02002D0657 — IT — 10.06.2021 — 003.001

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DECISIONE DELLA COMMISSIONE

►C1  del 14 agosto 2002 ◄

che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all'interpretazione dei risultati

[notificata con il numero C(2002) 3044]

(Testo rilevante ai fini del SEE)

(2002/657/CE)

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2.   CRITERI DI RENDIMENTO E ALTRE PRESCRIZIONI PER I METODI ANALITICI

È possibile utilizzare i metodi analitici o le combinazioni di metodi diversi da quelli descritti in seguito ai fini di screening o di conferma solo se è possibile provare che essi rispettano le prescrizioni pertinenti stabilite nella presente decisione.

2.1.   PRESCRIZIONI GENERALI

2.1.1.   Manipolazione dei campioni

I campioni sono ottenuti, manipolati e trattati in modo tale che esista la massima possibilità di rilevare la sostanza. Le procedure per la manipolazione del campione escludono la possibilità di contaminazione o perdita accidentale di analiti.

2.1.2.   Esecuzione delle prove

2.1.2.1.   Recupero

Se viene impiegato un fattore fisso di correzione del recupero, il recupero deve essere determinato durante l'analisi dei campioni per ciascun lotto di campioni. Se il recupero è entro i limiti potrà essere impiegato il fattore di correzione fisso; in caso contrario si impiega il fattore di recupero ottenuto per quel lotto specifico, ameno che non si debba applicare il fattore di recupero specifico dell'analita nel campione, nel qual caso è utilizzato il metodo di addizione standard (vedere 3.5) o uno standard interno per la determinazione quantitativa di un analita in un campione.

2.1.2.2.   Specificità

In condizioni sperimentali un metodo è in grado di distinguere tra l'analita e le altre sostanze. Deve essere fornita una stima della misura in cui ciò è possibile. Si devono adottare strategie per superare qualsiasi interferenza prevista con altre sostanze quando si utilizza la tecnica di misurazione descritta, ad esempio, prodotti omologhi, analoghi, prodotti metabolici del residuo in questione. È di fondamentale importanza studiare l'interferenza che potrebbe scaturire da componenti della matrice.

2.2.   METODI DI SCREENING

In ottemperanza alla direttiva 96/23/CE, sono utilizzate per finalità di screening solo quelle tecniche analitiche la cui validazione può essere dimostrata in modo documentato e rintracciabile e che hanno un tasso di falsi conformi inferiore al 5 % (errore β) al livello di interesse. Nel caso di un sospetto risultato non conforme, tale risultato è confermato per mezzo di un metodo di conferma

2.3.   METODI DI CONFERMA PER RESIDUI E CONTAMINANTI ORGANICI

I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici forniscono informazioni sulla struttura chimica dell'analita. Di conseguenza, i metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi. Tuttavia, se una singola tecnica non dispone di sufficiente specificità, laspecificità desideratadeve essere ottenutaper mezzo di procedure analitiche consistenti in combinazioni adeguate di raffinazione, separazione cromatografica e rilevazione spettrometrica.

I metodi o le combinazioni di metodi che seguono sono considerati adeguati per l'individuazione di residui o contaminanti organici per i gruppi di sostanze indicati:

2.3.1.   Criteri di rendimento comuni e prescrizioni

I metodi di confermaforniscono informazioni sullastrutturachimica dell'analita. Il metodo non è in grado di discriminare tra composti che forniscono la stessa risposta. I metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi

Ove impiegato nel metodo, all'inizio della procedura di estrazione si aggiunge all'aliquota da analizzare uno standard interno adeguato. A seconda della disponibilità, sono impiegate forme stabili dell'analita marcate con isotopi, che sono particolarmente indicate per la rilevazione con la spettrometria di massa, oppure composti correlati in modo strutturale all'analita.

Ove non sia possibile impiegare alcuno standard interno adeguato, l'identificazione dell'analita è confermata dalla co-cromatografia. In tal caso si ottiene un solo picco, dato che l'altezza (o l'area) del picco ingrandito è equivalente alla quantità di analita aggiunto. Con la gascromatografia (GC) o la cromatografia liquida (LC), la larghezza del picco a metà dell'altezza massima si trova entro il 90-110 % della larghezza originale e i tempi di ritenzione devono essere identici entro un margine del 5 %. Per i metodi basati sulla cromatografia su strato sottile (TLC) si intensifica solo il punto che si presume sia dovuto all'analita; non compare un nuovo punto e l'aspetto visivo non cambia.

Il materiale di riferimento o fortificato contenente quantità note di analita, al limite consentito o al limite di decisione, o in prossimità di tali limiti (campione di controllo non conforme), nonché i materiali di controllo conformi e i reagenti bianchi sono di preferenza utilizzati simultaneamente durante l'intera procedura con ciascun lotto di campioni da analizzare. L'ordine per l'inserimento degli estratti nello strumento di analisi è il seguente: reagente bianco, campione di controllo conforme, campione/i sottoposto/i a conferma, ancora campione di controllo conforme e, da ultimo, campione di controllo non conforme. È giustificata qualsiasi variazione rispetto a tale sequenza.

2.3.2   Criteri di rendimento aggiuntivi e altre prescrizioni per i metodi di analisi quantitativi

2.3.2.1.   Esattezza dei metodi quantitativi

Nel caso di analisi ripetute di un materiale di riferimento certificato, gli intervalli di riferimento per la deviazione della frazione di massa media determinata per via sperimentale e corretta per il recupero dal valore certificato sono i seguenti:

Quando tali MRC non sono disponibili, si accetta che l'esattezza delle misure sia valutata per mezzo del recupero di aggiunte di quantità note dell'analita, o degli analiti, ad una matrice bianca. I dati corretti con il recupero medio sono accettabili solo se rientrano negli intervalli riportati nella tabella 2

2.3.2.2.   Precisione dei metodi quantitativi

Il coefficiente di variazione (CV) inter-laboratorio per l'analisi ripetuta di un materiale di riferimento o fortificato, in condizioni di riproducibilità non supera il livello calcolato per mezzo dell'equazione di Horwitz. L'equazione è la seguente:

dove C è la frazione di massa espressa come potenza (esponente) di 10 (ad esempio, 1 mg/g = 10-3). Nella tabella 3 sono riportati degli esempi.

Per le analisi eseguite in condizioni di ripetibilità, il CV intra-laboratorio sarà compreso in genere tra la metà e i due terzi dei valori riportati in precedenza. Per le analisi eseguite in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio, il CV intra-laboratorio non supera il CV di riproducibilità.

Nel caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito, il metodo consegue una riproducibilità intra-laboratorio non superiore al corrispondente CV di riproducibilità ad una concentrazione di 0,5 × il limite consentito.

2.3.3.   Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la rilevazione per mezzo della spettrometria di massa

I metodi di spettrometria di massa possono essere presi in considerazione come metodi di conferma solo previa separazione cromatografica on-line o off-line.

2.3.3.1   Separazione cromatografica

Per le procedure GC-MS la separazione gas-cromatografica deve essere eseguita utilizzando colonne capillari. Per le procedure LC-MS la separazione cromatografica è eseguita utilizzando colonne LC adeguate. In ogni caso, il tempo di ritenzione minimo accettabile per l'analita sotto esame è pari al doppio del tempo di ritenzione corrispondente al volume vuoto dellacolonna. Il tempo di ritenzione (o tempo di ritenzione relativo) dell'analita nell'aliquota da analizzare corrisponde a quello dello standard di calibrazione entro una finestra del tempo di ritenzione specificata. La finestra del tempo di ritenzione deve essere commisurata al potere di risoluzione del sistema cromatografico. Il rapporto tra il tempo di ritenzione cromatografica dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'analita, corrisponde a quello della soluzione di calibrazione con una tolleranzadi 0,5 % per laGC e 2,5 % per laLC.

2.3.3.2   Rilevazione con tecniche di spettrometria di massa

La rilevazione con tecniche di spettrometria di massa è eseguita utilizzando tecniche MS quale la registrazione degli spettri della massa completi (scansioni complete) oppure la SIM (Selected Ion Monitoring), nonché tecniche MS-MS quali la SRM (Selected Reaction Monitoring), o altre tecniche MS o MS-MS in combinazione con modalità di ionizzazione appropriate. Nella spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) la risoluzione (R) è in genere superiore a 10 000 per l'intero intervallo di massa al 10 % della valle.

Scansione totale: quando la determinazione con tecniche di spettrometria di massa viene eseguita registrando gli spettri a scansione totale, è obbligatoria la presenza di tutti gli ioni diagnostici misurati (lo ione molecolare, addotti caratteristici dello ione molecolare, ioni frammentati caratteristici e gli ioni isotopi), con un'intensità relativa di oltre il 10 % nello spettro di riferimento dello standard di calibrazione.

SIM: quando la determinazione per mezzo della spettrometria di massa è eseguita con tecniche di frammentografia, è preferibile che lo ione molecolare sia uno degli ioni diagnostici selezionati (lo ione molecolare, addotti caratteristici dello ione molecolare, ioni frammentati caratteristici e tutti i loro ioni isotopi). Gli ioni diagnostici selezionati non devono avere origine esclusivamente dalla stessa parte della molecola. Il rapporto segnale-rumore per ciascuno ione diagnostico è ≥ 3:1.

Scansione totale e SIM: le intensità relative degli ioni rilevati, espresse come percentuale dell'intensità dello ione o della transizione più intensa, corrispondono a quelle dello standard di calibrazione, provenienti da soluzioni dello standard di calibrazione o da campioni drogati, a concentrazioni paragonabili, misurate nelle stesse condizioni, entro le seguenti tolleranze:

Interpretazione dei dati della spettrometria di massa: le intensità relative degli ioni diagnostici e/o delle coppie di ioni precursore/prodotto devono essere identificate confrontando gli spettri oppure integrando i segnali delle singole tracce della massa. Ogni volta che si applica la correzione del fondo (background), questa è applicata in modo uniforme nell'intero lotto (Cfr. 2.3.1, paragrafo 4) ed è chiaramente indicata.

Scansione completa: quando si registrano spettri a scansione totale in una singola spettrometria di massa, sono presenti almeno quattro ioni con un'intensità pari o superiore al 10 % del picco di base. Se presente nello spettro di riferimento con un'intensità relativa pari o superiore al 10 %, lo ione molecolare è incluso. Almeno quattro ioni si trovano entro le tolleranze massime consentite per le intensità relative degli ioni (tabella 5). È possibile eseguire ricerche computerizzate all'interno della libreria. In tal caso, il raffronto dei dati provenienti dalla spettrometria di massa sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di calibrazione superano un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in seguito. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.

SIM: quando i frammenti di massa sono misurati utilizzando tecniche diverse dalla scansione totale, per interpretare i dati sarà utilizzato un sistema di punti di identificazione. Per la conferma delle sostanze elencate nel gruppo A dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE sono richiesti almeno quattro punti di identificazione. Per la conferma delle sostanze elencate nel gruppo B dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE, sono richiesti almeno tre punti di identificazione. Nella tabella sottostante è riportato il numero di punti di identificazione che ciascuna tecnica di spettrometria di massa di base può ottenere. Tuttavia, per poter ricevere i punti di identificazione richiesti per la conferma ed il totale dei punti di identificazione da calcolare:

2.3.4.   Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la cromatografia accoppiata alla rilevazione con tecniche agli infrarossi

Picchi adeguati: i picchi adeguati sono i massimi di assorbimento di uno standard di calibrazione nello spettro dell'infrarosso che rispettano i requisiti che seguono.

2.3.4.1.   Rilevazione all'infrarosso

Assorbimento massimo: avviene su un numero d'onda compreso tra 4 000 e 500 cm-1.

Intensità dell'assorbimento: non è inferiore a

quando entrambe sono misurate rispetto all'assorbanza zero, e 5 % dell'assorbanza del picco più intenso nell'intervallo 4 000-500 cm-1 quando entrambe sono misurate rispetto alla linea base del picco.

Nota:

sebbene picchi adeguati in base al punto a) possano essere preferibili da un punto di vista teorico, quelli calcolati in base al punto b) risultano di più facile determinazione.

Viene determinato il numero di picchi nello spettro infrarosso dell'analita le cui frequenze corrispondono ad un picco adeguato nello spettro dello standard di calibrazione, entro un margine di ± 1 cm-1.

2.3.4.2.   Interpretazione dei dati dello spettro all'infrarosso

L'assorbimento è presente in tutte le regioni dello spettro dell'analita al quale corrisponde un picco sufficiente nello spettro di riferimento dello standard di calibrazione. Sono richiesti almeno sei picchi sufficienti nello spettro infrarosso dello standard di calibrazione. Se sono presenti meno di sei picchi adeguati (7) lo spettro risultante non può essere utilizzato come spettro di riferimento. Il «punteggio», vale a dire la percentuale di picchi sufficienti trovati nello spettro infrarosso dell'analita, deve essere almeno 50. Quando non esiste una corrispondenza precisa per un picco sufficiente, la regione pertinente dello spettro dell'analita è coerente con la presenza di un picco corrispondente. La procedura si applica solo ai picchi di assorbimento nello stesso spettro del campione con un intensità almeno tripla rispetto al rumore tra un picco ed il successivo.

2.3.5.   Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la determinazione di un analita utilizzando la LC con altre tecniche di rilevazione

2.3.5.1.   Separazione cromatografica

Se è disponibile un materiale adeguato a tale fine si utilizza uno standard interno. È preferibilmente uno standard correlato con un tempo di ritenzione prossimo a quello dell'analita. L'analita eluisce al tempo di ritenzione tipico per lo standard di calibrazione corrispondente alle stesse condizioni sperimentali. Il tempo di ritenzione minimo accettabile per un analita è pari a due volte il tempo di ritenzione corrispondente al volume vuoto della colonna. Il rapporto tra il tempo di ritenzione dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'analita, è identico a quello dello standard di calibrazione nella matrice appropriata, con un margine di ± 2,5 %.

2.3.5.2.   Rilevazione UV/VIS a scansione totale

Devono essere rispettati i criteri di rendimento per i metodi LC.

I massimi di assorbimento nello spettro dell'analita avvengono alle stesse lunghezze d'onda di quelli dello standard di calibrazione entro un margine determinato dalla risoluzione del sistema di rilevazione. Per la rilevazione a schiera di diodi (diode array) tale margine è in genere di ± 2 nm. Al di sopra dei 220 nm lo spettro dell'analita non è visivamente differente dallo spettro dello standard di calibrazione per le parti dei due spettri aventi un'assorbanza relativa pari o superiore al 10 %. Tale criterio è rispettato, in primo luogo, quando sono presenti gli stessi massimi e, in secondo luogo, quando la differenza osservata tra i due spettri non è superiore, in alcun punto, al 10 % dell'assorbanza dello standard di calibrazione. Nel caso di ricerche computerizzate all'interno della libreria, il raffronto dei dati provenienti dalla spettrometria sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di calibrazione supera un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in precedenza. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.

2.3.5.3.   Criteri di rendimento per la rilevazione fluorimetrica

Devono essere rispettati i criteri di rendimento per i metodi LC.

Ciò si applica alle molecole che presentano una fluorescenza nativa e alle molecole che presentano fluorescenza dopo trasformazione o derivazione. La scelta delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione combinate alle condizioni cromatografiche è compiuta in modo tale da ridurre al minimo l'insorgenza di componenti interferenti negli estratti dei campioni bianchi.

Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al 10 % dell'altezza massima del picco dell'analita.

2.3.5.4.   Criteri di rendimento per la determinazione di un analita per mezzo di un immunogramma LC

Un immunogramma LC non può essere utilizzato autonomamente come metodo di conferma.

Devono essere rispettati i criteri pertinenti per i metodi LC.

I parametri predefiniti per il controllo della qualità, vale a dire il legame non specifico, il legame relativo dei campioni di controllo, il valore di assorbanza del bianco, devono ricadere entro i limiti ottenuti durante la validazione del campione da analizzare.

L'immunogramma deve essere costituito da almeno cinque frazioni.

Ciascuna frazione è inferiore alla metà della larghezza del picco.

La frazione con il massimo contenuto di analita deve essere identica a quella per il campione sospetto, il campione di controllo non conforme e lo standard.

2.3.5.5.   Determinazione di un analita utilizzando la LC con rilevazione UV/VIS (lunghezza d'onda singola)

La LC con rilevazione UV/VIS (lunghezza d'onda singola) non è adeguata per essere impiegata autonomamente come metodo di conferma.

Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al 10 % dell'altezza massima del picco dell'analita.

2.3.6.   Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la determinazione di un analita per mezzo della TLC bidimensionale accoppiata alla rilevazione UV/VIS spettrometrica a scansione completa

La HPTLC bidimensionale e la co-cromatografia sono obbligatorie

I valori RF dell'analita corrispondono ai valori RF degli standard entro una tolleranza di ±5 %.

L'aspetto visivo dell'analita è indistinguibile da quello dello standard.

Per punti dello stesso colore, il centro del punto più vicino è separato dal centro del punto dell'analita di almeno la metà della somma del diametro dei punti.

Lo spettro dell'analita non è visivamente differente dallo spettro dello standard, come descritto per la rilevazione UV/VIS a scansione completa.

Nel caso di ricerche computerizzate all'interno della libreria, il raffronto dei dati provenienti dalla spettrometria sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di calibrazione supera un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in precedenza. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.

2.3.7.   Criteri di rendimento e prescrizioni per la determinazione di un analita per mezzo della GC in combinazione con l'ECD (electron capture detection, rilevazione con cattura degli elettroni)

Se è disponibile un materiale adeguato a tale fine si utilizza uno standard interno. Questo è preferibilmente una sostanza correlata con un tempo di ritenzione prossimo a quello dell'analita. L'analita eluisce al tempo di ritenzione tipico per lo standard di calibrazione corrispondente alle stesse condizioni sperimentali. Il rapporto tra il tempo di ritenzione dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'analita, è identico a quello dello standard di calibrazione nella matrice appropriata, con un margine dello 0,5 %. Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al 10 % dell'altezza massima del picco dell'analita. Per ottenere ulteriori informazioni si potrà ricorrere alla co-cromatografia.

2.4.   METODI DI CONFERMA PER GLI ELEMENTI

Le analisi di conferma per gli elementi chimici si basano sul concetto di identificazione inequivocabile e quantificazione accurata e precisa per mezzo delle proprietà fisico-chimiche uniche dell'elemento chimico studiato (ad esempio, lunghezza d'onda della radiazione emessa o assorbita caratteristica dell'elemento, massa atomica) al livello d'interesse.

I metodi o le combinazioni di metodi che seguono sono considerati adeguati per l'identificazione degli elementi chimici:

2.4.1.   Criteri di rendimento comuni e altre prescrizioni per i metodi di conferma

Il materiale di riferimento o fortificato contenente quantità note di analita, al limite massimo consentito o al limite di decisione (campione di controllo non conforme), nonché i materiali di controllo conformi e i reagenti bianchi devono di preferenza essere utilizzati simultaneamente durante l'intera procedura con ciascun lotto di campioni da analizzare. L'ordine raccomandato per l'inserimento degli estratti nello strumento di analisi è il seguente: reagente bianco, campione di controllo conforme, campione/i da confermare, campione di controllo conforme e, da ultimo, campione di controllo non conforme. Viene giustificato qualsiasi scostamento.

In genere la maggior parte delle tecniche di analisi richiede la completa digestione della matrice organica per ottenere soluzioni prima della determinazione dell'analita. Ciò può essere ottenuto utilizzando procedure di mineralizzazione a microonde che riducono al minimo il rischio di perdita e/o contaminazione degli analiti da analizzare. Sono utilizzati contenitori in Teflon decontaminati di buona qualità. Se si ricorre ad altri metodi di digestione a secco o con presenza di liquido, sono disponibili prove documentate che escludano potenziali fenomeni di perdita o di contaminazione. In talune circostanze, quale alternativa alla digestione, per separare gli analiti dai componenti della matrice e/o concentrare gli analiti al fine di introdurre i campioni nello strumento di analisi si potranno scegliere procedure di separazione (ad esempio, estrazione).

Per quanto riguarda la calibrazione, sia esterna che basata sul metodo di aggiunta dello standard, si presta attenzione a non superare l'intervallo di lavoro definito per l'analisi. Nel caso di calibrazione esterna, gli standard calibranti devono obbligatoriamente essere preparati in una soluzione che corrisponda il più possibile alla composizione della soluzione campione. Si applica inoltre la correzione del fondo se richiesto dalla circostanza analitica specifica.

2.4.2.   Criteri di rendimento aggiuntivi e altre prescrizioni per i metodi di analisi quantitativi

2.4.2.1.   Esattezza dei metodi quantitativi

Nel caso di analisi ripetute degli elementi di un materiale di riferimento certificato, la deviazione del contenuto medio determinato per via sperimentale dal valore certificato non ricade al di fuori del limite di ± 10 %. Quando tali MRC non sono disponibili, si accetta che l'esattezza delle misure venga valutata per mezzo del recupero di aggiunte di quantità note dell'elemento a campioni non conosciuti. Si attira l'attenzione sul fatto che, a differenza dell'analita, l'elemento aggiunto non è legato chimicamente nella vera matrice e che, pertanto, i risultati ottenuti con questa impostazione hanno validità inferiore a quelli ottenuti con l'uso degli MRC. I dati del recupero sono accettabili solo quando si trovano entro ± 10 % dal valore bersaglio.

2.4.2.2.   Precisione dei metodi quantitativi

Nel caso di analisi ripetute di un campione eseguite in condizioni di riproducibilità in laboratorio, il coefficiente di variazione (CV) intra-laboratorio della media non supera i seguenti valori:

2.4.3.   Prescrizioni specifiche per la DPASV (Differential Pulse Anodic Stripping Voltametry)

La completa distruzione della materia organica nei campioni prima delle analisi DPASV ha un'importanza assoluta. Nei voltamogrammi non sono visibili segnali ampi dovuti alla presenza di materiali organici. I costituenti della matrice inorganica possono influenzare le altezze dei picchi nella DPASV. La quantificazione è pertanto eseguita attraverso il metodo delle aggiunte di standard. Con il metodo sono forniti campioni di voltamogrammi tipici di una soluzione campione.

2.4.4.   Prescrizioni specifiche per l'AAS (Atomic Absorption Spectrometry)

Si tratta fondamentalmente di una tecnica ad elemento singolo che richiede, pertanto, un'ottimizzazione delle regolazioni sperimentali a seconda dell'elemento specifico da quantificare. Ogniqualvolta ciò sia possibile i risultati sono verificati qualitativamente e quantitativamente ricorrendo a linee di assorbimento alternative (idealmente, sono selezionate due linee differenti). Gli standard di calibrazione sono preparati in una matrice di soluzione che corrisponda il più possibile a quella della soluzione del campione da analizzare (ad esempio, concentrazione degli acidi o composizione dell'agente modificatore). Per ridurre al minimo i valori dei bianchi, tutti i reagenti sono della più elevata purezza disponibile. A seconda della modalità scelta per vaporizzare e/o atomizzare i campioni è possibile distinguere vari tipi di AAS.

2.4.4.1.   Prescrizioni specifiche per l'AAS con fiamma

Le regolazioni per gli strumenti sono ottimizzate per ciascun elemento. In particolare sono verificate le velocità di flusso e la composizione del gas. Per evitare interferenze provocate dall'assorbimento nel fondo, è impiegato un correttore di sorgente continuo. Nel caso di matrici sconosciute, si verifica se la correzione del fondo è richiesta o meno.

2.4.4.2.   Prescrizioni specifiche per l'AAS con fornace a grafite

Quando si lavora a livelli di tracce estremamente ridotte nella fornace a grafite la contaminazione in laboratorio spesso inficia l'accuratezza. Per la manipolazione del campione e dello standard si utilizzano pertanto reagenti ad elevata purezza, acqua deionizzata e oggetti in plastica inerte. Le regolazioni per gli strumenti sono ottimizzate per ciascun elemento. In particolare, occorre verificare le condizioni di pretrattamento e atomizzazione (temperatura, tempo) nonché le modifiche alla matrice.

Lavorando in condizioni di atomizzazione isotermica (ad esempio, tubo trasversale in grafite riscaldato con piattaforma Lvov integrata) (8) si ridurrà l'influenza della matrice sull'atomizzazione dell'analita. Oltre alla modifica della matrice e alla correzione Zeeman (9) del fondo è consentita la quantificazione per mezzo di una curva di calibrazione basata sulla misurazione di soluzioni standard acquose.

2.4.5.   Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'assorbimento atomico con generazione di idruri

I composti organici che contengono elementi quali arsenico, bismuto, germanio, piombo, antimonio, selenio, stagno e tellurio possono risultare estremamente stabili e possono richiedere una decomposizione ossidante per ottenere risultati corretti per il contenuto totale degli elementi. Si consiglia pertanto la digestione a microonde oppure l'incinerazione ad alta pressione in condizioni fortemente ossidanti. La massima cura è prestata alla conversione completa e riproducibile degli elementi nei loro idruri corrispondenti.

La formazione di idruro di arsenico in soluzione di acido cloridrico con NaBH4 dipende dalla stato di ossidazione dell'arsenico (As III: formazione rapida, As V: periodo di formazione più lungo). Per evitare una perdita di sensibilità per la determinazione di As V con tecniche di iniezione del flusso, provocate dal breve tempo di reazione in questo sistema, As V deve essere ridotto ad As III dopo la decomposizione ossidante. Lo ioduro di potassio/acido ascorbico o la cisteina sono adeguati a tale fine. I bianchi, le soluzioni di calibrazione e le soluzioni campione sono trattate nello stesso modo. L'utilizzo di un sistema a lotti consente di determinare entrambe le specie di arsenico senza compromettere l'accuratezza. A causa della formazione ritardata dell'idruro As V, la calibrazione è eseguita attraverso l'integrazione dell'area di picco. Sono ottimizzate le impostazioni per gli strumenti; il flusso del gas, che trasferisce l'idruro all'atomizzatore, è particolarmente importante e viene verificato.

2.4.6.   Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'assorbimento atomico con vapore freddo

Il vapore freddo è utilizzato solo in caso di mercurio. A causa della volatilizzazione e delle perdite di adsorbimento del mercurio elementare, si deve prestare particolare attenzione durante l'intera analisi. Si deve fare attenzione ad evitare la contaminazione da parte dei reagenti o dell'ambiente.

I composti organici che contengono mercurio richiedono una decomposizione ossidante per ottenere risultati corretti per il contenuto totale di mercurio. Per la decomposizione devono essere impiegati sistemi sigillati con digestione a microonde o incineratori ad alta pressione. Particolare cura è prestata alla pulitura delle apparecchiature venute a contatto con il mercurio.

L'utilizzo della tecnica di iniezione del flusso presenta alcuni vantaggi. Per i limiti di decisione inferiori si raccomanda l'adsorbimento del mercurio elementare su un adsorbitore in oro/platino seguito da desorbimento termico. Il contatto tra l'adsorbitore o la cella e l'umidità compromette la misurazione ed è evitato.

2.4.7.   Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'emissione atomica con plasma induttivo (ICP-AES)

La spettrometria dell'emissione atomica con plasma induttivo (10) è un metodo multi-elemento che consente la misurazione simultanea di più elementi. Per utilizzare l'ICP-AES, i campioni devono essere innanzitutto digeriti per decomporre le matrici organiche. Sono utilizzati sistemi sigillati con digestione a microonde oppure l'incinerazione ad alta pressione. La calibrazione degli strumenti e la scelta dell'elemento o della lunghezza d'onda svolgono un ruolo essenziale in un'analisi ICP-AES significativa. Per la calibrazione degli strumenti, nel caso di curve di calibrazione lineari, è in genere necessario misurare soluzioni di calibrazione di quattro sole concentrazioni, in quanto le curve di calibrazione dell'ICP-AES sono in genere lineari su quattro-sei ordini di grandezza di concentrazione. La calibrazione del sistema ICP-AES è eseguita, in genere, con uno standard multi-elemento a sua volta preparato in una soluzione che contiene la stessa concentrazione di acido della soluzione di misurazione. Si verificano le concentrazioni degli elementi per la curva lineare.

La scelta delle lunghezze d'onda per la misura delle emissioni da parte degli analiti è adeguata alle concentrazioni degli elementi da determinare. Quando la concentrazione dell'analita ricade all'esterno dell'intervallo operativo di una linea di emissione si impiega una linea di emissione differente. Si sceglie innanzitutto la linea di emissione più sensibile (senza interferenze) e successivamente una linea meno sensibile. Quando si lavora in prossimità o al limite di rilevazione, la scelta migliore è rappresentata dalla linea più sensibile per il rispettivo analita. Le principali difficoltà nella ICP-AES sono provocate dalle interferenze dello spettro e del fondo. Le possibili interferenze sono, ad esempio, lo spostamento semplice del fondo (simple background shift), lo spostamento inclinato del fondo (sloping background shift), la sovrapposizione diretta degli spettri e lo spostamento complesso del fondo (complex background shift). Ciascuna di queste interferenze ha cause e rimedi specifici. A seconda delle matrici, si applicano correzioni alle interferenze e si devono ottimizzare i parametri operativi. Alcune interferenze possono essere evitate per mezzo della diluizione o adattando le matrici. Il materiale di riferimento e fortificato contenente quantità note dell'analita (o degli analiti), nonché il materiale bianco, è trattato in modo identico ai campioni da analizzare con ogni lotto di campioni analizzati. Se l'analisi è volta a riscontrare una deviazione, lo standard è verificato, ad esempio, dopo dieci campioni, Tutti i reagenti e il gas plasma sono della massima purezza disponibile.

2.4.8.   Prescrizioni specifiche per la spettrometria di massa ad accoppiamento induttivo (ICP-MS) (11)

La determinazione di elementi di massa atomica media presenti in tracce, quali cromo, rame e nichel può essere soggetta a forti interferenze da parte di altri ioni isobarici e poliatomici. È possibile superare tali interferenze solo se è disponibile una potenza di risoluzione pari ad almeno 7 000-8 000. Le difficoltà collegate alle tecniche di MS comprendono la deviazione strumentale, gli effetti della matrice e l'interferenza degli ioni molecolari (m/z<80). Per correggere la deviazione degli strumenti e gli effetti della matrice è richiesta una standardizzazione interna multipla che copra lo stesso intervallo di massa degli elementi da determinare.

Prima delle misurazioni per mezzo della ICP-MS è richiesta la completa decomposizione della materia organica nei campioni. Come avviene per l'AAS, dopo la digestione in recipienti sigillati gli elementi volatili, ad esempio lo iodio, devono essere trasferiti ad uno stato di ossidazione stabile. Le combinazioni di ioni molecolari di argon (gas di plasma), idrogeno, carbonio, azoto ed ossigeno (acidi di dissoluzione, impurità del gas di plasma e gas atmosferici catturati) e la matrice del campione provocano interferenze particolarmente forti. Per evitare interferenze sono necessarie la digestione completa, le misurazioni del fondo, la scelta appropriata delle masse da analizzare, talvolta associata a una scarsa abbondanza (limite di rilevazione più basso) e degli acidi di dissoluzione, ad esempio l'acido nitrico.

Per gli elementi da determinare, le interferenze devono essere escluse dalla scelta appropriata di masse analitiche specifiche, compresa la conferma delle proporzioni di isotopi. Per ciascuna misurazione si verifica la risposta strumentale prendendo in considerazione fattori Fano, attraverso l'impiego di standard interni.

3.   VALIDAZIONE

La validazione dimostra che il metodo analitico è conforme ai criteri applicabili per le caratteristiche di rendimento pertinenti.

Finalità di controllo differenti richiedono categorie di metodi differenti. Nella tabella che segue sono illustrate le caratteristiche di rendimento da verificare per ogni tipi di metodo.

3.1.   PROCEDURE DI VALIDAZIONE

Nel presente capitolo sono illustrati esempi e/o riferimenti per le procedure di validazione dei metodi analitici. Per dimostrare che il metodo analitico è conforme ai criteri di rendimento per le caratteristiche di rendimento possono essere utilizzati altri approcci, a patto che forniscano informazioni di pari livello e qualità.

La validazione può inoltre essere eseguita attraverso uno studio inter-laboratorio, quali quelli istituiti dal Codex Alimentarius, dall'ISO o dall'IUPAC (12) oppure in base a metodi alternativi, quali studi condotti in singoli laboratori o attraverso la validazione interna (13)(14). In questa parte ci si concentra sugli studi condotti in singoli laboratori (o validazione interna) utilizzando una strategia modulare. Questo approccio prevede:

3.1.1.   Caratteristiche di rendimento indipendenti dal modello

Le caratteristiche di rendimento che seguono devono essere determinate a prescindere dall'approccio di validazione scelto. Per ridurre al minimo il carico di lavoro, per combinare gli esperimenti eseguiti per determinare parametri differenti potrà essere impiegato un approccio studiato con attenzione e valido dal punto di vista statistico.

3.1.1.1.   Specificità

Per i metodi analitici riveste importanza la capacità di discriminazione tra l'analita e sostanze strettamente correlate (isomeri, metaboliti, prodotti di degradazione, sostanze endogene, componenti della matrice, ecc.). Per verificare la presenza di interferenze sono necessari due approcci.

Si scelgono pertanto due sostanze potenzialmente in grado di interferirsi e si devono analizzare i campioni bianchi pertinenti per rilevare la presenza di possibili interferenze e valutarne gli effetti:

3.1.1.2.   Esattezza

Nel presente paragrafo si descrive la determinazione dell'esattezza (una componente dell'accuratezza) che può essere stabilita solo per mezzo di un materiale di riferimento certificato (MRC). Un MRC deve essere utilizzato ogniqualvolta sia disponibile. La procedura è descritta dettagliatamente nella ISO 5725-4 (5). Di seguito ne viene riportato un esempio:

Esattezza (%) = concentrazione media rilevata corretta per il recupero × 100/valore certificato.

Se non è disponibile alcun MRC, anziché l'esattezza, il recupero potrà essere determinato come descritto al paragrafo 4.1.2.1 in seguito.

3.1.1.3.   Robustezza/applicabilità (cambiamenti lievi)

Tali studi impiegano l'introduzione di lievi variazioni ragionevoli da parte del laboratorio e ne osservano le conseguenze.

Gli studi pre-investigativi devono essere svolti scegliendo fattori del pretrattamento, della pulitura e dell'analisi del campione che possono influenzare i risultati della misurazione. Tali fattori possono comprendere l'analista, l'origine e l'età dei reagenti, dei solventi degli standard e degli estratti del campione, la velocità di riscaldamento, la temperatura, il valore del pH, nonché numerosi altri eventi che possono verificarsi in laboratorio. Tali fattori devono essere modificati in un ordine di grandezza che corrisponde alle deviazioni riscontrate in genere nei laboratori.

L'idea basilare non è quella di studiare un cambiamento alla volta, ma di introdurre numerose variazioni contemporaneamente. Ad esempio, si presuma che A, B, C, D, E, F, G indichino i valori nominali di sette fattori differenti che possono influenzare i risultati se i loro valori nominali vengono variati leggermente. Si presuma che i valori alternativi siano indicati dalle lettere minuscole corrispondenti a, b, c, d, e, f, g. Ciò produce 2 (7) o 128 diverse possibili combinazioni.

È possibile scegliere un sottoinsieme di otto di queste combinazioni che presentano un equilibrio tra lettere maiuscole e minuscole (tabella 11). È necessario eseguire otto determinazioni che utilizzeranno una combinazione dei fattori scelti (A-G). I risultati delle determinazioni sono riportati nella tabella 11 come S-Z.

3.1.1.4.   Stabilità

È stato osservato che un'insufficiente stabilità dell'analita o dei costituenti della matrice nel campione durante la conservazione o l'analisi può dare luogo a deviazioni significative nel risultato finale dell'analisi. Si deve inoltre verificare la stabilità dello standard di calibrazione nella soluzione. La stabilità dell'analita è in genere ben caratterizzata in svariate condizioni di conservazione. Il monitoraggio della condizione di conservazione sarà parte del normale sistema di accreditamento del laboratorio. Di seguito vengono riportati esempi di come determinare la stabilità quando la condizione di conservazione non è nota.

Stabilità dell'analita in soluzione:

3.1.1.5.   Curve di calibrazione

Quando per la quantificazione vengono impiegate curve di calibrazione:

Ove sia necessaria una calibrazione seriale basata su una soluzione standard, si indicano gli intervalli accettabili per i parametri della curva di calibrazione che possono variare da serie a serie.

3.1.2.   Procedure di validazione convenzionali

Il calcolo dei parametri in base ai metodi convenzionali richiede l'esecuzione di svariati esperimenti singoli. Per ciascuna modifica importante si deve determinare la caratteristica di rendimento (cfr. il paragrafo «Robustezza/applicabilità», in precedenza). Per i metodi ad analita multiplo è possibile analizzare contemporaneamente svariati analiti, previa esclusione di possibili interferenze specifiche. In tal modo è possibile determinare svariate caratteristiche. Pertanto, per ridurre il carico di lavoro è consigliabile combinare per quanto possibile gli esperimenti (ad esempio, ripetibilità e riproducibilità intra-laboratorio con la specificità, analisi dei campioni bianchi per determinare il limite di decisione e test della specificità).

3.1.2.1.   Recupero

Se non esiste alcun MRC, il recupero deve essere determinato per mezzo di esperimenti che impiegano una matrice bianca fortificata ricorrendo, ad esempio, al seguente schema:

Questo metodo convenzionale per la determinazione del recupero è una variante del metodo di aggiunta dello standard descritto al punto 3.5, quando:

Ove non sia soddisfatta (o si presuma) di non soddisfare una qualsiasi delle condizioni elencate in precedenza, si deve eseguire la procedura completa per la determinazione del recupero per mezzo del metodo di aggiunta dello standard, come descritto al punto 3.5.

3.1.2.2.   Ripetibilità

3.1.2.3.   Riproducibilità intra-laboratorio

3.1.2.4.   Riproducibilità

Quando si deve verificare la riproducibilità, i laboratori devono partecipare a studi collaborativi in base alla ISO 5725-2 (5).

3.1.2.5.   Limite di decisione (CCα)

Il limite di decisione deve essere definito secondo i requisiti per l'identificazione o l'identificazione più la quantificazione in base alle definizioni contenute nella parte 2 «Criteri di rendimento e altre prescrizioni per i metodi analitici».

Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCα:

Nel caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCα:

Cfr. inoltre l'articolo 5 e il punto 3.2.

3.1.2.6.   Capacità di rilevazione (CCβ)

La capacità di rilevazione deve essere determinata in base alle prescrizioni per lo screening, l'identificazione o l'identificazione più la quantificazione come definite in precedenza (cfr. la parte 2).

Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCββ:

Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCβ:

Cfr. inoltre la sezione 3.2.

3.1.2.7.   Robustezza (cambiamenti significativi)

Il metodo analitico deve essere testato in condizioni sperimentali differenti che comprendono, ad esempio, specie differenti, matrici differenti o condizioni di campionatura differenti. I cambiamenti introdotti devono essere importanti. L'importanza di tali cambiamenti può essere valutata, ad esempio, utilizzando l'approccio di Youden (15) (16). Si deve determinare la caratteristica di rendimento per tutti i cambiamenti significativi che hanno dimostrato di avere un effetto significativo sul rendimento dell'analisi.

3.1.3.   Validazione in base a modelli alternativi

Ove si applichino procedure di validazione alternative, sono definiti nel protocollo di validazione il modello e la strategia di base con i rispettivi requisiti, ipotesi, e formule o si riportano almeno riferimenti circa la loro disponibilità. In seguito viene presentato un esempio di un approccio alternativo. Quando si applica, ad esempio, il modello di validazione interno, le caratteristiche di rendimento sono determinate in modo da consentire la validazione per cambiamenti significativi entro la stessa procedura di validazione. Ciò comporta la necessità di progettare un piano sperimentale per la validazione.

3.1.3.1.   Piano sperimentale

Un piano sperimentale deve essere progettato in base al numero delle varie specie e dei differenti fattori in corso di studio. Come primo passo dell'intera procedura di validazione si considerano pertanto le popolazioni campione che verranno analizzate in futuro in laboratorio al fine di selezionare le specie più importanti e quei fattori che potrebbero influenzare i risultati delle misurazioni. In seguito si sceglie l'intervallo di concentrazione in modo adeguato allo scopo in base al livello di interesse.

Dato che ciascun campione (ciascuna combinazione di livello di fattori) deve essere drogato con 4 concentrazioni differenti al livello di interesse e che è necessario analizzare un campione bianco per ciascun livello, per l'intero esperimento di validazione si devono eseguire 5 × 16 = 80.

Da questi 80 risultati delle misurazioni è possibile calcolare (13) (14):

Recupero:

Tali caratteristiche di rendimento consentono una valutazione esauriente del livello di rendimento del metodo, dato che viene studiato non solo l'effetto dei singoli fattori, ma anche le combinazioni pertinenti di tali fattori. Con l'aiuto di tale progetto sperimentale è possibile decidere se occorre escludere dalla curva di calibrazione complessiva questo o quel fattore selezionato, in quanto devia in modo significativo dalle deviazioni standard degli altri fattori.

3.1.3.2.   Curva di potenza

La curva di potenza fornisce informazioni sulla capacità di rilevazione del metodo entro l'intervallo di concentrazione scelto. Si riferisce al rischio di errore β quando si applica il metodo studiato. La curva di potenza consente di calcolare le capacità di rilevazione per le rispettive categorie (screening, conferma) o per i rispettivi tipi (qualitativo o quantitativo) di metodi per un determinato errore β (ad esempio, 5 %).

Figura 1:
Curva di potenza

Nella figura 1 è riportato un esempio della rappresentazione grafica della capacità di rilevazione (CCβ) di un metodo analitico. Questo particolare metodo ha il rischio residuo del 5 % di prendere una decisione falsa ad una concentrazione di 0,50 μg/kg. Ad una concentrazione di 0,55 μg/kg il rischio di prendere una decisione di falsa conformità scende all'1 %.

3.1.3.3.   Riproducibilità

La determinazione della riproducibilità di un metodo da parte degli studi di laboratorio singolo (validazione interna) richiede la partecipazione ripetuta a studi di competenza in base alle guide ISO 43-1(3) e 43-2(4). I laboratori hanno la facoltà di scegliere i propri metodi, a patto che tali metodi vengano impiegati in condizioni di routine. La deviazione standard del laboratorio può essere utilizzata per valutare la riproducibilità del metodo.

3.2.   RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEI DIVERSI LIMITI ANALITICI

Figura 2:
Sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito

Figura 3:
Sostanze con un limite consentito stabilito

3.3.   ESEMPIO DI CALCOLO DEL TEST DI ROBUSTEZZA PER CAMBIAMENTI LIEVI SECONDO L'APPROCCIO DI YOUDEN (16)

Deviazione standard delle differenze Di (SDi):

Quando la SDi è significativamente più grande della deviazione standard del metodo eseguito in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio (cfr. in precedenza), è inevitabile concludere che tutti i fattori insieme hanno un effetto sul risultato, anche se ciascun singolo fattore non mostra un'effetto significativo, e che il metodo non è sufficientemente robusto rispetto alle modifiche scelte.

3.4.   ESEMPI DI CALCOLI PER LA PROCEDURA DI VALIDAZIONE INTERNA

Esempi e calcoli per il protocollo di validazione interna come descritto per la validazione secondo modelli alternativi (3.1.3.) (13) (14).

3.5.   ESEMPI DI CALCOLI PER IL METODO DI AGGIUNTA DELLO STANDARD

Un campione da analizzare con un contenuto T dell'analita è diviso in due aliquote da analizzare 1 e 2, di massa m1 e m2 rispettivamente. L'aliquota 2 è drogata con un volume VA di una soluzione di concentrazione ρA dell'analita. Dopo le fasi di estrazione e purificazione del metodo vengono ottenuti due estratti delle aliquote aventi rispettivamente volume V1 e V2. Il recupero dell'analita deve essere rc. Entrambi gli estratti sono saggiati con un metodo di misurazione di sensibilità b e danno una risposta analitica, rispettivamente, di x1 e x2.

Se si presume che rc e b siano identici per l'analita nel campione nativo e nel campione addizionato, allora il contenuto T potrà essere calcolato come:

Tale metodo consentirà la determinazione del recupero rc. Quindi, in aggiunta all'analisi descritta in precedenza, parte dell'estratto dell'aliquota 1 (di volume V3) è drogata con una quantità nota ρB.VB dell'analita e saggiata a sua volta. La risposta analitica è x3 ed il recupero è:

È inoltre possibile calcolare la sensibilità b, come:

Sono state descritte tutte le condizioni di applicazioni e le informazioni dettagliate (18).

▼M3 —————

▼M1

ALLEGATO II

( 1 ) Componente finale: quella frazione di massa dell'analita contenuta nel campione che è presente nell'estratto finale.

( 2 ) Recupero (in questo contesto): quella frazione di massa dell'analita aggiunta al campione, che è presente nell'estratto finale. Nel resto del documento si presume che componente finale e recupero siano uguali e pertanto si impiegherà solo il termine «recupero».