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Document 32016R0266
Commission Regulation (EU) 2016/266 of 7 December 2015 amending, for the purpose of its adaptation to technical progress, Regulation (EC) No 440/2008 laying down test methods pursuant to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) (Text with EEA relevance)
Regolamento (UE) 2016/266 della Commissione, del 7 dicembre 2015, recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (Testo rilevante ai fini del SEE)
Regolamento (UE) 2016/266 della Commissione, del 7 dicembre 2015, recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (Testo rilevante ai fini del SEE)
C/2015/8529
OJ L 54, 1.3.2016, p. 1–446
(BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)
In force
1.3.2016 |
IT |
Gazzetta ufficiale dell'Unione europea |
L 54/1 |
REGOLAMENTO (UE) 2016/266 DELLA COMMISSIONE
del 7 dicembre 2015
recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH)
(Testo rilevante ai fini del SEE)
LA COMMISSIONE EUROPEA,
visto il trattato sul funzionamento dell'Unione europea,
visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un'Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l'articolo 13, paragrafo 2,
considerando quanto segue:
(1) |
Il regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione (2) istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l'ecotossicità delle sostanze chimiche applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006. |
(2) |
È necessario aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi in via prioritaria nuovi e aggiornati metodi di prova adottati di recente dall'OCSE), per tener conto del progresso tecnico e ridurre il numero di animali usati a scopi di sperimentazione, conformemente alla direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio (3). Le parti interessate sono state consultate in merito alla proposta. |
(3) |
L'adeguamento contiene 20 metodi di prova, ossia un nuovo metodo per la determinazione di una proprietà fisico-chimica, undici nuovi metodi di prova e tre metodi di prova aggiornati per la valutazione dell'ecotossicità, e cinque nuovi metodi di prova per valutare il destino e il comportamento ambientale. |
(4) |
È opportuno pertanto modificare di conseguenza il regolamento (CE) n. 440/2008. |
(5) |
Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato di cui all'articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006, |
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
Articolo 1
L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è modificato conformemente all'allegato del presente regolamento.
Articolo 2
Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.
Fatto a Bruxelles, il 7 dicembre 2015
Per la Commissione
Il presidente
Jean-Claude JUNCKER
(1) GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1.
(2) Regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione, del 30 maggio 2008, che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1).
(3) Direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33).
ALLEGATO
L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato:
(1) |
È inserita una nota all'inizio dell'allegato, prima della parte A: «Nota: prima di utilizzare uno dei metodi di prova descritti di seguito per testare una sostanza multicostituente (MCS), una sostanza di composizione sconosciuta o variabile, il prodotto di una reazione complessa o di origine biologica (UVCB) o una miscela e qualora l'applicabilità del metodo di prova per le sostanze MCS, UVCB o le miscele non sia stata descritta nel rispettivo metodo di prova, è opportuno chiedersi se il metodo sia adeguato per fornire risultati scientificamente validi e pertinenti ai fini regolamentari previsti. Se il metodo di prova è utilizzato per testare una sostanza MCS o UVCB o una miscela, è necessario rendere disponibili, nella misura del possibile, informazioni sufficienti sulla sua composizione, ad esempio tramite l'identità chimica dei costituenti, le loro proporzioni quantitative e le loro proprietà specifiche.» |
(2) |
È aggiunto il capitolo A.24: «A.24. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (N-OTTANOLO/ACQUA), METODO DELLA CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (HPLC) INTRODUZIONE Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE n. 117 (2004).
CONSIDERAZIONI INIZIALI
PRINCIPIO DELLA PROVA
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME
CRITERI DI QUALITÀ
SOSTANZE DI RIFERIMENTO
DESCRIZIONE DEL METODO Stima preliminare del coefficiente di ripartizione
Apparecchiatura
Fase mobile
Soluti
Condizioni sperimentali
Determinazione del tempo morto to
Equazione di regressione
DETERMINAZIONE DEL POW DELLA SOSTANZA IN ESAME
DATI E RELAZIONE Relazione sulla prova
BIBLIOGRAFIA
Appendice Metodi di calcolo del POW INTRODUZIONE
Principio dei metodi di calcolo
Affidabilità dei valori calcolati
Metodo Fujita-Hansch π
Metodo di Rekker
Metodo di Hansch-Leo
METODO COMBINATO
Osservazioni
BIBLIOGRAFIA SUI METODI DI CALCOLO
|
(3) |
Il capitolo C.3. è sostituito dal seguente: «C.3. ALGHE DI ACQUA DOLCE E CIANOBATTERI, PROVA DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA INTRODUZIONE
PRINCIPIO DELLA PROVA
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
VALIDITÀ DELLA PROVA
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO
APPLICABILITÀ DELLA PROVA
DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA Apparecchiature
Organismi sperimentali
Mezzo di crescita
Concentrazione iniziale della biomassa
Concentrazioni della sostanza chimica in esame
Repliche e controlli
Preparazione della coltura di inoculo
Preparazione delle soluzioni di prova
Incubazione
Durata della prova
Misurazioni e determinazioni analitiche
Altre osservazioni
Prova limite
DATI E RELAZIONI Tracciato delle curve di crescita
Variabili di risposta
Tasso di crescita specifico medio
Rendimento
Tracciato della curva concentrazione-risposta
Procedure statistiche
Stimolazione della crescita
Inibizione di origine non tossica della crescita
RELAZIONE SULLA PROVA
BIBLIOGRAFIA
Appendice 1 Definizioni Ai fini del presente metodo di prova sono usate le definizioni e le abbreviazioni seguenti. Biomassa : peso secco della materia vivente presente in una popolazione espresso in funzione di un determinato volume, ad esempio mg di alghe per litro di soluzione di prova. La biomassa di solito corrisponde alla massa, ma ai fini della presente prova questo termine è utilizzato per riferirsi alla massa per unità di volume. Dato che nella presente prova la biomassa è in genere misurata indirettamente, tramite conteggio delle cellule, fluorescenza ecc., l'uso del termine “biomassa” si riferisce anche a queste misurazioni alternative. Coefficiente di variazione (CV) : misura adimensionale della variabilità di un parametro, definita come il rapporto della deviazione standard rispetto alla media. Può essere espresso anche con una percentuale. Il coefficiente medio di variazione del tasso di crescita specifico medio nelle repliche delle colture di controllo deve essere calcolato come segue:
Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC — Lowest Observed Effect Concentration) : concentrazione più bassa saggiata di una sostanza alla quale si osserva un effetto di riduzione statisticamente significativo della crescita (p < 0,05) rispetto al controllo, nell'arco di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e di conseguenza la NOEC). Concentrazione senza effetti osservati (NOEC — No Observed Effect Concentration) : concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC. ECx : concentrazione della sostanza disciolta nel mezzo di prova che causa una riduzione dell'x % (per esempio del 50 %) della crescita dell'organismo sperimentale entro un periodo di esposizione definito (che deve essere esplicitato se diverso dalla durata completa o normale della prova). Per indicare in modo inequivoco se il valore EC si riferisce al tasso di crescita o al rendimento si utilizzano, rispettivamente, le abbreviazioni “ErC” e “EyC”. Mezzo di crescita : mezzo sintetico completo di coltura in cui le alghe crescono quando sono esposte alla sostanza chimica in esame. Quest'ultima è di norma disciolta nel mezzo di prova. Rendimento : valore di una variabile di misurazione che esprime la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e il valore della stessa variabile all'inizio del periodo di esposizione, utilizzata per esprimere l'aumento della biomassa durante la prova. Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. Sostanza chimica : sostanza o miscela. Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio): aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione. Tasso di crescita specifico : variabile di risposta che corrisponde al quoziente della differenza dei logaritmi naturali di un parametro di osservazione (nel presente metodo di prova, la biomassa) e il periodo di tempo rispettivo. Variabile di risposta : variabile per la stima della tossicità dedotta da qualsiasi parametro misurato che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. Per questo metodo i tassi di crescita e rendimento sono variabili di risposta ricavati dalla misura diretta della biomassa o di qualsiasi metodo alternativo menzionato. Appendice 2 Ceppi dimostratisi idonei alla prova Alghe verdi
Diatomee Navicula pelliculosa, UTEX 664 Cianobatteri
Fonti dei ceppi I ceppi raccomandati sono disponibili in colture unialgali provenienti dalle seguenti collezioni (in ordine alfabetico):
Aspetto e caratteristiche delle specie raccomandate
Indicazioni particolari per la coltura e la manipolazione delle specie sperimentali raccomandate Pseudokirchneriella subcapitata e Desmodesmus subspicatus Queste alghe verdi sono generalmente facili da coltivare in vari mezzi di coltura. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Le cellule sono generalmente separate e la densità cellulare si misura facilmente con un contatore elettronico di particelle o al microscopio. Anabaena flos-aquae La coltura madre si conserva in vari mezzi di crescita. In particolar modo si deve evitare che la coltura batch abbia superato la fase esponenziale di crescita al momento del rinnovo, poiché il recupero è difficile a questo punto. Anabaena flos-aquae forma catene di cellule raccolte in spirali (aggregati). La dimensione di tali aggregati varia in funzione delle condizioni di coltura. Per determinare la biomassa può essere necessario spezzare tali aggregati per contare le cellule al microscopio o con contatore elettronico di particelle. Le catene di sottocampioni possono essere spezzate in vari punti mediante sonicazione, per ridurre la variabilità di calcolo. Processi di sonicazione più lunghi del necessario per spezzare le catene in piccoli segmenti potrebbero distruggere le cellule. L'intensità e la durata della sonicazione devono essere identiche per ciascun gruppo trattato. Per contribuire a compensare la variabilità si contino sufficienti campi nella griglia dell'emocitometro (almeno 400). Ciò aumenterà l'affidabilità delle determinazioni della densità al microscopio. Dopo aver diviso le catene di cellule mediante attenta sonicazione, il volume cellulare totale di Anabaena può essere determinato utilizzando un contatore elettronico di particelle. La potenza della sonicazione deve essere regolata in modo da evitare di rompere le cellule. Utilizzare un agitatore a vortice o strumento analogo per assicurare che la sospensione di alghe utilizzata per inoculare i recipienti di prova sia sufficientemente mescolata e omogenea. I recipienti di prova devono essere posti su agitatori da banco reciproci o orbitali a circa 150 rpm. In alternativa, l'Anabaena può anche essere agitata ad intermittenza per evitare la formazione di aggregati. Qualora invece ciò avvenga, si provvederà a prelevare campioni rappresentativi ai fini della misura della biomassa. Un'agitazione vigorosa prima del prelievo può essere necessaria per disgregare gli ammassi algali. Synechococcus leopoliensis La coltura madre si conserva in diversi mezzi di crescita. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Synechococcus leopoliensis cresce formando bastoncelli isolati. La minuscola dimensione delle cellule ne rende difficile la conta al microscopio ai fini della misura della biomassa. In questo caso, è utile disporre di un contatore elettronico capace di contare particelle di dimensione fino a 1 μm. È applicabile anche la misurazione fluorimetrica in vitro. Navicula pelliculosa La coltura madre si conserva in diversi mezzi di crescita. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Si noti che in questo caso deve essere aggiunto silicato. Navicula pelliculosa può formare aggregati in alcune condizioni colturali. A causa della produzione lipidica, le cellule algali tendono a volte ad accumularsi nella pellicola che si forma in superficie. Se ciò avviene, si devono prendere misure apposite durante il prelievo di sottocampioni ai fini della determinazione della biomassa per garantire la rappresentatività dei campioni. Può risultare necessaria un'agitazione vigorosa, per esempio tramite un agitatore a vortice. Appendice 3 Mezzi di crescita Può essere utilizzato uno dei due mezzi di crescita seguenti.
Nella preparazione di questi mezzi occorre utilizzare sostanze chimiche di grado reagente o analitico e acqua deionizzata. Composizione del mezzo AAP (EPA USA) e di quello indicato nella linea guida n. 201 dell'OCSE
La relazione molare dell'EDTA sul ferro è leggermente superiore all'unità. Ciò impedisce al ferro di precipitare e minimizza allo stesso tempo la chelazione degli ioni di metalli pesanti. Nella prova condotta sulla diatomea Navicula pelliculosa, ai due mezzi deve essere aggiunto Na2SiO3 · 9H2O, per raggiungere una concentrazione di 1,4 mg di Si/l. Il pH del mezzo è ottenuto al punto di equilibrio tra il sistema carbonato del mezzo e la pressione parziale di CO2 nell'aria atmosferica. La relazione approssimativa tra il pH a 25 °C e la concentrazione molare di bicarbonato è espressa dalla seguente formula: pHeq = 11,30 + log [HCO3] Con 15 mg/l NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (mezzo USA-EPA) e con 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (mezzo OCSE). Composizione degli elementi del mezzo di prova
Preparazione del mezzo OCSE
Le soluzioni madre sono sterilizzate mediante filtrazione su membrana (diametro medio dei pori: 0,2 μm) o con autoclavaggio (15 minuti a 120 °C). Conservare le soluzioni al riparo dalla luce e alla temperatura di 4 °C. Le soluzioni madre 2 e 4 sono sterilizzate solo mediante filtrazione su membrana e non devono essere sottoposte ad autoclavaggio. Preparare il mezzo di crescita aggiungendo all'acqua un volume adeguato delle soluzioni madre da 1 a 4.
Attendere che il preparato raggiunga l'equilibrio con il CO2 atmosferico, se necessario facendo gorgogliare aria sterile e filtrata per alcune ore. Preparazione del mezzo AAP
Appendice 4 Esempio di metodo di coltura delle alghe Osservazioni generali La preparazione di colture sulla base del seguente metodo serve per ottenere colture algali destinate alle prove di tossicità. Occorre procedere in modo da preservare le colture algali da qualsiasi contaminazione batterica. Può essere utile avviare colture axeniche, ma devono essere utilizzate colture unialgali. Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili per evitare ogni contaminazione con batteri e altre alghe. Apparecchiatura e materiale Si veda alla voce “Apparecchiatura” del metodo di prova. Metodo per ottenere colture algali Preparazione di soluzioni nutritive (mezzi) Tutti i sali minerali del mezzo sono preparati sotto forma di soluzioni madre concentrate e conservate al freddo e al riparo dalla luce. Queste soluzioni sono sterilizzate tramite filtrazione o autoclavaggio. Preparare il mezzo aggiungendo la giusta quantità di soluzione madre all'acqua distillata sterile, facendo attenzione ad evitare ogni rischio di infezione. Per i mezzi solidi, aggiungere 0,8 % di agar. Coltura madre Le colture madri che fungono da materiale di prova iniziale sono piccole colture algali trasferite con regolarità su mezzo fresco. Se le colture non vengano usate con regolarità, esse vanno strisciate su provette inclinate riempite di agar. Le colture sono trasferite su mezzo fresco almeno una volta ogni due mesi. Le colture madri sono coltivate in beute contenenti il mezzo adeguato (volume di circa 100 ml). Quando le alghe vengono incubate a 20 °C con illuminazione continua, è necessario un trasferimento settimanale. Durante il trasferimento, una certa quantità di coltura “vecchia” viene trasferita con pipette sterili in una beuta contenente mezzo fresco; la quantità deve essere tale che, nel caso delle specie a crescita rapida, la concentrazione iniziale sia circa 100 volte inferiore di quella della coltura vecchia. Il tasso di crescita di una specie può essere determinato osservando la curva di crescita. Se questa è nota, è possibile stimare la densità alla quale la coltura deve essere trasferita in un mezzo nuovo. Ciò deve essere fatto prima che la coltura raggiunga la fase di mortalità. Precoltura La precoltura serve a fornire un quantitativo di alghe sufficiente per l'inoculo delle colture di prova. La precoltura è incubata alle condizioni sperimentali e utilizzata quando è ancora in crescita esponenziale, solitamente dopo un periodo di incubazione compreso tra 2 e 4 giorni. Qualora contengano cellule deformate o anomale, le colture algali devono essere scartate. Appendice 5 Analisi dei dati tramite regressione non lineare Considerazioni generali La risposta osservata nelle prove sulle alghe e nelle altre prove di crescita di microrganismi (aumento della biomassa) è espressa, per sua natura, da una variabile continua o metrica; tale variabile è data dalla velocità del processo se si utilizza il tasso di crescita o dalla sua integrale in funzione del tempo se si sceglie la biomassa. Queste due variabili sono raffrontate con il corrispondente risultato medio osservato su repliche dei controlli non esposti che presentano la risposta massima alle condizioni imposte, in cui la luce e la temperatura sono i principali fattori determinanti nelle prove sulle alghe. Il sistema è distribuito o omogeneo e la biomassa può essere considerata un continuum, senza considerare le singole cellule. La distribuzione della varianza del tipo di risposta di tale sistema dipende soltanto dai fattori sperimentali (descritti generalmente dalle distribuzioni log- normale o normale dell'errore), contrariamente a quanto avviene negli esperimenti biologici classici i cui effetti sono espressi con dati quantali e per i quali spesso si presume che la tolleranza (generalmente con distribuzione binomiale) di ciascun organismo costituisca la componente dominante della varianza. In questo caso, le risposte dei controlli hanno valore zero o quello del livello di fondo. Nella situazione semplice, la risposta normalizzata o relativa (r) diminuisce monotonicamente da 1 (inibizione nulla) a 0 (inibizione al 100 %). Si noti che tutte le risposte hanno un errore associato e che le inibizioni negative evidenti possono essere calcolate come risultato del solo errore casuale. Analisi della regressione Modelli Un'analisi della regressione mira a descrivere quantitativamente la curva concentrazione-risposta sotto forma di funzione matematica della regressione Y = f (C) o, più frequentemente, F (Z) dove Z = log C. La funzione inversa, C = f– 1 (Y) permette di calcolare i valori ECx, compresi i valori EC50, EC10 e EC20, e i corrispondenti limiti di confidenza a 95 %. Molte funzioni matematiche semplici hanno dimostrato di descrivere correttamente la relazione concentrazione-risposta ottenuta nelle prove di inibizione della crescita delle alghe. Fra dette funzioni rientrano, per esempio, l'equazione logistica, l'equazione asimmetrica di Weibull e la distribuzione log-normale, che sono tutte curve sigmoidee tendenti asintoticamente a zero per C → 0 e a 1 per C → infinito. L'uso di modelli di funzioni soglia continue (per esempio il modello di Kooijman per “l'inibizione della crescita della popolazione”, Kooijman et al, 1996) costituisce una soluzione proposta recentemente in alternativa ai modelli asintotici. Questo modello suppone che non si producano effetti a concentrazioni inferiori ad una certa soglia, EC0 +, stimata tramite estrapolazione della relazione concentrazione-risposta che consiste nell'intercettare l'asse delle concentrazioni per mezzo di una funzione continua semplice non differenziabile al punto di partenza. Si fa presente che l'analisi può essere una semplice minimizzazione delle somme dei quadrati dei residui (supponendo che la varianza sia costante) o dei quadrati ponderati se l'eterogeneità della varianza è compensata. Procedimento Scegliere un'equazione funzionale adeguata, Y = f (C), e interpolare i dati con una regressione non lineare. Utilizzare preferibilmente le misure rilevate in ciascuna beuta anziché i valori medi delle repliche, per trarre quante più informazioni possibile dai dati. D'altra parte, se la varianza è elevata, l'esperienza pratica induce a supporre che le medie delle repliche possono fornire una stima matematica più solida, meno influenzata dagli errori casuali dei dati rispetto a ciascun punto preso singolarmente. Rappresentare su un grafico i valori misurati e la curva interpolata e verificare se l'interpolazione è adeguata. L'analisi dei valori residui può essere uno strumento particolarmente utile a questo proposito. Se la funzione scelta per interpolare la curva concentrazione-risposta non descrive bene l'intera curva o un segmento fondamentale di questa, per esempio l'effetto alle basse concentrazioni, si scelga un altro modello di interpolazione, per esempio una curva asimmetrica, quale la funzione di Weibull, anziché la funzione simmetrica. Le inibizioni negative possono porre problemi con, per esempio, la funzione di distribuzione log-normale, che richiede parimenti una funzione alternativa di regressione. È sconsigliato assegnare un valore nullo o un valore positivo di piccola entità a questi valori negativi perché ciò distorce la distribuzione degli errori. Per stimare i valori di ECxlow può essere utile procedere a interpolazioni separate su parti della curva, per esempio il segmento in cui l'inibizione relativa è bassa. Sulla base dell'equazione interpolata (con “stima inversa”, C = f– 1 (Y)), calcolare stime specifiche caratteristiche della ECx e riportare almeno la EC50 e una o due ECxlow. L'esperienza maturata nelle prove pratiche ha dimostrato che la precisione della prova sulle alghe permette generalmente di ottenere una stima ragionevolmente precisa con soglia di inibizione del 10 % se i punti disponibili sono sufficientemente numerosi — a meno che non si produca una stimolazione alle basse concentrazioni, che renderebbe confusi i risultati della prova. La precisione della stima dei valori EC20 è spesso migliore di quelli EC10, perché la EC20 si situa generalmente sulla parte quasi lineare della curva centrale concentrazione-risposta. A volte, la EC10 può essere difficile da interpretare a causa della stimolazione di crescita, di modo che, sebbene la EC10 si ottenga generalmente con una precisione sufficiente, si raccomanda di riportare sempre anche la EC20. Fattori di ponderazione In generale, la varianza sperimentale non è costante e include una componente proporzionale; per questo motivo risulta opportuno procedere regolarmente ad una regressione ponderata. I fattori di ponderazione per tale analisi sono generalmente considerati inversamente proporzionali alla varianza: Wi = 1/Var(ri) Molti programmi di regressione permettono di effettuare un'analisi della regressione ponderata con fattori di ponderazione riportati in una tabella. Per maggiore semplicità, conviene normalizzare i fattori di ponderazione moltiplicandoli per n/Σ wi (n è il numero dei punti) di modo che la loro somma risulti 1. Normalizzare le risposte La normalizzazione con il valore medio delle risposte dei controlli pone alcuni problemi di principio e dà luogo ad una struttura della varianza piuttosto complicata. Dividendo i valori ottenuti dalle prove per il valore medio ottenuto dai controlli al fine di ottenere la percentuale di inibizione, si introduce un errore supplementare dovuto all'errore sulla media dei controlli. A meno che l'errore sia trascurabile, si devono correggere i fattori di ponderazione applicati alla regressione e i limiti di confidenza in funzione della covarianza con il controllo (Draper and Smith, 1981). Si sottolinea l'importanza di ottenere un'elevata precisione nella stima della media dei valori di controllo, per ridurre al minimo la varianza complessiva delle risposte relative. Tale varianza si calcola con la seguente formula: (il deponente i è riferito al livello di concentrazione i e il deponente 0 ai controlli) Yi = risposta relativa = ri/r0 = 1 – I = f(Ci) con una varianza Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri) · Var(ri) + ((∂ Yi / ∂ r0)2 · Var(r0) e poiché (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 and (∂ Y I/ ∂ r0) = ri/r0 2 con una distribuzione normale dei dati e delle repliche mi and m0 replicates: Var(ri ) = σ2/mi la varianza totale della risposta relativa, Yi diventa quindi: Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0 L'errore sulla media dei controlli è inversamente proporzionale alla radice quadrata del numero di repliche dei controlli utilizzato per il calcolo della media, e a volte è giustificato includere dati storici, riducendo così l'errore in modo sensibile. Un metodo alternativo consiste nel non normalizzare i dati né interpolare i valori relativi alle risposte assolute, ivi comprese le risposte dei controlli, bensì introdurre il valore della risposta dei controlli come parametro aggiuntivo da interpolare mediante regressione non lineare. Con una classica equazione di regressione a due parametri, questo metodo richiede l'interpolazione di 3 parametri e richiede pertanto più punti rispetto alla regressione non lineare su dati normalizzati utilizzando un valore predeterminato della risposta dei controlli. Intervalli di confidenza inversi Il calcolo degli intervalli di confidenza di una regressione non lineare mediante una stima inversa è abbastanza complesso e generalmente non rientra fra le opzioni standard dei normali programmi informatici di calcolo statistico. Intervalli di confidenza approssimativi possono essere ottenuti con programmi classici di regressione non lineare, tramite una riparametrizzazione (Bruce e Versteeg, 1992) consistente nel riformulare l'equazione matematica con le stime desiderate, per esempio la EC10 e la EC50, come parametri da stimare [data la funzione I = f (α, β, concentrazione), si utilizzino le relazioni di definizione f (α, β, EC10) = 0,1 e f (α, β, EC50) = 0,5 per sostituire f (α, β, concentrazione) con una funzione equivalente g (EC10, EC50, concentrazione]. Un calcolo più diretto (Andersen et al, 1998) consiste nel mantenere l'equazione di origine e applicare un'espansione di Taylor attorno alle medie di ri e r0. Negli ultimi anni si sono diffusi i metodi bootstrapping. Questi metodi utilizzano i dati misurati e un ricampionamento frequente diretto da un generatore di numeri casuali, per stimare la distribuzione empirica della varianza. BIBLIOGRAFIA Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632. Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York. Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem.11, 1485-1494 Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricoltural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420. |
(4) |
Il capitolo C.11 è sostituito dal seguente: «C. 11. FANGHI ATTIVI, PROVA DI INIBIZIONE DELLA RESPIRAZIONE (OSSIDAZIONE DEL CARBONIO E DELL'AMMONIO) INTRODUZIONE
PRINCIPIO DELLA PROVA
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
APPLICABILITÀ DEL METODO DI PROVA
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO
CRITERI DI VALIDITÀ E RIPRODUCIBILITÀ
DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA Recipienti e apparecchiature di prova
Reagenti
Acqua
Liquami artificiali
Sostanza chimica in esame
Sostanza chimica di riferimento
Inibitore specifico della nitrificazione
Controlli abiotici
Inoculo
PROCEDURA SPERIMENTALE
Condizioni sperimentali
Miscele di prova
Miscele di riferimento
Controlli in bianco
Controlli abiotici
Procedura generale e misurazioni
Potenziale di nitrificazione dei fanghi
Disegni sperimentali Prova per la definizione dell'intervallo
Prova definitiva
Misurazioni
Verifica della concentrazione della sostanza chimica in esame
DATI E RELAZIONE Calcolo dei tassi di consumo di ossigeno
Calcolo del tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione
Calcolo della percentuale di inibizione
Interpretazione dei risultati ECx
Stima della NOEC
Relazione sulla prova
BIBLIOGRAFIA
Appendice 1 Definizioni Le definizioni seguenti si applicano al presente metodo di prova. Sostanza chimica : sostanza o miscela. ECx (concentrazione efficace all'x %) : concentrazione che determina un effetto pari all'x % sugli organismi sperimentali in un determinato periodo di esposizione rispetto al controllo. Ad esempio, EC50 è una concentrazione che si ritiene produca un effetto su un endpoint in esame nel 50 % della popolazione esposta nel corso di un determinato periodo di esposizione. NOEC ( no observed effect concentration — concentrazione senza effetti osservabili): concentrazione della sostanza chimica in esame alla quale non si osserva alcun effetto. Nella presente prova, in un determinato periodo di esposizione, la concentrazione che corrisponde alla NOEC non ha alcun effetto statisticamente significativo (p < 0,05) rispetto al controllo. Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. Appendice 2 Figura 1 — Esempi di dispositivi di misurazione ![]() Legenda
Appendice 3 Figura 2 — Esempio di unità di misurazione, utilizzando una bottiglia per BOD ![]() Legenda
Appendice 4 Figura 3 — Esempi di curve di inibizione ![]() Legenda
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Il capitolo C.26. è sostituito dal seguente: «C.26 PROVA DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA DI SPECIE DI LEMNA INTRODUZIONE
PRINCIPIO DELLA PROVA
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME
VALIDITÀ DELLA PROVA
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO
DESCRIZIONE DEL METODO Apparecchiatura
Organismo sperimentale
Colture
Mezzo di prova
Soluzioni di prova
Gruppi di prova e gruppi di controllo
Esposizione
Condizioni di incubazione
Durata
Misurazioni e determinazioni analitiche
Frequenza delle misurazioni e delle determinazioni analitiche
Prova limite
DATI E RELAZIONI Tempo di raddoppio
Variabili di risposta
Tasso di crescita specifico medio
Rendimento
Tracciato delle curve concentrazione-risposta
Stima dell'ECx
Procedure statistiche
Relazioni
BIBLIOGRAFIA
Appendice 1 Definizioni Ai fini del presente metodo di prova si utilizzano le definizioni e le abbreviazioni seguenti. Biomassa : peso secco della materia vivente presente in una popolazione. In questa prova la biomassa è misurata indirettamente, di norma mediante conteggio delle fronde e l'area delle fronde, quindi l'uso del termine “biomassa” si riferisce anche a queste misurazioni indirette. Clone : organismo o cellula ottenuto a partire da un singolo individuo per riproduzione asessuata. Gli individui dello stesso clone sono pertanto geneticamente identici. Clorosi : ingiallimento del tessuto delle fronde. Colonia : aggregato di fronde madri e figlie (di norma da due a quattro) attaccate le une alle altre. Talvolta denominata “pianta”. Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC — Lowest Observed Effect Concentration ) : la concentrazione più bassa saggiata di una sostanza alla quale si osserva un effetto di riduzione statisticamente significativo della crescita (p < 0,05) rispetto al controllo, nell'arco di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni di prova superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e di conseguenza la NOEC). Concentrazione senza effetti osservati (NOEC — No Observed Effect Concentration) : concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC. Crescita : aumento della variabile di misurazione, per esempio il numero di fronde, il peso secco, il peso umido o l'area delle fronde durante il periodo di prova. ECx : concentrazione della sostanza chimica in esame disciolta nel mezzo di prova che determina una riduzione dell'x % (per esempio, 50 %) della crescita di Lemna entro un periodo di esposizione definito (che deve essere esplicitato se diverso dalla durata totale o normale della prova). Per indicare in modo inequivoco se il valore EC si riferisce al tasso di crescita o al rendimento si utilizzano le abbreviazioni “ErC” per il tasso di crescita e “EyC” per il rendimento, seguite dalla variabile di misurazione utilizzata, ad esempio ErC (numero di fronde). Endpoint della prova : indica il fattore generale che sarà modificato, rispetto al controllo, dalla sostanza chimica in esame. In questo metodo di prova l'endpoint è l'inibizione della crescita che può essere espressa da più variabili di risposta dedotte da una o più variabili di misurazione. Fenotipo : caratteristiche osservabili di un organismo, determinate dall'interazione dei suoi geni con l'ambiente. Flusso continuo : si riferisce a una prova in cui le soluzioni di prova sono rinnovate costantemente. Fronda : struttura individuale/singola del tipo “a foglia” di una pianta di lenticchia d'acqua. Si tratta dell'unità più piccola (individuo) in grado di riprodursi. Gibbosità : gobba o rigonfiamento della fronda. Mezzo di prova : mezzo di crescita sintetico completo in cui le piante sperimentali crescono quando sono esposte alla sostanza chimica in esame. Quest'ultima è di norma disciolta nel mezzo di prova. Monocoltura : coltura con una sola specie vegetale. Necrosi : tessuto morto delle fronde (ossia bianco o rigonfio d'acqua). Prova semistatica (con rinnovo) : prova in cui la soluzione di prova è periodicamente sostituita a determinati intervalli durante la prova. Prova statica : prova senza rinnovo della soluzione di prova durante la prova. Rendimento : valore di una variabile di misurazione che esprime la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e il valore della stessa variabile all'inizio del periodo di esposizione. Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. Sostanza chimica : sostanza o miscela. Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio): aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione. Variabili di misurazione : qualsiasi tipo di variabile che viene misurata per esprimere l'endpoint della prova utilizzando una o più variabili di risposta. Nel presente metodo il numero di fronde, l'area delle fronde, il peso fresco e il peso secco sono variabili di misurazione. Variabili di risposta : variabili per la stima della tossicità, ricavate da qualsiasi variabile di misurazione che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. Nel presente metodo di prova i tassi di crescita e il rendimento sono variabili di risposta ricavate da variabili di misurazione quali il numero di fronde, l'area delle fronde, il peso fresco e il peso secco. Appendice 2 Descrizione di Lemna spp. La pianta acquatica comunemente denominata “lenticchia d'acqua”, Lemna spp., appartiene alla famiglia delle Lemnaceae costituita da quattro generi presenti in tutto il mondo. La loro tassonomia e il loro aspetto sono stati descritti in maniera esaustiva (1)(2). Lemna gibba e L. minor sono specie rappresentative delle zone temperate e sono regolarmente utilizzate nelle prove di tossicità. Entrambe le specie possiedono un fusto discoide (fronda) galleggiante o sommerso e una radice estremamente sottile che parte dal centro della superficie inferiore di ogni fronda. Le specie di Lemna fioriscono raramente e si riproducono per via vegetativa dando luogo a nuove fronde (3). Rispetto alle piante più vecchie, le giovani tendono ad essere più pallide, avere radici più corte ed essere costituite da 2-3 fronde di misure diverse. Le dimensioni ridotte di Lemna, la sua struttura semplice, la riproduzione asessuata e il tempo di generazione breve rendono le piante di questo genere particolarmente adatte alle prove di laboratorio (4)(5). Data la possibile variazione di sensibilità da una specie all'altra, sono validi solo i confronti di sensibilità all'interno della stessa specie. Esempi di specie di Lemna utilizzati per le prove con riferimenti bibliografici
Fonti di specie di Lemna
BIBLIOGRAFIA
Appendice 3 Conservazione di una coltura madre Le colture madre possono essere conservate a basse temperature (4-10 °C) per lunghi periodi senza che occorra ristabilirle. Il mezzo di crescita di Lemna può essere identico a quello utilizzato per le prove, ma è possibile utilizzare anche altri mezzi ricchi di nutrienti per le colture madre. Periodicamente si prelevano e si trasferiscono, con una tecnica asettica, piante giovani di colore verde-chiaro in nuovi recipienti di coltura contenenti mezzo fresco. Alle temperature più basse qui proposte, le sottocolture possono essere avviate anche a intervalli di tre mesi. Occorre utilizzare recipienti di coltura in vetro sterili e chimicamente puliti (lavati con acido) e manipolare il materiale secondo tecniche asettiche. Se la coltura madre viene contaminata, per esempio da alghe o funghi, si adotteranno le misure necessarie per eliminare gli organismi contaminanti. Per le alghe e la maggior parte degli altri organismi contaminanti basta una sterilizzazione superficiale. A tal fine si preleva un campione del materiale vegetale contaminato, si tagliano le radici, si agita vigorosamente in acqua pulita e lo si immerge in una soluzione di ipoclorito di sodio a 0,5 % (v/v) per un periodo compreso tra 30 secondi e 5 minuti. In seguito si sciacqua il materiale vegetale con acqua sterile e lo si trasferisce, suddiviso per lotti, in recipienti di coltura contenenti mezzo fresco. Molte fronde moriranno dopo questo trattamento, soprattutto se il periodo di esposizione è stato lungo, ma alcune di quelle sopravvissute non saranno più contaminate e potranno essere inoculate in nuove colture. Appendice 4 Mezzi Si raccomandano mezzi di crescita diversi per L. minor e L. gibba: per L. minor, una versione modificata del mezzo stabilito dalla norma svedese (SIS) mentre per L. gibba, il mezzo 20X — AAP. La composizione di questi due mezzi sono riportate qui di seguito. Per preparare i mezzi occorre utilizzare sostanze chimiche di grado analitico o reagente e acqua deionizzata. Mezzo di crescita per Lemna stabilito dalla norma svedese (SIS)
Per ottenere un litro del mezzo SIS aggiungere gli ingredienti seguenti a 900 ml di acqua deionizzata:
Nota: per alcune sostanze chimiche in esame può essere necessario utilizzare anche la soluzione madre VII (tampone MOPS) (cfr. paragrafo 11). Il pH è portato a 6,5 ± 0,2 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata. Mezzo di crescita 20X — AAP Le soluzioni madre sono preparate in acqua sterile distillata o deionizzata. Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e al buio. In queste condizioni si possono conservare da 6 a 8 settimane. Per il mezzo 20X — AAP si preparano cinque soluzioni madre nutrienti (A1, A2, A3, B e C) utilizzando sostanze chimiche di grado reagente. Il mezzo di crescita è composto da 20 ml di ciascuna soluzione madre nutriente aggiunte a circa 850 ml di acqua deionizzata. Il pH è portato a 7,5 ± 0,1 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata. Il mezzo è successivamente filtrato con una membrana con pori di 0,2 μm (circa) in un recipiente sterile. Il mezzo di crescita destinato alle prove deve essere preparato 1 o 2 giorni prima dell'utilizzazione in modo che il pH abbia il tempo di stabilizzarsi. Il pH del mezzo di crescita deve essere controllato prima dell'utilizzo e riequilibrato, se necessario, aggiungendovi 0,1 o 1 mol di NaOH o HCl come suindicato.
Mezzo di STEINBERG (secondo la norma ISO 20079) Concentrazioni e soluzioni madre La norma ISO 20079 utilizza il mezzo modificato di Steinberg solo per Lemna minor (in quanto è la sola specie ammessa per tale metodo), ma alcune prove hanno dimostrato che si possono ottenere buoni risultati anche con Lemna gibba. Per preparare questo mezzo occorre utilizzare sostanze chimiche di grado reagente o analitico e acqua deionizzata. Preparare il mezzo nutriente a partire da soluzioni madre oppure dal mezzo dieci volte più concentrato, che è la concentrazione massima che si può ottenere senza precipitazione. Tabella 1 Mezzo di Steinberg a pH stabilizzato (modificato da Altenburger)
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