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Document 32024R0771

Regolamento di esecuzione (UE) 2024/771 della Commissione, del 29 febbraio 2024, recante modifica del regolamento (CE) n. 152/2009 che fissa i metodi di campionamento e d’analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

C/2024/1228

GU L, 2024/771, 15.3.2024, ELI: http://data.europa.eu/eli/reg_impl/2024/771/oj (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, GA, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

Legal status of the document In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg_impl/2024/771/oj

European flag

Gazzetta ufficiale
dell'Unione europea

IT

Serie L


2024/771

15.3.2024

REGOLAMENTO DI ESECUZIONE (UE) 2024/771 DELLA COMMISSIONE

del 29 febbraio 2024

recante modifica del regolamento (CE) n. 152/2009 che fissa i metodi di campionamento e d’analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE EUROPEA,

visto il trattato sul funzionamento dell’Unione europea,

visto il regolamento (UE) 2017/625 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 15 marzo 2017, relativo ai controlli ufficiali e alle altre attività ufficiali effettuati per garantire l’applicazione della legislazione sugli alimenti e sui mangimi, delle norme sulla salute e sul benessere degli animali, sulla sanità delle piante nonché sui prodotti fitosanitari, recante modifica dei regolamenti (CE) n. 999/2001, (CE) n. 396/2005, (CE) n. 1069/2009, (CE) n. 1107/2009, (UE) n. 1151/2012, (UE) n. 652/2014, (UE) 2016/429 e (UE) 2016/2031 del Parlamento europeo e del Consiglio, dei regolamenti (CE) n. 1/2005 e (CE) n. 1099/2009 del Consiglio e delle direttive 98/58/CE, 1999/74/CE, 2007/43/CE, 2008/119/CE e 2008/120/CE del Consiglio, e che abroga i regolamenti (CE) n. 854/2004 e (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, le direttive 89/608/CEE, 89/662/CEE, 90/425/CEE, 91/496/CEE, 96/23/CE, 96/93/CE e 97/78/CE del Consiglio e la decisione 92/438/CEE del Consiglio (regolamento sui controlli ufficiali) (1), in particolare l’articolo 34, paragrafo 6,

considerando quanto segue:

(1)

Il regolamento (CE) n. 152/2009 della Commissione (2) fissa i metodi di campionamento e d’analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali.

(2)

I metodi di campionamento e d’analisi fissati dal regolamento (CE) n. 152/2009 dovrebbero essere adattati alla luce degli sviluppi delle conoscenze scientifiche e tecnologiche. Il presente regolamento dovrebbe introdurre numerose modifiche minori che tengano conto dell’esperienza acquisita nell’applicazione del metodo di analisi o chiariscano talune disposizioni.

(3)

Il metodo di campionamento descritto nel regolamento (CE) n. 152/2009 non è adeguato per il campionamento ai fini del controllo della contaminazione microbiologica ed è pertanto escluso dall’ambito di applicazione. Tuttavia il fatto che, a seguito della modifica apportata dal regolamento (UE) n. 691/2013 (3), esso non sia più esplicitamente escluso dall’ambito di applicazione ha generato una certa confusione ed è pertanto opportuno escluderlo di nuovo esplicitamente dall’ambito di applicazione.

(4)

È opportuno introdurre disposizioni specifiche per il campionamento dei mangimi commercializzati dagli operatori del settore dei mangimi tramite una tecnica di comunicazione a distanza, dato che la vendita di alimenti per animali mediante tali tecniche è in aumento. In aggiunta alle disposizioni sull’incertezza di misura analitica e sul recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili, è opportuno introdurre disposizioni analoghe anche per l’analisi del contenuto di additivi per mangimi, dato che tali disposizioni sono pertinenti anche in questo caso. Poiché è dimostrato che l’applicazione del metodo di analisi per la determinazione dell’urea al di fuori dell’ambito dell’autorizzazione dell’urea come additivo per mangimi genera risultati analitici errati, è opportuno specificare l’ambito di applicazione di tale metodo e aggiungere informazioni riguardanti la valutazione del metodo e i risultati di uno studio collaborativo.

(5)

Diversi metodi di analisi fissati dal regolamento (CE) n. 152/2009 dovrebbero essere soppressi in quanto non sono più validi per i fini previsti. Il metodo di analisi per la determinazione delle basi azotate volatili e il metodo per la determinazione dei carbonati dovrebbero essere soppressi in quanto nella legislazione dell’Unione in materia di mangimi non vi è più alcun obbligo giuridico di controllare la conformità. L’attuale metodo di analisi per la determinazione del diclazuril contiene errori di natura redazionale e di conseguenza non fornisce risultati analitici affidabili. È pertanto opportuno sostituirlo con un metodo adattato che ha dimostrato di fornire risultati affidabili. I nuovi metodi di analisi del gossipolo libero e totale hanno dimostrato che il metodo di analisi per la determinazione del gossipolo libero e totale fissato dal regolamento (CE) n. 152/2009 non fornisce risultati affidabili e dovrebbe pertanto essere soppresso e sostituito da un riferimento alle norme europee (norme EN). I metodi di analisi per il controllo della presenza illecita di additivi il cui uso non è più autorizzato negli alimenti per animali dovrebbero essere soppressi in quanto nel frattempo sono stati sviluppati approcci di screening e metodi di analisi più sensibili.

(6)

Oltre ai metodi di analisi descritti negli allegati del presente regolamento, è opportuno fare riferimento alle norme EN da utilizzare nei controlli ufficiali.

(7)

Poiché il regolamento di esecuzione (UE) 2021/2047 della Commissione (4) ha autorizzato l’amprolio come nuovo additivo per mangimi, è opportuno aggiungere un metodo di analisi per la determinazione dell’amprolio nell’allegato IV del regolamento (CE) n. 152/2009.

(8)

Poiché le modifiche del regolamento (CE) n. 152/2009 sono sostanziali e riguardano più disposizioni presenti negli allegati dello stesso, per motivi di chiarezza è opportuno sostituire integralmente tali allegati.

(9)

Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato permanente per le piante, gli animali, gli alimenti e i mangimi,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

Modifiche del regolamento (CE) n. 152/2009

Il regolamento (CE) n. 152/2009 è così modificato:

1)

all’articolo 1, il primo comma è sostituito dal seguente:

«Il campionamento per il controllo ufficiale degli alimenti per animali, in particolare per quanto concerne la determinazione dei costituenti, compresi i materiali che contengono o sono costituiti da o sono prodotti a partire da organismi geneticamente modificati (OGM), gli additivi per mangimi come definiti dal regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio (*1) e le sostanze indesiderabili quali definite dalla direttiva 2002/32/CE del Parlamento europeo e del Consiglio (*2) è effettuato conformemente ai metodi di cui all’allegato I, ad eccezione del campionamento per il controllo della contaminazione microbiologica.»;

(*1)  Regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2003, sugli additivi destinati all’alimentazione animale (GU L 268 del 18.10.2003, pag. 29)."

(*2)  Direttiva 2002/32/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 7 maggio 2002, relativa alle sostanze indesiderabili nell’alimentazione degli animali (GU L 140 del 30.5.2002, pag. 10)."

2)

l’allegato I è sostituito dal testo che figura nell’allegato I del presente regolamento;

3)

l’allegato II è sostituito dal testo che figura nell’allegato II del presente regolamento;

4)

l’allegato III è sostituito dal testo che figura nell’allegato III del presente regolamento;

5)

l’allegato IV è sostituito dal testo che figura nell’allegato IV del presente regolamento;

6)

l’allegato V è sostituito dal testo che figura nell’allegato V del presente regolamento;

7)

l’allegato VII è sostituito dal testo che figura nell’allegato VI del presente regolamento;

8)

l’allegato VIII è soppresso.

Articolo 2

Entrata in vigore

Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, il 29 febbraio 2024

Per la Commissione

La presidente

Ursula VON DER LEYEN


(1)   GU L 95 del 7.4.2017, pag. 1.

(2)  Regolamento (CE) n. 152/2009 della Commissione, del 27 gennaio 2009, che fissa i metodi di campionamento e d’analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (GU L 54 del 26.2.2009, pag. 1).

(3)  Regolamento (UE) n. 691/2013 della Commissione, del 19 luglio 2013, che modifica il regolamento (CE) n. 152/2009 per quanto riguarda i metodi di campionamento e di analisi (GU L 197 del 20.7.2013, pag. 1).

(4)  Regolamento di esecuzione (UE) 2021/2047 della Commissione, del 23 novembre 2021, relativo all’autorizzazione del cloridrato di amprolio (COXAM) come additivo per mangimi destinati ai polli da ingrasso e alle pollastre allevate per la produzione di uova (titolare dell’autorizzazione: HuvePharma NV) (GU L 418 del 24.11.2021, pag. 13).


ALLEGATO I

«ALLEGATO I

METODI DI CAMPIONAMENTO

1.   FINALITÀ E CAMPO DI APPLICAZIONE

I campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali sono prelevati secondo i metodi sottoindicati. I campioni così ottenuti sono da considerarsi rappresentativi delle partite campionate.

Lo scopo del campionamento rappresentativo è prelevare una piccola frazione di un lotto in modo che la determinazione di una caratteristica specifica di tale frazione rappresenti il valore medio della caratteristica del lotto. Il campionamento avviene mediante prelievo ripetuto di campioni elementari in diversi punti del lotto. Tali campioni elementari sono mescolati per formare un campione globale, dal quale sono ricavati a loro volta dei campioni finali rappresentativi per divisione rappresentativa.

Se, a un controllo visivo o in base ad altre informazioni pertinenti, partite del mangime da sottoporre a campionamento mostrano una differenza di qualità dal resto del mangime dello stesso lotto, tali partite vengono separate dal resto del mangime e trattate come un sottolotto distinto. Qualora non fosse possibile suddividerlo in sottolotti, il mangime viene sottoposto a campionamento come lotto unico. In tali casi, ne è fatta menzione nel verbale di campionamento.

Se un mangime facente parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione viene sottoposto a campionamento conformemente alle disposizioni del presente regolamento e risulta non conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

Il campionamento può comprendere anche i mangimi commercializzati dagli operatori del settore dei mangimi tramite una tecnica di comunicazione a distanza conformemente all’articolo 11, paragrafo 3, del regolamento (CE) n. 767/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio (1). Il campionamento dei mangimi commercializzati tramite una tecnica di comunicazione a distanza è soggetto, in linea di principio, ai punti indicati nel presente allegato. Aspetti specifici del campionamento dei campioni di vendite a distanza sono descritti al punto 11.

2.   DEFINIZIONI

Lotto: quantità determinata di mangime che possiede caratteristiche comuni come l’origine, la varietà, il tipo di imballaggio, l’identità dell’imballatore, lo speditore o l’etichettatura e, nel caso di un processo produttivo, un’unità di produzione prodotta in un singolo impianto applicando parametri di produzione uniformi o più unità di produzione di questo tipo, se prodotte in ordine continuo e immagazzinate insieme.

Partita campionata: lotto o parte identificata del lotto o del sottolotto.

Campione sigillato: campione sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l’asportazione del sigillo.

Campione elementare: quantità prelevata da un punto della partita campionata.

Campione globale: insieme di campioni elementari prelevati da una stessa partita campionata.

Campione ridotto: parte del campione globale ottenuta mediante riduzione rappresentativa di quest’ultimo.

Campione finale: parte del campione globale (mescolato), del campione ridotto o del campione globale omogeneizzato, a seconda del tipo di controllo (cfr. punto 9.4).

Campione di laboratorio: campione destinato al laboratorio (come ricevuto dal laboratorio) che può essere il campione finale, il campione ridotto o il campione globale.

Campione di vendite a distanza: campione di un lotto di mangime commercializzato tramite una tecnica di comunicazione a distanza.

3.   DISPOSIZIONI GENERALI

I campioni sono prelevati da personale appositamente autorizzato dall’autorità competente.

Nel caso dei campioni di vendite a distanza, l’autorità competente richiede una quantità di mangime all’operatore del settore dei mangimi tramite una comunicazione a distanza.

Il campione è sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l’asportazione del sigillo.

Il marchio del sigillo è chiaramente identificabile e ben visibile.

Identificazione del campione: il campione è contrassegnato in modo indelebile e deve essere identificato in maniera tale da essere collegato inequivocabilmente al verbale di campionamento.

Da ciascun campione globale o campione ridotto sono prelevati i seguenti campioni finali: uno come controllo (verifica dell’applicazione della normativa) e uno per l’operatore del settore dei mangimi (campione per la difesa in caso di controversia). Infine può essere prelevato un altro campione finale come riferimento. Nel caso in cui l’intero campione globale sia omogeneizzato, i campioni finali sono prelevati dal campione globale omogeneizzato, a meno che tale procedura non sia in contrasto con le norme vigenti nello Stato membro in materia di diritti degli operatori del settore dei mangimi.

A norma dell’articolo 15, paragrafi 1 e 2, del regolamento (UE) 2017/625, se necessario per l’esecuzione del campionamento ufficiale, gli operatori del settore dei mangimi, su richiesta dalle autorità competenti:

concedono al personale delle autorità competenti l’accesso alle attrezzature sotto il loro controllo, anche mettendo a disposizione, se necessario, attrezzature per il campionamento e dispositivi di protezione individuale adeguati;

forniscono assistenza e collaborano con il personale delle autorità competenti per consentire il campionamento, anche mettendo a disposizione di tale personale gli alimenti per animali.

4.   STRUMENTI

4.1.   Gli strumenti utilizzati per il campionamento sono realizzati con materiali che non possono contaminare i prodotti da campionare. Se destinati ad essere riutilizzati varie volte, gli strumenti sono di agevole pulizia, per evitare una contaminazione crociata.

4.2.   Strumenti raccomandati per il prelievo di campioni di alimenti solidi per animali

4.2.1.   Campionamento manuale

4.2.1.1.

Pala a fondo piatto e a bordi laterali verticali.

4.2.1.2.

Sonda a lungo setto o a partizioni. Le dimensioni della sonda sono adeguate alle caratteristiche della partita campionata (profondità del recipiente, misure del sacco ecc.) e alla dimensione delle particelle costituenti l’alimento.

Se la sonda presenta diverse aperture per fare sì che il campione sia prelevato in diversi punti lungo la sonda, le aperture sono separate da compartimenti o scalate in sequenza.

4.2.2.   Campionamento meccanico

Per il prelievo di campioni di alimenti in flusso possono essere utilizzati strumenti meccanici appropriati. Gli strumenti meccanici sono considerati appropriati quando consentono di sottoporre a campionamento almeno l’intera sezione del flusso.

Il campionamento dei mangimi in movimento (a elevata velocità di flusso) può essere effettuato facendo uso di campionatori automatici.

4.2.3.   Divisori

Se possibile e opportuno, per preparare campioni ridotti rappresentativi possono essere utilizzati strumenti che servono a dividere i campioni in parti approssimativamente uguali.

5.   REQUISITI QUANTITATIVI PER QUANTO RIGUARDA IL NUMERO DI CAMPIONI ELEMENTARI

I requisiti quantitativi di cui ai punti 5.1 e 5.2 riguardanti il numero di campioni elementari sono applicabili a partite campionate di dimensioni massime di 500 tonnellate l’una e campionabili in modo rappresentativo. La procedura di campionamento descritta è ugualmente valida per i quantitativi superiori alla dimensione massima della partita campionata se non si tiene conto del numero massimo di campioni elementari indicato nelle tabelle ai punti 5.1.1, 5.1.3 e 5.1.5; in tal caso il numero di campioni elementari è determinato dalla formula contenente la radice quadrata che figura nella parte corrispondente della procedura (cfr. punto 5.3) e la dimensione minima del campione globale aumentata in proporzione. Ciò non impedisce di suddividere un lotto grande in sottolotti più piccoli e di sottoporre a campionamento ciascun sottolotto seguendo la procedura descritta ai punti 5.1 e 5.2.

La dimensione della partita campionata deve essere tale da consentire il prelievo di campioni in ogni sua parte.

Nel caso dei lotti o sottolotti molto grandi (> 500 tonnellate) e dei lotti trasportati o immagazzinati in un modo che non rende possibile effettuare campionamenti seguendo la procedura di cui ai punti 5.1 e 5.2 del presente punto, si adotta la procedura di campionamento indicata al punto 5.3.

Nel caso dei campioni di vendite a distanza, di norma l’autorità competente non conosce la dimensione del lotto per il quale è richiesto il quantitativo. La procedura di cui ai punti 5.1 e 5.2 non può pertanto essere utilizzata. In tal caso si applica la procedura descritta al punto 11.

Qualora sia tenuto per legge a rispettare il presente regolamento nell’ambito di un sistema di monitoraggio obbligatorio, l’operatore del settore dei mangimi può discostarsi dai requisiti quantitativi di cui al presente punto al fine di tenere conto delle caratteristiche operative, purché dimostri in modo convincente all’autorità competente l’equivalenza della procedura di campionamento per quanto concerne la rappresentatività e previa autorizzazione dell’autorità competente.

In casi eccezionali, quando non è possibile applicare i requisiti quantitativi del metodo di campionamento prescritto senza danneggiare il lotto in misura inaccettabile per il commercio (ad esempio a causa delle tipologie d’imballaggio, dei mezzi di trasporto, delle modalità di immagazzinamento ecc.), si può ricorrere a un metodo alternativo, a condizione che il campionamento sia il più rappresentativo possibile e che il metodo applicato sia chiaramente descritto e debitamente documentato.

5.1.   Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo delle sostanze o dei prodotti distribuiti in modo uniforme negli alimenti per animali

5.1.1.   Alimenti solidi alla rinfusa

Dimensioni della partita campionata

Numero minimo di campioni elementari

≤ 2,5 tonnellate

7

> 2,5 tonnellate

√ (20 volte il numero di tonnellate che costituiscono la partita campionata) (*1) , fino a un massimo di 40 campioni elementari

5.1.2.   Alimenti liquidi alla rinfusa

Dimensioni della partita campionata

Numero minimo di campioni elementari

≤ 2,5 tonnellate o ≤ 2 500 litri

4  (*2)

> 2,5 tonnellate o > 2 500 litri

7  (*2)

5.1.3.   Alimenti in confezioni

Gli alimenti (solidi e liquidi) possono essere confezionati in sacchetti, sacchi, barattoli, fusti ecc., ai quali si fa riferimento nella tabella seguente come «unità». Le unità grandi (≥ 500 kg o litri) si campionano in base alle disposizioni previste per gli alimenti alla rinfusa (cfr. punti 5.1.1 e 5.1.2).

Dimensioni della partita campionata

Numero minimo di unità da cui deve essere prelevato (almeno) un campione elementare (*3)

Da 1 a 20 unità

1 unità (*4)

Da 21 a 150 unità

3 unità (*4)

Da 151 a 400 unità

5 unità (*4)

> 400 unità

¼ della √ (numero di unità che costituiscono la partita campionata) (*5) , fino a un massimo di 40 unità

5.1.4.   Alimenti minerali formellati e mattonelle di sali minerali

Occorre campionare almeno un formellato o una mattonella per partita campionata di 25 unità, fino a un massimo di quattro formellati o mattonelle.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

5.1.5.   Foraggi grossolani/foraggio

Dimensioni della partita campionata

Numero minimo di campioni elementari (*6)

≤ 5 tonnellate

5

> 5 tonnellate

√ (punto 5 volte il numero di tonnellate che costituiscono la partita campionata) (*7), fino a un massimo di 40 campioni elementari

5.2.   Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali

Questi requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari si applicano nei casi seguenti:

controllo delle aflatossine, della segale cornuta, di altre micotossine e impurità botaniche nocive nelle materie prime per alimenti per animali;

controllo della contaminazione crociata da un costituente, incluso il materiale geneticamente modificato, o da una sostanza presumibilmente distribuita in modo non uniforme negli alimenti per animali.

Nel caso in cui l’autorità di controllo sospetti fortemente che una tale distribuzione non uniforme si presenti anche in caso di contaminazione crociata da un costituente o da una sostanza in un alimento per animali composto, si possono applicare i requisiti quantitativi indicati nella tabella che segue.

Dimensioni della partita campionata

Numero minimo di campioni elementari

< 80 tonnellate

Cfr. i requisiti quantitativi al punto 5.1. Il numero di campioni elementari da prelevare si moltiplica per 2,5.

≥ 80 tonnellate

100

5.3.   Requisiti quantitativi relativi ai campioni elementari nel caso di lotti molto grandi

Nel caso di grandi partite campionate (> 500 tonnellate): numero di campioni elementari da prelevare = 40 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di sostanze o prodotti distribuiti in modo uniforme nell’alimento, oppure 100 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali.

6.   REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI IL CAMPIONE GLOBALE

È richiesto un solo campione globale per partita campionata.

 

Natura degli alimenti

Dimensione minima del campione globale (*8)  (*9)

6.1.

Alimenti alla rinfusa

4  kg

6.2.

Alimenti in confezioni

4  kg (*10)

6.3.

Alimenti liquidi o semiliquidi

4 litri

6.4.

Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali:

6.4.1.

di peso unitario superiore a 1 kg

4  kg

6.4.2.

di peso unitario pari o inferiore a 1 kg

peso di quattro formellati o mattonelle originari

6.5.

Foraggio grossolano/foraggio

4  kg (*11)

7.   REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI I CAMPIONI FINALI

Campioni finali

È richiesta l’analisi di almeno un campione finale. L’entità del campione finale destinato all’analisi deve essere non inferiore ai quantitativi che seguono.

Alimenti solidi

500  g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)

Alimenti liquidi o semiliquidi

500  ml (*12)

8.   METODO DI CAMPIONAMENTO PER LOTTI MOLTO GRANDI O LOTTI IMMAGAZZINATI O TRASPORTATI CON MODALITÀ CHE NON PERMETTONO IL PRELIEVO DI CAMPIONI DA TUTTO IL LOTTO

8.1.   Principi generali

Se le modalità di trasporto o di immagazzinamento di un lotto non consentono il prelievo di campioni elementari dall’intero lotto, è preferibile effettuare il campionamento quando il lotto è in movimento.

Nel caso dei grandi depositi per immagazzinare alimenti per animali, gli operatori vanno incoraggiati ad installare nel deposito attrezzature che consentano di effettuare il campionamento (automatico) su tutto il lotto immagazzinato.

In caso di applicazione delle procedure di campionamento previste dal presente punto, l’operatore del settore dei mangimi o un suo rappresentante viene informato sulla procedura di campionamento. Se contesta la procedura, l’operatore o il suo rappresentante deve consentire all’autorità competente di effettuare prelievi per il campionamento in tutto il lotto a spese dell’operatore.

8.2.   Lotti grandi trasportati per nave

8.2.1.   Campionamento dinamico di lotti grandi trasportati per nave

È preferibile effettuare il campionamento di lotti grandi nelle navi quando il prodotto è in movimento (campionamento dinamico).

Il campionamento si effettua stiva per stiva (intendendo come stiva uno spazio separabile fisicamente). Le stive vengono comunque parzialmente svuotate l’una dopo l’altra, così che l’iniziale separazione fisica non sussiste più dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio. Il campionamento può pertanto essere effettuato in funzione della separazione fisica iniziale o della separazione dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio.

Le operazioni di scarico di una nave possono durare diversi giorni. Di norma, il campionamento deve essere effettuato a intervalli regolari durante l’intera fase di scarico. La presenza di un ispettore ufficiale per il campionamento durante l’intera operazione di scarico non è tuttavia sempre possibile o opportuna. È pertanto consentito il campionamento di una parte (partita campionata) dell’intero lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata.

In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

La presenza di un ispettore è necessaria anche quando il campione ufficiale è prelevato automaticamente. Tuttavia, nel caso in cui il campionamento sia effettuato in modo automatico con parametri prefissati non modificabili nel corso dello stesso e i campioni elementari siano posti in un recipiente sigillato, così da prevenire possibili frodi, la presenza di un ispettore è richiesta solo all’inizio del campionamento, ogni volta che il recipiente dei campioni deve essere cambiato e alla fine del campionamento.

8.2.2.   Campionamento statico di lotti trasportati per nave

Se il campionamento è eseguito in modo statico, si applica la stessa procedura prevista per le strutture di stoccaggio (sili) accessibili dall’alto (cfr. punto 8.4.1).

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile (dall’alto) del lotto/della stiva. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.3.   Campionamento di lotti grandi immagazzinati in depositi

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.4.   Campionamento di strutture di stoccaggio (sili)

8.4.1.   Campionamento di sili (facilmente) accessibili dall’alto

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.4.2.   Campionamento di sili non accessibili dall’alto (chiusi)

8.4.2.1.   Sili non accessibili dall’alto (chiusi) di dimensioni > 100 tonnellate

Il mangime immagazzinato in siffatti sili non è campionabile in modo statico. Pertanto, qualora si debba campionare il mangime che si trova all’interno del silo e non vi sia possibilità di spostare la spedizione, occorre accordarsi con l’operatore affinché questi informi l’ispettore su quando sarà svuotato il silo, di modo che il campionamento possa essere eseguito con il mangime in movimento.

8.4.2.2.   Sili non accessibili dall’alto (chiusi) di dimensioni < 100 tonnellate

La procedura di campionamento prevede che si inserisca in un recipiente un quantitativo compreso fra 50 e 100 kg e che si prelevi da esso il campione. Le dimensioni del campione globale corrispondono alla totalità del lotto e il numero dei campioni elementari alla quantità tratta dal silo e immessa nel recipiente per il campionamento. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.5.   Campionamento di alimenti alla rinfusa in grandi contenitori chiusi

Spesso tali lotti sono campionabili solo dopo essere stati scaricati. In certi casi non è possibile scaricare presso il punto di importazione o di controllo, per cui il campionamento va eseguito al momento dello scarico dei contenitori.

9.   ISTRUZIONI RELATIVE AI PRELIEVI, ALLA FORMAZIONE E ALL’IMBALLAGGIO DEI CAMPIONI

9.1.   Indicazioni generali

Prelevare e formare i campioni senza inutili ritardi, prendendo le precauzioni necessarie per evitare qualsiasi alterazione o contaminazione del prodotto. Le superfici, i recipienti e gli strumenti impiegati devono essere puliti e asciutti.

9.2.   Campioni elementari

I campioni elementari vanno prelevati a caso e in modo uniforme dall’insieme della partita campionata, e devono essere approssimativamente delle stesse dimensioni.

Il campione elementare è pari ad almeno 100 grammi o a 25 grammi in caso di foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica.

Qualora siano da prelevare meno di 40 campioni elementari, conformemente alle norme procedurali per il campionamento fissate al punto 8, le dimensioni di tali campioni sono determinate in funzione delle dimensioni prescritte per il campione globale da ottenere (cfr. punto 6).

In caso di campionamento di piccoli lotti di mangime confezionato da cui, in base ai requisiti quantitativi, sia da prelevare un numero limitato di campioni elementari, il campione elementare è dato dal contenuto di un’unità originaria di peso non superiore a 1 kg o di volume non superiore a un litro.

Per i campionamenti di mangime confezionato composto da piccole unità (ad esempio < 250 g), le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell’unità.

Nel caso dei campioni di vendite a distanza, le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell’unità e possono essere anche inferiori a 100 g o 100 ml in singoli casi.

9.2.1.   Alimenti alla rinfusa

Eventualmente si può procedere al campionamento al momento della messa in movimento della partita campionata (carico o scarico).

9.2.2.   Alimenti in confezioni

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare con una sonda o con una pala una parte del contenuto di ciascuna di tali unità. All’occorrenza svuotare separatamente le unità.

9.2.3.   Alimenti liquidi o semiliquidi omogenei o omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare una parte del contenuto di ciascuna unità, se necessario dopo omogeneizzazione.

I campioni elementari possono eventualmente essere prelevati al momento del travaso del prodotto.

9.2.4.   Alimenti liquidi o semiliquidi non omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare i campioni a diversi livelli.

I campioni possono essere prelevati anche al momento del travaso del prodotto, dopo eliminazione delle prime frazioni.

In entrambi i casi, il volume totale dei prelievi non deve essere inferiore a 10 litri.

9.2.5.   Alimenti minerali formellati e mattonelle di sali minerali

Dopo aver selezionato il numero prescritto di formellati o mattonelle da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare una parte da ciascun formellato o da ciascuna mattonella. Se si ha il sospetto che un formellato o una mattonella non sia omogeneo/a, è possibile prelevare come campione l’intero formellato o l’intera mattonella.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

9.3.   Formazione dei campioni globali

Mescolare i campioni elementari per costituire un unico campione globale.

9.4.   Formazione dei campioni finali

Il materiale del campione globale va mescolato con cura (2).

Introdurre ciascun campione in un contenitore/recipiente idoneo. Prendere tutte le precauzioni del caso per evitare qualsiasi modifica della composizione del campione o qualsiasi contaminazione o alterazione fortuita durante il trasporto o lo stoccaggio.

9.4.1.   Sostanze distribuite in modo uniforme

In caso di controllo di costituenti o sostanze distribuiti in modo uniforme nell’alimento, il campione globale può essere ridotto in modo rappresentativo a non meno di 2,0 kg o 2,0 litri (campione ridotto) (3), possibilmente facendo uso di un divisore meccanico o automatico. Per la verifica della presenza di residui di antiparassitari nei legumi, nei cereali in grani e nella frutta a guscio, il campione ridotto deve essere di almeno 3 kg. Se la natura dell’alimento non consente di utilizzare un divisore o se non si dispone di un divisore, si può ridurre il campione con il metodo della suddivisione in quarti.

Dal campione globale o dai campioni ridotti sono quindi prelevati campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia ed eventualmente riferimento) di entità approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui al punto 7.

9.4.2.   Sostanze distribuite in modo non uniforme

Se si controllano costituenti, incluso il materiale geneticamente modificato, o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali, il campione globale sarà:

i)

interamente omogeneizzato. Dal campione globale omogeneizzato sono quindi prelevati campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia ed eventualmente riferimento) di entità approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui al punto 7; o

ii)

ridotto a non meno di 2 kg o 2 litri (4) servendosi di un divisore meccanico o automatico. Solo se la natura dell’alimento non consente di utilizzare un divisore si può ridurre il campione, qualora necessario, con il metodo della suddivisione in quarti. Per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato nel quadro del regolamento (UE) n. 619/2011, il campione ridotto deve contenere almeno 35 000 semi/grani per permettere di ottenere campioni finali di almeno 10 000 semi/grani ai fini di verifica dell’applicazione della normativa, per la difesa in caso di controversia ed eventualmente come riferimento (cfr. nota (**) al punto 6 e nota (*) al punto 7).

Dal campione ridotto sono quindi prelevati campioni finali di entità approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui al punto 7.

9.5.   Imballaggio dei campioni

Sigillare ed etichettare i recipienti o le confezioni in modo che non possano essere aperti senza violare il sigillo. L’etichetta completa deve essere incorporata nel sigillo. In alternativa, il campione può essere messo in un recipiente che, una volta chiuso, non possa essere aperto senza danneggiarsi irreparabilmente e non possa quindi essere riutilizzato.

9.6.   Invio dei campioni al laboratorio

Il campione deve essere inviato senza indugio al laboratorio di analisi designato. Con esso vanno inviate anche le informazioni necessarie all’analista.

10.   VERBALI DI CAMPIONAMENTO

Per ogni campione va redatto un verbale che permetta di identificare in modo univoco la partita campionata e le sue dimensioni.

Il verbale deve anche recare nota di ogni eventuale scostamento rispetto alla procedura di campionamento prevista dal presente regolamento.

Il verbale va messo a disposizione, oltre che del laboratorio di controllo ufficiale, dell’operatore del settore dei mangimi e/o del laboratorio designato dall’operatore del settore dei mangimi.

11.   CAMPIONE DI VENDITE A DISTANZA

Nel caso dei campioni di vendite a distanza, l’alimento per animali è richiesto all’operatore del settore dei mangimi tramite tecniche di comunicazione a distanza. In tal caso, quando richiede l’alimento per animali l’autorità competente non è tenuta a identificarsi con un’identità ufficiale dinanzi all’operatore del settore dei mangimi e può utilizzare un’identità di copertura.

Il campione globale e i campioni finali del campione di vendite a distanza devono essere prelevati da personale appositamente autorizzato immediatamente dopo il ricevimento della spedizione. Per generare il campione globale occorre prelevare a caso e in modo uniforme un numero adeguato di campioni elementari dalla quantità totale ottenuta e miscelarli/omogeneizzarli con attenzione, conformemente, per quanto possibile, ai principi di cui al punto 5 e ai punti 9.2 e 9.3. Se l’alimento per animali è confezionato in singole unità, si devono ottenere almeno 4 unità dalle quali deve essere prelevato almeno un campione elementare. Qualora sia dimostrato, caso per caso, che le unità ottenute provengono da lotti diversi, il numero di unità da campionare deve essere ridotto e limitato alle unità provenienti dallo stesso lotto. In caso di analisi del campione di vendite a distanza per costituenti o sostanze distribuiti in modo non uniforme nell’alimento per animali, il numero di campioni elementari deve essere almeno 2,5 volte superiore rispetto al numero dei campioni analizzati per sostanze distribuite in modo uniforme in tutto l’alimento per animali.

Dal campione globale sono dunque prelevati i corrispondenti campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia ed eventualmente riferimento) conformemente, per quanto possibile, ai principi di cui al punto 9.4 e il verbale di campionamento indica che si tratta di un campione di vendite a distanza. L’autorità competente informa quindi immediatamente del campionamento l’operatore del settore dei mangimi. L’operatore del settore dei mangimi è inoltre informato che un campione (per difesa in caso di controversia) è tenuto, ove possibile, a sua disposizione dall’autorità competente in un determinato luogo a fini di difesa in caso di controversia o inviato all’operatore del settore dei mangimi o inviato al laboratorio designato dall’operatore del settore dei mangimi conformemente alle norme nazionali in vigore.

Se il campione è inviato direttamente al laboratorio ufficiale, il campione finale deve essere preparato e sigillato in laboratorio da personale appositamente autorizzato o in presenza di personale appositamente autorizzato. Il verbale di campionamento del campione di vendite a distanza deve essere inviato immediatamente dopo la formazione dei campioni finali all’autorità competente, che informa del campionamento l’operatore del settore dei mangimi.

Si ritiene che la quantità fornita dall’operatore del settore dei mangimi all’autorità competente rappresenti una parte di un lotto di alimenti per animali della stessa classe o con la medesima descrizione. Conformemente all’articolo 15 del regolamento (CE) n. 178/2002 del Parlamento europeo o del Consiglio (5), se tale parte del lotto è risultata non conforme ai requisiti UE, si presume, anche nel caso di un campione di vendite a distanza, che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita (se del caso nel corso di un’ispezione in loco), risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

».

(1)  Regolamento (CE) n. 767/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 13 luglio 2009, sull’immissione sul mercato e sull’uso dei mangimi, che modifica il regolamento (CE) n. 1831/2003 e che abroga le direttive 79/373/CEE del Consiglio, 80/511/CEE della Commissione, 82/471/CEE del Consiglio, 83/228/CEE del Consiglio, 93/74/CEE del Consiglio, 93/113/CE del Consiglio e 96/25/CE del Consiglio e la decisione 2004/217/CE della Commissione (GU L 229 dell’1.9.2009, pag. 1).

(*1)  Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

(*2)  Nel caso in cui non sia possibile rendere omogeneo il liquido, il numero di campioni elementari deve essere aumentato.

(*3)  Qualora l’apertura di un’unità possa alterare i risultati dell’analisi (per esempio nel caso degli alimenti umidi deperibili), il campione elementare è costituito dall’unità non aperta.

(*4)  Per le unità di contenuto non superiore a 1 kg o a un litro, il campione elementare è costituto dal contenuto di un’unità originaria.

(*5)  Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

(*6)  Si riconosce che in determinate situazioni (ad esempio nel caso degli insilati) non è possibile prelevare i necessari campioni elementari senza provocare danni inaccettabili al lotto. In tali situazioni può essere applicato un metodo di campionamento alternativo; per il campionamento di questo tipo di lotti è stata elaborata una guida, disponibile all’indirizzo https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/animal-feed-guidance_documents_691_2013_en.pdf.

(*7)  Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

(*8)  Se l’alimento da sottoporre a campionamento ha un valore elevato, si può prelevare una quantità inferiore di campione globale, purché ciò sia indicato e documentato nel verbale di campionamento.

(*9)  Conformemente alle disposizioni del regolamento (UE) n. 619/2011 della Commissione, del 24 giugno 2011, che fissa i metodi di campionamento e di analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali riguardo alla presenza di materiale geneticamente modificato per il quale sia in corso una procedura di autorizzazione o la cui autorizzazione sia scaduta (GU L 166 del 25.6.2011, pag. 9), il campione globale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 35 000 semi/grani. Ciò significa che per il mais il campione globale deve essere pari ad almeno 10,5 kg e per la soia a 7 kg. Per altri semi e grani come orzo, miglio, avena, riso, segale, frumento e colza, il campione globale di 4 kg corrisponde a più di 35 000 semi/grani.

(*10)  Nel caso degli alimenti confezionati, è possibile che le dimensioni delle singole unità non consentano di prelevare 4 kg per il campione globale.

(*11)  Qualora si tratti di foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica (ad esempio fieno o paglia), il campione globale deve essere di almeno 1 kg.

(*12)  Conformemente alle disposizioni del regolamento (UE) n. 619/2011, il campione finale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 10 000 semi/grani. Ciò significa che per il mais il campione finale deve essere pari ad almeno 3 000 g e per la soia a 2 000 g. Per altri semi e grani come orzo, miglio, avena, riso, segale, frumento e colza, il campione finale di 500 g corrisponde a più di 10 000 semi/grani.

(*13)  Se le dimensioni del campione globale sono considerevolmente inferiori a 4 kg o litri (cfr. note al punto 6), si può prelevare anche una quantità inferiore di campione finale, purché ciò sia indicato e documentato nel verbale di campionamento.

(*14)  Nel caso del campionamento di legumi, cereali in grani e frutta a guscio per determinare i residui di antiparassitari, il campione finale deve essere di almeno 1 kg, conformemente alle disposizioni della direttiva 2002/63/CE della Commissione, dell'11 luglio 2002, che stabilisce metodi comunitari di campionamento ai fini del controllo ufficiale dei residui di antiparassitari sui e nei prodotti alimentari di origine vegetale e animale e che abroga la direttiva 79/700/CEE (GU L 187, 16.7.2002, p. 30).

(*15)  In caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio, l’entità del campione finale da esaminare è di 1 kg.

(2)  Eventuali grumi vanno schiacciati, se necessario togliendoli dalla massa per poi reintegrarveli.

(3)  Ad eccezione del foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica.

(4)  Ad eccezione del foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica.

(5)  Regolamento (CE) n. 178/2002 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 28 gennaio 2002, che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l’Autorità europea per la sicurezza alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare (GU L 31 dell’1.2.2002, pag. 1).


ALLEGATO II

«ALLEGATO II

DISPOSIZIONI GENERALI RELATIVE AI METODI DI ANALISI DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI

A.   PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LE ANALISI

1.   Finalità

Le procedure descritte nel presente allegato riguardano la preparazione per l’analisi dei campioni, trasmessi ai laboratori di controllo dopo essere stati prelevati conformemente alle diposizioni di cui all’allegato I.

La preparazione dei campioni di laboratorio deve assicurare che le quantità pesate previste dai metodi di analisi siano omogenee e rappresentative dei campioni finali.

Oltre alle procedure descritte nel presente allegato, devono essere seguite le linee guida per la preparazione del campione di cui alla norma EN ISO 6498.

2.   Precauzioni

La procedura da seguire per la preparazione dei campioni dipende dai metodi di analisi impiegati e dai costituenti o dalle sostanze da controllare. È pertanto di fondamentale importanza che la procedura prescelta sia adeguata al metodo di analisi applicato e ai costituenti o alle sostanze da controllare.

Effettuare tutte le operazioni in modo da evitare, nei limiti del possibile, di contaminare il campione o di modificarne la composizione.

Effettuare le macinazioni, le miscelazioni e le setacciature senza ritardi, esponendo il meno possibile il campione all’aria e alla luce. Evitare l’impiego di mulini o attrezzature per la macinazione che potrebbero riscaldare eccessivamente il campione.

Per gli alimenti particolarmente sensibili al calore si raccomanda la macinazione manuale. Assicurarsi altresì che l’apparecchiatura in sé stessa non costituisca una fonte di contaminazione.

L’omogeneizzazione del campione ottenuta preparando una sospensione mediante miscelazione ad alto taglio con acqua ha dimostrato di fornire in alcuni casi sottocampioni più omogenei rispetto alla macinazione/omogeneizzazione a secco, in particolare nel caso di sostanze chimiche distribuite in modo eterogeneo. Tuttavia anche con l’omogeneizzazione mediante una sufficiente macinazione a secco potrebbero essere ottenuti sottocampioni omogenei.

In alcuni casi, ad esempio per la determinazione della segale cornuta, di impurità botaniche nocive ecc., l’omogeneizzazione del campione non può essere effettuata mediante macinazione, ma richiede una miscelazione sufficiente del campione.

Se il campione non può essere preparato senza causare una variazione sensibile del contenuto di umidità, quest’ultimo va determinato prima e dopo la preparazione, secondo il metodo previsto nell’allegato III, parte A.

3.   Procedura

3.1.   Procedura generale

L’aliquota è prelevata dal campione finale omogeneizzato. Il metodo del cono e della quartatura è sconsigliato, in quanto può dar luogo ad aliquote con un elevato errore di ripartizione.

3.1.1.   Alimenti che possono essere macinati direttamente

Mescolare il campione finale e raccoglierlo in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare di nuovo, al fine di garantire che l’omogeneizzazione sia completa, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare (aliquota).

3.1.2.   Alimenti che possono essere macinati dopo essiccazione

Salvo diversa indicazione specifica nei metodi di analisi, essiccare il campione finale, in modo da portarne il contenuto di umidità a un livello compreso tra l’8 e il 12 %, applicando la procedura di preessiccazione indicata al punto 4.3 del metodo di dosaggio dell’umidità menzionato nell’allegato III, parte A. Procedere quindi come indicato al punto 3.1.1.

3.1.3.   Alimenti liquidi o semiliquidi

Raccogliere il campione finale in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare bene, al fine di garantire che l’omogeneizzazione sia completa, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare (aliquota).

3.1.4.   Altri alimenti

Se i campioni finali non possono essere preparati secondo una delle procedure di cui sopra, applicare qualsiasi altra procedura di preparazione che consenta di ottenere quantità da analizzare (aliquote) omogenee e rappresentative dei campioni finali.

3.2.   Procedura specifica in caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio o nei casi in cui sia omogeneizzato l’intero campione globale

In caso di esame mediante ispezione visiva (senza uso del microscopio), si adopera l’intero campione globale o campione finale.

In caso di esame al microscopio, il laboratorio può ridurre il campione globale o ridurre ulteriormente il campione ridotto. I campioni finali per la difesa in caso di controversia ed eventualmente di riferimento si prelevano seguendo una procedura equivalente a quella seguita per il campione finale ai fini di verifica dell’applicazione della normativa.

Qualora l’intero campione globale sia omogeneizzato, i campioni finali si prelevano dal campione globale omogeneizzato.

Per la determinazione della segale cornuta e di impurità botaniche nocive, il campione finale deve essere suddiviso in 2 sottocampioni di peso uguale pari a circa 500 grammi. Si procede all’esame di un sottocampione. Se il risultato relativo al sottocampione è pari o inferiore al 50 % (soglia analitica) del livello massimo, il campione è conforme al livello massimo. Se il risultato è superiore al 50 % del livello massimo, occorre esaminare un altro sottocampione e la media dei risultati dei 2 sottocampioni è utilizzata per verificare la conformità al livello massimo.

4.   Conservazione e immagazzinamento dei campioni

Conservare i campioni a una temperatura tale da non alterare la loro composizione. Nel caso dei campioni destinati all’analisi di vitamine o di sostanze particolarmente sensibili alla luce, conservarli in modo tale che non vengano alterati dalla luce.

B.   DISPOSIZIONI CONCERNENTI I REATTIVI E L’APPARECCHIATURA DA UTILIZZARE NEI METODI DI ANALISI

1.

Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni specificate nei metodi di analisi, devono essere puri per analisi (p.a.). Per l’analisi degli elementi in traccia, la purezza dei reattivi deve essere controllata con una prova in bianco. A seconda del risultato ottenuto, può rendersi necessaria una purificazione supplementare dei reattivi.

2.

Per le operazioni di dissoluzione, diluizione, risciacquo o lavaggio, menzionate nei metodi di analisi senza indicazioni riguardo alla natura del solvente o del diluente, deve essere utilizzata acqua. Di norma, l’acqua deve essere demineralizzata o distillata. In casi particolari, indicati nei metodi di analisi, deve essere sottoposta a procedure specifiche di purificazione.

3.

Tenuto conto dell’abituale equipaggiamento dei laboratori di controllo, l’apparecchiatura descritta nei metodi di analisi si limita agli strumenti e agli apparecchi speciali o rispondenti a prescrizioni d’uso specifiche. Detto materiale deve essere pulito, soprattutto per le determinazioni di quantità minime di sostanze.

C.   APPLICAZIONE DEI METODI DI ANALISI ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI

1.   Procedura di estrazione

Diversi metodi determinano una procedura di estrazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di estrazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato un’efficienza di estrazione, per la matrice analizzata, equivalente a quella della procedura indicata nel metodo.

2.   Procedura di purificazione

Diversi metodi determinano una procedura di purificazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di purificazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato di produrre risultati, per la matrice analizzata, equivalenti a quelli prodotti dalla procedura indicata nel metodo.

3.   Numero di determinazioni

Qualora si analizzino sostanze indesiderabili, se il risultato della prima determinazione risulta significativamente (> 50 %) inferiore al valore della specifica oggetto di controllo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una doppia analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni è utilizzata per un’ulteriore valutazione.

Nel caso del controllo dei livelli minimi o massimi degli additivi per mangimi, se i risultati della prima determinazione sono al di sopra del livello minimo o al di sotto del livello massimo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una doppia analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni è utilizzata per un’ulteriore valutazione.

Se, nel controllare il contenuto dichiarato di una sostanza o di un dato ingrediente, il risultato della prima determinazione conferma il contenuto dichiarato (ossia, lo scarto tra il risultato dell’analisi e il contenuto dichiarato rientra in un margine di variazione accettabile), non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una doppia analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni è utilizzata per un’ulteriore valutazione (lo scarto tra il risultato dell’analisi e il contenuto dichiarato rientra o no in un margine di variazione accettabile).

In alcuni casi questo margine di variazione accettabile è definito in atti legislativi quali il regolamento (CE) n. 767/2009 e il regolamento (UE) 2019/4 del Parlamento europeo e del Consiglio. (1)

4.   Comunicazione del metodo di analisi applicato

Il rapporto di prova deve indicare il metodo di analisi applicato.

5.   Comunicazione del risultato dell’analisi

Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite nel metodo di analisi con un numero appropriato di cifre significative e, ove necessario, corretto in funzione del contenuto di umidità del campione finale prima della sua preparazione.

La maggior parte dei livelli regolamentari (ad esempio livello massimo, livello minimo) nella legislazione dell’UE in materia di alimenti per animali è stabilita in relazione a un mangime con un contenuto di umidità del 12 %. Pertanto in questi casi, al fine di valutare il risultato dell’analisi misurato sul campione rispetto al livello regolamentare, occorre innanzitutto dividere il risultato dell’analisi per il contenuto di materia secca del campione (in %) moltiplicato per 88, come indicato nella formula che segue:

Formula

dove:

Mc

:

contenuto di umidità del campione (in %). 100 – Mc rappresenta quindi il contenuto di materia secca del campione (in %);

Rana

:

risultato dell’analisi misurato sul campione;

R12 %

:

risultato per un mangime con un contenuto di umidità del 12 %; da valutare rispetto al livello regolamentare.

Inoltre, se sono soddisfatte le condizioni seguenti:

il risultato dell’analisi è significativamente (> 50 %) inferiore o superiore alle specifiche/informazioni sull’etichettatura da controllare (a seconda che le specifiche/informazioni sull’etichettatura riguardino un livello massimo o minimo);

il contenuto di umidità dell’alimento campionato è noto e si può stabilire che la correzione del contenuto di umidità non modificherà la valutazione,

allora, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità e l’analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, la correzione del contenuto di umidità può essere omessa (ad esempio nei casi in cui non esistono specifiche o livelli regolamentari), a meno che non sia necessaria per l’interpretazione.

Se il risultato dell’analisi è corretto in funzione del contenuto di umidità, anche l’incertezza di misura corrispondente deve essere corretta nell’ambito della stessa procedura.

In caso di determinazione della segale cornuta o di impurità botaniche nocive mediante esame visivo/al microscopio, non è necessario correggere il contenuto di umidità.

6.   Incertezza di misura analitica e tasso di recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili

Per quanto riguarda le sostanze indesiderabili ai sensi della direttiva 2002/32/CE, un prodotto destinato all’alimentazione animale è considerato non conforme al contenuto massimo fissato quando il risultato dell’analisi come media di due determinazioni indipendenti, relativo a un alimento con un contenuto di umidità del 12 %, è giudicato superiore al contenuto massimo, tenuto conto dell’incertezza di misura analitica estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 corrispondente a un livello di fiducia del 95 % circa, e della correzione per il recupero. Ciò significa che, al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall’analisi, corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l’incertezza di misura analitica estesa. Questa procedura è applicabile solo nei casi in cui il metodo di analisi consente di stimare l’incertezza di misura analitica estesa e la correzione per il recupero (ad esempio non è richiesta in caso di esame visivo/al microscopio).

Se il risultato dell’analisi del campione prelevato per la difesa in caso di controversia è superiore al contenuto massimo (senza tener conto dell’incertezza di misura analitica estesa), ciò conferma la non conformità accertata con il campione di controllo, in assenza di norme nazionali specifiche in materia.

Il risultato dell’analisi è riportato come segue (quando il metodo di analisi consente di stimare l’incertezza di misura analitica estesa):

a)

con correzione per il recupero, ove opportuno e pertinente, che qualora sia applicata deve essere indicata. Il tasso di recupero deve essere indicato a meno che la correzione intrinseca per distorsione faccia parte della procedura, ove la distorsione è la differenza tra il valore misurato e la concentrazione di riferimento. La correzione non è necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 %;

b)

nella forma «x +/– U», dove x è il risultato dell’analisi e U l’incertezza di misura analitica estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 (2) corrispondente a un livello di fiducia del 95 % circa.

Tuttavia, qualora il risultato dell’analisi risulti significativamente (> 50 %) inferiore al valore della specifica oggetto di controllo, e a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità e l’analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, il tasso di recupero e l’incertezza di misura analitica estesa possono essere omessi (ad esempio nei casi in cui non esistono specifiche o livelli regolamentari), a meno che l’incertezza di misura non sia necessaria per l’interpretazione.

7.   Incertezza di misura analitica e tasso di recupero in caso di analisi del contenuto di additivi per mangimi

Al fine di verificare la conformità ai contenuti minimi e massimi autorizzati degli additivi per mangimi, la presenza di un additivo per mangimi deve essere considerata non conforme ai contenuti minimi e massimi stabiliti se si ritiene che il risultato dell’analisi come media di due determinazioni indipendenti, relativo a un mangime con un contenuto di umidità del 12 %:

sia superiore al contenuto massimo, tenuto conto dell’incertezza di misura analitica estesa e della correzione per il recupero. Ciò significa che, al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall’analisi (ossia la media di due determinazioni), corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l’incertezza di misura analitica estesa;

sia inferiore al contenuto minimo, tenuto conto dell’incertezza di misura analitica estesa e della correzione per il recupero. Ciò significa che, al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall’analisi (ossia la media di due determinazioni), corretta per il fattore di recupero e dopo aver sommato l’incertezza di misura analitica estesa.

Se il risultato dell’analisi del campione prelevato per la difesa in caso di controversia è superiore al contenuto massimo (senza tener conto dell’incertezza di misura analitica estesa), ciò conferma la non conformità accertata con il campione di controllo, in assenza di norme nazionali specifiche in materia.

Il risultato dell’analisi è riportato come segue (quando il metodo di analisi consente di stimare l’incertezza di misura analitica estesa):

a)

con correzione per il recupero, ove opportuno e pertinente, che qualora sia applicata deve essere indicata. Il tasso di recupero deve essere indicato a meno che la correzione intrinseca per distorsione faccia parte della procedura, ove la distorsione è la differenza tra il valore misurato e la concentrazione di riferimento. La correzione non è necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 %;

b)

nella forma «x +/– U», dove x è il risultato dell’analisi (media di due determinazioni) e U l’incertezza di misura analitica estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 (3) corrispondente a un livello di fiducia del 95 % circa.

»

(1)  Regolamento (UE) 2019/4 del Parlamento europeo e del Consiglio, dell’11 dicembre 2018, relativo alla fabbricazione, all’immissione sul mercato e all’utilizzo di mangimi medicati, che modifica il regolamento (CE) n. 183/2005 del Parlamento europeo e del Consiglio e che abroga la direttiva 90/167/CEE del Consiglio (GU L 4 del 7.1.2019, pag. 1).

(2)  L’intervallo di confidenza del 95 % può essere raggiunto utilizzando un altro fattore come il fattore t.

(3)  L’intervallo di confidenza del 95 % può essere raggiunto utilizzando un altro fattore come il fattore t.


ALLEGATO III

«ALLEGATO III

METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA COMPOSIZIONE DELLE MATERIE PRIME PER ALIMENTI PER ANIMALI E DEGLI ALIMENTI COMPOSTI

A.   DETERMINAZIONE DELL’UMIDITÀ

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità degli alimenti per animali. Nel caso degli alimenti contenenti sostanze volatili, ad esempio acidi organici, va osservato che oltre al contenuto di umidità si rileva anche un numero importante di sostanze volatili.

Il metodo non riguarda l’analisi dei prodotti lattieri in quanto materie prime per alimenti per animali e dei mangimi composti costituiti principalmente da prodotti lattieri, l’analisi dei grassi e degli oli animali e vegetali, né quella dei semi e dei frutti oleaginosi.

La determinazione del contenuto di umidità nei semi oleaginosi deve essere effettuata secondo il metodo previsto dalla norma EN ISO 665 Semi e frutti oleaginosi - Determinazione del contenuto di umidità e di materia volatile, fermo restando che la soia deve essere macinata prima della determinazione del contenuto di umidità.

2.   Principio

Il campione è sottoposto a essiccazione in condizioni ben definite, varianti in funzione della natura dell’alimento. La perdita di peso è determinata per pesata. È necessario procedere a una preessiccazione quando si tratta di alimenti solidi aventi un elevato contenuto di umidità.

3.   Apparecchiatura

3.1.

Mulino da laboratorio costruito in materiale non assorbente l’umidità, facile a pulirsi, che permetta una macinazione rapida e uniforme senza provocare un sensibile riscaldamento, eviti al massimo il contatto con l’aria in ambiente esterno e risponda ai requisiti di cui ai punti 4.1.1 e 4.1.2 (ad esempio micromacinatori a martelli o a raffreddamento ad acqua, mulini a coni smontabili, macinatori a movimento lento o a dischi dentati).

3.2.

Bilancia analitica (precisione 1 mg).

3.3.

Recipienti asciutti, di vetro o di metallo inossidabile, provvisti di coperchi a chiusura ermetica; superficie utile che permetta di ottenere una ripartizione della quantità di prodotto su cui si opera dell’ordine di 0,3 g/cm2.

3.4.

Stufa isotermica (± 2 °C) a riscaldamento elettrico, adeguatamente ventilata, capace di assicurare una regolazione rapida della temperatura (1).

3.5.

Stufa a vuoto a riscaldamento elettrico regolabile munita di pompa a olio e di un dispositivo per l’introduzione di aria calda disidratata o di un agente disidratante (ad esempio ossido di calcio).

3.6.

Essiccatore a piastra in metallo o in porcellana, spessa, perforata, contenente un efficace disidratante.

4.   Procedura

Nota:

Le operazioni descritte in questa sezione debbono essere effettuate immediatamente dopo l’apertura degli imballaggi contenenti i campioni. Le analisi vanno eseguite almeno due volte.

4.1.   Preparazione

4.1.1.   Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.1.2 e 4.1.3

Prelevare almeno 50 g di campione. Se necessario macinare o dividere in particelle di grandezza appropriata in modo da evitare ogni variazione del contenuto di umidità (cfr. punto 6).

4.1.2.   Cereali e semole

Prelevare almeno 50 g di campione. Macinare in particelle di cui almeno la metà passi per un setaccio a maglie di 0,5 mm e non lasci più del 10 % di residuo su un setaccio a maglie rotonde di 1 mm di diametro.

4.1.3.   Alimenti liquidi o pastosi, alimenti costituiti essenzialmente da oli e grassi

Prelevare almeno 25 g di campione, pesati con l’approssimazione di 10 mg, aggiungere una quantità appropriata di sabbia anidra, pesata con l’approssimazione di 10 mg, e mescolare sino a ottenere un prodotto omogeneo.

4.2.   Essiccazione

Asciugare un recipiente (punto 3.3) provvisto di coperchio nella stufa regolata a 103 °C per 30 min +/- 1 min. Rimuovere dalla stufa e lasciar raffreddare a temperatura ambiente nell’essiccatore (punto 3.6).

4.2.1.   Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.2.2 e 4.2.3

Tarare, con la precisione di 1 mg, un recipiente provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l’approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 103 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per quattro ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 103 °C. Aprire la stufa, coprire immediatamente il recipiente con il coperchio, estrarlo dalla stufa, lasciarlo raffreddare per 30-45 minuti nell’essiccatore (punti 3.6) e pesare con l’approssimazione di 1 mg.

Nel caso di alimenti costituiti principalmente (> 50 %) da oli e grassi di origine animale e vegetale, lasciare essiccare per altri 30 minuti nella stufa a 103 °C. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.

4.2.2.   Cereali, farine, semole e semolini

Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l’approssimazione di 1 mg, 5 g circa di prodotto macinato e ripartirlo uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 130 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per due ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 130 °C. Aprire la stufa, coprire immediatamente il recipiente con il coperchio, estrarlo dalla stufa, lasciarlo raffreddare per 30-45 minuti nell’essiccatore (punti 3.6) e pesare con l’approssimazione di 1 mg.

4.2.3.   Alimenti composti contenenti più del 4 % di saccarosio o lattosio: materie prime per mangimi quali carrube, prodotti a base di cereali idrolizzati, germi di malto, fettucce di barbabietola, «solubili» di pesce e zuccheri.

Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l’approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, privo del coperchio, nella stufa a vuoto (punto 3.5) preriscaldata a una temperatura di 80-85 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile.

Portare la pressione a 100 Torr e lasciare essiccare a questa pressione per quattro ore in corrente d’aria secca e calda, o mediante un disidratante (punto 300 g circa per 20 campioni). In quest’ultimo caso interrompere la connessione con la pompa a vuoto quando è raggiunta la pressione prescritta. Misurare la durata dell’essiccazione a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 80-85 °C. Riportare poi con precauzione la stufa alla pressione atmosferica. Aprire la stufa, coprire immediatamente il recipiente con il coperchio, estrarlo dalla stufa, lasciarlo raffreddare per 30-45 minuti nell’essiccatore (punto 3.6) e pesare con l’approssimazione di 1 mg. Essiccare per altri 30 minuti nella stufa a vuoto, alla temperatura di 80-85 °C, e pesare di nuovo. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.

4.3.   Preessiccazione (essiccazione parziale)

È necessario essiccare parzialmente gli alimenti «umidi» con una frazione di massa inferiore all’85 % di materia secca (ad esempio foraggi, unifeed (piatto unico), alimenti (non) liquidi) prima della macinazione fine, al fine di analizzarne le sostanze stabili; per le sostanze instabili, l’essiccazione parziale non è possibile.

L’essiccazione parziale può essere effettuata utilizzando una stufa a ventilazione forzata o un forno a microonde oppure mediante liofilizzazione. Salvo nel caso dell’essiccazione parziale mediante liofilizzazione, l’obiettivo è essiccare l’alimento per animali mantenendo la temperatura del campione al di sotto di 60 °C, in modo da avere un effetto minimo sulla composizione chimica. L’essiccazione a temperature superiori a 60 °C provoca cambiamenti chimici negli alimenti per animali (ad esempio la degradazione delle proteine). Gli alimenti essiccati devono essere riportati a temperatura ambiente per circa 15 minuti prima di misurare la materia secca parziale, in modo da ridurre al minimo il potenziale cambiamento di umidità che può verificarsi durante la macinazione e lo stoccaggio. L’essiccazione a temperature inferiori a 60 °C non elimina tutta l’acqua dall’alimento; pertanto l’essiccazione parziale (iniziale) non consente di determinare la materia secca totale dell’alimento. Dopo l’essiccazione il sottocampione è macinato e analizzato per determinare la materia secca (finale) del campione parzialmente essiccato (umidità rimanente dal 3 % al 15 %) quando vengono determinati altri costituenti chimici.

Si raccomanda pertanto una procedura in due fasi per la determinazione della materia secca. Va anzitutto determinato il contenuto di materia secca parziale (se inferiore all’85 % di materia secca), poi va determinato il contenuto di materia secca rimanente su un campione macinato e la materia secca parziale va moltiplicata per la materia secca rimanente per determinare il contenuto totale di materia secca.

5.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di umidità (X), espresso in percentuale del campione, è dato dalle formule seguenti.

5.1.   Essiccazione senza preessiccazione

Formula

dove:

m

=

peso iniziale, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all’analisi;

m0

=

peso, in grammi, del campione essiccato.

5.2.   Essiccazione con preessiccazione (2)

Formula

dove:

m

=

peso iniziale, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all’analisi;

m1

=

peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all’analisi, dopo la preessiccazione;

m2

=

peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all’analisi, dopo la macinazione o frantumazione;

m0

=

peso, in grammi, del campione essiccato.

5.3.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare lo 0,2 % di umidità (valore assoluto), fatta eccezione per gli alimenti umidi per animali da compagnia e gli articoli masticabili per cani, per i quali la differenza non deve superare lo 0,5 % di umidità (valore assoluto).

6.   Osservazione

Qualora sia necessario procedere alla macinazione e questa comporti una variazione nel contenuto di umidità del prodotto, i risultati dell’analisi dei componenti dell’alimento devono essere corretti in funzione del contenuto di umidità del campione iniziale.

B.   DETERMINAZIONE DELL’UMIDITÀ NEI GRASSI E NEGLI OLI ANIMALI E VEGETALI

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità (acqua e altre sostanze volatili) dei grassi e degli oli animali e vegetali.

2.   Principio

Il campione viene sottoposto a essiccazione a 103 °C fino a cessazione della diminuzione di massa (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere inferiore o pari a 1 mg). La perdita di peso è determinata per pesata.

3.   Apparecchiatura

3.1.

Recipiente a fondo piano, di materiale resistente alla corrosione, diametro da 8 a 9 cm, altezza di 3 cm circa.

3.2.

Termometro con bulbo rinforzato e camera di espansione all’estremità superiore, tarato da circa 80 °C ad almeno 110 °C, lunghezza di 10 cm circa.

3.3.

Bagno di sabbia o piastra elettrica riscaldante.

3.4.

Essiccatore, contenente un efficace disidratante.

3.5.

Bilancia per analisi.

4.   Procedura

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 20 g circa del campione omogeneizzato nel recipiente (punto 3.1), asciutto e tarato, contenente il termometro (punto 3.2). Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante (punto 3.3), agitando continuamente con il termometro, in modo da far salire la temperatura a 90 °C in circa 7 minuti.

Ridurre l’intensità del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le bolle risalgono dal fondo del recipiente. La temperatura non deve superare i 105 °C. Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando non si formano più bolle.

Per assicurare l’eliminazione completa dell’umidità, riscaldare più volte a 103 ± 2 °C, raffreddando a 93 °C tra riscaldamenti successivi. Lasciare quindi raffreddare nell’essiccatore (punto 3.4) sino a temperatura ambiente e pesare. Ripetere l’operazione fino a quando la perdita di peso tra due pesate consecutive non supera i 2 mg.

Nota:

Un aumento del peso del campione dopo ripetuti riscaldamenti indica un’ossidazione del grasso; in questo caso, calcolare il risultato basandosi sulla pesata effettuata immediatamente prima che il peso abbia incominciato ad aumentare.

5.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di umidità (X), espresso in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula:

Formula

dove:

m

=

peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all’analisi;

m1

=

peso, in grammi, del recipiente con il suo contenuto prima del riscaldamento;

m2

=

peso, in grammi, del recipiente con il suo contenuto dopo il riscaldamento.

I risultati inferiori allo 0,05 % debbono recare la dicitura «meno di 0,05 %».

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare lo 0,1 % di umidità (valore assoluto).

C.   DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI AZOTO E CALCOLO DEL CONTENUTO DI PROTEINE GREGGE

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di proteine gregge degli alimenti per animali a partire dal contenuto di azoto, dosato secondo il metodo di Kjeldahl (3).

2.   Principio

Il campione viene mineralizzato in acido solforico in presenza di un catalizzatore. La soluzione acida è alcalinizzata con una soluzione di idrossido di sodio. L’ammoniaca viene isolata per distillazione e raccolta in una quantità determinata di acido solforico, il cui eccesso è titolato con una soluzione standard di idrossido di sodio.

In alternativa, l’ammoniaca liberatasi viene distillata in un eccesso di soluzione di acido borico e successivamente titolata con una soluzione di acido cloridrico o acido solforico.

3.   Reattivi

3.1.

Solfato di potassio.

3.2.

Catalizzatore: ossido rameico CuO o solfato di rame (II) pentaidrato CuSO4 5H2O.

3.3.

Zinco in granuli.

3.4.

Acido solforico, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indicatore rosso di metile: sciogliere 300 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.

Soluzione di idrossido di sodio (è possibile usare quello di purezza tecnica), β = 40 g/100 ml (m/v 40 %).

3.10.

Idrossido di sodio, soluzione volumetrica standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Idrossido di sodio, soluzione volumetrica standard, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Pietra pomice in granuli, lavata con acido cloridrico e calcinata.

3.13.

Acetanilide (p.f. = 114 °C, contenuto N = 10,36 %).

3.14.

Saccarosio (esente da azoto).

3.15.

Acido borico (H3BO3).

3.16.

Soluzione di indicatore rosso di metile: sciogliere 100 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo o metanolo.

3.17.

Soluzione di verde di bromocresolo: sciogliere 100 mg di verde di bromocresolo in 100 ml di etanolo o metanolo.

3.18.

Soluzione di acido borico (da 10 g/l a 40 g/l a seconda dell’apparecchiatura utilizzata).

Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale vanno aggiunti alle soluzioni di acido borico gli indicatori rosso di metile e bromocresolo. Nella preparazione di 1 litro di soluzione di acido borico, prima di portare a volume, aggiungere 7 ml di soluzione di indicatore rosso di metile (punto 3.16) e 10 ml di soluzione di verde di bromocresolo (punto 3.17).

A seconda dell’acqua utilizzata, il pH della soluzione di acido borico può variare da una partita all’altra. Il pH della soluzione di acido borico deve essere compreso tra 4,3 e 4,7. Per ottenere una prova in bianco positiva è spesso necessario un trattamento con una piccola quantità di alcali.

Nota:

L’aggiunta di circa 3-4 ml di NaOH (punto 3.11) a 1 litro di soluzione di acido borico a 10 g/l dà in genere buoni risultati. Conservare la soluzione a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce e da sorgenti di fumi di ammoniaca.

3.19.

Acido cloridrico, soluzione volumetrica standard, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Nota:

Si possono utilizzare altre concentrazioni di soluzioni volumetriche (punto 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 e 3.19) a condizione di apportare le necessarie correzioni nei calcoli. Le concentrazioni sono espresse sempre in cifre a quattro decimali.

4.   Apparecchiatura

Apparecchi per mineralizzazione, distillazione e titolazione secondo il metodo di Kjeldahl.

5.   Procedura

5.1.   Mineralizzazione

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo nel pallone dell’apparecchio di mineralizzazione. Aggiungere 15 g di solfato di potassio (punto 3.1), una quantità appropriata di catalizzatore (punto 3.2) (da 0,3 g a 0,4 g di ossido rameico, oppure da 0,9 g a 1,2 g di solfato di rame (II) pentaidrato), 25 ml di acido solforico (punto 3.4) e, se necessario, alcuni granuli di pietra pomice (punto 3.12). Mescolare.

Riscaldare il pallone prima moderatamente, agitando di tanto in tanto, se necessario, fino a carbonizzazione della massa e a scomparsa della schiuma; quindi scaldare più intensamente sino a ebollizione regolare del liquido. Il riscaldamento è adeguato se l’acido bollendo si condensa sulle pareti del pallone. Evitare che le pareti si surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano.

Quando la soluzione diventa limpida e di colore verde pallido prolungare l’ebollizione ancora per due ore. Lasciare quindi raffreddare.

5.2.   Distillazione

Aggiungere con precauzione un quantitativo d’acqua sufficiente a sciogliere completamente i solfati. Lasciar raffreddare. Aggiungere quindi, se necessario, qualche granulo di zinco (punto 3.3). Procedere come indicato al punto 5.2.1 o 5.2.2.

5.2.1.   Distillazione in acido solforico

Introdurre nel matraccio collettore dell’apparecchio di distillazione 25 ml misurati esattamente di acido solforico (punti 3.5 o 3.7, a seconda del presunto contenuto di azoto) e qualche goccia di indicatore rosso di metile (punto 3.8).

Collegare il pallone di mineralizzazione al refrigerante dell’apparecchio di distillazione e immergere l’estremità di quest’ultimo per almeno 1 cm nel liquido del matraccio collettore (cfr. osservazione al punto 8.3). Versare lentamente nel pallone 100 ml di soluzione di idrossido di sodio (punto 3.9) senza provocare una perdita di ammoniaca (cfr. osservazione al punto 8.1). Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell’ammoniaca.

5.2.2.   Distillazione in acido borico

Quando la titolazione del contenuto di ammoniaca del distillato è realizzata manualmente, si applica la procedura indicata di seguito. Quando l’unità di distillazione è interamente automatizzata, anche per quanto riguarda la titolazione del contenuto di ammoniaca del distillato, seguire le istruzioni d’uso di tale unità fornite dal fabbricante.

Collocare un matraccio collettore contenente 25-30 ml della soluzione di acido borico (punto 3.18) alla bocca d’uscita del refrigerante in modo che il tubo di evacuazione si trovi al di sotto della superficie dell’eccesso di soluzione di acido borico. Regolare l’unità di distillazione per ottenere 50 ml di soluzione di idrossido di sodio (punto 3.9). Far funzionare l’unità di distillazione conformemente alle istruzioni fornite dal fabbricante ed eliminare l’ammoniaca liberatasi per distillazione aggiungendo la soluzione di idrossido di sodio. Raccogliere il distillato nella soluzione di acido borico. La quantità di distillato (tempo di distillazione in corrente di vapore) dipende dal tenore di azoto nel campione. Seguire le indicazioni fornite dal fabbricante.

Nota:

In un’unità di distillazione semiautomatica l’aggiunta di eccesso di idrossido di sodio e la distillazione in corrente di vapore avvengono automaticamente.

5.3.   Titolazione

Procedere come indicato al punto 5.3.1 o 5.3.2.

5.3.1.   Acido solforico

Titolare l’eccesso di acido solforico nel matraccio collettore per mezzo di una soluzione di idrossido di sodio (punti 3.10 o 3.11) secondo la concentrazione dell’acido solforico usato, sino a raggiungere il punto finale.

5.3.2.   Acido borico

Titolare il contenuto del matraccio collettore con la soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (punti 3.19) o con la soluzione volumetrica standard di acido solforico (punti 3.6) per mezzo di una buretta e leggere la quantità di soluzione titolata utilizzata.

Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale, si raggiunge il punto finale all’apparire della prima traccia di colore rosa nel contenuto. Valutare il contenuto della buretta con l’approssimazione di 0,05 ml. La visualizzazione del punto finale può essere facilitata per mezzo di un agitatore magnetico illuminato o un rivelatore fotometrico.

È possibile farlo automaticamente per mezzo di un’unità di distillazione in corrente di vapore a titolazione automatica.

Seguire le istruzioni del fabbricante relative al funzionamento dell’unità di distillazione o del distillatore titolatore, a seconda dei casi.

Nota:

Quando è utilizzato un sistema di titolazione automatica, con soluzione di acido borico all’1 % (punto 3.18), la titolazione inizia subito dopo l’avvio della distillazione.

In caso di utilizzo di un’unità di distillazione interamente automatica, anche la titolazione automatica dell’ammoniaca può essere eseguita applicando il metodo di determinazione del punto finale per mezzo di un sistema di titolazione potenziometrica del pH.

In questo caso si ricorre a un titolatore automatico con pH-metro, tarato in maniera appropriata entro una gamma di valori compresa tra pH 4 e pH 7 conformemente ai normali metodi di taratura del pH in laboratorio.

Il punto finale in pH della titolazione è raggiunto a pH 4,6, che corrisponde al punto di inflessione (o di flesso) della curva di titolazione.

5.4.   Prova in bianco

Per confermare che i reattivi sono esenti da azoto, effettuare una prova in bianco (mineralizzazione, distillazione e titolazione) sostituendo il campione con 1 g di saccarosio (punto 3.14).

6.   Calcolo dei risultati

I calcoli sono effettuati conformemente al punto 6.1 o 6.2.

6.1.   Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.1

Calcolare il contenuto di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

Formula

dove:

V0

=

volume (ml) di NaOH (punti 3.10 o 3.11) usato nella prova in bianco;

V1

=

volume (ml) di NaOH (punti 3.10 o 3.11) usato nella titolazione del campione;

c

=

concentrazione (mol/l) dell’idrossido di sodio (punti 3.10 o 3.11);

m

=

peso (g) del campione.

6.2.   Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.2

6.2.1.   Titolazione con acido cloridrico

Calcolare il contenuto di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

Formula

dove:

m

=

peso (g) della quantità di sostanza sottoposta all’analisi;

c

=

concentrazione (mol/l) della soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (punto 3.19);

V0

=

volume (ml) di acido cloridrico usato nella prova in bianco;

V1

=

volume (ml) di acido cloridrico usato per la quantità di sostanza sottoposta all’analisi.

6.2.2.   Titolazione con acido solforico

Calcolare il contenuto di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

Formula

dove:

m

=

peso (g) della quantità di sostanza sottoposta all’analisi;

c

=

concentrazione (mol/l) della soluzione volumetrica standard di acido solforico (punto 3.6);

V0

=

volume (ml) di acido solforico (punto 3.6) usato per la prova in bianco;

V1

=

volume (ml) di acido solforico (punto 3.6) usato per la quantità di sostanza sottoposta all’analisi.

7.   Verifica del metodo

7.1.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:

lo 0,4 in valore assoluto, per i contenuti di proteine gregge inferiori al 20 %;

il 2,0 % del valore più elevato, per i contenuti di proteine gregge compresi fra il 20 e il 40 %;

lo 0,8 % in valore assoluto, per i contenuti di proteine gregge superiori al 40 %.

7.2.   Riproducibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione in laboratori distinti non deve superare:

l’1,8 % in valore assoluto, per i contenuti di proteine gregge inferiori al 20 %;

il 9,0 % del valore più elevato, per i contenuti di proteine gregge compresi fra il 20 e il 40 %;

il 3,6 % in valore assoluto, per i contenuti di proteine gregge superiori al 40 %.

7.3.   Precisione

Eseguire l’analisi (mineralizzazione, distillazione e titolazione) su una quantità appropriata di acetanilide (punto 3.13) (ad esempio da 0,2 a 0.3 g) in presenza di 1 g di saccarosio (punto 3.14); 1 g di acetanilide consuma 14,80 ml di acido solforico punto (punto 3.5). Il recupero deve essere almeno del 99 %.

8.   Osservazioni

8.1.

L’apparecchiatura può essere di tipo manuale, semiautomatico o automatico. Se l’apparecchio richiede un travasamento tra mineralizzazione e distillazione, il travasamento deve essere effettuato senza perdite. Se il pallone dell’apparecchio di distillazione non è provvisto di un imbuto separatore, aggiungere la soluzione di idrossido di sodio immediatamente prima di collegare il pallone al refrigerante, lasciando colare lentamente il liquido lungo le pareti.

8.2.

Se il prodotto mineralizzato si solidifica, ricominciare la determinazione usando un quantitativo di acido solforico (punto 3.4) superiore a quello indicato al punto 5.1.

8.3.

Per i prodotti poveri di sostanze azotate, il volume di acido solforico (punto 3.7) da introdurre nel matraccio collettore può essere ridotto, se necessario, a 10 o 15 ml e portato a 25 ml con acqua.

8.4.

Per analisi ordinarie possono essere applicati metodi alternativi per determinare le proteine gregge, ma il metodo di Kjeldahl descritto in questa parte C costituisce il metodo di riferimento. L’equivalenza tra i risultati ottenuti con il metodo alternativo (ad esempio, il metodo Dumas) e quelli del metodo di riferimento va dimostrata per ciascuna matrice singolarmente. Dato che i risultati ottenuti con un metodo diverso, anche dopo verifica dell’equivalenza, possono deviare leggermente da quelli ottenuti con il metodo di riferimento, è necessario indicare nella relazione di analisi il metodo utilizzato per la determinazione delle proteine gregge.

D.   DETERMINAZIONE DELL’UREA

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di urea utilizzata come additivo per mangimi negli alimenti per ruminanti.

2.   Principio

Il campione è messo in sospensione nell’acqua in presenza di un chiarificante. La sospensione è filtrata. Il contenuto di urea del filtrato è determinato, dopo aggiunta di 4-dimetilamminobenzaldeide (punto 4-DMAB), misurando la densità ottica alla lunghezza d’onda di 420 nm.

3.   Reattivi

3.1.

Soluzione di 4-dimetilamminobenzaldeide: sciogliere 1,6 g di 4-DMAB in 100 ml di etanolo al 96 % e aggiungere 10 ml di acido cloridrico (ρ20 1,19 g/ml). Questo reattivo si conserva soltanto per due settimane.

3.2.

Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco, Zn (CH3 COO)2 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml con acqua.

3.3.

Soluzione di Carrez II: sciogliere in acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio K4Fe(CN)6 3H2O. Portare a 100 ml con acqua.

3.4.

Carbone attivo non assorbente urea (eseguire un controllo).

3.5.

Urea, soluzione allo 0,1 % (p/v).

4.   Apparecchiatura

4.1.

Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto.

4.2.

Provette: 160 × 16 mm, a tappo smerigliato.

4.3.

Spettrofotometro.

5.   Procedura

5.1.   Analisi del campione

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 2 g del campione e introdurli con 1 g di carbone attivo (punto 3.4) in un matraccio tarato da 500 ml. Aggiungere 400 ml di acqua e 5 ml di soluzione di Carrez I (punto 3.2), agitare per circa 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II (punto 3.3). Mescolare per trenta minuti nell’agitatore rotativo. Portare a volume con acqua, agitare e filtrare.

Prelevare 5 ml di filtrati limpidi e incolori, introdurli nelle provette con tappo smerigliato, aggiungere 5 ml di soluzione di 4-DMAB (punto 3.1) e mescolare. Porre le provette in bagnomaria a 20 °C (+/- 4 °C). Dopo quindici minuti, misurare la densità ottica della soluzione del campione con lo spettrofotometro a 420 nm rispetto alla soluzione della prova in bianco dei reattivi.

5.2.   Curva di taratura

Prelevare volumi di 1, 2, 4, 5 e 10 ml della soluzione di urea (punto 3.5), introdurli in matracci tarati da 100 ml e portare a volume con acqua. Prelevare 5 ml di ciascuna soluzione aggiungendo ogni volta 5 ml di soluzione di 4-DMAB (punto 3.1), omogeneizzare e misurare la densità ottica, come indicato sopra, rispetto a una soluzione testimone contenente 5 ml di 4-DMAB e 5 ml d’acqua, esente da urea. Tracciare la curva di taratura.

6.   Calcolo dei risultati

Determinare la quantità di urea, nella parte di campione sottoposta all’analisi, servendosi della curva di taratura.

Esprimere il risultato in mg di urea per kg di campione.

7.   Valutazione del metodo

7.1.   Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione nel medesimo laboratorio e dal medesimo operatore non deve superare:

a 420 nm:

il 50 % del valore più elevato, per i contenuti di urea compresi fra 3 000 mg/kg e meno di 5 000 mg/kg;

il 25 % del valore più elevato, per i contenuti di urea compresi fra 5 000 mg/kg e meno di 7 000 mg/kg;

il 20 % del valore più elevato, per i contenuti di urea uguali o superiori a 7 000 mg/kg;

a 435 nm:

il 40 % del valore più elevato, per i contenuti di urea compresi fra 3 000 mg/kg e meno di 5 000 mg/kg;

il 25 % del valore più elevato, per i contenuti di urea compresi fra 5 000 mg/kg e meno di 9 000 mg/kg;

il 5 % del valore più elevato, per i contenuti di urea uguali o superiori a 9 000 mg/kg.

7.2.   Riproducibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione in laboratori distinti e/o da operatori diversi non deve superare:

a 420 nm:

3 000 mg/kg in valore assoluto, per i contenuti di urea compresi fra 3 000 mg/kg e meno di 12 000 mg/kg;

4 500 mg/kg in valore assoluto, per i contenuti di urea uguali o superiori a 12 000 mg/kg;

a 435 nm:

il 50 % del valore più elevato, per i contenuti di urea compresi fra 3 000 mg/kg e meno di 8 000 mg/kg;

il 25 % del valore più elevato, per i contenuti di urea uguali o superiori a 8 000 mg/kg.

8.   Risultati di uno studio collaborativo

È stato organizzato un esercizio di confronto interlaboratorio a livello di UE cui hanno partecipato 18 laboratori. Cinque campioni positivi di mangimi composti per ruminanti («MAT» nelle tabelle 1 e 2) sono stati analizzati (1 analisi) in duplicati ciechi; come bianco è stato analizzato una volta un mangime composto per ruminanti.

I calcoli dei limiti di ripetibilità (r) e riproducibilità (R) quali definiti dalle linee guida internazionali sono stati effettuati dopo aver eliminato gli outlier utilizzando l’analisi della varianza dei valori validi.

I dati sul rendimento del metodo calcolati (ripetibilità, riproducibilità) sono presentati nelle tabelle che seguono. Per tutti i campioni analizzati, compreso il bianco, non sono stati riscontrati falsi positivi o falsi negativi.

Tabella 1

Caratteristiche di rendimento del metodo per l’urea misurata a λ = 420 nm in tutti i materiali

 

MAT 2

MAT 5

MAT 3

MAT 4

MAT 6

 

Ovini

Bovini

Ovini

Ovini

Bovini

Frazione di massa bersaglio (mg kg-1)

3 000

5 000

7 001

9 036

11 000

Frazione di massa media (mg kg-1)

4 241

6 993

7 830

9 962

12 071

Deviazione standard di riproducibilità sR (mg kg-1)

1 141

1 303

985

994

1 711

Deviazione standard di ripetibilità sr (mg kg-1)

723

601

549

712

737

Deviazione standard relativa di riproducibilità RSDR (%)

27

19

13

10

14

Deviazione standard relativa di ripetibilità RSDr (%)

17

9

7

7

6

Limite di riproducibilità, R

[R = 2,8 × sR ]

3 195

3 649

2 759

2 784

4 790

Limite di ripetibilità, r

[r = 2,8 × sr ]

2 024

1 684

1 536

1 994

2 064


Tabella 2

Caratteristiche di rendimento del metodo per l’urea misurata a λ = 435 nm in tutti i materiali

 

MAT 2

MAT 5

MAT 3

MAT 4

MAT 6

 

Ovini

Bovini

Ovini

Ovini

Bovini

Frazione di massa bersaglio (mg kg-1)

3 000

5 000

7 001

9 036

11 000

Frazione di massa media (mg kg-1)

4 101

6 467

7 890

10 062

11 642

Deviazione standard di riproducibilità sR (mg kg-1)

706

1 194

675

745

1 378

Deviazione standard di ripetibilità sr (mg kg-1)

570

628

613

196

167

Deviazione standard relativa di riproducibilità RSDR (%)

17

18

9

7

12

Deviazione standard relativa di ripetibilità RSDr (%)

14

10

8

2

1

Limite di riproducibilità, R

[R = 2,8 × sR ]

1 977

3 344

1 889

2 087

3 859

Limite di ripetibilità, r

[r = 2,8 × sr ]

1 596

1 759

1 715

549

467

9.   Osservazioni

9.1.

Per contenuti di urea superiori al 3 %, ridurre la quantità di campione da sottoporre all’analisi a 1 g o diluire la soluzione originale, in modo da non avere più di 50 mg di urea in 500 ml.

9.2.

Per bassi contenuti di urea, aumentare la quantità di campione da sottoporre all’analisi fino a quando il filtrato resta limpido e incolore.

9.3.

I risultati degli studi collaborativi di cui sopra non indicano una differenza significativa di precisione tra l’urea misurata a 420 nm o a 435 nm.

E.   DETERMINAZIONE DEGLI AMMINOACIDI (TRIPTOFANO ESCLUSO)

I metodi di analisi da utilizzare per la determinazione degli amminoacidi (triptofano escluso) sono:

EN ISO 13903 Mangimi per animali - Determinazione del contenuto di amminoacidi;

EN ISO 17180 Mangimi per animali - Determinazione di lisina, metionina e treonina in aminoacidi prodotti commerciali e premiscele (4);

il metodo di analisi descritto di seguito ai punti da 1 a 10.

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo serve per determinare gli amminoacidi liberi (sia di sintesi che naturali) e totali (legati a peptidi e liberi) nelle materie prime per mangimi, nei mangimi composti e nelle premiscele contenenti meno del 10 % (5) di ciascun amminoacido mediante un analizzatore di amminoacidi. Il metodo è applicabile ai seguenti amminoacidi: cist(e)ina, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, acido aspartico, acido glutammico, glicina, istidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

Il metodo non distingue tra i vari sali di amminoacidi e non può distinguere la forma D degli amminoacidi dalla forma L; esso non è adatto per la determinazione del triptofano né degli analoghi idrossilati degli amminoacidi.

2.   Principio

2.1.   Amminoacidi liberi

Gli amminoacidi liberi sono estratti con acido cloridrico diluito. Le macromolecole azotate coestratte vengono fatte precipitare con acido solfosalicilico e vengono rimosse per filtrazione. La soluzione filtrata viene portata a pH 2,20. Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm.

2.2.   Amminoacidi totali

La scelta della procedura dipende dagli amminoacidi oggetto dell’analisi. Cist(e)ina e metionina devono essere ossidate ad acido cisteico e metionina sulfone prima dell’idrolisi. La tirosina deve essere determinata in idrolizzati di campioni non ossidati. Tutti gli altri amminoacidi elencati al punto 1 (Finalità e campo di applicazione) possono essere determinati sia nel campione ossidato sia in quello non ossidato.

L’ossidazione viene eseguita a 0 °C con una miscela di acido performico e di fenolo. L’eccesso del reagente di ossidazione viene decomposto con metabisolfito di sodio. Il campione ossidato o non ossidato è idrolizzato con acido cloridrico (punto 3.20) per 23 ore. L’idrolizzato è regolato a pH 2,20. Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm (punto 440 nm per la prolina).

3.   Reattivi

Usare acqua bidistillata o di qualità equivalente (conduttività < 10 μS).

3.1.

Perossido di idrogeno, p (p/p) = 30 %.

3.2.

Acido formico, p (p/p) = 98-100 %.

3.3.

Fenolo.

3.4.

Metabisolfito di sodio.

3.5.

Idrossido di sodio.

3.6.

Acido 5-solfosalicilico diidrato.

3.7.

Acido cloridrico, densità circa 1,18 g/ml.

3.8.

Citrato trisodico diidrato.

3.9.

2,2’-Tiodietanolo (tiodiglicole).

3.10.

Cloruro di sodio.

3.11.

Ninidrina.

3.12.

Etere di petrolio, intervallo di ebollizione tra 40 e 60 °C.

3.13.

Norleucina o altro composto adatto ad essere utilizzato come standard interno.

3.14.

Azoto gassoso (< 10 ppm di ossigeno).

3.15.

1-Ottanolo.

3.16.

Amminoacidi.

3.16.1.

Sostanze standard degli amminoacidi elencati al punto 1 (Finalità e campo di applicazione). Composti puri non contenenti acqua di cristallizzazione. Essiccare sotto vuoto su P2O5 o H2SO4 per 1 settimana prima dell’uso.

3.16.2.

Acido cisteico.

3.16.3.

Metionina sulfone.

3.17.

Soluzione di idrossido di sodio, c = 7,5 mol/l:

sciogliere 300 g di NaOH (punto 3.5) in acqua e portare a 1 litro.

3.18.

Soluzione di idrossido di sodio, c = 1 mol/l:

sciogliere 40 g di NaOH (punto 3.5) in acqua e portare a 1 litro.

3.19.

Soluzione di acido formico-fenolo:

miscelare 889 g di acido formico (punto 3.2) con 111 g d’acqua e aggiungere 4,73 g di fenolo (punto 3.3).

3.20.

Miscela di idrolisi, c = HCl 6 mol/l contenente 1 g di fenolo/l:

aggiungere 1 g di fenolo (punto 3.3) a 492 ml di HCl (punto 3.7) e portare a 1 litro con acqua.

3.21.

Miscela di estrazione, c = HCl 0,1 mol/l contenente 2 % di tiodiglicole: introdurre 8,2 ml di HCl (punto 3.7) in circa 900 ml d’acqua e miscelare, aggiungere 20 ml di tiodiglicole (punto 3.9) e portare a 1 litro con acqua (non miscelare direttamente le sostanze di cui ai punti 3.7 e 3.9).

3.22.

Acido 5-solfosalicilico, β = 6 %:

sciogliere 60 g di acido 5-solfosalicilico (punto 3.6) in acqua e portare a 1 litro con acqua.

3.23.

Miscela di ossidazione (acido performico-fenolo):

miscelare 0,5 ml di perossido di idrogeno (punto 3.1) con 4,5 ml di soluzione di acido formico e fenolo (punto 3.19) in un piccolo becher. Tenere in incubazione a 20-30 °C per 1 ora per ottenere acido performico; lasciare raffreddare su un bagno di acqua gelata (15 min) prima di aggiungere il campione.

Attenzione: evitare il contatto con la pelle e indossare indumenti di protezione.

3.24.

Tampone citrato, c = Na+ 0,2 mol/l, pH 2,20:

sciogliere 19,61 g di citrato di sodio (punto 3.8), 5 ml di tiodiglicole (punto 3.9), 1 g di fenolo (punto 3.3) e 16,50 ml di HCl (punto 3.7) in circa 800 ml d’acqua. Portare il pH a 2,20. Portare a 1 litro con acqua.

3.25.

Tamponi di eluizione preparati conformemente alle prescrizioni relative all’analizzatore (punto 4.9).

3.26.

Reattivo alla ninidrina preparato conformemente alle prescrizioni relative all’analizzatore (punto 4.9).

3.27.

Soluzioni standard di amminoacidi. Conservare queste soluzioni a temperatura inferiore a 5 °C.

3.27.1.

Soluzione madre standard di amminoacidi (punto 3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml di ciascuno in acido cloridrico.

Reperibile in commercio.

3.27.2.

Soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone, c = 1,25 μmol/ml.

Sciogliere 0,2115 g di acido cisteico (punto 3.16.2) e 0,2265 g di metionina sulfone (punto 3.16.3) in tampone citrato (punto 3.24) in un matraccio tarato da 1 litro e portare a volume con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 °C al massimo per 12 mesi. Questa soluzione non viene utilizzata se la soluzione madre standard (punto 3.27.1) contiene acido cisteico e metionina sulfone.

3.27.3.

Soluzione madre standard dello standard interno, ad esempio norleucina, c = 20 μmol/ml.

Sciogliere 0,6560 g di norleucina (punto 3.13) in tampone citrato (punto 3.24) in un matraccio tarato e portare a 250 ml con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 °C al massimo per 6 mesi.

3.27.4.

Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idrolizzati, c = 5 nmol/50 μl di acido cisteico e metionina sulfone e c = 10 nmol/50 μl di altri amminoacidi. Sciogliere 2,2 g di cloruro di sodio (punto 3.10) in un becher da 100 ml con 30 ml di tampone citrato (punto 3.24). Aggiungere 4,00 ml di soluzione madre standard di amminoacidi (punto 3.27.1), 4,00 ml di soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone (punto 3.27.2) e, se del caso, 0,50 ml di soluzione madre standard dello standard interno (punto 3.27.3). Portare il pH a 2,20 con idrossido di sodio (punto 3.18).

Trasferire quantitativamente in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con tampone citrato (punto 3.24) e miscelare.

Conservare a temperatura inferiore a 5 °C al massimo per 3 mesi.

Cfr. anche le osservazioni al punto 9.1.

3.27.5.

Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idrolizzati preparati secondo quanto prescritto al punto 5.3.3.1 e destinati all’uso con estratti (punto 5.2). Preparare la soluzione di taratura secondo quanto indicato al punto 3.27.4, ma senza cloruro di sodio.

Conservare a temperatura inferiore a 5 °C al massimo per 3 mesi.

4.   Apparecchiatura

4.1.

Pallone a fondo arrotondato da 100 o 250 ml provvisto di refrigerante a ricadere.

4.2.

Flacone di vetro borosilicatico da 100 ml con tappo a vite e guarnizione di gomma/teflon (ad esempio Duran, Schott) utilizzabile in stufa.

4.3.

Stufa a ventilazione forzata con regolazione della temperatura avente una precisione superiore a ± 2 °C.

4.4.

pH-metro (a tre cifre decimali).

4.5.

Filtro a membrana, da 0,22 μm.

4.6.

Centrifuga.

4.7.

Evaporatore rotante sotto vuoto.

4.8.

Agitatore meccanico o magnetico.

4.9.

Analizzatore di amminoacidi o apparecchiatura HPLC provvista di colonna a scambio ionico, dispositivo per ninidrina, derivatizzatore post-colonna e rivelatore fotometrico.

La colonna deve essere riempita di resine polistireniche sulfonate in grado di separare gli amminoacidi uno dall’altro e da altri prodotti reattivi alla ninidrina. Il flusso del tampone e del reattivo di ninidrina è garantito da pompe il cui grado di stabilità di portata è ± 0,5 % nell’intervallo tra l’analisi della soluzione di taratura e l’analisi del campione.

Con alcuni analizzatori di amminoacidi si possono utilizzare metodi di idrolisi in cui l’idrolizzato presenta una concentrazione di sodio di c = 0,8 mol/l e contiene tutto l’acido formico residuo dalla fase di ossidazione. Altri apparecchi non consentono una separazione soddisfacente di certi amminoacidi se l’idrolizzato contiene troppo acido formico e/o presenta elevate concentrazioni di ioni sodio. In questo caso il volume dell’acido è ridotto a circa 5 ml mediante evaporazione dopo l’idrolisi e prima della regolazione del pH. L’evaporazione è eseguita sotto vuoto a temperatura non superiore a 40 °C.

5.   Procedura

5.1.   Preparazione del campione

Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all’aria a una temperatura non superiore a 50 °C o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (punto 3.12) prima di essere triturati.

5.2.   Determinazione degli amminoacidi liberi

Pesare con l’approssimazione di 0,2 mg una quantità appropriata (1-5 g) del campione preparato (punto 5.1) in una beuta e aggiungere 100,0 ml di miscela di estrazione (punto 3.21). Agitare la miscela per 60 minuti con un agitatore meccanico o magnetico (punto 4.8). Lasciar depositare il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher da 100 ml.

Aggiungere 5,0 ml di soluzione di acido solfosalicilico (punto 3.22) sempre agitando e continuare ad agitare con agitatore magnetico per 5 minuti. Filtrare o centrifugare il surnatante per rimuovere eventuali precipitati. Introdurre 10,0 ml della soluzione risultante in un becher da 100 ml e portare il pH a 2,20 con una soluzione di idrossido di sodio (punto 3.18), trasferire in un matraccio tarato di volume appropriato utilizzando tampone citrato (punto 3.24) e portare a volume con la soluzione tampone (punto 3.24).

Se si usa uno standard interno, aggiungere 1,00 ml di standard interno (punto 3.27.3) ogni 100 ml di soluzione finale e portare a volume con la soluzione tampone (punto 3.24).

Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Se gli estratti non vengono cromatografati lo stesso giorno, conservarli a temperatura inferiore a 5 °C.

5.3.   Determinazione degli amminoacidi totali

5.3.1.   Ossidazione

Pesare, con l’approssimazione di 0,2 mg, da 0,1 a 1 g del campione preparato (punto 5.1) in:

un pallone a fondo arrotondato da 100 ml (punto 4.1) per l’idrolisi in sistema aperto (punto 5.3.2.3); o

un pallone a fondo arrotondato da 250 ml (punto 4.1) se è richiesta una bassa concentrazione di sodio (punto 5.3.3.1); o

un flacone da 100 ml dotato di tappo a vite (punto 4.2) (per l’idrolisi in sistema chiuso punto 5.3.2.4).

La porzione di campione pesata deve avere un contenuto di azoto di circa 10 mg e un contenuto di umidità non superiore a 100 mg.

Introdurre il pallone o il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio e raffreddare a 0 °C; aggiungere 5 ml di miscela di ossidazione (punti 3.23) e miscelare con una spatola di vetro con un’estremità ricurva. Sigillare il pallone o il flacone contenente la spatola con una pellicola impermeabile all’aria, introdurre il bagno di acqua e ghiaccio contenente il contenitore sigillato in un frigorifero a 0 °C e lasciarvelo per 16 ore. Dopo 16 ore togliere dal frigorifero e decomporre l’eccesso di reagente di ossidazione mediante l’aggiunta di 0,84 g di metabisolfito di sodio (punto 3.4).

Procedere come indicato al punto 5.3.2.1.

5.3.2.   Idrolisi

5.3.2.1.

Idrolisi dei campioni ossidati

Aggiungere al campione ossidato, preparato conformemente al punto 5.3.1, 25 ml di miscela di idrolisi (punto 3.20) avendo cura di risciacquare eventuali residui di campione che aderiscono alle pareti del recipiente e alla spatola.

Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, a seconda del metodo di idrolisi utilizzato.

5.3.2.2.

Idrolisi dei campioni non ossidati

Pesare in un pallone a fondo arrotondato da 100 ml o 250 ml (punto 4.1) o in un flacone da 100 ml con tappo a vite (punto 4.2), con l’approssimazione di 0,2 mg, una quantità da 0,1 a 1 g del campione preparato (punto 5.1). La porzione di campione pesata deve avere un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere con cautela 25 ml di miscela di idrolisi (punto 3.20) e miscelare con il campione. Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Idrolisi, sistema aperto

Aggiungere 3 biglie di vetro alla miscela (preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2) contenuta nel pallone e far bollire a ricadere per 23 ore a ebollizione continua. Al completamento dell’idrolisi, risciacquare il refrigerante con 5 ml di tampone citrato (punto 3.24). Togliere il pallone e farlo raffreddare in un bagno di ghiaccio.

Procedere come indicato al punto 5.3.3.

5.3.2.4.

Idrolisi, sistema chiuso

Introdurre il flacone contenente la miscela, preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2, in una stufa (punto 4.3) a 110 °C. Durante la prima ora, allo scopo di evitare un accumulo di pressione in conseguenza dello sviluppo di sostanze gassose e di evitare un’esplosione, porre il tappo a vite sopra al recipiente senza chiuderlo. Dopo un’ora, chiudere il recipiente con il tappo e lasciarlo nella stufa (punto 4.3) per 23 ore. Al completamento dell’idrolisi, togliere il flacone dalla stufa, aprire con cautela il tappo del flacone e introdurre il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio. Lasciar raffreddare.

Secondo la procedura usata per la regolazione del pH (punto 5.3.3), trasferire quantitativamente il contenuto del flacone in un becher da 250 ml o in un pallone a fondo arrotondato da 250 ml utilizzando tampone citrato (punto 3.24).

Procedere come indicato al punto 5.3.3.

5.3.3.   Regolazione del pH

Procedere alla regolazione del pH, conformemente al punto 5.3.3.1 o 5.3.3.2 in funzione della tolleranza al sodio dell’analizzatore di amminoacidi (punto 4.9).

5.3.3.1.

Per sistemi cromatografici (punto 4.9) che richiedono una bassa concentrazione di sodio

Quando si impiegano analizzatori di amminoacidi che richiedono una bassa concentrazione di sodio (quando il volume dell’acido deve essere ridotto), è consigliabile utilizzare una soluzione madre dello standard interno (punto 3.27.3).

In questo caso aggiungere 2,00 ml della soluzione madre dello standard interno (punto 3.27.3) all’idrolizzato prima dell’evaporazione.

Aggiungere 2 gocce di 1-ottanolo (punto 3.15) all’idrolizzato ottenuto conformemente alla procedura di cui al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

Utilizzando un evaporatore rotante (punto 4.7), ridurre il volume a 5-10 ml sotto vuoto a 40 °C. Se il volume viene ridotto accidentalmente a meno di 5 ml, scartare l’idrolizzato e ricominciare l’analisi.

Portare il pH a 2,20 con soluzione di idrossido di sodio (punto 3.18) e procedere conformemente al punto 5.3.4.

5.3.3.2.

Per tutti gli altri analizzatori di amminoacidi (punto 4.9)

Neutralizzare parzialmente gli idrolizzati ottenuti conformemente al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, aggiungendovi con cautela, sempre agitando, 17 ml di soluzione di idrossido di sodio (punto 3.17), facendo attenzione che la temperatura rimanga al di sotto di 40 °C.

Portare il pH a 2,20 a temperatura ambiente utilizzando la soluzione di idrossido di sodio di cui al punto 3.17 e, infine, una soluzione di idrossido di sodio conforme al punto 3.18. Procedere conformemente al punto 5.3.4.

5.3.4.   Soluzione del campione per cromatografia

Trasferire quantitativamente l’idrolizzato portato a pH 2,20 (punti 5.3.3.1 o 5.3.3.2) con tampone citrato (punto 3.24) in un matraccio tarato da 200 ml e portare a volume con tampone (punto 3.24).

Se non è stato ancora utilizzato uno standard interno, aggiungerne 2,00 ml (punto 3.27.3) e portare a volume con tampone citrato (punto 3.24). Miscelare accuratamente.

Procedere alla fase della cromatografia (punto 5.4).

Se le soluzioni del campione non vengono cromatografate nello stesso giorno, conservarle a temperatura inferiore a 5 °C.

5.4.   Cromatografia

Prima della cromatografia, portare l’estratto (punto 5.2) o l’idrolizzato (punto 5.3.4) a temperatura ambiente. Agitare la miscela e filtrarne una quantità appropriata attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm (punto 4.5). La soluzione limpida risultante viene sottoposta a cromatografia a scambio ionico utilizzando un analizzatore di amminoacidi (punto 4.9).

L’iniezione può venire eseguita manualmente o automaticamente. È importante iniettare sempre la stessa quantità (± 0,5 %) di soluzione nella colonna per l’analisi degli standard e dei campioni, salvo quando si usa uno standard interno; inoltre i rapporti sodio/amminoacidi nelle soluzioni standard e del campione devono essere il più possibile simili.

In generale, la frequenza delle iniezioni della soluzione di taratura dipende dalla stabilità del reattivo alla ninidrina e del sistema analitico. La soluzione standard o del campione è diluita con tampone citrato (punto 3.24) in misura tale che l’area del picco della soluzione standard sia compresa fra il 30 % e il 200 % dell’area del picco dell’amminoacido nel campione.

La cromatografia degli amminoacidi varierà leggermente secondo il tipo di analizzatore impiegato e la resina usata. Il sistema scelto deve essere in grado di separare gli amminoacidi uno dall’altro e dalle sostanze reattive alla ninidrina. Nel corso dell’operazione, il sistema cromatografico deve dare una risposta lineare alle variazioni delle quantità di amminoacidi introdotti in colonna.

Durante la fase di cromatografia, quando si analizza una soluzione equimolare (degli amminoacidi sottoposti a determinazione), si applicano i rapporti di altezza valle/picco citati più avanti. La soluzione equimolare deve contenere almeno il 30 % del carico massimo di ciascun amminoacido che può essere determinato con precisione tramite il sistema di analisi degli amminoacidi (punto 4.9).

Per la separazione treonina-serina, il rapporto di altezza valle/picco del più basso dei due amminoacidi che si sovrappongono sul cromatogramma non deve superare 2/10 (se la determinazione viene effettuata solo su cist(e)ina, metionina, treonina e lisina, una insufficiente separazione di picchi adiacenti influirà sfavorevolmente sulla determinazione). Per tutti gli altri amminoacidi la separazione deve essere maggiore di 1/10.

Il sistema deve poter separare la lisina da «artefatti di lisina» e dall’ornitina.

6.   Calcolo dei risultati

Determinare le aree del picco del campione e della soluzione standard per ogni singolo amminoacido e calcolare la quantità (X) in g di amminoacido per kg di campione secondo la seguente formula:

Formula

Se si usa uno standard interno moltiplicare per:

Formula

A

=

area del picco dell’idrolizzato o dell’estratto;

B

=

area del picco della soluzione standard di taratura;

C

=

area del picco dello standard interno nell’idrolizzato o nell’estratto;

D

=

area del picco dello standard interno, soluzione standard di taratura;

M

=

massa molare dell’amminoacido determinato;

c

=

concentrazione dello standard in μmol/ml;

m

=

peso del campione in g (corretto al peso originale se essiccato o sgrassato)

V

=

ml totali di idrolizzato (punto 5.3.4) o ml del volume di diluizione totale calcolati dell’estratto (punto 6.1).

La cistina e la cisteina sono determinate entrambe sotto forma di acido cisteico negli idrolizzati di campione ossidato, ma calcolate come cistina (6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) utilizzando una massa molare (M) di 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

La metionina è determinata come metionina sulfone negli idrolizzati del campione ossidato, ma calcolata come metionina utilizzando l’M della metionina (149,21 g/mol).

La metionina libera aggiunta viene determinata dopo estrazione sotto forma di metionina; per il calcolo si usa lo stesso valore M.

6.1.

Il volume della diluizione totale degli estratti (F) per la determinazione degli amminoacidi liberi (punto 5.2) è calcolato come segue:

Formula

V

=

volume dell’estratto finale.

7.   Valutazione del metodo

Il metodo è stato testato nel 1990, nel corso di uno studio di intercomparazione internazionale sulla base di quattro diversi alimenti per animali (alimento composto per suini, alimento composto per polli da ingrasso, concentrato proteico, premiscela).

Nota:

Il metodo è stato testato nel corso di un secondo studio di intercomparazione internazionale nel 2003 utilizzando coppie di duplicati ciechi di mangimi di finissaggio per polli da ingrasso, mangimi starter per polli da ingrasso, mais, farine di pesce e farine di pollame. Per ulteriori informazioni, cfr. la norma EN ISO 13903.

I risultati dello studio di intercomparazione del 1990 in termini di medie e deviazioni standard, dopo l’eliminazione degli outlier, figurano nelle tabelle del presente punto.

Medie in g/kg

Materiale di riferimento

Amminoacido

Treonina

Cist(e)ina

Metionina

Lisina

Alimento composto per suini

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Alimento composto per polli da ingrasso

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Concentrato proteico

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Premiscela

58,42

n = 16

90,21

n = 16

98,03

n = 16

n = numero di laboratori partecipanti.

7.1.   Ripetibilità

La ripetibilità (espressa come «deviazione standard entro il laboratorio») dello studio di intercomparazione della tabella di cui sopra è presentata nelle tabelle che seguono.

Coefficiente di variabilità (%) per la ripetibilità (CVr)

Materiale di riferimento

Amminoacido

Treonina

Cist(e)ina

Metionina

Lisina

Alimento composto per suini

1,9

n = 15

3,3

n = 17

3,4

n = 17

2,8

n = 13

Alimento composto per polli da ingrasso

2,1

n = 16

2,8

n = 18

3,1

n = 18

2,1

n = 16

Concentrato proteico

2,7

n = 16

2,6

n = 17

2,2

n = 17

2,4

n = 15

Premiscela

2,2

n = 16

2,4

n = 16

2,1

n = 16

n = numero di laboratori partecipanti.

7.2.   Riproducibilità

I risultati relativi alla deviazione standard tra laboratori dello studio di intercomparazione di cui sopra figurano nella tabella che segue.

Coefficiente di variabilità (%) per la riproducibilità (CVR)

Materiale di riferimento

Amminoacido

Treonina

Cist(e)ina

Metionina

Lisina

Alimento composto per suini

4,1

n = 15

9,9

n = 17

7,0

n = 17

3,2

n = 13

Alimento composto per polli da ingrasso

5,2

n = 16

8,8

n = 18

10,9

n = 18

5,4

n = 16

Concentrato proteico

3,8

n = 16

12,3

n = 17

13,0

n = 17

3,0

n = 15

Premiscela

4,3

n = 16

6,9

n = 16

6,7

n = 16

n = numero di laboratori partecipanti.

8.   Utilizzo di materiali di riferimento

La corretta applicazione del metodo può essere verificata ripetendo le misurazioni dei materiali di riferimento certificati, se disponibili. Si raccomanda di effettuare la taratura con una soluzione di taratura certificata di amminoacidi.

9.   Osservazioni

9.1.

A causa delle differenze tra gli analizzatori di amminoacidi, le concentrazioni finali delle soluzioni di taratura degli amminoacidi standard (cfr. punti 3.27.4 e 3.27.5) e dell’idrolizzato (cfr. punto 5.3.4) sono considerate valori indicativi.

Per tutti gli amminoacidi va verificato il range della risposta lineare dell’apparecchiatura.

La soluzione standard è diluita con tampone citrato per ottenere aree dei picchi al centro del range.

9.2.

Se si fa uso di apparecchi per cromatografia liquida ad alta prestazione per analizzare gli idrolizzati, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate conformemente alle raccomandazioni del fabbricante.

9.3.

L’applicazione del metodo ai mangimi composti o alle premiscele contenenti cloruro in misura superiore all’1 % (concentrato, alimenti a base di minerali, mangimi complementari) potrebbe comportare una sottostima della metionina; va previsto pertanto un trattamento speciale.

10.   Criteri di rendimento

La compilazione dei risultati (tranne per la tirosina) provenienti dai 2 studi collaborativi (del 1990, di cui al punto 7, e del 2005, di cui alla norma EN ISO 13903) fornisce i seguenti criteri per la ripetibilità e la riproducibilità. I valori tratti da queste 2 prove interlaboratorio potrebbero non essere applicabili a intervalli di concentrazioni e a matrici diversi da quelli dati.

10.1.   Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione nel medesimo laboratorio e dal medesimo operatore non deve superare:

il 6 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di glicina, alanina, lisina, prolina, acido glutammico, isoleucina e istidina;

l’8 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di treonina, fenilalanina, metionina, acido aspartico e leucina;

il 10 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di arginina e valina;

il 12 % del valore più elevato, per l’amminoacido totale serina;

il 15 % del valore più elevato, per l’amminoacido totale cist(e)ina.

10.2.   Riproducibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione in laboratori distinti e/o da operatori diversi non deve superare:

il 15 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di glicina, alanina e treonina;

il 20 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di lisina, prolina, fenilalanina, metionina e acido aspartico;

il 22 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di acido glutammico e leucina;

il 27 % del valore più elevato, per l’amminoacido totale arginina;

il 32 % del valore più elevato, per l’amminoacido totale isoleucina;

il 35 % del valore più elevato, per gli amminoacidi totali nel caso di valina e serina;

il 40 % del valore più elevato, per l’amminoacido totale istidina;

il 50 % del valore più elevato, per l’amminoacido totale cist(e)ina.

F.   DETERMINAZIONE DEL TRIPTOFANO

I metodi di analisi da utilizzare per la determinazione del triptofano sono:

EN ISO 13904 Mangimi per animali - Determinazione del contenuto di triptofano;

il metodo di analisi descritto di seguito ai punti da 1 a 9.

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo serve per la determinazione del triptofano totale e libero negli alimenti per animali. Esso non distingue la forma D dalla forma L.

2.   Principio

Per la determinazione del triptofano totale, il campione è idrolizzato in ambiente alcalino con una soluzione satura di idrossido di bario e riscaldato a 110 °C per 20 ore. A idrolisi avvenuta, viene aggiunto lo standard interno.

Per la determinazione del triptofano libero, il campione è estratto in ambiente moderatamente acido in presenza dello standard interno.

Il triptofano e lo standard interno nell’idrolizzato o nell’estratto sono determinati per HPLC per mezzo di un rivelatore a fluorescenza.

3.   Reattivi

3.1.

Usare acqua bidistillata o di qualità equivalente (conduttività < 10 μS/cm).

3.2.

Sostanza di riferimento (standard): triptofano (purezza/contenuto ≥ 99 %) essiccato sotto vuoto su pentossido di fosforo.

3.3.

Standard interno: α-metil-triptofano (purezza/contenuto ≥ 99 %) essiccato sotto vuoto su pentossido di fosforo.

3.4.

Idrossido di bario ottaidrato (prestare attenzione a non esporre eccessivamente il Ba(OH)2.8 H2O all’aria, per evitare la formazione di BaCO3, che potrebbe disturbare la determinazione) (cfr. osservazione al punto 9.3).

3.5.

Idrossido di sodio.

3.6.

Acido ortofosforico, p (p/p) = 85 %.

3.7.

Acido cloridrico, ρ20 1,19 g/ml.

3.8.

Metanolo, di qualità HPLC.

3.9.

Etere di petrolio, intervallo di ebollizione tra 40 e 60 °C.

3.10.

Soluzione di idrossido di sodio, c = 1 mol/l:

sciogliere 40,0 g di NaOH (punto 3.5) in acqua e portare a 1 litro con acqua (punto 3.1).

3.11.

Acido cloridrico, c = 6 mol/l:

prelevare 492 ml di HCl (punto 3.7) e portare a 1 litro con acqua.

3.12.

Acido cloridrico, c = 1 mol/l:

prelevare 82 ml di HCl (punto 3.7) e portare a 1 litro con acqua.

3.13.

Acido cloridrico, c = 0,1 mol/l:

prelevare 8,2 ml di HCl (punto 3.7) e portare a 1 litro con acqua.

3.14.

Acido ortofosforico, c = 0,5 mol/l:

prelevare 34 ml di acido ortofosforico (punto 3.6) e portare a 1 litro con acqua (punto 3.1).

3.15.

Soluzione concentrata di triptofano (punto 3.2), c = 2,50 μmol/ml:

n un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0,2553 g di triptofano (punto 3.2) in acido cloridrico (punto 3.13) e portare a volume con acido cloridrico (punto 3.13). Conservare a - 18 °C al massimo per 4 settimane.

3.16.

Soluzione concentrata dello standard interno, c = 2,50 μmol/ml:

in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0,2728 g di α-metil-triptofano (punto 3.3) in acido cloridrico (punto 3.13) e portare a volume con acido cloridrico (punto 3.13). Conservare a - 18 °C al massimo per 4 settimane.

3.17.

Soluzione standard di taratura di triptofano e di standard interno:

prelevare 2,00 ml di soluzione concentrata di triptofano (punto 3.15) e 2,00 ml di soluzione concentrata dello standard interno (α-metil-triptofano) (punto 3.16). Diluire con acqua (punto 3.1) e metanolo (punto 3.8) a circa lo stesso volume e a circa la stessa concentrazione di metanolo (10-30 %) dell’idrolizzato finito.

Questa soluzione deve essere preparata al momento, prima dell’uso.

Proteggere dalla luce solare diretta durante la preparazione.

3.18.

Acido acetico.

3.19.

1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo.

3.20.

Etanolammina p (p/p) > 98 %.

3.21.

Soluzione di 1 g di 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo (punto 3.19) in 100 ml di metanolo (punto 3.8).

3.22.

Fase mobile per HPLC: 3,00 g di acido acetico (punto 3.18) + 900 ml di acqua (punto 3.1) + 50,0 ml di soluzione (punto 3.21) di 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo (punto 3.19) in metanolo (punto 3.8) (1 g/100 ml); regolare il pH a 5,00 utilizzando etanolammina (punto 3.20); portare a 1 000 ml con acqua (punto 3.1).

4.   Apparecchiatura

4.1.

Apparecchiatura HPLC con rilevatore spettrofluorimetrico.

4.2.

Colonna per cromatografia liquida, 125 mm × 4 mm, C18, particelle di riempimento 3 μm, o equivalente.

4.3.

pH-metro.

4.4.

Matraccio di polipropilene, capacità 125 ml, a collo largo e coperchio a vite.

4.5.

Filtro a membrana, da 0,45 μm.

4.6.

Autoclave, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Agitatore meccanico o magnetico.

4.8.

Miscelatore Vortex.

5.   Procedura

5.1.   Preparazione dei campioni

Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all’aria a una temperatura non superiore a 50 °C o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (punto 3.9) prima di essere triturati.

5.2.   Determinazione del triptofano libero (estratto)

In una beuta pesare (con l’approssimazione di 1 mg) una quantità adeguata (1-5 g) del campione preparato (punto 5.1); aggiungere 100,0 ml di acido cloridrico (punto 3.13) e 5,00 ml di soluzione concentrata dello standard interno (punto 3.16). Agitare o mescolare per 60 minuti con un agitatore meccanico o magnetico (punto 4.7). Lasciare che si depositi il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher. Aggiungere 5 ml di acido orto-fosforico (punto 3.14). Portare il pH a 3 utilizzando idrossido di sodio (punto 3.10). Aggiungere sufficiente metanolo (punto 3.8) per ottenere una concentrazione compresa tra il 10 e il 30 % di metanolo nel volume finale. Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia (approssimativamente lo stesso volume della soluzione standard di taratura (punto 3.17)].

Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0,45 μm (punto 4.5) prima dell’iniezione nella colonna HPLC. Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Proteggere la soluzione standard e gli estratti dalla luce solare diretta. Se non è possibile analizzare gli estratti nello stesso giorno, questi devono essere conservati a 5 °C al massimo per 3 giorni.

5.3.   Determinazione del triptofano totale (idrolizzato)

Pesare (con l’approssimazione di 0,2 mg) da 0,1 a 1 g del campione preparato (punto 5.1) nel matraccio di polipropilene (punto 4.4). La porzione di campione pesata ha un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere 8,4 g di idrossido di bario (ottaidrato) (punto 3.4) e 10 ml di acqua. Miscelare con un miscelatore Vortex (punto 4.8) o con agitatore magnetico (punto 4.7). Lasciare il magnete rivestito di teflon nella miscela. Sciacquare le pareti del recipiente con 4 ml di acqua. Porre il coperchio a vite e chiudere il matraccio senza stringere. Trasferire in una autoclave (punto 4.6) con acqua bollente e lasciare esposto al vapore per 30-60 minuti. Chiudere l’autoclave e metterla in funzione a 110 (± 2) °C per 20 ore.

Prima di aprire l’autoclave, ridurre la temperatura poco al di sotto di 100 °C. Per evitare la cristallizzazione del Ba(OH)2.8 H2O, aggiungere alla miscela calda 30 ml di acqua a temperatura ambiente. Scuotere o agitare non violentemente. Aggiungere 2,00 ml di soluzione concentrata dello standard interno (α-metil-triptofano) (punto 3.16). Lasciare raffreddare i recipienti in un bagno di acqua e ghiaccio per 15 minuti.

Aggiungere quindi 5 ml di acido orto-fosforico (punto 3.14). Tenere il recipiente nel bagno di refrigerazione e neutralizzare con HCl (punto 3.11) sempre agitando; regolare quindi il pH a 3,0 utilizzando HCl (punto 3.12). Aggiungere una quantità sufficiente di metanolo per ottenere una concentrazione compresa tra 10 e 30 % di metanolo nel volume finale. Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia (ad esempio, 100 ml). L’aggiunta di metanolo non provoca precipitazione.

Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0,45 μm (punto 4.5) prima dell’iniezione nella colonna HPLC. Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Proteggere la soluzione standard e gli idrolizzati dalla luce solare diretta. Se non è possibile analizzare gli idrolizzati il giorno stesso, questi devono essere conservati a 5 °C al massimo per 3 giorni.

5.4.   Determinazione HPLC

Le seguenti condizioni di eluizione isocratica sono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti (cfr. anche osservazioni ai punti 9.1 e 9.2):

Colonna per cromatografia liquida (punto 4.2):

125 mm × 4 mm, C18, particelle di riempimento 3 μm, o equivalente

Temperatura della colonna:

temperatura ambiente

Fase mobile (punto 3.22):

3,00 g di acido acetico (punto 3.18) + 900 ml di acqua (punto 3.1) + 50,0 ml di soluzione (punto 3.21) di 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo (punto 3.19) in metanolo (punto 3.8) (1 g/100 ml); regolare il pH a 5,00 utilizzando etanolammina (punto 3.20); portare a 1 000 ml con acqua (punto 3.1)

Velocità di efflusso:

1 ml/min

Durata totale dell’eluizione:

circa 34 min

Lunghezza d’onda di rivelazione:

eccitazione: 280 nm, emissione: 356 nm

Volume di iniezione:

20 μl

6.   Calcolo dei risultati

Calcolare la quantità di triptofano (X), espressa in g per 100 g di campione, secondo la formula:

Formula

A

=

area del picco dello standard interno, soluzione standard di taratura (3.17);

B

=

area del picco del triptofano, estratto (punto 5.2) o idrolizzato (punto 5.3);

V1

=

volume in ml (2 ml) di soluzione concentrata di triptofano (punto 3.15) aggiunta alla soluzione di taratura (punto 3.17);

c

=

concentrazione in μmol/ml (= 2,50) di soluzione concentrata di triptofano (punto 3.15) aggiunta alla soluzione di taratura (punto 3.17);

V2

=

volume in ml della soluzione concentrata dello standard interno (punto 3.16) aggiunta all’estrazione (punto 5.2) (= 5,00 ml) o all’idrolizzato (punto 5.3) (= 2,00 ml);

C

=

area del picco dello standard interno, dell’estratto (punto 5.2) o dell’idrolizzato (punto 5.3);

D

=

area del picco del triptofano, soluzione standard di taratura (punto 3.17);

V3

=

volume in ml (= 2,00 ml) della soluzione concentrata dello standard interno (punto 3.16) aggiunta alla soluzione standard di taratura (punto 3.17);

m

=

peso del campione in g (corretto al peso iniziale se essiccato e/o sgrassato);

M

=

massa molare del triptofano (= 204,23 g/mol).

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni, effettuate in parallelo sullo stesso campione, non deve superare il 10 % del valore ottenuto più elevato.

8.   Risultati di uno studio collaborativo

È stato organizzato uno studio collaborativo a livello di UE (quarta intercomparazione) nel corso del quale 12 laboratori hanno analizzato tre campioni al fine di convalidare il metodo di idrolisi. Ogni campione è stato analizzato 5 volte. I risultati dello studio figurano nella tabella seguente.

 

Campione 1

Alimento per suini

Campione 2

Alimento per suini con aggiunta di L-triptofano

Campione 3

Alimento concentrato per suini

L

12

12

12

n

MEDIA [g/kg]

50

2,42

55

3,40

50

4,22

sr [g/kg]

0,05

0,05

0,08

r [g/kg]

0,14

0,14

0,22

CVr [%]

1,9

1,6

1,9

SR [g/kg]

0,15

0,20

0,09

R [g/kg]

0,42

0,56

0,25

CVR [%]

6,3

6,0

2,2

L =

numero di laboratori che hanno trasmesso risultati;

n =

numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier (valori aberranti identificati in base al test di Cochran-Dixon);

sr =

deviazione standard della ripetibilità;

SR =

deviazione standard della riproducibilità;

r =

ripetibilità;

R =

riproducibilità;

CVr =

coefficiente di variazione della ripetibilità, %;

CVR =

coefficiente di variazione della riproducibilità, %.

È stato organizzato un altro studio collaborativo a livello di UE (terza intercomparazione) nel corso del quale 13 laboratori hanno analizzato due campioni al fine di convalidare il metodo di estrazione del triptofano libero. Ogni campione è stato analizzato 5 volte. I risultati dello studio figurano nella tabella seguente.

 

Campione 4

Miscela di frumento e soia

Campione 5

Miscela di frumento e soia (= campione 4) con aggiunta di triptofano (0,457 g/kg)

L

n

12

55

12

60

MEDIA [g/kg]

0,391

0,931

sr [g/kg]

0,005

0,012

r [g/kg]

0,014

0,034

CVr [%]

1,34

1,34

SR [g/kg]

0,018

0,048

R [g/kg]

0,050

0,134

CVR [%]

4,71

5,11

L =

numero di laboratori che hanno trasmesso risultati;

n =

numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier (valori aberranti identificati in base al test di Cochran-Dixon);

sr =

deviazione standard della ripetibilità;

SR =

deviazione standard della riproducibilità;

r =

ripetibilità;

R =

riproducibilità;

CVr =

coefficiente di variazione della ripetibilità, %;

CVR =

coefficiente di variazione della riproducibilità, %.

È stato effettuato un altro studio di intercomparazione a livello di UE in cui 7 laboratori hanno analizzato quattro campioni ai fini della certificazione del triptofano per idrolisi. Più sotto sono riportati i risultati. Ogni campione è stato analizzato 5 volte.

 

Campione 1

Alimento composto per suini (CRM 117)

Campione 2

Farina di pesce a basso tenore di grassi

(CRM 118)

Campione 3

Farina di soia

(CRM 119)

Campione 4

Latte scremato in polvere

(CRM 120)

L

7

7

7

7

n

25

30

30

30

MEDIA [g/kg]

2,064

8,801

6,882

5,236

sr [g/kg]

0,021

0,101

0,089

0,040

r [g/kg]

0,059

0,283

0,249

0,112

CVr [%]

1,04

1,15

1,30

0,76

SR [g/kg]

0,031

0,413

0,283

0,221

R [g/kg]

0,087

1,156

0,792

0,619

CVR [%]

1,48

4,69

4,11

4,22

L =

numero di laboratori che hanno trasmesso risultati;

n =

numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier (valori aberranti identificati in base al test di Cochran-Dixon);

sr =

deviazione standard della ripetibilità;

SR =

deviazione standard della riproducibilità;

r =

ripetibilità;

R =

riproducibilità;

CVr =

coefficiente di variazione della ripetibilità, %;

CVR =

coefficiente di variazione della riproducibilità, %.

9.   Osservazioni

9.1.

Speciali condizioni cromatografiche consentono una migliore separazione tra triptofano e α-metil-triptofano.

Eluizione isocratica seguita da pulitura della colonna a gradiente:

Colonna per cromatografia liquida:

125 mm × 4 mm, C18, particelle di riempimento 5 μm, o equivalente

Temperatura della colonna:

32 °C

Fase mobile:

0,01 mol/l KH2PO4/metanolo, 95 + 5 (V + V)

B: Metanolo

Programma del gradiente:

0 min 100 % A

0 % B

15 min 100 % A

0 % B

17 min 60 % A

40 % B

19 min 60 % A

40 % B

21 min 100 % A

0 % B

33 min 100 % A

0 % B

Velocità di efflusso:

1,2 ml/min

Durata totale dell’eluizione:

circa 33 min

9.2.

La cromatografia varierà a seconda del tipo di HPLC e di materiale di riempimento utilizzati. Il sistema scelto deve permettere una completa separazione dei picchi del triptofano e dello standard interno. Inoltre è importante che i prodotti di degradazione siano nettamente separati dal triptofano e dallo standard interno. Vanno fatti passare idrolizzati senza standard interno in modo da verificare l’assenza di impurità sulla linea di base sotto lo standard interno. È importante che il tempo di eluizione sia sufficientemente lungo da consentire l’eluizione di tutti i prodotti di degradazione; in caso contrario gli ultimi picchi di eluizione possono interferire con le operazioni cromatografiche successive.

Nell’intervallo operativo, il sistema cromatografico dà una risposta lineare. Tale risposta è misurata a una concentrazione costante (concentrazione normale) dello standard interno e a concentrazioni variabili di triptofano. È importante che le altezze dei picchi del triptofano e dello standard interno si situino nell’intervallo lineare del sistema HPLC/fluorescenza. Se il picco o i picchi del triptofano e/o dello standard interno sono troppo bassi o troppo alti, l’analisi viene ripetuta con altre dimensioni del campione e/o un volume finale modificato.

9.3.   Idrossido di bario

Con il tempo, l’idrossido di bario si scioglie con maggiore difficoltà. Ciò causa una soluzione torbida per la determinazione HPLC, che può produrre bassi valori per il triptofano.

G.   DETERMINAZIONE DEGLI OLI E DEI GRASSI GREGGI

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di oli e grassi greggi negli alimenti per animali.

L’applicazione delle due procedure sotto descritte dipende dalla natura e dalla composizione dell’alimento, nonché dalla ragione per cui si esegue l’analisi.

Per la determinazione degli oli e dei grassi greggi nei semi e nei frutti oleaginosi nonché negli alimenti per animali il cui tenore di oli/grassi greggi è superiore al 15 %, l’estrazione deve essere effettuata secondo la procedura A e la riestrazione secondo la procedura B (punto 5.3).

1.1.   Procedura A - Oli e grassi greggi estraibili direttamente

Il metodo è applicabile alle materie prime per alimenti per animali di origine vegetale, fatta eccezione per quelle alle quali si applica la procedura B.

1.2.   Procedura B - Oli e grassi greggi totali

Il metodo è applicabile alle materie prime per alimenti per animali di origine animale e a tutti gli alimenti composti. Esso deve essere usato per tutte le materie prime dalle quali gli oli e i grassi non possono essere completamente estratti senza idrolisi preliminare, ad esempio il glutine, i lieviti, le proteine di patata e i prodotti che sono stati sottoposti a procedimenti quali l’estrusione, la fioccatura e il riscaldamento.

1.3.   Interpretazione dei risultati

Se il valore ottenuto con la procedura B è più elevato di quello ottenuto con la procedura A, si considera valore reale il risultato ottenuto con la procedura B.

2.   Principio

2.1.   Procedura A

Il campione è estratto con etere di petrolio. Il solvente è eliminato per distillazione e il residuo è essiccato e pesato.

2.2.   Procedura B

Il campione è trattato a caldo con acido cloridrico. La miscela è raffreddata e filtrata. Dopo essere stato lavato ed essiccato, il residuo è sottoposto all’analisi secondo la procedura A.

3.   Reattivi

3.1.

Etere di petrolio, intervallo di ebollizione tra 40 e 60 °C. L’indice di bromo deve essere inferiore a 1 e il residuo all’evaporazione inferiore a 2 mg/100 ml.

3.2.

Solfato di sodio, anidro.

3.3.

Acido cloridrico, c = 3 mol/l.

3.4.

Coadiuvante di filtrazione, ad esempio farina fossile, Hyflo-supercel.

4.   Apparecchiatura

4.1.

Dispositivo di estrazione. Se l’apparecchio è munito di un sifone (apparecchio di Soxhlet), la portata del riflusso è regolata in modo da ottenere almeno 10 cicli l’ora; se si tratta di un apparecchio senza sifone, il liquido rifluisce in quantità pari a circa 10 ml al minuto.

4.2.

Ditali da estrazione, esenti da sostanze solubili nell’etere di petrolio, la cui porosità sia compatibile con le prescrizioni di cui al punto 4.1.

4.3.

Stufa per essiccazione a vuoto a 75 ± 3 °C o a pressione atmosferica a 100 ± 3 °C.

5.   Procedura

5.1.   Procedura A (cfr. punto 8.1)

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 5 g del campione; introdurli in un ditale da estrazione (punto 4.2) e coprire con un tampone di cotone sgrassato.

Porre il ditale in un estrattore (punto 4.1) ed estrarre per sei ore con etere di petrolio (punto 3.1). Raccogliere l’estratto in un pallone asciutto e tarato, contenente frammenti di pietra pomice (6).

Eliminare il solvente per distillazione. Essiccare il residuo introducendo il pallone in una stufa per essiccazione (punto 4.3), lasciandovelo per un’ora e mezza. Lasciar raffreddare in essiccatore e pesare. Essiccare una seconda volta per 30 minuti, onde assicurarsi che il peso degli oli e dei grassi rimanga costante (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 1 mg).

5.2.   Procedura B

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 2,5 g del campione (cfr. punto 8.2); introdurli in un becher da 400 ml o in una beuta da 300 ml e aggiungere 100 ml di acido cloridrico (punto 3.3) e qualche frammento di pietra pomice. Ricoprire il becher con un vetro di orologio o applicare sulla beuta un refrigerante a ricadere. Portare la miscela a lenta ebollizione su piccola fiamma o su piastra riscaldante e lasciarvela per un’ora. Evitare che la sostanza aderisca alle pareti del recipiente.

Raffreddare e aggiungere una quantità di un coadiuvante di filtrazione (punto 3.4) sufficiente a evitare qualsiasi perdita di olio o grasso durante la filtrazione stessa. Filtrare su un doppio filtro di carta bagnato, esente da materie grasse. Lavare il residuo con acqua fredda fino a reazione neutra del filtrato. Verificare che il filtrato non contenga oli o grassi. La loro presenza nel filtrato indica che, prima dell’idrolisi, deve essere effettuata un’estrazione del campione con etere di petrolio, secondo la procedura A.

Porre il doppio filtro con il residuo su un vetro di orologio ed essiccare per un’ora e mezza nella stufa a pressione atmosferica (punto 4.3) a 100 ± 3 °C.

Introdurre il doppio filtro contenente il residuo secco in un ditale da estrazione (punto 4.2) e coprire con un tampone di cotone sgrassato. Porre il ditale in un estrattore (punto 4.1) e operare come indicato al punto 5.1, secondo e terzo capoverso.

5.3.   Procedura A e riestrazione secondo la procedura B

Per la determinazione degli oli e dei grassi greggi nei semi e nei frutti oleaginosi nonché negli alimenti per animali il cui tenore di oli/grassi greggi è superiore al 15 %, l’estrazione deve essere effettuata secondo la procedura A e la riestrazione secondo la procedura B.

Ciò significa che, dopo l’estrazione con etere di petrolio (procedura A), il residuo o una parte del residuo è sottoposto a riestrazione con acido cloridrico (procedura B). Il tenore di oli e grassi greggi è ottenuto sommando i risultati delle procedure A e B.

6.   Espressione dei risultati

Esprimere il risultato della pesata del residuo in percentuale del campione.

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione dallo stesso analista non supera:

lo 0,2 % in valore assoluto, per i contenuti di oli e grassi greggi inferiori al 5 %;

il 4,0 % del valore ottenuto più elevato, per i contenuti compresi fra 5 e 10 %;

lo 0,4 % in valore assoluto, per i contenuti superiori al 10 %.

8.   Osservazioni

8.1.

Per i prodotti a elevato tenore di oli e grassi, difficili da macinare o non appropriati per il prelevamento di una piccola quantità omogenea, procedere nel modo che segue.

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 20 g di campione e mescolarli con 10 g o più di solfato di sodio anidro (punto 3.2). Procedere all’estrazione con etere di petrolio (punto 3.1) come indicato al punto 5.1. Portare l’estratto ottenuto al volume di 500 ml con etere di petrolio (punto 3.1) e mescolare. Introdurre 50 ml della soluzione in un palloncino asciutto, contenente qualche frammento di pietra pomice, e tarato. Eliminare il solvente per distillazione, essiccare e proseguire come indicato al punto 5.1, ultimo capoverso.

Eliminare il solvente dal residuo di estrazione che si trova nel ditale, macinare il residuo alla finezza di 1 mm, porlo nuovamente nel ditale (non aggiungere solfato di sodio) e proseguire come indicato al punto 5.1, secondo e terzo capoverso.

Il tenore di oli e grassi greggi, espresso in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula:

Formula

dove:

m1

=

peso, in grammi, del residuo della prima estrazione (aliquota dell’estratto);

m2

=

peso, in grammi, del residuo della seconda estrazione.

8.2.

Per alcuni prodotti (ad esempio prodotti poveri di oli e grassi) il campione può essere più grande.

8.3.

Gli alimenti per animali da compagnia contenenti un elevato tenore d’acqua possono rendere necessaria l’aggiunta di solfato di sodio anidro prima dell’idrolisi e dell’estrazione secondo la procedura B.

8.4.

Nella procedura descritta al punto 5.2 potrebbe rivelarsi più efficace usare acqua calda, invece che fredda, per lavare il residuo dopo la filtrazione.

8.5.

Per alcuni alimenti per animali il tempo di essiccazione (1,5 ore) deve essere prolungato; tuttavia è evitato un tempo di essiccazione eccessivo, che potrebbe dare scarsi risultati. È possibile usare altresì un forno a microonde.

H.   DETERMINAZIONE DELLA CELLULOSA GREZZA

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare negli alimenti per animali le sostanze organiche esenti da grasso, insolubili in ambiente acido e in ambiente alcalino, convenzionalmente designate con il nome di cellulosa grezza.

Il metodo non è applicabile nel caso della lignocellulosa e del carbone vegetale (particelle troppo fini).

2.   Principio

Il campione, eventualmente sgrassato, è trattato successivamente con soluzioni bollenti di acido solforico e di idrossido di potassio di determinate concentrazioni. Il residuo è separato per filtrazione su vetro sinterizzato, lavato, essiccato, pesato e incenerito a 475-500 °C. La perdita di peso conseguente all’incenerimento corrisponde alla cellulosa grezza della quantità di prodotto sottoposta all’analisi.

3.   Reattivi

3.1.

Acido solforico, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Agente antischiuma (ad esempio, n-ottanolo).

3.3.

Coadiuvante della filtrazione (Celite 545 o equivalente), riscaldato a 500 °C per quattro ore (8.6).

3.4.

Acetone.

3.5.

Etere di petrolio, intervallo di ebollizione tra 40 e 60 °C.

3.6.

Acido cloridrico, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Soluzione di idrossido di potassio, c = 0,23 mol/l.

4.   Apparecchiatura

4.1.

Unità riscaldante per la mineralizzazione con soluzioni di acido solforico e di idrossido di potassio, dotata di supporto per crogiolo filtrante (punto 4.2) e di un tubo di uscita con valvola di svuotamento e a vuoto, eventualmente con aria compressa. Prima dell’uso quotidiano preriscaldare per cinque minuti l’unità con acqua bollente.

4.2.

Crogiolo filtrante in vetro con filtro in vetro sinterizzato, dimensione dei pori: 40-90 μm. Prima della messa in uso, riscaldare a 500 °C per alcuni minuti e raffreddare (punto 8.6).

4.3.

Cilindro da almeno 270 ml con refrigerante a ricadere, adatto all’ebollizione.

4.4.

Stufa per essiccazione con termostato.

4.5.

Forno a muffola con termostato.

4.6.

Unità per estrazione consistente in una piastra di supporto per il crogiolo filtrante (punto 4.2) e in un tubo di scarico con valvola di svuotamento e a vuoto.

4.7.

Anelli di giunzione per assemblare l’unità riscaldante (punto 4.1), il crogiolo (punto 4.2) e il cilindro (punto 4.3) e per collegare l’unità di estrazione a freddo (punto 4.6) e il crogiolo.

5.   Procedura

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 1 g del campione preparato e introdurlo nel crogiolo (punto 4.2) (cfr. osservazioni ai punti 9.1, 9.2 e 9.3) e aggiungere 1 g di coadiuvante di filtrazione (punto 3.3).

Assemblare l’unità riscaldante (punto 4.1) e il crogiolo filtrante (punto 4.2), quindi applicare il cilindro (punto 4.3) al crogiolo. Versare 150 ml di acido solforico bollente (punto 3.1) nel cilindro e crogiolo assemblati e, se necessario, aggiungere qualche goccia di agente antischiuma (punto 3.2).

Portare il liquido all’ebollizione in 5 ± 2 minuti e lasciar bollire vivacemente per esattamente 30 minuti.

Posizionare la valvola verso il tubo di scarico (punto 4.1) e, sotto vuoto, filtrare l’acido solforico attraverso il crogiolo filtrante e sciacquare il residuo tre volte con 30 ml di acqua bollente ciascuna, controllando che il residuo sia filtrato a secco dopo ogni risciacquo.

Richiudere la valvola di svuotamento e versare 150 ml di soluzione di idrossido di potassio bollente (punto 3.7) nel cilindro e nel crogiolo assemblati e aggiungere qualche goccia di agente antischiuma (punto 3.2). Portare il liquido all’ebollizione entro 5 ± 2 minuti e lasciar bollire vivacemente per esattamente 30 minuti. Filtrare e ripetere la procedura di risciacquo applicata all’acido solforico.

Dopo il risciacquo finale e l’essiccazione, staccare il crogiolo e il suo contenuto e ricollegarlo all’unità di estrazione a freddo (punto 4.6). Applicare il vuoto e sciacquare il residuo nel crogiolo tre volte con 25 ml di acetone ciascuna (punto 3.4) assicurandosi che il residuo sia filtrato a secco dopo ogni lavaggio.

Essiccare il crogiolo nella stufa a 130 °C fino a cessazione della diminuzione di massa. Dopo ogni essiccazione lasciar raffreddare nell’essiccatore e pesare rapidamente. Introdurre quindi il crogiolo nel forno a muffola e incenerire fino a peso costante (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 2 mg) a una temperatura compresa tra 475 e 500 °C per almeno 30 minuti.

Dopo ciascun riscaldamento, lasciar raffreddare in un primo momento nel forno, poi nell’essiccatore e pesare.

Procedere a una prova in bianco in assenza del campione. La perdita di peso conseguente all’incenerimento non deve essere superiore a 4 mg.

6.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di cellulosa grezza, in percentuale del campione, è dato dalla seguente espressione:

Formula

dove:

m

=

peso del campione, in grammi;

m0

=

perdita di peso conseguente all’incenerimento nel corso della determinazione, in grammi;

m1

=

perdita di peso conseguente all’incenerimento nel corso della prova in bianco, in grammi.

7.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:

lo 0,6 % in valore assoluto, per i contenuti di cellulosa grezza inferiori al 10 %;

il 6 % del valore più elevato, per i contenuti di cellulosa grezza uguali o superiori al 10 %.

8.   Riproducibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione in laboratori distinti non deve superare:

l’1,0 % in valore assoluto, per i contenuti di cellulosa grezza inferiori al 10 %;

il 10 % del valore più elevato, per i contenuti di cellulosa grezza uguali o superiori al 10 %.

9.   Osservazioni

9.1.

Gli alimenti per animali che contengono più del 10 % di grassi greggi debbono essere sgrassati prima dell’analisi con etere di petrolio (punto 3.5). Collegare il crogiolo filtrante (punto 4.2) e il suo contenuto all’unità di estrazione a freddo (punto 4.6), applicare il vuoto e sciacquare il residuo tre volte con 30 ml di etere di petrolio ciascuna, assicurandosi che il residuo sia secco. Collegare il crogiolo e il suo contenuto all’unità riscaldante (punto 4.1) e proseguire come indicato al punto 5.

9.2.

Gli alimenti per animali contenenti grassi che non possono essere estratti direttamente con etere di petrolio (punto 3.5) vanno sgrassati una prima volta come descritto al punto 8.1 e una seconda volta dopo ebollizione con l’acido. Dopo l’ebollizione con acido e i successivi lavaggi, collegare il crogiolo e il suo contenuto all’unità di estrazione a freddo (punto 4.6), lavare tre volte con 30 ml di acetone e rilavare altre tre volte con 30 ml di etere di petrolio. Filtrare sotto vuoto fino a completa essiccazione e continuare l’analisi secondo le indicazioni fornite al punto 5, iniziando con il trattamento con idrossido di potassio.

9.3.

Se l’alimento contiene più del 5 % di carbonati, espressi in carbonato di calcio, collegare il crogiolo (punto 4.2) con il campione pesato all’unità riscaldante (punto 4.1). Lavare il campione tre volte con 30 ml di acido cloridrico (punto 3.6). Dopo ogni aggiunta lasciare riposare il campione per circa un minuto prima di filtrarlo. Risciacquare una volta con 30 ml di acqua e proseguire come descritto al punto 5.

9.4.

Se l’apparecchio utilizzato è composto da più crogioli collegati alla stessa unità riscaldante, non eseguire due prove sullo stesso campione nella stessa serie.

9.5.

Se, dopo la bollitura, il filtraggio delle soluzioni acida e basica risulta difficile, iniettare aria compressa nel tubo di scarico dell’unità riscaldante e continuare a filtrare.

9.6.

La temperatura d’incenerimento non supera i 500 °C in modo da prolungare la durata dei crogioli filtranti in vetro. Vanno evitati possibili effetti da shock termico eccessivo durante i cicli di riscaldamento e di raffreddamento.

I.   DETERMINAZIONE DEGLI ZUCCHERI

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto in zuccheri riduttori e in zuccheri totali dopo inversione, espressi in glucosio o, se del caso, in saccarosio, per conversione mediante fattore 0,95. Il metodo è applicabile agli alimenti composti. Particolari metodi sono previsti per altri alimenti. All’occorrenza si doserà separatamente il lattosio e se ne terrà conto nel calcolo dei risultati.

Questo metodo deve essere utilizzato per determinare il contenuto di zuccheri da utilizzare nel calcolo del valore energetico dell’alimento per animali.

Nel caso in cui il contenuto di zuccheri debba essere determinato per altri scopi, possono essere utilizzati altri metodi di analisi.

2.   Principio

Gli zuccheri presenti sono sciolti nell’etanolo diluito; la soluzione è chiarificata con soluzioni di Carrez I e II. Dopo l’eliminazione dell’etanolo, le determinazioni sono effettuate, prima e dopo l’inversione, secondo il metodo di Luff-Schoorl.

3.   Reattivi

3.1.

Soluzione di etanolo al 40 % (v/v), densità: 0,948 g/ml a 20 °C, neutralizzato alla fenolftaleina.

3.2.

Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco Zn (CH3 COO)2 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml con acqua.

3.3.

Soluzione di Carrez II: sciogliere in acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio K4 Fe (CN)6 3H2O. Portare a 100 ml con acqua.

3.4.

Soluzione allo 0,1 % (p/v) di metilarancio.

3.5.

Acido cloridrico, 4 mol/l.

3.6.

Acido cloridrico, 0,1 mol/l.

3.7.

Soluzione di idrossido di sodio, 0,1 mol/l.

3.8.

Reattivo di Luff-Schoorl:

aggiungere, agitando prudentemente, la soluzione di acido citrico (punto 3.8.2) alla soluzione di carbonato di sodio (punto 3.8.3). Aggiungere quindi la soluzione di solfato di rame (punto 3.8.1) e portare a 1 litro con acqua. Lasciar riposare una notte e filtrare.

Controllare la concentrazione del reattivo così ottenuto (Cu 0,05 mol/l; NA2 CO3 1 mol/l), cfr. punto 5.4, ultimo capoverso. Il pH della soluzione è circa 9,4.

3.8.1.

Soluzione di solfato di rame: sciogliere 25 g di solfato di rame, Cu SO4 5H2O, esente da ferro, in 100 ml d’acqua.

3.8.2.

Soluzione di acido citrico: sciogliere 50 g di acido citrico, C6H8O7•H2O, in 50 ml d’acqua.

3.8.3.

Soluzione di carbonato di sodio: sciogliere 143,8 g di carbonato di sodio anidro in circa 300 ml d’acqua calda. Lasciar raffreddare.

3.9.

Soluzione di tiosolfato di sodio, 0,1 mol/l.

3.10.

Soluzione d’amido: aggiungere una miscela di 5 g d’amido solubile in 30 ml d’acqua a 1 litro d’acqua bollente. Far bollire per tre minuti, lasciar raffreddare, aggiungere eventualmente, come conservante, 10 mg di ioduro di mercurio.

3.11.

Acido solforico (punto 3 mol/l).

3.12.

Soluzione al 30 % (p/v) di ioduro di potassio.

3.13.

Granuli di pietra pomice bolliti nell’acido cloridrico, lavati in acqua ed essiccati.

3.14.

3-metilbutano-1-olo.

4.   Apparecchiatura

Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto.

5.   Procedura

5.1.   Estrazione del campione

Introdurre 2,5 g di sostanza, pesata con l’approssimazione di 1 mg, in un pallone tarato da 250 ml. Aggiungere 200 ml di etanolo (punto 3.1) e far girare il pallone per un’ora nell’agitatore rotativo. Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I (punto 3.2) e agitare per circa 30 secondi. Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II (punto 3.3) e agitare nuovamente per un minuto. Portare a volume con etanolo (punto 3.1), omogeneizzare e filtrare. Prelevare 200 ml del filtrato ed evaporare circa la metà del volume allo scopo di eliminare la maggior parte dell’etanolo. Trasferire quantitativamente il residuo d’evaporazione mediante acqua calda in un pallone tarato da 200 ml, raffreddare, portare a volume con acqua, omogeneizzare e filtrare, se necessario. Questa soluzione sarà utilizzata per la determinazione degli zuccheri riduttori e, dopo inversione, per la determinazione degli zuccheri totali.

5.2.   Determinazione degli zuccheri riduttori

Con una pipetta prelevare un volume di soluzione non superiore a 25 ml e contenente meno di 60 mg di zuccheri riduttori, espressi in glucosio. Se necessario, portare a 25 ml con acqua distillata e determinare il contenuto in zuccheri riduttori secondo il metodo di Luff-Schoorl. Il risultato è espresso in percentuale di glucosio presente nel campione.

5.3.   Determinazione degli zuccheri totali dopo inversione

Con una pipetta prelevare 50 ml della soluzione e introdurli in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere qualche goccia di soluzione di metilarancio (punto 3.4), poi, con molta attenzione, e sempre agitando, aggiungere acido cloridrico (punto 3.5) fino a ottenere un viraggio nettamente al rosso. Aggiungere 15 ml di acido cloridrico (punto 3.6), immergere il pallone per trenta minuti in bagnomaria a forte ebollizione e lasciarvelo per trenta minuti. Raffreddare rapidamente alla temperatura di circa 20 °C e aggiungere 15 ml di soluzione di idrossido di sodio (punto 3.7). Portare a 100 ml con acqua e omogeneizzare. Prelevare un volume non superiore a 25 ml e contenente meno di 60 mg di zuccheri riduttori, espressi in glucosio. Se necessario, portare a 25 ml con acqua distillata e determinare il contenuto in zuccheri riduttori secondo il metodo di Luff-Schoorl. Esprimere il risultato in percentuale di glucosio, o se del caso, di saccarosio moltiplicando per il fattore 0,95.

5.4.   Titolazione secondo il metodo di Luff-Schoorl

Con una pipetta prelevare 25 ml del reattivo di Luff-Schoorl (punto 3.8) e introdurlo in un erlenmeyer da 300 ml; aggiungere 25 ml esatti della soluzione zuccherina chiarificata. Dopo aver aggiunto 2 granuli di pietra pomice (punto 3.13) riscaldare, agitando a mano, su fiamma libera di altezza media e portare il liquido a ebollizione in circa due minuti. Trasferire immediatamente l’erlenmeyer su una tela metallica provvista di uno schermo d’amianto con un foro del diametro di circa 6 cm, sotto la quale è stata preventivamente accesa una fiamma. Questa è regolata in modo tale che venga riscaldato soltanto il fondo dell’erlenmeyer. Adattare sull’erlenmeyer un refrigerante a ricadere. A decorrere da questo momento far bollire per dieci minuti esatti. Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa cinque minuti titolare nel modo seguente.

Aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (punto 3.12) e, subito dopo, con molta attenzione (a causa del rischio di formazione di abbondante schiuma), 25 ml di acido solforico (punto 3.11). Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio (punto 3.9) sino all’apparire di una colorazione giallo opaco, aggiungere l’indicatore all’amido (punto 3.10) e terminare la titolazione.

Effettuare la stessa titolazione su di una miscela, esattamente misurata, di 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl (punto 3.8) e 25 ml d’acqua, dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (punto 3.12) e 25 ml di acido solforico (punto 3.11) senza portare a ebollizione.

6.   Calcolo dei risultati

Stabilire, a mezzo della tabella, la quantità (in mg) di glucosio corrispondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni, espressi in ml di tiosolfato di sodio 0,1 mol/l. Esprimere il risultato in percentuale del campione.

7.   Procedure speciali

7.1.

Per gli alimenti molto ricchi di melasso e altri alimenti poco omogenei, pesare 20 g e introdurli con 500 ml d’acqua in un pallone tarato da 1 litro. Far girare nell’agitatore rotativo per un’ora. Chiarificare con le soluzioni di Carrez I (punto 3.2) e Carrez II (punto 3.3) come descritto al punto 5.1, utilizzando tuttavia una quantità quattro volte più elevata di ciascun reattivo. Portare a volume con etanolo all’80 % (v/v).

Omogeneizzare e filtrare. Eliminare l’etanolo come descritto al punto 5.1. In assenza di amido destrinizzato, portare a volume con acqua distillata.

7.2.

Per i melassi e le materie prime per alimenti, ricchi in zuccheri e praticamente esenti da amido (carrube, fettucce essiccate di barbabietole ecc.), pesare 5 g, introdurli in un pallone tarato da 250 ml, aggiungere 200 ml di acqua distillata e far girare nell’agitatore rotativo per un’ora o più, se necessario. Chiarificare con le soluzioni di Carrez I (punto 3.2) e Carrez II (punto 3.3), come descritto al punto 5.1. Portare a volume con acqua fredda, omogeneizzare e filtrare. Per la determinazione degli zuccheri totali, procedere come descritto al punto 5.3.

8.   Osservazioni

8.1.

È consigliabile aggiungere circa 1 ml di 3-metilbutan-1-olo (punto 3.14) (senza tener conto del volume), prima dell’ebollizione con il reattivo di Luff-Schoorl, onde evitare la formazione di schiuma.

8.2.

La differenza tra il contenuto di zuccheri totali dopo l’inversione, espressi in glucosio, e il contenuto di zuccheri riduttori, sempre espressi in glucosio, moltiplicata per il fattore 0,95, dà il contenuto in percentuale di saccarosio.

8.3.

Per la determinazione del contenuto di zuccheri riduttori, a esclusione del lattosio, possono essere applicati due metodi.

8.3.1.

Per un calcolo approssimativo si moltiplica per 0,675 il contenuto di lattosio stabilito con un metodo d’analisi diverso e si detrae il risultato ottenuto dal contenuto di zuccheri riduttori.

8.3.2.

Per un calcolo esatto degli zuccheri riduttori, fatta eccezione del lattosio, è necessario partire dallo stesso campione per le due determinazioni finali. Una delle analisi è effettuata su una parte della soluzione ottenuta conformemente alla procedura di cui al punto 5.1, l’altra su una parte della soluzione ottenuta durante la determinazione del lattosio, secondo il metodo previsto a tal fine (dopo la fermentazione degli altri tipi di zuccheri e la chiarificazione).

In entrambi i casi, la quantità di zucchero presente è determinata secondo il metodo di Luff-Schoorl e calcolata in mg di glucosio. Uno dei valori è detratto dall’altro e la differenza è espressa in percentuale del campione.

Esempio

Le due quantità prelevate corrispondono, per ciascuna analisi, a un campione di 250 mg.

Nel primo caso si consumano 17 ml di una soluzione di tiosolfato di sodio di 0,1 mol/l, corrispondenti a 44,2 mg di glucosio, nel secondo 11 ml, corrispondenti a 27,6 mg di glucosio.

La differenza è di 16,6 mg di glucosio.

Il contenuto in zuccheri riduttori (eccettuato il lattosio), calcolato in glucosio, è pertanto:

Formula

Tabella dei valori per 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl

ml di Na2 S2 O3 0,1 mol/l, due minuti di riscaldamento, dieci minuti di ebollizione

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

Glucosio, fruttosio, zuccheri invertiti

C6 H12 O6

Lattosio

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

ml

mg

differenza

mg

differenza

ml

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,4

2,5

2,5

2,5

2,5

2,6

2,6

2,6

2,6

2,7

2,7

2,7

2,8

2,8

2,9

2,9

2,9

3,0

3,0

3,1

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,8

3,8

3,8

3,8

3,8

3,8

3,9

3,9

3,9

4,0

4,0

4,1

4,1

4,1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

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23

J.   DETERMINAZIONE DEL LATTOSIO

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di lattosio negli alimenti per animali che ne contengono più dello 0,5 %.

2.   Principio

Gli zuccheri sono disciolti nell’acqua. La soluzione è sottoposta a fermentazione con il lievito Saccharomyces cerevisiae che lascia intatto il lattosio. Dopo chiarificazione e filtrazione il contenuto in lattosio del filtrato è determinato con il metodo di Luff-Schoorl.

3.   Reattivi

3.1.

Sospensione di Saccharomyces cerevisiae: porre in sospensione 25 g di lievito fresco in 100 ml di acqua. La sospensione si conserva in frigorifero al massimo per una settimana.

3.2.

Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco Zn (CH3 COO)2 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml con acqua.

3.3.

Soluzione di Carrez II: sciogliere in acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio K4 Fe (CN)6 3H2O. Portare a 100 ml con acqua.

3.4.

Reattivo di Luff-Schoorl:

versare, agitando sempre lentamente, la soluzione di acido citrico (punto 3.4.2) nella soluzione di carbonato di sodio (punto 3.4.3). Aggiungere la soluzione di solfato di rame (punto 3.4.1) e portare a 1 litro con acqua. Lasciar riposare una notte e filtrare. Controllare la concentrazione del reattivo così ottenuto (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Il pH della soluzione è circa 9,4.

3.4.1.

Soluzione di solfato di rame: sciogliere 25 g di solfato di rame Cu SO4 5H2O, esente da ferro, in 100 ml d’acqua.

3.4.2.

Soluzione di acido citrico: sciogliere 50 g di acido citrico C6H8O7•H2O in 50 ml d’acqua.

3.4.3.

Soluzione di carbonato di sodio: sciogliere 143,8 g di carbonato di sodio anidro in circa 300 ml d’acqua calda. Lasciar raffreddare.

3.5.

Granuli di pietra pomice bolliti nell’acido cloridrico, lavati in acqua ed essiccati.

3.6.

Soluzione al 30 % (p/v) di ioduro di potassio.

3.7.

Acido solforico (punto 3 mol/l).

3.8.

Soluzione di tiosolfato di sodio (0,1 mol/l).

3.9.

Soluzione d’amido: aggiungere una miscela di 5 g d’amido solubile in 30 ml d’acqua a 1 litro d’acqua bollente. Far bollire per tre minuti, lasciar raffreddare e aggiungere eventualmente, come conservante, 10 mg di ioduro di mercurio.

4.   Apparecchiatura

Bagnomaria con termostato regolato a 38-40 °C.

5.   Procedura

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere 25-30 ml d’acqua. Porre il pallone per trenta minuti in un bagnomaria bollente e lasciarlo poi raffreddare a circa 35 °C. Aggiungere 5 ml di sospensione di lievito (punto 3.1) e omogeneizzare. Lasciar riposare il pallone per due ore in un bagnomaria, a una temperatura di 38-40 °C. Raffreddare quindi sino a circa 20 °C.

Aggiungere 2,5 ml di soluzione di Carrez I (punto 3.2) e agitare per trenta secondi; aggiungere poi 2,5 ml di soluzione di Carrez II (punto 3.3) e agitare nuovamente per trenta secondi. Portare a 100 ml con acqua, mescolare e filtrare. Prelevare con la pipetta un quantitativo di filtrato non eccedente i 25 ml e contenente preferibilmente da 40 a 80 mg di lattosio; porlo quindi in un erlenmeyer da 300 ml. Se necessario portare a 25 ml con acqua.

Procedere nello stesso modo a una prova in bianco con 5 ml di sospensione di lievito (punto 3.1). Determinare il contenuto di lattosio secondo il metodo di Luff-Schoorl come segue: aggiungere 25 ml esatti del reattivo di Luff-Schoorl (punto 3.4) e due granuli di pietra pomice (punto 3.5). Riscaldare agitando a mano su una fiamma libera di media altezza e portare il liquido all’ebollizione in circa due minuti. Trasferire immediatamente l’erlenmeyer su una tela metallica provvista di uno schermo d’amianto con un foro del diametro di circa 6 cm, sotto la quale è stata preventivamente accesa una fiamma. Questa è regolata in modo tale che venga riscaldato soltanto il fondo dell’erlenmeyer. Adattare sull’erlenmeyer un refrigerante a ricadere. A decorrere da questo momento far bollire per dieci minuti esatti. Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa cinque minuti titolare nel modo seguente.

Aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio (punto 3.6) e, subito dopo, con molta attenzione (a causa del rischio di formazione di abbondante schiuma), 25 ml di acido solforico (punto 3.7). Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio (punto 3.8) sino all’apparire di una colorazione giallo opaco, aggiungere l’indicatore all’amido (punto 3.9) e terminare la titolazione.

Effettuare la stessa titolazione su di una miscela, esattamente misurata, di 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl (punto 3.4) e 25 ml d’acqua, dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio punto (punto 3.6) e 25 ml di acido solforico (punto 3.7) senza portare a ebollizione.

6.   Calcolo dei risultati

Stabilire, a mezzo della tabella allegata, la quantità di lattosio in mg corrispondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni, espressi in ml di tiosolfato di sodio 0,1 mol/l.

Esprimere il risultato del lattosio anidro in percentuale del campione.

7.   Osservazione

1.

Per i prodotti contenenti più del 40 % di zuccheri fermentescibili, utilizzare più di 5 ml di sospensione di lievito (punto 3.1).

2.

Negli alimenti a «ridotto tenore di lattosio» (ad esempio latte per gatti), il lattosio è convertito in fruttosio, che non fermenta completamente entro 2 ore; questo risulta in valori più elevati o falsi positivi (a causa dei residui di fruttosio che rimangono nell’estratto).

Tabella dei valori per 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl

ml di Na2 S2 O3 0,1 mol/l, due minuti di riscaldamento, dieci minuti di ebollizione

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

Glucosio, fruttosio, zuccheri invertiti

C6 H12 O6

Lattosio

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

ml

mg

differenza

mg

differenza

ml

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,4

2,5

2,5

2,5

2,5

2,6

2,6

2,6

2,6

2,7

2,7

2,7

2,8

2,8

2,9

2,9

2,9

3,0

3,0

3,1

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,7

3,8

3,8

3,8

3,8

3,8

3,8

3,9

3,9

3,9

4,0

4,0

4,1

4,1

4,1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

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15

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K.   DETERMINAZIONE DELL’AMIDO

METODO POLARIMETRICO

1.   Finalità e campo di applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto in amido e in prodotti di degradazione dell’amido ad alto peso molecolare negli alimenti per animali, al fine di controllarne la conformità al valore energetico dichiarato (disposizioni di cui all’allegato VII) e al regolamento (CE) n. 767/2009.

Questo metodo deve essere utilizzato per determinare il contenuto di amido da utilizzare nel calcolo del valore energetico dell’alimento per animali.

Nel caso in cui il contenuto di amido debba essere determinato per altri scopi, possono essere utilizzati altri metodi di analisi.

2.   Principio

Il metodo prevede due determinazioni. Nella prima, il campione è trattato con acido cloridrico diluito. Dopo chiarificazione e filtrazione si misura per polarimetria il potere rotatorio della soluzione.

Nella seconda, il campione viene estratto con etanolo al 40 %. Dopo acidificazione del filtrato con acido cloridrico, chiarificazione e filtrazione, si misura il potere rotatorio come nella prima determinazione.

La differenza tra le due misure, moltiplicata per un fattore noto, dà il contenuto in amido del campione.

3.   Reattivi

3.1.

Acido cloridrico, soluzione al 25 % (p/p), densità: 1,126 g/ml.

3.2.

Acido cloridrico, soluzione all’1,13 % (p/v).

La concentrazione deve essere verificata per titolazione mediante una soluzione di idrossido di sodio 0,1 mol/l in presenza di rosso di metile allo 0,1 % (p/v) in etanolo al 94 % (v/v). Per la neutralizzazione di 10 ml, sono necessari 30,94 ml di NaOH 0,1 mol/l.

3.3.

Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco Zn (CH3 COO)2 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml con acqua.

3.4.

Soluzione di Carrez II: sciogliere in acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio K4 Fe(CN)6 3H2O. Portare a 100 ml con acqua.

3.5.

Soluzione di etanolo al 40 % (v/v), densità: 0,948 g/ml a 20 °C.

4.   Apparecchiatura

4.1.

Erlenmeyer da 250 ml a cono normalizzato con collo smerigliato, con refrigerante a ricadere.

4.2.

Polarimetro o saccarimetro.

5.   Procedura

5.1.   Preparazione del campione

Macinare il campione in modo che passi tutto attraverso un setaccio a maglie rotonde di 0,5 mm di diametro.

5.2.   Determinazione del potere rotatorio totale (P o S) (cfr. osservazione al punto 7.1)

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 2,5 g del campione macinato e introdurli in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere 25 ml di acido cloridrico (punto 3.2), agitare per ottenere una buona ripartizione della sostanza e aggiungere altri 25 ml di acido cloridrico (punto 3.2). Immergere il pallone in bagnomaria bollente, agitando energicamente e regolarmente per i primi tre minuti allo scopo di evitare la formazione di grumi. La quantità d’acqua del bagnomaria deve essere sufficiente per mantenere l’ebollizione quando vi è immerso il pallone. Quest’ultimo non può essere tolto dal bagnomaria durante l’agitazione. Dopo 15 minuti esatti togliere il pallone dal bagnomaria, aggiungere 30 ml d’acqua fredda e raffreddare immediatamente sino a 20 °C.

Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I (punto 3.3) e agitare per circa 30 secondi. Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II (punto 3.4) e agitare nuovamente per circa 30 secondi. Portare a volume con acqua, mescolare e filtrare. Se il filtrato non è perfettamente limpido (caso poco frequente), ripetere l’analisi usando una maggiore quantità di soluzioni di Carrez I e II, ad esempio 10 ml.

Misurare quindi il potere rotatorio della soluzione, in un tubo da 200 mm, con un polarimetro o un saccarimetro.

5.3.   Determinazione del potere rotatorio (P’ o S’) delle sostanze solubili in etanolo al 40 %

Pesare, con l’approssimazione di 1 mg, 5 g del campione, introdurli in un pallone tarato da 100 ml e aggiungere circa 80 ml di etanolo (punto 3.5) (cfr. osservazione al punto 7.2). Lasciar riposare il pallone per 1 ora a temperatura ambiente; durante questo intervallo agitarlo energicamente sei volte in modo che la sostanza sia ben mescolata con l’etanolo. Portare quindi a volume con etanolo (punto 3.5), mescolare e filtrare.

Pipettare 50 ml del filtrato (corrispondenti a 2,5 g del campione) in un erlenmeyer da 250 ml, aggiungere 2,1 ml di acido cloridrico (punto 3.1) e agitare energicamente. Applicare un refrigerante a ricadere sull’erlenmeyer e immergerlo in bagnomaria bollente. Dopo 15 minuti esatti ritirare l’erlenmeyer dal bagno, travasarne il contenuto in un pallone tarato da 100 ml, sciacquando con un po’ di acqua fredda, e raffreddare sino a 20 °C.

Chiarificare quindi con le soluzioni di Carrez I (punto 3.3) e II (punto 3.4), portare a volume con acqua, mescolare, filtrare e misurare il potere rotatorio come indicato al punto 5.2, secondo e terzo capoverso.

6.   Calcolo dei risultati

Il contenuto di amido (in %) è calcolato come segue:

6.1.   Misurazioni effettuate con il polarimetro

Formula

P

=

potere rotatorio totale in gradi d’arco;

P’

=

potere rotatorio in gradi d’arco delle sostanze solubili nell’etanolo al 40 % (v/v);

Formula

=

potere rotatorio specifico dell’amido puro. I valori numerici comunemente accettati per tale fattore sono i seguenti:

+ 185,9°

:

amido di riso;

+ 185,7°

:

fecola di patate;

+ 184,6°

:

amido di mais;

+ 182,7°

:

amido di frumento;

+ 181,5°

:

amido d’orzo;

+ 181,3°

:

amido d’avena;

+ 184,0°

:

altri tipi di amido e miscele di amido negli alimenti composti.

6.2.   Misurazioni effettuate con il saccarimetro

Formula

S

=

potere rotatorio totale in gradi saccarimetrici;

S’

=

potere rotatorio in gradi saccarimetrici delle sostanze solubili nell’etanolo al 40 % (v/v);

N

=

peso (in g) del saccarosio in 100 ml di acqua che dà un potere rotatorio di 100 gradi saccarimetrici misurati con un tubo di 200 mm:

16,29 g per i saccarimetri francesi;

26,00 g per i saccarimetri tedeschi;

20,00 g per i saccarimetri misti.

Formula

=

potere rotatorio specifico dell’amido puro (cfr. 6.1).

6.3.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare 0,4 in valore assoluto, per i contenuti di amido inferiori al 40 %, e l’1 % in valore relativo, per i contenuti di amido uguali o superiori al 40 %.

7.   Osservazioni

7.1.

Se il campione contiene più del 6 % di carbonati, espressi in carbonato di calcio, prima di determinare il potere rotatorio totale essi vanno distrutti per trattamento con l’esatta quantità necessaria di acido solforico diluito.

7.2.