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Commission Regulation (EU) 2016/266 of 7 December 2015 amending, for the purpose of its adaptation to technical progress, Regulation (EC) No 440/2008 laying down test methods pursuant to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) (Text with EEA relevance)
Regolamento (UE) 2016/266 della Commissione, del 7 dicembre 2015, recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (Testo rilevante ai fini del SEE)
Regolamento (UE) 2016/266 della Commissione, del 7 dicembre 2015, recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (Testo rilevante ai fini del SEE)
C/2015/8529
GU L 54 del 1.3.2016, p. 1–446
(BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)
recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH)
(Testo rilevante ai fini del SEE)
LA COMMISSIONE EUROPEA,
visto il trattato sul funzionamento dell'Unione europea,
visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un'Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l'articolo 13, paragrafo 2,
considerando quanto segue:
(1)
Il regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione (2) istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l'ecotossicità delle sostanze chimiche applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006.
(2)
È necessario aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi in via prioritaria nuovi e aggiornati metodi di prova adottati di recente dall'OCSE), per tener conto del progresso tecnico e ridurre il numero di animali usati a scopi di sperimentazione, conformemente alla direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio (3). Le parti interessate sono state consultate in merito alla proposta.
(3)
L'adeguamento contiene 20 metodi di prova, ossia un nuovo metodo per la determinazione di una proprietà fisico-chimica, undici nuovi metodi di prova e tre metodi di prova aggiornati per la valutazione dell'ecotossicità, e cinque nuovi metodi di prova per valutare il destino e il comportamento ambientale.
(4)
È opportuno pertanto modificare di conseguenza il regolamento (CE) n. 440/2008.
(5)
Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato di cui all'articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
Articolo 1
L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è modificato conformemente all'allegato del presente regolamento.
Articolo 2
Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.
(2) Regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione, del 30 maggio 2008, che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1).
(3) Direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33).
ALLEGATO
L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato:
(1)
È inserita una nota all'inizio dell'allegato, prima della parte A:
«Nota:
prima di utilizzare uno dei metodi di prova descritti di seguito per testare una sostanza multicostituente (MCS), una sostanza di composizione sconosciuta o variabile, il prodotto di una reazione complessa o di origine biologica (UVCB) o una miscela e qualora l'applicabilità del metodo di prova per le sostanze MCS, UVCB o le miscele non sia stata descritta nel rispettivo metodo di prova, è opportuno chiedersi se il metodo sia adeguato per fornire risultati scientificamente validi e pertinenti ai fini regolamentari previsti.
Se il metodo di prova è utilizzato per testare una sostanza MCS o UVCB o una miscela, è necessario rendere disponibili, nella misura del possibile, informazioni sufficienti sulla sua composizione, ad esempio tramite l'identità chimica dei costituenti, le loro proporzioni quantitative e le loro proprietà specifiche.»
(2)
È aggiunto il capitolo A.24:
«
A.24. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (N-OTTANOLO/ACQUA), METODO DELLA CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (HPLC)
INTRODUZIONE
Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE n. 117 (2004).
1.
Il coefficiente di ripartizione (P) è definito come il rapporto tra le concentrazioni all'equilibrio di una sostanza disciolta in un sistema a due fasi costituito da due solventi pressoché immiscibili. Nel caso del n-ottanolo e dell'acqua:
Il coefficiente di ripartizione è adimensionale poiché è il quoziente di due concentrazioni, e viene generalmente espresso sotto forma del suo logaritmo decimale.
2.
Pow è un parametro chiave negli studi sul destino ambientale delle sostanze chimiche. È stata dimostrata l'esistenza di una relazione altamente significativa tra il Pow delle sostanze in forma non ionizzata e il loro bioaccumulo nei pesci. È stato inoltre dimostrato che il Pow è un parametro utile nella previsione dell'assorbimento nel terreno e nei sedimenti, nonché per stabilire relazioni quantitative struttura-attività per un'ampia gamma di effetti biologici.
3.
La proposta originaria del presente metodo di prova si basava su un articolo di C.V. Eadsforth and P. Moser (1). Lo sviluppo del metodo di prova e l'esecuzione di una prova comparativa tra laboratori OCSE sono stati coordinati dall'Umweltbundesamt (Agenzia federale per l'ambiente) della Repubblica federale di Germania nel 1986 (2).
CONSIDERAZIONI INIZIALI
4.
I valori log Pow nell'intervallo da – 2 a 4 (talora fino a 5 e oltre) (1) possono essere determinati sperimentalmente utilizzando il metodo Shake-Flask (capitolo A.8 del presente allegato, linea guida dell'OCSE n. 107). Il metodo HPLC si applica per log Pow nell'intervallo da 0 a 6 (1)(2)(3)(4)(5). Questo metodo può richiedere una stima di Pow per l'assegnazione di sostanze di riferimento adeguate e l'avallo delle conclusioni tratte dai risultati della prova. I metodi di calcolo sono discussi brevemente nell'Appendice del presente metodo di prova. La modalità operativa del metodo HPLC è in isocratica.
5.
I valori di Pow dipendono dalle condizioni ambientali quali la temperatura, il pH, la forza ionica, ecc., queste dovrebbero essere definite nell'esperimento ai fini di una corretta interpretazione dei dati Pow. Per le sostanze ionizzabili potrebbe rendersi disponibile, ed essere utilizzato in alternativa, un altro metodo (ad esempio, il metodo pH-metrico per le sostanze ionizzate (6) descritto nel progetto di linea guida OCSE). Sebbene questo progetto di linea guida OCSE possa essere appropriato per determinare il Pow per tali sostanze ionizzabili, in alcuni casi è più opportuno utilizzare il metodo HPLC a un pH pertinente dal punto di vista ambientale (cfr. paragrafo 9).
PRINCIPIO DELLA PROVA
6.
Il metodo HPLC a fase inversa è condotto su colonne analitiche impaccate con una fase solida disponibile in commercio contenente idrocarburi a catena lunga (ad esempio C8, C18) chimicamente legati su silice.
7.
Una sostanza chimica iniettata su una colonna di questo tipo si riparte tra la fase mobile del solvente e la fase stazionaria idrocarburica man mano che viene trasportata lungo la colonna dalla fase mobile. Le sostanze sono ritenute in proporzione al loro coefficiente di ripartizione idrocarburo-acqua con le sostanze idrofile eluite per prime e quelle lipofile per ultime. Il tempo di ritenzione è descritto dal fattore di capacità k dato dalla seguente espressione:
dove tR è il tempo di ritenzione della sostanza in esame e t0 è il tempo morto, ossia il tempo medio necessario perché una molecola di solvente passi attraverso la colonna. Non sono richiesti metodi analitici quantitativi ed è necessaria solo la determinazione dei tempi di ritenzione.
8.
Il coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua di una sostanza in esame può essere calcolato sperimentalmente determinando il suo fattore di capacità k e quindi inserendo k nella seguente equazione:
dove
a, b
=
coefficienti di regressione lineare.
L'equazione riportata sopra può essere ottenuta mediante la regressione lineare del logaritmo dei coefficienti di ripartizione ottanolo/acqua delle sostanze di riferimento rispetto al logaritmo dei fattori di capacità delle sostanze di riferimento.
9.
Il metodo HPLC a fase inversa consente di ottenere la stima dei coefficienti di ripartizione nell'intervallo del log Pow compreso tra 0 e 6, ma tale intervallo può essere esteso in casi eccezionali tra 6 e 10. Ciò può richiedere la modifica della fase mobile (3). Il metodo non è applicabile a basi e acidi forti, complessi metallici, sostanze che reagiscono con l'eluente o tensioattivi. È possibile effettuare misurazioni sulle sostanze ionizzabili nella loro forma non ionizzata (acido libero o base libera) unicamente utilizzando un tampone appropriato con un pH inferiore al pKa per un acido libero o superiore al pKa per una base libera. Il metodo pH-metrico per l'esecuzione di prove sulle sostanze ionizzabili (6) potrebbe diventare disponibile ed essere utilizzato come metodo alternativo (6). Se il valore di log Pow è determinato ai fini della classificazione dei pericoli per l'ambiente o della valutazione del rischio ambientale, la prova va eseguita nell'intervallo di pH pertinente per l'ambiente naturale, ossia con un pH compreso tra 5 e 9.
10.
In alcuni casi la presenza di impurità può complicare l'interpretazione dei risultati a causa delle incertezze nell'assegnazione dei picchi. Per le miscele che risultano in una banda non risolta, si devono indicare i limiti superiore e inferiore di log Pow e l'area percentuale di ciascun picco di log Pow. Per le miscele costituite da un gruppo di omologhi, è necessario indicare anche la media ponderata del log Pow (7), calcolata sulla base dei singoli valori Pow e i corrispondenti valori percentuali dell'area di picco (8). Tutti i picchi che contribuiscono a un'area del 5 % o più dell'area totale di picco devono essere presi in considerazione nel calcolo (9):
La media ponderata del log Pow è valida solo per le sostanze o le miscele (ad esempio, il tallolio) costituite da omologhi (ad esempio, serie di alcani). Le misurazioni delle miscele possono restituire risultati significativi, a condizione che il rivelatore analitico utilizzato abbia la stessa sensibilità verso tutte le sostanze della miscela e che esse possano essere adeguatamente risolte.
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME
11.
La costante di dissociazione, la formula di struttura e la solubilità nella fase mobile devono essere note prima di utilizzare il metodo. Inoltre, sarebbe utile disporre delle informazioni sull'idrolisi.
CRITERI DI QUALITÀ
12.
Per aumentare l'affidabilità della misurazione, le determinazioni devono essere eseguite in duplicato.
—
Ripetibilità: il valore di log Pow ottenuto da miswurazioni ripetute effettuate nelle stesse condizioni e utilizzando lo stesso gruppo di sostanze di riferimento deve essere nell'intervallo di ± 0,1 unità logaritmiche.
—
Riproducibilità: se le misurazioni sono ripetute con un altro gruppo di sostanze di riferimento, i risultati possono differire. In genere, il coefficiente di correlazione R per la relazione tra log k e log Pow per un gruppo di sostanze in esame è di circa 0,9, valore corrispondente a un coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua del log Pow di ± 0,5 unità logaritmiche.
13.
La prova comparativa interlaboratorio ha mostrato che, con il metodo HPLC, i valori di log Pow possono essere ottenuti entro ± 0,5 unità dei valori ottenibili con il metodo Shake-Flask (2). In letteratura è possibile trovare altre comparazioni (4)(5)(10)(11)(12). I risultati più accurati si ottengono con grafici di correlazione basati su sostanze di riferimento aventi una struttura simile (13).
SOSTANZE DI RIFERIMENTO
14.
Al fine di correlare il fattore di capacità misurato k di una sostanza con il relativo Pow, è necessario tracciare un grafico di taratura utilizzando almeno 6 punti (cfr. paragrafo 24). E' compito dell'utilizzatore selezionare le sostanze di riferimento appropriate. Le sostanze di riferimento normalmente devono avere valori di log Pow comprendenti il log Pow della sostanza in esame; per esempio, almeno una sostanza di riferimento deve avere un Pow superiore a quello della sostanza in esame e un'altra sostanza di riferimento deve avere un Pow inferiore a quello della sostanza in esame. L'estrapolazione va utilizzata unicamente in casi eccezionali. È preferibile che tali sostanze di riferimento siano strutturalmente simili alla sostanza in esame. I valori di log Pow delle sostanze di riferimento utilizzati per la taratura devono essere basati su dati sperimentali attendibili. Tuttavia, per le sostanze con un log Pow elevato (generalmente superiore a 4), è possibile utilizzare valori calcolati, a meno che non si disponga di dati sperimentali attendibili. Se si utilizzano valori estrapolati, è necessario specificare un valore limite.
15.
Sono disponibili lunghi elenchi di valori di log Pow per molti gruppi di sostanze chimiche (14)(15). Se non sono disponibili dati sui coefficienti di ripartizione di sostanze strutturalmente simili, si può usare una taratura più generale basata su altre sostanze di riferimento. Nella tabella 1 sono elencate le sostanze di riferimento consigliate e i rispettivi valori di Pow. Per le sostanze ionizzabili, i valori forniti si applicano alla forma non ionizzata. L'attendibilità e la qualità dei valori sono state verificate durante la prova comparativa interlaboratorio.
Tabella 1
Sostanze di riferimento raccomandate
Numero CAS
Sostanza di riferimento
log Pow
pKa
1
78-93-3
2-butanone
(metiletilchetone)
0,3
2
1122-54-9
4-acetilpiridina
0,5
3
62-53-3
Anilina
0,9
4
103-84-4
Acetanilide
1,0
5
100-51-6
alcole benzilico
1,1
6
150-76-5
4-metossifenolo
1,3
pKa = 10,26
7
122-59-8
acido fenossiacetico
1,4
pKa = 3,12
8
108-95-2
Fenolo
1,5
pKa = 9,92
9
51-28-5
2,4-dinitrofenolo
1,5
pKa = 3,96
10
100-47-0
benzonitrile
1,6
11
140-29-4
fenilacetonitrile
1,6
12
589-18-4
alcole 4-metilbenzilico
1,6
13
98-86-2
acetofenone
1,7
14
88-75-5
2-nitrofenolo
1,8
pKa = 7,17
15
121-92-6
acido 3-nitrobenzoico
1,8
pKa = 3,47
16
106-47-8
4-cloroanilina
1,8
pKa = 4,15
17
98-95-3
nitrobenzene
1,9
18
104-54-1
alcole cinnamilico
(alcole cinnamico)
1,9
19
65-85-0
acido benzoico
1,9
pKa = 4,19
20
106-44-5
p-cresolo
1,9
pKa = 10,17
21
140-10-3
(trans)
acido cinnamico
2,1
pKa = 3,89 (cis)
4,44 (trans)
22
100-66-3
Anisolo
2,1
23
93-58-3
benzoato di metile
2,1
24
71-43-2
Benzene
2,1
25
99-04-7
acido 3-metilbenzoico
2,4
pKa = 4,27
26
106-48-9
4-clorofenolo
2,4
pKa = 9,1
27
79-01-6
tricloroetilene
2,4
28
1912-24-9
Atrazina
2,6
29
93-89-0
benzoato di etile
2,6
30
1194-65-6
2,6-diclorobenzonitrile
2,6
31
535-80-8
acido 3-clorobenzoico
2,7
pKa = 3,82
32
108-88-3
Toluene
2,7
33
90-15-3
1-naftolo
2,7
pKa = 9,34
34
608-27-5
2,3-dicloroanilina
2,8
35
108-90-7
clorobenzene
2,8
36
1746-13-0
allilfenil etere
2,9
37
108-86-1
bromobenzene
3,0
38
100-41-4
Etilbenzene
3,2
39
119-61-9
benzofenone
3,2
40
92-69-3
4-fenilfenolo
3,2
pKa = 9,54
41
89-83-8
Timolo
3,3
42
106-46-7
1,4-diclorobenzene
3,4
43
122-39-4
difenilammina
3,4
pKa = 0,79
44
91-20-3
Naftalene
3,6
45
93-99-2
benzoato di fenile
3,6
46
98-82-8
isopropilbenzene
3,7
47
88-06-2
2,4,6-triclorofenolo
3,7
pKa = 6
48
92-52-4
Bifenil
4,0
49
120-51-4
benzoato di benzile
4,0
50
88-85-7
2,4-dinitro-6-sec-butilfenolo
4,1
51
120-82-1
1,2,4-triclorobenzene
4,2
52
143-07-7
acido dodecanoico
4,2
pKa = 5,3
53
101-84-8
Difeniletere
4,2
54
85-01-8
Fenantrene
4,5
55
104-51-8
n-butilbenzene
4,6
56
103-29-7
Dibenzile
4,8
57
3558-69-8
2,6-difenilpiridina
4,9
58
206-44-0
Fluorantene
5,1
59
603-34-9
trifenilammina
5,7
60
50-29-3
DDT
6,5
DESCRIZIONE DEL METODO
Stima preliminare del coefficiente di ripartizione
16.
Se necessario, è possibile stimare il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame, preferibilmente ricorrendo a un metodo di calcolo (cfr. Appendice) o, se del caso, utilizzando il rapporto della solubilità della sostanza in esame nei solventi puri.
Apparecchiatura
17.
È richiesto un cromatografo in fase liquida dotato di pompa a bassi impulsi e di un sistema di rivelazione adeguato. Un rivelatore UV, che utilizza una lunghezza d'onda di 210 nm, o un rivelatore RI sono applicabili ad un'ampia gamma di gruppi chimici. La presenza di gruppi polari nella fase stazionaria può compromettere gravemente le prestazioni della colonna HPLC. Pertanto, le fasi stazionarie devono contenere una percentuale minima di gruppi polari (16). Si possono usare riempimenti commerciali a fase inversa a microparticelle o colonne preimpaccate. Si può posizionare una colonna di protezione tra il sistema di iniezione e la colonna analitica.
Fase mobile
18.
Per preparare il solvente di eluizione, che viene degassato prima dell'uso, si utilizzano il metanolo per HPLC e l'acqua distillata o deionizzata. Si consiglia di optare per l'eluizione isocratica. Si devono usare rapporti metanolo/acqua con un contenuto minimo di acqua del 25 %. Normalmente, una miscela metanolo/acqua 3:1 (v/v) è soddisfacente per eluire sostanze aventi un log P pari a 6 in un'ora ad una portata di 1 ml/min. Per le sostanze con un log P superiore a 6 può essere necessario abbreviare il tempo di eluizione (e quello delle sostanze di riferimento) diminuendo la polarità della fase mobile oppure la lunghezza della colonna.
19.
La sostanza in esame e le sostanze di riferimento devono essere solubili nella fase mobile, in concentrazione sufficiente a consentirne la rilevazione. Solo in casi eccezionali si possono usare degli additivi con la miscela metanolo-acqua perché modificano le proprietà della colonna. In questi casi è necessario accertarsi che i tempi di ritenzione delle sostanze in esame e delle sostanze di riferimento non siano influenzati. Se la miscela metanolo-acqua non è appropriata, si possono usare altre miscele solvente organico-acqua, per esempio etanolo-acqua, acetonitrile-acqua o alcole isopropilico (2-propanolo)-acqua.
20.
Il pH dell'eluente è un fattore critico per le sostanze ionizzabili. Esso deve rientrare nell'intervallo operativo di pH della colonna, che di solito è compreso tra 2 e 8. Si raccomanda di tamponare la soluzione. Occorre aver cura di evitare la precipitazione di sali e il deterioramento della colonna che si verificano con alcune miscele di fase organica/tampone. Le misurazioni mediante HPLC con fasi stazionarie a base di silice al di sopra di pH 8 non sono generalmente consigliabili perché l'uso di una fase mobile alcalina può provocare un rapido deterioramento delle prestazioni della colonna.
Soluti
21.
Le sostanze in esame e di riferimento devono essere sufficientemente pure per poter assegnare i picchi nei cromatogrammi alle rispettive sostanze. Le sostanze da usare a scopo di prova o di taratura devono, se possibile, essere disciolte nella fase mobile. Se si utilizza un solvente diverso dalla fase mobile per sciogliere le sostanze in esame e di riferimento, è necessario utilizzare la fase mobile per la diluizione finale prima dell'iniezione.
Condizioni sperimentali
22.
Durante la misura le variazioni della temperatura non devono essere superiori a ± 1 °C.
Determinazione del tempo morto to
23.
Il tempo morto t0 può essere misurato utilizzando sostanze organiche non ritenute (ad esempio tiourea o formammide). Un tempo morto più preciso può essere ottenuto dai tempi di ritenzione misurati o da una successione di circa 7 elementi di una serie omologa (ad esempio, n-alchilmetilchetoni) (17). I tempi di ritenzione tR (nC+ 1) sono tracciati in funzione di tR (nC), dove nC è il numero di atomi di carbonio. Si ottiene una retta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, dove A, che rappresenta k(nC + 1)/k(nC), è costante. Il tempo morto t0 è ottenuto dall'intercetta (1 – A)t0 e dal coefficiente angolare A.
Equazione di regressione
24.
La fase successiva consiste nel tracciare un log di correlazione k in funzione di un log P per le sostanze di riferimento appropriate con valori di log P simili al valore previsto per la sostanza in esame. In pratica, sono iniettate simultaneamente da 6 a 10 sostanze di riferimento. La determinazione dei tempi di ritenzione è effettuata preferibilmente con un registratore-integratore collegato al sistema di rivelazione. I logaritmi corrispondenti dei fattori di capacità, log k, sono tracciati come una funzione di log P. L'equazione di regressione viene eseguita a intervalli regolari, almeno una volta al giorno, in modo da tenere conto di eventuali variazioni delle prestazioni della colonna.
DETERMINAZIONE DEL POW DELLA SOSTANZA IN ESAME
25.
La sostanza in esame è iniettata nelle più piccole quantità rilevabili. Il tempo di ritenzione viene determinato in duplicato. Il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame è ottenuto mediante interpolazione del fattore di capacità calcolato sul grafico di taratura. Per coefficienti di ripartizione molto bassi o molto elevati è necessario ricorrere all'estrapolazione. In particolare in questi casi bisogna prestare attenzione ai limiti di confidenza della retta di regressione. Se il tempo di ritenzione del campione è al di fuori dell'intervallo dei tempi di ritenzione ottenuti per gli standard, è necessario specificare un valore limite.
DATI E RELAZIONE
Relazione sulla prova
26.
La relazione deve includere i seguenti elementi:
—
la stima preliminare del coefficiente di ripartizione (se determinata), i valori stimati e il metodo utilizzato; se è stato utilizzato un metodo di calcolo, la descrizione completa dello stesso, ivi incluse l'identificazione della base dati e informazioni dettagliate sulla scelta dei frammenti;
—
le sostanze in esame e di riferimento: la purezza, la formula di struttura e il numero CAS;
—
la descrizione dell'apparecchiatura e delle condizioni operative: la colonna analitica e la colonna di protezione;
—
la fase mobile, i mezzi di rilevamento, l'intervallo di temperatura, il pH;
—
i profili di eluizione (cromatogrammi);
—
il tempo morto e come è stato misurato;
—
i dati di ritenzione e i valori di log Pow desunti dalla letteratura per le sostanze di riferimento usate nella taratura;
—
i dettagli sulla retta di regressione stimata (log k in rapporto a log Pow) e il coefficiente di correlazione della retta, compresi gli intervalli di confidenza;
—
i dati di ritenzione media e il valore interpolato di log Pow per la sostanza in esame;
—
nel caso di una miscela: il cromatogramma del profilo di eluizione con indicazione dei valori soglia;
—
i valori di log Pow in relazione all'area percentuale del picco del log Pow;
—
il calcolo mediante il ricorso a una retta di regressione;
—
la media ponderata dei valori di log Pow calcolati, se pertinente.
BIBLIOGRAFIA
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C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pestic. Sci. 17, 311-325.
(4)
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Appendice
Metodi di calcolo del POW
INTRODUZIONE
1.
Quest'appendice fornisce una breve introduzione al calcolo del Pow. Per ulteriori informazioni, si rimanda il lettore ai libri di testo (1)(2).
2.
I valori calcolati del Pow sono utilizzati per:
—
decidere a quale metodo sperimentale ricorrere: il metodo Shake-Flask per un log Pow compreso tra -2 e 4 e il metodo HPLC per un log Pow tra 0 e 6;
—
selezionare le condizioni da utilizzare con HPLC (sostanze di riferimento, rapporto metanolo/acqua);
—
verificare l'attendibilità dei valori ottenuti mediante i metodi sperimentali;
—
fornire una stima quando non è possibile applicare i metodi sperimentali.
Principio dei metodi di calcolo
3.
I metodi di calcolo suggeriti nel presente documento sono basati sulla frammentazione teorica della molecola in sottostrutture adatte per le quali sono noti incrementi di log Pow affidabili. Il log Pow è ottenuto sommando i valori dei frammenti e i termini di correzione per le interazioni intramolecolari. Sono disponibili elenchi delle costanti di frammento e dei termini di correzione (1)(2)(3)(4)(5)(6). Alcuni di questi vengono regolarmente aggiornati (3).
Affidabilità dei valori calcolati
4.
In generale, l'affidabilità dei metodi di calcolo diminuisce con l'aumentare della complessità della sostanza in esame. Nel caso di molecole semplici di basso peso molecolare e con uno o due gruppi funzionali, ci si può attendere una deviazione da 0,1 a 0,3 unità di log Pow tra i risultati dei differenti metodi di frammentazione e i valori misurati. Il margine di errore dipende dall'affidabilità delle costanti di frammento utilizzate, dalla capacità di riconoscere le interazioni intramolecolari (ad esempio, i legami idrogeno) e dall'uso corretto dei termini di correzione. Nel caso delle sostanze ionizzanti, è necessario tenere conto della carica e del grado di ionizzazione (10).
Metodo Fujita-Hansch π
5.
La costante del sostituente idrofobo, π, introdotta originariamente da Fujita et al. (7), è definita come:
πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)
dove PhX è un derivato aromatico e PhH la sostanza madre.
ad esempio
πCl
= log Pow (C6H5Cl) — log Pow (C6H6)
= 2,84 – 2,13
= 0,71
Il metodo π è interessante soprattutto per le sostanze aromatiche. Sono disponibili i valori π per un gran numero di sostituenti (4)(5).
Metodo di Rekker
6.
Con il metodo di Rekker (8) il valore log Pow è calcolato nel modo seguente:
dove ai è il numero di volte che un dato frammento si presenta nella molecola e fi è l'incremento log Pow del frammento. I termini di interazione possono essere espressi come multiplo intero di una costante singola Cm (la cosiddetta “costante magica”). Le costanti di frammento fi e Cm sono state ricavate da un elenco di 1 054 valori sperimentali di Pow di 825 sostanze utilizzando l'analisi di regressione multipla (6)(8). La determinazione dei termini di interazione viene eseguita secondo regole fisse (6)(8)(9).
Metodo di Hansch-Leo
7.
Con il metodo di Hansch e Leo (4) il valore log Pow è calcolato nel modo seguente:
dove fi è la costante di frammento, Fj è il termine (fattore) di correzione e ai e bj indicano la corrispondente frequenza con cui si presentano. Un elenco di valori di frammento costituiti da atomi e gruppi e un elenco di termini di correzione Fj sono stati ottenuti per approssimazioni successive derivandoli da valori sperimentali di Pow. I termini di correzione sono stati suddivisi in varie differenti classi (1) (4). Sono stati sviluppati pacchetti software per tenere conto di tutte le regole e di tutti i termini di correzione (3).
METODO COMBINATO
8.
Il calcolo del log Pow di molecole complesse può essere migliorato considerevolmente se la molecola viene divisa in sottostrutture più grandi per le quali sono disponibili valori affidabili di log Pow, ottenuti da tabelle (3) (4) o da misurazioni esistenti. Tali frammenti (ad esempio sostanze eterocicliche, antrachinone, azobenzene) possono essere poi combinati con i valori π di Hansch o con le costanti di frammento di Rekker o Leo.
Osservazioni
i)
I metodi di calcolo sono applicabili unicamente a sostanze parzialmente o completamente ionizzate quando vengono presi in considerazione i fattori di correzione necessari.
ii)
Se si può assumere la presenza di legami idrogeno intramolecolari, è necessario aggiungere i corrispondenti termini di correzione (approssimativamente da + 0,6 a + 1,0 unità di log Pow) (1). Indicazioni della presenza di tali legami possono essere ottenute da modelli tridimensionali o da dati spettroscopici.
iii)
Se sono possibili varie forme tautomere, si deve assumere come base di calcolo la forma più probabile.
iv)
Bisogna seguire con attenzione le revisioni degli elenchi delle costanti di frammento.
BIBLIOGRAFIA SUI METODI DI CALCOLO
(1)
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(10)
R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, pag. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).
»
(3)
Il capitolo C.3. è sostituito dal seguente:
«
C.3. ALGHE DI ACQUA DOLCE E CIANOBATTERI, PROVA DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA
INTRODUZIONE
1.
Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 201 (2006; rettifica dell'allegato nel 2011). La revisione del metodo, nata dall'esigenza di includere nuove specie e aggiornarlo affinché soddisfi i requisiti relativi alla valutazione dei pericoli e alla classificazione delle sostanze chimiche, è stata effettuata sulla base di un'ampia esperienza pratica, del progresso scientifico nel settore degli studi di tossicità sulle alghe e di una estesa prassi normativa messa in atto fin dall'adozione del metodo iniziale.
2.
L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.
PRINCIPIO DELLA PROVA
3.
La presente prova è finalizzata a determinare gli effetti di una sostanza chimica sulla crescita di microalghe di acqua dolce e/o cianobatteri. Gli organismi sperimentali in fase di crescita esponenziale sono esposti alla sostanza chimica in esame in colture batch per un periodo che dura normalmente 72 ore. Nonostante la durata relativamente breve della prova è possibile valutare gli effetti su diverse generazioni.
4.
La risposta del sistema consiste nella riduzione della crescita in una serie di colture di alghe (unità di prova) esposte a varie concentrazioni della sostanza chimica in esame. La risposta è valutata come funzione della concentrazione di esposizione rispetto alla crescita media di colture di controllo identiche non esposte (repliche). Per ottenere l'espressione completa della risposta del sistema agli effetti tossici (sensibilità ottimale), le colture sono poste in condizioni idonee a una crescita esponenziale senza limitazioni, fornendo una quantità sufficiente di nutrienti e un'illuminazione continua per un periodo sufficiente a misurare la riduzione del tasso di crescita specifico.
5.
La crescita e l'inibizione della crescita sono quantificate attraverso misurazioni della biomassa delle alghe in funzione del tempo. La biomassa delle alghe è espressa in peso secco per volume, per esempio mg di alghe per litro di soluzione di prova. Dato tuttavia che è difficile misurare il peso secco, si ricorre a parametri alternativi, quali il conteggio delle cellule, che è quello più utilizzato, il volume cellulare, la fluorescenza, la densità ottica ecc. Il fattore di conversione del parametro alternativo misurato in biomassa deve essere noto.
6.
L'endpoint della prova è l'inibizione della crescita, espressa come l'aumento logaritmico della biomassa (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A partire dai tassi di crescita specifici medi registrati in una serie di soluzioni di prova si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del tasso di crescita (per esempio 50 %), espressa come ErCx (per esempio ErC50).
7.
Un'altra variabile di risposta considerata nel presente metodo è il rendimento, che può essere necessario utilizzare per soddisfare requisiti normativi specifici di alcuni paesi. È definito come la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e la biomassa all'inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del rendimento (per esempio 50 %), espressa come EyCx (per esempio EyC50).
8.
Si possono inoltre determinare mediante un calcolo statistico la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
9.
Le informazioni sulla sostanza chimica in esame che possono essere utili per stabilire le condizioni sperimentali comprendono la formula strutturale, la purezza, la stabilità alla luce, la stabilità alle condizioni sperimentali, le proprietà di assorbimento della luce, la pKa e i risultati degli studi di trasformazione, inclusa la biodegradabilità nell'acqua.
10.
Occorre conoscere l'idrosolubilità, il coefficiente di partizione ottanolo/acqua (Pow) e la pressione di vapore della sostanza chimica in esame e disporre di un metodo convalidato per la quantificazione della sostanza chimica nelle soluzioni di prova, metodo di cui devono essere noti l'efficienza di recupero e il limite di rilevamento.
VALIDITÀ DELLA PROVA
11.
Affinché la prova sia valida devono essere soddisfatti i criteri di esecuzione seguenti:
—
l'aumento esponenziale della biomassa nelle colture di controllo deve essere di un fattore almeno pari a 16 nell'arco delle 72 ore del periodo sperimentale. Questo valore corrisponde a un tasso di crescita specifico di 0,92/giorno– 1. Nelle specie più utilizzate il tasso di crescita è di solito assai più alto (cfr. appendice 2). Questo criterio può non essere rispettato quando si utilizzano specie che crescono più lentamente di quelle elencate nell'appendice 2, nel qual caso occorre prolungare la prova per ottenere un fattore di moltiplicazione della crescita almeno pari a 16 nelle colture di controllo, assicurandosi che la crescita sia esponenziale per tutta la prova. La durata può essere ridotta fino a un minimo di 48 ore per mantenere una crescita esponenziale senza limitazioni durante la prova, a condizione che sia raggiunto il fattore minimo di moltiplicazione 16;
—
il coefficiente medio di variazione dei tassi specifici di crescita in ogni sezione della prova (giorni 0-1, 1-2 e 2-3, per le prove di 72 ore) nelle colture di controllo (cfr. la voce “coefficiente di variazione” nell'appendice 1) non deve essere superiore a 35 %. Per il calcolo del tasso di crescita specifico per sezione, si veda il paragrafo 49. Questo criterio si applica al valore medio dei coefficienti di variazione calcolato per le repliche delle colture di controllo;
—
il coefficiente di variazione dei tassi di crescita specifici medi durante l'intero periodo di prova nelle repliche delle colture di controllo non deve superare il 7 % nelle prove con Pseudokirchneriella subcapitata e Desmodesmus subspicatus. Per altre specie utilizzate con minore frequenza questo valore non deve superare il 10 %.
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO
12.
La procedura sperimentale può essere verificata saggiando una o più sostanze chimiche di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (1). Anche il dicromato di potassio può essere utilizzato come sostanza chimica di riferimento per le alghe verdi. È preferibile effettuare una prova con una sostanza chimica di riferimento almeno due volte all'anno.
APPLICABILITÀ DELLA PROVA
13.
Il presente metodo di prova si presta soprattutto per le sostanze chimiche idrosolubili le quali, alle condizioni sperimentali, con tutta probabilità permangono nell'acqua. Per saggiare sostanze chimiche volatili, fortemente adsorbenti, colorate, a bassa idrosolubilità oppure sostanze chimiche che possono influire sulla disponibilità dei nutrienti o dei minerali nel mezzo di prova, possono essere necessarie determinate modifiche della procedura descritta (per esempio sistema chiuso, condizionamento dei recipienti di prova). Nei riferimenti bibliografici (2)(3) e (4) si trovano orientamenti sulle eventuali modifiche da apportare.
DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA
Apparecchiature
14.
I recipienti e le altre apparecchiature destinate a entrare in contatto con le soluzioni di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Gli strumenti devono essere lavati accuratamente per assicurare che nessun contaminante organico o inorganico possa interferire con la crescita delle alghe o la composizione delle soluzioni di prova.
15.
I recipienti sono in genere beute in vetro di dimensioni tali da contenere i volumi di coltura necessari per le misurazioni da effettuare durante la prova e garantire una superficie di contatto sufficiente per il trasferimento massico di CO2 dall'atmosfera (cfr. paragrafo 30). Si noti che il volume di liquido deve essere tale da permettere le determinazioni analitiche (cfr. paragrafo 37).
16.
Sono inoltre necessarie alcune o tutte le seguenti apparecchiature:
—
apparecchiature per le colture: si consiglia di utilizzare una camera o una cabina in cui la temperatura di incubazione prescelta possa essere mantenuta a ± 2 °C;
—
strumenti per la misurazione della luce: è importante tenere presente che il metodo di misurazione dell'intensità luminosa, in particolare il tipo di recettore (collettore), può influire sul valore misurato. È preferibile effettuare le misurazioni utilizzando un recettore sferico (4 π, sensibile alla luce diretta e riflessa proveniente da tutti gli angoli situati sopra e sotto il piano di misurazione) o un recettore 2 π (sensibile alla luce proveniente da tutti gli angoli situati sopra il piano di misurazione);
—
apparecchiatura per determinare la biomassa delle alghe. Il conteggio delle cellule, che è il parametro alternativo più comunemente utilizzato per determinare la biomassa delle alghe, può essere effettuato con un contatore elettronico di particelle, un microscopio con camera di conteggio o un citometro a flusso. Altri parametri alternativi per la biomassa possono essere misurati usando un citometro a flusso, un fluorimetro, uno spettrofotometro o un colorimetro. Per effettuare il calcolo è utile impiegare un fattore di conversione che metta in relazione il conteggio delle cellule e il peso secco. Per fornire misurazioni utili con basse concentrazioni di biomassa, quando si utilizza lo spettrofotometro può essere necessario usare cuvette con cammino ottico di almeno 4 cm.
Organismi sperimentali
17.
Possono essere utilizzate diverse specie di microalghe e di cianobatteri che non formano aggregati. I ceppi di cui all'appendice 2 sono risultati adatti alla procedura sperimentale del presente metodo di prova.
18.
Se si utilizzano altre specie, devono essere indicati il ceppo e/o la provenienza. È necessario confermare che la crescita esponenziale dell'alga selezionata per la prova può essere mantenuta per tutta la durata della prova nelle condizioni applicate.
Mezzo di crescita
19.
Si consigliano due mezzi di crescita alternativi: il mezzo dell'OCSE e il mezzo AAP. Le composizioni di entrambi i mezzi sono illustrate nell'appendice 3. Si fa presente che il valore iniziale del pH e la capacità tampone (regolazione dell'aumento del pH) di questi due mezzi sono diversi. I risultati delle prove possono pertanto variare in funzione del mezzo utilizzato, soprattutto nelle prove su sostanze chimiche ionizzanti.
20.
Può essere talvolta necessario modificare il mezzo di crescita, ad esempio se si saggiano metalli o agenti chelanti oppure se la prova è eseguita con diversi valori di pH. L'uso di un mezzo modificato deve essere descritto con precisione e giustificato (3)(4).
Concentrazione iniziale della biomassa
21.
La biomassa iniziale deve essere la stessa in tutte le colture e sufficientemente bassa da permettere una crescita esponenziale per tutto il periodo di incubazione senza il rischio di esaurimento dei nutrienti. La biomassa iniziale non deve superare 0,5 mg/l in peso secco. Si raccomandano le seguenti concentrazioni iniziali di cellule:
Pseudokirchneriella subcapitata
5 × 103 – 104 cellule/ml
Desmodesmus subspicatus
2-5 × 103 cellule/ml
Navicula pelliculosa
104 cellule/ml
Anabaena flos-aquae
104 cellule/ml
Synechococcus leopoliensis
5 × 104 – 105 cellule/ml
Concentrazioni della sostanza chimica in esame
22.
L'intervallo di concentrazione entro il quale possono verificarsi degli effetti può essere determinato in base ai risultati di precedenti prove a diversi intervalli di concentrazione. Per la prova definitiva si devono scegliere almeno cinque concentrazioni in progressione geometrica, con un fattore di separazione non superiore a 3,2. Un fattore più elevato può essere giustificato per le sostanze chimiche in esame la cui curva concentrazione-risposta è nulla. Le serie di concentrazioni devono di preferenza coprire l'intervallo che causa un'inibizione del 5 % - 75 % del tasso di crescita delle alghe.
Repliche e controlli
23.
Il disegno sperimentale deve comprendere tre repliche per ogni concentrazione di prova. Se non è necessario determinare la NOEC, il disegno sperimentale può essere modificato in modo da aumentare il numero delle concentrazioni e ridurre il numero delle repliche per concentrazione. Le repliche dei controlli devono essere almeno tre e, idealmente, il doppio delle repliche utilizzate per ogni concentrazione di prova.
24.
Una serie a parte di soluzioni di prova può essere preparata per le determinazioni analitiche delle concentrazioni della sostanza chimica in esame (cfr. paragrafi 36 e 38).
25.
Quando la sostanza chimica in esame è solubilizzata con un solvente il disegno sperimentale deve includere controlli supplementari contenenti il solvente alla stessa concentrazione utilizzata nelle colture di prova.
Preparazione della coltura di inoculo
26.
Per adattare le alghe alle condizioni sperimentali e garantire che siano nella fase di crescita esponenziale quando sono utilizzate per inoculare le soluzioni di prova, 2-4 giorni prima dell'inizio della prova si prepara una coltura di inoculo nel mezzo di prova. La biomassa delle alghe deve essere adattata affinché la coltura di inoculo mantenga una crescita esponenziale fino al momento in cui ha inizio la prova. La coltura di inoculo è incubata alle stesse condizioni delle colture di prova. Occorre misurare l'aumento della biomassa nella coltura di inoculo per verificare che, nelle condizioni di coltura, la crescita segua un andamento normale per il ceppo in esame. L'appendice 4 presenta un esempio di metodo di coltura delle alghe. Per evitare divisioni sincrone delle cellule durante la prova può essere necessaria una seconda fase di propagazione della coltura di inoculo.
Preparazione delle soluzioni di prova
27.
Tutte le soluzioni di prova devono contenere le stesse concentrazioni del mezzo di crescita e la stessa biomassa iniziale delle alghe utilizzate per la prova. Le soluzioni delle concentrazioni prescelte sono di solito preparate mescolando una soluzione madre della sostanza chimica in esame con il mezzo di crescita e la coltura di inoculo. Di solito le soluzioni madri sono preparate sciogliendo la sostanza nel mezzo di prova.
28.
Solventi quali acetone, alcol t-butilico e dimetilformammide possono essere utilizzati come veicoli per aggiungere sostanze chimiche a bassa idrosolubilità nel mezzo di prova (2)(3). La concentrazione di solvente non deve superare 100 μl/l e deve essere identica in tutte le colture (comprese quelle dei controlli).
Incubazione
29.
I recipienti di prova, chiusi con coperchi permeabili all'aria, sono agitati e collocati nell'incubatore. Durante la prova è necessario mantenere le alghe in sospensione e agevolare il trasferimento di CO2. A tal fine i recipienti sono agitati oppure il loro contenuto è rimescolato in permanenza. Le colture vanno mantenute ad una temperatura compresa tra 21 e 24 °C, con variazione ammissibile di ± 2 °C. Per le specie diverse da quelle di cui all'appendice 2, come per esempio le specie tropicali, può essere necessario utilizzare temperature più elevate, a condizione che i criteri di validità siano rispettati. Si raccomanda di disporre le beute all'interno dell'incubatore in maniera casuale e di cambiarne ogni giorno la posizione.
30.
Il pH del mezzo dei controlli non deve aumentare di oltre 1,5 unità durante la prova. Per i metalli e le sostanze chimiche che in parte ionizzano a un pH prossimo a quello della prova può essere necessario limitare l'evoluzione del pH per ottenere risultati riproducibili e chiaramente definiti. Un'evoluzione del pH inferiore a 0,5 unità è tecnicamente fattibile e può essere ottenuta inducendo un tasso adeguato di trasferimento massico di CO2 dall'aria circostante alla soluzione di prova, per esempio aumentando l'intensità dell'agitazione. Un'altra possibilità consiste nel ridurre la domanda di CO2 diminuendo la biomassa iniziale o la durata della prova.
31.
La superficie su cui le colture sono incubate deve ricevere un'illuminazione fluorescente, continua ed uniforme, per esempio del tipo “bianca fredda” o “naturale”. I requisiti di illuminazione variano in funzione dei ceppi di alghe e cianobatteri utilizzati. L'intensità della luce deve essere adeguata all'organismo sperimentale utilizzato. Per le specie di alghe verdi raccomandate l'intensità della luce a livello delle soluzioni di prova deve essere scelta nell'intervallo 60-120 μE · m– 2 · s– 1, misurata nell'intervallo di lunghezza d'onda che consente la fotosintesi (400-700 nm) con un recettore adeguato. Alcune specie, in particolare l'Anabaena flos-aquae, crescono bene con un'intensità luminosa più bassa e possono essere danneggiate da intensità elevate. Per queste specie occorre utilizzare un'intensità luminosa media compresa tra 40 e 60 μE · m– 2 · s– 1 (per quanto riguarda gli strumenti di misurazione calibrati in lux, l'intensità luminosa raccomandata di 60-120 μE · m– 2 · s– 1 corrisponde a circa 4 440 — 8 880 lux per la luce bianca fredda). Sulla zona di incubazione l'intensità luminosa non deve discostarsi più di ±15 % dall'intensità luminosa media.
Durata della prova
32.
La prova dura normalmente 72 ore, ma è possibile prolungarla o accorciarla a condizione che tutti i criteri di validità di cui al paragrafo 11 siano rispettati.
Misurazioni e determinazioni analitiche
33.
La biomassa delle alghe in ogni recipiente è determinata almeno una volta al giorno durante il periodo di prova. Se le misurazioni sono effettuate su piccoli volumi prelevati dalla soluzione di prova con una pipetta, tali volumi non devono essere rimessi nella soluzione.
34.
La biomassa è misurata mediante conteggio manuale delle cellule al microscopio o con un contatore elettronico di particelle (conteggio delle cellule e/o biovolume). È possibile utilizzare tecniche alternative, come per esempio la citometria a flusso, la fluorescenza clorofilliana in vitro o in vivo (5)(6) o la densità ottica, a condizione di poter dimostrare che esiste una correlazione soddisfacente con la biomassa per la gamma dei valori della biomassa della prova.
35.
Il pH delle soluzioni è misurato all'inizio e alla fine della prova.
36.
Se si dispone di un metodo per analizzare la sostanza chimica in esame nell'intervallo di concentrazione utilizzato, occorre analizzare le soluzioni di prova per verificare le concentrazioni iniziali e il mantenimento delle concentrazioni di esposizione durante la prova.
37.
Se si presume che le concentrazioni di esposizione della sostanza chimica in esame non si discostino più del 20 % dai valori nominali durante la prova, può essere sufficiente analizzare all'inizio e alla fine della prova una concentrazione alta, una bassa e una intorno al valore EC50 previsto. Si raccomanda di analizzare tutte le concentrazioni all'inizio e alla fine della prova se si presume che non si situeranno nell'intervallo dell'80-120 % della concentrazione nominale. Per le sostanze chimiche in esame volatili, instabili o fortemente adsorbenti si raccomanda di prelevare campioni aggiuntivi da analizzare ogni 24 ore durante il periodo di esposizione per definire con maggiore precisione la perdita della sostanza chimica in esame. Per queste sostanze potrebbe essere necessario aumentare il numero delle repliche. In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza chimica in esame è da effettuarsi soltanto in uno dei recipienti replicati (o nel contenuto mescolato di tutti i recipienti replicati).
38.
I mezzi di prova appositamente preparati per l'analisi delle concentrazioni di esposizione durante la prova devono essere trattati come quelli utilizzati per le prove, devono cioè essere inoculati con alghe e incubati alle stesse condizioni. Se occorre analizzare la concentrazione della sostanza chimica in esame disciolta, può essere necessario separare le alghe dal mezzo. A tal fine è preferibile procedere per centrifugazione a bassa velocità, sufficiente per far sedimentare le alghe.
39.
Se è dimostrato che per tutta la durata della prova la concentrazione della sostanza chimica in esame non è variata più di ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata inizialmente, l'analisi dei risultati può essere basata sui valori nominali o su quelli misurati inizialmente. Se la variazione rispetto alla concentrazione nominale o a quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati deve basarsi sulla media geometrica della concentrazione durante l'esposizione o su modelli che descrivono la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (3)(7).
40.
La prova di inibizione della crescita delle alghe è un sistema sperimentale più dinamico di altre prove di tossicità acquatica a breve termine. Di conseguenza può essere difficile determinare le concentrazioni reali di esposizione, soprattutto per le sostanze adsorbenti esaminate a basse concentrazioni. In questi casi, la scomparsa della sostanza chimica in esame dalla soluzione per adsorbimento sulla biomassa delle alghe in crescita non significa che essa sia scomparsa dal sistema sperimentale. All'atto di analizzare il risultato della prova è opportuno verificare se la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame durante la prova è accompagnata dalla diminuzione dell'inibizione della crescita. Se così fosse si potrebbe considerare l'applicazione di un modello adeguato per descrivere la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (7). In caso contrario, può essere opportuno basare l'analisi dei risultati sulle concentrazioni iniziali (nominali o misurate).
Altre osservazioni
41.
Si osserva al microscopio la coltura di inoculo per verificare che presenti un aspetto normale e sano e osservare eventuali anomalie delle alghe (che potrebbero essere causate dall'esposizione alla sostanza chimica in esame) alla fine della prova.
Prova limite
42.
In determinate circostanze, per esempio quando una prova preliminare indica che la sostanza chimica in esame non ha effetti tossici in concentrazioni fino a 100 mg/l o fino al suo limite di solubilità nel mezzo di prova (si scelga il valore più basso), può essere svolta una prova limite che consiste nel confrontare le risposte di un gruppo di controllo e di un gruppo trattato (a una concentrazione di 100 mg/l o pari al limite di solubilità). È vivamente raccomandato che l'assenza di tossicità sia corroborata da un'analisi della concentrazione di esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero delle repliche trattate, che devono essere almeno sei. Le variabili di risposta osservate nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato possono essere analizzate con una prova statistica che consenta di confrontare le medie, per esempio con un test t di Student. Se le varianze dei due gruppi sono ineguali, si esegue un test t adattato per varianze ineguali.
DATI E RELAZIONI
Tracciato delle curve di crescita
43.
La biomassa dei recipienti di prova può essere espressa nell'unità del parametro alternativo utilizzato per misurarla (per esempio, numero di cellule, fluorescenza).
44.
Per rappresentare graficamente le curve di crescita si riportano in tabelle la concentrazione stimata della biomassa delle colture di prova e dei controlli, le concentrazioni del materiale in esame e i tempi delle misurazioni, approssimati almeno all'ora. In questa prima fase si potrà utilizzare sia la scala lineare che quella logaritmica, ma quest'ultima è obbligatoria e in genere rappresenta meglio le variazioni del ritmo di crescita nell'arco della prova. Si osservi che la crescita esponenziale rappresentata in scala logaritmica risulta in una retta la cui pendenza indica il tasso di crescita specifico.
45.
Utilizzando i grafici, verificare se le colture dei controlli si sviluppano al tasso esponenziale previsto nel corso dell'intera prova. Studiare con attenzione tutti i punti e l'aspetto globale dei grafici, nonché verificare i dati grezzi e i procedimenti utilizzati, per rilevare eventuali errori. Verificare in particolare tutti i punti che sembrano discostarsi per un errore sistematico. Se l'individuazione degli errori del procedimento è palese e/o la probabilità di occorrenza di questi errori è elevata, il punto in causa deve essere evidenziato come valore anomalo e non deve essere incluso nella successiva analisi statistica (una concentrazione algale nulla in una delle due o tre repliche può indicare che l'inoculo non è avvenuto correttamente o che il recipiente non è stato pulito bene). Le ragioni che giustificano l'esclusione di un punto perché considerato valore anomalo devono essere esposte chiaramente nella relazione sulla prova. Sono accettate soltanto le ragioni dovute a (rari) errori metodologici e non a mera mancanza di precisione. I metodi statistici di identificazione dei valori anomali presentano un'utilità limitata per questo tipo di problema e non possono sostituire il giudizio di un esperto. È preferibile mantenere i valori anomali (segnalati come tali) tra i punti presentati su eventuali grafici o tabelle.
Variabili di risposta
46.
La prova è intesa a determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla crescita delle alghe. Il presente metodo di prova descrive due variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione di entrambe le variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito:
(a)
tasso di crescita specifico medio, calcolato in base all'aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di prova, espresso in giorni;
(b)
rendimento, che consiste nel valore della biomassa alla fine della prova meno il valore della biomassa all'inizio della prova.
47.
Si fa presente che i valori di tossicità calcolati utilizzando queste due variabili di risposta non sono comparabili, per cui occorre tenere conto di questa differenza al momento di utilizzare i risultati della prova. I valori dell'ECx basati sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (EyCx), se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non va considerata una differenza di sensibilità tra le due suddette variabili di risposta. Il concetto di tasso di crescita specifico medio si basa sull'andamento generale della crescita esponenziale delle alghe in colture non soggette a limitazioni; la tossicità è valutata in base agli effetti sul tasso di crescita senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico dei controlli, della pendenza della curva concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sulla variabile di rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. L'EyCx dipende dal tasso di crescita specifico della specie di alga utilizzata in ciascuna prova e dal tasso di crescita specifico massimo, che può variare da una specie di alga all'altra o persino da un ceppo all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche di specie o ceppi diversi di alga. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, stimare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, per i soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi il presente metodo di prova include anche la stima basata sul rendimento.
Tasso di crescita specifico medio
48.
Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è calcolato in funzione dell'aumento logaritmico della biomassa, utilizzando la seguente equazione per ciascuna replica dei gruppi di controllo e dei gruppi trattati [1]:
[1]
dove:
μi-j
è il tasso di crescita specifico medio dal momento i al momento j,
Xi
è la biomassa al momento i,
Xj
è la biomassa al momento j.
Per ciascun gruppo trattato e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita e le relative stime della varianza.
49.
Calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero periodo di prova (in genere dal giorno 0 al giorno 3), prendendo come valore di partenza il valore nominale della biomassa inoculata anziché il suo valore misurato, poiché di norma ciò permette di ottenere una maggiore precisione. Se lo strumento utilizzato per misurare la biomassa consente di determinare con sufficiente precisione una piccola biomassa di inoculo (per esempio un citometro a flusso), è possibile utilizzare il valore misurato della concentrazione iniziale della biomassa. Valutare anche il tasso di crescita in ogni sezione della prova, calcolato come il tasso di crescita specifico di ciascun giorno di prova (giorni 0-1, 1-2 e 2-3) e verificare se il tasso di crescita dei controlli rimane costante (cfr. i criteri di validità, paragrafo 11). Un tasso di crescita specifico del primo giorno sensibilmente inferiore al tasso di crescita specifico medio può indicare una fase di latenza. Sebbene sia possibile ridurre al minimo e praticamente eliminare la fase di latenza nelle colture di controllo mediante un'adeguata propagazione della precoltura, la presenza di una fase di latenza nelle colture trattate può essere indizio di una fase di recupero successiva ad uno choc tossico iniziale oppure di un'esposizione ridotta causata da una perdita della sostanza chimica in esame (anche per assorbimento sulla biomassa delle alghe) dopo l'esposizione iniziale. Il tasso di crescita sezione per sezione permette quindi di studiare i vari effetti della sostanza chimica in esame durante il periodo di esposizione. Una differenza significativa tra il tasso di crescita sezione per sezione e il tasso di crescita medio indica l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, il che richiede un attento esame delle curve di crescita.
50.
Si calcola la percentuale di inibizione del tasso di crescita per ciascuna replica del gruppo trattato utilizzando la seguente equazione [2]:
[2]
dove:
%Ir
è la percentuale di inibizione del tasso di crescita specifico medio,
μC
è il valore medio del tasso di crescita specifico (μ) medio del gruppo di controllo,
μT
è il tasso di crescita specifico medio delle repliche del gruppo trattato.
51.
Se le soluzioni di prova sono preparate utilizzando un solvente, per calcolare la percentuale di inibizione si devono utilizzare i controlli con solvente anziché i controlli senza solvente.
Rendimento
52.
Il rendimento è calcolato come differenza tra la biomassa alla fine della prova e la biomassa all'inizio della prova per ciascun recipiente del gruppo trattato e di controllo. Per ogni concentrazione di prova e di controllo si calcola un valore medio di rendimento e le relative stime della varianza. La percentuale di inibizione del rendimento (%Iy) può essere calcolata per ciascuna replica del gruppo trattato, secondo la seguente formula:
[3]
dove:
% Iy
è la percentuale d'inibizione del rendimento,
YC
è il valore medio del rendimento nel gruppo di controllo,
YT
è il valore del rendimento delle repliche del gruppo trattato.
Tracciato della curva concentrazione-risposta
53.
Riportare su un grafico la percentuale di inibizione in funzione del logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame e osservare con attenzione i punti ottenuti, senza tenere conto dei punti eliminati perché considerati valori anomali durante la prima fase. Tracciare, manualmente o con programma informatico d'interpolazione, una curva approssimata tra i punti per ottenere una prima impressione del rapporto concentrazione-risposta e successivamente procedere con un metodo più esatto, di preferenza un metodo statistico computerizzato. In funzione dell'uso al quale i dati sono destinati, della qualità (precisione) e della quantità dei dati, nonché della disponibilità di strumenti di analisi dei dati, si potrà decidere (a giusto titolo in alcuni casi) di interrompere l'analisi dei dati in questa fase e considerare soltanto le cifre chiave, vale a dire i valori EC50 e EC10 (e/o EC20), della curva interpolata manualmente (cfr. anche la sezione sottostante sugli effetti stimolatori). Vi sono valide ragioni per non ricorrere ad un metodo statistico, tra le quali:
—
i dati trattati con strumenti informatici non danno risultati più affidabili di quelli ottenuti con il giudizio di un esperto — in queste situazioni, alcuni programmi informatici potrebbero persino non essere in grado di fornire una soluzione affidabile (le ripetizioni divergenti ecc.),
—
le risposte allo stimolo della crescita non sono ben descritte dai programmi informatici disponibili (cfr. infra).
Procedure statistiche
54.
L'obiettivo consiste nel descrivere in maniera quantitativa, mediante un'analisi della regressione, la relazione concentrazione-risposta. È possibile utilizzare una regressione lineare ponderata, preceduta da una trasformazione di linearizzazione dei valori che descrivono la risposta osservata — per esempio in unità probit, logit o Weibull (8), ma è preferibile applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle irregolarità inevitabili dei dati e degli scarti rispetto alle distribuzioni regolari. Vicine allo zero o all'inibizione totale, queste irregolarità possono essere amplificate dalla trasformazione e interferire con l'analisi (8). Si fa presente che i metodi analitici standard che utilizzano le trasformazioni probit, logit o Weibull si applicano a dati quantali (per esempio, mortalità o sopravvivenza) e devono quindi essere modificati per poter essere utilizzati con i dati relativi alla crescita o alla biomassa. Per le procedure specifiche che consentono di determinare i valori dell'ECx a partire da dati continui si vedano i riferimenti (9)(10) e (11). L'uso di un'analisi della regressione non lineare è descritto nel dettaglio nell'appendice 5.
55.
Per ciascuna variabile di risposta da analizzare, si utilizza il rapporto concentrazione-risposta per stimare i valori puntuali dell'ECx. Laddove possibile per ogni stima si determinano i limiti di confidenza a 95 %. La corrispondenza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione deve essere valutata graficamente o con metodi statistici. L'analisi della regressione deve essere effettuata basandosi sulle risposte rilevate in ogni replica e non sulle medie dei gruppi trattati. Tuttavia, se risulta difficile o impossibile costruire una curva interpolante perché i dati sono troppo dispersi, si può ricorrere ad una regressione sulle medie dei gruppi in modo da ridurre l'influenza dei valori che potrebbero essere anomali. Il ricorso a questa opzione, che si discosta dalla procedura normale, deve essere indicato nella relazione di prova e motivato dall'impossibilità di interpolare la curva dei valori delle singole repliche con risultati soddisfacenti.
56.
Le stime dell'EC50 e i limiti di confidenza possono essere ottenuti anche mediante interpolazione lineare con bootstrapping (13), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.
57.
Per stimare la LOEC, e dunque la NOEC, per quanto riguarda gli effetti della sostanza chimica in esame sul tasso di crescita, è necessario paragonare le medie dei gruppi trattati mediante un'analisi della varianza (ANOVA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli ricorrendo a un metodo adeguato di comparazione multipla o di analisi della tendenza. A questo proposito possono risultare utili i test di Dunnett o di William (12)(14)(15)(16)(17). È necessario valutare se l'ipotesi di omogeneità della varianza dell'ANOVA è fondata, valutazione che può essere effettuata graficamente oppure con una prova formale (17), ad esempio con i test di Levene o di Bartlett. in particolare tramite il test di Levene. Se l'ipotesi dell'omogeneità della varianza non si conferma, può essere talvolta utile correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. Se l'eterogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta con una trasformazione, si prenderanno in considerazione metodi di analisi della tendenza come, ad esempio, i test di tendenza regressivi di Jonckheere. Il riferimento bibliografico (11) fornisce ulteriori informazioni sulla determinazione della NOEC.
58.
Alcuni sviluppi scientifici recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare l'abbandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali della CEx basate sulla regressione. Per questa prova sulle alghe non è stato definito alcun valore appropriato di x. Tuttavia, un intervallo tra il 10 e il 20 % sembra appropriato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile riportare sia l'EC10 sia l'EC20.
Stimolazione della crescita
59.
Si osserva talvolta una stimolazione della crescita (inibizione negativa) a basse concentrazioni. Questo fenomeno può derivare da ormesi (“stimolazione tossica”) o dall'introduzione di fattori di stimolazione della crescita, trasportati dal materiale in esame, nel mezzo utilizzato. Si fa presente che l'aggiunta di sostanze nutritive inorganiche non dovrebbe esercitare alcun effetto diretto dato che per tutta la prova il mezzo mantiene sostanze nutritive in eccesso. La stimolazione a basse concentrazioni può essere generalmente ignorata nei calcoli dell'EC50, a meno che sia estrema. Tuttavia, se tale stimolazione è estrema o quando il valore x nell'ECx da calcolare è basso, potrebbero essere necessarie procedure particolari. Si eviti, per quanto possibile, di eliminare semplicemente dall'analisi dei dati le risposte della stimolazione e, se il software di interpolazione della curva non è in grado di trattare gli effetti di tale stimolazione di lieve entità, si può fare ricorso a un'interpolazione lineare con bootstrapping. Se la stimolazione è estrema, è possibile considerare l'uso di un modello di ormesi (18).
Inibizione di origine non tossica della crescita
60.
I materiali in esame che assorbono la luce possono causare una diminuzione del tasso di crescita per effetto della riduzione della quantità di luce disponibile. Occorre distinguere questi tipi di effetti fisici dagli effetti tossici modificando le condizioni sperimentali e riportandoli separatamente nella relazione. I riferimenti (2) e (3) forniscono orientamenti al riguardo.
RELAZIONE SULLA PROVA
61.
La relazione sulla prova deve includere le informazioni indicate di seguito.
Sostanza chimica in esame:
—
stato fisico e proprietà fisico-chimiche pertinenti, compreso il limite di solubilità in acqua,
—
dati di identificazione chimica (per esempio il numero CAS), compresa la purezza (impurità).
Specie sperimentali:
—
ceppo, fornitore o provenienza e condizioni di coltura utilizzate.
Condizioni sperimentali:
—
data di inizio e durata della prova,
—
descrizione del disegno sperimentale: recipienti, volumi delle colture, densità della biomassa all'inizio della prova,
—
composizione del mezzo,
—
concentrazioni di prova e repliche (per esempio, numero di repliche, numero di concentrazioni di prova e progressione geometrica applicata),
—
descrizione dei metodi di preparazione delle soluzioni di prova, ivi compreso l'uso di solventi ecc.,
—
apparecchiatura per le colture,
—
intensità e qualità dell'illuminazione (fonte, omogeneità),
—
temperatura;
—
concentrazioni saggiate: concentrazioni di prova nominali e tutti i risultati delle analisi volte a determinare la concentrazione della sostanza chimica in esame nei recipienti di prova; vanno indicati anche l'efficienza di recupero del metodo e il limite di quantificazione nella matrice di prova,
—
tutte le differenze rispetto al presente metodo di prova,
—
metodo di determinazione della biomassa e dimostrazione della correlazione tra il parametro misurato e il peso secco.
Risultati:
—
pH all'inizio e alla fine della prova in tutti i recipienti trattati,
—
biomassa in ciascun recipiente in ciascun punto di misura e metodo di misura della biomassa,
—
curve di crescita (biomassa in funzione del tempo),
—
variabili di risposta calcolate per ciascuna replica trattata, con valore medio e coefficiente di variazione delle repliche,
—
rappresentazione grafica della relazione concentrazione-risposta,
—
stima della tossicità per le variabili di risposta, per esempio EC50, EC10 e EC20 e relativi intervalli di confidenza. Qualora siano calcolate, la LOEC e la NOEC e i metodi statistici utilizzati per determinarle,
—
se è stata eseguita un'analisi ANOVA, la portata dell'effetto individuato (per esempio, la differenza meno significativa),
—
eventuali stimoli della crescita osservati in qualsiasi gruppo trattato,
—
eventuali altri effetti osservati, per esempio alterazione morfologica delle alghe,
—
discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni su di essi dovute a eventuali differenze rispetto al presente metodo di prova.
BIBLIOGRAFIA
(1)
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(4)
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(5)
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(11)
OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
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(14)
Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
(15)
Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
(16)
Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.
(17)
Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.
(18)
Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
Appendice 1
Definizioni
Ai fini del presente metodo di prova sono usate le definizioni e le abbreviazioni seguenti.
Biomassa: peso secco della materia vivente presente in una popolazione espresso in funzione di un determinato volume, ad esempio mg di alghe per litro di soluzione di prova. La biomassa di solito corrisponde alla massa, ma ai fini della presente prova questo termine è utilizzato per riferirsi alla massa per unità di volume. Dato che nella presente prova la biomassa è in genere misurata indirettamente, tramite conteggio delle cellule, fluorescenza ecc., l'uso del termine “biomassa” si riferisce anche a queste misurazioni alternative.
Coefficiente di variazione (CV): misura adimensionale della variabilità di un parametro, definita come il rapporto della deviazione standard rispetto alla media. Può essere espresso anche con una percentuale. Il coefficiente medio di variazione del tasso di crescita specifico medio nelle repliche delle colture di controllo deve essere calcolato come segue:
1.
calcolare il CV (in percentuale) del tasso di crescita specifico medio a partire dai tassi di crescita quotidiani/sezione per sezione di ciascuna replica;
2.
calcolare il valore medio di tutti i valori calcolati al punto 1 per ottenere il coefficiente medio di variazione del tasso di crescita specifico quotidiano/sezione per sezione nelle repliche delle colture di controllo.
Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC — Lowest Observed Effect Concentration): concentrazione più bassa saggiata di una sostanza alla quale si osserva un effetto di riduzione statisticamente significativo della crescita (p < 0,05) rispetto al controllo, nell'arco di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e di conseguenza la NOEC).
Concentrazione senza effetti osservati (NOEC — No Observed Effect Concentration): concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC.
ECx: concentrazione della sostanza disciolta nel mezzo di prova che causa una riduzione dell'x % (per esempio del 50 %) della crescita dell'organismo sperimentale entro un periodo di esposizione definito (che deve essere esplicitato se diverso dalla durata completa o normale della prova). Per indicare in modo inequivoco se il valore EC si riferisce al tasso di crescita o al rendimento si utilizzano, rispettivamente, le abbreviazioni “ErC” e “EyC”.
Mezzo di crescita: mezzo sintetico completo di coltura in cui le alghe crescono quando sono esposte alla sostanza chimica in esame. Quest'ultima è di norma disciolta nel mezzo di prova.
Rendimento: valore di una variabile di misurazione che esprime la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e il valore della stessa variabile all'inizio del periodo di esposizione, utilizzata per esprimere l'aumento della biomassa durante la prova.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio): aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione.
Tasso di crescita specifico: variabile di risposta che corrisponde al quoziente della differenza dei logaritmi naturali di un parametro di osservazione (nel presente metodo di prova, la biomassa) e il periodo di tempo rispettivo.
Variabile di risposta: variabile per la stima della tossicità dedotta da qualsiasi parametro misurato che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. Per questo metodo i tassi di crescita e rendimento sono variabili di risposta ricavati dalla misura diretta della biomassa o di qualsiasi metodo alternativo menzionato.
Appendice 2
Ceppi dimostratisi idonei alla prova
Alghe verdi
Pseudokirchneriella subcapitata, (già nota come Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG
Desmodesmus subspicatus (già nota come Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG
Indicazioni particolari per la coltura e la manipolazione delle specie sperimentali raccomandate
Pseudokirchneriella subcapitata e Desmodesmus subspicatus
Queste alghe verdi sono generalmente facili da coltivare in vari mezzi di coltura. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Le cellule sono generalmente separate e la densità cellulare si misura facilmente con un contatore elettronico di particelle o al microscopio.
Anabaena flos-aquae
La coltura madre si conserva in vari mezzi di crescita. In particolar modo si deve evitare che la coltura batch abbia superato la fase esponenziale di crescita al momento del rinnovo, poiché il recupero è difficile a questo punto.
Anabaena flos-aquae forma catene di cellule raccolte in spirali (aggregati). La dimensione di tali aggregati varia in funzione delle condizioni di coltura. Per determinare la biomassa può essere necessario spezzare tali aggregati per contare le cellule al microscopio o con contatore elettronico di particelle.
Le catene di sottocampioni possono essere spezzate in vari punti mediante sonicazione, per ridurre la variabilità di calcolo. Processi di sonicazione più lunghi del necessario per spezzare le catene in piccoli segmenti potrebbero distruggere le cellule. L'intensità e la durata della sonicazione devono essere identiche per ciascun gruppo trattato.
Per contribuire a compensare la variabilità si contino sufficienti campi nella griglia dell'emocitometro (almeno 400). Ciò aumenterà l'affidabilità delle determinazioni della densità al microscopio.
Dopo aver diviso le catene di cellule mediante attenta sonicazione, il volume cellulare totale di Anabaena può essere determinato utilizzando un contatore elettronico di particelle. La potenza della sonicazione deve essere regolata in modo da evitare di rompere le cellule.
Utilizzare un agitatore a vortice o strumento analogo per assicurare che la sospensione di alghe utilizzata per inoculare i recipienti di prova sia sufficientemente mescolata e omogenea.
I recipienti di prova devono essere posti su agitatori da banco reciproci o orbitali a circa 150 rpm. In alternativa, l'Anabaena può anche essere agitata ad intermittenza per evitare la formazione di aggregati. Qualora invece ciò avvenga, si provvederà a prelevare campioni rappresentativi ai fini della misura della biomassa. Un'agitazione vigorosa prima del prelievo può essere necessaria per disgregare gli ammassi algali.
Synechococcus leopoliensis
La coltura madre si conserva in diversi mezzi di crescita. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati.
Synechococcus leopoliensis cresce formando bastoncelli isolati. La minuscola dimensione delle cellule ne rende difficile la conta al microscopio ai fini della misura della biomassa. In questo caso, è utile disporre di un contatore elettronico capace di contare particelle di dimensione fino a 1 μm. È applicabile anche la misurazione fluorimetrica in vitro.
Navicula pelliculosa
La coltura madre si conserva in diversi mezzi di crescita. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Si noti che in questo caso deve essere aggiunto silicato.
Navicula pelliculosa può formare aggregati in alcune condizioni colturali. A causa della produzione lipidica, le cellule algali tendono a volte ad accumularsi nella pellicola che si forma in superficie. Se ciò avviene, si devono prendere misure apposite durante il prelievo di sottocampioni ai fini della determinazione della biomassa per garantire la rappresentatività dei campioni. Può risultare necessaria un'agitazione vigorosa, per esempio tramite un agitatore a vortice.
Appendice 3
Mezzi di crescita
Può essere utilizzato uno dei due mezzi di crescita seguenti.
—
Mezzo OCSE: mezzo originale della linea guida n. 201 dell'OCSE, anche conforme alla norma ISO 8692
—
Mezzo AAP dell'EPA (USA), anche conforme all'ASTM.
Nella preparazione di questi mezzi occorre utilizzare sostanze chimiche di grado reagente o analitico e acqua deionizzata.
Composizione del mezzo AAP (EPA USA) e di quello indicato nella linea guida n. 201 dell'OCSE
Componente
AAP
OCSE
mg/l
mM
mg/l
mM
NaHCO3
15,0
0,179
50,0
0,595
NaNO3
25,5
0,300
NH4Cl
15,0
0,280
MgCl2 6H2O
12,16
0,0598
12,0
0,0590
CaCl2 · 2(H2O)
4,41
0,0300
18,0
0,122
MgSO4 · 7(H2O)
14,6
0,0592
15,0
0,0609
K2HPO4
1,044
0,00599
KH2PO4
1,60
0,00919
FeCl3 · 6(H2O)
0,160
0,000591
0,0640
0,000237
Na2EDTA · 2(H2O)
0,300
0,000806
0,100
0,000269*
H3BO3
0,186
0,00300
0,185
0,00299
MnCl2 · 4(H2O)
0,415
0,00201
0,415
0,00210
ZnCl2
0,00327
0,000024
0,00300
0,0000220
CoCl2 · 6(H2O)
0,00143
0,000006
0,00150
0,00000630
Na2MoO4 · 2(H2O)
0,00726
0,000030
0,00700
0,0000289
CuCl2 2(H2O)
0,000012
0,00000007
0,00001
0,00000006
pH
7,5
8,1
La relazione molare dell'EDTA sul ferro è leggermente superiore all'unità. Ciò impedisce al ferro di precipitare e minimizza allo stesso tempo la chelazione degli ioni di metalli pesanti.
Nella prova condotta sulla diatomea Navicula pelliculosa, ai due mezzi deve essere aggiunto Na2SiO3 · 9H2O, per raggiungere una concentrazione di 1,4 mg di Si/l.
Il pH del mezzo è ottenuto al punto di equilibrio tra il sistema carbonato del mezzo e la pressione parziale di CO2 nell'aria atmosferica. La relazione approssimativa tra il pH a 25 °C e la concentrazione molare di bicarbonato è espressa dalla seguente formula:
pHeq = 11,30 + log [HCO3]
Con 15 mg/l NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (mezzo USA-EPA) e con 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (mezzo OCSE).
Composizione degli elementi del mezzo di prova
Elemento
AAP
OCSE
mg/l
mg/l
C
2,144
7,148
N
4,202
3,927
P
0,186
0,285
K
0,469
0,459
Na
11,044
13,704
Ca
1,202
4,905
Mg
2,909
2,913
Fe
0,033
0,017
Mn
0,115
0,115
Preparazione del mezzo OCSE
Nutriente
Concentrazione nella soluzione madre
Soluzione madre 1:
macronutrienti
NH4Cl
1,5 g/l
MgCl2 · 6H2O
1,2 g/l
CaCl2 · 2H2O
1,8 g/l
MgSO4 · 7H2O
1,5 g/l
KH2PO4
0,16 g/l
Soluzione madre 2:
ferro
FeCl3 · 6H2O
64 mg/l
Na2EDTA · 2H2O
100 mg/l
Soluzione madre 3:
oligoelementi
H3BO3
185 mg/l
MnCl2 · 4H2O
415 mg/l
ZnCl2
3 mg/l
CoCl2 · 6H2O
1,5 mg/l
CuCl2 · 2H2O
0,01 mg/l
Na2MoO4 · 2H2O
7 mg/l
Soluzione madre 4:
bicarbonato
NaHCO3
50 g/l
Na2SiO3 · 9H20
Le soluzioni madre sono sterilizzate mediante filtrazione su membrana (diametro medio dei pori: 0,2 μm) o con autoclavaggio (15 minuti a 120 °C). Conservare le soluzioni al riparo dalla luce e alla temperatura di 4 °C.
Le soluzioni madre 2 e 4 sono sterilizzate solo mediante filtrazione su membrana e non devono essere sottoposte ad autoclavaggio.
Preparare il mezzo di crescita aggiungendo all'acqua un volume adeguato delle soluzioni madre da 1 a 4.
Aggiungere a 500 ml di acqua sterilizzata:
10 ml di soluzione madre 1
1 ml di soluzione madre 2
1 ml di soluzione madre 3
1 ml di soluzione madre 4
Portare a 1 000 ml con acqua sterilizzata.
Attendere che il preparato raggiunga l'equilibrio con il CO2 atmosferico, se necessario facendo gorgogliare aria sterile e filtrata per alcune ore.
Preparazione del mezzo AAP
1.
Aggiungere 1 ml di ciascuna soluzione madre di cui ai seguenti punti 2.1-2.7 a circa 900 ml di acqua deionizzata o distillata e diluire fino al volume di 1 litro.
2.
Preparare le soluzioni madre macronutrienti sciogliendo i seguenti composti in 500 ml di acqua deionizzata o distillata. I reagenti 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4 possono essere combinati in un'unica soluzione madre.
2.1
NaNO3
12,750 g
2.2
MgCl2 6H2O
6,082 g
2.3
CaCl2 · 2H2O
2,205 g
2.4
Soluzione madre micronutriente (cfr. punto 3).
2.5
MgSO4 · 7H2O
7,350 g
2.6
K2HPO4
0,522 g
2.7
NaHCO3
7,500 g
2.8
Na2SiO3 · 9H2O
Cfr. nota 1.
Nota 1: da utilizzare solo per le diatomee. Può essere aggiunto direttamente (202,4 mg) o tramite soluzione madre per raggiungere una concentrazione finale di 20 mg/l di Si nel mezzo.
3.
La soluzione madre micronutriente è preparata sciogliendo i seguenti composti in 500 ml di acqua deionizzata o distillata:
3.1
H3BO3
92,760 mg
3.2
MnCl2 · 4H2O
207,690 mg
3.3
ZnCl2
1,635 mg
3.4
FeCl3 · 6H2O
79,880 mg
3.5
CoCl2 · 6H2O
0,714 mg
3.6
Na2MoO4 · 2H2O
3,630 mg
3.7
CuCl2 · 2H2O
0,006 mg
3.8
Na2EDTA · 2H2O
150,000 mg [disodio (etilendiamina-)tetracetato]
3.9
Na2SeO4 · 5H2O
0,005 mg. Cfr. nota 2.
Nota 2: da utilizzare soltanto nel mezzo per le soluzioni madre di diatomee.
4.
Regolare il pH a 7,5 ± 0,1 con 0,1 N oppure 1,0 N NaOH o HCl.
5.
Filtrare il mezzo in un contenitore sterile attraverso un filtro a membrana con pori di 0,22 μm se si utilizza un contatore di particelle, oppure attraverso un filtro con pori di 0,45 μm se non si utilizza il contatore di particelle.
6.
Conservare il mezzo al riparo dalla luce, alla temperatura di circa 4 °C fino all'utilizzo.
Appendice 4
Esempio di metodo di coltura delle alghe
Osservazioni generali
La preparazione di colture sulla base del seguente metodo serve per ottenere colture algali destinate alle prove di tossicità.
Occorre procedere in modo da preservare le colture algali da qualsiasi contaminazione batterica. Può essere utile avviare colture axeniche, ma devono essere utilizzate colture unialgali.
Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili per evitare ogni contaminazione con batteri e altre alghe.
Apparecchiatura e materiale
Si veda alla voce “Apparecchiatura” del metodo di prova.
Metodo per ottenere colture algali
Preparazione di soluzioni nutritive (mezzi)
Tutti i sali minerali del mezzo sono preparati sotto forma di soluzioni madre concentrate e conservate al freddo e al riparo dalla luce. Queste soluzioni sono sterilizzate tramite filtrazione o autoclavaggio.
Preparare il mezzo aggiungendo la giusta quantità di soluzione madre all'acqua distillata sterile, facendo attenzione ad evitare ogni rischio di infezione. Per i mezzi solidi, aggiungere 0,8 % di agar.
Coltura madre
Le colture madri che fungono da materiale di prova iniziale sono piccole colture algali trasferite con regolarità su mezzo fresco. Se le colture non vengano usate con regolarità, esse vanno strisciate su provette inclinate riempite di agar. Le colture sono trasferite su mezzo fresco almeno una volta ogni due mesi.
Le colture madri sono coltivate in beute contenenti il mezzo adeguato (volume di circa 100 ml). Quando le alghe vengono incubate a 20 °C con illuminazione continua, è necessario un trasferimento settimanale.
Durante il trasferimento, una certa quantità di coltura “vecchia” viene trasferita con pipette sterili in una beuta contenente mezzo fresco; la quantità deve essere tale che, nel caso delle specie a crescita rapida, la concentrazione iniziale sia circa 100 volte inferiore di quella della coltura vecchia.
Il tasso di crescita di una specie può essere determinato osservando la curva di crescita. Se questa è nota, è possibile stimare la densità alla quale la coltura deve essere trasferita in un mezzo nuovo. Ciò deve essere fatto prima che la coltura raggiunga la fase di mortalità.
Precoltura
La precoltura serve a fornire un quantitativo di alghe sufficiente per l'inoculo delle colture di prova. La precoltura è incubata alle condizioni sperimentali e utilizzata quando è ancora in crescita esponenziale, solitamente dopo un periodo di incubazione compreso tra 2 e 4 giorni. Qualora contengano cellule deformate o anomale, le colture algali devono essere scartate.
Appendice 5
Analisi dei dati tramite regressione non lineare
Considerazioni generali
La risposta osservata nelle prove sulle alghe e nelle altre prove di crescita di microrganismi (aumento della biomassa) è espressa, per sua natura, da una variabile continua o metrica; tale variabile è data dalla velocità del processo se si utilizza il tasso di crescita o dalla sua integrale in funzione del tempo se si sceglie la biomassa. Queste due variabili sono raffrontate con il corrispondente risultato medio osservato su repliche dei controlli non esposti che presentano la risposta massima alle condizioni imposte, in cui la luce e la temperatura sono i principali fattori determinanti nelle prove sulle alghe. Il sistema è distribuito o omogeneo e la biomassa può essere considerata un continuum, senza considerare le singole cellule. La distribuzione della varianza del tipo di risposta di tale sistema dipende soltanto dai fattori sperimentali (descritti generalmente dalle distribuzioni log- normale o normale dell'errore), contrariamente a quanto avviene negli esperimenti biologici classici i cui effetti sono espressi con dati quantali e per i quali spesso si presume che la tolleranza (generalmente con distribuzione binomiale) di ciascun organismo costituisca la componente dominante della varianza. In questo caso, le risposte dei controlli hanno valore zero o quello del livello di fondo.
Nella situazione semplice, la risposta normalizzata o relativa (r) diminuisce monotonicamente da 1 (inibizione nulla) a 0 (inibizione al 100 %). Si noti che tutte le risposte hanno un errore associato e che le inibizioni negative evidenti possono essere calcolate come risultato del solo errore casuale.
Analisi della regressione
Modelli
Un'analisi della regressione mira a descrivere quantitativamente la curva concentrazione-risposta sotto forma di funzione matematica della regressione Y = f (C) o, più frequentemente, F (Z) dove Z = log C. La funzione inversa, C = f– 1 (Y) permette di calcolare i valori ECx, compresi i valori EC50, EC10 e EC20, e i corrispondenti limiti di confidenza a 95 %. Molte funzioni matematiche semplici hanno dimostrato di descrivere correttamente la relazione concentrazione-risposta ottenuta nelle prove di inibizione della crescita delle alghe. Fra dette funzioni rientrano, per esempio, l'equazione logistica, l'equazione asimmetrica di Weibull e la distribuzione log-normale, che sono tutte curve sigmoidee tendenti asintoticamente a zero per C → 0 e a 1 per C → infinito.
L'uso di modelli di funzioni soglia continue (per esempio il modello di Kooijman per “l'inibizione della crescita della popolazione”, Kooijman et al, 1996) costituisce una soluzione proposta recentemente in alternativa ai modelli asintotici. Questo modello suppone che non si producano effetti a concentrazioni inferiori ad una certa soglia, EC0 +, stimata tramite estrapolazione della relazione concentrazione-risposta che consiste nell'intercettare l'asse delle concentrazioni per mezzo di una funzione continua semplice non differenziabile al punto di partenza.
Si fa presente che l'analisi può essere una semplice minimizzazione delle somme dei quadrati dei residui (supponendo che la varianza sia costante) o dei quadrati ponderati se l'eterogeneità della varianza è compensata.
Procedimento
Scegliere un'equazione funzionale adeguata, Y = f (C), e interpolare i dati con una regressione non lineare. Utilizzare preferibilmente le misure rilevate in ciascuna beuta anziché i valori medi delle repliche, per trarre quante più informazioni possibile dai dati. D'altra parte, se la varianza è elevata, l'esperienza pratica induce a supporre che le medie delle repliche possono fornire una stima matematica più solida, meno influenzata dagli errori casuali dei dati rispetto a ciascun punto preso singolarmente.
Rappresentare su un grafico i valori misurati e la curva interpolata e verificare se l'interpolazione è adeguata. L'analisi dei valori residui può essere uno strumento particolarmente utile a questo proposito. Se la funzione scelta per interpolare la curva concentrazione-risposta non descrive bene l'intera curva o un segmento fondamentale di questa, per esempio l'effetto alle basse concentrazioni, si scelga un altro modello di interpolazione, per esempio una curva asimmetrica, quale la funzione di Weibull, anziché la funzione simmetrica. Le inibizioni negative possono porre problemi con, per esempio, la funzione di distribuzione log-normale, che richiede parimenti una funzione alternativa di regressione. È sconsigliato assegnare un valore nullo o un valore positivo di piccola entità a questi valori negativi perché ciò distorce la distribuzione degli errori. Per stimare i valori di ECxlow può essere utile procedere a interpolazioni separate su parti della curva, per esempio il segmento in cui l'inibizione relativa è bassa. Sulla base dell'equazione interpolata (con “stima inversa”, C = f– 1 (Y)), calcolare stime specifiche caratteristiche della ECx e riportare almeno la EC50 e una o due ECxlow. L'esperienza maturata nelle prove pratiche ha dimostrato che la precisione della prova sulle alghe permette generalmente di ottenere una stima ragionevolmente precisa con soglia di inibizione del 10 % se i punti disponibili sono sufficientemente numerosi — a meno che non si produca una stimolazione alle basse concentrazioni, che renderebbe confusi i risultati della prova. La precisione della stima dei valori EC20 è spesso migliore di quelli EC10, perché la EC20 si situa generalmente sulla parte quasi lineare della curva centrale concentrazione-risposta. A volte, la EC10 può essere difficile da interpretare a causa della stimolazione di crescita, di modo che, sebbene la EC10 si ottenga generalmente con una precisione sufficiente, si raccomanda di riportare sempre anche la EC20.
Fattori di ponderazione
In generale, la varianza sperimentale non è costante e include una componente proporzionale; per questo motivo risulta opportuno procedere regolarmente ad una regressione ponderata. I fattori di ponderazione per tale analisi sono generalmente considerati inversamente proporzionali alla varianza:
Wi = 1/Var(ri)
Molti programmi di regressione permettono di effettuare un'analisi della regressione ponderata con fattori di ponderazione riportati in una tabella. Per maggiore semplicità, conviene normalizzare i fattori di ponderazione moltiplicandoli per n/Σ wi (n è il numero dei punti) di modo che la loro somma risulti 1.
Normalizzare le risposte
La normalizzazione con il valore medio delle risposte dei controlli pone alcuni problemi di principio e dà luogo ad una struttura della varianza piuttosto complicata. Dividendo i valori ottenuti dalle prove per il valore medio ottenuto dai controlli al fine di ottenere la percentuale di inibizione, si introduce un errore supplementare dovuto all'errore sulla media dei controlli. A meno che l'errore sia trascurabile, si devono correggere i fattori di ponderazione applicati alla regressione e i limiti di confidenza in funzione della covarianza con il controllo (Draper and Smith, 1981). Si sottolinea l'importanza di ottenere un'elevata precisione nella stima della media dei valori di controllo, per ridurre al minimo la varianza complessiva delle risposte relative. Tale varianza si calcola con la seguente formula:
(il deponente i è riferito al livello di concentrazione i e il deponente 0 ai controlli)
Yi = risposta relativa = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)
con una varianza Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri) · Var(ri) + ((∂ Yi / ∂ r0)2 · Var(r0)
e poiché (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 and (∂ Y I/ ∂ r0) = ri/r02
con una distribuzione normale dei dati e delle repliche mi and m0 replicates: Var(ri ) = σ2/mi
la varianza totale della risposta relativa, Yi diventa quindi:
Var(Yi) = σ2/(r02 · mi) + ri2 · σ2/r04 · m0
L'errore sulla media dei controlli è inversamente proporzionale alla radice quadrata del numero di repliche dei controlli utilizzato per il calcolo della media, e a volte è giustificato includere dati storici, riducendo così l'errore in modo sensibile. Un metodo alternativo consiste nel non normalizzare i dati né interpolare i valori relativi alle risposte assolute, ivi comprese le risposte dei controlli, bensì introdurre il valore della risposta dei controlli come parametro aggiuntivo da interpolare mediante regressione non lineare. Con una classica equazione di regressione a due parametri, questo metodo richiede l'interpolazione di 3 parametri e richiede pertanto più punti rispetto alla regressione non lineare su dati normalizzati utilizzando un valore predeterminato della risposta dei controlli.
Intervalli di confidenza inversi
Il calcolo degli intervalli di confidenza di una regressione non lineare mediante una stima inversa è abbastanza complesso e generalmente non rientra fra le opzioni standard dei normali programmi informatici di calcolo statistico. Intervalli di confidenza approssimativi possono essere ottenuti con programmi classici di regressione non lineare, tramite una riparametrizzazione (Bruce e Versteeg, 1992) consistente nel riformulare l'equazione matematica con le stime desiderate, per esempio la EC10 e la EC50, come parametri da stimare [data la funzione I = f (α, β, concentrazione), si utilizzino le relazioni di definizione f (α, β, EC10) = 0,1 e f (α, β, EC50) = 0,5 per sostituire f (α, β, concentrazione) con una funzione equivalente g (EC10, EC50, concentrazione].
Un calcolo più diretto (Andersen et al, 1998) consiste nel mantenere l'equazione di origine e applicare un'espansione di Taylor attorno alle medie di ri e r0.
Negli ultimi anni si sono diffusi i metodi bootstrapping. Questi metodi utilizzano i dati misurati e un ricampionamento frequente diretto da un generatore di numeri casuali, per stimare la distribuzione empirica della varianza.
BIBLIOGRAFIA
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.
Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.
Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem.11, 1485-1494
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricoltural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.
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(4)
Il capitolo C.11 è sostituito dal seguente:
«
C. 11. FANGHI ATTIVI, PROVA DI INIBIZIONE DELLA RESPIRAZIONE (OSSIDAZIONE DEL CARBONIO E DELL'AMMONIO)
INTRODUZIONE
1.
Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 209 (2010). Si tratta della descrizione di un metodo per la determinazione degli effetti di una sostanza chimica sui microrganismi dei fanghi attivi (in gran parte batteri), misurandone i tassi di respirazione (ossidazione del carbonio e/o dell'ammonio) in determinate condizioni in presenza di diverse concentrazioni della sostanza in esame. Il metodo di prova si basa sul test messo a punto dall'ETAD (The Ecological and Toxicological Association of Dyes and Organic Pigments Manufacturers) (1) e (2), sulla precedente linea guida dell'OCSE n. 209 (3) e sulla norma ISO 8192 rivista (4). Il metodo di prova ha lo scopo di fornire un procedimento rapido di screening per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui microrganismi dei fanghi attivi nella fase biologica (aerobica) dei trattamenti negli impianti di depurazione delle acque reflue. I risultati della prova possono anche servire da indicatore delle concentrazioni idonee e non inibitrici delle sostanze chimiche in esame da utilizzare nelle prove di biodegradabilità (ad esempio i capitoli C.4 A-F, C.9, C.10, C.12 e C.29 del presente allegato, la linea guida OCSE n. 302C). In tal caso, la prova può essere eseguita come prova di screening, simile a una prova di definizione dell'intervallo delle concentrazioni o a una prova limite (cfr. paragrafo 39), prendendo in considerazione unicamente la respirazione totale. Tuttavia, è opportuno tener conto con cautela di queste informazioni per le prove di pronta biodegradabilità (cfr. capitolo C.4, A-F, e capitolo C.29 del presente allegato), per le quali la concentrazione dell'inoculo è significativamente inferiore a quella utilizzata nel presente metodo di prova. Infatti, l'assenza di inibizione in questa prova di respirazione non garantisce automaticamente condizioni inibitorie nelle prove di pronta biodegradabilità dei capitoli C.4, A-F, o C.29 del presente allegato.
2.
Nel complesso, la prova di inibizione della respirazione sembra essere stata applicata con successo da quando è stata pubblicata per la prima volta, ma in alcuni casi sono stati segnalati risultati spuri, ad esempio (2) (4) (5). Quindi, le curve di respirazione in funzione della concentrazione a volte risultano bifasiche, i tracciati dose-risposta possono essere distorti e i valori EC50 sono risultati inaspettatamente bassi (5). Dalle indagini è emerso che tali risultati si ottengono in caso di prove su fanghi attivi notevolmente nitrificanti e se la sostanza chimica in esame ha un effetto maggiore sull'ossidazione dell'ammonio che sulla generale ossidazione eterotrofica. Pertanto, è possibile ovviare ai risultati spuri mediante ulteriori prove, utilizzando un apposito inibitore della nitrificazione. Misurando il tasso di consumo di ossigeno in presenza e in assenza di un inibitore (ad esempio N-alliltiourea, ATU), è possibile calcolare il tasso di consumo di ossigeno, rispettivamente, dell'ossidazione totale, dell'ossidazione eterotrofica e della nitrificazione (4) (7) (8). È dunque possibile determinare gli effetti inibitori della sostanza chimica in esame sui due processi ed è possibile calcolare con il metodo classico i valori EC50 sia per l'ossidazione del carbonio organico (eterotrofica) sia per l'ossidazione dell'ammonio (nitrificazione). Va osservato che in alcuni rari casi, l'effetto inibitorio della N-alliltiourea può essere parzialmente o completamente annullato se essa forma dei complessi con le sostanze chimiche in esame o con un additivo del mezzo, per esempio gli ioni Cu++(6). Gli ioni Cu++ sono essenziali per le Nitrosomonas, ma sono tossici in concentrazioni elevate.
3.
La necessità di ricorrere alla nitrificazione nel trattamento aerobico delle acque reflue, in quanto tappa necessaria nel processo di eliminazione dei composti azotati dalle acque reflue mediante denitrificazione e ottenimento di prodotti gassosi, è diventato particolarmente urgente nei paesi europei; l'UE ha attualmente abbassato i limiti massimi di concentrazione dell'azoto negli effluenti trattati riversati nelle acque riceventi (5).
4.
Nella maggior parte dei casi, è sufficiente ricorrere solo al metodo per valutare l'effetto sui processi di ossidazione del carbonio organico. Tuttavia, in alcuni casi è necessario esaminare l'effetto sulla sola nitrificazione, o, separatamente, sulla nitrificazione e sull'ossidazione del carbonio organico, per poter interpretare i risultati e comprendere gli effetti.
PRINCIPIO DELLA PROVA
5.
I tassi di respirazione dei campioni di fanghi attivi alimentati con liquami artificiali sono misurati in una cella chiusa contenente un elettrodo a ossigeno, dopo un periodo di contatto di 3 ore. Per uno scenario d'esposizione realistico, potrebbero essere appropriati dei tempi di contatto più lunghi. Se la sostanza chimica in esame è rapidamente degradata, ad esempio tramite idrolisi abiotica, oppure presenta una volatilità che non permette di mantenerne adeguatamente la concentrazione, è possibile anche utilizzare un tempo di esposizione più corto, ad esempio 30 minuti. Il giorno stesso dell'esposizione occorre controllare la sensibilità di ciascun lotto di fanghi attivi, tramite una sostanza chimica di riferimento adeguata. La prova serve generalmente a determinare il valore ECx (per esempio EC50) della sostanza chimica in esame e/o la sua concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).
6.
È possibile determinare separatamente l'inibizione del consumo di ossigeno da parte dei microrganismi che ossidano il carbonio organico e dei microrganismi che ossidano l'ammonio, ricorrendo alla misura dei tassi di assorbimento di ossigeno in assenza e in presenza di N-alliltiourea, un inibitore specifico dell'ossidazione dell'ammonio in nitriti da parte dei batteri nitrificanti della prima fase. In questo caso la percentuale di inibizione del tasso di consumo di ossigeno è calcolata comparando il tasso di consumo di ossigeno in presenza della sostanza chimica in esame con il tasso medio di consumo di ossigeno dei controlli corrispondenti senza la sostanza chimica in esame, sia in presenza sia in assenza dell'inibitore specifico (N-alliltiourea).
7.
Il calcolo del tasso di consumo di ossigeno in miscele acquose contenenti la sostanza chimica in esame e liquame artificiale, senza i fanghi attivi, permette di determinare ogni consumo di ossigeno derivante da processi abiotici.
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
8.
È necessario disporre dell'identificazione chimica (di preferenza il numero CAS), del nome (di preferenza il nome IUPAC), delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, tensione di vapore, volatilità e adsorbimento della sostanza chimica in esame, in modo da permettere la corretta interpretazione dei risultati. Le sostanze chimiche volatili non possono normalmente essere sottoposte a prova in modo adeguato, se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. paragrafo 21).
APPLICABILITÀ DEL METODO DI PROVA
9.
Il metodo di prova può essere applicato alle sostanze chimiche idrosolubili, scarsamente solubili e volatili. Tuttavia, non è sempre possibile ottenere i valori EC50 con sostanze chimiche limitatamente solubili; inoltre, è possibile ottenere risultati validi con sostanze chimiche volatili soltanto a condizione che la maggior parte (per esempio > 80 %) della sostanza chimica in esame rimanga nella miscela di reazione alla fine del o dei periodi di esposizione. In caso di incertezza sulla stabilità o volatilità della sostanza chimica in esame, è necessario fornire dati analitici supplementari che permettano di stabilire la concentrazione corrispondente di ECx.
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO
10.
Le sostanze chimiche di riferimento devono essere testate periodicamente al fine di garantire che il metodo e le condizioni di prova siano affidabili, e per verificare la sensibilità di ciascun lotto di fanghi attivi utilizzati come inoculo batterico il giorno stesso dell'esposizione. La sostanza raccomandata come sostanza chimica inibitrice di riferimento è il 3,5-diclorofenolo (3,5-DCP), in quanto si tratta di un noto inibitore della respirazione e viene utilizzato in vari tipi di prove di inibizione/tossicità (4). Anche il solfato di rame (II) pentaidrato può essere utilizzato come sostanza chimica di riferimento per l'inibizione della respirazione totale (9). La N-metilanilina può essere utilizzata come inibitore di riferimento specifico della nitrificazione (4).
CRITERI DI VALIDITÀ E RIPRODUCIBILITÀ
11.
Il tasso di consumo di ossigeno dei controlli in bianco (senza la sostanza chimica in esame o la sostanza chimica di riferimento) non deve essere inferiore a 20 mg di ossigeno per un grammo di fanghi attivi (peso secco dei solidi sospesi) all'ora. Se il tasso è inferiore, la prova deve essere ripetuta con fanghi attivi lavati o con fanghi provenienti da un'altra fonte. Il coefficiente di variazione del tasso di consumo di ossigeno nei controlli replicati non deve superare il 30 % alla fine della prova definitiva.
12.
Nel 2004, in una prova interlaboratorio internazionale organizzata dall'ISO (4) che utilizzava fanghi attivi provenienti da liquami domestici, il valore EC50 del 3,5-DCP è risultato essere compreso nell'intervallo tra 2 mg/l e 25 mg/l per la respirazione totale, tra 5 mg/l e 40 mg/l per la respirazione eterotrofica e tra 0,1 mg/l e 10 mg/l per la respirazione legata alla nitrificazione. Se il valore EC50 del 3,5-DCP non si situa nell'intervallo previsto, occorre ripetere la prova con fanghi attivi provenienti da un'altra fonte. Il valore EC50 del solfato di rame (II) pentaidrato deve essere compreso nell'intervallo 53-155 mg/l per la respirazione totale (9).
DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA
Recipienti e apparecchiature di prova
13.
Occorre utilizzare normali apparecchiature di laboratorio e quanto indicato di seguito:
a)
recipienti di prova — usare ad esempio becher da 1 000 ml per contenere 500 ml di miscela di reazione (cfr. punto 5, fig. 1);
b)
cella e dispositivi di fissaggio per misurare la concentrazione di ossigeno disciolto; un idoneo elettrodo a ossigeno; una cella chiusa per contenere il campione senza spazio di testa e un registratore (cfr. ad esempio i punti 7, 8, 9, figura 1 dell'appendice 2). In alternativa, è possibile utilizzare una bottiglia per BOD con un manicotto idoneo che consenta di sigillare l'elettrodo a ossigeno al collo della bottiglia (cfr. figura 2 dell'appendice 3). Per evitare la perdita di liquido per sversamento quando si inserisce l'elettrodo a ossigeno, è opportuno inserire dapprima un imbuto o un tubo di vetro attraverso il manicotto oppure utilizzare recipienti con bordi svasati. In entrambi i casi è opportuno utilizzare un agitatore magnetico o un metodo di agitazione alternativo, ad esempio una sonda auto-agitatrice;
c)
agitatori e ancorette magnetici, ricoperti di materiale inerte, destinati ad essere utilizzati nella camera di misurazione e/o nei recipienti di prova;
d)
dispositivo di aerazione: se necessario, far passare aria compressa attraverso un filtro appropriato per eliminare polvere e olio e attraverso bottiglie di lavaggio contenenti acqua per umidificare l'aria. Il contenuto dei recipienti va aerato con pipette Pasteur, o altri dispositivi di aerazione che non adsorbono sostanze chimiche. È possibile utilizzare un agitatore orbitale operante a velocità comprese tra 150 e 250 giri al minuto con matracci da 2 000 ml di capacità, ad esempio, per soddisfare la domanda di ossigeno dei fanghi e superare difficoltà derivanti da sostanze chimiche che producono eccessiva schiuma, oppure sono volatili e rischiano di sfuggire al mezzo reattivo, o che sono difficili da disperdere se aerate mediante gorgogliamento. Il sistema di prova consiste di solito in una serie di becher aerati in modo continuo e in scala sequenziale (ad esempio, a intervalli di circa 10-15 minuti) e poi analizzati nello stesso ordine. È possibile utilizzare qualsiasi strumentazione certificata che consenta, simultaneamente, di aerare e misurare il tasso di consumo di ossigeno nelle miscele;
e)
pH-metro;
f)
centrifuga, centrifuga da laboratorio classica per fanghi in grado di girare a 10 000 m/s2.
Reagenti
14.
Occorre utilizzare sempre reagenti di grado analitico.
Acqua
15.
Utilizzare acqua distillata o deionizzata, contenente meno di 1 mg/l di DOC, salvo quando viene prescritto l'uso di acqua di rubinetto non clorata.
Liquami artificiali
16.
La composizione qualitativa e quantitativa del mezzo è la seguente:
—
peptone
16 g
—
estratto di carne (o estratto vegetale comparabile)
11 g
—
urea
3 g
—
cloruro di sodio (NaCl)
0,7 g
—
cloruro di calcio diidrato (CaCl2,2H2O)
0,4 g
—
solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4,7H20)
0,2 g
—
monoidrogenofosfato di potassio anidro (K2HPO4)
2,8 g
—
acqua distillata o deionizzata per 1 litro
17.
Questa soluzione deve avere un PH pari a 7,5 ± 0,5. Se non viene utilizzata subito, la soluzione preparata dovrà essere conservata al buio a temperature comprese tra 0 °C e 4 °C per una settimana al massimo, o in condizioni tali da non subire alterazioni nella composizione. Occorre osservare che questo liquame artificiale è 100 volte più concentrato di quello descritto nella relazione tecnica dell'OCSE “Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents”, dell'11 giugno 1976, con inoltre l'aggiunta di idrogenofosfato dipotassico.
18.
In alternativa, i componenti del mezzo di coltura possono essere sterilizzati individualmente prima dello stoccaggio, oppure il peptone e l'estratto di carne possono essere aggiunti poco prima di effettuare l'analisi. Prima dell'uso, il mezzo deve essere accuratamente mescolato ed il suo pH dovrà essere corretto se necessario fino a portarlo a 7,5 ± 0,5.
Sostanza chimica in esame
19.
Per le sostanze in esame facilmente solubili in acqua va preparata una soluzione madre, a una concentrazione che non ecceda il limite di solubilità in acqua (per evitare precipitazioni). Le sostanze scarsamente solubili in acqua, le miscele a base di componenti di varia solubilità e le sostanze adsorbenti vanno pesate direttamente nei recipienti di prova. In casi simili, il ricorso a soluzioni madre può costituire un'alternativa valida se, prima di aggiungere i fanghi attivi, viene svolta un'analisi delle concentrazioni delle sostanze chimiche in esame disciolte nei recipienti di prova. Se si ricorre al metodo Water Accommodated Fractions (WAF), è altresì necessario determinare analiticamente le concentrazioni delle sostanze chimiche in esame disciolte nei recipienti di prova. Occorre evitare di utilizzare solventi organici, emulsionanti/disperdenti per migliorare la solubilità. È possibile trattare con ultrasuoni le soluzioni madre e pre-agitare le sospensioni, ad esempio la notte precedente, se la stabilità della sostanza chimica in esame è sufficientemente attestata in tali condizioni.
20.
La sostanza chimica in esame potrebbe influenzare negativamente il pH nel sistema di prova. Prima di procedere alla prova occorre determinare il pH delle miscele con la sostanza chimica in esame attraverso una prova preliminare che stabilisca se vi sia la necessità di regolare il pH prima di svolgere la prova principale e poi, nuovamente, il giorno del suo svolgimento. Le soluzioni/sospensioni acquose della sostanza chimica in esame devono essere neutralizzate prima di aggiungere l'inoculo, se necessario. Tuttavia, poiché la neutralizzazione può modificare le proprietà chimiche della sostanza chimica, è consigliabile procedere a ulteriori prove, a seconda della finalità dello studio, per valutare l'effetto della sostanza in esame sui fanghi quando il pH non è regolato.
21.
Gli effetti tossici delle sostanze chimiche volatili, soprattutto nelle prove in cui l'aria è gorgogliata nel sistema, possono produrre livelli di effetti variabili derivanti da perdite di sostanza nel corso del periodo di esposizione. Occorre quindi procedere con cautela con tali sostanze, effettuando un'analisi specifica della miscela di controllo contenente la sostanza e modificando la modalità di aerazione.
Sostanza chimica di riferimento
22.
Se viene utilizzato il 3,5-diclorofenolo come sostanza chimica di riferimento, occorre preparare una soluzione di 1,00 g di 3,5-diclorofenolo in 1 000 ml di acqua (15). La dissoluzione è accelerata tramite un trattamento ad ultrasuoni e/o l'uso di acqua calda, che servono per portare a volume la soluzione dopo che si è raffreddata a temperatura ambiente. Tuttavia, occorre garantire che la struttura della sostanza chimica di riferimento non venga modificata. Il pH della soluzione va controllato e regolato a 7 — 8, se necessario, con l'aggiunta di NaOH oppure H2SO4.
23.
Se la sostanza chimica di riferimento è il solfato di rame (II) pentaidrato, vengono utilizzate concentrazioni a 58 mg/l, 100 mg/l e 180 mg/l (un fattore pari a 1,8). La sostanza viene pesata direttamente nei recipienti di prova (29 - 50 - 90 mg per 500 ml di volume totale). È poi disciolta in autoclave con 234 ml di acqua di rubinetto. Il solfato di rame (II) pentaidrato è facilmente solubile. A prova iniziata, vengono aggiunti 16 ml di liquame artificiale e 250 ml di fanghi attivi.
Inibitore specifico della nitrificazione
24.
Occorre preparare una soluzione madre di 2,32 g/l di N-alliltiourea (ATU). L'aggiunta di 2,5 ml di questa soluzione madre a una miscela di incubazione del volume finale di 500 ml produce una concentrazione finale di 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), che si sa essere sufficiente (4) a causare il 100 % di inibizione della nitrificazione in fanghi attivi nitrificanti contenenti 1,5 g/l di solidi sospesi.
Controlli abiotici
25.
In rare circostanze, una sostanza chimica in esame con forti proprietà riducenti può comportare un consumo di ossigeno abiotico misurabile. Sono allora necessari controlli abiotici per distinguere tra il consumo abiotico di ossigeno dovuto alla sostanza chimica in esame e quello dovuto alla respirazione microbica. I controlli abiotici sono preparati omettendo l'inoculo dalle miscele sperimentali. Analogamente, è possibile includere controlli abiotici senza inoculo al momento di analizzare la concentrazione ottenuta nella fase di esposizione (ad esempio quando si usano soluzioni madre a base di sostanze chimiche scarsamente idrosolubili oppure miscele di componenti con diversi gradi di idrosolubilità). In casi specifici, può essere necessario preparare un controllo abiotico con inoculo sterilizzato (ad es. sterilizzando in autoclave o aggiungendo sostanze tossiche sterilizzanti). Alcune sostanze chimiche possono produrre o consumare ossigeno solo a condizione che la superficie dove avviene la reazione sia sufficientemente ampia, anche se normalmente necessitano di una temperatura o una pressione molto superiori affinché la reazione abbia luogo. A tale riguardo, bisogna prestare particolare attenzione alle sostanze perossidiche. Un inoculo sterilizzato fornisce una superficie sufficientemente ampia.
Inoculo
26.
I fanghi attivi per uso generale devono essere raccolti all'uscita, o in prossimità dell'uscita, del serbatoio di aerazione di un impianto ben gestito per il trattamento delle acque reflue, alimentato principalmente da liquami domestici. A seconda della finalità della prova, si possono eventualmente utilizzare altri tipi o fonti di fanghi attivi adattati, ad esempio fanghi ricostituiti in laboratorio, con una concentrazione di solidi in sospensione che si situi tra 2 g/l e 4 g/l. Tuttavia, i fanghi provenienti da diversi impianti di trattamento avranno probabilmente caratteristiche e sensibilità diverse.
27.
I fanghi possono essere utilizzati così come sono stati raccolti, ma occorre eliminare le particelle grossolane mediante sedimentazione per un breve periodo, da 5 a 15 minuti, e quindi far decantare o setacciare lo strato superficiale contenente le particelle solide più sottili (setaccio con maglie da 1 mm2). In alternativa, è possibile omogenizzare i fanghi con un miscelatore per circa 15 secondi o più a lungo, ma tenendo debito conto della forza trasversale e del cambiamento di temperatura causati da un periodo di miscelazione prolungato.
28.
È spesso necessario lavare i fanghi, ad esempio quando la velocità di respirazione endogena è bassa. In primo luogo, i fanghi vanno centrifugati per un determinato periodo (ad esempio 10 minuti a circa 10 000 m/s2) per produrre un surnatante chiaro e pellet di solidi delle acque reflue. Il surnatante va scartato e i fanghi risospesi in acqua di rubinetto non clorata, agitandoli; l'acqua di lavaggio va rimossa attraverso una nuova centrifugazione per poi scartarla nuovamente. Il lavaggio e la centrifugazione vanno ripetuti, se necessario. Occorre determinare il peso secco compreso in un determinato volume di fanghi (costituiti da solidi risospesi), che poi vengono concentrati eliminando la frazione liquida oppure, al contrario, vengono diluiti con acqua di rubinetto non clorata in modo da ottenere la concentrazione di solidi richiesta, vale a dire 3 g/l. I fanghi attivi devono essere aerati continuamente (ad es. 2 l/min) alla temperatura della prova e, se possibile, vanno utilizzati il giorno stesso della raccolta. Se non è possibile farlo, i fanghi vanno alimentati quotidianamente con liquame artificiale (50 ml di liquame artificiale per litro di fanghi attivi), per altri due giorni. I fanghi vengono poi utilizzati per la prova: i risultati sono ritenuti validi, a condizione che non venga rilevato alcun cambiamento significativo nella loro attività, rispetto ai tassi di respirazione eterotrofica endogena da un lato e di respirazione legata alla nitrificazione dall'altro.
29.
Nel periodo di incubazione possono insorgere difficoltà dovute all'apparizione di schiuma che, se deborda dai recipienti di aerazione, trasporta con sé particelle solide dei fanghi. In alcuni casi la schiuma è semplicemente prodotta dai liquami artificiali, ma occorre prevedere che si formi se la sostanza chimica in esame è, o contiene, un tensioattivo. La perdita di solidi dei fanghi dalle miscele di prova comporta dei tassi di respirazione artificialmente più bassi che potrebbero essere erroneamente interpretati come risultanti da un'inibizione. Inoltre, l'aerazione di una soluzione di tensioattivi fa concentrare queste sostanze nello strato di schiuma; la perdita di schiuma dal dispositivo di prova renderà più deboli le concentrazioni di esposizione. La schiuma può essere controllata attraverso semplici metodi meccanici (ad esempio tramite agitazione manuale occasionale, con una bacchetta di vetro) o con l'addizione di un agente antischiuma siliconico privo di tensioattivi, e/o aerando attraverso il metodo del dibattimento in pallone. Se il problema è legato alla presenza di liquami artificiali, la composizione di questi ultimi viene modificata dall'aggiunta di un agente antischiuma in proporzione di 50 μl/l, ad esempio. Se è invece la sostanza chimica di prova a causare la schiuma, la quantità necessaria a ridurre la schiuma va determinata per la concentrazione massima, e tutti i recipienti di aerazione sono in seguito trattati con la stessa quantità (compresi quelli che non contengono schiuma, come quelli dei controlli in bianco e i recipienti di riferimento). Qualora siano utilizzati agenti antischiuma, non deve verificarsi alcuna interazione con l'inoculo e/o la sostanza chimica in esame.
PROCEDURA SPERIMENTALE
30.
È possibile determinare l'inibizione di tre diversi consumi di ossigeno (totale, eterotrofico e dovuto alla nitrificazione). Di norma, la misura dell'inibizione totale del consumo di ossigeno può considerarsi adeguata. Tuttavia, conviene determinare gli effetti sul consumo di ossigeno eterotrofico legati all'ossidazione del carbonio organico, da una parte, e all'ossidazione dell'ammonio dall'altra parte, quando alcune sostanze specifiche esigono la valutazione di questi due criteri supplementari oppure (se del caso) per spiegare le curve dose-risposta atipiche relative all'inibizione del consumo di ossigeno totale.
Condizioni sperimentali
31.
La prova va svolta a una temperatura che si situa nell'intervallo 20±2 °C.
Miscele di prova
32.
Le miscele di prova (FT come nella tabella 1) contenenti acqua, liquame artificiale e la sostanza in esame vanno preparate in modo da ottenere diverse concentrazioni nominali della sostanza chimica in esame (cfr. tabella 1 per esempi dei volumi dei componenti). Il pH deve essere aggiustato a 7,5 ± 0,5, se necessario; le miscele sono diluite con acqua e va aggiunto l'inoculo, fino a ottenere gli stessi volumi finali nei recipienti, per poi dare inizio all'aerazione.
Miscele di riferimento
33.
Le miscele di riferimento (FR) sono preparate come le miscele di prova, ma con la sostanza chimica di riferimento, ad esempio 3,5-diclorofenolo, invece della sostanza in esame.
Controlli in bianco
34.
I controlli in bianco (FB) vanno preparati all'inizio e alla fine del periodo di esposizione nelle prove che prevedono becher allestiti in modo sequenziale a intervalli regolari. Per i sistemi di prova con apparecchiature che consentono la misurasimultanea dei diversi consumi di ossigeno, occorre prevedere almeno due controlli in bianco per ogni lotto di analisi simultanee. I controlli in bianco contengono un uguale volume di fanghi attivi e mezzo artificiale ma non la sostanza chimica in esame né quella di riferimento. Essi devono essere diluiti con acqua per ottenere lo stesso volume della miscela contenente la sostanza in esame o quella di riferimento.
Controlli abiotici
35.
Se necessario, ad esempio se si sospetta o si ha la certezza che una sostanza chimica abbia forti proprietà riducenti, occorre preparare una miscela FA per misurare il consumo abiotico di ossigeno. La miscela deve contenere la stessa quantità di sostanza chimica in esame e di liquame artificiale e avere lo stesso volume delle miscele sperimentali, ma senza fanghi attivi.
Procedura generale e misurazioni
36.
Le miscele di prova e di riferimento insieme ai controlli in bianco e a quelli abiotici vengono incubati alla temperatura di prova in condizioni di aerazione forzata (da 0,5 a 1 l/min), in modo da mantenere la concentrazione dell'ossigeno disciolto sopra al 60 — 70 % di saturazione e assicurare che i fiocchi dei fanghi siano perennemente in sospensione. Occorre inoltre agitare le colture per mantenere i fiocchi di fanghi in sospensione. Si considera che l'incubazione abbia inizio al primo contatto dell'inoculo di fanghi attivi con gli altri componenti della miscela finale. Al termine dell'incubazione, cioè alla fine di un periodo di esposizione stabilito (in genere 3 ore), i campioni vengono ritirati per misurare la velocità di riduzione della concentrazione di ossigeno disciolto nella cella adibita all'uopo (fig. 2 dell'appendice 3) o in una bottiglia per BOD completamente piena. Le condizioni in cui si dà inizio all'incubazione dipendono anche dalla capacità di misurare i tassi di consumo di ossigeno da parte dell'apparecchiatura utilizzata. Per esempio, se l'apparecchiatura comprende un'unica sonda per l'ossigeno, le misurazioni vanno effettuate individualmente. In tal caso, le varie miscele necessarie per la prova del liquame artificiale saranno preparate senza l'inoculo, e una quantità adeguata di fanghi sarà aggiunta a ciascun recipiente della serie. Ogni incubazione sarà avviata a turno, ad intervalli convenientemente prestabiliti, ad esempio ogni 10 o 15 minuti. In alternativa, il sistema di misurazione può comprendere sonde multiple che facilitano misurazioni multiple e simultanee; in questo caso, è possibile aggiungere l'inoculo contemporaneamente in più gruppi appropriati di recipienti.
37.
La concentrazione di fanghi attivi in tutte le miscele di prova (di riferimento e in bianco, ma non nei controlli abiotici) è nominalmente pari a 1,5 g/l di solidi sospesi. Il consumo di ossigeno va misurato dopo 3 ore di esposizione. Nei casi in cui ciò sia necessario (descritti al paragrafo 5) occorre effettuare ulteriori misurazioni dopo 30 minuti supplementari.
Potenziale di nitrificazione dei fanghi
38.
Per decidere se i fanghi abbiano potere nitrificante, e, in caso affermativo, quale ne sia il tasso, occorre preparare miscele (FB) come nel controllo in bianco e miscele di “controllo” supplementari (FN), che contengano però anche N-alliltiourea a 11,6 mg/l. Queste miscele vanno aerate e incubate a 20° ± 2 °C per 3 ore. In seguito, occorre misurare i tassi di consumo di ossigeno e calcolare il tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione.
Disegni sperimentali
Prova per la definizione dell'intervallo
39.
Se del caso, occorre allestire una prova preliminare per valutare l'intervallo di concentrazioni della sostanza chimica in esame necessarie in una prova definitiva di determinazione dell'inibizione del consumo di ossigeno. In alternativa, l'assenza di inibizione del consumo di ossigeno da parte della sostanza chimica in esame in una prova preliminare può dimostrare che non sia necessario procedere a una prova definitiva; tuttavia, occorre includere dei triplicati che presentano la concentrazione più alta tra quelle testate nella prova preliminare (generalmente 1 000 mg/L, ma questo valore dipende dai dati che è necessario ottenere).
Soluzione madre della sostanza chimica in esame (ml)
(paragrafi da 19 a 21)
0,5
5
50
0
50
Soluzione madre di liquame artificiale (ml)
(paragrafo 16)
16
16
16
16
16
Sospensione di fanghi attivi (ml)
(paragrafi da 26 a 29)
250
250
250
250
0
Acqua
(paragrafo 15)
233,5
229
184
234
434
Volume totale delle miscele (ml)
500
500
500
500
500
Concentrazioni nella miscela
Sospensione di prova (mg/l)
Fanghi attivi
10
10
1 000
0
1 000
(solidi in sospensione) (mg/l)
1 500
1 500
1 500
1 500
0
40.
La prova deve essere eseguita con almeno tre concentrazioni della sostanza chimica in esame, per esempio, 10 mg/l, 100 mg/l e 1 000 mg/l, con un controllo in bianco e, se necessario, almeno tre controlli abiotici con le più alte concentrazioni della sostanza in esame (cfr. ad esempio la tabella 1). Idealmente, la concentrazione più bassa non dovrebbe avere alcun effetto sul consumo di ossigeno. Occorre calcolare i tassi di consumo di ossigeno e il tasso di nitrificazione, se rilevante; va poi calcolata l'inibizione percentuale. In funzione dello scopo della prova, è inoltre possibile determinare semplicemente la tossicità di una concentrazione limite, ad es. 1 000 mg/l. Se a questa concentrazione non si verifica alcun effetto tossico statisticamente significativo, non è necessario procedere ad ulteriori prove con concentrazioni più elevate o minori. Occorre notare che le sostanze scarsamente solubili in acqua, le miscele a base di componenti di varia solubilità e le sostanze adsorbenti vanno pesate direttamente nei recipienti di prova. In tal caso, il volume riservato alla soluzione madre della sostanza di prova va sostituito con acqua di diluizione.
Prova definitiva
Inibizione del consumo totale di ossigeno
41.
La prova va eseguita utilizzando una gamma di concentrazioni dedotta dalla prova preliminare. Per ottenere contemporaneamente un valore NOEC e un valore ECx (ad es. EC50), si raccomandano, nella maggior parte dei casi, sei concentrazioni di controllo e cinque concentrazioni di trattamento, in progressione geometrica, con cinque repliche. Il controllo abiotico non deve essere ripetuto se non si è registrato consumo di ossigeno nella prova preliminare; invece, in caso di consumo significativo, occorre includere controlli abiotici per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame. La sensibilità dei fanghi va verificata utilizzando la sostanza chimica di riferimento (3,5-diclorofenolo). La sensibilità dei fanghi va verificata per ciascuna serie di prove, in quanto è noto che essa tende a fluttuare. In tutti i casi i campioni vanno prelevati dai recipienti di prova dopo 3 ore (e, se necessario, anche dopo 3 ore e 30 minuti), per misurare il tasso di assorbimento di ossigeno nella cella dotata di elettrodo a ossigeno. In base ai dati raccolti, vengono calcolate le velocità di respirazione specifiche delle miscele di controllo e di prova; la percentuale di inibizione viene quindi calcolata a partire dall'equazione 7, indicata di seguito.
Differenziazione tra inibizione della respirazione eterotrofica e nitrificazione
42.
L'uso di un inibitore specifico della nitrificazione (ATU) consente di verificare direttamente gli effetti inibitori della sostanza chimica in esame sull'ossidazione eterotrofica; è inoltre possibile calcolare gli effetti sul tasso di nitrificazione sottraendo dal tasso totale di consumo (senza ATU) il tasso di consumo di ossigeno in presenza di ATU. Occorre preparare due serie di miscele di reazione secondo i disegni sperimentali per la determinazione dei valori ECx o NOEC di cui al paragrafo 41; inoltre, occorre aggiungere l'inibitore ATU a ciascuna miscela di una delle due serie, per ottenere una concentrazione finale di 11,6 mg/l, in quanto è stato dimostrato che questa concentrazione impedisce completamente la nitrificazione in fanghi con concentrazioni di solidi sospesi fino a 3 000 mg/l (4). I tassi di consumo di ossigeno vanno misurati dopo il periodo di esposizione; questi valori diretti rappresentano unicamente la respirazione eterotrofica, e gli scostamenti tra questi risultati e i tassi di respirazione totale associati corrispondono alla nitrificazione. Vengono poi calcolati i vari gradi di inibizione.
Misurazioni
43.
Alla fine del o dei periodi di esposizione, un campione viene trasferito dal primo recipiente di aerazione alla cella dotata di elettrodo a ossigeno (figura 1 dell'appendice 2), per procedere immediatamente alla misurazione della concentrazione dell'ossigeno disciolto. Se è disponibile un sistema a elettrodi multipli, le misurazioni possono essere effettuate simultaneamente. È fondamentale che l'agitazione (tramite ancoretta magnetica) avvenga alla stessa velocità applicata al momento di tarare l'elettrodo, in modo da garantire una risposta rapida della sonda alle variazioni nella concentrazione dell'ossigeno, e per assicurare la regolarità e la riproducibilità delle misurazioni dell'ossigeno nel recipiente di misurazione. Alcuni sistemi con elettrodi a ossigeno sono dotati di un agitatore generalmente adeguato. Tra una misurazione e l'altra la cella va sciacquata con acqua. In alternativa, si può utilizzare il campione per riempire una bottiglia per BOD (figura 2 dell'allegato 3) munita di un agitatore magnetico. Inserire una sonda dell'ossigeno con manicotto adattatore nel collo della bottiglia e avviare l'agitatore magnetico. In entrambi i casi la concentrazione di ossigeno disciolto deve essere misurata in continuo e registrata per un determinato periodo, solitamente 5 — 10 minuti, o finché la concentrazione di ossigeno scende al di sotto di 2 mg/l. Occorre poi rimuovere l'elettrodo, rimettere la miscela nel recipiente di aerazione e, se è necessario procedere a misurazioni dopo periodi di esposizione più estesi, continuare ad aerarla e agitarla.
Verifica della concentrazione della sostanza chimica in esame
44.
In alcuni casi, può essere necessario misurare la concentrazione della sostanza chimica nei contenitori di prova. Va osservato che se si utilizzano soluzioni madre di:
—
sostanze scarsamente idrosolubili,
—
miscele con componenti aventi diversi gradi di idrosolubilità,
—
sostanze caratterizzate da una buona idrosolubilità ma la cui soluzione madre presenta una concentrazione prossima al limite di solubilità in acqua,
la frazione disciolta non sarà nota, come non lo sarà la concentrazione effettiva della sostanza in esame che viene trasferita nei recipienti di prova. Al fine di caratterizzare l'esposizione, è necessaria una stima analitica delle concentrazioni della sostanza chimica nei recipienti di prova. Per una maggior semplificazione, la stima analitica va svolta prima di aggiungere l'inoculo. Dal momento che soltanto le frazioni disciolte vengono trasferite nei recipienti di prova, le concentrazioni misurate possono essere molto basse.
45.
Al fine di evitare analisi onerose in termini di tempo e di costi, si raccomanda semplicemente di pesare la sostanza in esame direttamente nei recipienti di prova e, per i calcoli successivi, di fare riferimento alla concentrazione nominale iniziale corrispondente a tale massa. È inutile operare una distinzione tra frazione disciolta, non disciolta e adsorbita della sostanza chimica in esame, in quanto tutte queste frazioni appaiono in condizioni reali negli impianti di trattamento delle acque reflue, e possono variare a seconda della composizione di queste ultime. L'obiettivo del presente metodo di prova è di produrre una stima realistica della concentrazione non inibitrice: il metodo non è adatto a determinare in dettaglio quali frazioni contribuiscano all'inibizione degli organismi dei fanghi attivi. Infine, le sostanze adsorbenti vengono anch'esse pesate direttamente nei loro recipienti di prova che devono essere in vetro silanizzato per minimizzare le perdite per adsorbimento.
DATI E RELAZIONE
Calcolo dei tassi di consumo di ossigeno
46.
I tassi di consumo di ossigeno sono calcolati a partire dalla media dei valori misurati, ad esempio utilizzando la parte lineare delle curve della concentrazione di ossigeno in funzione del tempo, limitando i calcoli alle concentrazioni di ossigeno tra 2,0 mg/l e 7,0 mg/l, poiché sia le basse che le elevate concentrazioni possono anch'esse influire sul tasso di consumo. Tuttavia, talvolta è inevitabile, nonché necessario, lavorare su valori che si situano al di fuori di questa forchetta, ad esempio quando la respirazione è fortemente inibita e, di conseguenza, molto lenta, oppure se particolari fanghi attivi respirano molto rapidamente. Ciò è accettabile, a condizione che le sezioni della curva del consumo di ossigeno siano lineari e il loro gradiente non cambi ai limiti dell'intervallo 2,0 mg/l o 7,0 mg/l di O2. Le sezioni curve del grafico indicano una stabilizzazione del sistema di misurazione o un'alterazione del tasso di consumo, e non vanno quindi utilizzate per il calcolo dei tassi di respirazione. Il tasso di consumo di ossigeno è espresso in milligrammi per litro e per ora (mg/lh) o in milligrammi per grammo di fanghi secchi per ora (mg/gh). Il tasso di consumo di ossigeno, R, in mg/lh, può essere dedotto o stimato a partire dalla sezione lineare della curva di quantità d'ossigeno decrescente, secondo l'equazione 1:
R = (Q1 – Q2)/Δt × 60
(1)
dove:
Q1
è la concentrazione di ossigeno all'inizio della sezione di curva lineare selezionata (mg/l);
Q2
è la concentrazione di ossigeno alla fine della sezione di curva lineare selezionata (mg/l);
Δt
è l'intervallo di tempo tra le due misure di cui sopra (min.).
47.
Il tasso di respirazione specifica (Rs) è espresso come quantità di ossigeno consumata per grammo di sostanza secca di fanghi per ora (mg/gh), secondo l'equazione 2:
Rs = R/SS
(2)
dove SS è la concentrazione di solidi sospesi nella miscela di prova (g/l).
48.
I diversi indici di R che possono essere combinati sono:
S
tasso specifico
T
tasso corrispondente alla respirazione totale
N
tasso di respirazione legato alla nitrificazione
H
tasso di respirazione eterotrofica
A
tasso corrispondente ai processi abiotici
B
tasso (medio) basato su prove in bianco
Calcolo del tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione
49.
La relazione tra la respirazione totale (RT), la respirazione legata alla nitrificazione (RN) e la respirazione eterotrofica (RH) è fornita dall'equazione 3:
RN = RT – RH
(3)
dove:
RN
è il tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione (mg/lh);
RT
è il tasso misurato di consumo di ossigeno del controllo in bianco (senza ATU; FB) (mg/lh);
RH
è il tasso misurato di consumo di ossigeno del controllo in bianco con ATU (FN) (mg/lh).
50.
Questa relazione è valida per i valori dei controlli in bianco (RNB, RTB, RHB), i controlli abiotici (RNA, RTA, RHA) e le prove con le sostanze chimiche (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). I tassi di respirazione specifici sono calcolati a partire da:
RNS = RN/SS
(4)
RTS = RT/SS
(5)
RHS = RH/SS
(6)
51.
Se in una prova preliminare il valore RN non è significativo (ad es. < 5 % di RT nei controlli in bianco), si può presumere che il consumo di ossigeno eterotrofico sia pari al consumo totale e che non si verifichi alcuna nitrificazione. Se le prove devono tenere conto degli effetti sui microrganismi eterotrofici e nitrificanti, è necessaria una fonte alternativa di fanghi attivi. Viene svolta una prova definitiva qualora si verifichi una soppressione nel consumo di ossigeno con diverse concentrazioni della sostanza chimica di prova.
Calcolo della percentuale di inibizione
52.
La percentuale di inibizione del consumo totale di ossigeno, IT, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 7:
IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %
(7)
53.
Allo stesso modo, la percentuale di inibizione del consumo eterotrofico di ossigeno, IH, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 8:
IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %
(8)
54.
Infine, l'inibizione del consumo di ossigeno dovuta alla nitrificazione, IN, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 9:
IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %
(9)
55.
Occorre tracciare l'inibizione percentuale del consumo di ossigeno in base al logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame (curva di inibizione, cfr. figura 3 dell'appendice 4). Le curve di inibizione vengono tracciate per ciascuna fase di aerazione di 3 ore, eventualmente aggiungendo 30 minuti supplementari. La concentrazione della sostanza chimica in esame corrispondente a un'inibizione del 50 % del consumo di ossigeno (EC50) va calcolata o stimata a partire da questo grafico. Se sono disponibili dati adeguati, è possibile calcolare o stimare i limiti di confidenza al 95 % del valore di EC50, la pendenza della curva e i valori rilevanti che rappresentano l'inizio dell'inibizione (ad esempio, EC10 o EC20) e la fine dell'intervallo di inibizione (ad esempio, EC80 o EC90).
56.
Va sottolineato che, vista la variabilità che spesso caratterizza i risultati, in molti casi può essere sufficiente esprimerli in ordine di grandezza, per esempio:
EC50
< 1 mg/l
EC50
da 1 mg/l a 10 mg/l
EC50
da 10 mg/l a 100 mg/l
EC50
>100 mg/l
Interpretazione dei risultati
ECx
57.
I valori ECx, inclusi i corrispondenti limiti di confidenza al 95 % superiori e inferiori per il parametro, sono calcolati utilizzando metodi statistici adeguati (ad esempio analisi probit, funzione logistica o funzione di Weibull, metodo di Spearman-Karber semplificato o interpolazione semplice (11)). Si ottiene un valore ECx inserendo il valore corrispondente all'x % della media del gruppo di controllo nell'equazione ottenuta. Per calcolare il valore EC50 o qualsiasi altro valore ECx, occorre sottoporre le medie per ciascun gruppo di trattamento (x) a un'analisi di regressione.
Stima della NOEC
58.
Se si procede a un'analisi statistica per determinare la NOEC, è necessario essere in possesso di statistiche per ciascun recipiente (ogni singolo recipiente è considerato una replica distinta). Occorre far ricorso a metodi statistici appropriati, conformemente al documento di orientamento dell'OCSE intitolato Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). In generale, gli effetti avversi della sostanza chimica in esame rispetto al controllo sono analizzati procedendo a una verifica dell'ipotesi unilaterale (più debole) con p ≤ 0,05.
Relazione sulla prova
59.
La relazione sulla prova comprende le informazioni riportate di seguito.
Sostanza chimica in esame
—
nome comune, nome chimico, numero CAS, purezza;
—
proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame (ad esempio log Kow, idrosolubilità, tensione di vapore, costante di Henry (H) ed eventuali informazioni sul destino della sostanza in esame, per esempio adsorbimento sui fanghi attivi);
Sistema di prova
—
origine, condizioni di funzionamento dell'impianto di trattamento delle acque reflue e affluenti da esso ricevuti, concentrazione, pretrattamento e manutenzione dei fanghi attivi;
Condizioni sperimentali
—
temperatura della prova, pH durante la prova, durata della o delle fasi di esposizione;
Risultati
—
consumo specifico di ossigeno dei controlli (mg di O2/(g fanghi × h);
—
insieme dei dati calcolati, curva o curve di inibizione e metodo di calcolo di EC50,
—
EC50 e, se possibile, limiti di confidenza al 95 %, eventualmente EC20, EC80; eventualmente NOEC e metodi statistici utilizzati, se non è possibile determinare il valore EC50;
—
risultati per l'inibizione totale e, se del caso, dell'inibizione dovuta alla respirazione eterotrofica e di quella dovuta alla nitrificazione;
—
consumo abiotico di ossigeno nel controllo chimico-fisico (se utilizzato);
—
nome della sostanza chimica di riferimento e risultati ottenuti con la stessa;
—
tutte le osservazioni e le eventuali deviazioni dal protocollo standard che potrebbero aver condizionato il risultato.
BIBLIOGRAFIA
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Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.
(2)
King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.
(3)
OCSE (1984), Fanghi attivi: saggio di inibizione della respirazione, linea guida dell'OCSE n. 209 (Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209), Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
(4)
ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.
(5)
Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.
(6)
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(7)
Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.
(8)
Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.
(9)
Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.
(10)
ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.
(11)
OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.
Appendice 1
Definizioni
Le definizioni seguenti si applicano al presente metodo di prova.
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
ECx (concentrazione efficace all'x %): concentrazione che determina un effetto pari all'x % sugli organismi sperimentali in un determinato periodo di esposizione rispetto al controllo. Ad esempio, EC50 è una concentrazione che si ritiene produca un effetto su un endpoint in esame nel 50 % della popolazione esposta nel corso di un determinato periodo di esposizione.
NOEC ( no observed effect concentration — concentrazione senza effetti osservabili): concentrazione della sostanza chimica in esame alla quale non si osserva alcun effetto. Nella presente prova, in un determinato periodo di esposizione, la concentrazione che corrisponde alla NOEC non ha alcun effetto statisticamente significativo (p < 0,05) rispetto al controllo.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova.
Appendice 2
Figura 1 —Esempi di dispositivi di misurazione
Legenda
1
fanghi attivi
2
mezzo artificiale
3
sostanza chimica in esame
4
aria
5
recipiente di miscelazione
6
agitatore magnetico
7
cella per la misurazione dell'ossigeno
8
elettrodo a ossigeno
9
strumento per la misurazione dell'ossigeno
10
dispositivo di registrazione
Appendice 3
Figura 2 —Esempio di unità di misurazione, utilizzando una bottiglia per BOD
Legenda
1
recipiente di prova
2
elettrodo a ossigeno
3
strumento per la misurazione dell'ossigeno
Appendice 4
Figura 3 —Esempi di curve di inibizione
Legenda
X
concentrazione di 3,5-diclorofenolo (mg/l)
Y
inibizione ( %)
inibizione della respirazione eterotrofica utilizzando fanghi nitrificanti
inibizione della nitrificazione utilizzando fanghi nitrificanti
»
(5)
Il capitolo C.26. è sostituito dal seguente:
«
C.26 PROVA DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA DI SPECIE DI LEMNA
INTRODUZIONE
1.
Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 221 (2006). È destinato a valutare la tossicità delle sostanze chimiche nei confronti delle piante acquatiche di acqua dolce del genere Lemna (lenticchia d'acqua). Si basa su metodi esistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6) ma include le modifiche apportate a questi metodi in modo da tenere conto sia degli ultimi progressi della ricerca sia delle consulenze di esperti su una serie di aspetti fondamentali. Il metodo qui proposto è stato convalidato da una prova interlaboratorio (ring test) internazionale (7).
2.
Il presente metodo illustra come condurre prove di tossicità su Lemna gibba e Lemna minor, due specie ampiamente studiate e che sono oggetto delle norme i cui riferimenti sono indicati in precedenza. La tassonomia di Lemna spp. è complessa a causa dell'esistenza di numerosi fenotipi. Benché la variabilità genetica di Lemna possa influire sulla risposta alle sostanze tossiche, i dati di cui disponiamo attualmente su questa fonte di variabilità sono insufficienti per raccomandare l'utilizzo di un clone specifico nel presente metodo di prova. Occorre rilevare che, sebbene la prova non sia effettuata con colture pure, sono adottate misure in varie fasi della procedura per mantenere al minimo la contaminazione da parte di altri organismi.
3.
Sono descritte dettagliatamente le procedure con rinnovo (procedura semistatica e a flusso continuo) e senza rinnovo (procedura statica) della soluzione di prova. In funzione degli obiettivi della prova e dei requisiti normativi si raccomanda di valutare l'uso di metodi semistatici e continui, per esempio per le sostanze che spariscono rapidamente dalla soluzione per volatilizzazione, fotodegradazione, precipitazione o biodegradazione. Ulteriori orientamenti sono contenuti nel riferimento bibliografico (8).
4.
L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.
PRINCIPIO DELLA PROVA
5.
Si allestiscono monoculture di piante del genere Lemna a crescita esponenziale con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame per un periodo di sette giorni. L'obiettivo della prova è quantificare gli effetti della sostanza chimica sulla crescita vegetativa nel corso di questo periodo, sulla base della valutazione di determinate variabili di misura. Il numero di fronde è la principale variabile di misurazione. Viene misurata almeno un'altra variabile (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), in quanto alcune sostanze chimiche possono avere un effetto più pronunciato su variabili di misurazione diverse dal numero di fronde. Per quantificare gli effetti della sostanza chimica, si confronta la crescita nelle soluzioni di prova con quella che avviene nei controlli e si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione della crescita (per esempio 50 %), espressa come ECx (per esempio EC50).
6.
L'endpoint della prova è l'inibizione della crescita, espressa come l'aumento logaritmico della variabile di misurazione (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A partire dai tassi di crescita specifici medi registrati in una serie di soluzioni di prova, si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del tasso di crescita (per esempio 50 %), espressa come ErCx (ad esempio ErC50).
7.
Un'altra variabile di risposta utilizzata nel presente metodo di prova è il rendimento, che può essere necessario utilizzare per soddisfare requisiti normativi specifici di alcuni paesi. È definito come la differenza tra il valore delle variabili di misurazione al termine del periodo di esposizione e il valore delle variabili di misurazione all'inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova, si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del rendimento (per esempio 50 %), espressa come EyCx (ad esempio EyC50).
8.
Si possono inoltre determinare mediante un calcolo statistico la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
9.
Occorre disporre di un metodo analitico con un'adeguata sensibilità per la quantificazione della sostanza chimica nel mezzo di prova.
10.
Le informazioni sulla sostanza chimica in esame che possono essere utili per stabilire le condizioni sperimentali comprendono la formula strutturale, la purezza, l'idrosolubilità, la stabilità in acqua e alla luce, la pKa, il Kow, la pressione di vapore e la biodegradabilità. L'idrosolubilità e la pressione di vapore possono essere utilizzate per calcolare la costante della legge di Henry, che indica se possono verificarsi perdite significative della sostanza chimica in esame nel corso della prova. Tale calcolo consente di sapere se occorre adottare misure specifiche per tenere sotto controllo le perdite. Quando le informazioni sulla solubilità e la stabilità della sostanza chimica in esame sono incerte, si consiglia di verificarle nelle condizioni sperimentali, ossia nel mezzo di crescita, alla temperatura e con l'illuminazione che si utilizzeranno nella prova.
11.
Quando la regolazione del pH del mezzo di prova è particolarmente importante, ossia quando si saggiano metalli o sostanze chimiche idroliticamente instabili, si raccomanda di aggiungere un tampone al mezzo di crescita (cfr. paragrafo 21). Al riferimento (8) sono forniti ulteriori orientamenti per saggiare sostanze chimiche le cui proprietà fisicochimiche rendono difficile la conduzione delle prove.
VALIDITÀ DELLA PROVA
12.
Affinché la prova sia valida, il tempo di raddoppio del numero di fronde nei controlli deve essere inferiore a 2,5 giorni (60 ore), che corrisponde approssimativamente ad una moltiplicazione per sette in sette giorni e a un tasso di crescita specifico medio di 0,275 g–1. Utilizzando il mezzo e le condizioni sperimentali descritti nel presente metodo, questo criterio può essere soddisfatto mediante una procedura statica (5), partendo comunque dal principio che può essere soddisfatto anche con prove semistatiche o a flusso continuo. Il calcolo del tempo di raddoppio è illustrato nel paragrafo 49.
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO
13.
La procedura sperimentale può essere verificata saggiando sostanze chimiche di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (7). Si consiglia di effettuare una prova con una sostanza chimica di riferimento almeno due volte l'anno o, qualora la prova sia realizzata con una frequenza inferiore, parallelamente alla determinazione della tossicità della sostanza chimica in esame.
DESCRIZIONE DEL METODO
Apparecchiatura
14.
Tutte le apparecchiature che entrano in contatto con i mezzi di prova devono essere di vetro o di un altro materiale chimicamente inerte. Le apparecchiature di vetro utilizzate per le colture e le prove devono essere sterili e esenti da contaminanti chimici che potrebbero penetrare nel mezzo di prova. I recipienti devono essere sufficientemente ampi da consentire alle fronde delle varie colonie dei recipienti di controllo di crescere senza sovrapporsi fino alla fine della prova. Le radici possono toccare il fondo dei recipienti, ma si consiglia di utilizzare recipienti con una profondità minima di 20 mm e un volume minimo di 100 ml. La scelta dei recipienti non riveste particolare importanza a condizione che si rispettino i suddetti requisiti. Becher di vetro, cristallizzatori o piastre Petri di vetro di dimensioni adeguate si sono dimostrati recipienti adatti. I recipienti di prova devono essere coperti per minimizzare l'evaporazione e la contaminazione accidentale, pur consentendo il ricambio d'aria necessario. Sono indicati recipienti di prova, e in particolare i rispettivi coperchi, che non creano zone d'ombra o alterano le caratteristiche dello spettro luminoso.
15.
Le colture e i recipienti di prova non devono essere tenuti insieme; è quindi opportuno utilizzare camere di crescita ambientali, incubatori o stanze separati. L'illuminazione e la temperatura devono essere regolabili e mantenute ad un livello costante (cfr. paragrafi 35-36).
Organismo sperimentale
16.
L'organismo utilizzato per questa prova è Lemna gibba o Lemna minor. L'appendice 2 contiene una breve descrizione delle specie di lenticchia d'acqua che sono state utilizzate per le prove di tossicità. Il materiale vegetale può essere ottenuto da una collezione di colture, da un altro laboratorio o raccolto sul terreno. In quest'ultimo caso, le piante vanno tenute nel mezzo che sarà utilizzato per le prove per almeno otto settimane prima del loro impiego. Le colture di partenza sono prelevate solo da siti chiaramente esenti da fonti evidenti di inquinamento. Se le colture provengono da un altro laboratorio o da una collezione, devono essere tenute nelle stesse condizioni per almeno tre settimane. La fonte del materiale vegetale, nonché la specie e il clone (se noto) utilizzati per la prova devono sempre essere indicati.
17.
Occorre utilizzare delle monoculture, chiaramente esenti da contaminazioni da parte di altri organismi come alghe e protozoi. Le piante sane di L. minor formano colonie comprendenti da due a cinque fronde, mentre le colonie sane di L. gibba possono presentare fino a sette fronde.
18.
La qualità e l'uniformità delle piante utilizzate per la prova avranno un impatto significativo sui risultati della stessa e vanno pertanto selezionate con cura. Occorre utilizzare piante giovani, in rapida crescita, prive di lesioni visibili e di parti scolorite (clorosi). Le colture di buona qualità presentano molte colonie con almeno due fronde. Un elevato numero di fronde singole è indizio di stress ambientale, ad esempio per scarsità di nutrienti, per cui materiale vegetale proveniente da colture con queste caratteristiche non deve essere utilizzato per le prove.
Colture
19.
Per ridurre la frequenza delle operazioni di manutenzione (per esempio, se per un certo periodo non si prevedono prove su Lemna), le colture possono essere conservate ad un'illuminazione e una temperatura ridotte (4-10 °C). Informazioni dettagliate sulle tecniche di coltura sono riportate nell'appendice 3. In caso di segni evidenti di contaminazione da parte di alghe o altri organismi è opportuno sterilizzare superficialmente un sottocampione di fronde di Lemna e trasferirlo in un terreno nuovo (cfr. appendice 3). In tal caso la parte restante della coltura contaminata va eliminata.
20.
Almeno sette giorni prima della prova, un numero sufficiente di colonie è trasferito, in condizioni asettiche, in un mezzo sterile nuovo ed è coltivato per 7-10 giorni nelle condizioni previste per la prova.
Mezzo di prova
21.
I vari mezzi raccomandati per Lemna minor e Lemna gibba sono descritti di seguito. L'aggiunta di un tampone di pH nel mezzo di prova (MOPS (acido 4-morfolinopropanosulfonico, n. CAS 1132-61-2) nel mezzo per L. minor e NaHCO3 nel mezzo per L. gibba) va ponderata con attenzione se si sospetta che possa interagire con la sostanza chimica in esame e condizionare l'espressione della sua tossicità. È possibile impiegare anche il mezzo di Steinberg (9), a condizione che siano rispettati i criteri di validità.
22.
Per le colture e le prove con L. minor si raccomanda l'uso di una versione modificata del mezzo di crescita della norma svedese (SIS). La composizione di questo mezzo è riportata nell'appendice 4.
23.
Per le colture e le prove con L. gibba si raccomanda l'uso del mezzo di crescita 20X — AAP, descritto nell'appendice 4.
24.
Per L. minor è adatto anche il mezzo di Steinberg, descritto nell'appendice 4, che può essere utilizzato anche per L. gibba a condizione che siano rispettati i criteri di validità.
Soluzioni di prova
25.
In genere le soluzioni di prova sono preparate mediante diluizione di una soluzione madre. Le soluzioni madre della sostanza chimica in esame sono solitamente preparate sciogliendo detta sostanza nel mezzo di crescita.
26.
La concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame non deve di norma superare il limite di solubilità della sostanza stessa in acqua, nelle condizioni di prova. Va rilevato, tuttavia, che le specie di Lemna galleggiano in superficie e rischiano di essere esposte a sostanze che si accumulano nell'interfaccia acqua-aria (per esempio sostanze a bassa idrosolubilità, idrofobe o tensioattivi). In tali circostanze l'esposizione risulterà da materiale diverso da quello presente nella soluzione, quindi le concentrazioni di prova potrebbero, in funzione delle caratteristiche della sostanza chimica in esame, essere superiori al limite di idrosolubilità. Per le sostanze chimiche a bassa idrosolubilità potrà essere necessario preparare una soluzione madre concentrata o disperdere la sostanza chimica utilizzando un solvente o un disperdente organico, al fine di agevolare l'aggiunta di quantità esatte della sostanza chimica in esame nel mezzo di prova e favorirne la dispersione e la dissoluzione. Occorre fare il possibile per evitare di utilizzare materiali di questo tipo. L'uso di solventi o disperdenti ausiliari non deve causare alcuna fitotossicità. Tra i solventi di uso comune che non provocano fitotossicità a concentrazioni fino a 100 μl/1 rientrano, ad esempio, l'acetone e il dimetilformammide. Se si utilizza un solvente o un disperdente, la sua concentrazione finale deve essere comunicata e tenuta al minimo (ossia ≤ 100 μl/1); deve inoltre essere identica in tutti i recipienti trattati e di controllo. Per ulteriori informazioni sull'uso dei disperdenti si veda il riferimento (8).
Gruppi di prova e gruppi di controllo
27.
Per determinare le concentrazioni sperimentali adeguate è utile conoscere già la tossicità della sostanza chimica in esame nei confronti di Lemna, per esempio sulla base di precedenti prove a diversi intervalli di concentrazione. Nella prova di tossicità definitiva di norma si devono scegliere almeno cinque concentrazioni in progressione geometrica. Di preferenza il fattore di separazione tra le concentrazioni non deve essere superiore a 3,2, ma si può utilizzare un valore più elevato se la curva concentrazione-risposta è piatta. L'uso di un numero di concentrazioni inferiore a cinque va giustificato. Occorre impiegare almeno tre repliche per ogni concentrazione di prova.
28.
Nel fissare l'intervallo delle concentrazioni di prova (per le prove di determinazione dell'intervallo e/o la prova di tossicità definitiva), occorre tenere presente quanto segue:
—
per determinare la ECx, le concentrazioni di prova devono situarsi intorno al valore ECx per garantire un intervallo di confidenza adeguato. Per esempio, quando si valuta la EC50, la concentrazione di prova più alta deve essere superiore al valore EC50. Se il valore EC50 si situa fuori dall'intervallo delle concentrazioni in esame i relativi intervalli di confidenza saranno ampi, il che rischia di impedire una valutazione corretta dell'adeguamento statistico del modello;
—
quando la finalità è valutare la LOEC/NOEC, la concentrazione di prova più bassa deve essere bassa a sufficienza affinché la crescita del gruppo trattato non sia significativamente inferiore a quella dei controlli. Inoltre la concentrazione di prova più alta deve essere alta a sufficienza affinché la crescita sia significativamente inferiore a quella dei controlli. In caso contrario, occorrerà ripetere la prova utilizzando un intervallo di concentrazione diverso (a meno che la concentrazione più alta coincida con il limite di solubilità o con la concentrazione limite massima richiesta, per esempio 100 mg/1).
29.
Ogni prova deve prevedere controlli con mezzo nutriente, numero di fronde e colonie, condizioni ambientali e procedure (come i recipienti di prova) identici a quelli dei recipienti trattati, ma senza la sostanza chimica in esame. Qualora si utilizzi un solvente o un disperdente ausiliario, la prova deve includere un controllo supplementare con il solvente/disperdente alle stesse concentrazioni utilizzate nei recipienti contenenti la sostanza chimica in esame. Il numero dei recipienti di controllo identici, e degli eventuali recipienti con solvente, deve essere almeno pari al numero dei recipienti utilizzati per ciascuna concentrazione di prova, e idealmente il doppio di tale numero.
30.
Se la determinazione della NOEC non è necessaria, la prova può essere modificata in modo da aumentare il numero di concentrazioni e ridurre il numero di repliche per concentrazione. Tuttavia le repliche dei controlli devono essere almeno tre.
Esposizione
31.
Si prelevano colonie, composte da 2 a 4 fronde visibili, dalle colture dell'inoculo e si distribuiscono a caso nei recipienti di prova in condizioni asettiche. Ciascun recipiente di prova deve contenere complessivamente da 9 a 12 fronde. Il numero di fronde e di colonie deve essere uguale in ciascun recipiente. L'esperienza acquisita con questo metodo e i dati ottenuti con la prova interlaboratorio (ring-test) indicano che bastano tre repliche per trattamento (con 9 - 12 fronde iniziali per replica) per individuare differenze di crescita tra i trattamenti dell'ordine del 4 % - 7 % per l'inibizione calcolata in base al tasso di crescita e del 10 % - 15 % per l'inibizione calcolata in base al rendimento (7).
32.
La disposizione dei recipienti di prova nell'incubatore deve essere casuale per ridurre al minimo l'influenza delle differenze spaziali in termini di intensità luminosa o termica. È inoltre necessario cambiare la posizione dei recipienti, per blocchi o in modo casuale, dopo le osservazioni (o più spesso).
33.
Se una prova di stabilità preliminare indica che nel corso della prova (7 giorni) la concentrazione della sostanza chimica in esame non può essere mantenuta (ossia la concentrazione misurata diminuisce più dell'80 % della concentrazione misurata inizialmente), si raccomanda di impiegare una procedura sperimentale semistatica. In tal caso, occorre esporre le colonie a soluzioni di prova e di controllo nuove almeno due volte durante la prova (per esempio, il 3o e il 5o giorno). La frequenza dell'esposizione al mezzo fresco dipenderà dalla stabilità della sostanza chimica in esame; una frequenza più elevata può essere necessaria per mantenere concentrazioni pressoché costanti nel caso di sostanze chimiche ad elevata volatilità o instabilità. In alcune circostanze può essere necessario ricorrere a una procedura a flusso continuo (8)(10).
34.
L'esposizione mediante un'applicazione fogliare (polverizzazione) non è contemplata nel presente metodo di prova; per informazioni in proposito si veda il riferimento bibliografico (11).
Condizioni di incubazione
35.
Occorre fornire un'illuminazione continua a fluorescenza bianca, calda o fredda, al fine di ottenere un'intensità luminosa compresa tra 85 e 135 μE · m– 2s– 1, misurata in una radiazione fotosinteticamente attiva (da 400 a 700 nm) in punti situati a una distanza dalla fonte luminosa identica a quella delle fronde di Lemna (intensità equivalente a 6 500-10 000 lux). Eventuali differenze rispetto all'intensità luminosa prescelta non devono superare, in tutta la zona in cui è condotta la prova, ± 15 %. Il metodo di rilevamento e misurazione della luce, in particolare il tipo di sensore, inciderà sul valore misurato. I sensori sferici (che rilevano la luce proveniente da tutti gli angoli situati sopra e sotto il piano di misurazione) e i sensori cosinusoidali (che rilevano la luce da tutti gli angoli situati sopra il piano di misurazione) sono preferibili ai sensori unidirezionali e indicheranno valori più elevati per una fonte luminosa multipla come quella qui descritta.
36.
La temperatura nei recipienti di prova deve essere mantenuta a 24 ± 2 °C. Il pH del mezzo di controllo non deve aumentare di oltre 1,5 unità nel corso della prova. Uno scarto superiore a 1,5 unità non invalida tuttavia la prova se il rispetto dei criteri di validità può essere dimostrato. In determinati casi occorre prestare particolare attenzione alle variazioni del pH, in particolare quando si saggiano sostanze chimiche instabili e metalli. Per ulteriori indicazioni al riguardo, si veda il riferimento bibliografico (8).
Durata
37.
La prova termina sette giorni dopo il trasferimento delle piante nei recipienti di prova.
Misurazioni e determinazioni analitiche
38.
All'inizio della prova si conta e si registra il numero di fronde contenute nei recipienti di prova, avendo cura di contare tutte le fronde emergenti chiaramente visibili. Il numero di fronde che presentano un aspetto normale o anomalo deve essere determinato all'inizio della prova, almeno una volta ogni tre giorni nel periodo di esposizione (ossia almeno due volte nell'arco dei sette giorni) e alla fine della prova. Occorre registrare anche le modifiche riscontrate nello sviluppo delle piante per quanto riguarda, per esempio, la dimensione e l'aspetto delle fronde, i segni di necrosi, clorosi e gibbosità, la frammentazione delle colonie o la diminuzione della loro galleggiabilità, nonché la lunghezza e l'aspetto delle radici. È anche necessario registrare le caratteristiche salienti del mezzo di prova (per esempio la presenza di materiale in sospensione, lo sviluppo di alghe nei recipienti di prova).
39.
Durante le prova, oltre a determinare il numero di fronde, si misurano gli effetti della sostanza chimica in esame su una o più delle seguenti variabili:
(i)
area totale delle fronde,
(ii)
peso secco,
(iii)
peso fresco.
40.
L'area totale delle fronde presenta il vantaggio di potere essere determinata per ciascun recipiente di prova e di controllo all'inizio, durante e al termine della prova. Il peso secco o fresco è determinato all'inizio della prova, utilizzando un campione della coltura di inoculo rappresentativo del materiale impiegato per avviare la prova, e alla fine della prova, con il materiale vegetale di ciascun recipiente di prova e di controllo. Se l'area delle fronde non è misurata, il peso secco è da preferirsi al peso fresco.
41.
L'area totale delle fronde, il peso secco e il peso fresco possono essere determinati nel modo seguente:
(i)
area totale delle fronde: l'area totale delle fronde di tutte le colonie può essere determinata mediante l'analisi dell'immagine. Con una videocamera si rileva la sagoma del recipiente di prova e delle piante (ponendo il recipiente su un illuminatore) e si digitalizza l'immagine ottenuta. A partire da una calibrazione realizzata con forme piane di superficie conosciuta si determina l'area totale delle fronde di ciascun recipiente di prova. Occorre evitare attentamente le interferenze causate dal bordo del recipiente. Un metodo più elaborato consiste nel fotocopiare i recipienti di prova e le piante, ritagliare la risultante sagoma delle colonie e determinarne la superficie mediante un analizzatore della superficie fogliare oppure carta millimetrata. Si possono utilizzare anche altre tecniche (per esempio il quoziente del peso della sagoma ritagliata nella carta per il peso di un pezzo di carta di superficie nota);
(ii)
peso secco: tutte le colonie di ciascun recipiente di prova sono prelevate e sciacquate con acqua distillata o deionizzata; sono poi poste su carta assorbente, che ne assorbe l'acqua in eccesso, e asciugate a 60 °C fino a ottenere un peso costante. Eventuali frammenti di radici devono essere inclusi. Il peso secco deve essere espresso con una precisione di almeno 0,1 mg;
(iii)
peso fresco: tutte le colonie sono trasferite in tubi di polistirolo (o altro materiale inerte) tarati, con fondo arrotondato e bucherellato (fori di 1 mm). I tubi sono in seguito centrifugati a 3 000 gpm per 10 minuti a temperatura ambiente. I tubi contenenti le colonie così asciugate sono nuovamente pesati e il preso fresco è calcolato per sottrazione della tara del tubo.
Frequenza delle misurazioni e delle determinazioni analitiche
42.
Se si applica una procedura statica, il pH di ciascun recipiente trattato deve essere misurato all'inizio e alla fine della prova. Se la procedura è semistatica, il pH deve essere misurato in ciascun lotto di soluzione di prova “nuova” prima di ogni rinnovo, così come nelle soluzioni “usate” corrispondenti.
43.
L'intensità luminosa è misurata nella camera di crescita, nell'incubatore o nella stanza in punti situati a una distanza dalla fonte luminosa identica a quella delle fronde di Lemna. La misurazione deve essere effettuata almeno una volta nel corso della prova. La temperatura del mezzo è registrata almeno una volta al giorno in un recipiente appositamente allestito a questo scopo e conservato alle stesse condizioni degli altri nella camera di crescita, nell'incubatore o nella stanza.
44.
Durante la prova, le concentrazioni della sostanza chimica in esame sono determinate a congrui intervalli. Nelle prove statiche, le concentrazioni devono essere rilevate almeno all'inizio e alla fine della prova.
45.
Nelle prove semistatiche in cui si presume che la concentrazione della sostanza chimica in esame non si mantenga entro un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale è necessario analizzare tutte le soluzioni di prova appena vengono preparate e al momento del rinnovo (cfr. paragrafo 33). Tuttavia, per le prove in cui la concentrazione della sostanza chimica in esame misurata inizialmente non si situa in un intervallo di ± 20 % del valore nominale, ma in cui un numero sufficiente di indizi dimostra che le concentrazioni iniziali sono ripetibili e stabili (ossia nell'intervallo tra 80 % e 120 % della concentrazione iniziale), le determinazioni chimiche possono limitarsi solo alla concentrazione di prova più alta e a quella più bassa. In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza chimica in esame prima del rinnovo deve essere effettuata su una sola replica per ciascuna concentrazione di prova (o in un recipiente in cui è stato mescolato il contenuto di tutti i recipienti trattati in modo identico).
46.
Nel caso delle prove con procedura a flusso continuo si può applicare uno schema di campionamento identico a quello descritto per le prove semistatiche, con un'analisi all'inizio, a metà e al termine della prova, ma senza l'analisi delle soluzioni “usate”, che in questo caso non è necessaria. In questo tipo di prova deve essere controllato giornalmente la velocità di flusso del diluente e della sostanza chimica in esame oppure della soluzione madre della sostanza chimica in esame.
47.
Se è comprovato che la concentrazione della sostanza chimica in esame si è mantenuta nel corso dell'intera prova entro un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata all'inizio, l'analisi dei risultati può basarsi sui valori nominali o quelli misurati all'inizio. Se lo scarto rispetto alla concentrazione nominale o quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati dovrà basarsi sulla media geometrica della concentrazione durante l'esposizione o su modelli che descrivono la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (8).
Prova limite
48.
In determinate circostanze, per esempio quando una prova preliminare indica che la sostanza chimica in esame non ha effetti tossici in concentrazioni fino a 100 mg/l oppure fino al suo limite di solubilità nel mezzo di prova (si scelga il valore più basso), può essere svolta una prova limite che consiste nel confrontare le risposte di un gruppo di controllo e di un gruppo trattato (a una concentrazione di 100 mg/l o pari al limite di solubilità della sostanza chimica in esame nel mezzo di prova). È vivamente raccomandato che l'assenza di tossicità sia corroborata da un'analisi della concentrazione di esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero delle repliche trattate, che deve essere raddoppiato. La crescita nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato può essere analizzata mediante una prova statistica di confronto delle medie, per esempio un test t di Student.
DATI E RELAZIONI
Tempo di raddoppio
49.
Per determinare il tempo di raddoppio (Td) del numero di fronde e verificare se lo studio rispetta questo criterio di validità (paragrafo 12), si applica la formula seguente ai dati risultanti dai controlli:
Td = ln 2/μ
in cui μ è il tasso di crescita specifico medio determinato secondo quanto indicato nei paragrafi 54-55.
Variabili di risposta
50.
La finalità di questa prova è di determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla crescita vegetativa di Lemna. Il presente metodo di prova descrive due variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione di entrambe le variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito:
(a)
tasso di crescita specifico medio, calcolato in base al cambiamento logaritmico del numero di fronde e, in aggiunta, all'evoluzione logaritmica di un altro parametro di misurazione (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) nel corso del tempo (espresso in giorni) nei gruppi di controllo e in ciascun gruppo trattato. Talvolta viene definito “tasso di crescita relativo” (12);
(b)
rendimento, calcolato in base ai cambiamenti del numero di fronde e a un altro parametro aggiuntivo di misurazione (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) nei gruppi di controllo e in ciascun gruppo trattato fino alla fine della prova.
51.
Occorre rilevare che i valori della tossicità calcolati utilizzando queste due variabili di risposta non sono comparabili, per cui occorre tenere conto di questa differenza al momento di utilizzare i risultati della prova. I valori dell'ECx basati sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (EyCx), se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non va considerata una differenza di sensibilità tra le due suddette variabili di risposta. Il concetto di tasso di crescita specifico medio si basa sull'andamento generale della crescita esponenziale delle lenticchie d'acqua in colture non soggette a limitazioni; la tossicità è valutata in base agli effetti sul tasso di crescita, senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico dei controlli, della curva discendente concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sul rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. L'EyCx dipende dal tasso di crescita specifico della specie di lenticchia d'acqua utilizzata in ogni prova e dal tasso di crescita specifico massimo che può variare da una specie all'altra, se non addirittura da un clone all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche di specie diverse né di cloni diversi di lenticchie d'acqua. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, stimare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, per soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi il presente metodo di prova include anche la stima basata sul rendimento.
52.
La stima della tossicità deve basarsi sul numero di fronde e su un'altra variabile di misura (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), perché alcune sostanze chimiche possono avere un effetto più marcato su una variabile diversa dal numero di fronde. Questo effetto potrebbe passare inosservato se il calcolo si basa unicamente sul numero di fronde.
53.
In una tabella si registrano il numero di fronde e qualsiasi altra variabile di risposta misurata (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), insieme alle concentrazioni della sostanza chimica in esame rilevate in ogni misurazione. Le analisi successive, per esempio per stimare la LOEC, la NOEC o l'ECx devono basarsi sui valori di ciascuna replica e non sulle medie calcolate di ciascun gruppo trattato.
Tasso di crescita specifico medio
54.
Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è calcolato in funzione dell'aumento logaritmico delle variabili di crescita — numero di fronde e un'altra variabile di misura (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) — utilizzando la formula riportata qui di seguito per ciascuna replica dei gruppi di controllo e dei gruppi trattati:
dove:
—
μi-j
è il tasso di crescita specifico medio dal momento i al momento j,
—
Ni
è la variabile di misurazione nel recipiente di prova o di controllo nel momento i,
—
Nj
è la variabile di misurazione nel recipiente di prova o di controllo nel momento j,
—
t
è il periodo di tempo tra i e j.
Per ciascuno gruppo trattato e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita e le relative stime della varianza.
55.
Occorre calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero periodo di prova (i momenti “i” e “j” nella formula suindicata corrispondono rispettivamente all'inizio e alla fine della prova). Per ciascuna concentrazione dei gruppi trattati e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita specifico e le rispettive stime della varianza. Occorre inoltre valutare il tasso di crescita in ogni sezione della prova per verificare gli effetti della sostanza chimica in esame durante il periodo di esposizione (per esempio, analizzando le curve di crescita dopo trasformazione logaritmica). Una differenza importante tra il tasso di crescita sezione per sezione e il tasso di crescita medio sta ad indicare l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, il che richiede un attento esame delle curve di crescita. In tal caso, un approccio prudente consiste nel confrontare i tassi di crescita specifici delle colture trattate durante il periodo di inibizione massima con quelli dei controlli nello stesso periodo.
56.
La percentuale di inibizione del tasso di crescita (Ir) può essere successivamente calcolata per ciascuna concentrazione di prova (gruppo trattato) secondo la formula seguente:
dove:
—
% Ir
:
è la percentuale di inibizione del tasso di crescita specifico medio,
—
μC
:
è il valore medio di μ nel gruppo di controllo,
—
μT
:
è il valore medio di μ nel gruppo trattato.
Rendimento
57.
Gli effetti sul rendimento sono determinati in funzione di due variabili di misurazione: il numero di fronde e un'altra variabile (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), per ciascun recipiente di prova all'inizio e al termine della prova. Per quanto riguarda il peso secco o il peso fresco, la biomassa di partenza è determinata a partire da un campione di fronde prelevato dallo stesso lotto utilizzato per inoculare i recipienti di prova (cfr. paragrafo 20). Per ciascuna concentrazione di prova e di controllo occorre calcolare un valore medio di rendimento nonché le stime della varianza. Per ogni gruppo trattato la percentuale media di inibizione del rendimento (% Iy) può essere calcolata secondo la formula seguente:
dove:
—
% Iy
è la percentuale di riduzione del rendimento,
—
bC
è la biomassa finale meno la biomassa di partenza del gruppo di controllo,
—
bT
è la biomassa finale meno la biomassa di partenza del gruppo trattato.
Tracciato delle curve concentrazione-risposta
58.
Occorre tracciare curve concentrazione-risposta che raffigurano la percentuale d'inibizione media della variabile di risposta (Ir oppure Iy calcolate come indicato nei paragrafi 56 o 57) e il logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame.
Stima dell'ECx
59.
Le stime dell'ECx (ad esempio, l'EC50) devono essere basate sia sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) sia sul rendimento (EyCx), che devono, a loro volta, basarsi sul numero di fronde e su un'altra variabile di misurazione (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), in quanto alcune sostanze chimiche in esame producono effetti diversi sul numero di fronde e su altre variabili di misurazione. I parametri di tossicità ricercati corrispondono pertanto a quattro valori di ECx per ciascun livello di inibizione x calcolato: ErCx (numero di fronde); ErCx (area totale delle fronde, peso secco o pesco fresco); EyCx (numero di fronde); e EyCx (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco).
Procedure statistiche
60.
L'obiettivo consiste nel descrivere in maniera quantitativa, mediante un'analisi della regressione, la relazione concentrazione-risposta. È possibile utilizzare una regressione lineare ponderata, preceduta da una trasformazione di linearizzazione dei dati di risposta — per esempio in unità probit, logit o Weibull (13) -, ma è preferibile applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle inevitabili irregolarità dei dati e degli scarti rispetto alle distribuzioni regolari. Vicine allo zero o all'inibizione totale, queste irregolarità possono essere amplificate dalla trasformazione e interferire con l'analisi (13). Si fa presente che i metodi analitici standard che utilizzano le trasformazioni probit, logit, o Weibull si applicano a dati quantali (per esempio, mortalità o sopravvivenza) e devono quindi essere modificati per poter essere utilizzati con i dati relativi alla crescita o al rendimento. Per le procedure che consentono di determinare i valori dell'ECx a partire da dati continui si vedano i riferimenti (14)(15)(16).
61.
Per ciascuna variabile di risposta da analizzare, occorre utilizzare la relazione concentrazione-risposta per stimare valori puntuali dell'ECx. Laddove possibile si determinano i limiti di confidenza a 95 % per ogni stima. La corrispondenza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione deve essere valutata graficamente o con metodi statistici. L'analisi della regressione deve essere effettuata basandosi sulle risposte rilevate in ogni replica e non sulle medie dei gruppi trattati.
62.
Le stime dell'EC50 e gli intervalli di confidenza possono essere ottenuti anche mediante interpolazione lineare con bootstrapping (17), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.
63.
Per stimare la LOEC, e quindi la NOEC, è necessario paragonare le medie dei gruppi trattati mediante tecniche di analisi della varianza (ANOVA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli ricorrendo a un metodo adeguato di comparazione multipla o di analisi della tendenza. A questo proposito possono essere utili i test di Dunnett o di Williams (18)(19)(20)(21). È necessario valutare se l'ipotesi di omogeneità della varianza dell'ANOVA è fondata, valutazione che può essere effettuata graficamente o tramite una prova formale (22), ad esempio i test di Levene o di Bartlett. Se l'ipotesi dell'omogeneità della varianza non si conferma, può essere talvolta utile correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. Se l'eterogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta mediante una trasformazione, si prenderanno in considerazione metodi di analisi della tendenza come, ad esempio, i test di tendenza regressivi di Jonckheere. Il riferimento bibliografico (16) fornisce ulteriori orientamenti sulla determinazione della NOEC.
64.
Alcuni sviluppi scientifici recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare l'abbandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali dell'ECx basate sulla regressione. Per questa prova su Lemna non è stato definito alcun valore appropriato di x. Tuttavia un intervallo da 10 % a 20 % sembra appropriato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile riportare sia l'EC10 sia l'EC20.
Relazioni
65.
La relazione sulla prova deve includere le informazioni indicate di seguito.
Sostanza chimica in esame:
—
stato fisico e proprietà fisico-chimiche, compreso il limite di solubilità in acqua,
—
dati di identificazione chimica (per esempio il numero CAS), compresa la purezza (impurità).
Specie sperimentali:
—
nome scientifico, clone (se noto) e provenienza.
Condizioni sperimentali:
—
procedura sperimentale utilizzata (statica, semi-statica o a flusso continuo),
—
data di inizio e durata della prova,
—
mezzo di prova,
—
descrizione del disegno sperimentale: recipienti e coperchi, volumi delle soluzioni, numero di colonie e di fronde per recipiente all'inizio della prova,
—
concentrazioni di prova (nominali e misurate, in funzione delle esigenze), numero di repliche per concentrazione,
—
metodi di preparazione delle soluzioni madre e delle soluzioni di prova, ivi compreso l'uso di eventuali solventi o disperdenti,
—
temperatura nel corso della prova,
—
fonte luminosa, intensità luminosa e omogeneità,
—
valori del pH dei mezzi di prova e di controllo,
—
concentrazioni della sostanza chimica in esame e rispettivo metodo di analisi, con i dati appropriati per la valutazione della qualità del metodo (studi di convalida, scarti tipo o intervalli di confidenza delle analisi),
—
metodi di determinazione del numero di fronde e di altre variabili di misurazione, per esempio peso secco, peso fresco o area delle fronde,
—
qualsiasi differenza rispetto al presente metodo di prova.
Risultati:
—
dati grezzi: numero di fronde e altre variabili di misurazione in ciascun recipiente di prova e di controllo per ciascuna osservazione e analisi,
—
medie e scarti tipo per ciascuna variabile di misurazione,
—
curve di crescita per ciascuna concentrazione (si raccomanda la trasformazione logaritmica della variabile di misurazione, si veda il paragrafo 55);
—
tempio di raddoppio/tasso di crescita nel controllo sulla base del numero di fronde,
—
calcolo delle variabili di risposta per ciascuna replica trattata, con valore medio e coefficiente di variazione delle repliche,
—
rappresentazione grafica della relazione concentrazione/effetto,
—
stime degli endpoint tossici per le variabili di risposta: per esempio EC50, EC10, EC20, e relativi intervalli di confidenza. Se calcolate, la LOEC e/o la NOEC e i metodi statistici utilizzati per determinarle,
—
se è stato praticato un test ANOVA, la portata dell'effetto individuato (per esempio, la differenza meno significativa),
—
eventuali stimoli della crescita osservati in qualsiasi gruppo trattato,
—
eventuali segni di fitotossicità e osservazioni delle soluzioni di prova,
—
discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute alle differenze rispetto al presente metodo di prova.
BIBLIOGRAFIA
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(18)
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(19)
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(20)
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(21)
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(22)
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Appendice 1
Definizioni
Ai fini del presente metodo di prova si utilizzano le definizioni e le abbreviazioni seguenti.
Biomassa: peso secco della materia vivente presente in una popolazione. In questa prova la biomassa è misurata indirettamente, di norma mediante conteggio delle fronde e l'area delle fronde, quindi l'uso del termine “biomassa” si riferisce anche a queste misurazioni indirette.
Clone: organismo o cellula ottenuto a partire da un singolo individuo per riproduzione asessuata. Gli individui dello stesso clone sono pertanto geneticamente identici.
Clorosi: ingiallimento del tessuto delle fronde.
Colonia: aggregato di fronde madri e figlie (di norma da due a quattro) attaccate le une alle altre. Talvolta denominata “pianta”.
Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC — Lowest Observed Effect Concentration): la concentrazione più bassa saggiata di una sostanza alla quale si osserva un effetto di riduzione statisticamente significativo della crescita (p < 0,05) rispetto al controllo, nell'arco di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni di prova superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e di conseguenza la NOEC).
Concentrazione senza effetti osservati (NOEC — No Observed Effect Concentration): concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC.
Crescita: aumento della variabile di misurazione, per esempio il numero di fronde, il peso secco, il peso umido o l'area delle fronde durante il periodo di prova.
ECx: concentrazione della sostanza chimica in esame disciolta nel mezzo di prova che determina una riduzione dell'x % (per esempio, 50 %) della crescita di Lemna entro un periodo di esposizione definito (che deve essere esplicitato se diverso dalla durata totale o normale della prova). Per indicare in modo inequivoco se il valore EC si riferisce al tasso di crescita o al rendimento si utilizzano le abbreviazioni “ErC” per il tasso di crescita e “EyC” per il rendimento, seguite dalla variabile di misurazione utilizzata, ad esempio ErC (numero di fronde).
Endpoint della prova: indica il fattore generale che sarà modificato, rispetto al controllo, dalla sostanza chimica in esame. In questo metodo di prova l'endpoint è l'inibizione della crescita che può essere espressa da più variabili di risposta dedotte da una o più variabili di misurazione.
Fenotipo: caratteristiche osservabili di un organismo, determinate dall'interazione dei suoi geni con l'ambiente.
Flusso continuo: si riferisce a una prova in cui le soluzioni di prova sono rinnovate costantemente.
Fronda: struttura individuale/singola del tipo “a foglia” di una pianta di lenticchia d'acqua. Si tratta dell'unità più piccola (individuo) in grado di riprodursi.
Gibbosità: gobba o rigonfiamento della fronda.
Mezzo di prova: mezzo di crescita sintetico completo in cui le piante sperimentali crescono quando sono esposte alla sostanza chimica in esame. Quest'ultima è di norma disciolta nel mezzo di prova.
Monocoltura: coltura con una sola specie vegetale.
Necrosi: tessuto morto delle fronde (ossia bianco o rigonfio d'acqua).
Prova semistatica (con rinnovo): prova in cui la soluzione di prova è periodicamente sostituita a determinati intervalli durante la prova.
Prova statica: prova senza rinnovo della soluzione di prova durante la prova.
Rendimento: valore di una variabile di misurazione che esprime la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e il valore della stessa variabile all'inizio del periodo di esposizione.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio): aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione.
Variabili di misurazione: qualsiasi tipo di variabile che viene misurata per esprimere l'endpoint della prova utilizzando una o più variabili di risposta. Nel presente metodo il numero di fronde, l'area delle fronde, il peso fresco e il peso secco sono variabili di misurazione.
Variabili di risposta: variabili per la stima della tossicità, ricavate da qualsiasi variabile di misurazione che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. Nel presente metodo di prova i tassi di crescita e il rendimento sono variabili di risposta ricavate da variabili di misurazione quali il numero di fronde, l'area delle fronde, il peso fresco e il peso secco.
Appendice 2
Descrizione di Lemna spp.
La pianta acquatica comunemente denominata “lenticchia d'acqua”, Lemna spp., appartiene alla famiglia delle Lemnaceae costituita da quattro generi presenti in tutto il mondo. La loro tassonomia e il loro aspetto sono stati descritti in maniera esaustiva (1)(2). Lemna gibba e L. minor sono specie rappresentative delle zone temperate e sono regolarmente utilizzate nelle prove di tossicità. Entrambe le specie possiedono un fusto discoide (fronda) galleggiante o sommerso e una radice estremamente sottile che parte dal centro della superficie inferiore di ogni fronda. Le specie di Lemna fioriscono raramente e si riproducono per via vegetativa dando luogo a nuove fronde (3). Rispetto alle piante più vecchie, le giovani tendono ad essere più pallide, avere radici più corte ed essere costituite da 2-3 fronde di misure diverse. Le dimensioni ridotte di Lemna, la sua struttura semplice, la riproduzione asessuata e il tempo di generazione breve rendono le piante di questo genere particolarmente adatte alle prove di laboratorio (4)(5).
Data la possibile variazione di sensibilità da una specie all'altra, sono validi solo i confronti di sensibilità all'interno della stessa specie.
Esempi di specie di Lemna utilizzati per le prove con riferimenti bibliografici
Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.
Lemna minor: United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (in svedese).
Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.
United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.
Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.
Lemna perpusilla: Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.
Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.
Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.
Fonti di specie di Lemna
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria
Department of Botany, University of Toronto
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2
Tel.: +1-416-978-3641
Fax:+1-416-978-5878
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca
North Carolina State University
Forestry Dept
Duckweed Culture Collection
Campus Box 8002
Raleigh, NC 27695-8002
Stati Uniti
Tel.: 001 (919) 515-7572
e-mail: astomp@unity.ncsu.edu
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University
SE-106 91
Stoccolma
Svezia
Tel.: +46 8 674 7240
Fax +46 8 674 7636
Federal Environmental Agency (UBA)
FG III 3.4
Schichauweg 58
12307 Berlino
Germania
e-mail: lemna@uba.de
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3.
Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.
4.
Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.
5.
Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.
Appendice 3
Conservazione di una coltura madre
Le colture madre possono essere conservate a basse temperature (4-10 °C) per lunghi periodi senza che occorra ristabilirle. Il mezzo di crescita di Lemna può essere identico a quello utilizzato per le prove, ma è possibile utilizzare anche altri mezzi ricchi di nutrienti per le colture madre.
Periodicamente si prelevano e si trasferiscono, con una tecnica asettica, piante giovani di colore verde-chiaro in nuovi recipienti di coltura contenenti mezzo fresco. Alle temperature più basse qui proposte, le sottocolture possono essere avviate anche a intervalli di tre mesi.
Occorre utilizzare recipienti di coltura in vetro sterili e chimicamente puliti (lavati con acido) e manipolare il materiale secondo tecniche asettiche. Se la coltura madre viene contaminata, per esempio da alghe o funghi, si adotteranno le misure necessarie per eliminare gli organismi contaminanti. Per le alghe e la maggior parte degli altri organismi contaminanti basta una sterilizzazione superficiale. A tal fine si preleva un campione del materiale vegetale contaminato, si tagliano le radici, si agita vigorosamente in acqua pulita e lo si immerge in una soluzione di ipoclorito di sodio a 0,5 % (v/v) per un periodo compreso tra 30 secondi e 5 minuti. In seguito si sciacqua il materiale vegetale con acqua sterile e lo si trasferisce, suddiviso per lotti, in recipienti di coltura contenenti mezzo fresco. Molte fronde moriranno dopo questo trattamento, soprattutto se il periodo di esposizione è stato lungo, ma alcune di quelle sopravvissute non saranno più contaminate e potranno essere inoculate in nuove colture.
Appendice 4
Mezzi
Si raccomandano mezzi di crescita diversi per L. minor e L. gibba: per L. minor, una versione modificata del mezzo stabilito dalla norma svedese (SIS) mentre per L. gibba, il mezzo 20X — AAP. La composizione di questi due mezzi sono riportate qui di seguito. Per preparare i mezzi occorre utilizzare sostanze chimiche di grado analitico o reagente e acqua deionizzata.
Mezzo di crescita per Lemna stabilito dalla norma svedese (SIS)
—
Le soluzioni madre I-V sono sterilizzate in autoclave (120 °C, 15 minuti) o mediante filtrazione su membrana (dimensione dei pori di circa 0,2 μm).
—
La soluzione madre VI (e opzionalmente VII) è sterilizzata solo mediante filtrazione su membrana; non deve essere sottoposta a sterilizzazione in autoclave.
—
Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e al buio. Le soluzioni madre I-V devono essere eliminate dopo sei mesi, mentre la soluzione madre VI (e opzionalmente VII) si conserva per un solo mese.
Soluzione madre
Sostanza
Concentrazione nella soluzione madre
(g/l)
Concentrazione nel mezzo preparato
(mg/l)
Mezzo preparato
Elemento
Concentrazione
(mg/l)
I
NaNO3
8,50
85
Na; N
32; 14
KH2PO4
1,34
13,4
K; P
6,0; 2,4
II
MgSO4 · 7H2O
15
75
Mg; S
7,4; 9,8
III
CaCl2 · 2H2O
7,2
36
Ca; Cl
9,8; 17,5
IV
Na2CO3
4,0
20
C
2,3
V
H3BO3
1,0
1,00
B
0,17
MnCl2 · 4H2O
0,20
0,20
Mn
0,056
Na2MoO4 · 2H2O
0,010
0,010
Mo
0,0040
ZnSO4. 7H2O
0,050
0,050
Zn
0,011
CuSO4 · 5H2O
0,0050
0,0050
Cu
0,0013
Co(NO3)2 · 6H2O
0,010
0,010
Co
0,0020
VI
FeCl3 · 6H2O
0,17
0,84
Fe
0,17
Na2 - EDTA 2H2O
0,28
1,4
-
-
VII
MOPS (tampone)
490
490
-
-
Per ottenere un litro del mezzo SIS aggiungere gli ingredienti seguenti a 900 ml di acqua deionizzata:
—
10 ml di soluzione madre I
—
5 ml di soluzione madre II
—
5 ml di soluzione madre III
—
5 ml di soluzione madre IV
—
1 ml di soluzione madre V
—
5 ml di soluzione madre VI
—
1 ml di soluzione madre VII (facoltativo)
Nota: per alcune sostanze chimiche in esame può essere necessario utilizzare anche la soluzione madre VII (tampone MOPS) (cfr. paragrafo 11).
Il pH è portato a 6,5 ± 0,2 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata.
Mezzo di crescita 20X — AAP
Le soluzioni madre sono preparate in acqua sterile distillata o deionizzata.
Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e al buio. In queste condizioni si possono conservare da 6 a 8 settimane.
Per il mezzo 20X — AAP si preparano cinque soluzioni madre nutrienti (A1, A2, A3, B e C) utilizzando sostanze chimiche di grado reagente. Il mezzo di crescita è composto da 20 ml di ciascuna soluzione madre nutriente aggiunte a circa 850 ml di acqua deionizzata. Il pH è portato a 7,5 ± 0,1 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata. Il mezzo è successivamente filtrato con una membrana con pori di 0,2 μm (circa) in un recipiente sterile.
Il mezzo di crescita destinato alle prove deve essere preparato 1 o 2 giorni prima dell'utilizzazione in modo che il pH abbia il tempo di stabilizzarsi. Il pH del mezzo di crescita deve essere controllato prima dell'utilizzo e riequilibrato, se necessario, aggiungendovi 0,1 o 1 mol di NaOH o HCl come suindicato.
la concentrazione finale di bicarbonato teoricamente ideale (che consente di evitare un adeguamento apprezzabile del pH) è 15 mg/l, e non 300 mg/l. Tuttavia il mezzo 20X — AAP è stato sempre utilizzato con una concentrazione di 300 mg/l, anche per il ring-test. [I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency].
Mezzo di STEINBERG (secondo la norma ISO 20079)
Concentrazioni e soluzioni madre
La norma ISO 20079 utilizza il mezzo modificato di Steinberg solo per Lemna minor (in quanto è la sola specie ammessa per tale metodo), ma alcune prove hanno dimostrato che si possono ottenere buoni risultati anche con Lemna gibba.
Per preparare questo mezzo occorre utilizzare sostanze chimiche di grado reagente o analitico e acqua deionizzata.
Preparare il mezzo nutriente a partire da soluzioni madre oppure dal mezzo dieci volte più concentrato, che è la concentrazione massima che si può ottenere senza precipitazione.
Tabella 1
Mezzo di Steinberg a pH stabilizzato (modificato da Altenburger)
Componente
Mezzo nutriente
Macroelementi
Peso molare
mg/l
mmol/l
KNO3
101,12
350,00
3,46
Ca(NO3)2 · 4H2O
236,15
295,00
1,25
KH2PO4
136,09
90,00
0,66
K2HPO4
174,18
12,60
0,072
MgSO4 · 7H2O
246,37
100,00
0,41
Microelementi
Peso molare
μg/l
μmol/l
H3BO3
61,83
120,00
1,94
ZnSO4 · 7H2O
287,43
180,00
0,63
Na2MoO4 · 2H2O
241,92
44,00
0,18
MnCl2 · 4H2O
197,84
180,00
0,91
FeCl3 · 6H2O
270,21
760,00
2,81
EDTA diidrato di sodio
372,24
1 500,00
4,03
Tabella 2
Soluzioni madre (macroelementi)
1.
Macroelementi (50 volte più concentrati)
g/l
Soluzione madre 1:
KNO3
17,50
KH2PO4
4,5
K2HPO4
0,63
Soluzione madre 2:
MgSO4 · 7H2O
5,00
Soluzione madre 3:
Ca(NO3)2 · 4H2O
14,75
Tabella 3
Soluzioni madre (microelementi)
2.
Microelementi (1 000 volte più concentrati)
mg/l
Soluzione madre 4:
H3BO3
120,0
Soluzione madre 5:
ZnSO4 · 7H2O
180,0
Soluzione madre 6:
Na2MoO4 · 2H2O
44,0
Soluzione madre 7:
MnCl2 · 4H2O
180,0
Soluzione madre 8:
FeCl3 · 6H2O
760,00
EDTA diidrato di sodio
1 500,00
—
Le soluzioni madre 2 e 3 possono essere mischiate, così come le soluzioni 4 e 7 (tenendo conto delle concentrazioni necessarie).
—
Per aumentarne la durata di conservazione, occorre sterilizzare le soluzioni madre in autoclave per 20 minuti a 121 °C oppure filtrarle in modo sterile su una membrana porosa (0,2 μm). Per la soluzione madre 8 si consiglia vivamente la sterilizzazione mediante filtrazione (0,2 μm).
Preparazione della concentrazione finale del mezzo di STEINBERG (modificato):
—
aggiungere 20 ml delle soluzioni madre 1, 2 e 3 (cfr. tabella 2) a circa 900 ml di acqua deionizzata per impedire la precipitazione;
—
aggiungere 1,0 ml delle soluzioni madre 4, 5, 6, 7 e 8 (cfr. tabella 3);
—
il pH deve essere pari a 5,5 ± 0,2 (aggiustare aggiungendo un volume minimo di soluzione di NaOH o di HCl);
—
portare a 1 000 ml con acqua;
—
se le soluzioni madre sono sterilizzate e si utilizza un'acqua adeguata non è necessaria un'ulteriore sterilizzazione. Se il mezzo finale viene sterilizzato, la soluzione madre 8 va aggiunta dopo il trattamento in autoclave (a 121 °C per 20 minuti).
Preparazione del mezzo di STEINBERG (modificato) concentrato dieci volte per conservazione temporanea:
—
aggiungere 20 ml delle soluzioni madre 1, 2 e 3 (cfr. tabella 2) a circa 30 ml di acqua per impedire la precipitazione;
—
aggiungere 1,0 ml delle soluzioni madre 4, 5, 6, 7 e 8 (cfr. tabella 3). Portare a 100 ml con acqua;
—
se le soluzioni madre sono sterilizzate e si utilizza un'acqua adeguata non è necessaria un'ulteriore sterilizzazione. Se il mezzo finale viene sterilizzato, la soluzione madre 8 va aggiunta dopo il trattamento in autoclave (a 121 °C per 20 minuti);
—
il pH del mezzo (concentrazione finale) deve essere pari a 5,5 ± 0,2.
»
(6)
Sono aggiunti i seguenti capitoli da C.31 a C.46:
«
C.31. PROVA SULLE PIANTE TERRESTRI: EMERGENZA DELLE PLANTULE E CRESCITA DELLE PLANTULE
INTRODUZIONE
1.
Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 208 (2006). I metodi di prova sono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici e dell'applicabilità a fini regolamentari. Il presente metodo di prova aggiornato è inteso a valutare i potenziali effetti delle sostanze chimiche sull'emergenza e la crescita delle plantule. Esso non copre gli effetti cronici o gli effetti sulla riproduzione (ossia granitura, formazione dei fiori, maturazione dei frutti). È necessario tenere conto delle condizioni di esposizione e delle proprietà delle sostanze chimiche da esaminare per garantire l'utilizzo di metodi di prova appropriati (ad esempio, nelle prove su metalli o composti di metalli è necessario considerare gli effetti del pH e dei controioni associati) (1). Il presente metodo di prova non riguarda le piante esposte ai vapori delle sostanze chimiche. Esso si applica alle prove su sostanze chimiche generali, biocidi e fitofarmaci (denominati anche prodotti fitosanitari o pesticidi). È stato elaborato sulla base di metodi esistenti (2) (3) (4) (5) (6) (7). Sono stati presi in considerazione anche altri riferimenti bibliografici correlati alle prove sulle piante (8) (9) (10). L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.
PRINCIPIO DELLA PROVA
2.
La prova valuta gli effetti dell'esposizione alla sostanza chimica in esame contenuta nel terreno (o in un'altra matrice del suolo appropriata) sull'emergenza delle plantule e sulle fasi iniziali di crescita delle piante superiori. I semi sono messi a contatto con il terreno trattato con la sostanza chimica in esame, i cui effetti sono valutati generalmente 14-21 giorni dopo l'emergenza del 50 % delle plantule nel gruppo di controllo. Gli endpoint misurati sono la valutazione visiva dell'emergenza delle plantule, il peso dei germogli secchi (in alternativa, il peso dei germogli freschi) e in alcuni casi l'altezza dei germogli, nonché la valutazione degli effetti nocivi visibili su diverse parti della pianta. Tali misurazioni e osservazioni sono confrontate con quelle effettuate su piante di controllo non trattate.
3.
A seconda della via di esposizione prevista, la sostanza chimica in esame è incorporata nel terreno (o eventualmente in una matrice del suolo artificiale) o applicata sulla superficie dello stesso, condizione rappresentativa della potenziale via di esposizione alla sostanza chimica. L'incorporazione avviene mediante il trattamento del terreno in massa. In seguito all'applicazione, il terreno è trasferito in vasi e quindi i semi della specie vegetale prescelta vengono piantati nel terreno. Nel caso dell'applicazione superficiale, la sostanza è applicata al terreno in vaso in cui siano già stati piantati i semi. Le unità di prova (i controlli e il terreno trattato più i semi) sono quindi collocate in un luogo in cui possano godere di condizioni appropriate in grado di favorire la germinazione e/o la crescita delle piante.
4.
Secondo l'obiettivo dello studio, la prova può essere eseguita al fine di determinare la curva dose-risposta oppure per saggiare una singola concentrazione/un singolo tasso, nel qual caso costituisce una prova limite. Se i risultati della prova a una singola concentrazione/un singolo tasso superano un determinato livello di tossicità (ad esempio, se si osservano effetti superiori all'x %), si procede all'esecuzione di una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni per determinare il limite superiore e quello inferiore per la tossicità, seguita da una prova a più concentrazioni/tassi per generare una curva dose-risposta. Si ricorre a un'analisi statistica appropriata per ottenere una concentrazione efficace ECx o un tasso di applicazione efficace ERx (ad esempio, EC25, ER25, EC50, ER50) per il parametro o i parametri pertinenti più sensibili. Questa prova consente di ottenere anche i valori per la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC, No Observed Effect Concentration) e la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC, Lowest Observed Effect Concentration).
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
5.
Le seguenti informazioni sono utili per identificare la via di esposizione prevista alla sostanza chimica e progettare la prova: formula strutturale, purezza, idrosolubilità, solubilità nei solventi organici, coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua, comportamento di assorbimento del suolo, tensione di vapore, stabilità chimica in acqua e alla luce e biodegradabilità.
VALIDITÀ DELLA PROVA
6.
Affinché la prova possa essere ritenuta valida, i controlli devono soddisfare i seguenti criteri:
—
l'emergenza delle plantule è pari ad almeno il 70 %;
—
sulle plantule non sono visibili effetti fitotossici (ad esempio clorosi, necrosi, appassimento, deformazioni di foglie e stelo) e si osservano solo variazioni normali della crescita e della morfologia per la specie esaminata;
—
il tasso medio di sopravvivenza delle plantule di controllo emerse è di almeno il 90 % per la durata dello studio;
—
le condizioni ambientali per una particolare specie sono identiche e i mezzi colturali contengono la stessa quantità di matrice del suolo, mezzo di supporto o substrato proveniente dalla stessa fonte.
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO
7.
È possibile sottoporre a prova una sostanza chimica di riferimento a intervalli regolari per verificare che l'esecuzione della prova, la risposta delle piante scelte per la prova e le condizioni sperimentali non cambino in modo significativo nel tempo. In alternativa, è possibile utilizzare misurazioni storiche della biomassa o della crescita dei controlli per esaminare le prestazioni del sistema di prova in laboratori particolari; tali misurazioni possono essere utilizzate anche per il controllo della qualità intralaboratorio.
DESCRIZIONE DEL METODO
Terreno naturale — substrato artificiale
8.
Le piante possono essere coltivate in vasi contenenti terreno sabbioso limoso, sabbia limacciosa o limo argilloso e sabbioso con tenore in carbonio organico dell'1,5 % (circa il 3 % di materia organica). Si può utilizzare anche del terriccio da rinvaso commerciale o una miscela di terreno sintetico contenente fino all'1,5 % di carbonio organico. Non bisogna utilizzare terreni argillosi se la sostanza chimica in esame ha notoriamente un'affinità elevata per le argille. Il terreno di campo deve essere setacciato per omogeneizzare la dimensione delle particelle in modo che non superino i 2 mm, rimuovendo le particelle più grosse. Si devono indicare il tipo e la struttura, la percentuale di carbonio organico, il pH e il tenore di sale calcolato in base alla conduttività elettronica del terreno preparato finale. Il terreno deve essere classificato in base a un sistema di classificazione standard (11). Al fine di ridurre gli effetti dei patogeni del terreno, quest'ultimo può essere pastorizzato o sottoposto a trattamento termico.
9.
L'impiego di terreno naturale può rendere più complessa l'interpretazione dei risultati e aumentare la variabilità a causa delle differenze nelle caratteristiche chimico-fisiche e nelle popolazioni microbiche. Queste variabili a loro volta modificano la capacità di ritenzione dell'umidità, la capacità di legame chimico, l'aerazione e il tenore in nutrienti e oligoelementi. Alle variazioni che riguardano questi fattori fisici si aggiungono variazioni relative alle caratteristiche chimiche, come il pH e il potenziale di ossido-riduzione, che possono influire sulla biodisponibilità della sostanza chimica in esame (12) (13) (14).
10.
Di solito i substrati artificiali non sono utilizzati per sottoporre a prova i fitofarmaci, ma possono essere utili per sottoporre a prova le sostanze chimiche generali o se si desidera ridurre al minimo la variabilità dei terreni naturali e aumentare la comparabilità dei risultati delle prove. I substrati utilizzati devono essere costituiti da materiali inerti che presentino interazioni minime con la sostanza chimica in esame, il vettore solvente o entrambi. La sabbia di quarzo lavata in acido, la lana minerale e le perle di vetro (per esempio con un diametro compreso tra 0,35 e 0,85 mm) si sono rivelate materiali inerti idonei, che assorbono la sostanza chimica in esame in misura minima (15), garantendo così la sua massima disponibilità per le plantule mediante assorbimento dalle radici. Tra i substrati non idonei figurano la vermiculite, la perlite o altri materiali altamente assorbenti. È necessario assicurare l'apporto di nutrienti che favoriscano la crescita delle piante per evitare che queste soffrano di carenze nutritive, le quali, ove possibile, devono essere accertate mediante un'analisi chimica o una valutazione visiva delle piante di controllo.
Criteri di selezione delle specie sperimentali
11.
La gamma delle specie selezionate deve essere ragionevolmente ampia, ad esempio in termini di diversità tassonomica nel regno vegetale, distribuzione, abbondanza, caratteristiche del ciclo di vita specifiche della specie e regioni di presenza naturale, per permettere lo sviluppo di una serie di risposte (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Nella selezione delle specie sperimentali bisogna tenere conto delle seguenti caratteristiche:
—
i semi della specie sono uniformi e facilmente reperibili presso una o più fonti standard affidabili e producono una germinazione regolare, affidabile e uniforme, nonché una crescita uniforme delle plantule;
—
la pianta può essere sottoposta a prova in laboratorio e può dare risultati affidabili e riproducibili nello stesso laboratorio e tra laboratori diversi;
—
la sensibilità della specie sottoposta a prova deve essere coerente con le risposte delle piante che si trovano nell'ambiente esposto alla sostanza chimica;
—
la specie è stata già utilizzata in qualche misura in precedenti prove di tossicità e il suo utilizzo, ad esempio nei saggi biologici sugli erbicidi, nello screening per la rilevazione di metalli pesanti, nelle prove di stress salino o minerale o negli studi sull'allelopatia, indica una sensibilità a una vasta gamma di fattori di stress;
—
la specie è compatibile con le condizioni colturali del metodo di prova;
—
la specie soddisfa i criteri di validità della prova.
Nell'appendice 2 sono elencate alcune delle specie storicamente più utilizzate nelle prove, mentre nell'appendice 3 sono elencate potenziali specie non coltivate.
12.
Il numero di specie da sottoporre a prova dipende dalle pertinenti disposizioni regolamentari e pertanto non è specificato nel presente metodo di prova.
Applicazione della sostanza chimica in esame
13.
La sostanza chimica deve essere applicata utilizzando un vettore appropriato (ad esempio, acqua, acetone, etanolo, polietilenglicole, gomma arabica, sabbia). È possibile sottoporre a prova anche le miscele (prodotti formulati o formulazioni) contenenti principi attivi e diversi adiuvanti.
Incorporazione nel terreno o nel substrato artificiale
14.
È possibile aggiungere all'acqua le sostanze chimiche idrosolubili o in sospensione in acqua e quindi mescolare la soluzione con del terreno con l'ausilio di un adeguato miscelatore. Questo tipo di prova può essere appropriato se l'esposizione alla sostanza chimica avviene attraverso il terreno o l'acqua interstiziale o se sussiste il rischio di assorbimento dalle radici. La quantità di sostanza in esame aggiunta non deve superare la capacità di ritenzione idrica del terreno. Il volume di acqua aggiunto deve essere identico per ogni concentrazione di prova, ma è opportuno limitarlo per impedire la formazione di agglomerati di terreno.
15.
Le sostanze chimiche che presentano una bassa idrosolubilità devono essere disciolte in un solvente volatile adeguato (ad esempio acetone, etanolo) e mescolate alla sabbia. Il solvente può quindi essere rimosso dalla sabbia utilizzando un flusso d'aria mentre si mescola continuamente la sabbia. La sabbia trattata è mescolata al terreno sperimentale. Viene preparato un secondo controllo costituito unicamente da sabbia e solvente. Ai trattamenti a tutti i livelli e al secondo controllo vengono aggiunti quantitativi identici di sabbia in cui il solvente sia stato mescolato e quindi rimosso. Nel caso in cui le sostanze chimiche in esame siano solide e insolubili, occorre mescolare il terreno asciutto e la sostanza in un miscelatore idoneo. Dopo avere aggiunto il terreno ai vasi si procede immediatamente con la semina.
16.
Quando si utilizza un substrato artificiale al posto del terreno, le sostanze chimiche idrosolubili possono essere disciolte nella soluzione nutritiva appena prima dell'inizio della prova. Le sostanze chimiche che non sono idrosolubili, ma che possono essere messe in sospensione nell'acqua mediante un vettore solvente, devono essere aggiunte con quest'ultimo alla soluzione nutritiva. Le sostanze chimiche non idrosolubili per le quali non è disponibile un vettore solubile in acqua non tossico devono essere disciolte in un solvente volatile appropriato. La soluzione, mescolata alla sabbia o alle perle di vetro, è collocata in un'apparecchiatura rotante sotto vuoto, dove viene fatta evaporare, lasciando uno strato uniforme di sostanza chimica sulla sabbia o sulle perle. È necessario estrarre una quantità pesata di perle con lo stesso solvente organico e dosare la sostanza chimica prima di riempire i vasi.
Applicazione superficiale
17.
Nel caso dei fitofarmaci, la sostanza chimica in esame spesso viene applicata mediante dispersione della soluzione di prova nebulizzata sulla superficie del terreno. Il modello e la capacità di tutte le apparecchiature utilizzate per eseguire le prove, comprese le apparecchiature con cui viene preparata e applicata la sostanza chimica in esame, devono essere tali da consentire un'esecuzione precisa delle prove, con una copertura riproducibile. La copertura deve essere uniforme sulle superfici del terreno. Bisogna prestare attenzione per evitare l'eventuale interazione, mediante assorbimento o reazione, delle sostanze chimiche con l'apparecchiatura (ad esempio, tubi di plastica e sostanze chimiche lipofile o elementi e parti in acciaio). La polverizzazione della sostanza chimica in esame sulla superficie del terreno è effettuata simulando le tipiche applicazioni con nebulizzatore. In generale, i volumi polverizzati devono corrispondere a quelli utilizzati nella normale pratica agricola e devono essere indicati (quantità d'acqua, ecc.). È necessario selezionare un tipo di ugello che consenta una copertura uniforme della superficie del terreno. Se si applicano solventi e vettori, bisogna stabilire un secondo gruppo di piante di controllo che riceva unicamente il solvente o il vettore. Tale procedura non è necessaria per i fitofarmaci che vengono testati come formulazioni.
Verifica della concentrazione o del tasso della sostanza chimica in esame
18.
Le concentrazioni o i tassi di applicazione devono essere confermati da un'adeguata verifica analitica. Per le sostanze chimiche solubili, la verifica di tutte le concentrazioni o di tutti i tassi può essere confermata mediante l'analisi della concentrazione più elevata della soluzione di prova, associata alla documentazione sulle diluizioni successive e all'utilizzo di apparecchiature per l'applicazione tarate (ad esempio, vetreria per analisi tarata, taratura del nebulizzatore). Nel caso delle sostanze chimiche insolubili, la verifica dei materiali compositi deve basarsi sul peso della sostanza chimica in esame aggiunta al terreno. Se è richiesta la dimostrazione dell'omogeneità, può rendersi necessaria l'analisi del terreno.
PROCEDURA
Disegno sperimentale
19.
Semi della stessa specie sono piantati nei vasi. Il numero di semi piantati per ogni vaso dipende dalla specie, dalle dimensioni del vaso e dalla durata della prova. Il numero di piante per vaso deve essere tale da garantire condizioni colturali adeguate ed evitare l'affollamento per l'intera durata della prova. La densità massima deve essere di circa 3-10 semi per 100 cm2, a seconda della dimensione dei semi. Si consiglia ad esempio, per un recipiente di 15 cm, una densità di 1-2 piante di mais, soia, pomodoro, cetriolo o barbabietola da zucchero, di tre piante di colza o piselli e di 5-10 piante di cipolla, grano o altri semi di piccole dimensioni. Il numero di semi e di vasi di replica (una replica corrisponde a un vaso e pertanto le piante nello stesso vaso non costituiscono una replica) deve essere adeguato alle condizioni richieste da un'analisi statistica ottimale (21). Va osservato che la variabilità è maggiore per le specie sperimentali per le quali si utilizza un numero inferiore di semi grandi per ciascun vaso (replica) rispetto alle specie sperimentali per le quali è possibile utilizzare un numero più alto di semi piccoli per ciascun vaso. Piantando il medesimo numero di semi in ogni vaso si può ridurre al minimo la variabilità.
20.
I gruppi di controllo sono utilizzati per garantire che gli effetti osservati siano associati o attribuiti unicamente all'esposizione alla sostanza chimica in esame. Il gruppo di controllo appropriato deve essere identico sotto tutti gli aspetti al gruppo sottoposto a prova, eccetto per l'esposizione alla sostanza chimica in esame. Nell'ambito di una data prova, tutte le piante sottoposte a prova, compresi i controlli, devono provenire dalla stessa fonte. Per prevenire le distorsioni, è indispensabile un'assegnazione casuale dei vasi di prova e di controllo.
21.
Va evitato l'uso di semi conciati con insetticidi o fungicidi (semi trattati). Tuttavia, l'uso di taluni fungicidi da contatto non sistemici (ad esempio il captano o il tiram) è consentito da alcune autorità di regolamentazione (22). L'eventuale problema dei patogeni portati da seme può essere risolto immergendo brevemente i semi in una soluzione debole di ipoclorito al 5 % e quindi sciacquandoli accuratamente con acqua corrente e asciugandoli. Non sono consentiti altri trattamenti curativi a base di fitofarmaci.
Condizioni sperimentali
22.
Le condizioni sperimentali devono essere molto simili alle condizioni necessarie alla crescita normale delle specie e delle varietà testate (cfr. appendice 4 per esempi delle condizioni sperimentali). Le piante emergenti devono essere curate facendo ricorso a buone pratiche colturali in locali ad ambiente controllato, fitotroni o serre. Quando si utilizzano strutture per la coltivazione, queste pratiche generalmente comprendono il controllo e una registrazione sufficientemente frequente (ad esempio giornaliera) della temperatura, dell'umidità, della concentrazione di biossido di carbonio, della luce (intensità, lunghezza d'onda, irraggiamento fotosinteticamente attivo) e del fotoperiodo, dei mezzi di irrigazione, ecc. al fine di assicurare una crescita soddisfacente della pianta quale stabilita sulla base dell'osservazione delle piante di controllo della specie selezionata. La temperatura delle serre va regolata attraverso sistemi di ventilazione, riscaldamento e/o raffreddamento. Le seguenti condizioni sono generalmente raccomandate per le prove in serra:
—
temperatura: 22 °C ± 10 °C;
—
umidità: 70 % ± 25 %;
—
fotoperiodo: minimo 16 ore di luce;
—
intensità luminosa: 350 ± 50 μE/m2/s. Potrebbe essere necessaria un'illuminazione aggiuntiva se l'intensità diminuisce al di sotto di 200 μE/m2/s, lunghezza d'onda 400-700 nm, ad eccezione di alcune specie con un fabbisogno di luce inferiore.
Le condizioni ambientali devono essere monitorate e riferite durante lo studio. Le piante devono essere coltivate in vasi vetrinati o di plastica non porosi poggiati su sottovasi. È possibile riposizionare periodicamente i vasi per ridurre al minimo la variabilità in termini di crescita delle piante (dovuta al variare delle condizioni sperimentali all'interno delle strutture per la coltivazione). I vasi devono essere sufficientemente grandi da consentire una crescita normale.
23.
È possibile integrare nutrienti del terreno in base alle necessità per mantenere il vigore delle piante. È possibile stabilire la necessità di ulteriori nutrienti e il calendario per la loro aggiunta osservando le piante di controllo. Si consiglia di irrigare le piante dal fondo dei contenitori (ad esempio utilizzando stoppini in fibra di vetro). Tuttavia un'irrigazione iniziale effettuata dall'alto può stimolare la germinazione dei semi e, in caso di applicazione sulla superficie del terreno, facilitare la penetrazione della sostanza chimica nello stesso.
24.
Le condizioni di coltura specifiche devono essere appropriate per la specie sottoposta a prova e la sostanza chimica in esame. È necessario mantenere le stesse condizioni ambientali per le piante utilizzate come controlli e quelle trattate, prendendo tuttavia misure adeguate per evitare l'esposizione incrociata (ad esempio a sostanze chimiche volatili) tra trattamenti differenti e l'esposizione dei controlli alla sostanza chimica in esame.
Esecuzione della prova a una singola concentrazione o a un singolo tasso
25.
Ai fini della determinazione della concentrazione o del tasso appropriato di una sostanza chimica per l'esecuzione di una prova a una singola concentrazione o a un singolo tasso (stimolazione/limite) vanno presi in considerazione diversi fattori. Per le sostanze chimiche generali, tra questi fattori figurano le proprietà chimico-fisiche. Per i fitofarmaci bisogna tenere conto delle proprietà chimico-fisiche e del modello d'uso della sostanza chimica in esame, della sua concentrazione massima o del suo tasso di applicazione massimo, del numero di applicazioni per ogni stagione e/o della persistenza della sostanza. Per stabilire se una sostanza chimica generale possiede proprietà fitotossiche, può essere opportuno eseguire la prova a un livello massimo di 1 000 mg/kg di terreno asciutto.
Prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni
26.
Se necessario, è possibile eseguire una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni per ottenere indicazioni sulle concentrazioni o sui tassi da testare nello studio dose-risposta definitivo. In una prova di questo tipo le concentrazioni o i tassi da testare devono essere ampiamente distanziati (ad esempio: 0,1 - 1,0 - 10 - 100 e 1 000 mg/kg di terreno asciutto). Per i fitofarmaci, si possono calcolare le concentrazioni o i tassi a partire dalla concentrazione o dal tasso di applicazione massimo o raccomandato, ad esempio 1/100, 1/10, 1/1 rispetto alla concentrazione o al tasso di applicazione massimo o raccomandato.
Esecuzione della prova a più concentrazioni o tassi
27.
Lo scopo di una prova a più concentrazioni o tassi è stabilire una relazione dose-risposta e determinare un valore ECx o ERx per l'emergenza, la biomassa e/o gli effetti visibili rispetto ai controlli non esposti, come richiesto dalle autorità di regolamentazione.
28.
Il numero di concentrazioni o di tassi e gli intervalli tra di essi devono essere sufficienti a produrre una relazione dose-risposta e un'equazione di regressione affidabili e a ottenere una stima dei valori ECx. o ERx.. Le concentrazioni o i tassi selezionati devono includere i valori ECx o ERx da determinare. Ad esempio, per ottenere un valore EC50 è preferibile eseguire la prova a tassi in grado di produrre un effetto compreso tra il 20 e l'80 %. Il numero raccomandato di concentrazioni o tassi di prova per conseguire questo risultato è pari almeno a 5 in una serie geometrica, più un controllo non trattato, con un fattore di spaziatura non superiore a 3. Per ogni gruppo di trattamento e di controllo, il numero di repliche deve essere pari almeno a 4 e il numero totale di semi almeno a 20. Al fine di aumentare la significatività statistica della prova, per alcune piante che presentano un tasso di germinazione basso o una crescita variabile possono essere necessarie più repliche. Se si utilizza un numero elevato di concentrazioni o tassi di prova, il numero di repliche può essere ridotto. Per stimare la NOEC, potrebbero essere necessarie più repliche al fine di ottenere la significatività statistica desiderata (23).
Osservazioni
29.
Durante il periodo di osservazione, ossia da 14 a 21 giorni dopo l'emergenza del 50 % delle piante di controllo (e, se del caso, dei controlli con solvente), le piante vengono osservate spesso (almeno una volta la settimana e, se possibile, una volta al giorno) per valutare l'emergenza, la fitotossicità visibile e la mortalità. Alla fine della prova è necessario registrare la misurazione della percentuale di emergenza e della biomassa delle piante sopravvissute, nonché gli effetti nocivi visibili sulle diverse parti della pianta, tra i quali figurano anomalie nell'aspetto delle plantule emerse, crescita ritardata, clorosi, scolorimento, mortalità ed effetti sullo sviluppo. La biomassa finale può essere misurata a partire dal peso medio finale dei germogli secchi delle piante sopravvissute, dopo aver raccolto i germogli sulla superficie del terreno e averli fatti essiccare fino a peso costante a 60 °C. In alternativa, è possibile misurare la biomassa finale a partire dal peso dei germogli freschi. Se richiesto dalle autorità di regolamentazione, l'altezza del germoglio può essere un ulteriore endpoint da misurare. È opportuno utilizzare un sistema di punteggio uniforme per le lesioni visibili per valutare le risposte tossiche osservabili. Esempi per l'esecuzione di valutazioni visive qualitative e quantitative sono forniti nei riferimenti (23) (24).
DATI E RELAZIONE
Analisi statistica
Prova a una singola concentrazione o a un singolo tasso
30.
I dati per ogni specie vegetale vanno analizzati utilizzando un metodo statistico appropriato (21). Si deve indicare il livello dell'effetto alla concentrazione o al tasso di prova oppure il mancato ottenimento di un dato effetto alla concentrazione o al tasso di prova (ad esempio, < x % dell'effetto con la concentrazione o il tasso y).
Prova a più concentrazioni o tassi
31.
Viene stabilita una relazione dose-risposta come equazione di regressione. Si può ricorrere a modelli diversi: ad esempio, per ottenere una stima di ECx o ERx (ad esempio EC25, ER25, EC50, ER50) e dei rispettivi limiti di confidenza per l'emergenza sotto forma di dati quantali, può essere appropriato utilizzare i metodi logit, probit, Weibull, Spearman-Karber, Spearman-Karber semplificato e così via. Per valutare la crescita delle plantule (peso e altezza) come endpoint continui, i valori ECx o ERx e i rispettivi limiti di confidenza possono essere stimati ricorrendo a un'analisi di regressione appropriata (ad esempio, l'analisi di regressione non lineare Bruce-Versteeg (25)). Ove possibile, il valore di R2 deve essere pari o superiore a 0,7 per le specie più sensibili e le concentrazioni o i tassi di prova utilizzati devono comprendere gli effetti dal 20 all'80 %. Qualora sia necessario stimare la NOEC, è preferibile ricorrere a prove statistiche potenti, da scegliere in base alla distribuzione dei dati (21) (26).
Relazione sulla prova
32.
La relazione sulla prova deve riportare i risultati degli studi e contenere una descrizione dettagliata delle condizioni sperimentali, un'approfondita disamina dei risultati, l'analisi dei dati e le conclusioni tratte dall'analisi. È necessario fornire una tabella di riepilogo e una sintesi dei risultati. La relazione deve includere le seguenti informazioni:
Sostanza chimica in esame:
—
dati di identificazione della sostanza chimica, proprietà pertinenti della sostanza chimica in esame (ad esempio, log Pow, idrosolubilità, tensione di vapore e informazioni sul destino e sul comportamento nell'ambiente, se disponibili);
—
dettagli sulla preparazione della soluzione di prova e verifica delle concentrazioni di prova, secondo quanto specificato al paragrafo 18.
Specie sperimentale:
—
dettagli sull'organismo sottoposto alla prova: specie/varietà, famiglia di piante, nome scientifico e nome comune, fonte e storia del seme con il maggior numero possibile di dettagli (ossia, nome del fornitore, percentuale di germinazione, classe di dimensione del seme, numero di lotto o partita, anno del seme o stagione di coltivazione, data di valutazione della germinazione), sopravvivenza, ecc.;
—
numero di specie monocotiledoni e dicotiledoni sottoposte a prova;
—
giustificazione della scelta delle specie;
—
descrizione della conservazione, del trattamento e del mantenimento dei semi.
Condizioni sperimentali:
—
infrastrutture di prova (ad esempio laboratorio fitologico, fitotrone e serra);
—
descrizione del sistema di prova (ad esempio dimensioni dei vasi, materiale dei vasi e quantità di terreno);
—
caratteristiche del terreno (struttura o tipo di terreno: distribuzione e classificazione delle particelle di terreno, proprietà chimico-fisiche tra cui la percentuale di materia organica, la percentuale di carbonio organico e il pH);
—
preparazione del terreno o del substrato (ad esempio terreno, terreno artificiale, sabbia, altro) prima della prova;
—
descrizione del mezzo nutritivo, se utilizzato;
—
applicazione della sostanza chimica in esame: descrizione del metodo di applicazione, descrizione dell'apparecchiatura, tassi di esposizione e volumi, comprese la verifica chimica, la descrizione del metodo di calibrazione e la descrizione delle condizioni ambientali durante l'applicazione;
—
condizioni colturali: intensità luminosa (ad esempio l'irraggiamento fotosinteticamente attivo), fotoperiodo, temperature minime/massime, metodo e programma di irrigazione, fertilizzazione;
—
numero di semi per vaso, numero di piante per dose, numero di repliche (vasi) per tasso di esposizione;
—
tipo e numero di controlli (controlli negativi e/o positivi, controllo con solvente se utilizzato);
—
durata della prova.
Risultati:
—
tabella di tutti gli endpoint per ciascuna replica, concentrazione/tasso di prova e specie;
—
numero e percentuale di emergenza rispetto ai controlli;
—
misurazioni della biomassa (peso secco o peso fresco dei germogli) delle piante come percentuale dei controlli;
—
altezza dei germogli delle piante come percentuale dei controlli, se misurata;
—
lesioni visibili in percentuale e descrizione qualitativa e quantitativa di tali lesioni (clorosi, necrosi, appassimento, deformazione di foglie e stelo, nonché assenza di qualsiasi effetto) causate dalla sostanza chimica in esame rispetto alle piante di controllo;
—
descrizione della scala di valutazione utilizzata per stimare le lesioni visibili, nel caso in cui venga fornita una valutazione visiva;
—
per gli studi a tasso singolo, è necessario indicare la percentuale di lesioni;
—
i valori ECx o ERx (ad esempio EC50, ER50, EC25, ER25) e i rispettivi limiti di confidenza. Se si effettua l'analisi di regressione, fornire l'errore standard per l'equazione di regressione e l'errore standard per la stima dei singoli parametri (ad esempio coefficiente angolare, intercetta);
—
valori di NOEC (e LOEC), se calcolati;
—
descrizione delle procedure statistiche e delle ipotesi utilizzate;
—
rappresentazione grafica di tali dati e della relazione dose-risposta delle specie sottoposte a prova.
Varianti delle procedure descritte nel presente metodo di prova ed eventuali eventi anomali verificatisi durante la prova.
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(26)
Capitolo C.33 del presente allegato: Prova sulla riproduzione dei lombrichi (Eisenia fetida/Eisenia andrei).
Appendice 1
Definizioni
Principio attivo (o sostanza attiva): materiale destinato a provocare uno specifico effetto biologico (ad esempio lotta contro gli insetti, contro le malattie delle piante e contro le erbe infestanti nella superficie interessata dal trattamento), denominato anche principio attivo (o sostanza attiva) di grado tecnico.
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
Fitofarmaci, prodotti fitosanitari o pesticidi: materiali con una specifica attività biologica utilizzati intenzionalmente per proteggere le colture dai parassiti (quali ad esempio micosi, insetti e piante concorrenti).
ECx (concentrazione efficace all'x %) o ERx (tasso efficace all'x %): la concentrazione o il tasso che provoca un cambiamento o un'alterazione indesiderata pari all'x % nell'endpoint in esame rispetto al controllo (ad esempio, una riduzione del 25 % o del 50 % dell'emergenza delle plantule, dell'altezza dei germogli e del numero finale di piante presenti o un aumento del 25 % o del 50 % delle lesioni visibili corrispondono rispettivamente ai valori EC25/ER25 o EC50/ER50).
Emergenza: comparsa del coleottile o del cotiledone sulla superficie del terreno.
Formulazione: prodotto formulato commerciale contenente la sostanza attiva (principio attivo), chiamato anche preparato finale (6) o prodotto finale tipico.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration — concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo): la concentrazione più bassa della sostanza chimica in esame che produce un effetto. In questa prova, la concentrazione corrispondente alla LOEC ha un effetto statisticamente significativo (p < 0,05) in un dato periodo di esposizione rispetto al controllo ed è più alta del valore della NOEC.
Piante non bersaglio: piante esterne all'area che comprende le piante bersaglio. Per i fitofarmaci, tale termine si riferisce generalmente alle piante non comprese nella superficie interessata dal trattamento.
NOEC (No Observed Effect Concentration — concentrazione senza effetti osservabili): concentrazione più alta della sostanza chimica in esame alla quale non si osserva alcun effetto. In questa prova, la concentrazione corrispondente alla NOEC non ha alcun effetto statisticamente significativo (p < 0,05) in un dato periodo di esposizione rispetto al controllo.
Fitotossicità: variazioni dannose (secondo le misurazioni e le valutazioni visive) rispetto al normale aspetto e al normale modello di crescita delle piante in risposta all'esposizione a una determinata sostanza chimica.
Replica: unità sperimentale che rappresenta il gruppo di controllo e/o il gruppo di trattamento. In questi studi una replica corrisponde a un vaso.
Valutazione visiva: accertamento del danno visibile sulla base dell'osservazione dello stato della pianta, del suo vigore, della presenza di malformazioni, clorosi e necrosi e dell'aspetto complessivo rispetto al controllo.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata applicando il presente metodo di prova.
Appendice 2
Elenco di specie storicamente utilizzate nelle prove sulle piante
Famiglia
Specie
Nomi comuni
DICOTYLEDONAE
Apiaceae (Umbelliferae)
Daucus carota
Carota
Asteraceae (Compositae)
Helianthus annuus
Girasole
Asteraceae (Compositae)
Lactuca sativa
Lattuga
Brassicaceae (Cruciferae)
Sinapis alba
Senape bianca
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica campestris var. chinensis
Cavolo cinese
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica napus
Colza
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica oleracea var. capitata
Cavolo cappuccio
Brassicaceae (Cruciferae)
Brassica rapa
Rapa
Brassicaceae (Cruciferae)
Lepidium sativum
Crescione inglese
Brassicaceae (Cruciferae)
Raphanus sativus
Ravanello
Chenopodiaceae
Beta vulgaris
Barbabietola da zucchero
Cucurbitaceae
Cucumis sativus
Cetriolo
Fabaceae (Leguminosae)
Glycine max (G. soja)
Soia
Fabaceae (Leguminosae)
Phaseolus aureus
Fagiolo mungo
Fabaceae (Leguminosae)
Phaseolus vulgaris
Fagiolo
Fabaceae (Leguminosae)
Pisum sativum
Pisello
Fabaceae (Leguminosae)
Trigonella foenum-graecum
Fieno greco
Fabaceae (Leguminosae)
Lotus corniculatus
Ginestrino
Fabaceae (Leguminosae)
Trifolium pratense
Trifoglio rosso
Fabaceae (Leguminosae)
Vicia sativa
Veccia
Linaceae
Linum usitatissimum
Lino
Polygonaceae
Fagopyrum esculentum
Grano saraceno
Solanaceae
Solanum lycopersicon
Pomodoro
MONOCOTYLEDONAE
Liliaceae (Amarylladaceae)
Allium cepa
Cipolla
Poaceae (Gramineae)
Avena sativa
Avena
Poaceae (Gramineae)
Hordeum vulgare
Orzo
Poaceae (Gramineae)
Lolium perenne
Loglio perenne
Poaceae (Gramineae)
Oryza sativa
Riso
Poaceae (Gramineae)
Secale cereale
Segale
Poaceae (Gramineae)
Sorghum bicolor
Sorgo da granella, sorgo gentile
Poaceae (Gramineae)
Triticum aestivum
Grano
Poaceae (Gramineae)
Zea mays
Mais
Appendice 3
Elenco di potenziali specie non coltivate
Potenziali specie secondo l'OCSE per le prove di tossicità sulle piante.
Nota: la seguente tabella fornisce informazioni su 52 specie non coltivate (i riferimenti sono riportati tra parentesi per ogni voce). I tassi di emergenza indicati provengono dalla letteratura pubblicata e sono forniti solo come indicazione generale. L'esperienza individuale può variare in base alla fonte dei semi e ad altri fattori.
il trattamento varia a seconda del colore dei semi (19) dormienza in deposito asciutto (19) germinazione inibita dall'oscurità (1, 18, 19) stratificazione a freddo (18) nessun trattamento speciale (14, 34)
PRE & POST (28, 31, 34)
A
32
CLUSIACEAE
Hypericum perforatum
(erba di San Giovanni comune)
Ρ
campi, seminativi, habitat aperti (16, 19)
0,1-0,23
(14, 19)
L = D
(14)
0
(1, 19)
3 (19)
11 (90 %) (18)
germinazione inibita dall'oscurità (1, 18, 19)
nessun trattamento speciale (5, 14, 15, 25, 27)
POST
(5, 15, 25, 27)
A, E, F
CONVOLVULACEAE
Ipomoea hederacea
(campanelle viola)
A
cigli stradali, habitat aperti, campi di mais (16)
28,2
(14)
L > D
(6, 10)
10-20
(6, 10, 21)
4 (100 %)
(10)
germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1)
nessun trattamento speciale (6, 21)
PRE & POST
(6, 12, 21, 28)
A
CYPERACEAE
Cyperus rotundus
(zigolo infestante)
Ρ
seminativi, pastura, cigli stradali (16, 30)
0,2
(14)
L = D
(14)
0 (1)
10-20 (6, 10)
12 (91 %)
(10)
germinazione inibita dall'oscurità (1)
nessun trattamento speciale (6, 10, 14)
PRE & POST
(6, 28, 31)
B
7
FABACEAE
Lotus corniculatus
(ginestrino)
Ρ
zone erborse, cigli stradali, habitat aperti (16, 19)
5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 — 7333
www.applewoodseed.com
E
Ernst Conservation Seeds
9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA
(800) 873 — 3321
www.ernstseed.com
F
Chiltern Seeds
Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND
+44 1229 581137
www.chiltemseeds.co.uk
G
Thompson & Morgan
P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 — 7333
www.thompson-morgan.com
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Appendice 4
Esempi di condizioni colturali appropriate per determinate specie coltivate
Le seguenti condizioni si sono rivelate idonee per 10 specie coltivate e possono essere utilizzate come riferimento anche per le prove su altre specie eseguite in laboratori fitologici:
Concentrazione di biossido di carbonio: 350 ± 50 ppm;
Umidità relativa: 70 ± 5 % durante i periodi di luce e 90 ± 5 % durante i periodi di oscurità;
Temperatura: 25 ± 3 °C durante il giorno, 20 ± 3 °C durante la notte;
Fotoperiodo: 16 ore di luce/8 ore di oscurità, presupponendo una lunghezza d'onda media di 400-700 nm;
Luce: luminanza di 350 ± 50 μE/m2/s, misurata al di sopra del fogliame.
Le specie coltivate sono le seguenti:
—
pomodoro (Solanum lycopersicon);
—
cetriolo (Cucumis sativus);
—
lattuga (Lactuca sativa);
—
soia (Glycine max);
—
cavolo cappuccio (Brassica oleracea var. capitata);
—
carota (Daucus carota);
—
avena (Avena sativa);
—
loglio perenne (Lolium perenne);
—
mais (Zea mays);
—
cipolla (Allium cepa).
C.32. PROVA DI RIPRODUZIONE SU ENCHITREIDI
INTRODUZIONE
1.
Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 220 (2004). Esso è finalizzato a valutare gli effetti delle sostanze chimiche sulla riproduzione degli Enchitreidi, Enchytraeus albidus (Henle 1873) nel terreno. Si basa principalmente su un metodo messo a punto dall'Umweltbundesamt (Germania) (1) che è stato sottoposto a prove interlaboratorio (2). Sono stati presi in considerazione anche altri metodi di valutazione della tossicità delle sostanze chimiche sugli Enchitreidi e i lombrichi (3)(4)(5)(6)(7)(8).
CONSIDERAZIONI INIZIALI
2.
Gli anellidi del suolo del genere Enchytraeus sono specie ecologicamente adatte per le prove ecotossicologiche. Benché spesso presenti nei terreni in cui vivono i lombrichi, gli Enchitreidi sono spesso però molto diffusi anche in terreni da cui i lombrichi sono assenti. Gli Enchitreidi possono essere utilizzati in prove di laboratorio come pure in studi sul campo e in semicampo. Da un punto di vista pratico numerose specie di Enchytraeus sono facili da manipolare e da allevare e il loro tempo di moltiplicazione è significativamente inferiore a quello dei lombrichi. La durata di una prova di riproduzione con gli Enchitreidi è pertanto di sole 4-6 settimane, mentre nel caso dei lombrichi (Eisenia fetida) è di 8 settimane.
3.
Nozioni di base di tipo ecologico e ecotossicologico sugli Enchitreidi in ambiente terrestre figurano nei riferimenti (9)(10)(11)(12).
PRINCIPIO DELLA PROVA
4.
Gli Enchitreidi adulti sono esposti a una gamma di concentrazioni della sostanza chimica in esame mescolata in un terreno artificiale. La prova può essere divisa in due fasi: a) una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, qualora non siano disponibili informazioni sufficienti, in cui la mortalità costituisce il principale risultato esaminato dopo due settimane di esposizione e b) la prova di riproduzione propriamente detta in cui sono valutati la consistenza totale della progenie per animale riproduttore e la sopravvivenza degli animali riproduttori. La durata complessiva della prova è di sei settimane. Dopo tre settimane vengono rimossi gli esemplari adulti e ne sono registrati i cambiamenti morfologici. Al termine delle tre settimane successive viene contata la progenie nata dai bozzoli prodotti dagli adulti. Il tasso di riproduzione degli animali esposti alla sostanza chimica in esame è confrontato con il o i gruppi di controllo per determinare i) la concentrazione senza effetti osservati (NOEC) e/o ii) l'ECx (ad esempio, EC10, EC50) utilizzando un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x del tasso di riproduzione. Le concentrazioni di prova devono comprendere l'ECx (e.g. EC10, EC50) in modo che l'ECx sia ottenuta per interpolazione anziché per estrapolazione.
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
5.
È auspicabile conoscere l'idrosolubilità, il log Kow, il coefficiente di ripartizione nel terreno (ad esempio, capitoli C.18 o C.19 del presente allegato) e la tensione di vapore della sostanza chimica in esame. È auspicabile anche l'acquisizione di informazioni supplementari sul destino della sostanza chimica in esame nel terreno, quali i tassi di fotolisi e di idrolisi.
6.
Il presente metodo di prova può essere usato per sostanze chimiche solubili o insolubili in acqua. Ciò che cambia sono tuttavia le modalità di applicazione della sostanza chimica in esame. Il metodo di prova non è applicabile alle sostanze chimiche volatili, ovvero alle sostanze chimiche per le quali la costante di Henry o il coefficiente di ripartizione aria/acqua sono maggiori di uno o alle sostanze chimiche per le quali la tensione di vapore è superiore a 0,0133 Pa a 25 °C.
VALIDITÀ DELLA PROVA
7.
Perché la prova sia valida, nei gruppi di controllo devono essere soddisfatti i seguenti criteri di prestazione:
—
la mortalità degli esemplari adulti non deve superare il 20 % al termine della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni e dopo le prime tre settimane della prova di riproduzione;
—
se per la prova sono stati utilizzati 10 esemplari adulti per recipiente, alla fine della prova la progenie deve essere pari ad almeno una media di 25 esemplari per recipiente;
—
il coefficiente di variazione relativamente alla consistenza media della progenie non deve essere superiore al 50 % alla fine della prova di riproduzione.
Una prova che non soddisfi i criteri suesposti non deve essere proseguita, a meno che non sia possibile giustificare una sua continuazione. La giustificazione va allegata alla relazione sulla prova.
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO
8.
È necessario sottoporre a prova una sostanza chimica di riferimento a intervalli regolari o, eventualmente, inserirla in ciascuna prova per verificare che la reazione degli organismi di prova non cambi significativamente nel corso del tempo. A tal fine una sostanza chimica di riferimento adeguata è il carbendazim, che ha effetti dimostrati sulla sopravvivenza e la riproduzione degli Enchitreidi (13)(14), o anche altre sostanze chimiche i cui dati sulla tossicità siano ben noti. In una prova interlaboratorio (2) è stata utilizzata una formulazione di carbendazim, nota con il nome commerciale di Derosal™ della società AgrEvo (Francoforte, Germania), contenente 360 g/l (32,18 %) di principio attivo. L'EC50 per la riproduzione determinata nella prova interlaboratorio si situava nella gamma 1,2 ± 0,8 mg di principio attivo per kg di massa secca (2). Se nella serie di prove è incluso uno standard di tossicità positivo, viene utilizzata una sola concentrazione e il numero delle repliche deve essere uguale a quello dei gruppi di controllo. Per il carbendazim, si raccomanda di sottoporre a prova 1,2 mg di principio attivo per kg peso a secco (saggiato in formulazione liquida).
DESCRIZIONE DELLA PROVA
Apparecchiatura
9.
I recipienti per la prova devono essere di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Sono adeguati recipienti di vetro (ad esempio, volume: 0,20 - 0,25 litro; diametro; ≈ 6 cm), muniti di coperchi trasparenti (ad esempio di vetro o di polietilene) progettati per ridurre l'evaporazione dell'acqua, consentendo al contempo gli scambi gassosi tra il terreno e l'atmosfera. I coperchi devono essere trasparenti per consentire la trasmissione della luce.
10.
L'esperimento richiede un'apparecchiatura normale di laboratorio, nello specifico:
—
una camera di essiccazione;
—
un microscopio stereoscopico;
—
un pH-metro e un fotometro;
—
bilance di precisione adeguata;
—
attrezzature adeguate per il controllo della temperatura;
—
attrezzature adeguate per il controllo dell'umidità (non essenziali se i recipienti per l'esposizione sono muniti di coperchi);
—
un'incubatrice o stanzetta con aria condizionata;
—
pinzette, ami o anse;
—
una bacinella per uso fotografico.
Preparazione del terreno artificiale
11.
In questa prova è utilizzato un terreno artificiale (5)(7) che presenta la seguente composizione (sulla base del peso a secco, con essiccazione fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C):
—
10 % di torba di spagno essiccata all'aria e finemente macinata (è accettabile una dimensione delle particelle di 2 ± 1 mm); si raccomanda di verificare che il terreno preparato con un nuovo lotto di torba sia adatto per l'allevamento dei lombrichi prima di essere utilizzato nella prova;
—
20 % di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %);
—
tra lo 0,3 e l'1,0 % circa di carbonato di calcio (CaCO3, polverizzato, al grado analitico) per ottenere un pH di 6,0 ± 0,5; il quantitativo di carbonato di calcio da aggiungere può dipendere principalmente dalla qualità/natura della torba;
—
circa il 70 % di sabbia di quarzo essiccata all'aria (in funzione del quantitativo di CaCO3 necessario), in prevalenza sabbia fine con più del 50 % delle particelle di dimensioni comprese tra 50 e 200 micron.
Prima di utilizzare il terreno artificiale nella prova, è opportuno dimostrarne l'adeguatezza per l'allevamento dei vermi e il rispetto dei criteri di validità della prova. Si raccomanda in particolare di effettuare un tale controllo per accertarsi che i risultati della prova non siano compromessi in caso di riduzione del tenore di carbonio organico del terreno artificiale, ad esempio riducendo il tenore di torba al 4-5 % e aumentando conseguentemente il tenore di sabbia. Con una tale riduzione del tenore di carbonio organico, possono diminuire le possibilità di assorbimento della sostanza chimica in esame nel terreno (carbonio organico) e aumentare la disponibilità della sostanza chimica in esame per i vermi. È stato dimostrato che l'Enchytraeus albidus può soddisfare i criteri di validità relativi alla riproduzione quando testato in terreni naturali con un tenore di carbonio organico inferiore a quello sopramenzionato, ad esempio 2,7 % (15), ed è stato sperimentalmente constatato — per quanto in misura limitata — che ciò vale anche con un terreno artificiale contenente il 5 % di torba.
Nota: Anche quando si utilizza terreno naturale in ulteriori prove (ad esempio, sperimentazioni di livello più elevato), deve essere dimostrata l'adeguatezza del terreno e il rispetto dei criteri di validità della prova.
12.
I componenti secchi del terreno sono accuratamente mescolati (ad esempio in un grande miscelatore da laboratorio), operazione che deve essere eseguita almeno una settimana prima dell'inizio della prova. La miscela di terreno va conservata per due giorni allo scopo di equilibrarne/stabilizzarne l'acidità. Per determinare il pH si miscela il terreno con una soluzione di 1 M di cloruro di potassio (KCl) o 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) in proporzione di 1 a 5 (cfr. (16) e appendice 3). Se l'acidità del suolo è superiore a quella della gamma prevista (cfr. paragrafo 11), può essere corretta aggiungendovi un quantitativo adeguato di CaCO3. Se il terreno è troppo alcalino, può essere riequilibrato aggiungendo un quantitativo superiore della miscela di cui al paragrafo 11, ma escludendo il CaCO3.
13.
La capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno artificiale è determinata in base alle procedure illustrate nell'appendice 2. Uno o due giorni prima dell'inizio della prova, il terreno artificiale secco è preumidificato aggiungendo acqua deionizzata in quantità sufficiente a ottenere circa la metà del tenore di acqua finale, ovvero tra il 40 % e il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica. All'inizio della prova il terreno preumidificato è suddiviso in porzioni corrispondenti al numero delle concentrazioni di prova (e, se del caso, alla sostanza chimica di riferimento) e dei gruppi di controllo utilizzati nella prova. Il tenore di umidità è adeguato al 40 %-60 % della capacità massima di ritenzione idrica aggiungendo la soluzione della sostanza chimica in esame e/o acqua distillata o deionizzata (cfr. paragrafi 19-21). Il tenore di umidità viene misurato all'inizio e alla fine della prova (con essiccazione fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C) e deve situarsi nella gamma ottimale per per la sopravvivenza degli animali. Un esame sommario del tenore di umidità del terreno può essere fatto stringendo leggermente in mano un pugno di terreno: se il tenore di umidità è corretto, tra le dita dovrebbero comparire goccioline d'acqua.
Selezione e preparazione degli animali per la prova
14.
La specie consigliata per questa prova è Enchytraeus albidus (Henle 1837 — verme bianco), della famiglia Enchytraeidae (ordine Oligochaeta, phylum Annelida). E. albidus è una delle specie di Enchitreidi più diffuse, con esemplari di lunghezza documentata fino a 35 mm (17)(18). E. albidus è una specie con distribuzione mondiale e si ritrova in ambiente marino, di acqua dolce e terrestre, principalmente nella materia organica in putrefazione (alghe, compost) e, raramente, nei terreni prativi (9). L'ampia tolleranza ecologica che caratterizza questa specie e alcune sue variazioni morfologiche indica che potrebbero esisterne varie razze.
15.
L'E. albidus è reperibile in commercio, sotto forma di mangime per pesci. Occorre verificare se l'allevamento è contaminato da altre specie, generalmente più piccole (1) (19), nel qual caso tutti gli animali vanno lavati con acqua in una capsula Petri. Per avviare un nuovo allevamento, si scelgono (utilizzando un microscopio stereoscopico) gli esemplari adulti di grandi dimensioni di E. albidus e si scartano tutti gli altri. L'E. albidus può essere allevato facilmente in un'ampia gamma di materiali organici (cfr. appendice 4). Il ciclo di vita dell'E. albidus è breve, dato che raggiunge la maturità in un tempo oscillante tra 33 (a 18 °C) e 74 giorni (a 12 °C) (1). Per questa prova possono essere utilizzati solo gli animali tenuti in laboratorio per almeno 5 settimane (una generazione) e che non abbiano mostrato complicazioni.
16.
Per la prova sono adatte anche altre specie del genere Enchytraeus, ad esempio E. buchholzi (Vejdovsky 1879) o E. crypticus (Westheide & Graefe 1992) (cfr. appendice 5). Se si impiegano altre specie di Enchytraeus occorre identificarle in modo chiaro e giustificare tale scelta nella relazione.
17.
Tutti gli animali impiegati nella prova devono essere esemplari adulti, devono portare uova (punti bianchi) nella regione del clitello e avere grosso modo le stesse dimensioni (lunghezza di circa 1 cm). La sincronizzazione della coltura di allevamento non è necessaria.
18.
Se gli Enchitreidi non sono allevati nello stesso tipo di terreno e alle condizioni (compresa l'alimentazione) utilizzate nella prova propriamente detta, essi devono essere acclimatati per un periodo che va da 24 ore a tre giorni. All'inizio è necessario acclimatare un numero di esemplari adulti superiore a quello necessario per l'esecuzione della prova per tenere conto della necessità di scartare esemplari con lesioni o inutilizzabili per altre ragioni. Alla fine del periodo di acclimatazione sono selezionati per la prova solo gli esemplari recanti uova e che non esibiscono anomalie comportamentali (come, ad esempio, cercare di uscire dal terreno). Gli animali sono rimossi con attenzione utilizzando pinzette da orafo, ami o anse e sono messi in una capsula Petri contenente un piccolo quantitativo di acqua dolce. A tal fine è preferibile utilizzare acua dolce artificiale come proposto nel capitolo C.20 del presente allegato (prova sulla riproduzione della Daphnia magna), in quanto l'acqua deionizzata, demineralizzata o del rubinetto potrebbe essere nociva per gli animali. Gli animali sono analizzati con un microscopio stereoscopico, scartando quelli che non contengono uova. Si deve prestare particolare cura a rimuovere e scartare eventuali acari o Collemboli che potrebbero aver infettato le colture. Gli animali sani non utilizzati per la prova devono essere reimmessi nella coltura madre.
Preparazione delle concentrazioni di prova
Sostanza chimica in esame solubile in acqua
19.
Viene preparata una soluzione della sostanza chimica in esame in acqua deionizzata in quantità sufficiente per tutte le repliche di una concentrazione di prova. Si raccomanda di utilizzare un quantitativo di acqua adeguato per raggiungere il tenore di umidità richiesto, ovvero tra il 40 % e 60 % della capacità massima di ritenzione idrica (cfr. paragrafo 13). Ciascuna soluzione della sostanza chimica in esame è adeguatamente miscelata con un lotto di terreno preumidificato prima di essere introdotta nel recipiente di prova.
Sostanza chimica in esame insolubile in acqua
20.
Nel caso di sostanze chimiche insolubili in acqua ma solubili nei solventi organici, la sostanza chimica in esame può essere disciolta nel minor volume possibile di un mezzo disperdente adeguato (per esempio, acetone). A tal fine devono essere utilizzati esclusivamente solventi volatili. Il mezzo disperdente viene nebulizzato oppure mescolato con un piccolo quantitativo, ad esempio 2,5 grammi, di sabbia di quarzo fine. Il mezzo disperdente è eliminato per evaporazione sotto una cappa chimica per almeno un'ora. La miscela di sabbia di quarzo e della sostanza chimica in esame è incorporata al terreno preumidificato, mescolando a fondo dopo l'aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il grado di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova.
21.
Per le sostanze poco solubili in acqua e nei solventi organici, è possibile mescolare alla quantità di sostanza chimica in esame l'equivalente di 2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata per recipiente di prova per ottenere la concentrazione sperimentale voluta. La miscela di sabbia di quarzo e della sostanza chimica in esame è incorporata al terreno preumidificato, mescolando a fondo dopo l'aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il tenore di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova. La procedura è ripetuta per ogni concentrazione di prova preparando anche un adeguato gruppo di controllo.
22.
Di norma le sostanze chimiche non devono essere sottoposte a prova a concentrazioni superiori a 1 000 mg/kg di massa secca di terreno. La prova a concentrazioni superiori può essere tuttavia necessaria in funzione degli obiettivi di una prova specifica.
ESECUZIONE DELLE PROVE
Gruppi di prova e di controllo
23.
Per ciascuna concentrazione di prova viene distribuito nel recipiente di prova (cfr.paragrafi 19-21) un quantitativo di terreno di prova corrispondente a 20 g di peso secco. Vengono inoltre preparati i recipienti di controllo privi della sostanza chimica in esame. In ciascun recipiente sono aggiunti gli alimenti in conformità alle procedure di cui al paragrafo 29. In ciascun recipiente sono distribuiti dieci animali scelti a caso. Gli animali sono deposti con cautela sulla superficie del terreno in ciascun recipiente di prova utilizzando, ad esempio, pinzette da orafo, ami o anse. Il numero di repliche per le concentrazioni di prova e i controlli dipende dal tipo di prova utilizzato (cfr. paragrafo 34). I recipienti di prova sono posizionati a caso nell'incubatrice di prova e tali posizioni sono cambiate, sempre a caso, con cadenza settimanale.
24.
Se per l'applicazione della sostanza chimica in esame si utilizza un mezzo disperdente, occorre allestire, oltre alla serie di prova, una serie di controllo contenente sabbia di quarzo nebulizzata o mescolata con un solvente. La concentrazione del solvente o disperdente deve essere la stessa di quella utilizzata nei recipienti di prova contenenti la sostanza chimica in esame. Una serie di controllo contenente ulteriore sabbia di quarzo (2,5 g per recipiente) deve essere allestita per le sostanze chimiche che richiedono una somministrazione in conformità con le procedure di cui al paragrafo 21.
Condizioni di prova
25.
La temperatura di prova è di 20 ± 2 °C. Per scoraggiare gli animali a uscire dal terreno, le prove sono condotte sulla base di un fotoperiodo controllato di luce/buio (di preferenza 16 ore di luce e 8 ore di buio) con un'intensità luminosa compresa tra 400 e 800 lux nella zona dei recipienti di prova.
26.
Al fine di verificare l'umidità del terreno, i recipienti sono pesati all'inizio della prova e successivamente una volta alla settimana. La perdita di peso è compensata con l'aggiunta di un quantitativo adeguato di acqua deionizzata. Va rilevato che la perdita di peso può essere ridotta mantenendo un'elevata umidità atmosferica (> 80 %) nell'incubatrice di prova.
27.
Il tenore di umidità e il pH devono essere misurati all'inizio della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni e all'inizio della prova vera e propria. Le misurazioni sono effettuate in campioni dei terreni di controllo e trattati (per tutte le concentrazioni) preparati e mantenuti nello stesso modo delle colture di prova ma non contenenti animali. Gli alimenti vengono aggiunti a tali campioni soltanto all'inizio della prova per facilitare l'attività microbica e in quantitativi identici a quelli aggiunti alle colture di prova. Non è necessario aggiungere ulteriori alimenti in tali recipienti durante la prova.
Alimentazione
28.
Per l'alimentazione può essere usato un mangime in grado di mantenere la popolazione di Enchitreidi; l'esperienza ha dimostrato che i fiocchi di avena, di preferenza sterilizzati in autoclave (o riscaldati) prima dell'uso per evitare la contaminazione microbica, costituiscono un alimento adeguato.
29.
All'inizio il mangime è somministrato miscelando 50 mg di fiocchi di avena macinati con il terreno di ciascun recipiente prima di introdurvi gli animali. In seguito il mangime è somministrato quotidianamente fino al 21o giorno. Il 28o giorno non viene aggiunto mangime poiché in questa fase gli esemplari adulti sono già stati rimossi e quelli appena nati hanno bisogno di relativamente poco cibo in più a partire da quel momento. L'alimentazione durante la prova prevede 25 mg di fiocchi di avena macinati per contenitore che devono essere sparsi con attenzione sulla superficie del terreno per evitare di recare danno agli animali. Per ridurre la comparsa di funghi, i fiocchi di avena devono essere interrati e ricoperti di un leggero strato di terreno. Se non tutto il mangime viene consumato, si deve diminuire la razione.
Concezione della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni
30.
Se necessario, viene effettuata una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, utilizzando, ad esempio, cinque diverse concentrazioni della sostanza chimica in esame: 0,1, 1,0, 10, 100 e 1 000 mg/kg (peso secco di terreno). È sufficiente una replica per ciascun gruppo di trattamento e di controllo.
31.
La durata complessiva della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni è di due settimane. Al termine della prova viene valutata la mortalità degli animali. Un animale è registrato come morto se non presenta alcuna reazione a uno stimolo meccanico all'estremità anteriore. Ulteriori informazioni sulla mortalità possono essere utili per decidere l'ordine di grandezza delle concentrazioni da utilizzare nella prova vera e propria. Devono inoltre essere registrate le modifiche comportamentali negli esemplari adulti (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova), i mutamenti morfologici (ad esempio, la presenza di ferite aperte) oltre alla presenza di progenie. Quest'ultima può essere determinata utilizzando il metodo di colorazione descritto nell'appendice 6.
32.
Il valore LC50 può essere determinato in modo approssimativo calcolando la media geometrica dei dati sulla mortalità. Nel determinare l'ordine di grandezza delle concentrazioni per la prova vera e propria si presuppone che gli effetti sulla riproduzione siano inferiori a LC50 di un fattore che può arrivare fino a 10. Si tratta tuttavia di una relazione empirica che potrebbe non verificarsi in casi particolari. Ulteriori osservazioni effettuate nella prova per determinare le concentrazioni, quali la presenza di progenie, possono aiutare ad affinare ulteriormente la gamma di concentrazioni di prova da utilizzare nella prova propriamente detta.
33.
Al fine di determinare in modo accurato il valore LC50 si raccomanda di effettuare la prova utilizzando almeno quattro repliche per concentrazione della sostanza chimica in esame e un numero adeguato di concentrazioni per ottenere almeno quattro risultati medi differenti e statisticamente significativi in rapporto a tali concentrazioni. Eventualmente viene utilizzato un numero analogo di concentrazioni e repliche per i gruppi di controllo.
Concezione della prova di riproduzione propriamente detta
34.
Sulla base delle raccomandazioni emerse da una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni (2), si propongono tre diverse articolazioni della prova.
—
Per determinare la NOEC si devono sottoporre a prova almeno cinque concentrazioni in una serie geometrica. Si raccomanda di utilizzare almeno quattro repliche per ciascuna concentrazione di prova oltre a otto controlli. Le concentrazioni devono essere spaziate di un fattore non superiore a 1,8.
—
Per determinare la ECx (ad esempio, EC10, EC50), occorre sottoporre a prova almeno cinque concentrazioni e tali concentrazioni devono comprendere la ECx così da consentire di ottenere ECx per interpolazione e non per estrapolazione. Si raccomanda di effettuare almeno quattro repliche per ciascuna concentrazione di prova e quattro repliche per i controlli. Il fattore di spaziatura può variare, ovvero essere pari o inferiore a 1,8 nella gamma di effetti attesa e superiore a 1,8 a concentrazioni superiori o inferiori.
—
Un approccio combinato consente di determinare sia la NOEC che la ECx. In questo caso si devono utilizzare otto concentrazioni di trattamento formanti una serie geometrica. Si raccomanda di utilizzare almeno quattro repliche per ciascun trattamento oltre a otto controlli. Le concentrazioni devono essere spaziate di un fattore non superiore a 1,8.
35.
Si devono utilizzare dieci animali adulti per recipiente di prova (cfr. paragrafo 23). Il mangime è distribuito nei recipienti di prova all'inizio della prova e successivamente una volta alla settimana (cfr. paragrafo 29) fino al 21o giorno incluso. Il 21o giorno campioni di terreno sono accuratamente ispezionati a mano e gli esemplari adulti viventi sono osservati e contati, registrandone le modifiche comportamentali (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova) e i mutamenti morfologici (ad esempio, la presenza di ferite aperte). Tutti gli esemplari adulti sono quindi rimossi dai recipienti e dal terreno di prova. Il terreno di prova contenente eventuali bozzoli che sono stati prodotti è mantenuto nell'incubatrice per tre ulteriori settimane nelle stesse condizioni di prova, fatta eccezione per il fatto che l'alimentazione è somministrata soltanto il 35o giorno (25 mg di fiocchi di avena macinati per contenitore).
36.
Dopo sei settimane si procede alla conta dei nuovi esemplari nati. Si raccomanda di utilizzare il metodo basato sulla colorazione rosso Bengala (cfr. appendice 6), per quanto si siano mostrate affidabili (4)(10)(11)(20) anche altre tecniche di estrazione in umido (ma non a caldo) e di flottazione (cfr. appendice 6). La colorazione rosso bengala è raccomandata in quanto l'estrazione in umido da un terreno può essere ostacolata dalla torbidità causata dalle particelle di argilla in sospensione.
Prova limite
37.
Se nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni non si osserva alcun effetto alla concentrazione più alta (ovvero 1 000 mg/kg), la prova di riproduzione può essere effettuata come prova limite utilizzando 1 000 mg/kg al fine di dimostrare che la NOEC per la riproduzione è superiore a questo valore.
Sintesi e calendario per la prova
38.
Le fasi della prova possono essere sintetizzate come segue:
Calendario
Prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni
Prova propriamente detta
Giorno –7 o precedente
—
Preparazione del terreno artificiale (miscela dei componenti secchi)
—
Preparazione del terreno artificiale (miscela dei componenti secchi)
Giorno –5
—
Verifica del pH del terreno artificiale
—
Misurazione della capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno
—
Verifica del pH del terreno artificiale
—
Misurazione della capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno
Giorno da –5 a –3
—
Selezione degli animali per l'acclimatazione
—
Selezione degli animali per l'acclimatazione
Giorno da — 3 a 0
—
Acclimatazione degli animali per almeno 24 ore
—
Acclimatazione degli animali per almeno 24 ore
Giorno –1
—
Preumidificazione artificiale del suolo e sua ripartizione in lotti
—
Preumidificazione artificiale del suolo e sua ripartizione in lotti
Giorno 0
—
Preparazione delle soluzioni madre
—
Applicazione della sostanza chimica in esame
—
Pesatura del terreno di prova nei recipienti di prova
—
Aggiunta del mangime
—
Aggiunta degli animali
—
Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo
—
Preparazione delle soluzioni madre
—
Applicazione della sostanza chimica in esame
—
Pesatura del terreno di prova nei recipienti di prova
—
Aggiunta del mangime
—
Aggiunta degli animali
—
Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo
Giorno 7
—
Misurazione del tenore di umidità del suolo
—
Misurazione del tenore di umidità del suolo
—
Alimentazione
Giorno 14
—
Determinazione della mortalità degli esemplari adulti
—
Stima della consistenza della progenie
—
Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo
—
Misurazione del tenore di umidità del suolo
—
Alimentazione
Giorno 21
—
Osservazione del comportamento degli adulti
—
Rimozione degli esemplari adulti
—
Determinazione della mortalità degli esemplari adulti
—
Misurazione del tenore di umidità del suolo
—
Alimentazione
Giorno 28
—
Misurazione del tenore di umidità del suolo
—
Nessuna alimentazione
Giorno 35
—
Misurazione del tenore di umidità del suolo
—
Alimentazione
Giorno 42
—
Conteggio della progenie
—
Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo
DATI E RELAZIONE
Trattamento dei risultati
39.
Il presente metodo di prova non presenta alcun orientamento statistico definito per analizzare i risultati della prova, anche se nell'appendice 7 sono fornite indicazioni generali.
40.
Nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni il principale risultato è dato dalla mortalità. Devono essere inoltre registrate le modifiche comportamentali negli esemplari adulti (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova), i mutamenti morfologici (ad esempio, ferite aperte) oltre alla presenza di progenie. Per determinare la LC50 è opportuno di norma applicare l'analisi Probit (21) o la regressione logistica. Tuttavia, nei casi in cui tale metodo di analisi si riveli inadeguato (ad esempio, se si ottengono meno di tre concentrazioni che provocano una mortalità parziale), possono essere utilizzati metodi alternativi, quali le medie mobili (22), il metodo Spearman-Karber semplificato (23) o l'interpolazione semplice (ad esempio, la media geometrica di LC0 e LC100, calcolata mediante la radice quadrata di LC0 moltiplicata per LC100).
41.
Nella prova vera e propria il risultato principale è la fecondità (ovvero, la consistenza della progenie prodotta). Tuttavia, come nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, tutti gli altri indicatori di nocività devono essere registrati nella relazione di prova. Ai fini dell'analisi statistica è necessario calcolare la media aritmetica e la deviazione standard relativa alla riproduzione negli animali sottoposti al trattamento e in quelli di controllo.
42.
Se è stata effettuata un'analisi della varianza, la deviazione standard, s, e i gradi di libertà, df, possono essere sostituiti con la stima raggruppata della varianza ottenuta rispettivamente dall'analisi della varianza (ANOVA) e dai suoi gradi di libertà — a condizione che la varianza non dipenda dalla concentrazione. In questo caso si utilizzano varianze uniche per i gruppi di controllo e di trattamento. Tali valori sono calcolati di solito mediante software statistici disponibili in commercio che utilizzano i risultati per recipiente come repliche. Se il raggruppamento dei dati relativi ai gruppi di controllo negativi e ai gruppi di controllo contenenti solventi appare più pertinente rispetto al calcolo dei risultati della prova in relazione a uno dei due gruppi di controllo, è necessario verificare mediante una prova che non vi siano differenze significative (un'indicazione delle prove adeguate figura al paragrafo 45 e all'appendice 7).
43.
Ulteriori prove e inferenze statistiche dipendono dal fatto che i valori delle repliche siano o no omogenei e distribuiti in modo normale per quanto attiene alla loro varianza.
Stima della NOEC
44.
Deve essere preferita l'applicazione di prove di potenza, verificando che i dati abbiano una distribuzione grosso modo normale sulla base delle informazioni disponibili, ad esempio quelle di altre prove interlaboratorio o di altri dati storici. L'omogeneità della varianza (omoschedasticità) è più determinante. L'esperienza ci insegna che la varianza aumenta spesso di pari passo con la media. In questi casi una trasformazione dei dati potrebbe determinare un'omogeneità della varianza. Tale trasformazione, tuttavia deve essere basata sull'esperienza acquisita con i dati storici piuttosto che sui dati in corso di analisi. In presenza di dati omogenei si deve procedere a prove t multiple, quali il test di Williams (α = 0,05, test a una coda) (24)(25) o in alcuni casi il test di Dunnett (26)(27). Va rilevato che, nei casi di repliche diseguali, i valori t della tabella devono essere rettificati come suggerito da Dunnett e Williams. Talvolta, in presenza di una variazione significativa, può accadere che l'aumento/diminuzione dei risultati non abbia carattere regolare. In questo caso è opportuno discostarsi in modo marcato dalla monotonicità del test di Dunnett. Nei casi di deviazione dalla monotonicità della varianza, può essere corretto indagare più da vicino i possibili effetti sulle varianze per decidere se sia possibile applicare le prove t senza perdere molto in potenza (28). In alternativa possono essere effettuati — e sono in genere preferibili alle prove t per varianze diseguali — una prova U multipla, ad esempio il test U di Bonferroni secondo Holm (29) o, quando i dati evidenziano un'eteroschedasticità ma sono altrimenti coerenti con un rapporto dose-risposta monotonico soggiacente, un'altra prova non parametrica [ad esempio, Jonckheere-Terpstra (30) (31) o Shirley (32) (33)]. (si veda anche lo schema di cui all'appendice 7).
45.
Se è stata effettuata una prova limite e sono stati rispettati i prerequisiti delle prove parametriche (normalità, omogeneità), si può utilizzare il test t bilaterale di Student oppure il test U di Mann-Whitney (29).
Stima dell'ECx
46.
Per calcolare qualsiasi valore di ECx si utilizzano le medie per trattamento per l'analisi di regressione (lineare o non lineare) dopo aver ottenuto un'adeguata funzione dose-risposta. Se la crescita degli animali è considerata una risposta continua, i valori della ECx- possono essere stimati avvalendosi di un'adeguata analisi di regressione (35). Tra le funzioni adeguate per i dati di tipo quantale (mortalità/sopravvivenza e consistenza della progenie prodotta) figurano le funzioni sigmoidee normali, le funzioni logistiche o di Weibull, contenenti due o quattro parametri, alcuni dei quali possono anche modellizzare una risposta ormetica. Se una funzione dose-risposta è stata adeguata mediante un'analisi della regressione lineare, si dove trovare mediante l'analisi della regressione un r2 (coefficiente di determinazione) e/o una pendenza significativi prima di stimare la ECx inserendo un valore corrispondente a x % della media del controllo nell'equazione ottenuta mediante analisi della regressione. I limiti di confidenza del 95 % sono calcolati come indicato da Fieller (citato in Finney (21)) o con altri metodi recenti appropriati.
47.
In alternativa la risposta è modellizzata come percentuale o proporzione del parametro del modello che è interpretato come la risposta media del controllo. In altri casi la curva sigmoide normale (logistica, Weibull) può essere spesso adeguata facilmente ai risultati utilizzando la procedura di regressione Probit (21). In questi casi la funzione di ponderazione deve essere adeguata per i risultati metrici, come illustrato da Christensen (36). Tuttavia, se viene constatata un'ormesi, è necessario sostituire l'analisi Probit con una funzione logistica o Weibull a quattro parametri adeguata mediante una procedura di regressione non lineare (37). Qualora sia impossibile adeguare ai dati una funzione appropriata dose-risposta, è possibile utilizzare metodi alternativi per stimare la ECx e i suoi limiti di confidenza, quali le medie mobili secondo Thompson (22) e il metodo Spearman-Karber semplificato (23).
RELAZIONE SULLA PROVA
48.
La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti.
Sostanza chimica in esame:
—
natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (ad esempio, idrosolubilità, tensione di vapore);
—
identificazione chimica della sostanza chimica in esame secondo la nomenclatura IUPAC, numero CAS, lotto di fabbricazione, lotto di condizionamento, formula strutturale e purezza;
—
data di scadenza del campione.
Specie di prova:
—
animali utilizzati per la prova: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento.
Condizioni di prova:
—
ingredienti e preparazione del terreno artificiale;
—
metodo di applicazione della sostanza chimica in esame;
—
descrizione delle condizioni di prova, tra cui temperatura, tenore di umidità, pH, ecc.;
—
descrizione completa del disegno e delle procedure di prova.
Risultati della prova:
—
mortalità degli esemplari adulti dopo due settimane e consistenza della progenie al termine della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni;
—
mortalità degli esemplari adulti dopo tre settimane di esposizione e censimento completo della progenie alla fine della prova propriamente detta;
—
eventuali sintomi di tipo fisico o patologico e variazioni comportamentali osservati negli organismi sperimentali;
—
LC50, NOEC e/o ECx (ad esempio, EC50, EC10) per la riproduzione se alcuni di tali valori sono applicabili con intervalli di confidenza e rappresentazione grafica del modello adeguato utilizzato per il loro calcolo, oltre a tutte le informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei risultati;
scostamenti rispetto alle procedure descritte nel presente metodo di prova ed eventi insoliti registrati nel corso della prova.
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Appendice 1
Definizioni
Ai fini del presente metodo di prova si applicano le seguenti definizioni:
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
ECx (concentrazione con effetto per effetto x %): la concentrazione che determina un effetto di x % sugli organismi di prova entro un determinato periodo di esposizione in rapporto a un gruppo di controllo. Nella presente prova le concentrazioni con effetto sono espresse come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno sperimentale.
LC0 (assenza di concentrazione letale): la concentrazione della sostanza chimica in esame che, in un dato periodo di tempo, non provoca la morte di nessuno degli organismi della prova che vi sono esposti. Nella presente prova la LC0 è espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova.
LC50 (concentrazione letale media): la concentrazione della sostanza chimica in esame che, in un dato periodo di tempo, provoca la morte del 50 % degli organismi di prova che vi sono esposti. Nella presente prova la LC50 è espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova.
LC100 (concentrazione letale totale): la concentrazione della sostanza chimica in esame che, in un dato periodo di tempo, provoca la morte del 100 % degli organismi di prova che vi sono esposti. Nella presente prova la LC100 è espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration — Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto significativo): la concentrazione più bassa della sostanza chimica in esame avente un effetto statisticamente significativo (p < 0,05). Nella presente prova la LOEC è espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova. Tutte le concentrazioni di prova superiori alla LOEC devono di norma produrre un effetto statisticamente differente da quello osservato nei gruppi di controllo. Tutti gli scostamenti nella rilevazione della LOEC rispetto a quanto indicato precedentemente devono essere giustificati nella relazione.
NOEC (No Observed Effect Concentration — Concentrazione senza effetti osservati) è la concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame — immediatamente al di sotto della LOEC — alla quale non è osservato alcun effetto. In questa prova la concentrazione corrispondente alla NOEC non produce effetti statisticamente significativi (p < 0,05) entro un determinato periodo di esposizione in confronto a un gruppo di controllo.
Tasso di riproduzione: la consistenza media della progenie prodotta per numero di esemplari adulti nel periodo di prova.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.
Appendice 2
Determinaziuone della capacità massima di ritenzione idrica
Determinazione della capacità massima di ritenzione idrica del terreno artificiale
Il metodo illustrato di seguito, e descritto nell'allegato C della norma ISO DIS 11268-2, è considerato appropriato.
Si raccoglie un quantitativo definito (ad esempio, 5 g) del terreno utilizzato per la prova servendosi di un dispositivo adeguato (coclea, ecc.). Si copre il fondo della coclea con un pezzo di carta da filtro e, dopo averla riempita d'acqua, la si mette a bagnomaria su un supporto. La coclea deve poi essere progressivamente immersa finché il livello dell'acqua venga a coprire la parte superiore del terreno e deve essere lasciata in acqua per almeno tre ore. Poiché non tutta l'acqua assorbita dai capillari del suolo può essere ritenuta, il campione di suolo deve essere lasciato a gocciolare per un periodo di due ore, collocando la coclea su un letto di sabbia di quarzo finemente tritata all'interno di un recipiente chiuso (per evitare l'essiccazione). Il campione deve quindi essere pesato ed essiccato fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C. La capacità di ritenzione idrica può quindi essere calcolata come segue:
dove:
S
=
substrato saturo di acqua + massa della coclea + massa del filtro di carta
T
=
tara (massa della coclea + massa del filtro di carta)
D
=
massa secca del substrato
RIFERIMENTI:
ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality -Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve.
Appendice 3
Determinazione del PH del terreno
Il seguente metodo per determinare il pH di un campione di terreno si basa sulla descrizione di cui alla norma ISO 10390 (Soil Quality — Determination of pH).
Un quantitativo definito di terreno è essiccato a temperatura ambiente per almeno 12 ore. Quindi viene preparata una sospensione del terreno (contenente almeno 5 grammi di terreno) pari a cinque volte il volume di quest'ultimo con una soluzione di 1 M di cloruro di potassio (KCl) al grado analitico o con una soluzione di 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) al grado analitico. La sospensione è quindi agitata accuratamente per cinque minuti. Dopo essere stata agitata la soluzione è lasciata a decantare per almeno due ore ma per non più di 24 ore. Il pH della fase liquida è quindi misurato utilizzando un pH-metro che deve essere calibrato prima di ogni misurazione utilizzando un'adeguata serie di soluzioni tampone (ad esempio, pH 4,0 e 7,0).
RIFERIMENTI:
ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve.
Appendice 4
Condizioni di allevamento di Enchytraeus sp.
Gli Enchitreidi della specie Enchytraeus albidus (così come di altre specie di Enchytraeus) possono essere allevati in grandi cassette di plastica (di dimensioni, ad esempio, 30 × 60 × 10 cm) riempite di una miscela 1:1 di terreno artificiale e di terreno da giardino naturale e non contaminato. Il compost è da evitare poiché può contenere sostanze tossiche, quali i metalli pesanti. Prima dell'utilizzo si deve eliminare la fauna indigena dal terreno (ad esempio, surgelandolo). È possibile utilizzare anche un terreno completamente artificiale, tenendo presente che il tasso di riproduzione potrebbe essere inferiore rispetto a quello ottenuto con i substrati misti. Il substrato utilizzato per l'allevamento deve avere un pH di 6,0 ± 0,5.
Gli animali sono tenuti al buio a una temperatura compresa tra 15 e 20 °C ± 2, evitando in ogni caso temperature superiori a 23 °C. Il terreno deve essere mantenuto umido ma non bagnato. Empiricamente si può verificare il tenore di umidità del terreno stringendo leggermente in mano un pugno di terreno: il tenore di umidità è corretto se tra le dita compaiono goccioline d'acqua. La produzione di condizioni anossiche deve essere evitata accertandosi che i coperchi dei recipienti utilizzati per l'allevamento consentano un adeguato scambio gassoso con l'atmosfera. Il terreno deve essere accuratamente rigirato ogni settimana per facilitarne l'aerazione.
Gli animali possono essere alimentati con fiocchi di avena. L'avena deve essere conservata in recipienti ermeticamente chiusi e deve essere sterilizzata in autoclave o riscaldata prima della somministrazione, onde prevenire eventuali infestazioni da acari della farina (ad esempio, Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) o acari predatori [ad esempio, Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina]. Dopo il trattamento a caldo l'alimento deve essere macinato in modo da poterlo distribuire con facilità sulla superficie del terreno. Di quando in quando i fiocchi di avena possono essere integrati con l'aggiunta di vitamine, latte e olio di fegato di merluzzo. Altri alimenti adatti sono il lievito per panificazione o il mangime per pesci “Tetramin”.
L'alimentazione è somministrata circa due volte alla settimana. Un quantitativo adeguato di fiocchi di avena è distribuito sulla superficie del terreno o adeguatamente mescolato allo stesso quando il terreno è rigirato per facilitarne l'aerazione. Il quantitativo totale di alimenti somministrati dipende dal numero di animali presenti nel terreno. A livello orientativo, è necessario aumentare il quantitativo di alimenti se quelli somministrati sono consumati entro un giorno. Al contrario, se, al momento della seconda somministrazione (una settimana dopo), vi sono residui di alimenti sul terreno, il loro quantitativo deve essere ridotto. Gli alimenti contaminati da funghi devono essere rimossi e sostituiti. Dopo tre mesi gli animali devono essere trasferiti in un terreno di allevamento fresco.
Le condizioni di allevamento sono ritenute soddisfacenti se gli animali: a) non cercano di scappare dal sostrato, b) si spostano rapidamente nel terreno, c) presentano una livrea brillante sulla quale le particelle di terreno non aderiscono d) presentano un colore più o meno biancastro, e) nell'allevamento sono presenti diverse fasce di età e f) si riproducono di continuo.
Appendice 5
Esecuzione della prova con altre specie di Enchytraeus
Selezione delle specie
Nella prova possono essere utilizzate specie diverse da E. albidus ma la procedura di prova e i criteri di validità devono essere opportunamente adeguati. Poiché sono disponibili molte specie di Enchytraeus che possono essere mantenute in laboratorio in modo soddisfacente, il criterio più importante per selezionare una specie diversa da E. albidus è la pertinenza ecologica oltre a una sensibilità comparabile. In alcuni casi il fatto di ricorrere a un'altra specie è inevitabile. Ad esempio nei paesi in cui l'E. albidus non è presente e non può essere importato (ad esempio per restrizioni imposte dalla quarantena), è necessario utilizzare un'altra specie di Enchytraeus.
Esempi di specie alternative adeguate
—
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992): Negli ultimi anni essa è stata spesso utilizzata negli studi ecotossicologici proprio perché semplice da allevare e da sottoporre a prova. Essa presenta tuttavia l'inconveniente delle piccole dimensioni che ne rendono difficoltosa la manipolazione rispetto a E. albidus. (soprattutto nelle fasi che precedono l'uso di un metodo di colorazione). E. crypticus: poiché questa specie è stata descritta solo negli allevamenti di lombrichi, la sua esistenza in natura non è certa e quindi non se ne conoscono le esigenze ecologiche.
—
Enchytraeus buchholzi (Vejdovsky 1879): Questa denominazione comprende con ogni probabilità un gruppo di specie tra loro strettamente collegate che sono difficili da distinguere sul piano morfologico. Il loro utilizzo nelle prove non è consigliato fino a quando gli esemplari utilizzati in una prova non possano essere attribuiti con certezza a una specie. L'E. buchholzi si trova di solito nei prati e in siti disturbati quali i lati delle strade.
—
Enchytraeus luxuriosus: questa specie, originariamente nota come E.
“
minutus
”, è stata descritta di recente (1). Essa è stata reperita per la prima volta da U. Graefe (Amburgo) in un prato nei pressi di St. Peter-Ording (Schleswig-Holstein, Germania). E. luxuriosus presenta dimensioni pari a circa la metà di quelle dell'E. albidus ma comunque superiori a quelle delle altre specie qui esaminate; potrebbe essere una buona alternativa all'E. albidus.
—
Enchytraeus bulbosus (Nielsen & Christensen 1963): Questa specie è stata reperita fino ad oggi in suoli minerali in Germania e Spagna, dove è comune ma di solito non molto abbondante. In confronto ad altre piccole specie di questo genere è relativamente facile da identificare. Non si conosce nulla del suo comportamento nelle prove di laboratorio o della sua sensibilità alle sostanze chimiche, ma è risultata, tuttavia, facile da allevare (E. Belotti, comunicazione personale).
Condizioni di allevamento
Tutte le specie di Enchytraeus sopramenzionate possono essere allevate nello stesso substrato utilizzato per l'E. albidus. Le loro dimensioni più ridotte implicano che i recipienti per l'allevamento possono essere più piccoli e che i quantitativi di cibo (ma non il tipo) devono essere opportunamente adeguati. Il ciclo di vita di queste specie è più breve rispetto a quello dell'E. albidus e la somministrazione degli alimenti deve avvenire con maggiore frequenza.
Condizioni di prova
Le condizioni di prova sono generalmente le stesse che si applicano nel caso dell'E. albidus,, fatta eccezione per quanto segue:
—
i recipienti di prova possono (ma non devono necessariamente) essere più piccoli;
—
la durata della prova di riproduzione può (ma non deve necessariamente) essere più breve, ovvero quattro anziché sei settimane; la durata della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni non deve tuttavia subire variazioni;
—
viste le dimensioni ridotte della progenie, si raccomanda vivamente di utilizzare per il conteggio il metodo della colorazione;
—
il criterio di validità relativo alla “consistenza della progenie per recipiente di prova nel gruppo di controllo” deve essere portato a “50”.
RIFERIMENTI:
(1)
Schmelz, R.M. and Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp.nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeidae, Clitellata, Annelida). Carolinea 57, 93-100.
Appendice 6
Descrizione dettagliata delle tecniche di estrazione
Colorazione con rosso Bengala
Questo metodo, sviluppato originariamente nell'ambito dell'ecologia lacustre (1), è stato proposto per la prima volta per il conteggio delle progenie di Enchitreidi nella prova di riproduzione degli Enchitreidi di W. de Coen (Università di Gand, Belgio). Una versione modificata (rosso Bengala mescolato con formaldeide anziché etanolo), indipendente da quella citata, è stata messa a punto dal RIVM (Bilthoven, Paesi Bassi) (2)(3).
Al termine della prova vera e propria (ovvero dopo sei settimane) il terreno presente nel recipiente è trasferito in un contenitore poco profondo. A tal fine si può utilizzare un recipiente Bellaplast o una bacinella per uso fotografico con fondo striato (questo perché le striature limitano il movimento degli animali nel campo di osservazione). Gli esemplari della progenie sono fissati con etanolo (circa 5 ml per replica). I recipienti sono quindi riempiti di acqua (da 1 a 2 centimetri) e vi sono aggiunte alcune gocce (da 200 a 300 μl) di rosso Bengala (soluzione all'1 % in etanolo), o in alternativa una soluzione allo 0,5 % di eosina, e i due componenti sono accuratamente miscelati. Dopo 12 ore gli animali dovrebbero presentare un colorito rossastro e dovrebbero essere facili da contare in quanto giaceranno sulla superficie del substrato. In alternativa la miscela substrato/alcool può essere filtrata con un setaccio (dimensione delle maglie: 0,250 mm) prima di procedere al conteggio degli animali. Utilizzando questa procedura, la caolinite, la torba e parte della sabbia sono eliminate attraverso il setaccio e gli animali colorati rosso sono più facili da reperire e contare. Anche l'utilizzo di lenti illuminate (lenti di dimensioni pari ad almeno 100 × 75 mm con un fattore di ingrandimento compreso tra 2 e 3×) può facilitare il conteggio.
La tecnica di colorazione riduce i tempi necessari per il conteggio di alcuni minuti per recipiente e, di norma, dovrebbe consentire a una persona di valutare tutti i recipienti di una prova in un massimo di due giorni.
Estrazione in umido
L'estrazione in umido deve essere praticata immediatamente dopo il termine della prova. Il terreno di ciascun recipiente di prova è versato in setacci di plastica con una dimensione delle maglie di circa 1 mm. I setacci sono quindi sospesi in ciotole di plastica senza che ne tocchino il fondo. Le ciotole sono accuratamente riempite di acqua finché i campioni nei setacci sono completamente immersi nell'acqua. Per garantire un tasso di recupero di più del 90 % degli animali presenti, il periodo di estrazione deve durare tre giorni e avvenire a una temperatura di 20 ± 2 °C. Al termine del periodo di estrazione i setacci sono rimossi e l'acqua (ad eccezione di un piccolo quantitativo) è lasciata a decantare lentamente, avendo cura di non smuovere il sedimento sul fondo delle ciotole. Le ciotole di plastica sono quindi agitate leggermente per sospendere il sedimento nell'acqua sovrastante. L'acqua è quindi trasferita in una capsula Petri e, dopo che le particelle di terreno si sono depositate, gli Enchitreidi possono essere individuati, rimossi e contati utilizzando un microscopio stereoscopico e pinze morbide di acciaio.
Flottazione
Un metodo basato sulla flottazione è stato descritto in una nota di R. Kuperman (4). Dopo aver fissato con etanolo il contenuto di un recipiente di prova, il terreno è cosparso con Ludox (silice colloidale AM-30, sospensione acquosa al 30 %) fino a un'altezza di 10-15 mm sopra la superficie del terreno. Dopo aver accuratamente mescolato il terreno con l'agente di flottazione per 2-3 minuti, la progenie galleggiante sulla superficie può essere agevolmente contata.
RIFERIMENTI:
(1)
Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305.
(2)
Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp.
(3)
Posthuma, L., Baerselmann, R., Van Veen, R.P.M. and Dirven-Van Breemen, E.M. (1997). Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeus crypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38, 108-121.
(4)
Phillips, C.T., Checkai, R.T. and Kuperman, R.G. (1998). An alternative to the O'Connor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC 19th Annual Meeting, Charlotte, USA. Abstract Book No. PMP069, p. 157.
Appendice 7
Tabella riassuntiva della valutazione statistica dei dati (determinazione della NOEC)
Escludere il controllo senza solvente
I due controlli possono essere raggruppati
I due controlli possono essere raggruppati
Sì
I due controlli sono identici? Test U
I due controlli sono identici? Test t
Test U di Bonferroni
Test di Jonckheere-Terpstra
Test di Shirley
Test di Dunn
Ulteriore controllo con solvente?
Ulteriore controllo con solvente?
Prova statistica non raccomandata
Almeno quattro repliche per trattamento?
Esito negativo
Trasformare i dati
Dati:
Variazione omogenea?
Distribuzione normale?
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
No
No
No
No
No
No
Test di Dunnett
Test di Williams
Escludere il controllo senza solvente
Inizio
Prove non parametriche
Prove parametriche
C.33. PROVA DI RIPRODUZIONE PER I LOMBRICHI (EISENIA FETIDA/ EISENIA ANDREI)
INTRODUZIONE
1.
Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE n. 222 (2004). Esso è finalizzato a valutare gli effetti di sostanze chimiche sulla riproduzione (e su altri endpoint subletali) delle specie di lombrico Eisenia fetida (Savigny 1826) o Eisenia andrei (Andre 1963) (1)(2). Il metodo è stato sottoposto a una prova interlaboratorio (3). Esiste già un metodo di prova per saggiare la tossicità acuta sui lombrichi (4). Sono stati pubblicati diversi orientamenti internazionali e nazionali per le prove di tossicità acuta e cronica sui lombrichi (5)(6)(7)(8).
2.
Le specie Eisenia fetida/Eisenia andrei sono considerate rappresentative della fauna del suolo e dei lombrichi in particolare. Informazioni di tipo ecologico sui lombrichi e sul loro impiego nelle prove ecotossicologiche figurano nei riferimenti (7)(9)(10)(11)(12).
PRINCIPIO DELLA PROVA
3.
I lombrichi adulti sono esposti a un intervallo di concentrazioni della sostanza chimica in esame, sia miscelata nel terreno, sia, nel caso dei pesticidi, applicata nel o sul suolo utilizzando procedure coerenti con il tipo di uso previsto della sostanza chimica. Il metodo di applicazione è specifico per le finalità della prova. L'intervallo di concentrazioni di prova è selezionato in modo da includervi sia gli effetti subletali sia quelli letali su un periodo di otto settimane. La mortalità e gli effetti sulla crescita in relazione ai lombrichi adulti sono determinati dopo 4 settimane di esposizione. Gli esemplari adulti sono quindi rimossi dal terreno e gli effetti sulla riproduzione sono quindi valutati dopo ulteriori quattro settimane contando la progenie presente nel suolo. Il tasso di riproduzione dei lombrichi esposti alla sostanza chimica in esame è confrontato con il o i gruppi di controllo per determinare i) la concentrazione senza effetti osservati (NOEC) e/o ii) ECx (ad esempio, EC10, EC50) utilizzando un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x del tasso di riproduzione. Le concentrazioni di prova devono comprendere la ECx (e.g. EC10, EC50) in modo che la ECx sia ottenuta per interpolazione anziché per estrapolazione (cfr. l'appendice 1 per le definizioni).
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
4.
Per facilitare la definizione delle adeguate procedure di prova, devono essere disponibili le seguenti informazioni sulla sostanza chimica in esame:
—
idrosolubilità;
—
log Kow;
—
tensione di vapore;
—
informazioni sul destino della sostanza e sul suo comportamento nell'ambiente, laddove possibile (ad esempio, tasso di fotolisi e di idrolisi se pertinenti per il tipo di uso previsto).
5.
Il presente metodo di prova è applicabile a tutte le sostanze chimiche a prescindere dalla loro idrosolubilità. Il metodo di prova non è applicabile alle sostanze chimiche volatili, definite in questa sede le sostanze chimiche per le quali la costante di Henry o il coefficiente di ripartizione aria/acqua sono maggiori di uno o le sostanze chimiche con tensione di vapore superiore a 0,0133 Pa a 25 °C.
6.
Nel presente metodo di prova non si tiene conto della possibile degradazione della sostanza chimica in esame durante il periodo della prova. Di conseguenza non si può partire dal presupposto che le concentrazioni di esposizione saranno mantenute ai valori iniziali per tutta la prova. In questo caso si raccomanda di procedere a un'analisi chimica della sostanza chimica in esame all'inizio e alla fine della prova.
SOSTANZA DI IFERIMENTO
7.
La NOEC e/o la ECx di una sostanza chimica di riferimento devono essere determinate per assicurare che le condizioni di prova in laboratorio siano adeguate e per verificare che la risposta degli organismi di prova non cambi a livello statistico nel corso del tempo. È consigliabile sottoporre a prova una sostanza chimica di riferimento almeno una volta all'anno o, se ciò avviene con cadenza superiore, in parallelo alla determinazione della tossicità della sostanza chimica in esame. Il carbendazim o il benomil sono sostanze chimiche di riferimento adeguate con effetti dimostrati sulla riproduzione (3). Effetti apprezzabili dovrebbero comparire tra a) 1 e 5 mg di sostanza attiva per kg di massa secca o b) 250-500 g/ha o 25-50 mg/m2. Se nella serie di prove è incluso uno standard di tossicità positivo, viene utilizzata una sola concentrazione e il numero delle repliche deve essere uguale a quello dei gruppi di controllo.
VALIDITÀ DELLA PROVA
8.
Affinché i risultati della prova possano e considerati validi, nei gruppi di controllo devono essere soddisfatti i seguenti criteri:
—
ciascuna replica (contenente 10 esemplari adulti) deve produrre una progenie di ≥ 30 esemplari entro la fine della prova;
—
il coefficiente di variazione della riproduzione deve essere ≤ 30 %;
—
la mortalità adulta nelle quattro settimane iniziali della prova deve essere ≤10 %.
Una prova che non soddisfi i criteri suesposti non deve essere proseguita, a meno che non sia possibile giustificare una sua continuazione. La giustificazione va allegata alla relazione.
DESCRIZIONE DELLA PROVA
Apparecchiatura
9.
Per la prova devono essere utilizzati recipienti in vetro o in altro materiale chimicamente inerte di capacità compresa tra uno e due litri. I recipienti devono presentare una sezione trasversale di circa 200 cm2 in modo che la profondità del substrato umido sia di circa 5-6 cm quando vengono aggiunti da 500 a 600 g di massa secca di substrato. Il coperchio del recipiente deve essere progettato in modo tale da consentire lo scambio gassoso tra il substrato e l'atmosfera e l'accesso alla luce (ad esempio, un coperchio trasparente e perforato) evitando tuttavia che i lombrichi possano fuggire. Se il quantitativo di substrato utilizzato per la prova è notevolmente superiore a 500-600 g per recipiente di prova, si deve aumentare di conseguenza anche il numero dei lombrichi.
10.
L'esperimento richiede un'apparecchiatura normale di laboratorio, nello specifico:
—
una camera di essiccazione;
—
un microscopio stereoscopico;
—
un pH-metro e un fotometro;
—
bilance di precisione adeguata;
—
attrezzature adeguate per il controllo della temperatura;
—
attrezzature adeguate per il controllo dell'umidità (non essenziali se i recipienti per l'esposizione sono muniti di coperchi);
—
un'incubatrice o stanzetta con aria condizionata;
—
pinzette, ami o anse;
—
bagnomaria.
Preparazione del terreno artificiale
11.
In questa prova è utilizzato un terreno artificiale (5)(7) che presenta la seguente composizione (sulla base del peso a secco, con essiccazione fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C):
—
10 % di torba di sfagno (con pH più vicino possibile a 5,5-6,0, priva di residui visibili di piante, finemente macinata ed essiccata fino al raggiungimento di un tenore di umidità misurato);
—
20 % di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %);
—
tra lo 0,3 e l'1.0 % di carbonato di calcio (CaCO3, polverizzato, al grado analitico) per ottenere un pH iniziale di 6,0 ± 0,5;
—
70 % di sabbia di quarzo essiccata all'aria (in funzione del quantitativo di CaCO3 necessario), in prevalenza sabbia fine con più del 50 % delle particelle di dimensioni comprese tra 50 e 200 micron.
Nota 1: Il quantitativo di CaCO3 necessario dipende dai componenti del terreno, inclusi gli alimenti, e deve essere determinato mediante misurazioni di sottocampioni di terreno immediatamente prima della prova. Il pH è misurato in un campione misto in una soluzione di 1 M di cloruro di potassio (KCl) o 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) (13).
Nota 2: Il tenore di carbonio organico del terreno artificiale può essere ridotto, diminuendo, ad esempio, il tenore di torba al 4-5 % e aumentando proporzionalmente il tenore di sabbia. Con una tale riduzione del tenore di carbonio organico, possono diminuire le possibilità di assorbimento della sostanza chimica in esame nel terreno (carbonio organico) e aumentare la disponibilità della sostanza chimica in esame per i vermi. È stato dimostrato che l'Eisenia fetida può soddisfare i criteri di validità relativi alla riproduzione quando sottoposta a prova in terreni naturali con un tenore più basso di carbonio organico, ad esempio 2,7 % (14), ed è stato sperimentalmente constatato che ciò vale anche con un terreno artificiale contenente il 5 % di torba. Pertanto, prima di utilizzare un terreno nella prova vera e propria non è necessario dimostrare l'adeguatezza del terreno artificiale per garantire la conformità della prova ai criteri di validità, a meno che il tenore di torba sia ridotto in proporzione maggiore a quanto sopra specificato.
Nota 3: Quando si utilizza terreno naturale in ulteriori prove (ad esempio, sperimentazioni di livello più elevato), è necessario dimostrare inoltre l'adeguatezza del terreno e il rispetto dei criteri di validità della prova.
12.
I componenti secchi del terreno sono accuratamente mescolati (ad esempio in un grande miscelatore da laboratorio) in una zona ben ventilata. Prima dell'inizio della prova, il terreno artificiale secco è umidificato aggiungendo acqua deionizzata in quantità sufficiente a ottenere circa la metà del tenore di acqua finale, ovvero tra il 40 % e il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica (equivalente al 50 ± 10 % di umidità per massa secca). In questo modo si produce un substrato che, quando compresso nella mano, non presenta acqua residua o stagnante. La capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno artificiale è determinata in base alle procedure illustrate nell'appendice 2, alla norma ISO 11274 (15) o a una norma UE equivalente.
13.
Se la sostanza chimica in esame è applicata sulla superficie del terreno o miscelata allo stesso senza acqua, il quantitativo finale di acqua può essere miscelato al terreno artificiale durante la preparazione dello stesso. Se la sostanza chimica in esame è miscelata nel terreno utilizzando un po' d'acqua, la restante acqua può essere aggiunta insieme alla sostanza chimica in esame (cfr. paragrafo 19).
14.
Il tenore di umidità viene misurato all'inizio e alla fine della prova in conformità alla norma ISO 11465 (16) o a una norma UE equivalente e il pH del terreno in conformità all'appendice 3 o alla norma ISO 10390 (13) o a una norma UE equivalente. Tali misurazioni sono effettuate utilizzando un campione del terreno di controllo e un campione di terreno per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame. Non è necessario adeguare il pH del terreno quando si sottopongono a prova sostanze chimiche acide o basiche. Il tenore di umidità deve essere monitorato per tutta la durata della prova pesando periodicamente i recipienti (cfr. paragrafi 26 e 30).
Selezione e preparazione degli animali per la prova
15.
Nella prova sono utilizzate le specie Eisenia fetida o Eisenia andrei (1)(2). Per iniziare la prova sono necessari lombrichi adulti con clitello di età compresa tra due mesi e un anno. I lombrichi devono essere selezionati da una coltura di allevamento sincronizzata ed essere compresi in una fascia di età relativamente omogenea (appendice 4). I singoli esemplari di un gruppo di prova non devono avere tra di loro una differenza di età superiore a quattro settimane.
16.
I lombrichi selezionati devono essere acclimatati per almeno un giorno nel tipo di terreno artificiale utilizzato per la prova. Durante questo periodo i lombrichi devono essere alimentati con lo stesso mangime che sarà loro somministrato nel corso della prova (cfr. paragrafi da 31 a 33).
17.
I lombrichi sono pesati individualmente e ripartiti a caso, per gruppi di 10, nei recipienti di prova all'inizio della stessa. Prima della prova i lombrichi sono lavati (con acqua deionizzata) e l'acqua in eccesso è rimossa deponendo i lombrichi per un istante su una carta filtro. La massa umida dei singoli lombrichi deve essere compresa tra 250 e 600 mg.
Preparazione delle concentrazioni di prova
18.
Per l'applicazione della sostanza chimica in esame possono essere usati due metodi: si miscela la sostanza chimica in esame nel terreno (cfr. paragrafi 19-21) o la si applica sulla superficie del terreno (cfr. i paragrafi 22-24). La scelta del metodo adeguato dipende dalle finalità della prova. In generale si raccomanda di miscelare nel suolo la sostanza chimica in esame. Tuttavia, talvolta possono essere necessarie procedure di applicazione conformi alle normali prassi agricole (ad esempio, nebulizzazione di una formulazione liquida o utilizzo di formulazioni speciali di pesticidi, quali granuli o prodotti di trattamento delle sementi). I solventi utilizzati per facilitare il trattamento del terreno con la sostanza chimica in esame devono essere selezionati sulla base della loro bassa tossicità per i lombrichi e nell'articolazione della prova deve essere previsto un adeguato controllo dei solventi (cfr. paragrafo 27).
Miscelazione nel suolo della sostanza chimica in esame
Sostanza chimica in esame solubile in acqua
19.
Immediatamente prima di iniziare la prova viene preparata una soluzione della sostanza chimica in esame in acqua deionizzata in quantità sufficiente per tutte le repliche di una concentrazione. Per facilitare la preparazione della soluzione di prova può essere necessario l'uso di un cosolvente. È opportuno preparare la soluzione nella quantità necessaria a raggiungere il tenore di umidità richiesto (tra il 40 % e il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica). La soluzione è accuratamente miscelata con il terreno prima di essere versata nel recipiente di prova.
Sostanza chimica in esame insolubile in acqua
20.
La sostanza chimica in esame è disciolta in un piccolo volume di un adeguato solvente organico (ad esempio, acetone) e quindi nebulizzata su un piccolo quantitativo di sabbia di quarzo fine o miscelata alla stessa. Il solvente è quindi eliminato per evaporazione sotto una cappa chimica per almeno alcuni minuti. La sabbia così trattata è quindi accuratamente miscelata al terreno artificiale preumidificato. Viene quindi aggiunta, e mescolata al terreno, acqua deionizzata (nel quantitativo richiesto) per conseguire il tenore di umidità finale, ovvero tra il 40 % e il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica. Il terreno è quindi pronto per essere versato nei recipienti di prova. È necessario tenere presente che alcuni solventi possono essere tossici per i lombrichi.
Sostanza chimica in esame insolubile in acqua e nei solventi organici
21.
Viene preparata una miscela di 10 g di quarzo industriale finemente macinata e del quantitativo della sostanza chimica in esame necessario per conseguire la concentrazione di prova nel terreno. La miscela così ottenuta è quindi accuratamente miscelata al terreno artificiale preumidificato. Viene quindi aggiunta, e mescolata al terreno, acqua deionizzata nel quantitativo richiesto per conseguire il tenore di umidità finale, ovvero tra il 40 % e il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica. Il terreno è quindi pronto per essere versato nei recipienti di prova.
Applicazione della sostanza chimica in esame sulla superficie del terreno
22.
Il terreno è trattato dopo l'aggiunta dei lombrichi. I recipienti di prova sono prima riempiti con il terreno umidificato, quindi i lombrichi vi sono depositati sulla superficie dopo essere stati pesati. Poiché i lombrichi sani di norma si infossano subito nel terreno, quelli che rimangono in superficie dopo 15 minuti devono essere rimossi in quanto “danneggiati”. In caso di sostituzione dei lombrichi, sia quelli nuovi sia quelli rimossi devono essere pesati in modo da conoscere all'inizio il peso vivo totale del gruppo di lombrichi esposti e il peso totale del recipiente contenente i lombrichi.
23.
Quindi viene applicata la sostanza chimica in esame, ma non prima che sia trascorsa una mezzora dall'introduzione dei lombrichi (o se vi sono lombrichi sulla superficie) per evitare qualsiasi esposizione diretta per via cutanea alla sostanza chimica in esame. Quando la sostanza chimica in esame è un pesticida può essere opportuno applicarla al terreno per nebulizzazione. La sostanza chimica in esame deve essere applicata sulla superficie del terreno quanto più uniformemente possibile, utilizzando un adeguato nebulizzatore da laboratorio per simulare la nebulizzazione in campo aperto. Prima dell'applicazione della sostanza è necessario rimuovere il coperchio del recipiente, sostituendolo con un rivestimento per proteggere le pareti laterali del recipiente. Il rivestimento può essere un recipiente di prova dal quale è stata rimossa la base. L'applicazione deve avvenire a una temperatura compresa tra 20 ± 2 °C e, nel caso delle soluzioni acquose, delle emulsioni o delle dispersioni a un tasso compreso tra 600 e 800 μl/m2. Il tasso deve essere verificato utilizzando un'adeguata tecnica di taratura. Le formulazioni speciali, quali granuli o prodotti di trattamento delle sementi, devono essere applicate in modo conforme alle prassi agricole.
24.
I recipienti di prova non devono essere coperti per un periodo di un'ora per consentire l'evaporazione degli eventuali solventi volatili associati all'applicazione della sostanza chimica in esame. Durante questo periodo si deve vigilare affinché nessun lombrico esca dai recipienti di prova.
PROCEDURA
Gruppi di prova e di controllo
25.
Si raccomanda di ripartire 10 lombrichi per 500-600 g di massa secca di terreno artificiale (ovvero, 50-60 g di terreno per lombrico). Qualora siano usati quantitativi superiori di terreno, come può avvenire nel caso delle prove di pesticidi con modalità particolari di applicazione, ad esempio i prodotti di trattamento delle sementi, il carico di 50-60 g di terreno per lombrico deve essere mantenuto aumentando il numero di lombrichi nei recipienti. Per ciascun recipiente di trattamento e di controllo sono preparati dieci lombrichi. I lombrichi sono lavati con acqua, asciugati e quindi lasciati per un po' su un foglio di carta assorbente per smaltire l'eccesso di acqua.
26.
Per evitare errori sistematici nella distribuzione dei lombrichi nei recipienti di prova, è necessario determinare l'omogeneità della popolazione utilizzata pesando individualmente 20 esemplari scelti a caso tra quelli destinati ad essere utilizzati nella prova. Una volta stabilita tale omogeneità, i lotti di lombrichi devono essere selezionati, pesati e destinati ai recipienti di prova utilizzando protocolli di randomizzazione. Dopo l'aggiunta dei lombrichi si deve pesare ciascun recipiente di prova per acquisire un peso iniziale da utilizzare come base per il monitoraggio del tenore di umidità del terreno nel corso della prova, come descritto al paragrafo 30. I recipienti di prova sono quindi coperti, come illustrato al paragrafo 9, e collocati nella camera utilizzata per la prova.
27.
Per ciascuno dei metodi di prova per l'applicazione della sostanza chimica, di cui ai paragrafi da 18 a 24, sono predisposti adeguati gruppi di controllo. Per la preparazione dei gruppi di controllo si seguono tutte le pertinenti procedure sopradescritte, ad eccezione del fatto che non viene aggiunta la sostanza chimica in esame. Quindi, se del caso, i solventi organici, la sabbia di quarzo o altri mezzi disperdenti sono utilizzati nei gruppi di controllo in concentrazioni/quantitativi conformi a quelli usati nei gruppi di trattamento. Se la sostanza chimica in esame è applicata con l'ausilio di un solvente o altro mezzo disperdente, è necessario predisporre un altro gruppo di controllo in cui non sono usati il mezzo disperdente o la sostanza chimica in esame al fine di assicurarsi che il mezzo disperdente non influenzi i risultati.
Condizioni di prova
28.
La prova si svolge a una temperatura di 20 ± 2 °C e sulla base di un fotoperiodo controllato di luce/buio (di preferenza 16 ore di luce e 8 ore di buio) con un'intensità luminosa compresa tra 400 e 800 lx nella zona dei recipienti di prova.
29.
I recipienti non sono aerati durante la prova ma devono disporre di coperchi progettati in modo tale da consentire lo scambio gassoso, limitando al contempo l'evaporazione dell'umidità (cfr. paragrafo 9).
30.
Per mantenere durante tutta la durata della prova il tenore di acqua del terreno dei recipienti di prova, questi ultimi (ad eccezione dei coperchi) sono ripesati periodicamente. Le perdite sono compensate con l'aggiunta di acqua deionizzata. Il tenore di acqua non deve variare di più del 10 % rispetto al valore che aveva all'inizio della prova.
Alimentazione
31.
Ai fini della prova è considerato accettabile qualsiasi alimento avente proprietà dimostrate tali da garantire, quantomeno, che i lombrichi mantengano il loro peso durante la prova. L'esperienza ha dimostrato che la farina di avena e lo stallatico equino o bovino costituiscono alimenti adeguati. Si deve tuttavia verificare che gli equini o i bovini di cui si intendono utilizzare le deiezioni non siano sottoposti a trattamento veterinario con sostanze chimiche quali fattori di crescita, nematicidi o prodotti veterinari analoghi che potrebbero risultare nocivi per i lombrichi nel corso della prova. Si raccomanda di procedere in proprio alla raccolta dello stallatico bovino, in quanto l'esperienza ha dimostrato che quello disponibile in commercio, e utilizzato come fertilizzante da giardino, può avere effetti nocivi sui lombrichi. Prima dell'uso lo stallatico deve essere essiccato all'aria, finemente tritato e pastorizzato.
32.
Prima dell'utilizzo nella prova ciascun nuovo lotto di alimenti viene somministrato a un allevamento di lombrichi non sottoposti a prova per accertarsi che sia di qualità adeguata. La crescita e la produzione di bozzoli non deve evidenziare una riduzione rispetto a quanto avviene per i lombrichi allevati in un terreno al quale non è stato aggiunto il nuovo lotto di alimenti (le condizioni sono illustrate nel metodo di prova C.8.(4)).
33.
Gli alimenti sono somministrati un giorno dopo l'aggiunta dei lombrichi e l'applicazione sul terreno della sostanza chimica in esame. Circa 5 g di alimento sono distribuiti sulla superficie del terreno di ciascun recipiente di prova e inumiditi con acqua deionizzata (circa 5-6 ml per recipiente). Successivamente gli alimenti sono somministrati una volta alla settimana nelle 4 settimane di durata della prova. Se non tutti gli alimenti vengono consumati, è necessario diminuire la razione per evitare la formazione di funghi o muffa. Gli esemplari adulti sono rimossi dal terreno il ventottesimo giorno della prova e ulteriori 5 g di alimenti sono distribuiti in ciascun recipiente di prova. Nelle restanti quattro settimane della prova non vengono somministrati altri alimenti.
Selezione delle concentrazioni di prova
34.
Le informazioni disponibili sulla tossicità della sostanza chimica in esame, ad esempio risultati di prove di tossicità acuta (4) e/o di studi di definizione dell'intervallo di concentrazione, dovrebbero essere di aiuto nella scelta delle concentrazioni di prova appropriate. Se necessario, viene effettuata una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, utilizzando, ad esempio, cinque diverse concentrazioni della sostanza chimica in esame: 0,1, 1,0, 10, 100 e 1 000 mg/kg (massa secca di terreno). È sufficiente una replica per ciascun gruppo di trattamento e di controllo. La prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni dura due settimane, al termine delle quali viene valutata la mortalità.
Disegno sperimentale
35.
Poiché per la prova non è possibile indicare un'unica statistica riepilogativa, il presente metodo fornisce indicazioni per determinare la NOEC e l'ECx. È probabile che in un futuro prossimo le autorità di regolamentazione richiedano la NOEC, come pure che, a breve termine, si generalizzi l'uso dell'ECx per ragioni di ordine ecologico e statistico. Pertanto, sulla base delle raccomandazioni emerse da una prova interlaboratorio di riproduzione degli enchitreidi (17), si propongono tre diverse articolazioni della prova.
36.
Nel fissare l'intervallo delle concentrazioni si deve tenere presente quanto segue:
—
Per determinare la NOEC si devono sottoporre a prova almeno cinque/dodici concentrazioni in una serie geometrica. Si raccomanda di utilizzare almeno quattro repliche per ciascuna concentrazione di prova oltre a otto controlli. Le concentrazioni devono essere spaziate di un fattore non superiore a 2,0.
—
Per determinare l'ECx (ad esempio, EC10, EC50) si raccomanda l'uso di un numero adeguato di concentrazioni per ottenere almeno quattro risultati medi differenti e statisticamente significativi in rapporto a tali concentrazioni. Si raccomanda di effettuare almeno due repliche per ciascuna concentrazione di prova e sei repliche per i controlli. Il fattore di distanza può variare, ovvero essere pari o inferiore a 1,8 nell'intervallo di effetti attesa e superiore a 1,8 a concentrazioni superiori o inferiori.
—
Un approccio combinato consente di determinare sia la NOEC che l'ECx. In questo caso si devono utilizzare otto concentrazioni di trattamento formanti una serie geometrica. Si raccomanda di utilizzare almeno quattro repliche per ciascun trattamento oltre a otto controlli. Le concentrazioni devono essere distanziate di un fattore non superiore a 1,8.
Durata della prova e misurazioni
37.
Il 28o giorno gli esemplari adulti viventi sono osservati e contati. Devono essere inoltre registrate le anomalie comportamentali (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili) e i mutamenti morfologici (ad esempio, la presenza di ferite aperte). Tutti gli esemplari adulti sono quindi rimossi dai recipienti di prova, contati e pesati. Il trasferimento del terreno contenente i lombrichi su un vassoio pulito prima della valutazione può facilitare la ricerca degli esemplari adulti. I lombrichi estratti dal suolo sono lavati (con acqua deionizzata) prima di essere pesati e l'acqua in eccesso è rimossa deponendo i lombrichi per un istante su una carta filtro. Tutti i lombrichi che non sono reperiti in questa fase sono registrati come morti, in quanto si suppone che siano morti e si siano decomposti prima della valutazione.
38.
Il terreno rimosso dai recipienti (privo dei lombrichi adulti ma contenete gli eventuali bozzoli prodotti) deve esservi reintrodotto. Il terreno è quindi mantenuto in incubatrice per altre quattro settimane nelle stesse condizioni di prova, ad eccezione del fatto che gli alimenti sono somministrati soltanto una volta all'inizio di tale fase della prova (cfr. paragrafo 33).
39.
Al termine del secondo periodo di quattro settimane si determina, utilizzando le procedure di cui all'appendice 5, la consistenza della progenie nata dai bozzoli e il numero di quest'ultimi. Durante la durata della prova è necessario inoltre registrare tutte le indicazioni di lesioni o effetti nocivi riscontrati sui lombrichi.
Prova limite
40.
Se nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni non si osserva alcun effetto alla concentrazione più alta (ovvero 1 000 mg/kg), la prova di riproduzione viene effettuata come prova limite utilizzando una concentrazione di prova pari a 1 000 mg/kg. Una prova limite fornisce l'opportunità di dimostrare che la NOEC per la riproduzione è superiore alla concentrazione limite, riducendo al contempo il numero di lombrichi utilizzati nella prova. Sia per il terreno di prova sia per quello di controllo devono essere usate otto repliche.
DATI E RELAZIONE
Trattamento dei risultati
41.
Il presente metodo di prova non presenta alcun orientamento statistico definito per analizzare i risultati della prova, anche se nell'appendice 6 sono fornite indicazioni generali.
42.
Un risultato significativo è costituito dalla mortalità. Devono essere inoltre registrate le modifiche comportamentali negli esemplari adulti (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova), i mutamenti morfologici (ad esempio, ferite aperte) oltre alla presenza di progenie. Per determinare la LC50 è opportuno di norma applicare l'analisi Probit (18) o la regressione logistica. Tuttavia, nei casi in cui tale metodo di analisi si riveli inadeguato (ad esempio, se si ottengono meno di tre concentrazioni che provocano una mortalità parziale), possono essere utilizzati metodi alternativi, quali le medie mobili (19), il metodo Spearman-Karber semplificato (20) o l'interpolazione semplice (ad esempio, la media geometrica di LC0 e LC100, calcolata mediante la radice quadrata di LC0 moltiplicata per LC100).
43.
L'altro risultato significativo è la fecondità (ovvero, la consistenza della progenie prodotta). Tuttavia, come nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, tutti gli altri indicatori di nocività devono essere registrati nella relazione di prova. Ai fini dell'analisi statistica è necessario calcolare la media aritmetica e la deviazione standard relativa alla riproduzione negli animali sottoposti al trattamento e in quelli di controllo.
44.
Se è stata effettuata un'analisi della varianza, la deviazione standard, s, e i gradi di libertà (df) possono essere sostituiti con la stima raggruppata della varianza ottenuta rispettivamente dall'analisi della varianza (ANOVA) e dai suoi gradi di libertà — a condizione che la varianza non dipenda dalla concentrazione. In questo caso si utilizzano varianze uniche per i gruppi di controllo e di trattamento. Tali valori sono calcolati di solito mediante software statistici disponibili in commercio che utilizzano i risultati per recipiente come repliche. Se il raggruppamento dei dati relativi ai controlli negativi e ai controlli contenenti solventi appare più pertinente rispetto al fatto di calcolare i risultati della prova in relazione a uno dei due controlli, è necessario verificare mediante una prova che non emergano differenze significative (per le prove adeguate si vedano il paragrafo 47 e l'appendice 6).
45.
Ulteriori prove e inferenze statistiche dipendono dal fatto che i valori delle repliche siano o no omogenei e distribuiti in modo normale per quanto attiene alla loro varianza.
Stima della NOEC
46.
Deve essere preferita l'applicazione di prove di potenza, verificando che i dati abbiano una distribuzione grosso modo normale sulla base delle informazioni disponibili, ad esempio quelle di altre prove interlaboratorio o di altri dati storici. L'omogeneità della varianza (omoschedasticità) è più determinante. L'esperienza ci insegna che la varianza aumenta spesso di pari passo con la media. In questi casi una trasformazione dei dati potrebbe determinare l'omoschedasticità. Tale trasformazione, tuttavia deve essere basata sull'esperienza acquisita con i dati storici piuttosto che sui dati in corso di analisi. In presenza di dati omogenei si deve procedere a prove t multiple, quali il test di Williams (α = 0,05, test a una coda) (21)(22) o in alcuni casi il test di Dunnett (23)(24). Va rilevato che, nei casi di repliche diseguali, i valori t della tabella devono essere rettificati come suggerito da Dunnett e Williams. Talvolta, in presenza di una variazione significativa, può accadere che l'aumento/diminuzione delle risposte non abbia carattere regolare. In questo caso è opportuno discostarsi in modo marcato dalla monotonicità del test di Dunnett. Nei casi di deviazione dall'omoschedasticità, può essere corretto indagare più da vicino i possibili effetti sulle varianze per decidere se sia possibile applicare le prove t senza perdere molto in potenza (25). In alternativa possono essere effettuati — e sono in genere preferibili alle prove t per varianze diseguali — una prova U multipla, ad esempio il test U di Bonferroni secondo Holm (26) o, quando i dati evidenziano un'eteroschedasticità ma sono altrimenti coerenti con un rapporto dose-risposta monotonico soggiacente, un'altra prova non parametrica (ad esempio, Jonckheere-Terpstra (27) (28) o Shirley (29) (30)). (si veda anche lo schema di cui all'appendice 6).
47.
Se è stata effettuata una prova limite e sono state rispettati i prerequisiti delle prove parametriche (normalità, omogeneità), si può utilizzare il test t bilaterale di Student oppure il test U di Mann-Whitney (31).
Stima dell'ECx
48.
Per calcolare qualsiasi valore di ECx si utilizzano le medie per trattamento per l'analisi di regressione (lineare o non lineare) dopo aver ottenuto un'adeguata funzione dose-risposta. Se la crescita degli animali è considerata una risposta continua, i valori della ECx- possono essere stimati avvalendosi di un'adeguata analisi di regressione (32). Tra le funzioni adeguate per i dati di tipo quantale (mortalità/sopravvivenza) e consistenza della progenie prodotta figurano le funzioni sigmoidee normali, le funzioni logistiche o di Weibull, contenenti due o quattro parametri, alcuni dei quali possono anche modellizzare una risposta ormetica. Se una funzione dose-risposta è stata adeguata mediante un'analisi della regressione lineare, si dove trovare mediante l'analisi della regressione un r2 (coefficiente di determinazione) e/o una pendenza significativi prima di stimare la ECx inserendo un valore corrispondente a x % della media del controllo nell'equazione ottenuta mediante analisi della regressione. I limiti di confidenza del 95 % sono calcolati come indicato da Fieller (citato in Finney (18)) o con altri metodi recenti appropriati.
49.
In alternativa la risposta è modellizzata come percentuale o proporzione del parametro del modello che è interpretato come la risposta media del controllo. In altri casi la curva sigmoide normale (logistica, Weibull) può essere spesso adeguata facilmente ai risultati utilizzando la procedura di regressione probit (18). In questi casi la funzione di ponderazione deve essere adeguata per i risultati metrici, come illustrato da Christensen (33). Tuttavia, se viene constatata un'ormesi, è necessario sostituire l'analisi Probit con una funzione logistica o Weibull a quattro parametri adeguata mediante una procedura di regressione non lineare (34). Qualora sia impossibile adeguare ai dati una funzione appropriata dose-risposta, è possibile utilizzare metodi alternativi per stimare la ECx e i suoi limiti di confidenza, quali le medie mobili secondo Thompson (19) e il metodo Spearman-Karber semplificato (20).
RELAZIONE SULLA PROVA
50.
La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti.
Sostanza chimica in esame:
—
descrizione completa della sostanza chimica in esame, partita, lotto, numero CAS, purezza;
—
proprietà della sostanza chimica in esame (ad esempio, log Kow, idrosolubilità, tensione di vapore, costante di Henry (H) e informazioni sul destino e sul comportamento).
Organismi di prova
—
animali utilizzati per la prova: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento;
—
età, intervallo delle dimensioni (massa) degli organismi di prova.
Condizioni di prova
—
informazioni sulla preparazione del terreno per la prova;
—
capacità massima di ritenzione idrica del terreno;
—
descrizione delle tecniche utilizzate per applicare sul terreno la sostanza chimica in esame;
—
informazioni sugli ausiliari chimici utilizzati per la somministrazione della sostanza chimica in esame;
—
se del caso, informazioni sulla calibratura dei dispositivi di nebulizzazione;
—
descrizione del disegno e delle procedure sperimentali;
—
dimensioni dei recipienti di prova e volume del terreno di prova;
—
condizioni della prova: intensità luminosa, durata dei fotoperiodi luce/buio, temperatura;
—
descrizione del regime alimentare, tipo e quantitativi degli alimenti utilizzati nella prova, date di somministrazione degli alimenti;
—
pH e tenore di acqua del terreno all'inizio e alla fine della prova.
Risultati della prova:
—
mortalità tra gli esemplari adulti ( %) in ciascun recipiente di prova al termine delle 4 settimane di prova;
—
massa totale degli esemplari adulti all'inizio della prova in ciascun recipiente di prova;
—
variazioni di peso degli esemplari adulti vivi (in % del peso iniziale) in ciascun recipiente di prova dopo le prime quattro settimane di prova;
—
consistenza della progenie prodotta in ciascun recipiente di prova al termine della stessa;
—
descrizione degli effetti evidenti o dei sintomi patologici o di cambiamenti distinti di comportamento;
—
risultati ottenuti con la sostanza chimica di riferimento;
—
LC50, NOEC e/o ECx (ad esempio, EC50, EC10) per la riproduzione, se alcuni di tali valori sono applicabili con intervalli di confidenza e rappresentazione grafica del modello adeguato utilizzato per il loro calcolo oltre a tutte le informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei risultati.
—
la curva della relazione dose-risposta;
—
i risultati applicabili a ciascun contenitore di prova;
scostamenti rispetto alle procedure descritte nel presente metodo di prova ed eventi insoliti registrati nel corso della prova.
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Chapter C.8 of this Annex, Earthworm acute toxicity test.
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Appendice 1
Definizioni
Al presente metodo di prova si applicano le seguenti definizioni:
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
ECx (concentrazione con effetto per effetto x %): la concentrazione che determina un effetto di x % sugli organismi sperimentali entro un determinato periodo di esposizione in confronto a un gruppo di controllo. Ad esempio, EC50 è una concentrazione che si stima provochi un effetto determinato sul 50 % di una popolazione esposta durante un periodo definito di esposizione. Nella presente prova le concentrazioni con effetto sono espresse come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova o come massa della sostanza chimica in esame per unità di superficie del terreno.
LC0 (assenza di concentrazione letale): la concentrazione della sostanza chimica in esame che, in un dato periodo di tempo, non provoca la morte di nessuno degli organismi della prova che vi sono esposti. Nella presente prova la LC0 è espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova.
LC50 (concentrazione letale media): la concentrazione della sostanza chimica in esame che, in un dato periodo di tempo, provoca la morte del 50 % degli organismi della prova che vi sono esposti. Nella presente prova l'LC50 espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova o come massa della sostanza chimica in esame per unità di superficie del terreno.
LC100 (concentrazione letale totale): la concentrazione della sostanza chimica in esame che, in un dato periodo di tempo, provoca la morte del 100 % degli organismi di prova che vi sono esposti. Nella presente prova la LC100 è espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration — Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto significativo): la concentrazione più bassa della sostanza chimica in esame avente un effetto statisticamente significativo (p < 0,05). Nella presente prova la LOEC espressa come massa della sostanza chimica in esame per massa a secco del terreno di prova o come massa della sostanza chimica in esame per unità di superficie del terreno. Tutte le concentrazioni di prova superiori alla LOEC devono di norma produrre un effetto statisticamente differente da quello osservato nei gruppi di controllo. Tutti gli scostamenti rispetto a quanto indicato precedentemente devono essere giustificati nella relazione.
NOEC (No Observed Effect Concentration — Concentrazione senza effetti osservati) è la concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame — immediatamente al di sotto della LOEC — alla quale non è osservato alcun effetto. In questa prova la concentrazione corrispondente alla NOEC non produce effetti statisticamente significativi (p < 0,05) entro un determinato periodo di esposizione in confronto a un gruppo di controllo.
Tasso di riproduzione: la media del numero della progenie prodotta per un determinato numero di esemplari adulti nel periodo di prova.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.
Appendice 2
Determinazione della capacità massima di ritenzione idrica del terreno
Per determinare la capacità massima di ritenzione idrica del terreno il metodo illustrato di seguito, e descritto nell'allegato C della norma ISO DIS 11268-2 (1), è considerato appropriato.
Si raccoglie un quantitativo definito (ad esempio, 5 g) del terreno utilizzato per la prova servendosi di un dispositivo adeguato (tubo Auger, ecc.). Si copre il fondo del tubo con un pezzo di carta da filtro e, dopo averla riempita d'acqua, la si mette a bagnomaria su un supporto. Il tubo Auger deve poi essere progressivamente immerso finché il livello dell'acqua venga a coprire la parte superiore del terreno e deve essere lasciata in acqua per almeno tre ore. Poiché non tutta l'acqua assorbita dai capillari del suolo può essere ritenuta, il campione di suolo deve essere lasciato a gocciolare per un periodo di due ore, collocando il tubo Auger su un letto di sabbia di quarzo finemente tritata all'interno di un recipiente coperto (per evitare l'essiccazione). Il campione deve quindi essere pesato ed essiccato fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C. La capacità di ritenzione idrica (WHC) può quindi essere calcolata come segue:
dove:
S
=
substrato saturo di acqua + massa del tubo Auger + massa del filtro di carta
T
=
tara (massa del tubo Auger + massa del filtro di carta)
D
=
massa secca del substrato
RIFERIMENTI:
(1)
ISO (International Organization for Standardisation ) (1996). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No.11268-2. ISO, Geneve.
Appendice 3
Determinazione del PH del terreno
Il seguente metodo per determinare il pH del terreno si basa sulla descrizione di cui alla norma ISO DIS 10390: Soil Quality — Determination of pH (1).
Un quantitativo definito di terreno è essiccato a temperatura ambiente per almeno 12 ore. Quindi viene preparata una sospensione del terreno (contenente almeno 5 grammi di terreno) pari a cinque volte il volume di quest'ultimo con una soluzione di 1 M di cloruro di potassio (KCl) al grado analitico o con una soluzione di 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) al grado analitico. La soluzione è quindi agitata vigorosamente per cinque minuti e quindi lasciata decantare per almeno due ore ma per non più di 24 ore. Il pH della fase liquida è quindi misurato utilizzando un pH-metro che deve essere calibrato prima di ogni misurazione utilizzando un'adeguata serie di soluzioni tampone (ad esempio, pH 4,0 e 7,0).
RIFERIMENTI:
(1)
ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve.
Appendice 4
Allevamento di Eisenia fetida /Eisenia andrei
È preferibile che l'allevamento sia condotto in una camera climatica a 20 °C ± 2 °C, temperatura alla quale, con la somministrazione di alimenti sufficienti, i lombrichi raggiungono la maturità in 2/3 mesi.
Entrambe le specie possono essere allevate in deiezioni animali di vario tipo. Il mezzo di allevamento raccomandato è una miscela di stallatico equino o bovino e torba in parti uguali. Si deve tuttavia verificare che gli equini o i bovini di cui si intendono utilizzare le deiezioni non siano sottoposti a trattamento veterinario con sostanze chimiche quali fattori di crescita, nematicidi o prodotti veterinari analoghi che potrebbero risultare nocivi per i lombrichi nel corso della prova. Si raccomanda di procedere in proprio alla raccolta dello stallatico bovino proveniente da fonte “organica”, in quanto l'esperienza ha dimostrato che quello disponibile in commercio, e utilizzato come fertilizzante da giardino, può avere effetti nocivi sui lombrichi. Il mezzo di cui trattasi deve avere un pH di circa 6-7 (adeguato con carbonato di calcio), una conduttività ionica bassa (meno di 6 mg o concentrazione di sali inferiore a 0,5 %) e non essere troppo contaminato da ammoniaca o urina animale. Il substrato deve essere umido ma non troppo bagnato. Le cassette di allevamento più idonee hanno capacità compresa tra 10 e 50 litri.
Per ottenere una popolazione di lombrichi omogenea per età e dimensioni (massa), è consigliabile iniziare l'allevamento con i bozzoli. L'allevamento, una volta creato, viene mantenuto mettendo i lombrichi adulti in una cassetta di allevamento contenente terreno fresco per un periodo compreso tra 14 e 28 giorni per consentire la produzione di ulteriori bozzoli. Gli esemplari adulti sono quindi rimossi e la progenie prodotta dai bozzoli è utilizzata come base per l'allevamento successivo. I lombrichi sono alimentati in permanenza con deiezioni animali e, di quando in quando, sono trasferiti in una cassetta con terreno fresco. L'esperienza ha dimostrato che lo stallatico equino o bovino o la farina di avena costituiscono alimenti adeguati. Si deve tuttavia verificare che gli equini o i bovini di cui si intendono utilizzare le deiezioni non siano sottoposti a trattamento veterinario con sostanze chimiche quali fattori di crescita, che potrebbero risultate nocivi per i lombrichi in un allevamento di lunga durata. I lombrichi nati dai bozzoli sono utilizzati per le prove quando hanno un'età compresa tra 2 o 12 mesi e sono considerati adulti.
I lombrichi delle specie sono considerati in buona salute se si muovono nel substrato, non tentano di fuggire e si riproducono continuamente. Una certa inazione dei lombrichi e una colorazione gialla dell'estremità posteriore sono indice di impoverimento del substrato. In questo caso si raccomanda di aggiungere terreno fresco o di ridurre la densità dell'allevamento.
Appendice 5
Tecniche per il conteggio della progenie nata dai bozzoli
La selezione manuale dei lombrichi dal terreno richiede molto tempo. Si raccomandano, pertanto, due metodi alternativi:
a)
i recipienti di prova sono messi a bagnomaria a una temperatura di 40 °C aumentata poi fino a 60 °C. Dopo circa 20 minuti la progenie dovrebbe apparire sulla superficie del terreno dalla quale può essere facilmente rimossa e contata;
b)
il terreno di prova può essere passato al setaccio utilizzando il metodo messo a punto da van Gestel et al. (1), a condizione che la torba, lo stallatico o la farina di avena aggiunti al terreno siano stati finemente tritati. Due setacci aventi larghezza delle maglie di 0,5 mm (diametro 30 cm) sono collocati l'uno sopra l'altro. Il contenuto del recipiente di prova è passato al setaccio utilizzando un getto potente di acqua del rubinetto. In questo modo, sul setaccio superiore restano principalmente i lombrichi più piccoli e i bozzoli. È importante notare che l'intera superficie del setaccio superiore deve essere mantenuta bagnata durante tutta l'operazione in modo che i lombrichi più piccoli galleggino su uno strato d'acqua e non scappino passando tra le maglie del setaccio. I migliori risultati si ottengono utilizzando il getto di una doccetta.
Una volta passato al setaccio tutto il terreno, il setaccio superiore può essere lavato sopra una ciotola in modo da raccogliere in quest'ultima i lombrichi piccoli e i bozzoli. Si lascia quindi decantare il contenuto della ciotola finché i bozzoli vuoti galleggino in superficie e quelli pieni e i giovani lombrichi si depositino sul fondo. Quindi si svuota la ciotola dall'acqua che vi era rimasta e i piccoli lombrichi e i bozzoli sono trasferiti in una capsula Petri contenente un po' d'acqua, dalla quale i lombrichi possono essere rimossi utilizzando un ago o pinzette.
L'esperienza ha dimostrato che il metodo (a) è il più efficace per l'estrazione dei piccoli lombrichi in quanto essi riescono a passare attraverso un setaccio, anche con maglie di 0,5 mm.
Si deve sempre determinare l'efficienza del metodo utilizzato per rimuovere i lombrichi (e, se del caso, i bozzoli) dal terreno. Se la progenie è raccolta utilizzando una tecnica di selezione a mano, è consigliabile ripetere l'operazione due volte su tutti i campioni.
RIFERIMENTI:
(1)
Van Gestel, C.A.M., W.A. van Dis, E.M. van Breemen, P.M. Sparenburg (1988). Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. Pedobiologia 32:367-371.
Appendice 6
Tabella riassuntiva della valutazione statistica dei dati (determinazione della NOEC)
Escludere il controllo senza solvente
I due controlli possono essere raggruppati
Escludere il controllo senza solvente
I due controlli possono essere raggruppati
Sì
I due controlli sono identici? Test U
I due controlli sono identici? Test t
Test U di Bonferroni
Test di Jonckheere-Terpstra
Test di Shirley
Test di Dunn
Ulteriore controllo con solvente?
Ulteriore controllo con solvente?
Prova statistica non raccomandata
Almeno quattro repliche per trattamento?
Esito negativo
Trasformare i dati
Dati:
Variazione omogenea?
Distribuzione normale?
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
No
No
No
No
No
No
Test di Dunnett
Test di Williams
Inizio
Prove non parametriche
Prove parametriche
C.34. DETERMINAZIONE DELL'INIBIZIONE DELL'ATTIVITÀ DEI BATTERI ANAEROBICI — RIDUZIONE DELLA PRODUZIONE DI GAS DA FANGHI DIGESTORI ANAEROBICI (DELLE ACQUE REFLUE)
INTRODUZIONE
1.
Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 224 (2007). Le sostanze chimiche scaricate in ambienti acquatici passano sia attraverso zone aerobiche che anaerobiche, nelle quali possono essere degradate e/o dove possono inibire l'attività batterica; in alcuni casi possono rimanere indisturbate in zone anaerobiche per decenni od oltre. Nel trattamento delle acque reflue, la prima fase (sedimentazione primaria) è aerobica nel surnatante e anaerobica nel subnatante dei fanghi. A queste segue nella fase secondaria una zona aerobica nel serbatoio di aerazione dei fanghi attivi e una zona anaerobica nel subnatante dei fanghi nella vasca di sedimentazione secondaria. I fanghi provenienti da entrambe le fasi sono solitamente sottoposti a trattamento anaerobico, che produce metano e biossido di carbonio normalmente utilizzati per la produzione di energia elettrica. In ambienti aperti, le sostanze chimiche che raggiungono i sedimenti nelle baie, negli estuari e nel mare sono suscettibili di restare in queste zone anaerobiche a tempo indeterminato a meno che siano biodegradabili. Alcune proprietà fisiche, quali una scarsa idrosolubilità, un elevato adsorbimento sui solidi in sospensione o un'incapacità di biodegradazione aerobica, permetteranno ad alcune sostanze chimiche di raggiungere tali zone in proporzioni più significative.
2.
Sebbene sia auspicabile che le sostanze chimiche scaricate nell'ambiente siano biodegradabili sia in condizioni aerobiche che anaerobiche, è fondamentale che esse non impediscano l'attività dei microrganismi nell'una o nell'altra zona. Nel Regno Unito vi sono stati alcuni casi di inibizione totale della produzione di metano dovuta, per esempio, al pentaclorofenolo contenuto negli scarichi industriali, che hanno comportato il trasporto dei fanghi inibiti, estremamente costoso, dai digestori verso siti “sicuri” e l'importazione di fanghi digestori sani da impianti vicini. Ma vi sono stati molti casi di perturbazioni meno gravi della digestione a causa di diverse altre sostanze chimiche, compresi aloidrocarburi alifatici (lavaggio a secco) e detergenti, che comportano un significativo deterioramento dell'efficienza del digestore.
3.
Solo il metodo di prova C.11 (1) si occupa dell'inibizione dell'attività batterica (inibizione della respirazione dei fanghi attivi), valutando l'effetto della sostanza chimica in esame sul tasso di consumo di ossigeno in presenza di substrato. Il metodo è stato ampiamente utilizzato per fornire un'allerta tempestiva circa possibili effetti nocivi delle sostanze chimiche sul trattamento aerobico delle acque reflue, e anche per valutare le concentrazioni non inibitorie delle sostanze chimiche in esame da utilizzare nelle varie prove di biodegradabilità. Il metodo di prova C.43 (2) permette di determinare (anche se limitatamente) la tossicità della sostanza in esame per la produzione di gas da fanghi anaerobici, diluita a un decimo della sua normale concentrazione di solidi per consentire la precisione richiesta nella valutazione della percentuale di biodegradazione. Visto che i fanghi diluiti possono essere più sensibili alle sostanze chimiche inibitrici, il gruppo ISO ha deciso di elaborare un metodo che prevede fanghi non diluiti. Dopo aver esaminato almeno tre documenti (provenienti da Danimarca, Germania e Regno Unito), alla fine sono state compilate due norme ISO: la prima utilizza fanghi non diluiti (ISO 13 641-1 (3)) e l'altra fanghi diluiti cento volte (ISO 13 641-2 (4)), in modo da rappresentare fanghiglia e sedimenti con una bassa presenza di popolazioni batteriche. Entrambi i metodi sono stati sottoposti a una prova interlaboratorio (ring test) (5); la prima è stata riconosciuta come norma accettabile, ma non vi è stata unanimità sulla seconda. Il Regno Unito ha ritenuto che il metodo richiedesse un'ulteriore indagine, data la percentuale significativa dei partecipanti che hanno segnalato una produzione di gas molto scarsa o inesistente, in parte perché la percentuale di spazio gassoso era troppo elevata (75 %) per una sensibilità ottimale.
4.
Alcuni lavori svolti in precedenza nel Regno Unito (6) (7) avevano descritto un metodo manometrico che ricorreva a fanghi digerenti non diluiti, con l'aggiunta di acque reflue non trattate come substrato, in matracci da 500 ml; l'apparecchiatura era complessa e il cattivo odore proveniente dai fanghi non trattati era sgradevole. In seguito è stata utilizzata con successo da Wilson et al. (10) l'apparecchiatura più compatta e pratica di Shelton e Tiedje (8), sviluppata da Battersby e Wilson (9). Kawahara et al (11) hanno preparato con successo altri fanghi standard in laboratorio da utilizzare nelle prove di biodegradabilità anaerobica e di inibizione su una serie di sostanze chimiche. Inoltre, i fanghi non trattati usati come substrato sono stati sostituiti con fanghi anaerobici diluiti cento volte o con fanghiglia, sedimenti ecc. a bassa attività batterica per un'ulteriore prova.
5.
Questo metodo permette di ottenere informazioni utili per prevedere il probabile effetto di una sostanza chimica sulla produzione di gas in digestori anaerobici. Tuttavia, solo prove più estese che simulano più rigorosamente il funzionamento dei digestori sono in grado di indicare se l'adattamento dei microrganismi alla sostanza in esame può avvenire o se agenti chimici che possono essere assorbiti e adsorbiti sui fanghi possono accumularsi fino a giungere a una concentrazione tossica su un periodo più lungo rispetto a quello di questa prova.
PRINCIPIO DELLA PROVA
6.
Aliquote di una miscela di fanghi a digestione anaerobica (da 20 g/l a 40 g/l di solidi totali) e una soluzione degradabile di substrato vengono incubate individualmente e in parallelo con la sostanza chimica in esame in quantità comprese in un determinato intervallo di concentrazioni, in recipienti chiusi per tre giorni al massimo. La quantità di gas prodotti (metano più anidride carbonica) è misurata tramite l'aumento della pressione (Pa) nei recipienti. L'inibizione percentuale della produzione di gas risultante dalle diverse concentrazioni della sostanza chimica in esame è calcolata a partire dalle quantità prodotte nei recipienti di prova e di controllo. Il valore EC50 e altre concentrazioni efficaci sono calcolate a partire dalle curve delle percentuali di inibizione in base alla concentrazione delle sostanze chimiche in esame o, più generalmente, al suo logaritmo decimale.
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME
7.
Le sostanze chimiche in esame devono, di norma, essere utilizzate nella forma più pura facilmente disponibile, in quanto le impurità presenti in alcune di esse, ad esempio i clorofenoli, possono essere molto più tossiche delle sostanze stesse. Tuttavia, occorre prendere in considerazione l'opportunità di testare le sostanze chimiche nella forma in cui sono state prodotte/rese commercialmente disponibili. Si sconsiglia di utilizzare regolarmente prodotti formulati, sebbene possa essere necessario ricorrervi in caso di sostanze chimiche scarsamente solubili. Occorre conoscere le seguenti proprietà della sostanza chimica in esame: solubilità in acqua e in alcuni solventi organici, tensione di vapore, coefficiente di adsorbimento, idrolisi e biodegradabilità in condizioni anaerobiche.
APPLICABILITÀ DEL METODO
8.
La prova si applica a sostanze chimiche solubili o insolubili in acqua, comprese sostanze chimiche volatili. È indispensabile prendere precauzioni particolari con i materiali caratterizzati da bassa solubilità in acqua (cfr. riferimento (12)) ed elevata volatilità. Si possono inoltre utilizzare inoculi provenienti da altri siti anaerobici, ad esempio fanghiglia, suoli saturi o sedimenti. I sistemi a batteri anaerobici precedentemente esposti a sostanze chimiche tossiche possono essere adattati cosicché mantengano la loro attività anche in presenza di sostanze xenobiotiche. Gli inoculi provenienti da sistemi batterici adattati potrebbero avere una maggiore tolleranza alle sostanze in esame rispetto a quelli provenienti da sistemi non adattati.
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO
9.
Per verificare la procedura, occorre svolgere una prova su una sostanza chimica di riferimento predisponendo recipienti adeguati in parallelo come parte delle normali prove sperimentali; il 3,5-diclorofenolo ha dimostrato di essere un inibitore costante della produzione di gas anaerobica, nonché del consumo di ossigeno da parte dei fanghi attivi e di altre reazioni biochimiche. Altre due sostanze chimiche hanno dimostrato di possedere una maggiore capacità inibitoria della produzione di metano rispetto al 3,5-diclorofenolo, vale a dire il metilene bis(tiocianato) e il pentaclorofenolo, ma i risultati di queste sostanze non sono stati convalidati. Il pentaclorofenolo è sconsigliato in quanto non è facilmente disponibile in forma pura.
RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI
10.
In una prova interlaboratorio internazionale (5) è stata rilevata solo una media riproducibilità tra i valori di EC50 dei 10 laboratori partecipanti, per il 3,5-diclorofenolo e l'acido 2-bromo-etano-sulfonico (l'intervallo per il primo andava da 32 mg/l a 502 mg/l e per il secondo da 220 a 2 190 mg/l).
Numero di laboratori
In mg/l
In mg/g di fanghi
media
deviazione standard
coefficiente di variazione
media
deviazione standard
coefficiente di variazione
3,5-triclorofenolo
10
153
158
103
5
4,6
92
acido 2-bromo-etano-sulfonico
10
1 058
896
85
34
26
76
Dati EC50 della prova interlaboratorio — fanghi non diluiti
11.
Gli alti coefficienti di variazione tra i laboratori riflettono principalmente le differenze di sensibilità dei microorganismi dei fanghi in quanto precedentemente esposti oppure non esposti alla sostanza in esame o ad altre sostanze chimicamente affini. La precisione nella determinazione del valore EC50 sulla base della concentrazione del fango era di poco superiore a quella del valore “volumetrico” (mg/l). Nei tre laboratori che hanno indicato la precisione del loro valore EC50 per il 3,5-diclorofenolo, i coefficienti di variazione erano nettamente inferiori (22, 9 e 18 %, rispettivamente, per il valore EC50 in mg/g) rispetto a quelli della media di tutti e dieci i laboratori. Le medie individuali dei tre laboratori erano, rispettivamente: 3,1, 3,2 e 2,8 mg/g. I coefficienti di variazione più bassi e accettabili all'interno dello stesso laboratorio, rispetto ai coefficienti molto più elevati tra i valori dei diversi laboratori (ossia 9-22 %, cf. 92 %), indicano la presenza di differenze significative nelle proprietà dei singoli fanghi.
DESCRIZIONE DEL METODO
Apparecchiature
12.
Occorre utilizzare normali apparecchiature di laboratorio e quanto indicato di seguito:
a)
incubatore — anti-scintilla e termostatato a 35 °C ± 2 °C;
b)
recipienti di prova in vetro pressoresistente di capacità nominale (15) adeguata, muniti di un setto rivestito a tenuta di gas, resistente a una pressione di circa 2 bar o 2 × 105 Pa (per il rivestimento si userà ad esempio del PTFE = politetrafluoroetilene). Si raccomanda di usare bottiglie da siero di volume nominale pari a 125 ml, con un volume effettivo di circa 160 ml, chiuse ermeticamente con setti per siero (16) e chiusure a ghiera in alluminio; è anche possibile usare bottiglie il cui volume totale va da 0,1 a 1 litro;
c)
manometro di precisione(17)e dispositivo di fissaggio degli aghi
la produzione totale di gas (metano più anidride carbonica) è misurata mediante un manometro in grado di misurare e far sfiatare il gas prodotto, ad esempio un manometro manuale di precisione collegato a un ago da siringa; una valvola a tre vie a tenuta di gas permette di sfiatare la pressione in eccesso (appendice 1). È necessario mantenere il volume interno delle tubature e della valvola del trasduttore di pressione al più basso livello possibile, in modo da contenere al massimo eventuali errori che possono essere introdotti se si trascura il volume delle apparecchiature;
d)
contenitori isolati, per il trasporto di fanghi digestori;
e)
valvole a pressione a tre vie;
f)
setaccio a maglie quadrate di 1 mm;
g)
serbatoio, per la digestione dei fanghi: un flacone di vetro o di polietilene ad alta densità, con una capacità di circa 5 litri, provvisto di un agitatore e di un dispositivo che consenta il passaggio di una corrente di azoto gassoso (cfr. paragrafo 13) attraverso lo spazio di testa;
h)
filtri a membrana (0,2 μm) per la sterilizzazione del substrato;
i)
microsiringhe, per la connessione a tenuta di gas del trasduttore di pressione (cfr. paragrafo 12 (c)) allo spazio di testa nelle bottiglie (vedere paragrafo 12 (b)); le microsiringhe servono anche ad aggiungere sostanze di prova liquide insolubili nelle bottiglie;
j)
scatola a guanti (glove box), facoltativa ma consigliata, con una leggera pressione positiva di azoto.
Reagenti
13.
Utilizzare sempre reagenti di grado analitico. Utilizzare sempre gas di azoto di elevata purezza con tenore di ossigeno inferiore a 5μl/l.
Acqua
14.
Se, in qualsiasi fase, è necessario ricorrere a diluizione, utilizzare acqua deionizzata precedentemente deaerata. Non è necessario procedere a controlli analitici su quest'acqua, ma occorre garantire che l'apparecchiatura per la deionizzazione sia sottoposta a manutenzione periodica. Utilizzare acqua deionizzata anche per la preparazione delle soluzioni madre. Verificare che le soluzioni o le diluizioni della sostanza chimica in esame siano prive di ossigeno prima di aggiungere l'inoculo anaerobico. Per procedere alla verifica, gorgogliare gas di azoto attraverso l'acqua di diluizione (o attraverso le diluizioni) per 1 ora prima di aggiungere l'inoculo, oppure, in alternativa, riscaldare l'acqua di diluizione fino al punto di ebollizione e lasciare raffreddare a temperatura ambiente in un'atmosfera priva di ossigeno.
Fanghi digeriti
15.
Raccogliere i fanghi digestori attivi prelevandoli da un digestore in un impianto di trattamento delle acque reflue, oppure da un digestore da laboratorio che tratti principalmente fanghi da liquami domestici. Altrove (11) sono disponibili informazioni pratiche sui fanghi provenienti da digestori da laboratorio. Se si intende fare uso di un inoculo adattato, occorre eventualmente prevedere di prelevare fanghi digestori da un impianto di trattamento delle acque reflue industriali. Per raccogliere i fanghi utilizzare bottiglie a collo ampio in polietilene ad alta densità o materiali analoghi, che possono espandersi. Aggiungere i fanghi alle bottiglie riempiendole fino a 1 cm dal tappo, sigillare ermeticamente, preferibilmente con una valvola di sicurezza (cfr. paragrafo 12 (e)) e riporre in contenitori isolati (paragrafo 12 (d)) per limitare quanto più possibile gli shock termici finché i fanghi vengono trasferiti in un incubatore a temperatura costante di 35 °C ± 2 °C. All'apertura delle bottiglie, fare attenzione a rilasciare il gas in eccesso aprendo con precauzione il tappo oppure utilizzando la valvola a pressione a tre vie (paragrafo 12 (e)). Se possibile utilizzare i fanghi entro poche ore dalla raccolta, oppure conservarli a 35 °C ± 2 °C sotto uno spazio di testa riempito di azoto per un massimo di tre giorni in modo da incidere limitatamente sull'attività.
Avvertenza: i fanghi digestori producono gas infiammabili che comportano rischi di incendio e di esplosione e contengono inoltre organismi potenzialmente patogeni. Si raccomanda quindi di adottare precauzioni adeguate al momento di manipolarli. Per motivi di sicurezza, non utilizzare recipienti di vetro per la raccolta dei fanghi.
Inoculo
16.
Immediatamente prima dell'uso, mescolare i fanghi tramite leggera agitazione e passarli a un setaccio con maglie di 1 mm2 (paragrafo 12 (f)) raccogliendoli in una bottiglia idonea (paragrafo 12 (g)) attraverso il cui spazio di testa viene fatta passare una corrente di azoto. Accantonare un campione per misurare la concentrazione del quantitativo totale di solidi secchi (cfr. ad esempio ISO 11 923 (13) o norme UE equivalenti). In generale, utilizzare i fanghi senza diluizione. La concentrazione dei solidi si situa solitamente tra il 2 e il 4 % (p/v). Controllare il valore del pH dei fanghi e, se necessario, correggerlo a pH 7± 0,5.
Substrato per la prova
17.
Sciogliere 10 g di brodo nutriente (es. Oxoid), 10 g di estratto di lievito e 10 g di D-glucosio in acqua deionizzata e portare a 100 ml. Sterilizzare filtrando attraverso una membrana con porosità di 0,2 μm (paragrafo 12 (h)) e usare immediatamente o conservare a 4 °C per non più di 1 giorno.
Sostanza chimica in esame
18.
Preparare una soluzione madre separata per ogni sostanza chimica idrosolubile in esame che contenga, ad esempio, 10 g/l della sostanza in acqua di diluizione priva si ossigeno (paragrafo 14). Utilizzare la quantità corretta di queste soluzioni madre per preparare le miscele di reazione in concentrazioni crescenti. In alternativa, è possibile preparare una serie di diluizioni di ogni soluzione madre in modo da aggiungere un volume identico in ciascuna bottiglia di prova per ciascuna concentrazione finale richiesta. Il pH della soluzione madre deve essere corretto a 7 ± 0,2, se necessario.
19.
Per le sostanze chimiche non sufficientemente solubili in acqua, consultare la norma ISO 10 634 (12) o la norma UE equivalente. Se è necessario utilizzare un solvente organico, evitare quelli come il cloroformio e il tetracloruro di carbonio, in quanto ne è nota la forte capacità inibitoria della produzione di metano. Preparare, in un solvente volatile adeguato, per esempio acetone o dietiletere, una soluzione a concentrazione adeguata di sostanze chimiche insolubili nell'acqua. Aggiungere il volume necessario di soluzione di solvente nelle bottiglie di prova vuote (paragrafo 12 (b)) e far evaporare il solvente prima di aggiungere i fanghi. Per altri trattamenti, ricorrere alla norma ISO 10 634 (12) o a una norma UE equivalente, tenendo però conto del fatto che i tensioattivi utilizzati per produrre emulsioni possono inibire la produzione anaerobica di gas. Se si ritiene che la presenza di solventi organici e agenti emulsionanti possa causare artefatti, la sostanza chimica può essere aggiunta direttamente alla miscela di prova sotto forma di polvere o di liquido. Le sostanze chimiche volatili e le sostanze chimiche in esame liquide e insolubili in acqua possono essere iniettate nelle bottiglie di siero inoculato utilizzando microsiringhe (paragrafo 12 (i)).
20.
Aggiungere le sostanze chimiche in esame alle bottiglie per ottenere una serie geometrica di concentrazioni, ad esempio 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l e 15,6 mg/l. Se non è possibile prevedere l'intervallo di tossicità sulla base di sostanze simili, occorre svolgere una prova preliminare per determinare l'intervallo di tossicità appropriato su concentrazioni di 1 000 mg/l, 100 mg/l e 10 mg/l.
Sostanza chimica di riferimento
21.
Preparare una soluzione acquosa di 3,5-diclorofenolo (10 g/l) aggiungendo gradualmente al solido la quantità minima di 5 mol/l di soluzione di idrossido di sodio, agitando nel contempo fino a scioglierlo. Aggiungere quindi acqua di diluizione deossigenata (paragrafo 14) al volume richiesto; la sonicazione può facilitare lo scioglimento. È possibile utilizzare altre sostanze chimiche di riferimento se l'intervallo medio del valore di EC50 è stato ottenuto in almeno tre prove con inoculi diversi (fonti diverse o tempi di raccolta diversi).
INTERFERENZA/ERRORI
22.
Alcuni componenti dei fanghi potrebbero presumibilmente reagire con potenziali inibitori rendendoli indisponibili per i microrganismi e dando luogo a un'inibizione ridotta o nulla. Inoltre, se i fanghi contengono già una sostanza chimica che esercita un effetto inibitore, si otterrebbero risultati erronei sottoponendo a prova tale sostanza chimica. Oltre a quelli appena citati, vi sono altri fattori che possono generare falsi risultati; sono elencati nell'appendice 3, insieme ai metodi per eliminare o perlomeno ridurre gli errori.
PROCEDURA SPERIMENTALE
23.
Il numero necessario di repliche dipende dal grado di precisione richiesto per gli indici di inibizione. Se i sigilli delle bottiglie sono sufficientemente a tenuta di gas per tutta la durata della prova, preparare un solo lotto (almeno tre repliche) di bottiglie di prova per ciascuna concentrazione richiesta. Analogamente, allestire un lotto di bottiglie contenenti la sostanza chimica di riferimento e una serie di controlli. Tuttavia, se i sigilli delle bottiglie sono affidabili solo se perforati una o poche volte, preparare un lotto (per, ad esempio, tre repliche) delle bottiglie di prova per ciascun intervallo (t) per il quale sono richiesti dei risultati per tutte le concentrazioni di una sostanza chimica sottoposta a prova. Analogamente, allestire dei lotti “t” di bottiglie per la sostanza chimica di riferimento e per i controlli.
24.
È raccomandato l'uso di una scatola a guanti (paragrafo 12 (j)). Almeno 30 minuti prima dell'inizio della prova avviare un flusso di gas di azoto nella scatola a guanti contenente tutte le necessarie apparecchiature. Verificare che la temperatura dei fanghi si mantenga tra 35 °C ± 2 °C quando si manipolano e sigillano le bottiglie.
Prova preliminare
25.
Se l'attività dei fanghi è sconosciuta, si raccomanda di effettuare una prova preliminare. Predisporre dei controlli che indichino, ad esempio, le concentrazioni di solidi a 10 g/l, 20 g/l e 40 g/l più il substrato, ma senza utilizzare la sostanza chimica in esame. Inoltre, utilizzare volumi diversi della miscela di reazione al fine di disporre di tre o quattro valori diversi del rapporto tra il volume dello spazio di testa e il volume del liquido. Tra i risultati dei volumi di gas prodotti a vari intervalli di tempo, si sceglieranno le condizioni più appropriate ad ottenere due misurazioni giornaliere caratterizzate da volumi significativi di gas e da un rilascio giornaliero di pressione con sensibilità ottimale (18) senza timore di esplosione.
Aggiunta delle sostanze chimiche in esame
26.
Aggiungere le sostanze chimiche idrosolubili in esame alle bottiglie di prova vuote (paragrafo 12 (b)) sotto forma di soluzioni acquose (paragrafo 18). Utilizzare lotti di bottiglie composti come minimo da triplicati di ciascuna concentrazione dell'intervallo (paragrafo 20). Nel caso di sostanze chimiche scarsamente solubili e insolubili, iniettare le loro soluzioni in solventi organici in bottiglie vuote con una microsiringa, fino a ottenere dei lotti di repliche per ognuna delle cinque concentrazioni della sostanza chimica in esame. Far evaporare il solvente facendo passare un getto di gas di azoto sulla superficie delle soluzioni nelle bottiglie di prova. In alternativa, è possibile aggiungere quantità pesate delle sostanze chimiche insolubili solide direttamente nelle bottiglie di prova.
27.
Se le sostanze chimiche in esame liquide insolubili e scarsamente solubili nell'acqua non vengono aggiunte utilizzando un solvente, è possibile introdurle direttamente tramite microsiringa nelle bottiglie dopo l'aggiunta dell'inoculo e del substrato di prova (cfr. paragrafo 30). Anche le sostanze chimiche volatili in esame possono essere aggiunte in questo modo.
Aggiunta dell'inoculo e del substrato
28.
Agitare un volume adeguato di fanghi digestori setacciati (cfr. paragrafo 16) in una bottiglia da 5 litri (paragrafo 12 (g)), facendo passare un flusso di gas di azoto nello spazio di testa. Bonificare le bottiglie di prova, contenenti le soluzioni acquose o le soluzioni in un solvente evaporato delle sostanze chimiche in esame, per circa due minuti con un flusso di gas di azoto per rimuovere l'aria. Ripartire le aliquote, ad esempio 100 ml, di fanghi ben mescolati nelle bottiglie di prova utilizzando una pipetta con puntale a foro largo o una provetta graduata. È essenziale riempire la pipetta in una volta sola con l'esatto volume di fanghi necessario, in quanto le materie solide dei fanghi sedimentano con facilità. Se il volume è eccessivo, svuotare la pipetta e ricominciare.
29.
Mentre si continua a bonificare con l'azoto, procedere ad aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di substrato (paragrafo 17) in modo da ottenere nella miscela una concentrazione di 2 g/l di ciascuna delle sostanze nutritive seguenti: brodo nutriente, estratto di lievito e D-glucosio. La tabella che segue riporta un esempio per lotti di prova.
Concentrazione finale in massa della sostanza chimica in esame nelle bottiglie di prova
(mg/l)
Volume della sostanza chimica in esame
(ml)
Reagenti e mezzi
(ml)
Soluzione madre
a)
10 g/l
par. 18
Soluzione madre
b)
1 g/l
par. 18
Acqua di diluizione
par. 14
Inoculo
par. 16
Substrato
par. 17
0
—
0
1,0
100
2
1
—
0,1
0,9
100
2
3,3
—
0,33
0,67
100
2
10
0,1
—
0,9
100
2
33
0,33
—
0,67
100
2
100
1,0
—
0
100
2
Volume totale della bottiglia = 160 ml. Volume del liquido = 103 ml.
Volume di gas = 57 ml, ovvero il 35,6 % del volume totale.
30.
Analogamente, bonificare con azoto un numero sufficiente di bottiglie di prova vuote per poter far fronte a eventuali sostanze liquide volatili o insolubili (cfr. paragrafo 27).
Controlli e sostanza chimica di riferimento
31.
Preparare lotti di bottiglie per almeno tre repliche, contenenti solo fanghi e substrato, che fungeranno da controlli. Preparare altre due bottiglie di replica contenenti fanghi e substrato addizionato di una quantità sufficiente di soluzione madre della sostanza di riferimento, 3,5 diclorofenolo (paragrafo 21), per arrivare alla concentrazione finale di 150 mg/l. Questa concentrazione dovrebbe inibire del 50 % circa la produzione di gas. È inoltre possibile preparare la sostanza di riferimento a diverse concentrazioni all'interno di un intervallo. Preparare quattro ulteriori bottiglie che serviranno per misurare il pH e che conterranno fanghi, acqua deossigenata e substrato. Aggiungere a due bottiglie la sostanza chimica in esame alla concentrazione massima per la prova e aggiungere alle rimanenti due bottiglie acqua deossigenata.
32.
Assicurarsi che tutte le bottiglie — con le sostanze chimiche in esame e di riferimento e con i controlli — contengano lo stesso volume (VR) di liquido; se necessario, aggiungere acqua deionizzata deossigenata (paragrafo 14) per aggiustare il volume. Lo spazio di testa deve risultare tra il 10 % e il 40 % del volume della bottiglia; il valore effettivo va selezionato a partire dai dati ottenuti in base alla prova preliminare. Dopo l'aggiunta di tutti i componenti alle bottiglie, rimuovere l'ago che fornisce il gas e sigillare ciascuna bottiglia con un tappo di gomma e un cappuccio di alluminio (paragrafo 12 (b)) inumidendo il tappo con una goccia d'acqua deionizzata per favorire l'inserimento. Agitare per mescolare il contenuto di ciascuna bottiglia.
Incubazione delle bottiglie
33.
Trasferire le bottiglie in un incubatore termostatato, preferibilmente dotato di un agitatore, e mantenuto a 35 °C ± 2 °C. Le bottiglie sono incubate al buio. Dopo circa 1 ora, equilibrare la pressione nelle bottiglie con la pressione atmosferica inserendo l'ago della siringa, collegato al manometro (paragrafo 12 (c)), attraverso il sigillo delle bottiglie, una alla volta, aprire la valvola fino a quando il manometro indica zero e infine chiuderla. L'ago va inserito con un angolo di circa 45° per evitare fughe di gas dalle bottiglie. Se le bottiglie incubate sono prive di agitatore, agitarle manualmente due volte al giorno durante l'intero periodo di incubazione per equilibrare il sistema. Incubare le bottiglie in posizione capovolta per evitare qualsiasi perdita di gas dal setto. Non è tuttavia consigliato invertire le bottiglie nei casi in cui le sostanze chimiche insolubili in esame possono aderire al fondo.
Misurazione della pressione
34.
Quando le bottiglie hanno raggiunto i 35 °C ± 2 °C, misurare e registrare il pH del contenuto di due delle quattro bottiglie allestite all'uopo, ed eliminarlo; continuare ad incubare al buio le bottiglie rimanenti. Misurare e registrare la pressione nelle bottiglie due volte al giorno nell'arco delle successive 48-72 ore, inserendo l'ago del manometro nel sigillo delle bottiglie, una alla volta, asciugando l'ago tra le misurazioni. Nel corso della misurazione, da svolgere il più velocemente possibile, tutte le parti della bottiglia vanno mantenute alla temperatura di incubazione. Leggere e registrare la pressione una volta stabilizzata. Successivamente, aprire la valvola di ventilazione e chiuderla quando la pressione è pari a zero. La prova dura, in genere, 48 ore a partire dal momento in cui la pressione è stata equilibrata per la prima volta, designato come “momento 0”. Per le sostanze chimiche volatili si procede a una sola lettura e ventilazione (alla fine dell'incubazione) o al massimo a due, per minimizzare la perdita di sostanza chimica in esame (10).
35.
Se la lettura della pressione dà un risultato negativo, non aprire la valvola. Talvolta nell'ago e nel corpo della siringa si accumula dell'umidità, che si traduce in un valore della pressione leggermente negativo. In questo caso, rimuovere l'ago, agitare il tubo, asciugare con un fazzoletto di carta e fissare un nuovo ago.
Misurazione del pH
36.
Misurare e registrare il pH del contenuto di ciascuna bottiglia dopo la misurazione della pressione finale.
DATI E RELAZIONE
Espressione dei risultati
37.
Calcolare la somma e la media delle pressioni rilevate in ciascun intervallo di tempo per ogni serie di repliche e calcolare la pressione media cumulata lorda del gas ad ogni intervallo di tempo per ogni serie di repliche. Tracciare le curve della produzione media cumulata di gas (Pa) in base al tempo, per le bottiglie di controllo, di prova e di riferimento. Selezionare un intervallo di tempo sulla parte lineare della curva, generalmente 48 ore, e calcolare la percentuale di inibizione (I) di ciascuna concentrazione, in base all'equazione [1]:
I = (1 – Pt/PC) × 100
[1],
dove
I
=
percentuale di inibizione, in %;
Pt
=
pressione gassosa prodotta con il materiale di prova in un tempo determinato, in Pascal (Pa);
Pc
=
pressione gassosa prodotta nel controllo nello stesso intervallo di tempo, in Pascal (Pa).
Sarebbe opportuno tracciare entrambe le curve, la curva I in base alla concentrazione, e una seconda curva in base al logaritmo della concentrazione, in modo da poter scegliere la curva più vicina alla linearità. Valutare il valore di EC50 (mg/l) visivamente o tramite analisi di regressione a partire dalla curva più vicina alla linearità. A fini comparativi può essere più utile esprimere la concentrazione della sostanza chimica in mg di sostanza chimica/g di solidi secchi totali. Al fine di ottenere questa concentrazione, è sufficiente dividere la concentrazione volumetrica (mg/l) per la concentrazione volumetrica dei solidi secchi nei fanghi (g/l) (paragrafo 16).
38.
Calcolare la percentuale di inibizione ottenuta dall'unica concentrazione della sostanza chimica di riferimento utilizzata, oppure il valore EC50 se è stato esaminato un numero sufficiente di concentrazioni.
39.
Convertire il valore della pressione media del gas prodotto nella bottiglia di controllo Pc (Pa) in volume facendo riferimento alla curva di taratura del manometro (appendice 2), calcolando da qui il rendimento del gas, espresso in termini di volume prodotto in 48 ore da 100 ml di fanghi non diluiti con una concentrazione di solidi dal 2 % (20 g/l) al 4 % (40 g/l).
Criteri di validità
40.
I risultati della prova interlaboratorio ISO (5) dimostrano che la sostanza chimica di riferimento (3,5-diclorofenolo) causa un'inibizione del 50 % della produzione di gas in un intervallo di concentrazioni che va da 32 mg/l a 510 mg/l, con una media di 153 mg/l (paragrafo 10). L'intervallo è così ampio che impedisce di fissare limiti precisi per l'inibizione utilizzabili come criteri di validità, che saranno disponibili solo quando saranno messe a punto tecniche di produzione di inoculo meno variabili. I volumi di gas prodotti nelle bottiglie di controllo nelle 48 ore variavano da 21 ml/g a 149 ml/g di materia secca dei fanghi (media 72 ml/g). Non è stato possibile stabilire alcuna relazione evidente tra il volume del gas prodotto e il corrispondente valore di EC50. Il pH finale era compreso tra 6,1 e 7,5.
41.
La prova è considerata valida se si ottiene un'inibizione superiore al 20 % nel controllo di riferimento contenente 150 mg/l di 3,5-diclorofenolo, se nel controllo in bianco vengono prodotti più di 50 ml di gas per g di sostanza secca e se il valore del pH è compreso nell'intervallo tra 6,2 e 7,5 alla fine della prova.
Relazione sulla prova
42.
La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni riportate di seguito.
Sostanza chimica in esame
—
nome comune, nome chimico, numero CAS, formula strutturale e proprietà fisico-chimiche pertinenti;
—
purezza (presenza di impurità) della sostanza in esame.
Condizioni sperimentali
—
volume del contenuto liquido e dello spazio di testa nei recipienti di prova;
—
descrizione dei recipienti di prova e della misurazione del gas (ad esempio, tipo di manometro);
—
applicazione della sostanza chimica in esame e della sostanza chimica di riferimento nel sistema sperimentale, concentrazioni di prova utilizzate e uso di eventuali solventi;
—
dettagli sull'inoculo utilizzato: nome dell'impianto di trattamento dei liquami, descrizione della fonte di acque reflue trattate (es. temperatura di funzionamento, tempo di ritenzione dei fanghi, origine principalmente domestica o liquami industriali ecc.), concentrazione dei solidi, attività di produzione di gas dei digestori anaerobici, precedente esposizione o possibile preadattamento a sostanze chimiche tossiche oppure sito di raccolta di fanghiglia, sedimenti ecc.;
—
temperature di incubazione e loro intervallo;
—
numero di repliche.
Risultati
—
valori del pH al termine della prova;
—
tutti i valori misurati nei recipienti di prova, nei bianchi e nei controlli contenti la sostanza di riferimento, come opportuno (cioè in Pa o millibar) sotto forma di tabella;
—
percentuale di inibizione nelle bottiglie di prova e di riferimento, e curve inibizione-concentrazione;
—
calcolo dei valori EC50, espressi in mg/l e mg/g;
—
produzione di gas per g di fanghi in 48 ore;
—
giustificazione in caso dell'eventuale rigetto dei risultati della prova;
—
discussione dei risultati, comprese le eventuali deviazioni dalle procedure descritte nel presente metodo di prova e discussione di eventuali deviazioni nei risultati della prova rispetto a quelli attesi dovute a interferenze ed errori;
—
spiegazioni che chiariscano se l'obiettivo della prova era la misurazione della tossicità di microrganismi precedentemente esposti oppure non esposti.
BIBLIOGRAFIA
(1)
Capitolo C.11 del presente allegato: Fanghi attivi — saggio di inibizione della respirazione.
(2)
Capitolo C.43 del presente allegato: Biodegradabilità anaerobica delle sostanze organiche nei fanghi digeriti — misurazione della produzione di gas.
(3)
International Organisation for Standardisation (2003) ISO 13 641-1 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 1: General Test.
(4)
International Organisation for Standardisation (2003) ISO 13 641-2 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 2: Test for low biomass concentrations.
(5)
ISO (2000) Ring test of ISO 13 641-1 and ISO 13 641-2. Determination of inhibition of activity of anaerobic bacteria. BL 6958/A. Evans MR, Painter HA. Brixham Environmental Laboratory, AstraZeneca UK Ltd., Brixham, TQ5 8BA UK.
(6)
Swanwick JD, Foulkes M (1971). Inhibition of anaerobic digestion of sewage sludge by chlorinated hydrocarbons. Wat. Pollut. Control, 70, 58-70.
(7)
HMSO (1986) Determination of the inhibitory effects of chemicals and waste waters on the anaerobic digestion of sewage sludge. ISBN 0 117519 43 X, In: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials UK.
(8)
Shelton DR, Tiedje JM (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Env. Microbiol. 47 850-857.
(9)
Battersby NS and Wilson V (1988). Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic compounds under methanogenic conditions. Chemosphere 17, 2441-2460.
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Wilson V, Painter HA and Battersby NS (1992). A screening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from sewage sludge. Proc. Int. Symp. on Ecotoxicology. Ecotoxicological Relevance of Test Methods, GSF Forschungzentrum, Neuherberg, Germany (1990). Eds. Steinberg C and Kettrup A, pp117-132 (1992).
(11)
Kawahara K, Yakabe Y, Chida T, and Kida K (1999). Evaluation of laboratory-made sludge for an anaerobic biodegradability test and its use for assessment of 13 chemicals. Chemosphere, 39 (12), 2007-2018.
(12)
International Organization for Standardization (1995) ISO 10 634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
(13)
International Organization for Standardization (1997) ISO 11 923 Water Quality — Determination of suspended solids by filtration through glass-fibre filters.
Appendice 1
Esempio di apparecchio per misurare la produzione di biogas tramite pressione gassosa
Legenda:
1
—
Manometro
2
—
Valvola a tre vie a tenuta di gas
3
—
Ago per siringa
4
—
Sigillo a tenuta stagna contro la fuoriuscita di gas (tappo a vite e setto)
5
—
Spazio di testa
6
—
Inoculo di fanghi digeriti
Recipienti di prova in ambiente a 35 °C ± 2 °C
Appendice 2
Conversione del manometro
Le pressioni lette sul manometro possono essere rapportate a volumi gassosi grazie a una curva di riferimento a partire dalla quale è possibile calcolare il volume di gas prodotto per grammo di fanghi secchi in 48 ore. Questo indice di attività è uno dei criteri utilizzati per valutare la validità dei risultati delle prove. La curva di taratura è prodotta iniettando determinati valori di gas a 35 °C ± 2 °C nelle bottiglie da siero contenenti un volume di acqua pari a quello della miscela di reazione, VR;
—
versare delle aliquote VR ml di acqua, mantenuta a 35 °C ± 2 °C in cinque bottiglie da siero. Sigillare le bottiglie e posarle in un bagnomaria a 35 °C ± 2 °C per un'ora per equilibrarle;
—
accendere il manometro, attendere finché si sia stabilizzato, e regolare su zero;
—
inserire l'ago della siringa attraverso il sigillo di una delle bottiglie, aprire la valvola fino a che il manometro dia zero e chiudere la valvola;
—
ripetere questa procedura con le bottiglie restanti;
—
iniettare 1 ml di aria a 35 °C ± 2 °C in ciascuna bottiglia. Inserire l'ago (del manometro) attraverso il sigillo di una delle bottiglie e lasciar stabilizzare la lettura della pressione. Registrare la pressione, aprire la valvola fino a quando la pressione è pari a zero e poi richiuderla;
—
ripetere questa procedura con le bottiglie restanti;
—
ripetere l'intera procedura utilizzando 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml e 50 ml di aria;
—
tracciare una curva di conversione della pressione (Pa) in base al volume di gas iniettato (ml). La risposta dello strumento è lineare nell'intervallo da 0 Pa a 70 000 Pa, e da 0 ml a 50 ml di produzione di gas.
Appendice 3
Identificazione dei fattori all'origine di risultati erronei
a) Qualità dei tappi per le bottiglie
In commercio sono disponibili diversi tipi di setti per le bottiglie di siero; molti di essi, inclusi quelli in gomma di butile, non sono più stagni se perforati da un ago come richiesto dal protocollo della prova. A volte la pressione scende molto lentamente una volta che il setto è stato perforato con l'ago della siringa. È raccomandato l'uso di setti a tenuta di gas per evitare perdite (paragrafo 12 (b)).
b) Umidità nell'ago della siringa
Talvolta nell'ago della siringa si accumula dell'umidità, che si traduce in un valore della pressione leggermente negativo. In questo caso, rimuovere l'ago, agitare il corpo della siringa, asciugare con un fazzoletto di carta e fissare un nuovo ago (paragrafi 12 (c) e 35).
c) Contaminazione da ossigeno
I metodi anaerobici sono soggetti a errore derivante da contaminazioni da ossigeno, che può portare a una riduzione della produzione di gas. In questo metodo tale eventualità va ridotta al minimo attraverso l'utilizzo di tecniche rigorosamente anaerobiche, compreso l'uso di una scatola a guanti.
d) Substrato grossolano nei fanghi
La produzione di gas anaerobica e la sensibilità del fango sono influenzate dai substrati trasferiti con l'inoculo nelle bottiglie. I fanghi digeriti provenienti dai digestori domestici anaerobici spesso contengono ancora delle materie riconoscibili, quali peli e residui vegetali della cellulosa, che complicano il prelievo di campioni rappresentativi. Le materie insolubili grossolane possono essere eliminate utilizzando un setaccio, facilitando in tal modo il prelievo di campioni rappresentativi (paragrafo 16).
e) Sostanze chimiche volatili in esame
Le sostanze chimiche volatili vengono liberate nello spazio di testa delle bottiglie. Ciò può comportare la perdita di una parte del materiale di prova dal sistema durante lo sfiato che segue alla misurazione della pressione, portando ad ottenere valori di EC50 erroneamente elevati. È possibile limitare questo tipo di errore scegliendo un rapporto corretto tra volume dello spazio di testa e volume liquido ed evitando di procedere allo sfiato dopo aver misurato la pressione (10).
f) Non linearità della produzione di gas
Se la curva della produzione cumulata media di gas rispetto al tempo di incubazione non è approssimativamente lineare sulle 48 ore, l'esattezza della prova può diminuire. Per ovviare a questo problema, è consigliabile utilizzare fanghi digestori provenienti da una fonte diversa e/o aggiungere una concentrazione più alta di substrato di prova, di brodo nutriente, di estratto di lievito e di glucosio (paragrafo 29).
Appendice 4
Applicazione a campioni ambientali a bassa concentrazione di biomassa — fanghiglie anaerobiche, sedimenti ecc.
INTRODUZIONE
A.1 In generale, le attività microbiche specifiche (volume di gas prodotto per g di solidi secchi) delle fanghiglie anaerobiche, dei sedimenti, dei suoli e di quant'altro presente in natura sono di gran lunga inferiori a quelle dei fanghi anaerobici derivanti da acque reflue. Per questo motivo è necessario modificare alcune delle condizioni sperimentali quando devono essere misurati gli effetti inibitori delle sostanze chimiche su questi campioni meno attivi. Per i campioni meno attivi, è possibile procedere in due modi:
a)
eseguire una prova preliminare modificata (paragrafo 25) con un campione non diluito di fanghiglia, suolo ecc. a 35 °C ± 2 °C o alla temperatura del luogo di raccolta del campione, per ottimizzare la simulazione (come nella parte 1 della norma ISO 13 641);
b)
eseguire una prova con un digestore diluito (1:100) per simulare l'attività ridotta che ci si attende dal campione ambientale, pur mantenendo la temperatura a 35 °C ± 2 °C (come nella parte 2 della norma ISO 13 641).
A.2 L'opzione a) può essere adottata seguendo il metodo qui descritto (equivalente alla parte 1 della norma ISO 13 641), ma è essenziale allestire una prova preliminare (paragrafo 25) per stabilire le condizioni ottimali, a meno che queste ultime non siano già note grazie a prove precedentemente eseguite. La fanghiglia o il campione di sedimento devono essere accuratamente mescolati, ad esempio in un miscelatore, e, se necessario, diluiti con una piccola quantità di acqua di diluizione deaerata (paragrafo 14) in modo da essere sufficientemente mobili per poter essere trasferiti con una pipetta con puntale a foro largo o una provetta graduata. Se si ritiene che gli elementi nutritivi siano insufficienti, il campione di fanghiglia può essere centrifugato (in condizioni anaerobiche) e risospeso nel mezzo minerale contenente estratto di lievito (A. 11).
A.3 L'opzione b) riproduce ragionevolmente l'attività ridotta dei campioni ambientali, ma senza l'alta concentrazione di solidi sospesi che caratterizza invece questo tipo di campioni. Il ruolo ricoperto da questi solidi per l'inibizione non è noto, ma è possibile che la reazione tra le sostanze chimiche in esame e i componenti della fanghiglia, nonché l'adsorbimento delle sostanze in esame sui solidi, comportino un abbassamento della tossicità della sostanza chimica in esame.
A.4 La temperatura è un altro fattore importante: una simulazione rigorosa impone di eseguire le prove alla stessa temperatura dei siti di campionatura, in quanto è noto che gruppi diversi di consorzi di batteri producenti metano operano a intervalli di temperature diverse, segnatamente i gruppi termofili (~30-35 °C), mesofili (20-25 °C) e psicrofili (< 20 °C), i cui modelli di inibizione possono differire.
A.5 Durata: nella prova generale, parte 1, su fanghi non diluiti, la produzione di gas nell'arco di 2-4 giorni era sempre sufficiente, mentre nella parte 2, su fanghi diluiti 1:100, la produzione nello stesso arco di tempo era insufficiente o assente, secondo la prova interlaboratorio. Nel descrivere quest'ultima prova Madsen et al (1996), affermano che sia necessaria una durata di almeno 7 giorni.
Prova con una bassa concentrazione di biomassa (opzione b)
Occorre apportare le modifiche e i cambiamenti seguenti, in aggiunta o in sostituzione di alcuni paragrafi e sottoparagrafi del testo principale.
A.6 In aggiunta al paragrafo 6: Principio della prova
“Questa tecnica può essere utilizzata con fanghi aerobici diluiti 1:100, per simulare in parte la debole attività della fanghiglia e dei sedimenti. La temperatura di incubazione può essere di 35 °C o equivalente a quella del sito in cui il campione è stato prelevato. Poiché l'attività batterica è molto inferiore rispetto a quella nei fanghi non diluiti, il periodo di incubazione va esteso ad almeno 7 giorni.”
A.7 In aggiunta al paragrafo 12 (a):
“l'incubatore deve poter continuare ad operare scendendo fino a temperature di 15 °C.”
A.8 Aggiungere un ulteriore reagente dopo il paragrafo 13:
“Acido fosforico (H3PO4), 85 % in massa nell'acqua.”
A.9 Aggiungere alla fine del paragrafo 16:
“Utilizzare una concentrazione finale di 0,20 ± 0,05 g/l di solidi secchi totali nella prova.”
A.10 Paragrafo 17. Substrato per la prova
Il substrato non deve essere utilizzato, ma è sostituito da estratto di lievito (cfr. paragrafi 17; A.11, A.12, A.13).
A.11 I fanghi anaerobici devono essere diluiti con mezzo minerale, contenente oligoelementi, e per comodità a tale mezzo viene aggiunto del substrato organico, ossia estratto di lievito.
In aggiunta al paragrafo 17:
“(a)
Mezzo minerale di prova, contenente estratto di lievito.
Viene preparato a partire da un mezzo di prova concentrato 10 volte (paragrafo 17 (b); A. 12) con una soluzione di oligoelementi (paragrafo 17, (c); A.13). Utilizzare solfuro di sodio nonaidrato preparato al momento (paragrafo 17 (b); A.12) o lavato e seccato prima dell'uso al fine di assicurarsi che possieda sufficienti capacità riduttive. Se la prova è condotta senza utilizzare una scatola a guanti (paragrafo 12 (j)), la concentrazione di solfuro di sodio nella soluzione madre deve essere aumentata fino a 2 g/l (da 1 g/l). Il solfuro di sodio può essere aggiunto a partire da una soluzione madre appropriata attraverso il setto delle bottiglie di prova chiuse, in quanto tale procedura riduce il rischio di ossidazione, per ottenere una concentrazione finale di 0,2 g/l. In alternativa, è possibile utilizzare citrato di titanio (III) (paragrafo 17 (b)), che va aggiunto attraverso il setto delle bottiglie di prova chiuse, fino a ottenere una concentrazione da 0,8 mmol/l a 1,0 mmol/l. Il citrato di titanio (III) è un agente riduttore molto efficace e poco tossico, che si può preparare così: sciogliere 2,94 g di citrato trisodico biidrato in 50 ml di acqua di diluizione priva di ossigeno (paragrafo 14) fino a ottenere una soluzione di 200 mmol/l; aggiungere 5 ml di una soluzione di cloruro di titanio (III) (15 g/100 ml di acqua di diluizione). Neutralizzare a pH 7 ± 0,5 con carbonato di sodio e versare in un'opportuna bottiglia da siero esponendo la soluzione a un flusso di gas di azoto. La concentrazione di citrato di titanio (III) in questa soluzione madre è di 164 mmol/l. Il mezzo di prova va utilizzato immediatamente o conservato a 4 °C per una giornata al massimo.
A.12
(b)
mezzo di prova concentrato dieci volte, preparato con i seguenti componenti:
diidrogenofosfato di potassio anidro (KH2PO4)
2,7 g
idrogenofosfato di sodio (Na2HPO4)
4,4 g
(o 11,2 g di dodecaidrato)
cloruro di ammonio (NH4Cl)
5,3 g
cloruro di calcio diidrato (CaCl2·2H2O)
0,75 g
cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2·6H2O)
1,0 g
cloruro ferroso (II) tetraidrato (FeCl2·4H2O)
0,2 g
resazurina (indicatore di ossidoriduzione)
0,01 g
sodio solfuro nonaidrato (Na2S·9H2O)
1,0 g
(o citrato di titanio (III)) concentrazione finale
da 0,8 mmol/l a 1,0 mmol/l
soluzione di oligoelementi (cfr· paragrafo 17 (c); A· 13)
10,0 ml
estratto di lievito
100 g
sciogliere in acqua di diluizione (paragrafo 14) e portare a:
1 000 ml
A.13
c)
Soluzione di oligoelementi, preparata con i seguenti componenti:
cloruro di manganese (II) tetraidrato (MnCl2 · 4H2O)
0,5 g
acido ortoborico (H3BO3)
0,05 g
cloruro di zinco (ZnCl2)
0,05 g
cloruro di rame (II) (CuCl2)
0,03 g
molibdato di disodio diidrato (Na2MoO4 · 2H2O)
0,01 g
cloruro di cobalto (II) esaidrato (CoCl2 · 6H2O)
1,0 g
cloruro di nichel (II) esaidrato (NiCl2 · 6H2O)
0,1 g
selenito di sodio (Na2SeO3)
0,05 g
sciogliere in acqua di diluizione (paragrafo 14) e portare a:
1 000 ml”
A.14 Paragrafo 25: Prova preliminare
È essenziale svolgere una prova preliminare come descritto al paragrafo 24, ma utilizzando invece concentrazioni di materie solide dei fanghi pari a un centesimo di quelle indicate, vale a dire 0,1g/l, 0,2g/l e 0,4g/l. Il periodo di incubazione deve essere di almeno 7 giorni.
Nota: nella prova interlaboratorio (5) il volume dello spazio di testa era troppo elevato, rappresentando il 75 % del volume totale; deve invece collocarsi nell'intervallo raccomandato, cioè dal 10 % al 40 %. Il criterio fondamentale da soddisfare riguarda l'ottenimento di un volume di gas prodotto che sia misurabile con una precisione accettabile (ad esempio, da ± 5 % a ± 10 %) per un'inibizione pari a circa l'80 %.
A.15 Paragrafi da 26 a 30: Aggiunta della sostanza chimica in esame, dell'inoculo e del substrato.
Le aggiunte sono effettuate nel modo descritto nei paragrafi che precedono, ma la soluzione di substrato (paragrafo 17) è sostituita da mezzo di prova più substrato di estratto di lievito (A.11).
Inoltre, la concentrazione finale di solidi secchi nei fanghi è ridotta da 2 g/l — 4 g/l a 0,2 ± 0,05 g/l (A.9). Due esempi di aggiunta di componenti alla miscela di prova sono riportati nella tabella A.1, che sostituisce la tabella di cui al paragrafo 29.
A.16 Paragrafo 33: Incubazione delle bottiglie
In previsione del calo della produzione di gas, l'incubazione si svolge per almeno 7 giorni.
A.17 Paragrafo 34: Misurazioni della pressione
La stessa procedura usata per misurare la pressione nello spazio di testa delle bottiglie viene utilizzata come indicato al paragrafo 34, qualora sia necessario analizzare le quantità nella fase gassosa. Se è necessario misurare le quantità totali di CO2 e di CH4, il pH della fase liquida è ridotto a circa pH 2 con l'iniezione H3PO4 in ogni bottiglia coinvolta e la pressione viene misurata dopo un'agitazione di 30 minuti alla temperatura della prova. Tuttavia, la misurazione della pressione in ciascuna bottiglia prima e dopo l'acidificazione fornisce maggiori informazioni sulla qualità dell'inoculo. Ad esempio, se la CO2 viene prodotta molto più rapidamente rispetto al metano, la sensibilità dei batteri fermentatori può essere modificata e/o la sostanza chimica in esame incide più facilmente sui batteri metanogeni.
A.18 Paragrafo 36: misurazione del pH
Se è necessario usare H3PO4, occorre preparare alcune bottiglie supplementari senza aggiunta di H3PO4, in particolare per la misurazione del pH.
RIFERIMENTO:
Madsen, T, Rasmussen, HB; and Nilsson, L (1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. Project No. 336, Water Quality Institute, Danish Environment Protection Agency, Copenhagen.
Tabella A.1.
Esempi della configurazione di prova per lotti sottoposti a esame
Componenti della miscela di reazione
Esempio 1
Esempio 2
Ordine normale di aggiunta
Concentrazione di inoculo preparato (g/l)
0,42
2,1
—
Volume dell'inoculo aggiunto (ml)
45
9
4
Concentrazione dell'inoculo nelle bottiglie di prova (g/l)
0,20
0,20
—
Volume del mezzo di prova aggiunto (ml)
9
9
2
Volume dell'acqua di diluzione aggiunta (ml)
36
72
3
Concentrazione dell'estratto di lievito nelle bottiglie di prova (g/l)
9,7
9,7
—
Volume della soluzione madre della sostanza chimica in esame (ml)
3
3
1
Volume di liquido totale (ml)
93
93
—
Appendice 5
Definizioni
Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni:
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova.
C.35 PROVA DI TOSSICITÀ SU LUMBRICULUS IN ACQUA-SEDIMENTO CON SEDIMENTO ADDIZIONATO
INTRODUZIONE
1.
Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 225 (2007). Gli animali endobentici che ingeriscono sedimento sono soggetti a un rischio potenzialmente elevato di esposizione a sostanze chimiche presenti nello stesso sedimento e richiedono pertanto particolare attenzione, ad es. (1), (2), (3). Tra gli organismi di questo tipo gli oligocheti acquatici svolgono un ruolo importante nel sedimento dei sistemi acquatici. Mediante la bioturbazione del sedimento e come animali da preda, essi possono influenzare fortemente la biodisponibilità delle sostanze chimiche in oggetto per altri organismi, ad esempio i pesci che si cibano di benthos. Contrariamente agli organismi epibentici, gli oligocheti acquatici endobentici (ad esempio il Lumbriculus variegatus) si infossano nel sedimento e ingeriscono particelle di sedimento al di sotto della sua superficie. Ciò garantisce l'esposizione degli organismi sperimentali alla sostanza chimica in esame per tutte le vie di assorbimento possibili (ad esempio attraverso il contatto con particelle di sedimento contaminate e la loro ingestione, ma anche per mezzo dell'acqua interstiziale e sovrastante).
2.
Questo metodo di prova è inteso a valutare gli effetti di un'esposizione prolungata dell'oligochete endobentico Lumbriculus variegatus (Müller) a sostanze chimiche associate al sedimento. Il metodo di prova si basa sugli attuali protocolli di prova sul bioaccumulo e sulla tossicità del sedimento, ad esempio (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10). Il metodo è descritto per condizioni di prova statiche. Questo metodo prevede che l'esposizione alla sostanza chimica in esame avvenga a mezzo di sedimento addizionato con la sostanza chimica in esame. Il sedimento addizionato è usato per simulare una contaminazione del sedimento con la sostanza chimica in esame.
3.
In genere le sostanze chimiche da saggiare su organismi che vivono nel sedimento persistono a lungo in questo comparto. L'esposizione di questi organismi può avvenire per diverse vie. L'importanza relativa di ogni via di esposizione e il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all'effetto tossico globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame e dalla sua destinazione finale nell'animale. Per le sostanze chimiche fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) oppure per le sostanze chimiche che si legano in modo covalente al sedimento, l'ingestione di alimenti contaminati può costituire una via di esposizione importante. Per non sottovalutare la tossicità delle sostanze chimiche in oggetto, l'alimento necessario per la riproduzione e la crescita degli organismi sperimentali è aggiunto al sedimento prima di applicare la sostanza chimica in esame (11). Il metodo di prova descritto è sufficientemente dettagliato da permettere, durante lo svolgimento della prova, adeguamenti al disegno sperimentale in funzione di particolari condizioni di laboratorio e delle varie caratteristiche delle sostanze in esame.
4.
Il metodo di prova mira a determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla riproduzione e la biomassa degli organismi sperimentali. I parametri biologici misurati sono il numero totale di vermi sopravvissuti e la biomassa (peso secco) alla fine dell'esposizione. I dati sono analizzati tramite un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe un effetto dell'x % ((ad es. EC50, EC25 ed EC10), oppure mediante verifica di un'ipotesi statistica per determinare la concentrazione senza effetti osservabili (No Observed Effect Concentration — NOEC) e la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (Lowest Observed Effect Concentration — LOEC).
5.
Il capitolo C. 27 del presente allegato, intitolato “Prova di tossicità su chironomide in acqua-sedimento con sedimento addizionato” (6) ha fornito numerosi dettagli essenziali e utili sulle prestazioni del metodo di prova sulla tossicità del sedimento presentato. Pertanto, questo documento è servito da base per apportare le modifiche necessarie per lo svolgimento delle prove di tossicità nel sedimento sul Lumbriculus variegatus. Tra gli ulteriori documenti di riferimento figurano, ad esempio, il manuale dell'ASTM “ASTM Standard Guide for Determination of the Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants by Benthic Invertebrates (3)”, gli “U.S. EPA Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates” (7) e la “ASTM Standard Guide for Collection, Storage, Characterization, and Manipulation of Sediments for Toxicological Testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates” (12). Inoltre per la redazione del presente documento le principali fonti di riferimento sono stati i dati empirici ottenuti nel corso di prove interlaboratorio (13) (relazione sulle prove interlaboratorio) e le informazioni dettagliate tratte dalla letteratura scientifica.
PREREQUISITI E ORIENTAMENTI
6.
Le informazioni sulla sostanza chimica in esame come le precauzioni, le condizioni di conservazione adeguate e i metodi di analisi vanno ottenute prima dell'inizio dello studio. Gli orientamenti relativi alle prove delle sostanze chimiche con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa l'esecuzione delle prove sono contenuti in (14).
7.
Prima di procedere a una prova, devono essere note le seguenti informazioni sulla sostanza chimica in esame:
—
nome comune, nome chimico (di preferenza nome IUPAC), formula strutturale, numero CAS, purezza;
—
tensione di vapore;
—
idrosolubilità;
8.
Le seguenti informazioni supplementari sono ritenute utili prima dell'inizio della prova:
—
coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua Kow;
—
coefficiente di ripartizione carbone organico/acqua, espresso come Koc;
—
idrolisi;
—
fototrasformazione in acqua;
—
biodegradabilità;
—
tensione superficiale.
9.
Le informazioni su alcune caratteristiche del sedimento da utilizzare vanno acquisite prima dell'inizio della prova (7). Per maggiori dettagli, cfr. i paragrafi da 22 a 25.
PRINCIPIO DELLA PROVA
10.
I vermi che presentano uno stato fisiologico simile (sincronizzati come descritto nell'appendice 5) sono esposti a una serie di concentrazioni di sostanze tossiche applicate nella fase di sedimentazione di un sistema sedimento-acqua. Il sedimento artificiale e l'acqua ricostituita vanno utilizzati come mezzi. Dei recipienti di prova senza l'aggiunta della sostanza chimica di prova fungono da controllo. La sostanza chimica in esame è addizionata al sedimento per ciascun livello di concentrazione al fine di ridurre al minimo la variabilità tra le repliche di ciascun livello di concentrazione. Gli organismi sperimentali sono successivamente introdotti nei recipienti di prova in cui sono state equilibrate le concentrazioni sedimento-acqua (cfr. paragrafo 29). Gli animali sperimentali vengono esposti ai sistemi sedimento-acqua per un periodo di 28 giorni. In considerazione del basso contenuto nutritivo del sedimento artificiale, il sedimento va arricchito con una fonte alimentare (cfr. i paragrafi 22 e 23 e l'appendice 4) per garantire che i vermi possano crescere e riprodursi in condizioni controllate. In questo modo si assicura inoltre che l'esposizione degli animali sperimentali avvenga sia attraverso l'acqua, sia attraverso l'alimentazione.
11.
L'endpoint preferenziale di questo tipo di studio è ECx (ad es. EC50, EC25, and EC10; concentrazione con un effetto sull'x % degli organismi sperimentali) per la riproduzione e la biomassa, rispettivamente, rispetto al controllo. Va tuttavia notato che, considerata l'elevata incertezza di ECx a basso valore (ad es. EC10, EC25) con limiti di confidenza estremamente elevati del 95 % (ad es. (15)) e il potere statistico calcolato nel corso delle verifiche dell'ipotesi, EC50 è ritenuto l'endpoint più affidabile. Inoltre, la NOEC e la LOEC possono essere calcolate per la biomassa e la riproduzione se il disegno sperimentale e i dati confermano tali calcoli (cfr. paragrafi da 34 a 38). La finalità dello studio — calcolo della EC x o della NOEC — determinerà il disegno sperimentale.
PROVE DI RIFERIMENTO
12.
Si prevede che per dimostrare la capacità di esecuzione della prova di un laboratorio siano sufficienti le prestazioni degli organismi di controllo e, in caso di disponibilità di dati storici, la ripetibilità della prova. Inoltre, a intervalli regolari possono essere eseguite prove di tossicità di riferimento utilizzando un tossico di riferimento per valutare la sensibilità degli organismi sperimentali. Le prove di tossicità di riferimento in acqua a 96 h dovrebbero essere sufficienti per dimostrare la sensibilità e la condizione degli animali sperimentali (4) (7). Le informazioni sulla tossicità del pentaclorofenolo (PCP) in prove complete (esposizione al sedimento addizionato per 28 giorni) figurano nell'appendice 6 e nella relazione sulla prova interlaboratorio del metodo di prova (13). La tossicità acuta del PCP in presenza di sola acqua è descritta, ad esempio, in (16). Queste informazioni possono essere usate per il confronto della sensibilità dell'organismo sperimentale nelle prove di riferimento in cui il PCP è usato come tossico di riferimento. Il cloruro di potassio (KC1) o il solfato di rame ((CuSO4) sono stati raccomandati come tossici di riferimento per il L. variegatus (4)(7). Ad oggi, la determinazione dei criteri di qualità basati sui dati di tossicità per KCl è difficile a causa della mancanza di dati desunti dalla letteratura sul L. variegatus. Le informazioni sulla tossicità del rame sul L. variegatus sono riportate nei riferimenti da (17) a (21).
VALIDITÀ DELLA PROVA
13.
Affinché una prova sia valida occorre che siano soddisfatti i seguenti criteri:
—
una prova interlaboratorio (13) ha dimostrato che, per il Lumbriculus variegatus, il numero medio di esemplari in vita per replica nei controlli alla fine dell'esposizione deve essere aumentato di un fattore di almeno 1,8 rispetto al numero di esemplari per replica all'inizio dell'esposizione;
—
il pH dell'acqua sovrastante deve essere compreso tra 6 e 9 per tutta la durata della prova;
—
la concentrazione dell'ossigeno nell'acqua sovrastante non deve essere inferiore al 30 % del valore di saturazione in aria (ASV) alla temperatura di prova nel corso della prova.
DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA
Sistema di prova
14.
Sono raccomandati sistemi statici senza rinnovo dell'acqua sovrastante. Se il rapporto sedimento-acqua (cfr. il paragrafo 15) è adeguato, di norma una moderata aerazione sarà sufficiente per mantenere la qualità dell'acqua a livelli accettabili per gli organismi sperimentali (ad esempio ottimizzare i livelli di ossigeno disciolto, ridurre al minimo l'accumulo di escrezioni). I sistemi semi-statici o a flusso con rinnovo continuo o a intermittenza dell'acqua sovrastante possono essere utilizzati solo in casi eccezionali, poiché si presume che il regolare rinnovo dell'acqua sovrastante incida sull'equilibrio chimico (ad esempio perdite di sostanza chimica in esame dal sistema di prova).
Recipienti e apparecchiatura di prova
15.
L'esposizione dovrebbe avvenire in becher di vetro, ad esempio con una capacità di 250 ml e un diametro di 6 cm. Possono essere utilizzati anche altri recipienti di vetro idonei, purché garantiscano profondità sufficiente ad accogliere il sedimento e l'acqua sovrastante. In ogni recipiente va versato uno strato di circa 1,5-3 cm di sedimento artificiale. Il rapporto tra la profondità dello strato sedimentario e la profondità dell'acqua sovrastante deve essere pari a 1:4. I recipienti devono presentare una capacità adeguata al tasso di carico, ossia al numero dei vermi sperimentali aggiunti per unità di peso di sedimento (cfr. anche il paragrafo 39).
16.
I recipienti e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con la sostanza chimica in esame devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Per tutte le parti dell'apparecchiatura, evitare accuratamente l'uso di materiali che rischino di provocare la dissoluzione o l'assorbimento delle sostanze chimiche in esame o la lisciviatura di altre sostanze chimiche e che possano avere un effetto avverso sugli animali sperimentali. Per le apparecchiature destinate ad entrare in contatto con il mezzo di prova si può usare politetrafluoroetilene (PTFE), acciaio inossidabile e/o vetro. Per sostanze chimiche organiche di cui è accertato l'adsorbimento di vetro, può rendersi necessario l'uso di vetro silanizzato. In tal caso le apparecchiature non possono essere riutilizzate.
Specie sperimentali
17.
La specie sperimentale utilizzata in questo tipo di studio è l'oligochete di acqua dolce Lumbriculus variegatus (Müller). Questa specie è tollerante verso una vasta gamma di tipi di sedimento ed è ampiamente utilizzata per le prove di bioaccumulo e tossicità nel sedimento [ad esempio (3), (5), (7), (9), (13), (15), (16), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35)]. Vanno riferiti sia l'origine degli animali sperimentali, sia la conferma dell'identità di specie (ad es. (36)), sia le condizioni di allevamento. Occorre identificare la specie prima dell'avvio della prova, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati allevati nel laboratorio che esegue la prova.
Allevamento degli organismi sperimentali
18.
Al fine di disporre di un numero sufficiente di vermi per svolgere le prove di tossicità nel sedimento, è utile mantenere i vermi in allevamento di laboratorio permanente. Nell'appendice 5 si forniscono orientamenti relativi ai metodi di allevamento per Lumbriculus variegatus e fonti per allevamenti iniziali. Per maggiori dettagli si vedano i riferimenti per l'allevamento di questa specie (3), (7), (27).
19.
Per garantire che le prove siano eseguite con animali della stessa specie, si raccomandano vivamente allevamenti monospecie. Si deve garantire che gli allevamenti e soprattutto i vermi usati nelle prove non presentino patologie osservabili o anomalie.
Acqua
20.
Si raccomanda l'uso di acqua ricostituita di cui al capitolo C.1 del presente allegato (37) come acqua sovrastante nella prova. L'acqua ricostituita può anche essere usata per l'allevamento in laboratorio dei vermi (cfr. appendice 2 per la preparazione). Se necessario, può essere utilizzata acqua naturale. L'acqua scelta deve essere di una qualità tale da permettere la crescita e la riproduzione della specie sperimentale durante i periodi di acclimatazione e di prova senza che si manifestino un aspetto o un comportamento anomali. È appurato che il Lumbriculus variegatus è in grado di sopravvivere, crescere e riprodursi in questo tipo di acqua (30), ed è garantita la massima standardizzazione delle condizioni di prova e di allevamento. Se si utilizza acqua artificiale ne va segnalata la composizione. Inoltre l'acqua prima dell'uso deve essere caratterizzata almeno in termini di pH, tenore di ossigeno e durezza (come mg CaCO3/l). L'analisi dell'acqua per microinquinanti prima dell'uso potrebbe fornire informazioni utili (cfr., ad esempio, l'appendice 3).
21.
Il pH dell'acqua sovrastante deve essere compreso tra 6,0 e 9,0 (cfr. il paragrafo 13). Se si prevede un aumento nello sviluppo di ammoniaca, si ritiene utile mantenere un pH compreso fra 6,0 e 8,0. Per le prove relative, ad esempio, ad acidi organici deboli, è consigliabile regolare il pH tamponando l'acqua da usare nella prova, come descritto ad esempio in (16). La durezza totale dell'acqua da usare nella prova deve essere tra 90 e 300 mg CaCO3 per litro di acqua naturale. L'appendice 3 riassume i criteri aggiuntivi per un'acqua di diluizione accettabile conformemente alla linea guida OCSE n. 210 (38).
Sedimento
22.
Poiché il sedimento naturale non contaminato da una particolare fonte può non essere disponibile nel corso di tutto l'anno e poiché organismi indigeni e microinquinanti possono influenzare la prova, è preferibile usare un sedimento artificiale (denominato anche sedimento formulato o sintetico). L'uso di un sedimento artificiale riduce al minimo la variabilità delle condizioni di prova e l'introduzione di fauna indigena. Il seguente sedimento è basato sul sedimento artificiale secondo (6), (39) e (40). Si raccomanda di utilizzarlo in questo tipo di prova ((6), (10), (30), (41), (42), (43)):
(a)
4-5 % (peso secco) di torba di sfagno; è importante usare la torba in polvere, livello di decomposizione: “media” finemente macinata (dimensioni delle particelle ≤ 0,5 mm), esclusivamente essiccata all'aria;
(b)
20 ± 1 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite preferibilmente superiore al 30 %);
(c)
75-76 % (peso secco) di sabbia di quarzo (sabbia fine, granulometria: ≤ 2 mm, ma > 50 % delle particelle di dimensioni comprese tra 50 e 200 μm);
(d)
acqua deionizzata, pari al 30–50 % del peso secco del sedimento, oltre ai componenti secchi del sedimento;
(e)
carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO3) per regolare il pH della miscela finale;
(f)
il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % (± 0,5 %), del peso secco del sedimento e dovrà essere ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, come indicato alle lettere a) e c);
(g)
prodotti alimentari, ad esempio polveri di foglie di ortica (Urtica sp., conforme alle norme farmaceutiche, per il consumo umano), o una miscela di polveri di foglie di ortica con alfacellulosa (1: 1), a 0,4 — 0,5 % di sedimento (peso secco), oltre ai componenti secchi del sedimento. Per i dettagli cfr. l'appendice 4.
23.
L'origine della torba, dell'argilla caolinica, dei prodotti alimentari e della sabbia deve essere nota. Oltre a quando specificato alla lettera (g), il capitolo C.27 del presente allegato (6) enumera materiali vegetali alternativi da usare come fonte di nutrimento: foglie disidratate di gelso (Morus alba), trifoglio bianco (Trifolium repens), spinacio (Spinacia oleracea) o cereali.
24.
La fonte alimentare scelta deve essere aggiunta prima o durante l'addizione al sedimento della sostanza chimica in esame. Essa dovrebbe consentire almeno una riproduzione accettabile nei controlli. La ricerca di microinquinanti nel sedimento artificiale o nei suoi componenti prima del suo utilizzo può fornire informazioni utili. Un esempio di preparazione del sedimento artificiale figura nell'appendice 4. I componenti possono anche essere mescolati allo stato secco, purché si dimostri che dopo l'aggiunta dell'acqua sovrastante non si separino (ad esempio, particelle di torba in sospensione) e che la torba o il sedimento siano condizionati a sufficienza (cfr. anche il paragrafo 25 e l'appendice 4). Il sedimento artificiale deve essere caratterizzato almeno in termini di origine dei componenti, distribuzione granulometrica (percentuale di sabbia, limo e argilla), tenore di carbonio organico totale, tenore di acqua e pH. La misurazione del potenziale di ossido-riduzione è facoltativa.
25.
Se necessario, ad esempio per specifici scopi sperimentali, può fungere da sedimento di prova e/o di coltura anche il sedimento naturale di siti non inquinati (3). Tuttavia, il sedimento naturale eventualmente usato deve essere caratterizzato almeno in termini di origine (sito di prelievo), pH e ammoniaca dell'acqua interstiziale, tenore di carbonio organico totale e tenore di azoto, distribuzione granulometrica (percentuale di sabbia, limo e argilla) e tenore di umidità (7), e deve essere esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in concorrenza con gli organismi sperimentali o esserne predatori. La misurazione del potenziale di ossido-riduzione e della capacità di scambio cationico è facoltativa. Prima dell'addizione della sostanza chimica, si raccomanda inoltre di mantenere il sedimento naturale per sette giorni alle stesse condizioni in cui in seguito verrà realizzata la prova. Alla fine di questo periodo di condizionamento, l'acqua sovrastante deve essere rimossa ed eliminata.
26.
Il sedimento deve essere di una qualità tale da permettere la sopravvivenza e la riproduzione degli organismi sperimentali per il periodo di esposizione senza che questi presentino un aspetto o un comportamento anomali. I vermi di controllo devono potersi infossare nel sedimento e devono ingerire il sedimento. La riproduzione dei controlli deve rispettare almeno i criterio di validità di cui al paragrafo 13. La presenza o l'assenza di grumi fecali sulla superficie del sedimento, che indica l'ingestione di sedimento da parte dei vermi, deve essere registrata e può essere utile per interpretare i risultati delle prove in relazione alle vie di esposizione. Informazioni supplementari sull'ingestione del sedimento possono essere ottenute utilizzando metodi descritti in (24), (25), (44), e (45), in cui si specifica l'ingestione di sedimento o la selezione di particelle negli organismi sperimentali.
27.
Le procedure di manipolazione relative al sedimento naturale prima dell'uso in laboratorio sono descritte in (3), (7) e (12). La preparazione e la conservazione del sedimento artificiale raccomandato per l'uso nel Lumbriculus è descritta nell'appendice 4.
Applicazione della sostanza chimica in esame
28.
La sostanza chimica in esame è addizionata al sedimento. Poiché si prevede che la maggior parte delle sostanze chimiche in esame presenti una bassa idrosolubilità, tali sostanze vanno disciolte in un solvente organico idoneo (ad esempio acetone, n-esano, cicloesano) al volume più ridotto possibile per preparare la soluzione madre. La soluzione madre deve essere diluita con lo stesso solvente usato per le soluzioni di prova. La tossicità e la volatilità del solvente, nonché la solubilità della sostanza chimica in esame nel solvente prescelto devono costituire i criteri principali per la scelta dell'agente solubilizzante. Per ogni livello di concentrazione va usato lo stesso volume della soluzione corrispondente. Il sedimento deve essere addizionato cospargendo la sostanza chimica per ciascun livello di concentrazione al fine di ridurre al minimo la variabilità della concentrazione della sostanza chimica in esame tra le repliche. Ciascuna delle soluzioni di prova viene quindi mescolata con sabbia di quarzo come descritto nel paragrafo 22 (a titolo di esempio, 10 g di sabbia di quarzo per recipiente di prova). Per coprire completamente la sabbia di quarzo si è rivelato sufficiente un volume di 0,20-0,25 ml per g di sabbia. Successivamente, il solvente deve evaporare a secco. Al fine di ridurre al minimo le perdite della sostanza chimica in esame attraverso la co-evaporazione (ad es. in funzione della tensione di vapore della sostanza chimica in esame), la sabbia coperta va usata immediatamente dopo l'essiccazione. La sabbia secca viene mescolata con la quantità di sedimento artificiale prevista per il corrispondente livello di concentrazione. Occorre tener conto, al momento della preparazione del sedimento, della sabbia già contenuta nella miscela tra la sostanza chimica in esame e la sabbia (il sedimento, quindi, va preparato utilizzando meno sabbia). Questa procedura ha il grande vantaggio di non introdurre praticamente alcun solvente nel sedimento (7). In alternativa, quando si utilizza un sedimento naturale, la sostanza chimica in esame può essere addizionata a una porzione di terreno essiccato all'aria e finemente macinato come descritto in precedenza per la sabbia di quarzo, oppure mescolata insieme al sedimento umido, con una successiva fase di evaporazione se si utilizza un agente solubilizzante. Accertarsi che la sostanza chimica in esame aggiunta al sedimento sia perfettamente e omogeneamente distribuita al suo interno. Se necessario possono essere analizzati sottocampioni per verificare le concentrazioni bersaglio nel sedimento e per determinare il grado di omogeneità. Può essere inoltre utile analizzare sottocampioni delle soluzioni di prova al fine di confermare le concentrazioni bersaglio nel sedimento. Poiché si utilizza un solvente per depositare la sostanza chimica in esame sulla sabbia di quarzo, va impiegato un controllo con solvente preparato con la stessa quantità di solvente del sedimento di prova. Il metodo usato per l'addizione della sostanza chimica al sedimento e le ragioni per la scelta di una procedura di addizione specifica diversa da quella qui descritta devono essere riportati nella relazione. Il metodo di addizione può essere adattato alle proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, ad esempio per evitare le perdite dovute alla volatilizzazione durante l'addizione o l'equilibratura. Ulteriori orientamenti in materia di procedure di addizione sono forniti nel documento “Environment Canada” (1995) (46).
29.
Una volta che il sedimento addizionato è stato preparato, ripartito nei recipienti di prova replicati e coperto con l'acqua di prova, è preferibile lasciare che la sostanza chimica in esame si ripartisca tra il sedimento e la fase acquosa (ad esempio (3) (7) (9)). Ciò dovrebbe avvenire, di preferenza, alle stesse condizioni di temperatura e aerazione utilizzate nella prova. Il tempo di equilibratura può durare alcune ore, dei giorni o, in rari casi, fino a diverse settimane (4-5 settimane), a seconda del sedimento e delle sostanze chimiche. (ad es. (27) (47). In questa prova, l'equilibrio completo non è richiesto, ma si raccomanda un periodo di equilibratura da 48 ore a 7 giorni, Pertanto, il tempo di degradazione della sostanza chimica in esame sarà ridotto al minimo. In funzione della finalità dello studio, ad esempio se si tratta di simulare condizioni ambientali, il sedimento addizionato può essere equilibrato o lasciato “invecchiare” per un periodo più lungo.
30.
Al termine di questo periodo di equilibratura, vanno prelevati dei campioni almeno dell'acqua sovrastante e nel sedimento cosparso, quantomeno alla concentrazione massima e a una concentrazione più bassa, ai fini dell'analisi della concentrazione della sostanza chimica in esame. Tali misurazioni analitiche della sostanza chimica in esame devono consentire di calcolare il bilancio di massa e di esprimere i risultati in funzione delle concentrazioni iniziali misurate. In linea di massima, il campionamento altera o distrugge il sistema idrico del sedimento. Pertanto, in genere non è possibile utilizzare le stesse repliche per il prelievo di campioni di sedimento e vermi. È necessario preparare recipienti “analitici” supplementari di dimensioni appropriate, sottoposti allo stesso trattamento (inclusa la presenza di organismi di prova), ma non utilizzati per le osservazioni biologiche. Le dimensioni dei recipienti scelti dovranno consentire di prelevare le quantità di campioni richieste dal metodo analitico. Informazioni dettagliate del campionamento sono riportate al paragrafo 53.
ESECUZIONE DELLA PROVA
Prova preliminare
31.
Se non sono disponibili informazioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per il Lumbriculus variegatus, può essere utile condurre un esperimento preliminare allo scopo di determinare l'intervallo di concentrazioni da sottoporre a esame nella prova definitiva e di ottimizzarne le condizioni sperimentali. A tal fine si utilizza una serie di concentrazioni della sostanza chimica in esame molto intervallate tra loro. I vermi sono esposti ad ogni concentrazione della sostanza chimica in esame per un periodo (ad es. 28 giorni come nella prova vera e propria) per consentire di stimare le concentrazioni di prova adeguate; non è necessaria alcuna replica. Il comportamento dei vermi, ad esempio la tendenza ad evitare il sedimento, che potrebbe essere causata dalla sostanza chimica in esame e/o dal sedimento, va osservato e registrato nel corso di una prova preliminare. Concentrazioni superiori a 1 000 mg/kg del peso secco del sedimento non vanno sottoposte alla prova preliminare.
Prova definitiva
32.
Nella prova definitiva è necessario usare e selezionare almeno cinque concentrazioni, ad esempio sulla base dei risultati della prova preliminare di determinazione dell'intervallo (paragrafo 31), e come descritto nei paragrafi 35, 36, 37 e 38.
33.
Oltre alle serie di prove va previsto un controllo (per la replica cfr. i paragrafi 36, 37 e 38) contenente tutti i componenti tranne la sostanza chimica in esame. Se per applicare la sostanza chimica in esame è usato un agente solubilizzante, questo non deve avere effetti significativi sugli organismi sperimentali e ciò va dimostrato usando un controllo aggiuntivo contenente soltanto solvente.
Disegno sperimentale
34.
Il disegno sperimentale comprende la selezione del numero delle concentrazioni della sostanza chimica in esame e dell'intervallo fra le stesse, il numero di recipienti per ciascun livello di concentrazione e il numero di vermi aggiunti per recipiente. Nei paragrafi 35, 36, 37 e 38 è descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della ECx, la stima della NOEC e per l'esecuzione di una prova limite.
35.
La concentrazione che determina un effetto (ad esempio e.g. EC50 EC25, EC10) e l'intervallo delle concentrazioni alle quali la sostanza chimica in esame produce un effetto d'interesse devono rientrare tra le concentrazioni incluse nella prova. Bisogna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione più debole che produce un effetto sugli organismi sperimentali o al di sopra della concentrazione massima prevista dalla prova. Se, in casi eccezionali, si procede a una tale estrapolazione, è necessario fornire una spiegazione esauriente nella relazione.
36.
Se deve essere stimato l'ECx, vanno sottoposte a prova almeno cinque concentrazioni con un minimo di tre repliche per ciascuna concentrazione; si raccomandano sei repliche per il controllo o, se utilizzato, il controllo con solvente, al fine di migliorare la stima della variabilità dei diversi gruppi di controllo. In ogni caso, per ottenere una buona stima del modello è consigliabile utilizzare un numero sufficiente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l'altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva di risposta in funzione della concentrazione sia poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito se si aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte nel range 5– 95 %. L'aumento del numero di repliche o la riduzione degli intervalli delle concentrazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova.
37.
Se devono essere stimati i valori LOEC/NOEC, si raccomandano almeno cinque concentrazioni di prova con almeno quattro repliche (si raccomandano sei repliche per il controllo o, se utilizzato, il controllo con solvente, al fine di migliorare la stima della variabilità dei diversi gruppi di controllo) e il fattore tra le concentrazioni non deve essere superiore a due. Alcune informazioni sulla potenza statistica riscontrata durante la verifica di ipotesi nella prova interlaboratorio del metodo di prova figurano nell'appendice 6.
38.
Si può condurre una prova limite (usando una concentrazione di prova e controlli) se non sono previsti effetti fino a 1 000 mg/kg di peso secco del sedimento, (ad es. in base a una prova preliminare di determinazione dell'intervallo) oppure se la prova a una singola concentrazione è inadeguata per confermare un valore NOEC di interesse. In quest'ultimo caso è necessario riportare nella relazione di prova una motivazione dettagliata della scelta dei limiti di concentrazione. Lo scopo della prova limite è quello di testare una concentrazione sufficientemente alta da consentire a chi di competenza di escludere eventuali effetti tossici della sostanza chimica in esame; il limite va fissato a una concentrazione la cui comparsa è improbabile in tutte le situazioni. Si raccomanda un rapporto di 1 000 mg/kg (peso secco). Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli organismi trattati che per i controlli. Alcune informazioni sulla potenza statistica riscontrata durante la verifica di ipotesi nella prova interlaboratorio del metodo di prova figurano nell'appendice 6.
Condizioni di esposizione
Organismi sperimentali
39.
La prova è eseguita con almeno 10 vermi per ogni replica utilizzata per la determinazione di parametri biologici. Questo numero di vermi corrisponde a circa 50-100 mg di biomassa fresca. Ipotizzando un tenore di materia secca pari al 17,1 % (48), ciò si traduce in circa 9-17 mg di biomassa secca per recipiente. U.S. EPA (2000 (7)) raccomanda di utilizzare un tasso di carico inferiore o uguale a 1: 50 (biomassa secca: TOC). Per il sedimento artificiale descritto al paragrafo 22, ciò corrisponde a circa 43 g (peso secco) di sedimento per 10 vermi ad un tenore TOC del 2,0 % del sedimento secco. Nei casi in cui si utilizzano più di 10 vermi per recipiente, la quantità di sedimento e acqua sovrastante deve essere adeguata di conseguenza.
40.
Tutti i vermi impiegati nella stessa prova devono avere la stessa origine e presentare uno stato fisiologico simile (cfr. appendice 5). Vanno selezionati vermi di dimensioni simili (cfr. paragrafo 39). Si raccomanda di pesare un sottocampione del lotto o dello stock di vermi prima della prova per stimare il peso medio.
41.
Gli animali utilizzati nella prova sono prelevati dal terreno di allevamento (cfr. appendice 5 per ulteriori particolari). Gli animali grandi (adulti) che non presentano segni di frammentazione recente sono trasferiti in piastre di vetro (ad esempio, capsula Petri) contenenti acqua pulita. Essi vengono successivamente sincronizzati come descritto nell'appendice 5. Dopo un periodo di rigenerazione da 10 a 14 giorni, vanno usati per la prova i vermi completi e intatti di dimensioni simili, che nuotano attivamente o si muovono dopo un leggero stimolo meccanico. Se le condizioni sperimentali sono diverse dalle condizioni di allevamento (ad esempio in termini di regime di temperatura, luce e acqua sovrastante), una fase di acclimatazione, ad es. di 24 ore, alla stessa temperatura e luce e con la medesima acqua sovrastante della prova dovrebbe essere sufficiente affinché gli animali si adattino alle condizioni sperimentali. Gli oligocheti adeguati a tali condizioni devono essere ripartiti a caso nei recipienti di prova.
Alimentazione
42.
Dal momento che il cibo è aggiunto al sedimento prima (o durante) l'applicazione della sostanza chimica in esame, gli animali non sono più alimentati durante la prova.
Illuminazione e temperatura
43.
Il fotoperiodo applicato durante l'allevamento e la prova di norma dura 16 ore (3), (7). L'intensità luminosa va mantenuta a un livello basso (ad esempio, 100-500 lux) per limitare le condizioni naturali alla superficie del sedimento, e va misurata almeno una volta nel corso del periodo di esposizione. La temperatura deve essere di 20 °C ± 2 °C per tutta la durata della prova. In una determinata data di misurazione la differenza di temperatura tra i recipienti di prova non deve essere superiore a ± 1 °C. I recipienti di prova devono essere collocati nell'incubatore di prova o nell'area di prova in modo casuale, ad esempio per ridurre al minimo gli errori sistematici di riproduzione a causa dell'ubicazione del recipiente.
Aerazione
44.
L'acqua sovrastante dei recipienti deve essere leggermente aerata (ad esempio 2-4 bolle al secondo) per mezzo di una pipetta Pasteur posizionata a circa 2 cm sopra la superficie del sedimento in modo da ridurre al minimo l'alterazione del sedimento. È necessario accertarsi che la concentrazione di ossigeno disciolto non scenda al di di sotto del 30 % del valore di saturazione in aria (ASV). L'apporto di aria va tenuto sotto controllo e, se necessario, adeguato almeno una volta al giorno nei giorni lavorativi.
Misurazione della qualità dell'acqua
45.
I seguenti parametri di qualità dell'acqua devono essere misurati nell'acqua sovrastante:
Temperatura:
almeno in un recipiente di prova per ciascun livello di concentrazione e in un recipiente di prova per i controlli una volta a settimana nonché all'inizio e alla fine del periodo di esposizione; se possibile, può essere registrata anche la temperatura nell'elemento circostante (ambiente o bagno d'acqua), ad esempio a cadenza oraria;
Tenore di ossigeno disciolto:
almeno in un recipiente di prova per ciascun livello di concentrazione e in un recipiente di prova per i campioni di controllo una volta a settimana nonché all'inizio e alla fine del periodo di esposizione; valore espresso in mg/l e % ASV (valore di saturazione in aria);
Alimentazione dell'aria:
deve essere controllata almeno una volta al giorno nei giorni lavorativi e se necessario adeguata;
pH:
almeno in un recipiente di prova per ciascun livello di concentrazione e in un recipiente di prova per i controlli una volta a settimana nonché all'inizio e alla fine del periodo di esposizione;
Durezza totale dell'acqua:
almeno in una replica dei controlli e in un recipiente al livello di concentrazione più elevato all'inizio e alla fine del periodo di esposizione; valore espresso in mg/l CaCO3;
Tenore totaledi ammoniaca:
almeno in una replica dei controlli e in un recipiente per tutti i livelli di concentrazione all'inizio e alla fine del periodo di esposizione e successivamente 3 volte a settimana; valore espresso in mg/l NH4+ oppure NH3 o azoto ammoniacale totale.
Se la misurazione dei parametri di qualità dell'acqua richiede l'eliminazione di una quantità significativa di campioni di acqua dai recipienti, può essere opportuno separare i recipienti per le misurazioni della qualità dell'acqua per non modificare il rapporto volumico acqua-sedimento.
Osservazioni biologiche
46.
Durante l'esposizione, i recipienti vanno osservati al fine di valutare le differenze visibili nel comportamento dei vermi (ad esempio, la tendenza ad evitare il sedimento, la presenza di grumi fecali sulla superficie del sedimento) rispetto ai controlli. Le osservazioni vanno registrate.
47.
Alla fine della prova, viene esaminata ogni replica (i recipienti supplementari destinati alle analisi chimiche possono essere esclusi dall'esame). Va usato un metodo adeguato per recuperare tutti i vermi dal recipiente. È necessario accertarsi che tutti i vermi siano recuperati illesi. Un metodo possibile è la setacciatura degli animali nel sedimento. Può essere usato un setaccio in acciaio di dimensione adeguata. La maggior parte dell'acqua sovrastante va fatta decantare con cura e il sedimento e l'acqua restanti vanno agitati al fine di creare una sospensione fangosa che può essere fatta passare attraverso il setaccio. Usando un setaccio di 500 μm, la maggior parte delle particelle di sedimento passerà molto rapidamente tra le maglie del setaccio; tuttavia la setacciatura va eseguita rapidamente al fine di evitare che i vermi si attacchino alle maglie o passino tra le stesse. Usando un setaccio di 250 μm i vermi non si attaccheranno alla maglia del setaccio o non passeranno tra le maglie; in questo è tuttavia necessario fare in modo che la trama trattenga il meno possibile le particelle di sedimento. Le sospensioni fangose di ciascun recipiente di replica possono essere passate al setaccio una seconda volta al fine di garantire che tutti i vermi siano recuperati. In alternativa si potrebbe usare il seguente metodo: scaldare il sedimento ponendo i recipienti di prova a bagnomaria a 50-60 °C; i vermi si staccheranno dal sedimento e potranno essere raccolti sulla superficie del sedimento con una pipetta ad apertura larga lucidata a fuoco. Un altro metodo alternativo potrebbe essere quello di produrre una sospensione fangosa che sarà sparsa su una vaschetta poco profonda di adeguate dimensioni. I vermi possono essere raccolti nello strato sottile di sospensione fangosa con un ago in acciaio o con una pinzetta da orologiaio (da utilizzare come una forchetta piuttosto che come una pinza per evitare di ferire i vermi) e trasferiti in acqua pulita. Dopo la separazione dei vermi dalla sospensione fangosa di sedimento, questi vanno sciacquati nel mezzo di prova e contati.
48.
Indipendentemente dal metodo utilizzato, i laboratori devono dimostrare che il loro personale è in grado di recuperare dal sedimento una media di almeno il 90 % degli organismi. Ad esempio, un certo numero di organismi sperimentali potrebbe essere aggiunto al sedimento di controllo o al sedimento delle prove e il loro recupero può essere previsto dopo 1 h (7).
49.
Il numero totale di esemplari vivi e morti per replica va registrato e valutato. I seguenti gruppi di vermi sono considerati morti:
a)
non vi è alcuna reazione dopo un leggero stimolo meccanico;
b)
vi sono segni di decomposizione (in combinazione con la lettera a));
c)
manca un certo numero di vermi.
Inoltre, i vermi in vita possono essere attribuiti a uno dei tre gruppi:
a)
vermi completi di dimensioni grandi (adulti) senza regioni corporee rigenerate;
b)
vermi completi con regioni corporee rigenerate e dal colore più chiaro (ad esempio dotati di una nuova parte posteriore, di una nuova parte posteriore o di entrambe le parti, anteriore e posteriore, nuove);
c)
vermi incompleti (ad esempio, vermi frammentati di recente con regioni corporee non rigenerate).
Tali osservazioni complementari non sono obbligatorie, ma possono essere utilizzate a titolo di interpretazione supplementare dei risultati biologici (ad esempio, un elevato numero di vermi assegnati al gruppo c) può indicare un ritardo di riproduzione o rigenerazione in un determinato trattamento). Inoltre, se tra vermi trattati e di controllo, si osservano differenze di aspetto (ad esempio lesioni del tegumento, sezioni corporee edematose), queste vanno registrate.
50.
Immediatamente dopo essere state contati/esaminati, i vermi vivi trovati in ciascuna replica sono trasferiti in piatti di bilancia asciutti, tarati ed etichettati (uno per replica) e soppressi con una goccia di etanolo per piatto di bilancia. I piatti di bilancia sono posizionati in un forno di essiccamento a 100 ± 5 °C al fine di essere essiccati nel corso della notte. In seguito sono raffreddati in un essiccatore e successivamente pesati, per determinare il peso secco (preferibilmente in g con almeno 4 cifre decimali).
51.
Oltre al peso totale secco, il peso secco esente da ceneri può essere determinato come descritto in (49), al fine di tenere conto dei componenti anorganici provenienti dal sedimento ingerito presente nell'apparato digerente dei vermi.
52.
La biomassa è determinata come biomassa totale per replica comprensiva dei vermi adulti e giovani. I vermi morti non sono tenuti in considerazione nella determinazione della biomassa per replica.
Verifiche delle concentrazioni delle sostanze chimiche in esame
Campionamento
53.
I campioni per procedere all'analisi chimica della sostanza chimica in esame devono essere prelevati almeno alla concentrazione massima e a una più bassa, almeno alla fine della fase di equilibratura (prima di introdurre gli organismi sperimentali), e al termine della prova. Devono essere campionati per l'analisi almeno il sedimento e l'acqua sovrastante. Per ogni matrice e trattamento a ciascuna data di campionamento vanno prelevati almeno due campioni. Uno dei due campioni può essere conservato come riserva (da analizzare, ad esempio, nel caso in cui una prima analisi si situi al di fuori dell'intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale). In caso di specifiche proprietà chimiche, ad esempio se si prevede una rapida degradazione della sostanza chimica in esame, la tempistica delle analisi può essere adeguata (ad esempio una maggiore frequenza di campionamento, un'analisi di più livelli di concentrazione) sulla base del parere di esperti. In questo caso i campioni possono essere prelevati in date di campionamento intermedie (ad esempio al settimo giorno dopo l'inizio dell'esposizione).
54.
L'acqua sovrastante deve essere raccolta con cura facendo decantare o sifonare l'acqua sovrastante, in modo da ridurre al minimo l'alterazione del sedimento. Prendere nota del volume dei campioni prelevati.
55.
In seguito alla rimozione dell'acqua sovrastante, il sedimento va omogeneizzato e trasferito in un contenitore appropriato. In seguito si registra il peso del campione di sedimento umido.
56.
Se è richiesta anche l'analisi della sostanza chimica in esame nell'acqua interstiziale, i campioni di sedimento omogeneizzati e pesati vanno centrifugati per ottenere l'acqua interstiziale. Ad esempio, circa 200 ml di sedimento umido possono essere versati in becher di centrifugazione da 250 ml. In seguito i campioni vanno centrifugati senza filtrazione per isolare l'acqua interstiziale, ad esempio a 10 000 ± 600 × g) per 30-60 minuti a una temperatura non superiore alla temperatura utilizzata per la prova. Dopo la centrifugazione si decanta o preleva con una pipetta il surnatante avendo cura che non vengano introdotte particelle di sedimento e si registra il volume. Il peso del pellet di sedimento rimanente viene registrato. Ciò può semplificare la stima del bilancio di massa o del recupero della sostanza chimica in esame nel sistema acqua-sedimento nel caso in cui il peso secco del sedimento sia determinato in ciascuna data di campionamento. In alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile analizzare le concentrazioni nell'acqua interstiziale.
57.
In mancanza di un'analisi immediata, tutti i campioni vanno conservati con un metodo appropriato, ad esempio seguendo le condizioni di conservazione raccomandate per limitare quando più possibile la degradazione della sostanza chimica in esame (ad esempio, i campioni ambientali sono comunemente conservati a – 18 °C al buio). È necessario ottenere informazioni sulle corrette modalità di conservazione per la specifica sostanza chimica in esame, ad esempio la durata e la temperatura di conservazione, le procedure di estrazione, ecc., prima dell'inizio dello studio.
Metodo di analisi
58.
Poiché tutta la procedura è basata sostanzialmente sull'accuratezza, la precisione e la sensibilità del metodo analitico utilizzato per la sostanza chimica in esame, controllare sperimentalmente che la precisione e la riproducibilità dell'analisi chimica, nonché il recupero della sostanza chimica in esame dall'acqua e dai campioni di sedimento, siano soddisfacenti per quel particolare metodo quantomeno alla concentrazione più bassa e più alta della prova. È inoltre necessario verificare che la sostanza chimica in esame non sia rilevabile nei recipienti di controllo in concentrazioni superiori al limite di quantificazione. Se necessario, si procede alla correzione delle concentrazioni nominali per tenere conto dei recuperi delle addizioni dei controlli di qualità (ad esempio, quando il recupero è al di fuori del range dell'80-120 % della quantità addizionata). Per l'intera durata della prova tutti i campioni devono essere manipolati in modo da ridurre al minimo la contaminazione e le perdite (derivanti, ad esempio, dall'adsorbimento della sostanza chimica in esame sul dispositivo di campionamento).
59.
Vanno registrati e rendicontati il recupero della sostanza chimica in esame, il limite di quantificazione e il limite di rilevazione nel sedimento e nell'acqua.
DATI E RELAZIONE
Trattamento dei risultati
60.
Le principali variabili di risposta della prova che devono essere valutate tassativamente dal punto di vista statistico sono la biomassa e il numero totale di vermi per replica. È inoltre possibile valutare anche la riproduzione (come aumento del numero dei vermi) e la crescita (come aumento della biomassa secca). In questo caso si può ottenere una stima del peso secco dei vermi all'inizio dell'esposizione, ad esempio mediante misurazione del peso secco di un sottocampione rappresentativo del lotto di vermi sincronizzati da utilizzare per la prova.
61.
Sebbene la mortalità non sia un endpoint di questa prova, nei limiti del possibile le mortalità vanno valutate. Al fine di stimare le mortalità, il numero di vermi che non reagiscono ad un leggero stimolo meccanico o hanno evidenziato segni di decomposizione nonché i vermi mancanti devono essere considerati morti. Le mortalità vanno almeno registrate e tenute in considerazione nell'interpretazione dei risultati delle prove.
62.
Le concentrazioni che determinano un effetto devono essere espresse in mg/kg del peso secco del sedimento. Se il recupero della sostanza chimica in esame misurata all'inizio dell'esposizione nel sedimento o nel sedimento e nell'acqua sovrastante è compreso in un intervallo tra l'80 % e il 120 % delle concentrazioni nominali, le concentrazioni che determinano un effetto (ECx, NOEC, LOEC) possono essere espresse sulla base di concentrazioni nominali. Se il recupero si discosta dalle concentrazioni nominali di oltre ± 20 % delle stesse, le concentrazioni che determinano un effetto (ECx, NOEC, LOEC) devono basarsi sulle concentrazioni iniziali misurate al principio dell'esposizione, ad esempio tenendo conto dell'equilibrio di massa della sostanza chimica in esame nel sistema di prova (cfr. paragrafo 30). In questi casi, dall'analisi delle soluzioni madre e/o delle soluzioni di applicazione possono essere ottenute informazioni supplementari al fine di confermare che il sedimento sperimentale sia stato preparato correttamente.
ECx
63.
I valori ECx per i parametri descritti al paragrafo 60 sono calcolati usando metodi statistici appropriati (ad esempio analisi Probit, funzione logistica o di Weibull, il metodo Trimmed Spearman-Karber o la semplice interpolazione). I riferimenti (15) e (50) forniscono orientamenti sulla valutazione statistica. Una ECx è ottenuta inserendo nell'equazione un valore corrispondente ad x % della media del controllo. Ai fini del calcolo dell'EC50 o di ogni altro valore ECx, le medie per trattamento ( ) vanno sottoposte ad analisi di regressione.
NOEC/LOEC
64.
Se l'analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC, sono necessarie statistiche per recipiente (i recipienti individuali sono considerati repliche). Si deve ricorrere a metodi statistici appropriati. In generale, gli effetti negativi della sostanza chimica in esame rispetto al controllo sono analizzati con verifica di ipotesi unilaterale (più debole) a p ≤ 0,05. Gli esempi sono riportati nei paragrafi che seguono. Ai paragrafi (15) e (50) sono forniti orientamenti sui metodi statistici appropriati.
65.
La distribuzione normale dei dati può essere sottoposta a prova, ad esempio con il test Kolmogorov-Smirnov per la bontà dell'adattamento, il test del rapporto tra intervallo e deviazione standard (test R/s) o il test Shapiro-Wilk (bilaterale, p ≤ 0,05). Per esaminare l'omogeneità delle varianze è possibile usare il test di Cohran, il test di Levene o i test di Bartlett (bilaterale, p ≤ 0,05). Se sono soddisfatti i prerequisiti dei protocolli dei test parametrici (normalità e omogeneità della varianza), possono essere svolti sia analisi della varianza a un fattore, sia successivi test multi-confronto. Per verificare eventuali differenze significative (p ≤ 0,05) tra i campioni di controllo e le varie concentrazioni della sostanza chimica in esame si può procedere a calcoli basati su confronti a coppie (ad esempio, il test di Dunnett a una coda) o test di tendenza regressivi (ad esempio il test di Williams). In caso contrario vanno usati metodi non parametrici (ad esempio il test U di Bonferroni secondo Holm o il test di tendenza Jonckheere-Terpstra) per determinare la LOEC e la NOEC.
Prova limite
66.
Se è stata effettuata una prova limite (confronto tra un controllo e un solo trattamento) e i prerequisiti dei test parametrici (normalità, omogeneità) sono soddisfatti, le risposte metriche (numero complessivo di vermi e biomassa come peso secco dei vermi) possono essere valutate con il test t di Student. In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali (t test di Welch) o a un test non parametrico, come il test U di Wilcoxon-Mann-Whithey. Alcune informazioni sulla potenza statistica riscontrata durante la verifica di ipotesi nella prova interlaboratorio del metodo figurano nell'appendice 6.
67.
Per determinare le differenze significative tra i controlli (campione di controllo e controllo con solvente), le repliche di ogni controllo possono essere sottoposte a prove come descritto per la prova limite. Se tali prove non rilevano differenze significative, tutte le repliche del controllo e del controllo con solvente possono essere raggruppate. Altrimenti tutti i trattamenti devono essere confrontati con quello del controllo con solvente.
Interpretazione dei risultati
68.
In caso di deviazioni dal presente metodo di prova e in caso di concentrazioni sperimentali misurate prossime al limite di rivelazione del metodo analitico, i risultati devono essere interpretati con cautela. Le eventuali deviazioni dal presente metodo di prova devono essere registrate.
Relazione sulla prova
69.
La relazione sulla prova comprende almeno le informazioni seguenti:
—
Sostanza chimica in esame:
—
identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula strutturale, numero CAS, ecc.), purezza e metodo di analisi per la quantificazione della sostanza chimica in esame; fonte della sostanza chimica in esame, identità e concentrazione di eventuali solventi utilizzati;
—
tutte le informazioni disponibili sulla natura fisica e sulle proprietà fisico-chimiche ottenute prima dell'inizio della prova (ad esempio, idrosolubilità, tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel terreno (o nel sedimento, se del caso), log Kow, stabilità nell'acqua, ecc.);
—
Specie sperimentali:
—
nome scientifico, ceppo, provenienza, eventuali pretrattamenti, acclimatazione, condizioni di allevamento, ecc.
—
Condizioni di prova:
—
procedimento sperimentale usato (ad es. statico, semi-statico o a flusso continuo);
—
disegno sperimentale (ad es. numero, materiale e dimensioni dei recipienti di prova, volume dell'acqua per recipiente, massa e volume sedimentale per recipiente (per procedimenti a flusso continuo o semi-statici: tasso di sostituzione del volume di acqua), eventuale aerazione avvenuta prima e durante la prova, numero di repliche, numero di vermi per replica all'inizio dell'esposizione, numero di concentrazioni di prova, durata dei periodi di condizionamento, equilibratura ed esposizione, frequenza dei campionamenti;)
—
spessore del sedimento e profondità dell'acqua sovrastante;
—
metodo di pretrattamento e di addizione/applicazione della sostanza chimica in esame;
—
concentrazioni nominali di prova, dettagli sul campionamento per l'analisi chimica e metodi analitici con cui sono state ottenute le concentrazioni della sostanza chimica in esame;
—
caratteristiche del sedimento come descritte ai paragrafi 24-25 ed eventuali altre misurazioni effettuate; preparazione di sedimento artificiale;
—
preparazione dell'acqua di prova (se si utilizza acqua artificiale) e caratteristiche (concentrazione di ossigeno, pH, conduttività, durezza ed eventuali altre misurazioni effettuate) prima dell'inizio della prova,
—
informazioni dettagliate sull'alimentazione, che comprendano il tipo di mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione;
—
intensità luminosa e fotoperiodo/i;
—
metodi utilizzati per la determinazione di tutti i parametri biologici (ad esempio campionamento, ispezione, pesatura degli organismi sperimentali) e tutti i parametri abiotici (ad esempio parametri di qualità dell'acqua e del sedimento);
—
volumi e/o il peso di tutti i campioni per l'analisi chimica;
—
informazioni particolareggiate sul trattamento dei campioni per l'analisi chimica, ivi compresi i dettagli su preparazione, conservazione, procedure di addizione, estrazione e procedure analitiche (e loro precisione) per la sostanza chimica in esame, oltre ai recuperi della sostanza chimica in esame.
—
Risultati:
—
qualità dell'acqua nei recipienti di prova (pH, temperatura, concentrazione di ossigeno disciolto, durezza, concentrazioni di ammoniaca ed eventuali altre misurazioni effettuate);
—
tenore di carbonio organico totale (TOC), rapporto peso secco/peso umido, pH del sedimento ed eventuali altre misurazioni effettuate;
—
numero totale e, se determinato, numero di vermi completi e incompleti in ciascun contenitore di prova alla fine della prova;
—
peso secco dei vermi di ciascun contenitore di prova alla fine della prova e, se misurato, peso secco di un sottocampione dei vermi all'inizio della prova;
—
ogni comportamento anomalo rilevato rispetto ai controlli (ad esempio, tendenza ad evitare il sedimento, presenza o assenza di grumi fecali);
—
eventuali casi di mortalità osservati;
—
stime degli endpoint di tossicità (ad es. ECx, NOEC e/o LOEC) nonché metodi statistici utilizzati per determinarli;
—
concentrazioni nominali sperimentali, concentrazioni sperimentali misurate e risultati di tutte le analisi condotte per determinare la concentrazione della sostanza chimica in esame nei recipienti di prova,
—
eventuali deviazioni dai criteri di validità.
—
Valutazione dei risultati:
—
conformità dei risultati ai criteri di validità di cui al paragrafo 13,
—
discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute allo scostamento dal presente metodo di prova.
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(47)
Landrum, P.F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Hung. Technol. 23, 588-595.
(48)
Brooke, L.T., Ankley, G.T., Call, D.J. & Cook, P.M. (1996). Gut content and clearance for three species of freshwater invertebrates. Environ. Toxicol. Chem. 15, 223-228.
(49)
Mount, D.R., Dawson, T.D. & Burkhard, L.P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244-1249.
(50)
OECD 2006. Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. OECD Series on Testing and Assessment No. 54, OECD, Paris, France.
(51)
Liebig M., Meller M. & Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten — Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. March 24-25, 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Germany. pp. 107-119.
Ulteriore letteratura sulle procedure statistiche:
Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Soc. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121.
Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491.
Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. Charles Griffin & Company Ltd, London.
Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Hung. Technol. 11(7), 714-719; Correction: Environ. Hung. Technol. 12 (1998), 417.
Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70.
Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981) Biometry. The principles and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York.
Miller, R.G., Jr. (1986). Beyond ANOVA, basics of applied statistics. ed. John Wiley & Sons. New York.
Shapiro S.S. & Wilk M.B (1965). An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika 52: 591-611.
Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519 531.
Appendice 1
Definizioni
Ai fini del presente metodo di prova si applicano le seguenti definizioni:
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
Periodo di condizionamento: periodo che serve a stabilizzare la flora microbica del sedimento e a rimuovere, ad esempio, l'ammoniaca che si forma nei componenti del sedimento; il periodo ha luogo prima dell'addizione della sostanza chimica al sedimento. Di norma, l'acqua sovrastante viene scartata dopo il condizionamento.
ECx: concentrazione della sostanza chimica in esame nel sedimento che causa un effetto dell'x % (ad esempio del 50 %) su un parametro biologico entro un periodo di esposizione specificato.
Periodo di equilibratura: serve per consentire alla sostanza chimica di ripartirsi tra la fase solida, l'acqua interstiziale e l'acqua sovrastante; il periodo ha luogo dopo l'addizione della sostanza chimica al sedimento e prima dell'aggiunta degli organismi sperimentali.
Fase di esposizione: tempo durante il quale gli organismi sperimentali sono esposti alla sostanza chimica in esame.
Sedimento artificiale, sintetico o formulato: miscela di materiali usati per simulare i componenti fisici di un sedimento naturale.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration — Concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo): è la più bassa concentrazione saggiata di una sostanza chimica in esame alla quale si osserva un effetto significativo (p < 0,05) rispetto al controllo. Tutte le concentrazioni superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Se queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e pertanto la NOEC).
NOEC (No Observed Effect Concentration, NOEC — Massima concentrazione senza effetti significativi): concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC che, se confrontata con il controllo, non ha un effetto statisticamente significativo (p < 0,05), entro un periodo di esposizione definito.
Coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua ((Kow): rapporto tra la solubilità di una sostanza chimica in n-ottanolo e quella in acqua all'equilibrio; rappresenta la lipofilia di una sostanza chimica (capitolo A.24 del presente allegato). Kow o il logaritmo di Kow (log Kow) viene usato come indicazione del potenziale di bioaccumulo di una sostanza chimica da parte di organismi acquatici.
Coefficiente di ripartizione carbonio organico-acqua (Koc): rapporto tra la concentrazione di una sostanza chimica nella o sulla frazione di carbonio organico di un sedimento e la concentrazione della sostanza chimica all'equilibrio.
Acqua sovrastante: l'acqua che copre il sedimento nel recipiente di prova.
Acqua interstiziale: l'acqua che occupa lo spazio tra il sedimento o le particelle di terreno.
Sedimento addizionato: sedimento al quale è stata aggiunta la sostanza chimica in esame.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.
Appendice 2
Composizione dell'acqua artificiale raccomandata
(adozione in base al capitolo C.1 del presente allegato (1).
(a)
Soluzione di cloruro di calcio
Dissolvere 11,76 g di CaCl2 · 2H2O in acqua deionizzata; portare a 1 l con acqua deionizzata.
(b)
Soluzione di solfato di magnesio
Dissolvere 4,93 g di MgSO4 · 7H2O in acqua deionizzata; portare a 1 l con acqua deionizzata.
(c)
Soluzione di carbonato di sodio
Dissolvere 2,59 g di MgSO3 × 7 H2O in acqua deionizzata; portare a 1 l con acqua deionizzata.
(d)
Soluzione di cloruro di potassio
Dissolvere 0,23 g KCl in acqua deionizzata; portare a 1 l con acqua deionizzata.
Tutte le sostanze chimiche devono avere purezza analitica.
La conduttività dell'acqua distillata o deionizzata non può superare 10 μScm– 1.
25 ml di ciascuna soluzione da (a) a (d) sono miscelati e il volume totale è portato a 1 l con acqua deionizzata. La somma degli ioni di calcio e magnesio in queste soluzioni è di 2,5 mmol/l.
Il rapporto degli ioni Ca e Mg è 4:1 e quello degli ioni Na e K è di 10:1. La capacità acida KS4.3 della presente soluzione è 0,8 mmol/l.
Aerare l'acqua di diluizione fino a quando non si raggiunge la saturazione dell'ossigeno, in seguito conservarla per circa due giorni senza ulteriore aerazione prima dell'uso.
RIFERIMENTI
(1)
Capitolo C.1 del presente allegato, “Tossicità acuta per i pesci”.
Appendice 3
Caratteristiche fisico-chimiche di un'acqua di diluizione accettabile
Componente
Concentrazioni
Particolato
< 20 mg/l
Carbonio organico totale
< 2 μg/l
Ammoniaca non ionizzata
< 1 μg/l
Cloro residuo
< 10 μg/l
Pesticidi organofosforati totali
< 50 ng/l
Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati
< 50 ng/l
Cloro organico totale
< 25 ng/l
(adottato in base ad OCSE (1992) (1))
RIFERIMENTI
(1)
OECD (1992). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paris.
Appendice 4
Orientamenti per la preparazione e conservazione sul sedimento artificiale raccomandato
Componenti del sedimento
Componente
Caratteristiche
% del sedimento peso secco
Torba
Torba di sfagno, livello di decomposizione: “medio”, essiccata all'aria, priva di residui visibili di piante, finemente macinata (dimensioni delle particelle ≤ 0,5 mm)
5 ± 0,5
Sabbia di quarzo
Granulometria: ≤ 2 mm, ma > 50 % delle particelle ha dimensioni comprese tra 50 e 200 μm
75 - 76
Argilla caolinica
Tenore di caolinite ≥ 30 %
20 ± 1
Fonte alimentare.
ad es. polveri di foglie di ortica (Folia urticae), foglie di Urtica dioica, finemente macinate (dimensione delle particelle ≤ 0,5 mm); conforme alle norme farmaceutiche, per il consumo umano; in aggiunta al sedimento secco
0,4 - 0,5 %
Carbonio organico
Regolato aggiungendo torba e sabbia
2 ± 0,5
Carbonato di calcio
CaCO3, in polvere, chimicamente puro, in aggiunta al sedimento secco
0,05 - 1
Acqua deionizzata
Conduttività ≤ 10 μS/cm, in aggiunta al sedimento secco
30 - 50
Nota: Se sono previste elevate concentrazioni di ammoniaca, ad esempio se è noto che la sostanza chimica in esame inibisce la nitrificazione, può essere utile sostituire il 50 % della polvere di ortiche ricca di azoto con cellulosa (ad esempio, polvere di alfa-cellulosa, chimicamente pura, con dimensione delle particelle ≤ 0,5 mm; (1) (2)).
Preparazione
Far essiccare all'aria e macinare finemente la torba. Preparare una sospensione della quantità richiesta di polvere di torba in acqua deionizzata utilizzando un omogeneizzatore ad alte prestazioni. Regolare il pH della sospensione a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. Tenere per almeno due giorni la sospensione a temperatura di 20 ± 2 °C agitandola leggermente per stabilizzare il pH e favorire il costituirsi di una flora microbica stabile. Misurare nuovamente il pH, che deve essere di 6,0± 0,5. Mescolare la sospensione di torba con gli altri componenti (sabbia e argilla caolinica) e con acqua deionizzata, fino ad ottenere un sedimento omogeneo con tenore in acqua pari al 30–50 % del peso secco del sedimento. Misurare ancora una volta il pH della miscela finale e regolare a 6,5-7,5 con CaCO3 se necessario. Tuttavia, se si prevede lo sviluppo di ammoniaca, può essere utile mantenere il pH del sedimento al di sotto di 7,0 (ad esempio tra 6,0 e 6,5). Prelevare campioni di sedimento per determinare il peso secco e il tenore di carbonio organico. Se si prevede lo sviluppo di ammoniaca, il sedimento artificiale può essere condizionato per sette giorni alle medesime condizioni in cui si realizzerà la prova (ad es. rapporto sedimento-acqua 1: 4, altezza dello strato di sedimento uguale a quella nei recipienti di prova) prima dell'addizione della sostanza chimica in esame, vale a dire che va coperto con acqua che deve essere areata. Alla fine di questo periodo di condizionamento, l'acqua sovrastante deve essere rimossa ed eliminata. Successivamente, la sabbia di quarzo addizionata viene mescolata con il sedimento per ciascun livello di trattamento; il sedimento è distribuito nei recipienti delle repliche e coperto con l'acqua di prova. I recipienti vengono quindi incubati alle stesse condizioni in cui si realizzerà la prova. È in questo momento che si avvia il periodo di equilibratura. L'acqua sovrastante deve essere areata.
La fonte alimentare scelta deve essere aggiunta prima o durante l'addizione al sedimento della sostanza chimica in esame. La stessa può essere inizialmente mescolata con la sospensione di torba (cfr. sopra). Tuttavia, un'eccessiva degradazione della fonte alimentare prima dell'aggiunta degli organismi sperimentali, ad esempio in caso di un lungo periodo di equilibratura, può essere evitata limitando il più possibile il periodo che intercorre tra l'aggiunta del prodotto alimentare e l'inizio dell'esposizione. Al fine di garantire che la sostanza chimica in esame sia addizionata al prodotto alimentare, la fonte alimentare va mescolata con il sedimento al più tardi il giorno in cui la sostanza chimica in esame è addizionata al sedimento.
Conservazione
I componenti secchi del sedimento artificiale possono essere conservati in luogo fresco e asciutto, a temperatura ambiente. Il sedimento preparato e addizionato con la sostanza chimica in esame deve essere usato immediatamente nella prova. È possibile conservare i campioni di sedimento addizionato fino all'analisi alle condizioni raccomandate per la sostanza chimica in esame.
RIFERIMENTI
(1)
Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429.
(2)
Liebig M., Meller M. & Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten — Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. March 24-25, 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Germany. pp. 107-119.
Appendice 5
Metodi di allevamento per il Lombricus variegatus
Il Lumbriculus variegatus (MÜLLER), della famiglia dei Lumbriculidae e sottoclasse degli Oligocheti, vive nel sedimento di acqua dolce ed è ampiamente utilizzato nelle prove eco-tossicologiche. Può essere facilmente allevato in condizioni di laboratorio. Segue un'illustrazione dei metodi di allevamento.
Metodi di allevamento
Le condizioni di allevamento del Lumbriculus variegatus sono descritte dettagliatamente in Phipps et al. (1993) (1), Brunson et al. (1998) (2), ASTM (2000) (3), U.S. EPA (2000) (4). Una breve sintesi di tali condizioni è riportata qui di seguito. Uno dei principali vantaggi del L. Variegatus è la riproduzione in tempi brevi, con conseguente rapido aumento della biomassa nelle popolazioni allevate in laboratorio (ad esempio (1), (3), (4), (5)).
I vermi possono essere allevati in grandi acquari (57-80 l) a 23 °C, con un fotoperiodo luce/buio pari a 16:8 (100-1 000 lux) usando acqua naturale rinnovata quotidianamente (45-50 litri per acquario). Il substrato viene preparato mediante fogli assorbenti di carta marrone non sbiancati, tagliati in strisce, che possono quindi essere imbevuti in acqua di coltura per alcuni secondi per trasformarsi in piccoli pezzi di substrato di carta. Questo substrato può essere usato direttamente per l'allevamento del Lumbriculus: lo si può usare per coprire il fondo del serbatoio oppure lo si può congelare in acqua deionizzata per un impiego successivo. Il nuovo substrato nel serbatoio di norma durerà per circa due mesi.
Ciascun allevamento di vermi inizia con 500-1 000 esemplari, nutriti con 10 ml di sospensione contenente 6 grammi di alimento iniziale per trote 3 volte a settimana, con rinnovo o flusso continuo dell'acqua. Per allevamenti statici o semistatici vanno previste frequenze minori di somministrazione del cibo al fine di evitare la proliferazione di funghi e batteri..
In tali condizioni il numero di esemplari dell'allevamento raddoppia generalmente in 10-14 giorni.
In alternativa, il Lumbriculus variegatus può anche essere allevato in un sistema costituito da uno strato di sabbia di quarzo come quello utilizzato per il sedimento artificiale (1-2 cm di spessore) e da acqua ricostituita. Come recipienti di allevamento possono essere usati contenitori in vetro o acciaio inossidabile con un'altezza da 12 a 20 cm. Il corpo idrico dei recipienti deve essere leggermente aerato (ad esempio 2-4 bolle al secondo) per mezzo di una pipetta Pasteur posizionata a circa 2 cm sopra la superficie del sedimento. Per evitare l'accumulo di ammoniaca, ad esempio, l'acqua sovrastante deve essere cambiata mediante un sistema a flusso continuo oppure, almeno una volta alla settimana, manualmente. Gli oligocheti possono essere tenuti a temperatura ambiente, con un fotoperiodo di 16 ore di luce (a un'intensità luminosa di 100-1 000 lux) e 8 ore di buio. Nella cultura semistatica (di rinnovo dell'acqua una volta a settimana), gli animali sono alimentati con TetraMin due volte alla settimana (ad esempio, 0,6-0,8 mg/cm2 di superficie del sedimento), che può essere applicato sotto forma di sospensione di 50 mg di TetraMin per ml di acqua deionizzata.
Il Lumbriculus variegatus può essere rimosso dagli allevamenti e riposto in un nuovo becher separato, ad esempio trasferendo il substrato con una rete a maglie molto fini o spostando gli stessi organismi con una pipetta di vetro lucidata a fuoco ad apertura larga (circa 5 mm di diametro). Se il substrato è co-trasferito nel nuovo becher, il becher contenente vermi e substrato è lasciato per una notte in condizioni di flusso continuo, il che eliminerà il substrato del becher, mentre i vermi rimarranno sul fondo del recipiente. In seguito i vermi potranno essere introdotti nei nuovi serbatoi di allevamento preparati o trattati ulteriormente ai fini della prova, come descritto in (3) e (4) o seguenti.
Un aspetto da considerare in modo critico quando si usa il L. variegatus nelle prove con sedimento è la sua modalità di riproduzione (architomia o morfallassi, ad es.(6)). Tale riproduzione asessuata produce due frammenti, che non si alimentano per un dato periodo, finché la testa o la coda non si rigenera (ad esempio, (7), (8)). Ciò significa che nel L. variegatus l'esposizione tramite ingestione di sedimento contaminato non avviene senza soluzione di continuità.
Pertanto è necessario procedere a una sincronizzazione al fine di ridurre al minimo la riproduzione e rigenerazione incontrollata e le conseguenti forti variazioni nei risultati della prova. Tali variazioni possono verificarsi se alcuni esemplari che si sono frammentati, e pertanto non si sono alimentati per un determinato periodo di tempo, sono meno esposti alla sostanza chimica in esame rispetto ad altri esemplari che non si sono frammentati nel corso della prova (9), (10), (11). Da 10 a 14 giorni prima dell'inizio dell'esposizione, i vermi vanno frammentati artificialmente (sincronizzazione). Per la sincronizzazione vanno selezionati vermi grandi (adulti), che preferibilmente non evidenziano segni di recente morfallassi. Questi vermi possono essere posti su un vetrino in una goccia di acqua di allevamento e sezionati con un bisturi nella regione mediana del corpo. Occorre fare attenzione affinché le estremità posteriori presentino dimensioni simili. Le estremità posteriori dovranno poi rigenerare nuove teste in un recipiente di allevamento che contiene lo stesso substrato di quello usato nell'allevamento e in acqua ricostituita fino all'inizio dell'esposizione. La rigenerazione di nuove teste è indicata dal fatto che i vermi sincronizzati si infossano nel substrato (la presenza di teste rigenerate può essere confermata dall'ispezione di un sottocampione rappresentativo di esemplari con un microscopio binoculare). È previsto che in seguito gli organismi sperimentali presentino uno stato fisiologico simile. Ciò significa che, quando la riproduzione per morfallassi avviene con vermi sincronizzati durante la prova, si prevede che praticamente tutti gli animali siano esposti in egual misura al sedimento addizionato. L'alimentazione dei vermi sincronizzati dovrebbe avvenire una volta, non appena i vermi cominciano a infossarsi nel substrato, o 7 giorni dopo la dissezione. Il regime di alimentazione deve essere comparabile con gli allevamenti normali, ma può essere opportuno nutrire i vermi sincronizzati con la stessa fonte alimentare utilizzata nella prova. I vermi vanno tenuti alla temperatura di prova, a 20 ± 2 °C. Dopo la rigenerazione, vanno usati per la prova i vermi completi e intatti che nuotano attivamente o si muovono dopo un leggero stimolo meccanico. Lesioni o autotomia dei vermi vanno evitati, ad esempio mediante l'uso di pipette con bordi lucidati a fuoco, o pinze dentarie in acciaio inossidabile quando si manipolano i vermi.
Fonti per allevamenti iniziali del Lumbriculus variegatus (indirizzi negli Stati Uniti adattati in base a (4))
Europa
ECT Oekotoxikologie GmbH
Böttgerstr. 2-14
D-65439 Flörsheim/Main
Germania
Bayer Crop Science AG
Sviluppo — Ecotossicologia
Alfred-Nobel-Str. 50
D-40789 Monheim
Germania
University of Joensuu
Laboratory of Aquatic Toxicology
Dept. of Biology
Yliopistokatu 7, P.O. Box 111
FIN-80101 Joensuu
Finlandia
Dresden University of Technology
Institut für Hydrobiologie
Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften
Mommsenstr. 13
D-01062 Dresden
Germania
C.N.R.- I.R.S.A.
Consiglio Nazionale delle Ricerche italiano
Istituto di ricerca delle acque
Via Mornera 25
I-20047 Brugherio MI
U.S.A.
U.S. Environmental Protection Agency
Mid-Continent Ecological Division
6201 Congdon Boulevard
Duluth, MN 55804
Michigan State University
Department of Fisheries and Wildlife
No. 13 Natural Resources Building
East Lansing, MI 48824-1222
U.S. Environmental Protection Agency
Environmental Monitoring System Laboratory
26 W. Martin Luther Dr.
Cincinnati, OH 45244
Wright State University
Institute for Environmental Quality
Dayton, OH 45435
Columbia Environmental Research Center
U.S. Geological Survey
4200 New Haven Road
Columbia, MO 65201
Great Lakes Environmental Research
Laboratory, NOAA
2205 Commonwealth Boulevard
Ann Arbor, MI 48105-1593
RIFERIMENTI
(1)
Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. and Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279.
(2)
Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. & Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201.
(3)
ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
(4)
U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
(5)
Kukkonen, J. and Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468.
(6)
Drewes C.D. & Fourtner C.R. (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94-103.
(7)
Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196-2202.
(8)
Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194.
(9)
Brust, K., O. Licht, V. Hultsch, D. Jungmann & R. Nagel (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, Vol. 20, pp. 2000–2007.
(10)
Oetken, M., K.-U. Ludwichowski & R. Nagel (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. By order of the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, March 2000.
(11)
Leppänen M.T. & Kukkonen J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Hung. Toxicol. 32, 1503-1508.
Appendice 6
Sintesi dei risultati delle prove interlaboratorio
“Prove di tossicità nel sedimento con Lumbriculus variegatus
”
Tabella 1
Risultati delle prove interlaboratorio individuali: quantità media dei vermi nei controlli e nei controlli con solvente alla fine della prova; DS = deviazione standard; CV = coefficiente di variazione.
quantità media di vermi nei controlli
DS
CV (%)
n
quantità media di vermi nei controlli con solvente
DS
CV (%)
n
32,3
7,37
22,80
3
39,0
3,61
9,25
3
40,8
6,55
16,05
6
36,0
5,29
14,70
3
41,5
3,54
8,52
2
38,5
7,05
18,31
4
16,3
5,99
36,67
6
30,8
6,70
21,80
4
24,3
10,69
43,94
3
26,3
3,06
11,60
3
28,5
8,29
29,08
4
30,7
1,15
3,77
3
28,3
3,72
13,14
6
28,8
2,56
8,89
6
25,3
5,51
21,74
3
27,7
1,53
5,52
3
23,8
2,99
12,57
4
21,3
1,71
8,04
4
36,8
8,80
23,88
6
35,0
4,20
11,99
6
33,0
3,58
10,84
6
33,5
1,73
5,17
4
20,7
2,73
13,22
6
15,0
6,68
44,56
4
42,0
7,07
16,84
6
43,7
0,58
1,32
3
18,2
3,60
19,82
6
21,7
4,04
18,65
3
32,0
3,95
12,34
6
31,3
4,79
15,32
4
Media interlaboratorio
29,59
20,10
30,61
13,26
DS
8,32
10,03
7,57
10,48
n
15
15
min
16,3
15,0
max
42,0
43,7
CV (%)
28,1
24,7
Tabella 2
Risultati delle prove interlaboratorio individuali: media del peso secco totale dei vermi per replica nei controlli e nei controlli con solvente alla fine della prova; DS = deviazione standard; CV = coefficiente di variazione.
Peso secco totale dei vermi per replica (controlli)
DS
CV (%)
n
Peso secco totale dei vermi per replica (controlli con solvente)
DS
CV (%)
n
24,72
6,31
25,51
3
27,35
4,08
14,93
3
30,17
2,04
6,75
6
33,83
10,40
30,73
3
23,65
3,61
15,25
2
28,78
4,68
16,28
4
12,92
6,83
52,91
6
24,90
6,84
27,47
4
21,31
4,17
19,57
3
25,87
5,30
20,49
3
22,99
4,86
21,16
4
24,64
5,09
20,67
3
18,91
1,91
10,09
6
19,89
1,77
8,89
6
24,13
1,63
6,75
3
25,83
2,17
8,41
3
22,15
3,18
14,34
4
22,80
2,60
11,40
4
35,20
8,12
23,07
6
31,42
8,45
26,90
6
41,28
5,79
14,02
6
41,42
4,37
10,55
4
15,17
5,78
38,09
6
10,50
3,42
32,53
4
35,69
8,55
23,94
6
38,22
1,23
3,21
3
19,57
5,21
26,65
6
28,58
6,23
21,81
3
29,40
2,16
7,34
6
31,15
2,70
8,67
4
Media interlaboratorio
25,15
20,36
27,68
17,53
DS
7,87
12,56
7,41
9,10
n
15
15
min
12,9
10,5
max
41,3
41,4
CV (%)
31,3
26,8
Tabella 3
Tossicità del PCP: sintesi degli endpoint della prova interlaboratorio; medie interlaboratorio per EC50, NOEC e LOEC, DS = deviazione standard, CV = coefficiente di variazione.
Parametro biologico
Media inter-laboratorio (mg/kg)
min
max
Fattore inter-laboratorio
DS
CV (%)
Media geometrica (mg/kg)
Numero complessivo di vermi
EC50
23,0
4,0
37,9
9,4
10,7
46,3
19,9
NOEC
9,9
2,1
22,7
10,7
7,2
72,3
7,6
LOEC
27,9
4,7
66,7
14,2
19,4
69,4
20,9
DMR (%)
22,5
7,1
39,1
Peso secco totale dei vermi
EC50
20,4
7,3
39,9
5,5
9,1
44,5
18,2
NOEC
9,3
2,1
20,0
9,4
6,6
70,4
7,4
LOEC
25,7
2,1
50,0
23,5
16,8
65,5
19,4
DMR (%)
24,8
10,9
44,7
Mortalità/sopravvivenza
LC50
25,3
6,5
37,2
5,7
9,4
37,4
23,1
NOEC
16,5
2,1
40,0
18,8
10,3
62,4
12,8
LOEC
39,1
4,7
66,7
14,2
18,1
46,2
32,6
Riproduzione (aumento del numero di vermi per replica)
EC50
20,0
6,7
28,9
4,3
7,6
37,9
18,3
NOEC
7,9
2,1
20,0
9,4
5,2
66,0
6,4
LOEC
22,5
2,1
50,0
23,5
15,4
68,6
16,0
DMR (%)
29,7
13,9
47,9
Crescita (aumento della biomassa per replica)
EC50
15,3
5,7
29,9
5,2
7,1
46,5
13,7
NOEC
8,7
2,1
20,0
9,4
6,0
68,1
6,9
LOEC
24,0
2,1
50,0
23,5
15,7
65,5
17,3
DMR (%)
32,2
13,6
65,2
DMR: differenza minima rilevabile rispetto ai valori di controllo nella verifica di ipotesi; usata come misura del potere statistico.
RIFERIMENTI
Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429.
C.36 PROVA DI INIBIZIONE DEL TASSO RIPRODUTTIVO DI UN ACARO PREDATORE (HYPOASPIS (GEOLAELAPS) ACULEIFER) IN CAMPIONI DI SUOLO
INTRODUZIONE
1.
Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 226 (2008). Il metodo di prova è formulato per valutare gli effetti delle sostanze chimiche contenute nel terreno sul tasso di riproduzione di una specie di acaro del suolo Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer (Canestrini) (Acari: Laelapidae) e permette pertanto di stimare l'inibizione del tasso di crescita della popolazione della specie in esame (1,2). Nella fattispecie, per tasso di riproduzione si intende il numero di esemplari giovani (cioè gli esemplari che non hanno ancora raggiunto lo stadio adulto) presenti al termine del periodo di prova. La specie H. aculeifer costituisce un livello trofico aggiuntivo rispetto alle specie per le quali sono già disponibili metodi di prova. Ai fini del presente metodo è considerata appropriata una prova di riproduzione che non comporta né discriminazione né quantificazione delle varie fasi del ciclo riproduttivo. Per le sostanze chimiche i cui scenari di esposizione non si realizzano nel terreno, vanno presi in considerazione approcci alternativi (3).
2.
L'acaro della specie Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer è considerato un valido rappresentante della pedofauna e degli acari predatori in particolare. È diffuso in tutto il mondo (5) e può essere facilmente raccolto e coltivato in laboratorio. L'appendice 7 illustra in sintesi la biologia dell'H. aculeifer. Informazioni generali sull'ecologia delle specie di acari e sul loro utilizzo nelle prove di ecotossicità sono riportate in (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12).
PRINCIPIO DELLA PROVA
3.
Esemplari adulti di femmine sono esposti a un intervallo di concentrazioni della sostanza chimica in esame mescolata al terreno. All'inizio della prova, 10 femmine adulte sono collocate in ciascun recipiente sperimentale. I maschi non sono inclusi nella prova poiché l'esperienza dimostra che — in presenza dei maschi — le femmine si accoppiano subito dopo aver superato lo stadio di deutoninfa. Inoltre, l'inclusione di maschi richiederebbe una laboriosa discriminazione delle fasi di sviluppo, con l'effetto di prolungare la prova. Di conseguenza, la fase dell'accoppiamento non rientra nella procedura di prova. Le femmine sono introdotte nella prova 28-35 giorni dopo l'inizio del periodo di deposizione delle uova in sincronizzazione (cfr. appendice 4), poiché si può ritenere che a quel punto le femmine si siano già accoppiate e abbiano superato la fase di pre-ovideposizione. Alla temperatura di 20 °C, la prova termina il 14° giorno dopo l'introduzione delle femmine (giorno 0), durata che consente alla prima progenie del gruppo di controllo di giungere allo stadio di deutoninfa (cfr. appendice 4). Come principale variabile di misurazione si calcola il numero di esemplari giovani per ciascun recipiente di prova nonché il numero di femmine sopravvissute. Il tasso riproduttivo degli acari esposti alla sostanza chimica in esame è confrontato con quello dei campioni di controllo al fine di determinare la ECx (per esempio EC10, EC50) o la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC) (cfr. l'appendice 1 per le definizioni), a seconda del disegno sperimentale prescelto (cfr. paragrafo 29). Una descrizione generale del calendario della prova è contenuta nell'appendice 8.
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
4.
È auspicabile conoscere l'idrosolubilità, il log Kow, il coefficiente di ripartizione acqua/terreno e la pressione di vapore della sostanza chimica in esame. È utile raccogliere informazioni supplementari sull'evoluzione della sostanza chimica in esame nel terreno, segnatamente i tassi di degradazione biotica e abiotica.
5.
Il presente metodo di prova può essere utilizzato per sostanze chimiche idrosolubili o insolubili in acqua. Tuttavia, la modalità di applicazione della sostanza chimica in esame varierà di conseguenza. Questo metodo di prova non si applica alle sostanze volatili, vale a dire le sostanze la cui costante di Henry o il coefficiente di ripartizione acqua/aria sono superiori a 1, o le sostanze la cui pressione di vapore supera 0,0133 Pa a 25 °C.
VALIDITÀ DELLA PROVA
6.
Il risultato della prova è considerato valido se i controlli non trattati soddisfano i seguenti criteri:
—
la mortalità media delle femmine adulte non supera il 20 % al completamento della prova;
—
il numero medio di esemplari giovani per replica (dove sono state introdotte 10 femmine adulte) è pari ad almeno 50 al completamento della prova;
—
il coefficiente di variazione calcolato per il numero di esemplari giovani di acari per replica non supera il 30 % al completamento della prova finale.
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO
7.
Per garantire che le condizioni sperimentali del laboratorio siano adeguate e per verificare che la risposta degli organismi sperimentali rimanga costante nel corso del tempo, deve essere effettuato il calcolo della ECx e/o NOEC della sostanza chimica di riferimento. Il dimetoato (CAS 60-51-5) rappresenta un'adeguata sostanza chimica di riferimento di cui è stato dimostrato l'effetto sulla dimensione della popolazione (4). L'acido borico (CAS 10043-35-3) può essere utilizzato in alternativa, ma gli studi su tale sostanza di riferimento sono meno numerosi. Sono disponibili due opzioni sperimentali:
—
la sostanza di riferimento può essere testata in parallelo alla determinazione della tossicità di ciascuna sostanza chimica in esame ad una concentrazione che — come deve essere preliminarmente dimostrato da uno studio dose-risposta — induce una riduzione della prole superiore al 50 %. In tal caso, il numero delle repliche deve essere identico a quello dei controlli (cfr. paragrafo 29).
—
In alternativa, si può sottoporre la sostanza chimica di riferimento ad una prova dose-risposta 1-2 volte all'anno. A seconda del disegno sperimentale scelto variano il numero di concentrazioni e di repliche così come il fattore di distanza (cfr. paragrafo 29), ma si deve ottenere una risposta pari al 10-90 % dell'effetto (fattore di distanza: 1,8). La EC50 del dimetoato calcolata sulla base del numero di esemplari giovani dev'essere compresa tra 3,0 e 7,0 mg di sostanza attiva/kg di terreno (in peso secco). Sulla base dei risultati conseguiti finora con l'acido borico, la EC50 basata sul numero degli esemplari giovani deve essere compresa nell'intervallo di 100-500 mg/kg di terreno (in peso secco).
DESCRIZIONE DEI FATTI
Recipienti e apparecchiatura di prova
8.
Occorre utilizzare recipienti in vetro o in altro materiale chimicamente inerte del diametro di 3-5 cm (altezza del terreno ≥ 1,5 cm), muniti di un coperchio a chiusura ermetica. È preferibile utilizzare i tappi a vite: in tal caso bisogna aerare i recipienti due volte a settimana. È altresì possibile utilizzare coperchi che consentono uno scambio gassoso diretto tra il substrato e l'atmosfera (ad es. garza). Il tasso di umidità deve essere sufficientemente elevato durante la prova, ed è pertanto essenziale verificare il peso di ciascun recipiente di prova durante la prova e aggiungere acqua se necessario. Tale controllo è particolarmente importante se non si dispone di tappi a vite. Se i recipienti sono opachi, il coperchio deve essere costituito di materiale che consenta alla luce di filtrare (ad esempio un coperchio trasparente perforato), ma impedisca la fuga degli acari. Le dimensioni e il tipo del recipiente di prova dipendono dal metodo di estrazione (cfr. appendice 5 per ulteriori dettagli). Quando si procede a un'estrazione mediante calore direttamente nel recipiente di prova, si deve aggiungere sul fondo una rete a maglie di dimensioni adeguate (che rimarrà sigillata fino all'estrazione), e lo spessore del terreno deve essere sufficiente per individuare un gradiente di temperatura e di umidità.
9.
La prova richiede un'apparecchiatura standard di laboratorio, in particolare:
—
recipienti di vetro, preferibilmente con tappi a vite;
—
camera di essiccazione;
—
stereomicroscopio;
—
pennelli per il trasferimento degli acari;
—
pH-metro e luxmetro;
—
bilance sufficientemente accurate;
—
adeguati strumenti di controllo della temperatura;
—
adeguati strumenti di controllo dell'umidità dell'aria (facoltativi se i recipienti sono dotati di coperchio);
—
incubatore o piccola camera a temperatura controllata;
—
apparecchiatura di estrazione (cfr. appendice 5) (13);
—
pannello luminoso sospeso con regolazione della luce;
—
barattoli di raccolta per gli acari estratti.
Preparazione del terreno artificiale
10.
Per questa prova viene utilizzato un terreno artificiale. Esso consiste dei seguenti componenti (tutti i valori sono commisurati alla massa secca):
—
5 % di torba di sfagno, essiccata all'aria e finemente macinata (è accettabile una granulometria di 2 ±1 mm);
—
20 % di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %);
—
74 % ca. di sabbia industriale essiccata all'aria (a seconda della quantità di CaCO3 necessaria), sabbia a grana prevalentemente fine con oltre il 50 % di particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 micron. Il quantitativo esatto di sabbia dipende dalla quantità di CaCO3 (cfr. infra): la quota combinata dei due componenti deve raggiungere il 75 %;
—
< 1,0 % di carbonato di calcio (CaCO3 in polvere, grado analitico) per ottenere un pH di 6,0 ± 0,5; la quantità di carbonato di calcio da aggiungere dipende soprattutto dalla qualità e dalla natura della torba (cfr. nota 1).
Nota 1: La quantità di CaCO3 necessaria dipenderà dai componenti del substrato del terreno e deve essere determinata misurando il pH su campioni prelevati nel terreno immediatamente prima della prova (14).
Nota 2: Il tenore di torba nel terreno artificiale differisce da quello raccomandato negli altri metodi di prova su organismi del suolo, in cui si utilizza nella maggior parte dei casi il 10 % di torba [ad esempio (15)]. Tuttavia, secondo l'EPPO (16), un tipico terreno agricolo non contiene più del 5 % di materia organica e la riduzione del tenore di torba riflette quindi la ridotta capacità di un terreno naturale di assorbire la sostanza chimica in esame rispetto al carbonio organico.
Nota 3: Se necessario, ad esempio per specifiche finalità sperimentali, possono essere utilizzati come substrato di prova e/o di coltura terreni naturali provenienti da siti non inquinati. Tuttavia, quando si utilizza un terreno naturale, occorre caratterizzarlo almeno in base ad origine (sito di prelievo), pH, consistenza (distribuzione granulometrica) e tenore di materia organica. Se disponibili, vanno indicati il tipo e la denominazione del terreno in base alla relativa classificazione e il terreno deve essere esente da contaminazioni. Se la sostanza chimica in esame è un metallo o un composto organometallico, si deve inoltre stabilire la capacità di scambio cationico (CESC) del terreno naturale. Si deve prestare particolare attenzione a soddisfare i criteri di validità, poiché i dati di riferimento sui terreni naturali sono generalmente scarsi.
11.
I componenti secchi del terreno sono mescolati accuratamente (ad esempio in un grande miscelatore da laboratorio). Il pH è determinato mediante un miscuglio di terreno e una soluzione 1 M di cloruro di potassio (KCl) o una soluzione 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) in un rapporto 1:5 [cfr. (14) e appendice 3). Se l'acidità del suolo è superiore al limite richiesto (cfr. paragrafo 10), essa può essere adeguata mediante un quantitativo adeguato di CaCO3. Se il suolo è troppo alcalino, il pH può essere ridotto con l'aggiunta di un supplemento della miscela contenente i primi tre componenti descritti al paragrafo 10, ad esclusione del CaCO3.
12.
La capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno artificiale è determinata conformemente ai protocolli descritti nell'appendice 2. Da due a sette giorni prima dell'inizio della prova, il terreno artificiale secco è preinumidito mediante aggiunta di una quantità sufficiente di acqua distillata o deionizzata fino a raggiungere circa la metà del tenore d'umidità finale, ossia il 40-60 % della WHC massima. Il tasso d'umidità viene portato al 40-60 % della capacità massima di ritenzione idrica aggiungendo la soluzione con la sostanza chimica in esame e/o acqua distillata o deionizzata (cfr. paragrafi 16-18). È possibile stimare approssimativamente il tasso di umidità del terreno premendo delicatamente un pugno di terreno in mano: se il tasso di umidità è corretto, appaiono piccole gocce d'acqua tra le dita.
13.
Il tenore di umidità del terreno è determinato all'inizio e alla fine della prova mediante essiccazione a 105 °C a peso costante, conformemente alla norma ISO 11465 (17), e la determinazione del pH del terreno avviene conformemente all'appendice 3 o alla norma ISO 10390 (14). Tali misurazioni devono essere realizzate in campioni supplementari senza acari, prelevati sia dal terreno di controllo sia da terreni contenenti ciascuna concentrazione sperimentale. Il pH del terreno non va aggiustato quando si testano sostanze acide o basiche. Occorre verificare il tenore di umidità durante tutta la prova mediante pesatura periodica dei recipienti (cfr. paragrafi 20 e 24).
Selezione e preparazione degli animali sperimentali
14.
La specie utilizzata nella prova è Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer, (Canestrini, 1883). Per dare inizio alla prova sono necessari esemplari adulti di femmine, ottenuti da una coorte sincronizzata. Gli acari sono introdotti circa 7-14 giorni dopo il passaggio allo stadio adulto, da 28 a 35 giorni dopo l'inizio della deposizione delle uova in fase di sincronizzazione (cfr. paragrafo 3 e appendice 4). Vanno registrati la fonte degli acari o il fornitore così come la manutenzione della coltura di laboratorio. Se si mantiene una coltura di laboratorio, si raccomanda di confermare l'identità della specie almeno una volta all'anno. L'appendice 6 contiene una scheda di identificazione.
Preparazione delle concentrazioni sperimentali
15.
La sostanza chimica in esame viene mescolata al terreno. La scelta dei solventi organici utilizzati per facilitare il trattamento del suolo con la sostanza chimica in esame va effettuata sulla base di criteri di bassa tossicità per gli acari; un adeguato controllo con solvente deve essere incluso nel disegno sperimentale (cfr. paragrafo 29).
Sostanza idrosolubile
16.
Una soluzione della sostanza chimica in esame è preparata in acqua deionizzata in quantità sufficiente per tutte le repliche con la stessa concentrazione sperimentale. Si raccomanda di utilizzare la quantità d'acqua necessaria per ottenere il tenore di umidità richiesto, ossia il 40-60 % della capacità massima di ritenzione idrica (cfr. paragrafo 12). Ciascuna soluzione della sostanza chimica in esame è mescolata accuratamente con un lotto di terreno pre-inumidito, prima di essere inserita nel recipiente di prova.
Sostanza insolubile in acqua
17.
Le sostanze chimiche insolubili nell'acqua, ma solubili in solventi organici possono essere dissolte nel minor volume possibile di un appropriato mezzo disperdente (ad esempio acetone). Vanno utilizzati soltanto solventi volatili. Quando si utilizzano tali solventi, tutte le concentrazioni di prova e il campione di controllo ne devono contenere la stessa quantità minima. Il solvente viene nebulizzato su o mescolato con una piccola quantità, ad esempio, 10 g, di sabbia fine di quarzo. Occorre rettificare il contenuto totale di sabbia nel substrato per tener conto di tale quantità. Inoltre, il solvente viene rimosso per evaporazione sotto cappa aspirante per almeno un'ora. Questa miscela di sabbia di quarzo e sostanza chimica in esame è incorporata al terreno preinumidito, mescolando a fondo dopo l'aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il grado di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova. Si noti che taluni solventi possono essere tossici per gli acari. Pertanto, si raccomanda di utilizzare un campione di controllo d'acqua aggiuntivo senza solvente se la sua tossicità non è nota. Se è adeguatamente dimostrata l'assenza di effetti del solvente (alle concentrazioni utilizzate) il controllo d'acqua non è necessario.
Sostanza poco solubile in acqua e nei solventi organici
18.
Per le sostanze chimiche poco solubili in acqua e nei solventi organici, si mescolano l'equivalente di 2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata per recipiente di prova (ad esempio, 10 g di sabbia fine di quarzo per quattro repliche) alla quantità di sostanza chimica in esame per ottenere la concentrazione sperimentale voluta. Occorre rettificare il contenuto totale di sabbia nel substrato per tener conto di tale quantità. Questa miscela di sabbia di quarzo e sostanza in esame è incorporata al terreno preinumidito, mescolando a fondo dopo l'aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il grado di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova. La procedura è ripetuta per ciascuna concentrazione sperimentale, preparando anche un idoneo controllo.
PROCEDURA
Gruppi di prova e gruppi di controllo
19.
Si raccomanda di usare 10 femmine adulte in 20 g di peso secco di terreno artificiale in ciascun recipiente di prova e di controllo. Gli organismi sperimentali devono essere aggiunti entro due ore dalla preparazione del substrato di prova finale (ossia dopo l'applicazione della sostanza chimica in esame). In alcuni casi specifici (ad esempio, se l'invecchiamento è considerato un fattore determinante), il tempo trascorso tra la preparazione del substrato di prova finale e l'aggiunta di acari può essere prolungato [per i dettagli sull'invecchiamento, cfr. (18)]. Occorre tuttavia fornire una giustificazione scientifica di tale decisione.
20.
Una volta aggiunti gli acari nel terreno, gli animali sono alimentati e il peso iniziale di ciascun recipiente di prova deve essere misurato e utilizzato come riferimento per monitorare il tenore di umidità del suolo per tutta la durata della prova, come descritto al paragrafo 24. I recipienti di prova vanno quindi coperti, come descritto nel paragrafo 8, e inseriti nella camera sperimentale.
21.
Sono preparati controlli appropriati per ciascuno dei metodi di applicazione della sostanza chimica in esame, presentati nei paragrafi da 15 a 18. La preparazione dei controlli si conforma ai protocolli descritti, tranne per il fatto che non viene aggiunta la sostanza chimica in esame. Pertanto, se del caso, nei controlli sono utilizzati solventi organici, sabbia di quarzo o altri mezzi disperdenti in concentrazioni/quantità equivalenti a quelle dei trattamenti. Quando si utilizza un solvente o un altro mezzo disperdente per addizionare la sostanza chimica in esame, occorre predisporre e testare anche un controllo supplementare privo del mezzo disperdente o della sostanza in esame ogniqualvolta sia ignota la tossicità del solvente (cfr. paragrafo 17).
Condizioni sperimentali
22.
La temperatura di prova deve essere di 20 ± 2 °C e deve essere registrata almeno una volta al giorno e corretta, se necessario. La prova è svolta in condizioni di cicli controllati di luce e di buio (preferibilmente 16 ore di luce e 8 di buio) con un illuminamento di 400-800 lux in prossimità dei recipienti di prova. Ai fini di comparabilità, tali condizioni sono identiche a quelle applicate in altri test ecotossicologici in campioni di terreno [ad esempio (15)].
23.
Quando si usano i tappi a vite devono essere assicurati gli scambi gassosi mediante aerazione dei recipienti di prova almeno due volte alla settimana. Se i recipienti sono coperti con garza, va prestata particolare attenzione a mantenere il tenore di umidità del terreno (cfr. paragrafi 8 e 24).
24.
Il tenore di acqua del substrato di terreno nei recipienti di prova va preservato per tutta la durata della prova pesando i recipienti di prova e, se necessario, aggiungendovi periodicamente dell'acqua (ad esempio una volta alla settimana). Le perdite devono essere compensate, come necessario, con acqua deionizzata. Il tasso d'umidità durante la prova non deve discostarsi di oltre il 10 % dal valore iniziale.
Alimentazione
25.
È stato dimostrato che gli acari del formaggio [Tyrophagus putrescentiae (Schrank, 1781)] costituiscono una fonte alimentare adeguata. Possono essere adatti anche piccoli Collemboli [e.g. larve di Folsomia candida (Willem, 1902) o Onychiurus fimatus (19), (20)], Enchitreidi [e.g. Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe, 1992)] o Nematodi [e.g. Turbatrix silusiae (de Man, 1913)] (21). Si raccomanda di controllare il cibo prima di utilizzarlo in una prova. Il tipo e la quantità di cibo devono garantire che sia disponibile un numero sufficiente di esemplari giovani in modo da soddisfare i criteri di validità (paragrafo 6). Nella scelta delle prede occorre considerare il meccanismo d'azione della sostanza chimica in esame (per esempio un acaricida può rivelarsi tossico anche per gli acari che servono come alimento, cfr. paragrafo 26).
26.
L'alimentazione va fornita ad libitum [ma ogni volta in piccole quantità (punta di spatola)]. A tal fine, possono essere utilizzati anche un dispositivo di aspirazione di bassa potenza, come proposto nelle prove sui Collemboli, o un pennello fine. Generalmente sarà sufficiente amministrare il cibo all'inizio della prova e quindi due o tre volte a settimana. Se la sostanza chimica in esame si rivela tossica per la preda, occorrerà considerare un aumento della frequenza di alimentazione e/o l'utilizzo di una fonte alternativa di alimenti.
Selezione delle concentrazioni sperimentali
27.
È utile raccogliere informazioni preliminari sulla tossicità della sostanza chimica in esame, derivanti ad esempio da studi per definire gli intervalli di concentrazione (range-finding studies), ai fini della scelta delle adeguate concentrazioni sperimentali. Se necessario, si conduce un test preliminare per definire gli intervalli di concentrazione con cinque concentrazioni della sostanza chimica in esame nell'intervallo di 0,1-1 000 mg/kg di terreno secco, con almeno una replica per ciascun trattamento e un gruppo di controllo. Il range-finding test deve durare 14 giorni, al termine dei quali sono determinati la mortalità degli acari adulti e il numero degli esemplari giovani. Nella prova finale è preferibile scegliere un intervallo di concentrazioni che includa le concentrazioni che producono un effetto sul numero degli esemplari giovani ma non sulla sopravvivenza della generazione progenitrice. Ciò è tuttavia escluso per le sostanze chimiche che causano effetti letali e subletali a concentrazioni analoghe. La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE50, CE25, CE10) e l'intervallo delle concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un effetto d'interesse devono rientrare tra le concentrazioni incluse nella prova. L'estrapolazione di valori molto inferiori alla concentrazione più bassa che incide sugli organismi sperimentali o superiori alla concentrazione sperimentale massima testata va effettuata solo in casi eccezionali e giustificata in modo dettagliato nella relazione.
Disegno sperimentale
Test di dose/risposta
28.
Sono proposti tre disegni sperimentali, basati sulle raccomandazioni di un'altra prova interlaboratorio (ring test) [prova di riproduzione di Enchitreidi (22)]. L'adeguatezza generale di questi tre disegni sperimentali è stata confermata dai risultati della validazione della specie H. aculeifer.
29.
Nel definire l'intervallo delle concentrazioni è necessario tenere conto dei seguenti elementi:
—
Per determinare la ECx (per esempio EC10, EC50) è necessario testare 12 concentrazioni. Si raccomanda di prevedere almeno due repliche per ciascuna concentrazione sperimentale e 6 campioni di controllo. Il fattore di distanza può variare, ma deve essere inferiore o pari a 1,8 nell'intervallo degli effetti previsti e superiore a 1,8 a concentrazioni superiori e inferiori.
—
Per determinare la NOEC, occorre testare almeno cinque concentrazioni in serie geometrica. Si raccomanda di includere quattro repliche per ciascuna concentrazione sperimentale e 8 campioni di controllo. Le concentrazioni devono distanziarsi tra loro di un fattore non superiore a 2,0.
—
Un approccio combinato permette di determinare la NOEC e la ECx, utilizzando otto concentrazioni di prova, disposte in serie geometriche. Si raccomanda di includere quattro repliche di trattamento e 8 controlli. Le concentrazioni devono distanziarsi tra loro di un fattore non superiore a 1,8.
Prova limite
30.
Se la concentrazione massima (ad esempio 1 000 mg/kg) individuata nel test di definizione dell'intervallo delle concentrazioni (range-finding test) non produce alcun effetto, la prova finale di riproduzione può essere effettuata come prova limite, alla concentrazione sperimentale di 1 000 mg/kg di peso secco di terreno. Una prova limite consente di dimostrare che la NOEC o la EC10 per la riproduzione è superiore alla concentrazione limite, utilizzando il numero minimo di acari. Vanno utilizzate 8 repliche sia per il suolo trattato sia per il controllo.
Durata della prova e misurazioni
31.
Vanno registrate tutte le differenze di comportamento e morfologia degli acari osservate nei controlli e nei recipienti trattati.
32.
Il 14o giorno gli acari superstiti sono estratti dal suolo mediante calore/luce o con un altro metodo appropriato (cfr. appendice 5). Gli esemplari giovani (cioè larve, protoninfe e deutoninfe) e adulti sono contati separatamente. Tutti gli acari adulti non recuperati in questa fase devono essere registrati come morti, poiché si suppone che siano morti e decomposti prima della valutazione. Occorre convalidare l'efficienza d'estrazione una o due volte all'anno su controlli contenenti valori noti di adulti e giovani. L'efficienza deve essere superiore in media al 90 %, combinata per tutte le fasi di sviluppo (cfr. appendice 5). I conteggi degli adulti e dei giovani non vanno adeguati in funzione dell'efficienza.
DATI E RELAZIONE
Trattamento dei risultati
33.
I paragrafi da 36 a 41 contengono informazioni sui metodi statistici che possono essere usati per analizzare i risultati della prova. Occorre inoltre consultare il documento n. 54 dell'OCSE Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity data: A Guidance to Application (31).
34.
Il principale parametro da valutare (endpoint) della prova è il tasso di riproduzione, ossia il numero di giovani esemplari generati per ciascuna replica (in cui sono state introdotte 10 femmine adulte). L'analisi statistica richiede il calcolo della media aritmetica (X) e della varianza (s2) del tasso di riproduzione per trattamento e per controllo. X e s2 sono impiegati nelle analisi ANOVA, come il test t di Student, il test di Dunnett o il test di William, oltre che nel calcolo degli intervalli di confidenza al 95 %.
Nota: Questo principale endpoint corrisponde alla fecondità misurata come il numero dei giovani vivi generati durante la prova diviso il numero di progenitrici introdotte all'inizio della prova.
35.
Il numero di femmine sopravvissute nei controlli non trattati è un criterio di validità fondamentale che deve essere documentato. Come nel test di definizione dell'intervallo delle concentrazioni, anche tutti gli altri segni di nocività vanno riportati nella relazione finale.
ECx
36.
I valori ECx e i relativi limiti di confidenza al 95 % superiori e inferiori per il parametro descritto nel paragrafo 34 sono calcolati utilizzando metodi statistici adeguati (ad esempio analisi Probit, funzione logistica o di Weibull, metodo semplificato di Spearman-Karber o interpolazione semplice). Si ottiene un valore ECx inserendo un valore pari a x % della media dei controlli nell'equazione risultante. Per calcolare la EC50 o qualsiasi altra ECx occorre sottoporre le medie per trattamento (X) a un'analisi di regressione.
NOEC/LOEC
37.
Quando si applica un'analisi statistica per determinare la NOEC/LOEC, è necessario disporre di statistiche per recipiente (i singoli recipienti sono considerati repliche). Occorre quindi utilizzare metodi statistici adeguati (conformemente al documento n. 54 dell'OCSE Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity data: A Guidance to Application). In generale, gli effetti nocivi della sostanza chimica in esame rispetto al controllo sono esaminati applicando un'ipotesi unilaterale (inferiore) con un'analisi a p ≤ 0,05. I paragrafi che seguono contengono esempi.
38.
La distribuzione normale dei dati può essere analizzata, ad esempio, mediante il test di bontà dell'adattamento di Kolmogorov-Smirnov, il test del rapporto tra intervalli e deviazione standard (test R/s) o il test di Shapiro-Wilk (bilaterale, p ≤ 0,05). Si può utilizzare il test di Cochran, il test di Levene o il test di Bartlett (bilaterale, p ≤ 0,05) per verificare l'omogeneità della varianza. Se sono soddisfatti i prerequisiti delle procedure di test parametrici (normalità, omogeneità della varianza), possono essere eseguiti un'analisi della varianza ANOVA a un fattore e successivi test multi-comparativi. I confronti multipli (ad esempio, test t di Dunnett) o i test di tendenza regressiva (ad esempio, test di Williams nel caso di una relazione dose-risposta monotona) possono essere utilizzati ai fini del calcolo di eventuali differenze significative (p ≤0,05) tra i controlli e le varie concentrazioni della sostanza chimica in esame (si scelga la prova raccomandata in conformità del documento n. 54 dell'OCSE Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity data: A Guidance to Application). Si possono tuttavia utilizzare metodi non parametrici (test U di Bonferroni secondo il test di tendenza di Holm o di Jonckheere-Terpstra) per determinare la LOEC e la NOEC.
Prova limite
39.
Se è stata svolta una prova limite (confronto tra il controllo e un unico trattamento) e se sono rispettati i presupposti necessari per le procedure delle prove parametriche (normalità, omogeneità), è possibile valutare le risposte metriche mediante il test di Student (t-test). In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey.
40.
Per determinare significative divergenze tra i controlli (campione di controllo e controllo con solvente), le repliche di ciascun controllo possono essere testate come descritto per la prova limite. Se le prove non rilevano alcuna differenza significativa, è possibile raggruppare assieme tutte le repliche di controllo e controlli con solvente. In caso contrario, occorre confrontare tutti i trattamenti con il controllo con solvente.
Relazione sulla prova
41.
La relazione sulla prova deve quantomeno includere le seguenti informazioni:
—
Sostanza chimica in esame
—
identità della sostanza chimica in esame, denominazione, partita, lotto e numero CAS, purezza;
—
proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame (ad esempio log Kow, idrosolubilità, pressione di vapore, costante di Henry (H) e di preferenza, informazioni sull'evoluzione della sostanza chimica in esame nel terreno).
—
Organismi sperimentali
—
individuazione degli organismi sperimentali e relativo fornitore, descrizione delle condizioni colturali;
—
fascia d'età degli organismi sperimentali.
—
Condizioni sperimentali
—
descrizione del disegno sperimentale e della procedura;
—
informazioni dettagliate sulla preparazione del terreno di prova; descrizione dettagliata se si utilizza un terreno naturale (origine, storia, distribuzione granulometrica, pH, tenore di materie organiche e, ove applicabile, classificazione del terreno);
—
capacità massima di ritenzione idrica del terreno;
—
descrizione della tecnica utilizzata per somministrare la sostanza chimica in esame nel terreno;
—
dettagli delle sostanze chimiche ausiliarie utilizzate per somministrare la sostanza chimica in esame;
—
dimensione dei recipienti di prova e massa secca di terreno per recipiente di prova;
—
condizioni sperimentali: intensità luminosa, durata dei cicli luce/buio, temperatura;
—
descrizione del regime di alimentazione, tipo e quantità di cibo fornito durante la prova, date di alimentazione;
—
pH e tenore di umidità del terreno all'inizio e durante la prova (controllo e ciascun trattamento);
—
descrizione dettagliata del metodo di estrazione e dell'efficienza di estrazione.
—
Risultati della prova
—
numero di esemplari giovani determinata in ciascun recipiente di prova al completamento della prova;
—
numero di femmine adulte e mortalità degli adulti ( %) in ciascun recipiente di prova al completamento della prova;
—
descrizione dei sintomi evidenti o modifiche evidenti di comportamento;
—
risultati ottenuti con la sostanza chimica di riferimento in esame;
—
sintesi delle analisi statistiche (ECx e/o NOEC) compresi i limiti di confidenza al 95 % e descrizione del metodo di calcolo;
—
curva della relazione concentrazione-risposta;
—
deviazioni rispetto alle procedure descritte nel presente metodo di prova e eventuali fatti insoliti verificatisi nel corso della prova.
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(11)
Schlosser, H.-J. and Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Boden-raubmilben (Gamasina). Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. N.F. 34, 413-433.
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(14)
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(15)
Capitolo C.8. del presente allegato. Tossicità per i lombrichi.
ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality –Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method, No. 11465. ISO, Geneve.
(18)
Fairbrother, A., Glazebrock, P.W., Van Straalen, N.M. and Tarazona, J.V. 2002. Test methods to determine hazards of sparingly soluble metal compounds in soils. SETAC Press, Pensacola, FL, USA.
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(20)
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(21)
Heckmann, L.-H., Ruf, A., Nienstedt, K. M. and Krogh, P. H. 2007. Reproductive performance of the generalist predator Hypoaspis aculeifer (Acari: Gamasida) when foraging on different invertebrate prey. Applied Soil Ecology 36, 130-135.
(22)
Capitolo C.32 del presente allegato — Prova di riproduzione degli Enchitreidi.
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(31)
OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54. ENV/JM/MONO(2006)18.
Appendice 1
Definizioni
Le seguenti definizioni si applicano ai fini del presente metodo di prova (nella presente prova tutte le concentrazioni che determinano un effetto sono espresse come massa della sostanza chimica in esame in rapporto alla massa secca del terreno di prova):
Sostanza chimica: sostanza o miscela.
NOEC (No Observed Effect Concentration — concentrazione senza effetti osservabili) la concentrazione della sostanza chimica in esame alla quale non si osserva alcun effetto. Nella fattispecie, la concentrazione che corrisponde alla NOEC non ha alcun effetto statisticamente significativo (p < 0,05) rispetto al controllo in un determinato periodo di esposizione.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration — Concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo): la concentrazione più bassa che produce un effetto statisticamente significativo (p < 0,05) rispetto al controllo in un determinato periodo di esposizione.
ECx (concentrazione efficace all'x %): la concentrazione che determina un effetto pari all'x % sugli organismi sperimentali in un determinato periodo di esposizione rispetto al controllo. Ad esempio, EC50 è una concentrazione che si ritiene produca un effetto su un parametro sottoposto a valutazione nel 50 % della popolazione esposta nel corso di un determinato periodo di esposizione.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata in applicazione del presente metodo di prova.
Appendice 2
Determinazione della capacità massima di ritenzione idrica del terreno
Il seguente metodo di determinazione della capacità massima di ritenzione idrica del terreno è considerato adeguato. Esso è descritto nell'allegato C della norma ISO DIS 11268-2 [Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction (23)].
Prelevare una determinata quantità (ad es. 5 g) del substrato del terreno di prova mediante appropriato strumento di campionamento (tubo Auger, ecc.). Coprire il fondo del tubo con un pezzo di carta da filtro imbevuta di acqua, e quindi disporlo su un supporto immerso nell'acqua. Il tubo deve essere progressivamente immerso fino a che il livello dell'acqua supera quello del terreno. Lasciare il tubo in acqua per circa tre ore. Poiché non tutta l'acqua assorbita dai capillari del terreno può essere ritenuta, il campione di terreno deve essere lasciato a drenare per 2 ore collocando il tubo sopra un letto di sabbia di quarzo fine molto umida posto in un recipiente chiuso (per evitare l'essiccamento). Registrare il peso del campione e lasciarlo asciugare ad una temperatura di 105 °C fino al raggiungimento di una massa costante. La capacità di ritenzione idrica (WHC) viene quindi calcolata come segue:
dove:
S= massa del substrato saturato in acqua + massa del tubo + massa della carta da filtro
T= tara (massa del tubo + massa della carta da filtro)
D= massa secca del substrato
Appendice 3
Determinazione del PH del terreno
Il seguente metodo di determinazione del pH del terreno si basa sulla norma ISO 10390: Qualità del terreno — Determinazione del pH (16).
Lasciare asciugare un determinato quantitativo di terreno a temperatura ambiente per almeno 12 ore. Preparare una sospensione del terreno (contenente almeno 5 g di terreno) in cinque volte il suo volume di una soluzione 1 M di cloruro di potassio (KCl) di grado analitico oppure di una soluzione 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) di grado analitico. Agitare vigorosamente la sospensione per cinque minuti e lasciarla depositare per almeno due ore ma non oltre 24 ore. Misurare il pH della fase liquida con un pH-metro, calibrato prima di ciascuna misurazione utilizzando una serie adeguata di soluzioni tampone (pH 4,0 e 7,0, ad esempio).
Appendice 4
Coltura di Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer, di acari degli alimenti e sincronizzazione delle colture
Coltura di Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer:
Le colture possono essere mantenute in contenitori di plastica o flaconi di vetro riempiti di una miscela di gesso di Parigi e di polvere di carbone (9:1). Il gesso deve restare umido con l'aggiunta, se necessario, di alcune gocce di acqua distillata o deionizzata. Le temperature di coltura ottimali sono comprese nell'intervallo 20 ±2 °C, il regime di luce/buio non è determinante per questa specie. Le prede possono essere acari della specie Typrophagus putrescentiae o del genere Caloglyphus (gli acari degli alimenti devono essere manipolati con cautela poiché possono provocare allergie negli esseri umani); i Nematodi, gli Enchitreidi e i Collemboli costituiscono prede altrettanto adeguate. La loro fonte deve essere documentata. La proliferazione della popolazione può avere inizio da un'unica femmina, poiché i maschi si sviluppano nelle uova non fecondate. Si registra un'ampia sovrapposizione tra le generazioni. Una femmina può vivere almeno 100 giorni e deporre circa 100 uova durante il suo ciclo di vita. Il tasso di ovideposizione massima viene raggiunto tra 10 e 40 giorni (nell'età adulta) e ammonta a 2,2 uova per femmina e per giorno. Lo sviluppo dell'uovo fino allo stadio adulto della femmina dura circa 20 giorni alla temperatura di ca. 20 °C. È necessario sviluppare e conservare più di una coltura prima della prova.
Coltura di Typrophagus putrescentiae:
Gli acari sono mantenuti in un recipiente di vetro ricoperto di lievito di birra finemente polverizzato, inserito in un secchiello di plastica riempito di una soluzione di KNO3 che impedisce la fuga degli animali. Gli acari degli alimenti sono inseriti sopra la polvere di lievito. Successivamente essi sono mescolati accuratamente a quest'ultima (che va sostituita due volte a settimana) con l'aiuto di una paletta.
Sincronizzazione della coltura
Gli esemplari utilizzati per la prova devono avere all'incirca la stessa età (circa 7 giorni dopo il passaggio allo stadio adulto). Alla temperatura colturale di 20 °C ciò si ottiene nel modo seguente:
Trasferire le femmine in un recipiente di coltura pulito e aggiungere una quantità sufficiente di cibo:
—
lasciarle deporre per due o tre giorni, quindi rimuoverle;
—
prelevare le femmine adulte per la prova tra il 28° e il 35° giorno dopo l'inizio dell'inserimento delle femmine adulte progenitrici nei recipienti di coltura puliti.
È facile distinguere le femmine adulte dai maschi e da esemplari in altri stadi di sviluppo grazie alla loro dimensione maggiore, la forma globosa, e lo scudo dorsale marrone (i maschi sono più sottili e piatti); gli esemplari immaturi sono di colore bianco-crema. Lo sviluppo degli acari segue all'incirca lo schema descritto di seguito a 20 °C (cfr. figura): uovo (5 giorni), larva (2 giorni), protoninfa (5 giorni), deutoninfa (7 giorni), periodo di preovideposizione della femmina (2 giorni). Al termine di tale periodo, gli acari passano allo stadio adulto.
Figura
Sviluppo di Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer a 20 °C. (rimozione = femmine utilizzate nella prova)
30
20 days
10
0
35d
Removal
28d
Adult
Deutonymph
Protonymph
Larva
Egg
egglaying
Gli animali adulti sono prelevati dalla coltura sincronizzata e introdotti nei recipienti di prova tra il 28° e il 35° giorno dopo l'inizio della deposizione delle uova delle progenitrici (ossia 7-14 giorni dopo il passaggio all'età adulta). Ciò garantisce che le femmine abbiano già superato il periodo di preovideposizione e si siano accoppiate con maschi presenti nel recipiente di coltura. Studi condotti su colture di laboratorio suggeriscono che, se i maschi sono presenti, le femmine si accoppiano al passaggio all'età adulta o subito dopo (Ruf, Vaninnen, oss. pers.). È stato scelto un periodo di sette giorni perché esso si integra facilmente nella routine del laboratorio e riduce la variabilità di sviluppo individuale tra gli acari. L'ovideposizione deve essere avviata con un numero di femmine almeno pari a quello che sarà necessario per la prova (per esempio, se servono 400 femmine ai fini della prova, occorre lasciare che almeno 400 femmine depongano le uova per due o tre giorni. Il numero di uova come punto di partenza per la sincronizzazione della popolazione deve essere di almeno 1 200 (rapporto tra i sessi di ca 0,5, mortalità circa 0,2)]. Per evitare episodi di cannibalismo, è preferibile che ciascun recipiente contenga non più di 20-30 femmine in periodo di deposizione.
Appendice 5
Metodi di estrazione
L'estrazione mediante calore è un metodo adatto per separare i microartropodi da un terreno o un substrato (cfr. figura). Il metodo si basa sull'attività degli organismi e, quindi, solo gli esemplari attivi possono essere registrati. Il principio dell'estrazione mediante calore consiste nel creare progressivamente condizioni più inospitali nel campione in modo da indurre gli organismi a lasciare il substrato e cadere in un liquido di fissaggio (ad esempio etanolo). I parametri fondamentali sono la durata dell'estrazione e il gradiente delle condizioni applicate, che deteriorano da buone a mediocri fino a diventare negative per gli organismi. La durata delle prove ecotossicologiche deve essere la più breve possibile, poiché una eventuale crescita della popolazione durante l'estrazione falsificherebbe i risultati. Inoltre, le condizioni di temperatura e di umidità nel campione devono rimanere entro valori ai quali gli acari siano in grado di muoversi. Il riscaldamento del campione di terreno provoca l'essiccamento del substrato; se ciò avviene troppo velocemente, alcuni acari potrebbero essiccare prima di riuscire a fuggire.
Di conseguenza, si propone la seguente procedura (24) (25):
Apparecchiatura: imbuto di Tullgren o metodi analoghi quali McFadyen (riscaldamento dall'alto, il campione deve essere collocato sopra un imbuto).
Regime di riscaldamento: 25 °C per 12 ore, 35 °C per 12 ore, 45 °C per 24 ore (48 h in totale). La temperatura del substrato va misurata.
Liquido di fissaggio: etanolo al 70 %
Descrizione particolareggiata: Utilizzare il recipiente di vetro che è servito per la prova. Togliere il coperchio e coprire l'imboccatura con un pezzo di rete o di stoffa. La stoffa deve avere una trama dalle dimensioni di 1,0-1,5 mm. Fissare la stoffa con un elastico. Capovolgere con cautela il recipiente e inserirlo nel dispositivo di estrazione. La stoffa impedisce al substrato di percolare nel liquido di fissaggio, ma lascia che gli acari escano dal campione. Avviare il regime di riscaldamento dopo aver inserito tutti i recipienti nel dispositivo. Terminare l'estrazione dopo 48 ore. Rimuovere le fiale di fissaggio e contare gli acari con un microscopio da dissezione.
Occorre che sia dimostrata l'efficacia di estrazione del metodo scelto una o due volte all'anno utilizzando recipienti che contengono un numero noto di esemplari giovani e adulti di acari allevati in un substrato di prova non trattato. L'efficacia deve essere ≥ 90 % (media combinata per tutti gli stadi di sviluppo).
Dispositivo di estrazione di tipo Tullgren
Heat source
Vial of alcohol
Wine mesh barrier
Sample goes here
Come preparare il recipiente di prova al completamento della prova e prima dell'estrazione
Test vessel
Elastic band
Mesh/fabric
Test substrate with mites
Appendice 6
Identificazione di Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
Sottoclasse/Ordine/Sottordine:
Famiglia:
Genere/Sottogenere/Specie:
Acari/Parasitiformes/Gamasida
Laelapidae
Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
Autore e data:
F. Faraji, Ph.D. (MITOX), 23 gennaio 2007
Letteratura utilizzata:
Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. Tierwelt Deutschlands 59, 2nd revised edition: 1-523.
Hughes, A.M. (1976). The mites of stored food and houses. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Technical Bulletin 9: 400 pp.
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Caratteristiche morfologiche:
Epistoma con bordo denticolare arrotondato; solchi ipostomali con più di 6 denticoli; setole dorsali caudali di Z4 non molto lunghe; setole dorsali setiformi; scudo genitale normale, poco sviluppato e che non raggiunge lo scudo anale; metà posteriore dello scudo dorsale senza setole non appaiate; zampe II e IV con qualche spessa macrosetola; setola dorsale Z5 circa due volte più lunga di J5; numero fisso di cheliceri con 12-14 denti e un numero variabile con 2 denti; Idiosoma lungo 520-680 μm.
Anche gli acari Hypoaspismiles sono utilizzati come indicatore biologico e possono essere confusi con la specie H. aculeifer. La principale differenza è la seguente:
gli acari H. miles appartengono al Sottogenere Cosmolaelaps e hanno setole dorsali in forma di lama mentre gli acari H. aculeifer appartengono al Sottogenere Geolaelaps e hanno setole dorsali setiformi.
Zampa II (femmina)
Zampa IV (femmina)
Hypoaspis aculeifer, scudo dorsale con setole caratteristiche
Disegni originali di F. Faraji
Hypoaspis miles (Hughes, 1976)
Hypoaspis aculeifer (Hughes, 1976)
100 μm
100 μm
100 μm
100 μm
100 μm
Appendice 7
Informazioni generali sulla biologia della specie Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
La specie Hypoaspis aculeifer appartiene alla famiglia delle Lealapidae, ordine degli Acari, classe Arachnida, phylum Arthropoda. Tali acari vivono in terreni di ogni tipo e si nutrono di altri Acari, Nematodi, Enchitreidi e Collemboli (26). In caso di penuria alimentare diventano cannibali (27). Il corpo degli acari predatori è caratterizzato da due segmenti: idiosoma e gnatosoma. Manca una netta differenziazione tra l'idiosoma nel prosoma (testa) e l'opistosoma (addome). Lo gnatosoma (scudo della testa) contiene gli strumenti preposti all'alimentazione quali le zampe e i cheliceri. I cheliceri sono trisegmentati e dotati di denti di diverse forme. Oltre che ai fini di ingestione i maschi utilizzano i cheliceri anche per trasferire gli spermatofori alle femmine. Uno scudo dorsale copre quasi completamente l'idiosoma. Gran parte dell'idiosoma della femmina è occupata dagli organi riproduttivi, che sono particolarmente evidenti poco prima dell'ovideposizione. Sulla superficie ventrale si rinvengono due scudi, lo scudo sternale e lo scudo genitale. Tutte le zampe, sono provviste di setole e di spine. Le setole servono ad ancorarsi durante lo spostamento nel terreno o sulla superficie del terreno. Il primo paio di zampe serve essenzialmente come antenne. Il secondo paio di zampe è utilizzato non soltanto per spostarsi, ma anche per immobilizzare la preda. Le spine del 4o paio di zampe fungono da protezione nonché da “motori di locomozione” (28). I maschi misurano da 0,55 a 0,65 mm di lunghezza, pesano da 10 a 15 μg. Le femmine misurano da 0,8 a 0,9 mm di lunghezza, pesano da 50 a 60 μg (8) (28) (Fig 1).
Figura 1
Femmina, maschio, protoninfa e larva di H. aculeifer.
A 23 °C, gli acari raggiungono la maturità sessuale dopo 16 giorni (femmine) e 18 giorni (maschi) (6). Le femmine trasportano gli spermatozoi mediante il solenostoma dal quale sono trasferiti nelle ovaie. Nelle ovaie, gli spermatozoi sono conservati e maturano. La fecondazione avviene solo dopo la maturazione degli spermatozoi nell'ovaio. Gli ovuli fecondati o non fecondati sono depositati dalle femmine in grappoli o separatamente, preferibilmente in crepe o fessure. Le femmine che si sono accoppiate possono generare progenie di entrambi i sessi, mentre dagli ovuli di femmine che non si sono accoppiate escono solo larve di maschi. Nel corso dello sviluppo fino all'età adulta, gli acari attraversano quattro fasi (uovo-larva, larva-protoninfa, protonimfa-deutoninfa, deutoninfa-adulto).
L'uovo è bianco-latte, ialino, ellittico e misura circa 0,37 mm di lunghezza ed è dotato di un solido mantello. In base a (8), la dimensione delle larve è compresa tra 0,42 e 0,45 mm. Le larve hanno solo tre paia di zampe. Nella regione della testa si sviluppano palpi e cheliceri. I cheliceri, muniti di alcuni piccoli denti, sono utilizzati per la schiusa. Dopo la prima muta, 1-2 giorni dopo la schiusa delle uova, si sviluppano le protoninfe, anch'esse bianche, di dimensioni 0,45-0,62 mm (8) che possiedono quattro paia di zampe. I cheliceri sono interamente dotati di denti. A partire da questo stadio gli acari cominciano a cercare nutrimento. A tal fine, gli acari usano i cheliceri per trafiggere la cuticola della preda e iniettarvi una secrezione per la digestione extra-intestinale. Il bolo alimentare può quindi essere succhiato dall'acaro. I cheliceri possono essere utilizzati anche per frammentare grosse porzioni di cibo (28). Dopo una nuova muta gli acari passano allo stadio di deutoninfe, che misurano da 0,60 a 0,80 mm (8) e sono di colore giallo-marrone chiaro. A partire da questo stadio si possono separare in femmine e maschi. Gli acari raggiungono lo stadio adulto dopo un'ulteriore muta, durante la quale gli animali rimangono inattivi e si sviluppa lo scudo marrone (dopo circa 14 giorni) (28) (29) (30). Il ciclo di vita degli acari è compreso tra 48 e 100 giorni a 25 °C (27).
Appendice 8
Sintesi e calendario delle principali azioni da svolgere ai fini della prova
Tempo (giorni)
inizio della prova = giorno 0
Azione / compito
Giorno da - 35
a - 28
Trasferimento delle femmine dalla coltura madre in recipienti puliti per avviare la sincronizzazione
2 giorni dopo: rimozione delle femmine
due o tre volte a settimana: apporto di cibo sufficiente
Giorno - 5 (+/– 2)
Preparazione del terreno artificiale
Giorno - 4 (+/– 2)
Determinazione della capacità di ritenzione idrica del terreno artificiale
Essiccazione durante la notte
Giorno successivo: pesatura dei campioni e calcolo della capacità di ritenzione idrica
Giorno - 4 (+/– 2)
Preinumidimento del terreno artificiale per ottenere una capacità di ritenzione idrica del 20-30 %
Giorno 0
Inizio della prova: aggiunta della sostanza chimica in esame nel terreno artificiale
Introduzione di 10 femmine in ciascuna replica
Pesatura di ciascuna replica
Preparazione di controlli abiotici per misurare il tenore di umidità e il pH, 2 repliche per ciascun trattamento
Essiccazione dei campioni umidi durante la notte
Giorno successivo: pesatura dei controlli umidi
Giorno successivo: misurazione del pH dei controlli abiotici essiccati
Giorno 3, 6, 9, 12 (ca.)
Apporto di una quantità sufficiente di prede in ciascuna replica
Pesatura di ciascuna replica e aggiunta della quantità d'acqua evaporata
Giorno 14
Completamento della prova: estrazione da tutte le repliche e controlli di efficienza dell'estrazione
Essiccazione dei controlli con contenuto d'acqua durante la notte
Giorno successivo: pesatura dei controlli con contenuto d'acqua
Giorno successivo: misurazione del pH dei controlli essiccati
Giorno 16
Completamento dell'estrazione
Giorno 16 +:
Registrazione del numero di adulti e di giovani nel materiale estratto
Registrazione dei risultati in apposite tabelle
Descrizione della procedura di prova negli appositi fogli per i protocolli sperimentali
C.37. SAGGIO DI 21 GIORNI SUI PESCI: SCREENING A BREVE TERMINE DELL' ATTIVITÀ ANDROGENICA, ESTROGENICA E DELL'INIBIZIONE DELL'AROMATASI
INTRODUZIONE
1.
Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida TG 230 (2009) dell'OCSE. La necessità di sviluppare e validare un saggio sui pesci per individuare le sostanze che agiscono a livello endocrino, deriva dai timori che i livelli di sostanze chimiche presenti nell'ambiente possano indurre effetti nocivi sull'uomo e sulla fauna selvatica a causa dell'interazione con il sistema endocrino. Nel 1998, l'OCSE ha avviato un'attività ad elevata priorità allo scopo di revisionare le linee guida esistenti ed elaborarne di nuove per lo screening e la valutazione di potenziali interferenti endocrini. Uno degli elementi di tale attività è stata l'elaborazione di una linea guida per l'individuazione delle sostanze chimiche attive sul sistema endocrino di specie ittiche. Il saggio di 21 giorni dell'attività endocrina su pesci è stato sottoposto ad un completo programma di validazione comprendente studi inter-laboratorio con sostanze chimiche selezionate, allo scopo di dimostrare la rilevanza e l'affidabilità della prova per l'individuazione delle sostanze chimiche inibitrici degli estrogeni e dell'aromatasi (1, 2, 3, 4, 5), nelle tre specie ittiche in esame: Pimephales promelas, di seguito indicati solo come “ciprinidi”), Oryzias latipes (medaka) e Danio rerio (danio zebrato) L'attività androgenica è rilevabile nelle prime due specie, a differenza di quanto avviene nel danio zebrato. Il presente metodo di prova non consente di individuare le sostanze chimiche antagoniste degli androgeni. I lavori di validazione sono stati sottoposti a revisione da parte di un comitato di esperti designati dai Coordinatori Nazionali del Programma delle Linee Guida dell'OCSE (6). Il saggio non mira a individuare specifici meccanismi di disfunzione ormonale giacché gli organismi di saggio possiedono un asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (asse HPG) sano, in grado di reagire alle sostanze che hanno effetti sull'asse HPG a vari livelli. Il saggio di tossicità a breve termine sulla riproduzione di pesci (TG OCSE 229) include la valutazione della fecondità ed eventualmente, l'istopatologia gonadica in Pimephales promelas (ciprinidi), nonché tutti gli endpoint inclusi nel presente metodo di prova. La Linea Guida OCSE 229 fornisce uno screening delle sostanze che agiscono sulla riproduzione attraverso vari meccanismi, tra cui quelli endocrini. È necessario tenere presenti le differenze tra le due linee guida prima di scegliere il metodo di prova più idoneo.
2.
Il presente metodo di prova descrive un saggio di screening in vivo in cui pesci, maschi sessualmente maturi e femmine riproduttrici insieme, sono esposti a una sostanza di prova, per un tempo limitato del loro ciclo biologico (21 giorni). Al termine dell'esposizione di 21 giorni, sia nei maschi che nelle femmine, sono misurati (a seconda della specie utilizzata) uno o due biomarcatori dell'attività estrogenica, androgenica o di inibizione dell'aromatasi della sostanza chimica di prova. Questi biomarcatori sono la vitellogenina (VTG) e i caratteri sessuali secondari. La vitellogenina viene misurata in Pimephales promelas (ciprinidi), Oryzias latipes (medaka) e Danio rerio (danio zebrato), mentre i caratteri sessuali secondari sono valutati soltanto in Pimephales promelas (ciprinidi) e Oryzias latipes (medaka).
3.
Il presente saggio è una prova in vivo per lo screening di taluni meccanismi di azione endocrina e la sua applicazione deve essere considerata nel contesto del “Quadro concettuale dell'OCSE per la sperimentazione e la valutazione delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino” (28).
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI
4.
La vitellogenina è generalmente prodotta dal fegato delle femmine di vertebrati ovipari in risposta agli estrogeni endogeni. Si tratta di un precursore delle proteine del tuorlo che, una volta prodotto nel fegato, è trasportato, attraverso il flusso sanguigno, agli ovociti in crescita, in cui è incorporato e modificato. La vitellogenina è difficilmente rilevabile nel plasma dei pesci maschi e di femmine immature, a causa dello scarso livello di estrogeni in circolo; tuttavia, il fegato è in grado di sintetizzare e secernere la vitellogenina in risposta ad una stimolazione estrogenica esogena.
5.
La misurazione della vitellogenina serve ad individuare sostanze chimiche con differenti meccanismi di azione estrogenica. Come documentato in numerose pubblicazioni scientifiche oggetto di valutazione inter pares (ad es. (7)), l'individuazione di sostanze chimiche estrogeniche può essere effettuata misurando l'induzione di vitellogenina nei pesci maschi,. L'induzione di vitellogenina è stata anche dimostrata dopo esposizione a androgeni aromatizzabili (8, 9). Una riduzione del livello di estrogeni circolanti nelle femmine, ottenuta, ad esempio, mediante inibizione dell'aromatasi — il complesso enzimatico che converte l'androgeno endogeno in estrogeno naturale 17β-estradiolo — induce una diminuzione del livello di vitellogenina. Questa viene utilizzata proprio per individuare le sostanze capaci di inibire l'aromatasi (10, 11). La rilevanza biologica della risposta della vitellogenina in seguito all'inibizione degli estrogeni o dell'aromatasi è consolidata ed è stata ampiamente documentata. Tuttavia la produzione di VTG nelle femmine può anche essere influenzata da meccanismi di tossicità generale e da meccanismi d'azione non-endocrini (epatotossicità, ad esempio).
6.
Vari metodi di misurazione sono stati sviluppati con successo e armonizzati per i saggi di routine. Questo è il caso dei metodi ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) che sono specie-specifici e utilizzano tecniche di immunochimica per quantificare la vitellogenina utilizzando piccoli campioni di fegato o di sangue prelevati su pesci (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Ai fini della misurazione della VTG possono essere prelevati campioni dalle specie Pimephales promelas, ciprinidi (sangue), Danio rerio, danio zebrato (sangue o omogenati testa/coda) e Oryzias latipes, medaka (fegato). In quest'ultima specie è stata rilevata una buona correlazione fra la concentrazione ematica ed epatica di VTG (19). Le procedure raccomandate per la raccolta dei campioni ai fini dell'analisi della vitellogenina sono descritte nell'appendice 6. Kit per la misurazione della vitellogenina sono comunemente reperibili; si raccomanda che tali kit si basino su un metodo ELISA validato e specifico per la specie in esame.
7.
I caratteri sessuali secondari dei pesci maschi di determinate specie sono visibili a occhio nudo, sono quantificabili e rispondono ai livelli degli androgeni endogeni. Ciò vale per Pimephales promelas (ciprinidi) e Oryzias latipes (medaka) ma non per il danio zebrato, che non possiede caratteri sessuali secondari quantificabili. Le femmine mantengono la capacità di sviluppare caratteri sessuali secondari maschili quando sono esposte a sostanze androgeniche presenti nell'acqua. Diversi studi scientifici documentano questo tipo di risposta in Pimephales promelas (ciprinidi) (20) e Oryzias latipes (medaka) (21). La diminuzione, nei maschi, dei caratteri sessuali secondari deve essere interpretata con cautela a causa della limitata significatività statistica dei relativi studi. Tale interpretazione, inoltre, dovrebbe basarsi sul giudizio esperto e sulla determinazione del “peso dell'evidenza”. L'utilizzo del danio zebrato per questa prova incontra dei limiti a motivo dell'assenza di caratteri sessuali secondari quantificabili capaci di rispondere alle sostanze che agiscono sugli androgeni.
8.
In Pimephales promelas (ciprinidi) il principale indicatore di esposizione ad androgeni esogeni è il numero dei tubercoli nuziali situati sul muso del pesce femmina. Nella femmina di Oryzias latipes (medaka) il numero dei processi papillari costituisce il principale marcatore dell'esposizione ad androgeni esogeni. Le procedure raccomandate per valutare i caratteri sessuali secondari in Pimephales promelas (ciprinidi)e Oryzias latipes (medaka)sono contenute, rispettivamente, nelle appendici 5A e 5B.
9.
Le definizioni dei termini utilizzati nel presente metodo di prova sono contenute nell'appendice 1.
PRINCIPIO DELLA PROVA
10.
Pesci maschi e femmine della medesima specie in stato riproduttivo sono esposti alle sostanze chimiche di prova all'interno della stessa vasca. Il loro stato di adulti riproduttori permette una chiara differenziazione tra i sessi e quindi un'analisi di ciascun biomarcatore in funzione del sesso e permette di registrarne la rispettiva sensibilità alle sostanze esogene. Al termine della prova, il sesso è confermato mediante esame macroscopico delle gonadi dopo l'apertura ventrale con forbici. Una tabella riassuntiva delle pertinenti condizioni sperimentali figura nell'appendice 2. Per questa prova si selezionano generalmente esemplari di pesci in condizione di riprodursi, mentre vanno scartati gli esemplari senescenti. La sezione relativa alla “selezione dei pesci” fornisce orientamenti sull'età dei pesci e sul loro stato di riproduttori. La prova è condotta mediante l'esposizione degli animali sperimentali a tre livelli di concentrazione della sostanza chimica in esame ed un controllo con acqua, oltre ad un eventuale controllo con solvente, se necessario. Per ciascun trattamento sono utilizzate due vasche o repliche (ogni vasca contiene 5 maschi e 5 femmine) per Oryzias latipes (medaka) e il danio zebrato; mentre quattro vasche o repliche sono utilizzate per trattamento (ogni vasca contenente 2 maschi e 4 femmine) per Pimephales promelas (ciprinidi). Ciò permette di tener conto del comportamento territoriale del ciprinide maschio preservando la potenza statistica della prova a un livello sufficiente. Il periodo di esposizione è di 21 giorni ed il campionamento dei pesci è effettuato al 21o giorno di esposizione.
11.
All'atto del campionamento effettuato il 21o giorno, tutti gli animali sono soppressi in modo incruento. I caratteri sessuali secondari sono misurati in Pimephales promelas (ciprinidi) e in Oryzias latipes (medaka) (v. appendice 5A e Appendice 5B); campioni di sangue sono prelevati per misurare la vitellogenina nel danio zebrato e nei ciprinidi; in alternativa può essere utilizzato anche un omogenato testa/coda per la determinazione della vitellogenina nel danio zebrato (appendice 6), mentre a tal fine nei medaka sono effettuati prelievi epatici (appendice 6).
CRITERI DI ACCETTAZIONE DELLA PROVA:
12.
Affinché i risultati della prova siano accettabili devono essere soddisfatte le seguenti condizioni:
—
la mortalità nei controlli con acqua (o solvente) non eccede 10 % al termine del periodo di esposizione;
—
la concentrazione dell'ossigeno disciolto è rimasta almeno al 60 % del valore di saturazione in aria per tutto il periodo di esposizione;
—
la temperatura dell'acqua non differisce mai di oltre ± 1,5 °C fra le diverse vasche nel periodo di esposizione ed è mantenuta entro un intervallo di 2 °C all'interno del range di temperatura specificato per la specie utilizzata (appendice 2);
—
i dati disponibili dimostrano che le concentrazioni della sostanza chimica in esame in soluzione sono state mantenute in modo soddisfacente entro un intervallo del ±20 % dei valori misurati medi.
DESCRIZIONE DEL METODO
Apparecchiatura
13.
Normale attrezzatura da laboratorio e in particolare:
(a)
misuratori dell'ossigeno e del pH;
(b)
attrezzatura per la determinazione della durezza e dell'alcalinità dell'acqua;
(c)
apparecchiatura adeguata per il controllo della temperatura e preferibilmente per il monitoraggio continuo;
(d)
vasche in materiale chimicamente inerte e di capacità adeguata in relazione al carico e alla densità di popolazione raccomandati (cfr. appendice 2);
(e)
substrato di riproduzione per i ciprinidi e il danio zebrato; l'appendice 4 fornice le necessarie indicazioni dettagliate.
(f)
bilancia sufficientemente precisa (precisione di ± 0,5 mg).
Acqua
14.
Per la prova si può utilizzare qualunque tipo di acqua in cui la specie in esame dimostri di sopravvivere a lungo termine e di crescere in modo adeguato. La qualità dell'acqua dovrebbe essere costante per tutta la durata della prova. Il pH deve essere compreso entro 6,5 e 8,5, ma nel corso della medesima prova deve essere compreso entro un intervallo di ±0,5 unità di pH. Per verificare che l'acqua di diluizione non alteri il risultato della prova (ad esempio per complessazione della sostanza chimica in esame), si dovrebbero prelevare e analizzare campioni a vari intervalli. La misurazione dei metalli pesanti (ad esempio Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni) dei principali anioni e cationi (ad esempio Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, and SO42-), dei pesticidi (ad esempio pesticidi organofosforati totali e organoclorurati totali), del carbonio organico totale e dei solidi in sospensione va effettuata ad esempio ogni tre mesi, se l'acqua di diluizione è di qualità relativamente costante. Se la qualità dell'acqua si è dimostrata costante per almeno un anno, le titolazioni possono essere effettuate con minore frequenza (ad esempio ogni sei mesi), Alcune caratteristiche chimiche di un'acqua di diluizione accettabile sono elencate nell'appendice 3.
Soluzioni di prova
15.
Le soluzioni di prova alle concentrazioni scelte vanno preparate per diluizione di una soluzione madre. La soluzione madre deve essere di preferenza preparata semplicemente miscelando o agitando la sostanza chimica in esame nell'acqua di diluizione con mezzi meccanici (cioè agitazione o ultrasuoni). Per ottenere una concentrazione adeguata della soluzione madre si possono utilizzare colonne di saturazione (colonne di solubilità). L'uso di un mezzo disperdente con solvente non è raccomandato, ma può rivelarsi necessario. In tal caso, è necessario testare in parallelo una vasca di controllo contenente la stessa concentrazione di solvente delle vasche contenenti la sostanza chimica in esame. Per sostanze chimiche difficili da testare, un solvente può essere la migliore soluzione tecnica; a tal fine si dovrebbe consultare il documento d'orientamento dell'OCSE sulle prove di tossicità in ambiente acquatico di sostanze o miscele “difficili” (22). La scelta del solvente è determinata dalle proprietà chimiche della sostanza. Il documento di orientamento dell'OCSE raccomanda di non superare una concentrazione massima di 100μl/l. Tuttavia un recente studio (23) ha dimostrato che l'uso di solventi durante le prove sulle sostanze attive sul sistema endocrino può generare preoccupazioni di altro tipo. Se è necessario usare un solvente, si raccomanda pertanto di ridurre la concentrazione al minimo tecnicamente possibile (che dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame).
16.
Va utilizzato un sistema sperimentale a flusso continuo che eroga e diluisce in modo continuato la soluzione madre della sostanza chimica in esame (ad esempio, pompa dosatrice, diluitore proporzionale, sistema di saturazione) per fornire le concentrazioni di prova nelle vasche sperimentali. La portata della soluzione madre e dell'acqua di diluizione dovrebbe essere controllata periodicamente, preferibilmente ogni giorno, e non dovrebbe variare di oltre il 10 % per tutta la durata della prova. Occorre evitare l'utilizzo di tubi in plastica di cattiva qualità o altri materiali che possano contenere sostanze biologicamente attive. Ai fini della selezione del materiale per il sistema a flusso continuo va preso in considerazione l'adsorbimento della sostanza chimica in esame rispetto a tale materiale.
Mantenimento dei pesci
17.
I pesci vanno selezionati da una popolazione allevata in laboratorio, preferibilmente dallo stesso ceppo, che sia stata acclimatata per almeno due settimane prima della sperimentazione in condizioni di qualità dell'acqua e di illuminazione simili a quelle usate durante la prova. È importante che il tasso di carico e la densità della popolazione (cfr. definizioni nell'appendice 1) siano adeguati per la specie utilizzata ai fini della prova (cfr. appendice 2).
18.
Dopo un periodo di ambientazione di 48 ore, si registra la mortalità e si applicano i seguenti criteri:
—
mortalità superiore al 10 % della popolazione in sette giorni: l'intero lotto viene respinto;
—
mortalità fra il 5 % e il 10 % della popolazione: acclimatazione per altri sette giorni; se nel corso della seconda settimana la mortalità supera il 5 %, respingere l'intero lotto;
—
mortalità inferiore al 5 % della popolazione in sette giorni: accettare il lotto.
19.
I pesci non devono essere sottoposti a trattamenti per patologie durante i periodi di acclimatazione, pre-esposizione ed esposizione.
Pre-esposizione e selezione dei pesci
20.
Si raccomanda una settimana di pre-esposizione, durante la quale i pesci rimangono in vasche simili a quelle della prova. I pesci vanno nutriti ad libitum durante tutto il periodo di acclimatazione e di esposizione. La fase di esposizione ha inizio con l'utilizzo di adulti sessualmente dimorfici provenienti da una popolazione allevata in laboratorio di animali sessualmente maturi (aventi, ad esempio nel caso dei ciprinidi e dei medaka, caratteri sessuali secondari visibili a occhio nudo), che si riproducono attivamente. A titolo di orientamento generale (che non può però essere considerato indipendentemente dall'osservazione dello stato riproduttivo dell'intero lotto), i ciprinidi dovrebbero avere un'età di circa 20 (±2) settimane, a condizione di essere stati allevati a una temperatura di 25 ± 2 °C durante l'intera vita; i medaka dovrebbero avere un'età di circa 16 (±2) settimane, a condizione di essere stati sempre allevati ad una temperatura di 25 ± 2 °C, mentre i pesci-zebra dovrebbero avere un'età di circa 16 (±2) settimane, se allevati ad una temperatura di 26 ± 2 °C.
DISEGNO SPERIMENTALE
21.
Sono utilizzate tre concentrazioni della sostanza chimica in esame e una vasca (contenente acqua) di controllo; se necessario un'altra vasca di controllo con solvente. I dati possono essere analizzati per determinare le differenze statisticamente significative tra le risposte corrispondenti a ciascuna concentrazione e al controllo. Tali analisi non servono a valutare i rischi, quanto a determinare se è necessario sottoporre la sostanza chimica in esame a ulteriore sperimentazione per stabilire potenziali effetti negativi a più lungo termine (sopravvivenza, sviluppo, crescita e riproduzione (24).
22.
Per i pesci zebra e i medaka, il 21o giorno di sperimentazione vengono prelevati campioni nei gruppi trattati per ciascun livello di concentrazione (5 maschi e 5 femmine in ciascuno delle due repliche) e nel gruppo (o nei gruppi) di controllo ai fini della misurazione della vitellogenina e della valutazione dei caratteri sessuali secondari, se del caso. Per i ciprinidi il 21o giorno vengono prelevati campioni nei gruppi trattati per ciascun livello di concentrazione (2 maschi e 4 femmine in ciascuno delle due repliche) e nel gruppo (o nei gruppi) di controllo ai fini della misurazione della vitellogenina e della valutazione dei caratteri sessuali secondari.
Selezione delle concentrazioni sperimentali
23.
Ai fini della prova la concentrazione massima è fissata al livello della concentrazione massima tollerata (CMT), ottenuta mediante un rangefinder o altri dati relativi alla tossicità, oppure fissata a 10 mg/l, oppure determinata in funzione della solubilità massima in acqua, a seconda di quale sia il risultato più basso. La CMT è definita come la concentrazione massima della sostanza chimica in esame che comporti una mortalità inferiore al 10 %. L'applicazione di tale approccio presuppone l'esistenza di dati empirici sulla tossicità acuta o altri dati sulla tossicità a fronte dei quali la CMT possa essere stimata. La stima della CMT potrebbe essere inaccurata e richiede generalmente il giudizio professionale di un esperto.
24.
Sono necessarie tre concentrazioni di prova, che differiscano di un fattore costante non superiore a 10, e una vasca di controllo con l'acqua di diluizione (più, se necessario, una vasca con solvente). Si raccomanda un intervallo dei fattori di distanza compreso tra 3,2 e 10.
PROCEDIMENTO
Selezione e pesatura dei pesci da sottoporre alla prova
25.
È importante ridurre al minimo la differenza di peso tra i pesci all'inizio della prova. L'appendice 2 fornisce gli intervalli adeguati delle dimensioni per le diverse specie raccomandate per questa prova. Se possibile, all'inizio del saggio, l'intervallo di peso di tutti i pesci maschi e femmine del lotto utilizzato deve essere mantenuta entro un margine di ± 20 % intorno alla media aritmetica di ciascun sesso. Si raccomanda di pesare un sottocampione di pesci prima della prova per stimare il peso medio.
Condizioni di esposizione
Durata
26.
La durata del test è di 21 giorni, preceduta da un periodo di pre-esposizione, la cui durata raccomandata è di una settimana.
Alimentazione
27.
I pesci sono nutriti ad libitum con cibo adatto (appendice 2) in quantità sufficiente per mantenerli in buona condizione fisica. Occorre evitare la crescita microbica e l'intorbidimento dell'acqua. A titolo indicativo, la razione quotidiana può essere suddivisa in due o tre parti uguali somministrate più volte al giorno, con almeno tre ore d'intervallo. Un'unica razione maggiore è accettabile, in particolare durante il fine settimana. I pesci non vanno nutriti nelle 12 ore che precedono i prelievi/la necroscopia.
28.
Il cibo somministrato ai pesci deve essere esaminato per individuare l'eventuale presenza di contaminanti [pesticidi organoclorurati, idrocarburi policiclici aromatici (IPA), policlorobifenili (PCB)]. Va evitata una dieta con un'alta concentrazione di fitoestrogeni, perché pregiudicherebbe la reazione della prova a un noto antagonista degli estrogeni (17-beta estradiolo).
29.
II cibo avanzato e il materiale fecale vanno rimossi dalle vasche almeno due volte alla settimana, ad esempio pulendo con cura il fondo di ciascuna vasca con un sifone.
Illuminazione e temperatura
30.
Il fotoperiodo e la temperatura dell'acqua devono essere adatti alla specie utilizzata (appendice 2).
Frequenza delle determinazioni e delle misurazioni analitiche
31.
Prima che inizi il periodo di esposizione, va verificato il buon funzionamento del sistema di distribuzione della sostanza chimica in esame. Vanno acquisiti tutti i metodi analitici necessari, comprese sufficienti conoscenze sulla stabilità della sostanza chimica nel sistema. Durante la prova, le concentrazioni della sostanza chimica in esame sono determinate a intervalli regolari verificando, preferibilmente ogni giorno ma almeno due volte alla settimana, la portata del diluente e della soluzione madre della sostanza tossica. Tale portata non deve variare di oltre il 10 % per tutta la durata del test. Si raccomanda di misurare le effettive concentrazioni della sostanza chimica in esame in ciascuna vasca all'inizio della prova e successivamente una volta alla settimana.
32.
Si raccomanda che i risultati siano basati sulle concentrazioni misurate. Tuttavia, se la concentrazione della sostanza chimica in esame in soluzione è stata adeguatamente mantenuta nel corso dell'intera prova in un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale, i risultati possono essere calcolati a partire dai valori nominali o misurati.
33.
Può essere necessario filtrare (ad esempio utilizzando membrane con pori di 0,45 μm) o centrifugare i campioni; in tal caso la procedura raccomandata è la centrifugazione. Se però è dimostrato che la sostanza chimica in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione.
34.
Durante la prova, l'ossigeno disciolto, la temperatura e il pH sono misurati in tutte le vasche almeno una volta alla settimana. La durezza totale e l'alcalinità sono misurate almeno una volta alla settimana nelle vasche di controllo e in una vasca con la massima concentrazione. È auspicabile che la temperatura sia controllata continuamente almeno in una vasca sperimentale.
Osservazioni
35.
Alcune risposte biologiche generali (ad es. sopravvivenza) e mirate (ad es. livelli di vitellogenina) sono valutate nel corso o al termine della prova. La misurazione e la valutazione di questi parametri e la loro utilità sono descritti più sotto.
Sopravvivenza
36.
Occorre esaminare i pesci quotidianamente durante la prova. Eventuali casi di mortalità vanno registrati e i pesci morti rimossi dalla vasca quanto prima possibile. Gli esemplari morti non devono essere sostituiti né nelle vasche di controllo né in quelle di sperimentazione. Il sesso degli esemplari morti durante la prova è determinata mediante osservazione macroscopica delle gonadi.
Comportamento e aspetto
37.
Deve essere annotato qualsiasi comportamento anomalo (rispetto ai controlli), che può comprendere segnali indicativi di una tossicità generale, quali iperventilazione, movimenti natatori scoordinati, perdita di equilibrio, inattività o alimentazione atipiche). Occorre inoltre rilevare le eventuali anomalie esterne (quali emorragie, decolorazione). Tali segnali di tossicità vanno valutati con prudenza in sede di interpretazione dei dati poiché potrebbero indicare concentrazioni alle quali i biomarcatori di potenziali effetti sul sistema endocrino non sono affidabili. Le osservazioni sul comportamento possono inoltre fornire informazioni qualitative utili per giustificare potenziali requisiti futuri in materia di sperimentazione sui pesci. Ad esempio è stata osservata un'aggressività territoriale nei maschi normali o nelle femmine mascolinizzate dei ciprinidi a seguito di esposizione ad androgeni. Nei pesci zebra, il caratteristico comportamento di accoppiamento e riproduzione dopo le prime luci dell'alba è ridotto o ostacolato dall'esposizione agli estrogeni o agli antiandrogeni.
38.
Poiché la manipolazione dei pesci potrebbe alterare rapidamente alcune caratteristiche fisiche (segnatamente il colore), occorre procedere ad osservazioni qualitative prima di rimuovere i pesci dal sistema sperimentale. Le esperienze finora effettuate sui ciprinidi indicano che alcune sostanze che agiscono sul sistema endocrino possono inizialmente alterare le seguenti caratteristiche esterne: colore della livrea (chiaro o scuro), motivi ricorrenti nella colorazione (presenza di strisce verticali) e forma del corpo (regione della testa e regione toracica). Le osservazioni relative alle caratteristiche fisiche dei pesci vanno pertanto valutate nel corso e al termine della prova.
Soppressione incruenta
39.
Il 21o giorno, vale a dire alla fine del periodo di esposizione, i pesci vengono soppressi con idonei quantitativi di tricaina [metan sulfonato di tricaina (MS 222) (CAS 886-86-2)] in soluzione di 100-500 mg/l tamponata con 300 mg/l NaHCO3 (bicarbonato di sodio, CAS 144-55-8) per ridurre l'irritazione della mucosa; prelievi di sangue o di tessuto sono quindi effettuati per la determinazione della vitellogenina (cfr. sezione sulla vitellogenina).
Osservazione dei caratteri sessuali secondari
40.
Determinate sostanze chimiche che agiscono sul sistema endocrino possono indurre alterazioni dei caratteri sessuali secondari specializzati (numero di tubercoli nuziali nei ciprinidi maschi e processi papillari nei medaka maschi). Segnatamente, sostanze che presentano particolari meccanismi di azione possono determinare la comparsa anomala di caratteri sessuali secondari in animali del sesso opposto. Ad esempio, antiandrogeni quali trenbolone, metiltestosterone e diidrotestosterone, possono provocare l'insorgere di tuberi nuziali sporgenti nei ciprinidi femmina e di processi papillari nei medaka femmina (11, 20, 21). È stato inoltre segnalato che antagonisti dei recettori degli estrogeni possono ridurre il numero dei tubercoli nuziali e le dimensioni dell'ispessimento situato tra nuca e dorso degli adulti maschi di ciprinidi (25, 26). Tali osservazioni morfologiche grossolane possono fornire informazioni qualitative e quantitative utili per giustificare potenziali requisiti futuri in materia di sperimentazione sui pesci. Il numero e le dimensioni dei tubercoli nuziali nei ciprinidi nonché quelli dei processi papillari nei medaka possono essere quantificati direttamente, o più comodamente, su esemplari non soggetti a test. Le procedure raccomandate per la valutazione dei caratteri sessuali secondari dei ciprinidi e dei medaka figurano rispettivamente nell'appendice 5A e appendice 5B.
Vitellogenina (VTG)
41.
Un campione di sangue è prelevato dall'arteria/ vena caudale mediante un tubo capillare ematocrito con eparina, o in alternativa mediante puntura cardiaca effettuata con siringa. In funzione della dimensione del pesce, i volumi di sangue prelevati sono generalmente di 5-60 μl per individuo nei ciprinidi e 5-15 μl per individuo nel danio zebrato Il plasma è separato dal sangue mediante centrifugazione prima di essere conservato con inibitori di proteasi a – 80 °C fino all'analisi per la determinazione della vitellogenina. Per contro, nei medaka è utilizzato un prelievo epatico e nel danio zebrato può essere impiegato un omogenato testa/coda come campione tissutale per la determinazione della vitellogenina (appendice 6). La misurazione della VTG è basato su un metodo ELISA omologo convalidato utilizzando anticorpi omologhi e uno standard VTG omologo. Si raccomanda di utilizzare un metodo in grado di individuare concentrazioni di VTG molto basse (fino a pochi ng/ml di plasma o ng/mg di tessuti), corrispondenti al livello generale nei pesci maschi non soggetti ad esposizione.
42.
Il controllo della qualità dell'analisi della vitellogenina sarà condotto mediante l'applicazione di standard, prove in bianco e almeno una duplicazione delle analisi. Per ciascun metodo ELISA va effettuato un test sull'effetto della matrice (effetto di diluizione del campione) per determinare il fattore minimo di diluizione del campione. Ciascuna piastra ELISA utilizzata per la determinazione della VTG deve comprendere i seguenti campioni di controllo della qualità: almeno sei standard di calibrazione che coprono l'intervallo di concentrazioni di vitellogenina attese e almeno una prova in bianco di collegamento non specifica (analisi in duplicato). L'assorbanza delle prove in bianco è inferiore al 5 % dell'assorbanza massima degli standard di calibratura. Sono analizzate almeno due aliquote (pozzetti in doppio) di ciascuna diluizione del campione. I pozzetti in doppio che differiscono di oltre il 20 % sono sottoposti a una nuova analisi.
43.
Il coefficiente di correlazione (R2) delle curve di calibrazione deve essere superiore a 0,99. Tuttavia una correlazione elevata non è sufficiente a garantire una previsione adeguata della concentrazione per tutti gli intervalli. Oltre ad ottenere una correlazione sufficientemente elevata per la curva di calibrazione, la concentrazione di ciascuno standard, calcolato a partire dalla curva di calibrazione, deve essere compresa tra 70 e 120 % della concentrazione nominale. Se le concentrazioni nominali tendono ad allontanarsi dalla retta di regressione della calibrazione (a concentrazioni inferiori, ad esempio), può essere necessario dividere la curva di calibrazione in due gruppi di intervalli, uno alto e uno basso, o utilizzare un modello non lineare per adattare i dati relativi all'assorbanza. Se la curva è divisa, i due segmenti di retta devono avere un coefficiente di correlazione R2 > 0,99.
44.
Il limite di rilevazione (LOD) è definito come il limite al di sotto del quale la concentrazione è troppo bassa perché la sostanza sia individuata, e il limite di quantificazione (LOQ) è definito come il limite al di sotto del quale la concentrazione è troppo bassa perché la sostanza sia individuata, moltiplicato per il coefficiente di diluizione più basso.
45.
Ciascun giorno in cui è effettuata l'analisi della vitellogenina, è analizzato un campione fortificato ottenuto a partire da uno standard di riferimento inter-prova (appendice 7). Il rapporto tra la concentrazione prevista e la concentrazione misurata verrà quindi annotato sistematicamente assieme ai risultati dei singoli test eseguiti nello stesso giorno.
DATI E RELAZIONE
Valutazione delle risposte dei biomarcatori mediante l'analisi della varianza (ANOVA)
46.
Per individuare gli effetti potenziali di una sostanza chimica sul sistema endocrino, si confrontano le risposte dei gruppi trattati e del gruppo di controllo mediante l'analisi della varianza (ANOVA). Se si utilizza un controllo contenente solvente, va effettuata un'adeguata analisi statistica del controllo con l'acqua di diluizione e del controllo contenente il solvente per ciascun endpoint. Si richiama la linea guida OCSE (2006C) (27) per gli orientamenti sul trattamento dei dati relativi al controllo con l'acqua di diluizione e col solvente nella successiva analisi statistica. Tutte le risposte biologiche ottenute vanno analizzate e valutate separatamente per ciascun sesso. Se non vengono soddisfatti i presupposti necessari per i metodi parametrici — distribuzione non normale (ad esempio al test di Shapiro-Wilk) o varianza eterogenea (al test di Bartlett o di Levene) — potrebbe essere necessario trasformare i dati per rendere omogenee le varianze prima di eseguire l'ANOVA oppure effettuare un'ANOVA ponderata. Il test (parametrico) di Dunnett per confronti multipli a coppia o il test (non parametrico) di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni possono essere utilizzati per una relazione dose-risposta non monotono. Altri test statistici possono essere utilizzati (i test di Jonckheere-Terpstra o di Williams) se la relazione dose-risposta è approssimativamente monotona. L'appendice 8 riporta un diagramma di analisi statistica inteso ad aiutare la scelta del test statistico più appropriata. Il documento dell'OCSE sugli attuali metodi di analisi statistica dei dati sull'ecotossicità (27) fornisce ulteriori informazioni in materia.
Elaborazione di relazioni sui risultati della prova
47.
I dati devono comprendere:
Infrastruttura utilizzata per la prova:
—
personale responsabile dello studio e rispettive mansioni;
—
ciascun laboratorio deve dimostrare di sapere utilizzare con adeguata competenza una serie di sostanze chimiche rappresentative.
Sostanza chimica in esame:
—
caratterizzazione della sostanza chimica in esame;
—
natura fisica e proprietà fisico-chimiche pertinenti;
—
metodo e frequenza di preparazione delle concentrazioni sperimentali
—
informazioni sulla stabilità e la biodegradabilità.
Solvente:
—
caratterizzazione del solvente (natura, concentrazione impiegata);
—
giustificazione della scelta del mezzo disperdente (se diverso dall'acqua).
Animali sperimentali
—
specie e ceppo
—
fornitore e stabilimento specifico del fornitore;
—
età dei pesci all'inizio della prova e loro stato riproduttivo;
—
informazioni dettagliate sulla procedura di acclimatazione degli animali;
—
peso del pesce all'inizio dell'esposizione (calcolato a partire da un sottocampione proveniente dalla popolazione di pesci).
Condizioni sperimentali:
—
metodo di prova utilizzato (tipo di prova, carico, densità della popolazione, ecc.);
—
metodo di preparazione delle soluzioni madre e loro portata;
—
concentrazioni nominali di prova, misurazione settimanale delle concentrazioni delle soluzioni di prova e metodo analitico utilizzato, medie dei valori misurati e loro deviazioni standard nelle vasche sperimentali e dimostrazione che le misure si riferiscono alle concentrazioni della sostanza chimica in esame in soluzione vera;
—
caratteristiche dell'acqua di diluizione (pH, durezza, alcalinità, temperatura, concentrazione di ossigeno disciolto, livelli di cloro residuo, carbonio organico totale, solidi in sospensione e eventuali altre misurazioni effettuate),
—
qualità dell'acqua nelle vasche sperimentali: pH, durezza, temperatura e concentrazione di ossigeno disciolto;
—
informazioni dettagliate sull'alimentazione (per esempio tipo di mangime, provenienza, quantità somministrata e frequenza) e analisi di eventuali contaminanti pertinenti (PCB, IPA e pesticidi organoclorurati).
Risultati
—
dimostrazione che i controlli soddisfano i criteri di validità della prova;
—
dati sulla mortalità per ciascuna concentrazione di prova e ciascun controllo;
—
Tecniche di analisi statistica utilizzate, trattamento dei dati e giustificazione delle tecniche usate;
—
dati sulle osservazioni biologiche della morfologia macroscopica, compresi i caratteri sessuali secondari e la vitellogenina;
—
risultati delle analisi di dati, presentati preferibilmente sotto forma di tabelle e grafici;
—
incidenza delle eventuali reazioni anomale da parte dei pesci e di eventuali effetti visibili indotti dalla sostanza chimica in esame.
ORIENTAMENTI PER L'INTERPRETAZIONE E L'ACCETTAZIONE DEI RISULTATI
48.
Questa sezione presenta alcune considerazioni che vanno tenute presenti ai fini dell'interpretazione dei risultati della prova per quanto riguarda i diversi parametri misurati. I risultati vanno interpretati con cautela nel caso in cui la sostanza chimica in esame sembri causare evidenti segni di tossicità o avere ripercussioni sullo stato generale dell'animale.
49.
Nel determinare l'intervallo delle concentrazioni di prova, occorre fare attenzione a non superare la concentrazione massima tollerata per assicurare che i dati siano interpretati in modo attendibile. È importante che almeno uno dei trattamenti effettuati risulti nell'assenza di segnali di effetti tossici. I sintomi patologici e i segnali di tossicità devono fare l'oggetto di una valutazione e di una relazione dettagliata. È possibile, ad esempio, che la produzione di VTG nelle femmine sia compromessa anche dalla tossicità generale e dai meccanismi di azione tossica non connessi al sistema endocrino (epatotossicità, ad esempio). Tuttavia l'interpretazione degli effetti può essere rafforzata mediante altri livelli di trattamento i cui risultati non siano inficiati da tossicità sistemica.
50.
Esistono alcuni parametri da considerare ai fini dell'accettazione dei risultati della prova. A titolo indicativo, i livelli di VTG vanno distinti nei gruppi di maschi e di femmine e devono essere separati da almeno tre ordini di grandezza nei ciprinidi e nel danio zebrato e di un ordine di grandezza nei medaka. Esempi della gamma dei valori rilevati nei gruppi di controllo e in ciascun gruppo di trattamento sono disponibili nelle relazioni di validazione (1, 2, 3, 4). Valori elevati di VTG nei maschi dei gruppi di controllo possono compromettere la prestazione del saggio e la capacità di individuare antagonisti degli estrogeni di bassa potenza. Valori bassi di VTG nelle femmine di controllo possono compromettere la prestazione della prova e la sua capacità di individuare inibitori dell'aromatasi e antagonisti degli estrogeni. Gli studi di validazione sono stati utilizzati per l'elaborazione di tali orientamenti.
51.
Se un laboratorio non ha mai effettuato la prova in precedenza o se sono state introdotte modifiche significative (cambio di ceppo o di fornitore di pesci), si consiglia di effettuare uno studio per verificare la competenza tecnica. Si raccomanda di utilizzare sostanze che presentano una gamma di attività e di effetti su alcuni dei parametri misurati durante la prova. In pratica, ogni laboratorio deve essere invitato a fornire i propri dati di controllo storici per i maschi e le femmine, e ad effettuare una prova con una sostanza usata per i controlli positivi dell'attività estrogenica (ad esempio 17β-estradiol ng/1 a 100 o un noto antagonista debole) che dia luogo ad un aumento della VTG nei maschi, una sostanza usata per i controlli positivi dell'inibizione dell'aromatasi (fadrozolo o procloraz a 300 μg/l) con una conseguente diminuzione della VTG nelle femmine e una sostanza usata per i controlli positivi dell'attività androgenica (17β -trenbolone a 5 μg/l, ad esempio) che dia luogo all'induzione di caratteri sessuali secondari nelle femmine dei ciprinidi e dei medaka. Tutti questi dati possono essere confrontati con i dati disponibili ricavati dagli studi di convalida (1, 2, 3) per garantire la competenza del laboratorio.
52.
In generale, le misurazioni della vitellogenina vanno considerate positive in caso di aumento statisticamente significativo della VTG nei maschi (p < 0,05) o di una diminuzione statisticamente significativa nelle femmine (p < 0,05), almeno alla concentrazione massima testata rispetto al gruppo di controllo e in assenza di segni di tossicità generale. Un risultato positivo è inoltre confermato dalla dimostrazione di una relazione biologicamente plausibile della curva dose-risposta. Come già menzionato, il calo della vitellogenina può non essere interamente di origine endocrina; tuttavia, un risultato positivo va generalmente interpretato come una prova di attività del sistema endocrino in vivo, e dovrebbe generalmente indurre ad avviare attività volte a ottenere ulteriori chiarimenti.
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Appendice 1
Abbreviazioni e definizioni
Sostanza chimica: sostanza o miscela
CV: coefficiente di variazione
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): prova di immunoassorbimento enzimatico
Tasso di carico: peso a umido dei pesci per volume di acqua
Densità della popolazione: numero di pesci per volume di acqua
VTG (Vitellogenina): lipo-glico-fosfo-proteina precursore delle proteine del tuorlo normalmente prodotta dalle femmine sessualmente attive di tutte le specie ovipare
CMT: concentrazione massima tollerata, che rappresenta circa il 10 % della LC50.
Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.
Appendice 2
Condizioni sperimentali per lo screening del sistema endocrino dei pesci
1.
Specie raccomandata
Ciprinide
(Pimephales promelas)
Medaka
(Oryzias latipes)
Danio zebrato
(Danio rerio)
2.
Tipo di prova
A flusso continuo
A flusso continuo
A flusso continuo
3.
Temperatura dell'acqua
25 ± 2 °C
25 ± 2 °C
26 ± 2 °C
4.
Qualità dell'illuminazione
Lampadine fluorescenti (ad ampio spettro)
Lampadine fluorescenti (ad ampio spettro)
Lampadine fluorescenti (ad ampio spettro)
5.
Intensità luminosa
10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lux, o 50-100 ft-c (livelli ambientali di laboratorio)
10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lux, o 50-100 ft-c (livelli ambientali di laboratorio)
10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lux, o 50-100 ft-c (livelli ambientali di laboratorio)
6.
Periodo di illuminazione (le transizioni alba / crepuscolo sono facoltative, ma non considerate necessarie)
16 ore di luce, 8 ore di oscurità
12-16 ore di luce, 12-8 ore di oscurità
12-16 ore di luce, 12-8 ore di oscurità
7.
Tasso di carico
< 5 g per l
< 5 g per l
< 5 g per l
8.
Volume della vasca sperimentale
10 l (minimo)
2 l (minimo)
5 l (minimo)
9.
Volume della soluzione sperimentale
8 l (minimo)
1,5 l (minimo)
4 l (minimo)
10.
Sostituzione del volume delle soluzioni sperimentali
Minimo 6 al giorno
Minimo 5 al giorno
Minimo 5 al giorno
11.
Età degli organismi oggetto della prova
vedere paragrafo 20.
vedere paragrafo 20.
vedere paragrafo 20.
12.
Peso umido approssimativo del pesce adulto (g)
femmine 1,5 ± 20 %
maschi: 2,5 ± 20 %
femmine 0,35 ± 20 %
maschi: 0,35 ± 20 %
femmine 0,65 ± 20 %
maschi: 0,4 ± 20 %
13.
Numero di pesci per vasca sperimentale
6 (2 maschi e 4 femmine)
10 (5 maschi e 5 femmine)
10 (5 maschi e 5 femmine)
14.
Numero di trattamenti
= 3 (oltre ai controlli appropriati)
= 3 (oltre ai controlli appropriati)
= 3 (oltre ai controlli appropriati)
15.
Numero di vasche per ciascun trattamento
4 minimo
2 minimo
2 minimo
16.
Numero di pesci per concentrazione di prova
16 femmine adulte e 8 maschi (4 femmine e 2 maschi in ciascuna vasca di replica)
10 femmine adulte and 10 maschi (5 femmine e 5 maschi in ciascuna vasca di replica)
10 femmine adulte and 10 maschi (5 femmine and 5 maschi in ciascuna vasca di replica)
17.
Regime alimentare
Adulti o naupli di artemia, vivi o congelati, due o tre volte al giorno (ad libitum), mangimi disponibili in commercio o una combinazione di questi elementi
Naupli di artemia due o tre volte al giorno (ad libitum), mangimi disponibili in commercio o una combinazione di questi elementi
Naupli di artemia due o tre volte al giorno (ad libitum), mangimi disponibili in commercio o una combinazione di questi elementi
18.
Aerazione
Nessuna aerazione tranne se la concentrazione dell'ossigeno disciolto scende al di sotto del 60 % della salutazione dell'aria
Nessuna aerazione tranne se la concentrazione dell'ossigeno disciolto scende al di sotto del 60 % della salutazione dell'aria
Nessuna aerazione tranne se la concentrazione dell'ossigeno disciolto scende al di sotto del 60 % della salutazione dell'aria
19.
Acqua di diluizione
Acqua di superficie o ricostituita o acqua di rubinetto non clorata, pulita
Acqua di superficie o ricostituita o acqua di rubinetto non clorata, pulita
Acqua di superficie o ricostituita o acqua di rubinetto non clorata, pulita
20.
Periodo di pre-esposizione
7 giorni (raccomandato)
7 giorni (raccomandato)
7 giorni (raccomandato)
21.
Durata dell'esposizione chimica
21 giorni
21 giorni
21 giorni
22.
Parametri biologici valutati
sopravvivenza
comportamento
caratteri sessuali secondari
VTG
sopravvivenza
comportamento
caratteri sessuali secondari
VTG
sopravvivenza
comportamento
VTG
23.
Criteri di validità della prova
Ossigeno disciolto >60 % del valore di saturazione; temperature media di 25 ± 2 °C; 90 % sopravvivenza dei pesci nei campioni di controllo; concentrazioni misurate della sostanza chimica in esame entro il 20 % dei valori medi misurati per ciascun livello di trattamento.
Ossigeno disciolto >60 % del valore di saturazione; temperature media di 24 ± 2 °C; 90 % sopravvivenza dei pesci nei campioni di controllo; concentrazioni misurate della sostanza chimica in esame entro il 20 % dei valori medi misurati per ciascun livello di trattamento.
Ossigeno disciolto >60 % del valore di saturazione; temperature media di 26 ± 2 °C; 90 % sopravvivenza dei pesci nei campioni di controllo; concentrazioni misurate della sostanza chimica in esame entro il 20 % dei valori medi misurati per ciascun livello di trattamento.
Appendice 3
Alcune caratteristiche chimiche di un'acqua di diluizione accettabile
Componente
Concentrazioni
Particolato
< 20mg/l
Carbonio organico totale
< 2mg/l
Ammoniaca non ionizzata
< 1μg/l
Cloro residuo
< 10μg/l
Pesticidi organofosforati totali
< 50ng/l
Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati
< 50ng/l
Cloro organico totale
< 25 ng/l
Appendice 4A
Substrato di riproduzione per danio rerio (danio zebrato)
Piattaforma di riproduzione: Piatto per strumenti in vetro, ad esempio di dimensioni 22 × 15 × 5,5 (larghezza × L × h), coperto da una griglia amovibile di acciaio inossidabile (con maglie di 2 mm di larghezza). La griglia di copertura è posta ad un'altezza inferiore al bordo del piatto.
Il substrato di riproduzione è fissato sulla griglia, creando una struttura in cui i pesci possono muoversi. Allo scopo sono adatte, ad esempio, piante artificiali per acquario di plastica verde, (NB: bisogna tener presente il possibile adsorbimento della sostanza chimica in esame sulla materia plastica). La plastica è lisciviata in un volume sufficiente di acqua calda e per un tempo sufficiente affinché nessuna sostanza sia rilasciata nella soluzione di prova. Se si utilizzano materiali in vetro, bisogna assicurare che i pesci non si feriscano o siano impediti nei movimenti durante le attività più vigorose.
La distanza tra il piatto e la parete della vasca deve essere di almeno 3 cm affinché la riproduzione non avvenga al di fuori del piatto. Le uova depositate sul piatto passano attraverso la griglia e possono essere prelevate 45-60 minuti dopo l'inizio dell'illuminazione. Le uova traslucide non aderiscono e possono facilmente essere contate alla luce trasversale. In presenza di cinque femmine per vasca, il numero di uova deposte può essere considerato basso se inferiore o pari a 20 al giorno, medio se compreso tra 20 e 100, e alto se superiore a 100. Il piatto di riproduzione è rimosso, le uova raccolte e la piattaforma di riproduzione reintrodotta nella vasca sperimentale, il più tardi possibile in serata o di prima mattina. La reintroduzione della piattaforma deve avvenire entro un'ora al massimo, perché altrimenti il segnale del substrato di riproduzione può indurre singoli accoppiamenti e una riproduzione al di fuori dei tempi controllati. Se la situazione richiede una successiva introduzione della piattaforma di riproduzione, occorre attendere almeno nove ore dopo l'inizio dell'illuminazione. A quest'ora tarda della giornata, la deposizione delle uova non è più indotta.
Appendice 4B
Substrato di riproduzione per la specie Pimephales promelas
Due o tre piastre e piatti di riproduzione combinati in plastica/ceramica/vetro o acciaio inossidabile sono collocati in ciascuna vasca sperimentale (ad.es. un pezzo di grondaia di forma semicircolare grigia di 80 mm di lunghezza posto su una piastrella di metallo dotata di bordi rialzati, lunga 130 mm) (v. foto). È dimostrato che le piastrelle in PVC o in ceramica opportunamente trattate possono costituire idonei substrati di riproduzione (Thorpe et al, 2007).
Si raccomanda l'uso di piastrelle abrase per migliorarne l'aderenza. Il piatto è inoltre munito di uno schermo di protezione per impedire che i pesci abbiano accesso alle uova depositate sul fondo a meno che sia stata dimostrata che le uova aderiscono efficacemente al substrato di riproduzione utilizzato.
La base è progettata per contenere tutte le uova che non aderiscono alla superficie della piastrella e che ricadrebbero quindi sul fondo della vasca (o le uova depositate direttamente sulla base di plastica piatta). Tutti i substrati di riproduzione sono lisciviati per almeno 12 ore in acqua di diluizione prima dell'uso.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98
Appendice 5A
Valutazione dei caratteri sessuali secondari di Pimephales promelas ai fini dell'individuazione di determinate sostanze attive a livello endocrino
Sintesi
Nei ciprinidi adulti della specie Pimephales promelas, le caratteristiche fisiche che possono assumere rilevanza ai fini della sperimentazione sugli interferenti endocrini sono le seguenti: colore della livrea (chiaro/scuro), motivi di colorazione (presenza o assenza di bande verticali), forma del corpo (forma della testa e della regione toracica, distensione addominale) e caratteri sessuali secondari specifici della specie (numero e dimensioni dei tubercoli nuziali, dimensioni del cuscinetto dorsale e dell'ovopositore).
I tubercoli nuziali sono situati sulla testa (cuscinetto dorsale) nei maschi adulti riproduttori, e sono generalmente disposti in modo bilaterale e simmetrico (Jensen et al. 2001). Le femmine delle vasche di controllo e i giovani esemplari maschi e femmine non mostrano alcuno sviluppo di tubercoli (Jensen et al. 2001). È possibile individuare fino a otto singoli tubercoli attorno agli occhi e tra le narici degli esemplari maschi. I tubercoli più grandi e numerosi formano due linee parallele situate immediatamente al di sotto delle narici e sopra la bocca. In molti pesci si riscontrano gruppi di tubercoli sotto la mascella inferiore; vicino alla bocca se ne trova generalmente solo una coppia mentre la parte ventrale può comprendere fino a quattro tubercoli. Il numero di tubercoli raramente supera i 30 (range di 18-28; Jensen et al. 2001). I tubercoli più numerosi presentano un'unica struttura di forma tondeggiante, di altezza approssimativamente pari al raggio. Nella maggior parte dei maschi riproduttori, alcuni tubercoli sono talmente estesi e prominenti che è impossibile distinguerli gli uni dagli altri.
Alcuni tipi di interferenti endocrini possono provocare l'insorgere abnorme di caratteri sessuali secondari nel sesso opposto; pertanto, gli antagonisti dei recettori degli androgeni come il 17β -metiltestosterone o il 17β -trenbolone possono provocare l'insorgere di tubercoli nuziali nelle femmine di Pimephales promelas (ciprinidi) femmina (Smith, 1974; Ankley et al., 2001, 2003), mentre gli antagonisti dei recettori degli estrogeni possono ridurre il numero o la dimensione dei tubercoli nuziali nei maschi (Miles-Richardson et al, 1999; Harries et al., 2000).
Segue una descrizione della caratterizzazione dei tubercoli nuziali nei in Pimephales promelas (ciprinidi), basata sul protocollo sperimentale utilizzato dal laboratorio dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (Duluth, MN). I prodotti e/o le attrezzature specifiche possono essere sostituiti da materiali comparabili disponibili.
L'utilizzazione di una lente di ingrandimento munita di illuminazione o microscopio binoculare da dissezione con illuminazione (3x) consente un'osservazione ottimale. Si osserverà il pesce in posizione dorsale, con la parte anteriore davanti (testa verso l'osservatore):
a)
Collocare il pesce in una piccola capsula di Petri (100 mm di diametro), sul ventre, parte anteriore verso l'avanti. Regolare il mirino per individuare i tubercoli. Far rotolare delicatamente il pesce da un lato all'altro per individuare le zone in cui si trovano i tubercoli. Contare e classificare i tubercoli.
b)
Ripetere l'osservazione sulla parte ventrale della testa, dopo aver collocato nella capsula di Petri il pesce sul dorso, parte anteriore verso l'avanti.
c)
Le osservazioni non dovrebbero superare i 2 minuti per ciascun esemplare.
Conteggio e classificazione dei tubercoli
Sono state individuate sei aree specifiche per la valutazione della presenza e dello sviluppo di tubercoli in Pimephales promelas (ciprinidi) adulti. È stata creato un modello per definire la localizzazione dei tubercoli e la quantità di tubercoli presenti (cfr. parte finale della presente appendice). Va registrato il numero di tubercoli che possono essere classificati come segue in funzione delle loro dimensioni: 0-nullo; 1-presente; 2-esteso e 3-prominente per ciascun organismo (figura 1).
Classe 0-: assenza di qualsiasi tubercolo. Classe 1-presente: un tubercolo che ha un unico punto di altezza quasi uguale al raggio (diametro). Classe 2-tubercolo esteso: individuato dal tessuto somigliante ad un asterisco, di solito con un'ampia base radiale con solchi che partono dal centro. L'altezza dei tubercoli è spesso più frastagliata ma può talvolta essere leggermente arrotondata. Classe 3-tubercolo prominente: generalmente abbastanza ampio, di forma arrotondata, con una struttura meno ben definita. Questi tubercoli si agglomerano talvolta fino a formare un'unica massa lungo una zona o più zone (B, C e D, si veda la descrizione qui sotto). Il colore e la forma sono simili alla classe 2, ma sono talvolta piuttosto indeterminati. Questo sistema di classificazione permette generalmente di ottenere un risultato globale di <50 in un maschio normale di controllo che presenta un numero di tubercoli compresi tra 18 e 20 (Jensen et al. 2001).
Figura 1
Alcuni pesci possono presentare più tubercoli di quelli risultanti dalle caselle del modello (cfr. appendice A) per una particolare zona. In tal caso, codici supplementari possono essere indicati all'interno, a destra o a sinistra della casella. Il modello non deve pertanto necessariamente presentarsi simmetrico. Un'altra tecnica per indicare i tubercoli pari o riuniti verticalmente lungo il piano orizzontale della bocca potrebbe consistere nell'indicare codici a 2 cifre in un'unica casella.
Aree di localizzazione:
A— Tubercoli situati attorno agli occhi. Localizzati in zona da dorsale a ventrale intorno al bordo anteriore dell'occhio. Più comunemente nei maschi testimoni maturi, assenti nelle femmine di controllo, generalmente in coppia (uno presso ciascun occhio) o singoli nelle femmine esposte a androgeni.
B— Tubercoli situati tra le narici (pori canali sensoriali). Nei maschi di controllo sono generalmente in coppia a livelli di sviluppo superiori (2-estesi o 3-prominenti). Assenti nelle femmine di controllo ma talvolta presenti nelle femmine esposte a androgeni.
C— Tubercoli situati immediatamente davanti alle narici, parallelamente alla bocca. Generalmente stesi o prominenti nei maschi di controllo maturi. Presenti o estesi nei maschi e nelle femmine esposte a androgeni.
D— Tubercoli situati parallelamente alla bocca. Generalmente classificati come “sviluppati” nei maschi di controllo. Assenti nelle femmine di controllo ma presenti nelle femmine esposte a androgeni.
E— Tubercoli situati sulla mascella inferiore, vicino alla bocca, in genere di piccole dimensioni e a coppie. Variabili nei maschi di controllo o trattati e nelle femmine trattate.
F— Tubercoli situati nella zona ventrale verso E. Generalmente piccoli e a coppie. Presenti nei maschi di controllo e nelle femmine esposte a androgeni.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
(1)
Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290.
(2)
Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360.
(3)
Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA,Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011.
(4)
Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141.
(5)
Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523.
(6)
Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145.
(7)
Smith RJF. 1974. Effects of 17-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038.
Matrice dei tubercoli
Classificazione numerica
ID
1- presente
Data
2-esteso
Punteggio totale
3-prominente
A
X1
X1
X1
X1
B
X1
X1
X1
X1
C
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
D
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
X1
E
X1
X1
F
X1
X1
X1
X1
Appendice 5B
Valutazione dei caratteri sessuali secondari nel medaka al fine di individuare alcune sostanze chimiche con attività endocrina
Di seguito è descritta la misurazione dei processi papillari (*2), che costituiscono i caratteri sessuali secondari nel medaka (Oryzias latipes).
(1)
Dopo l'escissione del fegato (appendice 6) la carcassa è introdotta in un tubo conico contenente circa 10 ml di formalina tamponata al 10 % (testa in alto, coda in basso). Se la gonade è fissata in una soluzione diversa dalla formalina tamponata al 10 %, praticare con un rasoio un taglio trasversale della carcassa tra la regione anteriore della pinna anale e l'ano, avendo cura di non rovinare il gonoporo e la gonade stessa (figura 3). Collocare la parte del corpo del pesce comprendente la testa nella soluzione fissativa per conservare la gonade, e la parte del corpo con la coda in formalina tamponata al 10 % come descritto sopra.
(2)
Dopo aver collocato il pesce in formalina tamponata al 10 %, afferrare con pinzette la regione anteriore della pinna anale e piegarla per una trentina di secondi affinché la pinna anale rimanga aperta. Tenendo la pinna anale con le pinzette, afferrare alcuni raggi della pinna nella regione anteriore avendo cura di non danneggiare i processi papillari.
(3)
Dopo aver tenuto la pinna anale aperta per una trentina di secondi, collocare il pesce in formalina tamponata al 10 % a temperatura ambiente fino alla misurazione dei processi papillari (la misurazione va effettuata dopo almeno 24 ore).
Misurazione
(1)
Dopo aver fissato il pesce in formalina tamponata al 10 % per almeno 24 ore, rimuovere la carcassa dal tubo conico e asciugare la formalina con carta da filtro (o carta assorbente).
(2)
Collocare il pesce con l'addome verso l'alto. Tagliare poi accuratamente la pinna anale con forbicine da dissezione (è preferibile tagliare la pinna anale con un pezzettino di pterigioforo).
(3)
Afferrare con le pinzette la regione anteriore della pinna anale asportata e disporla su un vetrino con qualche goccia d'acqua. Coprire quindi la pinna anale con un vetrino coprioggetti. Nell'afferrare la pinna anale con le pinzette, fare attenzione a non danneggiare i processi papillari.
(4)
Contare il numero di segmenti di raggio che presentano processi papillari utilizzando il contatore di un microscopio biologico (microscopio diritto o rovesciato). Si riconoscono i processi papillari quando è visibile una piccola formazione di processi papillari sul lato posteriore dei segmenti di raggio. Registrare in una tabella il numero di segmenti di raggio che presentano processi papillari in ciascun raggio di pinna (ad es. primo raggio: 0, secondo raggio: 10, terzo raggio: 12, ecc.) e registrarne la somma in un foglio Excel per ciascun esemplare. Se necessario, fotografare la pinna anale e contare il numero di segmenti di raggio che presentano processi papillari sulla foto.
(5)
Dopo la misurazione, riporre la pinna anale nel tubo conico descritto al punto (1) e conservarlo.
Figura 1
Differenze sessuali in base a forma e dimensioni della pinna anale. A: maschio; B: femmina. [Oka, T. B., (1931). Sui processi che avvengono sui raggi della pinna dell'esemplare maschio di Oryzias latipes e altri caratteri sessuali del pesce, cfr. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218].
Figura 2
A: Processi che avvengono sui segmenti congiunti del raggio della pinna anale. J.P., (joint plate): segmento congiunto; A.S.: spazio assiale; P:, processo. B: estremità distale della pinna anale. Gli attinotrichi (Act.) si trovano sulle punte. [Oka, T. B., (1931). Sui processi che avvengono sui raggi della pinna dell'esemplare maschio di Oryzias latipes e altri caratteri sessuali del pesce, cfr. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218].
Figura 3
Fotografia del corpo del pesce che mostra la linea di taglio quando la gonade è fissata in una soluzione diversa dalla formalina tamponata al 10 %. In tal caso, il resto del corpo è tagliato fra la regione anteriore della pinna anale e l'ano mediante rasoio (linea rossa). La testa è riposta nella soluzione fissativa per conservare la gonade, e la coda in formalina tamponata al 10 %.
Appendice 6
Procedure raccomandate per i prelievi effettuati ai fini dell'analisi della vitellogenina
Si avrà cura di evitare la contaminazione incrociata tra i campioni di VTG dei maschi e delle femmine.
Procedura 1A: Ciprinidi della specie Pimephales promelas, prelievo di sangue dall'arteria/vena caudale
Dopo anestesia, il peduncolo caudale è parzialmente reciso con un bisturi ed è prelevato un campione di sangue dall'arteria/vena caudale mediante un tubo capillare per microematocrito eparinato. Dopo il prelievo di sangue, il plasma viene rapidamente separato tramite centrifugazione a temperatura ambiente per 3 minuti a 15 000 g (o a una temperatura di 4 °C per 10 minuti a 15 000 g). A seguito della centrifugazione, si può determinare la percentuale di ematocrito. Il plasma viene successivamente ritirato dal tubo microematocrito e immagazzinato in un tubo da centrifuga con 0,13 unità di aprotinina (un inibitore di proteasi) a – 80 °C fino alla misurazione della vitellogenina. Secondo la dimensione del Ciprinide (che dipende dal sesso), i volumi di plasma prelevabili sono generalmente di 5-60 ml per individuo (Jensen et al. 2001).
Procedura 1B: Ciprinidi della specie Pimephales promelas, prelievo di sangue mediante puntura cardiaca
In alternativa, è possibile effettuare un prelievo di sangue con puntura cardiaca mediante siringa eparinizzata (1 000 unità di eparina per ml). Il sangue è trasferito in provette Eppendorf (mantenute nel ghiaccio) e quindi centrifugato (5 minuti a 7 000 g a temperatura ambiente). Il plasma va trasferito in provette Eppendorf pulite (in varie porzioni se il volume di plasma lo consente) e successivamente congelato rapidamente a -800C fino all'analisi (Panter et al., 1998).
Procedura 2A: Escissione del fegato in Oryzias latipes (medaka)
Rimozione dei pesci oggetti di prova dalla vasca sperimentale
(1)
I pesci oggetto della prova sono rimossi dalla vasca sperimentale mediante un retino. Si faccia attenzione a non far cadere i pesci in un'altra vasca sperimentale.
(2)
In linea di principio, i pesci oggetto della prova vanno rimossi nell'ordine seguente: esemplari di controllo, vasca di controllo contenente il solvente (se del caso), concentrazione minima, concentrazione media, concentrazione massima e controllo positivo. Inoltre, tutti i maschi vanno rimossi dalla vasca sperimentale prima delle femmine.
(3)
Il sesso di ogni esemplare di prova è identificato in base ai caratteri sessuali secondari esterni (forma della pinna anale, ad esempio).
(4)
Collocare i pesci in un contenitore per il trasporto fino alla postazione di lavoro per l'escissione del fegato. Verificare le etichette della vasca sperimentale e del contenitore di trasporto a fini di accuratezza e per confermare che il numero di pesci rimossi dalla vasca sperimentale e il numero di pesci rimasti nella vasca sperimentale corrispondano alle previsioni.
(5)
Se il sesso non può essere identificato tramite l'aspetto esterno del pesce, rimuovere tutti i pesci dalla vasca sperimentale. In tal caso, il sesso è identificato mediante osservazione della gonade o i caratteri sessuali secondari mediante microscopio stereoscopico.
Escissione del fegato
(1)
Trasferire il pesce oggetto della prova dal contenitore di trasporto alla soluzione anestetica mediante retino.
(2)
Dopo l'anestesia, i pesci oggetto della prova sono trasferiti sulla carta da filtro (o carta assorbente) con pinzette (di tipo comune). Nell'afferrare i pesci, applicare le pinzette ai lati della testa per evitare di rompere la coda.
(3)
Asciugare l'acqua dalla superficie del pesce oggetto della prova sulla carta da filtro (o carta assorbente).
(4)
Porre i pesci sul dorso. Praticare quindi una piccola incisione trasversale tra la regione ventrale della nuca e la regione centrale dell'addome mediante forbici da dissezione.
(5)
Introdurre le forbici da dissezione nella piccola incisione, e praticare un'incisione lungo la linea mediana dell'addome, da un punto caudale rispetto al manto branchiale fino al lato cranico dell'ano. Fare attenzione a non introdurre le forbici da dissezione troppo in profondità per non rovinare il fegato e la gonade.
(6)
Svolgere le seguenti operazioni al microscopio stereoscopico.
(7)
Porre i pesci sul dorso sulla carta assorbente (o in una capsula di Petri di vetro o su una piastra di vetro).
(8)
Allargare le pareti della cavità addominale mediante pinzette di precisione ed esporre gli organi interni. È anche possibile esporre gli organi interni eliminando una delle pareti della cavità addominale se necessario.
(9)
Esporre la parte di collegamento tra il fegato e la cistifellea utilizzando un altro paio di pinzette di precisione. Afferrare quindi il dotto biliare e recidere la cistifellea, facendo attenzione a non romperla.
(10)
Afferrare l'esofago e asportare il tratto gastrointestinale dal fegato con lo stesso metodo. Fare attenzione a non far colare il contenuto del tratto gastrointestinale. Recidere il tratto gastrointestinale caudale dall'ano e rimuoverlo dalla cavità addominale.
(11)
Eliminare la massa dei tessuti adiposi ed altri tessuti situati alla periferia del fegato, avendo cura di non rovinare il fegato.
(12)
Afferrare la zona della porta epatica con le pinzette di precisione e rimuovere il fegato dalla cavità addominale.
(13)
Porre il fegato sulla piastra di vetro. Con le pinzette di precisione, rimuovere eventuale altro tessuto adiposo o tessuto estraneo (rivestimento della parete addominale, ad esempio), se del caso, dalla superficie del fegato.
(14)
Pesare il fegato mediante una bilancia di precisione elettronica utilizzando come tara una microprovetta da 1,5 ml. Annotare il valore sul foglio di lavoro (precisione: 0,1 mg). Confermare le informazioni identificative sull'etichetta della microprovetta.
(15)
Chiudere il tappo della microprovetta contenente il fegato e conservarla su un supporto di raffreddamento (o un supporto ghiacciato).
(16)
Dopo ogni escissione di fegato, pulire gli strumenti di dissezione oppure sostituirli con strumenti puliti.
(17)
Rimuovere nello stesso modo il fegato da tutti i pesci presenti nel contenitore di trasporto.
(18)
Dopo l'escissione del fegato di tutti i pesci presenti nel contenitore (cioè tutti i maschi e tutte le femmine di una vasca sperimentale), porre tutti gli esemplari di fegato su supporti per tubi muniti di etichetta di identificazione e conservarli in congelatore. Se i fegati subiranno un pre-trattamento subito dopo l'escissione, gli esemplari devono essere trasportati fino alla postazione di lavoro più vicina in un supporto di raffreddamento (o un supporto ghiacciato).
Dopo l'escissione del fegato, la carcassa è pronta per la misurazione dei caratteri sessuali secondari.
Campioni
Conservare i campioni di fegato prelevati dai pesci oggetto di prova ad una temperatura ≤ -70 °C se non utilizzati per il pre-trattamento subito dopo l'escissione.
Figura 1
Praticare con le forbici un taglio nella parte anteriore delle pinne pettorali.
Figura 2
Tagliare la linea mediana dell'addome con forbici da un punto situato a circa 2 mm dal cranio fino all'ano.
Figura 3
Allargare le pareti addominali con pinzette per esporre il fegato e gli altri organi interni (in alternativa le pareti addominali possono essere pinzate lateralmente). La freccia mostra il fegato
Figura 4
Il fegato è dissezionato e rimosso mediante le pinzette.
Figura 5
Gli intestini sono rimossi delicatamente con le pinzette.
Figura 6
Le due estremità degli intestini e gli attacchi del mesenterio sono separati con le forbici.
Figura 7 (femmina)
La procedura è identica per le femmine.
Figura 8
Procedura completata.
Procedura 2B: Pre-trattamento del fegato per l'analisi della vitellogenina in Oryzias latipes (medaka)
Ritirare la bottiglia contenente il tampone di omogeneizzazione dal kit ELISA e raffreddarlo con ghiaccio tritato (temperatura della soluzione: ≤ 4 °C). Se si usa un tampone di omogeneizzazione proveniente da un kit EnBio ELISA, scongelare la soluzione a temperatura ambiente, e quindi raffreddare la bottiglia con ghiaccio tritato.
Calcolare il volume di tampone di omogeneizzazione per il fegato in base al peso di quest'ultimo (aggiungere 50 μl di tampone di omogeneizzazione per mg di fegato per l'omogenato). Per esempio: se il fegato pesa 4,5 mg, il volume del tampone di omogeneizzazione per il fegato è di 225 μl. Stilare un elenco dei volumi di tampone di omogeneizzazione per tutti i fegati.
Preparazione del fegato per il pre-trattamento
(1)
Ritirare la microprovetta da 1,5 ml contenente il fegato dal congelatore immediatamente prima del pre-trattamento.
(2)
Il pre-trattamento del fegato dei maschi è effettuato prima di quello delle femmine per evitare contaminazioni della vitellogenina. Inoltre, il pre-trattamento dei gruppi di prova è effettuata nel seguente ordine: controllo, vasca di controllo contenente il solvente (se del caso), concentrazione minima, concentrazione media, concentrazione massima e controllo positivo.
(3)
Il numero di microprovette da 1,5 ml contenenti i campioni epatici tolti dal congelatore in un dato momento non deve superare il numero di quelli che possono essere centrifugati subito.
(4)
Porre le microprovette da 1,5 ml contenenti i campioni epatici nel supporto ghiacciato secondo l'ordine di numerazione degli esemplari (non è necessario scongelare il fegato).
Svolgimento del pre-trattamento
1. Aggiunta del tampone di omogeneizzazione
(1)
Verificare nell'elenco il volume di tampone di omogeneizzazione da utilizzare per un determinato campione di fegato e aggiustare la micropipetta (intervallo dei volumi: 100-1 000 μl) al volume adeguato. Attaccare un puntale pulito alla micropipetta.
(2)
Rimuovere il tampone di omogeneizzazione dalla bottiglia del reagente e aggiungere il tampone nella microprovetta da 1,5 ml contenente il fegato.
(3)
Aggiungere il tampone di omogeneizzazione in tutte le microprovette da 1,5 ml contenenti i campioni di fegato seguendo la procedura sopra descritta. Non è necessario sostituire il puntale della micropipetta con uno nuovo, a meno che non sia contaminato o si sospetti possa esserlo.
2. Omogeneizzazione del fegato
(1)
Attaccare un nuovo pestello di omogeneizzazione all'omogeneizzatore della microprovetta.
(2)
Introdurre il pestello nella microprovetta da 1,5 ml. Tenere l'omogeneizzatore in modo da pressare il fegato tra la superficie del pestello e la parete interna della microprovetta.
(3)
Attivare l'omogeneizzatore per 10-20 secondi. Raffreddare la microprovetta con ghiaccio tritato durante l'operazione.
(4)
Ritirare il pestello dalla microprovetta e lasciar riposare per una decina di minuti. Procedere quindi a un'ispezione visiva dello stato della sospensione.
(5)
Se si osservano pezzi di fegato nella sospensione, ripetere le operazioni (3) e (4) per ottenere un omogenato epatico soddisfacente.
(6)
Conservare al fresco l'omogenato epatico in sospensione nel supporto ghiacciato fino alla sua centrifugazione.
(7)
Utilizzare un pestello nuovo per ciascun omogenato.
(8)
Omogeneizzare tutti i fegati con tampone di omogeneizzazione seguendo la procedura sopra descritta.
3. Centrifugazione dell'omogenato epatico in sospensione
(1)
Verificare che la temperatura della centrifuga refrigerata sia ≤ 5 °C.
(2)
Introdurre le microprovette da 1,5 ml contenenti l'omogenato epatico in sospensione nella centrifuga refrigerata (riequilibrare se necessario).
(3)
Centrifugare l'omogenato epatico in sospensione per 10 minuti a 13 000 g ad una temperatura ≤ 5 °C. Tuttavia, se i supernatanti sono adeguatamente separati, la forza centrifuga e la durata di centrifugazione possono essere adeguate come necessario.
(4)
Dopo la centrifugazione, verificare che i supernatanti siano adeguatamente separati (superficie: lipidi, strato intermedio: supernatante, strato inferiore: tessuto epatico). Se la separazione non è adeguata, ripetere la centrifugazione della sospensione alle stesse condizioni.
(5)
Rimuovere tutti i campioni dalla centrifuga refrigerata e trasferirli nel supporto ghiacciato secondo l'ordine di numerazione degli esemplari. Prestare attenzione a non rimettere in sospensione gli strati separati dopo la centrifugazione.
4. Raccolta del supernatante
(1)
Riporre quattro microprovette da 0,5 ml per la conservazione del supernatante nel supporto per provette.
(2)
Raccogliere 30 μl di ciascun supernatante (che forma lo strato intermedio dopo la separazione) con la micropipetta e versarli in una microprovetta da 0,5 ml, avendo cura di non raccogliere i lipidi dalla superficie o il tessuto epatico dal fondo.
(3)
Raccogliere il supernatante e versarlo in altri due microprovette da 0,5 ml seguendo la procedura sopra descritta.
(4)
Raccogliere il resto del supernatante con la micropipetta (se possibile: ≥ 100 μl). Versare quindi il supernatante nella rimanente microprovetta da 0,5 ml, avendo cura di non raccogliere i lipidi dalla superficie o il tessuto epatico dal fondo.
(5)
Tappare la microprovetta da 0,5 ml e registrare il volume del supernatante sull'etichetta. Trasferire immediatamente le microprovette sul supporto ghiacciato.
(6)
Sostituire il puntale della micropipetta con uno nuovo per ciascun supernatante. Se una grande quantità di grassi rimane attaccata al puntale, sostituirlo immediatamente con uno nuovo per evitare la contaminazione dell'estratto di fegato con il grasso.
(7)
Versare tutto il supernatante centrifugato in quattro microprovette da 0,5 ml seguendo la procedura sopra descritta.
(8)
Dopo aver versato il supernatante nelle microprovette da 0,5 ml, riporle tutte sul relativo supporto con l'etichetta di identificazione e inserirle immediatamente nel congelatore. Se le concentrazioni di VTG sono misurate subito dopo il pre-trattamento, conservare al fresco una microprovetta da 0,5 ml (contenente 30 μl di supernatante) nel relativo supporto e trasferirla alla postazione di lavoro in cui sarà condotta l'analisi ELISA. In tal caso, riporre le microprovette rimanenti nei supporti e metterle nel congelatore.
(9)
Dopo la raccolta del supernatante, eliminare il liquido residuale in modo adeguato.
Conservazione degli esemplari
Conservare le microprovette da 0,5 ml contenenti il supernatante dell'omogenato epatico a una temperatura ≤ -70 °C fino all'esecuzione dell'analisi ELISA.
Procedura 3A: Prelievo di campioni ematici dall'arteria/ vena caudale nel danio zebrato
Immediatamente dopo l'anestesia sezionare trasversalmente il peduncolo caudale ed eseguire un prelievo ematico dall'arteria/ vena caudale mediante tubo capillare microematocrito eparinato. I volumi di sangue raccolti variano tra 5 e 15 μl in funzione della dimensione del pesce. Un volume equivalente di tampone di aprotinina [6 μg/ml di soluzione salina tamponata al fosfato (PB)] è aggiunto al capillare e il plasma è separato dal sangue mediante centrifugazione (5 minuti a 600 g). Il plasma è raccolto in provette e conservato a -20 C fino alla misurazione della vitellogenina o di altre proteine di interesse.
Procedura 3B: Prelievo di sangue mediante puntura cardiaca nel danio zebrato
Per evitare la coagulazione del sangue e la degradazione della proteina, i campioni sono prelevati in una soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) contenente eparina (1 000 unità/ml) e aprotinina, inibitore di proteasi (2 TIU/ml). Come ingredienti del tampone, si raccomanda di utilizzare eparina, sale ammonico e aprotinina liofilizzata. Per il prelievo ematico, si raccomanda di utilizzare una siringa (1 ml) con ago fisso sottile (Braun Omnikan-F, ad esempio). La siringa va preriempita con il tampone (circa 100 μl), per eluire completamente i piccoli volumi sanguigni da ciascun pesce. I prelievi di sangue avvengono mediante puntura cardiaca. Inizialmente, il pesce viene anestetizzato con MS-222 (100 mg/l). Un'anestesia adeguata consente di distinguere il battito cardiaco del danio zebrato. Durante la puntura cardiaca, mantenere una pressione leggera sullo stantuffo della siringa. I volumi sanguigni che possono essere raccolti variano tra 20 e 40 microlitri. Dopo la puntura cardiaca, la miscela sangue/tampone è versata nella provetta. Il plasma è separato dal sangue mediante centrifugazione (20 minuti a 5 000 g) ed è conservato a una temperatura di -800 °C fino al momento dell'analisi.
Procedura 3C: POS: omogeneizzazione della testa e della coda nel danio zebrato
(1)
I pesci sono anestetizzati e soppressi in modo incruento come da protocollare sperimentale.
(2)
La testa e la coda del pesce sono tagliate come indicato da figura 1.
N.B.: Tutti gli strumenti da dissezione e il tagliere vanno lavati e puliti correttamente (ad. es. con etanolo al 96 %) tra il trattamento di ciascun pesce e il successivo per evitare la “contaminazione da vitellogenina” tra le femmine o i maschi trattati e i maschi non trattati.
Figura 1
Incidere dietro la pinna pettorale
Per istologia delle gonadi
Incidere dietro la pinna caudale
Per analisi della VTG
Per analisi della VTG
(3)
La testa e la coda di ciascun pesce sono pesate, insieme, con precisione fino al mg.
(4)
Dopo essere state pesate, tali parti sono collocate in apposite provette (ad es. provette Eppendorf da 1,5 ml) e conservate ad una temperatura di -80 °C fino alla loro omogeneizzazione oppure direttamente omogeneizzate in ghiaccio con 2 pestelli in plastica (possono essere adottati altri metodi purché implichino l'utilizzo di ghiaccio e ne risulti una massa omogenea). N.B.: Le provette vanno numerate in modo appropriato di modo che la testa e la coda del pesce possano essere collegate alla sezione corrispondente del corpo utilizzata per l'esame istologico delle gonadi.
(5)
Dopo aver ottenuto una massa omogenea, aggiungere un tampone di omogeneizzazione (*3) ghiacciato del peso pari a 4 volte il peso dei tessuti. Continuare a lavorare di pestello fino a che la miscela non risulti omogenea. N.B.: Utilizzare un nuovo pestello per ciascun pesce.
(6)
I campioni sono collocati nel ghiaccio fino a centrifugazione a 50 000 g per 30 minuti e ad una temperatura di 4 °C.
(7)
Con l'uso di una pipetta ripartire porzioni di 20 μl di supernatante in almeno due provette facendo penetrare la punta della pipetta al di sotto dello strato lipidico in superficie ed aspirando con attenzione il supernatante privo di parti grasse e di precipitato.
(8)
Le provette sono conservate ad una temperatura di – 80 °C fino al loro utilizzo.
Appendice 7
Campioni fortificati di vitellogenina e standard di riferimento inter-prova
Ogni giorno in cui sono effettuate prove sulla vitellogenina, è analizzato un campione fortificato in applicazione di uno standard di riferimento inter-prova. La vitellogenina utilizzata per preparare lo standard di riferimento inter-prova proverrà da un lotto diverso da quello utilizzato per preparare gli standard di calibrazione per la prova in corso.
Per preparare il campione fortificato, si aggiunge una quantità nota di standard inter-prova ad un campione di plasma di esemplare maschio di controllo. Il campione sarà ulteriormente fortificato fino a raggiungere una concentrazione di vitellogenina da 10 a 100 volte superiore alla concentrazione di vitellogenina prevista nei maschi di controllo. Il campione di plasma di esemplare maschio di controllo da fortificare può provenire da un unico esemplare o da più esemplari.
Un sottocampione del plasma di un esemplare maschio di controllo non fortificato sarà analizzato in almeno due pozzetti in duplicato. Anche il campione fortificato va analizzato in almeno due pozzetti in duplicato. Al fine di determinare la concentrazione prevista, la quantità media di vitellogenina di entrambi i campioni non rinforzati di plasma di maschio di controllo viene aggiunta alla quantità calcolata di vitellogenina aggiunta per arricchire i campioni. Il rapporto tra la concentrazione prevista e la concentrazione misurata dovrebbe essere rilevato assieme ai risultati dei singoli test effettuati lo stesso giorno.
In force
