26.9.2019   

HU

Az Európai Unió Hivatalos Lapja

L 247/1


A BIZOTTSÁG (EU) 2019/1390 RENDELETE

(2019. július 31.)

a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendelet mellékletének a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról

(EGT-vonatkozású szöveg)

AZ EURÓPAI BIZOTTSÁG,

tekintettel az Európai Unió működéséről szóló szerződésre,

tekintettel a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről szóló, 2006. december 18-i 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletre (1) és különösen annak 13. cikke (2) bekezdésére,

mivel:

(1)

A 440/2008/EK bizottsági rendelet (2) megállapítja az 1907/2006/EK rendelettel összefüggésben alkalmazandó, a vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására szolgáló vizsgálati módszereket.

(2)

A Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet (OECD) harmonizált és nemzetközileg elfogadott vizsgálati iránymutatásokat dolgoz ki a vegyi anyagok szabályozási célú vizsgálatára vonatkozóan. Az ezen a területen végbemenő tudományos fejlődésre figyelemmel az OECD időről időre új és átdolgozott vizsgálati iránymutatásokat ad ki.

(3)

A műszaki fejlődés figyelembevétele és a kísérleti célokra használt állatok számának az 1907/2006/EK rendelet 13. cikkének (2) bekezdésében előírt, lehetőség szerinti csökkentése érdekében a Bizottság két új vizsgálati módszert határoz meg az ökotoxicitás értékelésére, kilenc új vizsgálati módszert fektet le a toxicitás emberi egészségre gyakorolt hatásának meghatározására, és hét vizsgálati módszert aktualizál az OECD e területre vonatkozóan elfogadott vizsgálati iránymutatásai alapján. E vizsgálati módszerek közül tizenegy a bőr- és szemirritáció/-korrózió, a bőrszenzibilizáció, a genotoxicitás és az endokrin hatások in vitro vizsgálatához kapcsolódik. A Bizottság konzultált az érdekelt felekkel a javasolt módosításról.

(4)

A 440/2008/EK rendeletet ezért ennek megfelelően módosítani kell.

(5)

Az e rendeletben előírt intézkedések összhangban vannak az 1907/2006/EK rendelet 133. cikke alapján létrehozott bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT A RENDELETET:

1. cikk

A 440/2008/EK rendelet melléklete e rendelet mellékletének megfelelően módosul.

2. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

Kelt Brüsszelben, 2019. július 31-én.

a Bizottság részéről

az elnök

Jean-Claude JUNCKER


(1)  HL L 396., 2006.12.30., 1. o.

(2)  A Bizottság 440/2008/EK rendelete (2008. május 30.) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról (HL L 142., 2008.5.31., 1. o.).


MELLÉKLET

A 440/2008/EK rendelet melléklete a következőképpen módosul:

1.

A B. részben a B.4. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.4.   AKUT BŐRIRRITÁCIÓ/BŐRKORRÓZIÓ

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 404. vizsgálati iránymutatásában (2015) leírt módszerrel. A vegyi anyagok vizsgálatára vonatkozó OECD-iránymutatás rendszeres időközönként felülvizsgálat tárgyát képezi annak biztosítása érdekében, hogy tükrözze a rendelkezésre álló legjobb tudományos ismereteket. Az OECD 404. vizsgálati iránymutatásának felülvizsgálata során kiemelt figyelmet szenteltek az állatjóléti szempontokkal kapcsolatos lehetséges jobbító beavatkozásoknak és a vizsgálati vegyi anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló összes információ kiértékelésének, hogy ezáltal elkerülhető legyen a laboratóriumi állatokon történő szükségtelen kísérletezés. Az OECD (eredetileg 1981-ben elfogadott, majd 1992-ben, 2002-ben és 2015-ben átdolgozott) 404. vizsgálati iránymutatásának frissített kiadása hivatkozik a bőrirritáció/bőrkorrózió vonatkozásában végzett vizsgálatok és értékelések integrált megközelítéseiről (IATA) szóló iránymutatásra (1), amely a bőrirritációs és bőrkorróziós vizsgálatok moduláris megközelítésére tesz javaslatot. Az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés több, információforrásokat és adatelemző eszközöket csoportosító modult ismertet, továbbá i. iránymutatást nyújt arra nézve, hogy miként integrálhatók és használhatók az ismert vizsgálati és nem vizsgálati eredetű adatok a vegyi anyagok potenciális bőrirritációs és bőrkorróziós hatásainak felmérésére, és ii. javaslatot tesz a további vizsgálatok szükségességekor alkalmazható megközelítésre (1). Emellett az iránymutatás javasolja, hogy – amennyiben szükséges – az előzetes in vivo vizsgálat során az állatra ne egyszerre, hanem időben egymás után helyezzék fel a három teszttapaszt.

2.

A bőrirritáció és a bőrkorrózió fogalommeghatározása a vizsgálati módszer függelékében szerepel.

ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK

3.

A tudományos észszerűség és az állatok kímélete érdekében nem szabad in vivo vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg a vizsgálati vegyi anyag potenciális bőrkorróziós/bőrirritációs hatására vonatkozó összes rendelkezésre álló adatra el nem végezték a bizonyítékok súlyán alapuló (WoE) elemzést a bőrirritáció/bőrkorrózió vonatkozásában végzett vizsgálatok és értékelések integrált megközelítéseiről (IATA) szóló iránymutatás szerint, vagyis az iránymutatás három részének és az azokhoz tartozó moduloknak megfelelően (1). Röviden: az 1. rész az ismert adatokkal foglalkozik hét modulon keresztül, amelyek lefedik a humán adatokat, az in vivo adatokat, az in vitro adatokat, a fizikai-kémiai tulajdonságokkal kapcsolatos adatokat (pl. a pH-értéket, különösen az erős savasságot vagy lúgosságot) és a nem vizsgálatalapú módszereket. A 2. rész az adatok WoE-elemzésének elvégzését írja le. Amennyiben a WoE-elemzés nem meggyőző, tovább kell haladni a 3. rész szerint, amelynek során további vizsgálatokat kell végezni, először in vitro módszerekkel, majd legvégső esetben in vivo vizsgálatokkal. Az elemzés célja tehát az, hogy csökkentse az in vivo bőrkorróziós/bőrirritációs vizsgálatokat azon vizsgálati vegyi anyagok esetében, amelyekre az említett két végpont tekintetében más vizsgálatokból már elegendő bizonyíték áll rendelkezésre.

AZ IN VIVO VIZSGÁLAT ELVE

4.

A vizsgálati vegyi anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísérleti állat bőrén; a vizsgált állat nem kezelt bőrfelületei szolgálnak kontrollként. Az irritáció/korrózió mértékét meghatározott időközönként kell ellenőrizni és értékelni, továbbá a hatások teljes kiértékelése érdekében részletesebben is ismertetni. A vizsgálat időtartamának elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy meg lehessen határozni a megfigyelt hatások visszafordíthatóságát vagy visszafordíthatatlanságát.

5.

A vizsgálat bármely fázisában tartósan súlyos stressz és/vagy fájdalom jeleit mutató állatokat kíméletesen le kell ölni, és a vizsgálati vegyi anyagot ennek megfelelően kell értékelni. Az elhullás közelében lévő és súlyosan szenvedő állatok kíméletes leölésére vonatkozó döntés kritériumai külön iránymutatás (2) tárgyát képezik.

AZ IN VIVO VIZSGÁLAT ELŐKÉSZÍTÉSE

Az állatfaj kiválasztása

6.

A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell használni. Más fajok alkalmazását megfelelően indokolni kell.

Az állatok előkészítése

7.

A vizsgálat előtt körülbelül 24 órával el kell távolítani az állat szőrzetét úgy, hogy teljesen le kell nyírni az állat törzsének dorzális területét. Ügyelni kell arra, hogy eközben ne dörzsölődjön ki az állat bőre, és csak olyan állatokat szabad használni, amelyek bőre ép és egészséges.

8.

Egyes nyúltörzsek szőrzete sűrű foltokban nő, amelyek az év egyes szakaszaiban még szembetűnőbbek. Az ilyen sűrű szőrzetnövekedéssel jellemzett részeket nem szabad vizsgálati területként használni.

Tartási és etetési körülmények

9.

Az állatokat egyenként kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 20 °C-nak (± 3 °C) kell lennie. Noha a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és az – a takarítás időtartamától eltekintve – lehetőség szerint nem haladhatja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltakozásával. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett.

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

10.

A vizsgálati vegyi anyagot egy kis (körülbelül 6 cm2-es) bőrterületre kell kijuttatni, majd egy géztapasszal le kell takarni, és nem irritáló ragasztószalaggal kell a helyén rögzíteni. Olyan esetekben, amikor a közvetlen alkalmazás nem megoldható (pl. folyadékok vagy egyes masszák esetében), a vizsgálati vegyi anyagot először a géztapaszra kell felvinni, és azután azt kell a bőrre helyezni. Az expozíciós idő tartamára a tapaszt lazán kell a bőrre rögzíteni egy megfelelő, félig záró kötés alkalmazásával. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyagot a tapaszra viszik fel, azt úgy kell a bőrre rögzíteni, hogy megfelelő legyen a kontaktus, és a bőrön egyenletes legyen az anyag eloszlása. Gondoskodni kell arról, hogy az állat ne férhessen hozzá a tapaszhoz és ne nyelhesse le vagy lélegezhesse be a vizsgálati vegyi anyagot.

11.

A folyékony vizsgálati vegyi anyagok adagolása rendszerint hígítás nélkül történik. Szilárd anyagok vizsgálatakor (amelyeket szükség esetén porrá lehet őrölni) a vizsgálati vegyi anyagot a lehető legkisebb, de a bőrrel való megfelelő kontaktus biztosításához a lehető legkisebb mennyiségű vízzel (vagy szükség esetén más megfelelő vivőanyaggal) kell nedvesíteni. Ha vivőanyagként nem vizet alkalmaznak, annak lehetőleg ne, vagy csak minimális bőrirritáló hatása legyen.

12.

Ha megoldható, az általában 4 órás expozíciós idő végén az adott esetben megmaradt vizsgálati vegyi anyagot vízzel vagy megfelelő oldószerrel el kell távolítani, ügyelve arra, hogy ez ne befolyásolja a meglévő válaszreakciókat vagy a felhám épségét.

Dózis

13.

A vizsgálat helyére 0,5 ml folyadékot vagy 0,5 g szilárd anyagot vagy pasztát kell felvinni.

Előzetes vizsgálat (in vivo bőrirritációs/bőrkorróziós vizsgálat egy állat felhasználásával)

14.

Ha a bizonyítékok súlyán alapuló elemzés vagy korábbi in vitro vizsgálat alapján a vizsgálati vegyi anyag korróziós vagy irritáló hatásúnak minősül, illetve nem osztályozandó, általában nincsen szükség további in vivo vizsgálatokra. Amennyiben azonban indokoltnak látszik a további adatgyűjtés, az in vivo vizsgálatot először egy állaton kell elvégezni, az alábbi eljárás alkalmazásával. Az állatra egymást követően legfeljebb három teszttapaszt lehet felhelyezni. Az első tapaszt három perc után kell eltávolítani. Ha nem láthatók súlyos bőrreakciók, egy második tapaszt helyeznek fel egy másik helyre, majd egy óra elteltével eltávolítják. Ha a megfigyelések ebben a szakaszban azt mutatják, hogy humánusan megengedhető az expozíció négy órára történő meghosszabbítása, egy harmadik tapaszt is fel lehet helyezni, melyet négy óra múlva eltávolítanak és a válaszreakciót kiértékelik.

15.

Ha a három egymás utáni expozíció bármelyike után korróziós hatás tapasztalható, a vizsgálatot azonnal be kell fejezni. Ha az utolsó tapasz eltávolítása után sem figyelhető meg korróziós hatás, az állatot 14 napon át meg kell figyelni, kivéve, ha előbb jelentkezik korróziós hatás.

16.

Azokban az esetekben, amikor a vizsgálati vegyi anyag várhatóan nem okoz korróziós hatást, de irritáló lehet, egyetlen tapaszt kell felhelyezni egy állatra, négy óra időtartamra.

Megerősítő vizsgálat (in vivo bőrirritációs vizsgálat további állatok felhasználásával)

17.

Ha az előzetes vizsgálat során nem figyelhető meg korróziós hatás, legfeljebb további két állaton egy-egy tapasz és négyórás expozíciós idő alkalmazásával meg kell erősíteni az irritációt vagy a negatív válaszreakciókat. Ha az előzetes vizsgálat során irritációs válasz figyelhető meg, a megerősítő vizsgálat lépcsőzetesen vagy két további állat párhuzamos kezelésével is elvégezhető. Abban a kivételes esetben, ha nem végeznek előzetes vizsgálatot, két vagy három állatot lehet kezelni egy-egy tapasszal, amelyet négy óra múlva kell eltávolítani. Ha két állat használata esetén mindkettő ugyanolyan válaszreakciót mutat, további vizsgálatokra nincs szükség. Egyéb esetben egy harmadik állatot is be kell vonni a vizsgálatba. A nem egyértelmű válaszreakciókat esetlegesen további állatok bevonásával lehet értékelni.

Megfigyelési időszak

18.

A megfigyelési időszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen a megfigyelt hatások visszafordíthatóságának teljes kiértékelésére. A vizsgálatot azonban azonnal meg kell szakítani, ha az állat tartósan súlyos fájdalom vagy stressz jeleit mutatja. A hatások visszafordíthatóságának meghatározásához az állatokat a tapaszok eltávolítása után legfeljebb 14 napig meg kell figyelni. Ha a visszafordíthatóság a 14 napos időszak vége előtt bebizonyosodik, a kísérletet ekkor kell befejezni.

Klinikai megfigyelések és a bőrreakciók értékelése

19.

Minden állatnál meg kell vizsgálni a bőrpír (eritéma) vagy vizenyő (ödéma) jeleit és a válaszreakciókat a tapasz eltávolítása után 60 perccel, majd 24, 48 és 72 órával értékelni kell. Az egy állattal végzett előzetes vizsgálatban a vizsgálati területet a tapasz eltávolítása után azonnal is meg kell vizsgálni. A bőrreakciókat a csatolt táblázatban megadottak szerint kell értékelni és feljegyezni. Ha 72 óra elteltekor sem irritációként, sem korrózióként nem értékelhető bőrkárosodás látható, a hatások visszafordíthatóságának meghatározásához szükség lehet a megfigyelések folytatására a 14. napig. Az irritáció megfigyelésén kívül minden lokális toxikus hatást, mint például a bőr zsírtartalmának csökkentését, és bármely káros szisztémás hatást (pl. a mérgezés klinikai tüneteire és a testtömegre gyakorolt hatást) részletesen le kell írni és fel kell jegyezni. A nem egyértelmű válaszreakciók tisztázása érdekében fontolóra kell venni kórszövettani vizsgálatok elvégzését is.

20.

A bőrreakciók értékelése elkerülhetetlenül szubjektív. A bőrreakciók értékelésének harmonizálása és a vizsgáló laboratóriumok, illetve a megfigyelésekben és azok értékelésében részt vevők segítése érdekében a megfigyeléseket végző személyzetet megfelelően ki kell képezni az alkalmazott értékelő rendszer (lásd a csatolt táblázatot) használatára. Hasznos lehet egy, a bőrirritációk és más léziók értékelését ismertető, illusztrált útmutató is (3).

ADATOK ÉS JELENTÉS

21.

A végleges vizsgálati jelentésben a vizsgálatok eredményeit táblázatos formában kell összefoglalni, amelynek a 24. pontban felsorolt tételek mindegyikét tartalmaznia kell.

Az eredmények értékelése

22.

A bőrirritációs pontszámokat a léziók jellegével és súlyosságával, illetve visszafordíthatóságával vagy visszafordíthatatlanságával összefüggésben kell értékelni. Az egyes pontszámok nem jelentenek abszolút normát egy anyag irritációs tulajdonságai tekintetében, mivel a vizsgálandó anyag egyéb hatásait is értékelni kell. Az egyes pontszámokat ehelyett referenciaértékeknek kell tekinteni, amelyeket a vizsgálat során tett összes egyéb megfigyeléssel együttesen kell értékelni.

23.

Az irritációs válaszreakciók értékelésekor figyelembe kell venni a bőrléziók visszafordíthatóságát. Ha az olyan válaszreakciók, mint a szőrhiány (korlátozott területen), a kóros elszarusodás (hiperkeratózis), a szövetszaporodás (hiperplázia) vagy a hámlás a 14 napos megfigyelési időszak végére sem múlnak el, a vizsgálati vegyi anyagot irritálónak kell tekinteni.

Vizsgálati jelentés

24.

A vizsgálati jelentésnek a következő információkat kell tartalmaznia:

 

Az in vivo vizsgálatok indokolása:

A korábban rendelkezésre álló vizsgálati adatok WoE-elemzése, beleértve a lépcsőzetes vizsgálati stratégia során nyert adatokat is:

a korábbi vizsgálatokból rendelkezésre álló, vonatkozó adatok ismertetése;

a vizsgálati stratégia egyes szakaszaiban nyert adatok;

az elvégzett in vitro vizsgálatok, ezen belül az eljárások, illetve a vizsgált anyaggal és a referenciaanyagokkal kapott eredmények részleteinek ismertetése;

WoE-elemzés az in vivo vizsgálat elvégzéséhez.

 

Vizsgálati vegyi anyag:

Egy összetevőből álló anyag: kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján;

ismeretlen vagy változó összetételű anyagok, több összetevőből álló anyagok és keverékek, valamint komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok (UVCB-k): lehetőség szerint az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai alapján jellemezve;

fizikai megjelenés, vízoldékonyság és további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

eredet, gyártási szám, ha ismert;

a vizsgálati vegyi anyag/kontrollanyag kezelése a vizsgálatot megelőzően, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, felhasználási határideje vagy ismételt elemzésének napja, ha ismert;

tárolási feltételek.

 

Vivőanyag:

azonosítás, (adott esetben) koncentráció, alkalmazott térfogat;

a vivőanyag megválasztásának indokolása.

 

Kísérleti állat(ok):

a felhasznált faj/törzs, adott esetben az albínó nyúltól eltérő faj(ok) alkalmazásának indokolása;

az állat(ok) száma nemenként;

az egyes állatok testtömege a vizsgálat előtt és annak befejezésekor;

életkor a vizsgálat kezdetén;

az állat(ok) származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.

 

Vizsgálati körülmények:

az állat azon testrészének előkészítése, ahová felhelyezik a tapaszt;

a felhasznált tapasz típusának és a tapaszolási eljárásnak a részletes leírása;

a vizsgálati vegyi anyag előkészítésének, alkalmazásának és eltávolításának részletes ismertetése.

 

Eredmények:

az irritációs/korróziós válasz pontszámainak táblázatos formában történő megadása minden egyes állatra és minden egyes mérési időpontra vonatkozóan;

az összes megfigyelt lézió ismertetése;

a megfigyelt irritáció vagy korrózió jellegének és mértékének, illetve az esetleges kórszövettani eredményének a leíró jellegű ismertetése;

a bőrirritáción és -korrózión kívüli egyéb káros lokális hatások (pl. a bőr zsírtartalmának csökkenése) és szisztémás hatások ismertetése.

 

Az eredmények értékelése

 

Következtetések

SZAKIRODALOM

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

Táblázat

A Bőrreakciók Értékelése

Nincs bőrpír…

0

Nagyon enyhe bőrpír (alig észlelhető).…

1

Jól kifejezett bőrpír…

2

Közepes–súlyos mértékű bőrpír…

3

Pörkképződésig fokozódó súlyos bőrpír (céklavörös szín), amely lehetetlenné teszi a bőrpír osztályozását…

4

Elérhető maximális pontszám: 4

Nincs vizenyő…

0

Nagyon enyhe vizenyő (alig észlelhető)…

1

Enyhe vizenyő (a terület szélei az egyértelmű kiemelkedések miatt jól kifejezettek)…

2

Közepes súlyosságú vizenyő (körülbelül 1 mm-re emelkedik ki)…

3

Súlyos vizenyő (több mint 1 mm-re emelkedik ki és nagyobb, mint az expozíciós terület)…

4

Elérhető maximális pontszám: 4

A nem egyértelmű válaszreakciókat kórszövettani vizsgálattal lehet tisztázni.

Függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Vegyi anyag: anyag vagy keverék.

Bőrirritáció: a vizsgálati vegyi anyag alkalmazását követően 4 órán belül megjelenő, visszafordítható bőrkárosodás.

Bőrkorrózió: a vizsgálati vegyi anyag alkalmazását követően négy órán belül megjelenő, visszafordíthatatlan bőrkárosodás, azaz a felhámon át az irhára is átterjedő, látható szövetelhalás. A korróziós reakciót jellemzően fekélyek, vérzés, véres var, illetve a 14 napos megfigyelési időszak végén a bőr kifehéredése miatti elszíneződések, teljesen szőrtelen területek és hegek jellemzik. A kérdéses lézió értékeléséhez figyelembe kell venni a kórszövettant.

Vizsgálati vegyi anyag: az e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

2.

A B. részben a B.17. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.17.   EMLŐSSEJTEKEN HPRT ÉS XPRT GÉNNEL VÉGZETT IN VITRO GÉNMUTÁCIÓS VIZSGÁLATOK

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 476. vizsgálati iránymutatásával (2016). A vizsgálati módszereket a tudományos fejlődés, a változó szabályozási igények és az állatok kíméletének figyelembevételével rendszeresen felülvizsgálják. A B.17. vizsgálati módszer jelenlegi felülvizsgált változata a vizsgálat csaknem harminc éves alkalmazása során szerzett tapasztalatokat tükrözi, valamint annak a különálló, újonnan kifejlesztett módszernek az eredményeit, amelynek keretében timidin-kináz gén használatával végeznek emlőssejteken in vitro génmutációs vizsgálatokat. A B.17. vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Az OECD kidolgozott egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, az OECD genetikai toxikológiára vonatkozó vizsgálati iránymutatásainak közelmúltbeli változásait áttekintő dokumentumot (1).

2.

Az emlőssejteken végzett in vitro génmutációs vizsgálat célja a vegyi anyagok által előidézett génmutációk észlelése. Az e vizsgálatokban használt sejtvonalak forward (előremutató) mutációkat mérnek riportergénekben, konkrétan az endogén hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz génben (Hprt rágcsálósejtekben és HPRT emberi sejtekben; e vizsgálati módszer keretében együttes megnevezésük Hprt-gén és HPRT-vizsgálat) és a xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (gpt) transzgénben (a továbbiakban: XPRT-vizsgálat). A HPRT-és XPRT-mutációvizsgálatok a genetikai események különböző spektrumait észlelik. A HPRT-vizsgálat által észlelt mutációs eseményeken (pl. bázispárok cseréje, leolvasási keret eltolódása, kisebb deléciók és inszerciók) túlmenően a gpt transzgén autoszomális helye lehetővé teheti a nagy mértékű deléciókból és esetlegesen a mitotikus rekombinációból eredő mutációk észlelését, amelyek HPRT-vizsgálattal nem észlelhetők, mivel a Hprt-gén az X kromoszómán helyezkedik el (2) (3) (4) (5) (6) (7). Szabályozási célra jelenleg az XPRT-vizsgálatot a HPRT-vizsgálatnál ritkábban alkalmazzák.

3.

Az alkalmazott fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

4.

Az in vitro végrehajtott vizsgálatok rendszerint külső forrásból származó metabolikus aktiváció alkalmazását teszik szükségessé. Az exogén metabolikus aktivációs rendszer nem utánozza teljesen az in vivo körülményeket.

5.

Ügyelni kell arra, hogy ne álljanak elő olyan körülmények, amelyek álpozitív – tehát nem a vizsgálati vegyi anyag és a sejt genetikus anyagának közvetlen kölcsönhatásából származó – eredményre (azaz a vizsgálati rendszerrel való esetleges kölcsönhatásra) vezetnének; ilyen körülmény többek között a pH-érték vagy az ozmolalitás változása (8) (9) (10), a tenyészközeg összetevőivel való kölcsönhatás (11) (12) vagy a túlzott mértékű citotoxicitás (13). A 19. pontban meghatározott, ajánlott citotoxicitási felső határértékeket meghaladó citotoxicitás a HPRT-vizsgálat szempontjából túlzott mértékűnek minősül.

6.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLAT ELVE

7.

Azok a mutáns sejtek, amelyek nem mutatnak Hprt-enzimaktivitást a HPRT-vizsgálatban vagy xprt-enzimaktivitást az XPRT-vizsgálatban, rezisztensek a purinanalóg 6-thioguanin (TG) citosztatikus hatásaival szemben. A Hprt- (a HPRT-vizsgálatban) vagy a gpt -(az XPRT-vizsgálatban) proficiens sejtek érzékenyek a TG-re, ami a celluláris metabolizmus gátlását okozza, és megállítja a további sejtosztódást. Tehát a mutáns sejtek képesek sejtburjánzásra TG jelenlétében, míg a normál sejtek, amelyek (a HPRT-vizsgálatban) Hprt-enzimet vagy (az XPRT-vizsgálatban) gpt-enzimet tartalmaznak, nem képesek erre.

8.

Szuszpenzióban vagy egyrétegű (monolayer) tenyészetben növő sejteket megfelelő időtartamig (3–6 órán keresztül) külső forrásból származó metabolikus aktivációval és anélkül (lásd a 14. pontot) kezelik a vizsgálati vegyi anyaggal, majd a sejtkultúrát átültetik, hogy meghatározzák a citotoxicitást és lehetővé tegyék a fenotípusos expressziót a mutáns kiválasztása előtt (14) (15) (16) (17). A citotoxicitást a relatív túlélés alapján kell meghatározni, ami a közvetlenül a kezelést követően mért és a kezelés során tapasztalt sejtpusztulással kiigazított kolóniaképző képesség összevetve a negatív kontrollal (18. pont és 2. függelék). A kezelt tenyészeteket megfelelő, az egyes sejtvonalakra jellemző ideig tenyészközegben tartják, hogy lehetővé váljon az indukált mutációk közel optimális fenotípusos expressziója (ez általában legalább 7–9 napot igényel). A fenotípus expressziót követően a mutációs gyakoriságot úgy határozzák meg, hogy leültetnek ismert számú sejtet a szelekciós ágenst tartalmazó tápoldatba a mutáns telepek kimutatására, valamint a szelekciós ágenst nem tartalmazó tápoldatba a kolóniaképző képesség (életképesség) meghatározására. Megfelelő inkubációs idő után megszámolják a telepeket. A mutációs gyakoriság kiszámításának alapja a mutáns telepek száma, kiigazítva a mutáns kiválasztásának idején mért kolóniaképző képességgel.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Sejtek

9.

A HPRT- és XPRT-vizsgálatokban használt sejttípusoknak bizonyítottan érzékenynek kell lenniük a kémiai mutagén anyagokra, magas kolóniaképző képességgel, stabil kariotípussal és stabil spontán mutációs gyakorisággal kell rendelkezniük. A HPRT-vizsgálatokhoz leggyakrabban használt sejtek közé tartoznak a CHO, CHL és V79-es kínai hörcsög sejtek, az L5178Y egér-limfómasejtek és a TK6-os humán limfoblasztoid sejtek (18) (19). Az XPRT-vizsgálathoz CHO-ból származó AS52-es sejteket használnak, amelyek tartalmazzák a gpt transzgént (és Hprt-génjüket kiütötték) (20) (21); a HPRT-vizsgálat AS52-es sejteken nem végezhető el, mert azok hprt-génjét kiütötték. Más sejtvonalak használatát indokolni és validálni kell.

10.

A sejtvonalakat rutinszerűen ellenőrizni kell a modális kromoszómaszám stabilitása és az esetleges mikoplazma-fertőzés szempontjából (22) (23), és a sejtek nem használhatók fel, ha fertőzöttek vagy ha a modális kromoszómaszám megváltozott. A vizsgálólaboratóriumban használt sejtek rendes sejtciklusidejét meg kell állapítani, és annak összhangban kell lennie a közzétett sejtjellemzőkkel. Az induló sejtkészletben is ellenőrizni kell a spontán mutációs gyakoriságot, és a sejteket nem szabad felhasználni, ha a mutációs gyakoriság nem elfogadható.

11.

A vizsgálatban való felhasználás előtt a sejtkultúrákat, amennyiben szükséges, meg kell tisztítani a jelen lévő mutáns sejtektől, például HAT-tápfolyadékban történő tenyésztéssel a HPRT-vizsgálatnál, és MPA-tápfolyadékban az XPRT-vizsgálatnál (5) (24) (lásd az 1. függeléket). A megtisztított sejtek fagyasztással tartósíthatók, majd felolvasztva munkakészletként használhatók. Az újonnan felolvasztott munkakészlet azt követően használható fel a vizsgálathoz, hogy elérte szokásos megduplázódási idejét. XPRT-vizsgálat végzésekor a szokásos módon tenyésztett AS52-es sejtek számára olyan körülményeket kell biztosítani, amelyek garantálják a gpt-transzgén fennmaradását (20).

Tápfolyadék és tenyésztési körülmények

12.

A tenyészetek fenntartására megfelelő tápfolyadékot és inkubációs feltételeket kell biztosítani (tenyésztőedények, 5 %-os CO2-koncentrációjú, vízgőzzel telített levegő és 37 °C-os inkubációs hőmérséklet). A sejttenyészeteket mindig olyan körülmények között kell tartani, amelyek biztosítják az exponenciális növekedési szakaszt. Különösen fontos a tenyészközeg és a tenyésztési körülmények olyan módon történő megválasztása, hogy azok biztosítsák az optimális növekedési feltételeket az expressziós időszak alatt, valamint azt, hogy mind a vad típusú, mind a mutáns sejtvonalak kolóniaképző képessége optimális legyen.

A tenyészetek előkészítése

13.

A sejtvonalakat törzstenyészetekből kell felszaporítani, majd tápfolyadékba leoltani olyan sejtszámmal, hogy a sejtek a szuszpenziókban vagy az egyrétegű tenyészetekben a teljes kezelési és expressziós időszakban exponenciálisan növekedjenek (az egyrétegű tenyészetekben növő sejtek esetében például kerülendő a konfluencia).

Metabolikus aktiválás

14.

Nem megfelelő endogén metabolikus képességű sejtek használata esetén exogén metabolikus aktivációs rendszereket kell alkalmazni. A leggyakrabban használt rendszer – amely egyéb indok fennállása hiányában általánosságban ajánlott – a kofaktorokkal kiegészített mitokondriális frakció (S9), amelyet rágcsálók (általában patkány) olyan enzimindukáló reagensekkel kezelt májából izolálnak, mint az Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28), vagy a fenobarbitál és β-naftoflavon kombinációja (29) (30) (31) (32). Ez utóbbi kombináció nem ütközik a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló stockholmi egyezménnyel (33), és kimutatták róla, hogy hatékonysága a vegyes funkciójú oxidázok indukálásához az Aroclor 1254-ével megegyező (29) (31). Az S9 frakció jellemzően 1–2 térfogatszázalék koncentrációban használatos, de a végső vizsgálati közegben 10 térfogatszázalékra növelhető. Az alkalmazott exogén metabolikus aktivációs rendszer vagy metabolikus induktor típusának és koncentrációjának megválasztását befolyásolhatja a vizsgált anyagok osztálya (34) (35) (36).

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

15.

A szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat a sejtek kezelése előtt megfelelő oldószerrel elő kell kezelni, és szükség esetén hígítani kell (lásd a 16. pontot). A folyékony halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül hozzáadhatók a vizsgálati rendszerhez és/vagy hígíthatók a vizsgálati rendszer kezelése előtt. A gáz halmazállapotú vagy illékony vizsgálati vegyi anyagokat a standard protokollok megfelelő módosításával, például légmentesen lezárt tenyésztőedényekben történő kezeléssel kell vizsgálni (37) (38). A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó készítményeket közvetlenül a kezelés előtt kell előállítani, kivéve, ha az anyag tárolás során való stabilitása bizonyított.

VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK

Oldószerek

16.

Az oldószert oly módon kell kiválasztani, hogy optimális oldhatóságot biztosítson a vizsgálati vegyi anyagnak, ugyanakkor ne befolyásolja hátrányosan a vizsgálat lebonyolítását, vagyis ne változtassa meg a sejtek növekedését, ne befolyásolja a vizsgálati vegyi anyag integritását, ne lépjen reakcióba a tenyésztőedényekkel, és ne károsítsa a metabolikus aktivációs rendszert. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer (vagy tápfolyadék) használatát érdemes megfontolni. Jól bevált oldószer például a víz és a dimetil-szulfoxid. A szerves oldószerek koncentrációja a végleges kezelési közegben általában ne haladja meg az 1 térfogatszázalékot, a vizes oldószereké (sóoldat vagy víz) pedig a 10 térfogatszázalékot. Nem bevált oldószerek (például etanol vagy aceton) használata esetében a vizsgálati vegyi anyaggal és a vizsgálati rendszerrel való összeegyeztethetőségükre utaló adatokkal kell alátámasztani használatukat és azt, hogy a használt koncentrációnál nem genotoxikusak. Alátámasztó adatok hiányában szükséges nem kezelt kontrollok alkalmazása is (lásd az 1. függeléket) annak bizonyítására, hogy a kiválasztott oldószer nem vált ki káros vagy mutagén hatást.

A citotoxicitás mérése és az expozíciós koncentrációk kiválasztása

17.

A vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációjának meghatározása során kerülendő az olyan koncentráció, amely hamis pozitív válaszreakciókat válthat ki, mint például a túlzott citotoxicitást okozó koncentráció (lásd a 20. pontot), a tápfolyadékban történő kicsapódást okozó koncentráció (lásd a 21. pontot), illetve a pH vagy az ozmolalitás jelentős változását okozó koncentráció (lásd az 5. pontot). Ha a vizsgálati vegyi anyag a hozzáadásakor jelentős változást okoz a tenyészközeg pH-jában, a pH a kezelésre szolgáló végleges tenyészközeg pufferelésével kiigazítható, hogy elkerülhetők legyenek a hamis pozitív eredmények és megfelelő tenyésztési feltételeket lehessen fenntartani.

18.

A koncentráció kiválasztása a citotoxicitás és egyéb megfontolások alapján történik (lásd a 20–22. pontot). Bár a fő vizsgálatban alkalmazandó koncentrációk jobb meghatározásához egy előzetes vizsgálatban érdemes meghatározni a citotoxicitást, az előzetes vizsgálat nem követelmény. Még ha sor is kerül a citotoxicitás előzetes meghatározására, a fő vizsgálat során minden kultúrára el kell végezni a citotoxicitás mérését. A citotoxicitást a relatív túlélés alapján kell értékelni, amely a közvetlenül a kezelést követően átültetett sejtek kolóniaképző képessége (CE), kiigazítva a kezelés során bekövetkezett sejtpusztulással, majd összevetve a negatív kontrollok (ezek túlélési aránya 100 %-nak tekintendő) kiigazított kolóniaképző képességével (a képletet lásd a 2. függelékben).

19.

Legalább négy, az elfogadhatósági kritériumokat (megfelelő citotoxicitás, sejtszám stb.) teljesítő vizsgálati koncentrációt ki kell értékelni (az oldószeres és a pozitív kontrollokon túl). Bár két párhuzamos tenyészet használata ajánlott, az egyes vizsgált koncentrációknál párhuzamos vagy szimpla kezelt tenyészetek használhatók. A független párhuzamos tenyészetekben adott koncentráció mellett kapott eredményeket külön kell dokumentálni, az adatelemzéshez azonban összevonhatók (17). Az alacsony citotoxicitást vagy a citotoxicitás hiányát mutató vizsgálati vegyi anyagok esetében rendszerint megközelítőleg kétszeres-háromszoros koncentrációs intervallumok helyénvalóak. Citotoxicitás esetén a választott vizsgálati koncentrációknak le kell fedniük a citotoxicitást okozó koncentrációtól az azon koncentrációkig terjedő tartományt, ahol mérsékelt vagy alacsony a citotoxicitás, illetve nem jelentkezik citotoxicitás. Számos vizsgálati vegyi anyagnak meredek a koncentráció-válasz görbéje, és annak érdekében, hogy a citotoxicitás teljes tartományát le lehessen fedni, vagy részletesen meg lehessen vizsgálni a koncentráció-válasz összefüggést, szükség lehet egymáshoz közelebbi koncentrációk és négynél több koncentráció használatára, különösen olyan helyzetekben, ahol megismételt kísérlet szükséges (lásd a 43. pontot). Négynél több koncentráció alkalmazásának különösen szimpla tenyészetek alkalmazása esetében lehet jelentősége.

20.

Ha a legnagyobb koncentráció a citotoxicitáson alapul, a legmagasabb koncentrációval 10 és 20 % közötti relatív túlélési arányt kell megcélozni. A kizárólag 10 %-os vagy az alatti relatív túlélésnél jelentkező pozitív eredmények kiértékelése során körültekintően kell eljárni (43. pont).

21.

A legalacsonyabb oldhatatlan koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk mellett nem citotoxikus, nehezen oldható vizsgálati vegyi anyagok esetében a legmagasabb analizált koncentrációnak a vizsgálati vegyi anyaggal történő kezelés végén szemmel vagy inverz mikroszkóp segítségével látható zavarosságot vagy kicsapódást kell okoznia. Még abban az esetben is, ha a citotoxicitás a legalacsonyabb oldhatatlan koncentráció felett jön létre, ajánlatos egyetlen egy, zavarosságot vagy látható kicsapódást okozó koncentrációt vizsgálni, mivel a kicsapódás fals hatásokat eredményezhet. A kicsapódást okozó koncentrációnál ügyelni kell annak biztosítására, hogy a kicsapódás ne zavarja a vizsgálat lebonyolítását. Hasznos lehet a tápfolyadékban való oldhatóság meghatározása a kísérlet előtt.

22.

Ha nem figyelhető meg kicsapódás vagy korlátozó citotoxicitás, a legmagasabb vizsgálati koncentrációnak 10 mM-nek, 2 mg/ml-nek vagy 2 μl/ml-nek kell megfelelnie, melyek közül a legalacsonyabb a mérvadó (39) (40). Ha a vizsgálati vegyi anyag nem meghatározott összetételű, például ismeretlen vagy változó összetételű anyag, komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok (vagyis úgynevezett ismeretlen vagy változó összetételű vegyi anyagok (UVCB-k)) (41), környezeti extraktum stb., előfordulhat, hogy kellő citotoxicitás hiányában a legmagasabb koncentrációnak magasabbnak (például 5 mg/ml-nek) kell lennie ahhoz, hogy növekedjen az egyes összetevők koncentrációja. Megjegyzendő azonban, hogy ezek a követelmények eltérőek lehetnek a humán gyógyszerek esetében (42).

Kontrollok

23.

Minden kísérleti körülménynél párhuzamos negatív kontrollokat kell használni (lásd a 16. pontot), amelyeknél csak oldószert alkalmaznak a tenyészközegben, és a kezelésük ugyanolyan módon történik, mint a kezelt tenyészeteké.

24.

Párhuzamos pozitív kontrollok szükségesek annak igazolására, hogy a laboratórium képes az alkalmazott vizsgálati protokoll feltételei mellett mutagének azonosítására, valamint adott esetben az exogén metabolikus aktivációs rendszer eredményességének igazolására. Pozitív kontrollokra vonatkozó példák az alábbi 1. táblázatban találhatók. Indokolt esetben pozitív kontrollként alternatív anyagok használhatók. Mivel az emlőssejtek genetikai toxicitás szempontjából végzett in vitro vizsgálatai kellően szabványosítottak, az exogén metabolikus aktiváló rendszerrel vagy anélkül végzett kezeléseket alkalmazó vizsgálatok elvégezhetők mindössze egy – metabolikus aktiválást igénylő – pozitív kontrollal. Ebben az esetben ezen egyetlen pozitív kontroll válaszreakciója a metabolikus aktiváló rendszer aktivitását és a vizsgálati rendszer reagálóképességét is bizonyítja. Mindegyik pozitív kontrollt egy vagy több olyan koncentrációban kell alkalmazni, amely a háttérértékekhez viszonyítva reprodukálható és kimutatható növekedést okoz, hogy bizonyítani lehessen a vizsgálati rendszer érzékenységét, és a választ nem veszélyeztetheti a vizsgálati módszerben meghatározott határértékeket meghaladó citotoxicitás (lásd a 20. pontot).

1. táblázat

A laboratóriumok jártasságának értékeléséhez és a pozitív kontrollok kiválasztásához ajánlott referenciaanyagok

Metabolikus aktivációs körülmények

Lókusz

Anyag és CAS-szám

Exogén metabolikus aktiválás nélkül

Hprt

Etil-metán-szulfonát [CAS-szám: 62-50-0] Etil-nitrozo-karbamid [CAS-szám: 759-73-9] 4-Nitro-kinolin-1-oxid [CAS-szám: 56-57-5]

 

xprt

Sztreptonigrin [CAS-szám: 3930-19-6] Mitomicin-C [CAS-szám: 50-07-7]

Exogén metabolikus aktiválással

Hprt

3-Metil-kolantrén [CAS-szám: 56-49-5] 7,12-Dimetil-benzantracén [CAS-szám: 57-97-6] Benzo[a]pirén [CAS-szám: 50-32-8]

 

xprt

Benzo[a]pirén [CAS-szám: 50-32-8]

ELJÁRÁS

Kezelés a vizsgálati vegyi anyaggal

25.

A proliferáló sejteket metabolikus aktivációs rendszer jelenlétében és hiányában kezelik a vizsgálati vegyi anyaggal. Az expozíciónak megfelelő időtartamig kell tartania (ez rendszerint 3–6 óra).

26.

Az egyes vizsgálati (kontroll és kezelt) tenyészetekhez a vizsgálat bármely szakaszában alkalmazott minimális sejtszámnak a spontán mutációs gyakoriságon kell alapulnia. Általános iránymutatásként annyi sejtet kell kezelni és passzálni, amely elegendő ahhoz, hogy a vizsgálat minden szakaszában valamennyi tenyészetben előforduljon 10 spontán mutáció (17). A spontán mutációs gyakoriság rendszerint 5 és 20 × 10-6 közé esik. Az 5 × 10-6 spontán mutációs gyakoriság érdekében, valamint hogy biztosítani lehessen a spontán mutációk megfelelő számát (10 vagy több), még a kezelés során 90 %-os citotoxicitást (10 %-os relatív túlélést) okozó koncentrációk mellett kezelt tenyészetek esetében is legalább 20 × 106 sejt kezelése szükséges. Emellett az expressziós időszak során elegendő számú (2 milliónál soha nem kevesebb) sejtet kell tenyészteni majd leültetni a mutáns kiválasztásához (17).

A fenotípusos expresszió ideje és a mutációs gyakoriság mérése

27.

A kezelési időszak után a sejteket tovább kell tenyészteni, hogy a mutáns fenotípus kifejlődhessen. Általában 7–9 nap elegendő a frissen indukált Hprt- és xprt-mutánsok közel optimális fenotípusos expressziójához (43) (44). Ezen időszak alatt a sejteket az exponenciális növekedésük fenntartása érdekében rendszeresen át kell ültetni. A fenotípusos expressziót követően a sejteket újból leültetik a szelekciós ágenst (6-tioguanint) tartalmazó, illetve szelekciós ágens nélküli tápfolyadékba, hogy a kiválasztás időpontjában meg lehessen határozni a mutánsok számát, illetve a kolóniaképző képességet. A leültetés egyrétegű tenyészetek esetében végezhető tenyésztőedényekben, vagy sejtszuszpenzió esetén mikrotiter lemezeken. A mutánsok kiválasztásához a sejteket olyan sűrűségben kell átültetni, amely biztosítja a mutánsok optimális kinyerését (azaz elkerülhetővé teszi a metabolikus együttműködést) (17). A lemezeket a telepek optimális növekedését lehetővé tévő ideig (pl. 7–12 napig) inkubálni kell, és meg kell számolni a telepeket. A mutációs gyakoriság kiszámításának alapja a mutáns telepek száma, kiigazítva a mutánsok kiválasztásának idején mért kolóniaképző képességgel (a képleteket lásd a 2. függelékben).

A laboratórium jártassága

28.

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti elegendő tapasztalat igazolása érdekében kísérletsorozatot kell végrehajtaniuk referenciaként szolgáló, különböző mechanizmussal ható pozitív anyagokkal (legalább egy metabolikus aktiválással és legalább egy metabolikus aktiválás nélkül ható, az 1. táblázatban felsoroltak közül kiválasztott anyaggal), és különböző negatív kontrollokkal (különféle oldószerek/vivőanyagok használatával). E pozitív és negatív kontrollok válaszreakcióinak összhangban kell lenniük a szakirodalommal. Ez nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll a 30–33. pontban meghatározott, történeti adatokat tartalmazó adatbázis.

29.

A pozitív kontrollként kiválasztott anyagokat (lásd a 25. pontban szereplő 1. táblázatot) metabolikus aktiválás nélkül és metabolikus aktiválással is meg kell vizsgálni a laboratórium mutagén hatású vegyi anyagok kimutatásában és a metabolikus aktivációs rendszer hatékonyságának meghatározásában való jártasságának bizonyítására, valamint be kell mutatni, hogy a laboratórium megfelelően végzi a kezelés alatt a sejttenyésztést, a fenotípusos expressziót és a mutánsok kiválasztását, továbbá, hogy a kiértékelési eljárások is megfelelőek. A vizsgálati rendszer érzékenységének és dinamikus tartományának bizonyítása érdekében a kiválasztott anyagok koncentrációtartományát úgy kell megválasztani, hogy reprodukálható és koncentrációval összefüggő növekedést biztosítson a háttérértékekhez viszonyítva.

Történeti kontrolladatok

30.

A laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

a pozitív történeti kontrollok tartománya és eloszlása,

a negatív (nem kezelt, oldószeres) történeti kontrollok tartománya és eloszlása.

31.

A negatív történeti kontrollok eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal (22). Amint több kísérleti adat is felvételre kerül a kontrollok eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (17) (45) (46).

32.

A laboratórium negatív történeti kontrollokat tartalmazó adatbázisát első lépésként legalább 10 kísérlettel kell kiépíteni, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (47)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy a laboratóriumukban a módszertan „ellenőrzés alatt” áll (46). A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatok közé történő felvételének és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások a szakirodalomban találhatók (45).

33.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatoknak tartalmazniuk kell a szimpla tenyészetből vagy lehetőség szerint a párhuzamos tenyészetekből származó mutációs gyakoriságot, ahogyan az a 23. pontban szerepel. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív történeti kontrollokat tartalmazó adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (17) (45) (46). Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, ha ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer „ellenőrzés alatt áll” (lásd fent), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

34.

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy összhangban van-e a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisaival. Jelentősebb következetlenségek fennállása esetén új történeti kontrolladatbázist kell létrehozni.

ADATOK ÉS JELENTÉS

Az eredmények értékelése

35.

Az eredmények értékelésének tartalmaznia kell a (relatív túlélési arányban kifejezett) citotoxicitás kiszámításához szükséges valamennyi adatot. Az adatoknak mind a kezelt, mind a kontrolltenyészetek esetén magukban kell foglalniuk a kezelés végén mért sejtszámot, a közvetlenül a kezelés után átültetett sejtek számát és a telepek számát (illetve mikrotiter módszer használata esetén a telepet nem tartalmazó lyukak számát). Az egyes tenyészetek relatív túlélését a párhuzamos oldószeres kontrollhoz viszonyított százalékarányban kell kifejezni (a fogalommeghatározásokat lásd az 1. függelékben).

36.

Az eredmények bemutatásának tartalmaznia kell ezenfelül a mutációs gyakoriság kiszámításához szükséges valamennyi adatot. A kezelt tenyészetekre és a kontrolltenyészetekre vonatkozó adatoknak ki kell terjedniük: (1) a szelekciós ágenssel és anélkül leültetett sejtek számára (a mutánsok kiválasztása céljából történő leültetés időpontjában), valamint (2) a szelekciós ágenst tartalmazó és nem tartalmazó lemezeken számolt telepek számára (illetve mikrotiter módszer használata esetén a telepet nem tartalmazó lyukak számára). A mutációs gyakoriság kiszámításának alapja a mutáns telepek száma (a szelekciós ágenst tartalmazó lemezeken) kiigazítva a (szelekciós ágenst nem tartalmazó lemezeken mért) kolóniaképző képességgel. A mutációs gyakoriságot az 1 millió életképes sejtre jutó mutáns sejtek számaként kell kifejezni (a fogalommeghatározásokat lásd az 1. függelékben).

37.

Fel kell jegyezni az egyes tenyészetekhez tartozó adatokat. Ezenkívül az összes adatot össze kell foglalni táblázatos formában.

Elfogadhatósági kritériumok

38.

Egy-egy vizsgálat elfogadhatósága az alábbi kritériumokon alapul:

A párhuzamos negatív kontroll a 33. pont szerint foglalható bele a laboratórium negatív történeti kontrollokat tartalmazó adatbázisába.

A párhuzamos pozitív kontrolloknak (lásd a 24. pontot) a pozitív történeti kontrollokat tartalmazó adatbázisban generált válaszreakciókkal összeegyeztethető válaszokat, valamint a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést kell előidézniük.

Két kísérleti körülmény (metabolikus aktiválással és metabolikus aktiválás nélkül történő) vizsgálatára került sor, kivéve, ha az egyik pozitív eredményeket hozott (lásd a 25. pontot).

Megfelelő számú sejt és koncentráció elemezhető (25., 26. és 19. pont).

A legmagasabb koncentráció kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 20., 21. és 22. pontban ismertetett kritériumokkal.

Az eredmények értékelése és értelmezése

39.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha a vizsgált kísérleti körülmények bármelyikében:

legalább az egyik vizsgálati koncentráció statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy a növekedés a koncentrációval összefügg,

ezen eredmények bármelyike a negatív történeti kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértéken) kívül esik; lásd a 33. pontot).

Ezen kritériumok mindegyikének teljesülése esetén úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben képes génmutációkat előidézni a tenyésztett emlőssejtekben. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (46) (48).

40.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény esetén fennáll, hogy:

a vizsgálati koncentrációk egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva, a megfelelő trendpróbával végzett értékelés nem mutat koncentrációval összefüggő növekedést,

valamennyi eredmény a negatív történeti kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértéken) belül van; lásd a 33. pontot).

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben nem képes génmutációkat előidézni a tenyésztett emlőssejtekben.

41.

Az egyértelműen pozitív vagy negatív válasz igazolása nem követelmény.

42.

Olyan esetekben, amikor a válaszreakció – a fentiekben leírtak szerint – nem egyértelműen negatív vagy pozitív, illetve egy adott eredmény biológiai relevanciája megállapításának alátámasztása érdekében az adatokat szakértői vélemény és/vagy további vizsgálatok alapján kell értékelni. Hasznos lehet egy megismételt kísérlet lehetőleg módosított kísérleti körülmények (például a koncentrációk felosztása, más [S9-es koncentráció vagy S9 eredetű] metabolikus aktiválási feltételek) melletti elvégzése.

43.

Ritka esetekben az adatkészlet még további vizsgálatok után is eleve kizárja a pozitív vagy negatív eredményekre vonatkozó következtetést. Ezért a vizsgálati vegyi anyag válaszreakcióját kétértelműnek kell minősíteni (amit úgy kell értelmezni, hogy egyenlő valószínűséggel tekinthető pozitívnak és negatívnak).

Vizsgálati jelentés

44.

A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Vizsgálati vegyi anyag:

eredet, gyártási szám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben, ha ismert;

adott esetben a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás mérése abban a tápfolyadékban, amelyhez a vizsgálati vegyi anyagot hozzáadták.

 

Egy összetevőből álló anyag:

fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján

 

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi

előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai révén jellemezve.

 

Oldószer:

az oldószer kiválasztásának indokolása;

az oldószernek a végleges tápfolyadékon belüli aránya.

 

Sejtek:

 

Laboratóriumi törzstenyészetek esetén:

a sejtvonalak típusa és eredete;

a passzálások száma, ha rendelkezésre áll, és története a laboratóriumban;

a kariotípus jellemzői és/vagy a modális kromoszómaszám;

a sejttenyészetek fenntartásának módszerei.

a mikoplazmamentesség;

sejt megduplázódási ideje.

 

Vizsgálati körülmények:

a koncentrációk kiválasztásának és a tenyészetek számának indokolása, beleértve például a citotoxicitási adatokat és az oldhatóságra vonatkozó korlátokat;

a közeg összetétele, CO2-koncentráció, páratartalom;

a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja a tápfolyadékon belüli végső koncentrációjaként kifejezve (például μg vagy mg/a tápfolyadék ml-e vagy mM-ja);

a tápfolyadékhoz adott oldószer és vizsgálati vegyi anyag koncentrációja (és/vagy térfogata);

inkubációs hőmérséklet;

inkubációs idő;

a kezelés időtartama;

sejtsűrűség a kezelés időtartama alatt;

a metabolikus aktivációs rendszer típusa és összetétele (az S9 eredete, az S9 keverék elkészítési módszerei, az S9 keverék és az S9 koncentrációja vagy térfogata a végleges tápfolyadékban, az S9 minőségellenőrzése);

pozitív és negatív kontrollként szolgáló anyagok, végső koncentrációk az egyes kezelési körülmények esetén;

az expressziós időszak hossza (beleértve a leültetett sejtek számát, a szubkultúrákat és a tápfolyadékok cseréjét, ha szükséges);

a szelekciós ágens neve és koncentrációja;

a vizsgálatok elfogadhatósági kritériumai;

az életképes és mutáns sejtek számának megállapítására használt módszerek;

a citotoxicitás mérésére alkalmazott módszerek;

a citotoxicitás és az alkalmazott módszer szempontjából lényeges kiegészítő információk;

a leültetést követően végzett inkubálás időtartama;

azok a kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhetőnek tekintendők-e;

a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás meghatározására alkalmazott módszerek.

 

Eredmények:

az egyes tenyészetek esetében kezelt sejtek és átültetett sejtek száma;

a citotoxicitás mérése és egyéb megfigyelések, ha vannak ilyenek;

a kicsapódás jelei és a meghatározás időpontja;

a szelektív és nem szelektív folyadékba leültetett sejtek száma;

a telepek száma a nem szelektív közegben és a rezisztens telepek száma a szelektív közegben, valamint az ezeknél tapasztalható mutációs gyakoriság;

amennyiben lehetséges, a koncentráció-válasz összefüggés;

a párhuzamos negatív (oldószeres) és a pozitív kontrollokra vonatkozó adatok (koncentrációk és oldószerek);

a történeti negatív (oldószeres) és a pozitív kontrollokra vonatkozó adatok, a tartományok, az átlagok, a szórás és a konfidencia-intervallum (pl. 95 %) megadásával, továbbá az adatok száma;

statisztikai elemzések (az egyes tenyészetek és adott esetben az összevont párhuzamos tenyészetek tekintetében), valamint p-értékek, ha meghatározásra kerültek.

 

Az eredmények értékelése.

 

Következtetések

SZAKIRODALOM

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Párizs.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 66-101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616-9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Előkészület alatt álló kézirat).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (szerk.), Elsevier, North-Holland, 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). A környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló stockholmi egyezmény, az ENSZ Környezetvédelmi Programja (UNEP). Elérhető a következő címen: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 91-103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen., 5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Hozzáférés a Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezettől kérhető.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Ismeretlen vagy változó összetételű vegyi anyagok, komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok: UVCB-k,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Elérhető a következő címen:[https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (szerk.) Cambridge University Press, Cambridge, 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Bázispár-szubsztitúciót okozó mutagének: azok a vegyi anyagok, amelyek a bázispárok szubsztitúcióját okozzák a DNS-ben.

Vegyi anyag: anyag vagy keverék.

Kolóniaképző képesség: azon alacsony sűrűséggel leültetett sejtek százalékaránya, amelyek képesek megszámolható teleppé fejlődni.

Koncentrációk: a vizsgálati vegyi anyagnak a tápfolyadékon belüli végső koncentrációira utalnak.

Citotoxicitás: az e vizsgálati módszerbe tartozó vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek relatív túlélésének csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd az adott pontot).

Forward (előremutató) mutáció: a mutáns alak szülőktől származó típusától eltérő olyan génmutáció, amely a kódolt protein enzimaktivitásának vagy funkciójának változását vagy elvesztését eredményezi.

Frameshiftet okozó mutagének: azok a vegyi anyagok, amelyek egy vagy több bázispár addícióját vagy delécióját okozzák a DNS-ben.

Genotoxikus: általános kifejezés, amely magába foglalja a DNS- vagy kromoszómakárosodás valamennyi típusát, köztük a DNS-töréseket, adduktok képződését, átrendeződéseket, mutációkat, kromoszómaaberrációkat és aneuploidiát. A genotoxikus hatások nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszómakárosodást.

HAT-tápfolyadék: hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmazó tápfolyadék, amelyet Hprt-mutánsok szelektálására alkalmaznak.

Mitotikus rekombináció: a mitózis során a homológ kromatidok rekombinációja, ami kettős szálú DNS-töréseket vagy a heterozigótaság elvesztését okozhatja.

MPA-tápfolyadék:: xantint, adenint, timidint, aminopterint és mikofenolsavat tartalmazó tápfolyadék, amelyet Xprt-mutánsok szelektálására használnak.

Mutagén: örökletes elváltozást idéz elő a génekben lévő DNS-bázispár-szekvenciá(k)ban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszómaaberrációk).

Mutációs gyakoriság: a megfigyelt mutáns telepek számának és a szelektív tápfolyadékba leültetett sejtek számának aránya, kiigazítva a szelekció idején mért kolóniaképző képességgel (vagy életképességgel).

Fenotípusos expresszió ideje: a kezelést követő időtartam, amely során a genetikai változás rögzül a genomban, és a korábban meglévő géntermékek olyan mértékben kiürülnek, hogy a fenotípus-tulajdonság megváltozik.

Relatív túlélés: A relatív túlélést a kezelés okozta citotoxicitás mértékeként használják. A relatív túlélés a közvetlenül a kezelést követően átültetett sejtek kolóniaképző képessége, kiigazítva a kezelés során bekövetkezett sejtpusztulással, majd összevetve a negatív kontrollok (túlélési arányuk 100 %-nak tekintendő) kolóniaképző képességével.

S9 májfrakciók: 9 000 g centrifugálás utáni májhomogenátum felülúszója, azaz a nyers májextraktum.

S9 keverék: az S9 májfrakció és a metabolikus enzimaktivitáshoz szükséges kofaktorok keveréke.

Oldószeres kontroll: a csak a vizsgálati vegyi anyag feloldására használatos oldószert tartalmazó kontrolltenyészetek meghatározására szolgáló általános kifejezés.

Vizsgálati vegyi anyag: bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Nem kezelt kontroll: nem kezelt (azaz sem a vizsgálati vegyi anyaggal, sem oldószerrel nem kezelt), de a vizsgálati vegyi anyagot befogadó tenyészetekkel párhuzamosan és azonos módon feldolgozott tenyészetek.

UVCB: ismeretlen vagy változó összetételű vegyi anyagok, komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

2. függelék

A CITOTOXICITÁS ÉS A MUTÁCIÓS GYAKORISÁG MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ KÉPLETEK

A citotoxicitást a relatív túlélés alapján kell értékelni, ami a közvetlenül a kezelést követően átültetett sejtek kolóniaképző képessége (CE), kiigazítva a kezelés során bekövetkezett sejtpusztulással, majd összevetve a negatív kontrollok (túlélési arányuk 100 %-nak tekintendő) kiigazított kolóniaképző képességével (lásd alább a relatív túlélés kiszámítására szolgáló képletet).

A vizsgálati vegyi anyaggal kezelt tenyészetek kiigazított kolóniaképző készségét az alábbi módon kell meghatározni:

Formula

A vizsgálati vegyi anyaggal kezelt tenyészetek relatív túlélését az alábbi módon kell meghatározni:

Formula

A mutációs gyakoriság a szelektív tápfolyadékban lévő mutáns telepek kolóniaképző képességének és a nem szelektív tápfolyadék kolóniaképző képességének aránya, amelyet ugyanazon tenyészetre vonatkozva kell meghatározni, a szelekció időpontjában.

Formula

Amikor lemezeket alkalmaznak a kolóniaképző képesség meghatározásához:

Kolóniaképző képesség = Telepek száma/leültetett sejtek száma.

Amikor mikrotiter lemezeket alkalmaznak a kolóniaképző képesség meghatározásához:

A mikrotiter lemezek egyes lyukaiban lévő telepek száma Poisson-eloszláson alapul.

Kolóniaképző képesség = -LnP(0)/az egyes lyukakba leültetett sejtek száma

Ahol a -LnP(0) az üres lyukak valószínűsíthető száma a leoltott lyukak számához képest, és az alábbi képlettel határozható meg:

LnP(0) = -Ln (üres lyukak száma/leültetett lyukak száma)

3.

A B. részben a B.22. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.22.   DOMINÁNS LETÁLIS VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 478. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. A vizsgálati módszereket a tudományos fejlődés, a változó szabályozási igények és az állatok kíméletére irányuló megfontolások figyelembevételével rendszeresen felülvizsgálják. A vizsgálati módszer jelenlegi felülvizsgált változata tükrözi a vizsgálat csaknem harminc éves alkalmazása során szerzett tapasztalatokat, valamint azon alapul, hogy ez a vizsgálat beépíthető más toxicitási vizsgálatokba, például fejlődési, reprodukciós vagy genotoxicitási vizsgálatokba, vagy azokkal együtt alkalmazható; mindazonáltal a vizsgálat – korlátaiból és a kísérleti állatok nagy számából fakadóan – nem alkalmas elsődleges módszerként való használatra, ehelyett kiegészítő vizsgálati módszerként alkalmazható kizárólag olyan esetekben, amikor más módszerrel nem lehet eleget tenni a szabályozási követelményeknek. A toxicitási vizsgálatok kombinálása révén jelentősen csökkenthető a toxicitási vizsgálatokban alkalmazandó állatok száma. Az OECD kidolgozott egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, az OECD genetikai toxikológiára vonatkozó vizsgálati iránymutatásainak közelmúltbeli változásait áttekintő dokumentumot (1).

2.

A domináns letális vizsgálat célja annak kimutatása, hogy egy adott vegyi anyag okoz-e a csírasejtekben kromoszóma-rendellenességre visszavezethető mutációkat. Emellett a domináns letális vizsgálat a genotoxicitás értékelése szempontjából is releváns, mert az in vivo metabolizmus, valamint a farmakokinetikai és a DNS-hibajavító eljárások tényezői – jóllehet fajonként eltérnek – aktívak és hozzájárulnak a reakcióhoz. A vizsgálati vegyi anyag beadását követően kimutatott domináns letális mutáció azt jelzi, hogy az adott vizsgálati vegyi anyag hatást gyakorolt a vizsgált állat csíraszöveteire.

3.

A domináns letális mutációk embrionális, illetve magzati elhalást okoznak. A vizsgálati vegyi anyag beadását követően kimutatott domináns letális mutáció azt jelzi, hogy az adott vizsgálati vegyi anyag a vizsgált állat esetében hatást gyakorolt a csírasejtekre.

4.

A domináns letális vizsgálat hasznos a szomatikus in vivo végpontok használatával végzett vizsgálatok pozitív eredményének megerősítésére, továbbá releváns végpontja a csírasejtvonalon keresztül átörökített genetikai betegségekben rejlő, embereket érintő veszélyek és kockázatok előrejelzésének. A vizsgálat ugyanakkor munkaigényes, és jelentős mennyiségű állat szükséges hozzá; következésképpen elvégzése rendkívül költséges és időigényes. Mivel a domináns letális mutációk spontán gyakorisága meglehetősen nagy, a vizsgálat általában korlátozott érzékenységgel bír a mutációs gyakoriság enyhe növekedésének észlelése terén.

5.

A kulcsfontosságú fogalmak meghatározásai az 1. függelékben találhatók.

ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK

6.

A vizsgálatot leginkább egereken végzik (2) (3) (4), de egyes esetekben – amennyiben tudományosan indokolt – más fajok, például patkányok (5) (6) (7) (8) is megfelelőek lehetnek. A domináns letális hatások általában nagymérvű kromoszómakárosodásra (szerkezeti és számbeli rendellenességekre) vezethetők vissza (9) (10) (11), de a génmutáció sem zárható ki az okok közül. A domináns letális mutáció magában a csírasejtben, illetve a megtermékenyítést követően a korai embrióban alakul ki, az ivarsejt hibás működését nem idézi elő, ugyanakkor a megtermékenyített pete vagy a fejlődő embrió elhalását okozza.

7.

Minden egyes hímet megfelelő időközönként egymás után szűz nőstényekkel pároztatnak. A kezelést követő pároztatások száma a domináns letális vizsgálat végső céljától függ (23. pont), és azt úgy kell meghatározni, hogy a hím csírasejt érésének összes fázisát értékelni lehessen a domináns letális hatás szempontjából (12).

8.

Ha létezik arra vonatkozó bizonyíték, hogy a vizsgálati vegyi anyag vagy annak metabolitja(i) nem éri(k) el a herét, e vizsgálat alkalmazása nem megfelelő.

A VIZSGÁLAT ELVE

9.

Általában hím állatokat kezelnek megfelelő expozíciós úton a vizsgálati vegyi anyaggal, és a kezelt állatokat kezeletlen szűz nőstényekkel pároztatják. Egymás után következő pároztatási időszakok alkalmazásával különféle csírasejttípusok vizsgálhatók. A pároztatást követően megfelelő idő elteltével a nőstényeken eutanáziát hajtanak végre, majd méhüket megvizsgálva megállapítják a beágyazódások, valamint az élő és elhalt embriók számát. Egy adott vizsgálati vegyi anyag domináns letalitásának meghatározásához egybevetik a kezelt csoportban egy nőstényre jutó élő, beágyazódott embriók számát a vivőanyagos/oldószeres kontrollcsoportban egy nőstényre jutó élő, beágyazódott embriók számával. Az egy nőstényre jutó élettelen, beágyazódott embriók számának növekedése a kezelt csoportban a kontrollcsoportban tapasztalható hasonló adathoz képest a vizsgálati vegyi anyag által kiváltott, beágyazódás utáni veszteséget tükrözi. A beágyazódás utáni veszteség kiszámításához meghatározzák az elhalt és az összes beágyazódott embrió arányát a kezelt csoportban, majd összevetik azt a kontrollcsoport hasonló adatával. A beágyazódás előtti veszteség úgy becsülhető meg, hogy összehasonlítják a sárgatestek számából kivont összes beágyazódott embrió számát vagy az egy nőstényre jutó összes beágyazódott embrió számát a kezelt és kontrollcsoportokban.

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

10.

A vizsgálatban való jártasság igazolása érdekében a laboratóriumoknak bizonyítottan képesnek kell lenniük a közzétett adatok (például (13) (14) (15) (16) (17) (18)) szerinti domináns letalitási gyakoriság reprodukálására pozitív kontrollként szolgáló – például az 1. táblázatban felsorolt – anyagokkal (ideértve a gyenge reakciókat is) és vivőanyagos kontrollokkal, valamint a negatív kontrollokból származó adatoknak olyan gyakoriságot kell mutatniuk, amely összhangban áll az elfogadható adattartománnyal (lásd a fenti referenciákat) vagy a laboratóriumi történeti kontrollok eloszlásával, ha rendelkezésre állnak történeti adatok.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

11.

Egészséges, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. Általában egereket használnak, bár a patkányok is megfelelőek lehetnek. Bármely egyéb megfelelő emlősfaj használható, ha a jelentésben szerepel tudományos indokolás.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

12.

Rágcsálók esetében a kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 22o C-nak (±3 ° C) kell lennie. Bár ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, legyen legalább 40 %, és a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. Ha agresszív viselkedés nem várható és nem tapasztalható, a rágcsálókat kezelés és pároztatás előtt azonos nemű kis (legfeljebb öt) egyedből álló csoportokban, lehetőleg szilárd, megfelelő környezetgazdagítással ellátott ketrecekben kell tartani. Ha tudományos szempontból indokolt, az állatok egyedileg is elhelyezhetők.

Az állatok előkészítése

13.

Egészséges és ivarérett felnőtt hím és nőstény állatokat osztanak véletlenszerűen a kontroll- és kezelt csoportokba. Az egyes állatokat humánus, minimálisan invazív módszerrel (például gyűrűzéssel, címkézéssel, mikrocsip beültetésével vagy biometrikus azonosítással, de a lábujj vagy a fül kilyukasztása nélkül) egyedi azonosítóval kell ellátni, és legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. A pozitív kontrollal és a vizsgálati vegyi anyaggal való keresztszennyeződés kerülendő. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át.

A dózisok előkészítése

14.

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő oldószerben vagy vivőanyagban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Vizsgálati körülmények

Oldószer/Vivőanyag

15.

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat a választott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan anyag, amelyről feltehető, hogy kémiai reakcióba fog lépni a vizsgálati vegyi anyaggal. Jól ismert oldószerektől eltérő oldószerek/vivőanyagok alkalmazása esetén azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát ajánlatos megfontolni. Általánosan használt, kompatibilis oldószer/vivőanyag például többek között a víz, a fiziológiás sóoldat, a metil-cellulóz-oldat, a karboximetil-cellulóz-nátriumsó-oldat, az olívaolaj és a kukoricaolaj.

Pozitív kontrollok

16.

Egyidejűleg alkalmazott pozitív kontrollállatokat mindig kell alkalmazni, kivéve ha a laboratórium igazolta a vizsgálat lebonyolításában szerzett jártasságát, és a közelmúltban (például az elmúlt 5 évben) rutinszerűen használta a vizsgálatot. Ugyanakkor a pozitív kontrollcsoportba tartozó állatok esetében nem szükséges a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt állatokéval megegyező adagolási módot alkalmazni, vagy mintát venni valamennyi pároztatási időszakokban. Pozitív kontrollként olyan anyagokat kell használni, amelyekről ismert, hogy a vizsgálati feltételek mellett domináns letális hatást fejtenek ki. A kezelés kivételével a kontrollcsoportokba osztott állatokat azonos bánásmódban kell részesíteni a kezelt csoportokban lévő állatokkal.

17.

A pozitív kontrollanyagok dózisát úgy kell megválasztani, hogy enyhe vagy mérsékelt hatást fejtsenek ki, lehetővé téve a vizsgálat teljesítőképességének és érzékenységének kritikus értékelését, ugyanakkor megbízhatóan pozitív domináns letális hatást eredményezzenek. A pozitív kontrollként szolgáló anyagokra és a megfelelő dózisokra az 1. táblázat tartalmaz példákat.

1. táblázat

Példák pozitív kontrollként szolgáló anyagokra

Anyag [CAS-szám]

(hivatkozási szám)

Effektív dózis tartománya (mg/kg)

(rágcsáló fajok)

Adagolás időtartama (napokban)

Trietilén-melamin [51-18-3] (15)

0,25 (egerek)

1

Ciklofoszfamid [50-18-0] (19)

50–150 (egerek)

5

Ciklofoszfamid [50-18-0] (5)

25–100 (patkányok)

1

Etil-metánszulfonát[62-50-0] (13)

100-300 (egerek)

5

Akrilamid monomer [79-06-1] (17)

50 (egerek)

5

Klórambucil [305-03-3] (14)

25 (egerek)

1

Negatív kontrollok

18.

Minden mintavételi időpontban negatív kontrollállatokat is kell használni, amelyeket csak oldószerrel vagy vivőanyaggal kezeltek, és a kezelésük egyébiránt ugyanolyan módon történik, mint a kezelt csoportoké (20). Ha nem állnak rendelkezésre olyan történeti vagy publikált kontrolladatok, amelyek igazolják, hogy a választott oldószer/vivőanyag nem idéz elő domináns letális vagy egyéb káros hatásokat, a vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében nem kezelt kontrollállatokat is alkalmazni kell minden mintavételi időpontban.

ELJÁRÁS

Az állatok száma

19.

Minden egyes hímet előre meghatározott megfelelő időközönként (például hetente egyszer, 21. és 23. pont) egymás után, lehetőleg egyetlen szűz nősténnyel pároztatnak. A hímek csoportonkénti számát előre meg kell határozni, méghozzá úgy, hogy (az egyes pároztatási időszakokban pároztatott nőstényekkel együtt) kellő létszámban legyenek ahhoz, hogy megfelelő statisztikai erőt képviseljenek a domináns letalitási gyakoriság legalább megduplázódásához (44. pont).

20.

Az egyes pároztatási időszakokban rendelkezésre álló nőstények számát szintén az általuk képviselt statisztikai erő alapján kell előre meghatározni úgy, hogy lehetővé tudják tenni a domináns letalitási gyakoriság legalább megduplázódásának észlelését (vagyis elegendő vemhes nőstény legyen legalább összesen 400 beágyazott embrió biztosításához) (20) (21) (22) (23), illetve hogy elemzési egységenként (vagyis adagolásonkénti pároztatott csoportként) legalább egy elhalt, beágyazódott embrióra lehessen számítani (24).

Beadási időszak és pároztatási időszakok

21.

A kezelés utáni pároztatási időszakok számát a kezelési ütemterv határozza meg, amelynek biztosítania kell, hogy a hím csírasejt érésének minden fázisát értékelni lehessen a domináns letális hatás előidézése szempontjából (12) (25). A legfeljebb napi öt dózis beadásával járó egyszeri kezelés esetén az utolsó kezelés időpontjától számítva 8 (egereknél) vagy 10 (patkányoknál) pároztatást kell végrehajtani az egyhetes időszakok alatt. Többszöri dózis beadásakor a pároztatási időszakok száma a beadási időszak növelésével arányosan csökkenthető, amennyiben értékelni lehet a spermaképződés valamennyi fázisát (például egy 28 napos expozíciós időszak után csupán 4 hetes pároztatás elegendő az egerek összes spermaképződési fázisának elemzéséhez). Minden kezelési és pároztatási ütemtervet tudományosan indokolni kell.

22.

A nőstényeknek legalább egy ivari ciklus erejéig a hímekkel kell maradniuk (egy hét például mind az egereknél, mind a patkányoknál lefed egy ivari ciklust). Az egyhetes időköz alatt nem párosított nőstények felhasználhatók a következő pároztatási időszakban. Alternatív megoldásként a nőstények mindaddig a hímekkel tarthatók, amíg a párzásra sor nem került, ami a hüvelyben a sperma jelenlétéből, illetve a hüvelyi dugó megjelenéséből határozható meg.

23.

Az expozíciós és pároztatási eljárás függ a domináns letalitási vizsgálat végső céljától. Amennyiben a cél annak meghatározása, hogy egy adott vegyi anyag önmagában okoz-e domináns letális mutációt, az elfogadott módszer alapján az expozíciónak ki kell terjednie a teljes spermaképződési ciklusra (ami egerek esetén heti 5–7 kezeléssel 7 hét), és egyszer kell pároztatni, a ciklus végén. Ha azonban a cél a domináns letalitás előidézésére érzékeny csírasejttípus meghatározása, ajánlatos inkább egyszeri vagy 5 napon át tartó expozíciót követően egyhetes időközökben pároztatni.

Dózisok

24.

Ha előzetes range-finding studyvizsgálatra kerül sor amiatt, mert már nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok megválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek, nemek és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyeket a fő vizsgálatban fognak használni (26). A vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely anélkül, hogy vizsgálatkorlátozó toxicitást mutatna, a vizsgálati időszak tartamához viszonyítva a legmagasabb tolerált dózis (például rendellenes viselkedést vagy reakciókat, enyhe testtömeg-csökkenést vagy vérképzőrendszert érintő citotoxicitást vált ki), de elhullást, illetve humánus eutanáziát igénylő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy stresszt nem idéz elő (27).

25.

Az MTD nem befolyásolhatja kedvezőtlenül a pároztatás sikerét sem (21).

26.

A kis, nem mérgező dózisban specifikus biológiai aktivitást mutató vizsgálati vegyi anyagok (mint például a hormonok és a mitogének), valamint azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, kivételek lehetnek a dózismeghatározási követelmények alól, és eseti alapon kell őket értékelni.

27.

Annak érdekében, hogy dózis–válasz adatokat lehessen szerezni, a teljes vizsgálatnak egy negatív kontrollcsoportot, valamint legalább három dózist kell tartalmaznia, ahol a dózisok közötti szorzótényező általában 2, de legfeljebb 4. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást a dózistartomány-kereső vizsgálatban vagy meglévő adatok alapján, egyszeri adagolás esetén a legmagasabb dózisnak 2 000 mg/testtömegkilogrammnak kell lennie. Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, az MTD-nek a beadott legmagasabb dózisnak kell lennie, és a használt dózisoknak lehetőleg le kell fedniük a maximálistól az alacsony mértékű toxicitást okozó vagy toxicitást egyáltalán nem okozó dózisig terjedő tartományt. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást, legalább 14 napig tartó beadási időszak esetén, a legmagasabb dózisnak 1 000 mg/testtömeg kg/napnak, 14 napnál rövidebb beadási időszak esetében pedig 2 000 mg/testtömeg kg/napnak kell lennie.

A dózisok beadása

28.

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak – például takarmány, ivóvíz, szubkután, intravénás, topikális, inhalációs, orális (gyomorszondával) vagy implantáció – is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet(ek) megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció általában nem ajánlott, mivel az nem tervezett emberi expozíciós út, és kizárólag tudományos indokolással alkalmazható. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmányba vagy ivóvízbe keverik, különösen egyszeri adagolás esetén ügyelni kell arra, hogy a táplálék és a víz fogyasztása és a pároztatás közötti idő elegendő legyen a hatások kimutathatóságához (31. pont). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata rendszerint nem haladhatja meg az 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát (ha azt az állatjóléti tárgyú jogszabályok lehetővé teszik) meg kell indokolni. A koncentráció megfelelő beállításával kell minimalizálni a beadott térfogat variabilitását, és így kell biztosítani, hogy minden dózisnál azonos legyen a testtömegarányos térfogat.

Megfigyelések

29.

A kísérleti állatok esetében általános klinikai megfigyeléseket kell tenni, és a klinikai tüneteket legalább naponta egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban rögzíteni kell, továbbá figyelembe kell venni az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Az adagolási időszakban naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot morbiditás és mortalitás szempontjából. Minden állat tömegét le kell mérni a vizsgálat megkezdésekor, az ismételt dózisú vizsgálatok esetén hetente legalább egyszer, valamint az állatok végleges elaltatásakor. A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokat a vizsgálati időszak befejezése előtt végleg el kell altatni (27).

A szövetek gyűjtése és feldolgozása

30.

A nőstényeket a vemhesség második felében altatják el véglegesen, az egereket a vemhesség 13. napján, a patkányokat pedig a vemhesség 14–15. napján. Megvizsgálják, hogy tapasztalhatók-e méhükben domináns letális hatások, ehhez meghatározzák a beágyazódások, az élő és elhalt embriók, valamint a sárgatestek számát.

31.

A méhszarvakat és a petefészkeket átvizsgálják, hogy megszámlálják a sárgatesteket, valamint eltávolítsák és megszámolják a magzatokat és megmérjék tömegüket. Ügyelni kell arra, hogy a méhen belül feltárják az élő magzatok által takart elhalásokat és meghatározzák számukat. A magzati mortalitást fel kell jegyezni. Rögzíteni kell emellett a sikeresen megtermékenyített nőstények számát, továbbá az összes beágyazódás, beágyazódás előtti veszteség és beágyazódás utáni mortalitás számát (a korai és kései felszívódásokkal egyetemben). A látható magzatok ezenfelül legalább két hétig tartósíthatók Bouin-féle rögzítőszerben, hogy meg lehessen vizsgálni a jelentősebb külső fejlődési rendellenességeket (28), ami kiegészítő adatokat szolgáltathat a vizsgálati anyag reprodukciót és fejlődést érintő hatásairól.

ADATOK ÉS JELENTÉS

Az eredmények feldolgozása

32.

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, bemutatva a pároztatott hímek számát, a vemhes nőstények számát, valamint a nem vemhes nőstények számát. Minden párzás eredményét egyedileg kell jelenteni, egyenként azonosítva a hímet és a nőstényt. A kezelt hímek esetében fel kell jegyezni a pároztatási időszakot és a dózist, és minden nőstény esetében fel kell jegyezni a beágyazódott élő és elhalt embriók számát.

33.

A beágyazódás utáni veszteség kiszámításához meg kell határozni az elhalt és az összes beágyazódott embrió arányát a kezelt csoportban, majd össze kell vetni azt a vivőanyagos/oldószeres kontrollcsoport hasonló adatával.

34.

A beágyazódás előtti veszteség a sárgatestek számának és a beágyazódások számának különbségéből vagy az egy nőstényre jutó átlagos beágyazódások számának a kontrollpároztatásokhoz viszonyított fogyatkozásából számítható ki. Ha vizsgálták a beágyazódás előtti veszteséget, azt is jelenteni kell.

35.

A domináns letális tényező a következőképpen becsülhető meg: (beágyazódás utáni elhalálozások/összes beágyazódás nőstényenként) × 100.

36.

A toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat (a 29. pont alapján) jelenteni kell.

Elfogadhatósági kritériumok

37.

Az alábbi kritériumok határozzák meg a vizsgálat elfogadhatóságát:

A párhuzamos negatív kontroll adatai összhangban vannak a negatív történeti kontrolladatokra vonatkozólag közzétett normákkal és – amennyiben rendelkezésre állnak – a laboratórium történeti kontrolladataival (lásd a 10. és a 18. pontot).

A párhuzamos pozitív kontrollok olyan válaszreakciókat generálnak, amelyek összhangban vannak a pozitív történeti kontrolladatokra vonatkozólag közzétett normákkal és – amennyiben rendelkezésre állnak – a laboratórium pozitív történeti kontrollokat tartalmazó adatbázisával, továbbá a negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést idéznek elő (lásd a 17. és a 18. pontot).

Megfelelő számú beágyazódás és dózis képezte elemzés tárgyát (20. pont).

A legmagasabb dózis kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 24. és 27. pontban ismertetett kritériumoknak.

Az eredmények értékelése és értelmezése

38.

Legalább három kezelt dóziscsoportot kell megvizsgálni annak érdekében, hogy elegendő adat álljon rendelkezésre a dózis–válasz elemzéshez.

39.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

legalább az egyik vizsgálati dózis statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva;

a növekedés dózisfüggő legalább egy kísérleti körülménynél (például hetes pároztatási időszak) megfelelő vizsgálattal történő értékelés alapján; valamint

ezen eredmények bármelyike kívül esik a negatív kontrolladatok elfogadható tartományán vagy a laboratórium negatív történeti kontrolladatainak eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértéken).

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag képes domináns letális mutációkat előidézni a kísérleti állatok csírasejtjeiben. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások leírását a 44. pont tartalmazza; a szakirodalomban további ajánlott statisztikai megközelítések találhatók (20) (21) (22) (24) (29). Az alkalmazott statisztikai teszteknek az állatot kell kísérleti egységnek tekinteniük.

40.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha:

a vizsgálati dózisok egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva;

egyik kísérleti körülmény sem mutat a dózissal összefüggő növekedést; valamint

valamennyi eredmény a negatív kontrolladatok, vagy amennyiben rendelkezésre állnak, a laboratórium negatív történeti kontrolladatainak (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértéken) tartományába esik.

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag nem képes domináns letális mutációkat előidézni a kísérleti állatok csírasejtjeiben.

41.

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

42.

Ha a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, illetve egy adott eredmény (például kismértékű vagy határesethez közelítő növekedés) biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy a meglévő kísérleti adatok további vizsgálataival kell értékelni, például meg kell határozni, hogy a pozitív eredmény kívül esik-e a negatív kontrolladatok elfogadható tartományán vagy a laboratórium történeti negatív kontrolladatain (30).

43.

Ritka esetekben, az adatkészlet még további vizsgálatok után is eleve kizárja a pozitív vagy negatív eredményekre vonatkozó következtetést, ezért kétértelmű reakció lesz a következtetés.

44.

Az alkalmazott statisztikai teszteknek a hím állatot kell kísérleti egységnek tekinteniük. Bár előfordulhat, hogy a számadatok (pl. az egy nőstényre jutó beágyazódások száma) a Poisson-féle eloszlás és/vagy az arányszámok (pl. az elhalt beágyazódott embriók aránya) a binominális eloszlás szerint alakul, az ilyen adatok gyakori jellemzője a túlszóródás (31). Ennek megfelelően a statisztikai elemzésnek először a túl- és alulszóródás mértékét kell tesztelnie, például a Cochran-féle binomiális variancia próbával (32) vagy a Tarone-féle, binominális túlszóródást vizsgáló C(α)-próbával (31) (33). Amennyiben nem mutatható ki eltérés a binomiális eloszlástól, az egyes dózisok egymáshoz való viszonyára vonatkozó trendek vizsgálhatók Cochran-Armitage-féle trendpróbával (34), a kontrollcsoporttal való páronkénti összehasonlításhoz pedig a Fisher-egzakt teszt használható (35). Hasonlóképpen, ha nem tapasztalható eltérés a Poisson-eloszlástól, a számok alakulásának trendjei vizsgálhatók Poisson-regresszióval (36), a kontrollcsoporttal történő páronkénti összevetéshez pedig alkalmazható a Poisson-modell páronkénti kontrasztanalízise (36). Ha az eloszlás szignifikánsan túl- vagy alulbecsült, a nem paraméteres módszerek használata ajánlott (23) (31). Ilyenek a rangsor alapú próbák, például a Jonckheere–Terpstra-féle trendpróba (37) és a vivőanyagos/oldószeres kontrollcsoporttal való páronkénti összehasonlítással végzett Mann–Whitney-féle próbák (38), továbbá a tendencia feltárására és a kontrollcsoporttal történő páronkénti összehasonlításra szolgáló permutációs, újra-mintavételezési és bootstrap-eljárások (31) (39).

45.

A pozitív domináns letális vizsgálat bizonyítékát szolgáltatja annak, hogy a vizsgálati vegyi anyag genotoxicitást idéz elő a vizsgálathoz használt faj kezelt hímjének csírasejtjeiben.

46.

A válaszreakció biológiai jelentőségének értékelésekor támpontot adhat annak mérlegelése, hogy a megfigyelt értékek a kontrollokkal kapott régebbi eredmények tartományába esnek-e (40).

Vizsgálati jelentés

47.

A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia:

Összegzés.

 

Vizsgálati vegyi anyag:

eredet, gyártási szám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben, ha ismert;

adott esetben a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás mérése abban a tápfolyadékban, amelyhez a vizsgálati vegyi anyagot hozzáadták.

 

Egy összetevőből álló anyag:

fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján

 

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai révén jellemezve.

 

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése:

a vivőanyag megválasztásának indokolása;

a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/vivőanyagban, ha ismert;

a takarmány-, ivóvíz- vagy inhalációs készítmények előkészítése;

a készítmények analitikai meghatározásai (pl. stabilitás, homogenitás, névleges koncentráció), ha végeztek ilyen meghatározásokat.

 

Kísérleti állatok:

a felhasznált faj/törzs és megválasztásuk indokolása;

az állatok száma, kora és neme;

az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.;

az állatok egyedi azonosítására szolgáló módszerek;

rövid távú vizsgálatok esetében: az egyes hím állatok testtömege a vizsgálat kezdetekor és végén, egy hétnél hosszabb vizsgálatok esetében: az egyes állatok testtömege a vizsgálat során és a táplálékfelvételük. A testtömegtartományt, az átlagot és a szórást minden egyes csoportnál meg kell adni.

 

Vizsgálati körülmények:

a pozitív és negatív (vivőanyagos/oldószeres) kontrollok adatai;

a dózistartomány-kereső vizsgálat adatai;

a dózisok kiválasztásának indokolása;

a vizsgálati vegyi anyag előkészítésének részletes ismertetése;

a vizsgálati vegyi anyag beadására vonatkozó részletek;

a beadási mód indokolása;

az állati toxicitás mérésére szolgáló módszerek, beleértve adott esetben a kórszövettani vagy hematológiai elemzéseket, illetve az állatok megfigyelésének és a testtömeg mérésének gyakorisága;

negatív eredmény esetén annak ellenőrzésére szolgáló módszerek, hogy a vizsgálati vegyi anyag elérte-e a célszövetet vagy az általános keringési rendszert;

tényleges dózis (mg/testtömeg kg/nap) a vizsgálati vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjából (ppm) és a fogyasztásból számítva, ha alkalmazható;

a táplálék és víz minőségére vonatkozó részletek;

a ketrecek környezetgazdagítására vonatkozó részletek;

a kezelési és mintavételi ütemtervek részletes leírása és kiválasztásuk indokolása;

a fájdalomcsillapítás módja;

az eutanázia módja;

a szövetek izolálására és tartósítására használt eljárások;

valamennyi készlet és reagens beszerzési forrása és gyártási száma (ha elérhető);

a domináns letális hatások számolására szolgáló módszerek;

a pároztatási ütemterv;

a párzás igazolására használt módszer;

az eutanázia időpontja;

a domináns letális hatások értékelésének kritériumai, többek között a sárgatestek, beágyazódások, felszívódások és beágyazódás előtti veszteségek, élő és elhalt beágyazódott embriók száma.

 

Eredmények:

az állatok állapota a vizsgálati időszak előtt és alatt, beleértve a toxicitás jeleit;

a hím egyedek testtömege a kezelési és pároztatási időszakok alatt;

a pároztatott nőstények száma;

a dózis-válasz összefüggés, ahol lehetséges;

a párhuzamos és negatív történeti kontrolladatok tartományokkal, átlagértékekkel és szórásokkal;

az egyidejűleg elvégzett pozitív kontrollokra vonatkozó adatok;

az egyes anyaállatok táblázatba foglalt adatai: az egy anyaállatra jutó sárgatestek száma; az egy anyaállatra jutó beágyazódások száma; az egy anyaállatra jutó felszívódások és beágyazódás előtti veszteségek száma; az egy anyaállatra jutó élő beágyazódott embriók száma; az egy anyaállatra jutó elhalt beágyazódott embriók száma; a magzatok testtömege;

a fenti adatok pároztatási időszakonkénti és dózisonkénti összefoglalása, a domináns letalitás gyakoriságával;

statisztikai elemzések és alkalmazott módszerek.

 

Az eredmények értékelése.

 

Következtetés.

SZAKIRODALOM

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Párizs.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group „Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352, 159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20, 325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)

Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)

James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)

Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Vegyi anyag: anyag vagy keverék.

Sárgatest (corpus luteum): hormontermelő képződmény, amely a petefészekben alakul ki a petét kilökő tüsző helyén. A petefészkekben jelen lévő sárgatestek száma megegyezik a peteérés során keletkezett peték számával.

Domináns letális mutáció: a csírasejtben vagy a megtermékenyítést követően létrejövő mutáció, amely az embrió vagy a magzat elhalását okozza.

Termékenységi mutató: a pároztatott vemhes nőstények száma a pároztatott nőstények számához képest.

Pároztatási időszak: a kezelés vége és a kezelt hímek pároztatása között eltelő idő. Az időköz szabályozása révén felmérhetők a különböző csírasejttípusokra gyakorolt kémiai hatások. Az expozíció végét követő 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. és 8. hét során zajló egér pároztatásoknál mérhetők a spermiumot, kondenzált spermatidokat, kerek spermatidokat, pachitén spermatocitákat, korai spermatocitákat, differenciálódott spermatogóniumokat, differenciálódó spermatogóniumokat és csírasejt spermatogóniumokat ért hatások.

Beágyazódás előtti veszteség: a beágyazódások száma és a sárgatestek száma között különbség. Megbecsülhető a kezelt és a kontrollcsoportba beosztott nőstények összes beágyazódásainak összevetése alapján is.

Beágyazódás utáni veszteség: a kezelt csoport elhalt beágyazódásainak aránya összehasonlítva a kontrollcsoport összes beágyazódáshoz viszonyított elhalt beágyazódásaival.

Vizsgálati vegyi anyag: bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

UVCB: ismeretlen vagy változó összetételű vegyi anyagok, komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

2. függelék

A SPERMATOGENEZIS IDEJE EMLŐSÖKNÉL

Image 1

1. ábra: A hím csírasejt (napokban megadott) fejlődési idejének összevetése egér, patkány és ember között. Az árnyékolással jelzett időszakokban nem zajlik DNS-javítás.

A fentiekben látható az egérben, patkányban és emberben lezajló spermatogenezis sematikus ábrája (forrás: Adler, 1996). A nem differenciálódott spermatogóniumok közé tartoznak: A-szimpla; A-párosított; és A-összekapcsolt spermatogóniumok (Hess and de Franca, 2008). Az A-szimpla spermatogóniumokat tekintik a valódi ősivarsejteknek; ezért az ősivarsejtekre gyakorolt hatások felmérése érdekében (egereknél) legalább 49 napnak kell eltelnie a vizsgálati vegyi anyag utolsó beadása és a pároztatás között.

Hivatkozások

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science & Business Media:1-15.

4.

A B. részben a B.23. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.23   SPERMATOGONIÁLIS KROMOSZÓMARENDELLENESSÉG VIZSGÁLATA EMLŐSÖKÖN

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 483. vizsgálati iránymutatásával (2016). A vizsgálati módszereket a tudományos fejlődés, a változó szabályozási igények és az állatok kíméletére irányuló megfontolások figyelembevételével rendszeresen felülvizsgálják. A vizsgálati módszer átdolgozott változata tükrözi a vizsgálat hosszú éveken keresztüli alkalmazása során szerzett tapasztalatokat, valamint felveti annak lehetőségét, hogy ezt a vizsgálatot beépítsék más toxicitási vagy genotoxicitási vizsgálatokba, vagy azokkal együtt alkalmazzák. A toxicitási vizsgálatok kombinálása lehetővé teheti a toxicitási vizsgálatokban használt állatok számának csökkentését. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Az OECD kidolgozott egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, az OECD genetikai toxikológiára vonatkozó vizsgálati iránymutatásainak közelmúltbeli változásait áttekintő dokumentumot (1).

2.

A spermatogonális kromoszómarendellenesség emlősökön történő in vivo vizsgálatának célja azon vegyi anyagok azonosítása, amelyek strukturális kromoszóma-rendellenességeket okoznak emlősök spermatogoniális sejtjeiben (2), (3), (4). Ez a vizsgálat ezenfelül a genotoxicitás értékelése szempontjából is releváns, mert az in vivo metabolizmus, a farmakokinetikai és a DNS-hibajavító eljárások tényezői – jóllehet fajonként eltérnek – aktívak és hozzájárulnak a reakciókhoz. Ezt a vizsgálati módszert nem a számszerű rendellenességek mérésére tervezték; és nem is használják rutinszerűen erre a célra.

3.

E vizsgálat kimutatja (mind a kromoszóma, mind a kromatid típusú) szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket az osztódó spermatogonális ivarsejtekben, ezért várhatóan előre jelezheti az ivarsejtek öröklődő mutációit.

4.

A kulcsfontosságú fogalmak meghatározásai a függelékben találhatók.

ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK

5.

E vizsgálatban rendszerint rágcsálók használatosak, de egyes esetekben – amennyiben tudományosan indokolt – más fajok is megfelelőek lehetnek. A rágcsálók heréiből standard citogenetikai módszerekkel előállított készítmények mitotikus (spermiogoniális) és meiotikus (spermatocita) metafázist idéznek elő. A mitotikus és a meiotikus metafázis a kromoszómák morfológiája alapján határozható meg (4). Ez az in vivo citogenetikus vizsgálat észleli a szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket a spermatogonális mitózisokban. Más célsejtek nem képezik tárgyát e vizsgálati módszernek.

6.

A spermatogóniumokban a kromatid típusú rendellenességek észleléséhez a kezelést követő első mitotikus sejtosztódást kell megvizsgálni, még mielőtt ezek a rendellenességek a következő sejtosztódások során kromoszóma típusú rendellenességekké alakulnának. A kezelt spermatocitákról további információk szerezhetők a diakinézis-metafázis I-ben és metafázis II-ben jelentkező szerkezeti kromoszóma-rendellenességek meiotikus kromoszómaelemzésével.

7.

A herékben a spermatogóniumok számos generációja van jelen (5), és ezek a különböző ivarsejttípusok a kémiai kezeléssel szembeni érzékenység egész spektrumát átfoghatják. Így tehát az észlelt rendellenességek a kezelt spermatogónium-populációk halmozott válaszát jelentik. A herékből előállított készítményekben fellelhető mitotikus sejtek többsége B spermatogónium, amelyek megközelítőleg 26 órás sejtciklussal rendelkeznek (3).

8.

Ha létezik arra vonatkozó bizonyíték, hogy a vizsgálati vegyi anyag vagy annak metabolitja(i) nem éri(k) el a herét, ez a vizsgálat nem megfelelő.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

9.

Általában az állatokat megfelelő expozíciós úton kezelik a vizsgálati vegyi anyaggal, majd a kezelés után megfelelő időpontban eutanáziát hajtanak végre rajtuk. Az eutanázia előtt az állatokat metafázis-blokkoló szerrel (például kolchicinnel vagy Colcemid®-del) kezelik. Ezután kromoszómapreparátumot hoznak létre az ivarsejtekből és megfestik azokat, majd a metafázisban lévő sejtek elemzésével megállapítják a kromoszómaaberrációkat.

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

10.

A vizsgálatban való jártasság igazolása érdekében a laboratóriumoknak bizonyítottan képesnek kell lenniük reprodukálni a spermatogónium szerkezeti kromoszóma-rendellenességeinek gyakoriságára vonatkozó várható eredményeket pozitív kontrollként szolgáló – például az 1. táblázatban felsorolt – anyagokkal (ideértve a gyenge reakciókat is), valamint a negatív kontrollokból származó adatoknak olyan gyakoriságot kell mutatniuk, amely összhangban áll a szakirodalomban (pl. (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)) közzétett elfogadható adattartománnyal vagy a laboratóriumi kontrollok történeti szórásával, ha vannak történeti adatok.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

11.

Egészséges, fiatal, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. Rendszerint hím egereket használnak; ugyanakkor más megfelelő emlős fajok hímjei is alkalmazhatók, amennyiben az tudományosan indokolt, és lehetővé teszi a vizsgálatnak egy eltérő vizsgálati módszerrel való együttes alkalmazását. Rágcsálóktól eltérő fajok használatának tudományos indokolását közölni kell a jelentésben.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

12.

Rágcsálók esetében a kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 22°C-nak (±3°C) kell lennie. Bár ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, legyen legalább 40 %, és a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltakozásával. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. Ha agresszív viselkedés nem várható, a rágcsálókat kis csoportokban, lehetőleg szilárd aljú, megfelelő környezetgazdagítással ellátott ketrecekben kell tartani (ketrecenként legfeljebb öt egyed tartható). Ha tudományos szempontból indokolt, az állatok egyedileg is elhelyezhetők.

Az állatok előkészítése

13.

A rendszerint egészséges, fiatal, felnőtt (a kezelés kezdetén 8–12 hetes) állatokat használnak, és véletlenszerűen osztják be a kontroll- és a kezelt csoportokba. Az egyes állatokat humánus, minimálisan invazív módszerrel (például gyűrűzéssel, címkézéssel, mikrocsip beültetésével vagy biometrikus azonosítással, de a fül vagy a lábujj kilyukasztása nélkül) egyedi azonosítóval kell ellátni, és legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. A pozitív kontrollal és a vizsgálati vegyi anyaggal való keresztszennyeződés kerülendő. A vizsgálat kezdetén az egyes állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg a ±20 %-ot.

A dózisok előkészítése

14.

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő oldószerben vagy vivőanyagban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Vizsgálati körülmények – oldószer/vivőanyag

15.

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat az alkalmazott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan oldószer/vivőanyag, amely képes kémiai reakcióba lépni a vizsgálati vegyi anyagokkal. Jól ismert oldószerektől eltérő oldószerek/vivőanyagok alkalmazása esetén azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát kell megfontolni. Általánosan használt, kompatibilis oldószer/vivőanyag például többek között a víz, a fiziológiás sóoldat, a metil-cellulóz-oldat, a karboximetil-cellulóz-nátriumsó-oldat, az olívaolaj és a kukoricaolaj. Ha nem állnak rendelkezésre olyan történeti vagy publikált kontrolladatok, amelyek igazolják, hogy a választott atipikus oldószer/vivőanyag nem idéz elő szerkezeti kromoszóma-rendellenességet vagy más káros hatást, az oldószeres/vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében előzetes vizsgálatot kell végezni.

Pozitív kontrollok

16.

Egyidejűleg alkalmazott pozitív kontrollállatokat mindig kell alkalmazni, kivéve ha a laboratórium igazolta a vizsgálat lebonyolításában szerzett jártasságát, és a közelmúltban (például az elmúlt 5 évben) rutinszerűen használta a vizsgálatot. Párhuzamos pozitív kontrollcsoport hiányában minden egyes kísérletben értékelési kontrollokat (fixált és megfestetlen tárgylemezeket) kell alkalmazni. Ezek oly módon kaphatók meg, hogy a vizsgálat értékelésébe beszámítják a vizsgálat lebonyolítása szerinti laboratóriumban rendszeres időközönként (például 6–18 hónaponként) – például a jártasság vizsgálata során, vagy szükség esetén azt követően rendszeresen – pozitív kontrollokkal végzett különálló kísérlettel létrejött és tárolt megfelelő referenciamintákat.

17.

A pozitív kontrollként szolgáló anyagoknak megbízható módon ki kell váltaniuk a szerkezeti kromoszóma-rendellenességekkel rendelkező sejtek spontán szinthez képest kimutathatóan gyakoribbá válását. A pozitív kontrollok dózisát úgy kell megválasztani, hogy a hatások egyértelműek legyenek, de az értékelő ne tudja beazonosítani azonnal a kódolt mintákat. A pozitív kontrollként szolgáló anyagokra az 1. táblázat tartalmaz példákat.

1. táblázat

Példák pozitív kontrollként szolgáló anyagokra

Anyag [CAS-szám] (referenciaszám)

Ciklofoszfamid (monohidrát) [CAS-szám: 50-18-0 (CAS-szám 6055-19-2)] (9)

Ciklohexil-amin [CAS-szám: 108-91-8] (7)

Mitomicin C [CAS-szám: 50-07-7] (6)

Akrilamid monomer (CAS-szám: 79-06-1] (10)

Trietilén-melamin [CAS-szám: 51-18-3] (8)

Negatív kontrollok

18.

Minden mintavételi időpontban negatív kontrollállatokat is kell használni, amelyeket csak oldószerrel vagy vivőanyaggal kezeltek, és a kezelésük egyébiránt ugyanolyan módon történik, mint a kezelési csoportoké. Ha nem állnak rendelkezésre olyan történeti vagy publikált kontrolladatok, amelyek igazolják, hogy a választott oldószer/vivőanyag nem idéz elő kromoszóma-rendellenességeket vagy más káros hatásokat, a vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében nem kezelt kontrollállatokat is alkalmazni kell minden mintavételi időpontban.

ELJÁRÁS

Az állatok száma

19.

A vizsgálat megkezdésekor a csoportok méretét úgy kell megállapítani, hogy egy csoportban legalább öt hím állat legyen. Ez a csoportonkénti állatszám elegendőnek tekinthető ahhoz, hogy megfelelő mértékű statisztikai kiértékelést lehessen végezni (vagyis általában észlelni lehessen a kromoszóma-rendellenesség gyakoriságának legalább megduplázódását, amikor a negatív kontrollszint 0,05-ös szignifikanciaszint melletti 80 %-os valószínűségnél legalább 1,0 %) (3) (11). Útmutatás az állatok maximális számára vonatkozó tipikus követelményhez: a három dóziscsoporttal és egy párhuzamos negatív kontrollcsoporttal, továbbá egy pozitív kontrollcsoporttal (amelyek mindegyike csoportonként öt állatból áll) két mintavételi időpontban végzett vizsgálathoz 45 állatra lenne szükség.

A kezelés ütemterve

20.

A vizsgálati vegyi anyagot rendszerint egyetlen adagban adják be (egyszeri kezelés keretében); alkalmazható más adagolási rend is, amennyiben használata tudományos szempontból indokolt.

21.

A legnagyobb adaggal kezelt csoportnál a kezelés után két különböző időpontban mintát kell venni. Mivel a vizsgálati vegyi anyag(ok) felvételéhez és anyagcseréjéhez szükséges idő, valamint annak (azoknak) a sejtciklus-kinetikára gyakorolt hatása befolyásolhatja a kromoszóma-rendellenesség kimutatásának optimális időpontját, egy korai és egy későbbi mintavételt végeznek a kezelést követően körülbelül 24 és 48 órával. A legmagasabb dózisoktól eltérő dózisok esetén korai időpontban, a kezelés után 24 órával kell mintát venni (ami megegyezik a B spermatogóniumok sejtciklusának idejével vagy annál rövidebb, így nagyobb valószínűséggel értékelhetők a kezelés utáni első metafázisok), kivéve ha más időpontról bebizonyosodott, hogy az megfelelőbb.

22.

Más mintavételi idők is alkalmazhatók. Olyan vegyi anyagok esetében például, amelyek S fázistól független hatásokat fejtenek ki, megfelelőbbnek bizonyulhatnak a 24 óránál rövidebb mintavételi idők is.

23.

Ismételt dózisú kezelési eljárás is használható, például ha a vizsgálat elvégzésére egy másik végpontot érintő, 28 napig tartó beadási időszakot alkalmazó vizsgálattal (pl. a B.58. vizsgálati módszerrel) összefüggésben kerül sor; ez esetben azonban a mintavételi időszakok különbözősége miatt további állatcsoportok bevonására lenne szükség. Ennek megfelelően az ilyen ütemtervek megfelelőségét eseti alapon kell tudományos érvekkel alátámasztani.

24.

Az eutanázia előtt az állatok hasüregébe adott injekcióval megfelelő adag metafázist blokkoló vegyi anyagot (például Colcemid®-et vagy kolchicint) fecskendeznek be. Ezután az állatokból megfelelő időközönként mintákat kell venni. Egerek és patkányok esetében ez az időköz körülbelül 3–5 óra.

Dózisok

25.

Ha előzetes dózistartomány-kereső vizsgálatra kerül sor amiatt, hogy nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok kiválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyek a fő vizsgálatban alkalmazandóak, a dóziskereső vizsgálat végrehajtására vonatkozó ajánlások szerint (12). E vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely a vizsgálati időszak hosszához képest enyhe toxikus hatásokat kiváltó dózis (például rendellenes viselkedést vagy reakciókat, enyhe testtömeg-csökkenést vagy vérképzőrendszert érintő citotoxicitást vált ki), de amely elhullást, illetve az állatok végleges elaltatását szükségessé tévő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy stresszt nem idéz elő.

26.

A legmagasabb adag olyan adagként is definiálható, amely létrehoz valamilyen toxicitási jelet a spermatogóniumokban (például az első és második meiotikus metafázis esetében a spermatogonális mitózis arányának csökkenése). E csökkenés nem haladhatja meg az 50 %-ot.

27.

A kis, nem mérgező dózisban specifikus biológiai aktivitást mutató vizsgálati vegyi anyagok (mint például a hormonok és a mitogének), valamint azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, kivételek lehetnek a dózismeghatározási követelmények alól, és eseti alapon kell azokat értékelni.

28.

Annak érdekében, hogy dózis-válasz adatokat lehessen szerezni, a teljes vizsgálatnak egy negatív kontrollcsoportot (18. pont), valamint legalább három dózist kell tartalmaznia, ahol a dózisok közötti szorzótényező általában 2, de legfeljebb 4. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást a dózistartomány-kereső vizsgálatban vagy meglévő adatok alapján, egyszeri adagolás esetén a legmagasabb dózisnak 2 000 mg/testtömegkilogrammnak kell lennie. Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, az MTD-nek a beadott legmagasabb dózisnak kell lennie, és az alkalmazott dózisok lehetőleg fedjék le a maximálistól az alacsony mértékű toxicitást okozó vagy toxicitást egyáltalán nem okozó dózisig terjedő tartományt. Ha a célszövet (vagyis a here) toxicitása valamennyi vizsgált dózisnál megfigyelhető, érdemes nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni. A mennyiségi dózis-válasz adatok teljesebb körű jellemzését célzó vizsgálatok további dóziscsoportokat tehetnek szükségessé. Ezek a határértékek a vizsgálati vegyi anyagok bizonyos, külön követelmények hatálya alá tartozó típusai (például a humán gyógyszerek) esetében változóak lehetnek. Ha a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, a legmagasabb dózist és két alacsonyabb dózist kell kiválasztani (a fentiek szerint). Legalább 14 napig tartó beadási időszak esetén a legmagasabb dózisnak 1 000 mg/testtömeg kg/napnak, 14 napnál rövidebb beadási időszak esetében pedig 2 000 mg/testtömeg kg/napnak kell lennie.

A dózisok beadása

29.

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak (például takarmány, ivóvíz, topikális szubkután, intravénás, orális (gyomorszondával), inhalációs vagy implantáció) is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció tudományos indokolás hiányában általában nem ajánlott, mivel az fiziológiai szempontból nem releváns emberi expozíciós út. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmányba vagy ivóvízbe keverik, különösen egyszeri adagolás esetén ügyelni kell arra, hogy a táplálék és a víz fogyasztása és a mintavétel közötti idő elegendő legyen a hatások kimutathatóságához (lásd a 33. pontot). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata rendszerint nem haladhatja meg az 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát (ha azt az állatjóléti tárgyú jogszabályok lehetővé teszik) meg kell indokolni. A koncentráció megfelelő beállításával kell minimalizálni a beadott térfogat variabilitását, és így kell biztosítani, hogy minden dózisnál azonos legyen a testtömegarányos térfogat.

Megfigyelések

30.

A kísérleti állatok esetében általános klinikai megfigyeléseket kell tenni, és a klinikai tüneteket legalább naponta egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban rögzíteni kell, továbbá figyelembe kell venni az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot morbiditás és mortalitás szempontjából. Minden állat tömegét le kell mérni a vizsgálat megkezdésekor, az ismételt dózisú vizsgálatok esetén hetente legalább egyszer, valamint az állatok végleges elaltatásakor. A legalább egy hétig tartó vizsgálatok során a felvett táplálék mennyiségét legalább heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokat a vizsgálati időszak befejezése előtt el kell altatni (13).

Kromoszómapreparálás

31.

Közvetlenül az eutanázia után ivarsejt-szuszpenziót vesznek egyik vagy mindkét heréből, majd hipotóniás oldatba helyezik és ismert protokollok szerint – például (2) (14) (15) – fixálják azokat. A sejteket ezután tárgylemezre kenik és megfestik (16) (17). Valamennyi tárgylemezt kóddal kell ellátni, hogy az értékelő ne tudja beazonosítani azokat.

Elemzés

32.

Minden egyes állatnál legalább 200 jól szétterült metafázist kell elemezni (3) (11). Amennyiben a negatív történeti kontrolladatok 1 % alatti gyakoriságot mutatnak, a statisztikai értékelés növelése érdekében egyedenként több mint 200 sejtet kell értékelni. Olyan festési módszereket kell alkalmazni, amelyek lehetővé teszik a centromer azonosítását.

33.

A kromoszóma és a kromatid típusú rendellenességeket külön-külön kell feljegyezni és altípusonként (törések, kicserélődések) kell besorolni. A Gep-eket fel kell jegyezni, de nem kell figyelembe venni annak meghatározásakor, hogy egy adott vegyi anyag előidézi-e a kromoszóma-rendellenességet mutató sejtek számának szignifikáns növekedését. A laboratóriumban alkalmazott eljárásoknál biztosítani kell, hogy a kromoszóma-rendellenességeket jól képzett értékelők elemezzék, Mivel a tárgylemezek elkészítésére szolgáló eljárások következtében gyakran kiértékelhetetlen a metafázisok bizonyos hányada, mert az eljárás kromoszómaveszteséget okoz, a sejteket a centromerszám alapján kell értékelni, ami a kiértékelt sejteknél nem lehet kevesebb mint 2n±2, ahol az n az adott fajra jellemző haploid kromoszómaszám.

34.

Bár a vizsgálat célja a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek észlelése, fontos feljegyezni a poliploid sejtek és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek előfordulásának gyakoriságát, amennyiben láthatók ilyen sejtek (44. pont).

ADATOK ÉS JELENTÉS

Az eredmények feldolgozása

35.

Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. Minden egyes állat esetében értékelni kell a szerkezeti kromoszómaaberrációval/-aberrációkkal rendelkező sejtek számát és a sejtenkénti kromoszóma-rendellenességek számát. Az altípusonként (törések, kicserélődések) besorolt, kromatid és kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell felsorolni, megadva a számukat és a gyakoriságukat a kísérleti és a kontrollcsoportok esetében. A Gap-eket külön kell feljegyezni. A Gap-ek gyakoriságát bele kell foglalni a jelentésbe, de általában nem kell szerepeltetni az összes szerkezeti kromoszóma-rendellenesség gyakoriságának elemzésében. A poliploid és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek százalékos arányát észlelés esetén a jelentésbe kell foglalni.

36.

A toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat (a 30. pont alapján) jelenteni kell.

Elfogadhatósági kritériumok

37.

Az alábbi kritériumok határozzák meg a vizsgálat elfogadhatóságát:

A párhuzamos negatív kontroll adatai összhangban vannak a negatív történeti kontrolladatokra vonatkozó közzétett normákkal (amelyek alapján a kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejtek aránya várhatóan > 0 % és ≤ 1,5 %) és – amennyiben rendelkezésre állnak – a laboratórium történeti kontrolladataival (lásd a 10. és a 18. pontot).

A párhuzamos pozitív kontrollok olyan válaszokat generálnak, amelyek összhangban vannak a pozitív történeti kontrolladatokra vonatkozólag közzétett normákkal és – amennyiben rendelkezésre áll – a laboratórium pozitív történeti kontrollokat tartalmazó adatbázisával, továbbá a negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést idéznek elő (lásd a 17. és a 18. pontot).

Megfelelő számú sejt és dózis képezte elemzés tárgyát (lásd a 28. és a 32. pontot).

A legmagasabb dózis kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 25. és 26. pontban ismertetett legmagasabb dózisokkal.

38.

Ha mitózist és meiózist egyaránt tapasztalnak, meg kell határozni a spermatogonális mitózisok első és második meiotikus metafázishoz viszonyított arányát, állatonként 100 osztódó sejt összes mintájában valamennyi kezelt és negatív kontrollállathoz tartozó citotoxicitás méréseként. Ha csak mitózist figyelnek meg, a mitózisindexet állatonként legalább 1 000 sejtben kell meghatározni.

Az eredmények értékelése és értelmezése

39.

Legalább három kezelt dóziscsoportot kell megvizsgálni annak érdekében, hogy elegendő adat álljon rendelkezésre a dózis–válasz elemzéshez.

40.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

legalább az egyik vizsgálati dózis statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva;

a növekedés legalább egy mintavételi időpont tekintetében összefügg a dózissal; valamint

ezen eredmények bármelyike kívül esik a negatív kontrolladatok elfogadható tartományán vagy a laboratórium negatív történeti kontrolladatainak eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértéken).

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag képes kromoszóma-rendellenességeket előidézni a vizsgált állatok spermatogóniumaiban. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások a szakirodalomban is megtalálhatók (11) (18). Az alkalmazott statisztikai teszteknek az állatot kell kísérleti egységnek tekinteniük.

41.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha:

a vizsgálati dózisok egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva;

egyik kísérleti körülmény sem mutat a dózissal összefüggő növekedést; valamint

valamennyi eredmény a negatív kontrolladatok, vagy amennyiben rendelkezésre állnak, a laboratórium negatív történeti kontrolladatainak (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértéken) tartományába esik.

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag nem képes kromoszóma-rendellenességeket előidézni a vizsgált állatok spermatogóniumaiban. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások a szakirodalomban is megtalálhatók (11) (18). A negatív eredmény nem zárja ki annak lehetőségét, hogy a vegyi anyag kromoszóma-rendellenességet vagy génmutációt idéz elő a fejlődés egy későbbi, a vizsgálat tárgykörén kívül eső fázisában.

42.

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

43.

Ha a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, illetve egy adott eredmény (például kismértékű vagy határesethez közelítő növekedés) biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy a meglévő kísérleti adatok további vizsgálataival kell értékelni, például meg kell határozni, hogy a pozitív eredmény kívül esik-e a negatív kontrolladatok elfogadható tartományán vagy a laboratórium negatív történeti kontrolladatain (19).

44.

Ritka esetekben, az adatkészlet még további vizsgálatok után is eleve kizárja a pozitív vagy negatív eredményekre vonatkozó következtetést, ezért kétértelmű reakció lesz a következtetés.

45.

A poliploid sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a mitotikus folyamatokat és számszerű kromoszóma-rendellenességet idézhet elő (20). Az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a sejtciklus előrehaladását (21) (22), ami más mechanizmus révén idéz elő számszerű kromoszóma-rendellenességet, mint a mitotikus folyamatok gátlása (lásd a 2. pontot). Ezért a poliploid sejtek és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek előfordulását külön-külön kell feljegyezni.

Vizsgálati jelentés

46.

A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Összegzés.

 

Vizsgálati vegyi anyag:

eredet, gyártási szám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben, ha ismert;

adott esetben a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás mérése abban a tápfolyadékban, amelyhez a vizsgálati vegyi anyagot hozzáadták.

 

Egy összetevőből álló anyag:

fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján

 

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai révén jellemezve.

 

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése:

a vivőanyag megválasztásának indokolása;

a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/vivőanyagban;

a takarmány-, ivóvíz- vagy inhalációs készítmények előkészítése;

a készítmények analitikai meghatározásai (pl. stabilitás, homogenitás, névleges koncentráció), ha végeztek ilyen meghatározásokat.

 

Kísérleti állatok:

a felhasznált faj/törzs és a felhasználásuk indokolása;

az állatok száma és életkora,

az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.;

az állatok egyedi azonosítására szolgáló módszerek;

rövid távú vizsgálatok esetében: az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor és végén; egy hétnél hosszabb vizsgálatok esetében: az egyes állatok testtömege a vizsgálat során és a táplálékfelvételük. A testtömegtartományt, az átlagot és a szórást minden egyes csoportnál meg kell adni.

 

Vizsgálati körülmények:

a pozitív és negatív (vivőanyagos/oldószeres) kontrollok adatai;

a dózistartomány-kereső vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen vizsgálat;

a dózisok kiválasztásának indokolása;

a beadási mód indokolása;

a vizsgálati vegyi anyag előkészítésének részletes ismertetése;

a vizsgálati vegyi anyag beadására vonatkozó részletek;

a kiválasztott elpusztítási időpontok indokolása;

az állati toxicitás mérésére szolgáló módszerek, beleértve adott esetben a kórszövettani vagy hematológiai elemzéseket, illetve az állatok megfigyelésének és a testtömeg mérésének gyakorisága;

negatív eredmény esetén annak ellenőrzésére szolgáló módszerek, hogy a vizsgálati vegyi anyag elérte-e a célszövetet vagy az általános keringési rendszert;

tényleges dózis (mg/testtömeg kg/nap) a vizsgálati vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjából (ppm) és a fogyasztásból számítva, ha alkalmazható;

a táplálék és víz minőségére vonatkozó részletek;

a kezelési és mintavételi ütemtervek részletes leírása és kiválasztásuk indokolása;

az eutanázia módja;

a fájdalomcsillapítás módja (amennyiben alkalmaznak ilyet);

a szövetek izolálására használt eljárások;

metafázis-blokkoló vegyi anyag azonosítása, annak koncentrációja és kezelési időtartama;

a tárgylemez preparálásának módszerei;

a rendellenességek értékelésének kritériumai;

az elemzett sejtek száma (állatonként);

azon kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhetőnek tekintendők-e.

 

Eredmények:

az állatok állapota a vizsgálati időszak előtt és alatt, beleértve a toxicitás jeleit;

az állatok testsúlya és szerveik tömeg a termináláskor (több kezelés esetén a kezelési eljárás során mért testsúlyok);

toxicitás jelei;

mitotikus index;

spermatogóniummitózisok aránya az első és második meiotikus metafázishoz viszonyítva, vagy a célszövet expozíciójának egyéb bizonyítéka;

rendellenességek száma és típusa az egyes állatokban;

a rendellenességek csoportonkénti száma összesen, átlagokkal és szórással;

a rendellenességeket mutató sejtek csoportonkénti száma átlagokkal és szórással;

a dózis-válasz összefüggés, ahol lehetséges;

statisztikai elemzések és alkalmazott módszerek;

az egyidejűleg elvégzett negatív kontrollokra vonatkozó adatok;

negatív történeti kontrolladatok, a tartományok, az átlagok, a szórás és a 95 %-os konfidenciaintervallum (ha rendelkezésre áll) megadásával, vagy a vizsgálati eredmények elfogadhatóságának megállapításához használt, publikált negatív történeti kontrolladatok;

az egyidejűleg elvégzett pozitív kontrollokra vonatkozó adatok;

a ploidia változásai, ha észlelhetők, beleértve a poliploid és/vagy endoreduplikált sejtek gyakoriságát.

 

Az eredmények értékelése

 

Következtetések

SZAKIRODALOM

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(14)

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneuploidia: a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlettel (kromoszómakészletekkel) (poliploidia) való bármely eltérés.

Centroméra: olyan kromoszóma-régió(k), amely(ek)hez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Vegyi anyag: anyag vagy keverék.

Kromoszómasokféleség: a kromoszómák alakjában (pl. metacentrikus, akrocentrikus stb.) és méretében megfigyelhető változatosság.

Kromatid típusú rendellenesség: olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a különálló kromatidok törésében vagy a kromatidok közötti törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.

Kromoszóma típusú rendellenesség: olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy törésében és újraegyesülésében nyilvánul meg.

Klasztogén: bármely olyan vegyi anyag, amely sejtek vagy szervezetek populációjában szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okoz.

Gap: egyetlen kromatid szélességénél kisebb és a kromatidok minimális átrendeződését okozó akromatikus lézió.

Genotoxikus: olyan általános kifejezés, amely magában foglalja a DNS- vagy kromoszómakárosodás valamennyi típusát, köztük a töréseket, a deléciókat, az adduktok képződését, a nukleotidok módosulását és kapcsolódását, az átrendeződéseket, a mutációkat, a kromoszómaaberrációkat és az aneuploidiát. A genotoxikus hatás nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszómakárosodást.

Mitotikus index (MI): a metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya; e populáció proliferációja mértékének jelzése.

Mitózis: a sejtmag osztódása, amely általában profázisra, prometafázisra, metafázisra, anafázisra és telofázisra osztható fel.

Mutagén: örökletes elváltozást idéz elő a génekben lévő DNS-bázispár-szekvenciá(k)ban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszómaaberrációk).

Számszerű rendellenesség: a kromoszómák számának eltérése a felhasznált állatokra jellemző normál számértéktől.

Poliploidia: a haploid kromoszómaszám (n) egészszámú, de nem diploid (azaz 3n, 4n és így tovább) megsokszorozódása.

Szerkezeti rendellenesség: a sejtosztódás metafázisának mikroszkopikus vizsgálata során – deléciókként, fragmensekként és kicserélődésekként – észlelhető változás a kromoszóma szerkezetében.

Vizsgálati vegyi anyag: bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

UVCB: ismeretlen vagy változó összetételű vegyi anyagok, komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

5.

A B. részben a B.40. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.40.    IN VITRO BŐRKORRÓZIÓ: TRANSZKUTÁN ELEKTROMOS REZISZTENCIA (TER) VIZSGÁLATI MÓDSZER

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 430. vizsgálati iránymutatásában (2015) leírt módszerrel. A bőrkorrózió valamely vizsgálati vegyi anyag alkalmazását követően megjelenő, visszafordíthatatlan bőrkárosodás, amely a felhámon át az irhára is átterjedő látható szövetelhalást okoz [az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által kidolgozott, vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének globálisan harmonizált rendszerében (GHS) (1), valamint az Európai Unió (EU) anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendeletében (CLP-rendelet (1)) meghatározottak szerint]. Ez a továbbfejlesztett B.40. vizsgálati módszer olyan in vitro eljárást biztosít, amely lehetővé teszi a korróziót nem okozó és korróziót okozó anyagok és keverékek ENSZ GHS (1) és CLP-rendelet szerinti meghatározását.

2.

A bőrkorrózió felmérése jellemzően kísérleti állatokon történő vizsgálatot foglal magában (az OECD eredetileg 1981-ben elfogadott, majd 1992-ben, 2002-ben és 2015-ben felülvizsgált 404. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű B.4. vizsgálati módszer alkalmazásával) (2). E B.40. vizsgálati módszer mellett a vegyi anyagok bőrkorróziós hatásának vizsgálatára szolgáló más in vitro vizsgálati módszereket is validáltak és elfogadtak – az OECD 431. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű – B.40bis. vizsgálati módszerként (3) és – az OECD 435. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű – B.65. vizsgálati módszerként (4), amelyek igény szerint alkalmazhatók a korrozív vegyi anyagok alkategóriáinak azonosítására is. Az OECD 439. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű (5) B.46. vizsgálati módszer keretében pedig elfogadtak több, a bőrirritáció felmérésére szolgáló validált in vitro vizsgálati módszert. A bőrkorróziós és bőrirritációs vizsgálatok és értékelések integrált megközelítéseiről (IATA) szóló OECD-iránymutatás több, különböző információforrásokat és adatelemző eszközöket csoportosító modult ismertet, továbbá iránymutatást nyújt arra nézve, i. hogyan integrálhatók és használhatók az ismert vizsgálati és nem vizsgálati eredetű adatok a vegyi anyagok potenciális bőrirritációs és bőrkorróziós hatásainak felmérésére, és ii. javaslatot tesz egy, a további vizsgálatok szükségessége esetén alkalmazható megközelítésre (6).

3.

Ez a vizsgálati módszer a bőrkorrózióval mint az emberi egészség károsodásának egyik végpontjával foglalkozik. Alapja a patkánybőr transzkután elektromos rezisztenciáját (TER) mérő vizsgálati módszer, amelynek keretében bőrkorongokat használnak korrozív anyagok azonosítására, vizsgálva a normál stratum corneum integritására és barrierfunkciójára gyakorolt károsító hatásukat. A módszernek megfelelő, eredetileg 2004-ben elfogadott OECD vizsgálati iránymutatást az IATA-iránymutatás fényében 2015-ben módosították.

4.

Az in vitro bőrkorróziós vizsgálatok szabályozási célú értékelése érdekében elvégezték a bőrkorrózió felmérésére szolgáló, patkánybőr használatán alapuló TER vizsgálati módszer elővalidálási vizsgálatait (7), majd a hivatalos validálási vizsgálatát (8) (9) (10) (11). E vizsgálatok eredményei vezettek ahhoz az ajánláshoz, hogy a TER vizsgálati módszer (validált referenciamódszer - VRM) használható szabályozási célú in vivo bőrkorrózió felmérésére (12) (13) (14).

5.

Mielőtt az in vitro TER bőrkorróziós vizsgálati módszerhez hasonló vagy ahhoz képest módosított, a validált referenciamódszertől eltérő javasolt módszer szabályozási célú alkalmazásra kerülne, a validált referenciamódszerhez való hasonlóságának biztosítása érdekében a teljesítményszabványok (15) követelményeinek megfelelően meg kell határozni a javasolt felhasználása tekintetében fennálló megbízhatóságát, relevanciáját (pontosságát) és korlátait. Az adatok OECD-megállapodás szerinti kölcsönös elfogadása csak azután garantált, hogy a teljesítményszabványok szerint javasolt új vagy átdolgozott vizsgálati módszert felülvizsgálták és belefoglalták az OECD megfelelő vizsgálati iránymutatásába.

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

6.

Az alkalmazott fogalmak meghatározása a függelékben található.

ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK

7.

A validálási vizsgálat (10) és más közzétett tanulmányok (16) (17) szerint a patkánybőr TER vizsgálati módszer egy 122 anyagból álló adatbázis tekintetében 94 %-os (51/54) összérzékenységgel és 71 %-os specificitással (48/68) képes megkülönböztetni ismert bőrkorróziót okozó és bőrkorróziót nem okozó anyagokat.

8.

Ez a vizsgálati módszer a bőrkorrózió azonosítására szolgáló in vitro eljárás. Lehetővé teszi, hogy az ENSZ által kidolgozott GHS és a CLP-rendelet szerint megkülönböztessék a korróziót nem okozó és a korróziót okozó vizsgálati vegyi anyagokat. E vizsgálati módszer korlátai közé tartozik – ahogyan az a validálási vizsgálatokból kiderült (8) (9) (10) (11) –, hogy nem teszi lehetővé a korrozív anyagoknak és keverékeknek az ENSZ GHS és a CLP-rendelet szerinti alkategóriákba sorolását. A vizsgálati módszer jövőbeni használatát a vonatkozó szabályozási keret fogja meghatározni. Ez a vizsgálati módszer ugyan nem biztosít elegendő információt a bőrirritáció felméréséhez, de a B.46. vizsgálati módszer célja kifejezetten az, hogy a bőrirritációs egészségügyi hatásokat in vitro határozza meg (5). Egyetlen bőrexpozíció után a bőrt ért helyi hatások teljes kiértékeléséhez az integrált vizsgálati és értékelési megközelítésekről szóló OECD-iránymutatást kell tanulmányozni (6).

9.

A vizsgálati módszert alátámasztó validálás során igen sokféle, többségében különálló anyagot képviselő vegyi anyagot vizsgáltak, és a validálási vizsgálat empirikus adatbázisa összesen 60 anyagot tartalmazott, amelyek lefedik a kémiai osztályok széles körét (8) (9). Az összes rendelkezésre álló adat alapján a vizsgálati módszer a legkülönbözőbb kémiai osztályokra és halmazállapotokra, azon belül folyadékokra, félszilárd, szilárd és viaszos állagú anyagokra alkalmazható. Mivel azonban bizonyos halmazállapotok tekintetében nem állnak rendelkezésre könnyen hozzáférhető, megfelelő referenciaadatokkal bíró vizsgálati tételek, a validálás során viszonylag csekély számú viaszos állagú és korrozív szilárd anyag került felmérésére. A folyadékok lehetnek vizesek vagy nem vizesek; a szilárd anyagok lehetnek vízben oldódóak vagy oldhatatlanok. Olyan esetekben, amikor bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer nem alkalmazható valamely konkrét anyagkategóriára, a vizsgálati módszert nem szabad az adott anyagkategóriára alkalmazni. E vizsgálati módszerről feltételezhető továbbá, hogy az anyagokra való alkalmazhatóságának kiterjesztéseként keverékekre is alkalmazható. Mivel azonban a keverékek kategóriák és összetételek széles körét fedik le, és jelenleg kevés információ áll rendelkezésre a keverékek vizsgálatára vonatkozóan, azokban az esetekben, amikor bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer valamely konkrét keverékkategóriára nem alkalmazható (pl. az Eskes és munkatársai, 2012 által javasolt stratégia alapján) (18), a vizsgálati módszer az adott keverékkategóriára nem alkalmazható. A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. Gázokat és aeroszolokat validálási vizsgálatok keretében még nem vizsgáltak (8) (9). Bár elképzelhető, hogy ezek is vizsgálhatók TER vizsgálati módszerrel, a jelenlegi vizsgálati módszer nem teszi lehetővé gázok és aeroszolok vizsgálatát.

A VIZSGÁLAT ELVE

10.

A vizsgálati vegyi anyagot 24 órán át a bőrkorongok epidermális felületén alkalmazzák egy kétkamrás vizsgálati rendszerben, amelyben a bőrkorongok a két kamra elválasztására szolgálnak. A bőrkorongok kíméletes módon leölt, 28–30 napos patkányokról származnak. A korrozív vegyi anyagok azok, amelyek a normál stratum corneum integritásának és barrierfunkciójának elvesztését okozzák, amit a TER meghatározott határérték alá történő csökkenésével mérnek (16) (lásd a 32. pontot). A patkánybőr TER esetében az 5 kΩ határérték került kiválasztásra a széles tartományt felölelő anyagok nagyszámú adataiból, ahol az értékek túlnyomó többsége vagy világosan ezen érték felett (gyakran > 10 kΩ) vagy jóval alatta (gyakran < 3 kΩ) volt (16). Általában azok a vizsgálati vegyi anyagok, amelyek az állatokra nézve nem korrozívak, de irritálók vagy nem irritálók, nem csökkentik a TER-t e határérték alá. Továbbá más bőrkészítmények vagy más berendezés használata módosíthatja a határértéket, ami további validálásokat tesz szükségessé.

11.

A TER-ben a pozitív értékek – beleértve az 5 kΩ körülieket is – kontrollvizsgálata céljából a vizsgálati eljárás részét képezi egy festékmegkötést biztosító lépés is. A festékmegkötést biztosító lépés meghatározza, hogy az ionáteresztő képesség fokozódását a stratum corneum fizikai károsodása okozza-e. A patkánybőrt alkalmazó TER módszer a B.4. vizsgálati módszer (2) alapján vizsgált nyúlban előre jelezte az in vivo korrozivitást.

A JÁRTASSÁG BIZONYÍTÁSA

12.

Az e vizsgálati módszerhez kapcsolódó patkánybőr TER vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak az 1. táblázatban ajánlott tizenkét jártassági tesztanyag helyes osztályozásával igazolniuk kell szakmai jártasságukat. Ha a jegyzékben szereplő valamely anyag nem áll rendelkezésre, illetve ha indokolható, megfelelő in vivo és in vitro referenciaadatokkal rendelkező más – például a referencia-vegyianyagok jegyzékében feltüntetett (16) – anyag is használható, amennyiben a kiválasztási kritériumok megegyeznek az 1. táblázatban foglaltakkal.

1. táblázat

A jártassági tesztanyagok jegyzéke  (2)

Anyag

CAS-szám

Kémiai osztály (3)

ENSZ GHS/CLP szerinti, in vivo eredményeken alapuló kat. (4)

VRM szerinti, in vitro eredményeken alapuló kat.

Halmazállapot

pH (5)

In vivo korrozív hatású

N,N’-Dimetil-dipropiléntriamin

10563-29-8

szerves bázis

1A

6 × C

F

8,3

1,2-Diaminopropán

78-90-0

szerves bázis

1A

6 × C

F

8,3

Kénsav (10 %)

7664-93-9

szervetlen sav

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NK

F

1,2

Kálium-hidroxid (10 %-os aq.)

1310-58-3

szervetlen bázis

(1A/)1B/1C

6 × C

F

13,2

Oktánsav (kaprilsav)

124-07-2

szerves sav

1B/1C

4 × C 2 × NK

F

3,6

2-terc-Butilfenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × C 2 × NK

F

3,9

In vivo nem korrozív hatású

Izosztearinsav

2724-58-5

szerves sav

NK

6 × NK

F

3,6

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

szerves bázis

NK

6 × NK

Sz

5,5

Fenetil-bromid

103-63-9

elektrofil

NK

6 × NK

F

3,6

4-(Metil-tio)-benzaldehid

3446-89-7

elektrofil

NK

6 × NK

F

6,8

1,9-Dekadién

1647-16-1

semleges szerves

NK

6 × NK

F

3,9

Tetraklór-etilén

127-18-4

semleges szerves

NK

6 × NK

F

4,5

Rövidítések: aq = vizes; CAS-szám = Vegyianyag Nyilvántartási Szolgálat (CAS) nyilvántartási szám; VRM = Validált referenciamódszer; C = korrozív; NK = Nem korrozív

ELJÁRÁS

13.

A patkánybőr TER bőrkorróziós vizsgálati módszerhez rendelkezésre állnak szabványműveleti eljárások (19). Az e vizsgálati módszer keretébe tartozó patkánybőr TER vizsgálati módszereknek az alábbi feltételeknek kell megfelelniük:

Állatok

14.

Patkányokat kell használni, mert a bőrüknek a vizsgálati módszer során alkalmazható anyagokkal szembeni érzékenysége már korábban bebizonyosodott (12), emellett ez az egyetlen hivatalosan validált bőrforrás (8) (9). A patkányok kora (a bőr begyűjtésének időpontjában) és származása különösen fontos annak biztosítására, hogy a szőrtüszők nyugvó fázisban legyenek, mielőtt a felnőtt szőr nőni kezd.

15.

A fiatal, körülbelül 22 napos, hím vagy nőstény patkányok (Wistar vagy hasonló törzs) háton és horpaszon lévő szőrét kis nyírógéppel óvatosan eltávolítják. Azután az állatokat óvatosan törölgetve megmossák, miközben a lenyírt területet antibiotikumot tartalmazó oldatba merítik (amely a baktériumok növekedését hatékonyan gátló koncentrációban például sztreptomicint, penicillint, klóramfenikolt és amfotericint tartalmaz). Az állatokat az első mosást követő harmadik vagy negyedik napon ismételten megmossák antibiotikummal, és a második mosást követő 3 napon belül felhasználják azokat, amikor a stratum corneum megerősödött a szőrtelenítés után.

A bőrkorongok előkészítése

16.

Az állatokat 28–30 napos korukban kíméletes módon leölik; ez a kor kritikus. Ezután minden állatról eltávolítják a dorsolaterális bőrt, és a bőrtől való óvatos elválasztással lefejtik a felesleges szubkután zsírt. Egyenként körülbelül 20 mm-es átmérőjű bőrkorongokat távolítanak el. A bőrt a korongok felhasználása előtt tárolni lehet, ha kimutatható, hogy a pozitív és negatív kontrolladatok megegyeznek a friss bőrnél kapott adatokkal.

17.

Minden bőrkorongot egy PTFE (politetrafluoroetilén) cső vége fölé helyeznek, biztosítva, hogy az epidermális felület érintkezzen a csővel. Egy „O” gumigyűrűt pontosan a cső végére illesztenek, hogy a helyén tartsa a bőrt, és a felesleges szövetet levágják. Az „O” gumigyűrűt aztán vazelinnel óvatosan tömítik a PTFE-cső végéhez. A csövet egy rugós csipesz tartja egy MgSO4-oldatot (154 mM) tartalmazó befogadókamra belsejében (1. ábra). A bőrkorongot teljesen bele kell meríteni az MgSO4-oldatba. Egyetlen patkánybőrből 10–15 bőrkorongot lehet készíteni. A cső és az „O” gyűrű méreteit a 2. ábra mutatja.

18.

A vizsgálat kezdete előtt az egyes állati bőrök minőség-ellenőrzése céljából megmérik két bőrkorong TER-értékét. Mindkét korongnak 10 kΩ-nál nagyobb elektromosrezisztencia-értéket kell mutatnia ahhoz, hogy a többi korongot fel lehessen használni a vizsgálati módszerhez. Ha a rezisztencia értéke kisebb mint 10 kΩ, e bőrdarab többi korongját ki kell dobni.

A vizsgálati vegyi anyag és a kontrollanyagok alkalmazása

19.

A vizsgálati modell megfelelő teljesítménye érdekében minden vizsgálatmenettel (kísérlettel) egyidejűleg pozitív és negatív kontrollokat kell végezni. Minden vizsgálatmenetben (kísérletben) egyetlen állatról származó bőrkorongokat kell használni. Az ajánlott pozitív, illetve negatív vizsgálati vegyi anyagok: 10 M sósav, illetve desztillált víz.

20.

A folyékony vizsgálati vegyi anyagokat (150 μl) a cső belsejében egyenletesen viszik fel az epidermális felületre. Szilárd anyagokkal történő vizsgálat esetén megfelelő mennyiségű szilárd anyagot egyenletesen visznek fel a korongra annak biztosítására, hogy az epidermisz teljes felületét beborítsa. A szilárd anyagra deionizált vizet (150 μl) öntenek, és a csövet óvatosan felrázzák. A bőrrel való maximális érintkezés elérése érdekében előfordulhat, hogy a szilárd anyagot 30 °C-ra fel kell melegíteni olvasztás vagy lágyítás céljából, illetve őrölni vagy porítani kell.

21.

Minden vizsgálatmenet (kísérlet) során az egyes vizsgálati és kontrollanyagokhoz három bőrkorongot használnak. A vizsgálati vegyi anyagot 24 órán át alkalmazzák 20–23 °C-on. A vizsgálati vegyi anyagot legfeljebb szobahőmérsékletű csapvízsugárral addig mossák, amíg már nem lehet további anyagot eltávolítani.

TER-mérések

22.

A bőr ellenállásának TER-ként történő mérése egy kisfeszültségű, váltakozó áramú Wheatstone-híd segítségével történik (18). A mérőeszköz általános jellemzői: 1–3 Volt üzemi feszültség, 50–1 000 Hz-es szinusz- vagy négyszöghullámú váltakozó áram és legalább 0,1–30 kΩ mérési tartomány. A validálási vizsgálatban használt mérőeszköz az induktivitást, kapacitást és rezisztenciát sorrendben 2 000 H, 2 000 μF és 2 MΩ értékekig méri 100 Hz-es vagy 1 kHz-es frekvencián, soros vagy párhuzamos értékek felhasználásával. A TER-mérések céljára a korrozivitásra vonatkozó vizsgálati méréseket elektromos ellenállásban rögzítik 100 Hz-es frekvencián és soros értékeket felhasználva. Az elektromos ellenállás mérése előtt a bőr felületi feszültségét megfelelő mennyiségű 70 %-os etil-alkohollal csökkentik, amely beborítja az epidermiszt. Néhány másodperc elteltével az etil-alkoholt eltávolítják a csőből, majd azután a szövetet 3 ml MgSO4 -oldat (154 mM) hozzáadásával hidratálják. Az ellenállás kΩ/bőrkorongban való méréséhez a Wheatstone-híd elektródáit ráhelyezik a bőrkorong mindkét oldalára (1. ábra). Az elektróda méretei és a krokodilcsipeszek alatti elektródaszakasz hosszúsága a 2. ábrán látható. A belső elektródához csatolt csipesz az ellenállás mérésekor a PTFE-cső tetején található annak biztosítására, hogy állandó hosszúságú elektróda merüljön az MgSO4-oldatba. A külső elektródát a befogadókamra belsejébe úgy helyezik el, hogy az a kamra aljáig érjen. A rugós csipesz és a PTFE-cső alja közötti távolságot állandó értéken tartják (2. ábra), mivel ez a távolság befolyásolja a kapott rezisztencia értékét. Következésképpen a belső elektróda és a bőrkorong közötti távolságnak állandónak és minimálisnak kell lenni (1–2 mm).

23.

Ha a mért rezisztencia értéke nagyobb mint 20 kΩ, az valószínűleg a bőrkorong epidermális felületét borító vegyianyag-maradvány következménye. Ennek a bevonatnak az eltávolítása megkísérelhető például úgy, hogy kesztyűs hüvelykujjal befogják a PTFE csövet, és körülbelül 10 másodpercen át rázogatják; az MgSO4-oldatot eltávolítják és a rezisztenciamérést friss MgSO4-tal megismétlik.

24.

A vizsgálati műszer jellemzői és méretei, valamint a használt vizsgálati eljárás befolyásolhatja a kapott TER-értékeket. Az 5 kΩ korróziós határértéket az ebben a vizsgálati módszerben leírt speciális műszerrel és eljárással kapott adatok alapján számolták ki. Ha a vizsgálati feltételek megváltoznak, vagy más készüléket használnak, előfordulhat, hogy eltérő határ- és kontrollértékeket kell alkalmazni. Ezért ajánlatos a módszert és az ellenállás határértékét a validálási vizsgálatban (8) (9) használt anyagokból vagy a vizsgált anyagokhoz hasonló kémiai osztályú anyagokból kiválasztott jártassági tesztanyagok sorozatának vizsgálatával meghatározni. A megfelelő jártassági tesztanyagok jegyzékét az 1. táblázat tartalmazza.

Festékanyag-megkötő módszerek

25.

Bizonyos nem korrozív anyagoknak való expozíció eredményezheti a rezisztencia 5 kΩ határérték alá történő csökkenését, ami lehetővé teszi az ionoknak a stratum corneumon való passzálását, csökkentve ezáltal az elektromos rezisztenciát (5). Például a semleges szerves és felületaktív anyagok (például a tisztítószerek, emulgeálószerek és más felületaktív anyagok) eltávolíthatják a bőrzsírt, ezáltal a barrier az ionok számára áthatolhatóbbá válik. Így ha az ilyen vegyi anyagok TER-értéke alacsonyabb mint 5 kΩ vagy akörül van, és nem tapasztalható látható károsodás a bőrkorongokon, a kontrollon és kezelt szöveteken festékpenetrációs vizsgálatot kell végezni annak megállapítására, hogy a kapott TER-érték a bőr fokozottabb áteresztő képességének vagy a bőrkorróziónak az eredménye-e (7) (9). Ez utóbbi esetén, amikor a stratum corneum szétrepedt, ha a bőrfelszínre szulforhodamin B festéket visznek fel, ez gyorsan áthatol, és megfesti az alatta lévő szövetet. Ez a különleges festékanyag az anyagok széles skálájának ellenáll, és nem érinti a lent leírt kivonási eljárás.

Szulforhodamin B festékanyag alkalmazása és eltávolítása

26.

A TER-vizsgálatot követően a magnézium-szulfátot eltávolítják a csőből, és gondosan megvizsgálják, hogy a bőrön látható-e károsodás. Ha nincs nagyobb látható károsodás (pl. perforáció), szulforhodamin B festékanyag (Acid Red 52; C.I. 45100; CAS-szám: 3520-42-1), 150 μl 10 tömegszázalékos desztillált vizes oldatát alkalmazzák minden bőrkorong epidermális felületén 2 órán át. Ezeket a bőrkorongokat azután a felesleges/meg nem tapadt festékanyag eltávolítása érdekében körülbelül 10 másodpercig legfeljebb szobahőmérsékletű csapvízben lemossák. Minden egyes bőrdarabot gondosan eltávolítanak a PTFE-csőről és egy, deionizált vizet (8 ml) tartalmazó ampullába (például egy 20 ml-es üveg szcintillációs ampullába) helyezik. Az ampullákat óvatosan 5 percen át rázogatják minden felesleges/meg nem tapadt festékanyag eltávolítása érdekében. Ezt az öblítési eljárást megismétlik, azután a bőrkorongokat kiveszik, és desztillált vízben lévő 5 ml 30 tömegszázalékos nátrium-dodecil-szulfát (SDS) vizes oldatát tartalmazó ampullába helyezik, és egy éjszakán át 60 °C-on inkubálják.

27.

Az inkubálást követően minden bőrkorongot eltávolítanak és kidobnak, a fennmaradó oldatot pedig 8 percen át 21 °C-on centrifugálják (relatív centrifugális erő ~175 × g). 1 ml felülúszót kivesznek, és felhígítanak 1:5 térfogatban [azaz 1 ml + 4 ml] arányban 30 % (tömegszázalékos) SDS-sel. Megmérik az oldat optikai sűrűségét (OD) 565 nm-nél.

A festékanyag-tartalom kiszámítása

28.

Az OD-értékekből kiszámítják a korongonkénti szulforhodamin B festéktartalmat (9) (szulforhodamin B festék moláris extinkciós együtthatója 565 nm-en 8,7 × l04; molekulatömege 580 g). A festékanyag-tartalmat minden egyes bőrkorong esetében megfelelő kalibrációs görbe használatával meghatározzák, azután kiszámítják a párhuzamos vizsgálatok átlagos festékanyag-tartalmát.

Elfogadhatósági kritériumok

29.

Az átlag TER-eredmények elfogadhatók, ha az egyidejű pozitív és negatív kontrollértékek a vizsgálati laboratóriumban a módszer elfogadható tartományába esnek. A fent leírt módszertanra és készülékre vonatkozó elfogadható ellenállás-tartományokat az alábbi táblázat tartalmazza:

Kontroll

Anyag

Ellenállás-tartomány (kΩ)

Pozitív

10 M sósav

0,5–1,0

Negatív

Desztillált víz

10–25

30.

Az átlagos festékanyag-megkötési eredmények azzal a feltétellel fogadhatók el, hogy az egyidejű kontrollértékek a módszer elfogadható tartományába esnek. A fent leírt módszertan és készülék esetében a kontrollanyagok tekintetében javasolt elfogadható festéktartalom-tartományokat az alábbi táblázat tartalmazza:

Kontroll

Anyag

Festéktartalom tartománya (μg/korong)

Pozitív

10 M sósav

40–100

Negatív

Desztillált víz

15–35

Az eredmények értelmezése

31.

A TER határértékét, amely megkülönbözteti a korrozív és a nem korrozív vizsgálati vegyi anyagokat, a vizsgálati módszer optimalizálása során állapították meg, egy elővalidálási szakaszban tesztelték, és egy hivatalos validálási vizsgálatban igazolták.

32.

Az ENSZ GHS/CLP-rendelet osztályozási rendszeréhez kapcsolódó patkánybőr TER bőrkorróziós vizsgálati módszer előrejelzési modellje (9) (19) az alábbiak szerint alakul:

A vizsgálati vegyi anyag a bőrre nem korrozív hatású anyagnak tekintendő:

i.

ha a vizsgálati vegyi anyagra kapott átlagos TER-érték nagyobb mint (>) 5 kΩ; vagy

ii.

a vizsgálati vegyi anyagra kapott átlagos TER-érték kisebb vagy egyenlő (≤) 5 kΩ-mal, és

a bőrkorongok nem mutatnak látható károsodást (pl. perforációt), és

a korong átlagos festéktartalma kisebb (<) a 10 M HCl egyidejű pozitív kontrollnál megállapított átlagos bőrkorong-festéktartalomnál (a pozitív kontrollértékeket lásd a 30. pontban).

A vizsgálati vegyi anyagnak a bőrre korrozív hatása van:

i.

ha a vizsgálati vegyi anyagra kapott átlagos TER-érték kisebb vagy egyenlő (≤) 5 kΩ-mal, és a bőrkorongok láthatóan károsodtak (pl. perforálódtak), vagy

ii.

a vizsgálati vegyi anyagra kapott átlagos TER-érték kisebb vagy egyenlő (≤) 5 kΩ-mal, és

a bőrkorongok nem mutatnak látható károsodást (pl. perforációt), de

a korongok átlagos festéktartalma nagyobb vagy egyenlő (≥) a 10 M HCl egyidejű pozitív kontrollnál megállapított átlagos bőrkorong-festéktartalommal (a pozitív kontrollértékeket lásd a 30. pontban).

33.

Ha a besorolás egyértelmű, legalább három bőrkorong replikátum vizsgálatából álló egyszeri vizsgálatmenetnek (kísérletnek) elegendőnek kell lennie az adott vizsgálati vegyi anyag esetében. Határértéken lévő eredmények esetében azonban, ha például az egyes bőrkorong replikátumok eredményei nem egyeznek és/vagy az átlagos TER-érték 5 ± 0,5 kΩ, megfontolandó egy második független vizsgálatmenet (kísérlet) lefolytatása, illetve ha az első és a második vizsgálatmenet (kísérlet) eredményei különbözőek, egy harmadiké is.

ADATOK ÉS JELENTÉS

Adatok

34.

A vizsgálati vegyi anyagokra, valamint a pozitív és negatív kontrollokra vonatkozó rezisztenciaértékeket (kΩ) és adott esetben a festékanyag-tartalom értékeket (μg/korong) táblázatos formában kell megadni, beleértve minden vizsgálatmenet (kísérlet) során az egyes bőrkorong replikátumok esetében kapott adatokat és az átlagértékeket ± szórással. A jelentésbe bele kell foglalni valamennyi megismételt kísérletet. A bőrkorongok esetleges károsodását minden vizsgálati vegyi anyag esetében fel kell tüntetni.

Vizsgálati jelentés

35.

A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Vizsgálati vegyi anyag és kontrollként szolgáló anyagok:

Egy összetevőből álló anyag: kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján;

Több összetevőből álló anyagok, UVCB-k és keverékek: lehetőség szerint az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai alapján jellemezve;

fizikai megjelenés, vízoldékonyság és további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

eredet, gyártási szám, ha ismert;

a vizsgálati vegyi anyag/kontrollanyag kezelése a vizsgálatot megelőzően, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, felhasználási határideje vagy ismételt elemzésének napja, ha ismert;

tárolási feltételek.

 

Kísérleti állatok:

a használt törzs és nem;

az állatok kora, ha donorállatként használják azokat;

az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.;

a bőrpreparátumra vonatkozó részletek.

 

Vizsgálati körülmények:

a vizsgálati eszközökre vonatkozó kalibrációs görbék;

a festékanyag-megkötő vizsgálat kiértékelésére vonatkozó kalibrációs görbék, az OD-értékek mérésekor használt sávszélesség és adott esetben a mérőeszköz (pl. a spektrofotométer) OD-linearitási tartománya;

a TER-méréshez használt vizsgálati eljárás részletei;

adott esetben a festékanyag-megkötő vizsgálatához használt vizsgálati eljárás részletei;

az alkalmazott vizsgálati dózisok, az expozíciós időszak(ok) hossza és az expozíciós hőmérséklet(ek);

az expozíciós időszak után alkalmazott mosási eljárás részletei;

a vizsgálati vegyi anyagonként és kontrollonként (pozitív és negatív kontrollonként) használt bőrkorong replikátumok száma;

a vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása;

hivatkozás a modellel kapott korábbi adatokra. Ennek többek között az alábbiakat kell magában foglalnia:

i)

a pozitív és negatív kontrollok (kΩ-ban megadott) TER-értékének elfogadhatósága, tekintettel a pozitív és negatív kontrollok ellenállás-tartományára;

ii)

a pozitív és negatív kontrollok (μg/korongban megadott) festékanyag-tartalom értékének elfogadhatósága, tekintettel a pozitív és negatív kontrollok festékanyagtartalom-tartományára;

iii)

a vizsgálati eredmények elfogadhatósága, tekintettel a bőrkorong replikátumok adatainak korábbiakban tapasztalt változékonyságára;

az alkalmazott döntési kritériumok/előrejelzési modell leírása.

 

Eredmények:

A TER és a festékanyag-megkötő vizsgálat adatainak (ha releváns), ezek átlagának, szórásának (SD) és variációs koefficiensének (CV) táblázatba foglalása az egyes vizsgálati vegyi anyagokra és kontrollanyagokra, minden egyes vizsgálatmenetre (kísérletre) és valamennyi bőrkorong replikátumra (minden egyes állatra és minden egyes bőrmintára) vonatkozólag;

bármilyen megfigyelt jelenség leírása;

az alkalmazott előrejelzési modellel/döntési kritériumokkal összhangban kialakított osztályozás.

 

Az eredmények értékelése

 

Következtetések

SZAKIRODALOM

(1)

Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Elérhető a következő címen:[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

E melléklet B.4., Akut bőrirritáció/bőrkorrózió fejezete.

(3)

E melléklet B.40bis, In vitro bőrmodell fejezete.

(4)

E melléklet B.65., In vitro Membrán barrier vizsgálati módszer fejezete.

(5)

E melléklet B.46., In vitro bőrirritáció: Rekonstruált emberi felhámmodellen végzett vizsgálati módszer című fejezete.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In vitro12, 483-524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

1. ábra

A Patkánybőr Ter-Vizsgálatára Szolgáló Műszer

Image 2

2. ábra

Az Alkalmazott Politetrafluoroetiléncső (Ptfe-cső) És Befogadó Cső, Valamint Az Elektródák Méretei

Image 3

A fent ábrázolt eszközök legfontosabb elemei:

a PTFE-cső belső átmérője,

az elektródák PTFE-csőhöz és befogadó csőhöz viszonyított hosszúsága olyan legyen, hogy az elektródák ne érintkezzenek a bőrkoronggal, és hogy állandó hosszúságú elektróda legyen az MgSO4-oldatban,

az MgSO4-oldat befogadó csőben lévő mennyisége a PTFE-csőben lévő szinthez viszonyítva adjon egy bizonyos folyadékmélységet, ahogyan azt az 1. ábra mutatja,

a bőrkorongot kellő erősséggel kell a PTFE-csőhöz rögzíteni úgy, hogy az elektromos ellenállás a bőr tulajdonságaira vonatkozóan valós értéket adjon.

Függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítményének mutatója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. E kifejezést gyakran használják az »egyezés« megfelelőjeként, amely egy adott vizsgálati módszer alkalmazásakor az azonos eredmények arányát fejezi ki (20).

K : korrozív.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Egyezés : a kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek teljesítményének mutatója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. A kifejezést esetenként használják a pontosság megfelelőjeként, és úgy határozzák meg, mint a helyesen pozitívként vagy negatívként besorolt összes vizsgálati vegyi anyag aránya. Az egyezés nagy mértékben függ a vizsgálat tárgyát képező vizsgálati vegyi anyag típusaiban előforduló pozitív eredmények gyakoriságától (20).

GHS (a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az ENSZ által globálisan harmonizált rendszere) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (1).

IATA : integrált vizsgálati és értékelési megközelítés.

Keverék : két vagy több anyagot tartalmazó elegy vagy oldat.

Egy összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben az egyik fő összetevő legalább 80 tömegszázalékban van jelen.

Több összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben egynél több fő összetevő legalább 10 tömegszázalékban, de 80 tömegszázalékot nem meghaladó koncentrációban van jelen. A több összetevőből álló anyag gyártási folyamat eredménye. A keverék és a több összetevőből álló anyag között az a különbség, hogy a keverék két vagy több anyag összekeverésével, kémiai reakció nélkül jön létre. A több összetevőből álló anyag kémiai reakció eredménye.

NK : nem korrozív.

OD : optikai sűrűség.

Pozitív kontroll : a vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt rendszer. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Teljesítményszabványok : hitelesített referenciamódszeren alapuló szabványok, amelyek a javasolt, végrehajtás és funkcionalitás szempontjából hasonló vizsgálati módszer összehasonlíthatósági értékelésének alapjául szolgálnak. Ide tartoznak: i. a vizsgálati módszer alapvető összetevői; ii. a referencia-vegyianyagok minimális jegyzéke, amely a validált vizsgálati módszer által nyújtott teljesítmény elfogadhatóságának igazolására használt vegyi anyagokból került összeállításra; és iii. a validált vizsgálati módszer eredményei alapján meghatározott, hasonló megbízhatósági és pontossági szintek, amelyeket a javasolt vizsgálati módszernek teljesítenie kell a minimális jegyzék referencia-vegyianyagainak felhasználásával történő értékelése során.

Relevancia : a vizsgálati módszer és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálati módszer mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (20).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. A laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság kiszámításával állapítják meg (20).

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálati módszer helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (20).

In vivo bőrkorrózió: : a vizsgálati vegyi anyag alkalmazását követően négy órán belül megjelenő, visszafordíthatatlan bőrkárosodás, azaz a felhámon át az irhára is átterjedő látható szövetelhalás. A korróziós tünetek jellemzően fekély, vérzés, véres hegesedés és – 14 napos megfigyelés végén – a bőr kifehéredése miatt elszíneződés, teljes szőrhullásos területek és hegek. A kérdéses lézió értékeléséhez figyelembe kell venni a kórszövettant.

Specificitás : a vizsgálati módszerrel helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (20).

Anyag : olyan természetes állapotban előforduló vagy gyártási eljárásból származó kémiai elem és vegyületei, amely a stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagot és az alkalmazott eljárásból származó szennyező anyagokat is tartalmazhat, de nem tartalmaz olyan oldószert, amely az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltoztatása nélkül elkülöníthető.

Vizsgálatmenet : egyetlen vizsgálati vegyi anyag egyidejű tesztelése legalább három bőrkorong replikátumon.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Transzkután elektromos rezisztencia (TER) : a bőr elektromos rezisztenciájának mérése rezisztenciaértékként, kiloohmban kifejezve. A barrierfunkció vizsgálatának egy egyszerű és nagy teljesítményű módszere, amely során az ionok bőrön történő passzálását egy Wheatstone-híd segítségével rögzítik.

UVCB: : ismeretlen vagy változó összetételű anyagok, valamint komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

6.

A B. részben a B.40bis. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.40bis.    IN VITRO BŐRKORRÓZIÓ: REKONSTRUÁLT EMBERI FELHÁMMODELLEN VÉGZETT VIZSGÁLATI MÓDSZER

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 431. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. A bőrkorrózió valamely vizsgálati vegyi anyag alkalmazását követően megjelenő, visszafordíthatatlan bőrkárosodás, amely a felhámon át az irhára is átterjedő látható szövetelhalást okoz [az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által kidolgozott, vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének globálisan harmonizált rendszerében (GHS) (1), valamint az Európai Unió (EU) anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendeletében (CLP-rendelet) (6) meghatározottak szerint]. Ez a továbbfejlesztett B.40bis. vizsgálati módszer olyan in vitro eljárást biztosít, amely lehetővé teszi a korróziót nem okozó és korróziót okozó anyagok és keverékek ENSZ GHS és CLP-rendelet szerinti meghatározását. Emellett lehetővé teszi a korrozív anyagok részleges alkategorizálását.

2.

A vegyi anyagok bőrkorróziós hatásának felmérése jellemzően kísérleti állatokon történő vizsgálatot foglal magában (az OECD eredetileg 1981-ben elfogadott, majd 1992-ben, 2002-ben és 2015-ben felülvizsgált 404. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű B.4. vizsgálati módszer alkalmazásával) (2). E B.40bis. vizsgálati módszer mellett a vegyi anyagok bőrkorróziós hatásának vizsgálatára szolgáló két másik in vitro vizsgálati módszert is validáltak és elfogadtak, a B.40. vizsgálati módszert (amely az OECD 430. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű) (3) és a B.65. vizsgálati módszert (amely az OECD 435. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű) (4). A potenciális bőrirritációs hatás felmérésére pedig elfogadták az in vitro B.46. vizsgálati módszert (mely az OECD 439. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű) (5). A bőrkorróziós és bőrirritációs vizsgálatok és értékelések integrált megközelítéseiről (IATA) szóló OECD-iránymutatás több, információforrásokat és adatelemző eszközöket csoportosító modult ismertet, továbbá iránymutatást nyújt arra nézve, i. hogyan integrálhatók és használhatók az ismert vizsgálati és nem vizsgálati eredetű adatok a vegyi anyagok potenciális bőrirritációs és bőrkorróziós hatásainak felmérésére, és ii. javaslatot tesz egy, a további vizsgálatok szükségessége esetén alkalmazható megközelítésre (6).

3.

Ez a vizsgálati módszer a bőrkorrózióval mint az emberi egészség károsodásának egyik végpontjával foglalkozik. A módszerben (nem transzformált emberi epidermális keratinsejtekből felépített) rekonstruált emberi felhámot (RhE) alkalmaznak, amely nagy hasonlósággal modellezi az emberi bőr felső rétegének, azaz a felhámnak (epidermisznek) szövettani, morfológiai, biokémiai és fiziológiai tulajdonságait. A módszerrel egyenértékű, eredetileg 2004-ben elfogadott OECD-iránymutatás 2013-as átdolgozott változatába belefoglalták az RhE-modellt használó további vizsgálati módszereket és annak lehetőségét, hogy a módszereket a korrozív vegyi anyagok alkategóriába sorolására is alkalmazzák, 2015-ös átdolgozott kiadása pedig kitér az IATA-iránymutatásra és bevezet egy, az életképesség mérésére szolgáló alternatív eljárást.

4.

E vizsgálati módszer négy validált, kereskedelmi forgalomban kapható RhE-modellt foglal magában. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető vizsgálati modellek közül kettőn – az EpiSkin™ alapmodellen (SM) és az EpiDerm™ bőrkorróziós vizsgálaton (SCT) (EPI-200) – elővalidálási vizsgálatokat végeztek (7), majd ezt követően a bőrkorrózió értékelésére szolgáló hivatalos validálási vizsgálatot (8) (9) (10) is elvégezték (11) (12) (a továbbiakban validált referenciamódszerek, VRM-ek néven is hivatkozunk rájuk). E vizsgálatok következtetései vezettek ahhoz az ajánláshoz, hogy a fent említett két validált referenciamódszer használható a korrozív (K) és nem korrozív (NK) anyagok szabályozási célú megkülönböztetésére, valamint hogy az EpiSkin™ emellett a korrozív anyagok alkategóriába sorolására is alkalmazható (13) (14) (15). A teljesítményszabványok szerinti validálás alapján két másik kereskedelmi forgalomban kapható in vitro bőrkorróziós RhE vizsgálati modell mutatott az EpiDerm™ validált referenciamódszerhez hasonló eredményeket (16) (17) (18). Ez a két modell a SkinEthic™ RHE (7) és az epiCS® (korábbi nevén EST-1000), amelyek szintén használhatók a korrozív és nem korrozív anyagok szabályozási célú megkülönböztetésére (19) (20). A rekonstruált emberi felhámmodellek gyártói a validálást követően, 2012 és 2014 között vizsgálatokat végeztek egy továbbfejlesztett protokoll alapján, amely korrigálta a vizsgálati vegyi anyagok nem specifikus MTT-redukáló hatására visszavezethető interferenciákat, javítva ezáltal a modellek teljesítményét mind a korrozív/nem korrozív anyagok megkülönböztetése, mind a korrozív anyagok alkategóriába sorolása terén (21) (22). Az EpiDerm™ SCT, a SkinEthic™ RHE és az EpiCS® validálás utáni alkalmazása során nyert adatok statisztikai elemzése révén olyan alternatív előrejelzési modelleket azonosítottak, amelyek javították az alkategóriába sorolási előrejelző képességet (23).

5.

Mielőtt az in vitro RhE bőrkorróziós vizsgálati módszerhez hasonló vagy ahhoz képest módosított, a validált referenciamódszerektől eltérő javasolt módszer szabályozási célú alkalmazásra kerülne, a validált referenciamódszerekhez való hasonlóságának biztosítása érdekében az OECD 34. iránymutatásában lefektetett elvekkel (25) összhangban létrehozott teljesítményszabványok (24) követelményeinek megfelelően meg kell határozni a javasolt felhasználása tekintetében fennálló megbízhatóságát, relevanciáját (pontosságát) és korlátait. Az adatok kölcsönös elfogadása csak azután garantált, hogy a javasolt új vagy átdolgozott vizsgálati módszert a teljesítményszabványok szerint felülvizsgálták és belefoglalták a megfelelő vizsgálati iránymutatásba. A vizsgálati iránymutatásban szereplő vizsgálati modellek felhasználhatók az in vitro bőrkorróziós vizsgálati módszer vizsgálati eredményeire vonatkozó nemzeti követelmények kialakításához, ugyanakkor biztosítják az adatok kölcsönös elfogadásának előnyeit.

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

6.

Az alkalmazott fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK

7.

Ez a vizsgálati módszer lehetővé teszi a nem korrozív és korrozív anyagok és keverékek ENSZ GHS és CLP-rendelet szerinti azonosítását. A vizsgálati módszer emellett támogatja a korrozív anyagok és keverékek nem kötelező jellegű besorolását az ENSZ GHS (1) szerinti 1A alkategóriába, valamint egy kombinált 1B és 1C alkategóriába (21) (22) (23). A vizsgálati módszer egyik korlátja, hogy az 1C alkategóriába sorolt, ismert in vivo korrozív vegyi anyagok csekély száma miatt nem teszi lehetővé a bőrkorróziós 1B alkategória és 1C alkategória ENSZ GHS és CLP-rendelet szerinti megkülönböztetését. Az EpiSkin™, az EpiDerm™ SCT, a SkinEthic™ RHE és az epiCS® vizsgálati modellekkel elvégezhető az alkategóriába sorolás (vagyis 1A vagy 1B és 1C vagy nem korrozív (NK)).

8.

A vizsgálati módszerben szereplő, a nem korrozív és korrozív anyagok azonosítására alkalmazott, vizsgálati modelleket alátámasztó validálás során igen sokféle, többségében különálló anyagokat képviselő vegyi anyagot vizsgáltak; a validálási vizsgálat empirikus adatbázisa összesen 60 vegyi anyagot tartalmazott, amelyek lefedik a kémiai osztályok széles körét (8) (9) (10). A vizsgálati módszer kidolgozói vizsgálták a módszer alkategóriába sorolásra való alkalmazásához kapcsolódó érzékenységét, specificitását, pontosságát és laboratóriumon belüli megismételhetőségét, e vizsgálatok eredményét az OECD felülvizsgálta (21) (22) (23). Az összes rendelkezésre álló adat alapján a vizsgálati módszer a legkülönbözőbb kémiai osztályokra és halmazállapotokra, azon belül folyadékokra, félszilárd, szilárd és viaszos állagú anyagokra alkalmazható. A folyadékok lehetnek vizesek vagy nem vizesek; a szilárd anyagok lehetnek vízben oldódóak vagy oldhatatlanok. Ahol megoldható, a szilárd anyagokat alkalmazásuk előtt finom porrá kell őrölni; a mintát előzetesen nem szükséges más módon kezelni. Olyan esetekben, amikor bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer keretében alkalmazott vizsgálati modellek nem használhatók valamely konkrét vegyianyag-kategóriára, a vizsgálati modelleket nem szabad az adott vegyianyag-kategóriára alkalmazni. E vizsgálati módszerről feltételezhető továbbá, hogy az anyagokra való alkalmazhatóságának kiterjesztéseként keverékekre is alkalmazható. Mivel azonban a keverékek kategóriák és összetételek széles körét fedik le, és jelenleg kevés információ áll rendelkezésre a keverékek vizsgálatára vonatkozóan, azokban az esetekben, amikor bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer valamely konkrét keverékkategóriára nem alkalmazható (pl. a (26) szakirodalomban javasolt stratégia alapján), a vizsgálati módszer az adott keverékkategóriára nem alkalmazható. A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. Gázokat és aeroszolokat hitelesítési vizsgálat keretében még nem vizsgáltak (8) (9) (10). Bár elképzelhető, hogy ezek is vizsgálhatók a rekonstruált emberi felhámmodelles technikával, a jelenlegi vizsgálatimódszer-leírás nem engedi meg gázok és aeroszolok vizsgálatát.

9.

Azok a vizsgálati vegyi anyagok, amelyek ugyanabban a tartományban nyelik el a fényt, mint az MTT-formazán, és azok a vizsgálati vegyi anyagok, amelyek közvetlenül is képesek redukálni az MTT vitális festéket (MTT-formazánná), befolyásolhatják a szövet életképességének mérését, ennek korrigálása érdekében adaptált kontrollokra van szükség. Az esetlegesen szükséges adaptált kontrollok típusa függ a vizsgálati vegyi anyag által előidézett interferencia típusától és az MTT-formazán méréséhez használt eljárástól (lásd a 25–31. pontot).

10.

Ez a vizsgálati módszer ugyan nem biztosít megfelelő információkat a bőrirritáció felméréséhez, de az RhE vizsgálati rendszeren alapuló B.46. vizsgálati módszer célja kifejezetten az, hogy in vitro eljárással határozza meg a bőrirritáció egészségügyi hatását, noha más protokoll alkalmazásával (5). Egyetlen bőrexpozíció után a bőrt ért helyi hatások teljes kiértékeléséhez a vizsgálatok és értékelések integrált megközelítéseiről szóló OECD-iránymutatást kell tanulmányozni (6). Ezen integrált vizsgálati és értékelési megközelítés szerint in vitro bőrkorróziós vizsgálatokat (mint az ebben a vizsgálati módszerben leírtak) és bőrirritációs vizsgálatokat kell lefolytatni mielőtt az élő állatokon végzett vizsgálatokat fontolóra lehetne venni. Elfogadott tény, hogy az emberi bőr használatára nemzeti és nemzetközi etikai megfontolások és feltételek vonatkoznak.

A VIZSGÁLAT ELVE

11.

A vizsgálati vegyi anyagot egy olyan nem transzformált emberi epidermális keratinocitákat tartalmazó, háromdimenziós rekonstruált emberi felhámmodellre viszik fel topikálisan, amelyeket úgy tenyésztettek ki, hogy többrétegű, erősen differenciált emberi felhámot (epidermiszt) alkossanak. Ez szervezett bazális, spinózus és granuláris sejtrétegekből, valamint intercelluláris lamelláris lipidrétegeket tartalmazó többrétegű szarurétegből (stratum corneum) áll, amely tartalmazza a fő lipid osztályokat, amelyek analógok az in vivo megtalálhatókkal.

12.

Az RhE vizsgálati módszer azon az előfeltételen alapul, hogy a korrozív vegyi anyagok diffúzióval vagy erózióval képesek áthatolni a stratum corneumon, és az alatta lévő sejtrétegekre citotoxikus hatást gyakorolnak. A sejtek életképességét az MTT [3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid, tiazolil kék tetrazólium-bromid; CAS-száma: 298–93–1)] vitális festék enzimatikus úton kék formazán kristállyá történő átalakulása alapján mérik, amelyet a szövetekből történő kivonás után mennyiségileg meghatároznak (27). A korrozív hatású vegyi anyagokat azon képességük alapján azonosítják, hogy a sejtek életképességét meghatározott határérték alá csökkentik (lásd a 35. és a 36. pontot). Az RhE-alapú bőrkorróziós vizsgálati módszerről kimutatták, hogy képes előrejelezni a B.4. vizsgálati módszer (2) alapján nyulakon meghatározott in vivo bőrkorróziós hatásokat.

A JÁRTASSÁG BIZONYÍTÁSA

13.

Az e vizsgálati módszerhez kapcsolódó négy validált RhE vizsgálati modell rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak a 1. táblázatban felsorolt tizenkét jártassági tesztanyag megfelelő besorolásával igazolniuk kell szakmai jártasságukat. Valamely módszer alkategóriába sorolás céljára történő használta esetén bizonyítani kell az alkategóriák megfelelő meghatározásában való jártasságot is. Ha a jegyzékben szereplő valamely anyag nem áll rendelkezésre, illetve ha indokolható, megfelelő in vivo és in vitro referenciaadatokkal rendelkező más – például a referencia-vegyianyagok jegyzékében feltüntetett (24) – anyag is használható, amennyiben a kiválasztási kritériumok megegyeznek az 1. táblázatban foglaltakkal.

1. táblázat

A jártassági tesztanyagok jegyzéke  (8)

Anyag

CAS-szám

Kémiai osztály (9)

ENSZ GHS/CLP szerinti, in vivo eredményeken alapuló kat. (10)

VRM szerinti, in vitro eredményeken alapuló kat. (11)

MTT-redukáló (12)

Halmaz-állapot

1A alkategóriájú in vivo korrozív anyagok

Brómecetsav

79-08-3

Szerves sav

1A

(3) 1A

Sz

Bór-trifluorid-dihidrát

13319-75-0

Szervetlen sav

1A

(3) 1A

F

Fenol

108-95-2

Fenol

1A

(3) 1A

Sz

Diklór-acetil-klorid

79-36-7

Elektrofil

1A

(3) 1A

F

Kombinált 1B–1C alkategóriájú in vivo korrozív anyagok

Glioxilsav-monohidrát

563-96-2

Szerves sav

1B–1C

(3) 1B–1C

Sz

Tejsav

598-82-3

Szerves sav

1B–1C

(3) 1B–1C

F

Etanolamin

141-43-5

Szerves bázis

1B

(3) 1B–1C

I

Viszkózus

Sósav (14,4 %)

7647-01-0

Szervetlen sav

1B–1C

(3) 1B–1C

F

In vivo Nem korrozív anyagok

Fenetil-bromid

103-63-9

Elektrofil

NK

(3) NK

I

F

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Szerves bázis

NK

(3) NK

Sz

4-(metil-tio)-benzaldehid

3446-89-7

Elektrofil

NK

(3) NK

I

F

Laurinsav

143-07-7

Szerves sav

NK

(3) NK

Sz

Rövidítések: CAS-szám = Vegyianyag Nyilvántartási Szolgálat (CAS) nyilvántartási szám; VRM = Validált referenciamódszer; NK = Nem korrozív; I = Igen; Sz = szilárd; F = folyékony

14.

A jártasság igazolásának részeként ajánlott, hogy a felhasználó a rekonstruált emberi felhámmodell előállítója által meghatározottak szerint, átvétel után ellenőrizze a szövetek barrierjellemzőit. Ez különösen fontos, ha a szöveteket nagy távolságra/hosszú ideig szállították. Ha egy vizsgálati módszert már sikeresen igazoltak, és az alkalmazásában való jártasságot bizonyították, ilyen jellegű ellenőrzéseket nem szükséges rutinszerűen végezni. Ha azonban egy vizsgálati módszert rutinszerűen alkalmaznak, a barrierjellemzőket javasolt továbbra is rendszeres időközönként ellenőrizni.

ELJÁRÁS

15.

Az alábbiak általános leírását adják a vizsgálati módszer keretében alkalmazott, a bőrkorrózió felmérésére szolgáló RhE vizsgálati modellek összetevőinek és eljárásainak. Azok a rekonstruált emberi felhámmodellek, amelyeknek e vizsgálati módszer keretében történő használatát tudományosan megalapozottként elfogadták – vagyis az EpiSkin™ (SM), az EpiDerm™ (EPI-200), a SkinEthic™ RHE és az epiCS® modellek (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33) – kereskedelmi forgalomban beszerezhetők. E négy rekonstruált emberi felhámmodellhez rendelkezésre állnak szabványműveleti eljárások (34) (35) (36) (37), vizsgálati módszerük főbb összetevőit pedig a 2. melléklet foglalja össze. E modellek bármelyikének laboratóriumi kivitelezése és alkalmazása során tanácsos tanulmányozni a vonatkozó szabványműveleti eljárást. Az ehhez a vizsgálati módszerhez tartozó négy rekonstruált emberi felhámmodellel végzett vizsgálatoknak az alábbi feltételeknek kell megfelelniük:

A RHE VIZSGÁLATI MÓDSZER ÖSSZETEVŐI

Általános feltételek

16.

Az epitélium felépítéséhez nem transzformált emberi keratinocita sejteket kell használni. Élő epitélsejtek több rétegének (bazális réteg, stratum spinosum, stratum granulosum) kell jelen lennie a funkcionális stratum corneum alatt. A stratum corneumnak többrétegűnek kell lennie, és tartalmaznia kell az elengedhetetlenül szükséges lipidprofilt, hogy nagy ellenálló képességgel rendelkező funkcionális barriert képezzen a citotoxikus referencia-vegyianyagok, pl. a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) vagy a Triton X-100 gyors áthatolása ellen. A barrierfunkciót bizonyítani kell, ennek értékeléséhez meghatározható az a referencia-vegyianyag koncentráció, amely meghatározott idejű expozíciót követően 50 %-kal csökkenti a szövetek életképességét (IC50), vagy az az expozíciós idő, amely alatt egy adott, állandó koncentrációjú referencia-vegyianyag hatására a sejtek életképessége 50 %-kal csökken (ET50) (lásd a 18. pontot). A rekonstruált emberi felhámmodell folyadékzáró tulajdonságainak meg kell akadályozni, hogy az anyag passzáljon a stratum corneum körül az élő szövetbe, amely a bőr expozíciójának rossz modellezését eredményezné. A rekonstruált emberi felhámmodellnek baktérium-, vírus-, mikoplazma- és gombafertőzéstől mentesnek kell lennie.

Funkcionális feltételek

Életképesség

17.

A szövetek életképességének számszerű mérése MTT-vizsgálattal történik (27). A rekonstruált emberi felhám szövetkonstrukciójának élő sejtjei az MTT vitális festéket kék MTT-formazán kicsapódássá redukálják, amelyet azután izopropanol (vagy hasonló oldószer) használatával kivonnak a szövetből. Az extraháló oldószer optikai sűrűségének (OD) eléggé alacsonynak, azaz 0,1 alattinak kell lennie. A kivont MTT-formazán mennyisége meghatározható hagyományos abszorbancia (OD) méréssel vagy HPLC/UPLC spektrofotometriás eljárással (38). A rekonstruált emberi felhámmodell felhasználóinak biztosítaniuk kell, hogy az alkalmazott RhE-modell minden egyes tétele megfeleljen a negatív kontrollra vonatkozóan meghatározott kritériumoknak. A rekonstruált emberi felhámmodell előállítójának/forgalmazójának meg kell határoznia a negatív kontroll OD-értékének elfogadhatósági tartományát (alsó és felső határértékét). A vizsgálati módszerhez kapcsolódó négy validált RhE vizsgálati modell negatív kontrolljának OD-értékére vonatkozó elfogadhatósági tartományokat a 2. táblázat tartalmazza. Az HPLC/UPLC spektrofotometriás eljárást használóknak a negatív kontroll elfogadhatósági kritériumaként a 2. táblázatban szereplő negatív kontrollra vonatkozó OD-tartományok szolgálnak. Dokumentálni kell, hogy a negatív kontrollal kezelt szövetek az expozíció időtartama alatt stabil tenyészetben vannak (hasonló OD-értékeket adnak).

2. táblázat

A negatív kontroll OD-értékének elfogadhatósági tartománya a tétel minőségének ellenőrzéséhez

 

Alsó elfogadási határ

Felső elfogadási határ

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Barrierfunkció

18.

A stratum corneumnak és lipidprofiljának az IC50 vagy ET50 alapján végzett becslések szerint (3. táblázat) megfelelő ellenálló képességgel kell rendelkeznie ahhoz, hogy meg tudja akadályozni bizonyos citotoxikus referencia-vegyianyagok (pl. a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) vagy a Triton X-100) gyors áthatolását. Az RhE-modell előállítójának/forgalmazójának, a szövetek végfelhasználóhoz történő kiszállításakor igazolnia kell az alkalmazott rekonstruált emberi felhámmodell minden egyes tételének barrierfunkcióját (lásd a 21. pontot).

Morfológia

19.

A rekonstruált emberi felhámmodellen szövettani vizsgálatot kell végezni, amely igazolja a többrétegű – bazális, spinózus és granuláris sejtrétegekből (stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum) és szarurétegből (stratum corneum) álló – humán epidermiszszerű szerkezetet, valamint azt, hogy a modell lipidprofilja hasonlatos az emberi felhám lipidprofiljához. Az RhE-modell előállítójának/forgalmazójának, a szövetek végfelhasználóhoz történő eljuttatásakor az alkalmazott rekonstruált emberi felhámmodell minden tételén szövettani vizsgálattal igazolnia kell a szövetek megfelelő morfológiáját (lásd a 21. pontot).

Reprodukálhatóság

20.

A vizsgálati módszer felhasználóinak pozitív és negatív kontrollokkal igazolniuk kell a vizsgálati módszerek időbeli reprodukálhatóságát. Emellett a vizsgálati módszer kizárólag alkalmazható, ha az RhE-modell előállítója/forgalmazója adatokkal támasztja alá, hogy a módszer – pl. a jártassági tesztanyagok jegyzékében (1. táblázat) szereplő – korrozív és nem korrozív vegyi anyagokkal időben megismételhető. Valamely vizsgálati módszer alkategóriába sorolás céljára történő alkalmazása esetén a megismételhetőséget az alkategóriába sorolás tekintetében is bizonyítani kell.

Minőség-ellenőrzés

21.

A rekonstruált emberi felhámmodell csak abban az esetben alkalmazható, ha előállítója/forgalmazója igazolja, hogy az alkalmazott RhE-modell minden egyes tétele megfelel a gyártás utáni felszabadításra vonatkozóan meghatározott feltételeknek, amelyek közül az életképességre (17. pont), a barrierfunkcióra (18. pont) és a morfológiára (19. pont) vonatkozó kritériumok a leglényegesebbek. Ezeket az adatokat a vizsgálati módszer felhasználóinak rendelkezésére kell bocsátani, hogy ezeket az információkat fel tudják tüntetni a vizsgálati jelentésben. A korrozív hatás besorolásának megbízható előrejelzéseként kizárólag minőség-ellenőrzésen elfogadott szövettételeken végzett vizsgálatok eredményei fogadhatók el. Az IC50 és az ET50 eljárás elfogadhatósági tartományát (alsó és felső határértékét) a rekonstruált emberi felhámmodell előállítójának/forgalmazójának kell meghatároznia. A négy validált vizsgálati modell elfogadhatósági tartományát a 3. táblázat ismerteti.

3. táblázat

Minőség-ellenőrzési tételfelszabadítás feltételei

 

Alsó elfogadási határ

Felső elfogadási határ

EpiSkin™ (SM) (18 órás kezelés nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS)) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 óra

ET50 = 8,7 óra

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 óra

ET50 = 10,0 óra

epiCS® (1 % Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 óra

ET50 = 7,0 óra

A vizsgálati vegyi anyag és a kontrollként szolgáló vegyi anyagok alkalmazása

22.

Minden expozíciós időszak során valamennyi vizsgálati vegyi anyaghoz és kontrollhoz legalább két szövetreplikátumot kell használni. Folyékony és szilárd vegyi anyagok esetében egyaránt megfelelő mennyiségű vizsgálati vegyi anyagot kell alkalmazni, hogy az egyenletesen fedje az epidermisz felszínét, azaz minimum 70 μl/cm2 vagy 30 mg/cm2-t, ugyanakkor el kell kerülni a végtelen dózis alkalmazását. Modelltől függően szilárd vegyi anyagok alkalmazása előtt az epidermisz felületét ionmentesített vagy desztillált vízzel be kell nedvesíteni, hogy jobb legyen az érintkezés a vizsgálati vegyi anyag és az epidermisz felszíne között (34) (35) (36) (37). A szilárd anyagokat, amikor csak lehetséges finom por alakban kell vizsgálni. A felvitel módjának meg kell felelnie a vizsgálati vegyi anyagnak (lásd például a 34–37. referenciát). Az expozíciós időszak lejártával a vizsgálati vegyi anyagot vizes alapú pufferrel vagy 0,9 %-os NaCl-dal óvatosan le kell mosni az epidermisz felületéről. Attól függően, hogy a négy validált RhE vizsgálati modell közül melyiket használják, vizsgálati vegyi anyagonként két vagy három expozíciós időszak alkalmazandó (mind a négy validált rekonstruált emberi felhámmodell esetében: 3 perc és 1 óra; az EpiSkin™ esetében plusz egy 4 órás expozíciós időszak). Az alkalmazott RhE vizsgálati modell és a meghatározott expozíciós időszak függvényében az expozíció alatti inkubációs hőmérséklet szobahőmérséklet és 37 °C között változhat.

23.

Minden vizsgálatmenetben párhuzamos negatív és pozitív kontrollokkal bizonyítani kell, hogy a szövetek életképessége (negatív kontrollokkal), barrierfunkciója és az abból fakadó érzékenysége (pozitív kontrollokkal) egy meghatározott dokumentált elfogadhatósági tartományba esik. A javasolt pozitív kontrollanyag az alkalmazott rekonstruált emberi felhámmodelltől függően a jégecet vagy a 8N KOH. Megjegyzendő, hogy a 8N KOH közvetlen MTT-redukáló hatású, ezért szükség lehet a 25. és 26. pontban ismertetett adaptált kontrollok elvégzésére. A javasolt negatív kontrollanyag a 0,9 vegyesszázalékos NaCl-oldat vagy a víz.

A sejtek életképességének mérése

24.

E vizsgálati módszer alkalmazása során a sejtek életképességének mérésére a kvantitatív MTT-vizsgálatot kell alkalmazni (27). A szövetmintát 3 órára megfelelő koncentrációjú (0,3 vagy 1 mg/ml) MTT-oldatba helyezik. A kicsapódott kék formazán terméket azután oldószer (pl. izopropanol, savas izopropanol) használatával eltávolítják a szövetből, és egy maximum ±30 nm-es sávszűrő alkalmazásával 570 nm hullámhosszon az OD-érték meghatározásával, vagy egy HPLC/UPLC spektrofotometriás eljárás útján (lásd a 30. és 31. pontot) (38) megmérik a formazán koncentrációját.

25.

A vizsgálati vegyi anyagok megzavarhatják az MTT-vizsgálatot azáltal, hogy közvetlenül kék formazánná redukálják az MTT-t és/vagy azáltal, hogy színinterferenciát okoznak, ha a vizsgálati vegyi anyag jellegénél fogva vagy a kezelési eljárás következtében a formazánnal azonos OD-tartományban nyeli el a fényt (570 ± 30 nm, többnyire kék vagy lila vegyi anyagok esetében). E vizsgálati vegyi anyagok potenciális zavaró hatásának kiszűrése és korrigálása érdekében további kontrollokat kell végezni, mint például a nem specifikus MTT-redukció (NSMTT) kontrollt és a nem specifikus színeződés (NSC) kontrollt (lásd a 26–30. pontot). Ez különösen fontos abban az esetben, amikor egy adott vizsgálati vegyi anyagot nem távolítottak el teljesen a szövetből a mosás során, vagy amikor az anyag áthatol az epidermiszen, és így az MTT életképességi vizsgálat elvégzése során jelen van a szövetekben. A vizsgálati modellek szabványműveleti eljárásai részletes leírással szolgálnak arról, hogyan kell korrigálni a közvetlen MTT-redukáló hatást és a színezőanyagok okozta zavaró hatást (34) (35) (36) (37).

26.

A közvetlen MTT-redukáló hatással rendelkező anyagok azonosítása érdekében minden vizsgálati vegyi anyagot frissen készített MTT-közegbe kell helyezni (34) (35) (36) (37). Amennyiben a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó MTT-keverék színe kékre/lilára változik, a vizsgálati vegyi anyag feltételezhetően közvetlenül redukálja az MTT-t, ezért kiegészítő funkcionális ellenőrzést kell végezni elhalt epidermiszen, független vizsgálat keretében hagyományos abszorbancia (OD) mérés, illetve HPLC/UPLC spektrofotometriás eljárás útján. E kiegészítő funkcionális ellenőrzés során elhalt szöveteket használnak, amelyek reziduális metabolikus aktivitással rendelkeznek csupán, ugyanakkor a vizsgálati vegyi anyagot az élő szövetekhez hasonló mértékben abszorbeálják. Az egyes MTT-redukáló hatású vegyi anyagokkal expozíciós időszakonként legalább két elhalt szövetreplikátumot kezelnek, amelyeken elvégzik a teljes bőrkorróziós vizsgálatot. Ezután meghatározzák a szövetek valódi életképességét, ehhez az MTT-redukáló anyaggal kezelt élő szövetekkel kapott életképességi arányból levonják az ugyanazon MTT-redukáló anyaggal kezelt elhalt szövetekkel kapott nem specifikus MTT-redukció arányát, amelyet a vizsgálattal párhuzamosan végzett negatív kontrollal korrigálva számítanak ki (NSMTT-arány).

27.

Annak érdekében, hogy meghatározható legyen a színes vizsgálati vegyi anyagok, illetve a vízzel vagy izopropanollal való érintkezés következtében elszíneződött vizsgálati vegyi anyagok potenciális zavaró hatása, és dönteni lehessen a kiegészítő kontrollok szükségességéről, el kell végezni a vizsgálati vegyi anyag spektrumelemzését vízben (expozíciós környezet) és/vagy izopropanolban (extraháló oldat). Amennyiben vízben és/vagy izopropanolban a vizsgálati vegyi anyag 570 ± 30 nm-es tartományban nyeli el a fényt, további színezőanyag-kontrollokra van szükség, illetve alternatív megoldásként HPLC/UPLC spektrofotometriás eljárást lehet végezni, amelynek alkalmazásakor ezek a kontrollok nem szükségesek (lásd a 30. és 31. pontot). Hagyományos abszorbancia (OD) mérés esetén az egyes zavaró hatású színes vizsgálati vegyi anyagokkal expozíciós időszakonként legalább két élő szövetreplikátumot kezelnek, amelyeken elvégzik a teljes bőrkorróziós vizsgálatot, de az MTT inkubációs fázis során MTT-mentes oldatba helyezik azokat, hogy létrehozzanak egy nem specifikus színeződés (NSCélő) kontrollt. Az élő szövetekre jellemző biológiai változékonyságból kifolyólag az NSCélő kontrollt (minden egyes vizsgálatmenetben) valamennyi expozíciós időszakkal és színes vizsgálati vegyi anyaggal párhuzamosan el kell végezni. Ezután meghatározzák a szövetek valódi életképességét, ehhez a zavaró hatású vizsgálati vegyi anyaggal kezelt és MTT-oldatban inkubált élő szövetekkel kapott életképességi arányból levonják a korrigálandó vizsgálattal párhuzamosan elvégzett, a zavaró hatású vizsgálati vegyi anyaggal kezelt, viszont MTT nélküli közegben inkubált élő szövetekkel kapott nem specifikus elszíneződési százalékot (NSCélő arány).

28.

Azon hagyományos abszorbancia (OD) méréssel értékelt vizsgálati vegyi anyagok esetében, amelyek egyaránt okoznak közvetlen MTT-redukciót (lásd a 26. pontot) és színinterferenciát (lásd a 27. pontot), az előző pontokban ismertetett NSMTT és NSCélő kontrollok mellett szükség van egy harmadik fajta kontrollra is. Általában ez a helyzet áll elő az MTT-vizsgálatot zavaró sötét színű (pl. kék, lila, fekete) vizsgálati vegyi anyagoknál, mivel saját színük akadályozza, hogy a 26. pontban leírtak szerint értékelni lehessen közvetlen MTT-redukáló hatásukat. Ezek a vizsgálati vegyi anyagok egyaránt kötődhetnek élő és elhalt szövetekhez, ezért az NSMTT-kontroll nem csupán a vizsgálati vegyi anyag által előidézett közvetlen MTT-redukáló hatást korrigálja, hanem az anyag elhalt szövetekhez való kötődéséből eredő színinterferenciát is. Ez viszont a színinterferencia kétszeri korrekciójához vezethet, mivel az NSCélő kontroll már korrigálja a vizsgálati vegyi anyag élő szövetekhez való kötődéséből fakadó színinterferenciát. A színinterferencia esetleges kétszeri korrekciójának kiküszöbölése érdekében szükség van egy harmadik kontrollra, amely az elhalt szövetek esetében méri a nem specifikus elszíneződést (NSCelhalt). E kiegészítő kontroll során a vizsgálati vegyi anyaggal expozíciós időszakonként legalább két elhalt szövetreplikátumot kezelnek, amelyeken elvégzik a teljes bőrkorróziós vizsgálatot, de az MTT inkubációs fázis során MTT-mentes oldatba helyezik azokat. A független vizsgálatok/vizsgálatmenetek számától függetlenül vizsgálati vegyi anyagonként elegendő egyetlen NSCelhalt kontroll, azt azonban az NSMTT-kontrollal egyidejűleg, és ha megoldható, ugyanazon szövettételen kell elvégezni. Ezután meghatározzák a szövetek valódi életképességét, ehhez a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt élő szövetekkel kapott életképességi arányból levonják az NSMTT-arányt és az NSCélő arányát, majd hozzáadják a zavaró hatású vizsgálati vegyi anyaggal kezelt és MTT nélküli közegben inkubált elhalt szövetekkel kapott nem specifikus elszíneződési arányt, amelyet a korrigálandó vizsgálattal párhuzamosan végzett negatív kontrollhoz viszonyítva számítanak ki (NSCelhalt arány).

29.

Fontos megjegyezni, hogy a nem specifikus MTT-redukció és a nem specifikus színinterferencia a spektrofotométer linearitási tartománya fölé növelheti a szövetkivonat leolvasott értékeit. Ebből kifolyólag minden laboratóriumnak kereskedelmi forgalomban kapható MTT-formazán (CAS-száma: 57360-69-7) segítségével meg kell határoznia spektrofotométerének linearitási tartományát, mielőtt megkezdené a vizsgálati vegyi anyagok szabályozási célú vizsgálatát. A spektrofotométert használó hagyományos abszorbancia (OD) mérés alkalmas a közvetlen MTT-redukáló hatással bíró és színinterferenciát okozó vizsgálati vegyi anyagok értékelésére, amikor a szövetkivonatok vizsgálati vegyi anyaggal kapott, közvetlen MTT-redukció és/vagy színinterferencia tekintetében nem korrigált OD-értékei a spektrofotométer linearitási tartományán belül vannak, illetve amikor a vizsgálati vegyi anyaggal kapott nem korrigált életképességi arány alapján a vizsgálati vegyi anyag korrozívnak tekinthető (lásd a 35. és 36. pontot). Mindazonáltal a negatív kontroll 50 %-ánál nagyobb NSMTT-arányt és/vagy NSCélő arányt előidéző vizsgálati vegyi anyagok eredményei óvatosan értelmezendők.

30.

Azon színes vizsgálati vegyi anyagok esetében, amelyek nagy mértékben befolyásolják az MTT-vizsgálatot, és ezért hagyományos abszorbancia (OD) méréssel nem vizsgálhatók, az MTT-formazán HPLC/UPLC spektrofotometriás eljárással történő meghatározását lehet alkalmazni (lásd a 31. pontot) (37). A HPLC/UPLC spektrofotometriás rendszer lehetővé teszi, hogy az MTT-formazánt mennyiségi meghatározása előtt elkülönítsék a vizsgálati vegyi anyagtól (38). Ezért HPLC/UPLC spektrofotometriás módszer használata esetén a vizsgálati vegyi anyagtól függetlenül soha nincs szükség NSCélő és NSCelhalt kontrollra. Az NSMTT-kontroll ugyanakkor alkalmazandó, ha a vizsgálati vegyi anyag gyaníthatóan közvetlenül redukálja az MTT-t, vagy a színe miatt közvetlen MTT-redukáló hatását nem lehet felmérni (a 26. pontban ismertetett módon). Amennyiben HPLC/UPLC spektrofotometriásan mérik az MTT-formazánt, a szövetek életképességi aránya a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt élő szövetekkel kapott MTT-formazán csúcsterület és a párhuzamos negatív kontrollal kapott MTT-formazán csúcsterület aránya lesz. A közvetlen MTT-redukáló hatással rendelkező vizsgálati vegyi anyagok esetében a szövetek valódi életképességét úgy számítják ki, hogy a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt élő szövetekkel kapott életképességi arányból kivonják az NSMTT-arányt. Végül megjegyzendő, hogy azok a közvetlen MTT-redukáló hatású, esetleg színinterferenciát is okozó vegyi anyagok, amelyek a kezelést követően visszamaradnak a szövetben és olyan erős MTT-redukáló hatással bírnak, hogy a vizsgált szövetkivonatok OD-értéke (hagyományos OD mérés esetén), illetve csúcsterülete (HPLC/UPLC spektrofotometriás mérés esetén) kívül esik a spektrofotométer linearitási tartományán, nem értékelhetők, bár ilyen csak igen ritka esetben fordul elő.

31.

A HPLC/UPLC spektrofotometria bármely típusú vizsgálati vegyi anyagnál (színes, nem színes, MTT-redukáló vagy nem MTT redukáló hatású) alkalmazható az MTT-formazán mérésére (38). A HPLC/UPLC spektrofotometriás rendszerek sokfélesége miatt szükség van arra, hogy a szövetkivonatok MTT-formazán-tartalmának meghatározása előtt igazolják a HPLC/UPLC spektrofotometriás rendszer minősítését azzal, hogy eleget tesznek az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerfelügyelete (FDA) által az iparág számára kiadott, bioanalitikus módszerek validálására vonatkozó iránymutatásban (38) (39) szereplő standard minősítési paramétereken alapuló elfogadhatósági kritériumoknak. E kulcsfontosságú paraméterekről és elfogadhatósági kritériumokról a 4. függelék nyújt tájékoztatást. Amint eleget tettek a 4. függelékben meghatározott elfogadhatósági kritériumoknak, a HPLC/UPLC spektrofotometriás rendszer minősítettnek tekintendő, és alkalmas arra, hogy az itt leírt vizsgálati módszerben bemutatott kísérleti feltételek mellett elvégezze az MTT-formazán mérését.

Elfogadhatósági kritériumok

32.

Minden vizsgálati módszer esetében, amelynek során érvényes RhE-modelleket alkalmaznak, a negatív kontrollal kezelt szöveteknek olyan OD-értéket kell mutatniuk, amely tükrözi a szövetek 2. táblázatban feltüntetett értékek szerinti minőségét, és amely nem lehet alacsonyabb a korábbi adatok alapján megállapított határértékeknél. A pozitív kontrollanyaggal, vagyis jégecettel vagy 8N KOH-hal kezelt szöveteknek tükrözniük kell a szövetek azon képességét, hogy a vizsgálati modell feltételei mellett reagálnak a korrozív vegyi anyagokra (lásd a 2. függeléket). A vizsgáltati és/vagy kontroll vegyi anyagokkal kezelt szövetreplikátumok variabilitásának az egyes érvényes RhE-modellek követelményeiben szereplő elfogadott határértéken belül kell maradnia (lásd a 2. függeléket) (pl. a két szövetreplikátum közötti variabilitási különbség nem haladhatja meg a 30 %-ot). Amennyiben egy adott vizsgálatmenet negatív vagy pozitív kontrollja kívül esik az elfogadott tartományon, a vizsgálatmenetet érvénytelennek kell nyilvánítani, és meg kell ismételni. Ha a vizsgálati vegyi anyag variabilitása kívül esik a meghatározott tartományon, meg kell ismételni a vizsgálatát.

Az eredmények értelmezése és az előrejelzési modell

33.

Az egyes vizsgálati vegyi anyagokra vonatkozó OD-értéket kell felhasználni a 100 %-nak vett negatív kontrollhoz viszonyított százalékos életképesség kiszámításához. HPLC/UPLC spektrofotometria alkalmazása esetén a szövetek életképességi aránya a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt élő szövetekkel kapott MTT-formazán csúcsterület és a párhuzamos negatív kontrollal kapott MTT-formazán csúcsterület arányaként kerül meghatározásra. A sejtéletképesség százalékban megállapított határértéke, amelynek alapján megkülönböztethetők a korrozív és nem korrozív vizsgálati vegyi anyagok (vagy a különböző korrozív alkategóriák), és amelynek alapján az eredményeket értelmezni kell, a vizsgálati módszerhez tartozó vizsgálati modellekre vonatkozólag az alábbi 35. és 36. pontban kerül meghatározásra.

34.

Ha a létrejött besorolás egyértelmű, legalább két szövetreplikátum vizsgálatából álló egyszeri vizsgálatmenetnek elegendőnek kell lennie az adott vizsgálati vegyi anyag esetében. Határértéken lévő eredmények esetében azonban, ha például az egyes szövetreplikátumok eredményei nem egyeznek, megfontolható egy második vizsgálatmenet lefolytatása, és ha az első és a második vizsgálatmenet eredményei különbözőek, egy harmadiké is.

35.

Az ENSZ GHS/CLP-rendelet osztályozási rendszeréhez kapcsolódó EpiSkin™ bőrkorróziós vizsgálati modell előrejelzési modellje (9) (34) (22) a 4. táblázat szerint alakul:

4. táblázat

EpiSkin™ előrejelzési modell

Adott expozíciós időpontokban mért életképesség (t = 3, 60 és 240 perc)

Megfontolandó javaslat

< 35 % 3 perc expozíció után

Korrozív:

Opcionális 1A alkategóra (*1)

≥ 35 % 3 perc expozíció után ÉS

< 35 % 60 perc expozíció után

VAGY

≥ 35 % 60 perc expozíció után ÉS

< 35 % 240 perc expozíció után

Korrozív:

Opcionális 1B és 1C alkategória kombinációja

≥ 35 % 240 perc expozíció után

Nem korrozív

36.

Az ENSZ GHS/CLP-rendelet osztályozási rendszeréhez kapcsolódó EpiDerm™ SCT (10) (23)(35), SkinEthic™ RHE (17) (18) (23) (36) és epiCS® (16) (23) (37) bőrkorróziós vizsgálati modellek előrejelzési modellje az 5. táblázat szerint alakul:

5. táblázat

EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE és epiCS®

Adott expozíciós időpontokban mért életképesség (t = 3 és 60 perc)

Megfontolandó javaslat

1. LÉPÉS EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE és epiCS® használata esetén

< 50 % 3 perc expozíció után

Korrozív

≥ 50 % 3 perc expozíció után ÉS < 15 % 60 perc expozíció után

Korrozív

≥ 50 % 3 perc expozíció után ÉS≥ 15 % 60 perc expozíció után

Nem korrozív

2. LÉPÉS EpiDerm™ SCT használata esetén – az 1. lépésben korrozívnak minősített anyagoknál/keverékeknél

< 25 % 3 perc expozíció után

Opcionális 1A alkategóra *

≥ 25 % 3 perc expozíció után

Opcionális kombinált 1B–1C alkategória

2. LÉPÉS SkinEthic™ RHE használata esetén – az 1. lépésben korrozívnak minősített anyagoknál/keverékeknél

< 18 % 3 perc expozíció után

Opcionális 1A alkategóra *

≥ 18 % 3 perc expozíció után

Opcionális kombinált 1B–1C alkategória

2. LÉPÉS epiCS® használata esetén – az 1. lépésben korrozívnak minősített anyagoknál/keverékeknél

< 15 % 3 perc expozíció után

Opcionális 1A alkategóra *

≥ 15 % 3 perc expozíció után

Opcionális kombinált 1B–1C alkategória

ADATOK ÉS JELENTÉS

Adatok

37.

Mindegyik vizsgálatra vonatkozóan táblázatos jelentést kell készíteni az egyes szövetreplikátumok adatairól (például OD-értékek és számított százalékos sejt-életképességi adatok az egyes vizsgálati vegyi anyagok esetében, a besorolást is beleértve), amelyben szerepelnie kell a megismételt kísérletek adatainak is, ha voltak ilyenek. Ezen túlmenően jelentésbe kell foglalni az egyes vizsgálatokban használt szövetreplikátumok átlagát, életképességi tartományát és variációs koefficiensét. Az MTT-reagens és a közvetlen MTT-redukáló hatású vagy színes vizsgálati vegyi anyagok között megfigyelt kölcsönhatásokat a jelentésben minden vizsgálati vegyi anyag esetében fel kell tüntetni.

Vizsgálati jelentés

38.

A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Vizsgálati vegyi anyag és kontrollként szolgáló vegyi anyagok:

Egy összetevőből álló anyag: kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján;

Több összetevőből álló anyagok, UVCB-k és keverékek: amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai jellemzik;

fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

eredet, gyártási szám, ha ismert;

a vizsgálati vegyi anyag/kontrollanyag kezelése a vizsgálatot megelőzően, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, felhasználási határideje vagy ismételt elemzésének napja, ha ismert;

tárolási feltételek.

 

Az alkalmazott RhE-modell és protokoll, valamint használatuk indokolása (amennyiben szükséges)

 

Vizsgálati körülmények:

az alkalmazott RhE-modell (és gyártási szám);

az MTT-formazán mennyiségi meghatározására használt mérőeszköz (pl. spektrofotométer) kalibrálási adatai, a hullámhossz és (adott esetben) a sávszélesség, valamint a mérőeszköz linearitási tartománya;

az MTT-formazán számszerű mérésére alkalmazott módszer leírása;

a HPLC/UPLC-spektrofotometriás rendszer minősítésének leírása, ha releváns;

az alkalmazott specifikus RhE-modellre vonatkozó teljes körű alátámasztó adatok, köztük a modell teljesítménye. Ennek többek között az alábbiakat kell magában foglalnia:

i.

életképesség;

ii.

barrierfunkció;

iii.

morfológia;

iv.

reprodukálhatóság és előrejelző képesség;

v.

a modell minőség-ellenőrzése;

hivatkozás a modellel kapott korábbi adatokra. Ennek többek között magában kell foglalnia a minőség-ellenőrzési adatok elfogadhatóságát, tekintettel a korábbi tételadatokra;

a vizsgálati módszer végrehajtásában való jártasság bizonyítása a módszer rutinszerű használata előtt, a jártassági tesztanyagok vizsgálata révén.

 

Vizsgálati eljárás:

az alkalmazott vizsgálati eljárás részletes leírása (ideértve az expozíciós időszak utáni öblítési eljárásokat);

a vizsgálati vegyi anyag és a kontrollként szolgáló vegyi anyagok dózisa;

az expozíciós időszak(ok) hossza és az expozíciós hőmérséklet(ek);

a közvetlen MTT-redukáló hatással rendelkező és/vagy színváltozást okozó vizsgálati vegyi anyagokhoz alkalmazott kontrollok feltüntetése, amennyiben releváns;

vizsgálati vegyi anyagonként és kontrollonként (pozitív kontroll, negatív kontroll, NSMTT, NSCélő és NSCelhalt, ha releváns), valamint az egyes expozíciós időszakok során használt szövetreplikátumok;

a használt RhE-modell alapján alkalmazott döntési kritériumok/előrejelzési modell leírása;

a vizsgálati eljárás (többek között a mosási eljárások) bármilyen változtatásának leírása.

 

A vizsgálatmenet és a vizsgálat elfogadásának kritériumai:

a pozitív és negatív kontrollok átlagértéke és elfogadhatósági tartománya a korábbi adatokon alapul;

a pozitív és negatív kontrollokban használt szövetreplikátumok közötti elfogadható mértékű variabilitás;

a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt szövetreplikátumok közötti elfogadható mértékű variabilitás.

 

Eredmények:

az egyes vizsgálati vegyi anyagokra és kontrollokra, minden expozíciós időpontra, vizsgálatmenetre és szövetmérésre vonatkozó adatok, többek között az OD-érték vagy az MTT-formazán csúcsterület, szövetek életképességi aránya, szövetek átlagos életképességi aránya, a replikátumok közötti eltérések, szórások és/vagy variációs koefficiensek (amennyiben releváns) táblázatba foglalása;

amennyiben alkalmazandó, a közvetlen MTT-redukáló hatású és/vagy elszíneződést okozó vizsgálati vegyi anyagokhoz használt kontrollok eredményei, ideértve az OD-értéket vagy az MTT-formazán csúcsterületet, az NSMTT, az NSCélő és az NSCelhalt arányt, a szövetreplikátumok közötti különbségeket, szórásokat és/vagy variációs koefficienseket (amennyiben releváns), és a szövetek helyes végső életképességi arányát;

a meghatározott vizsgálatmenet és a vizsgálat elfogadhatósági kritériumai tekintetében a vizsgálati vegyi anyaggal/anyagokkal és a kontrollként szolgáló vegyi anyagokkal kapott eredmények;

a megfigyelt egyéb hatások leírása.

az alkalmazott előrejelzési modellel/döntési kritériumokkal összhangban kialakított osztályozás.

 

Az eredmények értékelése

 

Következtetések

SZAKIRODALOM

(1)

UN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth Revised Edition, UN New York valamint Geneva. Elérhető a következő címen:http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

(2)

E melléklet B.4., Akut bőrirritáció/bőrkorrózió fejezete.

(3)

E melléklet B.40., In vitro bőrkorrózió fejezete.

(4)

E melléklet B.65., In vitro Membrán barrier vizsgálati módszer fejezete.

(5)

E melléklet B.46., In vitro bőrirritáció: Rekonstruált emberi felhámmodellen végzett vizsgálati módszer című fejezete.

(6)

OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203) Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23:219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol.In vitro 12:471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for SkinCorrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in vitro 12:483-524.

(10)

Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. and Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.

(11)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. et Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129-147.

(12)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological TestMethods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(13)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(14)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(15)

EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21 March 2000.

(16)

Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. and Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol.In vitro 19: 925-929.

(17)

Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., and Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In vitro 20: 547-559.

(18)

Tornier C., Roquet M. and Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In vitro 24: 1379-1385.

(19)

EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17 November 2006.

(20)

EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12 June 2009.

(21)

OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(22)

Alépée N., Grandidier M.H., and Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In vitro 28:131-145.

(23)

Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., and Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In vitro 29:2055-2080.

(24)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris

(25)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(26)

Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(27)

Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55-63.

(28)

Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In vitro. In: In vitro Skin Toxicology. Rougier A.,. Goldberg A.M and Maibach H.I. (Eds): 133-140.

(29)

Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. and Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol.in vitro 8:889 - 891.

(30)

Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J and Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211 - 225.

(31)

Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. and Thivolet J. (1991). In vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310-319.

(32)

Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS and Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9, 163-171.

(33)

Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF and Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747-756.

(34)

EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

(35)

EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation's Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

(36)

SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

(37)

EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS® ) CellSystems.

(38)

Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., and McNamee P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In vitro 29: 741-761.

(39)

US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (2001. május). Elérhető a következő címen: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítményének mutatója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. E kifejezést gyakran használják az »egyezés« megfelelőjeként, amely egy adott vizsgálati módszer alkalmazásakor az azonos eredmények arányát fejezi ki (25).

Sejtek életképessége : a sejtpopulációk teljes aktivitását mérő paraméter (például a celluláris mitokondriális dehidrogenázoknak az MTT ([3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid, tiazolil kék] vitális festéket redukáló képessége), amely – a mért végponttól és az alkalmazott vizsgálati tervtől függően – korrelációt mutat az élő sejtek teljes számával és/vagy életképességével.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Egyezés : a kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek teljesítményének mutatója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. A kifejezést esetenként használják a pontosság megfelelőjeként, és úgy határozzák meg, mint a helyesen pozitívként vagy negatívként besorolt összes vizsgálati vegyi anyag aránya. Az egyezés nagy mértékben függ a vizsgálat tárgyát képező vizsgálati vegyi anyag típusaiban előforduló pozitív eredmények gyakoriságától (25).

ET50 : a referencia-vegyianyag meghatározott, állandó koncentrációban történő alkalmazása esetén a sejt életképességének 50 %-kal való csökkentéséhez szükséges expozíciós idő meghatározásával becsülhető meg, lásd még az IC50-et.

GHS (a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének globálisan harmonizált rendszere) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (1).

HPLC: : nagy teljesítményű folyadékkromatográfia.

IATA : integrált vizsgálati és értékelési megközelítés.

IC50 : annak a koncentrációnak a meghatározásával becsülhető meg, amelynél egy adott referencia-vegyianyag egy meghatározott expozíciós idő elteltével 50 %-kal (IC50) csökkenti a szövetek életképességét; lásd még az ET50-et.

Végtelen dózis : az epidermiszen alkalmazott vizsgálati vegyi anyag azon mennyisége, amely meghaladja az epidermisz felszínének teljes és egyenletes befedéséhez szükséges mennyiséget.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba.

Egy összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben az egyik fő összetevő legalább 80 tömegszázalékban van jelen.

MTT : 3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid; tiazolil kék tetrazólium-bromid.

Több összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben egynél több fő összetevő több mint 10 tömegszázalékban, de 80 tömegszázalékot nem meghaladó koncentrációban van jelen. A több összetevőből álló anyag gyártási folyamat eredménye. A keverék és a több összetevőből álló anyag között az a különbség, hogy a keverék két vagy több anyag összekeverésével, kémiai reakció nélkül jön létre. A több összetevőből álló anyag kémiai reakció eredménye.

NK : nem korrozív.

NSCelhalt kontroll : elhalt szöveteken végzett, nem specifikus színeződést mérő kontroll.

NSCélő kontroll : élő szöveteken végzett, nem specifikus színeződést mérő kontroll.

NSMTT : nem specifikus MTT-redukció.

OD : optikai sűrűség.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó vegyi anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Teljesítményszabványok : hitelesített referenciamódszeren alapuló szabványok, amelyek a javasolt, végrehajtás és funkcionalitás szempontjából hasonló vizsgálati módszer összehasonlíthatósági értékelésének alapjául szolgálnak. Ide tartoznak: i. a vizsgálati módszer alapvető összetevői; ii. a referencia-vegyianyagok minimális jegyzéke, amely a validált vizsgálati módszer által nyújtott teljesítmény elfogadhatóságának igazolására használt vegyi anyagokból került összeállításra; és iii. a validált vizsgálati módszer eredményei alapján meghatározott, azokhoz hasonló megbízhatósági és pontossági szint, amelyet a javasolt vizsgálati módszernek teljesítenie kell a referencia-vegyianyagok minimális jegyzéke szerinti értékelése során (25).

Relevancia : a vizsgálati módszer és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálati módszer mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (25).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. A laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság kiszámításával állapítják meg (25).

Vizsgálatmenet : egy vizsgálatmenet során egy vagy több vizsgálati vegyi anyagot vizsgálnak egy párhuzamos negatív kontrollal és egy pozitív kontrollal.

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálati módszer helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (25).

In vivo bőrkorrózió : a vizsgálati vegyi anyag alkalmazását követően négy órán belül megjelenő, visszafordíthatatlan bőrkárosodás, azaz a felhámon át az irhára is átterjedő látható szövetelhalás. A korróziós reakciót fekélyek, vérzés, véres var, illetve a 14 napos megfigyelési időszak végén a bőr kifehéredése miatti elszíneződések, teljesen szőrtelen területek és hegek jellemzik. A kérdéses lézió értékeléséhez figyelembe kell venni a kórszövettant.

Specificitás : a vizsgálati módszerrel helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (25).

Anyag : olyan természetes állapotban előforduló vagy gyártási eljárásból származó kémiai elem és vegyületei, amely a stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagot és az alkalmazott eljárásból származó szennyező anyagokat is tartalmazhat, de nem tartalmaz olyan oldószert, amely az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltoztatása nélkül elkülöníthető.

Vizsgálati vegyi anyag: : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

UPLC : ultranagy teljesítményű folyadékkromatográfia.

UVCB : ismeretlen vagy változó összetételű anyagok, valamint komplex reakciótermékek vagy biológiai anyagok.

2. függelék

A BŐRKORRÓZIÓS VIZSGÁLATKÉNT VALIDÁLT RHE VIZSGÁLATI MODELLEK FŐBB ÖSSZETEVŐI

A vizsgálati modell összetevői

EpiSkinTM

EpiDermTM SCT

SkinEthicTM RHE

epiCS®

A modell felülete

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

A szövetreplikátumok száma

Expozíciós időszakonként legalább 2

Expozíciós időszakonként legalább 2–3

Expozíciós időszakonként legalább 2

Expozíciós időszakonként legalább 2

A kezelési dózisok és alkalmazásuk

Folyadékok és viszkózus anyagok: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2)

Szilárd anyagok: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5 μl NaCl-oldat (9 g/l)

Viaszos/ragadós anyagok: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) nejlonhálóval

Folyadékok: 50 μl (79,4 μl/cm2) nejlonhálóval vagy anélkül

Elővizsgálat a vizsgálati vegyi anyag nejlonhálóval való kompatibilitására

Félszilárd anyagok: 50 μl (79,4 μl/cm2)

Szilárd anyagok: 25 μl H2O (vagy szükség esetén több) + 25 mg (39,7 mg/cm2)

Viaszos anyagok: kb. 8 mm átmérőjű lapos „korongszerű” darab helyezendő a 15 μl H2O-val megnedvesített szövetre.

Folyadékok és viszkózus anyagok: 40 μl ± 3μl (80 μl/cm2) nejlonháló használatával

Elővizsgálat a vizsgálati vegyi anyag nejlonhálóval való kompatibilitására

Szilárd anyagok: 20 μl ± 2 μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2)

Viaszos/ragadós anyagok: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) nejlonháló használatával

Folyadékok: 50 μl (83,3 μl/cm2) nejlonháló használatával

Elővizsgálat a vizsgálati vegyi anyag nejlonhálóval való kompatibilitására

Félszilárd anyagok: 50 μl (83,3 μl/cm2)

Szilárd anyagok: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (vagy szükség esetén több)

Viaszos anyagok: kb. 8 mm átmérőjű lapos „keksz alakú” darab helyezendő a 15 μl H2O-val megnedvesített szövetre

Közvetlen MTT-redukáló hatás előzetes felmérése

50 μl (folyadék) vagy 20 mg (szilárd)+ 2 ml MTT

0,3 mg/ml oldat 180 ± 5 percig 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

→ ha az oldat színe kékre/lilára vált, vízben elölt adaptált kontrollt kell végezni

50 μl (folyadék) vagy 25 mg (szilárd)+ 1 ml MTT

1 mg/ml oldat 60 percig 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

→ ha az oldat színe kékre/lilára vált, fagyasztással elölt adaptált kontrollt kell végezni

40 μl (folyadék) vagy 20 mg (szilárd)+ 1 ml MTT

1 mg/ml oldat 180± 15 percig 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH mellett

→ ha az oldat színe kékre/lilára vált, fagyasztással elölt adaptált kontrollt kell végezni

50 μl (folyadék) vagy 25 mg (szilárd)+ 1 ml MTT

1 mg/ml oldat 60 percig 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

→ ha az oldat színe kékre/lilára vált, fagyasztással elölt adaptált kontrollt kell végezni

Színinterferencia előzetes felmérése

10 μl (folyadék) vagy 10 mg (szilárd) + 90 μl H2O szobahőmérsékleten keverve 15 percig

→ ha az oldat elszíneződik, élő szöveteken adaptált kontrollt kell végezni

50 μl (folyadék) vagy 25 mg (szilárd) + 300 μl H2O 60 percre 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

→ ha az oldat elszíneződik, élő szöveteken adaptált kontrollt kell végezni

40 μl (folyadék) vagy 20 mg (szilárd) + 300 μl H2O szobahőmérsékleten keverve 60 percig

→ ha a vizsgálati vegyi anyag elszíneződik, élő szöveteken adaptált kontrollt kell végezni

50 μl (folyadék) vagy 25 mg (szilárd) + 300 μl H2O 60 percre 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

→ ha az oldat elszíneződik, élő szöveteken adaptált kontrollt kell végezni

Expozíciós idő és hőmérséklet

3 perc, 60 perc (± 5 perc) és 240 perc (± 10 perc)

Szellőztetett fülkében Szobahőmérsékleten (szobahőm., 18–28 oC)

3 perc szobahőmérsékleten, és 60 perc 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

3 perc szobahőmérsékleten, és 60 perc 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

3 perc szobahőmérsékleten, és 60 perc 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

Öblítés

25 ml 1x PBS (2 ml/öblítésenként)

20 alkalommal mosni 1x PBS-sel

20 alkalommal mosni 1x PBS-sel

20 alkalommal mosni 1x PBS-sel

Negatív kontroll

50 μl NaCl-oldat (9 g/l)

Minden expozíciós időpontban vizsgálva

50 μl H2O

Minden expozíciós időpontban vizsgálva

40 μl H2O

Minden expozíciós időpontban vizsgálva

50 μl H2O

Minden expozíciós időpontban vizsgálva

Pozitív kontroll

50 μl jégecet

Csak 4 órán át vizsgálva

50 μl 8N KOH

Minden expozíciós időpontban vizsgálva

40 μl 8N KOH

Csak 1 órán át vizsgálva

50 μl 8N KOH

Minden expozíciós időpontban vizsgálva

MTT-oldat

2 ml 0,3 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

MTT inkubációs idő és hőmérséklet

180 perc (± 15 perc) 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

180 perc 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

180 perc (± 15 perc) 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

180 perc 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH mellett

Extraháló oldószer

500 μl savasított izopropanol

(0,04 N HCl izopropanolban)

(izolált szövetet teljesen bemerítve)

2 ml izopropanol

(kinyerés az inzert tetejéről és aljáról)

1,5 ml izopropanol

(kinyerés az inzert tetejéről és aljáról)

2 ml izopropanol

(kinyerés az inzert tetejéről és aljáról)

Extrakciós időtartam és hőmérséklet

Éjszakán át szobahőmérsékleten, fénytől védett helyen

Szobahőmérsékleten rázás nélkül éjszakán át vagy 120 perces rázatással (~120 rpm)

Szobahőmérsékleten rázás nélkül éjszakán át vagy 120 perces rázatással (~120 rpm)

Szobahőmérsékleten rázás nélkül éjszakán át vagy 120 perces rázatással (~120 rpm)

OD leolvasás

570 nm (545–595 nm) referenciaszűrő nélkül

570 nm (vagy 540 nm) referenciasz