02017R0735 — HU — 28.04.2017 — 000.001

---

Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű és nem vált ki joghatást. Az EU intézményei semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért. A jogi aktusoknak – ideértve azok bevezető hivatkozásait és preambulumbekezdéseit is – az Európai Unió Hivatalos Lapjában közzétett és az EUR-Lex portálon megtalálható változatai tekintendők hitelesnek. Az említett hivatalos szövegváltozatok közvetlenül elérhetők az ebben a dokumentumban elhelyezett linkeken keresztül

►B

A BIZOTTSÁG (EU) 2017/735 RENDELETE (2017. február 14.) ►C1  a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendelet mellékletének a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról ◄ (EGT-vonatkozású szöveg) (HL L 112, 2017.4.28., 1. o)

Helyesbítette:

►C1	Helyesbítés, HL L 119, 15.5.2018, o 41  (735/2017)

---

▼B

A BIZOTTSÁG (EU) 2017/735 RENDELETE

(2017. február 14.)

▼C1

a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendelet mellékletének a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról

▼B

(EGT-vonatkozású szöveg)

1. cikk

A 440/2008/EK rendelet melléklete e rendelet mellékletének megfelelően módosul.

2. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

---

MELLÉKLET

A 440/2008/EK rendelet melléklete a következőképpen módosul:

„A.25.    DISSZOCIÁCIÓS ÁLLANDÓK A VÍZBEN (TITRÁLÁSI MÓDSZER – SPEKTROFOTOMETRIÁS MÓDSZER – KONDUKTOMETRIÁS MÓDSZER)

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 112. vizsgálati iránymutatásában (1981) leírt módszerrel.

Előfeltételek

Tájékoztató jellegű információk

Minősítő állítások

Standard dokumentumok

Ez a vizsgálati módszer a »Szakirodalom« című szakaszban felsorolt hivatkozásokban megadott módszereken és a »Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA« című, 1978. augusztus 18-i kiadványon alapul.

MÓDSZER – BEVEZETÉS A VIZSGÁLATBA, A VIZSGÁLAT CÉLJA, ALKALMAZÁSI KÖRE, RELEVANCIÁJA, ALKALMAZÁSA ÉS KORLÁTAI

Valamely anyag vízben történő disszociációja jelentőséggel bír a környezetre kifejtett hatásának értékelése során. A vízben történő disszociáció határozza meg az anyag formáját, amely viszont meghatározza a viselkedését és a szállítását. Befolyásolhatja a vegyi anyag talajon vagy üledéken történő adszorpcióját és a biológiai sejtekbe irányuló abszorpcióját.

Fogalommeghatározások és mértékegységek

A disszociáció a két vagy több, esetenként ionos kémiai anyaggá történő reverzibilis bomlás. A folyamatot általában a következő képlet jelöli:

RX ⇌ R ++ X –

a reakcióra irányadó koncentrációs egyensúlyi állandó pedig a következő:

Például abban a sajátos esetben, ha az R hidrogén (az anyag sav), az állandó:

vagy

Referenciaanyagok

Az alábbi referenciaanyagokat az új anyagok vizsgálata során nem kell minden esetben alkalmazni. Elsősorban azért vannak megadva, hogy időnként el lehessen végezni a módszer kalibrálását, valamint azért, hogy másik módszer alkalmazása esetén lehetőséget nyújtsanak az eredmények összehasonlítására.

Célszerű lenne több pK-értékkel rendelkező anyag alkalmazása, ahogyan az alább „A módszer elve” című részben szerepel. Ilyen anyag lehetne a következő:

A vizsgálati módszer elve

Az ismertetett kémiai folyamat általában csak kismértékben hőmérsékletfüggő a környezeti szempontból releváns hőmérséklet-tartományban. A disszociációs állandó meghatározása szükségessé teszi a vegyi anyag disszociált és nem disszociált formája koncentrációjának mérését. A fenti „Fogalommeghatározások és mértékegységek” című részben szereplő disszociációs reakció sztöchiometriájának ismerete alapján a megfelelő állandó meghatározható. Az e vizsgálati módszerben ismertetett konkrét esetben az anyag savként vagy bázisként viselkedik, és a disszociációs állandó meghatározása a legmegfelelőbben az anyag ionizált és nem ionizált formája relatív koncentrációjának és az oldat pH-értékének meghatározásával történik. A szóban forgó kifejezések közötti kapcsolatot a fenti „Fogalommeghatározások és mértékegységek” című részben szereplő pKa értékhez tartozó egyenlet adja meg. Egyes anyagok esetében egynél több disszociációs állandó van és hasonló egyenletek állíthatók fel. Az itt ismertetett módszerek közül néhány a nem sav–bázis disszociációra is alkalmazható.

Minőségi kritériumok

Megismételhetőség

A disszociációs állandó mérését legalább három alkalommal meg kell ismételni, és az értékeknek ± 0,1 log egységen belül kell elhelyezkedniük.

A VIZSGÁLATI ELJÁRÁSOK LEÍRÁSA

A pKa érték meghatározásának két alapvető megközelítése van. Az egyik az anyag ismert mennyiségének – szükség szerint – standard savval vagy bázissal történő titrálását, a másik az ionizált és a nem ionizált forma relatív koncentrációjának és pH-függőségének meghatározását foglalja magában.

Előkészületek

Az említett elveken alapuló módszerek titrálási, spektrofotometriás és konduktometriás eljárásként sorolhatók be.

Vizsgálati oldatok

A titrálási módszer és a konduktometriás módszer esetében a vegyi anyagot desztillált vízben kell feloldani. A spektrofotometriás módszer és más módszerek esetében pufferoldatok használatosak. A vizsgálati anyag koncentrációja nem haladhatja meg a 0,01 M, illetve a telítettségi koncentráció fele közül az alacsonyabb értéket, és az oldatok elkészítésekor az anyag legtisztább rendelkezésre álló formáját kell alkalmazni. Ha az anyag csak alig oldható, a fent feltüntetett koncentrációkhoz történő hozzáadását megelőzően feloldható kis mennyiségű, vízzel elegyedő oldószerben.

Az oldatokat Tyndall-sugár segítségével meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy előfordulnak-e bennük emulziók, különösen akkor, ha társoldószert használtak az oldékonyság javítására. Pufferoldatok használata esetén a puffer koncentrációja nem haladhatja meg a 0,05 M-t.

Vizsgálati körülmények

Hőmérséklet

A hőmérsékletet legalább ± 1 °C-ra kell szabályozni. A meghatározást lehetőleg 20 °C-on kell elvégezni.

Ha jelentős hőmérséklet-függőség gyanúja merül fel, a meghatározást legalább két másik hőmérsékleten is el kell végezni. A hőmérsékletközöknek ebben az esetben 10 °C-nak, a hőmérséklet-szabályozásnak pedig ± 0,1 °C-nak kell lennie.

Elemzések

A módszert a vizsgált anyag jellege határozza meg. A módszernek kellően érzékenynek kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a különböző kémiai anyagok meghatározását a vizsgálati oldat egyes koncentrációinál.

A vizsgálat végrehajtása

Titrálási módszer

A vizsgálati oldat meghatározása – szükség szerint – a standard bázikus vagy savas oldattal történő titrálással történik, melynek során a pH-értéket a titrálószer minden egyes hozzáadása után megmérik. Az egyenértékpont elérése előtt legalább 10 további hozzáadást kell végezni. Az egyensúly megfelelően gyors elérése esetén regisztráló potenciométer használható. Ehhez a módszerhez az anyag teljes mennyiségét és koncentrációját is pontosan ismerni kell. A szén-dioxid kizárása érdekében óvintézkedéseket kell tenni. Az eljárás, az óvintézkedések és a számítás részletei standard vizsgálatokban, például az (1), (2), (3), (4) hivatkozásban szerepelnek.

Spektrofotometriás módszer

Megállapítanak egy olyan hullámhosszot, ahol az anyag ionizált és nem ionizált formájának észrevehetően eltérő az extinkciós együtthatója. Az UV/VIS abszorpciós spektrumot állandó koncentrációjú oldatokból határozzák meg olyan pH-feltételek mellett, amelyeknél az anyag lényegében nem ionizált és amelyeknél teljesen ionizált, továbbá több köztes pH-érték mellett. Ez elvégezhető úgy, hogy további koncentrált savat (bázist) adnak hozzá egy, az anyagot egy többkomponensű pufferben tartalmazó, viszonylag nagy mennyiségű, kezdetben magas (alacsony) pH-értékű ((5) hivatkozás) oldathoz, vagy oly módon, hogy az anyagot például vízben, metanolban tartalmazó, ugyanolyan mennyiségű törzsoldatot adnak állandó mennyiségű, a kívánt pH-tartományt lefedő különféle pufferoldatokhoz. A kiválasztott hullámhosszon mért pH- és abszorbancia-érték alapján elegendő számú értéket kell kiszámítani a pKa értékhez legalább öt olyan pH-értéken alapuló adatok segítségével, amelyeknél az anyag legalább 10 százalékban, de 90 százaléknál kisebb mértékben ionizált. A kísérletek további részletezése és a számítási módszer az (1) hivatkozásban szerepel.

Konduktometriás módszer

Az anyagot tartalmazó, megközelítőleg 0,1 M koncentrációjú oldat vezetőképességét vezetőképes vízben, egy alacsony, ismert cellaállandójú cella segítségével megmérik. Ezen oldat több, pontosan elkészített hígításának vezetőképességét is megmérik. A koncentrációt minden egyes alkalommal megfelezik, és a sorozatnak a koncentráció tekintetében legalább egy nagyságrend-terjedelmet le kell fednie. Végtelen hígításnál a vezetőképesség határát nátriumsóval és extrapolálással végzett hasonló kísérlettel kell megállapítani. A disszociációfok ezt követően az egyes oldatok vezetőképessége alapján az Onsager-egyenlet segítségével számítható ki, és így az Ostwald-féle hígítási törvény segítségével a disszociációs állandó a következőképpen kapható meg: K = α2C/(1 – α), ahol C a mol/literben kifejezett koncentráció, α pedig a disszociált frakció. A CO2 kizárása érdekében óvintézkedéseket kell tenni. A kísérletek további részletezése és a számítási módszer a standard szövegekben, valamint az (1), (6) és (7) hivatkozásban szerepel.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Titrálási módszer

A pKa értéket a titrálási görbe 10 mért pontjához ki kell számítani. Az ilyen pKa értékek átlagát és szórását ki kell számítani. A módszernek tartalmaznia kell a standard bázis vagy sav mennyiségéhez viszonyított pH görbéjét, valamint táblázatos bemutatását.

Spektrofotometriás módszerek

Az egyes spektrumok esetén kapott abszorbancia- és pH-értékeket táblázatba kell foglalni. A pKa-ra legalább öt értéket kell kiszámítani a közbenső spektrumok adatpontjaiból, és ezen eredmények átlagát és szórását is meg kell határozni.

Konduktometriás módszer

Az ekvivalens vezetőképességet (Λ) minden egyes savkoncentrációhoz, továbbá egy savegyenérték és 0,98 egyenérték karbonátmentes nátrium-hidroxid keverékének minden egyes koncentrációjához ki kell számítani. A sav túlsúlyban van, hogy megelőzhető legyen a hidrolízis miatti OH– túlsúly. Az 1/Λ-t Ö_C függvényében kell ábrázolni, és a só Λo értéke a nulla koncentrációra történő extrapolációval megtalálható.

A sav Λo értéke a H+ és a Na+ szakirodalmi értékei segítségével számítható ki. A pKa minden egyes koncentráció esetén az α = Λi /Λo és a Ka = α2C/(1 – α) képletből számítható ki. A Ka-ra jobb értékek kaphatók a mobilitásra és az aktivitásra tekintettel történő korrekcióval. A pKa értékek átlagát és szórását ki kell számítani.

Vizsgálati jegyzőkönyv

Valamennyi nyers adatot és pKa értéket, valamint a számítási módszert (az (1) hivatkozásban javasoltak szerint lehetőleg táblázatos formában) be kell mutatni, csakúgy, mint a fent ismertetett statisztikai paramétereket. A titrálási módszerek esetében részletezni kell a titrálószerek standardizálását.

A spektrofotometriás módszer esetében minden spektrumot be kell mutatni. A konduktometriás módszer esetében a cellaállandó meghatározásának részleteit dokumentálni kell. Az alkalmazott eljárásra, az analitikai módszerekre és bármely felhasznált puffer jellegére vonatkozó információkat meg kell adni.

A vizsgálati hőmérséklet(ek)et dokumentálni kell.

SZAKIRODALOM

„B.5.    AKUT SZEMIRRITÁCIÓ/SZEMKORRÓZIÓ

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 405. vizsgálati iránymutatásában (2012) leírt módszerrel. A vegyi anyagok vizsgálatára vonatkozó OECD-iránymutatás rendszeres időközönként felülvizsgálat tárgyát képezi annak biztosítása érdekében, hogy tükrözze a rendelkezésre álló legjobb tudományos ismereteket. E vizsgálati iránymutatás korábbi felülvizsgálatai során különleges figyelmet fordítottak a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó összes információ értékelésével történő lehetséges javításokra, hogy elkerülhető legyen a laboratóriumi állatokon történő szükségtelen kísérletezés, és ezáltal tiszteletben lehessen tartani az állatjóléti szempontokat. A(z 1981-ben elfogadott és 1987-ben, 2002-ben és 2012-ben frissített) 405. vizsgálati iránymutatásban szerepel az az ajánlás, hogy az akut szemirritáció/szemkorrózió vizsgálatára előírt in vivo vizsgálat elvégzése előtt el kell végezni a rendelkezésre álló adatok bizonyító erejének elemzését (1). Ha nem áll rendelkezésre elegendő adat, azok mennyiségét ajánlott lépcsőzetes vizsgálatok alkalmazásával növelni (2) (3). A vizsgálati stratégia részét képezi validált és elfogadott in vitro vizsgálatok végzése, amelyek e vizsgálati módszer kiegészítésében kerülnek ismertetésre. A vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK rendelet ( 1 ) alkalmazásában integrált vizsgálati stratégia is szerepel a vonatkozó ECHA-iránymutatásban (21). Állatkísérletek csak akkor végezhetők, ha a rendelkezésre álló alternatív módszerek figyelembevételét, valamint a megfelelőnek ítélt módszerek alkalmazását követően megállapítást nyert a szükségességük. E frissített vizsgálati módszer szövegezésekor vannak olyan esetek, amikor e vizsgálati módszer alkalmazása továbbra is szükséges, vagy azt egyes szabályozási keretek előírják.

A legutóbbi frissítés elsősorban a fájdalomcsillapítók és az érzéstelenítők használatára összpontosított, azonban nem befolyásolta a vizsgálati iránymutatás alapvető koncepcióját és felépítését. Az ICCVAM ( 2 ) és egy független nemzetközi szakértői értékelő testület felülvizsgálta a helyi fájdalomcsillapítók, a szisztémás hatású érzéstelenítők és a kíméletes végpontok rutinszerű alkalmazásának hasznosságát és korlátozásait a szemirritáció in vivo biztonsági vizsgálata során (12). A felülvizsgálat megállapította, hogy a helyi fájdalomcsillapítók és a szisztémás hatású érzéstelenítők alkalmazásával a vizsgálat kimenetelének befolyásolása nélkül kiküszöbölhető a fájdalom és a szorongás nagy része vagy egésze, és azt javasolta, hogy ezeket az anyagokat mindig használják. Ez a vizsgálati módszer figyelembe veszi ezt a felülvizsgálatot. A helyi fájdalomcsillapítókat, a szisztémás hatású érzéstelenítőket és a kíméletes végpontokat rutinszerűen kell alkalmazni az akut szemirritáció és -korrózió in vivo vizsgálata során. Az alkalmazásuk alóli kivételeket meg kell indokolni. Az e módszer keretében ismertetett pontosítások lényegesen csökkenteni fogják, illetve kiküszöbölik az állatok fájdalmát és szorongását a legtöbb olyan vizsgálati helyzetben, amelyben az in vivo szembiztonsági vizsgálat továbbra is szükséges.

A kiegyensúlyozott előzetes fájdalomcsillapításnak magában kell foglalnia i. egy helyi fájdalomcsillapítóval (például proparakainnal vagy tetrakainnal) és egy szisztémás hatású érzéstelenítővel (például buprenorfinnal) végzett rutinszerű előkezelést, ii. (például buprenorfinnal és meloxicammal kiváltott) szisztémás fájdalomcsillapítás rutinszerű utókezelési ütemtervét, iii. az állatoknál esetlegesen jelentkező fájdalom és/vagy szorongás klinikai tüneteinek tervezett megfigyelését, nyomon követését és rögzítését, továbbá iv. valamennyi szemlézió jellegének, súlyosságának és alakulásának tervezett megfigyelését, nyomon követését és rögzítését. További részletek az alábbiakban ismertetett frissített eljárásokban találhatók. A vizsgálat zavarásának elkerülése érdekében a vizsgálati vegyi anyag beadását követően további helyi fájdalomcsillapítók vagy érzéstelenítők nem alkalmazhatók. Gyulladásgátló hatású fájdalomcsillapítók (például meloxicam) nem alkalmazhatók helyileg, és a szisztémásan alkalmazott dózisok nem zavarhatják a szemre gyakorolt hatásokat.

A fogalommeghatározások a vizsgálati módszer függelékében szerepelnek.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

A tudományos ésszerűség és az állatok kímélete érdekében nem szabad in vivo vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg a vegyi anyag potenciális szemkorróziós/szemirritáló hatására vonatkozó összes rendelkezésre álló adatra vonatkozóan el nem végezték az adatok bizonyító erejének elemzését. Ilyen adatok az embereken és/vagy laboratóriumi állatokon elvégzett vizsgálatok eredményei, egy vagy több, szerkezetileg rokon anyag vagy keverékeik szemkorróziós/szemirritáló hatásaival kapcsolatos bizonyítékok, a vegyi anyag nagymértékű savasságát vagy lúgosságát igazoló adatok (4) (5), valamint a bőrkorrózióra és szemkorrózióra/-irritációra irányuló validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo vizsgálatokból kapott eredmények (6) (13) (14) (15) (16) (17). Előfordulhat, hogy a vizsgálatokat már az adatok bizonyító erejének elemzése előtt elvégezték, vagy éppen annak eredményeként végzik el.

Bizonyos vegyi anyagok esetében az ilyen elemzés annak szükségességét jelezheti, hogy el kell végezni a vegyi anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának in vivo vizsgálatát. Minden ilyen esetben az in vivo szemvizsgálat alkalmazásának tervbevétele előtt először lehetőleg a vegyi anyag in vitro és/vagy in vivo bőrkorróziós hatásainak vizsgálatát kell elvégezni, és azt a B.4. vizsgálati módszeren belüli lépcsőzetes vizsgálati stratégiának (7) vagy az ECHA-iránymutatásban ismertetett integrált vizsgálati stratégiának (21) megfelelően kell kiértékelni.

A lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amely magában foglalja validált in vitro vagy ex vivo szemkorróziós/szemirritációs vizsgálatok elvégzését is, e vizsgálati módszer kiegészítésében és – a REACH alkalmazásában – az ECHA-iránymutatásban (21) kerül ismertetésre. Az in vivo vizsgálatok elvégzése előtt ilyen vizsgálati stratégia követése javasolt. Új vegyi anyagok esetében lépcsőzetes vizsgálati megközelítés javasolt a vegyi anyag korróziós/irritáló hatásaira vonatkozó, tudományos szempontból megfelelő adatok gyűjtésére. Ismert vegyi anyagok esetében, ha nem áll rendelkezésre elegendő adat a bőrkorróziós/bőrirritáló és szemkorróziós/szemirritáló hatásokról, e stratégia alkalmazásával pótolhatók a hiányzó adatok. Megfelelően meg kell indokolni, ha ettől eltérő vizsgálati stratégiát vagy eljárást alkalmaznak, vagy ha úgy döntenek, hogy nem használják a lépcsőzetes vizsgálati megközelítést.

AZ IN VIVO VIZSGÁLAT ELVE

Szisztémás hatású fájdalomcsillapítóval történő előkezelést és megfelelő helyi érzéstelenítők alkalmazását követően a vizsgálandó vegyi anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísérleti állat egyik szemén; a nem kezelt szem szolgál kontrollként. A szemirritáció/szemkorrózió mértékét meghatározott időközönként a kötőhártya, a szaruhártya és a szivárványhártya lézióinak pontozásával kell kiértékelni. A hatások teljes kiértékelése érdekében részletesen ismertetni kell a szemre gyakorolt egyéb hatásokat és a káros szisztémás hatásokat is. A vizsgálat időtartamának elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy meg lehessen határozni a hatások visszafordíthatóságát vagy visszafordíthatatlanságát.

A vizsgálat bármely fázisában súlyos szorongás és/vagy fájdalom vagy az e vizsgálati módszerben (lásd a 26. pontot) ismertetett kíméletes végpontoknak megfelelő léziók jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani, és a vegyi anyagot ennek megfelelően kell értékelni. Az elhullás közelében lévő és súlyosan szenvedő állatok humánus módon történő elpusztításáról szóló döntéssel kapcsolatos kritériumok OECD-iránymutatás (8) tárgyát képezik.

AZ IN VIVO VIZSGÁLAT ELŐKÉSZÍTÉSE

A fajok kiválasztása

A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. Más törzsek vagy fajok alkalmazását megfelelően meg kell indokolni.

Az állatok előkészítése

A vizsgálat megkezdése előtti 24 órában a vizsgálatra ideiglenesen kiválasztott kísérleti állat mindkét szemét meg kell vizsgálni. Szemirritációt, szemhibákat vagy korábban szerzett szaruhártya-sérülést mutató állatokat nem szabad használni.

Tartási és etetési körülmények

Az állatokat egyenként kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 20 °C (± 3 °C)-nak kell lennie. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot; a célérték az 50–60 %. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. A túlzott fényerősség kerülendő. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett.

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

Helyi érzéstelenítők és szisztémás hatású fájdalomcsillapítók alkalmazása

A szembiztonsági vizsgálatok során jelentkező fájdalom és szorongás elkerülése, illetve minimálisra csökkentése érdekében az alábbi eljárások javasoltak. Más, helyettesítő eljárások is választhatók, amennyiben bizonyítottan ugyanolyan hatékonyan vagy hatékonyabban biztosítják a fájdalom és a szorongás elkerülését vagy enyhítését.

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

A vizsgálati vegyi anyagot az alsó szemhéj óvatos elhúzása után az állat egyik szemének kötőhártyazsákjába kell bejuttatni. Ezt követően körülbelül egy másodpercig óvatosan össze kell fogni a szemhéjakat, hogy az anyag ki ne essen vagy ki ne folyjon. A másik, nem kezelt szem kontrollként szolgál.

Öblögetés

A kísérleti állatok szemét a vizsgálati vegyi anyag becseppentése után legalább 24 órán át nem szabad kimosni, kivéve szilárd anyagok alkalmazása esetén (lásd a 18. pontot), illetve ha azonnali korróziós vagy irritáló hatások tapasztalhatók. Ha szükségesnek tűnik, 24 óra múlva ki lehet mosni az állatok szemét.

Nem javasolt kísérőcsoport alkalmazása a mosás hatásának vizsgálatára, kivéve, ha az tudományosan indokolt. Ha kísérőcsoport szükséges, akkor ehhez két nyulat kell használni. A mosás körülményeit, pl. a mosás időpontját, a mosóoldat összetételét és hőmérsékletét, a mosás időtartamát és sebességét, valamint az alkalmazott térfogatot részletesen dokumentálni kell.

Dózisszintek

(1)    Folyadékok vizsgálata

Folyadékok vizsgálata esetén 0,1 ml-es dózist kell alkalmazni. Pumpás spray-ket nem szabad a vegyi anyag közvetlenül a szembe való permetezésére használni. A spray-t ki kell fújni, és tartalmát egy edényben össze kell gyűjteni, mielőtt 0,1 ml-t az állat szemébe cseppentenének.

(2)    Szilárd anyagok vizsgálata

Szilárd anyagok, masszák és szemcsés vegyi anyagok vizsgálata esetén az alkalmazott mennyiségnek 0,1 ml térfogatúnak kell lennie, illetve tömege nem haladhatja meg a 100 mg-ot. A vizsgálati vegyi anyagot finom porrá kell őrölni. Térfogatmérés előtt óvatosan össze kell tömöríteni, pl. a mérőedény megkocogtatásával. Amennyiben az első megfigyelési időpontban, azaz a kezelés után 1 órával azt tapasztalják, hogy a szilárd vizsgálati vegyi anyagot a fiziológiai mechanizmusok nem távolították el a kísérleti állat szeméből, a szemet sóoldattal vagy desztillált vízzel ki lehet öblögetni.

(3)    Aeroszolok vizsgálata

A szembe cseppentés előtt ajánlatos minden pumpás spray tartalmát és aeroszolt összegyűjteni. Az egyetlen kivételt ez alól a túlnyomásos aeroszolos flakonokban lévő vegyi anyagok képezik, amelyeket a párolgás miatt nem lehet összegyűjteni. Ilyen esetekben az állat szemét nyitva kell tartani, és a vizsgálati vegyi anyagot úgy kell a szembe juttatni, hogy a flakont 10 cm távolságban közvetlenül a szem előtt tartva és körülbelül egy másodpercig működtetve egyszer belefújnak az állat szemébe. A spray nyomásától és tartalmától függően a távolság ettől eltérő is lehet. Vigyázni kell arra, hogy a spray nyomása ne okozzon szemkárosodást. Megfelelő esetekben szükség lehet a spray ereje okozta »mechanikai« szemkárosodás lehetőségének figyelembevételére.

Az aeroszol dózisa a vizsgálat következő módon végzett szimulációjával becsülhető meg: a vegyi anyagot mérőpapírra kell permetezni egy olyan, közvetlenül a papír elé helyezett nyíláson keresztül, amelynek mérete megegyezik a nyúl szemének méretével. A szembe permetezett mennyiség közelítő becslésére a papír tömegének növekedése használatos. Illékony vegyi anyagok esetében a dózist úgy lehet megbecsülni, hogy a vizsgálati vegyi anyag eltávolítása előtt és után is megmérik a befogadó edény tömegét.

Kiindulási vizsgálat (egy állat alkalmazásával végzett in vivo szemirritációs/szemkorróziós vizsgálat)

Kifejezetten javasolt, hogy az in vivo vizsgálatra először egy állat alkalmazásával kerüljön sor (lásd e vizsgálati módszer kiegészítését: Lépcsőzetes vizsgálati stratégia szemirritáció és szemkorróziós hatás vizsgálatához). A megfigyeléseknek lehetővé kell tenniük a súlyosság és a visszafordíthatóság meghatározását, mielőtt egy második állaton végzett megerősítő vizsgálatra kerülne sor.

Ha e vizsgálat eredményei szerint az ismertetett eljárás alkalmazásával a vegyi anyag korróziós hatású vagy súlyosan irritálja a szemet, nem szabad további szemirritációs vizsgálatokat végezni.

Megerősítő vizsgálat (további állatok alkalmazásával végzett in vivo szemirritációs vizsgálat)

Ha a kiindulási vizsgálat során nem figyelhető meg korróziós vagy súlyos irritáló hatás, legfeljebb további két állat alkalmazásával ellenőrizni kell az irritációs vagy negatív válaszreakciókat. Ha a kiindulási vizsgálat során irritációs válasz tapasztalható, a megerősítő vizsgálatot ajánlatos lépcsőzetesen, egyszerre egy állaton elvégezni a két további állat egyszerre történő expozíciója helyett. Ha a második állat korróziós vagy súlyos irritáló hatásokat mutat, a vizsgálatot nem szabad folytatni. Ha a második állat eredményei elegendőek a veszélyességi osztály meghatározásához, akkor további vizsgálatokat nem szabad folytatni.

Megfigyelési időszak

A megfigyelési időszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen a megfigyelt hatások mértékének és visszafordíthatóságának teljes kiértékelésére. A kísérletet azonban azonnal be kell fejezni, ha az állat súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutatja (8). A hatások visszafordíthatóságának meghatározásához az állatokat általában a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után 21 napig kell megfigyelni. Ha a visszafordíthatóság a 21 napos időszak vége előtt bebizonyosodik, a kísérletet ekkor be kell fejezni.

Klinikai megfigyelések és a szemreakciók értékelése

A szemeket érintően a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után egy órával átfogó értékelést kell végezni arra nézve, hogy előfordulnak-e szemléziók vagy sem; ezt napi szintű értékelések követik. Az állatokat az első három napon naponta többször ki kell értékelni annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat befejezésére vonatkozó döntések meghozatalára időben sor kerüljön. A kísérleti állatokon a vizsgálat teljes időtartama alatt legalább naponta kétszer, minimum 6 órás intervallumokkal, vagy szükség esetén gyakrabban kell rutinszerű értékelést végezni a fájdalom és/vagy szorongás klinikai tünetei szempontjából (pl. a szem többszöri tapogatása vagy dörzsölése, túlzott pislogás, túlzott könnyezés) (9) (10) (11). Az állatokat i. megfelelően meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy van-e fájdalomra vagy szorongásra utaló bizonyíték, annak érdekében, hogy megalapozott döntéseket lehessen hozni a fájdalomcsillapító-adagolás növelésének szükségességéről, valamint ii. abból a szempontból, hogy van-e megállapított kíméletes végpontokra utaló bizonyíték, annak érdekében, hogy megalapozott döntéseket lehessen hozni arról, hogy helyénvaló-e az állatokon humánus módon eutanáziát végrehajtani, továbbá biztosítani lehessen, hogy e döntések meghozatalára időben sor kerüljön. Fluoreszcein festést rutinszerűen kell alkalmazni, és megfelelőnek ítélt esetben a szemkárosodás kimutatására és mérése szolgáló segédeszközként, valamint a humánus eutanázia tekintetében megállapított végpont-kritériumok teljesülésének értékelésére réslámpás biomikroszkópot kell használni (pl. szaruhártya-fekélyesedés fennállása esetén megvizsgálva a sérülés mélységét). A megfigyelt léziókról készült digitális fényképek gyűjthetők referenciaként, valamint a szemkárosodási mérték tartós rögzítésének biztosítása érdekében. Ha már megvan a döntő információ, az állatokat nem szabad a szükségesnél hosszabb ideig a kísérletben tartani. A súlyos fájdalmat vagy szorongást mutató állatokat haladéktalanul és humánus módon el kell pusztítani, és a vegyi anyagot ennek megfelelően kell értékelni.

A becseppentés után az alábbi szemléziókat mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani (a léziók fokozatait lásd az 1. táblázatban): szaruhártya-perforálódás vagy jelentős mértékű szaruhártya-fekélyesedés, ezen belül staphyloma (a szaruhártya rendellenes kidomborodása); vér jelenléte a szem elülső szemzugában; negyedfokú szaruhártya-homály; a fényreflex 72 órán át tartó hiánya (másodfokú szivárványhártya-válaszreakció); a kötőhártya fekélyesedése; a kötőhártyában vagy a pislogóhártyában jelentkező szövetelhalás; vagy leválás. Erre azért van szükség, mert az ilyen léziók általában nem visszafordíthatók. Javasolt továbbá, hogy a vizsgálatoknak a tervezett 21 napos megfigyelési időszak vége előtti befejezéséhez az alábbi szemléziókat használják kíméletes végpontokként. Ezek a léziók súlyosan irritáló vagy korróziós hatású sérülések, valamint olyan sérülések előrejelzésének minősülnek, amelyek várhatóan nem fordulnak vissza teljesen a 21 napos megfigyelési időszak végéig: a sérülés súlyos mélysége (pl. a stroma felületi rétegein túlra kiterjedő szaruhártya-fekélyesedés), a szaruhártyaszél 50 %-osnál nagyobb mértékű rongálódása (ahogyan azt az alsó szemhéj szöveteinek elfehéredése bizonyítja), valamint súlyos szemfertőzés (gennyes váladék). A következők kombinációja: a szaruhártya felületének vaszkularizációja (azaz pannus); a fluoreszceinnel megfestett terület a naponta végzett értékelés alapján az idő múlásával nem csökken; és/vagy a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után öt nappal elmarad az újrahámosodás, szintén a vizsgálat korai befejezésére vonatkozó klinikai döntést potenciálisan befolyásoló, hasznos kritériumnak minősül. E megállapítások azonban önmagukban nem elegendőek a vizsgálat korai befejezésére vonatkozó döntés indokolásához. A szemre gyakorolt súlyos hatások meghatározását követően laboratóriumi állatokat kezelő állatorvossal vagy ilyen állatokra szakosodott állatorvossal, illetve a klinikai léziók azonosítására képesítéssel rendelkező személyzettel kell konzultálni annak meghatározására szolgáló klinikai vizsgálat érdekében, hogy e hatások kombinációja indokolja-e a vizsgálat korai befejezését. A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után 1, 24, 48 és 72 óra elteltével meg kell mérni és rögzíteni kell a szemreakciókat (kötőhártya-, szaruhártya- és szivárványhártya-reakciók) (1. táblázat). A szemléziókat nem mutató állatokat legkorábban a becseppentés után 3 nappal lehet elpusztítani. A nem súlyos szemléziókat mutató állatokat legalább addig megfigyelés alatt kell tartani, amíg a léziók meg nem szűnnek, vagy legfeljebb 21 napig, amikor a vizsgálat befejeződik. A léziók állapotának és visszafordíthatóságának vagy visszafordíthatatlanságának meghatározása érdekében legalább az 1., a 24. a 48., a 72. órában, a 7., a 14. és a 21. napon kell megfigyelést végezni, és azt dokumentálni kell. Gyakrabban kell megfigyeléseket végezni, ha az szükséges annak meghatározásához, hogy a kísérleti állaton humánus megfontolásból eutanáziát kell-e végrehajtani, vagy negatív eredmények miatt el kell-e azokat távolítani a vizsgálatból.

A szemléziók mértékét (1. táblázat) minden egyes vizsgálatkor fel kell jegyezni. A szem bármely egyéb lézióját (pl. pannus, elszíneződés, elülső szemzug elváltozásai) vagy a káros szisztémás hatásokat szintén dokumentálni kell.

A reakciók vizsgálatát megkönnyítheti egy binokuláris kézi nagyító, egy kézi réslámpa, egy biomikroszkóp vagy bármely más megfelelő eszköz alkalmazása. A 24 óra után tett megfigyelések rögzítését követően a szemek még fluoreszcein segítségével is megvizsgálhatók.

A szemreakciók értékelése elkerülhetetlenül szubjektív. A szemreakciók értékelésének harmonizálása és a vizsgáló laboratóriumok, illetve a megfigyelésekben és azok értékelésében részt vevők segítése érdekében a megfigyeléseket végző személyzetet megfelelően ki kell képezni az alkalmazott értékelési rendszer használatára.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények értékelése

A szemirritációs pontszámokat a léziók jellegével és súlyosságával, illetve visszafordíthatóságukkal vagy visszafordíthatatlanságukkal összefüggésben kell meghatározni. Az egyes pontszámok nem jelentenek abszolút normát a vegyi anyagok irritációs tulajdonságai tekintetében, mivel a vizsgálati vegyi anyag egyéb hatásai is értékelés tárgyát képezik. Az egyes pontszámokat ehelyett referenciaértékeknek kell tekinteni, amelyeknek csak akkor van jelentőségük, ha az összes megfigyelés ismertetése és értékelése alátámasztja ezeket.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Az eredmények kiértékelése

A laboratóriumi állatokon végzett szemirritációs vizsgálatok eredményeinek emberre extrapolálása csak korlátozott érvényességű. Az albínó nyúl sok esetben érzékenyebb a szemirritáló vagy -korróziós anyagokra, mint az ember.

Ügyelni kell arra, hogy az adatok kiértékelése során kizárják a másodlagos fertőzés eredményeként jelentkező irritációt.

SZAKIRODALOM

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

Függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Sav-/alkálitartalék : savas készítmények esetében a nátrium-hidroxid meghatározott pH kialakításához szükséges, a készítmény 100 grammjára vetített (grammban kifejezett) mennyisége. Lúgos készítmények esetében a nátrium-hidroxid meghatározott pH kialakításához szükséges, a készítmény 100 grammjára vetített, grammban kifejezett kénsav mennyiségével egyenértékű (grammban kifejezett) mennyisége (Young et al. 1988).

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Szemirritációt nem okozó anyag : a szemirritációt okozó anyagok EPA szerinti I., II. vagy III., a GHS szerinti 1., 2., 2A. vagy 2B., illetve az EU szerinti 1. vagy 2. kategóriájába nem tartozó anyag (17) (18) (19).

Szemkorróziót okozó anyag : a) a szemben visszafordíthatatlan szövetkárosodást okozó anyag; b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I., illetve az EU szerinti 1. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag (17) (18) (19).

Szemirritációt okozó anyag : a) olyan vegyi anyag, amely visszafordítható elváltozást okoz a szemben; b) az EPA szerinti II. vagy III., a GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B, illetve az EU szerinti 2. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag (17) (18) (19).

Súlyos szemirritációt okozó anyag : a) olyan vegyi anyag, amely 21 napon belül meg nem szűnő szövetkárosodást vagy a fizikai látóképesség súlyos romlását okozza; b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I. vagy az EU szerinti 1. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó anyag (17) (18) (19).

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Lépcsőzetes megközelítés : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése (mérlegelési folyamata) : Az egyes adatok alapján nem feltétlenül nyilvánvaló következtetést megalapozó, az összegyűjtött információkra vonatkozó érvek és ellenérvek alkalmazása.

A B.5. VIZSGÁLATI MÓDSZER KIEGÉSZÍTÉSE ( 3 )

LÉPCSŐZETES VIZSGÁLATI STRATÉGIA SZEMIRRITÁCIÓ ÉS SZEMKORRÓZIÓS HATÁS VIZSGÁLATÁHOZ

Általános megfontolások

A tudományos ésszerűség és az állatok kímélete érdekében fontos, hogy elkerülhető legyen az állatokkal való szükségtelen kísérletezés, illetve minimálisra lehessen csökkenteni azoknak a vizsgálatoknak a számát, amelyek valószínűleg súlyos válaszreakciókat váltanak ki a kísérleti állatokban. Az in vivo vizsgálatok fontolóra vétele előtt minden, a vegyi anyag potenciális szemirritáló/szemkorróziós hatásával összefüggő információt ki kell értékelni. Előfordulhat, hogy már elegendő bizonyíték létezik a vizsgálati vegyi anyag szemirritációs vagy szemkorróziós potenciál szempontjából történő besorolására anélkül, hogy laboratóriumi állatokon kísérleteket kellene végezni. Az adatok bizonyító erejének elemzésével és a lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával tehát minimálisra csökkenthető az in vivo vizsgálatok szükségszerűsége, különösen, ha a vegyi anyag valószínűsíthetően súlyos reakciókat okoz.

A vegyi anyagok szemirritáló és szemkorróziós hatásával kapcsolatban rendelkezésre álló információk értékelésre javasolt elvégezni az adatok bizonyító erejének elemzését annak meghatározása érdekében, hogy az in vivo szemvizsgálatokon kívül szükség van-e egyéb vizsgálatokra az irritáló/korróziós potenciál jellemzéséhez. Ha további vizsgálatokra van szükség, a vonatkozó kísérleti adatok összegyűjtéséhez a lépcsőzetes vizsgálati stratégiát javasolt alkalmazni. Az olyan anyagok esetében, amelyeket korábban nem vizsgáltak, az anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának értékeléséhez szükséges adatsor előállításához a lépcsőzetes vizsgálati stratégiát kell alkalmazni. Az e kiegészítésben ismertetett kiindulási vizsgálati stratégiát egy OECD-munkaértekezleten (1) dolgozták ki, majd később a vegyi anyagok humán egészségügyi és környezeti hatásainak osztályozására szolgáló harmonizált integrált veszélyosztályozási rendszer keretében 1998 novemberében a Vegyi Anyag Bizottság és a Vegyi Anyag Munkacsoport 28. együttes ülésén jóváhagyták és kibővítették (2), és azt 2011-ben egy OECD-szakértői csoport naprakésszé tette.

Bár ez a vizsgálati stratégia nem képezi a B5. vizsgálati módszer szerves részét, kifejezésre juttatja a szemirritációs/szemkorróziós tulajdonságok meghatározására ajánlott megközelítést. Ez a megközelítés jelenti a bevált gyakorlatot, és etikai szempontból is irányadó az in vivo szemirritációs/szemkorróziós vizsgálatokhoz. A vizsgálati módszer útmutatást ad az in vivo vizsgálatok elvégzéséhez, és összefoglalja azokat a tényezőket, amelyekre az ilyen vizsgálatok mérlegelése előtt ki kell térni. A lépcsőzetes vizsgálati stratégia az adatok bizonyító erején alapuló megközelítést biztosít a vegyi anyagok szemirritációs/szemkorróziós tulajdonságaival kapcsolatos meglévő adatok értékeléséhez, valamint lépcsőzetes megközelítést biztosít azon vegyi anyagok vonatkozó adatainak összegyűjtéséhez, amelyekhez további vizsgálatokra van szükség, vagy amelyeket korábban egyáltalán nem vizsgáltak. A stratégia magában foglalja továbbá, hogy először validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo vizsgálatokat kell végezni, majd meghatározott körülmények mellett a B.4. vizsgálati módszerrel további vizsgálatokat (3) (4) kell lefolytatni.

A lépcsőzetes vizsgalati stratégia ismertetése

A vizsgálatoknak a lépcsőzetes vizsgálati stratégia (ábra) keretében történő elvégzése előtt minden rendelkezésre álló információt ki kell értékelni annak meghatározása érdekében, hogy szükség van-e in vivo szemvizsgálatokra. Bár egy-egy paraméter (pl. szélsőséges pH-érték) vizsgálatából is jelentős mennyiségű információ nyerhető ki, az összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell venni. A kérdéses vegyi anyag vagy szerkezeti analógjai hatásaival kapcsolatos összes vonatkozó adatot értékelni kell az adatok bizonyító erejéről való döntés meghozatalakor, és meg is kell indokolni ezt a döntést. Elsődleges hangsúlyt kell fektetni a vegyi anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló humán és állatkísérletek adataira, ezt követően az in vitro vagy ex vivo vizsgálatok eredményére. Lehetőség szerint kerülni kell korróziós hatású vegyi anyagok in vivo vizsgálatát. A vizsgálati stratégia során figyelembe veendő tényezők többek között a következők:

VONATKOZÓ VIZSGÁLATI ÉS KIÉRTÉKELÉSI STRATÉGIA SZEMIRRITÁCIÓ, ILLETVE SZEMKORRÓZIÓS HATÁS VIZSGÁLATÁHOZ

SZAKIRODALOM

„B.10.    Kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálata emlősökön

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 473. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

A kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálatának célja a tenyésztett emlősállatsejtekben szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okozó vegyi anyagok azonosítása (2) (3) (4). A szerkezeti rendellenességek kétféle típusúak lehetnek: kromoszóma vagy kromatid típusú rendellenességek. Poliploidia (többek között endoreduplikáció) felléphet a kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálata során. Míg az aneugének kiválthatnak poliploidiát, a poliploidia önmagában nem jelez aneugén potenciált, egyszerűen sejtcikluszavarra vagy citotoxicitásra (5) utalhat. E vizsgálatnak nem az aneuploidia mérése a célja. Az aneuploidia kimutatására in vitro mikronukleusz-vizsgálat (6) lenne ajánlott.

A kromoszóma-rendellenesség in vitro vizsgálata során emberek vagy rágcsálók megállapodott sejtvonalaiból származó tenyészetek vagy primer sejtkultúrák alkalmazhatók. A felhasznált sejteket a tenyészetben való növekedési képesség, a kariotípus stabilitása (többek között a kromoszómaszám) és a kromoszóma-rendellenességek spontán gyakorisága alapján kell kiválasztani (7). A rendelkezésre álló adatok jelenleg nem teszik lehetővé határozott ajánlások megfogalmazását, azonban arra utalnak, hogy a kémiai veszélyek értékelése során fontos figyelembe venni a vizsgálat céljára kiválasztott sejtek p53 státuszát, genetikai (kariotípus-) stabilitását, DNS-reparációs képességét és eredetét (rágcsáló-, illetve emberi sejtek). E vizsgálati módszer alkalmazóinak tehát érdemes figyelembe venniük a sejtek szóban forgó és egyéb tulajdonságainak a sejtvonalak teljesítményére kifejtett hatását a kromoszóma-rendellenességek indukálásának kimutatása során, mivel a tudomány fejlődik ezen a területen.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Az in vitro végrehajtott vizsgálatok rendszerint szükségessé teszik a metabolikus aktiválás valamilyen exogén forrásának használatát, kivéve, ha a sejtek metabolizálják a vizsgálati vegyi anyagokat. Az exogén metabolikus aktivációs rendszer nem utánozza teljes egészében az in vivo körülményeket. Ügyelni kell arra, hogy ne álljanak elő olyan körülmények, amelyek hamis pozitív eredményekhez – például nem a vizsgálati vegyi anyagok és a kromoszómák közvetlen kölcsönhatása okozta kromoszóma-károsodáshoz – vezethetnek; ilyen körülmény többek között a pH-érték vagy az ozmolalitás változása (8) (9) (10), a közeg összetevőivel való kölcsönhatás (11) (12) vagy a túlzott mértékű citotoxicitás (13) (14) (15) (16).

Ez a vizsgálati módszer azon kromoszóma-rendellenességek kimutatására használatos, amelyek klasztogén hatásokból fakadhatnak. A kromoszóma-rendellenességek indukálását metafázisban lévő sejtek segítségével kell elemezni. Így elengedhetetlen, hogy a sejtek a kezelt és a nem kezelt tenyészetekben is elérjék a mitózist. A mesterséges nanoanyagok esetében e vizsgálati módszer egyedi adaptálására lehet szükség, amelyet azonban ez a vizsgálati módszer nem ismertet.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az emberből vagy más emlősből származó sejttenyészeteket exogén metabolikus aktiválási forrással vagy anélkül is kezelni kell a vizsgálati vegyi anyaggal, kivéve megfelelő metabolizáló képességű sejtek használata esetén (lásd a 13. pontot). A sejttenyészetek vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciója megkezdését követően a sejteket megfelelő, előre meghatározott időközönként metafázis-blokkoló szerrel (például kolcemiddel vagy kolchicinnel) kell kezelni, majd az összegyűjtött, megfestett és metafázisban lévő sejteket mikroszkóp segítségével elemezni kell a kromatid típusú és kromoszóma típusú rendellenesség vizsgálata érdekében.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Sejtek

Különféle sejtvonalak (például kínaihörcsög-petefészek CHO), kínaihörcsögtüdő V79-es sejtvonal, kínaihörcsögtüdő (CHL)/IU, TK6-os sejtvonal) vagy primer sejtkultúrák, többek között ember vagy más emlős perifériás limfocitái használhatók (7). A használt sejtvonalaknak tudományosan indokoltnak kell lenniük. Primer sejtek használatakor állatjóléti okok miatt meg kell fontolni emberi eredetű primer sejtek használatát – amennyiben megvalósítható –, és azokból a humán etikai elveknek és a vonatkozó szabályozásoknak megfelelően kell mintát venni. Az emberi perifériás limfocitákat olyan fiatal (kb. 18–35 éves), nem dohányzó egyénektől kell venni, akik ismert betegséggel nem rendelkeznek, illetve a közelmúltban genotoxikus szereknek (például vegyi anyagoknak, ionizáló sugárzásnak) nem voltak kitéve olyan mértékben, amely fokozná a kromoszóma-rendellenességek háttérbeli előfordulását. Ez biztosítaná, hogy a kromoszóma-rendellenességek háttérbeli előfordulása alacsony és egységes legyen. A kromoszóma-rendellenességek alapesetbeli előfordulása az életkor előrehaladtával nő, és ez a tendencia a nőknél jellemzőbb, mint a férfiaknál (17) (18). Amennyiben több donortól származó sejteket együtt használnak fel, akkor a donorok számát meg kell adni. Igazolni kell, hogy a sejtek a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés kezdetétől a sejtekből történő mintavételig osztódtak. A sejttenyészeteket exponenciális sejtnövekedési fázisban (sejtvonalakban) kell tartani vagy osztódásra kell késztetni (primer limfocita-tenyészetek) a sejteknek a sejtciklus különböző szakaszaiban történő expozíciója érdekében, mivel a sejtfázisoknak a vizsgálati vegyi anyagokra való érzékenysége nem feltétlenül lehet ismert. Azok a primer sejtek, amelyeket az osztódás érdekében mitogén szerekkel kell stimulálni, a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció során általában már nem szinkronizáltak (például az emberi limfociták 48 órás mitogén stimulációt követően). Szinkronizált sejtek használata nem javasolt a kezelés során, indokolt esetben azonban elfogadható.

Tenyészközegek és tenyésztési körülmények

A tenyészetek fenntartására megfelelő tenyészközeget és inkubációs feltételeket (tenyésztőedények, megfelelő esetben 5 %-os CO2-koncentrációjú párás légkör, 37 °C-os inkubációs hőmérséklet) kell alkalmazni. A sejtvonalakat rutinszerűen ellenőrizni kell a modális kromoszómaszám stabilitása és a mikoplazma-fertőzés hiánya szempontjából (7) (19), és a sejtek nem használhatók fel, ha fertőzöttek, vagy ha a modális kromoszómaszám megváltozott. A vizsgálólaboratóriumban használt sejtvonalak, illetve primer sejtkultúrák rendes sejtciklusidejét meg kell állapítani, és annak összhangban kell lennie a közzétett sejtjellemzőkkel (20).

A tenyészetek előkészítése

Sejtvonalak: a sejteket törzstenyészetekből fel kell szaporítani, majd tenyészközegbe kell leoltani olyan sejtszámmal, hogy a sejtek a szuszpenziókban vagy a monolayer tenyészetekben továbbra is exponenciálisan növekedjenek a begyűjtés idejéig (a monolayer tenyészetekben növő sejtek esetében például kerülendő a konfluencia).

Limfociták: alvadásgátlóval (például heparinnal) kezelt teljes vért vagy szeparált limfocitákat kell tenyészteni (például emberi limfociták esetében 48 óráig) mitogén szer [emberi limfociták esetében például phytohaemagglutinin (PHA)] jelenlétében, annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció előtt sejtosztódást váltsanak ki.

Metabolikus aktiválás

A nem megfelelő endogén metabolikus képességű sejtek használata esetén exogén metabolikus aktivációs rendszereket kell alkalmazni. Amennyiben az ettől való eltérés nem indokolt, az alapértelmezetten ajánlott, legáltalánosabban használt rendszer a rágcsálók (általában patkányok) enziminduktorral (ilyen például az Aroclor 1254 (21) (22) (23) vagy fenobarbitál és ß-naftoflavon kombinációjával (24) (25) (26) (27) (28) (29)) kezelt májából preparált, kofaktor-kiegészítésű posztmitokondriális frakció (S9). Ez utóbbi kombináció nem ütközik a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló stockholmi egyezménnyel (30), és kiderült róla, hogy olyan hatékony, mint az Aroclor 1254 a vegyes funkciójú oxidáz indukálásához (24) (25) (26) (28). Az S9 frakció jellemzően 1–2 térfogatszázalék koncentrációban használatos, de a végső vizsgálati közegben 10 térfogatszázalékra növelhető. A mitotikus indexet csökkentő termékek, különösen a kalcium-komplexáló termékek (31) használata kerülendő a kezelés során. Az alkalmazott exogén metabolikus aktivációs rendszer vagy metabolikus induktor típusának és koncentrációjának megválasztását befolyásolhatja a vizsgált anyagok osztálya.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

A szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat a sejtek kezelése előtt megfelelő oldószerben elő kell készíteni, és szükség esetén hígítani kell (lásd a 23. pontot). A folyékony halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül hozzáadhatók a vizsgálati rendszerhez és/vagy hígíthatók a vizsgálati rendszer kezelése előtt. A gáz halmazállapotú vagy illékony vizsgálati vegyi anyagokat a standard protokollok megfelelő módosításával, például légmentesen lezárt tenyésztőedényekben történő kezeléssel kell vizsgálni (32) (33) (34). A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó készítményeket pontosan a kezelés előtt kell előállítani, kivéve, ha a stabilitásra vonatkozó adatok a tárolás elfogadhatóságát bizonyítják.

Vizsgálati körülmények

Oldószerek

Az oldószert oly módon kell kiválasztani, hogy optimalizálja a vegyi anyag oldhatóságát, ugyanakkor ne befolyásolja hátrányosan a vizsgálat lebonyolítását, vagyis ne változtassa meg a sejtek növekedését, ne érintse a vizsgálati vegyi anyag integritását, ne lépjen reakcióba a tenyésztőedényekkel, és ne károsítsa a metabolikus aktivációs rendszert. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer (vagy tenyészközeg) használatát érdemes megfontolni. Jól bevált oldószer például a víz vagy a dimetil-szulfoxid. A végleges kezelési közegben a szerves oldószerek általában nem haladhatják meg az 1 térfogatszázalékot, a vizes oldószerek (sós lé vagy víz) pedig a 10 térfogatszázalékot. Ha nem jól bevált szerves oldószereket (például etanolt vagy acetont) használnak, a használatukat a vizsgálati vegyi anyaggal és a vizsgálati rendszerrel való összeegyeztethetőségükre utaló, valamint azt jelző adatokkal kell alátámasztani, hogy a használt koncentrációnál nem genotoxikusak. Alátámasztó adatok hiányában fontos nem kezelt kontrollok (lásd az 1. függeléket) alkalmazása annak bizonyítására, hogy a kiválasztott oldószer nem vált ki ártalmas vagy klasztogén hatást.

A sejtproliferáció és a citotoxicitás mérése, valamint a kezelési koncentrációk kiválasztása

A vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációjának meghatározása során kerülendő az olyan koncentráció, amely hamis pozitív válaszreakciókat válthat ki, ilyen a túlzott citotoxicitást okozó koncentráció (lásd a 22. pontot), a tenyésztőközegben való kicsapódást okozó koncentráció (lásd a 23. pontot), illetve a pH vagy az ozmolalitás jelentős változását okozó koncentráció (lásd az 5. pontot). Ha a vizsgálati vegyi anyag a hozzáadásakor jelentős változást okoz a tenyészközeg pH-jában, a pH a kezelésre szolgáló végleges tenyészközeg pufferelésével kiigazítható, hogy elkerülhetők legyenek a hamis pozitív eredmények és megfelelő tenyésztési feltételeket lehessen fenntartani.

Mérni kell a sejtproliferációt annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat során elegendő számú kezelt sejt elérje a mitózist, és hogy a kezelésekre megfelelő szintű citotoxicitás mellett kerüljön sor (lásd a 18. és a 22. pontot). A citotoxicitást a fő kísérletben metabolikus aktiválással és anélkül is meg kell határozni a sejtelhalás és a sejtnövekedés megfelelő mutatóinak használatával. Bár egy kiindulási vizsgálat során hasznos lehet a citotoxicitás értékelése a fő kísérletben alkalmazandó koncentrációk jobb meghatározásához, a kiindulási vizsgálat nem kötelező. Végrehajtása esetén nem helyettesítheti a citotoxicitás fő kísérlet során történő mérését.

A relatív populációduplázódás (RPD) vagy a sejtszám relatív növekedése (RICC) megfelelő módszer a citotoxicitás citogenetikai vizsgálatok során történő értékelésére (13) (15) (35) (36) (55) (a képletekért lásd a 2. függeléket). Hosszú távú kezelés és a kezelés kezdetétől számított 1,5 normál sejtciklusidőn túli mintavétel esetén (azaz összesen 3 sejtciklusidőnél hosszabb idő elteltével) az RPD alulbecsülheti a citotoxicitást (37). Ilyen körülmények között az RICC jobb mértékegység lehet, illetve a citotoxicitás 1,5 normál sejtciklusidő utáni, RPD alkalmazásával történő értékelése hasznos becslést ad.

Ami a primer sejtkultúrákban lévő limfocitákat illeti, bár a mitotikus index (MI) a citotoxikus /citosztatikus hatások mérésére szolgál, azt befolyásolja, hogy a kezelés után mikor mérik, továbbá a használt mitogén és a sejtciklus esetleges megszakadása. Az MI azonban azért elfogadható, mert a citotoxicitás egyéb mérése nehézkes és kivitelezhetetlen lehet, és nem feltétlenül vonatkozik a PHA-stimulációra válaszreakcióként szaporodó limfociták célpopulációjára.

Bár a sejtvonalak esetében az RPD és az RICC, valamint a primer limfocita-tenyészet esetében az MI az ajánlott citotoxicitási paraméter, más mutatók (például a sejtintegritás, az apoptózis, a nekrózis, a sejtciklus) további hasznos információval szolgálhatnak.

Az elfogadhatósági kritériumokat (megfelelő citotoxicitás, sejtszám stb.) teljesítő, (az oldószeres és a pozitív kontrollokat nem tartalmazó) legalább három vizsgálati koncentrációt kell értékelni. A sejtek típusától (limfocita-sejtvonalak vagy primer limfocita-tenyészetek) függetlenül, minden egyes vizsgált koncentrációnál párhuzamos vagy szimpla kezelt tenyészetek használhatók. Bár két párhuzamos tenyészet használata ajánlatos, a szimpla tenyészetek is elfogadhatóak, amennyiben a szimpla vagy a párhuzamos tenyészetek esetében megegyezik az összességében értékelt sejtek száma. A szimpla tenyészetek használata különösen releváns, ha több mint három koncentráció értékelésére kerül sor (lásd a 31. pontot). A független párhuzamos tenyészetekben adott koncentráció mellett kapott eredmények összevonhatók az adatelemzéshez (38). Az alacsony citotoxicitást vagy a citotoxicitás hiányát mutató vizsgálati vegyi anyagok esetében rendszerint megközelítőleg kétszeres-háromszoros koncentrációs intervallumok helyénvalóak. Citotoxicitás fellépése esetén a vizsgálati koncentrációknak le kell fedniük a 22. pontban ismertetett, citotoxicitást okozó koncentrációtól azokig a koncentrációkig terjedő tartományt, ahol mérsékelt vagy alacsony a citotoxicitás, illetve nem jelentkezik citotoxicitás. Számos vizsgálati vegyi anyagnak meredek a koncentráció-válasz görbéje, és annak érdekében, hogy alacsony és mérsékelt citotoxicitásnál adatokat lehessen nyerni, vagy részletesen meg lehessen vizsgálni a dózis-válasz összefüggést, egymáshoz közelebbi koncentrációkat és/vagy háromnál több koncentrációt (szimpla tenyészeteket vagy párhuzamos tenyészeteket) kell használni, különösen olyan helyzetekben, ahol megismételt kísérlet szükséges (lásd a 47. pontot).

Ha a legmagasabb koncentráció a citotoxicitáson alapul, a legmagasabb koncentrációval 55 ± 5 %-os citotoxicitást kell megcélozni a citotoxicitás ajánlott paramétereinek alkalmazásával (azaz a sejtvonalak RICC és RPD mutatójának, illetve a primer limfocita-tenyészetek esetében az MI mutatónak a párhuzamos negatív kontroll 45 ± 5 %-ára csökkenésével). Az 55 ± 5 %-os citotoxicitási tartománynak csak a magasabb részén megtalálható pozitív eredmények értelmezése során körültekintően kell eljárni (13).

A legalacsonyabb oldhatatlan koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk mellett nem citotoxikus, kevéssé oldható vegyi anyagok esetében a legmagasabb analizált koncentrációnak a vizsgálati vegyi anyaggal történő kezelés végén szemmel vagy inverz mikroszkóp segítségével látható zavarosságot vagy kicsapódást kell okoznia. Még abban az esetben is, ha citotoxicitás a legalacsonyabb oldhatatlan koncentráció felett jön létre, ajánlatos egyetlen egy, zavarosságot vagy látható kicsapódást okozó koncentrációt vizsgálni, mivel a kicsapódás fals hatásokat eredményezhet. A kicsapódást okozó koncentrációnál ügyelni kell annak biztosítására, hogy a kicsapódás ne zavarja a vizsgálat lebonyolítását (például a megfestést vagy az értékelést). Hasznos lehet a tenyészközegben való oldhatóság meghatározása a kísérlet előtt.

Ha nem figyelhető meg kicsapódás vagy korlátozó citotoxicitás, a legmagasabb vizsgálati koncentrációnak 10 mM-nek, 2 mg/ml-nek vagy 2 μl/ml-nek kell megfelelnie, melyek közül a legalacsonyabb a mérvadó (39) (40) (41). Ha a vizsgálati vegyi anyag nem meghatározott összetételű, például ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyag (UVCB) (42), környezeti extraktum stb., előfordulhat, hogy kellő citotoxicitás hiányában a legmagasabb koncentrációnak magasabbnak (például 5 mg/ml-nek) kell lennie ahhoz, hogy növekedjen az egyes összetevők koncentrációja. Megjegyzendő azonban, hogy ezek a követelmények eltérőek lehetnek a humán gyógyszerek esetében (43).

Kontrollok

Minden begyűjtés alkalmával párhuzamos negatív kontrollokat kell használni (lásd a 15. pontot), amelyeknél csak oldószert alkalmaznak a kezelt közegben, és a kezelésük ugyanolyan módon történik, mint a kezelt tenyészeteké.

Párhuzamos pozitív kontrollok szükségesek annak igazolására, hogy a laboratórium képes az alkalmazott vizsgálati protokoll feltételei mellett klasztogének azonosítására, valamint adott esetben az exogén metabolikus aktivációs rendszer eredményességének igazolása érdekében. Pozitív kontrollokra vonatkozó példák az alábbi 1. táblázatban találhatók. Indokolt esetben pozitív kontrollként alternatív vegyi anyagok használhatók. Mivel az emlőssejtek genetikai toxicitás szempontjából végzett in vitro vizsgálatai kellően szabványosítottak, a pozitív kontrollok használata a metabolikus aktiválást igénylő klasztogénekre korlátozódhat. Amennyiben erre a nem aktivált vizsgálattal egyidejűleg, azonos időtartamú kezelés mellett kerül sor, ezen egyetlen pozitív kontroll válaszreakciója a metabolikus aktivációs rendszer aktivitását és a vizsgálati rendszer reagálóképességét is bizonyítani fogja. A(z S9 nélküli) hosszú távú kezelésnek azonban kell, hogy legyen saját pozitív kontrollja, mivel a kezelés időtartama eltér a metabolikus aktiválás alkalmazása mellett végzett vizsgálatétól. Mindegyik pozitív kontrollt egy vagy több olyan koncentrációban kell alkalmazni, amely a háttérértékekben reprodukálható és kimutatható növekedést okoz, hogy bizonyítani lehessen a vizsgálati rendszer érzékenységét (azaz a hatások egyértelműek, de az értékelést végző személy nem tudja beazonosítani azonnal a kódolt tárgylemezt), és a választ nem veszélyeztetheti a vizsgálati módszerben meghatározott határértékeket meghaladó citotoxicitás.

ELJÁRÁS

Kezelés a vizsgálati vegyi anyaggal

A proliferáló sejteket metabolikus aktivációs rendszer jelenlétében és hiányában kezelik a vizsgálati vegyi anyaggal.

Tenyészetbegyűjtési idő

A negatív eredmény megállapításához szükséges alapos értékeléshez mindhárom alábbi kísérleti körülményt meg kell teremteni, metabolikus aktiválással és anélkül végzett rövid távú kezeléssel, valamint metabolikus aktiválás nélküli hosszú távú kezeléssel (lásd a 43., 44. és 45. pontot):

Abban az esetben, ha a fenti kísérleti körülmények pozitív válaszreakciót eredményeznek, a többi kezelési eljárás vizsgálata nem feltétlenül szükséges.

Kromoszómapreparálás

A sejttenyészeteket a begyűjtésük előtt rendszerint 1–3 órán át kolcemiddel vagy kolchicinnel kell kezelni. Minden sejttenyészetet külön kell begyűjteni és feldolgozni a kromoszómapreparátumok készítéséhez. A kromoszómapreparátumok készítése a sejtek hipotóniás kezelését, fixálását és megfestését foglalja magában. A monolayer tenyészetekben a 3–6 órás kezelés végén mitotikus sejtek (ismertetőjegyük, hogy alakjuk kerek, és leválnak a felszínről) lehetnek jelen. Mivel ezek a mitotikus sejtek könnyen leválnak, a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó közeg eltávolításakor elveszhetnek. Ha bizonyíték van arra, hogy a mitotikus sejtek száma a kontrollokéhoz képest jelentősen megnő, valószínűsíthető mitotikus leállást jelezve, a sejteket centrifugálással be kell gyűjteni és vissza kell tenni a tenyészetekbe, annak elkerülése érdekében, hogy a begyűjtéskor elvesszenek a mitózisban lévő sejtek, valamint azok a sejtek, amelyeknél kromoszóma-rendellenesség kockázata áll fenn.

Elemzés

A kromoszóma-rendellenességek vizsgálatára irányuló mikroszkópos elemzés előtt minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni. Mivel gyakori, hogy a fixálási eljárások bizonyos arányban olyan metafázisban lévő sejteket eredményeznek, amelyek kromoszómkat veszítettek, ezért az értékelt sejteknek a modális kromoszómaszám ± 2-vel egyenlő számú centromérát kell tartalmazniuk.

Koncentrációnként legalább 300, jól szétterült metafázist kell értékelni és ellenőrizni annak megállapításához, hogy valamely vizsgálati vegyo anyag egyértelműen negatív (lásd a 45. pontot). Párhuzamos tenyészetek használata esetén a 300 sejtet egyenlő mértékben kell elosztani a párhuzamosok között. Koncentrációnként egy tenyészet alkalmazása esetén (lásd a 21. pontot) legalább 300, jól szétterült metafázist kell értékelni ebben az egy tenyészetben. 300 sejt értékelésének az az előnye, hogy fokozza a vizsgálat statisztikai erejét, és ráadásul a nulla értékek megfigyelése ritkán (várhatóan mindössze 5 %-os gyakorisággal) fog előfordulni (44). Az értékelt metafázisok száma csökkenthető, ha sok kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejt figyelhető meg és a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül.

Az egy vagy több szerkezeti kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejteket a gapek figyelembevételével és figyelmen kívül hagyásával is értékelni kell. A törések és a gapek (45), (46) irodalom szerinti fogalommeghatározása az 1. függelékben található. A kromatid és a kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell feljegyezni és altípusonként (törések, kicserélődések) kell besorolni. A laboratóriumban alkalmazott eljárásoknak biztosítaniuk kell, hogy a kromoszóma-rendellenességeket jól képzett értékelők elemezzék, és adott esetben szakértők értékeljék.

Bár a vizsgálat célja a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kimutatása, fontos a poliploidia és az endoreduplikáció gyakoriságának feljegyzése, amennyiben ezek láthatók (lásd a (2) pontot).

A laboratórium jártassága

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti elegendő tapasztalat igazolása érdekében kísérletsorozatot kell végrehajtaniuk referenciaként szolgáló, más-más mechanizmusú pozitív vegyi anyagokkal, továbbá (különböző oldószerek/vivőanyagok segítségével) különféle negatív kontrollokkal. E pozitív és negatív kontrollok válaszreakcióinak összhangban kell lenniük a szakirodalommal. Ez nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll a 37. pontban meghatározott történeti adatbázis.

A pozitív kontrollként szolgáló, kiválasztott vegyi anyagokat (lásd a 26. pont 1. táblázatát) metabolikus aktiválás nélkül végzett rövid és hosszú kezeléssel, továbbá metabolikus aktiválás jelenlétében végzett rövid kezeléssel is meg kell vizsgálni a laboratórium klasztogén hatású vegyi anyagok kimutatásában, valamint a metabolikus aktiváló rendszer eredményességének meghatározásában való jártasságának bizonyítása érdekében. A vizsgálati rendszer érzékenységének és dinamikus tartományának bizonyítása érdekében a kiválasztott vegyi anyagok koncentrációtartományát úgy kell megválasztani, hogy reprodukálható és koncentrációval összefüggő növekedést biztosítson a háttérértékekhez viszonyítva.

Történeti kontrolladatok

A laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (44) (47). A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisát első lépésként legalább 10 kísérlettel kell kiépíteni, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (48)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll (44). A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (47).

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy összhangban van-e a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisaival. Jelentősebb következetlenségek fennállása esetén új történeti kontrolladatbázist kell létrehozni.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok az egy tenyészetből vagy párhuzamos tenyészetek összességéből származó, kromoszóma-rendellenességekkel rendelkező sejtek előfordulását mutatják, ahogyan az a 21. pontban szerepel. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (44) (47). Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd a 37. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények ismertetése

Az egy vagy több szerkezeti kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejtek százalékos arányát értékelni kell. Az altípusonként (törések, kicserélődések) besorolt, kromatid és kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell felsorolni, megadva a számukat és a gyakoriságukat a kísérleti és a kontrolltenyészetek esetében. A gapeket külön-külön kell feljegyezni és jelenteni, de azokat nem kell beleszámolni a rendellenességek összgyakoriságba. A poliploidia és/vagy az endoreduplikált sejtek százalékos arányát észlelés esetén a jelentésbe kell foglalni.

A citotoxicitás egyidejű mérését a rendellenességek megállapítására irányuló fő kísérlet(ek)ben minden kezelt, negatív és pozitív kontrolltenyészet esetében fel kell jegyezni.

Az egyes tenyészetekhez tartozó adatokat meg kell adni. Ezenkívül minden adatot táblázat formájában kell összefoglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Egy-egy vizsgálat elfogadása az alábbi kritériumokon alapul:

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha a vizsgált kísérleti körülmények bármelyikében (lásd a 28. pontot):

Mindezen kritériumok teljesülése esetén úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben kromoszóma-rendellenességeket képes előidézni a tenyésztett emlőssejtekben. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (49) (50) (51).

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény mellett (lásd a 28. pontot):

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben nem képes kromoszóma-rendellenességeket előidézni a tenyésztett emlőssejtekben.

Az egyértelműen pozitív vagy negatív válasz igazolása nem követelmény.

Amennyiben a reakció nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, ahogyan az a fentiekben szerepel, illetve egy adott eredmény biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy további vizsgálatokkal kell értékelni. Hasznos lehet további sejtek értékelése (adott esetben) vagy – megismételt kísérlet lehetőleg módosított kísérleti körülmények (például a koncentrációk távolsága, más (S9-es koncentráció vagy S9 eredetű) metabolikus aktiválási feltételek) melletti – elvégzése.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatkészlet eleve kizárja a pozitív vagy negatív eredményekre vonatkozó következtetést, és ezért az lesz a következtetés, hogy a vizsgálati vegyi anyagra adott reakció kétértelmű.

A poliploid sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a mitotikus folyamatokat és számszerű kromoszóma-rendellenességet idézhet elő (52). Az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a sejtciklus végbemenetelét (53) (54) (lásd a 2. pontot). Ezért a poliploid sejtek és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek előfordulását külön-külön kell feljegyezni.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneuploidia : a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlettel (kromoszómakészletekkel) (poliploidia) való bármely eltérés.

Apoptózis : programozott sejthalál olyan lépések során keresztül, amelyek a sejt membránhoz kötött részecskékre történő szétesését eredményezik; a részecskék ezután fagocitózissal vagy sejtfelszínről történő leválással kerülnek eltávolításra.

Sejtproliferáció : a sejtek számának növekedése mitotikus sejtosztódással.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Kromatidtörés : egyetlen kromatid megszakadása, amit az egyik kromatid egyértelmű átrendeződése jelez.

Kromatid gap : egyetlen kromatid meg nem festődő régiója (akromatikus sérülése), ahol minimális a kromatid átrendeződése.

Kromatid típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a különálló kromatidok törésében vagy a kromatidok közötti törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.

Kromoszóma típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy törésében és újraegyesülésében nyilvánul meg.

Klasztogén : bármely olyan vegyi anyag, amely sejtek vagy eukarióta szervezetek populációjában szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okoz.

Koncentrációk : a vizsgálati vegyi anyagnak a tenyészközegen belüli végleges koncentrációira utalnak.

Citotoxicitás : az e vizsgálati módszerbe tartozó, sejtvonalak segítségével végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek relatív populációduplázódásában (RPD) vagy a számuk relatív növekedésében (RICC) bekövetkezett csökkenés a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 17. pontot és a 2. függeléket). Az e vizsgálati módszerbe tartozó, primer limfocita-tenyészetek segítségével végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek mitotikus indexének (MI) csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 18. pontot és a 2. függeléket).

Endoreduplikáció : az a folyamat, amely során valamely DNS-replikáció S fázisát követően a sejtmag nem lép be a mitózis fázisába, hanem egy másik S fázist indít. Az eredmény 4, 8, 16, … kromatiddal rendelkező kromoszómák létrejötte.

Genotoxikus : olyan általános kifejezés, amely magában foglalja a DNS- vagy kromoszómakárosodás valamennyi típusát, köztük a töréseket, a deléciókat, az adduktok képződését, a nukleotidok módosulását és kapcsolódását, az átrendeződéseket, a génmutációkat, a kromoszóma-rendellenességeket és az aneuploidiát. A genotoxikus hatás nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszómakárosodást.

Mitotikus index (MI) : a metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya; e populáció proliferációja mértékének jelzése.

Mitózis : a sejtmag osztódása, amely általában profázisra, prometafázisra, metafázisra, anafázisra és telofázisra osztható fel.

Mutagén : örökletes elváltozást idéz elő a génekben lévő DNS-bázispár szekvenciában/szekvenciákban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszóma-rendellenességek).

Számszerű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a felhasznált sejtekre jellemző normál számértéktől.

Poliploidia : ellentétben a csak egyetlen kromoszómát vagy bizonyos kromoszómákat érintő számszerű rendellenességekkel (aneuploidia), teljes kromoszómakészlet(ek) sejtekben és organizmusokban jelentkező számszerű rendellenessége.

p53 státusz : A p53 fehérje vesz részt a sejtciklus-szabályozásban, az apoptózisban és a DNS-reparációban. Azoknak a sejteknek, amelyeknél hiányzik funkcionális p53 fehérje, nem képesek apoptózis útján vagy a DNS-károsodásra reagáló p53 funkciókkal összefüggő egyéb mechanizmusok útján (például DNS-reparáció kiváltásával) leállítani a sejtciklust vagy eltávolítani a károsodott sejteket, elméletileg hajlamosabbnak kell lenniük génmutációkra vagy kromoszóma-rendellenességekre.

A sejtszám relatív növekedése (RICC) : a kémiai expozíciónak kitett tenyészetekben tapasztalható sejtszámnövekedés a nem kezelt tenyészetekben tapasztalható növekedéshez viszonyítva; százalékos arányként kifejezett viszonyszám.

Relatív populációduplázódás (RPD) : a populációduplázódások számának növekedése a kémiai expozíciónak kitett tenyészetekben, a nem kezelt tenyészetekben tapasztalható növekedéshez viszonyítva; százalékos arányként kifejezett viszonyszám.

S9 májfrakció : 9 000  g centrifugálás utáni májhomogenátum felülúszója, azaz a nyers májextraktum.

S9 keverék : az S9 májfrakció és a metabolikus enzimaktivitáshoz szükséges kofaktorok keveréke.

Oldószeres kontroll : a csak a vizsgálati vegyi anyag feloldására használatos oldószert befogadó kontrolltenyészetek meghatározására szolgáló általános kifejezés.

Szerkezeti rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszkopikus vizsgálata során – deléciókként és fragmensekként, kromoszómán belüli vagy a kromoszómák közötti átrendeződésként – észlelhető változás a kromoszóma szerkezetében.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Nem kezelt kontrollok : nem kezelt (azaz sem a vizsgálati vegyi anyaggal, sem oldószerrel nem kezelt), de a vizsgálati vegyi anyagot befogadó tenyészetekkel párhuzamosan, azonos módon feldolgozott tenyészetek.

---

2. függelék

A CITOTOXICITÁS ÉRTÉKELÉSÉRE SZOLGÁLÓ KÉPLETEK

Mitotikus index (MI):

A sejtszám relatív növekedése (RICC) vagy a relatív populációduplázódás (RPD) ajánlott, mivel mindkét módszer figyelembe veszi az osztódott sejtpopuláció arányát.

ahol:

Populációduplázódás = [log (kezelés utáni sejtszám ÷ kiindulási sejtszám)] ÷ log 2

Például 53 %-os RICC vagy RPD 47 %-os citotoxicitást/citosztázist jelez, az MI segítségével mért 55 %-os citotoxicitás/citosztázis pedig azt jelenti, hogy a tényleges MI a kontroll 45 %-a.

A kezelés előtti sejtszámot minden esetben meg kell mérni, és annak meg kell egyeznie a kezelt és a negatív kontrolltenyészetek esetében.

Míg az RCC (azaz a kezelt tenyészeteken belüli sejtszám és a kontrolltenyészeteken belüli sejtszám hányadosa) a múltban citotoxicitási paraméterként volt használatos, a továbbiakban már nem javasolt, mivel alulbecsülheti a citotoxicitást.

A negatív kontrolltenyészetekben a populációduplázódásnak összeegyeztethetőnek kell lennie azzal a követelménnyel, hogy a sejtekből a kezelés után körülbelül 1,5 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban kell mintát venni, valamint a mitotikus indexnek kellően magasnak kell lennie ahhoz, hogy elegendő számú, mitózisban lévő sejtet lehessen kapni és megbízhatóan ki lehessen számítani egy 50 %-os csökkenést.

”

„B.11.    Kromoszóma-rendellenességek vizsgálata emlősök csontvelőjében

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 475. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

A kromoszóma-rendellenességeknek az emlősök csontvelőjében végzett in vivo vizsgálata azért különösen releváns a genotoxicitás értékelése szempontjából, mert az in vivo metabolizmus tényezői, a farmakokinetikai és a DNS-reparációs folyamatok – bár fajonként változhatnak – aktívak és hozzájárulnak a reakciókhoz. Az in vivo vizsgálat valamely in vitro rendszer által kimutatott genotoxicitás további vizsgálatához is hasznos.

A kromoszóma-rendellenességek emlősökön végzett in vivo vizsgálata a vizsgálati vegyi anyag által az állatok – rendszerint rágcsálók – csontvelősejtjeiben előidézett szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kimutatására használatos (2), (3), (4), (5). A szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kétféle típusúak lehetnek: kromoszóma vagy kromatid típusú rendellenességek. Bár a genotoxikus vegyi anyagok többsége által előidézett rendellenességek többsége kromatid típusú, kromoszóma típusú rendellenességek is előfordulnak. A kromoszómakárosodás és az ehhez kapcsolódó események számos emberi genetikai betegséget okoznak, és érdemi bizonyíték van arra, hogy amikor ezek a léziók és a kapcsolódó események az onkogénekben és a tumorszuppresszor génekben okoznak elváltozásokat, szerepet játszanak az emberekben és a kísérleti rendszerekben kialakuló rákban. Poliploidia (többek között endoreduplikáció) felléphet a kromoszóma-rendellenességek in vivo vizsgálata során. A poliploidia fokozódása azonban önmagában nem jelez aneugén potenciált, egyszerűen sejtcikluszavarra vagy citotoxicitásra utalhat. E vizsgálatnak nem az aneuploidia mérése a célja. Az in vivo emlős eritrocita mikronukleusz-vizsgálat (e melléklet B.12. fejezete) vagy az emlősökön végzett in vitro celluláris mikronukleusz-vizsgálat (e melléklet B.49. fejezete) lenne az aneuploidia kimutatására ajánlott in vivo, illetve in vitro vizsgálat.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

E vizsgálatban rendszerint rágcsálók használatosak, de egyes esetekben – amennyiben tudományosan indokolt – más fajok is megfelelőek lehetnek. E vizsgálatban a csontvelő a célszövet, mivel egy gazdagon vaszkularizált szövet, és olyan gyorsan szaporodó sejtek populációját tartalmazza, amelyek könnyen izolálhatók és preparálhatók. Patkányoktól és egerektől eltérő fajok használatának tudományos indokolását közölni kell a jelentésben. Rágcsálóktól eltérő fajok használata esetén a csontvelő kromoszóma-rendellenességének mérését ajánlatos integrálni egy másik megfelelő toxicitásvizsgálatba.

Ha létezik arra vonatkozó bizonyíték, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok), vagy annak (azoknak) a metabolitja(i) nem éri(k) el a célszövetet, e vizsgálat alkalmazása nem feltétlenül megfelelő.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Az állatokat a megfelelő expozíciós úton kell kitenni a vizsgálati vegyi anyagnak, majd a kezelés után megfelelő időpontban humánus módon eutanáziát kell azokon végrehajtani. Az eutanázia előtt az állatokat metafázis-blokkoló szerrel (például kolchicinnel vagy kolcemiddel) kell kezelni. Ezután kromoszóma-preparálást kell végezni a csontvelősejtekből és azokat meg kell festeni, majd elemezni kell a metafázisban lévő sejteket kromoszóma-rendellenességek megállapítása céljából.

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

A jártasság vizsgálata

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti, a vizsgálat lefolytatásával kapcsolatos elegendő tapasztalat igazolása érdekében bizonyítottan képesnek kell lenniük a közzétett (például (6) irodalom), a kromoszóma-rendellenességek gyakoriságára vonatkozó adatok alapján várható eredmények reprodukálására legalább két, pozitív kontrollként szolgáló – például az 1. táblázatban felsorolt – vegyi anyaggal (ideértve az alacsony dózisban adagolt pozitív kontrollok által kiváltott gyenge reakciókat is) és kompatibilis vivőanyagos/oldószeres kontrollokkal (lásd a 22. pontot). E kísérletek során olyan dózisokat kell alkalmazni, amelyek reprodukálható és dózissal összefüggő növekedést biztosítanak, továbbá bizonyítják a vizsgálati rendszer érzékenységét és dinamikus tartományát az érintett szövetben (a csontvelőben), a laboratóriumon belül alkalmazandó értékelési módszer használatával. Ez a követelmény nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll 10–14. pontban meghatározott történeti adatbázis.

Történeti kontrolladatok

A jártassági vizsgálatok során a laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok történeti eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisának statisztikailag megbízhatónak kell lennie annak garantálása érdekében, hogy a laboratórium képes legyen ellenőrizni a negatív kontrollra vonatkozó adatok eloszlását. A szakirodalom szerint legalább 10 kísérletre lehet szükség, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (7)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll. A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (8).

Amennyiben a laboratórium nem végez elegendő számú kísérletet a negatív kontrollok statisztikailag megbízható eloszlásának megállapítására (lásd a 11. pontot) a (9. pontban ismertetett) jártassági vizsgálatok során, elfogadható, hogy az eloszlást az első rutinszerű vizsgálatok során határozzák meg. Ennek a megközelítésnek a (8) hivatkozásban foglalt ajánlásokat kell követnie, és az e kísérletek során kapott negatív kontrolleredményeknek továbbra is összhangban kell lenniük a negatív kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal.

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy milyen hatást gyakorol a létrejött adatoknak a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisával való összhangjára. Csak jelentősebb következetlenségek fennállása esetén kell új történeti kontrolladatbázist létrehozni, amennyiben szakértői vélemény megállapítja az adatok korábbi eloszlástól való eltérését (lásd a 11. pontot). Az újbóli létrehozás során nem feltétlenül van szükség negatív kontrollokat tartalmazó teljes adatbázisra egy tényleges vizsgálat lebonyolításához, amennyiben a laboratórium bizonyítani tudja, hogy a párhuzamos negatív kontrolljainak értékei továbbra is összhangban lesznek a korábbi adatbázisával vagy a kapcsolódó, közzétett adatokkal.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok a (gapeken kívüli) szerkezeti kromoszóma-rendellenességek egyes állatokban történő előfordulását mutatják. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd a 11. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

Egészséges, fiatal, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. A patkányok általánosan használtak, bár az egerek is megfelelőek lehetnek. Bármely egyéb megfelelő emlősfaj használható, ha a jelentésben szerepel tudományos indokolás.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Rágcsálók esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének 22 °C (±3 °C)-nak kell lennie. Bár ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, legyen legalább 40 %, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. Ha agresszív viselkedés nem várható, a rágcsálókat azonos ivarú és azonos kezelt csoporthoz tartozó kis csoportokban, lehetőleg szilárd aljú, megfelelő környezetgazdagítással ellátott ketrecekben kell tartani (ketrecenként legfeljebb öt egyed tartható). Az állatok kizárólag tudományosan indokolt esetben tarthatók egyenként.

Az állatok előkészítése

Szokásosan egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni (rágcsálók esetén ideális esetben a kezelés kezdetén 6–10 hetes állatokat, bár valamivel idősebb állatok is elfogadhatóak), és azokat véletlenszerűen kontroll- és kezelt csoportokba kell osztani. Az egyes állatokat humánus, minimálisan invazív módszerrel (például gyűrűzéssel, címkézéssel, mikrocsip beültetésével vagy biometrikus azonosítással, de a fül vagy a lábujj kilyukasztása nélkül) egyedi azonosítóval kell ellátni, és legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. A pozitív kontrollal és a vizsgálati vegyi anyaggal való keresztszennyeződés kerülendő. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át.

A dózisok előkészítése

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő oldószerekben vagy vivőanyagokban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Oldószer/Vivőanyag

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat az alkalmazott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan oldószer/vivőanyag, amelyről feltehető, hogy kémiai reakcióba fog lépni a vizsgálati vegyi anyagokkal. Jól ismert oldószerektől eltérő oldószerek/vivőanyagok alkalmazása esetén azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát ajánlatos megfontolni. Általánosan használt, kompatibilis oldószer/vivőanyag például többek között a víz, a fiziológiás sóoldat, a metilcellulóz oldat, a karboximetil-cellulóz-nátriumsó oldat, az olívaolaj és a kukoricaolaj. Azt igazoló történeti vagy közzétett adatok hiányában, hogy a választott atipikus oldószer/vivőanyag nem idéz elő szerkezeti rendellenességet vagy más ártalmas hatást, kiindulási vizsgálatot kell lebonyolítani az oldószeres/vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében.

Kontrollok

Pozitív kontrollok

Általában minden vizsgálat során alkalmazni kell olyan állatcsoportot, amelyet pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyaggal kezeltek. Ettől el lehet tekinteni, ha a vizsgálólaboratórium bizonyítja a vizsgálat lebonyolításában való jártasságát és megállapítja a pozitív kontrollok történeti tartományát. Párhuzamos pozitív kontrollcsoport hiányában minden egyes kísérletben értékelési kontrollokat (fixált és megfestetlen tárgylemezeket) kell alkalmazni. Ezek oly módon kaphatók meg, hogy a vizsgálat értékelésébe beszámítanak a vizsgálat lebonyolítása szerinti laboratóriumban rendszeres időközönként (például 6–18 hónaponként) – például a jártasság vizsgálata során, vagy szükség esetén azt követően rendszeresen – pozitív kontrollokkal végzett különálló kísérlettel létrejött és tárolt megfelelő referenciamintákat.

A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagoknak megbízható módon ki kell váltaniuk a szerkezeti kromoszóma-rendellenességekkel rendelkező sejtek spontán szinthez képest kimutathatóan gyakoribbá válását. A pozitív kontrollok dózisát úgy kell megválasztani, hogy a hatások egyértelműek legyenek, de az értékelő ne tudja beazonosítani azonnal a kódolt mintákat. Elfogadható, hogy a pozitív kontroll beadása a vizsgálati vegyi anyagétól eltérő módon, más kezelési ütemtervvel történjen, és hogy mintavételre csak egyetlen időpontban kerüljön sor. Ezen túlmenően, adott esetben megfontolható a vegyi anyagokkal azonos kémiai osztályba tartozó pozitív kontrollok használata. A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra az 1. táblázat tartalmaz példákat.

Negatív kontrollok

A negatív kontrollcsoport állatait minden mintavételi időpontban figyelembe kell venni, és azokat egyébként a kezelt csoportokkal azonos bánásmódban kell részesíteni, kivéve, hogy nem kapnak kezelést a vizsgálati vegyi anyaggal. Ha a vizsgálati vegyi anyag beadása során oldószert/vivőanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak meg kell kapnia ezt az oldószert/vivőanyagot. Ha azonban a vizsgálólaboratórium történeti adatai azt igazolják, hogy a negatív kontrollból származó, kromoszóma-rendellenességeket mutató sejtek állatok közötti sokfélesége és gyakorisága állandó minden mintavételi időpontban, a negatív kontrollokból elegendő lehet csak egyetlen mintavétel is. Amennyiben a negatív kontrollokhoz egyetlen mintavételt alkalmaznak, azt a vizsgálat során alkalmazott első mintavételi időpontban kell elvégezni.

ELJÁRÁS

Az állatok száma és ivara

A mikronukleusz-válasz általában hasonló a hím- és a nőivarú állatok körében (9), és ez várhatóan érvényes lesz a szerkezeti kromoszóma-rendellenességekre is; ezért a vizsgálatok többségét bármelyik ivarnál el lehet végezni. A hímek és a nőstények közötti lényeges eltéréseket (például a szisztémás toxicitás, a metabolizmus, a biológiai hasznosíthatóság, a csontvelő-toxicitás stb. többek között dózisbehatároló vizsgálattal megállapított eltéréseit) bizonyító adatok mindkét ivar használatát ösztönöznék. Ebben az esetben helyénvaló lehet mindkét ivarnál vizsgálatot végezni, például ismételt dózisú toxicitási vizsgálat keretében. Mindkét ivar használata esetén helyénvaló lehet a faktoriális kísérlettervezés alkalmazása. Az e kísérlettervezés segítségével végzendő adatelemzés részletei a 2. függelékben találhatók.

A vizsgálat megkezdésekor a csoportok méretét úgy kell megállapítani, hogy csoportonként legalább öt azonos ivarú – illetve mindkét ivar használata esetén mindkét ivarból öt – elemezhető állat legyen. Amennyiben a vegyi anyagoknak való emberi expozíció szexspecifikus lehet, mint például egyes gyógyszerek esetében, a vizsgálatot a megfelelő ivarú állatokkal kell elvégezni. Útmutatás az állatok maximális számára vonatkozó tipikus követelményhez: a három dóziscsoporttal és egy párhuzamos negatív kontrollcsoporttal, továbbá egy pozitív kontrollcsoporttal (melyek mindegyike öt, egy ivarhoz tartozó állatból áll) két mintavételi időpontban végzett csontvelővizsgálathoz 45 állatra lenne szükség.

Dózisszintek

Ha előzetes dózisbehatároló vizsgálatra kerül sor amiatt, hogy már nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok kiválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek, ivarok és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyek a fő vizsgálatban alkalmazandóak (10). A vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely anélkül, hogy vizsgálatkorlátozó toxicitást mutatna, a legmagasabb tolerált dózis a vizsgálati időszak tartamához viszonyítva (például testtömeg-csökkenést vagy vérképző rendszeri citotoxicitást vált ki), de elhullást, illetve humánus eutanáziát igénylő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy szorongást nem idéz elő (11).

A legmagasabb dózis a csontvelőben toxicitásra utaló jeleket kiváltó dózisként is meghatározható.

Azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, vagy olyan detoxifikációs folyamatokat idéznek elő, amelyek hosszú távú kezelés után az expozíció csökkenéséhez vezethetnek, kivételek lehetnek a dózisbeállítási kritériumok alól, és azokat eseti alapon kell értékelni.

Annak érdekében, hogy dózis-válasz adatokat lehessen szerezni, a teljes vizsgálatnak egy negatív kontrollcsoportot, valamint legalább három dózisszintet kell tartalmaznia, ahol a dózisszintek közötti szorzótényező általában 2, de legfeljebb 4. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást a dózisbehatároló vizsgálatban vagy meglévő adatok alapján, egyetlen beadás esetén a legmagasabb dózisnak 2 000 mg/testtömegkilogrammnak kell lennie. Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, az MTD-nek a beadott legmagasabb dózisnak kell lennie, és a használt dózisszintek lehetőleg fedjék le a maximálistól az alacsony mértékű toxicitást okozó vagy toxicitást egyáltalán nem okozó dózisig terjedő tartományt. Ha a célszövet (csontvelő) toxicitása valamennyi vizsgált dózisszintnél megfigyelhető, érdemes nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni. A mennyiségi dózis-válasz adatok teljesebb körű jellemzését célzó vizsgálatok további dóziscsoportokat tehetnek szükségessé. Ezek a határértékek a vizsgálati vegyi anyagok bizonyos, külön követelmények hatálya alá tartozó típusai (például a humán gyógyszerek) esetében változóak lehetnek.

Határérték-vizsgálat

Ha a dózisbehatároló kísérletek vagy a rokon állattörzsekből származó meglévő adatok azt jelzik, hogy a legalább a határdózist tartalmazó (az alábbiakban ismertetett) kezelési eljárás semmilyen megfigyelhető toxikus hatást nem vált ki, (többek között nem váltja ki a csontvelősejtek proliferációjának visszaesését vagy a célszövet citotoxicitásának más bizonyítékát), és ha nem várható genotoxicitás az in vitro genotoxicitási vizsgálatok alapján vagy a szerkezetileg rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján, akkor nem feltétlenül tekintendő szükségesnek három dózis használatával végrehajtott teljes vizsgálat, amennyiben bizonyítást nyert, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) eléri(k) a célszövetet (a csontvelőt). Ilyen esetekben a határdózisnál alkalmazott egyetlen dózisszint elegendő lehet. 14 napot meghaladó beadási időszak esetén a határdózis 1 000  mg/testtömeg kg/nap. A legfeljebb 14 napig tartó beadási időszak esetén a határdózis 2 000  mg/testtömeg kg/nap.

A dózisok beadása

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak (például takarmány, ivóvíz, helyi szubkután, intravénás, orális (gyomorszondával), inhalációs, intratracheális vagy implantáció) is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet(ek) megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció nem ajánlott, mivel az nem tervezett emberi expozíciós út, és kizárólag tudományos indokolással alkalmazható. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmányba vagy ivóvízbe keverik, különösen egyszeri adagolás esetén ügyelni kell arra, hogy a táplálék és a víz fogyasztása és a mintavétel közötti idő elegendő legyen a hatások kimutathatóságához (lásd a 33–34. pontot). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata rendszerint nem haladhatja meg az 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációértékeknél rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró vizsgálati vegyi anyagok kivételével, a koncentráció megfelelő beállításával minimálisra kell csökkenteni a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének eltéréseit, hogy valamennyi dózisszinten a testtömeghez viszonyítva konstans mennyiséget lehessen beadni a kísérleti állatoknak.

A kezelés ütemterve

A vizsgálati vegyi anyag beadása rendszerint egyszeri dózissal történik, nagy mennyiségű anyag beadásának megkönnyítése érdekében azonban kettéosztott dózissal is beadható (például ugyanazon a napon két vagy több alkalommal, legfeljebb 2–3 órás időközzel). Ilyen körülmények között, vagy amikor a vizsgálati vegyi anyag beadása inhaláció útján történik, a mintavétel időpontját az utolsó dózis beadásának vagy az expozíció végének időpontja alapján kell ütemezni.

Ehhez a vizsgálathoz kevés adat áll rendelkezésre az ismételt dózisú protokoll megfelelőségére vonatkozóan. Olyan körülmények között azonban, amikor érdemes kiegészíteni ezt a vizsgálatot ismételt dózisú toxicitási vizsgálattal, ügyelni kell a károsodott kromoszómájú mikotikus sejtek toxikus dózisoknál esetlegesen előforduló elveszítésének elkerülésére. Ez a kiegészítés elfogadható, amikor a legmagasabb dózis meghaladja a határdózist vagy megegyezik azzal (lásd a 29. pontot), és egy dóziscsoport a kezelési időszak során mindvégig megkapja a határdózist. A mikronukleusz-vizsgálat (a B.12. vizsgálati módszer) a kromoszóma-rendellenességek esetén első választásnak minősülő in vivo vizsgálatnak tekintendő, ha más vizsgálatokkal való integráció célszerű.

A csontvelőből két külön időpontban kell mintát venni az egyszeri dózissal végzett kezeléseket követően. Rágcsálók esetében az első mintavételi időköznek 1,5 normál sejtciklusidőhöz szükséges időnek kell lennie (ez utóbbi rendszerint a kezelési időszak utáni 12–18 órát jelenti). Mivel a vizsgálati vegyi anyag(ok) felvételéhez és anyagcseréjéhez szükséges idő, valamint annak a sejtciklus-kinetikára gyakorolt hatása befolyásolhatja a kromoszóma-rendellenesség kimutatásának optimális időpontját, az első mintavételi időpont után 24 órával ajánlott egy későbbi mintavétel. Az első mintavételi időpontban minden dóziscsoportot kezelni kell, és azokból elemzés céljára mintát kell gyűjteni, a későbbi mintavételi időpont(ok)ban azonban csak a legmagasabb dózist kell beadni. Ha tudományos indokolás alapján egy napnál hosszabb adagolási eljárást alkalmaznak, a mintavételt általában az utolsó kezelést követő legfeljebb kb. 1,5 normál sejtciklusidő elteltekor kell elvégezni.

A kezelést követően és a mintavétel előtt az állatokba hasüregbe adva megfelelő dózisú metafázis-blokkoló szert (például kolcemidet vagy kolchicint) kell befecskendezni, és ezt követően megfelelő idő elteltével mintát kell venni. Egerek esetében ez a megfelelő idő körülbelül 3–5 óra, patkányok esetében pedig 2–5 óra. A sejteket ki kell nyerni a csontvelőből, meg kell duzzasztani, fixálni kell és meg kell festeni, majd elemezni kell azokat a kromoszóma-rendellenességek szempontjából (12).

Megfigyelések

A kísérleti állatok esetében általános klinikai megfigyeléseket kell tenni, és a klinikai tüneteket legalább naponta egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban rögzíteni kell, továbbá figyelembe kell venni az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Az adagolási időszakban naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából. Minden állat tömegét le kell mérni a vizsgálat megkezdésekor, az ismételt dózisú vizsgálatok esetén hetente legalább egyszer, valamint az állatok leölésekor. A legalább egy hétig tartó vizsgálatok során a felvett táplálék mennyiségét legalább heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokon a vizsgálati időszak befejeződése előtt humánus módon eutanáziát kell végrehajtani (11).

A célszövet expozíciója

Amennyiben indokolt, és amennyiben más expozíciós adatok nem léteznek (lásd a 44. pontot), megfelelő időpont(ok)ban vérmintát kell venni annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagok plazmában lévő szintjét meg lehessen vizsgálni annak bizonyítása céljából, hogy a csontvelő expozíciója megtörtént.

Csontvelő- és kromoszóma-preparátumok

Közvetlenül a humánus módon végrehajtott eutanáziát követően az állatok combcsontjából vagy sípcsontjából csontvelősejteket kell venni, azokat hipotonizálni, majd fixálni kell. A metafázisban lévő sejteket tárgylemezeken szét kell teríteni és bevált módszerek segítségével meg kell festeni (lásd a (3) és a (12) hivatkozást).

Elemzés

Az elemzés előtt minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni, és azokat véletlenszerűen kell elrendezni, hogy az értékelést végző személy ne ismerje a kezelés körülményeit.

Minden kezelt állat (a pozitív kontrollállatokat is ideértve), továbbá a nem kezelt, vagy a vivőanyaggal/oldószerrel kezelt negatív kontrollba beosztott minden állat esetében állatonként legalább 1 000 sejtben meg kell határozni a mitiotikus indexet a citotoxicitás mérőszámaként.

Minden egyes állat esetében legalább 200 metafázist kell elemezni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek szempontjából, a gapek figyelembevételével és figyelmen kívül hagyásával is (6). Ha azonban a negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázis szerint a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek gyakoriságának átlagos háttérértéke 1 %-nál kevesebb a vizsgálólaboratóriumban, meg kell fontolni további sejtek értékelését. A kromatid és a kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell feljegyezni és altípusonként (törések, kicserélődések) kell besorolni. A laboratóriumban alkalmazott eljárásoknak biztosítaniuk kell, hogy a kromoszóma-rendellenességeket jól képzett értékelők elemezzék, és adott esetben szakértők értékeljék. Elismerve, hogy a tárgylemezek előkészítésére szolgáló eljárások következtében gyakran megszakad a metafázisok bizonyos aránya, ami kromoszómaveszteséggel jár, a kiértékelt sejteknek ezért legalább 2n±2 számú centromérát kell tartalmazniuk, ahol n az adott faj esetében a haploid kromoszómaszám.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. Minden egyes állat esetében értékelni kell a mitotikus indexet, a kiértékelt, metafázisban lévő sejtek számát, a metafázisban lévő sejtenkénti rendellenességek számát és a szerkezeti kromoszóma-rendellenessége(ke)t mutató sejtek százalékos arányát. Fel kell sorolni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek különböző típusait a számukkal és gyakoriságukkal együtt, kezelt és kontrollcsoportonként. A gapeket, valamint a poliploid sejteket és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejteket külön-külön kell feljegyezni. A gapek gyakoriságát a jelentésbe kell foglalni, de általában nem kell szerepeltetni az összes szerkezeti rendellenesség gyakoriságának elemzésében. Ha nincs bizonyíték arra, hogy a két ivar másként reagál, az adatok statisztikai elemzés céljából összevonhatók. Az állati toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat szintén a jelentésbe kell foglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Az alábbi kritériumok határozzák meg a vizsgálat elfogadhatóságát:

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

Ha egy adott mintavételi időpontban csak a legmagasabb dózis vizsgálatára kerül sor, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha statisztikailag szignifikáns növekedés tapasztalható a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva, és az eredmények a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) kívül esnek. A megfelelő statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (13). Dózis-válasz elemzéskor legalább három kezelt dóziscsoportot kell elemezni. A statisztikai vizsgálatoknak az állatot kell kísérleti egységként alkalmazniuk. A kromoszóma-rendellenességek vizsgálatának pozitív eredményei arra utalnak, hogy egy vizsgálati vegyi anyag szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket idéz elő a vizsgált faj csontvelőjében.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény esetén:

A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (13). A csontvelő vizsgálati vegyi anyag(ok)nak való expozíciójára vonatkozó bizonyíték lehet többek között a mitotikus index csökkenése vagy a vizsgálati vegyi anyag(ok) plazmában vagy vérben való előfordulásának mérése. Intravénás beadás esetén az expozícióra vonatkozó bizonyíték nem szükséges. Alternatív esetben az azonos expozíciós út és azonos faj alkalmazásával végzett független vizsgálat során kapott ADME-adatok használhatók a csontvelő-expozíció bizonyítására. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények mellett a vizsgálati vegyi anyag nem idéz elő szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket a vizsgált fajok csontvelőjében.

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

Olyan esetekben, ha a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, illetve egy adott eredmény (például kismértékű vagy határesethez közelítő növekedés) biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy a már lefolytatott kísérletek további vizsgálataival kell értékelni. Egyes esetekben hasznos lehet több sejt elemzése vagy módosított kísérleti körülmények mellett megismételt kísérlet végrehajtása.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatok eleve kizárják azt a következtetést, hogy a vizsgálati vegyi anyag pozitív vagy negatív eredményeket hoz, ezért a végkövetkeztetés szerint a vizsgálat kétértelmű lesz.

A poliploid sejteknek és az endoreduplikált metafázisú sejteknek az összes metafázis közötti gyakoriságát külön-külön kell feljegyezni. A poliploid/endoreduplikált sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a mitotikus folyamatokat vagy a sejtciklus előrehaladását (lásd a 3. pontot).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Összegzés

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneuploidia : a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlet(ek) többszöröződésével (lásd a poliploidiát) való bármely eltérés.

Centroméra : olyan kromoszóma-régió(k), amely(ek)hez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Kromatid típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a különálló kromatidok törésében vagy a kromatidok törésében és újraegyesülésében nyilvánul meg.

Kromoszóma típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.

Endoreduplikáció : az a folyamat, amely során valamely DNS-replikáció S fázisát követően a sejtmag nem lép be a mitózis fázisába, hanem egy másik S fázist indít. Az eredmény 4, 8, 16, … kromatiddal rendelkező kromoszómák létrejötte.

Gap : egyetlen kromatid szélességénél kisebb és a kromatidok minimális átrendeződését okozó akromatikus sérülés.

Mitotikus index : a mitózisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya, amely az adott sejtpopuláció proliferációs állapotának mérőszáma.

Számszerű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a felhasznált állatokra jellemző normál számértéktől (aneuploidia).

Poliploidia : ellentétben a kromoszómakészlet egy részében jelentkező számszerű változással (lásd az aneuploidiát), a teljes kromoszómakészlet kromoszómaszámának változásával járó számszerű kromoszóma-rendellenesség.

Szerkezeti kromoszóma-rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszkopikus vizsgálata során – deléciókként és fragmensekként, kromoszómán belüli vagy a kromoszómák közötti átrendeződésként – észlelhető változás a kromoszóma szerkezetében.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

---

2. függelék

AZ IVAROK KÖZÖTTI ELTÉRÉSEK KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK IN VIVO VIZSGÁLATA SORÁN TÖRTÉNŐ MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ FAKTORIÁLIS KÍSÉRLETTERVEZÉS

A faktoriális kísérlettervezés és annak elemzése

Ebben a kísérlettervezésben legalább 5 hím és 5 nőstény vizsgálatára kerül sor mindegyik koncentrációszintnél, ami legalább 40 állat (20 hím és 20 nőstény, valamint a releváns pozitív kontrollok) felhasználását eredményezi.

A kísérlettervezés, amely az egyszerűbb faktoriális kísérlettervezések egyike, kétirányú varianciaanalízissel egyenértékű, ahol a fő tényezők az ivar és a koncentrációszintek. Az adatok számos standard statisztikai szoftvercsomag, például az SPSS, az SAS, a STATA, a Genstat, valamint az R használatával elemezhetők.

Az analízis az adatkészleten belül a variabilitást az ivarok közötti variabilitásra, a koncentrációk közötti variabilitásra, valamint az ivarok és a koncentrációk közötti kölcsönhatáshoz kapcsolódó variabilitásra osztja. Az egyes feltételeket ugyanazon koncentrációnak kitett, az azonos ivarú állatok csoportjain belüli párhuzamos állatok közötti variabilitás becsült értékéhez viszonyítva kell megvizsgálni. A mögöttes módszertanra vonatkozó kimerítő részletek számos statisztikai tankönyvben (lásd a hivatkozásokat) és a statisztikai szoftvercsomagokkal együtt biztosított súgófájlokban is megtalálhatók.

Az analízis az ivar x koncentráció kölcsönhatási feltételnek az ANOVA-táblázatban ( 4 ) való vizsgálatával folytatódik. Szignifikáns kölcsönhatás hiányában az egyes ivarok vagy az egyes koncentrációszintek közötti értékek kombinálásával érvényes statisztikai vizsgálat végezhető a szintek között, az ANOVA szerinti, csoporton belül összesített variabilitási feltétel alapján.

Az analízis a becsült koncentrációk közötti variabilitás kontrasztokká osztásával folytatódik, ami lehetővé teszi a válaszok lineáris és kvadratikus kontrasztjainak megállapítását valamennyi koncentrációszintnél. Ha az ivar x koncentráció kölcsönhatás szignifikáns, ez a feltétel lineáris x ivar és kvadratikus x ivar kölcsönhatására vonatkozó kontrasztokká osztható. E feltételek arra vonatkozó vizsgálatokat biztosítanak, hogy a koncentráció-válaszok párhuzamosak-e a két ivar esetében, illetve hogy a két ivar különböző választ ad-e.

A csoporton belül összesített variabilitásra vonatkozó becslés felhasználható az átlagok közötti eltérés páronkénti vizsgálatához. Ezek az összehasonlítások elvégezhetők a két ivarra vonatkozó átlagok között és a különböző koncentrációszintekre vonatkozó átlagok között; ilyen például a negatív kontrollok szintjével való összehasonlítás. Amennyiben szignifikáns kölcsönhatás tapasztalható, összehasonlítható a különböző koncentrációk adott ivaron belüli átlaga vagy az ivarok azonos koncentrációnál számított átlaga.

Hivatkozások

Számos olyan statisztikai tankönyv létezik, amely a faktoriális kísérlettervezések elméletét, kialakítását, módszertanát, elemzését és értelmezését tárgyalja, a legegyszerűbb kétfaktoros elemzéstől a kísérlettervezés módszertanában alkalmazott bonyolultabb formákig. Az alábbi nem kimerítő lista. Egyes könyvekben összehasonlítható kísérlettervezésekre vonatkozó kidolgozott példák találhatók, esetenként az analízisek különféle szoftvercsomagok segítségével történő lefuttatásához szükséges kóddal együtt.

”

„B.12    Emlős eritrocita mikronukleusz-vizsgálat

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 474. vizsgálati iránymutatásában (2014) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

Az emlősökön végzett in vivo mikronukleusz-vizsgálat azért különösen releváns a genotoxicitás értékelése szempontjából, mert az in vivo metabolizmus tényezői, a farmakokinetikai és a DNS-reparációs folyamatok – jóllehet fajonként eltérnek – aktívak és hozzájárulnak a reakciókhoz. Az in vivo vizsgálat valamely in vitro rendszer által kimutatott genotoxicitás további vizsgálatához is hasznos.

Az emlősökön végzett in vivo mikronukleusz-vizsgálat a vizsgálati vegyi anyag által a kromoszómákban vagy az eritroblasztok mitiotikus rendszerében előidézett károsodás kimutatására használatos. A vizsgálat az állatok, rendszerint rágcsálók csontvelőjéből vagy perifériás vérsejtjeiből vett mintákban található eritrocitákon belüli mikronukleusz-képződést értékeli.

A mikronukleusz-vizsgálat célja a visszamaradó kromoszómatöredékeket vagy egész kromoszómákat tartalmazó mikronukleuszok kialakulását eredményező citogenetikai károsodást okozó vegyi anyagok meghatározása.

Amikor a csontvelői eritroblasztból éretlen eritrocita (néha más néven polikromáziás eritrocita vagy retikulocita) fejlődik ki, a fő sejtmag kilökődik, a már esetlegesen létrejött mikronukleuszok hátramaradhatnak a citoplazmában. E sejtekben a fő sejtmag hiánya miatt könnyebb a mikronukleuszok láthatóvá tétele vagy kimutatása. A kezelt állatokban a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának növekedése az előidézett szerkezeti vagy számszerű kromoszóma-rendelleneségekre utal.

Az újonnan kialakult mikronukleált eritrociták azonosítására és számszerűsítésére megfestéssel kerül sor, melyet mikroszkóp segítségével végzett vizuális értékelés vagy automatizált elemzés követ. Az ivarérett állatok perifériás vérében vagy csontvelőjében lévő elegendő éretlen eritrocita megszámlálását jelentős mértékben megkönnyíti az automatizált értékelési platformok használata. Ezek a platformok a kézi értékelés elfogadható alternatívái (2). Összehasonlító tanulmányokból kiderült, hogy e módszerek a megfelelő kalibráló standardok használatával együtt a kézi mikroszkópos értékelésnél jobb laboratóriumközi és laboratóriumon belüli reprodukálhatóságot és érzékenységet biztosíthatnak (3) (4). A mikronukleált eritrociták gyakoriságának mérésére alkalmas automatizált rendszerek többek között, de nem kizárólag a következők: áramlási citométerek (5), képelemző platformok (6) (7) és lézerszkenneléses citométerek (8).

Bár a vizsgálat keretében általában erre nem kerül sor, a kromoszómatöredékek számos kritérium mentén megkülönböztethetők az egész kromoszómáktól. Ilyen többek között a kinetokor vagy centromer DNS jelenlétének vagy hiányának megállapítása, melyek mindegyike az intakt kromoszómákra jellemző. A kinetokor vagy a centromer DNS hiánya arra utal, hogy a mikronukleusz csak kromoszómatöredékeket tartalmaz, míg a jelenlétük kromoszómaveszteséget jelez.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

Ebben a vizsgálatban a genetikai károsodás vizsgálata szempontjából a fiatal, ivarérett rágcsálók csontvelője a célszövet, mivel az eritrociták ebben a szövetben termelődnek. A perifériás vérben található éretlen eritrocitákban lévő mikronukleuszok mérése elfogadható más olyan emlősfajokban, amelyek esetében az e sejtekben szerkezeti vagy számszerű kromoszóma-rendellenességeket okozó vegyi anyagok kimutatására való megfelelő érzékenység (mikronukleuszok éretlen eritrocitákban való indukciójával) bizonyítást nyert, és amennyiben e választást tudományosan megindokolták. A fő végpont a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának meghatározása. A mikronukleuszt tartalmazó érett eritrociták perifériás vérbeli gyakorisága is használható végpontként olyan fajoknál, amelyeknek a lépe nem végez erőteljes kiválasztást a mikronukleált sejtekkel szemben, valamint abban az esetben, ha az állatok folyamatos kezelése az alkalmazott fajokban előforduló eritrocita élettartamát meghaladó ideig tart (pl. egereknél 4 hétig vagy tovább).

Ha létezik arra vonatkozó bizonyíték, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok), vagy annak (azoknak) a metabolitja(i) nem éri(k) el a célszövetet, e vizsgálat alkalmazása nem feltétlenül megfelelő.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Az állatokat megfelelő módon kell a vizsgálati vegyi anyagnak kitenni. Csontvelő használata esetén az állatokon a kezelés után megfelelő időpont(ok)ban humánus módon eutanáziát kell végrehajtani, a csontvelőt ki kell vonni, preparálni kell és meg kell festeni (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15). Perifériás vér használatakor a vért a kezelés után megfelelő időpont(ok)ban össze kell gyűjteni és preparátumokat kell létrehozni, majd meg kell festeni azokat (12), (16), (17), (18). Akut kezelés esetén fontos, hogy a csontvelő vagy a vér összegyűjtésére olyan időpontban kerüljön sor, amikor a mikronukleált éretlen eritrociták kezeléssel összefüggő megjelenése kimutatható. Perifériás vérből történő mintavétel esetén az is követelmény, hogy elegendő idő teljen el ahhoz, hogy ezek a jelenségek előforduljanak a keringő vérben. A preparátumokat mikroszkóp, képelemzés, áramlási citometria vagy lézerszkenneléses citometria segítségével végzett megjelenítéssel kell elemezni a mikronukleuszok jelenléte szempontjából.

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

A jártasság vizsgálata

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti, a vizsgálat lefolytatásával kapcsolatos elegendő tapasztalat igazolása érdekében bizonyítottan képesnek kell lenniük a közzétett (például (17) (19) (20) (21) (22) irodalom), a mikronukleusz gyakoriságára vonatkozó adatok alapján várható eredmények reprodukálására legalább két, pozitív kontrollként szolgáló – például az 1. táblázatban felsorolt – vegyi anyaggal (ideértve az alacsony dózisban adagolt pozitív kontrollok által kiváltott gyenge reakciókat is) és kompatibilis vivőanyagos/oldószeres kontrollokkal (lásd a 26. pontot). E kísérletek során olyan dózisokat kell alkalmazni, amelyek reprodukálható és dózissal összefüggő növekedést biztosítanak, továbbá bizonyítják a vizsgálati rendszer érzékenységét és dinamikus tartományát az érintett szövetben (a csontvelőben vagy a perifériás vérben), a laboratóriumon belül alkalmazandó értékelési módszer használatával. Ez a követelmény nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll 14–18. pontban meghatározott történeti adatbázis.

Történeti kontrolladatok

A jártassági vizsgálatok során a laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok történeti eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisának statisztikailag megbízhatónak kell lennie annak garantálása érdekében, hogy a laboratórium képes legyen ellenőrizni a negatív kontrollra vonatkozó adatok eloszlását. A szakirodalom szerint legalább 10 kísérletre lehet szükség, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (23)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll. A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (24).

Amennyiben a laboratórium nem végez elegendő számú kísérletet a negatív kontrollok statisztikailag megbízható eloszlásának megállapítására (lásd a 15. pontot) a (13. pontban ismertetett) jártassági vizsgálatok során, elfogadható, hogy az eloszlást az első rutinszerű vizsgálatok során határozzák meg. Ennek a megközelítésnek a (24) szakirodalomban foglalt ajánlásokat kell követnie, és az e kísérletek során kapott negatív kontrolleredményeknek továbbra is összhangban kell lenniük a negatív kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal.

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy milyen hatást gyakorol a létrejött adatoknak a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisával való összhangjára. Csak jelentősebb következetlenségek fennállása esetén kell új történeti kontrolladatbázist létrehozni, amennyiben szakértői vélemény megállapítja az adatok korábbi eloszlástól való eltérését (lásd a 15. pontot). Az újbóli létrehozás során nem feltétlenül van szükség negatív kontrollokat tartalmazó teljes adatbázisra egy tényleges vizsgálat lebonyolításához, amennyiben a laboratórium bizonyítani tudja, hogy a párhuzamos negatív kontrolljainak értékei továbbra is összhangban lesznek a korábbi adatbázisával vagy a kapcsolódó, közzétett adatokkal.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok a mikronukleált éretlen eritrociták egyes állatokban történő előfordulását jelzik. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd a 15. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

Egészséges, fiatal, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. Egerek, patkányok vagy más megfelelő emlősfajok használhatók. Perifériás vér használata esetén meg kell állapítani, hogy a mikronukleált sejteknek a lép általi eltávolítása nem veszélyezteti a kiválasztott fajokban indukált mikronukleuszok kimutatását. Ez az egerek és a patkányok perifériás vére tekintetében egyértelműen bizonyítást nyert (2). Patkányoktól és egerektől eltérő fajok használatának tudományos indokolását közölni kell a jelentésben. Rágcsálóktól eltérő fajok használata esetén az indukált mikronukleuszok mérését ajánlatos integrálni egy másik megfelelő toxicitásvizsgálatba.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Rágcsálók esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének 22 °C (±3 °C)-nak kell lennie. Bár ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, legyen legalább 40 %, és a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. Ha agresszív viselkedés nem várható, a rágcsálókat azonos ivarú és azonos kezelt csoporthoz tartozó kis csoportokban, lehetőleg szilárd aljú, megfelelő környezetgazdagítással ellátott ketrecekben kell tartani (ketrecenként legfeljebb öt egyed tartható). Az állatok kizárólag tudományosan indokolt esetben tarthatók egyenként.

Az állatok előkészítése

Szokásosan egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni (rágcsálók esetén ideális esetben a kezelés kezdetén 6–10 hetes állatokat, bár valamivel idősebb állatok is elfogadhatóak), és azokat véletlenszerűen kontroll- és kezelt csoportokba kell osztani. Az egyes állatokat humánus, minimálisan invazív módszerrel (például gyűrűzéssel, címkézéssel, mikrocsip beültetésével vagy biometrikus azonosítással, de a fül vagy a lábujj kilyukasztása nélkül) egyedi azonosítóval kell ellátni, és legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. A pozitív kontrollal és a vizsgálati vegyi anyaggal való keresztszennyeződés kerülendő. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át.

A dózisok előkészítése

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő oldószerekben vagy vivőanyagokban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Vizsgálati körülmények

Oldószer/Vivőanyag

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat az alkalmazott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan oldószer/vivőanyag, amely képes kémiai reakcióba lépni a vizsgálati vegyi anyagokkal. Jól ismert oldószerektől eltérő oldószerek/vivőanyagok alkalmazása esetén azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát ajánlatos megfontolni. Általánosan használt, kompatibilis oldószer/vivőanyag például többek között a víz, a fiziológiás sóoldat, a metilcellulóz oldat, a karboximetil-cellulóz-nátriumsó oldat, az olívaolaj és a kukoricaolaj. Azt igazoló történeti vagy közzétett adatok hiányában, hogy a választott atipikus oldószer/vivőanyag nem idéz elő mikronukleuszokat vagy más ártalmas hatást, kiindulási vizsgálatot kell lebonyolítani az oldószeres/vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében.

Kontrollok

Pozitív kontrollok

Általában minden vizsgálat során alkalmazni kell olyan állatcsoportot, amelyet pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyaggal kezeltek. Ettől el lehet tekinteni, ha a vizsgálólaboratórium bizonyítja a vizsgálat lebonyolításában való jártasságát és megállapítja a pozitív kontrollok történeti tartományát. Párhuzamos pozitív kontrollcsoport hiányában minden egyes kísérletben értékelési kontrollokat (az értékelési módszertől függően megfelelő, fixált és megfestetlen tárgylemezeket vagy sejtszuszpenzió-mintákat) kell alkalmazni. Ezek oly módon kaphatók meg, hogy a vizsgálat értékelésébe beszámítanak a rendszeres időközönként (például 6–18 hónaponként) – például a jártasság vizsgálata során, vagy szükség esetén azt követően rendszeresen – pozitív kontrollokkal végzett különálló kísérlettel létrejött és tárolt megfelelő referenciamintákat.

A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagoknak megbízható módon ki kell váltaniuk a mikronukleuszok spontán szinthez képest kimutathatóan gyakoribbá válását. Mikroszkóppal végzett kézi értékelés alkalmazásakor a pozitív kontrollok dózisát úgy kell megválasztani, hogy a hatások egyértelműek legyenek, de az értékelő ne tudja beazonosítani azonnal a kódolt mintákat. Elfogadható, hogy a pozitív kontroll beadása a vizsgálati vegyi anyagétól eltérő módon, más kezelési ütemtervvel történjen, és hogy mintavételre csak egyetlen időpontban kerüljön sor. Ezen túlmenően, adott esetben megfontolható a vegyi anyagokkal azonos kémiai osztályba tartozó pozitív kontrollok használata. A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra az 1. táblázat tartalmaz példákat.

1. táblázat

Példák pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra

Etil-metánszulfonát [CASRN 62-50-0]

Metil-metánszulfonát [CASRN 66-27-3]

N-etil-N-nitrozo-karbamid [CASRN 759-73-9]

Mitomicin C [CASRN 50-07-7]

Ciklofoszfamid monohidrát [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietilén-melamin [CASRN 51-18-3]

Kolchicin [CASRN 64-86-8] vagy vinblasztin[CASRN 865-21-4] – mint aneugének

Negatív kontrollok

A negatív kontrollcsoport állatait minden mintavételi időpontban figyelembe kell venni, és azokat egyébként a kezelt csoportokkal azonos bánásmódban kell részesíteni, kivéve, hogy nem kapnak kezelést a vizsgálati vegyi anyaggal. Ha a vizsgálati vegyi anyag beadása során oldószert/vivőanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak meg kell kapnia ezt az oldószert/vivőanyagot. Ha azonban a vizsgálólaboratórium történeti adatai azt igazolják, hogy a negatív kontrollból származó, mikronukleált sejtek állatok közötti sokfélesége és gyakorisága állandó minden mintavételi időpontban, a negatív kontrollokból elegendő lehet csak egyetlen mintavétel is. Amennyiben a negatív kontrollokhoz egyetlen mintavételt alkalmaznak, azt a vizsgálat során alkalmazott első mintavételi időpontban kell elvégezni.

Perifériás vér használata esetén a rövid távú vizsgálatoknál a párhuzamos negatív kontroll helyett elfogadható egy kezelés előtti minta, ha a létrejött adatok összhangban vannak a vizsgálólaboratórium történeti kontrolladatbázisával. Patkányok vonatkozásában beigazolódott, hogy a kezelés előtti kis mennyiségű (például naponta 100 μl-nél kevesebb) mintavétel csekély mértékben befolyásolja a mikronukleusz-háttérgyakoriságot (25).

ELJÁRÁS

Az állatok száma és ivara

A mikronukleusz-válasz általában hasonló a hím- és a nőivarú állatok körében, és ezért a vizsgálatok többsége bármelyik nemnél elvégezhető (26). A hímek és a nőstények közötti lényeges eltéréseket (például a szisztémás toxicitás, a metabolizmus, a biológiai hasznosíthatóság, a csontvelő-toxicitás stb. például többek között dózisbehatároló vizsgálattal megállapított eltéréseit) bizonyító adatok mindkét ivar használatát ösztönöznék. Ebben az esetben helyénvaló lehet mindkét ivarnál vizsgálatot végezni, például ismételt dózisú toxicitási vizsgálat keretében. Mindkét ivar használata esetén helyénvaló lehet a faktoriális kísérlettervezés alkalmazása. Az e kísérlettervezés segítségével végzendő adatelemzés részletei a 2. függelékben találhatók.

A vizsgálat megkezdésekor a csoportok méretét úgy kell megállapítani, hogy csoportonként legalább öt azonos ivarú – illetve mindkét ivar használata esetén mindkét ivarból öt – elemezhető állat legyen. Amennyiben a vegyi anyagoknak való emberi expozíció szexspecifikus lehet, mint például egyes gyógyszerek esetében, a vizsgálatot a megfelelő ivarú állatokkal kell elvégezni. Útmutatás az állatok maximális számára vonatkozó tipikus követelményhez: a 37. pontban megállapított paraméterek szerint, három dóziscsoporttal, valamint párhuzamos negatív és pozitív kontrollcsoportokkal (melyek mindegyike öt, egy ivarhoz tartozó állatból áll) végzett csontvelővizsgálathoz 25-35 állatra lenne szükség.

Dózisszintek

Ha előzetes dózisbehatároló vizsgálatra kerül sor amiatt, hogy már nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok kiválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek, ivarok és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyek a fő vizsgálatban alkalmazandóak (27). A vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely anélkül, hogy vizsgálatkorlátozó toxicitást mutatna, a legmagasabb tolerált dózis a vizsgálati időszak tartamához viszonyítva (például testtömeg-csökkenést vagy vérképző rendszeri citotoxicitást vált ki, de elhullást, illetve humánus eutanáziát igénylő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy szorongást nem idéz elő (28)).

A legmagasabb dózis olyan dózisként is definiálható, amely toxicitást okoz a csontvelőben (például a csontvelőben vagy a perifériás vérben az összes eritrocita között az éretlen eritrociták arányának több mint 50 %-os csökkenését, amely arány ugyanakkor nem lehet kevesebb, mint a kontrollérték 20 %-a). A perifériás vérkeringésben előforduló CD71-pozitív sejtek (például áramlási citometriával végzett) elemzésekor azonban az éretlen eritrociták e nagyon fiatal frakciója gyorsabban reagál a toxikus kihívásokra, mint az éretlen eritrociták nagyobb RNS-pozitív kohorsza. Ezért a toxicitás magasabbnak tűnhet a CD71-pozitív éretlen eritrociták frakcióját vizsgáló akut expozíciós tervek mellett, mint az akut expozíció azon terve szerint, amelynek során az RNS-tartalom alapján történik az éretlen eritrociták azonosítása. Ennélfogva abban az esetben, ha a kísérletek során öt vagy kevesebb kezelési napot alkalmaznak, a toxicitást okozó vizsgálati vegyi anyagok esetében a legmagasabb dózisszint azon dózisként definiálható, amely statisztikailag szignifikáns – a kontrollérték 5 %-ánál alacsonyabbra azonban vissza nem eső – csökkenést okoz a CD71-pozitív éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított arányában (29).

Azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, vagy olyan detoxifikációs folyamatokat idéznek elő, amelyek hosszú távú beadás után az expozíció csökkenéséhez vezethetnek, kivételek lehetnek a dózisbeállítási kritériumok alól, és azokat eseti alapon kell értékelni.

Annak érdekében, hogy dózis-válasz adatokat lehessen szerezni, a teljes vizsgálatnak egy negatív kontrollcsoportot, valamint legalább három dózisszintet kell tartalmaznia, ahol a dózisszintek közötti szorzótényező általában 2, de legfeljebb 4. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást a dózisbehatároló vizsgálat során vagy meglévő adatok alapján, legalább 14 napig tartó beadási időszak esetén a legmagasabb dózisnak 1 000  mg/testtömeg kg/napnak, 14 napnál rövidebb beadási időszak esetében pedig 2 000  mg/testtömeg kg/napnak kell lennie Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, az MTD-nek a beadott legmagasabb dózisnak kell lennie, és a használt dózisszintek lehetőleg fedjék le a maximálistól az alacsony mértékű toxicitást okozó vagy toxicitást egyáltalán nem okozó dózisig terjedő tartományt. Ha a célszövet (csontvelő) toxicitása valamennyi vizsgált dózisszintnél megfigyelhető, érdemes nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni. A mennyiségi dózis-válasz adatok teljesebb körű jellemzését célzó vizsgálatok további dóziscsoportokat tehetnek szükségessé. Ezek a határértékek a vizsgálati vegyi anyagok bizonyos, külön követelmények hatálya alá tartozó típusai (például a humán gyógyszerek) esetében változóak lehetnek.

Határérték-vizsgálat

Ha a dózisbehatároló kísérletek vagy a rokon állattörzsekből származó meglévő adatok azt jelzik, hogy a legalább a határdózist tartalmazó (az alábbiakban ismertetett) kezelési eljárás semmilyen megfigyelhető toxikus hatást nem vált ki, (többek között nem váltja ki a csontvelősejtek proliferációjának visszaesését vagy a célszövet citotoxicitásának más bizonyítékát), és ha nem várható genotoxicitás az in vitro genotoxicitási vizsgálatok alapján vagy a szerkezetileg rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján, akkor nem feltétlenül tekintendő szükségesnek három dózis használatával végrehajtott teljes vizsgálat, amennyiben bizonyítást nyert, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) eléri(k) a célszövetet (a csontvelőt). Ilyen esetekben a határdózisnál alkalmazott egyetlen dózisszint elegendő lehet. Legalább 14 napig tartó beadási időszak esetén a határdózis 1 000  mg/testtömeg kg/nap. 14 napnál rövidebb beadási időszak esetén a határdózis 2 000  mg/testtömeg kg/nap.

A dózisok beadása

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak (például takarmány, ivóvíz, helyi szubkután, intravénás, orális (gyomorszondával), inhalációs, intratracheális vagy implantáció) is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet(ek) megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció nem ajánlott, mivel az nem tervezett emberi expozíciós út, és kizárólag tudományos indokolással alkalmazható. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmányba vagy ivóvízbe keverik, különösen egyszeri adagolás esetén ügyelni kell arra, hogy a táplálék és a víz fogyasztása és a mintavétel közötti idő elegendő legyen a hatások kimutathatóságához (lásd a 37. pontot). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata rendszerint nem haladhatja meg az 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációértékeknél rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró vizsgálati vegyi anyagok kivételével, a koncentráció megfelelő beállításával minimálisra kell csökkenteni a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének eltéréseit, hogy valamennyi dózisszinten a testtömeghez viszonyítva konstans mennyiséget lehessen beadni a kísérleti állatoknak.

A kezelés ütemterve

Lehetőleg 2 vagy több kezelést kell 24 órás időközönként végezni, különösen e vizsgálat más toxicitásvizsgálatokba való beépítésekor. Alternatív esetben egyetlen kezelés végezhető, amennyiben tudományosan indokolt (például a vizsgálati vegyi anyagok közismerten blokkolják a sejtciklust). A vizsgálati vegyi anyagok több dózisra osztva is beadhatók, például nagy mennyiségű anyag beadásának megkönnyítése érdekében ugyanazon a napon két vagy több, legfeljebb 2–3 órás időközönként végzett kezeléssel. Ilyen körülmények között, vagy amikor a vizsgálati vegyi anyag beadása inhaláció útján történik, a mintavétel időpontját az utolsó dózis beadásának vagy az expozíció végének időpontja alapján kell ütemezni.

A vizsgálat egereken vagy patkányokon végezhető el az alábbi háromféle mód egyikén:

Releváns és tudományosan indokolt esetben, valamint más toxicitási vizsgálatokba való integráció megkönnyítése érdekében más adagolási vagy mintavételi eljárások is alkalmazhatók.

Megfigyelések

A kísérleti állatok esetében általános klinikai megfigyeléseket kell tenni, és a klinikai tüneteket legalább naponta egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban rögzíteni kell, továbbá figyelembe kell venni az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Az adagolási időszakban naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából. Minden állat tömegét le kell mérni a vizsgálat megkezdésekor, az ismételt dózisú vizsgálatok esetén hetente legalább egyszer, valamint az állatok leölésekor. A legalább egy hétig tartó vizsgálatok során a felvett táplálék mennyiségét legalább heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokon a vizsgálati időszak befejeződése előtt humánus módon eutanáziát kell végrehajtani (28). Bizonyos körülmények között az állatok testhőmérsékletét nyomon lehet követni, ugyanis a kezelés által előidézett hiper- és hipotermia közrejátszik a fals eredmények létrejöttében (32) (33) (34).

A célszövet expozíciója

Amennyiben indokolt, és amennyiben más expozíciós adatok nem léteznek (lásd a 48. pontot), megfelelő időpont(ok)ban vérmintát kell venni annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagok plazmában lévő szintjét meg lehessen vizsgálni annak bizonyítása céljából, hogy a csontvelő expozíciója megtörtént.

Csontvelő/vér preparálása

A csontvelősejteket rendszerint az állatok combcsontjából vagy sípcsontjából kell venni közvetlenül a humánus eutanáziát követően. A sejteket általában el kell távolítani, preparálni kell és meg kell festeni bevált módszerek segítségével. Megfelelő állatjóléti előírások szerint kis mennyiségű perifériás vér vehető a kísérleti állat túlélését lehetővé tevő módszer segítségével, például a farokvénából vagy más megfelelő érből történő vérvétellel, szívpunkcióval, vagy az állaton végzett eutanázia alkalmával egy nagy érből történő mintavétellel. Mind a csontvelőből származó eritrociták, mind a perifériás vérből származó eritrociták esetében érvényes, hogy a sejteket – az elemzési módszertől függően – azonnal meg lehet festeni szupravitálisan (16) (17) (18), azokból kenetpreparátumokat kell létrehozni, majd azokat mikroszkópos vizsgálat céljából meg kell festeni, vagy áramlási citometriás elemzés céljából fixálni kell és megfelelően meg kell festeni. A DNS-specifikus festékek (például akridinnarancs (35) vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y (36)) használata kiküszöbölhet néhányat a DNS-re nem jellemző festőanyag használatával mesterségesen előidézett változás közül. Ez az előny nem zárja eleve ki a hagyományos festékek (például mikroszkópos elemzéshez Giemsa) használatát. További rendszerek (például a magvas sejtek eltávolítására szolgáló cellulózoszlopok (37) (38)) is használhatók, feltéve, hogy már bebizonyosodott e rendszerekről, hogy kompatibilisek a laboratóriumi mintapreparálással.

Amennyiben e módszerek alkalmazandóak, kinetokor elleni antitestek (39), fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) végzett pancentromérás DNS-próbák (40), vagy pancentroméra-specifikus primerekkel végzett in situ jelölés megfelelő DNS-kontrasztfestéssel (41) alkalmazható a mikronukleuszok jellegének (kromoszóma/kromoszómatöredék) azonosítására annak meghatározásához, hogy a mikronukleusz-indukálási mechanizmus klasztogén vagy aneugén aktivitásnak tudható-e be. A klasztogén és aneugén hatású anyagok megkülönböztetésére egyéb, korábban hatékonynak bizonyult módszerek is alkalmazhatók.

Elemzés (kézi és automatizált)

Az elemzésre szánt összes tárgylemezt és mintát, beleértve a pozitív és a negatív kontrollokét is, egyedi kódolással kell ellátni, és azokat véletlenszerűen kell kiválasztani bármilyen elemzés előtt, hogy a kézi értékelést végző személy ne ismerje a kezelés körülményeit; ilyen kódolás a nem szemrevételezéses vizsgálaton alapuló és a kezelő személy általi torzítással nem érintett automatizált értékelési rendszerek használatakor nem szükséges. Minden egyes állatnál meg kell határozni az összes (éretlen + érett) eritrocitához viszonyítottan az éretlenek arányát, csontvelő esetében összesen legalább 500 eritrocita, perifériás vér esetében pedig legalább 2 000 eritrocita megszámlálásával (42). Állatonként legalább 4 000 éretlen eritrocitát kell pontozni a mikronukleált éretlen eritrociták előfordulásának megállapítása céljából (43). Ha a negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázis szerint a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának átlagos háttérértéke 0,1 %-nál kevesebb a vizsgálólaboratóriumban, meg kell fontolni további sejtek értékelését. A minták elemzésekor mikroszkópos vizsgálattal végzett értékelés esetén a kezelt állatokban az éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított aránya nem lehet kevesebb a vivőanyagos/oldószeres kontrollok arányának 20 %-ánál, CD71+ éretlen eritrociták citometriás módszerekkel végzett értékeléskor pedig nem lehet kevesebb a vivőanyagos/oldószeres kontrollok arányának kb. 5 %-ánál (lásd a 31. pontot) (29). Például a mikroszkóppal értékelt csontvelővizsgálatnál, ha az éretlen eritrociták kontrollaránya 50 % a csontvelőben, a toxicitás felső határértéke az éretlen eritrociták 10 %-os aránya lenne.

Mivel a patkánylép elkülöníti és megsemmisíti a mikronukleált eritrocitákat, a patkányok perifériás vérének elemzése során a vizsgálat magas érzékenységének fenntartása érdekében a mikronukleált éretlen eritrociták elemzését érdemes a legfiatalabb frakcióra korlátozni. Automatizált elemzési módszerek alkalmazásakor ezek a legéretlenebb eritrociták az RNS-tartalmuk alapján, vagy a felületükön megjelenő transzferrin receptorok (CD71+) magas szintje alapján határozhatók meg (31). A különböző festési módszerekkel végzett közvetlen összehasonlításból azonban kiderült, hogy kielégítő eredmények kaphatók különféle módszerekkel, beleértve az akridinnaranccsal végzett festést is (3) (4).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. Minden egyes állat esetében külön-külön kell feljegyezni a pontozott éretlen eritrociták számát, a mikronukleált éretlen eritrociták számát és az éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított arányát. Ha egereket kezelnek folyamatosan legalább négy hétig, a mikronukleált érett eritrociták számát és arányát meg kell adni, ha gyűjtöttek ilyen eritrocitákat. Az állati toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat szintén a jelentésbe kell foglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Az alábbi kritériumok határozzák meg a vizsgálat elfogadhatóságát:

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

Ha egy adott mintavételi időpontban csak a legmagasabb dózis vizsgálatára kerül sor, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha statisztikailag szignifikáns növekedés tapasztalható a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva, és az eredmények a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) kívül esnek. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (44) (45) (46) (47). Dózis-válasz elemzéskor legalább három kezelt dóziscsoportot kell elemezni. A statisztikai vizsgálatoknak az állatot kell kísérleti egységként alkalmazniuk. A mikronukleusz-vizsgálat pozitív eredményei azt jelzik, hogy a vizsgálati vegyi anyag hatására kialakulnak olyan mikronukleuszok, amelyek a vizsgált fajok eritroblasztjain belüli kromoszómák károsodásának vagy a mitotikus rendszer károsodásának eredményeként jönnek létre. Amennyiben a vizsgálatot a mikronukleuszokon belüli centromérák kimutatása céljával végezték, a centromérát tartalmazó mikronukleuszok (teljes kromoszóma-veszteségre utaló centromer DNS vagy kinetokor) létrejötte azt bizonyítja, hogy a vizsgálati vegyi anyag aneugén.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény esetén:

A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (44) (45) (46) (47). A csontvelő vizsgálati vegyi anyag(ok)nak való expozíciójára vonatkozó bizonyíték lehet többek között az éretlen eritrociták érett eritrocitákhoz viszonyított arányának csökkenése vagy a vizsgálati vegyi anyag(ok) plazmában vagy vérben való előfordulásának mérése. Intravénás beadás esetén az expozícióra vonatkozó bizonyíték nem szükséges. Alternatív esetben az azonos expozíciós út és azonos faj alkalmazásával végzett független vizsgálat során kapott ADME-adatok használhatók a csontvelő-expozíció bizonyítására. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények között a vizsgálati vegyi anyag nem idéz elő mikronukleuszokat a vizsgált fajok éretlen eritrocitáiban.

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

Olyan esetekben, ha a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, illetve egy adott eredmény (például kismértékű vagy határesethez közelítő növekedés) biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy a már lefolytatott kísérletek további vizsgálataival kell értékelni. Egyes esetekben hasznos lehet több sejt elemzése vagy módosított kísérleti körülmények mellett megismételt kísérlet végrehajtása.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatok eleve kizárják azt a következtetést, hogy a vizsgálati vegyi anyag pozitív vagy negatív eredményeket hoz, ezért a végkövetkeztetés szerint a vizsgálat kétértelmű lesz.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Centroméra : olyan kromoszóma-régió(k), amely(ek)hez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Eritroblaszt : az eritrocita fejlődésének az éretlen eritrocitát közvetlenül megelőző korai szakasza, amikor a sejt még tartalmaz magot.

Kinetokor : az eukarióta sejtek centroméráján kialakuló fehérjeszerkezet, amely a mitózis és a meiózis során összeköti a kromoszómát a mitotikus orsó mikrocsöves polimerjeivel, és amely a sejtosztódás során a testvérkromatidok szétválasztására szolgál.

Mikronukleusz : a sejtek fő magjától elkülönült kis járulékos mag, amelyet a mitózis (meiózis) telofázisa során hoznak létre visszamaradó kromoszómatöredékek vagy teljes kromoszómák.

Normokromáziás vagy érett eritrocita : olyan teljesen érett eritrocita, amely elveszítette az enukleációt követően megmaradó reziduális RNS-ét és/vagy más rövid életű sejtmarkereit, amelyek jellemzően eltűnnek az enukleáció után az utolsó eritroblaszt-osztódást követően.

Polikromáziás vagy éretlen eritrocita : köztes fejlődési szakaszban lévő, újonnan kialakult eritrocita, amely például a Wright–Giemsa elnevezésű klasszikus vérfesték kék és vörös komponenseivel egyaránt megfestődik az újonnan kialakult sejtben lévő reziduális RNS jelenléte miatt. Ezek az újonnan kialakult sejtek nagyjából azonosak a retikulocitákkal, vitális festék segítségével jelenítődnek meg, amelynek hatására a reziduális RNS retikulummá tömörül. Más módszerek, többek között az RNS fluoreszcens festékekkel történő monokróm festése vagy a CD71-hez hasonló, rövid életű felületi markerek fluoreszcens antitestekkel történő megjelölése jelenleg gyakran használatosak az újonnan kialakult vörösvérsejt azonosítására. A polikromáziás eritrociták, a retikulociták és a CD71-pozitív eritrociták mind éretlen eritrociták, bár mindegyiknek némileg eltérő az életkori eloszlása.

Retikulocita : a reziduális sejt-RNS jellegzetes retikulummá tömörülését okozó vitális festékkel megfestett, újonnan kialakult eritrocita. A retikulociták és a polikromáziás eritrociták egymáshoz nagyon közel álló fejlődési szakaszban vannak.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

---

2. függelék

AZ IVAROK KÖZÖTTI ELTÉRÉSEK MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ FAKTORIÁLIS KÍSÉRLETTERVEZÉS AZ IN VIVO MIKRONUKLEUSZ-VIZSGÁLAT SORÁN

A faktoriális kísérlettervezés és annak elemzése

Ebben a kísérlettervezésben legalább 5 hím és 5 nőstény vizsgálatára kerül sor mindegyik koncentrációszintnél, ami legalább 40 állat (20 hím és 20 nőstény, valamint a releváns pozitív kontrollok) felhasználását eredményezi.

A kísérlettervezés, amely az egyszerűbb faktoriális kísérlettervezések egyike, kétirányú varianciaanalízissel egyenértékű, ahol a fő tényezők az ivar és a koncentrációszintek. Az adatok számos standard statisztikai szoftvercsomag, például az SPSS, az SAS, a STATA, a Genstat, valamint az R használatával elemezhetők.

Az analízis az adatkészleten belül a variabilitást az ivarok közötti variabilitásra, a koncentrációk közötti variabilitásra, valamint az ivarok és a koncentrációk közötti kölcsönhatáshoz kapcsolódó variabilitásra osztja. Az egyes feltételeket ugyanazon koncentrációnak kitett, az azonos ivarú állatok csoportjain belüli párhuzamos állatok közötti variabilitás becsült értékéhez viszonyítva kell megvizsgálni. A mögöttes módszertanra vonatkozó kimerítő részletek számos statisztikai tankönyvben (lásd a hivatkozásokat) és a statisztikai szoftvercsomagokkal együtt biztosított súgófájlokban is megtalálhatók.

Az analízis az ivar x koncentráció kölcsönhatási feltételnek az ANOVA-táblázatban ( 5 ) való vizsgálatával folytatódik. Szignifikáns kölcsönhatás hiányában az egyes ivarok vagy az egyes koncentrációszintek közötti értékek kombinálásával érvényes statisztikai vizsgálat végezhető a szintek között, az ANOVA szerinti, csoporton belül összesített variabilitási feltétel alapján.

Az analízis a becsült koncentrációk közötti variabilitás kontrasztokká osztásával folytatódik, ami lehetővé teszi a válaszok lineáris és kvadratikus kontrasztjainak megállapítását valamennyi koncentrációszintnél. Ha az ivar x koncentráció kölcsönhatás szignifikáns, ez a feltétel lineáris x ivar és kvadratikus x ivar kölcsönhatására vonatkozó kontrasztokká osztható. E feltételek arra vonatkozó vizsgálatokat biztosítanak, hogy a koncentráció-válaszok párhuzamosak-e a két ivar esetében, illetve hogy a két ivar különböző választ ad-e.

A csoporton belül összesített variabilitásra vonatkozó becslés felhasználható az átlagok közötti eltérés páronkénti vizsgálatához. Ezek az összehasonlítások elvégezhetők a két ivarra vonatkozó átlagok között és a különböző koncentrációszintekre vonatkozó átlagok között; ilyen például a negatív kontrollok szintjével való összehasonlítás. Amennyiben szignifikáns kölcsönhatás tapasztalható, összehasonlítható a különböző koncentrációk adott ivaron belüli átlaga vagy az ivarok azonos koncentrációnál számított átlaga.

Hivatkozások

Számos olyan statisztikai tankönyv létezik, amely a faktoriális kísérlettervezések elméletét, kialakítását, módszertanát, elemzését és értelmezését tárgyalja, a legegyszerűbb kétfaktoros elemzéstől a kísérlettervezés módszertanában alkalmazott bonyolultabb formákig. Az alábbi nem kimerítő lista. Egyes könyvekben összehasonlítható kísérlettervezésekre vonatkozó kidolgozott példák találhatók, esetenként az analízisek különféle szoftvercsomagok segítségével történő lefuttatásához szükséges kóddal együtt.

”

„B.47.    A szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 437. vizsgálati iránymutatásában (2013) leírt módszerrel. A szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszert (a továbbiakban: BCOP vizsgálati módszer) az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központtal (ECVAM) és az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Japán Központtal (JaCVAM) együtt értékelte 2006-ban és 2010-ben (1) (2). Az első értékelés során abból a szempontból értékelték a BCOP vizsgálati módszert, hogy mennyire hasznos a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok (anyagok és keverékek) (1) azonosításához. A második értékelés során abból a szempontból értékelték a BCOP vizsgálati módszert, hogy mennyire hasznos a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt vegyi anyagok (anyagok és keverékek) (2) azonosításához. A BCOP validációs adatbázis összesen 113 anyagot és 100 keveréket tartalmazott (2) (3). Ezen értékelések és szakmai vizsgálatuk alapján megállapítást nyert, hogy a vizsgálati módszer helyesen tudja azonosítani a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszerének (GHS) (4), illetve az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendeletnek ( 6 ) (CLP-rendelet) a meghatározása szerint súlyos szemkárosodást okozó (1. kategóriába tartozó) vegyi anyagokat (anyagokat és keverékeket egyaránt), továbbá szemirritáció vagy súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagokat, ezért azt tudományosan megalapozottként elfogadták mindkét célra. Súlyos szemkárosodás a vizsgálati vegyi anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül nem teljes mértékben visszafordítható szövetkárosodás a szemben, vagy a látóképesség súlyos fizikai romlása. A súlyos szemkárosodást okozó vizsgálati vegyi anyagok az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandók be. A szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében be nem sorolt vegyi anyagok olyan vegyi anyagok, amelyek nem tesznek eleget az ENSZ-GHS szerinti 1. vagy 2. (2A. vagy 2B.) kategóriába való besorolás követelményeinek, vagyis azokra az ENSZ-GHS szerint kategória nélküliként történik hivatkozás. Ez a vizsgálati módszer a BCOP vizsgálati módszer ajánlott alkalmazását és korlátait tartalmazza a módszer értékelései alapján. Az OECD vizsgálati iránymutatásának eredeti, 2009-es változata és frissített, 2013-as változata közötti legfőbb eltérések többek között, de nem kizárólag a következők: a BCOP vizsgálati módszer ENSZ-GHS szerint besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazása (2. és 7. pont); a BCOP vizsgálati módszer alkoholok, ketonok és szilárd anyagok vizsgálatára (6. és 7. pont), valamint anyagok és keverékek vizsgálatára (8. pont) való alkalmazhatóságával kapcsolatos pontosítások; a felületaktív anyagok és a felületaktív anyagokat tartalmazó keverékek vizsgálatának módjával kapcsolatos pontosítások (28. pont); a pozitív kontrollokra vonatkozó frissítések és pontosítások (39. és 40. pont); a BCOP vizsgálati módszerrel kapcsolatos döntés kritériumainak frissítése (47. pont); a vizsgálat elfogadhatósági kritériumainak frissítése (48. pont); a Vizsgálati jegyzőkönyv elemeinek frissítése (49. pont); a fogalommeghatározásokat tartalmazó 1. függelék frissítése; a 2. függelék beillesztése a BCOP vizsgálati módszer különféle osztályozási rendszerek szerinti prediktív értéke tekintetében; a jártassági tesztanyagok jegyzékét tartalmazó 3. függelék frissítése, valamint a BCOP vizsgálathoz alkalmazott szaruhártyatartóról (1. pont) és az opaciméterről (2. és 3. pont) szóló 4. függelék frissítése.

Jelenleg általánosan elfogadott, hogy az előre látható jövőben egyetlen in vitro szemirritációs vizsgálat sem tudja majd helyettesíteni a Draize-féle in vivo szemvizsgálatot a különböző kémiai osztályoknál felmerülő irritáció teljes skálájának előrejelzésére. Előfordulhat azonban, hogy egy-egy (többszintű) vizsgálati stratégián belüli több alternatív vizsgálati módszer stratégiai kombinációja helyettesíteni tudja a Draize-féle szemvizsgálatot (5). A felülről építkező megközelítés (5) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan rendkívül irritáló hatású lehet, míg az alulról építkező megközelítés (5) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan nem okoz a besorolás szükségességéhez elegendő szemirritációt. A BCOP vizsgálati módszer bizonyos körülmények között és meghatározott korlátokkal a vegyi anyagok szemet érintő veszélyességükre tekintettel történő osztályozására és címkézésére alkalmazható in vitro vizsgálati módszer. Bár a BCOP vizsgálati módszer nem minősül a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot önállóan helyettesítő vizsgálati módszernek, első lépésként ajánlott a Scott és társai (5) által javasolt felülről építkező megközelítéshez hasonló vizsgálati stratégia keretében a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz a további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandó vegyi anyagok (4) azonosítására. A BCOP vizsgálati módszer ajánlott az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerinti kategória nélküli) vegyi anyagok (4) olyan vizsgálati stratégia keretében történő azonosítására, mint az alulról építkező megközelítés (5). Azonban az a vegyi anyag, amely a BCOP vizsgálati módszerrel előreláthatólag nem okoz súlyos szemkárosodást vagy nem tartozik a szemirritáció/súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt anyagok közé, további (in vitro és/vagy in vivo) vizsgálatot tenne szükségessé a végleges osztály megállapításához.

E vizsgálati módszer célja a vizsgálati vegyi anyag szemet érintő veszélyességi potenciáljának értékelésére használt eljárások ismertetése annak alapján, hogy az anyag izolált szarvasmarha-szaruhártyában kivált-e opacitást és fokozott permeabilitást. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése i. a csökkent fényátbocsátás (opacitás) és ii. a fluoreszcein-nátrium festékanyag fokozott áthatolása (permeabilitás) mérésével történik. A szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követően megállapítható opacitásból és permeabilitásból együttesen kell származtatni az ún. in vitro irritációs pontszámot (In Vitro Irritancy Score, a továbbiakban: IVIS), amely a vizsgálati vegyi anyag irritáció szempontjából való osztályba sorolására szolgál.

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Ez a vizsgálati módszer az ICCVAM BCOP vizsgálati módszerről szóló protokollján (6) (7) alapul, amelynek kidolgozása eredetileg az Institute for in vitro Sciences (In Vitro Tudományok Intézete; IIVS) protokolljából és a 124. INVITTOX-protokollból (8) származó információk alapján történt. Ez utóbbi az Európai Közösség által támogatott, 1997–1998-ban végzett elővalidációs vizsgálathoz használt protokoll. Mindkét protokoll alapja az a BCOP vizsgálati módszer volt, amelyről elsőként Gautheron és társai (9) számoltak be.

A BCOP vizsgálati módszer alkalmazható az ENSZ-GHS-ben meghatározott, súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába (4) sorolandó vegyi anyagok azonosítására. Erre a célra történő alkalmazásakor a BCOP vizsgálati módszer általános pontossága 79 % (150/191), hamis pozitív aránya 25 % (32/126), hamis negatív aránya pedig 14 % (9/65) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolt adataival való összevetéskor (3) (lásd a 2. függelék 1. táblázatát). Amikor bizonyos kémiai osztályokba (például alkoholok, ketonok) vagy fizikai osztályokba (például szilárd anyagok) tartozó vizsgálati vegyi anyagok nem szerepelnek az adatbázisban, a BCOP vizsgálati módszer általános pontossága 85 % (111/131), hamis pozitív aránya 20 % (16/81), hamis negatív aránya pedig 8 % (4/50) az ENSZ-GHS osztályozási rendszer vonatkozásában (3). A BCOP vizsgálati módszernek a súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolt) vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazásakor felmerülő hiányosságai a validációs adatbázisban az alkoholok és a ketonok esetében tapasztalt magas hamis pozitív arányokon és a szilárd anyagok esetében tapasztalt magas hamis negatív arányon alapulnak (1) (2) (3). Mivel azonban a BCOP vizsgálati módszerrel nem minden alkohol és keton előrejelzése túlzó, és a módszer egyes alkoholokat és ketonokat helyesen jelez előre az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként, ez a két szerves funkciós csoport nem tekintendő a vizsgálati módszer alkalmazási területén kívül esőnek. A vizsgálati módszer alkalmazójának kell eldöntenie azt, hogy valamely alkohol vagy keton túlzó előrejelzése elfogadható-e, illetve azt, hogy kell-e további vizsgálatot végezni az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretében. A szilárd anyagok esetében tapasztalt hamis negatív arányok tekintetében megjegyzendő, hogy változó és szélsőséges expozíciós körülményekhez vezethetnek a Draize-féle in vivo szemirritációs vizsgálat során, ami a tényleges irritációs hatásukra (10) vonatkozó irreleváns előrejelzéseket eredményezhet. Megjegyzendő az is, hogy a súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok azonosításával összefüggésben az ICCVAM validációs adatbázisában (2) (3) meghatározott hamis negatív arányok következtében az IVIS értéke egyik esetben sem lett ≤ 3, amely érték az ENSZ-GHS szerint a nem besorolt vegyi anyagok azonosítására használt kritérium. Ezen túlmenően a BCOP szerinti hamis negatív arányok ebben az összefüggésben nem kritikus jelentőségűek, mivel minden 3-nál nagyobb, de legfeljebb 55 IVIS értékű vizsgálati vegyi anyag vizsgálatára sor kerülne más, megfelelően validált in vitro vizsgálatokkal, vagy – a szabályozási követelményektől függően, az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia segítségével – utolsó lehetőségként nyulakon végzett vizsgálatokkal. Mivel a BCOP vizsgálati módszer egyes szilárd vegyi anyagokat helyesen jelez előre az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként, ez a halmazállapot szintén nem minősül a vizsgálati módszer alkalmazási területén kívül esőnek. A vizsgálók valamennyi típusú vegyi anyag esetében mérlegelhetik e vizsgálati módszer alkalmazását, amellyel 55-nél magasabb IVIS értéket további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandó súlyos szemkárosodást okozó reakcióra utaló jelként kell elfogadni. Ahogyan azonban már említésre került, az alkoholok és a ketonok esetében a kapott pozitív eredményeket az esetlegesen túlzó előrejelzés kockázata miatt óvatosan kell értelmezni.

A BCOP vizsgálati módszer az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (4) szerint a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására is alkalmazható. Erre a célra történő alkalmazásakor a BCOP vizsgálati módszer általános pontossága 69 % (135/196) hamis pozitív aránya 69 % (61/89), hamis negatív aránya pedig 0 % (0/107) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolt adataival való összevetéskor (3) (lásd a 2. függelék 2. táblázatát). A kapott hamis pozitív arány (a 3-nál magasabb IVIS értéket mutató, az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli vegyi anyagok in vivo vizsgálata, lásd a 47. pontot) rendkívül magas, de ebben az összefüggésben nem kritikus jelentőségű, mivel a minden 3-nál nagyobb, de legfeljebb 55 IVIS értékű vegyi anyagot ezután más, megfelelően validált in vitro vizsgálatoknak vetnek alá, vagy utolsó lehetőségként – a szabályozási követelményektől függően, az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia segítségével – nyulakon is megvizsgálják. A BCOP vizsgálati módszer nem mutat hiányosságokat az alkoholok, a ketonok és a szilárd anyagok vizsgálata tekintetében, amikor a cél a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli) vegyi anyagok azonosítása (3). A vizsgálók valamennyi típusú vegyi anyag esetében mérlegelhetik e vizsgálati módszer alkalmazását, amellyel a negatív eredményt (IVIS ≤ 3) arra utaló jelzésként kell elfogadni, hogy besorolás nem szükséges (az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli). Mivel a BCOP vizsgálati módszer a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagoknak csak a 31 %-át tudja helyesen azonosítani, nem lehet első választási lehetőség az alulról építkező megközelítés (5) megkezdéséhez, ha rendelkezésre állnak más validált és elfogadott, hasonló érzékenységű, de specifikusabb in vitro módszerek.

A BCOP validációs adatbázis összesen 113 anyagot és 100 keveréket tartalmazott (2) (3). A BCOP vizsgálati módszer ezért az anyagok és a keverékek vizsgálatára egyaránt alkalmazhatónak tekintendő.

Az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába alulosztályozott vegyi anyagok, valamint az ENSZ-GHS szerinti nem besorolt kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába felülosztályozott vegyi anyagok jelentős száma miatt a BCOP vizsgálati módszer nem ajánlott olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket szemirritáló hatásúként (azaz az ENSZ-GHS szerinti 2. vagy 2A. kategóriába tartozóként) kell besorolni, illetve olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket enyhén szemirritáló hatásúként (az ENSZ-GHS szerinti 2B. kategóriába tartozóként) kell besorolni (2) (3). E célból egy másik megfelelő módszerrel végzett további vizsgálatra lehet szükség.

A szarvasmarhaszemmel és a szarvasmarha-szaruhártyával végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az állati eredetű anyagok – ideértve többek között, de nem kizárólag a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (11).

Bár a BCOP vizsgálati módszer nem veszi figyelembe a kötőhártya- és az íriszsérüléseket, foglalkozik a szaruhártyára kifejtett hatásokkal, amelyek leginkább befolyásolják az in vivo besorolást az ENSZ-GHS osztályozás alkalmazásában. Önmagában a BCOP vizsgálati módszerrel nem értékelhető a szaruhártya-léziók visszafordíthatósága. Nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban azt javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmazható a visszafordíthatatlan hatások bizonyos típusainak azonosítására (12). További tudományos ismeretekre van azonban szükség annak megértéséhez, hogy a kezdeti nagyon súlyos sérüléssel össze nem függő visszafordíthatatlan hatások hogyan következnek be. Végezetül a BCOP vizsgálati módszer nem alkalmas a szembe kerülés következtében fellépő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.

Ez a vizsgálati módszer rendszeres időközönkénti frissítés tárgyát fogja képezni az új információk és adatok figyelembevételekor. Például kórszövettani vizsgálatok esetlegesen hasznosak lehetnek, ha a szaruhártya-károsodás teljesebb körű jellemzésére van szükség. Ahogyan a 160. OECD-iránymutatásban (13) vázlatosan szerepel, a felhasználóknak érdemes tartósítaniuk a szaruhártyákat és azokból kórszövettani mintákat preparálniuk, amelyek felhasználhatóak a vizsgálati módszer pontosságát esetlegesen tovább javító adatbázis fejlesztéséhez és döntési kritériumok kidolgozásához.

Minden olyan laboratóriumnak, amely először alkalmazza ezt a vizsgálati módszert, a 3. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagokat kell használnia. Mielőtt a laboratórium a BCOP vizsgálati módszer adatait a szabályozási követelmények szerinti veszélyességi osztályozás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja a BCOP vizsgálati módszer végrehajtásában való szakmai jártasságát.

A VIZSGÁLAT ELVE

A BCOP vizsgálati módszer olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro fenntartja a szarvasmarhák izolált szaruhártyájának normál fiziológiai és biokémiai működését. E vizsgálati módszerrel a vizsgálati vegyi anyag által okozott károsodás értékelése a szaruhártya opacitásváltozásának opaciméterrel, illetőleg permeabilitásváltozásának látható fényes spektrofotométerrel való kvantitatív mérése útján történik. Mindkét mérés az IVIS értékének kiszámítására használatos, amely a vizsgálati vegyi anyag in vivo szemirritációs potenciáljának előrejelzését megalapozó in vitro irritációs veszélyességi osztályozási kategória megállapítására szolgál (lásd a 48. pontban található döntési kritériumokat).

A BCOP vizsgálati módszer frissen levágott szarvasmarhából izolált szaruhártyákat használ fel. A szaruhártya opacitásának mérése kvantitatív módon, a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével történik. A permeabilitás mérése ugyancsak kvantitatív módon, a szaruhártya teljes vastagságán áthatoló és a hátsó kamrában található közegben kimutatható fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével történik. A vizsgálati vegyi anyagoknak a szaruhártya felhámjának felületére történő felvitele a szaruhártyatartó elülső kamrájába történő bevitellel történik. A 4. függelék tartalmazza a BCOP vizsgálati módszer során felhasznált szaruhártyatartó leírását és ábráját. A szaruhártyatartó a kereskedelmi forgalomban különféle forrásokból beszerezhető, vagy saját használatra megépíthető.

A szarvasmarhaszemek származása és életkora, valamint az állatfaj kiválasztása

A vágóhídon a szarvasmarhákat jellemzően emberi fogyasztás céljából vagy más kereskedelmi felhasználás céljából ölik le. A BCOP vizsgálati módszer keretében felhasználandó szaruhártyák csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmasnak minősülő, egészséges állatokból vehetők. Mivel a szarvasmarhák tömege fajtától, életkortól és nemtől függőn jelentős mértékben eltérhet, a vágásra kerülő állatok tekintetében nincs ajánlott tömeg.

Különböző életkorú állatokból származó szemek esetén a szaruhártya mérete változó lehet. A 30,5 mm vízszintes átmérőt meghaladó és legalább 1 100  μm középponti vastagságú szaruhártyák általában nyolcévesnél idősebb, a 28,5 mm átmérő és 900 μm középponti vastagság alatti szaruhártyák általában ötévesnél fiatalabb szarvasmarhából származnak (14). Emiatt nem szokás 60 hónaposnál idősebb szarvasmarhákból származó szaruhártyákat felhasználni. Hagyományosan nem szokás 12 hónaposnál fiatalabb szarvasmarhákból származó szemeket sem felhasználni, mivel ebben az életkorban a szemek még fejlődésben vannak, és a szaruhártya vastagsága és átmérője lényegesen kisebb a kifejlett szarvasmarhából származó szaruhártyákon mért értékeknél. Előnyeikre való tekintettel ugyanakkor megengedhető a fiatal (6 és 12 hónap közötti életkorú) állatokból származó szaruhártyák használata is, mivel ezek nagyobb mennyiségben állnak rendelkezésre, szűkebb az életkori tartományuk, és ez esetben kisebb a személyzet szarvasmarhák szivacsos agyvelőbántalmával szembeni esetleges kitettsége is (15). Mivel a szaruhártya méretének vagy vastagságának a korróziót és az irritációt okozó vegyi anyagokkal szembeni reagálási képességre gyakorolt hatásával kapcsolatban hasznos lenne további értékelést végezni, a felhasználóknak célszerű beszámolniuk az egyes vizsgálatokban felhasznált szaruhártyákat adó állatok becsült életkoráról és/vagy tömegéről.

A szemek begyűjtése és beszállítása a laboratóriumba

A szemeket a vágóhíd alkalmazottai gyűjtik be. A mechanikai és egyéb károsodásnak a lehető legkisebb mértékűre való csökkentése érdekében a szemeket a halál bekövetkezése után mihamarabb el kell távolítani, és az eltávolítás után azonnal, illetve szállítás közben le kell hűteni. A szemek potenciálisan irritatív vegyi anyagokkal szembeni expozíciójának megelőzése érdekében a vágóhíd alkalmazottai az állat fejének leöblítésekor nem használhatnak mosószert.

A szemeket megfelelő méretű edénybe öntött, hűtött, Hank-féle kiegyenlített sóoldatba (HBBS-oldat) kell helyezni oly módon, hogy az oldat a szemeket teljesen ellepje, és azokat a laboratóriumba oly módon kell beszállítani, hogy a lehető legkisebb legyen a károsodás és/vagy a bakteriális fertőzés esélye. Mivel a szemek begyűjtése a vágás során történik, azok vérrel és más biológiai anyagokkal – többek között baktériumokkal és más mikroorganizmusokkal – érintkezhetnek. Ezért fontos annak biztosítása, hogy a kontamináció veszélye a lehető legkisebb legyen (például a szemeket tartalmazó edény nedves jégen tárolásával a begyűjtés és a szállítás során, a szemek szállítás közbeni tárolására használt HBSS-oldathoz antibiotikumok [például 100 IU/ml koncentrációban penicillin és 100 mg/ml koncentrációban sztreptomicin] hozzáadásával).

A szemek begyűjtése és a szaruhártyák BCOP vizsgálati módszer közbeni felhasználása között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie (a begyűjtésnek és a felhasználásnak jellemzően ugyanazon a napon meg kell történnie), és igazolni kell, hogy ez az idő nem befolyásolja a vizsgálat eredményeit. Ezek az eredmények a szemek kiválasztási kritériumain, valamint a pozitív és a negatív kontrollok reakcióin alapulnak. A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek egy meghatározott napon begyűjtött szemállományból kell származnia.

A BCOP vizsgálati módszer során felhasznált szemek kiválasztási kritériumai

A szemek épségét a laboratóriumba való beérkezést követően gondosan meg kell vizsgálni a sérülések – többek között a fokozott opacitás, a karcolások és a rendellenes érburjánzás (neovaszkularizáció) – szempontjából. A vizsgálat céljára csak ép szemekből származó szaruhártyák használhatók fel.

Az egyes szaruhártyák minőségét a vizsgálat során később is kell értékelni. Azokat a szaruhártyákat, amelyek opacitása a kezdeti egyórás kiegyenlítődési időszak elteltével hét opacitásegységnél nagyobb vagy opaciméterrel azzal egyenértékű, valamint a felhasznált szaruhártyatartókat ki kell dobni (MEGJEGYZÉS: az opacimétert az opacitási egységek meghatározásához használt opacitás-etalonnal kell kalibrálni, lásd a 4. függeléket).

Minden kezelt csoportnak (a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt csoportnak, a párhuzamos negatív és pozitív kontrolloknak) legalább három szemből kell állnia. A BCOP vizsgálati módszer során a negatív kontroll céljára három szaruhártyát kell felhasználni. Mivel minden szaruhártya a teljes szemgolyóból kivágással kerül eltávolításra, majd pedig rögzítésre kerül a szaruhártyakamrában, előfordulhat, hogy a kezelés mesterségesen befolyásolja az egyes szaruhártyák (a negatív kontrollt is ideértve) opacitás- és permeabilitásértékét. Ezenfelül, az IVIS számítása során a negatív kontrollal kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeinek felhasználásával korrigálják a vizsgálati vegyi anyaggal és a pozitív kontrollal kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeit.

ELJÁRÁS

A szemek előkészítése

Az ép szaruhártyákat a későbbi kezelés elősegítése érdekében oly módon kell preparálni, hogy az ínhártyából 2–3 mm-es perem maradjon, ügyelve arra, hogy a szaruhártya fel- és belhámja ne sérüljön. Az izolált szaruhártyákat fel kell erősíteni a külön erre a célra kialakított, a szaruhártya felhámjával érintkező elülső, illetve belhámjával érintkező hátsó kamrából álló szaruhártyatartókra. Mindkét kamrát (a hátsó kamrával kezdve) teljesen fel kell tölteni előmelegített, fenolvörösmentes Eagle-féle tápfolyadékkal (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM), ügyelve a buborékképződés megelőzésére. A berendezést ezt követően 32 ± 1 °C-on legalább egy órán át ekvilibrálni kell annak érdekében, hogy a szaruhártyák a közeggel kiegyenlítődjenek, és lehetőség szerint elérjék normális metabolikus aktivitásukat (a szaruhártya felületének hőmérséklete in vivo kb. 32 °C).

A kiegyenlítődési időszak eltelte után mindét kamrát friss, előmelegített, fenolvörösmentes Eagle-féle tápfolyadékkal fel kell tölteni, és minden egyes szaruhártyán le kell olvasni a kiindulási opacitásértéket. A makroszkopikus szöveti károsodást (például karcolásokat, elszíneződést, rendellenes érburjánzást) mutató, illetve a hétnél nagyobb vagy opaciméterrel azzal egyenértékű opacitású szaruhártyákat és a felhasznált szaruhártyatartókat el kell dobni. Legalább három szaruhártyát kell kiválasztani negatív (vagy oldószeres) kontrollként szolgáló szaruhártyaként. A megmaradó szaruhártyákat ezt követően kezelt csoportra és pozitív kontrollcsoportra kell osztani.

Mivel a víz fajhője nagyobb, mint a levegőé, a víz stabilabb hőmérsékleti viszonyokat biztosít az inkubáláshoz. Ezért a szaruhártyatartó és tartalmának 32 ± 1 °C hőmérsékleten való tartására vízfürdő használata ajánlott. A hőmérséklet állandóságának biztosítását szolgáló óvintézkedések (például a tartók és a közeg előmelegítése) mellett azonban használható levegős inkubátor is.

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

Két eltérő kezelési protokoll használatos, az egyik a folyadékok és a szilárd és folyékony felületaktív anyagok, a másik pedig a nem felületaktív szilárd anyagok esetében.

A folyadékok vizsgálata hígítatlan állapotban történik. A félszilárd anyagok, krémek és gyanták vizsgálata rendszerint a folyadékokra vonatkozó protokoll szerint történik. A felületaktív anyagok vizsgálata 10 vegyesszázalék (m/V) koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készített oldatban történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre. Ha a hígítás koncentrációja ettől eltérő, akkor azt megfelelően meg kell indokolni. A felületaktív anyagokat tartalmazó keverékek hígítatlan állapotban vagy megfelelő koncentrációjúra hígított állapotban vizsgálhatók, a megfelelő in vivo expozíciós forgatókönyvtől függően. A vizsgált koncentrációt megfelelően meg kell indokolni. A szaruhártyákat a folyadéknak vagy felületaktív anyagnak 10 percig kell kitenni. Ettől eltérő expozíciós idő alkalmazását tudományos szempontból megfelelően meg kell indokolni. A felületaktív anyag és a felületaktív anyagot tartalmazó keverék fogalommeghatározását lásd az 1. függelékben.

A nem felületaktív szilárd anyagok jellemző vizsgálata 20 vegyesszázalék (m/V) koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid-oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készült oldat vagy szuszpenzió formájában történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre. A szilárd anyagok bizonyos körülmények között és megfelelő tudományos indokolással hígítatlanul, a szaruhártya felületére a nyitott kamrás módszerrel (lásd a 32. pontot) való közvetlen felvitellel is vizsgálhatók. A szaruhártyát a szilárd anyagnak négy órán át kell kitenni, de a folyadékok és a felületaktív anyagok esetéhez hasonlóan – tudományos szempontú megfelelő indokolással – más expozíciós idő is alkalmazható.

A vizsgálati vegyi anyag fizikai jellegétől és kémiai tulajdonságaitól (például szilárd anyag vagy folyadék, viszkózus vagy nem viszkózus folyadék) függően más felviteli módok is alkalmazhatók. A legfontosabb annak biztosítása, hogy a vizsgálati vegyi anyag megfelelően beborítsa a felhám felületét, valamint az, hogy az öblítési lépések során megfelelően eltávolítsák. A nem és a kissé viszkózus, folyékony vizsgálati vegyi anyagok esetében jellemzően a zárt kamrás, míg a közepes és a nagy viszkozitású folyékony vizsgálati vegyi anyagok, illetve a tiszta szilárd anyagok esetében jellemzően a nyitott kamrás módszer használatos.

A zárt kamrás módszer esetében az elülső kamrába a szaruhártya felhámjának befedéséhez elegendő mennyiségű (750 μl) vizsgálati vegyi anyagot kell a kamra tetején található adagolónyílásokon keresztül bevinni, majd az expozíció idejére a nyílásokat a kamradugaszokkal le kell zárni. Fontos annak biztosítása, hogy valamennyi szaruhártya megfelelő időközig legyen kitéve a vizsgálati vegyi anyagnak.

A nyitott kamrás módszer esetében a kezelés előtt el kell távolítani az elülső kamra ablakzáró gyűrűjét és az ablaknyílás üvegét. A kontrollként szolgáló vagy a vizsgálati vegyi anyagot (750 μl vagy a szaruhártya teljes befedéséhez elegendő mennyiségben) mikropipettával közvetlenül a szaruhártya felhámjának felületére kell felvinni. Ha a vizsgálati vegyi anyagot nehezen lehet pipettába felszívni, az az adagolás elősegítése érdekében finnpipettába pumpálható. A finnpipetta hegyét bele kell helyezni a fecskendő adagolójába, hogy az anyagot nyomás alatt lehessen betölteni a hegybe. A fecskendő dugattyúját a pipetta szelepének felfelé húzásával egyidejűleg be kell nyomni. Ha a pipetta hegyében légbuborékok jelennek meg, a vizsgálati vegyi anyagot el kell távolítani (ki kell nyomni) és a műveletet mindaddig ismételni kell, amíg a pipetta hegye légbuborékok nélkül feltelik. Szükség esetén normál fecskendő is használható (tű nélkül), mivel lehetővé teszi a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének pontos mérését és a szaruhártya felhámjának felületére való könnyebb felvitelét. Az adagolást követően a zárt rendszer visszaállítása érdekében az ablaknyílás üvegét vissza kell szerelni az elülső kamrára.

Inkubáció az expozíciót követően

Az expozíciós idő elteltével a vizsgálati vegyi anyagot, a negatív kontrollként vagy pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagot el kell távolítani az elülső kamrából, és a felhámot legalább háromszor (vagy mindaddig, amíg észlelhetőek a vizsgálati vegyi anyag látható nyomai) fenolvörös indikátort tartalmazó Eagle-féle tápfolyadékkal át kell mosni. Az öblítéshez azért kell fenolvörös indikátort tartalmazó közeget használni, mert a fenolvörös indikátor színváltozásának megfigyelésével ellenőrizhető a savas és a lúgos vizsgálati vegyi anyagok leöblítésének eredményessége. A szaruhártyát háromnál többször is le kell mosni, ha a fenolvörös indikátor még mindig elszíneződik (sárgára vagy lilára) vagy ha a vizsgálati vegyi anyag még mindig látható. A közeg vizsgálati vegyi anyagtól való megtisztítását követően a szaruhártyákat utoljára át kell öblíteni (fenolvörös indikátort nem tartalmazó) Eagle-féle tápfolyadékkal. Az utolsó öblítéshez azért kell (fenolvörös indikátort nem tartalmazó) Eagle-féle tápfolyadékot használni, mert így biztosítható az opacitásmérés előtt a fenolvörös indikátornak az elülső kamrából való eltávolítása. Ezt követően az elülső kamrát – fenolvörös indikátor bekeverése nélkül – ismételten fel kell tölteni friss Eagle-féle tápfolyadékkal.

Folyadékok és felületaktív anyagok esetében a szaruhártyákat az öblítést követően legalább további két órán át 32 ± 1 °C hőmérsékleten inkubálni kell. Bizonyos körülmények között hasznos lehet hosszabb utóexpozíciós időt alkalmazni, amiről eseti alapon kell dönteni. A szilárd anyagokkal kezelt szaruhártyákat a négyórás expozíciós idő végén alaposan le kell öblíteni, utóinkubáció azonban nem szükséges.

Folyadékok és felületaktív anyagok esetében az expozíciót követő inkubáció végén, nem felületaktív szilárd anyagok esetében a négyórás expozciós idő elteltével minden egyes szaruhártya opacitását és permeabilitását fel kell jegyezni. Egyben minden szaruhártyát szemrevételezéssel is meg kell vizsgálni, és a releváns észrevételeket (pl. szövetleválás, vizsgálati vegyi anyag maradéka, egyenetlen fényáteresztési minták) fel kell jegyezni. Ezek a megfigyelések fontosak lehetnek, mivel azok megjelenhetnek az opaciméteren leolvasott értékek eltéréseiben is.

Kontrollként szolgáló vegyi anyagok

Minden vizsgálatban párhuzamos negatív vagy oldószeres/vivőanyagos kontrollt és pozitív kontrollt is kell alkalmazni.

Hígítatlan folyékony anyagok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak kimutatása és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálati módszerben párhuzamos negatív kontrollt (például 0,9 %-os nátrium-klorid oldatot vagy desztillált vizet) kell alkalmazni. Az egyidejű negatív kontroll alkalmazása egyben azt is biztosítja, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek nem kívánt irritatív hatást.

Hígított folyadékok, felületaktív anyagok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak észlelése és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálati módszerben párhuzamos oldószeres/vivőanyagos kontrollt kell alkalmazni. Csak olyan oldószer, illetőleg vivőanyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre.

Az a vegyi anyag, amelyről ismert, hogy pozitív hatást vált ki, minden vizsgálatban párhuzamos pozitív kontrollként szerepel a vizsgálati rendszer integritásának és helyes működtetésének igazolása érdekében. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollnál jelentkező hatás időbeli változása is megfigyelhető legyen, az irritatív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Folyékony vizsgálati vegyi anyagok esetében pozitív kontrollként például 100 %-os etanol vagy 100 %-os dimetil-formamid alkalmazható. Szilárd vizsgálati vegyi anyagok esetében pozitív kontrollként például 0,9 %-os nátrium-klorid-oldathoz 20 vegyesszázalék (m/V) koncentrációban adagolt imidazol alkalmazható.

A referencia-vegyianyagok jól használhatók egy adott kémiai vagy termékosztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának értékelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.

Mért végpontok

Az opacitást a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével kell meghatározni. A szaruhártya opacitásának kvantitatív mérése opaciméterrel történik, amely a mért opacitásértéket folyamatos skálán mutatja.

A permeabilitást a szaruhártya összes sejtrétegén (azaz a szaruhártya külső felületén a felhámtól a szaruhártya belső felületén a belhámig) áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével kell meghatározni. A szaruhártyatartónak a felhámmal érintkező elülső kamráját 1 ml (folyadék vagy felületaktív anyag vizsgálata esetében 4 mg/ml, nem felületaktív szilárd anyag vizsgálata esetében 5 mg/ml) fluoreszcein-nátrium-oldattal, a belhámmal érintkező hátsó kamrát pedig friss EMEM oldattal kell feltölteni. A tartót ezt követően vízszintes helyzetben 90 ± 5 percig 32 ± 1 °C hőmérsékleten inkubálni kell. A hátsó kamrába áthatoló fluoreszcein-nátrium mennyiségének mérése ultraibolya- és látható fényes fényspektroszkópiás eljárással történik. Az eljárás keretében folyamatos skálán meg kell határozni és fel kell jegyezni a 490 nm-hez tartozó optikai sűrűségek (OD490) vagy abszorbanciák értékét. A fluoreszcein permeabilitásának értékeit szabványos 1 cm-es fényút alkalmazásával, a látható fényes spektrofotométerrel mért OD490 értékek alapján kell meghatározni.

Az előzőekben leírt módszer alternatívájaképpen 96 lyukú mikrotiterlemez-olvasó is alkalmazható azzal a feltétellel, hogy i. a fluoreszceines OD490 értékek meghatározásához megállapítható a lemezolvasó lineáris tartománya, és ii. a 96 lyukú lemezen annyi fluoreszceinmintát használnak, amennyi ahhoz szükséges, hogy az így meghatározott OD490 értékek megegyezzenek a szabványos 1 cm-es fényúttal mért értékekkel (ehhez teljesen [általában 360 μl-rel] feltöltött lyukak lehetnek szükségesek).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

Azt követően, hogy az opacitás- és az átlagos permeabilitásértékeket (OD490) a háttéropacitás, illetve a negatív kontroll OD490 permeabilitásértékeinek figyelembevételével korrigálták, az egyes kezelt csoportok átlagos opacitás- és átlagos OD490 permabilitásértékeit egy kísérleti úton származtatott összefüggés segítségével kezelt csoportonként egyetlen jelzőszámmá, az in vitro irritációs pontszámmá (IVIS) kell alakítani:

IVIS = átlagopacitás + (15 × OD490 átlagpermeabilitás).

Sina és társai (16) szerint ezt a képletet belső és laboratóriumközi vizsgálatok keretében dolgozták ki. Egy több laboratóriumban 36 vegyületen elvégzett vizsgálatsorozat adatain többváltozós analízist hajtottak végre azon egyenlet meghatározása végett, amely az in vivo és az in vitro adatok között a legjobb illeszkedést biztosítja. Két különböző társaság tudományos szakemberei elvégezték ezt az analízist és közel azonos egyenleteket származtattak.

Az opacitás- és a permeabilitásértékeket egymástól függetlenül is ki kell értékelni annak meghatározására, hogy a vizsgálati vegyi anyag a korróziót vagy a súlyos irritációt nem csak a két végpont egyikében váltotta-e ki (lásd a döntési kritériumokat).

Döntési kritériumok

A vizsgálati vegyi anyagok súlyos szemkárosodást okozóként (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként), valamint a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli) vegyi anyagokként történő meghatározására szolgáló IVIS-határértékek az alábbiakban szerepelnek:

A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai

A vizsgálat akkor minősül elfogadhatónak, ha a pozitív kontrollhoz tartozó IVIS érték az aktuális (legalább háromhavonta, illetőleg az ilyen vizsgálatot rendszertelenül, azaz havi egy alkalomnál ritkábban végző laboratóriumok esetében minden elfogadható vizsgálat után aktualizált) történeti átlag körüli két szórás intervalluma közé esik. A negatív vagy az oldószeres/vivőanyagos kontrollon tapasztalható hatásokhoz tartozó opacitás- és permeabilitásértékeknek kisebbnek kell lenniük az adott negatív kontrollal vagy oldószerrel/vivőanyaggal kezelt szarvasmarha-szaruhártya háttéropacitására és háttérpermeabilitására megállapított felső határnál. Ha a létrejött besorolás egyértelmű, akkor legalább három szaruhártya vizsgálatából álló egyszeri vizsgálatmenetnek elegendőnek kell lennie az adott vizsgálati vegyi anyag esetében. Az első vizsgálatmenet határesethez közeli eredményei esetében azonban fontolóra kell venni egy második vizsgálatmenetet (ez azonban nem feltétlenül szükséges), valamint egy harmadik vizsgálatmenetet is, ha az első két vizsgálatmenetnél nem egyezik meg az IVIS eredmények átlaga. Ebben az összefüggésben az első vizsgálatmenet eredménye akkor minősül határesethez közelinek, ha a három szaruhártyán alapuló előrejelzések nem egyeztek meg, például:

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:

SZAKIRODALOM

Elérhető a következő címen: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességének mértékét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálati módszer milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket.

Referencia-vegyianyag : a vizsgálati vegyi anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként használt vegyi anyag. A referencia-vegyianyagnak a következő tulajdonságokkal kell rendelkeznie: i. állandó és megbízható forrás(ok)ból kell származnia; ii. a vizsgálati vegyi anyagok osztályához hasonló szerkezettel és funkcionalitással kell rendelkeznie; iii. ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell állnia az ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt hatástartományban ismert hatásúnak kell lennie.

Alulról építkező megközelítés : a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében feltehetőleg besorolást nem igénylő vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a besorolást nem igénylő vegyi anyagok (negatív eredmény) más vegyi anyagokhoz (pozitív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Szaruhártya : a szemgolyó elülső részén az íriszt és a pupillát fedő és a szem belsejébe a fényt bevezető, áttetsző rész.

Szaruhártya opacitása : a szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követő átlátszatlanság mértékét leíró jellemző. Az opacitás megnövekedése a szaruhártya károsodását jelzi. Az opacitás értékelése történhet szubjektív módon (mint például a nyulakon végzett Draize-féle szemvizsgálatban) vagy objektív módszerrel (műszerrel, például opaciméterrel).

Szaruhártya permeabilitása : a szaruhártya felhámjának károsodását leíró számadat; meghatározása a szaruhártya összes sejtrétegén áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérése alapján történik.

Szemirritáció : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül teljes mértékben visszafordítható szemelváltozások. Megfelel a »Reverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 2. kategóriának« (4).

Hamis negatív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen negatívnak minősített pozitív vegyi anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Hamis pozitív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozitívnak minősített negatív vegyi anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon velejáró sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni egy élő szervezetet, egy rendszert vagy egy (al)populációt érintő expozíciója esetén.

In vitro irritációs pontszám (IVIS) : a BCOP vizsgálati módszer során alkalmazott, kísérleti úton származtatott összefüggés, amely az egyes kezelt csoportok opacitásának és permeabilitásának átlagértékeit minden egyes kezelt csoportra egyetlen in vitro pontszám formájában fejezi ki. IVIS = átlagopacitás + (15 x átlagpermeabilitás).

Irreverzibilis szemkárosodás : lásd: »Súlyos szemkárosodás«.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (4).

Negatív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó kezeletlen replikátum. Ezt a mintát a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt dolgozzák fel annak megállapítása érdekében, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Nem besorolt : a szemirritáció tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába tartozóként) nem besorolt vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként) nem besorolt vegyi anyagok. Megfeleltethető az ENSZ-GHS szerinti »kategória nélküli« vegyi anyagoknak.

Opaciméter : a szaruhártya fényátbocsátását kvantitatív módon értékelő, a szaruhártya opacitásának mérésére alkalmazott műszer. Rendszerint két kamrából áll, amelyek mindegyike saját fényforrással és fotocellával van ellátva. Az egyik kamrában helyezkedik el a kezelt szaruhártya, míg a másik a műszer kalibrálására és alaphelyzetbe állítására szolgál. Egy kontrollrekeszt (folyadékkal nem töltött üres kamra ablakok nélkül) halogénlámpa fényével átvilágítanak, a fényt fotocellával érzékelik, és ezt összevetik a szaruhártyát tartalmazó kamrát magában foglaló vizsgálati rekeszen átvezetett, fotocellával érzékelt fénnyel. A fotocellák segítségével mért fényátbocsátás eltérését összevetik, és az ebből adódó számszerű opacitásérték digitális kijelzőn jelenik meg.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó vegyi anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollválaszban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Reverzibilis szemkárosodás : lásd: »Szemirritáció«.

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik.

Súlyos szemkárosodás : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem külső felületére való juttatását követő olyan szövetkárosodás kialakulása, vagy a látás olyan súlyos fizikai romlása, amely a behatást követő 21 napon belül nem fordítható vissza teljes mértékben. Megfeleltethető az »Irreverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriának« (4).

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó kezeletlen minta, amelyet hozzáadnak a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákhoz és más kontrollmintákhoz, és ennek alapján megállapíthatók az ugyanazon oldószerben oldott vagy vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékei. A minta párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálatával az is megállapítható, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (4).

Felületaktív anyag : olyan anyag (például mosószer), amely képes csökkenteni a folyadékok felületi feszültségét, és így lehetővé tenni azok habképződését vagy szilárd anyagokba történő bejutását.

Felületaktív anyagot tartalmazó keverék : e vizsgálati módszer összefüggésében olyan keverék, amely egy vagy több felületaktív anyagot tartalmaz, 5 %-nál magasabb végső koncentrációban.

Felülről építkező megközelítés : a feltehetőleg súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok (pozitív eredmény) más vegyi anyagokhoz (negatív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Többszintű vizsgálati stratégia : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (4).

ENSZ-GHS szerinti 1. kategória : lásd: »Súlyos szemkárosodás«.

ENSZ-GHS szerinti 2. kategória : lásd: »Szemirritáció«.

ENSZ-GHS szerinti nem besorolt : az ENSZ-GHS szerinti 1. vagy 2. (2A. vagy 2B.) kategóriába való besorolás követelményeinek nem megfelelő vegyi anyagok. Megfelelnek a »Kategória nélküli« vegyi anyagoknak.

Validált vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága validálási vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelelő pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást.

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése : a rendelkezésre álló különféle érvek és ellenérvek mérlegelésének folyamata az adott vegyi anyag veszélyességével kapcsolatban a megfelelő következtetés levonása és alátámasztása céljából.

---

2. függelék

A BCOP VIZSGÁLATI MÓDSZER PREDIKTÍV ÉRTÉKE

---

3. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK A BCOP VIZSGÁLATI MÓDSZERHEZ

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak az 1. táblázatban ajánlott 13 vegyi anyag szemet érintő veszélyességi osztályozásának helyes meghatározásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat. E vegyi anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (405. vizsgálati iránymutatás) (17) eredményei és az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (azaz az 1., 2A., 2B. vagy nem besorolt) alapján a szemet érintő veszélyek hatástartománya szempontjából reprezentatívak legyenek (4). A kiválasztás másik kritériuma az volt, hogy a vegyi anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok álljanak rendelkezésre, és a BCOP vizsgálati módszer alapján kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre. A referenciaadatok az ésszerűsített összefoglaló dokumentumban (3) és a BCOP vizsgálati módszer felülvizsgálatára vonatkozó ICCVAM-háttérdokumentumban (2) (18) találhatók.

---

4. függelék

SZARUHÁRTYATARTÓ A BCOP VIZSGÁLATHOZ

A BCOP vizsgálathoz alkalmazott szaruhártyatartó inert anyagból (például polipropilénből) készül. A tartó két részből (elülső és hátsó kamrából) áll, és két, egymáshoz hasonló hengeres belső kamrával rendelkezik. Mindkét kamra kb. 5 ml-nyi mennyiség befogadására alkalmas és üvegablakban végződik, amelyen keresztül az opacitás mérését rögzítik. Mindkét belső kamra átmérője 1,7 cm, mélysége 2,2 cm. ( 7 ) A szivárgás megelőzésére a hátsó kamrában tömítőgyűrű található. A szaruhártyákat a belhámi oldalukkal lefelé kell a hátsó kamra tömítőgyűrűjére fektetni, majd az elülső kamrákat a szaruhártyák felhámi oldalára kell elhelyezni. A kamrákat a kamrák külső peremén található három, rozsdamentes acélból készült csavar rögzíti. Az egyes kamraházak végén üvegablak található, amely a szaruhártyához való könnyebb hozzáférés érdekében eltávolítható. A szivárgás megelőzésére az üvegablak és a kamra között is van egy tömítőgyűrű. Mindegyik kamra tetején két nyílás található, amelyen keresztül betölthető és üríthető a közeg és a vizsgálati vegyi anyagok. A kezelési és az inkubációs időszak alatt ezeket a nyílásokat gumikupak zárja le. A szaruhártyatartókon keresztüli fényátbocsátás megváltozhat, mivel a belső kamra lyukainak vagy az üvegablakoknak a kopása vagy elhasználódása vagy a felületükön egyes kémiai maradékanyagok felhalmozódása befolyásolhatja a fényszóródást vagy -visszaverődést. Ez a szaruhártyatartókon keresztüli kiindulási fényátbocsátás (és ennek megfelelően a leolvasott kiindulási opacitésértékek) növekedését vagy csökkenését idézheti elő, és az egyes kamrákban mért szaruhártya-opacitás várható kiindulási értékében bekövetkezett jelentős változásban nyilvánulhat meg (azaz a szaruhártya-opacitás kezdeti értékei az egyes szaruhártyatartókban szokásosan 2 vagy 3 opacitásegységgel eltérhetnek a várt kiindulási értékektől). A vizsgálati vegyi anyagok jellegétől és a kamrák használatának gyakoriságától függően minden laboratóriumnak meg kell fontolnia a szaruhártyatartókon keresztüli fényátbocsátás változásainak értékelésére vonatkozó program kialakítását. A kiindulási értékek meghatározásához a szaruhártyatartók a rutinszerű használat előtt a teljes közeggel töltött, szaruhártyát nem tartalmazó kamrák kiindulási opacitásértékeinek (vagy fényátbocsátásának) mérésével ellenőrizhetők. A szaruhártyatartókat ezt követően rendszeresen ellenőrizni kell a használati ideje alatti fényátbocsátás változása szempontjából. A vizsgálati vegyi anyagok, a használatuk gyakorisága és a szaruhártya-opacitás kiindulási értékei változásának megfigyelése alapján minden laboratórium megállapíthatja a szaruhártyatartók ellenőrzésének gyakoriságát. Ha a szaruhártyatartókon keresztüli fényátbocsátás jelentős változása figyelhető meg, mérlegelni kell a szaruhártyatartók belső felületének megfelelő takarítását és/vagy tisztítását, illetve a szaruhártyatartók cseréjét.

Szaruhártyatartó: bontott diagram

---

5. függelék

AZ OPACIMÉTER

Az opaciméter a fényátbocsátás mérésére szolgáló műszer. Például az Electro Design (Riom, Franciaország) által gyártott, a BCOP vizsgálati módszer validálása során használt OP-KIT berendezés esetében egy halogénlámpa fényét kontrollrekeszen (ablaktalan, illetve folyadékkal nem töltött üres kamrán) keresztül egy fotocellához juttatják és összevetik a szaruhártyát tartalmazó kamrát magában foglaló vizsgálati rekeszen átvezetett, a fotocellával érzékelt fénnyel. A fotocellák segítségével mért fényátbocsátás eltérését összevetik, és az ebből adódó számszerű opacitásérték digitális kijelzőn jelenik meg. Ennek alapján történik az opacitásegységek megállapítása. Ettől eltérő beállítású (például a kontroll- és a kísérleti kamra párhuzamos mérését nem igénylő) opaciméter-típusok használhatók, ha bizonyítottan a validált berendezéséhez hasonló eredményeket adnak.

Az opaciméternek az előrejelző modellben leírt különféle besorolásokhoz tartozó határértékek által kijelölt tartományokban (vagyis a szemkorróziót, illetve a súlyos irritatív hatást meghatározó határértékig) lineáris viselkedést kell tanúsítania. Annak érdekében, hogy a leolvasások 75–80 opacitásegységig lineárisak és pontosak legyenek, az opacimétert több kalibrátorral kell kalibrálni. A kalibrátorokat a kalibrációs kamrába (a kalibrátorok tartására átalakított szaruhártyakamrába) kell helyezni, és leolvasást kell végezni az opaciméteren. A kalibrációs kamrákat úgy kell kialakítani, hogy a kalibrátorok a fényforrástól és a fotocellától ugyanolyan távolságra helyezkedjenek el, mint a szaruhártyák az opacitásmérés során. A referenciaértékek és a kezdeti beállított pont a használt berendezés típusától függ. Az opacitásmérés linearitását megfelelő (műszerspecifikus) eljárásokkal kell biztosítani. Az Electro Design (Riom, Franciaország) által gyártott OP-KIT berendezés esetében például az opacimétert először 0 opacitásegységre kalibrálják oly módon, hogy a kalibrációs kamrát használják, kalibrátort nem. Ezt követően három különböző kalibrátort kell egyenként a kalibrációs kamrába helyezni, és mérni kell az opacitást. Az első, a második és a harmadik kalibrátor behelyezésekor rendre az előre beállított 75, 150 és 225 (± 5 % tűrés) opacitásegységet kell tudni leolvasni.

”

„B.48    Izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 438. vizsgálati iránymutatásában (2013) leírt módszerrel. Az izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszert (a továbbiakban: ICE vizsgálati módszer) az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központtal (ECVAM) és az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Japán Központtal (JaCVAM) együtt értékelte 2006-ban és 2010-ben (1) (2) (3). Az első értékelés során az ICE vizsgálati módszert a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszerében (GHS) (1) (2) (4), illetve az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendeletben ( 8 ) (CLP-rendelet) meghatározott, súlyos szemkárosodást okozó (1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok (anyagok és keverékek) azonosítására szolgáló szűrővizsgálatkénti használatra tudományosan megalapozott vizsgálati módszerként támogatták. A második értékelés során abból a szempontból értékelték az ICE vizsgálati módszert, hogy mennyire hasznos az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt vegyi anyagok (3) (4) azonosításához. A validálási vizsgálat eredményei és a szakértői értékelő testület ajánlásai megtartották az ICE vizsgálati módszernek a súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok besorolásához történő alkalmazására vonatkozó eredeti ajánlást, mivel a rendelkezésre álló adatbázis nem változott az ICCVAM általi eredeti validálás óta. Ebben a szakaszban az ICE vizsgálati módszer alkalmazási területének más kategóriákkal való bővítésére vonatkozó további ajánlásokat nem fogalmaztak meg. A validációs vizsgálatban használt in vitro és in vivo adatkészlet ismételt értékelése során arra helyeződött a hangsúly, hogy az ICE vizsgálati módszer mennyire hasznos a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosításában (5). Ez az ismételt értékelés azt állapította meg, hogy az ICE vizsgálati módszer az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció és a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására is alkalmazható (4) (5). Ez a vizsgálati módszer az ICE vizsgálati módszer ajánlott alkalmazásait és korlátait ezen értékelések alapján tartalmazza. Az OECD vizsgálati iránymutatásának eredeti, 2009-es változata és frissített, 2013-as változata közötti legfőbb eltérések többek között, de nem kizárólag a következők: az ICE vizsgálati módszernek az ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazása, a Vizsgálati jegyzőkönyv elemeinek frissítése, a fogalommeghatározásokat tartalmazó 1. függelék frissítése és a jártassági tesztanyagokról szóló 2. függelék frissítése.

Jelenleg általánosan elfogadott, hogy az előre látható jövőben egyetlen in vitro szemirritációs vizsgálat sem tudja majd helyettesíteni a Draize-féle in vivo szemvizsgálatot a különböző kémiai osztályoknál felmerülő irritáció teljes skálájának előrejelzésére. Előfordulhat azonban, hogy egy-egy (többszintű) vizsgálati stratégián belüli több alternatív vizsgálati módszer stratégiai kombinációja helyettesíteni tudja a Draize-féle in vivo szemvizsgálatot (6). A felülről építkező megközelítés (7) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan rendkívül irritáló hatású lehet, míg az alulról építkező megközelítés (7) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan nem okoz a besorolás szükségességéhez elegendő szemirritációt. Az ICE vizsgálati módszer bizonyos körülmények között és a 8–10. pontban meghatározott korlátokkal a vegyi anyagok szemet érintő veszélyességükre tekintettel történő osztályozására és címkézésére alkalmazható in vitro vizsgálati módszer. Bár az ICE vizsgálati módszer nem minősül a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot önállóan helyettesítő vizsgálati módszernek, első lépésként ajánlott a Scott és társai (7) által javasolt felülről építkező megközelítéshez hasonló vizsgálati stratégia keretében a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz a további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandó vegyi anyagok (4) azonosítására. Az ICE vizsgálati módszer ajánlott az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerinti nem besorolt) vegyi anyagok azonosítására (4), ezért első lépésként használható az alulról építkező megközelítésben (7). Azonban az a vegyi anyag, amely az ICE vizsgálati módszerrel előreláthatólag nem okoz súlyos szemkárosodást vagy nem tartozik a szemirritáció/súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt anyagok közé, további (in vitro és/vagy in vivo) vizsgálatot tenne szükségessé a végleges osztály megállapításához. Ezenfelül az ICE vizsgálati módszernek az ENSZ-GHS-től eltérő osztályozási rendszeren belüli, alulról építkező megközelítés keretében történő alkalmazásáról egyeztetni kell a megfelelő szabályozó hatóságokkal.

E vizsgálati módszer célja a vizsgálati vegyi anyag szemet érintő veszélyességi potenciáljának értékelésére alkalmazott eljárások ismertetése annak alapján, hogy a csirkéből eltávolított csirkeszemben képes-e toxicitást kiváltani. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése i. az opacitás kvalitatív értékelésével, ii. a szembe juttatott fluoreszcein következtében bekövetkező felhámkárosodás (fluoreszcein-visszatartás) kvalitatív értékelésével, iii. a megvastagodás (felduzzadás) kvantitatív mérésével és iv. a felület makroszkopikus morfológiai károsodásának kvalitatív értékelésével történik. A szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követően megállapítható szaruhártya-opacitás, felduzzadás és károsodás értékelését külön-külön kell végezni, majd ezekből a jellemzőkből együttesen kell származtatni az ún. szemirritációs osztályt.

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Ez a vizsgálati módszer a 160. OECD-iránymutatásban (8) javasolt protokollon alapul, melynek kidolgozására az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) nemzetközi validálási vizsgálatát (1) (3) (9) követően, az alternatív módszerek validálásával foglalkozó európai, illetve japán központ (ECVAM, JaCVAM), valamint a hollandiai TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology kutatószervezet részvételével került sor. A protokoll alapját publikált protokollokból származó információk, valamint a TNO által használt jelenlegi protokoll képezik (10) (11) (12) (13) (14).

A vizsgálati módszer alapjául szolgáló validálás során igen sokféle vegyi anyag vizsgálatára sor került, és a validálási vizsgálat empirikus adatbázisa összesen 152 vegyi anyagot, ezen belül 72 anyagot és 80 keveréket tartalmazott (5). A vizsgálati módszer szilárd anyagokra, folyadékokra, emulziókra és gélekre alkalmazandó. A folyadékok lehetnek vizesek vagy nem vizesek; a szilárd anyagok lehetnek vízben oldódóak vagy oldhatatlanok. Gázokat és aeroszolokat validálási vizsgálat keretében még nem vizsgáltak.

Az ICE vizsgálati módszer alkalmazható a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába (4) sorolandó vegyi anyagok azonosítására. Erre a célra történő alkalmazásakor az ICE vizsgálati módszer azonosított korlátai az alkoholok esetében tapasztalt hamis pozitív arányokon, valamint a szilárd és a felületaktív anyagok esetében tapasztalt hamis negatív arányon alapulnak (1) (3) (9). Ebben az összefüggésben azonban a hamis negatív arányok (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriának nem az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriakénti azonosítása) nem kritikus jelentőségűek, mivel minden negatív eredményű vizsgálati vegyi anyag vizsgálatára sor kerülne más, megfelelően validált in vitro vizsgálattal (vizsgálatokkal), vagy utolsó lehetőségként – a szabályozási követelményektől függően, az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia segítségével – nyulakon végzett vizsgálatokkal. Megjegyzendő, hogy a szilárd anyagok változó és szélsőséges expozíciós körülményekhez vezethetnek a Draize-féle in vivo szemirritációs vizsgálat során, ami a tényleges irritációs hatásukra (15) vonatkozó irreleváns előrejelzéseket eredményezhet. A vizsgálók valamennyi típusú vegyi anyag esetében mérlegelhetik e vizsgálati módszer alkalmazását, amellyel a pozitív eredményt súlyos szemkárosodásra utaló jelként, azaz további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandóként kell elfogadni. Az alkoholok esetében azonban a kapott pozitív eredményeket a túlzó előrejelzés kockázata miatt óvatosan kell értelmezni.

A súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazásakor az ICE vizsgálati módszer általános pontossága 86 % (120/140), hamis pozitív aránya 6 % (7/113), hamis negatív aránya pedig 48 % (13/27) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer (4) (5) szerint besorolt adataival való összevetéskor.

Az ICE vizsgálati módszer az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (4) szerint a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására is alkalmazható. Az ICE vizsgálati módszernek az ENSZ-GHS-től eltérő osztályozási rendszeren belüli, alulról építkező megközelítés keretében történő alkalmazásáról egyeztetni kell a megfelelő szabályozó hatóságokkal. Ez a vizsgálati módszer valamennyi típusú vegyi anyagra alkalmazható, amellyel a negatív eredményt a szemirritáció és a súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolandóként kell elfogadni. A validációs adatbázisból származó egy eredmény alapján azonban előfordulhat, hogy a rothadásgátló szerves oldószert tartalmazó festékek előrejelzése nem megfelelő (5).

A szemirritáció vagy súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazásakor az ICE vizsgálati módszer általános pontossága 82 % (125/152), hamis pozitív aránya 33 % (26/79), hamis negatív aránya pedig 1 % (1/73) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolt adataival való összevetéskor (4) (5). Amikor bizonyos kémiai osztályokba tartozó vizsgálati vegyi anyagok (például rothadásgátló szerves oldószert tartalmazó festékek) nem szerepelnek az adatbázisban, az ICE vizsgálati módszer pontossága 83 % (123/149), hamis pozitív aránya 33 % (26/78), hamis negatív aránya pedig 0 % (0/71) az ENSZ-GHS osztályozási rendszer vonatkozásában (4) (5).

Az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába alulosztályozott vegyi anyagok, valamint az ENSZ-GHS szerint be nem sorolt kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába felülosztályozott vegyi anyagok jelentős száma miatt az ICE vizsgálati módszer nem ajánlott olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket szemirritáló hatásúként (azaz az ENSZ-GHS szerinti 2. vagy 2A. kategóriába tartozóként) kell besorolni, illetve olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket enyhén szemirritáló hatásúként (az ENSZ-GHS szerinti 2B. kategóriába tartozóként) kell besorolni. E célból egy másik megfelelő módszerrel végzett további vizsgálatra lehet szükség.

A csirkeszemmel végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az emberi és az állati eredetű anyagok – ideértve többek között, de nem kizárólag a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (16).

Bár az ICE vizsgálati módszer nem veszi figyelembe a nyulakon végzett szemirritációs vizsgálatban értékelt kötőhártya- és íriszsérüléseket, foglalkozik a szaruhártyára kifejtett hatásokkal, amelyek leginkább befolyásolják az in vivo besorolást az ENSZ-GHS osztályozás alkalmazásában. Másrészről, noha maga az ICE vizsgálat nem alkalmas a szaruhártya-léziók visszafordíthatóságának értékelésére, nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmas lehet a visszafordíthatatlan hatások bizonyos típusainak azonosítására (17). Különösen további tudományos ismeretekre van szükség annak megértésére, hogy a kezdeti nagyon súlyos sérüléssel össze nem függő visszafordíthatatlan hatások hogyan következnek be. Végezetül az ICE vizsgálat nem alkalmas a szembe kerülés következtében fellépő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.

Ez a vizsgálati módszer rendszeres időközönkénti frissítés tárgyát fogja képezni az új információk és adatok figyelembevételekor. Például kórszövettani vizsgálatok esetlegesen hasznosak lehetnek, ha a szaruhártya-károsodás teljesebb körű jellemzésére van szükség. E lehetőség értékelése érdekében a felhasználóknak érdemes tartósítaniuk a szaruhártyákat és azokból kórszövettani mintákat preparálniuk, amelyek felhasználhatóak a vizsgálati módszer pontosságát esetlegesen tovább javító adatbázis fejlesztéséhez és döntési kritériumok kidolgozásához. Az OECD kidolgozott egy in vitro szemtoxicitás-vizsgálati módszerekről szóló útmutatót, amely a kórszövettani minták gyűjtésére vonatkozó részletes eljárásokat, valamint arra vonatkozó információkat tartalmaz, hogy hová kell benyújtani a mintákat és/vagy a kórszövettani adatokat (8).

Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot először alkalmazza, a 2. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségéről. Mielőtt a laboratórium az ICE vizsgálat adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi osztályozás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja az ICE vizsgálati módszer végrehajtásában való szakmai jártasságát.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az ICE vizsgálat olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro fenntartja a csirkeszem működését. A módszerrel a vizsgálati vegyi anyag által okozott károsodás jellemzése a szaruhártya felduzzadásának, opacitásának és fluoreszcein-visszatartásának értékelése útján történik. Míg e két utóbbi paraméter kvalitatív értékelést igényel, a szaruhártya felduzzadásának elemzése kvantitatív módszerrel történik. A mérési eredményeket az általános irritációs index kiszámításához használatos kvantitatív pontszámmá vagy a szemet in vitro érintő veszélyesség osztályozásához használatos kvalitatív kategóriává, azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriává vagy az ENSZ-GHS szerinti nem besorolttá kell alakítani. Ezt követően ezen eredmények bármelyike felhasználható a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan súlyos in vivo szemkárosodást okozó hatásának vagy annak előrejelzésére, hogy az anyagot nem kell a szemet érintő veszélyességi osztályozás szerint besorolni (lásd a döntési kritériumokat). Nem sorolhatók be azonban az ICE vizsgálati módszer előrejelzései szerint súlyos szemkárosodást nem okozó, illetve nem besorolt vegyi anyagok (lásd a 11. pontot).

A csirkeszemek származása és életkora

A múltban a vizsgálathoz vágóhídról beszerzett, emberi fogyasztás céljából leölt csirkékből nyert szemeket használtak, ami biztosította, hogy nem kellett laboratóriumi állatokat tartani. Csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmas, egészséges állatokból nyert szemek használhatóak fel.

Bár a csirkék optimális életkorának felmérése céljából nem végeztek ellenőrzött vizsgálatot, a vizsgálat céljára igénybe vett csirkék életkora és tömege a hagyományosan vágóhídra kerülő vágócsirkék életkorának és tömegének felel meg (azaz kb. 7 hetes, 1,5-2,5 kg tömegű csirkék).

A szemek begyűjtése és beszállítása a laboratóriumba

A csirke elkábítását (mely rendszerint elektromos sokkal történik) és a nyak kivéreztetési célú bemetszését követően a fejet azonnal el kell távolítani. Annak érdekében, hogy a csirkefejeket a vágóhídról a károsodás és/vagy bakteriális fertőzés megelőzéséhez szükséges gyorsasággal a laboratóriumba lehessen szállítani, célszerű a laboratórium közelében helyi beszerzési forrást találni. A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai betartásának biztosítása érdekében a csirkefejek begyűjtése és a szemek enukleáció utáni szuperfúziós kamrába helyezése közötti időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie (ennek jellemzően két órán belül meg kell történnie). A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek egy meghatározott napon begyűjtött szemállományból kell származnia.

Mivel a szemeknek a fejből való kimetszése a laboratóriumban történik, az egész fejeket szobahőmérsékleten (jellemzően 18 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten), fiziológiás sóoldattal nedvesített kendőkkel párásított műanyag dobozokban kell a vágóhídról a laboratóriumba szállítani.

Az ICE vizsgálatban felhasznált szemek kiválasztási kritériumai és a szemek száma

A vizsgálatból ki kell zárni azokat a szemeket, amelyek esetében a kivételt követően nagy (0,5-nél nagyobb) a fluoreszceines foltosodás kiindulási értéke vagy a szaruhártya-opacitási pontszám.

Minden kezelt csoportnak és a párhuzamos pozitív kontrollcsoportnak legalább három szemből kell állnia. A negatív, illetve – ha az oldószer nem sóoldat – az oldószeres kontrollcsoportnak legalább egy szemből kell állnia.

A GHS szerint nem besorolt eredményhez vezető szilárd anyagok esetében ajánlott három szemmel egy második vizsgálatmenetet is végrehajtani a negatív eredmény megerősítése vagy elvetése érdekében.

ELJÁRÁS

A szemek előkészítése

A szemhéjat óvatosan be kell metszeni, ügyelve a szaruhártya sérülésének elkerülésére. Ezután a szaruhártya épségét a szaruhártya felületére néhány másodpercre felvitt, majd izotóniás sóoldattal leöblített, egy cseppnyi 2 vegyesszázalékos (m/V) nátrium-fluoreszcein alkalmazásával mielőbb értékelni kell. A fluoreszceinnel kezelt szemeket ezután réslámpás mikroszkóppal meg kell vizsgálni, és ellenőrizni kell, hogy a szaruhártya nem sérült-e meg (vagyis a fluoreszcein-visszatartási és a szaruhártya-opacitási pontszám legfeljebb 0,5 lehet).

Ha a szem sérüléstől mentes, akkor el kell távolítani a koponyából, ügyelve a szaruhártya sérülésének elkerülésére. A szemgolyót – a pislogóhártyát sebészeti csipesszel feszesen tartva – ki kell húzni a szemüregből, és a szemizmokat tompa hegyű hajlított ollóval át kell vágni. A szaruhártya túlzott nyomás miatti károsodásának (azaz a nyomásos mesterséges szövetelváltozásnak) a kerülése fontos.

A szemnek a szemüregből való eltávolításakor a szemidegből egy szabad szemmel is jól látható részt rajta kell hagyni. A szemet a szemüregből való eltávolítást követően nedvszívó párnára kell helyezni, majd le kell vágni róla a pislogóhártyát és az egyéb kötőszöveteket.

A kivett szemet korrózióálló acél csíptetőre kell erősíteni oly módon, hogy a szaruhártya függőleges helyzetben legyen. A csíptetőt ezt követően be kell helyezni a szuperfúziós készülék egyik kamrájába (18). A csíptetőt a szuperfúziós készülékben úgy kell elhelyezni, hogy az izotóniás sóoldat cseppjei (percenként 3–4 csepp, illetve percenként 0,1–0,15 ml) a teljes szaruhártyát érjék. A szuperfúziós készülék kamráinak hőmérsékletét 32 ± 1,5 °C-on kell tartani. A 3. függelék bemutatja a szuperfúziós készülék jellemző kialakítását és a szemcsíptetőket; ezek az eszközök kereskedelmi forgalomban is kaphatók, de saját használatra is megépíthetők. A készülék az egyes laboratóriumok igényeinek (például a vizsgálandó szemek számának) megfelelően módosítható.

A szemeket a szuperfúziós készülékbe való behelyezés után ismét meg kell vizsgálni réslámpás mikroszkóppal annak ellenőrzésére, hogy az előkészítés során nem sérültek-e meg. A réslámpás mikroszkóp mélységmérőjével ekkor a szaruhártya csúcsán meg kell mérni a szaruhártya vastagságát is. Ki kell cserélni azokat a szemeket, i. amelyeknek fluoreszcein-visszatartási pontszáma 0,5-nél nagyobb, ii. amelyeknek szaruhártya-opacitása 0,5-nél nagyobb, valamint iii. amelyek a károsodás bármely további jelét mutatják. Az e szempontok alapján ki nem zárt szemek közül ki kell zárni mindazokat, amelyek szaruhártya-vastagsága az összes szem átlagától 10 %-kal nagyobb mértékben eltér. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás mikroszkópok különböző résbeállítás esetén eltérő szaruhártya-vastagságot adhatnak. A résszélességet 0,095 mm-re kell állítani.

Valamennyi szem megvizsgálása és jóváhagyása után a szemeket körülbelül 45–60 percig inkubálni kell annak érdekében, hogy a vizsgálandó anyag felvitele előtt a vizsgálati rendszerrel ekvilibrálódjanak. A kiegyenlítődési idő eltelte után fel kell jegyezni a kiindulási (azaz a nulla időpillanatban érvényes) szaruhártya-vastagságot és opacitást. E végpont tekintetében az előkészítéskor meghatározott fluoreszcein-pontszámot kell kiindulási értékként használni.

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

A kiindulási referenciamérések után a szemeket (tartójukkal együtt) azonnal ki kell venni a szuperfúziós készülékből, vízszintes helyzetbe kell hozni, majd fel kell vinni a vizsgálati vegyi anyagot a szaruhártyára.

A folyékony vizsgálati vegyi anyagokat általában hígítatlan állapotban kell vizsgálni, de szükség esetén (például ha a vizsgálati terv így rendelkezik) hígítás is alkalmazható. Hígított vizsgálati vegyi anyagok esetén lehetőleg fiziológiás sóoldatot kell alkalmazni. Ellenőrzött körülmények között másféle oldószer is használható, a fiziológiás sóoldattól eltérő oldószerek megfelelőségét azonban külön igazolni kell.

A folyékony vizsgálati vegyi anyagokat oly módon kell felvinni a szaruhártya felületére, hogy a szaruhártya teljes felületét egyenletesen befedje. A szabványos mennyiség 0,03 ml.

A szilárd vegyi anyagokat lehetőleg dörzscsészében, mozsárban vagy hasonló őrlőeszközben a lehető legfinomabbra kell őrölni. A port oly módon kell felvinni a szaruhártya felületére, hogy azt a vizsgálati vegyi anyag egyenletesen befedje; a szabványos mennyiség 0,03 g.

A (folyékony vagy szilárd) vizsgálati vegyi anyagot 10 másodpercig hatni kell hagyni, majd szobahőmérsékleten le kell öblíteni (kb. 20 ml) izotóniás sóoldattal. Ezt követően a szemet (tartójával együtt) az eredeti függőleges helyzetben vissza kell helyezni a szuperfúziós készülékbe. Szükség esetén a 10 másodperces felvitelt követően és későbbi időpontokban (például a vizsgálati vegyi anyag maradványainak a szaruhártyán való felfedezésekor) további öblítés alkalmazható. Az öblítéshez kiegészítőként használt sóoldat mennyisége általában nem kritikus jelentőségű, a vegyi anyag szaruhártyához tapadásának észlelése azonban fontos.

Kontrollként szolgáló vegyi anyagok

Minden vizsgálatban párhuzamos negatív vagy oldószeres/vivőanyagos kontrollt és pozitív kontrollt is kell alkalmazni.

Hígítatlan folyadékok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak észlelése céljából és annak biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos negatív kontrollként fiziológiás sóoldatot kell alkalmazni.

Hígított folyadékok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak kimutatása céljából és annak biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos oldószeres/vivőanyagos kontrollt kell alkalmazni. A 31. pontban foglaltaknak megfelelően csak olyan oldószer, illetőleg vivőanyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre.

Annak ellenőrzése érdekében, hogy a kiváltott hatás megfelelő-e, minden egyes kísérletben ismerten szemirritációt okozó anyagot is vizsgálni kell párhuzamos pozitív kontrollként. Mivel az ICE vizsgálat célja a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása, a pozitív kontrollnak olyan referencia-vegyianyagnak kell lennie, amely ebben a vizsgálati módszerben súlyos hatást vált ki. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollnál jelentkező hatás időbeli változása is megfigyelhető legyen, a súlyos hatás nem lehet túlságosan erőteljes. A pozitív kontrollra vonatkozóan megfelelő mennyiségű in vitro adatot kell generálni oly módon, hogy kiszámítható legyen a pozitív kontroll statisztikailag meghatározott elfogadható tartománya. Ha egy adott pozitív kontrollra vonatkozóan nincs elegendő korábbi adat az ICE vizsgálati módszer alkalmazásából, akkor ezen adatok előállításához külön vizsgálatok lehetnek szükségesek.

Folyékony vizsgálati vegyi anyagok esetében pozitív kontrollként például 10 %-os ecetsav vagy 5 %-os benzalkónium-klorid, szilárd vizsgálati vegyi anyagok esetében pedig például nátrium-hidroxid vagy imidazol alkalmazható.

A referencia-vegyianyagok jól használhatók egy adott kémiai vagy termékosztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának értékelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.

Mért végpontok

A kezelt szaruhártyákat a kezelés előtt, majd a kezelést követő leöblítés után 30, 75, 120, 180 és 240 perc (± 5 perc) elteltével kell értékelni. Ezek az időpontok a négyórás kezelési időn belül megfelelő mennyiségű mérést adnak, miközben a mérések között elegendő idő marad valamennyi szem szükséges megfigyelésének elvégzésére.

Az értékelt végpontok: a szaruhártya opacitása, felduzzadása, fluoreszcein-visszatartása és morfológiai elváltozásai (például a felhám benyomódása vagy fellazulása). A fluoreszcein-visszatartás kivételével (amelyet csak a kezelés előtt és a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció után 30 perccel kell meghatározni) minden végpontot valamennyi fenti időpontban meg kell határozni.

A szaruhártya opacitásának, fluoreszcein-visszatartásának, morfológiai elváltozásainak és – lebonyolítás esetén – kórszövettani vizsgálatának dokumentálására ajánlott fényképeket készíteni.

A négy óra elteltével végrehajtott utolsó vizsgálatot követően ajánlatos a szemeket az esetleges kórszövettani vizsgálathoz megfelelő fixálóban (például semleges pufferolt formalinban) tartani (a részletekért lásd a 14. pontot és a (8) hivatkozást.

A szaruhártya felduzzadását a réslámpás mikroszkóp optikai pachométerével végzett szaruhártyavastagság-mérésekből kell meghatározni. A felduzzadást százalékos arányként kell kifejezni, és a következő képletből, a mért szaruhártya-vastagságok felhasználásával kell kiszámítani:

Minden megfigyelési időpontban meg kell határozni az összes vizsgált szem szaruhártya-felduzzadásának átlagos százalékos arányát. A bármely időpontban megfigyelt szaruhártya-felduzzadás átlagértékének maximuma alapján minden vizsgálati vegyi anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot kell rendelni (lásd az 51. pontot).

Az 1. táblázatban szemléltetett szaruhártya-opacitási pontszámot a szaruhártya legsűrűbben opálos területe alapján kell megállapítani. Minden megfigyelési időpontban meg kell határozni az összes vizsgált szem szaruhártya-opacitásának átlagát. A bármely időpontban megfigyelt szaruhártya-opacitási pontszámok átlagának maximuma alapján minden vizsgálati vegyi anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot kell rendelni (lásd az 51. pontot).

A fluoreszcein-visszatartást kizárólag a 30 perc elteltével végzett megfigyelési időpontban kell értékelni a 2. táblázatban foglaltak szerint. A 30 perc elteltével végzett megfigyelés időpontjában meg kell határozni az összes vizsgált szem fluoreszcein-visszatartásának átlagát, és ennek alapján minden vizsgálati vegyi anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot kell rendelni (lásd az 51. pontot).

A morfológiai elváltozások között megemlítendő a szaruhártya felhámsejtjeinek »benyomódása«, a felhám »fellazulása«, a szaruhártya felületének »érdesedése« és a vizsgálati vegyi anyag »feltapadása« a szaruhártya felületére. Ezek a megfigyelések különböző súlyosságúak lehetnek, és egyidejűleg is előfordulhatnak. E megállapítások besorolása a vizsgáló szubjektív megítélésétől függ.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

A szaruhártya opacitását, felduzzadását és fluoreszcein-visszatartását külön-külön kell értékelni, és az egyes végpontokhoz külön-külön ICE-osztályt kell megállapítani. Ezt követően az egyes végpontokhoz tartozó ICE-osztályok együttes figyelembevételével meg kell határozni az egyes vizsgálati vegyi anyagok irritációs besorolását.

Döntési kritériumok

Az egyes végpontok értékelését követően az ICE-osztályok megállapítását előre meghatározott tartományok alapján kell elvégezni. A szaruhártya-felduzzadás (3. táblázat), a szaruhártya-opacitás (4. táblázat) és a fluoreszcein-visszatartás (5. táblázat) jellemzése az alábbiakban bemutatott skálákon, négy ICE-osztály alkalmazásával történik. Fontos megjegyezni, hogy a 3. táblázatban feltüntetett szaruhártya-felduzzadási pontszámok csak akkor érvényesek, ha a vastagság mérése (például Haag-Streit BP900 típusú) 1. számú mélységmérő tartozékkal felszerelt és 9

-re (0,095 mm) állított résszélességű réslámpás mikroszkóppal történik. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás mikroszkópok különböző résbeállítás esetén eltérő szaruhártya-vastagságot adhatnak.

A vizsgálati vegyi anyag in vitro irritációs besorolását a szaruhártya opacitása, felduzzadása és a 6. táblázatban ismertetett fluoreszcein-visszatartása alapján meghatározott kategóriák kombinációjának megfelelő GHS-osztályozás leolvasásával kell értékelni.

A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai

A vizsgálat akkor minősül elfogadhatónak, ha a párhuzamos negatív vagy vivőanyagos/oldószeres kontrollokat a GHS szerint nem besorolt anyagként, a párhuzamos pozitív kontrollokat pedig a GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként azonosítják.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálati módszer milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket.

Referencia-vegyianyag : a vizsgálati vegyi anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként használt vegyi anyag. A referencia-vegyianyagnak a következő tulajdonságokkal kell rendelkeznie: i. állandó és megbízható forrás(ok)ból kell származnia; ii. a vizsgálati vegyi anyagok osztályához hasonló szerkezettel és funkcionalitással kell rendelkeznie; iii. ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell állnia az ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt hatástartományban ismert hatásúnak kell lennie.

Alulról építkező megközelítés : a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében feltehetőleg besorolást nem igénylő vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a besorolást nem igénylő vegyi anyagok (negatív eredmény) más vegyi anyagokhoz (pozitív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Szaruhártya : a szemgolyó elülső részén az íriszt és a pupillát fedő és a szem belsejébe a fényt bevezető, áttetsző rész.

Szaruhártya opacitása : a szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követő átlátszatlanság mértékét leíró jellemző. Az opacitás megnövekedése a szaruhártya károsodását jelzi.

Szaruhártya felduzzadása : az ICE vizsgálatban a szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követő felpuffadása mértékét objektív módon jellemző érték. Százalékos arányként kell kifejezni, és a szaruhártya-vastagság kiindulási (a vizsgálati vegyi anyag felvitele előtti) értékéből és az ICE vizsgálat során vizsgált vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciót követően rendszeres időközönként végzett mérésekből kell kiszámítani. A szaruhártya felduzzadásának foka jelzi a szaruhártya károsodásának mértékét.

Szemirritáció : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül teljes mértékben visszafordítható szemelváltozások. Megfelel a »Reverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 2. kategóriának« (4).

Hamis negatív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen negatívnak minősített pozitív vegyi anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Hamis pozitív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozitívnak minősített negatív vegyi anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Fluoreszcein-visszatartás : az ICE vizsgálatban a szaruhártya felhámsejtjeiben a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciót követően visszatartott fluoreszcein-nátrium mennyiségét szubjektív módon jellemző adat. A fluoreszcein-visszatartás foka utal a szaruhártyafelhám károsodásának mértékére.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Irreverzibilis szemkárosodás : lásd: »Súlyos szemkárosodás« és »ENSZ-GHS szerinti 1. kategória«.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (4).

Negatív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó kezeletlen replikátum. Ezt a mintát a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni annak megállapításához, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Nem besorolt : a szemirritáció tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 2. kategóriába tartozóként) nem besorolt vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként) nem besorolt vegyi anyagok. Megfelelnek az »ENSZ-GHS szerinti nem besorolt« vegyi anyagoknak.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó vegyi anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a súlyos hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik.

Reverzibilis szemkárosodás : lásd: »Súlyos szemkárosodás« és »ENSZ-GHS szerinti 2. kategória«.

Súlyos szemkárosodás : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem külső felületére való juttatását követően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos fizikai romlása, amely a beadást követően 21 napon belül nem fordítható vissza teljes mértékben. Megfelel az »Irreverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriának« (4).

Réslámpás mikroszkóp : a szem binokuláris mikroszkóp nagyítása alatti, álló sztereoszkópiás kép alkotásával történő közvetlen vizsgálatára alkalmazott műszer. Az ICE vizsgálatban a műszer a csirkeszem elülső szerkezeteinek, illetve a mélységmérő tartozékkal a szaruhártya vastagságának objektív mérésére használatos.

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó nem kezelt minta, amelyet a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni az ugyanazon oldószerben feloldott vagy ugyanazon vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékeinek megállapítása érdekében. Párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálata esetén ez a minta azt is bizonyítja, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (4).

Felületaktív anyag : olyan anyag (például mosószer), amely csökkentheti a folyadékok felületi feszültségét, és így lehetővé teszi, hogy habozzanak vagy áthatoljanak szilárd anyagokon; nedvesítőszerként is ismert.

Felülről építkező megközelítés : a feltehetőleg súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok (pozitív eredmény) más vegyi anyagokhoz (negatív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Többszintű vizsgálati stratégia : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (4).

ENSZ-GHS szerinti 1. kategória : lásd: »Súlyos szemkárosodás« és/vagy »Irreverzibilis szemkárosodás«.

ENSZ-GHS szerinti 2. kategória : lásd: »Szemirritáció« és/vagy »Reverzibilis szemkárosodás«.

ENSZ-GHS szerinti »nem besorolt« : az ENSZ-GHS szerinti 1. vagy 2. (2A. vagy 2B.) kategóriába való besorolás követelményeinek nem megfelelő vegyi anyagok. Megfelelnek a »Nem besorolt« vegyi anyagoknak.

Validált vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága validálási vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelelő pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást.

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése : a rendelkezésre álló különféle érvek és ellenérvek mérlegelésének folyamata az adott vegyi anyag veszélyességével kapcsolatban a megfelelő következtetés levonása és alátámasztása céljából.

---

2. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK AZ ICE VIZSGÁLATI MÓDSZERHEZ

Az e vizsgálati módszerre támaszkodó vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak az 1. táblázatban ajánlott 13 vegyi anyag szemet érintő veszélyességi osztályozásának helyes meghatározásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat. E vegyi anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (405. vizsgálati iránymutatás) eredményei és az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (azaz az 1., 2A., 2B. vagy kategória nélküli) alapján a szemet érintő veszélyek hatástartománya szempontjából reprezentatívak legyenek (4) (6). A kiválasztás másik kritériuma az volt, hogy a vegyi anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok álljanak rendelkezésre, és az ICE vizsgálati módszer alapján kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre. A referenciaadatok az ésszerűsített összefoglaló dokumentumban (5) és az ICE vizsgálati módszer felülvizsgálatára vonatkozó ICCVAM-háttérdokumentumban (9) találhatók.

---

3. függelék

AZ ICE VIZSGÁLATHOZ SZUPERFÚZIÓS KÉSZÜLÉKET ÉS SZEMCSÍPTETŐKET SZEMLÉLTETŐ ÁBRÁK

(A szuperfúziós készülék és a szemcsíptető további általános leírását lásd: Burton et al. (18))

”

„B.49    In vitro celluláris mikronukleusz-vizsgálat emlősökön

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 487. vizsgálati iránymutatásával (2016). Ez a vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

Az in vitro mikronukleusz-vizsgálat (a továbbiakban: MNvit vizsgálat) interfázisban lévő sejtek citoplazmájában mikronukleuszok (MN) kimutatására szolgáló genotoxicitási vizsgálat. A mikronukleuszok acentrikus (vagyis centromérával nem rendelkező) kromoszómatöredékekből vagy olyan ép kromoszómákból származhatnak, amelyek a sejtosztódás anafázisa során nem képesek a sejtpólusokra vándorolni. Ezért az MNvit vizsgálat olyan in vitro módszer, amely átfogó alapot szolgáltat a kromoszóma-károsító potenciál in vitro vizsgálatához, ugyanis a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció során vagy után sejtosztódáson átesett sejtekben aneugének és klasztogének egyaránt kimutathatók (2) (3) (további részletekért lásd a 13. pontot). A mikronukleuszok olyan károsodást jeleznek, amely átkerült az utódsejtekbe, míg a metafázisban lévő sejtekben értékelt kromoszóma-rendellenességek nem feltétlenül öröklődnek. A változások egyik esetben sem feltétlenül egyeztethetők össze a sejtek túlélésével.

Ez a vizsgálati módszer egyaránt lehetővé teszi az aktin-polimerizációt gátló citokalazin-B-t (a továbbiakban: citoB) tartalmazó és nélkülöző protokollok használatát. A citoB mitózist megelőző hozzáadása kétmagvú sejteket eredményez, és ennélfogva kizárólag a mitózison átesett sejtek esetében teszi lehetővé a mikronukleuszok azonosítását és analízisét (4) (5). Ez a vizsgálati módszer a citokinezis-gátlást nem alkalmazó protokollok használatát is lehetővé teszi, feltéve, hogy a vizsgált sejtpopuláció mitózisa bizonyítható.

Amellett, hogy MNvit vizsgálat alkalmazható a mikronukleuszokat indukáló vegyi anyagok azonosítására, a kinetokorok immunkémiai jelölése, illetve a centroméra/teloméra-próbák hibridizációja (fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)) arról is további információkat biztosíthat, hogy milyen mechanizmussal történt a kromoszómasérülés és a mikronukleusz-képződés (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Az említett jelölési és a hibridizációs technikákat akkor lehet alkalmazni, ha fokozódik a mikronukleusz-képződés, és a vizsgáló szeretné megállapítani, hogy ez a fokozódás klasztogén és/vagy aneugén hatásra jött-e létre.

Mivel az interfázisos sejtekben lévő mikronukleuszok viszonylag objektív módon vizsgálhatók, a laboratóriumi személyzetnek csak a citoB használata esetén előforduló kétmagvú sejtek számát, valamint a mikronukleált sejtek összes esetbeli előfordulását kell meghatároznia. Ennek következtében a tárgylemezek viszonylag gyorsan értékelhetők, és az elemzés automatizálható. Ez a gyakorlatban kezelésenként több száz helyett több ezer sejt értékelését teszi lehetővé, növelve a vizsgálat erejét. Végül megállapítható, hogy mivel a mikronukleuszok visszamaradó kromoszómákból keletkezhetnek, lehetséges olyan aneuploidiát indukáló anyagok azonosítása, amelyek a kromoszóma-rendellenességek hagyományos vizsgálatával, például e melléklet B.10. fejezete (18) szerint nehezen tanulmányozhatók. Az e vizsgálati módszerben ismertetett MNvit vizsgálat ugyanakkor speciális technikák, például a 4. pontban említett FISH alkalmazása nélkül nem teszi lehetővé a kromoszómaszám változását és/vagy ploidiát okozó és a klasztogén hatású vegyi anyagok megkülönböztetését.

Az MNvit vizsgálat számos különféle sejttípus esetében, valamint citoB jelenlétében és hiányában is megbízhatóan lebonyolítható. Az MNvit vizsgálat hitelességét különböző sejttípusok (sejtvonal-tenyészetek vagy primer sejtkultúrák) alkalmazásával nyert nagy mennyiségű adat támasztja alá (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Ezek közé tartoznak különösen a Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) által koordinált nemzetközi validálási vizsgálatok (19) (20) (21) (22) (23) és a genotoxicitás vizsgálatával foglalkozó nemzetközi műhely (International Workshop on Genotoxicity Testing) jelentései (5) (17). A rendelkezésre álló adatokat az Európai Bizottság Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központja (ECVAM) is újraértékelte egy, az adatok bizonyító erejét mérlegelő retrospektív validálási vizsgálatban, és a vizsgálati módszert az ECVAM tudományos tanácsadó bizottsága (ESAC) tudományosan megalapozott módszerként jóváhagyta (37) (38) (39).

Az emlőssejtek MNvit vizsgálata során emberekből vagy rágcsálókból származó sejtvonal-tenyészetek vagy primer sejtkultúrák alkalmazhatók. Mivel a mikronukleusz-képződés háttérgyakorisága befolyásolja a vizsgálat érzékenységét, ezért stabil és meghatározott mikronukleusz-képződési háttérgyakorisággal rendelkező sejttípusok alkalmazása javasolt. A felhasznált sejteket a tenyészetben való megfelelő növekedési képesség, a kariotípusuk stabilitása (többek között a kromoszómaszám) és a mikronukleuszok spontán gyakorisága alapján kell kiválasztani (40). A rendelkezésre álló adatok jelenleg nem teszik lehetővé határozott ajánlások megfogalmazását, azonban arra utalnak, hogy a kémiai veszélyek értékelése során fontos figyelembe venni a vizsgálat céljára kiválasztott sejtek p53 státuszát, genetikai (kariotípus-) stabilitását, DNS-reparációs képességét és eredetét (rágcsáló-, illetve emberi sejtek). E vizsgálati módszer alkalmazóinak tehát érdemes figyelembe venniük a sejtek szóban forgó és egyéb tulajdonságainak a sejtvonalak teljesítményére kifejtett hatását a mikronukleuszok indukálásának kimutatása során, mivel a tudomány fejlődik ezen a területen.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Az in vitro végrehajtott vizsgálatok rendszerint szükségessé teszik a metabolikus aktiválás valamilyen exogén forrásának használatát, kivéve, ha a sejtek metabolizálják a vizsgálati vegyi anyagokat. Az exogén metabolikus aktivációs rendszer nem utánozza teljesen az in vivo körülményeket. Ügyelni kell arra, hogy ne álljanak elő olyan körülmények, amelyek a vizsgálati vegyi anyagok genotoxicitását nem tükröző, hamis pozitív eredményekhez vezethetnek. Ilyen körülmény többek között a pH (41) (42) (43) vagy az ozmolalitás változása, a sejttenyésztő közeggel fellépő kölcsönhatás (44) (45) vagy a túlzott mértékű citotoxicitás (lásd a 29. pontot).

A mikronukleuszok indukálásának vizsgálatához elengedhetetlen, hogy a kezelt és a nem kezelt tenyészetekben egyaránt végbemenjen mitózis. A mikronukleuszok értékeléséhez az a szakasz szolgáltatja a legtöbb információt, amelyben a sejt a vizsgálati vegyi anyaggal végzett kezelés során vagy után egy mitózison esett át. A gyártott nanoanyagok esetében e vizsgálati módszer egyedi adaptálására van szükség, amelyet azonban ez a vizsgálati módszer nem ismertet.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az emberből vagy más emlősből származó sejttenyészeteket exogén metabolikus aktiválási forrással vagy anélkül is kezelni kell a vizsgálati vegyi anyaggal, kivéve megfelelő metabolizáló képességű sejtek használata esetén (lásd a 19. pontot).

A vizsgálati vegyi anyaggal történt expozíció során vagy után a sejteket elegendő ideig kell tenyészteni ahhoz, hogy kromoszómakárosodás vagy a sejtciklusra/sejtosztódásra kifejtett egyéb hatás jöhessen létre, és ez az interfázisban lévő sejtekben mikronukleuszok képződéséhez vezessen. Az aneuploidia indukálásához a vizsgálati vegyi anyagnak általában jelen kell lennie a mitózis során. A mikronukleuszok jelenlétét a begyűjtött és megfestett, interfázisban lévő sejtekben vizsgálják. Ideális esetben a mikronukleuszokat csak azokban a sejtekben kell megszámolni, amelyek a vizsgálati vegyi anyaggal történt expozíció során vagy – ha van ilyen – a kezelés utáni időszakban estek át mitózison. A citokinezis-gátlóval kezelt tenyészetekben ez könnyen megvalósítható csupán a kétmagvú sejtek értékelésével. Citokinézis-gátló hiányában fontos annak bizonyítása, hogy a vizsgált sejtek – a sejtpopuláció növekedése alapján – valószínűleg sejtosztódáson estek át a vizsgálati vegyi anyaggal történt expozíció során vagy után. Minden protokoll esetében fontos bizonyítani, hogy a sejtproliferáció a kontroll- és a kezelt tenyészetekben egyaránt végbement, és a mikronukleuszok értékeléséhez használt összes tenyészetben meg kell állapítani a vizsgálati vegyi anyag által kiváltott citotoxicitás vagy citosztázis mértékét.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Sejtek

Emberek vagy más emlősök perifériás véréből származó tenyésztett primer limfociták (7) (20) (46) (47) és bizonyos rágcsáló sejtvonalak, például a CHO, V79, CHL/IU és L5178Y sejtek vagy humán sejtvonalak, például TK6 sejtvonal alkalmazhatók (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (lásd a 6. pontot). Eddig egyéb sejtvonalak, például HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2 sejtek (52) (53), A549 és szíriai hörcsögembrióból származó primer sejtek (54) voltak használatosak mikronukleusz-vizsgálathoz, ezúttal azonban nem volt teljes a validálásuk. E sejtvonalak és sejttípusok alkalmazását a vizsgálat során mutatott teljesítményük alapján, az »Elfogadhatósági kritériumok« című részben leírtak szerint kell indokolni. Beszámolók szerint a citoB potenciálisan befolyásolhatja az L5178Y sejtek növekedését, ezért nem ajánlott ezzel a sejtvonallal (23). Primer sejtek használatakor állatjóléti okok miatt meg kell fontolni emberi eredetű sejtek használatát – amennyiben megvalósítható –, és azokból a humán etikai elveknek és a vonatkozó szabályozásoknak megfelelően kell mintát venni.

Az emberi perifériás limfocitákat olyan fiatal (kb. 18–35 éves), nem dohányzó egyénektől kell venni, akik ismert betegséggel nem rendelkeznek, illetve a közelmúltban genotoxikus szereknek (például vegyi anyagoknak, ionizáló sugárzásnak) nem voltak kitéve olyan mértékben, amely fokozná a mikronukleált sejtek háttérbeli előfordulását. Ez biztosítaná, hogy a mikronukleált sejtek háttérbeli előfordulása alacsony és egységes legyen. A mikronukleált sejtek alapesetbeli előfordulása az életkor előrehaladtával nő, és ez a tendencia a nőknél jellemzőbb, mint a férfiaknál (55). Amennyiben több donortól származó sejteket együtt használnak fel, akkor a donorok számát meg kell adni. Igazolni kell, hogy a sejtek a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés kezdetétől a sejtekből történő mintavételig osztódtak. A sejttenyészeteket exponenciális növekedési fázisban (sejtvonalakban) kell tartani vagy osztódásra kell késztetni (primer limfocita-tenyészetek) a sejteknek a sejtciklus különböző szakaszaiban történő expozíciója érdekében, mivel a sejtfázisoknak a vizsgálati vegyi anyagokra való érzékenysége nem feltétlenül lehet ismert. Azok a primer sejtek, amelyeket az osztódás érdekében mitogén szerekkel kell stimulálni, a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció során általában már nem szinkronizáltak (például az emberi limfociták 48 órás mitogén stimulációt követően). Szinkronizált sejtek használata nem javasolt a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés során, indokolt esetben azonban elfogadható.

Tenyészközegek és tenyésztési körülmények

A tenyészetek fenntartására megfelelő tenyészközeget és inkubációs feltételeket (tenyésztőedények, megfelelő esetben 5 %-os CO2-koncentrációjú párás légkör, 37 °C-os hőmérséklet) kell alkalmazni. A sejtvonalakat rutinszerűen ellenőrizni kell a modális kromoszómaszám stabilitása és a mikoplazma-fertőzés hiánya szempontjából, és a sejtek nem használhatók fel, ha fertőzöttek, vagy ha a modális kromoszómaszám megváltozott. A vizsgálólaboratóriumban használt sejtvonalak, illetve primer sejtkultúrák rendes sejtciklusidejét meg kell állapítani, és annak összhangban kell lennie a közzétett sejtjellemzőkkel.

A tenyészetek előkészítése

Sejtvonalak: a sejteket törzstenyészetekből fel kell szaporítani, majd tenyészközegbe kell leoltani olyan sejtszámmal, hogy a sejtek a szuszpenziókban vagy a monolayer tenyészetekben továbbra is exponenciálisan növekedjenek a begyűjtés idejéig (a monolayer tenyészetekben növő sejtek esetében például kerülendő a konfluencia).

Limfociták: alvadásgátlóval (például heparinnal) kezelt teljes vért vagy szeparált limfocitákat kell tenyészteni (például emberi limfociták esetében 48 óráig) mitogén szer [emberi limfociták esetében például phytohaemagglutinin (PHA)] jelenlétében, annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagnak és a citoB-nek való expozíció előtt sejtosztódást váltsanak ki.

Metabolikus aktiválás

Megfelelő endogén metabolikus kapacitással nem rendelkező sejtek használata esetén exogén metabolizáló rendszereket kell alkalmazni. Amennyiben másik rendszer nem indokolt, az alapértelmezetten ajánlott, legáltalánosabban használt rendszer a rágcsálók (általában patkányok) enziminducerrel (ilyen például az Aroclor 1254 (56) (57) vagy fenobarbitál és b-naftoflavon kombinációjával (58) (59) (60)) kezelt májából preparált, kofaktor-kiegészítésű posztmitokondriális frakció (S9). Ez utóbbi kombináció nem ütközik a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló stockholmi egyezménnyel (61), és kiderült róla, hogy olyan hatékony, mint az Aroclor 1254 a vegyes funkciójú oxidáz indukálásához (58) (59) (60). Az S9 frakció jellemzően 1–2 térfogatszázalék koncentrációban használatos, de a végső vizsgálati közegben 10 térfogatszázalékra növelhető. A mitotikus indexet csökkentő termékek, különösen a kalcium-komplexáló termékek (62) használata kerülendő a kezelés során. Az alkalmazott exogén metabolikus aktivációs rendszer vagy metabolikus induktor típusának és koncentrációjának megválasztását befolyásolhatja a vizsgált anyagok osztálya.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

A szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat a sejtek kezelése előtt megfelelő oldószerben elő kell készíteni, és szükség esetén hígítani kell. A folyékony halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül hozzáadhatók a vizsgálati rendszerhez és/vagy hígíthatók a vizsgálati rendszer kezelése előtt. A gáz halmazállapotú vagy illékony vizsgálati vegyi anyagokat a standard protokollok megfelelő módosításával, például légmentesen lezárt edényekben történő kezeléssel kell vizsgálni (63) (64) (65). A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó készítményeket pontosan a kezelés előtt kell előállítani, kivéve, ha a stabilitásra vonatkozó adatok a tárolás elfogadhatóságát bizonyítják.

Vizsgálati körülmények

Oldószerek

Az oldószert oly módon kell kiválasztani, hogy optimalizálja a vegyi anyag oldhatóságát, ugyanakkor ne befolyásolja hátrányosan a vizsgálat lebonyolítását, vagyis ne változtassa meg a sejtek növekedését, ne érintse a vizsgálati vegyi anyag integritását, ne lépjen reakcióba a tenyésztőedényekkel, és ne károsítsa a metabolikus aktivációs rendszert. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer (vagy tenyészközeg) használatát érdemes megfontolni. Jól bevált oldószer a víz vagy a dimetil-szulfoxid (DMSO). A szerves oldószerek mennyisége nem haladhatja meg az 1 térfogatszázalékot. CitoB DMSO-ban történő feloldása esetén a vizsgálati vegyi anyaghoz és a citoB-hez felhasznált szerves oldószer teljes mennyisége sem haladhatja meg az 1 térfogatszázalékot; annak biztosítása érdekében, hogy a szerves oldószer százalékos aránya ne fejtsen ki káros hatást, nem kezelt kontrollokat kell használni. A végleges kezelési közegben a vizes oldószerek (sós lé vagy víz) nem haladhatják meg a 10 térfogatszázalékot. Ha jól bevált szerves oldószerektől eltérő oldószereket (például etanolt vagy acetont) használnak, a használatukat a vizsgálati vegyi anyaggal és a vizsgálati rendszerrel való összeegyeztethetőségükre utaló, valamint azt jelző adatokkal kell alátámasztani, hogy a használt koncentrációnál nem genotoxikusak. Alátámasztó adatok hiányában fontos nem kezelt kontrollok (lásd az 1. függeléket), valamint oldószeres kontrollok alkalmazása annak bizonyítására, hogy a kiválasztott oldószer nem vált ki ártalmas vagy kromoszómakárosító hatást (például aneuploidiát vagy klasztogén hatást).

CitoB alkalmazása citokinezis-gátlóként

Az MNvit vizsgálat teljesítményét illetően az egyik legfőbb szempont annak biztosítása, hogy az értékelt sejtek a kezelés során vagy – ha volt ilyen – a kezelés utáni inkubációs periódusban mitózison essenek át. A mikronukleuszok értékelése ezért azokra a sejtekre korlátozandó, amelyek a kezelés során vagy után átestek mitózison. A citokinezis gátlására a legelterjedtebben alkalmazott szer a citoB, mivel gátolja az aktin kapcsolódását, ezzel megakadályozza az utódsejtek mitózis utáni szétválását, ami kétmagvú sejtek képződéséhez vezet (6) (66) (67). A vizsgálati vegyi anyag által a sejtproliferáció kinetikájára gyakorolt hatás citoB használata esetén párhuzamosan mérhető. Humán limfociták alkalmazása esetén a citoB citokinezis-gátlóként alkalmazandó, mivel a sejtciklusidők változóak lesznek a donorok körében, és mivel nem az összes limfocita fog reagálni a PHA-stimulációra. A citoB nem kötelező más sejttípusok esetén, ha megállapítható, hogy sejtosztódáson mentek át, ahogyan a 27. pontban szerepel. A citoB továbbá nem általánosan használatos, ha a mintákat áramlási citometriás módszerekkel értékelik a mikronukleuszok szempontjából.

A citoB megfelelő koncentrációját az egyes sejttípusokra vonatkozóan a laboratóriumnak kell meghatároznia annak érdekében, hogy az oldószeres kontrolltenyészetekben optimális gyakorisággal alakuljanak ki kétmagvú sejtek, továbbá be kell igazolódnia annak, hogy az értékeléshez megfelelő számú kétmagvú sejtet hoz létre. A citoB megfelelő koncentrációja általában 3–6 μg/ml (19).

A sejtproliferáció és a citotoxicitás mérése, valamint a kezelési koncentrációk kiválasztása

A vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációjának meghatározása során kerülendő az olyan koncentráció, amely hamis pozitív válaszreakciókat válthat ki, ilyen a túlzott citotoxicitást okozó koncentráció (lásd a 29. pontot), a tenyészközegben való kicsapódást okozó koncentráció (lásd a 30. pontot), illetve a pH vagy az ozmolalitás jelentős változását okozó koncentráció (lásd az 9. pontot). Ha a vizsgálati vegyi anyag a hozzáadásakor jelentős változást okoz a tenyészközeg pH-jában, a pH a kezelésre szolgáló végleges tenyészközeg pufferelésével kiigazítható, hogy elkerülhetők legyenek a hamis pozitív eredmények és megfelelő tenyésztési feltételeket lehessen fenntartani.

Mérni kell a sejtproliferációt annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat során elegendő kezelt sejt átessen a mitózison, és hogy a kezelésekre megfelelő szintű citotoxicitás mellett kerüljön sor (lásd a 29. pontot). A citotoxicitást a fő kísérletben metabolikus aktiválással és anélkül is kell meghatározni a sejtelhalás és a sejtnövekedés megfelelő mutatóinak használatával (lásd a 26. és a 27. pontot). Bár egy kiindulási előzetes vizsgálat során hasznos lehet a citotoxicitás értékelése a fő kísérletben alkalmazandó koncentrációk jobb meghatározásához, a kiindulási vizsgálat nem kötelező. Végrehajtása esetén nem helyettesítheti a citotoxicitás fő kísérlet során történő mérését.

A tenyészetek citoB-vel történő kezelése, valamint a tenyészetben található egymagvú, kétmagvú és többmagvú sejtek relatív gyakoriságainak mérése pontos módszer a kezelés sejtproliferációt előidéző és citotoxikus vagy citosztatikus hatásának mennyiségi meghatározására (6), valamint biztosítja, hogy csak a kezelés során vagy után osztódott sejtek kerüljenek értékelésre. A tenyészetenként legalább 500 sejtből számított citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI) (6) (27) (68) vagy replikációs index (RI) (a képletekért lásd a 2. függeléket) ajánlott egy-egy kezelés citotoxikus vagy citosztatikus aktivitásának a kezelt és a kontrolltenyészetekben kapott értékek összevetésével történő becsléséhez. A citotoxicitás egyéb mutatóinak (például a sejtek egybefüggősége, apoptózis, nekrózis, metafázis-számolás, sejtciklus) értékelése hasznos információval szolgálhat, de azokat a CBPI vagy az RI helyett kell használni.

A citoB nélkül végzett vizsgálatokban igazolni kell, hogy a tenyészeten belüli sejtek osztódtak, annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyaggal végzett kezelés alatt vagy az után az értékelt sejtek jelentős hányada átessen az osztódáson, ellenkező esetben hamis negatív válaszreakciók alakulhatnak ki. Egy-egy kezelés citotoxikus és citosztatikus aktivitásának becslésére (17) (68) (69) (70) (71) a relatív populációduplázódásnak (RPD) vagy a sejtszám relatív növekedésének (RICC) a mérése ajánlott (a képletekért lásd a 2. függeléket). Meghosszabbított mintavételi idők esetén (például 1,5–2 normál sejtciklusideig tartó kezelés és további 1,5–2 normál sejtciklusidő eltelte utáni begyűjtés, ami összesen a 38. és 39. pontban foglalt 3–4 normál sejtciklusidőnél hosszabb mintavételi időket eredményez) az RPD alulbecsülheti a citotoxicitást (71). Ilyen körülmények között az RICC jobb mértékegység lehet, illetve a citotoxicitás 1,5–2 normál sejtciklusidő utáni értékelése hasznos becslés lehet. A citotoxicitás, illetve a citosztázis egyéb markereinek (például a sejtek egybefüggősége, apoptózis, nekrózis, metafázis-számolás, proliferációs index (PI), sejtciklus, nukleoplazmikus hidak vagy sejtmag-kidudorodások) értékelése további hasznos információkkal szolgálhat, azonban nem alkalmazható sem az RPD, sem az RICC helyett.

Az elfogadhatósági kritériumokat (megfelelő citotoxicitás, sejtszám stb.) teljesítő, (az oldószeres és a pozitív kontrollokat nem tartalmazó) legalább három vizsgálati koncentrációt kell értékelni. A sejtek típusától (limfocita-sejtvonalak vagy primer limfocita-tenyészetek) függetlenül, minden egyes vizsgált koncentrációnál párhuzamos vagy szimpla kezelt tenyészetek használhatók. Bár két párhuzamos tenyészet használata ajánlatos, a szimpla tenyészetek is elfogadhatóak, amennyiben a szimpla vagy a párhuzamos tenyészetek esetében megegyezik az összességében értékelt sejtek száma. A szimpla tenyészetek használata különösen releváns, ha több mint három koncentráció értékelésére kerül sor (lásd a 44–45. pontot). A független párhuzamos tenyészetekből adott koncentráció mellett kapott eredmények összevonhatók az adatelemzéshez. Az alacsony citotoxicitást vagy a citotoxicitás hiányát mutató vizsgálati vegyi anyagok esetében rendszerint megközelítőleg kétszeres-háromszoros koncentrációs intervallumok helyénvalóak. Citotoxicitás fellépése esetén a vizsgálati koncentrációknak le kell fedniük a 29. pontban ismertetett, citotoxicitást okozó koncentrációtól azokig a koncentrációkig terjedő tartományt, ahol mérsékelt vagy alacsony a citotoxicitás, illetve nem jelentkezik citotoxicitás. Számos vizsgálati vegyi anyagnak meredek a koncentráció-válasz görbéje, és annak érdekében, hogy alacsony és mérsékelt citotoxicitásnál adatokat lehessen nyerni, vagy részletesen meg lehessen vizsgálni a dózis-válasz összefüggést, egymáshoz közelebbi koncentrációkat és/vagy háromnál több koncentrációt (szimpla tenyészeteket vagy párhuzamos tenyészeteket) kell használni, különösen olyan helyzetekben, ahol megismételt kísérlet szükséges (lásd a 60. pontot).

Ha a legmagasabb koncentráció a citotoxicitáson alapul, a legmagasabb koncentrációval 55 ± 5 %-os citotoxicitást kell megcélozni a citotoxicitás ajánlott paramétereinek alkalmazásával (azaz citoB használatának hiányában a sejtvonalak RICC és RPD mutatójának, illetve citoB használata esetén a CBPI vagy RI mutatónak a párhuzamos negatív kontroll 45± 5 %-ára csökkentésével) (72). Az 55 ± 5 %-os citotoxicitási tartománynak csak a magasabb részén megtalálható pozitív eredmények értelmezése során körültekintően kell eljárni (71).

A legalacsonyabb oldhatatlan koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk mellett nem citotoxikus, kevéssé oldható vegyi anyagok esetében a legmagasabb analizált koncentrációnak a vizsgálati vegyi anyaggal történő kezelés végén szemmel vagy inverz mikroszkóp segítségével látható zavarosságot vagy kicsapódást kell okoznia. Még abban az esetben is, ha citotoxicitás a legalacsonyabb oldhatatlan koncentráció felett jön létre, ajánlatos egyetlen egy, zavarosságot vagy látható kicsapódást okozó koncentrációt vizsgálni, mivel a kicsapódás álhatásokat eredményezhet. A kicsapódást okozó koncentrációnál ügyelni kell annak biztosítására, hogy a kicsapódás ne zavarja a vizsgálat lebonyolítását (például a megfestést vagy az értékelést). Hasznos lehet a tenyészközegben való oldhatóság meghatározása a kísérlet előtt.

Ha nem figyelhető meg kicsapódás vagy korlátozó citotoxicitás, a legmagasabb vizsgálati koncentrációnak 10 mM-nek, 2 mg/ml-nek vagy 2 μ/ml-nek kell megfelelnie, melyek közül a legalacsonyabb a mérvadó (73) (74) (75). Ha a vizsgálati vegyi anyag nem meghatározott összetételű, például ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyag (UVCB) (76), környezeti extraktum stb., előfordulhat, hogy kellő citotoxicitás hiányában a legmagasabb koncentrációnak magasabbnak (például 5 mg/ml-nek) kell lennie ahhoz, hogy növekedjen az egyes összetevők koncentrációja. Megjegyzendő azonban, hogy ezek a követelmények eltérőek lehetnek a humán gyógyszerek esetében (93).

Kontrollok

Minden begyűjtés alkalmával párhuzamos negatív kontrollokat kell használni (lásd a 21. pontot), amelyeknél csak oldószert alkalmaznak a kezelt közegben, és a feldolgozásuk ugyanolyan módon történik, mint a kezelt tenyészeteké.

Párhuzamos pozitív kontrollok szükségesek annak igazolására, hogy a laboratórium képes az alkalmazott vizsgálati protokoll feltételei mellett klasztogének és aneugének azonosítására, valamint adott esetben az exogén metabolikus aktivációs rendszer eredményességének igazolása érdekében. Pozitív kontrollokra vonatkozó példák az alábbi 1. táblázatban találhatók. Indokolt esetben pozitív kontrollként alternatív vegyi anyagok használhatók.

Jelenleg nem ismert olyan aneugén hatású anyag, amely genotoxikus aktivitásához metabolikus aktiválást igényelne (17). Mivel az emlőssejtek genetikai toxicitás szempontjából végzett in vitro vizsgálatai a metabolikus aktiválással és anélkül, ugyanannyi ideig egyidejűleg végzett rövid távú kezelések esetében kellően szabványosítottak, a pozitív kontrollok használata a metabolikus aktiválást igénylő klasztogénekre korlátozódhat. Ebben az esetben egyetlen klasztogén pozitív kontroll válaszreakciója a metabolikus aktivációs rendszer aktivitását és a vizsgálati rendszer reagálóképességét is bizonyítani fogja. A(z S9 nélküli) hosszú távú kezelésnek azonban kell, hogy legyen saját pozitív kontrollja, mivel a kezelés időtartama eltér a metabolikus aktiválás alkalmazása mellett végzett vizsgálatétól. Ha metabolikus aktiválással és anélkül végzett rövid távú kezeléshez klasztogént választanak ki egyetlen pozitív kontrollként, a metabolikus aktiválás nélküli hosszú távú kezeléshez aneugént kell kiválasztani. Az S9 preparátumot nem igénylő, metabolikusan megfelelő sejtekben a klasztogén és az aneugén hatás vizsgálatához egyaránt szükséges pozitív kontrollt alkalmazni.

Mindegyik pozitív kontrollt egy vagy több olyan koncentrációban kell alkalmazni, amely a háttérértékekben reprodukálható és kimutatható növekedést okoz, hogy bizonyítani lehessen a vizsgálati rendszer érzékenységét (azaz a hatások egyértelműek, de értékelést végző személy nem tudja beazonosítani azonnal a kódolt tárgylemezt), és a választ nem veszélyeztetheti a vizsgálati módszerben meghatározott határértékeket meghaladó citotoxicitás.

ELJÁRÁS

A kezelés ütemterve

A sejtciklus meghatározott fázisában ható aneugén, illetve klasztogén anyagok azonosítási valószínűségének maximalizálása érdekében fontos, hogy a sejtek összes különböző ciklusát képviselő elegendő számú sejt kezelésére kerüljön sor a vizsgálati vegyi anyaggal. Minden kezelésnek a sejtek exponenciális növekedése alatt kell kezdődnie és befejeződnie, és a sejteknek a mintavétel időpontjáig tovább kell növekedniük. A kezelés ütemterve a sejtvonalak és primer sejtkultúrák esetében ezért valamelyest eltérhet a limfocitákétól, amelyek mitogén stimulációt igényelnek ahhoz, hogy megkezdődjön a sejtciklusuk (17). Limfociták esetében a leghatékonyabb módszer, ha a vizsgálati vegyi anyaggal végzett kezelés a PHA-stimuláció után 44–48 órával kezdődik, amikorra a sejtek aszinkron módon fognak osztódni (6).

A közzétett adatokból (19) az derül ki, hogy a legtöbb aneugén és klasztogén anyag kimutatása rövid, 3–6 órás kezelési időszak alkalmazásával – S9 jelenlétében vagy hiányában – történik, amelyet a vizsgálati vegyi anyag eltávolítása, majd – a kezelés megkezdése után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban történő –mintavétel követ (7).

A negatív eredmény megállapításához szükséges alapos értékeléshez ugyanakkor mindhárom alábbi kísérleti körülményt meg kell teremteni, metabolikus aktiválással és anélkül végzett rövid távú kezeléssel, valamint metabolikus aktiválás nélküli hosszú távú kezeléssel (lásd az 56., 57. és 58. pontot):

Abban az esetben, ha a fenti kísérleti körülmények pozitív válaszreakciót eredményeznek, a többi kezelési eljárás vizsgálata nem feltétlenül szükséges.

Amennyiben ismert vagy feltehető, hogy a vizsgálati vegyi anyag befolyásolja a sejtciklusidőt (például nukleozidanalógok vizsgálatakor), különösen a p53 státusz meghatározására alkalmas sejtek esetében (35) (36) (77), a mintavételi vagy visszanyerési idők legfeljebb további 1,5–2,0 normál sejtciklusidővel (azaz a rövid távú és a hosszú távú kezelés megkezdése után összesen 3,0–4,0 sejtciklusidőre) meghosszabbíthatók. Ezeknek a választási lehetőségeknek azokban a helyzetekben van jelentőségük, amikor problémát jelenthet a vizsgálati vegyi anyag és a citoB lehetséges kölcsönhatása. Meghosszabbított mintavételi idők (azaz összesen 3,0–4,0 sejtciklusidőnyi tenyésztési idő) alkalmazásakor ügyelni kell annak biztosítására, hogy a sejtek még mindig aktívan osztódjanak. Limfociták esetében például az exponenciális növekedés a stimuláció utáni 96 óra elteltével csökkenhet és a sejtek monolayer tenyészetei konfluenssé válhatnak.

A sejtek kezelésének javasolt ütemtervét az 2. táblázat foglalja össze. Ezek az általános kezelési ütemtervek a vizsgálati vegyi anyag stabilitásától és reaktivitásától, illetve az alkalmazott sejtek konkrét szaporodási jellemzőitől függően módosíthatóak (és indokolandóak).

A monolayer tenyészetekben a 3–6 órás kezelés végén mitotikus sejtek (ismertetőjegyük, hogy alakjuk kerek, és leválnak a felszínről) lehetnek jelen. Mivel ezek a mitotikus sejtek könnyen leválnak, a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó közeg eltávolításakor elveszhetnek. Ha bizonyíték van arra, hogy a mitotikus sejtek száma a kontrollokéhoz képest jelentősen megnő, valószínűsíthető mitotikus leállást jelezve, a sejteket centrifugálással be kell gyűjteni és vissza kell tenni a tenyészetbe, annak elkerülése érdekében, hogy a begyűjtéskor elvesszenek a mitózisban lévő sejtek, valamint azok a sejtek, amelyeknél mikronukleuszok/kromoszóma-rendellenesség kockázata áll fenn.

A sejtek begyűjtése és a tárgylemez preparálása

A begyűjtést és a feldolgozást minden tenyészetnél külön kell végezni. A sejtek előkészítéséhez hozzátartozhat a hipotóniás kezelés, ez a lépés azonban nem szükséges, ha a sejtek megfelelő szétterítése egyéb módon is elérhető. A tárgylemez preparálása során különböző technikák alkalmazhatók, amennyiben ezek az értékeléshez jó minőségű sejtpreparátumokat eredményeznek. Az érintetlen sejtmembránú és citoplazmájú sejteket meg kell tartani, hogy ki lehessen mutatni a mikronukleuszokat és (a citokinezis-gátlási módszer esetén) megbízhatóan azonosítani lehessen a kétmagvú sejteket.

A tárgylemezek különböző módszerekkel festhetők meg, például Giemsa vagy fluoreszkáló DNS-specifikus festékekkel. A megfelelő fluoreszcens festékek (például akridinnarancs (78) vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y (79)) használata kiküszöbölhet néhányat a DNS-re nem jellemző festőanyag használatával mesterségesen előidézett változás közül. A mikronukleuszok tartalmának azonosítására kinetokor elleni antitestek, FISH módszerrel végzett pancentromérás DNS-próbák vagy pancentromer-specifikus primerekkel végzett in situ jelölés megfelelő DNS-kontrasztfestéssel alkalmazható (az egész kromoszómák megfestődnek, míg az acentrikus kromoszómatöredékek nem), amennyiben a mikronukleuszok keletkezésének mechanizmusára vonatkozó információkra van szükség (16)(17). A klasztogén és aneugén hatású anyagok megkülönböztetésére egyéb, korábban hatékonynak bizonyult és validált módszerek is alkalmazhatók. Egyes sejtvonalak esetében például a szub-2N sejtmagok képelemzéshez, lézerszkenneléses citometriához vagy áramlási citometriához hasonló eljárásokkal hipodiploid eseményekként történő mérése szintén szolgáltathat hasznos információt (80) (81) (82). A sejtmagok morfológiai megfigyelései ugyancsak utalhatnak lehetséges aneuploidiára. Ezenfelül a metafázisban lévő sejtek kromoszóma-rendellenességeinek lehetőleg ugyanazon sejttípuson és hasonló érzékenységű protokollal történő vizsgálata is hasznos lehet annak meghatározásához, hogy a mikronukleuszok kromoszómatörésnek tudhatók-e be (annak ismeretében, hogy a kromoszómaveszteség kimutatására nem kerülne sor a kromoszóma-rendellenességek vizsgálata során).

Elemzés

A mikronukleuszok gyakoriságának vizsgálatára irányuló mikroszkópos elemzés előtt minden tárgylemezt, az oldószeres és a nem kezelt (ha használnak ilyeneket), valamint a pozitív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni. Megfelelő eljárásokat kell alkalmazni az automatizált értékelési rendszer, például áramlási citometria, lézerszkenneléses citometria vagy képelemzés alkalmazásakor esetlegesen felmerülő elfogultság vagy részrehajlás szabályozása érdekében. Függetlenül attól, hogy milyen automatizált platform használatos a mikronukleuszok számolására, a CBPI, az RI, az RPD, illetve az RICC mutatót egyidejűleg vizsgálni kell.

A citoB-vel kezelt tenyészetekben a mikronukleuszok gyakoriságát koncentrációnként és kontrollonként legalább 2 000 kétmagvú sejtben elemezni kell (83), amelyeknek párhuzamosok alkalmazása esetén egyenlően kell megoszlaniuk a párhuzamosok között. Dózisonként egy tenyészet esetén (lásd a 28. pontot) tenyészetenként legalább 2 000  kétmagvú sejtet (83) kell értékelni ebben az egy tenyészetben. Ha (párhuzamos tenyészetek esetén) az egyes koncentrációkban tenyészetenként 1 000 -nél vagy (egy tenyészet alkalmazása esetén) 2 000 -nél jelentősen kevesebb kétmagvú sejt áll rendelkezésre értékelés céljára, és nem mutatható ki a mikronukleuszok számának jelentős növekedése, akkor vizsgálatot adott esetben több sejt vagy kevésbé citotoxikus koncentrációk alkalmazásával meg kell ismételni. Ügyelni kell arra, hogy ne kerüljenek értékelésre olyan kétmagvú sejtek, amelyek szabálytalan alakúak vagy amelyeknél a két mag mérete jelentősen eltér. Ezen túlmenően a kétmagvú sejtek nem tévesztendők össze a rosszul szétterített többmagvú sejtekkel. A kettőnél több fő magot tartalmazó sejteknél nem szabad vizsgálni a mikronukleuszokat, mivel ezekben a sejtekben magasabb lehet a mikronukleusz-képződés háttérgyakorisága (84). Egymagvú sejtek értékelése elfogadható, amennyiben a vizsgálati vegyi anyagról bebizonyosodott, hogy interferál a citoB aktivitásával. Ilyen esetekben a citoB nélkül megismételt vizsgálat hasznos lehet. A kétmagvú sejtek mellett az egymagvú sejtek értékelése hasznos információval szolgálhat (85) (86), de nem kötelező.

A citoB-vel végzett kezelés nélkül vizsgált sejtvonalakban vizsgálati koncentrációnként és kontrollonként legalább 2 000 sejtben (83) kell értékelni a mikronukleuszokat, amely sejteknek párhuzamosok alkalmazása esetén egyenlően kell megoszlaniuk a párhuzamosok között. Koncentrációnként egy tenyészet alkalmazása esetén (lásd a 28. pontot) legalább 2 000 sejtet kell értékelni ebben az egy tenyészetben. Ha (párhuzamos tenyészetek esetén) az egyes koncentrációkban tenyészetenként 1 000 -nél vagy (egy tenyészet alkalmazása esetén) 2 000 -nél jelentősen kevesebb sejt áll rendelkezésre értékelés céljára, és nem mutatható ki a mikronukleuszok számának jelentős növekedése, akkor vizsgálatot adott esetben több sejt vagy kevésbé citotoxikus koncentrációk alkalmazásával meg kell ismételni.

CitoB alkalmazása esetén a sejtproliferáció értékelése érdekében tenyészetenként legalább 500 sejtből meg kell határozni a CBPI-t vagy az RI-t (lásd a 2. függeléket). Amennyiben a kezeléseket citoB hiányában végzik, a 24–28. pontban foglaltaknak megfelelően elengedhetetlen annak bizonyítása, hogy a tenyészetben lévő sejtek osztódtak.

A laboratórium jártassága

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti elegendő tapasztalat igazolása érdekében kísérletsorozatot kell végrehajtaniuk referenciaként szolgáló, más-más mechanizmusú pozitív vegyi anyagokkal (legalább egy metabolikus aktiválással és legalább egy metabolikus aktiválás nélkül ható, valamint egy aneugén mechanizmus útján ható, az 1. táblázatban felsoroltak közül kiválasztott vegyi anyaggal), és különféle negatív kontrollokkal (többek között nem kezelt tenyészetek és különböző oldószerek/vivőanyagok). E pozitív és negatív kontrollok válaszreakcióinak összhangban kell lenniük a szakirodalommal. Ez nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll a 49–52. pontban meghatározott történeti adatbázis.

A pozitív kontrollként szolgáló, kiválasztott vegyi anyagokat (lásd az 1. táblázatot) metabolikus aktiválás nélkül végzett rövid és hosszú kezeléssel, továbbá metabolikus aktiválás jelenlétében végzett rövid kezeléssel is meg kell vizsgálni a laboratórium klasztogén és aneugén hatású vegyi anyagok kimutatásában való jártasságának bizonyítása, a metabolikus aktivációs rendszer eredményességének meghatározása, valamint az értékelési eljárások (mikroszkóppal végzett vizuális elemzés, áramlási citometria, lézerszkenneléses citometria vagy képelemzés) megfelelőségének bizonyítása érdekében. A vizsgálati rendszer érzékenységének és dinamikus tartományának bizonyítása érdekében a kiválasztott vegyi anyagok koncentrációtartományát úgy kell megválasztani, hogy reprodukálható és koncentrációval összefüggő növekedést biztosítson a háttérértékekhez viszonyítva.

Történeti kontrolladatok

A laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a negatív kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (87) (88). A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisát első lépésként legalább 10 kísérlettel kell kiépíteni, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (88)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll (83). A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (87).

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy az adatok összhangban vannak-e a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisaival. Jelentősebb következetlenségek fennállása esetén új történeti kontrolladatbázist kell létrehozni.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok az egy tenyészetből vagy párhuzamos tenyészetek összességéből származó mikronukleált sejtek előfordulását mutatják, ahogyan az a 28. pontban szerepel. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (87) (88). Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd az 50. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények ismertetése

A citokinezis-gátlási módszer alkalmazása esetén a mikronuleusz-képződés indukciójának értékelése során (a mikronukleuszok sejtenkénti számától függetlenül) csak a mikronukleuszokkal rendelkező kétmagvú sejtek gyakoriságát kell felhasználni. Az egy, két vagy több mikronukleusszal rendelkező sejtek értékelése külön-külön jelentésbe foglalható és hasznos információval szolgálhat, de nem kötelező.

Egyidejűleg az összes kezelt tenyészet, negatív és pozitív kontrolltenyészet esetében el kell végezni a citotoxicitás és/vagy a citosztázis méréseit (16). A citokinezis-gátlási módszer alkalmazása esetén a kezelt és kontrolltenyészetek esetében a sejtciklus késésének mutatójaként ki kell számolni a CBPI-t vagy az RI-t. CitoB nélkül végzett vizsgálatoknál az RPD-t vagy az RICC-t kell alkalmazni (lásd a 2. függeléket).

Az egyes tenyészetekhez tartozó adatokat meg kell adni. Ezenkívül minden adatot táblázat formájában kell összefoglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Egy-egy vizsgálat elfogadása az alábbi kritériumokon alapul:

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha a vizsgált kísérleti körülmények bármelyikében (lásd a 36–39. pontot):

Mindezen kritériumok teljesülése esetén úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben kromoszómatöréseket és/vagy szám feletti kromoszómákat vagy kromoszómaveszteséget képes előidézni. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások a szakirodalomban is megtalálhatók (90) (91) (92).

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény mellett (lásd a 36–39. pontot):

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben nem képes kromoszómatöréseket és/vagy szám feletti kromoszómákat vagy kromoszómaveszteséget előidézni. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások a szakirodalomban is megtalálhatók (90) (91) (92).

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

Amennyiben a reakció nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, ahogyan az a fentiekben szerepel, illetve egy adott eredmény biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy további vizsgálatokkal kell értékelni. Hasznos lehet további sejtek értékelése (adott esetben) vagy megismételt kísérlet lehetőleg módosított kísérleti körülmények (például a koncentrációk távolsága, más [S9-es koncentráció vagy S9 eredetű] metabolikus aktiválási feltételek) melletti elvégzése.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatkészlet nem teszi lehetővé a pozitív vagy negatív reakcióra vonatkozó következtetést, ezért kétértelmű reakció lesz a következtetés.

Az MNvit vizsgálatban a mikronukleusz-képződést indukáló vizsgálati vegyi anyagok azért válthatnak ki ilyen hatást, mert kromoszómatörést, kromoszómaveszteséget vagy a kettő együttesét idézik elő. Annak vizsgálatára, hogy a mikronukleusz-képződés indukciója klasztogén és/vagy aneugén hatás eredménye-e, kinetokor elleni antitestekkel, centroméraspecifikus in situ próbákkal vagy egyéb módszerekkel végzett további elemzések alkalmazhatók.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneugén : olyan vegyi anyag vagy folyamat, amely a mitózissal vagy meiózissal történő sejtosztódási ciklus elemeivel kölcsönhatásba lépve a sejtek vagy organizmusok aneuploidiáját eredményezi.

Aneuploidia : a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlettel (kromoszómakészletekkel) (poliploidia) való bármely eltérés.

Apoptózis : programozott sejthalál olyan lépések során keresztül, amelyek a sejt membránhoz kötött részecskékre történő szétesését eredményezik; a részecskék ezután fagocitózissal vagy sejtfelszínről történő leválással kerülnek eltávolításra.

Sejtproliferáció : a sejtek számának növekedése mitotikus sejtosztódással.

Centroméra : a kromoszóma azon DNS-régiója, ahol a két kromatida összeér, és amelyhez a két kinetokor oldalirányban kapcsolódik.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Koncentrációk : a vizsgálati vegyi anyagnak a tenyészközegen belüli végleges koncentrációira utalnak.

Klasztogén : bármely olyan vegyi anyag vagy hatás, amely sejtek vagy eukarióta szervezetek populációjában szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okoz.

Citokinezis : a mitózist közvetlenül követő sejtosztódási folyamat, amelynek eredményeként két utódsejt képződik egy-egy sejtmaggal.

Citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI) : a kezelt populációban tapasztalható másodszor osztódó sejtek aránya a nem kezelt kontrollhoz képest (a képletet lásd a 2. függelékben).

Citosztázis : a sejtszaporodás gátlása (a képletet lásd a 2. függelékben).

Citotoxicitás :
az e vizsgálati módszerbe tartozó, citokalazin-B jelenlétében végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek citokinezis-gátlási proliferációs indexének (CBPI) vagy replikációs indexének (RI) csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 26. pontot és a 2. függeléket).
Az e vizsgálati módszerbe tartozó, citokalazin-B nélkül végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek relatív populációduplázódásának (RPD) vagy a relatív sejtszám-növekedésnek (RICC) a csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 27. pontot és a 2. függeléket):

Genotoxikus : olyan általános kifejezés, amely magában foglalja a DNS- vagy kromoszómakárosodás valamennyi típusát, köztük a töréseket, a deléciókat, az adduktok képződését, a nukleotidok módosulását és kapcsolódását, az átrendeződéseket, a génmutációkat, a kromoszóma-rendellenességeket és az aneuploidiát. A genotoxikus hatás nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszómakárosodást.

Interfázisban lévő sejtek : azok a sejtek, amelyek nincsenek a mitózis fázisában.

Kinetokor : protein tartalmú struktúra, amely a kromoszóma centroméra részén épül fel, és amelyhez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Mikronukleusz : a sejtek fő magjától elkülönült kis járulékos mag, amelyet a mitózis (meiózis) telofázisa során hoznak létre visszamaradó kromoszómatöredékek vagy teljes kromoszómák.

Mitózis : a sejtmag osztódása, amely általában profázisra, prometafázisra, metafázisra, anafázisra és telofázisra osztható fel.

Mitotikus index : a metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya; e populáció sejtproliferációja mértékének jelzése.

Mutagén : örökletes elváltozást idéz elő a génekben lévő DNS-bázispár szekvenciában/szekvenciákban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszóma-rendellenességek).

Nondiszjunkció : a kromatidpárok nem válnak szét, és különülnek el a kifejlődő utódsejtekbe, rendellenes kromoszómaszámmal rendelkező utódsejteket eredményezve.

p53 státusz : A p53 fehérje vesz részt a sejtciklus-szabályozásban, az apoptózisban és a DNS-reparációban. Azok a sejtek, amelyeknél hiányzik funkcionális p53 fehérje, nem képesek apoptózis útján vagy a DNS-károsodásra reagáló p53 funkciókkal összefüggő egyéb mechanizmusok útján (például DNS-reparáció kiváltásával) leállítani a sejtciklust vagy eltávolítani a károsodott sejteket, elméletileg hajlamosabbnak kell lenniük génmutációkra vagy kromoszóma-rendellenességekre.

Poliploidia : ellentétben a csak egyetlen kromoszómát vagy bizonyos kromoszómákat érintő számszerű rendellenességekkel (aneuploidia), teljes kromoszómakészlet(ek) sejtekben és organizmusokban jelentkező számszerű rendellenessége.

Proliferációs index (PI) : a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).

A sejtszám relatív növekedése (RICC) : a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).

Relatív populációduplázódás (RPD) : a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).

Replikációs index (RI) : a kezelt tenyészetben tapasztalható sejtosztódási ciklusok aránya a nem kezelt kontrollhoz képest, az expozíciós időszakban és a visszanyerés időszakában (a képletet lásd a 2. függelékben).

S9 májfrakció : 9 000 g centrifugálás utáni májhomogenátum felülúszója, azaz a nyers májextraktum.

S9 keverék : az S9 májfrakció és a metabolikus enzimaktivitáshoz szükséges kofaktorok keveréke.

Oldószeres kontroll : a csak a vizsgálati vegyi anyag feloldására használatos oldószert befogadó kontrolltenyészetek meghatározására szolgáló általános kifejezés.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Nem kezelt kontroll : nem kezelt (azaz sem a vizsgálati vegyi anyaggal, sem oldószerrel nem kezelt), de a vizsgálati vegyi anyagot befogadó tenyészetekkel párhuzamosan, azonos módon feldolgozott tenyészetek.

---

2. függelék

A CITOTOXICITÁS ÉRTÉKELÉSÉRE SZOLGÁLÓ KÉPLETEK

CitoB alkalmazása esetén a citotoxicitás értékelését a citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI) vagy a replikációs index (RI) alapján kell végezni (17) (69). A CBPI a sejtenkénti sejtmagok átlagos számát mutatja meg, így alkalmazható a sejtproliferáció kiszámítására. Az RI a citoB-expozíció időszaka alatt megmutatja a kezelt tenyészeteken belüli sejtenkénti sejtciklusok relatív számát a kontrolltenyészetekhez viszonyítva, így alkalmazható a %-os citosztázis kiszámítására.

%-os citosztázis = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}

valamint:

T

=

a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt tenyészet

C

=

kontrolltenyészet

ahol:

Tehát az 1-es CBPI (az összes sejt egymagvú) 100 %-os citosztázisnak felel meg.

Citosztázis = 100 – RI

T

=

kezelt tenyészetek

C

=

kontrolltenyészetek

Tehát az 53 %-os RI azt jelenti, hogy a kontrolltenyészetben kétmagvú és többmagvú sejtekké osztódott sejtek számához képest a kezelt tenyészetben ennek csak 53 %-a osztódott, vagyis a citosztázis 47 %-os.

Amennyiben citoB-t nem alkalmaznak , a citotoxicitás értékelésére a sejtszám relatív növekedése (RICC) vagy a relatív populációduplázódás (RPD) ajánlott (69), mivel mindkét módszer figyelembe veszi az osztódott sejtpopuláció arányát.

ahol:

Populációduplázódás = [log (kezelés utáni sejtszám ÷ kiindulási sejtszám)] ÷ log 2

Tehát az 53 %-os RICC vagy RPD 47 %-os citotoxicitást/citosztázist jelez.

Proliferációs index (PI) alkalmazásával a citotoxicitás az 1 sejtből (cl1), 2 sejtből (cl2), 3-4 sejtből (cl4) és 5–8 sejtből (cl8) álló telepek megszámlálásával határozható meg.

A PI a citotoxicitás értékes és megbízható paramétereként használatos a citoB nélkül in vitro tenyésztett sejtvonalak esetében is (35) (36) (37) (38), és hasznos további paraméternek tekinthető.

A kezelés előtti sejtszámnak minden esetben meg kell egyeznie a kezelt tenyészetek és a negatív kontrolltenyészetek esetében.

Míg az RCC (azaz a kezelt tenyészeteken belüli sejtszám és a kontrolltenyészeteken belüli sejtszám hányadosa) a múltban citotoxicitási paraméterként volt használatos, a továbbiakban már nem javasolt, mivel alulbecsülheti a citotoxicitást.

Automatizált értékelési rendszerek, például áramlási citometria, lézerszkenneléses citometria vagy képelemzés alkalmazása esetén a képletben a sejtszám helyettesíthető a sejtmagok számával.

A negatív kontrolltenyészetekben a populációduplázódásnak vagy a replikációs indexnek összeegyeztethetőnek kell lennie azzal a követelménnyel, hogy a sejtekből a kezelés után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban kell mintát venni.

”

„B.59.    In chemico bőrszenzibilizáció: közvetlen peptidreaktivitási vizsgálat

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 442C. vizsgálati iránymutatásában (2015) leírt módszerrel. A bőrszenzibilizáló anyag a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) (1) és az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendelet ( 9 ) (CLP-rendelet) szerint olyan anyag, amely a bőrrel való érintkezést követően allergiás reakciót vált ki. Ez a vizsgálati módszer olyan in chemico eljárást (közvetlen peptidreaktivitási vizsgálat, a továbbiakban: DPRA) tesz lehetővé, amellyel elősegíti a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetését az ENSZ-GHS-nek és a CLP-rendeletnek megfelelően.

A bőrszenzibilizációt előidéző főbb biológiai eseményeket illetően általános egyetértés van. A bőrszenzibilizációhoz kapcsolódó kémiai és biológiai mechanizmusokról már rendelkezésre álló ismereteket úgynevezett káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) (2) foglalja össze a molekuláris kiváltó eseménytől a köztes eseményeken át a káros hatásig, amely embereknél allergiás kontakt bőrgyulladás, rágcsálóknál pedig kontakt túlérzékenység. A bőrszenzibilizációs káros kimeneti út esetében a molekuláris kiváltó esemény az elektrofil anyagok és a bőrben lévő fehérjék nukleofil centrumai között létrejövő kovalens kötés.

A bőrszenzibilizáció vizsgálata jellemzően kísérleti állatokon történő vizsgálatot foglal magában. A tengerimalacokon alkalmazott klasszikus módszerek, vagyis a Magnusson–Kligman-féle tengerimalac-maximizációs vizsgálat és a Bühler-féle vizsgálat (B.6. vizsgálati módszer (3)) egyaránt a bőrszenzibilizáció indukciós és kiváltási fázisával foglalkozik. Az egereken alkalmazott lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA, B.42. vizsgálati módszer (4)) és két nem radioaktív változata, az LLNA: DA (B.50. vizsgálati módszer (5)) és az LLNA: BrdU-ELISA (B.51. vizsgálati módszer (6)), amely mind csak az indukciós reakciót vizsgálja, szintén elfogadottá vált, mivel állatjólét szempontjából előnyösebbek, mint a tengerimalacon végzett vizsgálatok, és objektív mérést tesznek lehetővé a bőrszenzibilizáció indukciós fázisában.

Újabban a mechanisztikus alapú in chemico és in vitro vizsgálati módszerek a vegyi anyagok bőrszenzibilizációs veszélyének értékelése szempontjából tudományosan megalapozottnak tekinthetőek. Szükség lesz azonban nem állatokon alkalmazott módszerek (in silico, in chemico, in vitro) integrált vizsgálati és értékelési megközelítésen belüli kombinációira a jelenleg alkalmazott állatkísérletek teljes felváltásához, mivel a jelenleg rendelkezésre álló, nem állatokon alkalmazott vizsgálati módszerekre a káros kimeneti út mechanisztikus szempontjai csak korlátozott mértékben terjednek ki (2) (7).

A bőrszenzibilizációs káros kimeneti út molekuláris kiváltó eseményét, vagyis a fehérjereaktivitást illetően a DPRA alkalmazása javasolt, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagok reaktivitását a lizint vagy ciszteint tartalmazó szintetikus peptidmodellekhez viszonyítva kell számszerűsíteni (8). Ezt követően a cisztein és a lizin százalékos peptidkiürülési értékei alapján az anyag besorolható a négy reaktivitási osztály egyikébe, amivel támogatható a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetése (9).

A DPRA-t az állatkísérletek alternatív módszereinek uniós referencialaboratóriuma (EURL ECVAM) által irányított validálási vizsgálatban értékelték, az EURL ECVAM tudományos tanácsadó bizottsága (ESAC) pedig független szakértői értékelésnek vetette alá; mindezek alapján megállapítást nyert, hogy a DPRA tudományosan megalapozott (10) ahhoz, hogy integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének támogatására lehessen felhasználni veszélyességi osztályozás és címkézés céljából. A DPRA-ból származó adatok és más információk együttes használatára fellelhetők példák a szakirodalomban (11) (12) (13) (14).

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁG ÉS KORLÁTOK

A fehérjereaktivitás és a bőrszenzibilizáló potenciál közötti összefüggés jól ismert (15) (16) (17). Mindazonáltal, mivel a fehérjekötés csak egy kulcsfontosságú esemény, jóllehet a bőrszenzibilizációs káros kimeneti út molekuláris kiváltó eseménye, a fehérjereaktivitásról vizsgálati és vizsgálat nélküli módszerekkel előállított információk önmagukban nem feltétlenül elegendőek ahhoz, hogy megállapítható legyen a vegyi anyagok bőrszenzibilizáló potenciáljának hiánya. Ezért az e vizsgálati módszerrel kapott adatokat integrált megközelítés, például integrált vizsgálati és értékelési megközelítés összefüggésében kell mérlegelni olyan egyéb, kiegészítő információkkal együtt, mint a bőrszenzibilizációs káros kimeneti út más kulcsfontosságú eseményeivel foglalkozó in vitro vizsgálatok eredményei, valamint a vizsgálat nélküli módszerekkel, köztük a kémiai analógokból kereszthivatkozással kapott adatok.

Ez a vizsgálati módszer az integrált vizsgálati és értékelési megközelítéssel összefüggésben egyéb, kiegészítő információkkal együtt alkalmazva felhasználható a bőrszenzibilizáló (vagyis az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének támogatására. Ez a vizsgálati módszer nem alkalmazható önmagában sem a bőrszenzibilizáló anyagoknak az ENSZ-GHS-ben/a CLP-rendeletben meghatározott 1A. és 1B. alkategóriába sorolására, sem a hatáserősség előrejelzésére a biztonsági értékeléssel kapcsolatos döntések esetén. A szabályozási kerettől függően azonban a DPRA pozitív eredménye önmagában is felhasználható a vegyi anyagok ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába sorolására.

A DPRA vizsgálati módszerről bebizonyosodott, hogy áthelyezhető a nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiával (HPLC) végzett elemzés területén tapasztalattal rendelkező laboratóriumokba. A vizsgálati módszertől várható előrejelzések reprodukálhatóságának mértéke a laboratóriumokon belül 85 %, a laboratóriumok között pedig 80 % (10). A validálási vizsgálatban (18) és a közzétett tanulmányokban (19) kapott eredmények összességében azt jelzik, hogy a DPRA a szenzibilizáló (azaz az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) anyagokat az LLNA vizsgálati módszer eredményeihez képest 80 %-os (N=157) pontossággal különbözteti meg a nem szenzibilizáló anyagoktól, 80 % az érzékenysége (88/109), a specifikussága pedig 77 % (37/48). A DPRA nagyobb valószínűséggel jelez előre alacsonyabb értékeket olyan vegyi anyagoknál, amelyeknek alacsonytól mérsékeltig terjedő a szenzibilizáló hatása (azaz az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1B. alkategóriába tartozó anyagoknál), mint a rendkívül bőrszenzibilizáló hatást mutató vegyi anyagoknál (azaz az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1A. alkategóriába tartozó anyagoknál) (18) (19). A DPRA mint önálló vizsgálati módszer esetében itt megadott pontossági értékek azonban csak irányadóak, ugyanis a vizsgálati módszert az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében más információforrásokkal együtt és a fenti 9. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni. Ezen túlmenően a bőrszenzibilizáció nem állatokon alkalmazott módszereinek értékelésekor nem szabad megfeledkezni arról, hogy az LLNA vizsgálat, valamint más állatkísérletek nem feltétlenül tükrözik teljes egészében az érintett fajnál, például az embernél fennálló helyzetet. Az összes rendelkezésre álló adat alapján a DPRA-ról bebizonyosodott, hogy különféle szerves funkciós csoportokat, reakciómechanizmusokat, (in vivo vizsgálatok során meghatározott) bőrszenzibilizáló hatásokat és fizikai-kémiai tulajdonságokat képviselő vizsgálati vegyi anyagokra alkalmazható (8) (9) (10) (19). Ezek az információk összességében azt jelzik, hogy a DPRA érdemben hozzájárul a bőrszenzibilizáció veszélyének azonosításához.

E vizsgálati módszer esetében a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező vegyi anyagra vonatkozik, nem a DPRA anyagok és/vagy keverékek vizsgálatára való alkalmazhatóságához kapcsolódik. Ez a vizsgálati módszer fémvegyületek vizsgálatára nem alkalmazandó, mivel ismert, hogy azok kovalens kötéstől elérő mechanizmusok útján lépnek reakcióba a fehérjékkel. A vizsgálati vegyi anyagnak 100 mM végső koncentrációjú, megfelelő oldószerben oldhatónak kell lennie (lásd a 18. pontot). Az említett koncentrációnál nem oldható vizsgálati vegyi anyagok azonban alacsonyabb oldható koncentrációkban még vizsgálhatók. Ilyen esetben a pozitív eredmény továbbra is felhasználható a vizsgálati vegyi anyag bőrszenzibilizáló hatásúként történő azonosítására, a negatív eredmény alapján azonban nem szabad a reakcióképesség hiányára következtetni. Jelenleg kevés információ áll rendelkezésre a DPRA ismert összetételű keverékekre való alkalmazhatóságával kapcsolatban (18) (19). A DPRA mindazonáltal technikailag alkalmazandónak tekinthető az ismert összetételű, több összetevőből álló anyagok és keverékek vizsgálatára (lásd a 18. bekezdést). E vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. A jelenlegi előrejelzési modell a vizsgálati vegyi anyag és a peptid meghatározott mólaránya miatt nem alkalmazható ismeretlen összetételű, összetett keverékekre, ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagokra (azaz az UVCB anyagokra). E célból új, gravimetriás megközelítésen alapuló előrejelzési megközelítést kell kidolgozni. Olyan esetekben, ha bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer nem alkalmazható más, konkrét vegyianyag-kategóriákra, a vizsgálati módszert nem szabad e vegyianyag-kategóriákra alkalmazni.

Ez a vizsgálati módszer a metabolikus rendszert nem érintő in chemico módszer. E vizsgálati módszerrel nem mutathatók ki olyan vegyi anyagok, amelyek enzimatikus bioaktivációt igényelnek a bőrszenzibilizáló potenciáljuk kifejtéséhez (azaz a pro-hapténok). Beszámolók szerint az abiotikus átalakulást követően szenzibilizálóvá váló vegyi anyagok (azaz a pre-hapténok) egyes esetekben megfelelően kimutathatók ezzel a vizsgálati módszerrel (18). A fentiek fényében: a vizsgálati módszerrel kapott negatív eredményeket a közölt korlátokra tekintettel és az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretébe tartozó egyéb információforrásokkal összefüggésben kell értelmezni. A peptidhez nem kovalens kötéssel kapcsolódó, de az oxidációjához (cisztein-dimerizációval) hozzájáruló vizsgálati vegyi anyagok a peptidkiürülés esetleges túlbecsléséhez vezethetnek, esetlegesen hamis pozitív előrejelzéseket és/vagy magasabb reaktivitási osztályba sorolást eredményezve (lásd a 29. és a 30. pontot).

A fentieknek megfelelően a DPRA a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetését támogatja. Hozzájárulhat azonban a szenzibilizáló hatás értékeléséhez is (11), ha az integrált vizsgálati és értékelési megközelítéshez hasonló integrált megközelítések keretében alkalmazzák. Lehetőleg humán adatokon alapuló további munkára van azonban szükség annak meghatározásához, hogy a DPRA eredményei hogyan járulhatnak hozzá a hatáserősség vizsgálatához.

A VIZSGÁLAT ELVE

A DPRA a cisztein- vagy lizintartalmú peptidek vizsgálati vegyi anyaggal 25±2,5 °C-on 24 óráig végzett inkubációt követően megmaradó koncentrációját számszerűsítő in chemico módszer. A szintetikus peptidek a kimutatás elősegítése érdekében fenilalanint tartalmaznak. A relatív peptidkoncentráció mérése gradiens elúcióval és 220 nm hullámhosszon UV-detektálással végzett nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiával (HPLC) történik. A cisztein- és a lizintartalmú peptidek százalékos kiürülési értékeit ezt követően ki kell számítani és előrejelzési modellben kell alkalmazni (lásd a 29. pontot), ami lehetővé teszi a vizsgálati vegyi anyagnak a szenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok közötti különbségtétel alátámasztására használt négy reaktivitási osztály egyikébe sorolását.

Az e vizsgálati módszerben ismertetett módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak a 2. függelékben felsorolt tíz jártassági tesztanyag felhasználásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat.

ELJÁRÁS

Ez a vizsgálati módszer a DPRA-ra vonatkozó 154. sz. DB-ALM protokollon (20) alapul, amely az EURL ECVAM által koordinált validálási vizsgálathoz használt protokoll. A módszer laboratóriumi végrehajtása és alkalmazása során e protokoll alkalmazása ajánlott. Az alábbiakban a DPRA főbb összetevőinek és eljárásainak leírása található. Alternatív HPLC-beállítás alkalmazása esetén annak DB-ALM protokollban ismertetett, validált rendszerrel való egyenértékűségét bizonyítani kell (például a 2. függelékben található jártassági tesztanyagok vizsgálatával).

A cisztein- illetve a lizintartalmú peptidek előkészítése

A ciszteintartalmú (Ac-RFAACAA-COOH) és lizintartalmú (Ac-RFAAKAA-COOH), 85 %-osnál nagyobb és lehetőleg 90–95 %-os tisztaságú szintetikus peptideket tartalmazó törzsoldatokat frissen kell elkészíteni, közvetlenül a vizsgálati vegyi anyaggal való inkubálásukat megelőzően. A ciszteintartalmú peptidek végső koncentrációjának 7,5 pH-jú foszfátpufferben 0,667 mM-nek, míg a lizintartalmú peptidek végső koncentrációjának 10,2 pH-jú ammónium-acetát pufferben 0,667 mM-nek kell lennie. A HPLC-vizsgálatmenet sorozatát úgy kell beállítani, hogy a HPLC-elemzés ideje 30 óránál rövidebb maradjon. A validálási vizsgálatban használt és az e vizsgálati módszerben ismertetett HPLC-rendszerhez egyetlen HPLC-vizsgálatmenetben legfeljebb 26 elemzési minta alkalmazható (amelyek magukban foglalják a vizsgálati vegyi anyagot, a pozitív kontrollt és a megfelelő számú oldószeres kontrollokat a vizsgálat során használt oldószerek száma alapján; minden mintát három példányban kell vizsgálni). Az ugyanazon vizsgálatmenetben elemzett összes párhuzamoshoz ugyanazokat a cisztein- és lizintartalmú peptideket tartalmazó törzsoldatokat kell felhasználni. Az egyes gyártási sorozatokból származó peptidek esetében a felhasználás előtt ajánlott bebizonyítani a megfelelő oldhatóságukat.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

A vizsgálati vegyi anyag megfelelő oldószerben való oldhatóságát a DPRA DB-ALM protokolljában (20) ismertetett szolubilizációs eljárás utáni vizsgálat végrehajtása előtt kell vizsgálni. Egy megfelelő oldószer teljes egészében feloldja a vizsgálati vegyi anyagot. Mivel a DPRA során a vizsgálati vegyi anyag inkubálása túlnyomórészt a cisztein- vagy lizintartalmú peptidekkel történik, az áttetsző oldat képződésének szemrevételezéses ellenőrzése elegendőnek tekintendő annak megállapításához, hogy a vizsgálati vegyi anyag (és több összetevőből álló anyag vagy keverék vizsgálata esetén a vizsgálati vegyi anyag valamennyi összetevője) feloldódik. Megfelelő oldószer az acetonitril, a víz, illetve a víz és az acetonitril 1:1 arányú keveréke, az izopropanol, az aceton vagy az aceton és az acetonitril 1:1 arányú keveréke. Más oldószerek akkor alkalmazhatók, ha nem fejtenek ki hatást a peptid C. referenciakontrollokkal (azaz a megfelelő oldószerben feloldott, csak peptidből álló mintákkal; lásd a 3. függeléket) nyomon követett stabilitására. Utolsó lehetőségként, ha a vizsgálati vegyi anyag nem oldható ezen oldószerek egyikében sem, kísérletet kell tenni 300 μL dimetil-szulfoxidban való szolubilizálására, a keletkezett oldatot pedig 2 700 μL acetonitrillel kell hígítani, és ha a vizsgálati vegyi anyag nem oldható ebben a keverékben, kísérletet kell tenni ugyanakkora mennyiségű vizsgálati vegyi anyag 1 500 μL dimetil-szulfoxidban való szolubilizálására, a keletkezett oldatot pedig 1 500 μL acetonitrillel kell hígítani. 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez a vizsgálati vegyi anyagot előzetesen ki kell mérni üvegfiolákba és közvetlenül a vizsgálata előtt megfelelő oldószerben fel kell oldani. Ismert összetételű keverékek és több összetevőből álló anyagok esetében az összetevők (a víz kivételével) arányának összegzésével egyetlen tisztaságot kell meghatározni, továbbá a keverék minden egyes összetevője (a víz kivételével) molekulatömegének és azok egyedi arányának figyelembevételével egyetlen látszólagos molekulatömeget kell meghatározni. Ezt követően a kapott tisztaságot és látszólagos molekulatömeget kell felhasználni a vizsgálati vegyi anyag 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez szükséges tömegének kiszámításához. Olyan polimerek esetében, amelyeknél a domináns molekulatömeg nem határozható meg, 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez figyelembe vehető a monomer molekulatömege (vagy polimert alkotó különféle monomerek látszólagos molekulatömege). Ismert összetételű keverékek, több összetevőből álló anyagok vagy polimerek vizsgálata során azonban mérlegelni kell a tiszta vegyi anyag vizsgálatát is. Folyadékok esetében a tiszta vegyi anyagot önmagában, előzetes hígítás nélkül, a ciszteintartalmú peptidekkel 1:10, illetve a lizintartalmú peptidekkel 1:50 mólarányban végzett inkubálással kell vizsgálni. Szilárd anyagok esetében a vizsgálati vegyi anyagot a látszólagos 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez használt oldószerrel megegyező oldószerben, maximális oldható koncentrációjában kell feloldani. Ezt követően önmagában, további hígítás nélkül, a ciszteintartalmú peptidekkel 1:10, illetve a lizintartalmú peptidekkel 1:50 arányban végzett inkubálással kell vizsgálni. A látszólagos 100 mM koncentrációjú oldat és a tiszta vegyi anyag egyező eredményeinek (reaktív vagy nem reaktív) az eredményre vonatkozó határozott következtetést kell lehetővé tenniük.

A pozitív kontroll, a referenciakontrollok és a koelúciós kontrollok elkészítése

Pozitív kontrollként acetonitrilben oldott, 100 mM koncentrációjú fahéjaldehidet (CAS-szám: 104-55-2; ≥95 %-os élelmiszer-minőségű tisztaság) kell alkalmazni. Alkalmazhatók más, lehetőleg középtartományba eső kiürülési értékeket biztosító, megfelelő pozitív kontrollok is, ha rendelkezésre állnak történeti adatok hasonló vizsgálatmenet-elfogadhatósági kritériumok származtatásához. A HPLC-vizsgálatmenet sorozatának ezenfelül referenciakontrollokat (azaz mindössze a megfelelő oldószerben feloldott peptidet tartalmazó mintákat) is tartalmaznia kell, amelyek a HPLC rendszer alkalmasságának a vizsgálat előtti ellenőrzésére (A. referenciakontrollok), a referenciakontrollok időbeli stabilitásának ellenőrzésére (B. referenciakontrollok), valamint annak ellenőrzésére használatosak, hogy a vizsgálati vegyi anyag feloldására alkalmazott oldószer nincs hatással a százalékos peptidkiürülésre (C. referenciakontrollok) (lásd a 3. függeléket). Az egyes vegyi anyagok tekintetében a megfelelő referenciakontroll használatos az adott vegyi anyagok százalékos peptidkiürülésének kiszámításához (lásd a 26. pontot). Ezenfelül a vizsgálatmenet-sorozatnak minden egyes elemzett vizsgálati vegyi anyag esetében kizárólag a vizsgálati vegyi anyaggal alkotott koelúciós kontrollt kell tartalmaznia a vizsgálati vegyi anyag lizintartalmú vagy ciszteintartalmú peptidekkel való lehetséges koelúciójának kimutatására.

A vizsgálati vegyi anyag ciszteintartalmú és lizintartalmú peptideket tartalmazó oldatokkal való inkubálása

A ciszteintartalmú peptideket tartalmazó oldatokat 1:10 arányban, a lizintartalmú peptideket tartalmazó oldatokat pedig 1:50 arányban kell automata mintaadagoló üvegfiolákban inkubálni a vizsgálati vegyi anyaggal. Ha a vizsgálati vegyi anyag alacsony vízoldékonysága miatt a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó oldat peptidoldathoz történő hozzáadásakor azonnal kicsapódás figyelhető meg, ebben az esetben nem lehet megbizonyosodni arról, hogy a vizsgálati vegyi anyagból mennyi maradt az oldatban ahhoz, hogy a peptiddel reakcióba lépjen. Ezért ilyen esetben a pozitív eredmények még felhasználhatóak, a negatív eredmények azonban bizonytalanok és kellő körültekintéssel értelmezendőek (a 100 mM koncentrációig nem oldható vegyi anyagok vizsgálatához lásd még a 11. pont rendelkezéseit). A reakcióoldatot a HPLC-elemzés lefuttatása előtt 24±2 óráig 25±2,5 °C-on, sötétben kell hagyni. Minden egyes vizsgálati vegyi anyagot mindkét peptid esetében három példányban kell elemezni. A HPLC-elemzés előtt a mintákat szemrevételezéssel kell ellenőrizni. Ha kicsapódás vagy fázisszétválás figyelhető meg, a mintákat elővigyázatosságból alacsony sebességen (100–400xg) centrifugálni lehet, hogy a kicsapódás a fiola aljára kerüljön, ugyanis a nagy mennyiségű kicsapódás eltömítheti a HPLC-csöveket vagy -oszlopokat. Ha az inkubációs időszak után kicsapódás vagy fázisszétválás figyelhető meg, a peptidkiürülés esetlegesen alulbecsülhető, és a reaktivitás hiányra vonatkozó következtetés nem vonható le kellő bizonyossággal negatív eredmény esetén.

A HPLC standard kalibrációs görbe elkészítése

A ciszteintartalmú és a lizintartalmú peptidekhez is standard kalibrációs görbét kell létrehozni. A peptidstandardokat 20 %-os vagy 25 %-os acetonitril-oldatban kell előkészíteni: a ciszteintartalmú peptidek esetében (7,5 pH-jú) foszfátpufferrel, a lizintartalmú peptidek esetében pedig (10,2 pH-jú) ammónium-acetát pufferrel előállított pufferben. A (0,667 mM koncentrációjú) peptid-törzsoldat sorozathígítási standardjainak alkalmazásával 6 kalibráló oldatot kell készíteni a 0,534–0,0167 mM közötti tartomány lefedése érdekében. A standard kalibrációs görbén a hígítópuffer vakpróbáját is fel kell tüntetni. Megfelelő kalibrációs görbék esetén r2 > 0,99.

A HPLC előkészítése és HPLC-elemzés

A HPLC-rendszer megfelelőségét ellenőrizni kell az elemzés elvégzése előtt. A peptidkiürülést UV-detektorral (fotodiódasoros detektorral vagy 220 nm-en küldött jellel működő hullámhossz-abszorbancia-detektorral) ellátott HPLC segítségével kell nyomon követni. A megfelelő oszlopot telepíteni kell a HPLC-rendszerbe. A validált protokollban ismertetett HPLC-beállítás előnyben részesített oszlopként Zorbax SB-C-18 típusú, 2,1 mm x 100 mm x 3,5 mikron méretű oszlopot alkalmaz. Az egész rendszert a működtetése előtt legalább két órán keresztül ezzel a fordított fázisú HPLC-oszloppal kell 30 °C-on 50 % A. fázissal (0,1 térfogatszázalék trifluoracetát-sav vízben) és 50 % B. fázissal (0,0,85 térfogatszázalék trifuloracetát-sav acetonitrilben) ekvilibrálni. A HPLC-elemzést 0,35 ml/perc áramlási sebesség mellett, lineáris gradiensként 10 percen keresztül 10–25 %-os acetonitrilt alkalmazva kell elvégezni oly módon, hogy ezután az egyéb anyagok eltávolítása érdekében gyorsan 90 %-osra kell növelni az acetonitrilt. Az egyes standardokból, mintákból és kontrollokból egyenlő mennyiséget kell befecskendezni. Az oszlopot a befecskendezések között hét percig az eredeti körülmények között újra ekvilibrálni kell. Eltérő fordított fázisú HPLC alkalmazása esetén a fent ismertetett beállítási paramétereket esetlegesen ki kell igazítani a cisztein- és a lizintartalmú peptidek megfelelő elúciójának és integrációjának biztosítása érdekében, esetlegesen ki kell igazítani a befecskendezett mennyiséget is, amely az alkalmazott rendszertől függően változhat (jellemzően 3–10 μl tartományban mozoghat). Fontos, hogy alternatív HPLC-beállítás alkalmazása esetén a fent ismertetett, validált beállítással való egyenértékűségét bizonyítani kell (például a 2. függelékben található jártassági tesztanyagok vizsgálatával). Az abszorbanciát 220 nm hullámhosszon kell nyomon követni. Fotodiódasoros detektor használata esetén a 258 nm-en mért abszorbanciát is rögzíteni kell. Megjegyzendő, hogy egyes acetonitril-szállítmányok negatív hatást fejthetnek ki a peptidek stabilitására, és ezt figyelembe kell venni az új gyártási sorozatból származó acetonitril használatakor. A 220-as csúcsterület és a 258-as csúcsterület aránya a koelúció mutatójaként használható. Az egyes minták esetében a 90 % <kontrollminták területi mutatójának átlaga ( 10 )<100 % közötti tartományba eső mutató megbízhatóan jelezheti, hogy nem következett be koelúció.

Egyes vizsgálati vegyi anyagok kiválthatják a ciszteintartalmú peptid oxidációját. A dimerizált ciszteintartalmú peptid csúcsa szemrevételezéssel ellenőrizhető. Ha úgy tűnik, hogy a dimerizáció bekövetkezett, ezt fel kell jegyezni, mivel a százalékos peptidkiürülés túlbecsülhető, ami hamis pozitív előrejelzésekhez és/vagy magasabb reaktivitási osztályba soroláshoz vezethet (lásd a 29. és 30. pontot).

A cisztein- és a lizintartalmú peptidek esetében a HPLC-elemzés egyidejűleg (ha két HPLC-rendszer áll rendelkezésre) vagy különböző napokon is elvégezhető. Ha az elemzésre különböző napokon kerül sor, mindkét napon frissen kell elkészíteni a vizsgálati vegyi anyagokat tartalmazó összes oldatot. Az elemzést úgy kell időzíteni, hogy biztosítható legyen az, hogy az első minta injektálása 22–26 órával a vizsgálati vegyi anyag peptidoldattal való elegyítését követően kezdődjön meg. A HPLC-vizsgálatmenet sorozatát úgy kell beállítani, hogy a HPLC-elemzés ideje 30 óránál rövidebb maradjon. A validálási vizsgálatban használt és az e vizsgálati módszerben ismertetett HPLC-beállítás legfeljebb 26 elemzési mintához alkalmazható egyetlen HPLC-vizsgálatmenetben (lásd még a 17. pontot). A HPLC-elemzési sorozat egy példája a 3. függelékben található.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

A cisztein- és a lizintartalmú peptid koncentrációját minden egyes mintában 220 nm-en kell fotometrikusan meghatározni a megfelelő csúcsok csúcsterületének (görbe alatti terület, AUC) mérésével és a peptid koncentrációjának a standardokból származtatott lineáris kalibrációs görbe segítségével történő kiszámításával.

A százalékos peptidkiürülést minden egyes mintában a csúcsterület mérésével, majd ennek a releváns C. referenciakontrollok (lásd a 3. függeléket) csúcsterület-átlagával, az alább ismertetett képlet szerint kell meghatározni.

Elfogadhatósági kritériumok

Ahhoz, hogy a vizsgálatmenet érvényesnek minősüljön, az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük:

Ha e kritériumok közül egy vagy több nem teljesül, a vizsgálatmenetet meg kell ismételni.

Ahhoz, hogy a vizsgálati vegyi anyag eredményei érvényesnek minősüljenek, az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük:

Előrejelző modell

A százalékos cisztein- és lizinkiürülés átlagát minden egyes vegyi anyagnál ki kell számítani. A negatív kiürülés »0«-nak tekintendő az átlag kiszámítása során. Az 1. táblázatban szemléltetett, 1:10 arányban ciszteint, 1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modell alkalmazásával a 6,38 %-os átlagos peptidkiürülési küszöbértéket kell használni a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében történő megkülönböztetésének alátámasztására. Az előrejelzési modellnek a vizsgálati vegyi anyagok adott reaktivitási osztályba (alacsony, mérsékelt és magas reaktivitás) sorolásához történő alkalmazása talán hasznosnak bizonyulhat egy integrált vizsgálati és értékelési megközelítésen belüli hatáserősség-vizsgálat szempontjából.

Előfordulhatnak olyan esetek, amikor a vizsgálati vegyi anyag (az anyag, illetve valamely több összetevőből álló anyag vagy keverék egy vagy több összetevője) jelentős mértékben abszorbeálódik 220 nm-en, és retenciós ideje megegyezik a peptidével (koelúció). A vizsgálati vegyi anyag és a peptid elúciós idejének további szétválasztása érdekében a koelúció megoldható a HPLC-beállítás kismértékű kiigazításával. Ha a koelúció megoldására alternatív HPLC-beállítás használatos, a validált beállítással való egyenértékűségét be kell bizonyítani (például a 2. függelékben található jártassági tesztanyagok vizsgálatával). Koelúció bekövetkezésekor a peptid csúcsa nem integrálható és a százalékos peptidkiürülés kiszámítása nem lehetséges. Ha az ilyen vizsgálati vegyi anyagok koelúciója a cisztein- és a lizintartalmú peptidekkel is bekövetkezik, az elemzésről »nem meggyőző«-ként kell beszámolni. Olyan esetekben, ha a koelúció csak a lizintartalmú peptiddel következik be, a 2. táblázatban közölt, 1:10 arányban ciszteint alkalmazó előrejelzési modell alkalmazható.

Előfordulhatnak egyéb olyan esetek, amikor a vizsgálati vegyi anyag vagy bármelyik peptid retenciós ideje közötti átfedés nem teljes. Ilyen esetekben a százalékos peptidkiürülési értékeket meg lehet becsülni és fel lehet használni az 1:10 arányban ciszteint, illetve az 1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modellben, a vizsgálati vegyi anyag reaktivitási osztályba sorolása ugyanakkor nem végezhető el pontosan.

A vizsgálati vegyi anyag esetében a cisztein- és a lizintartalmú peptideknél is elegendőnek kell lennie egyetlen HPLC-elemzésnek, ha az eredmény nem egyértelmű. A pozitív és a negatív eredmények megkülönböztetéséhez használt küszöbértékhez közeli eredmények (vagyis határesethez közeli eredmények) esetében további vizsgálatokra lehet szükség. Ha a százalékos kiürülés átlaga az 1:10 arányban ciszteint/1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modell esetén 3–10 % közé esik, vagy ha a százalékos ciszteinkiürülés az 1:10 arányban ciszteint alkalmazó előrejelzési modell esetén 9–17 % közé esik, mérlegelni kell egy második vizsgálatmenetet, valamint az első két vizsgálatmenet nem egyező eredményei esetén egy harmadik vizsgálatmenetet.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálat milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket (21).

Káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) : valamely megcélzott vegyi anyag vagy hasonló vegyi anyagok csoportjának kémiai szerkezetéből kiinduló, a molekuláris kiváltó eseményen keresztül az érintett in vivo eredményig végbemenő eseménysorozat (2).

Kalibrációs görbe : valamely ismert anyag kísérleti válaszértéke és analitikai koncentrációja közötti összefüggés (más néven: standard görbe).

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Variációs koefficiens : a variabilitás mértékegysége, amelyet a párhuzamos adatcsoportok esetében a szórás és az átlag hányadosaként kell kiszámítani. Százalékos arányként történő kifejezéséhez 100-zal megszorozható.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Integrált vizsgálati és értékelési megközelítés : valamely vegyi anyag vagy vegyianyag-csoport veszélyeinek azonosításához (potenciál), jellemzéséhez (hatáserősség) és/vagy biztonsági értékeléséhez (potenciál, hatáserősség és expozíció) alkalmazott strukturált megközelítés, amely stratégiai szempontból beépít és mérlegel minden olyan releváns adatot, amely hozzájárul a lehetséges veszélyre és/vagy kockázatra és/vagy a további célirányos és ezért minimális vizsgálat szükségességére vonatkozó szabályozói döntéshozatalhoz.

Molekuláris kiváltó esemény : valamely biológiai rendszer vegyi anyag által, molekuláris szinten kiváltott zavara, amely a káros kimeneti útban a kezdőeseményként határozandó meg.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (1).

Egy összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben az egyik fő összetevő legalább 80 tömegszázalékban van jelen.

Több összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben egynél több fő összetevő legalább 10 tömegszázalékban, de 80 tömegszázalékot nem meghaladó koncentrációban van jelen. A több összetevőből álló anyag gyártási folyamat eredménye. A keverék és a több összetevőből álló anyag között az a különbség, hogy a keverék két vagy több anyag összekeverésével, kémiai reakció nélkül jön létre. A több összetevőből álló anyag kémiai reakció eredménye.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Referenciakontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó nem kezelt minta, amelyet a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni az ugyanazon oldószerben feloldott vagy ugyanazon vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékeinek megállapítása érdekében. Párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálata esetén ez a minta azt is bizonyítja, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Relevancia : a vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (21).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik (21).

Reprodukálhatóság : ugyanazon vegyi anyag ugyanazon vizsgálati protokollal végzett vizsgálata során kapott eredmények egyezése (lásd: megbízhatóság) (21).

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálati módszer helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (21).

Specifikusság : a vizsgálati módszerrel helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (21).

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (1).

A rendszer alkalmassága : a műszer teljesítményének (például érzékenységének) az analitikai programcsomag lefuttatása előtt, referenciastandard segítségével végzett elemzésével történő meghatározása (22).

Vizsgálati vegyi anyag : a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező anyagra való hivatkozáshoz használatos.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (1).

UVCB : Ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagok.

Érvényes vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amely kellően relevánsnak és megbízhatónak minősül egy adott célra, és amely tudományosan megalapozott elveken alapul. Egy-egy vizsgálati módszer abszolút értelemben soha nem érvényes, kizárólag meghatározott céllal összefüggésben az (21).

---

2. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK

In chemico bőrszenzibilizáció: közvetlen peptidreaktivitási vizsgálat

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak oly módon kell igazolniuk szakmai jártasságukat, hogy az 1. táblázatban javasolt 10 jártassági tesztanyagra vonatkozóan a közvetlen peptidreaktivitási vizsgálattal a várható előrejelzést helyesen állapítják meg, továbbá az egyes peptidek tekintetében a 10 jártassági tesztanyag közül 8 esetében a referenciatartományba eső cisztein- és lizinkiürülési értékeket kapják meg. E jártassági tesztanyagok kiválasztása oly módon történt, hogy a bőrszenzibilizáció veszélye esetén bekövetkező különféle válaszreakciókat képviseljék. További kiválasztási kritérium volt, hogy a jártassági tesztanyagok kereskedelmi forgalomban kaphatóak legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok és a közvetlen peptidreaktivitási vizsgálattal generált, kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre, és azokat az EURL ECVAM által koordinált validálási vizsgálatban felhasználják a vizsgálati módszernek a vizsgálatban részt vevő laboratóriumokban történő sikeres végrehajtásának bizonyítása érdekében.

---

3. függelék

ELEMZÉSSOROZATRA VONATKOZÓ PÉLDÁK

B.60.    In vitro bőrszenzibilizáció: ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 442D. vizsgálati iránymutatásában (2015) leírt módszerrel. A bőrszenzibilizáló anyag a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) (1) és az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendelet ( 11 ) (CLP-rendelet) szerint olyan anyag, amely a bőrrel való érintkezést követően allergiás reakciót vált ki. Ez a vizsgálati módszer olyan in vitro eljárást (ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat) tesz lehetővé, amellyel támogatható a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetése az ENSZ-GHS-nek (1) és a CLP-rendeletnek megfelelően.

A bőrszenzibilizációt előidéző főbb biológiai eseményeket illetően általános egyetértés van. A bőrszenzibilizációhoz kapcsolódó kémiai és biológiai mechanizmusokról már rendelkezésre álló ismereteket úgynevezett káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) (2) foglalja össze a molekuláris kiváltó eseménytől a köztes eseményeken át a káros hatásig, amely embereknél allergiás kontakt bőrgyulladás, rágcsálóknál pedig kontakt túlérzékenység (2) (3). A molekuláris kiváltó esemény az elektrofil anyagok és a bőrben lévő fehérjék nukleofil centrumai között létrejövő kovalens kötés. E káros kimeneti úton a második kulcsfontosságú esemény a keratinsejtekben következik be, többek között gyulladást okozó reakciók, valamint konkrét sejtjelző útvonalakhoz, például az antioxidáns/elektrofil válaszelemtől (ARE) függő útvonalakhoz kapcsolódó génexpresszió formájában. A harmadik kulcsfontosságú esemény a dendritikus sejtek aktivációja, melynek értékelése jellemzően konkrét sejtfelületi markerek, kemokinek és citokinek expressziója alapján történik. A negyedik kulcsfontosságú esemény a T-sejtek proliferációja, melynek közvetett értékelése az egereken alkalmazott lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (4) keretében történik.

A bőrszenzibilizáció vizsgálata jellemzően kísérleti állatokon történő vizsgálatot foglal magában. A tengerimalacokon alkalmazott klasszikus módszerek, vagyis a Magnusson–Kligman-féle tengerimalac-maximizációs vizsgálat és a Bühler-féle vizsgálat (B.6. vizsgálati módszer (5)) egyaránt a bőrszenzibilizáció indukciós és kiváltási fázisával foglalkozik. Az egereken alkalmazott lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA, B.42. vizsgálati módszer (4)) és két nem radioaktív változata, az LLNA: DA (B.50. vizsgálati módszer (6)) és az LLNA: BrdU-ELISA (B.51. vizsgálati módszer (7)), amely mind csak az indukciós reakciót vizsgálja, szintén elfogadottá vált, mivel állatjólét szempontjából előnyösebbek, mint a tengerimalacon végzett vizsgálatok, és objektív mérést tesznek lehetővé a bőrszenzibilizáció indukciós fázisában.

Újabban a mechanisztikus alapú in chemico és in vitro vizsgálati módszerek a vegyi anyagok bőrszenzibilizációs veszélyének értékelése szempontjából tudományosan megalapozottnak tekinthetőek. Szükség lesz azonban nem állatokon alkalmazott módszerek (in silico, in chemico, in vitro) integrált vizsgálati és értékelési megközelítésen belüli kombinációira a jelenleg alkalmazott állatkísérletek teljes felváltásához, mivel a jelenleg rendelkezésre álló, nem állatokon alkalmazott vizsgálati módszerekre a káros kimeneti út mechanisztikus szempontjai csak korlátozott mértékben terjednek ki (2) (3).

Ez a vizsgálati módszer (ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat) a 2. pontban kifejtett második kulcsfontosságú esemény tárgyalására javasolt. Beszámolók szerint a bőrszenzibilizáló anyagok antioxidáns válaszelemmel (ARE) szabályozott géneket idéznek elő (8) (9). A bőrszenzibilizáló anyagokhoz hasonló, kisméretű elektrofil anyagok kifejthetnek hatást a Keap1 szenzorfehérjére (Kelch-like ECH-associated protein 1) például cisztein-maradékának kovalens módosításával, ami az Nrf2 transzkripciós faktortól (nukleáris faktor-eritroid 2-kapcsolt faktor 2) való különválását eredményezi. A disszociált Nrf2 ezt követően aktiválhat ARE-függő géneket, például a II. fázisban ható detoxifikáló enzimeket kódoló géneket (8) (10) (11).

Jelenleg az e vizsgálati módszer keretébe tartozó in vitro ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat csak a KeratinoSensTM vizsgálat, amelyre vonatkozóan validálási vizsgálatokat bonyolítottak (9) (12) (13), és azokat az állatkísérletek alternatív módszereinek uniós referencialaboratóriuma (EURL ECVAM) által végzett független szakértői értékelés (14) követte. A KeratinoSensTM vizsgálat egy integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében történő alkalmazásra, a veszélyességi osztályozás és címkézés céljából a bőrszenzibilizáló és nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének alátámasztására tudományosan megalapozottnak minősült (14). A vizsgálati módszert bevezetni kívánó laboratóriumok a KeratinoSensTM vizsgálat során használt rekombináns sejtvonalat a vizsgálati módszer kifejlesztőjével kötött licenciamegállapodással szerezhetik meg (15).

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁG ÉS KORLÁTOK

Mivel a Keap1-Nrf2-ARE útvonal aktiválása a bőrszenzibilizációs káros kimeneti útnak csak a második kulcsfontosságú eseményét érinti, nem valószínű, hogy a vizsgálati módszerekből származó, ezen útvonal aktiválásán alapuló információk önmagukban elegendőek a vegyi anyagok bőrszenzibilizáló hatásának megállapításához. Ezért az e vizsgálati módszerrel kapott adatokat integrált megközelítés, például integrált vizsgálati és értékelési megközelítés összefüggésében kell mérlegelni olyan egyéb, kiegészítő információkkal együtt, mint a bőrszenzibilizációs káros kimeneti út más kulcsfontosságú eseményeivel foglalkozó in vitro vizsgálatok eredményei, valamint a vizsgálat nélküli módszerekkel, köztük a kémiai analógokból kereszthivatkozással kapott adatok. Az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer alkalmazására vonatkozó példák egyéb információkkal együtt a szakirodalomban szerepelnek (13) (16) (17) (18) (19).

Ez a vizsgálati módszer az integrált vizsgálati és értékelési megközelítéssel összefüggésben felhasználható a bőrszenzibilizáló (vagyis az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének támogatására. Ez a vizsgálati módszer nem alkalmazható önmagában sem a bőrszenzibilizáló anyagoknak az ENSZ-GHS-ben/a CLP-rendeletben meghatározott 1A. és 1B. alkategóriába sorolására, sem a hatáserősség előrejelzésére a biztonsági értékeléssel kapcsolatos döntések esetén. A szabályozási kerettől függően azonban a pozitív eredmények önmagukban is felhasználhatók a vegyi anyagok ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába sorolására.

A validálási vizsgálat adatkészlete és a vizsgálati módszer független szakértői értékeléséhez használt házon belüli vizsgálatok alapján a KeratinoSensTM vizsgálatról bebizonyosodott, hogy áthelyezhető a sejttenyésztés területén tapasztalattal rendelkező laboratóriumokba. A vizsgálati módszertől várható előrejelzések reprodukálhatóságának mértéke a laboratóriumokon belül és között mintegy 85 % (14). A KeratinoSensTM vizsgálatnak a bőrszenzibilizáló (azaz az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) anyagok nem szenzibilizáló anyagoktól való megkülönböztetése tekintetében érvényes, az LLNA vizsgálati módszer eredményéhez viszonyított pontossága, (77 % – 155/201), érzékenysége (78 % – 71/91) és specifikussága (76 % – 84/110) a vizsgálati módszer értékelése és szakértői értékelése céljából az EURL ECVAM-hoz benyújtott összes adat figyelembevételével került kiszámításra (14). Ezek a számadatok hasonlóak a mintegy 145 anyag (77 %-os pontosság, 79 %-os érzékenység, 72 %-os specifikusság) házon belüli vizsgálata alapján nemrég közzétett számadatokhoz (13). A KeratinoSensTM vizsgálat nagyobb valószínűséggel jelez előre alacsonyabb értékeket olyan vegyi anyagoknál, amelyeknek alacsonytól mérsékeltig terjedő a szenzibilizáló hatása (azaz az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1B. alkategóriába tartozó anyagoknál), mint a rendkívül bőrszenzibilizáló hatást mutató vegyi anyagoknál (azaz az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1A. alkategóriába tartozó anyagoknál) (13) (14). Ezek az információk összességében azt jelzik, hogy a KeratinoSensTM vizsgálat érdemben hozzájárul a bőrszenzibilizáció veszélyének azonosításához. A KeratinoSensTM vizsgálat mint önálló vizsgálati módszer esetében itt megadott pontossági értékek azonban csak irányadóak, ugyanis a vizsgálati módszert az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében más információforrásokkal együtt és a fenti 9. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni. Ezen túlmenően a bőrszenzibilizáció nem állatokon alkalmazott módszereinek értékelésekor nem szabad megfeledkezni arról, hogy az LLNA vizsgálat, valamint más állatkísérletek nem feltétlenül tükrözik teljes egészében az érintett fajnál, például az embernél fennálló helyzetet.

E vizsgálati módszer esetében a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező vegyi anyagra vonatkozik, nem az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat anyagok és/vagy keverékek vizsgálatára való alkalmazhatóságához kapcsolódik. A jelenleg rendelkezésre álló adatok alapján a KeratinoSensTM vizsgálatról bebizonyosodott, hogy különféle szerves funkciós csoportokat, reakciómechanizmusokat, (in vivo vizsgálatok során meghatározott) bőrszenzibilizáló hatásokat és fizikai-kémiai tulajdonságokat képviselő vizsgálati vegyi anyagokra alkalmazandó (9) (12) (13) (14). Elsősorban egy összetevőből álló anyagok vizsgálatára került sor, bár a keverékek vizsgálatára vonatkozóan is rendelkezésre áll korlátozott mennyiségű információ (20). A vizsgálati módszer mindazonáltal a több összetevőből álló anyagok és keverékek vizsgálatára technikailag alkalmazható. E vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt azonban meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. Ezenfelül a több összetevőből álló anyagok vagy keverékek vizsgálata során figyelembe kell venni a citotoxikus összetevőknek a megfigyelt válaszreakciókkal való lehetséges kölcsönhatását. A vizsgálati módszer olyan vizsgálati vegyi anyagokra alkalmazandó, amelyek a vízben vagy dimetil-szulfoxidban oldhatók vagy azokkal stabil diszperziót (azaz olyan kolloidot vagy szuszpenziót, amelyben a vizsgálati vegyi anyag nem ülepedik le, illetve nem válik szét az oldószertől különböző fázisokra) alkotnak (több összetevőből álló anyag vagy keverék vizsgálata esetén ez a vizsgálati vegyi anyag összes összetevőjére igaz). Azok a vizsgálati vegyi anyagok, amelyek a legmagasabb előírt végleges koncentrációnál (2 000 μM) nem teljesítik ezeket a feltételeket (lásd a 22. pontot), alacsonyabb koncentrációknál továbbra is vizsgálhatók. Ilyen esetben a pozitivitás 39. pontban ismertetett kritériumainak megfelelő eredmények továbbra is felhasználhatók a vizsgálati vegyi anyag bőrszenzibilizálóként történő azonosítására, míg az 1 000 μM koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk alkalmazásával kapott negatív eredmény nem meggyőzőnek tekintendő (lásd a 39. pontban lévő előrejelzési modellt). Az 5-nél nem magasabb LogP értékű anyagok vizsgálata általában sikeres, míg a 7-nél magasabb LogP értékű, rendkívül hidrofób anyagok a vizsgálati módszert ismert alkalmazhatóságán kívül esnek (14). Az 5 és 7 közötti LogP értékű anyagokra vonatkozóan csak kevés információ áll rendelkezésre.

A negatív eredményeket óvatosan kell értelmezni, mivel a kizárólagosan a lizinmaradékok felé reaktivitást mutató anyagokat a vizsgálati módszer negatívként mutathatja ki. Ezen túlmenően az alkalmazott sejtvonal korlátozott metabolikus képessége (21) és a kísérleti körülmények miatt különösen a lassú oxidációs rátájú pro-hapténok (azaz például a P450 enzim közreműködésével enzimatikus aktivációt igénylő vegyi anyagok) és pre-hapténok (azaz az automatikus oxidációval aktiválódó vegyi anyagok) is adhatnak negatív eredményeket. Másrészt a nem szenzibilizálóként ható, de ennek ellenére kémiai stresszorként fellépő vizsgálati vegyi anyagok hamis pozitív eredményekhez vezetnek (14). Ezenfelül a rendkívül citotoxikus vizsgálati vegyi anyagok nem mindig értékelhetők megbízhatóan. Végezetül a luciferáz enzimmel kölcsönhatásba lépő vizsgálati vegyi anyagok megzavarhatják a luciferáz hatását a sejtes tesztekben, látszólagos gátlást vagy megnövekedett lumineszcenciát okozva (22). Beszámoltak például arról, hogy az 1 μM-nél magasabb fitoösztrogén-koncentráció a luciferáz riportergén túlzott aktiválása miatt zavarja a lumineszcencia jeleit más, luciferáz alapú riportergén-vizsgálatokban (23). Következésképp a magas fitoösztrogén-koncentráció mellett vagy feltehetőleg a luciferáz riportergént a fitoösztrogénhez hasonlóan túlzottan aktiváló hasonló vegyi anyagok magas koncentrációja mellett kapott luciferáz-expressziót körültekintően meg kell vizsgálni (23). Olyan esetekben, ha bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer nem alkalmazható más, konkrét vegyianyag-kategóriákra, a vizsgálati módszert nem szabad e vegyianyag-kategóriákra alkalmazni.

A KeratinoSensTM vizsgálat – amellett, hogy alátámasztja a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok közötti különbségtételt – olyan koncentráció-válasz információval is szolgál, amely hozzájárulhat a szenzibilizáló hatáserősség értékeléséhez is, ha az integrált értékelési és vizsgálati megközelítéshez hasonló integrált megközelítés keretében használják (19). Szükség van azonban további, lehetőleg megbízható humán adatokon alapuló kutatásra annak meghatározása érdekében, hogy a KeratinoSensTM vizsgálat eredményei hogyan járulnak hozzá a hatáserősség értékeléséhez (24) és a szenzibilizáló anyagoknak az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti alkategóriákba sorolásához.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer a szelektálható plazmiddal stabilan transzfektált HaCaT emberi keratinocitákból származó immortalizált adherens sejtvonalakat használ. A sejtvonal az azt alkotó promóter, valamint a bőrszenzibilizáló anyagokkal közismerten felülszabályozott génből származó antioxidáns válaszelem fúziójának transzkripciós szabályozása mellett tartalmazza a luciferáz gént (25) (26). A luciferáz jel az endogén Nrf2-függő gének szenzibilizáló anyagokkal való aktiválását tükrözi, és a rekombináns sejtvonalon belüli luciferáz jelnek az Nrf2 transzkripciós faktortól való függősége bizonyítást nyert (27). Ez lehetővé teszi a luciferázgén-indukció (lumineszcencia-detektálással történő) kvantitatív mérését, mégpedig az Nfr2 transzkripciós faktor elektrofil anyagoknak való expozíciót követő, sejteken belüli aktivitásának mutatójaként jól bevált fénytermelő luciferáz szubsztrátok segítségével.

A KeratinoSens™ vizsgálatban a vizsgálati vegyi anyagok akkor minősülnek pozitívnak, ha egy adott küszöbérték felett a luciferáz-aktivitás statisztikailag szignifikáns (azaz 1,5-szeresnél nagyobb vagy 50 %-os) indukcióját idézik elő egy olyan meghatározott koncentráció alatt, amely nem befolyásolja jelentősen a sejtéletképességet (azaz 1 000 μM alatti és olyan koncentráció mellett, amelynél a sejtéletképesség 70 % feletti (9) (12)). E célból az oldószeres (negatív) kontrollal szembeni luciferáz-aktivitás valahányszoros indukciójának maximális értékét (Imax) meg kell határozni. Ezen túlmenően, mivel a sejteket a vizsgálati vegyi anyag több koncentrációjának kell kitenni, a luciferáz-aktivitás küszöbérték (azaz EC1,5 érték) feletti, statisztikailag szignifikáns indukciójához szükséges koncentrációt a dózis-válasz görbéből kell interpolálni (a számításokért lásd a 32. pontot). Végezetül citotoxicitás-méréseket kell végezni annak értékeléséhez, hogy a luciferáz-aktivitás indukciójának szintje a citotoxikus koncentrációknál alacsonyabb koncentráció mellett bekövetkezik-e.

Az e vizsgálati módszerhez kapcsolódó, ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak a 2. függelékben felsorolt tíz jártassági tesztanyag felhasználásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat.

A KeratinoSens™ vizsgálathoz hasonló ARE-Nrf2 luciferáz alapú, új vagy módosított in vitro vizsgálati módszerek validálásának megkönnyítéséhez rendelkezésre állnak teljesítményszabványok (28), amelyek lehetővé teszik e vizsgálati iránymutatás időben történő módosítását az új módszerek e vizsgálati iránymutatásba való beépítéséhez. Az adatok OECD-megállapodás szerinti kölcsönös elfogadása csak a teljesítményszabványoknak megfelelően validált vizsgálati módszerek esetében lesz garantált, ha e vizsgálati módszereket az OECD felülvizsgálta és belefoglalta a megfelelő vizsgálati iránymutatásba.

ELJÁRÁS

Az e vizsgálati iránymutatás keretébe tartozó egyetlen módszer jelenleg a tudományosan megalapozott KeratinoSensTM vizsgálat (9) (12) (13) (14). A KeratinoSensTM vizsgálathoz rendelkezésre állnak a standard műveleti eljárások, amelyeket alkalmazni kell e vizsgálati módszer laboratóriumi végrehajtása és igénybevétele során (15). A vizsgálati módszert bevezetni kívánó laboratóriumok a KeratinoSensTM vizsgálat során használt rekombináns sejtvonalat a vizsgálati módszer kifejlesztőjével kötött licenciamegállapodással szerezhetik meg. A következő pontok ismertetik az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer főbb összetevőit és eljárásait.

A keratinocita-tenyészetek előkészítése

A luciferáz riportergént az ARE-elem szabályozása mellett stabilan beillesztő transzgénikus sejtvonalat kell használni (például a KeratinoSens™ sejtvonalat). A sejteket a beérkezésüket követően (például 2–4 passzálással) szaporítani kell, és homogén állományként fagyasztva kell tárolni. Az ebből az eredeti állományból származó sejtek maximális számú passzálással szaporíthatók (ez a KeratinoSensTM esetében 25), és megfelelő fenntartó közeg használatával (a KeratinoSensTM esetében ez szérumot és Geneticint tartalmazó DMEM) rutinszerű vizsgálat céljára alkalmazhatók.

A sejteknek a vizsgálathoz 80–90 %-ban konfluensnek kell lenniük, és ügyelni kell annak biztosítására, hogy a sejtek soha ne növekedjenek a teljes konfluencia eléréséig. A vizsgálat előtt egy nappal a sejteket be kell gyűjteni, és azokat 96-lyukú lemezeken szét kell oszlatni (a KeratinoSensTM esetében lyukanként 10 000 sejt lehet). Annak biztosítása érdekében, hogy az egyes lyukak között homogén legyen a sejtszám eloszlása, ügyelni kell annak elkerülésére, hogy a leoltás alatt a sejtek leülepedjenek. Eltérő esetben e lépés következtében nagymértékű lehet a lyukankénti variabilitás. Minden megismételt kísérlet esetében a luciferáz-aktivitás méréséhez három párhuzamost, a sejtéletképesség-vizsgálathoz pedig egy párhuzamost kell alkalmazni.

A vizsgálati vegyi anyag és a kontrollanyagok előkészítése

A vizsgálati vegyi anyagot és a kontrollanyagokat a vizsgálat napján kell előkészíteni. A KeratinoSensTM vizsgálathoz a vizsgálati vegyi anyagokat dimetil-szulfoxidban (DMSO) kell a kívánt végső koncentrációra (például 200 mM) feloldani. A DMSO-oldatok önsterilizálónak tekinthetők, ezért csíramentesítő szűrésre nincs szükség. A DMSO-ban nem oldható vizsgálati vegyi anyagot csíramentes vízben vagy tenyészközegben kell feloldani, és az oldatokat például szűréssel kell csíramentesíteni. A meghatározott molekulatömeggel nem rendelkező vizsgálati vegyi anyaghoz a KeratinoSensTM vizsgálatban alapértelmezett koncentrációjú (40 mg/mL vagy 4 vegyesszázalékos) törzsoldatot kell készíteni. A DMSO-tól, a víztől vagy a tenyészközegtől eltérő oldószerek használata esetén kellő mértékű tudományos indokolást kell adni.

A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó DMSO-törzsoldatok alapján a vizsgálandó vegyi anyag 12 (a KeratinoSensTM vizsgálatban 0,098 mM és 200 mM közötti) törzskoncentrációjának előállításához DMSO-val kell oldatsorozatot készíteni. A DMSO-ban nem oldható vizsgálati vegyi anyagok esetében a törzskoncentráció előállításához szükséges hígításokat csíramentes vízzel vagy csíramentes tenyészközeggel kell elvégezni. A használt oldószertől függetlenül a törzskoncentrációkat ezt követően szérumot tartalmazó tenyészközegben 25-szörösükre tovább kell hígítani, végül pedig további 4-szeres hígítási tényezővel kell kezeléshez felhasználni, hogy a vizsgálati vegyi anyag végső koncentrációja a KeratinoSensTM vizsgálatban 0,98 és 2 000 μM közötti tartományba essen. Indokolt esetben más koncentrációk is alkalmazhatók (például citotoxicitás vagy gyenge oldhatóság esetén).

A KeratinoSensTM vizsgálatban alkalmazott negatív (oldószeres) kontroll a DMSO (CAS-szám: 67-68-5, ≥ 99 %-os tisztaság), amelyhez lemezenként hat lyukat kell előkészíteni. Ahhoz, hogy a végső negatív (oldószeres) kontroll koncentrációja 1 % legyen, a 22. pontban a törzskoncentrációkra vonatkozóan leírtakkal megegyező módon kell hígítani; e koncentrációról ismeretes, hogy nem befolyásolja a sejtéletképességet, emellett ugyanazon DMSO-koncentrációnak felel meg, mint a vizsgálati vegyi anyagban és a pozitív kontrollban található DMSO-koncentráció. DMSO-ban nem oldható, vízzel hígított vizsgálati vegyi anyag esetében a DMSO szintjét a végső vizsgálati oldatot tartalmazó összes lyukban 1 %-ra kell kiigazítani, csakúgy, mint a többi vizsgálati vegyi anyag és kontrollanyag esetében.

A KeratinoSensTM vizsgálatban alkalmazott pozitív kontroll a fahéjaldehid (CAS-szám: 14371-10-9, ≥ 98 %-os tisztaság), amelyhez (6,4 mM koncentrációjú törzsoldatból) öt, 0,4–6,4 mM közötti törzskoncentráció-sorozatot kell készíteni DMSO-ban, és a 22. pontban a törzskoncentrációkra vonatkozóan leírtakkal megegyező módon kell hígítani, hogy a pozitív kontroll végső koncentrációja 4–64 μM között legyen. Alkalmazhatók más, megfelelő, lehetőleg középtartományban lévő EC1,5 értékeket adó pozitív kontrollok is, ha rendelkezésre állnak történeti adatok hasonló vizsgálatmenet elfogadhatósági kritériumainak származtatásához.

A vizsgálati vegyi anyag és a kontrollanyagok alkalmazása

Minden egyes vizsgálati vegyi anyag és pozitív kontrollanyag esetében egy kísérletre van szükség a (pozitív vagy negatív) előrejelzéshez, amely kísérlet három-három párhuzamost tartalmazó, legalább két független ismétlésből áll (azaz n=6). A két független ismétlés nem egyező eredményei esetén három párhuzamost tartalmazó harmadik ismétlést kell végezni (azaz n=9). Mindegyik független ismétlést más-más napon, a vizsgálati vegyi anyagot és az egymástól függetlenül begyűjtött sejteket tartalmazó friss törzsoldattal kell elvégezni. A sejtek azonban származhatnak ugyanabból a passzálásból.

A 20. pontban ismertetett leoltást követően a sejteket 24 órán át 96-lyukú mikrotiterlemezeken kell növeszteni. A közeget ezt követően el kell távolítani és friss tenyészközeggel (a KeratinoSensTM vizsgálat esetén 150 μl mennyiségű, szérumot igen, de Geneticint nem tartalmazó tenyészközeggel) kell felváltani, amelyhez a 25-szörös hígítású vizsgálati vegyi anyagból és a kontrollanyagokból 50 μl-t kell adni. A háttérértékek megállapítása érdekében lemezenként legalább egy lyukat üresen (sejt és kezelés nélkül) kell hagyni.

A KeratinoSensTM vizsgálatban a kezelt lemezeket ezt követően kb. 48 óráig 37±1 °C-on 5 % CO2 jelenlétében inkubálni kell. Ügyelni kell az illékony vizsgálati vegyi anyagok elpárolgásának elkerülésére, valamint a lyukak vizsgálati vegyi anyagokkal való keresztszennyeződésének elkerülésére, például a lemezek vizsgálati vegyi anyagokkal való inkubálás előtt fóliával való befedésével.

A luciferáz-aktivitás mérése

A megfelelő lumineszcencia-leolvasások biztosításához három tényező kulcsfontosságú:

E három tényező teljesülésének biztosítása érdekében a vizsgálat előtt a 3. függelékben ismertetett beállítással kontrollkísérletet kell végezni.

A KeratinoSensTM vizsgálatban a vizsgálati vegyi anyaggal és a kontrollanyagokkal alkalmazott 48 órás expozíciós idő elteltével a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal kell átmosni, és a lumineszcencia-leolvasásokhoz tartozó megfelelő lízispuffert 20 percig szobahőmérsékleten az egyes lyukakba kell adagolni.

A sejtlizátumokat tartalmazó lemezeket ezt követően leolvasás céljából a luminométerbe kell helyezni, amelyet a KeratinoSensTM vizsgálatban a következőkre programoznak be: i. a luciferáz szubsztrát hozzáadása az egyes lyukakhoz (például 50 μl), ii. 1 másodperces várakozás, és iii. a luciferáz-aktivitás integrálása 2 másodpercig. Alternatív beállítások használata esetén, például az alkalmazott luminométer-modelltől függően ezeket meg kell indokolni. Ezenfelül fénylő szubsztrát is alkalmazható azzal a feltétellel, hogy a 3. függelék szerinti minőség-ellenőrzési kísérlet teljesül.

Citotoxicitás-vizsgálat

A KeratinoSensTM sejtéletképesség-vizsgálathoz a közeget a 48 órás expozíciós idő elteltével az MTT-t (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5- difenil-tetrazólium-bromid, Tiazolil kék tetrazólium-bromid; CAS-szám: 298-93-1) tartalmazó friss közeggel kell felváltani, és a sejteket 4 órán keresztül 37 °C-on 5 % CO2 jelenlétében inkubálni kell. Az MTT-közeget ezt követően el kell távolítani és a sejteket egy éjszakán át lizálni kell (például az egyes lyukakba adagolt 10 %-os SDS-oldattal). A felrázás után az abszorpciót például 600 nm-en meg kell mérni fotométerrel.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

A KeratinoSensTM vizsgálatban az alábbi paramétereket kell kiszámítani:

1. egyenlet:

ahol:

Lminta

a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó lyukban leolvasott lumineszcencia-érték

Lvakpróba

a sejtek és kezelés nélküli vakpróbalyukban leolvasott lumineszcencia-érték

Loldószer

a sejteket és az oldószeres (negatív) kontrollt tartalmazó lyukakban leolvasott átlagos lumineszcencia-érték

Az EC1,5 értéket a 2. egyenlet szerinti lineáris interpolációval, az általános EC1,5 értéket pedig az egyes ismétlések mértani középértékeként kell kiszámítani.

2. egyenlet:

ahol:

Ca	a μM-ben kifejezett legalacsonyabb koncentráció 1,5-szeres indukciónál magasabb indukció mellett

Cb	a μM-ben kifejezett legmagasabb koncentráció 1,5-szeres indukciónál alacsonyabb indukció mellett

Ia	a 1,5-szeres indukciónál magasabb indukció melletti legalacsonyabb koncentrációnál mért valahányszoros indukció (három párhuzamos lyuk átlaga)

Ib	a 1,5-szeres indukciónál alacsonyabb indukció melletti legmagasabb koncentrációnál mért valahányszoros indukció (három párhuzamos lyuk átlaga)

Az életképességet a 3. egyenlettel kell kiszámítani:

3. egyenlet:

ahol:

Vminta

a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó lyukban leolvasott MTT-abszorbanciaérték

Vvakpróba

a sejtek és kezelés nélküli vakpróbalyukban leolvasott MTT-abszorbanciaérték

Voldószer

a sejteket és az oldószeres (negatív) kontrollt tartalmazó lyukakban leolvasott átlagos MTT-abszorbanciaérték

Az IC50 és az IC30 értéket a 4. egyenlet szerinti lineáris interpolációval, az általános IC50 és IC30 értéket pedig az egyes ismétlések mértani középértékeként kell kiszámítani.

4. egyenlet:

ahol:

X	a kiszámítandó %-os csökkenés az adott koncentrációnál (50, illetve 30 az IC50 és az IC30 esetén)

Ca	a μM-ben kifejezett legalacsonyabb koncentráció x %-ot meghaladó életképesség-csökkenés mellett

Cb	a μM-ben kifejezett legmagasabb koncentráció x %-ot el nem érő életképesség-csökkenés mellett

Va	az x %-ot meghaladó életképesség-csökkenés melletti legalacsonyabb koncentrációnál várható %-os életképesség

Vb	az x %-ot el nem érő életképesség-csökkenés melletti legmagasabb koncentrációnál várható %-os életképesség

A 1,5-szeresnél magasabb luciferáz-aktivitás indukciót mutató koncentrációknál oly módon kell kiszámítani a statisztikai szignifikanciát (például kétvégű Student-féle t-próbával), hogy a három párhuzamos minta lumineszcencia-értékeit össze kell vetni az oldószeres (negatív) kontrollként szolgáló lyukakban leolvasott lumineszcencia-értékekkel annak meghatározásához, hogy a luciferáz-aktivitás indukciója statisztikailag szignifikáns-e (p <0 ,05). A 1,5-szeresnél magasabb luciferáz-aktivitás indukció melletti legalacsonyabb koncentráció az EC1,5 értéket meghatározó érték. Minden esetben ellenőrizni kell, hogy ez az érték az IC30 érték alatt van-e, ami arra utal, hogy az EC1,5 értéket meghatározó koncentráció mellett 30 %-nál kisebb mértékű a sejtéletképesség csökkenése.

Az adatokat ajánlott szemrevételezéssel ellenőrizni grafikonok segítségével. Ha nem figyelhető meg egyértelmű dózis-válasz görbe, vagy ha a kapott dózis-válasz görbe kétfázisú (azaz kétszer lépi túl a másfélszeres küszöbértéket), a kísérletet meg kell ismételni annak ellenőrzése érdekében, hogy ez a vizsgálati vegyi anyagra jellemző-e vagy kísérleti műhibának tulajdonítható-e. Abban az esetben, ha a kétfázisú válasz független kísérletben reprodukálható, az alacsonyabb EC1,5 értéket (a 1,5-szeres küszöbérték első átlépésének időpontjában megfigyelt koncentrációt) kell jelentésbe foglalni.

Azon ritka esetekben, ha 1,5-szeres küszöbérték feletti, statisztikailag nem szignifikáns indukció figyelhető meg, majd statisztikailag szignifikáns indukció magasabb koncentráció mellett, ezen ismétlések eredményei csak akkor minősülnek érvényesnek és pozitívnak, ha a 1,5-szeres küszöbérték feletti statisztikailag nem szignifikáns indukció nem citotoxikus koncentráció esetén következett be.

Végezetül azon vizsgálati vegyi anyagok esetében, amelyek már a 0,98 μM legalacsonyabb vizsgálati koncentrációnál 1,5-szeres vagy magasabb indukciót idéznek elő, a 0,98-nál kisebb EC1,5 értéket a dózis-válasz görbe szemrevételezéses ellenőrzése alapján kell meghatározni.

Elfogadhatósági kritériumok

A KeratinoSensTM vizsgálat alkalmazásakor az alábbi elfogadhatósági kritériumoknak kell teljesülniük. Először is a pozitív kontrollanyaggal, a fahéjaldehiddel elért luciferáz-aktivitás indukciónak a 1,5-szeres küszöbérték felett statisztikailag szignifikánsnak kell lennie (például t-próba alkalmazásával) legalább a vizsgált koncentrációk egyikében (4-64 μM között).

Másodszor, az EC1,5 értéknek a vizsgálatot végző létesítmény történeti átlagát magában foglaló két szórás intervallumában kell lennie (például a validációs adatkészlet alapján 7 μM és 30 μM közötti értéknek), amit rendszeresen frissíteni kell. Ezen túlmenően a fahéjaldehidre vonatkozó három párhuzamosban az átlagos indukciónak 64 μM koncentráció mellett 2 és 8 között kell lennie. Ha az utóbbi kritérium nem teljesül, a fahéjaldehid dózis-válaszát körültekintően kell ellenőrizni, és a vizsgálatok kizárólag akkor elfogadhatóak, ha a luciferáz-aktivitás indukció és a pozitív kontrollanyag koncentrációja együttes növekedése mellett egyértelmű dózis-válasz van.

Végezetül a negatív (oldószeres) DMSO-tartalmú kontroll esetében leolvasott lumineszcencia-értékek átlagos variációs koefficiensének minden ismétlésben (három példányban vizsgált 6 lyukban) 20 %-nál alacsonyabbnak kell lennie. Ha magasabb a variabilitás, az eredményeket el kell vetni.

Az eredmények értelmezése és az előrejelzési modell

A KeratinoSensTM előrejelzés akkor minősül pozitívnak, ha két ismétlésből kettőben vagy három ismétlésből ugyanabban a kettőben mind a négy alábbi feltétel teljesül, egyéb esetben a KeratinoSensTM előrejelzés negatívnak minősül (1. ábra):

Ha egy adott ismétlésen belül az első három feltétel mindegyike teljesül, de nem figyelhető meg egyértelmű dózis-válasz a luciferáz-indukció esetében, akkor ezen ismétlés eredményét nem meggyőzőnek kell tekinteni és további vizsgálatokra lehet szükség (1. ábra). Ezenfelül az 1 000 μM-nál kisebb (vagy a nem meghatározott MW értékű vizsgálati vegyi anyagok esetében 200 μg/ml-nél kisebb) koncentráció mellett kapott negatív eredményt szintén nem meggyőzőnek kell tekinteni (lásd a 11. pontot).

1. ábra

A KeratinoSensTM vizsgálatban alkalmazott előrejelzési modell. A KeratinoSensTM előrejelzést integrált értékelési és vizsgálati megközelítés keretében, valamint a 9. és 11. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni.

Ritka esetekben a citotoxikus szintekhez nagyon közel luciferáz-aktivitást indukáló vizsgálati vegyi anyagok egyes ismétlésekben és nem citotoxikus szinteknél pozitívak lehetnek (azaz az EC1,5 értéket meghatározó koncentráció alacsonyabb, mint (<) az IC30 érték), más ismétlésekben pedig csak a citotoxikus szinteknél (azaz az EC1,5 értéket meghatározó koncentráció magasabb, mint (>) az IC30 érték). Az ilyen vizsgálati vegyi anyagokat szűkebb körű dózis-válasz elemzéssel és alacsonyabb hígítási tényezővel (például 1,33-szoros vagy Ö2 (=1,41)-szeres hígítással a lyukak között) újra meg kell vizsgálni annak meghatározásához, hogy az indukció citotoxikus szinten történt-e vagy sem (9).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálat milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket (29).

Káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) : valamely megcélzott vegyi anyag vagy hasonló vegyi anyagok csoportjának kémiai szerkezetéből kiinduló, a molekuláris kiváltó eseményen keresztül az érintett in vivo eredményig végbemenő eseménysorozat (2).

ARE : antioxidáns válaszelem (más néven: EpRE, elektrofil válaszelem), számos citoprotektív és II. fázisú gén felfelé irányuló promóter régiójában megtalálható válaszelem. Ha Nfr2 aktiválja, e gének transzkripciós indukcióját közvetíti.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Variációs koefficiens : a variabilitás mértékegysége, amelyet a párhuzamos adatcsoportok esetében a szórás és az átlag hányadosaként kell kiszámítani. Százalékos arányként történő kifejezéséhez 100-zal megszorozható.

EC1,5 : 1,5-szeres luciferáz-indukció esetén interpolált koncentráció.

IC30 : a sejtéletképesség 30 %-os csökkenését kiváltó koncentráció.

IC50 : a sejtéletképesség 50 %-os csökkenését kiváltó koncentráció.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Integrált vizsgálati és értékelési megközelítés : valamely vegyi anyag vagy vegyianyag-csoport veszélyeinek azonosításához (potenciál), jellemzéséhez (hatáserősség) és/vagy biztonsági értékeléséhez (potenciál, hatáserősség és expozíció) alkalmazott strukturált megközelítés, amely stratégiai szempontból beépít és mérlegel minden olyan releváns adatot, amely hozzájárul a lehetséges veszélyre és/vagy kockázatra és/vagy a további célirányos és ezért minimális vizsgálat szükségességére vonatkozó szabályozói döntéshozatalhoz.

Imax : a luciferáz-aktivitásnak az oldószeres (negatív) kontrollhoz viszonyított maximális indukciós tényezője, amelyet a vizsgálati vegyi anyag bármely koncentrációjánál mérnek.

Keap1 : Kelch-like ECH-associated protein 1, az Nrf2-aktivitást szabályozó szenzorfehérje. Nem indukált feltételek mellett a Keap1 szenzorfehérje az Nrf2 transzkripciós faktort célozza meg a proteaszómán belüli ubikvitináció és fehérjebomlás céljából. A Keap1 reaktív ciszteinmaradékainak kis molekulákkal végbemenő kovalens módosítása az Nrf2 transzkripciós faktornak a Keap1 szenzorfehérjétől való szétválásához vezethet (8) (10) (11).

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (1).

Egy összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben az egyik fő összetevő legalább 80 tömegszázalékban van jelen.

Több összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben egynél több fő összetevő legalább 10 tömegszázalékban, de 80 tömegszázalékot nem meghaladó koncentrációban van jelen. A több összetevőből álló anyag gyártási folyamat eredménye. A keverék és a több összetevőből álló anyag között az a különbség, hogy a keverék két vagy több anyag összekeverésével, kémiai reakció nélkül jön létre. A több összetevőből álló anyag kémiai reakció eredménye.

Nrf2 : Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, az antioxidáns válaszelem útvonalában érintett transzkripciós faktor. Ha az Nrf2-ben nem megy végbe ubikvitináció, felépíti a citoplazmát és transzlokálódik a sejtmagba, ahol számos citoprotektív gén felfelé tartó promóter régiójában kapcsolódik az ARE válaszelemhez, elindítva e gének transzkripcióját (8) (10) (11).

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Relevancia : a vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (29).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik (29).

Reprodukálhatóság : ugyanazon vegyi anyag ugyanazon vizsgálati protokollal végzett vizsgálata során kapott eredmények egyezése (lásd: megbízhatóság) (29).

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálati módszer helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (29).

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : valamely vizsgálati rendszernek a vizsgálati vegyi anyagon kívüli összes összetevőjét tartalmazó párhuzamos, amely azonban magában foglalja az alkalmazott oldószert. Az ugyanabban az oldószerben feloldott vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták esetében a kiindulási érték létrehozásához használatos.

Specifikusság : a vizsgálati módszerrel helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (29).

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (1).

Vizsgálati vegyi anyag : a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező anyagra való hivatkozáshoz használatos.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (1).

UVCB : Ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagok.

Érvényes vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amely kellően relevánsnak és megbízhatónak minősül egy adott célra, és amely tudományosan megalapozott elveken alapul. Egy-egy vizsgálati módszer abszolút értelemben soha nem érvényes, kizárólag meghatározott céllal összefüggésben az (29).

---

2. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK

In vitro bőrszenzibilizáció: ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak igazolniuk kell szakmai jártasságukat oly módon, hogy az 1. táblázatban javasolt 10 jártassági tesztanyagra vonatkozóan a KeratinoSens™ vizsgálattal várható előrejelzést helyesen kapják meg, továbbá a 10 jártassági tesztanyag közül 8 esetében a referenciatartományba eső EC1,5 és IC50 értékeket kapják meg. E jártassági tesztanyagok kiválasztása oly módon történt, hogy az a bőrszenzibilizáció veszélye esetén bekövetkező különféle válaszreakciók tartományát illetően reprezentatív legyen. További kiválasztási kritérium volt, hogy a jártassági tesztanyagok kereskedelmi forgalomban kaphatóak legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok és a KeratinoSensTM vizsgálatból származó, kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre.

---

3. függelék

A LUMINESZCENCIA-MÉRÉSEK MINŐSÉG-ELLENŐRZÉSE

A KeratinoSensTM vizsgálat során optimális lumineszcencia-mérések biztosításához kapcsolódó alapkísérlet

Ahhoz, hogy a luminométerrel megbízható eredmények szülessenek, az alábbi három paraméter kritikus jelentőségű:

A vizsgálat előtt a kontroll-lemez alábbiakban ismertetett beállítás melletti vizsgálatával (hármas elemzéssel) ajánlott meggyőződni a lumineszcencia-mérések megfelelőségéről.

A lemez beállítása az első kísérlethez

EGDMA = etilén-glikol-dimetakrilát (CAS-szám: 97-90-5), erős indukciót kiváltó vegyi anyag

CA = fahéjaldehid, pozitív referenciaanyag (CAS-szám: 104-55-2)

A minőségellenőrzés céljából végzett elemzésnek a következőket kell bebizonyítania:

B.61.    Fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálat a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítására

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 460. vizsgálati iránymutatásában (2012) leírt módszerrel. A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer bizonyos körülmények között és konkrét korlátok mellett alkalmazható a vegyi anyagok (anyagok és keverékek) szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozóként történő besorolására, amely kategóriákat a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszere (GHS) (1. kategória), az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendelet ( 12 ) (CLP-rendelet) (1. kategória), valamint az USA Környezetvédelmi Ügynöksége (EPA) (I. kategória) határozta meg (1) (2). E vizsgálati módszer alkalmazásában a súlyos szemirritációt okozó anyagok olyan vegyi anyagok, amelyek a vizsgálati vegyi anyag beadását követően 21 napon belül vissza nem fordítható szövetkárosodást okoznak a szemben, vagy amelyek a látás súlyos fizikai romlását okozzák, míg a szemkorróziót okozó anyagok olyan vegyi anyagok, amelyek visszafordíthatatlan szövetkárosodást okoznak a szemben. E vegyi anyagok az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába, a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába vagy az US EPA szerinti I. kategóriába sorolt vegyi anyagok.

Míg a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer nem tekintendő érvényesnek a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot teljes egészében helyettesítő vizsgálatként, a szabályozói követelmények szerinti osztályozásra és címkézésre szolgáló, többszintű vizsgálati stratégia részeként ajánlott. Ezért a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer a szemkorróziót/súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítására szolgáló, felülről építkező megközelítés első lépéseként ajánlott, kifejezetten bizonyos vegyianyag-típusok (azaz vízoldékony anyagok és keverékek) esetén (3) (4).

Jelenleg általánosan elfogadott, hogy az előrelátható jövőben egyetlen in vitro szemirritációs vizsgálat sem tudja majd helyettesíteni az in vivo szemvizsgálatot (B.5. vizsgálati módszer, (5)) a különböző kémiai osztályok okozta irritációk teljes körének előrejelzéséhez. Előfordulhat azonban, hogy egy adott (többszintű) vizsgálati stratégián belüli több alternatív vizsgálati módszer stratégiai kombinációi helyettesíteni tudják az in vivo szemvizsgálatot (4). A felülről építkező megközelítés (4) akkor alkalmazandó, amikor a rendelkezésre álló információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan rendkívül irritatív potenciállal rendelkezik.

A 35. pontban részletezett előrejelzési modell alapján a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer korlátozott alkalmazási területen belül további vizsgálat nélkül azonosíthat vegyi anyagokat szemkorróziót/súlyos szemirritációt okozóként (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként, a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozóként, az US EPA szerinti I. kategóriába tartozóként). Ugyanez feltételezhető a keverékek esetében, bár azokra nem terjedt ki a validálás. Ezért a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer a B.5. vizsgálati módszer (5) lépcsőzetes vizsgálati stratégiája alapján alkalmazható a vegyi anyagok szemirritációs/szemkorróziós hatásának meghatározásához. A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszerrel nem szemkorróziót okozóként vagy súlyos szemirritációt okozóként előrejelzett vegyi anyagokat azonban legalább egy olyan további (in vitro és/vagy in vivo) vizsgálati módszerrel meg kell vizsgálni, amelyek képesek pontosan azonosítani i. a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálatban in vitro hamis negatív szemkorróziót/súlyos szemirritációt okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába, a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába és az US EPA szerinti I. kategóriába tartozó) vegyi anyagokat; ii. a szemkorrózió/szemirritáció tekintetében be nem sorolt (az ENSZ-GHS szerinti nem besorolt, a CLP-rendelet szerinti nem besorolt és az US EPA szerinti IV. kategóriába tartozó) vegyi anyagokat; és/vagy iii. a mérsékelten/enyhén szemirritáló (az ENSZ-GHS szerinti 2A. és 2B. kategóriába, a CLP-rendelet szerinti 2. kategóriába és az US EPA szerinti II. és III. kategóriába tartozó) vegyi anyagokat.

E vizsgálati módszer célja a vizsgálati vegyi anyag szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó esetleges hatásának értékelésére alkalmazott eljárások ismertetése annak alapján, hogy az anyag képes-e károsodást előidézni impermeábilis, konfluens felhám-monolayerben. A transzepitheliális permeabilitás integritása a például kötőhártyában és a szaruhártyában megtalálható felhám egyik fő funkciója. A transzepitheliális permeabilitást különféle tight junctionok szabályozzák. Kiderült, hogy a szaruhártyafelhám permeabilitásának in vivo körülmények közötti növekedése korrelál a szemirritáció kialakulása során megfigyelt gyulladás és szemfelszín-károsodás mértékével.

A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszerben a vizsgálati vegyi anyaggal való rövid expozíciós időt követően fellépő toxikus hatásokat a permeábilis inzerteken tenyésztett Madin-Darby kutyavese (MDCK) sejtek felhám-monolayerében áthatoló fluoreszcein-nátrium permeabilitásának növekedésével mérik. A bekövetkező fluoreszcein-szivárgás mennyisége arányos a vegyi anyag által a tight junctionokban, a dezmoszómákban és a sejtmembránokban előidézett károsodással, és felhasználható a vizsgálati vegyi anyag által a szemre kifejtett esetleges toxicitás becsléséhez. Az 1. függelékben található egy diagram a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszerhez inzert membránján tenyésztett MDCK-sejtekről.

A fogalommeghatározások a 2. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Ez a vizsgálati módszer a 71. sz. INVITTOX-protokollon (6) alapul, amelynek értékelésére az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központ (ECVAM), valamint az USA alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottsága (ICCVAM) és az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Japán Központ (JaCVAM) együttműködése keretében végzett nemzetközi validálási vizsgálatban került sor.

A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer nem ajánlott enyhén/mérsékelten irritálóként besorolandó vegyi anyagok, illetve a szemirritáció tekintetében be nem sorolandó (azaz az ENSZ-GHS szerinti 2A., 2B. kategóriába tartozó, nem besorolt, a CLP-rendelet szerinti 2. kategóriába tartozó, nem besorolt, az US EPA szerinti II., III. és IV. kategóriába tartozó) vegyi anyagok (anyagok és keverékek) azonosítására, ahogyan azt a validálási vizsgálat demonstrálta (3) (7).

A vizsgálati módszer kizárólag a vízoldékony vegyi anyagokra (anyagokra és keverékekre) alkalmazandó. A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer általában pontosan előrejelzi a vízoldékony vegyi anyagok és/vagy azon vegyi anyagok súlyos szemirritációs potenciálját, amelyeknek a toxikus hatását nem érinti a hígítás (7). Ahhoz, hogy egy vegyi anyagot kísérleti körülmények között vízoldékonyként soroljanak be, steril, (1,0–1,8 mM koncentrációban) kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBBS-oldat) oldhatónak kell lennie ≥ 250 mg/ml (a 100 mg/ml határértéket egy dózissal meghaladó) koncentráció mellett. Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag a 100 mg/ml koncentrációnál alacsonyabb koncentrációnál oldható, de már e koncentrációnál 20 % fluoreszcein-szivárgást idéz elő (azaz FL20 < 100 mg/ml), még mindig besorolható a GHS szerinti 1. vagy az EPA szerinti I. kategóriába.

E vizsgálati módszer meghatározott korlátai kizárják az alkalmazási körből az erős savakat és bázisokat, a sejtfixáló anyagokat, valamint a rendkívül illékony vegyi anyagokat. E vegyi anyagoknak a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszerrel nem mért mechanizmusai vannak, ilyen például a kiterjedt koaguláció, a szappanosodás vagy a speciális kémiai reakciók. E vizsgálati módszer más meghatározott korlátai a színes és viszkózus vizsgálati vegyi anyagok esetén érvényes prediktív képességre vonatkozó eredményeken alapulnak (7). A módszerben javasolt, hogy mivel mindkét említett vegyianyag-típus nehezen eltávolítható a monolayerből a rövid expozíciós idő után, a vizsgálati módszer prediktivitása több mosási szakasz alkalmazásával javítható. A folyadékban szuszpendált szilárd vegyi anyagok hajlamosak kicsapódni, és előfordulhat, hogy a sejteket érő végső koncentráció nehezen határozható meg. Ha az említett kémiai és fizikai osztályokba tartozó anyagokat kizárják az adatbázisból, akkor a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálat pontossága az EU, az EPA és a GHS osztályozási rendszerében egyaránt jelentősen javul (7).

E vizsgálati módszer célját (azaz kizárólag a szemkorróziót, illetve a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása) figyelembe véve a hamis negatív arányok (lásd a 13. pontot) jelentősége nem kritikus, hiszen az érintett vegyi anyagokat a szabályozói követelményektől függően – az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés (5) keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával – később más, megfelelően validált in vitro vizsgálatokkal vagy nyulakon végzett vizsgálatokkal is megvizsgálják (lásd még a 3. és a 4. pontot).

A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer más, meghatározott korlátai a hamisnegatív- és hamis pozitív arányokon alapulnak. Ha felülről építkező megközelítés első lépéseként használták a szemkorróziót/súlyos szemirritációt okozó, vízoldékony anyagok és keverékek (azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába, a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába, az US EPA szerinti I. kategóriába tartozó anyagok és keverékek) azonosítására, a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer hamis pozitív aránya in vivo eredményekkel összevetve 7 % (7/103; ENSZ-GHS és CLP-rendelet) és 9 % (9/99; US EPA) közé esett, hamis negatív aránya pedig in vivo eredményekkel összevetve 54 % (15/28; US EPA) és 56 % (27/48; ENSZ-GHS és CLP-rendelet) közé esett. A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszerben hamis pozitív és/vagy hamis negatív eredményeket mutató vegyianyag-csoportok itt nincsenek meghatározva.

Bizonyos technikai korlátok az MDCK-sejttenyészetre jellemzőek. A fluoreszcein-nátrium festéknek a monolayeren történő áthaladását blokkoló tight junctionokat a sejtpasszálások számának növekedése egyre inkább veszélyezteti. A tight junctionok hiányos kialakulása következében egyre több fluoreszcein-szivárgás történik a nem kezelt kontrollokban. Ezért fontos a nem kezelt kontrollokban megengedhető maximális szivárgás meghatározása (lásd a 38. pontot: 0 % szivárgás). Az összes in vitro vizsgálathoz hasonlóan előfordulhat, hogy a sejtek idővel átalakulnak, ezért elengedhetetlen, hogy a vizsgálatokhoz közöljék a passzálások számának tartományát.

A jelenlegi alkalmazási terület egyes esetekben bővíthető, de csak a tanulmányozott vizsgálati vegyi anyagok kiterjesztett – lehetőleg vizsgálatokkal előállított – adatkészletének elemzését követően (3). Ez a vizsgálati módszer ennek megfelelően frissítés tárgyát fogja képezni az új információk és adatok figyelembevételekor.

Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot először alkalmazza, a 3. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségéről. Mielőtt a laboratórium a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálat adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi osztályozás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer végrehajtásában való szakmai jártasságát.

A VIZSGÁLAT ELVE

A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer féligáteresztő inzerteken tenyésztett MDCK CB997 sejtvonalhoz tartozó cső alakú felhámsejtek konfluens monolayerében végzett citotoxicitás- és sejtfunkció-alapú in vitro vizsgálat, amely sejtek az in vivo szaruhártya-felhám nem proliferáló állapotát modellezik. Az MDCK sejtvonal jól bevált sejtvonal, amely a kötőhártya- és a szaruhártya-felhám apikális oldalán megtalálható tight junctionokhoz és dezmoszómákhoz hasonló tight junctionokat és dezmoszómákat alkot. A tight junctionok és a dezmoszómák in vivo körülmények között megakadályozzák, hogy oldott anyagok és idegen anyagok hatoljanak a szaruhártya-felhámba. A károsodott tight junctionok és dezmoszómák miatt megszűnő transzepitheliális impermeabilitás a vegyi anyag által előidézett szemirritáció egyik korai eseménye.

A vizsgálati vegyi anyagot az inzert apikális oldalán tenyésztett sejtek konfluens rétegére kell felvinni. Rövid, 1 perces expozíciót kell rutinszerűen alkalmazni a humán expozíció során adódó normál kiürülési arány visszaadása érdekében. A rövid expozíciós idő egyik előnye, hogy a víz alapú anyagok és keverékek tisztán vizsgálhatók, ha az expozíciós idő után könnyen eltávolíthatók. Ez lehetővé teszi az eredmények közvetlenebb összehasonlítását a vegyi anyagok emberekre gyakorolt hatásaival. A vizsgálati vegyi anyagot ezt követően el kell távolítani, és a nem toxikus, rendkívül fluoreszcens fluoreszcein-nátrium festéket 30 percre a monolayer apikális oldalán kell hatni hagyni. A vizsgálati vegyi anyag által a tight junctionokban okozott károsodást a sejtrétegen meghatározott időn belül átszivárgó fluoreszcein mennyiségével kell meghatározni.

A monolayeren és az inzert membránján keresztül a lyukban lévő oldat meghatározott térfogatába átkerülő fluoreszcein-nátrium festéket (a fluoreszcein-nátrium festék a lyukba szivárog) a lyukban lévő fluoreszcein-koncentráció spektrofluorométerrel végzett mérésével kell meghatározni. A fluoreszcein-szivárgás (FL) mennyiségét két kontrollon – egy vakpróba-kontrollon és a maximális szivárgást képviselő kontrollon – leolvasott fluoreszcein-intenzitás (FI) értékére hivatkozva kell kiszámítani. A szivárgás százalékos arányát és ennélfogva a tight junctionok károsodásának mértékét e kontrollokhoz viszonyítva kell kifejezni, a vizsgálati vegyi anyag mindegyik meghatározott koncentrációja esetében. Ezt követően ki kell számítani az FL20 értéket (azaz azt a koncentrációt, amely a nem kezelt konfluens monolayernél és a sejtek nélküli inzerteknél rögzített értékhez viszonyítva 20 % fluoreszcein-szivárgást okoz). Az FL20 (mg/ml) érték a szemkorróziót okozó és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosításához tartozó előrejelzési modellben használatos (lásd a 35. pontot).

A visszanyerés a vizsgálati vegyi anyag toxicitási profiljának fontos része, amelyet az in vivo szemirritációs vizsgálat szintén értékel. Előzetes elemzések azt jelezték, hogy a visszanyerésre vonatkozó adatok (a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciót követő legfeljebb 72 óráig) fokozhatják a 71. sz. INVITTOX-protokoll prediktív értékét, azonban további értékelésre van szükség, és ahhoz – lehetőleg további vizsgálatokkal előállított – további adatok kellenek (6). Ez a vizsgálati módszer ennek megfelelően frissítés tárgyát fogja képezni az új információk és adatok figyelembevételekor.

ELJÁRÁS

A monolayer sejttenyészet elkészítése

Az MDCK CB997 sejtvonalhoz tartozó sejtekből álló monolayer sejttenyészetet sejttenyésztő lombikban Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápfolyadékban (DMEM) és F12-es tápanyagkeverékben (L-glutaminnal, 15 mM HEPES pufferrel, 1,0–1,8 mM koncentrációjú kalciummal és 10 %-os, melegen deaktivált FCS/FBS szérummal előállított 1-szeres koncentrátumban) fejlődő szubkonfluens sejtek felhasználásával kell elkészíteni. Fontos, hogy a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálat során alkalmazott valamennyi közegnek/oldatnak a tight junctionok kialakulásának és épségének biztosítása érdekében 1,0 mM (111 mg/l) és 1,8 mM (200 mg/l) közötti koncentrációban kalciumot kell tartalmaznia. A tight junctionok egyenletes és reprodukálható kialakulásának biztosítása érdekében ellenőrizni kell a sejtpasszálások számának tartományát. A sejteknek a felolvasztástól számítva 3–30 közötti passzálási tartományban kell lenniük, mivel az e passzálási tartományon belüli sejtek hasonló funkciójúak, ami elősegíti, hogy a vizsgálati eredmények reprodukálhatóak legyenek.

A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer végrehajtása előtt a sejteket tripszines emésztéssel le kell választani a lombikról, centrifugálni kell, és megfelelő mennyiségű sejtet le kell oltani a 24-lyukú lemezekre helyezett inzertekbe (lásd az 1. függeléket). A sejtek leoltásához 80–150 μm vastagságú és 0,45 μm méretű pórusokkal rendelkező, vegyes cellulóz-észterekből álló membránokkal ellátott, 12 mm átmérőjű inzerteket kell használni. A validálási vizsgálatban Millicell-HA típusú, 12 mm-es inzerteket használtak. Az inzert- és a membrántípus tulajdonságai fontosak, mivel befolyásolhatják a sejtnövekedést és a kémiai kötést. Egyes vegyianyag-típusok a Millicell-HA típusú inzert membránjához kötődhetnek, ami befolyásolhatja az eredmények értelmezését. Más membránok használata esetén jártassági tesztanyagokat (lásd a 3. függeléket) kell használni az egyenértékűség igazolására.

Az inzert membránjához kapcsolódó kémiai kötés gyakoribb a töltéssel rendelkező membránhoz vonzódó kationos vegyi anyagok, például a benzalkónium-klorid esetében (7). Az inzert membránjához kapcsolódó kémiai kötés növelheti a vegyi anyag expozíciós idejét, ami a vegyi anyag toxikus potenciáljának túlbecsléséhez vezet, ugyanakkor fizikailag is csökkentheti az inzerten keresztüli fluoreszcein-szivárgást azáltal, hogy az inzert membránjához kötődő kationos vegyi anyaghoz köti a festéket, ami a vegyi anyag toxikus potenciáljának alulbecsléséhez vezet. Ez könnyen nyomon követhető oly módon, hogy kizárólag a membránt teszik ki a vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációjának, és ezt követően a fluoreszcein-nátrium festéket normál koncentráció mellett, standard ideig (sejtkontroll nélkül) kell hozzáadni. Ha a fluoreszcein-nátrium festék kötése bekövetkezik, az inzert membránja a vizsgálati vegyi anyag lemosását követően megsárgul. Ezért ahhoz, hogy értelmezni lehessen a vizsgálati vegyi anyag sejtekre kifejtett hatását, a kötési tulajdonságainak ismerete elengedhetetlen.

A sejtek inzertekre történő leoltásának konfluens monolayert kell létrehozniuk a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció időpontjában. Inzertenként 1,6 × 105 sejtet (400 μl, 4 × 105 sejt/ml sűrűségű sejtszuszpenziót) kell adagolni. E körülmények között 96 órás tenyésztést követően általában konfluens monolayer jön létre. A leoltás előtt az inzerteket szemrevételezéssel kell ellenőrizni, hogy meggyőződjenek arról, hogy a 30. pontban leírt szemrevételezéses ellenőrzéskor rögzített esetleges károsodások a kezelésnek tudhatók be.

Az MDCK sejttenyészeteket párás légkörben, 5 % ± 1 % CO2-koncentráció mellett és 37 ± 1 °C-on, inkubátorban kell tartani. A sejteknek baktérium-, vírus-, mikoplazma- és gombafertőzéstől mentesnek kell lenniük.

A vizsgálati és a kontrollként szolgáló vegyi anyagok alkalmazása

Minden egyes kísérletmenethez a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó friss törzsoldatot kell készíteni, és azt az elkészítéstől számított 30 percen belül fel kell használni. A szérum-fehérjekötés elkerülése érdekében a vizsgálati vegyi anyagokat (1,0–1,8 mM koncentrációban) kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes HBBS-oldatban kell előkészíteni. A vizsgálati vegyi anyag 250 mg/ml koncentráció melletti, HBBS-oldatban való oldhatóságát a vizsgálat előtt fel kell mérni. Ha a vizsgálati vegyi anyag e koncentráció mellett 30 perc alatt stabil szuszpenziót vagy emulziót alkot (azaz megőrzi egységességét és nem ülepedik le, vagy nem válik szét egynél több fázissá), a HBBS-oldat továbbra is használható oldószerként. Ha azonban megállapítást nyer, hogy a vegyi anyag HBBS-oldatban oldhatatlan e koncentráció mellett, mérlegelni kell a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszertől eltérő vizsgálati módszerek alkalmazását. Olyan esetekben, ha megállapítást nyer, hogy a vegyi anyag HBBS-oldatban oldhatatlan, körültekintően kell mérlegelni a könnyű ásványolaj oldószerként történő alkalmazását, mivel nem áll rendelkezésre elegendő adat annak megállapításához, hogy a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálat ilyen körülmények között hogyan teljesít.

Az összes vizsgálandó vegyi anyagot a törzsoldatból, steril, (1,0–1,8 mM koncentrációban) kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes HBBS-oldatban kell előkészíteni öt, előre meghatározott koncentrációban: tömeg per térfogat alapján hígítva (1,25, 100, 250 mg/ml), továbbá egy tiszta vagy telített oldat formájában. Szilárd vegyi anyag vizsgálatakor egy nagyon magas, 750 mg/ml koncentrációt is alkalmazni kell. A vegyi anyag e koncentrációját esetlegesen finnpipettával kell a sejtekre felvinni. Ha a toxicitás 25 és 100 mg/ml közötti koncentráció mellett állapítható meg, az következőkben felsorolt, további koncentrációkat kell kétszer megvizsgálni: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml. Az FL20 értéket e koncentrációkból kell levezetni, amennyiben az elfogadhatósági kritériumok teljesülnek.

A vizsgálati vegyi anyagokat konfluens monolayerekre kell felvinni a sejttenyésztő közeg eltávolítását és a steril, meleg (37 °C-os), (1,0–1,8 mM koncentrációban) kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes HBBS-oldatban történt kétszeri mosást követően. Ezt megelőzően a szűrőket szemrevételezéssel ellenőrizni kell abból a szempontból, hogy előfordulnak-e rajtuk olyan korábbi rongálódások, amelyeket tévesen tulajdoníthatnának a vizsgálati vegyi anyagokkal való esetleges összeegyeztethetetlenségnek. A vizsgálati vegyi anyag minden egyes koncentrációjához és a kontrollanyagokhoz minden egyes vizsgálatmenetben legalább három párhuzamost kell használni. 1 percig tartó, szobahőmérsékleten végzett expozíciót követően a vizsgálati vegyi anyagot felszívással óvatosan el kell távolítani, a monolayert kétszer át kell mosni steril, meleg (37 °C-os), (1,0–1,8 mM koncentrációban) kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes HBBS-oldattal és a fluoreszcein-szivárgást azonnal meg kell mérni.

A párhuzamos negatív kontrollokat és a párhuzamos pozitív kontrollokat minden egyes vizsgálatmenetben annak bizonyítására kell felhasználni, hogy a sejtek monolayeren belüli integritása (negatív kontrollok) és érzékenysége (pozitív kontrollok) egy meghatározott történeti elfogadhatósági tartományba esik. A pozitív kontrollként javasolt vegyi anyag a 100 mg/ml koncentrációban alkalmazott Brij 35 (CAS-szám: 9002-92-0). E koncentrációnak kb. 30 % fluoreszcein-szivárgást kell biztosítania (a fluoreszcein-szivárgás, azaz a sejtréteg-károsodás elfogadott tartománya: 20–40 %). A negatív kontrollként javasolt vegyi anyag az (1,0–1,8 mM koncentrációban) kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes HBBS-oldat (nem kezelt, vakpróba-kontroll). A FL20 értékek kiszámíthatósága érdekében a maximális szivárgást képviselő kontrollt is alkalmazni kell minden egyes vizsgálatmenetben. A maximális szivárgást sejteket nem tartalmazó kontrollinzert felhasználásával kell meghatározni.

A fluoreszcein-permeabilitás meghatározása

Közvetlenül a vizsgálati és a kontrollként szolgáló vegyi anyagok eltávolítását követően 400 μl térfogatú, 0,1 mg/ml koncentrációjú fluoreszcein-nátrium oldatot (0,01 vegyesszázalékos, [1,0–1,8mM koncentrációban] kalciumot tartalmazó, fenolvörösmentes HBBS-oldatban) kell a (például Millicell-HA típusú) inzertekhez adni. A tenyészeteket 30 percig szobahőmérsékleten kell tartani. A fluoreszceinnel végzett inkubálás végén az inzerteket óvatosan el kell távolítani az egyes lyukakból. Minden szűrőn szemrevételezéses ellenőrzést kell végezni, és a kezelés során esetlegesen bekövetkezett károsodásokat rögzíteni kell.

A monolayeren és az inzerten átszivárgott fluoreszcein mennyiségét számszerűsíteni kell az inzertek eltávolítását követően a lyukakban maradt oldatban. A méréseket 485 nm-es gerjesztési hullámhossznál, illetve 530 nm-es kibocsátási hullámhossznál kell elvégezni. A spektrofluorométer érzékenységét úgy kell beállítani, hogy a maximális fluoreszcein-szivárgás (a sejteket nem tartalmazó inzertnél) és a minimális fluoreszcein-szivárgás (negatív kontrollal kezelt konfluens monolayert tartalmazó inzertnél) közötti számszerű eltérés a lehető legmagasabb legyen. A használt spektrofluorométer eltérései miatt olyan érzékenység alkalmazása javasolt, amely a maximális fluoreszcei-szivárgást képviselő kontrollnál 4 000 -nél magasabb fluoreszcencia-intenzitást ad. A fluoreszcein-szivárgás maximális értéke nem haladhatja meg a 9 999 -et. A fluoreszcein-szivárgás maximális intenzitásának a használt spektrofluorométer lineáris tartományába kell esnie.

Az eredmények értelmezése és az előrejelzési modell

A fluoreszcein-szivárgás mennyiségének arányosnak kell lennie a tight junctionok vegyi anyag által előidézett károsodásával. A vegyi anyag minden vizsgált koncentrációja esetén a fluoreszcein-szivárgás százalékos arányát a vizsgálati vegyi anyagnak a negatív kontroll (a negatív kontrollal kezelt sejtek konfluens monolayerében leolvasott érték) alapján és a maximális szivárgást képviselő kontroll (a sejteket nem tartalmazó inzerten keresztüli fluoreszcein-szivárgás leolvasott értéke) alapján adódó FL-értékekre hivatkozással kapott FL-értékeiből kell kiszámítani

A maximális szivárgás fluoreszcencia-intenzitásának átlaga = x

A 0 %-os szivárgás fluoreszcencia-intenzitásának átlaga = y

A 100 %-os szivárgás átlagát a 0 %-os szivárgás átlagának a maximális szivárgás átlagából való kivonásával kell kiszámítani,

azaz x – y = z

Az egyes rögzített dózisok százalékos szivárgását oly módon kell kiszámítani, hogy a 0 %-os szivárgást ki kell vonni a három párhuzamos leolvasás (m) fluoreszcencia-intenzitása átlagából, és a kapott értéket el kell osztani a 100 %-os szivárgással, azaz %FL = [(m-y) / z] × 100 %, ahol:

m

=

az érintett koncentrációra vonatkozó három párhuzamos mérés fluoreszcencia-intenzitásának átlaga

% FL

=

a sejtrétegen átszivárgó fluoreszcein százalékos aránya

A 20 % fluoreszcein-szivárgást okozó vegyianyag-koncentráció kiszámítására szolgáló alábbi egyenletet kell alkalmazni:

FLD = [(A-B) / (C-B)] × (MC –MB) + MB

ahol:

D

=

a gátlás %-os aránya

A

=

a károsodás %-os aránya (20 % fluoreszcein-szivárgás)

B

=

a fluoreszcein-szivárgás %-os aránya < A

C

=

a fluoreszcein-szivárgás %-os aránya > A

MC

=

C koncentrációja (mg/ml-ben)

MB

=

B koncentrációja (mg/ml-ben)

Az alábbiakban szerepel az az FL20 határérték, amelynek segítéségével előrejelezhető a vegyi anyagok szemkorróziót/súlyos szemirritációt okozókénti besorolása:

A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer csak a vízoldékony, szemkorróziót okozó és súlyos szemirritációt okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába, a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába, az US EPA szerinti I. kategóriába tartozó) anyagok azonosításához ajánlott (lásd az 1. és a 10. pontot).

Ahhoz, hogy a vízoldékony vegyi anyagokat (anyagokat és keverékeket (3) (6) (7) »súlyos szemkárosodást okozóként« (az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozóként) vagy »szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozóként« (az US EPA szerinti I. kategóriába tartozóként) azonosítsanak, a vizsgálati vegyi anyag FL20 értéke legfeljebb 100 mg/ml lehet.

Az eredmények elfogadása

A maximális fluoreszcein-szivárgás átlagának (x) nagyobbnak kell lennie 4 000 -nél (lásd a 31. pontot), a 0 %-os szivárgás átlaga (y) legfeljebb 300 lehet, a 100 %-os szivárgás átlagának (z) pedig 3 700 és 6 000 közé kell esnie.

Egy-egy vizsgálat akkor minősül elfogadhatónak, ha a pozitív kontroll 20–40 %-os károsodást okozott a sejtrétegben (melynek mérésére a %-os fluoreszcein-szivárgás szolgál).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Adatok

Az egyes vizsgálatmenetek esetében az egyes párhuzamos lyukakból származó adatokat (például minden vizsgálati vegyi anyag esetében a fluoreszcencia-intenzitás értékeit és a fluoreszcencia-szivárgás kiszámított százalékos adatait, beleértve a besorolást is) táblázatos formában kell jelentésbe foglalni. Ezen túlmenően az egyes párhuzamos mérések átlagait ± szórását minden egyes vizsgálatmenetben jelentésbe kell foglalni.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

A FLUORESZCEIN-SZIVÁRGÁSON ALAPULÓ VIZSGÁLATI MÓDSZERHEZ INZERT MEMBRÁNJÁN TENYÉSZTETT MDCK SEJTEKET ÁBRÁZOLÓ DIAGRAM

MDCK sejtek konfluens rétegét egy inzert féligáteresztő membránján kell tenyészteni. Az inzerteket 24-lyukú lemezek lyukaiba kell helyezni.

Ábra forrása: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, UK.

---

2. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálati módszer milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

EPA szerinti I. Kategória : 21 napnál hosszabb ideig fennálló szemkorróziót (a szem szöveteiben visszafordíthatatlan pusztulást) vagy szaruhártya-elváltozást vagy -irritációt okozó vegyi anyag (2).

CLP-rendelet (az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EU rendelet) : a vegyi anyagok (anyagok és keverékek) osztályozásának az ENSZ által kidolgozott globálisan harmonizált rendszerét (GHS) az Európai Unióban (EU) végrehajtó rendelet.

Hamis negatív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen negatívnak minősített pozitív vegyi anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Hamis pozitív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozitívnak minősített negatív vegyi anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

FL20 : azon koncentráció meghatározásával becsülhető meg, amelynél a vizsgálati vegyi anyag a sejtrétegen keresztül 20 %-os fluoreszcein-szivárgást okoz.

Fluoreszcein-szivárgás : a sejtrétegen átjutó fluoreszcein spektrofluorométerrel mért mennyisége.

GHS (a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az ENSZ által globálisan harmonizált rendszere) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását.

GHS szerinti 1. kategória : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem külső felületére való juttatását követően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos fizikai romlása, amely a beadást követően 21 napon belül nem fordítható vissza teljes mértékben.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Keverék : az ENSZ-GHS összefüggésében olyan, két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben ezek az anyagok nem lépnek egymással reakcióba.

Negatív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó kezeletlen replikátum. Ezt a mintát a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni annak megállapításához, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Nem besorolt : az ENSZ-GHS szerinti 1., 2A. vagy 2B., a CLP-rendelet szerinti 1. vagy 2., vagy az US EPA szerinti I., II. vagy III. kategóriába szemirritációt okozóként nem besorolt vegyi anyagok.

Szemkorróziót okozó anyag : a) a szemben visszafordíthatatlan szövetkárosodást okozó vegyi anyag; b) az ENSZ-GHS szerinti 1., a CLP-rendelet szerinti 1., vagy az US EPA szerinti I. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag.

Szemirritációt okozó anyag : a) olyan vegyi anyag, amelynek a szem külső felületére való felvitele visszafordítható elváltozást okoz; b) az ENSZ-GHS szerinti 2A. vagy 2B., a CLP-rendelet szerinti 2., vagy az US EPA szerinti II. vagy III. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag.

Súlyos szemirritációt okozó anyag : a) olyan vegyi anyag, amelynek a szem külső felületére való felvitele a beadást követően 21 napon belül vissza nem fordítható szövetkárosodást vagy a látás súlyos fizikai romlását okozza; b) az ENSZ-GHS szerinti 1., a CLP-rendelet szerinti 1., vagy az US EPA szerinti I. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó vegyi anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Jártassági tesztanyagok : a referencia-vegyianyagok jegyzékén belüli alcsoport, amelyet a tapasztalattal nem rendelkező laboratóriumok a validált referencia-vizsgálatimódszerben való jártasságuk igazolására használhatnak fel.

Relevancia : a vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (8).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik.

Helyettesítő vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek célja, hogy a veszélyek azonosítására és/vagy kockázatértékelésre rutinszerűen alkalmazott és elfogadott vizsgálatot helyettesítse, és amelyről megállapították, hogy az elfogadott vizsgálattal összehasonlítva, az összes lehetséges vizsgálati helyzetben és vegyi anyag esetében a humán vagy állati egészség egyenértékű vagy jobb védelmét biztosítja.

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálat helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (8).

Súlyos szemkárosodás : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem külső felületére való juttatását követően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos fizikai romlása, amely a beadást követően 21 napon belül nem fordítható vissza teljes mértékben.

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó nem kezelt minta, amelyet a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni az ugyanazon oldószerben feloldott vagy ugyanazon vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékeinek megállapítása érdekében. Párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálata esetén ez a minta azt is bizonyítja, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Specifikusság : a vizsgálat elvégzésével helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében.

Anyag : az ENSZ-GHS összefüggésében használt fogalom a természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemekre és azok vegyületeire, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Többszintű vizsgálati stratégia : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

Validált vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága validálási vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelelő pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást (8).

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése : a rendelkezésre álló különféle érvek és ellenérvek mérlegelésének folyamata az adott vegyi anyag veszélyességével kapcsolatban a megfelelő következtetés levonása és alátámasztása céljából.

---

3. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK A FLUORESZCEIN-SZIVÁRGÁSON ALAPULÓ VIZSGÁLATI MÓDSZERHEZ

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak az 1. táblázatban ajánlott 8 vegyi anyag szemkorróziót érintő veszélyességi osztályozásának helyes meghatározásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat. E vegyi anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (405. vizsgálati iránymutatás, B.5. vizsgálati módszer (5)) alapján a lokális szemirritáció/szemkorrózió (azaz az ENSZ-GHS szerinti 1., 2A. és 2B. kategória, valamint az ENSZ-GHS rendelet szerinti nem besorolt) hatástartománya szempontjából reprezentatívak legyenek. A fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer validált alkalmazási körét (azaz kizárólag a szemkorróziót, illetve a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítását) figyelembe véve azonban a jártasság igazolása osztályozási célból csak két vizsgálati kimenetelre (szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó, vagy szemkorróziót, illetve súlyos szemirritációt nem okozó) értelmezhető. A kiválasztás másik kritériuma az volt, hogy a vegyi anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok álljanak rendelkezésre, és a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer alapján kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre. Ezen okból kifolyólag a jártassági tesztanyagok kiválasztása a „Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing” (8) című, a fluoreszcein-szivárgáson alapuló vizsgálati módszer visszamenőleges validálásához felhasznált dokumentum alapján történt.

B.62.    Lúgos közegben végzett in vivo üstökösvizsgálat emlősökön

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 489. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. A lúgos közegben végzett in vivo üstökösvizsgálat (egysejtes gélelektroforézis) (a továbbiakban egyszerűen: üstökösvizsgálat) állatok – rendszerint rágcsálók – potenciálisan genotoxikus anyag(ok)nak kitett több szövetéből izolált sejtekben vagy sejtmagokban bekövetkező DNS-száltörések kimutatására használatos. Az üstökösvizsgálatot különféle szakértői csoportok felülvizsgálták, és arra vonatkozóan ajánlásokat tettek közzé (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10). E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (11).

Az üstökösvizsgálat célja a DNS-károsodást okozó vegyi anyagok azonosítása. Az üstökösvizsgálat lúgos közegben (> pH 13) kimutathatja azokat az egyszeres és kettős DNS-száltöréseket, amelyek például a DNS-sel, az alkalikus közegben labilis helyekkel való közvetlen kölcsönhatásból vagy a DNS kivágásos reparációja miatti átmeneti DNS-száltörésekből fakadnak. E száltörések reparálódhatnak tartós hatás bekövetkezése nélkül, okozhatnak sejthalált, vagy rögzülhetnek tartós, életképes változást eredményező mutációban. Okozhatnak kromoszóma-károsodást is, amely számos emberi betegséggel, többek között a rákkal is összefügg.

A rágcsálókon végzett üstökösvizsgálat hivatalos validációs kísérletét 2006–2012 között, az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Japán Központ (JaCVAM) koordinálása mellett, az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központ (ECVAM), az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) és az Országos Toxikológiai Program (NTP) Alternatív Toxikológiai Módszerek Értékelésével Foglalkozó Ügynökségközi Központja (NICEATM) (12) közreműködésével végezték. Ez a vizsgálati módszer tartalmazza az üstökösvizsgálat ajánlott alkalmazását és korlátait, emellett a validálási kísérlet során felhasznált végleges protokollon (12), valamint további releváns, közzétett és közzé nem tett (laboratóriumi védett) adatokon alapul.

A kulcsfontosságú fogalmak meghatározásai az 1. függelékben találhatók. Megjegyzendő, hogy ehhez a vizsgálathoz számos különböző platform használható (mikroszkóp-tárgylemezek, gél-spotok, 96-lyukú lemezek stb.). Praktikus okokból e dokumentum fennmaradó részében végig a »tárgylemez« kifejezés használatos, de magában foglalja az összes többi platformot is.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Az üstökösvizsgálat az eukarióta sejtekben bekövetkező DNS-száltörések mérésére szolgáló módszer. A tárgylemezen lévő agarózba helyezett különálló sejteket/sejtmagokat detergenssel, magas sókoncentráció mellett lizálni kell. A lízis szakasza digerálja a sejtek és a sejtmagok membránját, továbbá lehetővé teszi az általában nukleoidoknak és DNS-fragmensnek nevezett spirálszerű DNS-hurkok kioldódását. A magas pH melletti elektroforézis üstökösre emlékeztető szerkezeteket eredményez, amelyek – megfelelő fluoreszcens festékek használatával – fluoreszcens mikroszkópos vizsgálattal megfigyelhetők; a DNS-fragmensek a méretükből adódóan a »magtól« a »csóváig« vándorolnak, és az üstököscsóva intenzitásának az összes intenzitáshoz (a mag és a csóva együttvéve) viszonyított aránya a DNS-töredezettség mértékét tükrözi (13) (14) (15).

A lúgos közegben végzett in vivo üstökösvizsgálat különösen releváns a genotoxikus veszély értékeléséhez, amennyiben a vizsgálatra adott válaszok az in vivo felszívódástól, eloszlástól, metabolizmustól és kiválasztástól (ADME: absorption, distribution, metabolism, excretion), valamint a DNS-reparációs folyamatoktól is függnek. Ezek a fajoktól, a szövetektől és a DNS-károsodás típusaitól függően változhatnak.

Az állatjólétre vonatkozó követelmények teljesítése, különösen az állatok alkalmazásának visszaszorítása (3R-elv – Replacement, Reduction, Refinement; az állatkísérletek helyettesítése, csökkentése, finomítása) érdekében ez a vizsgálat beépíthető más toxikológiai vizsgálatokba, például ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokba (10) (16) (17), vagy a végpont ötvözhető más genotoxicitási végpontokkal, például az in vivo emlős eritrocita mikronukleusz-vizsgálattal (18) (19) (20). Üstökösvizsgálatot leggyakrabban rágcsálókon végeznek, bár alkalmazzák más emlősfajokra és emlősöktől eltérő fajokra is. A rágcsálóktól eltérő fajok alkalmazását tudományos és etikai szempontból eseti alapon meg kell indokolni, és kifejezetten ajánlott, hogy üstökösvizsgálatot rágcsálóktól eltérő fajokon csak másik toxicitásvizsgálat keretében végezzenek, nem pedig önálló vizsgálatként.

Az expozíciós út és a vizsgálandó szövet(ek) kiválasztását a vizsgálati vegyi anyagokra vonatkozóan rendelkezésre álló/létező összes ismeret alapján kell meghatározni, például a tervezett/várható emberi expozíciós út, metabolizmus és eloszlás, az érintkezés helyén kiváltott esetleges hatások, szerkezeti figyelmeztető jelek, genotoxicitásra vagy toxicitásra vonatkozó egyéb adatok, valamint a vizsgálat célja alapján. Ezért adott esetben a vizsgálati vegyi anyagok genotoxikus potenciálját meg lehet vizsgálni a rákkeltő és/vagy más toxikus hatás célszövetében/célszöveteiben. Ez a vizsgálat valamely in vitro rendszer által kimutatott genotoxicitás további vizsgálatához is hasznosnak minősül. A vizsgált szövetben akkor helyénvaló in vivo üstökösvizsgálatot végezni, ha ésszerűen lehet számítani a vizsgált szövet megfelelő expozíciójára.

A vizsgálat legkiterjedtebb validálására eddig együttműködésen alapuló vizsgálatok, például a JaCVAM által (12) és Rothfuss és társai által 2010-ben végzett kísérlet (10) keretében, hímivarú patkányok szomatikus szöveteiben került sor. A JaCVAM nemzetközi validálási kísérletben májat és gyomrot használtak. A májat azért, mert a legaktívabb szerv a vegyi anyagok anyagcseréjében és azért is, mert gyakori célszerv a karcinogenitás vizsgálatához. A gyomrot azért használták, mert az orális expozíciót követően általában a gyomor a vegyi anyagokkal való első érintkezés helye, bár a gyomor-bél traktus más területeit, például a patkóbelet és az éhbelet is figyelembe kell venni az érintkezési hely szöveteiként, amelyek relevánsabbnak tekinthetők az emberi gyomor, mint a rágcsálók mirigyes gyomra tekintetében. Ügyelni kell annak biztosítására, hogy ezek a szövetek ne legyenek kitéve a vizsgálati vegyi anyag túl magas koncentrációinak (21). Ez az eljárás elvileg minden olyan szövetre alkalmazható, amelyekből elemezhető, egysejtes szuszpenziók vagy sejtmagszuszpenziók állíthatók elő. Több laboratórium védett adatai igazolják, hogy sikeresen alkalmazható sok különféle szövetnél, és számos olyan kiadvány létezik, amelyekből kiderül, hogy az eljárás alkalmazható májtól és gyomortól eltérő szervekre vagy szövetekre, például az éhbélre (22), a vesére (23) (24), a bőrre (25) (26), vagy a húgyhólyagból (27) (28), a tüdő- és bronchoalveoláris mosásból származó (a belélegzett vegyi anyagok vizsgálata szempontjából releváns) sejtekre (29) (30), a vizsgálatokat emellett elvégezték több szerven is (31) (32).

Bár a csírasejtekre kifejtett genotoxikus hatások érdekesek lehetnek, meg kell jegyezni, hogy a lúgos közegben végzett standard üstökösvizsgálat, ahogyan e vizsgálati módszer leírásában szerepel, az érett csírasejtekben végbemenő DNS-száltörések méréséhez nem tekintendő megfelelőnek. Mivel a csírasejt-genotoxicitásra irányuló üstökösvizsgálat (33) alkalmazásával kapcsolatos szakirodalmi áttekintésben a DNS-károsodásra vonatkozóan magas és változó szintű háttérértékeket közöltek, az érett csírasejtekre (például spermára) irányuló üstökösvizsgálatnak a vizsgálati módszerbe való beépíthetősége előtt szükség lehet a protokoll módosítására, valamint jobb szabványosítási és validálási vizsgálatokra. Ezen túlmenően az e vizsgálati módszerben ismertetett, ajánlott expozíciós séma nem optimális, és az érett spermában bekövetkező DNS-száltörések érdemi elemzéséhez hosszabb expozíciós vagy mintavételi időre lenne szükség. A szakirodalomban a különböző differenciálódási szakaszokban lévő heresejteken végzett üstökösvizsgálattal mért genotoxikus hatásokról számoltak be (34) (35). Megjegyzendő azonban, hogy az ivarmirigyek szomatikus és csírasejteket egyaránt tartalmaznak. Ezen okból kifolyólag a teljes ivarmirigyben (herében) kapott pozitív eredmények nem feltétlenül tükröznek csírasejt-károsodást, mindazonáltal azt jelzik, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) és/vagy metabolitjai(k) elérték az ivarmirigyet.

Az üstökösvizsgálat standard kísérleti körülményei mellett a keresztkötések nem mutathatók ki megbízhatóan. Bizonyos, módosított kísérleti körülmények mellett a DNS-DNS és a DNS-fehérje keresztkötések és más bázismódosulások, például oxidálódott bázisok mutathatók ki (23) (36) (37) (38) (39). A protokoll szükséges módosításainak megfelelő jellemzéséhez azonban további munkára lenne szükség. Ezért az itt ismertetett vizsgálatnak nem a keresztkötő ágensek kimutatása az elsődleges célja. A vizsgálat még módosításokkal együtt sem megfelelő az aneugének kimutatására.

A tudomány jelenlegi állása miatt az in vivo üstökösvizsgálathoz több további korlát kapcsolódik (lásd a 3. függeléket). A vizsgálati módszer a jövőben várhatóan felülvizsgálat tárgyát fogja képezni, és szükség esetén a szerzett tapasztalatok fényében is felülvizsgálatra kerül.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Az állatokat megfelelő módon kell a vizsgálati vegyi anyagnak kitenni. Az adagolás és a mintavétel részletes leírása a 36–40. pontban található. A kiválasztott mintavételi időpont(ok)ban a vizsgált szöveteket preparálni kell, majd egysejtes szuszpenziókat vagy sejtmagszuszpenziókat kell készíteni (hasznosnak ítélt esetben, például máj esetében in situ perfúzió végezhető), és azokat puha agarba kell ágyazni, hogy ne mozduljanak el a tárgylemezeken. A sejteket/sejtmagokat lízispufferrel kell kezelni a sejt és/vagy a sejtmag membránjának eltávolítása érdekében, és erős lúgnak (például pH≥13) kell kitenni a DNS kitekeredésének, valamint a kilazult DNS-hurkok és -fragmensek kioldódásának lehetővé tétele érdekében. Az agarban lévő sejtmag-DNS-t ezt követően elektroforézisnek kell alávetni. A rendes, nem fragmentált DNS-molekulák abban a helyzetben maradnak, amelyben a sejtmag-DNS volt az agarban, míg a fragmentált DNS-ek és a kilazult DNS-hurkok az anód felé vándorolnak. Az elektroforézist követően a DNS-t megfelelő fluoreszcens festék segítségével kell megjeleníteni. A preparátumokat mikroszkóp, valamint teljesen vagy félig automatizált képelemző rendszerek segítségével kell elemezni. Az elektroforézis során történő DNS-vándorlás mértéke és távolsága a DNS-fragmensek mennyiségét és méretét tükrözi. Az üstökösvizsgálat esetében több végpont van. A DNS-károsodás vizsgálatához a csóvában lévő DNS-tartalom (csóva DNS %-os aránya vagy a csóva intenzitásának %-os aránya) ajánlott (12) (40) (41) (42). Elegendő számú sejtmag elemzését követően a vizsgálati eredmények elbírálása érdekében az adatokat megfelelő módszerekkel kell elemezni.

Megjegyzendő, hogy a módszertan különböző aspektusainak – többek között a minták preparálásának, az elektroforézis feltételeinek, a vizuális elemzési paramétereknek (például a festék intenzitásának, a mikroszkóp-izzófény intenzitásának, illetve a mikroszkópszűrő- és -kameradinamikák használatának) és a környezeti feltételeknek (például a háttérvilágításnak) – a módosítása vizsgálat tárgyát képezte és befolyásolhatja a DNS-vándorlást (43) (44) (45) (46).

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

Az egyes laboratóriumoknak az üstökösvizsgálatban való kísérleti szakértelmüket annak demonstrálásával kell igazolniuk, hogy mindegyik alkalmazott faj mindegy egyes célszövete esetében képesek megfelelő minőségű egysejtes szuszpenziókat vagy sejtmagszuszpenziókat előállítani. A preparátumok minőségét először a vivőanyaggal kezelt állatok reprodukálhatóan alacsony tartományba eső %-os csóva DNS-ével kell értékelni. A jelenlegi adatok szerint a patkánymájban a csóva DNS %-os arányának csoportos átlaga (a mediánok átlaga alapján, e kifejezések részletezését lásd az 57. pontban) lehetőleg ne haladja meg a 6 %-ot, ami összhangban lenne a JaCVAM validálási kísérletében (12) szereplő értékekkel, valamint más, közzétett és védett adatokkal. Jelenleg nem áll rendelkezésre elég információ ahhoz, hogy az egyéb szövetek esetében optimális vagy elfogadható tartományokra vonatkozóan ajánlásokat lehessen megfogalmazni. Ez indokolt esetben nem zárja ki eleve más szövetek alkalmazását. A Vizsgálati jegyzőkönyvnek megfelelő áttekintést kell adnia az e szövetekben végrehajtott üstökösvizsgálat teljesítőképességéről, a közzétett szakirodalomra vagy a védett adatokra hivatkozással. Először is a csóva DNS %-os arányának a kontrollokban lehetőleg alacsony tartományban kell lennie ahhoz, hogy pozitív hatás kimutatásához kellően dinamikus tartományt lehessen biztosítani. Másodszor, az egyes laboratóriumoknak képesnek kell lenniük arra, hogy a különböző hatásmechanizmusú, az 1. táblázatban javasolt direkt mutagén és a promutagén anyagok esetében reprodukálják a várt válaszokat (lásd a 29. pontot).

Adott esetben ki lehet választani pozitív anyagokat például a JaCVAM validálási kísérletéből (12) vagy más közzétett adatok alapján (lásd a 9. pontot), a választást meg kell indokolni, és a vizsgált szövetekben kiváltott, egyértelmű pozitív válaszokat demonstrálni kell. Az ismert mutagének, például az alacsony dózisban adagolt EMS elenyésző hatásának kimutatására való képességet is igazolni kell, például megfelelő számú és elosztású dózisokkal fennálló dózis-válasz összefüggések létrehozásával. Eleinte a leggyakrabban használt szövetek, például a rágcsálómáj tekintetében szerzett jártasságra kell összpontosítani, ahol a meglévő adatokkal és a várt eredményekkel összehasonlítást lehet végezni (12). Más szövetekből, például a gyomorból, a patkóbélből, az éhbélből, a vérből stb. származó adatokat egyszerre kell összegyűjteni. A laboratóriumnak minden vizsgálni tervezett faj minden egyes szövete tekintetében igazolnia kell a jártasságát, továbbá azt, hogy egy ismert mutagénnel (például EMS-sel) elfogadható pozitív válasz kapható az adott szövetben.

A vivőanyagos/a negatív kontrollokra vonatkozó adatokat össze kell gyűjteni a negatív adatválaszok reprodukálhatóságának igazolása, valamint annak megállapítása érdekében, hogy a vizsgálat technikai aspektusait megfelelően kontrollálták, illetve annak jelzésére, hogy a kontrollok történeti tartományát újra létre kell hozni (lásd a 22. pontot).

Megjegyzendő, hogy míg boncoláskor többféle szövet begyűjthető és feldolgozható üstökösvizsgálat céljából, a laboratóriumnak jártasnak kell lennie egyetlen állat többféle szövetének begyűjtésében, biztosítva ezáltal, hogy egyetlen potenciális DNS-károsodás se vesszen el és az üstökösvizsgálat ne kerüljön veszélybe. Az eutanáziától a szövetek feldolgozás céljából végzett eltávolításáig eltelt idő kritikus jelentőségű lehet (lásd a 44. pontot).

Az e vizsgálatban való jártasság kialakítása során figyelembe kell venni az állatjólétet, ennélfogva az egyéb vizsgálatok során felhasznált állatok szövetei felhasználhatók a vizsgálat különböző aspektusaival kapcsolatos kompetencia kifejlesztése során. Ezen túlmenően nem feltétlenül kell teljes körű vizsgálatot végrehajtani az új vizsgálati módszerek laboratóriumi kialakításának szakaszaiban, a szükséges készségek kifejlesztése során pedig kevesebb állatot vagy vizsgálati koncentrációt lehet alkalmazni.

Történeti kontrollokadatok

A jártassági vizsgálatok során a laboratóriumnak a releváns szövetek és fajok esetében a pozitív és negatív kontrollok történeti tartományának és eloszlásának megállapítását szolgáló történeti adatbázist kell kiépítenie. A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (47). A különböző szövetek és a különböző fajok, továbbá a különböző vivőanyagok és beadási módok a negatív kontrollok esetében eltérő értékeket adhatnak a csóva DNS %-os arányára. Ezért fontos minden egyes szövet és faj esetében negatív kontrollokra vonatkozó tartományokat létrehozni. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (48)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll. Előfordulhat, hogy a megfelelő pozitív kontrollanyagokat, a dózistartományokat és a kísérleti körülményeket (például az elektroforézis feltételeit) is optimalizálni kell az elenyésző hatások kimutatásához (lásd a 17. pont).

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy összhangban van-e a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisaival. Jelentősebb következetlenségek fennállása esetén új történeti kontrolladatbázist kell létrehozni.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

Szokásosan egészséges, fiatal, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó rágcsálókat kell alkalmazni (amelyeknek a kezelés kezdetén 6–10 hetesnek kell lenniük, bár valamivel idősebb állatok is elfogadhatóak). A rágcsálófaj kiválasztásának i. (az adatok viszonyíthatósága és az integrált vizsgálatok elvégezhetősége érdekében) az egyéb toxicitásvizsgálatokban használt fajokon, ii. (a karcinogenezis mechanizmusának vizsgálata során) a karcinogenitás-vizsgálatban tumort kifejlesztett fajokon, vagy iii. az emberek szempontjából leginkább releváns anyagcseréjű fajokon kell alapulnia, ha ismerek ilyen fajok. E vizsgálatban rendszerint patkányokat kell használni. Etikai és tudományosan indokolt esetben azonban más fajok is használhatók.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Rágcsálók esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének ideális esetben 22 °C (±3 °C)-nak kell lennie. Ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, de legyen legalább 30 %, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. A rágcsálókat azonos ivarú rágcsálókból (általában legfeljebb öt egyedből) álló kis csoportokban kell elhelyezni, amennyiben nem várható agresszív viselkedés. Az állatok kizárólag tudományosan indokolt esetben tarthatók egyenként. Amennyiben lehetséges, szilárd aljzatot kell használni, mivel a rácspadló súlyos sérülést okozhat (49). Megfelelő környezetgazdagítást kell biztosítani.

Az állatok előkészítése

Az állatokat véletlenszerűen kell besorolni a kontroll- és kezelt csoportokba. Az egyes állatokat egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése előtt legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. Az állatok azonosításához a legkevésbé invazív módszert kell alkalmazni. Megfelelő módszer a gyűrűzés, a címkézés, a mikrocsip beültetése vagy a biometrikus azonosítás. A fül vagy a lábujj kilyukasztása tudományosan nem indokolt ezekben a vizsgálatokban. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy a lehető legkisebb legyen a ketrec elhelyezéséből eredő esetleges hatás. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg a ± 20 %-ot.

A dózisok előkészítése

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő vivőanyagokban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók (50) (51).

A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Vizsgálati körülmények

Vivőanyag

A vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat az alkalmazott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan vivőanyag, amelyről feltehető, hogy kémiai reakcióba fog lépni a vizsgálati vegyi anyagokkal. Jól ismert oldószerektől eltérő vivőanyagok használata esetén azok használatát alá kell támasztani a kísérleti állatok, a beadási mód és a végpont tekintetében a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát ajánlatos megfontolni. Megjegyzendő, hogy egyes vivőanyagok (különösen a viszkózus vivőanyagok) gyulladást okozhatnak és az érintkezés helyén növelhetik a DNS-száltörések háttérszintjét, különösen többszöri beadás esetén.

Kontrollok

Pozitív kontrollok

Ez alkalommal legalább három, egy ivarhoz tartozó, vagy mindkét ivar használata esetén mindkét ivarhoz tartozó állatból álló (lásd a 32. pontot), pozitív kontrollal kezelt csoportot kell alkalmazni minden vizsgálatnál. Lehet, hogy a jövőben igazolható lesz, hogy a megfelelő jártassággal csökkenthető a pozitív kontrollok szükségessége. Több mintavételi időpont alkalmazása esetén (például egyetlen beadást tartalmazó protokollnál) elég az egyik mintavételi időpontban pozitív kontrollt alkalmazni, de biztosítani kell a kiegyensúlyozott kísérlettervezést (lásd a 48. pontot). A párhuzamos pozitív kontrollanyagokat nem szükséges a vizsgálati vegyi anyaggal azonos útvonalon adagolni, bár az érintkezés helyén kifejtett hatások mérésekor fontos ugyanannak az útvonalnak az alkalmazása. A pozitív kontrollanyagoknak igazoltan DNS-száltöréseket kell előidézniük a vizsgálati vegyi anyag szempontjából lényeges összes szövetben; a választott pozitív kontroll valószínűsíthetően az EMS, mivel az az összes vizsgált szövetben DNS-száltöréseket okoz. A pozitív kontrollanyagok dózisát úgy kell megválasztani, hogy mérsékelt hatást fejtsenek ki, lehetővé téve a vizsgálat teljesítőképességének és érzékenységének kritikus szempontú értékelését; e dózisok a laboratórium által a jártasság igazolása során készített dózis-válasz görbéken is alapulhatnak. A párhuzamos pozitív kontroll állataiban a csóva DNS %-os arányának összhangban kell lennie az adott faj egyes szövetei és az adott fajnál alkalmazott mintavételi időpont esetében előre meghatározott laboratóriumi tartománnyal (lásd a 16. pontot). A pozitív kontrollként szolgáló anyagokra és a hozzájuk tartozó (rágcsáló) célszövetekre az 1. táblázat tartalmaz példákat. Az 1. táblázatban megadottaktól eltérő anyagok tudományosan indokolt esetben választhatók.

1. táblázat

Példák a pozitív kontrollként szolgáló anyagokra és azok célszöveteire

Etil-metánszulfonát (CAS-szám: 62-50-0) bármely szövet esetében

N-etil-N-nitrozo-karbamid (CAS-szám: 759-73-9) a máj, a gyomor, a patkóbél vagy az éhbél esetében

Metil-metánszulfonát (CAS-szám: 66-27-3) a máj, a gyomor, a patkóbél vagy az éhbél esetében, a tüdő- és bronchoalveoláris (BAL) mosással kinyert sejtek, a vese, a húgyhólyag, a tüdő, a here és a csontvelő/vér esetében

N-metil-N′ -nitro-N-nitrozoguanidin (CAS-szám: 70-25-7) a gyomor, a patkóbél vagy az éhbél esetében

1,2-dimetil-hidrazin 2-hidroklorid (CAS-szám: 306-37-6) a máj és a zsigerek esetében

N-metil-N-nitrozo-karbamid (CAS-szám: 684-93-5) a máj, a csontvelő, a vér, a vese, a gyomor, az éhbél és az agy esetében.

Negatív kontrollok

Az egyes vizsgálatokban minden mintavételi időpont és szövet esetében csak vivőanyaggal és egyébiránt a kezelt csoportokéval megegyező módon kezelt negatív kontrollállat-csoportot kell használni. A negatív kontroll állataiban lévő csóva DNS %-os arányának az adott faj egyes szövetei és az adott fajnál alkalmazott mintavételi időpont esetében előre meghatározott laboratóriumi háttértartományban kell lennie (lásd a 16. pontot). Ha a kontrollokra vonatkozóan nem állnak rendelkezésre olyan történeti vagy közzétett adatok, amelyek igazolják, hogy a választott vivőanyag, a beadások száma vagy a beadási mód nem idéz elő ártalmas vagy genotoxikus hatásokat, a vivőanyag-kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében a teljes vizsgálat lebonyolítása előtt kiindulási vizsgálatot kell végezni.

ELJÁRÁS

Az állatok száma és ivara

Bár kevés adat létezik olyan nőivarú állatokra vonatkozóan, amelyek alapján ivarok közötti összehasonlítást lehetne végezni az üstökösvizsgálattal kapcsolatban, az egyéb in vivo genotoxicitási válaszok általában hasonlóak a hím- és a nőivarú állatok között, ezért a vizsgálatok többsége mindkét ivarnál elvégezhető. A hímek és a nőstények közötti lényeges eltéréseket (például a szisztémás toxicitás, a metabolizmus, a biológiai hasznosíthatóság stb. például többek között dózisbehatároló vizsgálattal megállapított eltéréseit) bizonyító adatok mindkét ivar használatát ösztönzik. Ebben az esetben helyénvaló lehet mindkét ivarnál vizsgálatot végezni, például ismételt dózisú toxicitási vizsgálat keretében. Mindkét ivar használata esetén helyénvaló lehet a faktoriális kísérlettervezés alkalmazása. Az e kísérlettervezés segítségével végzendő adatelemzés részletei a 2. függelékben találhatók.

A vizsgálat megkezdésekor (és a jártasság megállapítása során) a csoportok méretét úgy kell megállapítani, hogy csoportonként legalább öt azonos ivarú – illetve mindkét ivar használata esetén mindkét ivarból öt – (a párhuzamos pozitív kontrollcsoportban kevesebb; lásd a 29. pontot) elemezhető állat legyen. Amennyiben a vegyi anyagoknak való emberi expozíció szexspecifikus lehet, mint például egyes gyógyszerek esetében, a vizsgálatot a megfelelő ivarú állatokkal kell elvégezni. Útmutatás a tipikus állatok maximális számára vonatkozó követelményhez: a 33. pontban megállapított paraméterek szerint, három dóziscsoporttal, valamint párhuzamos negatív és pozitív kontrollcsoportokkal (melyek mindegyike öt, egy ivarhoz tartozó állatból áll) végzett vizsgálathoz 25–35 állatra lenne szükség.

A KEZELÉS ÜTEMTERVE

Az állatokat legalább két napon át napi rendszerességgel kezelni kell (azaz az állatokat kb. 24 órás időközönként két vagy több alkalommal kell kezelni), és a mintákat az utolsó kezelést követő 2–6 órában (vagy a Tmax időpontban) kell begyűjteni (12). A hosszabb ideig tartó adagolási rendből (például 28 napos napi adagolásból) származó minták elfogadhatóak. Bizonyítást nyert, hogy az üstökösvizsgálat és az eritrocita mikronukleusz-vizsgálat sikeresen ötvözhető (10) (19). Az üstökösvizsgálat céljából történő szövetmintavétel lebonyolítását, valamint a más típusú toxikológiai vizsgálatokhoz végzett szövetmintavétel követelményeit azonban alaposan figyelembe kell venni. Az utolsó dózist követő 24 óra elteltével végzett mintagyűjtés, amely az általános toxicitásvizsgálatok esetében jellemző, a legtöbb esetben nem megfelelő (lásd a mintavétel időpontjáról szóló 40. pontot). Más kezelési és mintavételi ütemtervek alkalmazását meg kell indokolni (lásd a 3. függeléket). Alkalmazható például egyetlen kezelés és több mintavétel, azonban megjegyzendő, hogy az egyetlen beadással végzett vizsgálathoz a több mintavételi időpont szükségessége miatt több állatra van szükség, de alkalmanként ez előnyben részesíthető, például akkor, ha a vizsgálati vegyi anyag a megismételt beadását követően túlzott toxicitást idéz elő.

A vizsgálat végrehajtásának módjától függetlenül a vizsgálat elfogadható, amennyiben a vizsgálati vegyi anyag pozitív választ vált ki, illetve negatív vizsgálat esetében, amennyiben igazolást nyert a célszövet(ek) expozícióját vagy a célszövet(ek)re kifejtett toxikus hatást közvetlen vagy közvetett módon alátámasztó bizonyíték, vagy a határdózis elérése esetén (lásd a 36. pont).

A vizsgálati vegyi anyagok több dózisra osztva is beadhatók, például nagy mennyiségű anyag beadásának megkönnyítése érdekében ugyanazon a napon két, legfeljebb 2–3 órás időközönként végzett kezeléssel. Ilyen körülmények között a mintavételi időpontokat az utolsó adagolás időpontja alapján kell ütemezni (lásd a 40. pontot).

Dózisszintek

Ha előzetes dózisbehatároló vizsgálatra kerül sor amiatt, hogy más, releváns vizsgálatokból nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok kiválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek, ivarok és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyek a fő vizsgálatban alkalmazandóak, a dózisbehatároló vizsgálat végrehajtására vonatkozó aktuális megközelítések szerint. A vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely a vizsgálati időszak hosszához képest enyhe toxikus hatásokat kiváltó dózis (például egyértelmű klinikai tüneteket, köztük rendellenes viselkedést vagy reakciókat, enyhe testtömeg-csökkenést vagy a célszövetben citotoxicitást vált ki), de amely elhullást, illetve eutanáziát igénylő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy szorongást nem idéz elő. Legalább 14 napig adagolt, nem toxikus vizsgálati vegyi anyag esetén a maximális dózis (határdózis) 1 000  mg/testtömeg kg/nap. 14 napnál rövidebb beadási időszak esetén a maximális dózis (határdózis) 2 000  mg/testtömeg kg/nap. Ezek a határértékek a vizsgálati vegyi anyagok bizonyos, külön szabályozás hatálya alá tartozó típusai (például a humán gyógyszerek) esetében változóak lehetnek.

Azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, vagy olyan detoxifikációs folyamatokat idéznek elő, amelyek hosszú távú beadás után az expozíció csökkenéséhez vezethetnek, kivételek lehetnek a dózisbeállítási kritériumok alól, és azokat eseti alapon kell értékelni.

Az üstökösvizsgálat akut és szubakut változata esetében egyaránt a maximális dózis (MTD, maximális megvalósítható dózis, maximális expozíciós dózis vagy határdózis) mellett az egyes mintavételi időpontok esetében a dózissal összefüggő válaszok bizonyításához legalább két további, megfelelően elosztott (lehetőleg kevesebb mint 10 hányadosú) dózisszint csökkenő sorozatát kell kiválasztani. Az alkalmazott dózisszinteknek ugyanakkor lehetőleg át kell fogniuk a maximálistól a már csak kissé vagy egyáltalán nem toxikusig terjedő tartományt is. Ha a célszövet toxicitása valamennyi vizsgált dózisszintnél megfigyelhető, érdemes nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni (lásd az 54–55. pontot). A dózis-válasz görbe alakjának teljesebb körű jellemzését célzó vizsgálatok további dóziscsoporto(ka)t tehetnek szükségessé.

A dózisok beadása

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak (például takarmány, ivóvíz, helyi szubkután, intravénás, orális (gyomorszondával), inhalációs, intratracheális vagy implantáció) is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet(ek) megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció általában nem ajánlott, mivel az nem jellemző emberi expozíciós út, és kizárólag tudományos indokolással alkalmazható (például vizsgálati célra alkalmazott egyes pozitív kontrollanyagok vagy bizonyos, hasüregbe adott gyógyszerek esetében). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata nem haladhatja meg a 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát (ha az állatjóléti tárgyú jogszabályok lehetővé teszik) meg kell indokolni. Amennyiben lehetséges, a különböző dózisszinteket az adagolt készítmény koncentrációjának kiigazításával kell elérni, hogy valamennyi dózisszintnél a testtömeghez képest állandó térfogatot lehessen biztosítani.

Mintavételi időpont

A mintavételi időpont kritikus változó, ugyanis az az időszak határozza meg, amely ahhoz szükséges, hogy a vizsgálati vegyi anyagok maximális koncentrációt érjenek el a célszövetben, valamint ahhoz, hogy DNS-száltörések következzenek be, de még mielőtt ezek a törések megszűnnek, reparálódnak vagy sejthalálhoz vezetnek. Az üstökösvizsgálattal kimutatott egyes, DNS-száltörésekhez vezető léziók fennállása nagyon rövid lehet, legalább is egyes, in vitro körülmények között vizsgált vegyi anyagok esetében (52) (53). Ennek megfelelően, amennyiben feltehető, hogy átmeneti DNS-károsodások alakulnak ki, intézkedéseket kell tenni az eltűnésük mérséklése érdekében, mégpedig annak biztosításával, hogy a szövetmintavételre kellően korán, lehetőleg az alább megadott, alapértelmezett időpontok előtt kerüljön sor. Az optimális mintavételi időpont(ok) a vegyi anyagra vagy a beadási módra jellemző(ek) lehet(nek), ami például a szövet intravénás beadással történő vagy belélegzéses expozíciója esetén gyors expozíciót eredményez. Ennek megfelelően a mintavételi időpontokat kinetikus adatok alapján kell meghatározni, ha rendelkezésre állnak ilyen adatok (például Tmax időpontban, a plazmán vagy a szöveten belüli csúcskoncentráció (Cmax) elérésekor, vagy többszöri beadás esetén állandósult állapotban). Kinetikus adatok hiányában a genotoxicitás mérésére megfelelő kompromisszumot jelent két vagy több kezelés esetén az utolsó kezelést követő 2–6 órán belüli mintavétel, illetve egyszeri beadást követően 2–6 órán belüli és 16–26 órán belüli mintavétel, bár ügyelni kell arra, hogy az utolsó (vagy egyetlen) dózist követően minden állat boncolása egyszerre történjen. A célszervekben kiváltott toxikus hatások megjelenésére vonatkozó adatok (ha rendelkezésre állnak) szintén felhasználhatók a megfelelő mintavételi időpontok kiválasztásához.

Megfigyelések

Naponta legalább egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban az állatok egészségére vonatkozó, általános klinikai megfigyelést kell végezni és azt dokumentálni kell, figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát (54). Naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából. Hosszabb időtartamú vizsgálatok esetén az állatokat legalább hetente egyszer, valamint a vizsgálati időszak befejeződésekor le kell mérni. A felvett táplálékot a takarmány megváltoztatásakor és legalább heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokon a vizsgálati időszak befejeződése előtt eutanáziát kell végrehajtani, és azok általában nem használhatóak üstökösvizsgálathoz.

A szövetek gyűjtése

Mivel a DNS-száltörések (üstökösök) indukcióját gyakorlatilag bármilyen szövetben tanulmányozni lehet, a begyűjtendő szövet(ek) kiválasztását egyértelműen meg kell indokolni, és azt a vizsgálat lefolytatásának okára, illetve a vizsgálati vegyi anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló ADME-, genotoxicitási, karcinogenitási és más toxicitási adatokra kell alapozni. A megfontolandó lényeges tényezők közé kell tartoznia a vizsgálati vegyi anyagok beadási útjának (a valószínű emberi expozíciós útra/utakra alapozva), becsült szöveti megoszlásának és felszívódásának, anyagcseréje szerepének, valamint a lehetséges hatásmechanizmusának. A leggyakrabban vizsgált szövet a máj, és a májra vonatkozóan áll rendelkezésre a legtöbb adat. Ezért háttérinformációk hiányában, és amennyiben nem kerül sor konkrét célszövetek azonosítására, a májból történő mintavétel indokolt, mivel ez a xenobiotikus anyagcsere elsődleges helye, és gyakran ki van téve a kiindulási anyag(ok)nak és metabolitjának (azok metabolitjainak). Egyes esetekben relevánsabb lehet az érintkezés helyének vizsgálata (orálisan adagolt vegyi anyagok esetében például a mirigyes gyomor vagy a patkóbél/éhbél vizsgálata, vagy belélegzett vegyi anyagok esetében a tüdő vizsgálata). A vizsgálat konkrét céljai alapján további vagy más szöveteket kell kiválasztani, de hasznos lehet ugyanazon állatok több szövetének vizsgálata, amennyiben a laboratórium igazolta az adott szövetek terén szerzett jártasságát és több szövet egyidejű kezelése terén szerzett szakértelmét.

Minták elkészítése

A következő (44–49.) pontokban ismertetett eljárások esetében fontos, hogy minden oldatot, illetve stabil szuszpenziót a lejárati idejükön belül fel kell használni, vagy szükség esetén azokat frissen kell elkészíteni. A következő bekezdésekben az is szerepel, hogy i. az egyes szövetek boncolás utáni eltávolításához, ii. az egyes szövetek sejtszuszpenziókban/sejtmagszuszpenziókban történő feldolgozásához, valamint iii. a szuszpenzió feldolgozásához és a tárgylemezek preparálásához igénybe vett idő egyaránt kritikus változónak minősül (a fogalommeghatározásokat lásd az 1. függelékben), és az e műveletszakaszoknál elfogadható időtartamot a módszer kialakítása és a jártasság igazolása során kell meghatározni.

Az állatokon a hatályos állatjóléti jogszabályokkal és a 3R elvével összhangban a vizsgálati vegyi anyaggal végzett utolsó kezelés utáni megfelelő időpont(ok)ban eutanáziát kell végrehajtani. A kiválasztott szövet(ek)et el kell távolítani, fel kell boncolni, egy részét (részüket) pedig az üstökösvizsgálat céljára kell begyűjteni, ugyanakkor a szövet ugyanazon részéből származó metszetet kell kivágni és azt formaldehid-oldatba vagy hasonló fixálószerbe kell helyezni egy standard módszerek (12) szerint végzendő, esetleges kórszövettani elemzés céljából (lásd az 55. pontot). Az üstökösvizsgálat céljára szánt szövetet zúzópufferbe kell helyezni, a maradék vér eltávolítása érdekében megfelelően át kell öblíteni hideg zúzópufferrel, és a feldolgozásig jéghideg zúzópufferben kell tárolni. In situ perfúziót is lehet végezni, például a máj, a vese esetében.

A sejtizolálásra/sejtmag-izolálásra vonatkozóan számos közzétett módszer létezik. Ilyen többek között a szövetek – például a máj és a vese – összezúzása, a nyálkahártya felületének kaparása a gyomor-bél traktus esetében, a homogenizálás és az enzimatikus emésztés. A JaCVAM validálási kísérlete csak izolált sejteket vizsgált, ezért annak érdekében, hogy a módszer kialakításánál, valamint a jártasság igazolásánál a JaCVAM kísérleti adataira lehessen hivatkozni, az izolált sejtek részesítendők előnyben. Kiderült azonban, hogy izolált sejtek vagy nem izolált sejtek használata esetén nincs lényeges különbség a vizsgálati eredmények között (8). A sejtek/sejtmagok izolálására szolgáló különböző módszerek (például homogenizálás, zúzás, enzimatikus emésztés és hálóval végzett szűrés) is hasonló eredményeket adtak (55). Következésképp izolált sejtek vagy izolált sejtmagok is felhasználhatók. A laboratóriumoknak alaposan értékelniük és validálniuk kell a különálló sejtek/sejtmagok izolálására szolgáló szövetspecifikus módszereket. A 40. pontban foglaltaknak megfelelően az üstökösvizsgálattal kimutatott DNS-száltörésekhez vezető bizonyos léziók fennállása igen rövid lehet (52) (53). Ezért az egysejtes szuszpenziók vagy a sejtmagszuszpenziók elkészítéséhez alkalmazott módszertől függetlenül fontos, hogy a szövetek feldolgozására az állatok leölését követő lehető legrövidebb időn belül sor kerüljön, és azok olyan körülmények közé kerüljenek, amelyek visszafogják a léziók megszűnését (például a szövet alacsony hőmérsékleten tartásával). A sejtszuszpenziókat – mindaddig, amíg nem használatra készek – jéghideg hőmérsékleten kell tárolni annak érdekében, hogy a minták közötti minimális eltérést, valamint a pozitív és a negatív kontrollok megfelelő válaszát lehessen demonstrálni.

TÁRGYLEMEZEK PREPARÁLÁSA

A tárgylemez-preparálást az egysejtes szuszpenziók vagy a sejtmagszuszpenziók elkészítése után a lehető legrövidebb időn belül (ideális esetben egy órán belül) el kell végezni, az állat elpusztulása és a tárgylemez-preparálás közötti hőmérsékletet és időt azonban szigorúan ellenőrizni és validálni kell a laboratóriumi körülmények között. Az alacsony olvadáspontú agarózhoz a tárgylemezek elkészítése érdekében adott sejtszuszpenzió mennyisége (általában 0,5–1,0 %) nem csökkentheti az alacsony olvadáspontú agaróz százalékos arányát 0,45 % alá. Az optimális sejtszámot az üstökösök számlálásához használt képelemző rendszer határozza meg.

Lízis

A lízis feltételei szintén kritikus változót jelentenek, és zavarhatják a DNS-módosulás konkrét típusaiból (egyes DNS-alkilációkból és DNS-bázisok melléktermékeiből) fakadó száltöréseket. Ezért a lízis feltételeit az egyes kísérleteken belüli összes tárgylemez esetében a lehető legállandóbban kell tartani. A preparálást követően a tárgylemezeket lehűtött lizáló oldatba kell helyezni legalább egy órára (vagy egy éjszakára), kb. 2–8 °C-os hőmérsékleten, tompított fényviszonyok mellett, az esetlegesen UV-komponenseket tartalmazó fehér fényt kiiktató például sárga fényre (vagy fénytől védett közegbe). Ezen inkubációs időszakot követően, még a lúgos közegben végbemenő kitekeredés előtt a tárgylemezeket a maradék detergens és só eltávolítása érdekében át kell öblíteni. Az öblítés végezhető tisztított vízzel, semlegesítő pufferrel vagy foszfátpufferrel. Elektroforézis-puffer is használható. Ezáltal fennmarad a lúgos közeg az elektroforézis-kamrában.

Kitekeredés és elektroforézis

A tárgylemezeket véletlenszerűen kell elhelyezni a merülő típusú elektroforézis-egység platformján, amelynek elegendő elekroforézis-oldatot kell tartalmaznia ahhoz, hogy a tárgylemezek felületét teljesen elfedje (az elmerítés mélységének is következetesnek kell lennie az egyes vizsgálatmenetekben). Egy másik típusú üstökösvizsgálatban például az aktív hűtésű, keringtetésű és nagyfeszültségű áramellátású elektroforézis-egységeknél magasabb az oldat rétege, ezáltal nagyobb lesz az elektromos áram erőssége, míg a feszültség állandó marad. A minták elektroforézis-tartályba helyezéséhez kiegyensúlyozott kísérlettervezést kell alkalmazni, hogy mérséklődjenek a tartályon belüli esetleges trendhatások vagy peremhatások és minimálisra csökkenjen az egyes tételek közötti variabilitás, azaz az egyes elektroforézis-vizsgálatmenetekben a vizsgált állatokból ugyanakkora számú tárgylemezt, valamint a különböző dóziscsoportokból, negatív és pozitív kontrollokból származó mintákat kell felhasználni. A tárgylemezeket legalább 20 percig állni kell hagyni, hogy a DNS kitekeredjen, ezt követően pedig a vizsgálat érzékenységét és dinamikus tartományát maximalizáló (azaz az érzékenység maximalizálása érdekében a negatív és a pozitív kontrolloknál a csóva DNS elfogadható %-os arányát eredményező), szabályozott körülmények között elektroforézisnek kell alávetni. A DNS-vándorlás mértéke lineárisan összefügg az elektroforézis időtartamával, valamint a potenciállal (V/cm) is. A JaCVAM kísérlete alapján legalább 20 percre vonatkoztatva ez 0,7 V/cm lehet. Az elektroforézis időtartama kritikus változónak minősül, és az elektroforézis idejét úgy kell beállítani, hogy optimális legyen a dinamikus tartomány. A hosszabb ideig (például az érzékenység maximalizálása érdekében 30 vagy 40 percig) tartó elektroforézis következtében rendszerint erősebb pozitív válaszok alakulnak ki az ismert mutagénekkel. A hosszabb ideig tartó elektroforézis azonban túlzott vándorlást is előidézhet a kontrollmintákban. Az egyes vizsgálatokban a feszültséget állandó szinten kell tartani, a többi paraméter variabilitásának pedig szűk és meghatározott tartományban kell lennie, a JaCVAM kísérletében például a 0,7 V/m 300 mA kezdeti áramerősséget eredményezett. Az előírt feltételek elérése és a kísérlet alatti fenntartása érdekében a puffer mélységét ki kell igazítani. Az elekroforézis kezdetén és végén mért áramerősséget rögzíteni kell. Ezért az egyes vizsgált szövetek tekintetében érintett laboratóriumok jártasságának első alkalommal történő igazolásakor meg kell határozni az optimális feltételeket. Az elektroforézis-oldat hőmérsékletét a kitekeredés és az elektroforézis során alacsony szinten, rendszerint 2–10 °C-on kell tartani (10). Az elektroforézis-oldatnak a kitekeredés kezdetén, az elektroforézis kezdetén és az elektroforézis végén mért hőmérsékletét rögzíteni kell.

Az elektroforézis befejezését követően a tárgylemezeket legalább 5 percig a semlegesítő pufferbe kell meríteni, illetve azzal át kell öblíteni. A gélek »friss« állapotban (azaz 1–2 napon belül) megfesthetők és kiértékelhetők, vagy későbbi kiértékelés céljából (azaz a megfestést követő 1–2 héten belül) dehidratálhatók (56). A feltételeket azonban a jártasság igazolása során kell validálni, és e feltételek mindegyike vonatkozásában történeti adatokat kell előállítani, amelyeket külön-külön kell tárolni. Az utóbbi esetben a tárgylemezeket legalább 5 percen keresztül, abszolút etanolba merítéssel kell dehidratálni, hagyni kell a levegőn megszáradni, majd a kiértékelésig szobahőmérsékleten vagy hűtőben tartott edényben kell tárolni.

Mérési módszerek

Az üstökösökről automatizált vagy félig automatizált képelemző rendszer segítségével kvantitatív értékelést kell készíteni. A tárgylemezeket megfelelő fluoreszcens festékkel (például SYBR Gold, Green I, propídium-jodid vagy etídium-bromid) meg kell festeni, és megfelelő (például 200-szoros) nagyításnál meg kell figyelni megfelelő detektorokkal vagy digitális (például CCD-) kamerával felszerelt epifluoreszcens mikroszkóppal.

A sejtek az üstökösképek atlaszában (57) ismertetett három kategóriába sorolhatók: értékelhető, nem értékelhető és »fantomsejt« (a további magyarázatot lásd az 56. pontban). A mesterségesen előidézett változások elkerülése érdekében a csóva DNS százalékos aránya szempontjából csak az (egyértelműen meghatározott maggal és csóvával rendelkező, a szomszédos sejtekkel kölcsönhatásba nem lépő) értékelhető sejteket kell értékelni. A nem értékelhető sejtek gyakoriságát nem kell dokumentálni. A fantomsejtek gyakoriságát mintánként legalább 150 sejt (további részletekért lásd az 56. pontot) vizuális értékelése alapján kell meghatározni (mivel az egyértelműen meghatározott mag hiánya azt jelenti, hogy nem mutathatók ki könnyen képelemzéssel), valamint külön-külön kell dokumentálni.

Minden elemzendő tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni és »vakon« kell értékelni, hogy az értékelést végző személy ne ismerje a kezelés körülményeit. Minden egyes minta (szövetenként és állatonként vett minta) esetében legalább 150 sejtet kell elemezni (a fantomsejtek kivételével – lásd az 56. pontot). Dózisonként legalább öt állat (a párhuzamos pozitív kontrollban kevesebb állat – lásd a 29. pontot) esetében állatonként 150 sejt értékelése Smith és társai 2008-as elemzése (5) szerint megfelelő statisztikai erőt biztosít. Tárgylemezek használata esetén ez csoportonként öt állatból álló mintánál mintánként 2–3 értékelt tárgylemezt jelent. A tárgylemez több területén kell megfigyelést végezni olyan sűrűség mellett, amely biztosítja, hogy a csóvák ne legyenek átfedésben. A tárgylemezek peremén végzett értékelés kerülendő.

Az üstökösvizsgálatban a DNS-száltörések független végpontokkal mérhetők, ilyen a csóva DNS %-os aránya, a csóvahossz és a csóva létrejöttének pillanata. Megfelelő képelemző szoftver használata esetén mindhárom mérés elvégezhető. A csóva DNS %-os aránya (más néven: a csóva %-os intenzitása) azonban ajánlott az eredmények értékeléséhez és értelmezéséhez (12) (40) (41) (42), és (a sejtek teljes intenzitásának százalékos arányában kifejezett) a csóvában lévő DNS-fragmens intenzitása határozza meg (13).

Szövetkárosodás és citotoxicitás

Az üstökösvizsgálat pozitív megállapításai nem feltétlenül kizárólag a genotoxicitásnak tulajdoníthatók, a célszövet toxiticitása is fokozhatja a DNS-vándorlást (12) (41). Ezzel ellentétben az ismert genotoxikus anyagok esetében gyakran megfigyelhető alacsony vagy mérsékelt citotoxicitás (12), ami arra utal, hogy kizárólag üstökösvizsgálatban nem lehet megkülönböztetni a genotoxicitás által előidézett DNS-vándorlást a citotoxicitás által előidézett DNS-vándorlástól. A DNS-vándorlás fokozódásának megfigyelése esetén azonban ajánlott megvizsgálni egy vagy több citotoxicitás-mutatót, ugyanis ez segíthet a megállapítások értelmezésében. A citotoxicitás egyértelmű bizonyítékának fennállása esetén fokozódó DNS-vándorlást óvatosan kell értelmezni.

Számos citotoxicitás-mérésre született javaslat, és ezek közül a kórszövettani elváltozások a szövetekre kifejtett toxicitás releváns kritériumának tekintendők. Többek között a gyulladásra, a sejtbeszűrődésre, az apoptotikus vagy a nekrotikus elváltozásokra vonatkozó megfigyeléseket összefüggésbe hozták a DNS-vándorlás fokozódásával, azonban ahogyan azt a JaCVAM validálási kísérlete (12) bebizonyítja, a DNS-vándorlás fokozódásával mindig összefüggő kórszövettani elváltozások végleges jegyzéke nem áll rendelkezésre. A klinikai kémiai változások (például AST, ALT) szintén szolgálhatnak a szövetkárosodásra vonatkozó hasznos információkkal, és figyelembe vehetők további mutatók is, mint a kaszpáz-aktiválás, a TUNEL-festés, az Anexin V-festés stb. Mindemellett kevés közzétett adat van e mutatók in vivo vizsgálatokhoz történő felhasználására vonatkozóan, és egyes mutatók nem annyira megbízhatóak, mint mások.

A fantomsejtek olyan sejtek, amelyek mikroszkopikus képe kisméretű vagy hiányzó magból és nagyméretű, kiterjedt csóvából áll, továbbá súlyosan károsodott sejteknek minősülnek, bár az etiológiájuk bizonytalan (lásd a 3. függeléket). A csóva DNS %-os arányának képelemzéssel végzett mérése a csóva külső megjelenése miatt megbízhatatlan, ezért a fantomsejteket külön kell értékelni. A fantomsejtek előfordulását fel kell jegyezni és jelentésbe kell foglalni, és a vélhetően a vizsgálati vegyi anyagnak tulajdonítható, releváns növekedést óvatosan kell megvizsgálni és értelmezni. A vizsgálati vegyi anyagok potenciális hatásmechanizmusának ismerete segítséget nyújt ezekhez a megfontolásokhoz.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Az állat a kísérleti egység, ezért mind az egyes állatokra vonatkozó adatokat, mind az összefoglalt eredményeket meg kell jeleníteni táblázatos formában. Az adatok hierarchikus jellege miatt a csóva DNS %-os arányának mediánját ajánlott minden egyes tárgylemez esetében meghatározni, és minden egyes állat esetében ajánlott kiszámítani a mediánértékek átlagát (12). Ezt követően az egyes állatokra vonatkozó átlagértékek átlagát kell meghatározni a csoportra vonatkozó átlag kiszámításához. Mindezeket az értékeket bele kell foglalni a jelentésbe. Tudományos és statisztikai szempontból indokolt esetben más megközelítések is alkalmazhatók (lásd az 53. pont). Statisztikai elemzés különféle megközelítések alapján végezhető (58) (59) (60) (61). Az alkalmazandó statisztikai módszerek kiválasztásakor a fenti hivatkozásokban tárgyalt módon mérlegelni kell, hogy kell-e transzformálni az adatokat (például logaritmusra vagy négyzetgyökre) vagy az összes értékhez (még a nullától különböző értékekhez is) hozzá kell-e adni egy alacsony számot (például 0,001-et) a sejtek nulla értéke által kifejtett hatások mérséklése érdekében. Mindkét ivar használata esetén a kezelés és az ivar közötti kölcsönhatás elemzésének részletezése, valamint a megállapított eltérések meglététől vagy elmaradásától függően végzett későbbi adatelemzés a 2. függelékben található. A toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat szintén jelentésbe kell foglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Egy-egy vizsgálat elfogadása az alábbi kritériumokon alapul:

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

Mindezen kritériumok teljesülése esetén úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag DNS-száltöréseket képes előidézni az ebben a vizsgálati rendszerben tanulmányozott szövetekben. Ha e kritériumok közül csak egy vagy kettő teljesül, lásd a 62. pontot.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha:

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag az e vizsgálati rendszerben tanulmányozott szövetekben nem képes DNS-száltörést előidézni.

Az egyértelműen pozitív vagy negatív válasz igazolása nem követelmény.

Amennyiben a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív (azaz az 59. és a 60. pontban felsorolt kritériumok mindegyike nem teljesül), illetve egy adott eredmény biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy további vizsgálatokkal kell értékelni, ha ez tudományosan indokolt. Hasznos lehet további sejtek értékelése (adott esetben) vagy megismételt kísérlet lehetőleg optimalizált kísérleti körülmények (például dózisok távolsága, más beadási módok, eltérő mintavételi időpontok vagy más szövetek alkalmazása) melletti elvégzése.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatkészlet eleve kizárja a pozitív vagy negatív eredményekre vonatkozó következtetést, ezért kétértelmű reakció lesz a következtetés.

A pozitív vagy kétértelmű eredmény biológiai relevanciájának értékeléséhez szükség van a célszövetben kifejtett citotoxicitásra vonatkozó információkra (lásd az 54–55. pontot). Ha pozitív vagy kétértelmű megállapítások kizárólag a citotoxicitásra utaló egyértelmű bizonyíték fennállása esetén figyelhetők meg, arra kell következtetni, hogy a vizsgálat a genotoxicitás szempontjából kétértelmű, kivéve, ha rendelkezésre áll elegendő olyan információ, amely alátámasztja a végleges következtetést. A vizsgálat negatív kimenetele esetében, amennyiben minden vizsgált dózisnál toxicitásra utaló jelek vannak, érdemes lehet nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Lúgos közegben végzett egysejtes gélelektroforézis : az egyes sejtek/sejtmagok szintjén bekövetkezett elsődleges DNS-károsodás kimutatására szolgáló, érzékeny eljárás.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Üstökös : a nukleoidok elektroforetikus mezőben felvett, az üstökösökéhez hasonlító alakja: a mag a sejtmag, a csóvát pedig a sejtmagból az elektromos mezőbe vándorló DNS alkotja.

Kritikus változó/paraméter : a protokoll változója, amelynek kismértékű változása jelentős hatást gyakorolhat a vizsgálat következtetésére. A kritikus változók szövetspecifikusak lehetnek. A kritikus változók nem módosítandók, különösen a vizsgálaton belül, annak figyelembevétele nélkül, hogy a módosítás hogyan változtatja meg a vizsgálaton belüli választ, például ahogyan a pozitív és a negatív kontrollok válaszának terjedelme és variabilitása azt jelzi. A Vizsgálati jegyzőkönyvben fel kell sorolni a kritikus változókat érintően a vizsgálat során vagy a laboratóriumra vonatkozó standard protokollhoz képest végzett változtatásokat, és azok mindegyikét meg kell indokolni.

Csóva-intenzitás vagy a csóva DNS %-os aránya : az üstököscsóva intenzitása a teljes intenzitáshoz (mag és csóva együttvéve) viszonyítva. A százalékos arányként kifejezett DNS-töredezettség mértékét tükrözi.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

UVCB : ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagok.

---

2. függelék

AZ IVAROK KÖZÖTTI ELTÉRÉSEK MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ FAKTORIÁLIS KÍSÉRLETTERVEZÉS AZ IN VIVO ÜSTÖKÖSVIZSGÁLAT SORÁN

A faktoriális kísérlettervezés és annak elemzése

Ebben a kísérlettervezésben legalább 5 hím és 5 nőstény vizsgálatára kerül sor mindegyik koncentrációszintnél, ami legalább 40 állat (20 hím és 20 nőstény, valamint a releváns pozitív kontrollok) felhasználását eredményezi.

A kísérlettervezés, amely az egyszerűbb faktoriális kísérlettervezések egyike, kétirányú varianciaanalízissel egyenértékű, ahol a fő tényezők az ivar és a koncentrációszintek. Az adatok számos standard statisztikai szoftvercsomag, például az SPSS, az SAS, a STATA, a Genstat, valamint az R használatával elemezhetők.

Az analízis az adatkészleten belül a variabilitást az ivarok közötti variabilitásra, a koncentrációk közötti variabilitásra, valamint az ivarok és a koncentrációk közötti kölcsönhatáshoz kapcsolódó variabilitásra osztja. Az egyes feltételeket ugyanazon koncentrációnak kitett, az azonos ivarú állatok csoportjain belüli párhuzamos állatok közötti variabilitás becsült értékéhez viszonyítva kell megvizsgálni. A mögöttes módszertanra vonatkozó kimerítő részletek számos statisztikai tankönyvben (lásd a hivatkozásokat) és a statisztikai szoftvercsomagokkal együtt biztosított súgófájlokban is megtalálhatók.

Az analízis az ivar x koncentráció kölcsönhatási feltételnek az ANOVA-táblázatban ( 13 ) való vizsgálatával folytatódik. Szignifikáns kölcsönhatás hiányában az egyes ivarok vagy az egyes koncentrációszintek közötti értékek kombinálásával érvényes statisztikai vizsgálat végezhető a szintek között, az ANOVA szerinti, csoporton belül összesített variabilitási feltétel alapján.

Az analízis a becsült koncentrációk közötti variabilitás kontrasztokká osztásával folytatódik, ami lehetővé teszi a válaszok lineáris és kvadratikus kontrasztjainak megállapítását valamennyi koncentrációszintnél. Ha az ivar x koncentráció kölcsönhatás szignifikáns, ez a feltétel lineáris x ivar és kvadratikus x ivar kölcsönhatására vonatkozó kontrasztokká osztható. E feltételek arra vonatkozó vizsgálatokat biztosítanak, hogy a koncentráció-válaszok párhuzamosak-e a két ivar esetében, illetve hogy a két ivar különböző választ ad-e.

A csoporton belül összesített variabilitásra vonatkozó becslés felhasználható az átlagok közötti eltérés páronkénti vizsgálatához. Ezek az összehasonlítások elvégezhetők a két ivarra vonatkozó átlagok között és a különböző koncentrációszintekre vonatkozó átlagok között; ilyen például a negatív kontrollok szintjével való összehasonlítás. Amennyiben szignifikáns kölcsönhatás tapasztalható, összehasonlítható a különböző koncentrációk adott ivaron belüli átlaga vagy az ivarok azonos koncentrációnál számított átlaga.

Hivatkozások

Számos olyan statisztikai tankönyv létezik, amely a faktoriális kísérlettervezések elméletét, kialakítását, módszertanát, elemzését és értelmezését tárgyalja, a legegyszerűbb kétfaktoros elemzéstől a kísérlettervezés módszertanában alkalmazott bonyolultabb formákig. Az alábbi nem kimerítő lista. Egyes könyvekben összehasonlítható kísérlettervezésekre vonatkozó kidolgozott példák találhatók, esetenként az analízisek különféle szoftvercsomagok segítségével történő lefuttatásához szükséges kóddal együtt.

---

3. függelék

A VIZSGÁLAT JELENLEGI KORLÁTAI

A tudomány jelenlegi állása miatt az in vivo üstökösvizsgálathoz több korlát kapcsolódik. E korlátok várhatóan mérséklődni fognak vagy a meghatározásuk szűkebb körű lesz, mivel a vizsgálat alkalmazása terén szerzett több tapasztalat megválaszolja a szabályozási környezetben felmerülő biztonsági kérdéseket.

Hivatkozások

”

„C.13.    Bioakkumuláció halakban: Vízi vagy étrendi expozíció

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 305. vizsgálati iránymutatásában (2012) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer felülvizsgálatának kettős célja van: Először is, magában kíván foglalni egy étrendi bioakkumulációs ( 14 ) vizsgálatot, amely alkalmas arra, hogy meghatározza a nagyon csekély vízoldékonyságú anyagok bioakkumulációs potenciálját. Másodszor szándékolt olyan vizsgálati módszer létrehozása, amely állatjóléti indokból adott esetben kevesebb halat használ fel, és amely költséghatékonyabb.

A C.13. konszolidált vizsgálati módszer (1) elfogadása óta eltelt évek során számos anyag vizsgálatára sor került, és mind a laboratóriumok, mind a szabályozó hatóságok jelentős tapasztalatra tettek szert. Ennek alapján arra a meggyőződésre jutottak, hogy a vizsgálat bonyolultságát mérsékelni lehet bizonyos konkrét kritériumok (vö. 88. pont) teljesülése esetén, és hogy lehetőség van lépcsőzetes megközelítésre. A tapasztalat azt is mutatta, hogy az olyan biológiai tényezők, mint a növekedés és a halak lipidtartalma, jelentősen befolyásolhatják az eredményeket, és azokat esetleg figyelembe kell venni. Ráadásul elismert tény, hogy a vízben nagyon csekély mértékben oldható anyagok vizsgálata a gyakorlatban nem mindig megvalósítható. Emellett vízi környezetben található, nagyon csekély mértékben vízoldékony anyagok tekintetében a vízi expozíció korlátozott jelentőségű lehet az étrendi módszerhez viszonyítva. Ez olyan vizsgálati módszer kialakításához vezetett, ahol a halakra étrendi expozíciót alkalmaznak (vö. 7–14. pont és 97. ponttól). Az étrendi expozíciós vizsgálat validálása (laboratóriumok közötti összehasonlítás) 2010-ben zajlott (51).

A fontosabb változások többek között a következők:

A bioakkumulációs vizsgálatok bármelyikének lefolytatása előtt a vizsgálati anyagról a következőket kell tudni:

A választott expozíciós módszertől vagy mintavételi rendszertől függetlenül ez a vizsgálati módszer az anyagok halakban megjelenő bioakkumulációs potenciáljának jellemzésére szolgáló eljárást írja le. Bár az átfolyásos vizsgálatot előnyben kell részesíteni, félstatikus rendszerek is megengedhetők, feltéve hogy az érvényességi kritériumoknak (vö. 24. és 113. pont) megfelelnek. Az étrendi expozíciós útvonalban nincs szükség átfolyásos rendszerre a vizsgálati anyag vízi koncentrációjának fenntartása érdekében, de segít fenntartani az oldott oxigén koncentrációját és tiszta vizet biztosít, továbbá megszünteti pl. az exkrétumok hatását.

A választott vizsgálati módszertől függetlenül e módszer elegendő részlettel szolgál a vizsgálat kivitelezéséhez, miközben kellő szabadságot enged a kísérleti terv egyes laboratóriumok körülményeihez és a vizsgálati anyagok változó jellemzőihez igazítására. A vízi expozíciós vizsgálat leghatékonyabban 1,5–6,0 log KOW értékkel rendelkező stabil szerves vegyi anyagokra alkalmazható (13), de még alkalmazható erőteljesen víztaszító anyagokra is (amelyek esetében a log KOW > 6,0), ha igazolható a vizsgálati anyag stabil és teljesen feloldott koncentrációja a vízben. Ha nem mutatható ki a vizsgálati anyag stabil koncentrációja a vízben, a vizes vizsgálat nem lenne megfelelő, és ezért az anyag halakban történő teszteléséhez az étrendi megközelítésre lesz szükség (jóllehet az étrendi vizsgálat eredményeinek kiértékelése és felhasználása a szabályozói kerettől függ). A kb. 9,0-ig terjedő log KOW értékkel rendelkező szerves vegyi anyagok előzetesen becsült biokoncentrációs tényezője (BCF, illetve néha KB) a Bintein és társai egyenletével kapható meg (14). A biokoncentrációs tényező (BCF) előzetesen becsült értéke az ilyen erősen víztaszító anyagok esetében feltehetően nagyobb lesz, mint a laboratóriumi kísérletekből várt állandósult állapoti biokoncentrációs tényező (BCFSS) értéke, különösen, ha egyszerű lineáris modellt alkalmaznak az előzetes becsléshez. A bioakkumulációs potenciált jellemző paraméterek a felvételi sebességi állandó (k 1), az ürülési sebességi állandó, ideértve a tisztulási sebességi állandót (k 2), az állandósult állapoti biokoncentrációs tényező (BCFSS), a kinetikus biokoncentrációs tényező (BCFK) és az étrendi biomagnifikációs tényező (BMF) ( 16 ).

A radioaktívan jelölt vizsgálati anyagok megkönnyíthetik a víz-, táp- és halminták analízisét, és felhasználhatók annak eldöntésére, hogy kell-e metabolit-azonosítást és -számszerűsítést végezni. Amennyiben csak az összes radioaktív maradékot mérték (például égetéssel vagy szövetfeloldással), a BCF vagy a BMF a kiindulási anyagon, bármely visszatartott metaboliton és az asszimilált szénen is alapul. A valamennyi radioaktív maradékon alapuló BCF vagy BMF értékeket ezért nem lehet közvetlenül összehasonlítani egyedül a kiindulási anyag egyedi kémiai analíziséből nyert BCF vagy BMF értékkel. A BCF vagy BMF kiindulási anyagon alapuló meghatározása érdekében a radioaktív jelölésen alapuló vizsgálatok során végzett elemzések előtt szétválasztási eljárásokat, pl. TLC, HPLC vagy GC ( 17 ) lehet alkalmazni. Szétválasztási módszerek alkalmazása esetén el kell végezni a kiindulási anyag és a megfelelő metabolitok azonosítását és számszerűsítését ( 18 ) (vö. 65. pont), ha a BCF vagy BMF értéknek a kiindulási anyag halban meglévő koncentrációján és nem az összes radioaktívan jelölt maradékon kell alapulnia. A halakon végzett anyagcsere-vizsgálatot vagy in vivo eloszlási vizsgálatot bioakkumuláció-vizsgálattal is lehet kombinálni a szövetekben levő maradékok analízise és azonosítása révén. Az anyagcsere lehetősége megfelelő eszközökkel jelezhető előre (pl. OECD QSAR eszköztár (15) és szabadalmaztatott QSAR programok).

Az azzal kapcsolatos döntést, hogy vízi vagy értrendi expozíciós vizsgálatot végezzenek-e és milyen összeállításban, a 3. pontban felsorolt tényezőkre kell alapozni, a megfelelő szabályozói keretet is figyelembe véve. Például a magas log KOW értékkel rendelkező, de a rendelkezésre álló analitikai módszerek érzékenységének fényében értékelhető vízoldékonyságot mutató anyagok tekintetében elsődlegesen a vízi expozíciós vizsgálatot kell mérlegelni. Lehetséges ugyanakkor, hogy a vízoldékonyságra vonatkozó információ nem meghatározó e víztaszító anyagok esetében, ezért az alkalmazandó vizsgálati módszerrel kapcsolatos döntés meghozatala előtt vizsgálni kell a vízi expozíciós vizsgálatra alkalmas, stabil, mérhető oldott vízi koncentrációk elkészítésének lehetőségét (a stabil emulziók nem megengedettek) (16). Nem lehet pontos, előíró jellegű iránymutatást adni arra vonatkozóan, hogy a vízoldékonyság és az oktanol-víz megoszlási hányados kizárási kritériumai alapján melyik módszert kell alkalmazni, mivel más tényezők (analitikai módszerek, bomlás, adszorpció stb.) észlelhető hatást gyakorolhatnak a módszer alkalmazhatóságára a fent említett okokból. Ugyanakkor az 5 feletti log KOW érték és a ~0,01 – 0,1 mg/l alatti vízoldékonyság kijelöli az anyagok azon tartományát, ahol a vízi expozíció egyre nehézkesebbé válhat.

A vizsgálat megválasztását esetlegesen befolyásoló más tényezőket is mérlegelni kell, beleértve az anyag vizsgálati edényekhez és készülékhez való lehetséges adszorpcióját, a vizes oldatokban való stabilitását szemben a haltápban tapasztalható stabilitásával (17) (18), stb.

Az ilyen gyakorlati szempontokkal kapcsolatos információ elérhető más, lezárt vizes vizsgálatokból. A bioakkumulációs vizsgálatok végrehajtásával kapcsolatos szempontok értékelésére vonatkozó további információ elérhető a szakirodalomban (pl. (19)).

Az olyan anyagok esetében, amelyeknél az oldhatóság vagy a vízben oldott koncentráció fenntartása, illetve e koncentrációk elemzése nem jelent korlátot a vízi expozíciós módszer megvalósítása számára, az anyagok biokoncentrációs potenciálját lehetőség szerint ezzel a módszerrel kell meghatározni. Mindenesetre ellenőrizni kell, hogy az alkalmazandó vízi expozíciós koncentráció(k) a vizsgálati közegben a vízoldékonyságon belül marad(nak). Az oldott vizsgálati anyag állandó koncentrációinak fenntartására különböző módszerek használhatók, például törzsoldatok vagy passzív adagolási rendszerek (pl. az oszlopelúciós módszer) alkalmazása, ameddig bizonyítható, hogy a koncentráció fenntartható és a vizsgálati közeg nem tér el a 27. pontban ajánlottól.

Az erőteljesen víztaszító anyagok (5 feletti log KOW érték és ~0,01 – 0,1 mg/l alatti vízoldékonyság) esetén a vízi expozíció egyre nehézkesebbé válhat. A korlátok oka lehet, hogy a vízben oldott koncentráció nem tartható fenn egy kellően állandónak tekinthető szinten (pl. az expozíciós tartóedények üvegére való rárakódás vagy a halak általi gyors felvétel miatt), vagy az, hogy az alkalmazandó vízi koncentráció annyira alacsony, hogy az analitikai meghatározási határ tartományába esik, vagy elmarad attól ( 19 ). E nagymértékben víztaszító anyagok esetében az étrendi vizsgálat ajánlott, feltéve hogy a vizsgálat összhangban van a vonatkozó szabályozói kerettel és a kockázatértékelési igényekkel.

A felületaktív anyagok esetében mérlegelni kell, hogy a vízi biokoncentrációs vizsgálat megvalósítható-e, tekintettel az anyag tulajdonságaira, egyébként az étrendi vizsgálat valószínűleg megfelelőbb. A felületaktív anyagok csökkentik a két folyadék közötti határfelületi feszültséget. Amfifil jellegük miatt (azaz, hogy mind hidrofil, mind víztaszító résszel rendelkeznek) felhalmozódnak olyan határfelületeken, mint a víz-levegő határfelület, a víz-táp határfelület és az üvegfalak, ami megakadályozza ezek vízi koncentrációjának meghatározását.

Az étrendi vizsgálat kiküszöbölheti az expozíciós szempontok némelyikét olyan összetett keverékek esetében, amelyek összetevőinek vízoldékonysági határértékei különböznek, ennyiben a keverék valamennyi alkotóelemének való hasonló expozíció valószínűbb, mint a vizes módszer esetén (vö. (20))

Meg kell jegyezni, hogy az étrendi megközelítés inkább étrendi biomagnifikációs tényezőt és nem biokoncentrációs tényezőt (BCF) ad ( 20 ). Rendelkezésre állnak megközelítések a kinetikus biokoncentrációs tényező (BCFK) becslésére az étrendi vizsgálatból nyert adatok alapján (amint azt a 8. függelék ismerteti), ám ezeket fenntartásokkal kell alkalmazni. Ezek a megközelítések elsősorban elsőrendű kinetikát feltételeznek, és csak vegyületek bizonyos csoportjaira alkalmazhatók. Valószínűtlen, hogy ezeket használni lehessen felületaktív anyagok esetében (lásd a 12. pontot).

Az olyan minimalizált vízi expozíciós vizsgálat, amelyet kevesebb mintavételi ponttal építenek fel az állatok számának és/vagy az erőforrásoknak a csökkentése érdekében (vö. a 83. ponttól), csak azokra az anyagokra alkalmazható, amelyek esetében okkal várható, hogy a felvétel és a tisztulás megközelítőleg elsőrendű kinetikát követ (azaz általában nem ionizált szerves anyagok esetében, vö. 88. pont).

C.13. – I:    Vízi expozíción alapuló biokoncentrációs halvizsgálat

A VIZSGÁLAT ELVE

A vizsgálat két fázisból áll: az expozíciós (felvételi) és az expozíció utáni (tisztulási) fázisból. A felvételi fázis alatt az egy fajhoz tartozó halak csoportja a vizsgálati anyag egy vagy több választott koncentrációjával érintkezik, a vizsgálati anyag tulajdonságaitól függően (vö. 49. pont). Ezután átkerülnek a vizsgálati anyagot nem tartalmazó közegbe a tisztulási fázisra. A tisztulási fázis mindig szükséges, kivéve, ha az anyag felvétele a felvételi fázis alatt elhanyagolható volt. A vizsgálati anyag koncentrációját a halakban/halakon (vagy meghatározott szövetén/szövetében) a vizsgálat mindkét fázisa alatt figyelemmel kísérik. A kitett csoporton túlmenően, a halak egy kontrollcsoportját azonos körülmények között tartják – leszámítva a vizsgálati anyag hiányát – annak érdekében, hogy a biokoncentrációs vizsgálat során megfigyelt esetleges ártalmas hatások a megfelelő kontrollcsoporthoz legyenek viszonyíthatók, és meghatározhatók legyen a vizsgálati anyag háttér-koncentrációi ( 21 ).

A vízi expozíciós vizsgálat során a felvételi fázis általában 28 nap. Ez az időtartam szükség esetén meghosszabbítható (vö. 18. pont), vagy lerövidíthető, ha igazolt, hogy az állandósult állapotot korábban elérték (a fogalommeghatározások és mértékegységek tekintetében lásd az 1. függeléket). Az 5. függelék egyenleteivel lehet következtetni a felvételi fázis hosszára és az állandósult állapot eléréséhez szükséges időre. A tisztulási periódus ezután a hal vizsgálati anyagnak való expozíciója megszüntetésével, azaz egy másik tiszta, ugyanolyan közeget, de vizsgálati anyagot nem tartalmazó edénybe való áthelyezésével kezdődik. Amennyiben lehetséges, a biokoncentrációs tényezőt lehetőleg az állandósult állapotban a halban (Cf) és vízben lévő (Cw) koncentráció arányaként (BCFSS; a meghatározást lásd az 1. függelékben), továbbá a felvételi (k 1) és tisztulási (k 2) sebességi állandó hányadosával, elsőrendű kinetikát feltételezve, kinetikus biokoncentrációs tényezőként (BCFK; a meghatározást és a mértékegységeket lásd az 1. függelékben) kell kiszámítani ( 22 ).

Amennyiben 28 nap alatt nem áll be az állandósult állapot, a BCF-et vagy kinetikus megközelítés alkalmazásával kell kiszámítani (vö. 38. pont), vagy a felvételi fázist meg kell hosszabbítani. Amennyiben ez megvalósíthatatlanul hosszú felvételi fázishoz vezetne az állandósult állapot eléréséig (vö. 37. és 38. pont, valamint 5. függelék), előnyben kell részesíteni a kinetikus megközelítést. Vagylagosan, nagymértékben víztaszító anyagok esetében az étrendi vizsgálat ajánlott ( 23 ), feltéve hogy az étrendi vizsgálat összhangban van a vonatkozó szabályozói kerettel.

A felvételi sebességi állandót, a tisztulási (ürülési) sebességi állandót (vagy állandókat, amennyiben összetettebb modellt alkalmaztak), a biokoncentrációs tényezőt (állandósult állapot és/vagy kinetikai), és amennyiben lehetséges, e paraméterek mindegyike esetében a konfidenciahatárokat, a halban és a vízben mért vizsgálatianyag-koncentrációt legjobban leíró modell szerint számítják ki (vö. 5. függelék).

A halak tömegének a vizsgálat során bekövetkező növekedése következtében a fejlődő halakban csökken a vizsgálatianyag-koncentráció (ez az úgynevezett növekedés okozta hígulás), így a kinetikus BCF-et alulbecslik, ha nem korrigálják a növekedés tekintetében (vö. 72. és73. pont).

A BCF a halban megfigyelt teljes koncentráción alapul (azaz teljes nedves tömegének függvényeként fejezik ki). Különleges célokra azonban meghatározott szövetek és szervek (pl. izom, máj) is használhatók, amennyiben a hal elég nagy, illetve ha a hal ehető (filé) és nem ehető (zsiger) részekre osztható. Mivel számos szerves anyagnál egyértelmű kapcsolat van a biokoncentrációs potenciál és a víztaszító képesség között, ezért ugyanilyen kapcsolat van a vizsgálati hal lipidtartalma és az ilyen anyagok megfigyelt biokoncentrációja között is. Ezért a nagy lipofilitású (azaz log KOW > 3) anyagokra kapott vizsgálati eredmények variabilitása e forrásának csökkentéséhez a biokoncentrációt 5 %-os lipidtartalmú halra normalizálva kell kifejezni (a teljes nedves testtömeg alapján), a vizsgálatból közvetlenül származtatott lipidtartalmon kívül. Erre azért van szükség, hogy olyan alapot szolgáltassanak, amelyből kiindulva a különböző anyagokkal és/vagy vizsgálati fajokkal kapcsolatos eredmények összevethetők egymással. Az 5 %-os lipidtartalom széles körben alkalmazott, mivel ez az ilyen vizsgálati módszerben általában használt halak átlagos lipidtartalmát jelenti (21).

A VIZSGÁLATI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

A vizsgálati anyag bevezetésben (3. pont) megadott tulajdonságain felül más szükséges információ a vizsgálat során alkalmazandó halfajokra gyakorolt, lehetőleg aszimptotikus LC50 (azaz az idő függvényében meghatározott) toxicitás és/vagy a hosszú távú halvizsgálatok (pl. C.47. (22), C.15. (23), C.14. (24) vizsgálati módszer) alapján becsült toxicitás.

Ismert pontosságú és érzékenységű analitikai módszernek kell rendelkezésre állnia a vizsgálati anyag kvantifikálására a vizsgálati oldatokban és a biológiai anyagban, a mintakészítés és tárolás részleteivel együtt. A vizsgálati anyag vízben és halszövetekben érvényes analitikai meghatározási határának is ismertnek kell lennie. Amennyiben radioaktívan jelölt vizsgálati anyagot használnak, annak a legnagyobb tisztaságúnak kell lennie (pl. lehetőség szerint > 98 %), és ismerni kell a szennyeződésekhez tartozó százalékos radioaktivitást.

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

A vizsgálat érvényességéhez a következő feltételeknek kell teljesülniük:

REFERENCIAANYAGOK

Ismert biokoncentrációs potenciállal és alacsony anyagcserével jellemzett referenciaanyagok alkalmazása hasznos lehet a kísérleti eljárás ellenőrzéséhez, ha erre szükség van (pl. ha a laboratórium nem rendelkezik korábbi tapasztalattal a vizsgálatot érintően, vagy ha a kísérleti körülmények megváltoztak).

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Felszerelés

A vizsgálat során kerülni kell az olyan anyagok használatát, amelyek oldódhatnak, szorbeálódhatnak vagy kimosódhatnak az eszközökből, és ártalmasak lehetnek a halakra. Szabványos, kémiailag közömbös anyagból készült, a töltési aránynak megfelelő térfogatú négyszögletes vagy hengeres tartályok használhatók (vö. 43. pont). A puha műanyag csövek használatát minimalizálni kell. Politetrafluoretilén, rozsdamentes acél és/vagy üvegcsövek használata ajánlott. A tapasztalatok alapján a nagy adszorpciós együtthatójú vizsgálati anyagok, mint a szintetikus piretroidok esetében szükséges lehet szilanizált üveg használata. Ilyen esetekben a felszerelést használat után el kell dobni. A vizsgálati szervezetek hozzáadása előtt a vizsgálati rendszereket lehetőség szerint annyi ideig kell kitenni a vizsgálati vegyi anyag vizsgálat során alkalmazandó koncentrációinak, amennyi a stabil expozíciós koncentrációk fenntartásának bizonyításához előírt.

Víz

A vizsgálathoz általában természetes vizet kell használni, amely nem szennyezett, és állandó minőségű forrásból származik. Ugyanakkor mesterséges víz (azaz olyan ásványmentesített víz, amelyhez ismert mennyiségben tápanyagot adtak) alkalmasabb lehet az állandó minőség időbeli biztosítására. A hígítóvíz (azaz a vizsgálati anyaggal a vizsgálati edénybe helyezés előtt elkevert víz, vö. 30. pont) minőségének lehetővé kell tennie a választott halfajok túlélését az akklimatizációs és a vizsgálati időszakok alatt anélkül, hogy bármilyen rendellenes külső megjelenés vagy viselkedés jelentkezne. Ideális esetben a vizsgálati fajok bizonyítottan képesek túlélni, fejlődni és szaporodni a hígítóvízben (pl. laboratóriumi tenyészetben, vagy életciklusra vonatkozó toxicitásvizsgálatnál). A vizet legalább a pH-val, keménységgel, valamennyi szilárd anyaggal, teljes szervesszén-tartalommal (TOC ( 25 )), és lehetőleg ammónium-, nitrittartalommal és alkalitással, továbbá tengeri fajok esetében sótartalommal is jellemezni kell. A halak optimális jólétéhez fontos paraméterek nem teljesen ismertek, de a 2. függelék megadja számos paraméter esetében az ajánlott maximális koncentrációt a vizsgálathoz használt édes- és tengervízre.

A vizsgálati időszak alatt a hígítóvíznek állandó minőségűnek kell lennie. A pH-értékének 6,0 és 8,5 között kell lennie a vizsgálat kezdetekor, de egy adott vizsgálat során ± 0,5 pH egységnyi tartományon belül kell maradnia. Analízis céljából bizonyos időközönként, de legalább a vizsgálat kezdetekor és végén mintákat kell venni annak érdekében, hogy a hígítóvíz ne befolyásolhassa hátrányosan a vizsgálati eredményeket (például a vizsgálati anyag komplexálásával), vagy ne legyen káros hatással a halállomány teljesítményére. Meg kell határozni a következők mennyiségét: a nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd és Ni), a fontosabb anionok és kationok (pl. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, és SO4 2–), a peszticidek (pl. összes szerves foszfor és összes szerves klór tartalmú peszticidek), a teljes szervesszén-tartalom és a szuszpendált szilárd anyagok, például háromhavonta, amennyiben a hígítóvízről tudott, hogy viszonylag állandó minőségű. Amennyiben a hígítóvíz minősége legalább egy éven keresztül állandónak bizonyul, a vizsgálatot ritkábban és nagyobb időközönként is el lehet végezni (pl. minden hat hónapban).

A hígítóvíz természetes részecske- és teljes szervesszén-tartalmának (TOC) is a lehető legalacsonyabbnak kell lenni, hogy a vizsgálati anyag ne adszorbeálódjon szerves anyagon, ami csökkenthetné a biológiai hasznosíthatóságot és egyúttal a BCF alulbecslését eredményezné. A maximális elfogadható érték 5 mg/l szemcsés anyagok esetében (szárazanyag, 0,45 μm-es szűrőn nem jut át) és 2 mg/l a teljes szervesszén-tartalom esetében (vö. 2. függelék). A hígítóvizet szűrni kell felhasználás előtt, amennyiben szükséges. A kísérleti halaktól (ürülék) és a tápmaradékból származó szerves széntartalom járulékának a lehető legkisebbnek kell lenni a vizsgálati vízben (vö. 46. pont).

Vizsgálati oldatok

A vizsgálati anyagból megfelelő koncentrációjú törzsoldatot kell készíteni. A törzsoldatot célszerű a vizsgálati anyagnak egyszerűen a hígítóvízbe keverésével vagy összerázással elkészíteni. Egyes esetekben megfelelő alternatíva lehet szilárd fázisú deszorpciós adagolási rendszer. Oldószerek és diszpergálószerek (oldódást segítő szerek) alkalmazása általában nem ajánlott (vö (25)); ugyanakkor ezen anyagok használata elfogadható lehet a megfelelő koncentrációjú törzsoldat létrehozásához, de minden erőfeszítést meg kell tenni az ilyen anyagok használatának minimalizálására, és ezeknek a micellák képződése szempontjából kritikus koncentrációját nem szabad túllépni (ha van ilyen). Alkalmazható oldószer az aceton, az etanol, a metanol, a dimetil-formamid és a trietilén-glikol; a korábban használt diszpergálószerek pedig a Tween 80, a 0,01 %-os metilcellulóz és a HCO-40. A végleges vizsgálati közegben az oldószer koncentrációjának valamennyi kezelés során azonosnak kell lennie (azaz függetlenül a vizsgálati anyag koncentrációjától), és az nem lépheti túl az oldószerre vizsgálati körülmények tekintetében meghatározott toxicitási küszöbértékeket. A legmagasabb szint a 100 mg/l (vagy 0,1 ml/l) koncentráció. Valószínűtlen, hogy a 100 mg/l oldószer-koncentráció jelentősen változtatna a vizsgálati anyag maximális, a közegben elérhető oldott koncentrációján (25). Ismerni kell, hogy az oldószer (a vizsgálati anyaggal együtt) mennyivel járul hozzá a vizsgálati víz teljes szervesszén-tartalmához. A vizsgálat során a vizsgálati edényekben a teljes szervesszén-tartalom nem haladhatja meg a vizsgálati anyagból és, amennyiben alkalmazták, az oldószerből vagy oldódást segítő szerből ( 26 ) származó szerves szén koncentrációját 10 mg/l-nél nagyobb mértékben (± 20 %). A szervesanyag-tartalom jelentős hatást gyakorolhat a szabadon oldott vizsgálati anyag mennyiségére az átfolyásos halvizsgálatok során, különösen az erősen lipofil anyagok tekintetében. A szilárd fázisú mikroextrakció (vö. 60. pont) fontos információt szolgáltathat a kötött és szabadon oldott vegyületek arányáról; a kettő közül ez utóbbi képviseli vélhetően a biológiailag hasznosítható részt. A vizsgálati anyag koncentrációja el kell maradjon a vizsgálati anyag vizsgálati közegben tapasztalható oldhatósági határértékétől oldószer vagy oldódást segítő szer használata ellenére. Gondosan kell eljárni a biológiailag könnyen lebontható oldószerek használata esetén, mivel átfolyásos vizsgálatokban baktériumnövekedés révén problémát okozhatnak. Ha oldódást segítő szer használata nélkül nem lehetséges törzsoldatot készíteni, meg kell fontolni, hogy az étrendi vizsgálat nem megfelelőbb-e a vízi expozíciós vizsgálattal szemben.

Átfolyásos vizsgálatokban a vizsgálati anyag törzsoldatát folyamatosan adagoló és hígító rendszerre (pl. állandó áramlási sebességet biztosító pumpa, szabályozható hígító rendszer, telítőrendszer) vagy szilárd fázisú deszorpciós adagolási rendszerre van szükség a vizsgálati koncentrációk kísérleti kamrákba juttatásához. Az egyes kamrák esetében lehetőség szerint legalább a napi öt térfogatcserét lehetővé kell tenni. Az átfolyásos mód részesítendő előnyben, de amennyiben nem alkalmazható (pl. ha a vizsgálati szervezetekre károsan hat), félstatikus módszer használható, feltéve hogy az érvényességi kritériumok teljesülnek (vö. 24. pont). A törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét a vizsgálat előtt 48 órával, és azt követően a vizsgálat során legalább naponta ellenőrizni kell. Az ellenőrzés magában foglalja az áramlási sebesség meghatározását az egyes vizsgálati kamrákban, és biztosítja, hogy ne változzon 20 %-nál nagyobb mértékben sem az egyes kamrákban, sem azok között.

A fajok megválasztása

A fajok megválasztásánál fontos követelmény, hogy könnyen és megfelelő méretben elérhetők, és a laboratóriumban kielégítő körülmények között tarthatók legyenek. A halfajok megválasztásának egyéb követelményei közé tartozik a fontosság rekreációs, kereskedelmi, ökológiai szempontból éppúgy, mint az összehasonlítható érzékenység, múltbeli sikeres használat stb. Az ajánlott vizsgálati fajok a 3. függelékben találhatók. Más fajok is használhatók, de a vizsgálati eljárást esetleg át kell dolgozni a megfelelő vizsgálati körülmények biztosításához. Ez esetben a fajok és a kísérleti módszer megválasztásának indoklását fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben. Általánosságban a kisebb halfajok használata lerövidíti az állandósult állapot eléréséhez szükséges időt, de több halra (mintára) lehet szükség a lipidtartalom és a halban található vizsgálatianyag-koncentrációk megfelelő elemzéséhez. Emellett lehetséges, hogy a fiatal és időseb egyedek közötti, a légzés sebességét és az anyagcserét érintő különbségek gátolhatják a különböző vizsgálatokkal és vizsgálati fajokkal elért eredmények összehasonlítását. Meg kell jegyezni, hogy a halfajok gyors növekedéssel járó (fiatal) életszakaszban történő vizsgálata bonyolíthatja az adatok kiértékelését.

A halak tartása (mind a vízi, mind az étrendi expozíció esetében)

A törzsállományt legalább kéthetes időszakban a vizsgálati hőmérsékleten akklimatizálni kell (vö. 28. pont), és kellő táplálékot kell biztosítani ez idő alatt (vö. 45. pont). Mind a víz, mind az étrend típusának meg kell egyeznie a vizsgálat során használttal.

A 48 órás betelepítési időszak után a mortalitást rögzíteni kell, és az alábbi követelményeket kell alkalmazni:

A vizsgálathoz csak láthatóan betegségtől és rendellenességtől mentes halak használhatók. A beteg halakat el kell dobni. A vizsgálatot megelőző két hétben és a vizsgálat alatt a halak nem kaphatnak kezelést betegségre.

A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE

Elővizsgálat

Hasznos lehet elővizsgálatokat végezni a meghatározó vizsgálat vizsgálati körülményeinek optimalizálására (pl. a vizsgálati anyag koncentrációjának megválasztása, a felvételi és tisztulási fázisok tartama), vagy annak meghatározása érdekében, hogy teljes vizsgálatot kell-e folytatni. Az elővizsgálatot úgy kell kialakítani, hogy be lehessen szerezni a szükséges információt. El lehet dönteni, hogy a BCF megállapításához elegendő-e minimalizált vizsgálat, vagy teljes vizsgálatra van szükség (vö. a minimalizált vizsgálatot ismertető 83–95. pont).

Az expozíció körülményei

A felvételi fázis időtartama

A felvételi fázis időtartamának előrejelzése előzetes tapasztalatból (pl. előző vizsgálatból vagy szerkezetileg rokon anyagot érintő akkumulációs vizsgálatból), vagy bizonyos, a vizsgálati anyag vízoldékonysága, vagy oktanol/víz megoszlási együtthatója ismeretét felhasználó tapasztalati összefüggésekből nyerhető (feltéve, hogy a felvétel első rendű kinetikát követ, vö. 5. függelék).

A felvételi fázisnak 28 napig kell tartania, kivéve, ha igazolható, hogy az állandósult állapot korábban kialakult (lásd az 1. függeléket a fogalommeghatározások és mértékegységek tekintetében). Állandósult állapot látható a halban mért vizsgálati anyag (Cf) időfüggő ábráján, amennyiben a görbe párhuzamos az időtengellyel, és a Cf három egymást követő, legalább két nap különbséggel vett mintán alapuló elemzése ± 20 %-on belül van egymáshoz képest, és a Cf jelentős időbeli növekedése nem tapasztalható az első és az utolsó egymást követő elemzés között. Összevont minták analízisénél legalább négy egymást követő analízis szükséges. Olyan vizsgálati anyagoknál, amelyek felvétele lassú, megfelelőbbek a hétnapos időközök. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 28 nap alatt, vagy a BCF-et kell kizárólag a kinetikus megközelítéssel kiszámítani, ami nem függ az állandósult állapot elérésétől, vagy a felvételi fázist kell kiterjeszteni további méréseket végezve, amíg az állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 60 napig. Emellett a felvételi fázis végén a vizsgálati anyag halban lévő koncentrációjának kellően magasnak kell lennie a tisztulási fázisból a k2 megbízható becslésének garantálása érdekében. Ha 28 nap elteltével nem mutatható ki jelentős felvétel, a vizsgálat leállítható.

A tisztulási fázis időtartama

Az elsőrendű kinetikát követő anyagok esetében a felvételi fázis időtartamának a fele rendszerint elég a test anyagterhelésének megfelelő (pl. 95 %-os) csökkenéséhez (vö. 5. függelék a becslés magyarázatához). Amennyiben a 95 %-os csökkenéshez szükséges idő aránytalanul hosszú, meghaladja például a felvételi fázis hosszának kétszeresét (azaz több mint 56 nap), rövidebb időtartam is alkalmazható (azaz amíg a vizsgálati anyag koncentrációja kisebb lesz az állandósult állapoti koncentráció 10 %-ánál). Az elsőrendű kinetikát eredményező egyrekeszes modellnél összetettebb felvételi és tisztulási fázissal rendelkező anyagoknál azonban hosszabb tisztulási fázisra lehet szükség. Ha ennyire összetett mintázat tapasztalható és/vagy várható, a vizsgálat megfelelő kialakításának biztosítása érdekében ajánlott biostatisztikustól és/vagy farmakokinetikustól szakvéleményt kérni. Meghosszabbított tisztulási időszak esetén a mintába felveendő halak száma korlátokat jelenthet, és a halak közötti növekedésbeli különbségek befolyásolhatják az eredményt. Az időtartamot az a periódus szabhatja meg, amelynek során a halban a vizsgálati anyag koncentrációja az analitikai meghatározási határ fölött marad.

A vizsgálati halak száma

A halak számát vizsgálati koncentrációnként úgy kell kiválasztani, hogy legalább négy hal álljon rendelkezésre minden mintavételi ponton. A halakat csak akkor lehet összevonni, ha az egyedi halvizsgálat nem megvalósítható. Ha a görbeillesztésben (és a származtatott paraméterekben) nagyobb pontosságot kívánnak elérni, vagy ha anyagcsere-vizsgálatra van szükség (pl. a metabolitok és a kiindulási anyag közötti különbségtétel érdekében radioaktívan jelölt vizsgálati anyagok esetén), mintavételi pontonként több halat kell biztosítani. A lipidtartalmat ugyanazon a biológiai anyagon kell meghatározni, mint amit a vizsgálati anyag koncentrációjának meghatározására használtak. Amennyiben ez nem megvalósítható, további halakra lehet szükség (vö. 56–57. pont).

Ha felnőtt (azaz ivarérett) halakat használnak, azok nem lehetnek az ívási időszakban, illetve nem lehetnek olyanok, amelyek a közelmúltban raktak ikrát (azaz már leikrázott halak) akár a vizsgálat előtt, akár annak során. Rögzíteni kell, hogy hímeket vagy nőstényeket, vagy mindkettőt használnak-e a kísérletben. Mindkét ivar használata esetén dokumentálni kell, hogy az expozíció kezdete előtt a két ivar között a növekedés és a lipidtartalom különbsége jelentéktelen; különösen, ha szükséges lehet a hím és nőstény halak egybegyűjtése az anyag kimutatható koncentrációinak és/vagy a lipidtartalom garantálására.

Mindegyik vizsgálatban hasonló tömegű halakat kell kiválasztani úgy, hogy a legkisebbek ne legyenek kisebbek a legnagyobb hal tömegének kétharmadánál. Ugyanabba a korcsoportba tartozzanak, és a származásuk is azonos legyen. Mivel a halak tömege és kora jelentős hatással lehet a BCF értékekre (12), ezeket a részleteket pontosan rögzíteni kell. Ajánlott az átlagtömeg becslése érdekében a vizsgálat kezdete előtt röviddel a halállomány egy mintaalcsoportját lemérni (vö. 61. pont).

Betelepítés

A halak méretéhez viszonyítva nagy mennyiségű vizet kell használni annak érdekében, hogy minimalizálni lehessen a vizsgálati vegyület vízben lévő koncentrációjában a vizsgálat kezdetén halak hozzáadásával okozott csökkenést, és hogy elkerülhető legyen az oldott oxigén koncentrációjának csökkenése. Fontos, hogy a betelepítési arány a használt vizsgálati fajnak megfelelő legyen. Minden esetben 0,1–1,0 g hal (nedves tömeg) per liter víz per nap az ajánlott betelepítési arány. Akkor használható nagyobb betelepítési arány, ha igazolt, hogy a vizsgálati anyag megkövetelt koncentrációja ± 20 %-os határon belül tartható, és hogy az oldott oxigén koncentrációja nem esik 60 %-os telítettség alá (vö. 24. pont).

A megfelelő betelepítési rendszerek kiválasztásánál a halfajok természetes élőhelyét figyelembe kell venni. A fenéken élő halak például nagyobb alapterületű akváriumot igényelnek ugyanazon víztérfogat esetén, mint a nyílt vízi halfajok.

Etetés

Az akklimatizációs és vizsgálati időszak alatt a halakat megfelelő, ismert lipid- és összfehérje-tartalmú táppal kell etetni, az egészségük megőrzéséhez és a testtömegük fenntartásához elegendő mennyiségben (valamennyi növekedés megengedett). Az alkalmazott fajtól, a kísérleti körülményektől és a tápanyag kalorikus értékétől függően naponta rögzített szinten kell etetni az akklimatizációs és a vizsgálati időszakban (pl. a szivárványos pisztráng esetében a testtömeg megközelítőleg 1–2 %-a naponta). Az etetési arányt úgy kell megválasztani, hogy el lehessen kerülni a gyors növekedést és a lipidtartalom számottevő emelkedését. Azonos etetési arány fenntartása érdekében a táp mennyiségét adott esetben, például hetente újra kell számolni. E számításhoz az egyes vizsgálati kamrákban található halak tömege a kamrából legújabban vett halminta tömegéből becsülhető meg. A kamrában maradó halakat nem kell lemérni.

A vizsgálati kamrákból a maradék tápot és az ürüléket az etetést követően rövid időn belül (30 perc–1 óra) naponta szívócsövön keresztül el kell távolítani. A vizsgálat alatt a kamrákat a lehető legtisztábban kell tartani, hogy a szervesanyag-koncentráció a lehető legkisebb legyen (vö. 29. pont), mivel a szerves szén jelenléte korlátozhatja a vizsgálati anyag biológiai hasznosíthatóságát (12).

Mivel számos táp készül hallisztből, biztosítani kell, hogy a táp ne befolyásolja a vizsgálati eredményeket vagy váltson ki káros hatásokat, pl. abból eredően, hogy növényvédő szereket, nehézfémeket és/vagy magát a vizsgálati anyagot (vagy ezek nyomait) tartalmazza.

Fény és hőmérséklet

12–16 órás megvilágítási idő javasolt, és hőmérsékletnek megfelelőnek (± 2 °C) kell lennie vizsgálati fajok számára (vö. 3. függelék). A megvilágítás típusának és jellemzőinek ismertnek kell lennie. Figyelmet kell fordítani a vizsgálati anyag – a vizsgálat megvilágítási körülményei közötti – lehetséges fototranszformációjára. Megfelelő megvilágítást kell használni, hogy a fény hatására nem természetes bomlástermékek lehetőleg ne keletkezzenek. Néhány esetben megfelelő lehet a 290 nm alatti UV-sugárzást kiszűrő ernyő használata.

Vizsgálati koncentrációk

A vizsgálatot eredetileg nem poláris szerves anyagokra tervezték. Az ilyen típusú anyagok esetében a halak egyetlen koncentrációjának való expozíciója elegendő, mivel nem várható koncentrációs hatás, jóllehet a vonatkozó szabályozói keret kétféle koncentrációt is előírhat. Ha e körön kívüli anyagokat vizsgálnak, vagy a koncentrációtól való lehetséges függésre utaló jelek ismertek, a vizsgálatot két vagy több koncentrációval kell lefolytatni. Ha csak egy koncentrációt vizsgálnak, az egy koncentráció alkalmazását indokolni kell (vö. 79. pont). A vizsgálati koncentrációnak emellett olyan alacsonynak kell lennie, ami praktikus vagy gyakorlatilag megvalósítható (azaz nem közel az oldhatósági határhoz).

Egyes esetekben várható, hogy az anyag biokoncentrációja a vízbeli koncentrációtól függ (azaz fémek esetében, ahol a halak általi felvétel legalább részben szabályozott lehet). Ilyen esetben szükséges, hogy legalább két, de inkább több, környezeti szempontból releváns koncentrációt vizsgáljanak (vö. 49. pont). Emellett olyan anyagok esetében, amelyeknél a vizsgálati koncentrációnak gyakorlati okokból az oldhatósági határhoz közel kell lennie, javasolt legalább két koncentráció vizsgálata, mivel ez rálátást biztosíthat az expozíciós koncentrációk megbízhatóságára. A vizsgálati koncentrációk megválasztásába bele kell foglalni a környezeti szempontból reális koncentrációt, illetve az adott értékelés céljából releváns koncentrációt.

A vizsgálati anyag koncentrációját/koncentrációit úgy kell megválasztani, hogy azok a krónikus hatási szintje alatt, vagy az akut aszimptotikus LC50-értékének körülbelül 1 %-a alatt maradjanak egy környezeti szempontból releváns tartományban, és legalább egy nagyságrenddel meg kell haladják az alkalmazott analitikai módszerre vízben jellemző meghatározási határt. A legnagyobb megengedett vizsgálati koncentráció az akut (96 órás)/krónikus LC50 aránnyal is meghatározható (néhány anyag esetében a megfelelő arány kb. 3 lehet, de egyes esetekben 100 felett). Amennyiben második koncentrációt is alkalmaznak, azt úgy kell megválasztani, hogy a fenti értéktől 10-es szorzótényezővel különbözzön. Amennyiben ez nem lehetséges a toxicitási kritérium miatt (amely korlátozza a vizsgálati koncentráció felső határát) és az analitikai határérték miatt (amely korlátozza a vizsgálati koncentráció alsó határát), 10-nél kisebb szorzótényező is használható, és fontolóra kell venni radioaktívan jelölt (a legmagasabb, lehetőség szerint > 98 % tisztaságú) vizsgálati anyag használatát. Gondoskodni kell arról, hogy a vizsgálati anyag vizsgálati közegben jellemző oldhatósági határa feletti koncentrációt ne alkalmazzanak.

Kontrollcsoportok

A vizsgálati sorozaton kívül hígítóvizet tartalmazó kontrollt (vö. 30. és 31. pont), és az oldószert tartalmazó kontrollt is be kell állítani.

A vízminőség mérésének gyakorisága

A vizsgálat során mindegyik vizsgálati és kontrolledényben mérni kell az oldottoxigén-koncentrációt, a teljes szervesszén-tartalmat (TOC), a pH-értéket és a hőmérsékletet. A vízkeménységet és a sótartalmat (amennyiben ez mérvadó szempont) mérni kell a kontroll(ok)ban és az egyik edényben. Ha két vagy több koncentrációt vizsgálnak, ezeket a paramétereket a magasabb (vagy a legmagasabb) koncentrációnál kell mérni. Az oldott oxigént és (adott esetben) a sótartalmat legalább háromszor kell mérni a felvételi periódusban – annak elején, közepén és a végén – és egyszer egy héten a tisztulási periódusban. TOC-t a vizsgálat kezdetén (a felvételi fázis előtt 24 és 48 órával) a halak bevitele előtt, és a felvételi és tisztulási fázis alatt pedig legalább hetente egyszer kell mérni. A hőmérsékletet naponta, pH-t a periódusok kezdetén és végén, a keménységet vizsgálatonként egyszer kell mérni és rögzíteni. A hőmérsékletet ajánlott folyamatosan mérni, legalább egy edényben.

Hal- és vízmintavételezés és -analízis

Mintavételezési ütemterv

A vizsgálati kamrákból a vizsgálati anyag koncentrációjának meghatározásához a halak bevitele előtt, valamint a felvételi és a tisztulási fázis alatt kell vízmintát venni. Vízmintát a halmintával egy időben, etetés előtt kell venni. A gyakoribb mintavétel hasznos lehet a halak bevitelét követő állandó koncentráció biztosítása érdekében. A felvételi fázis alatt meg kell határozni a vizsgálati anyag koncentrációját az érvényességi kritériumok teljesülésének ellenőrzése céljából (24. pont). Ha a tisztulási fázis elején vett vízminta elemzése nem mutat ki vizsgálati anyagot, ez felhasználható annak indokolására, hogy miért nem mérik a vizsgálati anyagot a vizsgálati és a kontrollvízben a tisztulási fázis fennmaradó részében.

A felvételi fázis alatt legalább ötször, a tisztulási fázis alatt legalább négyszer kell halmintát venni a vizsgálati anyag tekintetében. Mivel egyes esetekben e mintaszámok alapján nehéz ésszerűen pontosan megbecsülni a BCF értékét, különösen, ha az egyszerű elsőrendűtől eltérő felvételi és tisztulási kinetika mutatkozik, tanácsos mindkét periódusban gyakrabban mintát venni (vö. 4. függelék).

A lipidtartalmat ugyanazon a biológiai anyagon kell meghatározni, mint amelyet a vizsgálati anyag koncentrációjának meghatározására használtak, legalább a felvételi fázis elején és végén, illetve a tisztulási fázis végén. Amennyiben ez nem megvalósítható, legalább három független halat kell mintavételezni a lipidtartalom meghatározására ugyanezen három időpont mindegyikében. A halak tartályonkénti számát a kísérlet kezdetekor ennek megfelelően kell kiigazítani ( 27 ). Vagylagosan, ha a kontrollhalakban (azaz a törzsállományból származó halakban) nem mutatható ki a vizsgálati anyag jelentős mennyisége, a vizsgálatban alkalmazott kontrollhalakat csak a lipidtartalom tekintetében kell vizsgálni, és a vizsgálati csoport(ok)ban a vizsgálati anyag elemzése (és a kapcsolódó felvételi sebességi állandó, tisztulási sebességi állandó és BCF-értékek) kiigazítható a kontrollcsoport lipidtartalmában a vizsgálat során bekövetkezett változásoknak megfelelően ( 28 ).

Elpusztult vagy beteg halat nem szabad a vizsgálati anyag vagy a lipidkoncentráció tekintetében elemezni.

Az elfogadható mintavételi ütemterv egy példája a 4. függelékben található. Más feltételezett KOW-értékkel más ütemtervet is gyorsan ki lehet dolgozni a 95 %-os felvételhez szükséges expozíciós idő kiszámításához (a számítások tekintetében lásd az 5. függeléket).

A mintavételezést a felvételi fázisban addig kell folytatni, amíg létre nem jön az állandósult állapot (lásd az 1. függeléket a fogalommeghatározások és a mértékegységek tekintetében), vagy ameddig a felvételi fázis más okból le nem zárul (28 vagy 60 napot követően; vö. 37. és 38. pont). A tisztulási fázis kezdete előtt a halakat át kell helyezni tiszta edényekbe.

Mintavételezés és minta-előkészítés

Az analízishez a vízmintákat például inert csövön keresztül, a vizsgálati kamra középső pontjából veszik. A centrifugálás és a szűrés sem képes mindenkor arra, hogy szétválassza a vizsgálati anyag biológiailag nem hasznosítható részét a biológiailag hasznosíthatótól. Ha szétválasztási technikát alkalmaznak, a Vizsgálati jegyzőkönyvben mindig meg kell adni e technika indoklását vagy validálását, tekintettel a biológiai hasznosíthatósággal kapcsolatos nehézségekre (25). Főként a nagymértékben víztaszító anyagok esetében (azaz, amelyeknél a log KOW érték > 5) (12) (26), ahol előfordulhat a szűrőre vagy a centrifugáló tartályokra való rárakódás, a mintákat nem szabad ilyen kezelésnek alávetni. Ehelyett a tartályokat minél tisztábban kell tartani (vö. 46. pont), és a teljes szervesszén-tartalmat a felvételi és a tisztulási fázis alatt is figyelemmel kell kísérni (vö. 53. pont). Az alacsonyabb biológiai hasznosíthatósággal kapcsolatos lehetséges problémák elkerülése érdekében szilárd fázisú mikroextrakciós technikákkal történő mintavételt lehet alkalmazni a csekély mértékben oldható és rendkívül víztaszító anyagok esetében.

A mintába felvett halat azonnal le kell ölni, a legmegfelelőbb és leghumánusabb módszerrel (a teljes halra vonatkozó mérések esetén a vízzel való leöblítésen, vö. 28. pont, és a hal itatóspapírral történő szárításán túlmenően nincs szükség további eljárásra). A hal tömegét és teljes hosszát meg kell mérni ( 29 ). Az egyes halak esetében a mért tömeget és hosszt össze kell kapcsolni az elemzett anyag koncentrációjával (és adott esetben a lipidtartalommal), például az egyes mintavételezett halakra alkalmazott egyedi azonosító kóddal.

A lebomlás vagy egyéb veszteségek elkerülése érdekében a halakat és a vizet lehetőleg rögtön mintavételezés után kell analizálni, és a vizsgálat előrehaladtával ki kell számolni a felvételi és a tisztulási sebességi állandó közelítő értékeit. Az azonnali analízis lehetővé teszi annak kiküszöbölését is, hogy egy platót (állandósult állapotot) késve ismerjenek fel.

Az azonnali analízis meghiúsulása esetén a mintákat megfelelő módszerrel kell tárolni. A vizsgálat kezdete előtt információkat kell szerezni a különböző vizsgálati anyagok tárolásának megfelelő módszeréről – például mélyhűtés, 4 °C-on tartás, extrakció stb. A tárolás időtartamát úgy kell megválasztani, hogy biztosított legyen, hogy az anyag ne romoljon meg a tárolás során.

Az analitikai módszer minősége

Mivel az egész eljárást alapvetően a vizsgálati anyaghoz használt analitikai módszer pontossága és érzékenysége határozza meg, kísérlettel ellenőrizni kell az anyag analízisének pontosságát és reprodukálhatóságát, és azt, hogy a vizsgálati anyag vízből és halakból való visszanyerése az adott módszer tekintetében kielégítő-e. Ennek az elővizsgálat részét kell képeznie. Azt is ellenőrizni kell, hogy a vizsgálati anyag nem észlelhető-e a használt hígítóvízben. A vizsgálati anyag vízben és halakban meglévő koncentrációjának a vizsgálat során kapott értékeit – szükség szerint – korrigálni kell a visszanyeréssel és a kontrollok háttérértékeivel. A hal- és vízmintákkal végig úgy kell bánni, hogy minimális legyen a szennyezés és a (pl. a mintavevő eszköz adszorpciójából eredő) veszteség.

Halminták analízise

Amennyiben a vizsgálat során radioaktívan jelölt anyagokat használtak, mérhető az össz-radioaktivitás (a kiindulási anyagé és a metabolitokét együttesen), vagy a minták megtisztíthatók úgy, hogy a kiindulási anyag külön analizálható legyen. Ha a BCF-nek a kiindulási anyagon kell alapulnia, legalább a felvételi fázis végén jellemezni kell a főbb metabolitokat (vö. 6. pont). A főbb metabolitok azok, amelyek a halszövetben az összes maradékanyag ≥ 10 %-át képviselik, amelyek két egymást követő mintavételi ponton ≥ 5 %-át képviselik, amelyek a felvételi fázis egészében emelkedő szintet mutatnak, továbbá amelyekkel kapcsolatosan toxikológiai aggályok ismertek. Ha az egész halra vonatkozó BCF az összes radioaktív jelöléssel ellátott maradékanyag esetében ≥ 500, tanácsos – és az anyagok egyes kategóriái, például a peszticidek esetében erőteljesen ajánlott – a főbb metabolitok azonosítása és számszerűsítése. E metabolitok számszerűsítését egyes szabályozó hatóságok is előírhatják. Ha a halszövetben az összes radioaktív jelöléssel ellátott maradékanyag ≥ 10 %-ában azonosítanak és számszerűsítenek bomlástermékeket, ajánlott a bomlástermékek vizsgálati vízben történő azonosítása és számszerűsítése is. Amennyiben ez nem megvalósítható, ezt ki kell fejteni a Vizsgálati jegyzőkönyvben.

A vizsgálati anyag koncentrációját rendszerint meg kell határozni minden lemért halban. Amennyiben ez nem lehetséges, az egyes mintavételi alkalmakkor összevonhatók a minták, de az összesítés korlátozza az adatokra alkalmazható statisztikai eljárások számát, ezért a kívánt összevonási eljáráshoz, statisztikai eljáráshoz és statisztikai erőhöz szükséges, megfelelő számú halat kell felvenni a vizsgálatba. A (27) és (28) referencia használható a megfelelő összevonási eljárások bevezetéseként.

A BCF-et (a nedves tömeg alapján) 5 %-os lipidtartalmú halra normalizálva kell kifejezni a vizsgálatból közvetlenül származtatotton kívül (vö. 21. pont), kivéve, ha igazolható, hogy a vizsgálati anyag elsődlegesen nem lipidekben halmozódik fel. A halak lipidtartalmát minden mintavételi alkalommal meg kell határozni amennyiben lehetséges, ezt lehetőség szerint a vizsgálati anyag analíziséhez készítettel azonos extraktumon kell elvégezni, mert a lipideket gyakran el kell távolítani az extraktumból, mielőtt kromatográfiásan elemezhetők lennének. Ugyanakkor a vizsgálati anyagok elemzéséhez gyakran speciális extrakciós eljárásokra van szükség, amelyek ellentmondásban lehetnek a lipid meghatározására szolgáló vizsgálati módszerekkel. Ebben az esetben (amíg nem áll rendelkezésre megfelelő, nem destruktív műszeres módszer), ajánlott különböző stratégiát alkalmazni a hal lipidtartalmának meghatározására (vö. 56. pont). A lipidtartalom meghatározására megfelelő módszereket kell alkalmazni (20). Szabványmódszerként a kloroform/metanol extrakciós technika (29) ajánlott (30), alternatív technikaként pedig a Smedes-féle módszer (31). Ez utóbbi módszert az extrakció összehasonlítható hatékonysága, nagy pontosság, kevesebb toxikus szerves oldószer alkalmazása jellemzi, emellett könnyen elvégezhető. Megfelelő indoklással alkalmazhatók más olyan módszerek, amelyek tekintetében a pontosság lehetőség szerint az ajánlott módszerekhez hasonló. Az alkalmazott módszert fontos részletesen ismertetni.

A halak növekedésének mérése

A vizsgálat kezdetén a törzsállományból öt–tíz hal tömegét és teljes hosszát kell egyenként lemérni. Ezek megegyezhetnek a lipidanalízishez használt halakkal (vö. 56. pont). Az egyes mintavételekhez használt, mind a vizsgálati, mind a kontrollcsoportból származó halak tömegét és hosszát a kémiai és lipidanalízis előtt meg kell mérni. E mintába felvett halakra vonatkozó mérések használhatók a vizsgálati és kontrolltartályokban maradó halak tömegének és hosszának becsléséhez (vö. 45. pont).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Eredmények feldolgozása

A vizsgálati anyag felvételi görbéje úgy jön létre, hogy a felvételi fázisban a halakban/halakon (vagy meghatározott szövetekben/szöveteken) mért koncentrációt az idő függvényében, aritmetikus skálán ábrázolják. Amennyiben a görbe platót ér el, vagyis megközelítőleg párhuzamos az időtengellyel, az állandósult állapoti BCF (BCFSS) a következő képlet alapján számolható:

A Cf alakulását befolyásolhatja a halak növekedése (vö. 72. és 73. pont). Az expozíciós koncentráció átlagát (Cw) az időbeli eltérés befolyásolja. Várható, hogy az idővel súlyozott átlagos koncentráció relevánsabb és pontosabb a bioakkumulációs vizsgálatok szempontjából, még akkor is, ha az eltérés a megfelelő validálási tartományon belül van (vö. 24. pont). A vízben mért idővel súlyozott átlagos koncentráció (TWA) az 5. függelék 1. szakasza alapján számítható ki.

A kinetikus biokoncentrációs tényezőt (BCFK) a két elsőrendű kinetikai sebességállandó k 1/k 2 hányadosaként kell meghatározni. A k 1, k 2 sebességállandókat és a BCFK-t a felvételi és a tisztulási fázis egyidejű illesztéséből lehet kinyerni. Vagylagosan a k 1-et és a k 2-t lépcsőzetesen is meg lehet határozni (lásd az 5. függeléket e két módszer leírása és összehasonlítása tekintetében). A tisztulási sebességi állandót (k 2) esetleg korrigálni kell a növekedés okozta hígulásra tekintettel (vö. 72. és 73. pont). Amennyiben a felvételi és/vagy tisztulási görbe nyilvánvalóan nem elsőrendű, összetettebb modelleket kell alkalmazni (lásd az 5. függelék hivatkozásait), és biostatisztikus és/vagy farmakokinetikus szakvéleményét kell kikérni.

A halak tömegére/hosszára vonatkozó adatok

Az egyes halak nedves tömegét és teljes hosszát minden mintavételezési intervallum vonatkozásában elkülönített táblázatban kell vezetni a vizsgálati és a kontrollcsoport tekintetében a felvételi (ideértve a felvételi fázis kezdetén meglévő törzsállományt) és a tisztulási fázis során. Az egyes halak esetében a mért tömeget és hosszt össze kell kapcsolni az elemzett vegyi anyag koncentrációjával, például a mintába felvett egyes halakra alkalmazott egyedi azonosító kóddal. A kinetikus BCF-értékek növekedés okozta hígulásra tekintettel történő korrigálásának céljára a növekedés előnyben részesített mértéke a tömeg (lásd a 73. pontot és az 5. függeléket a növekedés okozta hígulás tekintetében alkalmazott korrekció módszere vonatkozásában).

A növekedés okozta hígulásra tekintettel alkalmazott korrekció és a lipidtartalomra tekintettel történő normalizáció

A halak tisztulási fázisban bekövetkezett növekedése csökkentheti a halakban mért vegyianyag-koncentrációt, ezáltal a teljes tisztulási sebességi állandó (k 2) magasabb lesz, mint a kiválasztási folyamatokból (pl. légzés, anyagcsere, kiürítés) eredne. A kinetikus biokoncentrációs tényezőket korrigálni kell a növekedés okozta hígulásra tekintettel. A növekedés a BCFSS-t is befolyásolja, de nem áll rendelkezésre elfogadott eljárás a BCFSS növekedésre tekintettel történő korrigálására. Jelentős növekedés esetén a növekedésre tekintettel korrigált BCFK-t (BCFKg) is számítani kell, mivel lényegesebb mérték lehet, mint a biokoncentrációs tényező. A vizsgálati halak lipidtartalma (amely nagymértékben összefügg a víztaszító anyagok biológiai felhalmozódásával) kellő mértékben változhat a gyakorlatban, így szükség lehet egy rögzített lipidtartalomra (5 % w/w) tekintettel történő normalizációra, amely hasznosan jeleníti meg mind a kinetikus, mind az állandósult állapoti biokoncentrációs tényezőket, kivéve, ha igazolható, hogy a vizsgálati anyag elsődlegesen nem lipidekben halmozódik fel (pl. egyes perfluorozott anyagok fehérjékhez kapcsolódhatnak). Az e számításokkal kapcsolatos egyenletek és példák az 5. függelékben találhatók.

A kinetikus BCF növekedés okozta hígulásra tekintettel történő korrigálásához a tisztulási sebességi állandót ki kell igazítani a növekedés figyelembevételével. A növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandó (k 2g) a növekedési sebességi állandó (a mért tömeggel kapcsolatos adatokból számolt k g) teljes tisztulási sebességi állandóból (k 2) való kivonásával számítható ki. A növekedéssel korrigált kinetikus biokoncentrációs tényezőt ezt követően úgy lehet kiszámítani, hogy el kell osztani a felvételi sebességi állandót (k 1) a növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandóval (k 2g) (vö. 5. függelék). Egyes esetekben ez a megközelítés hibás lehet. Például nagyon lassan tisztuló, gyorsan növekedő halakban vizsgált anyagok esetében a származtatott k 2g nagyon csekély lehet, így az ennek származtatásához használt két sebességi állandóban kritikus lesz a hiba, és bizonyos esetekben a k g becslései meghaladhatják a k 2-t. A növekedés okozta hígulásra tekintettel végzett korrekciót szükségtelenné tevő alternatív megközelítés a vizsgálati anyag halankénti (egész halra vetített) tömegét tükröző tisztulási adatokat alkalmazza, szemben a szokásos, a vizsgálati anyagnak a hal egységnyi tömegéhez viszonyított tömegére (koncentrációra) vonatkozó adatokkal. Ez könnyen elérhető adat, mivel az e vizsgálati módszer szerinti vizsgálatoknak a feljegyzett szöveti koncentrációkat az egyes halak tömegéhez kell kapcsolniuk. Az erre szolgáló egyszerű eljárást az 5. függelék ismerteti. Meg kell jegyezni, hogy a k 2-t akkor is fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben, ha ezt az alternatív megközelítést alkalmazzák.

A kinetikus és az állandósult állapoti biokoncentrációs tényezőket a halak alapértelmezett 5 %-os (w/w) lipidtartalmához viszonyítva is fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben, hacsak nem igazolható, hogy a vizsgálati anyag elsődlegesen nem lipidekben halmozódik fel. A halakkal kapcsolatos koncentrációs adatokat vagy a BCF-et az 5 % és a (nedves tömeg százalékában kifejezett) tényleges (egyedi) átlagos lipidtartalom hányadosa szerint kell normalizálni (vö. 5. függelék).

Ha a kémiai és a lipidanalízist ugyanazon a halon végezték el, akkor az adott halra vonatkozó, egyedi, a lipidtartalom tekintetében normalizált adatokat kell felhasználni a lipidtartalom szempontjából normalizált BCF kiszámításához. Vagylagosan, ha a kontrollcsoportba és a kitett csoportba tartozó halak növekedése hasonlóan alakul, a kontrollhalak lipidtartalma önmagában felhasználható a lipidtartalomra tekintettel történő korrekcióhoz (vö. 56. pont). A lipidtartalom szempontjából normalizált BCF kiszámításának egyik módszere az 5. függelékben található.

Az eredmények kiértékelése

Amennyiben a vizsgálati oldatok mért koncentrációi az analitikai módszer érzékelési határához közeli szinten vannak, az eredményeket óvatosan kell kiértékelni.

A vizsgálati és a kontrollcsoportban megfigyelt átlagos növekedés elvben nem lehet nagymértékben különböző, hogy a toxikus hatások kizárhatók legyenek. A két csoport növekedési sebességi állandóit vagy növekedési görbéit megfelelő eljárással össze kell hasonlítani ( 30 ).

Az egyértelműen definiált felvételi és tisztulási görbe megbízható biokoncentrációs adatokat jelez. A sebességi állandók tekintetében a χ2 görbeillesztési vizsgálat eredményeinek megfelelő illeszkedést kell mutatniuk (azaz kis mérési hibaszázalékot (32)) a bioakkumulációs modell esetében, hogy a sebességi állandókat megbízhatónak lehessen tekintetni (vö. 5. függelék). Ha egynél több vizsgálati koncentrációt alkalmaznak, a felvételi/tisztulási állandók vizsgálati koncentrációk közötti eltérésének 20 % alatt kell lennie ( 31 ). Amennyiben ez nem áll fenn, az koncentrációtól való függésre utalhat. Az alkalmazott vizsgálati koncentrációk felvételi/tisztulási sebességi állandóinak megfigyelt jelentős különbségét rögzíteni kell, és meg kell adni rá a lehetséges magyarázatokat. A jól megtervezett vizsgálatokból kapott BCF-ek 95 %-os konfidenciahatára általában megközelíti a származtatott BCF ± 20 %-át.

Ha két vagy több koncentrációt vizsgálnak, az eredményeket mindkét vagy valamennyi koncentráció esetében felhasználják annak vizsgálatára, hogy az eredmények következetesek-e, továbbá annak kimutatására, hogy van-e koncentrációfüggés. Ha csak egy koncentrációt vizsgálnak az állatok és/vagy erőforrások használatának mérséklése érdekében, indokolni kell az egy koncentráció alkalmazását.

Az eredményként adódó BCFSS kétséges, ha a BCFK lényegesen nagyobb, mint a BCFSS, mivel ez arra utalhat, hogy nem jött létre állandósult állapot, vagy hogy nem vették figyelembe a növekedés okozta hígulást és a mennyiség csökkenésével járó folyamatokat. Ha a BCFSS jóval meghaladja a BCFK-t, a felvételi és tisztulási sebességi állandók származtatását ellenőrizni kell a hibák tekintetében és újra kell értékelni. Más illesztési eljárás javíthatja a BCFK becslését (vö. 5. függelék).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A vizsgálati anyagra vonatkozó, a 3. pontban feltüntetett információn felül a Vizsgálati jegyzőkönyv a következő információt tartalmazza:

C.13. – II:    Vízi expozíción alapuló minimalizált halvizsgálat

BEVEZETÉS

A mind a laboratóriumok, mind a szabályozó hatóságok által a teljes vizsgálatok lefolytatása és kiértékelése során szerzett egyre több tapasztalat azt mutatja, hogy néhány kivétellel elsőrendű kinetika érvényes a felvételi és tisztulási sebességi állandók becslésére. Így a felvételi és tisztulási sebességi állandók becsülhetők minimális mintavételi ponttal, és származtatható a kinetikus BCF.

A BCF-vizsgálatok alternatív tervei megvizsgálásának eredeti célja az volt, hogy kialakítsanak egy kisebb vizsgálatot, amelyet köztes vizsgálati lépésként fel lehet használni a KOW-n és QSAR-okon alapuló BCF-becslések megcáfolására vagy megerősítésére, és így nem lesz szükség teljes vizsgálat lefolytatására számtalan anyag tekintetében, minimalizálhatók a költségek és az állatok felhasználása a mintavételezés és a végrehajtott elemzési szekvenciák számának csökkentése útján. A korábbi vizsgálati módszerek elsődleges tervét követve annak érdekében, hogy lehetővé váljon a vizsgálati eredmények meglévő BCF-adatokkal való integrációja, és hogy könnyebb legyen a vizsgálat végrehajtása és az adatok kiértékelése, a cél az volt, hogy kellő pontosságú BCF-becsléseket biztosítsanak a kockázatértékelési döntésekhez. A teljes vizsgálatra alkalmazandó megfontolások közül számos ebben az esetben is érvényes (vö. 24. pont), pl. az érvényességi kritériumok, valamint a vizsgálat leállítása, ha jelentéktelen felvétel látható a felvételi fázis végén (vö. 16. és 38. pont).

A minimalizált vizsgálati tervbe felvehető anyagoknak ahhoz az általános területhez kell tartozniuk, amelynek tekintetében e vizsgálati módszert kialakították, ezek a nem poláris szerves anyagok (vö. 49. pont). Ha bármi arra utal, hogy a vizsgálandó anyag esetlegesen eltérő viselkedést mutat (pl. egyértelműen eltér az elsőrendű kinetikától), teljes vizsgálatot kell végezni szabályozói céllal.

A minimalizált vizsgálat általában nem tart rövidebb ideig, mint a standard BCF-vizsgálat, hanem kevesebb halminta-vételt foglal magában (a magyarázat tekintetében lásd a 6. függeléket). Ugyanakkor a tisztulási időszak csökkenthető a gyorsan tisztuló anyagok esetében, hogy ne legyenek a érzékelési/meghatározási határtól elmaradó, halban megfigyelt koncentrációk a vizsgálat vége előtt. Az egyetlen koncentrációt és minimális expozíciót alkalmazó halvizsgálat felhasználható a teljes vizsgálat szükségességének meghatározására; és ha a sebességi állandók és a BCF kiszámításához használt, eredményül adódó adatok megbízhatóak (vö. 93. pont), a teljes vizsgálattól el lehet tekinteni, ha az eredményként adódó BCF nem éri el az aggodalomra okot adó szabályozói értékeket.

Egyes esetekben előnyösebb lehet egynél több koncentrációt alkalmazó minimalizált vizsgálati terv mint előzetes vizsgálat lefolytatása annak meghatározására, hogy egy adott anyagra vonatkozó BCF-becslések koncentrációfüggőek-e. Ha a minimalizált vizsgálatból származó BCF-becslések koncentrációfüggést mutatnak, szükség lesz a teljes vizsgálat lefolytatására. Ha e minimalizált vizsgálat alapján a BCF-becslések nem koncentrációfüggőek, de az eredmények nem tekinthetők döntőnek, minden további teljes vizsgálat lefolytatható egyetlen koncentrációval, ezáltal csökkentve az állatok felhasználását a két (vagy több) koncentrációt alkalmazó teljes vizsgálathoz képest.

A minimalizált vizsgálatra alkalmas anyagok esetében a következő feltételeknek kell teljesülniük:

A MINIMALIZÁLT TERVET KÖVETŐ VIZSGÁLATOK MINTAVÉTELI TERVE

Halak mintavételezése

A halak mintavételezése négy mintavételi pontra korlátozódik:

Víz mintavételezése

A minimalizált terv szerint a vizet a teljes vizsgálathoz hasonlóan mintavételezik (vö. 54. pont) vagy legalább a felvételi fázis során ötször, egyenlően elosztott időközönként, a tisztulási fázisban pedig hetente.

A tervezés módosításai

Tekintettel a vizsgálati anyag tulajdonságaira, az érvényes QSAR előrejelzésekre és a vizsgálat konkrét céljára, mérlegelni lehet a vizsgálati terv módosításait:

Számítások

E megközelítés mögött az a logika húzódik, hogy a teljes vizsgálatban a biokoncentrációs tényező vagy állandósult állapoti biokoncentrációs tényezőként (BCFSS) határozható meg a vizsgálati anyag halszövetben mért koncentrációja és a vizsgálati anyag vízben mért koncentrációja hányadosának kiszámításával, vagy kinetikus biokoncentrációs tényezőként a (BCFK) felvételi sebességi állandó k 1 és a tisztulási sebességi állandó k 2 hányadosának kiszámításával. A BCFK akkor is érvényes, ha az anyag állandósult állapoti koncentrációját nem érik el a felvételi fázisban, feltéve, hogy a felvétel és a tisztulás megközelítőleg elsőrendű kinetikai folyamatokat követ. Abszolút minimumként két adatpontra van szükség a felvételi és tisztulási sebességi állandók becsléséhez, egyre a felvételi fázis végén (azaz a tisztulási fázis kezdetén) egyre pedig a tisztulási fázis végén (vagy annak jelentős része elteltét követően). Közbenső mintavételi pont ajánlott a felvételi és tisztulási kinetika ellenőrzésére ( 33 ). A számítások tekintetében lásd az 5. és 6. függeléket.

Az eredmények kiértékelése

A vizsgálat érvényességének és informatív értékének áttekintéséhez meg kell győződni arról, hogy a tisztulási fázis meghalad-e egy felezési időt. A BCFKm-et (a minimalizált vizsgálatból számított kinetikus BCF-et) össze kell hasonlítani a minimalizált BCFSS értékkel (amely a felvételi fázis végén azon feltételezés mellett számított BCFSS, hogy az állandósult állapot létrejött. Ez puszta feltételezés, mivel a mintavételi pontok száma nem elegendő ennek bizonyításához). Ha BCFKm < minimalizált BCFSS, a minimalizált BCFSS érték az előnyben részesített érték. Ha a BCFKm a minimalizált BCFSS kevesebb, mint 70 %-a, az eredmények nem érvényesek, és teljes vizsgálatot kell lefolytatni.

Ha a minimalizált vizsgálat olyan BCFKm eredményt ad, amely a szabályozói aggályokat felvető értéktartományba esik, teljes vizsgálatot kell folytatni. Ha az eredmény messze elmarad a szabályozói aggályokat felvető értékektől (jóval felette vagy alatta van), nincs feltétlenül szükség teljes vizsgálatra, vagy egyetlen koncentráción alapuló teljes vizsgálat is lefolytatható, ha a vonatkozó szabályozói keret ezt előírja.

Ha az egy koncentráció alkalmazásával lefolytatott minimalizált vizsgálatot követően megállapítást nyer, hogy teljes vizsgálatra van szükség, ezt el lehet végezni egy második koncentráción. Ha az eredmények összhangban vannak, el lehet tekinteni egy eltérő koncentrációval lefolytatott további teljes vizsgálattól, mivel várhatóan az anyag biokoncentrációja nem koncentrációfüggő. Ha a minimalizált vizsgálatot két koncentráció mellett folytatták le, és az eredmények nem utalnak koncentrációfüggésre, a teljes vizsgálat lefolytatható csak egy koncentrációval is (vö. 87. pont).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A minimalizált vizsgálatra vonatkozó jelentésnek a teljes vizsgálatra előírt valamennyi információt tartalmaznia kell (vö. 81. pont), kivéve azokat, amelyeket nem lehet előállítani (azaz az állandósult állapotig eltelt időt bemutató görbét vagy az állandósult állapoti biokoncentrációs tényezőt, ez utóbbi helyett a minimalizált vizsgálatban számított BCFSS-t kell megadni). Emellett a Vizsgálati jegyzőkönyvben ki kell térni a minimalizált vizsgálat alkalmazásának indokolására és az eredményként adódó BCFKm-re.

C.13. – III.:    Étrendi expozíción alapuló bioakkumulációs halvizsgálat

BEVEZETÉS

Az e szakaszban bemutatott módszert olyan anyagok tekintetében kell használni, amelyek esetében a vízi expozíciós módszer nem megvalósítható (például mivel az állandó, mérhető vízi koncentrációk nem tarthatók fenn, vagy a test megfelelő anyagterhelése nem érhető el az expozíció 60 napja alatt; a vízi expozíció tekintetében lásd az előző szakaszokat). Meg kell jegyezni ugyanakkor, hogy e vizsgálat végpontja inkább étrendi biomagnifikációs tényező (BMF) és nem biokoncentrációs tényező (BCF) ( 34 ).

2001 májusában a vízben csekély mértékben oldódó szerves anyagok biológiai felhalmozódásának vizsgálatára új módszert mutattak be a SETAC Europe (Környezettoxikológiai és Kémiai Társaság) madridi konferenciáján (36). Ez a munka a szakirodalomban ismertetett, különböző közölt bioakkumulációs vizsgálatokon alapult, amelyekben a vizsgálati anyaggal kiegészített tápot tartalmazó adagolási módszert alkalmaztak (pl. (37)). 2004 elején olyan protokolltervezetet (38) nyújtottak be az EU PBT munkacsoportjához, amelynek célja a vízben csekély mértékben oldódó szerves anyagok bioakkumulációs potenciáljának mérése, amely anyagok esetében a standard, vízi expozíción alapuló biokoncentrációs módszer nem megvalósítható; e tervezetet háttérdokumentum kísérte (39). A módszer tekintetében megadott további indok az volt, hogy a vízben csekély mértékben oldódó (azaz, ahol log K OW >5) ezen anyagoknak való potenciális környezeti expozíció jórészt az étrend útján alakulhat ki (vö. (40) (41) (42) (43) (44)). Ebből az okból az étrendi expozíciós vizsgálatokra egyes, vegyi anyagokra vonatkozó közzétett rendeletek is hivatkoznak ( 35 ). Fel kell ismerni ugyanakkor, hogy az itt bemutatott módszerben a vizes fázisú expozíciót gondosan kerülik, így az e vizsgálati módszerből adódó BMF érték közvetlenül nem hasonlítható össze a terepvizsgálat során nyert BMF értékkel (ahol kombinálható a vízi és az étrendi expozíció).

E vizsgálati módszer e szakasza ezen a protokollon (38) alapul, és olyan új módszer, amely a C.13. vizsgálati módszer korábbi verziójában nem jelent meg. Ez az alternatív vizsgálat lehetővé teszi, hogy az étrendi expozíciós útvonalat szabályozott laboratóriumi körülmények között közvetlenül vizsgálják.

A lehetséges vizsgálóknak e vizsgálati módszer 1–14. pontját kell áttekinteniük, hogy tájékozódjanak, mikor részesítendő előnyben az étrendi expozíciós vizsgálat a vízi expozíciós vizsgálattal szemben. Az anyagokkal kapcsolatos különböző megfontolások vonatkozásában rendelkezésre állnak információk, amelyeket a vizsgálat lefolytatása előtt mérlegelni kell.

A radioaktív jelöléssel ellátott vizsgálati anyagok alkalmazását ugyanolyan megfontolások mentén kell mérlegelni, mint a vízi expozíciós módszer esetén (vö. 6. és 65. pont).

Az étrendi módszer egynél több anyag egyetlen vizsgálat keretében való elemzésére is alkalmas bizonyos kritériumok teljesülése esetén; ezeket a 112. pont fejti ki részletesebben. Az egyszerűség érdekében a módszer itt egyetlen vizsgálati anyagot elemző vizsgálatot mutat be.

Az étrendi vizsgálat sok szempontból hasonló a vízi expozíciós módszerhez, nyilvánvalóan az expozíciós útvonal kivételével. Így az itt bemutatott módszer és az előző szakaszban ismertetett vízi expozíciós módszer között számos vonatkozásban átfedés van. Lehetőség szerint kereszthivatkozás utal a korábbi szakasz vonatkozó pontjaira, de az olvashatóság és érthetőség érdekében bizonyos mennyiségű ismétlés elkerülhetetlen.

A VIZSGÁLAT ELVE

Átfolyásos vagy félstatikus körülmények alkalmazhatók (vö. 4. pont); az átfolyásos körülmények javasoltak az anyagnak vízi úton való, a vizsgálati anyaggal kiegészített táp vagy ürülék deszorpciója eredményeként előálló esetleges expozíció mérséklése érdekében. A vizsgálat két fázisból áll: felvétel (vizsgálati anyaggal kiegészített táp) és tisztulás (tiszta, kezeletlen táp) (vö. 16. pont). A felvételi fázisban a halak vizsgálati csoportját a vizsgálati anyaggal kiegészített, ismert összetételű kereskedelmi haltápon alapuló, előre meghatározott étrend szerint etetik, napi rendszerességgel. A halaknak ideális esetben valamennyi beadott tápot el kell fogyasztaniuk (vö. 141. pont). A halakat ezt követően tiszta, kezeletlen kereskedelmi haltáppal kell etetni a tisztulási időszakban. A vízi expozíciós módszerhez hasonlóan, szükség esetén egynél több, különböző kiegészített vizsgálatianyag-koncentrációknak kitett vizsgálati csoportokat lehet alkalmazni, de a nagymértékben víztaszító szerves vizsgálati anyagok többsége esetében elegendő egyetlen vizsgálati csoport (vö. 49. és 107. pont). Ha félstatikus körülményeket alkalmaznak, a halakat új közegbe és/vagy új vizsgálati kamrába kell áthelyezni a felvételi fázis végén (amennyiben a felvételi fázisban alkalmazott közeg és/vagy eszköz kimosódás következtében a vizsgálati anyaggal szennyeződött). A vizsgálati anyag halakban lévő koncentrációit a vizsgálat mindkét fázisa alatt mérik. A vizsgálati anyaggal kiegészített étrenden tartott halak csoportja (a vizsgálati csoport) mellett kontrollcsoportot is kell beállítani azonos körülmények között, és ezeket ugyanúgy kell etetni, leszámítva, hogy a kereskedelmi haltápot nem egészítik ki a vizsgálati anyaggal. E kontrollcsoport lehetővé teszi, hogy a vizsgálati anyag háttérszintjeit számszerűsítsék a vizsgálati anyagnak ki nem tett halakban, és összehasonlításul szolgál bármely, a vizsgálati csoportban megfigyelt, kezeléssel összefüggő káros hatás vonatkozásában ( 36 ). Ezenfelül lehetővé teszi a növekedési sebességi állandók csoportok közötti összehasonlítását, annak ellenőrzésére, hogy a beadott táp azonos mennyiségeit fogyasztották-e el (az étrendek ízletessége közötti lehetséges különbségeket szintén figyelembe kell venni a különböző növekedési sebességi állandók magyarázataként, vö. 138. pont). Fontos, hogy mind a felvételi, mind a tisztulási fázisban egyenértékű tápanyagot tartalmazó étrenddel etessék a vizsgálati és a kontrollcsoportot is.

A módszer kialakítóinak tapasztalatai alapján általában elegendő a 7–14 napig tartó felvételi fázis (38) és (39). E tartománynak úgy kellene a lehető legkisebbre csökkentenie a vizsgálat elvégzésének költségét, hogy továbbra is biztosítja a legtöbb anyagnak való elegendő expozíciót. Ugyanakkor egyes esetekben a felvételi fázis meghosszabbítható (vö. 127. pont). A felvételi fázis során az anyag koncentrációja a halban nem biztos, hogy állandósult állapotot ér el, így az adatkezelés és az e módszerből adódó eredmények szokásosan a szöveti maradékok kinetikus elemzésén alapulnak. (Megjegyzés: az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő becslésére szolgáló egyenleteket itt alkalmazni lehet, mint a vízi expozíciós vizsgálatnál – lásd az 5. függeléket.) A tisztulási fázis akkor kezdődik, amikor a halat először etetik kiegészítetlen táppal, és szokásosan legfeljebb 28 napig tart, vagy – amennyiben az korábban következik be –, addig az időpontig, amikor a vizsgálati vegyi anyag mennyisége már nem számszerűsíthető az egész halban. A tisztulási fázis lerövidíthető vagy meghosszabbítható 28 napon túlra, a mért vegyianyag-koncentráció és a halak méretének időbeli változásától függően.

Ez a módszer lehetővé teszi a következők meghatározását: anyagspecifikus felezési idő (t 1/2, a k 2 tisztulási sebességi állandóból), a halban lévő vizsgálati anyag asszimilációs hatékonysága (felszívódás a bélből; a); kinetikus étrendi biomagnifikációs tényezője (BMFK), a növekedéssel korrigált kinetikus étrendi biomagnifikációs tényezője (BMFKg), és a lipidtartalommal korrigált ( 37 ) kinetikus étrendi biomagnifikációs tényezője (BMFKL) (és/vagy a növekedéssel és lipidtartalommal korrigált kinetikus étrendi biomagnifikációs tényező, BMFKgL). A vízi expozíciós módszerhez hasonlóan, a halak tömegének a vizsgálat során bekövetkező növekedése következtében a fejlődő halakban felhígul a vizsgálati anyag, így a (kinetikus) BCF-et alulbecslik, ha nem korrigálják a növekedés tekintetében (vö. 162 és 163. pont). Ráadásul, ha a becslések szerint az állandósult állapotot elérték a felvételi fázisban, tájékoztató jellegű állandósult állapoti BMF-et lehet számolni. Rendelkezésre állnak olyan megközelítések, amelyek lehetővé teszik a kinetikus biokoncentrációs tényező (BCFK) étrendi vizsgálatból nyert adatok alapján történő becslését (pl. (44) (45) (46) (47) (48)). Az e megközelítések mellett és ellen szóló érvek a 8. függelékben találhatók.

A vizsgálatot elsődlegesen csekély mértékben oldható, nem poláris szerves anyagokra dolgozták ki, amelyek megközelítőleg elsőrendű felvételi és tisztulási kinetikát követnek a halakban. Amennyiben olyan anyagot vizsgálnak, amely megközelítőleg nem elsőrendű felvételi és tisztulási kinetikát követ, összetettebb modelleket kell alkalmazni (lásd az 5. függelék hivatkozásait), és biostatisztikus és/vagy farmakokinetikus szakvéleményét kell kikérni.

A BMF-et szokásosan a vizsgálati anyag egész halra (nedves tömeg) vetített elemzésével határozzák meg. Amennyiben a vizsgálat célkitűzései szempontjából releváns, konkrét szövetekből (pl. izom, máj) mintát lehet venni, ha a hal ehető és nem ehető részekre osztható (vö. 21. pont). Emellett el lehet végezni a gyomor-bél traktus eltávolítását és különálló elemzését az egész halban mérhető koncentrációhoz való hozzájárulás meghatározása érdekében a felvételi fázis végén található és a tisztulási fázis kezdetéhez közeli mintavételi pontok tekintetében, vagy anyagmérleg alapú megközelítés részeként.

A mintába felvett egész hal lipidtartalmát mérni kell, így a koncentrációk a lipidtartalomra tekintettel korrigálhatók, figyelembe véve mind az étrend, mind a hal lipidtartalmát (vö. 56. és 57. pont, valamint 7. függelék).

A vizsgálat során esetleg bekövetkező növekedés kiszámításának céljából a mintába felvett egyedek tömegét mérni és rögzíteni kell, továbbá azt az adott egyed tekintetében elemzett vegyianyag-koncentrációhoz kell kapcsolni (pl. egyedi azonosító kóddal kell feltüntetni a mintába felvett minden hal tekintetében). A halak teljes hosszát is mérni kell, ahol lehetséges ( 38 ). A tömegre vonatkozó adatok szükségesek a BCF-nek az étrendi vizsgálat tisztulási adatai felhasználásával készült becsléséhez is.

A VIZSGÁLATI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

A vizsgálati anyagra vonatkozó, a 3. és 22. pontban feltüntetett információt rendelkezésre kell bocsátani. Általában nincs szükség a vizsgálati anyag vízi koncentrációjával kapcsolatos analitikai módszerre; a koncentráció haltápban és halszövetben történő mérését szolgáló, kellően érzékeny módszer előírt.

A módszer egynél több anyag egyetlen vizsgálat keretében való elemzésére is alkalmas. A vizsgálati anyagoknak ugyanakkor egymással kompatibilisnek kell lenniük, hogy ne lépjenek kölcsönhatásba egymással, vagy ne változzon meg kémiai azonosságuk a haltáphoz való hozzáadásukkal. A cél az, hogy az egyes együtt vizsgálati anyagok tekintetében mért eredmények ne különbözzenek nagy mértékben azoktól az eredményektől, amelyek az egyes vizsgálati anyagok egyedi vizsgálatából adódnának. Előzetes analitikai munkával kell megállapítani, hogy mindegyik anyag visszanyerhető-e a többszörösen kiegészített táp- és halszövetmintából, i. nagy visszanyerési arány (pl. > a névleges 85 %-a) mellett és ii. a szükséges vizsgálati érzékenységgel. Az együtt vizsgált anyagok teljes dózisának el kell maradnia az esetlegesen toxikus hatást okozó kombinált koncentrációtól (vö. 51. pont). Ezenfelül a halban bekövetkező lehetséges káros hatásokat és a több anyag egyidejű vizsgálatával összefüggő potenciális kölcsönhatásokat (pl. anyagcserehatások) figyelembe kell venni a kísérlettervezés során. Kerülni kell az ionizálható anyagok egyidejű vizsgálatát. Az expozíciót tekintve ez a módszer alkalmas összetett keverékek esetén is (vö. 13. pont, jóllehet a más módszerek esetén érvényes analitikai korlátozásokat itt is alkalmazni kell).

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

A vizsgálat érvényességéhez a következő feltételeknek kell teljesülniük (vö. 24. pont):

REFERENCIAANYAGOK

Ha a laboratórium korábban még nem végezte a vizsgálatot vagy jelentős változások történtek (pl. a haltörzs vagy a beszállító változásai, más halfajok, a halak méretének, a haltápnak vagy a tápkiegészítési módszernek a jelentős változása stb.), célszerű technikai jártassági vizsgálatot lefolytatni referenciaanyag alkalmazásával. A referenciaanyagot elsődlegesen annak megállapítására használják, hogy a tápkiegészítési módszer megfelelő-e a maximális homogenitás és a vizsgálati anyag biológiai hasznosíthatóságának garantálásához. A nem poláris víztaszító anyagok esetében például hexaklór-benzolt (HCB) alkalmaztak, de a HCB veszélyessége miatt mérlegelni kell más olyan anyagok alkalmazását, amelyeket érintően a felvétel és a biomagnifikáció tekintetében megbízható adatok állnak rendelkezésre ( 39 ). Ha referenciaanyagot alkalmaznak, az azzal kapcsolatos alapvető információt fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben, ideértve a nevet, a tisztaságot, a CAS-számot, a szerkezetet és a toxicitási adatokat (ha rendelkezésre állnak), mint a vizsgálati anyag esetében (vö. 3. és 22. pont).

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Felszerelés

Az anyagokat és felszereléseket a vízi expozíciós módszernél bemutatottak szerint kell használni (vö. 26. pont). Átfolyásos vagy statikus megújítási vizsgálati rendszert kell alkalmazni, amely biztosítja, hogy elegendő mennyiségű hígítóvíz áramoljon a vizsgálati tartályokba. Az áramlási sebességet rögzíteni kell.

Víz

A vizsgálati vizet a vízi expozíciós módszernél bemutatottak szerint kell használni (vö. 27–29. pont). A vizsgálati közegnek a leírt jellemzőkkel kell rendelkeznie, minőségének pedig állandónak kell maradnia a vizsgálat során. A természetes részecsketartalomnak és teljes szervesszén-tartalomnak a lehető legalacsonyabbnak kell lennie a vizsgálat megkezdése előtt (≤ 5 mg/l részecske; ≤ 2 mg/l teljes szervesszén-tartalom). A teljes szervesszén-tartalmat csak a vizsgálat megkezdése előtt, a vizsgálati víz jellemzésének részeként kell mérni (vö. 53. pont).

Étrend

Kereskedelmi forgalomban kapható haltáp (lebegő és/vagy lassan elsüllyedő pellet) ajánlott, amelynek legalább fehérje- és zsírtartalma ismert. A tápnak egységes pelletméretűnek kell lennie, hogy fokozottabb legyen az étrendi expozíció hatékonysága, azaz a halak többet egyenek a tápból, ahelyett, hogy megeszik a nagyobb darabokat, a kisebbeket pedig nem. A pelleteknek a hal méretéhez viszonyítva megfelelő méretűnek kell lenniük a vizsgálat kezdetén (pl. durván 0,6–0,85 mm pelletátmérő alkalmazható a 3–7 cm teljes hosszúságú halak esetén, valamint 0,85–1,2 mm pelletátmérő alkalmazható a 6–12 cm teljes hosszúságú halak esetén). A tisztulási szakasz kezdetén a pellet méretét a halak növekedéséhez lehet igazítani. A megfelelő, kereskedelemben is forgalmazott tápösszetételre a 7. függelékben található példa. E módszer kialakítása során szokásosan 15–20 % (w/w) teljes lipidtartalmú vizsgálati étrendet alkalmaztak. Egyes területeken nem biztos, hogy kapható ilyen magas lipidkoncentrációjú haltáp. Ilyen esetekben a vizsgálatot le lehet folytatni alacsonyabb lipidtartalmú táppal, és szükség esetén az etetési arányt kell megfelelően kiigazítani a hal egészségének megőrzéséhez (előzetes vizsgálat alapján). A vizsgálati és kontrollcsoport étrendjének teljes lipidtartalmát mérni és rögzíteni kell a vizsgálat megkezdése előtt és a felvételi fázis végén. A Vizsgálati jegyzőkönyvben fel kell tüntetni a kereskedelmi haltápbeszállító által a tápanyagok, a nedvesség, a rost és a hamu, és lehetőség szerint az ásványi anyagok, továbbá a növényvédőszer-maradékok (pl. »standard«, prioritásként kezelendő szennyező anyagok) elemzése tekintetében közölt részletes adatokat.

A táp vizsgálati anyaggal való kiegészítésekor minden erőfeszítést meg kell tenni annak érdekében, hogy biztosított legyen a homogenitás a vizsgálati étrendben. A vizsgálati csoport tekintetében a vizsgálati anyag tápban meglévő koncentrációjának megválasztása során figyelembe kell venni az analitikai módszer érzékenységét, a vizsgálati anyag toxicitását (NOEC, ha ismert), és a releváns fizikai és kémiai adatokat. Ha alkalmaznak referenciaanyagot, azt a vizsgálati anyag koncentrációjának 10 %-a körüli koncentrációval kell bevezetni (de mindenesetre a lehető legalacsonyabb szinten), figyelemmel az elemzés érzékenységére (pl. a hexaklór-benzol esetében a tápban mért 1–100 μg/g koncentrációt elfogadhatónak tekintették; vö. (47) a HCB asszimilációs hatékonyságát érintő további információ tekintetében).

A haltáp számos módszerrel kiegészíthető a vizsgálati anyaggal, az anyag fizikai tulajdonságai és oldhatósága függvényében (lásd a 7. függeléket a tápkiegészítési módszerek további részletei tekintetében):

Néhány esetben, pl. kevésbé víztaszító vizsgálati anyagoknál valószínűbb, hogy deszorbeálnak a tápból, ezért szükség lehet arra, hogy az elkészített pelleteket kis mennyiségű kukorica-/halolajjal bevonják (lásd 142. pont). Ilyen esetekben a kontrolltápot hasonlóan kell kezelni, és a végül elkészített tápot kell használni a lipidtartalom mérésénél.

Ha referenciaanyagot alkalmaznak, az azzal kapcsolatos eredményeknek összehasonlíthatóknak kell lenniük az ugyanilyen körülmények között, hasonló etetési aránnyal végzett vizsgálatok szakirodalmi adataival (vö. 45. pont) és a referenciaanyag-specifikus paramétereknek meg kell felelniük a 113. pontban megfogalmazott, vonatkozó kritériumoknak (3., 4. és 5. pont).

Ha olajat vagy hordozó oldószert használnak a vizsgálati anyag vivőanyagaként, e vivőanyag ugyanolyan mennyiségét a kontrollcsoport étrendjébe is bele kell keverni (a vizsgálati anyag nélkül), hogy fenntartsák a kiegészített étrenddel való egyenértékűséget. Fontos, hogy mind a felvételi, mind a tisztulási fázisban egyenértékű tápanyagot tartalmazó étrenddel etessék a vizsgálati és a kontrollcsoportot is.

A kiegészített tápot olyan körülmények között kell tárolni, hogy fennmaradjon a vizsgálati anyag stabilitása a tápkeverékben (pl. hűtés), és e körülményeket fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben.

A halfajok kiválasztása

A vízi expozíciónál meghatározott halfajokat lehet használni (vö. 32. pont és 3. függelék). Általánosságban szivárványos pisztrángot (Oncorhynchus mykiss), pontyot (Cyprinus carpio), amerikai csellét (Pimephales promelas) használtak a szerves anyagokat érintő étrendi bioakkumulációs vizsgálatokban még e vizsgálati módszer közzététele előtt. A vizsgálati fajok olyan étkezési szokásokkal kell rendelkezzenek, hogy a beadott tápadagot gyorsan elfogyasszák, annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálati anyag tápbeli koncentrációját befolyásoló tényezőket (pl. vízbe szivárgás és vízi expozíció lehetősége) a minimálisra szorítsák. Az ajánlott méret/tömegtartományba tartozó halakat kell használni (vö. 3. függelék). A halak nem lehetnek olyan kicsik, hogy a méretük gátolja az egyedenkénti könnyű analízist. A halfajok gyors növekedéssel járó életszakaszban történő vizsgálata bonyolíthatja az adatok kiértékelését, és a nagy növekedési sebesség befolyásolhatja az asszimilációs hatékonyság kiszámítását ( 40 ).

A halak tartása

Az akklimatizációra, a mortalitásra és a betegségre vonatkozó elfogadhatósági kritériumok megegyeznek a vízi expozíciós módszernél a vizsgálat lefolytatása előtti időszak vonatkozásában ismertetettekkel (vö. 33–35. pont).

A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE

Elővizsgálati munka és dózisbehatároló vizsgálat

Elővizsgálati analitikai munkára van szükség az anyag kiegészített tápból/halszövetből történő visszanyerésének igazolására. A tápbeli megfelelő koncentráció megválasztására irányuló dózisbehatároló vizsgálat nem mindig szükséges. Annak igazolása céljából, hogy nem figyeltek meg káros hatásokat, illetve a kiegészített táp ízletességének, az analitikai módszer halszövet és táp szempontjából vett érzékenységének, valamint a tisztulási fázis során a megfelelő etetési arány és mintavételezési időközök megválasztásának stb. értékelése érdekében előzetes etetési kísérleteket lehet végezni, de ezek nem kötelezőek. Az előzetes vizsgálat hasznos lehet a tisztulási szakaszban mintába veendő halak számának becsléséhez. Ennek eredményeként lényegesen csökkenhet az alkalmazott halak száma, különösen azon vizsgálati anyagok tekintetében, amelyek kifejezetten alkalmasak anyagcserére.

Az expozíció körülményei

A felvételi fázis tartama

7–14 napos felvételi fázis általában elegendő; ezalatt egy halcsoportot a kontrolltáppal kell etetni, egy másikat a vizsgálati táppal, naponta, a vizsgálati faj és a kísérleti körülmények függvényében előre meghatározott adagban, pl. a testtömeg (nedves tömeg) 1–2 %-ában szivárványos pisztráng esetén. Az etetési arányt úgy kell megválasztani, hogy el lehessen kerülni a gyors növekedést és a lipidtartalom számottevő emelkedését. Szükség esetén a felvételi fázis meghosszabbítható korábbi vizsgálatok gyakorlati tapasztalatainak vagy a vizsgálati (vagy hasonló) anyag halban megfigyelt felvétele/tisztulása ismeretének függvényében. A vizsgálat kezdete a vizsgálati anyaggal kiegészített táppal való első etetés időpontja. Egy kísérleti nap az etetés időpontjától röviddel (pl. egy órával) a következő etetés időpontja előttig tart. A felvétel első kísérleti napja tehát a kiegészített táppal való első etetés időpontjában kezdődik, és röviddel a kiegészített táppal való második etetés előtt ér véget. A gyakorlatban a felvételi fázis röviddel (pl. egy órával) a kiegészítetlen vegyi anyaggal való első etetés előtt ér véget, mivel a hal továbbra is emészti a kiegészített tápot és felszívja a vizsgálati anyagot a közbeeső 24 órában. Fontos biztosítani, hogy a vizsgálati anyaggal az analitikai módszerre tekintettel a test kellően magas (nem toxikus) anyagterhelését érjék el, hogy legalább egy nagyságrendnyi csökkenés mérhető legyen a tisztulási fázisban. Különleges esetekben (28 napig) meghosszabbított felvételi fázis is alkalmazható, további mintavétel mellett, hogy betekintést lehessen nyerni a felvételi kinetikába. A felvétel során a halban mért koncentráció nem feltétlenül éri el az állandósult állapotot. Az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő, mint a halban mért értékelhető koncentráció eléréséhez szükséges valószínűsíthető időtartamra utaló jel becslésére szolgáló egyenleteket itt alkalmazni lehet, mint a vízi expozíciós vizsgálatnál (vö. 5. függelék).

Néhány esetben tudott lehet, hogy – akár gyenge analitikai érzékenység, akár alacsony asszimilációs hatékonyság miatt – az anyag hal általi felvételére nem lesz elég a 7–14 nap ahhoz, hogy a tápban alkalmazott koncentrációval kellően magas halban mért koncentrációt lehessen elérni, hogy elemezhető legyen legalább egy nagyságrendnyi csökkenés a tisztulási szakaszban. Ilyen esetekben előnyös lehet az eredeti etetési fázist 14 napon túlra meghosszabbítani, vagy kifejezetten a nagymértékben feldolgozható anyagok esetében magasabb étrendi koncentrációt kell fontolóra venni. Ugyanakkor óvatosan kell eljárni, hogy a test anyagterhelése a felvétel során a (becsült) krónikus hatást nem okozó koncentráció (NOEC) alatt maradjon a halszövetben (vö. 138. pont).

A tisztulási fázis időtartama

A tisztulás szokásosan 28 napig tart, és akkor kezdődik, amikor a vizsgálati csoportba tartozó halakat tiszta, kezeletlen táppal etetik a felvételi fázist követően. A tisztulási fázis a »kiegészítetlen« táppal való első etetéssel kezdődik, és nem közvetlenül az utolsó »kiegészített« táppal való etetést követően, mivel a hal továbbra is emészti a kiegészített tápot és felszívja a vizsgálati anyagot a közbeeső 24 órában, amint az a 126. pontban is szerepel. Ennélfogva a tisztulási fázisban az első mintát rövid idővel a kiegészítetlen táppal való második etetés előtt kell venni. E tisztulási szakasz célja azon anyagok felderítése, amelyek potenciális felezési ideje legfeljebb 14 nap, ami összhangban áll a bioakkumulatív anyagok felezési idejével ( 41 ), így a 28 napra két felezési idő jut ilyen anyagok esetében. A nagyon nagy mértékben bioakkumulatív anyagok esetében előnyös lehet a tisztulási fázis meghosszabbítása (ha az előzetes vizsgálat erre utal).

Ha az anyag nagyon lassan ürül ki, és így pontos felezési idő nem határozható meg a tisztulási szakaszban, az információ még mindig elengedő lehet értékelési célokra a nagyfokú bioakkumuláció jelzésére. Ezzel ellentétben, ha egy anyag olyan gyorsan ürül ki, hogy megbízható nulla időpillanati koncentráció (a felvétel vége/tisztulás kezdetekori koncentráció, C 0,d) és k 2 nem származtatható, el lehet végezni a k 2 konzervatív becslését (vö. 7. függelék).

Ha a hal korábbi intervallumok (pl. 7 vagy 14 nap) során végzett elemzései azt mutatják, hogy az anyag a 28 napos teljes periódus előtt a számszerűsítési szintek alatt ürült ki, a további mintavételezés megszakítható és a vizsgálat lezárható.

Egyes esetekben a vizsgálati anyagnak esetleg nem mérhető a felvétele a felvételi időszak végén (vagy a második tisztulási mintában). Ha igazolható, hogy i. a 113. pontban foglalt érvényességi kritériumok teljesültek, és ii. a felvétel hiánya nem a vizsgálat egyéb hiányosságaiból ered (pl. nem elég hosszú felvételi idő, a tápkiegészítési technika hiányossága, amelynek következtében gyengül a biológiai hasznosíthatóság, az analitikai módszer nem érzékeny, a hal nem fogyasztja el a tápot stb.), be lehet fejezni a vizsgálatot anélkül, hogy újra le kellene azt folytatni hosszabb felvételi időszakkal. Ha az előzetes munka arra utalt, hogy ez lehet a helyzet, az anyagmérleg megközelítés részeként tanácsos lehet az ürülék elemzése, ha lehetséges, emésztetlen vizsgálati anyag feltárása érdekében.

A vizsgálati halak száma

A vízi expozíciós vizsgálatnál leírtak szerint hasonló tömegű és hosszúságú halakat kell kiválasztani, úgy, hogy a legkisebbek ne legyenek kisebbek a legnagyobb hal tömegének kétharmadánál (vö. 40–42. pont).

A vizsgálandó halak teljes számát a mintavételi ütemterv szerint kell megválasztani (minimum egy mintát kell venni a felvételi fázis végén, és négy–hat mintát a tisztulási fázisban, de a fázisok időtartamának függvényében), figyelembe véve az analitikai módszer érzékenységét, a felvételi fázis végén (előzetes ismeretek alapján) valószínűleg elérendő koncentrációt, és a tisztulás időtartamát (ha a korábbi ismeretek lehetővé teszik a becslést). Minden egyes alkalommal öt–tíz halat kell mintavételezni, és a növekedési paramétereket (tömeg és teljes hossz) a kémiai vagy lipidanalízis előtt kell megmérni.

A halak körében az inherens méretbeli, a növekedési sebességet érintő és a fiziológiai különbségek, továbbá az egyes halak által elfogyasztott beadott táp valószínű mennyiségi eltérése miatt legalább öt halat mintába kell venni az egyes intervallumok során a vizsgálati csoportból és ötöt a kontrollcsoportból, hogy megfelelően meg lehessen állapítani az átlagos koncentrációt és annak változékonyságát. A felhasznált halak közötti eltérések valószínűleg nagyobb mértékben járulnak hozzá a vizsgálatban az általános akaratlan változékonysághoz, mint az alkalmazott analitikai módszerekben rejlő változékonyság, és ezáltal indokolja a mintavételezési pontonkénti legfeljebb tíz hal használatát egyes esetekben. Ugyanakkor, amennyiben a vizsgálati anyag kontrollhalakban lévő háttér-koncentrációja nem mérhető a tisztulási fázis kezdetén, két–három kontrollhal kémiai elemzése a végső mintavételi alkalommal csak addig elegendő, ameddig a többi kontrollhalat minden mintavételi ponton továbbra is mintavételezik a tömeg és teljes hossz tekintetében (azért, hogy ugyanolyan számú halat mintavételezzenek a vizsgálati és a kontrollcsoportban a növekedés tekintetében). A halakat egyedileg kell tárolni, tömegüket és teljes hosszukat mérni (még akkor is, ha a mintavételi eredmények szempontjából későbbi összevonás szükséges).

A például 28 napos tisztulási időtartamot és öt tisztulási mintavételt tartalmazó standard vizsgálat tekintetében ez összesen 59–120 halat jelent a vizsgálati csoportból és 50–110 halat a kontrollcsoportból, feltételezve, hogy az anyagra vonatkozó analitikai módszer lehetővé teszi a lipidanalízis ugyanazon a halon történő elvégzését. Ha a lipidanalízis nem végezhető el ugyanazon a halon, mint a kémiai analízis, és a kontrollhalak kizárólag lipidanalízishez való felhasználása szintén nem megvalósítható (vö. 56. pont), további 15 halra lesz szükség (háromra a vizsgálat kezdetekor a törzsállományból, háromra a tisztulási fázis kezdetekor a kontroll- és vizsgálati csoport mindegyikéből és háromra a kísérlet végén a kontroll- és vizsgálati csoportok mindegyikéből). A mintavételezési ütemtervre és a halak számára vonatkozó példa a 4. függelékben található.

Betelepítés

A vízi expozíciós módszernél bemutatottak szerint hasonlóan magas víz–hal arányt kell alkalmazni (vö. 43. és 44. pont). Jóllehet a hal–víz betelepítési arányok nem gyakorolnak hatást az expozíciós koncentrációra ebben a vizsgálatban, literenként naponta 0,1–1,0 g hal (nedves tömeg) betelepítési arány ajánlott a megfelelő oldottoxigén-koncentrációk fenntartása és a vizsgálati szervezeteket érő stressz minimálisra csökkentése érdekében.

Vizsgálati étrend és etetés

Az akklimatizációs időszakban a halakat megfelelő, a fent leírt étrend szerint kell etetni (117. pont). Ha a vizsgálatot átfolyásos körülmények között végzik, az áramlást az etetés idejére fel kell függeszteni.

A vizsgálat során a vizsgálati csoportnak adott étrendnek meg kell felelnie a fent meghatározottnak (116–121. pont). Az anyagspecifikus tényezők, az analitikai érzékenység, az étrendben környezeti feltételek mellett várható koncentráció, valamint a krónikus toxicitási szintnek/a test anyagterhelésének figyelembevétele mellett a kiegészítési célkoncentráció megválasztása során tekintettel kell lenni a táp ízletességére (hogy a halak megegyék). A vizsgálati anyag névleges kiegészítési koncentrációját fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben. A tapasztalatok szerint a kiegészítési koncentrációk a 1–1000 μg/g közötti tartományban olyan vizsgálati anyagok tekintetében jelentenek gyakorlati munkatartományt, amelyek nem mutatnak specifikus toxikus mechanizmust. A nem specifikus mechanizmuson keresztül reagáló anyagok esetében a szöveti maradékértékek nem haladhatják meg az 5 μmol/g lipidet, mivel az e feletti maradékok valószínűsíthetően krónikus hatást okoznak (19) (48) (50) ( 42 ). Más anyagok esetén gondoskodni kell arról, hogy a halmozott expozíció nyomán ne alakuljanak ki káros hatások (vö. 127. pont). Ez kimondottan igaz, ha egynél több anyagot vizsgálnak egyidejűleg (vö. 112. pont).

A haltáp háromféleképpen egészíthető ki a vizsgálati anyag megfelelő mennyiségével, amint az a 119. pontban és a 7. függelékben szerepel. A táp kiegészítésének módszereit és eljárásait fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben. A kontrollhalakat kezeletlen táppal kell etetni, amelynek ugyanolyan mennyiségű kiegészítetlen olajos vivőanyagot kell tartalmaznia, ha ilyet a kiegészített táp esetében alkalmaztak a felvételi fázisban, vagy »tiszta« oldószerrel kezelt táppal, ha a vizsgálati csoport tápjának elkészítéséhez oldószer vivőanyagot használtak. A kezelt és kezeletlen tápot legalább három példányban kell analitikailag mérni a vizsgálati anyag koncentrációjára tekintettel a vizsgálat megkezdése előtt és a felvételi fázis végén. A kezelt tápnak való expozíciót (felvételi fázis) követően a halakat (mindkét csoportban) kezeletlen táppal kell etetni (tisztulási fázis).

A halakat előre meghatározott adaggal kell etetni (a faj függvényében, pl. naponta a nedves testtömeg 1–2 %-ának megfelelő mennyiséggel a szivárványos pisztráng esetében). Az etetési arányt úgy kell megválasztani, hogy el lehessen kerülni a gyors növekedést és a lipidtartalom számottevő emelkedését. Az etetés kísérlet során beállított pontos arányát fel kell jegyezni. Az első etetést a törzsállomány tömegének a közvetlenül a vizsgálat megkezdése előtt tervezett méréséhez kell igazítani. A kísérlet során bekövetkező növekedés figyelembevétele érdekében a táp mennyiségét az egyes mintavételi alkalmakkor mintavételezett halak nedves tömegéhez kell igazítani. A vizsgálati és kontrolltartályokban található halak tömege és hossza megbecsülhető az egyes mintavételi alkalmakkor használt halak tömege és teljes hossza alapján; a vizsgálati és kontrolltartályokban maradó halak tömegét és hosszát nem kell megmérni. Fontos, hogy a kísérlet során fenntartsák ugyanazt az etetési arányt.

Az etetést meg kell figyelni, hogy meggyőződjenek arról, a halak láthatóan elfogyasztják a beadott tápot, annak garantálására, hogy a számításokhoz megfelelő táplálékfelvételi sebességet alkalmazzanak. Az előzetes etetési kísérleteket vagy korábbi tapasztalatokat figyelembe kell venni, hogy olyan etetési arányt válasszanak, amely biztosítja, hogy a napi egyszeri etetés során beadott valamennyi táp elfogyjon. Ha következetesen marad el nem fogyasztott táp, célszerű az adagot egy további etetési időre elosztani minden kísérleti napon (tehát pl. a napi egyszeri etetést felváltani a kétszeri, fele adagot tartalmazó etetéssel). Ha erre van szükség, a második etetést előre meghatározott időpontban kell elvégezni, és azt úgy kell ütemezni, hogy a halak mintavételezése előtt a lehető legtöbb idő teljen el (pl. a második etetés idejét a kísérleti nap első felére kell tenni).

Jóllehet a halak általában gyorsan elfogyasztják a tápot, fontos annak biztosítása, hogy a vegyi anyag adszorbeálódjon a táphoz. Törekedni kell annak elkerülésére, hogy a vizsgálati anyag kioldódjon a tápból a vízbe és ezáltal a halat az étrendi út mellett a vizsgálati anyag vízi koncentrációinak tegye ki. Ez úgy érhető el, hogy az el nem fogyasztott tápot (és az ürüléket) az etetést követő egy órán, de lehetőség szerint 30 percen belül eltávolítják a vizsgálati és kontrolltartályokból. Ezenfelül használható olyan rendszer, amelyben a vizet folyamatosan tisztítják aktívszén-szűrővel, amely elnyel bármilyen »oldott« szennyező anyagot. Az átfolyásos rendszerek segíthetnek a táp részecskéinek és az oldott anyagoknak a gyors kiöblítésében ( 43 ). Egyes esetekben a csekély mértékben módosított kiegészítetttáp-készítési technika segíthet e probléma enyhítésében (lásd a 119. pontot).

Fény és hőmérséklet

Amint a vízi expozíciós módszernél is (vö. 48. pont), 12–16 órás megvilágítási idő javasolt, és a hőmérsékletnek megfelelőnek (± 2 °C) kell lennie a vizsgálathoz használt fajok számára (vö. 3. függelék). A megvilágítás típusának és jellemzőinek ismertnek kell lenni, és azt dokumentálni kell.

Kontrollcsoportok

Egy kontrollcsoportot kell alkalmazni, és a halakat ugyanakkora adaggal kell etetni, mint a vizsgálati csoportot, de a tápban nem lehet jelen a vizsgálati anyag. Ha olajat vagy oldószer vivőanyagot használtak a táp kiegészítésére a vizsgálati csoportban, a kontrollcsoportnál ugyanilyen módon kell eljárni, leszámítva, hogy nem lehet jelen vizsgálati anyag, így a vizsgálati és a kontrollcsoport étrendje egyenértékű (vö. 121. és 139. pont).

A vízminőség mérésének gyakorisága

A vízi expozíciónál leírt feltételek itt is érvényesek, kivéve, hogy a teljes szervesszén-tartalmat csak a vizsgálat megkezdése előtt, a vizsgálati víz jellemzésének részeként kell mérni (vö. 53. pont).

Hal- és tápmintavételezés és -analízis

Tápminták analízise

A vizsgálati és kontrolltáp mintáit legalább három példányban kell analizálni a vizsgálati anyagra és a lipidtartalomra tekintettel, legalább a felvételi fázis kezdete előtt és a végén. Az analitikai módszereket és a táp homogenitását biztosító eljárásokat fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben.

A mintákat a vizsgálati anyag tekintetében az elfogadott és validált módszer alapján kell analizálni. Előzetes vizsgálatot lehet végezni a meghatározási határ, a százalékos visszanyerés, a kölcsönhatások és a tervezett mintamátrixban az analitikai változékonyság megállapítására. Radioaktív jelöléssel ellátott anyagok vizsgálata esetén hasonló megfontolásokat kell mérlegelni, mint a vízi expozíciónál, de a víz analízisének helyébe a táp analízise lép (vö. 65. pont).

Halak analízise

Az egyes halminta-vételi alkalmakkor 5–10 egyedet kell mintába venni a kitett és a kontrollcsoportokból (bizonyos esetekben a kontrollhalak száma csökkenthető, vö. 134. pont).

A mintavételi alkalmakat minden kísérleti napon ugyanakkorra kell időzíteni (az etetési időhöz viszonyítva), és azokat úgy kell ütemezni, hogy minimálisra csökkenjen annak valószínűsége, hogy táp maradjon a bélben a felvételi fázis alatt és a tisztulási fázis korai szakaszában, annak megelőzése érdekében, hogy a teljes vizsgálatianyag-koncentrációt hamis adatok alapján határozzák meg (azaz a mintába felvett halakat el kell távolítani a kísérleti nap végén; figyelembe véve, hogy a kísérleti nap az etetéskor kezdődik és a következő etetéskor ér véget, megközelítőleg 24 órával később. A tisztulási fázis a kiegészítetlen táppal való első etetéssel kezdődik (vö. 128. pont). A tisztulási fázis első mintája (amelyet röviddel a kiegészítetlen táppal való második etetés előtt vesznek) fontos, mivel e mérésből kiindulva egy nappal visszamenőleges extrapolációt alkalmaznak a nulla időpillanati koncentráció becslésére (C 0,d, a felvétel végén/tisztulás kezdetén a halban lévő koncentráció). Fakultatívan eltávolítható a hal gyomor-bél traktusa, és elkülönítetten analizálható a felvétel végén és a tisztulás 1. és 3. napján.

Az egyes mintavételi alkalmakkor a halakat ki kell venni mindkét vizsgálati edényből, és a vizes módszerben leírtakkal megegyező módon kell kezelni (vö. 61–63. pont).

A vizsgálati anyag koncentrációit az egész halban (nedves tömeg) legalább a felvételi fázis végén és a tisztulási fázis során mérni kell, mind a kontroll-, mind a vizsgálati csoportban. A tisztulási fázisban négy–hat mintavételi pont ajánlott (pl. az 1., a 3., a 7., a 14. és a 28. napon). Fakultatívan további mintavételi pont vehető fel 1–3 napnyi felvétel után, hogy az asszimilációs hatékonyságot meg lehessen becsülni a felvétel lineáris fázisából, míg a hal még az expozíciós időszak elején van. Az ütemtervtől két főbb eltérés lehet: i. ha meghosszabbított felvételi fázist alkalmaznak a felvételi kinetika vizsgálása céljából, további mintavételi pontokra van szükség a felvételi fázisban, így további halakat kell a vizsgálatba bevonni (vö. 126. pont); ii. ha a vizsgálat a felvételi fázis végén nem mérhető felvétel miatt lezárul (vö. 131. pont). A mintába felvett halegyedek tömegét (és teljes hosszát) mérni kell, hogy meg lehessen határozni a növekedési sebességi állandókat. Az anyag konkrét halszövetben lévő koncentrációját is mérni lehet a felvétel végén és kiválasztott tisztulási időpontokban. Radioaktív jelöléssel ellátott anyagok vizsgálata esetén hasonló megfontolásokat kell mérlegelni, mint a vízi expozíciónál, de a víz analízisének helyébe a táp analízise lép (vö. 65. pont).

Referenciaanyagok időszakos alkalmazása esetén (vö. 25. pont) lehetőség szerint a koncentrációkat a vizsgálati csoportban a felvételi fázis végén és a vizsgálati anyag szempontjából meghatározott valamennyi tisztulási időpontban mérni kell (egész hal); a koncentrációkat a kontrollcsoportokban csak a felvétel végén kell analizálni (egész hal). Bizonyos körülmények között (például ha a vizsgálati anyagra és a referenciaanyagra vonatkozó analitikai módszerek nem összeegyeztethetők, és ezért további halakra lenne szükség a mintavételi ütemterv betartásához), más megközelítést lehet alkalmazni a következők szerint, a további szükséges halak számának minimálisra csökkentése érdekében. A referenciaanyag koncentrációit a tisztulás során csak az 1. és 3. napon és két további mintavételi pontban kell mérni, amelyeket úgy kell megválasztani, hogy a nulla időpillanati koncentráció (C 0,d) és a k 2 megbízhatóan becsülhető legyen a referenciaanyag tekintetében.

Ha lehetséges, az egyes halak lipidtartalmát minden mintavételi alkalommal, vagy legalább a felvételi fázis elején és végén, illetve a tisztulási fázis végén meg kell határozni (vö. 56. és 67. pont). Az analitikai módszertől függően (vö. 67. pont és 4. függelék), lehetőség van ugyanazt a halat használni a lipidtartalom és a vizsgálatianyag-koncentráció meghatározásához. Ez a halak számának minimálisra csökkentése miatt javasolt. Ugyanakkor, amennyiben ez nem lehetséges, a vízi expozíciós módszernél leírt megközelítés alkalmazható (lásd az 56. pontot ezen alternatív lipidmérési lehetőségek tekintetében). A lipidtartalom számszerűsítésére alkalmazott módszert dokumentálni kell a Vizsgálati jegyzőkönyvben.

Az analitikai módszer minősége

Kísérleti ellenőrzéseket kell végezni az anyagspecifikus analitikai módszer specifikusságának, pontosságának és utánozhatóságának, valamint a vizsgálati anyag tápból és halból való visszanyerésének biztosítására.

A halak növekedésének mérése

A vizsgálat kezdetén a törzsállományból vett halmintát kell lemérni tömeg (és teljes hossz) tekintetében. E halakat röviddel (pl. egy órával) azelőtt kell mintavételezni, hogy az első kiegészített tápot beadnák, és azokat a 0. kísérleti naphoz kell rendelni. A halak számának ebben a mintában legalább annyinak kell lennie, mint a vizsgálat során vett mintákban. Ezek némelyike megegyezhet a lipidanalízishez a felvételi fázis kezdete előtt használt halakkal (vö. 153. pont). Az egyes mintavételekkor a halak tömegét és hosszát meg kell mérni. Az egyes halak esetében a mért tömeget és hosszt össze kell kapcsolni az elemzett vegyi anyag koncentrációjával (és adott esetben a lipidtartalommal), például a mintába felvett egyes halakra alkalmazott egyedi azonosító kóddal. E mintába felvett halak mérései a vizsgálati és kontrolltartályokban maradó halak tömegének és hosszának becsléséhez használhatók.

A kísérlet értékelése

A mortalitást naponta meg kell figyelni és rögzíteni kell. Emellett a káros hatásokat is meg lehet figyelni, például az abnormális viselkedést vagy a pigmentációt; ezeket rögzíteni kell. A halak akkor tekinthetők élettelennek, ha nem látható semmilyen légzőmozgás és az enyhe mechanikus stimulációra sincs reakció. Az élettelen vagy egyértelműen elhullásközeli állapotban lévő halat el kell távolítani.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Eredmények feldolgozása

A vizsgálati eredményeket a tisztulási sebességi állandónak (k 2) a hal nedves össztömege függvényében történő kiszámítására használják. A növekedési sebességi állandót (k g) a hal tömege növekedésének átlaga alapján számítják ki, és abból adható meg a növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandó (k 2g) szükség esetén. Rögzíteni kell továbbá az asszimilációs hatékonyságot (aa bélből való felszívódást), a kinetikus biomagnifikációs tényezőt (BMFK) (szükség esetén a növekedéssel korrigálva, BMFKg), annak lipidtartalommal korrigált értékét (BMFKL vagy BMFKgL, ha a növekedés okozta hígulásra tekintettel korrigálják) és az etetési arányt. Emellett becsülhető a felvételi fázisban az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő (pl. az állandósult állapot 95 %-a vagy t 95 = 3,0/k 2), és felvehető az állandósult állapoti BMF (BMFSS) (vö. 105. és 106. pont és az 5. függelék), ha a t 95 érték arra utal, hogy az állandósult állapot valószínűleg megvalósult. Ugyanazt a lipidkorrekciót kell alkalmazni erre a BMFSS-re, mint a kinetikailag származtatott BMF-re (BMFK) a lipidtartalommal korrigált érték (BMFSSL) megadása érdekében (figyelembe kell venni, hogy nincs elfogadott eljárás az állandósult állapoti BMF növekedés okozta hígulásra tekintettel történő korrigálására). Az e számításokkal kapcsolatos képletek és példák a 7. függelékben találhatók. Rendelkezésre állnak megközelítések a kinetikus biokoncentrációs tényező (BCFK) becslésére az étrendi vizsgálatból nyert adatok alapján. Ezt a 8. függelék tárgyalja.

A halak tömegére/hosszára vonatkozó adatok

A halegyedek nedves tömegét és hosszát minden időtartam tekintetében külön kell feltüntetni a táblázatban a vizsgálati és a kontrollcsoportok vonatkozásában, a felvételi fázis minden mintavételi napjára (a törzsállomány esetén a felvétel kezdetén; a kontrollcsoport és a vizsgálati csoport esetén a felvétel végén és – ha van ilyen mintavétel – a korai fázisban, azaz a felvétel 1–3. napján, továbbá a tisztulási fázisban, pl. az 1., 2., 4., 7., 14., 28. napon a kontroll- és vizsgálati csoport esetén). A növekedés és a növekedés okozta hígulás mérésére a tömeg az előnyben részesített mérték. Az adatok növekedés okozta hígulásra tekintettel történő korrigálásához használt módszer(eke)t lásd alább (162. és 163. pont) és az 5. függelékben.

A vizsgálati anyagok koncentrációja a halra vonatkozó adatokban

A halegyedekben (vagy összevont halmintákban, ha az egyedi mérés nem lehetséges) található vizsgálatianyag-maradékokra vonatkozó méréseket nedves tömeg koncentrációban (w/w) kifejezve kell táblázatba foglalni a vizsgálati és a kontrollhalak tekintetében az egyes mintavételi alkalmakra vonatkoztatva. Ha lipidanalízist is végeztek minden mintába felvett halon, az egyedi lipidtartalommal korrigált koncentrációkat lipidkoncentrációban (w/w lipid) kifejezve lehet származtatni és táblázatba foglalni.

Tisztulási sebesség és biomagnifikációs tényező

A biomagnifikációs tényező adatokból történő kiszámítása érdekében először is az asszimilációs hatékonyságot (a vizsgálati anyag bélből való felszívódását, α) kell meghatározni. Ehhez a 7. függelékben található A7.1. egyenletet kell használni, amelyhez ismerni kell a következő adatokat: a származtatott koncentráció a halban a tisztulási fázis nulla időpillanatában, a (teljes) tisztulási sebességi állandó (k 2), koncentráció a tápban (Cfood), a táplálékfelvételi sebességi állandó (I), továbbá a felvételi időszak tartama (t). Az ln (koncentráció) és a tisztulási idő közötti lineáris kapcsolat meredekségét és metszését mint teljes tisztulási sebességi állandót (k 2= meredekség) és a nulla időpillanati koncentrációt (C 0,d = eintercept) kell rögzíteni, a fentiek szerint. A származtatott értékeket ellenőrizni kell a biológiai elfogadhatóság szempontjából (pl. az asszimilációs együttható mint tört, nem lehet nagyobb 1-nél). Az (I)-t a táp tömegének és az egyes napokon etetett halak tömegének hányadosaként kell megadni (ha az etetés a testtömeg 2 %-ának megfelelő arányban történik, az (I) 0,02 lesz). Ugyanakkor szükség lehet arra, hogy a számításhoz használt etetési arányt a halak növekedéséhez igazítsák (ez elvégezhető úgy, hogy az ismert növekedési sebességi állandó felhasználásával becslik a halaknak a felvételi fázis egyes időpillanataira jellemző tömegét; vö. 7. függelék). Amennyiben k 2-t és C 0,d-t nem lehet származtatni, például mivel a koncentrációk a második tisztulási mintában a meghatározási határ alatt vannak, elvégezhető a k 2 és a BMFK»felső határának« konzervatív becslése (vö. 7. függelék).

Az asszimilációs hatékonyság (α) meghatározását követően a biomagnifikációs tényező kiszámítható úgy, hogy az α és a táplálékfelvételi sebességi állandó (I) szorzatát elosztják a (teljes) tisztulási sebességi állandóval (k 2). A növekedéssel korrigált biomagnifikációs tényezőt ugyanígy kell kiszámítani, de a növekedéssel korrigált tisztulási együtthatót kell használni (k 2g; vö. 162. és 163. pont). Az asszimilációs hatékonyság alternatív becslését akkor lehet származtatni, ha a felvételi fázis korai, lineáris szakaszában vett halmintán szövetanalízist végeztek; vö. 151. pont és 7. függelék. Ez az érték az asszimilációs hatékonyság független becslése egy lényegében expozícióval nem érintett szervezet esetében (azaz a halak a felvételi fázis elejéhez közel vannak). A tisztulási adatok alapján becsült asszimilációs hatékonyságot általában a BMF származtatására használják.

A lipidtartalomra és a növekedés okozta hígulásra tekintettel alkalmazott korrekció

A halak tisztulási fázisban bekövetkezett növekedése csökkentheti a halban mért vegyianyag-koncentrációt, ezáltal a teljes tisztulási sebességi állandó (k2 ) magasabb lesz, mint ami csak a kiválasztási folyamatokból (pl. anyagcsere, kiürítés) eredne (vö. 72. pont). A vizsgálati halak lipidtartalma (amely nagymértékben összefügg a víztaszító anyagok bioakkumulációjával), valamint a táp lipidtartalma a gyakorlatban kellően változékony ahhoz, hogy korrekcióra legyen szükség annak érdekében, hogy a biomagnifikációs tényezőket hasznosan lehessen bemutatni. A biomagnifikációs tényezőt korrigálni kell a növekedés okozta hígulásra tekintettel (mint a kinetikus BCF-et a vízi expozíciós módszernél), továbbá korrigálni kell a tápnak a hal lipidtartalmához viszonyított lipidtartalma vonatkozásában (lipidkorrekciós tényező). Az e számításokkal kapcsolatos egyenletek és példák az 5., illetve a 7. függelékben találhatók.

A növekedés okozta hígulásra tekintettel történő korrekcióhoz ki kell számítani a növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandót (k 2g) (az egyenletek tekintetében lásd az 5. függeléket). Ezt a növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandót (k 2g) kell használni a növekedéssel korrigált biomagnifikációs tényező kiszámításához, mint a 73. pontban. Egyes esetekben ez a megközelítés nem alkalmazható. A növekedés okozta hígulásra tekintettel végzett korrekciót szükségtelenné tevő alternatív megközelítés a vizsgálati anyag halankénti (egész halra vetített) tömegét tükröző tisztulási adatokat alkalmazza, szemben a szokásos, a vizsgálati anyagnak a hal egységnyi tömegéhez viszonyított tömegére (koncentrációra) vonatkozó adatokkal. Ez könnyen elérhető adat, mivel az e vizsgálati módszer szerinti vizsgálatoknak a feljegyzett szöveti koncentrációkat az egyes halak tömegéhez kell kapcsolniuk. Az erre szolgáló egyszerű eljárást az 5. függelék ismerteti. Meg kell jegyezni, hogy a k 2-t akkor is becsülni kell és fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben, ha ezt az alternatív megközelítést alkalmazzák.

A hal és a táp lipidtartalmára tekintettel végzett korrekcióhoz, ha nem végeztek lipidanalízist valamennyi mintavételezett halon, a halban és a tápban lévő lipidfrakciók (w/w) átlagát származtatni kell ( 44 ). A lipidkorrekciós tényezőt (Lc ) ezt követően úgy kell kiszámítani, hogy a halak lipidfrakciójának átlagát el kell osztani a táp lipidfrakciójának átlagával. A lipidtartalommal korrigált biomagnifikációs tényező kiszámításához a növekedéssel korrigált vagy adott esetben nem korrigált biomagnifikációs tényezőt el kell osztani a lipidkorrekciós tényezővel.

Ha a kémiai és a lipidanalízist ugyanazon a halon végezték el mindegyik mintavételi ponton, akkor az adott halra vonatkozó, egyedi, a lipidtartalom tekintetében korrigált szöveti adatokat kell felhasználni a lipidtartalom szempontjából korrigált BMF közvetlen kiszámításához (vö. (37)). A lipidtartalomra tekintettel korrigált koncentrációs adatok ábrája megmutatja a lipid alapú C 0,d-t és a k 2-t. Ekkor matematikai elemzést lehet végezni a 7. függelék ugyanazon egyenleteivel, de az asszimilációs hatékonyságot (a) a lipidtartalom tekintetében normalizált táplálékfelvételi sebességi állandó (I lipid) és a lipidalapú étrendi koncentráció (C food-lipid) felhasználásával kell kiszámítani. A lipiddel korrigált paramétereket ezt követően ugyanúgy felhasználják a BMF kiszámítására (meg kell jegyezni, hogy a növekedési sebességi állandóval való korrekciót a lipidfrakcióra kell alkalmazni és nem a hal nedves tömegére a lipidtartalommal és a növekedéssel korrigált BMFKgL kiszámításához).

Az eredmények kiértékelése

A vizsgálati és a kontrollcsoportban megfigyelt átlagos növekedés elvben nem lehet nagymértékben különböző, hogy a toxikus hatások kizárhatók legyenek. A két csoport növekedési sebességi állandóit vagy növekedési görbéit megfelelő eljárással össze kell hasonlítani ( 45 )).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A vizsgálat végeztével végleges jelentés készül, amely tartalmazza a vizsgálati anyaggal, a vizsgálati fajokkal és a vizsgálati körülményekkel kapcsolatos, a 81. pontban felsorolt információkat (mint a vízi expozíciós módszer esetében). Ezek mellett az alábbi információt kell megadni:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK

SZAKIRODALOM

---

2. függelék

AZ ELFOGADHATÓ MINŐSÉGŰ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY FONTOSABB KÉMIAI TULAJDONSÁGA

---

3. függelék

VIZSGÁLATHOZ AJÁNLOTT HALFAJOK

Különböző torkolati és tengeri fajok kevésbé széles körben használtak, például:

A táblázatban felsorolt édesvízi halak könnyen tenyészthetők, és/vagy könnyen beszerezhetők egész évben, míg a tengeri és torkolati fajok beszerezhetősége részben bizonyos országokra korlátozódik. A fent felsorolt halfajok halastóban vagy laboratóriumban is (betegségek és paraziták szempontjából ellenőrzött körülmények között) tenyészthetők, így a vizsgálati állatok egészségesek lesznek és származásuk ismert lesz. Ezek a halak a világ sok részében beszerezhetők.

SZAKIRODALOM

---

4. függelék

MINTAVÉTELI ÜTEMTERVEK A VÍZI ÉS AZ ÉTRENDI EXPOZÍCIÓS VIZSGÁLATHOZ

1.    Elméleti példa teljes vízi expozíciós biokoncentrációs vizsgálat mintavételi ütemtervére log KOW = 4 anyagok esetében

2.    Elméleti példa az anyag étrendi bioakkumulációs vizsgálatának mintavételezési ütemtervére 10 napos felvételi és 42 napos tisztulási fázist követve

A fázis és a mintavétel ütemezésével kapcsolatos észrevétel: a felvételi fázis a kiegészített táppal való első etetéskor kezdődik. Egy kísérleti nap az etetés időpontjától röviddel a 24 órával későbbi következő etetés időpontja előttig tart. Az első mintavételre (a táblázatban 1) röviddel (pl. egy órával) az első etetés előtt kell sort keríteni. A vizsgálat során a mintavételt ideális esetben röviddel a következő napi etetés előtt kell elvégezni (azaz körülbelül a mintavételi napon végrehajtott etetést követően 23 órával). A felvételi fázis röviddel azelőtt ér véget, hogy az első kiegészítetlen tápot beadnák, amikor a tisztulási fázis kezdődik (a vizsgálati csoportba tartozó halak valószínűleg még emésztik a kiegészített tápot a kiegészített táppal való utolsó etetést követő 24 órában). Ez azt jelenti, hogy a felvételi fázis végi mintát röviddel a kiegészítetlen táppal való első etetés előtt kell venni, a tisztulási fázis első mintáját pedig a kiegészítetlen táppal való első etetést követő körülbelül 23 órával.

---

5. függelék

ÁLTALÁNOS SZÁMÍTÁSOK

1.   BEVEZETÉS

Az általános vízi bioakkumulációs halvizsgálati modell a felvételi és ürülési folyamatokkal írható le, figyelmen kívül hagyva a tápon keresztül történő felvételt. A halban lévő koncentráció változási sebességét (mg·kg-1·nap-1) leíró differenciál egyenlet (dC f/dt) a következő (1):

ahol:

k 1

=

A hal általi felvétel elsőrendű sebességi állandója (l·kg-1·nap-1).

k 2

=

A halból való tisztulás elsőrendű sebességi állandója (nap-1).

kg

=

A halnövekedés elsőrendű sebességi állandója (»növekedés okozta hígulás«) (nap-1).

km

=

A metabolikus átalakulás elsőrendű sebességi állandója (nap-1).

ke

=

A fekália ürítésének elsőrendű sebességi állandója (nap-1).

C w

=

Koncentráció a vízben (mg·l-1).

Cf

=

Koncentráció a halban (mg·kg-1 nedves tömeg).

A biológiailag felhalmozódó anyagok esetében várható, hogy az idővel súlyozott átlag (TWA) a leginkább releváns expozíciós koncentráció a vízben (Cw) a megengedett ingadozási tartományon belül (vö. 24. pont). A vízbeli koncentráció idővel súlyozott átlagát ajánlott a C.20. vizsgálati módszer 6. függelékében található eljárás szerint kiszámítani (2). Meg kell jegyezni, hogy a vízi koncentráció ln-transzformációja akkor megfelelő, ha exponenciális bomlás várható a megújítási időszakok között, pl. félstatikus vizsgálati terv esetén. Átfolyásos rendszerben nincs szükség az expozíciós koncentrációk ln-transzformációjára. Ha származtatják a vízi koncentráció idővel súlyozott átlagát, azt fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben, és fel kell használni a későbbi számítások során.

A BCF-re irányuló standard halvizsgálatban a felvétel és a tisztulás leírható két elsőrendű kinetikai folyamattal.

Állandósult állapotban, feltételezve, hogy a növekedés és az anyagcsere elhanyagolható (azaz a k g és k m értékek nem különböztethetők meg a nullától), a felvételi sebesség megegyezik a tisztulási sebességgel, így az A5.2. egyenlet és az A5.3. egyenlet kombinálásából a következő összefüggés adódik:

ahol:

C f-SS

=

Állandósult állapoti koncentráció a halban (mg·kg-1 nedves tömeg).

C w-SS

=

Állandósult állapoti koncentráció a vízben (mg l-1).

A k 1/k 2 hányadosa kinetikus BCF-ként (BCFK) ismert, és annak meg kell egyeznie az állandósult állapoti BCF-fel (BCFSS), amely a halban lévő állandósult állapoti koncentráció és a vízben lévő ilyen koncentráció hányadosából adódik, de eltérések fordulhatnak elő, ha az állandósult állapot bizonytalan volt, vagy ha a kinetikus BCF-et növekedéssel korrigálták. Ugyanakkor, mivel a k 1 és k 2 állandók, az állandósult állapotot nem feltétlenül kell elérni a BCFK származtatásához.

Ez az 5. függelék ezen elsőrendű egyenletek alapján általános számításokat tartalmaz, amelyek mind a vízi, mind az étrendi expozíciós bioakkumulációs módszerekhez szükségesek. Az 5. 6. és 8. szakasz ugyanakkor csak a vízi expozíciós módszer tekintetében releváns, ám itt »általános« módszerként szerepel. A lépcsőzetes (4. és 5. szakasz) és szimultán (6. szakasz) modellek lehetővé teszik a kinetikus BCF-ek származtatásához használt felvételi és tisztulási állandók kiszámítását. A k 2 meghatározásának lépcsőzetes módszere (4. szakasz) fontos az étrendi módszer esetében, mivel mind az asszimilációs hatékonyság, mind a BMF kiszámításához nélkülözhetetlen. Az étrendi módszerre sajátosan jellemző számításokat a 7. függelék mutatja be.

2.   A FELVÉTELI FÁZIS IDŐTARTAMÁNAK ELŐREJELZÉSE

A vizsgálat elvégzése előtt a k 2, és így az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő adott százaléka megbecsülhető a k 2 és az n-oktanol/víz megoszlási együttható (K OW) vagy a k 1 és a BCF tapasztalati összefüggéséből. Fontos megjegyezni azonban, hogy az e szakaszban bemutatott egyenletek csak akkor alkalmazhatók, ha a felvétel és a tisztulás elsőrendű kinetikát követ. Ha egyértelműen nem ez a helyzet, ajánlott biostatisztikustól és/vagy farmakokinetikustól szakvéleményt kérni, amennyiben a felvételi fázissal kapcsolatos előrejelezésekre van szükség.

A k 2 (nap-1) becslése több módszerrel is végezhető. Például elsőként az alábbi tapasztalati összefüggéseket lehet felhasználni ( 47 ):

vagy

W = a kezelt halak tömegének átlaga (nedves tömeg grammja) a felvétel végén/tisztulás kezdetén ( 48 )

Egyéb összefüggéseket lásd a (6) hivatkozásban. Előnyös lehet összetettebb modellek alkalmazása a k 2 becslése során, ha például valószínűsíthető, hogy jelentős anyagcserére kerülhet sor (7) (8). Ugyanakkor, minél bonyolultabb az adott modell, annál nagyobb körültekintést kell tanúsítani az előrejelzések értelmezésénél. A nitrocsoportok jelenléte például gyors anyagcserére utalhat, de nem mindig ez a helyzet. Ezért a felhasználónak mindig össze kell vetnie az előrejelzési módszer eredményeit a kémiai szerkezettel és bármely más releváns információval (például előzetes vizsgálatokkal) a vizsgálat ütemtervének meghatározásakor.

A k2-becslés felhasználásával, a felvételt és tisztulást leíró általános kinetikai egyenletből (elsőrendű kinetika) kiszámítható az állandósult állapot bizonyos százalékának eléréséhez szükséges idő, feltételezve, hogy a növekedés és az anyagcsere elhanyagolható. Ha a vizsgálat során jelentős növekedés tapasztalható, az alább leírt becslések nem megbízhatók. Ilyen esetekben jobb a növekedéssel korrigált k 2g alkalmazása, amint az később bemutatásra kerül (lásd e függelék 7. szakaszát):

vagy ha Cw állandó:

Az állandósult állapot közelítésekor (t→∞) az A5.10. egyenlet egyszerűsíthető (vö. (9) (10)):

vagy

Ekkor a BCF × Cw a halakban mérhető koncentráció közelítése »állandósult állapotban« (Cf-SS). [Megjegyzés: ugyanez a megközelítés alkalmazható az állandósult állapoti BMF becslésére az étrendi vizsgálatnál. Ebben az esetben a BCF helyébe a BMF, a C w helyébe a C food, azaz a tápban lévő koncentráció lép a fenti egyenletekben]

Az A5.10. egyenlet átírható:

vagy

Az A5.14. egyenlet alkalmazásával megjósolható az állandósult állapot bizonyos százalékának eléréséhez szükséges idő, amennyiben az A5.5. vagy A5.6. egyenlet felhasználásával a k 2-t előzetesen megbecsülték.

Iránymutatásként: statisztikailag elfogadható adatok (BCFK) előállításához a felvételi fázis statisztikailag optimális időtartama az a periódus, ami ahhoz szükséges, hogy a halban lévő vizsgálatianyag-koncentráció logaritmusának görbéje lineáris időskálán ábrázolva elérje az állandósult állapot 50 %-át (azaz 0,69/k 2), de ne legyen nagyobb az állandósult állapot 95 %-ánál (azaz 3,0/k 2-nél)(11). Amennyiben a felhalmozódás túllép az állandósult állapot 95 %-án, el lehet végezni a BCFSS kiszámítását.

Az állandósult állapot 80 %-ának eléréséhez szükséges idő (az A5.14. egyenlet felhasználásával):

vagy

Ugyanígy az állandósult állapot 95 %-ának eléréséhez szükséges idő:

Például log Kow = 4 értékkel jellemzett vizsgálati anyag esetében a felvételi fázis időtartama (azaz az állandósult állapot bizonyos százalékának eléréséhez szükséges idő, pl. t 80 vagy t 95) (az A5.5., A5.16. és A5.17. egyenletet használva):

logk 2 = 1,47 – 0,414 · 4

k 2 =0,652 nap-1

vagy

Ezenkívül:

kifejezés használható az effektív állandósult állapot eléréséhez szükséges idő (t eSS) kiszámításához (12). Amelynek eredménye a log K OW = 4 értékkel jellemzett anyagok esetében:

teSS = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 óra

3.   A TISZTULÁSI FÁZIS IDŐTARTAMÁNAK ELŐREJELZÉSE

A test anyagterhelésének a kezdeti koncentráció bizonyos százalékára való csökkentéséhez szükséges idő megbecsülhető a felvételt és tisztulást leíró általános egyenletből (elsőrendű kinetikát feltételezve, vö. A5.9. egyenlet) (1) (13).

A tisztulási fázisban Cw (vagy az étrendi vizsgálat esetén Cfood) nullának feltételezett. Az egyenlet ezt követően egyszerűsíthető:

vagy

ahol Cf,0 a koncentráció a tisztulási fázis kezdetén.

Az 50 %-os tisztulás aztán t 50 időpontban következik be:

vagy

Hasonlóan, a 95 %-os tisztulás elérésének időpontja:

Amennyiben 80 %-os felvételt használnak az első periódusban (1,6/k 2), és 95 %-os ürülést a tisztulási fázisban (3,0/k 2), akkor a tisztulási fázis megközelítőleg kétszer hosszabb a felvételi fázisnál.

Meg kell jegyezni, hogy a becslések azon a feltevésen alapulnak, hogy a felvételi és tisztulási mintázat elsőrendű kinetikát követ. Amennyiben nyilvánvalóan nem elsőrendű a kinetika, ezek a becslések nem érvényesek.

4.   LÉPCSŐZETES MÓDSZER A K 2 TISZTULÁSI (ÜRÜLÉSI) SEBESSÉGI ÁLLANDÓ MEGHATÁROZÁSÁRA

A legtöbb biokoncentrációs adatról feltételezett, hogy »ésszerűen« jól leírható egy egyszerű kétváltozós modellel, amely a tisztulási fázisban (természetes alapú logaritmusos skálán) a halakban lévő koncentrációk pontjaira illeszthető egyenest ad.

Meg kell jegyezni, hogy az egyenes vonaltól való eltérések elsőrendűnél összetettebb tisztulási mintázatot jelezhetnek. Az elsőrendű kinetikától eltérő tisztulási típusok meghatározására a grafikus módszer alkalmazható.

A k 2 több (mintavételi) időpont esetén történő kiszámítására az ln (koncentráció) lineáris regresszióját kell elvégezni az idő függvényében. A regressziós egyenes meredeksége adja a tisztulási sebességi állandó, k 2 becslését ( 49 ). A metszésből könnyen (hibahatárokra is figyelemmel) kiszámítható a halban lévő átlagos koncentráció a tisztulási fázis kezdetén (C0,d; amely megfelel a halban a felvételi fázis végén lévő átlagos koncentrációnak) (49) :

A k 2 kiszámítása, ha csak két (mintavételi) időpont áll rendelkezésre (mint a minimalizált terv esetén), a két átlagkoncentrációt a következő egyenlet váltja fel:

Ahol ln(C f1) és ln(C f2) a t 1, illetve t 2, időre jellemző koncentráció természetes alapú logaritmusa, továbbá t 2 és t 1 a két minta begyűjtésének ideje a tisztulási fázis kezdetéhez viszonyítva ( 50 ).

5.   LÉPCSŐZETES MÓDSZER A K 1 FELVÉTELI SEBESSÉGI ÁLLANDÓ MEGHATÁROZÁSÁRA (CSAK VÍZI EXPOZÍCIÓS MÓDSZER ESETÉN)

A k 1 értékének a felvételi fázisra jellemző, egymást követő időpontok koncentrációs adataira tekintettel történő meghatározásához a következő modellhez illeszkedő számítógépes programot kell használni:

Ahol a k 2 az előző számításból adódik, C f(t) és C w(t) pedig a halban és a vízben lévő koncentráció t időben.

A k 1 kiszámítására, ha csak két (mintavételi) időpont áll rendelkezésre (mint a minimalizált terv esetén), a következő képletet kell használni:

Ahol a k 2 a korábbi számításból adódik, Cf a halban lévő koncentráció a tisztulási fázis kezdetén, Cw pedig a vízben lévő átlagkoncentráció a felvételi fázisban ( 51 ).

A megfelelő illeszkedés értékeléséhez alkalmazható a k 1 és k 2 mért, mintavételezett pontadatokhoz viszonyítva ábrázolt meredekségének vizuális megfigyelése. Ha az derül ki, hogy a lépcsőzetes módszer gyenge becslést ad a k 1-re, akkor a k 1 és a k 2 kiszámítására az egyidejű megközelítést kell alkalmazni (lásd a következő 6. szakaszt). Az eredményül adódó meredekséget össze kell vetni az ábrázolt mért adatokkal a megfelelő illeszkedés vizuális vizsgálatának céljából. Ha az illeszkedés továbbra sem megfelelő, az arra utalhat, hogy nem elsőrendű kinetikáról van szó, és összetettebb modelleket kell alkalmazni.

6.   EGYIDEJŰ MÓDSZER A FELVÉTELI ÉS A TISZTULÁSI (ÜRÜLÉSI) SEBESSÉGI ÁLLANDÓ SZÁMÍTÁSÁRA (CSAK VÍZI EXPOZÍCIÓS MÓDSZER ESETÉN)

Számítógépes programok használhatók a k 1 és k 2 értékének az egymást követő időpontok koncentrációs adataiból és az alábbi modell alapján történő kiszámítására

ahol:

t c

=

a felvételi fázis végének időpontja.

Ez a megközelítés közvetlenül megadja a k 1 és k 2 becsléseinek standard hibáit. Ha a k 1/k 2 helyébe a BCF lép (vö. A5.4. egyenlet) az A5.25 A5.26. egyenletben, a BCF standard hibáját és a 95 %-os konfidencia-intervallumot is meg lehet becsülni. Ez kifejezetten hasznos, ha különböző becsléseket kell összehasonlítani adattranszformáció következtében. A függő változó (a halban lévő koncentráció) ln-transzformációval vagy anélkül is illeszthető, és értékelhető az eredményül adódó BCF bizonytalansága.

Mivel egyidejű becslés esetén erőteljes korreláció állapítható meg a k 1 és k 2 paraméterek között, tanácsos lehet először csak a tisztulási adatokból kiszámolni a k 2-t (lásd fent); a k 2 a legtöbb esetben a tisztulási görbéből viszonylag nagy pontossággal megbecsülhető. Ezt követően nem lineáris regresszióval ki lehet számolni k 1-et a felvételi adatokból ( 52 ). A lépcsőzetes illesztéskor tanácsos ugyanazt az adattranszformációt alkalmazni.

A megfelelő illeszkedés értékeléséhez alkalmazható az eredményül adódó, a mintavételezett pontadatokhoz viszonyítva ábrázolt meredekségek vizuális megfigyelése. Ha az derül ki, hogy ez a módszer gyenge becslést ad a k 1-re, akkor a k 1 és a k 2 kiszámítására az egyidejű megközelítést kell alkalmazni. Az illesztett modellt itt is össze kell vetni az ábrázolt mért adatokkal a megfelelő illeszkedés vizuális vizsgálatának céljából; és az egyes illesztési típusoknál az eredményül adódó paraméterbecsléseket össze kell vetni a k 1 és k 2 tekintetében, az eredményül adódó BCF-et, standard hibáikat és/vagy konfidencia-intervallumaikat.

Ha az illeszkedés nem megfelelő, az arra utalhat, hogy nem elsőrendű kinetikáról van szó, és más, összetettebb modelleket kell alkalmazni. Az egyik legáltalánosabb komplikáció a halak növekedése a vizsgálat során.

7.   A NÖVEKEDÉS OKOZTA HÍGULÁSRA TEKINTETTEL ALKALMAZOTT KORREKCIÓ KINETIKUS BCF ÉS BMF ESETÉN

Ez a szakasz a hal vizsgálat során történő növekedésére (az úgynevezett növekedés okozta hígulásra) tekintettel végzett korrekció standard módszerét ismerteti, amely csak elsőrendű kinetika esetén érvényes. Ha arra utaló jelek láthatók, hogy az elsőrendű kinetika nem valósul meg, ajánlott biostatisztikus szakvéleményét kérni a növekedés okozta hígulásra tekintettel végzett megfelelő korrekció tekintetében, vagy az alább bemutatott, tömeg alapú megközelítést alkalmazni.

Egyes esetekben a növekedés okozta hígulásra tekintettel végzett korrekció módszere nem kellően pontos, vagy néha nem működik (például nagyon lassan tisztuló, gyorsan növekedő halakban vizsgált anyagok esetében a származtatott, növekedés okozta hígulásra tekintettel korrigált tisztulási sebességi állandó, k 2g nagyon csekély lehet, így az ennek származtatásához használt két sebességi állandóban kritikus lesz a hiba, és bizonyos esetekben a k g becslései meghaladhatják a k 2-t). Ilyen esetben alternatív megközelítés (azaz tömeg alapú megközelítés) használható, amely akkor is működik, ha a folyamat nem elsőrendű kinetikát követett, és ekkor nem lesz szükség a korrekcióra. E megközelítés a szakasz végén olvasható.

A növekedési sebességi állandó kivonásának módszere a növekedésre tekintettel történő korrekcióhoz

A standard módszerhez valamennyi egyedi tömeg- és hosszadatot természetes alapú logaritmusára kell konvertálni és az ln(tömeg) vagy ln(1/tömeg) adatokat az idő (nap) függvényében kell ábrázolni, külön a kezelt és a kontrollcsoport vonatkozásában. Ugyanazt az eljárást kell lefolytatni külön a felvételi és a tisztulási fázisra. A növekedés okozta hígulásra tekintettel végzett korrekcióhoz általában megfelelőbb az egész vizsgálat során nyert tömegadatokat használni a növekedési sebességi állandó (k g) kiszámítása érdekében, de a felvételi és a tisztulási fázis tekintetében származtatott növekedési sebességi állandók közötti statisztikailag szignifikáns eltérések arra utalhatnak, hogy a tisztulási fázis sebességi állandóját kell alkalmazni. A kezeléssel összefüggő hatások ellenőrzéséhez használhatók a vizes vizsgálatokból származó, a vizsgálati és kontrollcsoportra vonatkozó teljes növekedési sebességek.

Legkisebb négyzetes lineáris korrelációt számítanak a nap függvényében kifejezett ln(haltömeg)-re (és a nap függvényében kifejezett ln(1/tömeg)-re), minden csoport (vizsgálati és kontrollcsoportok, egyedi adatok és nem a napi átlagértékek) és az egész vizsgálat, a felvételi és a tisztulási fázis tekintetében, standard statisztikai eljárásokkal. Az egyenesek meredekségeinek szóródását kiszámítják és felhasználják a meredekségek (növekedési sebességi állandók) közötti eltérések statisztikai szignifikanciájának értékeléséhez (p = 0,05), a Student-féle t-próba (vagy egynél több koncentráció vizsgálata esetén az ANOVA) alkalmazásával. A növekedésre tekintettel történő korrekció céljaira általában előnyösebb tömegadatokat használni. Az ugyanilyen módon kezelt hosszadatok hasznosak lehetnek a kontroll- és a vizsgálati csoportok kezeléssel összefüggő hatásokra tekintettel történő összehasonlítására. Ha a tömegadatok analízise nem utal statisztikailag szignifikáns eltérésre, a vizsgálati és kontrolladatokat össze lehet vonni, és a vizsgálat céljára teljes halnövekedési sebességi állandót (k g) lehet számítani, mint a lineáris korreláció általános meredekségét. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek figyelhetők meg, az egyes halcsoportokra és/vagy vizsgálati fázisra jellemző növekedési sebességi állandókat külön-külön kell feltüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben. Az egyes kezelt csoportokból származó sebességi állandót ekkor az adott csoportban kell a növekedés okozta hígulásra tekintettel végzett korrekcióhoz használni. Ha a felvételi és a tisztulási fázis sebességi állandói között statisztikai különbségek figyelhetők meg, a tisztulási fázis tekintetében származtatott sebességi állandókat kell alkalmazni.

A tisztulási sebességi állandó (k 2g) meghatározásához a számított növekedési sebességi állandó (k g) nap–1-ben kifejezve) kivonható a teljes tisztulási sebességi állandóból (k 2).

A felvételi sebességi állandót elosztják a növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandóval a növekedéssel korrigált kinetikus BCF kiszámításához (amelynek jelölése BCFKg, vagy BMFKg).

Az étrendi vizsgálathoz származtatott növekedési sebességi állandót az A7.5 egyenletben használják fel a növekedéssel korrigált BMFKg kiszámításához (vö. 7. függelék).

Tömeg alapú módszer a növekedésre tekintettel történő korrekcióhoz

A fenti, növekedési sebességi állandó kivonásán alapuló módszer alternatívája, ahol nincs szükség növekedésre tekintettel történő korrekcióra, a következőképpen használható. Az elv a tisztulási adatok egész halra vetített tömeg alapján történő használata, és nem koncentrációalapú használata.

A tisztulási fázis szöveti koncentrációit (vizsgálati anyag tömege/ a hal egységnyi tömege) konvertálni kell a vizsgálati anyag tömege/hal hányadosra: a koncentrációkat és az egyes halak tömegét táblázatos formában meg kell feleltetni egymásnak (pl. számítógépes táblázatkezelővel) és az egyes koncentrációkat meg kell szorozni a teljes haltömeggel az adott mérés tekintetében, így adódik a vizsgálati anyag tömege/hal hányadosok sora a tisztulási fázis valamennyi mintája vonatkozásában.

A vizsgálati anyag tömegére vonatkozó adatok természetes alapú logaritmusát a kísérleti idő (tisztulási fázis) függvényében kell ábrázolni, szokás szerint.

A vízi expozíciós módszer tekintetében a felvételi sebességi állandót a szokásos módon kell származtatni (lásd a 4. és 6. szakaszt; megjegyzendő, hogy a »szokásos«k 2 értéket kell használni a görbeillesztési egyenletekben a k 1 tekintetében), és a tisztulási sebességi állandót a fenti adatokból kell származtatni. Minthogy a tisztulási sebességi állandó eredményül adódó értéke független a növekedéstől, mivel azt egész halankénti tömeg alapján számították ki, ezt k 2g-vel és nem k 2-vel kell jelölni.

8.   AZ 5 %-OS LIPIDTARTALOMRA TÖRTÉNŐ LIPIDNORMALIZÁCIÓ (CSAK VÍZI EXPOZÍCIÓS MÓDSZER ESETÉN)

A vízi expozíciós vizsgálatból adódó (kinetikus és állandósult állapoti) BCF-eredményeket a halak alapértelmezett 5 %-os (nedves tömeg) lipidtartalmához viszonyítva is fel kell tüntetni a Vizsgálati jegyzőkönyvben, hacsak nem igazolható, hogy a vizsgálati anyag elsődlegesen nem lipidekben halmozódik fel (pl. egyes perfluorozott anyagok fehérjékhez kapcsolódhatnak). A halakkal kapcsolatos koncentrációs adatokat vagy a BCF-et a nedves tömegre vetített 5 %-os lipidtartalomra kell konvertálni. Ha az anyagkoncentráció és a lipidtartalom mérésére ugyanazokat a halakat használják valamennyi mintavételi ponton, a halban mért minden egyedi koncentrációt korrigálni kell az adott halnak a lipidtartalma vonatkozásában.

ahol:

C f,L

=

a lipidtartalomra vonatkoztatott koncentráció a halban (mg kg–1 nedves tömeg)

L

=

a lipidfrakció (nedves tömeg alapján)

C f

=

a vizsgálatianyag-koncentráció a halban (mg kg–1 nedves tömeg)

Ha a lipidanalízist nem végezték el minden, mintába felvett halon, akkor a lipidérték átlaga alapján kerül sor a BCF normalizálására. Az állandósult állapoti BCF tekintetében a kezelt csoportban a felvételi fázis végén rögzített átlagértéket kell használni. A kinetikus BCF normalizációja esetén lehetnek olyan esetek, amelyeknél eltérő megközelítés indokolt, például ha a lipidtartalom jelentősen módosul a felvételi vagy a tisztulási fázis során. Ugyanakkor továbbra is szokás szerint azt az etetési arányt kell alkalmazni, amely a lehető legkisebbre csökkenti a lipidtartalomban beállt drasztikus változásokat.

ahol:

BCFKL

=

a lipidtartalomra vonatkoztatott kinetikus BCF (L kg–1)

L n

=

az átlagos lipidfrakció (nedves tömeg alapján)

BCFK

=

a kinetikus BCF (L kg–1)

SZAKIRODALOM

---

6. függelék

A VÍZI EXPOZÍCIÓS VIZSGÁLAT EGYENLETI SZAKASZA: MINIMALIZÁLT VIZSGÁLATI TERV

E megközelítés mögött az a logika húzódik, hogy a teljes vizsgálatban a biokoncentrációs tényező vagy állandósult állapoti biokoncentrációs tényezőként (BCFSS) határozható meg a vizsgálati anyag halszövetben mért koncentrációja és a vizsgálati anyag vízben mért koncentrációja hányadosának kiszámításával, vagy kinetikus biokoncentrációs tényezőként a (BCFK) felvételi sebességi állandó k 1 és a tisztulási sebességi állandó k 2 hányadosának kiszámításával. A BCFK akkor is érvényes, ha az anyag állandósult állapoti koncentrációját nem érik el a felvételi fázisban, feltéve, hogy a felvétel és a tisztulás megközelítőleg elsőrendű kinetikai folyamatokat követ.

Ha a vizsgálati anyag szövetekben lévő koncentrációjának (C f1) mérését az expozíció végén (t 1) végzik el, és a szöveti koncentrációt (C f2) ezt követően egy bizonyos idő elteltével (t 2) újra megmérik, a tisztulási sebességi állandó (k 2) megbecsülhető az 5. függelékben található A5.22. egyenlettel.

A k 1 felvételi sebességi állandó ezt követően algebrikusan meghatározható az 5. függelék A5.23. egyenletével (ahol a C f megegyezik a C f1-gyel, a t pedig t 1-gyel)(1). A minimalizált terv kinetikus biokoncentrációs tényezője (amelyet BCFKm-ként jelölnek a más módszerek alkalmazásával meghatározott kinetikus biokoncentrációs tényezőktől való megkülönböztetés céljával) így a következő:

A koncentrációkat vagy eredményeket a növekedés okozta hígulásra tekintettel ki kell igazítani és normalizálni kell a hal 5 %-os lipidtartalmára, amint az az 5. függelékben szerepel.

A minimalizált BCFSS a felvételi fázis végén számított BCF, feltéve, hogy az állandósult állapot létrejött. Ez puszta feltételezés, mivel a mintavételi pontok száma nem elegendő ennek bizonyításához.

ahol:

C f-minSS = Koncentráció a halban a felvételi fázis végén a feltételezett állandósult állapotban (mg·kg–1 nedves tömeg).

C w-minSS = Koncentráció a vízben a felvételi fázis végén a feltételezett állandósult állapotban (mg·l–1).

SZAKIRODALOM

---

7. függelék

AZ ÉTRENDI EXPOZÍXIÓS VIZSGÁLAT EGYENLETEKET TARTALMAZÓ SZAKASZA

1.   PÉLDA A MEGFELELŐ KERESKEDELMI HALTÁP ALKOTÓELEMEINEK MENNYISÉGÉRE

2.   PÉLDÁK TÁPKIEGÉSZÍTÉSI MÓDSZEREKRE

Általános szempontok

A kontrolltápokat pontosan úgy kell elkészíteni, ahogy a kiegészített tápokat, de a vizsgálati anyag nélkül.

A kezelt táp koncentrációjának ellenőrzéséhez az adagolt tápból három példányban kell kivonni mintát megfelelő extrakciós módszerrel, valamint a vizsgálatianyag-koncentrációt és a radioaktivitást mérni kell a kivonatokban. Igazolni kell a minták közötti alacsony eltérés melletti nagyfokú (> 85 %) analitikai visszanyerést (az anyagnak a vizsgálat kezdetekor mintavételezett legalább három koncentrációja nem térhet el ± 15 %-ot meghaladóan az átlagtól).

Az étrendi vizsgálat során három tápmintát kell gyűjteni analitikai célból a 0. napon és a felvételi fázis végén a tápban található vizsgálatianyag-tartalom meghatározása érdekében.

A haltáp elkészítése (hígítatlan) folyékony vizsgálati anyaggal

A kezelt haltápban a névleges koncentráció célértékét például 500 μg vizsgálati anyag/g tápban kell meghatározni. A hígítatlan vizsgálati anyag (molekulatömegben vagy konkrét radioaktivitással kifejezett) megfelelő mennyiségét hozzá kell adni a haltáp ismert tömegéhez üvegedényben vagy rotációs bepárló edényben. A haltáp tömegének elegendőnek kell lennie a felvételi fázis tartamára (figyelembe véve, hogy szükség lehet a mennyiségek növelésére az egyes etetésekkor a halak növekedése miatt). A haltápot/vizsgálati anyagot előző este kell összekeverni lassú keveréssel (pl. roto-rack keverővel vagy rotációval, ha rotációs bepárló edényt alkalmaznak). A kiegészített tápot olyan körülmények között kell tárolni, hogy a használatig fennmaradjon a vizsgálati anyag stabilitása a tápkeverékben (pl. hűtés).

A haltáp elkészítése kukoricaolaj vagy halolaj vivőanyaggal

A szilárd vizsgálati anyagokat mozsárban finom porrá kell őrölni. A folyékony vizsgálati anyagok közvetlenül hozzáadhatók a kukorica- vagy halolajhoz. A vizsgálati anyagot kukoricaolaj vagy halolaj ismert mennyiségével kell feloldani (pl. 5–15 ml). Az adagolt olajat mennyiségileg egy megfelelő méretű rotációs bepárló edénybe kell áthelyezni. Az adagolt olaj készítéséhez használt lombikot az olaj két kis alikvotjával kell kiöblíteni, és ezt az edényhez hozzá kell adni annak biztosítása érdekében, hogy az oldott vizsgálati anyag egésze átkerüljön oda. Az olajban való teljes feloldódás/diszperzió biztosítására (vagy ha egynél több vizsgálati anyagot alkalmaznak a vizsgálat során) mikrokeverőt kell behelyezni, a lombikot le kell dugaszolni és a keveréket gyorsan össze kell keverni előző este. A vizsgálathoz szükséges haltáp megfelelő mennyiségét (szokásosan pellet formában) az edénybe kell helyezni, és az edény tartalmát homogénné kell keverni az üvegedény folyamatos, legalább 30 percig tartó forgatásával, de lehetőség szerint előző este. Ezt követően a kiegészített tápot megfelelően kell tárolni (pl. hűteni kell) annak garantálására, hogy a tápban a vizsgálati anyag stabilitása a használatig megmaradjon.

A haltáp elkészítése szerves oldószerrel

A vizsgálati anyag megfelelő (molekulatömegben vagy konkrét radioaktivitással kifejezett), a célzott dózis elérésére alkalmas mennyiségét megfelelő szerves oldószerben fel kell oldani (pl. ciklohexán vagy aceton, 10–40 ml, de nagyobb térfogat alkalmazandó, ha a kiegészítendő táp mennyiségétől függően ez szükséges). Az oldat alikvotját vagy egészét (az adagnak megfelelően hozzáadva) el kell keverni az ahhoz elegendő haltáp megfelelő mennyiségével, hogy a vizsgálat során elérjék az előírt névleges dózisszintet. A tápot/vizsgálati anyagot rozsdamentes keverőtálban lehet keverni, és a frissen adagolt haltáp bent hagyható a tálban vegyifülke alatt két napig (alkalmanként megkeverve), hogy a felesleges oldószer elpárologjon, vagy összekeverhető rotációs bepárló edényben, folyamatos keverés mellett. A felesleges oldószer »elfújható« légárammal vagy nitrogénnel, ha szükséges. Vigyázni kell arra, hogy a vizsgálati anyag ne kristályosodjon az oldószer eltávolítását követően. A kiegészített tápot olyan körülmények között kell tárolni (pl. hűtés), hogy a használatig fennmaradjon a vizsgálati anyag stabilitása a tápkeverékben.

3.   AZ ASSZIMILÁCIÓS HATÉKONYSÁG ÉS A BIOMAGNIFIKÁCIÓS TÉNYEZŐ KISZÁMÍTÁSA

Az asszimilációs hatékonyság kiszámításához a teljes tisztulási sebességi állandót először meg kell becsülni az 5. függelék 4. szakasza alapján (a lépcsőzetes módszer alkalmazásával, azaz standard lineáris regresszióval), a tisztulási fázis mintavételezett koncentrációinak átlagát használva. Az etetési arány állandója, I és a felvétel időtartama, t a vizsgálat ismert paraméterei. A C food, a vizsgálati anyag tápban mért koncentrációjának átlaga a vizsgálatban mért változó. C 0,d a felvételi fázis végén a vizsgálati anyag halban lévő koncentrációja általában a tisztulási napok függvényében ábrázolt ln(koncentráció) metszéspontjából származtatható.

Az anyag asszimilációs hatékonysága (a, a vizsgálati anyag bélből való felszívódása) a következőképpen számítható ki:

ahol:

C 0,d = származtatott koncentráció a halban a felvételi fázis nulla időpillanatában (mg·kg-1);

k 2 = teljes (növekedéssel nem korrigált) tisztulási sebességi állandó (nap-1), az 5. függelék 3. szakaszában szereplő egyenletek szerint számítva;

I = táplálékfelvételi sebességi állandó (g táp g-1·hal nap-1).

C food = koncentráció a tápban (mg·kg-1 táp);

t = az etetési időszak tartama (nap)

Ugyanakkor, a számításhoz használt etetési arányt (I) adott esetben ki kell igazítani a hal növekedésével, hogy pontos asszimilációs hatékonyságot (a) kapjunk. Olyan vizsgálatban, amelynek során a halak jelentősen növekednek a felvételi fázisban (ahol nem korrigálják a tápmennyiséget az előre meghatározott etetési arány fenntartása érdekében), a tényleges etetési arány a felvételi fázis előrehaladtával elmarad az előre meghatározottól, így magasabb lesz a »valódi« asszimilációs hatékonyság. (Meg kell jegyezni, hogy a BMF általános számítása szempontjából ez nem fontos, mivel az I feltételei ténylegesen kiesnek az A7.1. és az A7.4. egyenlet között.) A növekedés okozta hígulással korrigált átlagos etetési arány, I g többféleképpen származtatható, de a leginkább lényegre törő és legprecízebb módszer az ismert növekedési sebességi állandó felhasználása (k g) a vizsgálati halak tömegének felvételi fázis időpillanataiban történő becslésére, azaz:

ahol:

W f(t) = az átlagos haltömeg t felvételi napon

W f,0 = az átlagos haltömeg a kísérlet kezdetén

Ezen a módon (legalább) a kísérlet utolsó napjára vonatkozó átlagos haltömeg (W f,end-of-uptake) megbecsülhető. Minthogy az etetési arányt a Wf,0 alapján állapították meg, a felvétel egyes napjainak tényleges etetési arányát e két tömegértékkel ki lehet számítani. A növekedéssel korrigált etetési arány, I g (g táp g-1 hal nap-1), amelyet az I helyett használnak, ha a felvételi fázisban gyors növekedés tapasztalható, ezt követően kiszámítható így:

Az asszimilációs hatékonyság (α) meghatározását követően a BMF kiszámítható úgy, hogy az α és az etetési arány állandójának (I, vagy I g, ha az α kiszámítására azt használják) szorzatát elosztják a teljes tisztulási sebességi állandóval (k 2):

A növekedéssel korrigált biomagnifikációs tényezőt is ugyanígy kell kiszámítani, a növekedéssel korrigált tisztulási együttható használatával (az 5. függelék 7. szakaszának megfelelően származtatott érték). Ugyanígy, ha az I g-t α kiszámítására használják, akkor itt is azt kell használni az I helyett:

ahol:

α = asszimilációs hatékonyság (a vizsgálati anyag bélből való felszívódása):

k 2 = teljes (növekedéssel nem korrigált) tisztulási sebességi állandó (nap-1), az 5. függelék 3. szakaszában szereplő egyenletek szerint számítva;

k 2g = növekedéssel korrigált tisztulási sebességi állandó (nap-1)

I. = táplálékfelvételi sebességi állandó (g táp g-1·hal nap-1).

A növekedéssel korrigált felezési idő (t 1/2) a következőképpen számítható ki.

Az anyag tápból való asszimilációs hatékonysága meg is becsülhető, ha a felvételi fázis lineáris szakaszában (az 1. és a 3. nap között) meghatározták a szöveti maradékokat. Ebben az esetben az anyag asszimilációs hatékonysága (α) a következőképpen határozható meg:

ahol:

C fish (t) = a vizsgálati anyag koncentrációja a halban t időpontban (mg kg-1 nedves tömeg).

4.   LIPIDTARTALOMRA TEKINTETTEL TÖRTÉNŐ KORREKCIÓ

Ha minden mintavételi intervallum tekintetében ugyanazon a halon mérték a lipidtartalmat, mint amelyiken a kémiai analízist végezték, az egyedi koncentrációkat korrigálni kell a lipidtartalom alapján és az ln(lipidtartalommal korrigált koncentráció)-t a tisztulás függvényében (nap) kell ábrázolni a C0,d és a k 2 levezetéséhez. Az asszimilációs hatékonyság (A7.1. egyenlet) ezt követően lipidtartalom alapján is kiszámítható, a Cfood lipidtartalom alapján történő használatával (azaz a Cfood-ot meg kell szorozni a táp átlagos lipidfrakciójával). Az ezt követő, az A7.4. egyenlet és az A7.5. egyenlet alkalmazásával végzett számítások közvetlenül megadják a lipidtartalommal (és a növekedés okozta hígulásra tekintettel) korrigált BMF-et.

Másként a halban és a tápban található átlagos lipidfrakciót (w/w) mind a kezelt, mind a kontrollcsoport tekintetében származtatják (a táp és a kontrollcsoportba tartozó halak tekintetében ez általában az expozíció kezdetén és végén mért adatokból nyerik, a kezelt csoportba tartozó halak tekintetében pedig kizárólag az expozíció végi adatokból). Egyes vizsgálatokban a halak lipidtartalma jelentősen emelkedhet; ilyen esetekben helyénvalóbb a vizsgálati halban lévő átlagos lipidkoncentráció alkalmazása, amelyet az expozíció és a tisztulás végén mért értékekből számítanak ki. Általánosságban a csak a kezelt csoportból származó adatokat mindkét lipidfrakció származtatására használni kell.

A lipidkorrekciós tényezőt (L c) a következőképpen kell kiszámítani:

ahol az L fish és az L food az átlagos lipidfrakció a halban, illetve a tápban.

A lipidkorrekciós tényezőt a lipidtartalommal korrigált biomagnifikációs tényező (BMFL) számítására használják:

5.   A MÉRT NULLA IDŐPILLANATI KONCENTRÁCIÓ (C 0,m ) ÉS A SZÁRMAZTATOTT NULLA IDŐPILLANATI KONCENTRÁCIÓ (C 0,d) KÖZÖTTI KÜLÖNBSÉGEK ÉRTÉKELÉSE

A mért nulla időpillanati koncentrációt (C0,m) és a származtatott nulla időpillanati koncentrációt (C0,d) össze kell hasonlítani. Ha nagyon hasonlóak, akkor az a tisztulási paraméterek származtatásához használt elsőrendű modellt támasztja alá.

Egyes vizsgálatokban jelentős különbség lehet a származtatott nulla időpillanati érték (C 0,d) és a mért nulla időpillanati átlagkoncentráció (C 0,m)között (lásd e vizsgálati módszer 159. pontjának utolsó ponttal jelölt bekezdését). Ha a C 0,d sokkal alacsonyabb, mint a C 0,m (C 0,d << C 0,m), a különbség arra utalhat, hogy emésztetlen kiegészített táp található a bélben. Ezt kísérletben lehet vizsgálni az eltávolított bél külön analízisével, ha további (egész hal) mintákat vettek és tároltak a felvételi fázis végén. Másfelől, ha a tisztulási fázis lineáris regressziójára alkalmazott, statisztikailag érvényes kiugróérték-teszt arra utal, hogy a tisztulási fázis első mintavételi pontja tévesen magas, megfelelő lehet a lineáris regresszió elvégzése a k 2 származtatásához, de el kell hagyni az első tisztulási koncentrációs pontot. Ilyen esetekben, ha a lineáris regresszióban rejlő bizonytalanság nagymértékben csökken, és egyértelmű, hogy megközelítőleg elsőrendű kinetika érvényesült, megfelelő lehet az eredményként adódó C 0,d és k 2 érték alkalmazása az asszimilációs hatékonysági számításokban. Ezt teljes körűen meg kell indokolni a Vizsgálati jegyzőkönyvben. Az is lehet, hogy nem elsőrendű kinetika érvényesült a tisztulási fázisban. Ha ez valószínű (azaz a természetes alapú logaritmusra transzformált adatok láthatóan görbét adnak a lineáris regresszió egyeneséhez képest), akkor a k 2 és a C 0,d számításai valószínűleg nem lesznek érvényesek, és biostatisztikus szakvéleményét ajánlott kikérni.

Ha a C 0,d sokkal magasabb, mint a mért érték (C 0,d >> C 0,m), ez a következőkre utalhat: az anyag nagyon gyorsan ürült ki (azaz a mintavételi pontok az analitikai módszer meghatározási határához közelítettek már a tisztulási fázis igen korai szakaszában, vö. az alábbi 6. szakaszt); eltérés történt az elsőrendű tisztulási kinetikától; a k 2 és a C 0,d származtatásához használt lineáris regresszió hibás, vagy a mintavétel valamely időpontjában probléma történt a mért vizsgálati koncentrációkkal. Ilyen esetben a lineáris regresszió ábráját gondosan át kell vizsgálni olyan minták után kutatva, amelyek a meghatározási határon vagy ahhoz közel vannak, keresve a kiugró értékeket és a nyilvánvaló görbületet (ami a nem elsőrendű kinetikára utal), ezt pedig ki kell emelni a Vizsgálati jegyzőkönyvben. A lineáris regresszió bármely későbbi, a becsült értékek javítását szolgáló újraértékelését be kell mutatni és meg kell indokolni. Ha jelentős eltérés figyelhető meg az elsőrendű kinetikához képest, akkor a k 2 és a C 0,d számításai valószínűleg nem lesznek érvényesek, és biostatisztikus szakvéleményét ajánlott kikérni.

6.   ÚTMUTATÁS NAGYON GYORSAN TISZTULÓ VIZSGÁLATI ANYAGOKHOZ

Amint a vizsgálati módszer 129. pontjában kifejtésre került, egyes anyagok olyan gyorsan tisztulhatnak, hogy megbízható nulla időpillanati koncentráció, C 0,d és k 2 nem származtatható, mivel a tisztulási fázis nagyon korai szakaszában (azaz a második tisztulási mintától kezdve) az anyag ténylegesen nem mérhető (a koncentrációk a jelentés szerint a meghatározási határon vannak). Ez a helyzet volt megfigyelhető az e vizsgálati módszer alátámasztására végzett laboratóriumok közötti összehasonlításban a benzo[a]pirén esetén, és ezt rögzítették a módszer validálási jelentésében is. Ilyen esetekben a lineáris regresszió nem végezhető el megbízhatóan, és valószínűleg irreálisan magasra becsüli a C 0,d-t, amelynek következtében az asszimilációs hatékonyság jóval nagyobb lesz, mint 1. Ezekben az esetekben ki lehet számítani a k 2 konzervatív becslését és a BMF felső határát.

A tisztulási fázis azon adatpontjainak felhasználásával, ahol a koncentrációt mérték, az első »nem érzékelt« koncentrációval (a meghatározási határon megállapított koncentráció) bezárólag, a lineáris regresszió (a természetes alapú logaritmusra transzformált koncentrációs adatok az idő függvényében) megadja a k 2 becslését Az ilyen típusú esetek tekintetében valószínű, hogy csak két adatpontot vonnak be (pl. a tisztulás 1. és 2. mintavételi napja), és ezt követően a k 2 megbecsülhető az 5. függelék A5.22. egyenletének felhasználásával. Ezt a becsült k 2 értéket lehet használni az asszimilációs hatékonyság A7.1. egyenlet szerinti becsléséhez, ahol az egyenletben szereplő C 0,d értéket a mért nulla időpillanati koncentrációval (C 0,m) lehet helyettesíteni azokban az esetekben, ahol a C 0,d-t egyértelműen jóval magasabbra becsülik, mint amit a vizsgálattal el lehetett volna érni. Ha a C0,m nem mérhető, a halszövetekben megfigyelhető érzékelési határt kell alkalmazni. Ha egyes esetekben az α érték > 1, az asszimilációs hatékonyságot legrosszabb esetben 1-nek kell feltételezni.

A legnagyobb BMFK ezt követően megbecsülhető az A7.4. egyenlettel, és azt »jóval kisebb mint« (<<) értékként kell megadni. Ha például 3 %-os etetési aránnyal végeznek vizsgálatot, a tisztulási felezési idő pedig kevesebb, mint három nap, a legrosszabb esetre jellemző α = 1, akkor a BMFK valószínűleg körülbelül 0,13 alatt lesz. Tekintve e becslés célját és azt a tényt, hogy az értékek jellegüket tekintve konzervatívak lesznek, nem szükséges azokat korrigálni a növekedés okozta hígulásra, illetve a hal és a táp lipidtartalmára tekintettel.

---

8. függelék

A KÍSÉRLETI BCF-EK ÉTRENDI EXPOZÍCIÓS VIZSGÁLAT SORÁN GYŰJTÖTT ADATOK ALAPJÁN TÖRTÉNŐ BECSLÉSÉT SZOLGÁLÓ MEGKÖZELÍTÉSEK

Az étrendi módszer azért került be ebbe a vizsgálati módszerbe, hogy vizsgálni lehessen olyan anyagok bioakkumulációját, amelyek gyakorlatilag a vízi expozíciós módszerrel nem vizsgálhatók. A vízi expozíciós módszer biokoncentrációs tényezőt ad, míg az étrendi módszer közvetlenül tájékoztat az etetés biomagnifikációs potenciáljáról. Számos kémiai biztonsági rendszerben a vízi biokoncentrációval kapcsolatos információra van szükség (például a kockázatértékelésben és a globálisan harmonizált osztályozási rendszerben). Éppen ezért az étrendi vizsgálat során generált adatokat fel kell használni a vízi expozíciós módszer szerint lefolytatott vizsgálatokkal összehasonlítható biokoncentrációs tényező becslésére ( 53 ). Ez a szakasz kifejti azokat a megközelítéseket, amelyeket követni lehet ennek elvégzéséhez, ugyanakkor elismeri az e becslésekben rejlő hiányosságokat is.

Az étrendi vizsgálat méri a tisztulást, hogy megadja a tisztulási sebességi állandót, k 2. Ha a rendelkezésre álló adatok alapján felvételi sebességi állandó becsülhető olyan helyzetben, amikor a halat vízen keresztül tették ki a vizsgálati anyagnak, megbecsülhető a kinetikus BCF.

A felvételi sebességi állandó vizsgálati anyagnak való vízi expozíció tekintetében történő becslése számos feltevésre épül, amelyek közül bármelyik hozzájárulhat a becslés bizonytalanságához. Emellett a BCF becslésének e megközelítése feltételezi, hogy a teljes tisztulási sebesség (ideértve az olyan hozzájáruló tényezőket, mint a testben való megoszlás és az egyedi tisztulási folyamatok) független a vizsgálati anyag által a test anyagterhelésének előidézéséhez használt expozíciós módszertől.

Az e becslési megközelítésben rejlő főbb feltételezések az alábbiak szerint foglalhatók össze:

Az étrendi felvételt követő tisztulás ugyanolyan, mint a vízi expozíciót követő tisztulás egy adott anyag tekintetében.

A vízből való felvétel elsőrendű kinetikát követ.

A felvétel becslésére használt módszertől függően:

A felvétel becslési módszerének kifejlesztéséhez használt adatbázis (»oktatóanyag«) reprezentatív a vizsgálat alá vont anyag szempontjából.

A nyilvánosság számára hozzáférhető szakirodalom több publikációjában szerepelnek egyenletek, amelyek a hal által a vízből a kopoltyún keresztül történő felvételt egy anyag oktanol-víz megoszlási együtthatójához, a haltömeghez (1) (2) (3) (4), a térfogathoz és/vagy a lipidtartalomhoz, a membrán permeációjához/diffúziójához (5) (6), a hal légcsere-térfogatához (7) kapcsolják, és amelyeket illékonysági/anyagmérleg-megközelítésből származtatnak (8) (9) (10). Ezzel összefüggésben e módszereket Crookes és Brooke (11) értékeli részletesen. Barbernek (12) az étrendi felvételen alapuló bioakkumuláció modellezésére összpontosító publikációja szintén hasznos e tekintetben, mivel adatokat tartalmaz a kopoltyún keresztüli felvétel sebességi modelljeiből. A 2004-es étrendi protokoll (13) háttérdokumentumának egy szakaszát is e szempontnak szentelték.

E modellek legtöbbjét korlátozott adatbázisok felhasználásával vezették le. Az olyan modellek esetében, ahol rendelkezésre állnak a modell kifejlesztéséhez használt adatbázisok részletei, úgy tűnik, hogy az alkalmazott anyagok hasonló szerkezetűek vagy hasonló osztályba tartoznak (a rendeltetést tekintve, pl. szerves klórtartalmú anyagok). Ez is hozzáadódik ahhoz a bizonytalansághoz, amely egy adott modell másfajta anyag felvételi sebességi állandójának előrejelzésére történő használatában rejlik, a vizsgálatspecifikus megfontolások, mint a faj, a hőmérséklet stb. mellett.

A rendelkezésre álló módszerek áttekintése (11) kiemelte, hogy egyik módszer sem »helytállóbb« a másiknál. Éppen ezért az alkalmazott modellt egyértelműen indokolni kell. Ahol több olyan módszer áll rendelkezésre, amelynek a használata indokolható, körültekintőnek tűnik több k 1 (és így BCF) becslés bemutatása, illetve k 1 (és BCF) értéktartományok megadása a többféle felvételi becslési módszer szerint. Ugyanakkor, tekintettel a modelltípusokban és az azok kidolgozásához használt adatsorokban rejlő különbségekre, az e különbözőképpen származtatott becslések átlagértékének alkalmazása nem mindig helyénvaló.

Egyes kutatók azt javasolták, hogy a BCF ilyen becsléseit korrigálják a biológiai hasznosíthatóságra tekintettel, hogy figyelembe vegyék az anyag oldott szerves szénre (DOC) való adszorpcióját a vízi expozíciós feltételek mellett, és így összhangba hozzák a becslést a vízi expozíciós vizsgálatok eredményeivel (pl. (13) (14)). Ez a korrekció ugyanakkor nem feltétlenül helytálló, tekintettel a vízi expozíciós vizsgálathoz »a legrosszabb eset« becslése vonatkozásában szükséges alacsony DOC-szintekre (azaz a biológiailag hasznosítható anyagok aránya az oldatban mért anyagokhoz). A nagymértékben víztaszító anyagok esetében a kopoltyún keresztül történő felvétel korlátozott lehet a kopoltyúfelülethez közeli passzív diffúzió sebessége miatt, ebben az esetben lehetséges, hogy a korrekció ezt a hatást veszi figyelembe, és nem azt, amelyre eredetileg szánták.

Tanácsos azokra a módszerekre összpontosítani, amelyekhez olyan ráfordításokra van szükség, amelyek esetében azonnal rendelkezésre állnak adatok az itt bemutatott étrendi vizsgálatban vizsgált anyagok vonatkozásában (azaz a log KOW, a haltömeg). Összetettebb ráfordításokat igénylő más módszerek is alkalmazhatók, de további mérésekre lehet szükség a vizsgálat során, vagy részletesen ismerni kell a vizsgálati anyagot, illetve a halfajt, amely információ lehet, hogy nem széles körben elérhető. Emellett a modell megválasztását befolyásolhatja a validálási szint és az alkalmazhatósági terület (az áttekintés és a különböző módszerek összehasonlítása tekintetében lásd a (11) hivatkozást).

Szem előtt kell tartani, hogy az eredményül adódó k 1 becslés és a becsült BCF bizonytalan, és azt a bizonyító erő elemzésén alapuló megközelítés szerint kell kezelni a származtatott BMF-fel és az anyag paramétereivel (pl. molekulaméret) együtt, hogy átfogó képet lehessen kapni az anyag bioakkumulációs potenciáljáról. E paraméterek értelmezése és alkalmazása a szabályozói kerettől függhet.

SZAKIRODALOM

”

„C.20.    Daphnia magnán végzett reprodukciós vizsgálat

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 211. vizsgálati iránymutatásában (2012) leírt módszerrel. Az OECD iránymutatásait időszakonként felülvizsgálják a tudományos fejlődés fényében. A reprodukciós vizsgálatra vonatkozó 211. iránymutatás alapját a 202. vizsgálati iránymutatás (1984) II. része képezi, amely a Daphnia-fajok reprodukciós vizsgálatával foglalkozik. Általánosan elismert, hogy az említett 202. vizsgálati iránymutatásnak megfelelően végrehajtott vizsgálatokból nyert adatok eltérőek lehetnek. Ennek nyomán jelentős erőfeszítést tettek e változatosság okainak meghatározása érdekében, egy jobb vizsgálati módszer kidolgozásának céljával. A 211. vizsgálati iránymutatás ezen 1992-ben (1), 1994-ben (2) és 2008-ban (3) folytatott kutatási tevékenység, laboratóriumok közötti összehasonlítás és validálási vizsgálatok eredménye.

A reprodukciós vizsgálati iránymutatás eredeti verziója (202. vizsgálati iránymutatás, 1984) és második verziója (211. vizsgálati iránymutatás, 1998) közötti alapvető különbségek a következők:

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

A VIZSGÁLAT ELVE

E vizsgálat elsődleges célja annak felmérése, hogy a vegyi anyagok milyen hatást gyakorolnak a Daphnia magna reprodukciós teljesítményére. Ebből a célból fiatal, a vizsgálat kezdetekor 24 órásnál nem idősebb nőstény Daphniákat (a szülőket) a vízhez különféle koncentrációszintekben adagolt vizsgálati vegyi anyag hatásának kell kitenni. A vizsgálat időtartama 21 nap. A vizsgálat végén fel kell mérni az élő utódok teljes számát. A szülők reprodukciós teljesítményét más módokon is ki lehet fejezni (pl. az első utód megjelenésének napjától számítva a naponta egy állatra jutó élő utódok száma), ezt azonban a vizsgálat végén élő utódok teljes száma mellett, kiegészítésként fel kell tüntetni a jelentésben. A félstatikus vizsgálat más, gerinctelenekre vonatkozó reprodukciós vizsgálati módszerekhez képest egyedi kialakítása miatt lehetőség van az egyes szülőkre egyenként jutó élő utódok számának megállapítására is. Ez a gerinctelenekre vonatkozó más reprodukciós vizsgálati módszerekkel szemben lehetővé teszi, hogy amennyiben a szülő balesetszerűen és/vagy véletlenszerűen elpusztul a vizsgálati időszakban, szaporulatát ki lehessen venni az adatok értékeléséből. Így amennyiben szülői elhullás következik be a vegyi anyagnak kitett párhuzamosokban, vizsgálni kell, hogy a mortalitás koncentráció-válasz mintázatot követ-e, azaz hogy a válaszban jelentős regresszió tapasztalható-e a vizsgálati vegyi anyag koncentrációjának függvényében, pozitív meredekség mellett (a Cochran–Armitage-féle trendpróbához hasonló statisztikai vizsgálat alkalmazható erre a célra). Ha a mortalitás nem koncentráció-válasz mintázatot követ, azokat a párhuzamosokat, amelyeknél szülői elhullás tapasztalható, ki kell venni a vizsgálati eredmény elemzéséből. Ha a mortalitás koncentráció-válasz mintázatot követ, a szülői elhullást a vizsgálati vegyi anyag hatásának kell tulajdonítani, és a párhuzamosokat nem szabad kivenni az elemzésből. Ha a vizsgálat során a szülő nem megfelelő bánásmód vagy baleset miatt balesetszerűen, illetve a vizsgálati vegyi anyag hatásával össze nem függő, meg nem magyarázható váratlan esemény következtében véletlenszerűen pusztul el, illetve ha a szülőről kiderül, hogy hímivarú, a párhuzamost ki kell venni az elemzésből (lásd még az 51. pontban). A vizsgálati vegyi anyag reprodukciós teljesítményre gyakorolt toxikus hatását ECx-ben kell megadni úgy, hogy az adatokat nem lineáris regresszióval egy megfelelő modellbe illesztik, hogy meg lehessen becsülni azt a koncentrációt, amely x % csökkenést okoz a reprodukciós teljesítményben; illetve vagylagosan NOEC/LOEC értékben kell kifejezni (4). A legalacsonyabb használt hatásos koncentrációnak (pl. EC10) lehetőség szerint a vizsgálati koncentrációk tartományain belül kell elhelyezkednie, ami azt jelenti, hogy ezt az értéket interpolációval és nem extrapolációval kell kiszámítani.

A jelentésben a szülők túlélési arányát és az első ivadékok megjelenésének idejét is fel kell tüntetni. Vizsgálni lehet továbbá a vegyi anyag más paraméterekre pl. a növekedésre (testhossz) gyakorolt hatásait is, és lehetőség szerint a populáció belső növekedési ütemét (lásd a 44. pontot).

A VIZSGÁLATI VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

A Daphnia magna fajjal végzett akut toxicitási vizsgálatok eredményei (lásd e melléklet C.2. fejezetét: Daphnia-fajok akut immobilizációs vizsgálata) hasznosak lehetnek a reprodukciós vizsgálatok során a vizsgálati koncentrációk megfelelő tartományának kiválasztásában. Ismerni kell a vizsgálati vegyi anyag vízoldékonyságát és gőznyomását, és a vizsgálati oldatokban lévő vegyi anyag mennyiségi meghatározásához rendelkezni kell egy olyan megbízható analitikai módszerrel, amelynél ismert a visszanyerési hatékonyság és meghatározási határ.

A vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó azon információkhoz, amelyek hasznosak lehetnek a vizsgálati körülmények megállapításához, tartozik még a vegyi anyag szerkezeti képlete, tisztasága, fénystabilitása, stabilitása vizsgálati körülmények között, a pKa és Pow értékek, valamint a biológiai lebonthatóságra vonatkozó vizsgálat eredményei is (lásd e melléklet C.4. fejezetét a gyors biológiai lebonthatóság meghatározásáról, illetve a C.29. fejezetet a gyors biológiai lebonthatóságról – CO2 légmentesen lezárt edényekben).

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

A vizsgálat érvényességéhez az alábbi teljesítménykritériumoknak kell teljesülniük a kontrollcsoport(ok)ban:

Megjegyzés: Ugyanez az érvényességi kritérium (20 %) alkalmazható a baleseti és véletlenszerű szülői elhullásra a kontrollcsoportokban, valamint a vizsgálati koncentrációk mindegyike tekintetében.

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Felszerelés

A vizsgálati edények és minden más, a vizsgálati oldatokkal közvetlenül érintkező más felszerelések üvegből vagy más, kémiailag közömbös anyagból készülnek. A vizsgálati edények általában üveglombikok.

Ezenfelül szükség lehet az alábbi berendezések némelyikére vagy mindegyikére:

Vizsgálati szervezet

A vizsgálat során használandó állatfaj a Daphnia magna Straus ( 54 ).

A klónt lehetőleg genotípusos meghatározással kell beazonosítani. Kutatások (1) kimutatták, hogy az A. Klón (amely a franciaországi IRCHA-ból származik) (5) reprodukciós teljesítménye következetesen kielégíti az e vizsgálati módszerben leírt feltételek mellett tenyésztett, a vizsgálatot túlélő egyes szülőkre átlagosan jutó ≥ 60 utód érvényességi kritériumot. Emellett azonban más klónok is elfogadhatók, feltéve, hogy a Daphnia tenyészetről kimutatható, hogy kielégíti a vizsgálat érvényességi kritériumait.

A vizsgálat kezdetekor az állatok nem lehetnek 24 óránál idősebbek, és nem származhatnak az első szaporulatból. Egészséges törzstenyészetből kell származniuk (azaz nem szabad stressz jeleit mutatniuk, ilyen például magas mortalitás, hímek és ephippiumok jelenléte, az első szaporulat késedelme, színtelen állatok stb.). A törzstenyészet állatait a vizsgálat céljaira alkalmazandókhoz hasonló tenyésztési körülmények között kell tartani (megvilágítás, hőmérséklet, közeg, táplálék és állatok mennyisége térfogategységre számolva). Ha a vizsgálat során használandó tenyészközeg jellemzői eltérnek azon közeg jellemzőitől, amelyben a Daphniákat szokásos módon tenyésztik, akkor helyénvaló egy szokásosan mintegy háromhetes akklimatizációs időszak biztosítása a vizsgálat előtt (azaz egy generációnyi idő), a szülők stresszmentesítése érdekében.

Vizsgálati közeg

Javasolt egy teljes körűen meghatározott közeg használata a vizsgálat során. Így elkerülhető az adalékanyagok (pl. alga, talajkivonatok) használata, amelyeket nehéz jellemezni, és mindez elősegíti a laboratóriumok közötti szabványosítás lehetőségét. E célra az Elendt M4 (6) és M7 közeg (lásd a 2. függeléket) bizonyult alkalmasnak. Azonban másfajta közegek (pl. (7) és (8)) is elfogadhatók, feltéve, hogy a Daphnia tenyészet teljesítménye bizonyíthatóan kielégíti a vizsgálat érvényességi kritériumait.

Nem definiált adalékanyagokat tartalmazó közegek használata esetén az ilyen adalékanyagokat egyértelműen meg kell határozni, és információkat kell adni a Vizsgálati jegyzőkönyvben az összetételükről és különösen a széntartalmukról, mert az hozzájárulhat az alkalmazott etetéshez. Javasolt a szerves adalékanyagot tartalmazó törzsoldat teljes szervesszén-tartalmának (TOC) és/vagy a kémiai oxigénigényének (KOI) meghatározása, és annak becslése, hogy ez mennyivel járul hozzá az elkészített vizsgálati közeg TOC/KOI tartalmához. Javasolt továbbá a közeg (algák hozzáadása előtti) TOC szintjét 2 mg/l alatt tartani (9).

Fémtartalmú vegyi anyagok vizsgálatakor fontos annak felismerése, hogy a vizsgálati közeg tulajdonságai (pl. keménységi fok, kelátképző képesség) hatással lehetnek a vizsgálati vegyi anyag toxicitására. Emiatt kívánatos a teljes körűen meghatározott közeg használata. Jelenleg azonban a Daphnia magna hosszú távú tenyésztésére alkalmasnak ítélt, teljes körűen meghatározott közeg egyedül az Elendt M4 és M7. Mindkét közeg tartalmaz EDTA kelátképző szert. Az eddigi vizsgálatok (2) kimutatták, hogy – szemben az EDTA-t egyáltalán nem tartalmazó közegekkel – a kadmium »látszólagos toxicitása« általában alacsonyabb, amennyiben a reprodukciós vizsgálatot az M4 és M7 közegben végzik el. Ezért az M4 és M7 használata nem javasolt a fémtartalmú vegyi anyagok vizsgálatához, és célszerű kerülni az ismert kelátképző szereket tartalmazó másfajta közegek használatát is. A fémtartalmú vegyi anyagok vizsgálatához tanácsos alternatív közeg használata, mint pl. az EDTA-t nem tartalmazó, ASTM szerint előállított kemény édes mesterséges víz (9). Az ASTM szerint előállított kemény édes mesterséges víz és a tengerialga-kivonat e keveréke (10) alkalmas a Daphnia magna (2) hosszú távú tenyésztésére.

Az oldott oxigén koncentrációját a vizsgálat kezdetekor és a vizsgálat során mindvégig 3 mg/l felett kell tartani. A pH-értéknek a 6–9 közötti tartományba kell esnie, és az nem változhat egyik vizsgálat során sem 1,5 egységnél nagyobb mértékben. Javasolt a 140 mg/l (CaCO3) vízkeménység választása. Az e szintet elérő és ezt meghaladó feltételek mellett elvégzett vizsgálatok bizonyították a reprodukciós teljesítmény összhangját az érvényességi kritériumokkal (11) (12).

Vizsgálati oldatok

A kiválasztott koncentrációknak megfelelő vizsgálati oldatokat rendszerint a törzsoldat hígításával készítik el. A törzsoldatot lehetőleg a vizsgálati vegyi anyagnak a vizsgálati közegbe mechanikai eszközök, pl. keverő, ultrahang vagy más megfelelő módszer segítségével történő bekeverésével vagy hozzákeverésével kell elkészíteni, lehetőség szerint oldószer vagy diszpergálószer felhasználása nélkül. A vizsgálati szervezetek hozzáadása előtt a vizsgálati rendszereket lehetőség szerint annyi ideig kell kitenni a vizsgálati vegyi anyag vizsgálat során alkalmazandó koncentrációinak, amennyi a stabil expozíciós koncentrációk fenntartásának bizonyításához előírt. Ha a vizsgálati vegyi anyag nehezen oldható vízben, az OECD nehezen vizsgálható anyagok kezelésére vonatkozó iránymutatását kell követni (13). Az oldószerek vagy diszpergálószerek használatát kerülni kell, de azokra szükség lehet az adagolás szempontjából megfelelő koncentrációjú törzsoldat elkészítéséhez.

A vizsgálati koncentrációkon kívül egy hígítóvíz-kontrollt (megfelelő párhuzamosokkal) és – ha elkerülhetetlen – egy oldószert tartalmazó kontrollt (megfelelő párhuzamosokkal) kell működtetni. A vizsgálat során csak olyan oldószer vagy diszpergálószer alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol jelentős hatást vagy csak minimális hatást gyakorol a hatásváltozóra. Az alkalmas oldószereket (pl. aceton, etanol, metanol, dimetil-formamid és trietilén-glikol), valamint az alkalmas diszpergálószereket (pl. Cremophor, RH40, 0,01 %-os metilcellulóz és a HCO-40) a (13) irodalom sorolja fel. Amennyiben oldószert vagy diszpergálószert használnak, annak végső koncentrációja nem lehet nagyobb 0,1 ml/l-nél (13), és annak minden vizsgálati edényben azonosnak kell lennie, a hígítóvíz-kontrolltartályt kivéve. Törekedni kell azonban az ilyen oldószerek koncentrációjának minimalizálására.

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

Az expozíció körülményei

Időtartam

A vizsgálat időtartama 21 nap.

Betelepítés

A szülőket elkülönítetten tartják, vizsgálati edényenként egyesével, edényenként általában 50–100 ml közegben (a Daphnia magna tekintetében; egyes kisebb Daphnia-fajok esetében, mint pl. a Ceriodaphnia dubia, kisebb mennyiség is elegendő lehet), kivéve, ha a vizsgálathoz átfolyásos vizsgálati tervre van szükség.

Néha szükségessé válhat nagyobb térfogatok használata a vizsgálati vegyi anyag koncentrációjának meghatározására használt analitikai eljárás követelményeinek a teljesítése érdekében, de megengedett a párhuzamosok összevonása is kémiai analízis céljára. Amennyiben 100 ml-nél nagyobb térfogatot használnak, akkor szükségessé válhat a Daphniáknak adott tápadag növelése, a megfelelő táplálékmennyiség és az érvényességi kritériumok betartásának biztosítása érdekében.

Kísérlethez felhasznált állatok

A félstatikus vizsgálatok esetében minden egyes koncentrációszintnél legalább tíz, egyedileg elhelyezett állatra, továbbá a kontrollcsoportokban is legalább tíz, egyedileg elhelyezett állatra van szükség.

Az átfolyásos vizsgálatokhoz alkalmasnak bizonyult minden egyes koncentrációszinthez tartozóan negyven állatot négy, egyenként tíz állatból álló csoportba osztani (1). Kisebb számú vizsgálati szervezet is felhasználható, ez esetben koncentrációszintenként minimum 20 állat bevonása javasolt, amelyeket egyenlő létszámban kell elosztani legalább két edényben (pl. négy párhuzamos, egyenként öt darab Daphniával). Megjegyzendő, hogy az olyan vizsgálatok során, ahol az állatokat csoportosan tartják, nem zárható ki egyetlen utód sem a statisztikai elemzésből, ha véletlenszerű vagy baleseti szülői elhullás következik be a szaporodást követően, így ezekben az esetekben a reprodukciós teljesítményt a vizsgálat kezdetekor meglévő egy szülőre jutó élő utódok teljes számában kell kifejezni.

A kezelések vizsgálati edények közötti elosztását és a vizsgálati edények összes későbbi kezelését véletlenszerű sorrendben kell végezni. Az ennek elmulasztásából eredő eltéréseket a koncentrációhatásnak lehet tulajdonítani. Különösen igaz ez, ha a kísérleti egységeket kezelési vagy koncentráció szerinti sorrendben vizsgálják, és ekkor egyes, az idővel összefüggő hatások (mint pl. a kezelő személy fáradtsága vagy más jellegű hibák) jelentősebb hatásokat eredményezhetnek magasabb koncentrációknál. Továbbá, ha a vizsgálati eredményeket valószínűsíthetően befolyásolja a vizsgálat egy kezdeti vagy környezeti vonatkozású feltétele – pl. a laboratóriumon belüli elhelyezés –, akkor fontolóra kell venni a vizsgálat leállítását.

Etetés

A félstatikus vizsgálatoknál lehetőleg naponta kell a tápot beadni, de legalább hetente háromszor (azaz a közeg cseréjével megegyezően). Figyelembe kell venni az expozíciós koncentrációk táp hozzáadása okán történő esetleges hígulását, és lehetőség szerint ezt kellő koncentrációjú algaszuszpenziókkal kell elkerülni. Az ettől való eltéréseket (pl. az átfolyásos vizsgálatoknál) jelezni kell.

A vizsgálat során a szülőknek beadott étrendet lehetőleg a következő élő algasejtekből (egy vagy több felhasználásával) kell összeállítani: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata (korábban Selenastrum capricornutum) és Desmodesmus subspicatus (korábban Scenedesmus subspicatus). A beadott étrendet az egyes szülőknek biztosítandó szerves szén (C) mennyiségére kell alapozni. Kutatások (14) bizonyították, hogy a Daphnia magna esetében a 0,1 és 0,2 mg C/Daphnia/nap közötti adagok elegendőek a vizsgálati érvényességi kritériumokat kielégítő megfelelő szaporulatszám eléréséhez. Az adagolást a vizsgálat időtartama alatt vagy egyenletesen lehet végezni, vagy, amennyiben megfelelőbbnek látszik, akkor kezdetben egy alacsonyabb szint alkalmazható, majd az fokozatosan növelhető, figyelembe véve a szülők növekedésének ütemét. Ebben az esetben is az adagolásnak mindenkor meg kell maradnia a 0,1–0,2 mg C/Daphnia/nap tartományon belül.

Amennyiben helyettesítő méréseket alkalmaznak (pl. algasejtszám vagy fényelnyelés) a tápadagban szükséges széntartalom adagolása érdekében (célszerűségi okokból, hiszen a széntartalom mérése időigényes elfoglaltság), úgy minden egyes laboratóriumnak ki kell dolgoznia a saját nomogramját, amely az algatenyészet széntartalmával kapcsolatos helyettesítő paraméterekre vonatkozik (lásd a 3. függelékben a nomogramok elkészítéséhez adott tanácsokat). A nomogramokat évente legalább egyszer ellenőrizni kell, vagy még gyakrabban, amennyiben időközben megváltoznak az algatenyészeti feltételek. A széntartalom helyettesítő mérésére a fényelnyelés vizsgálata jobb módszernek bizonyult, mint a sejtek száma (15).

A Daphniáknak koncentrált algaszuszpenziót kell adni, hogy minimalizálható legyen az alga tenyészközeg tesztedényekbe átkerülő mennyisége. Algakoncentrátumot centrifugálással lehet nyerni, amit Daphnia tenyészközegben történő reszuszpenzió követ.

Megvilágítás

16 órás megvilágítás 15–20 μE · m–2 · s–1 mértéket meg nem haladó fényerősséggel, amelyet a víz felszínén kell mérni. A luxban kalibrált fénymérő műszereknél a hideg fehér fényre megadott 1 000 –1 500  luxos tartomány felel meg az ajánlott 15–20 μE·m–2 · s–1-es fényerősségnek.

Hőmérséklet

A vizsgálati közeg hőmérsékletének 18–22 °C között kell lennie. Emellett a hőmérséklet – lehetőség szerint – egyik vizsgálat esetében sem változik e tartományon belül 2 °C-nál nagyobb mértékben (pl. 18–20, 19–21 vagy 20–22 °C) napi szinten. Helyes módszer lehet egy további vizsgálati edényt a hőmérséklet alakulásának nyomon követésére beállítani.

Levegőztetés

A vizsgálati edényeket nem szabad a vizsgálat során levegőztetni.

Vizsgálati terv

Dózisbehatároló vizsgálat

Szükség esetén dózisbehatároló vizsgálatot kell végezni például a vizsgálati vegyi anyag ötfajta koncentrációjával és két párhuzamossal minden egyes kezelt és kontrolltenyészet vonatkozásában. A Daphnia és/vagy más vízi szervezetekkel szembeni akut toxicitásra vonatkozó, a hasonló vegyi anyagokkal folytatott vizsgálatokból vagy a szakirodalomból nyert további információ hasznos lehet a dózisbehatároló vizsgálatban alkalmazandó koncentrációk tartományának meghatározásában.

A dózisbehatároló vizsgálat tartama 21 nap vagy a hatásszintek megbízható előrejelzése szempontjából kellően hosszú időtartam. A vizsgálat végén fel kell mérni a Daphnia reprodukcióját. Fel kell jegyezni a szülők számát és az utódok megjelenését.

Meghatározó vizsgálat

Szokásos esetben legalább ötfajta, a hatásos koncentrációt (pl. ECx) magában foglaló vizsgálati koncentrációt kell olyan mértani sorban elrendezni, amelyet 3,2-t meg nem haladó szorzótényező jellemez. Minden vizsgálati koncentrációhoz megfelelő számú párhuzamost kell használni (lásd a 24–25. pontot). Ötnél kevesebb vizsgálati koncentráció használatát indokolni kell. A vegyi anyagokat nem szabad a vizsgálati közegben való oldhatósági határértékük felett vizsgálni. A kísérlet lefolytatása előtt tanácsos a vizsgálati terv statisztikai erejének és a megfelelő statisztikai módszerek használatának figyelembevétele (4). A koncentrációk meghatározása során az alábbiakat kell szem előtt tartani:

Ha a dózisbehatároló vizsgálat során a legmagasabb koncentrációnál (pl. 10 mg/l) nem figyelhetők meg hatások, vagy ha a vizsgálati vegyi anyag a más szervezetekre kifejtett toxicitás hiánya és/vagy alacsony felvétel vagy a felvétel hiánya alapján nagyon valószínűsíthetően alacsony toxicitású vagy nem toxikus, a reprodukciós vizsgálatot határérték-vizsgálatként is el lehet végezni pl. 10 mg/l vizsgálati koncentráció és kontrolltenyészet alkalmazásával. Tíz párhuzamost kell használni mind a kezelt csoport, mind a kontrollcsoport esetében. Ha a határérték-vizsgálatot átfolyásos rendszerben kell elvégezni, kevesebb párhuzamos is elegendő. A határérték-vizsgálat lehetőséget biztosít annak igazolására, hogy a határkoncentrációnál nem áll fenn statisztikailag szignifikáns hatás, ha azonban hatásokat jegyeznek fel, általában teljes vizsgálatra van szükség.

Kontrollcsoportok

A vizsgálati anyaggal kezelt vizsgálati sorozatokkal párhuzamosan a vizsgálati közeg egy kontrollcsoport-sorozatát és – adott esetben – egy, oldószert vagy diszpergálószert tartalmazó kontrollcsoport-sorozatot kell beállítani. Ebben az esetben az oldószer vagy diszpergálószer koncentrációjának meg kell egyeznie a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó edényekben használt koncentrációval. Megfelelő számú párhuzamost kell használni (lásd 23–24. pont).

Egy jól végrehajtott vizsgálat során általában a kontrollcsoportban lévő egy szülőre jutó élő szaporulat variációs koefficiense az átlagos szám körül ≤ 25 %; ezt azon vizsgálati terv esetén kell rögzíteni, ha a szülőket elkülönítve tartják a vizsgálat során.

A vizsgálati közeg megújítása

A közeg megújításának gyakorisága a vizsgálati vegyi anyag stabilitásától függ, azonban hetente legalább három csere szükséges. Amennyiben az előzetes stabilitási vizsgálatok (lásd 7. pont) azt mutatták, hogy a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja nem stabil (azaz kívül esik a névleges koncentráció 80–120 %-os tartományán, vagy a kiinduláskor mért koncentráció 80 %-a alá csökken) a két megújítás közötti maximális időtartam (azaz három nap) alatt, úgy számba kell venni a vizsgálati közeg gyakoribb megújításának lehetőségét vagy egy átfolyásos vizsgálat alkalmazását.

Amennyiben a közeget félstatikus vizsgálatok során megújítják, akkor a vizsgálati edényekből egy második sorozatot is be kell állítani, és a szülőket pl. egy megfelelő átmérőjű üvegpipetta segítségével kell áthelyezni. A Daphniákkal együtt áthelyezett vizsgálati közeg mennyiségét a minimumra kell csökkenteni.

Megfigyelések

A vizsgálat során tett megfigyelések eredményeit adatlapokon kell rögzíteni (lásd a példákat a 4. és 5. függelékben). Amennyiben más mérések elvégzése is követelmény (lásd 44. pont), akkor további megfigyelések elvégzése is szükséges lehet.

Utódok

Az egyes szülőktől származó utódokat lehetőleg naponta ki kell emelni és meg kell számlálni az első utódnemzedék megjelenésének napjától kezdve, annak megakadályozására, hogy elfogyasszák a szülőknek szánt táplálékot. E módszer alkalmazásában csak az élő utódokat kell megszámlálni, de feljegyezhető az abortált peték és az elhullott utódok száma is.

Mortalitás

Lehetőleg naponta, vagy legalább az utódok megszámlálásával megegyező gyakorisággal fel kell jegyezni a szülő állatok elhullását.

Egyéb paraméterek

Bár e módszert alapvetően a reprodukciós teljesítményre gyakorolt hatások felmérése érdekében dolgozták ki, általa azonban más hatások is kellő részletességgel számszerűsíthetők, statisztikai elemzéseket lehetővé téve. A túlélő szülő reprodukciós teljesítményét, azaz a vizsgálat során túlélő szülőnként született élő utódok számát fel lehet jegyezni. Ezt össze lehet vetni a legfontosabb hatásváltozóval (a vizsgálat kezdetekor meglévő, a vizsgálat során nem véletlen- vagy balesetszerűen elpusztult szülők egyenkénti reprodukciós teljesítményével). Amennyiben szülői elhullás következik be a vegyi anyagnak kitett párhuzamosokban, vizsgálni kell, hogy a mortalitás koncentráció-válasz mintázatot követ-e, azaz hogy a válaszban jelentős regresszió tapasztalható-e a vizsgálati vegyi anyag koncentrációjának függvényében, pozitív meredekség mellett (a Cochran–Armitage-féle trendpróbához hasonló statisztikai vizsgálat alkalmazható erre a célra). Ha a mortalitás nem koncentráció-válasz mintázatot követ, azokat a párhuzamosokat, amelyeknél szülői elhullás tapasztalható, ki kell venni a vizsgálati eredmény elemzéséből. Ha a mortalitás koncentráció-válasz mintázatot követ, a szülői elhullást a vizsgálati vegyi anyag hatásának kell tulajdonítani, és a párhuzamosokat nem szabad kivenni a vizsgálati eredmény elemzéséből. A növekedési ütem mérése igen kívánatos, mert ezzel információk nyerhetők az esetleges szubletális hatásokról, ami hasznos lehet a kizárólag a reprodukciós hatásokra irányuló mérések mellett; a szülők hosszának (azaz a léctüske nélkül mért testhossznak) a mérése javasolt a vizsgálat végén. A többi mérhető vagy számítható paraméter közé tartozik az első utódnemzetség (majd a következő csoportok) megjelenéséig eltelt idő, az egy szülőre jutó utódok száma és mérete, az abortált utódok száma, hím újszülöttek (OECD, 2008) vagy ephippia jelenléte és lehetőség szerint a populáció belső növekedési üteme (a meghatározás tekintetében lásd az 1. függeléket és az újszülöttek ivarának meghatározása tekintetében a 7. függeléket).

Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága

Az oxigénkoncentrációt, a hőmérsékletet, a keménységet és a pH-értékeket hetente legalább egyszer mérni kell, a közeg megújítása előtt és után, a kontrollcsoportokban és a vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációit tartalmazó edényekben.

A vizsgálat során szabályos időközönként meg kell határozni a vizsgálati vegyi anyag koncentrációit.

A félstatikus vizsgálatok során, ahol a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja a névleges koncentráció ± 20 százalékos sávján belülre várható (azaz a 80–120 %-os sávon belül; lásd 6., 7. és 39. pont), minimális intézkedésként javasolt a legmagasabb és a legalacsonyabb vizsgálati koncentrációk elemzése frissen elkészített és a megújítás idején meglévő állapotban, a vizsgálat első hete során egy alkalommal (azaz az elemzéseket az azonos oldatból vett mintán kell elvégezni; először, amikor az oldat frissen elkészült, majd a megújítás alkalmával). E meghatározásokat ezt követően legalább hetente egyszer meg kell ismételni.

Az olyan vizsgálatok során, ahol a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja nem várható a névleges koncentráció ± 20 százalékos sávján belülre, elemezni kell az összes vizsgálati koncentrációt a frissen elkészült oldatoknál és a megújítás alkalmával. Azonban az olyan vizsgálatok esetében, ahol a vizsgálati vegyi anyag kezdetkor mért koncentrációja nem marad meg a névleges koncentráció ± 20 százalékos sávján belül, viszont elégséges bizonyíték hozható fel annak bemutatására, hogy a kezdeti koncentrációk megismételhetők és stabilak (azaz a kezdeti koncentrációértékek 80–120 %-os tartományán belül vannak), a kémiai jellegű méréseket a vizsgálat 2. és 3. hetében a legmagasabb és a legalacsonyabb vizsgálati koncentrációk meghatározására lehet lecsökkenteni. Mindegyik esetben a vizsgálati vegyi anyag koncentrációinak a megújítást megelőző meghatározását csak minden egyes vizsgálati koncentráció egyetlen párhuzamos edényén kell elvégezni.

Az átfolyásos vizsgálatok esetében megfelelő a félstatikus vizsgálatoknál leírtakhoz hasonló mintavételi eljárás alkalmazása (azonban a »régi« oldatok mérése nem alkalmazható ezen esetben). Az első hét során azonban tanácsos lehet a mintavételi esetek számát megnövelni (pl. három méréssorozatra), a vizsgálati koncentrációk stabilitásának biztosítása érdekében. Az ilyen típusú vizsgálatok esetében a hígítóvíz és a vizsgálati vegyi anyag átfolyási sebességét naponta kell ellenőrizni.

Amennyiben bizonyítható, hogy a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja a vizsgálat teljes időtartama alatt mindvégig sikeresen a névleges vagy a kezdetkor mért koncentráció ± 20 százalékán belül marad, akkor az eredményeket a névleges vagy a kezdeti mért értékekre lehet alapozni. Ha a névleges vagy a kezdeti mért koncentrációhoz képest az eltérés nagyobb ± 20 százaléknál, akkor az eredményeket az idővel súlyozott átlaghoz képest lehet kifejezni (a számítási útmutatót lásd a 6. függelékben).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Eredmények feldolgozása

E vizsgálat célja a vizsgálati vegyi anyag által a reprodukciós teljesítményre gyakorolt hatás meghatározása. Az egy szülőre jutó utódok összlétszámát minden egyes vizsgálati edényre (azaz párhuzamosra) nézve ki kell számítani. Ezenfelül a reprodukció kiszámítható a túlélő szülő szervezet élő szaporulata alapján is. Ugyanakkor az ökológiailag leginkább releváns hatásváltozó az azon szülőkre jutó utódok teljes száma, amelyek nem balesetszerűen ( 55 ) vagy véletlenszerűen ( 56 ) pusztultak el a vizsgálat során. Ha valamely szülő baleset- vagy véletlenszerűen elpusztul a vizsgálat során, vagy kiderül róla, hogy hím, akkor az ilyen párhuzamost ki kell hagyni az elemzésből. Az elemzést ekkor csökkentett számú párhuzamosra kell alapozni. Amennyiben szülői elhullás következik be a vegyi anyagnak kitett párhuzamosokban, vizsgálni kell, hogy a mortalitás koncentráció-válasz mintázatot követ-e, azaz hogy a válaszban jelentős regresszió tapasztalható-e a vegyi anyag koncentrációjának függvényében, pozitív meredekség mellett (a Cochran-Armitage-féle trendpróbához hasonló statisztikai vizsgálat alkalmazható erre a célra). Ha a mortalitás nem koncentráció-válasz mintázatot követ, azokat a párhuzamosokat, amelyeknél szülői elhullás tapasztalható, ki kell venni a vizsgálati eredmény elemzéséből. Ha a mortalitás koncentráció-válasz mintázatot követ, a szülői elhullást a vizsgálati vegyi anyag hatásának kell tulajdonítani, és a párhuzamosokat nem szabad kivenni a vizsgálati eredmény elemzéséből.

Összegezve, ha a hatásokat LOEC és NOEC vagy ECx segítségével fejezik ki, ajánlott a reprodukcióra gyakorolt hatást a fent említett mindkét hatásváltozó alkalmazásával kiszámítani, azaz

és ezt követően végső eredményként az e két hatásváltozó valamelyikének felhasználásával kiszámított NOEC, LOEC vagy ECx értéket alkalmazni.

A statisztikai elemzés alkalmazása, pl. ANOVA-eljárások, a kontrollcsoport kezeléseinek Student-féle t-próba, Dunnett-féle próba, Williams-féle próba vagy lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-próba segítségével történő összehasonlítása előtt ajánlott az adatok transzformációját mérlegelni, ha ez szükséges az adott statisztikai vizsgálat követelményeinek való megfelelés érdekében. Nem paraméteres alternatívaként alkalmazható a Dunn-féle vagy a Mann–Whitney-féle próba. 95 %-os konfidencia-intervallumokat kell számítani az egyedi kezelési átlagokhoz.

A túlélő szülők száma a nem kezelt kontrollokban érvényességi kritérium, és azt dokumentálni kell és fel kell tüntetni a jelentésben. Más ártalmas hatásokat, például az abnormális viselkedést és a toxikológiailag szignifikáns megállapításokat a végleges jelentésben is fel kell tüntetni.

ECx

Az ECx értékeket, ideértve az azokhoz tartozó alsó és felső konfidenciahatárokat, a megfelelő statisztikai módszerek segítségével kell kiszámítani (pl. logisztikai vagy Weibull-függvény, csonkolt Spearman–Karber módszer vagy egyszerű interpoláció). Az EC10, EC50 vagy bármely más ECx kiszámításához a teljes adatállományt regresszióanalízisnek kell alávetni.

NOEC/LOEC

Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC meghatározása, megfelelő statisztikai módszereket kell alkalmazni az OECD »Aktuális megközelítések az ökotoxicitási adatok statisztikai elemzésében: alkalmazási útmutató« című 54. dokumentuma (4) szerint. Általában a vizsgálati vegyi anyag káros hatásait a kontrollal összehasonlítva egyoldali hipotézisvizsgálattal (p ≤ 0,05) vizsgálják.

A normál eloszlást és a szóródáshomogenitást megfelelő statisztikai próbával pl. Shapiro-Wilk-próbával, illetve Levene-féle próbával (p≤ 0,05) lehet tesztelni. Egyirányú ANOVA és azt követően többszörös összehasonlító próbákat lehet végezni. Többszörös összehasonlítással (pl. Dunnett-féle próba) vagy lefelé lépegető trendpróbákkal (pl.: Williams-féle próba vagy lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-próba) lehet kiszámítani, hogy vannak-e jelentős különbségek (p ≤ 0,05) a kontrollok és a vizsgálati vegyi anyag különböző koncentrációi között (az ajánlott próbát az OECD 54. útmutató dokumentuma (4) szerint kell kiválasztani). Ellenkező esetben nemparaméteres módszereket (pl. a Holm szerint módosított Bonferroni-féle U-próbát vagy a Jonckheere–Terpstra-féle trendpróbát) kell használni a NOEC és a LOEC meghatározására.

Határérték-vizsgálat

Ha határérték-vizsgálatot (a kontroll és egyetlen kezelés összehasonlítása) végeztek, és a paraméteres vizsgálati eljárások előfeltételei (normalitás, homogenitás) teljesülnek, a metrikus válaszokat a Student-féle próbával (t-próba) lehet értékelni. Ha ezek a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenlő varianciákat feltételező t-próba (például Welch-féle próba) vagy egy nemparaméteres próba, például a Mann–Whitney-féle U-próba alkalmazható.

A kontrollok (kontroll és oldószeres vagy diszpergálószeres kontroll) közötti szignifikáns különbségek meghatározása céljából az egyes kontrollok párhuzamosait a határérték-vizsgálatnál leírtak szerint kell vizsgálni. Ha ezek a tesztek nem mutatnak ki szignifikáns eltérést, a kontroll és az oldószeres kontroll párhuzamosait össze lehet vonni. Ellenkező esetben az összes kezelést az oldószeres kontrollal kell összehasonlítani.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

E vizsgálati módszer alkalmazásában a következő fogalommeghatározások alkalmazandók:

Baleseti elhullás : nem szándékoltan bekövetkező váratlan esemény (azaz ismert ok) által előidézett, a vegyi anyaggal össze nem függő elhullás.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

ECx : a vízben oldott vizsgálati vegyi anyag azon koncentrációja, amely a Daphnia reprodukciójában x % csökkenést okoz meghatározott expozíciós időszak alatt.

Véletlenszerű elhullás : ismeretlen okból bekövetkezett, a vegyi anyaggal össze nem függő elhullás.

A populáció belső növekedési üteme : a populáció növekedésének mértéke, amely a reprodukciós teljesítményből és a korspecifikus pusztulásból tevődik össze (1) (2) (3). Az egyensúlyi populációk esetében ez pontosan nulla. A növekedő populációknál pozitív, a csökkenő populációknál negatív. Ez utóbbi nyilvánvalóan nem fenntartható, és végül kihaláshoz vezet.

Érzékelési határ : a legalacsonyabb koncentráció, amelyet érzékelni lehet, de számszerűsíteni már nem.

Meghatározási határ : a számszerűsíthetően mérhető legalacsonyabb koncentráció.

Megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (LOEC) : azon legalacsonyabb vizsgálati koncentráció, amelynél a kontrollcsoporttal összevetve megfigyelhető a vizsgálati vegyi anyag statisztikailag szignifikáns hatása a reprodukcióra és a szülők mortalitására (p < 0,05-nél) a megfigyelt expozíciós időszakban. Azonban a LOEC-szint feletti valamennyi vizsgálati koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább egyenlő a LOEC-szinten megfigyelttel vagy súlyosabb annál. Amennyiben e két feltétel nem teljesíthető, akkor kimerítő magyarázatot kell adni arra, hogy hogyan történt a LOEC (és ennélfogva a NOEC) kiválasztása.

Mortalitás : egy állat akkor tekinthető kimúltnak, ha mozdulatlan, azaz ha nem képes úszni, vagy ha a tesztedény enyhe rázogatása után 15 másodpercen belül nem figyelhető meg mozgás a függelékben vagy az utóbélben. (Más meghatározás használata esetén ezt a hozzá tartozó irodalmi hivatkozással együtt kell megadni.)

Megfigyelhető hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : a közvetlenül a LOEC alatti vizsgálati koncentráció, amely – a kontrollcsoporttal való összevetésben – nem fejt ki statisztikailag szignifikáns hatást (p < 0,05) a meghatározott expozíciós időszak alatt.

Utódok : azon fiatal Daphnia-egyedek, amelyek a vizsgálat során születnek a szülőktől.

Szülők : a vizsgálat kezdetén jelen lévő nőstény Daphnia-egyedek, amelyek reprodukciós teljesítménye e vizsgálat tárgyát képezi.

Reprodukciós teljesítmény : a vizsgálati időszakban a túlélő szülőkre jutó élő utódok száma.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgálati anyag vagy keverék.

SZAKIRODALOM

---

2. függelék

TELJES KÖRŰEN MEGHATÁROZOTT ELENDT M7 ÉS M4 KÖZEG ELŐÁLLÍTÁSA

Akklimatizálás az Elendt M7 és M4 közeghez

Egyes laboratóriumok nehézségekbe ütköztek, amikor Daphniát próbáltak átvinni M4 (1) és M7 közegbe. Fokozatos akklimatizálással, azaz a saját közegből előbb 30, majd 60, végül 100 százalékos Elendt-közegbe való áthelyezéssel azonban némi sikert értek el. Az akklimatizáció akár egy hónapig is eltarthat.

Előkészítés

Nyomelemek

Először megfelelő tisztaságú (azaz deionizált, desztillált vagy fordított ozmózissal előállított) víz felhasználásával egyedi nyomelemeket tartalmazó, különféle törzsoldatokat (I) kell készíteni. E különféle törzsoldatokból (I) egy második, egyetlen törzsoldat (II) készül, amely már tartalmazza az összes nyomelemet (kombinált oldat), azaz:

M4 és M7 közeg

Az M4 és M7 közeget a II. törzsoldatból, makroelemekből és vitaminokból kell elkészíteni a következőképpen:

A kombinált vitamintörzsoldatot kis alikvot mennyiségekben, fagyasztott állapotban kell tartani. A közeghez a vitaminokat röviddel a felhasználás előtt kell hozzáadni.

---

3. függelék

ÖSSZES SZERVES SZÉN (TOC) MEGHATÁROZÁSA ÉS NOMOGRAM KÉSZÍTÉSE ALGAALAPÚ TÁP TOC-TARTALMÁNAK ÁBRÁZOLÁSÁRA

Elismert tény, hogy az algaalapú táp széntartalmát általában nem közvetlenül kell mérni, hanem olyan helyettesítő paraméterekkel rendelkező korrelációk (azaz nomogramok) alapján, mint pl. az algaszám vagy a fényelnyelés.

A TOC értékét az UV-sugárzásra alapozott vagy a perszulfátos módszerek helyett inkább magas hőmérsékletű oxidáció által célszerű mérni. (Útmutatásul lásd: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

A nomogram elkészítéséhez az algákat a tenyészközegtől centrifugálással el kell különíteni, amit desztillált vízben való reszuszpenzió követ. A helyettesítő paramétert és a TOC-koncentrációt minden mintában három példányban kell mérni. Kizárólag desztillált vizet tartalmazó vakmintákat kell elemezni, és a TOC-koncentrációt az algát tartalmazó minta TOC-koncentrációjából kell levonni.

A nomogram lineárisan fut a szénkoncentrációk megkövetelt tartományában. A példák alább találhatók.

Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).

mg/l száraz tömeg regressziója mg C/l-re vetítve. Félfolyamatos batch tenyésztéssel tenyésztett sejtek desztillált vízben újraszuszpendált koncentrált szuszpenziójából nyert adatok.

x-tengely: a koncentrált algaalapú táplálék mg C/l-ben

y-tengely: a koncentrált algaalapú táp száraz tömege mg/l-ben

Korrekciós együttható – 0,980

Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).

A sejtszám regressziója mg C/l-re vetítve. Félfolyamatos batch tenyésztéssel tenyésztett sejtek desztillált vízben újraszuszpendált koncentrált szuszpenziójából nyert adatok.

x-tengely: a koncentrált algaalapú táplálék mg C/l-ben

y-tengely: a koncentrált algaalapú táplálék sejtszám/l-ben

Korrekciós együttható – 0,926

Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).

Az elnyelés regressziója mg C/l-re vetítve (1 cm-es fényúttal). Félfolyamatos batch tenyésztéssel tenyésztett sejtek desztillált vízben újraszuszpendált koncentrált szuszpenziójából nyert adatok.

x-tengely: a koncentrált algaalapú táplálék mg C/l-ben

y-tengely: 1/10 hígítású koncentrált algaalapú táplálék abszorbanciája 440 nm-en

Korrekciós együttható – 0,998

---

4. függelék

MINTAADATLAP A KÖZEGMEGÚJÍTÁS, FIZIKAI/KÉMIAI FIGYELEMMEL KÍSÉRÉS SORÁN KELETKEZETT ADATOK, ETETÉS, DAPHNIA-REPRODUKCIÓ ÉS SZÜLŐI MORTALITÁS RÖGZÍTÉSÉHEZ

---

5. függelék

MINTAADATLAP KÉMIAI ANALÍZISEK EREDMÉNYEINEK RÖGZÍTÉSÉHEZ

a)    Mért koncentrációk

b)    Mért koncentrációk a névleges koncentrációk százalékában

---

6. függelék

IDŐVEL SÚLYOZOTT ÁTLAG SZÁMÍTÁSA

Idővel súlyozott átlag

Mivel a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja a közeg megújításai közötti időintervallumban csökkenhet, szükséges mérlegelni, hogy melyik az a koncentráció, amelyet reprezentatívnak kell kiválasztani azon koncentrációtartomány meghatározása szempontjából, amelynek a Daphnia szülők ki vannak téve. A kiválasztást biológiai és statisztikai megfontolásokra kell alapozni. Például amennyiben úgy tűnik, hogy a reprodukciót főként az alkalmazásra kerülő legmagasabb koncentráció befolyásolja, akkor azt kell alkalmazni. Amennyiben azonban fontosabbnak látszik a toxikus vegyi anyag halmozott vagy hosszabb idő alatt jelentkező hatása, akkor egy átlagos koncentráció választása a célszerűbb. Ebben az esetben az idővel súlyozott átlagkoncentráció a megfelelő, mivel ez figyelembe veszi a pillanatnyi koncentrációnak az idő függvényében történő változásait.

1. ábra

Példa az idővel súlyozott átlagra

Az 1. ábra egy (egyszerűsített) hétnapos, a közeg megújítását a 0., 2. és 4. napra ütemező vizsgálatot mutat be.

Az idővel súlyozott átlagot úgy kell kiszámítani, hogy az idővel súlyozott átlag nagysága megegyezzen a koncentrációgörbe alatti területtel. A fenti példa számítási menetét az 1. táblázat mutatja be.

A terület az egyes megújítási időszakokra megszerkesztett exponenciális görbe alatti területet jelöli. A következő képlettel kell kiszámítani:

Az idővel súlyozott átlag (IS átlag) a Teljes terület és az Összes nap hányadosa.

A Daphnia reprodukciós vizsgálat céljaira természetesen a táblázatot úgy kell kiterjeszteni, hogy az 21 napot fedjen le.

Egyértelmű, hogy ha csak a közeg egyes megújítási időszakainak az elején és végén végeznek megfigyeléseket, akkor nincs mód annak a megerősítésére, hogy a csökkenés valóban exponenciális. Egy másfajta görbe a Területre nézve másfajta számítási eredményre vezetne. Az exponenciális csökkenési folyamat azonban valószínűsíthető, és egyéb információk hiányában valószínűleg a legjobb görbét adja.

Óvatosságra int azonban, ha a megújítási időszak végén a kémiai analízis nem mutat ki semmilyen vegyi anyagot. Ha nem lehet megbecsülni, hogy milyen gyorsan tűnt el a vizsgálati vegyi anyag az oldatból, akkor lehetetlen reálisan megítélni a görbe alatti terület nagyságát, és emiatt lehetetlen megállapítani egy ésszerű, idővel súlyozott átlagot.

---

7. függelék

ÚTMUTATÁS AZ ÚJSZÜLÖTT IVARÁNAK MEGHATÁROZÁSÁHOZ

Megváltozott környezeti körülmények között, például lerövidített megvilágítási időszak, hőmérséklet, csökkenő tápkoncentráció és növekvő populációsűrűség előfordulhat hímivarú újszülött egyedek megjelenése (Hobaek and Larson, 1990; Kleiven et al., 1992). A hímivarú egyedek megjelenése emellett egyes rovarfejlődés-szabályozókra adott ismert válasz (Oda et al., 2005). Olyan körülmények között, amelyekben vegyi stresszforrások a partenogén nőstényektől származó reproduktív utódok csökkenéséhez vezetnek, várható a hímivarúegyedek nagyobb száma (OECD, 2008). A rendelkezésre álló információ alapján nem jelezhető előre, hogy az ivararány vagy a reprodukciós végpont lesz-e érzékenyebb, ugyanakkor vannak arra utaló jelek (referencia »validálási jelentés«, 1. rész), hogy a hímivarú egyedek számának e növekedése kevésbé érzékeny, mint a szaporulatban bekövetkező csökkenés. Ezért e vizsgálati módszer elsődleges célja annak felmérése, hogy mennyi utód születik, a hímivarú egyedek megjelenése opcionális megfigyelés tárgyát képezheti. Ha a tanulmány ezt az opcionális végpontot értékeli, egy további, a kontrollban legfeljebb 5 % hímivarú egyeddel kapcsolatos vizsgálati érvényességi kritériumot kell alkalmazni.

A Daphnia ivara megkülönböztetésének leginkább gyakorlatias és legkönnyebb módja a fenotípusos tulajdonságok alkalmazása, minthogy a hímek és a nőstények genetikailag azonosak, és ivarukat a környezet határozza meg. A hímek és nőstények első csápjának hossza és alakja eltérő, azaz a hímivarú egyedeké hosszabb, mint a nőstényeké (1. ábra). A különbség már közvetlenül a születést követően észlehető, jóllehet másodlagos ivari jellegek is kifejlődnek a növekedéskor (lásd pl. a 2. ábrát, in: Olmstead és LeBlanc, 2000).

A morfológiai ivar megfigyelése érdekében az egyes vizsgálati állatok újszülöttjeit pipettával át kell helyezni vizsgálati közeget tartalmazó petricsészébe. A közegnek a lehető legkisebbnek kell lennie, hogy korlátozza az állatok mozgását. Az első csáp sztereomikroszkóppal (× 10–60) figyelhető meg.

1. ábra

A D. magna 24 órás hím (balra) és nőstény (jobbra) egyede. A hímek a nőstényektől az első csápjuk hossza és alakja alapján különböztethetők meg, amint az a bekarikázott részen látható (Tatarazako et al., 2004).

HIVATKOZÁSOK

Hobaek A and Larson P. 1990. Sex determination in Daphnia magna. Ecology 71: 2255-2268.

Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992. Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli. Oikos 65, 197-206.

Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M., and Iguchi T. 2005. Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs. Chemosphere 61:1168-1174.

OECD, 2008. Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000. Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry 19:2107-2113.

Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004. Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea). Environmental Science 17, 439-449.

”

Ha ezek a határértékek nem teljesülnek, akkor a vizsgálatot egy másik forrásból származó oltóanyaggal meg kell ismételni, és/vagy felül kell vizsgálni az eljárásokat. Például ha az a probléma, hogy a vakpróbákban sok IC keletkezik, akkor a 27–32. pontban leírt eljárást kell alkalmazni.”

„C.47    A halak korai életszakaszára vonatkozó toxicitási vizsgálat

BEVEZETÉS

A VIZSGÁLAT ELVE

A VIZSGÁLATI VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Vizsgálati kamrák

Az állatfaj kiválasztása

A tenyészhalak tartása

A megtermékenyített peték, embriók és lárvák kezelése

Víz

Vizsgálati oldatok

ELJÁRÁS

Az expozíció körülményei

Időtartam

Betelepítés

Fény és hőmérséklet

Etetés

Vizsgálati koncentrációk

Kontrollok

Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága

Megfigyelések

26.	Az embrionális fejlődés fázisa : a vizsgálati vegyi anyag hatásának való expozíció kezdetén az embrionális fejlődési fázis azonosítását a lehető legpontosabban kell elvégezni. Erre a megfelelően tartósított és megtisztított peték egy reprezentatív mintája használható.

27.

A peték kikelése és túlélése : A kikelés és túlélés folyamatait naponta egyszer meg kell figyelni, és a tapasztalt számadatokat fel kell jegyezni. Amennyiben az embrionális fejlődési fázisban (pl. a vizsgálat első vagy második napján) gombaképződés figyelhető meg a petéken, úgy az érintett petéket meg kell számlálni és el kell távolítani. Az elpusztult embriókat, lárvákat és növendék halakat észlelésükkor azonnal el kell távolítani, mert gyorsan bomlásnak indulnak és a többi hal mozgásának hatására széteshetnek. Az elhullott egyedek kiemelésekor különös gondot kell fordítani arra, hogy a szomszédos embriók/lárvák nehogy fizikailag sérüljenek. Az elhullás jelei a fajtól és az életciklus szakaszától függően változnak. Például: — megtermékenyített peték: különösen a korai szakaszokban az áttetszőség jelentős csökkenése és színbeli elváltozás, amit a fehérjék koagulációja és/vagy kicsapódása okoz, ami fehér opálos színt eredményez, — embriók, lárvák és növendék halak: mozdulatlanság és/vagy a légzőmozgások és/vagy a szívverés hiánya és/vagy reakció elmaradása fizikai ingerekre.

28.

Rendellenes külső megjelenés : a vizsgálat időtartamától és a leírt rendellenesség jellegétől függően megfelelő időközönként fel kell jegyezni a rendellenes testformájú lárvák vagy növendék halak számát. Meg kell jegyezni, hogy rendellenesen fejlődött lárvák és növendék halak természetes körülmények között is előfordulnak, és egyes fajok esetében a kontrollcsoport(ok)ban mennyiségük akár több százalékot is elérhet. Amennyiben a deformitás és az ezzel összefüggő rendellenes viselkedés olyan súlyosnak tekinthető, hogy az az élőlény számára már jelentős szenvedést okoz, és elérte azt a pontot, amikor a felépülés már nem lehetséges, úgy az érintett egyedet el lehet távolítani a vizsgálatból. Az ilyen állatokon eutanáziát kell végrehajtani, és a további adatelemzés szempontjából mortalitásként kell kezelni. E vizsgálati módszer tekintetében ajánlott legtöbb faj esetében normális embrionális fejlődést dokumentáltak (9) (10) (11) (12).

29.

Rendellenes viselkedés : a rendellenes viselkedésmódokat – pl. hiperventilláció, koordinálatlan úszásmód, a fajra nem jellemző nyugalom és a fajra nem jellemző táplálkozási mód – a vizsgálat teljes időtartamától függő időközönként (például a melegvízi halfajok esetében naponta egyszer) fel kell jegyezni. Bár e hatásokat nehéz számszerűsíteni, ha megfigyelhetők, akkor segíthetnek a mortalitási adatok értelmezésében.

30.

Tömeg : a vizsgálat végén az összes életben maradt halat le kell mérni legalább párhuzamosonként (feljegyezve a párhuzamosban szereplő állatok számát és az egyes állatok átlagos tömegét): lehetőség szerint a halak nedves (itatóspapírral szárított) tömegét kell jelentésbe foglalni, de a száraz tömeg is elfogadható (13).

31.

Hosszúság : a kísérlet végén le kell mérni az egyedi hosszúságokat. Ajánlott a teljes hossz mérése, ugyanakkor, ha a farokuszonyon rothadás vagy kimaródás, pusztulás jelei fordulnak elő, akkor a standard hosszt lehet használni. Egy adott vizsgálatban szereplő valamennyi hal esetében ugyanazt a módszert kell alkalmazni. Az egyedi hosszúságot például tolómérővel, digitális fényképezőgéppel vagy kalibrált okulár-mikrométerrel lehet mérni. A jellemző minimális hosszúságok meghatározása a 2. függelékben található.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Vizsgálati jegyzőkönyv

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

A farok tövéig mért hossz : az orrcsúcs és a farokúszó középső sugarának végpontja közötti távolság, és olyan halak esetében alkalmazandó, amelyeknél nehéz meghatározni, hogy a gerincoszlop hol ér véget (www.fishbase.org)

Standard hossz : az orrcsúcstól az utolsó csigolya poszterior végéig vagy a hipurális lemez mediolaterális részének poszterior végéig mért távolság. Leegyszerűsítve ez a mérés nem tartalmazza a farokúszó hosszát. (www.fishbase.org)

Teljes hossz :
az orrcsúcs és a farokúszó hosszabbik lebenyének csúcsa közötti távolság, amelyet általában a lebenyek középvonal mentén való összenyomásával mérnek. Ez egy egyenes vonalú mérés, nem követi a test görbületét (www.fishbase.org)
1. ábra
A használt különböző hosszúságok leírása

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

ECx (hatásos koncentráció x % hatás eléréséhez) : az a koncentráció, amely valamely hatás x %-át okozza a vizsgálati szervezetekben egy adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva. Például az EC50 az a becsült koncentráció, amely a vizsgálat valamilyen végpontja tekintetében a kitett populáció 50 %-ában okoz hatást a meghatározott expozíciós idő alatt.

Megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (LOEC) : a vizsgálati vegyi anyag azon legalacsonyabb vizsgálati koncentrációja, amelynél a kontrollal összevetve még megfigyelhető a vegyi anyag statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05). Azonban az LOEC-szint feletti valamennyi vizsgálati koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább egyenlő az LOEC-szinten megfigyelttel vagy súlyosabb annál. Amennyiben e két feltétel nem teljesíthető, akkor kimerítő magyarázatot kell adni arra, hogy hogyan történt az LOEC (és ennélfogva az NOEC) kiválasztása. Az 5. és 6. függelék útmutatást ad.

Megfigyelhető hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : a közvetlenül az LOEC alatti vizsgálati koncentráció, amely – a kontrollcsoporttal való összevetésben – nem fejt ki statisztikailag szignifikáns hatást (p < 0,05) a meghatározott expozíciós időszak alatt.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

UVCB : ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyag.

IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry (Elméleti és Alkalmazott Kémia Nemzetközi Uniója).

SMILES : molekulák egyszerűsített egy sorban történő beviteli rendszere

---

2. függelék

VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK, IDŐTARTAM ÉS A JAVASOLT FAJOK TÚLÉLÉSI KRITÉRIUMAI

---

3. függelék

A VIZSGÁLATHOZ JAVASOLT FAJOKBÓL SZÁRMAZÓ TENYÉSZÁLLATOK ÉS KÍSÉRLETI ÁLLATOK ETETÉSÉRE ÉS KEZELÉSÉRE VONATKOZÓ IRÁNYMUTATÁS

---

4. függelék

AZ ELFOGADHATÓ MINŐSÉGŰ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY FONTOSABB KÉMIAI TULAJDONSÁGA

---

5. függelék

STATISZTIKAI ÚTMUTATÓ AZ NOEC MEGHATÁROZÁSÁHOZ

Általános rész

Az elemzés egysége a párhuzamos tartály. Tehát folyamatos mennyiségek esetén, mint például a méret, ki kell számítani a párhuzamos minták átlagát vagy mediánját, és ezek a párhuzamos értékek lesznek az elemzendő adatok. Az alkalmazott vizsgálat statisztikai erejét lehetőleg az egyes laboratóriumok megfelelő, korábbi kontrolladatokból álló adatbázisa alapján igazolni kell. A 75–80 %-os erő mellett kimutatható mérethatást minden egyes végpontra vonatkozóan meg kell adni az alkalmazandó statisztikai próbával.

A vizsgálati módszer kidolgozásának időpontjában rendelkezésre álló adatbázisok meghatározzák a javasolt statisztikai eljárások keretében elérhető statisztikai erőt. Az egyes laboratóriumoknak igazolniuk kell, hogy teljesíteni tudják az említett statisztikai erőre vonatkozó követelményt, oly módon, hogy saját maguk elvégzik az erőre vonatkozó elemzést vagy igazolják, hogy a variációs koefficiens egyetlen válaszreakció esetében sem haladja meg a vizsgálati iránymutatás kidolgozása során használt variációs koefficiensek 90. percentilisét. A variációs koefficiens értékeit az 1. táblázat tartalmazza. Amennyiben csak a párhuzamosok átlagai vagy mediánjai állnak rendelkezésre, a párhuzamoson belüli variációs koefficienst figyelmen kívül lehet hagyni.

A laboratóriumi toxikológiai vizsgálatok értékelésére alkalmazott szinte valamennyi statisztikai vizsgálat célja a kezelt és a nem kezelt csoport összehasonlítása. Ezért a Dunnett- vagy a Williams-féle próbák elvégzése előtt nem helyénvaló szignifikáns ANOVA F-próbát előírni, vagy szignifikáns Kruskal–Wallis-féle próbát Jonckheere–Terpstra-, Mann–Whitney- vagy Dunn-féle próba elvégzése előtt (Hochberg és Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964).

A Dunnett-féle próba magában foglalja a többszörös összehasonlítás korrekcióját, a szelekciós tesztként elvégzett F-próba kedvezőtlen hatással van a Dunnett-féle próba által kiadott hamis pozitív és hamis negatív eredmények arányára. Ehhez hasonlóan a lépésenként 0,05-ös szignifikanciaszintet alkalmazó Williams- és Jonckheere–Terpstra-féle lefelé lépegető próbák általánosan megőrzik az 5 %-os hamis pozitív arányt, és ezt az arányt, valamint a vizsgálat statisztikai erejét a szelekciós tesztként elvégzett F- vagy Kruskal–Wallis-féle próba negatívan befolyásolja. A Mann–Whitney- és a Dunn-féle próba esetében is el kell végezni a többszörös összehasonlításra tekintettel történő korrekciót, és a Bonferroni–Holm-féle korrekció javasolt.

A hipotézisvizsgálatokra vonatkozó ajánlások többségét és az említett vizsgálatok alapját képező feltételezések ellenőrzését a széles körű szakirodalmi jegyzéket is tartalmazó OECD (2006) iránymutatás részletesen tárgyalja.

A kontrollok kezelése oldószer használata esetén

Oldószer alkalmazása esetén hígítóvizes és oldószeres kontrollt is be kell állítani. A két kontrollt minden egyes válaszreakció tekintetében össze kell hasonlítani, és amennyiben a kontrollok között nem tapasztalható szignifikáns eltérés, úgy azokat statisztikai elemzés céljából egyesíteni kell. Ellenkező esetben az oldószeres kontrollt kell használni az NOEC meghatározására vagy az ECx érték becslésére, a vizes kontrollt pedig figyelmen kívül kell hagyni. Lásd az érvényességi kritériumokban szereplő korlátozásokat (7. pont)

A hosszúság, a tömeg, a peték kikelési vagy a lárvák mortalitási aránya, illetve a rendellenesen fejlődött lárvák aránya, továbbá a kikelés vagy a felúszás első vagy utolsó napja tekintetében t-próbát vagy Mann–Whitney-féle próbát kell végezni a hígítóvizes és az oldószeres kontroll összehasonlítására 0,05-ös szignifikanciaszint mellett, valamennyi kezelt csoport figyelmen kívül hagyásával. A vizsgálatok eredményeit jegyzőkönyvbe kell foglalni.

A méretre vonatkozó mérések (hossz és tömeg)

A halegyedek hosszára és tömegére vonatkozó értékek normális vagy log-normális eloszlásúak lehetnek. A párhuzamos vizsgálatok átlagai a centrális határeloszlás-tétel értelmében általában mindkét esetben normális eloszlást mutatnak, és ezt három édesvízi fajjal végzett több mint száz ELS (korai életszakasz)-vizsgálat adatai is alátámasztják. Amennyiben az adatok vagy a korábbi adatbázisok a halegyedek méretére vonatkozó értékek tekintetében log-normális eloszlásra utalnak, úgy ki lehet számítani a párhuzamosonként a halegyedekre vonatkozó átlagértékek logaritmusát, ahol az elemzendő adatok a párhuzamosok átlagai logaritmusainak antilogaritmusai lesznek.

Az adatokat a normális eloszlásnak való megfelelés és a varianciahomogenitás teljesülése szempontjából értékelni kell. E célból az ANOVA modell reziduálisai a koncentrációval mint egyetlen magyarázó változóval használandók. Vizuális meghatározást lehet végezni szórásdiagramok és hisztogramok segítségével, vagy szár-levél diagramokat lehet használni. E helyett végezhető formális próba is, mint például a Shapiro–Wilk- vagy az Anderson–Darling-féle próba. A varianciahomogenitás teljesülését ugyanazon szórásdiagram alapján vizuális meghatározással vagy formálisan, Levene-féle próbával lehet megállapítani. A normalitás és a variancia homogenitása tekintetében csak paraméteres próbákat (pl. Williams, Dunnett) kell értékelni.

Figyelmet kell fordítani az esetleges kiugró értékekre és azok elemzésre gyakorolt hatására. A Tukey-féle kiugróérték-próbát és a fent leírt reziduálisok ábráinak vizuális ellenőrzését lehet alkalmazni. Figyelembe kell venni, hogy a megfigyelések a párhuzamos vizsgálatok egészére vonatkoznak, tehát egy kiugró értéket csak gondos mérlegelés után tanácsos az elemzés során figyelmen kívül hagyni.

Azok a statisztikai vizsgálatok, amelyek felhasználják a kísérleti elrendezés jellemzőit és a biológiai elvárásokat, lefelé lépegető trendpróbák, mint például a Williams- és Jonckheere–Terpstra-féle próbák. Ezek a vizsgálatok monoton koncentráció-hatás összefüggést feltételeznek, és az adatokat aszerint kell értékelni, hogy megfelelnek-e ennek a feltételezésnek. Ezt a párhuzamosok átlagát a vizsgálati koncentráció függvényében ábrázoló szórásdiagram vizuális értékelésével lehet megállapítani. Segíthet, ha a szórásdiagramra egy szakaszonként lineáris görbét fektetnek, ami összeköti a párhuzamos vizsgálatokon belüli mintamérettel súlyozott átlagkoncentrációkat. A szakaszonként lineáris görbe nagymértékű eltérése a monotonitástól arra utalna, hogy a trendpróbák helyett más próbákat kellene használni. Alternatívaként formális próbák alkalmazhatók. Egy egyszerű formális próba a koncentrációk átlagértékeinek lineáris és kvadratikus kontrasztjainak kiszámítását célozza. Amennyiben a kvadratikus kontraszt szignifikáns, a lineáris kontraszt pedig nem szignifikáns, az a monotonitással kapcsolatos problémára utalhat, amit a görbék alapján további értékelésnek kell alávetni. Ahol felvetődik a normalitás és a varianciahomogenitás kérdése, az említett kontrasztokat rangsorba rendezett transzformált adatokból lehet létrehozni. Egyéb eljárások, mint például a Bartholomew-teszt is alkalmazhatók a monotonicitás vizsgálatára, viszont ezek összetettebb eljárások.

2. ábra

NOEC folyamatábra – a méretre vonatkozó mérések (hosszúság és tömeg)

Azokat az eseteket kivéve, ahol az adatok nem felelnek meg ezen próbák követelményeinek, a NOEC a Williams- vagy a Jonckheere–Terpstra-féle próba lefelé lépegető alkalmazásával határozható meg. Az OECD (2006) iránymutatása részletesen ismerteti ezeket az eljárásokat. A lefelé lépegető trendpróba követelményeinek nem megfelelő adatok esetén Dunnett-féle próbát vagy Tamhane–Dunnett (T3) tesztet lehet alkalmazni; mindkét teszt magában foglalja a többszörös összehasonlítások miatt szükséges korrekciót. Ezek a próbák feltételezik a normalitást, a Dunnett-féle próba pedig a variancia homogenitását. Amennyiben ezek a feltételek nem teljesülnek, Dunn-féle nem-paraméteres próbát lehet végezni. Az OECD (2006) iránymutatása tartalmazza az említett próbák részleteit. A 2. ábra áttekintést ad arról, hogy a megfelelő vizsgálatot hogyan lehet megválasztani.

A peték kikelése és a lárvák túlélése

Az adatok a kikelt peték vagy a túlélő lárvák aránya az egyedi párhuzamosokban. Ezeket az arányokat az extra-binomiális variancia szempontjából értékelni kell, ami az ilyen mérések esetében szokásos, de nem általános eljárás. A 3. ábrán látható folyamatábra útmutatást ad a választható vizsgálatokra vonatkozóan; a részletes leírást lásd a szövegben.

Két próbát alkalmaznak gyakran. A Tarone C(α) tesztet (Tarone, 1979) és a khí-négyzet próbát, amelyeket minden egyes vizsgálati koncentrációra külön-külön kell alkalmazni. Amennyiben akár egyetlen vizsgálati koncentráció esetében extra-binomiális varianciát találnak, akkor az erre alkalmas módszert kell használni.

1. képlet

Tarone C (α) teszt (Tarone 1979)

ahol
az átlagos arány egy adott koncentráció esetében, m a párhuzamos tartályok száma, nj a párhuzamosokban lévő állatok száma j, és xj az adott párhuzamosban lévő válaszreakciót mutató állatok száma, pl. nem kelt ki vagy elpusztult. Ezt a vizsgálatot minden egyes koncentrációra külön-külön kell elvégezni. Ezt a tesztet módosított khí-négyzet próbának lehet tekinteni, ugyanakkor a Tarone által végzett, korlátozott statisztikai erőre vonatkozó szimulációk azt bizonyították, hogy nagyobb statisztikai erőt képvisel, mint a khí-négyzet próba.

3. ábra

A peték kikelésére és a lárvák mortalitására vonatkozó NOEC folyamatábra

Amennyiben az extra-binomiális varianciára nincs szignifikáns bizonyíték, a lefelé lépegető Cochran–Armitage-féle próbát lehet alkalmazni. Ez a próba nem veszi figyelembe a párhuzamosokat, így amennyiben van ilyen bizonyíték, úgy a Cochran–Armitage-féle próba Rao–Scott-féle módosítását javasolt elvégezni, amely számításba veszi a párhuzamosokat, azok méretét és az extra-binomiális varianciát. Végezhető még lefelé lépegető Williams- és Jonckheere–Terpstra-féle próba, valamint Dunnett-féle próba a méretre vonatkozó mérésekre leírtak szerint. Az említett próbák extra-binomiális variancia esetén, illetve annak hiányában is alkalmazhatók, azonban némiképp alacsonyabb statisztikai erőt képviselnek (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao és Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996).

A kikelés vagy a felúszás első vagy utolsó napja

A válaszreakció egy egész szám, amely azt a vizsgálati napot adja meg, amelyen a jelzett megfigyelést végezték az adott párhuzamos tartály esetében. Az értéktartomány általában igen szűk, és gyakran nagy a kötött értékek aránya, pl. a kikelés első napja valamennyi kontrollpárhuzamosban és esetleg egy vagy két alacsony vizsgálati koncentrációban megegyezik. Az ilyen adatok esetében a paraméteres próbák, mint például a Williams- és a Dunnett-féle próba, nem megfelelőek. Hacsak nincs bizonyíték arra, hogy az eredmények a monotonitástól jelentősen eltérnek, a lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-féle próba nagyon erőteljes módszer a vizsgálati vegyi anyag hatásainak kimutatására. Egyébként a Dunn-féle próbát lehet alkalmazni.

A lárvák rendellenességei

A válaszreakció a valamilyen rendellenességet mutató lárvák száma. Ennek a válaszreakciónak az előfordulási gyakorisága általában alacsony, és néhány olyan probléma merül fel vele kapcsolatban, mint a kikelés első napja esetében, valamint a koncentráció-hatás összefüggés néha szabálytalan. Amennyiben az adatok legalább hozzávetőleg monoton koncentrációs görbét követnek, a lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-féle próba erőteljes módszer a hatások kimutatására. Egyébként a Dunn-féle próbát lehet alkalmazni.

HIVATKOZÁSOK:

Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken.

Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121.

Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252.

Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491.

Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648.

Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454.

Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York.

Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton.

Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133.

Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.

Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.

Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.

Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley.

Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590.

Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117.

Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531.

Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952.

Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14.

---

6. függelék

STATISZTIKAI ÚTMUTATÓ REGRESSZIÓS BECSLÉSEKHEZ

Általános rész

A modell illesztéséhez alkalmazott megfigyelések a párhuzamosok átlagai (hosszúság és tömeg) vagy azok arányai (a peték kikelése és a lárvák mortalitása) (OECD 2006).

Általában a párhuzamos minták méretét súlyként használó súlyozott regresszió a javasolt módszer. Más súlyozási rendszerek is alkalmazhatók, mint például az előrejelzett átlagos válaszreakcióval történő súlyozás, valamint ennek és a párhuzamos minták méretével való súlyozásnak a kombinációja. A koncentráción belüli mintavariancia reciprokával történő súlyozás nem ajánlott (Bunke et al. 1999, Seber és Wild, 2003, Motulsky és Christopoulos 2004, Huet et al. 2003).

A válaszreakciók elemzést megelőző bármilyen transzformációja esetén meg kell őrizni a megfigyelések függetlenségét, és az ECx értékét és konfidenciahatárait az eredeti mértékegységben és nem a transzformált egységben kell kifejezni. Például a hosszúság logaritmusának 20 %-os változása nem egyenértékű a hosszúság 20 %-os változásával (Lyles et al. 2008, Draper és Smith 1999).

A 4. ábrán látható folyamatábra áttekintést nyújt az ECx becsléseire vonatkozóan. További részletek az alábbi szövegben találhatók.

4. ábra

A párhuzamosok átlagos hosszára és tömegére, vagy a peték kikelésére és a lárvák mortalitására vonatkozó ECx becslések folyamatábrája, a részleteket lásd a szövegben

A peték kikelésével és a lárvák mortalitásával kapcsolatos megfontolások

A peték kikelése és a lárvák mortalitása tekintetében általában a legjobb megoldás egy csökkenő modell illesztése, kivéve, ha az alább ismertetett probit modell illesztését választják. Tehát a ki nem kelt peték vagy az elpusztult lárvák arányát kell modellezni. Ennek az az oka, hogy az ECx arra a koncentrációra utal, amely esetében a kontrollok átlagos válaszreakciójának x %-ával egyenértékű változás következik be. Amennyiben a kontrollpeték 5 %-a nem kel ki és a kikelés sikertelenségét modellezik, akkor az EC20 azt a koncentrációt jelenti, amely esetében a kontrollpeték 5 %-os sikertelen kikelése 20 %-kal változik, ami 0,2*0,05=0,01 értékű vagy 1 százalékpontos változásnak, azaz 6 %-os sikertelen kikelésnek felel meg. Ilyen csekély változást a rendelkezésre álló adatokból nem lehet megbecsülni és annak biológiai szempontból nincs jelentősége. Amennyiben a kikelő peték arányát modellezik, a kontrollarány ebben a példában 95 % lesz és a kontroll átlagának 20 %-os csökkenése 0,95*0,2=0,18 értékű változást jelentene, tehát a kikelés sikeressége 95 %-ról 77 %-ra csökken (= 95–18) és ezt a hatást okozó koncentrációt lehet megbecsülni, ami feltehetően nagyobb jelentőséggel bírhat. Ez a méretre vonatkozó mérésekkel kapcsolatosan nem jelent problémát, noha a méretre gyakorolt kedvezőtlen hatások általában méretcsökkenést jelentenek.

A méretre (hosszúság és tömeg) és a peték kikelésének sikerességére vagy a lárvák túlélésére vonatkozó modellek

A Brain–Cousens-féle hormetikus modell kivételével az OECD (2006) iránymutatás az említett modellek mindegyikét ismerteti és ajánlja. Az OECD 2–5 elnevezésű modellekben foglaltakat az ökotoxicitás-vizsgálatok kapcsán Slob (2002) tanulmánya is tárgyalja. Természetesen számos egyéb modell hasznos lehet. Bunke és munkatársai (1999) számos olyan modellt sorolnak fel, amelyek itt nem kerültek említésre, és bőségesen állnak rendelkezésre más modellekre való hivatkozások. Az alábbiakban felsorolt modellek az ökotoxicitás-vizsgálatok esetében különösen alkalmasak és széles körben elterjedtek.

5 vizsgálati koncentrációval és kontrollal

6 vagy ennél több vizsgálati koncentrációval és kontrollal

Amennyiben hormézis látható (a peték sikeres kikelése vagy a lárvák túlélése esetén nem valószínű, ugyanakkor a méretre vonatkozó megfigyelések során néha előfordul)

A peték sikertelen kikelésére és a lárvák mortalitására vonatkozó egyéb modellek

Egyetlen modell illeszkedésének megfelelősége

A modellek összehasonlítása

Az ECx becslés minősége

Az ECx konfidencia-intervalluma nem lehet túl tág. Statisztikai megítélés szükséges annak eldöntésére, hogy a konfidencia-intervallum mennyire lehet tág, hogy az ECx még használható legyen. A peték kikelésére és a méretre vonatkozó adatokhoz illeszkedő regressziós modellek szimulációi azt mutatják, hogy az ECx (x=10, 20 vagy 30) konfidencia-intervallumainak 75 %-a nem lép túl két vizsgálati koncentrációt. Ez általános útmutatást ad arra vonatkozóan, hogy mi az elfogadható, és praktikus útmutató arra, hogy mi az, ami megvalósítható. Számos szerző állítja, hogy szükség van arra, hogy a konfidencia-intervallumokat a modellek minden paramétere tekintetében feljegyezzék, és hogy a modellparaméterek tág konfidencia-intervallumai elfogadhatatlan modelleket jeleznek (Ott és Longnecker 2008, Alvord és Rossio 1993, Motulsky és Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber és Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005).

Az ECx (vagy bármely más modellparaméter) konfidencia-intervalluma nem tartalmazhatja a nullát (Motulsky és Christopoulos 2004). Ez a minimális szignifikáns különbséggel egyenértékű regresszió, amelyet a hipotézisvizsgálati megközelítésekben gyakran említenek (pl. Wang et al. 2000). Ez a konfidencia-intervallummal is megegyezik, hogy az LOEC szintjén mért átlagos válaszreakció ne tartalmazza a kontroll átlagát. Vizsgálni kell, hogy a paraméterek becslései tudományosan elfogadhatók-e. Pl. ha az y0 konfidencia-intervalluma ±20 %, akkor egyetlen EC10 becslés sem elfogadható. Amennyiben a modell 20 %-os hatást jelez előre C koncentrációnál és a maximális megfigyelhető hatás C és annál alacsonyabb koncentrációnál 10 %-os, akkor az EC20 nem elfogadható (Motulsky és Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005).

Az ECx nem teheti szükségessé a pozitív koncentrációk tartományán kívüli extrapolációt (Draper és Smith 1999, OECD 2006). Az ECx értékére vonatkozó általános iránymutatás az lehet, hogy az érték ne legyen több mint kb. 25 %-kal a legalacsonyabb vizsgálati koncentráció alatt, vagy ne legyen több mint kb. 25 %-kal a legmagasabb vizsgálati koncentráció felett.

HIVATKOZÁSOK:

Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163.

Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96.

Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240.

Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London.

Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London.

Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons.

Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46

Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York.

Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886.

Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.

Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA.

O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121

OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.

Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA

Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199.

Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003

Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312

Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000.

C.48.    A halakon végzett rövid távú reprodukciós vizsgálat

BEVEZETÉS

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

A VIZSGÁLAT ELVE

A VIZSGÁLAT ELFOGADHATÓSÁGI KRITÉRIUMAI

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Felszerelés

Víz

Vizsgálati oldatok

A halak tartása

Az expozíciót előkészítő időszak és a halak kiválasztása

VIZSGÁLATI ELRENDEZÉS

A vizsgálati koncentrációk megválasztása

ELJÁRÁS

A vizsgálati halak kiválasztása és lemérése

Az expozíció körülményei

Időtartam

Etetés

Fény és hőmérséklet

Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága

Megfigyelések

Túlélés

Viselkedés és külső megjelenés

Fekunditás

A halak humánus leölése

A másodlagos ivari jellegek megfigyelése

Vitellogenin (VTG)

A gonadális kórszövettani vizsgálat értékelése

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

A biomarker-válaszok értékelése varianciaanalízissel (ANOVA)

A vizsgálati eredmények jegyzőkönyvezése

ÚTMUTATÓ A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSÉHEZ ÉS ELFOGADÁSÁHOZ

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

RÖVIDÍTÉSEK ÉS FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

CV : variációs koefficiens

ELISA : enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (enzyme-linked immunosorbent assay).

HPG-tengely : hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely.

Betelepítési arány : a halak nedvesen mért tömege egységnyi mennyiségű vízben.

MTC : legnagyobb elviselhető koncentráció, amely az LC50 körülbelül 10 %-a.

Állománysűrűség : a halak egy térfogategységre eső száma.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

VTG : a vitellogenin a szikben található foszfo-, lipo- és glikoproteinek prekurzora, amely alapesetben az ikrarakó fajok szexuálisan aktív nőstényeiben fordul elő.

---

2. függelék

A HALAKBAN VÉGZETT ENDOKRIN SZŰRŐVIZSGÁLAT KÍSÉRLETI KÖRÜLMÉNYEI

---

3. függelék

AZ ELFOGADHATÓ MINŐSÉGŰ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY FONTOSABB KÉMIAI TULAJDONSÁGA

---

4A.függelék

ÍVÁSI ALJZAT A ZEBRADÁNIÓ RÉSZÉRE

Ívási tálca : bármilyen, üvegből készült eszköztartó edény, például 22 × 15 × 5,5 cm méretű (hosszúság × szélesség × mélység), eltávolítható rozsdamentes acél ráccsal fedve (2 mm-es lyukbőség). A rácsnak a perem alatti magasságban kell fednie az eszköztartó edény nyílását.

A rácsra ívási aljzatot kell rögzíteni. A közegnek olyan szerkezetet kell biztosítania a halak részére, amelybe beköltözhetnek. A zöld műanyagból készült mesterséges akváriumnövények például alkalmasak erre a célra (megjegyzés: figyelembe kell venni a vizsgálati vegyi anyagnak a műanyaghoz való lehetséges adszorpcióját). A műanyagot elegendő ideig megfelelő mennyiségű meleg vízben kell áztatni, hogy ne bocsásson ki vegyi anyagokat a vizsgálati vízbe. Üvegből készült anyagok használata esetén biztosítani kell, hogy a halak intenzív mozgásuk során ne sérüljenek meg vagy szoruljanak be.

A tálca és az üvegfalak közötti távolság legalább 3 cm legyen, hogy az ívás ne történhessen a tálcán kívül. A tálcára lerakott ikrák átesnek a rácson, és 45–60 perccel a megvilágítás kezdete után mintát lehet venni belőlük. Az átlátszó ikrák nem tapadnak, és keresztirányú fény segítségével könnyen meg lehet számolni őket. Edényenként öt nőstény használata esetén a legfeljebb 20 ikra/nap mennyiség alacsonynak, a legfeljebb 100 ikra/nap mennyiség közepesnek, a több mint 100 ikra/nap mennyiség pedig magasnak számít. Az ívási tálcát – a lehető legkésőbbi esti időpontban vagy kora reggel – el kell távolítani, az ikrákat össze kell gyűjteni, majd az ívási tálcát újra be kell helyezni a vizsgálati edénybe. Az újrabehelyezésig eltelt idő nem haladhatja meg az egy órát, különben az ívási aljzat hatása szokatlan időben jelentkező egyedi párzást és ívást válthat ki. Ha valamilyen körülmény az ívási tálca későbbi behelyezését teszi szükségessé, ezt legalább 9 órával a megvilágítás kezdete után kell megtenni. E késői napszakban a tálca behelyezése már nem vált ki ívást.

---

4B. függelék

ÍVÁSI ALJZAT AMERIKAI CSELLE RÉSZÉRE

Két vagy három kombinált műanyag/kerámia/üveg vagy rozsdamentes acél ívási lemezt és tálcát kell helyezni mindegyik vizsgálati kamrába (pl. 80 mm hosszú szürke, félkör alakú ereszcsatorna-darab egy 130 mm hosszú szegélyes tálcára helyezve) (lásd a képet). A megfelelően kezelt PVC- vagy kerámialemezek megfelelő ívási aljzatnak bizonyultak (Thorpe et al, 2007.).

A jobb tapadás érdekében ajánlott a lemezeket megcsiszolni. Emellett a tálcát célszerű hálóval lefedni azt megakadályozandó, hogy a halak hozzáférjenek a lehullott ikrákhoz, kivéve, ha igazolt, hogy az ikrák hatékonyan tapadnak a használt ívási aljzathoz.

Az alaplap célja, hogy felfogja azokat az ikrákat, amelyek nem tapadnak meg a lemez felületén és ezért a tartály aljára esnének (vagy azokat az ikrákat, amelyeket a halak közvetlenül a lapos műanyag alaplapra raktak le). Az ívási aljzatot felhasználás előtt legalább 12 órán keresztül áztatni kell a hígítóvízben.

Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98.

---

5A. függelék

A MÁSODLAGOS IVARI JELLEGEK VIZSGÁLATA AZ AMERIKAI CSELLÉBEN BIZONYOS ENDOKRIN RENDSZERRE HATÓ VEGYI ANYAGOK KIMUTATÁSA CÉLJÁBÓL

Áttekintés

A hormonháztartást zavaró anyagok vizsgálata során a fizikai megjelenés potenciálisan fontos jellemzői lehetnek a felnőtt amerikai csellék esetében többek között: a testszín (azaz világos/sötét), a mintázat (azaz a függőleges sávok jelenléte vagy hiánya), a test alakja (azaz a fej és a pektorális régió alakja, a has puffadtsága), valamint a speciális másodlagos ivari jellegek (azaz a nászkiütések száma és mérete, a dorzális lemez és a tojócső mérete).

A nászkiütések a szaporodásbiológiailag aktív hím amerikai csellék fején (dorzális lemez) találhatók, és általában kétoldali szimmetrikus mintázatba rendeződnek (Jensen et al. 2001). A kontrollnőstényeken, illetve a növendék hímeken és nőstényeken nem figyelhető meg a nászkiütések kifejlődése (Jensen et al. 2001). A hímek szeme körül és orrlyukai között akár nyolc egyedi nászkiütés is lehet. A legtöbb és legnagyobb nászkiütés közvetlenül az orrlyukak alatt és a száj fölött, két párhuzamos vonalban található. Számos halban nászkiütés-csoportok helyezkednek el az alsó állkapocs alatt; ezek közül a szájhoz legközelebb elhelyezkedők általában egy különálló párt alkotnak, míg a ventrálisabb csoportok akár négy nászkiütésből is állhatnak. A gyakorlatban a nászkiütések száma ritkán haladja meg a 30-at (tartomány: 18–28; Jensen et al. 2001). A (számuk tekintetében) domináns nászkiütések különálló, viszonylag kerek képződmények, amelyek magassága körülbelül megegyezik a sugarukkal. A szaporodásbiológiailag aktív hímek többségének van legalább néhány olyan nászkiütése, amely olyan mértékben megnagyobbodott és hangsúlyossá vált, hogy az egyes struktúrákat nem lehet megkülönböztetni.

A hormonháztartást zavaró anyagok bizonyos típusai egyes másodlagos ivari jellegek rendellenes előfordulását okozhatják a másik nemben; például az androgénreceptor-agonisták – mint a 17α-metiltesztoszteron vagy a 17β-trenbolon – nászkiütések kifejlődését okozhatják a nőstény amerikai cselléknél (Smith, 1974; Ankley et al. 2001, 2003), míg az ösztrogénreceptor-agonisták a hímeknél csökkenhetik a nászkiütések számát vagy méretét (Miles–Richardson et al. 1999; Harris et al. 2000.).

Az alábbiakban az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynökségének (US Environmental Protection Agency) duluth-i (Minnesota állam) laboratóriumában alkalmazott eljárások alapján ismertetjük a nászkiütések jellemzését az amerikai cselle esetében. Az egyes termékek és/vagy berendezések hasonló rendelkezésre álló anyagokkal is helyettesíthetők.

A nászkiütések megfigyelésére leginkább megvilágított nagyító vagy 3X nagyítású megvilágított preparálómikroszkóp alkalmas. A halat dorzális irányból és anterior részével előre kell vizsgálni (fejjel a megfigyelő felé).

A nászkiütések megszámlálása és pontozása

Felnőtt amerikai cselle esetében hat specifikus területet határoztak meg, ahol meg kell vizsgálni a nászkiütések jelenlétét és fejlődését. A jelenlévő nászkiütések elhelyezkedésének és mennyiségének feltérképezésére kifejlesztettek egy sablont (lásd a függelék végén). Az egyes élőlények esetében a nászkiütések számát rögzíteni kell, méretüket a következőképpen lehet mennyiségileg rangsorolni: 0 – hiányzik, 1– jelen van, 2 – megnagyobbodott és 3 – hangsúlyos (1. ábra).

0 pont – hiányoznak a nászkiütések. 1 pont – jelen van, és a tuberkulumnak van egy olyan pontja, amelynek magassága csaknem egyenlő a nászkiütés sugarával. 2 pont – megnagyobbodott, megjelenésében csillagra emlékeztető szövet jellemzi, és rendszerint nagy sugaras alapja van a középpontból eredő bordákkal vagy barázdákkal. A nászkiütés felszíne gyakran egyenetlen, de időnként kissé lekerekedett is lehet. 3 pont – hangsúlyos, általában elég nagy és lekerekedett, kevésbé definiált struktúrával. Időnként ezek a nászkiütések összefutnak és egy adott területen vagy különböző területek kombinációján összefüggő tömeget képeznek (B, C és D, alább ismertetve). A nászkiütések színezete és struktúrája a 2 ponttal értékelt nászkiütésekéhoz hasonlít, de időnként eléggé megkülönböztethetetlen. Ez a pontozási rendszer a 18–20 nászkiütéssel rendelkező normál kontrollhímek esetében általában < 50 általános nászkiütés-pontszámot eredményez (Jensen et al. 2001).

1. ábra

Az adott minősítési területen lévő nászkiütések tényleges száma néhány hal esetében meghaladhatja a sablon celláinak számát. Ilyen esetben a további pontszámokat a cellán belül, illetve a cellától jobbra vagy balra lehet megadni. A sablonnak ezért nem kell szimmetrikusnak lennie. További technika a párban álló vagy a száj vízszintes síkja mentén vertikálisan összekapcsolódott nászkiütések feltérképezésére, hogy egy cellában két nászkiütés-minősítő pontszámot adnak meg.

Feltérképezendő régiók:

Hivatkozások:

---

5B. függelék

A MÁSODLAGOS IVARI JELLEGEK VIZSGÁLATA A JAPÁN RIZSHALBAN EGYES, AZ ENDOKRIN RENDSZERRE HATÓ VEGYI ANYAGOK KIMUTATÁSA CÉLJÁBÓL

Az alábbiakban a papilláris nyúlványok ( *1 ) mérési módját ismertetjük, amelyek a japán rizshal (Oryzias latipes) jellemző másodlagos ivari jellegei.

Mérés

1. ábra

A farok alatti úszó alakjában és méretében megfigyelhető, ivarok közötti különbséget bemutató ábra. A, hím; B, nőstény. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.

2. ábra

A: nyúlványok a farok alatti úszósugár összekapcsolódott lemezein. J.P.: összekapcsolódott lemez; A.S.: axiális tér; P.: nyúlvány. B.: az úszósugár disztális vége. Actinotrichia (Act.) az úszósugár hegyén. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.

3. ábra

A hal testéről készült fénykép a kettévágás helyével, ha az ivarmirigyet 10 %-os semleges pufferelt formalintól eltérő fixálóoldatban fixálják. Ebben az esetben a testet a farok alatti úszó anterior régiója és a végbélnyílás között borotva segítségével ketté kell vágni (piros vonal), majd a haltest feji része az ivarmirigy-fixálóoldatba, míg a haltest farki része 10 %-os semleges pufferelt formalinba kerül.

---

6. függelék

A VITELLOGENINANALÍZIS CÉLJÁRA AJÁNLOTT MINTAVÉTELI ELJÁRÁSOK

Ügyelni kell arra, hogy elkerüljék a hímekből és nőstényekből vett VTG-minták közötti keresztszennyeződést.

1A. eljárás:     Amerikai cselle, vérvétel farokvénából/-artériából

Érzéstelenítés után a faroktestet szikével részben át kell vágni, és heparinnal kezelt mikrohematokrit kapilláriscsővel vért kell gyűjteni a farokvénából/-artériából. A vér levételét követően a vérplazmát 3 percig 15 000 g -vel (vagy alternatív megoldásként 10 percig 15 000 g-vel 4 °C-on) történő centrifugálással gyorsan el kell választani. Centrifugálás után szükség esetén meg lehet határozni a százalékos hematokritértéket. A plazmarészt ezután el kell távolítani a mikrohematokrit csőből, és 0,13 egység aprotinin (proteáz-inhibitor) hozzáadása után a VTG-meghatározás elvégzéséig centrifugacsőben, – 80 °C hőmérsékleten kell tárolni. A begyűjthető vérplazmatérfogat az amerikai cselle méretétől függően (ami ivarfüggő) általában 5–60 mikroliter/hal (Jensen et al. 2001).

1B. eljárás:     Amerikai cselle, vérvétel szívpunkcióval

Alternatív megoldásként a vér szívpunkcióval is gyűjthető heparinnal kezelt fecskendő használatával (1 000 egység heparin/ml). A vért (jégen tartott) Eppendorf-csövekbe kell áttölteni, majd centrifugálni (5 perc, 7 000 g, szobahőmérséklet). A vérplazmát tiszta Eppendorf-csövekbe kell áttölteni (alikvotokban, ha a vérplazma térfogata ezt lehetővé teszi), majd -80 °C-on azonnal le kell fagyasztani és az analízisig így tárolni (Panter et al. 1998).

2 A. eljárás:     Japán rizshal, a máj kimetszése a rizshal esetében

A vizsgálati halak eltávolítása a vizsgálati kamrából

A máj kimetszése

A hal teste a máj kimetszését követően felhasználható ivarmirigy-szövettanra és a másodlagos ivari jellegek vizsgálatára.

Mintapéldány

Ha a vizsgálati halakból vett májmintákat röviddel a kimetszés után nem használják fel előkezelésre, akkor ≤ – 70 °C-on kell azokat tárolni.

1. ábra

Ollóval bemetszést kell ejteni közvetlenül a mellúszók előtt.

2. ábra

A has középvonalát a végbélnyílástól körülbelül 2 mm-re kraniálisan elhelyezkedő pontig ollóval fel kell vágni.

3. ábra

A hasfalat a máj és az egyéb belső szervek szabaddá tétele céljából fogóval ki kell tárni.

(Alternatív megoldásként a hasfalat oldalra is le lehet tűzni.)

A nyíl a májat jelzi.

4. ábra

A májat fogóval határozottan fel kell tárni és kimetszeni.

5. ábra

A beleket fogóval óvatosan vissza kell húzni.

6. ábra

A belek mindkét végét és a mesenterialis függelékeket ollóval el kell vágni.

7. ábra (nőstény)

Az eljárás a nőstények esetében is ugyanaz.

8. ábra

A befejezett eljárás.

2B. eljárás:     Japán rizshal (Oryzias latipes), a máj előkezelése vitellogeninanalízishez

A homogenizátumpuffert ki kell venni az ELISA-készletből, és az üvegében hagyva zúzott jéggel le kell hűteni (az oldat hőmérséklete: ≤ 4 °C). Ha az EnBio ELISA rendszer homogenizáló pufferét használják, az oldatot szobahőmérsékleten fel kell olvasztani, majd a palackot zúzott jéggel lehűteni.

A májhoz szükséges homogenizátumpuffer térfogatát a máj tömege alapján kell kiszámítani (egy mg májhoz 50 μl homogenizátumpuffert kell adni). Például ha a máj tömege 4,5 mg, a májhoz adandó homogenizátumpuffer mennyisége 225 μl. Listát kell készíteni az összes májhoz szükséges homogenizátumpuffer térfogatáról.

A máj előkészítése az előkezeléshez

Az előkezelés végrehajtása

1)   A homogenizátumpuffer hozzáadása

A listán ellenőrizni kell a homogenizátumpuffernek az adott májmintához használandó térfogatát, és be kell állítani a mikropipettát (térfogattartomány: 100–1 000 μl) a megfelelő térfogatra. A mikropipettához tiszta hegyet kell csatlakoztatni.

A homogenizátumpuffert fel kell szívni a reagenspalackból, és a puffert be kell adni a májat tartalmazó 1,5 ml-es mikrocsőbe.

A májat tartalmazó valamennyi 1,5 ml-es mikrocsőbe be kell adni a homogenizátumpuffert a fent leírt eljárás szerint. A mikropipetta hegyét nem kell kicserélni. Ha azonban a pipettahegy szennyezett vagy feltehetően szennyezett, a hegyet ki kell cserélni.

2)   A máj homogenizálása

3)   A szuszpendált májhomogenizátum centrifugálása

4)   A felülúszó gyűjtése

A minta tárolása

A májhomogenizátum felülúszóját tartalmazó 0,5 ml-es mikrocsöveket az ELISA-vizsgálatban történő felhasználásig ≤ – 70 °C-on kell tárolni.

3A. eljárás:     Zebradánió, vérvétel farokvénából/-artériából

A faroktövet közvetlenül az érzéstelenítés után keresztben át kell vágni, és heparinnal kezelt mikrohematokrit kapilláriscsővel fel kell fogni a vért a farokvénából/-artériából. A vér térfogata a hal méretétől függően 5–15 μl. A mikrokapilláris-csőbe azonos térfogatú aprotinin puffert (6 μg/ml PBS-ben) kell adni, és a vérplazmát centrifugálással (5 perc, 600 g) szeparálni a vérből. A vérplazmát a kémcsövekben kell összegyűjteni, és a vitellogenin vagy az egyéb vizsgált fehérjék analizálásáig – 20 °C-on kell tárolni.

3B. eljárás:     Zebradánió, vérvétel szívpunkcióval

A véralvadás és a fehérjék lebomlásának elkerülése érdekében a mintákat heparint (1 000 egység/ml) és aprotinin proteázinhibitort (2 TIU/ml) tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) kell gyűjteni. A puffer összetevőjeként heparin, ammóniumsó és liofilizált aprotinin használata ajánlott. A vérvétel céljára rögzített vékony tűvel (pl. Braun Omnikan-F) ellátott fecskendő (1 ml) használata javasolt. A fecskendőt előre meg kell tölteni a pufferrel (körülbelül 100 μl), hogy teljesen feloldja a halakból származó kis vértérfogatokat. A vérmintát szívpunkcióval kell venni. Először a halat MS-222 oldattal (100 mg/l) érzésteleníteni kell. Megfelelő érzéstelenítéssel kivehetővé válik a zebradánió szívverése. A szív megszúrása közben enyhe nyomást kell kifejteni a fecskendő dugattyújára. A begyűjthető vértérfogat 20–40 mikroliter között van. A szívpunkció után a vér-puffer keveréket a kémcsőbe kell tölteni. A vérplazmát a vérből centrifugálással (20 perc, 5 000 g) kell elkülöníteni, és az analízisig – 80 °C-on tárolni.

3C. eljárás     Szabványműveleti előírás: Zebradánió, fej/farok homogenizátum készítése

Fontos megjegyzés: A nem indukált hímek nőstényektől vagy indukált hímektől eredő »vitellogeninszennyeződésének« megelőzése céljából a boncolóeszközöket, valamint a vágódeszkát az egyes halak kezelése között le kell öblíteni és alaposan meg kell tisztítani (pl. 96 %-os etanollal).

1. ábra

---

7. függelék

DÚSÍTOTT VITELLOGENINMINTÁK ÉS INTER-ASSAY (VIZSGÁLATKÖZI) REFERENCIASTANDARD

Minden olyan napon, amikor VTG-vizsgálatot végeznek, egy inter-assay (vizsgálatközi) referenciastandard felhasználásával készült dúsított mintát is analizálni kell. Az inter-assay referenciastandard készítéséhez használt VTG-nek az elvégzendő vizsgálat céljára készített kalibrációs standardokban használt vitellogenintől eltérő tételből kell származnia.

A dúsított minta ismert mennyiségű inter-assay standardnak egy kontrollhím vérplazmájából vett mintához történő hozzáadásával készül. A mintát úgy kell feldúsítani, hogy a VTG koncentrációja elérje a kontrollcsoportban lévő hím halakban várható vitellogeninszint 10–100-szorosát. A kontrollhím vérplazmájából vett dúsítandó minta származhat egyetlen halból vagy lehet több halból származó kompozit minta is.

A kontrollhímből vett vérplazma nem dúsított részmintáját legalább két lyukban analizálni kell. A dúsított mintát is legalább két lyukban kell analizálni. A várható koncentráció meghatározásához a VTG-nek a kontrollhím vérplazmájából vett két nem dúsított mintában mért átlagos mennyiségét hozzá kell adni a dúsított mintákhoz adott VTG számított mennyiségéhez. E várható koncentrációnak a mért koncentrációhoz viszonyított arányát az adott napon elvégzett valamennyi vizsgálat eredményeivel együtt jegyzőkönyvezni kell.

---

8. függelék

DÖNTÉSI FOLYAMATÁBRA A STATISZTIKAI ELEMZÉSI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSÁHOZ

C.49.    A halembriók akut toxicitási vizsgálata

BEVEZETÉS

A VIZSGÁLAT ELVE

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Felszerelés

Vizsgálati kamrák

A vízre és a vizsgálatra vonatkozó körülmények

Vizsgálati oldatok

A tenyészhalak tartása

Jártassági vizsgálat

Peteképződés

Peték differenciálódása

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

Az expozíció körülményei

Vizsgálati koncentrációk

Kontrollcsoportok

Az expozíció kezdete és a vizsgálat időtartama

A peték elosztása a 24 lyukú lemezek között

Megfigyelések

Analitikai mérések

HATÁRÉRTÉK-VIZSGÁLAT

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Eredmények feldolgozása

Vizsgálati jegyzőkönyv

SZAKIRODALOM

http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:HU:PDF

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Apikális végpont : populációszintű hatás előidézése.

Blastula : az animalis pólus körüli sejtképződés, amely a szik egy részét is lefedi.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Epibólia : elsődlegesen epidermalis sejtek erőteljes elterjedése az embrió gastrula állapotában, és a háti szakaszról a hasi szakaszra vándorlása, amelynek eredményeként az entrodermális sejtrétegek betüremkedéshez hasonló folyamattal internalizálódnak és az embrió körülöleli a szikanyagot.

Átfolyásos vizsgálat : az expozíció során a vizsgálati oldat vizsgálati rendszeren történő folyamatos áramlása mellett folytatott vizsgálat.

Lemez belső kontrollja : olyan belső kontroll, amelyben a 24 lyukú lemezen 4 lyukat hígítóvízzel töltenek meg, hogy azonosítsák a lemezek gyártó általi vagy az eljárás során a kutató általi lehetséges szennyezését, illetve a lemezből eredő azon hatásokat, amelyek esetleg befolyásolhatják a vizsgálat eredményét (pl. hőmérséklet gradiens).

IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry (Elméleti és Alkalmazott Kémia Nemzetközi Uniója).

A halak tartására szolgáló víz : az a víz, amelyben a felnőtt halakat tartják.

Medián letális koncentráció (LC50) : a vizsgálati vegyi anyag azon koncentrációja, amely a becslések szerint a vizsgálat időtartama alatt a vizsgálati szervezetek 50 %-ára nézve halálos.

Félstatikus oldatcserés vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynél rendszeresen, meghatározott időszakonként (pl. 24 óránként) ki kell cserélni a vizsgálati oldatokat.

SMILES : Simplified Molecular Input Line Entry Specification (molekulák egyszerűsített egy sorban történő beviteli rendszere).

Szomita : a gerinces embriók fejlődése során az őscsigolyák (szomiták) a mezoderma oldalirányú, a velőcső körüli rendeződései, amelyekből adott estben kifejlődik a kötőszövet (dermatoma), a vázizomzat (miotoma) és a csigolyák (szklerotoma).

Statikus vizsgálat : olyan vizsgálat, amelyben az oldatok mindvégig változatlanok maradnak a vizsgálat során.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

UVCB-k : ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

---

2. függelék

A ZEBRADÁNIÓEMBRIÓVAL FOLYTATOTT AKUT TOXICITÁSI VIZSGÁLATOKRA VONATKOZÓ TARTÁSI, TENYÉSZTÉSI ÉS TIPIKUS KÖRÜLMÉNYEK

---

3. függelék

A ZEBRADÁNIÓK RENDES FEJLŐDÉSE 26 °C-ON

1. ábra: A zebradánió (Danio rerio) korai fejlődésének kiválasztott szakaszai: A megtermékenyítést követő 0,2 – 1,75 óra (forrás: Kimmel et al., 1995 (35)). A szokásos fejlődés időrendjét lehet alapul venni a megtermékenyülés és a peték életképességének megállapításához (lásd a 26. pontot: A megtermékenyített peték kiválasztása).

2. ábra: A zebradánió (Danio rerio) késői fejlődésének kiválasztott szakaszai (chorion nélküli embriók a láthatóság optimalizálása érdekében): A megtermékenyítést követő 22 – 48 óra (forrás: Kimmel et al., 1995 (35)).

3. ábra: A zebradánió (Danio rerio) embrióinak rendes fejlődése: (1) 0,75 óra, kétsejtes szakasz; (2) 1 óra, négysejtes szakasz; (3) 1,2 óra, nyolcsejtes szakasz (4) 1,5 óra, 16 sejtes szakasz; (5) 4,7 óra, az epibólia kezdete; (6) 5,3 óra, megközelítőleg 50 %-os epibólia (forrás: Braunbeck & Lammer 2006 (40)).

---

4. függelék

1. ábra

A 24 lyukú lemez kialakítása

1–5

=

öt vizsgálati koncentráció / vegyi anyag;

nC

=

negatív kontroll (hígítóvíz);

iC

=

lemez belső kontrollja (hígítóvíz);

pC

=

pozitív kontroll (3,4-DCA 4mg/l);

sC

=

oldószeres kontroll

2. ábra

A zebradánióembrióval folytatott akut toxicitási vizsgálat folyamatábrája (balról jobbra): peték termelődése, a peték begyűjtése, előzetes expozíció a megtermékenyítés után azonnal, üvegedényekben; a megtermékenyített peték kiválasztása inverz mikroszkóppal vagy binokuláris mikroszkóppal, továbbá a megtermékenyített peték megfelelő vizsgálati koncentrációkat/kontrolloldatokat tartalmazó 24 lyukú lemezekbe történő kiosztása, n=a vizsgálati koncentrációnként/kontrollonként szükséges peték száma (itt 20), hpf = a megtermékenyítést követően eltelt órák.

---

5. függelék

A ZEBRADÁNIÓEMBRIÓVAL FOLYTATOTT AKUT TOXICITÁSI VIZSGÁLAT LETÁLIS VÉGPONTJAINAK ATLASZA

A következő apikus végpontok akut toxicitásra, és ennélfogva az embriók elhullására utalnak: az embrió koagulációja, a farok elválásának elmaradása, az őscsigolyák képződésének elmaradása és a szívverés hiánya. E végpontok illusztrálására az alábbi mikrofelvételek szolgálnak:

1. ábra

Az embrió koagulációja

Erős fényű helyszíni megvilágítás mellett a koagulált zebradánióembriók változatos átlátszatlan zárványokat mutatnak.

2. ábra

Őscsigolya kialakulásának elmaradása

Jóllehet a fejlődése megközelítőleg 10 órával elmaradott, a 24 órás zebradánióembrió az a) ábrán jól kifejlett szomitákat mutat (→), míg a b) ábrán látható embriónál nem tapasztalhatók szomitaképződésre utaló jelek (→). Jóllehet a szikzacskó kifejezetten ödémás (*), a 48 órás zebradánióembrió a c) ábrán jól kifejlett szomitákat mutat (→), míg a d) ábrán látható 96 órás embriónál nem tapasztalhatók szomitaképződésre utaló jelek (→). Meg kell jegyezni, hogy a d) ábrán szereplő embrió esetében gerincferdülés (scoliosis) és perikardiális ödéma (*) látható.

3. ábra

A farokbimbó elválásának elmaradása oldalnézetből

(a: →; 96 órás zebradánióembrió). Megfigyelhető a szemhólyagok hiánya is (*).

4. ábra

A szívverés hiányát

A szívverés hiányát – jellegéből adódóan – nehéz mikrofelvételen megjeleníteni. A szívverés hiányát a szív összehúzódásának elmaradása jelöli (kettős nyíl). A vérsejtek mozdulatlansága pl. az aorta abdominalisban (→ a kis képen) nem a szívverés hiányára utal. Megjegyzendő a szomitaképződés hiánya is ennél az embriónál (*az izomszövetek homogén és nem szegmentált megjelenése). A szívverés hiányának megfigyelésére irányadó idő legalább egy perc, minimum 80-szoros nagyítás mellett.

C.50.    Myriophyllum spicatummal végzett üledékmentes toxicitási vizsgálat

BEVEZETÉS

A VIZSGÁLAT ELVE

A VIZSGÁLATI VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

REFERENCIA-VEGYIANYAG

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Felszerelés

Vizsgálati szervezet

Tenyésztés

Vizsgálati közeg

Vizsgálati oldatok

Vizsgálati csoportok és kontrollcsoportok

Expozíció

Vizsgálati körülmények

Időtartam

Mérések és analitikai meghatározások

i.	Az oldalágak teljes hossza : Az oldalágak hosszát úgy lehet meghatározni, hogy az összes oldalágat vonalzóval lemérik az expozíció végén. Az oldalágak teljes hossza az egyes vizsgálati és kontrolledényekben található összes oldalág hosszának összege.

ii.	A hajtások teljes hossza : A fő hajtás hosszát képelemzéssel vagy vonalzó segítségével lehet megállapítani. A hajtások teljes hossza az egyes vizsgálati és kontrolledényekben található oldalágak teljes hosszának és a fő hajtás hosszának összege az expozíció végén.

iii.	A gyökerek teljes hossza : A gyökér hosszát úgy lehet meghatározni, hogy az összes gyökeret vonalzóval lemérik az expozíció végén. A gyökerek teljes hossza az egyes vizsgálati és kontrolledényekben található összes gyökér összege.

iv.

Nedves tömeg : A nedves tömeget úgy lehet meghatározni, hogy a vizsgálati szervezetek tömegét megmérik az expozíció végén. Az egyes vizsgálati és kontrolledényekben található valamennyi növényanyagot desztillált vízzel le kell öblíteni és cellulózpapírral szárazra kell itatni. Ezen előkészületeket követően a nedves tömeget méréssel határozzák meg. A kezdeti élőanyag-tömeget (nedves tömeg) a vizsgálati edények beoltásához használt tételből származó vizsgálati szervezetekből vett minta alapján kell meghatározni.

v.

Száraz tömeg : A nedves tömeg meghatározásának előkészületeit követően a vizsgálati szervezeteket 60 °C-on állandó tömegűre kell szárítani. Ez a tömeg a száraz tömeg. A kezdeti élőanyag-tömeget (száraz tömeg) a vizsgálati edények beoltásához használt tételből származó vizsgálati szervezetekből vett minta alapján kell meghatározni.

vi.	Örvök száma : A fő hajtás mentén valamennyi örvöt meg kell számlálni.

A mérések és az analitikai meghatározások gyakorisága

Határérték-vizsgálat

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Hatásváltozók

a)

Átlagos fajlagos növekedési sebesség : Ezt a hatásváltozót a fő hajtás hossza logaritmusának, valamint más további mért paraméterek (a hajtások teljes hossza, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg, az örvök száma) logaritmusának időbeli (napi) változása alapján kell kiszámítani a kontroll- és az egyes kezelt csoportokban. Megjegyzés: Az oldalágak teljes hossza és a gyökerek teljes hossza mérési paraméterek tekintetében nem számítható átlagos fajlagos növekedési sebesség. A vizsgálat elején a vizsgálati szervezetnek nincs oldalága és gyökérzete (az előkultúrából származó preparátum alapján); a nulla értékről kiindulva az átlagos fajlagos növekedési sebességet nem határozzák meg.

b)

Hozam : Ezt a hatásváltozót a fő hajtás hossza, valamint más további mért paramétereknek (azaz lehetőség szerint a hajtások teljes hosszának, a nedves tömegnek, a száraz tömegnek vagy az örvök számának) a kontroll- és az egyes kezelt csoportokban a vizsgálat végéig bekövetkező változása alapján kell kiszámítani.

Átlagos fajlagos növekedési sebesség

ahol:

μi-j : az átlagos fajlagos növekedési sebesség az „i”-től a „j” időpillanatig
Ni : a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolledényben az „i” időpillanatban
Nj : a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolledényben a „j” időpillanatban
t : az „i”-től „j”-ig terjedő időtartam.

Minden kezelt és kontrollcsoportra ki kell számítani egy átlagot a növekedési sebességre, valamint meg kell becsülni a szórásnégyzetet.

ahol:

% Ir : átlagos fajlagos növekedési sebesség százalékos gátlása
μC : a μ átlaga a kontrollban
μT : a μ átlaga a kezelt csoportban

Hozam

ahol:

% Iy : a hozam százalékos csökkenése
bC : az élőanyag-tömeg végső értéke és kiindulási értéke közötti különbség a kontrollcsoportban
bT : az élőanyag-tömeg végső értéke és kiindulási értéke közötti különbség a kezelt csoportban.

Megkettőződési idő

Td = ln 2/μ

Ahol μ az 50–52. pontban leírtak szerint meghatározott átlagos fajlagos növekedési sebesség.

A koncentráció–hatás görbék elkészítése

Az ECx becslése

Statisztikai eljárások

Jegyzőkönyvezés

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Élőanyagtömeg (biomassza) : a populációban jelen lévő élő anyag nedves és/vagy száraz tömege. Ebben a vizsgálatban az élőanyagtömeg a fő hajtás, az összes oldalág és az összes gyökér összege.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Klorózis : a vizsgálathoz felhasznált szervezet, különösen az örvök színének zöldről sárgásra történő változása.

ECx : a vizsgálati közegben oldott vizsgálati vegyi anyag azon koncentrációja, amely meghatározott expozíciós időszak alatt x %-os (pl. 50 %-os) csökkenést okoz a Myriophyllum spicatum növekedésében (ha eltér a teljes vagy szokásos vizsgálati időtartamtól, értékét külön meg kell adni). Annak egyértelmű jelzésére, hogy az EC-érték a növekedési sebesség vagy a hozam alapján került-e meghatározásra, növekedési sebesség esetén „ErC”, hozam esetén pedig „EyC” jelölést kell használni, majd ezt követően meg kell adni a mérési változót, például: ErC (a fő hajtás hossza).

Növekedés : a mérési változóknak, pl. a fő hajtás hosszának, az oldalágak teljes hosszának, a hajtások teljes hosszának, a gyökerek teljes hosszának, a nedves tömegnek, a száraz tömegnek vagy az örvök számának a növekedése a vizsgálati időszakra tekintve.

Növekedési sebesség (átlagos fajlagos növekedési sebesség) : a mérési változó logaritmikus növekedése az expozíciós idő alatt. Megjegyzés: A növekedési sebességgel összefüggő hatásváltozók függetlenek a vizsgálat időtartamától mindaddig, amíg az expozícióval nem érintett kontrollszervezetek növekedési mintázata exponenciális.

Megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (LOEC) : az a legalacsonyabb vizsgált koncentráció, amely mellett adott expozíciós idő alatt a vegyi anyag statisztikailag szignifikáns mértékben (p < 0,05) csökkenti a növekedésre kifejtett hatást a kontrolltenyészethez képest. Azonban az LOEC-szint feletti valamennyi vizsgálati koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább egyenlő az LOEC-szinten megfigyelttel vagy súlyosabb annál. Amennyiben e két feltétel nem teljesíthető, akkor kimerítő magyarázatot kell adni arra, hogy hogyan történt az LOEC (és ennélfogva az NOEC) kiválasztása.

Mérési változók : a vizsgálat végpontjának egy vagy több különböző hatásváltozó segítségével történő kifejezése érdekében mért valamennyi változó. Ebben a vizsgálati módszerben a mérési változók a fő hajtás hossza, az oldalágak teljes hossza, a hajtások teljes hossza, a gyökerek teljes hossza, a nedves tömeg, a száraz tömeg és az örvök száma.

Monokultúra : egyetlen növényfajból álló tenyészet.

Nekrózis : a vizsgálati szervezet elhalt (például fehér vagy sötétbarna) szövete.

Megfigyelhető hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : az a vizsgálati koncentráció, amely közvetlenül az LOEC alatt helyezkedik el.

Hatásváltozó : a toxikus hatás becslésére használt, az élőanyagtömeg leírására szolgáló bármely mért változóból különböző számítási módszerekkel levezethető változó. Ebben a vizsgálati módszerben hatásváltozó a növekedési sebesség és a hozam, amelyeket a fő hajtás hosszából, a hajtások teljes hosszából, a nedves tömegből, a száraz tömegből vagy az örvök számából mint mérési változókból származtatnak.

Félstatikus (oldatcserés) vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati oldatot bizonyos időközönként lecserélik.

Statikus vizsgálat : olyan vizsgálati módszer, amelynek során a vizsgálati oldatot nem cserélik le.

Vizsgálati vegyi anyag : e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

A vizsgálat végpontja : az az általános tényező, amelyre a vizsgálat irányul, és amely a vizsgálati vegyi anyag hatására a kontrolltenyészethez képest megváltozik. Ebben a vizsgálati módszerben a vizsgálat végpontja a növekedésgátlás, amely különböző, egy vagy több mérési változóból származtatott hatásváltozók segítségével fejezhető ki.

Vizsgálati közeg : az a teljes, szintetikus tápoldat, amelyben a vizsgálati növények a vizsgálati vegyi anyag jelenlétében növekednek. A vizsgálati vegyi anyag általában oldott formában van jelen a vizsgálati közegben.

UVCB-k : ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

Hozam : az élőanyagtömeget leíró mérési változó értéke az expozíciós idő végén, mínusz ugyanezen változó értéke az expozíciós idő kezdetén. Megjegyzés: ha az expozícióval nem érintett szervezetek növekedési mintázata exponenciális, a hozam alapú hatásváltozók a vizsgálat előrehaladtával csökkennek.

---

2. függelék

MÓDOSÍTOTT ANDREWS-FÉLE KÖZEG TÖRZSTENYÉSZETHEZ ÉS ELŐKULTÚRÁHOZ

A törzstenyészethez és előkultúrához szükséges módosított Andrews-féle közeget öt külön elkészített tápanyag-törzsoldatból kell elkészíteni 3 % szacharóz hozzáadásával.

A törzsoldatok 6 hónapig tárolhatók hűtőszekrényben (5–10 °C-on). Csak az 5. sz. törzsoldatnak kisebb az eltarthatósági ideje (két hónap).

A 3.1. törzsoldat (2. táblázat) elkészítését követően mélyfagyasztani kell ezt az oldatot, megközelítőleg 11 ml-es alikvotokban (legalább – 18 °C-on). A mélyfagyasztott adagok öt évig tarthatók el.

A 3. törzsoldat elkészítéséhez ki kell olvasztani a 3.1. törzsoldatot, abból 10 ml-t 1 l -es mérőlombikba kell tölteni, és ultratiszta vizet kell hozzáadni a lombik jelzéséig.

A módosított Andrews-féle közeg előállításához 2 500 ml ultratiszta vizet kell tölteni egy 5 l-es mérőlombikba. Az egyes törzsoldatokból 50 ml hozzáadását követően a mérőlombikot fel kell tölteni 90 %-ra ultratiszta vízzel, a pH-t pedig 5,8-re kell beállítani.

Ezt követően 150 g oldott szacharózt kell hozzáadni (3 % 5 l-re); majd a mérőlombikot a jelölésig fel kell tölteni ultratiszta vízzel. Végül a tápoldatot 1 l-es Schott-lombikba kell tölteni, és autoklávban 121 °C-on 20 percig kell kezelni.

Az így nyert tápoldat hűtőszekrényben (5–10 °C-on) három hónapig sterilen tartható.

Módosított Andrews-féle közeg az üledékmentes toxicitási vizsgálathoz

Az 1. és 2. táblázatban említett öt tápanyag-törzsoldatból tízszeres koncentrációjú, a vizsgálati oldathoz szükséges, módosított Andrews-féle közeg készül, 30 % szacharóz hozzáadásával. Ehhez 100 ml ultratiszta vizet kell tölteni 1 l-es mérőlombikba. Az egyes törzsoldatokból 100 ml hozzáadását követően a pH-t 5,8-ra kell beállítani. Ezt követően 30 % oldott szacharózt kell hozzáadni (300 g-ot 1 000  ml-re); majd a mérőlombikot a jelölésig fel kell tölteni ultratiszta vízzel.

Végül a tápoldatot 0,5 l-es Schott-lombikba kell tölteni, és autoklávban 121 °C-on 20 percig kell kezelni.

Az így nyert tízszeres koncentrációjú tápoldat hűtőszekrényben (5–10 °C-on) három hónapig sterilen tartható.

---

3. függelék

A TÖRZSTENYÉSZETEK TARTÁSA

Ez a 3. függelék a Myriophyllum spicatum L ( 57 ), a süllőhínárok családjába tartozó, víz alatt növekedő kétszikű növény törzstenyészetét ismerteti. Június és augusztus között nem feltűnő, rózsaszín/fehér virágok törnek a vízfelszínre. A növények erős rizómarendszerrel a talajban gyökereznek, és a teljes északi féltekén megtalálhatók tápanyagban gazdag, ugyanakkor nem szennyezett és magas mésztartalmú állóvizekben, sáros táptalajban. A Myriophyllum spicatum az édesvizet kedveli, de brakkvízben is megél.

A laboratóriumi körülmények között használt üledékmentes törzstenyészethez steril növényekre van szükség. Steril növények beszerezhetők a német Umweltbundesamt (Németország Szövetségi Környezetvédelmi Ügynöksége) ökotoxikológiai laboratóriumából.

Vagylagosan a vizsgálati szervezetek nem steril növényekből is elkészíthetők az E 1913-04 ASTM-megjelöléssel összhangban. Lásd alább az ASTM-szabvány kivonatát, a terepről begyűjtött Myriophyllum sibiricum tenyésztési eljárására vonatkozóan:

„Ha a kiindulópont terepről begyűjtött, nem steril növény, a M. sibiricum sarjhajtásait ősszel kell begyűjteni. A sarjhajtásokat kvarchomokkal vagy pl. Turface®-szel fedett, 5 cm steril üledéket és 18 l reagens vizet tartalmazó 20 l-es akváriumba kell helyezni. Az akváriumot szellőztetni kell, továbbá 15 °C hőmérsékletet és naponta 16 órában 200–300 μmol m–2 s–1 fluxussűrűséget kell fenntartani. Az akváriumban található növénytenyészet háttérforrásként alkalmazható, ha a steril növénytenyészetek a növesztőfülke mechanikus meghibásodása vagy szennyezés miatt, illetve egyéb okból tönkremennek. Az akváriumban tenyésztett növények nem sterilek, a steril kultúrák pedig nem tarthatók megszakított tenyésztési rendszerben. A tenyészet sterilizálásához a növényeket ki kell venni az akváriumból, körülbelül fél órán keresztül ioncserélt folyóvízzel át kell öblíteni. Csíramentes környezetben, lamináris áramlású fülkében a növényeket kevesebb, mint 20 percig fertőtleníteni kell (amíg a növényszövet nagy része ki nem fehéredik és csak a rügy zöld) 3 %-os (térfogatszázalék), 0,01 % megfelelő felületaktív anyagot tartalmazó nátrium-hipoklorit oldatban. A fertőtlenítőszert és a növényi anyagot el kell keverni. A több nódusszal rendelkező szegmenseket 45 ml sterilizált, módosított Andrews-féle közeget tartalmazó steril tenyésztőcsövekbe kell áthelyezni, a csöveket egyszerű tenyésztőcső-kupakkal kell lezárni. Az egyes vizsgálati kamrákba csak egy növényi szegmens helyezhető be. A tenyésztőedény lezárását laboratóriumi tömítőfólia biztosítja. Amint a steril tenyészet elkészült, a több nóduszt tartalmazó növényi szegmenst 10–12 naponta friss, folyékony táptalajt tartalmazó új vizsgálati kamrákba kell áthelyezni. Az agarlemezen történő tenyésztésnél bemutatottak szerint a növényeknek sterilnek kell lenniük és maradniuk a vizsgálat megkezdése előtt nyolc héten át.”

Mivel a módosított Andrews-féle közeg szacharózt tartalmaz (amely kedvez a gombák és baktériumok növekedésének), valamennyi anyagot, oldatot steril körülmények között kell elkészíteni, és a tenyésztést is így kell elvégezni. Valamennyi folyadékot és berendezést a használat előtt sterilizálni kell. A sterilizációt 4 órás hőkezeléssel (210 °C) kell elvégezni, vagy autoklávval 121 °C-on 20 percig. Emellett minden lombikot, edényt, tálat stb. és egyéb eszközt lángkezelésnek kell alávetni közvetlenül a használat előtt steril munkaasztalon.

A törzstenyészetek csökkentett megvilágítás mellett alacsony hőmérsékleteken (50 μE m–2 s–1, 20 ± 2 °C) hosszabb ideig újbóli elkészítés nélkül is fenntarthatók. A Myriophyllum tápoldatának meg kell egyeznie a vizsgálatok során alkalmazottal, de a törzstenyészetek más, tápanyagokban gazdag közegben is tarthatók.

A növényi szegmenseket steril körülmények között több 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban és/vagy 2 000 ml-es Fernbach-lombikban kell elosztani, amelyet megközelítőleg 450 ml, illetve 1 000 ml módosított Andrews-féle közeggel kell feltölteni. Ezt követően a lombikokat cellulóz dugóval steril körülmények között le kell dugaszolni.

Emellett teljes mértékben szükség van az eszközök steril munkaasztalon történő lángkezelésére közvetlenül a használat előtt. A számtól és a mérettől függően a növényeket friss tápoldatba kell áthelyezni megközelítőleg háromhetente.

E megújított tenyésztéshez a csúcs, illetve a szár középső részének szegmensei is használhatók. Az áthelyezett növények (vagy növényi szegmensek) száma és mérete attól függ, hogy mennyi növényre van szükség. Például áthelyezhető öt, 5 cm-es hajtásszegmens egy Fernbach-lombikba és három, szintén 5 cm-es hajtásszegmens egy Erlenmeyer-lombikba. A gyökeres, virágos, elhalt vagy egyébként a többitől eltérő részeket el kell dobni.

1. ábra

A növények feldarabolása a törzstenyészethez és az előkultúrához három hétig tartó tenyésztés után.

A növények tenyésztését 500 ml-es Erlenmeyer- és 2 000  ml-es Fernbach-lombikban kell elvégezni hűtött inkubátorban, 20 ± 2 °C-on megközelítőleg 100–150 μE m–2 s–1 vagy 6 000 –9 000  lux megvilágítás mellett („melegfehér” színhőmérsékletű kamrai megvilágítással).

2. ábra

Növények tenyésztése hűtő inkubátorban kamrai megvilágítással.

Kémiailag tiszta (savval lemosott) és steril üveg tenyésztőedényeket kell alkalmazni, a kezelés során csíramentes körülményeket biztosítva. A törzstenyészet pl. algával, gombával és/vagy baktériummal történő szennyeződése esetén új tenyészetet kell készíteni, vagy más laboratóriumból származó törzstenyészetet kell használni az adott tenyészet cseréjére.

---

4. függelék

AZ ELŐKULTÚRA TARTÁSA ÉS A VIZSGÁLATI SZERVEZET ELŐKÉSZÍTÉSE VIZSGÁLATRA

Az előkultúrához a törzstenyészet hajtásait két örvöt tartalmazó szegmensekre kell vágni; a szegmenseket módosított (3 % szacharózt tartalmazó) Andrews-féle közeggel feltöltött Fernbach-lombikba kell helyezni. Az egyes lombikok legfeljebb 50 hajtásszegmenst tartalmazhatnak. Gondoskodni kell ugyanakkor arról, hogy a szegmensek élő részek legyenek, ne legyen sem gyökerük, sem oldaláguk, sem bimbójuk (lásd a 3. függelék 1. ábráját).

Az előkultúra szervezeteit 14–21 napon át kell tenyészteni steril körülmények között, olyan környezeti kamrában, ahol a világos/sötét fázisok 16/8 órás periódusokban váltakoznak. A fényerősséget a 100–150 μE m–2 s–1 tartományban kell megválasztani. A vizsgálati edényekben a hőmérséklet 23 ± 2 °C legyen.

Mivel a módosított Andrews-féle közeg szacharózt tartalmaz (amely kedvez az algák, a gombák és a baktériumok növekedésének), a vizsgálati vegyi anyagok oldatait steril körülmények között kell elkészíteni, és a tenyésztést is így kell elvégezni. Valamennyi folyadékot és berendezést a használat előtt sterilizálni kell. A sterilizációt 4 órás hőkezeléssel (210 °C) kell elvégezni, vagy autoklávval 121 °C-on 20 percig. Emellett minden lombikot, edényt, tálat stb. és egyéb eszközt lángkezelésnek kell alávetni közvetlenül a használat előtt steril munkaasztalon.

A hajtásokat steril körülmények között el kell távolítani az előkultúrára szolgáló lombikból, a lehető leghomogénebb anyagot választva. Az egyes vizsgálatokhoz legalább 60 vizsgálati szervezet szükséges (a vizsgálati vegyi anyag nyolc koncentrációja melletti vizsgálat esetén). A vizsgálathoz az előkultúrák friss oldalágait kell kiválasztani, azokat a tőtől 2,5 cm-re le kell vágni (ezt vonalzóval kell mérni), majd át kell helyezni steril módosított Andrews-féle közeget tartalmazó főzőpohárba. Ezeket a friss oldalágakat fel lehet használni az üledékmentes Myriophyllum spicatummal végzett toxicitási vizsgálathoz.

2. ábra

Az előkultúrából származó növények feldarabolása az üledékmentes Myriophyllum spicatummal végzett toxicitási vizsgálathoz.

C.51.    Myriophyllum spicatummal végzett víz–üledék rendszerű toxicitási vizsgálat

BEVEZETÉS

A VIZSGÁLAT ELVE

A VIZSGÁLATI VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

REFERENCIA-VEGYIANYAG

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Vizsgálati felszerelés

Vizsgálati szervezet

A vizsgálati szervezet tenyésztése

Üledék

Vizsgálati közeg

Kísérleti terv

A vizsgálati vegyi anyag koncentrációi és kontrollcsoportok

Határérték-vizsgálat

Vizsgálati oldatok

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

Telepítési fázis

Egységes növényanyag megválasztása

Vizes fázisú expozíció

Üledék útján végzett expozíció

A vízszint fenntartása a vizsgálat alatt

Vizsgálati körülmények

A vizsgálat időtartama

Mérések és analitikai meghatározások

A mérések és az analitikai meghatározások gyakorisága

A vizsgálati vegyi anyag analitikai mérései

AZ ADATOK ÉRTÉKELÉSE

Hatásváltozók

Átlagos fajlagos növekedési sebesség

ahol:

μi-j

:

az átlagos fajlagos növekedési sebesség az „i”-től a „j” időpillanatig

Ni

:

a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolledényben az „i” időpillanatban

Nj

:

a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolledényben a „j” időpillanatban

t

:

az „i”-től „j”-ig terjedő időtartam.

ahol:

% Ir

:

az átlagos fajlagos növekedési sebesség százalékos gátlása

μC

:

a μ átlaga a kontrollban

μT

:

a μ átlaga a kezelt csoportban

Hozam

ahol:

% Iy

:

a hozam százalékos csökkenése

bC

:

az élőanyag-tömeg végső értéke és kiindulási értéke közötti különbség a kontrollcsoportban

bT

:

az élőanyag-tömeg végső értéke és kiindulási értéke közötti különbség a kezelt csoportban.

A koncentráció–hatás görbék elkészítése

ECx becslése

Statisztikai eljárások

JELENTÉSTÉTEL

SZAKIRODALOM

---

1. függelék

A SMART- ÉS A BARKO-FÉLE KÖZEG ÖSSZETÉTELE

---

2. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Élőanyag-tömeg : a populációban lévő élő anyag nedves és/vagy száraz tömege. Ebben a vizsgálatban az élőanyag-tömeg a fő hajtás, az összes oldalág és az összes gyökér összege.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Klorózis : a vizsgálati szervezet, különösen az örvök színének zöldről sárgásra történő változása.

ECx : a vizsgálati közegben oldott vizsgálati vegyi anyag azon koncentrációja, amely x % (pl. 50 %) csökkenést okoz a Myriophyllum spicatum növekedésében meghatározott expozíciós időszak alatt (kifejezetten ki kell térni rá, ha eltér a teljes vagy szokásos vizsgálati időtartamtól). Ahhoz, hogy egyértelmű legyen, hogy az EC értékét a növekedési sebességből vagy a hozamból nyerték-e, növekedési sebesség esetén „ErC”-t, hozam esetén „EyC”-t kell írni, majd ezt követően meg kell adni a mérési változót, például: ErC (a fő hajtás hossza).

Növekedés : a mérési változóknak, pl. a fő hajtás hosszának, az oldalágak teljes hosszának, a hajtások teljes hosszának, a gyökerek teljes hosszának, a nedves tömegnek, a száraz tömegnek vagy az örvök számának a növekedése a vizsgálati időszakban.

Növekedési sebesség (átlagos fajlagos növekedési sebesség) : a mérési változó logaritmikus növekedése az expozíciós idő alatt. Megjegyzés: a növekedési sebességgel összefüggő hatásváltozók függetlenek a vizsgálat időtartamától mindaddig, amíg az expozícióval nem érintett kontrollszervezetek növekedési mintázata exponenciális.

Megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (LOEC) : az a legalacsonyabb vizsgált koncentráció, amely mellett adott expozíciós idő alatt a vegyi anyag statisztikailag szignifikáns mértékben (p < 0,05) csökkenti a növekedésre kifejtett hatást a kontrolltenyészethez képest. Azonban az LOEC-szint feletti valamennyi vizsgálati koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább egyenlő az LOEC-szinten megfigyelttel vagy súlyosabb annál. Amennyiben e két feltétel nem teljesíthető, akkor kimerítő magyarázatot kell adni arra, hogy hogyan történt az LOEC (és ennélfogva az NOEC) kiválasztása.

Mérési változók : minden olyan változó, amelyet a vizsgálat végpontjának egy vagy több különböző hatásváltozó segítségével történő kifejezése érdekében mérnek. Ebben a vizsgálati módszerben a mérési változók a fő hajtás hossza, az oldalágak teljes hossza, a hajtások teljes hossza, a gyökerek teljes hossza, a nedves tömeg, a száraz tömeg és az örvök száma.

Monokultúra : egyetlen növényfajból álló tenyészet.

Nekrózis : a vizsgálati szervezet elhalt (például fehér vagy sötétbarna) szövete.

Megfigyelhető hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : az a vizsgálati koncentráció, amely közvetlenül az LOEC alatt helyezkedik el.

Hatásváltozó : a toxikus hatás becslésére használt változó, amely különböző számítási módokkal az élőanyag-tömeg leírására szolgáló bármelyik mért változóból levezethető. Ebben a vizsgálati módszerben hatásváltozó a növekedési sebesség és a hozam, amelyeket a fő hajtás hosszából, a hajtások teljes hosszából, a nedves tömegből, a száraz tömegből vagy az örvök számából, mint mérési változókból származtatnak.

Félstatikus (oldatcserés) vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati oldatot bizonyos időközönként lecserélik.

Statikus vizsgálat : olyan vizsgálati módszer, amelynek során a vizsgálati oldatot nem cserélik le.

Vizsgálati vegyi anyag : e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

A vizsgálat végpontja : az az általános tényező, amelyre a vizsgálat irányul, és amely a vizsgálati vegyi anyag hatására a kontrolltenyészethez képest megváltozik. Ebben a vizsgálati módszerben a vizsgálat végpontja a növekedésgátlás, amely különböző, egy vagy több mérési változóból származtatott hatásváltozók segítségével fejezhető ki.

Vizsgálati közeg : az a teljes, szintetikus tápoldat, amelyben a vizsgálati növények a vizsgálati vegyi anyag jelenlétében növekednek. A vizsgálati vegyi anyag általában oldott formában van jelen a vizsgálati közegben.

UVCB-k : ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

Hozam : az élőanyag-tömeget leíró mérési változó értéke az expozíciós idő végén, mínusz ugyanezen változó értéke az expozíciós idő kezdetén. Megjegyzés: ha az expozícióval nem érintett szervezetek növekedési mintázata exponenciális, a hozam alapú hatásváltozók a vizsgálat előrehaladtával csökkennek.

”

---

( 1 ) Az Európai Parlament és a Tanács 2006. december 18-i 1907/2006/EK rendelete a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről. HL L 304., 2007.11.22., 1. o.

( 2 ) Az USA alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottsága.

( 3 ) A szemirritációnak a REACH szerinti átfogó vizsgálati stratégiájának alkalmazását lásd még az ECHA Útmutató az információs követelményekhez és a kémiai biztonsági értékeléshez című dokumentumának R.7a. fejezetében: Végpontokra vonatkozó útmutató: http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

( 4 ) Az általános lineáris modellekhez (General Linear Models; GLM) hasonló modellezési megközelítést alkalmazó statisztikusok az analízist ettől eltérő, de hasonló módon is megközelíthetik, azonban nem feltétlenül vezetik le a számítógépes korszak előtt kidolgozott statisztikaszámítás algoritmikus megközelítéseiig visszanyúló, hagyományos ANOVA-táblázatot.

( 5 ) Az általános lineáris modellekhez (General Linear Models; GLM) hasonló modellezési megközelítést alkalmazó statisztikusok az analízist ettől eltérő, de hasonló módon is megközelíthetik, azonban nem feltétlenül vezetik le a számítógépes korszak előtt kidolgozott statisztikaszámítás algoritmikus megközelítéseiig visszanyúló, hagyományos ANOVA-táblázatot.

( 6 ) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról (HL L 353., 2008.12.31., 1. o.).

( 7 ) A megadott méretek 12–60 hónapos tehenekhez használt szaruhártyatartókon alapulnak. 6–12 hónapos egyedek esetében a tartót úgy kell kialakítani, hogy mindkét kamra térfogata 4 ml, a belső kamrák átmérője 1,5 cm, mélysége pedig 2,2 cm legyen. Új típusú szaruhártyatartók esetében nagyon fontos, hogy a vizsgálati vegyi anyagnak kitett szaruhártya-felület és a hátsó karma térfogatának hányadosa megegyezzen a hagyományos szaruhártyatartó hasonló adatával. Ez azért szükséges, hogy az IVIS javasolt képletébe beírandó permeabilitásértékek helyesen legyenek meghatározva.

( 8 ) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról (HL L 353., 2008.12.31., 1. o.).

( 9 ) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról (HL L 353., 2008.12.31., 1. o.).

( 10 ) Átlag alatt a dokumentum egészében számtani átlag értendő.

( 11 ) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról (HL L 353., 2008.12.31., 1. o.).

( 12 ) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról (HL L 353., 2008.12.31., 1. o.).

( 13 ) Az általános lineáris modellekhez (General Linear Models; GLM) hasonló modellezési megközelítést alkalmazó statisztikusok az analízist ettől eltérő, de hasonló módon is megközelíthetik, azonban nem feltétlenül vezetik le a számítógépes korszak előtt kidolgozott statisztikaszámítás algoritmikus megközelítéseiig visszanyúló, hagyományos ANOVA-táblázatot.

( 14 ) A fogalommeghatározások és mértékegységek tekintetében lásd az 1. függeléket.

( 15 ) Néha P OW-vel is jelölik, amelyet az A.8. vizsgálati módszerben szereplő lombikrázásos módszerrel (4), az A.24. vizsgálati módszer szerinti HPLC-módszerrel (5) vagy az A.23. vizsgálati módszer szerinti lassú keveréses módszerrel (6) határoznak meg. A generátor-kolonna módszere alkalmanként használható a log KOW meghatározására. Korlátozott számú tanulmány áll rendelkezésre, amely ezen a technikán alapul, elsődlegesen a klórozott bifenilek és dibenzodioxinok esetében (pl. Li és Doucette, 1993) (3). Az esetlegesen ionizáló anyagok tekintetében a log K OW-nak a nem ionizált formára kell vonatkoznia.

( 16 ) A fogalommeghatározások és mértékegységek tekintetében lásd az 1. függeléket.

( 17 ) TLC: vékonyréteg-kromatográfia; HPLC: nagynyomású folyadékkromatográfia; GC: gázkromatográfia

( 18 ) Bizonyos szabályozói keretrendszerekben a metabolitok analízise adott feltételek teljesülése esetén kötelező lehet (vö. 65. pont).

( 19 ) Általában a vízben mért koncentrációnak a felvételi fázisban legalább egy nagyságrenddel a meghatározási határ felett kell lennie, hogy a vizsgálat tisztulási fázisában a test anyagterhelésének több mint egy felezési ideje mérhető legyen.

( 20 ) A fogalommeghatározások és mértékegységek tekintetében lásd az 1. függeléket.

( 21 ) A legtöbb vizsgálati anyag ideális esetben nem mutatható ki a kontrollvízben. A háttér-koncentráció csak természetes körülmények között előforduló anyagok (pl. egyes fémek), illetve olyan anyagok esetén lehet releváns, amelyek mindenütt megtalálhatók a környezetben.

( 22 ) Amennyiben az elsőrendű kinetika nyilvánvalóan nem teljesül, összetettebb modelleket kell használni (lásd az 5. függelék hivatkozásait), és biostatisztikus szakvéleményét kell kikérni.

( 23 ) A felvételt korlátozhatja az alacsony expozíciós koncentráció a biokoncentrációs vizsgálatban alkalmazott alacsony vízoldékonyság miatt, míg sokkal magasabb expozíciós koncentráció érhető el az étrendi vizsgálattal.

( 24 ) A több összetevőből álló anyagok, UVCB-k és keverékek esetében az egyes releváns összetevők vízoldékonyságát figyelembe kell venni a megfelelő expozíciós koncentrációk meghatározásához.

( 25 ) A TOC tartalmazza a részecskékből származó és az oldott szerves szenet is, azaz TOC = POC + DOC.

( 26 ) Jóllehet általánosságban nem ajánlott, oldószer vagy oldódást segítő anyag használata esetén az ezen anyagból származó szerves szenet hozzá kell adni a vizsgálati anyagból származó szerves szénhez, hogy értékelni lehessen a vizsgálati edényekben a szervesszén-koncentrációt.

( 27 ) Ha a lipidtartalmat nem ugyanabban a halban vizsgálják, mint a vizsgálati anyagot, a halaknak legalább hasonló tömegűnek és (ha releváns) azonos ivarúnak kell lenniük.

( 28 ) Ez az alternatíva csak arra az esetre érvényes, ha valamennyi vizsgálati csoportot hasonló méretű csoportokban tartanak, a halakat ugyanolyan mintázat szerint távolítják el és ugyanúgy etetik. Ez biztosítja, hogy a halak növekedése valamennyi vizsgálati csoportban hasonlóan alakuljon, ha a vizsgálati koncentráció elmarad a toxikus tartománytól. Hasonló növekedés esetén várhatóan a lipidtartalom is hasonló lesz. A kontroll eltérő növekedése az anyag hatását jelezheti és érvényteleníti a vizsgálatot.

( 29 ) A tömeg mellett a teljes hosszt is rögzíteni kell, mivel a vizsgálat során bekövetkezett hossznövekedés mértékének összehasonlítása megfelelően jelzi, hogy bekövetkezett-e káros hatás.

( 30 ) A növekedési sebességi állandókon t-próba végezhető annak vizsgálata érdekében, hogy a növekedés eltérő-e a kontroll- és a vizsgálati csoportok között, vagy F-próba végezhető a szóródás elemzése esetén. Szükség esetén F-próba vagy valószínűségi arány használható a megfelelő növekedési modell megválasztásához (54. OECD-monográfia, (32)).

( 31 ) E százalékos arányok feltételezik, hogy az analitikai módszer megbízható és a felezési idő kevesebb, mint 14 nap. Ha az analitikai módszer kevésbé megbízható, vagy ha a felezési idő (jóval) magasabb, e számok nagyobbak lesznek.

( 32 ) A minimalizált vizsgálat ténylegesen felhasználható gyors anyagcsere kimutatására, ha a gyors anyagcsere valószínűsége köztudott.

( 33 ) Ha csak két adatpontot mérnek, a BCFKm konfidenciahatárainak becslését bootstrap módszerekkel is el lehet végezni. Ha közbenső adatpontok is rendelkezésre állnak, a BCFKm konfidenciahatárait a teljes vizsgálathoz hasonlóan lehet kiszámítani.

( 34 ) A fogalommeghatározások és mértékegységek tekintetében lásd az 1. függeléket.

( 35 ) A vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK rendelet (HL L 396, 2006.12.30., 1. o.) alkalmazásában e kérdéssel a »Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment« című dokumentum R.7c., R.7.10.3.1. fejezete, R.7.10.4.1. fejezete, és R7.10-2. ábrája foglalkozik.

( 36 ) A legtöbb vizsgálati anyag ideális esetben nem mutatható ki a kontrollvízben. A háttér-koncentráció csak természetes körülmények között előforduló anyagok (pl. egyes fémek), illetve olyan anyagok esetén lehet releváns, amelyek mindenütt megtalálhatók a környezetben.

( 37 ) Ha a BMF-et egy anyag adott szervezetben mérhető koncentrációjának és a szervezet táplálékában mérhető koncentrációjának hányadosaként határozzák meg állandósult állapotban, a lipidtartalmat figyelembe kell venni azáltal, hogy a szervezet és a táp lipidtartalmára tekintettel kiigazítást végeznek, ezért ez pontosabban »korrekcióként« írható le. Ez a megközelítés eltér a szervezet előre megállapított lipidtartalmához viszonyított »normalizációtól«, amint arra a vízi expozíciós biokoncentrációs vizsgálatban sor kerül.

( 38 ) A teljes hosszt is rögzíteni kell a vizsgálat során, mivel megfelelően jelzi, hogy bekövetkezett-e káros hatás.

( 39 ) A HCB szerepel a Stockholmi Egyezmény A. és C. mellékletében, valamint a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló 850/2004/EK rendelet (HL L 158., 2004.4.30., 7. o.) I. és III. mellékletében.

( 40 ) A felvételi fázis során bekövetkezett gyors növekedés esetén a valódi etetési arány az expozíció elején beállított alá csökken.

( 41 ) Vízi expozíciós vizsgálatban a 14 napos felezési idő kb. 10 000 L/kg BCF-nek felel meg, 1 g-os halak és ennek megfelelő, mintegy 500 L/kg/d felvételi sebesség mellett (a Sijm és munkatársai féle egyenlet szerint (46)).

( 42 ) Mivel az aktuális belső koncentrációkat csak a vizsgálat végrehajtását követően lehet meghatározni, a várható belső koncentrációt becsülni kell (pl. a várható BMF és a tápban meglévő koncentráció alapján; vö. A5.8. egyenlet az 5. függelékben).

( 43 ) A vizsgálati anyag vizsgálati közegben való, a hal általi kiválasztásnak vagy a tápból való kioldódásnak köszönhető jelenléte nem küszöbölhető ki teljes mértékben. Ezért az egyik lehetőség az, hogy megmérik az anyag koncentrációját a vízben a felvételi időszak végén, különösen ha félstatikus kialakítást alkalmaznak, annak megállapítása érdekében, hogy sor kerülhetett-e vízi expozícióra.

( 44 ) Ez a megközelítés az étrendi vizsgálat sajátossága, amely eltér a vízi expozíció esetén követett eljárástól, ezért ebben az esetben az egyértelműség érdekében a korrekció szó használatos a normalizáció helyett – lásd még a (106) bekezdéshez tartozó lábjegyzetet.

( 45 ) A növekedési sebességi állandókon t-próba végezhető annak vizsgálata érdekében, hogy a növekedés eltérő-e a kontroll- és a vizsgálati csoportok között, vagy F-próba végezhető a szóródás elemzése esetén. Szükség esetén F-próba vagy valószínűségi arány használható a megfelelő növekedési modell megválasztásához (54. OECD-monográfia, (32)).

( 46 ) A táp fehérje-, lipid-, nyersrost- és hamutartalom tekintetében történő analízisére szolgáló módszer; ez az információ általában a táp beszállítójától szerezhető be.

( 47 ) Mint minden tapasztalati összefüggés esetében, itt is meg kell győződni arról, hogy a vizsgálati anyag az összefüggés alkalmazási körébe tartozik-e.

( 48 ) A halak felvételi fázis végén jellemző tömegét korábbi vizsgálati adatokból, vagy a vizsgálati faj vizsgálat kezdetére jellemző szokásos tömegéből kiinduló, egy tipikus (pl. 28 napos) felvételi fázis során valószínűsíthető méretnövekedésével kapcsolatos ismeretek alapján lehet megbecsülni.

( 49 ) A lineáris regressziót lehetővé tevő legtöbb programban megadják a becslések standard hibáit és konfidencia-intervallumait is, pl. a Microsoft Excelben az adatelemzési eszközcsomag használatával.

( 50 ) A lineáris regressziós módszerrel szemben e képlet alkalmazása nem ad standard hibát a k2 vonatkozásában.

( 51 ) A lineáris illesztési eljárással szemben e módszer általában nem ad standard hibát vagy konfidencia-intervallumot a becsült k1 vonatkozásában.

( 52 ) Meg kell jegyezni, hogy a k2 becslésének bizonytalanságát tulajdonképpen nem használják a bioakkumulációs modellben, ahol azt lényegében állandónak tekintik a k1 lépcsőzetes illesztési módszerbe történő beillesztésekor. Az eredményként adódó BCF-bizonytalanság ezért eltérő lesz az egyidejű és a lépcsőzetes illesztési módszerben.

( 53 ) A természetben a vízi környezetben a legnagyobb expozíciót előidéző út a felvétel a rendkívül víztaszító anyagok esetében, így a becsült BCF szorosan nem jeleníti meg az ilyen anyag bioakkumulációs potenciálját.

( 54 ) Más Daphnia-fajokat is fel lehet használni, feltéve, hogy azok kielégítik a megfelelő érvényességi kritériumokat (a kontrollcsoportban a reproduktív teljesítményre vonatkozó érvényességi kritérium valamennyi fajra alkalmazandó). Más Daphnia-fajok használata esetén ezeket egyértelműen azonosítani kell, és alkalmazásukat meg kell indokolni.

( 55 ) Akaratlan elhullás: nem szándékoltan bekövetkező váratlan esemény (azaz ismert ok) által előidézett, a vegyi anyaggal össze nem függő elhullás.

( 56 ) Véletlen elhullás: ismeretlen okból bekövetkezett, a vegyi anyaggal össze nem függő elhullás.

( *1 ) A papilláris nyúlványok normális esetben csak felnőtt hímeknél jelennek meg és a farok alatti úszó sugarain, az úszó poszterior végétől számított másodiktól a hetedik vagy nyolcadik úszósugárig találhatók meg (1. és 2. ábra). A nyúlványok ugyanakkor csak ritkán jelennek meg a farok alatti úszó poszterior végétől számított első úszósugáron. Ez a szabványműveleti előírás kiterjed a nyúlványok első úszósugáron történő mérésére is (ebben a szabványműveleti előírásban az úszósugarak számjele a farok alatti úszó poszterior végétől számított sorszámukra utal).

( *2 ) Homogenizáló puffer:

MEGJEGYZÉS: A homogenizáló pufferoldatot a készítés napján fel kell használni. Használat közben jégre kell helyezni.

( 57 ) Carl von Linné (*1707. május 23., Råshult /Älmhult; † 1778. január 10., Uppsala).