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Document 32016R0266

Regolamento (UE) 2016/266 della Commissione, del 7 dicembre 2015, recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (Testo rilevante ai fini del SEE)

C/2015/8529

OJ L 54, 1.3.2016, p. 1–446 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2016/266/oj

1.3.2016   

IT

Gazzetta ufficiale dell'Unione europea

L 54/1


REGOLAMENTO (UE) 2016/266 DELLA COMMISSIONE

del 7 dicembre 2015

recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH)

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE EUROPEA,

visto il trattato sul funzionamento dell'Unione europea,

visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un'Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l'articolo 13, paragrafo 2,

considerando quanto segue:

(1)

Il regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione (2) istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l'ecotossicità delle sostanze chimiche applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006.

(2)

È necessario aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi in via prioritaria nuovi e aggiornati metodi di prova adottati di recente dall'OCSE), per tener conto del progresso tecnico e ridurre il numero di animali usati a scopi di sperimentazione, conformemente alla direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio (3). Le parti interessate sono state consultate in merito alla proposta.

(3)

L'adeguamento contiene 20 metodi di prova, ossia un nuovo metodo per la determinazione di una proprietà fisico-chimica, undici nuovi metodi di prova e tre metodi di prova aggiornati per la valutazione dell'ecotossicità, e cinque nuovi metodi di prova per valutare il destino e il comportamento ambientale.

(4)

È opportuno pertanto modificare di conseguenza il regolamento (CE) n. 440/2008.

(5)

Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato di cui all'articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è modificato conformemente all'allegato del presente regolamento.

Articolo 2

Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, il 7 dicembre 2015

Per la Commissione

Il presidente

Jean-Claude JUNCKER


(1)  GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1.

(2)  Regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione, del 30 maggio 2008, che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1).

(3)  Direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33).


ALLEGATO

L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato:

(1)

È inserita una nota all'inizio dell'allegato, prima della parte A:

«Nota:

prima di utilizzare uno dei metodi di prova descritti di seguito per testare una sostanza multicostituente (MCS), una sostanza di composizione sconosciuta o variabile, il prodotto di una reazione complessa o di origine biologica (UVCB) o una miscela e qualora l'applicabilità del metodo di prova per le sostanze MCS, UVCB o le miscele non sia stata descritta nel rispettivo metodo di prova, è opportuno chiedersi se il metodo sia adeguato per fornire risultati scientificamente validi e pertinenti ai fini regolamentari previsti.

Se il metodo di prova è utilizzato per testare una sostanza MCS o UVCB o una miscela, è necessario rendere disponibili, nella misura del possibile, informazioni sufficienti sulla sua composizione, ad esempio tramite l'identità chimica dei costituenti, le loro proporzioni quantitative e le loro proprietà specifiche.»

(2)

È aggiunto il capitolo A.24:

«

A.24.   COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (N-OTTANOLO/ACQUA), METODO DELLA CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (HPLC)

INTRODUZIONE

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE n. 117 (2004).

1.

Il coefficiente di ripartizione (P) è definito come il rapporto tra le concentrazioni all'equilibrio di una sostanza disciolta in un sistema a due fasi costituito da due solventi pressoché immiscibili. Nel caso del n-ottanolo e dell'acqua:

Formula

Il coefficiente di ripartizione è adimensionale poiché è il quoziente di due concentrazioni, e viene generalmente espresso sotto forma del suo logaritmo decimale.

2.

Pow è un parametro chiave negli studi sul destino ambientale delle sostanze chimiche. È stata dimostrata l'esistenza di una relazione altamente significativa tra il Pow delle sostanze in forma non ionizzata e il loro bioaccumulo nei pesci. È stato inoltre dimostrato che il Pow è un parametro utile nella previsione dell'assorbimento nel terreno e nei sedimenti, nonché per stabilire relazioni quantitative struttura-attività per un'ampia gamma di effetti biologici.

3.

La proposta originaria del presente metodo di prova si basava su un articolo di C.V. Eadsforth and P. Moser (1). Lo sviluppo del metodo di prova e l'esecuzione di una prova comparativa tra laboratori OCSE sono stati coordinati dall'Umweltbundesamt (Agenzia federale per l'ambiente) della Repubblica federale di Germania nel 1986 (2).

CONSIDERAZIONI INIZIALI

4.

I valori log Pow nell'intervallo da – 2 a 4 (talora fino a 5 e oltre) (1) possono essere determinati sperimentalmente utilizzando il metodo Shake-Flask (capitolo A.8 del presente allegato, linea guida dell'OCSE n. 107). Il metodo HPLC si applica per log Pow nell'intervallo da 0 a 6 (1)(2)(3)(4)(5). Questo metodo può richiedere una stima di Pow per l'assegnazione di sostanze di riferimento adeguate e l'avallo delle conclusioni tratte dai risultati della prova. I metodi di calcolo sono discussi brevemente nell'Appendice del presente metodo di prova. La modalità operativa del metodo HPLC è in isocratica.

5.

I valori di Pow dipendono dalle condizioni ambientali quali la temperatura, il pH, la forza ionica, ecc., queste dovrebbero essere definite nell'esperimento ai fini di una corretta interpretazione dei dati Pow. Per le sostanze ionizzabili potrebbe rendersi disponibile, ed essere utilizzato in alternativa, un altro metodo (ad esempio, il metodo pH-metrico per le sostanze ionizzate (6) descritto nel progetto di linea guida OCSE). Sebbene questo progetto di linea guida OCSE possa essere appropriato per determinare il Pow per tali sostanze ionizzabili, in alcuni casi è più opportuno utilizzare il metodo HPLC a un pH pertinente dal punto di vista ambientale (cfr. paragrafo 9).

PRINCIPIO DELLA PROVA

6.

Il metodo HPLC a fase inversa è condotto su colonne analitiche impaccate con una fase solida disponibile in commercio contenente idrocarburi a catena lunga (ad esempio C8, C18) chimicamente legati su silice.

7.

Una sostanza chimica iniettata su una colonna di questo tipo si riparte tra la fase mobile del solvente e la fase stazionaria idrocarburica man mano che viene trasportata lungo la colonna dalla fase mobile. Le sostanze sono ritenute in proporzione al loro coefficiente di ripartizione idrocarburo-acqua con le sostanze idrofile eluite per prime e quelle lipofile per ultime. Il tempo di ritenzione è descritto dal fattore di capacità k dato dalla seguente espressione:

Formula

dove tR è il tempo di ritenzione della sostanza in esame e t0 è il tempo morto, ossia il tempo medio necessario perché una molecola di solvente passi attraverso la colonna. Non sono richiesti metodi analitici quantitativi ed è necessaria solo la determinazione dei tempi di ritenzione.

8.

Il coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua di una sostanza in esame può essere calcolato sperimentalmente determinando il suo fattore di capacità k e quindi inserendo k nella seguente equazione:

Formula

dove

a, b

=

coefficienti di regressione lineare.

L'equazione riportata sopra può essere ottenuta mediante la regressione lineare del logaritmo dei coefficienti di ripartizione ottanolo/acqua delle sostanze di riferimento rispetto al logaritmo dei fattori di capacità delle sostanze di riferimento.

9.

Il metodo HPLC a fase inversa consente di ottenere la stima dei coefficienti di ripartizione nell'intervallo del log Pow compreso tra 0 e 6, ma tale intervallo può essere esteso in casi eccezionali tra 6 e 10. Ciò può richiedere la modifica della fase mobile (3). Il metodo non è applicabile a basi e acidi forti, complessi metallici, sostanze che reagiscono con l'eluente o tensioattivi. È possibile effettuare misurazioni sulle sostanze ionizzabili nella loro forma non ionizzata (acido libero o base libera) unicamente utilizzando un tampone appropriato con un pH inferiore al pKa per un acido libero o superiore al pKa per una base libera. Il metodo pH-metrico per l'esecuzione di prove sulle sostanze ionizzabili (6) potrebbe diventare disponibile ed essere utilizzato come metodo alternativo (6). Se il valore di log Pow è determinato ai fini della classificazione dei pericoli per l'ambiente o della valutazione del rischio ambientale, la prova va eseguita nell'intervallo di pH pertinente per l'ambiente naturale, ossia con un pH compreso tra 5 e 9.

10.

In alcuni casi la presenza di impurità può complicare l'interpretazione dei risultati a causa delle incertezze nell'assegnazione dei picchi. Per le miscele che risultano in una banda non risolta, si devono indicare i limiti superiore e inferiore di log Pow e l'area percentuale di ciascun picco di log Pow. Per le miscele costituite da un gruppo di omologhi, è necessario indicare anche la media ponderata del log Pow (7), calcolata sulla base dei singoli valori Pow e i corrispondenti valori percentuali dell'area di picco (8). Tutti i picchi che contribuiscono a un'area del 5 % o più dell'area totale di picco devono essere presi in considerazione nel calcolo (9):

Formula

La media ponderata del log Pow è valida solo per le sostanze o le miscele (ad esempio, il tallolio) costituite da omologhi (ad esempio, serie di alcani). Le misurazioni delle miscele possono restituire risultati significativi, a condizione che il rivelatore analitico utilizzato abbia la stessa sensibilità verso tutte le sostanze della miscela e che esse possano essere adeguatamente risolte.

INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME

11.

La costante di dissociazione, la formula di struttura e la solubilità nella fase mobile devono essere note prima di utilizzare il metodo. Inoltre, sarebbe utile disporre delle informazioni sull'idrolisi.

CRITERI DI QUALITÀ

12.

Per aumentare l'affidabilità della misurazione, le determinazioni devono essere eseguite in duplicato.

Ripetibilità: il valore di log Pow ottenuto da miswurazioni ripetute effettuate nelle stesse condizioni e utilizzando lo stesso gruppo di sostanze di riferimento deve essere nell'intervallo di ± 0,1 unità logaritmiche.

Riproducibilità: se le misurazioni sono ripetute con un altro gruppo di sostanze di riferimento, i risultati possono differire. In genere, il coefficiente di correlazione R per la relazione tra log k e log Pow per un gruppo di sostanze in esame è di circa 0,9, valore corrispondente a un coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua del log Pow di ± 0,5 unità logaritmiche.

13.

La prova comparativa interlaboratorio ha mostrato che, con il metodo HPLC, i valori di log Pow possono essere ottenuti entro ± 0,5 unità dei valori ottenibili con il metodo Shake-Flask (2). In letteratura è possibile trovare altre comparazioni (4)(5)(10)(11)(12). I risultati più accurati si ottengono con grafici di correlazione basati su sostanze di riferimento aventi una struttura simile (13).

SOSTANZE DI RIFERIMENTO

14.

Al fine di correlare il fattore di capacità misurato k di una sostanza con il relativo Pow, è necessario tracciare un grafico di taratura utilizzando almeno 6 punti (cfr. paragrafo 24). E' compito dell'utilizzatore selezionare le sostanze di riferimento appropriate. Le sostanze di riferimento normalmente devono avere valori di log Pow comprendenti il log Pow della sostanza in esame; per esempio, almeno una sostanza di riferimento deve avere un Pow superiore a quello della sostanza in esame e un'altra sostanza di riferimento deve avere un Pow inferiore a quello della sostanza in esame. L'estrapolazione va utilizzata unicamente in casi eccezionali. È preferibile che tali sostanze di riferimento siano strutturalmente simili alla sostanza in esame. I valori di log Pow delle sostanze di riferimento utilizzati per la taratura devono essere basati su dati sperimentali attendibili. Tuttavia, per le sostanze con un log Pow elevato (generalmente superiore a 4), è possibile utilizzare valori calcolati, a meno che non si disponga di dati sperimentali attendibili. Se si utilizzano valori estrapolati, è necessario specificare un valore limite.

15.

Sono disponibili lunghi elenchi di valori di log Pow per molti gruppi di sostanze chimiche (14)(15). Se non sono disponibili dati sui coefficienti di ripartizione di sostanze strutturalmente simili, si può usare una taratura più generale basata su altre sostanze di riferimento. Nella tabella 1 sono elencate le sostanze di riferimento consigliate e i rispettivi valori di Pow. Per le sostanze ionizzabili, i valori forniti si applicano alla forma non ionizzata. L'attendibilità e la qualità dei valori sono state verificate durante la prova comparativa interlaboratorio.

Tabella 1

Sostanze di riferimento raccomandate

 

Numero CAS

Sostanza di riferimento

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanone

(metiletilchetone)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetilpiridina

0,5

 

3

62-53-3

Anilina

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilide

1,0

 

5

100-51-6

alcole benzilico

1,1

 

6

150-76-5

4-metossifenolo

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

acido fenossiacetico

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenolo

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenolo

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

benzonitrile

1,6

 

11

140-29-4

fenilacetonitrile

1,6

 

12

589-18-4

alcole 4-metilbenzilico

1,6

 

13

98-86-2

acetofenone

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenolo

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

acido 3-nitrobenzoico

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-cloroanilina

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

nitrobenzene

1,9

 

18

104-54-1

alcole cinnamilico

(alcole cinnamico)

1,9

 

19

65-85-0

acido benzoico

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-cresolo

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

acido cinnamico

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisolo

2,1

 

23

93-58-3

benzoato di metile

2,1

 

24

71-43-2

Benzene

2,1

 

25

99-04-7

acido 3-metilbenzoico

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-clorofenolo

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

tricloroetilene

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazina

2,6

 

29

93-89-0

benzoato di etile

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diclorobenzonitrile

2,6

 

31

535-80-8

acido 3-clorobenzoico

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluene

2,7

 

33

90-15-3

1-naftolo

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dicloroanilina

2,8

 

35

108-90-7

clorobenzene

2,8

 

36

1746-13-0

allilfenil etere

2,9

 

37

108-86-1

bromobenzene

3,0

 

38

100-41-4

Etilbenzene

3,2

 

39

119-61-9

benzofenone

3,2

 

40

92-69-3

4-fenilfenolo

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timolo

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diclorobenzene

3,4

 

43

122-39-4

difenilammina

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalene

3,6

 

45

93-99-2

benzoato di fenile

3,6

 

46

98-82-8

isopropilbenzene

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-triclorofenolo

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenil

4,0

 

49

120-51-4

benzoato di benzile

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sec-butilfenolo

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triclorobenzene

4,2

 

52

143-07-7

acido dodecanoico

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difeniletere

4,2

 

54

85-01-8

Fenantrene

4,5

 

55

104-51-8

n-butilbenzene

4,6

 

56

103-29-7

Dibenzile

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenilpiridina

4,9

 

58

206-44-0

Fluorantene

5,1

 

59

603-34-9

trifenilammina

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

DESCRIZIONE DEL METODO

Stima preliminare del coefficiente di ripartizione

16.

Se necessario, è possibile stimare il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame, preferibilmente ricorrendo a un metodo di calcolo (cfr. Appendice) o, se del caso, utilizzando il rapporto della solubilità della sostanza in esame nei solventi puri.

Apparecchiatura

17.

È richiesto un cromatografo in fase liquida dotato di pompa a bassi impulsi e di un sistema di rivelazione adeguato. Un rivelatore UV, che utilizza una lunghezza d'onda di 210 nm, o un rivelatore RI sono applicabili ad un'ampia gamma di gruppi chimici. La presenza di gruppi polari nella fase stazionaria può compromettere gravemente le prestazioni della colonna HPLC. Pertanto, le fasi stazionarie devono contenere una percentuale minima di gruppi polari (16). Si possono usare riempimenti commerciali a fase inversa a microparticelle o colonne preimpaccate. Si può posizionare una colonna di protezione tra il sistema di iniezione e la colonna analitica.

Fase mobile

18.

Per preparare il solvente di eluizione, che viene degassato prima dell'uso, si utilizzano il metanolo per HPLC e l'acqua distillata o deionizzata. Si consiglia di optare per l'eluizione isocratica. Si devono usare rapporti metanolo/acqua con un contenuto minimo di acqua del 25 %. Normalmente, una miscela metanolo/acqua 3:1 (v/v) è soddisfacente per eluire sostanze aventi un log P pari a 6 in un'ora ad una portata di 1 ml/min. Per le sostanze con un log P superiore a 6 può essere necessario abbreviare il tempo di eluizione (e quello delle sostanze di riferimento) diminuendo la polarità della fase mobile oppure la lunghezza della colonna.

19.

La sostanza in esame e le sostanze di riferimento devono essere solubili nella fase mobile, in concentrazione sufficiente a consentirne la rilevazione. Solo in casi eccezionali si possono usare degli additivi con la miscela metanolo-acqua perché modificano le proprietà della colonna. In questi casi è necessario accertarsi che i tempi di ritenzione delle sostanze in esame e delle sostanze di riferimento non siano influenzati. Se la miscela metanolo-acqua non è appropriata, si possono usare altre miscele solvente organico-acqua, per esempio etanolo-acqua, acetonitrile-acqua o alcole isopropilico (2-propanolo)-acqua.

20.

Il pH dell'eluente è un fattore critico per le sostanze ionizzabili. Esso deve rientrare nell'intervallo operativo di pH della colonna, che di solito è compreso tra 2 e 8. Si raccomanda di tamponare la soluzione. Occorre aver cura di evitare la precipitazione di sali e il deterioramento della colonna che si verificano con alcune miscele di fase organica/tampone. Le misurazioni mediante HPLC con fasi stazionarie a base di silice al di sopra di pH 8 non sono generalmente consigliabili perché l'uso di una fase mobile alcalina può provocare un rapido deterioramento delle prestazioni della colonna.

Soluti

21.

Le sostanze in esame e di riferimento devono essere sufficientemente pure per poter assegnare i picchi nei cromatogrammi alle rispettive sostanze. Le sostanze da usare a scopo di prova o di taratura devono, se possibile, essere disciolte nella fase mobile. Se si utilizza un solvente diverso dalla fase mobile per sciogliere le sostanze in esame e di riferimento, è necessario utilizzare la fase mobile per la diluizione finale prima dell'iniezione.

Condizioni sperimentali

22.

Durante la misura le variazioni della temperatura non devono essere superiori a ± 1 °C.

Determinazione del tempo morto to

23.

Il tempo morto t0 può essere misurato utilizzando sostanze organiche non ritenute (ad esempio tiourea o formammide). Un tempo morto più preciso può essere ottenuto dai tempi di ritenzione misurati o da una successione di circa 7 elementi di una serie omologa (ad esempio, n-alchilmetilchetoni) (17). I tempi di ritenzione tR (nC+ 1) sono tracciati in funzione di tR (nC), dove nC è il numero di atomi di carbonio. Si ottiene una retta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, dove A, che rappresenta k(nC + 1)/k(nC), è costante. Il tempo morto t0 è ottenuto dall'intercetta (1 – A)t0 e dal coefficiente angolare A.

Equazione di regressione

24.

La fase successiva consiste nel tracciare un log di correlazione k in funzione di un log P per le sostanze di riferimento appropriate con valori di log P simili al valore previsto per la sostanza in esame. In pratica, sono iniettate simultaneamente da 6 a 10 sostanze di riferimento. La determinazione dei tempi di ritenzione è effettuata preferibilmente con un registratore-integratore collegato al sistema di rivelazione. I logaritmi corrispondenti dei fattori di capacità, log k, sono tracciati come una funzione di log P. L'equazione di regressione viene eseguita a intervalli regolari, almeno una volta al giorno, in modo da tenere conto di eventuali variazioni delle prestazioni della colonna.

DETERMINAZIONE DEL POW DELLA SOSTANZA IN ESAME

25.

La sostanza in esame è iniettata nelle più piccole quantità rilevabili. Il tempo di ritenzione viene determinato in duplicato. Il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame è ottenuto mediante interpolazione del fattore di capacità calcolato sul grafico di taratura. Per coefficienti di ripartizione molto bassi o molto elevati è necessario ricorrere all'estrapolazione. In particolare in questi casi bisogna prestare attenzione ai limiti di confidenza della retta di regressione. Se il tempo di ritenzione del campione è al di fuori dell'intervallo dei tempi di ritenzione ottenuti per gli standard, è necessario specificare un valore limite.

DATI E RELAZIONE

Relazione sulla prova

26.

La relazione deve includere i seguenti elementi:

la stima preliminare del coefficiente di ripartizione (se determinata), i valori stimati e il metodo utilizzato; se è stato utilizzato un metodo di calcolo, la descrizione completa dello stesso, ivi incluse l'identificazione della base dati e informazioni dettagliate sulla scelta dei frammenti;

le sostanze in esame e di riferimento: la purezza, la formula di struttura e il numero CAS;

la descrizione dell'apparecchiatura e delle condizioni operative: la colonna analitica e la colonna di protezione;

la fase mobile, i mezzi di rilevamento, l'intervallo di temperatura, il pH;

i profili di eluizione (cromatogrammi);

il tempo morto e come è stato misurato;

i dati di ritenzione e i valori di log Pow desunti dalla letteratura per le sostanze di riferimento usate nella taratura;

i dettagli sulla retta di regressione stimata (log k in rapporto a log Pow) e il coefficiente di correlazione della retta, compresi gli intervalli di confidenza;

i dati di ritenzione media e il valore interpolato di log Pow per la sostanza in esame;

nel caso di una miscela: il cromatogramma del profilo di eluizione con indicazione dei valori soglia;

i valori di log Pow in relazione all'area percentuale del picco del log Pow;

il calcolo mediante il ricorso a una retta di regressione;

la media ponderata dei valori di log Pow calcolati, se pertinente.

BIBLIOGRAFIA

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459-1475.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Aggiornamento della linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 107 — Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361-386.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pestic. Sci. 17, 311-325.

(4)

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Appendice

Metodi di calcolo del POW

INTRODUZIONE

1.

Quest'appendice fornisce una breve introduzione al calcolo del Pow. Per ulteriori informazioni, si rimanda il lettore ai libri di testo (1)(2).

2.

I valori calcolati del Pow sono utilizzati per:

decidere a quale metodo sperimentale ricorrere: il metodo Shake-Flask per un log Pow compreso tra -2 e 4 e il metodo HPLC per un log Pow tra 0 e 6;

selezionare le condizioni da utilizzare con HPLC (sostanze di riferimento, rapporto metanolo/acqua);

verificare l'attendibilità dei valori ottenuti mediante i metodi sperimentali;

fornire una stima quando non è possibile applicare i metodi sperimentali.

Principio dei metodi di calcolo

3.

I metodi di calcolo suggeriti nel presente documento sono basati sulla frammentazione teorica della molecola in sottostrutture adatte per le quali sono noti incrementi di log Pow affidabili. Il log Pow è ottenuto sommando i valori dei frammenti e i termini di correzione per le interazioni intramolecolari. Sono disponibili elenchi delle costanti di frammento e dei termini di correzione (1)(2)(3)(4)(5)(6). Alcuni di questi vengono regolarmente aggiornati (3).

Affidabilità dei valori calcolati

4.

In generale, l'affidabilità dei metodi di calcolo diminuisce con l'aumentare della complessità della sostanza in esame. Nel caso di molecole semplici di basso peso molecolare e con uno o due gruppi funzionali, ci si può attendere una deviazione da 0,1 a 0,3 unità di log Pow tra i risultati dei differenti metodi di frammentazione e i valori misurati. Il margine di errore dipende dall'affidabilità delle costanti di frammento utilizzate, dalla capacità di riconoscere le interazioni intramolecolari (ad esempio, i legami idrogeno) e dall'uso corretto dei termini di correzione. Nel caso delle sostanze ionizzanti, è necessario tenere conto della carica e del grado di ionizzazione (10).

Metodo Fujita-Hansch π

5.

La costante del sostituente idrofobo, π, introdotta originariamente da Fujita et al. (7), è definita come:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

dove PhX è un derivato aromatico e PhH la sostanza madre.

ad esempio

πCl

= log Pow (C6H5Cl) — log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

Il metodo π è interessante soprattutto per le sostanze aromatiche. Sono disponibili i valori π per un gran numero di sostituenti (4)(5).

Metodo di Rekker

6.

Con il metodo di Rekker (8) il valore log Pow è calcolato nel modo seguente:

Formula

dove ai è il numero di volte che un dato frammento si presenta nella molecola e fi è l'incremento log Pow del frammento. I termini di interazione possono essere espressi come multiplo intero di una costante singola Cm (la cosiddetta “costante magica”). Le costanti di frammento fi e Cm sono state ricavate da un elenco di 1 054 valori sperimentali di Pow di 825 sostanze utilizzando l'analisi di regressione multipla (6)(8). La determinazione dei termini di interazione viene eseguita secondo regole fisse (6)(8)(9).

Metodo di Hansch-Leo

7.

Con il metodo di Hansch e Leo (4) il valore log Pow è calcolato nel modo seguente:

Formula

dove fi è la costante di frammento, Fj è il termine (fattore) di correzione e ai e bj indicano la corrispondente frequenza con cui si presentano. Un elenco di valori di frammento costituiti da atomi e gruppi e un elenco di termini di correzione Fj sono stati ottenuti per approssimazioni successive derivandoli da valori sperimentali di Pow. I termini di correzione sono stati suddivisi in varie differenti classi (1) (4). Sono stati sviluppati pacchetti software per tenere conto di tutte le regole e di tutti i termini di correzione (3).

METODO COMBINATO

8.

Il calcolo del log Pow di molecole complesse può essere migliorato considerevolmente se la molecola viene divisa in sottostrutture più grandi per le quali sono disponibili valori affidabili di log Pow, ottenuti da tabelle (3) (4) o da misurazioni esistenti. Tali frammenti (ad esempio sostanze eterocicliche, antrachinone, azobenzene) possono essere poi combinati con i valori π di Hansch o con le costanti di frammento di Rekker o Leo.

Osservazioni

i)

I metodi di calcolo sono applicabili unicamente a sostanze parzialmente o completamente ionizzate quando vengono presi in considerazione i fattori di correzione necessari.

ii)

Se si può assumere la presenza di legami idrogeno intramolecolari, è necessario aggiungere i corrispondenti termini di correzione (approssimativamente da + 0,6 a + 1,0 unità di log Pow) (1). Indicazioni della presenza di tali legami possono essere ottenute da modelli tridimensionali o da dati spettroscopici.

iii)

Se sono possibili varie forme tautomere, si deve assumere come base di calcolo la forma più probabile.

iv)

Bisogna seguire con attenzione le revisioni degli elenchi delle costanti di frammento.

BIBLIOGRAFIA SUI METODI DI CALCOLO

(1)

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(10)

R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, pag. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

»

(3)

Il capitolo C.3. è sostituito dal seguente:

«

C.3.   ALGHE DI ACQUA DOLCE E CIANOBATTERI, PROVA DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 201 (2006; rettifica dell'allegato nel 2011). La revisione del metodo, nata dall'esigenza di includere nuove specie e aggiornarlo affinché soddisfi i requisiti relativi alla valutazione dei pericoli e alla classificazione delle sostanze chimiche, è stata effettuata sulla base di un'ampia esperienza pratica, del progresso scientifico nel settore degli studi di tossicità sulle alghe e di una estesa prassi normativa messa in atto fin dall'adozione del metodo iniziale.

2.

L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.

PRINCIPIO DELLA PROVA

3.

La presente prova è finalizzata a determinare gli effetti di una sostanza chimica sulla crescita di microalghe di acqua dolce e/o cianobatteri. Gli organismi sperimentali in fase di crescita esponenziale sono esposti alla sostanza chimica in esame in colture batch per un periodo che dura normalmente 72 ore. Nonostante la durata relativamente breve della prova è possibile valutare gli effetti su diverse generazioni.

4.

La risposta del sistema consiste nella riduzione della crescita in una serie di colture di alghe (unità di prova) esposte a varie concentrazioni della sostanza chimica in esame. La risposta è valutata come funzione della concentrazione di esposizione rispetto alla crescita media di colture di controllo identiche non esposte (repliche). Per ottenere l'espressione completa della risposta del sistema agli effetti tossici (sensibilità ottimale), le colture sono poste in condizioni idonee a una crescita esponenziale senza limitazioni, fornendo una quantità sufficiente di nutrienti e un'illuminazione continua per un periodo sufficiente a misurare la riduzione del tasso di crescita specifico.

5.

La crescita e l'inibizione della crescita sono quantificate attraverso misurazioni della biomassa delle alghe in funzione del tempo. La biomassa delle alghe è espressa in peso secco per volume, per esempio mg di alghe per litro di soluzione di prova. Dato tuttavia che è difficile misurare il peso secco, si ricorre a parametri alternativi, quali il conteggio delle cellule, che è quello più utilizzato, il volume cellulare, la fluorescenza, la densità ottica ecc. Il fattore di conversione del parametro alternativo misurato in biomassa deve essere noto.

6.

L'endpoint della prova è l'inibizione della crescita, espressa come l'aumento logaritmico della biomassa (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A partire dai tassi di crescita specifici medi registrati in una serie di soluzioni di prova si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del tasso di crescita (per esempio 50 %), espressa come ErCx (per esempio ErC50).

7.

Un'altra variabile di risposta considerata nel presente metodo è il rendimento, che può essere necessario utilizzare per soddisfare requisiti normativi specifici di alcuni paesi. È definito come la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e la biomassa all'inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del rendimento (per esempio 50 %), espressa come EyCx (per esempio EyC50).

8.

Si possono inoltre determinare mediante un calcolo statistico la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).

INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME

9.

Le informazioni sulla sostanza chimica in esame che possono essere utili per stabilire le condizioni sperimentali comprendono la formula strutturale, la purezza, la stabilità alla luce, la stabilità alle condizioni sperimentali, le proprietà di assorbimento della luce, la pKa e i risultati degli studi di trasformazione, inclusa la biodegradabilità nell'acqua.

10.

Occorre conoscere l'idrosolubilità, il coefficiente di partizione ottanolo/acqua (Pow) e la pressione di vapore della sostanza chimica in esame e disporre di un metodo convalidato per la quantificazione della sostanza chimica nelle soluzioni di prova, metodo di cui devono essere noti l'efficienza di recupero e il limite di rilevamento.

VALIDITÀ DELLA PROVA

11.

Affinché la prova sia valida devono essere soddisfatti i criteri di esecuzione seguenti:

l'aumento esponenziale della biomassa nelle colture di controllo deve essere di un fattore almeno pari a 16 nell'arco delle 72 ore del periodo sperimentale. Questo valore corrisponde a un tasso di crescita specifico di 0,92/giorno– 1. Nelle specie più utilizzate il tasso di crescita è di solito assai più alto (cfr. appendice 2). Questo criterio può non essere rispettato quando si utilizzano specie che crescono più lentamente di quelle elencate nell'appendice 2, nel qual caso occorre prolungare la prova per ottenere un fattore di moltiplicazione della crescita almeno pari a 16 nelle colture di controllo, assicurandosi che la crescita sia esponenziale per tutta la prova. La durata può essere ridotta fino a un minimo di 48 ore per mantenere una crescita esponenziale senza limitazioni durante la prova, a condizione che sia raggiunto il fattore minimo di moltiplicazione 16;

il coefficiente medio di variazione dei tassi specifici di crescita in ogni sezione della prova (giorni 0-1, 1-2 e 2-3, per le prove di 72 ore) nelle colture di controllo (cfr. la voce “coefficiente di variazione” nell'appendice 1) non deve essere superiore a 35 %. Per il calcolo del tasso di crescita specifico per sezione, si veda il paragrafo 49. Questo criterio si applica al valore medio dei coefficienti di variazione calcolato per le repliche delle colture di controllo;

il coefficiente di variazione dei tassi di crescita specifici medi durante l'intero periodo di prova nelle repliche delle colture di controllo non deve superare il 7 % nelle prove con Pseudokirchneriella subcapitata e Desmodesmus subspicatus. Per altre specie utilizzate con minore frequenza questo valore non deve superare il 10 %.

SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO

12.

La procedura sperimentale può essere verificata saggiando una o più sostanze chimiche di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (1). Anche il dicromato di potassio può essere utilizzato come sostanza chimica di riferimento per le alghe verdi. È preferibile effettuare una prova con una sostanza chimica di riferimento almeno due volte all'anno.

APPLICABILITÀ DELLA PROVA

13.

Il presente metodo di prova si presta soprattutto per le sostanze chimiche idrosolubili le quali, alle condizioni sperimentali, con tutta probabilità permangono nell'acqua. Per saggiare sostanze chimiche volatili, fortemente adsorbenti, colorate, a bassa idrosolubilità oppure sostanze chimiche che possono influire sulla disponibilità dei nutrienti o dei minerali nel mezzo di prova, possono essere necessarie determinate modifiche della procedura descritta (per esempio sistema chiuso, condizionamento dei recipienti di prova). Nei riferimenti bibliografici (2)(3) e (4) si trovano orientamenti sulle eventuali modifiche da apportare.

DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA

Apparecchiature

14.

I recipienti e le altre apparecchiature destinate a entrare in contatto con le soluzioni di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Gli strumenti devono essere lavati accuratamente per assicurare che nessun contaminante organico o inorganico possa interferire con la crescita delle alghe o la composizione delle soluzioni di prova.

15.

I recipienti sono in genere beute in vetro di dimensioni tali da contenere i volumi di coltura necessari per le misurazioni da effettuare durante la prova e garantire una superficie di contatto sufficiente per il trasferimento massico di CO2 dall'atmosfera (cfr. paragrafo 30). Si noti che il volume di liquido deve essere tale da permettere le determinazioni analitiche (cfr. paragrafo 37).

16.

Sono inoltre necessarie alcune o tutte le seguenti apparecchiature:

apparecchiature per le colture: si consiglia di utilizzare una camera o una cabina in cui la temperatura di incubazione prescelta possa essere mantenuta a ± 2 °C;

strumenti per la misurazione della luce: è importante tenere presente che il metodo di misurazione dell'intensità luminosa, in particolare il tipo di recettore (collettore), può influire sul valore misurato. È preferibile effettuare le misurazioni utilizzando un recettore sferico (4 π, sensibile alla luce diretta e riflessa proveniente da tutti gli angoli situati sopra e sotto il piano di misurazione) o un recettore 2 π (sensibile alla luce proveniente da tutti gli angoli situati sopra il piano di misurazione);

apparecchiatura per determinare la biomassa delle alghe. Il conteggio delle cellule, che è il parametro alternativo più comunemente utilizzato per determinare la biomassa delle alghe, può essere effettuato con un contatore elettronico di particelle, un microscopio con camera di conteggio o un citometro a flusso. Altri parametri alternativi per la biomassa possono essere misurati usando un citometro a flusso, un fluorimetro, uno spettrofotometro o un colorimetro. Per effettuare il calcolo è utile impiegare un fattore di conversione che metta in relazione il conteggio delle cellule e il peso secco. Per fornire misurazioni utili con basse concentrazioni di biomassa, quando si utilizza lo spettrofotometro può essere necessario usare cuvette con cammino ottico di almeno 4 cm.

Organismi sperimentali

17.

Possono essere utilizzate diverse specie di microalghe e di cianobatteri che non formano aggregati. I ceppi di cui all'appendice 2 sono risultati adatti alla procedura sperimentale del presente metodo di prova.

18.

Se si utilizzano altre specie, devono essere indicati il ceppo e/o la provenienza. È necessario confermare che la crescita esponenziale dell'alga selezionata per la prova può essere mantenuta per tutta la durata della prova nelle condizioni applicate.

Mezzo di crescita

19.

Si consigliano due mezzi di crescita alternativi: il mezzo dell'OCSE e il mezzo AAP. Le composizioni di entrambi i mezzi sono illustrate nell'appendice 3. Si fa presente che il valore iniziale del pH e la capacità tampone (regolazione dell'aumento del pH) di questi due mezzi sono diversi. I risultati delle prove possono pertanto variare in funzione del mezzo utilizzato, soprattutto nelle prove su sostanze chimiche ionizzanti.

20.

Può essere talvolta necessario modificare il mezzo di crescita, ad esempio se si saggiano metalli o agenti chelanti oppure se la prova è eseguita con diversi valori di pH. L'uso di un mezzo modificato deve essere descritto con precisione e giustificato (3)(4).

Concentrazione iniziale della biomassa

21.

La biomassa iniziale deve essere la stessa in tutte le colture e sufficientemente bassa da permettere una crescita esponenziale per tutto il periodo di incubazione senza il rischio di esaurimento dei nutrienti. La biomassa iniziale non deve superare 0,5 mg/l in peso secco. Si raccomandano le seguenti concentrazioni iniziali di cellule:

Pseudokirchneriella subcapitata

5 × 103 – 104 cellule/ml

Desmodesmus subspicatus

2-5 × 103 cellule/ml

Navicula pelliculosa

104 cellule/ml

Anabaena flos-aquae

104 cellule/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 cellule/ml

Concentrazioni della sostanza chimica in esame

22.

L'intervallo di concentrazione entro il quale possono verificarsi degli effetti può essere determinato in base ai risultati di precedenti prove a diversi intervalli di concentrazione. Per la prova definitiva si devono scegliere almeno cinque concentrazioni in progressione geometrica, con un fattore di separazione non superiore a 3,2. Un fattore più elevato può essere giustificato per le sostanze chimiche in esame la cui curva concentrazione-risposta è nulla. Le serie di concentrazioni devono di preferenza coprire l'intervallo che causa un'inibizione del 5 % - 75 % del tasso di crescita delle alghe.

Repliche e controlli

23.

Il disegno sperimentale deve comprendere tre repliche per ogni concentrazione di prova. Se non è necessario determinare la NOEC, il disegno sperimentale può essere modificato in modo da aumentare il numero delle concentrazioni e ridurre il numero delle repliche per concentrazione. Le repliche dei controlli devono essere almeno tre e, idealmente, il doppio delle repliche utilizzate per ogni concentrazione di prova.

24.

Una serie a parte di soluzioni di prova può essere preparata per le determinazioni analitiche delle concentrazioni della sostanza chimica in esame (cfr. paragrafi 36 e 38).

25.

Quando la sostanza chimica in esame è solubilizzata con un solvente il disegno sperimentale deve includere controlli supplementari contenenti il solvente alla stessa concentrazione utilizzata nelle colture di prova.

Preparazione della coltura di inoculo

26.

Per adattare le alghe alle condizioni sperimentali e garantire che siano nella fase di crescita esponenziale quando sono utilizzate per inoculare le soluzioni di prova, 2-4 giorni prima dell'inizio della prova si prepara una coltura di inoculo nel mezzo di prova. La biomassa delle alghe deve essere adattata affinché la coltura di inoculo mantenga una crescita esponenziale fino al momento in cui ha inizio la prova. La coltura di inoculo è incubata alle stesse condizioni delle colture di prova. Occorre misurare l'aumento della biomassa nella coltura di inoculo per verificare che, nelle condizioni di coltura, la crescita segua un andamento normale per il ceppo in esame. L'appendice 4 presenta un esempio di metodo di coltura delle alghe. Per evitare divisioni sincrone delle cellule durante la prova può essere necessaria una seconda fase di propagazione della coltura di inoculo.

Preparazione delle soluzioni di prova

27.

Tutte le soluzioni di prova devono contenere le stesse concentrazioni del mezzo di crescita e la stessa biomassa iniziale delle alghe utilizzate per la prova. Le soluzioni delle concentrazioni prescelte sono di solito preparate mescolando una soluzione madre della sostanza chimica in esame con il mezzo di crescita e la coltura di inoculo. Di solito le soluzioni madri sono preparate sciogliendo la sostanza nel mezzo di prova.

28.

Solventi quali acetone, alcol t-butilico e dimetilformammide possono essere utilizzati come veicoli per aggiungere sostanze chimiche a bassa idrosolubilità nel mezzo di prova (2)(3). La concentrazione di solvente non deve superare 100 μl/l e deve essere identica in tutte le colture (comprese quelle dei controlli).

Incubazione

29.

I recipienti di prova, chiusi con coperchi permeabili all'aria, sono agitati e collocati nell'incubatore. Durante la prova è necessario mantenere le alghe in sospensione e agevolare il trasferimento di CO2. A tal fine i recipienti sono agitati oppure il loro contenuto è rimescolato in permanenza. Le colture vanno mantenute ad una temperatura compresa tra 21 e 24 °C, con variazione ammissibile di ± 2 °C. Per le specie diverse da quelle di cui all'appendice 2, come per esempio le specie tropicali, può essere necessario utilizzare temperature più elevate, a condizione che i criteri di validità siano rispettati. Si raccomanda di disporre le beute all'interno dell'incubatore in maniera casuale e di cambiarne ogni giorno la posizione.

30.

Il pH del mezzo dei controlli non deve aumentare di oltre 1,5 unità durante la prova. Per i metalli e le sostanze chimiche che in parte ionizzano a un pH prossimo a quello della prova può essere necessario limitare l'evoluzione del pH per ottenere risultati riproducibili e chiaramente definiti. Un'evoluzione del pH inferiore a 0,5 unità è tecnicamente fattibile e può essere ottenuta inducendo un tasso adeguato di trasferimento massico di CO2 dall'aria circostante alla soluzione di prova, per esempio aumentando l'intensità dell'agitazione. Un'altra possibilità consiste nel ridurre la domanda di CO2 diminuendo la biomassa iniziale o la durata della prova.

31.

La superficie su cui le colture sono incubate deve ricevere un'illuminazione fluorescente, continua ed uniforme, per esempio del tipo “bianca fredda” o “naturale”. I requisiti di illuminazione variano in funzione dei ceppi di alghe e cianobatteri utilizzati. L'intensità della luce deve essere adeguata all'organismo sperimentale utilizzato. Per le specie di alghe verdi raccomandate l'intensità della luce a livello delle soluzioni di prova deve essere scelta nell'intervallo 60-120 μE · m– 2 · s– 1, misurata nell'intervallo di lunghezza d'onda che consente la fotosintesi (400-700 nm) con un recettore adeguato. Alcune specie, in particolare l'Anabaena flos-aquae, crescono bene con un'intensità luminosa più bassa e possono essere danneggiate da intensità elevate. Per queste specie occorre utilizzare un'intensità luminosa media compresa tra 40 e 60 μE · m– 2 · s– 1 (per quanto riguarda gli strumenti di misurazione calibrati in lux, l'intensità luminosa raccomandata di 60-120 μE · m– 2 · s– 1 corrisponde a circa 4 440 — 8 880 lux per la luce bianca fredda). Sulla zona di incubazione l'intensità luminosa non deve discostarsi più di ±15 % dall'intensità luminosa media.

Durata della prova

32.

La prova dura normalmente 72 ore, ma è possibile prolungarla o accorciarla a condizione che tutti i criteri di validità di cui al paragrafo 11 siano rispettati.

Misurazioni e determinazioni analitiche

33.

La biomassa delle alghe in ogni recipiente è determinata almeno una volta al giorno durante il periodo di prova. Se le misurazioni sono effettuate su piccoli volumi prelevati dalla soluzione di prova con una pipetta, tali volumi non devono essere rimessi nella soluzione.

34.

La biomassa è misurata mediante conteggio manuale delle cellule al microscopio o con un contatore elettronico di particelle (conteggio delle cellule e/o biovolume). È possibile utilizzare tecniche alternative, come per esempio la citometria a flusso, la fluorescenza clorofilliana in vitro o in vivo (5)(6) o la densità ottica, a condizione di poter dimostrare che esiste una correlazione soddisfacente con la biomassa per la gamma dei valori della biomassa della prova.

35.

Il pH delle soluzioni è misurato all'inizio e alla fine della prova.

36.

Se si dispone di un metodo per analizzare la sostanza chimica in esame nell'intervallo di concentrazione utilizzato, occorre analizzare le soluzioni di prova per verificare le concentrazioni iniziali e il mantenimento delle concentrazioni di esposizione durante la prova.

37.

Se si presume che le concentrazioni di esposizione della sostanza chimica in esame non si discostino più del 20 % dai valori nominali durante la prova, può essere sufficiente analizzare all'inizio e alla fine della prova una concentrazione alta, una bassa e una intorno al valore EC50 previsto. Si raccomanda di analizzare tutte le concentrazioni all'inizio e alla fine della prova se si presume che non si situeranno nell'intervallo dell'80-120 % della concentrazione nominale. Per le sostanze chimiche in esame volatili, instabili o fortemente adsorbenti si raccomanda di prelevare campioni aggiuntivi da analizzare ogni 24 ore durante il periodo di esposizione per definire con maggiore precisione la perdita della sostanza chimica in esame. Per queste sostanze potrebbe essere necessario aumentare il numero delle repliche. In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza chimica in esame è da effettuarsi soltanto in uno dei recipienti replicati (o nel contenuto mescolato di tutti i recipienti replicati).

38.

I mezzi di prova appositamente preparati per l'analisi delle concentrazioni di esposizione durante la prova devono essere trattati come quelli utilizzati per le prove, devono cioè essere inoculati con alghe e incubati alle stesse condizioni. Se occorre analizzare la concentrazione della sostanza chimica in esame disciolta, può essere necessario separare le alghe dal mezzo. A tal fine è preferibile procedere per centrifugazione a bassa velocità, sufficiente per far sedimentare le alghe.

39.

Se è dimostrato che per tutta la durata della prova la concentrazione della sostanza chimica in esame non è variata più di ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata inizialmente, l'analisi dei risultati può essere basata sui valori nominali o su quelli misurati inizialmente. Se la variazione rispetto alla concentrazione nominale o a quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati deve basarsi sulla media geometrica della concentrazione durante l'esposizione o su modelli che descrivono la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (3)(7).

40.

La prova di inibizione della crescita delle alghe è un sistema sperimentale più dinamico di altre prove di tossicità acquatica a breve termine. Di conseguenza può essere difficile determinare le concentrazioni reali di esposizione, soprattutto per le sostanze adsorbenti esaminate a basse concentrazioni. In questi casi, la scomparsa della sostanza chimica in esame dalla soluzione per adsorbimento sulla biomassa delle alghe in crescita non significa che essa sia scomparsa dal sistema sperimentale. All'atto di analizzare il risultato della prova è opportuno verificare se la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame durante la prova è accompagnata dalla diminuzione dell'inibizione della crescita. Se così fosse si potrebbe considerare l'applicazione di un modello adeguato per descrivere la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (7). In caso contrario, può essere opportuno basare l'analisi dei risultati sulle concentrazioni iniziali (nominali o misurate).

Altre osservazioni

41.

Si osserva al microscopio la coltura di inoculo per verificare che presenti un aspetto normale e sano e osservare eventuali anomalie delle alghe (che potrebbero essere causate dall'esposizione alla sostanza chimica in esame) alla fine della prova.

Prova limite

42.

In determinate circostanze, per esempio quando una prova preliminare indica che la sostanza chimica in esame non ha effetti tossici in concentrazioni fino a 100 mg/l o fino al suo limite di solubilità nel mezzo di prova (si scelga il valore più basso), può essere svolta una prova limite che consiste nel confrontare le risposte di un gruppo di controllo e di un gruppo trattato (a una concentrazione di 100 mg/l o pari al limite di solubilità). È vivamente raccomandato che l'assenza di tossicità sia corroborata da un'analisi della concentrazione di esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero delle repliche trattate, che devono essere almeno sei. Le variabili di risposta osservate nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato possono essere analizzate con una prova statistica che consenta di confrontare le medie, per esempio con un test t di Student. Se le varianze dei due gruppi sono ineguali, si esegue un test t adattato per varianze ineguali.

DATI E RELAZIONI

Tracciato delle curve di crescita

43.

La biomassa dei recipienti di prova può essere espressa nell'unità del parametro alternativo utilizzato per misurarla (per esempio, numero di cellule, fluorescenza).

44.

Per rappresentare graficamente le curve di crescita si riportano in tabelle la concentrazione stimata della biomassa delle colture di prova e dei controlli, le concentrazioni del materiale in esame e i tempi delle misurazioni, approssimati almeno all'ora. In questa prima fase si potrà utilizzare sia la scala lineare che quella logaritmica, ma quest'ultima è obbligatoria e in genere rappresenta meglio le variazioni del ritmo di crescita nell'arco della prova. Si osservi che la crescita esponenziale rappresentata in scala logaritmica risulta in una retta la cui pendenza indica il tasso di crescita specifico.

45.

Utilizzando i grafici, verificare se le colture dei controlli si sviluppano al tasso esponenziale previsto nel corso dell'intera prova. Studiare con attenzione tutti i punti e l'aspetto globale dei grafici, nonché verificare i dati grezzi e i procedimenti utilizzati, per rilevare eventuali errori. Verificare in particolare tutti i punti che sembrano discostarsi per un errore sistematico. Se l'individuazione degli errori del procedimento è palese e/o la probabilità di occorrenza di questi errori è elevata, il punto in causa deve essere evidenziato come valore anomalo e non deve essere incluso nella successiva analisi statistica (una concentrazione algale nulla in una delle due o tre repliche può indicare che l'inoculo non è avvenuto correttamente o che il recipiente non è stato pulito bene). Le ragioni che giustificano l'esclusione di un punto perché considerato valore anomalo devono essere esposte chiaramente nella relazione sulla prova. Sono accettate soltanto le ragioni dovute a (rari) errori metodologici e non a mera mancanza di precisione. I metodi statistici di identificazione dei valori anomali presentano un'utilità limitata per questo tipo di problema e non possono sostituire il giudizio di un esperto. È preferibile mantenere i valori anomali (segnalati come tali) tra i punti presentati su eventuali grafici o tabelle.

Variabili di risposta

46.

La prova è intesa a determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla crescita delle alghe. Il presente metodo di prova descrive due variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione di entrambe le variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito:

(a)

tasso di crescita specifico medio, calcolato in base all'aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di prova, espresso in giorni;

(b)

rendimento, che consiste nel valore della biomassa alla fine della prova meno il valore della biomassa all'inizio della prova.

47.

Si fa presente che i valori di tossicità calcolati utilizzando queste due variabili di risposta non sono comparabili, per cui occorre tenere conto di questa differenza al momento di utilizzare i risultati della prova. I valori dell'ECx basati sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (EyCx), se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non va considerata una differenza di sensibilità tra le due suddette variabili di risposta. Il concetto di tasso di crescita specifico medio si basa sull'andamento generale della crescita esponenziale delle alghe in colture non soggette a limitazioni; la tossicità è valutata in base agli effetti sul tasso di crescita senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico dei controlli, della pendenza della curva concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sulla variabile di rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. L'EyCx dipende dal tasso di crescita specifico della specie di alga utilizzata in ciascuna prova e dal tasso di crescita specifico massimo, che può variare da una specie di alga all'altra o persino da un ceppo all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche di specie o ceppi diversi di alga. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, stimare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, per i soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi il presente metodo di prova include anche la stima basata sul rendimento.

Tasso di crescita specifico medio

48.

Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è calcolato in funzione dell'aumento logaritmico della biomassa, utilizzando la seguente equazione per ciascuna replica dei gruppi di controllo e dei gruppi trattati [1]:

Formula

[1]

dove:

μi-j

è il tasso di crescita specifico medio dal momento i al momento j,

Xi

è la biomassa al momento i,

Xj

è la biomassa al momento j.

Per ciascun gruppo trattato e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita e le relative stime della varianza.

49.

Calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero periodo di prova (in genere dal giorno 0 al giorno 3), prendendo come valore di partenza il valore nominale della biomassa inoculata anziché il suo valore misurato, poiché di norma ciò permette di ottenere una maggiore precisione. Se lo strumento utilizzato per misurare la biomassa consente di determinare con sufficiente precisione una piccola biomassa di inoculo (per esempio un citometro a flusso), è possibile utilizzare il valore misurato della concentrazione iniziale della biomassa. Valutare anche il tasso di crescita in ogni sezione della prova, calcolato come il tasso di crescita specifico di ciascun giorno di prova (giorni 0-1, 1-2 e 2-3) e verificare se il tasso di crescita dei controlli rimane costante (cfr. i criteri di validità, paragrafo 11). Un tasso di crescita specifico del primo giorno sensibilmente inferiore al tasso di crescita specifico medio può indicare una fase di latenza. Sebbene sia possibile ridurre al minimo e praticamente eliminare la fase di latenza nelle colture di controllo mediante un'adeguata propagazione della precoltura, la presenza di una fase di latenza nelle colture trattate può essere indizio di una fase di recupero successiva ad uno choc tossico iniziale oppure di un'esposizione ridotta causata da una perdita della sostanza chimica in esame (anche per assorbimento sulla biomassa delle alghe) dopo l'esposizione iniziale. Il tasso di crescita sezione per sezione permette quindi di studiare i vari effetti della sostanza chimica in esame durante il periodo di esposizione. Una differenza significativa tra il tasso di crescita sezione per sezione e il tasso di crescita medio indica l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, il che richiede un attento esame delle curve di crescita.

50.

Si calcola la percentuale di inibizione del tasso di crescita per ciascuna replica del gruppo trattato utilizzando la seguente equazione [2]:

Formula

[2]

dove:

%Ir

è la percentuale di inibizione del tasso di crescita specifico medio,

μC

è il valore medio del tasso di crescita specifico (μ) medio del gruppo di controllo,

μT

è il tasso di crescita specifico medio delle repliche del gruppo trattato.

51.

Se le soluzioni di prova sono preparate utilizzando un solvente, per calcolare la percentuale di inibizione si devono utilizzare i controlli con solvente anziché i controlli senza solvente.

Rendimento

52.

Il rendimento è calcolato come differenza tra la biomassa alla fine della prova e la biomassa all'inizio della prova per ciascun recipiente del gruppo trattato e di controllo. Per ogni concentrazione di prova e di controllo si calcola un valore medio di rendimento e le relative stime della varianza. La percentuale di inibizione del rendimento (%Iy) può essere calcolata per ciascuna replica del gruppo trattato, secondo la seguente formula:

Formula

[3]

dove:

% Iy

è la percentuale d'inibizione del rendimento,

YC

è il valore medio del rendimento nel gruppo di controllo,

YT

è il valore del rendimento delle repliche del gruppo trattato.

Tracciato della curva concentrazione-risposta

53.

Riportare su un grafico la percentuale di inibizione in funzione del logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame e osservare con attenzione i punti ottenuti, senza tenere conto dei punti eliminati perché considerati valori anomali durante la prima fase. Tracciare, manualmente o con programma informatico d'interpolazione, una curva approssimata tra i punti per ottenere una prima impressione del rapporto concentrazione-risposta e successivamente procedere con un metodo più esatto, di preferenza un metodo statistico computerizzato. In funzione dell'uso al quale i dati sono destinati, della qualità (precisione) e della quantità dei dati, nonché della disponibilità di strumenti di analisi dei dati, si potrà decidere (a giusto titolo in alcuni casi) di interrompere l'analisi dei dati in questa fase e considerare soltanto le cifre chiave, vale a dire i valori EC50 e EC10 (e/o EC20), della curva interpolata manualmente (cfr. anche la sezione sottostante sugli effetti stimolatori). Vi sono valide ragioni per non ricorrere ad un metodo statistico, tra le quali:

i dati trattati con strumenti informatici non danno risultati più affidabili di quelli ottenuti con il giudizio di un esperto — in queste situazioni, alcuni programmi informatici potrebbero persino non essere in grado di fornire una soluzione affidabile (le ripetizioni divergenti ecc.),

le risposte allo stimolo della crescita non sono ben descritte dai programmi informatici disponibili (cfr. infra).

Procedure statistiche

54.

L'obiettivo consiste nel descrivere in maniera quantitativa, mediante un'analisi della regressione, la relazione concentrazione-risposta. È possibile utilizzare una regressione lineare ponderata, preceduta da una trasformazione di linearizzazione dei valori che descrivono la risposta osservata — per esempio in unità probit, logit o Weibull (8), ma è preferibile applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle irregolarità inevitabili dei dati e degli scarti rispetto alle distribuzioni regolari. Vicine allo zero o all'inibizione totale, queste irregolarità possono essere amplificate dalla trasformazione e interferire con l'analisi (8). Si fa presente che i metodi analitici standard che utilizzano le trasformazioni probit, logit o Weibull si applicano a dati quantali (per esempio, mortalità o sopravvivenza) e devono quindi essere modificati per poter essere utilizzati con i dati relativi alla crescita o alla biomassa. Per le procedure specifiche che consentono di determinare i valori dell'ECx a partire da dati continui si vedano i riferimenti (9)(10) e (11). L'uso di un'analisi della regressione non lineare è descritto nel dettaglio nell'appendice 5.

55.

Per ciascuna variabile di risposta da analizzare, si utilizza il rapporto concentrazione-risposta per stimare i valori puntuali dell'ECx. Laddove possibile per ogni stima si determinano i limiti di confidenza a 95 %. La corrispondenza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione deve essere valutata graficamente o con metodi statistici. L'analisi della regressione deve essere effettuata basandosi sulle risposte rilevate in ogni replica e non sulle medie dei gruppi trattati. Tuttavia, se risulta difficile o impossibile costruire una curva interpolante perché i dati sono troppo dispersi, si può ricorrere ad una regressione sulle medie dei gruppi in modo da ridurre l'influenza dei valori che potrebbero essere anomali. Il ricorso a questa opzione, che si discosta dalla procedura normale, deve essere indicato nella relazione di prova e motivato dall'impossibilità di interpolare la curva dei valori delle singole repliche con risultati soddisfacenti.

56.

Le stime dell'EC50 e i limiti di confidenza possono essere ottenuti anche mediante interpolazione lineare con bootstrapping (13), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.

57.

Per stimare la LOEC, e dunque la NOEC, per quanto riguarda gli effetti della sostanza chimica in esame sul tasso di crescita, è necessario paragonare le medie dei gruppi trattati mediante un'analisi della varianza (ANOVA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli ricorrendo a un metodo adeguato di comparazione multipla o di analisi della tendenza. A questo proposito possono risultare utili i test di Dunnett o di William (12)(14)(15)(16)(17). È necessario valutare se l'ipotesi di omogeneità della varianza dell'ANOVA è fondata, valutazione che può essere effettuata graficamente oppure con una prova formale (17), ad esempio con i test di Levene o di Bartlett. in particolare tramite il test di Levene. Se l'ipotesi dell'omogeneità della varianza non si conferma, può essere talvolta utile correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. Se l'eterogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta con una trasformazione, si prenderanno in considerazione metodi di analisi della tendenza come, ad esempio, i test di tendenza regressivi di Jonckheere. Il riferimento bibliografico (11) fornisce ulteriori informazioni sulla determinazione della NOEC.

58.

Alcuni sviluppi scientifici recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare l'abbandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali della CEx basate sulla regressione. Per questa prova sulle alghe non è stato definito alcun valore appropriato di x. Tuttavia, un intervallo tra il 10 e il 20 % sembra appropriato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile riportare sia l'EC10 sia l'EC20.

Stimolazione della crescita

59.

Si osserva talvolta una stimolazione della crescita (inibizione negativa) a basse concentrazioni. Questo fenomeno può derivare da ormesi (“stimolazione tossica”) o dall'introduzione di fattori di stimolazione della crescita, trasportati dal materiale in esame, nel mezzo utilizzato. Si fa presente che l'aggiunta di sostanze nutritive inorganiche non dovrebbe esercitare alcun effetto diretto dato che per tutta la prova il mezzo mantiene sostanze nutritive in eccesso. La stimolazione a basse concentrazioni può essere generalmente ignorata nei calcoli dell'EC50, a meno che sia estrema. Tuttavia, se tale stimolazione è estrema o quando il valore x nell'ECx da calcolare è basso, potrebbero essere necessarie procedure particolari. Si eviti, per quanto possibile, di eliminare semplicemente dall'analisi dei dati le risposte della stimolazione e, se il software di interpolazione della curva non è in grado di trattare gli effetti di tale stimolazione di lieve entità, si può fare ricorso a un'interpolazione lineare con bootstrapping. Se la stimolazione è estrema, è possibile considerare l'uso di un modello di ormesi (18).

Inibizione di origine non tossica della crescita

60.

I materiali in esame che assorbono la luce possono causare una diminuzione del tasso di crescita per effetto della riduzione della quantità di luce disponibile. Occorre distinguere questi tipi di effetti fisici dagli effetti tossici modificando le condizioni sperimentali e riportandoli separatamente nella relazione. I riferimenti (2) e (3) forniscono orientamenti al riguardo.

RELAZIONE SULLA PROVA

61.

La relazione sulla prova deve includere le informazioni indicate di seguito.

 

Sostanza chimica in esame:

stato fisico e proprietà fisico-chimiche pertinenti, compreso il limite di solubilità in acqua,

dati di identificazione chimica (per esempio il numero CAS), compresa la purezza (impurità).

 

Specie sperimentali:

ceppo, fornitore o provenienza e condizioni di coltura utilizzate.

 

Condizioni sperimentali:

data di inizio e durata della prova,

descrizione del disegno sperimentale: recipienti, volumi delle colture, densità della biomassa all'inizio della prova,

composizione del mezzo,

concentrazioni di prova e repliche (per esempio, numero di repliche, numero di concentrazioni di prova e progressione geometrica applicata),

descrizione dei metodi di preparazione delle soluzioni di prova, ivi compreso l'uso di solventi ecc.,

apparecchiatura per le colture,

intensità e qualità dell'illuminazione (fonte, omogeneità),

temperatura;

concentrazioni saggiate: concentrazioni di prova nominali e tutti i risultati delle analisi volte a determinare la concentrazione della sostanza chimica in esame nei recipienti di prova; vanno indicati anche l'efficienza di recupero del metodo e il limite di quantificazione nella matrice di prova,

tutte le differenze rispetto al presente metodo di prova,

metodo di determinazione della biomassa e dimostrazione della correlazione tra il parametro misurato e il peso secco.

 

Risultati:

pH all'inizio e alla fine della prova in tutti i recipienti trattati,

biomassa in ciascun recipiente in ciascun punto di misura e metodo di misura della biomassa,

curve di crescita (biomassa in funzione del tempo),

variabili di risposta calcolate per ciascuna replica trattata, con valore medio e coefficiente di variazione delle repliche,

rappresentazione grafica della relazione concentrazione-risposta,

stima della tossicità per le variabili di risposta, per esempio EC50, EC10 e EC20 e relativi intervalli di confidenza. Qualora siano calcolate, la LOEC e la NOEC e i metodi statistici utilizzati per determinarle,

se è stata eseguita un'analisi ANOVA, la portata dell'effetto individuato (per esempio, la differenza meno significativa),

eventuali stimoli della crescita osservati in qualsiasi gruppo trattato,

eventuali altri effetti osservati, per esempio alterazione morfologica delle alghe,

discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni su di essi dovute a eventuali differenze rispetto al presente metodo di prova.

BIBLIOGRAFIA

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International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

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(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

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Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Appendice 1

Definizioni

Ai fini del presente metodo di prova sono usate le definizioni e le abbreviazioni seguenti.

Biomassa : peso secco della materia vivente presente in una popolazione espresso in funzione di un determinato volume, ad esempio mg di alghe per litro di soluzione di prova. La biomassa di solito corrisponde alla massa, ma ai fini della presente prova questo termine è utilizzato per riferirsi alla massa per unità di volume. Dato che nella presente prova la biomassa è in genere misurata indirettamente, tramite conteggio delle cellule, fluorescenza ecc., l'uso del termine “biomassa” si riferisce anche a queste misurazioni alternative.

Coefficiente di variazione (CV) : misura adimensionale della variabilità di un parametro, definita come il rapporto della deviazione standard rispetto alla media. Può essere espresso anche con una percentuale. Il coefficiente medio di variazione del tasso di crescita specifico medio nelle repliche delle colture di controllo deve essere calcolato come segue:

1.

calcolare il CV (in percentuale) del tasso di crescita specifico medio a partire dai tassi di crescita quotidiani/sezione per sezione di ciascuna replica;

2.

calcolare il valore medio di tutti i valori calcolati al punto 1 per ottenere il coefficiente medio di variazione del tasso di crescita specifico quotidiano/sezione per sezione nelle repliche delle colture di controllo.

Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto statisticamente significativo (LOECLowest Observed Effect Concentration) : concentrazione più bassa saggiata di una sostanza alla quale si osserva un effetto di riduzione statisticamente significativo della crescita (p < 0,05) rispetto al controllo, nell'arco di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e di conseguenza la NOEC).

Concentrazione senza effetti osservati (NOECNo Observed Effect Concentration) : concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC.

ECx : concentrazione della sostanza disciolta nel mezzo di prova che causa una riduzione dell'x % (per esempio del 50 %) della crescita dell'organismo sperimentale entro un periodo di esposizione definito (che deve essere esplicitato se diverso dalla durata completa o normale della prova). Per indicare in modo inequivoco se il valore EC si riferisce al tasso di crescita o al rendimento si utilizzano, rispettivamente, le abbreviazioni “ErC” e “EyC”.

Mezzo di crescita : mezzo sintetico completo di coltura in cui le alghe crescono quando sono esposte alla sostanza chimica in esame. Quest'ultima è di norma disciolta nel mezzo di prova.

Rendimento : valore di una variabile di misurazione che esprime la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e il valore della stessa variabile all'inizio del periodo di esposizione, utilizzata per esprimere l'aumento della biomassa durante la prova.

Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.

Sostanza chimica : sostanza o miscela.

Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio): aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione.

Tasso di crescita specifico : variabile di risposta che corrisponde al quoziente della differenza dei logaritmi naturali di un parametro di osservazione (nel presente metodo di prova, la biomassa) e il periodo di tempo rispettivo.

Variabile di risposta : variabile per la stima della tossicità dedotta da qualsiasi parametro misurato che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. Per questo metodo i tassi di crescita e rendimento sono variabili di risposta ricavati dalla misura diretta della biomassa o di qualsiasi metodo alternativo menzionato.

Appendice 2

Ceppi dimostratisi idonei alla prova

Alghe verdi

 

Pseudokirchneriella subcapitata, (già nota come Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (già nota come Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Diatomee

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cianobatteri

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Fonti dei ceppi

I ceppi raccomandati sono disponibili in colture unialgali provenienti dalle seguenti collezioni (in ordine alfabetico):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

Stati Uniti

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

Regno Unito

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

Università di Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

Germania

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

Stati Uniti

Aspetto e caratteristiche delle specie raccomandate

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Aspetto

Unicellulari, curve e ritorte

Per lo più unicellulari, ovali

Bastoncelli

Catene di cellule ovali

Bastoncelli

Dimensioni (L × L) μm

8-14 × 2-3

7-15 × 3-12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Volume cellulare (μm3/cell)

40-60 (2)

60-80 (2)

40-50 (2)

30-40 (2)

2,5 (3)

Peso cellulare secco (mg/cell)

2-3 × 10– 8

3-4 × 10– 8

3-4 × 10– 8

1-2 × 10– 8

2-3 × 10– 9

Tasso di crescita (4) (giorno– 1)

1,5 -1,7

1,2-1,5

1,4

1,1-1,4

2,0 — 2,4

Indicazioni particolari per la coltura e la manipolazione delle specie sperimentali raccomandate

Pseudokirchneriella subcapitata e Desmodesmus subspicatus

Queste alghe verdi sono generalmente facili da coltivare in vari mezzi di coltura. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Le cellule sono generalmente separate e la densità cellulare si misura facilmente con un contatore elettronico di particelle o al microscopio.

Anabaena flos-aquae

La coltura madre si conserva in vari mezzi di crescita. In particolar modo si deve evitare che la coltura batch abbia superato la fase esponenziale di crescita al momento del rinnovo, poiché il recupero è difficile a questo punto.

Anabaena flos-aquae forma catene di cellule raccolte in spirali (aggregati). La dimensione di tali aggregati varia in funzione delle condizioni di coltura. Per determinare la biomassa può essere necessario spezzare tali aggregati per contare le cellule al microscopio o con contatore elettronico di particelle.

Le catene di sottocampioni possono essere spezzate in vari punti mediante sonicazione, per ridurre la variabilità di calcolo. Processi di sonicazione più lunghi del necessario per spezzare le catene in piccoli segmenti potrebbero distruggere le cellule. L'intensità e la durata della sonicazione devono essere identiche per ciascun gruppo trattato.

Per contribuire a compensare la variabilità si contino sufficienti campi nella griglia dell'emocitometro (almeno 400). Ciò aumenterà l'affidabilità delle determinazioni della densità al microscopio.

Dopo aver diviso le catene di cellule mediante attenta sonicazione, il volume cellulare totale di Anabaena può essere determinato utilizzando un contatore elettronico di particelle. La potenza della sonicazione deve essere regolata in modo da evitare di rompere le cellule.

Utilizzare un agitatore a vortice o strumento analogo per assicurare che la sospensione di alghe utilizzata per inoculare i recipienti di prova sia sufficientemente mescolata e omogenea.

I recipienti di prova devono essere posti su agitatori da banco reciproci o orbitali a circa 150 rpm. In alternativa, l'Anabaena può anche essere agitata ad intermittenza per evitare la formazione di aggregati. Qualora invece ciò avvenga, si provvederà a prelevare campioni rappresentativi ai fini della misura della biomassa. Un'agitazione vigorosa prima del prelievo può essere necessaria per disgregare gli ammassi algali.

Synechococcus leopoliensis

La coltura madre si conserva in diversi mezzi di crescita. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati.

Synechococcus leopoliensis cresce formando bastoncelli isolati. La minuscola dimensione delle cellule ne rende difficile la conta al microscopio ai fini della misura della biomassa. In questo caso, è utile disporre di un contatore elettronico capace di contare particelle di dimensione fino a 1 μm. È applicabile anche la misurazione fluorimetrica in vitro.

Navicula pelliculosa

La coltura madre si conserva in diversi mezzi di crescita. Le collezioni di colture forniscono informazioni sui mezzi adeguati. Si noti che in questo caso deve essere aggiunto silicato.

Navicula pelliculosa può formare aggregati in alcune condizioni colturali. A causa della produzione lipidica, le cellule algali tendono a volte ad accumularsi nella pellicola che si forma in superficie. Se ciò avviene, si devono prendere misure apposite durante il prelievo di sottocampioni ai fini della determinazione della biomassa per garantire la rappresentatività dei campioni. Può risultare necessaria un'agitazione vigorosa, per esempio tramite un agitatore a vortice.

Appendice 3

Mezzi di crescita

Può essere utilizzato uno dei due mezzi di crescita seguenti.

Mezzo OCSE: mezzo originale della linea guida n. 201 dell'OCSE, anche conforme alla norma ISO 8692

Mezzo AAP dell'EPA (USA), anche conforme all'ASTM.

Nella preparazione di questi mezzi occorre utilizzare sostanze chimiche di grado reagente o analitico e acqua deionizzata.

Composizione del mezzo AAP (EPA USA) e di quello indicato nella linea guida n. 201 dell'OCSE

Componente

AAP

OCSE

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 6H2O

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

La relazione molare dell'EDTA sul ferro è leggermente superiore all'unità. Ciò impedisce al ferro di precipitare e minimizza allo stesso tempo la chelazione degli ioni di metalli pesanti.

Nella prova condotta sulla diatomea Navicula pelliculosa, ai due mezzi deve essere aggiunto Na2SiO3 · 9H2O, per raggiungere una concentrazione di 1,4 mg di Si/l.

Il pH del mezzo è ottenuto al punto di equilibrio tra il sistema carbonato del mezzo e la pressione parziale di CO2 nell'aria atmosferica. La relazione approssimativa tra il pH a 25 °C e la concentrazione molare di bicarbonato è espressa dalla seguente formula:

pHeq = 11,30 + log [HCO3]

Con 15 mg/l NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (mezzo USA-EPA) e con 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (mezzo OCSE).

Composizione degli elementi del mezzo di prova

Elemento

AAP

OCSE

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Preparazione del mezzo OCSE

Nutriente

Concentrazione nella soluzione madre

Soluzione madre 1:

macronutrienti

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Soluzione madre 2:

ferro

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Soluzione madre 3:

oligoelementi

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Soluzione madre 4:

bicarbonato

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Le soluzioni madre sono sterilizzate mediante filtrazione su membrana (diametro medio dei pori: 0,2 μm) o con autoclavaggio (15 minuti a 120 °C). Conservare le soluzioni al riparo dalla luce e alla temperatura di 4 °C.

Le soluzioni madre 2 e 4 sono sterilizzate solo mediante filtrazione su membrana e non devono essere sottoposte ad autoclavaggio.

Preparare il mezzo di crescita aggiungendo all'acqua un volume adeguato delle soluzioni madre da 1 a 4.

 

Aggiungere a 500 ml di acqua sterilizzata:

 

10 ml di soluzione madre 1

 

1 ml di soluzione madre 2

 

1 ml di soluzione madre 3

 

1 ml di soluzione madre 4

 

Portare a 1 000 ml con acqua sterilizzata.

Attendere che il preparato raggiunga l'equilibrio con il CO2 atmosferico, se necessario facendo gorgogliare aria sterile e filtrata per alcune ore.

Preparazione del mezzo AAP

1.

Aggiungere 1 ml di ciascuna soluzione madre di cui ai seguenti punti 2.1-2.7 a circa 900 ml di acqua deionizzata o distillata e diluire fino al volume di 1 litro.

2.

Preparare le soluzioni madre macronutrienti sciogliendo i seguenti composti in 500 ml di acqua deionizzata o distillata. I reagenti 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4 possono essere combinati in un'unica soluzione madre.

2.1

NaNO3

12,750 g

2.2

MgCl2 6H2O

6,082 g

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g

2.4

Soluzione madre micronutriente (cfr. punto 3).

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g

2.6

K2HPO4

0,522 g

2.7

NaHCO3

7,500 g

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

Cfr. nota 1.

Nota 1: da utilizzare solo per le diatomee. Può essere aggiunto direttamente (202,4 mg) o tramite soluzione madre per raggiungere una concentrazione finale di 20 mg/l di Si nel mezzo.

3.

La soluzione madre micronutriente è preparata sciogliendo i seguenti composti in 500 ml di acqua deionizzata o distillata:

3.1

H3BO3

92,760 mg

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg

3.3

ZnCl2

1,635 mg

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [disodio (etilendiamina-)tetracetato]

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg. Cfr. nota 2.

Nota 2: da utilizzare soltanto nel mezzo per le soluzioni madre di diatomee.

4.

Regolare il pH a 7,5 ± 0,1 con 0,1 N oppure 1,0 N NaOH o HCl.

5.

Filtrare il mezzo in un contenitore sterile attraverso un filtro a membrana con pori di 0,22 μm se si utilizza un contatore di particelle, oppure attraverso un filtro con pori di 0,45 μm se non si utilizza il contatore di particelle.

6.

Conservare il mezzo al riparo dalla luce, alla temperatura di circa 4 °C fino all'utilizzo.

Appendice 4

Esempio di metodo di coltura delle alghe

Osservazioni generali

La preparazione di colture sulla base del seguente metodo serve per ottenere colture algali destinate alle prove di tossicità.

Occorre procedere in modo da preservare le colture algali da qualsiasi contaminazione batterica. Può essere utile avviare colture axeniche, ma devono essere utilizzate colture unialgali.

Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili per evitare ogni contaminazione con batteri e altre alghe.

Apparecchiatura e materiale

Si veda alla voce “Apparecchiatura” del metodo di prova.

Metodo per ottenere colture algali

Preparazione di soluzioni nutritive (mezzi)

Tutti i sali minerali del mezzo sono preparati sotto forma di soluzioni madre concentrate e conservate al freddo e al riparo dalla luce. Queste soluzioni sono sterilizzate tramite filtrazione o autoclavaggio.

Preparare il mezzo aggiungendo la giusta quantità di soluzione madre all'acqua distillata sterile, facendo attenzione ad evitare ogni rischio di infezione. Per i mezzi solidi, aggiungere 0,8 % di agar.

Coltura madre

Le colture madri che fungono da materiale di prova iniziale sono piccole colture algali trasferite con regolarità su mezzo fresco. Se le colture non vengano usate con regolarità, esse vanno strisciate su provette inclinate riempite di agar. Le colture sono trasferite su mezzo fresco almeno una volta ogni due mesi.

Le colture madri sono coltivate in beute contenenti il mezzo adeguato (volume di circa 100 ml). Quando le alghe vengono incubate a 20 °C con illuminazione continua, è necessario un trasferimento settimanale.

Durante il trasferimento, una certa quantità di coltura “vecchia” viene trasferita con pipette sterili in una beuta contenente mezzo fresco; la quantità deve essere tale che, nel caso delle specie a crescita rapida, la concentrazione iniziale sia circa 100 volte inferiore di quella della coltura vecchia.

Il tasso di crescita di una specie può essere determinato osservando la curva di crescita. Se questa è nota, è possibile stimare la densità alla quale la coltura deve essere trasferita in un mezzo nuovo. Ciò deve essere fatto prima che la coltura raggiunga la fase di mortalità.

Precoltura

La precoltura serve a fornire un quantitativo di alghe sufficiente per l'inoculo delle colture di prova. La precoltura è incubata alle condizioni sperimentali e utilizzata quando è ancora in crescita esponenziale, solitamente dopo un periodo di incubazione compreso tra 2 e 4 giorni. Qualora contengano cellule deformate o anomale, le colture algali devono essere scartate.

Appendice 5

Analisi dei dati tramite regressione non lineare

Considerazioni generali

La risposta osservata nelle prove sulle alghe e nelle altre prove di crescita di microrganismi (aumento della biomassa) è espressa, per sua natura, da una variabile continua o metrica; tale variabile è data dalla velocità del processo se si utilizza il tasso di crescita o dalla sua integrale in funzione del tempo se si sceglie la biomassa. Queste due variabili sono raffrontate con il corrispondente risultato medio osservato su repliche dei controlli non esposti che presentano la risposta massima alle condizioni imposte, in cui la luce e la temperatura sono i principali fattori determinanti nelle prove sulle alghe. Il sistema è distribuito o omogeneo e la biomassa può essere considerata un continuum, senza considerare le singole cellule. La distribuzione della varianza del tipo di risposta di tale sistema dipende soltanto dai fattori sperimentali (descritti generalmente dalle distribuzioni log- normale o normale dell'errore), contrariamente a quanto avviene negli esperimenti biologici classici i cui effetti sono espressi con dati quantali e per i quali spesso si presume che la tolleranza (generalmente con distribuzione binomiale) di ciascun organismo costituisca la componente dominante della varianza. In questo caso, le risposte dei controlli hanno valore zero o quello del livello di fondo.

Nella situazione semplice, la risposta normalizzata o relativa (r) diminuisce monotonicamente da 1 (inibizione nulla) a 0 (inibizione al 100 %). Si noti che tutte le risposte hanno un errore associato e che le inibizioni negative evidenti possono essere calcolate come risultato del solo errore casuale.

Analisi della regressione

Modelli

Un'analisi della regressione mira a descrivere quantitativamente la curva concentrazione-risposta sotto forma di funzione matematica della regressione Y = f (C) o, più frequentemente, F (Z) dove Z = log C. La funzione inversa, C = f– 1 (Y) permette di calcolare i valori ECx, compresi i valori EC50, EC10 e EC20, e i corrispondenti limiti di confidenza a 95 %. Molte funzioni matematiche semplici hanno dimostrato di descrivere correttamente la relazione concentrazione-risposta ottenuta nelle prove di inibizione della crescita delle alghe. Fra dette funzioni rientrano, per esempio, l'equazione logistica, l'equazione asimmetrica di Weibull e la distribuzione log-normale, che sono tutte curve sigmoidee tendenti asintoticamente a zero per C → 0 e a 1 per C → infinito.

L'uso di modelli di funzioni soglia continue (per esempio il modello di Kooijman per “l'inibizione della crescita della popolazione”, Kooijman et al, 1996) costituisce una soluzione proposta recentemente in alternativa ai modelli asintotici. Questo modello suppone che non si producano effetti a concentrazioni inferiori ad una certa soglia, EC0 +, stimata tramite estrapolazione della relazione concentrazione-risposta che consiste nell'intercettare l'asse delle concentrazioni per mezzo di una funzione continua semplice non differenziabile al punto di partenza.

Si fa presente che l'analisi può essere una semplice minimizzazione delle somme dei quadrati dei residui (supponendo che la varianza sia costante) o dei quadrati ponderati se l'eterogeneità della varianza è compensata.

Procedimento

Scegliere un'equazione funzionale adeguata, Y = f (C), e interpolare i dati con una regressione non lineare. Utilizzare preferibilmente le misure rilevate in ciascuna beuta anziché i valori medi delle repliche, per trarre quante più informazioni possibile dai dati. D'altra parte, se la varianza è elevata, l'esperienza pratica induce a supporre che le medie delle repliche possono fornire una stima matematica più solida, meno influenzata dagli errori casuali dei dati rispetto a ciascun punto preso singolarmente.

Rappresentare su un grafico i valori misurati e la curva interpolata e verificare se l'interpolazione è adeguata. L'analisi dei valori residui può essere uno strumento particolarmente utile a questo proposito. Se la funzione scelta per interpolare la curva concentrazione-risposta non descrive bene l'intera curva o un segmento fondamentale di questa, per esempio l'effetto alle basse concentrazioni, si scelga un altro modello di interpolazione, per esempio una curva asimmetrica, quale la funzione di Weibull, anziché la funzione simmetrica. Le inibizioni negative possono porre problemi con, per esempio, la funzione di distribuzione log-normale, che richiede parimenti una funzione alternativa di regressione. È sconsigliato assegnare un valore nullo o un valore positivo di piccola entità a questi valori negativi perché ciò distorce la distribuzione degli errori. Per stimare i valori di ECxlow può essere utile procedere a interpolazioni separate su parti della curva, per esempio il segmento in cui l'inibizione relativa è bassa. Sulla base dell'equazione interpolata (con “stima inversa”, C = f– 1 (Y)), calcolare stime specifiche caratteristiche della ECx e riportare almeno la EC50 e una o due ECxlow. L'esperienza maturata nelle prove pratiche ha dimostrato che la precisione della prova sulle alghe permette generalmente di ottenere una stima ragionevolmente precisa con soglia di inibizione del 10 % se i punti disponibili sono sufficientemente numerosi — a meno che non si produca una stimolazione alle basse concentrazioni, che renderebbe confusi i risultati della prova. La precisione della stima dei valori EC20 è spesso migliore di quelli EC10, perché la EC20 si situa generalmente sulla parte quasi lineare della curva centrale concentrazione-risposta. A volte, la EC10 può essere difficile da interpretare a causa della stimolazione di crescita, di modo che, sebbene la EC10 si ottenga generalmente con una precisione sufficiente, si raccomanda di riportare sempre anche la EC20.

Fattori di ponderazione

In generale, la varianza sperimentale non è costante e include una componente proporzionale; per questo motivo risulta opportuno procedere regolarmente ad una regressione ponderata. I fattori di ponderazione per tale analisi sono generalmente considerati inversamente proporzionali alla varianza:

Wi = 1/Var(ri)

Molti programmi di regressione permettono di effettuare un'analisi della regressione ponderata con fattori di ponderazione riportati in una tabella. Per maggiore semplicità, conviene normalizzare i fattori di ponderazione moltiplicandoli per n/Σ wi (n è il numero dei punti) di modo che la loro somma risulti 1.

Normalizzare le risposte

La normalizzazione con il valore medio delle risposte dei controlli pone alcuni problemi di principio e dà luogo ad una struttura della varianza piuttosto complicata. Dividendo i valori ottenuti dalle prove per il valore medio ottenuto dai controlli al fine di ottenere la percentuale di inibizione, si introduce un errore supplementare dovuto all'errore sulla media dei controlli. A meno che l'errore sia trascurabile, si devono correggere i fattori di ponderazione applicati alla regressione e i limiti di confidenza in funzione della covarianza con il controllo (Draper and Smith, 1981). Si sottolinea l'importanza di ottenere un'elevata precisione nella stima della media dei valori di controllo, per ridurre al minimo la varianza complessiva delle risposte relative. Tale varianza si calcola con la seguente formula:

(il deponente i è riferito al livello di concentrazione i e il deponente 0 ai controlli)

Yi = risposta relativa = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

con una varianza Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri) · Var(ri) + ((∂ Yi / ∂ r0)2 · Var(r0)

e poiché (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 and (∂ Y I/ ∂ r0) = ri/r0 2

con una distribuzione normale dei dati e delle repliche mi and m0 replicates: Var(ri ) = σ2/mi

la varianza totale della risposta relativa, Yi diventa quindi:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

L'errore sulla media dei controlli è inversamente proporzionale alla radice quadrata del numero di repliche dei controlli utilizzato per il calcolo della media, e a volte è giustificato includere dati storici, riducendo così l'errore in modo sensibile. Un metodo alternativo consiste nel non normalizzare i dati né interpolare i valori relativi alle risposte assolute, ivi comprese le risposte dei controlli, bensì introdurre il valore della risposta dei controlli come parametro aggiuntivo da interpolare mediante regressione non lineare. Con una classica equazione di regressione a due parametri, questo metodo richiede l'interpolazione di 3 parametri e richiede pertanto più punti rispetto alla regressione non lineare su dati normalizzati utilizzando un valore predeterminato della risposta dei controlli.

Intervalli di confidenza inversi

Il calcolo degli intervalli di confidenza di una regressione non lineare mediante una stima inversa è abbastanza complesso e generalmente non rientra fra le opzioni standard dei normali programmi informatici di calcolo statistico. Intervalli di confidenza approssimativi possono essere ottenuti con programmi classici di regressione non lineare, tramite una riparametrizzazione (Bruce e Versteeg, 1992) consistente nel riformulare l'equazione matematica con le stime desiderate, per esempio la EC10 e la EC50, come parametri da stimare [data la funzione I = f (α, β, concentrazione), si utilizzino le relazioni di definizione f (α, β, EC10) = 0,1 e f (α, β, EC50) = 0,5 per sostituire f (α, β, concentrazione) con una funzione equivalente g (EC10, EC50, concentrazione].

Un calcolo più diretto (Andersen et al, 1998) consiste nel mantenere l'equazione di origine e applicare un'espansione di Taylor attorno alle medie di ri e r0.

Negli ultimi anni si sono diffusi i metodi bootstrapping. Questi metodi utilizzano i dati misurati e un ricampionamento frequente diretto da un generatore di numeri casuali, per stimare la distribuzione empirica della varianza.

BIBLIOGRAFIA

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem.11, 1485-1494

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricoltural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

»

(4)

Il capitolo C.11 è sostituito dal seguente:

«

C. 11.   FANGHI ATTIVI, PROVA DI INIBIZIONE DELLA RESPIRAZIONE (OSSIDAZIONE DEL CARBONIO E DELL'AMMONIO)

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 209 (2010). Si tratta della descrizione di un metodo per la determinazione degli effetti di una sostanza chimica sui microrganismi dei fanghi attivi (in gran parte batteri), misurandone i tassi di respirazione (ossidazione del carbonio e/o dell'ammonio) in determinate condizioni in presenza di diverse concentrazioni della sostanza in esame. Il metodo di prova si basa sul test messo a punto dall'ETAD (The Ecological and Toxicological Association of Dyes and Organic Pigments Manufacturers) (1) e (2), sulla precedente linea guida dell'OCSE n. 209 (3) e sulla norma ISO 8192 rivista (4). Il metodo di prova ha lo scopo di fornire un procedimento rapido di screening per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui microrganismi dei fanghi attivi nella fase biologica (aerobica) dei trattamenti negli impianti di depurazione delle acque reflue. I risultati della prova possono anche servire da indicatore delle concentrazioni idonee e non inibitrici delle sostanze chimiche in esame da utilizzare nelle prove di biodegradabilità (ad esempio i capitoli C.4 A-F, C.9, C.10, C.12 e C.29 del presente allegato, la linea guida OCSE n. 302C). In tal caso, la prova può essere eseguita come prova di screening, simile a una prova di definizione dell'intervallo delle concentrazioni o a una prova limite (cfr. paragrafo 39), prendendo in considerazione unicamente la respirazione totale. Tuttavia, è opportuno tener conto con cautela di queste informazioni per le prove di pronta biodegradabilità (cfr. capitolo C.4, A-F, e capitolo C.29 del presente allegato), per le quali la concentrazione dell'inoculo è significativamente inferiore a quella utilizzata nel presente metodo di prova. Infatti, l'assenza di inibizione in questa prova di respirazione non garantisce automaticamente condizioni inibitorie nelle prove di pronta biodegradabilità dei capitoli C.4, A-F, o C.29 del presente allegato.

2.

Nel complesso, la prova di inibizione della respirazione sembra essere stata applicata con successo da quando è stata pubblicata per la prima volta, ma in alcuni casi sono stati segnalati risultati spuri, ad esempio (2) (4) (5). Quindi, le curve di respirazione in funzione della concentrazione a volte risultano bifasiche, i tracciati dose-risposta possono essere distorti e i valori EC50 sono risultati inaspettatamente bassi (5). Dalle indagini è emerso che tali risultati si ottengono in caso di prove su fanghi attivi notevolmente nitrificanti e se la sostanza chimica in esame ha un effetto maggiore sull'ossidazione dell'ammonio che sulla generale ossidazione eterotrofica. Pertanto, è possibile ovviare ai risultati spuri mediante ulteriori prove, utilizzando un apposito inibitore della nitrificazione. Misurando il tasso di consumo di ossigeno in presenza e in assenza di un inibitore (ad esempio N-alliltiourea, ATU), è possibile calcolare il tasso di consumo di ossigeno, rispettivamente, dell'ossidazione totale, dell'ossidazione eterotrofica e della nitrificazione (4) (7) (8). È dunque possibile determinare gli effetti inibitori della sostanza chimica in esame sui due processi ed è possibile calcolare con il metodo classico i valori EC50 sia per l'ossidazione del carbonio organico (eterotrofica) sia per l'ossidazione dell'ammonio (nitrificazione). Va osservato che in alcuni rari casi, l'effetto inibitorio della N-alliltiourea può essere parzialmente o completamente annullato se essa forma dei complessi con le sostanze chimiche in esame o con un additivo del mezzo, per esempio gli ioni Cu++(6). Gli ioni Cu++ sono essenziali per le Nitrosomonas, ma sono tossici in concentrazioni elevate.

3.

La necessità di ricorrere alla nitrificazione nel trattamento aerobico delle acque reflue, in quanto tappa necessaria nel processo di eliminazione dei composti azotati dalle acque reflue mediante denitrificazione e ottenimento di prodotti gassosi, è diventato particolarmente urgente nei paesi europei; l'UE ha attualmente abbassato i limiti massimi di concentrazione dell'azoto negli effluenti trattati riversati nelle acque riceventi (5).

4.

Nella maggior parte dei casi, è sufficiente ricorrere solo al metodo per valutare l'effetto sui processi di ossidazione del carbonio organico. Tuttavia, in alcuni casi è necessario esaminare l'effetto sulla sola nitrificazione, o, separatamente, sulla nitrificazione e sull'ossidazione del carbonio organico, per poter interpretare i risultati e comprendere gli effetti.

PRINCIPIO DELLA PROVA

5.

I tassi di respirazione dei campioni di fanghi attivi alimentati con liquami artificiali sono misurati in una cella chiusa contenente un elettrodo a ossigeno, dopo un periodo di contatto di 3 ore. Per uno scenario d'esposizione realistico, potrebbero essere appropriati dei tempi di contatto più lunghi. Se la sostanza chimica in esame è rapidamente degradata, ad esempio tramite idrolisi abiotica, oppure presenta una volatilità che non permette di mantenerne adeguatamente la concentrazione, è possibile anche utilizzare un tempo di esposizione più corto, ad esempio 30 minuti. Il giorno stesso dell'esposizione occorre controllare la sensibilità di ciascun lotto di fanghi attivi, tramite una sostanza chimica di riferimento adeguata. La prova serve generalmente a determinare il valore ECx (per esempio EC50) della sostanza chimica in esame e/o la sua concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).

6.

È possibile determinare separatamente l'inibizione del consumo di ossigeno da parte dei microrganismi che ossidano il carbonio organico e dei microrganismi che ossidano l'ammonio, ricorrendo alla misura dei tassi di assorbimento di ossigeno in assenza e in presenza di N-alliltiourea, un inibitore specifico dell'ossidazione dell'ammonio in nitriti da parte dei batteri nitrificanti della prima fase. In questo caso la percentuale di inibizione del tasso di consumo di ossigeno è calcolata comparando il tasso di consumo di ossigeno in presenza della sostanza chimica in esame con il tasso medio di consumo di ossigeno dei controlli corrispondenti senza la sostanza chimica in esame, sia in presenza sia in assenza dell'inibitore specifico (N-alliltiourea).

7.

Il calcolo del tasso di consumo di ossigeno in miscele acquose contenenti la sostanza chimica in esame e liquame artificiale, senza i fanghi attivi, permette di determinare ogni consumo di ossigeno derivante da processi abiotici.

INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME

8.

È necessario disporre dell'identificazione chimica (di preferenza il numero CAS), del nome (di preferenza il nome IUPAC), delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, tensione di vapore, volatilità e adsorbimento della sostanza chimica in esame, in modo da permettere la corretta interpretazione dei risultati. Le sostanze chimiche volatili non possono normalmente essere sottoposte a prova in modo adeguato, se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. paragrafo 21).

APPLICABILITÀ DEL METODO DI PROVA

9.

Il metodo di prova può essere applicato alle sostanze chimiche idrosolubili, scarsamente solubili e volatili. Tuttavia, non è sempre possibile ottenere i valori EC50 con sostanze chimiche limitatamente solubili; inoltre, è possibile ottenere risultati validi con sostanze chimiche volatili soltanto a condizione che la maggior parte (per esempio > 80 %) della sostanza chimica in esame rimanga nella miscela di reazione alla fine del o dei periodi di esposizione. In caso di incertezza sulla stabilità o volatilità della sostanza chimica in esame, è necessario fornire dati analitici supplementari che permettano di stabilire la concentrazione corrispondente di ECx.

SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO

10.

Le sostanze chimiche di riferimento devono essere testate periodicamente al fine di garantire che il metodo e le condizioni di prova siano affidabili, e per verificare la sensibilità di ciascun lotto di fanghi attivi utilizzati come inoculo batterico il giorno stesso dell'esposizione. La sostanza raccomandata come sostanza chimica inibitrice di riferimento è il 3,5-diclorofenolo (3,5-DCP), in quanto si tratta di un noto inibitore della respirazione e viene utilizzato in vari tipi di prove di inibizione/tossicità (4). Anche il solfato di rame (II) pentaidrato può essere utilizzato come sostanza chimica di riferimento per l'inibizione della respirazione totale (9). La N-metilanilina può essere utilizzata come inibitore di riferimento specifico della nitrificazione (4).

CRITERI DI VALIDITÀ E RIPRODUCIBILITÀ

11.

Il tasso di consumo di ossigeno dei controlli in bianco (senza la sostanza chimica in esame o la sostanza chimica di riferimento) non deve essere inferiore a 20 mg di ossigeno per un grammo di fanghi attivi (peso secco dei solidi sospesi) all'ora. Se il tasso è inferiore, la prova deve essere ripetuta con fanghi attivi lavati o con fanghi provenienti da un'altra fonte. Il coefficiente di variazione del tasso di consumo di ossigeno nei controlli replicati non deve superare il 30 % alla fine della prova definitiva.

12.

Nel 2004, in una prova interlaboratorio internazionale organizzata dall'ISO (4) che utilizzava fanghi attivi provenienti da liquami domestici, il valore EC50 del 3,5-DCP è risultato essere compreso nell'intervallo tra 2 mg/l e 25 mg/l per la respirazione totale, tra 5 mg/l e 40 mg/l per la respirazione eterotrofica e tra 0,1 mg/l e 10 mg/l per la respirazione legata alla nitrificazione. Se il valore EC50 del 3,5-DCP non si situa nell'intervallo previsto, occorre ripetere la prova con fanghi attivi provenienti da un'altra fonte. Il valore EC50 del solfato di rame (II) pentaidrato deve essere compreso nell'intervallo 53-155 mg/l per la respirazione totale (9).

DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA

Recipienti e apparecchiature di prova

13.

Occorre utilizzare normali apparecchiature di laboratorio e quanto indicato di seguito:

a)

recipienti di prova — usare ad esempio becher da 1 000 ml per contenere 500 ml di miscela di reazione (cfr. punto 5, fig. 1);

b)

cella e dispositivi di fissaggio per misurare la concentrazione di ossigeno disciolto; un idoneo elettrodo a ossigeno; una cella chiusa per contenere il campione senza spazio di testa e un registratore (cfr. ad esempio i punti 7, 8, 9, figura 1 dell'appendice 2). In alternativa, è possibile utilizzare una bottiglia per BOD con un manicotto idoneo che consenta di sigillare l'elettrodo a ossigeno al collo della bottiglia (cfr. figura 2 dell'appendice 3). Per evitare la perdita di liquido per sversamento quando si inserisce l'elettrodo a ossigeno, è opportuno inserire dapprima un imbuto o un tubo di vetro attraverso il manicotto oppure utilizzare recipienti con bordi svasati. In entrambi i casi è opportuno utilizzare un agitatore magnetico o un metodo di agitazione alternativo, ad esempio una sonda auto-agitatrice;

c)

agitatori e ancorette magnetici, ricoperti di materiale inerte, destinati ad essere utilizzati nella camera di misurazione e/o nei recipienti di prova;

d)

dispositivo di aerazione: se necessario, far passare aria compressa attraverso un filtro appropriato per eliminare polvere e olio e attraverso bottiglie di lavaggio contenenti acqua per umidificare l'aria. Il contenuto dei recipienti va aerato con pipette Pasteur, o altri dispositivi di aerazione che non adsorbono sostanze chimiche. È possibile utilizzare un agitatore orbitale operante a velocità comprese tra 150 e 250 giri al minuto con matracci da 2 000 ml di capacità, ad esempio, per soddisfare la domanda di ossigeno dei fanghi e superare difficoltà derivanti da sostanze chimiche che producono eccessiva schiuma, oppure sono volatili e rischiano di sfuggire al mezzo reattivo, o che sono difficili da disperdere se aerate mediante gorgogliamento. Il sistema di prova consiste di solito in una serie di becher aerati in modo continuo e in scala sequenziale (ad esempio, a intervalli di circa 10-15 minuti) e poi analizzati nello stesso ordine. È possibile utilizzare qualsiasi strumentazione certificata che consenta, simultaneamente, di aerare e misurare il tasso di consumo di ossigeno nelle miscele;

e)

pH-metro;

f)

centrifuga, centrifuga da laboratorio classica per fanghi in grado di girare a 10 000 m/s2.

Reagenti

14.

Occorre utilizzare sempre reagenti di grado analitico.

Acqua

15.

Utilizzare acqua distillata o deionizzata, contenente meno di 1 mg/l di DOC, salvo quando viene prescritto l'uso di acqua di rubinetto non clorata.

Liquami artificiali

16.

La composizione qualitativa e quantitativa del mezzo è la seguente:

peptone

16 g

estratto di carne (o estratto vegetale comparabile)

11 g

urea

3 g

cloruro di sodio (NaCl)

0,7 g

cloruro di calcio diidrato (CaCl2,2H2O)

0,4 g

solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4,7H20)

0,2 g

monoidrogenofosfato di potassio anidro (K2HPO4)

2,8 g

acqua distillata o deionizzata per 1 litro

 

17.

Questa soluzione deve avere un PH pari a 7,5 ± 0,5. Se non viene utilizzata subito, la soluzione preparata dovrà essere conservata al buio a temperature comprese tra 0 °C e 4 °C per una settimana al massimo, o in condizioni tali da non subire alterazioni nella composizione. Occorre osservare che questo liquame artificiale è 100 volte più concentrato di quello descritto nella relazione tecnica dell'OCSE “Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents”, dell'11 giugno 1976, con inoltre l'aggiunta di idrogenofosfato dipotassico.

18.

In alternativa, i componenti del mezzo di coltura possono essere sterilizzati individualmente prima dello stoccaggio, oppure il peptone e l'estratto di carne possono essere aggiunti poco prima di effettuare l'analisi. Prima dell'uso, il mezzo deve essere accuratamente mescolato ed il suo pH dovrà essere corretto se necessario fino a portarlo a 7,5 ± 0,5.

Sostanza chimica in esame

19.

Per le sostanze in esame facilmente solubili in acqua va preparata una soluzione madre, a una concentrazione che non ecceda il limite di solubilità in acqua (per evitare precipitazioni). Le sostanze scarsamente solubili in acqua, le miscele a base di componenti di varia solubilità e le sostanze adsorbenti vanno pesate direttamente nei recipienti di prova. In casi simili, il ricorso a soluzioni madre può costituire un'alternativa valida se, prima di aggiungere i fanghi attivi, viene svolta un'analisi delle concentrazioni delle sostanze chimiche in esame disciolte nei recipienti di prova. Se si ricorre al metodo Water Accommodated Fractions (WAF), è altresì necessario determinare analiticamente le concentrazioni delle sostanze chimiche in esame disciolte nei recipienti di prova. Occorre evitare di utilizzare solventi organici, emulsionanti/disperdenti per migliorare la solubilità. È possibile trattare con ultrasuoni le soluzioni madre e pre-agitare le sospensioni, ad esempio la notte precedente, se la stabilità della sostanza chimica in esame è sufficientemente attestata in tali condizioni.

20.

La sostanza chimica in esame potrebbe influenzare negativamente il pH nel sistema di prova. Prima di procedere alla prova occorre determinare il pH delle miscele con la sostanza chimica in esame attraverso una prova preliminare che stabilisca se vi sia la necessità di regolare il pH prima di svolgere la prova principale e poi, nuovamente, il giorno del suo svolgimento. Le soluzioni/sospensioni acquose della sostanza chimica in esame devono essere neutralizzate prima di aggiungere l'inoculo, se necessario. Tuttavia, poiché la neutralizzazione può modificare le proprietà chimiche della sostanza chimica, è consigliabile procedere a ulteriori prove, a seconda della finalità dello studio, per valutare l'effetto della sostanza in esame sui fanghi quando il pH non è regolato.

21.

Gli effetti tossici delle sostanze chimiche volatili, soprattutto nelle prove in cui l'aria è gorgogliata nel sistema, possono produrre livelli di effetti variabili derivanti da perdite di sostanza nel corso del periodo di esposizione. Occorre quindi procedere con cautela con tali sostanze, effettuando un'analisi specifica della miscela di controllo contenente la sostanza e modificando la modalità di aerazione.

Sostanza chimica di riferimento

22.

Se viene utilizzato il 3,5-diclorofenolo come sostanza chimica di riferimento, occorre preparare una soluzione di 1,00 g di 3,5-diclorofenolo in 1 000 ml di acqua (15). La dissoluzione è accelerata tramite un trattamento ad ultrasuoni e/o l'uso di acqua calda, che servono per portare a volume la soluzione dopo che si è raffreddata a temperatura ambiente. Tuttavia, occorre garantire che la struttura della sostanza chimica di riferimento non venga modificata. Il pH della soluzione va controllato e regolato a 7 — 8, se necessario, con l'aggiunta di NaOH oppure H2SO4.

23.

Se la sostanza chimica di riferimento è il solfato di rame (II) pentaidrato, vengono utilizzate concentrazioni a 58 mg/l, 100 mg/l e 180 mg/l (un fattore pari a 1,8). La sostanza viene pesata direttamente nei recipienti di prova (29 - 50 - 90 mg per 500 ml di volume totale). È poi disciolta in autoclave con 234 ml di acqua di rubinetto. Il solfato di rame (II) pentaidrato è facilmente solubile. A prova iniziata, vengono aggiunti 16 ml di liquame artificiale e 250 ml di fanghi attivi.

Inibitore specifico della nitrificazione

24.

Occorre preparare una soluzione madre di 2,32 g/l di N-alliltiourea (ATU). L'aggiunta di 2,5 ml di questa soluzione madre a una miscela di incubazione del volume finale di 500 ml produce una concentrazione finale di 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), che si sa essere sufficiente (4) a causare il 100 % di inibizione della nitrificazione in fanghi attivi nitrificanti contenenti 1,5 g/l di solidi sospesi.

Controlli abiotici

25.

In rare circostanze, una sostanza chimica in esame con forti proprietà riducenti può comportare un consumo di ossigeno abiotico misurabile. Sono allora necessari controlli abiotici per distinguere tra il consumo abiotico di ossigeno dovuto alla sostanza chimica in esame e quello dovuto alla respirazione microbica. I controlli abiotici sono preparati omettendo l'inoculo dalle miscele sperimentali. Analogamente, è possibile includere controlli abiotici senza inoculo al momento di analizzare la concentrazione ottenuta nella fase di esposizione (ad esempio quando si usano soluzioni madre a base di sostanze chimiche scarsamente idrosolubili oppure miscele di componenti con diversi gradi di idrosolubilità). In casi specifici, può essere necessario preparare un controllo abiotico con inoculo sterilizzato (ad es. sterilizzando in autoclave o aggiungendo sostanze tossiche sterilizzanti). Alcune sostanze chimiche possono produrre o consumare ossigeno solo a condizione che la superficie dove avviene la reazione sia sufficientemente ampia, anche se normalmente necessitano di una temperatura o una pressione molto superiori affinché la reazione abbia luogo. A tale riguardo, bisogna prestare particolare attenzione alle sostanze perossidiche. Un inoculo sterilizzato fornisce una superficie sufficientemente ampia.

Inoculo

26.

I fanghi attivi per uso generale devono essere raccolti all'uscita, o in prossimità dell'uscita, del serbatoio di aerazione di un impianto ben gestito per il trattamento delle acque reflue, alimentato principalmente da liquami domestici. A seconda della finalità della prova, si possono eventualmente utilizzare altri tipi o fonti di fanghi attivi adattati, ad esempio fanghi ricostituiti in laboratorio, con una concentrazione di solidi in sospensione che si situi tra 2 g/l e 4 g/l. Tuttavia, i fanghi provenienti da diversi impianti di trattamento avranno probabilmente caratteristiche e sensibilità diverse.

27.

I fanghi possono essere utilizzati così come sono stati raccolti, ma occorre eliminare le particelle grossolane mediante sedimentazione per un breve periodo, da 5 a 15 minuti, e quindi far decantare o setacciare lo strato superficiale contenente le particelle solide più sottili (setaccio con maglie da 1 mm2). In alternativa, è possibile omogenizzare i fanghi con un miscelatore per circa 15 secondi o più a lungo, ma tenendo debito conto della forza trasversale e del cambiamento di temperatura causati da un periodo di miscelazione prolungato.

28.

È spesso necessario lavare i fanghi, ad esempio quando la velocità di respirazione endogena è bassa. In primo luogo, i fanghi vanno centrifugati per un determinato periodo (ad esempio 10 minuti a circa 10 000 m/s2) per produrre un surnatante chiaro e pellet di solidi delle acque reflue. Il surnatante va scartato e i fanghi risospesi in acqua di rubinetto non clorata, agitandoli; l'acqua di lavaggio va rimossa attraverso una nuova centrifugazione per poi scartarla nuovamente. Il lavaggio e la centrifugazione vanno ripetuti, se necessario. Occorre determinare il peso secco compreso in un determinato volume di fanghi (costituiti da solidi risospesi), che poi vengono concentrati eliminando la frazione liquida oppure, al contrario, vengono diluiti con acqua di rubinetto non clorata in modo da ottenere la concentrazione di solidi richiesta, vale a dire 3 g/l. I fanghi attivi devono essere aerati continuamente (ad es. 2 l/min) alla temperatura della prova e, se possibile, vanno utilizzati il giorno stesso della raccolta. Se non è possibile farlo, i fanghi vanno alimentati quotidianamente con liquame artificiale (50 ml di liquame artificiale per litro di fanghi attivi), per altri due giorni. I fanghi vengono poi utilizzati per la prova: i risultati sono ritenuti validi, a condizione che non venga rilevato alcun cambiamento significativo nella loro attività, rispetto ai tassi di respirazione eterotrofica endogena da un lato e di respirazione legata alla nitrificazione dall'altro.

29.

Nel periodo di incubazione possono insorgere difficoltà dovute all'apparizione di schiuma che, se deborda dai recipienti di aerazione, trasporta con sé particelle solide dei fanghi. In alcuni casi la schiuma è semplicemente prodotta dai liquami artificiali, ma occorre prevedere che si formi se la sostanza chimica in esame è, o contiene, un tensioattivo. La perdita di solidi dei fanghi dalle miscele di prova comporta dei tassi di respirazione artificialmente più bassi che potrebbero essere erroneamente interpretati come risultanti da un'inibizione. Inoltre, l'aerazione di una soluzione di tensioattivi fa concentrare queste sostanze nello strato di schiuma; la perdita di schiuma dal dispositivo di prova renderà più deboli le concentrazioni di esposizione. La schiuma può essere controllata attraverso semplici metodi meccanici (ad esempio tramite agitazione manuale occasionale, con una bacchetta di vetro) o con l'addizione di un agente antischiuma siliconico privo di tensioattivi, e/o aerando attraverso il metodo del dibattimento in pallone. Se il problema è legato alla presenza di liquami artificiali, la composizione di questi ultimi viene modificata dall'aggiunta di un agente antischiuma in proporzione di 50 μl/l, ad esempio. Se è invece la sostanza chimica di prova a causare la schiuma, la quantità necessaria a ridurre la schiuma va determinata per la concentrazione massima, e tutti i recipienti di aerazione sono in seguito trattati con la stessa quantità (compresi quelli che non contengono schiuma, come quelli dei controlli in bianco e i recipienti di riferimento). Qualora siano utilizzati agenti antischiuma, non deve verificarsi alcuna interazione con l'inoculo e/o la sostanza chimica in esame.

PROCEDURA SPERIMENTALE

30.

È possibile determinare l'inibizione di tre diversi consumi di ossigeno (totale, eterotrofico e dovuto alla nitrificazione). Di norma, la misura dell'inibizione totale del consumo di ossigeno può considerarsi adeguata. Tuttavia, conviene determinare gli effetti sul consumo di ossigeno eterotrofico legati all'ossidazione del carbonio organico, da una parte, e all'ossidazione dell'ammonio dall'altra parte, quando alcune sostanze specifiche esigono la valutazione di questi due criteri supplementari oppure (se del caso) per spiegare le curve dose-risposta atipiche relative all'inibizione del consumo di ossigeno totale.

Condizioni sperimentali

31.

La prova va svolta a una temperatura che si situa nell'intervallo 20±2 °C.

Miscele di prova

32.

Le miscele di prova (FT come nella tabella 1) contenenti acqua, liquame artificiale e la sostanza in esame vanno preparate in modo da ottenere diverse concentrazioni nominali della sostanza chimica in esame (cfr. tabella 1 per esempi dei volumi dei componenti). Il pH deve essere aggiustato a 7,5 ± 0,5, se necessario; le miscele sono diluite con acqua e va aggiunto l'inoculo, fino a ottenere gli stessi volumi finali nei recipienti, per poi dare inizio all'aerazione.

Miscele di riferimento

33.

Le miscele di riferimento (FR) sono preparate come le miscele di prova, ma con la sostanza chimica di riferimento, ad esempio 3,5-diclorofenolo, invece della sostanza in esame.

Controlli in bianco

34.

I controlli in bianco (FB) vanno preparati all'inizio e alla fine del periodo di esposizione nelle prove che prevedono becher allestiti in modo sequenziale a intervalli regolari. Per i sistemi di prova con apparecchiature che consentono la misurasimultanea dei diversi consumi di ossigeno, occorre prevedere almeno due controlli in bianco per ogni lotto di analisi simultanee. I controlli in bianco contengono un uguale volume di fanghi attivi e mezzo artificiale ma non la sostanza chimica in esame né quella di riferimento. Essi devono essere diluiti con acqua per ottenere lo stesso volume della miscela contenente la sostanza in esame o quella di riferimento.

Controlli abiotici

35.

Se necessario, ad esempio se si sospetta o si ha la certezza che una sostanza chimica abbia forti proprietà riducenti, occorre preparare una miscela FA per misurare il consumo abiotico di ossigeno. La miscela deve contenere la stessa quantità di sostanza chimica in esame e di liquame artificiale e avere lo stesso volume delle miscele sperimentali, ma senza fanghi attivi.

Procedura generale e misurazioni

36.

Le miscele di prova e di riferimento insieme ai controlli in bianco e a quelli abiotici vengono incubati alla temperatura di prova in condizioni di aerazione forzata (da 0,5 a 1 l/min), in modo da mantenere la concentrazione dell'ossigeno disciolto sopra al 60 — 70 % di saturazione e assicurare che i fiocchi dei fanghi siano perennemente in sospensione. Occorre inoltre agitare le colture per mantenere i fiocchi di fanghi in sospensione. Si considera che l'incubazione abbia inizio al primo contatto dell'inoculo di fanghi attivi con gli altri componenti della miscela finale. Al termine dell'incubazione, cioè alla fine di un periodo di esposizione stabilito (in genere 3 ore), i campioni vengono ritirati per misurare la velocità di riduzione della concentrazione di ossigeno disciolto nella cella adibita all'uopo (fig. 2 dell'appendice 3) o in una bottiglia per BOD completamente piena. Le condizioni in cui si dà inizio all'incubazione dipendono anche dalla capacità di misurare i tassi di consumo di ossigeno da parte dell'apparecchiatura utilizzata. Per esempio, se l'apparecchiatura comprende un'unica sonda per l'ossigeno, le misurazioni vanno effettuate individualmente. In tal caso, le varie miscele necessarie per la prova del liquame artificiale saranno preparate senza l'inoculo, e una quantità adeguata di fanghi sarà aggiunta a ciascun recipiente della serie. Ogni incubazione sarà avviata a turno, ad intervalli convenientemente prestabiliti, ad esempio ogni 10 o 15 minuti. In alternativa, il sistema di misurazione può comprendere sonde multiple che facilitano misurazioni multiple e simultanee; in questo caso, è possibile aggiungere l'inoculo contemporaneamente in più gruppi appropriati di recipienti.

37.

La concentrazione di fanghi attivi in tutte le miscele di prova (di riferimento e in bianco, ma non nei controlli abiotici) è nominalmente pari a 1,5 g/l di solidi sospesi. Il consumo di ossigeno va misurato dopo 3 ore di esposizione. Nei casi in cui ciò sia necessario (descritti al paragrafo 5) occorre effettuare ulteriori misurazioni dopo 30 minuti supplementari.

Potenziale di nitrificazione dei fanghi

38.

Per decidere se i fanghi abbiano potere nitrificante, e, in caso affermativo, quale ne sia il tasso, occorre preparare miscele (FB) come nel controllo in bianco e miscele di “controllo” supplementari (FN), che contengano però anche N-alliltiourea a 11,6 mg/l. Queste miscele vanno aerate e incubate a 20° ± 2 °C per 3 ore. In seguito, occorre misurare i tassi di consumo di ossigeno e calcolare il tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione.

Disegni sperimentali

Prova per la definizione dell'intervallo

39.

Se del caso, occorre allestire una prova preliminare per valutare l'intervallo di concentrazioni della sostanza chimica in esame necessarie in una prova definitiva di determinazione dell'inibizione del consumo di ossigeno. In alternativa, l'assenza di inibizione del consumo di ossigeno da parte della sostanza chimica in esame in una prova preliminare può dimostrare che non sia necessario procedere a una prova definitiva; tuttavia, occorre includere dei triplicati che presentano la concentrazione più alta tra quelle testate nella prova preliminare (generalmente 1 000 mg/L, ma questo valore dipende dai dati che è necessario ottenere).

Tabella 1

Esempi di miscele per una prova preliminare

Reagente

Concentrazione iniziale

Soluzione madre della sostanza chimica in esame

10 g/l

Soluzione madre del mezzo artificiale

Cfr. paragrafo 16

Sospensione madre di fanghi attivi

3 g/l di solidi sospesi

Componenti delle miscele

Dosaggio nei recipienti di prova (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Soluzione madre della sostanza chimica in esame (ml)

(paragrafi da 19 a 21)

0,5

5

50

0

50

Soluzione madre di liquame artificiale (ml)

(paragrafo 16)

16

16

16

16

16

Sospensione di fanghi attivi (ml)

(paragrafi da 26 a 29)

250

250

250

250

0

Acqua

(paragrafo 15)

233,5

229

184

234

434

Volume totale delle miscele (ml)

500

500

500

500

500

Concentrazioni nella miscela

 

 

 

 

 

Sospensione di prova (mg/l)

Fanghi attivi

10

10

1 000

0

1 000

(solidi in sospensione) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

La prova deve essere eseguita con almeno tre concentrazioni della sostanza chimica in esame, per esempio, 10 mg/l, 100 mg/l e 1 000 mg/l, con un controllo in bianco e, se necessario, almeno tre controlli abiotici con le più alte concentrazioni della sostanza in esame (cfr. ad esempio la tabella 1). Idealmente, la concentrazione più bassa non dovrebbe avere alcun effetto sul consumo di ossigeno. Occorre calcolare i tassi di consumo di ossigeno e il tasso di nitrificazione, se rilevante; va poi calcolata l'inibizione percentuale. In funzione dello scopo della prova, è inoltre possibile determinare semplicemente la tossicità di una concentrazione limite, ad es. 1 000 mg/l. Se a questa concentrazione non si verifica alcun effetto tossico statisticamente significativo, non è necessario procedere ad ulteriori prove con concentrazioni più elevate o minori. Occorre notare che le sostanze scarsamente solubili in acqua, le miscele a base di componenti di varia solubilità e le sostanze adsorbenti vanno pesate direttamente nei recipienti di prova. In tal caso, il volume riservato alla soluzione madre della sostanza di prova va sostituito con acqua di diluizione.

Prova definitiva

Inibizione del consumo totale di ossigeno

41.

La prova va eseguita utilizzando una gamma di concentrazioni dedotta dalla prova preliminare. Per ottenere contemporaneamente un valore NOEC e un valore ECx (ad es. EC50), si raccomandano, nella maggior parte dei casi, sei concentrazioni di controllo e cinque concentrazioni di trattamento, in progressione geometrica, con cinque repliche. Il controllo abiotico non deve essere ripetuto se non si è registrato consumo di ossigeno nella prova preliminare; invece, in caso di consumo significativo, occorre includere controlli abiotici per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame. La sensibilità dei fanghi va verificata utilizzando la sostanza chimica di riferimento (3,5-diclorofenolo). La sensibilità dei fanghi va verificata per ciascuna serie di prove, in quanto è noto che essa tende a fluttuare. In tutti i casi i campioni vanno prelevati dai recipienti di prova dopo 3 ore (e, se necessario, anche dopo 3 ore e 30 minuti), per misurare il tasso di assorbimento di ossigeno nella cella dotata di elettrodo a ossigeno. In base ai dati raccolti, vengono calcolate le velocità di respirazione specifiche delle miscele di controllo e di prova; la percentuale di inibizione viene quindi calcolata a partire dall'equazione 7, indicata di seguito.

Differenziazione tra inibizione della respirazione eterotrofica e nitrificazione

42.

L'uso di un inibitore specifico della nitrificazione (ATU) consente di verificare direttamente gli effetti inibitori della sostanza chimica in esame sull'ossidazione eterotrofica; è inoltre possibile calcolare gli effetti sul tasso di nitrificazione sottraendo dal tasso totale di consumo (senza ATU) il tasso di consumo di ossigeno in presenza di ATU. Occorre preparare due serie di miscele di reazione secondo i disegni sperimentali per la determinazione dei valori ECx o NOEC di cui al paragrafo 41; inoltre, occorre aggiungere l'inibitore ATU a ciascuna miscela di una delle due serie, per ottenere una concentrazione finale di 11,6 mg/l, in quanto è stato dimostrato che questa concentrazione impedisce completamente la nitrificazione in fanghi con concentrazioni di solidi sospesi fino a 3 000 mg/l (4). I tassi di consumo di ossigeno vanno misurati dopo il periodo di esposizione; questi valori diretti rappresentano unicamente la respirazione eterotrofica, e gli scostamenti tra questi risultati e i tassi di respirazione totale associati corrispondono alla nitrificazione. Vengono poi calcolati i vari gradi di inibizione.

Misurazioni

43.

Alla fine del o dei periodi di esposizione, un campione viene trasferito dal primo recipiente di aerazione alla cella dotata di elettrodo a ossigeno (figura 1 dell'appendice 2), per procedere immediatamente alla misurazione della concentrazione dell'ossigeno disciolto. Se è disponibile un sistema a elettrodi multipli, le misurazioni possono essere effettuate simultaneamente. È fondamentale che l'agitazione (tramite ancoretta magnetica) avvenga alla stessa velocità applicata al momento di tarare l'elettrodo, in modo da garantire una risposta rapida della sonda alle variazioni nella concentrazione dell'ossigeno, e per assicurare la regolarità e la riproducibilità delle misurazioni dell'ossigeno nel recipiente di misurazione. Alcuni sistemi con elettrodi a ossigeno sono dotati di un agitatore generalmente adeguato. Tra una misurazione e l'altra la cella va sciacquata con acqua. In alternativa, si può utilizzare il campione per riempire una bottiglia per BOD (figura 2 dell'allegato 3) munita di un agitatore magnetico. Inserire una sonda dell'ossigeno con manicotto adattatore nel collo della bottiglia e avviare l'agitatore magnetico. In entrambi i casi la concentrazione di ossigeno disciolto deve essere misurata in continuo e registrata per un determinato periodo, solitamente 5 — 10 minuti, o finché la concentrazione di ossigeno scende al di sotto di 2 mg/l. Occorre poi rimuovere l'elettrodo, rimettere la miscela nel recipiente di aerazione e, se è necessario procedere a misurazioni dopo periodi di esposizione più estesi, continuare ad aerarla e agitarla.

Verifica della concentrazione della sostanza chimica in esame

44.

In alcuni casi, può essere necessario misurare la concentrazione della sostanza chimica nei contenitori di prova. Va osservato che se si utilizzano soluzioni madre di:

sostanze scarsamente idrosolubili,

miscele con componenti aventi diversi gradi di idrosolubilità,

sostanze caratterizzate da una buona idrosolubilità ma la cui soluzione madre presenta una concentrazione prossima al limite di solubilità in acqua,

la frazione disciolta non sarà nota, come non lo sarà la concentrazione effettiva della sostanza in esame che viene trasferita nei recipienti di prova. Al fine di caratterizzare l'esposizione, è necessaria una stima analitica delle concentrazioni della sostanza chimica nei recipienti di prova. Per una maggior semplificazione, la stima analitica va svolta prima di aggiungere l'inoculo. Dal momento che soltanto le frazioni disciolte vengono trasferite nei recipienti di prova, le concentrazioni misurate possono essere molto basse.

45.

Al fine di evitare analisi onerose in termini di tempo e di costi, si raccomanda semplicemente di pesare la sostanza in esame direttamente nei recipienti di prova e, per i calcoli successivi, di fare riferimento alla concentrazione nominale iniziale corrispondente a tale massa. È inutile operare una distinzione tra frazione disciolta, non disciolta e adsorbita della sostanza chimica in esame, in quanto tutte queste frazioni appaiono in condizioni reali negli impianti di trattamento delle acque reflue, e possono variare a seconda della composizione di queste ultime. L'obiettivo del presente metodo di prova è di produrre una stima realistica della concentrazione non inibitrice: il metodo non è adatto a determinare in dettaglio quali frazioni contribuiscano all'inibizione degli organismi dei fanghi attivi. Infine, le sostanze adsorbenti vengono anch'esse pesate direttamente nei loro recipienti di prova che devono essere in vetro silanizzato per minimizzare le perdite per adsorbimento.

DATI E RELAZIONE

Calcolo dei tassi di consumo di ossigeno

46.

I tassi di consumo di ossigeno sono calcolati a partire dalla media dei valori misurati, ad esempio utilizzando la parte lineare delle curve della concentrazione di ossigeno in funzione del tempo, limitando i calcoli alle concentrazioni di ossigeno tra 2,0 mg/l e 7,0 mg/l, poiché sia le basse che le elevate concentrazioni possono anch'esse influire sul tasso di consumo. Tuttavia, talvolta è inevitabile, nonché necessario, lavorare su valori che si situano al di fuori di questa forchetta, ad esempio quando la respirazione è fortemente inibita e, di conseguenza, molto lenta, oppure se particolari fanghi attivi respirano molto rapidamente. Ciò è accettabile, a condizione che le sezioni della curva del consumo di ossigeno siano lineari e il loro gradiente non cambi ai limiti dell'intervallo 2,0 mg/l o 7,0 mg/l di O2. Le sezioni curve del grafico indicano una stabilizzazione del sistema di misurazione o un'alterazione del tasso di consumo, e non vanno quindi utilizzate per il calcolo dei tassi di respirazione. Il tasso di consumo di ossigeno è espresso in milligrammi per litro e per ora (mg/lh) o in milligrammi per grammo di fanghi secchi per ora (mg/gh). Il tasso di consumo di ossigeno, R, in mg/lh, può essere dedotto o stimato a partire dalla sezione lineare della curva di quantità d'ossigeno decrescente, secondo l'equazione 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

dove:

Q1

è la concentrazione di ossigeno all'inizio della sezione di curva lineare selezionata (mg/l);

Q2

è la concentrazione di ossigeno alla fine della sezione di curva lineare selezionata (mg/l);

Δt

è l'intervallo di tempo tra le due misure di cui sopra (min.).

47.

Il tasso di respirazione specifica (Rs) è espresso come quantità di ossigeno consumata per grammo di sostanza secca di fanghi per ora (mg/gh), secondo l'equazione 2:

Rs = R/SS

(2)

dove SS è la concentrazione di solidi sospesi nella miscela di prova (g/l).

48.

I diversi indici di R che possono essere combinati sono:

S

tasso specifico

T

tasso corrispondente alla respirazione totale

N

tasso di respirazione legato alla nitrificazione

H

tasso di respirazione eterotrofica

A

tasso corrispondente ai processi abiotici

B

tasso (medio) basato su prove in bianco

Calcolo del tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione

49.

La relazione tra la respirazione totale (RT), la respirazione legata alla nitrificazione (RN) e la respirazione eterotrofica (RH) è fornita dall'equazione 3:

RN = RT – RH

(3)

dove:

RN

è il tasso di consumo di ossigeno dovuto alla nitrificazione (mg/lh);

RT

è il tasso misurato di consumo di ossigeno del controllo in bianco (senza ATU; FB) (mg/lh);

RH

è il tasso misurato di consumo di ossigeno del controllo in bianco con ATU (FN) (mg/lh).

50.

Questa relazione è valida per i valori dei controlli in bianco (RNB, RTB, RHB), i controlli abiotici (RNA, RTA, RHA) e le prove con le sostanze chimiche (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). I tassi di respirazione specifici sono calcolati a partire da:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Se in una prova preliminare il valore RN non è significativo (ad es. < 5 % di RT nei controlli in bianco), si può presumere che il consumo di ossigeno eterotrofico sia pari al consumo totale e che non si verifichi alcuna nitrificazione. Se le prove devono tenere conto degli effetti sui microrganismi eterotrofici e nitrificanti, è necessaria una fonte alternativa di fanghi attivi. Viene svolta una prova definitiva qualora si verifichi una soppressione nel consumo di ossigeno con diverse concentrazioni della sostanza chimica di prova.

Calcolo della percentuale di inibizione

52.

La percentuale di inibizione del consumo totale di ossigeno, IT, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Allo stesso modo, la percentuale di inibizione del consumo eterotrofico di ossigeno, IH, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Infine, l'inibizione del consumo di ossigeno dovuta alla nitrificazione, IN, determinata per ciascuna concentrazione della sostanza chimica in esame, è calcolata con l'equazione 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Occorre tracciare l'inibizione percentuale del consumo di ossigeno in base al logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame (curva di inibizione, cfr. figura 3 dell'appendice 4). Le curve di inibizione vengono tracciate per ciascuna fase di aerazione di 3 ore, eventualmente aggiungendo 30 minuti supplementari. La concentrazione della sostanza chimica in esame corrispondente a un'inibizione del 50 % del consumo di ossigeno (EC50) va calcolata o stimata a partire da questo grafico. Se sono disponibili dati adeguati, è possibile calcolare o stimare i limiti di confidenza al 95 % del valore di EC50, la pendenza della curva e i valori rilevanti che rappresentano l'inizio dell'inibizione (ad esempio, EC10 o EC20) e la fine dell'intervallo di inibizione (ad esempio, EC80 o EC90).

56.

Va sottolineato che, vista la variabilità che spesso caratterizza i risultati, in molti casi può essere sufficiente esprimerli in ordine di grandezza, per esempio:

EC50

< 1 mg/l

EC50

da 1 mg/l a 10 mg/l

EC50

da 10 mg/l a 100 mg/l

EC50

>100 mg/l

Interpretazione dei risultati

ECx

57.

I valori ECx, inclusi i corrispondenti limiti di confidenza al 95 % superiori e inferiori per il parametro, sono calcolati utilizzando metodi statistici adeguati (ad esempio analisi probit, funzione logistica o funzione di Weibull, metodo di Spearman-Karber semplificato o interpolazione semplice (11)). Si ottiene un valore ECx inserendo il valore corrispondente all'x % della media del gruppo di controllo nell'equazione ottenuta. Per calcolare il valore EC50 o qualsiasi altro valore ECx, occorre sottoporre le medie per ciascun gruppo di trattamento (x) a un'analisi di regressione.

Stima della NOEC

58.

Se si procede a un'analisi statistica per determinare la NOEC, è necessario essere in possesso di statistiche per ciascun recipiente (ogni singolo recipiente è considerato una replica distinta). Occorre far ricorso a metodi statistici appropriati, conformemente al documento di orientamento dell'OCSE intitolato Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). In generale, gli effetti avversi della sostanza chimica in esame rispetto al controllo sono analizzati procedendo a una verifica dell'ipotesi unilaterale (più debole) con p ≤ 0,05.

Relazione sulla prova

59.

La relazione sulla prova comprende le informazioni riportate di seguito.

 

Sostanza chimica in esame

nome comune, nome chimico, numero CAS, purezza;

proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame (ad esempio log Kow, idrosolubilità, tensione di vapore, costante di Henry (H) ed eventuali informazioni sul destino della sostanza in esame, per esempio adsorbimento sui fanghi attivi);

 

Sistema di prova

origine, condizioni di funzionamento dell'impianto di trattamento delle acque reflue e affluenti da esso ricevuti, concentrazione, pretrattamento e manutenzione dei fanghi attivi;

 

Condizioni sperimentali

temperatura della prova, pH durante la prova, durata della o delle fasi di esposizione;

 

Risultati

consumo specifico di ossigeno dei controlli (mg di O2/(g fanghi × h);

insieme dei dati calcolati, curva o curve di inibizione e metodo di calcolo di EC50,

EC50 e, se possibile, limiti di confidenza al 95 %, eventualmente EC20, EC80; eventualmente NOEC e metodi statistici utilizzati, se non è possibile determinare il valore EC50;

risultati per l'inibizione totale e, se del caso, dell'inibizione dovuta alla respirazione eterotrofica e di quella dovuta alla nitrificazione;

consumo abiotico di ossigeno nel controllo chimico-fisico (se utilizzato);

nome della sostanza chimica di riferimento e risultati ottenuti con la stessa;

tutte le osservazioni e le eventuali deviazioni dal protocollo standard che potrebbero aver condizionato il risultato.

BIBLIOGRAFIA

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(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OCSE (1984), Fanghi attivi: saggio di inibizione della respirazione, linea guida dell'OCSE n. 209 (Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209), Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

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Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

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Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Appendice 1

Definizioni

Le definizioni seguenti si applicano al presente metodo di prova.

Sostanza chimica : sostanza o miscela.

ECx (concentrazione efficace all'x %) : concentrazione che determina un effetto pari all'x % sugli organismi sperimentali in un determinato periodo di esposizione rispetto al controllo. Ad esempio, EC50 è una concentrazione che si ritiene produca un effetto su un endpoint in esame nel 50 % della popolazione esposta nel corso di un determinato periodo di esposizione.

NOEC ( no observed effect concentration — concentrazione senza effetti osservabili): concentrazione della sostanza chimica in esame alla quale non si osserva alcun effetto. Nella presente prova, in un determinato periodo di esposizione, la concentrazione che corrisponde alla NOEC non ha alcun effetto statisticamente significativo (p < 0,05) rispetto al controllo.

Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova.

Appendice 2

Figura 1 —   Esempi di dispositivi di misurazione

Image

Legenda

1

fanghi attivi

2

mezzo artificiale

3

sostanza chimica in esame

4

aria

5

recipiente di miscelazione

6

agitatore magnetico

7

cella per la misurazione dell'ossigeno

8

elettrodo a ossigeno

9

strumento per la misurazione dell'ossigeno

10

dispositivo di registrazione

Appendice 3

Figura 2 —   Esempio di unità di misurazione, utilizzando una bottiglia per BOD

Image

Legenda

1

recipiente di prova

2

elettrodo a ossigeno

3

strumento per la misurazione dell'ossigeno

Appendice 4

Figura 3 —   Esempi di curve di inibizione

Image

Legenda

X

concentrazione di 3,5-diclorofenolo (mg/l)

Y

inibizione ( %)

Image

inibizione della respirazione eterotrofica utilizzando fanghi nitrificanti

Image

inibizione della nitrificazione utilizzando fanghi nitrificanti

»

(5)

Il capitolo C.26. è sostituito dal seguente:

«

C.26   PROVA DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA DI SPECIE DI LEMNA

INTRODUZIONE

1.

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 221 (2006). È destinato a valutare la tossicità delle sostanze chimiche nei confronti delle piante acquatiche di acqua dolce del genere Lemna (lenticchia d'acqua). Si basa su metodi esistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6) ma include le modifiche apportate a questi metodi in modo da tenere conto sia degli ultimi progressi della ricerca sia delle consulenze di esperti su una serie di aspetti fondamentali. Il metodo qui proposto è stato convalidato da una prova interlaboratorio (ring test) internazionale (7).

2.

Il presente metodo illustra come condurre prove di tossicità su Lemna gibba e Lemna minor, due specie ampiamente studiate e che sono oggetto delle norme i cui riferimenti sono indicati in precedenza. La tassonomia di Lemna spp. è complessa a causa dell'esistenza di numerosi fenotipi. Benché la variabilità genetica di Lemna possa influire sulla risposta alle sostanze tossiche, i dati di cui disponiamo attualmente su questa fonte di variabilità sono insufficienti per raccomandare l'utilizzo di un clone specifico nel presente metodo di prova. Occorre rilevare che, sebbene la prova non sia effettuata con colture pure, sono adottate misure in varie fasi della procedura per mantenere al minimo la contaminazione da parte di altri organismi.

3.

Sono descritte dettagliatamente le procedure con rinnovo (procedura semistatica e a flusso continuo) e senza rinnovo (procedura statica) della soluzione di prova. In funzione degli obiettivi della prova e dei requisiti normativi si raccomanda di valutare l'uso di metodi semistatici e continui, per esempio per le sostanze che spariscono rapidamente dalla soluzione per volatilizzazione, fotodegradazione, precipitazione o biodegradazione. Ulteriori orientamenti sono contenuti nel riferimento bibliografico (8).

4.

L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.

PRINCIPIO DELLA PROVA

5.

Si allestiscono monoculture di piante del genere Lemna a crescita esponenziale con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame per un periodo di sette giorni. L'obiettivo della prova è quantificare gli effetti della sostanza chimica sulla crescita vegetativa nel corso di questo periodo, sulla base della valutazione di determinate variabili di misura. Il numero di fronde è la principale variabile di misurazione. Viene misurata almeno un'altra variabile (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), in quanto alcune sostanze chimiche possono avere un effetto più pronunciato su variabili di misurazione diverse dal numero di fronde. Per quantificare gli effetti della sostanza chimica, si confronta la crescita nelle soluzioni di prova con quella che avviene nei controlli e si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione della crescita (per esempio 50 %), espressa come ECx (per esempio EC50).

6.

L'endpoint della prova è l'inibizione della crescita, espressa come l'aumento logaritmico della variabile di misurazione (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A partire dai tassi di crescita specifici medi registrati in una serie di soluzioni di prova, si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del tasso di crescita (per esempio 50 %), espressa come ErCx (ad esempio ErC50).

7.

Un'altra variabile di risposta utilizzata nel presente metodo di prova è il rendimento, che può essere necessario utilizzare per soddisfare requisiti normativi specifici di alcuni paesi. È definito come la differenza tra il valore delle variabili di misurazione al termine del periodo di esposizione e il valore delle variabili di misurazione all'inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova, si determina la concentrazione che causa una data percentuale di inibizione del rendimento (per esempio 50 %), espressa come EyCx (ad esempio EyC50).

8.

Si possono inoltre determinare mediante un calcolo statistico la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC).

INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME

9.

Occorre disporre di un metodo analitico con un'adeguata sensibilità per la quantificazione della sostanza chimica nel mezzo di prova.

10.

Le informazioni sulla sostanza chimica in esame che possono essere utili per stabilire le condizioni sperimentali comprendono la formula strutturale, la purezza, l'idrosolubilità, la stabilità in acqua e alla luce, la pKa, il Kow, la pressione di vapore e la biodegradabilità. L'idrosolubilità e la pressione di vapore possono essere utilizzate per calcolare la costante della legge di Henry, che indica se possono verificarsi perdite significative della sostanza chimica in esame nel corso della prova. Tale calcolo consente di sapere se occorre adottare misure specifiche per tenere sotto controllo le perdite. Quando le informazioni sulla solubilità e la stabilità della sostanza chimica in esame sono incerte, si consiglia di verificarle nelle condizioni sperimentali, ossia nel mezzo di crescita, alla temperatura e con l'illuminazione che si utilizzeranno nella prova.

11.

Quando la regolazione del pH del mezzo di prova è particolarmente importante, ossia quando si saggiano metalli o sostanze chimiche idroliticamente instabili, si raccomanda di aggiungere un tampone al mezzo di crescita (cfr. paragrafo 21). Al riferimento (8) sono forniti ulteriori orientamenti per saggiare sostanze chimiche le cui proprietà fisicochimiche rendono difficile la conduzione delle prove.

VALIDITÀ DELLA PROVA

12.

Affinché la prova sia valida, il tempo di raddoppio del numero di fronde nei controlli deve essere inferiore a 2,5 giorni (60 ore), che corrisponde approssimativamente ad una moltiplicazione per sette in sette giorni e a un tasso di crescita specifico medio di 0,275 g–1. Utilizzando il mezzo e le condizioni sperimentali descritti nel presente metodo, questo criterio può essere soddisfatto mediante una procedura statica (5), partendo comunque dal principio che può essere soddisfatto anche con prove semistatiche o a flusso continuo. Il calcolo del tempo di raddoppio è illustrato nel paragrafo 49.

SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO

13.

La procedura sperimentale può essere verificata saggiando sostanze chimiche di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (7). Si consiglia di effettuare una prova con una sostanza chimica di riferimento almeno due volte l'anno o, qualora la prova sia realizzata con una frequenza inferiore, parallelamente alla determinazione della tossicità della sostanza chimica in esame.

DESCRIZIONE DEL METODO

Apparecchiatura

14.

Tutte le apparecchiature che entrano in contatto con i mezzi di prova devono essere di vetro o di un altro materiale chimicamente inerte. Le apparecchiature di vetro utilizzate per le colture e le prove devono essere sterili e esenti da contaminanti chimici che potrebbero penetrare nel mezzo di prova. I recipienti devono essere sufficientemente ampi da consentire alle fronde delle varie colonie dei recipienti di controllo di crescere senza sovrapporsi fino alla fine della prova. Le radici possono toccare il fondo dei recipienti, ma si consiglia di utilizzare recipienti con una profondità minima di 20 mm e un volume minimo di 100 ml. La scelta dei recipienti non riveste particolare importanza a condizione che si rispettino i suddetti requisiti. Becher di vetro, cristallizzatori o piastre Petri di vetro di dimensioni adeguate si sono dimostrati recipienti adatti. I recipienti di prova devono essere coperti per minimizzare l'evaporazione e la contaminazione accidentale, pur consentendo il ricambio d'aria necessario. Sono indicati recipienti di prova, e in particolare i rispettivi coperchi, che non creano zone d'ombra o alterano le caratteristiche dello spettro luminoso.

15.

Le colture e i recipienti di prova non devono essere tenuti insieme; è quindi opportuno utilizzare camere di crescita ambientali, incubatori o stanze separati. L'illuminazione e la temperatura devono essere regolabili e mantenute ad un livello costante (cfr. paragrafi 35-36).

Organismo sperimentale

16.

L'organismo utilizzato per questa prova è Lemna gibba o Lemna minor. L'appendice 2 contiene una breve descrizione delle specie di lenticchia d'acqua che sono state utilizzate per le prove di tossicità. Il materiale vegetale può essere ottenuto da una collezione di colture, da un altro laboratorio o raccolto sul terreno. In quest'ultimo caso, le piante vanno tenute nel mezzo che sarà utilizzato per le prove per almeno otto settimane prima del loro impiego. Le colture di partenza sono prelevate solo da siti chiaramente esenti da fonti evidenti di inquinamento. Se le colture provengono da un altro laboratorio o da una collezione, devono essere tenute nelle stesse condizioni per almeno tre settimane. La fonte del materiale vegetale, nonché la specie e il clone (se noto) utilizzati per la prova devono sempre essere indicati.

17.

Occorre utilizzare delle monoculture, chiaramente esenti da contaminazioni da parte di altri organismi come alghe e protozoi. Le piante sane di L. minor formano colonie comprendenti da due a cinque fronde, mentre le colonie sane di L. gibba possono presentare fino a sette fronde.

18.

La qualità e l'uniformità delle piante utilizzate per la prova avranno un impatto significativo sui risultati della stessa e vanno pertanto selezionate con cura. Occorre utilizzare piante giovani, in rapida crescita, prive di lesioni visibili e di parti scolorite (clorosi). Le colture di buona qualità presentano molte colonie con almeno due fronde. Un elevato numero di fronde singole è indizio di stress ambientale, ad esempio per scarsità di nutrienti, per cui materiale vegetale proveniente da colture con queste caratteristiche non deve essere utilizzato per le prove.

Colture

19.

Per ridurre la frequenza delle operazioni di manutenzione (per esempio, se per un certo periodo non si prevedono prove su Lemna), le colture possono essere conservate ad un'illuminazione e una temperatura ridotte (4-10 °C). Informazioni dettagliate sulle tecniche di coltura sono riportate nell'appendice 3. In caso di segni evidenti di contaminazione da parte di alghe o altri organismi è opportuno sterilizzare superficialmente un sottocampione di fronde di Lemna e trasferirlo in un terreno nuovo (cfr. appendice 3). In tal caso la parte restante della coltura contaminata va eliminata.

20.

Almeno sette giorni prima della prova, un numero sufficiente di colonie è trasferito, in condizioni asettiche, in un mezzo sterile nuovo ed è coltivato per 7-10 giorni nelle condizioni previste per la prova.

Mezzo di prova

21.

I vari mezzi raccomandati per Lemna minor e Lemna gibba sono descritti di seguito. L'aggiunta di un tampone di pH nel mezzo di prova (MOPS (acido 4-morfolinopropanosulfonico, n. CAS 1132-61-2) nel mezzo per L. minor e NaHCO3 nel mezzo per L. gibba) va ponderata con attenzione se si sospetta che possa interagire con la sostanza chimica in esame e condizionare l'espressione della sua tossicità. È possibile impiegare anche il mezzo di Steinberg (9), a condizione che siano rispettati i criteri di validità.

22.

Per le colture e le prove con L. minor si raccomanda l'uso di una versione modificata del mezzo di crescita della norma svedese (SIS). La composizione di questo mezzo è riportata nell'appendice 4.

23.

Per le colture e le prove con L. gibba si raccomanda l'uso del mezzo di crescita 20X — AAP, descritto nell'appendice 4.

24.

Per L. minor è adatto anche il mezzo di Steinberg, descritto nell'appendice 4, che può essere utilizzato anche per L. gibba a condizione che siano rispettati i criteri di validità.

Soluzioni di prova

25.

In genere le soluzioni di prova sono preparate mediante diluizione di una soluzione madre. Le soluzioni madre della sostanza chimica in esame sono solitamente preparate sciogliendo detta sostanza nel mezzo di crescita.

26.

La concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame non deve di norma superare il limite di solubilità della sostanza stessa in acqua, nelle condizioni di prova. Va rilevato, tuttavia, che le specie di Lemna galleggiano in superficie e rischiano di essere esposte a sostanze che si accumulano nell'interfaccia acqua-aria (per esempio sostanze a bassa idrosolubilità, idrofobe o tensioattivi). In tali circostanze l'esposizione risulterà da materiale diverso da quello presente nella soluzione, quindi le concentrazioni di prova potrebbero, in funzione delle caratteristiche della sostanza chimica in esame, essere superiori al limite di idrosolubilità. Per le sostanze chimiche a bassa idrosolubilità potrà essere necessario preparare una soluzione madre concentrata o disperdere la sostanza chimica utilizzando un solvente o un disperdente organico, al fine di agevolare l'aggiunta di quantità esatte della sostanza chimica in esame nel mezzo di prova e favorirne la dispersione e la dissoluzione. Occorre fare il possibile per evitare di utilizzare materiali di questo tipo. L'uso di solventi o disperdenti ausiliari non deve causare alcuna fitotossicità. Tra i solventi di uso comune che non provocano fitotossicità a concentrazioni fino a 100 μl/1 rientrano, ad esempio, l'acetone e il dimetilformammide. Se si utilizza un solvente o un disperdente, la sua concentrazione finale deve essere comunicata e tenuta al minimo (ossia ≤ 100 μl/1); deve inoltre essere identica in tutti i recipienti trattati e di controllo. Per ulteriori informazioni sull'uso dei disperdenti si veda il riferimento (8).

Gruppi di prova e gruppi di controllo

27.

Per determinare le concentrazioni sperimentali adeguate è utile conoscere già la tossicità della sostanza chimica in esame nei confronti di Lemna, per esempio sulla base di precedenti prove a diversi intervalli di concentrazione. Nella prova di tossicità definitiva di norma si devono scegliere almeno cinque concentrazioni in progressione geometrica. Di preferenza il fattore di separazione tra le concentrazioni non deve essere superiore a 3,2, ma si può utilizzare un valore più elevato se la curva concentrazione-risposta è piatta. L'uso di un numero di concentrazioni inferiore a cinque va giustificato. Occorre impiegare almeno tre repliche per ogni concentrazione di prova.

28.

Nel fissare l'intervallo delle concentrazioni di prova (per le prove di determinazione dell'intervallo e/o la prova di tossicità definitiva), occorre tenere presente quanto segue:

per determinare la ECx, le concentrazioni di prova devono situarsi intorno al valore ECx per garantire un intervallo di confidenza adeguato. Per esempio, quando si valuta la EC50, la concentrazione di prova più alta deve essere superiore al valore EC50. Se il valore EC50 si situa fuori dall'intervallo delle concentrazioni in esame i relativi intervalli di confidenza saranno ampi, il che rischia di impedire una valutazione corretta dell'adeguamento statistico del modello;

quando la finalità è valutare la LOEC/NOEC, la concentrazione di prova più bassa deve essere bassa a sufficienza affinché la crescita del gruppo trattato non sia significativamente inferiore a quella dei controlli. Inoltre la concentrazione di prova più alta deve essere alta a sufficienza affinché la crescita sia significativamente inferiore a quella dei controlli. In caso contrario, occorrerà ripetere la prova utilizzando un intervallo di concentrazione diverso (a meno che la concentrazione più alta coincida con il limite di solubilità o con la concentrazione limite massima richiesta, per esempio 100 mg/1).

29.

Ogni prova deve prevedere controlli con mezzo nutriente, numero di fronde e colonie, condizioni ambientali e procedure (come i recipienti di prova) identici a quelli dei recipienti trattati, ma senza la sostanza chimica in esame. Qualora si utilizzi un solvente o un disperdente ausiliario, la prova deve includere un controllo supplementare con il solvente/disperdente alle stesse concentrazioni utilizzate nei recipienti contenenti la sostanza chimica in esame. Il numero dei recipienti di controllo identici, e degli eventuali recipienti con solvente, deve essere almeno pari al numero dei recipienti utilizzati per ciascuna concentrazione di prova, e idealmente il doppio di tale numero.

30.

Se la determinazione della NOEC non è necessaria, la prova può essere modificata in modo da aumentare il numero di concentrazioni e ridurre il numero di repliche per concentrazione. Tuttavia le repliche dei controlli devono essere almeno tre.

Esposizione

31.

Si prelevano colonie, composte da 2 a 4 fronde visibili, dalle colture dell'inoculo e si distribuiscono a caso nei recipienti di prova in condizioni asettiche. Ciascun recipiente di prova deve contenere complessivamente da 9 a 12 fronde. Il numero di fronde e di colonie deve essere uguale in ciascun recipiente. L'esperienza acquisita con questo metodo e i dati ottenuti con la prova interlaboratorio (ring-test) indicano che bastano tre repliche per trattamento (con 9 - 12 fronde iniziali per replica) per individuare differenze di crescita tra i trattamenti dell'ordine del 4 % - 7 % per l'inibizione calcolata in base al tasso di crescita e del 10 % - 15 % per l'inibizione calcolata in base al rendimento (7).

32.

La disposizione dei recipienti di prova nell'incubatore deve essere casuale per ridurre al minimo l'influenza delle differenze spaziali in termini di intensità luminosa o termica. È inoltre necessario cambiare la posizione dei recipienti, per blocchi o in modo casuale, dopo le osservazioni (o più spesso).

33.

Se una prova di stabilità preliminare indica che nel corso della prova (7 giorni) la concentrazione della sostanza chimica in esame non può essere mantenuta (ossia la concentrazione misurata diminuisce più dell'80 % della concentrazione misurata inizialmente), si raccomanda di impiegare una procedura sperimentale semistatica. In tal caso, occorre esporre le colonie a soluzioni di prova e di controllo nuove almeno due volte durante la prova (per esempio, il 3o e il 5o giorno). La frequenza dell'esposizione al mezzo fresco dipenderà dalla stabilità della sostanza chimica in esame; una frequenza più elevata può essere necessaria per mantenere concentrazioni pressoché costanti nel caso di sostanze chimiche ad elevata volatilità o instabilità. In alcune circostanze può essere necessario ricorrere a una procedura a flusso continuo (8)(10).

34.

L'esposizione mediante un'applicazione fogliare (polverizzazione) non è contemplata nel presente metodo di prova; per informazioni in proposito si veda il riferimento bibliografico (11).

Condizioni di incubazione

35.

Occorre fornire un'illuminazione continua a fluorescenza bianca, calda o fredda, al fine di ottenere un'intensità luminosa compresa tra 85 e 135 μE · m– 2s– 1, misurata in una radiazione fotosinteticamente attiva (da 400 a 700 nm) in punti situati a una distanza dalla fonte luminosa identica a quella delle fronde di Lemna (intensità equivalente a 6 500-10 000 lux). Eventuali differenze rispetto all'intensità luminosa prescelta non devono superare, in tutta la zona in cui è condotta la prova, ± 15 %. Il metodo di rilevamento e misurazione della luce, in particolare il tipo di sensore, inciderà sul valore misurato. I sensori sferici (che rilevano la luce proveniente da tutti gli angoli situati sopra e sotto il piano di misurazione) e i sensori cosinusoidali (che rilevano la luce da tutti gli angoli situati sopra il piano di misurazione) sono preferibili ai sensori unidirezionali e indicheranno valori più elevati per una fonte luminosa multipla come quella qui descritta.

36.

La temperatura nei recipienti di prova deve essere mantenuta a 24 ± 2 °C. Il pH del mezzo di controllo non deve aumentare di oltre 1,5 unità nel corso della prova. Uno scarto superiore a 1,5 unità non invalida tuttavia la prova se il rispetto dei criteri di validità può essere dimostrato. In determinati casi occorre prestare particolare attenzione alle variazioni del pH, in particolare quando si saggiano sostanze chimiche instabili e metalli. Per ulteriori indicazioni al riguardo, si veda il riferimento bibliografico (8).

Durata

37.

La prova termina sette giorni dopo il trasferimento delle piante nei recipienti di prova.

Misurazioni e determinazioni analitiche

38.

All'inizio della prova si conta e si registra il numero di fronde contenute nei recipienti di prova, avendo cura di contare tutte le fronde emergenti chiaramente visibili. Il numero di fronde che presentano un aspetto normale o anomalo deve essere determinato all'inizio della prova, almeno una volta ogni tre giorni nel periodo di esposizione (ossia almeno due volte nell'arco dei sette giorni) e alla fine della prova. Occorre registrare anche le modifiche riscontrate nello sviluppo delle piante per quanto riguarda, per esempio, la dimensione e l'aspetto delle fronde, i segni di necrosi, clorosi e gibbosità, la frammentazione delle colonie o la diminuzione della loro galleggiabilità, nonché la lunghezza e l'aspetto delle radici. È anche necessario registrare le caratteristiche salienti del mezzo di prova (per esempio la presenza di materiale in sospensione, lo sviluppo di alghe nei recipienti di prova).

39.

Durante le prova, oltre a determinare il numero di fronde, si misurano gli effetti della sostanza chimica in esame su una o più delle seguenti variabili:

(i)

area totale delle fronde,

(ii)

peso secco,

(iii)

peso fresco.

40.

L'area totale delle fronde presenta il vantaggio di potere essere determinata per ciascun recipiente di prova e di controllo all'inizio, durante e al termine della prova. Il peso secco o fresco è determinato all'inizio della prova, utilizzando un campione della coltura di inoculo rappresentativo del materiale impiegato per avviare la prova, e alla fine della prova, con il materiale vegetale di ciascun recipiente di prova e di controllo. Se l'area delle fronde non è misurata, il peso secco è da preferirsi al peso fresco.

41.

L'area totale delle fronde, il peso secco e il peso fresco possono essere determinati nel modo seguente:

(i)

area totale delle fronde: l'area totale delle fronde di tutte le colonie può essere determinata mediante l'analisi dell'immagine. Con una videocamera si rileva la sagoma del recipiente di prova e delle piante (ponendo il recipiente su un illuminatore) e si digitalizza l'immagine ottenuta. A partire da una calibrazione realizzata con forme piane di superficie conosciuta si determina l'area totale delle fronde di ciascun recipiente di prova. Occorre evitare attentamente le interferenze causate dal bordo del recipiente. Un metodo più elaborato consiste nel fotocopiare i recipienti di prova e le piante, ritagliare la risultante sagoma delle colonie e determinarne la superficie mediante un analizzatore della superficie fogliare oppure carta millimetrata. Si possono utilizzare anche altre tecniche (per esempio il quoziente del peso della sagoma ritagliata nella carta per il peso di un pezzo di carta di superficie nota);

(ii)

peso secco: tutte le colonie di ciascun recipiente di prova sono prelevate e sciacquate con acqua distillata o deionizzata; sono poi poste su carta assorbente, che ne assorbe l'acqua in eccesso, e asciugate a 60 °C fino a ottenere un peso costante. Eventuali frammenti di radici devono essere inclusi. Il peso secco deve essere espresso con una precisione di almeno 0,1 mg;

(iii)

peso fresco: tutte le colonie sono trasferite in tubi di polistirolo (o altro materiale inerte) tarati, con fondo arrotondato e bucherellato (fori di 1 mm). I tubi sono in seguito centrifugati a 3 000 gpm per 10 minuti a temperatura ambiente. I tubi contenenti le colonie così asciugate sono nuovamente pesati e il preso fresco è calcolato per sottrazione della tara del tubo.

Frequenza delle misurazioni e delle determinazioni analitiche

42.

Se si applica una procedura statica, il pH di ciascun recipiente trattato deve essere misurato all'inizio e alla fine della prova. Se la procedura è semistatica, il pH deve essere misurato in ciascun lotto di soluzione di prova “nuova” prima di ogni rinnovo, così come nelle soluzioni “usate” corrispondenti.

43.

L'intensità luminosa è misurata nella camera di crescita, nell'incubatore o nella stanza in punti situati a una distanza dalla fonte luminosa identica a quella delle fronde di Lemna. La misurazione deve essere effettuata almeno una volta nel corso della prova. La temperatura del mezzo è registrata almeno una volta al giorno in un recipiente appositamente allestito a questo scopo e conservato alle stesse condizioni degli altri nella camera di crescita, nell'incubatore o nella stanza.

44.

Durante la prova, le concentrazioni della sostanza chimica in esame sono determinate a congrui intervalli. Nelle prove statiche, le concentrazioni devono essere rilevate almeno all'inizio e alla fine della prova.

45.

Nelle prove semistatiche in cui si presume che la concentrazione della sostanza chimica in esame non si mantenga entro un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale è necessario analizzare tutte le soluzioni di prova appena vengono preparate e al momento del rinnovo (cfr. paragrafo 33). Tuttavia, per le prove in cui la concentrazione della sostanza chimica in esame misurata inizialmente non si situa in un intervallo di ± 20 % del valore nominale, ma in cui un numero sufficiente di indizi dimostra che le concentrazioni iniziali sono ripetibili e stabili (ossia nell'intervallo tra 80 % e 120 % della concentrazione iniziale), le determinazioni chimiche possono limitarsi solo alla concentrazione di prova più alta e a quella più bassa. In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza chimica in esame prima del rinnovo deve essere effettuata su una sola replica per ciascuna concentrazione di prova (o in un recipiente in cui è stato mescolato il contenuto di tutti i recipienti trattati in modo identico).

46.

Nel caso delle prove con procedura a flusso continuo si può applicare uno schema di campionamento identico a quello descritto per le prove semistatiche, con un'analisi all'inizio, a metà e al termine della prova, ma senza l'analisi delle soluzioni “usate”, che in questo caso non è necessaria. In questo tipo di prova deve essere controllato giornalmente la velocità di flusso del diluente e della sostanza chimica in esame oppure della soluzione madre della sostanza chimica in esame.

47.

Se è comprovato che la concentrazione della sostanza chimica in esame si è mantenuta nel corso dell'intera prova entro un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata all'inizio, l'analisi dei risultati può basarsi sui valori nominali o quelli misurati all'inizio. Se lo scarto rispetto alla concentrazione nominale o quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati dovrà basarsi sulla media geometrica della concentrazione durante l'esposizione o su modelli che descrivono la diminuzione della concentrazione della sostanza chimica in esame (8).

Prova limite

48.

In determinate circostanze, per esempio quando una prova preliminare indica che la sostanza chimica in esame non ha effetti tossici in concentrazioni fino a 100 mg/l oppure fino al suo limite di solubilità nel mezzo di prova (si scelga il valore più basso), può essere svolta una prova limite che consiste nel confrontare le risposte di un gruppo di controllo e di un gruppo trattato (a una concentrazione di 100 mg/l o pari al limite di solubilità della sostanza chimica in esame nel mezzo di prova). È vivamente raccomandato che l'assenza di tossicità sia corroborata da un'analisi della concentrazione di esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero delle repliche trattate, che deve essere raddoppiato. La crescita nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato può essere analizzata mediante una prova statistica di confronto delle medie, per esempio un test t di Student.

DATI E RELAZIONI

Tempo di raddoppio

49.

Per determinare il tempo di raddoppio (Td) del numero di fronde e verificare se lo studio rispetta questo criterio di validità (paragrafo 12), si applica la formula seguente ai dati risultanti dai controlli:

Td = ln 2/μ

in cui μ è il tasso di crescita specifico medio determinato secondo quanto indicato nei paragrafi 54-55.

Variabili di risposta

50.

La finalità di questa prova è di determinare gli effetti della sostanza chimica in esame sulla crescita vegetativa di Lemna. Il presente metodo di prova descrive due variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione di entrambe le variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito:

(a)

tasso di crescita specifico medio, calcolato in base al cambiamento logaritmico del numero di fronde e, in aggiunta, all'evoluzione logaritmica di un altro parametro di misurazione (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) nel corso del tempo (espresso in giorni) nei gruppi di controllo e in ciascun gruppo trattato. Talvolta viene definito “tasso di crescita relativo” (12);

(b)

rendimento, calcolato in base ai cambiamenti del numero di fronde e a un altro parametro aggiuntivo di misurazione (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) nei gruppi di controllo e in ciascun gruppo trattato fino alla fine della prova.

51.

Occorre rilevare che i valori della tossicità calcolati utilizzando queste due variabili di risposta non sono comparabili, per cui occorre tenere conto di questa differenza al momento di utilizzare i risultati della prova. I valori dell'ECx basati sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (EyCx), se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non va considerata una differenza di sensibilità tra le due suddette variabili di risposta. Il concetto di tasso di crescita specifico medio si basa sull'andamento generale della crescita esponenziale delle lenticchie d'acqua in colture non soggette a limitazioni; la tossicità è valutata in base agli effetti sul tasso di crescita, senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico dei controlli, della curva discendente concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sul rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. L'EyCx dipende dal tasso di crescita specifico della specie di lenticchia d'acqua utilizzata in ogni prova e dal tasso di crescita specifico massimo che può variare da una specie all'altra, se non addirittura da un clone all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche di specie diverse né di cloni diversi di lenticchie d'acqua. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, stimare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, per soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi il presente metodo di prova include anche la stima basata sul rendimento.

52.

La stima della tossicità deve basarsi sul numero di fronde e su un'altra variabile di misura (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), perché alcune sostanze chimiche possono avere un effetto più marcato su una variabile diversa dal numero di fronde. Questo effetto potrebbe passare inosservato se il calcolo si basa unicamente sul numero di fronde.

53.

In una tabella si registrano il numero di fronde e qualsiasi altra variabile di risposta misurata (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), insieme alle concentrazioni della sostanza chimica in esame rilevate in ogni misurazione. Le analisi successive, per esempio per stimare la LOEC, la NOEC o l'ECx devono basarsi sui valori di ciascuna replica e non sulle medie calcolate di ciascun gruppo trattato.

Tasso di crescita specifico medio

54.

Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è calcolato in funzione dell'aumento logaritmico delle variabili di crescita — numero di fronde e un'altra variabile di misura (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco) — utilizzando la formula riportata qui di seguito per ciascuna replica dei gruppi di controllo e dei gruppi trattati:

Formula

dove:

μi-j

è il tasso di crescita specifico medio dal momento i al momento j,

Ni

è la variabile di misurazione nel recipiente di prova o di controllo nel momento i,

Nj

è la variabile di misurazione nel recipiente di prova o di controllo nel momento j,

t

è il periodo di tempo tra i e j.

Per ciascuno gruppo trattato e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita e le relative stime della varianza.

55.

Occorre calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero periodo di prova (i momenti “i” e “j” nella formula suindicata corrispondono rispettivamente all'inizio e alla fine della prova). Per ciascuna concentrazione dei gruppi trattati e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita specifico e le rispettive stime della varianza. Occorre inoltre valutare il tasso di crescita in ogni sezione della prova per verificare gli effetti della sostanza chimica in esame durante il periodo di esposizione (per esempio, analizzando le curve di crescita dopo trasformazione logaritmica). Una differenza importante tra il tasso di crescita sezione per sezione e il tasso di crescita medio sta ad indicare l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, il che richiede un attento esame delle curve di crescita. In tal caso, un approccio prudente consiste nel confrontare i tassi di crescita specifici delle colture trattate durante il periodo di inibizione massima con quelli dei controlli nello stesso periodo.

56.

La percentuale di inibizione del tasso di crescita (Ir) può essere successivamente calcolata per ciascuna concentrazione di prova (gruppo trattato) secondo la formula seguente:

Formula

dove:

:

% Ir

:

è la percentuale di inibizione del tasso di crescita specifico medio,

:

μC

:

è il valore medio di μ nel gruppo di controllo,

:

μT

:

è il valore medio di μ nel gruppo trattato.

Rendimento

57.

Gli effetti sul rendimento sono determinati in funzione di due variabili di misurazione: il numero di fronde e un'altra variabile (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), per ciascun recipiente di prova all'inizio e al termine della prova. Per quanto riguarda il peso secco o il peso fresco, la biomassa di partenza è determinata a partire da un campione di fronde prelevato dallo stesso lotto utilizzato per inoculare i recipienti di prova (cfr. paragrafo 20). Per ciascuna concentrazione di prova e di controllo occorre calcolare un valore medio di rendimento nonché le stime della varianza. Per ogni gruppo trattato la percentuale media di inibizione del rendimento (% Iy) può essere calcolata secondo la formula seguente:

Formula

dove:

% Iy

è la percentuale di riduzione del rendimento,

bC

è la biomassa finale meno la biomassa di partenza del gruppo di controllo,

bT

è la biomassa finale meno la biomassa di partenza del gruppo trattato.

Tracciato delle curve concentrazione-risposta

58.

Occorre tracciare curve concentrazione-risposta che raffigurano la percentuale d'inibizione media della variabile di risposta (Ir oppure Iy calcolate come indicato nei paragrafi 56 o 57) e il logaritmo della concentrazione della sostanza chimica in esame.

Stima dell'ECx

59.

Le stime dell'ECx (ad esempio, l'EC50) devono essere basate sia sul tasso di crescita specifico medio (ErCx) sia sul rendimento (EyCx), che devono, a loro volta, basarsi sul numero di fronde e su un'altra variabile di misurazione (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco), in quanto alcune sostanze chimiche in esame producono effetti diversi sul numero di fronde e su altre variabili di misurazione. I parametri di tossicità ricercati corrispondono pertanto a quattro valori di ECx per ciascun livello di inibizione x calcolato: ErCx (numero di fronde); ErCx (area totale delle fronde, peso secco o pesco fresco); EyCx (numero di fronde); e EyCx (area totale delle fronde, peso secco o peso fresco).

Procedure statistiche

60.

L'obiettivo consiste nel descrivere in maniera quantitativa, mediante un'analisi della regressione, la relazione concentrazione-risposta. È possibile utilizzare una regressione lineare ponderata, preceduta da una trasformazione di linearizzazione dei dati di risposta — per esempio in unità probit, logit o Weibull (13) -, ma è preferibile applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle inevitabili irregolarità dei dati e degli scarti rispetto alle distribuzioni regolari. Vicine allo zero o all'inibizione totale, queste irregolarità possono essere amplificate dalla trasformazione e interferire con l'analisi (13). Si fa presente che i metodi analitici standard che utilizzano le trasformazioni probit, logit, o Weibull si applicano a dati quantali (per esempio, mortalità o sopravvivenza) e devono quindi essere modificati per poter essere utilizzati con i dati relativi alla crescita o al rendimento. Per le procedure che consentono di determinare i valori dell'ECx a partire da dati continui si vedano i riferimenti (14)(15)(16).

61.

Per ciascuna variabile di risposta da analizzare, occorre utilizzare la relazione concentrazione-risposta per stimare valori puntuali dell'ECx. Laddove possibile si determinano i limiti di confidenza a 95 % per ogni stima. La corrispondenza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione deve essere valutata graficamente o con metodi statistici. L'analisi della regressione deve essere effettuata basandosi sulle risposte rilevate in ogni replica e non sulle medie dei gruppi trattati.

62.

Le stime dell'EC50 e gli intervalli di confidenza possono essere ottenuti anche mediante interpolazione lineare con bootstrapping (17), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.

63.

Per stimare la LOEC, e quindi la NOEC, è necessario paragonare le medie dei gruppi trattati mediante tecniche di analisi della varianza (ANOVA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli ricorrendo a un metodo adeguato di comparazione multipla o di analisi della tendenza. A questo proposito possono essere utili i test di Dunnett o di Williams (18)(19)(20)(21). È necessario valutare se l'ipotesi di omogeneità della varianza dell'ANOVA è fondata, valutazione che può essere effettuata graficamente o tramite una prova formale (22), ad esempio i test di Levene o di Bartlett. Se l'ipotesi dell'omogeneità della varianza non si conferma, può essere talvolta utile correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. Se l'eterogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta mediante una trasformazione, si prenderanno in considerazione metodi di analisi della tendenza come, ad esempio, i test di tendenza regressivi di Jonckheere. Il riferimento bibliografico (16) fornisce ulteriori orientamenti sulla determinazione della NOEC.

64.

Alcuni sviluppi scientifici recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare l'abbandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali dell'ECx basate sulla regressione. Per questa prova su Lemna non è stato definito alcun valore appropriato di x. Tuttavia un intervallo da 10 % a 20 % sembra appropriato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile riportare sia l'EC10 sia l'EC20.

Relazioni

65.

La relazione sulla prova deve includere le informazioni indicate di seguito.

 

Sostanza chimica in esame:

stato fisico e proprietà fisico-chimiche, compreso il limite di solubilità in acqua,

dati di identificazione chimica (per esempio il numero CAS), compresa la purezza (impurità).

 

Specie sperimentali:

nome scientifico, clone (se noto) e provenienza.

 

Condizioni sperimentali:

procedura sperimentale utilizzata (statica, semi-statica o a flusso continuo),

data di inizio e durata della prova,

mezzo di prova,

descrizione del disegno sperimentale: recipienti e coperchi, volumi delle soluzioni, numero di colonie e di fronde per recipiente all'inizio della prova,

concentrazioni di prova (nominali e misurate, in funzione delle esigenze), numero di repliche per concentrazione,

metodi di preparazione delle soluzioni madre e delle soluzioni di prova, ivi compreso l'uso di eventuali solventi o disperdenti,

temperatura nel corso della prova,

fonte luminosa, intensità luminosa e omogeneità,

valori del pH dei mezzi di prova e di controllo,

concentrazioni della sostanza chimica in esame e rispettivo metodo di analisi, con i dati appropriati per la valutazione della qualità del metodo (studi di convalida, scarti tipo o intervalli di confidenza delle analisi),

metodi di determinazione del numero di fronde e di altre variabili di misurazione, per esempio peso secco, peso fresco o area delle fronde,

qualsiasi differenza rispetto al presente metodo di prova.

 

Risultati:

dati grezzi: numero di fronde e altre variabili di misurazione in ciascun recipiente di prova e di controllo per ciascuna osservazione e analisi,

medie e scarti tipo per ciascuna variabile di misurazione,

curve di crescita per ciascuna concentrazione (si raccomanda la trasformazione logaritmica della variabile di misurazione, si veda il paragrafo 55);

tempio di raddoppio/tasso di crescita nel controllo sulla base del numero di fronde,

calcolo delle variabili di risposta per ciascuna replica trattata, con valore medio e coefficiente di variazione delle repliche,

rappresentazione grafica della relazione concentrazione/effetto,

stime degli endpoint tossici per le variabili di risposta: per esempio EC50, EC10, EC20, e relativi intervalli di confidenza. Se calcolate, la LOEC e/o la NOEC e i metodi statistici utilizzati per determinarle,

se è stato praticato un test ANOVA, la portata dell'effetto individuato (per esempio, la differenza meno significativa),

eventuali stimoli della crescita osservati in qualsiasi gruppo trattato,

eventuali segni di fitotossicità e osservazioni delle soluzioni di prova,

discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute alle differenze rispetto al presente metodo di prova.

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(21)

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(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Appendice 1

Definizioni

Ai fini del presente metodo di prova si utilizzano le definizioni e le abbreviazioni seguenti.

Biomassa : peso secco della materia vivente presente in una popolazione. In questa prova la biomassa è misurata indirettamente, di norma mediante conteggio delle fronde e l'area delle fronde, quindi l'uso del termine “biomassa” si riferisce anche a queste misurazioni indirette.

Clone : organismo o cellula ottenuto a partire da un singolo individuo per riproduzione asessuata. Gli individui dello stesso clone sono pertanto geneticamente identici.

Clorosi : ingiallimento del tessuto delle fronde.

Colonia : aggregato di fronde madri e figlie (di norma da due a quattro) attaccate le une alle altre. Talvolta denominata “pianta”.

Concentrazione minima alla quale si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC Lowest Observed Effect Concentration ) : la concentrazione più bassa saggiata di una sostanza alla quale si osserva un effetto di riduzione statisticamente significativo della crescita (p < 0,05) rispetto al controllo, nell'arco di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni di prova superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e di conseguenza la NOEC).

Concentrazione senza effetti osservati (NOEC No Observed Effect Concentration) : concentrazione di prova immediatamente inferiore alla LOEC.

Crescita : aumento della variabile di misurazione, per esempio il numero di fronde, il peso secco, il peso umido o l'area delle fronde durante il periodo di prova.

ECx : concentrazione della sostanza chimica in esame disciolta nel mezzo di prova che determina una riduzione dell'x % (per esempio, 50 %) della crescita di Lemna entro un periodo di esposizione definito (che deve essere esplicitato se diverso dalla durata totale o normale della prova). Per indicare in modo inequivoco se il valore EC si riferisce al tasso di crescita o al rendimento si utilizzano le abbreviazioni “ErC” per il tasso di crescita e “EyC” per il rendimento, seguite dalla variabile di misurazione utilizzata, ad esempio ErC (numero di fronde).

Endpoint della prova : indica il fattore generale che sarà modificato, rispetto al controllo, dalla sostanza chimica in esame. In questo metodo di prova l'endpoint è l'inibizione della crescita che può essere espressa da più variabili di risposta dedotte da una o più variabili di misurazione.

Fenotipo : caratteristiche osservabili di un organismo, determinate dall'interazione dei suoi geni con l'ambiente.

Flusso continuo : si riferisce a una prova in cui le soluzioni di prova sono rinnovate costantemente.

Fronda : struttura individuale/singola del tipo “a foglia” di una pianta di lenticchia d'acqua. Si tratta dell'unità più piccola (individuo) in grado di riprodursi.

Gibbosità : gobba o rigonfiamento della fronda.

Mezzo di prova : mezzo di crescita sintetico completo in cui le piante sperimentali crescono quando sono esposte alla sostanza chimica in esame. Quest'ultima è di norma disciolta nel mezzo di prova.

Monocoltura : coltura con una sola specie vegetale.

Necrosi : tessuto morto delle fronde (ossia bianco o rigonfio d'acqua).

Prova semistatica (con rinnovo) : prova in cui la soluzione di prova è periodicamente sostituita a determinati intervalli durante la prova.

Prova statica : prova senza rinnovo della soluzione di prova durante la prova.

Rendimento : valore di una variabile di misurazione che esprime la differenza tra la biomassa al termine del periodo di esposizione e il valore della stessa variabile all'inizio del periodo di esposizione.

Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.

Sostanza chimica : sostanza o miscela.

Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio): aumento logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione.

Variabili di misurazione : qualsiasi tipo di variabile che viene misurata per esprimere l'endpoint della prova utilizzando una o più variabili di risposta. Nel presente metodo il numero di fronde, l'area delle fronde, il peso fresco e il peso secco sono variabili di misurazione.

Variabili di risposta : variabili per la stima della tossicità, ricavate da qualsiasi variabile di misurazione che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. Nel presente metodo di prova i tassi di crescita e il rendimento sono variabili di risposta ricavate da variabili di misurazione quali il numero di fronde, l'area delle fronde, il peso fresco e il peso secco.

Appendice 2

Descrizione di Lemna spp.

La pianta acquatica comunemente denominata “lenticchia d'acqua”, Lemna spp., appartiene alla famiglia delle Lemnaceae costituita da quattro generi presenti in tutto il mondo. La loro tassonomia e il loro aspetto sono stati descritti in maniera esaustiva (1)(2). Lemna gibba e L. minor sono specie rappresentative delle zone temperate e sono regolarmente utilizzate nelle prove di tossicità. Entrambe le specie possiedono un fusto discoide (fronda) galleggiante o sommerso e una radice estremamente sottile che parte dal centro della superficie inferiore di ogni fronda. Le specie di Lemna fioriscono raramente e si riproducono per via vegetativa dando luogo a nuove fronde (3). Rispetto alle piante più vecchie, le giovani tendono ad essere più pallide, avere radici più corte ed essere costituite da 2-3 fronde di misure diverse. Le dimensioni ridotte di Lemna, la sua struttura semplice, la riproduzione asessuata e il tempo di generazione breve rendono le piante di questo genere particolarmente adatte alle prove di laboratorio (4)(5).

Data la possibile variazione di sensibilità da una specie all'altra, sono validi solo i confronti di sensibilità all'interno della stessa specie.

Esempi di specie di Lemna utilizzati per le prove con riferimenti bibliografici

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (in svedese).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Fonti di specie di Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Tel.: +1-416-978-3641

Fax:+1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Stati Uniti

Tel.: 001 (919) 515-7572

e-mail: astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

Stoccolma

Svezia

Tel.: +46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlino

Germania

e-mail: lemna@uba.de

BIBLIOGRAFIA

1.

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

2.

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

3.

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

4.

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

5.

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Appendice 3

Conservazione di una coltura madre

Le colture madre possono essere conservate a basse temperature (4-10 °C) per lunghi periodi senza che occorra ristabilirle. Il mezzo di crescita di Lemna può essere identico a quello utilizzato per le prove, ma è possibile utilizzare anche altri mezzi ricchi di nutrienti per le colture madre.

Periodicamente si prelevano e si trasferiscono, con una tecnica asettica, piante giovani di colore verde-chiaro in nuovi recipienti di coltura contenenti mezzo fresco. Alle temperature più basse qui proposte, le sottocolture possono essere avviate anche a intervalli di tre mesi.

Occorre utilizzare recipienti di coltura in vetro sterili e chimicamente puliti (lavati con acido) e manipolare il materiale secondo tecniche asettiche. Se la coltura madre viene contaminata, per esempio da alghe o funghi, si adotteranno le misure necessarie per eliminare gli organismi contaminanti. Per le alghe e la maggior parte degli altri organismi contaminanti basta una sterilizzazione superficiale. A tal fine si preleva un campione del materiale vegetale contaminato, si tagliano le radici, si agita vigorosamente in acqua pulita e lo si immerge in una soluzione di ipoclorito di sodio a 0,5 % (v/v) per un periodo compreso tra 30 secondi e 5 minuti. In seguito si sciacqua il materiale vegetale con acqua sterile e lo si trasferisce, suddiviso per lotti, in recipienti di coltura contenenti mezzo fresco. Molte fronde moriranno dopo questo trattamento, soprattutto se il periodo di esposizione è stato lungo, ma alcune di quelle sopravvissute non saranno più contaminate e potranno essere inoculate in nuove colture.

Appendice 4

Mezzi

Si raccomandano mezzi di crescita diversi per L. minor e L. gibba: per L. minor, una versione modificata del mezzo stabilito dalla norma svedese (SIS) mentre per L. gibba, il mezzo 20X — AAP. La composizione di questi due mezzi sono riportate qui di seguito. Per preparare i mezzi occorre utilizzare sostanze chimiche di grado analitico o reagente e acqua deionizzata.

Mezzo di crescita per Lemna stabilito dalla norma svedese (SIS)

Le soluzioni madre I-V sono sterilizzate in autoclave (120 °C, 15 minuti) o mediante filtrazione su membrana (dimensione dei pori di circa 0,2 μm).

La soluzione madre VI (e opzionalmente VII) è sterilizzata solo mediante filtrazione su membrana; non deve essere sottoposta a sterilizzazione in autoclave.

Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e al buio. Le soluzioni madre I-V devono essere eliminate dopo sei mesi, mentre la soluzione madre VI (e opzionalmente VII) si conserva per un solo mese.

Soluzione madre

Sostanza

Concentrazione nella soluzione madre

(g/l)

Concentrazione nel mezzo preparato

(mg/l)

Mezzo preparato

 

 

 

 

Elemento

Concentrazione

(mg/l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4. 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2 - EDTA 2H2O

0,28

1,4

-

-

VII

MOPS (tampone)

490

490

-

-

Per ottenere un litro del mezzo SIS aggiungere gli ingredienti seguenti a 900 ml di acqua deionizzata:

10 ml di soluzione madre I

5 ml di soluzione madre II

5 ml di soluzione madre III

5 ml di soluzione madre IV

1 ml di soluzione madre V

5 ml di soluzione madre VI

1 ml di soluzione madre VII (facoltativo)

Nota: per alcune sostanze chimiche in esame può essere necessario utilizzare anche la soluzione madre VII (tampone MOPS) (cfr. paragrafo 11).

Il pH è portato a 6,5 ± 0,2 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata.

Mezzo di crescita 20X — AAP

Le soluzioni madre sono preparate in acqua sterile distillata o deionizzata.

Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e al buio. In queste condizioni si possono conservare da 6 a 8 settimane.

Per il mezzo 20X — AAP si preparano cinque soluzioni madre nutrienti (A1, A2, A3, B e C) utilizzando sostanze chimiche di grado reagente. Il mezzo di crescita è composto da 20 ml di ciascuna soluzione madre nutriente aggiunte a circa 850 ml di acqua deionizzata. Il pH è portato a 7,5 ± 0,1 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata. Il mezzo è successivamente filtrato con una membrana con pori di 0,2 μm (circa) in un recipiente sterile.

Il mezzo di crescita destinato alle prove deve essere preparato 1 o 2 giorni prima dell'utilizzazione in modo che il pH abbia il tempo di stabilizzarsi. Il pH del mezzo di crescita deve essere controllato prima dell'utilizzo e riequilibrato, se necessario, aggiungendovi 0,1 o 1 mol di NaOH o HCl come suindicato.

Soluzione madre

Sostanza

Concentrazione nella soluzione madre

(g/l) (7)

Concentrazione nel mezzo preparato

(mg/l) (7)

Mezzo preparato

 

 

 

 

Elemento

Concentrazione

(mg/l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na;N

190;84

MgCl2.6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2.2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2 · O

1,4

30

K;P

9,4;3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2.4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3.6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA.2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2.6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4.2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2.2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

Mezzo di STEINBERG (secondo la norma ISO 20079)

Concentrazioni e soluzioni madre

La norma ISO 20079 utilizza il mezzo modificato di Steinberg solo per Lemna minor (in quanto è la sola specie ammessa per tale metodo), ma alcune prove hanno dimostrato che si possono ottenere buoni risultati anche con Lemna gibba.

Per preparare questo mezzo occorre utilizzare sostanze chimiche di grado reagente o analitico e acqua deionizzata.

Preparare il mezzo nutriente a partire da soluzioni madre oppure dal mezzo dieci volte più concentrato, che è la concentrazione massima che si può ottenere senza precipitazione.

Tabella 1

Mezzo di Steinberg a pH stabilizzato (modificato da Altenburger)

Componente

Mezzo nutriente

Macroelementi

Peso molare

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Microelementi

Peso molare

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA diidrato di sodio

372,24

1 500,00

4,03


Tabella 2

Soluzioni madre (macroelementi)

1.

Macroelementi (50 volte più concentrati)

g/l

Soluzione madre 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Soluzione madre 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Soluzione madre 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tabella 3

Soluzioni madre (microelementi)

2.

Microelementi (1 000 volte più concentrati)

mg/l

Soluzione madre 4:

H3BO3

120,0

Soluzione madre 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Soluzione madre 6: