)

Diluire 5,0 ml della soluzione madre di acetato di DL-α-tocoferolo (3.10.1) sino a 25,0 ml con etanolo e misurare lo spettro UV di questa soluzione su etanolo (3.1), nello spettrofotometro (4.6), tra 250 e 320 nm.

Il massimo di assorbimento si situa a 284 nm:

= 43,6 a 284 nm in etanolo

A questa diluizione, si deve ottenere un valore di estinzione compreso tra 0,84 e 0,88 .

5.6.2.    Standard di DL-α-tocoferolo

5.6.2.1.    Preparazione della soluzione standard di lavoro

Trasferire con pipetta 2 ml della soluzione madre di DL-α-tocoferolo (3.11.1) in un matraccio tarato da 50 ml, sciogliere in metanolo (3.3) e portare a volume con metanolo. La concentrazione nominale di questa soluzione è di 40 μg di DL-α-tocoferolo/ml, equivalente a 44,0 μg di acetato di DL-α-tocoferolo/ml. La soluzione standard di lavoro deve essere preparata al momento, poco prima dell'uso.

5.6.2.2.    Preparazione delle soluzioni di taratura e della curva di taratura

In una serie di matracci tarati da 20 ml trasferire 1,0 , 2,0 , 4,0 e 10,0 ml della soluzione standard di lavoro, portare a volume con metanolo (3.3) e miscelare. Le concentrazioni nominali di queste soluzioni sono 2,0 , 4,0 , 8,0 e 20,0 μg/ml di DL-α-tocoferolo e cioè 2,20 , 4,40 , 8,79 e 22,0 μg/ml di acetato di DL-α-tocoferolo.

Iniettare più volte 20 μl di ogni soluzione di taratura e determinare le altezze medie dei picchi (aree). Sulla base delle altezze medie (aree) dei picchi tracciare una curva di taratura.

5.6.2.3.    Standardizzazione UV della soluzione madre di DL-α-tocoferolo (3.11.1)

Diluire 2,0 ml della soluzione madre di DL-α-tocoferolo (3.11.1) sino a 25,0 ml con etanolo e misurare lo spettro UV di questa soluzione su etanolo (3.1) nello spettrofotometro (4.6) tra 250 nm e 320 nm. Il massimo di assorbimento si situa a 292 nm:

= 75,8 a 292 nm in etanolo

A questa diluizione si dovrebbe ottenere un valore di estinzione di 0,6 .

6.   Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in μg/ml (calcolata come acetato di α-tocoferolo) in base all'altezza (area) media dei picchi della vitamina E, per riferimento alla curva di taratura (5.6.1.2 o 5.6.2.2).

Il contenuto w di vitamina E (in mg/kg) del campione è dato dalla seguente formula:

[mg/kg]

dove

7.   Osservazioni

8.   Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 % del risultato più elevato.

9.   Risultati di uno studio effettuato in cooperazione tra vari laboratori ( 12 )

C.   DETERMINAZIONE DEGLI OLIGOELEMENTI FERRO, RAME, MANGANESE E ZINCO

1.   Finalità e campo d'applicazione

Questo metodo consente di determinare gli oligoelementi ferro, rame, manganese e zinco contenuti negli alimenti per animali. Le soglie di quantificazione dei suddetti elementi sono:

2.   Principio

Il campione viene disciolto in acido cloridrico dopo distruzione delle sostanze organiche eventualmente presenti. Gli elementi ferro, rame, manganese e zinco sono determinati, dopo opportuna diluizione, mediante spettrometria di assorbimento atomico.

3.   Reattivi

Osservazioni preliminari

L'acqua utilizzata per la preparazione dei reattivi e delle soluzioni per l'analisi deve essere esente da cationi da determinare, preparata o per doppia distillazione dell'acqua in un apparecchio in borosilicato o in quarzo o per doppio passaggio su resine a scambio ionico.

I reattivi debbono essere di purezza almeno «analitica». L'assenza dell'elemento da determinare deve essere controllata mediante una prova in bianco. Se necessario, i reattivi dovranno essere ulteriormente purificati.

In luogo delle soluzioni standard appresso elencate è possibile impiegare soluzioni standard commerciali purché fornite di garanzia e controllate prima dell'uso.

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento ( 13 )

5.1.   Campioni contenenti sostanze organiche

5.1.1.    Incenerimento e preparazione della soluzione da analizzare ( 14 )

Umettare le ceneri con acqua e trasferirle in un becher da 250 ml. Lavare bene il crogiolo con complessivi 5 ml circa di acido cloridrico (3.1) e travasare lentamente e accuratamente quest'ultimo nel becher (si può avere una reazione violenta per formazione di CO2). Aggiungere goccia a goccia dell'acido cloridrico (3.1), agitando finché l'effervescenza sia terminata. Evaporare a secco agitando ogni tanto con un bacchetta di vetro.

Aggiungere al residuo 15 ml di acido cloridrico 6 mol/l (3.2) e successivamente circa 120 ml d'acqua. Rimescolare con la bacchetta di vetro, che va lasciata nel becher, e coprire quest'ultimo con un vetro di orologio. Portare il liquido a leggera ebollizione e mantenerla finché non si vedono più dissolversi le ceneri. Filtrare su carta filtro senza ceneri e raccogliere il filtrato in un matraccio tarato da 250 ml. Lavare il becher e il filtro prima con 5 ml di acido cloridrico 6 mol/l caldo (3.2), poi, per due volte, con acqua bollente. Portare a volume con acqua (la concentrazione dell'acido cloridrico è 0,5 mol/l).

Note:

5.1.2.    Determinazione spettrofotometrica

5.1.2.1.    Preparazione delle soluzioni di taratura

Per ciascun oligoelemento da dosare, preparare una serie di soluzioni di taratura a partire dalle soluzioni standard di lavoro di cui ai punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 e 3.10.1, in modo che la concentrazione dell'acido cloridrico in ciascuna di esse sia all'incirca 0,5 mol/l, e, nel caso del ferro, del manganese e dello zinco, la concentrazione del cloruro di lantanio corrisponda allo 0,1 % di La (p/v).

Le concentrazioni prescelte per gli oligoelementi devono trovarsi nell'intervallo di sensibilità dello spettrofotometro utilizzato. Le tabelle di seguito riportano, a titolo di esempio, alcuni tipi di composizione delle soluzioni di taratura; nondimeno a seconda del tipo e della sensibilità dello spettrofotometro impiegato potrebbe essere necessario scegliere altre concentrazioni.

Ferro

Rame

Manganese

Zinco

5.1.2.2.    Preparazione della soluzione da sottoporre ad analisi

Per la determinazione del rame, la soluzione preparata secondo quanto indicato al punto 5.1.1 può in linea generale essere utilizzata direttamente. Se è necessario portare la sua concentrazione nell'intervallo delle concentrazioni delle soluzioni di taratura, una sua aliquota può essere pipettata in un pallone tarato da 100 ml e portata a volume con acido cloridrico 0,5 mol/l (3.3).

Per la determinazione del ferro, del manganese e dello zinco, pipettare un'aliquota della soluzione preparata secondo quanto indicato al punto 5.1.1 in un pallone tarato da 100 ml; aggiungere 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio (3.11) e portare a volume con acido cloridrico 0,5 mol/l (3.3) (cfr. anche punto 8, «Osservazione»).

5.1.2.3.    Prova in bianco

Effettuare una prova in bianco comprendente tutte le operazioni prescritte nel procedimento, escludendo la presenza del campione. La soluzione di taratura «0» non deve essere utilizzata come «bianco».

5.1.2.4.    Misurazione dell'assorbimento atomico

Misurare l'assorbimento delle soluzioni di taratura e della soluzione da analizzare, impiegando una fiamma ossidante aria-acetilene, alle lunghezze d'onda seguenti:

Ripetere ogni misurazione quattro volte.

5.2.   Alimenti a base di minerali

In assenza di materiali organici, l'incenerimento preliminare è superfluo. Operare come descritto al punto 5.1.1.1, a partire dal secondo capoverso. L'evaporazione in presenza di acido fluoridrico può essere tralasciata.

6.   Calcolo dei risultati

Tramite la curva di taratura calcolare la concentrazione degli oligoelementi nella soluzione in esame ed esprimere il risultato in mg d'oligoelemento per kg di campione (ppm).

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione dallo stesso analista non supera:

8.   Osservazione

La presenza di notevoli quantità di fosfati può interferire nella determinazione del ferro, del manganese e dello zinco. Questa interferenza deve essere corretta aggiungendo soluzione di cloruro di lantanio (3.11). Tuttavia, se nel campione il rapporto di peso Ca + Mg/P risulta > 2, non è necessario aggiungere soluzione di cloruro di lantanio (3.11) alla soluzione da analizzare e alle soluzioni di taratura.

D.   DETERMINAZIONE DELL'ALOFUGINONE

DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3-idrossi-2-piperidil)acetonil]chinazolin-4(3H)-one bromidrato

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di alofuginone negli alimenti per animali. Il limite di quantificazione è di 1 mg/kg.

2.   Principio

Dopo essere stato trattato con acqua calda, l'alofuginone è estratto come base libera in acetato di etile e successivamente ripartito come cloridrato in soluzione acquosa acida. L'estratto è purificato mediante cromatografia a scambio ionico. Il tenore di alofuginone è determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) a fase inversa, usando un rivelatore UV.

3.   Reattivi

In un matraccio tarato da 500 ml pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 50 mg di alofuginone (3.6), sciogliere in una soluzione tampone di acetato ammonico (3.18), portare a volume con la soluzione tampone e mescolare. Questa soluzione è stabile per tre settimane a 5 oC se conservata al buio.

In una serie di palloni graduati da 100 ml trasferire 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 e 6,0 ml della soluzione madre standard (3.6.1). Portare a volume con la fase mobile (3.21) e agitare. Queste soluzioni hanno concentrazioni rispettivamente di 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 e 6,0 μg/ml di alofuginone. Devono essere preparate al momento, poco prima dell'uso.

Sciogliere 50 g di carbonato di sodio (3.11) in acqua, portare a 1 litro e aggiungere cloruro di sodio (3.12) fino a saturazione.

Diluire 10 ml di HCI (3.7) con acqua e portare a 1 litro.

Sciogliere 19,3 g di acetato di ammonio (3.3) e 30 ml di acido acetico (3.5) in acqua (3.14) e portare a 1 litro.

Sciacquare un quantitativo adatto di amberlite (3.2) con acqua fino a eliminazione completa di tutti gli ioni cloruro, eliminazione che viene verificata eseguendo una prova al nitrato di argento (3.20) sulla fase acquosa che è stata messa da parte. Sciacquare quindi la resina con 50 ml di metanolo (3.8), eliminare il metanolo e conservare la resina in metanolo fresco.

Sciogliere 0,17 g di nitrato di argento (3.9) in 10 ml di acqua.

Mescolare 500 ml di acetonitrile (3.1), 300 ml di soluzione tampone di acetato ammonico (3.18) e 1 200 ml di acqua (3.14). Regolare il pH a 4,3 con acido acetico (3.5). Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 μm (4.8) e degassarla (ad esempio sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni). Questa soluzione è stabile per un mese se conservata al buio in un contenitore chiuso.

4.   Apparecchiatura

5.   Procedimento

5.1.   Indicazioni generali

5.2.   Estrazione

Pesare, con l'approssimazione di 0,1 g, 10 g del campione preparato in una provetta da centrifuga da 200 ml, aggiungere 0,5 g di ascorbato sodico (3.10), 0,5 g di EDTA (3.13) e 20 ml di acqua e agitare. Immergere la provetta in bagnomaria (80 oC) per 5 minuti. Dopo aver fatto raffreddare a temperatura ambiente, aggiungere 20 ml di soluzione di carbonato di sodio (3.15) e agitare. Aggiungere immediatamente 100 ml di acetato di etile (3.4) e agitare vigorosamente a mano per 15 secondi. Introdurre quindi la provetta nel bagno ultrasonico (4.1) per 3 minuti e allentare il tappo. Centrifugare per 2 minuti e decantare la fase di acetato etilico attraverso un filtro in fibra di vetro (4.6) in un imbuto separatore da 500 ml. Ripetere l'estrazione del campione con un secondo volume di 100 ml di acetato di etile. Lavare gli estratti combinati, per un minuto, con 50 ml di soluzione di carbonato di sodio saturata con cloruro di sodio (3.16) ed eliminare lo strato acquoso.

Estrarre lo strato organico, per un minuto, con 50 ml di acido cloridrico (3.17). Raccogliere lo strato acido inferiore in un imbuto separatore da 250 ml. Riestrarre lo strato organico per 1,5 minuti con altri 50 ml di acido cloridrico e aggiungere al primo estratto. Lavare gli estratti acidi combinati agitando per 10 secondi con 10 ml di acetato di etile (3.4).

Trasferire quantitativamente lo strato acquoso in un pallone a fondo arrotondato da 250 ml ed eliminare la fase organica. Far evaporare dalla soluzione acida tutto l'acetato di etile restante mediante un evaporatore rotante (4.2). La temperatura del bagnomaria non deve superare i 40 oC. Con un vuoto di circa 25 mbar tutto l'acetato di etile residuo sarà rimosso entro 5 minuti a 38 oC.

5.3.   Purificazione

5.3.1.    Preparazione della colonna di amberlite

Per ciascun estratto di campione viene preparata una colonna XAD-2. Mediante metanolo (3.8) trasferire in una colonna di vetro (4.5) 10 g di amberlite preparata (3.19). Aggiungere un piccolo tampone di lana di vetro alla sommità del letto della resina. Lasciar colare il metanolo dalla colonna e lavare la resina con 100 ml d'acqua, fermando il flusso quando il liquido raggiunge la sommità del letto della resina. Attendere che la colonna si stabilizzi per 10 minuti prima di utilizzarla. Evitare comunque che la colonna si essicchi.

5.3.2.    Purificazione del campione

Trasferire quantitativamente l'estratto (5.2) sulla sommità della colonna di amberlite preparata (5.3.1) ed eluire, scartando l'eluato. La velocità di eluizione non deve superare 20 ml/min. Risciacquare il pallone con 20 ml di acido cloridrico (3.17) e usare quest'ultimo liquido per lavare la colonna di resina. Eliminare eventuali residui di soluzione acida insufflando aria. Eliminare i liquidi di lavaggio. Aggiungere 100 ml di metanolo (3.8) alla colonna e lasciar eluire per 5-10 minuti, raccogliendo l'eluato in un pallone da 250 ml. Attendere che il metanolo residuo si stabilizzi per 10 minuti con la resina e continuare l'eluizione con un flusso non superiore a 20 ml/min, raccogliendo l'eluato nello stesso pallone. Evaporare il metanolo sull'evaporatore rotante (4.2); la temperatura del bagnomaria non deve superare i 40 oC. Trasferire quantitativamente il residuo in un pallone tarato da 10 ml applicando la fase mobile (3.21). Portare a volume con la fase mobile e agitare. Filtrare una parte attraverso un filtro a membrana (4.7). Riservare questa soluzione per la determinazione mediante HPLC (5.4).

5.4.   Determinazione HPLC

5.4.1.    Parametri

I parametri qui riportati sono di riferimento. È possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti.

Colonna per cromatografia liquida (4.4.1)

Fase mobile per HPLC (3.21)

Velocità di efflusso: 1,5 -2 ml/min

Lunghezza d'onda di rivelazione: 243 nm

Volume iniettato: 40-100 μl.

Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando più volte la soluzione di taratura (3.6.2) contenente 3,0 μg/ml fino a ottenimento di altezze (aree) del picco e tempi di ritenzione costanti.

5.4.2.    Curva di taratura

Iniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.6.2) e misurare le altezze (aree) dei picchi per ciascuna concentrazione. Tracciare la curva di taratura riportando in ordinate le altezze medie o le aree medie dei picchi delle soluzioni di taratura e in ascisse le corrispondenti concentrazioni in μg/ml.

5.4.3.    Soluzione del campione

Iniettare più volte l'estratto di campione (5.3.2) utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l'altezza (area) media dei picchi dell'alofuginone.

6.   Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in μg/ml in base all'altezza (area) media dei picchi dell'alofuginone, per riferimento alla curva di taratura (5.4.2).

Il contenuto di alofuginone w (mg/kg) del campione è dato dalla formula seguente:

dove

7.   Convalida dei risultati

7.1.   Identità

L'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia oppure usando un rivelatore a serie di diodi in cui vengono confrontati gli spettri dell'estratto di campione e della soluzione di taratura (3.6.2) contenente 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografia

Un estratto di campione viene «rinforzato» mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.6.2). Il quantitativo di alofuginone addizionato deve essere analogo a quello stimato di alofuginone rilevato nell'estratto di campione.

Deve aumentare soltanto l'altezza del picco dell'alofuginone, tenuto conto sia della quantità addizionata che della diluizione dell'estratto. L'ampiezza del picco, a metà della sua altezza massima, deve corrispondere, con uno scostamento massimo del 10 %, all'ampiezza originale.

7.1.2.    Rivelazione a serie di diodi

I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri:

Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.

7.2.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo stesso campione non deve superare 0,5 mg/kg per contenuti di alofuginone sino a un massimo di 3 mg/kg.

7.3.   Recupero

Per quanto riguarda il campione in bianco addizionato il recupero non è inferiore all'80 %.

8.   Risultati di uno studio collaborativo

È stato organizzato uno studio collaborativo ( 15 ) nel corso del quale otto laboratori hanno analizzato tre campioni.

E.   DETERMINAZIONE DELLA ROBENIDINA

Cloridrato di 1,3-bis[(4-clorobenzilidene) amino]guanidina

1.   Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di robenidina negli alimenti per animali. Il limite di quantificazione è di 5 mg/kg.

2.   Principio

Il campione è estratto con metanolo acidificato. L'estratto è essiccato e una parte aliquota è purificata in una colonna di ossido di alluminio. La robenidina, eluita dalla colonna con metanolo, è concentrata e portata volume adeguato con la fase mobile. Il tenore di robenidina è determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) a fase inversa, utilizzando un rivelatore UV.

3.   Reattivi

Travasare 4,0 ml di acido cloridrico (ρ20 = 1,18 g/ml) in un pallone tarato da 500 ml, portare a volume con metanolo (3.1) e agitare. Questa soluzione è preparata al momento, poco prima dell'uso.

Sferette di tipo 3A, 8-12 mesh (1,6 -2,5 mm, alluminosilicato cristallino, diametro dei pori 0,3 mm).

Trasferire 100 g di allumina acida in un contenitore adatto e aggiungere 2,0 ml di acqua. Tappare e agitare per circa 20 minuti. Conservare in un contenitore ben chiuso.

Sciogliere 3,40 g di potassio diidrogeno fosfato in acqua (qualità HPLC) in un matraccio tarato da 1 000 ml, portare a volume e agitare.

Sciogliere 3,55 g di fosfato di sodio bibasico anidro (o 4,45 g di diidrato, o 8,95 g di dodecaidrato) in acqua (di qualità HPLC), in un matraccio tarato da 1 litro, portare a volume e agitare.

Miscelare i seguenti reattivi:

Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 μm (4.6) e degassarla (ad esempio, sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni).

Robenidina pura: 1,3 -bis [(4-clorobenziliden) amino] guanidina cloridrato.

Pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 30 mg di robenidina standard (3.9). Sciogliere con metanolo acidificato (3.2) in un matraccio tarato da 100 ml, portare a volume con lo stesso solvente e agitare. Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservarlo al buio.

Travasare 10,0 ml della soluzione madre standard (3.9.1) in un matraccio tarato da 250 ml, portare a volume con la fase mobile (3.8) e agitare. Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservarlo al buio.

In una serie di matracci tarati da 50 ml travasare 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 e 25,0 ml della soluzione standard intermedia (3.9.2). Portare a volume con la fase mobile (3.8) e agitare. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 1,2 , 2,4 , 3,6 , 4,8 e 6,0 μg/ml di robenidina. Devono essere preparate al momento, poco prima dell'uso.

4.   Apparecchiatura

Colonna realizzata in vetro ambra, dotata di rubinetto e serbatoio di circa 150 ml di capacità, diametro interno 10-15 mm, lunghezza 250 mm.